CN102037361A - 恶性黑色素瘤的分子诊断和分类 - Google Patents

恶性黑色素瘤的分子诊断和分类 Download PDF

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Abstract

本发明提供了使用在黑素瘤细胞中过表达的分子标志物来诊断黑素瘤和提供黑素瘤预后的方法。本发明提供了用于诊断和预后的试剂盒。本发明还提供了鉴定可用于治疗或预防黑素瘤及黑素瘤发展的化合物的方法。

Description

恶性黑色素瘤的分子诊断和分类
相关申请的交叉引用
本发明要求2008年3月5日提交的USSN 61/034,109的优先权，其通过引用以整体并入本文。
2006年9月6日提交的USSN 60/842,730，2007年3月29日提交的USSN 60/908,774，2007年7月20日提交的60/951,060以及2007年9月6日提交的国际申请No.PCT/US2007/077793也通过引用并入本申请。联邦政府资助下的研究或开发的发明权利声明
本发明在政府资助NCI基金No.RO1CA114337和CA122947下完成。政府享有本发明的某些权利。
背景技术
黑素瘤是美国第五大常见的恶性肿瘤，其发生率的上升比任何其它癌症都更为迅速。目前约七十分之一的美国人预计在其一生中会患上黑素瘤。黑素瘤是一种黑素细胞(色素细胞)的恶性肿瘤。尽管大多数黑素瘤在皮肤中出现，但是该癌症也可在粘膜表面或者神经脊细胞迁移到的其它部位出现。没有传播超出其原发部位的黑素瘤是完全可以医治的，因为这些早期形式是未侵袭超出乳头状真皮的薄病变。对这些早期局限性黑素瘤的治疗是手术切除，其边缘与原发性病变的细微分级成正比。一些传播到区域淋巴结的黑素瘤可通过广泛切除原发瘤并摘除所涉及的区域淋巴结来治疗。相比之下，更晚期形式的黑素瘤由于转移而具有高致死风险。当发生转移时，癌细胞可通过淋巴结传播到远处部位，例如肝、肺或脑。该疾病晚期患者的预后很差，平均存活6至10个月。
医治早期形式黑素瘤的能力及其向不可医治的转移性形式的快速转变，二者的结合决定了需要用于该疾病早期检测的更准确诊断方法以及用作疾病发展预后的更好标志物，以提供更确定的医学治疗策略。使得基于精确诊断和预后来设计合适治疗策略的问题更加复杂的是，医生发现黑素瘤经常显示出不可预知的临床行为。例如，原发肿瘤的垂直厚度是决定存活的最重要的预后因素之一，但是许多具有厚黑素瘤的患者不发生转移，而一小部分具有薄肿瘤的患者却因该病而死。因此，需要改进的标志物来改进预后算法，用于新诊断的黑素瘤患者。尽管研究了很多，但是尚没有分子因子常规用于黑素瘤患者的诊断和预后评价。这些生物标志物会提供早期黑素瘤检测的新方法，并且会构成黑素瘤风险评估的靶标以及新药开发的靶标。本发明的方法和组合物提供了这些针对黑素瘤患者的额外工具。
发明内容
总体而言，本发明的方法发现了检测下列标志物在黑素瘤诊断或者提供其预后中的特别用途：NCOA3、Wnt-2、PHIP(普列克底物蛋白同源结构域相互作用蛋白，pleckstrin homology domain interacting protein)、骨桥蛋白(osteopontin，SPP1)、WIF1、ARPC2、G1P3/IFNα诱导蛋白、MIP1α、Bfl1/Bcl-2相关蛋白A1、RGS1、纤连蛋白1(FN1)和/或POU5F1/Oct3/4，其在黑素瘤细胞中差异性表达(上调或下调)，并与黑素瘤发展相关。因此，这些标志物可用于诊断性地区分黑素瘤和良性痣。它们也可用于预后，以确定总存活概率、SLN状况、无复发存活率以及疾病特定存活率。所述标志物可单独或组合使用。在一个实施方案中，Wnt-2、ARPC2、SPP1、RGS1和FN1用于五标志物诊断测定，以分辨良性痣与黑素瘤。在另一个实施方案中，NCOA3和SPP1，以及NCOA3、SPP1和RGS1用于两标志物或三标志物预后测定，以确定总体存活概率、SLN状况、无复发存活率以及疾病特定存活率。在又一个实施方案中，ARPC2、FN1、NCOA3、RGS1、SPP1和WNT2用于黑素瘤的六标志物诊断测定。在另一个实施方案中，RGS1、NCOA3、SPP1和PHIP用于黑素瘤的四标志物预后测定。
本发明提供了包含用于检测一种或多种标志物之试剂的诊断和预后试剂盒。本发明还提供了鉴定能够通过调节下列标志物预防或治疗黑素瘤发展之化合物的方法，所述标志物即：NCOA3、Wnt-2、PHIP(普列克底物蛋白同源结构域相互作用蛋白)、骨桥蛋白(SPP1)、WIF1、ARPC2、G1P3/IFNα诱导蛋白、MIP1α、Bfl1/Bcl-2相关蛋白A1、RGS1、纤连蛋白1或POU5F1/Oct3/4。最后，提供了治疗方法，其中使用特异性结合下列一种或多种标志物的siRNA分子治疗黑素瘤，所述标志物即：NCOA3、Wnt-2、PHIP(普列克底物蛋白同源结构域相互作用蛋白)、骨桥蛋白(SPP1)、WIF1、ARPC2、G1P3/IFNα诱导蛋白、MIP1α、Bfl1/Bcl-2相关蛋白A1、RGS1、纤连蛋白1或POU5F1/Oct3/4。
在第一个实施方案中，本发明提供了诊断对象中黑素瘤的方法，其如下进行：将来自对象的生物样品与特异性结合选自以下的多肽标志物的一种或多种试剂相接触：NCOA3、Wnt-2、PHIP(普列克底物蛋白同源结构域相互作用蛋白)、骨桥蛋白(SPP1)、WIF1、ARPC2、G1P3/IFNα诱导蛋白、MIP1α、Bfl1/Bcl-2相关蛋白A1、RGS1、纤连蛋白1或POU5F1/Oct3/4，或者与一种或多种特异性结合选自下列的核酸标志物的试剂相接触：NCOA3、Wnt-2、PHIP(普列克底物蛋白同源结构域相互作用蛋白)、骨桥蛋白(SPP1)、WIF1、ARPC2、G1P3/IFNα诱导蛋白、MIP1α、Bfl1/Bcl-2相关蛋白A1、RGS1、纤连蛋白1或POU5F1/Oct3/4，然后测定一种或多种标志物是否在样品中差异性表达，从而提供对黑素瘤的诊断。在本实施方案的一个方面中，该方法包括测定样品中两种或更多种标志物是否差异性表达，其中所述标志物独立选择。在该实施方案的另一个方面中，所述试剂可以抗体，其可以是单克隆抗体。在该实施方案的另一个方面中，所述试剂可以是核酸，包括寡核苷酸或RT-PCR引物组。在该实施方案的其他一些方面中，所述黑素瘤是原发黑素瘤或转移黑素瘤，所述样品可以是皮肤活检。在该实施方案的另一些方面中，该诊断区分良性痣与恶性黑素瘤。在该实施方案的一个具体方面中，所述标志物是Wnt-2。在一些形式中，测定的步骤可使用酶免疫测定进行，例如ELISA或免疫组织化学测定。在其它一些形式中，测定的步骤可使用FISH或CGH进行。
在第二个实施方案中，本发明提供了一种提供对象中黑素瘤预后的方法，其如下进行：将来自对象的生物样品与一种或多种特异性结合选自下列的多肽标志物的试剂相接触：NCOA3、Wnt-2、PHIP(普列克底物蛋白同源结构域相互作用蛋白)、骨桥蛋白(SPP1)、WIF1、ARPC2、G1P3/IFNα诱导蛋白、MIP1α、Bfl1/Bcl-2相关蛋白A1、RGS1、纤连蛋白1或POU5F1/Oct3/4，或者与一种或多种特异性结合选自下列的核酸标志物的试剂相接触：NCOA3、Wnt-2、PHIP(普列克底物蛋白同源结构域相互作用蛋白)、骨桥蛋白(SPP1)、WIF1、ARPC2、G1P3/IFNα诱导蛋白、MIP1α、Bfl1/Bcl-2相关蛋白A1、RGS1、纤连蛋白1或POU5F1/Oct3/4，然后测定样品中标志物是否差异性表达，由此提供对黑素瘤的预后。在本实施方案的一个方面中，该方法包括测定样品中两种或更多种标志物是否差异表达，其中所述标志物独立选择。在该实施方案的另一个方面中，所述试剂可以抗体，其可以是单克隆抗体。在该实施方案的另一个方面中，所述试剂可以是核酸，包括寡核苷酸或RT-PCR引物组。在该实施方案的其他一些方面中，所述黑素瘤是原发黑素瘤或转移黑素瘤，所述样品可以是皮肤活检。在该实施方案的另一些方面中，所述预后可以转移至区域淋巴结、复发或死亡。在该实施方案的一个具体方面中，标志物是NCOA3。在一些形式中，测定的步骤可使用酶免疫测定进行，例如ELISA或免疫组织化学测定。在其它一些形式中，测定的步骤可使用FISH或CGH进行。
在第三个实施方案中，本发明提供了鉴定预防或治疗黑素瘤发展之化合物的方法，其如下进行：将化合物与含有表达下列标志物之细胞的样品相接触：NCOA3、Wnt-2、PHIP(普列克底物蛋白同源结构域相互作用蛋白)、骨桥蛋白(SPP1)、WIF1、ARPC2、G1P3/IFNα诱导蛋白、MIP1α、Bfl1/Bcl-2相关蛋白A1、RGS1、纤连蛋白1或POU5F1/Oct3/4，然后测定该化合物对标志物的功能性作用，由此鉴定预防或治疗黑素瘤的化合物。在本实施方案的一些方面中，该方法包括测定化合物对两种或更多种标志物的功能性作用，其中所述标志物各自独立选择。在该实施方案的多个方面中，所述化合物可以是小分子、siRNA、核酶或抗体，其可以是单克隆抗体。在该实施方案的一些方面中，所述黑素瘤是原发黑素瘤或转移黑素瘤。
在第四个实施方案中，本发明提供了诊断对象中黑素瘤或提供其预后的方法，其如下进行：(a)将来自该对象的生物样品与特异性结合多肽或核酸标志物的试剂相接触，所述标志物为Wnt-2、骨桥蛋白、ARPC2、RGS1和纤连蛋白1的标志物，然后测定所述标志物是否在该对象中差异性表达，由此提供对黑素瘤的诊断或预后。在一些方面中，所述方法还包括检测多肽或核酸标志物，包括PHIP(普列克底物蛋白同源结构域相互作用蛋白)、WIF1、G1P3/IFNα诱导蛋白、MIP1α、Bfl1/Bcl-2相关蛋白A1、或POU5F1/Oct3/4的标志物。在一些形式中，测定的步骤可以使用酶免疫测定进行，例如ELISA或免疫组织化学测定。在其它一些形式中，测定的步骤可使用FISH或CGH进行。
在第五个实施方案中，本发明提供了诊断对象中黑素瘤或提供其预后的方法，其如下进行：(a)将来自对象的生物样品与特异性结合选自Wnt-2、骨桥蛋白、ARPC2、RGS1或纤连蛋白1标志物的两种或更多种多肽或核酸标志物的试剂相接触，然后测定所述标志物是否在该对象中差异性表达(其中所述标志物各自独立选择)，由此提供对黑素瘤的诊断或预后。在该实施方案的一些方面中，所述试剂结合下列多肽标志物：Wnt-2、骨桥蛋白、ARPC2、RGS1和纤连蛋白1。在该实施方案的另一些方面中，所述试剂结合多肽标志物骨桥蛋白、NCOA3和RGS1。在最后这一方面的多个形式中，所述方法还包括检测Wnt-2、PHIP(普列克底物蛋白同源结构域相互作用蛋白)、骨桥蛋白(SPP1)、WIF1、ARPC2、G1P3/IFNα诱导蛋白、MIP1α、Bfl1/Bcl-2相关蛋白A1、纤连蛋白1或POU5F1/Oct3/4的多肽或核酸标志物。在一些形式中，测定的步骤可以使用酶免疫测定进行，例如ELISA或免疫组织化学测定。在其它一些形式中，测定的步骤可使用FISH或CGH进行。
在第六个实施方案中，本发明提供了诊断对象中黑素瘤或提供其预后的方法，其如下进行：(a)将来自对象的生物样品与特异性结合骨桥蛋白、NCOA3和RGS1多肽或核酸标志物的试剂相接触，然后测定所述标志物是否在该对象中差异性表达，由此提供对黑素瘤的诊断或预后。在该实施方案的一个方面中，所述方法还包括检测多肽或核酸标志物，包括Wnt-2、PHIP(普列克底物蛋白同源结构域相互作用蛋白)、WIF1、ARPC2、G1P3/IFNα诱导蛋白、MIP1α、Bfl1/Bcl-2相关蛋白A1、纤连蛋白1和POU5F1/Oct3/4的标志物。在一些形式中，测定的步骤可使用酶免疫测定进行，例如ELISA或免疫组织化学测定。在其它一些形式中，测定的步骤可使用FISH或CGH进行。
在第七个实施方案中，本发明提供了诊断对象中黑素瘤或提供其预后的方法，其如下进行：(a)将来自对象的生物样品与特异性结合两种或更多种多肽或核酸标志物的试剂相接触，所述两种或更多种标志物为骨桥蛋白、NCOA3或RGS1的标志物，其中标志物各自独立选择，然后测定所述标志物是否在该对象中差异性表达，由此提供对黑素瘤的诊断或预后。在该实施方案的一个方面中，所述试剂特异性结合骨桥蛋白和NCOA3的多肽或核酸标志物。在一些形式中，测定的步骤可使用酶免疫测定进行，例如ELISA或免疫组织化学测定。在其它一些形式中，测定的步骤可使用FISH或CGH进行。
在第八个实施方案中，本发明提供了用于诊断对象中黑素瘤或提供其预后的试剂盒。该试剂盒可包含第一容器和第二容器，所述第一容器包含特异性结合多肽或核酸标志物的第一试剂，所述标志物可以是NCOA3、Wnt-2、PHIP(普列克底物蛋白同源结构域相互作用蛋白)、骨桥蛋白(SPP1)、WIF1、ARPC2、G1P3/IFNα诱导蛋白、MIP1α、Bfl1/Bcl-2相关蛋白A1、RGS1、纤连蛋白1或POU5F1/Oct3/4的标志物，所述第二容器包含特异性结合多肽或核酸标志物的第二试剂，所述标志物可以是NCOA3、Wnt-2、PHIP(普列克底物蛋白同源结构域相互作用蛋白)、骨桥蛋白(SPP1)、WIF1、ARPC2、G1P3/IFNα诱导蛋白、MIP1α、Bfl1/Bcl-2相关蛋白A1、RGS1、纤连蛋白1或POU5F1/Oct3/4的标志物，其中第二试剂与第一试剂结合不同的标志物。在该实施方案的一个具体方面中，第一试剂特异性结合NCOA3标志物，第二试剂结合骨桥蛋白标志物。在该实施方案的另一个方面中，第一和第二试剂特异性结合Wnt-2、骨桥蛋白、ARPC2、RGS1或纤连蛋白1的多肽或核酸标志物，其中第二试剂结合与第一试剂结合不同的标志物。所述试剂盒还可含有用于使用酶免疫测定例如ELISA或免疫组织化学测定进行检测的其他试剂。在其他一些形式中，所述试剂盒还可含有另外的用于使用FISH或CGH进行检测的试剂。
在第九个实施方案中，本发明提供了诊断对象中黑素瘤或提供其预后的方法，其如下进行：(a)向对象施用特异性结合多肽或核酸标志物的试剂，所述标志物为NCOA3、Wnt-2、PHIP(普列克底物蛋白同源结构域相互作用蛋白)、骨桥蛋白、WIF1、ARPC2、G1P3/IFNα诱导蛋白、MIP1α、Bfl1/Bcl-2相关蛋白A1、RGS1、纤连蛋白1或者POU5F1/Oct3/4的标志物，然后测定所述标志物是否在该对象中差异性表达，由此提供对黑素瘤的诊断或预后。在本实施方案的一些方面中，该方法包括测定两种或更多种标志物是否在该样品中差异表达，其中所述标志物独立选择。在一些方面中，诊断或提供预后的方法包括用抗体试剂进行体内成像，所述抗体可以是单克隆抗体。也可使用其他成像剂例如适配体(aptamer)和镜像体(speiglmer)。
在第十个实施方案中，本发明提供了诊断对象中黑素瘤的方法，其如下进行：(a)将来自对象的生物样品与特异性结合生物样品中一种或多种选定标志物的一种或多种试剂相接触，其中所述标志物包括(i)Wnt-2、NCOA3、PHIP(普列克底物蛋白同源结构域相互作用蛋白)、骨桥蛋白(SPP1)、WIF1、ARPC2、G1P3/IFNα诱导蛋白、MIP1α、Bfl1/Bcl-2相关蛋白A1、RGS1、纤连蛋白1和POU5F1/Oct3/4的多肽或者(ii)编码这些多肽的核酸；然后(b)测定所述标志物是否在该样品中过表达或低表达，由此提供对该对象中黑素瘤的诊断。该方法也可包括下列步骤：将标志物表达的升高与样品中细胞的转移性表型相关联。在该实施方案的多个方面中，所述试剂可以是抗体、核酸或RT-PCR引物组。在另一些方面中，样品是皮肤活检。在该实施方案的另一个方面中，至少一种标志物选自Wnt-2、NCOA3、PHIP、ARPC2、RGS1和纤连蛋白1的多肽或者编码这些多肽的核酸。在另一些方面，所述诊断区分良性痣与恶性黑素瘤。在一些形式中，测定的步骤可以使用酶免疫测定进行，例如ELISA或免疫组织化学测定。在其它一些形式中，测定的步骤可使用FISH或CGH进行。
在第十一个实施方案中，本发明提供了提供对象中黑素瘤预后的方法，其如下进行：(a)将来自对象的生物样品与特异性结合生物样品中一种或多种选定标志物的一种或多种试剂相接触，其中所述标志物包括(i)Wnt-2、NCOA3、PHIP(普列克底物蛋白同源结构域相互作用蛋白)、骨桥蛋白(SPP1)、WIF1、ARPC2、G1P3/IFNα诱导蛋白、MIP1α、Bfl1/Bcl-2相关蛋白A1、RGS1、纤连蛋白1和POU5F1/Oct3/4的多肽或者(ii)编码这些多肽的核酸；以及(b)测定所述标志物是否在样品中过表达或低表达，由此提供该对象中黑素瘤的预后。在该实施方案的多个方面中，所述试剂可以是抗体、核酸或RT-PCR引物组。在另一些方面中，样品是皮肤活检。在该实施方案的另一个方面中，至少一种标志物选自NCOA3、骨桥蛋白和RGS1的多肽或者编码这些多肽的核酸。在该实施方案的另一些方面中，所述一种或多种所选标志物的表达升高与可包括转移到区域淋巴结、复发和死亡的预后相关。在一些形式中，测定的步骤可以使用酶兔疫测定进行，例如ELISA或免疫组织化学测定。在其它一些形式中，测定的步骤可使用FISH或CGH进行。
在第十二个实施方案中，本发明提供了诊断对象中黑素瘤或提供其预后的方法，其通过下列方式进行：(a)将来自对象的生物样品与特异性结合样品中不同选定标志物的两种或更多种试剂相接触，其中所述标志物包括(i)Wnt-2、骨桥蛋白、ARPC2、RGS1和纤连蛋白1的多肽或者(ii)编码所述多肽的核酸，其中标志物各自独立选择，以及(b)测定所选标志物是否在该样品中过表达或者低表达，由此诊断对象中的黑素瘤或者提供其预后。在该实施方案的一个方面中，所述试剂特异性结合多肽标志物Wnt-2、骨桥蛋白、ARPC2、RGS1和纤连蛋白1或者编码这些多肽的核酸标志物。在一些形式中，测定的步骤可以使用酶免疫测定进行，例如ELISA或免疫组织化学测定。在其它一些形式中，测定的步骤可使用FISH或CGH进行。
在第十三个实施方案中，本发明提供了诊断对象中黑素瘤或提供其预后的方法，其如下进行：(a)将来自对象的生物样品与特异性结合样品中选定多肽或核酸标志物的试剂相接触，其中所述标志物为骨桥蛋白、NCOA3和RGS1，以及(b)测定所选标志物是否在该样品中过表达或低表达，由此诊断对象中的黑素瘤或者提供其预后。所述方法还可包括检测多肽或核酸标志物的步骤，包括Wnt-2、PHIP(普列克底物蛋白同源结构域相互作用蛋白)、骨桥蛋白(SPP1)、WIF1、ARPC2、G1P3/IFNα诱导蛋白、MIP1α、Bfl1/Bcl-2相关蛋白A1、纤连蛋白1和POU5F1/Oct3/4的标志物。在一些形式中，测定的步骤可使用酶免疫测定进行，例如ELISA或免疫组织化学测定。在其它一些形式中，测定的步骤可使用FISH或CGH进行。
在第十四个实施方案中，本发明提供了诊断对象中黑素瘤或提供其预后的方法，其如下进行：(a)将来自对象的生物样品与特异性结合样品中不同选定标志物的两种或更多种试剂相接触，其中所述标志物包括(i)骨桥蛋白、NCOA3和RGS1的多肽或者(ii)编码所述多肽的核酸；其中标志物各自独立选择；以及(b)测定所选标志物是否在该样品中过表达或者低表达，由此诊断对象中的黑素瘤或者提供其预后。在该实施方案的一个方面中，所述试剂特异性结合骨桥蛋白和NCOA3的多肽标志物或者编码骨桥蛋白和NCOA3的核酸标志物。在一些形式中，测定的步骤可使用酶免疫测定进行，例如ELISA或免疫组织化学测定。在其它一些形式中，测定的步骤可使用FISH或CGH进行。
在第十五个实施方案中，本发明提供了用于诊断对象中黑素瘤或提供其预后的试剂盒，其中所述试剂盒含有(a)特异性结合选自下列的多肽或核酸标志物的第一试剂：Wnt-2、NCOA3、PHIP(普列克底物蛋白同源结构域相互作用蛋白)、骨桥蛋白(SPP1)、WIF1、ARPC2、G1P3/IFNα诱导蛋白、MIP1α、Bfl1/Bcl-2相关蛋白A1、RGS1、纤连蛋白1和POU5F1/Oct3/4；，和(b)特异性结合选自下列的多肽或核酸标志物的第二试剂：Wnt-2、NCOA3、PHIP(普列克底物蛋白同源结构域相互作用蛋白)、骨桥蛋白(SPP1)、WIF1、ARPC2、G1P3/IFNα诱导蛋白、MIP1α、Bfl1/Bcl-2相关蛋白A1、RGS1、纤连蛋白1和POU5F1/Oct3/4，其中第二试剂结合与第一试剂结合不同的标志物。在该实施方案的一个方面中，第一试剂特异性结合包括Wnt-2、NCOA3、PHIP、ARPC2、RGS1或纤连蛋白1的多肽在内的标志物，或者第一试剂特异性结合包括NCOA3、骨桥蛋白和RGS1的多肽在内的标志物。所述试剂盒还可含有通过使用酶免疫测定例如ELISA或免疫组织化学测定进行检测的其他试剂。在其他一些形式中，所述试剂盒还可含有另外的用于使用FISH或CGH进行检测的试剂。
在第十六个实施方案中，本发明提供了诊断对象中黑素瘤或者提供其预后的方法，其如下进行：(a)向对象施用特异性结合对象中一种或多种选定标志物的一种或多种试剂，所述标志物包括(i)Wnt-2、NCOA3、PHIP(普列克底物蛋白同源结构域相互作用蛋白)、骨桥蛋白(SPP1)、WIF1、ARPC2、G1P3/IFNα诱导蛋白、MIP1α、Bfl1/Bcl-2相关蛋白A1、RGS1、纤连蛋白1和POU5F1/Oct3/4的多肽，或者(ii)编码所述多肽的核酸，然后(b)测定所述标志物是否在该对象中过表达或低表达，从而提供黑素瘤的诊断或预后。
在第十七个实施方案中，本发明提供了鉴定预防或治疗黑素瘤发展的化合物的方法，其如下进行：(a)将化合物与样品相接触，所述样品包含表达选自以下之标志物的细胞：Wnt-2、NCOA3、PHIP(普列克底物蛋白同源结构域相互作用蛋白)、骨桥蛋白(SPP1)、WIF1、ARPC2、G1P3/IFNα诱导蛋白、MIP1α、Bfl1/Bcl-2相关蛋白A1、RGS1、纤连蛋白1或POU5F1/Oct3/4，和(b)测定该化合物对所述标志物的功能性作用，从而鉴定预防或治疗黑素瘤的化合物。在本实施方案的一个方面中，鉴定化合物的方法包括测定化合物对两种或更多种标志物的功能性作用，其中标志物各自独立选择。
在第十八个实施方案中，本发明提供了诊断对象中黑素瘤的方法，其如下进行：将来自对象的生物样品与各自特异性结合生物样品中至少一种选定标志物的试剂相接触，所述选定标志物包括：(i)ARPC2、FN1、NCOA3、RGS1、骨桥蛋白(SPP1)和WNT2的多肽，或者(ii)编码所述多肽的核酸，其中每种标志物有至少一种试剂与其结合，以及(b)测定所选标志物是否在该生物样品中过表达或者低表达，由此提供对象中的黑素瘤诊断。在该实施方案的一个方面中，所述试剂可以是抗体，其可以是单克隆抗体。在一些方面中，所述抗体可以是带标记的。在该实施方案的另一个方面中，所述试剂可以是核酸，包括寡核苷酸或RT-PCR引物组。在该实施方案的其他一些方面中，所述黑素瘤是原发黑素瘤或转移黑素瘤，所述样品可以是皮肤活检。在该实施方案的另一些方面中，所述诊断区分良性痣与恶性黑素瘤。在一些方面中，进行测定，其将所选标志物的表达提高与样品中细胞的转移性表型相关联。在一些形式中，测定的步骤可以使用酶免疫测定进行，例如ELISA或免疫组织化学测定。在其它一些形式中，测定的步骤可使用FISH或CGH进行。
在第十九实个施方案中，本发明提供了用于诊断对象中黑素瘤的试剂盒，所述试剂盒包含各与生物样品中至少一种选定标志物特异性结合的试剂，所述选定标志物包括：(i)ARPC2、FN1、NCOA3、RGS1、骨桥蛋白(SPP1)和WNT2的多肽，或者(ii)编码所述多肽的核酸，其中每种标志物有至少一种试剂与其结合。在该实施方案的一个方面中，所述试剂可以是抗体，其可以是单克隆抗体。在一些方面中，所述抗体可以是带标记的。在该实施方案的另一个方面中，所述试剂可以是核酸，包括寡核苷酸或RT-PCR引物组。所述试剂盒还可含有用于使用酶免疫测定例如ELISA或免疫组织化学测定进行检测的其他试剂。在其他一些形式中，所述试剂盒还可含有用于使用FISH或CGH进行检测的其他试剂。
在第二十个实施方案中，本发明提供了诊断对象中黑素瘤的方法，所述方法包括下列步骤：(a)向对象施用各自特异性结合对象中至少一种选定标志物的试剂，所述选定标志物包括：(i)ARPC2、FN1、NCOA3、RGS1、骨桥蛋白(SPP1)和WNT2的多肽，或者(ii)编码所述多肽的核酸，其中每种标志物有至少一种试剂与其结合，以及(b)测定所选标志物是否在该生物样品中过表达或者低表达，由此提供黑素瘤的诊断。在该实施方案的一个方面中，所述试剂可以是抗体，其可以是单克隆抗体。在该实施方案的另一个方面中，所述抗体可以是带标记的。
在第二十一个实施方案中，本发明提供了提供对象中黑素瘤预后的方法，其通过下列方式进行：(a)将来自对象的生物样品与各自特异性结合生物样品中至少一种选定标志物的试剂相接触，所述选定标志物包括：(i)RGS1、NCOA3、骨桥蛋白(SPP1)和PHIP的多肽，或(ii)编码所述多肽的核酸，其中每种标志物有至少一种试剂与其结合，以及(b)测定所选标志物是否在该生物样品中过表达或低表达，由此提供对象中黑素瘤的诊断。在该实施方案的一个方面中，所述试剂可以是抗体，其可以是单克隆抗体。在一些方面中，所述抗体可以是带标记的。在该实施方案的另一个方面中，所述试剂可以是核酸，包括寡核苷酸或RT-PCR引物组。在该实施方案的其他一些方面中，所述黑素瘤是原发黑素瘤或转移黑素瘤，所述样品可以是皮肤活检。在该实施方案的另一些方面中，所述预后可以是转移至区域淋巴结、复发或死亡。在一些形式中，测定的步骤可以使用酶免疫测定进行，例如ELISA或免疫组织化学测定。在其它一些形式中，测定的步骤可使用FISH或CGH进行。
在第二十二个实施方案中，本发明提供了提供对象中黑素瘤预后的试剂盒，所述试剂盒包含各自与生物样品中至少一种所选标志物特异性结合的试剂，所选标志物包括：(i)RGS1、NCOA3、骨桥蛋白(SPP1)和PHIP的多肽，或者(ii)编码所述多肽的核酸，其中每种标志物有至少一种试剂与其结合。在该实施方案的一个方面中，所述试剂可以抗体，其可以是单克隆抗体。在一些方面中，所述抗体可以是带标记的。在该实施方案的另一个方面中，所述试剂可以是核酸，包括寡核苷酸或RT-PCR引物组。所述试剂盒还可含有用于使用酶免疫测定例如ELISA或免疫组织化学测定进行检测的其他试剂。在其他一些形式中，所述试剂盒还可含有用于使用FISH或CGH进行检测的其他试剂。
附图说明
图1：原发黑素瘤的显微照片，其显示无NCOA3免疫染色(A图)和强NCOA3免疫染色(B图)。
图2：根据NCOA3表达水平的无复发存活(relapse free survival，RFS)(A图)及疾病特定存活(disease specific survival，DSS)(B图)的Kaplan-Meier分析。
图3：上图，促结缔组织增生性黑素瘤中的NCOA3免疫染色。注意纺锤状细胞的棕色染色。下图，来自同一患者的淋巴结转移中的NCOA3免疫染色。注意中央肿瘤细胞的弥散性染色。
图4：靶向小鼠NCOA3的核酶(Rz)及siRNA的抗转移活性。将B16-F10黑素瘤细胞静脉注射进10只C57B1/6小鼠的组。在注射后第3和10天，静脉注射阳离子脂质：编码对照载体序列的DNA复合物或者靶向小鼠NCOA3RNA不同位点的两种核酶和siRNA。在第25天处死小鼠，分析转移肺肿瘤的个数。与仅有对照(4613)载体相比，所有四种构建体都显示转移肿瘤负荷显著降低(P＜0.05)。
图5：用多种抗NCOA3或对照构建体处理的有肿瘤小鼠的肺重量。实验细节与图4所述的相同。
图6：靶向NCOA3的核酶397(Rz)针对小鼠乳腺癌的抗转移活性。将4T1乳腺癌细胞静脉注射到10只BALB/c小鼠的组。在注射的第3和10天，静脉注射阳离子脂质：编码对照载体序列、Rz397、siRNA385以及在核酶(m-Rz397)或siRNA(m-siRNA385)中含单碱基突变的突变体对照的DNA复合物。在第25天处死小鼠，分析转移肺肿瘤的个数。Rz397处理的小鼠具有比siRNA385、m-Rz397或者仅对照载体处理的小鼠明显更少的肺肿瘤。
图7：靶向NCOA3在体外抑制了肿瘤细胞侵袭。用仅载体或者表达靶向小鼠NCOA3的Rzs397的载体或siRNA385转染B16细胞，使用Boyden腔室测定在转染后24小时测定侵袭。
图8：复合黑素细胞痣中Wnt-2免疫染色的低倍(40x，A图)和高倍(100x，B图)显微照片，显示表皮内痣巢中强烈染色，表皮下和真皮巢中染色减少。
图9：原发黑素瘤(4.1mm厚，克拉克IV级)中Wnt-2免疫染色的低倍(40X，A图)和高倍(100X，B图)显微照片，其显示强染色的表皮内黑素瘤簇侵入真皮中。
图10：靶向小鼠Wnt-2的核酶(Mo-Wnt2-Rz879)的抗转移活性。将B16-F10黑素瘤细胞静脉注射进10只C57Bl/6小鼠中。在注射后第7天，静脉注射阳离子脂质：编码对照载体序列或者靶向不同小鼠Wnt-2RNA的核酶的DNA复合物。在第25天处死小鼠，分析转移肺肿瘤的个数。与仅对照(4613)载体相比，抗Wnt-2核酶显示转移肿瘤负荷显著降低(P＝0.0006)。
图11：痣中出现的原发黑素瘤中Wnt-2免疫染色的低倍(40x，A图)和高倍(100x，B图)显微照片，显示连接和真皮组分中黑素瘤(M)强染色，其下真皮先天性痣(N)中无染色。
图12：靶向小鼠PHIP的核酶(Rz)和siRNA的抗转移活性。将B16-F10黑素瘤细胞静脉注射进10只C57Bl/6小鼠中。在注射后第3和10天，静脉注射阳离子脂质：编码对照载体序列或者靶向小鼠PHIP RNA不同位点的三种核酶和siRNA的DNA复合物。在第25天处死小鼠，分析转移肺肿瘤的个数。与仅对照(4613)载体相比，两种核酶(Rz122和Rz314)以及一种siRNA(siRNA723)构建体显示转移肿瘤负荷显著降低(P＜0.05)。
图13：靶向PHIP在体外抑制了肿瘤细胞侵袭。用表达靶向小鼠PHIP的Rzs314或siRNA385的载体转染B16细胞，使用Boyden腔室测定在转染后24小时测定侵袭。与失活突变体核酶(mRz314)相比，Rz314显著抑制B16的侵袭，与几种对照无活性siRNA相比，siRNA723显著抑制B16的侵袭。
图14：通过荧光原位杂交(FISH)确定黑素瘤中NCOA3基因的拷贝数。
图15：使用全部五种标志物的组合标志物强度得分进行的多标志物测定的黑素瘤诊断ROC曲线。
图16：将标志物强度得分与顶部-底部差异相结合的用于训练组和验证组的诊断算法。对于算法中的每个诊断陈述，包含了训练组中正确和不正确观察结果的数目。
图17A-E：良性痣中ARPC2(A图)、FN1(B图)、RGS1(C图)、SPP1(D图)和WNT2(E图)免疫染色的代表性显微照片。
图18A-E：黑素瘤中ARPC2(A图)、FN1(B图)、RGS1(C图)、SPP1(D图)和WNT2(E图)免疫染色的代表性显微照片。
图19：使用单独一个标志物(FN1)、三种标志物(FN1、ARPC2、SPP1)和全部五种标志物的黑素瘤诊断中的ROC曲线。
图20A-E：与痣相关而出现的黑素瘤中ARPC2(A图)、FN1(B图)、RGS1(C图)、SPP1(D图)和WNT2(E图)免疫染色的代表性显微照片，其中M代表黑素瘤，N代表痣。
图21A-E：由五种标志物每一种正确诊断的误诊黑素细胞赘生物的免疫染色。A)具有起初被诊断为良性痣的0.76mm厚、克拉克III级非溃烂黑素瘤的44岁女性中的ARPC2染色；B)具有发育异常痣的29岁女性中的FN1染色，其最初诊断为0.25mm、克拉克II级黑素瘤；C)具有最初诊断为非典型性表皮内黑素细胞增生的病变的第IV期转移黑素瘤的31岁女性中RGS1的染色；D)具有0.8mm、克拉克4级非溃烂型促结缔组织增生性黑素瘤的46岁男性中的SPP1染色，其最初诊断为Spitz痣；E)具有0.76mm、克拉克III级非溃烂型黑素瘤的44岁女性中的WNT2染色，其最初诊断为良性痣。
图22：用于六基因黑素瘤诊断测定的使用顶部-底部得分差异的诊断算法。
图23：用于六基因黑素瘤诊断测定的使用染色强度得分和顶部-底部差异的诊断算法。
发明详述
简介
尽管研究得很多，但是尚没有常规用于黑素瘤患者诊断和预后评价的分子标志物。开发这些标志物的先决条件是了解黑素瘤细胞中差异表达的基因。
我们确定了Wnt-2、NCOA3、PHIP(普列克底物蛋白同源结构域相互作用蛋白)、骨桥蛋白(SPP1)、WIF1、ARPC2、G1P3/IFNα诱导蛋白、MIP1α、Bfl1/Bcl-2相关蛋白A1、RGS1、纤连蛋白1和POU5F1/Oct3/4在黑素瘤中显示差异表达。
如下文详细描述地，这些基因显示独特的表达模式，其是黑素瘤发展的不同方面的特征，因此可用于诊断和预后该癌症的不同阶段。例如，我们的数据显示，NCOA3是黑素瘤转移到区域淋巴结、疾病复发和死亡的良好指示物，而Wnt-2可以作为良性痣相对于恶性黑素瘤的诊断标志物。此外，我们的数据显示，相比于良性痣，SPP1在黑素瘤中过表达。我们的数据还显示，NCOA3可用作会转移到区域淋巴结的一部分促结缔组织增生性黑素瘤的预测物。这些结果显示，本发明公开的标志物可单独或组合用于为医生提供更确定的诊断和预后工具。
另外，这些基因编码的蛋白质在黑素瘤中差异表达。
因此，本发明提供了基于黑素瘤细胞中NCOA3、Wnt-2、PHIP(普列克底物蛋白同源结构域相互作用蛋白)、骨桥蛋白(SPP1)、WIF1、ARPC2、G1P3/IFNα诱导蛋白、MIP1α、Bfl1/Bcl-2相关蛋白A1、RGS1、纤连蛋白1和/或POU5F1/Oct3/4的差异表达来进行黑素瘤诊断和预后评价的方法。所述标志物可单独使用，或以两种或更多种的组合使用，或者作为标志物组使用。在一个实施方案中，基于ARPC2、FN1、NCOA3、RGS1、骨桥蛋白(SPP1)和WNT2的差异表达的六标志物测定用于诊断黑素瘤。在另一个实施方案中，基于RGS1、NCOA3、骨桥蛋白(SPP1)和PHIP的差异表达的四标志物测定用于提供黑素瘤的预后。本发明还提供了用于黑素瘤诊断或预后的试剂盒，其包含一种或多种检测所述标志物的试剂。本发明还提供用于治疗黑素瘤的治疗性siRNA，其与一种或多种所述标志物的序列互补。
定义
黑素瘤是开始于黑素细胞(一种产生色素的细胞)中的一种癌症。尽管常见于皮肤，但是黑素瘤也可发生于眼睛，并罕见地发生于鼻部通道、口、咽粘膜、阴道及肛门粘膜的膜中。美国癌症联合委员会(AJCC)设计了一种根据病理标准和存活率将黑素瘤分为4个阶段(具有许多亚阶段)的体系。黑素瘤可源于皮肤上的痣或良性痣，并通过由AJCC分级体系所定义的阶段发展。更多背景参见例如Harrison′s Principles ofInternal Medicine，Kasper等，第16版，2005。
术语“标志物”表示与正常细胞相比，在癌细胞的细胞中表达、表面上表达或者被癌细胞分泌的分子(通常为蛋白质、核酸、糖或脂质)，其可用于诊断癌症、提供预后。这些标志物是差异表达的分子，例如相比于正常细胞，在黑素瘤或其他癌细胞中过表达或低表达，例如，相比于正常细胞、痣或者原发癌症(与转移相比)1倍过表达/低表达、2倍过表达/低表达、3倍过表达/低表达或更多。另外，标志物可以是癌细胞中不正确地合成的分子，例如与正常细胞中表达的分子相比含有缺失、添加或突变的分子。
标志物可单独或与其他标志物组合使用，用于任何用途，例如黑素瘤的诊断或预后，如本文所公开。
本文使用的“黑素瘤评价标志物”表示在黑素瘤细胞中差异表达的标志物，同样地表示多肽或者编码多肽或多肽任何部分的核酸。
“生物样品”包括组织(例如活检和尸检样品)的切片，以及为组织学目的而取得的冷冻切片。这些样品包括皮肤样品、粘膜表面样品、血和血液级分或制品(例如血清、血浆、血小板、红血球等)、痰、淋巴和舌组织，培养细胞例如原代培养物、外植体和转化细胞，粪便、尿等。生物样品通常得自真核生物，最优选哺乳动物，例如灵长类如黑猩猩或人；牛；狗；猫；啮齿动物例如豚鼠、大鼠、小鼠、兔。
“活检”表示为诊断或预后评价而取出组织样品的过程，也表示组织样品本身。本领域已知的任何活检技术均可用于本发明的诊断和预后方法。所应用的活检技术取决于待评价的组织类型(例如皮肤、粘膜表面等)，肿瘤的大小和类型(例如实体或悬浮，血液或腹水)等因素。代表性活检技术包括但不限于切除活检、切取活检、针吸活检、手术活检。“切除活检”表示取出整个肿瘤块及其周围的少量正常组织边缘。“切取活检”表示取出包含肿瘤横截直径的组织楔块。通过内窥镜或荧光镜进行的诊断或预后可需要肿瘤块的“空芯针吸活检”或者“细针穿刺活检”，其通常含有来自肿瘤块内的细胞悬液。活检技术讨论于例如Harrison’s Principles ofInternal Medicine，Kasper等编辑，第16版，2005，第70章以及整个第五部分。
术语“过表达”或“过表达的”可互换，表示与正常细胞、痣或原发癌相比，以可检测的更高水平转录或翻译的蛋白质或核酸(通常是在癌细胞中)。该术语包括与正常细胞相比，由于转录、转录后加工、翻译、翻译后加工、细胞定位(例如细胞器、细胞质、细胞核、细胞表面)以及RNA和蛋白质稳定性而导致的过表达。可使用检测mRNA(即RT-PCR、PCR、杂交)或者蛋白质(即ELISA、免疫组织化学技术)的常规方法检测过表达。过表达可以是与正常细胞相比的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高。在某些情况下，过表达是相比于正常细胞1倍、2倍、3倍、4倍或更高水平的转录或翻译。过表达还可包括与正常细胞中无表达相比，样品细胞中的任何表达。
术语“低表达”或“低表达的”可互换，表示与正常细胞、痣或原发癌相比，以可检测的更低水平转录或翻译的蛋白质或核酸(通常是在癌细胞中)。该术语包括与正常细胞相比，由于转录、转录后加工、翻译、翻译后加工、细胞定位(例如细胞器、细胞质、细胞核、细胞表面)以及RNA和蛋白质稳定性而导致的低表达。可使用检测mRNA(即RTPCR、PCR、杂交)或者蛋白质(即ELISA、免疫组织化学技术)的常规技术检测低表达。低表达可以是与正常细胞相比的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％等。在某些情况下，低表达是相比于正常细胞1倍、2倍、3倍、4倍或更低水平的转录或翻译。低表达还可包括与正常细胞中任何表达相比，样品细胞中无表达。
“治疗性处理”和“癌症治疗”表示化学治疗、激素治疗、放射疗法、免疫疗法和生物(靶向)治疗。
本文中“治疗有效量或剂量”或“足够量或剂量”表示产生施用所要效果的剂量。确切的剂量取决于治疗目的，本领域技术人员可使用已知方法得知(参见例如Lieberman，Pharmaceutical Dosage Forms(1-3卷，1992)；Lloyd，The Art，Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999)；Pickar，Dosage Calculations(1999)；以及Remington：The Scienceand Practice of Pharmacy，第20版，2003，Gennaro编辑，Lippincott，Williams&Wilkins)。
在两种或更多种核酸或多肽序列的情况下，术语“同一性”或百分比“同一性”表示使用BLAST或BLAST 2.0序列比较算法采用如下所述缺省参数测定或者通过手工比对和肉眼观察(参见例如NCBI网页http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/，等等)时，相同或者具有特定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸的两种或更多种序列或子序列(即在比较窗口或指定区域上以最高对应性进行比较和比对时，在特定区域上约60％同一性，优选65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性)。随后，这些序列称为具有“显著同一性”。此定义也表示或者可应用于测试序列的互补序列。该定义还包括具有缺失和/或添加的序列，以及具有替换的那些。如下所述，优选算法可补偿缺口等。优选地，同一性在长度至少约25个氨基酸或核苷酸的区域上存在，或者更优选在长度为50-100个氨基酸或核苷酸长的区域上存在。
对于序列比较，通常将一个序列作为参考序列，用以比较测试序列。使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机，必要时指定子序列坐标，指定序列算法程序参数。优选地，可使用缺省程序参数，或者可指定其他参数。然后，根据序列参数，序列比较算法计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。
本文使用的“比较窗口”包括对任何连续位置数的一个区段的提及，所述数目选自20至600，通常约50至约200，更通常约100至约150，其中在两个序列最佳比对后该序列可与相同个数连续位置的参考序列比较。用于比较的序列比对方法是本领域中公知的。可进行用于比较的序列最佳比对，例如通过Smith&Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)的局部同源算法，通过Needleman&Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源性比对算法，通过Pearson&Lipman，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA85：2444(1988)的相似性检索方法，通过这些算法的计算机实施形式(GAP、BE STFIT、FASTA和TFASTA，在Wisconsin Genetics软件包中，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)，或者通过手工比对和肉眼观察(参见例如 Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等编辑.1987-2005，Wiley Interscience))。
适于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的优选实例有BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul等Nuc.Acids Res.25：3389-3402(1977)和Altschul等J.Mol.Biol.215：403-410(1990)。按照本文所述的参数，使用BLAST和BLAST 2.0确定本发明核酸和蛋白质的百分比序列同一性。实施BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心公开获得(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。该算法包括首先通过鉴定查询序列中长度W的短字节来鉴定高得分序列对(HSP)，其在与数据库序列中相同长度的字节比对时匹配或满足某正值阈值得分T。T称为邻近字节得分阈值(Altschul等，见上文)。这些初始邻近字节名字用作引发检索的种子，以发现含有它们的更长的HSP。所述字节命中沿各个序列双向延伸，直到可提高累计比对得分。对于核苷酸序列，使用参数M(匹配残基对的奖分；总是＞0)和N(不匹配残基的罚分；总是＜0)计算累计得分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累计得分。在下列情况时字节命中向各方向的延伸停止：累计比对得分比其最大实现值减少了数量X；由于一个或多个负分残基比对的积累，累计得分达到0或更低；或者到达序列末端。BLAST算法参数的W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)缺省使用：字长(W)11，期望(E)10，M＝5，N＝-4以及比较两条链。对于氨基酸序列，BLASTP程序缺省使用：字长3，期望(E)10，以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff&Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915(1989))比对(B)50，期望(E)10，M＝5，N＝-4，以及比较两条链。
“核酸”表示脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸以及其单链或双链形式的多聚体，以及其互补物。该术语涵盖了含有已知核苷酸类似物或经修饰主链残基或键的核酸，它们为合成的、天然的以及非天然的，其具有与参照核酸相似的结合特性，并且其以与参照核苷酸相似的方式代谢。这些类似物的实例包括而不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸、2-O-甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNA)。
“RNAi分子”或“siRNA”表示形成双链RNA的核酸，当siRNA与基因或靶基因在同一细胞中表达时，该双链RNA具有降低或抑制所述基因或靶基因表达的能力。因此，“siRNA”表示互补链形成的双链RNA。siRNA中杂交形成双链分子的互补部分通常具有显著或完全的同一性。在一个实施方案中，siRNA表示与靶基因具有显著或完全同一性并形成双链siRNA的核酸。siRNA的序列可对应于全长靶基因或者其子序列。通常，siRNA的长度为至少约15-50核苷酸(例如，双链siRNA中每个互补序列的长度为15-50个核苷酸，双链siRNA的长度为约15-50个碱基对，优选约20-30个碱基核苷酸，优选长度为约20-25个核苷酸，例如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。
“反义”多核苷酸是与靶多核苷酸基本互补并能与所述靶多核苷酸特异性杂交的多核苷酸。
核酶是能够催化RNA的特异性切割的酶活性RNA分子。核酶分子的组成优选包含一个或多个与靶mRNA互补的序列，以及负责mRNA切割的公知催化序列或功能等同序列(参见例如美国专利No.5,093,246，其通过引用以整体并入本文)。设计用于催化切割靶mRNA转录本的核酶分子也可用于阻止对象靶mRNA的翻译。
除非另外指明，否则特定核酸序列还暗示涵盖其保守修饰的变体(例如简并密码子替换)和互补序列，以及明确指出的序列。特别地，可通过产生这样的序列来实现简并密码子替换：其中一个或多个所选(或全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧次黄苷残基所替换(Batzer等，Nucleic Acid Res.19：5081(1991)；Ohtsuka等，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；Rossolini等，Mol.Cell.Probes 8：91-98(1994))。术语核酸与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸可互换使用。
特定核酸序列也暗示涵盖“剪接变体”以及编码癌抗原截短形式的核酸序列。类似地，由核酸编码的特定蛋白质暗示涵盖任何由该核酸的剪接变体或截短形式编码的蛋白质。顾名思义，“剪接变体”是基因选择性剪接的产物。转录之后，原始核酸转录本可发生剪接，使得不同的(选择性)核酸剪接产物编码不同多肽。产生剪接变体的机制可有所不同，包括外显子的选择性剪接。通过通读转录而来自于相同核酸的选择性多肽也涵盖在该定义中。剪接反应的任何产物(包括剪接产物的重组形式)都包括在该定义中。核酸可以是在5′端或3′端截短的。多肽可以是在N端或C端截短的。截短形式的核酸或多肽序列可以是天然的或者重组产生的。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换，表示氨基酸残基的多聚体。该术语适用于这样的氨基酸多聚体，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然氨基酸的人工化学模拟物，并且适用于天然氨基酸多聚体和非天然氨基酸多聚体。
术语“氨基酸”表示天然和合成的氨基酸，以及以与天然氨基酸相似的方式发挥作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然氨基酸是由遗传密码所编码的氨基酸以及其后经修饰的氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物表示与天然氨基酸具有相同的基本化学结构(即与氢、羧基、氨基和R基团相连的α碳)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍。这些类似物具有经修饰的R基团(例如正亮氨酸)或者经修饰的肽骨架，但是保留了与天然氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物表示具有与氨基酸一般化学结构不同的结构，但是以类似于天然氨基酸的方式发挥功能的化合物。
氨基酸在本文中可由公知的三字母符号来表示，或者由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号表示。类似地，核苷酸可由其公认的单字母代码表示。
“保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列。对于特定核酸序列，保守修饰变体表示编码相同的或基本相同的氨基酸序列的核酸，或者当核酸不编码氨基酸序列时，表示基本相同的序列。因为遗传密码的简并性，任何给定蛋白质都由很多功能上相同的核酸编码。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码丙氨酸。因此，在密码子指定为丙氨酸的每个位置，密码子可改变成任何相应密码子，而不改变所编码的多肽。这些核酸变化是“沉默变化”，是保守修饰变化的一种。本文中编码多肽的每个核酸序列也描述了核酸的每种可能的沉默变化。本领域技术人员会了解，核酸中的每个密码子(除了AUG和TGG之外，AUG通常是唯一的蛋氨酸密码子，TGG通过是唯一的色氨酸密码子)可经修饰而产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每种沉默变化包含在与表达产物相关的每个所述序列中，但是不包含在与实际探针序列相关的序列中。
同氨基酸序列一样，本领域技术人员会了解，核酸、肽、多肽或蛋白质序列中改变、添加或缺失所编码序列中单个氨基酸或小百分比氨基酸的各个替换、缺失或添加是“保守修饰变体”，其中所述改变导致氨基酸替换成化学相似的氨基酸。提供功能相似氨基酸的保守替换表是本领域中公知的。这些保守修饰变体是多态性变体、种间同源物和本发明等位基因之外的，并且不排除上述项。
下列八个组各含有彼此保守性替换的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、缬氨酸(v)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、蛋氨酸(M)。参见例如Creighton，Proteins(1984)。
“标记”或“可检测部分”是可通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其他物理手段检测的组合物。例如，可用的标记包括32P、荧光染料、电子密度试剂、酶(例如通常用于ELISA的)、生物素、洋地黄毒苷或半抗原以及可变成可检测的蛋白质，例如通过将放射性标记掺入肽中或者用于检测与所述肽特异性反应的抗体。
术语“重组”在用于指代例如细胞或核酸、蛋白质或载体时，表示该细胞、核酸、蛋白质或载体已通过引入异源核酸或蛋白质或者改变天然核酸或蛋白质而进行修饰，或者表示该细胞来源于如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达不在天然(非重组)形式该细胞中发现的基因，或者表达在其他情况下异常表达、低表达或根本不表达的天然基因。
短语“严格杂交条件”表示探针通常在核酸的复杂混合物中会与其靶标子序列杂交而不与其它序列杂交的条件。严格景件是序列依赖性的，在不同的环境中是不同的。较长的序列在更高的温度下特异性杂交。对核酸杂交的广泛指导可见于Tijssen，Techniques in Biochemistry and MolecularBiology--Hybridization with Nucleic Probes，“Overview of principles ofhybridization and the strategy of nucleic acid assays”(1993)。通常，严格条件选择成比特定序列在确定离子强度pH下的热解链温度(Tm)低约5-10℃。Tm是(在确定的离子强度、pH和核酸浓度下)与靶标互补的探针中有50％与靶序列杂交的平衡状态时的温度(因为引物靶序列过量存在，因此在Tm时，50％的探针处于平衡状态)。严格条件还可通过加入去稳定剂例如甲酰胺来实现。对于选择性或特异性杂交，阳性信号是背景的至少两倍，优选背景杂交10倍。示例性严格杂交条件如下：50％甲酰胺、5×SSC和1％SDS，在42℃下孵育，或者5×SSC、1％SDS，在65℃下孵育，用0.2×SSC和0.1％SDS在65℃下清洗。
如果所编码的多肽具有显著同一性，则在严格条件彼此不杂交的核酸仍然具有显著同一性。例如，这发生于使用遗传密码所允许的最高密码子简并性产生核酸拷贝的情况下。在这些情况下，核酸通常在中等严格杂交条件下杂交。示例性“中等严格杂交条件”包括在40％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS的缓冲液中在37℃下杂交，在1×SSC中45℃下清洗。阳性杂交是背景的至少两倍。本领域技术人员容易了解，可利用替代性杂交和清洗条件来提供相似严格度的条件。确定杂交条件的其他指导在多个参考文献中提供，例如Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等编辑，见上文。
对于PCR，低严格扩增通常使用约36℃的温度，但退火温度可根据引物长度为约32℃至48℃不等。对于高严格度PCR扩增，约62℃的温度是典型的，但高严格度退火温度根据引物长度和特异性可为约50℃至约65℃。高严格和低严格扩增的典型循环条件包括90℃-95℃下30秒-2分钟的变性阶段，持续30秒-2分钟的退火阶段，以及约72℃下1-2分钟的延伸阶段。低严格和高严格扩增反应的方案和指南例如由下列所提供，Innis等.(1990)PCR Protocols，A Guide to Methods and Applications，Academic Press，Inc.N.Y.)。
“抗体”表示包含特异性结合和识别抗原的来自免疫球蛋白基因或其片段的构架区的多肽。所识别的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及众多免疫球蛋白可变区基因。轻链分类为κ或λ。重链分类为γ、μ、α、δ或ε，其继而分别定义免疫球蛋白类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。通常，抗体的抗原结合区是结合的特异性和亲和力中最关键的。抗体可以是多克隆的或单克隆的，来自于血清、杂交瘤或是重组克隆的，还可以是嵌合的、灵长类化的或人源化的。
示例性免疫球蛋白(抗体)结构单元包含四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每一对具有一个“轻”链(约25kDa)和一个“重”链(约50-70kDa)。每条链的N端定义了约100至110个或更多氨基酸的可变区，其主要负责抗原识别。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别表示这些轻链和重链。
抗体例如以完整免疫球蛋白的形式存在，或者作为以多种肽酶消化所产生的许多充分表征的片段存在。因此，例如，胃蛋白酶在绞链区二硫键之下消化抗体，产生F(ab)′2——Fab的二聚体，其本身是通过二硫键与VH-CH1连接的轻链。F(ab)′2可在温和条件下还原，使得绞链区二硫键断裂，从而将F(ab)′2二聚体转变为Fab′单体。Fab′单体基本上是Fab和一部分绞链区。(参见Fundamental Immunology(Paul编辑，第三版1993)。尽管通过消化完整抗体而定义了许多抗体片段，但是本领域技术人员了解，这些片段可使用化学方式或使用重组DNA方法从头合成。因此，本文使用的术语“抗体”也包括通过修饰完整抗体产生的抗体片段，或者使用重组DNA方法从头合成的抗体片段(例如单链Fv)，或者使用噬菌体展示文库鉴定的抗体片段(参见例如McCafferty 等Nature 348：552-554(1990))。
在一个实施方案中，抗体与“效应子”部分缀合。所述效应子部分可以是许多分子，包括标记部分例如放射性标记或荧光标记。
本领域技术人员参考本公开内容会理解，本发明代表性标志物的氨基酸或核苷酸序列可通过在线检索获得自任何合适来源。例如，下列氨基酸和核苷酸序列(其通过参考并入本文)可使用Entrez搜索引擎获得自NCBI网站。
NCOA3指人中类固醇受体共激活蛋白家族的一个成员。编码NCOA3的代表性核酸的登录号包括：NM_008679、BC092516和BC088343等等。代表性NCOA3蛋白的登录号包括：CAI42141、CAC17693、CAB40662、AAH88343和NP_032705等等。
Wnt-2指可结合细胞表面受体以激活细胞中信号通路的胞外蛋白质家族的一个成员。编码Wnt-2的代表性核酸的登录号包括NM_003391和NM_023653等等。代表性Wnt-2蛋白的登录号包括：NP_004176、NP_078613和AAF30299等等。
PHIP(普列克底物蛋白同源结构域相互作用蛋白)指最初鉴定为与胰岛素受体底物-1(IRS-1)蛋白(其为胰岛素受体酪氨酸激酶磷酸化的底物)上普列克底物蛋白同源(PH)结构域结合之蛋白的蛋白质。参见例如Farhang-Fallah，J.等J.Biol.Chem.，275：40492-40497(2000)。PHIP的代表性核酸和蛋白序列的登录号包括：AAH08909、NP060404、XP999437和NM017934等等。
骨桥蛋白或SPP1(分泌磷蛋白1)指磷酸化糖蛋白家族，其在骨矿物基质中十分丰富并且促进骨再生和重建。其也在其他组织中产生，在许多疾病的调控和发展中起作用，如提高肿瘤细胞的侵袭和蛋白水解能力。骨桥蛋白的代表性蛋白序列的登录号包括：AAA62729、AAA59974、CAA40091、AAC28619和NM_000582等等。
WIF1、ARPC2、G1P3/IFNα诱导蛋白、MIP1α、Bfl1/Bcl-2相关蛋白A1、RGS1、纤连蛋白1(FN1)或POU5F1/Oct3/4的代表性序列如下：WIF1：NM_007191；ARPC2：NM_152862和NM_005731；GIP3aka IFI6：NM_022872、NM_002038和NM_022873；Mip-1αaka CCL3：NM_002983；Bfl-1aka BCL2A1：NM_004049；RGS1：NM_002922；FN1(纤连蛋白1)：NM_212475、NM_054034、NM_212476、NM_002026、NM_212474、NM_212478和NM_212482；POU5F1：NM_002701和NM_203289。
编码NCOA3、Wnt-2、PHIP(普列克底物蛋白同源结构域相互作用蛋白)、骨桥蛋白(SPP1)、WIF1、ARPC2、G1P3/IFNα诱导蛋白、MIP1α、Bfl1/Bcl-2相关蛋白A1、RGS1、纤连蛋白1(FN1)或POU5F1/Oct3/4的核酸或者其编码多肽表示所有形式的核酸(例如基因、前体mRNA、mRNA)或蛋白质，其多态性变体、等位基因、突变体和种间同源物(适用于核酸或蛋白质)，其(1)与参考核酸所编码的多肽或本文所述蛋白质序列在优选在至少约25、50、100、200、500、1000或更多氨基酸的区域上具有高于约60％氨基酸序列同一性，65％、70％、75％、80％、85％、90％、优选91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高氨基酸序列同一性的氨基酸序列；(2)与针对包含参考氨基酸序列、其免疫原性片段以及其保守修饰变体的免疫原产生的抗体(例如多克隆抗体)特异性结合；(3)在严格杂交条件下与编码参考氨基酸序列及其保守修饰变体的核酸特异性杂交；(4)具有与参考核酸序列在优选至少约25、50、100、200、500、1000或更多核苷酸的区域上有高于约95％、优选高于约96％、97％、98％、99％或更高核苷酸同一性的核酸序列。多核苷酸或多肽序列通常来自哺乳动物，包括但不限于灵长类例如人；啮齿动物例如大鼠、小鼠、仓鼠；牛、猪、马、绵羊或任何哺乳动物。本发明的核酸和蛋白质包括天然或重组分子。这些抗原的截短形式和选择性剪接形式包括在该定义中。
短语“特异性(或选择性)结合”在指代蛋白质、核酸、抗体或小分子化合物时，表示由蛋白质或核酸(经常在蛋白质或核酸以及其他生物物质的异源群体中)的存在情况决定的结合反应，所述蛋白质或核酸特别是NCOA3、Wnt-2、PHIP(普列克底物蛋白同源结构域相互作用蛋白)、骨桥蛋白(SPP1)、WIF1、ARPC2、G1P3/IFNα诱导蛋白、MIP1α、Bfl1/Bcl-2相关蛋白A1、RGS1、纤连蛋白1(FN1)或POU5F1/Oct3/4。就抗体来说，在指定的免疫测定条件下，指定抗体可以至少两倍于背景地结合特定蛋白质，更常见比背景高10至100倍。在这些条件下与抗体的特异性结合需要针对特定蛋白质进行了特异性选择的抗体。例如，可对多克隆抗体进行选择，以仅获得与所选抗原有特异性免疫反应性而与其他蛋白质则没有的多克隆抗体。这种选择可以通过去除与其他分子交叉反应的抗体来实现。可使用多种免疫测定形式来选择与特定蛋白质有特异性免疫反应性的抗体。例如，通常使用固相ELISA免疫测定来选择与蛋白质有特异性免疫反应性的抗体(参见例如Harlow&Lane，Antibodies，A LaboratoryManual(1988)，其描述了可用于测定特异性免疫反应性的免疫测定形式和条件)。
对于测试调节标志物蛋白质之化合物的测定，短语“功能作用”包括测定间接或直接受标志物蛋白质影响的参数，所述标志物蛋白质例如NCOA3、Wnt-2、PHIP(普列克底物蛋白同源结构域相互作用蛋白)、骨桥蛋白(SPP1)、WIF1、ARPC2、G1P3/IFNα诱导蛋白、MIP1α、Bfl1/Bcl-2相关蛋白A1、RGS1、纤连蛋白1(FN1)或POU5F1/Oct3/4，例如化学或表型作用，例如NCOA3翻译活性的改变或者Wnt-2信号途径活性的改变，以及这些蛋白质对细胞代谢和生长的下游作用。因此，功能作用包括配体结合活性、翻译活化或抑制、细胞增殖的能力、黑素瘤发展过程中细胞中的表达以及黑素瘤细胞的其他特征。“功能作用”包括体外、体内和离体活性。
“测定功能作用”表示对提高或降低间接或直接受标志物影响之参数的化合物进行测定，所述标志物质例如NCOA3、Wnt-2、PHIP(普列克底物蛋白同源结构域相互作用蛋白)、骨桥蛋白(SPP1)、WIF1、ARPC2、G1P3/IFNα诱导蛋白、MIP1α、Bfl1/Bcl-2相关蛋白A1、RGS1、纤连蛋白1(FN1)或POU5F1/Oct3/4，例如测定物理和化学或表型作用。这些功能性作用可通过本领域技术人员所知的任何手段来测定，例如光谱学特征的改变(例如荧光、吸光度、折射率)；流体动力学(例如形状)、色谱；或者蛋白质的溶解特性；配体结合测定，例如与抗体的结合；测量可诱导标志物或标志物的转录活化；测量酶活性的变化；增加或减少细胞增殖、凋亡、细胞周期停滞的能力，测量细胞表面标志物的变化。测定化合物对黑素瘤细胞发展的功能作用也可使用本领域技术人员已知的测定进行，例如通过尾静脉注射黑素瘤细胞到小鼠中来测定黑素瘤转移。这些功能作用可通过本领域技术人员所知的许多手段来评价，例如定量或定性测量形态特征变化的显微术，测量黑素瘤细胞中所表达的其他基因的RNA或蛋白水平的变化，测量RNA稳定性，鉴定下游或报告基因表达(CAT、萤光素酶、β-gal、GFP等)，例如通过化学发光、荧光、比色反应、抗体结合、可诱导标志物等等。
标志物的“抑制剂”、“活化剂”和“调节剂”用于表示使用体外和体内黑素瘤标志物测定所鉴定的活化、抑制或调节性分子，所述标志物例如NCOA3、Wnt-2、PHIP(普列克底物蛋白同源结构域相互作用蛋白)、骨桥蛋白(SPP1)、WIF1、ARPC2、G1P3/IFNα诱导蛋白、MIP1α、Bfl1/Bcl-2相关蛋白A1、RGS1、纤连蛋白1(FN1)或POU5F1/Oct3/4。抑制剂是这样的化合物，其例如与黑素瘤标志物结合，部分或完全阻断其活性，降低、阻止、延迟活化、失活、失敏或下调其活性或表达，例如拮抗剂，所述标志物例如NCOA3、Wnt-2、PHIP(普列克底物蛋白同源结构域相互作用蛋白)、骨桥蛋白(SPP1)、WIF1、ARPC2、G1P3/IFNα诱导蛋白、MIP1α、Bfl1/Bcl-2相关蛋白A1、RGS1、纤连蛋白1(FN1)或POU5F1/Oct3/4。“活化剂”是这样的化合物，其提高、启动、活化、利于、提高活化、敏化、激动或上调黑素瘤标志物活性，例如激动剂，所述标志物例如NCOA3、Wnt-2、PHIP(普列克底物蛋白同源结构域相互作用蛋白)、骨桥蛋白(SPP1)、WIF1、ARPC2、G1P3/IFNα诱导蛋白、MIP1α、Bfl1/Bcl-2相关蛋白A1、RGS1、纤连蛋白1(FN1)或POU5F1/Oct3/4。抑制剂、活化剂或调节剂还包括黑素瘤标志物的遗传修饰形式，所述标志物例如NCOA3、Wnt-2、PHIP(普列克底物蛋白同源结构域相互作用蛋白)、骨桥蛋白(SPP1)、WIF1、ARPC2、G1P3/IFNα诱导蛋白、MIP1α、Bfl1/Bcl-2相关蛋白A1、RGS1、纤连蛋白1(FN1)或POU5F1/Oct3/4，例如活性改变的形式，以及天然和合成配体、拮抗剂、激动剂、抗体、肽、环肽、核酸、反义分子、核酶、RNAi分子、小有机分子等。抑制剂和活化剂的此类测定包括如在体外、在细胞中或在细胞提取物中表达黑素瘤标志物，例如NCOA3、Wnt-2、PHIP(普列克底物蛋白同源结构域相互作用蛋白)、骨桥蛋白(SPP1)、WIF1、ARPC2、G1P3/IFNα诱导蛋白、MIP1α、Bfl1/Bcl-2相关蛋白A1、RGS1、纤连蛋白1(FN1)或POU5F1/Oct3/4，应用推定的调节剂化合物，然后测定对活性的功能作用，如上所述。
将经潜在活化剂、抑制剂或调节剂处理的包含黑素瘤标志物的样品或测定与无抑制剂、活化剂或调节剂的对照样品进行比较，以测定抑制的程度，所述标志物例如NCOA3、Wnt-2、PHIP(普列克底物蛋白同源结构域相互作用蛋白)、骨桥蛋白(SPP1)、WIF1、ARPC2、G1P3/IFNα诱导蛋白、MIP1α、Bfl1/Bcl-2相关蛋白A1、RGS1、纤连蛋白1(FN1)或POU5F1/Oct3/4。将对照样品(未经抑制剂处理)指定为100％的相对蛋白质活性值。在活性值相对于对照为约80％、优选50％、更优选25-0％时，实现了黑素瘤标志物例如NCOA3、Wnt-2、PHIP(普列克底物蛋白同源结构域相互作用蛋白)、骨桥蛋白(SPP1)、WIF1、ARPC2、G1P3/IFNα诱导蛋白、MIP1α、Bfl1/Bcl-2相关蛋白A1、RGS1、纤连蛋白1(FN1)或POU5F1/Oct3/4的抑制。在活性值相对于对照(未经活化剂处理)为110％、更优选150％、更优选200-500％(即对照的2-5倍高)、更优选1000-3000％时，实现了黑素瘤标志物例如NCOA3、Wnt-2、PHIP(普列克底物蛋白同源结构域相互作用蛋白)、骨桥蛋白(SPP1)、WIF1、ARPC2、G1P3/IFNα诱导蛋白、MIP1α、Bfl1/Bcl-2相关蛋白A1、RGS1、纤连蛋白1(FN1)或POU5F1/Oct3/4的激活。
本文所用的术语“测试化合物”或“药物候选”或“调节剂”或语法上的等同表述描述了待测试直接或间接调节黑素瘤标志物之能力的任何天然或合成分子，例如蛋白质、寡肽(例如约5至约25个氨基酸长，优选约10至20个或12至18个氨基酸长，优选12、15或18个氨基酸长)、小有机分子、多糖、肽、环肽、脂质、脂肪酸、siRNA、多核苷酸、寡核苷酸等，所述标志物例如NCOA3、Wnt-2、PHIP(普列克底物蛋白同源结构域相互作用蛋白)、骨桥蛋白(SPP1)、WIF1、ARPC2、G1P3/IFNα诱导蛋白、MIP1α、Bfl1/Bcl-2相关蛋白A1、RGS1、纤连蛋白1(FN1)或POU5F1/Oct3/4。测试化合物可以为测试化合物文库的形式，例如提供足够多样性程度的组合文库或随机文库。测试化合物任选地与融合伴侣相连，例如靶向化合物、挽救化合物、二聚化化合物、稳定化化合物、可寻址化合物及其他功能性部分。通常如下产生具有有用特性的新化学实体：鉴定具有一些期望特性或活性(例如抑制活性)的测试化合物(称为“先导化合物”)来，产生先导化合物的变体以及评价这些变体化合物的特性和活性。通常，这些分析使用高通量筛选方法(HTS)。
“小有机分子”指天然或合成的有机分子，其具有大于约50道尔顿且小于约2500道尔顿的分子量，优选小于约2000道尔顿，优选在约100至约1000道尔顿之间，更优选在约200至约500道尔顿之间。
诊断和预后方法
本发明提供了诊断黑素瘤或者提供其预后的方法，其通过检测在不同恶性阶段的黑素瘤细胞中差异表达之标志物的表达来实现。诊断包括测定患者或患者样品中NCOA3、Wnt-2、PHIP(普列克底物蛋白同源结构域相互作用蛋白)、骨桥蛋白(SPP1)、WIF1、ARPC2、G1P3/IFNα诱导蛋白、MIP1α、Bfl1/Bcl-2相关蛋白A1、RGS1、纤连蛋白1(FN1)或POU5F1/Oct3/4多肽或核酸的表达水平，以及然后将该表达水平与基线值或范围进行比较。通常，基线值是未患黑素瘤的健康人中该多肽或核酸的代表性表达水平，如使用生物样品例如皮肤活检所测量的。本发明的多核苷酸或核酸水平偏离基线范围的变化(向上或向下)显示患者患有癌症或者有发生癌症的风险，这取决于所用的标志物。就NCOA3、Wnt-2、PHIP(普列克底物蛋白同源结构域相互作用蛋白)、骨桥蛋白(SPP1)、ARPC2、G1P3/IFNα诱导蛋白、MIP1α、Bfl1/Bcl-2相关蛋白A1、RGS1、纤连蛋白1(FN1)或POU5F1/Oct3/4来说，过表达与黑素瘤的诊断相一致。就Wif1来说，低表达与黑素瘤的诊断一致。
本文使用的术语“提供预后”表示提供对黑素瘤可能的病程和结局的预测。所述方法还可用于设计黑素瘤治疗的合适疗法，例如通过显示黑素瘤是否仍处于良性阶段或者黑素瘤是否已发展到需要介入性治疗的阶段来实现。
测定中可使用抗体试剂，以使用本领域技术人员已知的多种免疫测定中的任意种检测患者样品中NCOA3、Wnt-2、PHIP(普列克底物蛋白同源结构域相互作用蛋白)、骨桥蛋白(SPP1)、WIF1、ARPC2、G1P3/IFNα诱导蛋白、MIP1α、Bfl1/Bcl-2相关蛋白A1、RGS1、纤连蛋白1(FN1)或POU5F1/Oct3/4的表达水平。适用于检测NCOA3的单克隆抗体试剂公开于2008年3月4日提交的美国专利申请号61/033663。此外，适用于检测Wnt-2表达的单克隆抗体试剂公开于2008年3月4日提交的美国专利申请号61/033,641。这些参考文献通过引用并入本文用以全部目的。
免疫测定技术和方案通常描述于Price和Newman，“Principles andPractice of Immunoassay，”第二版，Grove′s Dictionaries，1997；和Gosling，“Immunoassays：A Practical Approach，”Oxford UniversityPress，2000。可使用多种免疫测定技术，包括竞争性和非竞争性免疫测定。参见例如Self等Curr.Opin.Biotechnol.，7：60-65(1996)。术语“免疫测定”涵盖包括下列的方法，而不限于此：酶兔疫测定(enzyme immunoassays，EIA)例如酶放大免疫测定技术(enzyme multiplied immunoassaytechnique，EMIT)、酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA)、IgM抗体捕获ELISA(IgM antibody capture ELISA，MAC ELISA)，和微粒酶免疫测定(microparticle enzyme immunoassay，MEIA)；免疫组织化学(immunohistochemical，IHC)测定；毛细管电泳免疫测定(capillary electrophoresis immunoassays，CEIA)；放射性免疫测定(radioimmunoassays，RIA)；免疫放射测定(immunoradiometricassays，IRMA)；荧光偏振免疫测定(fluorescence polarizationimmunoassays，FPIA)；和化学发光测定(chemiluminescence，CL)。如果需要，这些免疫测定可以是自动化的。免疫测定也可与激光感生荧光联合使用。参见例如Schmalzing等Electrophoresis，18：2184-93(1997)；Bao，J.Chromatogr.B.Biomed.Sci.，699：463-80(1997)。脂质体免疫测定(例如流动注射脂质体免疫测定和脂质体免疫传感器)也适用于本发明。参见例如Rongen等J.Immunol.Methods，204：105-133(1997)。另外，浊度测定适用于本发明方法，其中蛋白质/抗体复合物的形成导致光散射增加，其转化为作为标志物浓度函数的峰值速率信号。浊度测定可从BeckmanCoulter(Brea，CA；Kit#449430)购得，可使用Behring浊度分析仪(Fink等J.Clin.Chem.Clin.Biochem.，27：261-276(1989))进行。
可直接地或间接地检测抗体与蛋白质的特异性免疫结合。直接标记包括与抗体相连的荧光或发光标签、金属、染料、放射性核素等。可使用碘-125(125I)标记的抗体。使用蛋白质特异性化学发光抗体进行的化学发光测定适于灵敏的非放射性蛋白质水平检测。用荧光团标记的抗体也是合适的。荧光团的实例包含但不限于DAPI、荧光素、Hoechst33258、R-藻青蛋白、B-藻红蛋白、R-藻红蛋白、罗丹明、德克萨斯红和丽丝胺(lissamine)。间接标记包括本领域中公知的多种酶，例如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、尿素酶等。可使用辣根过氧化物酶检测系统，例如，使用发色底物四甲基联苯胺(TMB)，其在过氧化氢存在下产生可在450nm检测的可溶性产物。可使用带有发色底物磷酸对硝基苯基酯的碱性磷酸酶检测系统，例如，产生可容易地在405nm检测的可溶性产物。类似地，可使用带有发色底物邻硝基苯基-β-D-半乳吡喃糖苷(ONPG)的β-半乳糖苷酶检测系统，其产生可在410nm检测的可溶性产物。可使用带有例如尿素-溴甲酚紫底物的尿素酶检测系统(Sigma Immunochemicals；St.Louis，MO)。
可分析来自直接或间接标记的信号，例如使用分光光度计检测来自发色底物的颜色；使用辐射计数器检测辐射，例如用γ粒子计数器检测125I；或者使用荧光计检测某种波长的光存在下的荧光。对于酶联抗体的检测，可使用分光光度计根据制造商说明进行定量分析，例如EMAX微滴定板读数器(Molecular Devices；Menlo Park，CA)。如果需要，本发明的测定可以自动化或者用机器人进行，可同时检测来自多个样品的信号。
所述抗体可固定于多种固体支持物上，例如磁或色谱基质颗粒，测定平板的表面(例如微滴定孔)，固体基底材料片或膜(例如塑料、尼龙、纸)等。可通过在固体支持物上以阵列涂覆抗体或多种抗体来制备测定条。然后，可将该条浸入测试样品，通过清洗和检测步骤进行快速处理，产生可测量信号，例如色斑。
或者，核酸结合分子例如探针、寡核苷酸、寡核苷酸阵列和引物可用于测定中，以检测患者样品中的差异性RNA表达，例如RT-PCR。在一个实施方案中，根据本领域中已知的标准方法使用RT-PCR。在另一个实施方案中，可使用PCR测定，例如可获得自例如Applied Biosystems的
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测定，以检测核酸及其变体。在另一些实施方案中，qPCR和核酸微阵列可用于检测核酸。可根据本领域技术人员已知的方法制备结合所选癌症生物标志物的试剂，或者从以商品购买。
可使用常规方法例如Southern分析、逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)实现核酸的分析，或任何其他基于与标志物编码序列一部分互补的核酸序列进行杂交的方法(例如狭缝点杂交)也在本发明的范围内。可用的PCR扩增方法描述于例如Ausubel等和Innis等，见上文。一般性核酸杂交方法描述于Anderson，“Nucleic Acid Hybridization，”BIOSScientific Publishers，1999。多个核酸序列(例如基因组DNA、mRNA或cDNA)的扩增或杂交也可由设置于微阵列中的mRNA或cDNA序列进行。微阵列方法一般性地描述于Hardiman，“Microarrays Methods andApplications：Nuts&Bolts，”DNA Press，2003；以及Baldi等“DNAMicroarrays and Gene Expression：From Experiments to Data Analysisand Modeling，”Cambridge University Press，2002。
核酸标志物以及其变体的分析可使用本领域已知的方法进行，包括但不限于微阵列、基于聚合酶链式反应(PCR)的分析、序列分析、荧光原位杂交(FISH)、比较基因组杂交(CGH)和电泳分析。基于PCR的分析的非限制性实例包括
Figure BPA00001252827700301
等位基因区分测定，其可获得自AppliedBiosystems。序列分析的非限制性实例包括Maxam-Gilbert测序、Sanger测序、毛细管阵列DNA测序、热循环测序(Sears等Biotechniques，13：626-633(1992))、固相测序(Zimmerman等Methods Mol.Cell Biol.，3：39-42(1992))、使用质谱的测序例如基质辅助激光解吸/离子时间飞行质谱(MALDI-TOF/MS；Fu等Nat.Biotechnol.，16：381-384(1998))以及通过杂交进行的测序。Chee等Science，274：610-614(1996)；Drmanac等Science，260：1649-1652(1993)；Drmanac等Nat.Biotechnol.，16：54-58(1998)。电泳分析的非限制性实例包括平板凝胶电泳，例如琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，毛细管电泳和变性梯度凝胶电泳。检测核酸变体的其它方法包括例如来自Third Wave Technologies，Inc.的测定、限制性片断长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)分析、等位基因特异性寡核苷酸杂交、异双链体迁移测定、单链构象多态性(single strand conformational polymorphism，SSCP)分析、单核苷酸引物延伸(single-nucleotide primer extension，SNUPE)和焦磷酸测序(pyrosequencing)。
FISH和CGH是分析基因组DNA失衡遗传变化的方法。简单地说，标记(例如红色荧光标记)来自测试样品(例如黑素瘤细胞)的基因组DNA，并与另一种颜色标记的(例如绿色荧光标记)正常基因组DNA混合，将混合物与正常人的分裂中期涂片(metaphase spread)、组织制备物或其他参考标准品杂交。以绿色与红色荧光比值的提高或降低，相对于正常分裂中期染色体对黑素瘤样品中染色体失衡的区域(拷贝数增加或减少)进行定位或作图。进行FISH或CGH的详细方案是本领域中可获得的，例如在下列中，Molecular Cytogenetics：Protocols and Applications，Yao-Shan Fan编辑，Humana Press，2002；Cancer Cytogenetics：Methodsand Protocols，John Swansbury编辑，Humana Press，2003。
在进行FISH和CGH时，通过下列方式制备染色体样品：将细胞以单细胞悬液或组织制备物的形式沉积于固体支持物(例如载玻片)上，并通过选择提供细胞最佳空间分辨率和最佳杂交效率的固定剂来进行固定。原位杂交通常需要下列基本步骤：(1)固定待分析的组织或生物学结构；(2)对所述生物学结构进行预杂交处理，以提高靶标DNA的可接近性，并减少非特异性结合；(3)将核酸混合物与生物学结构或组织中的核酸杂交；(4)杂交后清洗，以除去未在杂交中结合的核酸片段；和(5)检测杂交的核酸片段。在一些情况下，需要对重复顺序的杂交能力进行封闭。出于这些目的，可使用人基因组DNA作为封闭这些杂交的试剂。对于杂交，以一种染料标记与染色体目的区域(例如本文公开的一种或多种标志物)杂交的测试探针，以另一种染料标记与不同区域杂交的对照探针。与目的染色体中稳定部分(例如着丝粒区)杂交的核酸常常可用作对照探针。使用这些对照，可以补偿样品之间杂交效率的差异。如果在单个杂交中使用多种测试标志物，则其每一种可用可分别区分的标记来标记。
鉴于FISH和CGH方法的灵敏度，可使用多种测试样品。可使用石蜡包埋的肿瘤切片，同样可使用新鲜或冷冻的材料。其他类型的制备物包含来自于未培养的原发肿瘤的制备物(参见例如Kallioniemi，A.等Cytogenet.Cell Genet.60：190-193(1992))。例如，可使用来自肿瘤的血样或者小活检组织样品。(参见例如Kallioniemi，A.等Cytogenet.Cell Genet.60：190-193(1992))。也可分析获得自刺吸活检的细胞或者体液(例如血、尿、痰等)中的细胞。
本文所述测定中可使用了可检测部分。可使用多种可检测部分，标记的选择取决于所需的灵敏度，与抗体缀合的简单与否，稳定性要求以及可用的装置和处理规定(disposal provision)。合适的可检测部分包括但不限于放射性核素、荧光染料(例如荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、Oregon GreenTM、罗丹明、得克萨斯红、四罗丹明异硫氰酸酯(tetrarhodimine isothioeynate，TRITC)、Cy3、Cy5等)、荧光标记(例如绿色荧光蛋白(GFP)、藻红蛋白等)、由肿瘤相关蛋白酶活化的自猝灭荧光化合物、酶(例如萤光素酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)、纳米颗粒、生物素、洋地黄毒苷等。
可用的物理形式包括具有用于检测多种不同标志物的多个离散的可寻址位置的表面。这些形式包括微阵列和某些毛细管装置。参见例如Ng等J.Cell Mol.Med.，6：329-340(2002)；美国专利No.6,019,944。在这些实施方案中，每个离散表面位置可包含抗体，以固定用于在每个位置处检测的一种或多种标志物。或者，表面可包含固定于该表面离散位置的一个或多个离散颗粒(例如微粒或纳米颗粒)，其中所述微粒包含抗体以固定用于检测的一种或多种标志物。
分析可以多种物理形式进行。例如，微量滴定板或自动化的使用可利于大量测试样品的处理。或者，可开发单样品形式，以利于及时的诊断或预后。
或者，本发明的抗体或核酸探针可应用到固定于显微镜用载玻片上的患者活检切片上。可使用本领域已知的多种光学或荧光显微方法观察所得抗体染色或原位杂交图案。
在一些实施方案中，可通过原位显示一种或多种本文所公开的基因序列或多肽的表达对患者的黑素瘤进行诊断或其他评价。显示存活患者中分子(核酸、多肽及其他生化物质)的存在或表达的本领域技术人员会了解，本文所述的基因表达信息可用于多种显示方法中。这些方法包括但不限于单光子发射计算机断层术(single-photon emission-computedtomography，SPECT)和正电子发射断层术(positron-emittingtomography，PET)方法。参见例如Vassaux和Groot-wassink，“In VivoNoninvasive Imaging for Gene Therapy，”J.Biomedicine andBiotechnology，2：92-101(2003)；Turner，J.，Smyth，P.，Fallon，J.F.，Kennedy，J.L.，Potkin，S.G.，FIRST BIRN(2006).Imaging and genetics in  schizophrenia.Neuroinformatics，出版中。
PET和SPECT成像显示器官和组织的化学功能，而其他成像技术例如X射线、CT和MRI则显示结构。PET和SPECT成像可用于鉴定和监测黑素瘤的发展。在一些情况下，使用PET或SPECT成像使得可以在症状发作前数年检测到疾病。使用用于标记和显现多肽及核苷酸的存在或表达的小分子已经获得了成功，例如在显示阿尔茨海默病患者脑中蛋白质方面，例如Herholz K等Mol Imaging Biol.，6(4)：239-69(2004)；Nordberg A，Lancet Neurol.，3(9)：519-27(2004)；Neuropsychol Rev.，Zakzanis KK等13(1)：1-18(2003)；Kung MP等，BrainRes.，1025(1-2)：98-105(2004)；和Herholz K，Ann Nucl Med.，17(2)：79-89(2003)所述。抗体和核酸探针也是可用的。
本文公开的差异表达基因或者它们所编码的肽或其片段可用于PET和SPECT成像应用的情况中。在用适于PET或SPECT应用的示踪残基修饰后，与核酸标志物或与那些转录本所编码任何多肽发生相互作用或结合的分子可用于显示基因表达模式，并利于本文所述的诊断和预后。类似地，如果所编码的多肽编码酶，则与酶催化产物相互作用的标记分子可用于本文所述的体内成像和诊断应用。
组合物和试剂盒
本发明提供了用于实施本文所述测定的组合物和试剂盒，其使用对本发明多肽具有特异性的抗体或者对本发明多核苷酸具有特异性的核酸。
用于实施本发明诊断测定的试剂盒通常在合适的容器装置中包含探针(其包含与本发明标志物多肽或多核苷酸特异性结合的抗体或核酸序列)以及用于检测所述探针存在情况的标记。该试剂盒可包含几种抗体或编码本发明多肽的多核苷酸序列，例如第一抗体和/或第二和/或第三和/或其他抗体，其识别NCOA3、Wnt-2、PHIP(普列克底物蛋白同源结构域相互作用蛋白)、骨桥蛋白(SPP1)、WIF1、ARPC2、G1P3/IFNα诱导蛋白、MIP1α、Bfl1/Bcl-2相关蛋白A1、RGS1、纤连蛋白1(FN1)或POU5F1/Oct3/4。
试剂盒的容器装置通常包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器和/或其他容器，对本发明多肽之一具有特异性的第一抗体或者对本发明多核苷酸之一具有特异性的第一核酸可置于和/或适当地分装于其中。在提供第二和/或第三和/或另外组分时，试剂盒通常还会含有第二、第三和/或其他容器，其中可放置该组分。或者，容器可含有多于一种抗体或核酸试剂的混合物，每种试剂特异性结合本发明的不同标志物。本发明的试剂盒通常还包括封装含有抗体或核酸探针的装置以用于销售。这些容器可包括注塑和/或吹塑塑料容器，所需的小瓶保存于其中。
所述试剂盒还可包含阳性和阴性对照，以及根据本发明方法使用其中所含试剂盒组分的说明。
体内成像
本发明的多种标志物还提供了用于体内成像的试剂，例如黑素瘤向区域淋巴结转移的成像使用检测NCOA3、Wnt-2、PHIP(普列克底物蛋白同源结构域相互作用蛋白)、骨桥蛋白(SPP1)、WIF1、ARPC2、G1P3/IFNα诱导蛋白、MIP1α、Bfl1/Bcl-2相关蛋白A1、RGS1、纤连蛋白1(FN1)或POU5F1/Oct3/4蛋白或核酸的带标记试剂。可使用体内成像技术，例如作为手术切除的指导，或者用于检测黑素瘤的远处传播。对于体内成像目的而言，检测NCOA3、Wnt-2、PHIP(普列克底物蛋白同源结构域相互作用蛋白)、骨桥蛋白(SPP1)、WIF1、ARPC2、G1P3/IFNα诱导蛋白、MIP1α、Bfl1/Bcl-2相关蛋白A1、RGS1、纤连蛋白1(FN1)或POU5F1/Oct3/4存在情况的试剂(例如抗体)可用发射正电子的同位素(例如18F)进行标记，用于正电子发射断层术(PET)；用γ-射线同位素(例如99mTc)进行标记，用于单光子发射计算机断层术(SPECT)；用顺磁性分子或纳米颗粒(例如Gd3+螯合物或带涂层的磁性纳米颗粒)进行标记，用于磁共振成象(MRI)；用近红外荧光团所标记用于近红外(近IR)成像；用萤光素酶(萤火虫、细菌或腔肠动物)或其他发光分子标记，用于生物发光成像；或者由全氟化碳填充的囊泡标记，用于超声。
此外，这些试剂可包含荧光部分，例如荧光蛋白、肽或荧光染料分子。荧光染料的常见类别包括但不限于呫吨类，例如罗丹明、对甲氨基酚和荧光素及其衍生物；bimanes；香豆素及其衍生物例如伞形酮和氨甲基香豆素；芳香胺例如丹酰；方酸类染料；苯并呋喃；荧光花青素类(FluorescentCyanines)；咔唑；二氰基亚甲基吡喃、聚甲炔、oxabenzanthrane、呫吨、吡喃
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、carbostyl、二萘嵌苯、吖啶酮、喹吖啶酮、红荧烯、蒽、蔻、菲、芘、丁二烯、1，2-二苯乙烯、镧系金属螯合物、稀土金属螯合物以及这些染料的衍生物。荧光染料例如在美国专利No.4,452,720，美国专利No.5,227,487和美国专利No.5,543,295中讨论。
适用于实施本发明的其他荧光标记包括荧光素染料。典型的荧光素染料包括但不限于5-羧基荧光素、荧光素-5-异硫氰酸酯和6-羧基荧光素；其他荧光素染料的实例可见于例如美国专利No.6,008,379，美国专利No.5,750,409，美国专利No.5,066,580和美国专利No.4,439,356。负荷部分C可包括罗丹明染料，例如四甲基罗丹明-6-异硫氰酸酯、5-羧基四甲基罗丹明、5-羧基对甲氨基酚衍生物、四甲基和四乙基罗丹明、二苯基二甲基和二苯基二乙基罗丹明、二萘基罗丹明、罗丹明101磺酰氯(以德克萨斯红的商品名销售)，以及其他罗丹明染料。其它罗丹明染料可见于例如美国专利No.6,080,852，美国专利No.6,025,505，美国专利No.5,936,087，美国专利No.5,750,409。负荷部分C可包括花青素类染料，例如Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5，Cy5.5、Cy7。也可使用磷光化合物包括卟啉、酞菁、多芳香化合物例如芘、蒽和苊等等。
试剂(如抗体)可包含放射性部分，例如放射性同位素，如211At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P、Lu的放射性同位素等。
鉴定化合物的方法
可使用多种方法来鉴定预防或治疗黑素瘤发展的化合物。通常，提供易于测量的参数的测定适于在多孔板的孔中进行，以利于筛选如本文所述测试化合物文库的成员。因此，在一个实施方案中，可将合适数量的细胞铺板于多孔板的孔中，可测定测试化合物对NCOA3、Wnt-2、PHIP(普列克底物蛋白同源结构域相互作用蛋白)、骨桥蛋白(SPP1)、WIF1、ARPC2、G1P3/IFNα诱导蛋白、MIP1α、Bfl1/Bcl-2相关蛋白A1、RGS1、纤连蛋白1(FN1)或POU5F1/Oct3/4表达的作用。
待测试化合物可以是任何小化合物或者大分子，例如蛋白质、糖、核酸或脂类。通常，测试化合物将是小化学分子和肽。基本上任何化合物均可用作本发明此方面的测试化合物，尽管最经常使用可溶于水或有机(尤其是基于DMSO的)溶液的化合物。所述测定设计成通过下述方式筛选大化学文库：使测定步骤自动化并将来自任何方便来源的化合物提供给测定，其通常平行进行(例如，在机器人测定中以微滴定形式在微量滴定板上进行)。应了解，有许多化合物的供应商，包括Sigma(St.Louis，MO)，Aldrich(St.Louis，MO)，Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)，FlukaChemika-Biochemica Analytika(Buchs Switzerland)等等。
在一个优选实施方案中，使用高通量筛选方法，其包括提供含有大量潜在治疗化合物的组合化学文库或肽文库。然后，在一个或多个测定中筛选这些“组合化学文库”或“配体文库”，如本发明所述，以鉴定显示所需特征活性的文库成员(特别是化学物种类或亚类)。在这种情况下，筛选这些化合物降低NCOA3、Wnt-2、PHIP(普列克底物蛋白同源结构域相互作用蛋白)、骨桥蛋白(SPP1)、WIF1、ARPC2、G1P3/IFNα诱导蛋白、MIP1α、Bfl1/Bcl-2相关蛋白A1、RGS1、纤连蛋白1(FN1)或POU5F1/Oct3/4表达的能力。
组合化学文库是由化学合成或生物合成、通过组合许多化学“构建块”(例如试剂)而产生的许多不同的化合物。例如，对于给定的化合物长度(即多肽化合物中的氨基酸数)，通过以每种可能的形式组合一组化学构建块(氨基酸)而形成线性组合化学文库，例如多肽文库。可通过这种化学构建块的组合混合来合成数百万种化合物。
组合化学文库的制备和筛选是本领域技术人员公知的。这些组合化学文库包括但不限于肽文库(参见例如美国专利5,010,175，Furka，Int.J.Pept.Prot.Res.，37：487-493(1991)以及Houghton等Nature，354：84-88(1991))。也可使用产生化学多样性文库的其它化学品。这些化学品包括但不限于：拟肽(例如PCT公开No.WO 91/19735)，编码的肽(例如PCT公开No.WO 93/20242)，随机生物寡聚体(例如PCT公开No.WO 92/00091)，苯并二氮
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(例如美国专利No.5,288,514)，多样体类(diversomers)例如乙内酰脲、苯二氮
Figure BPA00001252827700362
类和二肽(Hobbs等PNAS USA，90：6909-6913(1993))，插烯多肽(Hagihara等J.Amer.Chem.Soc.，114：6568(1992))，具有葡萄糖骨架的非肽的肽模拟物(Hirschmann等J.Amer.Chem.Soc.，114：9217-9218(1992))，小化合物文库的类似有机合成(Chen等J.Amer.Chem.Soc.，116：2661(1994))，寡氨基甲酸酯(Cho等Science，261：1303(1993))和/或肽基膦酸酯(Campbell等J.Org.Chem.，59：658(1994))，核酸文库(参见Ausubel，Berger and Sambrook，au supra)，肽核酸文库(参见例如美国专利No.5,539,083)，抗体文库(参见例如Vaughn等NatureBiotechnology，14(3)：309-314(1996)and PCT/US96/10287)，碳水化合物文库(参见例如Liang等Science，274：1520-1522(1996)和美国专利No.5,593,853)，小有机分子文库(参见例如benzodiazepines，Baum C&EN，Jan 18，page 33(1993)；类异戊二烯，美国专利No.5,569,588；噻唑啉酮和metathiazanones，美国专利No.5,549,974；吡咯烷，美国专利Nos.5,525,735和5,519,134；吗啉代化合物，美国专利No.5,506,337；苯并二氮
Figure BPA00001252827700363
5,288,514等等)。
制备组合文库的装置是市售的(参见例如357MPS，390MPS，Advanced Chem Tech，Louisville KY，Symphony，Rainin，Woburn，MA，433A Applied Biosystems，Foster City，CA，9050 Plus，Millipore，Bedford，MA)。此外，许多组合文库本身是市售的(参见例如ComGenex，Princeton，N.J.，Asinex，Moscow，Ru，Tripos，Inc.，St.Louis，MO，ChemStar，Ltd，Moscow，RU，3D Pharmaceuticals，Exton，PA，Martek Biosciences，Columbia，MD，等等)。
在本发明的高通量测定中，可以在一天筛选多达数千种不同调节剂或配体。尤其是，可使用微量滴定板的每个孔进行针对所选潜在调节剂的单独测定，或者，如果要观察浓度或孵育时间的作用时，可以每5-10个孔一种调节剂。因此，一个标准微量滴定板可测定约96种调节剂。如果使用1536孔板，这一块板可轻易地测定约100-约1500种不同的化合物。可以每天测定许多块板；使用本发明的集成系统可以进行多达约6000、20000、50000或100000或更多种不同化合物的测定筛选。使用核酸抑制标志物蛋白表达的方法
可使用多种核酸(例如反义核酸、siRNA或核酶)来抑制本发明标志物的功能。在位点特异性识别序列处切割mRNA的核酶可用于破坏靶标mRNA，尤其是通过使用锤头状核酶。锤头状核酶在由与靶标mRNA形成互补碱基对的侧翼区域所确定的位置切割mRNA。优选地，靶标mRNA具有下列的两碱基序列：5′-UG-3′。锤头状核酶的构建和产生是本领域公知的。
基因靶向性核酶必须含有与靶标mRNA的两个区域互补的杂交区，每个区域的长度为至少5个，优选6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核苷酸。另外，核酶具有高度特异性的核糖核酸内切酶活性，其自催化切割靶标有义mRNA。
对于反义、siRNA或核酶寡核苷酸，可使用硫代磷酸酯寡核苷酸。磷酸二酯键以及杂环或糖的修饰可带来效率的提高。硫代磷酸酯用于修饰磷酸二酯键。N3′-P5′氨基磷酸酯键已被描述为使得寡核苷酸对核酸酶稳定，并提高与RNA的结合。肽核酸(PNA)键是对核糖和磷酸二酯主链的完全替换，并对核酸酶稳定，增加与RNA的结合亲和力，并且不被核糖核酸酶H所切割。其基本结构也可进行修饰，允许对其作为反义组分进行优化。对于杂环的修饰，已证明某些杂环修饰增强了反义作用，而不干扰核糖核酸酶H的活性。这些修饰的一个实例为C-5噻唑修饰。最后，也可考虑糖的修饰。在细胞培养物和体内，2′-O-丙基和2′-甲氧基乙氧基核糖修饰使得寡核苷酸对核酸酶稳定。
可通过直接转染或者转染并通过表达载体表达来将抑制性寡核苷酸递送到细胞。合适的表达载体包括哺乳动物表达载体和病毒载体，其中已克隆了具有合适调节序列的抑制性寡核苷酸，所述调节序列包括启动子，从而导致反义RNA在宿主细胞中表达。合适的启动子可以是组成型或发育特异性启动子。转染递送可通过本领域中已知的脂质体转染试剂来实现(例如Xtreme转染试剂，Roche，Alameda，CA；Lipofectamine制剂，Invitrogen，Carlsbad，CA)。由阳离子型脂质体、逆转录病毒载体介导的递送以及直接递送都是有效的。另一种可能的递送模式是使用抗体靶向至靶细胞的细胞表面标志物。
对于转染，包含一个或多个核酸分子(有或没有载体)的组合物可包含用于施用给对象的递送运载体，包括脂质体，运载体和稀释剂及其盐，和/或可以可药用制剂的形式存在。递送核酸分子的方法描述于例如Gilmore，等Curr Drug Delivery(2006)3：147-5以及Patil，等AAPSJournal(2005)7：E61-E77，其均通过引用并入本文。siRNA分子的递送也描述于数个美国专利公开中，包括例如2006/0019912；2006/0014289；2005/0239687；2005/0222064；和2004/0204377，其公开内容均通过引用并入本文。核酸分子可通过本领域技术人员已知的多种方法施用给细胞，所述方法包括但不限于包装在脂质体中、通过离子电渗、通过电穿孔、或者通过掺入其他运载体中，包括可生物降解的聚合物、水凝胶、环糊精。(参见例如Gonzalez等1999，Bioconjugate Chem.，10，1068-1074；Wang等的国际PCT公开No.WO 03/47518和WO 03/46185)，聚(乳酸-co-羟基乙酸)(PLGA)和PLCA微球(参见例如美国专利No.6,447,796和美国专利申请公开No.2002/130430)，可生物降解纳米胶囊和生物粘附微球，或者通过蛋白质载体(O′Hare和Normand，国际PCT公开No.WO 00/53722)。在另一个实施方案中，本发明的核酸分子也可与聚乙烯亚胺及其衍生物配制在一起或相复合，例如聚乙烯亚胺-聚乙二醇-N-乙酰半乳糖胺(PEI-PEG-GAL)或聚乙烯亚胺-聚乙二醇-三-N-乙酰半乳糖胺(PEI-PEG-triGAL)衍生物。
可用于本发明的脂质体转染试剂实例包括例如CellFectin，其为阳离子型脂质N，NI，NII，NIII-四甲基-N，NI，NII，NIII-四棕榈基-y-精胺与二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)的1∶1.5(M/M)脂质体制剂(GIBCO BRL)；Cytofectin GSV，其为阳离子型脂质与DOPE的2∶1(M/M)脂质体制剂(Glen Research)；DOTAP(N-[1-(2，3-二油酰氧基)-N，N，N-三甲基-甲基硫酸铵)(Boehringer Manheim)；Lipofectamine，其为聚阳离子型脂质DOSPA与中性脂质DOPE的3∶1(M/M)脂质体制剂(GIBCO BRL)；和(5)siPORT(Ambion)；HiPerfect(Qiagen)；X-treme GENE(Roche)；RNAicarrier(Epoch Biolabs)和TransPass(New England Biolabs)。
在一些实施方案中，反义、siRNA或核酶序列通过哺乳动物表达载体递送至细胞中。例如，适于siRNA表达的哺乳动物表达载体是市售的，例如，来自Ambion(例如pSilencer vectors)，Austin，TX；Promega(例如GeneClip，siSTRIKE，SiLentGene)，Madison，WI；Invitrogen，Carlsbad，CA；InvivoGen，San Diego，CA；和Imgenex，San Diego，CA。通常，用于转录siRNA分子的表达载体具有U6启动子。
在一些实施方案中，反义、siRNA或核酶序列通过病毒表达载体递送至细胞。适于递送这些分子至细胞的病毒载体包括腺病毒载体、腺相关病毒载体和逆转录病毒载体(包括慢病毒载体)。例如，开发用于递送和表达siRNA寡核苷酸的病毒载体是市售的，来自例如GeneDetect，Bradenton，FL；Ambion，Austin，TX；Invitrogen，Carlsbad，CA；OpenBioSystems，Huntsville，AL；和Imgenex，San Diego，CA。
实施例
下列实施例为举例说明而提供，而非对本发明作出限制。
实施例1：NCOA3过表达与黑素瘤结局的相关性
使用含有来自具有确定组织学并随访的343名患者的原发黑素瘤的黑素瘤组织微阵列(TMA)的免疫组织化学分析来评价NCOA3的表达。使用Cox回归和Kaplan-Meier分析来评估多个预后因素的存在与否对黑素瘤患者的无复发存活(RFS)和疾病特定存活(DSS)的影响。使用logistic回归分析来评估多个因素的存在与否对前哨淋巴结(sentinel lymph node，SLN)转移的影响。
如下文我们的结果所证明的，NCOA3表达程度的提高对SLN转移(p＝0.013)和SLN转移的平均数(P＝0.031)具有显著预测性。Kaplan-Meier分析证明了NCOA3过表达与RFS(P＝0.021)及DSS(P＝0.030)降低之间的显著相关性。logistic回归分析显示，NCOA3表达程度的提高是SLN状态的独立预测因素(P＝0.017)。多变量Cox回归分析显示了NCOA3表达对RFS(P＝0.0095)和DSS(P＝0.021)的独立影响。NCOA3是预测DSS的最强因素，要好于肿瘤厚度和溃烂。因此，这些结果将NCOA3鉴定为黑素瘤结局的新的独立标志物，其对SLN转移、RFS和DSS有显著影响。
黑素瘤TMA的表征和构建
我们构建了343个原发黑素瘤的TMA，其随访至少两年，有复发记录，或者进行了SLN活检。表1中显示人群的人口统计概要。在343名患者中，259名进行了SLN活检，因此提供了有关SLN状态的信息。接受SLN活检的标准包括以下项：黑素瘤厚度≥1.0mm，或者在厚度1.0mm以下的黑素瘤中存在下列任意组织学因素：Clark IV或V级，溃烂，涉及血管，微卫星，大范围消退(覆盖肿瘤直径的50％以上)或者活检不充分(部分活检显示黑素瘤横断于底部)。该人群的平均随访是49个月，随访中值为45个月。如前所述，通过从石蜡块取出1.0mm直径的组织核心来构建TMA(参见Kashani-Sabet M.等JClin Oncol，22：617-623，2004；Kononen J.等Nat Med 4：844-847，1998。
表1：患者人口统计学摘要
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免疫组织化学
对载玻片脱蜡，在二甲苯中再水化，然后在10mM柠檬酸盐缓冲液中微波处理。用3％过氧化氢阻断内源过氧化物酶活性，将载玻片依次与亲和素和生物素封闭试剂一起孵育。然后，将一抗(小鼠单克隆抗NCOA3IgG(Abcam #_ab14139))以1∶10稀释度加入，在室温下孵育60分钟。将生物素化马抗小鼠IgG抗体(Vector Laboratories，Burlingame，CA)作为用于放大的二抗，然后与ABC-HRP(Vector Laboratories)一起孵育30分钟，然后是DAB/过氧化氢溶液(Sigma)。
免疫组织化学染色的评价
对每个组织阵列核心染色最强的区域评分。使用下列标准对NCOA3蛋白质的表达进行分级：未染色(0)，弱染色(1)，中等染色(2)以及强染色(3)。由对病例身份不知情的病理学家为阵列评分，由分离的独立评分试验重复每个得分。对于少数重复试验中评分矛盾的情况，确定一致得分。NCOA3染色的特异性对照包括乳腺癌、黑素瘤细胞系(LOX和FEM)以及黑素瘤组织切片。阳性对照包括乳腺癌切片以及LOX和FEM细胞，而阴性对照包括扁桃体组织和乳腺癌细胞系T47D。用于免疫组织化学的阴性对照包括使用磷酸盐缓冲液替换一抗，所有其他实验条件保持不变。
统计学分析
用于评估多种预后因素对黑素瘤结局的重要性的统计方法之前已有描述。(参见Kashani-Sabet M.等J Clin Oncol，22：617-623，2004；Kashani-Sabet M.等J Clin Oncol，20：1826-1831，2002；Kashani-Sabet，M.等Arch Dermatol，137：1169-1173，2001。对于RFS和DSS，最初基于Kaplan-Meier分析中DSS预测值的最佳取舍值选择高NCOA3得分的定义(确定为2或3的得分)，在RFS和DSS的所有后续单变量和多变量分析中均一且一致地使用相同的取舍值。使用Fisher精确检验以及单变量和多变量Cox回归来评估高NCOA3表达与RFS或DSS之间的相关性。对于SLN状态，根据单变量logistic回归分析的结果，最佳取舍值确定为得分0和1或者2和3，所有后续检验SLN状态的分析均一且一致地使用相同的取舍值。使用卡方分析以及单变量和多变量logistic回归来评估NCOA3表达与SLN转移之间的相关性。使用方差分析(ANOVA)和定向Le检验评估NCOA3表达的提高与平均SLN计数之间的相关性。除了此定向分析之外，所有报告的P值都是两侧的。除了AJCC分析的预后因素之外，数据集中还包括下列因素：有丝分裂速率、肿瘤血管供应、微卫星存在与否、血管涉及以及消退。临床或病理属性的编码如前所述进行(参见Kashani-Sabet M.等J Clin Oncol，22：617-623，2004)。
结果
由于我们的cDNA微阵列结果表明NCOA3基因在转移性黑素瘤中与非相关原发肿瘤相比差异表达，我们要在含有343个原发黑素瘤核心的TMA中在蛋白质水平上检查NCOA3表达的预后影响。使用靶向人NCOA3的市售单克隆抗体(小鼠单克隆抗NCOA3IgG(Abcam#_ab14139))分析NCOA3表达，由对患者结局不知情的观察者评分。
所检测的343个核心中，20个(8％，图1A)没有NCOA3表达，111个(32.4％，图1B)强表达(得分为3)。NCOA3的表达与黑素瘤的组织学亚型不显著相关(数据未显示)，可能的例外是促结缔组织增生性黑素瘤，其中仅有一个原发肿瘤显示强染色。另外，NCOA3表达不与黑素瘤的几种已知组织学预后因素相关联，例如肿瘤厚度，溃烂，Clark分级，有丝分裂速率，血管涉及，微卫星或者肿瘤血管供应(数据未显示)。
首先，我们通过单变量分析分析了NCOA3表达与黑素瘤结局之间的相关性。高NCOA3表达(确定为得分2或3)显著增加黑素瘤复发的风险(52.2％相对于35.9％，P＝0.010，Fisher精确检验)，并且在用Kaplan-Meier分析时降低该人群中黑素瘤患者的RFS(P＝0.021，对数秩检验，图2A)。高NCOA3表达与由于黑素瘤所致死亡的风险提高相关(31.9％相对于18.5％，P＝0.021，Fisher精确检验)，并通过Kaplan-Meier分析与降低的DSS相关(P＝0.030，对数秩检验，图2B)。
除了复发和死亡的风险之外，通过logistic回归分析，NCOA3表达增加与阳性SLN状态(微转移至区域淋巴结基底的一个度量)显著相关(P＝0.013)。NCOA3染色得分为0的患者具有7.1％的SLN阳性发生率，得分为1或2的患者增加至27.4％，得分为3的患者中是38.3％(P＝0.036，卡方检验)。令人注意地，NCOA3表达水平也与SLN肿瘤负荷相关，如通过所涉及的SLN平均个数所测量的。因此，NCOA3染色得分为0的患者中，所涉及淋巴结的平均个数为0.07。得分为1或2的患者中，增加到0.47个淋巴结，得分为3的患者中为0.57个淋巴结(P＝0.0004ANOVA，P＝0.030Le定向检验)。
接下来，我们用多变量分析研究了NCOA3表达对黑素瘤结局的影响。进行多变量Cox回归分析，包括NCOA3状态和AJCC分级委员会针对黑素瘤所评价的六个临床和组织学预后因素(包括肿瘤厚度和溃烂)，目前用于皮肤黑素瘤AJCC分级分类的因素(参见Balch C.M等J ClinOncol，19：3622-3634，2001；Balch C.M等J Clin Oncol，19：3635-3648，2001)。该分析显示，NCOA3状态是RFS(表2)和DSS(表3)的独立预测物。在DSS的Cox回归分析中，NCOA3作为决定存活的最强因素出现，胜过肿瘤厚度和溃烂。随后，多变量logistic回归分析证明，在模型中包含六个其他预后因素时，NCOA3表达是SLN状态的独立预测物(表4)。
最后，我们评估了在将数据组所包含(且可用于分析)的全部12种因素都输入多变量模型时，多种预后因素的预测值。除了前文提到的七种因素之外，该分析包括有丝分裂速率、肿瘤血管供应程度以及是否存在血管涉及、微卫星和消退。当所有12种因素都包含在多变量模型中时，NCOA3过表达仍然显著预测了DSS和SLN状态(数据未显示)。
表2.临床、组织学和分子因素对黑素瘤人群RFS之影响的Cox回归分析
预后因素             风险比  卡方    P值(双尾)
Clark分级            2.22    16.77   ＜.00005
溃烂                 1.94    13.86   .0002
NCOA3水平(2、3相比于 1.69    6.72    .0095
0、1)
肿瘤厚度             1.27    5.28    .022
部位                 1.39    3.61    .057
年龄                 1.03    .22     .64
性别                 1.04    .04     .85
表3.临床、组织学和分子因素对黑素瘤人群DSS之影响的Cox回归分析
预后因素         风险比  卡方    P值(双尾)
NCOA3水平(2、3相 1.91    5.29    .021
比于0、1)
肿瘤厚度         1.34    4.69    .030
溃烂             1.65    4.89    .027
Clark分级        1.75    5.00    .025
部位             1.09    1.65    .20
年龄             1.41    2.27    .13
性别    1.00    .0002    .99
表4.临床、组织学和分子因素对SLN转移之影响的logistic回归分析
预后因素            卡方    P值(双尾)
年龄下降            12.92   .0003
肿瘤厚度            8.10    .0044
Clark分级           5.14    .023
NCOA3表达(3相比于   5.70    .017
1、2相比于0)
性别                1.43    .23
溃烂                0.79    .37
部位                0.09    .76
讨论
这些结果显示，原发皮肤黑素瘤中NCOA3过表达与黑素瘤复发和疾病相关死亡显著相关。在AJCC分级委员会分析的六个预后因素包含在多变量模型中时，NCOA3表达显著预测了该人群的RFS和DSS。重要的是，在这些分析的每一个中，NCOA3表达都胜过肿瘤厚度，并作为预测DSS的最强因素出现。自从修正的黑素瘤AJCC分级分类公开以来(参见Balch C.M等J Clin Oncol，19：3635-3648，2001)，在AJCC分级委员会分析的六种因素包含在多变量模型中时，很少有分子预后因素显示为具有独立的预后意义，所以突出了将NCOA3表达与黑素瘤相关结局相关联这一发现的潜在重要性。
另外，在模型中包含全部12个可用的预后因素时，NCOA3状态仍提供了有关DSS和SLN状态的独立预后信息。此分析包括例如有丝分裂速率和血管涉及的因素，其已在多个分析中显示出比溃烂更有用。(参见Kashani-Sabet M.等J Clin Oncol，20：1826-1831，2002；Azzola M.F.等Cancer，97：1488-1498，2003。综上，这些结果证明了NCOA3作为黑素瘤结局的新的独立分子标志物的用途，其对黑素瘤的重要结局测量有显著影响。
令人感兴趣的是，过表达NCOA3的基因表达谱研究中所检测的转移主要是淋巴结转移，表明了NCOA3表达对黑素瘤淋巴结转移的潜在重要性。而不仅仅是高NCOA3表达与SLN转移风险显著增加相关。
与NCOA3表达和SLN状态之间强相关一致的是，观察到高NCOA3表达很少在该分析中包含的促结缔组织增生性黑素瘤小亚类中见到。我们也对前哨淋巴结活检为阳性的促结缔组织增生性黑素瘤患者进行了免疫组织化学分析。分析证明，原发肿瘤以及淋巴结转移都是阳性(图3)。这表明，NCOA3免疫染色在鉴定发生前哨淋巴结转移的促结缔组织增生性黑素瘤病例中的用途。
由于在该数据组中大部分患者进行了SLN活检，本发明所报告结果中的一部分有可能由于选择偏好而失真。对于在薄(＜1.0mm)和厚(＞4.0mm)肿瘤以及特定组织学亚型(例如促结缔组织增生性黑素瘤)的情况下选择患者进行SLN活检，仍然有争议。因此，推荐进行SLN活检所用的选择标准可能对报告结局数据有影响。因而，NCOA3过表达的重要性可能与进行SLN活检的患者最为相关。
最后，由于其在激素敏感性和激素非依赖性恶性肿瘤中的重要性，这些结果揭示了NCOA3作为癌症预后标志物的广泛意义。
总之，我们的结果显示，NCOA3过表达与复发风险增加以及黑素瘤相关存活降低之间显著相关。另外，它们显示NCOA3表达是黑素瘤结局几种度量的独立预测物，包括DSS、RFS和SLN状态，表明NCOA3是原发皮肤黑素瘤的新的预后标志物。
实施例2：抑制NCOA3在小鼠模型中抑制了黑素瘤转移性发展
本实施例显示，NCOA3基因的表达对于黑素瘤转移性表型的维持来说是重要的。我们使用全身性非病毒核酶(Kashani-Sabet，2002)和基于siRNA的基因递送来靶向NCOA3基因。将靶向小鼠NCOA3的锤头状核酶和siRNA克隆到我们的表达质粒中，在肿瘤接种后第3天和第10天用对照或NCOA3抑制载体处理带有肿瘤的小鼠。肺中转移肿瘤负荷的分析(由肺肿瘤的个数所显示)显示，与载体对照相比，用抗NCOA3核酶或siRNA处理的动物负荷显著减少(图4)。肺重量分析(转移肿瘤负荷的另一个度量)显示Rz397是唯一显著抑制C57B1/6肺重量的构建体(图5)。这些研究清楚地证明，基因表达谱分析在鉴定黑素瘤发展的功能性以及分子标志物中的用途。此外，它们显示，由cDNA微阵列分析所鉴定的标志物可作为转移性黑素瘤治疗的靶标。
有趣的是，靶向核苷酸的抗NCOA3核酶397的全身性施用还抑制了BALB/c小鼠中4T1小鼠乳腺癌细胞的转移性发展。在4T1模型中，核酶在抗肿瘤作用方面优于靶向NCOA3相同区域的siRNA以及载体对照和突变体、失活核酶和siRNA对照。这些结果表明了NCOA3打靶在转移乳腺癌和黑素瘤治疗中的潜在治疗性用途。
最后，体外将Rz397或siRNA385瞬时转染进B16黑素瘤细胞，这减少了肿瘤细胞向matrigel的侵袭，提示了NCOA3打靶抑制肿瘤转移的可能机制(图7)。
实施例3：黑素瘤发展中Wnt-2的差异表达
我们在40个良性痣和376个原发黑素瘤的组织微阵列测试组中以及34个与痣相关出现的原发黑素瘤组织切片的验证组中进行了WNT-2表达的免疫组织化学分析。良性痣显示，痣交界区中Wnt-2强染色，痣基部几乎完全没有表达。相反，原发黑素瘤显示更均一的染色模式，染色在垂直生长界面上没有明显变化。原发黑素瘤基部的Wnt-2免疫染色显著高于痣基部。与痣相关出现的黑素瘤的Wnt-2表达匹配成对分析显示，所有病例中痣交界区中Wnt-2染色均显著高于同一个痣的基部。另外，在所有病例中原发黑素瘤的Wnt-2得分均显著高于痣基部的匹配对照。这些在下文给出的结果证实了WNT通路活化在黑素瘤发展中的重要性，显示Wnt-2为黑素瘤的新的生物标志物。
选择加入数据组中的痣和黑素瘤
构建两个数据组用于本研究中进行的分析：(i)测试组，由138个良性痣和376个原发黑素瘤的组织微阵列组成，和(ii)验证组，34个在痣中产生的原发黑素瘤的组织切片。痣阵列中包括的138个痣中，40个有一部分表皮包括在核心中，以允许准确分析痣交界区相对于痣基部的Wnt-2染色。所研究的微阵列中40个痣的组成如下：5个后天混合痣，9个先天混合痣，7个后天真皮内痣，17个先天真皮内痣，1个后天发育异常痣和1个交界痣。黑素瘤微阵列中所包括的原发黑素瘤的组织学亚型如下：176个浅表扩散型黑素瘤，132个结节性黑素瘤，14个雀斑痣恶性黑素瘤，22个肢端黑素瘤，10个促结缔组织增生性黑素瘤以及22个未分类黑素瘤。在验证组中，我们制备了来自34个在痣中产生的原发黑素瘤病例的组织切片。34个病例中，28个具有含交界和真皮组分的痣，而31个具有真皮痣和侵入的黑素瘤。下列是痣和黑素瘤的组织学亚型概述：22个先天性痣，8个后天痣，1个发育异常痣，19个浅表散布型黑素瘤，7个结节性黑素瘤和5个未分类黑素瘤。
组织阵列
组织微阵列如前所述使用Beecher阵列装置取1.0mm直径的组织核心来制备(参见Kononen，J.等Nat Med，1998，4：844-847；Kashani-SabetM.等J Clin Oncol，2004，22：617-623)。块构建之后，使用组织切片机切成5μm切片，置于装置的载玻片上。制备平均约40个组织/阵列的总共16个黑素瘤阵列以及总共4个痣阵列。黑素瘤阵列包含总共673个组织核心(150个患者的具有副本核心的457个原发黑素瘤)。痣阵列包含总共138个组织核心。组织微阵列上的457个原发黑素瘤中，376个可认为有Wnt-2染色。
免疫组织化学
染色前，将载玻片在60℃下烘30分钟，脱蜡，通过在二甲苯中漂洗再水化。然后，将载玻片在10mM柠檬酸盐缓冲液中微波处理。用3％过氧化氢阻断内源过氧化物酶活性。用PBS清洗后，将载玻片在室温下与正常兔血清一起孵育30分钟，以减少非特异性背景染色，然后用PBS清洗。然后，将一抗(山羊多克隆抗Wnt-2 IgG(Biovision))以1∶5稀释度加入，在4℃下过夜孵育。将生物素化山羊抗兔IgG抗体(VectorLaboratories，Burlingame，CA)作为用于放大的二抗，然后与ABC-HRP(Vector Laboratories)一起孵育30分钟，然后是DAB/过氧化氢溶液(Sigma)。用苏木精复染载玻片，用permount封片。对于组织阵列载玻片和常规切片，使用相同的Wnt-2免疫组织化学染色方案。
免疫组织化学染色的评价
对每个组织阵列核心和组织切片染色最强的区域评分。使用下列标准对Wnt-2蛋白质的表达进行分级：未染色(0)，弱染色(1+)，中等染色(2+)以及强染色(3+)。将没有侵袭性黑素瘤或痣的样品或者不可判断的样品排除在分析之外。由对病例身份不知情的病理学家为阵列和切片评分，评分独立进行两次，对于矛盾的评分确定一致的得分。Wnt-2染色的特异性对照包括乳腺癌、黑素瘤细胞系(LOX和FEM)以及黑素瘤组织切片。
统计学分析
用于评估多个预后因素对黑素瘤相关结局的重要性的统计方法如下：在组织微阵列中，使用二项符号检验和威尔科克森配对符号秩检验来检验痣交界区和痣基部Wnt-2免疫染色的潜在差异。使用Mann-Whitney检验来检验痣基部和黑素瘤基部Wnt-2免疫染色之间的潜在差异。在痣中产生的原发黑素瘤的组织切片中，使用二项符号检验和威尔科克森配对符号秩检验来检验痣交界区和痣基部Wnt-2免疫染色的潜在差异。使用二项符号检验和威尔科克森配对符号秩检验来检验痣基部和黑素瘤基部Wnt-2免疫染色的潜在差异。报告的全部P值为两侧的(two-sided)。
结果
由于我们的cDNA微阵列结果显示Wnt通路在黑素瘤中与痣相比差异表达，我们试图检测更大的独立黑素细胞肿瘤群体中Wnt-2的差异表达。为此，我们构建了含有138个黑素细胞痣和376个原发黑素瘤的组织微阵列的测试组，以及34个含有已有痣的原发黑素瘤的组织切片的验证组。使用靶向人Wnt-2的市售单克隆抗体分析Wnt-2的表达。在优化Wnt-2免疫组织化学染色的过程中，我们发现了良性痣中Wnt-2的有趣染色模式。良性痣显示，痣交界区中Wnt-2强染色，痣基部几乎完全没有表达(图8)。
由于这一发现，我们将我们对痣组织微阵列中Wnt-2表达的分析限于含有一部分表皮的那些痣核心，使得可以对痣交界区和痣基部的免疫染色进行比较。这将有效的痣阵列组减少到40个病例。在40个所检测病例的每一个中，痣交界区中Wnt-2免疫染色都高于匹配的基部，该发现具有高度显著性(P＜0.00005，二项符号检验)。在将阵列中存在的痣分为两个最常见的组织学亚型(即真皮内黑素细胞痣和复合黑素细胞痣)时，痣基部的Wnt-2免疫染色缺失仍然是显著的(P＜0.001，二项符号检验)。
接下来，我们研究了含有376个原发黑素瘤核心的组织阵列中的Wnt-2免疫染色。与痣不同，原发黑素瘤显示更均匀的染色模式，在整个垂直生长面上没有染色减少(图9)。所分析的绝大多数原发黑素瘤显示一定程度的Wnt-2表达，仅有8例缺乏染色(3.8％)。此外，在不同黑素瘤组织学亚型之间存在均一的Wnt-2表达强度(表5)。Wnt-2表达与几种公知黑素瘤预后标志物之间没有显著相关性，包括肿瘤厚度，溃烂，Clark分级，有丝分裂速率，微卫星和血管涉及(数据未显示)。
表5.原发黑素瘤的不同组织学亚型的Wnt-2表达程度
Figure BPA00001252827700491
缩写：SSM，浅表扩散型黑素瘤；NM，结节性黑素瘤；LMM，雀斑痣恶性黑素瘤；AM，肢端黑素瘤；DM，促结缔组织增生性黑素瘤；NOC，未分类黑素瘤。
然后，我们比较了原发黑素和痣中观察到的Wnt-2免疫染色。鉴于痣中的Wnt-2表达模式，我们比较了痣基部与黑素瘤基部所观察到的Wnt-2得分。黑素瘤基部的平均得分(1.88)显著高于痣基部的平均得分(0.57，P＜0.00005，非配对T检验)。
为了进一步研究组织微阵列中所观察到的痣和原发黑素瘤之间的差异性Wnt-2表达，我们推理出，评价潜在差异的最佳情况是之前已有痣的黑素瘤病例，对于它们来说许多可能的干扰因素(年龄、性别、解剖学位置以及可能不相关的痣和黑素瘤的组织学亚型等等)被自动对照，由此产生实际的配对分析。因此，我们收集了34个与痣相关的原发黑素瘤病例的验证组，在5μm组织切片上进行Wnt-2的免疫组织化学染色。
首先，我们分析了痣交界区相对于痣基部的Wnt-2表达。在34个病例中，28个在切片中具有交界区和痣基部。在28个病例的每一个中，痣交界区中Wnt-2免疫染色都高于匹配的基部，该发现具在高度显著性(P＜0.00005，二项符号检验和威尔科克森配对符号秩检验)。通过分析高和低Wnt-2得分的病例百分比证实了痣基部Wnt-2的表达显著降低。因此，90.6％的交界区得分为2或3，而94.1％的痣基部得分为0或1(表6)。有趣的是，所有痣的交界区都没有不染色(得分0)，所检测的痣基部中没有强染色(得分3)，进一步说明了该二分法。
表6.痣交界区与痣基部Wnt-2免疫染色程度
Wnt-2得分   痣交界区                痣基部
            (表现出得分的％病例)
0/1+        9.4％                   94.1％
2/3+        90.6％                  5.9％
最后，我们比较了黑素瘤基部和所染色样品中其相关痣基部的Wnt-2表达模式。34个病例中，31个具有痣基部和黑素瘤基部用于比较。在29个病例中，黑素瘤基部的Wnt-2免疫染色显著高于其匹配的痣基部(如图11所示)，两个病例显示Wnt-2得分相同(P＜0.00005，二项符号检验和威尔科克森配对符号秩检验)。痣基部的Wnt-2表达在任何情况下均不高于黑素瘤。该现象再一次反映在痣和黑素瘤内的Wnt-2染色强度之中。因此，100％的黑素瘤具有大于0的Wnt-2得分，相比之下痣为32.4％(表7)。没有黑素瘤缺乏Wnt-2表达(得分为0)，没有痣显示基部的强染色(得分为3)。
表7.黑素瘤基部与痣基部的Wnt-2免疫染色
Wnt-2得分                黑素瘤基部   痣基部
0(表现出得分的％病例)    0％          67.6％
＞0(表现出得分的％病例)  100％        32.4％
我们还对另外三组人群进行了Wnt-2免疫染色，(i)发育异常痣，(ii)Spitz痣，和(iii)误诊的黑素细胞赘生物。我们的分析显示，在痣群体中观察到的差异性Wnt-2表达可特别地扩展到发育异常痣(P＜0.05)和Spitz痣(p＝0.004)，它们是其为因在组织病理学水平上难以与黑素瘤区分而著名的痣亚型。在这些病例的每一个中，痣交界区中Wnt-2免疫染色均高于痣基部，两者都是统计学上显著的。最后，我们分析了7个其中不明确黑素细胞赘生物病例，其基于随后的疾病复发(5个病例中痣的诊断被证明是不正确的)或者专家病理学复查(2个病例中推翻了对黑素瘤的诊断)是误诊的。在7个病例里的6个中，Wnt-2免疫染色的模式指出了最后的正确诊断，包括最初误诊为痣的全部5个病例。这些结果显示，由于其能够正确诊断这些病例中的85.7％，Wnt-2免疫染色能辅助不明确黑素细胞肿瘤的诊断。
讨论
在本研究中，我们提供了Wnt-2在黑素瘤发展中在蛋白质水平上差异表达的令人信服的证据。我们的结果清楚地显示，在组织微阵列分析以及配对分析(其中每个黑素瘤与其之前已有的痣配对)中，Wnt-2在黑素瘤中与黑素细胞痣相比差异表达。在后一分析中，发现仅有黑素瘤在其基部高表达Wnt-2，仅有痣显示在其基部缺乏Wnt-2表达。
另外，在黑素细胞痣中观察到Wnt-2表达的有趣模式。在所研究的每个病例中，痣基部Wnt-2的表达均明显低于交界区。此外，在阵列研究和痣中出现的黑素瘤的分析中，很大比例(55％)的所检测痣的基部缺乏Wnt-2免疫染色。
Wnt-2染色模式在痣中与黑素瘤相比的显著差异显示了Wnt-2免疫染色在不明确黑素细胞肿瘤的分子诊断中的用途。来自痣和黑素瘤组织阵列的结果显示了高Wnt-2染色在黑素瘤诊断中98％的特异性，其具有70％的特异性。我们的数据根据Wnt-2表达水平区分了痣和黑素瘤。基部染色强烈(得分2或3+)的黑素细胞病变非常可能是黑素瘤(99.6％)。基部显示较少染色(得分0或1)的病变当时30％是黑素瘤，得到了所观察到的灵敏度。但是，随后将分析这些病变的交界区，在几乎每个病例中痣都显示较深部分中染色减少，而黑素瘤显示在交界区和较深区域之间染色均匀。迄今为止，尽管已分析了肿瘤细胞增殖的标志物(例如Ki-67；参见Smolle，J.等Am J Dermatopathol，1989，11：301-307；Rieger，E.等JCutan Pathol，1993，20：229-236；Kaleem，Z.等Mod Pathol，2000，13：217-222)在此差异诊断困境中的作用，但尚没有标志物显示出临床上可用的在痣和黑素瘤之间的强表达差异。
对Wnt-2观察到的免疫染色减少已经在其他一些标志物中观察到，包括S100A6、Melan-A和HMB-45(参见Fullen，D.R.等JCutan Pathol，2001，28：393-399；Busam，K.J.等Am J Surg Pathol，1998，22：976-982；Kucher，C.等Am J Dermatopathol，2004，26：452-457)。但是，这些标志物通常不用于区分痣和原发黑素瘤。另外，在一些此类研究中，真皮内痣是所检测的主要痣类型。真皮内痣已知在其基部发生显著的成熟。在我们的研究中，在分为痣亚型时，在可能不具有相同成熟模式的真皮内痣、混合痣(一般地)以及后天混合痔、发育异常和Spitz痣的基部，Wnt-2免疫染色均显著下调。这显示了Wnt-2作为黑素瘤分子诊断标志物的更广泛用途。
本发明所述的cDNA微阵列结果也允许在黑素瘤中区分诊断与预后标志物。基因表达谱分析显示，独特的基因表达特征表征了从痣过渡到原发黑素瘤以及从原发黑素瘤到转移性黑素瘤。(参见Haqq C.等Proc NatlAcad Sci USA，2005，102：6092-6097)。因此，在痣向黑素瘤过渡中差异表达的标志物可作为最有用的诊断标志物，而在原发到转移过渡中鉴定的标志物可作为最有用的预后标志物。这得到了Wnt-2免疫染色结果的支持，该结果表明其作为诊断标志物最有用，而不是预后标志物。尽管痣和黑素瘤之间的Wnt-2免疫染色有显著差异，但是Wnt-2表达与几种已知黑素瘤预后标志物却没有显著相关性。
为了分析Wnt-2打靶对转移发展的潜在治疗益处，我们分析了全身性递送靶向小鼠Wnt-2的锤头状核酸酶对B16黑素瘤的抗肿瘤效力。将B16细胞静脉注射进C57B1/6小鼠，在肿瘤细胞注射后第7天用对照空载体或表达抗Wnt-2核酶的质粒载体处理小鼠。由处死后转移肺肿瘤的数目评定转移负荷。如图10所示，抗Wnt-2核酶表达构建体的单次注射导致了对大的(＞2mm)血管发生依赖性肺肿瘤的显著抑制。这些研究支持了Wnt-2打靶在抑制转移发展中的作用。
综上，这些结果显示了Wnt-2对黑素细胞转化的重要性。尽管WNT通路活化似乎发生在黑素瘤发展的早期，但是来自体外和体内研究的数据都表明，Wnt-2表达是黑素瘤细胞持续存活和增殖所需的。基于抗体和siRNA的Wnt-2打靶在体外导致了几种黑素瘤细胞系的凋亡诱导，在体内导致了异种移植物的显著抑制。我们实验室进行的初步研究也显示，小鼠模型中黑素瘤的转移发展需要Wnt-2表达(参见上文图10)。因此，这些结果提示了Wnt-2打靶用作黑素瘤合理治疗性策略的潜在治疗用途。本文所用的免疫染色测定可有助于鉴定适用于采用特异性Wnt-2抑制剂靶向治疗方法的患者人群。
总之，我们的研究证明了黑素瘤与痣中WNT通路的差异表达，证实了之前从黑素细胞赘生物基因表达谱分析中获得的结果。另外，它们证实了WNT-2活化在黑素瘤发展中的重要性。最后，它们教导了Wnt-2作为黑素瘤新生物标志物以及作为治疗潜在靶标的用途。
实施例4：PHIP在黑素瘤中的作用
我们评价了PHIP(普列克底物蛋白同源结构域相互作用蛋白)基因在黑素瘤的侵袭和转移表型中的作用。我们设计了小鼠PHIP的几种核酶和siRNA抑制剂，将其克隆进表达质粒。在肿瘤细胞接种后第3天和第10天注射时，将靶向PHIP的基于质粒的核酶和siRNA全身性递送进带有转移B16黑素瘤的C57B1/6小鼠导致了转移发展的显著抑制(如转移肺肿瘤个数所显示的)。另外，我们研究了PHIP贡献于黑素瘤发展的机制(图12)。我们用表达如上所述活性核酶或siRNA或者对照、无活性核酶或siRNA的质粒瞬时转染B16细胞，检测这些转染细胞对matrigel测定的侵袭。这些结果显示，抗PHIP siRNA和核酶显著抑制了侵袭(图13)。综上，这些结果鉴定了PHIP在黑素瘤中的新的促侵袭和转移表型，显示PHIP可作为黑素瘤转移治疗的合理靶标。
实施例5：骨桥蛋白在黑素瘤中的作用
我们还研究了骨桥蛋白表达在黑素瘤中的预后作用。我们在含有接受前哨淋巴结活检、随访两年或者有复发记录的350个原发黑素瘤样品的组织微阵列中评估了OPN免疫染色。OPN表达记录为0(缺乏)、1(弱)、2(中等)和3(强)。根据单变量分析，OPN表达提高与SLN转移风险提高相关联(如logistic回归所确定的)，并与无复发存活(RFS)和总存活(OS)的降低相关联(如Kaplan-Meier分析所确定)。根据包含6种其他已知黑素瘤预后标志物的多变量logistic回归分析，OPN(定义为得分为0，相对于1、2和3)表达增加是SLN转移的独立预测物。根据多变量Cox回归分析，高OPN表达(定义为得分0和1，相对于2和3)是无复发存活和总存活降低的独立预测物(参见下文表8和9)。根据其在预测SLN状态、RFS和OS中的作用，这些结果将OPN鉴定为黑素瘤预后的新的独立标志物。
表8、临床、组织学和分子因素对SLN转移之影响的logistic回归分析
预后因素                  卡方    P值
年龄降低                  15.35   ＜.001
肿瘤厚度                  10.70   .001
OPN表达(1，2，3，相对于0) 7.60    .006
Clark分级                 1.82    .18
性别                      1.81    .18
部位                      0.80    .37
溃烂                      0.43    .51
表9临床、组织学和分子因素对黑素瘤人群O之S影响的Cox回归分析
预后因素                  风险比  卡方    P值
OPN水平(2，3，相对于0，1) 1.60    6.37    .012
Clark分级                 1.68    5.84    .016
溃烂                      1.55    5.77    .016
肿瘤厚度                  1.29    5.03    .025
部位                      1.44    3.53    .06
年龄                      1.06    1.29    .26
性别                      1.065   .10     .75
实施例6：黑素瘤中NCOA3的拷贝数
我们还通过荧光原位杂交(FISH)确定了黑素瘤中NCOA3的拷贝数。我们开发了检测NCOA3表达的FISH测定，分析了4个显示NCOA3过表达的黑素瘤病例。使用FISH对这些病例的分析显示，每一个病例都具有高拷贝数的NCOA3基因(图14)。这是第一次证明，黑素瘤中存在高拷贝数的NCOA3基因。
实施例7：黑素瘤中的RGS1表达
在301名患者的组织微阵列中研究RGS1表达对黑素瘤结局的预后影响。使用存档的原发黑素瘤样品的免疫组织化学分析确定RGS1表达，由对患者结局不知情的病理学家根据染色强度以四级标准(0-3)进行评分。
高RGS1表达与肿瘤厚度增加相关。在RGS1得分为0的肿瘤中，平均肿瘤厚度为2.2mm，在得分大于0的肿瘤中其增至4.09mm(P＜0.00005，t检验)。另外，RGS1表达的提高与肿瘤血管供应提高相关(P＝0.045)。根据单变量logistic回归分析，RGS1表达提高与SLN状态显著相关(P＝0.04，卡方统计4.12)。如阳性SLN平均个数所确定地，RGS1表达提高也与SLN负荷增加相关。因此，RGS1得分为0的患者中，SLN阳性平均个数为0.118，在得分为1或2的病例中增至0.415，在得分为3的病例中为0.723(P＝0.0055，ANOVA)。根据Kaplan-Meier分析，相比于低RGS1表达(得分0或1)的病例，高RGS1表达(定义为得分2或3)与明显恶化的疾病特定存活(DSS)相关联(P＝0.018，对数秩检验)。
多变量Cox回归分析显示，RGS1可作为黑素瘤相关结局的有效独立预测物，如无复发存活(表10)、总存活(表11)和疾病特定存活(表12)分析所确定。根据分步Cox回归，Clark分级、溃烂和RGS1表达保持对RFS的有效预测性。根据分步Cox回归，Clark分级、溃烂、部位和RGS1表达保持对OS的有效预测性。根据分步Cox回归，厚度和RGS1表达保持对DSS的有效预测性。纳入12种组织学或临床预后因素后，根据分步Cox回归分析，RGS1表达是RFS(P＝0.04)、OS(P＝0.036)和DSS(P＝0.01)的独立预测物。这些结果将RGS1确立为新的黑素瘤独立预后因素。
表10多种因素对黑素瘤人群无复发存活(RFS)之影响的Cox回归分析
预后因素            风险比  卡方    P值
Clark分级           1.97    22.9    ＜.00005
溃烂                2.01    14.2    .0002
RGS水平(0，1，2，3) 1.30    6.65    .0099
部位                1.29    2.01    .16
年龄                .94     1.25    .26
性别                1.22    1.12    .29
肿瘤厚度            1.12    .87     .35
表11、多种因素对黑素瘤人群中总体存活之影响的Cox回归分析
预后因素            风险比  卡方    P值
Clark分级           1.43    5.25    .022
溃烂                1.72    6.98    .0083
RGS水平(0，1，2，3) 1.34    6.63    .01
部位                1.49    3.71    .054
年龄                1.06    .98     .32
肿瘤厚度            1.24    2.69    .10
性别                1.31    1.54    .22
表12、多种因素对黑素瘤人群疾病特定存活之影响的Cox回归分析
预后因素            风险比  卡方  P值
RGS水平(0，1，2，3) 1.43    7.09  .0077
Clark水平           1.52    5.47  .019
溃烂        1.54  3.30   .069
肿瘤厚度    1.29  2.74   .098
部位        1.29  1.22   .27
性别        1.23  .71    .40
年龄        .98   .05    .82
实施例8：用于预后的两标志物和三标志物测定
我们分析了组合标志物表达对黑素瘤结局的影响。首先，我们检查了NCOA3和SPP1标志物表达可用的309个原发黑素瘤样品中的SLN阳性。将NCOA3和SPP1的表达根据logistic回归建立的最佳取舍值分为高或低。高NCOA3表达定义为得分2和3，而高SPP1表达定义为得分大于0。在两种标志物均为低得分的病例中，SLN阳性率当时为0％；在低SPP1和高NCOA3的病例中其增加至12.5％，低NCOA3和高SPP1的病例中为26.7％，两种标志物均为高得分的病例中为37.0％。标志物表达对SLN状态的增量影响是高度显著的(双尾P值为0.0007)。另外，过表达标志物数目的增加显著预测了SLN状态，如单变量logistic回归分析所确定(卡方统计14.7，P＝0.0001)。分析高表达标志物个数(0、1或2)的单变量logistic回归分析显示，标志物过表达的增加对SLN状态有显著影响(P＝0.0004)。接下来，我们研究了组合标志物表达对SLN肿瘤负荷的影响，如阳性SLN平均个数所确定。在两种标志物均为低得分的病例中，阳性SLN的平均个数是0；在低SPP1和高NCOA3的病例中增加至0.25％，低NCOA3和高SPP1的病例中为0.38，两种标志物均为高得分的病例中为0.63。标志物表达对SLN肿瘤负荷的增量影响也是显著的(非定向Kruskal-Wallis检验0.01；Le定向显著性检验0.0066)。
接下来，研究组合标志物表达对该人群中黑素瘤无复发存活(RFS)的影响。在两种标志物均为低得分的病例中，平均RFS是0.45年；在低SPP1和高NCOA3的病例中增加至0.50，在低NCOA3和高SPP1的病例中为0.55，两种标志物均为高得分的病例中为0.56(Le定向显著性检验，0.0091)。另外，过表达标志物数的增加有效预测了RFS，如单变量Cox回归分析所确定(P＝0.017)。类似地，在组合标志物数据时，对总体存活(OS)也有影响。在两种标志物均为低得分的病例中，平均OS是0.47年；在低SPP1和高NCOA3的病例中增加至0.51，在低NCOA3和高SPP1的病例中为0.55，在两种标志物均为高得分的病例中为0.57(Le定向显著性检验，0.018)。最后，在将标志物表达得分组合后，对疾病特定存活(DSS)有影响。因此，在两种标志物均为低得分的病例中，平均DSS是0.47年；在低SPP1和高NCOA3的病例中增加至0.52，在低NCOA3和高SPP1的病例中为0.52，在两种标志物均为高得分的病例中为0.60(P值0.04，ANOVA，Le定向显著性检验，0.0069)。另外，过表达标志物数的增加有效预测了DSS，如单变量Cox回归分析所确定(P＝0.013)。
最后，使用多变量分析对组合标志物表达得分的影响进行分析。使用logistic回归对组合标志物表达数据对SLN状态的影响进行分析。该分析显示，组合NCOA3/SPP1状态是决定SLN状态的第一因素，优于常规组织学标志物(下文表13)。根据分步回归分析，仅有组合NCOA3/SPP1状态(P＝0.0013)、肿瘤厚度(P＝0.0016)和血管涉及(P＝0.039)有效预测了SLN状态。
在使用多种标志物时，用于这些标志物的试剂可同时或依次(或两者皆有)应用和检测。在使用多种标志物时，测定标志物表达量的步骤可同时、依次进行，或两者皆有。
表13、多种因素对黑素瘤人群SLN状态之影响的Cox回归分析
预后因素            卡方        P值(双尾)
组合NCOA3/SPP1水平  9.08        .0026
血管涉及            6.05        .014
肿瘤厚度            3.95        .047
Clark分级           2.89        .089
消退                2.71        .10
微卫星              1.38        .24
溃烂                .36         .55
有丝分裂速率        .34         .56
肿瘤血管供应        .0024       .96
使用多变量Cox回归研究了组合标志物表达得分对RFS的影响。通过分步回归分析，组合NCOA3/SPP1状态(P＝.02)、Clark分级(P＝.0002)、溃烂(P＜.00005)、有丝分裂速率(P＝.0003)和微卫星(P＜.00005)显著预测了SLN状态。
最后，还使用多变量Cox回归研究了组合标志物表达得分对DSS的影响。此分析显示，当模型中包含9种组织学因素时，组合NCOA3/SPP1状态是决定DSS的独立因素(下文表14)。通过分步Cox回归分析，微卫星(P＝0.0001)、有丝分裂速率(P＝0.0002)、溃烂(P＝0.0066)和组合NCOA3/SPP1状态(P＝0.029)仍是DSS的显著预测物。这些结果确立了组合标志物表达得分之预后影响的显著性，并且证明了多标志物预后测定由于其对SLN状态、RFS和DSS的独立影响而用于黑素瘤的效用。还在三标志物测定中将RGS1与NCOA3/SPP1一起测定，初步结果显示了对DSS的显著影响(表15)。
表14、多种因素对黑素瘤人群DSS之影响的Cox回归分析
预后因素            风险比  卡方   P值(双尾)
微卫星              3.77    14.2   .0002
有丝分裂速率        1.89    5.68   .017
组合NCOA3/SPP1水平  1.69    4.32   .038
Clark分级           1.69    2.80   .09
血管涉及            1.25    .60    .44
消退                .44     2.35   .44
溃烂                1.22    .45    .50
肿瘤厚度            1.10    .36    .55
肿瘤血管供应        1.18    .33    .57
表15、多种因素对黑素瘤人群DSS之影响的Cox回归分析
预后因素                风险比 卡方     P值(双尾)
组合NCOA3/SPP1/RGS1水平 3.33    7.48    .0062
SLN状态                 1.80    3.93    .047
肿瘤厚度                1.50    3.34    .068
Clark分级               1.41    2.24    .13
溃烂                    1.22    .38     .54
性别                    1.14    .20     .66
年龄                    1.04    .17     .68
部位                    .96     .02     .88
实施例9：区分良性痣和恶性黑色素瘤的多标志物测定
简介
本实施例证明了免疫组织化学分析可用于验证在RNA水平上所观察到的基因表达差异以及测试痣和黑素瘤的鉴别诊断中该分析的诊断值。
方法
研究患者：构建由699个黑素细胞赘生物构成的几个数据组用以本研究中所进行的分析：训练组，由119个良性痣和421个原发黑素瘤的组织微阵列(tissue macroarray，TMA)组成，四个验证组：38个在痣中产生的黑素瘤的组织切片(得到75个可评估的黑素细胞肿瘤)；39个发育异常痣；21个Spitz痣；以及24个最初误诊的黑素细胞赘生物。所研究的TMA中119个训练组痣的组成如下：31个先天真皮内痣；29个后天真皮内痣；21个后天发育异常痣；18个先天混合痣；15个后天混合痣；4个交界痣；以及1个未分类痣。训练TMA中所包含的421个原发黑素瘤的组织学亚型如下：202个浅表扩散型黑素瘤；135个结节性黑素瘤；23个肢端黑素瘤；18个雀斑痣恶性黑素瘤；16个促结缔组织增生性黑素瘤；和27个未分类黑素瘤。在含有与痣相关产生的原发黑素瘤的组织组中，痣和黑素瘤组织学亚型的概述如下：22个先天痣；8个后天痣；3个后天发育异常痣；1个后天混合痣；1个后天真皮内痣；1个先天发育异常痣；1个先天混合痣；1个先天真皮内痣；23个浅表扩散型黑素瘤；7个结节性黑素瘤；和7个未分类黑素瘤。
组织阵列：根据Kononen J，等Nat Med，1998，4：844-7和Kashani-Sabet M，等J Clin Oncol，2004，22：617-23所述方法产生组织微阵列。制备总共16个黑素瘤阵列以及总共4个痣阵列，平均约40个组织/阵列。黑素瘤阵列包含总共673个组织核心(150个患者的具有副本核心的457个原发黑素瘤)。痣阵列包含总共138个组织核心。
免疫组织化学：染色前，将载玻片在60℃下烘30分钟，脱蜡，通过在二甲苯中漂洗再水化。然后，将载玻片在10mM柠檬酸盐缓冲液中微波处理。用3％过氧化氢阻断内源过氧化物酶活性。就WNT2来说，用PBS清洗后，将载玻片在室温下与正常兔血清一起孵育30分钟，以减少非特异性背景染色，然后用PBS清洗。就FN1来说，载玻片依次与亲和素和生物素封闭试剂一起孵育。然后加入一抗[山羊多克隆抗WNT2IgG(Biovision，1∶5稀释)；兔多克隆抗SPP1IgG(Abcam，1∶200稀释)；兔多克隆抗FN1IgG(Dako，1∶400稀释)；兔多克隆抗ARPC2IgG(Upstate，1∶50稀释)；和鸡抗RGS1 IgG(GeneTex，1∶100稀释用于TMA，1∶50稀释用于组织切片)]，在4℃下孵育过夜。将生物素化山羊抗兔、抗鸡或兔抗山羊IgG抗体(Vector Laboratories，Burlingame，CA)作为用于放大的二抗，然后与ABC-HRP(Vector Laboratories)一起孵育30分钟，然后是DAB/过氧化氢溶液(Sigma)。用苏木精复染载玻片，用permount封片。除另有注明，否则对于组织阵列载玻片和常规切片均使用相同的Wnt-2免疫组织化学染色方案。
免疫组织化学染色的评价：对每个组织阵列核心和组织切片最强染色的区域进行评分。使用下列标准在细胞强度上对标志物蛋白的表达进行分级：未染色(0)，弱染色(1)，中等染色(2)以及强染色(3)。在赘生物表皮与真皮之间的交界(交界区或“顶部”)以及其基部(“底部”)对标志物表达强度进行评分。就肿瘤而言，“顶部”和“底部”位置分别表示垂直生长(侵袭性)肿瘤的顶部以及肿瘤侵入的最深区域。就相关的痣而言，鉴定并记录了三种标准类型的痣(参见例如Sagebiel R.W.，J InvestDermatol，1993；100：322S-325S，用以分类)。在先天模式的痣中，顶部记录于交界区和/或乳头状真皮区，底部在网状真皮中所鉴定的最深的痣处。在后天模式的痣中，顶部记录于交界区和/或乳头状真皮区，底部在乳头状真皮中所鉴定的最深的痣处。类似地，在发育异常痣中，前体痣附近的侧向生长是发育异常的随机异型(atypia)和结构改变的特征，顶部记录于交界区，底部在乳头状真皮和/或网状真皮中所鉴定的最深的痣处。将没有黑素瘤或痣的样品排除在该分析之外。由于染色不足或者缺少结构特征而无法判断的样品作为缺失观测值处理。由对病变身份不知情的病理学家为阵列和切片评分，评分独立进行两次，对于所有标志物的矛盾评分确定一致的得分。多个抗体的特异性外部阳性对照如下：乳腺癌(WNT2、SPP1)；黑素瘤细胞系LOX和FEM(WNT2、ARPC2、SPP1)；黑素瘤组织切片(WNT2、FN1、ARPC2、RGS1、SPP1)；正常肾脏(FN1)；胸腺(RGS1)和非霍奇金淋巴瘤(RGS1)。用于免疫组织化学的技术阴性对照包括使用磷酸盐缓冲液替换一抗，所有其他实验条件保持相同。
统计学分析：用单变量logistic回归评估每个标志物强度(黑素细胞赘生物的基部)的诊断效力。用多变量logistic回归评估全部五种标志物的组合强度的诊断效力。对于多标志物测定，使用接受者工作特性(receiver operating characteristics，ROC)曲线分析诊断效力，计算ROC曲线下面积。使用Fisher精确检验计算并分析特异性和灵敏度分数。对每个标志物使用Mann-Whitney检验来检验痣基部和黑素瘤基部中标志物免疫染色强度之间的差异。还对每种标志物使用Mann-Whitney检验来检验病变交界区与病变基部标志物免疫染色强度之间的差异。所报告的全部P值为两侧的。
为了评估标志物表达得分的可靠性，对训练组中的每个病例，将WNT2强度得分与平均密度测量强度(来自定量图像分析)进行比较。首先，鉴定了与0-3标志物表达分级最密切对应的四个平均密度测量强度连续范围。然后，将WNT2标志物表达得分与其平均密度测量强度(在两者都可用时)的一致性定义为病变百分比，其中标志物表达强度和平均密度测量强度在诊断上是等同的。定义相似的WNT2的百分比一致性，并计算“顶部-底部”表达得分的差异。
基于来自训练组中540个病变的数据，从MDMS(Surprise，AZ)获得诊断算法。这些算法首先证实了具有发育异常或Spitz样特征的病变为发育异常或Spitz痣，然后将所有未确认的病变诊断为不同类型的良性痣或黑素瘤。对于“顶部-底部”差异得分本身以及与表达得分强度组合的“顶部-底物”差异得分，独立获得不同的诊断算法。图2中显示涵盖这些算法中每一个的最终诊断算法。该最终诊断算法应用于所有四个验证组的病变。
结果
接下来，我们证实了之前我们的研究中所鉴定的一些对应转录本的差异性蛋白质表达，并在更大的独立黑素细胞赘生物人群中检验了黑素瘤多标志物诊断测定的应用。为此，我们收集了699个黑素细胞肿瘤的组织组，其包括540个原发黑素瘤和黑素细胞痣的TMA的训练组，以及与痣/黑素瘤鉴别诊断相关的四个包含159个黑素细胞赘生物组织切片的验证组。首先，使用靶向上述蛋白的市售抗体在训练组中分析五种所选标志物(ARC2、FN1、RGS1、SPP1和WNT2)的表达。按照四级等级对每个标志物的染色强度进行评分。
在优化标志物免疫组织化学染色的过程中，观察到良性痣中的有趣染色模式。良性痣显示，在痣的交界区中系统性地较强染色，而在痣基部缺乏表达。相反，在比较病变交界区和基部时，在黑素瘤的侵入部分中标志物的表达更均匀。因而，我们针对每个黑素细胞赘生物的交界区(“顶部”)和基部(“底部”)的表达强度为TMA评分，其中在阵列上展示的样品核心上病变的取向清楚可见.
首先，使用应用于每个病变基部的四级强度等级，对五种标志物中每一种诊断黑素瘤与痣的能力逐一进行评价。鉴定了划分每个标志物四级等级的最好方法(表16中显示)。最好的等级划分法定义为使得所得与单变量logistic回归分析相关的卡方值最大化。根据其诊断灵敏度和特异性分数，还评定了每种最佳划分的标志物区分痣和黑素瘤的能力。与痣相比，五种分子标志物中每一种均显示在黑素瘤中显著过表达(表16)。
进行几种分析以检验标志物的组合是否可使用其能力来诊断黑素瘤。特别地，我们检验了仅着眼于底部表达强度得分的分析、着眼于病变交界区与基部之间表达差异的分析(“顶部-底部”分析)以及涵盖两种数据类型的第三个分析。
首先，我们对所组合的五种标志物进行了检查每个病变基部所赋值的表达强度得分的分析。通过多元logistic回归将最佳划分的标志物表达得分组合，将恶性概率赋给每个有完整数据可用的病变。然后，在最佳分离点划分所赋值的概率，得到93.6％的特异性和75.8％的灵敏度(P＜0.00005，Fisher精确检验)。另外，对于此多标志物分析，构建接收者工作特性(ROC)曲线，在图1中显示，相关的曲线下面积(AUC)为0.9105。
出于说明性目的，我们对每种标志物以及3种标志物组合分别重复该分析。单标志物(例如FN1)分析显示最小AUC为0.5622，其在包含另两种标志物(ARPC2和SPP1)时增加到中等水平0.7036，在模型中包含全部五种标志物时，达到最高值AUC 0.9105。
然后，我们仅利用全部五种标志物的“顶部-底部”标志物表达差异进行分析。病变交界区相对于基部的标志物表达的分析显示，与黑素瘤相比，痣一致地缺乏五种标志物中每一种的表达，黑素瘤中标志物免疫染色则均匀得多。在用Mann Whitney检验进行分析时，这一痣与黑素瘤之间显著不同的“顶部-底部”标志物表达模式在五种标志物每一种中均如此(数据未显示)，每种标志物的特异性和灵敏度显示于表17。事实上，就WNT2这一种标志物来说，在所分析的144个病变中痣和黑素瘤之间“顶部-底部”差异得分的两个分布完美分离。因此，所分析的每个痣从交界区到基部失去表达，而每个黑素瘤从交界区到基部具有均一的表达。在WNT2的情形中痣与黑素瘤的这种完美区分使得不可能另外依赖logistic回归作为我们唯一的分析工具。面对这些理想区分，logistic回归预测方法不能产生回归系数的极大似然估计。因此，为了分析标志物表达模式的诊断有效性，在组合全部五种标志物时，获得了由14个区分标准组成的诊断算法。前四个标准着眼于证实(或证伪)具有发育异常特征的病变是否确实是发育异常痣。其余十个标准着眼于上述Mann Whitney检验所确定为方向一致的非发育异常病变垂直表达得分的差异。将此诊断算法应用于训练组中540个病变，产生84.6％的特异性和98.7％的灵敏度(P＜0.00005，Fisher精确检验)。
为了阐明表达得分以及“顶部-底部”差异的可靠性，进行了定量成像分析。对训练组中WNT2染色的病变进行数字扫描，对每个病变计算平均密度测量强度。使用诊断黑素瘤的相应取舍值，以相同诊断的病变百分比计算，标志物强度等级与平均密度测量强度之间的一致性为90.3％(P＜0.00005，Mann Whitney检验)。我们还评价了“顶部-底部”表达得分差异的一致性，观察到标志物强度得分与平均密度测量分析之间98.4％的一致性(P＜0.00005，Mann Whitney检验)。平均密度测量强度得分单独的logistic回归分析再现了标志物强度得分所鉴定的WNT2诊断精确性(P＜0.00005)。另外，WNT2平均密度测量强度得分的“顶部-底部”分析显示了97.1％的特异性，96.6％的灵敏度，再现了由标志物表达得分发现的结果。
最后，我们研究了使用标志物表达得分和“顶部-底部”差异的多标志物测定在诊断黑素瘤中的效用。同样，由于WNT2的垂直表达得分的完美分离，我们无法使用logistic回归。因此，使用来自表达强度得分以及病变交界区相对于基部差异表达的两种数据获得算法(显示于图2)，以区分痣和黑素瘤。有趣的是，在检查痣中的标志物表达时，训练组中所包含的全部21个发育异常痣仅基于其ARPC2和FN1表达强度得分就可鉴定。因此，开发了不同的算法来证实所有具有发育异常特征的痣事实上是发育异常的。这一证实算法含有四个基于ARPC2和FN1表达强度的区分标准。然后，将针对发育异常痣的算法与基于“顶部-底部”差异以及标志物表达得分的算法相组合。将这种最终诊断算法应用于训练组，在黑素瘤诊断中实现94.9％的特异性和90.6％的灵敏度(P＜0.00005，Fisher精确检验)。仅使用此诊断算法进行其他分析。
为了验证在训练组中开发的多标志物测定，我们在与痣和黑素瘤之间组织学区别有更高相关性的四个不同验证组中研究了五种标志物的表达强度和模式。在TMA中，我们意在收集一大群黑素细胞赘生物，用于验证来自cDNA微阵列分析的标志物差异表达，以及研究我们多标志物测定的效用。但是，某些痣亚型并没有鉴别诊断的困境，某些黑素瘤亚型并非从之前存在的痣产生。
为了证实我们来自训练组的结果，评价潜在表达差异的最佳情形是与已有的痣相关产生的黑素瘤病例，其中许多潜在干扰因素(年龄、性别、解剖学位置以及可能无关的痣和黑素瘤组织学亚型等等)被自动对照。因此，我们收集了与痣相关的38个原发黑素瘤病例的验证组，得到75个可评价的黑素细胞赘生物。另外，我们收集了另外两个与该组织学鉴别诊断直接相关的验证组：21个Spitz痣的病例；和39个发育异常痣的病例。在痣相对于黑素瘤的组织学鉴别诊断中，它们是两种最常出现问题的痣亚型。最后，我们研究了24个之前误诊病变的数据组中的标志物表达，包括6个最初诊断为黑素瘤而其随后通过一致皮肤病理学复查诊断为痣的病变，以及18个最初诊断为痣而随后局部复发和/或转移从而被回溯诊断为黑素瘤的病变。在所有验证组中，考虑到痣交界区相对于痣基部处标志物表达的重要性，我们使用5μM组织切片上的免疫组织化学分析研究了标志物表达。
利用采用了标志物表达得分强度以及“顶部-底部”表达得分差异的算法，多标志物测定在75个由痣产生的黑素瘤中诊断黑素瘤时实现了94.7％的特异性和97.3％的灵敏度。另外，从TMA上发育异常痣的分析中开发的算法精确鉴定了94.9％(37/39)的发育异常痣切片和95.2％(20/21)的Spitz痣。最后，多标志物测定正确诊断了18/24(75.0％)之前误诊的病变。将黑素细胞肿瘤的多个训练组和验证组合并后，多标志物测定产生95.1％的特异性和90.5％的灵敏度(P＜0.00005，Fisher精确检验)。在多个数据组中使用多种诊断算法的多标志物测定的灵敏度、特异性和AUC的比较显示于表18。
讨论
本实施例公开了由最近的cDNA微阵列分析提出的使用五种生物标志物区分黑素瘤和良性痣的多标志物分子测定。在该分析中，无监督谱系聚类分析在少量新获得的黑素细胞赘生物中根据基因表达谱正确区分了痣和黑素瘤，展示了在黑素瘤和痣中差异表达的一大组基因(参见HaqqC.等Proc Natl Acad Sci USA，2005；102：6092-7)。在本实施例中，我们验证了五种该分析所建议基因的差异表达，测试了多标志物测定诊断黑素瘤和痣的效用。此多标志物免疫组织化学测定在由含有大量痣和原发黑素瘤的TMA构成的训练组中显示了94.9％的特异性和90.6％的灵敏度。基于该分析，随后在与痣与黑素瘤的鉴别诊断直接相关的四个不同验证组中进行多标志物诊断测定，并且能够精确诊断高百分比的痣中产生的黑素瘤、Spitz和发育异常痣，以及之前误诊的黑素细胞赘生物。在组合数据组中，多标志物测定在黑素瘤诊断中产生了95.1％的特异性和90.5％的灵敏度。
我们的结果证明，由ARPC2、FN1、RGS1、SPP1和WNT2蛋白表达水平构成的多标志物测定可用于痣与黑素瘤的鉴别诊断，这是病理学中最困难的任务之一。我们的研究是迄今为止最大规模的对黑素瘤诊断中分子标志物应用的分析，并且独一无二地利用了痣和黑素瘤的组织学异质性所要求的综合组织组。该多标志物测定纠正了四分之三的曾得到错误病理诊断的病例，包括最初误诊为痣的黑素瘤，其中病变的临床行为引发了对之前病理学报告的复查。因此，本文所述多标志物测定可用于辅助黑素瘤的组织学诊断，从而为负责不明确黑素细胞赘生物患者的病理学家及其他临床医师提供重要的新信息。
本发明的一个重要优点是可避免黑素瘤诊断的错误。这些错误导致许多患者接受不适当的治疗。此外，黑素瘤误诊是美国癌症医疗差错索赔中第二常见的原因，仅次于乳腺癌诊断中的错误。(参见Troxel D.B.，Am JSurg Pathol，2003；27：1278-83)。误诊为黑素瘤的患者始终担忧复发，并且不能获得人寿保险，而误诊为痣的患者则被剥夺了针对其恶性肿瘤的适当治疗，可能包括前哨淋巴结活检和全身性辅助治疗。我们的结果证明，所述多标志物测定可逆转(并且因此可能防止)高百分比的由黑素细胞赘生物常规组织学分析导致的错误。
cDNA微阵列分析所提出的标志物差异表达在痣的免疫组织化学分析中是不均匀的，痣交界区经常以高于痣基部的水平表达所述标志物。这与大多数黑素瘤正好相反，黑素瘤在标志物表达的“顶部-底部”分析中显示均一性。因而，蛋白的表达模式是痣和黑素瘤之间的有效鉴别因素，一般说来，优于绝对转录本表达得分。尽管我们的结果证实了首先由转录组分析鉴定的基因差异表达，但它们还通过证明黑素细胞赘生物基部所存在的最高基因表达差异细化了该分析所获得的信息。
我们选择免疫组织化学而不是其它可能更定量的测定(例如定量PCR)来验证cDNA微阵列结果的原因之一是，免疫组织化学能提供所研究病变的基因表达原位分析。我们的结果描述了可开发为痣和黑素瘤组织病理学分析辅助的分子测定的效用。
尽管免疫组织化学分析本身的特点是半定量的，但是我们使用定量成像分析评估了观察者标志物强度得分的可靠性。我们发现，观察者标志物强度得分与定量分析所确定的平均密度测量强度之间的诊断准确度有高一致性(＞90％)，在“顶部-底部”表达得分差异中有更高的一致性(98％)。鉴于仅着眼于病变交界区相对于基部的得分的诊断算法在训练组中产生84.6％的特异性和98.7％的灵敏度，我们的结果表明了这些标志物的分析可在临床背景下应用于黑素细胞赘生物诊断的潜在便利性。
尽管少数其它标志物也观察到免疫染色的垂直减少，包括S100A6、Melan-A和HMB-45，但是这些标志物在痣和原发黑素瘤的辨别中没有价值，因为它们在痣和黑素瘤中没有差异表达(参见Busam K.J.，等Am JSurg Pathol.1998，22：976-82；Fullen D.R.，等J Cutan Pathol，2001；28：393-9；Kucher C.，等Am J Dermatopathol，2004；26：452-7；HaqqC.等Proc Natl Acad Sci USA 2005；102：6092-7)。另外，在一些此类研究中，真皮内痣是所检测的主要痣类型。真皮内痣已知在其基部发生显著的“成熟”。在我们的研究中，在真皮内痣、混合痣以及Spitz和发育异常痣的基部观察到标志物免疫染色的下调。这表明了此多标志物测定作为黑素瘤分子诊断标志物的更加广泛的用途。
在本实施例中，我们描述了能以高精确度诊断黑素细胞赘生物的多标志物免疫组织化学测定，因此有助于解决这一困难的病理鉴别诊断。
表16、仅使用单标志物表达得分辨别黑素瘤与痣
标志物  最佳分级划分         卡方    P-值
ARPC2   0和1、2和3           24.2    ＜.00005
FN1     0和1、2和3           4.75    .0294
RGS1    0、1、2和3           8.98    .0027
SPP1    0、1和2、3           11.1    .0009
WNT2    0、1、2、3(整个分级) 86.6    ＜.00005
表17、对于每种标志物使用训练数据中病变交界区和病变基部(“顶部-底部”)得分的黑素瘤诊断准确度
标志物   特异性(％)  灵敏度(％)  P-值
                                 (Fisher确切检验)
ARPC2    59.7        96.1        ＜.00005
FN1      23.3        98.9        .0101
SPP1    61.5   99.0   ＜.00005
RGS1    33.3   99.0   ＜.00005
WNT2    100    100    ＜.00005
表18、在多个组织组中并使用不同的诊断算法，多标志物测定的黑素瘤诊断的灵敏度、特异性和AUC的比较＊
数据组      诊断算法        特异性    灵敏度  AUC
                            (％)      (％)
训练        仅标志物强度    93.6      75.8    .9105
训练        仅垂直表达      84.6      98.7    .9165
训练        组合表达得分    94.9      90.6    .9277
训练和验证  组合表达得分    95.1      90.5    .9275
＊每个分析的P值＜.00005(Fisher确切检验)
实施例10：针对黑素瘤的六基因诊断标志物测定
我们在698个患者的合并数据组中评价了六基因测定在黑素瘤和痣的鉴别诊断中的效用，所述数据组包含538个患者的训练组(119个痣和419个黑素瘤)和160个患者的验证组。使用免疫组织化学分析评价六种基因(ARPC2、FN1、NCOA3、RGS1、骨桥蛋白(SPP1)和WNT2)的表达。通过logistic回归分析，六基因测定(在仅通过标志物表达得分分析时)显示77.9％的灵敏度和92％的特异性，ROC下的AUC为0.914。开发了诊断算法用于研究六标志物的顶部-底部得分在黑素瘤诊断中的效用(图22)。仅用该顶部-底部分析(其中标志物表达在痣中均匀丧失，而在黑素瘤中保持此垂直表达)显示了96.4％的灵敏度和82.8％的特异性。最后，开发了涵盖标志物强度得分以及顶部-底部差异的诊断算法(图23)。此诊断算法应用于训练组病变产生了92％的灵敏度和94.1％的特异性。最后，将该相同诊断算法应用于四个验证组，在由痣产生的黑素瘤中显示了97.4％的灵敏度和94.7％的特异性，正确地鉴定了37/39(95％)的发育异常痣，20/21(95％)Spitz痣和18/24(75％)之前误诊的肿瘤。在合并数据组中，该多标志物测定显示了92.2％的灵敏度和94.6％的特异性。这些结果证明了该六标志物测定在黑素瘤和痣的诊断中的效用。
实施例11：用于黑素瘤的四基因预后测定
我们研究了当合并全部四种标志物的表达水平时RGS1、NCOA3、骨桥蛋白(SPP1)和PHIP的预后影响。我们针对标志物可用的TMA上412个原发皮肤黑素瘤病例开发了预后指标，其反映过表达(定义为高于该标志物的取舍点)的标志物数目。首先，通过单变量分析来分析多标志物阳性对以下三种重要结局参数的影响：前哨淋巴结状态(SLN状态)、无复发存活(RFS)和疾病特定存活(DSS)。根据单变量分析，过表达标志物个数的提高有效预测了SLN状态(P＝0.002，logistic回归)、RFS(P＜0.0001，Cox回归)和DSS(P＜0.0001，Cox回归)。
接下来，通过多变量分析对多标志物的预后影响进行了分析，其中利用AJCC黑素瘤委员会分析所包含的六个因素。通过多变量分析，在纳入这些因素时，多标志物测定是SLN状态(表19)、RFS(表20)和DSS(表21)的独立预测物。在DSS的分析中，多标志物测定以预测DSS的第一因素出现。即使纳入SLN状态后，多标志物指标仍保持有效预测性(表22)。另外，根据Kaplan-Meier分析，标志物阳性的提高有效预测了RFS(P＜0.0001)和DSS(P＜0.0001)。这些结果证明了多标志物测定的强大预后影响。
表19、多种因素对黑素瘤人群SLN状态之影响的Cox回归分析
预后因素         卡方    风险比  P值
年龄             19.60   0.65    ＜.0001
多标志物表达水平 8.35    1.33    .0039
肿瘤厚度         6.89    1.68    .0087
Clark分级        1.63    1.36    .20
性别             1.49    1.46    .22
溃烂             .77     1.32    .38
部位             .0006   1.01    .98
表20、多种因素对黑素瘤人群RFS之影响的Cox回归分析
预后因素         卡方     风险比  P值
Clark分级        25.15    1.81    ＜.0001
多标志物表达水平 15.52    1.19    .0001
溃烂             13.20    1.79    .0003
部位             3.53     1.34    .06
肿瘤厚度         1.18     1.11    .28
年龄             .30      0.97    .59
性别    0    1.00    .999
表21.、多种因素对黑素瘤人群DSS之影响的Cox回归分析
预后因素         卡方    风险比  P值
多标志物表达水平 14.18   1.24    .0002
Clark分级        8.16    1.55    .0043
溃烂             4.23    1.52    .04
肿瘤厚度         3.89    1.29    .049
部位             2.66    1.40    .10
性别             .01     1.02    .92
年龄             .010    .99     .93
表22.、多种因素对黑素瘤人群DSS之影响的Cox回归分析
预后因素            卡方    风险比  P值
多标志物表达水平    8.25    1.31    .004
肿瘤厚度            6.58    1.62    .01
SLN状态             2.69    1.55    .10
溃烂                1.88    1.45    .17
Clark水平           1.25    1.24    .26
性别                0.20    1.13    .66
年龄                0.15    1.03    .70
部位                0.09    1.08    .77
应该理解，本文所述实施例和实施方案仅用于说明的目的，本领域技术人员会根据它们想到多种修改或改变，这些修改和改变将包含在本申请的精神和范围之内，以及本发明所附特征和权利要求的范围之内。本文引用的所有公开、专利和专利申请通过引用并入本文用于所有目的。

Claims (33)

1.诊断对象中黑素瘤的方法，所述方法包括下列步骤：
(a)使来自该对象的生物样品与试剂相接触，每种试剂与生物样品中至少一种选定标志物特异性结合，所述选定标志物包括：(i)ARPC2、FN1、NCOA3、RGS1、SPP1和WNT2的多肽，或者(ii)编码所述多肽的核酸，其中每种标志物至少有一种试剂与其结合；和
(b)测定是否有任何选定标志物在该样品中过表达或低表达；从而提供对该对象中黑素瘤的诊断。
2.根据权利要求1的方法，其中所述试剂是抗体。
3.根据权利要求2的方法，其中所述抗体是带标记的。
4.根据权利要求2的方法，其中所述测定是使用选自免疫组织化学测定和ELISA的酶免疫测定进行的。
5.根据权利要求1的方法，其中所述试剂是核酸。
6.根据权利要求1的方法，其中所述试剂是RT PCR引物。
7.根据权利要求1的方法，其中所述样品是皮肤活检。
8.根据权利要求1的方法，其中所述测定步骤包括将所述标志物的表达提高与样品中细胞的转移性表型相关联。
9.根据权利要求1的方法，其中所述诊断将良性痣与恶性黑素瘤区分开来。
10.根据权利要求1的方法，其中所述测定步骤包括使用FISH或CGH。
11.用于诊断对象中黑素瘤的试剂盒，所述试剂盒包含试剂，每种试剂与生物样品中至少一种选定标志物特异性结合，所述选定标志物包括：i)ARPC2、FN1、NCOA3、RGS1、SPP1和WNT2的多肽，或者ii)编码所述多肽的核酸。
12.根据权利要求11的试剂盒，其中所述试剂是抗体。
13.根据权利要求12的试剂盒，其中所述抗体是带标记的。
14.根据权利要求12的试剂盒，其还包含其他试剂，其用于使用选自免疫组织化学测定和ELISA的酶免疫测定进行的检测。
15.根据权利要求12的试剂盒，其还包含其他试剂，其用于使用FISH或CGH进行的检测。
16.根据权利要求11的试剂盒，其中所述试剂是核酸。
17.根据权利要求11的试剂盒，其中所述试剂是RT PCR引物。
18.诊断对象中黑素瘤的方法，所述方法包括下列步骤：
(a)向该对象施用试剂，每种试剂与该对象中至少一种选定标志物特异性结合，所述选定标志物包括：(i)ARPC2、FN1、NCOA3、RGS1、SPP1和WNT2的多肽，或者(ii)编码所述多肽的核酸，其中每种标志物至少有一种试剂与其结合；和
(b)测定所述标志物是否在该对象中过表达或低表达；从而提供对黑素瘤的诊断。
19.提供对象中黑素瘤预后的方法，所述方法包括下列步骤：
(a)使来自该对象的生物样品与试剂相接触，每种试剂与该生物样品中至少一种选定标志物特异性结合，所述选定标志物包括：(i)RGS1、NCOA3、SPP1和PHIP的多肽，或者(ii)编码所述多肽的核酸，其中每种标志物至少有一种试剂与其结合；和
(b)测定所述选定标志物是否在该样品中过表达或低表达；从而提供该对象中黑素瘤的预后。
20.根据权利要求19的方法，其中所述试剂是抗体。
21.根据权利要求20的方法，其中所述抗体是带标记的。
22.根据权利要求20的方法，其中所述测定是使用选自免疫组织化学测定和ELISA的酶免疫测定进行的。
23.根据权利要求19的方法，其中所述试剂是核酸。
24.根据权利要求19的方法，其中所述试剂是RT PCR引物。
25.根据权利要求23的方法，其中所述测定是使用FISH或CGH进行的。
26.根据权利要求19的方法，其中至少一种选定标志物的表达提高与选自以下的预后相关：转移至区域淋巴结、复发和死亡。
27.用于提供对象中黑素瘤预后的试剂盒，所述试剂盒包含试剂，每种试剂与生物样品中至少一种选定标志物特异性结合，所述选定标志物包括：i)RGS1、NCOA3、SPP1和PHIP的多肽，或者ii)编码所述多肽的核酸，其中每种标志物至少有一种试剂与其结合。
28.根据权利要求27的试剂盒，其中所述试剂是抗体。
29.根据权利要求28的试剂盒，其中所述抗体是带标记的。
30.根据权利要求27的试剂盒，其还包含其他试剂，其用于使用选自免疫组织化学测定和ELISA的酶免疫测定进行的检测。
31.根据权利要求27的试剂盒，其中所述试剂是核酸。
32.根据权利要求27的试剂盒，其中所述试剂是RT PCR引物。
33.根据权利要求27的试剂盒，其还包含其他试剂，其用于使用FISH或CGH进行的检测。
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