CN115385990B - 分离的多肽及其在用于诊断或预测卵巢癌中的用途和检测设备 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种分离的多肽及其在用于诊断或预测卵巢癌中的用途。所述分离的多肽包括具有如SEQ ID NO:1～9所示的氨基酸序列中的至少一种多肽；所述分离的多肽在制备多肽芯片和试剂盒中的用途，所述试剂盒用于诊断或预测卵巢癌、评估盆腔肿块的卵巢癌风险、评估卵巢癌预后或检测卵巢癌相关抗体。采用上述分离的多肽可检测卵巢癌相关抗体的含量，进而可用于诊断或预测卵巢癌、评估盆腔肿块卵巢癌风险或评估卵巢癌预后，且具有较高的准确率和特异性。

Description

分离的多肽及其在用于诊断或预测卵巢癌中的用途和检测 设备
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体地，本发明涉及一种分离的多肽及其在用于诊断或预测卵巢癌中的用途和检测设备，更具体地，本发明涉及一种分离的多肽、标志物、多肽芯片、试剂盒以及检测设备。
背景技术
卵巢癌是目前致死率最高的妇科恶性肿瘤，由于缺乏有效的早期诊断方法，大部分卵巢癌患者确诊时已经处于疾病晚期，治疗效果不佳。此外，在临床手术前，难以准确预估卵巢肿瘤为良性肿瘤还是为恶性肿瘤，卵巢肿瘤的良恶性需要进行术后病理才能确定，错误的术前评估会导致不必要的手术治疗，或者延误恶性肿瘤的治疗。因此，提高卵巢癌早期发现和鉴别诊断的效能对改善卵巢癌治疗效果具有重要的意义。
因此，亟需开发一种无需手术即可准确诊断和预测卵巢癌的方法。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提供了一种用于诊断或预测卵巢癌的分离的多肽，该分离的多肽可特异性结合其抗体，含有该分离的多肽的多肽芯片可检测待测样本中的抗体的含量，并对卵巢肿瘤的良恶性进行准确评估。
本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
生物标志物在卵巢癌诊断或预测中发挥重要的作用。目前血液中CA125含量在卵巢癌监测中被广泛使用，但CA125在其他妇科疾患(例如子宫内膜异位和/或盆腔炎性疾病患者)中也有升高，其在卵巢癌的敏感度和特异性上的欠缺使得其无法很好地满足临床需求；尤其是CA125在卵巢良性肿瘤中也有升高，无法很好地应用于早期卵巢癌的筛查。虽然目前基于联合使用血清CA125和HE4水平的卵巢恶性风险评估法(简称ROMA或ROMA模型)已被FDA批准，但其只适用于卵巢癌术前对存在盆腔肿块的女性进行危险分层，而非卵巢癌早期筛选。在特异性75.0％时，其预测盆腔肿块为卵巢恶性肿瘤的敏感度89.0％，但阳性预测值仅为62.3％，准确率79.4％。
目前临床对血清标志物进行检测时常用酶联免疫吸附法(ELISA)，该方法单次检测只能检测单一血清标志物，当检测多种血清标志物时费时费力且需要消耗大量血清样本。因此，单一的生物标志物在卵巢癌诊断或预测方面效果不能很好地满足临床需求。而多种标志物联合检测的生物芯片成为研发的热点，目前市场上用于肿瘤诊断的芯片多为蛋白芯片，其由于大分子蛋白的不稳定性，蛋白芯片的有效期极为有限。
多肽芯片是将一系列多肽片段固定到载体上，用来检测相配对的未知蛋白的一种检测技术。在临床应用领域，多肽芯片常被用于血液标志物发现、病人个体在疾病进程中体液免疫反应的变化、疗效监控、病人分级、诊断工具开发和疫苗研发等。多肽芯片由于是纯化学合成，表面自身带有保护基，有效期相比蛋白芯片得以大大延长。此外，现有的蛋白芯片表面最多可有数万量级的蛋白数据采集点，而多肽芯片则可以把数据采集点的量级提高到百万甚至更高。因此，多肽芯片相比蛋白芯片具有天然的优势。多肽芯片是一个较新的产业领域，我国的多肽芯片诊断试剂盒较少，有极为广阔的发展空间。
基于此，发明人通过四组卵巢癌患者混合血清对包含600条候选多肽的多肽阵列进行检测，多肽长度为12个氨基酸。筛选出在四组卵巢癌混合血清中阳性频率≥2/4的多肽位点，最终得到29个多肽。发明人进一步将29个多肽合成到纤维素膜上，制成多肽芯片，进行单血清样本检测。获取每个患者的多肽芯片检测数值、CA125蛋白表达量、年龄、绝经情况等变量，用LASSO回归筛选出重要变量并建立多肽联合诊断模型，最终得到由本发明的9种多肽(即为本申请中分离的多肽)、CA125蛋白表达量、年龄、绝经情况所构成的卵巢癌风险预测模型。发明人发现，上述9种多肽均可结合其相应自身抗体，通过检测待测患者血液中上述的一种或多种多肽对应自身抗体含量，可有效对待测患者的卵巢肿瘤良恶性进行准确评估以及进行早期卵巢癌的筛查。
因此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种分离的多肽。根据本发明的实施例，所述分离的多肽包括具有如SEQ ID NO:1～9所示的氨基酸序列中的至少一种多肽。
发明人经过试验发现，上述分离的多肽可结合其对应的自身抗体，并且发现卵巢癌患者血液中识别上述多肽的自身抗体含量与非卵巢癌个体血液中识别上述多肽的自身抗体含量也存在显著性差异。因此，采用上述分离的多肽可检测卵巢癌相关抗体的含量，进而可用于诊断或预测卵巢癌、评估盆腔肿块卵巢癌风险或评估卵巢癌预后，且具有较高的准确率和特异性。
根据本发明的实施例，所述分离的多肽包括具有如SEQ ID NO:1～9所示的氨基酸序列中的至少6种多肽，优选为7～9种。由此，可进一步提高对待测患者的卵巢癌诊断或预测、盆腔肿块的卵巢癌风险评估或卵巢癌预后评估的准确率和特异性。
FLELKLLYKEVD(SEQ ID NO:1)；
QPWPEHSWSSSS(SEQ ID NO:2)；
RRTEGPAQWPPP(SEQ ID NO:3)；
EWELDPVKDVLI(SEQ ID NO:4)；
YSSEWELDPVKD(SEQ ID NO:5)；
ISVVSNYSSEWE(SEQ ID NO:6)；
NSVLHSREQSPL(SEQ ID NO:7)；
HAAIDNWVVRAP(SEQ ID NO:8)；
CALYASEEEIGQ(SEQ ID NO:9)。
在本发明的另一方面，本发明提出了一种核酸分子。根据本发明的实施例，所述核酸分子编码前述的分离的多肽。根据本发明实施例的核酸分子可以有效地用于表达上述分离的多肽。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，所述表达载体携带前述的核酸分子。根据本发明实施例的表达载体可以有效地用于表达上述分离的多肽，尤其是在原核生物或者低等真核生物表达体系中可以有效地表达上述分离的多肽。
根据本发明的实施例，所述表达载体为真核表达载体，优选地，所述表达载体为慢病毒载体。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，所述重组细胞包括：携带前述的核酸分子或前述的表达载体；或，表达前述的分离的多肽。本发明实施例的重组细胞可用于上述分离的多肽体外表达和大量获得。
根据本发明的实施例，所述重组细胞是通过将前述的表达载体引入至宿主细胞中而获得的。
根据本发明的实施例，所述重组细胞包括真核细胞或原核细胞。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种复合物。根据本发明的实施例，所述复合物包括：前述的分离的多肽；第一载体，所述第一载体通过偶联、缀合或融合的方式与所述分离的多肽相连。根据本发明实施例的复合物可特异性结合其对应的抗体，采用上述分离的多肽可检测卵巢癌相关抗体的含量，还可用于诊断或预测卵巢癌、评估盆腔肿块的卵巢癌风险或评估卵巢癌预后，且具有较高的准确率和特异性。
根据本发明的实施例，所述第一载体包括蛋白或脂类。
根据本发明的实施例，所述第一载体为血清白蛋白。
示例性为，所述血清白蛋白为野生型人血清白蛋白。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种多肽芯片。根据本发明的实施例，所述多肽芯片包括：前述的分离的多肽或前述的复合物；基质，所述分离的多肽与所述基质相连。根据本发明实施例的多肽芯片可特异性结合上述分离的多肽所对应的抗体，可检测卵巢癌相关抗体的含量，还可用于诊断或预测卵巢癌、评估盆腔肿块的卵巢癌风险，且具有较高的准确率和特异性。
根据本发明的实施例，所述基质包括选自醋酸纤维素膜、玻璃片、硝酸纤维素膜、尼龙膜和硅片中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述分离的多肽与所述基质通过共价键相连。
需要说明的是，多个所述分离的多肽位于所述基质的不同区域，即为多个分离的多肽之间互不影响。
根据本发明的实施例，所述分离的多肽的C端与所述基质相连。由此，可将分离的多肽固定于基质上。
根据本发明的实施例，进一步包括标签多肽，所述标签多肽与所述基质通过共价键相连。由此，标签多肽作为阳性对照的多肽，该多肽检测值可作为多肽芯片检测数值标准化的参数。
根据本发明的实施例，所述标签多肽的C端与所述基质相连。
根据本发明的实施例，所述标签多肽包括选自HIS标签、FLAG标签、HA标签、Myc标签和Strep II标签中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述标签多肽为FLAG标签多肽。
根据本发明的实施例，所述FLAG标签多肽具有如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
MDYKDDDDK(SEQ ID NO:10)。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括：前述的分离的多肽、前述的核酸分子、前述的表达载体、前述的重组细胞、前述的分离的抗体、前述的复合物或前述的多肽芯片。根据本发明实施例的试剂盒可有效检测上述分离的多肽对应的自身抗体的含量，进而可诊断或预测卵巢癌、评估盆腔肿块的卵巢癌风险或评估卵巢癌预后，且具有较高的准确率和特异性。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种前述的分离的多肽、前述的核酸分子、前述的表达载体、前述的重组细胞、前述的分离的抗体、前述的复合物或前述的多肽芯片在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于诊断或预测卵巢癌、评估盆腔肿块的卵巢癌风险、评估卵巢癌预后或检测卵巢癌相关抗体。
根据本发明的实施例，所述卵巢癌包括卵巢癌I期、卵巢癌II期、卵巢癌III期或卵巢癌IV期。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种检测设备。根据本发明的实施例，所述检测设备包括：第一检测单元，包括前述的复合物、前述的多肽芯片或前述的试剂盒，用于检测待测样本中所述多肽芯片上的多肽所对应的抗体的含量。多肽芯片上的多肽可特异性结合其所对应的抗体，该抗体均为卵巢癌相关抗体。因此，采用上述检测设备可有效检测待测样本中卵巢癌相关抗体的含量，可用于后续对待测样本所对应的待测患者进行卵巢癌的诊断或预测、盆腔肿块卵巢癌风险的评估和卵巢癌预后的评估。
根据本发明的实施例，所述待测样本来源于待测患者。
根据本发明的实施例，所述检测设备进一步包括：分析单元，用于基于所述抗体的含量，确定所述待测患者是否患有卵巢癌、评估所述待测患者盆腔肿块的卵巢癌风险或评估所述待测患者卵巢癌的预后。
根据本发明的实施例，所述多肽芯片包含具有如SEQ ID NO:1～9所示的氨基酸序列的多肽。由此，可提高待测患者的卵巢癌诊断或预测、盆腔肿块卵巢癌风险评估和卵巢癌预后评估的准确率和特异性。
根据本发明的实施例，所述检测设备进一步包括：第二检测单元，用于检测待测样本中CA125蛋白的表达量。
根据本发明的实施例，所述确定所述待测患者是否患有卵巢癌、评估所述待测患者盆腔肿块的卵巢癌风险或评估所述待测患者卵巢癌预后是通过如下公式的评分y确定的：
y＝ez/(ez+1)；
z＝(-2.2039)+0.0129*A1-0.0122*A2+0.0187*A3-0.0104*A4+0.0019*A5+0.0135*A6+0.0036*A7-0.0159*A8-0.0295*A9+0.0069*CA125+0.0412*age+0.8056*menopause；
其中，A1为具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的多肽所对应的抗体的含量；
A2为具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽所对应的抗体的含量；
A3为具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的多肽所对应的抗体的含量；
A4为具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的多肽所对应的抗体的含量；
A5为具有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的多肽所对应的抗体的含量；
A6为具有如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的多肽所对应的抗体的含量；
A7为具有如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的多肽所对应的抗体的含量；
A8为具有如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的多肽所对应的抗体的含量；
A9为具有如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的多肽所对应的抗体的含量；
CA125为CA125蛋白的表达量；
age为所述待测患者的年龄；
menopause为所述待测患者的绝经情况，未绝经的待测患者的menopause取值为0，绝经的待测患者的menopause取值为1。
发明人经过试验发现，采用上述9种分离的多肽(或含有上述9种分离的多肽的多肽芯片)与其他卵巢癌相关标志物(例如CA125)、临床信息(年龄、绝经情况等)联合，可提高待测患者的卵巢癌诊断或预测、盆腔肿块的卵巢癌风险评估和卵巢癌预后评估的准确率和特异性。
根据本发明的实施例，所述A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8和A9预先进行标准化处理。
根据本发明的实施例，标准化处理是通过如下公式进行的：X’＝100*X/标签多肽的检测值，其中，X为A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8或A9，X’为A1’、A2’、A3’、A4’、A5’、A6’、A7’、A8’或A9’。由此，可进一步提高待测患者的卵巢癌诊断或预测、盆腔肿块的卵巢癌风险评估和卵巢癌预后评估的准确率和特异性。
示例性为，A1’＝100*A1/标签多肽的检测值。
根据本发明的实施例，所述标签多肽包括选自HIS标签、FLAG标签、HA标签、Myc标签和Strep II标签中的至少之一，优选为FLAG标签多肽。
根据本发明的实施例，所述FLAG标签多肽具有如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，评分y＞0.605表示所述待测患者为卵巢癌患者、所述待测患者存在患有卵巢癌的风险、所述待测患者的盆腔肿块为卵巢癌、所述待测患者的卵巢癌预后效果差；或者评分y≤0.605表示所述待测患者未患卵巢癌、所述待测患者的肿瘤为良性肿瘤、所述待测患者不存在患有卵巢癌的风险、所述待测患者的盆腔肿块不为卵巢癌、所述待测患者的卵巢癌预后良好。
根据本发明的实施例，所述卵巢癌包括卵巢癌I期、卵巢癌II期、卵巢癌III期或卵巢癌IV期。
根据本发明的实施例，所述待测样本包括选自全血样本、血清样本和血浆样本中的至少之一。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1为实施例3中不同组别受试者的多肽联合模型评分的分布，其中，**代表差异显著且p<0.01，***代表差异显著且p<0.001；
图2为实施例3中采用多肽联合模型区分卵巢癌与非卵巢癌的ROC曲线；
图3为实施例4中采用多肽联合模型区分早期卵巢癌与非卵巢癌的ROC曲线；
图4为实施例5中采用多肽联合模型鉴别恶性卵巢肿瘤与良性肿瘤的ROC曲线。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
在本文中，术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
在本文中，术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。
在本文中，术语“表达载体”通常是指能够插入在合适的宿主中自我复制的核酸分子，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述表达载体可包括主要用于将DNA或RNA插入细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体，以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体。所述表达载体还包括具有多种上述功能的载体。所述表达载体可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述表达载体的合适的宿主细胞，所述表达载体可以产生期望的表达产物。
在本文中，术语“重组细胞”通常是指采用基因工程技术或细胞融合技术对宿主细胞的遗传物质进行修饰改造或重组，获得具有稳定遗传的独特性状的细胞。其中，术语“宿主细胞”是指可导入重组表达载体的原核细胞或真核细胞。本文所用术语“转化的”或“转染的”是指通过本领域已知的各种技术将核酸(例如载体)引入细胞。合适的宿主细胞可以用本发明的DNA序列转化或转染，并且可以用于靶蛋白的表达和/或分泌。
在本文中，术语“卵巢癌”通常是指恶性肿瘤，具体为卵巢癌I期、卵巢癌II期、卵巢癌III期或卵巢癌IV期；术语“卵巢癌患者”通常是指恶性肿瘤患者，具体为卵巢癌I期、卵巢癌II期、卵巢癌III期或卵巢癌IV期的患者。
在本文中，术语“早期卵巢癌”通常是指卵巢癌I期和卵巢癌II期；术语“晚期卵巢癌”通常是指卵巢癌III期和卵巢癌IV期。
在本文中，术语“敏感度”是指在检测群体中，测试为阳性的患病个体占总患病个体的百分比。术语“特异性”是指1减去假阳性率的概率，其中“假阳性率”是指实际上未患病的个体中，测试结果为阳性的个体在总未患病个体的百分比。术语“准确率”是指在检测群体中，测试为真阳性与真阴性的人数之和占受试总人数的百分率表示。术语“阳性预测值”是指在检测群体中，真阳性人数占试验结果阳性人数的百分比，表示试验结果阳性者属于真病例的概率。术语“阴性预测值”是指在检测群体中，真阴性人数占试验结果阴性人数的百分比，表示试验结果阴性者属于非病例的概率。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
需要说明的是，本发明实施例中所述的血液样本来自于既往人类肿瘤生物样本库。所有受试者均填写了知情同意书，并且同意使用他们的临床数据。
实施例1：多肽芯片的制备
发明人利用INTAVIS公司MultiPepRSi高通量平行多肽合成仪，将600条长度为12个氨基酸的候选多肽和FLAG标签多肽(具有如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列)合成连接到硝酸纤维素膜自带的N端。在氨基酸循环中，每增加1个氨基酸，均用乙酸酐封闭未反应的NH2基团，用哌啶脱去Fmoc保护基团，暴露被保护的NH2基团，以便进行下一个循环，直至多肽芯片合成完毕。制备好的多肽芯片抽真空包装后，4℃保存。
实施例2：分离的多肽的初步筛选
采用实施例1合成的多肽芯片对四组卵巢癌混合血清进行检测，筛选出阳性频率≥2/4的多肽位点，筛选得到29条多肽。
具体多肽芯片检测步骤如下：(1)依次用100％、75％、50％乙醇和1×PBS溶液将多肽芯片水化15min；(2)用含5％脱脂奶粉的PBS-T(含1‰吐温的1×PBS)作为封闭液，室温封闭1h；(3)将每组混合血清以封闭液按1:1000比例稀释，与芯片4℃孵育过夜；(4)用PBS-T洗4次，15分钟/次；(5)将HRP标记的山羊抗人IgG(ThermoFisher公司，货号62-8420)加入封闭液(以1：2000比例稀释)中，同时将HRP标记的anti-FLAG tag抗体(Abcam公司，货号ab49763)加入封闭液(以1：500比例稀释)，混匀后与多肽芯片4℃孵育3h；(6)用PBS-T洗4次，15分钟/次；(7)将ECL显色剂A、B液按1:1混匀后浸泡多肽芯片1min，把多肽芯片置于保鲜膜上，用化学发光成像系统读取多肽芯片的荧光信号。利用TotalLab TL100软件处理化学发光成像系统得到的图像，得到多肽位点灰度值(即为X)，以FLAG标签多肽灰度值作为100，将各多肽位点的灰度值进行标准化处理，标准化后数值即为多肽所对应的抗体的含量，将得到的标准化处理的数据X’进行后续试验，筛选出阳性频率≥2/4的多肽位点，筛选得到29条多肽。其中，标准化处理是通过如下公式进行的：
X’＝100*X/FLAG标签多肽检测值。
实施例3：多肽芯片的多肽联合诊断模型的确定
1、原始数据的获取：发明人进一步将29个多肽和FLAG标签多肽合成到硝酸纤维素膜上，按照实施例1步骤制成多肽芯片，按照实施例2所述的多肽芯片检测步骤对348例待测患者的血清进行单血清样本检测，获取每个患者的29种多肽各自对应的抗体表达量，以FLAG标签多肽灰度值作为100，将各多肽位点的灰度值进行标准化处理。其中，348例待测患者中，200例为卵巢恶性肿瘤个体，148例为健康个体或卵巢良性肿瘤个体。
然后采用CA125癌抗原测定试剂盒(化学发光免疫分析法)测待测患者血清中的CA125含量(单位为U/mL)。
2、多肽芯片的多肽联合诊断模型的建立：
将348例患者样本按7：3分为训练集和测试集。获得每个样本标准化后的多肽芯片检测数据、CA125蛋白表达量、年龄、绝经情况等变量。基于训练集的数据，采用LASSO回归方法从29个多肽的检测值、CA125表达量、年龄、绝经情况等变量中筛选出影响卵巢癌评估、预测的重要变量，进行拟合和建模。LASSO回归时采用十折交叉验证(10-fold cross-validation)来获取模型的最佳参数。用最佳参数生成多肽联合诊断模型。然后基于测试集的数据，对模型进行测试。
前述最佳多肽联合诊断模型中变量包括氨基酸序列如SEQ ID NO:1～9所示的9种分离的多肽(简称多肽)、CA125蛋白表达量、年龄和绝经情况。9种多肽分别命名为A1(具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的多肽所对应的抗体的含量)、A2(具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽所对应的抗体的含量)、A3(具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的多肽所对应的抗体的含量)、A4(具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的多肽所对应的抗体的含量)、A5(具有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的多肽所对应的抗体的含量)、A6(具有如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的多肽所对应的抗体的含量)、A7(具有如SEQ IDNO:7所示的氨基酸序列的多肽所对应的抗体的含量)、A8(具有如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的多肽所对应的抗体的含量)和A9(具有如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的多肽所对应的抗体的含量)。然后分别将A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8和A9进行标准化处理。其中，X’＝100*X/FLAG标签多肽检测值，X为A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8或A9，X’为A1’、A2’、A3’、A4’、A5’、A6’、A7’、A8’或A9’。示例性为，A1’＝100*A1/FLAG标签多肽检测值。
多肽联合诊断模型的风险评分(y)为：
y＝ez/(ez+1)；
z＝(-2.2039)+0.0129*A1’-0.0122*A2’+0.0187*A3’-0.0104*A4’+0.0019*A5’+0.0135*A6’+0.0036*A7’-0.0159*A8’-0.0295*A9’+0.0069*CA125+0.0412*age+0.8056*menopause；
其中，CA125为CA125蛋白的表达量；
age为所述待测患者的年龄；
menopause为所述待测患者的绝经情况，未绝经的待测患者的menopause取值为0，绝经的待测患者的menopause取值为1。
其中，y值代表待测患者患卵巢恶性肿瘤的风险值，y>0.605表示待测患者为卵巢恶性肿瘤患者，y≤0.605表示待测患者为卵巢良性肿瘤个体或健康个体。
3、采用步骤2得到的多肽联合诊断模型对上述测试集中101例患者进行检测。101例待测患者分别分为三组受试者，即为对照受试者(包括卵巢良性肿瘤个体和健康个体)、早期受试者(包括I、II期卵巢癌患者)和晚期受试者(包括III、IV期卵巢癌患者)。其中，不同组别受试者的多肽联合诊断模型评分的分布如图1，多肽联合诊断模型用于区分卵巢癌和非卵巢癌人群的ROC曲线如图2。结果发现，以y＝0.605为临界值，该多肽联合诊断模型区分卵巢癌与非卵巢癌人群的敏感度为80.4％，特异性为86.7％，阳性预测值为88.2％，阴性预测值为78.0％，准确率为83.2％，AUC为0.922。
此外，发明人还采用步骤1所述方法对上述101例待测患者血清中的CA125进行检测(即为对照组)，CA125检测结果以常用的35U/mL作为表达临界值。结果发现，敏感度为80.4％，特异性为64.4％，阳性预测值为73.8％，阴性预测值为72.5％，准确率为73.3％，AUC为0.81。
由上可知，与对照组相比，本申请的多肽联合诊断模型在区分卵巢癌与非卵巢癌人群时，能够显著提高特异性和准确率。因此，进一步说明本申请的多肽联合诊断模型对区分卵巢癌与非卵巢癌具有较高的诊断效能。
实施例4：多肽芯片对待测患者早期卵巢癌诊断或预测的验证
发明人将氨基酸序列如SEQ ID NO:1～9所示的9种多肽和FLAG标签多肽合成到硝酸纤维素膜上，按照实施例1步骤制成多肽芯片。然后按照实施例2所述的多肽芯片检测步骤对29例早期(I、II期)卵巢癌患者和45例非卵巢癌个体(卵巢良性肿瘤个体和健康个体)的血清进行检测，以研究多肽联合诊断模型用于卵巢癌早期筛查的效能。具体的检测方法和多肽联合诊断模型的风险评分参见实施例3，多肽联合诊断模型鉴别早期卵巢癌和非卵巢癌人群的ROC曲线如图3。结果发现，以y＝0.605为临界值，本发明的多肽联合诊断模型的准确率为78.4％，AUC为0.854。
发明人采用实施例3的方法对上述29例早期(I、II期)卵巢癌患者和45例非卵巢癌个体(卵巢良性肿瘤个体和健康个体)的血清中的CA125进行检测(即为对照组)，CA125检测结果以常用的35U/mL作为表达临界值，结果发现，准确率为64.9％，AUC为0.675。
由上可知，与对照组相比，本发明的多肽联合诊断模型的准确率和AUC显著提升。因此，可进一步说明本发明多肽芯片有利于提升卵巢癌早期筛查的准确率。
实施例5：多肽芯片对待测患者盆腔肿块的卵巢癌风险评估的验证1
发明人采用实施例4制得的多肽芯片对95例存在盆腔肿块(56例卵巢恶性肿瘤患者和39例卵巢良性肿瘤)的女性患者的血清进行检测，以研究多肽联合诊断模型用于评估待测患者盆腔肿块为良性肿瘤或恶性卵巢肿瘤的效能。具体的检测方法和多肽联合诊断模型的风险评分参见实施例3，多肽联合诊断模型鉴别恶性卵巢肿瘤和良性卵巢肿瘤的ROC曲线如图4。结果发现，以y＝0.605为临界值，本发明的多肽联合诊断模型鉴别恶性肿瘤与良性肿瘤的敏感度为80.4％，特异性为87.2％，阳性预测值为90.0％，阴性预测值为75.6％，准确率为83.2％，AUC为0.916。
发明人采用实施例3的方法对上述56例卵巢恶性肿瘤患者和39例卵巢良性肿瘤患者的血清中的CA125进行检测(即为对照组)，CA125检测结果以常用的35U/mL作为表达临界值，结果发现，其特异性为59.0％，阳性预测值为73.8％，阴性预测值为67.6％，准确率为71.6％，AUC为0.797。
由上可知，与对照组相比，本发明的多肽联合诊断模型的特异性、准确率和AUC显著提升。因此，可进一步说明本发明多肽芯片有利于提升区分良性肿瘤与恶性卵巢肿瘤的特异性和准确率。
实施例6：多肽芯片对待测患者盆腔肿块的卵巢癌风险评估的验证2
发明人采用实施例4制得的多肽芯片对实施例5中95例存在盆腔肿块(56例卵巢恶性肿瘤和39例卵巢良性肿瘤)的女性患者的血清进行检测。结果发现，以y＝0.605为临界值，本发明的多肽联合诊断模型在特异性75.0％时，预测盆腔肿块为卵巢恶性肿瘤的敏感度为89.3％，阳性预测值为83.7％，准确率为83.4％。
根据文献报道，ROMA模型(Fujirebio Diagnostics'ROMATM(HE4 EIA+ARCHITECTCA 125IITM)Test)对存在盆腔肿块的女性患者进行危险分层(即为对照组)，在特异性75.0％时，预测盆腔肿块为卵巢恶性肿瘤的敏感度89.0％，阳性预测值62.3％，准确率79.4％。
上述结果表明，多肽联合诊断模型相比ROMA模型敏感度相似，而阳性预测值和准确率更好。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (19)

1.一种多肽芯片，其特征在于，所述多肽芯片由9种分离的多肽和基质组成，所述分离的多肽与所述基质相连；
所述9种分离的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1~9所示。
2.一种多肽芯片，其特征在于，所述多肽芯片由9种分离的多肽、基质和标签多肽组成；
所述9种分离的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1~9所示；
所述分离的多肽与所述基质相连；
所述标签多肽与所述基质通过共价键相连，所述标签多肽作为阳性对照。
3.根据权利要求1或2所述的多肽芯片，其特征在于，所述基质包括选自醋酸纤维素膜、玻璃片、硝酸纤维素膜、尼龙膜和硅片中的至少之一。
4.根据权利要求1或2所述的多肽芯片，其特征在于，所述分离的多肽与所述基质通过共价键相连。
5.根据权利要求1或2所述的多肽芯片，其特征在于，所述分离的多肽的C端与所述基质相连。
6.根据权利要求2所述的多肽芯片，其特征在于，所述标签多肽的C端与所述基质相连。
7.根据权利要求1或2所述的多肽芯片，其特征在于，所述分离的多肽是采用固相合成法获得的。
8.根据权利要求2所述的多肽芯片，其特征在于，所述标签多肽包括选自HIS标签、FLAG标签、HA标签、Myc标签和Strep II标签中的之一。
9.根据权利要求8所述的多肽芯片，其特征在于，所述标签多肽为FLAG标签多肽。
10.根据权利要求9所述的多肽芯片，其特征在于，所述FLAG标签多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
11.一种试剂盒，其特征在于，包括：
权利要求1~10任一项所述的多肽芯片。
12.根据权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，进一步包括用于检测CA125蛋白表达量的试剂。
13.权利要求1~10任一项所述的多肽芯片在制备诊断或预测卵巢癌、评估盆腔肿块的卵巢癌风险、评估卵巢癌预后或检测卵巢癌相关抗体的试剂盒中的用途。
14.一种检测设备，其特征在于，包括：
第一检测单元，包括权利要求1~10任一项所述的多肽芯片或权利要求11~12任一项所述的试剂盒，用于检测待测样本中所述多肽芯片上的分离的多肽所对应的抗体的含量；
分析单元，用于基于所述抗体的含量，确定所述待测患者是否患有卵巢癌、评估所述待测患者盆腔肿块的卵巢癌风险或评估所述待测患者卵巢癌的预后。
15.根据权利要求14所述的检测设备，其特征在于，所述待测样本来源于待测患者。
16.根据权利要求14所述的检测设备，其特征在于，所述检测设备进一步包括：
第二检测单元，用于检测待测样本中CA125蛋白的表达量。
17.根据权利要求14所述的检测设备，其特征在于，所述确定所述待测患者是否患有卵巢癌、评估所述待测患者盆腔肿块的卵巢癌风险或评估所述待测患者卵巢癌预后是通过如下公式的评分y确定的：
y=ez/(ez+1)；
z=(-2.2039+0.0129*A1-0.0122*A2+0.0187*A3-0.0104*A4+0.0019*A5+0.0135*A6+0.0036*A7-0.0159*A8-0.0295*A9+0.0069*CA125+0.0412*age+0.8056*menopause；
其中，A1为具有如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列的多肽所对应的抗体的含量；
A2为具有如SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列的多肽所对应的抗体的含量；
A3为具有如SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列的多肽所对应的抗体的含量；
A4为具有如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列的多肽所对应的抗体的含量；
A5为具有如SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列的多肽所对应的抗体的含量；
A6为具有如SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列的多肽所对应的抗体的含量；
A7为具有如SEQ ID NO: 7所示的氨基酸序列的多肽所对应的抗体的含量；
A8为具有如SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列的多肽所对应的抗体的含量；
A9为具有如SEQ ID NO: 9所示的氨基酸序列的多肽所对应的抗体的含量；
CA125为CA125蛋白的表达量；
age为所述待测患者的年龄；
menopause为所述待测患者的绝经情况，未绝经的待测患者的menopause取值为0，绝经的待测患者的menopause取值为1。
18.根据权利要求17所述的检测设备，其特征在于，评分y＞0.605表示所述待测患者为卵巢癌患者、所述待测患者存在患有卵巢癌的风险、所述待测患者的盆腔肿块为卵巢癌、所述待测患者的卵巢癌预后效果差；或者
评分y≤0.605表示所述待测患者未患卵巢癌、所述待测患者的肿瘤为良性肿瘤、所述待测患者不存在患有卵巢癌的风险、所述待测患者的盆腔肿块不为卵巢癌、所述待测患者的卵巢癌预后良好。
19.根据权利要求14所述的检测设备，其特征在于，所述待测样本包括选自全血样本、血清样本和血浆样本中的至少之一。
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蛋白质组学在卵巢癌诊治中的研究进展;赵群;邓小虹;;癌变.畸变.突变(第03期);全文 *

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