CN102998448A - 来源于前列腺分泌液中的前列腺癌标记物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及来源于前列腺分泌液中的前列腺癌标记物。揭示了一组新的前列腺癌标志物：结合珠蛋白(Haptoglobin)α链、纤连蛋白1(Fibronectin 1)、白蛋白(Albumin)和/或SERPINB1。前列腺液中，这些蛋白质在前列腺癌患者中的表达显著高于非癌患者的表达。因此，可基于这些蛋白质来开发诊断、评估、预后前列腺癌的试剂或试剂盒。

Description

来源于前列腺分泌液中的前列腺癌标记物

技术领域

本发明属于生物技术以及临床诊断领域；更具体地，本发明涉及来源于前列腺分泌液中的前列腺癌标记物。

背景技术

目前诊断前列腺癌(PCa)主要的诊断标记物是PSA，但其临床诊断上存在特异性和灵敏度不高的问题，导致临床实践中面临大量不必要的活检。这些问题一方面给病人带来许多副作用，另外一方面造成医疗资源和费用的大量浪费。

早期诊断PCa、对确诊的PCa有选择地进行治疗或单纯随访观察、避免过度治疗是成功诊治PCa的关键。目前在临床上主要依靠PSA检测、直肠指检、影像学检查和组织病理检查等手段，但它们都存在一定的局限性，给早期PCa的确诊、治疗选择和预后判断带来了一定困难。例如临床上广泛应用于早期诊断PCa的标志物为PSA，但是PSA特异性和敏感性都偏低。约15％PCa患者的血清PSA在正常范围，前列腺炎和前列腺良性增生患者的PSA水平也会出现升高，而且PSA对判定PCa是否转移及预后的作用不确切。

目前对前列腺癌评价，分型和预后基本还是停留在用Nomograms上(常用的是用Partin表)，主要指标大多是临床指标，例如活检的Gleason评分，临床分期，血清中PSA水平进行综合评价。在一个大规模的研究中，研究者发现Partin表预测淋巴结侵入，储精囊侵入，前列腺胞外，或是局限在前列腺的癌症等的检测的AUC分别为0.77，0.74，0.62和0.68。因此，迫切需要寻找新的PCa标志物。

直接用血清来寻找癌症标志物，具有很大的困难，也会碰到许多挑战，即使在拥有先进质谱仪的状况下，这种挑战也仍然存在。因为血清里有几种高丰度蛋白，如白蛋白、免疫球蛋白、补体因子，它们构成血清中97％的蛋白，而生物标记物通常是表达量相当低的蛋白。血清中蛋白的表达丰度是很大的，比如白蛋白的浓度是7.5×10⁵nmol/L；而PSA浓度在3ng/ml，相当于10^-1nmol/L，这说明PSA和白蛋白之间相差7.5×10⁶倍。目前，质谱所能检测到的蛋白动态范围只有10²-10⁴，远远不够，即使利用蛋白抗体柱去除高丰度蛋白，成效仍然不明显。即使去掉99％的蛋白，它的动态范围仍然接近于10⁵。因此有必要从其他来源，寻找血清标记物。

和血液相比，作为用于前列腺癌临床诊断的样品，前列腺分泌液具有以下三方面优势：1、理论上，前列腺液中的成分比血液中的成分更能直接、真实地反映前列腺癌的病理特点。2、前列腺液的来源具有高度的前列腺特异性。因此，前列腺分泌液(Expressed Prostatic Secretions，EPS)中所有的蛋白质(哪怕它们也存在于别的器官)都具有作为前列腺特异蛋白的资格用于新的前列腺临床诊断癌标记蛋白的筛选。这无疑显著地降低了筛选新的前列腺癌标记蛋白的难度。3、那些在血液中因水平极低而不易被发现的前列腺癌标记蛋白如果也在前列腺液中存在的话，则较容易被检测出来。这一点对寻找早期前列腺癌标记蛋白无疑具有特别的意义，这是因为早期前列腺癌和晚期的相比，其体积很小，因而分泌物就更少。

本发明人在2008年率先对前列腺液进行了蛋白质组学研究和严格的过滤分析，共115种蛋白质成功地在前列腺分泌液鉴定出(Li R等，Analysis ofexpressed prostatic secretions reveals rich source of biomarker candidates，Proteomics Clinical Application.2008；2：543-555)。和国外不同实验室报道的前列腺癌组织转录水平的数据相比较，本发明人发现其中48种蛋白质的mRNA水平在前列腺癌组织也是增加的。随后前列腺分泌液的蛋白质组得到了更深入的研究，也有更多的蛋白质被鉴定(Drake，R.R.，et al.，Clinical collection and proteinproperties of expressed prostatic secretions as a source for biomarkers of prostaticdisease.J Proteomics，2009.72(6)：p.907-17；Drake，R.R.，et al.，In-depthproteomic analyses of direct expressed prostatic secretions.J Proteome Res，2010.9(5)：p.2109-16.)。

与国际上规模很大的、筛选具有临床诊断应用前景的、新的前列腺癌标志物的研究相比，在过去十多年里将前列腺分泌液作为前列腺癌临床诊断研究样品的报道却是寥寥无几。因此，本领域很有必要研究优化获取前列腺液的方法以及研究前列腺液中的新的蛋白标记物。

发明内容

本发明的目的在于提供来源于前列腺分泌液中的前列腺癌标记物。

本发明的另一目的在于提供所述来源于前列腺分泌液中的前列腺癌标记物的用途。

在本发明的第一方面，提供一种结合珠蛋白(Haptoglobin)α链、纤连蛋白1(Fibronectin 1)、白蛋白(Albumin)、PSA和/或SERPINB1的用途，用于制备从前列腺液中诊断前列腺癌的试剂。

在一个优选例种，所述的试剂还用于前列腺癌的后和/或前列腺癌治疗疗效的评估，较佳地以前列腺液作为样本。

在另一优选例中，所述的试剂是特异性识别结合珠蛋白α链、纤连蛋白1、白蛋白、PSA和/或SERPINB1的抗体。

在另一优选例中，所述的抗体是多克隆抗体或单克隆抗体。

在另一优选例中，对应结合珠蛋白(Haptoglobin)α链、纤连蛋白1(Fibronectin)、白蛋白(Albumin)、PSA和/或SERPINB1这5种蛋白质，同时制备2种、3种、4种或5种所述的从前列腺液中诊断前列腺癌的试剂。

在另一优选例中，所述的结合珠蛋白(Haptoglobin)α链还包括其糖基化修饰体。

在本发明的另一方面，提供一种用于诊断前列腺癌的试剂，其是特异性识别结合珠蛋白α链、纤连蛋白1、白蛋白、PSA和/或SERPINB1的抗体。

在另一优选例中，所述的抗体特异性识别结合珠蛋白α链，其是多克隆抗体。

在另一优选例中，所述的抗体是AbCam公司产品(ab85846)。

在本发明的另一方面，提供一种用于从前列腺液中诊断前列腺癌的试剂盒，其中包括：

容器，以及位于容器中的抗体，该抗体特异性识别结合珠蛋白α链。

在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括：

容器，以及位于容器中的抗体，该抗体特异性识别纤连蛋白1；

容器，及位于容器中的抗体，该抗体特异性识别白蛋白；和/或

容器，及位于容器中的抗体，该抗体特异性识别SERPINBl。

在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括：容器，及位于容器中的抗体，该抗体特异性识别PSA。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、前列腺分泌液的2D-电泳图。将前列腺癌患者与同龄人的非癌患者的EPS样品各20份分别等量混合后各取60ug用于每一块2D胶的电泳。IEF范围是3-10。胶的浓度为12％。

图2、前列腺癌患者组与非癌对照组前列腺分泌液中Hepatoglobin水平的检测。

具体实施方式

本发明人致力于从前列腺分泌液中寻找前列腺癌的特异性标志物(标记物)，经过深入的研究，揭示了一组新的前列腺癌标志物：结合珠蛋白(Haptoglobin)α链、纤连蛋白1(Fibronectin 1)、白蛋白(Albumin)、PSA和/或SERPINB1。前列腺液中，这些蛋白质在前列腺癌患者中的表达显著高于非癌患者的表达。因此，可基于这些蛋白质来开发从前列腺液中诊断、评估、预后前列腺癌的试剂。

前列腺癌标志物

结合珠蛋白(Haptoglobin)是一种已知的蛋白，人类Hepatoglobin蛋白全长由406个氨基酸组成，该蛋白的GenBank登录号为(Hs.513711)。其中前导肽由18个氨基酸组成，α链由144个氨基酸组成。β链由244个氨基酸组成。α链与β链还能组合成不同比例的聚合体。此外，在α链上还存在各种糖基化修饰。

纤连蛋白1(Fibronectin 1)是一种已知的蛋白，人类Fibronectin 1蛋白全长由2265个氨基酸组成，该蛋白的GenBank登录号为(AB.191261.1)。

白蛋白(Albumin)是一种已知的蛋白，人类Albumin蛋白全长由609个氨基酸组成，该蛋白的GenBank登录号为NP_000468。

SERPINB1是一种已知的蛋白，人类SERPINB1蛋白全长379个氨基酸组成，该蛋白的GenBank登录号为AAH09015.1。

PSA是一种已知的前列腺癌标志物，人类PSA蛋白全长由261个氨基酸组成，该蛋白的GenBank登录号为MIM：176820。

上述各种蛋白质的片段、衍生物或修饰形式也包括在本发明中，只要这些蛋白的片段、衍生物或修饰形式上包括该蛋白特有的决定簇(或表位)，也能够用于制备特异性的抗体，所获得的抗体对于识别相应的蛋白具有特异性，不会识别其它不相关蛋白。

本发明人通过分析前列腺癌患者的前列腺分泌液的蛋白表达情况，发现结合珠蛋白α链、纤连蛋白1、白蛋白、PSA和/或SERPINB1与前列腺癌密切相关。在前列腺癌患者的的前列腺分泌液中，结合珠蛋白α链、纤连蛋白1、白蛋白和SERPINB1发生显著的表达增加。

基于本发明人的新发现，可以以结合珠蛋白α链、纤连蛋白1、白蛋白、PSA和/或SERPINB1作为检测(确定、鉴定或诊断)哺乳动物前列腺癌的标志物(标记物)。通过分析这些蛋白中一种或多种蛋白的表达情况(包括基因水平上或蛋白水平上)，从而得知受试者的前列腺癌的情况，为疾病的诊断或预后提供依据，或可早期评估受试者罹患前列腺癌的可能性。

可采用各种技术来检测结合珠蛋白α链、纤连蛋白1、白蛋白、PSA和/或SERPINB1的表达情况，这些技术均包含在本发明中。检测可以针对蛋白，也可针对相应的cDNA，或针对mRNA。可用已有的技术如(但不限于)：Western印迹、SDS-PAGE、原位杂交、酶联免疫反应、聚合酶链反应(PCR)、Southern印迹、蛋白序列分析、质谱分析或DNA序列分析等。

较佳地，本发明以前列腺液作为待测样本(样品)。

试剂和试剂盒

本发明还提供了用于在分析物中检测结合珠蛋白α链、纤连蛋白1、白蛋白、PSA和/或SERPINB1的表达情况的试剂。所述的试剂例如是：特异性识别(或结合)结合珠蛋白α链、纤连蛋白1、白蛋白、PSA或SERPINB1的抗体。

作为本发明的一种优选方式，利用所述蛋白的特异性抗体来检测所述蛋白的表达情况以及表达量，从而可作出判断。较佳地，还设置正常的对照组，以确定所述蛋白在正常动物体中的表达情况。较佳地，所述的特异性抗体上携带可识别信号，从而可方便、直观地获得检测结果。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的结合珠蛋白α链、纤连蛋白1、白蛋白、PSA或SERPINB1、或其具有抗原性的片段，可被施用于动物(如家兔，小鼠，大鼠等)以诱导多克隆抗体的产生，多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。与之相似的，表达结合珠蛋白α链、纤连蛋白1、白蛋白、PSA或SERPINB1、或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。所述的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。

本发明还提供了用于在分析物中检测结合珠蛋白α链、纤连蛋白1、白蛋白和/或SERPINB1的表达情况，从而分析前列腺癌状况的试剂盒，该试剂盒包括：容器，以及分别位于容器中的特异性识别结合珠蛋白α链、纤连蛋白1、白蛋白或SERPINB1的抗体。每一种抗体位于一个容器中。

此外，所述的试剂盒中还可包括用于杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：杂交液、酶、对照液、显色液、洗液等。

此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书等，从而便于本领域技术人员应用该试剂盒。

本发明的主要优点在于：

本发明获得了一批新的前列腺癌相关蛋白质，可用于开发新的前列腺癌(PCa)临床诊断试剂以及诊断方法。

本发明解决了现有技术中前列腺癌临床实践中面临的由于诊断标记物PSA的特异性和灵敏度造成的大量不必要的活检，这些问题一方面给病人带来许多副作用，另外一方面造成医疗资源和费用的大量浪费。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1、前列腺液的收集与处理

1.1向1.5ml Eppendorf管加入5-10ul、300倍工作溶度的、3种蛋白质水解酶抑制剂混合物(工作溶度如下：Leupepetin 5ug/ml，Antipain 5ug/ml与Chymo statin 10ug/ml)。

分装后，将管存放-20℃冰箱待用，或直接用于下面步骤。

1.2利用常规的临床技术采集前列腺液滴入1.1的管中(约50ul)。

1.3简单混匀(避免Votexing)。以下步骤都在低温进行。

1.4离心。3000rpm/分，5-10分钟。

1.5将上清液收集，转入另一个预冷的Eppendorf管，这部分就是前列腺分泌液(EPS)。转移液体时，不能扰动沉淀部分。

1.7以上所有样品存放-80℃冰箱。

1.8标记好样品。保留每一个病人(或样品提供人)的基本病情资料(PSA水平，肿瘤分级)。

实施例2、样品的蛋白质组学研究方法

2.1EPS样品处理

2.1.1常规方法定量测定每一份样品的蛋白质浓度。

2.1.2将前列腺癌患者与同龄人的非癌患者的EPS样品各20份分别等量混合(20ug蛋白/份)，即分别为实验组样品(30份前列腺癌患者的样品混合液)与对照组样品(30份非癌患者的样品混合液)。

2.1.2向样品中加入三氯醋酸，终浓度为50％(重量/体积)，用于沉淀蛋白质，并达到适度净化蛋白质的目的。将样品在5000rpm/min速度离心5分钟，除去上清液。从冰箱中取-20℃冷冻保存的常规样品水化缓冲液，置室温溶解。向每组样品加入总体积为250ul的样品水化缓冲液，充分混匀。

2.2双向电泳

2.2.1从冰箱中取冷冻保存的IPG预制胶条，室温中放置5分钟。然后沿着聚焦盘的边缘至左而右线性连续性地加入样品溶液。上样量为80ug/条。

2.2.2用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层，胶面朝下置于聚焦盘中样品溶液上，使得胶条的正极对应于聚焦盘的正极，确保胶条两端与正负电极紧密接触。按常规操作进行主动水化。

2.2.3第一向等电聚焦(IEF)

IPG胶条水化后，进行等电聚焦(电泳条件：500v 2hrs)。等电聚焦结束后，迅速将IPG胶条分别置于5ml平衡缓冲液A和5ml平衡缓冲液B中各平衡20min。

2.2.4为了进行第二向SDS-PAGE电泳，配制12％垂直SDS凝胶：将垂直SDS凝胶溶液注入玻璃板夹层中，上部留1cm的空间，并将水饱和正丁醇封住最上面，聚合2小时。此间，将经过平衡的IPG胶条浸入电泳缓冲液中30秒钟。然后将IPG胶条放置于SDS胶面上，使二者充分接触，并避免操作时产生气泡。用热的低熔点琼脂糖封胶。将凝胶转移至电泳槽中，进行电泳，至溴酚蓝离胶下沿0.5cm)。将跑好的胶进行常规银染。

前列腺癌患者的EPS样品、非前列腺癌患者的EPS样品的电泳结果如图1所示。

2.3软件分析

银染显色的凝胶通过GS-710光密度扫描仪获取图像，Imagemaster(GEhealthcare公司)进行分析统3次重复实验的2-D图谱，得到合乎统计学标准的蛋白质差异点。

本发明人共发现至少15个具有统计学意义的差异点。

2.4蛋白质的质谱鉴定

2.4.1将所需研究的蛋白点从胶上割下，用胰蛋白酶进行胶内酶解后，萃取、并冻干酶切产物肽段。

2.4.2酶切产物肽段用纳升级液相色谱(LC MDLC整机系统，GE公司)分离。经过C18预柱脱盐后，通过C18分析柱(75um×15cm)分离。分离条件0.1％(体积/体积)甲酸，流速300nL/min，90分钟梯度洗脱。每一个需要进一步确认的蛋白质，其胰蛋白酶切后的肽段为母离子经过MS/MS(LTQ ORBITRAP，Thermo公司)后，检测其碎片离子的质荷比，同时记录信号。

2.4.3质谱原始数据在相应的蛋白质数据库下进过SEQUEST、X！tandem、Trans-Proteomic-Pipeline软件处理，检索NCBInr蛋白质数据库。

2.4.4在前列腺癌患者前列腺分泌液中，表达水平显著增加的一些蛋白质得到了鉴定。它们分别是纤连蛋白1(Fibronectin 1)、结合珠蛋白(Haptoglobin)(α链)、白蛋白(Albumin)、SERPINB1与PSA。

实施例3、前列腺癌患者组与非癌对照组前列腺分泌液中Hepatoglobin水平的检测

随机将前列腺癌患者组与非癌对照组前列腺分泌液各三份，每份10微克蛋白质用于Western Blotting技术分析。Hepatoglobin的兔多抗(一抗)为AbCam公司产品(ab85846)，使用时稀释倍数为3000-5000倍。此外，前列腺分泌液的Western Blotting技术分析涉及的其它细节都为常规技术。图2显示前列腺分泌液的Western Blotting技术分析结果。

根据文献报道，人类Hepatoglobin蛋白全长由406个氨基酸组成。其中前导肽由18个氨基酸组成，α链由144个氨基酸组成。β链由244个氨基酸组成。α链与β链还能组合成不同比例的聚合体。此外，在α链上还存在各种糖基化修饰。

本发明人所用的人Hepatoglobin的兔多抗，既能识别α链也能识别β链。图2中分子量约26KD的条带在所有6个样品中的含量比较接近，可作为每个样品电泳上样量相同的一个证据。根据分子量分析，该条带是Hepatoglobin的β链。

在分子量位于16KD到26KD之间，观测到三个条带存在于前列腺癌患者的EPS中，而它们在非癌患者EPS中的含量有的明显低于前列腺癌患者，有的几乎就测不出来。根据它们的分子量分析，它们代表Hepatoglobin的α链及其不同的糖基化修饰体。

综合上述，前列腺癌患者EPS中Hepatoglobin-α链的水平明显高于其非癌患者EPS的存在。这一结论与本发明人上述的质谱分析结果是一致的。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种结合珠蛋白α链、纤连蛋白1、白蛋白、PSA和/或SERPINB1的用途，用于制备从前列腺液中诊断前列腺癌的试剂。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的试剂还用于前列腺癌的后和/或前列腺癌治疗疗效的评估。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的试剂是特异性识别结合珠蛋白α链、纤连蛋白1、白蛋白、PSA和/或SERPINB1的抗体。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，对应结合珠蛋白α链、纤连蛋白1、白蛋白、PSA和/或SERPINB 1这5种蛋白质，同时制备2种、3种、4种或5种所述的从前列腺液中诊断前列腺癌的试剂。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的结合珠蛋白α链还包括其糖基化修饰体。

6.一种用于诊断前列腺癌的试剂，其是特异性识别结合珠蛋白α链、纤连蛋白1、白蛋白、PSA和/或SERPINB1的抗体。

7.如权利要求6所述的试剂，其特征在于，所述的抗体特异性识别结合珠蛋白α链，其是多克隆抗体。

8.一种用于从前列腺液中诊断前列腺癌的试剂盒，其中包括：

容器，以及位于容器中的抗体，该抗体特异性识别结合珠蛋白α链。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，其中还包括：

容器，以及位于容器中的抗体，该抗体特异性识别纤连蛋白1；

容器，及位于容器中的抗体，该抗体特异性识别白蛋白；和/或

容器，及位于容器中的抗体，该抗体特异性识别SERPINB1。

10.如权利要求8或9所述的试剂盒，其特征在于，其中还包括：

容器，及位于容器中的抗体，该抗体特异性识别PSA。

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