CN109517062A - 能够结合linc00266-1多肽的抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及癌症的诊断和治疗领域。本发明公开了一种能够结合LINC00266‑1多肽的抗体。该抗体可以用于肿瘤的检测或诊断，或患者预后情况的评估与监测。

Description

能够结合LINC00266-1多肽的抗体
技术领域
本发明涉及癌症的诊断和治疗领域，具体而言，涉及一种能够结合LINC00266-1多肽的抗体。
背景技术
lncRNA LINC00266-1在美国国立卫生研究院NCBI数据库中被注释为一种长链非编码RNA，现有认为lncRNA LINC00266-1是不能编码蛋白质或多肽的。
因而，现有技术也不存在能够特异性结合LINC00266-1多肽的抗体。
发明内容
本发明涉及一种包含抗原结合结构域的分离的结合蛋白，其能够特异性结合LINC00266-1多肽；所述LINC00266-1多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
根据本发明的另一方面，本发明还涉及如上所述的结合蛋白在制备用于肿瘤诊断和/或预后评估的试剂或试剂盒中的应用，其中增加的LINC00266-1多肽的浓度是实体瘤的指征和/或实体瘤预后不良的指征。
根据本发明的另一方面，本发明还涉及包含如上所述的结合蛋白的试剂、试剂盒或试纸条。
与现有技术相比，本发明至少具有如下优点：
本发明提供一种用于检测LINC00266-1多肽的抗体，LINC00266-1多肽是实体恶性肿瘤预后评估判断的新标记物。临床研究证实，LINC00266-1多肽在实体恶性肿瘤组织中高表达与实体恶性肿瘤患者预后差呈正相关。癌组织中LINC00266-1多肽高水平的患者具有更短的生存期和更高的死亡率。据此，LINC00266-1抗体可作为检测剂，有效提高了临床中实体恶性肿瘤预后判断的阳性率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1所示为本发明实施例2中针对LINC00266-1多肽的抗原表位肽1和2的抗体能够特异性识别和检测LINC00266-1多肽以及LINC00266-1多肽类似物，及针对抗原表位肽1的抗体有更优异的特异性的结果图；
图2为本发明实施例2中，针对LINC00266-1多肽的抗原表位肽1的抗体能够特异性识别和检测LINC00266-1多肽的结果图；
图3为本发明实施例3中，在同一来源不同侵袭转移潜能癌细胞中LINC00266-1多肽表达的结果；
图4为本发明实施例4中，3对新鲜冷冻成对的胃癌、肝癌组织与其对应癌旁组织中LINC00266-1多肽表达的结果；
图5本发明实施例5中，在结肠癌和对应癌旁正常结肠组织中LINC00266-1多肽表达的示意图；图5a表示对应的癌旁正常结肠组织；图5b表示结肠癌组织；
图6为本发明实施例5中，LINC00266-1多肽在90对成对的结肠癌组织与其对应癌旁正常结肠组织石蜡切片中表达的统计分析结果(N：癌旁组织，T：癌组织)；
图7为本发明实施例5中LINC00266-1多肽表达水平高、低与结肠癌患者死亡率关联的结果；
图8为本发明实施例5中LINC00266-1多肽高、低表达水平影响结肠癌患者预后判断的Kaplan-Meier生存分析曲线图。
具体实施方式
本发明涉及一种包含抗原结合结构域的分离的结合蛋白，其能够特异性结合LINC00266-1多肽；所述LINC00266-1多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
“结合蛋白”此用语包括全长抗体或抗体片段，抗体可以为多克隆抗体及单克隆抗体。此外，“抗体”此用语包括天然发生的抗体以及非天然发生的抗体，包括例如嵌合型(chimeric)、双功能型(bifunctional)、人源化(humanized)抗体以及人抗体，以及相关的合成异构形式(isoforms)。
在一些实施方式中，所述结合蛋白可以通过SEQ ID NO：1或其部分(例如SEQ IDNO：2及3)为结合对象通过筛选的方式得到，例如噬箘体展示技术，以及本领域技术人员所公知的其他理由抗原筛选抗体的技术。或者通过本发明所提供的免疫的方式。
长链非编码RNA(Long Non-Protein Coding RNA，lncRNA)起初被认为是基因组转录的“噪音”，不具有生物学功能。然而，近年来的研究表明，实际上lncRNA以RNA的形式在多种层面上(表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等)调控了基因的表达水平。然而近年来的研究表明，某些的序列中包含的一小段却看上去好像一个编码区域，也能编码一些蛋白(A Micropeptide Encoded by a Putative Long Noncoding RNA Regulates MusclePerformance，Douglas M.et al，Cell，2015)。即便如此，现有技术仍普遍认为绝大多数lncRNA不会编码任何蛋白质。
长链基因间非编码RNA(Long Intergenic Non-Protein Coding RNA，lincRNA)是lncRNA中的一种，LINC00266-1(Gene ID：140849)是最近新发现的一种lincRNA，其功能还未探究清楚。
在本发明之前，还没有出现涉及本发明LINC00266-1多肽以及本发明蛋白多肽用于实体恶性肿瘤预后评估及诊断的公开报道，也没有证实长链非编码RNA LINC00266-1编码一种活性多肽的公开报道，更没有出现LINC00266-1多肽用于实体恶性肿瘤预后评估及诊断的公开报道。
在一些实施方式中，所述抗体以LINC00266-1多肽的SEQ ID NO：2或3所示表位序列作为免疫原免疫得到。
进一步的，所述SEQ ID NO：2或3所示序列作为抗原时，其纯度＞85％。
在一些实施方式中，在进行免疫之前，所述免疫原与载体蛋白进行偶联。
在一些实施方式中，所述载体蛋白为钥孔戚血蓝蛋白。
在一些实施方式中，所述结合蛋白为全长抗体，其恒定区序列选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD任何其中之一。
在一些实施方式中，所述恒定区的种属来源为牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡或人。
在一些实施方式中，所述结合蛋白为纳米抗体、F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、scFv、双特异抗体和抗体最小识别单位中的一种。
在一些实施方式中，所述结合蛋白标记有显示信号强度的指示剂。
所述指示剂可以用来指示抗原-抗体复合物的存在/含量，以进行定性/定量分析。
在一些实施方式中，所述显示信号强度的指示剂包括荧光物质、量子点、地高辛标记探针、生物素、放射性同位素、放射性造影剂、顺磁离子荧光微球、电子致密物质、化学发光标记物、超声造影剂、光敏剂、胶体金或酶中的任一种。
在一些实施方式中，所述荧光物质包括Alexa 350、Alexa 405、Alexa 430、Alexa488、Alexa 555、Alexa 647、AMCA、氨基吖啶、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、6-羧基罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、Cascade Blue、Cy2、Cy3、Cy5、Cy7、6-FAM、丹磺酰氯、荧光素、HEX、6-JOE、NBD(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑)、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green514、Pacific Blue、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚蓝紫、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、酞菁、偶氮甲碱、花青、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、稀土金属穴状化合物、三双吡啶基二胺铕、铕穴状化合物或螯合物、二胺、双花青苷、La Jolla蓝染料、别藻蓝蛋白、allococyanin B、藻蓝蛋白C、藻蓝蛋白R、硫胺、藻红青蛋白、藻红蛋白R、REG、罗丹明绿、罗丹明异硫氰酸酯、罗丹明红、ROX、TAMRA、TET、TRIT(四甲基罗丹明异硫醇)、四甲基罗丹明和德克萨斯红中的任一种。
在一些实施方式中，所述放射性同位素包括110In、111In、177Lu、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、90Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154-158Gd、32P、11C、13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb和83Sr中的任一种。
在一些实施方式中，所述酶包括辣根过氧化酶、碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶中的任一种。
在一些实施方式中，所述荧光微球为：聚苯乙烯荧光微球，内部包裹有稀土荧光离子铕。
根据本发明的另一方面，本发明还涉及如上所述的结合蛋白在制备用于肿瘤诊断和/或预后评估的试剂或试剂盒中的应用，其中增加的LINC00266-1多肽的浓度是实体瘤的指征和/或实体瘤预后不良的指征。
在一些实施方式中，所述肿瘤为实体瘤。
在一些实施方式中，所述实体瘤选自晚期或转移性恶性实体瘤。
术语“晚期或转移性恶性实体瘤”是指组织学或细胞学上所证实诊断的晚期、不可切除和/或转移性复发或难治性恶性实体瘤，其对标准疗法无效或不存在经证明对其有效的疗法。根据本发明，恶性实体瘤包括但不限于癌、肉瘤、黑素瘤及淋巴瘤。
在一些实施方式中，所述实体瘤选自胰腺癌、膀胱癌、结肠直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肾癌、肝细胞癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、食管癌、头颈部癌、黑素瘤、神经内分泌癌、CNS癌、脑肿瘤、骨癌和软组织肉瘤。
可以理解的是，本发明提供的结合蛋白不仅可作为实体恶性肿瘤预后判断的生物标志物的检测剂，而且采用本发明针对LINC00266-1多肽的特异性抗体来检测本发明的LINC00266-1多肽在癌症组织切片中的表达强弱，可有助于判断实体恶性肿瘤的发生及其恶性程度和转移倾向。
根据本发明的另一方面，本发明还涉及包含如上所述的结合蛋白的试剂、试剂盒或试纸条。
在一些实施方式中，所述试剂、试剂盒或试纸条还包括一种或更多种其它实体瘤标志物的检测剂。
在一些实施方式中，所述一种或更多种其它实体瘤标志物选自：CEA、NSE、CA 19-9、CA 125、PSA、proGRP、SCC、NNMT、抗-p53自身抗体、Seprase和DPPIV/Seprase。
根据本发明的一方面，本发明还涉及一种评估肿瘤，例如实体瘤的方法，所述方法包括：
(a)使用如上所述的结合蛋白测量样品中的LINC00266-1多肽的浓度，(b)任选地，测量样品中的一种或更多种其它的癌症标志物的浓度，和(c)使用步骤(a)的测量结果和任选的步骤(b)的测量结果来评估癌症，其中增加的LINC00266-1多肽浓度是癌症的指征。
诊断的理想场景是这样的情形，其中单一事件或过程会造成各种疾病，例如，在感染性疾病中。在所有其它情况下，正确的诊断可能非常困难，尤其当疾病的病因学不能完全理解时，如在许多癌症类型的情况下。如熟练的技术人员将明白的，对于给定的多因子病，没有生化标志物的诊断是100％特异性且同100％灵敏度。相反地，可使用生化标志物(例如，CYFRA21-1、CEA、CA 15-3、CA 19-9、ErbB-2或本文证实的LINC00266-1多肽)来以某种可能性或预测值评估例如疾病的存在与否或严重性。因此，在常规的临床诊断中，通常综合考虑各种临床症状和生物学标志物来诊断、治疗和控制潜在的疾病。
在一些实施方式中，所述样品为细胞提取物。
本文使用的″组织裂解物″、″细胞裂解物″、″裂解物″、″裂解的样品″、″组织提取物″或″细胞提取物″表示包含裂解的组织或细胞的样品和/或生物样品材料，即其中组织或细胞的结构完整性已经被破坏。为了释放细胞或组织样品的内容物，通常用酶和/或化学试剂处理所述材料，以溶解、降解或破坏这样的组织或细胞的细胞壁和细胞膜。熟练的技术员非常熟悉用于得到裂解物的适当方法。该过程被术语″裂解″包括。
在一些实施方式中，所述方法用于肿瘤，例如实体瘤诊断和/或预后评估。
在一个具体的实施方式中，可以根据癌组织切片中与二抗偶联的二氨基联苯胺结合的癌细胞染色的强度和面积进行汇总评分；所述癌细胞染色的强度评分和所述癌细胞的染色面积评分相加，从而获得LINC00266-1多肽在癌细胞中表达强弱的最终评分；以LINC00266-1多肽在癌组织样品中得分与对应癌旁正常组织得分相比，大于1即表示LINC00266-1多肽在癌组织中高表达(high)，其它则为低表达(low)。依据所述比分判断LINC00266-1多肽在癌组织中表达强弱水平，结合分析组织石蜡切片对应的临床预后信息，从而实现对实体恶性肿瘤的预后判断。
在某些实施方式中，还包括对癌组织免疫组化染色切片进行成像的步骤。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
制备抗LINC00266-1多肽抗体，及检测制备的抗LINC00266-1多肽抗体的效价，具体操作流程如下：
(1)通过化学合成的方法对设计的针对LINC00266-1多肽的抗原表位肽1(SEQ IDNO：2所示)和抗原表位肽2(SEQ ID NO：3所示)进行合成(吉尔生化(上海)有限公司)，随后将合成的抗原表位肽1和抗原表位肽2分别与钥孔戚血蓝蛋白偶联作为免疫抗原1和免疫抗原2，采用高压液相色谱(HPLC)对该免疫抗原进行分离纯化，使其纯度＞85％。
取2只健康的体重不小于2kg新西兰兔，分别命名为抗原表位肽1的兔，以及抗原表位肽2的兔。各采集上述兔耳动脉血液2～3ml，分离获得血清，将该血清作为阴性对照血清。
(2)将上述经HPLC分离纯化后的免疫抗原1表位肽和免疫抗原2表位肽分别与对应的新西兰兔和进行免疫抗原多点注射。具体过程如下：
第一步，用PBS缓冲液溶解与钥孔戚血蓝蛋白偶联的LINC00266-1多肽抗原表位肽。然后按照质量1∶1等比与弗氏完全佐剂(Freund’s complete adjuvant，FCA)，或者弗氏不完全佐剂(Freund’s incomplete adjuvant，FIA)混合乳化。
第二步，经FCA乳化的500ug免疫抗原在新西兰兔的背部进行多点注射。2周后，再次在新西兰兔的背部多点注射FCA乳化的500ug免疫抗原。2周后，改用FIA乳化的250ug免疫抗原在新西兰兔的背部进行多点注射。之后每隔1周，用250ug经FIA乳化的免疫抗原在新西兰兔的背部进行多点注射，共进行4次。
(3)免疫抗原多点注射过程结束前的1周，通过新西兰兔耳动脉收集兔1号和2号的血液各2～3ml，分离纯化出血清，进行酶联免疫吸附剂测定(enzyme linkedimmunosorbent assay，ELISA)分析，判断所制备针对LINC00266-1多肽抗体的效价。
随后，将上述分离纯化得到的兔耳血清与上述的LINC00266-1多肽免疫抗原进行亲和纯化，从而获得抗LINC00266-1多肽抗体。
(4)用PBS缓冲液将LINC00266-1多肽免疫抗原稀释到5μg/ml。取稀释好的免疫抗原加入96孔板的相应孔中，每孔加入100ul，4℃孵化过夜。次日，将96孔板液体弃掉，用蒸馏水润洗96孔板3次。然后，每孔加200ul封闭液(含PBS缓冲液，1％BSA，0.05％TWEEN-20)，之后放置于37℃恒温箱孵育2小时。弃掉96孔板孔中液体，用蒸馏水润洗96孔板5次。每孔加100ul样品稀释液(2％BSA溶液)，然后按照1∶3125，1∶6250，1∶12500，1∶25000，1∶50000的比例进行梯度稀释。上述阴性对照血清按照稀释比例1∶3000进行稀释，将稀释后的阴性对照血清加入96孔板，每孔加100ul，37℃恒温箱孵育1小时。随后，用蒸馏水润洗96孔板5次，弃掉废液。之后，每孔加入100ul辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG(HRP-labeled goatanti-rabbit IgG)稀释液(稀释比例为1∶5000)，放置于37℃恒温箱孵育45分钟。用蒸馏水润洗96孔板5次，丢弃废液。每孔加100ul底物四甲基联苯胺(TMB)显色液，室温下放置5～8分钟，加2M硫酸终止反应。然后在酶标仪上扫板。
由表1结果可知，基于抗原表位肽1的制备的抗LINC00266-1多肽的抗体效价均大于1∶50000，效价的测定结果符合梯度稀释规律，抗体效价比较高。据此，基于抗原肽1获得了高效价的抗LINC00266-1多肽抗体。
表1.ELISA法检测抗LINC00266-1抗体效价测定结果。
由表2结果可知，基于抗原表位肽2的新西兰兔1号和兔2号制备的抗LINC00266-1多肽的抗体效价均大于1∶50000，效价的测定结果符合梯度稀释规律。据此，基于抗原肽2获得了高效价的抗LINC00266-1多肽抗体。
表2.ELISA法检测抗LINC00266-1抗体效价测定结果。
基于抗原表位肽1和抗原表位肽2制备的抗体效价比较，基于抗原表位肽1制备的抗体具有更好的效果，说明抗原表位肽1具有更高的免疫原性。
实施例2
基于抗原表位肽1制备的抗LINC00266-1抗体及基于抗原表位肽2制备的抗LINC00266-1抗体对LINC00266-1多肽的特异性检测实验，具体步骤如下：
第一步，构建LINC00266-1-GFP融合基因表达载体。首先，将野生型GFP(GFPwt)基因翻译启动子ATGGTG序列定点突变为ATTGTT(GFPmut)。因此破坏了GFP基因的翻译，变成利用LINC00266-1基因上的翻译启动子ATG进行翻译，从而表达产生LINC00266-1-GFP融合蛋白。利用脂质体Lipo2000(Life technology)转染HeLa细胞(ATCC，Number：CCL-2)24小时后，收集细胞裂解制备蛋白样品。分别利用本发明的基于抗原表位肽1制备的抗LINC00266-1多肽的抗体和基于抗原表位肽2制备的抗LINC00266-1多肽的抗体，采用WESTERN BLOT免疫印迹的方法，检测LINC00266-1-GFP融合蛋白的表达情况。结果如图1所示，LINC00266-1-GFP融合蛋白分子量约35KD，借助本发明基于抗原表位肽1制备的抗LINC00266-1多肽的抗体和基于抗原表位肽2制备的抗LINC00266-1多肽的抗体均分别可以在35KD的位置特异性检测到此LINC00266-1-GFP融合蛋白的表达。然而采用阴性对照血清(pre-serum)进行相应的WESTERN BLOT免疫印迹检测，则不能检测到蛋白条带。并且基于抗原表位肽1制备的抗LINC00266-1多肽的抗体检测到的LINC00266-1-GFP融合蛋白条带位置单一、特异性较抗原表位肽2制备的抗LINC00266-1多肽的抗体更优异。
之后，分别利用抗GFP抗体和本发明基于抗原表位肽1制备的抗LINC00266-1抗体，采用WESTERN BLOT免疫印迹的方法，检测LINC00266-1-GFP融合蛋白的表达情况。结果如图2a所示，LINC00266-1-GFP融合蛋白分子量约35KD，借助抗GFP抗体和本发明基于抗原表位肽1制备的抗LINC00266-1抗体均分别可以在35KD的位置特异性检测到此LINC00266-1-GFP融合蛋白的表达。然而采用阴性对照血清(pre-serum)进行相应的WESTERN BLOT免疫印迹检测，则不能检测到蛋白条带。并且抗LINC00266-1抗体检测到的LINC00266-1-GFP融合蛋白条带位置与抗GFP抗体检测到的LINC00266-1-GFP融合蛋白条带位置完全一致，说明基于抗原表位肽1制备的抗LINC00266-1抗体特异性检测到了LINC00266-1多肽。本实验以检测β-actin作为内参。
第二步，采用针对LINC00266-1的2个小RNA干扰片段siRNA#1和siRNA#2沉默结肠癌细胞SW620(ATCC，Number：CCL-227)中LINC00266-1基因的表达。提取细胞的总蛋白，采用WESTERN BLOT免疫印迹的方法，检测LINC00266-1多肽的表达水平。RT-PCR技术发现siRNA干扰片段能显著沉默结肠癌SW620细胞中LINC00266-1 RNA的表达水平，结果参见图2b。图2c所示，通过WESTERN BLOT免疫印迹的方法，用抗LINC00266-1抗体检测siRNA沉默前后SW620细胞内LINC00266-1多肽水平的变化，发现LINC00266-1多肽水平显著降低。也说明制备的抗LINC00266-1抗体能够特异识别和检测LINC00266-1多肽。本实验以β-actin作为内参。
以下实施例所采用的LINC00266-1多肽的抗体，如无特别说明，均是抗原表位肽1免疫得到。
实施例3
采用WESTERN BLOT免疫印迹的方法，利用本发明制备的抗LINC00266-1抗体在同一来源不同侵袭转移潜能结肠癌细胞中检测LINC00266-1多肽的表达水平，具体流程如下：
收集2对同一来源不同侵袭转移潜能结肠癌细胞SW480与SW620(ATCC，Number：分别为CCL-228和CCL-227)、HTC-116(ATCC，Number：CCL-247)和HTC-116high(此细胞由本实验室前期筛选建立)，裂解细胞制备蛋白样品。利用WESTERN BLOT免疫印迹方法，采用本发明制备的抗LINC00266-1多肽抗体检测了成对细胞之间LINC00266-1多肽水平的差异。结果如图3所示，LINC00266-1多肽水平在高侵袭转移潜能结肠癌细胞SW620和HTC-116high中明显上调。本实验以β-actin作为内参。
实施例4
收集2017年在广州医科大学附属第三医院确诊为胃癌、肝癌并手术切除的胃癌、肝癌患者各3名。获取其新鲜的肿瘤组织及对应癌旁正常组织。所有胃癌、肝癌患者术前均未接受任何抗肿瘤治疗，并且未患有其它肿瘤疾病。
采用液氮研磨法分别研磨胃癌、肝癌组织和对应的癌旁正常胃组织/肝组织，加入蛋白裂解液，裂解研磨后的组织，提取组织总蛋白。采用WESTERN BLOT免疫印迹的方法，利用本发明制备的抗LINC00266-1多肽抗体检测LINC00266-1多肽在此3对胃癌、肝癌组织及其对应癌旁正常胃组织/肝组织中的水平差异。
结果如图4a和4b所示，相对于癌旁正常胃组织/肝组织，LINC00266-1多肽水平在胃癌、肝癌组织中明显上调。本实验以β-actin作为内参。
实施例5
为进一步证明大规模临床样品中LINC00266-1多肽水平与癌症患者病理学特征和癌症患者生存时间之间的关系，选取90对结肠癌患者行免疫组化分析，具体过程如下：
采集确诊为结肠癌患者的(男47例，女43例，年龄65.5±13.1岁)结肠癌组织以及其对应癌旁正常结肠组织，并制作成石蜡组织芯片(上海芯超公司，HCol-Ade180Sur-14)。
免疫组化采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结SP(streptavidin-perosidase)法。具体步骤如下：将结肠癌组织及配对的癌旁正常结肠组织的组织芯片常规烤片、脱蜡水化，置入1mM EDTA(pH 8.0)缓冲液中，用高压蒸汽修复法进行抗原修复。然后，冷却至室温，利用3％的H2O2阻断灭活内源性过氧化物酶，孵育15min。2％PBS缓冲液冲洗切片3次，每次3min。然后，滴加山羊血清封闭液，室温下孵育25min。再滴加50ul本发明制备的抗LINC00266-1抗体(1∶300)，4℃孵育过夜。次日，用2％PBS缓冲液冲洗5次，每次5min。再滴加50ul HRP标记的羊抗兔Ig G(二抗)(1∶2000)，室温孵育45min。之后用2％PBS缓冲液冲洗5次，每次5min。随后，使用二氨基联苯胺(Diaminobenzidine，DAB)显色1～3min，苏木素复染，常规脱水透明，中性树胶封片。
依据本实验室前期建立的半定量免疫组化结果判断方法，分析免疫组化染色图片。
具体为：依据染色强度，无棕黄色为0分；淡棕黄色为1分；棕黄色为2分；棕褐色为3分。依据相同物镜下观察阳性细胞数，阳性细胞数≤10％为0分；阳性细胞数11％～50％为2分；阳性细胞数51％～80％为3分；阳性细胞数＞80％为4分。
将癌细胞染色强度得分和阳性细胞数百分比的得分相加，即为此样品的LINC00266-1多肽表达水平的总得分。依据LINC00266-1多肽在结肠癌组织样品得分与对应癌旁正常结肠组织得分相比进行分组：1)比值大于1，即表示LINC00266-1多肽在结肠癌组织中高表达(high)，2)其余，则为低表达(low)。结果如图5所示，图5是本发明实施例5的LINC00266-1多肽在结肠癌组织和其对应癌旁正常结肠组织中的表达水平结果。其中，图5a表示对应癌旁正常结肠组织，图5b表示结肠癌组织。
对石蜡切片Lin00266-1多肽染色强度分值及临床信息行统计分析。采用SPSS12.0统计软件包分析，GraphPad Prism 5软件绘图。LINC00266-1多肽在结肠癌组织与对应癌旁正常结肠组织得分用Mann-Whitney U test方法进行统计分析。结果如图6所示，与对应癌旁正常结肠组织(N)相比，LINC00266-1多肽水平在结肠癌组织(T)中显著上调(p＜0.001)。
在此基础上，依据LINC00266-1多肽表达水平，以LINC00266-1多肽在结肠癌组织样品中得分与对应癌旁正常结肠组织得分相比，大于1即表示LINC00266-1在结肠癌组织中高表达(high)，其它则为低表达(low)，从而分成LINC00266-1多肽高、低表达2组。进一步评估了LINC00266-1多肽水平与结肠癌病理学指标的相关性，包括病人的性别，年龄，组织分级(Histological Grade)，T分期(pT status)，N分期(pN status)，临床分期(Clinicalstage)。结果如表3所示，我们发现LINC00266-1多肽高水平组具有更差的临床分期(p＝0.031)。随后我们通过Cox比例风险回归模型分析发现，LINC00266-1多肽高表达(即癌/癌旁＞1)是影响患者总生存期的独立危险因素(表4，HR(95％CI)＝2.57(1.14-5.77)，p＝0.023)。
表3.LINC00266-1多肽水平与结肠癌病理学特征之间的相关性
表4.LINC00266-1多肽表达高水平是影响患者总生存期的独立危险因素
对LINC00266-1多肽表达水平进行高、低分组，我们发现LINC00266-1多肽高表达(high)结肠癌患者有53.1％的死亡率，而LINC00266-1多肽低表达(low)结肠癌患者只有22.0％的死亡率。LINC00266-1多肽高表达结肠癌患者组的死亡率是LINC00266-1多肽低表达结肠癌组死亡率的2.4倍(结果见图7)。采用Kaplan-Meier法和log-rank检验，分析了LINC00266-1多肽表达高低与结肠癌患者生存期的相关性。结果如图8所示，LINC00266-1多肽高表达结肠癌患者组存活率更低、预后更差(p＝0.003)；LINC00266-1多肽高表达结肠癌患者平均存活时间仅仅为48个月，而LINC00266-1多肽低表达结肠癌患者平均存活时间为63个月。LINC00266-1多肽高表达结肠癌患者平均存活时间较低表达组缩短15个月。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.包含抗原结合结构域的分离的结合蛋白，其能够特异性结合LINC00266-1多肽；所述LINC00266-1多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.根据权利要去1所述的结合蛋白，其特征在于，所述抗体以LINC00266-1多肽的SEQID NO：2或3所示表位序列作为免疫原免疫得到。
3.根据权利要去2所述的结合蛋白，其特征在于，在进行免疫之前，所述免疫原与载体蛋白进行偶联。
4.根据权利要去3所述的结合蛋白，其特征在于，所述载体蛋白为钥孔戚血蓝蛋白。
5.根据权利要去1所述的结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白为全长抗体，其恒定区序列选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD任何其中之一。
6.根据权利要求5所述的结合蛋白，其特征在于，所述恒定区的种属来源为牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡或人。
7.根据权利要去1所述的结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白为纳米抗体、F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、seFv、双特异抗体和抗体最小识别单位中的一种。
8.根据权利要去1～7任一项所述的结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白标记有显示信号强度的指示剂；
优选的，所述显示信号强度的指示剂包括荧光物质、量子点、地高辛标记探针、生物素、放射性同位素、放射性造影剂、顺磁离子荧光微球、电子致密物质、化学发光标记物、超声造影剂、光敏剂、胶体金或酶中的任一种。
9.权利要去1～8任一项所述的结合蛋白在制备用于肿瘤诊断和/或预后评估的试剂或试剂盒中的应用，其中增加的LINC00266-1多肽的浓度是实体瘤的指征和/或实体瘤预后不良的指征；
优选的，所述肿瘤为实体瘤；
更优选的，所述实体瘤选自胰腺癌、膀胱癌、结肠直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肾癌、肝细胞癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、食管癌、头颈部癌、黑素瘤、神经内分泌癌、CNS癌、脑肿瘤、骨癌和软组织肉瘤。
10.包含权利要求1～8任一项所述的结合蛋白的试剂、试剂盒或试纸条。
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