CN109517049A - Linc00266-1多肽作为实体瘤标志物的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及癌症的诊断和治疗领域。本发明公开了LINC00266‑1多肽作为实体瘤通用标志物的应用。LINC00266‑1多肽的测量可以用于肿瘤的检测或诊断，或患者预后情况的评估与监测。

Description

LINC00266-1多肽作为实体瘤标志物的应用
技术领域
本发明涉及癌症的诊断和治疗领域，具体而言，涉及LINC00266-1多肽作为实体瘤标志物的应用。
背景技术
癌症是世界上第二大死亡原因，每年造成约880万人死亡。从全球范围来看，近六分之一的死亡是由于癌症引起的。近年来，随着人们物质生活水平的提高，生活节奏加快、饮食结构的改变，人口老龄化的加剧，环境污染等原因导致实体恶性肿瘤发病率逐年攀升，并且呈现出年轻化的趋势。
虽然早期实体恶性肿瘤患者的5年生存率多可达80％以上，但是因为早期实体恶性肿瘤无特异性的症状和体征，病人就诊率低下。加上缺乏便利、有效的普查手段及缺乏敏感度高、特异度强的筛查方法，仅有不到30％的实体恶性肿瘤患者在早期得到确证。大多数患者就诊时，其疾病已经进入进展期，有的甚至发生了远处转移，严重缩短患者的存活时间，影响患者生活质量。虽然近年来随着实体恶性肿瘤诊疗技术的不断发展，新药物、新治疗技术的出现，使得实体恶性肿瘤患者的预后有了很大的改善，但晚期癌症患者的预后仍然不尽如意。临床治疗常常因实体恶性肿瘤发生了复发或远处转移而宣告失败。缺乏有效的肿瘤监测指标是重要原因。因此，当前鉴定能用于提示实体恶性肿瘤转移、复发倾向的新标记物，将有助于临床上评估实体恶性肿瘤患者术后复发率及预后，为手术切除后是否需要进一步的联合辅助治疗提供判断依据。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明涉及一种LINC00266-1多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明还请求保护LINC00266-1多肽片段，其包含SEQ ID NO：1所示序列中的至少5个连续氨基酸。
另外，特异性地测量LINC00266-1多肽所需的试剂在制备用于肿瘤诊断和/或预后评估的试剂或试剂盒中的应用，其中增加的LINC00266-1多肽的浓度是实体瘤的指征和/或实体瘤预后不良的指征。
本发明还涉及一种试剂盒，其包含特异性地测量LINC00266-1多肽或LINC00266-1多肽片段所需的试剂。
与现有技术相比，本发明至少具有如下优点：
(1)提供一种用于实体恶性肿瘤预后评估判断的新标记物：LINC00266-1多肽。临床研究证实，LINC00266-1多肽在实体恶性肿瘤组织中高表达与实体恶性肿瘤患者预后差呈正相关。癌组织中LINC00266-1多肽高水平的患者具有更短的生存期和更高的死亡率。据此，LINC00266-1多肽作为生物标志物有效的提高了临床中使用试剂盒进行实体恶性肿瘤预后判断的阳性率。
(2)本发明的LINC00266-1多肽不仅可作为实体恶性肿瘤预后判断的生物标志物，而且采用本发明针对LINC00266-1多肽的特异性抗体来检测LINC00266-1多肽在组织切片中的表达强弱，可有助于判断实体恶性肿瘤的发生及其恶性程度和转移倾向。
(3)在本发明之前，还没有出现涉及本发明LINC00266-1多肽以及本发明蛋白多肽用于实体恶性肿瘤预后评估及诊断的公开报道，也没有证实长链非编码RNA LINC00266-1编码一种活性多肽的公开报道，更没有出现LINC00266-1多肽用于实体恶性肿瘤预后评估及诊断的公开报道。
综上所述，本发明具有上述诸多的优点及实用价值，并在同类产品中未见有类似的方法公开发表或使用而确属创新。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1所示为本发明实施例2中针对LINC00266-1多肽的抗体能够特异性识别和检测LINC00266-1多肽的结果图；
图2为本发明实施例3中，在同一来源不同侵袭转移潜能癌细胞中LINC00266-1多肽表达的结果；
图3为本发明实施例4中，3对新鲜冷冻成对的胃癌、肝癌组织与其对应癌旁组织中LINC00266-1多肽表达的结果；
图4本发明实施例5中，在结肠癌和对应癌旁正常结肠组织中LINC00266-1多肽表达的示意图；图4a表示对应的癌旁正常结肠组织；图4b表示结肠癌组织；
图5为本发明实施例5中，LINC00266-1多肽在90对成对的结肠癌组织与其对应癌旁正常结肠组织石蜡切片中表达的统计分析结果(N：癌旁组织，T：癌组织)；
图6为本发明实施例5中LINC00266-1多肽表达水平高、低与结肠癌患者死亡率关联的结果；
图7为本发明实施例5中LINC00266-1多肽高、低表达水平影响结肠癌患者预后判断的Kaplan-Meier生存分析曲线图。
具体实施方式
本发明涉及一种LINC00266-1多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明还涉及LINC00266-1多肽片段，其包含SEQ ID NO：1所示序列中的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、25、40、45、50、55、60、65或70个连续氨基酸。
长链非编码RNA(Long Non-Protein Coding RNA，lncRNA)起初被认为是基因组转录的“噪音”，不具有生物学功能。然而，近年来的研究表明，实际上lncRNA以RNA的形式在多种层面上(表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等)调控了基因的表达水平。然而近年来的研究表明，某些的序列中包含的一小段却看上去好像一个编码区域，也能编码一些蛋白(A Micropeptide Encoded by a Putative Long Noncoding RNA Regulates MusclePerformance，Douglas M.et al，Cell，2015)。即便如此，现有技术仍普遍认为绝大多数lncRNA不会编码任何蛋白质。
长链基因间非编码RNA(Long Intergenic Non-Protein Coding RNA，lincRNA)是lncRNA中的一种，LINC00266-1(Gene ID：140849)是最近新发现的一种lincRNA，其功能还未探究清楚。
在本发明之前，还没有出现涉及本发明LINC00266-1多肽以及本发明蛋白多肽用于实体恶性肿瘤预后评估及诊断的公开报道，也没有证实长链非编码RNA LINC00266-1编码一种活性多肽的公开报道，更没有出现LINC00266-1多肽用于实体恶性肿瘤预后评估及诊断的公开报道。
如本领域技术人员显而易见的，本发明不应当解释为限于SEQ ID NO：1所示的LINC00266-1多肽。LINC00266-1多肽的生理或人工片段、LINC00266-1多肽的二级修饰以及LINC00266-1多肽的等位基因变体也包括在本发明内。多肽的变体由相同基因编码，但是它们的等电点(＝PI)或分子量(＝MW)或二者可以不同，例如，作为替代性的mRNA或前-mRNA处理的结果。变体的氨基酸序列与对应的标志物序列具有95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性。人工片段优选地包括合成地或通过重组技术生产的肽，其至少包含一个诊断目标表位，所述表位由源自SEQ ID NO：1所公开的序列的至少5、6、7、8、9或10个连续氨基酸组成。这样的片段可以有利地用于制备抗体或作为免疫测定中的标准品。
本文使用的术语″标志物″或″生化标志物″指要用作分析患者实验样品的靶标的分子。这样的分子靶标的实例是蛋白或多肽。在本发明中用作标志物的蛋白或多肽预期包括所述蛋白的天然存在的变体以及所述蛋白或所述变体的片段，特别是免疫学上可检测的片段。免疫学上可检测的片段优选地包含所述标志物多肽的至少5、6、7、8、9、10、11、12、15或20个连续氨基酸。本领域的技术人员可认识到，由细胞释放的蛋白或存在于胞外基质中的蛋白可能受到损害(例如，在炎症过程中)，且可被降解或切割成这样的片段。某些标志物以无活性形式合成，其可以随后通过蛋白酶解来激活。如熟练的技术人员将明白的，蛋白或其片段也可以作为复合物的部分而存在。这样的复合物也可以用作本发明意义上的标志物。另外，或在替代方案中，标志物多肽或其变体可以携带翻译后修饰。翻译后修饰的非限制性实例是糖基化、酰化和/或磷酸化。
根据本发明的一方面，本发明还涉及特异性地测量LINC00266-1多肽所需的试剂在制备用于实体瘤诊断和/或预后评估的试剂或试剂盒中的应用，其中增加的LINC00266-1多肽的浓度是实体瘤的指征和/或实体瘤预后不良的指征。
上述，需要理解的是，本发明提供一种用于实体恶性肿瘤预后评估判断的新标记物：LINC00266-1多肽。经过临床研究证实，其在实体恶性肿瘤组织中高表达与实体恶性肿瘤患者预后差呈明显正相关。癌组织中LINC00266-1多肽高水平的患者具有更短的生存期和更高的死亡率。据此，LINC00266-1多肽作为生物标志物有效的提高了临床中使用试剂盒进行实体恶性肿瘤预后判断的阳性率。
可以理解的是，本发明提供的LINC00266-1多肽不仅可作为实体恶性肿瘤预后判断的生物标志物，而且采用本发明针对LINC00266-1多肽的特异性抗体来检测本发明的LINC00266-1多肽在癌症组织切片中的表达强弱，可有助于判断实体恶性肿瘤的发生及其恶性程度和转移倾向。
在一些实施方式中，所述实体瘤选自胰腺癌、膀胱癌、结肠直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肾癌、肝细胞癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、食管癌、头颈部癌、黑素瘤、神经内分泌癌、CNS癌、脑肿瘤、骨癌和软组织肉瘤。
在一些实施方式中，所述实体瘤选自晚期或转移性恶性实体瘤。
术语“晚期或转移性恶性实体瘤”是指组织学或细胞学上所证实诊断的晚期、不可切除和/或转移性复发或难治性恶性实体瘤，其对标准疗法无效或不存在经证明对其有效的疗法。根据本发明，恶性实体瘤包括但不限于癌、肉瘤、黑素瘤及淋巴瘤。
在一些实施方式中，所述浓度通过免疫学方法测量。
在一些实施方式中，特异性地测量LINC00266-1多肽所需的试剂(特异性的结合剂)是，例如，LINC00266-1多肽的配体或受体(如果存在的化)、结合LINC00266-1多肽的凝集素、结合LINC00266-1多肽的适配体或结合LINC00266-1多肽的抗体及抗体片段。特异性的结合剂对其相应的靶分子具有至少107l/mol的亲和力。特异性的结合剂优选对其靶分子具有108l/mol、或更优选109l/mol的亲和力。技术人员将理解，使用术语″特异性的″表示，样品中存在的其它生物分子不与LINC00266-1多肽的特异性的结合剂发生显著的结合。
优选地，与除靶分子之外的生物分子结合的水平产生这样的结合亲和力，其最多分别是与靶分子亲和力的仅10％或更少、仅5％或更少、仅2％或更少、或仅1％或更少。优选的特异性的结合剂将同时满足上述关于亲和力和特异性的最小标准。
本发明还涉及一种试剂盒，其包含特异性地测量LINC00266-1多肽或LINC00266-1多肽片段所需的试剂。
在一些实施方式中，所述特异性地测量LINC00266-1多肽或LINC00266-1多肽片段所需的试剂包含抗体。
在一些实施方式中，所述试剂盒还包括一种或更多种其它实体瘤标志物的检测剂。
在一些实施方式中，所述一种或更多种其它实体瘤标志物选自：CEA、NSE、CA 19-9、CA 125、PSA、proGRP、SCC、NNMT、抗-p53自身抗体、Seprase和DPPIV/Seprase。
根据本发明的一方面，本发明还涉及一种评估肿瘤，例如实体瘤的方法，所述方法包括：
(a)使用如上所述的特异性地测量LINC00266-1多肽所需的试剂测量样品中的LINC00266-1多肽的浓度，(b)任选地，测量样品中的一种或更多种其它的癌症标志物的浓度，和(c)使用步骤(a)的测量结果和任选的步骤(b)的测量结果来评估癌症，其中增加的LINC00266-1多肽浓度是癌症的指征。
诊断的理想场景是这样的情形，其中单一事件或过程会造成各种疾病，例如，在感染性疾病中。在所有其它情况下，正确的诊断可能非常困难，尤其当疾病的病因学不能完全理解时，如在许多癌症类型的情况下。如熟练的技术人员将明白的，对于给定的多因子病，没有生化标志物的诊断是100％特异性且同100％灵敏度。相反地，可使用生化标志物(例如，CYFRA21-1、CEA、CA 15-3、CA 19-9、ErbB-2或本文证实的LINC00266-1多肽)来以某种可能性或预测值评估例如疾病的存在与否或严重性。因此，在常规的临床诊断中，通常综合考虑各种临床症状和生物学标志物来诊断、治疗和控制潜在的疾病。
在一些实施方式中，所述样品为细胞提取物。
本文使用的″组织裂解物″、″细胞裂解物″、″裂解物″、″裂解的样品″、″组织提取物″或″细胞提取物″表示包含裂解的组织或细胞的样品和/或生物样品材料，即其中组织或细胞的结构完整性已经被破坏。为了释放细胞或组织样品的内容物，通常用酶和/或化学试剂处理所述材料，以溶解、降解或破坏这样的组织或细胞的细胞壁和细胞膜。熟练的技术员非常熟悉用于得到裂解物的适当方法。该过程被术语″裂解″包括。
在一些实施方式中，所述方法用于肿瘤，例如实体瘤诊断和/或预后评估。
在一个具体的实施方式中，可以根据癌组织切片中与二抗偶联的二氨基联苯胺结合的癌细胞染色的强度和面积进行汇总评分；所述癌细胞染色的强度评分和所述癌细胞的染色面积评分相加，从而获得LINC00266-1多肽在癌细胞中表达强弱的最终评分；以LINC00266-1多肽在癌组织样品中得分与对应癌旁正常组织得分相比，大于1即表示LINC00266-1多肽在癌组织中高表达(high)，其它则为低表达(low)。依据所述比分判断LINC00266-1多肽在癌组织中表达强弱水平，结合分析组织石蜡切片对应的临床预后信息，从而实现对实体恶性肿瘤的预后判断。
在某些实施方式中，还包括对癌组织免疫组化染色切片进行成像的步骤。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
制备抗LINC00266-1多肽抗体，及检测制备的抗LINC00266-1多肽抗体的效价，具体操作流程如下：
(1)通过化学合成的方法对设计的针对LINC00266-1多肽的抗原表位肽(SEQ IDNO：2所示序列)进行合成(吉尔生化(上海)有限公司)，随后将合成的抗原表位肽与钥孔戚血蓝蛋白偶联作为免疫抗原，采用高压液相色谱(HPLC)对该免疫抗原进行分离纯化，使其纯度＞85％。
取2只健康的体重不小于2kg新西兰兔，分别命名为兔1号和兔2号。各采集上述兔耳动脉血液2～3ml，分离获得血清，将该血清作为阴性对照血清。
(2)将上述经HPLC分离纯化后的免疫抗原对新西兰兔1号和2号进行免疫抗原多点注射。具体过程如下：
第一步，用PBS缓冲液溶解与钥孔戚血蓝蛋白偶联的LINC00266-1多肽抗原表位肽。然后按照质量1∶1等比与弗氏完全佐剂(Freund’s complete adjuvant，FCA)，或者弗氏不完全佐剂(Freund’s incomplete adjuvant，FIA)混合乳化。
第二步，经FCA乳化的500ug免疫抗原在新西兰兔1号和2号的背部进行多点注射。2周后，再次在新西兰兔1号和2号的背部多点注射FCA乳化的500ug免疫抗原。2周后，改用FIA乳化的250ug免疫抗原在新西兰兔1号和2号的背部进行多点注射。之后每隔1周，用250ug经FIA乳化的免疫抗原在新西兰兔1号和2号的背部进行多点注射，共进行4次。
(3)免疫抗原多点注射过程结束前的1周，通过新西兰兔耳动脉收集兔1号和2号的血液各2～3ml，分离纯化出血清，进行酶联免疫吸附剂测定(enzyme linkedimmunosorbent assay，ELISA)分析，判断所制备针对LINC00266-1多肽抗体的效价。
随后，将上述分离纯化得到的兔1号和2号耳血清与上述的LINC00266-1多肽免疫抗原进行亲和纯化，从而获得抗LINC00266-1多肽抗体。
(4)用PBS缓冲液将LINC00266-1多肽免疫抗原稀释到5μg/ml。取稀释好的免疫抗原加入96孔板的相应孔中，每孔加入100ul，4℃孵化过夜。次日，将96孔板液体弃掉，用蒸馏水润洗96孔板3次。然后，每孔加200ul封闭液(含PBS缓冲液，1％BSA，0.05％TWEEN-20)，之后放置于37℃恒温箱孵育2小时。弃掉96孔板孔中液体，用蒸馏水润洗96孔板5次。每孔加100ul样品稀释液(2％BSA溶液)，然后按照1∶3125，1∶6250，1∶12500，1∶25000，1∶50000的比例进行梯度稀释。上述阴性对照血清按照稀释比例1∶3000进行稀释，将稀释后的阴性对照血清加入96孔板，每孔加100ul，37℃恒温箱孵育1小时。随后，用蒸馏水润洗96孔板5次，弃掉废液。之后，每孔加入100ul辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG(HRP-labeled goatanti-rabbit IgG)稀释液(稀释比例为1∶5000)，放置于37℃恒温箱孵育45分钟。用蒸馏水润洗96孔板5次，丢弃废液。每孔加100ul底物四甲基联苯胺(TMB)显色液，室温下放置5～8分钟，加2M硫酸终止反应。然后在酶标仪上扫板。
由表1结果可知，基于新西兰兔1号和兔2号制备的抗LINC00266-1多肽的抗体效价均大于1∶50000，效价的测定结果符合梯度稀释规律，兔1号和兔2号抗体效价均比较高。据此，获得了高效价的抗LINC00266-1多肽抗体。
表1.ELISA法检测抗LINC00266-1抗体效价测定结果
实施例2
抗LINC00266-1抗体对LINC00266-1多肽的特异性检测实验，具体步骤如下：
第一步，构建LINC00266-1-GFP融合基因表达载体。首先，将野生型GFP(GFPwt)基因翻译启动子ATGGTG序列定点突变为ATTGTT(GFPmut)。因此破坏了GFP基因的翻译，变成利用LINC00266-1基因上的翻译启动子ATG进行翻译，从而表达产生LINC00266-1-GFP融合蛋白。利用脂质体Lipo2000(Life technology)转染HeLa细胞(ATCC，Number：CCL-2)24小时后，收集细胞裂解制备蛋白样品。分别利用抗GFP抗体和本发明的抗LINC00266-1多肽的抗体，采用WESTERN BLOT免疫印迹的方法，检测LINC00266-1-GFP融合蛋白的表达情况。结果如图1a所示，LINC00266-1-GFP融合蛋白分子量约35KD，借助抗GFP抗体和本发明的抗LINC00266-1抗体均分别可以在35KD的位置特异性检测到此LINC00266-1-GFP融合蛋白的表达。然而采用阴性对照血清(pre-serum)进行相应的WESTERN BLOT免疫印迹检测，则不能检测到蛋白条带。并且抗LINC00266-1抗体检测到的LINC00266-1-GFP融合蛋白条带位置与抗GFP抗体检测到的LINC00266-1-GFP融合蛋白条带位置完全一致，说明抗LINC00266-1抗体特异性检测到了LINC00266-1多肽。本实验以检测β-actin作为内参。
第二步，采用针对LINC00266-1的2个小RNA干扰片段siRNA#1和siRNA#2沉默结肠癌细胞SW620(ATCC，Number：CCL-227)中LINC00266-1基因的表达。提取细胞的总蛋白，采用WESTERN BLOT免疫印迹的方法，检测LINC00266-1多肽的表达水平。RT-PCR技术发现siRNA干扰片段能显著沉默结肠癌SW620细胞中LINC00266-1 RNA的表达水平，结果参见图1b。图1c所示，通过WESTERN BLOT免疫印迹的方法，用抗LINC00266-1抗体检测siRNA沉默前后SW620细胞内LINC00266-1多肽水平的变化，发现LINC00266-1多肽水平显著降低。也说明制备的抗LINC00266-1抗体能够特异识别和检测LINC00266-1多肽。本实验以β-actin作为内参。
实施例3
采用WESTERN BLOT免疫印迹的方法，利用本发明制备的抗LINC00266-1抗体在同一来源不同侵袭转移潜能结肠癌细胞中检测LINC00266-1多肽的表达水平，具体流程如下：
收集2对同一来源不同侵袭转移潜能结肠癌细胞SW480与SW620(ATCC，Number：分别为CCL-228和CCL-227)、HTC-116(ATCC，Number：CCL-247)和HTC-116high(此细胞由本实验室前期筛选建立)，裂解细胞制备蛋白样品。利用WESTERN BLOT免疫印迹方法，采用本发明制备的抗LINC00266-1多肽抗体检测了成对细胞之间LINC00266-1多肽水平的差异。结果如图2所示，LINC00266-1多肽水平在高侵袭转移潜能结肠癌细胞SW620和HTC-116high中明显上调。本实验以β-actin作为内参。
实施例4
收集2017年在广州医科大学附属第三医院确诊为胃癌、肝癌并手术切除的胃癌、肝癌患者各3名。获取其新鲜的肿瘤组织及对应癌旁正常组织。所有胃癌、肝癌患者术前均未接受任何抗肿瘤治疗，并且未患有其它肿瘤疾病。
采用液氮研磨法分别研磨胃癌、肝癌组织和对应的癌旁正常胃组织/肝组织，加入蛋白裂解液，裂解研磨后的组织，提取组织总蛋白。采用WESTERN BLOT免疫印迹的方法，利用本发明制备的抗LINC00266-1多肽抗体检测LINC00266-1多肽在此3对胃癌、肝癌组织及其对应癌旁正常胃组织/肝组织中的水平差异。
结果如图3a和3b所示，相对于癌旁正常胃组织/肝组织，LINC00266-1多肽水平在胃癌、肝癌组织中明显上调。本实验以β-actin作为内参。
实施例5
为进一步证明大规模临床样品中LINC00266-1多肽水平与癌症患者病理学特征和癌症患者生存时间之间的关系，选取90对结肠癌患者行免疫组化分析，具体过程如下：
采集确诊为结肠癌患者的(男47例，女43例，年龄65.5±13.1岁)结肠癌组织以及其对应癌旁正常结肠组织，并制作成石蜡组织芯片(上海芯超公司，HCol-Ade180Sur-14)。
免疫组化采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结SP(streptavidin-perosidase)法。具体步骤如下：将结肠癌组织及配对的癌旁正常结肠组织的组织芯片常规烤片、脱蜡水化，置入1mM EDTA(pH 8.0)缓冲液中，用高压蒸汽修复法进行抗原修复。然后，冷却至室温，利用3％的H2O2阻断灭活内源性过氧化物酶，孵育15min。2％PBS缓冲液冲洗切片3次，每次3min。然后，滴加山羊血清封闭液，室温下孵育25min。再滴加50ul本发明制备的抗LINC00266-1抗体(1∶300)，4℃孵育过夜。次日，用2％PBS缓冲液冲洗5次，每次5min。再滴加50ul HRP标记的羊抗兔Ig G(二抗)(1∶2000)，室温孵育45min。之后用2％PBS缓冲液冲洗5次，每次5min。随后，使用二氨基联苯胺(Diaminobenzidine，DAB)显色1～3min，苏木素复染，常规脱水透明，中性树胶封片。
依据本实验室前期建立的半定量免疫组化结果判断方法，分析免疫组化染色图片。
具体为：依据染色强度，无棕黄色为0分；淡棕黄色为1分；棕黄色为2分；棕褐色为3分。依据相同物镜下观察阳性细胞数，阳性细胞数≤10％为0分；阳性细胞数11％～50％为2分；阳性细胞数51％～80％为3分；阳性细胞数＞80％为4分。
将癌细胞染色强度得分和阳性细胞数百分比的得分相加，即为此样品的LINC00266-1多肽表达水平的总得分。依据LINC00266-1多肽在结肠癌组织样品得分与对应癌旁正常结肠组织得分相比进行分组：1)比值大于1，即表示LINC00266-1多肽在结肠癌组织中高表达(high)，2)其余，则为低表达(low)。结果如图4所示，图4是本发明实施例5的LINC00266-1多肽在结肠癌组织和其对应癌旁正常结肠组织中的表达水平结果。其中，图4a表示对应癌旁正常结肠组织，图4b表示结肠癌组织。
对石蜡切片Lin00266-1多肽染色强度分值及临床信息行统计分析。采用SPSS12.0统计软件包分析，GraphPad Prism 5软件绘图。LINC00266-1多肽在结肠癌组织与对应癌旁正常结肠组织得分用Mann-Whitney U test方法进行统计分析。结果如图5所示，与对应癌旁正常结肠组织(N)相比，LINC00266-1多肽水平在结肠癌组织(T)中显著上调(p＜0.001)。
在此基础上，依据LINC00266-1多肽表达水平，以LINC00266-1多肽在结肠癌组织样品中得分与对应癌旁正常结肠组织得分相比，大于1即表示LINC00266-1在结肠癌组织中高表达(high)，其它则为低表达(low)，从而分成LINC00266-1多肽高、低表达2组。进一步评估了LINC00266-1多肽水平与结肠癌病理学指标的相关性，包括病人的性别，年龄，组织分级(Histological Grade)，T分期(pT status)，N分期(pN status)，临床分期(Clinicalstage)。结果如表2所示，我们发现LINC00266-1多肽高水平组具有更差的临床分期(p＝0.031)。随后我们通过Cox比例风险回归模型分析发现，LINC00266-1多肽高表达(即癌/癌旁＞1)是影响患者总生存期的独立危险因素(表3，HR(95％CI)＝2.57(1.14-5.77)，p＝0.023)。
表2.LINC00266-1多肽水平与结肠癌病理学特征之间的相关性
表3.LINC00266-1多肽表达高水平是影响患者总生存期的独立危险因素
对LINC00266-1多肽表达水平进行高、低分组，我们发现LINC00266-1多肽高表达(high)结肠癌患者有53.1％的死亡率，而LINC00266-1多肽低表达(low)结肠癌患者只有22.0％的死亡率。LINC00266-1多肽高表达结肠癌患者组的死亡率是LINC00266-1多肽低表达结肠癌组死亡率的2.4倍(结果见图6)。采用Kaplan-Meier法和log-rank检验，分析了LINC00266-1多肽表达高低与结肠癌患者生存期的相关性。结果如图7所示，LINC00266-1多肽高表达结肠癌患者组存活率更低、预后更差(p＝0.003)；LINC00266-1多肽高表达结肠癌患者平均存活时间仅仅为48个月，而LINC00266-1多肽低表达结肠癌患者平均存活时间为63个月。LINC00266-1多肽高表达结肠癌患者平均存活时间较低表达组缩短15个月。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.LINC00266-1多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.LINC00266-1多肽片段，其包含SEQ ID NO：1所示序列中的至少5个连续氨基酸。
3.特异性地测量LINC00266-1多肽所需的试剂在制备用于肿瘤诊断和/或预后评估的试剂或试剂盒中的应用，其中增加的LINC00266-1多肽的浓度是实体瘤的指征和/或实体瘤预后不良的指征。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂或试剂盒用于检测受试者肿瘤组织或癌旁组织。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为实体瘤。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述实体瘤选自胰腺癌、膀胱癌、结肠直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肾癌、肝细胞癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、食管癌、头颈部癌、黑素瘤、神经内分泌癌、CNS癌、脑肿瘤、骨癌和软组织肉瘤。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述浓度通过免疫学方法测量。
8.一种试剂盒，其包含特异性地测量权利要求1所述的LINC00266-1多肽或权利要求2所述的LINC00266-1多肽片段所需的试剂。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其还包括一种或更多种其它实体瘤标志物的检测剂。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述一种或更多种其它实体瘤标志物选自：CEA、NSE、CA 19-9、CA 125、PSA、proGRP、SCC、NNMT、抗-p53自身抗体、Seprase和DPPIV/Seprase。
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