CN103472234B

CN103472234B - 一种酶联免疫检测及制备方法

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Publication number: CN103472234B
Application number: CN201310280425.8A
Authority: CN
Inventors: 赵以睿; 王慕元; 张鹏; 连绘
Original assignee: WUHAN SANYING BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: WUHAN SANYING BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2013-07-05
Filing date: 2013-07-05
Publication date: 2015-01-07
Anticipated expiration: 2033-07-05
Also published as: CN103472234A

Abstract

本发明涉及一种酶联免疫检测及制备方法，是一种新的抗人FN1蛋白的单抗包被酶标板及ELISA检测试剂盒的制备方法。其关键之处主要在于用基因工程方法制备特异性的鼠抗人FN1蛋白单抗，并将此抗体纯化后包被于酶标板上，作为试剂盒的一部分。试剂盒还包括FN1重组蛋白标准品、抗FN1蛋白的多抗、辣根过氧化物酶标记的二抗、样本稀释液、洗涤液、抗体稀释液、显色液、终止液。试剂盒建立了快捷简便测定人血清、血浆中FN1浓度的测定方法。试剂盒主要供科学研究用或癌症相关疾病的临床研究使用。

Description

一种酶联免疫检测及制备方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体地说涉及一种检测人纤维连接蛋白（FN1）的酶联免疫检测试剂盒，本发明还涉及上述试剂盒的制备方法。

背景技术

FN1 (Fibronectin 1) 即I型纤连蛋白，是一种糖蛋白，分别以可溶形式存在于体液中，或以不可溶化形式存在于细胞外基质中。溶于血浆纤维结合蛋白是血浆中的主要蛋白成分。不溶性细胞纤连蛋白是细胞外基质的主要组成部分。纤维连接蛋白参与细胞的黏附和迁移过程，包括胚胎发育，伤口愈合，血液凝固，宿主防御和转移。在细胞粘附，生长，迁移和分化中起着重要的作用，如伤口愈合和胚胎发育过程是很重要的。（Roumen, P. et al. Fibronectin at a glance[J]. J Cell Sci, 2002, 115, 3861-3863.）

FN一般以二聚体形式分泌，各个单体的分子量为220-250kDa。主要由成纤维细胞、内皮细胞、软骨细胞、神经胶质细胞和肌细胞等合成。所有FN由同一个基因编码产生，因转录后的mRNA经组织特异性的不同切割方式生成不同的翻译产物。FN上的多个结构域，能与胶原、纤维蛋白、肝素和特异性细胞膜受体结合。参与体内众多生理作用和功能，如各种细胞间的吸附和迁移，细胞骨架组装，酪氨酸磷酸化和肿瘤转移等。在腺泡分化过程中，纤维连接蛋白表达能调节乳腺上皮细胞增殖（Courtney M. Williams, et al. Fibronectin Expression Modulates Mammary Epithelial Cell Proliferation during Cain Differentiation [J]. Cancer Res. 2008 May 1; 68(9): 3185–3192.). 同时FN1还是头部和颈部鳞状细胞癌的抗辐射的潜在生物标志物（Jerhammar F,et al. Fibronectin 1 is a potential biomarker for radioresistance in head and neck squamous cell carcinoma [J]. Cancer Biology and Therapy, 2010, 10(12):1244-51.）

龚明等，研究了纤维连接蛋白1 (FN1) 基因表达与人纤维肉瘤肺转移的相关性。将HT1080细胞经裸鼠尾静脉注射接种，采集肿瘤浸润组织与正常对照组肺组织RNA，合成cDNA，以含1176个人肿瘤相关基因的芯片行cDNA微阵列分析，以实时定量RT-PCR法测定两组FN1表达。利用激光捕获法采集实验组小鼠肿瘤浸润肺组织及周围组织RNA，分别以实时定量RT-PCR法测定FN1表达.结果肺转移组与对照组相比，FN1表达明显上调。肿瘤浸润肺组织与周围组织相比，FN1表达明显上调。结论得出FN1基因高表达可能与人纤维肉瘤肺转移有关。(GONG,M. et al. Association of gene FN1 with pulmonary metastasis of human fibrosarcoma [J]. CHINESE JOURNAL OF ONCOLOGY; 2007, 29(1))

WO2008046510A1说明了FN1作为生物标志物，治疗和诊断疾病的作用，阐述了FN1与心血管疾病、血液系统疾病、呼吸系统疾病、肿瘤、胃肠道疾病、炎症、生殖病症、神经系统疾病、泌尿系统疾病等相关。WO2005US17274阐述了FN1作为生物标志物，治疗和诊断中风的应用。

文献广泛报道了FN1作为一种生物标志物在疾病的诊断和治疗中的作用，而目前一种好目前，国际上几大ELISA试剂盒生产商只是单一地生产FN1蛋白或抗体，而尚未有生产整套FN1 ELISA试剂盒的报道，缺乏FN1在人的血液、组织或细胞中定量的研究。本发明构建了一套用酶联免疫方法定量测定人样本中内源性FN1的浓度。

发明内容

本发明的目的：提供一种新的用于人血清、或细胞培养上清中人源FN1定量检测的ELISA试剂盒。本发明技术方案如下：

1、抗人FN1的特异性单抗包被反应板的制备，通过以下步骤：

（1） 30 KD FN1蛋白片段的获得：

① 30KD FN1蛋白片段的原核表达：以BC005858 DNA(购自美国典型培养物保藏中心，ATCC)为模板，用一对特异性的正反引物，PCR扩增FN1 DNA片段（156nt-786nt），将所得片段克隆于载体pET28a（购自德国Merck公司），转化BL21（DE3）（购自Merck）感受态大肠杆菌，根据卡那霉素抗性筛选阳性克隆。提取阳性克隆的质粒DNA进行鉴定，得到与目的片段分子量相一致的片段，初步判定为阳性。以PCR阳性克隆提取质粒DNA，进行测序，结果表明FN1 cDNA片段正确克隆至pET28a，为一个具有630bp的完整开放式阅读框，与GenBank中人源FN1基因100%同源，推算其表达的蛋白质分子量为30 KD，PI为5.0。

② 30KD FN1蛋白片段的鉴定：转化了重组质粒的大肠杆菌BL21经诱导后将菌体收集，超声波裂解，菌体蛋白经SDS-PAGE蛋白电泳及考马斯染色显示，在30KD附近新增一条带，经Western blotting鉴定，能与FN1的抗体发生强阳性反应，说明该30KD的FN1蛋白具有较强的免疫原性。

③ 30KD的FN1蛋白片段的制备与纯化：经大量培养、诱导、表达，使用Ni²⁺亲和层析柱（购自Pharmacia）纯化带有6×His标记的FN1蛋白，得到大量30KD FN1蛋白片段。

（2）制备抗FN1的单抗：

① FN1蛋白的动物免疫：将30KD的FN1蛋白片段与福氏佐剂混合并经充分乳化后，皮下注射，免疫鼠龄在8～12周的BALB/c健康小鼠（购自湖北省实验动物研究中心）3至4只，每次免疫间隔为2周，直至血清效价高于40000:1。

② 杂交瘤细胞的制备：在末次免疫后4天，分离鼠脾细胞，在PEG存在条件下选择与对数生长期的Sp2/0骨髓瘤细胞株（购自中国典型培养物保藏中心，CCTCC）以4:1的比例融合，饲养细胞来自小鼠腹腔细胞。融合后的细胞以含HAT的培养基筛选，经有限稀释后选出高抗体分泌孔，将孔内细胞克隆，进行抗原特异的ELISA测定，挑选高分泌性细胞株扩大培养或冻存。

③ 单抗制备：将分泌特异性单抗的杂交瘤细胞株进行小鼠腹腔接种，待产生腹水后收集腹水，用葡萄球菌A蛋白交联的亲和层析柱（购自Pharmacia公司）纯化单抗。抗体存于含55%甘油、0.1%BHA和0.01%硫柳汞的0.01mol/l、pH7.4的PBS之中。

（3）以所得单抗包被反应板：单抗用pH9.6的碳酸盐缓冲溶液稀释成适当浓度，包被96孔板，每孔100μl，置于4℃湿盒 16-24小时，PBST洗涤3次，每次30秒，然后拍干，除尽孔内液体。

（4）封闭：用含8%小牛血清的pH7.4的PBS封闭，每孔200μl，37℃，2小时孵育后，PBST洗涤3次，干燥后密封；该板即为抗FN1的单抗包被的酶标反应板，可用于FN1的定量检测。

2、FN1标准品（FN1蛋白溶液）的制备：

（1） FN1蛋白的原核表达：以DNA(购自ATCC)为模板，用一对特异性的正反引物，PCR扩增FN1（156nt-786nt）目的基因，将所得基因克隆于载体pET28a，转化BL21（DE3）感受态大肠杆菌，根据卡那霉素抗性筛选阳性克隆。提取阳性克隆的质粒DNA进行鉴定，得到与目的片段分子量相一致的片段，初步判定为阳性。以PCR阳性克隆提取质粒DNA，进行测序，结果表FN1蛋白质的cDNA正确克隆至pET28a，为一个具有630bp的完整开放式阅读框，与GenBank中FN1基因100%同源，推算其分子量为30KD，PI为5.0。

（2） FN1蛋白的鉴定：转化了重组质粒的大肠杆菌BL21经诱导后将菌体收集，超声波裂解，菌体蛋白经SDS-PAGE蛋白电泳及考马斯染色显示，在30KD附近新增一条带，经Western blotting鉴定，能与FN1的抗体发生强阳性反应，说明FN1蛋白具有较强的免疫原性。

（3） FN1蛋白的制备与纯化：经大量培养、诱导、表达，使用Ni²⁺亲和层析柱纯化，得到大量FN1蛋白。

（4） FN1标准品制备：将FN1蛋白保存于含55%甘油、0.1%BHA和0.01%硫柳汞的0.01mol/l、pH7.4的PBS之中，并使FN1蛋白的终浓度为1mg/ml

3、FN1阳性对照样品的制备：将FN1蛋白溶于含50%甘油、10%人血清、0.5%BSA、0.1%BHA和0.01%硫柳汞的0.01mol/l、pH7.4的PBS之中，并使FN1蛋白的终浓度为5μg/ml。

4、FN1的多抗的制备：

（1）动物免疫：取纯化好的FN1蛋白与福氏佐剂混合并经充分乳化后，脊柱两侧、对称多点皮下注射，免疫3-4月龄、体重在1.7Kg以上的健康日本大耳白兔（购自湖北省实验动物研究中心）3至4只，每次免疫间隔为2周，免疫1月后再次免疫后第8天耳静脉取血测血清效价，直至血清效价高于40000:1。

（2）血清获取：兔中耳动脉取血，每次40ml，静置30分钟后离心，3000rpm、5分钟，上清即为血清。

（3）多抗的纯化：用FN1蛋白交联的亲和层析柱（购自Pharmacia）纯化，得到FN1的多抗，保存于含55%甘油、0.1%BHA和0.01%硫柳汞的0.01mol/l、pH7.4的PBS之中，多抗的终浓度为1mg/ml。

（4）将得到多抗进行NIH/3T3细胞的蛋白印迹和组织样本免疫组化，图3和图4，结果说明我们制得多抗能与人天然的FN1蛋白反应，且具有特异性。

5、酶标二抗：购自美国R＆D systems，为辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的羊抗兔IgG。

6、本试剂盒对FN1的 ELISA检测步骤包括：

（1）待测样品、标准样、阳性对照依次加入微孔中，进行孵育，FN1将与固相载体表面的捕获抗体——预先包被在孔内的抗体相结合。

（2）经过洗涤，将特异性的抗FN1的多抗加入孔内，在第二次孵育中，多抗扮演检测抗体，并与第一次孵育中被捕获的FN1结合。

（3）洗去多余的多抗，加入酶标二抗，在第三次孵育中，酶标二抗与上一步中的多抗——检测抗体相结合，形成一个4组分的夹心形状的结合物。

（4）洗去未结合的酶标二抗，加入酶的底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺（tetramethyl benzidine，TMB），孔内液体在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，加入终止液，转化成黄色。颜色的深浅和样品中FN1的含量呈正相关。

（5）用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（O.D.值），计算样品中FN1浓度。

这种新的FN1 ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒由上述特异性的FN1的单抗包被的酶标板、FN1蛋白标准品、FN1的阳性对照样品、FN1的多抗、辣根过氧化物酶标记的二抗构成，具体组分为：（1）酶标板：由FN1的单抗包被；（2）样品稀释液：含8%小牛血清pH7.4的0.01mol/l PBS；（3）洗涤液；（4）FN1蛋白标准品；（5）FN1的阳性对照样品；（6）FN1的多抗；（7）辣根过氧化物酶标记的二抗；（8）显色液：TMB-H₂O₂系统；（9）终止液：2mol/l H₂SO₄溶液。

FN各个单体的分子量为220-250kDa，由于其mRNA存在选择性剪接，FN蛋白产生诸多亚型。此外，FN通常在C端以二硫键形成二聚体。我们选择性克隆了FN的C端210个氨基酸片段，该片段基本上包含于各种形态的FN蛋白，基于此开发的抗体和试剂盒将能广泛敏感地识别FN蛋白。本试剂盒所有指标符合美国R＆D systems ELISA试剂盒各项指标的严格要求。目前，国外几大ELISA试剂盒生产商尚未有FN1的ELISA试剂盒的报道，而国内厂家的产品处于初创阶段，基本没有FN1的阳性内参，所得到的测量结论值得商榷。本试剂盒采用20个阴性样品的平均值加上2倍标准方差作为最低检出线，为0.028ng/ml，本发明提高了检出精度。

本发明选取包含了识别功能区的FN1片段，并将其作为抗原免疫小鼠得到特异性的高纯度单抗。对单抗进行特异性检测，用人脑组织进行蛋白印迹检测（图5），验证单抗能特异性识别人天然的FN1蛋白，以此单抗作为捕获FN1的抗体，保证了检测结果的特异性，最大程度避免了假阳性。验证多抗的特异性（图3和图4），随后以特异性多抗作为检测抗体，进一步排除了假阳性；加入酶标二抗，形成一个4组分的夹心形状的结合物，最后加入底物显色液，将以上得到的正确信号有效放大，对比同步平行进行的标准品和内参实验，进一步排除实验中的试剂或操作误差，最终得到可信赖的结论。

本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：

1、应用范围广泛：适用于人血清、组织和细胞培养物；

2、检测速度快：仅约3小时；

3、使用便捷：不需要复杂仪器；

4、步骤简单；

5、所得结果准确可靠：通过多步特异性的抗原、抗体的亲和反应，层层有效地降低了非特异性反应；而且除提供标准品外，还提供阳性对照，确保所得数据排除了众多试剂、温度等因子的干扰。

附图说明：

图1：本发明试剂盒盒体及组成成分。

图2：从大肠杆菌中表达纯化的FN1蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

图3：FN1多克隆抗体的蛋白印迹图，检测样本是NIH/3T3细胞。

图4：FN1多克隆抗体的免疫组化图，检测组织是石蜡包埋的人结肠癌，抗体稀释比例1:50。

图5：FN1单克隆抗体蛋白印迹图，检测组织人大脑，抗体稀释比1：500。

具体实施方式

1、试剂：

（1）包被液（0.02mol/l，pH9.6的碳酸钠——碳酸氢钠缓冲液）：Na₂CO₃ 0.6g，NaHCO₃ 1.16g，Na₂N₃ 0.2g，加双蒸水至1000ml，调pH至9.6。

（2）标本稀释液（含8%小牛血清pH7.4的0.01mol/l PBS）：NaCl 8.0g，NaH₂PO₄·2H₂O 0.3g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，KCl 0.2g，硫柳汞0.1g，加双蒸水至1000ml，调pH至7.4。

（3）封闭液（8%小牛血清/PBS溶液）：小牛血清80ml，0.01mol/l pH7.4 PBS 920ml。

（4）洗涤液（pH7.4 PBST）：NaCl 8.0g，NaH₂PO₄·2H₂O 0.3g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，Tween 20 0.5g，硫柳汞0.1g，加双蒸水至1000ml，调pH至7.4。

（5）酶标二抗（HRP标记的羊抗兔多抗）：购自美国R＆D systems，使用时用PBS稀释至1:10000稀释。

（6） FN1蛋白标准品：全长210个氨基酸的FN1蛋白的0.01mol/l PBS溶液，pH7.4，含55%甘油、0.1%BHA和0.01%硫柳汞，FN1终浓度为1mg/ml，使用时用标本稀释液稀释至16、8 、4、2、1、0.5、0.25、0 ng/ml 八个梯度。

（7） FN1的阳性对照样品： FN1蛋白的0.01mol/l、pH7.4的PBS溶液，含50%甘油、10%人血清、0.5%BSA、0.1%BHA和0.01%硫柳汞，FN1的终浓度为16μg/ml，使用时用标本稀释液作1:1000稀释。

（8）抗FN1的多抗：多抗的PBS溶液，含55%甘油、0.1%BHA和0.01%硫柳汞的0.01mol/l、pH7.4，多抗的终浓度为1mg/ml，使用时用标本稀释液作1:10000稀释。

（9）底物显色液（TMB-H₂O₂系统）：

① 底物液A（3',3',5,5'-四甲基联苯胺tetramethyl benzidine，TMB）：TMB 200毫克，无水乙醇100ml，加双蒸水至990ml；

② 底物液B（H₂O₂尿素）：Na₂HPO₄·12H₂O 36.8g，柠檬酸9.3g，1%过氧化氢尿素4.8ml，加双蒸水至1000ml，调pH至5.2。

③ 加入酶标孔前10分钟将底物液A和底物液B两者1:1混合，作为底物显色液。

（10）终止液（2mol/l H₂SO₄溶液）：烧杯内预先加入600ml双蒸水，将浓硫酸100ml缓慢滴加，不断搅拌，冷却至室温后定容至900ml。

2、主要仪器：

（1）酶标仪：BIO-RAD Model 680。

（2） ELISA反应板：美国Corning Incorporated costar R 96 Well EIA/RIA plate。

（3）水浴锅：购自美国Napco公司，Model 203。

3、方法：

（1）酶标二抗最适滴度的选择

① 将100ng/ml兔IgG包被反应板，洗涤；

② 将酶标二抗用标本稀释液作一系列稀释，加入孔内，37℃，孵育40分钟后，PBST洗涤3次；

③ 加入底物显色，20分钟后加入终止液；

④ 读取吸光值，取吸光值为1.0时的酶标二抗稀释度——1:10000作为酶标二抗的最佳稀释度。

（2）棋盘法选择单抗的最佳包被滴度

① 用包被液将单抗作一系列稀释后，4℃包被反应板16-24小时，PBST洗涤3次，除尽孔内液体；

② 加入标准样和FN1阳性对照、阴性参考血清溶液，孵育，洗涤；

③ 加入多抗溶液，孵育，洗涤；

④ 加入酶标二抗，孵育，洗涤；

⑤ 加入底物显色，20分钟后加入终止液；

⑥ 读取吸光值，选取FN1阳性对照样吸光值为0.8至1.0，阴性对照的吸光值小于0.1的单抗包被稀释度——1:10000作为最佳稀释度。

（3）单抗包被反应板的制备方法：

① 以碳酸盐缓冲液稀释单抗，包被96孔板，每孔100μl，置于4℃湿盒16-24小时，PBST洗涤3次，每次30秒，然后拍干，除尽孔内液体；

② 用含8%小牛血清的pH7.4的PBS封闭，每孔200μl，37℃，2小时，PBST洗涤3次，干燥后密封；该板即为抗FN1的单抗包被的酶标板，可用于FN1的特异性检测。

（4）试剂盒的构成：

所述试剂盒由特异性单抗包被反应板制得的酶标板、标本稀释液、洗涤液、酶标二抗、FN1标准品、FN1阳性对照样品、多抗、底物、终止液组成，具体组分为：

① 酶标板：FN1的单抗包被的酶标板；

② 标本稀释液：含8%小牛血清和pH7.4的0.01mol/l PBS；

③ 洗涤液：pH7.4 PBST；

④ 酶标二抗：HRP标记的羊抗兔IgG；

⑤ FN1标准品： FN1蛋白的PBS溶液，FN1终浓度为16 ng/ml；

⑥ FN1阳性对照样品： FN1蛋白的PBS溶液，FN1终浓度为1mg/ml；

⑦ 多抗：多抗的PBS溶液，抗体终浓度为1mg/ml；

⑧ 底物显色液：TMB-H₂O₂系统；

⑨ 终止液：2mol/l H₂SO₄溶液。

（5）利用上述试剂盒检测组织或细胞培养物、血清中FN1浓度的方法：

① 将待测样品、标准品、阳性对照样品进行处理：用标本稀释液将血清样品进行1:10000、阳性对照1:10000稀释；标准品用标本稀释液稀释成16、8 、4、2、1、0.5、0.25、0 ng/ml 八个梯度；

② 将待测样品、标准样、阳性对照依次加入酶标孔中，每孔100μl，37℃孵育1小时，PBST洗涤3次，每次洗涤均拍干孔内液体；

③ 将抗FN1的多抗加入酶标孔内，每孔100μl，37℃孵育1小时，PBST洗涤3次；

④ 加入酶标二抗，每孔100μl，37℃孵育40分钟，PBST洗涤3次，每次洗涤均拍干孔内液体；

⑤ 加入酶的底物，每孔100μl，室温孵育20分钟后加入终止液，每孔50μl；

⑥ 用酶标仪在450nm波长下测定吸光度，制作不同浓度标准品的吸光值为Y轴、以其浓度的对数为X轴制得标准曲线。

计算结果：如果阳性对照样品的测定值和标示值（16μg/ml）相比较，其变异系数小于15%，说明测定过程可靠，可依据标准曲线计算所测样品中FN1浓度。

Claims

1.人FN1的单抗包被酶标板的制法，通过下列步骤制备而成：

(1)以BC005858DNA为模板，PCR扩增FN1DNA片段156nt-786nt，与载体PET28a连接，转化BL21，表达大量30KD FN1蛋白片段；

(2)将30KD FN1蛋白免疫小白鼠，取其脾细胞与鼠骨髓瘤细胞融合，选择阳性杂交瘤细胞于鼠腹水中培养，纯化蛋白得到抗FN1的单抗；

(3)将所得单抗用pH9.6的碳酸盐缓冲溶液稀释后包被96孔板，100μl/孔，4℃16-24小时，PBST洗涤3次，每次30秒，然后除尽孔内液体；

(4)用含8％小牛血清的pH7.4的PBS封闭，每孔200μl，37℃，2小时，PBST洗涤3次，干燥后密封；该板即为抗FN1的单抗包被的酶标板，可用于FN1的特异性检测。

2.应用权利要求1所述的人FN1的单抗包被酶标板的ELISA检测试剂盒，其特征为：由权利要求1所述的抗FN1的单抗包被的酶标板、FN1标准品、FN1的阳性对照样品、抗FN1的多抗、样品稀释液、洗涤液、显色液、终止液构成，具体组分为：(1)酶标板：由FN1的单抗包被；(2)样品稀释液：含8％小牛血清和1％抗人IgG的pH7.4的0.01mol/l PBS；(3)洗涤液：pH7.4PBST；(4)酶标二抗：购自美国R&D systems的辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)标记的羊抗兔IgG；(5)FN1标准品：FN1的PBS溶液，FN1终浓度为1mg/ml；(6)FN1阳性对照样品：FN1的PBS溶液，FN1终浓度为1mg/ml；(7)抗FN1的多抗：多抗的PBS溶液，多抗的终浓度为1mg/ml；(8)显色液：TMB-H₂O₂系统；(9)终止液：2mol/l H₂SO₄溶液。