CN109142755A - 一种诊断早期食管鳞状细胞癌的四种自身抗体联合检测试剂盒及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种诊断早期食管鳞状细胞癌的多种自身抗体联合检测试剂盒及应用。该试剂盒包括固相基质和包被于固相基质上的抗原蛋白，所述的抗原蛋白由TP53、HRAS、CTAG1A和NSG1组成。本发明首次采用TP53、HRAS、CTAG1A和NSG1作为一个组合用于ESCC的早期诊断，具有较高的敏感性和特异性，有助于进一步改进ESCC早期诊断的血清学筛查质量，进而促进患者治愈率的提高与生存率的延长。

Description

一种诊断早期食管鳞状细胞癌的四种自身抗体联合检测试剂 盒及应用

技术领域

本发明属于医学诊断技术领域，具体而言，涉及一种基于Luminex xMAP技术的诊断早期食管鳞状细胞癌的多种自身抗体联合检测试剂盒及应用。

背景技术

食管鳞状细胞癌(ESCC)是世界范围内常见的上消化道恶性肿瘤之一。中国作为一个食管癌高发区，ESCC在全世界发病率最高，并且位列癌症致死原因的第四位(Ferlay J,Soerjomataram I,Dikshit R,Eser S,Mathers C,Rebelo M,et al.Cancer incidenceand mortality worldwide:Sources,methods andmajor patterns in GLOB℃AN2012.Int J Cancer2015；136(5):E359-86.)。ESCC患者早期多无特异临床症状，难以被察觉，其发现困难，五年生存率仅为15-25％(PennathurA,Gibson MK,Jobe BA,LuketichJD.Oesophageal carcinoma.Lancet 2013；381(9864):400-12.)。作为传统的筛查方法，内窥镜检查和粘膜活检被广泛应用于ESCC的早期诊断，但由于随机内镜活检取样存在的误差及其诊断的侵入性限制了其在ESCC早期诊断及无症状人群筛查中的应用。因此，发现新的早期ESCC生物标志物作为非侵入性筛查试验以提高患者的存活率是至关重要的。

近年来的研究发现，人体的免疫系统可对自身抗肿瘤相关抗原(TAAs)产生体液免疫应答，并在肿瘤发生过程中引发大量自身抗体释放至血清中。越来越多的证据表明，血清中存在的TAAs的循环自身抗体在癌症患者临床症状出现前的3-5年即可被检测到，可作为早期癌症患者新的筛选标记物(Tan HT,Low J,Lim SG,Chung MC.Serum autoantibodiesas biomarkers for early cancer detection.FEBS J 2009；276(23):6880-904)。因此，相比TAAs，针对TAAs血清自身抗体的检测可为早期无症状癌症患者的监测提供更灵敏的方法；此外，针对TAAs的自身抗体在血清中可稳定、持久的存在。自身抗体的这些特点，使其有望成为ESCC早期诊断的理想血清学标志物。

不同疾病的自身抗体谱均不同，因此获得特定疾病的自身抗体谱对相关诊断具有重要意义。特定疾病自身抗体的发现是通过其识别抗原来进行定义和筛选，方法均基于抗原-抗体特异性结合的免疫检测。抗原的来源包括重组表达蛋白、cDNA表达库、细胞或组织分离的蛋白组等，筛选方法主要是免疫印迹，高通量蛋白质芯片，酶联免疫吸附等。目前的研究中，人们仍然在试图寻找诊断ESCC更加敏感特异的抗TAAs自身抗体，虽然已有抗TAAs自身抗体的文献报道，但是其敏感性和特异性较低，临床应用价值有限。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种敏感性和特异性高，从而有效诊断早期食管鳞状细胞癌的多种自身抗体联合检测试剂盒及应用。

本发明人前期采用高通量蛋白芯片(HuProt v3.0，含20240种蛋白，美国约翰霍普金斯医学院高通量生物学中心提供)技术，经一系列筛选、验证步骤，共发现8种IgG型抗TP53、ETHE1、CTAG1A、C1QTNF1、TEX264、CLDN2、NSG1、HRAS自身抗体对早期肺癌具有较好的诊断价值。

令人意外的是，在后续开展的一项小样本的研究中，我们发现8种自身抗体中的抗TP53，HRAS，CTAG1A(P<0.01)与NSG1(P<0.05)在早期ESCC组(n＝50)的水平与阳性率均明显高于食管良性病变(EBL)组(n＝50)与健康对照(HC)组(n＝50)。

为了确定四种自身抗体标志物对ESCC具有较好的早期诊断价值，本发明人开展了大样本队列研究，研究中我们通过酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测569例血清样本，评估四种自身抗体检测对ESCC早期诊断的性能。研究结果显示，四种自身抗体的组合检测可以显著区分早期ESCC患者组与对照组(EBL+HC)，其敏感性和特异性显著优于现有肿瘤诊断标志物，适合开发成具有临床应用价值的联合检测试剂盒。

从而，根据本发明人的试验研究，本发明的技术方案概况如下：

一种诊断早期食管鳞状细胞癌的四种自身抗体联合检测试剂盒，该试剂盒包括固相基质和包被于固相基质上的抗原蛋白，所述的抗原蛋白由TP53、HRAS、CTAG1A和NSG1组成。

进一步优选地，如上所述诊断早期食管鳞状细胞癌的四种自身抗体联合检测试剂盒，其中的抗原蛋白上带有标签蛋白。

再进一步优选地，如上所述诊断早期食管鳞状细胞癌的四种自身抗体联合检测试剂盒，其中的标签蛋白为His标签、GST标签、Flag标签或HA标签。

进一步优选地，如上所述诊断早期食管鳞状细胞癌的四种自身抗体联合检测试剂盒，其中的固相基质为微孔板、微球体或多孔膜构成的支持基质。

进一步优选地，如上所述诊断早期食管鳞状细胞癌的四种自身抗体联合检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括样本稀释液、洗涤液、第二抗体、第二抗体稀释液、显色液和终止液。

再进一步优选地，如上所述诊断早期食管鳞状细胞癌的四种自身抗体联合检测试剂盒，其特征在于，所述的第二抗体为抗人免疫球蛋白的抗体，其上带有可检测的标记物。

再进一步优选地，如上所述诊断早期食管鳞状细胞癌的四种自身抗体联合检测试剂盒，其特征在于，所述的第二抗体为PE标记的山羊抗人免疫球蛋白的抗体。

另外，本研究中四种自身抗体针对的TAAs，其中P53作为一种公认的抑癌基因，参与细胞周期、凋亡、衰老、DNA修复等多种细胞功能的调节]，在多种肿瘤(包括ESCC)中存在突变、过表达等方面的异常改变。HRas是ras癌基因家族的一员，其突变与膀胱癌、甲状腺癌、涎腺导管癌、上皮-肌上皮癌、肾癌等的发生有关。CTAG1A又称纽约食管鳞状上皮癌抗原1(NY-ESO-1)，是肿瘤睾丸抗原(CTA)亚家族之一，可诱导机体产生针对肿瘤细胞的强烈免疫应答。NSG1又称神经元特异基因家族成员1，是一种由神经元细胞表达的内涵体蛋白。四种自身抗体中抗TP53、CTAG1A抗体已有文献报道与ESCC的诊断(包括早期诊断)有关，但敏感性较低，而抗HRAS、NSG1抗体在ESCC早期诊断的应用目前国内外均未见文献报道。本发明的研究发现，四种自身抗体单独检测对ESCC早期诊断的敏感性仅仅介于18.6％至30.2％之间，进一步的研究中对四种自身抗体所有可能组合模式(任意两种、任意三种以及四种自身抗体联合)的性能进行分析，通过训练集的建模与验证集的验证，发现四种标志物的组合检测对早期ESCC具有非常高的诊断性能，其敏感性可提高至60％(特异性90％)，提示四种自身抗体的组合对ESCC的早期诊断具有巨大的应用前景。因此，本发明还提供了抗TP53自身抗体、抗HRAS自身抗体、抗CTAG1A自身抗体和抗NSG1自身抗体作为联合诊断标志物在制备诊断食管鳞状细胞癌的试剂盒中的应用。

ELISA法是单项标志物的常规检测方法，但在多种自身抗体的组合检测方面，ELISA法操作繁琐，其临床应用价值有限。相比ELISA法，将Luminex xMAP技术应用于血清自身抗体组合的组合检测，无疑具有高通量的优势。在本研究中，我们成功构建了基于Luminex xMAP技术的多重检测方法，可在一份血清样本中同时开展四种自身抗体的检测，研究结果表明，四种自身抗体的Luminex法检测结果与ELISA法之间具明显的相关性，这进一步证实了TP53，HRAS，CTAG1A和ESCC共四种自身抗体标志物对ESCC具有非常好的早期诊断价值。因此，本发明优选所述的试剂盒为基于Luminex xMAP技术的多重检测试剂盒。

与现有技术相比，本发明首次采用TP53、HRAS、CTAG1A和NSG1作为一个组合用于ESCC的早期诊断，具有较高的敏感性和特异性。另外，本发明首次通过开展的队列研究，在大样本范围内深入阐明了四种自身抗体抗TP53、HRAS、CTAG1A和NSG1的组合检测对ESCC具有理想的早期诊断价值。最后，本发明通过Luminex xMAP技术平台，建立了四种自身抗体组合的多重检测方法。以上研究成果的取得，有助于进一步改进ESCC早期诊断的血清学筛查质量，进而促进患者治愈率的提高与生存率的延长。

附图说明

图1：四种血清自身抗体检测对食管鳞状细胞癌早期诊断的试验研究流程；

图2：四种血清自身抗体的Western blotting法鉴定结果；

图3：phase I自身抗体的诊断性能；

图4：phase I自身抗体组合模式的鉴定；

图5：phase II自身抗体的诊断性能；

图6：四种重组蛋白耦联荧光微球的检测；

图7：Luminex法与ELISA法检测结果的相关性；

图8：phase III自身抗体的诊断性能；

图9：小样本试验各组之间八种血清自身抗体水平的比较。

具体实施例

下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。另外，实施例中未注明具体技术操作步骤或条件者，均按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：八种血清自身抗体检测对食管鳞状细胞癌早期诊断试验研究(小样本)

1材料和方法

1.1研究对象

收集2015年3月至2016年2月来自福建省立医院的150份血清样本，其中早期ESCC患者50例，EBL患者50例，HC患者50例。50例早期ESCC患者均在内镜的基础上结合细胞学或组织病理学确诊，未接受化疗、放疗等任何抗肿瘤治疗，TNM分类为0，I，II期。50例EBL患者来自同期在福建省立医院住院初治的患者，包括食管良性肿瘤、食管良性溃疡、食管糜烂及反流性食管炎等。50例HC患者来自福建省立医院体检中心的健康体检成人，未显示任何恶性肿瘤的证据。本研究由福建省立医院的伦理委员会批准；研究对象临床资料详见表1。

表1：前期小样本研究对象的临床特征

1.2 ELISA法检测八种血清自身抗体

以0.5ng/μl的TP53、ETHE1、CTAG1A、C1QTNF1、TEX264、CLDN2、NSG1、HRAS重组蛋白(酵母系统表达，带GST标签蛋白，美国约翰霍普金斯医学院高通量生物学中心提供)包被酶标孔板(美国Thermo Fisher Scientific公司)，100μl/孔，4℃包被过夜；用含0.2％吐温20的磷酸盐缓冲液(PBST)洗涤3遍后，3％牛血清白蛋白(BSA)(美国Amresco公司)300μl/孔，37℃封闭1小时；PBST洗1遍后，加入1:500稀释的血清样本，100μl/孔，37℃温育1小时；PBST洗4遍后，加入1:40000稀释的HRP标记羊抗人IgG抗体(Jackson immuno公司)，100μl/孔，37℃温育30min；PBST洗4遍后，加入四甲基联苯胺(TMB)和3％过氧化氢(H₂O₂)(厦门英科新创公司)各50μl，37℃避光显色10min；加入2mol/L硫酸(H₂SO₄)(厦门英科新创公司)50μl终止显色，通过酶标仪(TECAN公司)在450nm波长处测定每孔吸光度(OD)值。

2结果

2.1八种血清自身抗体检测对ESCC早期诊断试验研究

该小样本的研究包括50例早期ESCC患者、50例EBL患者与50例HC。表1可见，早期ESCC组与EBL组、HC组之间在年龄、性别、吸烟史上无显著性差异(P>0.05)。ELISA检测结果显示，八种血清自身抗体中的抗TP53，HRAS，CTAG1A(P<0.01)与NSG1(P<0.05)在早期ESCC组(n＝50)的阳性率与水平均明显高于食管良性病变(EBL)组(n＝50)与健康对照(HC)组(n＝50)(表2，图9)。八种血清自身抗体中的抗ETHE1、C1QTNF1、TEX264与CLDN2(P>0.05)的水平与阳性率在早期ESCC组与EBL/HC无统计学意义(表2，图9)。

表2：各组之间八种血清自身抗体阳性率的比较

实施例2：四种血清自身抗体检测对食管鳞状细胞癌早期诊断试验研究(大样本)

基于小样本研究结果，本研究的目的是通过构建的ELISA法在569例血清的大样本范围内深入研究抗TP53、HRAS、CTAG1A、NSG1抗体检测对ESCC早期诊断的价值，开展的研究队列包括409例的训练集与160例具独立匹配性的验证集。

1材料和方法

1.1研究对象

收集2016年2月至2018年6月来自福建省立医院的569份血清样本，其中早期ESCC患者179例，EBL患者180例，HC患者210例。179例早期ESCC患者均在内镜的基础上结合细胞学或组织病理学确诊，未接受化疗、放疗等任何抗肿瘤治疗，TNM分类为0，I，II期。180例EBL患者来自同期在福建省立医院住院初治的患者，包括食管良性肿瘤、食管良性溃疡、食管糜烂及反流性食管炎等。210例HC患者来自福建省立医院体检中心的健康体检成人，未显示任何恶性肿瘤的证据。本研究由福建省立医院的伦理委员会批准；研究对象临床资料详见表3、表4。

表3:Phase I研究对象的临床特征

表4：Phase II研究对象的临床特征

1.2免疫印迹法鉴定四种血清自身抗体

取TP53(71kDa)、HRAS(46kDa)、CTAG1A(45kDa)、NSG1(48kDa)重组蛋白(酵母系统表达，带GST标签蛋白，美国约翰霍普金斯医学院高通量生物学中心提供)各200ng和GST标签蛋白(26kDa)50ng，99℃变性5min，进行12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳，电转移至硝酸纤维素膜(NC膜)上；5％牛血清白蛋白封闭NC膜上非特异性结合位点1h，加入相应抗体(血清标本1:500稀释，抗GST单克隆抗体1:2000稀释)4℃孵育过夜；TBST洗涤3次，每次10min；加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人IgG(上海碧云天生物科技公司)或羊抗兔IgG(上海碧云天生物科技公司)，室温孵育1h；TBST洗涤3次，每次10min；加入SuperSingalWest Femto化学发光检测底物工作液(美国Thermo Fisher公司)，室温下孵育1min，然后置化学发光成像仪(上海培清科技有限公司)里观察、拍照。

1.3 ELISA法检测四种血清自身抗体

以0.5ng/μl的TP53、HRAS、CTAG1A、NSG1重组蛋白(酵母系统表达，带GST标签蛋白，美国约翰霍普金斯医学院高通量生物学中心提供)包被酶标孔板(美国Thermo FisherScientific公司)，100μl/孔，4℃包被过夜；用含0.2％吐温20的磷酸盐缓冲液(PBST)洗涤3遍后，3％牛血清白蛋白(BSA)(美国Amresco公司)300μl/孔，37℃封闭1小时；PBST洗1遍后，加入1:500稀释的血清样本，100μl/孔，37℃温育1小时；PBST洗4遍后，加入1:40000稀释的HRP标记羊抗人IgG抗体(Jackson immuno公司)，100μl/孔，37℃温育30min；PBST洗4遍后，加入四甲基联苯胺(TMB)和3％过氧化氢(H₂O₂)(厦门英科新创公司)各50μl，37℃避光显色10min；加入2mol/L硫酸(H₂SO₄)(厦门英科新创公司)50μl终止显色，通过酶标仪(TECAN公司)在450nm波长处测定每孔吸光度(OD)值。

1.4 Luminex微球耦联

根据制造商的说明书(Luminex Corp.)进行微球耦联。步骤如下：将5.0×10⁶的原料微球转移到微量离心管中；加入10μl 50mg/ml磺基-NHS和10μl 50mg/ml EDC，室温下温育20分钟；用50mM MES(pH5.0)洗涤活化的微球以除去过量的磺基-NHS和EDC；将10μg重组蛋白加入微量离心管中，再加入50mM MES(pH5.0)使总体积至500μl，并在室温下旋转孵育2小时；耦联的微球经含有0.1％BSA、0.02％Tween-20、0.05％叠氮化钠(pH7.4)的PBS洗涤两次后，2-8℃避光保存备用。

1.5基于Luminex xMAP技术平台的多重检测

在Luminex xMAP技术平台上，进行自身抗体标记物多重检测体系的构建。步骤如下：将10μl血清样品(1:20)与25μl重组蛋白耦联微球混匀后，加入96孔微量滴定板(Millipore)中，37℃平板振荡器(1000rpm)上温育15分钟；PBST洗涤三次；加入PE标记的山羊抗人IgG抗体(Millipore)，37℃平板振荡器(1000rpm)上孵育15分钟；用PBST洗涤三次；加入100μl测定缓冲液重悬微球，在Luminex 200流式荧光检测仪上检测微球的荧光信号，以Luminex xPONENT软件计算每种荧光微球的中值荧光强度(MFI)值。

1.6自身抗体组合检测模式的发现与验证

基于训练集标本的ELISA检测结果绘制受试者工作特征曲线(R℃)，计算R℃下面积(AUC)，以评估每种候选标志物对早期ESCC患者的诊断性能。使用两个标准评估每种候选标志物的最佳cut off值：1)至少90％的特异性2)最高的区分能力。通过最佳cut off值确定验证集样本四种血清自身抗体对早期ESCC的诊断敏感性与特异性^[6]。分析四种自身抗体所有可能组合模式(任意两种、任意三种以及四种自身抗体组合)的性能，鉴定对ESCC具理想早期诊断价值的组合模式，步骤如下：1)将每种标志物的实际检测信号值转换为1或0，1表示信号值大于最佳cut off值，否则为0。2)计算设定的n种标志物组合二进制分值的总和，作为相应血清样本的总分。如果样本的总分大于k(1≤k≤n)，则为阳性；记录每种组合的灵敏度和特异性。3)用最佳区分能力鉴定标志物组合及其k值，获得最佳组合的模式；最佳组合的标志物通过对独立验证集样本的检测予以进一步验证，并使用类似方法进行评估。

2结果

2.1研究设计

本研究旨在评估四种血清自身抗体(抗TP53、HRAS、CTAG1A和NSG1抗体)组合检测对ESCC早期诊断的性能，并建立自身抗体组合的多重检测方法。研究被分为三个阶段，相应流程图见图1。Phase I，通过对409例训练集样本(包括129例早期ESCC患者、130例EBL患者与150例HC)四种血清自身抗体的ELISA法检测，建立用于ESCC早期诊断的自身抗体组合模型；Phase II，通过对160例验证集样本(组成与训练集相匹配)自身抗体的ELISA法检测，验证建立的自身抗体组合模型，并明确四种自身抗体区分早期ESCC患者组与对照组(EBL+HC)的能力。Phase III，在可实现多重标记与检测的高通量流式荧光检测技术(Luminex xMAP)平台上，研发用于ESCC早期诊断相关血清自身抗体组合模式的多重检测方法。

2.2 Western blotting法鉴定四种血清自身抗体

四种血清自身抗体的Westernblotting鉴定结果见图2。如图2A-D所示，ELISA检测自身抗体(+)的早期ESCC患者血清均只与目的蛋白结合，不与GST标签蛋白结合；ELISA检测自身抗体(-)的EBL患者、HC的血清均不与目的蛋白和GST标签蛋白结合。试验结果证实在早期ESCC患者血清中存在针对以上四种抗TP53、HRAS、CTAG1A和NSG1的自身抗体。

2.3 ESCC早期诊断自身抗体组合模型的建立

409例训练集包括129例早期ESCC患者、130例EBL患者与150例HC。表3可见，训练集的早期ESCC组与EBL组、HC组之间在年龄、性别、吸烟史上无显著性差异(P>0.05)。ELISA检测结果显示，四种血清自身抗体在早期ESCC组的水平均明显高于EBL组、HC组(P<0.01)(图3)。抗TP53对早期ESCC的AUC、敏感性、特异性分别为0.574、25.6％、97.5％；抗HRAS对早期ESCC的AUC、敏感性、特异性分别为0.701、29.5％、96.8％；抗CTAG1A对早期ESCC的AUC、敏感性、特异性分别为0.809、30.2％、95.7％；抗NSG1对早期ESCC的AUC、敏感性、特异性分别为0.613、18.6％、96.8％。

通过对四种自身抗体所有可能组合模式(任意两种、任意三种以及四种自身抗体组合)的分析，结果显示四种标志物的组合检测对早期ESCC具有最高的诊断性能，其敏感性与特异性分别为62.8％、88.9％(图4)。

2.4 ESCC早期诊断自身抗体组合模型的验证

160例验证集包括50例早期ESCC患者、50例EBL患者与60例HC。表4可见，验证集的早期ESCC组与EBL组、HC组之间在年龄、性别、吸烟史上无显著性差异(P>0.05)。ELISA检测结果显示，四种血清自身抗体在早期ESCC组的水平均明显高于EBL组、HC组(P<0.01)；四种标志物组合对早期ESCC的诊断敏感性与特异性分别为58.0％、90.0％(图5)。

2.5在Luminex xMAP技术平台上建立用于四种自身抗体的多重检测方法

采用构建的Luminex xMAP多重检测方法进行160例验证集样本四种血清自身抗体水平的检测。图6可见，四种重组蛋白的耦联荧光微球在Luminex 200流式荧光检测仪上可被独立、准确地检测到。图7可见，四种标志物的Luminex法检测结果与ELISA法之间具明显的相关。图8A可见，采用Luminex法检测，四种标志物的组合对早期ESCC的诊断敏感性和特异性分别为66.0％、90.9％；图8B可见，ELISA与Luminex法对四种标志物组合检测的阳性符合率为76.1％。

Claims (10)

1.一种诊断早期食管鳞状细胞癌的四种自身抗体联合检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括固相基质和包被于固相基质上的抗原蛋白，所述的抗原蛋白由TP53、HRAS、CTAG1A和NSG1组成。

2.根据权利要求1所述诊断早期食管鳞状细胞癌的四种自身抗体联合检测试剂盒，其特征在于，所述的抗原蛋白上带有标签蛋白。

3.根据权利要求2所述诊断早期食管鳞状细胞癌的四种自身抗体联合检测试剂盒，其特征在于，所述标签蛋白为His标签、GST标签、Flag标签或HA标签。

4.根据权利要求1所述诊断早期食管鳞状细胞癌的四种自身抗体联合检测试剂盒，其特征在于，所述的固相基质为微孔板、微球体或多孔膜构成的支持基质。

5.根据权利要求1所述诊断早期食管鳞状细胞癌的四种自身抗体联合检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括样本稀释液、洗涤液、第二抗体、第二抗体稀释液、显色液和终止液。

6.根据权利要求5所述诊断早期食管鳞状细胞癌的四种自身抗体联合检测试剂盒，其特征在于，所述的第二抗体为抗人免疫球蛋白的抗体，其上带有可检测的标记物。

7.根据权利要求6所述诊断早期食管鳞状细胞癌的四种自身抗体联合检测试剂盒，其特征在于，所述的第二抗体为PE标记的山羊抗人免疫球蛋白的抗体。

8.抗TP53自身抗体、抗HRAS自身抗体、抗CTAG1A自身抗体和抗NSG1自身抗体作为联合诊断标志物在制备诊断食管鳞状细胞癌的试剂盒中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的诊断为食管鳞状细胞癌的早期诊断。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的试剂盒为基于Luminex xMAP技术的多重检测试剂盒。