CN108362870A - 一种用于人fkbpl蛋白的酶联免疫检测及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种酶联免疫及其检测方法，是一种新的抗人FKBPL蛋白的单抗包被酶标板及酶联免疫试剂盒的制备方法。其关键之处主要在于用基因工程方法制备特异性的鼠抗人FKBP蛋白的单抗，并将此抗体纯化后包被于酶标板上，做为试剂盒的一部分。试剂盒还包括FKBPL的重组蛋白标准品、抗人FKBPL蛋白的多抗、辣根过氧化物酶标记的二抗、样本稀释液、抗体稀释液、显色液、终止液。试剂盒建立了快捷简便测定人血清和血浆中FKBPL蛋白浓度的测定方法。试剂盒主要用于供科学研究和临床实验的研究使用。

Description

一种用于人FKBPL蛋白的酶联免疫检测及制备方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体地说涉及一种检测人FKBPL蛋白(FK506结合蛋白类似蛋白)的酶联免疫检测试剂盒。本发明还涉及上述试剂盒的制备方法。
背景技术
FKBPL(FK506-binding protein like)即FK506结合蛋白，与免疫亲和素蛋白家族很相似，能够参与免疫调控以及细胞过程中的蛋白质折叠和运输。FKBPL被认为对射线诱导的抵抗能力方面有潜在的作用，还能够参与到细胞周期的调控中。FKBPL蛋白能够参与对细胞应激的应答，在1999年首次被单独提出来，并命名为DIR1（Robson T. et al. A novelhuman stress response-related gene with a potential role in inducedradioresistance[J]. Radiat Res, 1999, 152, 451-461.）后来又因为它与FKBP蛋白家族的同源性被重新分类，并重新命名为FKBL类似蛋白，并且有研究发现他能够参与新和成的P21蛋白（后来命名为Wisp39蛋白）的稳定合成。（Jascur T. et al. Regulation of p21(WAF1/CIP1) stability by WISp39, a Hsp90 binding TPR protein[J]. Mol Cell,2005, 17, 237-249.）FKBPL蛋白能够与Hsp90、糖皮质激素受体以及肌动蛋白相互作用，从而起到一定的信号传导作用，功能方面跟FKBPs家族蛋白很相似。（McKeen HD. et al. Anovel FK506-like binding protein interacts with the glucocorticoid receptorand regulates steroid receptor signaling[J]. Endocrinology, 2008, 149, 5724-5734.）有研究发现FKBPL蛋白能够影响雌激素受体信号传导，并且对乳腺癌药物tamoxifen的反应有着决定性作用。（McKeen HD. et al. FKBPL regulates estrogen receptorsignaling and determines response to endocrine therapy[J]. Cancer Res, 2010,70, 1090-1100.）罗宾逊等人在1999年发现将L132或者UM-UC-3人膀胱癌细胞中的FKBPL敲除掉，会导致细胞周期的G2、G1和S期减缓，并通过促进DNA单链断裂来增加细胞对x射线的抵抗能力。（Robson T. et al. A novel human stress response-related gene with apotential role in induced radioresistance[J]. Radiat Res, 1999, 152, 451-461.）Valentine等人在2011年发现全长的FKBPL的表达会抑制HMEC-1细胞的迁移，血小管以及体内外微血管的形成。（Valentine A. et al. FKBPL and peptide derivatives:novel biological agents that inhibit angiogenesis by a CD44-dependentmechanism[J]. Clin Cancer Res, 2011, 17, 1044-1056.）McKeen等人通过基因芯片技术发现FKBPL的高表达与乳腺癌患者存活率之间存在高度相关性，FKBPL的药物研发也深入到癌症I期的研究中。
因此，FKBPL更是一种在癌症中具有独特和重要功能的标记物，这对于癌症前期诊断具有重大意义。（Robson T. et al. The therapeutic and diagnostic potential ofFKBPL; a novel anticancer protein[J]. Drug Discov Today, 2012, 17, 544-548.）而目前国际上几大ELISA试剂盒生产商只是单一地生产FKBPL蛋白或抗体，而尚未有生产整套FKBPL ELISA试剂盒的报道，缺乏FKBPL在人的血液、组织或细胞中定量的研究。本发明构建了一套用酶联免疫方法定量测定人样本中内源性FKBPL的浓度。
发明内容
本发明的目的：提供一种新的用于人血清、或细胞培养上清中人源FKBPL定量检测的ELISA试剂盒。
本发明技术方案如下：
1、抗人FKBPL的特异性单抗包被反应板的制备，通过以下步骤：
（1）48 KD FKBPL蛋白片段的获得：
48 KD FKBPL蛋白片段的原核表达：以BC004168 DNA(购自美国典型培养物保藏中心，ATCC)为模板，用一对特异性的正反引物，PCR扩增FKBPL DNA片段（259nt-966nt），将所得片段克隆于载体pET28a（购自德国Merck公司），转化BL21（DE3）（购自Merck）感受态大肠杆菌，根据卡那霉素抗性筛选阳性克隆。提取阳性克隆的质粒DNA进行鉴定，得到与目的片段分子量相一致的片段，初步判定为阳性。以PCR阳性克隆提取质粒DNA，进行测序，结果表明FKBPLcDNA片段正确克隆至pET28a，为一个具有708 bp的完整开放式阅读框，与GenBank中人源FKBPL基因100%同源，推算其表达的蛋白质分子量为48 KD，PI为5.2。
①48 KD FKBPL蛋白片段的鉴定：转化了重组质粒的大肠杆菌BL21经诱导后将菌体收集，超声波裂解，菌体蛋白经SDS-PAGE蛋白电泳及考马斯染色显示，在48 KD附近新增一条带，经Western blotting鉴定，能与FKBPL的抗体发生强阳性反应，说明该48 KD的FKBPL蛋白具有较强的免疫原性。
② 48 KD的FKBPL蛋白片段的制备与纯化：经大量培养、诱导、表达，使用Ni2+亲和层析柱（购自Pharmacia）纯化带有6×His标记的FKBPL蛋白，得到大量48 KD FKBPL蛋白片段。
（2） 制备抗FKBPL的单抗：
① FKBPL蛋白的动物免疫：将48KD的FKBPL蛋白片段与福氏佐剂混合并经充分乳化后，皮下注射，免疫鼠龄在8～12周的BALB/c健康小鼠（购自湖北省实验动物研究中心）3至4只，每次免疫间隔为2周，直至血清效价高于40000:1。
②杂交瘤细胞的制备：在末次免疫后4天，分离鼠脾细胞，在PEG存在条件下选择与对数生长期的Sp2/0骨髓瘤细胞株（购自中国典型培养物保藏中心，CCTCC）以4:1的比例融合，饲养细胞来自小鼠腹腔细胞。融合后的细胞以含HAT的培养基筛选，经有限稀释后选出高抗体分泌孔，将孔内细胞克隆，进行抗原特异的ELISA测定，挑选高分泌性细胞株扩大培养或冻存。
③单抗制备：将分泌特异性单抗的杂交瘤细胞株进行小鼠腹腔接种，待产生明显腹水后收集腹水，用葡萄球菌A蛋白交联的亲和层析柱（购自Pharmacia公司）纯化单抗。抗体存于含55%甘油、0.1%BHA和0.01%硫柳汞的0.01mol/l、pH7.4的PBS之中。
（3）以所得单抗包被反应板：单抗用pH 9.6的碳酸盐缓冲溶液稀释成适当浓度，包被96孔板，每孔100μl，置于4℃湿盒 16-24小时，PBST洗涤3次，每次30秒，然后拍干，除尽孔内液体。
（4）封闭：用含8%小牛血清的pH7.4的PBS封闭，每孔200μl，37℃，2小时孵育后，PBST洗涤3次，干燥后密封；该板即为抗FKBPL的单抗包被的酶标反应板，可用于FKBPL的定量检测。
2、FKBPL标准品（FKBPL蛋白溶液）的制备：
（1）FKBPL蛋白的原核表达：以DNA(购自ATCC)为模板，用一对特异性的正反引物，PCR扩增FKBPL（259nt-966nt）目的基因，将所得基因克隆于载体pET28a，转化BL21（DE3）感受态大肠杆菌，根据卡那霉素抗性筛选阳性克隆。提取阳性克隆的质粒DNA进行鉴定，得到与目的片段分子量相一致的片段，初步判定为阳性。以PCR阳性克隆提取质粒DNA，进行测序，结果表FKBPL蛋白质的cDNA正确克隆至pET28a，为一个具有708 bp的完整开放式阅读框，与GenBank中FKBPL基因100%同源，推算其分子量为48 KD，PI为5.2。
（2）FKBPL蛋白的鉴定：转化了重组质粒的大肠杆菌BL21经诱导后将菌体收集，超声波裂解，菌体蛋白经SDS-PAGE蛋白电泳及考马斯染色显示，在48 KD附近新增一条带，经Western blotting鉴定，能与FKBPL的抗体发生强阳性反应，说明FKBPL蛋白具有较强的免疫原性。
（3）FKBPL蛋白的制备与纯化：经大量培养、诱导、表达，使用Ni2+亲和层析柱纯化，得到大量FKBPL蛋白。
（4） FKBPL标准品制备：将FKBPL蛋白保存于含55%甘油、0.1%BHA和0.01%硫柳汞的0.01mol/l、pH7.4的PBS之中，并使FKBPL蛋白的终浓度为10 ng/mL
3、FKBPL阳性对照样品的制备：将FKBPL蛋白溶于含50%甘油、0.5%BSA、0.1%BHA和0.01%硫柳汞的0.01mol/l、 pH7.4的PBS之中，并使FKBPL蛋白的终浓度为10 ng/ml。
4、FKBPL的多抗的制备：
（1）动物免疫：取纯化好的FKBPL蛋白与福氏佐剂混合并经充分乳化后，脊柱两侧、对称多点皮下注射，免疫3-4月龄、体重在1.7Kg以上的健康日本大耳白兔（购自湖北省实验动物研究中心）3至4只，每次免疫间隔为2周，免疫1月后再次免疫后第8天耳静脉取血测血清效价，直至血清效价高于40000:1。
（2）血清获取：兔中耳动脉取血，每次40ml，静置30分钟后离心，3000rpm、5分钟，上清即为血清。
（3）多抗的纯化：用FKBPL蛋白交联的亲和层析柱（购自Pharmacia）纯化，得到FKBPL的多抗，保存于含55%甘油、0.1%BHA和0.01%硫柳汞的0.01mol/l、pH7.4的PBS之中，多抗的终浓度为1mg/ml。
（4）将得到多抗进行人血浆的蛋白印迹和睾丸组织样本免疫组化，图3，结果说明我们制得多抗能与人天然的FKBPL蛋白反应，且具有特异性。
5、酶标二抗：购自美国R＆D systems，为辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP）标记的羊抗兔IgG。
6、本试剂盒对FKBPL的 ELISA检测步骤包括：
（1）待测样品、标准样、阳性对照依次加入微孔中，进行孵育，FKBPL将与固相载体表面的捕获抗体——预先包被在孔内的抗体相结合。
（2）经过洗涤，将特异性的抗FKBPL的多抗加入孔内，在第二次孵育中，多抗扮演检测抗体，并与第一次孵育中被捕获的FKBPL结合。
（3）洗去多余的多抗，加入酶标二抗，在第三次孵育中，酶标二抗与上一步中的多抗——检测抗体相结合，形成一个4组分的夹心形状的结合物。
（4）洗去未结合的酶标二抗，加入酶的底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺（tetramethyl benzidine，TMB），孔内液体在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，加入终止液，转化成黄色。颜色的深浅和样品中FKBPL的含量呈正相关。
（5）用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（O.D.值），计算样品中FKBPL浓度。
这种新的FKBPL ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒由上述特异性的FKBPL的单抗包被的酶标板、FKBPL蛋白标准品、FKBPL的阳性对照样品、FKBPL的多抗、辣根过氧化物酶标记的二抗构成，具体组分为：（1）酶标板：由FKBPL的单抗包被；（2）样品稀释液：含8%小牛血清pH7.4的0.01mol/l PBS；（3）洗涤液；（4）FKBPL蛋白标准品；（5）FKBPL的阳性对照样品；（6）FKBPL的多抗；（7）辣根过氧化物酶标记的二抗；（8）显色液：TMB-H2O2系统；（9）终止液：2mol/l H2SO4溶液。
本试剂盒所有指标符合美国R＆D systems ELISA试剂盒各项指标的严格要求。目前，国外几大ELISA试剂盒生产商尚未有FKBPL的ELISA试剂盒的报道，而国内厂家的产品处于初创阶段，基本没有FKBPL的阳性内参，所得到的测量结论值得商榷。本试剂盒采用20个阴性样品的平均值加上2倍标准方差作为最低检出线，为7 pg/ml，本发明提高了检出精度。
本发明选取包含了识别功能区的FKBPL片段，并将其作为抗原免疫小鼠得到特异性的高纯度单抗。对单抗进行特异性检测，用人血浆进行蛋白印迹检测（图5），验证单抗能特异性识别人天然的FKBPL蛋白，以此单抗作为捕获FKBPL的抗体，保证了检测结果的特异性，最大程度避免了假阳性。验证多抗的特异性（图2，图3和图4），随后以特异性多抗作为检测抗体，进一步排除了假阳性；加入酶标二抗，形成一个4组分的夹心形状的结合物，最后加入底物显色液，将以上得到的正确信号有效放大，对比同步平行进行的标准品和内参实验，进一步排除实验中的试剂或操作误差，最终得到可信赖的结论。
本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：
1、应用范围广泛：适用于人血清、组织和细胞培养物；
2、检测速度快：仅约3小时；
3、使用便捷：不需要复杂仪器；
4、步骤简单；
5、所得结果准确可靠：通过多步特异性的抗原、抗体的亲和反应，层层有效地降低了非特异性反应；而且除提供标准品外，还提供阳性对照，确保所得数据排除了众多试剂、温度等因子的干扰。
附图说明：
图1：本发明试剂盒盒体及组成成分。
图2：用MCF-7 细胞检测FKBPL蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
图3：用人脑组织总蛋白检测FKBPL蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
图4： FKBPL多克隆抗体的免疫组化图，检测样本是石蜡包埋的人睾丸，抗体稀释比1:50。
图5：FKBPL多克隆抗体的免疫组化图，检测样本是石蜡包埋的人乳腺癌组织，抗体稀释比1:50。
具体实施方式
1、试剂：
（1）包被液（0.02mol/l，pH9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液）：Na2CO3 0.6g，NaHCO31.16g，Na2N3 0.2g，加双蒸水至1000ml，调pH至9.6。
（2）标本稀释液（含8%小牛血清pH7.4的0.01mol/l PBS）：NaCl 8.0g，NaH2PO4·2H2O 0.3g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，KCl 0.2g，硫柳汞0.1g，加双蒸水至1000ml，调pH至7.4。
（3）封闭液（8%小牛血清/PBS溶液）：小牛血清80ml，0.01mol/l pH7.4 PBS 920ml。
（4）洗涤液（pH7.4 PBST）：NaCl 8.0g，NaH2PO4·2H2O 0.3g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，Tween 20 0.5g，硫柳汞0.1g，加双蒸水至1000ml，调pH至7.4。
（5）酶标二抗（HRP标记的羊抗兔多抗）：购自美国R＆D systems，使用时用PBS稀释至1:10000稀释。
（6）FKBPL蛋白标准品：全长235个氨基酸的FKBPL蛋白的0.01mol/l PBS溶液，pH7.4，含55%甘油、0.1%BHA和0.01%硫柳汞，FKBPL终浓度为10 ng/ml，使用时用标本稀释液稀释至10、5 、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0 ng/ml 八个梯度。
（7）FKBPL的阳性对照样品： FKBPL蛋白的0.01mol/l、pH7.4的PBS溶液，含50%甘油、10% 牛血清、0.5%BSA、0.1%BHA和0.01%硫柳汞，FKBPL的终浓度为10 ng/ml，使用时用标本稀释液作1:1000稀释。
（8）抗FKBPL的多抗：多抗的PBS溶液，含55%甘油、0.1%BHA和0.01%硫柳汞的0.01mol/l、pH7.4，多抗的终浓度为1mg/ml，使用时用标本稀释液作1:10000稀释。
（9）底物显色液（TMB-H2O2系统）：
① 底物液A（3',3',5,5'-四甲基联苯胺tetramethyl benzidine，TMB）：TMB 200毫克，无水乙醇100ml，加双蒸水至990ml；
②底物液B（H2O2尿素）：Na2HPO4·12H2O 36.8g，柠檬酸9.3g，1%过氧化氢尿素4.8ml，加双蒸水至1000ml，调pH至5.2。
③加入酶标孔前10分钟将底物液A和底物液B两者1:1混合，作为底物显色液。
（10）终止液（2mol/l H2SO4溶液）：烧杯内预先加入600ml双蒸水，将浓硫酸100ml缓慢滴加，不断搅拌，冷却至室温后定容至900ml。
2、主要仪器：
（1）酶标仪：BIO-RAD Model 680。
（2）ELISA反应板：美国Corning Incorporated costar R 96 Well EIA/RIAplate。
（3）水浴锅：购自美国Napco公司，Model 203。
3、方法：
（1）酶标二抗最适滴度的选择
①将100ng/ml兔IgG包被反应板，洗涤；
②将酶标二抗用标本稀释液作一系列稀释，加入孔内，37℃，孵育40分钟后，PBST洗涤3次；
③加入底物显色，20分钟后加入终止液；
④读取吸光值，取吸光值为1.0时的酶标二抗稀释度——1:10000作为酶标二抗的最佳稀释度。
（2）棋盘法选择单抗的最佳包被滴度
①用包被液将单抗作一系列稀释后，4℃包被反应板16-24小时，PBST洗涤3次，除尽孔内液体；
②加入标准样和FKBPL阳性对照、阴性参考溶液，孵育，洗涤；
③加入多抗溶液，孵育，洗涤；
④加入酶标二抗，孵育，洗涤；
⑤加入底物显色，20分钟后加入终止液；
⑥读取吸光值，选取FKBPL阳性对照样吸光值为0.8至1.0，阴性对照的吸光值小于0.1的单抗包被稀释度——1:10000作为最佳稀释度。
（3）单抗包被反应板的制备方法：
①以碳酸盐缓冲液稀释单抗，包被96孔板，每孔100μl，置于4℃湿盒16-24小时，PBST洗涤3次，每次30秒，然后拍干，除尽孔内液体；
②用含8%小牛血清的pH7.4的PBS封闭，每孔200μl，37℃，2小时，PBST洗涤3次，干燥后密封；该板即为抗FKBPL的单抗包被的酶标板，可用于FKBPL的特异性检测。
（4）试剂盒的构成：
所述试剂盒由特异性单抗包被反应板制得的酶标板、标本稀释液、洗涤液、酶标二抗、FKBPL标准品、FKBPL阳性对照样品、多抗、底物、终止液组成，具体组分为：
①酶标板：FKBPL的单抗包被的酶标板；
②标本稀释液：含8%小牛血清和pH7.4的0.01mol/l PBS；
③洗涤液：pH7.4 PBST；
④酶标二抗：HRP标记的羊抗兔IgG；
⑤FKBPL标准品： FKBPL蛋白的PBS溶液，FKBPL终浓度为10 ng/ml；
⑥FKBPL阳性对照样品： FKBPL蛋白的PBS溶液，FKBPL终浓度为1mg/ml；
⑦ 多抗：多抗的PBS溶液，抗体终浓度为1mg/ml；
⑧底物显色液：TMB-H2O2系统；
⑨终止液：2mol/l H2SO4溶液。
（5）利用上述试剂盒检测组织或细胞培养物、血清中FKBPL浓度的方法：
①将待测样品、标准品、阳性对照样品进行处理：用标本稀释液将血清样品进行1:10000、阳性对照1:10000稀释；标准品用标本稀释液稀释成2000、1000 、500、250、125、62.5、31.25、0 pg/ml 八个梯度；
②将待测样品、标准样、阳性对照依次加入酶标孔中，每孔100μl，37℃孵育1小时，PBST洗涤3次，每次洗涤均拍干孔内液体；
③将抗FKBPL的多抗加入酶标孔内，每孔100μl，37℃孵育1小时，PBST洗涤3次；
④加入酶标二抗，每孔100μl，37℃孵育40分钟，PBST洗涤3次，每次洗涤均拍干孔内液体；
⑤加入酶的底物，每孔100μl，室温孵育20分钟后加入终止液，每孔50μl；
⑥用酶标仪在450nm波长下测定吸光度，制作不同浓度标准品的吸光值为Y轴、以其浓度的对数为X轴制得标准曲线。
⑦计算结果：如果阳性对照样品的测定值和标示值（10 ng/ml）相比较，其变异系数小于10%，说明测定过程可靠，可依据标准曲线计算所测样品中FKBPL浓度。

Claims (2)

1.人FKBPL的单抗包被酶标板的制法，通过下列步骤制备而成：
以BC004168 DNA为模板，PCR扩增FKBPL DNA片段（259nt-966nt）基因片段，与载体PET28a连接，转化BL21，表达大量48 KD FKBPL蛋白片段；
将48 KD FKBPL蛋白免疫小白鼠，取其脾细胞与鼠骨髓瘤细胞融合，选择阳性杂交瘤细胞于鼠腹水中培养，纯化蛋白得到抗FKBPL的单抗；
将所得单抗用pH9.6的碳酸盐缓冲溶液稀释后包被96孔板，100μl/孔，4℃ 16-24小时，PBST洗涤3次，每次30秒，然后除尽孔内液体；
用含8% 小牛血清的pH7.4的PBS封闭，每孔200μl，37℃，2小时，PBST洗涤3次，干燥后密封；该板即为抗FKBPL的单抗包被的酶标板，可用于FKBPL的特异性检测。
2.应用权利要求1所述的人FKBPL的单抗包被酶标板的ELISA检测试剂盒，其特征为：由权利要求1所述的抗FKBPL的单抗包被的酶标板、FKBPL标准品、FKBPL的阳性对照样品、抗FKBPL的多抗、样品稀释液、洗涤液、显色液、终止液构成，具体组分为：（1）酶标板：由FKBPL的单抗包被；（2）样品稀释液：含8% 小牛血清的pH7.4的0.01mol/l PBS；（3）洗涤液：pH7.4PBST；（4）酶标二抗：购自美国R＆D systems的辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的羊抗兔IgG；（5）FKBPL标准品：FKBPL的PBS溶液，FKBPL终浓度为10 ng/ml；（6）FKBPL阳性对照样品：FKBPL的PBS溶液，FKBPL终浓度为10 ng/ml；（7）抗FKBPL的多抗：多抗的PBS溶液，多抗的终浓度为1mg/ml；（8）显色液：TMB-H2O2系统；（9）终止液：2mol/L H2SO4溶液。
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