PT2257810E - Diagnóstico molecular e classificação de melanoma maligno - Google Patents

Description

ΕΡ 2 257 810/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Diagnóstico molecular e classificação de melanoma maligno"

ANTECEDENTES DO INVENTO 0 melanoma é a quinta malignidade mais comum nos Estados Unidos e a sua incidência está a aumentar mais rapidamente do que qualquer outra forma de cancro. Actualmente espera-se que cerca de um em cada setenta americanos desenvolva melanoma durante a sua vida. 0 melanoma é um tumor maligno de melanócitos (células pigmentares). Apesar da maioria dos melanomas ocorrer na pele, este cancro pode também ocorrer nas superfícies mucosas ou noutros locais para os quais migrem as células da cristã neural. Os melanomas que não espalharam para além do seu local de origem são altamente curáveis dado que essas formas precoces são lesões finas que não invadiram para além da derme papilar. 0 tratamento de tais melanomas de localização precoce é a excisão cirúrgica com margens proporcionais ao micro-estágio da lesão primária. Alguns melanomas que espalharam para gânglios linfáticos regionais podem ser curáveis com excisão vasta do tumor primário e remoção dos gânglios linfáticos regionais envolvidos.

Contrariamente, as formas mais avançadas de melanoma apresentam um risco elevado de mortalidade devida a metastização. Quando ocorre metastização as células de cancro pode espalhar-se através dos gânglios linfáticos para locais distantes tais como figado, pulmões ou cérebro. 0 prognóstico para doentes nos estágios tardios desta doença é fraco com uma sobrevivência média de seis a dez meses. A capacidade de curar formas precoces de melanoma associada à sua rápida conversão para uma forma metastática incurável sublinha a necessidade de métodos de diagnóstico mais precisos tanto para detecção precoce desta doença como para a definição de melhores marcadores que sirvam como elementos de prognóstico da progressão da doença de modo a proporcionar estratégias melhor informadas de tratamento médico. A agravar o problema de conceber estratégias terapêuticas adequadas baseadas em diagnósticos e prognósticos adequados está o facto de os médicos terem verificado que o melanoma apresenta frequentemente um comportamento clinico 2 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ imprevisível. Por exemplo, enquanto a espessura vertical do tumor primário é um dos factores de prognóstico determinantes da sobrevivência mais importantes, muitos doentes com melanomas espessos não têm metástases enquanto um subgrupo pequeno de doentes com tumores finos morre da sua doença. São portanto necessários melhores marcadores para melhorar os algoritmos de prognóstico para doentes de melanoma recém-diagnosticados. Apesar de serem extensivamente estudados, não se utilizam rotineiramente factores moleculares para a avaliação diagnóstica e prognóstica de doentes de melanoma. Tais biomarcadores proporcionariam novas perspectivas para detecção precoce de melanoma e constituiriam alvos para avaliação de risco de melanoma, assim como alvos para desenvolvimento de novos fármacos. Os métodos e composições deste invento proporcionam essas ferramentas adicionais para o tratamento de doentes com melanoma.

SUMÁRIO SUCINTO DO INVENTO

De um modo geral, os métodos deste invento podem ser especialmente utilizados para o diagnóstico de melanoma por detecção dos marcadores NC0A3, Wnt-2, osteopontina (SPP1), ARPC2, RGS1 e Fibronectina 1 (FN1), que são expressos diferencialmente (regulação negativa ou positiva) em células de melanoma. Estes marcadores podem assim ser utilizados para diagnóstico para distinguir melanoma de nevos benignos. Os marcadores são usados em combinação. ARPC2, FNl, NC0A3, RGSl, SPP1 e WNT2 são usados num ensaio de diagnóstico com seis marcadores para melanoma.

Proporcionam-se kits de diagnóstico compreendendo reagentes para detectar os marcadores.

Numa primeira concretização, este invento proporciona um método in vitro para diagnosticar melanoma num indivíduo, compreendendo o método as etapas de: (a) pôr em contacto uma amostra biológica do indivíduo com reagentes que ligam especificamente um painel de marcadores seleccionados compreendendo: (i) os polipéptidos ARPC2, FNl, NC0A3, RGSl, SPP1 e WNT2 ou (ii) os ácidos 3 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ nucleicos que codificam os polipéptidos, em que ocorre a ligação de pelo menos um reagente a cada marcador; e (b) determinar se cada um dos marcadores seleccionados está ou não sobrexpresso ou subexpresso na amostra; proporcionando assim um diagnóstico para melanoma no indivíduo.

Num aspecto desta concretização, o reagente pode ser um anticorpo que pode ser monoclonal. Noutro aspecto desta concretização, o reagente pode ser um ácido nucleico incluindo um oligonucleótido ou um conjunto de iniciadores de RT PCR. Noutros aspectos desta concretização, o melanoma é melanoma primário ou melanoma metastático e a amostra pode ser uma biópsia de pele. Em aspectos adicionais desta concretização o diagnóstico distingue entre nevos benignos e melanoma maligno. Nalguns formatos, a etapa de determinação pode ser efectuada utilizando um imuno-ensaio enzimático, tal como um ELISA ou um ensaio imuno-histoquimico. Noutros formatos a etapa de determinação pode ser efectuada usando FISH ou CGH.

Numa segunda concretização, o presente invento proporciona um kit para uso no diagnóstico de melanoma num indivíduo, compreendendo o kit reagentes que ligam especificamente um painel de marcadores seleccionados compreendendo: (i) os polipéptidos ARPC2, FNl, NC0A3, RGS1, SPP1 e WNT2 ou (i i) os ácidos nucleicos que codificam os polipéptidos. 0 kit pode conter adicionalmente reagentes adicionais para efectuar detecção por utilização de um ensaio imuno-enzimático, tal como um ELISA ou ensaio imuno-histoquimico. Noutros formatos, o kit pode conter adicionalmente reagentes adicionais para efectuar detecção usando FISH ou CGH.

DESCRIÇÃO SUCINTA DOS ESQUEMAS

Figura 1: Fotomicrografias de melanoma primário demonstrando imunocoloração NC0A3 ausente (painel A) e intensa (painel B).

Figura 2: Análise de Kaplan-Meier de sobrevivência livre de recidiva (RFS) (painel A) e de sobrevivência específica de 4 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ doença (DSS) (painel B) de acordo com o nível e expressão de NC0A3.

Figura 3: Painel superior. Coloração imunológica NC0A3 em melanoma desmoplásico. Note-se a coloração castanha das células fusiformes. Painel inferior. Coloração imunológica NC0A3 em metástases do gânglio linfático do mesmo doente. Note-se a coloração difusa de células tumorais no centro.

Figura 4: Actividade anti-metastática de ribozimas (Rz) e ARNsi dirigidos a NC0A3 murino. Injectaram-se células de melanoma B16-F10 por via intravenosa em grupos de 10 ratinhos C57B1/6. Aos dias 3 e 10 após a injecção injectaram-se por via intravenosa complexos de lípido catiónico:ADN que codifica sequências de controlo de vector ou duas ribozimas e ARNsi que têm como alvo locais diferentes de ARN de NCOA3 murino. Sacrificaram-se os ratinhos ao dia 25 e analisou-se o número de tumores metastáticos do pulmão. Todas as quatro construções demonstraram reduções significativas na carga de tumor metastático comparativamente com o vector de controlo (4613) sozinho (P < 0,05).

Figura 5: Pesos dos pulmões de ratinhos com tumores tratados com várias construções anti-NCOA3 ou de controlo. Os detalhes experimentais são idênticos aos descritos na figura 4 .

Figura 6: Actividade anti-metastática da ribozima 397 (Rz) dirigida a NCOA3 contra cancro de mama murino. Injectaram-se células de carcinoma de mama 4T1 por via intravenosa em grupos de 10 ratinhos BALB/c. Aos dias 3 e 10 após a injecção injectaram-se por via intravenosa complexos de lípido catiónico:ADN que codifica sequências de controlo de vector Rz397, siARN385 e controlos de mutante contendo uma mutação de base única na ribozima (m-Rz397) ou ARNsi (m-siARN385). Sacrificaram-se os ratinhos ao dia 25 e analisou-se o número de tumores metastáticos do pulmão. Os ratinhos tratados com Rz397 apresentaram significativamente menos tumores de pulmão do que os ratinhos tratados com siARN385, m-Rz397 ou com o vector de controlo sozinho. 5 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ

Figura 7: Ter NC0A3 como alvo suprime invasão de células de tumor in vitro. Transfectaram-se células B16 apenas com vector ou com vector que expressa Rzs397 ou siARN385 dirigido a NC0A3 murino e determinou-se a invasão usando um ensaio de câmara de Boyden 24 horas após a transfecção.

Figura 8: Fotomicrografias com baixa ampliação (40x, painel A) e com elevada ampliação (lOOx, painel B) da imunocoloração de Wnt-2 num nevo melanocitico composto, mostrando coloração intensa nos ninhos intra-epidérmicos do nevo e com menor coloração nos ninhos subepidérmicos e dérmicos.

Figura 9: Fotomicrografias com baixa ampliação (40x, painel A) e com elevada ampliação (lOOx, painel B) da imunocoloração de Wnt-2 num melanoma primário (4,1 mm de espessura, Clark nivel IV) demonstrando agregados de melanoma intra-epidérmico com coloração intensa a invadir a derme.

Figura 10: Actividade anti-metastática de uma ribozima dirigida a Wnt-2 murina (Mo-Wnt2-Rz879). Injectaram-se por via intravenosa células de melanoma B16-F10 em grupos de 10 ratinhos C57B1/6. Ao dia 7 após a injecção, injectaram-se por via intravenosa complexos de lipido catiónico:ADN que codifica sequências de controlo de vector ou uma ribozima dirigida a ARN de Wnt-2 murina diferente. Sacrificaram-se ratinhos ao dia 25 e analisou-se o número de tumores metastáticos do pulmão. A ribozima anti-Wnt-2 demonstrou reduções significativas da carga de tumor metastático comparativamente com o vector de controlo (4613) sozinho (P = 0,0006).

Figura 11: Fotomicrografias com baixa ampliação (40x, painel A) e com elevada ampliação (lOOx, painel B) da imunocoloração de Wnt-2 num melanoma primário ocorrente num nevo, apresentando melanoma fortemente corado (M) nas componentes de junção e dérmica, com ausência de coloração no nevo congénito dérmico subjacente (N).

Figura 12: Actividade anti-metastática de ribozimas (Rz) e ARNsi dirigidos a PHIP murino. Injectaram-se por via intravenosa células de melanoma B16-F10 em grupos de 10 ratinhos C57B1/6. Aos dias 3 e 10 após a injecção, injectaram- 6 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ se por via intravenosa complexos de lípido catiónico:ADN que codifica sequências de controlo de vector ou três ribozimas e ARNsi dirigidos a locais diferentes de ARN de PHIP murino. Sacrificaram-se os ratinhos ao dia 25 e analisou-se o número de tumores metastáticos do pulmão. Duas ribozimas (Rzl22 e Rz314) e uma construção de ARNsi (siARN723) demonstraram reduções significativas da carga de tumor metastático comparativamente com o vector de controlo (4613) sozinho (P < 0,05) .

Figura 13: Ter PHIP como alvo suprime a invasão de células tumorais in vitro. Transfectaram-se células B16 com vector que expressa Rz314 ou siARN385 dirigidos a PHIP murino e determinou-se a invasão usando um ensaio de câmara de Boyden 24 horas após a transfecção. Houve uma supressão significativa da invasão BI 6 por Rz314 comparativamente com uma ribozima mutante desactivada (mRz314) e por SÍARN723 comparativamente com vários controlos de ARNsi inactivos.

Figura 14: Determinação do número de cópias do gene NCOA3 em melanoma por hibridação in situ de fluorescência (FISH).

Figura 15. Gráfico ROC no diagnóstico de melanoma para o ensaio de multi-marcador usando pontuações de intensidade de marcador combinadas para todos os cinco marcadores.

Figura 16. Algoritmo de diagnóstico utilizado para os conjuntos de treino e validação combinando pontuações de intensidade de marcador assim como diferenças de topo para fundo. Para cada frase de diagnóstico no algoritmo incluem-se o número de observações correctas e incorrectas do conjunto de treino. representativas de FN1 (painel B) , RGS1 (painel E) em nevos

Figura 17A-E. Fotomicrografias imunocoloração para ARPC2 (painel A) , (painel C), SPP1 (painel D) e WNT2 benignos.

Figura 18A-E. Fotomicrografias representativas de imunocoloração para ARPC2 (painel A) , FN1 (painel B) , RGSl (painel C), SPPl (painel D) e WNT2 (painel E) em melanomas. 7 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ

Figura 19. Gráficos ROC no diagnóstico de melanoma usando um marcador sozinho (FN1), três marcadores (FN1, ARPC2, SPP1) e todos os cinco marcadores.

Figura 20 A-E. Fotomicrografias representativas de imunocoloração para ARPC2 (painel A) , FN1 (painel B) , RGS1 (painel C) , SPP1 (painel D) e WNT2 (painel E) em melanomas provenientes de associação com um nevo, em que M representa o melanoma e N representa o nevo.

Figura 21A-E. Imunocoloração para neoplasias melanociticas com diagnóstico errado, correctamente diagnosticados para cada um dos cinco marcadores. A) Coloração de ARPC2 numa mulher de 44 anos com melanoma não ulcerado com espessura de 0,76 mm, Clark nivel III, diagnosticado inicialmente como um nevo benigno; B) Coloração de FN1 numa mulher de 29 anos com um nevo displásico diagnosticado inicialmente como um melanoma de 0,25 mm, Clark nível II; C) Coloração de RGS1 numa mulher de 31 anos com melanoma metastático de estágio IV com uma lesão diagnosticada inicialmente como uma proliferação melanocítica intra-epidérmica atípica; D) Coloração de SPP1 num homem de 46 anos com melanoma desmoplásico não ulcerado de 0,8 mm, Clark nível 4, diagnosticado inicialmente como um nevo de Spitz; E) Coloração de WNT2 numa mulher de 44 anos com melanoma não ulcerado com espessura de 0,76 mm, Clark nível III, diagnosticado inicialmente como um nevo benigno.

Figura 22. Algoritmo de diagnóstico utilizando diferenças nas pontuações de topo para fundo para ensaio diagnóstico de melanoma de seis genes.

Figura 23. Algoritmo de diagnóstico utilizando pontuações de intensidade de coloração e diferenças de topo para fundo para ensaio diagnóstico de melanoma de seis genes.

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO

INTRODUÇÃO

Apesar da investigação intensa, não são utilizados rotineiramente marcadores moleculares para avaliação 8 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ diagnóstica e prognóstica de doentes de melanoma. Um pré-requisito para o desenvolvimento de tais marcadores é o conhecimento de genes que são expressos diferencialmente em células de melanoma.

Determinamos que os genes Wnt-2, NC0A3, osteopontina (SPP1), ARPC2, RGS1 e Fibronectina 1 apresentam expressão diferencial em melanoma.

Tal como descrito detalhadamente seguidamente, estes genes apresentam padrões de expressão distintivos que são caracteristicos de diferentes aspectos da progressão de melanoma e podem assim ser utilizados para diagnóstico e prognóstico dos diferentes estágios deste cancro. Por exemplo, os nossos dados revelam que NC0A3 é um bom indicador da metástase de melanoma para gânglios linfáticos regionais, recidiva da doença e morte, enquanto Wnt-2 pode ser um marcador diagnóstico para nevos benignos relativamente a melanoma maligno. Além disso, os nossos dados indicam que SPP1 está sobrexpresso em melanomas comparativamente com nevos benignos. Os nossos dados também revelam que se pode utilizar NC0A3 como um previsor de um subgrupo de melanoma desmoplásico que metastizará para gânglios linfáticos regionais. Estes resultados revelam que os marcadores aqui revelados podem ser utilizados sozinhos ou em combinação para proporcionar ao médico ferramentas de diagnóstico e prognóstico mais definitivas.

Além disso, as proteinas codificadas por estes genes são expressas diferencialmente em melanomas.

Assim, este invento proporciona métodos para o diagnóstico de melanoma baseados na expressão diferencial de NC0A3, Wnt-2, osteopontina (SPP1), ARPC2, RGS1 e Fibronectina 1 em células de melanoma. Usam-se os marcadores em combinação como um painel ou como marcadores. Utiliza-se um ensaio de seis marcadores baseado em expressão diferencial de ARPC2, FN1, NC0A3, RGS1, osteopontina (SPP1) e WNT2 para o diagnóstico de melanoma. 0 invento também proporciona kits para diagnóstico de melanoma compreendendo reagentes para detectar os marcadores. 9 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ

DEFINIÇÕES Ο melanoma é uma forma de cancro que se inicia nos melanócitos, as células que produzem pigmento. Apesar de ocorrer frequentemente na pele, o melanoma também pode ocorrer no olho e raramente nas membranas das passagens nasal, oral e mucosas faringea, vaginal e anal. 0 comité conjunto do cancro americano ("American Joint Committee on Câncer" - AJCC) desenvolveu um sistema para classificar melanomas em 4 estágios (com muitos sub-estágios) com base em critérios patológicos e taxas de sobrevivência. 0 melanoma pode provir de sinais ou nevos benignos na pele e progredir através dos estágios definidos pelo sistema de estágios da AJCC. Consultar, e.g., Harrison's Principies of Internai Medicine, Kasper et al., 16a ed., 2005, para antecedentes adicionais. A expressão "marcador" refere-se a uma molécula (tipicamente proteína, ácido nucleico, hidrato de carbono ou lípido) que é expressa na célula, expressa à superfície de uma célula de cancro ou excretada por uma célula de cancro comparativamente com uma célula normal e que é útil para o diagnóstico de cancro, para proporcionar um prognóstico. Tais marcadores são moléculas que são expressas diferencialmente, e.g., sobrexpressas ou subexpressas num melanoma ou outra célula de cancro comparativamente com uma célula normal, por exemplo, sobrexpressão ou subexpressão de uma vez, sobrexpressão ou subexpressão de duas vezes, sobrexpressão ou subexpressão de três vezes ou mais comparativamente com uma célula normal, um nevo ou um cancro primário (relativamente a metástases). Além disso, um marcador pode ser uma molécula que é sintetizada de forma desadequada na célula de cancro, por exemplo, uma molécula que contém deleções, adições ou mutações comparativamente com a molécula expressa numa célula normal.

Podem utilizar-se marcadores sozinhos ou em combinação com outros marcadores para quaisquer das utilizações, e.g., diagnóstico ou prognóstico de melanoma, tal como aqui reveladas.

Tal como aqui utilizado, "um marcador de avaliação de melanoma" refere-se a um marcador expresso diferencialmente em células de melanoma e refere-se equivalentemente a um 10 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ polipéptido ou ácido nucleico que codifica o polipéptido ou qualquer parte do polipéptido. "Amostra biológica" inclui secções de tecidos tais como amostras de biópsias e autópsias e secções congeladas retiradas com objectivos histológicos. Tais amostras incluem amostras de pele, amostras de superfícies mucosas, sangue e fracções e produtos de sangue (e.g., soro, plasma, plaquetas, eritrócitos e semelhantes), expectoração, linfa e tecido da lingua, células cultivadas, e.g., culturas primárias, explantes e células transformadas, fezes, urina, etc. Obtém-se tipicamente uma amostra biológica de um organismo eucariótico, com a maior preferência de um mamifero tal como um primata e.g., chimpanzé ou humano; vaca; cão; gato; um roedor, e.g., porquinho-da-india, rato, ratinho, coelho.

Uma "biópsia" refere-se ao processo de remover uma amostra de tecido para avaliação de diagnóstico ou prognóstico e refere-se também ao próprio espécime de tecido. Pode aplicar-se qualquer técnica de biópsia conhecida na especialidade aos métodos de diagnóstico do presente invento. A técnica de biópsia aplicada dependerá do tipo de tecido a avaliar (e.g., pele, superfície mucosa, etc.), do tamanho e tipo do tumor (e.g., sólido ou em suspensão, sangue ou ascites), entre outros factores. As técnicas de biópsia representativas incluem, biópsia excisional, biópsia incisional, biópsia com agulha, biópsia cirúrgica, não se lhes limitando. Uma "biópsia excisional" refere-se à remoção de uma massa tumoral inteira com uma pequena margem de tecido normal que a rodeia. Uma "biópsia incisional" refere-se à remoção de tecido em forma de cunha que inclui um diâmetro de corte transversal do tumor. Um diagnóstico ou prognóstico feito por endoscopia ou fluoroscopia pode necessitar de uma "biópsia com agulha cortante" da massa de tumor ou de uma "biópsia com aspiração com agulha fina" que contém geralmente uma suspensão de células do interior da massa de tumor. Discutem-se técnicas de biópsia, por exemplo, em Harrison's Principies of Internai Medicine, Kasper, et al., ed., 16a ed., 2005, capitulo 70 e ao longo da parte V.

As expressões "sobrexpressar", "sobrexpressão" ou "sobrexpresso" referem-se indiferentemente a uma proteina ou 11 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ ácido nucleico que é transcrito ou traduzido a um nivel superior e de forma detectável, habitualmente numa célula de cancro, comparativamente com uma célula normal, um nevo ou um cancro primário. A expressão inclui sobrexpressão devido a transcrição, processamento pós-transcrição, tradução, processamento pós-tradução, localização celular (e.g., organelo, citoplasma, núcleo, superfície celular) e estabilidade de ARN e proteina comparativamente com uma célula normal. Pode detectar-se sobrexpressão utilizando técnicas convencionais para detectar ARNm (i.e., RT-PCR, PCR, hibridação) ou proteínas (i.e., ELISA, técnicas de imuno-histoquimica). A sobrexpressão pode ser de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais comparativamente com uma célula normal. Em determinados casos, a sobrexpressão é de uma vez, duas vezes, três vezes, quatro vezes ou a niveis superiores de transcrição ou tradução comparativamente com uma célula normal. A sobrexpressão pode também incluir qualquer expressão numa célula de amostra comparativamente com a ausência de expressão numa célula normal.

As expressões "subexpressar", "subexpressão" ou "subexpresso" referem-se indiferentemente a uma proteina ou ácido nucleico que é transcrito ou traduzido a um nivel inferior e de forma detectável, habitualmente numa célula de cancro, comparativamente com uma célula normal, um nevo ou um cancro primário. A expressão inclui subexpressão devido a transcrição, processamento pós-transcrição, tradução, processamento pós-tradução, localização celular (e.g., organelo, citoplasma, núcleo, superfície celular) e estabilidade de ARN e proteína comparativamente com uma célula normal. Pode detectar-se subexpressão utilizando técnicas convencionais para detectar ARNm (i.e., RT-PCR, PCR, hibridação) ou proteínas (i.e., ELISA, técnicas de imuno-histoquímica). A subexpressão pode ser de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, etc. comparativamente com uma célula normal. Em determinados casos, a subexpressão é de uma vez, duas vezes, três vezes, quatro vezes ou a níveis inferiores de transcrição ou tradução comparativamente com uma célula normal. A subexpressão pode também incluir a ausência de expressão numa célula de amostra comparativamente com qualquer expressão numa célula normal. 12 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ "Tratamento terapêutico" e "terapias de cancro" referem-se a quimioterapia, terapia hormonal, radioterapia, imunoterapia e terapia biológica (dirigida). "Quantidade ou dose terapeuticamente eficaz" ou "quantidade ou dose suficiente" significa aqui uma dose que produz os efeitos para os quais é administrada. A dose exacta dependerá do objectivo do tratamento e será verificável pelo perito na especialidade utilizando técnicas conhecidas (consultar, e.g., Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vol. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of

Pharmaceutical Compounding (1999); Pickar, Dosage Calculations (1999); e Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a edição, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkins).

As expressões "idênticas" ou percentagem de "identidade", no contexto de duas ou mais sequências de ácidos nucleicos ou polipéptido, referem-se a duas ou mais sequências ou subsequências que são a mesma ou têm uma percentagem especifica de resíduos de aminoácidos ou nucleótidos que é a mesma (i.e., cerca de 60% de identidade, preferentemente 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade ao longo de uma região específica, quando comparada e alinhada para correspondência máxima ao longo de uma janela de comparação ou região designada) tal como medido usando os algoritmos de comparação de sequências BLAST ou BLAST 2.0 com parâmetros por omissão seguidamente descritos ou por alinhamento manual e inspecção visual (consultar, e.g., o portal na internet de NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ ou semelhantes). Diz-se então que tais sequências são "substancialmente idênticas". Esta definição também se refere ao complementar de uma sequência de ensaio ou pode ser a este aplicada. A definição também inclui sequências que têm deleções e/ou adições, assim como aquelas que têm substituições. Tal como seguidamente descrito os algoritmos preferíveis podem contabilizar falhas e semelhantes. Preferentemente existe identidade ao longo de uma região que tem pelo menos cerca de 25 aminoácidos ou nucleótidos de comprimento ou com maior preferência ao longo de uma região que tem 50-100 aminoácidos ou nucleótidos de comprimento. 13 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ

Para comparação de sequências, tipicamente uma sequência funciona como uma sequência de referência relativamente à qual se comparam sequências de ensaio. Quando se utiliza um algoritmo de comparação de sequências, introduzem-se as sequências de ensaio e de referência num computador, designam-se as coordenadas de subsequências, caso necessário e designam-se os parâmetros do programa de algoritmo de sequência. Preferentemente podem utilizar-se os parâmetros de programa por omissão ou podem designar-se parâmetros alternativos. 0 algoritmo de comparação de sequência calcula então as percentagens de identidade de sequência para as sequências de ensaio relativamente à sequência de referência, com base nos parâmetros do programa.

Uma "janela comparativa" tal como aqui utilizada inclui referência ao segmento de qualquer uma das várias posições contiguas seleccionadas do grupo que consiste de 20 a 600, habitualmente cerca de 50 a cerca de 200, mais habitualmente cerca de 100 a cerca de 150 nos quais uma sequência pode ser comparada com uma sequência de referência com o mesmo número de posições contiguas após as duas sequências serem optimamente alinhadas. Os métodos de alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na especialidade. O alinhamento óptimo de sequências para comparação pode ser efectuado, e.g., pelo algoritmo de homologia local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), pelo método de busca de semelhança de Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sei. USA 85:2444 (1988), pelas implementações computorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no pacote utilitário Wisconsin Genetics do Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) ou por alinhamento manual e inspecção visual (consultar, e.g., Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., ed. 1987-2005, Wiley Interscience)).

Um exemplo preferido de algoritmo que é adequado para determinar a percentagem de identidade de sequência e semelhança de sequência são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, que se descrevem em Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977) e Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990), respectivamente. Utilizam-se BLAST e BLAST 2.0 com os 14 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ parâmetros aqui descritos, para determinar a percentagem de identidade de sequência para os ácidos nucleicos e proteínas descritos. Os utilitários para efectuar análises BLAST estão disponíveis publicamente através de National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo envolve primeiramente a identificação de pares com sequências de elevada pontuação (HSP) por identificação de palavras curtas de comprimento W numa sequência de interrogação, que podem emparelhar ou satisfazer um limiar positivo de pontuação T quando alinhadas com uma palavra com o mesmo comprimento numa sequência de base de dados. Refere-se T como o limiar de pontuação de palavra vizinha (Altschul et al., anteriormente). Estes acertos iniciais de palavra vizinha funcionam como sementes para iniciar buscas para encontrar HSP mais longas que os contenham. Estendem-se os acertos de palavra em ambos os sentidos ao longo de cada sequência até a uma distância que permita aumento da pontuação de alinhamento cumulativa. Calculam-se as pontuações cumulativas usando para as sequências de nucleótidos os parâmetros M (pontuação de prémio para um par de resíduos emparelhados; sempre >0) e N (pontuação de penalização para um par de resíduos desemparelhados; sempre < 0). Para sequências de aminoácidos, usa-se uma matriz de pontuação para calcular a pontuação cumulativa. Interrompe-se a extensão dos acertos de palavra em ambos os sentidos quando: a pontuação de alinhamento cumulativa desce da quantidade X relativamente ao valor máximo atingido; a pontuação cumulativa fica a zero ou inferior devido à acumulação de um ou mais alinhamentos de resíduos com pontuação negativa; ou quando se atinge o final de qualquer das sequências. Os parâmetros do algoritmo BLAST W, T e X determinam a sensibilidade e velocidade do alinhamento. 0 programa BLASTN (para sequências de nucleótidos) usa por omissão um comprimento de palavra (W) de 11, um valor provável (E) de 10, M=5, N=-4 e uma comparação de ambas as cadeias. Para sequências de aminoácidos, o programa BLASTP usa por omissão um comprimento de palavra de 3 e um valor provável (E) de 10 e a matriz de pontuação BLOSUM62 (consultar Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:10915 (1989)) alinhamentos (B) de 50, valor esperado (E) de 10, M=5, N=-4 e uma comparação de ambas as cadeias. 15 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ "Ácido nucleico" refere-se a desorribonucleótidos ou ribonucleótidos e seus polímeros nas formas em cadeia simples ou em cadeia dupla e sues complementares. A expressão abrange ácidos nucleicos contendo análogos de nucleótido ou resíduos ou ligações de esqueleto modificados conhecidos, que são sintéticos, de ocorrência natural e de ocorrência não natural, que têm propriedades de ligação semelhantes às do ácido nucleico de referência e que são metabolizados de forma semelhante aos nucleótidos de referência. São exemplos de tais análogos, fosforotiolatos, fosforoamidatos, metilfosfonatos, metilfosfonatos quirais, ribonucleótidos 2-0-metilo, ácidos nucleicos peptídicos (PNA), não se lhes limitando. "Molécula de ARNi" ou um "ARNsi" refere-se a um ácido nucleico que forma um ARN em cadeia dupla, em que o ARN em cadeia dupla tem a capacidade de reduzir ou inibir a expressão de um gene ou gene alvo quando o ARNsi é expresso na mesma célula do gene ou do gene alvo. Assim, "ARNsi" refere-se ao ARN em cadeia dupla formado pelas cadeias complementares. As partes complementares do ARNsi que hibridam para formar uma molécula em cadeia dupla têm identidade substancial ou completa. Numa concretização, um ARNsi refere-se a um ácido nucleico que tem identidade substancial ou completa com um gene alvo e forma um ARNsi em cadeia dupla. A sequência do ARNsi pode corresponder à sequência completa do gene alvo ou a uma sua subsequência. Tipicamente, o ARNsi tem pelo menos cerca de 15-50 nucleótidos de comprimento (e.g., cada sequência complementar do ARNsi em cadeia dupla tem 15-50 nucleótidos de comprimento e o ARNsi em cadeia dupla tem cerca de 15-50 pares de bases de comprimento, preferentemente cerca de 20-30 bases de nucleótidos, preferentemente cerca de 20-25 nucleótidos de comprimento, e.g., 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleótidos de comprimento.

Um polinucleótido "anti-sentido" é um polinucleótido que é substancialmente complementar a um polinucleótido alvo e tem a capacidade de hibridar especificamente com o polinucleótido alvo.

As ribozimas são moléculas de ARN enzimáticas capazes de catalisar clivagem específica de ARN. A composição de moléculas de ribozima inclui preferentemente uma ou mais 16 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ sequências complementares ao ARNm alvo e a sequência catalítica bem conhecida responsável por clivagem de ARNm ou uma sequência funcionalmente equivalente (consultar, e.g., patente U.S. n° 5 093 246). As moléculas de ribozima concebidas para clivar cataliticamente produtos de transcrição de ARNm alvo podem também ser usadas para evitar tradução de ARNm alvo do indivíduo.

Salvo indicação em contrário, uma sequência de ácido nucleico específica também abrange implicitamente as suas variantes modificadas conservativamente (e.g., substituições de codão degeneradas) e sequências complementares, assim como a sequência explicitamente indicada. Especificamente, podem obter-se substituições de codão degeneradas pela geração de sequências nas quais a terceira posição de um ou mais codões seleccionados (ou de todos) é substituída com resíduos de bases mistas e/ou de desoxi-inosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)). Utiliza-se a expressão ácido nucleico indiferentemente a gene, ADNc, ARNm, oligonucleótido e polinucleótido.

Uma sequência de ácido nucleico específica pode também abranger implicitamente "variantes de splicing" e sequências de ácido nucleico que codificam formas truncadas de antigénios de cancro. De igual modo, uma proteína específica codificada por um ácido nucleico abrange implicitamente qualquer proteína codificada por um variante de splicing ou forma truncada desse ácido nucleico. As "variantes de splicing", como o próprio nome sugere, são produtos de splicing alternativo de um gene. Após transcrição, um produto de transcrição de ácido nucleico inicial pode sofrer splicing de modo a que produtos de splicing diferentes (alternativos) codifiquem polipéptidos diferentes. Os mecanismos para a produção de variantes de splicing variam mas incluem splicing alternativo de exões. São também abrangidos por esta definição os polipéptidos alternativos derivados do mesmo ácido nucleico por transcrição com continuação de leitura. Incluem-se nesta definição quaisquer produtos de uma reacção de splicing, incluindo formas recombinantes dos produtos de splicing. Os ácidos nucleicos podem ser truncados na extremidade 5' ou na 17 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ extremidade 3'. Os polipéptidos podem ser truncados na extremidade N-terminal ou na extremidade C-terminal. As versões truncadas de sequências de ácido nucleico ou de polipéptido podem ser de ocorrência natural ou podem ser criadas de forma recombinante.

As expressões "polipéptido", "péptido" e "proteína" são aqui utilizadas indiferentemente em referência a um polímero de resíduos de aminoácido. As expressões aplicam-se a polímeros de aminoácido nos quais um ou mais resíduos de aminoácido são um produto químico mimético artificial de um aminoácido de ocorrência natural correspondente, assim como polímeros de aminoácido de ocorrência natural e polímeros de aminoácido de ocorrência não natural. A expressão "aminoácido" refere-se a aminoácidos de ocorrência natural e sintéticos, assim como a análogos de aminoácidos e a produtos miméticos de aminoácido que funcionam de modo semelhante aos aminoácidos de ocorrência natural. Os aminoácidos de ocorrência natural são aqueles codificados pelo código genético assim como aqueles aminoácidos que são mais tarde modificados, e.g., hidroxiprolina, γ-carboxiglutamato e 0-fosfosserina. Análogos de aminoácidos refere-se a compostos que têm a mesma estrutura química básica que um aminoácido de ocorrência natural, i.e., um carbono α que está ligado a um hidrogénio, um grupo carboxilo, um grupo amino e um grupo R, e.g., homosserina, norleucina, metioninassulfóxido, metioninametilsulfónio. Tais análogos têm grupos R modificados (e.g., norleucina) ou esqueletos de péptido modificados, mas retêm a mesma estrutura química básica que um aminoácido de ocorrência natural. Os produtos miméticos de aminoácidos referem-se a compostos químicos que têm uma estrutura que é diferente da estrutura química geral de um aminoácido, mas que funciona de forma semelhante a um aminoácido de ocorrência natural.

Podem aqui referir-se aminoácidos quer pelos seus símbolos de três letras de conhecimento geral quer pelos seus símbolos de uma letra recomendados pela comissão de nomenclatura bioquímica da IUPAC-IUB. De igual modo, podem referir-se os nucleótidos pelos seus códigos de uma letra habitualmente aceites. 18 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ "Variantes modificados conservativamente" aplica-se tanto a sequências de aminoácidos como de ácidos nucleicos. Relativamente a sequências de ácidos nucleicos especificas, variantes modificados conservativamente referem aqueles ácidos nucleicos que codificam sequências de aminoácidos idênticas ou essencialmente idênticas ou nas quais o ácido nucleico não codifica uma sequência de aminoácido, até sequências essencialmente idênticas. Devido à degenerescência do código genético, um grande número de ácidos nucleicos funcionalmente idênticos codificam qualquer determinada proteína. Por exemplo, os codões GCA, GCC, GCG e GCU codificam todos o aminoácido alanina. Assim, em cada posição na qual uma alanina é especificada por um codão, o codão pode ser alterado para qualquer dos codões correspondentes descritos sem alterar o polipéptido codificado. Tais variações de ácido nucleico são "variações silenciosas" que são uma espécie de variações com modificação conservativa. Cada sequência de ácido nucleico aqui que codifica um polipéptido também descreve qualquer variação silenciosa possível do ácido nucleico. 0 perito reconhecerá que cada codão num ácido nucleico (com excepção de AUG, que é habitualmente o único codão para metionina e TGG, que é habitualmente o único codão para triptofano) pode ser modificado para proporcionar uma molécula funcionalmente idêntica. Assim, cada variação silenciosa de um ácido nucleico que codifica um polipéptido está implícita em cada sequência descrita relativamente ao produto de expressão, mas não relativamente às sequências de sonda reais.

Relativamente às sequências de aminoácidos o perito reconhecerá que substituições, deleções ou adições individuais de uma sequência de ácido nucleico, péptido, polipéptido ou proteína que alterem, adicionem ou deletem um único aminoácido ou uma pequena percentagem de aminoácidos na sequência codificada é uma "variante modificada conservativamente" na qual a alteração resulta na substituição de um aminoácido com um aminoácido quimicamente semelhante. As tabelas de substituições conservativas proporcionando aminoácidos funcionalmente semelhantes são bem conhecidas na especialidade. Tais variantes modificadas conservativamente são adicionais a variantes polimórficas, inter-espécies homólogas e alelos, não as excluindo. 19 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ

Os seguintes oito grupo contêm cada um aminoácidos que são substituições conservativas entre si: 1) Alanina (A), Glicina (G) ; 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutâmico (E) ; 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L) , Metionina (M) , Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W); 7) Serina (S), Treonina (T) ; e 8) Cisterna (C) , Metionina (M) . Consultar, e.g., Creighton, Proteins (1984).

Um "marcador" ou uma "parte detectável" é uma composição detectável por meios espectroscópicos, fotoquimicos, bioquimicos, imunoquimicos, quimicos ou outros meios fisicos. o o

Por exemplo, os marcadores uters rncluem P, corantes fluorescentes, reagentes electronicamente densos, enzimas (e.g., tal como habitualmente utilizadas num ELISA), biotina, digoxigenina ou haptenos e proteinas que podem ser tornados detectáveis, e.g., por incorporação de um marcador radioactivo no péptido ou utilizado para detectar anticorpos que reagem especificamente com o péptido. A expressão "recombinante" quando utilizada em referência, e.g., a uma célula ou ácido nucleico, proteina ou vector, indica que a célula, ácido nucleico, proteina ou vector foi modificada pela introdução de um ácido nucleico ou proteina heterólogo ou pela alteração de um ácido nucleico ou proteina nativos ou que a célula é derivada de uma célula assim modificada. Assim, por exemplo, as células recombinantes expressam genes que não se encontram na forma nativa (não recombinante) da célula ou expressam genes nativos que são de outro modo expressos anomalamente, subexpressos ou que não são expressos. A frase "condições de hibridação rigorosas" refere-se a condições nas quais uma sonda hibridará com a sua subsequência alvo, tipicamente numa mistura complexa de ácidos nucleicos, mas não hibridará com outras sequências. As condições rigorosas são dependentes da sequência e serão diferentes em circunstâncias diferentes. As sequências mais longas hibridarão especificamente a temperaturas mais elevadas. Apresenta-se um guia extenso para hibridação de ácidos nucleicos em Tijssen, Techniques In Biochemistry and Molecular 20 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ

Biology--Hybridization with Nucleic Probes, "OverView of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993). De um modo geral, seleccionam-se condições rigorosas para serem cerca de 5-10°C inferiores ao ponto de fusão térmico (Tm) para a sequência especifica para força iónica e pH definidos. A Tm é a temperatura (para força iónica, pH e concentração nucleica definidos) à qual 50% das sondas complementares ao alvo hibridam com a sequência alvo no equilíbrio (como as sequências alvo estão presentes em excesso, à Tm, 50% das sondas estão ocupadas no equilíbrio). As condições rigorosas podem ser também obtidas por adição de agentes desestabilizantes tais como formamida. Para hibridação selectiva ou especifica, um sinal positivo é pelo menos duas vezes a hibridação de base, preferentemente 10 vezes a hibridação de base. Os exemplos de condições de hibridação rigorosa podem ser como se segue: formamida a 50%, 5x SSC e SDS a 1%, incubação a 42 °C ou 5x SSC, SDS a 1%, incubação a 65 °C com lavagem em 0,2x SSC e SDS a 0,1% a 65 °C.

Os ácidos nucleicos que não hibridam entre si em condições rigorosas são ainda substancialmente idênticos se os polipéptidos que codificam forem substancialmente idênticos. Tal ocorre, por exemplo, quando se cria uma cópia de um ácido nucleico usando a degenerescência máxima de codões permitida pelo código genético. Em tais casos, os ácidos nucleicos hibridam tipicamente em condições de hibridação de rigor moderado. Os exemplos de "condições de hibridação de rigor moderado" incluem uma hibridação num tampão de formamida a 40%, NaCl 1 M, SDS a 1% a 37 °C e uma lavagem em IX SSC a 45 °C. Uma hibridação positiva é pelo menos duas vezes a hibridação de base. Os peritos reconhecerão facilmente que se podem utilizar condições alternativas de hibridação e lavagem para proporcionar condições com rigor semelhante. Proporcionam-se linhas orientadoras adicionais para determinar os parâmetros de hibridação em numerosas referências, e.g., e Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel, et al.r anteriormente.

Para PCR, uma temperatura de cerca de 36 °C é típica para amplificação com baixo rigor, apesar das temperaturas de hibridação poderem variar entre cerca de 32 °C e 48 °C dependendo do comprimento do iniciador. Para amplificação por 21 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ PCR com rigor elevado é típica uma temperatura de cerca de 62 °C, apesar da temperatura de hibridação de rigor elevado poder variar entre cerca de 50 °C a cerca de 65 °C, dependendo do comprimento e especificidade do iniciador. As condições típicas de ciclo para amplificações tanto de rigor elevado como de baixo rigor incluem uma fase de desnaturação de 90 °C - 95 °C durante 30 seg - 2 min, uma fase de hibridação que dura 30 seg - 2 min e uma fase de extensão a cerca de 72 °C durante 1-2 min. Proporcionam-se protocolos e orientações para reacções de amplificação de rigor baixo e elevado, e.g., em Innis et al. (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N.Y.). "Anticorpo" refere-se a um polipéptido compreendendo uma região de esqueleto de um gene de imunoglobulina ou seus fragmentos que liga e reconhece especificamente um antigénio. Os genes reconhecidos pela imunoglobulina incluem os genes de região constante kapa, lambda, alfa, gama, delta, épsilon e miu, assim como a miríade de genes de região variável de imunoglobulina. As cadeias leves classificam-se como kapa ou lambda. As cadeias pesadas classificam-se como gama, miu, alfa, delta ou épsilon, o que por sua vez define as classes de imunoglobulina IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Tipicamente, a região de ligação de antigénio de um anticorpo será mais crítica em especificidade e afinidade de ligação. Os anticorpos podem ser policlonais ou monoclonais, derivados de soro, um hibridoma ou clonados de forma recombinante e podem ser também quiméricos, primatizados ou humanizados.

Um exemplo de unidade estrutural de imunoglobulina (anticorpo) compreende um tetrâmero. Cada tetrâmero é composto por dois pares idênticos de cadeias de polipéptido apresentando cada par uma cadeia "leve" (cerca de 25 kDa) e uma cadeia "pesada" (cerca de 50-70 kDa). O N-terminal de cada cadeia define uma região variável com cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos que é a principal responsável pelo reconhecimento de antigénio. As expressões cadeia leve variável (VL) e cadeia pesada variável (VH) referem-se a estas cadeias leve e pesada respectivamente.

Os anticorpos existem, e.g., como imunoglobulinas intactas ou como vários fragmentos bem caracterizados 22 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ produzidos por digestão com diferentes peptidases. Assim, por exemplo, a pepsina digere um anticorpo nas ligações dissulfureto da região de dobra para produzir F(ab)'2, um dimero de Fab que é ele próprio uma cadeia leve ligada a VH-CH1 por uma ligação dissulfureto. 0 F(ab)'2 pode ser reduzido em condições suaves para quebrar a ligação dissulfureto na região de dobra convertendo assim o dimero F(ab)72 a um monómero Fab' . 0 monómero Fab' é essencialmente Fab com parte da região de dobra (consultar Fundamentamental Immunology (Paul ed., 3a ed. 1993). Embora vários fragmentos de anticorpo se definam em termos da digestão de um anticorpo intacto, o perito considerará que tais fragmentos podem ser sintetizados de novo quer quimicamente quer utilizando metodologias de ADN recombinante. Assim, a expressão anticorpo tal como aqui utilizada, também inclui fragmentos de anticorpo quer produzidos pela modificação de anticorpos inteiros quer sintetizados de novo utilizando metodologias de ADN recombinante (e.g., Fv de cadeia simples) ou aqueles identificados utilizando bibliotecas de disposição de fagos (consultar, e.g., McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)).

Numa concretização, o anticorpo é conjugado com uma parte "efectora". A parte efectora pode ser qualquer de entre várias moléculas, incluindo partes de marcação tais como marcadores radioactivos ou marcadores fluorescentes.

As sequências de aminoácido ou de nucleótido dos marcadores representativos para uso no presente invento estão disponíveis na internet a partir de qualquer fonte adequada, tal como será entendido pelos peritos na especialidade relativamente a esta descrição. Por exemplo, as seguintes sequências de aminoácidos e de nucleótidos estão disponíveis no portal de NCBI usando a ferramenta de busca Entrez. NCOA3 refere-se a um membro da família de proteínas co-activadoras do receptor de esteróides em humanos. Os números de acesso para ácidos nucleicos representativos que codificam NCOA3 incluem: NM_008679, BC092516 e BC088343, entre outros. Os números de acesso para proteínas NCOA3 representativas incluem: CAI42141, CAC17693, CAB40662, AAH88343 e NP_032705, entre outros. 23 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ

Wnt-2 refere-se a um membro da família de proteínas extracelulares que podem ligar-se a receptores da superfície celular para activar uma via de sinalização em células. Os números de acesso para ácidos nucleicos representativos que codificam Wnt-2 incluem: NM_003391 e NM_023653, entre outros. Os números de acesso para proteínas Wnt-2 incluem NP_004176, NP 078613 e AAF30299, entre outros. A osteopontina ou SPP1 (fosfoproteína 1 excretada), refere-se a uma família de glicoproteínas fosforiladas que é abundante na matriz mineral do osso e acelera a regeneração e remodelação ósseas. Também é produzida noutros tecidos e desempenha um papel na regulação e progressão de muitas doenças através do aumento das capacidades invasivas e proteolíticas das células de tumor. Os números de acesso para sequências de proteína representativas para osteopontina incluem: AAA62729, AAA59974, CAA 40091, AAC28619 e NM_000582, entre outros.

Os números de acesso para sequências representativas para ARPC2, RGS1 ou Fibronectina 1 são como se seguem: ARPC2: NM_152862 e NM_005731; RGSl: NM_002922; FN1 (fibronectina 1) : NM_212475, NM_054034, NM_212476, NM_002026, NM_212474, NM_212478 e NM_212482.

Os ácidos nucleicos que codificam NCOA3, Wnt-2, osteopontina (SPP1), ARPC2, RGSl ou Fibronectina 1 ou seus polipéptidos codificados referem-se a todas as formas de ácidos nucleicos (e.g., gene, pré-ARNm, ARNm) ou proteínas, seus variantes polimórficos, alelos, mutantes e homólogos inter-espécies que (tal como aplicável a ácido nucleico ou proteína): (1) têm uma sequência de aminoácidos que tem mais de cerca de 60% de identidade de sequência de aminoácidos, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, preferentemente 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou mais de identidade de sequência de aminoácidos, preferentemente ao longo de uma região com pelo menos cerca de 25, 50, 100, 200, 500, 1000 ou mais aminoácidos, com um polipéptido codificado por um ácido nucleico referenciado ou uma sequência de aminoácidos aqui descrita; (2) se liga especificamente a anticorpos, e.g., anticorpos policlonais, desenvolvidos contra um imunogénio 24 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ compreendendo uma sequência de aminoácidos referenciada, seus fragmentos imunogénicos e suas variantes modificadas conservativamente; (3) hibrida especificamente sob condições de hibridação rigorosa com um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos referenciada e suas variantes modificadas conservativamente; (4) tem uma sequência de ácidos nucleicos que mais de cerca de 95%, preferentemente mais de cerca de 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência de nucleótidos, preferentemente ao longo de uma reqião com pelo menos cerca de 25, 50, 100, 200, 500, 1000 ou mais nucleótidos, com uma sequência de ácidos nucleicos de referência. Uma sequência de polinucleótido ou de polipéptido é tipicamente de um mamifero incluindo, primata, e.g., humano; roedor, e.g., rato, ratinho, hamster; vaca, porco, cavalo, ovelha ou qualquer mamifero, não se lhes limitando. Os ácidos nucleicos e proteínas incluem tanto moléculas de ocorrência natural como moléculas recombinantes. As formas truncadas e com splicing alternativo desses antigénios estão incluídas na definição. A frase "liga especificamente (ou selectivamente)" em referência a uma proteína, ácido nucleico, anticorpo ou composto de molécula pequena refere-se a uma reacção de ligação que determina a presença da proteína ou ácido nucleico, nomeadamente NCOA3, Wnt-2, osteopontina (SPP1), ARPC2, RGS1 ou Fibronectina 1 muitas vezes numa população heterogénea de proteínas ou ácidos nucleicos e outros elementos biológicos. No caso de anticorpos, em condições de imuno-ensaio determinadas, um anticorpo específico pode ligar-se a uma proteína em particular com pelo menos duas vezes o nível basal e mais tipicamente mais de 10 a 100 vezes o nível basal. A ligação específica de um anticorpo sob tais condições necessita de um anticorpo que é seleccionado para a sua especificidade para uma proteína em particular. Por exemplo, podem seleccionar-se anticorpos policlonais para obter apenas aqueles anticorpos policlonais que apresentam especificamente reactividade imunológica com o antigénio seleccionado e não com outras proteínas. Pode obter-se esta selecção por subtracção dos anticorpos que reagem de forma cruzada com outras moléculas. Podem utilizar-se vários formatos de imuno-ensaio para seleccionar anticorpos que apresentam reactividade imunológica específica com uma proteína em particular. Por 25 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ exemplo, utilizam-se rotineiramente imuno-ensaios ELISA em fase sólida para seleccionar anticorpos que apresentam reactividade imunológica especifica com uma proteina (consultar, e.g., Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988) para uma descrição de formatos de imuno-ensaios e condições que podem ser utilizadas para determinar reactividade imunológica especifica). A frase "efeitos funcionais" no contexto de ensaios para testar compostos que modulam uma proteina marcadora inclui a determinação de um parâmetro que é indirecta ou directamente influenciado por uma proteina marcadora tal como NC0A3, Wnt-2, osteopontina (SPP1), ARPC2, RGS1 ou Fibronectina 1, e.g., um efeito quimico ou fenotipico tal como actividade de transcrição alterada de NC0A3 ou actividade alterada da via de sinalização de Wnt-2 e os efeitos a jusante de tais proteínas sobre o metabolismo e crescimento celulares. Assim, um efeito funcional inclui actividade de ligação de ligando, activação ou repressão de transcrição, a capacidade das células proliferarem, expressão em células durante a progressão de melanoma e outras características das células de melanoma. Os "efeitos funcionais" incluem actividades in vitro, in vivo e ex vivo. "Determinar o efeito funcional" significa ensaiar para a presença de um composto que aumenta ou diminui um parâmetro que está indirecta ou directamente sob a influência de um marcador tal como NC0A3, Wnt-2, osteopontina (SPP1), ARPC2, RGS1 ou Fibronectina 1, e.g., medição dos efeitos físicos e químicos ou fenotípicos. Tais efeitos funcionais podem medir-se por quaisquer meios conhecidos dos peritos na especialidade, e.g., alterações das características espectroscópicas (e.g., fluorescência, absorvância, índice de refracção); hidrodinâmicas (e.g., forma), cromatográficas; ou propriedades de solubilidade para a proteína; ensaios de ligação de ligando, e.g., ligação a anticorpos; medição de marcadores indutíveis ou activação do marcador por transcrição; medição de alterações na actividade enzimática; capacidade de aumentar ou diminuir proliferação celular, apoptose, paragem de ciclo celular, medição de alterações nos marcadores de superfície celular. Pode também efectuar-se a determinação do efeito funcional de um composto na progressão 26 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ de células de melanoma usando ensaios conhecidos dos peritos na especialidade tal como metástase de células de melanoma por injecção de células de melanoma na veia da cauda de ratinhos. Podem avaliar-se os efeitos funcionais através de muitos meios conhecidos dos peritos na especialidade, e.g., microscopia para medições quantitativas ou qualitativas das alterações nas caracteristicas morfológicas, medição de alterações nos niveis de ARN ou proteina para outros genes expressos em células de melanoma, medição da estabilidade de ARN, identificação da expressão de genes a jusante ou genes repórter (CAT, luciferase, β-gal, GFP e semelhantes), e.g., através de quimioluminescência, fluorescência, reacções colorimétricas, ligação de anticorpo, marcadores indutiveis, etc.

Utilizam-se "inibidores", "activadores" e "moduladores" dos marcadores em referência a activar, inibir ou modular moléculas identificadas utilizando ensaios in vitro e in vivo de marcadores de melanoma tais como NC0A3, Wnt-2, osteopontina (SPP1), ARPC2, RGS1 ou Fibronectina 1. Os inibidores são compostos que, e.g., se ligam, bloqueiam parcial ou totalmente a actividade, diminuem, evitam ou atrasam activação, inactivam, dessensibilizam ou regulam negativamente a actividade ou expressão de marcadores de melanoma tais como NC0A3, Wnt-2, osteopontina (SPP1), ARPC2, RGS1 ou Fibronectina 1, e.g., antagonistas. Os "activadores" são compostos que aumentam, abrem, activam, facilitam, melhoram a activação, sensibilizam, agonizam ou regulam positivamente a actividade de marcadores de melanoma tais como NC0A3, Wnt-2, osteopontina (SPP1), WIF1, ARPC2, RGS1 ou Fibronectina 1, e.g., agonistas.

Os inibidores, activadores ou moduladores também incluem versões modificadas geneticamente de marcadores de melanoma tais como NC0A3, Wnt-2, osteopontina (SPP1), ARPC2, RGS1 ou Fibronectina 1, e.g., versões com actividade alterada assim como ligandos, antagonistas, agonistas, anticorpos, péptidos, péptidos cíclicos, ácidos nucleicos, moléculas anti-sentido, ribozimas, moléculas de ARNi, moléculas orgânicas pequenas e semelhantes, de ocorrência natural e sintéticos. Tais ensaios para inibidores e activadores incluem, e.g., expressar marcadores de melanoma tais como NC0A3, Wnt-2, osteopontina (SPP1), ARPC2, RGS1 ou Fibronectina 1, in vitro, em células ou extractos de células, aplicar possíveis compostos moduladores 27 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ e seguidamente determinar os efeitos funcionais sobre a actividade tal como anteriormente descrito.

Comparam-se amostras ou ensaios compreendendo marcadores de melanoma tais como NC0A3, Wnt-2, osteopontina (SPPl), ARPC2, RGS1 ou Fibronectina 1, que são tratados com um activador, inibidor ou modulador potencial com amostras de controlo sem o inibidor, activador ou modulador para analisar a extensão da inibição. Atribuem-se às amostras de controlo (não tratadas com inibidores) um valor relativo de actividade de proteína de 100%. Obtém-se inibição de marcadores de melanoma tais como NCOA3, Wnt-2, osteopontina (SPPl), ARPC2, RGS1 ou Fibronectina 1 quando o valor de actividade relativamente ao controlo é cerca de 80%, preferentemente 50%, mais preferentemente 25-0%. Obtém-se activação de marcadores de melanoma tais como NCOA3, Wnt-2, osteopontina (SPPl), WIF1, ARPC2, RGS1 ou Fibronectina 1 quando o valor de actividade relativamente ao controlo (não tratado com activadores) é 110%, mais preferentemente 150%, ainda mais preferentemente 200-500% (i.e., duas a cinco vezes superior relativamente ao controlo), mais preferentemente 1000-3000% superior. A expressão "composto de ensaio" ou "fármaco candidato" ou "modulador" ou equivalentes gramaticais tal como aqui utilizadas descrevem qualquer molécula, de ocorrência natural ou sintética, e.g., proteína, oligopéptido (e.g., desde cerca de 5 a cerca de 25 aminoácidos de comprimento, preferentemente desde cerca de 10 a 20 ou 12 a 18 aminoácidos de comprimento, preferentemente 12, 15 ou 18 aminoácidos de comprimento), molécula orgânica pequena, polissacárido, péptido, péptido circular, lípido, ácido gordo, ARNsi, polinucleótido, oligonucleótido, etc., a ser ensaiado para a capacidade de modular directa ou indirectamente marcadores de melanoma tais como NCOA3, Wnt-2, osteopontina (SPPl), ARPC2, RGS1 ou Fibronectina 1. O composto de ensaio pode estar na forma de uma biblioteca de compostos de ensaio tal como uma biblioteca combinatorial ou randomizada que proporciona uma gama de diversidade suficiente. Os compostos de ensaio estão opcionalmente ligados a um parceiro de fusão, e.g., compostos de direcção ao alvo, compostos de salvamento, compostos de dimerização, compostos estabilizantes, compostos dirigidos e outras partes funcionais. Convencionalmente geram-se novas 28 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ entidades químicas com propriedades úteis por identificação de um composto de ensaio (denominado um "composto líder") com alguma propriedade ou actividade pretendida, e.g., actividade de inibição, criação de variantes do composto líder e avaliação da propriedade e actividade desses compostos variantes. Muitas vezes utilizam-se métodos de rastreio de alto rendimento (HTS) para tal análise.

Uma "molécula orgânica pequena" refere-se a uma molécula orgânica de ocorrência natural ou sintética, que tem um peso molecular superior a cerca de 50 daltons e inferior a cerca de 2500 daltons, preferentemente inferior a cerca de 2000 daltons, preferentemente entre cerca de 100 e cerca de 1000 daltons, com maior preferência entre cerca de 200 e cerca de 500 daltons.

MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO E DE PROGNÓSTICO O presente invento proporciona métodos de diagnóstico de melanoma por detecção de expressão de marcadores expressos diferencialmente em células de melanoma em diferentes estágios de malignidade. O diagnóstico envolve a determinação do nível de expressão de polipéptido ou ácido nucleico de NCOA3, Wnt-2, osteopontina (SPP1), ARPC2, RGS1 e Fibronectina 1 num doente ou numa amostra de doente seguido de comparação do nível de expressão com uma linha de base ou gama. Tipicamente, o valor de linha de base é representativo de níveis de expressão do polipéptido ou ácido nucleico num indivíduo saudável que não sofra de melanoma, tal como medido usando uma amostra biológica tal como uma biópsia de pele. A variação dos níveis de um polinucleótido ou ácido nucleico do invento de uma gama de linha de base (para cima ou para baixo) indica que o doente tem um cancro ou está em risco de desenvolver um cancro, dependendo do marcador utilizado. No caso de sobrexpressão de NCOA3, Wnt-2, osteopontina (SPP1), ARPC2, RGS1 e Fibronectina 1, tal seria consistente com um diagnóstico de melanoma.

Tal como aqui utilizada, a expressão "proporcionar um prognóstico" refere-se a proporcionar uma previsão de um decurso e resultados prováveis de melanoma. Os métodos podem ser também utilizados para conceber uma terapia adequada para tratamento de melanoma, e.g., por indicação se o melanoma está 29 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ ainda num estágio benigno ou se o melanoma avançou para um estágio no qual seria necessária terapia agressiva.

Podem utilizar-se reagentes de anticorpo em ensaios para detectar níveis de expressão de NC0A3, Wnt-2, osteopontina (SPP 1), ARPC2, RGS1 e Fibronectina 1 em amostras de doentes usando qualquer um de entre vários imuno-ensaios conhecidos dos peritos na especialidade. Revelam-se reagentes de anticorpos monoclonais adequados para uso na detecção de expressão de NC0A3 no pedido U.S. número 61/033663, apresentado a 4 de Março de 2008. Além disso, revelam-se reagentes de anticorpos monoclonais adequados para uso na detecção de expressão de Wnt-2 no pedido U.S. número 61/033 641, apresentado a 4 de Março de 2008.

Descrevem-se na generalidade técnicas e protocolos de imuno-ensaio em Price e Newman, "Principies and Practice of Immunoassay", 2a edição, Grove's Dictionaries, 1997; e

Gosling, "Immunoassays: A Practical Approach", Oxford

University Press, 2000. Podem utilizar-se várias técnicas de imuno-ensaio, incluindo imuno-ensaios competitivos e não competitivos. Consultar, e.g., Self et al., Curr. Opin. Biotechnol., 7:60-65 (1996). A expressão imuno-ensaio abrange técnicas incluindo, imuno-ensaios enzimáticos (EIA) tal como a técnica de imuno-ensaio multiplicada por enzima (EMIT), ensaio de imuno-absorção enzimática (ELISA), ELISA de captura de anticorpo IgM (MAC ELISA) e imuno-ensaio de enzimas em micropartículas (MEIA); ensaios imuno-histoquímicos (IHC); imuno-ensaios de electroforese capilar (CEIA); radio-imuno-ensaios (RIA); ensaios imunorradiométricos (IRMA); imuno-ensaios de polarização de fluorescência (FPIA); e ensaios quimioluminescentes (CL), não se lhes limitando. Caso pretendido tais imuno-ensaios podem ser automatizados. Podem também utilizar-se imuno-ensaios em conjunção com fluorescência induzida por laser. Consultar, e.g., Schmalzing et al., Electrophoresis, 18:2184-93 (1997); Bao, J.

Chromatogr. B. Biomed. Sei., 699:463-80 (1997). Os imuno- ensaios com lipossomas, tal como imuno-ensaios com lipossomas com injecção de fluxo e imuno-sensores de lipossomas, são também adequados para uso no presente invento. Consultar, e.g., Rongen et al., J. Immunol. Methods, 204:105-133 (1997).

Além disso, os ensaios nefelométricos, nos quais a formação de 30 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ complexos proteína/anticorpo resulta no aumento da luz dispersa que é convertida para um sinal de velocidade de pico em função da concentração de marcador, são adequados para uso nos métodos do presente invento. Os ensaios nefelométricos estão disponíveis comercialmente de Beckman Coulter (Brea, CA; Kit n° 449430) e podem ser efectuados usando um analisador nefelométrico Behring Nephelometer Analyzer (Fink et al., J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 27:261-276 (1989)). A ligação imunológica específica do anticorpo a proteínas pode ser detectada directa ou indirectamente. Os marcadores directos incluem marcadores fluorescentes ou luminescentes, metais, corantes, radionuclídeos e semelhantes, ligados ao anticorpo. Pode usar-se um anticorpo marcado com iodo-125 ( I) . Um ensaio de quimiolummescencia usando um anticorpo quimioluminescente específico para a proteína é adequado para detecção sensível e não radioactiva dos níveis de proteína. Um anticorpo marcado com fluorocromo é também adequado. Os exemplos de fluorocromos incluem, DAPI, fluoresceína, Hoechst 33258, R-ficocianina, B-ficoeritrina, R-ficoeritrina, rodamina, vermelho do Texas e lissamina, não se lhes limitando. Os marcadores indirectos incluem várias enzimas bem conhecidas na especialidade tais como peroxidase de rábano (HRP), fosfatase alcalina (AP), β-galactosidase, urease e semelhantes. Pode usar-se um sistema de detecção de peroxidase de rábano, por exemplo, com o substrato cromogénico tetrametilbenzidina (TMB), que proporciona um produto solúvel na presença de peróxido de hidrogénio que é detectável a 450 nm. Pode usar-se um sistema de detecção de fosfatase alcalina com o substrato cromogénico fosfato de p-nitrofenilo, por exemplo, que proporciona um produto solúvel facilmente detectável a 405 nm. De igual modo, pode usar-se um sistema de detecção de β-galactosidase com o substrato cromogénico o-nitrofenil^-D-galactopiranosídeo (ONPG), que proporciona um produto solúvel detectável a 410 nm. Pode usar-se um sistema de detecção de urease com um substrato tal como ureia-púrpura de bromocresol (Sigma Immunochemicals; St. Louis, MO).

Pode analisar-se um sinal do marcador directo ou indirecto, por exemplo, usando um espectrofotómetro para detectar cor de um substrato cromogénico; um contador de radiações para detectar radiação tal como um contador gama 125 31 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ para detecção de I; ou um fluorímetro para detectar fluorescência na presença de luz de determinado comprimento de onda. Para detecção de anticorpos ligados a enzima, pode efectuar-se uma análise quantitativa usando um espectrofotómetro tal como um leitor de microplacas EMAX Microplate Reader (Molecular Devices; Menlo Park, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Caso pretendido, os ensaios do presente invento podem ser automatizados ou efectuados por um robot e podem detectar simultaneamente o sinal de várias amostras.

Podem imobilizar-se os anticorpos em vários suportes sólidos tais como partículas magnéticas ou de matriz cromatográfica, a superfície de uma placa de ensaio (e.g., poços de microtitulação), peças de um material ou membrana de substrato sólido (e.g., plástico, nylon, papel) e semelhantes. Pode preparar-se uma tira de ensaio revestindo o anticorpo ou vários anticorpos numa matriz ou suporte sólido. Esta tira pode ser então mergulhada na amostra de ensaio e processada rapidamente através de etapas de lavagem e detecção para gerar um sinal mensurável, tal como uma mancha corada.

Alternativamente podem usar-se moléculas de ligação de ácido nucleico tais como sondas, oligonucleótidos, matrizes de oligonucleótidos e iniciadores em ensaios para detectar expressão diferencial de ARN em amostras de doentes, e.g., RT-PCR. Numa concretização usa-se RT-PCR de acordo com métodos padrão conhecidos na especialidade. Noutra concretização podem usar-se ensaios de PCR tais como ensaios Taqman® disponíveis de, e.g., Applied Biosystems para detectar ácidos nucleicos e suas variantes. Noutras concretizações, pode usar-se qPCR e micromatrizes de ácido nucleico para detectar ácidos nucleicos. Podem preparar-se reagentes que ligam biomarcadores de cancro seleccionados de acordo com métodos conhecidos dos peritos na especialidade ou podem adquirir-se comercialmente. A análise de ácidos nucleicos pode ser efectuada usando técnicas rotineiras tais como análise "Southern", reacção de polimerização em cadeia com transcriptase reversa (RT-PCR) ou quaisquer outros métodos baseados em hibridação com uma sequência de ácido nucleico que é complementar a uma parte de uma sequência de codificação de marcador (e.g., hibridação de 32 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ transferência "slot") estão também abrangidos pelo âmbito do presente invento. Descrevem-se técnicas de amplificação por PCR aplicáveis em, e.g., Ausubel et ai. e Innis et ai., anteriormente. Descrevem-se métodos gerais de hibridação de ácido nucleico em Anderson, "Nucleic Acid Hybridization", BIOS Scientific Publishers, 1999. Podem também efectuar-se amplificação ou hibridação de várias sequências de ácido nucleico (e.g., ADN genómico, ARNm ou ADNc) a partir de sequências de ARNm ou ADNc organizadas numa micromatriz. Descrevem-se na generalidade métodos de micromatriz em Hardiman, "Microarrays Methods and Applications: Nuts & Bolts", DNA Press, 2003; e Baldi et al., "DNA Microarrays and Gene Expression: From Experiments to Data Analysis and Modeling", Cambridge University Press, 2002.

Pode efectuar-se análise de marcadores de ácidos nucleicos e suas variantes usando técnicas conhecidas na especialidade incluindo, micromatrizes, análise baseada em reacção de polimerização em cadeia (PCR), análise de sequência, hibridação fluorescente in situ (FISH), hibridação genómica comparativa (CGH) e análise electroforética, não se lhes limitando. Um exemplo não limitativo de uma análise baseada em PCR inclui um ensaio de discriminação alélica Taqman® disponível de Applied Biosystems. Os exemplos não limitativos de análise de sequência incluem sequenciação de Maxam-Gilbert, sequenciação de Sanger, sequenciação de ADN em matriz capilar, sequenciação de ciclo térmico (Sears et ai., Biotechniques, 13:626-633 (1992)), sequenciação em fase sólida (Zimmerman et al., Methods Mol. Cell Biol., 3:39-42 (1992)), sequenciação com espectrometria de massa tal como espectrometria de massa de tempo de voo e dessorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI-TOF/MS; Fu et ai., Nat. Biotechnol., 16:381-384 (1998)) e sequenciação por hibridação.

Chee et al., Science, 274:610-614 (1996); Drmanac et al.,

Science, 260:1649-1652 (1993); Drmanac et al., Nat.

Biotechnol., 16:54-58 (1998). Os exemplos não limitativos de análise de electroforese incluem electroforese em gel em placa tal como electroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida, electroforese capilar e electroforese em gel com gradiente desnaturante. Outros métodos para detectar variantes de ácido nucleico incluem, e.g., o ensaio INVADER® de Third Wave Technologies, Inc., análise de polimorfismo do comprimento de 33 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ fragmento de restrição (RFLP), hibridação de oligonucleótido específico de alelo, um ensaio de mobilidade de cadeia dupla heteróloga, análise de polimorfismo conformacional em cadeia simples (SSCP), extensão de iniciador de nucleótido único (SNUPE) e pirossequenciação. FISH e CGH são métodos de análise de ADN genómico para alterações genéticas desequilibradas. Sucintamente marca-se (e.g., com um marcador fluorescente vermelho) ADN genómico de uma amostra de ensaio (e.g., células de melanoma) e mistura-se com ADN genómico normal marcado com outra cor (e.g., marcador fluorescente verde) e hibrida-se a mistura com um esfregaço de metafase humana normal, preparação de tecido ou outro padrão de referência. As regiões de desequilíbrio cromossómico (número de cópias aumentado ou diminuído) na amostra de melanoma localizam-se ou mapeiam relativamente aos cromossomas normais em metafase como aumentos ou diminuições da razão entre fluorescência verde e vermelha. Estão disponíveis na especialidade protocolos detalhados para efectuar FISH ou CGH, por exemplo, em Molecular Cytogenetics: Protocols and Applications, editado por Yao-Shan Fan, Humana Press, 2002; Câncer Cytogenetics: Methods and Protocols, editado por John Swansbury, Humana Press, 2003.

Ao efectuar FISH e CGH, prepara-se uma amostra cromossómica por deposição de células, como suspensões de célula única ou como uma preparação de tecido, em suportes sólidos tais como lâminas de vidro e fixa-se escolhendo um fixador que proporcione a melhor resolução espacial das células e uma eficácia de hibridação óptima. A hibridação in situ envolve geralmente as seguintes etapas principais: (1) fixação do tecido ou estrutura biológica a analisar; (2) tratamento de pré-hibridação da estrutura biológica para aumentar a acessibilidade ao ADN alvo e para reduzir a ligação não específica; (3) hibridação da mistura de ácidos nucleicos com o ácido nucleico na estrutura biológica ou tecido; (4) lavagens pós-hibridação para remover fragmentos de ácido nucleico que não se ligaram na hibridação; e (5) detecção dos fragmentos de ácido nucleico hibridados. Nalguns casos, é necessário bloquear a capacidade de hibridação das sequências repetitivas. Com esse objectivo, pode usar-se ADN genómico humano como um agente para bloquear tal hibridação. Para a 34 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ hibridação, marcam-se sondas de ensaio que hibridem com uma região cromossómica de interesse (e.g., um ou mais dos marcadores aqui revelados) com um corante e marca-se com um segundo corante uma sonda de controlo que hibride com uma região diferente. Um ácido nucleico que hibride com uma parte estável do cromossoma de interesse, tal como com a região de centrómero, é muitas vezes útil como uma sonda de controlo. Pela utilização de tais controlos, podem avaliar-se diferenças entre as eficiências de hibridação de amostra para amostra. Caso se utilizem marcadores de ensaio múltiplos numa única hibridação, cada um pode ser marcado com um marcador distinguível separadamente.

Dada a sensibilidade dos métodos FISH e CGH podem usar-se várias amostras de ensaio. Podem usar-se secções de tumor embebidas em parafina assim como material fresco ou congelado. Outros tipos de preparações incluem as derivadas de tumores primários não cultivados (consultar, e.g., Kallioniemi, A. et al., Cytogenet. Cell Genet. 60:190-193 (1992)). Por exemplo, podem usar-se amostras de sangue ou amostras de tecido de biópsia pequena de tumores, (consultar, e.g., Kallioniemi, A. et al., Cytogenet. Cell Genet. 60:190-193 (1992)). Podem também analisar-se pequenos números de células obtidas de biópsia por aspiração ou células em fluidos corporais (e.g., sangue, urina, expectoração e semelhantes).

Pode usar-se uma parte detectável nos ensaios aqui descritos. Pode usar-se uma grande variedade de partes detectáveis, dependendo a escolha de marcador da sensibilidade necessária, facilidade de conjugação com o anticorpo, requisitos de estabilidade e instrumentação disponível e normas de eliminação. As partes detectáveis adequadas incluem, radionuclídeos, corantes fluorescentes (e.g., fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína (FITC), Oregon Green™, rodamina, vermelho do Texas, isotiocianato de tetrarrodimina (TRITC), Cy3, Cy5, etc.), marcadores fluorescentes (e.g., proteína fluorescente verde (GFP), ficoeritrina, etc.), compostos fluorescentes com auto-atenuação que são activados por proteases associadas a tumor, enzimas (e.g., luciferase, peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, etc.), nanopartículas, biotina, digoxigenina e semelhantes, não se lhes limitando. 35 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ

Os formatos físicos úteis compreendem superfícies com uma variedade de localizações discretas e dirigidas para a detecção de vários marcadores diferentes. Tais formatos incluem micromatrizes e determinados dispositivos capilares. Consultar, e.g., Ng et al., J. Cell Mol. Med., 6:329-340 (2002); patente U.S. n° 6 019 944. Nestas concretizações, cada localização superficial discreta pode compreender anticorpos para imobilizar um ou mais marcadores para detecção em cada localização. As superfícies podem compreender alternativamente uma ou mais partículas discretas (e.g., micropartículas ou nanopartícuias) imobilizadas em localizações discretas de uma superfície, em que as micropartículas compreendem anticorpos para imobilizar um ou mais marcadores para detecção. A análise pode ser efectuada numa grande variedade de formatos físicos. Por exemplo, a utilização de placas de microtitulação ou automação poderia ser usada para facilitar o processamento de grandes números de amostras de ensaio. Alternativamente poderiam desenvolver-se formatos de amostra única para facilitar diagnóstico ou prognóstico de um modo atempado.

Alternativamente as sondas de anticorpos ou de ácido nucleico do invento podem ser aplicadas a secções de biópsias de doente imobilizadas em lâminas de microscópio. A coloração de anticorpo ou o padrão de hibridação in situ pode ser visualizado usando qualquer um de entre vários métodos de microscopia de luz visível ou de fluorescência conhecido na especialidade.

Em algumas concretizações, o melanoma num doente pode ser diagnosticado ou avaliado de outra forma por visualização da expressão in situ de uma ou mais das sequências génicas ou polipéptidos aqui reveladas. Os peritos na especialidade de visualização da presença ou expressão de moléculas incluindo ácidos nucleicos, polipéptidos e outros produtos bioquímicos em doentes vivos considerarão que a informação de expressão génica aqui descrita pode ser utilizada no contexto de vários métodos de visualização. Tais métodos incluem métodos de tomografia computorizada por emissão de fotão único (SPECT) e tomografia por emissão de positrões (PET), não se lhes 36 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ limitando. Consultar, e.g., Vassaux e Groot-wassink, "In Vivo Noninvasive Imaging for Gene Therapy", J. Biomedicine and Biotechnology, 2: 92-101 (2003); Turner, J., Smyth, P.,

Fallon, J.F., Kennedy, J.L., Potkin, S.G., FIRST BIRN (2006). Imaging and genetics in schizophrenia. Neuroinformatics, no prelo. A imagem por PET e SPECT mostra o funcionamento quimico de órgãos e tecidos, enquanto outras técnicas de imagem - tais como raios-X, tomografia axial computorizada e ressonância magnética - apresentam estruturas. A utilização de imagem por PET e SPECT é útil para identificar e monitorizar o desenvolvimento de melanoma. Em alguns casos, o uso de imagem por PET ou SPECT permite a detecção de doenças com anos de antecedência relativamente ao aparecimento dos primeiros sintomas. O uso de moléculas pequenas para marcação e visualização da presença ou expressão de polipéptidos e nucleótidos teve sucesso, por exemplo, na visualização de proteinas em cérebros de doentes de Alzheimer, tal como descrito por, e.g., Herholz K et al., Mol Imaging Biol., 6(4):239-69 (2004); Nordberg A, Lancet Neurol., 3(9):519-27 (2004); Neuropsychol Rev., Zakzanis KK et al., 13(1):1-18 (2003); Kung MP et al, Brain Res., 1025(1-2):98-105 (2004); e

Herholz K, Ann Nucl Med., 17(2):79-89 (2003). São também úteis anticorpos e sondas de ácido nucleico.

Os genes com expressão diferencial aqui revelados ou os péptidos ou seus fragmentos por eles codificados, podem usar-se no contexto de aplicações de imagem por PET e SPECT. Após modificação com residuos traçadores apropriados para aplicações PET ou SPECT, podem usar-se moléculas que interagem ou que se ligam a marcadores de ácido nucleico ou a quaisquer polipéptidos codificados por esses produtos de transcrição para visualizar os padrões de expressão génica e facilitar diagnóstico e prognóstico tal como aqui descrito. De igual modo, se os polipéptidos codificados codificarem enzimas, podem usar-se moléculas marcadas que interagem com os produtos de catálise pela enzima para as aplicações de imagem in vivo e de diagnóstico aqui descritas. 37 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ

COMPOSIÇÕES Ε KITS 0 invento proporciona composições e kits para levar à prática os ensaios aqui descritos usando anticorpos especificos para os polipéptidos ou ácidos nucleicos específicos para os polinucleótidos do invento.

Os kits para levar à prática os ensaios de diagnóstico do invento incluem tipicamente, em recipientes adequados, uma sonda que compreende um anticorpo ou sequência de ácido nucleico que se liga especificamente aos polipéptidos ou polinucleótidos marcadores do invento e um marcador para detectar a presença da sonda. Os kits podem incluir vários anticorpos ou sequências de polinucleótido que codificam polipéptidos do invento, e.g., anticorpos que reconhecem NC0A3, Wnt-2, osteopontina (SPP1), ARPC2, RGS1 e Fibronectina 1.

Os recipientes dos kits incluirão geralmente pelo menos um frasquinho, tubo de ensaio, frasco, garrafa, seringa e/ou outro recipiente no qual se pode colocar e/ou aliquotar adequadamente um primeiro anticorpo específico para um dos polipéptidos ou um primeiro ácido nucleico específico para um dos polinucleótidos do presente invento. Quando se proporciona um segundo componente e/ou um terceiro componente e/ou um componente adicional, o kit também conterá geralmente um segundo recipiente e/ou um terceiro recipiente e/ou outro recipiente adicional dentro do qual se possa colocar este componente. Alternativamente, um recipiente pode conter uma mistura de mais de um reagente de anticorpo ou de ácido nucleico, ligando cada reagente especificamente um marcador diferente de acordo com o presente invento. Os kits do presente invento também incluirão tipicamente meios para conter as sondas de anticorpo ou ácido nucleico num recipiente confinado para venda comercial. Tais recipientes podem incluir recipientes de plástico de injecção e/ou moldado por injecção de sopro nos quais estão contidos os frasquinhos pretendidos.

Os kits podem compreender adicionalmente controlos positivos e negativos, assim como instruções para o uso dos componentes do kit neles contidos de acordo com os métodos do presente invento. 38 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ

EXEMPLOS

Apresentam-se os exemplos seguintes para ilustrar o invento, não o limitando. EXEMPLO 1: Correlação entre a sobrexpressão de NC0A3 e o resultado do melanoma

Avaliou-se a expressão de NC0A3 usando análise de imuno-histoquímica de uma micromatriz de tecido de melanoma (TMA) contendo melanomas primários de 343 doentes com histologia definida e seguimento. Avaliou-se o impacto da presença ou ausência de vários factores de prognóstico na sobrevivência livre de recidiva (RFS) e na sobrevivência especifica de doença (DSS) em doentes de melanoma usando regressão de Cox e análise Kaplan-Meier. Avaliou-se o impacto da presença ou ausência de vários factores na metástase do gânglio linfático sentinela (SLN) usando análise de regressão logística.

Tal como demonstrado pelos nossos resultados seguidamente apresentados, o aumento do grau de expressão de NC0A3 foi uma previsão significativa de metástase de SLN (P=0,013) e do número médio de metástases SLN (P=0,031). A análise de Kaplan-Meier demonstrou uma associação significativa entre a sobrexpressão de NC0A3 e diminuição de RFS (P=0,021) e DSS (P=0,030) . A análise de regressão logística revelou que um grau aumentado de expressão de NCOA3 é um previsor independente do estado de SLN (P=0,017). A análise multivariada por regressão de Cox mostrou o impacto independente da expressão de NCOA3 em RFS (P=0,0095) e DSS (P=0,021). O NCOA3 foi o factor mais poderoso de previsão de DSS, ultrapassando a espessura do tumor e a ulceração. Assim, estes resultados identificam NCOA3 como um marcador novo e independente de resultado de melanoma com um impacto significativo em metástase de SLN, RFS e DSS.

Caracterização e construção de TMA de melanoma

Construímos uma TMA de 343 melanomas primários com pelo menos dois anos de seguimento, recidiva documentada ou que foram submetidos a biópsia de SLN. A análise demográfica do 39 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ grupo é apresentada na tabela 1. Dos 343 doentes, 259 tinham sido submetidos a biópsia de SLN, proporcionando assim informação relativamente ao estado do SLN. Os critérios para ser submetido a biópsia do SLN incluem os seguintes: melanoma com espessura h 1,0 mm ou presença de qualquer dos seguintes factores histológicos em melanomas com espessura inferior a 1,0 mm: Clark no nivel IV ou V, ulceração, envolvimento vascular, microssatélites, regressão extensiva (cobertura superior a 50% do diâmetro do tumor) ou biópsia inadequada (biópsia parcial apresentando melanoma cortado transversalmente na base). O seguimento médio deste grupo foi de 4 9 meses, com uma mediana de seguimento de 45 meses. Construíram-se as TMA tal como anteriormente descrito retirando do bloco de parafina núcleos de tecido de 1,0 mm de diâmetro (consultar Kashani-Sabet M. et al., J Clin Oncol, 22:617-623, 2004; Kononen J. et al., Nat Med 4: 844-847, 1998.

Tabela 1: Resumo da demografia dos doentes Número (%, caso aplicável) 53 227 (66,2)

Variável demográfica Idade (mediana) Género masculino Localização anatómica

Cabeça e 60 (17,5) pescoço

Tronco 137 (39,9)

Extremidade 146 (42,6)

Tipo histológico de tumor 159 (46, 4) 121 (35,3) 19 (5,5) 11 (3,2) 9 (2,6) 24 (7,0) 22 (6,4) 110 (32,1) 97 (28,3) 114 (33,2)

Melanoma de espalhamento superficial Melanoma nodular Melanoma acral Melanoma lentigo maligno Melanoma desmoplásico Melanoma sem outra classificação Espessura do tumor TI (< 1,0 mm) T2 (1,01-2,0 mm) T3 (2,01-4,0 mm) T4 (> 4,0 mm) 40 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ

Imuno-histoquímica

Eliminou-se a parafina das lâminas e re-hidratou-se em xileno, seguido de microondas em tampão citrato 10 mM. Bloqueou-se a actividade de peroxidase endógena com peróxido de hidrogénio a 3% e incubaram-se as lâminas sequencialmente com reagentes de bloqueio avidina e biotina. Adicionou-se então o anticorpo primário, IgG anti-NCOA3 monoclonal de ratinho (Abcam n° abl4139) a uma diluição 1:10 e incubou-se durante 60 min à temperatura ambiente. Utilizou-se anticorpo IgG de cavalo anti-ratinho biotinilado (Vector Laboratories, Burlingame, CA) como anticorpo secundário para amplificação, seguido de incubação com ABC-HRP (Vector Laboratories) durante 30 min e DAB/solução de peróxido de hidrogénio (Sigma).

Avaliação da coloração imuno-histoquimica

Pontuaram-se as regiões de coloração mais intensa para cada núcleo de matriz de tecido. Graduou-se a expressão da proteina NC0A3 usando a seguintes escala: sem coloração (0), coloração fraca (1), coloração moderada (2) e coloração intensa (3) . As matrizes foram pontuadas por um patologista que desconhecia a identidade dos casos e replicou-se cada pontuação por um ensaio independente pontuado separadamente. Determinou-se uma pontuação consensual para os poucos casos de pontuação discrepante ao longo dos ensaios em replicado. Os controlos de especificidade para coloração para NCOA3 incluiram tumor de mama, linhas celulares de melanoma (LOX e FEM) e secções de tecido de melanoma. Os controlos positivos incluiram secções de tumor de mama assim como células LOX e FEM, enquanto os controlos negativos incluiram tecido de amígdalas e a linha celular de carcinoma de mama T47D. O controlo negativo usado para imuno-histoquimica incluiu o uso de soro fisiológico tamponado de fosfato em vez de anticorpo primário, mantendo-se constantes todas as outras constantes experimentais.

Análise estatística

Descreveram-se anteriormente os métodos estatísticos utilizados para avaliar a significância dos diferentes factores de prognóstico sobre o resultado de melanoma. 41 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ (consultar Kashani-Sabet Μ. et al., J Clin Oncol, 22:617-623, 2004; Kashani-Sabet M. et al., J Clin Oncol, 20:1826-1831, 2002; Kashani-Sabet, M. et al., Arch Dermatol. 137:1169-1173, 2001. Tanto para RFS como para DSS, a definição de pontuações NCOA3 elevadas (definidas como uma pontuação de 2 ou 3) foi originalmente seleccionada com base nos melhores valores limiar para um valor de previsão para DSS em análise de Kaplan-Meier e utilizaram-se os mesmos valores de limiar de forma uniforme e consistente em todas as análises univariadas e multivariadas subsequentes de RFS e DSS. Avaliou-se a associação entre expressão elevada de NCOA3 e RFS ou DSS usando o teste exacto de Fisher e análise tanto univariada como multivariada por regressão de Cox. Para o estado do SLN, determinaram-se os melhores valores de limiar como uma pontuação de 0 relativamente a 1 ou 2 relativamente a 3 com base nos resultados de análise de regressão logística univariada e usaram-se os mesmos limiares de forma uniforme e consistente para todas as análises subsequentes para análise do estado do SLN. Avaliou-se a associação entre o aumento da expressão de NCOA3 e a metástase de SLN utilizando análise de qui-quadrado e regressão logística tanto univariada como multivariada. Avaliou-se a associação entre o aumento da expressão de NCOA3 e a contagem média de SLN usando análise de variância (ANOVA) e o teste direccional Le. Com excepção desta análise direccional, todos os valores de P reportados são de dois braços. Além dos factores de prognóstico analisados pela AJCC, incluíram-se os seguintes factores no conjunto de dados: taxa mitótica, vascularização do tumor, presença ou ausência de microssatélites, envolvimento vascular e regressão. Efectuou-se a codificação para atributos clínicos ou patológicos tal como anteriormente descrito (consultar Kashani-Sabet M. et al., J Clin Oncol, 22:617-623, 2004).

Resultados

Devido aos nossos resultados em micromatriz de ADNc que sugerem expressão diferencial do gene NCOA3 em melanomas metastáticos comparativamente com tumores primários não relacionados, tivemos como objectivo analisar o impacto prognóstico da expressão de NCOA3 ao nível de proteína numa TMA contendo 343 núcleos de melanomas primários. Analisou-se a expressão de NCOA3 usando um anticorpo monoclonal disponível 42 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ comercialmente dirigido a NC0A3 humano (IgG monoclonal de ratinho anti-NC0A3 (Abcam n° abl4139)) e foi pontuado por um observador sem conhecimento dos resultados dos doentes. A expressão de NC0A3 estava ausente em 20 (8%, figura IA) e era intensa (pontuação 3) em 111 (32,4%, figura 1B) dos 343 núcleos analisados. A expressão de NCOA3 não se correlacionou significativamente com o subtipo histológico do melanoma (dados não apresentados) com a possivel excepção de melanomas desmoplásicos nos quais apenas um tumor primário apresentou coloração intensa. Além disso, a expressão de NCOA3 não se correlacionou com vários factores de prognóstico histológicos conhecidos para melanoma tal como espessura do tumor, ulceração, nivel de Clark, taxa mitótica, envolvimento vascular, microssatélites ou vascularização do tumor (dados não apresentados).

Primeiramente analisámos a associação entre expressão de NC0A3 e resultado de melanoma por análise univariada. A expressão elevada de NC0A3 (definida com uma pontuação 2 ou 3) aumentou significativamente o risco de recidiva de melanoma (52,2% relativamente a 35,9%, P=0,010, teste exacto de Fisher) e reduziu a RFS de doentes de melanoma neste grupo quando analisado por análise de Kaplan-Meier (P=0,021, teste de Log-Rank, figura 2A). A expressão elevada de NCOA3 foi associada a aumento do risco de morte devido a melanoma (31,9% relativamente a 18,5%, P=0,021, teste exacto de Fisher) e redução da DSS por análise de Kaplan-Meier (P= 0,030, teste de Log-Rank, figura 2B).

Além do risco de recidiva e morte, o aumento da expressão de NCOA3 correlacionou significativamente com estado positivo de SNL, uma medida de micrometástases na bacia ganglionar regional por análise de regressão logistica (P = 0,013). Os doentes com uma pontuação de coloração de NCOA3 de 0 tinham uma prevalência de 7,1% de positivos para SNL, que aumentou para 27,4% em doentes com uma pontuação de 1 ou 2 e 38,3% em doentes com uma pontuação de 3 (P=0,036, teste de Qui-quadrado). Estranhamente, o nivel de expressão de NCOA3 também se correlacionou com a carga de tumor SLN tal como medida pelo número médio de SLN envolvidos. Assim, em doentes com uma pontuação de coloração NCOA3 de 0, o número médio de gânglios 43 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ envolvidos foi 0,07. Estes aumentaram para 0,47 gânglios em doentes com uma pontuação de 1 ou 2 e 0,57 gânglios em doentes com uma pontuação de 3 (P = 0, 0004 ANOVA, P = 0,030 teste Le direccional).

Seguidamente analisámos o impacto da expressão de NCOA3 no resultado de melanoma por análise multivariada. Efectuou-se análise multivariada por regressão de Cox incluindo o estado NCOA3 e seis factores de prognóstico clínicos e histológicos avaliados pelo comité de definição de estágios de melanoma AJCC, incluindo espessura do tumor e ulceração, que são os factores actualmente usados na classificação de estágios da AJCC para melanoma cutâneo (consultar Balch C.M et al., J Clin Oncol, 19:3622-3634, 2001; Balch C.M et al., J Clin Oncol, 19:3635-3648, 2001). Esta análise revelou que o estágio NCOA3 era um factor de previsão independente tanto de RFS (tabela 2) como de DSS (tabela 3) . Na análise por regressão de Cox de DSS, o NC0A3 provou ser o factor mais poderoso na determinação da sobrevivência ultrapassando tanto a espessura do tumor como a ulceração. Subsequentemente, a análise de regressão logística multivariada demonstrou que a expressão de NCOA3 era um previsor independente do estado de SLN quando se incluíam no modelo os outros seis factores de prognóstico (tabela 4).

Finalmente pretendemos avaliar o valor de previsão de vários factores de prognóstico quando todos os 12 factores incluídos no conjunto de dados (e disponíveis para análise) eram integrados nos modelos multivariados. Além dos sete factores anteriormente mencionados esta análise incluiu a taxa mitótica, o grau de vascularização do tumor, assim como a presença ou ausência de envolvimento vascular, microssatélites e regressão. A sobrexpressão de NCOA3 permaneceu com capacidade de previsão significativa para os estados DSS e SLN (dados não apresentados), quando se incluíram todos os 12 factores nos modelos multivariados. 44 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ

Tabela 2. Análise por regressão de Cox do impacto de factores clínicos, histológicos e moleculares na RFS do grupo de melanoma

Factor de prognóstico Razão de Qui- Valor de P risco quadrado (dois braços) Nível de Clark 2,22 16, 77 < 0,00005 Ulceração 1, 94 13,86 0,0002 Nível de NCOA3 (2,3 relativamente a 0,1) 1, 69 6, 72 0,0095 Espessura do tumor 1,27 5,28 0,022 Local 1,39 3, 61 0,057 Idade 1,03 0,22 0, 64 Sexo 1,04 0,04 0,85 Tabela 3. Análise por regressão de Cox do impacto de factores clínicos, histológicos e moleculares na DSS do grupo de melanoma Factor de prognóstico Razão de Qui- Valor de P risco quadrado (dois braços) Nível de NCOA3 (2,3 relativamente a 0,1) 1, 91 5,29 0,021 Espessura do tumor 1,34 4, 69 0,030 Ulceração 1,65 4,89 0,027 Nível de Clark 1,75 5, 00 0,025 Idade 1,09 1, 65 0,20 Local 1,41 2,27 0,13 Sexo 1,00 0,0002 0, 99 Tabela 4. Análise por regressão logística do impacto de factores clínicos, histológicos e moleculares na metástase do SLN Factor de prognóstico Qui- Valor de P quadrado (dois braços) Menor idade 12, 92 0,0003 Espessura do tumor 8,10 0,0044 Nível de Clark 5, 14 0,023 Expressão de NCOA3 (3 relativamente 5,70 0,017 a 1, 2 relativamente a 0) 45 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ

Factor de prognóstico Qui- Valor de P Sexo quadrado 1,43 (dois braços) 0,23 Ulceração 0,79 0,37 Local 0,09 0,76

Discussão

Estes resultados demonstram que a sobrexpressão de NC0A3 em melanoma cutâneo primário se correlaciona significativamente com a recidiva de melanoma e morte específica da doença. A expressão de NC0A3 teve um valor de previsão significativo de RFS e DSS deste grupo quando se incluiram nos modelos multivariados os seis factores de prognóstico analisados pelo comité de classificação de estágios da AJCC. É importante referir que a expressão de NC0A3 teve melhor desempenho que a espessura do tumor em cada uma destas análises e revelou ser o factor de previsão de DSS mais poderoso. Desde a publicação da classificação de estágios revista da AJCC para melanoma (consultar Balch C.M et al., J Clin Oncol, 19:3635-3648, 2001), demonstrou-se que apenas alguns factores moleculares de prognóstico têm significância de prognóstico independente quando se incluem nos modelos multivariados os seis factores analisados pelo comité de classificação de estágios da AJCC, o que sublinha o significado potencial das revelações que correlacionam expressão de NCOA3 e resultado associado a melanoma.

Além disso, o estado de NCOA3 continuou a proporcionar informação independente de prognóstico relativamente aos estados de DSS e SLN quando se incluíam no modelo todos os 12 factores de prognóstico disponíveis. Esta análise incluiu factores tais como taxa mitótica e envolvimento vascular, que se provaram em várias análises ser mais poderosos que a ulceração (consultar Kashani-Sabet M. et al., J Clin Oncol, 20:1826-1831, 2002; Azzola M.F. et al., Câncer, 97:1488-1498, 2003. Tomados conjuntamente, estes resultados demonstram a utilidade de NCOA3 como um marcador molecular de resultado de melanoma, novo e independente, com um impacto significativo em medidas importantes de resultado para melanoma. 46 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ

Curiosamente, as metástases analisadas no estudo do perfil de expressão génica e que sobrexpressaram NC0A3 foram principalmente metástases de gânglio linfático primário, indicando a potencial importância da expressão de NC0A3 para a metástase de gânglio linfático em melanoma. A elevada expressão de NC0A3 correlacionou com um aumento significativo do risco de metástase do SLN. A observação que a expressão elevada de NC0A3 foi raramente verificada no pequeno subgrupo de melanomas desmoplásicos incluídos nesta análise foi consistente com a forte correlação entre expressão de NC0A3 e estado SLN. Também efectuamos imuno-histoquimica num doente com melanoma desmoplásico com biópsia positiva para gânglio sentinela. A análise demonstra resultados positivos tanto no tumor primário como na metástase de gânglio linfático (figura 3). Tal sugere a utilidade da imunocoloração de NC0A3 na identificação de casos de melanoma desmoplásico que sofrem metástase de gânglio linfático sentinela.

Dada a predominância de doentes submetidos a biópsia de SLN neste conjunto de dados, é possível que alguns dos resultados aqui relatados possam ter sido mudados por desvios de selecção. Ainda existe controvérsia relativamente à selecção de doentes a submeter a biópsia de SLN num conjunto de tumores finos (< 1,0 mm) e espessos (> 4,0 mm) e subtipos histológicos específicos, tais como melanoma desmoplásico. Assim, os critérios de selecção usados para recomendar biópsia de SLN podem ter influenciado os dados relatados para o resultado. Consequentemente, a significância da sobrexpressão de NCOA3 pode ser mais relevante para doentes submetidos a biópsia de SLN.

Finalmente, estes resultados revelam a significância de base alargada que NCOA3 tem como um marcador de prognóstico em cancro dada a sua importância em malignidades sensíveis a hormona e independentes de hormona.

Em conclusão, os nossos resultados mostram uma correlação significativa entre sobrexpressão de NCOA3 e aumento do risco de recidiva e sobrevivência reduzida relacionada com melanoma. Além disso, os nossos resultados revelam que a expressão de 47 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ NC0A3 é um previsor independente para várias medidas de resultado de melanoma incluindo DSS, RFS e estado SLN, revelando que NC0A3 é um novo marcador prognóstico para melanoma cutâneo primário. EXEMPLO 2: A inibição de NC0A3 suprime progressão metastática de melanoma em modelos murinos

Este exemplo mostra que a expressão do gene NC0A3 é importante para manutenção do fenótipo metastático em melanoma. Utilizamos ribozimas não viricas sistémicas (Kashani-Sabet, 2002) e entrega génica baseada em ARNsi de modo a ter como alvo o gene NCOA3. Clonaram-se no nosso plasmideo de expressão ribozimas de cabeça de martelo e ARNsi que tinham como alvo NCOA3 murina e trataram-se ratinhos com tumor com vectores de controlo ou de supressão de NCOA3 aos dias 3 e 10 após inoculação de células de tumor. A análise da carga de tumores metastáticos no pulmão (tal como evidenciado pelo número de tumores de pulmão) mostrou uma diminuição significativa nos animais tratados quer com a ribozima anti-NCOA3 quer com ARNsi relativamente a vector de controlo (figura 4) . A análise dos pesos dos pulmões, outra medida da carga de tumores metastáticos, revelou Rz397 como sendo a única construção que suprimia significativamente os pesos dos pulmões em ratinhos C57B1/6 (figura 5). Estes estudos demonstram claramente a utilidade do perfil de expressão génica para a identificação de marcadores funcionais e moleculares da progressão de melanoma. Além disso, estes estudos indicam que os marcadores identificados por análises de micromatrizes de ADNc podem representar alvos para terapia de melanoma metastático.

Curiosamente, a administração sistémica do nucleótido 397 direccionado de ribozima anti-NCOA3 também suprimiu a progressão metastática de células de carcinoma de mama murino 4T1 em ratinhos BALB/c (figura 6) . No modelo 4T1, a ribozima foi superior nos seus efeitos anti-tumor comparativamente com o direccionamento de ARNsi da mesma região de NCOA3, assim como com o controlo de vector e mutante e os controlos de ribozima desactivada e de ARNsi. Estes resultados sugerem a potencial utilidade terapêutica de ter como alvo NCOA3 na terapia de cancro de mama metastático assim como de melanoma. 48 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ

Finalmente, a transfecção transitória de Rz397 ou SÍARN385 para células de melanoma B16 in vitro reduziu a invasão de células tumorais no matrigel, sugerindo um mecanismo potencial pelo qual ter como alvo NC0A3 suprime metástase de tumor (figura 7). EXEMPLO 3: Expressão diferencial de Wnt-2 na progressão de melanoma

Efectuamos análise imuno-histoquímica de expressão de WNT-2 num conjunto de ensaio de micromatriz de tecido de 40 nevos benignos e 376 melanomas primários e um conjunto de validação de 34 secções de tecido de melanoma primário ocorrente em associação com um nevo. Os nevos benignos mostraram coloração forte para Wnt-2 na zona de junção do nevo, com perda de expressão quase universal na base do nevo. Contrariamente, os melanomas primários apresentaram um padrão de expressão mais uniforme, sem variação aparente da coloração ao longo da fase de crescimento vertical. A imuno-coloração com Wnt-2 na base de melanomas primários foi significativamente maior do que na base de nevos. A análise de amostras emparelhadas da expressão de Wnt-2 de melanoma ocorrente em associação com um nevo mostrou que a coloração com Wnt-2 na zona de junção do nevo foi significativamente maior em todos os casos comparativamente com a base do mesmo nevo. Além disso, a pontuação de Wnt-2 para os melanomas primários foi significativamente maior em todos os casos comparativamente com os seus respectivos controlos na base do nevo. Estes resultados apresentados seguidamente validam a importância da activação da via WNT na progressão de melanoma e revelam Wnt-2 como um novo biomarcador para melanoma.

Selecção de nevos e melanomas para incorporação em conjuntos de dados

Construíram-se dois conjuntos de dados para a análise efectuada neste estudo: (i) um conjunto de ensaio que consiste de uma micromatriz de tecido de 138 nevos benignos e 37 6 melanomas primários e (ii) um conjunto de validação de 34 secções de tecido de melanoma primário ocorrente num nevo. Dos 138 nevos incluídos nas matrizes de nevo, 40 tinham uma parte 49 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ da epiderme incluída no núcleo para permitir a análise rigorosa de coloração Wnt-2 na zona de junção do nevo relativamente à base do nevo. A composição dos 40 nevos nas micromatrizes estudadas foi a seguinte: 5 nevos compostos adquiridos, 9 nevos compostos congénitos, 7 nevos intradérmicos adquiridos, 17 nevos intradérmicos congénitos, 1 nevo displásico adquirido e 1 nevo de junção. Os subtipos histológicos do melanoma primário incluído nas micromatrizes de melanoma são os seguintes: 176 melanomas de espalhamento superficiais, 132 melanomas nodulares, 14 melanomas lêntigos malignos, 22 melanomas acrais, 10 melanomas desmoplásicos e 22 melanomas sem outra classificação. No conjunto de validação, criámos secções de tecidos de 34 casos de melanoma primário ocorrente num nevo. Dos 34 casos, 28 tinham nevo com componentes de junção e dérmica, enquanto 31 tinham nevo dérmico e melanoma invasivo. Seguidamente apresenta-se a classificação de subtipo histológico para nevo e melanoma: 22 nevos congénitos, 8 nevos adquiridos, 1 nevo displásico, 19 melanomas de espalhamento superficial, 7 melanomas nodulares e 5 melanomas sem outra classificação.

Matrizes de tecido

Criaram-se micromatrizes de tecido tal como descrito anteriormente por remoção de núcleos de tecido de 1,0 mm de diâmetro utilizando um instrumento de criação de matrizes Beecher (consultar Kononen, J. et al., Nat Med, 1998, 4: 844-847; Kashani-Sabet M. et al., J Clin Oncol, 2004, 22: 617-623) . Após construção do bloco, cortaram-se secções de 5 ym utilizando um micrótomo de tecidos e colocaram-se em lâminas carregadas. Preparou-se um total de 16 matrizes de melanoma e um total de 4 matrizes de nevo com uma média de aproximadamente 40 tecidos por matriz. As matrizes de melanoma incluíram um total de 673 núcleos de tecido (457 melanomas primários com núcleos em duplicado de 150 doentes). As matrizes de nevo incluíram um total de 138 núcleos de tecido. Dos 457 melanomas primários da micromatriz de tecidos, 376 foram interpretáveis para coloração com Wnt-2. 50 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ

Imuno-histoquímica

Sujeitaram-se as lâminas a aquecimento a 60 °C durante 30 min antes da coloração e desparafinizaram-se e re-hidrataram-se por enxaguamento com xileno. Sujeitaram-se então as lâminas a microondas em tampão de citrato 10 mM. Bloqueou-se a actividade de peroxidase endógena com peróxido de hidrogénio a 3%. Após lavagem com PBS, incubaram-se as lâminas à temperatura ambiente durante 30 min com soro de coelho normal para reduzir a linha de base de coloração não específica e seguidamente lavaram-se com PBS. Adicionou-se então o anticorpo primário, IgG de cabra policlonal anti-Wnt-2 (Biovision) a uma diluição 1:5 e incubou-se durante a noite a 4 °C. Utilizou-se um anticorpo IgG de cabra anti-coelho biotinilado (Vector Laboratories, Burlingame, CA) como anticorpo secundário para amplificação, seguido por incubação com ABC-HRP (Vector Laboratories) durante 30 min e solução de DAB/peróxido de hidrogénio (Sigma). Contra-coraram-se as lâminas com hematoxilina e montaram-se com "permount".

Utilizou-se o mesmo protocolo de coloração imuno-histoquímica Wnt-2 para lâminas de matriz de tecido e para secções de rotina.

Avaliação da coloração imuno-histoguimica

Pontuaram-se as regiões com coloração mais intensa para cada núcleo de matriz de tecido e secção de tecido. A expressão de proteína Wnt-2 foi pontuada utilizando a seguinte escala: sem coloração (0), coloração fraca (1 + ) , coloração moderada (2+) e coloração intensa (3+). Excluíram-se da análise os espécimes sem melanoma invasivo ou nevo ou espécimes que não foram interpretáveis. As matrizes e secções foram pontuadas por um patologista que desconhecia a identidade dos casos com duas pontuações independentes e uma pontuação consensual determinada para pontuações discrepantes. Os controlos de especificidade para coloração Wnt-2 incluíram tumor da mama, linhas celulares de melanoma (LOX e FEM) e secções de tecido de melanoma. 51 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ

Análise estatística

Os métodos estatísticos utilizados para avaliar a significância de vários factores de prognóstico nos resultados associados com melanoma são os seguintes: nas micromatrizes de tecidos testou-se a diferença potencial entre imuno-coloração Wnt-2 na zona de junção do nevo e na base do nevo utilizando o teste de sinal binomial e o teste de Wilcoxon de sinal para amostras emparelhadas. A diferença potencial entre imuno-coloração Wnt-2 na base do nevo e na base do melanoma foi ensaiada utilizando o teste de Mann-Whitney. Nas secções de tecido de melanoma primário ocorrente num nevo, a diferença potencial entre imuno-coloração Wnt-2 na zona de junção do nevo e na base do nevo foi testada utilizando o teste de sinal binomial e teste de Wilcoxon de sinal para amostras emparelhadas. A diferença potencial entre imuno-coloração Wnt-2 na base do nevo e na base do melanoma foi testada utilizando o teste de sinal binomial e teste de Wilcoxon de sinal para amostras emparelhadas. Todos os valores de P apresentados são de dois braços.

Resultados

Devido aos nossos resultados de micromatriz de ADNc que mostram expressão diferencial da via Wnt em melanomas comparativamente com nevos, tivemos como objectivo sondar a expressão diferencial de Wnt-2 num conjunto maior e independente de neoplasias melanocíticas. Para tal fim, construímos um conjunto de ensaio contendo micromatrizes de tecidos com 138 nevos melanocíticos e 376 melanomas primários e um conjunto de validação de 34 secções de tecido contendo melanomas primários com um nevo pré-existente. Analisou-se a expressão de Wnt-2 utilizando um anticorpo monoclonal disponível comercialmente que tem como alvo Wnt-2 humana. No processo de optimizar a coloração imuno-histoquímica para Wnt-2, verificámos um padrão de coloração curioso para Wnt-2 em nevos benignos. Os nevos benignos apresentaram uma coloração forte para Wnt-2 na zona de junção do nevo, com perda de expressão quase universal na base do nevo (figura 8).

Em consequência de tal observação, restringimos a nossa análise de expressão de Wnt-2 nas micromatrizes de tecidos de 52 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ nevo aos núcleos de nevos que continham uma parte da epiderme, de modo a ser possível tal comparação da imuno-coloração entre a zona de junção do nevo e a base do nevo. Tal reduziu o conjunto de matriz de nevos efectivos a 40 casos. Em cada um dos 40 casos analisados, a imuno-coloração Wnt-2 foi mais elevada na zona de junção do nevo, comparativamente à sua base correspondente, uma observação que foi altamente significativa (P < 0,00005, teste de sinal binomial). A perda de imuno-coloração Wnt-2 na base do nevo foi ainda significativa quando se divide em subtipos de nevos para os subtipos histológicos mais comuns de nevos presentes nas matrizes, nomeadamente nevos intradérmicos e nevos compostos melanocíticos (P < 0,001, teste de sinal binomial).

Seguidamente analisámos a imuno-coloração Wnt-2 numa matriz de tecidos contendo 376 núcleos de melanomas primários. Contrariamente aos nevos, os melanomas primários mostraram um padrão de coloração mais uniforme, sem qualquer diminuição da coloração ao longo da fase de crescimento vertical (figura 9). A grande maioria de melanomas primários analisados mostrou alguma expressão de Wnt-2, sem coloração apenas em 8 casos (3,8 %) . Além disso, a intensidade da expressão de Wnt-2 estava presente uniformemente ao longo dos diferentes subtipos histológicos de melanoma (tabela 5). Não havia qualquer correlação significativa entre a expressão de Wnt-2 e vários marcadores de prognóstico para melanoma bem conhecidos, incluindo espessura do tumor, nível de Clark, ulceração, taxa mitótica, microssatélites e envolvimento vascular (dados não apresentados).

Tabela 5, Grau de expressão de Wnt-2 ao longo de diferentes subtipos histológicos de melanomas primários

Subtipo histológico Número de casos (%)

SSM

NM

LMM

Pontuação Wnt-2 0 1 2 3 7/176 45/176 92/176 32/176 (4,0) (25,6) (52,3) (18,2) 5/132 28/132 60/132 39/132 (3,8) (21,2) (45,5) (29,5) 0/14 5/14 (35,7) 7/14 (50) 2/14 (14,3) 53 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ

Subtipo histológico Pontuação Wnt-2 Número de casos (%) 0 1 2 3 AM 1/22 (4,5) 7/22 (31, 8) 11/22 (50) 3/22 (13,6) DM 0/10 5/10 (50) 3/10 (30) 2/10 (20) NOC 1/22 (4,5) 10/22 (45,5 ) 8/22 (36,4) 3/22 (13,6) Abreviaturas : SSM, melanoma de espalhamento superficial; NM, melanoma nodular; LMM, melanoma lêntigo maligno ; AM, melanoma acral; DM, melanoma desmoplásico; NOC, melanoma sem outra classificação.

Seguidamente comparámos a imuno-coloração Wnt-2 nos melanomas primários com a verificada nos nevos. Dado o padrão de expressão de Wnt-2 nos nevos, comparámos a pontuação Wnt-2 da base do nevo com a verificada na base do melanoma. A pontuação média na base dos melanomas (1,88) foi significativamente superior à pontuação média na base dos nevos (0,57, P< 0,00005, teste T não emparelhado).

De modo a analisar adicionalmente a expressão diferencial de Wnt-2 entre nevos e melanomas primários observada nas micromatrizes de tecidos, pensámos que um conjunto ideal para avaliar as diferenças potenciais eram casos de melanoma com nevos pré-existentes, para os quais muitos factores de potencial confusão (idade, sexo, localização anatómica e subtipos histológicos de nevo e melanoma potencialmente irrelevantes, entre outros) são controlados automaticamente, criando assim uma análise verdadeiramente de amostras emparelhadas. Assim recolhemos um conjunto de validação de 34 casos de melanoma primário em associação com um nevo e efectuámos coloração imuno-histoquimica de Wnt-2 em secções de tecido de 5 μΜ.

Inicialmente, analisámos a expressão de Wnt-2 na zona de junção do nevo relativamente à base do nevo. Dos 34 casos, 28 tinham tanto zona de junção, como base do nevo presentes na secção. Em cada um dos 28 casos, a imuno-coloração Wnt-2 na zona de junção do nevo foi superior à sua base correspondente, 54 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ uma observação que foi altamente significativa (P < 0,00005, ensaio de sinal binomial e teste de Wilcoxon de sinal para amostras emparelhadas). A diminuição drástica da expressão de Wnt-2 na base do nevo foi corroborada por análise da percentagem de caso com pontuações Wnt-2 elevadas comparativamente a baixas. Assim, 90,6% das zonas de junção tinham pontuações de 2 ou 3, enquanto 94,1 % das bases de nevo tinham pontuações de 0 ou 1 (tabela 6) . Curiosamente, não existia ausência de coloração (pontuação de 0) na zona de junção de qualquer nevo e nenhuma coloração intensa (pontuação de 3) na base dos nevos analisados, ilustrando adicionalmente esta dicotomia.

Tabela 6, Grau de imuno-coloração Wnt-2 na zona de junção do nevo relativamente à base do nevo

Pontuação Wnt- Zona de junção do nevo Base do 2 nevo (% casos que expressam na pontuação) 0/1 + 2/3 + 94,1% 5, 9% 9, 4% 90, 6%

Finalmente, comparámos o padrão de expressão de Wnt-2 na base do melanoma com o da base do seu nevo associado nos espécimes corados. Dos 34 casos, 31 tinham para comparação tanto base do nevo, como base do melanoma. Em 29 casos, a imuno-coloração Wnt-2 foi significativamente maior na base do melanoma comparativamente com a sua respectiva base do nevo (tal como apresentado na figura 11), com dois casos apresentando pontuações Wnt-2 idênticas (P < 0,00005, teste de sinal binomial e teste de Wilcoxon de sinal para amostras emparelhadas) . Em nenhum caso a expressão Wnt-2 foi superior na base do nevo comparativamente com o melanoma. Uma vez mais, este fenómeno reflectiu-se na intensidade da coloração Wnt-2 nos nevos e melanomas. Assim, 100% dos melanomas tinham uma pontuação Wnt-2 maior do que 0, comparativamente a 32,4% dos nevos (tabela 7). Nenhum dos melanomas tinha ausência de expressão de Wnt-2 (pontuação de 0) e nenhum dos nevos apresentou coloração intensa (pontuação de 3) na sua base. 55 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ

Tabela 7. Imuno-coloração relativamente a base do nevo Wnt-2 na base de melanoma Pontuação Wnt-2 Base de Base do melanoma nevo 0 (% de casos que expressam a pontuação) 0% 67, 6% >0 (% de casos que expressam a pontuação) 100% 32,4%

Também efectuámos imuno-coloração Wnt-2 em três conjuntos adicionais, (i) nevos displásicos, (ii) nevos de Spitz e (iii) neoplasias melanociticas mal diagnosticadas. Δ nossa análise revelou que a expressão diferencial de Wnt-2 verificada no conjunto de nevos pode se alargar especificamente a nevos displásicos (p <0,05) e nevos de Spitz (p =0,004), subtipos de nevos que são notoriamente difíceis de distinguir de melanoma ao nível histopatológico. Em cada um destes casos, a imuno-coloração Wnt-2 foi maior na zona de junção do nevo do que na base do nevo, observações que foram ambas estatisticamente significativas. Finalmente, analisámos 7 casos nos quais uma neoplasia melanocítica ambígua tinha sido mal diagnosticada com base na recidiva subsequente da doença (5 casos em que um diagnóstico de nevo estava incorrecto) ou em revisão da patologia por perito (2 casos em que um diagnóstico de melanoma foi invalidado). Em 6 dos 7 casos, o padrão de imuno-coloração Wnt-2 indicou um diagnóstico eventualmente correcto, incluindo todos os cinco casos inicialmente mal diagnosticados como nevos. Estes resultados mostram a capacidade da imuno-coloração Wnt-2 auxiliar no diagnóstico de neoplasias melanociticas ambíguas, dada a sua capacidade de diagnosticar correctamente 85,7% de tais casos.

Discussão

Neste estudo proporcionamos evidências convincentes da expressão diferencial de Wnt-2 ao nível de proteína na progressão de melanoma. Os nossos resultados demonstram claramente que Wnt-2 é expressa diferencialmente em melanomas comparativamente a nevos melanocíticos, tanto na análise de micromatriz de tecidos, como na análise de amostras emparelhadas, na qual cada melanoma foi emparelhado com o seu 56 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ nevo pré-existente. Nesta última análise, verificou-se que apenas os melanomas expressam altamente Wnt-2 na sua base e demonstrou-se que apenas os nevos não têm expressão de Wnt-2 na sua base.

Adicionalmente verificou-se um padrão interessante de expressão de Wnt-2 nos nevos melanociticos. Em todos os casos analisados, a expressão de Wnt-2 foi significativamente mais baixa na base do nevo do que na sua zona de junção. Além disso, a imuno-coloração Wnt-2 estava ausente na base de uma proporção significativa (55%) de nevos analisados ao longo tanto dos estudos de matriz, como da análise de melanoma ocorrente num nevo.

As diferenças significativas no padrão de coloração Wnt-2 em nevos relativamente a melanomas demonstra a utilidade de imuno-coloração Wnt-2 no diagnóstico molecular de neoplasias melanociticas ambiguas. Os resultados das matrizes de tecido de nevo e melanoma mostram uma especificidade de 98% para coloração Wnt-2 intensa no diagnóstico de melanoma, com uma especificidade de 70%. Os nossos dados distinguem entre nevos e melanomas com base no nivel de expressão de Wnt-2. As lesões melanociticas que coram intensamente (pontuação de 2 ou 3+) na sua base têm uma elevada probabilidade de serem melanomas (99,6%). As lesões que apresentam coloração fraca na sua base (pontuação de 0 ou 1) foram melanomas 30% das vezes, proporcionando a sensibilidade verificada. No entanto, estas lesões seriam então analisadas na sua zona de junção, com os nevos demonstrando diminuição de coloração nas partes mais profundas em virtualmente todos os casos, enquanto os melanomas demonstraram coloração uniforme entre as zonas de junção e mais profundas. Até à data, embora se tenham analisado marcadores de proliferação de células de tumor (tais como Ki-67; consultar Smolle, J. et al., Am J Dermatopathol, 1989, 11:301-307; Rieger, E. et al., J Cutan Pathol, 1993, 20:229-236; Kaleem, Z. et al., Mod Pathol, 2000, 13:217-222) para o seu papel neste dilema de diagnóstico diferencial, nenhum marcador mostrou apresentar uma forte diferença na expressão entre nevo e melanoma de modo a ser útil clinicamente. 57 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ A diminuição observada da imuno-coloração com Wnt-2 foi verificada com alguns outros marcadores, incluindo S100A6, Melan-A e HMB-45 (consultar Fullen, D.R. et al., J Cutan Pathol, 2001, 28:393-399; Busam, K.J. et al., Am J Surg Pathol, 1998, 22:976-982; Kucher, C. et al., Am J Dermatopathol, 2004, 26:452-457). No entanto, estes marcadores não são utilizados rotineiramente para distinguir entre nevos e melanomas primários. Além disso, em alguns destes estudos, os nevos intradérmicos foram o tipo dominante de nevos analisados. Sabe-se que os nevos intradérmicos sofrem maturação significativa na sua base. No nosso estudo, quando analisado pelo subtipo de nevo, ocorreu regulação negativa significativa de imuno-coloração Wnt-2 na base de nevos intradérmicos, nevos compostos (em geral), bem como nevos compostos adquiridos displásicos e nevos de Spitz, que pode não ter o mesmo padrão de maturação. Tal demonstra uma utilidade mais abrangente de Wnt-2 como um marcador de diagnóstico molecular para melanoma.

Os resultados de micromatriz de ADNc descritos neste invento também permitem a distinção entre marcadores de diagnóstico e de prognóstico em melanoma. A determinação do perfil de expressão génica revelou que a transição de nevo para melanoma primário, bem como a de melanoma primário para metastático, é caracterizada por assinaturas de expressão génica distintas (consultar Haqq C. et al., Proc Natl Acad Sei USA, 2005, 102: 6092-6097). Assim os marcadores que foram expressos diferencialmente na transição de nevo para melanoma podem ser mais úteis como marcadores de diagnóstico, enquanto os marcadores identificados na transição primário para metástases podem ser mais úteis como marcadores de prognóstico. Tal é corroborado pelos resultados de imuno-coloração Wnt-2 que sugerem a sua maior utilidade como marcador de diagnóstico relativamente a prognóstico. Embora exista uma diferença significativa na imuno-coloração Wnt-2 entre nevos e melanoma, não existe associação significativa entre a expressão de Wnt-2 e vários marcadores de prognóstico conhecidos para melanoma.

De modo a analisar o potencial beneficio terapêutico de ter como alvo Wnt-2 para progressão metastática, analisámos a eficácia anti-tumor de entrega sistémica de uma ribozima em 58 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ cabeça de martelo que tem como alvo Wnt-2 murina contra melanoma B16. Injectaram-se intravenosamente células B16 em ratinhos C57B1/6 e trataram-se os ratinhos com um vector vazio de controlo ou um vector de plasmideo que expressa a ribozima anti-Wnt-2, 7 dias após injecção das células de tumor. Avaliou-se a carga metastática pelo número de tumores de pulmão metastático após sacrifício. Tal como apresentado na figura 10, uma única injecção da construção que expressa ribozima anti-Wnt-2 resultou numa supressão significativa de tumores de pulmão grandes (> 2 mm) , dependentes de angiogénese. Estes estudos corroboram o papel de alvo de Wnt-2 na supressão de progressão metastática.

Conjuntamente, estes resultados mostram a importância de Wnt-2 na transformação de melanócitos. Enquanto a via de activação WNT parece ocorrer precocemente no desenvolvimento de melanoma, os dados tanto de estudos in vitro, como in vivo sugerem que a expressão de Wnt-2 é necessária para sobrevivência continuada e proliferação das células de melanoma. O alvo de Wnt-2 tanto baseado em anticorpo, como em ARNsi resultou na indução de apoptose de várias linhas celulares de melanoma in vitro e em supressão significativa do crescimento de xeno-enxertos in vivo. Os estudos preliminares obtidos no nosso laboratório também sugerem uma necessidade de expressão de Wnt-2 na progressão metastática de melanoma em modelos murinos (consultar a figura 10, anteriormente). Assim, estes resultados sugerem a potencial utilidade terapêutica de ter como alvo Wnt-2 como uma estratégia terapêutica racional para melanoma. E o ensaio de imuno-coloração aqui utilizado pode auxiliar na identificação de um conjunto de doentes elegíveis para uma abordagem terapêutica de alvo com inibidores específicos de Wnt-2.

Em conclusão, os nossos estudos demonstram a expressão diferencial da via WNT em melanomas relativamente a nevos, confirmando os resultados obtidos anteriormente do perfil de expressão génica de neoplasias melanocíticas. Além disso, confirmam a importância da activação de WNT-2 na progressão de melanoma. Finalmente, ensinam a utilidade de Wnt-2 como um novo biomarcador para melanoma e como um alvo potencial para terapia. 59 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ EXEMPLO 4: Papel de osteopontina em melanoma

Também analisamos o papel de prognóstico da expressão de osteopontina em melanoma. Avaliamos a imuno-coloração OPN numa micromatriz de tecidos contendo 350 espécimes de melanoma primário em fase de biópsia de gânglio linfático sentinela, com dois anos de seguimento ou com recidiva documentada. Registou-se a expressão de OPN como 0 (ausente), 1 (fraca), 2 (moderada) e 3 (intensa). Por análise univariada, o aumento da expressão de OPN correlaciona-se com um risco aumentado de metástases SLN (tal como determinado por regressão logística), bem como menor sobrevivência livre de recidiva (RFS) e sobrevivência global (OS), tal como determinado por análise de Kaplan-Meier. Por análise de regressão logística multivariada, o aumento de expressão de OPN (definido como uma pontuação de 0 relativamente a 1, 2 e 3) foi independentemente previsora de metástases de SLN com a inclusão de 6 outros marcadores de prognóstico conhecidos para melanoma. Por análise multivariada por regressão de Cox, a expressão elevada de OPN (definida como uma pontuação de 0 e 1 relativamente a 2 e 3) foi independentemente previsora de sobrevivência livre de recidiva e sobrevivência global (consultar as seguintes tabelas 8 e 9). Estes resultados identificam OPN como um novo marcador independente de prognóstico de melanoma, dado o seu papel na previsão do estado SLN, RFS e OS.

Tabela 8. Análise de regressão logística do impacto de factores clínicos, histológicos e moleculares em metástases SLN

Factor de prognóstico Qui Valor de Menor idade quadrado 15, 35 P < ,001 Espessura do tumor 10,70 0,001 Expressão de OPN (1,2,3 relativamente a 0) 7, 60 0,006 Nível de Clark 1,82 0,18 Sexo 1,81 0,18 Local 0,80 0,37 Ulceração 0,43 0,51 60 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ

Tabela 9, Análise de regressão de Cox do impacto de factores clinicos, histológicos e melanoma moleculares na OS do grupo de Factor de prognóstico Razão de Qui Valor de risco quadrado P Nivel de OPN (2,3 relativamente a 0,1) 1,60 6, 37 0,012 Nivel de Clark 1, 68 5, 84 0,016 Ulceração 1,55 5,77 0,016 Espessura do tumor 1,29 5, 03 0,025 Local 1,44 3,53 0,06 Idade 1,06 1,29 0,26 Sexo 1,065 0,10 0,75 EXEMPLO 5: Número de cópias de NC0A3 em melanoma Também determinámos o número de cópias de NCOA3 em melanoma por hibridação fluorescente in situ (FISH).

Desenvolvemos um ensaio FISH para detectar expressão de NCOA3 e analisámos 4 casos de melanoma que mostraram sobrexpressão de NCOA3. A análise destes casos por FISH mostrou que cada um dos casos tinha um elevado número de cópias do gene NCOA3 (figura 14). Esta é a primeira demonstração que está presente em melanoma um elevado número de cópias do gene NCOA3. EXEMPLO 6: Expressão de RGS1 em melanoma O impacto de prognóstico da expressão de RGS1 no resultado de melanoma foi analisado numa micromatriz de tecidos de 301 doentes. Determinou-se a expressão de RGS1 utilizando análise imuno-histoquímica de espécimes de tumor de melanoma primário arquivado e foram pontuados numa escala de quatro pontos (0-3) com base na intensidade de coloração por um patologista que desconhecia o resultado dos doentes.

Uma expressão elevada de RGS1 correlacionou-se com espessura aumentada de tumor. Em tumores com uma pontuação de RGS1 de 0, a espessura média de tumor foi 2,2 mm, que aumentou para 4,09 mm em tumores com uma pontuação maior do que 0 (P < 0,00005, teste T). Além disso, o aumento da expressão de RGS1 61 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ correlacionou-se com aumento da vascularidade de tumor (P=0,045). 0 aumento da expressão de RGS1 estava correlacionada significativamente com o estado SLN por análise de regressão logística univariada (P=0,04, estatística de qui quadrado 4,12) . 0 aumento da expressão de RGS1 também se correlacionou com o aumento da carga SLN, tal como determinado pelo número médio de SLN positivos. Assim, em doentes com uma pontuação RGSl de 0, o número médio de SLN positivos foi de 0,118, que aumentou para 0,415 em casos com uma pontuação de 1 ou 2 e 0,723 em casos com uma pontuação de 3 (P=0,0055 por ANOVA). Por análise de Kaplan-Meier, a expressão elevada de RGSl (definida como uma pontuação de 2 ou 3) estava associada com uma sobrevivência específica da doença (DSS) significativamente pior comparativamente a casos com baixa expressão de RGSl (pontuação de 0 ou 1) (P=0,018, teste de

Log-Rank). A análise multivariada por regressão de Cox mostrou que RGSl é um previsor independente significativo do resultado associado a melanoma, tal como determinado por análise de sobrevivência livre de recidiva (tabela 10) , sobrevivência global (tabela 11) e sobrevivência específica de doença (tabela 12) . Por regressão Cox em etapas, o nível de Clark, ulceração e expressão de RGSl mantiveram-se significativamente previsores de RFS. Por regressão Cox em etapas, o nível de

Clark, ulceração, local e expressão de RGSl mantiveram-se significativamente previsores de OS. Por regressão Cox em etapas, a espessura e expressão de RGSl mantiveram-se significativamente previsores de DSS. Com a inclusão de 12 factores de prognóstico histológicos ou clínicos, a expressão de RGSl foi um previsor independente de RFS (P=0,04), OS (P=0,036) e DSS (P=0,01) por análise de regressão de Cox em etapas. Estes resultados estabeleceram RGSl como um novo factor de prognóstico independente para melanoma. 62 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ

Tabela 10, Análise de regressão factores na sobrevivência livre < melanoma FACTOR DE PROGNÓSTICO RAZÃO DE de Cox do impacto de vários de recidivas (RFS) de grupo de RISCO QUI-QUADRADO VALOR DE P Nivel de Clark 1, 97 22, 9 < 0,00005 Ulceração 2,01 14,2 0,0002 Nivel de RGS (0,1,2,3) 1,30 6, 65 0,0099 Local 1,29 2,01 0,16 Idade 0, 94 1,25 0,26 Sexo 1,22 1,12 0,29 Espessura do tumor 1,12 0,87 0,35 Tabela 11, Análise de regressão de Cox do impacto de vários factores na sobrevivência global de grupo de melanoma FACTOR DE PROGNÓSTICO RAZÃO DE RISCO QUI-QUADRADO VALOR DE P Nivel de Clark 1,43 5,25 0,022 Ulceração 1,72 6, 98 0,0083 Nivel de RGS (0,1,2,3) 1,34 6, 63 0,01 Local 1,49 3, 71 0,054 Idade 1,06 0, 98 0,32 Espessura do tumor 1,24 2, 69 0,10 Sexo 1,31 1,54 0,22 Tabela 12, Análise de regressão de Cox do impacto de vários factores na sobrevivência específica de doença de grupo de melanoma FACTOR DE PROGNÓSTICO RAZÃO DE RISCO QUI-QUADRADO VALOR DE P Nível de RGS (0,1,2,3) 1,43 7,09 0,0077 Nível de Clark 1,52 5, 47 0,019 Ulceração 1,54 3, 30 0,069 Espessura do tumor 1,29 2,74 0,098 Local 1,29 1,22 0,27 Sexo 1,23 0,71 0,40 Idade 0, 98 0,05 0,82 63 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ EXEMPLO COMPARATIVO 7: Ensaio de dois e três marcadores para prognóstico

Analisámos o impacto da expressão combinada de marcadores no resultado de melanoma. Inicialmente analisámos a positividade SLN em 309 amostras de melanoma primário quando a expressão de marcador se encontrava disponivel para NCOA3 e SPP1. A expressão de NCOA3 e SPP1 foi pontuada como elevada ou baixa com base nos limiares óptimos estabelecidos por regressão logística. Definiu-se expressão de NCOA3 elevada como uma pontuação de 2 e 3 enquanto a expressão de SPP1 elevada foi definida como uma pontuação superior a 0. Em casos com baixas pontuações para ambos os marcadores, ocorreu positividade SLN 0% das vezes; tal aumentou para 12,5% em casos com SPP1 baixo e NCOA3 elevado, 26,7% em casos com NCOA3 baixo e SPP1 elevado e 37,0% em casos com pontuações elevadas para ambos os marcadores. O impacto incremental da expressão de marcador no estado SLN foi altamente significativo (valor de P de dois braços 0, 0007) . Adicionalmente, o aumento do número de marcadores sobrexpressos foi um previsor significativo do estado SLN tal como determinado por análise de regressão logistica univariada (estatística de qui quadrado 14,7, P=0,0001). Uma análise de regressão logistica univariada que analisou o número de marcadores altamente expressos (0, 1 ou 2) mostrou um impacto significativo no estado SLN com o aumento da sobrexpressão de marcador (P=0,0004). Seguidamente, analisámos o impacto da expressão combinada de marcadores na carga de tumor SLN, tal como determinada pelo número médio de SLN positivos. Nos casos com baixas pontuações para ambos os marcadores, o número médio de SLN positivos foi 0; Tal aumentou para 0,25% nos casos com SPP1 baixo e NCOA3 alto, 0,38 nos casos com NCOA3 baixo e SPP1 alto e 0,63 nos casos com pontuações elevadas para ambos os marcadores. O impacto incremental de expressão de marcador em carga de tumor SLN foi também significativo (teste de Kruskal-Wallis não direccional 0,01; teste de significância direccional Le 0,0066).

Seguidamente, o impacto da expressão combinada de marcador foi analisado na sobrevivência livre de recidiva (RFS) de melanoma neste conjunto. Nos casos com baixas pontuações para ambos os marcadores, a RFS média foi 0,45 anos; tal aumentou para 0,50 nos casos com SPP1 baixo e NCOA3 64 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ alto, 0,55 nos casos com NCOA3 baixo e SPP1 alto e 0,56 nos casos com pontuações elevadas para ambos os marcadores (teste de significância direccional Le 0,0091). Adicionalmente, o aumento do número de marcadores sobrexpressos foi um previsor significativo de RFS tal como determinada por análise univariada por regressão de Cox (P=0,017) . Similarmente, houve um impacto na sobrevivência global (OS) quando se combinaram os dados dos marcadores. Nos casos com pontuações baixas para ambos os marcadores, a OS média foi de 0,47 anos; tal aumentou para 0,51 nos casos com SPP1 baixo e NCOA3 elevado, 0,55 nos casos com NCOA3 baixo e SPP1 elevado e 0,57 nos casos com pontuações elevadas para ambos os marcadores (teste de significância direccional Le 0,018). Finalmente, ocorreu um impacto na sobrevivência especifica de doença (DSS) quando se combinaram as pontuações de expressão de marcador. Assim, nos casos com pontuações baixas para ambos os marcadores, a DSS média foi de 0,47 anos; tal aumentou para 0,52 nos casos com SPP1 baixo e NCOA3 elevado, 0,52 nos casos com NCOA3 baixo e SPP1 elevado e 0,60 nos casos com pontuações elevadas para ambos os marcadores (valor de P 0,04 ANOVA, teste de significância direccional Le 0,0069). Adicionalmente, o aumento do número de marcadores sobrexpressos foi um previsor significativo de DSS tal como determinado por análise univariada por regressão Cox (P=0,013).

Finalmente, o impacto das pontuações combinadas de expressão de marcador foi analisado utilizando análises multivariadas. O impacto dos dados combinados de expressão de marcador no estado SLN foi analisado utilizando regressão logística. Esta análise mostrou que o estado combinado de NCOA3/SPP1 é o principal factor determinante do estado SLN, ultrapassando os marcadores histológicos de rotina (tabela 13 seguidamente). Através de análise de regressão em etapas, apenas o estado combinado NCOA3/SPP1 (P=0,0013), espessura de tumor (P=0,0016) e envolvimento vascular (P=0,039) foram previsores significativos do estado SLN.

Quando se utilizam marcadores múltiplos, os reagentes para estes marcadores podem ser aplicados e analisados simultânea ou sequencialmente ou ambos. Quando se utilizam marcadores múltiplos, a etapa de determinar a quantidade de 65 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ expressão pode ser efectuada para os marcadores simultânea, sequencialmente ou ambas.

Tabela 13, Análise de regressão de Cox do impacto de vários factores no estado SLN do grupo de melanoma FACTOR DE PROGNÓSTICO QUI- VALOR DE P (DOIS QUADRADO BRAÇOS) Nível combinado de NCOA3/SPP1 9, 08 0,0026 Envolvimento vascular 6, 05 0,014 Espessura do tumor 3, 95 0,047 Nível de Clark 2,89 0,089 Regressão 2,71 0,10 Microssatélites 1,38 0,24 Ulceração 0,36 0,55 Taxa mitótica 0,34 0,56 Vascularidade de tumor 0,0024 0,96 Analisou-se o impacto da pontuação combinada da expressão de marcador em RFS utilizando regressão de Cox multivariada. Através de análise de regressão em etapas, o estado combinado de NC0A3/SPP1 (P= 0,02) , nivel de Clarck (P=0,002), ulceração (P<0,00005), taxa mitótica (P=0,0003) e microssatélites (P<0, 00005) foram previsores significativos do estado SLN.

Finalmente, analisou-se também o impacto da pontuação combinada da expressão de marcador em DSS utilizando regressão de Cox multivariada. Esta análise demonstrou que o estado combinado de NCOA3/SPP1 é um factor independente determinante de DSS quando se incluíram 9 factores histológicos no modelo (tabela 14, seguidamente). Através de análise de regressão de Cox em etapas, microssatélites (P=0,0001), taxa mitótica (P=0,0002), ulceração (P=0,0066) e estado combinado NCOA3/SPP1 (P=0,029) permanecerem previsores significativos de DSS. Estes resultados estabelecem a significância do impacto de prognóstico das pontuações combinadas de expressão de marcador e demonstram a utilidade de um ensaio de prognóstico multi-marcador para melanoma, dado o seu impacto independente no estado SLN, RFS e DSS. Ensaiar-se-á também RGS1 num ensaio de 66 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ três marcadores com NC0A3/SPP1, com os resultados preliminares mostrando um impacto significativo em DSS (tabela 15).

Tabela 14, Análise de regressão de Cox do impacto de vários factores em DSS do grupo de melanoma FACTOR DE PROGNÓSTICO RAZÃO DE QUI VALOR DE P (DE RISCO QUADRADO DOIS BRAÇOS) Microssatélites 3,77 14,2 0,0002 Taxa mitótica 1,89 5, 68 0,017 Nivel combinado de 1, 69 4,32 0,038 NC0A3/SPP1 Nivel de Clarck 1, 69 2,80 0,09 Envolvimento vascular 1,25 0, 60 0,44 Regressão 0,44 2,35 0,44 Ulceração 1,22 0,45 0,50 Espessura de tumor 1,10 0,36 0,55 Vascularidade de tumor 1, 18 0,33 0,57 Tabela 15, Análise de regressão de Cox do impacto de vários factores em DSS de grupo de melanoma FACTOR DE PROGNÓSTICO RAZÃO DE QUI VALOR DE P (DE RISCO QUADRADO DOIS BRAÇOS) Nivel combinado de 3,33 7,48 0,0062 NC0A3/SPP1/RGS1 Estado SLN 1,80 3, 93 0,047 Espessura de tumor 1,50 3,34 0,068 Nivel de Clarck 1,41 2,24 0,13 Ulceração 1,22 0,38 0,54 Sexo 1,14 0,20 0, 66 Idade 1,04 0,17 0, 68 Localização 0, 96 0,02 0,88 EXEMPLO COMPARATIVO 8: Um ensaio multi-marcador para distinguir nevos benignos de melanomas malignos

Introdução

Este exemplo demonstra a utilização de análise imuno-histoquímica para verificar tanto as diferenças na expressão 67 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ génica observada ao nível de ARN, como para ensaiar o valor de diagnóstico desta análise no diagnóstico diferencial de nevo relativamente a melanoma. Métodos

Doentes do estudo: Construíram-se vários conjuntos de dados, compostos por 699 neoplasias melanocíticas, para as análises efectuadas neste estudo: um conjunto de treino, consistindo de uma micromatriz de tecidos (TMA) de 119 nevos benignos e 421 melanomas primários e quatro conjuntos de validação: secções de tecido de 38 melanomas ocorrentes num nevo (resultando em 75 neoplasias melanocíticas avaliáveis); 39 nevos displásicos; 21 nevos de Spitz; e 24 neoplasias melanocíticas mal diagnosticadas inicialmente. A composição do conjunto de treino de 119 nevos nas TMA estudadas é a seguinte: 31 nevos intradérmicos congénitos; 29 nevos intradérmicos adquiridos; 21 nevos displásicos adquiridos; 18 nevos compostos congénitos; 15 nevos compostos adquiridos; 4 nevos de junção; e 1 nevo não classificado. Os subtipos histológicos dos 421 melanomas primários incluídos nas TMA de treino são os seguintes: 202 melanomas de espalhamento superficial; 135 melanomas nodulares; 23 melanomas acrais; 18 melanomas lêntigos malignos; 16 melanomas desmoplásicos; e 27 melanomas sem outra classificação. No conjunto de tecidos contendo melanomas primários ocorrentes em associação com um nevo, a classificação de subtipo histológico para nevo e melanoma é a seguinte: 22 nevos congénitos; 8 nevos adquiridos; 3 nevos displásicos adquiridos; 1 nevo composto adquirido; 1 nevo intradérmico adquirido; 1 nevo displásico congénito; 1 nevo composto congénito; 1 nevo intradérmico congénito; 23 melanomas de espalhamento superficial; 7 melanomas nodulares; e 7 melanomas sem outra classificação.

Matrizes de tecidos: Geraram-se micromatrizes de tecidos de acordo com o método descrito em Kononen J, et al., Nat Med, 1998, 4:844-7; e Kashani-Sabet M, et al., J Clin Oncol, 2004, 22:617-23. Preparou-se um total de 16 matrizes de melanoma e um total de 4 matrizes de nevo com uma média de aproximadamente 40 núcleos de tecido por matriz. As matrizes de melanoma incluíram um total de 673 núcleos de tecido (457 melanomas primários com núcleos em duplicado para 150 68 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ doentes) . As matrizes de nevo incluíram um total de 138 núcleos de tecido.

Imuno-histoquímica: Aqueceram-se as lâminas a 60 °C durante 30 min antes de coloração e desparafinizaram-se e re-hidrataram-se por enxaguamento com xileno. As lâminas foram então sujeitas a microondas em tampão citrato 10 mM. Bloqueou-se a actividade de peroxidase endógena com peróxido de hidrogénio a 3%. No caso de WNT2, após lavagem com PBS, incubaram-se as lâminas à temperatura ambiente durante 30 minutos com soro de coelho normal para reduzir a coloração de base não específica e seguidamente lavou-se com PBS. No caso de FN1, as lâminas foram incubadas sequencialmente com reagentes de bloqueamento de avidina e biotina. Adicionou-se então o anticorpo primário [IgG policlonal de cabra anti-WNT2 (Biovision, diluição 1:5); IgG policlonal de coelho anti-SPPl (Abcam, diluição 1:200); IgG policlonal de coelho anti-FNl (Dako, diluição 1:400); IgG policlonal de coelho anti-ARPC2 (Upstate, diluição 1:50); e IgG de galinha anti-RGSl (GeneTex, diluição 1:100 para TMA e diluição 1:50 para secções de tecido)] e incubou-se durante a noite a 4 °C. Utilizou-se anticorpo IgG de cabra anti-coelho, anti-galinha ou de coelho anti-cabra biotinilado (Vector Laboratories, Burlingame, CA) como um anticorpo secundário para amplificação, seguido por incubação com ABC-HRP (Vector Laboratories) durante 30 min e solução de DAB/peróxido de hidrogénio (Sigma). Contra-coraram-se as lâminas com hematoxilina e montaram-se com "permount". Salvo menção em contrário, utilizou-se o mesmo protocolo de coloração imuno-histoquímica para lâminas de matriz de tecidos e para secções de rotina.

Avaliação de coloração imuno-histoquímica: Pontuaram-se as regiões de coloração mais intensa para cada núcleo de matriz de tecidos e secção de tecido. Pontuou-se a expressão de proteínas marcadoras em intensidade celular utilizando a seguinte escala: sem coloração (0), coloração fraca (1), coloração moderada (2) e coloração intensa (3) . Pontuou-se a intensidade de expressão de marcador tanto na junção entre a epiderme e derme (zona de junção ou "topo") do neoplasma, como na sua base ("fundo"). As localizações de "topo" e "fundo" em termos de tumor referem-se ao topo do crescimento vertical (invasivo) do tumor e à área mais profunda de invasão de 69 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ tumor, respectivamente. Em termos dos nevos associados, identificaram-se e registaram-se três tipos padrão de nevos (consultar, e.g., Sagebiel R.W., J Invest Dermatol, 1993; 100:322S-325S para classificação). Em nevos de padrão congénito, registou-se o topo na região de junção e/ou dérmica papilar e o fundo no nevo identificado mais profundo na derme reticular. Em nevos de padrão adquirido, registou-se o topo na região de junção e o fundo no nevo identificado mais profundo na derme papilar. De igual forma, em nevos displásicos, o crescimento lateral adjacente ao nevo precursor caracteriza a atipia aleatória e as alterações arquitectónicas de displasia e registou-se o topo na região de junção e o fundo no nevo identificado mais profundo na derme papilar e/ou derme reticular. Excluiram-se da análise espécimes sem melanoma ou nevo. Os espécimes que não foram interpretáveis devido a coloração insuficiente ou ausência de caracteristicas arquitectónicas foram tratados como observações em falta. Pontuaram-se as matrizes e secções por um patologista sem conhecimento da identidade das lesões com duas pontuações independentes e uma pontuação consensual determinada para pontuações discrepantes para todos os marcadores. Os controlos positivos externos de especificidade para os vários anticorpos foram os seguintes: tumor de mama (WNT2, SPP1); linhas celulares de melanoma LOX e FEM (WNT2, ARPC2, SPP1); secções de tecido de melanoma (WNT2, FN1, ARPC2, RGS1, SPP1); rim normal (FN1); timo (RGS1) e linfoma não Hodgkin (RGS1). O controlo negativo técnico utilizado para imuno-histoquímica incluiu a utilização de soro fisiológico tamponado com fosfato em vez de anticorpo primário, mantendo todas as outras condições iguais.

Análise estatística: Avaliou-se a eficácia de diagnóstico da intensidade de cada marcador (no fundo da neoplasia melanocitica) com regressão logística univariada. Avaliou-se eficácia de diagnóstico da intensidade da combinação de todos os cinco marcadores com regressão logística multivariada. Para o ensaio de multi-marcador, a eficácia de diagnóstico foi analisada utilizando característica de receptor-operador (ROC) e calculou-se a área sob a curva ROC. Calcularam-se as proporções de especificidade e sensibilidade e analisaram-se utilizando o teste exacto de Fisher. A diferença entre a intensidade de imuno-coloração de marcador na base do nevo e 70 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ na base do melanoma foi testada para cada marcador utilizando o teste de Mann-Whitney. A diferença entre intensidade de imuno-coloração de marcador na zona de junção da lesão e na base da lesão foi também testada para cada marcador utilizando o teste de Mann-Whitney. Todos os valores de P apresentados são de dois braços.

Para avaliar a fiabilidade das pontuações de expressão de marcador, compararam-se as pontuações de intensidade WNT2 com a intensidade densitométrica média (derivada de uma análise de imagem quantitativa) para cada caso no conjunto de treino. Inicialmente identificaram-se quatro gamas sequenciais da intensidade densitométrica média que corresponderam melhor à escala 0-3 de expressão de marcador. Seguidamente definiu-se a concordância entre as pontuações de expressão de marcador WNT2 e a sua intensidade densitométrica média (quando ambas estavam disponiveis) como a percentagem de lesões nas quais tanto a intensidade de expressão de marcador, como a intensidade densitométrica média foram equivalentes em termos de diagnóstico. Definiu-se uma concordância em percentagem semelhante para pontuações WNT2 e calculou-se para as diferenças nas pontuações de expressão "fundo-topo".

Com base nos dados de 540 lesões no conjunto de treino, obtiveram-se algoritmos de diagnóstico de MDMS (Surprise, AZ). Estes algoritmos primeiramente confirmaram que uma lesão com caracteristicas displásicas ou Spitzóides eram nevo displásico ou de Spitz e seguidamente diagnosticaram todas as lesões não confirmadas como um tipo diferente de nevo benigno ou um melanoma. Obtiveram-se algoritmos de diagnóstico independentes para diferenças de pontuação "fundo-topo", por si só, e para diferenças de pontuação "fundo-topo" combinadas com as pontuações de intensidade de expressão. O algoritmo de diagnóstico final que abrange cada um destes algoritmos aparece na figura 2. Este algoritmo de diagnóstico final foi aplicado às lesões em todos os quatro conjuntos de validação.

Resultados

Seguidamente confirmámos a expressão de proteína diferencial de vários dos produtos de transcrição identificados correspondentes no nosso estudo anterior e 71 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ analisámos a utilidade de um ensaio de diagnóstico multi-marcador para melanoma num grupo maior independente de neoplasias melanociticas. Para tal fim, combinámos um conjunto de tecidos de 699 neoplasias melanociticas, compreendendo um conjunto de treino de TMA, com 540 melanomas primários e nevos melanociticos, e quatro conjuntos de validação, compreendendo secções de tecido de 159 neoplasias melanociticas relevantes para o diagnóstico diferencial de nevo relativamente a melanoma. Analisou-se inicialmente a expressão de cinco marcadores seleccionados (ARC2, FN1, RGS1, SPP1 e WNT2) no conjunto de treino utilizando anticorpos disponíveis comercialmente que têm como alvo as proteínas mencionadas anteriormente. Pontuou-se cada marcador numa escala de quatro pontos para intensidade de coloração.

No processo de optimizar a coloração imuno-histoquímica dos marcadores, verificou-se um padrão de coloração curioso em nevos benignos. Os nevos benignos apresentaram uma coloração sistematicamente mais forte na zona de junção do nevo, com perda de expressão na base do nevo). Contrariamente, a expressão dos marcadores foi mais uniforme nas partes invasivas de melanomas em comparação entre a zona junção da lesão e a base. Em consequência, pontuámos as TMA para intensidade de expressão tanto na zona de junção ("topo"), como na base ("fundo") de cada neoplasia melanocítica na qual a orientação da lesão foi claramente demonstrável no núcleo do espécime representado nas matrizes.

Inicialmente avaliou-se cada um dos cinco marcadores individualmente para a sua capacidade de diagnosticar melanoma relativamente a nevo, utilizando a escala de intensidade de quatro pontos aplicada à base de cada lesão. Identificou-se a melhor forma para particionar cada escala de marcador de quatro pontos (apresentada na tabela 16) . Definiu-se o melhor método de partição da escala como o que maximiza o valor de qui quadrado resultante associado com a sua análise de regressão logística univariada. A capacidade de cada marcador optimamente particionado para discriminar entre nevos e melanomas foi também avaliada de acordo com a sua sensibilidade de diagnóstico e proporções de especificidade. Demonstrou-se que cada um dos cinco marcadores moleculares é 72 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ sobrexpresso significativamente em melanomas comparativamente a nevos (tabela 16).

Efectuaram-se várias análises para analisar se a combinação de marcadores foi útil na sua capacidade para diagnosticar melanoma. Especificamente examinámos uma análise focada nas pontuações de intensidade de expressão da base apenas, uma focando na diferença da expressão entre a zona da lesão da junção e da base (análise "fundo-topo") e uma terceira análise que abrange ambos os tipos de dados.

Inicialmente efectuámos uma análise examinando as pontuações da intensidade de expressão atribuídas à base de cada lesão para os cinco marcadores combinados. Combinaram-se as pontuações da expressão de marcador particionadas optimamente através de regressão logística múltipla e atribui-se uma probabilidade de ser maligno para cada uma das lesões para as quais existiam dados completos. As probabilidades atribuídas foram então particionadas no seu ponto óptimo de separação, atingindo uma especificidade de 93,6% e uma sensibilidade de 75,8% (P< 0,00005, teste exacto de Fisher). Adicionalmente, construiu-se uma curva característica recebedor-operador (ROC) para esta análise multi-marcador e apresenta-se na figura 1, com uma área sob a curva (AUC) associada de 0,9105.

Para fins ilustrativos, replicámos esta análise para cada um dos marcadores individualmente e para combinações de 3 marcadores. A análise de um único marcador (e.g., FN1) apresentou a AUC mais baixa de 0,5622, que aumentou para um nível intermédio de 0,7036, quando se incluíram dois marcadores adicionais (ARPC2 e SPP1), culminando na AUC de 0,9105, quando se incluíram todos os cinco marcadores no modelo.

Em segundo lugar, efectuámos uma análise utilizando apenas as diferenças entre a expressão de marcador "fundo-topo" para todos os cinco marcadores. A análise de expressão de marcador na zona de junção da lesão relativamente a base mostrou que os nevos perderam consistentemente expressão para cada um dos cinco marcadores comparativamente aos melanomas, nos quais a imuno-coloração de marcador foi muito mais 73 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ uniforme. Este padrão de expressão de marcador "fundo-topo" notoriamente diferente entre nevos e melanomas foi replicado para cada um dos cinco marcadores, quando analisados pelo teste Mann Whitney (dados não apresentados), com a especificidade e sensibilidade para cada marcador indicada na tabela 17. De facto, no caso de um marcador, WNT2, ocorreu uma separação perfeita entre as duas distribuições de diferença de pontuações "fundo-topo" entre nevos e melanomas nas 144 lesões analisadas. Assim, todos os nevos analisados perderam expressão da sua zona de junção para a sua base, enquanto todos os melanomas tinham expressão uniforme da zona de junção para a sua base. Esta discriminação perfeita entre nevo e melanoma no caso WNT2 impossibilitou confiança subsequente na regressão logística como nossa única ferramenta analítica. 0 procedimento de estimativa da regressão logística não pode produzir estimativas de probabilidade máxima dos coeficientes de regressão em face de tal discriminação perfeita. Assim, de modo a analisar a validade de diagnóstico do padrão de expressão de marcador, quando se combinaram todos os cinco marcadores, obteve-se um algoritmo de diagnóstico que consistiu de 14 critérios de discriminação. Os primeiros quatro critérios focaram-se na confirmação (ou não) se uma lesão com características displásicas realmente era um nevo displásico. Os restantes dez critérios focaram-se na diferença nas pontuações de expressão vertical de lesões não displásicas determinada para ser direccionalmente consistente pelos testes Mann Whitney supramencionados. A aplicação deste algoritmo de diagnóstico às 540 lesões no conjunto de treino proporcionou uma especificidade de 84,6% e uma sensibilidade de 98,7% (P< 0,00005, teste exacto de Fisher).

De modo a avaliar a fiabilidade das pontuações da expressão e as diferenças "fundo-topo", efectuou-se uma análise de imagem quantitativa. As lesões coradas com WNT2 no conjunto de treino foram digitalizadas e calculou-se a intensidade densitométrica média para cada lesão. A concordância entre a escala de intensidade de marcador e a intensidade densitométrica média foi de 9,3% quando calculada como a percentagem das lesões consideradas diagnosticadas identicamente, utilizando limiares de corte correspondentes para diagnosticar melanoma (P < 0,00005, teste de Mann

Whitney). Também avaliámos a concordância nas diferenças nas 74 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ pontuações de expressão "fundo-topo" e verificou-se uma concordância de 98,4% entre as pontuações de intensidade de marcador e a análise densitométrica média (P < 0,00005, teste Mann Whitney). A análise de regressão logística das pontuações de intensidade densitométrica média apenas reproduziu a exactidão de diagnóstico de WNT2 (P< 0, 00005) identificado pelas pontuações de intensidade de marcador. Adicionalmente, uma análise de pontuações de intensidade densitométrica média WNT2 "fundo-topo" mostrou uma especificidade de 97,1%, com uma sensibilidade de 96,6%, reproduzindo os resultados verificados para as pontuações de expressão de marcador.

Finalmente tentámos explorar a utilidade do ensaio multi-marcador para diagnosticar melanoma utilizando pontuações de expressão de marcador, bem como diferenças "fundo-topo". Uma vez mais, dada a separação perfeita nas pontuações de expressão vertical para WNT2, não foi possível utilizar regressão logística. Assim, obteve-se um algoritmo utilizando tanto os dados das pontuações de intensidade de expressão, bem como a expressão diferencial na zona de junção da lesão relativamente à base (apresentada na figura 2) para discriminar entre nevo e melanoma. Curiosamente, quando se analisou a expressão de marcador nos nevos, todos os 21 nevos displásicos incluídos no conjunto de treino foram identificáveis apenas com base nas suas pontuações de intensidade de expressão de ARPC2 e FN1. Desenvolveu-se então um algoritmo independente para confirmar como realmente displásicos todos os nevos com características displásicas. Este algoritmo de confirmação continha quatro critérios de discriminação com base na intensidade de expressão de ARPC2 e FN1. O algoritmo para nevos displásicos foi então combinado com um algoritmo baseado nas diferenças "fundo-topo", bem como pontuações de expressão de marcador. A aplicação deste algoritmo de diagnóstico final ao conjunto de treino atingiu uma especificidade de 94,9% e uma sensibilidade de 90,6% no diagnóstico de melanoma (P< 0,00005, teste exacto de Fisher). Efectuaram-se análises adicionais utilizando apenas este algoritmo de diagnóstico.

Para validar o ensaio de multi-marcador desenvolvido no conjunto de treino, analisámos tanto a intensidade, como o padrão de expressão dos cinco marcadores para a sua expressão 75 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ em quatro conjuntos de validação distintos com a maior relevância para distinção histológica entre nevo e melanoma. Nas TMA tivemos como objectivo reunir um grande grupo de neoplasias melanociticas, tanto para validar a expressão diferencial dos marcadores derivados de análise de micromatriz de ADNc, como para analisar a utilidade do nosso ensaio multi-marcador. No entanto, determinados subtipos de nevos não apresentam um dilema de diagnóstico diferencial e determinados subtipos de melanomas não provêm de nevos pré-existentes.

De modo a validar os nossos resultados do conjunto de treino, um cenário óptimo para avaliar diferenças potenciais na expressão foram casos de melanoma ocorrentes em associação com nevos pré-existentes, para os quais muitos factores de confusão potencial (idade, sexo, localização anatómica e subtipos histológicos potencialmente irrelevantes de nevo e melanoma, entre outros) são controlados automaticamente. Assim, reunimos um conjunto de validação de 38 casos de melanoma primário em associação com um nevo, resultando em 75 neoplasias melanociticas avaliáveis. Adicionalmente recolhemos dois conjuntos de validação adicionais directamente relevantes para este diagnóstico histológico diferencial: 21 casos de nevo de Spitz; e 39 casos de nevo displásico. Estes são os dois subtipos de nevos problemáticos mais comuns no diagnóstico histológico diferencial de nevo relativamente a melanoma. Finalmente analisámos a expressão de marcador num conjunto de dados de 24 lesões anteriormente mal diagnosticadas, incluindo 6 lesões inicialmente diagnosticadas como melanoma que foram subsequentemente diagnosticadas como nevo através de uma revisão dermatopatológica consensual e 18 lesões inicialmente diagnosticadas como nevo que subsequentemente tiveram uma recidiva local e/ou metastizaram e foram retrospectivamente diagnosticados como melanoma. Em todos os conjuntos de validação, dada a importância da expressão de marcador na zona de junção do nevo relativamente à base do nevo, analisámos a expressão de marcador utilizando análise imuno-histoquimica em secções de tecido de 5 μΜ.

Utilizando os algoritmos com pontuação de intensidade de expressão de marcador, bem como as diferenças das pontuações de expressão "fundo-topo", o ensaio multi-marcador atingiu uma especificidade de 94,7% e 97,3% de sensibilidade no 76 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ diagnóstico de melanoma nos 75 melanomas ocorrentes num nevo (figura suplementar xx). Adicionalmente, o algoritmo desenvolvido para a análise de nevos displásicos na TMA identificou correctamente 94,9% (37/39) das secções de nevo displásico e 95,2% (20/21) dos nevos de Spitz. Finalmente, o ensaio de multi-marcador diagnosticou correctamente 18/24 (75,0%) das lesões anteriormente mal diagnosticadas. Quando se combinaram os vários conjuntos de treino e de neoplasias melanociticas de validação, o ensaio de multi-marcador proporcionou uma especificidade de 95,1% e uma sensibilidade de 90,5% (P< 0,00005, teste exacto de Fisher). Apresenta-se na tabela 18 uma comparação da sensibilidade, especificidade e AUC do ensaio de multi-marcador nos vários conjuntos de dados e utilizando vários algoritmos de diagnóstico.

Discussão

Este exemplo revela um ensaio molecular de multi-marcador para distinguir melanoma de nevo benigno utilizando cinco biomarcadores que foram sugeridos por uma análise de micromatriz de ADNc recente. Nessa análise, a análise de agrupamentos hierárquicos não supervisionada separou correctamente nevo de melanoma num pequeno número de neoplasias melanociticas disponiveis recentemente, com base nos perfis de expressão génica e demonstrou um grande conjunto de genes que foram expressos diferencialmente em melanomas relativamente a nevos (consultar Haqq C. et al. Proc Natl Acad Sei USA, 2005; 102:6092-7). Neste exemplo, validámos a expressão diferencial de cinco dos genes sugeridos por essa análise e ensaiou-se a utilidade de um ensaio multi-marcador para diagnosticar melanoma relativamente a nevo. Este ensaio imuno-histoquimico multi-marcador apresentou uma especificidade de 94,9% e uma sensibilidade de 90,6% num conjunto de treino compreendendo uma TMA contendo um elevado número de nevos e melanomas primários. Com base nesta análise, o ensaio de diagnóstico multi-marcador foi então sujeito a quatro conjuntos de validação diferentes com relevância directa para o diagnóstico diferencial de nevo relativamente a melanoma e foi capaz de diagnosticar com exactidão uma elevada percentagem de melanomas ocorrentes num nevo, nevos de Spitz e displásicos, bem como neoplasias melanociticas anteriormente mal diagnosticadas. No conjunto de dados combinados, o ensaio 77 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ de multi-marcador proporcionou uma especificidade de 95,1% e uma sensibilidade de 90,5% no diagnóstico de melanoma.

Os nossos resultados demonstram que um ensaio de multi-marcador compreendendo níveis de expressão de proteína ARPC2, FN1, RGS1, SPP1 e WNT2 pode ser útil no diagnóstico diferencial de nevo relativamente a melanoma, que representa uma das tarefas mais complicadas em patologia. 0 nosso estudo é o maior até à data a analisar a utilidade de marcadores moleculares em diagnóstico de melanoma e único na utilização de um conjunto compreensivo de tecidos necessários pela heterogeneidade histológica tanto de nevos, como de melanomas. 0 ensaio de multi-marcador corrigiu três quartos dos casos em que se tinha efectuado diagnósticos patológicos incorrectos, incluindo melanomas inicialmente mal diagnosticados como nevos, nos quais o comportamento clínico da lesão tinha dado início a revisão do relatório patológico anterior. Assim, o ensaio de multi-marcador aqui descrito pode ser utilizado para auxiliar no diagnóstico histológico de melanoma, proporcionando assim nova informação importante para patologistas e outros médicos responsáveis pelo tratamento de doentes com neoplasias melanocíticas ambíguas.

Uma vantagem importante deste invento é que se podem evitar erros de diagnóstico de melanoma. Tais erros podem levar muitos doentes a fazerem terapias desadequadas. Além disso, o mau diagnóstico de melanoma é a segunda causa mais comum para pedidos de indeminização por erro médico em cancro nos Estados Unidos, sendo apenas ultrapassado por erros no diagnóstico de cancro da mama (consultar Troxel D.B., Am J Surg Pathol, 2003; 27:1278-83). Os doentes com diagnósticos de melanoma errado vivem constantemente com medo de recidivas e podem não ser capazes de obter seguros de vida, enquanto os diagnósticos de nevo errados não são tratados com a terapia adequada para a sua malignidade, incluindo potencialmente biópsia do gânglio linfático sentinela e terapia adjuvante sistémica. Os nossos resultados demonstram que o ensaio multi-marcador pode reverter (e portanto evitar potencialmente) uma elevada percentagem de erros causados pela análise histológica de rotina de neoplasias melanocíticas. 78 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ A expressão diferencial dos marcadores sugerida pela análise de micromatriz de ADNc não foi uniforme na análise imuno-histoquimica do nevo, dado que a zona de junção do nevo expressa frequentemente os marcadores a um nivel mais elevado do que a base do nevo. Tal é marcadamente em contraste com a maioria dos melanomas, que mostrou uniformidade na análise de expressão de marcador "fundo-topo". Consequentemente, o padrão de expressão de proteina foi um agente de discriminação significativo entre nevo e melanoma e, em geral, superior às pontuações de expressão de produto de transcrição absolutas. Embora os nossos resultados confirmem a expressão diferencial dos genes primeiramente identificados pela análise de transcriptoma, eles refinam a informação conseguida por essa análise demonstrando que a maior diferença na expressão génica encontra-se na base de neoplasia melanocitica.

Uma das razões pelas quais seleccionámos imuno- histoquimica para validar os resultados de micromatriz de ADNc relativamente a outros ensaios potencialmente mais quantitativos, tais como PCR quantitativo, foi a capacidade da imuno-histoquimica proporcionar análise in situ de expressão génica para a lesão em causa. Os nossos resultados descrevem a utilidade de um ensaio molecular que poderia ser desenvolvido como um auxiliar à análise histopatológica de nevos e melanomas.

Embora a análise imuno-histoquimica tenha uma natureza semi-quantitativa, nós avaliamos a fiabilidade das pontuações de intensidade de marcador do observador utilizando uma análise de imagem quantitativa. Verificámos uma elevada taxa de concordância (> 90%) entre a exactidão do diagnóstico das pontuações de intensidade de marcador de observador e intensidade densitométrica média determinada pela análise quantitativa e ainda uma maior taxa de concordância (98%) das diferenças de pontuações de expressão "fundo-topo". Dado que um algoritmo de diagnóstico focado nas pontuações das zonas de junção da lesão relativamente a base proporcionou uma especificidade de 84,6% e sensibilidade de 98,7% no conjunto de treino, os nossos resultados sugerem a facilidade potencial da aplicação da análise destes marcadores ao diagnóstico de neoplasias melanociticas na prática clinica. 79 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ

Embora se tenha verificado uma diminuição vertical da imuno-coloração com alguns outros marcadores, incluindo S100A6, Melan-A e HMB-45, estes marcadores não têm qualquer valor na distinção entre nevos e melanomas primários, porque não são expressos diferencialmente nos nevos relativamente a melanomas (consultar Busam K.J., et al., Am J Surg Pathol., 1998, 22:976-82; Fullen D.R., et al., J Cutan Pathol, 2001; 28:393-9; Kucher C., et al., Am J Dermatopathol, 2004; 26:452-7; Haqq C. et ai., Proc Natl Acad Sei USA 2005; 102:6092-7).

Adicionalmente, em alguns destes estudos, os nevos intradérmicos foram o tipo de nevo dominante analisado. Sabe-se que os nevos intradérmicos sofrem "maturação" significativa na sua base. No nosso estudo, a regulação negativa da imuno-coloração de marcador foi verificada na base de nevos intradérmicos, nevos compostos, bem como nevos de Spitz e displásicos. Tal indica a maior utilidade alargada deste ensaio de multi-marcador como um marcador de diagnóstico molecular para melanoma.

Neste exemplo, descrevemos um ensaio de imuno- histoquímica de multi-marcador que pode diagnosticar neoplasias melanociticas com um elevado grau de exactidão, auxiliando assim neste difícil diagnóstico diferencial patológico.

Tabela 16, Discriminação de melanoma relativamente a nevo com a utilização de apenas pontuações de um único marcador Marcador Partição de escala óptima Qui Valor de quadrado P ARPC2 0 relativamente a 1, 2 relativamente a 3 24,2 <0,00005 FN1 0 relativamente a 1, 2 relativamente a 3 4,75 0,0294 RGS1 0, 1, 2 relativamente a 3 8, 98 0,0027 SPP1 0,1 relativamente a 2,3 11,1 0,0009 WNT2 0, 1, 2, 3 (escala completa) 86, 6 <0,00005 80 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ

Tabela 17, Exactidão de diagnóstico para melanoma utilizando pontuação de zona de junção da lesão relativamente a base da lesão ("fundo-topo") nos dados de treino para cada marcador individual

Marcador Especificidade (%) Sensibilidade (%) Valor de P (Teste exacto de Fisher) ARPC2 59, 7 96,1 <0,00005 FN1 23,3 98, 9 0,0101 SPP1 61,5 99, 0 <0,00005 RGS1 33,3 99, 0 <0,00005 WNT2 100 100 <0,00005 Tabela 18, Comparação de sensibilidade, especificidade e de ensaio de multi-marcador para diagnóstico de melanoma em vários conjuntos de tecidos e utilizando diferentes algoritmos de diagnóstico*

Conjunto Algoritmo de Especificidade Sensibilidade AUC de dados diagnóstico (%) (%) Treino Apenas intensidade de marcador 93, 6 75, 8 0,9105 Treino Apensas expressão vertical 84, 6 98,7 0,9165 Treino Pontuações de expressão combinadas 94, 9 90, 6 0,9277 Treino e validação Pontuações de expressão combinadas 95, 1 90,5 0,9275 * Valor de Fisher) p para cada análise < 0,00005 (Teste exacto de 81 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ

Exemplo 9: Um ensaio de marcador de diagnóstico de seis genes para melanoma

Avaliámos a utilidade de um ensaio de seis genes no diagnóstico diferencial de melanoma relativamente a nevo num conjunto de dados combinados de 698 doentes compreendendo um conjunto de treino de 538 doentes (119 nevos e 419 melanomas) e um conjunto de validação de 160 doentes. A expressão de seis genes (ARPC2, FN1, NCOA3, RGSl, osteopontina (SPP1) e WNT2) foi avaliada utilizando análise imuno-histoquimica. Através de análise de regressão logística, o ensaio de seis genes (quando analisado apenas pelas pontuações de expressão de marcador) mostrou uma sensibilidade de 77,9% e uma especificidade de 92%, com uma AUC sob a ROC de 0,914. Desenvolveu-se um algoritmo de diagnóstico para analisar a utilidade de pontuações fundo-topo para os seis marcadores no diagnóstico de melanoma (figura 22) . Esta análise apenas fundo-topo (na qual a expressão de marcador foi perdida uniformemente em nevos, enquanto esta expressão vertical foi mantida nos melanomas) revelou uma sensibilidade de 96,4% e uma especificidade de 82,8%. Finalmente desenvolveu-se um algoritmo de diagnóstico que abrangeu pontuações de intensidade de marcador, bem como diferenças fundo-topo (figura 23) . A aplicação deste algoritmo de diagnóstico ao conjunto de lesões de treino proporcionou uma sensibilidade de 92% e uma especificidade de 94,1%. Finalmente, este mesmo algoritmo de diagnóstico foi aplicado aos quatro conjuntos de validação e revelou uma sensibilidade de 97,4% e uma especificidade de 94,7% em melanomas ocorrentes num nevo e identificou correctamente 37/39 (95%) de nevos displásicos, 20/21 (95%) de nevos de Spitz e 18/24 (75%) de neoplasias anteriormente mal diagnosticadas. No conjunto de dados combinados, o ensaio de multi-marcador revelou uma sensibilidade de 92,2% e uma especificidade de 94,6%. Estes resultados demonstram a utilidade deste ensaio de seis marcadores no diagnóstico de melanomas, bem como de nevos.

Exemplo comparativo 10: Um ensaio de prognóstico de quatro genes para melanoma

Analisámos o impacto no prognóstico dos níveis de expressão de RGSl, NCOA3, osteopontina (SPP1) e PHIP quando se 82 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ combinam os níveis de expressão para todos os quatro marcadores. Desenvolvemos um índice de prognóstico que reflectiu o número de marcadores sobrexpresso (definido como o ponto limiar anterior para esses marcadores) para cada um dos 412 casos de melanoma cutâneo primário presentes em TMA para os quais estava disponível a expressão de marcador. Inicialmente analisámos a positividade de impacto de multi-marcador por análise univariada de três parâmetros de resultados importantes: estado do gânglio linfático sentinela (estado SLN), sobrevivência livre de recidiva (RFS) e sobrevivência específica de doença (DSS). Através de análise univariada, o aumento do número de marcadores sobrexpressos foi um previsor significativo do estado SLN (P=0,002, regressão logística), RFS (P<0, 0 0 01, regressão de Cox) e DSS (P<0,0001, regressão de Cox).

Seguidamente analisámos o índice multi-marcador para o seu impacto no prognóstico através de análise multivariada, utilizando os seis factores incluídos pela análise de comité de melanoma AJCC. Através de análise multivariada, o ensaio de multi-marcador foi um previsor independente do estado SLN (tabela 19), RFS (tabela 20) e DSS (tabela 21) com a inclusão destes factores. Na análise de DSS, o ensaio de multi-marcador salientou-se como o principal factor de previsão de DSS. O índice multi-marcador permaneceu significativamente previsor mesmo com a inclusão do estado SLN (tabela 22).

Adicionalmente, o aumento da positividade do marcador foi um previsor significativo da RFS (P<0,0001) e DSS (P<0,0001) através de análise Kaplan-Meier. Estes resultados demonstraram o poderoso impacto de prognóstico do ensaio de multi-marcador. 83 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ

Tabela 19. Análise de regressão de Cox do impacto de vário factores no estado SLN do grupo de melanoma VALOR DE FACTOR DE PROGNÓSTICO QUI _ RAZÃO DE RISCO QUADRADO P Idade 19, 60 0, 65 <0,0001 Nível de expressão de muiti- 8,35 1,33 0,0039 marcador Espessura de tumor 6,89 1, 68 0,0087 Nível de Clarck 1, 63 1,36 0,20 Sexo 1,49 1,46 0,22 Ulceração 0,77 1,32 0,38 Local 0,0006 1,01 0, 98 Tabela 20, Análise de regressão de Cox do impacto de vário factores em RFS de grupo de melanoma VALOR DE FACTOR DE PROGNÓSTICO QUI RAZÃO DE RISCO QUADRADO P Nível de Clarck 25, 15 1,81 <,0001 Nível de expressão de multi- 15, 52 1,19 0,0001 marcador Ulceração 13,20 1,79 0,0003 Local 3, 53 1,34 0,06 Espessura de tumor 1,18 1,11 0,28 Idade 0,30 0, 97 0,59 Sexo 0 1,00 0, 999 Tabela 21, Análise de regressão de Cox do impacto de vários factores em DSS de grupo de melanoma VALOR DE FACTOR DE PROGNÓSTICO QUI RAZÃO DE RISCO QUADRADO P Nível de expressão de multi- 14,18 1,24 0,0002 marcador Nível de Clarck 8,16 1,55 0,0043 Ulceração 4,23 1,52 0,04 Espessura de tumor 3,89 1,29 0,049 Local 2, 66 1,40 0,10 Sexo 0,01 1,02 0, 92 Idade 0,01 0, 99 0, 93 84 ΕΡ 2 257 810/ΡΤ

Tabela 22, Análise de regressão de Cox do impacto de vários factores em DSS de grupo de melanoma

VALOR DE FACTOR DE PROGNÓSTICO Nível de expressão de multi-marcador

Espessura de tumor

Estado SLN

Ulceração Nível de Clarck

Sexo

Idade

Local QUI- RAZAO DE RISCO QUADRADO P 8,25 1,31 0,004 6, 58 1, 62 0,01 2, 69 1,55 0,10 1,88 1,45 0,17 1,25 1,24 0,26 0,20 1,13 0, 66 0,15 1,03 0,70 0,09 1,08 0,77

Lisboa, 2013-07-31

Claims (11)

1. ΕΡ 2 257 810/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Método in vitro para diagnosticar melanoma num indivíduo, em que o método compreende as etapas de: (a) pôr em contacto uma amostra biológica do indivíduo com reagentes que se ligam especificamente a um painel de marcadores seleccionados compreendendo: (i) os polipéptidos ARPC2, FN1, NC0A3, RGS1, SPP1 e WNT2 ou (ii) os ácidos nucleicos que codificam os polipéptidos, em que há pelo menos um reagente que se liga a cada marcador; e (b) determinar se cada um dos marcadores seleccionados é ou não sobrexpresso ou subexpresso na amostra; proporcionando assim um diagnóstico de melanoma no indivíduo.
2. 2. Método da reivindicação 1, em que: (a) os reagentes são anticorpos; (b) os reagentes são anticorpos marcados; (c) os reagentes são anticorpos e a referida determinação é efectuada utilizando um imuno-ensaio enzimático do grupo que consiste de ensaio de imuno-histoquímica e ELISA; (d) os reagentes são ácidos nucleicos; (e) os reagentes são iniciadores de RT PCR; ou (f) a etapa de determinação compreende a utilização de FISH ou CGH.
3. 3. Método da reivindicação 1, em que a amostra é uma biópsia de pele.
4. 4. Método da reivindicação 1, em que a etapa de determinação compreende correlacionar expressão elevada do marcador com um fenótipo metastático para células na amostra.
5. 5. Método da reivindicação 1, em que o diagnóstico distingue entre nevos benignos e melanoma maligno. ΕΡ 2 257 810/ΡΤ 2/2
6. 6. Kit para utilização em diagnóstico de melanoma num indivíduo, em que o kit compreende reagentes que ligam especificamente um painel de marcadores seleccionados compreendendo: (i) os polipéptidos ARPC2, FNl, NC0A3, RGS1, SPP1 e WNT2 ou (ii) os ácidos nucleicos que codificam os polipéptidos.
7. 7. Kit da reivindicação 6, em que os reagentes são anticorpos.
8. 8. Kit da reivindicação 7, em que os anticorpos estão marcados.
9. 9. Kit da reivindicação 7, compreendendo ainda reagentes adicionais para detecção utilizando um imuno-ensaio enzimático seleccionado do grupo que consiste de ensaio de imuno-histoquímica e ELISA.
10. 10. Kit da reivindicação 7, compreendendo ainda reagentes adicionais para detecção utilizando FISH ou CGH.
11. 11. Kit da reivindicação 6, em que os reagentes são ácidos nucleicos ou são iniciadores de RT PCR. Lisboa, 2013-07-31