CN105102986A - 用于评价前列腺癌进度的分析方法、前列腺癌进度的评价方法、前列腺癌的检测方法以及检查试剂盒 - Google Patents

用于评价前列腺癌进度的分析方法、前列腺癌进度的评价方法、前列腺癌的检测方法以及检查试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN105102986A
CN105102986A CN201480016470.5A CN201480016470A CN105102986A CN 105102986 A CN105102986 A CN 105102986A CN 201480016470 A CN201480016470 A CN 201480016470A CN 105102986 A CN105102986 A CN 105102986A
Authority
CN
China
Prior art keywords
amount
test portion
prostate cancer
prostate
npy
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201480016470.5A
Other languages
English (en)
Inventor
植田幸嗣
中川英刀
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Original Assignee
RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by RIKEN Institute of Physical and Chemical Research filed Critical RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Publication of CN105102986A publication Critical patent/CN105102986A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57434—Specifically defined cancers of prostate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01J—ELECTRIC DISCHARGE TUBES OR DISCHARGE LAMPS
    • H01J49/00—Particle spectrometers or separator tubes
    • H01J49/0027—Methods for using particle spectrometers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/575—Hormones
    • G01N2333/5755—Neuropeptide Y

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及用于评价前列腺癌进度的分析方法以及前列腺癌进度的评价方法，其包括测定来自从生物体采集的血液或尿液的试料中的神经肽Y的量的工序，本发明的前列腺癌的检测方法包括测定来自从生物体采集的血液或尿液的试料中的、神经肽Y的量以及前列腺特异抗原的量的工序。

Description

用于评价前列腺癌进度的分析方法、前列腺癌进度的评价方法、前列腺癌的检测方法以及检查试剂盒
技术领域
本发明涉及用于评价前列腺癌进度的分析方法、前列腺癌进度的评价方法、前列腺癌的检测方法、用于评价前列腺癌进度的检查试剂盒、以及用于检测前列腺癌的检查试剂盒。
背景技术
已知前列腺特异抗原(PSA)是一种激肽释放酶(Kallikrein)-3，其从1969年被发现(非专利文献1)、1994年被食品药品管理局(FDA)认可为PSA检查以来，被认为是前列腺癌的最佳诊断手段(非专利文献2)。实际上，在美国，1年内在4400万50岁以上的男性中至少有70％接受PSA检查。但是，在2011年10月，美国予防医学服务工作组(USPSTF)发布了有关前列腺癌的临床结果在统计上的证据，主张不要再继续对健康的男性进行PSA检查(非专利文献3)。该结论单纯是基于以下考虑：相对于前列腺癌患者的整体生存率而言PSA检查的好处还没有达到需要冒着扩大侵袭性的前列腺活组织检查的事例数以及扩大医疗费用的风险的程度。预估为了预防1个人患前列腺癌而死亡，却要在PSA筛查中花掉520万美元(非专利文献4)。
至今，本领域一直在探索PSA以外的前列腺癌生物标记候补。例如，非专利文献5中记载：根据从患前列腺疾病的患者采集前列腺组织进行免疫染色的研究，神经肽Y(NPY)以及巨噬细胞抑制因子1(MIC-1)在前列腺上皮内肿瘤(PIN)患者及前列腺癌患者的前列腺组织中表达的情况较多。另外，专利文献1记载了编码NPY的mRNA量，在前列腺肿瘤组织中比在正常的前列腺组织中多。
〔现有技术文献〕
专利文献
〔专利文献1〕日本公表专利公报“日本特表2005-523727号公报(2005年8月11日公表)”
非专利文献
〔非专利文献1〕Ablin，R.J.，Pfeiffer，L.，Gonder，M.J.，andSoanes，W.A.(1969)，Experimentalmedicineandsurgery27，406-410.
〔非专利文献2〕Catalona，W.J.，Smith，D.S.，Ratliff，T.L.，Dodds，K.M.，Coplen，D.E.，Yuan，J.J.，Petros，J.A.，andAndriole，G.L.(1991)，TheNewEnglandjournalofmedicine324，1156-1161.
〔非专利文献3〕Chou，R.，Croswell，J.M.，Dana，T.，Bougatsos，C.，Blazina，I.，Fu，R.，Gleitsmann，K.，Koenig，H.C.，Lam，C.，Maltz，A.，Rugge，J.B.，andLin，K.(2011)，Annalsofinternalmedicine155，762-771.
〔非专利文献4〕Brett，A.S.，andAblin，R.J.(2011)，TheNewEnglandjournalofmedicine365，1949-1951.
〔非专利文献5〕KrishanK.Rasiah，JamesG.Kench，MargaretGardiner-Garden，AndrewV.Biankin，DavidGolovsky，PhillipC.Brenner，RajiKooner，GordonF.O’Neill，JenniferJ.Turner，WarickDelprado，C.SoonLee，DavidA.Brown，SamuelN.Breit，JohnJ.Grygiel，LisaG.Horvath，PhillipD.Stricker，RobertL.Sutherland，andSusanM.Henshall，(2006)，CancerEpidemiolBiomarkersPrev2006；15(4)，711-716.
发明内容
〔发明所要解决的技术问题〕
如上所述，PSA在临床上作为前列腺癌的生物标记使用。但是，为了减少前列腺癌的过度诊断带来的上述危险，强烈希望开发能够有效对PSA的低特异性予以弥补的检测方法。
另外，目前为止前列腺癌进度评价只能够通过在进行了侵袭性高的活组织检查后，根据病理性检查镜像来主观判断。如果在血液检查阶段等早期阶段就能够判断前列腺癌进度，则可大大地减少患者的负担，并且可使用客观标准确定迅速的治疗方针。因此，期待开发能够极早进行的评价前列腺癌进度的方法。
予以说明，虽然非专利文献5中记载了前列腺组织中NPY的表达量，但是对于NPY在其它的试料(血液及尿液等)中的存在量，没有任何公开。对于各蛋白质而言，其在组织中的表达量与其在其它试料中的存在量并不相关，这是公知的。而且，非专利文献5中公开前列腺组织中的NPY表达量与前列腺癌进度不相关。另外，专利文献1中也没有记载NPY的肽量与前列腺癌进度之间的关系。而且，非专利文献5及专利文献1中都没有记载灵敏度及特异性的验证数据。
本发明就是鉴于上述问题而完成的发明，其目的在于提供一种用于评价前列腺癌进度的分析方法、前列腺癌进度的评价方法、以及能够有效地对PSA的低特异性予以弥补的前列腺癌的检测方法等。
〔用于解决技术问题的手段〕
本发明的用于评价前列腺癌进度的分析方法包含测定试料中的神经肽Y的量的工序，所述试料来自从生物体采集的血液或尿液。
本发明的前列腺癌的检测方法包含测定试料中的神经肽Y的量及前列腺特异抗原量的工序，所述试料来自从生物体采集的血液或尿液。
本发明的前列腺癌进度的评价方法包含测定试料中的神经肽Y的量的工序，所述试料来自从生物体采集的血液或尿液。
本发明的检查试剂盒的一实施方式是用于评价前列腺癌进度的检查试剂盒，其包含用于测定试料中的神经肽Y的量的肽探针，所述试料来自从生物体采集的血液或尿液。
本发明的检查试剂盒的另一实施方式是用于评价前列腺癌进度的检查试剂盒，包含用于测定试料中的神经肽Y的量的抗体，还包含以下至少一方：用于测定试料中的前列腺特异抗原的量的抗体或肽探针、用于测定试料中的TMPRSS2:ERG的mRNA的量的核酸探针或核酸引物、以及用于测定试料中的PCA3RNA的量的核酸探针或核酸引物，所述试料来自从生物体采集的血液或尿液。
本发明的检查试剂盒的又一实施方式是一种用于检测前列腺癌的检查试剂盒，包含用于测定试料中的神经肽Y的量的抗体或肽探针、以及用于测定试料中的前列腺特异抗原的量的抗体或肽探针，所述试料来自从生物体采集的血液或尿液。
本说明书包含本申请的优先权基础即日本专利申请2013-061094号的说明书以及/或图面中记载的内容。
发明的效果
本发明能提供一种用于评价前列腺癌进度的分析方法、前列腺癌进度的评价方法、以及可有效地对PSA的低特异性予以弥补的前列腺癌的检测方法等。
附图说明
图1是表示实施例中的RefinerMSsoftware的整体工作流程的图。
图2是表示实施例中的QUEST-MS技术的概要以及由QUEST-MS技术得到的纯化结果的图。
图3表示实施例中的由Expressionistproteomeserver通过Absent/PresentSearch法得到的前列腺癌的生物标记的筛查结果。
图4是表示实施例中的有关NPY的免疫组织化学染色解析结果的图。
图5是表示实施例中的在生物标记的确认实验中使用的有关NPY的MRM条件优化的图。
图6是表示实施例中的基于MRM评价NPY测定量的再现性的图。
图7是表示实施例中的、NPY(MRM色谱的面积)、PSA(通过医院中的ELISA测定的值)、或NPY+PSA(逻辑曲线回归值)的各ROC曲线的比较图。
图8是表示实施例中的、由ROC曲线解析来评价诊断潜在性的图。
图9是表示实施例中手术前及手术后的样品中血浆NPY水平的结果的图。
具体实施方式
本申请发明者这次独自开发了在生物标记的探索中有用的QUEST-MS(QuickEnrichmentofSmallTargetsforMassSpectrometry)技术。并且，为了鉴定前列腺癌的生物标记而应用QUEST-MS技术。其结果是，发现神经肽Y(NPY)与前列腺癌进度具有高度的相关性，并且发现NPY能够有效地对PSA的低特异性予以弥补，最终完成了本发明。
〔1.用于评价前列腺癌进度的分析方法以及前列腺癌进度的评价方法〕
本发明的用于评价前列腺癌进度的分析方法包括测定来自从生物体采集的血液或尿液的试料中的神经肽Y(NPY)量的工序。
本发明的前列腺癌进度的评价方法包括测定来自从生物体采集的血液或尿液的试料中NPY量的工序。
本发明的分析方法以及评价方法优选包含测定NPY量的工序以及测定前列腺特异抗原(PSA)、TMPRSS2:ERG的mRNA以及PCA3(prostatecancerantigen3；prostatecancergene3)RNA中至少一方的量的工序。本发明的分析方法以及评价方法更优选包括测定NPY量的工序以及测定PSA的量的工序。
予以说明，以下将本发明中测得的多肽(NPY及PSA)统称为“前列腺癌标记肽”。另外，以下将本发明中测得的RNA(TMPRSS2:ERG的mRNA以及PCA3RNA)统称为“前列腺癌标记RNA”。另外，将“前列腺癌标记肽”及“前列腺癌标记RNA”统称为“前列腺癌标记”。
“前列腺癌标记肽”不仅包括上述多肽的全长，还包括其片断，还包括上述多肽的前体。即，例如“测定NPY的量”是指测定全长的NPY多肽、NPY多肽的片断以及NPY多肽的前体中的至少一种。要测定其量的NPY可以为例如NPY1-97、NPY1-28、NPY29-97、NPY68-97、NPY29-67或NPY29-64。另外，也可以为它们的分解物。另外，还可以为NPY31-47、NPY54-61、NPY68-80或NPY81-88、或包含这些中任一部分的全长NPY或NPY片断。
“前列腺癌标记RNA”中不仅包括上述RNA的全长，也包括其片断，也包括RNA的前体。予以说明，TMPRSS2:ERG为TMPRSS2基因与ERG基因的融合mRNA。TMPRSS2:ERG的TMPRSS2与ERG的融合方式没有特别的限定，可以举出例如文献：JianghuaWang，YiCai，ChengxiRen，andMichaelIttmann，CancerRes2006；66：8347-8351.中记载的方式。PCA3RNA为PCA3基因的转录产物，为未编码(non-coding)RNA。
特别的是，在前列腺癌患者的血清中会检测到与健康人的血清相比更多的上述前列腺癌标记肽。因此，特别是通过测定血清中的前列腺癌标记肽的存在量，再与健康人的存在量相比，可测出前列腺癌。另外，特别的是，上述前列腺癌患者的尿液中与健康人的尿液相比，能够检测到更多的前列腺癌标记RNA。因此，特别是通过测定尿液中的前列腺癌标记RNA的存在量，再与健康人的存在量相比较，可测出前列腺癌。
进而，NPY相对于前列腺癌的特异性优良，且其量与前列腺癌进度高度相关(参照后述实施例)，因此，特别优选作为用于评价前列腺癌进度的生物标记。
在此，“前列腺癌”是指包括腺癌(前列腺腺癌)在内的前列腺产生的恶性肿瘤。
“进度”是指基于格里森评分(GleasonScore)(GS)、TNM分类或血清PSA值等的基准而得到的进度。予以说明，在本发明中，“进度”不仅包括在癌症的情况下评价癌进度，还包括未患癌的评价。“前列腺癌进度的评价”不仅仅包括针对患有前列腺癌的受检对象评价癌进度，还包括将受检对象评价为未患前列腺癌。即，“前列腺癌进度的评价”中也包括“未患前列腺癌”的评价。
“灵敏度”是指对出现特定疾病的集团进行检测时呈现阳性(受检对象异常值)的比例(真阳性的比例)。另外，“特异性”是指对未出现特定疾病的集团进行检查时呈现阴性(正常值)的比例(真阴性的比例)。另外，“阳性准确率”是指在检查中，显示阳性的受检对象中的实际患病的个体的比例。另外，“阴性准确率”是指在检查中，显示阴性的受检对象中的实际未患病的个体的比例。
本发明的分析方法以及评价方法只要包含测定来自从生物体采集的血液或尿液的试料中的NPY量的工序即可，其它的具体工序以及使用的器具以及装置没有特别的限定。
本说明书中，“测定前列腺癌标记的量”是指测定生物体试料或对其进行纯化而得到的试料中的前列腺癌标记的存在量或浓度。“前列腺癌标记的量”可以为绝对量(绝对质量或绝对浓度)，也可以为相对量(相对质量或相对浓度)。另外，例如可以为质量分析中的峰面积、或发光测定中的发光强度等，也可以为相对于规定的基准的倍数值。
本发明中使用的“试料”是来自从生物体(受检对象)采集的血液或尿液的试料。作为来自血液的试料，可以举出例如全血、血清、血浆等。在测定NPY的量时以及测定PSA的量时，“试料”优选为其中的全血、血清以及血浆，更优选为血清及血浆。测定TMPRSS2:ERG的mRNA的量时以及测定PCA3RNA的量时，“试料”优选其中的尿液。
另外，受检对象为人、小鼠、大鼠、兔子及猴等，优选为人。作为采血的部位，可以举出例如肘窝皮静脉、桡侧皮静脉以及尺侧皮静脉等。予以说明，在测定多种前列腺癌标记的量时，可以使用同一个试料进行测定，也可以使用不同的试料进行测定。
另外，受检对象可以预先已知患有前列腺癌，或者未知是否患有前列腺癌。在得知患有前列腺癌的情况下，可评价该受检对象的前列腺癌进行到何种程度。另外，在未知是否患有前列腺癌的情况下，可评价该受检对象是否患有前列腺癌，以及在患有前列腺癌的情况下可以评价前列腺癌达到了何种程度。
作为本发明的评价方法的一例，可以通过测定来自受检对象的生物体试料中的NPY的量，再测定来自对照受检对象(健康人及各种进度的前列腺癌患者)的生物体试料中的NPY的量，将两者进行比较来评价前列腺癌进度。具体而言，通过比较来自受检对象的试料中的NPY量与来自各对照受检对象的试料中的NPY的量，可以在统计学上评价该受检对象是否患有前列腺癌以及罹患的前列腺癌进行到什么进度。来自对照受检对象的试料中的NPY量可使用预先测定的值。或者，也可预先测定来自对照受检对象的生物体试料中的NPY的量，再以此为基础确定与各进度对应的量的范围，如果来自受检对象的生物体试料中的NPY量处于与某一进度对应的量的范围内，即可判断其进度。
另外，通过将与健康人及各进度的前列腺癌患者不同的良性前列腺肥大症(BPH)患者也列入对照受检对象范围，可以更高精度判定进度。本发明的分析方法及评价方法中，尤其可以更高精度区别容易呈伪阳性的BPH和前列腺癌。
予以说明，对照受检对象中至少有进度不同的2名以上的前列腺癌患者即可，有时也可不含有健康人及BPH患者。
在对受检对象的NPY量和对照受检对象的NPY量进行比较时，其显著性差异可以通过例如t检验、F检验、卡方检验或Mann-Whitney'sUtest等统计学方法进行判断。
进而，通过组合NPY和上述其它前列腺癌标记进行评价，可以对前列腺癌进度进行更准确的评价。
作为一例，组合NPY和PSA进行评价时，可以使用例如测定的NPY量及PSA量进行逻辑回归运算。计算方法使用例如文献：Pepe，M.S.，Cai，T.，andLongton，G.(2006)，Biometrics62，221-229.中记载的方法即可。根据该逻辑回归值可算出前列腺癌进度。对于NPY与PSA的组合而言，灵敏度及特异性均良好，可对前列腺癌进度进行更准确的评价。
另外，除了可对NPY与PSA的组合运用逻辑回归法以外，还可以对NPY与至少一种其它的前列腺癌标记的组合运用逻辑回归法。
测定前列腺癌标记肽量的方法只要能够对前列腺癌标记肽的存在量进行定量或半定量，则没有特别的限定，可以使用例如利用针对各前列腺癌标记肽具有特异性的免疫学手法的方法、利用针对各前列腺癌标记肽具有特异性的肽探针的方法、液相柱色谱法以及质量分析法等。作为使用抗体的方法，可以举出例如ELISA法、定量蛋白质印迹法、放射免疫测定法、免疫层析法以及免疫沉降法等。作为ELISA法的种类，没有特别的限定，可以举出所谓抗原测定体系(测定生物试料中含有的抗原量)的、利用直接吸附法而进行的ELISA、利用竞争法而进行的ELISA、利用夹层法(Sandwich法)进行的ELISA、以及利用微流路式或微球等的专门用于微量试料的测定的ELISA等。
对各前列腺癌标记肽具有特异性的抗体可以为单克隆抗体，也可以为多克隆抗体，但优选为单克隆抗体。例如，人的NPY以及PSA的氨基酸序列可以从UniProt等公共数据库获得。例如，数据库UniProt中，人的NPY的注册序号为P01303，人的PSA的注册序号为P07288。基于这些信息，本领域技术人员能够容易地确定适合的氨基酸序列来作为用于制作对各前列腺癌标记肽具有特异性的抗体的抗原。
本发明中，“抗体”包括免疫球蛋白的全部类型(class)以及亚类(subclass)以及抗体的功能性片段。所述抗体的概念中包括多克隆抗体及单克隆抗体中的任一天然型抗体，还包括使用基因重组技术制造的抗体以及该抗体的功能性片段。“抗体的功能性片段”是指具有所述抗体的一部分区域，且具有抗原结合能力的物质(与结合性片段同义)。天然型抗体没有特别的限定，能来自包括人、小鼠、大鼠、猴子、羊、兔子、骆驼、无峰驼、牛以及鸡等在内的所有的物种。作为使用基因重组而制造的抗体，没有特别的限定，可以举出通过改变天然型抗体的基因而得到的人类化抗体以及灵长类化抗体等的嵌合抗体、合成抗体、重组抗体、突变抗体以及接枝键合抗体(例如与其它的蛋白质及放射性标志等结合或融合后的抗体)。对于已经使用基因重组技术而制造的抗体而言，也包括如上所述那样与改变天然型抗体的基因的情况相同地实施了同样的改变的抗体。另外，作为抗体的功能性片段，可以举出例如F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv(variablefragmentofantibody)、sFv、dsFv(disulphidestabilizedFv)以及dAb(singledomainantibody)等。
进而，本发明中结合性片段的概念中也包括，在维持针对目标多肽的反应性的范围内经过了突变的抗体片段和结合性片段。上述的突变可使用本领域技术人员适宜选择的基因改变技术等公知的技术进行。
用可引起足能被检测到的信号的报告分子(reportermolecular)来标记第二抗体且将该第二抗体与上述抗体形成复合体，便能进行上述抗体的检测。或者，上述抗体可以预先用报告分子标记。报告分子例如为酶、含有发荧光团的分子、或含有放射性核种的分子。作为这样的报告分子，有各种各样公知的物质，适宜选择即可。
报告分子使用酶时，酶可以使用例如过氧化酶、β-半乳糖甙酶、碱性磷酸酶、葡糖氧化酶或乙酰胆碱酯酶等。这些酶与抗体的结合可通过使用马来酰亚胺化合物等交联剂的公知方法进行。作为底物，可以根据所使用的酶的种类使用公知的物质。例如，酶使用过氧化酶时，可以使用3，3’，5，5’-四甲基联苯胺等。另外，酶使用碱性磷酸酶时，可以使用对硝基酚等。作为放射性核种，可以使用125I或3H等。作为荧光色素，可以使用异硫氰酸荧光素(FITC)或四甲基若丹明异硫氰酸盐(TRITC)等。
可以使用利用将第二抗体固相化而得的金胶体的凝聚效应进行检测的免疫层析法等简便的测定体系。
另外，在使用肽探针的方法中，可以使用例如上述报告分子所标识的肽探针。
由此，在前列腺癌标记肽的量的测定中，可以使用包含发色或荧光测定的发光测定法、或放射测定法等。
质量分析法使用公知的质量分析装置进行即可。由于使用质量分析装置的质量分析法的灵敏度及精度优良，因此可以进行准确的判断。进而，通过使用能够多种成分同时分析的多通道型质量分析装置，可以一次性测定2种以上的前列腺癌标记肽的量。进而，也可以同时测定与前列腺癌以外的其它疾病相关的生物标记，可以尝试一次性测定各种疾病。另外，为了进行更精确的检测，优选使用联用(tandem)型质量分析装置(MS/MS)。作为本发明的检测方法中使用的质量分析装置，只要可以定量则没有特别的限定，可以使用四极杆质量分析装置及飞行时间质量分析装置等现有公知的质量分析装置。
测定前列腺癌标记肽的量的方法优选质量分析法或发光测定法。
在前列腺癌标记肽量的测定中使用的试料，优选在测定前列腺癌标记肽的量之前进行2次以上的反相萃取，并进行浓缩制成包含NPY的组分，对该组分进行NPY量的测定。由此，可以有效地除去大的蛋白质(例如，>20kDa)，提高NPY量的测定精度。作为包含NPY的组分而回收的组分只要包含NPY，则并不限定其分子量的范围，回收包含例如分子量小于20kDa的肽的组分即可。另外，在也测定NPY以外的前列腺癌标记肽量的情况下，可以根据其分子量来确定回收的组分。反相萃取优选使用例如后述的实施例中记载的QUEST-MS技术。
另外，使用质量分析法进行测定时，使用于前列腺癌标记肽量的测定中的试料优选在从生物体采集之后且测定前列腺癌标记肽量之前进行改性处理。作为改性处理，可以举出例如添加离液序列高的盐(chaotropicsalt)、酸改性、加热处理以及添加表面活性剂等处理。作为改性剂，可以举出例如尿素以及胍基乙酸等。接着，优选进行还原及烷基化。还原及烷基化使用公知的方法即可。通过上述改性、还原及烷基化的处理，肽中的半胱氨酸的二硫键被切断和封端。因此，在质量分析前进行的消化处理中，可以基于胰朊酶等消化酶进行充分消化。
予以说明，在测定多种前列腺癌标记肽的量时，根据其种类的不同，测定方法可以不同也可以相同。
测定前列腺癌标记RNA量的方法只要能够将前列腺癌标记RNA的存在量定量或者半定量，则没有特别的限定，可以采用使用例如PCR法等核酸扩增法将RNA扩增的方法等。作为使用核酸扩增法的方法，可以举出例如逆转录PCR法、实时(Realtime)PCR以及定量RT-PCR等。作为直接检测RNA的方法，可以举出RNA印迹杂交法等。予以说明，在测定前列腺癌标记RNA的量时，可以将生物体试料中含有的RNA作为模板来制备cDNA。
人的TMPRSS2:ERG以及PCA3的碱基序列可通过NCBI等公共数据库得到。例如，数据库NCBI中，人的TMPRSS2的注册序号为NM_005656，人的ERG的注册序号为NM_004449，人的PCA3的注册序号为NR_015342。另外，TMPRSS2:ERG的TMPRSS2与ERG的融合方式的例子记载于例如文献：JianghuaWang，YiCai，ChengxiRen，andMichaelIttmann，CancerRes2006；66：8347-8351.中。根据这些信息，本领域技术人员可以容易地设计用于使TMPRSS2:ERG的mRNA或PCA3RNA扩增的适合的引物。另外，根据上述信息，本领域技术人员可以容易地设计用于通过RNA印迹杂交法等检测TMPRSS2:ERG的mRNA或PCA3RNA的适合的核酸探针。
予以说明，在测定多种前列腺癌标记RNA的量时，根据其种类不同，测定的方法可以不同，也可以相同。
〔2.前列腺癌的检测方法〕
本发明的前列腺癌的检测方法包含检测来自从生物体采集的血液或尿液的试料中的、NPY量及PSA量的工序。
举出本发明的检测方法的一例：测定来自受检对象的生物体试料中的NPY量及PSA量，再测定来自对照受检对象(健康人)的生物体试料中的该NPY量及PSA的量，将这两者进行比较即可检测前列腺癌。具体而言，例如使用测定的NPY量及PSA量，分别计算受检对象及对照受检对象的逻辑回归值。计算方法使用例如文献：Pepe，M.S.，Cai，T.，andLongton，G.(2006)，Biometrics62，221-229.中记载的方法即可。发现两者的逻辑回归值存在显著性差异时，就判断该受检对象患有前列腺癌或者患有前列腺癌的可能性高。来自对照受检对象的试料中的NPY量及/或PSA量可使用预先测定的值。或者，也可预先测定来自对照受检对象的生物体试料中的NPY量以及PSA量，计算逻辑回归值，根据该值确定逻辑回归值的正常值范围，当来自受检对象的生物体试料的逻辑回归值不在上述正常值范围内时，判断为患有前列腺癌。
另外，通过在对照受检对象中加入与健康人不同的BPH患者，能够以更高的精度判断是否患有前列腺癌。本发明的前列腺癌的检测方法特别是能够以更高的精度将容易呈伪阳性的BPH与前列腺癌相区别。
在对受检对象的逻辑回归值和对照受检对象的逻辑回归值进行比较时，其显著性差异可以通过例如t检验、F检验、卡方检验或Mann-Whitney'sUtest等统计学方法来判断。
测定NPY的量以及PSA的量的方法，只要能够将它们的存在量定量或半定量地确定，则没有特别的限定，使用例如上述〔1.用于评价前列腺癌进度的分析方法以及前列腺癌进度的评价方法〕的栏中记载的方法即可。
本发明的前列腺癌的检测方法可以通过NPY有效地对PSA的低特异性予以弥补(也可参照后述的实施例)。此时，不会使PSA的灵敏度过度降低。即，灵敏度及特异性均良好，可以准确地检测前列腺癌。特别是特异性的提高可以减少过度诊断以及不需要的活组织检查，进而缓解男性的身体及精神的压力。
〔3.检查试剂盒〕
本发明的检查试剂盒的一实施方式为用于评价前列腺癌进度的检查试剂盒，包含用于测定来自从生物体采集的血液或尿液的试料中的NPY量的肽探针。本发明的检查试剂盒优选包含以下至少一方：用于测定来自从生物体采集的血液或尿液的试料中的PSA量的抗体或肽探针、用于测定TMPRSS2:ERG的mRNA量的核酸探针或核酸引物、以及用于测定PCA3RNA量的核酸探针或核酸引物。
本发明的检查试剂盒的又一实施方式是用于评价前列腺癌进度的检查试剂盒，包含用于测定来自从生物体采集的血液或尿液的试料中的神经肽Y量的抗体，还包含以下至少一方：用于测定来自从生物体采集的血液或尿液的试料中的前列腺特异抗原量的抗体或肽探针、用于测定TMPRSS2:ERG的mRNA量的核酸探针或核酸引物、以及用于测定PCA3RNA量的核酸探针或核酸引物。
肽探针是指与NPY或PSA特异性结合的肽性探针。具体而言，可以举出例如与NPY或PSA特异性结合的肽序列。试剂盒中所包含的肽探针除了包含天然氨基酸以外，还可包含非天然型氨基酸。
核酸探针是指与TMPRSS2:ERG的mRNA或PCA3RNA特异性结合的核酸探针，更具体而言可以举出TaqMan探针以及Invader探针等。核酸引物是指能够将TMPRSS2:ERG的mRNA或PCA3RNA或将它们逆转录之后的cDNA特异性地扩增的核酸引物，更具体而言，可以举出在核酸扩增法中使用的引物。
本领域技术人员可以根据从上述公共数据库得到的氨基酸序列或碱基序列的信息容易地设计抗体、肽探针、核酸探针以及核酸引物。
用于评价前列腺癌进度的检查试剂盒还可根据需要具有以下至少一方：在免疫学上用于检测抗体或肽探针的各种试剂(第二抗体、报告分子以及缓冲剂等)及器具(检测板以及移液管等)、用于检测核酸探针的各种试剂(缓冲剂等)及器具(检测板以及移液管等)、核酸扩增法中使用的各种试剂(多聚酶、各dNTP及缓冲剂等)及器具(试管以及移液管等)、检查试剂盒的使用说明书、测定时使用的对照用的试料、解析测定结果时使用的对照用的数据等。予以说明，用于评价前列腺癌进度的检查试剂盒的使用说明书中记录了上述〔1.用于评价前列腺癌进度的分析方法以及前列腺癌进度的评价方法〕的栏中说明的本发明的分析方法和/或评价方法的内容。
本发明的检查试剂盒的又一实施方式是一种用于检测前列腺癌的检查试剂盒，包含用于测定来自从生物体采集的血液或尿液的试料中的神经肽Y量的抗体或肽探针、以及用于测定前列腺特异抗原量的抗体或肽探针。
用于检测前列腺癌的检查试剂盒还可根据需要具有以下至少一方：在免疫学上用于检测抗体或肽探针的各种试剂(第二抗体、报告分子及缓冲剂等)及器具(检测板及移液管等)、检查试剂盒的使用说明书、测定时使用的对照用的试料、解析测定结果时使用的对照用的数据等。予以说明，用于检测前列腺癌的检查试剂盒的使用说明书中记录有上述〔2.前列腺癌的检测方法〕的栏中说明的本发明的检测方法的内容。
虽然没有特别限定，但是用于评价前列腺癌进度的检测试剂盒以及用于检测前列腺癌的检查试剂盒优选为例如利用ELISA法或免疫层析法的检查试剂盒。
〔4.其它〕
通过上述〔1.用于评价前列腺癌进度的分析方法以及前列腺癌进度的评价方法〕的栏下说明的分析方法或评价方法、或在上述〔2.前列腺癌的检测方法〕的栏下说明的检测方法而得到的结果可用作医生诊断时的一种诊断材料。另外，通过进行上述〔1.用于评价前列腺癌进度的分析方法以及前列腺癌进度的评价方法〕的栏下说明的分析方法或评价方法、或上述〔2.前列腺癌的检测方法〕的栏下说明的检测方法，对于出现可能患了前列腺癌的结果的受检对象，可以根据需要结合医生的诊断结果进行治疗。在此，作为治疗的一例，可以举出由医生、或者有些情况下是医生以外的专家进行的化学疗法、放射治疗以及外科手术等。特别是本发明的分析方法及评价方法可以评价前列腺癌进度，因此可以根据进度迅速确定适合的治疗方法。
更具体而言，例如根据经本发明的方法所得到的结果，医生判断为“前列腺癌进度高”时，可以在考虑其它检查方法(直肠诊断检查、超声波检查、MRI检查等)的结果、受检对象的年龄以及家族史等的基础上进行前列腺活组织检查。通常，根据前列腺活组织检查的结果就可以确诊有无患前列腺癌，并确立治疗方针。对于医生判断“前列腺癌进度高”而言，可以预先设置规定的基准值，受检对象的测定值在该基准值以上时，判断为“前列腺癌进度高”。
另一方面，通过经本发明的方法所得到的结果，医生判断为“未患前列腺癌”或者“前列腺癌进度低”时，之后可以定期进行NPY以及PSA等前列腺癌标记的测定，观察经过。予以说明，前列腺癌进度的评价并不限定于“高”“低”这2个级别，可以设定更多的级别。
如后述的实施例所示，纤维连接蛋白(fibronectin)以及电子转移黄素蛋白质-辅酶脱氢酶也被鉴定为前列腺癌的候补生物标记。因此，纤维连接蛋白以及电子转移黄素蛋白质-辅酶脱氢酶均可通过与NPY和/或PSA组合使用，进行前列腺癌进度评价以及前列腺癌的检测。评价方法和检测方法与上述同样即可。
〔5.总结〕
由此，本发明的用于评价前列腺癌进度的分析方法包含测定来自从生物体采集的血液或尿液的试料中的神经肽Y量的工序。
本发明的用于评价前列腺癌进度的分析方法优选还包含测定来自从生物体采集的血液或尿液的试料中的、前列腺特异抗原、TMPRSS2:ERG的mRNA以及PCA3RNA中至少一方的量的工序。
本发明的用于评价前列腺癌进度的分析方法优选还包含测定来自从生物体采集的血液或尿液的试料中的前列腺特异抗原量的工序。
本发明的用于评价前列腺癌进度的分析方法中，有时通过质量分析法或发光测定法来测定神经肽Y的量。
本发明的用于评价前列腺癌进度的分析方法中，所述试料优选为全血、血清或血浆。
本发明的用于评价前列腺癌进度的分析方法中，有时在测定上述神经肽Y量的工序中，将上述试料反相萃取2次以上，取得包含神经肽Y的组分，对得到的组分测定神经肽Y的量。
本发明的前列腺癌的检测方法包含测定来自从生物体采集的血液或尿液的试料中的、神经肽Y量以及前列腺特异抗原量的工序。
本发明的前列腺癌进度的评价方法包含测定来自从生物体采集的血液或尿液的试料中的神经肽Y量的工序。
本发明的检查试剂盒的一实施方式是用于评价前列腺癌进度的检查试剂盒，包含用于测定来自从生物体采集的血液或尿素的试料中的神经肽Y量的肽探针。
本发明的检查试剂盒的又一实施方式优选还包含以下至少一方：用于测定试料中的前列腺特异抗原的量的抗体或肽探针、用于测定试料中的TMPRSS2:ERG的mRNA量的核酸探针或核酸引物、以及用于测定试料中的PCA3RNA量的核酸探针或核酸引物；所述试料来自从生物体采集的血液或尿液。
本发明的检查试剂盒的又一实施方式为用于评价前列腺癌进度的检查试剂盒，包含用于测定试料中的神经肽Y量的抗体，还包含以下至少一方：用于测定试料中的前列腺特异抗原的量的抗体或肽探针、用于测定试料中的TMPRSS2:ERG的mRNA量的核酸探针或核酸引物、以及用于测定试料中的PCA3RNA量的核酸探针或核酸引物；所述试料来自从生物体采集的血液或尿液。
本发明的检查试剂盒的又一实施方式是用于测定前列腺癌的检查试剂盒，包含用于测定试料中的神经肽Y的量的抗体或肽探针、以及用于测定试料中的前列腺特异抗原的量的抗体或肽探针，所述试料来自从生物体采集的血液或尿液。
以下示出实施例对本发明的实施方式进行详细的说明。当然，本发明并不限定于以下的实施例，细微部分可以进行各种各样的变更。进而，本发明并不限定于上述的实施方式，在权利要求所示的范围内可以进行各种变更，将各公开的技术手段适当组合而得到的实施方式也包含在本发明的技术范围内。另外，本说明书中记载的文献也可以全部作为参考而援引在此。
实施例
〔实验顺序〕
(试剂)
三(2-羧基乙基)膦(TCEP)、碘乙酰胺以及碳酸氢铵从Sigma-Aldrich公司购入。尿素从GEHealthcare公司购入。TrypsinGold从Promega公司购入。三氟乙酸(TFA)从株式会社岛津制作所购入。
(血浆样品)
在高知大学医学部附属医院采集了用于筛查生物标记的EDTA-血浆样品(n＝116、表1)。予以说明，採血部位为腕静脉。
〔表1〕
*良性前列腺肥大症**前列腺癌***格里森评分(Gleasonscore)
在确认生物标记的实验中，在癌研究会有明医院(JFCR)癌筛查服务中心采集了26名健康人的血浆样品作为对照。另外，确认实验中，在高知大学医学部附属医院、京都大学医学部附属医院以及岩手医科大学附属医院采集了来自19名良性前列腺肥大症(BPH)患者的血浆样品以及来自65名前列腺癌患者的血浆样品(表2)。予以说明，採血部位为腕静脉。
〔表2〕
*良性前列腺肥大症**前列腺癌***格里森评分(Gleasonscore)
向上述所有患者完整地说明了实验顺序，并让他们签署了同意书。以下的实验得到了各设施内伦理委员会的认可。包括理化学研究所伦理委员会、高知大学医学部、JFCR、京都大学、以及岩手医科大学的设施内审查委员会。
(QUEST-MS纯化)
在96孔的聚丙烯制板上，将20μL的血浆样品与80μL的含有10M尿素的50mM碳酸氢铵混合。接着，将样品使用5mMTCEP在37℃还原15分钟，并使用25mM碘乙酰胺在室温下烷基化15分钟。再将样品用50mM碳酸氢铵稀释4倍，并放置于平衡后的OasisHLB96-孔超微淋洗板(μElutionPlate)(每孔2mg吸附剂、30μm粒径、Waters公司制)上。予以说明，在固相萃取板上进行的全部操作是使用特别订制的96孔自动注射器进行的。
用500μL的70％乙腈预先使Oasis板湿润，接着，用500μL的含有0.1％TFA的2％乙腈，以250μL/分的速度平衡。以100μL/分的速度载入样品后，使用500μL的含有0.1％TFA的2％乙腈，以250μL/分的速度将板清洗2次。使用100μL的40％乙腈，以100μL/分的速度使蛋白质洗脱，接着，在第2次对Oasis板进行纯化之前，用0.1％TFA稀释5倍。对稀释后的样品以与上述第一次纯化相同的条件进行了处理。
将洗脱液使用真空离心脱水装置进行冷冻干燥，使用8ng/μL的含有TrypsinGold(Promega公司制)的50mM碳酸氢铵在37℃下消化6小时。添加50μL的含有1.2％TFA的4％乙腈，以使消化反应停止。
(LC/MS/MS分析)
上述QUEST-MS纯化后，使用在Ultimate3000nano-flowHPLC(ThermoFisherScientific公司制)上配备的质量分析装置(LTQ-Orbitrap-Velosmassspectrometer，ThermoFisherScientific公司制)对1μL样品进行分析。使用0.1％甲酸作为溶剂A，使用含有0.1％甲酸的乙腈作为溶剂B，用C18Chip-column(75μm×200mm，日京TECHNOS株式会公司制)分离肽。此时的流速为250nL/分，溶剂B的梯度为2～30％下95分钟，30～95％下15分钟。将洗脱得到的肽在2000V的喷雾电压下离子化，用数据依赖型片断法(fragmentmethod)得到MS数据。测定扫描(surveyscan)是在m/z400～1600、分辨度60，000、AGC目标值1.0×106离子数(ioncount)的条件下进行的。将各测定扫描中强度处于前20位的前体离子，提供给具有线性离子阱且AGC目标值为5000离子数的普通CID扫描模式下的低分辨率MS/MS来取得数据。
(ExpressionistRefinerMS的无标签(labelfree)定量)
将来自LTQOrbitrap-Velos质量分析装置的原始数据输入ExpressionistRefinerMSmodule(GenedataAG公司制)。ExpressionistRefinerMSmodule的后续数据处理以及无标记定量分析均通过自公司的服务器系统进行。RefinerMS软件的整个工作流程如图1所示。对2DMS色谱面(x＝m/z、y＝RT)上的10个数据点中的每个点设定SpectrumGrid，接着，以RTWindow＝500scans以及Quantile＝80的条件，进行第1次的ChemicalNoiseSubtraction。在第2次的ChemicalNoiseSubtraction中，对每3个RT扫描，通过Movingaverageestimator对色谱图进行平滑化，除去强度小于1000的信号。在第3次以及第4次的ChemicalNoiseSubtraction中分别以minimumRTlength＝8scans的RTStructureRemoval、以及minimumm/zlength＝4points的m/zStructureRemoval的条件，处理了数据。对降噪后数据的每10个扫描设定ChromatogramGrid，并使用下述的参数进行ChromatogramRTAlignment：m/zWindow＝10points、RTWindow＝10scans、GapPenalty＝1、RTSearchInterval＝2minutes、AlignmentScheme＝pairwisealignmentbasedtree。接着，使用下述的参数，通过SummedPeakDetectionActivity来检测暂时得以平均化的色谱中的峰：SummationWindow＝2minutes、Overlap＝50、MinimumPeakSize＝10scans、MaximumMergeDistance＝4datapoints、Gap/PeakRatio＝10、Method＝curvature-basedpeakdetection、PeakRefinementThreshold＝5、ConsistencyFilterThreshold＝0.6。最后，通过SummedIsotopeClusteringActivity，将源自同一分子的同位素峰分组，划归出同位素群集。此时的参数如下：MinimumCharge＝1、MaximumCharge＝8、MaximumMissingPeaks＝0、FirstAllowedGapPosition＝3、Ionization＝protonation、RTTolerance＝0.1minute、m/zTolerance＝0.05Da、MinimumClusterSizeRatio＝0.5。
(ExpressionistAnalyst的生物标记的提取)
为了使新的生物标记群的特异性最大化，通过Absent/PresentSearch算法来筛选所检测到的未重复的153，057个肽。Absent/PresentSearch算法用以提取在2个组(“健康对照者+BPH”对“前列腺癌”)之间表现出“全”或“无”的特征的肽。选择了在43名对照者的至多1人中被检测到且在73名前列腺癌患者的至少11人中被检测到的肽，并将该肽提供给进一步的确认实验。
(蛋白质的鉴定)
使用ProteomeDiscoverer1.3software(ThermoFischerScientific公司制)进行SEQUEST数据库搜索。将MS/MS数据，对照人类蛋白质数据库SwissProt2012_09(20，235sequences)进行检索。检索参数如下：EnzymeName＝Trypsin、PrecursorMassTolerance＝3ppm、FragmentMassTolerance＝0.8Da、DynamicModification＝Oxidation(M)、StaticModification＝Carbamidomethyl(C)。SEQUESTDecoyDatabaseSearch接受了FDR(falsediscoveryrate)小于1％的肽鉴定。Rawdata公开于PRIDE数据库(http：//www.ebi.ac.uk/pride/)中。
(关于NPY的MRM(多反应监测，multiplereactionmonitoring))
除了添加最终浓度为1fmol/μL的BSA胰朊酶消化物作为内部对照之外，以上述方式将血浆样品提供于QUEST-MS法，接着，使用Agilent1200nano-flowHPLCsystem(AgilentTechnologies公司制)附带的4000QTRAPmassspectrometer(ABSciex公司制)进行分析。使用0.1％甲酸作为溶剂A，使用含有0.1％甲酸的乙腈作为溶剂B，用C18Chip-column(75μm×200mm，日京TECHNOS株式会公司制)分离肽。流速为250nL/分，溶剂B的梯度为在2～30％下10分钟、在30～95％下5分钟的这2个阶段的直线梯度。将对NPY及BSA(KYAtechnologies公司制)具有特异性的MRM离子对，通过Analyst1.5software(ABSciex公司制)的MRM模式同时进行监测。装置的设定如下：Ionizationsprayvoltage＝2200V、Curtaingas(N2)＝12psi、CAD＝4、Declusteringpotential＝70V、Entrancepotential＝10V、Q1resolution＝HIGH、Q3resolution＝LOW、Pauseinbetween＝2msec。将得到的MRM色谱使用MultiQuant2.02software(ABSciex公司制)进行解析。使各离子对的质谱在1ptwindow下平滑化，对峰面积进行定量。在对12个NPY的离子对的碰撞能量进行了优化后，单以与NPY81-88肽相对应的Q1/Q3＝466.23/272.20，进行实质上的定量。这是由于该离子对可显示最高的灵敏度的缘故。进而，使用以同样方式测定的BSA肽，将NPY81-88的峰面积以如下所述的方式标准化：NormalizedNPY＝Area(NPY81-88，Q1/Q3＝466.2/272.2)/Area(BSA66-75，Q1/Q3＝582.3/951.5)×10000。
(银染色及图像解析)
为了评价QUEST-MS纯化的效果，用16％Tris-tricineSDS-PAGE凝胶(LifeTechnologies公司制)分离了纯化的样品的1/5。使用SilverQuestSilverStainingkit(LifeTechnologies公司制)，根据使用说明书对凝胶进行染色。将染色后的凝胶使用GS-800CalibratedDensitometer(Bio-RadLaboratories公司制)进行扫描，再通过ImageJsoftware进行解析。
(免疫组织的化学染色)
使用Ventanaautomatedimmunohistochemicalsystems(VentanaMedicalSystems公司制)进行免疫组织的化学实验。使用从8名前列腺癌患者采集的外科受检对象或活体受检对象的slice切片(用福尔马林固定并埋入石蜡)。8名前列腺癌患者中包括具有前列腺上皮内肿瘤(PIN)病变的3名患者。将slice切片与以1：400稀释后的多克隆抗NPY抗体(Abcam公司制)溶液共同培养16分钟。自动化的实验报告(protocol)基于了间接式生物素-抗生物素蛋白体系，该间接式生物素-抗生物素蛋白体系中使用了被标记有生物素的第二抗体、及经苏木精对比染色后的二氨基联苯胺底物。通过使用兔子非免疫血清作为第一抗体进行负染色来确认结合的特异性。
〔结果〕
(基于QUEST-MS技术的低分子量多肽的浓缩)
为了利用正确的生物标记的筛查以及血液中的小靶多肽来进行均匀的临床应用，需要显示高灵敏度、高再现性、高处理量、低成本以及操作容易性的预分析性纯化方法。为了满足这些基准，本申请发明者们确立了关于血浆中小于20kDa的蛋白质的简单且有效的浓缩方法(图2的(a))，并起名为quickenrichmentofsmalltargetsformassspectrometry(QUEST-MS)。QUEST-MS法包括对粗血浆进行改性、还原、烷基化以及后续的联用(tandem)反相萃取(每96个样品仅仅需要1.5小时)。
干燥后的QUEST-MS纯化样品可以直接用于SDS-PAGE或ELISA等蛋白质检测。该QUEST-MS纯化样品可在胰朊酶处理后进行质量分析。
为了体现利用OasisHLBplate进行1～4次反相萃取后的、低分子量蛋白质的浓缩效果，可以用16％Tris-tricine凝胶将各阶段的粗血浆以及纯化蛋白质分离，再进行银染色。将该结果示于图2的(b)。将该凝胶的定量密度分析解析的结果示于图2的(c)。染色后的凝胶的5个泳道(lane)的定量密度色谱表明了各固相提取步骤中有效地除去了>20kDa的蛋白质。特别是通过利用OasisHLBplate进行2次反相萃取，小于20kDa的低分子量蛋白质的比例超过90％。这些小的蛋白质得以良好且容易地分离，是基于了避免使孔径大于(8nm)的巨大的蛋白质流出以及避免中等程度大小的蛋白质(20～100kDa)因相对于Oasis聚合物珠上疏水性残基的过度吸收强度而被洗脱的原则。重复反相萃取3次以上时，虽然可以提高低分子量蛋白质的纯化度，但是从处理能力及成本的优越性的观点出发，在生物标记的进一步探索以及确认实验中使用纯化了2次的样品。
(针对前列腺癌的低分子量生物标记的筛查)
为了避开设施间的采样偏差，在1个医院采集了在生物标记的筛查阶段所分析的116个血浆样品(表1)，使用严格管理下的标准操作规程。将20μL各血浆样品在QUEST-MS纯化之前冷冻溶解一次。根据116个纯化样品的LC/MS/MS分析，检测出153，057个未重复的肽，如上所述，在ExpressionistRefinerMSmodule中定量。特别是该低分子量蛋白质组的样本中包含4种来自PSA的肽：I25VGGWECEK33(m/z＝539.25，z＝+2)、H34SQPWQVLVASR45(m/z＝469.92，z＝+3)、A48VCGGVLVHPQWVLTAAHCIR68(m/z＝782.08，z＝+3)、以及L126SEPAELTDAVK137(m/z＝636.84，z＝+2)。这些肽在对照组(健康对照者+BPH患者)中分别被检测到4、3、4、5例。另一方面，这些肽在前列腺癌患者组中分别被检测到15、13、10、11例。根据医院提供的PSA检查的值，估计本申请发明者的方法中针对PSA的检测极限值约为10ng/mL。该结果表明，根据样品的平均值进行的一般的比较检验(t检验以及ANOVA等)并不适合特异性标记的提取。这是由于对照组的低浓度肿瘤标记的有效值理应非常少的缘故。通常，对照样品的肿瘤标记的理想检测频率接近于0，因此对于对照样品可以不运用t检验或ANOVA。
接着，为了使新生物标记群的特异性最大化，使用Absent/PresentSearch算法。其结果是鉴定出了在43名对照(24人的健康对照者+19人的BPH患者)中被检测到0或1例且在73名前列腺癌患者中被检测到至少11例的189个肽。图3的(a)中，153，057个的全部肽中，189个肽显示了前列腺癌特异性的检测图案，这些肽在对照组中仅被检测到0或1例。予以说明，189个肽的定量信息用2维平面上的黑点或线表示。X轴表示110个人，Y轴表示LC/MS/MS的峰强度。图3的(b)表示基于检测频率的189个候补生物标记肽的分类。例如，有62个肽在11个前列腺癌样品中被检测到且在1个对照样品(健康对照或BPH)中被检测到。
在前列腺癌患者的诊断中，上述提取的肽与PSA相比，具有同等以上的高灵敏度，而且伪阳性的比例低，可以视为生物标记的候补。另一方面，使用SEQUEST数据库搜索解析(FDR<0.01)，从116个筛查样品中鉴定出了1126个未重复的血浆蛋白质。将189个候补生物标记与蛋白质鉴定数据群进行匹配，结果成功地鉴定出表3所示的3个肽。从mRNA在大脑神经系统表达以及具前列腺特异性的观点出发，将神经肽Y(NPY)用于了后续的确认实验。
〔表3〕
*序列中的数字表示氨基酸序号
**健康对照者或BPH患者检查出的例数
***前列腺患者之间检查出的例数
(前列腺癌组织中的NPY表达)
图4表示关于NPY的免疫组织化学染色结果。图4的(a)及(b)表示前列腺癌的NPY的代表性免疫染色图案。格里森评分(GleasonScore)分别为3+4(a)以及4+5(b)。在前列腺癌组织中观察使用抗NPY抗体的免疫反应性，发现在前列腺癌细胞的细胞质中，免疫反应性非常强，但是在非癌的前列腺上皮中免疫反应性弱(图4的(b)的右侧)。图4的(c)表示使用抗NPY抗体的细胞质的免疫反应性在高级别的前列腺上皮内肿瘤(PIN)的前体细胞中也被观察到。这些结果表明了前列腺肿瘤性病变度高的NPY表达。
(基于NPY的MRM的反复解析)
为了评价不同的医院或分析方法的偏差，使用独立的样品组以及其它的质量分析定量法MRM，进一步进行关于NPY的确认实验。在此，作为健康对照，使用来自JFCR的样品来代替高知大学医学部附属医院的样品，作为前列腺疾患的样品，使用来自京都大学以及岩手医科大学的样品(表2)。以来自NPY的4种不同的肽作为靶，将110个QUEST-MS纯化后的样品用4000QTRAP质量分析装置进行了分析。在进行MRM测定之前，首先，从分别与4种NPY肽对应的3个离子对中，找出能够给予最高的MRM色谱峰强度的最佳离子对以及冲突能量(CE)。其结果示于图5(a)以及(b)。得知，对应于NPY81-88的离子对Q1/Q3＝466.2/272.2在CE＝17eV时，为NPY灵敏度最高的报告离子对。予以说明，在图5(a)中，Q1或Q3的右侧的数字分别表示四极杆1或3的m/z的设定。
进而，向各样品中添加10fmol的消化BSA，用作使分析间的偏差标准化的内部对照。接着，通过分析6个不同时刻的3个血浆样品来评价基于MRM的NPY测定的量再现性，将其结果示于图6。图6中，误差棒(errorbar)表示3个独立测定的标准偏差。如图6所示，变动系数(CV)均比3.5％小。使用上述优化后的MRM条件，将110个的个例的血浆中的NPY进行定量，将其结果示于图7(a)的盒形图。另外，图7(b)中表示ELISA定量后的PSA的浓度。根据这些结果可知，特别是BPH患者与格里森评分(GleasonScore)(GS)5-6的前列腺癌患者之间，与PSA检查(p＝0.2746，t检验)相比，NPY显示了更高的诊断特异性(p＝0.0396，t检验)。该结果可以证明在生物标记的筛查实验中，NPY的Absent/PresentSearch分析中能够利用NPY来特异性地检测出前列腺癌。
予以说明，图7中，虚线表示对照组(N+BPH)与前列腺癌群的边界。该边界通过后述的图8所示的ROC曲线解析算出。较大偏离的值在标绘图(plot)的上方区域中与其浓度并记。
虽然NPY具有高的特异性，但是为了进一步使灵敏度提高，使用逻辑回归法尝试确立基于NPY与PSA的组合的诊断系统(图7的(c))。为了使ROC曲线的曲线下面积(AUC)最大，计算逻辑回归值(根据文献：Pepe，M.S.，Cai，T.，andLongton，G.(2006)，Biometrics62，221-229.)。图8的(a)～(c)中表示分别使用110个血浆样品的NPY(MRM色谱的面积)、PSA(通过医院的ELISA测定的值)、及NPY+PSA(逻辑曲线回归值)而作成的3个ROC曲线的比较。予以说明，图8中，“x＝”所示的切点表示各标记所呈现的最佳极限值。另外，“Sens”表示灵敏度，“Spec”表示特异性，“PV+”表示阳性准确率，“PV-”表示阴性准确率。
45名对照(25人健康对照者以及20人的BPH患者)与65名前列腺癌患者的区别中，PSA的灵敏度以及特异性分别为87.7％以及66.7％。另一方面，NPY与PSA的组合的灵敏度以及特异性分别为81.5％以及82.2％。该结果表明：NPY可以在不显著性失去PSA检查的高灵敏度的情况下，弥补PSA检查的特异性低的这一问题。这可以减少过度诊断和不需要的活组织检查，进而缓解男性的身体以及精神压力。
另外，NPY与前列腺癌进度相关性高，通过单独使用NPY，或者通过NPY与PSA的组合，可以进一步准确地评价进度。
进而，为了实际证明NPY在疗效评价中的有效性，分析了从4个前列腺癌患者中采集的手术前以及手术后的样品。图9表示3次MRM分析的结果。图9中，天数表示经尿道前列腺切除手术(TURP)后的经过时间。误差棒表示3次独立测定的标准偏差。如图9所示，手术5～7日后，3位患者(患者2～4)中的血浆NPY水平有所减少(*p<0.05，t检验)。特别是，患者4的NPY水平在手术的5日后，减少至小于cutoff值(5189.0)。另一方面，患者1在手术1个月后，NPY水平仅稍有变化。虽然没有临床证据，但是推测患者1的长期居高的NPY浓度是已复发或有微小转移病灶的反映。
〔产业上的利用可能性〕
本发明可用于前列腺癌进度的评价以及前列腺癌的检测。因此，本发明可广泛用于诊断医疗领域以及保健医学领域。
本说明书中引用的全部刊行物、专利以及专利申请可直接作为参考而援引于本说明书中。

Claims (12)

1.一种用于评价前列腺癌进度的分析方法，其中，
包含测定试料中的神经肽Y的量的工序，所述试料来自从生物体采集的血液或尿液。
2.根据权利要求1所述的分析方法，其中，
还包含测定试料中的前列腺特异抗原、TMPRSS2:ERG的mRNA、及PCA3RNA中的至少一方的量的工序，所述试料来自从生物体采集的血液或尿液。
3.根据权利要求1所述的分析方法，其中，
还包含测定试料中的前列腺特异抗原的量的工序，所述试料来自从生物体采集的血液或尿液。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的分析方法，其中，
通过质量分析法或发光测定法测定神经肽Y的量。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的分析方法，其中，
所述试料为全血、血清或血浆。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的分析方法，其中，
在测定所述神经肽Y的量的工序中，将所述试料反相萃取2次以上得到含有神经肽Y的组分，测定所得到的组分的神经肽Y的量。
7.一种前列腺癌的检测方法，其中，
包含测定试料中的神经肽Y的量以及前列腺特异抗原的量的工序，所述试料来自从生物体采集的血液或尿液。
8.一种前列腺癌进度的评价方法，其中，
包含测定试料中的神经肽Y的量的工序，所述试料来自从生物体采集的血液或尿液。
9.一种检查试剂盒，其是用于评价前列腺癌进度的检查试剂盒，包含用于测定试料中的神经肽Y的量的肽探针，所述试料来自从生物体采集的血液或尿液。
10.根据权利要求9所述的检查试剂盒，还包含以下至少一方：用于测定试料中的前列腺特异抗原的量的抗体或肽探针、用于测定试料中的TMPRSS2:ERG的mRNA的量的核酸探针或核酸引物、以及用于测定试料中的PCA3RNA的量的核酸探针或核酸引物，所述试料来自从生物体采集的血液或尿液。
11.一种检查试剂盒，其是用于评价前列腺癌进度的检查试剂盒，其中，
包含用于测定试料中的神经肽Y的量的抗体，
还包含以下至少一方：用于测定试料中的前列腺特异抗原的量的抗体或肽探针、用于测定试料中的TMPRSS2:ERG的mRNA的量的核酸探针或核酸引物、以及用于测定试料中的PCA3RNA的量的核酸探针或核酸引物，
所述试料来自从生物体采集的血液或尿液。
12.一种检查试剂盒，其是用于检测前列腺癌的检查试剂盒，包含用于测定试料中的神经肽Y的量的抗体或肽探针、以及用于测定试料中的前列腺特异抗原的量的抗体或肽探针，所述试料来自从生物体采集的血液或尿液。
CN201480016470.5A 2013-03-22 2014-03-20 用于评价前列腺癌进度的分析方法、前列腺癌进度的评价方法、前列腺癌的检测方法以及检查试剂盒 Pending CN105102986A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2013-061094 2013-03-22
JP2013061094A JP5429725B1 (ja) 2013-03-22 2013-03-22 前立腺癌の進行度の評価方法、前立腺癌の検出方法、および検査キット
PCT/JP2014/057879 WO2014148627A1 (ja) 2013-03-22 2014-03-20 前立腺癌の進行度の評価のための分析方法、前立腺癌の進行度の評価方法、前立腺癌の検出方法、および検査キット

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105102986A true CN105102986A (zh) 2015-11-25

Family

ID=50287380

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480016470.5A Pending CN105102986A (zh) 2013-03-22 2014-03-20 用于评价前列腺癌进度的分析方法、前列腺癌进度的评价方法、前列腺癌的检测方法以及检查试剂盒

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20160003831A1 (zh)
EP (1) EP2977763A4 (zh)
JP (1) JP5429725B1 (zh)
CN (1) CN105102986A (zh)
SG (1) SG11201507741TA (zh)
WO (1) WO2014148627A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10970604B2 (en) 2018-09-27 2021-04-06 Industrial Technology Research Institute Fusion-based classifier, classification method, and classification system

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016127999A1 (en) * 2015-02-10 2016-08-18 University Of Copenhagen Neuropeptide y as a prognostic marker of prostate cancer

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101018874A (zh) * 2004-08-13 2007-08-15 千年药品公司 用于鉴定、评估、预防和治疗前列腺癌的基因、组合物、试剂盒和方法
WO2008067065A2 (en) * 2006-10-19 2008-06-05 Shiv Srivastava Methods, kits, and systems for diagnosing and prognosing prostate cancer using secreted biomarkers
CN102573875A (zh) * 2009-08-14 2012-07-11 阿勒根公司 使用速激肽再靶向内肽酶治疗癌症的方法

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1390523B1 (en) * 2000-11-20 2007-05-09 Eastern Virginia Medical School Methods and devices for the quantitative detection of prostate specific membrane antigen and other prostatic markers
JP2005523727A (ja) * 2002-05-01 2005-08-11 アイアールエム エルエルシー 腫瘍のバイオマーカーを発見して腫瘍を診断する方法
US9075065B2 (en) * 2008-09-12 2015-07-07 Dako Denmark A/S Prostate cancer biomarker
EP2295977A1 (en) * 2009-09-03 2011-03-16 Koninklijke Philips Electronics N.V. Novel tumor markers
CA2835449A1 (en) * 2011-05-10 2012-11-15 Nuclea Biotechnologies, Inc. Predictive biomarkers for prostate cancer
JP5656782B2 (ja) 2011-09-12 2015-01-21 三菱電機株式会社 冷蔵庫
WO2013134860A1 (en) * 2012-03-16 2013-09-19 University Health Network Cancer biomarkers and methods of use
WO2013166343A2 (en) * 2012-05-04 2013-11-07 Nuclea Biotechnologies, Inc. Mrm-ms signature assay

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101018874A (zh) * 2004-08-13 2007-08-15 千年药品公司 用于鉴定、评估、预防和治疗前列腺癌的基因、组合物、试剂盒和方法
WO2008067065A2 (en) * 2006-10-19 2008-06-05 Shiv Srivastava Methods, kits, and systems for diagnosing and prognosing prostate cancer using secreted biomarkers
CN102573875A (zh) * 2009-08-14 2012-07-11 阿勒根公司 使用速激肽再靶向内肽酶治疗癌症的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KRISHAN K.RASMIOLOGY等: ""Aberrant Neuropeptide Y and Macrophage Inhibitory Cytokine-1 Expression Are Early Events in Prostate Cancer Development and Are Associated with Poor Prognosis"", 《CANCER EPIDEMIOLOGY， BIOMARKERS &PREVENTION，》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10970604B2 (en) 2018-09-27 2021-04-06 Industrial Technology Research Institute Fusion-based classifier, classification method, and classification system

Also Published As

Publication number Publication date
EP2977763A1 (en) 2016-01-27
US20160003831A1 (en) 2016-01-07
JP5429725B1 (ja) 2014-02-26
JP2014185944A (ja) 2014-10-02
SG11201507741TA (en) 2015-10-29
WO2014148627A1 (ja) 2014-09-25
EP2977763A4 (en) 2017-02-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Diamandis Tumor markers: physiology, pathobiology, technology, and clinical applications
Rhea et al. Cancer biomarkers: surviving the journey from bench to bedside
KR100679173B1 (ko) 위암 진단용 단백질 마커 및 이를 이용한 진단키트
CN102317784B (zh) 作为癌症标记物的armet
US8658166B2 (en) Methods and materials for the diagnosis of prostate cancers
KR101219519B1 (ko) 렉틴을 이용한 암 진단 방법
US20140274794A1 (en) Methods and Compositions for Diagnosis of Ovarian Cancer
KR20160072027A (ko) 간암 진단용 바이오마커 및 그 용도
CN101680884A (zh) 检测先兆子痫的方法
WO2008039774A1 (en) Extracellular and membrane-associated prostate cancer markers
Jones et al. Prostate cancer diagnosis in the clinic using an 8-protein biomarker panel
EP2580592B1 (en) Method, array and use thereof
Shi et al. Multiplexed targeted mass spectrometry assays for prostate cancer-associated urinary proteins
JP2005523727A (ja) 腫瘍のバイオマーカーを発見して腫瘍を診断する方法
EP3270163B1 (en) Method of detecting proteins in human samples and uses of such methods
CN105102986A (zh) 用于评价前列腺癌进度的分析方法、前列腺癌进度的评价方法、前列腺癌的检测方法以及检查试剂盒
CN116121392A (zh) 用于胰腺囊性肿瘤诊断的方法和试剂
Bogdanovska-Todorovska et al. Correlation of immunohistochemistry and fluorescence in situ hybridization for HER-2 assessment in breast cancer patients: single centre experience
KR101334123B1 (ko) 소세포폐암 진단용 조성물 및 소세포폐암 진단키트
EP2895863B1 (en) New biomarkers for the diagnosis and/or prognosis of clear cell renal cell carcinoma
US11791043B2 (en) Methods of prognosing early stage breast lesions
KR102091747B1 (ko) 유방암 진단용 바이오마커 및 이의 용도
CN102998448A (zh) 来源于前列腺分泌液中的前列腺癌标记物
KR102000387B1 (ko) 췌관내유두상점액종양의 악성도를 감별할 수 있는 단백질 바이오마커 및 그 용도
US20190137498A1 (en) Methods and compositions for detecting cancer

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20151125

RJ01 Rejection of invention patent application after publication