TW201610247A - 因應化合物濃度使抗原結合能力變化的抗原結合分子及其資料庫 - Google Patents

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Abstract

本發明的課題在於提供目標組織專一的抗原結合分子、因應非天然化合物濃度而改變抗原結合活性之抗原結合分子、含各不同之複數個該抗原結合分子之資料庫、含有該抗原結合分子之醫藥組合物、篩選該抗原結合分子之方法、及其製造方法等。本案發明人等發現到：藉由創作依存於低分子化合物之濃度而改變對於抗原之結合活性的抗原結合分域或含抗原結合分域之抗原結合分子，進一步創作各不同之複數個該抗原結合分域或含抗原結合分域之資料庫，並使用該資料庫，能夠解決上述課題。藉由使用本發明之抗原結合分子，能目標組織專一性地治療起因於目標組織之各種病症。

Description

因應化合物濃度使抗原結合能力變化的抗原結合分子及其資料庫
本發明係關於因應低分子化合物之濃度而改變對於抗原之結合活性之抗原結合分域或含抗原結合分域之抗原結合分子之資料庫。本發明又關於因應非天然化合物之濃度而改變對抗原之結合活性之抗原結合分域或含抗原結合分域之抗原結合分子、該抗原結合分子之製造方法及篩選方法、以及含有該抗原結合分子之醫藥組合物。
抗體在血漿中的安定性高、副作用少，故作為醫藥品受到重視。其中IgG1型的抗體醫藥已有複數個上市，現在也有許多抗體醫藥品正在開發(非專利文獻1、及非專利文獻2)。
作為使用抗體醫藥之癌治療藥，至今認可的已有對抗CD20抗原之Rituxan、對抗EGFR抗原之Cetuximab、對抗HER2抗原之Herceptin等(非專利文獻3)。該等抗體分子結合於在癌細胞表現的抗原，利用ADCC等發揮對於癌細胞之傷害活性。如此的利用ADCC等的細胞傷害活性，已知係依存於治療用抗體在目標細胞表現的抗原的數目(非專利文獻4)，所以從治療用抗體之效果之觀點，成為目標之抗原之表現量高較 理想。但是即使抗原的表現量高，若正常組織有抗原表現，會對於正常細胞發揮ADCC等傷害活性，所以副作用成為大問題。所以，作為癌治療藥的治療用抗體所標靶的抗原，宜為於癌細胞專一性地表現較佳。例如：對抗已知為癌抗原之EpCAM抗原的抗體分子，作為癌治療藥被認為有前景，但是已知EpCAM抗原在胰臟也會表現，實際上，在臨床試驗已有報告因投予抗EpCAM抗體，觀察到由於對於胰臟之細胞傷害活性引起的胰炎的副作用(非專利文獻5)。
受惠利用發揮ADCC活性所致細胞傷害活性之抗體醫藥之成功，已有人報告藉由將天然型人IgG1之Fc區之N型糖鏈之岩藻糖除去而獲致ADCC活性之增強(非專利文獻6)、利用天然型人IgG1之Fc區之胺基酸取代獲致對於FcγRIIIa之結合增強而得之ADCC活性之增強(非專利文獻7)等以發揮強大細胞傷害活性的第二世代之改良抗體分子。作為以上述NK細胞中介之ADCC活性以外的機轉對於癌細胞發揮傷害活性的抗體醫藥，也有人報告將有強大細胞傷害活性的藥物和抗體接合而成的Antibody Drug Conjugate(ADC)(非專利文獻8)、及藉由於癌細胞中增援T細胞而發揮對癌細胞之傷害活性的低分子抗體(非專利文獻9)等來發揮強大細胞傷害活性的改良抗體分子。
如此的發揮更強大的細胞傷害活性的抗體分子，即使對於抗原表現不多的癌細胞仍能發揮細胞傷害活性，另一方面，對於抗原表現少的正常組織也同樣會發揮細胞傷害活性。實際上，相較於對抗EGFR抗原之天然型人IgG1即 Cetuximab，對抗CD3與EGFR之雙專一性抗體EGFR-BiTE能藉由於癌細胞中增援T細胞以對於癌細胞發揮強大的細胞傷害活性並發揮抗腫瘤效果。另一方面，EGFR在正常組織也會表現，所以也已觀測到將EGFR-BiTE對於食蟹獼猴投予時出現嚴重的副作用(非專利文獻10)。又，在對抗癌細胞中為高表現之CD44v6的抗體結合mertansine而得的ADCbivatuzumab mertansine，由於CD44v6在正常組織也會表現，所以臨床上已觀測到嚴重的皮膚毒性&肝毒性(非專利文獻11)。
如上，當使用即使對於抗原表現少的癌細胞仍能發揮強大的細胞傷害活性的抗體時，須要目標抗原極為癌專一性地表現，但是如同Herceptin之目標抗原HER2、Cetuximab之目標抗原EGFR在正常組織也會表現，據認為極度癌專一性地表現的癌抗原的數目有限。所以，即使能夠強化對於癌之細胞傷害活性，對於正常組織之細胞傷害作用造成的副作用仍可能是問題。
又，最近，有人揭示：藉由抑制癌中有助免疫抑制之CTLA4而增強腫瘤免疫的ipilimumab，會使轉移性黑色素瘤的整體存活(Overall survival)延長(非專利文獻12)。但是ipilimumab會將CTLA4予以全身性地抑制，所以腫瘤免疫增強的另一方面，會因全身性免疫活化造成自體免疫病症狀的嚴重副作用，成為問題(非專利文獻13)。
另一方面，作為對付癌以外之病症的抗體醫藥，已知藉由抑制發炎性．自體免疫病症中的發炎細胞介素能發揮治療效果的抗體醫藥(非專利文獻14)。例如以TNF作為目標 的Remicade、Humira、及將IL-6R作為目標之Actemra，對於類風濕性關節炎發揮高治療效果，但另一方面，也已知由於該等細胞介素全身性地被中和，而觀察到感染症的副作用(非專利文獻15)。
作為能應用在第二代抗體醫藥的技術，已開發出各種技術，已有人報告使效應子機能、抗原結合能力、藥物動態、安定性提高、或使用免疫原性風險減低的技術等(非專利文獻16)，但幾乎無人報告用以解決如上述副作用之能將抗體醫藥對於目標組織專一性地作用的技術。例如：有人報告：針對如癌組織、發炎性組織之病變部位，利用該等目標組織之pH為酸性的條件的pH依存性抗體(專利文獻1、及2)。但是癌組織、發炎性組織相較於正常組織，pH的降低(亦即氫離子濃度之上昇)微小，難以製作檢知分子量極小之氫離子濃度之些微上昇並作用的抗體，且同時有時破骨細胞骨吸收窩領域等正常組織、對象之病變以外的組織的pH也為酸性條件，故據認為將pH之條件作為病變部位專一的環境因子利用仍有許多課題。另一方面，有人報告：製作藉由在如癌組織、發炎性組織之病變部位表現的蛋白酶切斷方會發揮抗原結合活性之抗體之方法(專利文獻3)。但是蛋白酶切斷抗體係不可逆，所以據認為於該病變部位被切斷的抗體乘著血流回到正常組織，也會於正常組織和抗原結合，此為課題。又，據認為如此的蛋白酶的癌專一性也尚有課題。所以，尚未知有為了避免副作用且同時發揮藥效，於正常組織、血液中不全身性地作用，在病變部位即癌、發炎部位會可逆地作用的技術。又，也未知有可利用 以外來性化合物之非侵入投予以控制抗體活性、藥理作用的方法。
【先前技術文獻】 【專利文獻】
【專利文獻1】國際公開第WO2003/105757號
【專利文獻2】國際公開第WO2012/033953號
【專利文獻3】國際公開第WO2010/081173號
【非專利文獻】
【非專利文獻1】Monoclonal antibody successes in the clinic. Janice M Reichert, Clark J Rosensweig, Laura B Faden & Matthew C Dewitz, Nat. Biotechnol. (2005) 23, 1073 - 1078
【非專利文獻2】The therapeutic antibodies market to 2008. Pavlou AK, Belsey MJ., Eur. J. Pharm. Biopharm. (2005) 59 (3), 389-396
【非專利文獻3】Monoclonal antibodies: versatile platforms for cancer immunotherapy. Weiner LM, Surana R, Wang S., Nat. Rev. Immunol. (2010) 10 (5), 317-327
【非專利文獻4】Differential responses of human tumor cell lines to anti-p185HER2 monoclonal antibodies. Lewis GD, Figari I, Fendly B, Wong WL, Carter P, Gorman C, Shepard HM, Cancer Immunol. Immunotherapy (1993) 37, 255-263
【非專利文獻5】ING-1, a monoclonal antibody targeting Ep-CAM in patients with advanced adenocarcinomas. de Bono JS, Tolcher AW, Forero A, Vanhove GF, Takimoto C, Bauer RJ, Hammond LA, Patnaik A, White ML, Shen S, Khazaeli MB, Rowinsky EK, LoBuglio AF, Clin. Cancer Res. (2004) 10 (22), 7555-7565
【非專利文獻6】Non-fucosylated therapeutic antibodies as next-generation therapeutic antibodies. Satoh M, Iida S, Shitara K., Expert Opin. Biol. Ther. (2006) 6 (11), 1161-1173
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有鑑於上述背景，若能取得可因應於目標組織專一性地存在或產生之低分子之濃度而控制向目標抗原之結合之抗體(以下，在本說明書中有時稱為「低分子開關抗體」(Small molecule switch antibody))，則該抗體會於腫瘤部位、發炎部位等病變部位可逆地作用，能避免副作用，故極有用。又，若能取得因應非天然化合物之濃度而控制向抗原之結合之抗體，該抗體可藉由能使抗體活性、藥理作用在病變部位活化之外來性化合物投予、或能非侵入投予之外來性化合物的投予以控制，故極有用。
但是該抗體並無任何以習知方法，即將非人動物以抗原免疫之方法、利用來自人及非人動物之抗體資料庫之方法取得的報告。
因此強力尋求能提供因應在目標組織專一性地存在或產生之低分子、或因應非天然化合物之濃度而控制向任意目標抗原之結合的抗體(低分子開關抗體)，進一步於短期間有效率地取得該抗體之方法。
本案發明人等為了達成上述目的而努力研究，結果創製出含有因應目標組織專一的化合物之濃度而對於抗原 之結合活性變化之抗原結合分域的抗原結合分子。又，本案發明人等發現：該抗原結合分子或含有該抗原結合分子之醫藥組合物有用於治療起因於目標組織之病症，且投予該抗原結合分子對於治療起因於目標組織之病症有用，且在治療起因於目標組織之病症之醫藥時。該抗原結合分子有用。
本案發明人等進一步成功地製作：因應活體內之環境要素之不同、或因應非天然化合物之投予，可能改變抗原結合分子對於抗原之結合活性之涉及低分子結合的胺基酸殘基於抗原結合分域所含之序列彼此不同之含複數個抗原結合分子之資料庫，並使用該資料庫篩選及製作該抗原結合分子之方法，乃完成本發明。
本發明係基於如此的見解而生，具體而言包括以下例示性記載的態樣。
[態樣1]
一種資料庫，係由以下(i)或(ii)為主而成，(i)序列互不相同之複數個抗原結合分域或含有抗原結合分域之抗原結合分子；或(ii)編碼為該序列互不相同之複數個抗原結合分域或含有抗原結合分域之抗原結合分子之核酸；其特徵為：前述抗原結合分子分域或抗原結合分子係因應低分子化合物之濃度而改變對於抗原之結合活性之抗原結合分域或含抗原結合分域之抗原結合分子。
[態樣2]
如態樣[1]之資料庫，係以包括下列(a)及(b)之步驟的方法製造：(a)在因應低分子化合物之濃度而改變對於抗原之結合活性之抗原結合分域或對於低分子化合物有結合活性之抗原結合分域中，指定滿足以下(i)至(iii)中任一者以上之胺基酸部位之步驟；(i)未涉及對該低分子化合物之結合的1或複數個胺基酸部位；(ii)就親代抗原結合分域所屬之動物種之抗體之資料庫存(repertory)而言，胺基酸出現頻度有多樣性的1或複數個胺基酸部位；(iii)對於典型結構(Canonical structure)之形成不重要的1或複數個胺基酸部位；及(b)設計含有前述抗原結合分域中之編碼為未改變體之核酸及編碼為步驟(a)指定之1或複數個胺基酸部位有改變之序列互異之前述抗原結合分域或含有抗原結合分域之抗原結合分子之複數個改變體的核酸的資料庫之步驟。
[態樣3]
如態樣[2]之資料庫，係以包括下列(a)至(d)之步驟的方法製造：(a)在因應低分子化合物之濃度而改變對於抗原之結合活性之抗原結合分域或對於低分子化合物有結合活性之抗原結合分域中，指定滿足以下(i)至(iii)中任一者以上之胺基酸部位之步驟； (i)未涉及對該低分子化合物之結合的1或複數個胺基酸部位；(ii)就親代抗原結合分域所屬之動物種之抗體之資料庫存而言，胺基酸出現頻度有多樣性的1或複數個胺基酸部位；(iii)對於典型結構之形成不重要的1或複數個胺基酸部位；(b)製作於步驟(a)指定之1或複數個胺基酸部位有改變之序列互異之前述抗原結合分域或含有抗原結合分域之抗原結合分子之複數個改變體之步驟；(c)指定前述各改變體之對於該低分子化合物之結合活性實質上不帶來變化之1或複數個胺基酸之改變之步驟；及(d)製造含有編碼為未改變體之核酸及編碼為含有於步驟(c)指定之1或複數個胺基酸有改變之序列互異之前述抗原結合分域或含有抗原結合分域之抗原結合分子之複數個改變體的核酸的資料庫。
[態樣4]
如態樣[1]之資料庫，係以包含以下1)及2)之步驟的方法製造：1)使含有複數個對於低分子化合物有結合活性之抗原結合分子的資料庫與低分子化合物接觸之步驟、及2)從該資料庫將編碼為對於低分子化合物有結合活性之抗原結合分子之複數個改變體的核酸予以濃縮之步驟。
[態樣5]
如態樣[4]之資料庫，其中，前述抗原結合分子係含有抗體 之重鏈可變區及輕鏈可變區的抗原結合分子，依包含以下1)至3)中任一步驟之方法製造；1)如態樣[4]之資料庫包含編碼為位在重鏈可變區之胺基酸改變的1或複數個改變體的核酸，從該資料庫將編碼為對於低分子化合物有結合活性之抗原結合分子之複數個改變體之核酸予以濃縮並設計資料庫；2)如態樣[4]之資料庫包含編碼為位在輕鏈可變區之胺基酸改變的1或複數個改變體的核酸，從該資料庫將編碼為對於低分子化合物有結合活性之抗原結合分子之複數個改變體之核酸予以濃縮並設計資料庫；3)將編碼為從步驟1)及步驟2)之各可變區資料庫濃縮的抗原結合分子的核酸予以組合以設計資料庫。
[態樣6]
如態樣[1]至[5]中任一項之資料庫，其中，前述抗原結合分子係抗原結合分域與病毒外殼蛋白質之至少一部分的融合多胜肽。
[態樣7]
如態樣[1]至[5]中任一項之資料庫，其中，前述抗原結合分子係含有抗體之重鏈及輕鏈之抗原結合分子，更包含設計前述重鏈及/或輕鏈之合成資料庫的步驟。
[態樣8]
如態樣[7]之資料庫，其中，前述抗體之重鏈及/或輕鏈含有來自生殖細胞系列之框架序列。
[態樣9]
如態樣[1]至[8]中任一項之資料庫，其中，前述低分子化合物為目標組織專一的化合物或非天然化合物。
[態樣10]
如態樣[1]至[9]中任一項之資料庫，其中，前述目標組織為癌組織或發炎性組織。
[態樣11]
如態樣[10]之資料庫，其中，前述癌組織專一的化合物係選自於由具有嘌呤環結構之核苷、胺基酸及其代謝產物、脂質及其代謝產物、糖代謝之一次代謝產物、以及菸鹼醯胺及其代謝產物構成之群組中之至少1種化合物。
[態樣12]
如態樣[1]至[11]中任一項之資料庫，其中，前述低分子化合物為犬尿胺酸(kynurenine)、腺苷、腺苷1磷酸、腺苷2磷酸、或腺苷3磷酸。
[態樣13]
如態樣[1]至[12]中任一項之資料庫，其中，未涉及與前述低分子化合物之結合之胺基酸部位係從以下選擇的任一者以上之胺基酸以外：H鏈：97、100c、101、94、95、100d、100e、33、50、52、56、57、58、99、100、100a、54、55(Kabat編號)；L鏈：49、55、95c、96、95a、95b(Kabat編號)。
[態樣14]
一種抗原結合分子之製造方法，該抗原結合分子含有因應 低分子化合物之濃度而改變對於抗原之結合活性之抗原結合分域，包含以下(a)至(g)之步驟：(a)於低分子化合物非存在下使如態樣[1]至[13]中任一項之資料庫與抗原接觸；(b)選擇於前述步驟(a)未結合於抗原之抗原結合分域；(c)將前述步驟(b)選擇的抗原結合分域於低分子化合物存在下與抗原接觸；(d)選擇前述步驟(c)結合於抗原之抗原結合分域；(e)將編碼為前述步驟(d)選擇的抗原結合分域的多核苷酸連結於編碼為含Fc區之多胜肽的多核苷酸；(f)培養已導入以可作用地連結前述步驟(e)獲得之多核苷酸的載體的細胞；及(g)從前述步驟(f)培養之細胞之培養液回收抗原結合分子。
[態樣15]
一種抗原結合分子之製造方法，該抗原結合分子含有因應低分子化合物之濃度而改變對於抗原之結合活性之抗原結合分域，包含以下(a)至(e)之步驟：(a)將如態樣[1]至[13]中任一項之資料庫於低分子化合物存在下與抗原接觸；(b)以比前述步驟(a)更低濃度的低分子化合物使抗原結合分域解離並回收；(c)使編碼為前述步驟(b)回收之抗原結合分域的多核苷酸連結於編碼為含Fc區之多胜肽的多核苷酸； (d)培養已導入以可作用地連結前述步驟(c)獲得之多核苷酸的載體的細胞；及(e)從前述步驟(d)培養之細胞之培養液回收抗原結合分子。
[態樣16]
如態樣[14]或[15]之含有因應低分子化合物之濃度而改變對於抗原之結合活性之抗原結合分域之抗原結合分子之製造方法，更包含以下(a)至(b)之步驟：(a)將如態樣[1]至[13]中任一項之資料庫與低分子化合物接觸；及(b)選擇前述步驟(a)回收之抗原結合分域。
[態樣17]
如態樣[14]至[16]中任一項之抗原結合分子之製造方法，其中，前述低分子化合物為犬尿胺酸、腺苷、腺苷1磷酸、腺苷2磷酸、或腺苷3磷酸。
[態樣18]
一種抗原結合分子，含有因應非天然化合物之濃度而改變對抗原之結合活性之抗原結合分域。
[態樣19]
一種醫藥組合物，含有如態樣[18]之抗原結合分子。
該技術領域之人士當然理解：將上述記載之1或複數個態樣任意組合者，只要基於該技術領域之人士之技術常識在技術上不矛盾，則包括在本發明。
本發明之因應低分子化合物之濃度而改變對於抗原之結合活性之抗原結合分域或含有抗原結合分域之抗原結合分子、以及含其之醫藥組合物，藉由在正常組織、血液中不全身性作用，在目標組織之病變部位即癌、發炎部位為可逆作用，能避免副作用且同時發揮藥效，能治療起因於該目標組織之病症。
再者，若使用本發明之含有序列互異之複數個因應低分子化合物之濃度而改變對於抗原之結合活性之抗原結合分域或含有抗原結合分域之抗原結合分子的資料庫，能於短時間以良好效率取得如上述對於組織專一的病症的治療有用的各種抗原結合分子。
該本發明之資料庫之一態樣中，指定未涉及對於低分子化合物之結合的抗原結合分子分域的胺基酸部位，設計含有編碼為序列互異之抗原結合分域之核酸的資料庫，以使該部位之胺基酸成為1~數種胺基酸，藉此，比起利用非人哺乳動物之免疫的方法、利用人或非人動物來源抗體資料庫，能提供可有效率地取得於化合物存在下對於抗原之結合能力變化之抗原結合分子的資料庫。
第1圖顯示於低分子不存在的正常環境，低分子開關抗體(Small molecule switch antibody)不結合於抗原，而於低分子高濃度存在的目標組織，結合於抗原。
第2圖顯示藉由低分子夾持於抗體與抗原之複合體，低分 子發揮開關機能。低分子若不存在，則抗體與抗原的交互作用不充分，抗體無法結合於抗原，但若低分子存在，藉由夾持在抗體與抗原間，抗體能結合於抗原。
第3圖顯示使用在對於兔免疫之腺苷類似物2'-Adenosine-PEG-peptide之結構。
第4圖顯示使用在對於兔免疫之腺苷類似物5'-Adenosine-PEG-peptide之結構。
第5圖顯示使用在對於兔免疫之腺苷類似物之胜肽部分取代為生物素而得之2'-Adenosine-PEG-biotin之結構。
第6圖顯示使用在對於兔免疫之腺苷類似物之胜肽部分取代為生物素而得之5'-Adenosine-PEG-biotin之結構。
第7圖顯示由兔B細胞選殖獲得之各抗體對於2'-Adenosine-PEG-Biotin之結合活性之比較結果。各抗體與2'-Adenosine-PEG-Biotin交互作用時之結合量除以各抗體之捕捉量(RU)而得之值(N_binding_100)示於縱軸，2'-Adenosine-PEG-Biotin之交互作用後從各抗體將2'-Adenosine-PEG-Biotin解離60秒後之值除以各抗體之捕捉量(RU)而得之值(N_stability_100)示於橫軸。
第8A圖顯示選殖體SMB0002結合於腺苷(交互作用)之表面電漿子共振分析之感應圖。感應圖自上起按順序代表100(2重複)50、25、12.5、6.25、3.13nM之腺苷與SMB0002之交互作用。
第8B圖顯示選殖體SMB0002結合於ATP(交互作用)之表面電漿子共振分析之感應圖。感應圖自上起按順序代表5000、 1250、313、78.1nM之ATP與SMB0002之交互作用。
第9圖顯示選殖體SMB0002結合於腺苷及ATP之競爭ELISA之結果。
第10A圖顯示選殖體SMB0002結合於AMP(交互作用)之表面電漿子共振分析之感應圖。感應圖自上起按順序代表500、250(2重複)、125、62.5、31.3、15.6、7.81μM之AMP與SMB0002之交互作用。
第10B圖顯示選殖體SMB0002結合於ADP(交互作用)之表面電漿子共振分析之感應圖。感應圖自上起按順序代表第200圖、1000(2重複)、500、250、125、62.5、31.3μM之ADP與SMB0002之交互作用。
第11A圖顯示SMB0002抗體與腺苷之腺嘌呤環部分間結合的樣式。圖中，該抗體之H鏈以粗線表示、L鏈以細線表示、腺苷以球棒模型表示。距腺嘌呤環3.8Å以內的胺基酸殘基以棍棒(stick)模型。破折線代表在該抗體與腺嘌呤環部分之間處於3.2Å以內的距離的氫鍵。
第11B圖顯示SMB0002抗體與腺苷之核糖部分結合之樣式。圖中，該抗體之H鏈以粗線表示、L鏈以細線表示、腺苷以球棒模型表示。距核糖部分3.8Å以內的胺基酸殘基以棍棒模型表示。破折線代表該抗體與核糖部分之間處於3.2Å以內的距離的氫鍵。點線區域內代表AMP結合時預測的磷酸基的存在區域。
第12圖顯示人化SMB0002結合於腺苷(交互作用)之表面電漿子共振分析之感應圖。感應圖自上起按順序代表200、 100、50(2重複)、25、12.5、6.25、3.125nM之腺苷與人化SMB0002之交互作用。
第13圖顯示人化SMB0002結合於AMP(交互作用)之表面電漿子共振分析之感應圖。感應圖自上起按順序代表500、250、125(2重複)、62.5、31.3、15.6、7.8μM之AMP與人化SMB0002之交互作用。
第14圖顯示人化SMB0002結合於ADP(交互作用)之表面電漿子共振分析之感應圖。感應圖自上起按順序代表1000(2重複)、500、250、125、62.5μM之ADP與人化SMB0002之交互作用。
第15圖顯示人化SMB0002結合於ATP(交互作用)之表面電漿子共振分析之感應圖。感應圖自上起按順序代表1000(2重複)、500、250、125、62.5μM之ATP與人化SMB0002之交互作用。
第16圖顯示選殖體6RNMSC1-2_F02對於人IL-6R結合之ELISA之結果。縱軸為評價因各低分子有無，抗體向人IL-6R之結合活性之吸光度之值。
第17圖顯示選殖體6RNMSC1-3_G02對於人IL-6R結合之ELISA之結果。縱軸為評價因各低分子有無，抗體向人IL-6R之結合活性之吸光度之值。
第18圖顯示抗體對於人IL-6R結合之ELISA之結果。縱軸為評價因各胺基酸或胺基酸代謝物之有無，抗體向人IL-6R之結合活性之吸光度之值。
第19圖顯示於100μmol/L犬尿胺酸存在下、10mmol/L ATP存在下、犬尿胺酸、ATP非存在下時，6RNMSC1-2_F02與1μmol/L IL-6R之交互作用之感應圖。實線代表犬尿胺酸存在下之交互作用、點線代表ATP存在下之交互作用、及破折線代表該等非存在下之交互作用。
第20圖係對於已固定在感應晶片CM5的IL-6R，於100μmol/L犬尿胺酸存在下使其與6RNMSC1-2_F02交互作用，之後觀察於含有100μmol/L犬尿胺酸之緩衝液或不含犬尿胺酸之緩衝液條件下6RNMSC1-2_F02從IL-6R之解離之圖表。圖縱軸代表令於100μmol/L犬尿胺酸存在下之6RNMSC1-2_F02之結合量為100而常態化後的值，橫軸代表交互作用開始後的經過時間(秒)。實線代表於犬尿胺酸存在下，6RNMSC1-2_F02從IL-6R之解離，點線代表於犬尿胺酸非存在下，6RNMSC1-2_F02從IL-6R之解離。
第21圖顯示將5μg/L之6RNMSC1-2_F02作為分析物，使其進行180秒交互作用，評價對於固定在感應晶片CM5上之IL-6R的回應的圖表。縱軸代表與6RNMSC1-2_F02交互作用前後之回應之變化(RU)、橫軸代表在溶液中所含之犬尿胺酸濃度(μmol/L)。
第22圖顯示選殖體6RNMSC1-2_F02結合於犬尿胺酸(交互作用)之表面電漿子共振分析之感應圖。感應圖自上起按順序代表1.25、0.625、0.313、0.156、0.078、0.039mM之犬尿胺酸與6RNMSC1-2_F02之交互作用。又，動力學參數為：ka=709(1/s),kd=0.17(1/s),KD=0.239(mmol/L)。
第23圖顯示選殖體6RNMSC1-2_F02結合於3-羥基-DL- 犬尿胺酸(交互作用)之表面電漿子共振分析之感應圖。感應圖自上起按順序代表0.625、0.313、0.156、0.078、0.039mM之3-羥基-DL-犬尿胺酸與6RNMSC1-2_F02之交互作用。
第24圖顯示選殖體6RNMSC1-2_F02結合於化合物RO0635389-000-001(交互作用)之表面電漿子共振分析之感應圖。感應圖自上起按順序代表0.625、0.313、0.156mM之化合物RO0635389-000-001與6RNMSC1-2_F02之交互作用。
第25圖顯示選殖體6RNMSC1-2_F02結合於化合物RO0635390-000-001(交互作用)之表面電漿子共振分析之感應圖。感應圖自上起按順序代表0.625、0.313、0.156mM之化合物RO0635390-000-001與6RNMSC1-2_F02之交互作用。
第26圖顯示選殖體6RNMSC1-2_F02因犬尿胺酸存在下(實線)非存在下(破折線)，向IL6R之結合(交互作用)變化之Octet之感應圖。縱軸代表對於IL6R之回應。
第27圖顯示選殖體6RNMSC1-2_F02因3-羥基-DL-犬尿胺酸存在下(實線)非存在下(破折線)，IL6R之結合(交互作用)變化之Octet之感應圖。縱軸代表對於IL6R之回應。
第28圖顯示選殖體6RNMSC1-2_F02因化合物RO0635389-000-001存在下(實線)非存在下(破折線)，IL6R之結合(交互作用)變化之Octet之感應圖。縱軸代表對於IL6R之回應。
第29圖顯示選殖體6RNMSC1-2_F02因化合物RO0635390-000-001存在下(實線)非存在下(破折線)，IL6R之結合(交互作用)變化之Octet之感應圖。縱軸代表對於IL6R之 回應。
第30圖顯示6RNMSC1-2_F02 Fab片段與犬尿胺酸結合之樣式。圖中，該抗體之H鏈以粗線表示、L鏈以細線表示、犬尿胺酸以球棒模型表示。距犬尿胺酸3.8Å以內的胺基酸殘基以棍棒模型表示。破折線代表在該抗體與犬尿胺酸之間處於3.3Å以內的距離的氫鍵或靜電交互作用。
第31圖顯示選殖體6RNMSC1-2_F02之H49Y改變體結合於犬尿胺酸(交互作用)之表面電漿子共振分析之感應圖。感應圖自上起按順序代表1.25、0.625、0.313、0.156、0.078、0.039mM之犬尿胺酸與6RNMSC1-2_F02H49Y之交互作用。又，動力學參數為：ka=2543(1/s),kd=0.24(1/s),KD=0.095(mmol/L)。
第32圖顯示對於6RNMSC1-2_F02之框架序列導入用以回復生殖系列序列之變異而得的選殖體F02h011/F021003結合於犬尿胺酸(交互作用)之表面電漿子共振分析之感應圖。感應圖自上起按順序代表1000、500、250、125、62.5μM之犬尿胺酸與F02h011/F021003之交互作用。
第33圖顯示對於F02h011/F021003導入使向犬尿胺酸之結合增強之改變的選殖體F02h011/F021098結合於犬尿胺酸(交互作用)之表面電漿子共振分析之感應圖。感應圖自上起按順序代表500、250、125、62.5、31.315.6μM之犬尿胺酸與F02h011/F021098之交互作用。
第34圖顯示6RNMSC1-2_F02 Fab片段與犬尿胺酸結合之樣式圖。圖中，該抗體之重鏈以黑色粗線表示、輕鏈以灰色細 線表示、犬尿胺酸以球棒模型表示。距犬尿胺酸4.2Å以內的胺基酸殘基以棍棒模型表示。
第35圖顯示6RNMSC1-2_F02 Fab片段與犬尿胺酸結合之樣式。圖中，該抗體之重鏈以黑色粗線表示、輕鏈以灰色細線表示、犬尿胺酸以球棒模型表示。輕鏈Ser56(kabat編號)以棍棒模型表示。破折線與破折線上的數字代表輕鏈Ser56與犬尿胺酸間之非氫原子間的最短距離。
第36圖顯示6RNMSC1-2_F02 Fab片段與犬尿胺酸之結合樣式。圖中，該抗體之重鏈以黑色粗線表示、輕鏈以灰色細線表示、犬尿胺酸以球棒模型表示。重鏈Gly50及、輕鏈Asp28(kabat編號)以棍棒模型表示。
第37圖顯示於各低分子1mM存在下．非存在下，各選殖體1μM與固定在感應晶片CM5上之IL-6R與進行120秒交互作用時之結合量(Binding response(RU))。
第38圖顯示於各低分子1mM存在下．非存在下，各選殖體10μg/mL與固定在Octet感應晶器上之IL-6R進行120秒交互作用時之結合量(Binding response(RU))。
第39圖顯示由犬尿胺酸資料庫Ver.A取得之選殖體6RFHm12-4_040、6RFHm12-4_078、6RFHm14-4_087、6RFHm14-4_093、6RFHm17-4_006、6RFHm17-4_010對於hIL-6R，於各條件下之ELISA之結果。正對照使用6RNMSC1-2_F02。縱軸為評價抗體向hIL-6R之結合活性之吸光度之值。各條件詳示於表38。
第40圖顯示由犬尿胺酸資料庫Ver.A取得之選殖體 hIAFHm12-4_018、hIAFHm12-4_061、hIAFHm14-4_001、hIAFHm14-4_041、hIAFHm17-4_026、hIAFHm17-4_072對於hIgA-Fc，於各條件下之ELISA之結果。縱軸為評價抗體向hIgA-Fc之結合活性之吸光度之值。各條件之詳情示於表41。
第41圖顯示由犬尿胺酸資料庫Ver.A取得之選殖體I6FHm12-4_068、I6FHm12-4_094、I6FHm14-4_007、I6FHm14-4_030、I6FHm17-4_016、I6FHm17-4_036對於hIL-6，於各條件下之ELISA之結果。縱軸顯示評價抗體向hIL-6之結合活性之吸光度之值。各條件之詳情示於表44。
第42圖評價ATP對於ATNLSA1-4_D12之生物素標識抗原(5'-Adenosine-PEG-biotin,ATP-PEG-biotin之混合)結合的抑制能力的圖。
第43圖顯示成為開關之低分子夾於抗體與抗原之間，將接觸抗原之抗體可變區部分予以資料庫化，而能取得對任意抗原之低分子開關抗體的合理設計(rational design)抗體資料庫的概念。
第44圖顯示由利用結合於ATP/腺苷之抗體為模板之合理設計抗體資料庫獲得之選殖體I6RLSA1-6_011對於人IL-6，於ATP及腺苷10mM存在/非存在下之ELISA之結果。縱軸顯示評價抗體向人IL-6之結合活性之吸光度之值正對照使用由合理設計抗體資料庫獲得之無論低分子存在/非存在，對於人IL-6顯示結合活性之選殖體。負對照使用M13KO7 Helper Phage。
第45圖顯示由利用結合於ATP/腺苷之抗體為模板之合理 設計抗體資料庫獲得之選殖體6RRLSA1-6_037、6RRLSA1-6_045對於人IL-6受體，於ATP及腺苷10mM存在/非存在下之ELISA之結果。縱軸為評價抗體向人IL-6受體之結合活性之吸光度之值。負對照(圖中記為nega)使用M13KO7 Helper Phage。
第46圖顯示由利用結合於ATP/腺苷之抗體為模板之合理設計抗體資料庫獲得之選殖體HSADSA1-6_020對於HAS，於ATP及腺苷10mM存在/非存在下之ELISA之結果。縱軸為評價抗體向HSA之結合活性之吸光度之值。正對照使用由合理設計抗體資料庫獲得之無論低分子存在/非存在對於HSA顯示結合活性的選殖體。負對照使用M13KO7 Helper Phage。
以下定義及詳細說明係為了容易理想本說明書說明之本發明而提供。
胺基酸
本說明書中，例如如Ala/A、Leu/L、Arg/R、Lys/K、Asn/N、Met/M、Asp/D、Phe/F、Cys/C、Pro/P、Gln/Q、Ser/S、Glu/E、Thr/T、Gly/G、Trp/W、His/H、Tyr/Y、Ile/I、Val/V，胺基酸以單字母碼或3字母碼、或其兩者表示記載。
胺基酸之改變
為了改變抗原結合分子之胺基酸序列中之胺基酸，可適當採用部位專一的變異誘發法(Kunkel等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82,488-492))、Overlap extension PCR等公知方法。又，作為取代成天然胺基酸以外之胺基酸的胺基酸改變方 法，也有複數個公知方法可採用(Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.(2006)35,225-249、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2003)100(11),6353-6357)。例如：含有終止碼之一即UAG密碼子(Amber codon)的互補amber suppressor tRNA結合了非天然胺基酸而得的tRNA無細胞轉譯系系統(Clover Direct(Protein Express))等亦為理想。
本說明書中，表示胺基酸之改變部位時使用之「及/或」之用語之意義，包括「及」與「或」適當組合的各種組合。具體而言，例如「33位、55位、及/或96位之胺基酸被取代」，包括以下胺基酸之改變的變化形；(a)33位、(b)55位、(c)96位、(d)33位及55位、(e)33位及96位、(f)55位及96位、(g)33位及55位及96位。
本說明書中，又，就表達胺基酸改變的方式，可適當使用在代表特定位置的數字前後加註改變前與改變後之胺基酸之單字母碼或3字母碼的表達方式。例如：於抗體可變區所含之胺基酸施加取代時使用之N100bL或Asn100bLeu這類改變，代表Kabat編號表示之100b位之Asn取代成Leu。亦即，數字代表Kabat編號表示之胺基酸位置，於其前記載之胺基酸之單字母碼或3字母碼代表取代前之胺基酸、其後記載之胺基酸之單字母碼或3字母碼代表取代後之胺基酸。同樣，對於抗體不變區所含之Fc區施加胺基酸取代時使用的P238D或Pro238Asp這類改變，表示EU編號表示之238位之Pro取代為Asp。亦即，數字代表EU編號表示之胺基酸位置，在其前記載之胺基酸之單字母碼或3字母碼代表取代前之胺基酸、 其後記載之胺基酸之單字母碼或3字母碼代表取代後的胺基酸。
抗原
本說明書中，「抗原」只要是包含抗原結合分域結合之抗原決定基即可，其結構不限於特定結構。於其他含意，抗原可為無機物也可為有機物。抗原可列舉如以下分子；17-IA、4-1BB、4Dc、6-酮-PGF1a、8-異-PGF2a、8-側氧基-dG、A1腺苷受體、A33、ACE、ACE-2、活化素(activin)、活化素A、活化素AB、活化素B、活化素C、活化素RIA、活化素RIA ALK-2、活化素RIB ALK-4、活化素RIIA、活化素RIIB、ADAM、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAM8、ADAM9、ADAMTS、ADAMTS4、ADAMTS5、位址素(Addressin)、aFGF、ALCAM、ALK、ALK-1、ALK-7、Alpha-1-抗胰蛋白酶(antitrypsin)、Alpha-V/Beta-1拮抗劑、ANG、Ang、APAF-1、APE、APJ、APP、APRIL、AR、ARC、ART、Artemin、抗Id、ASPARTIC、心房性鈉利尿因子、av/b3整合素、Ax1、b2M、B7-1、B7-2、B7-H、B-淋巴球刺激因子(BlyS)、BACE、BACE-1、Bad、BAFF、BAFF-R、Bag-1、BAK、Bax、BCA-1、BCAM、Bcl、BCMA、BDNF、b-ECGF、bFGF、BID、Bik、BIM、BLC、BL-CAM、BLK、BMP、BMP-2 BMP-2a、BMP-3成骨素(Osteogenin)、BMP-4 BMP-2b、BMP-5、BMP-6Vgr-1、BMP-7(OP-1)、BMP-8(BMP-8a、OP-2)、BMPR、BMPR-IA(ALK-3)、BMPR-IB(ALK-6)、BRK-2、RPK-1、BMPR-II(BRK-3)、BMP、b-NGF、BOK、鈴蟾素(Bombesin)、骨 來源神經營養因子、BPDE、BPDE-DNA、BTC、補體因子3(C3)、C3a、C4、C5、C5a、C10、CA125、CAD-8、抑鈣素(Calcitonin)、cAMP、癌胎兒性抗原(CEA)、癌關連抗原、細胞自溶酶(cathepsin)A、細胞自溶酶B、細胞自溶酶C/DPPI、細胞自溶酶D、細胞自溶酶E、細胞自溶酶H、細胞自溶酶L、細胞自溶酶O、細胞自溶酶S、細胞自溶酶V、細胞自溶酶X/Z/P、CBL、CCI、CCK2、CCL、CCL1、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9/10、CCR、CCR1、CCR10、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CD1、CD2、CD3、CD3E、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27L、CD28、CD29、CD30、CD30L、CD32、CD33(p67蛋白質)、CD34、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD49a、CD52、CD54、CD55、CD56、CD61、CD64、CD66e、CD74、CD80(B7-1)、CD89、CD95、CD123、CD137、CD138、CD140a、CD146、CD147、CD148、CD152、CD164、CEACAM5、CFTR、cGMP、CINC、肉毒桿菌毒素、產氣莢膜梭菌毒素、CKb8-1、CLC、CMV、CMV UL、CNTF、CNTN-1、COX、C-Ret、CRG-2、CT-1、CTACK、CTGF、CTLA-4、PD1、PDL1、LAG3、TIM3、galectin-9、CX3CL1、CX3CR1、CXCL、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、 CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCR、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、細胞角質素腫瘤關連抗原、DAN、DCC、DcR3、DC-SIGN、補體控制因子(Decay accelerating factor)、des(1-3)-IGF-I(腦IGF-1)、Dhh、地谷新(Digoxin)、DNAM-1、Dnase、Dpp、DPPIV/CD26、Dtk、ECAD、EDA、EDA-A1、EDA-A2、EDAR、EGF、EGFR(ErbB-1)、EMA、EMMPRIN、ENA、內皮受體、腦啡肽酶(Enkephalinase)、eNOS、Eot、伊紅趨素(Eotaxin)1、EpCAM、EphrinB2/EphB4、EPO、ERCC、E-選擇蛋白(selectin)、ET-1、因子IIa、因子VII、因子VIIIc、因子IX、纖維母細胞活化蛋白質(FAP)、Fas、FcR1、FEN-1、鐵蛋白、FGF、FGF-19、FGF-2、FGF3、FGF-8、FGFR、FGFR-3、纖維蛋白(Fibrin)、FL、FLIP、Flt-3、Flt-4、卵泡刺激激素、Fractalkine、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、G250、Gas6、GCP-2、GCSF、GD2、GD3、GDF、GDF-1、GDF-3(Vgr-2)、GDF-5(BMP-14、CDMP-1)、GDF-6(BMP-13、CDMP-2)、GDF-7(BMP-12、CDMP-3)、GDF-8(myostatin)、GDF-9、GDF-15(MIC-1)、GDNF、GDNF、GFAP、GFRa-1、GFR-Alpha 1、GFR-Alpha 2、GFR-Alpha 3、GITR、升糖素、Glut4、糖蛋白質IIb/IIIa(GPIIb/IIIa)、GM-CSF、gp130、gp72、GRO、成長激素釋放因子、半抗原(NP-cap或NIP-cap)、HB-EGF、HCC、HCMV gB外膜糖蛋白質、HCMV gH外膜糖蛋白質、HCMV UL、造血成長因子(HGF)、Hep B gp120、肝素酶、Her2、 Her2/neu(ErbB-2)、Her3(ErbB-3)、Her4(ErbB-4)、單純皰疹病毒(HSV)gB糖蛋白質、HSV gD糖蛋白質、HGFA、高分子量黑色腫關連抗原(HMW-MAA)、HIV gp120、HIV IIIB gp 120 V3迴圈、HLA、HLA-DR、HM1.24、HMFG PEM、HRG、Hrk、人心肌凝蛋白、人細胞巨大病毒(HCMV)、人成長激素(HGH)、HVEM、I-309、IAP、ICAM、ICAM-1、ICAM-3、ICE、ICOS、IFNg、Ig、IgA受體、IgE、IGF、IGF結合蛋白質、IGF-1R、IGFBP、IGF-I、IGF-II、IL、IL-1、IL-1R、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-5R、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-18R、IL-21、IL-23、IL-27、干擾素(INF)-Alpha、INF-Beta、INF-gamma、抑制素(inhibin)、iNOS、胰島素A鏈、胰島素B鏈、類胰島素增殖因子1、整合素Alpha 2、整合素Alpha 3、整合素Alpha 4、整合素Alpha 4/Beta 1、整合素Alpha 4/Beta 7、整合素Alpha 5(Alpha V)、整合素Alpha 5/Beta 1、整合素Alpha 5/Beta 3、整合素Alpha 6、整合素Beta 1、整合素Beta 2、干擾素gamma、IP-10、I-TAC、JE、激肽釋放酶2、激肽釋放酶5、激肽釋放酶6、激肽釋放酶11、激肽釋放酶12、激肽釋放酶14、激肽釋放酶15、激肽釋放酶L1、激肽釋放酶L2、激肽釋放酶L3、激肽釋放酶L4、KC、KDR、角質細胞生長因子(KGF)、laminin 5、LAMP、LAP、LAP(TGF-1)、潛在的TGF-1、潛在的TGF-1 bp1、LBP、LDGF、LECT2、Lefty、路易士-Y抗原、路易士-Y關連抗原、LFA-1、LFA-3、Lfo、LIF、LIGHT、核糖蛋白、LIX、LKN、Lptn、L-選擇蛋白、LT-a、LT-b、LTB4、LTBP-1、肺表面、黃體形成激 素、淋巴毒素Beta受體、Mac-1、MAdCAM、MAG、MAP2、MARC、MCAM、MCAM、MCK-2、MCP、M-CSF、MDC、Mer、METALLOPROTEASES、MGDF受體、MGMT、MHC(HLA-DR)、MIF、MIG、MIP、MIP-1-Alpha、MK、MMAC1、MMP、MMP-1、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-2、MMP-24、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MPIF、Mpo、MSK、MSP、黏蛋白(Muc1)、MUC18、Muellerian抑制物質、Mug、MuSK、NAIP、NAP、NCAD、N-C adherin、NCA 90、NCAM、NCAM、Neprilysin、neurotrophin-3、-4、或-6、neurturin、神經成長因子(NGF)、NGFR、NGF-Beta、nNOS、NO、NOS、Npn、NRG-3、NT、NTN、OB、OGG1、OPG、OPN、OSM、OX4OL、OX40R、p150、p95、PADPr、副甲狀腺激素、PARC、PARP、PBR、PBSF、PCAD、P-鈣黏蛋白、PCNA、PDGF、PDGF、PDK-1、PECAM、PEM、PF4、PGE、PGF、PGI2、PGJ2、PIN、PLA2、胎盤性鹼性磷解酶(PLAP)、P1GF、PLP、PP14、前胰島素、prorelaxin、Protein C、PS、PSA、PSCA、前列腺專一膜抗原(PSMA)、PTEN、PTHrp、Ptk、PTN、R51、RANK、RANKL、RANTES、RANTES、relaxin A鏈、relaxin B鏈、腎活素(rennin)、呼吸器多核體病毒(RSV)F、RSV Fgp、Ret、類風濕性因子(Rheumatoid factor)、RLIP76、RPA2、RSK、S100、SCF/KL、SDF-1、SERINE、血清白蛋白、sFRP-3、Shh、SIGIRR、SK-1、SLAM、SLPI、SMAC、SMDF、SMOH、SOD、SPARC、Stat、STEAP、STEAP-II、TACE、TACI、TAG-72(腫瘤關連糖蛋白質-72)、TARC、TCA-3、T細胞受體(例如：T細胞受體Alpha /Beta)、TdT、TECK、TEM1、TEM5、TEM7、TEM8、TERT、睾丸PLAP狀鹼性磷解酶、TfR、TGF、TGF-Alpha、TGF-Beta、TGF-Beta Pan Specific、TGF-Beta RI(ALK-5)、TGF-Beta RII、TGF-Beta RIIb、TGF-Beta RIII、TGF-Beta 1、TGF-Beta 2、TGF-Beta 3、TGF-Beta 4、TGF-Beta 5、凝血酶、胸腺Ck-1、甲狀腺刺激激素、Tie、TIMP、TIQ、組織因子、TMEFF2、Tmpo、TMPRSS2、TNF、TNF-Alpha、TNF-Alpha Beta、TNF-Beta 2、TNFc、TNF-RI、TNF-RII、TNFRSF10A(TRAIL R1 Apo-2、DR4)、TNFRSF10B(TRAIL R2 DR5、KILLER、TRICK-2A、TRICK-B)、TNFRSF10C(TRAIL R3 DcR1、LIT、TRID)、TNFRSF10D(TRAIL R4 DcR2、TRUNDD)、TNFRSF11A(RANK ODF R、TRANCE R)、TNFRSF11B(OPG OCIF、TR1)、TNFRSF12(TWEAK R FN14)、TNFRSF13B(TACI)、TNFRSF13C(BAFF R)、TNFRSF14(HVEM ATAR、HveA、LIGHT R、TR2)、TNFRSF16(NGFR p75NTR)、TNFRSF17(BCMA)、TNFRSF18(GITR AITR)、TNFRSF19(TROY TAJ、TRADE)、TNFRSF19L(RELT)、TNFRSF1A(TNF RI CD120a、p55-60)、TNFRSF1B(TNF RII CD120b、p75-80)、TNFRSF26(TNFRH3)、TNFRSF3(LTbR TNF RIII、TNFC R)、TNFRSF4(OX40 ACT35、TXGP1 R)、TNFRSF5(CD40 p50)、TNFRSF6(Fas Apo-1、APT1、CD95)、TNFRSF6B(DcR3 M68、TR6)、TNFRSF7(CD27)、TNFRSF8(CD30)、TNFRSF9(4-1BB CD137、ILA)、TNFRSF21(DR6)、TNFRSF22(DcTRAIL R2 TNFRH2)、TNFRST23(DcTRAIL R1 TNFRH1)、TNFRSF25(DR3 Apo-3、LARD、TR-3、TRAMP、WSL-1)、TNFSF10(TRAIL Apo-2配體、TL2)、TNFSF11(TRANCE/RANK配體ODF、OPG配體)、TNFSF12(TWEAK Apo-3配體、DR3配體)、TNFSF13(APRIL TALL2)、TNFSF13B(BAFF BLYS、TALL1、THANK、TNFSF20)、TNFSF14(LIGHT HVEM配體、LTg)、TNFSF15(TL1A/VEGI)、TNFSF18(GITR配體AITR配體、TL6)、TNFSF1A(TNF-aConectin(Conectin)、DIF、TNFSF2)、TNFSF1B(TNF-b LTa、TNFSF1)、TNFSF3(LTb TNFC、p33)、TNFSF4(OX40配體gp34、TXGP1)、TNFSF5(CD40配體CD154、gp39、HIGM1、IMD3、TRAP)、TNFSF6(Fas配體Apo-1配體、APT1配體)、TNFSF7(CD27配體CD70)、TNFSF8(CD30配體CD153)、TNFSF9(4-1BB配體CD137配體)、TP-1、t-PA、Tpo、TRAIL、TRAILR、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRANCE、運鐵蛋白受體、TRF、Trk、TROP-2、TLR(Toll-like receptor)1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TSG、TSLP、腫瘤關連抗原CA125、腫瘤關連抗原表現路易士Y關連碳水化物、TWEAK、TXB2、Ung、uPAR、uPAR-1、尿激酶、VCAM、VCAM-1、VECAD、VE-Cadherin、VE-cadherin-2、VEFGR-1(flt-1)、VEGF、VEGFR、VEGFR-3(flt-4)、VEGI、VIM、病毒抗原、VLA、VLA-1、VLA-4、VNR整合素、von Willebrand因子、WIF-1、WNT1、WNT2、WNT2B/13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNT11、WNT16、XCL1、XCL2、XCR1、XCR1、 XEDAR、XIAP、XPD、HMGB1、IgA、Aβ、CD81、CD97、CD98、DDR1、DKK1、EREG、Hsp90、IL-17/IL-17R、IL-20/IL-20R、氧化LDL、PCSK9、prekallikrein、RON、TMEM16F、SOD1、Chromogranin A、Chromogranin B、tau、VAP1、高分子Kininogen、IL-31、IL-31R、Nav1.1、Nav1.2、Nav1.3、Nav1.4、Nav1.5、Nav1.6、Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9、EPCR、C1、C1q、C1r、C1s、C2、C2a、C2b、C3、C3a、C3b、C4、C4a、C4b、C5、C5a、C5b、C6、C7、C8、C9、factor B、factor D、factor H、properdin、sclerostin、fibrinogen、fibrin、prothrombin、thrombin、組織因子、factor V,factor Va、factor VII、factor VIIa、factor VIII、factor VIIIa、factor IX、factor IXa、factor X、factor Xa、factor XI、factor XIa、factor XII、factor XIIa、factor XIII、factor XIIIa、TFPI、antithrombin III、EPCR、thrombomodulin、TAPI,tPA、plasminogen、plasmin、PAI-1,PAI-2、GPC3、Syndecan-1、Syndecan-2、Syndecan-3、Syndecan-4、LPA、S1P以及激素及成長因子用的受體。抗原宜為在癌組織或發炎性組織中的癌細胞．免疫細胞．基質細胞等表現的抗原為較佳。
上述抗原例示也有記載受體，該等受體係於血漿中等活體液中以可溶型存在的情形，可作為本發明之含有因應低分子化合物(例如：目標組織專一的化合物)之濃度改變對於抗原之結合活性之抗原結合分域之抗原結合分子所結合的抗原。如此之可溶型受體之一非限定態樣，例如：Mullberg等人(J. Immunol.(1994)152(10),4958-4968)記載之可溶型IL-6R，即由序列編號：1表示之IL-6R多胜肽序列中之1至357號胺基酸構成的蛋白質。
上述抗原之例示包括在細胞膜表現的膜型分子、及從細胞分泌到細胞外的可溶型分子。本發明之含有因應目標組織專一的化合物之濃度而改變對於抗原之結合活性變化之抗原結合分域之抗原結合分子，係結合於從細胞分泌之可溶型分子時，該抗原結合分子宜為如後述具有中和活性。
對可溶型分子存在之溶液無限定，本可溶型分子能存在活體液，亦即填滿活體內之脈管或組織．細胞之間的所有液體。非限定之一態樣中，本發明之抗原結合分子結合之可溶型分子，可存在於細胞外液。細胞外液，在脊椎動物係指血漿、組織間液、淋巴液、緻密的結締組織、腦脊髓液、髓液、穿刺液、或關節液等骨及軟骨中之成分、肺泡液(支氣管肺泡洗滌液)、腹水、胸水、心囊水、囊泡液、或眼房水(房水)等細胞透過液(細胞之主動輸送．分泌活動之結果產生的各種腺腔內的液體、及消化管腔等體腔內液)的總稱。
本發明之含有因應低分子化合物(例如：目標組織專一的化合物)的濃度而改變對於抗原之結合活性之抗原結合分域之抗原結合分子，當係結合於在細胞膜表現的膜型分子時，就該抗原結合分子之理想例而言，可列舉：如後述具細胞傷害活性、或結合細胞傷害性物質或具結合能力之抗原結合分子為理想例。又，具細胞傷害活性、或結合細胞傷害性物質或有結合能力之性質替換為、或除該性質以外更有中和活性的抗 原結合分子，也是一非限定態樣之理想例。
抗原決定部位(epitope)
意指抗原中存在之抗原決定基之抗原決定部位，係指本說明書揭示之抗原結合分子中之抗原結合分域所結合之抗原上之部位。因此，例如：抗原決定部位可由其結構定義。又，該抗原決定部位也可由認識該抗原決定部位之抗原結合分子中對於抗原之結合活性定義。抗原為胜肽或多胜肽時，也可利用構成抗原決定部位之胺基酸殘基指定抗原決定部位。又，抗原決定部位為糖鏈時，也可利用特定糖鏈構造來指定抗原決定部位。
直線狀抗原決定部位，係包含認識胺基酸一次序列的抗原決定部位的抗原決定部位。直線狀抗原決定部位典型在固有序列中至少含有3個，且最普通為至少5個，例如約8至約10個，6至20個胺基酸。
立體結構抗原決定部位，與直線狀抗原決定部位相對照，係指含有抗原決定部位之胺基酸之一次序列並非所認識之抗原決定部位之單一規定成分的抗原決定部位(例如：胺基酸之一次序列不一定由規定抗原決定部位之抗體所認識之抗原決定部位)。立體結構抗原決定部位，可能包含對於直線狀抗原決定部位為更多之數之胺基酸。關於立體結構抗原決定部位之認識，抗體認識胜肽或蛋白質之三維結構。例如：蛋白質分子折疊形成三維結構時，形成立體結構抗原決定部位之某個胺基酸及/或多胜肽主鏈，可以並排，抗體可認識抗原決定部位。決定抗原決定部位之立體結構之方法，包含例如X射線結 晶學、二維核磁共振分光學及部位專一性旋轉標誌及電磁常磁性共振分光學，但不限於該等。例如參考：Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology(1996)、第66卷、Morris(編)。
與抗原決定部位結合之抗原結合分域之結構，稱為抗原結合位(paratope)。利用在抗原決定部位與抗原結合位之間作用之氫鍵、靜電力、凡得瓦力、疏水鍵等，使得抗原決定部位與抗原結合位安定結合。此抗原決定部位與抗原結合位間之結合力，稱為親和性(affinity)。複數個抗原與複數個抗原結合分子結合時之結合力之總和，稱為結合性(avidity)。當包含複數個抗原結合分域之(亦即多價之)抗體等結合於複數個抗原決定部位時，結合力(affinity)會相乘地作用，因此結合性高於親和性。
結合活性
以下例示確認含有對抗IL-6R之抗原結合分域的待驗抗原結合分子其對於抗原決定部位之結合的確認方法，但是確認含有對抗IL-6R以外之抗原的抗原結合分域之待驗抗原結合分子其對於抗原決定部位之結合的確認方法，也可依照下列例示適當實施。
例如：含有對抗IL-6R之抗原結合分域的待驗抗原結合分子會認識IL-6R分子中存在之線狀抗原決定部位之情事，例如可以如下方式確認。為了上述目的，合成由構成IL-6R之細胞外分域之胺基酸序列構成的線狀胜肽。該胜肽可化學合成。或，利用IL-6R之cDNA中之編碼為相當於細胞外分域之 胺基酸序列之區域，以基因工程方法可獲得。其次，評價由構成細胞外分域之胺基酸序列所構成的線狀胜肽與含有對於IL-6R之抗原結合分域的待驗抗原結合分子間的結合活性。例如，利用以經固定化之線狀胜肽為抗原之ELISA，可評價該抗原結合分子對於該胜肽之結合活性。或，依據IL-6R表現細胞中，該抗原結合分子之結合時由於線狀胜肽所致抑制的水平，可以明確獲得對於線狀胜肽之結合活性。利用該等試驗，可以明確獲得該抗原結合分子對於線狀胜肽之結合活性。
又，含有對抗IL-6R之抗原結合分域的待驗抗原結合分子會認識立體結構抗原決定部位之情事，可由以下方式確認。為了上述目的，製備表現IL-6R之細胞。含有對抗IL-6R之抗原結合分域的待驗抗原結合分子接觸IL-6R表現細胞時，會強力結合於該細胞，另一方面，對於固定化有該抗原結合分子之由構成IL-6R之細胞外分域的胺基酸序列而成的線狀胜肽，實質上不結合時等。在此，實質上不結合，係指對於人類IL-6R表現細胞之結合活性之80%以下、通常50%以下，較佳為30%以下，尤佳為15%以下之結合活性。
包含對抗IL-6R之抗原結合分域之待驗抗原結合分子其對於IL-6R表現細胞之結合活性之測定方法，例如：Antibodies A Laboratory Manual記載之方法(Ed Harlow,David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)359-420)。亦即，可利用以IL-6R表現細胞為抗原之ELISA或FACS(fluorescence activated cell sorting)之原理評價。
ELISA格式中，包含對抗IL-6R之抗原結合分域 之待驗抗原結合分子其對於IL-6R表現細胞之結合活性，可利用比較酵素反應所生成之信號水平而定量評價。亦即，在固定化有IL-6R表現細胞之ELISA板添加待驗多胜肽組合體，利用認識待驗抗原結合分子之酵素標記檢測結合於抗體細胞之待驗抗原結合分子。或FACS中，製作待驗抗原結合分子之稀釋系列，決定對於IL-6R表現細胞之抗體結合力價(titer)，藉此可比較待驗抗原結合分子對於IL-6R表現細胞之結合活性。
待驗抗原結合分子對於在懸浮於緩衝液等之細胞表面上表現之抗原之結合，可利用流式細胞計數器檢測。流式細胞計數器已知例如如下裝置。
FACSCantoTM II
FACSAriaTM
FACSArrayTM
FACSVantageTM SE
FACSCaliburTM(均為BD Biosciences公司的商品名)
EPICS ALTRA HyPerSort
Cytomics FC 500
EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC
Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC(均為Beckman Coulter公司的商品名)
例如：包含對抗IL-6R之抗原結合分域之待驗抗原結合分子其對於抗原之結合活性之理想測定方法，例如以下方法。首先，以認識與表現IL-6R之細胞反應之待驗抗原結合分子的經FITC標定的二次抗體染色。將待驗抗原結合分子以適 當理想的緩衝液稀釋，可將該抗原結合分子製成所望濃度。例如可使用10μg/ml至10ng/ml之間的任一濃度。其次，以FACSCalibur(BD公司)測定螢光強度及細胞數。抗體對於該細胞之結合量，反映於使用CELL QUEST軟體(BD公司)解析所得之螢光強度，亦即幾何平均值(幾何平均)。亦即，藉由獲得該幾何平均之值，可測定待驗抗原結合分子之結合量所代表之待驗抗原結合分子之結合活性。
包含對抗IL-6R之抗原結合分域之待驗抗原結合分子與某抗原結合分子共有抗原決定部位之情事，可藉由兩者對於相同抗原決定部位之彼此競爭而確認。抗原結合分子間之彼此競爭，可利用交叉阻斷試驗等檢測。例如彼此競爭ELISA試驗為較佳的交叉阻斷試驗。
具體而言，交叉阻斷試驗中，包被在微滴定板之井上的IL-6R蛋白質，於候選的彼此競爭抗原結合分子存在下或非存在下，預備溫育後，添加待驗抗原結合分子。井中之IL-6R蛋白質所結合之待驗抗原結合分子之量，間接相關於成為彼此競爭之候選的彼此競爭抗原結合分子對於相同抗原決定部位之結合之結合能力。亦即，彼此競爭抗原結合分子對於相同抗原決定部位之親和性愈大，則對於包被有待驗抗原結合分子之IL-6R蛋白質之井的結合活性愈低。
經由IL-6R蛋白質而結合於井之待驗抗原結合分子之量，可藉由預先標記抗原結合分子而輕易測定。例如，經生物素標記之抗原結合分子，可藉由抗生物素蛋白過氧化酶接合體及適當基質測定。利用過氧化酶等酵素標記之交叉阻斷試 驗，尤其稱為彼此競爭ELISA試驗。抗原結合分子可以用能檢測或測定之其他標記物質予以標記。具體而言，放射標記或螢光標記等為公知。
比起於不存在候選之彼此競爭抗原結合分子組合體下實施之對照試驗中獲得之結合活性，彼此競爭抗原結合分子若能阻斷包含對抗IL-6R之抗原結合分域之待驗抗原結合分子之結合至少20%，較佳為至少20-50%，更佳為至少50%，則該待驗抗原結合分子係與彼此競爭抗原結合分子實質上結合於相同抗原決定部位，或對於相同抗原決定部位之結合為彼此競爭之抗原結合分子。
包含對抗IL-6R之抗原結合分域之待驗抗原結合分子所結合之抗原決定部位在鑑別結構時，待驗抗原結合分子與對照抗原結合分子共有抗原決定部位之情事，可藉由比較兩者之抗原結合分子對於構成該抗原決定部位之胜肽導入有胺基酸變異而成之胜肽之結合活性而予以評價。
如此測定結合活性之方法，例如可藉由比較前述ELISA格式中，待驗抗原結合分子及對照抗原結合分子對於導入有變異的線狀胜肽的結合活性而測定。就ELISA以外之方法而言，也可藉由將對於結合於管柱之該變異胜肽的結合活性，以使待驗抗原結合分子與對照抗原結合分子流下該管柱後溶出到溶出液中之抗原結合分子進行定量而測定。使變異胜肽例如與GST之融合胜肽吸附於管柱之方法為公知。
又，當鑑別的抗原決定部位為立體抗原決定部位時，待驗抗原結合分子與對照抗原結合分子共有抗原決定部位 之情事，可藉由以下方法評價。首先，製備表現IL-6R之細胞以及表現對於抗原決定部位導入有變異之IL-6R的細胞。對於該等細胞懸浮於PBS等適當緩衝液而成的細胞懸浮液添加待驗IL-6R與對照IL-6R。其次，對於經適當緩衝液洗滌的細胞懸浮液，添加能夠認識待驗IL-6R與對照IL-6R的經FITC標記的抗體。利用FACSCalibur(BD公司)測定由標記抗體染色之細胞之螢光強度及細胞數。將待驗IL-6R與對照IL-6R之濃度以適當緩衝液適當稀釋以製備為所望濃度後使用。例如可使用10μg/ml至10ng/ml之間的任一濃度。標記抗體對於該細胞之結合量，反映於使用CELL QUEST軟體(BD公司)解析所獲得之螢光強度，亦即幾何平均值。亦即藉由獲得該幾何平均值，可以測定以標記抗體之結合量所代表之待驗抗原結合分子與對照抗原結合分子之結合活性。
本方法中，例如「實質上不結合於變異IL-6R表現細胞」之情事，可藉由以下方法判斷。首先，將已對於表現變異IL-6R之細胞結合之待驗抗原結合分子與對照抗原結合分子以標記抗體染色。接著，檢測細胞之螢光強度。螢光檢測使用FACSCalibur當做流式細胞計數儀時，獲得之螢光強度可以使用CELL QUEST軟體解析。從多胜肽組合體存在下及非存在下之幾何平均值，將其比較值(△幾何平均)依下列計算式計算，可以求得抗原結合分子之結合所致之螢光強度之增加比例。
(式1)△幾何平均值=幾何平均值(多胜肽組合體存在下)/幾何 平均值(多胜肽組合體非存在下)
將由解析獲得之反映待驗抗原結合分子對於變異IL-6R表現細胞之結合量的幾何平均比較值(變異IL-6R分子△幾何平均值)，與反映待驗抗原結合分子對於IL-6R表現細胞之結合量的△幾何平均值比較值進行比較。於該情形，求取對於變異IL-6R表現細胞及IL-6R表現細胞之△幾何平均比較值時使用之待驗抗原結合分子之濃度調整為彼此相同或實質上為相同濃度尤佳。可利用預先確認認識IL-6R中之抗原決定部位的抗原結合分子當做對照抗原結合分子。
待驗抗原結合分子對於變異IL-6R表現細胞之△幾何平均比較值，若比起待驗抗原結合分子對於IL-6R表現細胞之△幾何平均比較值之至少80%、較佳為50%、更佳為30%、尤佳為15%還小，則判定為「實質上不結合於變異IL-6R表現細胞」。求取幾何平均值(Geometric Mean)之計算式，記載於CELL QUEST Software User’s Guide(BD biosciences公司)。若比較比較值而其實質上可視為相同之程度，則可評價待驗抗原結合分子與對照抗原結合分子之抗原決定部位為相同。
目標組織
本說明書中使用之用語「目標組織」，係指包含存在本發明之抗原結合分子因應低分子化合物濃度而結合之抗原的細胞的組織，且係該抗原結合分子對於表現於該細胞之膜型分子的結合、或對於該組織存在之可溶型分子之結合，對於含該組織之活體帶來正面藥理作用的組織。於此情形，「正面藥理作用」，是指對於含目標組織之病態部位對含該組織之活體帶來 的症狀的減輕、緩和、寛解、或治癒的作用。作為帶來如此藥理作用之一非限定機轉的態樣，例如：癌等惡性腫瘤帶來的症狀時，可列舉對於癌細胞之細胞傷害活性及增殖抑制及癌組織中之免疫活化等。作為如此的一非限定機轉的態樣，例如：發炎性病症時可列舉發炎組織中的發炎性細胞介素作用的阻隔活性、免疫抑制等。
癌組織專一的化合物
本說明書中使用之用語「癌組織專一的化合物(癌組織專一的化合物)」，係指相較於非癌組織，在癌組織中差別地存在的化合物。本說明書中，「癌」的用語一般用於代表惡性新生物，其可為轉移性或非轉移性。例如：消化道、皮膚等上皮組織發生的癌腫瘤的一非限定例，可列舉腦腫瘤、皮膚癌、頸頭部癌、食道癌、肺癌、胃癌、十二指腸癌、乳癌、前列腺癌、子宮頸癌、子宮體癌、胰臟癌、肝臟癌、大腸癌、結腸癌、膀胱癌、及卵巢癌等。又，肌肉等非上皮性組織(間質)發生的肉瘤的非限定例，可列舉骨肉瘤、軟骨肉瘤、橫紋肌肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、及血管肉瘤等。再者，造血器來源之血液癌之非限定例，可列舉包括霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)及非霍奇金氏淋巴瘤(non Hodgkin's lymphoma)之惡性淋巴瘤、包括急性(acute myelocytic leukemia)或慢性骨髓性白血病(chronic myelocytic leukemia)、及急性(acute lymphatic leukemia)或慢性淋巴性白血病(chronic lymphatic leukemia)之白血病、以及多發性骨髓瘤(multiple myeloma)。本說明書廣義地使用的「新生物」之用語，也意指新產生的各種病態組織腫 瘤。本發明中，新生物係以產生腫瘤形成，且其部分形成血管為特徵。新生物，例如：血管瘤、神經膠瘤、畸形瘤等良性瘤、或、例如：癌瘤、肉瘤、膠細胞瘤、星狀膠細胞瘤、神經芽細胞瘤、網膜芽瘤等惡性瘤。
用語「癌組織」係指含有至少一個癌細胞的組織。因此指例如癌組織含癌細胞與血管的方式，貢獻於含癌細胞及內皮細胞之腫瘤(tumor mass)形成的所有細胞型。本說明書中，腫瘤指腫瘤組織焦點(a foci of tumor tissue)。「腫瘤」之用語一般用於指良性新生物或惡性新生物。
例如：在一些實施形態中，癌組織專一的化合物，可為於癌組織存在但於非癌組織不存在、或於癌組織不存在但於非癌組織存在等定性的癌組織專一性規定的化合物。於另一實施形態，癌組織專一的化合物，可為相較於非癌組織以不同濃度(例如：高濃度或低濃度)存在於癌組織等定量上的癌組織專一性規定的化合物。例如：癌組織專一的化合物以任意濃度差別地存在。但是一般癌組織專一的化合物可增加到至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少100%、至少110%、至少120%、至少130%、至少140%、至少150%、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少103倍、至少104倍、至少105倍、至少106倍、或更多、最多無限大(亦即非癌組織不存在時)的濃度存在，或一般，以減少至至少5%、至少 10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少100%(亦即，代表不存在)的濃度存在。癌組織專一的化合物，以統計上顯著濃度(亦即，以使用Welch之t檢定或Wilcoxon之順位和檢定中任一者決定的p值小於0.05及/或q值小於0.10)，較佳為差別地存在。作為癌組織專一的化合物之一非限定態樣，可列舉如以下癌組織所含之癌細胞、免疫細胞、基質細胞特有的代謝活性所產生之癌組織專一的代謝產物(癌組織專一的代謝產物；癌細胞專一的代謝產物、浸潤於癌組織之免疫細胞專一的代謝產物、癌基質細胞專一的代謝產物)化合物。
本說明書中使用之用語「非天然化合物」，係指非天然來源之化學物質及其代謝物。作為發明之一態樣，係指從活體外對於活體內投予後，具累積在目標組織的性質的非天然來源的化學物質及其代謝物。非天然化合物可列舉(1)Capecitabine(Capecitabine(Xeloda))及其代謝物5-FU(fluorouracil)、及(2)TH-302與Bromo-Ifosfamide mustard(Br-IPM)等。5-FU為(capecitabine(Capecitabine(Xeloda))之代謝物，已知有癌組織專一的代謝酵素cytidine deaminase與thymidine phosphorylase代謝(Desmoulin F.et al.Drug Metab Dispos.2002)。又，TH-302，已知在如癌組織周邊，於低氧條件下還原而變換為Br-IPM(Duan JX,et al.J Med Chem.2008)。例如：若投予(capecitabine(capecitabine(xeloda))，會 被癌專一的代謝酵素等代謝為5-FU，故癌局部的5-FU的濃度提高(Desmoulin F.et al.Drug Metab Dispos.2002)，因此據認為可利用將5-FU作為開關之抗體，而只在癌局部選擇性結合於目標抗原。又，代謝酵素以外，據認為也可將於對癌專一的低氧環境、酸性環境下生成的分子作為開關。例如：TH-302(Duan JX,et al.J Med Chem.2008)在低氧條件下被代謝為Br-IPM，所以據認為可藉由以Br-IPM作為開關之抗體，而於癌局部選擇地結合於目標抗原。例如：作為將非天然化合物對於活體投予之方法，可列舉經口投予、點眼投予、經皮投予、經鼻投予、經靜脈投予、經肺投予等公知投予方法，但不限定於此等。
本說明書中使用之用語「非天然化合物」之另一態樣，也包括帶有在目標組織累積之性質之化學物質及其代謝物，除此以外也包括藉由將成為開關之非天然化合物利用例如經口投予，而使抗體作用成為能以經口劑之服用控制的化學物質等。亦即，將某能以經口等非侵入投予之非天然化合物作為開關，將對於某抗原呈結合性的開關抗體事先進行靜脈內或皮下投予等侵入投予，並能藉由將成為開關之外來性化合物以經口等非侵入投予，以控制抗體作用之化學物質等。如此的化合物質，例如ATPγS、犬尿胺酸代謝物等，但不限定於此。
抗體醫藥因半減期長，會有產生副作用時，此作用持續的缺點，但若能以如上方式將抗體作用利用將非天然化合物經口等非侵入投予以控制，則產生副作用時可藉由停止開關分子投予以中止藥作用。又，可藉由預先投予開關抗體，而只於因 病症產生症狀時投予開關分子，只在必要時進行經口等非侵入投予以發揮藥理作用。
本發明中，「因應非天然化合物之濃度而改變對抗原之結合活性之含有抗原結合分域之抗原結合分子」，當對於活體投予時可帶來正面藥理作用。
癌組織專一的代謝產物
用語「代謝」係指於生物組織內產生的化學變化，包括「同化」及「異化」。同化係指分子之生合成或蓄積，異化係指分子之分解。「代謝產物」係指起因於物質代謝之中間體或產物。「一次代謝產物」係指直接相關於細胞或生物之成長或繁殖過程的代謝產物，「二次代謝產物」係指未和此等之成長或繁殖過程直接相關，產生未直接涉及細胞或生物共通之生命現象的物質的代謝之結果所生成的抗生物質、色素等生產物。代謝產物也可為「活體高分子」之代謝產物，也可為「低分子」之代謝產物。「活體高分子」為由1種以上之重複單元構成的高分子。活體高分子一般在生物系發現，為組織生物的細胞及於其附著之細胞間基質、組織間基質等形成結構物之分子量約5000以上之分子，尤其多糖類(碳水化物等)及胜肽(此用語係以包括多胜肽及蛋白質的方式使用)及多核苷酸，同樣地，可列舉此等的類似體，例如胺基酸類似體或由非胺基酸基構成或含此等的化合物。
本說明書中使用之用語「低分子」係指於存在活體之「活體高分子」以外的天然來源的化學物質或非天然來源的化學物質。較佳為目標組織專一的化合物或非天然化合物， 但不限定於此。本說明書記載之一非限定態樣之癌組織專一的代謝產物，可列舉癌細胞專一的低分子代謝產物(Eva Gottfried,Katrin Peter and Marina P.Kreutz,From Molecular to Modular Tumor Therapy(2010)3(2),111-132)。進一步，也包括於浸潤於癌組織之免疫細胞高量產生的代謝產物、支持癌細胞生存及/或成長之基質細胞(癌基質細胞或癌間質纖維母細胞(CAF))高量產生的代謝產物。作為浸潤之免疫細胞，可列舉樹狀細胞、抑制性樹狀細胞、抑制性T細胞、疲弊T細胞(exhausted T cell)、骨髓系來源抑制細胞(myeloma derived suppressor cell、MDSC)等。又，本發明中，代謝產物包括於癌組織存在之細胞(癌細胞、免疫細胞、基質細胞)，也包括因細胞凋零、壞死等而細胞死時從細胞內向細胞外釋放的化合物。
為了鑑別癌細胞專一的代謝產物，可適當使用轉錄物層級之解析、(例如：Dhanasekaran等(Nature(2001)412,822-826)、Lapointe等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2004)101,811-816或Perou等人(Nature(2000)406,747-752等)或蛋白質組(proteome)層級之解析(例如：Ahram等人(Mol.Carcinog.(2002)33,9-15、Hood等人(Mol.Cell.Proteomics(2005)4,1741-1753)，此外可適當使用以代謝學的變化為中心之代謝學(Metabolomics)解析。亦即，為了鑑別待驗試樣中之代謝產物，可適當使用單獨或組合使用高壓液體層析(HPLC)、核磁共振(NMR)(Brindle等人(J.Mol.Recognit.(1997)10,182-187)、質量分析法(Gates及Sweeley(Clin.Chem.(1978)24,1663-1673)(GC/MS及LC/MS))及ELISA等之代謝學的曲線變 化(profiling)。
由該等研究已了解癌細胞可在低氧壓條件下生長之代謝產物(例如葡萄糖或氧)及生長因子之濃度梯度改變而構成之腫瘤內之異質性(Dang及Semenza(Trends Biochem.Sci.(1999)24,68-72))。該等研究中，為了理解腫瘤惡性度之不同程度所致能量利用路徑之變化，也使用細胞株模型(Vizan等人(Cancer Res.(2005)65,5512-5515)。代謝學平台之技術構成要素之非限定態樣，可列舉Lawton等人(Pharmacogenomics(2008)9,383)記載之試樣萃取、分離、檢測、分光分析、數據正規化、類別專一的代謝產物之描寫、路徑輿圖、確認、及候選代謝產物之功能性特徵附加。利用該等方法可鑑別所望之癌組織之癌細胞專一的代謝產物。
本發明使用之癌組織專一的化合物、或癌組織專一的代謝產物之非限定態樣，可列舉從以下化合物選擇之至少一種化合物。至少一種化合物，包括後述相同抗原結合分域對於抗原之結合活性係依存於一種癌組織專一的化合物、或依存癌組織專一的代謝產物，此外也包含依存複數個種類之癌組織專一的化合物、或癌組織專一的代謝產物之情況。
(1)乳酸、琥珀酸、檸檬酸等解糖系、或克氏循環之一次代謝產物
本發明使用之癌組織專一的化合物，尤其癌細胞專一的代謝產物之非限定態樣，可列舉乳酸、琥珀酸、檸檬酸等的比起在周圍存在之非癌部組織，於癌組織以較高濃度存在之葡萄糖代謝之結果生成之一次代謝產物為理想例。丙酮酸激酶、己糖 激酶、及乳酸脫氫酵素(LDH)等解糖系(Embden-Myerhof路徑)酵素之上方調節(upregulation)為特徵之解糖系表現型，自以往已知就Warburg效果而言，為固體腫瘤之特徵。
亦即，腫瘤細胞中，非M1構造同型，而是於嫌氣條件下對於解糖(erobic glycolysis)為必要之M2構造同型之丙酮酸激酶高表現據認為活體內對於腫瘤細胞之生長有利(Christofk等人(Nature(2008)452,230-233)。利用丙酮酸激酶生成之丙酮酸，於嫌氣條件下會受到因乳酸脫氫酵素(LDH)之平衡反應結果生成之乳酸所為之反饋抑制。由於該反饋抑制，會促進粒腺體之呼吸(克氏循環)、及抑制細胞增殖，所以被人稱為LDH、己糖激酶、及葡萄糖運送蛋白(GLUT)之上方調節對於腫瘤細胞增殖發揮重要作用(Fantin等人(Cancer Cell(2006)9,425-434))。葡萄糖由解糖系代謝，其最終代謝產物乳酸於腫瘤之周圍與質子一起共輸送之結果，被認為腫瘤之周邊組織之pH會變成酸性條件。解糖系之最終產物乳酸、粒腺體之呼吸促進而生成之琥珀酸及檸檬酸，已知會堆積在癌組織(Teresa等人(Mol.Cancer(2009)8,41-59))。本發明使用之癌組織專一的化合物，尤其癌細胞專一的代謝產物之非限定態樣，可列舉如此之由解糖系之代謝生成之一次代謝產物即乳酸、琥珀酸、檸檬酸等。又，已知因細胞死會使細胞內高濃度存在之琥珀酸往細胞外漏出(Nature Immunology,(2008)9,1261-1269)。所以據認為細胞死頻繁發生的癌組織中，琥珀酸之濃度上昇。
(2)丙胺酸、麩胺酸、天冬胺酸等胺基酸
上述葡萄糖代謝以外，也已知嫌氣條件下須要連續供給對於活體高分子之生合成為必要之必須胺基酸及非必須胺基酸之腫瘤細胞中，胺基酸代謝也會變化。據稱：麩醯胺酸作為在其側鏈包括二個氮之氮運搬體，係於活體最廣泛分布之胺基酸。攝入麩醯胺酸到細胞內之速度上昇之腫瘤細胞，據稱作為麩醯胺酸捕集器(glutamine trap)的功能。如此之麩醯胺酸之攝入及變換為麩胺酸及乳酸之活性之上昇，稱為「麩醯胺酸分解(glutaminolysis)」，被認為是已轉形之(腫瘤)細胞之特徵(Mazurek及Eigenbrodt(Anticancer Res.(2003)23,1149-1154、以及Mazurek等人(J.Cell.Physiol.(1999)181,136-146))。其結果，癌患者血漿中之麩醯胺酸水平減少，但麩胺酸濃度增大(Droge等人(Immunobiology(1987)174,473-479)。並且，利用肺癌組織之經13C放射標記之葡萄糖之代謝研究，觀察到13C標記琥珀酸、13C標記丙胺酸、13C標記麩胺酸、及13C標記檸檬酸之濃度間有相關。本發明使用之癌組織專一的化合物之非限定態樣中，如此之由於麩醯胺酸分解等而在癌組織以高濃度堆積之丙胺酸、麩胺酸、天冬胺酸等為理想例。
(3)犬尿胺酸(kyneurine)等胺基酸之代謝產物
吲哚胺2,3-二氧合酶(IDO)，係黑色素瘤、結腸癌、及腎臟癌等許多癌中為高表現之色胺酸代謝酵素(Uyttenhove等人(Nat.Med.(2003)9,1269-127)，已知有二種構造同型存在(L0b等人(CancerImmunol.Immunother.(2009)58,153-157))。IDO係催化色胺酸變換為犬尿胺酸(化1表示之)，且為菸鹼醯 胺核苷酸(NAD)之新生路徑之最初之酵素。又，在不表現IDO之腦膠質瘤，利用肝臟之色胺酸2,3-二氧合酶(TDO)，從色胺酸生成犬尿胺酸(Opitz等人(Nature(2011)478,7368,197-203))。又，IDO在於癌組織浸潤之樹狀細胞也會表現，樹狀細胞也產生犬尿胺酸(J.Immunol.(2008)181,5396-5404)。又，IDO也會在癌組織之骨髓系來源抑制細胞(MDSC)表現，MDSC也產生犬尿胺酸(Yu等人(J.Immunol.(2013)190,3783-3797))。
犬尿胺酸已知會抑制同種T細胞回應(Frumento等人(J.Exp.Med.(2002)196,459-468)，有人提倡藉由如此之抑制，腫瘤細胞潛行通過抗腫瘤免疫回應，且藉由犬尿胺酸作用在腦膠質瘤表現之烯丙基烴受體之內因性配體之自泌增殖機構，促進腦膠質瘤細胞之增殖(Opitz等人(上揭))。犬尿胺酸係由犬尿胺酸酶變換為鄰胺苯甲酸(anthranilic acid)([化2]表示)，並由犬尿胺酸3-脫羧酶變換為3-羥基犬尿胺酸([化3]表示)。鄰胺苯甲酸(anthranilic acid)、及3-羥基犬尿胺酸，均變換為成為NAD之前驅體之3-羥基鄰胺苯甲酸(anthranilic acid)。
犬尿胺酸，由於犬尿胺酸胺基轉移酶變換為犬尿喹啉酸(Kynurenic acid)([化4]表示)。本發明使用之癌組織專一的化合物，尤其癌細胞專一的代謝產物之非限定態樣，可列舉如此之犬尿胺酸、及其代謝產物、鄰胺苯甲酸(anthranilic acid)、3-羥基犬尿胺酸、及犬尿喹啉酸等胺基酸之代謝產物為理想例。
(4)前列腺素E2(Prostaglandin E2)等花生四烯酸之代謝產物
前列腺素E2(PGE2)([化5])，係包括由環氧合酶(COX)-1/2 合成之前列腺素及前列凝素(Thromboxane)之稱為前列腺素類(prostanoid)之花生四烯酸之代謝物(Warner及Mitchell(FASEB J.(2004)18,790-804))。促進PGE2結腸癌細胞之增殖，並抑制其細胞凋零(apoptosis)(Sheng等人(Cancer Res.(1998)58,362-366))。已知許多癌細胞中，環氧合酶之表現改變。亦即，COX-1在幾乎所有組織中以結構性表現，相對於此，COX-2主要於腫瘤因某種發炎性細胞激素及癌基因誘導發現(Warner及Mitchell(前掲))。COX-2之過量表現，據報告與乳癌之預後惡度(Denkert等人(Clin.Breast Cancer(2004)4,428-433)、及卵巢癌急速疾病進行(Denker等人(Mod.Pathol.(2006)19,1261-1269)有關連性。又，於癌組織浸潤之抑制性T細胞也產生前列腺素E2(Curr.Med.Chem.(2011)18,5217-5223)。花生四烯酸之代謝物之前列腺素、白三烯等低分子已知作為控制癌之自泌、及/或旁泌增殖之刺激因子(Nat.Rev.Cancer(2012)12(11)782-792)。本發明使用之癌組織專一的化合物，尤其癌細胞專一的代謝產物或於癌組織浸潤之免疫細胞專一的代謝物之一非限定態樣，可列舉如此之前列腺素E2等花生四烯酸之代謝產物為理想例。前列腺素E2以外，Thromboxane A2(TXA2)在大腸癌等癌組織的產生有增加(J.Lab.Clin.Med.(1993)122,518-523)，可列舉為本發明之花生四烯酸之代謝產物之一非限定態樣。
【化5】
(5)腺苷、腺苷3磷酸(ATP)、腺苷2磷酸(ADP)、腺苷1磷酸(AMP)等具嘌呤環結構之核苷
癌細胞已知若死亡，會有細胞內大量之ATP往細胞外漏出。所以，癌組織之ATP濃度，比正常組織顯著較高(PLoS One.(2008)3,e2599)。複數個類型的細胞會將ATP、ADP及AMP型之腺核苷酸游離。會由細胞外-5'-核苷酸酶(eco-5'-nucleotidase)(CD73)之類之細胞表面之細胞外酵素代謝(Resta及Thompson(Immunol.Rev.(1998)161,95-109)以及Sadej等人(Melanoma Res.(2006)16,213-222)。腺苷係低濃度且於細胞外環境以結構性存在之嘌呤核苷，但據報告固體癌發現的低氧組織中，細胞外腺苷濃度顯著增加(Blay及Hoskin(Cancer Res.(1997)57,2602-2605)。CD73在腫瘤及免疫細胞之表面表現(Kobie等人(J.Immunol.(2006)177,6780-6786)，於乳癌(Canbolat等人(Breast Cancer Res.Treat.(1996)37,189-193)、胃癌(Durak等人(Cancer Lett.(1994)84,199-202)、胰臟癌(Flocke及Mannherz(Biochim.Biophys.Acta(1991)1076,273-281)及膠質母細胞瘤(Bardot等人(Br.J.Cancer(1994)70,212-218))發現活性上昇。腺苷在癌組織堆積，有人認為係因細胞質由於5'-核苷酸酶造成AMP之脫磷 酸，而使細胞內腺苷生成增加所引起(Headrick及Willis(Biochem.J.(1989)261,541-550)。又，於癌組織浸潤之抑制性T細胞等也表現ATP分解酵素，並產生腺苷(Proc.Natl.Acad.Sci.(2006)103(35),13132-13137、Curr.Med.Chem.(2011)18,5217-5223)。產生之腺苷，據認為經由A2A受體等腺苷受體使癌組織成為受免疫抑制之環境(Curr.Med.Chem.(2011),18,5217-23)。本發明使用之癌組織專一的化合物之非限定態樣，如此因ATP等嘌呤核苷酸之代謝造成於癌組織以高濃度堆積之ATP、ADP、AMP、或腺苷等為理想例。又，因腺苷會被腺苷去胺基酶(adenosine deaminase)分解成肌苷，故肌苷以高濃度堆積。
(6)尿酸
尿酸係活體內，嘌呤核苷之代謝路徑之產物，於血液或間質腔等細胞外游離。又，近年已知癌組織等病變部位存在之死細胞會游離出尿酸(Nat.Med.(2007)13,851-856)。本發明使用之癌組織專一的化合物之非限定態樣中，如此之因ATP等嘌呤核苷酸之代謝而於癌組織以高濃度堆積之尿酸，亦為理想例。
(7)1-甲基菸鹼醯胺
複數個人類癌組織中，已知酵素菸鹼醯胺N-甲基轉移酶為高表現。本酵素當從菸鹼醯胺產生安定代謝物即1-甲基菸鹼醯胺時，因為會消耗成為甲基提供體之S-腺苷甲硫胺酸(SAM)之甲基，有人認為由於癌細胞之SAM濃度減少所伴隨之DNA之甲基化能力減損之機構，使菸鹼醯胺N-甲基轉移酶之高表 現會幫助腫瘤化(tumorigenesis)(Ulanovskaya等人(Nat.Chem.Biol.(2013)9(5)300-306))。本酵素之安定代謝產物1-甲基菸鹼醯胺，已知會分泌到癌細胞之細胞外(Yamada等人(J.Nutr.Sci.Vitaminol.(2010)56,83-86))，本發明使用之癌組織專一的化合物之非限定之態樣，可列舉如此之因菸鹼醯胺之代謝而於癌組織以高濃度堆積之1-甲基菸鹼醯胺等為理想例。
發炎組織專一的化合物
本說明書中使用之用語「發炎組織專一性的化合物(發炎組織專一的化合物)」，係比起非發炎組織，於發炎組織中差別存在之化合物。本說明書中，「發炎組織」，可列舉如下等為理想例：
．類風濕關節炎或退化性關節炎之關節
．支氣管氣喘或COPD之肺(肺泡)
．發炎性腸疾病或克羅病或潰瘍性大腸炎之消化器官
．肝臟、腎臟、肺之纖維化症之纖維化組織
．臟器移植時發生排斥反應之組織
．動脈硬化或心衰竭之血管、心臟(心肌)
．代謝症候群之內臟脂肪
．異位性皮膚炎等皮膚炎之皮膚組織
．椎間板脫出或慢性腰痛之脊髓神經。
發炎組織專一的代謝產物
發炎組織專一的代謝產物，係指於發炎性組織浸潤之免疫細胞高量產生之代謝產物、及於發炎組織中受傷害之正常細胞專一的高量產生之代謝產物。浸潤之免疫細胞，可舉效應子T 細胞、成熟樹狀細胞、嗜中球、顆粒細胞(肥胖細胞)、嗜鹼球等。又，本發明中，代謝產物也包括發炎組織存在之細胞(免疫細胞、正常細胞)由於細胞凋零或壞死等而死亡時，從細胞內往細胞外放出之化合物。
本發明使用之發炎組織專一的化合物、或發炎組織專一的代謝產物之非限定之態樣，可列舉從以下化合物選擇之至少一種化合物為宜。至少一種化合物，包括指後述相同抗原結合分域所致對於抗原之結合活性，係依存於一種發炎組織專一的化合物、或發炎組織專一的代謝產物，此外，也包括依存於複數個種類之發炎組織專一的化合物、或發炎組織專一的代謝產物的情況。
(1)前列腺素E2(Prostaglandin E2)等花生四烯酸之代謝產物
類風濕關節炎或退化性關節炎，已知PGE2濃度高(Eur.J.Clin.Pharmacol.(1994)46,3-7.、Clin.Exp.Rheumatol.(1999)17,151-160、Am.J.Vet.Res.(2004)65,1269-1275.)。本發明使用之發炎組織專一的化合物，尤其發炎細胞專一的代謝產物或於發炎組織浸潤之免疫細胞專一的代謝物之非限定之態樣，可列舉如此之前列腺素E2等花生四烯酸之代謝產物為理想例。
(2)腺苷、腺苷3磷酸(ATP)、腺苷2磷酸(ADP)、腺苷1磷酸(AMP)等具嘌呤環結構之核苷
發生支氣管氣喘引起之發炎的肺泡中，已知ATP濃度高(Nat.Med.(2007)13,913-919)。又，發生COPD引起之發炎之 肺泡中，已知ATP濃度為高(Am.J.Respir.Crit.Care Med.(2010)181,928-934)。又，類風濕關節炎患者之關節液中，觀察到腺苷濃度為高(Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis(2004)36877-882)。又，在因GVHD引起排斥反應之組織中，已知ATP濃度為高(Nat.Med.(2010)16,1434-1438)。又，已知肺、肝臟、腎臟之纖維化組織，腺苷濃度增加(FASEB J.(2008)22,2263-2272、J.Immunol.(2006)176,4449-4458、J.Am.Soc.Nephrol.(2011)22(5),890-901、PLoS ONE J.(2010)5(2),e9242)。又，在肺纖維症患者之纖維化組織，觀察到ATP濃度為上昇(Am.J.Respir.Crit.Care Med.(2010)182,774-783)。本發明使用之發炎性組織專一的化合物之非限定之態樣，可列舉如此之因ATP等嘌呤核苷酸之代謝而於發炎組織以高濃度堆積之ATP、ADP、AMP、或腺苷等為理想例。又，腺苷因adenosine deaminase分解為肌苷，故肌苷以高濃度堆積。
(3)尿酸
尿酸係於活體內之嘌呤核苷之代謝路徑之產物，在血液或間質腔等細胞外游離。又，近年已知從壞死(necrosis)進行之細胞游離的尿酸，會促進發炎性回應(J.Clin.Invest.(2010)120(6),1939-1949)。本發明使用之發炎組織專一的化合物之非限定之態樣，可列舉如此之因ATP等嘌呤核苷酸之代謝而於發炎性組織以高濃度堆積之尿酸為理想例。
抗原結合分域
本說明書中，「抗原結合分域」只要能結合於目的之抗原 則可使用任意構造之分域。如此的分域，例如：抗體之重鏈及輕鏈之可變區、存在於活體內之細胞膜蛋白質Avimer所含之約35個胺基酸之稱為A分域之模組(WO2004/044011、WO2005/040229)、包含於細胞膜表現之糖蛋白質fibronectin中之蛋白質所結合之域10Fn3分域之Adnectin(WO2002/032925)、以構成由ProteinA之58個胺基酸構成的3個螺旋束(bundle)的IgG結合分域為支架(scaffold)的Affibody(WO1995/001937)、具含33個胺基酸殘基之轉彎(turn)與2個反向並行之螺旋以及迴圈的次單元返覆層疊的構造的ankyrin返覆(ankyrin repeat：AR)之分子表面所露出之區DARPins(Designed Ankyrin Repeat proteins)(WO2002/020565)、將嗜中性球明膠酶結合lipocalin(neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL))等lipocalin分子中高度保守的8個反向並行的股中央方向扭曲成的活塞桶(barrel)構造的單側予以支撐的4個迴圈區Anticalin等(WO2003/029462)、就八目鰻、沼田鰻等無顎類之獲得免疫系統而言不具免疫球蛋白之構造的可變性淋巴球受體(variable lymphocyte receptor(VLR))之富含白胺酸殘基之返覆(leucine-rich-repeat(LRR))模組返覆疊層而獲得之馬蹄形構造之內部之平行型片構造之中空區(WO2008/016854)為佳。
本發明之抗原結合分域之較佳例，例如含抗體之重鏈及輕鏈之可變區的抗原結合分域。如此的抗原結合分域，例如「scFv(single chain Fv)」、「單鏈抗體(single chain antibody)」、「Fv」、「scFv2(single chain Fv 2)」、「Fab」或「F(ab')2」等為 較佳。
本發明之抗原結合分子中，抗原結合分域可以結合於相同的抗原決定部位。在此，相同之抗原決定部位可存在於由例如：序列編號：1記載之胺基酸序列構成的蛋白質中。或，本發明之抗原結合分子中，抗原結合分域可以結合於彼此不同的抗原決定部位。在此，不同的抗原決定部位，可存在於由例如：序列編號：1記載之胺基酸序列構成的蛋白質中。
專一性
專一性，係指專一性結合之分子的其中一分子對於其結合之一或複數個之對手分子以外之分子為實質上不結合之狀態。又，抗原結合分域對於某抗原中含有複數個抗原決定部位中之特定之抗原決定部位為專一的情形也可使用。又，抗原結合分域所結合之抗原決定部位係含於複數個不同抗原之情形，具有該抗原結合分域之抗原結合分子可與包含該抗原決定部位之各種抗原結合。在此，實質上不結合，係依如前述結合活性之項目所記載之方法決定，指對於該對手方之分子以外之分子之結合活性為對手方之分子之結合活性之80%以下，通常50%以下，較佳為30%以下，尤佳為15%以下。
細胞傷害活性
本發明之一非限定態樣中，提供包括因應低分子化合物(例如：癌組織專一的化合物、發炎組織專一的化合物、或此等之代謝物)之濃度而改變對抗原之結合活性之抗原結合分域，且對於膜型分子表現於其細胞膜之細胞有細胞傷害活性之抗原結合分子、及包含該抗原結合分子作為有效成分之醫藥組合 物。本發明中，細胞傷害活性，例如抗體依存性細胞媒介性細胞傷害(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity：ADCC)活性、補體依存性細胞傷害(complement-dependent cytotoxicity：CDC)活性及由於T細胞所致的細胞傷害活性等。本發明中，CDC活性係指利用補體系之細胞傷害活性。另一方面，ADCC活性係指包括於目標細胞之細胞膜表現之膜型分子所結合之抗原結合分域之抗原結合分子之Fc區，經由免疫細胞等由該免疫細胞表現之Fcγ受體中介而結合且該免疫細胞對於目標細胞造成傷害之活性。目的抗原結合分子是否有ADCC活性，或是否有CDC活性，可依公知方法測得(例如Current protocols in Immunology,Chapter7.Immunologic studies in humans、Coligan等人編(1993)等)。
具體而言，首先製備效應子細胞、補體溶液、目標細胞。
(1)效應子細胞之製備
從CBA/N小鼠等摘出之脾臓，在RPMI1640培養基(Invitrogen)中將脾臓細胞分離。以含10%胎牛血清(FBS、HyClone)之同培養基洗滌過的該脾臓細胞之濃度調整為5×106/ml，可製備效應子細胞。
(2)補體溶液之製備
以含10% FBS之培養基(Invitrogen)將Baby Rabbit Complement(CEDARLANE)稀釋為10倍，可製備補體溶液。
(3)目標細胞之製備
將表現抗原之細胞與0.2 mCi之51Cr-鉻酸鈉 (GEhealthcare bioscience)一起在含10% FBS之DMEM培養基中，於37℃培養1小時，將該目標細胞做放射性標記。放射性標記後，以含10% FBS之RPMI1640培養基洗滌3次後的細胞濃度調整為2×105/ml，可製備該目標細胞。
ADCC活性、或CDC活性依下列所述方法測定。測定ADCC活性的情形，在加到96井U底板(Becton Dickinson)各50μl的目標細胞與抗原結合分子在室溫反應15分鐘。之後，將加有效應子細胞100μl之該板在二氧化碳培養箱內靜置4小時。抗體之終濃度可設為例如0或10μg/ml等的濃度。靜置後，使用gamma計數器(COBRAII AUTO-GAMMA、MODEL D5005、Packard Instrument Company)測定從各井回收的100μl上清的放射活性。使用測定值依(A-C)/(B-C)x 100之計算式可計算細胞傷害活性(%)。A係表示在各試樣之放射活性(cpm)、B係表示在加有1% NP-40(nacalai tesque)之試樣之放射活性(cpm)、C係表示在僅含目標細胞之試樣之放射活性(cpm)。
另一方面，測定CDC活性的情形，係將在96井平底板(Becton Dickinson)加入的各50μl的目標細胞與抗原結合分子加在冰上反應15分鐘。之後，將加有補體溶液100μl之該板於二氧化碳培養箱靜置4小時。抗體之終濃度可設為例如0或3μg/ml等濃度。靜置後使用gamma計數器測定從各井回收之100μl之上清之放射活性。細胞傷害活性與ADCC活性測定以同樣方式可計算。
又，後述化學療法劑、毒性胜肽或放射性化學物 質等細胞傷害性物質結合之修飾抗原結合分子修飾物，也可理想地作為本發明之具細胞傷害活性之抗原結合分子使用。如此之修飾抗原結合分子(以下稱為抗原結合分子藥物接合物)，可藉由將獲得之抗原結合分子進行化學性修飾以取得。又，作為抗原結合分子之修飾方法，可適當使用於抗體藥物接合物等的領域已確立的方法。又，有毒性胜肽結合之修飾抗原結合分子，可藉由將編碼為該毒性胜肽之基因與編碼為本發明之抗原結合分子之基因於讀框內連結而得之融合基因於適當寄主細胞中表現後，從該細胞之培養液單離以取得。
中和活性
本發明之一非限定態樣中，提供包括因應低分子化合物(例如：癌組織專一的化合物、發炎組織專一的化合物、此等之代謝物等)之濃度而改變對於抗原之結合活性的抗原結合分域且該對於膜型分子具有中和活性之抗原結合分子為有效成分之誘導免疫回應之醫藥組合物。本發明之一另外的非限定態樣中，提供包括因應低分子化合物(例如：癌組織專一的化合物、發炎組織專一的化合物、此等之代謝物等)濃度而改變對於抗原之結合活性之抗原結合分域且對於膜型分子係表現於其細胞膜之細胞顯示細胞傷害活性，此外對於該膜型分子有中和活性之作為抗原結合分子有效成分之誘導免疫回應之醫藥組合物。一般而言，中和活性係指抑制病毒或毒素等對細胞有生物學活性之配體之該生物學活性之活性。亦即，有中和活性之物質，係指結合於該配體或該配體所結合之受體，並抑制該配體與受體之結合之物質。利用中和活性使與配體結合受抑制之受 體，不能發揮經由該受體媒介之生物學活性。具有如此之中和活性之抗體，一般稱為中和抗體。該中和活性，係藉由將在成為對象的配體存在下其生物學活性在待驗物質存在或非存在下之條件之間比較而測定。
例如，作為IL-6受體之主要配體考量者，以序列編號：27表示之IL-6為理想例。其胺基末端形成細胞外分域之I型膜蛋白質IL-6受體，會與因IL-6而誘導二聚物化之gp 130受體一起形成異四聚物(HEINRICH等人(Biochem.J.(1998)334,297-314))。由於該異四聚物之形成，組合於gp130受體之Jak活化。Jak進行自磷酸化及受體之磷酸化。受體及Jak之磷酸化部位，對於屬於如Stat3之有SH2之Stat家族之分子、或MAP激酶、PI3/Akt、其他具SH2之蛋白質或適應子(adaptor)，發揮結合部位之作用。其次，結合於gp130受體之Stat由於Jak而磷酸化。經磷酸化之Stat形成二聚物並移到核內，調整目標基因之轉錄。Jak或Stat經由其他類別之受體而涉及信號的串流。脫離控制的IL-6之信號串流，會觀察到自體免疫疾病之病態或發炎、多發性骨髓癌或前列腺癌等癌。能作為癌基因之Stat3，在許多癌中係持續地被活化。前列腺癌與多發性骨髓瘤中，來自IL-6受體之信號串流與來自上皮成長因子受體(EGFR)家族成員之信號串流之間有串音(crosstalk)(Ishikawa等人(J.Clin.Exp.Hematopathol.(2006)46(2),55-66))。
如此之細胞內之信號串流對每一細胞種類不同，可因應目的目標細胞適當設定目標分子，不限定於上述因子。 藉由測定活體內信號之活化，可評價中和活性。又，以對於存在活體內信號串流之下游的目標基因的轉錄誘導作用作為指標，可檢測活體內信號之活化。目標基因之轉錄活性之改變，可利用報告子試驗法的原理檢測。具體而言，在目標基因之轉錄因子或起動子區之下游配置GFP(Green Fluorescence Protein)或發光酶等報告子基因，並測定其報告子活性，可就轉錄活性之改變測定作為報告子活性。活體內信號活化之測定套組，也可適當使用市售品(例如，Mercury Pathway Profiling Luciferase System(Clontech)等)。
再者，通常就測定作用於促進細胞增殖之方向之作用於信號串流的EGF受體家族等受體配體之中和活性之方法而言，可藉由測定目標細胞之增殖活性而評價中和抗體之中和活性。例如，就抗HB-EGF抗體基於中和活性對於例如HB-EGF等其增殖受EGF家族之成長因子而促進之細胞增殖之抑制效果予以評價或測定之方法而言，可理想地使用以下方法。在試管內評價或測定該細胞增殖抑制活性之方法，可使用測定培養基中添加之[3H]標記胸腺嘧啶由活細胞之攝入作為DNA複製能力指目標方法。就更簡便的方法，有於顯微鏡下計測將trypan blue等色素排除到細胞外之能力的色素排除法、或MTT法。後者係利用活細胞有將四唑鎓鹽MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)轉換為藍色的formazan產物的能力。更具體而言，在待驗細胞的培養液中同時加入配體及待驗抗體並經過一定時間後，將MTT溶液加入培養液並靜置一定時間以使細胞攝入 MTT。其結果黃色化合物MTT由於細胞內之粒腺體內的琥珀酸脫氫酵素而變換為藍色的化合物。使該藍色生成物溶解並呈色後測定其吸光度，作為活細胞數的指標。MTT以外，也有MTS、XTT、WST-1、WST-8等試藥有市售(nacalai tesque等)，可理想地使用。活性測定時，作為對照抗體，將與抗HB-EGF抗體有相同之構造同型之抗體且不具有該細胞增殖抑制活性之結合抗體與抗HB-EGF抗體同樣地使用，藉由抗HB-EGF抗體顯示比對照抗體強的細胞增殖抑制活性，可判定活性。
用於評價活性之細胞，例如其增殖受HB-EGF促進之細胞，例如卵巢癌細胞RMG-1細胞株、經利用將以編碼為人類EGFR之細胞外分域與小鼠GCSF受體之細胞內分域於同一讀框融合而得之融合蛋白質hEGFR/mG-CSFR之基因表現之方式結合之載體轉形之小鼠Ba/F3細胞等可理想地使用。如此，該技術領域中具有通常知識者可適當選擇用於評價活性之細胞而使用於測定前述細胞增殖活性。
抗體
本說明書中，抗體係指天然者或部分或完全合成所製造之免疫球蛋白。抗體可從其天然存在之血漿或血清等天然資源或產生抗體之融合瘤細胞之培養上清單離，或可使用基因重組等方法部分或完全合成。抗體例如免疫球蛋白之構造同型(isotype)及此等構造同型之次類(subclass)為較佳例。人類免疫球蛋白已知有IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgM9種類型(構造同型)。本發明之抗體在該等構造同型之中，可含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。人類IgG1、人類IgG2、 人類IgG3、人類IgG4抗體之不變區，由於基因多型而致之複數個副型序列記載於Sequences of proteins of immunological interest,NIH Publication No.91-3242，但本發明可為其中任一者。尤其人類IgG1之序列，可為EU編號356-358號之胺基酸序列為DEL，也可為EEM。又，就人類Igκ(Kappa)不變區與人類Igλ(Lambda)不變區而言，由於基因多型而致之複數個副型序列記載於Sequences of proteins of immunological interest,NIH Publication No.91-3242，但本發明可為其中任一者。
製作具有所望結合活性之抗體之方法於該技術領域之具有通常知識者為公知。以下列舉製作與IL-6結合之抗體(抗IL-6R抗體)之方法。與IL-6R以外之抗原結合的抗體也可依據下列例示適當製作。
抗IL-6R抗體可使用公眾所知方法以多株或單株抗體之形式取得。抗IL-6R抗體，宜製作哺乳動物來源的單株抗體。哺乳動物來源的單株抗體，包含由融合瘤產生者，及由基因工程的方法以含抗體基因之表現載體轉形而得之寄主細胞所產生者等。本發明之單株抗體包括「人類化抗體」或「嵌合抗體」。
單株抗體產生融合瘤，可使用公知技術依例如以下方式製作。亦即，使用IL-6R蛋白質當做感作抗原，依通常之免疫方法將哺乳動物免疫。將獲得之免疫細胞以通常的細胞融合法與公知之親代細胞融合。其次依照通常之篩選法，篩選單株抗體產生細胞，可選擇產生抗IL-6R抗體之融合瘤。
具體而言，單株抗體之製作係依例如以下所示方 式實行。首先，藉由表現在序列編號：2揭示其核苷酸序列之IL-6R基因，取得當做抗體取得之感作抗原使用的以序列編號：1表示的IL-6R蛋白質。亦即，藉由將編碼為IL-6R之基因序列插入公知之表現載體，而將適當的寄主細胞轉形。從該寄主細胞中或培養上清中以公知方法精製所望之人類IL-6R蛋白質。為了從培養上清中取得可溶型之IL-6R，例如可使Mullberg等人(J.Immunol.(1994)152(10),4958-4968)記載之序列編號：1表示之可溶型IL-6R多胜肽序列當中1至357號之胺基酸構成之蛋白質表現，以代替表現以序列編號：1表示之IL-6R蛋白質。又，經精製的天然IL-6R蛋白質也同樣可當做感作抗原使用。
對於哺乳動物免疫時使用之感作抗原，可使用該精製IL-6R蛋白質。IL-6R之部分胜肽也可當做感作抗原使用。於此時，該部分胜肽可利用人類IL-6R之胺基酸序列以化學合成取得。又，也可將IL-6R基因之一部分納入表現載體使表現而取得。再者，使用蛋白質分解酵素將IL-6R蛋白質分解也可取得，但是當做部分胜肽使用之IL-6R胜肽之區域及大小不限於特別之態樣。較佳區域可從序列編號：1之胺基酸序列當中相當於20-357號胺基酸之胺基酸序列選擇任意序列。構成當做感作抗原之胜肽的胺基酸的數目至少為5以上，例如6以上或7以上較佳。更具體而言，可將8~50、較佳為10~30個殘基之胜肽當做感作抗原使用。
又，將IL-6R蛋白質之所望之部分多胜肽或胜肽與不同的多胜肽融合成的融合蛋白質可利用為感作抗原。為了 製造當做感作抗原使用之融合蛋白質，例如可適當利用抗體之Fc片段或胜肽標籤(tag)等。表現融合蛋白質之載體，可藉由將編碼為所望之二種或更多種多胜肽片段之基因於同一讀框(inframe)融合，並將該融合基因以前述方式插入表現載體而製作。融合蛋白質之製作方法記載於Molecular Cloning 2nd ed.(Sambrook,J et al.,Molecular Cloning 2nd ed.,9.47-9.58(1989)Cold Spring Harbor Lab.press)。可當做感作抗原使用之IL-6R之取得方法及使用其之免疫方法，在WO2003/000883、WO2004/022754、WO2006/006693等亦有具體記載。
以該感作抗原免疫之哺乳動物不限於特定動物，宜考慮與細胞融合使用之親代細胞之間的適合性選擇。一般的囓齒類動物例如小鼠、大鼠、倉鼠，或兔、猴等較佳。
依公知方法將上述動物以感作抗原免疫。例如就一般方法而言，係藉由將感作抗原對於哺乳動物之腹腔內或皮下注射而投予以實施免疫。具體而言，將以PBS(Phosphate-Buffered Saline)或生理食鹽水等以適當稀釋倍率稀釋過的感作抗原，視所望與通常的佐劑例如佛洛依德完全佐劑混合並乳化後，將該感作抗原對於哺乳動物每4至21日投予數次。又，感作抗原免疫時可以使用適當擔體。尤其使用小分子量之部分胜肽當做感作抗原時，有時以結合有白蛋白、血藍蛋白(keyhole lympet hemocyanin)等擔體蛋白質的該感作抗原胜肽進行免疫為理想。
又，產生所望抗體之融合瘤可使用DNA免疫並依 以下方式製作。DNA免疫，係指在免疫動物中投予以能表現編碼為抗原蛋白質之基因的態樣構建之載體DNA的該免疫動物中，藉由感作抗原在該免疫動物之活體內表現，能提供免疫刺激之免疫方法。比起對於免疫動物投予蛋白質抗原之一般免疫方法，DNA免疫可期待如下的優越性。
-可維持如IL-6R之膜蛋白質之構造而提供免疫刺激
-無需精製免疫抗原
為了以DNA免疫獲得本發明之單株抗體，首先將表現IL-6R蛋白質之DNA對於免疫動物投予。編碼為IL-6R之DNA可利用PCR等公知方法合成。將獲得之DNA插入適當表現載體並對於免疫動物投予。表現載體例如可以理想地利用pcDNA3.1等市售表現載體。將載體對於活體投予之方法，可使用一般使用之方法。例如，可藉由將吸附有表現載體之金粒子以基因槍導入免疫動物個體之細胞內而實施DNA免疫。再者，認識IL-6R之抗體之製作也可使用國際公開WO2003/104453記載之方法製作。
以此方式將哺乳動物免疫，確認血清中與IL-6R結合之抗體力價上升後，從哺乳動物採取免疫細胞以供細胞融合。較佳之免疫細胞尤佳為使用脾細胞。
與前述免疫細胞融合之細胞，可使用哺乳動物之骨髓瘤細胞。骨髓瘤細胞宜具有為了篩選的適當選擇標記。選擇標記，係指能於特定培養條件下生存之(或無法生存)之形質。選擇標記中，次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase)缺損(以下簡 稱為HGPRT缺損)、或胸腺嘧啶激酶缺損(以下簡稱為TK缺損)等為公知。具HGPRT或TK缺損之細胞，具有次黃嘌呤-胺基喋呤-胸腺嘧啶感受性(以下簡稱為HAT感受性)。HAT感受性之細胞在HAT選擇培養基中無法合成DNA會死滅，但若與正常細胞融合則會利用正常細胞之補救合成路徑(salvage pathway)繼續合成DNA，故能在HAT選擇培養基中增殖。
HGPRT缺損或TK缺損之細胞，各可以含6硫鳥嘌呤(thioguanine)、8氮雜鳥嘌呤(以下簡稱為8AG)、或5'溴去氧尿嘧啶之培養基選擇。於DNA中納入該等嘧啶類似物之正常細胞會死滅。另一方面，未納入該等嘧啶類似物之該等酵素缺損之細胞，能在選擇培養基中生存。其他稱為G418耐受性之選擇標記，係利用新黴素耐受性基因提供對於2-去氧鏈黴胺(streptamine)系抗生物質(慶大黴素(gentamycin類似體)之耐受性。對細胞融合為理想的各種骨髓瘤細胞為公知。
如此的骨髓瘤細胞例如可理想地使用例如：P3(P3x63Ag8.653)(J.Immunol.(1979)123(4),1548-1550)、P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81,1-7)、NS-1(C.Eur.J.Immunol.(1976)6(7),511-519)、MPC-11(Cell(1976)8(3),405-415)、SP2/0(Nature(1978)276(5685),269-270)、FO(J.Immunol.Methods(1980)35(1-2),1-21)、S194/5.XX0.BU.1(J.Exp.Med.(1978)148(1),313-323)、R210(Nature(1979)277(5692),131-133)等。
基本上可依照公知方法例如Keller與Milstein等 人的方法(Methods Enzymol.(1981)73,3-46)等，實施前述免疫細胞與骨髓瘤細胞之細胞融合。
更具體而言，可於例如細胞融合促進劑存在下於通常的營養培養液中實施前述細胞融合。融合促進劑可使用例如聚乙二醇(PEG)、仙台病毒(HVJ)等，為更提高融合效率，可視所望添加使用二甲基亞碸等輔助劑。
免疫細胞與骨髓瘤細胞之使用比例可任意設定。例如相對於骨髓瘤細胞將免疫細胞定為1至10倍較佳。前述細胞融合使用之培養液，例如適於前述骨髓瘤細胞株增殖之RPMI1640培養液、MEM培養液、此外，可使用該種細胞培養使用之通常之培養液，再者，可理想地添加胎牛血清(FCS)等血清補液。
細胞融合係將前述免疫細胞與骨髓瘤細胞以既定量於前述培養液中充分混合，並且將預先加溫至約37℃之PEG溶液(例如平均分子量1000至6000左右)以通常30至60%(w/v)之濃度添加。藉由將混合液緩慢混合，會形成所望之融合細胞(融合瘤)。接著，逐次添加上述列舉之適當培養液，反複實施離心並去除上清之操作，可將對於融合瘤之生長不利的細胞融合劑等除去。
以如此方式獲得之融合瘤，可藉由於通常之選擇培養液，例如HAT培養液(含次黃嘌呤、胺基喋呤、胸腺嘧啶之培養液)培養而選擇。為了使所望之融合瘤以外之細胞(非融合細胞)死滅，可使繼續進行使用上述HAT培養液之培養足夠時間(通常該足夠時間為數日至數週)。其次，以通常之極限稀 釋法，實施產生所望抗體之融合瘤之篩選及單一選殖。
以如此方式獲得之融合瘤，可利用因應細胞融合使用之骨髓瘤具有之選擇標記的選擇培養液而選擇。例如具HGPRT或TK缺損之細胞，可藉由以HAT培養液(含次黃嘌呤、胺基喋呤及胸腺嘧啶之培養液)培養而選擇。亦即，當使用HAT感受性骨髓瘤細胞於細胞融合時，可在HAT培養液中將成功與正常細胞細胞融合的細胞選擇性增殖。為了使所望融合瘤以外之細胞(非融合細胞)死滅，可以繼續使用上述HAT培養液之培養足夠時間。具體而言，一般可藉由數日至數週的培養而選擇所望之融合瘤。其次可利用通常之極限稀釋法，實施產生所望之抗體的融合瘤的篩選及單一選殖。
所望之抗體之篩選及單一選殖，可依照基於公知抗原抗體反應之篩選方法而理想地實施。例如，結合於IL-6R之單株抗體可以結合於在細胞表面表現的IL-6R。如此的單株抗體例如可藉由FACS(fluorescence activated cell sorting)篩選。FACS係將與螢光抗體接觸之細胞以雷射光解析，並測定各個細胞發出之螢光，而可測定抗體對於細胞表面之結合的系統。
為了利用FACS篩選產生本發明之單株抗體的融合瘤，首先要製備表現IL-6R之細胞。用於篩選之較佳細胞為使IL-6R強制表現之哺乳動物細胞。藉由以當做寄主細胞之未經轉形之哺乳動物細胞為對照，可以選擇性檢測抗體對於細胞表面之IL-6R的結合活性。亦即，藉由選擇產生未結合於寄主細胞而結合於IL-6R強制表現細胞的抗體的融合瘤，可以取得 產生IL-6R單株抗體之融合瘤。
或抗體對於經固定化之IL-6R表現細胞的結合活性可依據ELISA之原理評價。例如，將IL-6R表現細胞固定化在ELISA板的井。使融合瘤之培養上清接觸井內之固定化細胞，以檢測結合於固定化細胞的抗體。單株抗體為小鼠來源時，與細胞結合之抗體可利用抗小鼠免疫球蛋白抗體檢測。該等篩選所選擇之產生具有對於抗原之結合能力.的所望抗體的融合瘤，可利用極限稀釋法等選殖。
以此方式製作之產生單株抗體之融合瘤可在通常之培養液中繼代培養。而且，該融合瘤可於液態氮中長期保存。
將該融合瘤依照通常方法培養，可從其培養上清取得所望之單株抗體。或可將融合瘤對於與其具適合性之哺乳動物投予使增殖，並從其腹水獲取單株抗體。前者之方法對於獲得高純度抗體為適當。
從該融合瘤等抗體產生細胞選殖的抗體基因所編碼之抗體也可適當利用。藉由將經選殖的抗體基因納入適當載體並導入寄主，可以表現該基因所編碼的抗體。抗體基因之單離與對於載體之導入、及用於將寄主細胞轉形之方法，例如已由Vandamme等人確立(Eur.J.Biochem.(1990)192(3),767-775)。下列所述重組抗體之製造方法亦為公知。
例如，可從產生抗IL-6R抗體之融合瘤細胞取得編碼為抗IL-6R抗體之可變區(V區)之cDNA。為此，通常首先從融合瘤萃取全體RNA。用於從細胞萃取mRNA之方法，例如可利用如下方法。
-胍(guanidine)超離心法(Biochemistry(1979)18(24),5294-5299)
-AGPC法(Anal.Biochem.(1987)162(1),156-159)
萃取到的mRNA可使用mRNA Purification Kit(GE Health care bioscience製)等精製。或如QuickPrep mRNA Purification Kit(GE Health care bioscience製)等，也有用於從細胞直接萃取全體mRNA之市售套組。使用如此的套組，可從融合瘤取得mRNA。從獲得之mRNA使用反轉錄酵素可合成編碼為抗體V區之cDNA。cDNA可利用AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit(生化學工業社製)等合成。又，為了cDNA之合成及放大，可適當利用SMART RACE cDNA放大套組(Clontech製)及使用PCR之5’-RACE法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85(23),8998-9002、Nucleic Acids Res.(1989)17(8),2919-2932)。又，在如此的cDNA合成之過程中，可在cDNA的兩末端導入後述適當的限制酶部位。
從獲得之PCR產物精製目的之cDNA片段，其次與載體DNA連結。以如此方式製作重組載體，並導入大腸菌等，選擇群落(colony)後，從形成有該群落之大腸菌製備所望之重組載體。並且針對該重組載體是否具有目的cDNA之鹼基序列，可使用公知之方法例如二去氧核苷酸鏈終結法等確認。
為了取得編碼為可變區之基因，利用使用可變區基因放大用引子之5’-RACE法係屬簡便。首先，以從融合瘤細胞萃取之RNA當做模板，合成cDNA，獲得5’-RACE cDNA資料庫。5’-RACE cDNA資料庫之合成可適當使用SMART RACE cDNA放大套組等市售套組。
以獲得之5’-RACE cDNA資料庫為模板，以PCR法將抗體基因放大。依據公知之抗體基因序列可設計小鼠抗體基因放大用之引子。此等引子為依免疫球蛋白之次類而各不相同的鹼基序列。因此，次類理想為預先使用Iso Strip小鼠單株抗體同種型決定套組(Roche diagnostics)等市售套組決定。
具體而言，當目的為取得例如編碼為小鼠IgG之基因時，可利用能將編碼為當做重鏈之γ1、γ2a、γ2b、γ3、當做輕鏈之κ鏈與λ鏈的基因放大的引子。為了放大IgG之可變區基因，一般係利用於3'側之引子黏合有相當於接近可變區之不變區之部分的引子。另一方面，5'側之引子係利用5’RACE cDNA資料庫製作套組所附帶的引子。
利用如此放大之PCR產物，可再構成由重鏈與輕鏈之組合而成的免疫球蛋白。以再構成之免疫球蛋白對於IL-6R之結合活性當做指標，可以篩選所望之抗體。例如目的為取得對抗IL-6R之抗體時，抗體對於IL-6R之結合，更佳為專一性的。與IL-6R結合之抗體可藉由例如以下方式篩選；(1)使從融合瘤獲得之含有由cDNA編碼之V區的抗體接觸IL-6R表現細胞之步驟、(2)檢測IL-6R表現細胞與抗體之間的結合之步驟、及(3)選擇與IL-6R表現細胞結合之抗體之步驟。
檢測抗體與IL-6R表現細胞之間的結合的方法為公知。具體而言，可利用先前所述FACS等方法，檢測抗體與IL-6R表現細胞間之結合。為了評價抗體之結合活性，可適當 利用IL-6R表現細胞之固定標本。
以結合活性為指標之抗體之篩選方法，亦宜使用利用噬菌體載體之淘選法。從多株抗體表現細胞群，以重鏈與輕鏈之次類之資料庫的形式取得抗體基因時，利用噬菌體載體之篩選方法係屬有利。編碼為重鏈與輕鏈之可變區之基因，可藉由以適當連結子序列連結，而形成單鏈Fv(scFv)。藉由將編碼為scFv之基因插入噬菌體載體，可取得於表面表現scFv之噬菌體。該噬菌體與所望抗原接觸後，藉由回收與抗原結合之噬菌體，可以回收編碼為具目的結合活性之scFv的DNA。該操作可視需要反複實施，而將具所望之結合活性之scFv濃縮。
獲得編碼為目的抗IL-6R抗體之V區的cDNA後，將該cDNA以認識插入於該cDNA之兩末端的限制酶部位之限制酶消化。較佳之限制酶，係認識構成抗體基因之鹼基序列中出現頻度低之鹼基序列並消化。再者，為了將1副本的消化片段以正確方向插入載體，宜插入提供附著末端之限制酶。藉由將以上述方式經消化之編碼為抗IL-6R抗體之V區的cDNA插入適當表現載體，可以取得抗體表現載體。此時，若將編碼為抗體不變區(C區)之基因、與編碼為前述V區之基因於同一讀框融合，則可取得嵌合抗體。在此，嵌合抗體係指不變區與可變區之來源不同者。因此，除了小鼠-人類等的異種嵌合抗體，人類-人類同種嵌合抗體也包含在本發明之嵌合抗體。藉由預先在具不變區之表現載體插入前述V區基因，可以構建嵌合抗體表現載體。具體而言，可於例如保持有編碼為所望之抗體不變區(C區)之DNA的表現載體之5’側，適當配置消化前述V 區基因之限制酶之限制酶認識序列。藉由將以相同組合之限制酶消化過的兩者於同一讀框融合，可以構建嵌合抗體表現載體。
為了製造抗IL-6R單株抗體，可以將抗體基因於由表現控制區控制之下表現的方式納入表現載體。用於表現抗體之表現控制區，包含例如增強子或啟動子。又，也可在胺基末端附加適當的信號序列，以使表現的抗體分泌到細胞外。例如係使用具胺基酸序列MGWSCIILFLVATATGVHS(序列編號：3)之胜肽當做信號序列，但是也可附加其他適當的信號序列。將表現的多胜肽在上述序列之羧基末端部分切斷，切斷的多胜肽可以成熟多胜肽之形式分泌到細胞外。其次，藉由以該表現載體將適當的寄主細胞轉形，可以取得表現編碼為抗IL-6R抗體之DNA的重組細胞。
為了表現抗體基因，可將編碼為抗體重鏈(H鏈)及輕鏈(L鏈)之DNA納入分別的表現載體。藉由納入有H鏈與L鏈之載體，對於相同寄主細胞同時轉形(co-transfect)，可以表現具備H鏈與L鏈之抗體分子。或可將編碼為H鏈及L鏈之DNA納入單一的表現載體，而將寄主細胞轉形(參照國際公開WO 1994/11523)。
用以藉由將經單離之抗體基因導入適當寄主而製作抗體之寄主細胞與表現載體的複數個組合為公知。該等表現系均可應用於單離本發明之抗原結合分域。真核細胞當做寄主細胞時，可適當使用動物細胞、植物細胞、或真菌細胞。具體而言，動物細胞例如以下細胞。
(1)哺乳類細胞：CHO(中國倉鼠卵巢細胞株(Chinese hamster ovary cell line))、COS(猴腎細胞株(Monkey kidney cell line))、骨髓瘤(Sp2/O、NS0等)、BHK(幼倉鼠腎細胞株(baby hamster kidney cell line))、Hela、Vero、HEK293(有受剪切之腺病毒的人類胚胎腎細胞株(human embryonic kidney cell line with sheared adenovirus)(Ad)5DNA)、PER.C6細胞(經腺病毒型E1A及E1B基因轉形的人類胚胎網膜細胞株(human embryonic retinal cell line transformed with the Adenovirus Type 5(Ad5)E1A and E1B genes))等(Current Protocols in Protein Science(May、2001、Unit 5.9、Table 5.9.1))
(2)兩生類細胞：非洲爪蟾卵母細胞等
(3)昆蟲細胞：sf9、sf21、Tn5等
或植物細胞以煙草(Nicotiana tabacum)等煙草(Nicotiana)屬來源之細胞而得之抗體基因表現系為公知。植物細胞之轉形可以適當利用癒傷組織培養之細胞。
又，真菌細胞可以利用如下的細胞。
-酵母：啤酒酵母(Saccharomyces serevisiae)等糖化酵母(Saccharomyces)屬、甲醇同化酵母(Pichia pastoris)等Pichia屬
-絲狀菌：黑麴黴(Aspergillus niger)等麴菌(Aspergillus)屬
又，利用原核細胞之抗體基因之表現系亦為公知。例如使用細菌細胞時，可以適當利用大腸菌(E.coli)、枯草菌等細菌細胞。於該等細胞中，以轉形導入含有目的抗體基因之表現載體。藉由將經轉形之細胞於體外培養，可從該轉形 細胞之培養物獲取所望之抗體。
重組抗體之產生，除了上述寄主細胞，尚可利用基因轉殖動物。亦即，從導入有編碼為所望抗體之基因的動物，可獲取該抗體。例如，將抗體基因藉由於同一讀框插入編碼為乳汁中固有產生之蛋白質的基因內部，可以構建融合基因。乳汁中分泌之蛋白質，例如可利用羊β酪蛋白等。將含有插入有抗體基因之融合基因的DNA片段注入羊胚，並將該經注入之胚胎導入雌羊體內。從接受胚胎的羊產生之基因轉殖羊(或其子孫)所產之乳汁，可以取得所望之抗體與乳汁蛋白質之融合蛋白質。又，為了增加從基因轉殖羊產生之含所望之抗體之乳汁量，可對於基因轉殖羊投予荷爾蒙(Bio/Technology(1994),12(7),699-702)。
本說明書記載之抗原結合分子對於人類投予時，該分子中之抗原結合分域，可適當採用以降低對於人類之異種抗原性等為目的經人類為改變過的基因重組型抗體來源的抗原結合分域。基因重組型抗體例如包含人類化(Humanized)抗體等。該等改變抗體可使用公知方法適當製造。
本說明書記載之用於製作抗原結合分子中的抗原結合分域所使用之抗體之可變區，通常由插入在4個框架區(FR)的3個互補性決定區(complementarity-determining region；CDR)構成。CDR係實質上決定抗體之結合專一性之區域。CDR之胺基酸序列富有多樣性。另一方面，構成FR之胺基酸序列，即使在具有不同之結合專一性的抗體之間也常會顯示高度同一性。所以，一般可利用CDR之移植而將某抗體之結合專一 性移植到其他抗體。
人類化抗體也稱為再構成(reshaped)人類抗體。具體而言，將人類以外之動物例如小鼠抗體之CDR移植到人類抗體而成之人類化抗體等為公知。為了獲得人類化抗體之一般基因重組方法亦為已知。具體而言，就將小鼠抗體之CDR移植到人類FR的方法而言，例如Overlap Extension PCR為公知。於Overlap Extension PCR，係對於用於合成人類抗體FR之引子中，附加編碼為待移植之小鼠抗體之CDR的鹼基序列。引子係針對4個FR各別準備。一般將小鼠CDR移植到人類FR時，選擇與小鼠之FR具高同一性之人類FR時，對於維持CDR機能為有利。亦即，一般較佳為利用與相鄰於待移植之小鼠CDR的FR之胺基酸序列為高同一性之胺基酸序列構成之人類FR。
又，連結之鹼基序列可設計為彼此於同一讀框連接。藉由各引子，可個別合成人類FR。其結果，可獲得於各FR附加有編碼為小鼠CDR之DNA的產物。各產物之編碼為小鼠CDR之鹼基序列，可設計成彼此重疊。接著，使以人類抗體基因為模板而合成之產物之重疊的CDR部分彼此黏合，進行互補鏈合成反應。利用該反應，人類FR經由小鼠CDR之序列而連結。
最後，將連結有3個CDR與4個FR之V區基因，利用黏合在其5'末端與3'末端並附加有適當之限制酶認識序列的引子，將其全長放大。藉由將以上述方式獲得之DNA與編碼為人類抗體C區之DNA以於同一讀框融合之方式插入於表 現載體中，藉此可製作人類型抗體表現用載體。將該重組載體導入寄主並樹立重組細胞後，培養該重組細胞，使編碼為該人類化抗體之DNA表現，藉此使該培養細胞之培養物中產生該人類化抗體(參照歐洲專利公開EP 239400、國際公開WO1996/002576)。
以定性或定量測定以上述方式製作之人類化抗體對於抗原之結合活性並進行評價，可以理想地選擇當經由CDR連結時該CDR會形成良好之抗原結合部位的人類抗體之FR。視需要，可以將FR之胺基酸殘基取代，使再構成人類抗體之CDR能形成適當的抗原結合部位。例如，應用將小鼠CDR移植到人類FR時使用之PCR法，可對於FR導入胺基酸序列之變異。具體而言，可對於與FR黏合之引子導入部分的鹼基序列的變異。以如此的引子合成之FR，導入有鹼基序列之變異。以上述方法測定並評價將胺基酸取代過的變異型抗體對於抗原之結合活性，可以選擇具所望性質之變異FR序列(Cancer Res,1993,53,851-856)。
又，可以將具有人類抗體基因所有資料庫存的基因轉殖動物(參照國際公開WO1993/012227、WO1992/003918、WO1994/002602、WO1994/025585、WO1996/034096、WO1996/033735)當做免疫動物，以DNA免疫取得所望之人類抗體。
再者，使用人類抗體資料庫以淘選取得人類抗體之技術亦為已知。例如，將人類抗體之V區以單鏈抗體(scFv)之形式，以噬菌體呈現法使表現在噬菌體之表面。可以選擇表 現與抗原結合之scFv的噬菌體。藉由解析選擇之噬菌體之基因，可以決定編碼為與抗原結合之人類抗體之V區的DNA序列。決定與抗原結合之scFv之DNA序列後，將該V區序列與所望之人類抗體C區之序列於同一讀框融合後插入適當表現載體，可以製作表現載體。將該表現載體導入上述列舉之適當表現細胞中，並使編碼為該人類抗體之基因表現，可取得該人類抗體。該等方法已為公知(參照國際公開WO1992/001047、WO1992/020791、WO1993/006213、WO1993/011236、WO1993/019172、WO1995/001438、WO1995/015388)。
噬菌體展示法以外，作為使用人抗體資料庫利用淘選取得人抗體之技術，已知有使用無細胞轉譯系之技術、在細胞或病毒表面提示抗原結合分子之技術、使用乳劑之技術等。例如：作為使用無細胞轉譯系之技術，可使用利用終止密碼子之除去等而介由核糖體形成mRNA與轉譯的蛋白質的複合體的核糖體展示法、使用嘌呤黴素等化合物使基因序列與轉譯之蛋白質共價鍵結之cDNA展示法、mRNA展示法、使用對核酸結合之蛋白質而形成基因與轉譯之蛋白質之複合體之CIS展示法等。又，作為於細胞或病毒表面提示抗原結合分子之技術，除了噬菌體展示法以外，可使用E.coli展示法、革蘭氏陽性菌展示法、酵母展示法、哺乳類細胞展示法、病毒展示法等。作為使用乳劑之技術，可使用於乳劑中內包基因及轉譯關連分子進行的反轉錄病毒展示法等。該等方法已為公知(Nat Biotechnol.2000 Dec；18(12)：1287-92、Nucleic Acids Res.2006；34(19)：e127、Proc Natl Acad Sci U S A.2004 Mar 2；101(9)：2806-10、Proc Natl Acad Sci U S A.2004Jun 22；101(25)：9193-8、Protein Eng Des Sel.2008 Apr；21(4)：247-55、Proc Natl Acad Sci U S A.2000 Sep 26；97(20)：10701-5、MAbs.2010 Sep-Oct；2(5)：508-18、Methods Mol Biol.2012；911：183-98)。
又，就取得抗體基因之方法而言，除上述以外，也可適當使用Bernasconi等人(Science(2002)298,2199-2202)或WO2008/081008記載之B細胞選殖(各抗體之編碼序列之鑑別及選殖、其單離、及各抗體(尤其IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)製作用之表現載體構建之用途等)之方法。
又，本發明中，作為抗體之一非限定態樣，可列舉認識非T細胞受體而是認識抗原之抗體或其片段、T細胞之信號分域之融合體納入到T細胞而得之嵌合型抗原受體(Chimeric antigen receptor)以及納入有該嵌合型抗原受體之T細胞，但不限定於此。
EU編號及Kabat編號
依照本發明使用之方法，指定為抗體之CDR與FR之胺基酸位置係依照Kabat規定(Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute of Health,Bethesda,Md.,1987年及1991年)。本說明書中，抗原結合分子為抗體或抗原結合片段時，可變區之胺基酸係依照Kabat編號，不變區之胺基酸係依照Kabat之胺基酸位置的EU編號表示。
因應低分子化合物濃度而改變結合活性的抗原結合分域
低分子化合物例如：目標組織專一的化合物或非天然化合物。以下列舉依存於目標組織專一的化合物的抗原結合分域的選擇方法等，但依存於目標組織專一的化合物以外的低分子化合物的抗原結合分域的選擇方法等也可依下列例適當實施。為了取得因應目標組織專一性的化合物濃度而改變對於抗原之結合活性之抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)，亦即，目標組織專一性的化合物依存性的抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)，可適當使用上述結合活性項目所示之方法等。作為一非限定態樣，以下列舉一些具體例。例如為了確認比起於目標組織專一性的化合物不存在下抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)對於抗原之結合活性，於該化合物存在下抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)對於抗原之結合活性變化為較高，比較於目標組織專一性的化合物不存在下及存在下、或低濃度存在下及高濃度存在下時，抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)對抗原之結合活性。於一不同的非限定態樣中，為了確認例如：比起存在低濃度目標組織專一性的化合物時，抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)對於抗原之結合活性，於該化合物高濃度存在下抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)對於抗原之結合活性變化為較高，比較於目標組織專一性的化合物低濃度存在下及高濃度存在下時，抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)對於抗原之結合活性。
又，本發明中，「目標組織專一性的化合物存在下對於抗原之結合活性，高於該化合物不存在下對於抗原之結合 活性」之表達法，也可表達為「抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)於目標組織專一性的化合物不存在下對於抗原之結合活性低於該化合物存在下對於抗原之結合活性」。又，本發明中，「抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)於目標組織專一性的化合物不存在下對於抗原之結合活性低於該化合物存在下對於抗原之結合活性」，有時也會記載為「抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)於目標組織專一性的化合物不存在下對於抗原之結合活性弱於該化合物存在下對於抗原之結合活性」。
又，本發明中，「存在高濃度目標組織專一性的化合物時對於抗原之結合活性高於該化合物低濃度存在下對於抗原之結合活性」之表達，也可表達為「抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)於存在低濃度目標組織專一性的化合物時對於抗原之結合活性低於該化合物高濃度存在下對於抗原之結合活性」。又，本發明中，「抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)於存在低濃度目標組織專一性的化合物時對於抗原之結合活性低於該化合物高濃度存在下對於抗原之結合活性」，有時記載為「抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)於存在低濃度目標組織專一性的化合物時對於抗原之結合活性弱於該化合物高濃度存在下對於抗原之結合活性」。
測定對於抗原之結合活性時，目標組織專一性的化合物濃度以外之條件可由該技術領域中具有通常知識者適當選擇，不特別限定。例如可於HEPES緩衝液、37℃之條件 測定。例如可使用Biacore(GE Healthcare)等測定。抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)與抗原之結合活性之測定，於抗原為可溶型分子時，可將抗原作為分析物流過固定有抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)之晶片，以評價對於可溶型分子之結合活性，抗原為膜型分子時，可將抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)作為分析物，流過固定有抗原之晶片，以評價對於膜型分子之結合活性。
本發明之抗原結合分子所含之抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)於目標組織專一性的化合物不存在下對於抗原之結合活性，只要弱於目標組織專一性的化合物存在下對於抗原之結合活性即可，於該化合物不存在下對於抗原之結合活性與該化合物存在下對於抗原之結合活性之比不特別限定，較佳為對於抗原之目標組織專一性的化合物不存在下之KD(Dissociation constant：解離常數)與存在下之KD之比KD(化合物不存在下)/KD(化合物存在下)之值為2以上，更佳為KD(化合物不存在下)/KD(化合物存在下)之值為10以上，又更佳為KD(化合物不存在下)/KD(化合物存在下)之值為40以上。KD(化合物不存在下)/KD(化合物存在下)之值之上限不特別限定，只要該技術領域中具有通常知識者之技術可製作即可，可為400、1000、10000等任意值。目標組織專一性的化合物不存在下時，未觀察到對於抗原之結合活性的情形，其上限成為無限大之數值。
本發明之抗原結合分子所含之抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)，只要於存在低濃度目標組織專一 性的化合物時對於抗原之結合活性弱於存在高濃度目標組織專一性的化合物時對於抗原之結合活性即可，在低濃度存在該化合物時對於抗原之結合活性與在高濃度存在該化合物時對於抗原之結合活性之比不特別限定，較佳為對於抗原，存在低濃度目標組織專一性的化合物時KD(Dissociation constant：解離常數)與高濃度存在時之KD之比，即KD(化合物低濃度存在下)/KD(化合物高濃度存在下)之值為2以上，更佳為KD(化合物低濃度存在下)/KD(化合物高濃度存在下)之值為10以上，又更佳為KD(化合物低濃度存在下)/KD(化合物高濃度存在下)之值為40以上。KD(化合物低濃度存在下)/KD(化合物高濃度存在下)之值之上限不特別限定，只要該技術領域中具有通常知識者之技術能製作，可為400、1000、10000等任意值。於低濃度存在目標組織專一性的化合物時未觀察到對於抗原之結合活性之情形，其上限成為無限大之數值。
對於抗原之結合活性之值，於抗原為可溶型抗原之情形，可使用KD(解離常數)，於抗原為膜型抗原之情形，可使用視KD(Apparent dissociation constant：視解離常數)。KD(解離常數)、及視KD(視解離常數)可依該技術領域中具有通常知識者公知之方法測定，例如可使用Biacore(GE healthcare)、scatchard作圖法、流式細胞計數器等。
又，代表本發明之抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)在目標組織專一性的化合物不存在下對於抗原之結合活性與存在下對於抗原之結合活性之比之其他指標，例如也可理想地使用解離速度常數kd(Dissociation rate constant：解離速度常數)。代表結合活性之比之指標，使用kd(解離速度常數)代替KD(解離常數)時，對於抗原在目標組織專一性的化合物不存在下對於抗原之結合活性之比之kd(解離速度常數)與在該化合物存在下之kd(解離速度常數)之比，即kd(化合物不存在下)/kd(化合物存在下)之值，較佳為2以上，更佳為5以上，又更佳為10以上，再更佳為30以上。Kd(化合物不存在下)/kd(化合物存在下)之值之上限不特別限定，只要該技術領域中具有通常知識者之技術常識可製作即可，可為50、100、200等各種值。目標組織專一性的化合物不存在下時，未觀察到對於抗原之結合活性的情形也不生解離，因此其上限成為無限大之數值。
又，代表本發明之抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)在目標組織專一性的化合物存在低濃度時對於抗原之結合活性與高濃度存在時對於抗原之結合活性之比之其他指標，例如也可理想地使用解離速度常數kd(Dissociation rate constant：解離速度常數)。代表結合活性之比之指標，使用kd(解離速度常數)代替KD(解離常數)時，對於抗原在目標組織專一性的化合物存在低濃度時對於抗原之結合活性之比之kd(解離速度常數)與在該化合物高濃度存在時之kd(解離速度常數)之比，即kd(化合物低濃度存在下)/kd(化合物高濃度存在下)之值，較佳為2以上，更佳為5以上，又更佳為10以上，再更佳為30以上。Kd(化合物低濃度存在下)/kd(化合物高濃度存在下)之值之上限不特別限定，只要該技術領域中具有通常知識者之技術常識可製作即可，可為50、100、200等各種值。 目標組織專一性的化合物低濃度存在時，未觀察到對於抗原之結合活性的情形也不生解離，因此其上限成為無限大之數值。
抗原結合活性之值，於抗原為可溶型抗原之情形，可使用kd(解離速度常數)，於抗原為膜型抗原之情形，可使用視kd(Apparent dissociation rate constant：視解離速度常數)。kd(解離速度常數)、及視kd(視解離速度常數)，可使用該技術領域中具有通常知識者公知之方法測定，例如可使用Biacore(GE healthcare)、流式細胞計數器等。又，本發明中，當測定某濃度目標組織專一性的化合物時抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)對於抗原之結合活性時，宜將該化合物濃度以外之條件設為相同。
例如本發明提供之一個態樣，即在目標組織專一性的化合物不存在時對於抗原之結合活性低於在該化合物存在時對於抗原之結合活性之抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)，可依包含以下步驟(a)~(c)之抗原結合分域(或抗原結合分子)之篩選取得。
(a)獲得目標組織專一性的化合物不存在時抗原結合分域(或抗原結合分子)之抗原結合活性，(b)獲於目標組織專一性的化合物存在時抗原結合分域(或抗原結合分子)之抗原結合活性，(c)選擇目標組織專一性的化合物不存在時抗原結合活性低於該化合物存在時抗原結合活性之抗原結合分域(或抗原結合分子)。
例如本發明提供之一個態樣，即存在低濃度目標 組織專一性的化合物時對於抗原之結合活性低於在該化合物以高濃度存在時對於抗原之結合活性之抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)，可依包含以下步驟(a)~(c)之抗原結合分域(或抗原結合分子)之篩選取得。
(a)獲得存在低濃度目標組織專一性的化合物時抗原結合分域(或抗原結合分子)之抗原結合活性，(b)獲得存在高濃度目標組織專一性的化合物時抗原結合分域(或抗原結合分子)之抗原結合活性，(c)選擇存在低濃度目標組織專一性的化合物時抗原結合活性低於該化合物以高濃度存在時抗原結合活性之抗原結合分域(或抗原結合分子)。
例如本發明提供之一個態樣，即存在目標組織專一性的化合物不存在時對於抗原之結合活性低於在該化合物存在時對於抗原之結合活性之抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)，可依包含以下步驟(a)~(c)之抗原結合分域(或抗原結合分子)或此等之資料庫之篩選取得。
(a)於目標組織專一性的化合物存在時，使抗原結合分域(或抗原結合分子)或此等之資料庫接觸抗原，(b)將於前述步驟(a)結合於抗原之抗原結合分域(或抗原結合分子)置於該化合物不存在下，(c)單離於前述步驟(b)解離之抗原結合分域(或抗原結合分子)。
例如本發明提供之一個態樣，即存在低濃度目標組織專一性的化合物時對於抗原之結合活性低於在該化合物 以高濃度存在時對於抗原之結合活性之抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)，可依包含以下步驟(a)~(c)之抗原結合分域(或抗原結合分子)或此等之資料庫之篩選取得。
(a)於存在高濃度目標組織專一性的化合物時使抗原結合分域(或抗原結合分子)或此等之資料庫與抗原接觸，(b)將於前述步驟(a)結合於抗原之抗原結合分域(或抗原結合分子)置於該化合物低濃度存在下，(c)單離於前述步驟(b)解離之抗原結合分域(或抗原結合分子)。
例如本發明提供之一個態樣，即目標組織專一性的化合物不存在時對於抗原之結合活性低於在該化合物存在時對於抗原之結合活性之抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)，可依包含以下步驟(a)~(d)之抗原結合分域(或抗原結合分子)或此等之資料庫之篩選取得。
(a)於目標組織專一性的化合物不存在下使抗原結合分域(或抗原結合分子)之資料庫與抗原接觸，(b)選擇於前述步驟(a)未與抗原結合之抗原結合分域(或抗原結合分子),(c)使於前述步驟(b)選擇之抗原結合分域(或抗原結合分子)於該化合物存在下與抗原結合，(d)單離於前述步驟(c)結合於抗原之抗原結合分域(或抗原結合分子)。
例如本發明提供之一個態樣，即存在低濃度目標組織專一性的化合物時對於抗原之結合活性低於在該化合物 以高濃度存在時對於抗原之結合活性之抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)，可依包含以下步驟(a)~(d)之抗原結合分域(或抗原結合分子)或此等之資料庫之篩選取得。
(a)於目標組織專一性的化合物低濃度存在下使抗原結合分域(或抗原結合分子)之資料庫與抗原接觸，(b)選擇於前述步驟(a)未與抗原結合之抗原結合分域(或抗原結合分子)，(c)使於前述步驟(b)選擇之抗原結合分域(或抗原結合分子)於該化合物高濃度存在下與抗原結合，(d)單離於前述步驟(c)結合於抗原之抗原結合分域(或抗原結合分子)。
例如本發明提供之一個態樣，即目標組織專一性的化合物不存在時對於抗原之結合活性低於在該化合物存在時對於抗原之結合活性之抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)，可依包含以下步驟(a)~(c)之抗原結合分域(或抗原結合分子)或此等之資料庫之篩選取得。
(a)於目標組織專一性的化合物存在下使抗原結合分域(或抗原結合分子)之資料庫接觸固定有抗原之管柱，(b)使於前述步驟(a)結合於管柱之抗原結合分域(或抗原結合分子)於該化合物不存在下從管柱溶出，(c)將於前述步驟(b)溶出之抗原結合分域(或抗原結合分子)予以單離。
例如本發明提供之一個態樣，即存在低濃度目標組織專一性的化合物時對於抗原之結合活性低於該化合物以 高濃度存在時對於抗原之結合活性之抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)，可依包含以下步驟(a)~(c)之抗原結合分域(或抗原結合分子)或此等之資料庫之篩選取得。
(a)於目標組織專一性的化合物以高濃度存在下使抗原結合分域(或抗原結合分子)之資料庫接觸固定有抗原之管柱，(b)使於前述步驟(a)結合於管柱之抗原結合分域(或抗原結合分子)於該化合物以低濃度存在下從管柱溶出，(c)將於前述步驟(b)溶出之抗原結合分域(或抗原結合分子)予以單離。
例如本發明提供之一個態樣，即目標組織專一性的化合物不存在時對於抗原之結合活性低於在該化合物存在時對於抗原之結合活性之抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)，可依包含以下步驟(a)~(d)之篩選方法取得。
(a)於目標組織專一性的化合物不存在下使抗原結合分域(或抗原結合分子)之資料庫通過固定有抗原之管柱，(b)回收於前述步驟(a)未結合於管柱而溶出之抗原結合分域(或抗原結合分子)，(c)使前述步驟(b)回收之抗原結合分域(或抗原結合分子)於該化合物存在下結合於抗原，(d)將於前述步驟(c)結合於抗原之抗原結合分域(或抗原結合分子)單離。
例如本發明提供之一個態樣，即存在低濃度目標組織專一性的化合物時對於抗原之結合活性低於在該化合物以高濃度存在時對於抗原之結合活性之抗原結合分域(或包含 該分域之抗原結合分子)，可依包含以下步驟(a)~(d)之篩選方法取得。
(a)於目標組織專一性的化合物於低濃度存在下使抗原結合分域(或抗原結合分子)之資料庫通過固定有抗原之管柱，(b)回收於前述步驟(a)未結合於管柱而溶出之抗原結合分域(或抗原結合分子)，(c)使前述步驟(b)回收之抗原結合分域(或抗原結合分子)於該化合物高濃度存在下結合於抗原，(d)將於前述步驟(c)結合於抗原之抗原結合分域(或抗原結合分子)單離。
例如本發明提供之一個態樣，即目標組織專一性的化合物不存在時對於抗原之結合活性低於在該化合物存在時對於抗原之結合活性之抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)，可依包含以下步驟(a)~(d)之篩選方法取得。
(a)於目標組織專一性的化合物存在下使抗原結合分域(或抗原結合分子)之資料庫與抗原接觸，(b)取得於前述步驟(a)結合於抗原之抗原結合分域(或抗原結合分子)，(c)將前述步驟(b)取得之抗原結合分域(或抗原結合分子)置於化合物不存在下，(d)將前述步驟(c)中抗原結合活性弱於在前述步驟(b)選擇之基準之抗原結合分域(或抗原結合分子)予以單離。
例如本發明提供之一個態樣，即存在低濃度目標組織專一性的化合物時對於抗原之結合活性低於在該化合物 以高濃度存在時對於抗原之結合活性之抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)，可依包含以下步驟(a)~(d)之篩選方法取得。
(a)於目標組織專一性的化合物高濃度存在下使抗原結合分域(或抗原結合分子)之資料庫與抗原接觸，(b)取得於前述步驟(a)結合於抗原之抗原結合分域(或抗原結合分子)，(c)將前述步驟(b)取得之抗原結合分域(或抗原結合分子)置於化合物低濃度存在下，(d)將前述步驟(c)中抗原結合活性弱於在前述步驟(b)選擇之基準之抗原結合分域(或抗原結合分子)予以單離。
又，前述步驟也可重複2次以上。因此依本發明，提供藉由在上述篩選方法更包括重複(a)~(c)或(a)~(d)之步驟2次以上之步驟的篩選方法取得之目標組織專一性的化合物不存在時對於抗原之結合活性低於該化合物存在時對於抗原之結合活性之抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)或存在低濃度目標組織專一性的化合物時對於抗原之結合活性低於該化合物以高濃度存在時對於抗原之結合活性之抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)。(a)~(c)或(a)~(d)之步驟重複的次數不特別限定，通常為10次以內。
本發明之篩選方法中，目標組織專一性的化合物，可為相較於非目標組織，以相異濃度(例如：高濃度或低濃度)存在於目標組織等之定量性目標組織專一性規定之化合物。例如：目標組織專一的化合物以任意濃度差別地存在。但 是一般而言，目標組織專一性的化合物，可於至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少100%、至少110%、至少120%、至少130%、至少140%、至少150%、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少103倍、至少104倍、至少105倍、至少106倍、或更多且直到無限大(亦即於非目標組織不存在之情形)之增加濃度存在。
區別低濃度及高濃度之閾值可因應化合物適當設定。例如：於ATP或腺苷之閾值之一非限定態樣中，作為閾值，低濃度條件可從10nM、1nM、100pM、10pM、1pM或0M之值適當設定。因應設定之閾值，高濃度條件，可從各閾值之至少110%、至少120%、至少130%、至少140%、至少150%、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少103倍、至少104倍、至少105倍、至少106倍之值適當設定。又，於PGE2之一非限定態樣中，作為閾值，低濃度條件可從10pM、1pM、100fM、10fM、1fM或0M之值適當設定。因應設定之閾值，高濃度條件可從各閾值之至少110%、至少120%、至少130%、至少140%、至少150%、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少103倍、至少104倍、至少105倍、至少106倍之值適當設定。再者，作為犬尿胺酸之一非限定態樣中，作為閾值，低濃度條件可從10μM、1μM、100nM、10nM、1nM或0M之值適當設定。 因應設定之閾值，高濃度條件可從各閾值之至少110%、至少120%、至少130%、至少140%、至少150%、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少103倍、至少104倍、至少105倍、至少106倍之值適當設定。
抗原結合分域(或抗原結合分子)之抗原結合活性，可利用對於該技術領域中具有通常知識者為公眾所知之方法測定，針對目標組織專一性的化合物之濃度以外之條件，可由該技術領域中具有通常知識者適當決定。抗原結合分域(或抗原結合分子)之抗原結合活性，可就KD(Dissociation constant：解離常數)、視KD(Apparent dissociation constant：視解離常數)、解離速度kd(Dissociation rate：解離速度常數)、或視kd(Apparent dissociation：視解離速度常數)等的形式進行評價。此等可利用對於該技術領域中具有通常知識者為公眾所知之方法測定，例如可使用Biacore(GE healthcare)、scatchard作圖法、FACS等。
本發明中，選擇目標組織專一性的化合物存在時抗原結合活性高於該化合物不存在時抗原結合活性之抗原結合分域或抗體之步驟，係與選擇目標組織專一性的化合物不存在時抗原結合活性低於該化合物存在時抗原結合活性之抗原結合分域或抗體之步驟之含意相同。
又，本發明中，選擇存在高濃度目標組織專一性的化合物時抗原結合活性高於該化合物於低濃度存在下時之抗原結合活性之抗原結合分域或抗體之步驟，係與選擇目標組織專一性的化合物不存在時抗原結合活性低於該化合物存在 時抗原結合活性之抗原結合分域或抗體的步驟的含意相同。
只要是目標組織專一性的化合物不存在時對於抗原之結合活性低於該化合物存在時對於抗原之結合活性，則該化合物存在時之抗原結合活性與不存在時之抗原結合活性之差距不特別限定，較佳為該化合物存在時之抗原結合活性為不存在時之抗原結合活性之2倍以上，更佳為10倍以上，又更佳為40倍以上。該抗原結合活性之差距之上限不特別限定，只要是該技術領域中具有通常知識者之技術可製作，亦可為400倍、1000倍、10000倍等各種值。目標組織專一性的化合物不存在下，未觀察到對於抗原之結合活性之情形，其上限成為無限大之數值。
利用前述篩選方法篩選之本發明之抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)可為任意抗原結合分域(或抗原結合分子)，可篩選例如上述抗原結合分域(或抗原結合分子)。例如：可篩選具有天然序列之抗原結合分域(或抗原結合分子)，也可篩選胺基酸序列經取代之抗原結合分域(或抗原結合分子)。
資料庫
依某一態樣，本發明之抗原結合分域(或包含該分域之抗原結合分子)，可從使抗原結合分子對於抗原之結合活性依存於目標組織專一性的化合物變化之至少一個胺基酸殘基含於抗原結合分域之彼此序列不同之複數個抗原結合分子為主而成之資料庫取得。作為低分子化合物之一非限定態樣，可列舉目標組織專一的化合物或非天然化合物。作為目標組織專一的 化合物，可列舉：(1)乳酸、琥珀酸、檸檬酸等解糖系、或克氏循環(Krebs cycle)之一次代謝產物、(2)丙胺酸、麩胺酸、或天冬胺酸等胺基酸、(3)犬尿胺酸、及其代謝產物、鄰胺苯甲酸、3-羥基犬尿胺酸、及犬尿喹啉酸等胺基酸之代謝產物、(4)前列腺素E2等花生四烯酸之代謝產物、以及(5)腺苷、腺苷3磷酸(ATP)、腺苷2磷酸(ADP)、腺苷1磷酸(AMP)等具有嘌呤環結構之核苷等。以下，針對如此之使抗原結合分子對於抗原之結合活性因應於作為目標組織專一性的化合物之腺苷、及/或ATP變化之至少一個胺基酸殘基含於抗原結合分域之彼此序列互異之複數個抗原結合分子為主而成之資料庫舉例說明，但是因應腺苷、及/或ATP以外之低分子化合物之濃度而改變對於抗原之結合活性的抗原結合分子的資料庫也可依下例適當適用。
本說明書中，「資料庫」係指有不同序列的複數個抗原結合分子或含有抗原結合分子之複數個融合多胜肽、或編碼為該等序列之核酸、聚核苷酸的組。資料庫中所含之複數個抗原結合分子或含有抗原結合分子之複數個融合多胜肽之序列，可為單一序列，也可為彼此序列互異之抗原結合分子或含有抗原結合分子之融合多胜肽。
本說明書中，作為「資料庫」之態樣，不僅可提供能有效率地取得於低分子存在下結合於目標抗原並於低分子不存在下不結合於目標抗原之抗原結合分子的資料庫(低分子依存性)，也可提供於可有效率地取得於低分子不存在下結合於目標抗原並於低分子存在下不結合於目標抗原之抗體的資料庫(低分子逆依存性)。
本發明的一實施形態，可製作本發明之抗原結合分子與異種多胜肽之融合多胜肽。在某實施形態中，融合多胜肽可以和病毒外殼蛋白質，例如選自於由pIII、pVIII、pVII、pIX、Soc、Hoc、gpD、pVI及其變異體構成之群中的病毒外殼蛋白質的至少一部分融合。
某實施形態中，本發明之抗原結合分子可為ScFv、Fab片段、F(ab)2或F(ab')2，故於另一實施形態，可提供為該等抗原結合分子與異種多胜肽之融合多胜肽，且序列互異之複數個融合多胜肽為主而成的資料庫。具體而言，可提供該等抗原結合分子與病毒外殼蛋白質例如選自於由pIII、pVIII、pVII、pIX、Soc、Hoc、gpD、pVI及其變異體構成之群組中之病毒外殼蛋白質之至少一部分融合成的融合多胜肽即序列互異之複數個融合多胜肽為主而成的資料庫。本發明之抗原結合分子可更含有二聚物化分域。於某實施形態，前述二聚物化分域可存在於抗體之重鏈或輕鏈之可變區與病毒外殼蛋白質之至少一部分之間。此二聚物化分域可含有二聚物化序列之至少1個、及/或含1個或複數個半胱胺酸殘基之序列。此二聚物化分域較佳為和重鏈可變區或不變區之C末端連結。二聚物化分域，取決於前述抗體可變區是否是就和病毒之外殼蛋白質成分之融合多胜肽成分而製成(二聚物化分域之後沒有Amber終止密碼子)或是否是前述抗體可變區主要不含病毒外殼蛋白質成分而製成(例如：二聚物化分域之後有Amber終止密碼子)，可以採取各種結構。前述抗體可變區係主要製作成和病毒之外殼蛋白質成分之融合多胜肽時，利用1或複數個 雙硫鍵及/或單一的二聚物化序列可進行二價提示。
本說明書中，彼此序列互異之複數個抗原結合分子之記載中的「彼此序列互異」之用語，係指資料庫中之各個抗原結合分子之序列彼此相異。亦即，資料庫中之彼此互異之序列之數目，係反映資料庫中之序列相異之獨立選殖體之數目，有時也稱為「資料庫尺寸」。通常之噬菌體展示資料庫，係106至1012，可利用核糖體展示法等公眾所知之技術將資料庫尺寸擴大到1014。但是噬菌體資料庫之淘選選擇時使用之噬菌體粒子之實際數目，通常比資料庫尺寸大10至10,000倍。該過剩的倍數，也稱為「資料庫當量數」，但代表可能存在具有相同胺基酸序列之各個選殖體10至10,000個。所以本發明中之「彼此序列互異」之用語，係指排除資料庫當量數後之資料庫中之各個抗原結合分子之序列彼此不同，更具體而言，係指彼此序列互異之抗原結合分子存在106至1014個分子，較佳為107至1012分子，更佳為108至1011，尤佳為108至1010個分子。
又，本發明之由複數個抗原結合分子為主而成之資料庫之記載中之用語「複數個」，例如本發明之抗原結合分子、融合多胜肽、聚核苷酸分子、載體或病毒通常係指其物質2種以上之集合。例如：若某2種以上之物質就特定形質彼此互異，則代表此物質存在有2種以上。舉例而言，在胺基酸序列中之特定胺基酸位置觀察到的變異體胺基酸。例如：柔性殘基以外、或在表面露出之非常多樣化的胺基酸位置的特定變異體胺基酸以外係實質相同，較佳為有相同序列之本發明之2種以 上之抗原結合分子時，本發明之抗原結合分子存在多個。其他例中，若有編碼為柔性殘基之鹼以外、或編碼為於表面露出之非常多樣之胺基酸位置之特定之變異體胺基酸之鹼以外實質相同，較佳為相同序列之本發明之2種以上之聚核苷酸分子，則本發明之聚核苷酸分子存在複數個個。
再者，本發明之由複數個抗原結合分子為主而成之資料庫之記載中，「為主而成」之用語，係反映資料庫中之序列之不同獨立選殖體之數目當中，依低分子化合物(例如：目標組織專一的化合物)之濃度條件而抗原結合分子對於抗原之結合活性相異之抗原結合分子之數目。具體而言，顯示如此結合活性之抗原結合分子在資料庫中至少有104個分子存在較佳。又，更佳為本發明之抗原結合分域係從顯示如此結合活性之抗原結合分子至少存在105分子之資料庫取得。更佳為本發明之抗原結合分域可從顯示如此結合活性之抗原結合分子至少存在106分子之資料庫取得。尤佳為本發明之抗原結合分域可從顯示如此結合活性之抗原結合分子至少存在107分子之資料庫取得。又，較佳為本發明之抗原結合分域可從顯示如此結合活性之抗原結合分子至少存在108分子之資料庫取得。於另一表達中，資料庫中不同序列之獨立選殖體之數目中，依腺苷、及/或ATP之存在或不存在而抗原結合分域對於抗原之結合活性不同之抗原結合分子之比例，也可理想地表達。具體而言，本發明之抗原結合分域，可從顯示如此結合活性之抗原結合分子含於資料庫中不同序列之獨立選殖體之數目之10-6%%至80%，較佳為10-5%至60%，更佳為10-4%至40%的資料庫 取得。融合多胜肽、聚核苷酸分子或載體之情形，亦與上述相同，可由分子數目或在分子全體之比例表達。又，病毒之情形，亦與上述相同，可由病毒個體之數目或在個體全體之比例表達。於本發明之一非限定態樣，複數個抗原結合分子所結合之抗原為1種時，顯示如此之結合活性之抗原結合分子在資料庫中宜存在至少10分子，100分子，1000分子，104分子，105分子，106分子，107分子或108分子較佳。又，本發明之抗原結合分域宜從至少存在至少10分子之顯示如此之結合活性的抗原結合分子的資料庫取得。本發明之抗原結合分域更宜從至少存在至少100分子之顯示如此之結合活性的抗原結合分子的資料庫取得。特佳為本發明之抗原結合分域宜從至少存在至少1000分子之顯示如此之結合活性的抗原結合分子的資料庫取得。
本發明之一態樣提供以包括下列(a)及(b)之步驟的方法製造的資料庫：(a)在因應低分子化合物之濃度而改變對於抗原之結合活性之抗原結合分域或對於低分子化合物有結合活性之抗原結合分域中，指定滿足以下(i)至(iii)中任一者以上之胺基酸部位之步驟；(i)未涉及對該低分子化合物之結合的1或複數個胺基酸部位；(ii)就親代抗原結合分域所屬之動物種之抗體之資料庫存(repertory)而言，胺基酸出現頻度有多樣性的1或複數個胺基酸部位； (iii)對於典型結構之形成不重要的1或複數個胺基酸部位；及(b)設計含有前述抗原結合分域中之編碼為未改變體之核酸及編碼為步驟(a)指定之1或複數個胺基酸部位有改變之序列互異之前述抗原結合分域或含有抗原結合分域之抗原結合分子之複數個改變體的核酸的資料庫之步驟。
本發明中，「未涉及對於低分子化合物之結合的1或複數個胺基酸部位」，可利用低分子化合物與抗體之複合體之結晶結構解析、使用NMR之立體結構解析、或胺基酸之變異導入等手法進行鑑別。作為本發明之一非限定態樣，可由低分子與抗體之複合體之結晶結構解析，鑑別未涉及與低分子之結合之抗體之殘基。在此，「涉及與低分子之結合」，係指包括：形成抗體之H鏈或L鏈之胺基酸中的側鏈或主鏈之原子與低分子化合物的原子，在會對於結合活性造成效果的距離形成分子間交互作用之狀態、或某胺基酸殘基使結合於低分子化合物時，CDR迴圈等立體結構的構形安定化等間接性影響的幫助低分子化合物之結合的狀態、以及滿足兩者的狀態。
本說明書中，「形成分子間交互作用之狀態」，可從例如低分子與抗體之複合體之結晶結構解析，依構成形成抗體H鏈或L鏈之胺基酸之側鏈或構成主鏈之非氫原子與構成低分子化合物之非氫原子間的原子間距離判定。比如，上述原子間距離宜為3.0Å、3.2Å、3.4Å、3.6Å、3.8Å、4.0Å、4.2Å、4.4Å、4.6Å、4.8Å或5.0Å以內為較佳，但不限定於此。更理想的上述原子間距離為3.6Å、3.8Å、4.0Å或4.2Å以內。
更詳言之，可依立體結構上的原子間距離與形成之分子間交互作用之種類以及原子種類的資訊，直接判定交互作用的可能性。更正確地，係從改變為Ala、Gly的胺基酸殘基變異導入對於低分子化合物之活性造成的影響來判斷，但不限於此。
本說明書中，「間接影響的狀態」，可藉由例如從低分子與抗體之複合體之立體結構詳細解析各胺基酸殘基之構形、和詳細解析周圍殘基間之分子間交互作用之狀況，以推測是否對於低分子之結合有間接性影響，更正確地，係從改變為Ala、Gly的胺基酸殘基變異導入對於低分子化合物之活性造成的影響來判斷，但不限於此。
作為本發明之一態樣，可選擇即使將鑑別為未涉及低分子之結合的殘基取代為其他胺基酸，仍能適度維持對於化合物之結合的胺基酸。藉此，可設計選出的殘基中出現選擇之胺基酸的資料庫。於此情形，可設計由複數個抗原結合分子為主而成的資料庫，使被鑑別為未設及低分子化合物之結合的殘基取代為彼此不同之胺基酸而得的抗原結合分子的集合。
於另一態樣，未涉及對於低分子化合物之結合的胺基酸部位之判定，也可認為係從未涉及與低分子化合物之結合之胺基酸部位中選擇的任一個以上之胺基酸部位以外的胺基酸部位。
作為本發明之一非限定態樣，「未涉及對於低分子化合物之結合的1或複數個胺基酸部位」可利用胺基酸之變異導入之方法鑑別。例如：將可變區之胺基酸全面的改變，以使用Biacore等之公知方法測定各個改變體對低分子之結合，並就KD值算出各個改變體對於低分子之結合活性(親和性)。該 KD值和為親代序列的未改變體的KD值比較，顯示高於一定基準之結合的改變處，但定為未涉及對於低分子化合物之結合的胺基酸部位。例如：使用Biacore等公知方法測定之結果，算出各個改變體對低分子之結合活性(親和性)作為KD值，就重鏈部位而言，未因改變而使低分子結合能力低於未改變體之1/100、1/50、1/10、1/9、1/8、1/7、1/6、1/5、1/4、1/3或1/2之結合能力者、及就輕鏈部位而言，未因改變而使低分子結合能力低於未改變體之1/100、1/50、1/10、1/9、1/8、1/7、1/6、1/5、1/4、1/3或1/2之結合能力者，判定為未涉及對於低分子化合物之結合的胺基酸部位，但不限於上述基準。或不進行與親代序列未改變體之KD值之比較，而是計算各個改變體對於低分子之結合活性(親和性)作為KD值，當就重鏈部位而言，不低於10mM、1mM、100uM、10uM、1uM、100nM、10nM、1nM、100pM、10pM、或1pM之結合能力者，及就輕鏈部位而言，不低於10mM、1mM、100uM、10uM、1uM、100nM、10nM、1nM、100pM、10pM、或1pM之結合能力者，判定為未涉及對於低分子化合物之結合的胺基酸部位，但不限於上述基準。
未改變及改變體對於低分子之結合活性之測定，可由該技術領域有通常知識者公知方法(Biacore、ELISA、ECL等)適當選擇並實施。
於另一態樣，未涉及對於低分子化合物之結合的胺基酸部位之判定，也可認為係從涉及與低分子化合物之結合之胺基酸部位中選擇出的任一個以上之胺基酸部位以外的胺基酸部位。
本發明中，「設計含有編碼為序列互異之前述抗原 結合分域或含有抗原結合分域之抗原結合分子之複數個改變體的核酸的資料庫」，包括例如利用NNK、TRIM Library等(Gonzalez-Munoz A et al.MAbs 2012,Lee CV et al.J Mol Biol.2004,Knappik A.et al.J Mol Biol.2000,Tiller T et al.MAbs 2013)之公知資料庫技術，設計包括特定部位之胺基酸改變為所望胺基酸之抗原結合分域或含有抗原結合分域之抗原結合分子之複數個改變體之資料庫，但不特別限於此態樣。
本發明中，「1或複數個胺基酸」，不特別限定胺基酸數目，可為2種以上之胺基酸、5種以上之胺基酸、10種以上之胺基酸、15種以上之胺基酸或20種胺基酸。
發明中，「胺基酸出現頻度有多樣性之胺基酸部位」，係指親代抗體(親代抗原結合分域)所屬之動物種之抗體資料庫存以1%以上之出現頻度存在的胺基酸種類有2種以上的胺基酸部位。
本發明中，「親代抗原結合分域」係指成為資料庫製作之模板之因應低分子化合物之濃度而改變對於抗原之結合活性之抗原結合分域、或對於低分子化合物有結合活性之抗原結合分域。
本發明中，「親代抗原結合分域所屬動物種之抗體之資料庫存」，係指該親代抗原結合分域所來源之動物種中，在基因上認定的抗體基因序列的資料庫存。就未限定之一例，該親代抗原結合分域為人來源時，親代抗原結合分域所屬動物種之抗體之資料庫存，係指人基因中認定的抗體基因序列的資料庫存，該親代抗原結合分域為兔來源時，親代抗原結合分域 所屬動物種之抗體之資料庫存係指兔基因中認定的抗體基因序列的資料庫存。惟，不包含即使基因上存在，取決於終始密碼子存在、讀框偏移而實際未表現為抗體的序列。
該親代抗原結合分域為非人動物來源時，可依常法將其人化，此手法為該技術領域中通常知識者廣為公知(歐洲專利公開EP239400、國際公開WO1996/002576、WO1993/012227、WO1992/003918、WO1994/002602、WO1994/025585、WO1996/034096、WO1996/033735、WO1992/001047、WO1992/020791、WO1993/006213、WO1993/011236、WO1993/019172、WO1995/001438、WO1995/015388、Cancer Res.,(1993)53,851-856、BBRC.,(2013)436(3)：543-50等)。將該親代抗原結合分域依常法人化後實施資料庫化時，本發明之「親代抗原結合分域所屬之動物種之抗體之資料庫存」中，實施人化前之抗原結合分域、及人化後的抗原結合分域兩者均可採用為親代抗原結合分域，伴隨於此，就同一動物種實施人化前之抗原結合分域所來源之動物種、與人的兩者的資料庫存都可適用。舉一非限定例，實施人化前之抗原結合分域為兔來源時，親代抗原結合分域所屬之動物種之抗體之資料庫存，係指人及/或兔之基因中認定的抗體基因序列的資料庫存。惟，不包含即使基因上存在，取決於終始密碼子存在、讀框偏移而實際未表現為抗體的序列。
親代抗原結合分域屬於動物種之抗體的資料庫存，舉一非限定例，可參照既知之資料庫調査。胺基酸出現頻度有多樣性之部位一般存在於CDR區域。於一態樣，當決定 公知及/或天然抗體之非常多樣的位置時，Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute of Health Bethesda Md.)(1987年及1991年)提供之數據為有效。又，在網際網路上的複數個資料庫(http：//vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/、http：//www.bioinf.org.uk/abs/index.html)提供了收集的複數個人輕鏈及重鏈之序列及其配置，該等序列及其配置之資對於本發明中非常多樣的位置決定有用。
又，作為其他態樣，親代抗原結合分域所屬動物種之抗體的資料庫存，可選殖從該生物種取得之抗體基因並解析序列以調査。舉一非限定例。針對人抗體資料庫存，可藉由從健常人之淋巴球來源之抗體基因構建，並解析由此資料庫存未含有偏差(bias)的抗體序列即天然(naïve)序列構成的天然資料庫的序列以調査(Gejima等(Human Antibodies(2002)11,121-129)及Cardoso等(Scand.J.Immunol.(2000)51,337-344))。資料庫存調査時，宜針對至少100種類，較佳為200種類，更佳為400種類以上的序列進行解析。
本發明中，親代抗原結合分域所屬動物種之抗體的資料庫存不限於此，但更佳為針對親代抗原結合分域所屬生殖系列之次群組實施調査。框架例如可適當使用V-Base(http：//vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)等的網站包括的現在已知完全人型的框架區域的序列，以作為本發明之抗原結合分子所含之生殖細胞系列之序列。生殖細胞系列之序列可基於其類似性分類為次群組(Tomlinson等(J.Mol.Biol.(1992)227,776-798)Williams及Winter(Eur.J.Immunol.(1993)23, 1456-1461)及Cox等(Nat.Genetics(1994)7,162-168)。舉一例，人抗體中，已報告就重鏈可變區有7個次群組、Vκ有7個次群組、Vλ有10種次群組，針對各胺基酸部位，將親代抗原結合分域所屬之次群組內中的胺基酸的資料庫存解析，可藉此調査，但不特別限定其態樣。
本發明中，「對於典型結構之形成不重要之胺基酸部位」中，抗體之典型結構係指抗體重鏈及輕鏈的主要CDR1、2之立體結構的簇集，結構可以依抗體之次群組、CDR之長度、序列分類。各典型結構中，對於結構維持為重要的殘基已公知，藉由參照Chothia等(J.Mol.Biol.(1992)227,799-817)、Al-Lazikani等人(J.Mol.Biol.(1997)273,927-948)、Tomlinson等(J.Mol.Biol.(1992)227,776-798)等的報告，可指定該母抗原結合分子被分類的典型結構、及對於其結構為重要的殘基。
又，抗體以外之抗原結合分域中，已知存在對於結構維持為重要的殘基，不限於此，但可依製作之變異體之結構解析等，以鑑別各個抗原結合分域中，對於典型結構之形成不重要之胺基酸部位。
本發明之資料庫的其他一態樣可列舉以下資料庫。
一種資料庫，係以包括下列(a)至(d)之步驟的方法製造：(a)在因應低分子化合物之濃度而改變對於抗原之結合活性之抗原結合分域或對於低分子化合物有結合活性之抗原結合分域中，指定滿足以下(i)至(iii)中任一者以上之胺基酸部位之步驟； (i)未涉及對該低分子化合物之結合的1或複數個胺基酸部位；(ii)就親代抗原結合分域所屬之動物種之抗體之資料庫存而言，胺基酸出現頻度有多樣性的1或複數個胺基酸部位；(iii)對於典型結構之形成不重要的1或複數個胺基酸部位；(b)製作於步驟(a)指定之1或複數個胺基酸部位有改變之序列互異之前述抗原結合分域或含有抗原結合分域之抗原結合分子之複數個改變體之步驟；(c)指定前述各改變體之對於該低分子化合物之結合活性實質上不帶來變化之1或複數個胺基酸之改變之步驟；及(d)製造含有編碼為未改變體之核酸及編碼為含有於步驟(c)指定之1或複數個胺基酸有改變之序列互異之前述抗原結合分域或含有抗原結合分域之抗原結合分子之複數個改變體的核酸的資料庫之步驟。
本發明中「製作序列互異之前述抗原結合分域或含有抗原結合分域之抗原結合分子之複數個改變體之步驟」中，可將步驟(a)指定之胺基酸部位之中，關於CDR1及CDR2之部位取代為生殖細胞系列之出現頻度為10%以上、9%以上、8%以上、7%以上、6%以上、5%以上、4%以上、3%以上、2%以上或1%以上之胺基酸，關於CDR3之部位可取代為於生殖細胞系列之出現頻度為10%以上、9%以上、8%以上、7%以上、6%以上、5%以上、4%以上、3%以上、2%以上或1%以上之胺基酸而製作各個改變體，但不限定於此。
本發明中，「複數個改變體」係指相對於親代序列抗原結合分域之未改變體，至少1或更多胺基酸被取代之抗原結合分域的各不同的改變體。
本發明中，「指定前述各改變體之對於該低分子化合物之結合活性實質上不帶來變化之1或複數個胺基酸之改變之步驟」有以下的含意。例如：各個改變體向低分子之結合，可依使用Biacore等的公知方法測定，就各個改變體對於低分子之結合活性(親和性)計算KD值。該KD值和親代序列未改變體之KD值比較，於顯示比起一定基準高的結合的改變處判定為可改變部位，在該部位被取代的胺基酸判定為可資料庫化的胺基酸(資料庫中，出現的柔性殘基)，但不限定於此。或，不是和親代序列未改變體之KD值比較，而是各個改變體之KD值顯示比一定基準高的結合的改變處判定為可改變部位，將在該部位被取代的胺基酸判定為可資料庫化的胺基酸(資料庫中，出現的柔性殘基)，但不限定於此。
本發明中，判定可資料庫化之胺基酸時「顯示高於一定基準之結合之改變處」，有如以下含意。例如：依使用Biacore等公知方法測定之結果，計算各個改變體對於低分子之結合活性(親和性)作為KD值，判定就重鏈部位而言不因改變而使低分子結合能力比未改變體之1/100、1/50、1/10、1/9、1/8、1/7、1/6、1/5、1/4、1/3或1/2之結合能力低者、及就輕鏈部位而言，不因改變而使低分子結合能力比未改變體之1/100、1/50、1/10、1/9、1/8、1/7、1/6、1/5、1/4、1/3或1/2之結合能力低者為可改變部位，並可判定該部位中被取代之胺 基酸為可資料庫化之胺基酸處，但不限定於上述基準。或不和親代序列未改變體之KD值比較，而是計算各個改變體對於低分子之結合活性(親和性)作為KD值，判定就重鏈部位而言，不低於10mM、1mM、100uM、10uM、1uM、100nM、10nM、1nM、100pM、10pM、或1pM之結合能力者、及就輕鏈部位而言，不低於10mM、1mM、100uM、10uM、1uM、100nM、10nM、1nM、100pM、10pM、或1pM之結合能力者為可改變部位，將在該部位被取代的胺基酸判定為可資料庫化的胺基酸，但不限定於上述基準。
未改變及改變體對於低分子之結合活性之測定，可從該技術領域中有通常知識者公知之方法(Biacore、ELISA、ECL等)適當選擇並實施。
於另一態樣，未涉及對於低分子化合物之結合的胺基酸部位之判定，可考慮從涉及與低分子化合物之結合之胺基酸部位中選擇的任一個以上之胺基酸部位以外之胺基酸部位。
本發明中，「製造含有編碼為未改變體之核酸及編碼為含有於步驟(c)指定之1或複數個胺基酸有改變之序列互異之前述抗原結合分域或含有抗原結合分域之抗原結合分子之複數個改變體的核酸的資料庫之步驟」，包括建構資料庫，使步驟(d)指定之各胺基酸之特定部位中，胺基酸出現頻度相等(例如胺基酸資料庫存為10種時，各胺基酸出現10%的方式)的態樣，但不限定於此。
本發明之資料庫之另一態樣，可列舉以下資料庫。
一種資料庫，係以包含以下1)及2)之步驟的方法製造： 1)使含有複數個對於低分子化合物有結合活性之抗原結合分子的資料庫與低分子化合物接觸之步驟；及2)從該資料庫將編碼為對於低分子化合物有結合活性之抗原結合分子之複數個改變體的核酸予以濃縮之步驟。
就其他態樣而言，該資料庫的抗原結合分子含有抗體之重鏈可變區及輕鏈可變區，可使用依包含以下1)至3)中任一步驟之方法製造；1)將包含編碼為位在重鏈可變區之胺基酸改變的1或複數個改變體的核酸的資料庫，從該資料庫將編碼為對於低分子化合物有結合活性之抗原結合分子之複數個改變體之核酸予以濃縮並設計資料庫；2)將包含編碼為位在輕鏈可變區之胺基酸改變的1或複數個改變體的核酸的資料庫，從該資料庫將編碼為對於低分子化合物有結合活性之抗原結合分子之複數個改變體之核酸予以濃縮並設計資料庫；3)將編碼為從步驟1)及步驟2)之各可變區資料庫濃縮的抗原結合分子的核酸予以組合以設計資料庫。
本發明中，「濃縮」係指比起濃縮作業實施前之資料庫，編碼為有目的活性之改變體的核酸存在比率上昇。舉一非限定例，將編碼為對於低分子化合物有結合活性之抗原結合分子之改變體之核酸予以濃縮，可藉由利用淘選使編碼為對於低分子化合物有結合活性之抗原結合分子之改變體的核酸存在比率上昇以達成。更具體而言，舉一例而言，可藉由含有複數個抗原結合分子之資料庫利用噬菌體展示法而於表面提示 之噬菌體與該低分子化合物接觸，以洗滌作業去除提示無結合活性之分子之噬菌體及未提示分子之噬菌體後，只回收提示維持結合之抗原結合分子之噬菌體，以利用淘選使編碼為對於低分子化合物有結合活性之抗原結合分子之改變體之核酸存在比率上昇，但不限於此。更具體而言，編碼為有目的活性之改變體之核酸存在比率，比起濃縮作業實施前之資料庫，宜有1.1倍以上上昇較佳。更佳為藉由使編碼為有目的活性之改變體之核酸存在比率上升1.2倍以上、1.5倍以上、2倍以上、4倍以上、10倍以上、25倍以上、100倍以上，以製作本發明之資料庫。
資料庫之製造方法
本發明並關於製造上述說明之本發明包含之各種態樣之「資料庫」之方法。
本發明之「資料庫之製造方法」不限於如以下的任一特定方法，只要能製造上述本發明「資料庫」之方法均包括。
本發明之「資料庫之製造方法」，例如：以下例示之方法。
又，以下例示之「資料庫之製造方法」中，各特定事項具有如上述本發明之「資料庫」所詳述的技術意義。
(例1)
一種資料庫之製造方法，該資料庫係由以下(i)或(ii)為主而成的資料庫，(i)序列互不相同之複數個抗原結合分域或含有抗原結合分域之抗原結合分子，或(ii)編碼為該序列互不相同之複數個抗原結合分域或含有 抗原結合分域之抗原結合分子之核酸，前述抗原結合分子分域或抗原結合分子係因應低分子化合物之濃度而改變對於抗原之結合活性之抗原結合分域或含有抗原結合分域之抗原結合分子，包括下列(a)及(b)之步驟：(a)在因應低分子化合物之濃度而改變對於抗原之結合活性之抗原結合分域或對於低分子化合物有結合活性之抗原結合分域中，指定滿足以下(i)至(iii)中任一者以上之胺基酸部位之步驟；(i)未涉及對該低分子化合物之結合的1或複數個胺基酸部位；(ii)就親代抗原結合分域所屬之動物種之抗體之資料庫存(repertory)而言，胺基酸出現頻度有多樣性的1或複數個胺基酸部位；(iii)對於典型結構之形成不重要的1或複數個胺基酸部位；及(b)設計含有前述抗原結合分域中之編碼為未改變體之核酸及編碼為步驟(a)指定之1或複數個胺基酸部位有改變之序列互異之前述抗原結合分域或含有抗原結合分域之抗原結合分子之複數個改變體的核酸的資料庫之步驟。
(例2)
一種資料庫之製造方法，該資料庫係由以下(i)或(ii)為主而成的資料庫，(i)序列互不相同之複數個抗原結合分域或含有抗原結合 分域之抗原結合分子，或(ii)編碼為該序列互不相同之複數個抗原結合分域或含有抗原結合分域之抗原結合分子之核酸，前述抗原結合分子分域或抗原結合分子係因應低分子化合物之濃度而改變對於抗原之結合活性之抗原結合分域或含有抗原結合分域之抗原結合分子，包括下列(a)至(d)之步驟：(a)在因應低分子化合物之濃度而改變對於抗原之結合活性之抗原結合分域或對於低分子化合物有結合活性之抗原結合分域中，指定滿足以下(i)至(iii)中任一者以上之胺基酸部位之步驟；(i)未涉及對該低分子化合物之結合的1或複數個胺基酸部位；(ii)就親代抗原結合分域所屬之動物種之抗體之資料庫存而言，胺基酸出現頻度有多樣性的1或複數個胺基酸部位；(iii)對於典型結構之形成不重要的1或複數個胺基酸部位；(b)製作於步驟(a)指定之1或複數個胺基酸部位有改變之序列互異之前述抗原結合分域或含有抗原結合分域之抗原結合分子之複數個改變體之步驟；(c)指定前述各改變體之對於該低分子化合物之結合活性實質上不帶來變化之1或複數個胺基酸之改變之步驟；及(d)製造含有編碼為未改變體之核酸及編碼為含有於步驟(c)指定之1或複數個胺基酸有改變之序列互異之前述抗原 結合分域或含有抗原結合分域之抗原結合分子之複數個改變體的核酸的資料庫。
(例3)
一種資料庫之製造方法，該資料庫係由以下(i)或(ii)為主而成的資料庫，(i)序列互不相同之複數個抗原結合分域或含有抗原結合分域之抗原結合分子；或(ii)編碼為該序列互不相同之複數個抗原結合分域或含有抗原結合分域之抗原結合分子之核酸；前述抗原結合分子分域或抗原結合分子係因應低分子化合物之濃度而改變對於抗原之結合活性之抗原結合分域或含有抗原結合分域之抗原結合分子；包括下列1)及2)之步驟：1)使含有複數個對於低分子化合物有結合活性之抗原結合分子的資料庫與低分子化合物接觸之步驟，及2)從該資料庫將編碼為對於低分子化合物有結合活性之抗原結合分子之複數個改變體的核酸予以濃縮之步驟。
(例4)
一種資料庫之製造方法，該資料庫係由以下(i)或(ii)為主而成的資料庫，前述抗原結合分子分域或抗原結合分子係因應低分子化合物之濃度而改變對於抗原之結合活性之抗原結合分域或含有抗原結合分域之抗原結合分子；(i)序列互不相同之複數個抗原結合分域或含有抗原結合 分域之抗原結合分子；或(ii)編碼為該序列互不相同之複數個抗原結合分域或含有抗原結合分域之抗原結合分子之核酸；包括下列1)至3)中之任一步驟：1)前述(例3)之資料庫包含編碼為位在重鏈可變區之胺基酸改變的1或複數個改變體的核酸，從該資料庫將編碼為對於低分子化合物有結合活性之抗原結合分子之複數個改變體之核酸予以濃縮並設計資料庫；2)前述(例3)之資料庫包含編碼為位在輕鏈可變區之胺基酸改變的1或複數個改變體的核酸，從該資料庫將編碼為對於低分子化合物有結合活性之抗原結合分子之複數個改變體之核酸予以濃縮並設計資料庫；3)將編碼為從步驟1)及步驟2)之各可變區資料庫濃縮的抗原結合分子的核酸予以組合以設計資料庫。
(例5)
一種資料庫之製造方法，係製造如前述(例1)至(例4)中任一項之資料庫之方法，其中，前述抗原結合分子係抗原結合分域與病毒外殼蛋白質之至少一部分的融合多胜肽。
(例6)
一種資料庫之製造方法，係製造如前述(例1)至(例4)中任一項之資料庫之方法，其中，其中，前述抗原結合分子係含有抗體之重鏈及輕鏈之抗原結合分子，更包含設計前述重鏈及/或輕鏈之合成資料庫的步驟。
(例7)
如(例6)之資料庫之製造方法，其中，前述抗體之重鏈及/或輕鏈含有來自生殖細胞系列之框架序列。
(例8)
如前述(例1)至(例7)中之任一項之資料庫之製造方法，其中，前述低分子化合物為目標組織專一的化合物或非天然化合物。
(例9)
如前述(例1)至(例8)中之任一項之資料庫之製造方法，其中，前述目標組織為癌組織或發炎性組織。
(例10)
如前述(例9)之資料庫之製造方法，其中，前述癌組織專一的化合物為選自於由具有嘌呤環結構之核苷、胺基酸及其代謝產物、脂質及其代謝產物、糖代謝之一次代謝產物、以及菸鹼醯胺及其代謝產物構成之群組中之至少1種化合物。
(例11)
如前述(例1)至(例10)中之任一項之資料庫之製造方法，其中，前述低分子化合物為犬尿胺酸、腺苷、腺苷1磷酸、腺苷2磷酸、或腺苷3磷酸、。
(例12)
如前述(例1)至(例11)中之任一項之資料庫之製造方法，其中，資料庫之製造方法未涉及與前述低分子化合物之結合之胺基酸部位係選自於以下任一以上之胺基酸以外：H鏈：97、100c、101、94、95、100d、100e、33、50、52、56、57、58、99、100、100a、54、55(Kabat編 號)；L鏈：49、55、95c、96、95a、95b(Kabat編號)。
資料庫(其他態樣)
本發明中，作為能取得因應低分子化合物之濃度而改變對於抗原之結合活性之抗原結合分域之資料庫之一態樣，可列舉以下資料庫。
一種資料庫，該資料庫係由以下(i)或(ii)為主而成的資料庫，(i)序列互不相同之複數個抗原結合分域或含有抗原結合分域之抗原結合分子；或(ii)編碼為該序列互不相同之複數個抗原結合分域或含有抗原結合分域之抗原結合分子之核酸；其特徵為：前述抗原結合分子分域或抗原結合分子係對於低分子化合物有結合活性之抗原結合分域或含有抗原結合分域之抗原結合分子。
本態樣之資料庫宜有1.2×108以上之多樣性較佳。
本態樣中，再者，由複數個抗原結合分子為主而成之資料庫之記載中，「為主而成」之用語，係反映資料庫中之序列之不同獨立選殖體之數目當中，對於低分子化合物(例如：目標組織專一的化合物)有結合活性之抗原結合分子之數目。具體而言，顯示如此結合活性之抗原結合分子在資料庫中至少有104個分子存在較佳。於另一表達中，資料庫中不同序列之獨立選殖體之數目中，依低分子之存在或不存在而抗原結合分域對於抗原之結合活性不同之抗原結合分子之比例，也可理想地表 達。具體而言，本發明之抗原結合分域，可從顯示如此結合活性之抗原結合分子含於資料庫中不同序列之獨立選殖體之數目之10-6%%至80%，較佳為10-5%至60%，更佳為10-4%至40%，更佳為10-3%至40%，又更佳為10-2%至40%的資料庫取得。融合多胜肽、聚核苷酸分子或載體之情形，亦與上述相同，可由分子數目或在分子全體之比例表達。又，病毒之情形，亦與上述相同，可由病毒個體之數目或在個體全體之比例表達。
本發明中，作為能取得因應低分子化合物之濃度而改變對於抗原之結合活性之抗原結合分域之資料庫之一態樣，可列舉以下資料庫。
係以(i)序列互異之複數個抗體分子；或(ii)編碼為該序列互異之複數個抗體分子之核酸為主而成的資料庫，前述抗體分子係對於低分子化合物有結合活性之抗體分子，滿足以下(i)至(vi)中任一者以上之多樣性；
(i)重鏈CDR1之多樣性為13以上
(ii)重鏈CDR2之多樣性為129以上
(iii)重鏈CDR3之多樣性為5以上
(iv)輕鏈CDR1之多樣性為193以上
(iv)輕鏈CDR2之多樣性為7以上
(v)輕鏈CDR3之多樣性為17以上。
本態樣中，由複數個抗原結合分子為主而成之資料庫之記載中，「為主而成」之用語，係反映資料庫中之序列之不同獨立選殖體之數目當中，對於低分子化合物(例如：目標組織專一的化合物)有結合活性之抗原結合分子之數目。具體而言，顯 示如此結合活性之抗原結合分子在資料庫中至少有104個分子存在較佳。於另一表達中，資料庫中不同序列之獨立選殖體之數目中，依低分子之存在或不存在而抗原結合分域對於抗原之結合活性不同之抗原結合分子之比例，也可理想地表達。具體而言，本發明之抗原結合分域，可從顯示如此結合活性之抗原結合分子含於資料庫中不同序列之獨立選殖體之數目之10-6%%至80%，較佳為10-5%至60%，更佳為10-4%至40%，更佳為10-3%至40%，又更佳為10-2%至40%的資料庫取得。融合多胜肽、聚核苷酸分子或載體之情形，亦與上述相同，可由分子數目或在分子全體之比例表達。又，病毒之情形，亦與上述相同，可由病毒個體之數目或在個體全體之比例表達。
本發明中，作為能取得因應低分子化合物之濃度而改變對於抗原之結合活性之抗原結合分域之資料庫之一態樣，可列舉以下資料庫。
一種資料庫，該資料庫係由以下(i)或(ii)為主而成的資料庫，(i)序列互不相同之複數個抗原結合分域或含有抗原結合分域之抗原結合分子；或(ii)編碼為該序列互不相同之複數個抗原結合分域或含有抗原結合分域之抗原結合分子之核酸；用於取得前述抗原結合分子分域或抗原結合分子係對於低分子化合物有結合活性之抗原結合分域或含有抗原結合分域之抗原結合分子，且因應低分子化合物之濃度而改變對於抗原之結合活性之抗原結合分域或含有抗原結合分域之抗原結 合分子。
本態樣中，由複數個抗原結合分子為主而成之資料庫之記載中，「為主而成」之用語，係反映資料庫中之序列之不同獨立選殖體之數目當中，對於低分子化合物(例如：目標組織專一的化合物)有結合活性之抗原結合分子之數目。具體而言，顯示如此結合活性之抗原結合分子在資料庫中至少有104個分子存在較佳。於另一表達中，資料庫中不同序列之獨立選殖體之數目中，依低分子之存在或不存在而抗原結合分域對於抗原之結合活性不同之抗原結合分子之比例，也可理想地表達。具體而言，本發明之抗原結合分域，可從顯示如此結合活性之抗原結合分子含於資料庫中不同序列之獨立選殖體之數目之10-6%%至80%，較佳為10-5%至60%，更佳為10-4%至40%，更佳為10-3%至40%，又更佳為10-2%至40%的資料庫取得。融合多胜肽、聚核苷酸分子或載體之情形，亦與上述相同，可由分子數目或在分子全體之比例表達。又，病毒之情形，亦與上述相同，可由病毒個體之數目或在個體全體之比例表達。
因低分子存在或不存在而使抗原結合分域對於抗原之結合活性改變之胺基酸
關於製造資料庫時使用之模板(因應低分子化合物之濃度而改變對於抗原之結合活性之抗原結合分域或對於低分子化合物有結合活性之抗原結合分域)之取得方法(篩選方法)，可以將該等抗原結合分域等任意地製備，可從預先存在之抗原結合分域或抗體、預先存在之資料庫(噬菌體資料庫等)、由對於動物免疫獲得之融合瘤或來自免疫動物之B細胞製作之抗體 或資料庫，與不限定的作為低分子化合物之一態樣的腺苷或ATP適當連結之高免疫原性之T細胞抗原決定部位胜肽之類的佐劑作用劑間之連結物(conjugate)免疫之動物之B細胞等免疫細胞製作之抗體或資料庫等。作為該T細胞抗原決定部位胜肽之一非限定例，可理想地列舉來自Tetanus toxin之p30幫助者胜肽(以序列編號：4表示，也稱為Fragment C(FrC))等。
作為依前述篩選方法取得之本發明之抗原結合分域或抗體之製備法之一非限定態樣，例如：存在於活體內之細胞膜蛋白質Avimer所含之約35個胺基酸之稱為A分域之模組、包含於細胞膜表現之糖蛋白質fibronectin中之蛋白質所結合之域10Fn3分域之Adnectin、以構成由ProteinA之58個胺基酸構成的3個螺旋束(bundle)的IgG結合分域為支架(scaffold)的Affibody、具含33個胺基酸殘基之轉彎(turn)與2個反向並行之螺旋以及迴圈的次單元返覆層疊的構造的ankyrin返覆(ankyrin repeat：AR)之分子表面所露出之區DARPins(Designed Ankyrin Repeat proteins)、將嗜中性球明膠酶結合lipocalin(neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL))等lipocalin分子中高度保守的8個反向並行的股中央方向扭曲成的活塞桶(barrel)構造的單側予以支撐的4個迴圈區Anticalin等、就八目鰻、沼田鰻等無顎類之獲得免疫系統而言不具免疫球蛋白之構造的可變性淋巴球受體(variable lymphocyte receptor(VLR))之富含白胺酸殘基之返覆(leucine-rich-repeat(LRR))模組返覆疊層而獲得之馬蹄形構造之內部之平行型片構造之中空區等構成的資料庫。
本發明之抗原結合分域之較佳例，例如含抗體之重鏈及輕鏈之可變區的抗原結合分域。如此的抗原結合分域，例如「scFv(single chain Fv)」、「單鏈抗體(single chain antibody)」、「Fv」、「scFv2(single chain Fv 2)」、「Fab」或「F(ab')2」或IgG等為較佳，亦可使用由此等構成的資料庫。
再者，作為依前述篩選方法取得之本發明之抗原結合分域或抗體之製備法之一非限定態樣，可採用使用前述資料庫依淘選製造對於低分子化合物有結合活性之抗原結合分域或抗體之手法。資料庫不限於此等，可使用噬菌體展示資料庫、核糖體展示資料庫、mRNA展示資料庫、cDNA展示資料庫、CIS展示資料庫、E.coli展示資料庫、革蘭氏陽性菌展示資料庫、酵母展示資料庫、哺乳類細胞展示資料庫、病毒展示資料庫、反轉錄病毒展示資料庫等。
作為利用前述淘選製備對於低分子化合物有結合活性之抗原結合分域或抗體之手法之一態樣，可使用固定於珠等擔體的低分子化合物。可依：將被固相化的低分子化合物以化學性地介由連結子連接於生物素之狀態合成的低分子化合物，和固定有鏈黴抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白的珠或板接觸之手法、以和牛血清白蛋白(BSA)等佐劑利用共價鍵而連接之低分子化合物利用疏水交互作用而黏著於珠或板之手法等製作，但不限於此。該等方法已公知(J Immunol Methods.2003 Sep；280(1-2)：139-55、BMC Biotechnol.2009 Jan 29；9：6.doi：10.1186/1472-6750-9-6)。藉由將該等對已固相化的低分子化合物有結合活性之抗原結合分域或抗體回收，能製備對於低 分子化合物有結合活性之抗原結合分域或抗體。
或，作為利用前述淘選製備對於低分子化合物有結合活性之抗原結合分域或抗體之手法之另一態樣，可使用經螢光標識之低分子化合物、經生物素標識之低分子化合物與經螢光標識之鏈黴抗生物素蛋白(streptavidin)(或中性抗生物素蛋白或抗生物素蛋白)。對於提示在細胞等表面的資料庫，使該經螢光標識之低分子化合物、或經生物素標識之低分子化合物與經螢光標識之鏈黴抗生物素蛋白(或中性抗生物素蛋白或抗生物素蛋白)接觸後，使用fluorescence activated cell sorting(FACS)法可製備該對於低分子化合物有結合活性之抗原結合分域或抗體。該等方法已公知(Proc Natl Acad Sci U S A.2000 Sep 26；97(20)：10701-5.)。
又，作為利用前述淘選製備對於低分子化合物有結合活性之抗原結合分域或抗體之手法之另一態樣，可使用已存在之對於低分子化合物有結合活性之抗原結合分域。例如：雖不限於此，當以腺苷及/ATP為例時，可將對ATP有結合活性之屬激酶家族的分子作為抗原結合分域，且可將對腺苷有結合活性之屬於腺苷去胺酶家族的分子作為抗原結合分域。藉由將涉及該等ATP、腺苷之結合之部分予以資料庫化，可取得對於ATP、腺苷濃度依存地結合於抗原之抗原結合分子。
作為使用非抗體狀蛋白質之抗原結合分域之取得法，雖不限於此，可採用使用該非抗體狀蛋白質之迴圈形成部位、α螺旋之表面殘基等的資料庫。如此的資料庫的構建法已公知(Nat Biotechnol.2004 May；22(5)：575-82、J Mol Biol.1998 Dec 11；284(4)：1141-51.、Nat Biotechnol.1997 Aug；15(8)：772-7)。再者，如上述，使用構建的資料庫依淘選取得對於低分子化合物有結合活性之抗原結合分域的技術也公知。舉一例，將構建的資料庫利用噬菌體展示法在噬菌體表面表現。表現結合於和牛血清白蛋白、生物素等連接的低分子化合物的結合分域的噬菌體，可使用珠、免疫管、板等選擇。對如此的低分子化合物有結合活性之非抗體狀抗原結合分域之取得法已公知(Proc Natl Acad Sci U S A.1999 Mar 2；96(5)：1898-903)。再者，該等對於低分子化合物有結合活性之抗原結合分域雖不限於此，但藉由結晶結構解析、製作變異體並評價結合活性，可指出未涉及向低分子化合物之結合之胺基酸部位、對於典型結構之形成不重要之胺基酸部位(J Mol Biol.2003 Jul 4；330(2)：385-96、Proteins.2003 Oct 1；53(1)：121-9)。以如此的方式對於特定胺基酸部位導入多樣性，可建構本發明之資料庫。再者，本發明中，作為另一態樣，也可使用限定了胺基酸部位的資料庫。舉一非限定例，據報告為非抗體狀抗原結合分域的嗜中球明膠酶結合Lipocalin(neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL))等Lipocalin分子中，支持高度保守的8個逆並行股向中央方向扭轉而成的桶(barrel)結構的單側的4個迴圈區域Anticalin中，使用在結合於低分子化合物之結合的胺基酸部位、與使用在結合於蛋白質的結合的胺基酸部位已知係為不同，可以使用改變了涉及對於其分別的結合的胺基酸部位的彼此互異的資料庫為公知(FEBS Lett.2014 Jan 21；588(2)：213-8)。所以，從可取 得對於低分子化合物之結合分域的資料庫取得該對於低分子化合物有結合活性之抗原結合分域後，對於所取得之該對於低分子化合物有結合活性之抗原結合分域，藉由對於為了取得對於蛋白質有結合活性之抗原結合分域而使用的胺基酸部位導入多樣性，可建構本發明之資料庫。更具體而言，人Lipocalin2(Human lipocalin2,Lcn2)中，V33、L36、I41、Y52、T54、S68、L70、W79、R81、K134、T136、Y138各胺基酸部位可作為低分子化合物結合分域取得用資料庫之多樣性導入部位(J Am Chem Soc.2009 Mar 18；131(10)：3565-76)，同樣，A40、L42、E44、K46、D47、Q49、K50、L70、R72、K73、D 77、W79、P101、G102、L103、K125、S127、Q128、R130、Y132各胺基酸部位可作為蛋白質結合分域取得用資料庫之多樣性導入部位係為公知(Proc Natl Acad Sci U S A.2009 May 19；106(20)：8198-203)。所以，首先使用含有在V33、L36、I41、Y52、T54、S68、L70、W79、R81、K134、T136、Y138各胺基酸部位帶有多樣性的抗原結合分域的資料庫，取得該對於低分子化合物有結合活性之抗原結合分域之後，對於所取得之該對於低分子化合物有結合活性之抗原結合分域，對於A40、L42、E44、K46、D47、Q49、K50、R72、K73、D77、P101、G102、L103、K125、S127、Q128、R130、Y132各胺基酸部位導入多樣性，可以建構本發明之資料庫，但不限於此。關於Lipocalin分子以外之非抗體狀抗原結合分域及抗體，該技術領域中有通常知識者也可藉由適當參考上述資料庫之構建方法而製造本發明之資料庫。又，作為其他的一態樣，可以利用對 於低分子化合物有結合活性之抗原結合分域。就一例而言，可利用已公知對於ATP、ADP、AMP及腺苷有結合活性之屬於Lipocalin家族之Rhodnius prolixus aggregation inhibitorl(RPAI-1)(J Biol Chem.2000 Apr 28；275(17)：12639-50、Biochemistry.2002 Mar 19；41(11)：3810-8)。雖不限定，但可藉由解析該抗原結合分域之結晶結構、製作變異體並評價結合活性，以指出未涉及向低分子化合物之結合的胺基酸部位、對於典型結構之形成不重要之胺基酸部位。藉由以此方式在指定的胺基酸部位導入多樣性，可建構本發明之資料庫。ATP、ADP、AMP及腺苷以外，對於組織胺、血清素、腎上腺素、去甲腎上腺素等各種低分子化合物有結合活性之屬於Lipocalin家族之抗原結合分域之存在為公知(J Biol Chem.2003 Feb 14；278(7)：4611-7、Expert Rev Clin Immunol.2007 Jul；3(4)：491-501)，可藉由使用此等，以建構使用了各種對於低分子化合物有結合活性之抗原結合分域的本發明的資料庫，但不限定於此。
關於其他非抗體狀抗原結合分域及抗體，該技術領域中有通常知識者也可適當參考上述資料庫之構建方法以製造本發明之資料庫。
作為本發明之一非限定態樣，以腺苷及/或ATP為例，詳細說明如下，但關於腺苷及/或ATP以外之低分子，也可依據下列例適當適用。如前述，作為因腺苷及/或ATP存在或不存在而改變抗原結合分子對於抗原之結合活性的胺基酸，可列舉形成腺苷及/或ATP結合模體的胺基酸。前述胺基 酸在被含有之抗原結合分域中之胺基酸位置不限於特定位置，只要能因腺苷及/或ATP存在或不存在而改變抗原結合分域對於抗原之結合活性，可為形成抗原結合分域之重鏈可變區或輕鏈可變區中任一位置。亦即，本發明之抗原結合分域，可由因腺苷及/或ATP存在或不存在而改變抗原結合分子對於抗原之結合活性的胺基酸含於重鏈抗原結合分域的序列互異之抗原結合分子為主而成資料庫取得。於一非限定態樣中，本發明之抗原結合分域，可由因腺苷及/或ATP存在或不存在而改變抗原結合分子對抗原之結合活性的胺基酸係含於重鏈之CDR1、CDR2、及/或CDR3的序列互異之抗原結合分子為主的資料庫取得。於非限定之另一態樣中，本發明之抗原結合分域，可由因腺苷及/或ATP存在或不存在而改變抗原結合分子對於抗原之結合活性的胺基酸係含於重鏈之FR1、FR2、FR3及/或FR4的序列互異之抗原結合分子為主而成的資料庫取得。
又，本發明之一態樣中，本發明之抗原結合分域，可由因腺苷及/或ATP存在或不存在而改變抗原結合分子對於抗原之結合活性的胺基酸係含於重鏈及/或輕鏈之抗原結合分域的序列互異之抗原結合分子為主的資料庫取得。一非限定態樣中，本發明之抗原結合分域，可由因腺苷及/或ATP存在或不存在而改變抗原結合分子對於抗原之結合活性的胺基酸係含於重鏈及/或輕鏈之CDR1、CDR2、及/或CDR3的序列互異之抗原結合分子為主而成的資料庫取得。於非限定之另一態樣，本發明之抗原結合分域，可由因腺苷及/或ATP存在或不存在而改變抗原結合分子對於抗原之結合活性的胺基酸係含 於重鏈及/或輕鏈之FR1、FR2、FR3及/或FR4的序列互異之抗原結合分子為主而成的資料庫。
作為如此的胺基酸之一非限定態樣，可列舉重鏈可變區所含之52位、52a位、53位、96位、100a位、或100c位之胺基酸中之任1個以上之胺基酸等。又，如此的胺基酸之一非限定態樣，可列舉重鏈可變區所含之52位之Ser、52a位之Ser、53位之Arg、96位之Gly、100a位之Leu、100c位之Trp等胺基酸中之任1個以上之胺基酸。
抗原結合分子之輕鏈及/或重鏈可變區之框架序列，只要是因腺苷及/或ATP存在或不存在而改變抗原結合分子對於抗原之結合活性的胺基酸含於重鏈及/或輕鏈之抗原結合分域即可，任意框架序列均可使用。框架序列的起源不限定，可從非人動物之任意生物或人取得。較佳的任意生物可列舉選自小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、沙鼠、貓、兔、狗、山羊、綿羊、牛、馬、駱駝、及非人靈長類動物的生物。尤其理想實施形態中，抗原結合分子之輕鏈及/或重鏈可變區之框架序列宜具有人生殖細胞系框架序列。因此本發明之一態樣中，框架序列若完全為人的序列，則對於人投予(例如疾病之治療)時，據認為本發明之抗原結合分子幾乎或完全不會引起免疫原性反應。由上述含意，本發明之「含有生殖細胞系列之序列」，係指本發明之框架序列之一部分和任一人生殖細胞系框架序列之一部分為相同。具體而言，本發明之框架序列，宜和生殖細胞系列序列有至少50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、或100%以上之相同性較佳。例如：本發明之抗 原結合分子之重鏈FR2之序列係複數個不同之人生殖細胞系框架序列之重鏈FR2序列組合成的序列時，亦為本發明之「含生殖細胞系列之序列」的抗原結合分子。又，本發明之抗原結合分子之框架序列為經取代之序列時，亦為本發明之「含生殖細胞系列之序列」的抗原結合分子。作為如此的經取代之序列，特別例如人生殖細胞系框架序列之一部分胺基酸取代為因腺苷及/或ATP存在或不存在而改變抗原結合分子對於抗原之結合活性的胺基酸而成的序列。
框架，例如在V-Base(http：//vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)等網站包含的現在已知的完全人型框架區域之序列為理想。該等框架區域之序列可適當使用於作為本發明之抗原結合分子所含之生殖細胞系列之序列。生殖細胞系列之序列可依其類似性分類(Tomlinson等(J.Mol.Biol.(1992)227,776-798)Williams及Winter(Eur.J.Immunol.(1993)23,1456-1461)及Cox等(Nat.Genetics(1994)7,162-168))。可從分類成7個次群組的Vκ、分類成10個次群組的Vλ、分類成7個次群組的VH，適當選出理想的生殖細胞系列的序列。
完全人型的VH序列不只限於下列，但可舉例如VH1次群組(例如：VH1-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH1-24、VH1-45、VH1-46、VH1-58、VH1-69)、VH2次群組(例如：VH2-5、VH2-26、VH2-70)、VH3次群組(VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-33、VH3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、 VH3-64、VH3-66、VH3-72、VH3-73、VH3-74)、VH4次群組(VH4-4、VH4-28、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-59、VH4-61)、VH5次群組(VH5-51)、VH6次群組(VH6-1)、VH7次群組(VH7-4、VH7-81)之VH序列等為理想例。此等在公知文獻(Matsuda等(J.Exp.Med.(1998)188,1973-1975))等也有記載，該技術領域中有通常知識者可依據該等序列資訊適當設計本發明之抗原結合分子。此等以外之完全人型之框架或框架之準區域也可理想地使用。
完全人型的Vκ序列不只限於下列，但可舉例如分類為Vk1次群組之A20、A30、L1、L4、L5、L8、L9、L11、L12、L14、L15、L18、L19、L22、L23、L24、O2、O4、O8、O12、O14、O18、分類為Vk2次群組之A1、A2、A3、A5、A7、A17、A18、A19、A23、O1、O11、分類為Vk3次群組之A11、A27、L2、L6、L10、L16、L20、L25、分類為Vk4次群組之B3、分類為Vk5次群組之B2(本說明書中，也記載為Vk5-2))、分類為Vk6次群組之A10、A14、A26等(Kawasaki等(Eur.J.Immunol.(2001)31,1017-1028)、Schable及Zachau(Biol.Chem.Hoppe Seyler(1993)374,1001-1022)及Brensing-Kuppers等(Gene(1997)191,173-181))為理想例。
完全人型之Vλ序列不只限於下列，可舉例如分類為VL1次群組之V1-2、V1-3、V1-4、V1-5、V1-7、V1-9、V1-11、V1-13、V1-16、V1-17、V1-18、V1-19、V1-20、V1-22、分類為VL1次群組之V2-1、V2-6、V2-7、V2-8、V2-11、V2-13、V2-14、V2-15、V2-17、V2-19、分類為VL3次群組之V3-2、 V3-3、V3-4、分類為VL4次群組之V4-1、V4-2、V4-3、V4-4、V4-6、分類為VL5次群組之V5-1、V5-2、V5-4、V5-6等(Kawasaki等(Genome Res.(1997)7,250-261))為理想例。
通常該等框架序列由於一個或更多胺基酸殘基的不同而彼此互異。該等框架序列可以與本發明之「依腺苷及/或ATP存在或不存在使抗原結合分域對於抗原之結合活性變化之至少一個胺基酸殘基」一起使用。與本發明之「依腺苷及/或ATP存在或不存在使抗原結合分域對於抗原之結合活性變化之至少一個胺基酸殘基」一起使用之完全人類型之框架之例，不僅限定於此，其他也有比如KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY、POM等(例如前述Kabat等人(1991)及Wu等人(J.Exp.Med.(1970)132,211-250))。
本發明不拘於特定理論，在使用生殖細胞系序列能期待排除幾乎於個人的有害免疫反應之理由之一，據認為係如下所述。由於在通常之免疫反應中發生之親和性成熟步驟，會在免疫球蛋白之可變區頻繁地發生體細胞之突變。該等突變主要產生在其該序列為超可變的CDR的周邊，但也會影響到框架區的殘基。該等框架的突變在生殖細胞系之基因不存在，成為患者之免疫原性的可能性少。據推論此係通常之人類族群係已暴露於由生殖細胞系之基因表現的框架序列中的大複數個，而有免疫寛容，可預測該等生殖細胞系之框架在患者為低免疫原性或非免疫原性。為了使免疫寛容之可能性最大，可從普通存在之機能性生殖細胞系基因之集合選擇編碼為可變區之基因。
為了製作本發明之依腺苷及/或ATP存在或不存在使抗原結合分域對於抗原之結合活性變化之胺基酸包含於可變區序列之序列、重鏈可變區或輕鏈可變區之序列、或CDR序列或框架序列之抗原結合分子，可適當採用部位專一性的變異誘發法(Kunkel等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82,488-492))或Overlap extension PCR等公知方法。
例如，可藉由將選擇預先含有依腺苷及/或ATP存在或不存在使抗原結合分域對於抗原之結合活性變化之至少一個胺基酸殘基之作為CDR序列及/或框架序列之輕鏈可變區、及製作為隨機化可變區序列資料庫之重鏈可變區予以組合，而製作本發明之含有複數個序列彼此互異之抗原結合分子之資料庫。
又，在選擇預先含有前述依腺苷或ATP存在或不存在使抗原結合分域對於抗原之結合活性變化之至少一個胺基酸殘基之作為CDR序列及/或框架序列之重鏈及/或輕鏈可變區之序列中，也可設計使得含有多樣的胺基酸作為該胺基酸殘基以外之殘基。本發明中，如此之殘基稱為柔性殘基。本發明之抗原結合分子對於抗原之結合活性，只要會依組織專一的化合物之濃度之條件改變即可，該柔性殘基之數目及位置不限定於特定態樣。亦即重鏈及/或輕鏈之CDR序列及/或FR序列可包括一個或更多柔性殘基。是否能將柔性殘基及其殘基取代為其他某一胺基酸而資料庫化，可藉由進行腺苷及/或ATP與抗體之複合體之結晶結構解析或變異導入以鑑別。例如：可從腺苷及/或ATP與抗體之複合體之結晶結構解析，鑑別未涉及 腺苷及/或ATP之結合之抗體之殘基。可選擇鑑別為即使將未涉及腺苷及/或ATP之結合鑑別之殘基取代為其他胺基酸仍能維持對於化合物之適度結合之胺基酸。藉此，能設計在選擇之殘基出現經選擇之胺基酸之資料庫。於此情形，可設計由複數個抗原結合分子為主而成之資料庫，以使得成為鑑別為未涉及腺苷及/或ATP之結合之殘基取代為彼此不同之胺基酸而得之抗原結合分子之集合。亦即，藉由組合取代為彼此互異之胺基酸之各個柔性殘基，可帶來含有該柔性殘基之抗原結合分子之序列之多樣性。
又，可設計含有該等殘基之抗原結合分子，使得鑑別為涉及腺苷及/或ATP之結合之殘基中至少一個成為選自該殘基及與該殘基不同之殘基之任意殘基。作為鑑別為涉及腺苷及/或ATP之結合之胺基酸之一非限定態樣，可列舉重鏈可變區所含之52位、52a位、53位、96位、100a位、或100c位之胺基酸中之任一者以上之胺基酸等。又，作為如此之胺基酸之一非限定態樣，可列舉重鏈可變區所含之52位之Ser、52a位之Ser、53位之Arg、96位之Gly、100a位之Leu、100c位之Trp等胺基酸中之任一者以上之胺基酸。例如：前述100a位之Leu鑑別為涉及腺苷及/或ATP之結合之情形，資料庫中包含之抗原結合分子之100a位之胺基酸殘基，除了Leu以外，也可為選自His、Met、Leu、Arg、Trp、或Tyr中之任一者之柔性殘基之胺基酸殘基。
作為前述柔性殘基之一非限定態樣，可列舉重鏈可變區所含之31位、32位、33位、35位、50位、55位、56 位、57位、58位、59位、95位、96位、97位、98位、99位、100位、100a位、及100b位之胺基酸。作為如此之胺基酸之另一非限定態樣，可列舉輕鏈可變區所含之26位、27位、27a位、27b位、27c位、28位、29位、31位、32位、50位、51位、52位、53位、54位、55位、89位、90位、91位、92位、93位、94位、95a位、96位、及97位之胺基酸。
作為前述柔性殘基之一非限定態樣，可列舉係重鏈可變區所含之胺基酸：31位之胺基酸為Asp、Gly、Asn、Ser、Arg、或Thr中之任一者、32位之胺基酸為Ala、Phe、His、Asn、Ser、或Tyr中之任一者、33位之胺基酸為Ala、Glu、Asp、Gly、Phe、Ile、His、Lys、Met、Leu、Asn、Gln、Pro、Ser、Arg、Trp、Val、Tyr、或Thr中之任一者、35位之胺基酸為His、Ser、Thr、Tyr、或Asn中之任一者、50位之胺基酸為Ala、Glu、Asp、Gly、Phe、Ile、His、Lys、Met、Leu、Asn、Gln、Pro、Arg、Thr、Trp、Val、Tyr、或Ser中之任一者、55位之胺基酸為Ala、Glu、Asp、Gly、Leu、Thr、Ser、Arg、或Asn中之任一者、56位之胺基酸為Ala、Glu、Asp、Gly、Phe、Ile、His、Lys、Met、Leu、Gln、Pro、Ser、Thr、Trp、Val、或Tyr中之任一者、 57位之胺基酸為Ala、Lys、Arg、Thr、或Ile中之任一者、58位之胺基酸為Asp、Gly、Phe、His、Ser、Thr、Tyr、或Asn中之任一者、59位之胺基酸為Leu、或Tyr中之任一者、95位之胺基酸為Ala、Ile、Lys、Met、Leu、Arg、Trp、Val、Tyr、或Phe中之任一者、96位之胺基酸為Ala、Asp、Asn、或Ser中之任一者、97位之胺基酸為Ala、Asp、Gly、Ile、His、Lys、Met、Leu、Asn、Ser、Val、Tyr、或Arg中之任一者、98位之胺基酸為Ala、Glu、Asp、Gly、Phe、Ile、His、Met、Leu、Asn、Gln、Pro、Ser、Arg、Thr、Trp、Val、Tyr、或Lys中之任一者、99位之胺基酸為Ala、Glu、Asp、Phe、His、Lys、Asn、Gln、Ser、Arg、Trp、Val、Tyr、或Gly中之任一者、100位之胺基酸為Ala、Glu、Gly、Phe、Ile、His、Lys、Met、Leu、Asn、Gln、Pro、Ser、Arg、Thr、Trp、Val、Tyr、或Asp中之任一者、100a位之胺基酸為Ala、Phe、Ile、His、Lys、Met、Arg、Trp、Val、或Tyr中之任一者、或100b位之胺基酸為Ala、Glu、Asp、Gly、Phe、Ile、His、Lys、Met、Leu、Gln、Pro、Ser、Arg、Thr、Trp、Val、Tyr、或Asn中之任一者之胺基酸。
作為前述柔性殘基之一非限定態樣，可列舉係輕鏈可變區所含之胺基酸： 26位之胺基酸為Ala、Ser、或Thr中之任一者、27位之胺基酸為Thr、或Ser中之任一者、27a位之胺基酸為Gly、Asn、Thr、或Ser中之任一者、27b位之胺基酸為Asn、或Asp中之任一者、27c位之胺基酸為Ile、或Val中之任一者、28位之胺基酸為Asp、或Gly中之任一者、29位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Ser、Arg、Thr、Tyr、或Gly中之任一者、31位之胺基酸為Glu、Asp、Lys、或Asn中之任一者、32位之胺基酸為Ala、Asp、Ser、Thr、或Tyr中之任一者、50位之胺基酸為Asp、Gly、Lys、Asn、Gln、Ser、Arg、Tyr、或Glu中之任一者、51位之胺基酸為Asp、Gly、Lys、Asn、Thr、或Val中之任一者、52位之胺基酸為Ala、Asp、Asn、Thr、或Ser中之任一者、53位之胺基酸為Glu、Asp、His、Asn、Gln、Ser、Tyr、或Lys中之任一者、54位之胺基酸為Lys、或Arg中之任一者、55位之胺基酸為Leu、或Pro中之任一者、89位之胺基酸為Ala、Gly、Phe、Leu、Asn、Gln、Thr、Val、Tyr、或Ser中之任一者、90位之胺基酸為Ala、Leu、Thr、Val、或Ser中之任一者、91位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、His、Lys、Asn、Ser、 Arg、Thr、Trp、Val、或Tyr中之任一者、92位之胺基酸為Glu、Asp、Ser、Arg、Thr、Val、Tyr、或Ala中之任一者、93位之胺基酸為Ala、Asp、Ile、Asn、Ser、Arg、Thr、Val、Tyr、或Gly中之任一者、94位之胺基酸為Ala、Asp、Gly、Ile、Asn、Arg、Thr、或Ser中之任一者、95位之胺基酸為Ala、Glu、Asp、Gly、Phe、Ile、His、Lys、Met、Leu、Gln、Pro、Ser、Arg、Thr、Trp、Val、Tyr、或Asn中之任一者、95a位之胺基酸為Ala、Glu、Asp、Gly、Ile、His、Lys、Leu、Gln、Pro、Ser、Arg、Thr、Tyr、或Asn中之任一者、96位之胺基酸為Ala、Asp、Gly、Phe、His、Lys、Leu、Asn、Gln、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val中之任一者、或97位之胺基酸為Ala、Gly、Ile、Met、Leu、Ser、或Val中之任一者之胺基酸。
作為本發明之一態樣，低分子化合物為犬尿胺酸時，能否將柔性殘基及其殘基取代為其他的哪個胺基酸並資料庫化，可藉由犬尿胺酸與抗體之複合體之結晶結構解析、變異導入以鑑別。例如：從犬尿胺酸與抗體之複合體之結晶結構解析，可以鑑別未涉及犬尿胺酸之結合的抗體的殘基。可選擇即使將鑑別為未涉及犬尿胺酸之結合的殘基取代為其他胺基酸，仍維持向化合物之適當程度結合的胺基酸。藉此，可設計選擇之殘基中，出現選擇之胺基酸的資料庫。此時，可以設計 由複數個抗原結合分子為主而成的資料庫，使成為鑑別為未涉及犬尿胺酸之結合的殘基取代為彼此不同之胺基酸而得的抗原結合分子的集合。亦即，藉由將取代為互異之胺基酸的各個柔性殘基予以組合，可帶來含有該柔性殘基之抗原結合分子的序列之多樣性。
又，可將鑑別為涉及犬尿胺酸之結合的殘基的至少一個成為從該殘基及和該殘基不同之殘基選擇的任意殘基的方式，設計含該等殘基之抗原結合分子。作為鑑別為涉及犬尿胺酸之結合之胺基酸一非限定態樣，就其側鏈涉及和犬尿胺酸之結合之胺基酸殘基，可舉H鏈：P97、R100c、D101(Kabat編號)、L鏈：H49、F55(Kabat編號)之胺基酸中之任1個以上之胺基酸為例。又，作為在主鏈部分密切涉及和犬尿胺酸之結合的胺基酸殘基，可列舉H鏈：R94、D95、R100c、G100d、A100e之胺基酸中之任1個以上之胺基酸。再者，從X射線結晶結構，就H鏈CDR3之結構維持和犬尿胺酸之結合構形方面為重要的殘基，可列舉H鏈：P97、P100b、G100d之胺基酸中之任1個以上之胺基酸。
本發明中，低分子為犬尿胺酸時之柔性殘基之一非限定態樣，可列舉重鏈可變區所含之24位、26位、27位、28位、29位、30位、31位、32位、33位、50位、51位、52位、52a位、53位、54位、55位、56位、58位、73位、95位、96位、97位、98位、99位、100位、100a位、100b位、100c位、100d位、100e位、100f位、及102位之胺基酸。如此的胺基酸的另一非限定態樣，可列舉輕鏈可變區所含之27d 位、27e位、28位、29位、32位、46位、49位、50位、51位、52位、53位、54位、55位、92位、93位、及94位之胺基酸。
作為前述柔性殘基之一非限定態樣，可列舉係重鏈可變區所含之胺基酸：24位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中之任一者、26位之胺基酸為Gly、Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中之任一者、27位之胺基酸為Gly、Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中之任一者、28位之胺基酸為Thr、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp、或Tyr中之任一者、29位之胺基酸為Phe、Ile、Leu、Trp、或Tyr中之任一者、30位之胺基酸為Ser、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp、或Tyr中之任一者、31位之胺基酸為Ser、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Gln、Arg、Thr、Val、Trp、或Tyr中之任一者、 32位之胺基酸為Tyr、Phe、或His中之任一者、33位之胺基酸為Ala、Gly、Ile、Lys、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、或Trp中之任一者、50位之胺基酸為Gly、Ala、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中之任一者、51位之胺基酸為Ile、Ala、Gly、Lys、Leu、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中之任一者、52位之胺基酸為Ile、Ala、Glu、Phe、His、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中之任一者、52a位之胺基酸為Pro、Ala、Gly、Ser、Thr、或Trp中之任一者、53位之胺基酸為Ile、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中之任一者、54位之胺基酸為Phe、Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中之任一者、55位之胺基酸為Gly、Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中之任一者、56位之胺基酸為Thr、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp、或Tyr 中之任一者、58位之胺基酸為Asn、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中之任一者、73位之胺基酸為Glu、Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、或Tyr中之任一者、95位之胺基酸為Asp、或Gly中之任一者、96位之胺基酸為Ala、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中之任一者、97位之胺基酸為Pro、Ala、Asn、或Ser中之任一者、98位之胺基酸為Val、Leu、或Thr、中之任一者、99位之胺基酸為Val、Ala、Asp、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、或Tyr中之任一者、100位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中之任一者、100a位之胺基酸為Arg、Ala、Asp、Glu、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr或Val中之任一者、100b位之胺基酸為Pro、Ala、Lys、Asn、Gln、Arg或Ser中之任一者、100c位之胺基酸為Arg、His、Lys、或Gln中之任一者、100d位之胺基酸為Gly、或Asn中之任一者、100e位之胺基酸為Ala、Gly或Ser中之任一者、 100f位之胺基酸為Phe、或Leu中之任一者、或102位之胺基酸為Ile、Ala、Asp、Glu、Phe、His、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Thr、Val、Trp、或Tyr中之任一者的胺基酸。
作為前述柔性殘基之一非限定態樣，可列舉為輕鏈可變區所含之胺基酸：27d位之胺基酸為His、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中之任一者、27e位之胺基酸為Ser、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp、或Tyr中之任一者、28位之胺基酸為Asp、Ala、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中之任一者、29位之胺基酸為Gly、Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中之任一者、32位之胺基酸為Tyr、Ala、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gln、Arg、Val、或Trp中之任一者、46位之胺基酸為Leu、Ile、Met、Asn、或Val中之任一者、49位之胺基酸為Tyr、Phe、His、或Trp中之任一者、50位之胺基酸為Glu、Ala、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Gln、Ser、Thr、Val、或Tyr中之任一者、 51位之胺基酸為Ile、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、Lys、Leu、Met、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中之任一者、52位之胺基酸為Ser、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Gln、Arg、Thr、Val、Trp、或Tyr中之任一者、53位之胺基酸為Asn、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中之任一者、54位之胺基酸為、Arg、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中之任一者、55位之胺基酸為Phe、Leu、Met、Arg、或Tyr中之任一者、92位之胺基酸為Thr、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Gln、Arg、Ser、Val、Trp、或Tyr中之任一者、93位之胺基酸為Gln、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Asn、Arg、Ser、Thr、Val、或Tyr中之任一者、或94位之胺基酸為Phe、His、Ile、Lys、Asn、Gln、Arg、ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中之任一者之胺基酸。
本發明中，作為低分子為犬尿胺酸時之柔性殘基之一非限定態樣，可列舉重鏈可變區所含之28位、31位、33位、50位、51位、52位、54位、55位、56位、58位、96位、 97位、99位、100位、100a位、100b位、及100c位之胺基酸。如此的胺基酸的其他非限定態樣，可列舉輕鏈可變區所含之27d位、27e位、28位、29位、32位、52位、53位、54位、56位、92位、及93位之胺基酸。
作為本發明之一態樣，低分子化合物為腺苷時，能否將柔性殘基及其殘基取代為其他的哪個胺基酸並資料庫化，可藉由腺苷與抗體之複合體之結晶結構解析、變異導入以鑑別。例如：從腺苷與抗體之複合體之結晶結構解析，可以鑑別未涉及腺苷之結合的抗體的殘基。可選擇即使將鑑別為未涉及腺苷之結合的殘基取代為其他胺基酸，仍維持向化合物之適當程度結合的胺基酸。藉此，可設計選擇之殘基中，出現選擇之胺基酸的資料庫。此時，可以設計由複數個抗原結合分子為主而成的資料庫，使成為鑑別為未涉及腺苷之結合的殘基取代為彼此不同之胺基酸而得的抗原結合分子的集合。亦即，藉由將取代為互異之胺基酸的各個柔性殘基予以組合，可帶來含有該柔性殘基之抗原結合分子的序列之多樣性。
又，可將鑑別為涉及腺苷之結合的殘基的至少一個成為從該殘基及和該殘基不同之殘基選擇的任意殘基的方式，設計含該等殘基之抗原結合分子。作為鑑別為涉及腺苷之結合之胺基酸一非限定態樣，可舉H鏈：A33、I50、G52、S56、T57、W58、G99、Y100、T100a(Kabat編號)、L鏈：Y95c、N96(Kabat編號)之胺基酸中之任1個以上之胺基酸為例。
本發明中，低分子為腺苷時之柔性殘基之一非限 定態樣，可列舉重鏈可變區所含之31位、32位、53位、54位、55位、56位、57位、59位、61位、62位、65位、96位、97位、98位、100位、100a位、101位、及102位之胺基酸。作為如此的胺基酸之另一非限定態樣，可列舉輕鏈可變區所含之28位、29位、32位、93位、94位、95位、95a位、95b位、及95c位之胺基酸。
作為前述柔性殘基之一非限定態樣，可舉為重鏈可變區所含之胺基酸：31位之胺基酸為Asn、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中之任一者、32位之胺基酸為Tyr、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、或Trp中之任一者、53位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、或Tyr中之任一者、54位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Gln、Ser、Thr、Val、或Tyr中之任一者、55位之胺基酸為Ser、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Gln、Arg、Thr、Val、或Tyr中之任一者、56位之胺基酸為Ser、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Gln、Arg、Thr、或Val中之任一者、57位之胺基酸為Thr、Ala、Ile、Lys、Leu、Asn、Gln、Arg、Ser或Val中之任一者、59位之胺基酸為Tyr、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、 Ile、Lys、Leu、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、或Trp中之任一者、61位之胺基酸為Ser、Ala、Phe、His、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp、或Tyr中之任一者、62位之胺基酸為Trp、Ala、Asp、Glu、Phe、或Gly中之任一者、65位之胺基酸為Gly、Ala、Asp、Glu、Phe、Ile、Lys、Leu、Asn、Gln、Arg、Thr、Val、或Trp中之任一者、96位之胺基酸為Arg、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Asn、Gln、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中之任一者、97位之胺基酸為Phe、Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中之任一者、98位之胺基酸為Val、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、或Thr中之任一者、100位之胺基酸為Tyr或Phe中之任一者、100a位之胺基酸為Thr、Ser或Val中之任一者、101位之胺基酸為Asp、Ala、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中之任一者、或102位之胺基酸為Pro、Asp、或Asn中之任一者的胺基酸。
作為前述柔性殘基之一非限定態樣，可列舉為輕 鏈可變區所含之胺基酸：28位之胺基酸為Trp、Ala、Phe、His、Lys、Asn、Ser、Thr、Val、或Tyr中之任一者
29位之胺基酸為Asn、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中之任一者、32位之胺基酸為Tyr、Aa、Asp、Phe、Gly、或His中之任一者、93位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Leu、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、果Tyr中之任一者、94位之胺基酸為Asn、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中之任一者、95位之胺基酸為Ser、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp、或Tyr中之任一者、95a位之胺基酸為Gly、Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Val、Trp、或Tyr中之任一者、95b位之胺基酸為Trp、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、或Tyr中之任一者、或95c位之胺基酸為Tyr、Phe、His、Lys、Leu、Asn或Val中之任一者的胺基酸為例。
作為本發明之一態樣，低分子化合物為腺苷1磷酸時，能否將柔性殘基及其殘基取代為其他的哪個胺基酸並資料庫化，可藉由腺苷1磷酸與抗體之複合體之結晶結構解析、變異導入以鑑別。例如：從腺苷1磷酸與抗體之複合體之結晶結構解析，可以鑑別未涉及腺苷1磷酸之結合的抗體的殘基。可選擇即使將鑑別為未涉及腺苷1磷酸之結合的殘基取代為其他胺基酸，仍維持向化合物之適當程度結合的胺基酸。藉此，可設計選擇之殘基中，出現選擇之胺基酸的資料庫。此時，可以設計由複數個抗原結合分子為主而成的資料庫，使成為鑑別為未涉及腺苷1磷酸之結合的殘基取代為彼此不同之胺基酸而得的抗原結合分子的集合。亦即，藉由將取代為互異之胺基酸的各個柔性殘基予以組合，可帶來含有該柔性殘基之抗原結合分子的序列之多樣性。
又，可將鑑別為涉及腺苷1磷酸之結合的殘基的至少一個成為從該殘基及和該殘基不同之殘基選擇的任意殘基的方式，設計含該等殘基之抗原結合分子。鑑別為涉及和腺苷1磷酸之腺嘌呤環部分以及核糖部分之結合的胺基酸，和腺苷同樣，作為一非限定態樣，可舉H鏈：A33、I50、G52、S56、T57、W58、G99、Y100、T100a(Kabat編號)、L鏈：Y95c、N96(Kabat編號)之胺基酸中之任1個以上之胺基酸為例。又，鑑別為涉及和腺苷1磷酸之磷酸基部分之結合的胺基酸的一非限定態樣，可列舉H鏈CDR2之D54、S55、S56、T57、W58以及、L鏈CDR3之G95a、W95b、Y95c(Kabat編號)之胺基酸中之任1個以上之胺基酸為例。
作為前述柔性殘基之一非限定態樣，可舉為重鏈可變區所含之胺基酸：31位之胺基酸為Asn、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中之任一者、32位之胺基酸為Tyr、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、或Trp中之任一者、53位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、或Tyr中之任一者、54位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Gln、Ser、Thr、Val、或Tyr中之任一者、55位之胺基酸為Ser、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Gln、Arg、Thr、Val、或Tyr中之任一者、56位之胺基酸為Ser、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Gln、Arg、Thr、或Val中之任一者、57位之胺基酸為Thr、Ala、Ile、Lys、Leu、Asn、Gln、Arg、Ser或Val中之任一者、59位之胺基酸為Tyr、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、或Trp中之任一者、61位之胺基酸為Ser、Ala、Phe、His、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp、或Tyr中之任一者、62位之胺基酸為Trp、Ala、Asp、Glu、Phe、或Gly中之任一者、 65位之胺基酸為Gly、Ala、Asp、Glu、Phe、Ile、Lys、Leu、Asn、Gln、Arg、Thr、Val、或Trp中之任一者、96位之胺基酸為Arg、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Asn、Gln、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中之任一者、97位之胺基酸為Phe、Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中之任一者、98位之胺基酸為Val、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、或Thr中之任一者、100位之胺基酸為Tyr或Phe中之任一者、100a位之胺基酸為Thr、Ser或Val中之任一者、101位之胺基酸為Asp、Ala、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中之任一者、或102位之胺基酸為Pro、Asp、或Asn中之任一者的胺基酸為例。
作為前述柔性殘基之一非限定態樣，可舉為輕鏈可變區所含之胺基酸：28位之胺基酸為Trp、Ala、Phe、His、Lys、Asn、Ser、Thr、Val、或Tyr中之任一者
29位之胺基酸為Asn、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr 中之任一者、32位之胺基酸為Tyr、Ala、Asp、Phe、Gly、或His中之任一者、93位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Leu、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、或Tyr中之任一者、94位之胺基酸為Asn、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr中之任一者、95位之胺基酸為Ser、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp、或Tyr中之任一者、95a位之胺基酸為Gly、Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Val、Trp、或Tyr中之任一者、95b位之胺基酸為Trp、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、或Tyr中之任一者、或95c位之胺基酸為Tyr、Phe、His、Lys、Leu、Asn或Val中之任一者的胺基酸為例。
作為本發明之一態樣，低分子化合物為腺苷2磷酸、或腺苷3磷酸時，能否將柔性殘基及其殘基取代為其他的哪個胺基酸並資料庫化，可藉由腺苷2磷酸、或腺苷3磷酸與抗體之複合體之結晶結構解析、以及類似化合物腺苷與抗體之複合體之結晶結構的模擬、變異導入以鑑別。例如：從使用腺 苷2磷酸、或腺苷3磷酸與抗體之複合體之結晶結構解析的模擬，可以鑑別未涉及腺苷2磷酸、或腺苷3磷酸之結合的抗體的殘基。可選擇即使將鑑別為未涉及腺苷2磷酸、或腺苷3磷酸之結合的殘基取代為其他胺基酸，仍維持向化合物之適當程度結合的胺基酸。藉此，可設計選擇之殘基中，出現選擇之胺基酸的資料庫。此時，可以設計由複數個抗原結合分子為主而成的資料庫，使成為鑑別為未涉及腺苷2磷酸、或腺苷3磷酸之結合的殘基取代為彼此不同之胺基酸而得的抗原結合分子的集合。亦即，藉由將取代為互異之胺基酸的各個柔性殘基予以組合，可帶來含有該柔性殘基之抗原結合分子的序列之多樣性。
又，可將鑑別為涉及腺苷2磷酸、或腺苷3磷酸之結合的殘基的至少一個成為從該殘基及和該殘基不同之殘基選擇的任意殘基的方式，設計含該等殘基之抗原結合分子。鑑別為涉及和腺苷2磷酸、或腺苷3磷酸之腺嘌呤環部分以及核糖部分之結合的胺基酸，和腺苷同樣，作為一非限定態樣，可舉H鏈：A33、I50、G52、S56、T57、W58、G99、Y100、T100a(Kabat編號)、L鏈：Y95c、N96(Kabat編號)之胺基酸中之任1個以上之胺基酸為例。又，鑑別為涉及和腺苷2磷酸、或腺苷3磷酸之磷酸基部分之結合的胺基酸，可依據結晶結構和上述同樣實施推測，以預測能增加向腺苷2磷酸、或腺苷3磷酸之結合的改變。
本說明書中，柔性殘基係指當比較公知之及/或天然抗體或抗原結合分域之胺基酸序列時，在該位置提示之幾個 具有不同胺基酸之輕鏈及重鏈可變區上之胺基酸為非常多樣的位置所存在胺基酸殘基的變化(variation)。非常多樣的位置一般存在於CDR區。於一態樣中，當決定公知之及/或天然抗體之非常多樣的位置時，Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute of Health Bethesda Md.)(1987年及1991年)提供之資料係為有效。又，在網路上的許多資料庫(http：//vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/、http：//www.bioinf.org.uk/abs/index.html)，提供收集的複數個人類輕鏈及重鏈序列及其配置，該等序列及其配置的資訊在決定本發明中之非常多樣的位置時有用。依本發明，當胺基酸位在的位置較佳有約2至約20，更佳為約3至約19，較佳為約4至約18、較佳為5至17、較佳為6至16、較佳為7至15、較佳為8至14、較佳為9至13、較佳為10至12個可能的不同胺基酸殘基的多樣性時，其位置可稱為非常多樣。在一些實施形態中，有些胺基酸位置，可具有較佳為至少約2、較佳為至少約4、較佳為至少約6、較佳為至少約8、較佳為約10、較佳為約12之可能的相異胺基酸殘基的多樣性。
又，藉由組合導入有前述因低分子存在或不存在而使抗原結合分域對於抗原之結合活性改變之至少一個胺基酸殘基而得之輕鏈可變區及製作為作為隨機化可變區序列資料庫之重鏈可變區，也能製作本發明之含有複數個序列彼此互異之抗原結合分子之資料庫。同樣地，藉由組合導入有前述因低分子存在或不存在而使抗原結合分域對於抗原之結合活性改變之至少一個胺基酸殘基，且其他的胺基酸殘基為柔性殘基 所設計之重鏈可變區，也能製作本發明之含有複數個序列彼此互異之抗原結合分子之資料庫。
當組合導入有前述前述低分子化合物之濃度條件而使抗原結合分子之結合活性改變之輕鏈可變區及製作為作為隨機化可變區序列資料庫之重鏈可變區時，也和前述同樣，能設計成使柔性殘基含於該輕鏈可變區的序列。本發明之抗原結合分子對抗原之結合活性，只要可因腺苷及/或ATP存在或不存在而變化即可，該柔性殘基之數目及位置不限於特定態樣。亦即，重鏈及/或輕鏈之CDR序列及/或FR序列可含有一或更多柔性殘基。
作為被組合之重鏈可變區，例隨機化可變區資料庫為理想。隨機化可變區資料庫之製作方法可將公知方法適當組合。本發明之一非限定態樣中，經特定抗原免疫的動物、感染症患者、接種疫苗而血中抗體價上昇之人、癌患者、自體免疫病症之淋巴球來源之抗體基因為依據構建之免疫資料庫，可理想地作為隨機化可變區資料庫。
又，本發明之一非限定態樣中，基因體DNA中之V基因或再構建且有功能的V基因之CDR序列取代為含有編碼為適當長度之密碼組之序列之合成寡核苷酸組而得之合成資料庫，也可理想地作為隨機化可變區資料庫。於該等情形，由觀察重鏈之CDR3之基因序列之多樣性，也可僅取代CDR3序列。於抗原結合分子之可變區生出胺基酸之多樣性的基準，係使露出於抗原結合分子表面之位置之胺基酸殘基帶有多樣性。露出於表面之位置，係指可基於抗原結合分子之結構、結 構整體、及/或模式化的結構而判斷可露出表面，及/或可與抗原接觸之位置，一般為其CDR。較佳為露出表面之位置，係使用來自如InsightII程式(Accelrys)之電腦程式，使用來自抗原結合分子之三維模型的座標決定。露出表面之位置，可使用在該技術領域公知之演算法(例如，Lee及Richards(J.Mol.Biol.(1971)55,379-400)、Connolly(J.Appl.Cryst.(1983)16,548-558))決定。露出表面之位置之決定，可使用適於蛋白質模型化之軟體及從抗體獲得之三維結構資訊實施。為了如此的目的可利用之軟體，可列舉SYBYL活體高分子模組軟體(Tripos Associates)。一般而言，又較佳為當演算法需要使用者輸入的大小參數時，將計算使用之探針的「大小」設為半徑約1.4Å以下。再者，使用個人類電腦用軟體決定露出於表面之區及面積之方法，記載於Pacios(Comput.Chem.(1994)18(4),377-386及J.Mol.Model.(1995)1,46-53)。
又，於本發明之一非限定態樣，為了使抗體之安定性提高，也可將含CDR區域及/或框架區域之可變區之胺基酸予以適當改變。作為如此的胺基酸的一非限定態樣，可列舉1位、5位、10位、30位、48位、58位之胺基酸。更具體而言，可列舉1位之Gln、5位之Gln、10位之Asp、30位之Asn、48位之Leu、58位之Asn。為了使抗體之安定性提高，可將該等胺基酸取代為生殖細胞系列的序列所含之對應的胺基酸。如此的生殖細胞系列的一非限定態樣的序列，可列舉VH3-21的序列。此時，可將1位之Gln取代為Glu、5位之Gln取代為Val、10位之Asp取代為Gly、30位之Asn取代為Ser、48位 之Leu取代為Val、58位之Asn取代為Tyr。
又，本發明之一非限定態樣中，尤佳為使用從健康正常人類之淋巴球來源的抗體基因所構建，在其資料庫存不含偏差(bias)之抗體序列即未改變序列構成之未改變資料庫作為隨機化可變區資料庫(Gejima等人(Human Antibodies(2002)11,121-129)及Cardoso等人(Scand.J.Immunol.(2000)51,337-344))。本發明記載之含有未改變序列之胺基酸序列，係指從如此之未改變資料庫取得的胺基酸序列。
Fc區
Fc區包括來自抗體重鏈之不變區的胺基酸序列。Fc區，係EU編號表示之約216位之胺基酸，從木瓜酶切斷部位之鉸鏈區域的N末端起，包括該鉸鏈、CH2及CH3分域之抗體之重鏈不變區的部分。Fc區可從人IgG1取得，但不限於IgG之特定次類別。該Fc區之理想例，可舉如後述，在pH酸性域中對於FcRn有結合活性的Fc區。又，該Fc區之理想例，可舉如後述，對於Fcγ受體有結合活性之Fc區。如此之Fc區之一非限定態樣，可列舉人IgG1(序列編號：5)、IgG2(序列編號：6)、IgG3(序列編號：7)、或IgG4(序列編號：8)表示之Fc區。
Fcγ受體(FcγR)
Fcγ受體(也記載為FcγR)，係指能與IgG1、IgG2、IgG3、IgG4單株抗體之Fc區結合的受體，實質上意指由Fcγ受體基因編碼之蛋白質之家族的任一成員。人類中，該家族包括含同型異構物FcγRIa、FcγRIb及FcγRIc之FcγRI(CD64)；含同型異構物FcγRIIa(包括副型H131及R131，即FcγRIIa(H)及 FcγRIIa(R))、FcγRIIb(包括FcγRIIb-1及FcγRIIb-2)及FcγRIIc之FcγRII(CD32)；及含同型異構物FcγRIIIa(包括副型V158及F158，即FcγRIIIa(V)及FcγRIIIa(F))及FcγRIIIb(包括副型FcγRIIIb-NA1及FcγRIIIb-NA2)之FcγRIII(CD16)，以及任意未曾發現的人類FcγR類或FcγR同型異構物或副型，但不限定於該等。FcγR，包括人類、小鼠、大鼠、兔及猴來源者，但不限定於此等，可為任意生物來源。小鼠FcγR類，包括FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)及FcγRIII-2(FcγRIV、CD16-2)、及任意未曾發現的小鼠FcγR類或FcγR同型異構物或副型，但不限定於該等。如此的Fcγ受體之理想例，可舉人類FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)、FcγRIIb(CD32)、FcγRIIIa(CD16)及/或FcγRIIIb(CD16)。人類FcγRI之聚核苷酸序列及胺基酸序列各記載於序列編號：9(NM_000566.3)及10(NP_000557.1)，FcγRIIa(副型H131)之聚核苷酸序列及胺基酸序列各記載於序列編號：11(BC020823.1)及12(AAH20823.1)(副型R131為序列編號：12之166號胺基酸取代為Arg之序列)、FcγRIIb之聚核苷酸序列及胺基酸序列各記載於序列編號：13(BC146678.1)及14(AAI46679.1)，FcγRIIIa之聚核苷酸序列及胺基酸序列各記載於序列編號：15(BC033678.1)及16(AAH33678.1)，FcγRIIIb之聚核苷酸序列及胺基酸序列各記載於序列編號：17(BC128562.1)及18(AAI28563.1)(括弧內代表RefSeq註冊編號)。Fcγ受體是否有與IgG1、IgG2、IgG3、IgG4單株抗體之Fc區結合之活性，除了上述記載之FACS或ELISA格式以外，也可利用ALPHA screen(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)或利用表面電漿子共振(SPR)現象之BIACORE法等確認(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2006)103(11),4005-4010)。
包括FcγRIa、FcγRIb及FcγRIc之FcγRI(CD64)及包括同型異構物FcγRIIIa(包括副型V158及F158)及FcγRIIIb(包括副型FcγRIIIb-NA1及FcγRIIIb-NA2)之FcγRIII(CD16)，會與IgG之Fc部分結合之α鏈及在細胞內傳遞活化信號之有ITAM之共通γ鏈組合。另一方面，含有同型異構物FcγRIIa(包括副型H131及R131)及FcγRIIc之FcγRII(CD32)本身的細胞質分域，包括ITAM。該等受體在巨噬細胞或肥大細胞(mast cell)、抗原提示細胞等許多免疫細胞表現。該等受體藉由與IgG之Fc部分結合而傳遞的活化信號，促進巨噬細胞之吞噬能力或發炎性細胞激素產生、肥大細胞之脫顆粒、抗原提示細胞之機能亢進。如上述，具有傳遞活化信號之能力之Fcγ受體，在本發明也稱為活性型Fcγ受體。
另一方面，FcγRIIb(包括FcγRIIb-1及FcγRIIb-2)本身的細胞質內分域包括傳遞抑制型信號之ITIM。B細胞中，由於FcγRIIb與B細胞受體(BCR)的交聯，抑制來自BCR之活化信號。結果使BCR之抗體產生受抑制。巨噬細胞中，由於FcγRIII與FcγRIIb之交聯使吞噬能力或發炎性細胞激素的產生能力受抑制。如上述有傳遞抑制化信號之能力之Fcγ受體，在本發明也稱為抑制型Fcγ受體。
Fc區對於FcγR之結合活性
如前述，作為本發明之抗原結合分子含有之Fc區，可列 舉對於Fcγ受體有結合活性之Fc區。作為如此之Fc區之一非限定態樣，可列舉人類IgG1(序列編號：5)、IgG2(序列編號：6)、IgG3(序列編號：7)、或IgG4(序列編號：8)表示之Fc區。Fcγ受體是否對於IgG1、IgG2、IgG3、IgG4單株抗體之Fc區有結合活性，可利用如上記載之FACS或ELISA格式確認，此外也可利用ALPHA screen(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)或利用表面電漿子共振(SPR)現象之BIACORE法等確認(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2006)103(11),4005-4010)。
ALPHA screen，係利用使用提供者與接受者的2種珠之ALPHA技術，依下列之原理實施。接近於提供者珠之分子會與結合於接受者珠之分子以生物學交互作用，僅在2珠接近的狀態檢測出發光信號。由雷射激發的提供者珠內的光敏劑將周邊的氧變換為激發狀態的單態氧。單態氧擴散到提供者珠周邊，到達接近的接受者珠時會引起珠內之化學發光反應，最終發出光。與提供者珠結合之分子及結合於接受者珠之分子彼此未交互作用時，提供者珠產生之單態氧未到達接受者珠，故不起化學發光反應。
例如於提供者珠結合有包括經生物素標記之Fc區之抗原結合分子，於接受者珠結合有以麩胱甘肽S轉移酶(GST)標籤化的Fcγ受體。競爭的含Fc區改變體之抗原結合分子不存在時，有天然型Fc區之抗原結合分子與Fcγ受體會交互作用並產生520-620nm的信號。含有未標籤化的Fc區改變體之抗原結合分子，會與有天然型Fc區之抗原結合分子在與Fcγ 受體間之交互作用競爭。將競爭結果表示之螢光減少予以定量，可決定相對的結合親和性。抗體等抗原結合分子使用Sulfo-NHS-生物素等予以生物素化係為公知。將Fcγ受體以GST予以標籤化之方法，可適當採用將編碼為Fcγ受體之聚核苷酸與編碼為GST之聚核苷酸於同一讀框融合而得之融合基因連結於保持有可作用之載體的細胞等中表現，並使用麩胱甘肽管柱精製之方法等。獲得之信號可藉由使用例如GRAPHPAD PRISM(GraphPad公司、San Diego)等的軟體以非線性回歸解析之一部位競爭(one-site competition)模型擬合(fitting)而理想地解析。
將觀察交互作用之物質的其中之一(配體)固定在感應晶片之金薄膜上，並從感應晶片的背側照射光使在金薄膜與玻璃的交界面發生全反射，則反射光的一部分會形成反射強度下降的部分(SPR信號)。將觀察交互作用之物質的其中另一者(分析物)流過感應晶片的表面並使配體與分析物結合，則經固定化之配體分子的質量增加，感應晶片表面之溶劑之折射率會改變。藉由該折射率的變化，SPR信號的位置會偏移(反之，結合若解離，則回到信號位置)。Biacore系統取上述偏移量，亦即感應晶片表面之質量變化作為縱軸，將質量之時間變化作為測定資料表示(感測圖)。從感測圖的曲線，求出動力學：結合速度常數(ka)與解離速度常數(kd)，由該常數之比求出親和性(KD)。BIACORE法也可理想地使用於抑制測定法。抑制測定法，例如Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2006)103(11),4005-4010。
Fcγ受體(FcγR)結合改變Fc區
作為本發明含有之Fc區，除了人類IgG1(序列編號：5)、IgG2(序列編號：6)、IgG3(序列編號：7)、或IgG4(序列編號：8)表示之Fc區以外，也可適當使用比起天然型人類IgG之Fc區對於Fcγ受體之結合活性，對於Fcγ受體之結合活性較高之FcγR結合改變Fc區。本說明書中，「天然型人類IgG之Fc區」，係指序列編號：5、6、7或8例示之人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4之Fc區之EU編號297位所結合之糖鏈係含岩藻醣之糖鏈之Fc區。如此之FcγR結合改變Fc區，可藉由改變天然型人類IgG之Fc區之胺基酸以製作。FcγR結合改變Fc區對於FcγR之結合活性，是否比天然型人類IgG之Fc區對於FcγR之結合活性高，可使用前述結合活性之項目記載之方法適當實施。
本發明中，Fc區之「胺基酸之改變」或「胺基酸改變」，包含改變為與初始Fc區之胺基酸序列不同之胺基酸序列。只要初始Fc區之修飾改變體在pH中性域會與人類Fcγ受體結合，可使用任一Fc區作為初始Fc區。又，將已施有改變之Fc區作為初始Fc區再進一步施加改變之Fc區也可理想地作為本發明之Fc區。初始Fc區，可指多胜肽本身、含有初始Fc區之組成物、或編碼為初始Fc區之胺基酸序列。初始Fc區，可包含利用在抗體項目大概說明的重組而產生之公眾所知之Fc區。初始Fc區之起源不限定，但可從非人類動物之任意生物或人類取得。較佳為任意生物，可列舉小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、沙鼠、貓、兔、狗、羊、山羊、牛、馬、駱駝、及 非人類靈長類選出的生物。於其他態樣中，初始Fc區可也從食蟹猴、狨猴、恒河猴、黑猩猩、或人類取得。較佳為初始Fc區從人類IgG1取得，但不限於IgG之特定類別。此代表可適當使用人類IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4之Fc區作為初始Fc區。同樣地，本說明書中，意指前述任意生物來源的IgG之任意類別或次類之Fc區，可較佳地作為初始Fc區。天然存在之IgG之變異體或操作型，例如記載於公眾所知之文獻(Curr.Opin.Biotechnol.(2009)20(6),685-91、Curr.Opin.Immunol.(2008)20(4),460-470、Protein Eng.Des.Sel.(2010)23(4),195-202、國際公開WO2009/086320、WO2008/092117、WO2007/041635、及WO2006/105338)，但不限定於此等。
作為改變之例子，可列舉一個以上的變異，例如：取代為和出發Fc區之胺基酸不同之胺基酸殘基的變異、或對於出發Fc區之胺基酸插入1個以上之胺基酸殘基或從出發Fc區之胺基酸有一個以上之胺基酸缺失等。較佳為改變後的Fc區之胺基酸序列中包括含有天然不發生之Fc區之至少部分的胺基酸序列。如此的變種必然會和出發Fc區有未達100%的序列同一性或類似性。理想的實施形態中，變種具有和出發Fc區之胺基酸序列有約75%~未達100%之胺基酸序列同一性或類似性，更佳為有約80%~未達100%，更佳為約85%~未達100%，又更佳為約90%~未達100%、最佳為有約95%~未達100%的同一性或類似性的胺基酸序列。本發明之一非限定態樣中，在出發Fc區及本發明之FcγR結合改變Fc區之間有至少1個胺基酸的差異。出發Fc區與本發明之FcγR結合改變Fc 區之胺基酸的差異，尤其可依前述EU編號指定之胺基酸殘基之位置之特定胺基酸的差異而可理想地指定。如此之變種之製作方法列舉在「胺基酸之改變」之項目。
本發明之抗原結合分子所含之比起天然型人IgG之Fc區對於Fcγ受體之結合活性，對於Fcγ受體之結合活性較高之FcγR結合改變Fc區(FcγR結合改變Fc區)可依各種方法取得，具體而言，可藉由將作為出發Fc區使用之人IgG型免疫球蛋白進行胺基酸之改變而取得該FcγR結合改變Fc區。用於改變的理想IgG型免疫球蛋白的Fc區，例如：序列編號：5、6、7或8例示之人IgG(IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4、及此等之改變體)的Fc區。
向其他胺基酸之改變，只要是比起天然型人IgG之Fc區對於Fcγ受體之結合活性，對於Fcγ受體之結合活性較高即可，各種位置的胺基酸均可改變。抗原結合分子含有人IgG1之Fc區作為人Fc區時，宜含有比起結合於EU編號297位之糖鏈為含岩藻糖之糖鏈的天然型人IgG的Fc區對於Fcγ受體之結合活性，帶來對於Fcγ受體之結合活性更高之效果的改變較佳。如此的胺基酸之改變，例如國際公開WO2007/024249、WO2007/021841、WO2006/031370、WO2000/042072、WO2004/029207、WO2004/099249、WO2006/105338、WO2007/041635、WO2008/092117、WO2005/070963、WO2006/020114、WO2006/116260及WO2006/023403等中已有報告。
測定本發明之抗原結合分子所含之Fcγ受體結合 分域與Fcγ受體之結合活性之pH之條件，可適當使用pH酸性域至pH中性域之條件。測定本發明之抗原結合分子所含之Fcγ受體結合分域與Fcγ受體之結合活性之條件的pH酸性域至pH中性域，通常係指pH5.8~pH8.0。較佳為以pH6.0~pH7.4之任意pH值所示之範圍，較佳選自pH6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、及7.4，尤佳為接觸癌組織之pH的pH6.15~7.4(Vaupel等人(Cancer Res.(1989)49,6449-6665))。測定條件使用之溫度，就Fcγ受體結合分域與人Fcγ受體之結合親和性，可於10℃~50℃之任意溫度評價。較佳為為了決定人Fcγ受體結合分域與Fcγ受體之結合親和性，使用15℃~40℃之溫度。更佳為，如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、及35℃中之任一者的20℃至35℃的任意溫度也同樣，可使用於決定Fcγ受體結合分域與Fcγ受體之結合親和性。25℃的溫度係本發明之態樣之一非限定例。
本說明書中，FcγR結合改變Fc區對於Fcγ受體之結合活性高於天然型Fc區對於Fcγ受體之結合活性，係指FcγR結合改變Fc區對於FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa及/或FcγRIIIb中之任一者之人Fcγ受體的結合活性，高於天然型Fc區對於該等人Fcγ受體之結合活性。例如：係指依據上述解析方法，比較作為對照之含有人IgG天然型Fc區之抗原結合分子之結合活性，顯示含有FcγR結合改變Fc區之抗原結合分子之結合活性宜為105%以上，較佳為110%以上、115%以上、120%以上、125%以上，尤佳為130%以上、135%以上、140% 以上、145%以上、150%以上、155%以上、160%以上、165%以上、170%以上、175%以上、180%以上、185%以上、190%以上、195%以上、2倍以上、2.5倍以上、3倍以上、3.5倍以上、4倍以上、4.5倍以上、5倍以上、7.5倍以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、100倍以上之結合活性。天然型Fc區可使用出發Fc區，也可使用同次類別的抗體的天然型Fc區。
本發明中，作為對照之人IgG之天然型Fc區，可理想地使用結合於EU編號表示之297位之胺基酸之糖鏈係含岩藻糖的糖鏈的天然型人IgG的Fc區。是否結合於EU編號表示之297位之胺基酸之糖鏈為含岩藻糖之糖鏈，可使用已知手法獲得(Non-fucosylated therapeutic antibodies as next-generation therapeutic antibodies.Satoh M,Iida S,Shitara K.,Expert Opin.Biol.Ther.(2006)6(11),1161-1173)。例如：可依如下列方法，判定結合於天然型人IgG的Fc區的糖鏈是否為含岩藻糖之糖鏈。使受檢天然型人IgG和N-Glycosidase F(Roche diagnostics)反應，使糖鏈從受檢天然型人IgG游離(Weitzhandler等人(J.Pharma.Sciences(1994)83,12,1670-1675)。然後，使乙醇反應，將已去除蛋白質的反應液(Schenk等(J.Clin.Investigation(2001)108(11)1687-1695)的濃縮乾固物利用2-胺基吡啶進行螢光標記(Bigge等(Anal.Biochem.(1995)230(2)229-238)。將利用使用纖維素匣之固相萃取而脫試藥的經螢光標識之2-AB化糖鏈，以順相層析解 析。觀察檢測到的層析圖的峰部，可判定結合於人IgG之天然型Fc區的糖鏈是否為含岩藻糖之糖鏈。
就作為對照之含有相同次類別之抗體之天然型Fc區的抗原結合分子而言，可適當使用具有IgG單株抗體的Fc區的抗原結合分子。該Fc區之結構記載於序列編號：5(資料庫登錄號AAC82527.1之N末有A加成)、6(資料庫登錄號AAB59393.1之N末有A加成)、7(資料庫登錄號CAA27268.1)、及8(資料庫登錄號AAB59394.1之N末有A加成)。又，當使用含有某特定同型之抗體的Fc區的抗原結合分子作為待驗物質時，可藉由使用具有該特定同型之IgG單株抗體的Fc區的抗原結合分子作為對照，而驗證含受檢Fc區之抗原結合分子對於Fcγ受體之結合活性之效果。如上述，可適當選擇含有已驗證對於Fcγ受體之結合活性高的Fc區的抗原結合分子。
對於選擇性的Fcγ受體有結合活性的Fc區
又，本發明中，可理想地使用的Fcγ受體結合分域，例如具有對於特定的Fcγ受體的結合活性比其對於其他Fcγ受體的結合活性更高之性質的Fcγ受體結合分域(對於選擇性的Fcγ受體有結合活性之Fcγ受體結合分域)。當使用抗體(就Fcγ受體結合分域而言為Fc區)作為抗原結合分子時，一分子抗體只能結合一分子的Fcγ受體，所以於一分子抗原結合分子已結合於抑制型Fcγ受體的狀態，無法結合於其他活性型FcγR，於已結合於活性型Fcγ受體之狀態，無法結合於其他活性型Fcγ受體、抑制型Fcγ受體。
對於活性型Fcγ受體之結合活性比起對於抑制型 Fcγ受體之結合活性更高的Fc區
如前述，活性型Fcγ受體可列舉含FcγRIa、FcγRIb及FcγRIc之FcγRI(CD64)、含FcγRIIa以及FcγRIIIa(包括副型V158及F158)及FcγRIIIb(包括副型FcγRIIIb-NA1及FcγRIIIb-NA2)之FcγRIII(CD16)為理想例。又，FcγRIIb(包括FcγRIIb-1及FcγRIIb-2)為抑制型Fcγ受體之理想例。
本說明書中，對於特定的Fcγ受體之結合活性比起對其他Fcγ受體之結合活性為高之例，例如：對於活性型Fcγ受體之結合活性比對於抑制型Fcγ受體之結合活性高的情形。此時，稱為Fc區對於FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIIa及/或FcγRIIIb中之任一人Fcγ受體之結合活性，比起對於FcγRIIb之結合活性高。例如：依上述解析方法，顯示含Fc區之抗原結合分子對於FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIIa及/或FcγRIIIb中之任一人Fcγ受體之結合活性為對於FcγRIIb之結合活性之105%以上，較佳為110%以上、120%以上、130%以上、140%以上，尤佳為150%以上、160%以上、170%以上、180%以上、190%以上、200%%以上、250%以上、300%以上、350%以上、400%以上、450%以上、500%以上、750%以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍以上之結合活性。對於活性型Fcγ受體之結合活性比對於抑制型Fcγ受體之結合活性還高的Fc區，可理想地含於抗原結合分域結合於膜型分子之本發明之抗原結合分子中。含有如此的Fc區的IgG1抗體，已知後述ADCC活性會增強，所以含有該Fc區之抗原結合分子做為本發明之醫藥組合物所含之 抗原結合分子亦為有用。
本發明之一非限定態樣中，對於活性型Fcγ受體之結合活性比對於抑制型Fcγ受體之結合活性還高(對於抑制型Fcγ受體有選擇性結合活性)Fc區，例如前述EU編號表示之221位、222位、223位、224位、225位、227位、228位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、243位、244位、245位、246位、247位、249位、250位、251位、254位、255位、256位、258位、260位、262位、263位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、271位、272位、273位、274位、275位、276位、278位、279位、280位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、288位、290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304位、305位、311位、313位、315位、317位、318位、320位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、336位、337位、339位、376位、377位、378位、379位、380位、382位、385位、392位、396位、421位、427位、428位、429位、434位、436位及440位之群中選出之至少一個以上之胺基酸改變為和天然型Fc區不同之胺基酸的Fc區為理想例。
對於抑制型Fcγ受體之結合活性比對於活性型Fcγ受體之結合活性還高之Fc區
本說明書中，對於特定的Fcγ受體之結合活性比起對於其他Fcγ受體之結合活性還高之例，例如：對於抑制型Fcγ受體之結合活性比對於活性型Fcγ受體之結合活性還高的情形。此時稱為：Fc區對於FcγRIIb之結合活性比起對於FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIIa及/或FcγRIIIb中之任一人Fcγ受體之結合活性還高。例如：依上述解析方法，顯示含Fc區之抗原結合分子對於FcγRIIb之結合活性為對於FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIIa及/或FcγRIIIb中之任一人Fcγ受體之結合活性之105%以上，較佳為110%以上、120%以上、130%以上、140%以上，尤佳為150%以上、160%以上、170%以上、180%以上、190%以上、200%%以上、250%以上、300%以上、350%以上、400%以上、450%以上、500%以上、750%以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍以上之結合活性。對於抑制型Fcγ受體之結合活性比對於活性型Fcγ受體之結合活性還高的Fc區，可理想地含於抗原結合分域結合於可溶型分子之本發明之抗原結合分子中。
本發明之一非限定態樣中，對於抑制型Fcγ受體之結合活性比對於活性型Fcγ受體之結合活性還高(對於抑制型Fcγ受體有選擇性結合活性)之Fc區，例如前述Fc區之胺基酸中之EU編號表示之238或328之胺基酸改變為和天然型Fc區不同之胺基酸的Fc區為理想例。
本發明之一非限定態樣中，作為對於抑制型Fcγ受體之結合活性比起對於活性型Fcγ受體之結合活性還高(對於抑制型Fcγ受體有選擇性的結合活性)的Fc區，如為前述Fc 區之EU編號表示之胺基酸且改變成係EU編號表示之238之胺基酸為Asp、或328之胺基酸為Glu的任一者以上的Fc區為理想例。又，作為對於抑制型Fcγ受體有選擇性的結合活性的Fc區，也可適當選擇US2009/0136485記載的Fc區或改變。
本發明之一非限定態樣中，係前述Fc區之EU編號表示之胺基酸且改變成EU編號表示之238之胺基酸為Asp、或328之胺基酸為Glu中任一者以上的Fc區為理想例。
本發明之一非限定態樣中，改變成PCT/JP2012/054624例示之EU編號表示之238位之Pro取代為Asp、及EU編號表示之237位之胺基酸為Trp、EU編號表示之237位之胺基酸為Phe、EU編號表示之267位之胺基酸為Val、EU編號表示之267位之胺基酸為Gln、EU編號表示之268位之胺基酸為Asn、EU編號表示之271位之胺基酸為Gly、EU編號表示之326位之胺基酸為Leu、EU編號表示之326位之胺基酸為Gln、EU編號表示之326位之胺基酸為Glu、EU編號表示之326位之胺基酸為Met、EU編號表示之239位之胺基酸為Asp、EU編號表示之267位之胺基酸為Ala、EU編號表示之234位之胺基酸為Trp、EU編號表示之234位之胺基酸為Tyr、EU編號表示之237位之胺基酸為Ala、EU編號表示之237位之胺基酸為Asp、EU編號表示之237位之胺基酸為Glu、EU編號表示之237位之胺基酸為Leu、EU編號表示之237位之胺基酸為Met、EU編號表示之237位之胺基酸為Tyr、EU編號表示之330位之胺基酸為Lys、EU編號表示之330位之胺基酸為Arg、EU編號表示之233位之胺基酸為Asp、 EU編號表示之268位之胺基酸為Asp、EU編號表示之268位之胺基酸為Glu、EU編號表示之326位之胺基酸為Asp、EU編號表示之326位之胺基酸為Ser、EU編號表示之326位之胺基酸為Thr、EU編號表示之323位之胺基酸為Ile、EU編號表示之323位之胺基酸為Leu、EU編號表示之323位之胺基酸為Met、EU編號表示之296位之胺基酸為Asp、EU編號表示之326位之胺基酸為Ala、EU編號表示之326位之胺基酸為Asn、EU編號表示之330位之胺基酸為Met中任一者以上的Fc區為理想例。
糖鏈經修飾之Fc區
本發明提供之抗原結合分子所含之Fc區，可包括以結合於該Fc區之糖鏈之組成係結合岩藻糖缺損糖鏈之Fc區之比例提高之方式、或附加有二分化N-乙醯基葡萄糖胺之Fc區之比例提高之方式修飾過的Fc區。若從抗體Fc區所結合之N-配糖體結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡萄糖胺將岩藻糖殘基去除，已知會使對FcγRIIIa之親和性增強(非專利文獻6)。含有如此之Fc區之IgG1抗體，已知後述ADCC活性會增強，所以含該Fc區之抗原結合分子作為本發明之醫藥組成物所含之抗原結合分子也有用。從抗體Fc區結合之N-配糖體結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡萄糖胺去除了岩藻糖殘基之抗體，例如以下抗體；經糖化修飾之抗體(國際公開WO1999/054342等)、糖鏈所附加之岩藻糖有缺損之抗體(國際公開WO2000/061739、WO2002/031140、WO2006/067913等)、 更具體而言，作為從抗體Fc區所結合之N-糖苷鍵複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺去除岩藻醣殘基而得之抗體之不同之一非限定態樣，為了製作於糖鏈加成之岩藻醣已缺損之抗體(國際公開WO2000/061739、WO2002/031140、WO2006/067913等)，而改變形成接受糖鏈修飾之多胜肽之糖鏈結構之活性，結果可製作於糖鏈加成岩藻醣之能力低之寄主細胞。藉由在該寄主細胞表現所望之抗體基因，可從該寄主細胞之培養液回收在此糖鏈中之岩藻醣已缺損之該抗體。作為形成多胜肽之糖鏈結構之活性，可列舉從岩藻糖基轉移酶(EC 2.4.1.152)、岩藻糖轉運蛋白(SLC35C1)、GMD(GDP-甘露糖4,6-脫水酶)(EC 4.2.1.47)、Fx(GDP-酮-6-去氧甘露糖3,5-差向異構酶，4-還原酶)(EC 1.1.1.271)、及GFPP(GDP-β-L-岩藻糖焦磷酸化酶)(EC 2.7.7.30)構成之群組中選出之酵素或轉運蛋白之活性為非限定之理想例。該等酵素或轉運蛋白只要能發揮活性即可，不指定其結構。本說明書中，將能發揮該等活性之蛋白質稱為機能性蛋白質。作為改變該等活性之方法之一非限定態樣，可列舉該等活性之缺失。為了製作該等活性缺失之寄主細胞，可適當採用破壞該等機能性蛋白質之基因使不能作用之方法等公知方法(國際公開WO2000/061739、WO2002/031140、WO2006/067913等)。如此之活性缺失之寄主細胞，可以利用將CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髓瘤細胞、P3X63小鼠骨髓瘤細胞、PER細胞、PER.C6細胞、HEK293細胞、或融合瘤細胞等的內在性該等機能性蛋白質之基因破壞使無法作用之方法等以製作。
具有含二分化GlcNAc結構之糖鏈的抗體(國際公開WO2002/079255等)為公知。一非限定態樣中，為了製作含二分化GlcNAc之糖鏈的抗體，係製作表現編碼為具有GnTIII(β-1,4-甘露糖基-糖蛋白，4-β-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶)(EC 2.4.1.144)活性或GalT(β-1,4-半乳糖基轉移酶)(EC 2.4.1.38)活性之機能性蛋白質的基因的寄主細胞。另一非限定之理想態樣中，係製作除了前述機能性蛋白質以外，尚共同表現編碼為具有人類ManII(甘露糖苷酶II)(3.2.1.114)活性之機能性蛋白質之基因、編碼為具有GnTI(β-1,2-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶I)(EC 2.4.1.94)活性之機能性蛋白質之基因、編碼為具有GnTII(β-1,2-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶II)(EC 2.4.1.143)活性之機能性蛋白質之基因、編碼為具有ManI(甘露糖苷酶)(EC 3.2.1.113)活性之機能性蛋白質之基因、及α-1,6-岩藻糖基轉移酶(EC 2.4.1.68)之寄主細胞(國際公開WO2004/065540)。
藉由對於如前述糖鏈加成岩藻醣之能力低之寄主細胞、及具有形成含二分化GlcNAc結構之糖鏈之活性的寄主細胞轉形導入含有抗體基因之表現載體，可分別製作從抗體Fc區所結合之N-糖苷鍵複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡糖胺去除岩藻醣殘基而得之抗體、及具有具二分化GlcNAc之糖鏈之抗體。該等抗體之製造方法，也可應用以提高本發明之Fc區所結合之糖鏈之組成係提高已結合岩藻醣缺損糖鏈之Fc區之比例之方式、或以提高已加成二分化N-乙醯基葡糖胺之Fc區之比例之方式修飾之含改變Fc區之抗原結合分子之製造 方法。利用如此之製造方法製作之本發明之抗原結合分子所含之Fc區結合之糖鏈之組成，可利用在前述「Fcγ受體(FcγR)結合改變Fc區」記載之方法確認。
多重專一性抗原結合分子或多重抗原結合位之抗原結合分子
特徵為其至少一個抗原結合分域係與抗原分子中之第1抗原決定部位結合且其至少一個其他之抗原結合分域係與抗原分子中之第2抗原決定部位結合的至少包含二個抗原結合分域之抗原結合分子，從其反應之專一性之觀點，稱為多重專一性抗原結合分子。當利用一分子之抗原結合分子所含之二種類之抗原結合分域使該抗原結合分子結合於二個不同之抗原決定部位的情形，該抗原結合分子稱為雙專一性抗原結合分子。又，當利用一分子之抗原結合分子所含之三種類之抗原結合分域使該抗原結合分子結合於三個不同之抗原決定部位的情形，該抗原結合分子稱為三重專一性抗原結合分子。
與抗原分子中之第1抗原決定部位結合之抗原結合分域中之抗原結合位、及與第1抗原決定部位在結構方面相異之第2抗原決定部位結合之抗原結合分域中之抗原結合位，其結構係彼此互異。所以，特徵為其至少一個抗原結合分域係與抗原分子中之第1抗原決定部位結合且其至少一個其他之抗原結合分域係與抗原分子中之第2抗原決定部位結合的至少包含二個抗原結合分域之抗原結合分子，從其結構之專一性之觀點，稱為多重抗原結合位抗原結合分子。利用一分子之抗原結合分子含有之二種類之抗原結合分域使該抗原結合分子結合 於二個相異之抗原決定部位的情形，該抗原結合分子稱為二重抗原結合位抗原結合分子。又，利用一分子之抗原結合分子含有之三種類之抗原結合分域使該抗原結合分子結合於三個相異之抗原決定部位的情形，該抗原結合分子稱為三重抗原結合位抗原結合分子。
包含一或複數個抗原結合分域之多價之多重專一性或多重抗原結合位抗原結合分子及其製備方法，也記載於Conrath等人(J.Biol.Chem.(2001)276(10)7346-7350)、Muyldermans(Rev.Mol.Biotech.(2001)74,277-302)及Kontermann R.E.(2011)Bispecific Antibodies(Springer-Verlag)等非專利文獻、以及國際公開WO1996/034103或WO1999/023221等專利文獻等。藉由在此等文獻記載之多重專一性或多重抗原結合位抗原結合分子及其製備方法，可製作本發明之抗原結合分子。
雙專一性抗體及其製作方法
作為製備如前述多重專一性或多重抗原結合位抗原結合分子及其製備方法之一態樣，可採用下列例示之雙專一性抗體及其製作方法。雙專一性抗體，係指包含對不同抗原決定部位專一性結合之二種可變區的抗體。IgG型之雙專一性抗體，可藉由從將2種產生IgG抗體之融合瘤融合而產生的混成融合瘤(hybrid hybridoma(quadroma)分泌(Milstein等人(Nature(1983)305,537-540)。
當使用前述抗體之項目記載之重組方法製造雙專一性抗體的情形，可採用將編碼為含目的之二種可變區之重鏈 的基因導入細胞並使此等共同表現的方法。但是如此的共同表現方法中，僅考慮重鏈之組合，會成為如下的組合成為2：1：1之分子數之比例存在的混合物，即(i)含有與第1抗原決定部位結合之可變區的重鏈及含有與第2抗原決定部位結合之可變區的重鏈成為一對的重鏈的組合、(ii)僅成為含有與第1抗原決定部位結合之可變區之重鏈成為一對之重鏈之組合、(iii)僅含有與第2抗原決定部位結合之可變區的重鏈成為一對的重鏈的組合。從此等三種重鏈之組合之混合物難以將含目的之重鏈組合之抗原結合分子精製。
當使用如此的重組方法製造雙專一性抗體時，可藉由對於構成重鏈之CH3分域施以適當胺基酸取代之改變，而優先分泌含有異質組合之重鏈的雙專一性抗體。具體而言，將存在於其中一重鏈之CH3分域的胺基酸側鏈取代為較大側鏈(knob(「突起」之意))，並將存在於另一重鏈之CH3分域的胺基酸側鏈取代為較小側鏈(hole(「空隙」之意))，藉此使突起能配置於空隙內，而引起異種重鏈形成之促進及同種重鏈形成之妨害的方法(國際公開WO1996/027011、Ridgway等人(Protein Engineering(1996)9,617-621)、Merchant等人(Nat.Biotech.(1998)16,677-681))。
又，也已知將利用多胜肽之組合、或多胜肽構成之異種多聚物之組合之控制方法用在重鏈之組合而製作雙專一性抗體之技術。亦即，可採用藉由改變形成重鏈內界面之胺基酸殘基以控制使具相同序列之重鏈之組合受抑制且形成序列相異之二條重鏈的方法於雙專一性抗體之製作(國際公開 WO2006/106905)。如此的方法也可採用於製造雙專一性抗體。
本發明之一非限定態樣中，作為抗原結合分子含有的Fc區，可適當使用上述雙專一性抗體作為起源之形成Fc區之二條多胜肽。更具體而言，宜使用二條多胜肽，其係形成Fc區之二條多胜肽，特徵為：其中一多胜肽之胺基酸序列當中EU編號表示之349之胺基酸為Cys、366之胺基酸為Trp且另一多胜肽之胺基酸序列當中EU編號表示之356之胺基酸為Cys、366之胺基酸為Ser、368之胺基酸為Ala、407之胺基酸為Val。
此外，在本發明之一非限定態樣中，作為Fc區可採用二條多胜肽，其係形成Fc區之二條多胜肽，特徵為：其中一多胜肽之胺基酸序列當中EU編號表示之409之胺基酸為Asp，另一多胜肽之胺基酸序列當中EU編號表示之399之胺基酸為Lys。上述態樣中，也可理想地將409之胺基酸從Asp換為Glu、399之胺基酸從Lys換為Arg。又，也可除了399之胺基酸之Lys以外，尚追加使360之胺基酸為Asp或392之胺基酸為Asp。
本發明之其他非限定態樣中，作為Fc區可理想地採用二條多胜肽，其係形成Fc區之二條多胜肽，特徵為：其中一多胜肽之胺基酸序列當中EU編號表示之370之胺基酸為Glu，另一多胜肽之胺基酸序列當中EU編號表示之357之胺基酸為Lys。
本發明之又另一非限定態樣中，作為Fc區宜使用二條多胜肽，其係形成Fc區之二條多胜肽，特徵為：其中一多 胜肽之胺基酸序列當中EU編號表示之439之胺基酸為Glu，另一多胜肽之胺基酸序列當中EU編號表示之356之胺基酸為Lys。
本發明之另一非限定態樣中，作為Fc區，可適當採用此等組合之以下態樣中之任一者；(i)二條多胜肽，為形成Fc區之二條多胜肽，其特徵為：其中一多胜肽之胺基酸序列當中EU編號表示之409之胺基酸為Asp、370之胺基酸為Glu，另一多胜肽之胺基酸序列當中EU編號表示之399之胺基酸為Lys、357之胺基酸為Lys(本態樣中，EU編號表示之370之胺基酸之Glu也可換為Asp，EU編號表示之370之胺基酸之Glu也可換為392之胺基酸之Asp)；(ii)二條多胜肽，為形成Fc區之二條多胜肽，其特徵為：其中一多胜肽之胺基酸序列當中EU編號表示之409之胺基酸為Asp、439之胺基酸為Glu，且另一多胜肽之胺基酸序列當中EU編號表示之399之胺基酸為Lys、356之胺基酸為Lys(本態樣中，EU編號表示之439之胺基酸之Glu也可換為360之胺基酸之Asp、EU編號表示之392之胺基酸之Asp或439之胺基酸之Asp)；(iii)二條多胜肽，為形成Fc區之二條多胜肽，其特徵為：其中一多胜肽之胺基酸序列當中EU編號表示之370之胺基酸為Glu、439之胺基酸為Glu，且另一多胜肽之胺基酸序列當中EU編號表示之357之胺基酸為Lys、356之胺基酸為Lys；或為形成Fc區之二條多胜肽，其特徵為：其中一多胜肽之胺 基酸序列當中EU編號表示之409之胺基酸為Asp、370之胺基酸為Glu、439之胺基酸為Glu，且另一多胜肽之胺基酸序列當中EU編號表示之399之胺基酸為Lys、357之胺基酸為Lys、356之胺基酸為Lys(本態樣中，EU編號表示之370之胺基酸也可不取代為Glu，而且370之胺基酸不取代為Glu的前提，可將439之胺基酸之Glu換為Asp或將439之胺基酸之Glu換為392之胺基酸之Asp)。
再者，本發明之另一非限定態樣中，可理想採用二條多胜肽，其為形成Fc區之二條多胜肽，特徵為：其中多胜肽之胺基酸序列當中EU編號表示之356之胺基酸為Lys，另一多胜肽之胺基酸序列當中EU編號表示之435之胺基酸為Arg、439之胺基酸為Glu。
再者，本發明之其他非限定態樣可理想採用二條多胜肽，其為形成Fc區之二條多胜肽，特徵為：其中一多胜肽之胺基酸序列當中EU編號表示之356之胺基酸為Lys、357之胺基酸為Lys，另一多胜肽之胺基酸序列當中EU編號表示之370之胺基酸為Glu、435之胺基酸為Arg、439之胺基酸為Glu。
又，上述異種重鏈之組合技術以外，可以將作為將形成與第1抗原決定部位結合之可變區的輕鏈、及形成與第2抗原決定部位結合之可變區的輕鏈各和形成與第1抗原決定部位結合之可變區的重鏈、及形成與第2抗原決定部位結合之可變區的重鏈組合的已知異種輕鏈的組合技術即CrossMab技術(Scaefer等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2011)108, 11187-11192))用在製作本發明提供之多重專一性或多重抗原結合位抗原結合分子。又，作為利用引起相異IgG4之重鏈彼此之交換，使形成與第1抗原決定部位組合之可變區之重鏈、及形成與第2抗原決定部位結合之可變區之重鏈組合之異種重鏈之組合技術為已知之Fab-Arm Exchange(Labrijn等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2013)110,5145-5150)、WO2008119353)，也可在製作本發明提供之多重專一性或多重抗原結合位抗原結合分子使用。
效應子細胞
本發明中，「效應子細胞」可於包含T細胞(CD4+(幫助者淋巴球)T細胞及/或CD8+(細胞傷害性)T細胞)、多核白血球(嗜中球、嗜酸球、嗜鹼球、肥胖細胞)、單球、巨噬體、組織球或天然殺手細胞(NK細胞)、NK狀T細胞、Kupffer細胞、Langerhans細胞、或淋巴素活化殺手細胞(LAK細胞)等白血球、B淋巴球、或樹狀細胞或巨噬體等抗原提示細胞之最廣義的含意使用，但理想之效應子細胞，例如CD8+(細胞傷害性)T細胞、NK細胞、或巨噬體。若為於效應子細胞之細胞膜表現之膜型分子，則可作為本發明之抗原結合分子含有之至少1個抗原結合分域所結合之抗原使用，但理想的膜型分子，可列舉構成TCR之多胜肽、CD3、CD2、CD28、CD44、CD16、CD32、CD64、或NKG2D或NK細胞活化配體作為非限定例。
細胞傷害性物質
為了使本發明之抗原結合分子與癌細胞結合並發揮細胞傷害活性，也可使抗原結合分子有細胞傷害性物質結合。作為 細胞傷害性物質，可為以下例示之化學療法劑，也可為Curr Opin Chem Biol(2010)14,529-37、國際公開2009/140242揭示之化合物，該等化合物利用適當的連結子等與抗原結合分子結合。本發明之抗原結合分子係作為醫藥組合物使用時，在對於對象(受試者、患者等)投予該抗原結合分子前也可能使該等細胞傷害性物質結合，也可在投予之前後或同時投予。
又，結合了後述化學療法劑、毒性胜肽或放射性化學物質等細胞傷害性物質之修飾抗原結合分子修飾物，也可理想地作為本發明之具細胞傷害活性之抗原結合分子使用。如此之修飾抗原結合分子(以下稱為抗原結合分子藥物接合物)，可藉由對於獲得之抗原結合分子進行化學性修飾以取得。又，作為抗原結合分子之修飾方法，可適當使用在抗體藥物接合物等領域已經確立的方法。又，已有毒性胜肽結合之修飾抗原結合分子，可藉由將編碼為該毒性胜肽之基因與編碼為本發明之抗原結合分子之基因於讀框內連結而得之融合基因於適當寄主細胞中表現後，從該細胞之培養液單離以取得。
本發明之抗原結合分子所結合之化學療法劑可列舉如下：阿扎立平(azaribine)、阿那曲唑(anastrozole)、阿扎胞苷(azacytidine)、博萊黴素(bleomycin)、硼替佐米(bortezomib)、苔蘚抑素-1(bryostatin-1)、白消安(busulfan)、喜樹鹼(camptothecin)、10-羥基喜樹鹼(10-hydroxycamptothecin)、卡莫司汀(carmustine)、西樂葆(celebrex)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、順鉑(cisplatin)、伊立替康(irinotecan)、卡鉑(carboplatin)、克拉屈濱(cladribine)、 環磷醯胺(cyclophosphamide)、阿糖胞苷(cytarabine)、達卡巴嗪(dacarbazine)、多西他賽(docetaxel)、放線菌素D(dactinomycin)、柔紅黴素葡萄糖醛酸(daunomycin glucuronide)、柔紅黴素(daunorubicin)、地塞米松(dexamethasone)、二乙基己烯雌酚(diethylstilbestrol)、多柔比星(doxorubicin)、多柔比星葡萄糖醛酸苷(doxorubicin glucuronide)、表柔比星(epirubicin)、乙炔基雌二醇(ethinyl estradiol)、雌莫司汀(estramustine)、足葉乙甙(etoposide)、足葉乙甙葡萄糖苷酸(etoposide glucuronide)、脫氧氟尿苷(floxuridine)、氟達拉濱(fludarabine)、氟他胺(flutamide)、氟脲嘧啶(fluorouracil)、氟甲睾酮(fluoxymesterone)、吉西他濱(gemcitabine)、羥基孕酮己酸(hydroxyprogesterone caproate)、羥基脲(hydroxyurea)、去甲氧柔紅黴素(idarubicin)、異環磷醯胺(ifosfamide)、亞葉酸鈣(leucovorin)、洛莫司汀(lomustine)、美登素(maytansinoid)、氮芥(mechlorethamine)、甲羥孕酮乙酸酯(medroxyprogesterone acetate)、醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、美法崙(melphalan)、巰基嘌呤(mercaptopurine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光輝黴素(mithramycin)、絲裂黴素(mitomycin)、米托坦(mitotane)、苯基丁酸(phenylbutyrate)、潑尼松(prednisone)、甲基芐肼(procarbazine)、紫杉醇(paclitaxel)、噴司他丁(pentostatin)、司莫司汀(semustine)、鏈脲佐菌素(streptozocin)、他莫昔芬(tamoxifen)、紫杉烷類(taxanes)、紫杉醇(taxol)、丙酸睾酮(testosterone propionate)、沙利度胺(thalidomide)、硫鳥嘌呤 (thioguanine)、塞替派(thiotepa)、替尼泊苷(teniposide)、托泊替康(topotecan)、尿嘧啶芥末(uracil mustard)、長春鹼(vinblastine)、長春瑞濱(vinorelbine)、長春新鹼(vincristine)。
本發明中，理想之化學療法劑為低分子之化學療法劑。低分子之化學療法劑，在本發明之抗原結合分子結合後，干涉抗原結合分子之功能之可能性仍低。本發明中，低分子之化學療法劑通常具有100~2000，較佳為200~1000之分子量。在此例示之化學療法劑均為低分子之化學療法劑。該等本發明之化學療法劑，包括於活體內變換為活性之化學療法劑之前驅藥。前驅藥之活化可利用酵素性變換，也可為非酵素性的變換。
又，本發明之抗原結合分子結合之細胞傷害物質，可列舉Pseudomonas exotoxin A、Saporin-s6、Diphtheria toxin、Cnidarian toxin等毒性胜肽(毒素)、Radioiodine、Photosensitizer。毒性胜肽，例如：以下為理想例。
-白喉毒素A鏈(Diphtheria toxin A Chain)(Langone等人(Methods in Enzymology(1993)93,307-308)
-假單胞菌外毒素(Pseudomonas Exotoxin)(Pai等人(Nat.Med.(1996)2(3),350-353)
-蓖麻蛋白鏈(Ricin A Chain)(Fulton等人(J.Biol.Chem.(1986)261,5314-5319)、Sivam等人(Cancer Res.(1987)47,3169-3173)、Cumber等人(J.Immunol.Methods(1990)135,15-24)、Wawrzynczak等人(Cancer Res.(1990)50,7519-7562)、Gheeite等人(J.Immunol.Methods(1991)142,223-230))
-無糖鏈蓖麻蛋白A鏈(Deglicosylated Ricin A Chain)(Thorpe等人(Cancer Res.(1987)47,5924-5931)
-相思豆毒素A鏈(Abrin A Chain)(Wawrzynczak等人(Br.J.Cancer(1992)66,361-366)、；Wawrzynczak等人(Cancer Res(1990)50,7519-7562)、Sivam等人(Cancer Res.(1987)47,3169-3173)、Thorpe等人(Cancer Res.(1987)47,5924-5931)
-白樹種子儲藏蛋白(Gelonin)(Sivam等人(Cancer Res.(1987)47,3169-3173)、Cumber等人(J.Immunol.Methods(1990)135,15-24)、Wawrzynczak等人(Cancer Res.(1990)50,7519-7562)、Bolognesi等人(Clin.Exp.Immunol.(1992)89,341-346))
-商陸抗病毒蛋白(PAP-s或Pokeweed anti-viral protein fromseeds)(Bolognesi等人(Clin.Exp.Immunol.(1992),89,341-346))
-Briodin(Briodin)(Bolognesi等人(Clin.Exp.Immunol.(1992)89,341-346))
-皂草毒蛋白(Saporin)(Bolognesi等人(Clin.Exp.Immunol.(1992),89,341-346))
-苦瓜毒蛋白(Momordin)(Cumber等人(J.Immunol.Methods(1990)135,15-24)、(Wawrzynczak等人(Cancer Res.(1990)50,7519-7562)(Bolognesi等人(Clin.Exp.Immunol.(1992)89,341-346)
-木鳖毒蛋白(Momorcochin)(Bolognesi等人(Clin.Exp.Immunol.(1992)89,341-346)
-香石竹毒蛋白32(Dianthin 32)(Bolognesi等人(Clin.Exp.Immunol.(1992)89,341-346)
-香石竹毒蛋白30(Dianthin 30)(Stirpe等人(FEBS Let.(1986)195,1-8)
-蒴蓮根毒蛋白(Modeccin)(Stirpe等人(FEBS Let.(1986)195,1-8)
-檞寄生素(Viscumin)(Stirpe等人(FEBS Let.(1986)195,1-8)
-Volkesin(Volkesin)(Stirpe等人(FEBS Let.(1986)195,1-8)
-商陸毒蛋白(Dodecandrin)(Stirpe等人(FEBS Let.(1986)195,1-8)
-Tritin(Tritin)(Stirpe等人(FEBS Let.(1986)195,1-8)
-絲瓜籽毒蛋白(Luffin)(Stirpe等人(FEBS Let.(1986)195,1-8)
-括樓種子毒蛋白(Trichokirin)(Casellas等人(Eur.J.Biochem.(1988)176,581-588)、Bolognesi等人(Clin.Exp.Immunol.(1992)89,341-346)
抗原結合分子
本發明中，抗原結合分子係以代表含有低分子化合物(例如：目標組織專一的化合物)存在時對於抗原之結合活性高於該化合物不存在時對於抗原之結合活性之抗原結合分域的最廣含意使用，具體而言，此等只要顯示對於抗原之結合活性即可，包括各種分子型。例如：抗原結合分域與Fc區結合之分子， 例如抗體。抗體包括單一單株抗體(包含致效劑及拮抗劑抗體)、人類抗體、人類化抗體、嵌合抗體等。又，當作抗體之片段使用時，抗原結合分域及抗原結合片段(例如，Fab、F(ab')2、scFv及Fv)為理想例。將既有之安定的α/β筒狀蛋白質構造等立體構造作為支架(scaffold)，僅將其一部分構造用於建構抗原結合分域而資料庫化之支架分子，也包括在本發明之抗原結合分子。
本發明之抗原結合分子，可包含媒介對Fcγ受體之結合及/或對於FcRn之結合之Fc區之至少一部分。例如，於非限定之一態樣中，抗原結合分子可為抗體或Fc融合蛋白質。融合蛋白質，係指含有與在天然在具有其自然不連結之第1胺基酸序列之多胜肽連結之第2胺基酸序列之多胜肽的嵌合多胜肽。例如，融合蛋白質可包括編碼為Fc區之至少部分(例如賦予對Fcγ受體之結合之Fc區之部分及/或賦予對FcRn之結合之Fc區之部分)之胺基酸序列之多胜肽。胺基酸序列也可存在於一起運到融合蛋白質之其他蛋白質，或此等通常存在於相同蛋白質但會重新再編入融合多胜肽中。融合蛋白質例如可依化學合成，或製作以所望關係編碼為胜肽區之聚核苷酸並以表現其之基因重組的方法製作。
本發明之各分域可利用多胜肽鍵直接連結，並可經由連結子連結。連結子，可使用能依基因工程導入之任意胜肽連結子、或合成化合物連結子(例如Protein Engineering(1996)9(3),299-305)揭示之連結子等，但本發明以胜肽連結子較理想。胜肽連結子之長度不特別限定，可視目的由該技術 領域中具有通常知識者適當選擇，但理想長度為5個胺基酸以上(上限不特別限定，通常為30個胺基酸以下，較佳為20個胺基酸以下)，尤佳為15個胺基酸。
例如：胜肽連結子之情形：Ser
Gly．Ser
Gly．Gly．Ser
Ser．Gly．Gly
Gly．Gly．Gly．Ser(序列編號：19)
Ser．Gly．Gly．Gly(序列編號：20)
Gly．Gly．Gly．Gly．Ser(序列編號：21)
Ser．Gly．Gly．Gly．Gly(序列編號：22)
Gly．Gly．Gly．Gly．Gly．Ser(序列編號：23)
Ser．Gly．Gly．Gly．Gly．Gly(序列編號：24)
Gly．Gly．Gly．Gly．Gly．Gly．Ser(序列編號：25)
Ser．Gly．Gly．Gly．Gly．Gly．Gly(序列編號：26)
(Gly．Gly．Gly．Gly．Ser(序列編號：21))n
(Ser．Gly．Gly．Gly．Gly(序列編號：22))n[n為1以上之整數]等為理想例。惟，胜肽連結子之長度或序列可視目的由該技術領域中具有通常知識者適當選擇。
合成化學物連結子(化學交聯劑)，為胜肽交聯通常使用之交聯劑，例如N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)、辛二酸二琥珀醯亞胺酯(DSS)、辛二酸二(硫琥珀醯亞胺基)酯(BS 3)、二硫雙(琥珀醯亞胺基丙酸酯)(DSP)、二硫雙(硫琥珀醯亞胺基丙酸 酯)(DTSSP)、乙二醇雙(琥珀醯亞胺基琥珀酸酯)(EGS)、乙二醇雙(硫琥珀醯亞胺基琥珀酸酯)(硫-EGS)、二琥珀醯亞胺基酒石酸鹽(DST)、二硫琥珀醯亞胺基酒石酸鹽(硫-DST)、雙[2-(琥珀醯亞胺氧羰基氧)乙基]碸(BSOCOES)、雙[2-(硫琥珀醯亞胺氧羰基氧)乙基]碸(硫-BSOCOES)等，該等交聯劑在市面上可購得。
連結各分域之連結子使用多個時，可均使用同種連結子，也可使用異種連結子。又，上述記載例示之連結子以外，也可適當使用有例如His標籤、HA標籤、myc標籤、FLAG標籤等胜肽標籤之連結子。又，氫鍵、雙硫鍵、共價鍵、離子性交互作用或該等結合之組合而彼此結合之性質也可適當利用。例如利用抗體之CH1與CL間之親和性、利用與異Fc區組合時以前述雙專一性抗體為起源之Fc區。再者，在分域間形成之雙硫鍵也可適當地利用。
為了將各分域以胜肽鍵連結，將編碼為該分域之聚核苷酸於同一讀框連結。聚核苷酸於同一讀框連結之方法，以限制片段之接合或融合PCR、重疊PCR等方法為公知，本發明之抗原結合分子之製作也可適當單獨或組合使用該等方法。本發明中，用語「經連結」、「經融合」、「連結」或「融合」可相互交換的使用。該等用語，指利用包含上述化學結合手段或重組方法之所有方法將二個以上之多胜肽等的要素或成分形成為單一構造的方式進行連結。於同一讀框融合，當二以上之要素或成分為多胜肽時，係指以維持該多胜肽之正確讀取框之方式，為了形成連續的較長的讀取框之二個以上讀取框單位 之連結。當二分子之Fab作為抗原結合分域使用時，該抗原結合分域與含Fc區之不變區未經連結子而以胜肽鍵於同一讀框連結而得之本發明之抗原結合分子抗體，可作為本發明之理想抗原結合分子使用。
低分子化抗體
本發明使用之抗體，不限於抗體之全長分子，也可為低分子化抗體或其修飾物。低分子化抗體，包括全長抗體(whole antibody、例如whole IgG等)有部分缺損之抗體片段。只要有對抗原之結合活性，則不特別限定。本發明中的低分子化抗體只要是全長抗體之一部分即不特別限定，宜包含重鏈可變區(VH)或/及輕鏈可變區(VL)較佳。VH或VL之胺基酸序列可包含取代、缺失、加成及/或插入。又，只要具有對於抗原之結合活性，則VH或/及VL中部分缺損亦可。又，可變區可嵌合化或人型化。抗體片段之具體例，例如：Fab、Fab'、F(ab')2、Fv等。又，低分子化抗體之具體例，例如：Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv(single chain Fv)、雙體抗體(Diabody)、sc(Fv)2(single chain(Fv)2)等。該等抗體之多量體(例如：二聚體、三聚體、四聚體、聚合物)也包括在本發明之低分子抗體。
抗體片段，可藉由將抗體以木瓜酶、胃蛋白酶處理而獲得，或，可藉由建構編碼為該等抗體片段之基因，將其導入到表現載體後，於適當寄主細胞使其表現而取得(例如參考例如：Co等(J.Immunol.(1994)152,2968-2976)、Better及Horwitz(Methods in Enzymology(1989)178,476-496)、Plueckthun及Skerra等(Methods in Enzymology(1989)178, 476-496)、Lamoyi(Methods in Enzymology(1989)121,652-663)、Rousseaux等(Methods in Enzymology(1989)121,663-669)及Bird等(TIBTECH(1991)9,132-137))。
雙體抗體(Diabody)係指利用基因融合而建構之二價(bivalent)之低分子化抗體(Holliger等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90,6444-6448、EP404,097、WO1993/11161等)。雙體抗體，係由二條多胜肽鏈構成之二聚體。通常，多胜肽鏈分別在相同鏈中以VL及VH之無法彼此結合之程度之短之約5個殘基連結子結合。所以，在同一多胜肽鏈上編碼之VL與VH，因為其之間的連結子短，無法形成單鏈可變區片段，而會形成二聚體。其結果，雙體抗體成為有二個抗原結合部位。
scFv可藉由將抗體之H鏈V區域與L鏈V區域連結以取得。具體而言，scFv可藉由將H鏈V區域與L鏈V區域經由連結子，較佳為胜肽連結子予以連結而製作(Huston等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,(1988)85,5879-5883)。scFv中，H鏈V區域及L鏈V區域，也可為在本說明書作為抗體記載之任意抗體來源。將V區域連結之胜肽連結子，無特別的限制，例如可使用由3各至25個殘基左右構成的任意單鏈胜肽、或後述胜肽連結子等作為連結子。作為V區域之連結方法，可利用如上述PCR法。將編碼為前述抗體之H鏈或H鏈V區域之DNA序列、及編碼為L鏈或L鏈V區域之DNA序列當中編碼為全部或所望胺基酸序列之DNA部分當作模板，並使用具有對應於其兩端之序列之序列的一對引子的PCR 法，可將編碼為scFv之DNA放大。其次藉由將編碼為胜肽連結子部分之DNA、及設計為其兩端與各H鏈、L鏈能連結之序列之一對引子組合並進行PCR反應，可取得具所望序列之DNA。又，若先製作編碼為scFv之DNA，可依常法取得含有此等之表現載體、及利用該表現載體轉形之重組細胞，又，培養其結果獲得之重組細胞，並使編碼為該scFv之DNA表現，可取得該scFv。
sc(Fv)2，係將2條VH及2條VL以連結子等結合成單鏈之低分子化抗體(Hudson等(J.Immunol.Methods(1999)231,177-189)。sc(Fv)2可藉由例如將scFv以連結子連結以製作。
又，宜為特徵係2條VH及2條VL以單鏈多胜肽之N末端側作為基點，依VH、VL、VH、VL([VH]連結子[VL]連結子[VH]連結子[VL])之順序排列之抗體為較佳。2條VH與2條VL之順序不特別限於上述配置，任意順序排列均可。例如可依以下方式配置。
-[VL]連結子[VH]連結子[VH]連結子[VL]
-[VH]連結子[VL]連結子[VL]連結子[VH]
-[VH]連結子[VH]連結子[VL]連結子[VL]
-[VL]連結子[VL]連結子[VH]連結子[VH]
-[VL]連結子[VH]連結子[VL]連結子[VH]
作為將抗體可變區結合之連結子，可使用與前述抗原結合分子之項目記載連結子為同樣之連結子。例如：本發明中特好的sc(Fv)2之態樣，可列舉例如以下之sc(Fv)2。
-[VH]胜肽連結子(15胺基酸)[VL]胜肽連結子(15胺基酸)[VH]胜肽連結子(15胺基酸)[VL]
結合4個抗體可變區時，通常需要3個連結子，但可全部使用相同連結子也可使用不同的連結子。本發明非限定之低分子化抗體態樣，可列舉係彼此互異之抗體結合部位且其中一抗體結合部位結合到在癌細胞、浸潤於發炎組織之細胞等的細胞膜結合之膜型分子存在之抗原決定部位，另一抗體結合部位結合於在效應子細胞之細胞膜表現之膜型分子中存在之抗原決定部位的Diabody或sc(Fv)2。上述Diabody或sc(Fv)2中，其中一抗體結合部位對於與癌細胞、浸潤於發炎組織之細胞等之細胞膜結合之膜型分子存在之抗原決定部位之結合活性可依存於低分子化合物(例如：癌組織專一的化合物、發炎組織專一的化合物、非天然化合物)，其中一抗體結合部位對於在效應子細胞之細胞膜結合之膜型分子存在之抗原決定部位的結合活性，可依存於低分子化合物(例如：癌組織專一的化合物、發炎組織專一的化合物、非天然化合物)，又，兩抗體結合部位之結合活性可依存於低分子化合物(例如：癌組織專一的化合物、發炎組織專一的化合物、非天然化合物)。
本發明一非限定低分子化抗體之態樣，可列舉係彼此互異之抗體結合部位，且其中一抗體結合部位係與癌細胞、浸潤於發炎組織之細胞等之細胞膜結合之膜型分子存在之抗原決定部位結合，另一抗體結合部位係與細胞傷害性物質存在之抗原決定部位結合之Diabody或sc(Fv)2。上述Diabody或sc(Fv)2中，其中一抗體結合部位對於癌細胞、浸潤於發炎 組織之細胞膜結合之膜型分子存在之抗原決定部位之結合活性，可依存於低分子化合物(例如：癌組織專一的化合物、發炎組織專一的化合物、非天然化合物)，且其中一抗體結合部位對於細胞傷害性物質存在之抗原決定部位之結合活性可依存於低分子化合物(例如：癌組織專一的化合物、發炎組織專一的化合物、非天然化合物)，又，兩抗體結合部位之結合活性可依存於癌組織專一性化合物。
為了獲得如此之低分子化抗體，可將抗體以酵素例如：木瓜酶、胃蛋白等處理，使生成抗體片段、或建構編碼為該等抗體片段或低分子化抗體之DNA，將其導入表現載體後，使適當寄主細胞表現(例如參照：Co,M.S.et al.,J.Immunol.(1994)152,2968-2976；Better,M.and Horwitz,A.H.,Methods Enzymol.(1989)178,476-496；Pluckthun,A.and Skerra,A.,Methods Enzymol.(1989)178,497-515；Lamoyi,E.,Methods Enzymol.(1986)121,652-663；Rousseaux,J.et al.,Methods Enzymol.(1986)121,663-669；Bird,R.E.and Walker,B.W.,Trends Biotechnol.(1991)9,132-137)。
FcRn
與屬於免疫球蛋白超級家族之Fcγ受體不同，人類FcRn在構造上與主要組織不適合性複合體(MHC)第I類之多胜肽在構造相類似，且與第I類之MHC分子有22至29%之序列同一性(Ghetie等人，Immunol.Today(1997)18(12),592-598)。FcRn，係由與可溶性β或輕鏈(β2微球蛋白)複合體化之穿膜α或重鏈構成的異二聚體的形式表現。如MHC，FcRn之α鏈係 由3個細胞外分域(α1、α2、α3)構成，且短的細胞質分域係將蛋白質繋留在細胞表面。α1及α2域會與抗體之Fc區中之FcRn結合分域交互作用(Raghavan等人(Immunity(1994)1,303-315)。
FcRn係於哺乳動物之母性胎盤或卵黃嚢表現，其涉及IgG從母親移動到胎兒。此外，於表現FcRn之囓齒類新生兒的小腸中，涉及母體IgG從攝取FcRn之初乳或乳橫切移動到刷子緣上皮。FcRn有複數個種類，在複數個其他組織、及各種內皮細胞系表現。其在人類成人類血管內皮、肌肉血管系、及肝臓洞狀毛細血管也有表現。FcRn會與IgG結合，並且再循環到血清，而據認為有維持IgG之血漿中濃度之作用。FcRn對於IgG分子之結合，通常係嚴格依存於pH，最適結合據認為是小於7.0之pH酸性域。
以含序列編號：28表示之信號序列之多胜肽當做前驅體之人類FcRn，於活體內(序列編號：29記載包含信號序列之其多胜肽)會與人類β2-微球蛋白形成複合體。與β2-微球蛋白形成複合體之可溶型人類FcRn可使用通常之重組表現方法製造。可以評價本發明之Fc區對於與如此的與β2-微球蛋白形成複合體之可溶型人類FcRn的結合活性。本發明中，未特別記載時，人類FcRn指能與本發明之Fc區結合之形態者，例如人類FcRn與人類β2-微球蛋白之複合體。
作為本發明與不變區改變技術之組合之態樣，可列舉和於酸性pH的FcRn結合增強改變Fc技術(WO2002060919、WO2004035752、WO2000042072)、於中性 pH的FcRn結合增強改變Fc技術(WO2011122011、WO2012133782)、抑制型Fcγ受體選擇性結合增強技術(WO2012115241、WO2013125667)、活性型Fcγ受體選擇性結合增強技術(ADCC活性增強技術)(WO2013002362)、使向Rheumatoid factor之結合活性降低之技術(WO2013046704)等之抗體改變技術的組合。
本發明與可變區改變技術之非限定組合之態樣，可列舉和pH依存性抗體(WO2009125825)、鈣依存性抗體(WO2012073992)等改變技術之組合。
包含二分子之FcRn及一分子之活性型Fcγ受體四者之異複合體
依FcRn與IgG抗體間的結晶學的研究，FcRn-IgG複合體，係由二分子之FcRn對一分子之IgG構成，且據認為位於IgG之Fc區兩側之CH2及CH3分域之接觸面附近發生二分子之結合(Burmeister等(Nature(1994)372,336-343)。另一方面，如PCT/JP2012/058603之實施例3已確認，抗體之Fc區能形成含有二分子之FcRn及一分子之活性型Fcγ受體四者的複合體(PCT/JP2012/058603)。此異複合體之形成，係針對於含有pH中性域之條件下對於FcRn有結合活性之Fc區之抗原結合分子之性質進行解析之結果而明白的現象。
本發明不受特定理論所拘束，但也認為抗原結合分子含有之Fc區與含二分子之FcRn及一分子之活性型Fcγ受體四者之異複合體之形成，會對於抗原結合分子投予到活體內時之抗原結合分子在該活體內之藥物動態(血漿中滯留性)、及 對於所投予之抗原結合分子之免疫回應(免疫原性)帶來如以下之影響。免疫細胞上除了表現各種活性型Fcγ受體也表現FcRn，抗原結合分子在免疫細胞上形成如此之四者複合體，使對於免疫細胞之親和性提高，而且藉由進一步將細胞內分域組合化，使內在化信號增強，啟示會促進攝入免疫細胞。抗原提示細胞中也同樣，藉由在抗原提示細胞之細胞膜上形成四者複合體，啟示可能使抗原結合分子容易攝入抗原提示細胞。一般而言，被攝入抗原提示細胞之抗原結合分子，係在抗原提示細胞內之溶體被分解，並且對於T細胞提示。結果，藉由在抗原提示細胞之細胞膜上形成上述四者複合體，使攝入針對抗原結合分子之抗原提示細胞被促進，可能造成抗原結合分子之血漿中滯留性惡化。又，同樣，可能引發免疫回應(惡化)。
所以，當將如此之形成四者複合體之能力下降的抗原結合分子對活體投予時，可認為該抗原結合分子之血漿中滯留性提高，由於該活體引起之免疫回應誘發受抑制。在如此之包括抗原提示細胞之免疫細胞上抑制該複合體形成之抗原結合分子之理想態樣，可列舉以下三種。
抑制異複合體形成之抗原結合分子
(態樣1)含有於pH中性域條件下對於FcRn有結合活性，且對於活性型FcγR之結合活性低於對於天然型Fc區之活性型FcγR之結合活性之Fc區之抗原結合分子
態樣1之抗原結合分子，係藉由與二分子之FcRn結合而形成三者複合體，但不形成含有活性型FcγR之複合體。對於活性型FcγR之結合活性低於天然型Fc區對於活性型 FcγR之結合活性的Fc區，可如前述藉由改變天然型Fc區之胺基酸而製作。改變Fc區對於活性型FcγR之結合活性，是否比起天然型Fc區對於活性型FcγR之結合活性低，可使用前述結合活性之項目記載之方法適當實施。
作為活性型Fcγ受體，可列舉包括FcγRIa、FcγRIb及FcγRIc之FcγRI(CD64)、FcγRIIa(包括副型R131及H131)以及包括構造同型FcγRIIIa(包括副型V158及F158)及FcγRIIIb(包括副型FcγRIIIb-NA1及FcγRIIIb-NA2)之FcγRIII(CD16)為理想例。
本說明書中，Fc區改變體對於活性型Fcγ受體之結合活性低於天然型Fc區對於活性型Fcγ受體之結合活性，係指Fc區改變體對於FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa及/或FcγRIIIb中之任一者之人類Fcγ受體的結合活性，低於天然型Fc區對於該等人類Fcγ受體之結合活性。例如：係指依據上述解析方法，相較於作為對照之含天然型Fc區之抗原結合分子之結合活性，含Fc區改變體之抗原結合分子之結合活性顯示95%以下，較佳為90%以下、85%以下、80%以下、75%以下，尤佳為70%以下、65%以下、60%以下、55%以下、50%以下、45%以下、40%以下、35%以下、30%以下、25%以下、20%以下、15%以下、10%以下、9%以下、8%以下、7%以下、6%以下、5%以下、4%以下、3%以下、2%以下、1%以下之結合活性。作為天然型Fc區，可使用初始Fc區，也可使用野生型抗體之不同構造同型之Fc區。
又，天然型對於活性型FcγR之結合活性，係指人 類IgG1對於Fcγ受體之結合活性較佳，使對於Fcγ受體之結合活性減低，可藉由上述改變，除此以外癟可藉由改變為人類IgG2、人類IgG3、人類IgG4之構造同型以達成。又，使對於Fcγ受體之結合活性下降，除了上述改變以外，也可藉由使含Fc區之抗原結合分子於大腸菌等未加成糖鏈之寄主表現以獲得。
作為對照之含Fc區之抗原結合分子，可適當使用具有IgG單株抗體之Fc區之抗原結合分子。該Fc區之結構，記載於序列編號：5(RefSeq註冊編號AAC82527.1之N末端有A加成)、6(RefSeq註冊編號AAB59393.1之N末端有A加成)、7(RefSeq註冊編號CAA27268.1)、8(RefSeq註冊編號AAB59394.1之N末端有A加成)。又，當將含有某特定構造同型之抗體之Fc區之抗原結合分子作為待測物質的情形，藉由將具有該特定構造同型之IgG單株抗體之Fc區的抗原結合分子當作對照，可驗證含該Fc區之抗原結合分子所致之對Fcγ受體之結合活性之效果。如上述，可適當選擇已驗證含有對於Fcγ受體之結合活性為高之Fc區之抗原結合分子。
本發明之一非限定態樣中，作為對於活性型FcγR之結合活性低於天然型Fc區對活性型FcγR之結合活性的Fc區之例，可列舉前述Fc區之胺基酸中之EU編號表示之234、235、236、237、238、239、270、297、298、325、328、及329中之任一者以上之胺基酸改變為與天然型Fc區相異之胺基酸的Fc區為理想例，但Fc區之改變不限於上述改變，例如也可為 Cur.Opin.in Biotech.(2009)20(6),685-691記載之脫糖鏈(N297A,N297Q)、IgG1-L234A/L235A、IgG1-A325A/A330S/P331S、IgG1-C226S/C229S、IgG1-C226S/C229S/E233P/L234V/L235A、IgG1-L234F/L235E/P331S、IgG1-S267E/L328F、IgG2-V234A/G237A、IgG2-H268Q/V309L/A330S/A331S、IgG4-L235A/G237A/E318A、IgG4-L236E等改變、及國際公開WO2008/092117記載之G236R/L328R、L235G/G236R、N325A/L328R、N325L/L328R等改變、及EU編號233位、234位、235位、237位之胺基酸之插入、國際公開WO2000/042072記載之部位之改變。
又，本發明之一非限定態樣中，係前述Fc區之EU編號表示之胺基酸：234位之胺基酸為Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr或Trp中之任一者、235位之胺基酸為Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Met、Pro、Ser、Thr、Val或Arg中之任一者、236位之胺基酸為Arg、Asn、Gln、His、Leu、Lys、Met、Phe、Pro或Tyr中之任一者、237位之胺基酸為Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、His、Ile、Leu、Lys、Met、Pro、Ser、Thr、Val、Tyr或Arg中之任一者、238位之胺基酸為Ala、Asn、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Thr、Trp或Arg中之任一者、239位之胺基酸為Gln、His、Lys、Phe、Pro、Trp、Tyr 或Arg中之任一者、265位之胺基酸為Ala、Arg、Asn、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val中之任一者、266位之胺基酸為Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、267位之胺基酸為Arg、His、Lys、Phe、Pro、Trp或Tyr中之任一者、269位之胺基酸為Ala、Arg、Asn、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val中之任一者、270位之胺基酸為Ala、Arg、Asn、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val中之任一者、271位之胺基酸為Arg、His、Phe、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、295位之胺基酸為Arg、Asn、Asp、Gly、His、Phe、Ser、Trp或Tyr中之任一者、296位之胺基酸為Arg、Gly、Lys或Pro中之任一者、297位之胺基酸為Ala、298位之胺基酸為Arg、Gly、Lys、Pro、Trp或Tyr中之任一者、300位之胺基酸為Arg、Lys或Pro中之任一者、324位之胺基酸為Lys或Pro中之任一者、325位之胺基酸為Ala、Arg、Gly、His、Ile、Lys、Phe、 Pro、Thr、TrpTyr、或Val中之任一者、327位之胺基酸為Arg、Gln、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val中之任一者、328位之胺基酸為Arg、Asn、Gly、His、Lys或Pro中之任一者、329位之胺基酸為Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val或Arg中之任一者、330位之胺基酸為Pro或Ser中之任一者、331位之胺基酸為Arg、Gly或Lys中之任一者、或332位之胺基酸為Arg、Lys或Pro中之任一者
中之任一者以上之經改變之Fc區為理想例。
(態樣2)含有於pH中性域條件下對FcRn有結合活性，且對抑制型FcγR之結合活性高於對於活性型Fcγ受體之結合活性之Fc區的抗原結合分子
態樣2之抗原結合分子，可藉由結合於二分子之FcRn與一分子之抑制型FcγR而形成包含此等四者的複合體。但是一分子之抗原結合分子僅可與一分子之FcγR結合，所以，一分子之抗原結合分子在已與抑制型FcγR結合之狀態無法與其他活性型FcγR結合。再者，據報告已與抑制型FcγR結合之狀態攝入細胞內之抗原結合分子會再循環到細胞膜上，並避免在細胞內分解(Immunity(2005)23,503-514)。亦即，對於抑制型FcγR有選擇性的結合活性的抗原結合分子，據認為無法形成成為免疫回應之原因的含活性型FcγR及二分子之 FcRn之異複合體。
作為活性型Fcγ受體，含FcγRIa、FcγRIb及FcγRIc之FcγRI(CD64)、FcγRIIa(包括副型R131及H131)以及含構造同型FcγRIIIa(包括副型V158及F158)及FcγRIIIb(包括副型FcγRIIIb-NA1及FcγRIIIb-NA2)之FcγRIII(CD16)為理想例。又，FcγRIIb(包括FcγRIIb-1及FcγRIIb-2)為抑制型Fcγ受體之理想例。
本說明書中，對於抑制型FcγR之結合活性高於對於活性型Fcγ受體之結合活性，係指Fc區改變體對於FcγRIIb之結合活性，高於對於FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa及/或FcγRIIIb中之任一人類Fcγ受體之結合活性。例如：依據上述解析方法，含Fc區改變體之抗原結合分子對於FcγRIIb之結合活性，顯示對於FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa及/或FcγRIIIb中之任一人類Fcγ受體之結合活性之105%以上，較佳為110%以上、120%以上、130%以上、140%以上，尤佳為150%以上、160%以上、170%以上、180%以上、190%以上、200%%以上、250%以上、300%以上、350%以上、400%以上、450%以上、500%以上、750%以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上之結合活性。
對於FcγRIIb之結合活性高於FcγRIa、FcγRIIa(包括副型R131及H131)及FcγRIIIa(包括副型V158及F158)最佳。FcγRIa對於天然型IgG1之親和性極高，所以，據認為在活體內由於大量內因性IgG1使結合飽和，因此，即使對FcγRIIb之結合活性高於FcγRIIa及FcγRIIIa、低於FcγRIa，仍會抑制 該複合體形成。
作為對照之含Fc區之抗原結合分子，可適當使用具有IgG單株抗體之Fc區之抗原結合分子。該Fc區之結構，記載於序列編號：5(RefSeq註冊編號AAC82527.1之N末端有A加成)、6(RefSeq註冊編號AAB59393.1之N末端有A加成)、7(RefSeq註冊編號CAA27268.1)、8(RefSeq註冊編號AAB59394.1之N末端有A加成)。又，當使用含特定之構造同型之抗體之Fc區之抗原結合分子作為待測物質使用的情形，藉由將具有該特定構造同型之IgG單株抗體之Fc區之抗原結合分子作為對照，可驗證由於該含Fc區之抗原結合分子所致之對Fcγ受體之結合活性之效果。以上述方式，可適當選擇含有已驗證對Fcγ受體之結合活性為高之Fc區之抗原結合分子。
本發明之一非限定態樣中，作為對抑制型FcγR有選擇性結合活性之Fc區之例，可列舉前述Fc區之胺基酸中之EU編號表示之238或328之胺基酸改變為與天然型Fc區相異之胺基酸之Fc區為理想例。又，作為對於抑制型Fcγ受體有選擇性結合活性之Fc區，US2009/0136485記載之Fc區或改變也可適當選擇。
又，本發明之一非限定態樣中，係前述Fc區之EU編號表示之胺基酸且EU編號表示之238之胺基酸改變為Asp、或328之胺基酸改變為Glu中之任一者以上之Fc區為理想例。
又，本發明之一非限定態樣中，EU編號表示之238位之Pro取代為Asp、及EU編號表示之237位之胺基酸為Trp、 EU編號表示之237位之胺基酸為Phe、EU編號表示之267位之胺基酸為Val、EU編號表示之267位之胺基酸為Gln、EU編號表示之268位之胺基酸為Asn、EU編號表示之271位之胺基酸為Gly、EU編號表示之326位之胺基酸為Leu、EU編號表示之326位之胺基酸為Gln、EU編號表示之326位之胺基酸為Glu、EU編號表示之326位之胺基酸為Met、EU編號表示之239位之胺基酸為Asp、EU編號表示之267位之胺基酸為Ala、EU編號表示之234位之胺基酸為Trp、EU編號表示之234位之胺基酸為Tyr、EU編號表示之237位之胺基酸為Ala、EU編號表示之237位之胺基酸為Asp、EU編號表示之237位之胺基酸為Glu、EU編號表示之237位之胺基酸為Leu、EU編號表示之237位之胺基酸為Met、EU編號表示之237位之胺基酸為Tyr、EU編號表示之330位之胺基酸為Lys、EU編號表示之330位之胺基酸為Arg、EU編號表示之233位之胺基酸為Asp、EU編號表示之268位之胺基酸為Asp、EU編號表示之268位之胺基酸為Glu、EU編號表示之326位之胺基酸為Asp、EU編號表示之326位之胺基酸為Ser、EU編號表示之326位之胺基酸為Thr、EU編號表示之323位之胺基酸為Ile、EU編號表示之323位之胺基酸為Leu、EU編號表示之323位之胺基酸為Met、EU編號表示之296位之胺基酸為Asp、EU編號表示之326位之胺基酸為Ala、EU編號表示之326位之胺基酸為Asn、EU編號表示之330位之胺基酸為Met中之任一者以上之經改變的Fc區為理想例。
(態樣3)含有構成Fc區之二條多胜肽其中之一 在pH中性域之條件下對於FcRn有結合活性且另一在pH中性域之條件下對於FcRn無結合能力活性之Fc區的抗原結合分子
態樣3之抗原結合分子，能藉由一分子之FcRn與一分子之FcγR結合而形成三者複合體，但是不形成包含二分子之FcRn與一分子之FcγR四者之異複合體。本態樣3之抗原結合分子含有之構成Fc區之二條多胜肽其中之一在pH中性域之條件下對於FcRn有結合活性且另一在pH中性域之條件下對於FcRn無結合能力活性之Fc區，可適當使用將雙專一性抗體(bispecific抗體)作為起源之Fc區。雙專一性抗體，係對於相異抗原具有專一性之二種類之抗體。IgG型之雙專一性抗體，可藉由使將2種產生IgG抗體之融合瘤融合而產生之混成融合瘤(hybrid hybridoma)(quadroma)分泌(Milstein等人(Nature(1983)305,537-540)。
當上述態樣3之抗原結合分子係使用前述抗體項目記載之重組方法製造的情形，可採用將編碼為構成目的之二種Fc區之多胜肽之基因導入細胞並使此等共同表現的方法。但是製造的Fc區，會成為以2：1：1之分子數比例存在以下分子之混合物，即：構成Fc區之二條多胜肽其中之一在pH中性域之條件下對於FcRn有結合活性且另一多胜肽於pH中性域之條件下對於FcRn無結合能力活性之Fc區、構成Fc區之二條多胜肽均在pH中性域之條件下對於FcRn有結合活性之Fc區、構成Fc區之二條多胜肽均在pH中性域之條件下對於FcRn無結合活性之Fc區。難以從3種IgG精製出含有目的組合之Fc區之抗原結合分子。
當使用如此的重組方法製造態樣3之抗原結合分子時，可藉由對於構成Fc區之CH3分域施以適當胺基酸取代之改變，而優先分泌含有異質組合之Fc區的抗原結合分子。具體而言，將存在於其中一重鏈之CH3分域的胺基酸側鏈取代為較大側鏈(knob(「突起」之意))，並將存在於另一重鏈之CH3分域的胺基酸側鏈取代為較小側鏈(hole(「空隙」之意))，藉此使突起能配置於空隙內，而引起異種重鏈形成之促進及同種重鏈形成之妨害的方法(WO1996/027011、Ridgway等人(Protein Engineering(1996)9,617-621)、Merchant等人(Nat.Biotech.(1998)16,677-681))。
又，也已知將利用多胜肽之組合、或多胜肽構成之異種多聚物之組合之控制方法用在構成Fc區之二條多胜肽之組合而製作雙專一性抗體之技術。亦即，可採用藉由改變形成構成Fc區之二條多胜肽內之界面之胺基酸殘基以控制使具相同序列之構成Fc區之多胜肽之組合受抑制且形成序列相異之二條構成Fc區之多胜肽之組合體的方法於雙專一性抗體之製作(WO2006/106905)。具體而言，在前述雙專一性抗體及其製作方法之項目記載之方法，於製造本發明之態樣3之抗原結合分子時可作為一非限定態樣。
此等態樣1~3之抗原結合分子，相較於能形成四者複合體之抗原結合分子，均可期待使免疫原性下降、及血漿中滯留性提高。
抗原結合分域之製造方法
本發明提供於低分子化合物存在時對於抗原之結合活性 高於該化合物不存在時對於抗原之結合活性之抗原結合分域之製造方法。
亦即，本發明提供一種抗原結合分域之製造方法，包含以下(a)~(e)之步驟；(a)獲得低分子化合物不存在時抗原結合分域之抗原結合活性之步驟，(b)獲得低分子化合物存在時抗原結合分域之抗原結合活性之步驟，(c)選擇低分子化合物不存在時之抗原結合活性低於該化合物存在時之抗原結合活性之抗原結合分域之步驟，(d)培養導入有將編碼為(c)選擇之抗原結合分域之聚核苷酸以可作用地連結之載體的細胞之步驟，及(e)從(d)培養之細胞之培養液回收抗原結合分域之步驟。
又，本發明提供一種抗原結合分域之製造方法，包含以下(a)~(e)之步驟；(a)獲得存在低濃度低分子化合物時抗原結合分域之抗原結合活性之步驟，(b)獲得存在高濃度低分子化合物時抗原結合分域之抗原結合活性之步驟，(c)選擇存在低濃度低分子化合物時之抗原結合活性低於該化合物以高濃度存在時之抗原結合活性之抗原結合分域之步驟，(d)培養導入有將編碼為(c)選擇之抗原結合分域之聚核苷酸以可作用地連結之載體的細胞之步驟，及 (e)從(d)培養之細胞之培養液回收抗原結合分域之步驟。
再者，本發明提供一種抗原結合分域之製造方法，包含以下(a)~(e)之步驟；(a)於低分子化合物存在時使抗原結合分域或此等之資料庫與抗原接觸之步驟，(b)將前述步驟(a)與抗原結合之抗原結合分域放置於該化合物不存在下之步驟，(c)將前述步驟(b)解離之抗原結合分域單離之步驟，(d)培養導入有將編碼為(c)選擇之抗原結合分域之聚核苷酸以可作用地連結之載體的細胞之步驟，及(e)從(d)培養之細胞之培養液回收抗原結合分域之步驟。
再者，本發明提供一種抗原結合分域之製造方法，包含以下(a)~(e)之步驟；(a)於存在高濃度低分子化合物時使抗原結合分域或此等之資料庫與抗原接觸之步驟，(b)將於前述步驟(a)與抗原結合之抗原結合分域放置於該化合物低濃度存在下之步驟，(c)將前述步驟(b)解離之抗原結合分域單離之步驟，(d)培養導入有將編碼為(c)選擇之抗原結合分域之聚核苷酸以可作用地連結之載體的細胞之步驟，及(e)從(d)培養之細胞之培養液回收抗原結合分域之步驟。
又，本發明提供一種抗原結合分域之製造方法，包含以下(a)~(f)之步驟；(a)於低分子化合物不存在下使抗原結合分域之資料庫 與抗原接觸之步驟，(b)選擇於前述步驟(a)未與抗原結合之抗原結合分域之步驟，(c)使於前述步驟(b)選擇之抗原結合分域於該化合物存在下與抗原結合之步驟，(d)將前述步驟(c)與抗原結合之抗原結合分域單離之步驟，(e)培養導入有將編碼為(d)選擇之抗原結合分域之聚核苷酸以可作用地連結之載體的細胞之步驟，及(f)從(d)培養之細胞之培養液回收抗原結合分域之步驟。
又，本發明提供一種抗原結合分域之製造方法，包含以下(a)~(f)之步驟；(a)於低分子化合物低濃度存在下使抗原結合分域之資料庫與抗原接觸之步驟，(b)選擇於前述步驟(a)未與抗原結合之抗原結合分域之步驟，(c)使於前述步驟(b)選擇之抗原結合分域於該化合物高濃度存在下與抗原結合之步驟，(d)將前述步驟(c)與抗原結合之抗原結合分域單離之步驟，(e)培養導入有將編碼為(d)選擇之抗原結合分域之聚核苷酸以可作用地連結之載體的細胞之步驟，及(f)從(e)培養之細胞之培養液回收抗原結合分域之步驟。
再者，本發明提供一種抗原結合分域之製造方 法，包含以下(a)~(e)之步驟；(a)於低分子化合物存在下使抗原結合分域之資料庫接觸固定有抗原之管柱之步驟，(b)使於前述步驟(a)與管柱結合之抗原結合分域於該化合物不存在下從管柱溶出之步驟，(c)將前述步驟(b)溶出之抗原結合分域單離之步驟，(d)培養導入有將編碼為(c)選擇之抗原結合分域之聚核苷酸以可作用地連結之載體的細胞之步驟，及(e)從(d)培養之細胞之培養液回收抗原結合分域之步驟。
再者，本發明提供一種抗原結合分域之製造方法，包含以下(a)~(e)之步驟；(a)於低分子化合物高濃度存在下使抗原結合分域之資料庫接觸固定有抗原之管柱之步驟，(b)使於前述步驟(a)已與管柱結合之抗原結合分域於該化合物低濃度存在下從管柱溶出之步驟，(c)將前述步驟(b)溶出之抗原結合分域單離之步驟，(d)培養導入有將編碼為(c)選擇之抗原結合分域之聚核苷酸以可作用地連結之載體的細胞之步驟，及(e)從(d)培養之細胞之培養液回收抗原結合分域之步驟。
再者，本發明提供一種抗原結合分域之製造方法，包含以下(a)~(f)之步驟；(a)於低分子化合物不存在下使抗原結合分域之資料庫通過固定有抗原之管柱之步驟，(b)回收於前述步驟(a)未與管柱結合而是溶出之抗原結 合分域之步驟，(c)使於前述步驟(b)回收之抗原結合分域於該化合物存在下與抗原結合之步驟，(d)將前述步驟(c)與抗原結合之抗原結合分域單離之步驟，(e)培養導入有將編碼為(d)選擇之抗原結合分域之聚核苷酸以可作用地連結之載體的細胞之步驟，及(f)從(e)培養之細胞之培養液回收抗原結合分域之步驟。
再者，本發明提供一種抗原結合分域之製造方法，包含以下(a)~(f)之步驟；(a)於低分子化合物低濃度存在下使抗原結合分域之資料庫通過固定有抗原之管柱之步驟，(b)回收於前述步驟(a)未與管柱結合而是溶出之抗原結合分域之步驟，(c)使於前述步驟(b)回收之抗原結合分域於該化合物高濃度存在下與抗原結合之步驟，(d)將前述步驟(c)與抗原結合之抗原結合分域單離之步驟，(e)培養導入有將編碼為(d)選擇之抗原結合分域之聚核苷酸以可作用地連結之載體的細胞之步驟，及(f)從(e)培養之細胞之培養液回收抗原結合分域之步驟。
再者，本發明提供一種抗原結合分域之製造方法，包含以下(a)~(f)之步驟；(a)於低分子化合物存在下使抗原結合分域之資料庫與 抗原接觸之步驟，(b)取得於前述步驟(a)已與抗原結合之抗原結合分域之步驟，(c)將於前述步驟(b)取得之抗原結合分域放置於化合物不存在下之步驟，(d)將前述步驟(c)之抗原結合活性弱於在前述步驟(b)選擇之基準之抗原結合分域單離之步驟，(e)培養導入有將編碼為(d)選擇之抗原結合分域之聚核苷酸以可作用地連結之載體的細胞之步驟，及(f)從(e)培養之細胞之培養液回收抗原結合分域之步驟。
再者，本發明提供一種抗原結合分域之製造方法，包含以下(a)~(f)之步驟；(a)於低分子化合物高濃度存在下使抗原結合分域之資料庫與抗原接觸之步驟，(b)取得於前述步驟(a)已與抗原結合之抗原結合分域之步驟，(c)將於前述步驟(b)取得之抗原結合分域放置於化合物低濃度存在下之步驟，(d)將前述步驟(c)之抗原結合活性弱於在前述步驟(b)選擇之基準之抗原結合分域單離之步驟，(e)培養導入有將編碼為(d)選擇之抗原結合分域之聚核苷酸以可作用地連結之載體的細胞之步驟，及(f)從(e)培養之細胞之培養液回收抗原結合分域之步驟。
「細胞」、「細胞系」及「細胞培養」在本說明書 係以相同含意使用，如此的稱呼可包括細胞或細胞系的所有後代。如此，例如：「轉形體」及「轉形細胞」之類的用語，無論繼代數，包括由此而來的一次對象細胞及培養物。又，也可理解為因為故意或偶發性的突異使得所有的後代的DNA的內容並非精確地相同。也包括於起初之轉形細胞篩選出的具有實質相同機能或生物學的活性的變異體的後代。當意圖記載相異稱呼時，從該記載之前後關係應可明白其意圖。使用之細胞，可適當選擇在前述「抗體」項目記載之細胞中之適當者。
提及編碼序列之表現時，控制序列係指為了於特定寄主生物以可作用地連結之編碼序列之表現所必要之DNA鹼基序列。例如原核生物的理想控制序列，包括啟動子，視情形有操縱組序列、核糖體結合部位、及不是十分理解之其他之序列。真核細胞，為了表現編碼序列，利用啟動子、PolyA化信號及增強子已為公眾所知。
關於核酸「可作用地連結」，係指該核酸與其他核酸序列在機能方面有關係。例如，前驅序列(presequence)或分泌前導的DNA，當就某多胜肽之分泌以前驅體蛋白質的形式表現的情形，與該多胜肽之DNA以可作動地結合。起動子或增強子，在其影響某編碼序列之轉錄的情形，與其序列以可作用地連結。或核糖體結合部，在位於其容易轉譯的位置的情形，以可作用地與編碼序列連結。通常，「可作用地連結」，係指結合之DNA序列連續，且為分泌前導的情形，連續且位於讀取框內。但增強子不需連續。連結可藉由以適當的限制部位接合而達成。不存在如此之部位之情形，合成寡核苷酸適應子 (adaptor)或連結子可依習知的慣用方式使用。又，依前述Overlap Extension PCR之方法也可製作連結的核酸。
「接合」係在2個核酸片段之間形成磷酸二酯鍵之方法。為了將2個片段接合，必需使片段的末端彼此搭配。視情形，該末端在核酸內切酶消化之後立即可有搭配性。但為了適於接合，首先在核酸內切酶消化之後需將一般形成之附著末端改為平滑末端。為了成為平滑末端，將DNA於適當緩衝液中於15℃、於4種去氧核糖核苷酸三磷酸之存在下，以DNA聚合酶I或T4DNA聚合酶之Klenow片段的約10單位處理至少15分鐘。其次將DNA以酚氯仿萃取與乙醇沉澱、或二氧化矽精製精製。待連結之DNA片段係以等莫耳量加到溶液中。在該溶液中，加入ATP、接合酶緩衝液，以外，如T4DNA接合酶之接合酶係就DNA0.5μg含有約10單位。將DNA連結到載體的情形，載體首先由適當的限制核酸內切酶以消化作用使成線狀。成為線狀之片段其次以細菌之鹼性磷解酶或小牛腸管之磷解酶處理，而預防在接合之步驟之間之該片段自行接合。
本發明之製造方法中，將由上述「低分子化合物依存性的抗原結合分域」之項目說明之方法選擇之低分子化合物存在時對於抗原之結合活性高於該化合物不存在時對於抗原之結合活性之抗原結合分域予以單離。例如以此方式單離之抗原結合分域係從資料庫選出的情形，係依後述實施例所記載，將編碼為該抗原結合分域之聚核苷酸利用從噬菌體等病毒依通常之基因放大而單離。又，當如此之經單離之抗原結合分域或抗體係從融合瘤等細胞之培養液選出的情形，如前述抗體 之項目所示，係從該細胞將抗體基因等依通常之基因放大單離。
抗原結合分子之製造方法
本發明提供低分子化合物存在時對於抗原之結合活性高於該化合物不存在時對於抗原之結合活性之抗原結合分子之製造方法。
亦即，本發明提供一種抗原結合分子之製造方法，包含以下(a)~(f)之步驟；(a)獲得低分子化合物不存在時抗原結合分域之抗原結合活性之步驟，(b)獲得低分子化合物存在時抗原結合分域之抗原結合活性之步驟，(c)選擇低分子化合物不存在時之抗原結合活性低於該化合物存在時之抗原結合活性之抗原結合分域之步驟，(d)將編碼為(c)選擇之抗原結合分域之聚核苷酸與編碼為含Fc區之多胜肽之聚核苷酸連結之步驟，(e)培養導入有將(d)獲得之聚核苷酸以可作用地連結之載體的細胞之步驟，及(f)從(e)培養之細胞之培養液回收抗原結合分子之步驟。
又，本發明提供一種抗原結合分子之製造方法，包含以下(a)~(f)之步驟；(a)獲得存在低濃度低分子化合物時抗原結合分域之抗原結合活性之步驟，(b)獲得存在高濃度低分子化合物時抗原結合分域之抗 原結合活性之步驟，(c)選擇存在低濃度低分子化合物時之抗原結合活性低於該化合物以高濃度存在時抗原結合活性之抗原結合分域之步驟，(d)將編碼為(c)選擇之抗原結合分域之聚核苷酸與編碼為含Fc區之多胜肽之聚核苷酸連結之步驟，(e)培養導入有將(d)獲得之聚核苷酸以可作用地連結之載體的細胞之步驟，及(f)從(e)培養之細胞之培養液回收抗原結合分子之步驟。
再者，本發明提供一種抗原結合分子之製造方法，包含以下(a)~(f)之步驟；(a)於低分子化合物存在時使抗原結合分域或此等之資料庫與抗原接觸之步驟，(b)將前述步驟(a)與抗原結合之抗原結合分域放置於該化合物不存在下之步驟，(c)將前述步驟(b)解離之抗原結合分域單離之步驟，(d)將編碼為(c)選擇之抗原結合分域之聚核苷酸與編碼為含Fc區之多胜肽之聚核苷酸連結之步驟，(e)培養導入有將(d)獲得之聚核苷酸以可作用地連結之載體的細胞之步驟，及(f)從(e)培養之細胞之培養液回收抗原結合分子之步驟。
再者，本發明提供一種抗原結合分子之製造方法，包含以下(a)~(f)之步驟；(a)於存在高濃度低分子化合物時使抗原結合分域或此 等之資料庫與抗原接觸之步驟，(b)將於前述步驟(a)與抗原結合之抗原結合分域放置於該化合物低濃度存在下之步驟，(c)將前述步驟(b)解離之抗原結合分域單離之步驟，(d)將編碼為(c)選擇之抗原結合分域之聚核苷酸與編碼為含Fc區之多胜肽之聚核苷酸連結之步驟，(e)培養導入有將(d)獲得之聚核苷酸以可作用地連結之載體的細胞之步驟，及(f)從(e)培養之細胞之培養液回收抗原結合分子之步驟。
又，本發明提供一種抗原結合分子之製造方法，包含以下(a)~(g)之步驟；(a)於低分子化合物不存在下使抗原結合分域之資料庫與抗原接觸之步驟，(b)選擇於前述步驟(a)未與抗原結合之抗原結合分域之步驟，(c)使於前述步驟(b)選擇之抗原結合分域於該化合物存在下與抗原結合之步驟，(d)將前述步驟(c)與抗原結合之抗原結合分域單離之步驟，(e)將編碼為(d)選擇之抗原結合分域之聚核苷酸與編碼為含Fc區之多胜肽之聚核苷酸連結之步驟，(f)培養導入有將(e)獲得之聚核苷酸以可作用地連結之載體的細胞之步驟，及(g)從(f)培養之細胞之培養液回收抗原結合分子之步驟。
又，本發明提供一種抗原結合分子之製造方法，包含以下(a)~(g)之步驟；(a)於低分子化合物低濃度存在下使抗原結合分域之資料庫與抗原接觸之步驟，(b)選擇於前述步驟(a)未與抗原結合之抗原結合分域之步驟，(c)使於前述步驟(b)選擇之抗原結合分域於該化合物高濃度存在下與抗原結合之步驟，(d)將前述步驟(c)與抗原結合之抗原結合分域單離之步驟，(e)將編碼為(d)選擇之抗原結合分域之聚核苷酸與編碼為含Fc區之多胜肽之聚核苷酸連結之步驟，(f)培養導入有將(e)獲得之聚核苷酸以可作用地連結之載體的細胞之步驟，及(g)從(f)培養之細胞之培養液回收抗原結合分子之步驟。
再者，本發明提供一種抗原結合分子之製造方法，包含以下(a)~(f)之步驟；(a)於低分子化合物存在下使抗原結合分域之資料庫接觸固定有抗原之管柱之步驟，(b)將於前述步驟(a)已與管柱結合之抗原結合分域於該化合物不存在下從管柱溶出之步驟，(c)將前述步驟(b)溶出之抗原結合分域單離之步驟，(d)將編碼為(c)選擇之抗原結合分域之聚核苷酸與編碼為含Fc區之多胜肽之聚核苷酸連結之步驟， (e)培養導入有將(d)獲得之聚核苷酸以可作用地連結之載體的細胞之步驟，及(f)從(e)培養之細胞之培養液回收抗原結合分子之步驟。
再者，本發明提供一種抗原結合分子之製造方法，包含以下(a)~(f)之步驟；(a)於低分子化合物高濃度存在下使抗原結合分域之資料庫接觸固定有抗原之管柱之步驟，(b)將於前述步驟(a)與管柱結合之抗原結合分域於該化合物低濃度存在下從管柱溶出之步驟，(c)將前述步驟(b)溶出之抗原結合分域單離之步驟，(d)將編碼為(c)選擇之抗原結合分域之聚核苷酸與編碼為含Fc區之多胜肽之聚核苷酸連結之步驟，(e)培養導入有將(d)獲得之聚核苷酸以可作用地連結之載體的細胞之步驟，及(f)從(e)培養之細胞之培養液回收抗原結合分子之步驟。
再者，本發明提供一種抗原結合分子之製造方法，包含以下(a)~(g)之步驟；(a)於低分子化合物不存在下使抗原結合分域之資料庫通過固定有抗原之管柱之步驟，(b)回收於前述步驟(a)未與管柱結合而是溶出之抗原結合分域之步驟，(c)使於前述步驟(b)回收之抗原結合分域於該化合物存在下與抗原結合之步驟，(d)將前述步驟(c)與抗原結合之抗原結合分域單離之步 驟，(e)將編碼為(d)選擇之抗原結合分域之聚核苷酸與編碼為含Fc區之多胜肽之聚核苷酸連結之步驟，(f)培養導入有將(e)獲得之聚核苷酸以可作用地連結之載體的細胞之步驟，及(g)從(f)培養之細胞之培養液回收抗原結合分子之步驟。
再者，本發明提供一種抗原結合分子之製造方法，包含以下(a)~(g)之步驟；(a)於低分子化合物低濃度存在下使抗原結合分域之資料庫通過固定有抗原之管柱之步驟，(b)回收於前述步驟(a)未與管柱結合而是溶出之抗原結合分域之步驟，(c)將於前述步驟(b)回收之抗原結合分域於該化合物高濃度存在下與抗原結合之步驟，(d)使前述步驟(c)與抗原結合之抗原結合分域之步驟，(e)將編碼為(d)選擇之抗原結合分域之聚核苷酸與編碼為含Fc區之多胜肽之聚核苷酸連結之步驟，(f)培養導入有將(e)獲得之聚核苷酸以可作用地連結之載體的細胞之步驟，及(g)從(f)培養之細胞之培養液回收抗原結合分子之步驟。
再者，本發明提供一種抗原結合分子之製造方 法，包含以下(a)~(g)之步驟；(a)於低分子化合物存在下使抗原結合分域之資料庫與抗原接觸之步驟， (b)取得於前述步驟(a)與抗原結合之抗原結合分域之步驟，(c)將前述步驟(b)取得之抗原結合分域放置於化合物不存在下之步驟，(d)將前述步驟(c)中抗原結合活性弱於前述步驟(b)選擇之基準之抗原結合分域單離之步驟，(e)將編碼為(d)選擇之抗原結合分域之聚核苷酸與編碼為含Fc區之多胜肽之聚核苷酸連結之步驟，(f)培養導入有將(e)獲得之聚核苷酸以可作用地連結之載體的細胞之步驟，及(g)從(f)培養之細胞之培養液回收抗原結合分子之步驟。
再者，本發明提供一種抗原結合分子之製造方法，包含以下(a)~(g)之步驟；(a)於低分子化合物高濃度存在下使抗原結合分域之資料庫與抗原接觸之步驟，(b)取得於前述步驟(a)與抗原結合之抗原結合分域之步驟，(c)將於前述步驟(b)取得之抗原結合分域放置於化合物低濃度存在下之步驟，(d)將前述步驟(c)之抗原結合活性弱於前述步驟(b)選擇之基準之抗原結合分域單離之步驟，(e)將編碼為(d)選擇之抗原結合分域之聚核苷酸與編碼為含Fc區之多胜肽之聚核苷酸連結之步驟，(f)培養導入有將(e)獲得之聚核苷酸以可作用地連結之 載體的細胞之步驟，及(g)從(f)培養之細胞之培養液回收抗原結合分子之步驟。
再者，本發明提供一種含有因應低分子化合物之濃度而改變對於抗原之結合活性之抗原結合分域之抗原結合分子之製造方法，包含以下(a)~(g)之步驟；(a)於低分子化合物不存在下使本發明之資料庫與抗原接觸之步驟，(b)選擇於前述步驟(a)未結合於抗原之抗原結合分域之步驟，(c)將前述步驟(b)選擇的抗原結合分域於低分子化合物存在下與抗原接觸之步驟，(d)選擇前述步驟(c)結合於抗原之抗原結合分域之步驟，(e)將編碼為(d)選擇之抗原結合分域之聚核苷酸與編碼為含Fc區之多胜肽之聚核苷酸連結之步驟，(f)培養導入有將(e)獲得之聚核苷酸以可作用地連結之載體的細胞之步驟，及(g)從(f)培養之細胞之培養液回收抗原結合分子之步驟。
再者，上述態樣以外，尚提供一種含有因應低分子化合物之濃度而改變對於抗原之結合活性之抗原結合分域之抗原結合分子之製造方法，更包含以下(a)~(b)之步驟：(a)使本發明之資料庫接觸低分子化合物之步驟，及(b)選擇於前述步驟(a)回收之抗原結合分域之步驟。
再者，本發明提供一種含有因應低分子化合物之濃度而改變對於抗原之結合活性之抗原結合分域之抗原結合 分子之製造方法，包含以下(a)~(e)之步驟：(a)使本發明之資料庫於低分子化合物存在下與抗原接觸之步驟，(b)以比前述步驟(a)更低濃度的低分子化合物使抗原結合分域解離並回收之步驟，(c)使編碼為前述步驟(b)回收之抗原結合分域的多核苷酸連結於編碼為含Fc區之多胜肽的多核苷酸之步驟，(d)培養已導入以可作用地連結前述步驟(c)獲得之多核苷酸的載體的細胞之步驟，及(e)從前述步驟(d)培養之細胞之培養液回收抗原結合分子之步驟。
再者，上述態樣以外，尚提供一種含有因應低分子化合物之濃度而改變對於抗原之結合活性之抗原結合分域之抗原結合分子之製造方法，更包含以下(a)~(b)之步驟：(a)使本發明之資料庫接觸低分子化合物之步驟，及(b)選擇於前述步驟(a)回收之抗原結合分域之步驟。
作為對於編碼為抗原結合分域之聚核苷酸連結其聚核苷酸序列之Fc區之一非限定態樣，可列舉人類IgG1(序列編號：5)、IgG2(序列編號：6)、IgG3(序列編號：7)、或IgG4(序列編號：8)表示之抗體之不變區含有之Fc區。Fc區，係EU編號表示之約216位之胺基酸之木瓜酶切斷部位之鉸鍊區之N末端起、包含該鉸鍊、CH2及CH3分域之抗體之重鏈不變區之部分。Fc區，可從人類IgG1取得，但不限於IgG之特定次類。
作為對於編碼為抗原結合分域之聚核苷酸連結其聚核苷酸序列之Fc區之一非限定態樣，也可列舉比起天然型人類IgG之Fc區對於活性型FcγR之結合活性，對於活性型FcγR之結合活性較低之Fc區。如此之Fc區，可列舉選自EU編號表示之：EU編號表示之234、235、236、237、238、239、270、297、298、325、328、及329中任一者以上之胺基酸已改變為與例如：序列編號：5、6、7、或8表示之天然型Fc區為不同的胺基酸的Fc區為理想例，但Fc區之改變不限於上述改變，例如Cur.Opin.in Biotech.(2009)20(6),685-691記載之脫糖鏈(N297A,N297Q)、IgG1-L234A/L235A、IgG1-A325A/A330S/P331S、IgG1-C226S/C229S、IgG1-C226S/C229S/E233P/L234V/L235A、IgG1-L234F/L235E/P331S、IgG1-S267E/L328F、IgG2-V234A/G237A、IgG2-H268Q/V309L/A330S/A331S、IgG4-L235A/G237A/E318A、IgG4-L236E等改變、及國際公開WO2008/092117記載之G236R/L328R、L235G/G236R、N325A/L328R、N325L/L328R等改變、及EU編號233位、234位、235位、237位中，胺基酸之插入、國際公開WO2000/042072記載之部位之改變亦可。
本發明之抗原結合分子含有之Fc區，係修飾成使該Fc區結合之糖鏈之組成係結合有岩藻醣缺損糖鏈之Fc區之比例高、或加成有二分化N-乙醯基葡糖胺之Fc區之比例高之Fc區時，作為前述經轉形之細胞，可適當使用接受糖鏈修飾之多胜肽形成糖鏈結構之活性改變使得對於糖鏈加成岩藻醣之 能力低之寄主細胞(國際公開WO2000/061739、WO2002/031140、WO2006/067913等)。該寄主細胞之一非限定態樣，可適當使用從岩藻糖基轉移酶(EC 2.4.1.152)、岩藻糖轉運蛋白(SLC35C1)、GMD(GDP-甘露糖4,6-脫水酶)(EC 4.2.1.47)、Fx(GDP-酮-6-去氧甘露糖3,5-差向異構酶，4-還原酶)(EC 1.1.1.271)、及GFPP(GDP-β-L-岩藻糖焦磷酸化酶)(EC 2.7.7.30)構成之群中選出之酵素或運送蛋白之活性係缺失之寄主細胞(國際公開WO2000/061739、WO2002/031140、WO2006/067913等)。如此之活性缺失之寄主細胞，可藉由將CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髓瘤細胞、P3X63小鼠骨髓瘤細胞、PER細胞、PER.C6細胞、HEK293細胞、或融合瘤細胞等的內在性的機能性蛋白質之基因破壞為無法作用的方法等製作。
本發明之抗原結合分子含有之Fc區為具有二分化GlcNAc之糖鏈之Fc區時，作為前述經轉形之細胞，為了製作含二分化GlcNAc之糖鏈的抗體，係適當使用表現編碼為具有GnTIII(β-1,4-甘露糖基-糖蛋白，4-β-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶)(EC 2.4.1.144)活性或GalT(β-1,4-半乳糖基轉移酶)(EC 2.4.1.38)活性之機能性蛋白質的基因的寄主細胞(國際公開WO2002/079255等)。另一非限定之理想態樣中，係適當使用除了前述機能性蛋白質以外，尚共同表現編碼為具有人類ManII(甘露糖苷酶II)(3.2.1.114)活性之機能性蛋白質之基因、編碼為具有GnTI(β-1,2-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶I)(EC 2.4.1.94)活性之機能性蛋白質之基因、編碼為具有 GnTII(β-1,2-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶II)(EC 2.4.1.143)活性之機能性蛋白質之基因、編碼為具有ManI(甘露糖苷酶)(EC 3.2.1.113)活性之機能性蛋白質之基因、及α-1,6-岩藻糖基轉移酶(EC 2.4.1.68)之寄主細胞(國際公開WO2004/065540)。
使用從上述細胞之培養液單離等依上述抗體之項目記載之抗體之製造方法的方法，可製造本發明之抗原結合分子。前述含Fc區之多胜肽之一非限定態樣，例如：序列編號：5、6、7、或8表示之抗體之不變區。又，本發明之抗原結合分子之一非限定態樣，例如全長抗體分子。
醫藥組合物
依本發明提供一種醫藥組合物，其為了避免副作用且同時發揮藥效，包含於正常組織或血液中不全身性作用，而是於係病變部位之癌或發炎部位作用之抗原結合分子。本發明之醫藥組合物含有之抗原結合分子，由於可因應於目標組織中，專一性地存在之化合物及/或在該組織堆積等的天然化合物之濃度而控制向目標抗原之結合，例如該抗原結合分子，於將癌組織、發炎組織中之抗原作為目標時，會與於癌組織中之癌細胞．免疫細胞．基質細胞等表現之抗原、癌組織分泌之抗原、或發炎性組織中之免疫細胞等表現之抗原、發炎性組織分泌之抗原結合，且不與正常組織表現之抗原結合，所以可避免對於正常組織之細胞傷害作用或中和作用等造成副作用，對於癌發揮強大的細胞傷害作用或增殖抑制作用、免疫亢進作用等、或於發炎性組織發揮對於發炎性細胞之免疫抑制效果等。例如：包含對於癌組織專一性化合物依存性地在T細胞表現之CD3結合之 抗原結合分域、及與癌細胞表現之EGFR結合之抗原結合分域的雙專一性抗原結合分子或雙重抗原結合位之抗原結合分子，不會與正常組織表現之EGFR結合，而會與癌細胞表現之EGFR結合，所以會避免副作用且同時發揮強大的抗腫瘤效果。亦即，對於癌細胞附近之T細胞表現的CD3會以癌組織專一性化合物依存性的結合，但是對於癌細胞附近以外之T細胞表現之CD3不結合，所以會活化癌細胞附近存在的T細胞，且避免副作用，同時發揮強大的抗腫瘤效果。
如上，於目標組織與抗原結合，且於其他正常組織或血液中不與抗原結合之抗原結合分子，會避免副作用且同時發揮藥效。本發明提供於活體內之目標組織以高濃度存在之低分子作為開關而與抗原結合之抗原結合分子，亦即，低分子開關抗原結合分子(Small molecule switch antigen binding molecule)，於該低分子不存在之正常環境不與抗原結合，而於該低分子以高濃度存在之目標組織可與抗原結合。
如此之低分子開關抗原結合分子之一非限定態樣，首先，可列舉於癌組織或發炎性組織以高濃度存在且能作為開關功能之癌組織或發炎性組織專一性化合物即腺苷(adenosine)、腺苷3磷酸(adenosine 5'-triphosphate；ATP)、肌苷(inosine)、犬尿胺酸(犬尿胺酸)、前列腺素E2(prostaglandin E2；PGE2)、琥珀酸(succinic acid)、乳酸(lactic acid)夾持於本發明之抗原結合分子(含有之抗體結合部位)與抗原(含有之抗原決定部位)，而發揮開關機能之癌組織或發炎性組織專一性的化合物依存性抗原結合分子。若該化合物不存在，本發明之 抗原結合分子所含之抗體結合部位與抗原含有之抗原決定部位間之交互作用不夠，本發明之抗原結合分子無法與抗原結合，但若該化合物存在，藉由夾於本發明之抗原結合分子所含之抗體結合部位與抗原含有之抗原決定部位之間，於該化合物以高濃度存在之癌組織或發炎性組織等目標組織中與抗原結合之該抗原結合分子能夠對於表現該抗原之細胞發揮藥效。又，成為此開關之化合物之結合係可逆的，故據認為該等化合物之開關所致之本發明之抗原結合分子對於抗原之結合之控制係可逆的。如此，在癌組織或發炎性組織等病變部位之癌組織或發炎性組織，與癌細胞或免疫細胞等病態細胞結合或與於癌組織或發炎性組織分泌之抗原結合且可發揮藥效之本發明之抗原結合分子，作為醫藥組合物係有用。本發明之醫藥組合物可包含醫藥上可容許之擔體。
本發明中，醫藥組合物係指通常用於疾病之治療或預防、或檢查．診斷用的藥劑。又，本發明中，「包含因應低分子化合物之濃度而對於抗原之結合活性改變之抗原結合分子的醫藥組合物」之用語(在此，低分子化合物為目標組織專一的化合物、非天然化合物等)，也可代換為「包含對於治療對象投予因應低分子化合物之濃度而對於抗原之結合活性改變之抗原結合分子之步驟的疾病之治療方法」，也可代換為「在製造用於治療疾病之醫藥時使用因應低分子化合物之濃度而對於抗原之結合活性改變化之抗原結合分子之用途」。又，「包含因應低分子化合物之濃度而對於抗原之結合活性改變之抗原結合分子的醫藥組合物」之用語，也可代換為「為了 治療疾病，使用因應低分子化合物之濃度而對於抗原之結合活性改變化之抗原結合分子」。
本發明之醫藥組成物，能以該技術領域之人士公知之方法製劑化。例如：能以與水或其他藥學上可容許之液體的無菌性溶液、或懸浮液劑之注射劑之形式以非經口的使用。例如：藥理學上可容許之擔體或介質，具體而言，可考慮適當組合滅菌水或生理食鹽水、植物油、乳化劑、懸浮劑、界面活性劑、安定劑、香味劑、賦形劑、運載劑、防腐劑、黏結劑等，以一般認可的製藥實務要求的單位用量形態混合而製劑化。該等製劑中的有效成分量，可設定為可獲得指示範圍之適當容量。
用於注射之無菌組成物，可使用如注射用蒸餾水之運載劑而依通常之製劑實務配方。注射用之水溶液，例如生理食鹽水、葡萄糖或含其他輔助藥(例如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化鈉)之等張液。也可併用適當的溶解輔助劑，例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇、聚乙二醇等)、非離子性界面活性劑(聚山梨糖醇酸酯80(TM)、HCO-50等)。
油性液，例如麻油、黃豆油，溶解輔助劑可併用苯甲酸苄酯及/或苯甲醇。又，也可摻合緩衝劑(例如：磷酸鹽緩衝液及乙酸鈉緩衝液)、止痛劑(例如：鹽酸普羅卡因)、安定劑(例如：苯甲醇及酚)、抗氧化劑。製備的注射液通常充填在適當的安瓿。
本發明之醫藥組成物較佳為以非經口投予。例如可製成注射劑型、經鼻投予劑型、經肺投予劑型、經皮投予型 之組成物。例如可利用靜脈內注射、肌肉內注射、腹腔內注射、皮下注射等對於全身或局部投予。
投予方法可視患者之年齡、症狀適當選擇。含抗原結合分子之醫藥組成物之投予量，例如可設定為每次體重1kg為0.0001mg至1000mg之範圍。或，可定為例如每位患者為0.001~100000mg之投予量，但本發明不一定限於該等數值。投予量及投予方法，視患者之體重、年齡、症狀等而變動，但如為該技術領域之人士，可考慮該等條件，設定適當的投予量及投予方法。
又，本發明記載之胺基酸序列所包含之胺基酸，有時會受到轉譯後修飾(例如：N末端之麩醯胺酸由於焦麩胺醯基化而修飾為焦麩胺酸為該技術領域之人士熟知之修飾)，但如此的胺基酸為轉譯後修飾時，當然也包含在本發明記載之胺基酸序列。
本說明書記載之1或複數個態樣任意組合者，只要依據該技術領域中有通常知識者之技術常識無技術上矛盾，當然包括在本發明，此事為該技術領域中有通常知識者能理解。
又，本說明書引用之所有先前技術文獻納入本說明書作為參考。
以下對於本發明於實施例更具體說明，但是本發明不限於此等實施例。
【實施例】
[實施例1]以於目標組織以高濃度存在之低分子 作為開關而與抗原結合之抗體之概念及取得策略
(1-1)於目標組織專一的化合物存在下對於抗原之結合能力變化之開關抗體之概念
為了避免副作用同時發揮藥效，尋求於正常組織或血液中不全身性作用，而是在係病變部位之癌或發炎部位作用之新藥開發技術。投予後與癌細胞表現之抗原結合且無法與在正常組織表現之抗原結合之抗體分子，能避免對於正常組織因為細胞傷害作用導致之副作用且同時對於癌發揮強大的細胞傷害作用。例如：前述EGFR-BiTE(非專利文獻9)係經改變之抗原結合分子，該不與正常組織表現之EGFR結合，而與癌細胞表現之EGFR結合之分子，能避免副作用且同時發揮強大抗腫瘤效果。又，BiTE藉由CD3補充T細胞且活化，以發揮抗腫瘤效果(非專利文獻8)，所以對於EGFR-BiTE，若能賦予會與癌細胞附近存在的T細胞表現之CD3結合，而與癌細胞附近以外存在之T細胞表現之CD3不結合之性質，則賦予了如此之性質之改變EGFR-BiTE，能夠將癌之T細胞活化，可避免副作用且同時發揮強大的抗腫瘤效果。
抗體分子不限於作為對抗癌之抗體醫藥，抗體分子若能在類風濕關節炎中引起發炎之關節之滑膜液中與細胞介素結合並抑制其作用，且不會全身性地抑制，則據認為可避免由於全身性細胞激素之中和造成傳染病風險增大，且同時可對於類風濕關節炎等發炎性疾病.自體免疫疾病發揮高治療效果。
如上，於癌組織與抗原結合，且於其他正常組織 或血液中不與抗原結合之抗體，能避免副作用且發揮藥效。但是至今為止，尚無具有如此特性之理想抗體被報告。而，以活體內之癌組織中以高濃度存在之低分子、或有對於活體投予後會堆積在癌組織之性質的化合物作為開關而與抗原結合之抗體分子，亦即，低分子開關抗體(Small molecule switch antibody)，如第1圖，於不存在低分子之環境不與抗原結合，於低分子以高濃度存在之目標組織可與抗原結合。
在開發如此之低分子開關抗體時，首先找尋於癌組織以高濃度存在且據認為能作為開關使用之低分子。其結果，腺苷(adenosine)、腺苷3磷酸(adenosine 5'-triphosphate；ATP)、肌苷(inosine)、犬尿胺酸(犬尿胺酸)、前列腺素E2(prostaglandin E2；PGE2)、琥珀酸(succinic acid)、乳酸(lactic acid)作為開關有希望。該等低分子均藉由從癌細胞自體產生、或從細胞死之癌細胞放出、或從於癌組織浸潤之免疫細胞等產生，而於癌組織以高濃度存在，且於正常組織或血液中相較於癌組織以較低濃度存在。
其次，探尋具有對於活體投予後會堆積於癌組織之性質的分子。Xeloda、TH302這些前驅藥當對於活體內投予後，會被於癌組織表現的代謝酵素代謝，產生成為開關之低分子。亦即5-FU(fluorouracil)、Br-IPM等被認為作為開關有前景。5-FU係Capecitabine(Xeloda)之代謝物，已知會被係癌組織專一的代謝酵素之胞嘧啶核苷去胺酶(cytidine deaminase)與胸腺嘧啶磷解酶(thymidine phosphorylase)代謝(Desmoulin F.et al.Drug Metab Dispos.2002)。又，TH-302，已知會在如癌 組織周邊，於低氧條件下被還原而轉變成Br-IPM(Duan JX,et al.J Med Chem.2008)。由該等可知：將前驅藥對於活體內投予後，以在癌組織表現之代謝酵素代謝，會變成以高濃度存在，於正常組織、血液中，比起癌組織係以低濃度存在。
該等低分子，如第2圖，若能夾於抗體與抗原之複合體，則該低分子可執行開關功能。或藉由該等低分子結合於抗體，使抗體之抗原結合部位之立體結構改變，藉此能使向抗原之結合能力改變的話，該低分子能發揮開關機能。亦即，若低分子不存在，抗體與抗原之交互作用不夠，抗體無法與抗原結合，但若低分子存在，藉由夾於抗體與抗原之間，抗體能與抗原結合。換言之，於低濃度低分子存在下，抗體與抗原之交互作用不足，抗體無法與抗原結合，但是於高濃度之低分子存在下藉由夾於抗體與抗原之間，抗體能與抗原結合。又，成為此開關之低分子之結合係可逆的，所以利用該等低分子開關控制抗原結合係可逆的。
也可藉由將成為開關之外來性化合物經口投予、藉由以經口劑之服用來控制抗體之作用。亦即，也可將能以經口等非侵入性投予之外來性化合物作為開關，將對於某抗原顯示結合之開關抗體先以靜脈內或皮下投予等侵入式投予，並將成為開關之外來性化合物予以經口等非侵入性投予，而控制此抗體之作用。抗體醫藥的半減期長，故有產生副作用的情形則其作用會持續的缺點，但若能以此方式將抗體之作用利用外來性化合物之經口等非侵入性投予以控制，則副作用產生時可藉由停止開關分子投予以停止藥作用。又，可藉由事先投予開關 抗體，並於因為病症產生症狀時才投予開關分子，以僅於必要時利用經口等非侵入性投予而發揮藥理作用。
(1-2)於目標組織專一的化合物存在下對於抗原之結合能力改變化之開關抗體之取得策略
作為用於以更良好效率創製於目標組織專一的化合物存在之有無而可逆地和抗原結合之開關抗體的方法，有利用資料庫技術之方法。藉由將維持和目標組織專一的化合物之結合的抗體作為模板，並將未涉及和化合物之結合之可變區予以資料庫化，能比起通常的抗體資料庫，以更高頻度出現能和化合物結合之抗體，所以據認為能以良好效率取得有所望性質之抗原結合分子。首先，為了取得成為資料庫之模板序列的抗體，嘗試取得對於已知於癌細胞以高濃度存在之腺苷或ATP的結合抗體。
[實施例2]利用兔B細胞選殖取得抗腺苷抗體
(2-1)用以製作腺苷結合資料庫之免疫原之設計
作為對兔免疫之免疫原，使用第3圖所示之2'-Adenosine-PEG-Tetanus toxin p30 helper peptide(2'-Adenosine-PEG-peptide)、及第4圖所示之5'-Adenosine-PEG-Tetanus toxin p30 helper peptide(5'-Adenosine-PEG-peptide)。Tetanus toxin p30 helper peptide係由FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(序列編號：4)之胺基酸序列構成，鑑別為在幫助者T細胞上表現之T細胞受體之抗原決定部位的胜肽(Eur.J.Immunol.(1989)19,2237-2242)。已知活化抗體產生(J.Immunol.(1992)149, 717-721)，藉由與腺苷連結，作用為佐劑，期待能增加對抗腺苷之抗體之產生。設計以使產生之抗體之抗原決定部位與腺苷不易含於Tetanus toxin p30 helper peptide，腺苷與Tetanus toxin p30 helper peptide之連結係介由PEG。腺苷為ATP之代謝物，ATP之磷酸基係加成於腺苷之5'位羥基，因此，據認為腺苷之5'位羥基不是抗原決定部位之抗體，可與腺苷結合也可與ATP結合。即，5'-Adenosine-PEG-Tetanus toxin p30 helper peptide藉由作為免疫原，可容易獲得能與腺苷與ATP兩者結合之抗體，推測藉由將2'-Adenosine-PEG-Tetanus toxin p30helper peptide作為免疫原，容易獲得與腺苷結合且與ATP不結合之抗體，故依(2-2)記載製作與腺苷之2'位或5'位連結之包含Tetanus toxin p30 helper peptide之二種免疫原。
此外，依以下方式製作將Tetanus toxin p30 helper peptide替換為使生物素接合物之2'-Adenosine-PEG-biotin(第5圖)及5'-Adenosine-PEG-biotin(第6圖)。藉由驗證對於此等二種腺苷-PEG-生物素之結合，可判別不是包括Tetanus toxin p30 helper peptide作為抗原決定部位之抗體。
(2-2)用於腺苷結合資料庫製作之免疫原之合成
將2'-Adenosine-PEG-peptide(adenosine 2'-PEG-peptide conjugate或2'-(PEG-peptide)adenosine)及2'-Adenosine-PEG-biotin(adenosine 2'-PEG-biotin conjugate或2'-(PEG-biotin)adenosine)以如下方式合成。又，合成之2'-Adenosine-PEG-peptide或2'-Adenosine-PEG-biotin依以下條件分析或分級。
LCMS之分析條件如下。
HPLC之分級條件如下。
(2-2-1)化合物006(Boc-Phe-Asn-Asn-Phe-Thr(tBu)-Val-Ser(tBu)-Phe-Trp(Boc)-Lue-Arg(Pbf)-Val-Pro-Lys(Boc)-Val-Ser(tBu)-Ala-Ser(tBu)-His(Trt)-Leu-Glu(tBu)-OH)之合成
使用胜肽合成機(Multipep RS；Intavis)，依Fmoc法實施胜肽合成。所有之Fmoc胺基酸係從渡邊化學工業購買。又，操作之詳細程序依合成機附帶的手冊。
於合成機中放置已鍵結C末端之Fmoc-Glu(tBu)-OH之2-氯三苯甲基樹脂(每根管柱250mg、30根管柱、11.7mmol)、各種Fmoc胺基酸(0.6mol/L)與1-羥基-7-氮雜苯并三唑(0.375mol/L)之N,N-二甲基甲醯胺溶液、二異丙基碳二醯亞胺之N,N-二甲基甲醯胺溶液(10%v/v)，並且使用含5%(wt/v)之尿素之哌啶之N,N-二甲基甲醯胺溶液(20%v/v)作為Fmoc脫保護溶液實施合成反應。樹脂以N,N-二甲基甲醯胺洗滌後，進行Fmoc脫保護，再進行Fmoc胺基酸之縮合反應，作為1個循環，重複此循環，在樹脂表面上使胜肽伸長。伸長結束後，將樹脂以三氟乙醇洗滌，加入三氟乙醇/二氯甲烷(=1/1)，從樹脂切出胜肽，獲得化合物006(7.2g)粗產物。
LCMS(ESI)m/z=1185(M+3H)3+
保持時間：1.24分(分析條件SQDAA05)
(2-2-2)化合物007之合成
將於冷卻至0℃之腺苷(2.00g、7.48mmol)之N,N-二甲基甲醯胺(40ml)懸浮液中已加入60%氫化鈉(0.42g、10.48mol)之反應液在0℃攪拌1小時。將已加入溴乙酸甲酯(0.76ml、8.01mmol)之該反應液於室溫攪拌5小時。將已加入乙酸(1ml)及甲醇(3ml)之反應混合物減壓濃縮。將獲得之殘渣以順相矽膠管柱層析(二氯甲烷/甲醇)精製，獲得化合物007(0.93g、37%)。
LCMS(ESI)m/z=340(M+H)+
保持時間：0.27分(分析條件SQDFA05)
(2-2-3)化合物008之合成
將已加入第三丁基二甲基矽基氯(999mg、6.63mol)及咪唑(722mg、10.61mol)之化合物007(900mg、2.65mmol)之吡啶(8ml)溶液於室溫攪拌4小時。將從反應混合物經乙酸乙酯/水萃取而得之有機層以飽和食鹽水洗滌。將以無水硫酸鈉乾燥過的有機層過濾後減壓濃縮。將獲得之殘渣以順相矽膠管柱層析(二氯甲烷/甲醇)精製，獲得化合物008(1.17g、78%)。
LCMS(ESI)m/z=568(M+H)+
保持時間：1.10分(分析條件SQDFA05)
(2-2-4)化合物009之合成
將加入已溶於水(0.17ml)之氫氧化鋰(61mg、2.55mol)之化合物008(290mg、0.511mmol)之甲醇(0.34ml)/四氫呋喃(0.34ml)溶液於室溫攪拌30分鐘。將以1M鹽酸中和之反應混合物減壓濃縮。將從濃縮殘渣以乙酸乙酯/水萃取而得之有機層以飽和食鹽水洗滌。以無水硫酸鈉乾燥過的有機層經過濾後減壓濃縮，獲得化合物009(319mg、90%)。
LCMS(ESI)m/z=552(M-H)-
保持時間：0.97分(分析條件SQDFA05)
(2-2-5)化合物010及化合物011之合成
【化11】
將已加入1-羥基苯并三唑(75mg、0.553mol)及1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二醯亞胺鹽酸鹽(106mg、0.553mol)之化合物009(255mg、0.460mmol)之N,N-二甲基甲醯胺(1.5ml)溶液於室溫攪拌3分鐘。將已加入O-(2-胺基乙基)-O'-2-疊氮乙基)九乙二醇(291mg、0.553mmol)的反應液於室溫攪拌3小時。將已減壓濃縮之反應混合物之殘渣以逆相矽膠管柱層析(10mM乙酸銨水溶液/甲醇)精製，獲得化合物010(177mg、42%)及011(72mg、19%)。
化合物010
LCMS(ESI)m/z=1063(M+H)+
保持時間：0.98分(分析條件SQDFA05)
化合物011
LCMS(ESI)m/z=949(M+H)+
保持時間：0.67分(分析條件SQDFA05)
(2-2-6)化合物012之合成
將已加入10%鈀碳(34mg)之化合物010(170mg、0.160mmol)之乙醇(1ml)溶液於氫氣環境攪拌2小時。再加入 10%鈀碳(34mg)，於氫氣環境攪拌2小時，使反應完結。將反應液之濾液減壓濃縮，獲得化合物012(34mg、95%)。
LCMS(ESI)m/z=1037(M+H)+
保持時間：0.70分(分析條件SQDFA05)
(2-2-7)化合物013及化合物014之合成
將已加入化合物006(354mg、0.110mmol)、1-羥基苯并三唑(13mg、0.100mol)及1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二醯亞胺鹽酸鹽(19mg、0.100mol)之化合物012(86mg、0.083mmol)之N,N-二甲基甲醯胺(1.5ml)溶液於室溫攪拌2小時。將反應混合物之濾液以表2記載之分級條件A精製，獲得 化合物013及014之混合物(72mg)。
化合物013
LCMS(ESI)m/z=1525(M+3H)3+、1144(M+4H)4+
保持時間：1.13分(分析條件SQDAA50)
化合物014
LCMS(ESI)m/z=1444(M+3H)3+、1083(M+4H)4+
保持時間：1.02分(分析條件SQDAA50)
(2-2-8)2'-Adenosine-PEG-peptide(adenosine 2'-PEG-peptide conjugate或2'-(PEG-peptide)adenosine)(化合物015)之合成
將已加入三氟乙酸(16ml)、二氯甲烷(8ml)、水(1.3ml)、及四異丙基矽烷(1.3ml)之化合物013及014之混合物(42mg)於室溫攪拌6小時。將已減壓濃縮之反應混合物之殘渣以表2記載之分級條件B精製，獲得化合物015(10mg)。
LCMS(ESI)m/z=1090(M+3H)3+、818(M+4H)4+
保持時間：0.52分(分析條件SQDAA50)
(2-2-9)化合物016之合成
【化16】
將已加入10%鈀碳(34mg)之化合物011(70mg、0.074mmol)之乙醇(1ml)溶液於氫氣環境攪拌5小時。將反應液之濾液減壓濃縮，獲得化合物016(58mg、85%)。
LCMS(ESI)m/z=923(M+H)+
保持時間：0.50分(分析條件SQDFA05)
(2-2-10)化合物017之合成
將已加入N-琥珀醯亞胺基D-生物素(24mg、0.069mmol)、及三乙胺(13μl、0.094mol)之化合物016(58mg、0.063mmol)之N,N-二甲基甲醯胺(1ml)溶液於室溫攪拌2小時。再加入N-琥珀醯亞胺基D-生物素(5mg、0.015mmol)後，於室溫攪拌1.5小時，使反應完結。將反應混合物以逆相矽膠管柱層析(10mM乙酸銨水溶液/甲醇)精製，獲得化合物017(50mg、69%)。
LCMS(ESI)m/z=1149(M+H)+
保持時間：1.04分(分析條件SQDFA05)
(2-2-11)2'-Adenosine-PEG-生物素(adenosine 2'-PEG-biotin conjugate或2'-(PEG-biotin)adenosine)(化合物 018)之合成
將已加入1M氟化四正丁基銨四氫呋喃溶液(65μl、0.065mmol)之化合物017(62mg、0.054mmol)之四氫呋喃(2ml)溶液於室溫攪拌1小時。再加入1M氟化四正丁基銨四氫呋喃溶液(20μl、0.020mmol)，於室溫攪拌1小時使反應完結。將已減壓濃縮之反應液之殘渣以逆相矽膠管柱層析(0.1%甲酸水溶液/0.1%甲酸乙腈)精製，獲得化合物018(12mg、21%)。
LCMS(ESI)m/z=1035(M+H)+
保持時間：0.71分(分析條件SQDAA05)
又，5'-Adenosine-PEG-peptide及5'-Adenosine-PEG-biotin也使用同樣反應合成。
(2-3)利用動物製作腺苷結合抗體及抗體之篩選
將兔以通常之方法利用2'-Adenosine-PEG-peptide及/或5'-Adenosine-PEG-peptide免疫。使用autoMACS Pro Separator與FACSAria(BD)之Adenosine-PEG-biotin結合性及兔IgG之表現為指標，從經免疫之兔血液採集之細胞懸浮液挑選出有腺苷結合活性之細胞之候選者。其次，篩選在挑選之細胞之培養上清中分泌之抗體。篩選，係利用ELISA法評價是否對於 Adenosine-PEG-biotin有結合活性。又，將Adenosine與Adenosine-PEG-biotin一起加入1000倍以上，是否會抑制對於Adenosine-PEG-biotin之結合，也是以ELISA法評價。從具有對於Adenosine-PEG-biotin之結合活性且將以Adenosine-PEG-biotin與Adenosine一起加入時會抑制對於Adenosine-PEG-biotin之結合作為指標而挑選的細胞，使用PCR法取得H鏈可變區及L鏈可變區。將取得之可變區與人類IgG1重鏈不變區、及人類輕鏈不變區組合表現。
[實施例3]從兔B細胞選殖獲得之選殖體之評價
(3-1)從兔B細胞選殖獲得之選殖體對於2'-Adenosine-PEG-Biotin之結合活性之評價
使用SPR法評價利用兔B細胞選殖法獲得之選殖體對於腺苷之結合活性。使用Biacore 4000(GE Healthcare)，以反應動力學解析上述選殖體與2'-Adenosine-PEG-Biotin之抗原抗體反應。使目的之抗體捕捉到經胺偶聯法固定有適量protein A/G(Invitrogen)之感應晶片CM5(GE Healthcare)。其次，將作為分析物之100nmol/L之2'-Adenosine-PEG-Biotin交互作用60秒後，追蹤測定分析物之解離60秒。運行緩衝液使用HBS-P+(GE Healthcare)。測定均於25℃實施，分析物之稀釋使用運行緩衝液。
將使2'-Adenosine-PEG-Biotin交互作用時之結合量除以各抗體之捕捉量(RU)得到之值(N_binding_100)、及2'-Adenosine-PEG-Biotin交互作用後從各抗體解離2'-Adenosine-PEG-Biotin60秒後之值除以各抗體之捕捉量(RU) 得到之值(N_stability_100)作為指標，比較各抗體對於2'-Adenosine-PEG-Biotin之結合活性。惟，捕捉量為1500 RU以下之抗體未能充分觀察到結合，故排除在探討的對象以外。其結果如第7圖。從第7圖之結果可知：利用B細胞選殖法可取對對於腺苷以各種親和性結合之選殖體。
(3-2)2'-Adenosine-PEG-Biotin結合選殖體對於腺苷及ATP之結合活性之評價及其序列解析
已認定對2'-Adenosine-PEG-Biotin結合之選殖體對於腺苷或ATP之結合，以SPR法及競爭ELISA法進行評價。
(3-2-1)2'-Adenosine-PEG-Biotin結合選殖體利用SPR法所為之對於腺苷之結合之評價
使用Biacore T200(GE Healthcare)，解析B cell cloning法獲得之抗體SMB0002、SMB0089、SMB0104與腺苷之抗原抗體反應之交互作用。使目的之抗體捕捉到在感應晶片CM5(GE Healthcare)上經以胺偶聯法適量固定之protein A/G(Invitrogen)，使抗原腺苷交互作用。運行緩衝液使用50mmol/L TrisHCl、150mmol/L NaCl、0.02%(w/v)Tween20、pH7.6。測定均於25℃實施，抗原之稀釋使用運行緩衝液。
針對SMB0002，將抗原稀釋液與空白運行緩衝液以流速30μL/min添加75秒，使各抗原於捕捉在感測晶片上抗體交互作用。之後以流速30μL/min流通運行緩衝液4分鐘，觀察抗原從抗體之解離。之後，以流速30μL/min添加30秒10mmol/L Glycine-HCl,pH1.5，將感測晶片再生。從測定獲得之感測圖，計算動力學參數結合速度常數ka(1/Ms)、及解離 速度常數kd(1/s)。依該等常數計算解離常數KD(M)。各參數之計算係使用Biacore T200 Evaluation Software(GE Healthcare)。
其結果發現：SMB0002對於腺苷顯示結合。評價選殖體與腺苷以100(2重複)、50、25、12.5、6.25、3.13nM之濃度之結合時觀察到的感測圖整理於第8A圖。如第8A圖，認為SMB0002對於腺苷之KD為1.5×10-8(mol/L)。
(3-2-2)2'-Adenosine-PEG-Biotin結合選殖體利用SPR法所為之對於ATP之結合之評價
使用Biacore T200(GE Healthcare)，解析與ATP之抗原抗體反應之交互作用。使目的之抗體捕捉到在感應晶片CM5(GE Healthcare)上經以胺偶聯法適量固定之protein A/G(Invitrogen)，使抗原ATP交互作用。運行緩衝液使用10mmol/L ACES、150mmol/L NaCl、0.05%(w/v)Tween20、pH7.4。測定均於25℃實施，抗原之稀釋使用運行緩衝液。
針對SMB0002，將抗原稀釋液與空白運行緩衝液以流速20μL/min注射2分鐘，使各抗原於捕捉在感測晶片上抗體交互作用。之後以流速20μL/min流通運行緩衝液3分鐘，觀察抗原從抗體之解離。之後，以流速30μL/min注射30秒10mmol/L Glycine-HCl,pH1.5，將感測晶片再生。從測定獲得之感測圖，計算動力學參數結合速度常數ka(1/Ms)、及解離速度常數kd(1/s)。依該等常數計算解離常數KD(M)。各參數之計算係使用Biacore T200 Evaluation Software(GE Healthcare)。
其結果發現：SMB0002對於ATP也會顯示結合。評價選殖體與ATP以5000、1250、313、78.1nM之濃度之結合時觀察到的感測圖整理於第8B圖。如第8A圖及第8B圖，認為SMB0002對於腺苷與ATP兩者顯示結合。SMB0002對於腺苷之KD為1.5E-8(mol/L)，SMB0002對於ATP之KD為1.0E-5(mol/L)。
(3-2-3)2'-Adenosine-PEG-Biotin結合選殖體利用競爭ELISA法進行之對於腺苷及ATP之結合評價
將已認為對於2'-Adenosine-PEG-Biotin結合之抗體以PBS稀釋成1μg/mL，加到384 well之MAXISorp(Nunc)之各井，於室溫放置1小時以上，使與板結合。去除板之各井中經PBS稀釋之抗體後，將已加入含1% BSA之TBS之該板放置1小時以上。之後去除含1% BSA之TBS pH7.4，將已加入經PBS稀釋之50nM之2'-Adenosine-PEG-Biotin、經PBS稀釋之50nM之2'-Adenosine-PEG-Biotin與500μM之Adenosine之混合物、經PBS稀釋之50nM之2'-Adenosine-PEG-Biotin與500μM之ATP之混合物、或僅加入PBS中之任一者之該板，放置於室溫1小時。之後，將該板之各井以含0.05% Tween-20之PBS 80μL洗滌3次。之後，將經PBS稀釋為20000倍之Streptavidine-HRP(Thermo fisher scientific)已加到各井之板，於室溫放置1小時以上。對於經含0.05% Tween-20之PBS 80μL洗滌3次之該板之各井，加入發色基質(ABTS peroxidase substrate)。將該板溫育1小時後，將各井中之溶液之發色以Molecular Device公司製SpectraMax測定405nm之吸光度。
其結果，如第9圖，由於過量添加腺苷與ATP，使對於2'-Adenosine-PEG-Biotin之結合受抑制，故確認該等選殖體係不僅是2'-Adenosine-PEG-Biotin，也結合與腺苷與ATP兩者之抗體。
(3-2-4)腺苷及ATP結合選殖體的序列解析
已認定對於腺苷與ATP兩者有結合之選殖體SMB0002之胺基酸序列如表3。
[實施例4]利用抗ATP/腺苷抗體之以全面性改變以設計AMP/ADP/ATP/腺苷開關抗體取得用之資料庫
已知在癌組織及發炎性組織中，腺苷及ATP之濃度高。後述參考實施例2中，據認為：藉由將已構建之結合於ATP之抗體為模板之合理設計資料庫，取得複數個只於ATP存在下對於抗原顯示結合能力之抗體，而同樣地建構將對於腺苷、AMP、ADP、ATP顯示結合能力之抗體作為模板的資料庫，可取得只於腺苷、AMP、ADP、ATP存在下對於抗原顯示結合能力的抗體。
(4-1)利用SPR法評價腺苷結合抗體SMB0002向AMP及ADP之結合
以後述參考實施例1所示之方法，以和實施例3-2所示使用Biacore之測定方法同樣的方法測定表現及精製的SMB0002向AMP之結合。評價SMB0002與AMP以500、250(2重複)、 125、62.5、31.25、15.625、7.8125μM之濃度結合時觀察到的感應圖示於第10A圖。如第10A圖，認為SMB0002對於AMP有結合。SMB0002對於AMP之KD為5.9×10-5(mol/L)。
又，以和實施例3-2所示之使用Biacore之測定方法為同樣方法，只將NaCl濃度改變為600mM，測定向ADP之結合。評價SMB0002與ADP 2000、1000(2重複)、500、250、250、125、62.5、31.3μM之濃度結合時觀察到的感應圖示於第10B圖。如第10B圖，認為SMB0002對於ADP有結合。SMB0002對於ADP之KD為2.4×10-4(mol/L)。
(4-2)腺苷結合抗體SMB0002之X射線結晶結構解析
利用X射線結晶結構解析解明實施例3中，從被免疫之兔取得之腺苷結合抗體SMB0002與腺苷之複合體之立體結構。
(4-2-1)結晶化用SMB0002全長抗體之製備
結晶化用SMB0002全長抗體之製備及精製依該技術領域中有通常知識者公知之方法實施。
(4-2-2)從全長抗體製備SMB0002Fab片段
將獲得之SMB0002全長抗體利用分子量區分尺寸10000MWCO之超過濾膜濃縮後，製備成以4mM L-Cystein、5mM EDTA、25mM MES pH 6.5稀釋成1.5mg/ml的樣本，對於其加入相對於全長抗體以質量比計為百分之1量之Papain(Roche Applied Science)，於35℃靜置2小時。之後，加入溶有protease inhibitor cocktail mini、無EDTA(Roche Applied Science)1錠的20ml的25mM乙酸鈉緩衝液pH5.0， 以停止反應。然後，將此樣本添加到於以25mM乙酸鈉緩衝液pH5.0平衡化過的1ml尺寸的陽離子交換管柱HiTrap SP HP(GE Healthcare)的下游流串聯連接1ml尺寸之ProteinA擔體管柱HiTrap MabSelect Sure(GE Healthcare)的管柱，將同緩衝液中NaCl濃度直線地提高，實施溶出，而獲得SMB0002抗體的Fab片段之精製級分。然後，將獲得之精製級分利用5000MWCO之超過濾膜濃縮，將其添加到經25mM HEPES緩衝液pH 7.0、100mM NaCl平衡化之凝膠過濾管柱Superdex 200 16/60 prep grade(GE Healthcare)，利用同緩衝液從管柱溶出，獲得結晶化用SMB0002的Fab片段。又，全部的管柱操作係於低溫下實施。
(4-2-3)SMB0002Fab片段與腺苷複合體之結晶化
使用經5000MWCO之超過濾膜將上述方法精製之結晶化用SMB0002_Fab樣本濃縮至A280=22.3。之後，添加腺苷直到終濃度成為0.9mM，利用sitting-drop蒸氣擴散法將該複合體結晶化。結晶化使用Hydra II Plus One(MATRIX)，對20% PEG3350,0.2M Ammonium citrate dibasic之貯池溶液，以貯池溶液：結晶化樣本為0.2μl：0.2μl混合，製成結晶化液滴。將密封的該結晶化液滴於20℃靜置，成功地獲得薄板狀之結晶。
(4-2-4)從SMB0002 Fab片段與腺苷複合體結晶而來之X射線繞射數據之測定
將獲得之SMB0002 Fab片段與腺苷複合體之1個單結晶浸於0.2M ammonium citrate dibasic，0.025M HEPES pH7，25% PEG3350，0.1M NaCl，1mM腺苷，16% Glycerol之溶液後，藉由使用附微小的尼龍環的銷，將溶液鏟出，於液態氮中冷凍。使用高能量加速器研究機構之放射光設施Phonton Factory之BL-17A，測定前述結晶之X射線繞射數據。又，測定中一直將冷凍結晶放置在-178℃之氮氣流中，藉此維持冷凍狀態。使用束線具備並安裝的CCD偵測器Quantum 315r(ADSC)，使結晶每次旋轉0.6°，收集總共300張X射線繞射影像。從獲得之繞射影像之晶格常數之決定、對於繞射斑點賦予指數、及繞射數據之處理，係以程式Xia2(J.Appl.Cryst.(2010)43,186-190)、XDS Package(Acta Cryst.(2010)D66,125-132)及Scala(Acta Cryst.(2006)D62,72-82)進行。最終，獲得解析能力至多1.76Å之該結晶之繞射強度數據。本結晶，屬於空間群P1，晶格常數a=49.960Å、b=105.730Å、c=106.166Å、α=62.58°、β=77.29°、γ=77.49°。
(4-2-5)SMB0002 Fab片段與腺苷複合體之X射線結晶結構解析
為了決定SMB0002 Fab片段與腺苷複合體結晶之結構決定，使用Phaser程式(J.Appl.Cryst.(2007)40,658-674)實施分子取代法。從獲得之結晶格子之大小以及SMB0002 Fab片段之分子量，預測非對稱單元中之複合體數為4個。使用Discovery Studio3.5(Accelrys)，製作該抗體之同源模型，將此模型分成可變區與不變區部分，使用各自之結構座標作為探索用模型，依旋轉函數與並進函數決定於結晶格子內之走向與位置。進一步對於獲得之初期結構模型，實施將可變區與不變區 部分獨立運動之剛體精密化，結果對於25-3.0Å之繞射強度數據之結晶學的可靠度因子R值為46.36%、Free R值為46.10%。又，一面觀察依據使用程式REFMAC5(Acta Cryst.(2011)D67,355-367)之結構精密化、與由依據實驗決定之結構因子Fo與從模型計算之結構因子Fc計算之位相計算之以2Fo-Fc、Fo-Fc當做係數之電子密度輿圖，一面反複進行於程式Coot(Acta Cryst.(2010)D66,486-501)上進行模型修正，藉此進行模型之精密化。再依據以2Fo-Fc、Fo-Fc當做係數之電子密度輿圖，將水分子納入結構模型，進行精密化。最終使用解析能力為25-1.76Å之168160個繞射強度資料，對於含14681個非氫原子之模型，結晶學的可靠度因子R值為19.82%、Free R值為23.15%。
(4-2-6)SMB0002與腺苷之交互作用部位之鑑別
最終，SMB0002_Fab片段與腺苷之複合體之結晶結構以解析能力1.76Å決定。本結晶之非對稱單位中，存在4個SMB0002_Fab片段，均有腺苷結合，且其結合樣式均大致相同。依本結晶結構，可知：腺苷係以腺嘌呤環朝向形成在該抗體的Fab片段之H鏈與L鏈間之囊的後部的方式結合。
如第11A圖，腺苷之腺嘌呤環部分由該抗體之H鏈A33、I50、W58、Y100、L鏈Y95c、N96之各側鏈以及H鏈G99、T100a之各主鏈所認識。尤其L鏈N96側鏈和腺苷1位之N以及6位之NH2形成2根氫鍵，再者可知：H鏈T100a主鏈之羰基氧以及醯胺NH基、與腺嘌呤環之6位之NH2以及7位之N之間，各形成氫鍵，藉此可牢固地認識。再者，腺嘌呤環被該 抗體之H鏈A33、I50、W58、Y100及L鏈Y95c之各側鏈包圍，形成此等殘基與凡得瓦交互作用、CH-π交互作用。H鏈G99、T100a均以主鏈部分和腺嘌呤環形成交互作用，但因G99在Ramachandran圖上有Gly獨特的φ-Ψ角，故據認為對於和腺苷結合時維持H鏈CDR3之迴圈結構為重要。又，T100a側鏈也和H鏈CDR3的其他殘基形成交互作用，據認為藉此可發揮和腺苷結合時維持H鏈CDR3迴圈之結構重要的作用。如第11B圖，腺苷之核糖部分被H鏈S56、W58、L鏈Y95c之各側鏈以及T57之主鏈、H鏈G52認識。該等殘基之交互作用主要係依凡得瓦交互作用，但H鏈S56於側鏈可觀察到與核糖之3'位OH有弱的氫鍵形成。H鏈G52，包括其Cα原子，和核糖部分形成複數個凡得瓦交互作用，據認為發揮對於腺苷認識的重要作用。而H鏈T57只以主鏈和核糖部分交互作用，側鏈未直接涉及結合。
如實施例4-1所示，該抗體不只會結合於腺苷，雖結合活性較小，也會結合於AMP。本結晶結構中，腺苷之核糖5'位OH和腺嘌呤環部分3位之N形成分子內交互作用，AMP中未形成此鍵結合，而是5'位之O的位置稍微改變，結果據推測AMP之磷酸基存在於第11B圖所示點線內的區域。本區域處於H鏈CDR2以及L鏈CDR3之殘基可交互作用之位置，可期待藉由對於H鏈CDR2以及L鏈CDR3導入適當變異，而增強向AMP之結合。
由以上之結果，可知該抗體認識腺苷之樣式，且鑑別出和腺苷之結合密切相關的抗體可變區之胺基酸殘基。作為和腺苷 之結合密切相關的胺基酸殘基，可列舉H鏈：A33、I50、G52、S56、T57、W58、G99、Y100、T100a(Kabat編號)、L鏈：Y95c、N96(Kabat編號)。又，作為可能位在AMP之5'位磷酸基附近的殘基，可預測H鏈CDR2之D54、S55、S56、T57、W58以及L鏈CDR3之G95a、W95b、Y95c，變化為此等殘基的改變有可能和AMP之結合增強。
再者，藉由對於ADP、ATP也依結晶結構實施同樣的考察，也能預測能使向ADP、ATP之結合增強之改變。
(4-3)兔來源抗體SMB0002之人化
SMB0002為兔來源之抗體，故在製作人抗體資料庫時，序列之人化依該技術領域中有通常知識者公知之方法實施(歐洲專利公開EP239400、國際公開WO1996/002576、WO1993/012227、WO1992/003918、WO1994/002602、WO1994/025585、WO1996/034096、WO1996/033735、WO1992/001047、WO1992/020791、WO1993/006213、WO1993/011236、WO1993/019172、WO1995/001438、WO1995/015388、Cancer Res.,(1993)53,851-856、BBRC.,(2013)436(3)：543-50等)。
人化SMB0002(重鏈可變區序列：序列編號：85、輕鏈可變區序列：序列編號：86，依參考實施例1-1所示方法表現及精製。人化SMB0002與腺苷及AMP之結合係依使用Biacore T200(GE Healthcare)之方法測定並解析。使在感應晶片CM5(GE Healthcare)上以胺偶聯法固定適量的protein A(Invitrogen)捕捉目的抗體，觀察和抗原腺苷或AMP、ADP、 ATP之交互作用。運行緩衝液，於為腺苷或AMP時，使用50mM TrisHCl、150mM NaCl、0.02%(w/v)Tween20、pH7.6，為ADP或ATP時使用50mM TrisHCl、150mM NaCl、0.02%(w/v)Tween20、2mM MgCl2、pH7.6。測定均於25℃實施，抗原稀釋使用運行緩衝液。
對於已捕捉到感應晶片上之抗體，以流速30μL/min添加抗原稀釋液與空白運行緩衝液75秒，觀察抗原與抗體之結合。之後以流速30μL/min流入運行緩衝液5分鐘，觀察到抗原從抗體之解離。之後，將10mM Glycine-HCl,pH1.5以流速30μL/min添加30秒，將感應晶片再生。從測定獲得之感應圖，計算動力學參數結合速度常數ka(1/Ms)、及解離速度常數kd(1/s)。依該等常數計算解離常數KD(M)。各參數之計算係使用Biacore T200 Evaluation Software(GE Healthcare)。
其結果，發現人化SMB0002對於腺苷、AMP、ADP、ATP有結合。以腺苷濃度200、100、50(2重複)、25、12.5、6.25、3.125nM之試樣對於選殖體交互作用時觀察到的感應圖整理於第12圖。人化SMB0002對於腺苷之KD為7.5×10-9M。然後，AMP濃度500、250、125(2重複)、62.5、31.3、15.6、7.8μM之試樣對於選殖體以交互作用時觀察到的感應圖整理於第13圖。人化SMB0002對於AMP之KD為3.5×10-5M。ADP濃度1000(2重複)、500、250、125、62.5μM之試樣對於選殖體交互作用時觀察到的感應圖整理於第14圖。人化SMB0002對於ADP之KD為7.9×10-5M。最後，ATP濃度 1000(2重複)、500、250、125、62.5μM之試樣對選殖體交互作用時觀察到的感應圖整理於第15圖。人化SMB0002對於ATP之KD為1.4×10-4M。人化SMB0002對於腺苷及AMP,ADP,ATP有結合活性，故將此序列作為人抗體資料庫構建之模板序列。
(4-4)用以依據X射線結晶結構解析結果設計資料庫之全面的改變體評價
實施例(4-2)中，解析腺苷結合抗體SMB0002與腺苷之複合體之結晶結構。從結晶結構解析之結果，推測該抗體所認識之腺苷(及AMP)之認識樣式、及推定未密切相關於向腺苷(及AMP)之結合之抗體可變區之胺基酸殘基。藉由對於將腺苷認識部位附近存在之殘基取代為各胺基酸之改變體進行全面評價，據認為能判定可資料庫化部位及可資料庫化胺基酸。即，藉由判定未密切涉及對於腺苷或AMP、ADP、ATP之部位、或即使涉及結合但不會使對於腺苷或AMP、ADP、ATP之結合大幅降低(不使結合成為零)之天然序列以外之胺基酸所存在之部位及胺基酸，據認為能判定可資料庫化部位及可資料庫化胺基酸。製作對於實施例(4-3)製作之人化SMB0002，對於該等殘基導入改變而得之多個改變體。
重鏈部位之中被改變之部位(表中，記載為「Kabat」之Kabat編號表示之部位)以及該部位中之改變前之胺基酸(表中記載為「天然序列」之胺基酸)及改變後的胺基酸(表中記載為「改變胺基酸」之胺基酸)示於表4。
輕鏈部位之中已改變之部位(表中，記載為「Kabat」之Kabat編號表示之部位)以及該部位中之改變前之胺基酸(表中，記載為「天然序列」之胺基酸)及改變後的胺基酸(表中記載為「改變胺基酸」之胺基酸)示於表5。
依後述參考實施例1所示方法，測定表現及精製之各改變體向腺苷及AMP之結合，以實施例4-3所示之使用Biacore之方法，只將MgCl2濃度改變為2mM，實施測定。測定之結果，各改變體對於腺苷及AMP之親和性(Affinity)就KD值算出。重鏈中，各改變體與為親代序列之人化SMB0002對於腺苷之KD值之比較之結果示於表6，對於AMP之KD值之比較之結果示於表7。輕鏈中，各改變體與人化SMB0002對於腺苷之KD值之比較結果示於表8，對於AMP之KD值之比較 結果示於表9。
(4-5)依全面性改變體評價結果設計資料庫
在資料庫設計時，依據實施例4-4獲得之資訊，選擇滿足以下條件中之至少一個條件的部位作為可資料庫化部位。
條件1)對於和腺苷或AMP、ADP、ATP之結合未密切相關的部位、或雖涉及結合但是不會使對於腺苷或AMP、ADP、ATP之結合大幅降低(結合不為零)之天然序列以外之胺基酸存在的部位；條件2)就抗體的資料庫存而言，有某程度胺基酸出現頻度多樣性的部位；條件3)對於典型結構之形成不重要的部位。
依實施例(4-4)之評價結果，將顯示對於腺苷及AMP之KD值均比親代序列(人化SMB0002)對於腺苷及AMP之KD值有高20%之結合之改變體至少有一個以上存在之處，判定為滿足上述條件之可改變部位。該部位中，顯示被取代之胺基酸之中，對於腺苷及AMP之KD值均比親代序列(人化SMB0002)對於腺苷及AMP之KD值高20%之結合的胺基酸，判定為可資料庫化之胺基酸(資料庫中，可出現之柔性殘基)。藉由設計在人化SMB0002之CDR部位中，判定之可改變部位含有從前述改變體之解析選出之可資料庫化胺基酸(資料庫中，能出現之柔性殘基)及未改變體之胺基酸(亦即人化SMB0002之天然序列所含之胺基酸)之胺基酸資料庫存所含之胺基酸當中至少任一個以上之胺基酸出現之資料庫，可建構ATP/AMP/ADP/腺苷開關抗體取得用之資料庫。重鏈中，含胺基酸資料庫存之部位、以及該部位中之胺基酸資料庫存示於表10。輕鏈中，含胺基酸資料庫存之部位、以及該部位中之胺基 酸資料庫存示於表11。表中，記載為「Kabat」之Kabat編號表示之部位代表可改變部位，記載為「天然序列」之胺基酸，代表該部位中之未改變體之胺基酸，記載為「可資料庫化胺基酸」之胺基酸，代表該部位中之可資料庫化胺基酸。設計各可改變酸部位中，出現選出之胺基酸資料庫存所含胺基酸中之至少一者的資料庫。
【表11】
合成含有如此設計之資料庫所含之各序列之基因，使用該等各個基因之集合體(資料庫)作為模板，利用能使VH及VL分別放大的引子將基因資料庫放大。將已放大的合理設計的人抗體重鏈可變區之基因資料庫與人抗體輕鏈可變區之基因資料庫，導入具有人IgG來源CH1序列及人IgG來源輕鏈不變區序列兩者的適當噬粒載體。將此噬粒載體利用電穿孔向大腸菌導入，建構提示由人抗體可變區-不變區構成之Fab分域，且能取得將腺苷或AMP、ADP、ATP作為開關而能結合於抗原之抗體的合理設計資料庫。以此方式，由具多樣腺苷或AMP、ADP、ATP結合活性之H鏈及L鏈構成之合理設計資料庫，據認為：作為如第43圖所示，腺苷或AMP、ADP、 ATP夾於抗體與抗原之間，且能以良好效率取得含有對於任意抗原之AMP/ADP/ATP/腺苷開關抗體的人抗體的資料庫為有用。又，如上述，SMB0002不僅可結合於腺苷與AMP，也可結合於ADP、ATP，故預料對於和AMP、ADP、ATP及腺苷有類似結構之cAMP及ATP-gamma-S也有結合活性。是以，本資料庫據認為對於取得因ATP、ADP、AMP、cAMP、腺苷、或ATP-gamma-S中任一者以上之低分子之有無而改變對於任意目標抗原之結合活性的開關抗體為有用。
[實施例5]利用成為開關之分子所為之淘選設計AMP/ADP/ATP/腺苷開關抗體取得用之資料庫
於實施例4記載了利用全面性改變設計資料庫化部位，並建構將對於腺苷、AMP、ADP、ATP顯示結合能力之抗體作為模板之資料庫之方法。作為資料庫製作方法的不同作法，利用對於成為開關之分子的淘選的方法亦為有用。
(5-1)腺苷結合抗體SMB0002之X射線結晶結構解析
實施例4-2中，已解析腺苷結合抗體SMB0002與腺苷之複合體之結晶結構。從結晶結構解析之結果，推測該抗體所認識之腺苷(及AMP)之認識樣式、及假定未密切相關於向腺苷(及AMP)之結合之抗體可變區之胺基酸殘基。
SMB0002為兔來源之抗體，所以在製作人抗體資料庫時，依該技術領域中有通常知識者公知之方法實施序列之人化(同前述)。
在設計資料庫時，選擇滿足以下條件中之至少一 者的部位作為可資料庫化之部位。
條件1)對於和腺苷或AMP、ADP、ATP之結合未密切相關的部位、或雖涉及結合但是不會使對於腺苷或AMP、ADP、ATP之結合大幅降低(結合不為零)之天然序列以外之胺基酸存在的部位；條件2)作為抗體的資料庫存有某程度胺基酸出現頻度多樣性之部位；條件3)對於典型結構之形成不重要的部位。
首先，設計重鏈中滿足上述條件之部位，且係人化SMB0002的序列所含部位之中關於CDR1,CDR2,CDR3之部位對於和腺苷或AMP、ADP、ATP之結合未密切相關的部位之胺基酸只出現在某一定之鹼基的資料庫。例如NNK、TRIM Library等(Gonzalez-Munoz A et al.MAbs 2012,Lee CV et al.J Mol Biol.2004,Knappik A.et al.J Mol Biol.2000,Tiller T et al.MAbs 2013)。將設計的基因序列的集合體進行基因合成(重鏈可變區資料庫)，和人化SMB0002之輕鏈可變區序列(親代序列、序列編號：86)組合，導入到具有人IgG來源CH1序列及人IgG來源輕鏈不變區序列之適當噬粒載體。將此噬粒載體利用電穿孔導入到大腸菌，以建構能將腺苷、AMP、ADP、ATP中之任一者作為開關而結合於抗原之人抗體重鏈可變區噬菌體展示資料庫。
然後，設計輕鏈中滿足上述條件之部位，且係人化SMB0002的序列所含部位之中關於CDR1,CDR2,CDR3之部位對於和腺苷或AMP、ADP、ATP之結合未密切相關的部位 之胺基酸只出現某在一定之鹼基的資料庫。例如NNK、TRIM Library等。將設計的基因序列的集合體進行基因合成(輕鏈可變區資料庫)，和人化SMB0002之重鏈可變區序列(親代序列、序列編號：85)組合，導入到具有人IgG來源CH1序列及人IgG來源輕鏈不變區序列之適當噬粒載體。將此噬粒載體利用電穿孔導入到大腸菌，以建構能將腺苷、AMP、ADP、ATP中之任一者作為開關而結合於抗原之人抗體輕鏈可變區噬菌體展示資料庫。
為了從構建的重鏈、輕鏈可變區各自的噬菌體展示資料庫取得對於ATP、ADP、AMP或腺苷專一性地結合之抗體集團，實施對於生物素化ATP，生物素化ADP、生物素化AMP或生物素化腺苷之淘選。
生物素化腺苷依實施例2-2-11記載之方法製備。ATP-PEG-生物素可由JenaBioscience公司、型錄號碼NU-926-BI0購買並使用。AMP、ADP和ATP同樣係於腺苷之5'位羥基有磷酸基加成之結構，所以希望和生物素化ATP同樣，從磷酸基結合適當的連結子(PEG連結子等)，並於其末端附加生物素。
從保持構建的噬菌體展示用噬粒的大腸菌生產噬菌體。將於實施噬菌體生產之大腸菌之培養液中添加2.5M NaCl/10%PEG而沉澱之噬菌體之集團以TBS稀釋，獲得噬菌體資料庫液。然後，於該噬菌體資料庫液添加BSA使終濃度成為4%。使用固定於磁珠的抗原實施淘選。磁珠可使用NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或Streptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)。
淘選中，回收可對於腺苷、AMP、ADP或ATP結合之噬菌體。具體而言，對於製備的噬菌體資料庫液加入生物素標識抗原，使噬菌體資料庫於室溫接觸腺苷、AMP、ADP或ATP60分鐘。加入經BSA阻斷的磁珠、使抗原與噬菌體之複合體和磁珠於室溫結合15分鐘。將珠以1mL的TBST與TBS洗滌。之後將已加入最終濃度1mg/mL之含胰蛋白酶之TBS的珠於室溫懸浮15分鐘後，立即使用磁座分離珠，將噬菌體溶液回收。由於胰蛋白酶之添加，未提示Fab之噬菌體之pIII蛋白質(幫助者噬菌體來源之pIII蛋白質)被切斷，對於未提示Fab之噬菌體喪失對於大腸菌之感染能力。將已用胰蛋白酶溶液溶出之噬菌體加入到成為對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10mL之大腸菌株ER2738。於37℃緩慢地實施上述大腸菌之攪拌培養1小時以使噬菌體感染大腸菌。將已感染的大腸菌接種到225mm x 225mm之板。然後從已接種的大腸菌的培養液回收噬菌體以回收噬菌體資料庫液。實施多次同樣的淘選，獲得向腺苷、AMP、ADP或ATP結合之噬菌體集團。
從重鏈、輕鏈可變區噬菌體展示資料庫分別取得之對於抗原(腺苷、AMP、ADP或ATP)結合之噬菌體為具有向抗原結合之能力的集團，所以，推測由此兩者之組合製作之Fab提示噬菌體資料庫會含有多設維持成為開關之低分子結合的選殖體，可認為能製作以良好效率取得開關抗體的資料庫。
感染重鏈、輕鏈各自的噬菌體資料庫的大腸菌可 依該技術領域中有通常知識者公知之方法萃取基因。將使用以此取得之各個基因之集合體(資料庫)作為模板而利用能將VH及VL分別放大的引子，將基因資料庫放大。將已放大的人抗體重鏈可變區之基因資料庫與人抗體輕鏈可變區之基因資料庫導入到具有人IgG來源CH1序列及人IgG來源輕鏈不變區序列兩者之適當噬粒載體。將此噬粒載體利用電穿孔對於大腸菌導入，而建構能取得提示由人抗體可變區-不變區構成之Fab分域，且將腺苷或AMP、ADP、ATP作為開關而能結合於抗原之抗體的設計資料庫。如上，由有多樣之腺苷或AMP、ADP、ATP結合活性之H鏈及L鏈構成之設計資料庫，據認為：作為如第43圖所示，含有腺苷或AMP、ADP、ATP夾於抗體與抗原之間，且能以良好效率取得對於任意抗原之AMP/ADP/ATP/腺苷開關抗體的人抗體的資料庫為有用。又，如上述，SMB0002不僅可結合於腺苷與AMP，也可結合於ADP、ATP，故預料對於和AMP、ADP、ATP及腺苷有類似結構之cAMP及ATP-gamma-S也有結合活性。是以，本資料庫據認為對於取得因ATP、ADP、AMP、cAMP、腺苷、或ATP-gamma-S中任一者以上之低分子之有無而改變對於任意目標抗原之結合活性的開關抗體為有用。
[實施例6]從使用噬菌體展示技術之人抗體資料庫，取得於低分子存在下結合於人IL-6受體(hIL-6R)之抗體
(6-1)利用珠淘選，從未改變(naïve)人抗體資料庫取得於低分子存在下結合於hIL-6R之抗體
從後述參考實施例1構建之未改變人抗體噬菌體展示資料 庫，篩選於低分子存在下對於人IL-6受體(hIL-6R)顯示結合活性之抗體。亦即，收集提示對於已捕捉於珠之hIL-6R會在低分子存在下顯示結合活性之抗體的噬菌體。將於低分子不存在的條件從珠溶出之噬菌體溶出液回收噬菌體。於此取得方法中，抗原係使用經生物素標識之hIL-6R。
從保持已構建之噬菌體展示用噬粒的大腸菌產生的噬菌體依一般的方法精製。之後獲得經TBS透析處理的噬菌體資料庫液。然後對於噬菌體資料庫液添加BSA，使終濃度成為4%。使用固定於磁珠之抗原實施淘選。磁珠使用NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或Streptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)。
為了有效率地取得能在癌組織中作為開關功能的依存於低分子的低分子開關抗體，實施將於下列各種低分子(腺苷(adenosine)、腺苷3磷酸(adenosine 5'-triphosphate；ATP)、肌苷(inosine)、犬尿胺酸(犬尿胺酸)、前列腺素E2(prostaglandin E2；PGE2)、琥珀酸(succinic acid)、乳酸(lactic acid))之混合液(以下記載為SC(small molecule cocktail))存在下結合於抗原並於SC不存在下不結合於抗原之抗體濃縮的淘選。
具體而言，使製備之噬菌體資料庫液，和由250pmol之生物素標識抗原以及各終濃度為1mM之腺苷3磷酸鈉鹽(ATP-Na)、腺苷(adenosine)、肌苷(Inosine)、琥珀酸(Succinic acid)、及乳酸(Lactic acid)、終濃度為1μM之前列腺素E2(PGE2)、以及終濃度為100μM之犬尿胺酸(Kynurenine)構成 且以NaOH調整pH為7.4而得之SC，於室溫接觸60分鐘。然後於噬菌體資料庫液加入經BSA阻斷的磁珠，使抗原與噬菌體之複合體和磁珠於室溫結合15分鐘。將珠SC/TBS(含SC之TBS)洗滌1次。之後，使已加入1mg/mL之胰蛋白酶溶液0.5mL的珠於室溫懸浮15分鐘後，立即使用磁座分離珠，將噬菌體溶液回收。將回收的噬菌體溶液加到成為對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10mL之大腸菌株ER2738。於37℃緩慢地實施上述大腸菌之攪拌培養1小時以使噬菌體感染大腸菌。將已感染的大腸菌接種在225mm x 225mm之板。然後從已接種的大腸菌的培養液回收噬菌體以製備噬菌體資料庫液。
第1次淘選中，實施可於低分子存在下結合之噬菌體之回收，於第2次以後的淘選中，則實施只於SC存在下會結合於抗原之噬菌體之濃縮。具體而言，於製備的噬菌體資料庫液加入40pmol之生物素標識抗原及SC、NaOH，以使噬菌體資料庫於室溫接觸抗原及低分子60分鐘。加入經BSA阻斷的磁珠，使抗原與噬菌體之複合體和磁珠於室溫結合15分鐘。將珠以1mL之SC/TBST與SC/TBS洗滌。之後將已加入0.5mL之TBS的珠於室溫懸浮後，立即使用磁座分離珠，將噬菌體溶液回收。再重複此作業後，將分2次溶出的噬菌體液混合。於回收的噬菌體溶液加入100mg/mL之胰蛋白酶5μL，未提示Fab之噬菌體之pIII蛋白質(幫助者噬菌體來源之pIII蛋白質)被切斷，未提示Fab之噬菌體喪失對於大腸菌之感染能力。將從經胰蛋白酶處理之噬菌體溶液回收的噬菌體加到成為對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10mL之大腸菌株 ER2738。於37℃緩慢地實施上述大腸菌之攪拌培養1小時以使噬菌體感染大腸菌。將已感染的大腸菌接種到225mm x 225mm之板。然後從已接種的大腸菌的培養液回收噬菌體以回收噬菌體資料庫液。取得於SC存在下對於抗原有結合活性之抗體的淘選重複3次。
(6-2)利用噬菌體ELISA評價於低分子存在下的結合活性
(6-1)從獲得之大腸菌之單一群落，依常法(Methods Mol.Biol.(2002)178,133-145)回收含噬菌體之培養上清。將依參考實施例(1-3)記載之方法精製之精製噬菌體依以下程序供ELISA使用。將StreptaWell 96微滴定板(Roche)以含有生物素標識hIL-6R之100μL TBS包被一晚。將該板之各井以TBST洗滌以去除未結合於板的生物素標識hIL-6R後，將該井以250μL之2%脫脂乳-TBS阻斷1小時以上。去除2%脫脂乳-TBS，之後，將已於各井加入製備之精製噬菌體的該板於室溫靜置1小時以使提示噬菌體之抗體於SC不存在/存在下結合於各井存在之生物素標識hIL-6R。於經TBST或SC/TBST洗滌之各井，加入經TBS或SC/TBS稀釋之HRP結合抗M13抗體(Amersham Pharmacia Biotech)後，將此板溫育1小時。以TBST或SC/TBST洗滌後，利用添加硫酸使已添加TMB single溶液(ZYMED)之各井中之溶液之發色反應停止，之後利用450nm之吸光度測定該發色。
藉由使用單離的960個選殖體實施噬菌體ELISA，獲得於低分子混合物存在下對於抗原hIL-6R有結合活 性之選殖體6RNMSC1-2_F02及6RNMSC1-3_G02。
(6-3)結合於hIL-6R之抗體之表現與精製
對於從(6-2)記載之噬菌體ELISA表示之判斷為於SC存在下對於生物素標識hIL-6R有結合活性之選殖體6RNMSC1-2_F02及6RNMSC1-3_G02使用專一的引子(序列編號：78及80)放大之基因之鹼基序列進行解析(6RNMSC1-2_F02：重鏈的序列示於序列編號：32，輕鏈的序列示於序列編號：33、6RNMSC1-3_G02：重鏈的序列示於序列編號：34，輕鏈的序列示於序列編號：35)。編碼為6RNMSC1-2_F02、6RNMSC1-3_GO2及陰性對照抗人Glypican3抗體GC413(重鏈為序列編號：36、輕鏈為序列編號：37)之可變區的基因係插入到人IgG1/Kappa之動物表現用質體。表現的抗體依後述參考實施例1記載之方法精製。
(6-4)取得之抗體對於hIL-6R之結合所必要之低分子之鑑別
將取得之6RNMSC1-2_F02及6RNMSC1-3_G02與GC413之3種抗體於表12所示的9種條件下供ELISA使用。又，以表13所示緩衝液將各低分子適當調整為表12所示之濃度。抗原使用經生物素標識之hIL-6R。
【表12】
先將StreptaWell 96微滴定板(Roche)以含生物素標識hIL-6R之100μL之PBS於室溫包被1小時以上。將該板之各井以TBST洗滌以去除未結合於板的生物素標識hIL-6R後，將該井以阻斷緩衝液(2%脫脂乳/TBS)250μL阻斷1小時以上。於已去除阻斷緩衝液的各井，加入以表12之終濃度以含低分子之樣本緩衝液製備成2.5μg/mL的精製IgG各100μL，將該板於室溫靜置1小時，以使各IgG結合於各井存在的生物素標識hIL-6R。用以表12之終濃度含低分子之清洗緩衝液洗滌後，於各井加入經含同低分子之樣本緩衝液稀釋之HRP結合抗人IgG抗體(BIOSOURCE)，將板溫育1小時。以含各低分子之清洗緩衝液洗滌後，藉由添加硫酸使已加入有 TMB single溶液(ZYMED)之各井中之溶液之發色反應停止後，利用450nm之吸光度測定該發色。又，緩衝液使用含表13記載之組成的緩衝液。
測定結果示於第16圖與第17圖。使用6RNMSC1-2_F02及6RNMSC1-3_G02時，比起於條件8(全部的低分子混合物溶液)之吸光度，於條件9(無低分子)的吸光度顯著較低。由此結果可確認：6RNMSC1-2_F02及6RNMSC1-3_G02具有因應低分子有無而改變和抗原之結合的性質。使用6RNMSC1-2_F02時，於條件7(犬尿胺酸100uM)顯示和條件8同等的吸光度，於其他條件下，吸光度顯著較低，顯示6RNMSC1-2_F02是於犬尿胺酸存在下和抗原hIL-6R結合之抗體(第16圖)。使用6RNMSC1-3_G02時，於條件1(ATP-Na1mM)顯示和條件8同等的吸光度，於其他條件下則為吸光度顯著低的結果，顯示6RNMSC1-3_G02係於ATP存在下和抗原hIL-6R結合之抗體(第17圖)。可知：藉由使用如此的方法，能一次取得複數個不同的於低分子存在下改變向抗原之結合能力之抗體。
[實施例7]6RNMSC1-2_F02抗體之定性
(7-1)利用ELISA評價於犬尿胺酸以外之胺基酸及胺基酸代謝物存在下對於hIL-6R之結合活性
實施例6取得之於低分子存在下結合於hIL-6R之抗體6RNMSC1-2_F02，係於犬尿胺酸存在下結合於hIL-6R之抗體。驗證一系列色胺酸代謝物等胺基酸代謝物是否可作為本發明使用之癌組織專一的化合物，尤其癌細胞專一的代謝產物的 一非限定理想態樣。
將實施例6所示之於犬尿胺酸存在下對於抗原有結合活性之抗體6RNMSC1-2_F02及作為陰性對照之GC413，於表14所示7種條件下供ELISA使用。以表13所緩衝液將各胺基酸及其代謝物適當調整成表14所示濃度。抗原使用經生物素標識之hIL-6R。
首先將StreptaWell 96微滴定板(Roche)以含生物素標識抗原之100μL之PBS於室溫包被1小時以上。將該板之各井以TBST洗滌以去除未結合於板之抗原後，將該井以阻斷緩衝液(2%脫脂乳/TBS)250μL阻斷1小時以上。於已去除阻斷緩衝液之各井，加入以表14之終濃度含低分子之樣本緩衝液製備成2.5μg/mL的精製IgG各100μL，將該板於室溫靜置1小時以使各IgG結合於各井存在之抗原。利用以表14之終濃度含胺基酸及胺基酸代謝物之清洗緩衝液洗滌後，將經 含胺基酸及胺基酸代謝物之樣本緩衝液稀釋的HRP結合抗人IgG抗體(BIOSOURCE)添加到各井，將板溫育1小時。以含各胺基酸及胺基酸代謝物之清洗緩衝液洗滌後，藉由添加硫酸使已加入有TMB single溶液(ZYMED)之各井中之溶液之發色反應停止後，利用450nm之吸光度測定該發色。又，緩衝液使用含有表13記載之組成的緩衝液。
測定之結果示於第18圖。使用6RNMSC1-2_F02時，比起於條件1(犬尿胺酸溶液)之吸光度，條件7(無低分子)的吸光度顯著較低。同樣，於條件5(3-羥基犬尿胺酸溶液)之吸光度和條件1顯示同樣高吸光度，啟示：6RNMSC1-2_F02是不只在犬尿胺酸存在下，在犬尿胺酸之代謝物存在下也會結合於抗原hIL-6R之抗體。又，於其他條件為顯著低吸光度，啟示6RNMSC1-2_F02係即使有犬尿胺酸之前驅體即色胺酸存在，仍不結合於抗原hIL-6R之抗體。於癌的微環境中，因代謝色胺酸而產生犬尿胺酸的酵素IDO的表現上昇，所以於色胺酸存在下不結合於抗原而於犬尿胺酸及其代謝物存在下會結合於抗原之抗體，據認為對於只在癌微環境下結合於抗原之抗體為重要。又，由此可認為：藉由使用同樣方法，可取得不只一種胺基酸代謝物存在，在結構不同的複數個胺基酸代謝物存在下結合於目的抗原之抗體。
如上，將被癌專一的酵素(本實施例為IDO及其下游之代謝酵素)代謝並於癌局部產生之分子作為開關之抗體，據認為能只於癌局部選擇性地結合於目標抗原。本實施例中，係將內因性分子即色胺酸因癌專一的代謝酵素所得之代謝產 物作為開關，但是也可以將從外部利用經口或靜脈內投予等而投予之人工的分子(非天然分子)或內因性分子因癌專一的代謝酵素所得之代謝產物作為開關。例如實施例1揭示：若投予capecitabine(xeloda)，會被癌專一的代謝酵素等代謝成5-FU，故癌局部的5-FU的濃度提高(Desmoulin F.et al.Drug Metab Dispos.2002)，據認為利用5-FU作為開關之抗體，能只於癌局部選擇性地結合於目標抗原。又，代謝酵素以外，據認為也可將於癌專一的低氧環境、酸性環境下生成之分子作為開關。例如：TH-302(Duan JX,et al.J Med Chem.2008)因在低氧條件下代謝為Br-IPM，故可藉由將Br-IPM作為開關之抗體，只於癌局部選擇性地結合於目標抗原。
(7-2)利用表面電漿子共振評價犬尿胺酸所致之對於人IL6受體之結合之影響
使用Biacore T200(GE Healthcare)解析6RNMSC1-2_F02與人IL-6受體(hIL-6R)之抗原抗體反應之交互作用。使以胺偶聯法固定適量protein A(Invitrogen)適當量而得的感應晶片CM5(GE Healthcare)捕捉目的抗體，使抗原hIL-6R交互作用。運行緩衝液使用20mmol/L ACES、150mmol/L NaCl、0.05%(w/v)Tween20、pH7.4。抗原hIL-6R之交互作用於25℃測定，hIL-6R之稀釋使用運行緩衝液，運行緩衝液使用加有100μmol/L犬尿胺酸之緩衝液，為了比較對照的運行緩衝液，使用加有10mmol/L ATP之緩衝液。
將hIL-6R稀釋液與空白運行緩衝液以流速10μL/min注射1分鐘，使已捕捉於感應晶片上之 6RNMSC1-2_F02和hIL-6R交互作用。之後，以流速10μL/min流過運行緩衝液1分鐘，觀察到hIL-6R從抗體解離後，將10mmol/L Glycine-HCl、pH1.5以流速30μL/min注射30秒，使感應晶片再生。依由測定獲得之感應圖算出之動力學參數結合速度常數ka(1/Ms)、及解離速度常數kd(1/s)，算出6RNMSC1-2_F02對於hIL-6R之解離常數KD(M)。各參數之計算使用Biacore T200 Evaluation Software(GE Healthcare)。
於此測定取得之於100μmol/L犬尿胺酸存在下、10mmol/L ATP存在下、或不存在下，6RNMSC1-2_F02與1μmol/L之hIL-6R之交互作用之感應圖示於第19圖。如第19圖，6RNMSC1-2_F02於100μmol/L之犬尿胺酸存在下結合於hIL-6R但犬尿胺酸不存在下未觀察到對於hIL-6R之結合。由此可確認：6RNMSC1-2_F02具有以犬尿胺酸作為開關而結合於hIL-6R之性質。又，6RNMSC1-2_F02於100μmol/L犬尿胺酸存在下之解離常數KD為1.5μmol/L。
(7-3)犬尿胺酸開關對於抗體從hIL-6R解離之效果
使用Biacore T200(GE Healthcare)，評價於犬尿胺酸存在下對於hIL-6R有結合之6RNMSC1-2_F02，是否於犬尿胺酸存在下會犬尿胺酸濃度依存地解離。運行緩衝液使用20mmol/L ACES、150mmol/L NaCl、0.05%(w/v)Tween20、pH7.4及20mmol/L ACES、150mmol/L NaCl、0.05%(w/v)Tween20、pH7.4、100μmol/L犬尿胺酸，於25℃測定。使含100μmol/L之犬尿胺酸之經20mmol/L ACES、150mmol/L NaCl、0.05% (w/v)Tween20、pH7.4稀釋而得的5μg/mL的6RNMSC1-2_F02作為分析物，和利用胺偶聯固定化有hIL-6R之感應晶片CM5交互作用180秒後，觀察於各運行緩衝液條件下，hIL-6R解離的狀態。為了比較於各運行緩衝液條件下的解離程度，比較令於100μmol/L犬尿胺酸存在下6RNMSC1-2_F02對於hIL-6R之結合量為100而標準化(normalize)之值。代表此標準化後的6RNMSC1-2_F02與hIL-6R之交互作用的狀態的感應圖示於第20圖。從第20圖之結果可知：6RNMSC1-2_F02於犬尿胺酸存在下和hIL-6R結合後，若犬尿胺酸變得不存在，會將hIL-6R快速解離。亦即，確認：利用犬尿胺酸控制抗體對於hIL-6R之結合為可逆的。
(7-4)犬尿胺酸濃度對於hIL-6R之結合造成之影響之評價
然後使用Biacore T200(GE Healthcare)，評價6RNMSC1-2_F02與hIL-6R之抗原抗體反應中，犬尿胺酸濃度之影響。運行緩衝液使用20mmol/L ACES、150mmol/L NaCl、0.05%(w/v)Tween20、pH7.4，6RNMSC1-2_F02與人IL-6R之抗原抗體反應於25℃測定。在感應晶片CM5上利用胺偶聯將hIL-6R固定化，將製備成含各種濃度之犬尿胺酸的經20mmol/L ACES、150mmol/L NaCl、0.05%(w/v)Tween20、pH7.4稀釋之1μg/mL之6RNMSC1-2_F02作為分析物，使其進行180秒交互作用，觀察其結合量之變化。其結果示於第21圖。由此結果可確認：成為開關之犬尿胺酸濃度愈高，6RNMSC1-2_F02對於hIL-6R有更多結合。
又，此評價系中，hIL-6R係固定在感應晶片上，故可認為6RNMSC1-2_F02以二價結合。如此的6RNMSC1-2_F02以二價認識hIL-6R的評價系中，也觀察到犬尿胺酸濃度愈高，則6RNMSC1-2_F02之hIL-6R之結合量愈增加。由此結果可知：於二價之結合中，6RNMSC1-2_F02亦具有將犬尿胺酸作為開關而對於IL-6R結合之性質。
由該等結果可知：6RNMSC1-2_F02，係將犬尿胺酸作為開關，於犬尿胺酸存在下結合於hIL-6R並於犬尿胺酸不存在下從hIL-6R解離之抗體。又，確認：6RNMSC1-2_F02，於犬尿胺酸不存在下對於hIL-6R不顯示結合活性，可進行完全的ON/OFF控制，作為開關的機能。
(7-5)6RNMSC1-2_F02對於犬尿胺酸之衍生物之結合能力評價
使用Biacore T200(GE Healthcare)，評價從資料庫取得之犬尿胺酸依存性抗體6RNMSC1-2_F02與犬尿胺酸及其衍生物之結合。衍生物評價以下7種分子。犬尿胺酸之異構物D-犬尿胺酸、衍生物3-羥基-DL-犬尿胺酸、4-(4-METHYLPHENYL)-4-OXOBUTYRIC ACID、RO0447436-000-001、RO0635389-000-001、RO0438566-001-001、RO0635390-000-001。各化合物之化學結構示於以下。
【化19】 D-犬尿胺酸
3-羥基-DL-犬尿胺酸
4-(4-甲苯基)-4-側氧基丁酸(4-(4-METHYLPHENYL)-4-OXOBUTYRIC ACID)
RO0447436-000-001
【化23】 RO0635389-000-001
RO0438566-001-001
RO0635390-000-001
使感應晶片CM4(GE Healthcare)上以胺偶聯法固定的適量proteinA(Invitrogen)捕捉目的抗體，使其與抗原即犬尿胺酸及衍生物交互作用。運行緩衝液使用50mmol/L TrisHCl、150mmol/L NaCl、0.02%(w/v)Tween20、5% DMSO、pH7.6。測定均於15℃實施，抗原之稀釋使用運行緩衝液。
針對6RNMSC1-2_F02，將抗原稀釋液與空白運行緩衝液以流速30μL/min添加60秒，使各抗原和感應晶片上捕捉的抗體交互作用。之後，以流速30μL/min流過運行緩衝 液60秒，觀察抗原從抗體之解離。從測定獲得之感應圖計算動力學參數結合速度常數ka(1/Ms)、及解離速度常數kd(1/s)。依據該等常數計算解離常數KD(M)。各參數之計算係使用Biacore T200 Evaluation Software(GE Healthcare)。
評價之結果，犬尿胺酸與6RNMSC1-2_F02交互作用之動力學參數決定為ka=709(1/s),kd=0.17(1/s),KD=0.239(mmol/L)。又，評價之結果獲得之感應圖示於第22圖。代表和衍生物之結合結果之感應圖示於第23圖：3-羥基-DL-犬尿胺酸、第24圖：RO0635389-000-001、第25圖：RO0635390-000-001。感應圖之表示使用Scrubber2(Biologic software)及Microsoft Office Excel 2007。由此結果可知：6RNMSC1-2_F02不只可結合於犬尿胺酸，也會結合於3-羥基-DL-犬尿胺酸、及RO0635389-000-001、RO0635390-000-001這些一部分的犬尿胺酸衍生物。
(7-6)6RNMSC1-2_F02對於非天然低分子之回應性評價
使用Octet(PRIMETECH)，評價在從資料庫取得之犬尿胺酸開關抗體6RNMSC1-2_F02與hIL-6R之抗原抗體反應中，各種低分子之影響。就低分子而言，評價為犬尿胺酸及衍生物的實施例(7-5)所示的全部8種分子。測定緩衝液使用TBS、pH7.4，於30℃測定。於鏈黴抗生物素蛋白感應晶片上固定生物素化hIL-6R，使抗體交互作用，觀察其結合量之變化。抗體之稀釋，使用測定緩衝液及測定緩衝液分別添加了各低分子中之任一者的緩衝液，製備成各低分子之終濃度為100uM、抗體 之終濃度為10μg/mL。
於此測定取得之於100uM之各低分子存在下、或不存在下，6RNMSC1-2_F02對於hIL-6R之結合性示於第26圖：犬尿胺酸、第27圖：3-羥基-DL-犬尿胺酸、第28圖：RO0635389-000-001、第29圖：RO0635390-000-001。如第26圖，6RNMSC1-2_F02於100uM犬尿胺酸存在下結合於hIL-6R，於犬尿胺酸不存在下未觀察到對於hIL-6R之結合。由此也由Octet確認了：具有將犬尿胺酸作為開關而結合於hIL-6R之性質。又，如第27圖-29，於犬尿胺酸以外之低分子即3-羥基-DL-犬尿胺酸及RO0635389-000-001、RO0635390-000-001這些能向6RNMSC1-2_F02結合之犬尿胺酸衍生物的低分子存在下觀察到結合，於此等低分子不存在下未觀察到向hIL-6R之結合。由以上啟示：可從資料庫取得將犬尿胺酸及其衍生物(非天然化合物)作為開關之hIL-6R抗體。
實施例7-3中，顯示將內因性分子作為開關，由本實施例顯示也可使用人工分子(非天然分子)作為開關。亦即，顯示也可製作將從外部利用經口或靜脈內投予等投予之人工的分子(非天然分子)因癌專一的代謝酵素產生之非天然之代謝產物作為開關之抗體。
[實施例8]利用犬尿胺酸開關抗hIL-6R抗體進行利用全面性改變獲得之犬尿胺酸開關抗體用之資料庫之設計
癌組織中已知犬尿胺酸之濃度高。參考實施例2中藉由構建之將結合於ATP之抗體作為模板的合理設計資料庫，取得了複數個只於ATP存在下對於抗原顯示結合能力的抗體，同樣 地，可認為藉由建構將對於犬尿胺酸顯示結合能力抗體作為模板之資料庫，取得只於犬尿胺酸存在下對於抗原顯示結合能力之抗體。
(8-1)將犬尿胺酸作為開關之hIL-6R結合抗體6RNMSC1-2_F02之X射線結晶結構解析
實施例7中，已利用X射線結晶結構解析解明由資料庫取得之將犬尿胺酸作為開關之hIL-6R結合抗體6RNMSC1-2_F02與犬尿胺酸之複合體之立體結構。
(8-1-1)結晶化用6RNMSC1-2_F02全長抗體之製備
結晶化用6RNMSC1-2_F02全長抗體之製備及精製依該技術領域中有通常知識者公知之方法實施。
(8-1-2)從全長抗體製備6RNMSC1-2_F02 Fab片段
將獲得之6RNMSC1-2_F02抗體以分子量區分尺寸10000MWCO之超過濾膜濃縮後，製成以100mM Tris緩衝液pH 8.0稀釋成2mg/ml的樣本，於其中加入相對於全長抗體以質量比計為四百分之1量之Endoproteinase Lys-C Sequencing Grade(Roche Applied Science)，於35℃靜置45分鐘。加入溶有protease inhibitor cocktail mini，無EDTA(Roche Applied Science)1錠的20ml的25mM乙酸鈉緩衝液pH5.0，以停止反應。然後，將此樣本添加到於以25mM乙酸鈉緩衝液pH5.0平衡化過的1ml尺寸的陽離子交換管柱HiTrap SP HP(GE Healthcare)的下游流串聯連接1ml尺寸之ProteinA擔體 管柱HiTrap MabSelect Sure(GE Healthcare)的管柱，將同緩衝液中NaCl濃度直線地提高，實施溶出，而獲得6RNMSC1-2_F02抗體的Fab片段之精製級分。然後，將獲得之精製級分添加到經25mM HEPES緩衝液pH 7.5、100mM NaCl平衡化之凝膠過濾管柱Superdex 200 16/60 prep grade(GE Healthcare)，利用同緩衝液從管柱溶出，獲得結晶化用6RNMSC1-2_F02的Fab片段。又，全部的管柱操作係於低溫下實施。
(8-1-3)6RNMSC1-2_F02 Fab片段與犬尿胺酸複合體之結晶之製作
使用經5000MWCO之超過濾膜將上述方法精製之結晶化用6RNMSC1-2_F02的Fab片段的樣本濃縮成A280=24.1。之後，添加溶於100% DMSO之50mM犬尿胺酸直到終濃度成為2mM，利用sitting-drop蒸氣擴散法將該複合體結晶化。結晶化使用Hydra II Plus One(MATRIX)，對0.2M Lithium sulfate monohydrate、30.0%w/v PEG 3350、0.1M Tris pH 8.5之貯池溶液，以貯池溶液：結晶化樣本為0.2μl：0.2μl混合，製成結晶化液滴。將密封的該結晶化液滴於20℃靜置，成功地獲得細柱狀之結晶。再將獲得之結晶的1個於室溫浸於0.18M Lithium sulfate monohydrate、27.3% PEG3350、0.09M HEPES pH7.5、18.2% Ethylene Glycol、4.5mM犬尿胺酸、9% DMSO之溶液30分鐘，獲得6RNMSC1-2_F02 Fab片段與犬尿胺酸複合體之結晶。
(8-1-4)從6RNMSC1-2_F02 Fab片段與犬尿胺酸複合體之結晶而來之X射線繞射數據之測定
將上述方法獲得之6RNMSC1-2_F02 Fab片段與犬尿胺酸複合體之1個單結晶藉由使用附微小的尼龍環的銷，將溶液鏟出，於液態氮中冷凍。使用高能量加速器研究機構之放射光設施Phonton Factory之BL-5A，測定前述結晶之X射線繞射數據。又，測定中一直將冷凍結晶放置在-178℃之氮氣流中，藉此維持冷凍狀態。使用束線具備並安裝的CCD偵測器Quantum 315r(ADSC)，使結晶每次旋轉0.6°，收集總共360張X射線繞射影像。從獲得之繞射影像之晶格常數之決定、對於繞射斑點賦予指數、及繞射數據之處理，係以程式Xia2(J.Appl.Cryst.(2010)43,186-190)、XDS Package(Acta Cryst.(2010)D66,125-132)及Scala(Acta Cryst.(2006)D62,72-82)進行。最終，獲得解析能力至多2.33Å之該結晶之繞射強度數據。本結晶，屬於空間群P1，晶格常數a=55.830Å、b=56.040Å、c=80.340Å、α=87.81°、β=82.88°、γ=65.54°。
(8-1-5)6RNMSC1-2_F02 Fab片段與犬尿胺酸複合體之X射線結晶結構解析
為了決定6RNMSC1-2_F02 Fab片段與犬尿胺酸複合體之結構，使用Phaser程式(J.Appl.Cryst.(2007)40,658-674)實施分子取代法。從獲得之結晶格子之大小以及6RNMSC1-2_F02 Fab片段之分子量，預測非對稱單元中之複合體數為2個。使用Discovery Studio3.5(Accelrys)，製作該抗體之同源模型，將此模型分成可變區與不變區部分，使用各自之結構座標作為探索用模型，依旋轉函數與並進函數決定於結晶格子內之走向與位置。進一步對於獲得之初期結構模型，實施 將可變區與不變區部分獨立運動之剛體精密化，結果對於25-3.0Å之繞射強度數據之結晶學的可靠度因子R值為40.57%、Free R值為38.91%。又，一面觀察依據使用程式REFMAC5(Acta Cryst.(2011)D67,355-367)之結構精密化、與由依據實驗決定之結構因子Fo與從模型計算之結構因子Fc計算之位相計算之以2Fo-Fc、Fo-Fc當做係數之電子密度輿圖，一面反複進行於程式Coot(Acta Cryst.(2010)D66,486-501)上進行模型修正，藉此進行模型之精密化。最終使用解析能力為25-2.33Å之34135個繞射強度資料，對於含7019個非氫原子之模型，結晶學的可靠度因子R值為20.4%、Free R值為26.56%。
(8-1-6)6RNMSC1-2_F02與犬尿胺酸之交互作用部位之鑑別
最終，實施例7中從資料庫取得之將犬尿胺酸作為開關之hIL-6R結合抗體6RNMSC1-2-F02之Fab片段與犬尿胺酸之複合體之結晶結構以解析能力2.33Å決定。本結晶之非對稱單位中，存在2分子該抗體的Fab片段，只有其中一者認為有犬尿胺酸之結合。可知：犬尿胺酸主要由該抗體之H鏈CDR3認識，此時在稍偏離和通常抗原結合使用的部分的位置和該抗體結合。
如第30圖，犬尿胺酸分子由該抗體之H鏈P97、R100c、D101、L鏈H49、F55之各側鏈以及H鏈R94、D95、R100c、G100d、A100e之各主鏈認識。又，犬尿胺酸之胺基酸骨架中之胺基於中性時帶正電荷，在H鏈D95、R94、A100e之各主 鏈之羰基氧以及D101側鏈之羧基之間認為有複數個氫鍵以及靜電交互作用。再者，帶負電荷之犬尿胺酸之羧基會和H鏈G100d、R100c之各主鏈之醯胺NH基形成複數個氫鍵。該等強力的氫鍵及靜電交互作用的網絡，據認為對於該抗體認識犬尿胺酸方面發揮重要作用。進一步，H鏈R100c之側鏈和犬尿胺酸之苯環部分形成陽離子-π交互作用，此外犬尿胺酸的苯環部分被L鏈H49、F55以及H鏈D101包圍，和此等殘基形成凡得瓦交互作用，有助於和犬尿胺酸之結合認識。又，L鏈H49之側鏈，確認和犬尿胺酸之芳香環上之NH2基之間有微弱氫鍵。
以上之結果可知該抗體對於犬尿胺酸之認識樣式，而且可鑑別密切相關於和犬尿胺酸之結合之抗體可變區之胺基酸殘基。作為其側鏈和犬尿胺酸之結合密切相關的胺基酸殘基，可列舉H鏈：P97、R100c、D101(Kabat編號)、L鏈：H49、F55(Kabat編號)。又，主鏈部分密切涉及和犬尿胺酸之結合之殘基，可列舉H鏈R94、D95、R100c、G100d、A100e。再者，P97、P100b、G100d這些殘基，其因結構特徵，據認為：藉由使H鏈CDR3之結構維持對於和犬尿胺酸之結合為必要之構形，間接大大地有助於和犬尿胺酸之結合。
(8-2)6RNMSC1-2_F02之改變體中之對於犬尿胺酸之結合能力之評價
(8-2-1)6RNMSC1-2_F02之重鏈改變體中之對於犬尿胺酸之結合能力之評價
如上述，利用結晶結構解析找出可能對於和犬尿胺酸之結 合有重要作用的殘基為重鏈之P97、P100b、R100c、G100d、D101等。實際上針對該等中的一些殘基製作改變體，並評價與犬尿胺酸之結合能力。製作之改變體如下。P97A、P97G、P100bG、R100cA、G100dA、G100dV、D101A(表15)。
依後述參考實施例1所示方法表現、精製而得之6RNMSC1-2_F02之各種改變體，依和實施例(7-5)所示之Biacore為同樣方法，評價向犬尿胺酸之結合。其結果再度確認6RNMSC1-2_F02向犬尿胺酸之結合，但是其他全部的改變體向犬尿胺酸之結合能力為減弱或大幅減弱。亦即從結晶結構找出的對於和犬尿胺酸之結合為重要的殘基，確認是涉及結合，支持結晶結構解析結果。
(8-2-2)6RNMSC1-2_F02之H49Y改變體中之對於犬尿胺酸之結合能力之評價
從結晶結構解析，和犬尿胺酸發生重要交互作用的輕鏈的胺基酸殘基只有H49(Kabat編號)。又，從序列解析之結果推測6RNMSC1-2_F02之框架係VLkappa-2生殖細胞系列來源。Kabat編號49號之胺基酸在VLkappa-2生殖細胞系列 中，幾乎都是Tyr，保守性非常高。故，製作將His49取代為Tyr之改變體，驗證His對於犬尿胺酸之交互作用之貢獻度。
將依後述參考實施例1所示方法表現、精製之6RNMSC1-2_F02之His49Tyr改變體(重鏈序列編號：32、輕鏈序列編號：45)，以和實施例(7-5)所示之Biacore同樣方法，評價向犬尿胺酸之結合。其結果可知：H49Y維持向犬尿胺酸之結合。又，動力學參數決定為ka=2543(1/s),kd=0.24(1/s),KD=0.095(mmol/L)。顯示評價結果之感應圖示於第31圖。
(8-2-3)6RNMSC1-2_F02之向生殖細胞系框架序列之改變
從序列解析之結果推測6RNMSC1-2_F02之VH框架為VH1-69生殖細胞系列來源。又，推測6RNMSC1-2_F02之VL框架為Vκ2-28生殖細胞系列來源。而，為了提高抗體之安定性，將6RNMSC1-2_F02之框架序列回復成生殖細胞系框架序列，將VH_Met108Leu、VL_Thr07Ser、VL_Ser11Leu、VL_Leu15Pro、VL_Gln17Glu、VL_Leu36Tyr、VL_Gln37Leu、VL_Arg39Lys、VL_Pro43Ser、VL_Arg45Gln、VL_His49Tyr、VL_Ala67Ser、VL_Asn70Asp(數字代表Kabat編號)之改變導入到6RNMSC1-2_F02之框架序列，命名為F02h011/F021003(重鏈可變區序列：序列編號：95、輕鏈可變區序列：序列編號：96)。以DSC測定依參考實施例1-1所示方法表現及精製之F02h011/F021003之Tm。利用DSC所為之測定依該技術領域中有通常知識者公知之方法實施。已施加該等改變之6RNMSC1-2_F02之改變體之Tm從82.9℃提高為85.2℃，認 為其結構有安定化。又，F02h011/F021003與犬尿胺酸之結合，以實施例(7-5)所示之使用Biacore之方法之中，抗原稀釋液及空白運行緩衝液之添加時間變更為30秒的條件測定，確認維持向犬尿胺酸之結合。犬尿胺酸結合之動力學參數決定為ka=3664(1/s),kd=0.40(1/s),KD=0.11(mmol/L)，顯示評價結果之感應圖示於第32圖。有時就抗體資料庫而言使用高安定性之框架亦為理想，故F02h011/F021003使用後述實施例(8-2-3)及實施例(9-2)之框架序列。框架序列示於表16。
(8-2-4)F02h011/F021003之向犬尿胺酸之結合增強之改變之探索
由實施例(8-1)、(8-2-1)之結果可預測推測涉及6RNMSC1-2_F02向犬尿胺酸之結合的殘基。再者，除了該等殘基，也探尋有可能因改變而增強向犬尿胺酸之結合的殘基。
具體而言，由該抗體的Fab片段與犬尿胺酸之複合體之結晶結構選擇如第34圖所示，距犬尿胺酸4.2Å以內存在之胺基酸殘基。其結果，新找到重鏈Tyr32、Arg100a、(kabat編號)、輕鏈Leu46(kabat編號)。又，重鏈CDR3為對於犬尿胺酸之結合貢獻最大的CDR迴圈，據認為改變為此迴圈上之 殘基，能間接影響向犬尿胺酸之結合，所以在儘可能多的殘基位置實施胺基酸殘基之改變。但是和輕鏈Arg96形成強力氫鍵而規定迴圈之結構之重鏈Asp95、和輕鏈Glu50形成氫鍵而規定迴圈之結構之重鏈Arg100a、側鏈和犬尿胺酸朝相反方向，即使導入改變，推測也無法和犬尿胺酸形成交互作用之重鏈Pro100b，則從改變殘基部位之候選者除外。又，輕鏈Ser56，如第35圖所示，雖距犬尿胺酸之距離遠，但是側鏈以朝犬尿胺酸的方向存在，可藉由改變為比Ser更長的胺基酸殘基而形成和犬尿胺酸之交互作用，故選擇作為改變殘基部位。又，由後述實施例(9-2)之結果顯示：重鏈Gly50及輕鏈Asp28取代為Ala的話，向犬尿胺酸之結合活性會增強。該等殘基部位因不是能直接和犬尿胺酸交互作用之位置(第36圖)，推測當和犬尿胺酸結合時會使Fab全體之構形安定，而有間接的貢獻。再者，針對該等殘基部位，據認為藉由改變為Ala以外，能進一步增強向犬尿胺酸之結合，故該殘基位置也被選擇作為全面性改變部位。藉由對於該等殘基取代為各胺基酸而得之改變體實施全面性評價，驗證能否鑑別可期待使向犬尿胺酸之結合能力增強之效果的改變。
對於實施例(8-2-3)製作之F02h011/F021003，如上改變之部位(表中，記載為「Kabat」之Kabat編號表示之部位)以及該部位中之改變前之胺基酸(表中，記載為「天然序列」之胺基酸)及改變後的胺基酸(表中，記載為「改變胺基酸」之胺基酸)示於表17。
【表17】
依後述參考實施例1所示方法表現及精製而得之各改變體之向犬尿胺酸之結合，以實施例(7-5)所示使用Biacore之方法之中，抗原稀釋液及空白運行緩衝液之添加時間變更為30秒的條件測定。又，針對一部分改變體，以固定Protein A之感應晶片之種類改變為感應晶片Series S CM3(GE Healthcare)之條件進行測定。當犬尿胺酸之解離快，無法決定解離速度常數時，於使各抗原交互作用的期間(結合相)中，依據結合回應的大小的平衡值解析計算解離常數KD(M)。此時，參數之計算出使用Biacore T200 Evaluation Software(GE Healthcare)。測定之結果，算出各改變體對於犬尿胺酸之親和性(Affinity)作為KD值。各改變體與F02h011/F021003對於犬尿胺酸之KD值之比較之結果示於表18。
【表18】
期待向犬尿胺酸之結合增強之改變之中，施加Lch_Ser56Tyr之改變的序列命名為F02h011/F021098(重鏈可變區序列：序列編號：95、輕鏈可變區序列：序列編號：97)，作為資料庫之模板序列。F02h011/F021098與犬尿胺酸之結合，係以實施例(7-5)所示使用Biacore之方法之中，改變為抗原稀釋液及空白運行緩衝液之添加時間為30秒、固定Protein A之感應晶片之種類為感應晶片Series S CM3(GE Healthcare)的條件測定。犬尿胺酸對F02h011/F021098結合之動力學參數，決定為ka=3686(1/s),kd=0.26(1/s),KD=0.072(mmol/L)。顯示評價結果之感應圖示於第33圖。
(8-3)為了依X射線結晶結構解析結果設計資料庫之全面性改變體評價
實施例(8-1)中，已解析6RNMSC1-2_F02與犬尿胺酸之複合體之結晶結構。從結晶結構解析之結果，鑑別該抗體所認識之犬尿胺酸之認識樣式、及推測未密切涉及向犬尿胺酸之結合之抗體可變區之胺基酸殘基。藉由將以下所示殘基取代為各胺 基酸而得之改變體予以全面性評價，據認為可判定可資料庫化之部位及可資料庫化胺基酸。即，藉由判定未密切涉及犬尿胺酸之結合之部位、或即使涉及結合但不會使對於犬尿胺酸之結合大幅降低(結合不為零)之天然序列以外之胺基酸為存在之部位及胺基酸，據認為能判定可資料庫化之部位及可資料庫化胺基酸。對於實施例(8-2-4)製作之已施加增強對於犬尿胺酸之結合的改變的F02h011/F021098，製作複數個已對於該等殘基導入改變之改變體。
重鏈部位之中已改變之部位(表中，記載為「Kabat」之Kabat編號表示之部位)以及該部位中之改變前之胺基酸(表中，記載為「天然序列」之胺基酸)及改變後的胺基酸(表中記載為「改變胺基酸」之胺基酸)示於表19。
【表19】
輕鏈部位之中已改變之部位(表中，記載為「Kabat」之Kabat編號表示之部位)以及該部位中之改變前之胺基酸(表 中，記載為「天然序列」之胺基酸)及改變後的胺基酸(表中記載為「改變胺基酸」之胺基酸)示於表20。
依後述參考實施例1所示方法表現及精製而得之各改變體向犬尿胺酸之結合，以實施例(7-5)所示之使用Biacore之方法之中，抗原稀釋液及空白運行緩衝液之添加時間改為30秒之條件測定。又，針對一部分改變體，使用固定Protein A之感應晶片之種類改為感應晶片Series S CM3(GE Healthcare)之條件進行測定。犬尿胺酸之解離快速而無法決定解離速度常數時，則於使各抗原交互作用之期間(結合相)，依據結合回應的大小得到的平衡值解析計算解離常數KD(M)。於此時之參數計算出亦使用Biacore T200 EvaluationSoftware(GE Healthcare)。測定之結果，計算各改變體對於犬尿胺酸之親和性(Affinity)作為KD值。重鏈中之各改變體以及 親代序列F02h011/F021098對於犬尿胺酸之KD值之比較之結果示於表21。輕鏈中之各改變體與親代序列F02h011/F021098對於犬尿胺酸之KD值之比較之結果示於表22。
【表21】
【表22】
(8-4)依全面性改變體評價結果之資料庫設計
設計資料庫時，係依據實施例(8-2-4)、(8-3)及後述實施例(9-2)獲得之資訊，選擇滿足以下條件中之至少一者的部位作為可資料庫化之部位。
條件1)未密切涉及對於犬尿胺酸之結合的部位、或雖涉及結合但不會使對於犬尿胺酸之結合大幅降低之天然序列以外之胺基酸存在之部位、條件2)作為抗體的資料庫存有某程度胺基酸出現頻度多樣性之部位、條件3)對於典型結構之形成不重要的部位。
從實施例(8-2-4)、(8-3)及後述實施例(9-2)實施之評價結果，判定各評價中，比起親代序列對於犬尿胺酸之KD值高出20%之結合之改變體有至少1處以上存在之處，為滿足上述條件之可改變部位。判定：該部位中被取代之胺基酸之 中，顯示各評價中比起親代序列對於犬尿胺酸之KD值有高出20%之結合之胺基酸為可資料庫化之胺基酸(資料庫中能出現之柔性殘基)。藉由設計實施例(8-2-4)製作之已施加對於犬尿胺酸之結合增強之改變的F02h011/F021098中，判定的各可改變部位含有依改變體之解析選出之可資料庫化胺基酸(資料庫中可出現之柔性殘基)及未改變體之胺基酸(亦即F02h011/F021098之天然序列所含之胺基酸)之胺基酸資料庫存中所含胺基酸中之至少任1種以上之胺基酸出現之資料庫，可建構犬尿胺酸開關抗體取得用之資料庫。重鏈中含有胺基酸資料庫存之部位、以及該部位中之胺基酸資料庫存示於表23。輕鏈中含有胺基酸資料庫存之部位、以及該部位之胺基酸資料庫存示於表24。表中記載為「Kabat」之Kabat編號表示之部位代表可改變部位，記載為「天然序列」之胺基酸代表該部位中之未改變體之胺基酸，記載為「可資料庫化胺基酸」之胺基酸代表該部位中之可資料庫化胺基酸。設計各可改變之酸部位中，選出之胺基酸資料庫存所含之胺基酸中至少任一者出現之資料庫。
【表23】
【表24】
合成含有如此設計之資料庫所含之各序列之基因，使用該等各個基因之集合體(資料庫)作為模板，利用能使VH及VL分別放大的引子將基因資料庫放大。將已放大的合理設計的人抗體重鏈可變區之基因資料庫與人抗體輕鏈可變區之基因資料庫，導入具有人IgG來源CH1序列及人IgG來源輕鏈不變區序列兩者的適當噬粒載體。將此噬粒載體利用電穿孔向大腸菌導入，建構提示由人抗體可變區-不變區構成之Fab分域，且能取得將犬尿胺酸作為開關而能結合於抗原之抗體的合理設計資料庫。以此方式，由具多樣犬尿胺酸結合活性之H鏈及L鏈構成之合理設計資料庫，據認為：作為能以良好效率取得含有對於任意抗原之犬尿胺酸開關抗體的人抗體的資料庫為有用。又，如實施例(7-6)，6RNMSC1-2_F02不只結合於犬尿胺酸，也會結合於犬尿胺酸之代謝物3-羥基犬尿胺酸、RO0635389-000-001等犬尿胺酸衍生物，故可預測對於和 犬尿胺酸有類似結構的其他衍生物也有結合活性。所以，可認為本資料庫對於取得因犬尿胺酸、犬尿胺酸代謝物、甚至為活體外分子之犬尿胺酸衍生物中任一以上之低分子之有無而改變對於任意目標抗原之結合活性的開關抗體有用。
[實施例9]利用成為開關之分子進行之淘選設計犬尿胺酸開關抗體取得用之資料庫
實施例8已記載利用全面性改變設計資料庫化部位，並建構將對於犬尿胺酸顯示結合能力之抗體作為模板之資料庫的方法。就資料庫製作方法而言，使用不同方法即利用對於成為開關之分子的淘選的方法也有用。
(9-1)將犬尿胺酸作為開關之hIL-6R結合抗體6RNMSC1-2_F02之X射線結晶結構解析
實施例(8-1)中已解析6RNMSC1-2_F02與犬尿胺酸之複合體之結晶結構。從結晶結構解析之結果，已鑑別：該抗體所認識之犬尿胺酸之認識樣式、及假定未密切涉及向犬尿胺酸之結合之抗體可變區之胺基酸殘基。
(9-2)可資料庫化之部位選擇評價及資料庫設計
實施對於實施例(8-2-2)製作之F02h011/F021003(重鏈可變區序列：序列編號：95輕鏈可變區序列：序列編號：96)依結晶結構解析結果而挑選之各部位取代為Ala或Val之改變體之評價，據認為能選擇可資料庫化之部位之選擇。
(9-2-1)重鏈可變區之可資料庫化之部位選擇評價及資料庫設計
首先，製作就重鏈中之F02h011/F021003之重鏈序列所含 部位之中，依結晶結構解析結果挑選的各部位，取代為Ala或Val之各改變體。改變之部位(表中，記載為「Kabat」之Kabat編號表示之部位)以及該部位中之改變前之胺基酸(表中，記載為「天然序列」之胺基酸)及改變後的胺基酸(表中記載為「改變胺基酸」之胺基酸)示於表25。
依後述參考實施例1所示方法表現及精製而得之各改變體之向犬尿胺酸之結合，係將實施例(7-5)所示之使用Biacore之方法中之抗原添加時間改為30秒之條件實施測定。犬尿胺酸之解離快速而無法決定解離速度常數時，則於使各抗原交互作用之期間(結合相)，依據結合回應的大小得到的平衡值解析計算解離常數KD(M)。於此時之參數計算出亦使用Biacore T200 Evaluation Software(GE Healthcare)。測定之結果，計算各改變體對於犬尿胺酸之親和性(Affinity)作為KD值。各改變體與親代抗體F02h011/F021003對於犬尿胺酸之KD值之比較之結果示於表26。
設計資料庫時，依上述改變體評價及實施例(8-2-4)之評價獲得之資訊，選出滿足以下條件中至少一者的部位作為可資料庫化之部位。
條件1)未密切涉及對於犬尿胺酸之結合的部位、或即使涉及結合但不會使對於犬尿胺酸之結合大幅降低(結合不為零)之天然序列以外之胺基酸為存在部位；條件2)作為抗體的資料庫存有某程度胺基酸出現頻度多樣性之部位；條件3)對於典型結構之形成不重要的部位。
設計實施例(8-2-4)製作之已導入向犬尿胺酸之結合增強之改變的F02h011/F021098之重鏈序列(序列編號：95)中，依上述條件選出之部位之胺基酸限定出現在某一定之鹼基的資料庫。例如NNK、TRIM Library等(Gonzalez-Munoz A et al.MAbs 2012,Lee CV et al.J Mol Biol.2004,Knappik A.et al.J Mol Biol.2000,Tiller T et al.MAbs 2013)。實施評價之各部位中，顯示比起親代序列F02h011/F021003對於犬尿胺酸之KD值高20%之結合之改變處，判定為滿足上述條件之可改變部位。又，即使是其含有之部位，但判斷係結構上重要殘基的部位則從資料庫化部位除外，或限定出現之胺基酸而進行資料庫化。使用NNK密碼子之資料庫化部位(表中以○表達)、固定於天然序列之部位(表中以×表達)、及限定出現之胺基酸時，此胺基酸示於表27。
【表27】
設計之基因序列，係使用於資料庫化部位出現NNK密碼子或限定之胺基酸的密碼子的引子進行基因合成(重鏈可變區資料庫)，和F02h011/F021098之輕鏈可變區序列(親代序列、序列編號：97)組合，導入到具有人IgG來源CH1序列及人IgG來源輕鏈不變區序列之適當噬粒載體。藉由將此噬粒載體利用電穿孔向大腸菌導入，以建構將犬尿胺酸作為開關而能結合於抗原之人抗體重鏈可變區噬菌體展示資料庫。
(9-2-2)輕鏈可變區之可資料庫化之部位選擇評價及資料庫設計
然後製作關於輕鏈中，F02h011/F021003之輕鏈序列所含部位之中依結晶結構解析結果挑選的各部位，取代為Ala或Val而得之各改變體。改變之部位(表中，記載為「Kabat」之Kabat編號表示之部位)以及該部位之改變前之胺基酸(表中，記載為「天然序列」之胺基酸)及改變後的胺基酸(表中記載為「改變胺基酸」之胺基酸)示於表28。
依後述參考實施例1所示方法表現及精製而得之各改變體向犬尿胺酸之結合，係將實施例(7-5)所示之使用 Biacore之方法中之抗原添加時間改為30秒之條件實施測定。犬尿胺酸之解離快速而無法決定解離速度常數時，則於使各抗原交互作用之期間(結合相)，依據結合回應的大小得到的平衡值解析計算解離常數KD(M)。於此時之參數計算出亦使用Biacore T200 Evaluation Software(GE Healthcare)。測定之結果，計算各改變體對於犬尿胺酸之親和性(Affinity)作為KD值。各改變體與親代序列F02h011/F021003對於犬尿胺酸之KD值之比較之結果示於表29。
設計資料庫時，依上述改變體評價及實施例(8-2-4)之評價獲得之資訊，選擇滿足以下條件中至少一者之部位作為可資料庫化之部位。
條件1)未密切涉及對於犬尿胺酸之結合的部位、或即使涉及結合但不會使對於犬尿胺酸之結合大幅降低(結合不為零)之天然序列以外之胺基酸存在之部位；條件2)作為抗體的資料庫存有某程度胺基酸出現頻度多樣性之部位；條件3)對於典型結構之形成不重要的部位。
設計實施例(8-2-4)製作之已導入向犬尿胺酸之結合增強之改變的F02h011/F021098之輕鏈序列(序列編號：97)中，依上述條件選出之部位之胺基酸只限定為出現在某一定之鹼基的資料庫。例如NNK、TRIM Library等。實施評價之各 部位中，顯示比起親代序列F02h011/F021003對於犬尿胺酸之KD值高20%之結合之改變處，判定為滿足上述條件之可改變部位。又，即使是其含有之部位，但判斷係結構上重要殘基的部位則從資料庫化部位除外，或限定出現之胺基酸而進行資料庫化。使用NNK密碼子之資料庫化部位(表中以○表達)、固定於天然序列之部位(表中以×表達)、及限定出現之胺基酸時，此胺基酸示於表30。
設計之基因序列，係使用於資料庫化部位出現NNK密碼子或限定之胺基酸的密碼子的引子進行基因合成(輕鏈可變區資料庫)，和F02h011/F021098之重鏈可變區序列(親代序列、序列編號：95)組合，導入到具有人IgG來源CH1序列及人IgG來源輕鏈不變區序列之適當噬粒載體。藉由將此噬粒載體利用電穿孔向大腸菌導入，以建構將犬尿胺酸作為開關而能結合於抗原之人抗體輕鏈可變區噬菌體
(9-3)用以製作犬尿胺酸結合資料庫之生物素化犬尿胺酸之合成
如實施例(7-6)所示，6RNMSC1-2_F02中，犬尿胺酸之衍生物也作為開關的作用。此等衍生物均有犬尿胺酸之3位4位5位中任一者經取代之結構，且由6RNMSC1-2_F02與犬尿胺酸之複合體之結晶結構解析結果預測到向犬尿胺酸之3位4位或5位導入生物素不會干擾6RNMSC1-2_F02與抗原hIL-6R之 結合，所以希望從3位4位5位之任一者結合適當連結子(PEG連結子等)，並於其末端附加生物素。
以下顯示本發明之生物素化犬尿胺酸之實施例。本發明之生物素化犬尿胺酸可依各種方法合成，其一部分以下列方案說明。方案為例示，本發明不只限於明示之化學反應及條件。本發明之代表的化合物可使用適當中間體、公知之化合物、及試藥合成。
(9-3-1)犬尿胺酸之4位附有連結子之生物素化合物之合成
依以下記載之方法，可製備生物素化犬尿胺酸化合物028及029。又，生物素化犬尿胺酸化合物及合成中間體依以下條件分析。
LCMS之分析條件如下。
【表31】
【化26】
於5-溴-2-碘苯胺(化合物019、4.90g、16.5mmol、 COMBI-BLOCKS)與二碳酸二第三丁酯(7.54g、41.1mmol)之四氫呋喃(100ml)溶液中，於氮氣流下於0℃費時15分鐘加入雙(三甲基矽基)胺基鈉(38%四氫呋喃溶液、1.9mol/L、21.6ml、41.1mmol)，於0℃攪拌30分鐘，於室溫攪拌18小時。將反應液以乙酸乙酯(300ml)稀釋，以1M鹽酸、飽和重碳酸鈉溶液、及飽和食鹽水洗滌後，以硫酸鈉乾燥，並進行減壓濃縮。將獲得之殘渣以順相矽膠管柱層析(乙酸乙酯/己烷)精製，獲得化合物020(6.14g、90%)。
LCMS(ESI)m/z=342、344(M-Bu+H)+
保持時間：0.97分(分析條件H)
於N-第三丁氧基-(5-溴-2-碘苯基)胺甲酸酯(化合物020、12.0g、30.2mmol)之四氫呋喃(120ml)溶液中，於氮氣流下於-78℃加入甲基溴化鎂(1M、33.2ml、33.2mmol)，於同溫度攪拌1小時。其次加入正丁基鋰(2.5M、13.3ml、33.3mmol)後，於-78℃攪拌2小時。於此溶液中於-78℃費時30分鐘加入(2S)-2-[[第三丁氧基羰基]胺基]-4-側氧基丁酸酯(化合物021、4.20g、15.4mmol、Roberts等、Bioorg.Med.Chem.Letters,13(2),265-267(2003))之四氫呋喃(15ml)溶液，再於同溫度攪拌2小時。於反應液加入1M鹽酸，以乙酸乙酯萃取3次。將收集的有機層以1M鹽酸、飽和重碳酸鈉溶液、及飽 和食鹽水洗滌後，減壓濃縮。將獲得之殘渣以順相矽膠管柱層析(乙酸乙酯/石油醚)精製，獲得化合物022(7.50g、89%)。
LCMS(ESI)m/z=569(M+Na)+
保持時間：1.93分(分析條件A)
於化合物022(7.50g、13.8mmol)之二氯甲烷(100ml)溶液中，於25℃加入Dess-Martin Periodinane(11.7g、27.6mmol)，攪拌2小時。將反應混合物之乙酸乙酯稀釋溶液以硫代硫酸鈉水溶液、碳酸氫鈉水溶液、飽和食鹽水洗滌並減壓濃縮。將獲得之殘渣以順相矽膠管柱層析(乙酸乙酯/石油醚)精製，獲得化合物023(5.80g、78%)。
LCMS(ESI)m/z=565(M+Na)+
保持時間：1.78分(分析條件A)
將化合物023(2.50g、4.58mmol)、碘化銅(I)(438mg、2.30mmol)、(1R,2R)-(-)-N,N'-二甲基環己烷-1,2-二胺(654mg、4.60mmol)、碘化鈉(1.40g、9.34mmol)之二噁烷(60ml)溶液於氮氣環境下於120℃攪拌16小時。將減壓濃縮後的反應混合液之殘渣以順相矽膠管柱層析(乙酸乙酯/石油醚)精製，獲得 化合物024(1.60g、59%)。
LCMS(ESI)m/z=613(M+Na)+
保持時間：1.95分(分析條件B)
將化合物024(1.60g、2.71mmol)、肆(三苯基膦)鈀(627mg、0.54mmol)、碘化銅(103mg、0.54mmol)、雙(2-丙炔基)醚(893mg、9.49mmol)、三乙醯胺(960mg、9.49mmol)之四氫呋喃(20ml)溶液於氮氣環境下於25℃攪拌16小時。將已減壓濃縮之反應混合液之殘渣以順相矽膠管柱層析(乙酸乙酯/石油醚)精製，獲得化合物025(700mg、46%)。
LCMS(ESI)m/z=579(M+Na)+
保持時間：2.68分(分析條件B)
將化合物025(60.0mg、0.11mmol)、biotin-PEG4-N3(化合物026、60.0mg、0.13mmol)、硫酸銅．5水合物(10.0mg、0.040mmol)、1M抗壞血酸鈉水溶液(5滴)、之四氫呋喃(2.0ml)與第三丁醇(2.0ml)混合溶液於25℃攪拌16小時。將已減壓濃縮之反應混合液之殘渣以順相矽膠管柱層析(甲醇/二氯甲烷) 精製，獲得化合物027(100mg、91%)。
LCMS(ESI)m/z=1001(M+H)+
保持時間：1.40分(分析條件C)
於化合物027(100mg、0.10mmol)之二氯甲烷(10ml)溶液中加入三氟乙酸(2.0ml)，於25℃攪拌2小時。經已減壓濃縮之反應混合液之殘渣以高速液體層析精製，獲得化合物028(27.8mg、37%)。
LCMS(ESI)m/z=745(M+H)+
保持時間：2.14分(分析條件D)
於化合物027(100mg、0.10mmol)、鈀/碳(20mg)之甲醇(10ml)溶液費時5小時吹入氫氣。將反應混合物過濾後減壓濃縮，於殘渣之二氯甲烷(10ml)溶液加入三氟乙酸(1.0ml)，於25℃攪拌1小時。將已減壓濃縮之反應混合液之殘渣以高速液體層析精製，獲得化合物029(13.5mg、18%)。
LCMS(ESI)m/z=749(M+H)+
保持時間：1.20分(分析條件B)
(9-3-2)於犬尿胺酸之5位附有連結子之生物素化 合物之合成
依以下記載之方法，可製備生物素化犬尿胺酸化合物036。
於N-第三丁氧基-(4-溴-2-碘苯基)胺甲酸酯(Wensbo等、Tetrahedron,51(37),10323-10342(1995))(化合物030、7.50 g、18.8mmol)之四氫呋喃(80ml)溶液中於氮氣流下於-78℃加入甲基溴化鎂(1M、20ml、20mmol)，於同溫度攪拌20分鐘。其次加入正丁基鋰(2.5M、10ml、25mmol)後，於-78℃攪拌30分鐘。於此溶液中於-78℃費時30分鐘加入(2S)-2-[[第三丁氧基羰基]胺基]-4-側氧基丁酸酯(化合物021、2.57g、9.40mmol)之四氫呋喃(20ml)溶液，再於同溫度攪拌1小時。於反應液中加入1M鹽酸，以乙酸乙酯萃取3次。將收集的有機層以1M鹽酸、飽和重碳酸鈉溶液、及飽和食鹽水洗滌，以硫酸鈉乾燥後減壓濃縮。將獲得之殘渣以順相矽膠管柱層析(乙酸乙酯/石油醚)精製，獲得化合物031(4.56g、89%)。
LCMS(ESI)m/z=569(M+Na)+
保持時間：1.78分(分析條件A)
於化合物031(4.56g、8.36mmol)之二氯甲烷(100ml)溶液中，於25℃加入Dess-Martin Periodinane(8.89g、21.0mmol)，攪拌3小時。於反應混合物加入硫代硫酸鈉水溶液後，以二氯甲烷萃取3次。將合併的有機層以碳酸氫鈉水溶液洗滌後，以硫酸鈉乾燥並減壓濃縮。將獲得之殘渣以順相矽膠管柱層析(乙酸乙酯/石油醚)精製，獲得化合物032(3.60g、79%)。
LCMS(ESI)m/z=567(M+H)+
保持時間：1.90分(分析條件E)
將化合物032(3.60g、6.62mmol)、碘化銅(I)(650mg、3.41mmol)、(1R,2R)-(-)-N,N'-二甲基環己烷-1,2-二胺(940mg、6.61mmol)、碘化鈉(1.98g、13.2mmol)之二噁烷(60ml)溶液於氮氣環境下於120℃攪拌16小時。將經減壓濃縮之反應混合液之殘渣以順相矽膠管柱層析(乙酸乙酯/石油醚)精製，獲得化合物033(3.10g、79%)。
LCMS(ESI)m/z=613(M+Na)+
保持時間：1.33分(分析條件E)
將化合物033(3.10g、5.25mmol)、肆(三苯基膦)鈀(1.21g、1.05mmol)、碘化銅(200mg、1.05mmol)、雙(2-丙炔基)醚(1.73mg、18.4mmol)、三乙醯胺(1.86g、18.4mmol)之四氫呋喃(20ml)溶液於氮氣環境下於25℃攪拌16小時。將已減壓濃縮之反應混合液之殘渣以順相矽膠管柱層析(乙酸乙酯/石油醚)精製，獲得化合物034(1.00g、34%)。
LCMS(ESI)m/z=579(M+Na)+
保持時間：1.28分(分析條件E)
將化合物034(90.0mg、0.20mmol)、biotin-PEG4-N3(化合物026、90.0mg、0.16mmol)、硫酸銅．5水合物(10mg、0.040mmol)、1M抗壞血酸鈉水溶液(10滴)、之四氫呋喃(2ml)與第三丁醇(2ml)混合溶液於25℃攪拌16小時。將已減壓濃縮之反應混合液之殘渣以順相矽膠管柱層析(甲醇/二氯甲烷)精製，獲得化合物035(155mg、76%)。
LCMS(ESI)m/z=100l(M+H)+
保持時間：1.13分(分析條件F)
於化合物035(85.0mg、0.080mmol)、鈀/碳(10mg)之甲醇(10ml)溶液吹入氫氣4小時。將反應混合物過濾後減壓濃縮，於殘渣之二氯甲烷(5.0ml)溶液加入三氟乙酸(1.0ml)，於25℃攪拌1小時。將已減壓濃縮之反應混合液之殘渣以高速液體層析精製，獲得化合物036(18.9mg、31.6%)。
LCMS(ESI)m/z=749(M+H)+
保持時間：0.70分(分析條件G)
(9-4)使用重鏈及輕鏈可變區噬菌體展示資料庫取得結合於犬尿胺酸之抗體集團
為了從實施例(9-2-1)及(9-2-2)設計、構建之重鏈、輕鏈可變區各自的噬菌體展示資料庫取得對於犬尿胺酸專一性地結合的抗體集團，實施對於實施例(9-3)合成之生物素化犬尿胺酸的淘選。為此，先使抗體噬菌體展示資料庫於生物素化犬尿胺酸不存在下與磁珠接觸，去除提示即使在生物素化犬尿胺酸不存在下仍對於磁珠有結合活性之抗體的噬菌體。然後，於生物素化犬尿胺酸存在之條件下同樣實施淘選，以實施對於生物素化犬尿胺酸有專一的結合活性的抗體的篩選。
使保持構建之噬菌體展示噬粒載體的大腸菌感染M13KO7△pIII(稱為hyperphage)(PROGEN Biotechnik)，從於30℃培養一晚之上清回收噬菌體。將於進行噬菌體產生之大腸菌之培養液添加2.5M NaCl/10%PEG而沉澱之噬菌體之集團以TBS稀釋，而製作抗體多價提示噬菌體資料庫液。然後於該噬菌體資料庫液添加BSA，使終濃度成為4%。使用固定於磁珠之抗原實施淘選。磁珠使用NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或Streptavidin coated beads(Dynabeads MyOne StreptAvidin T1)。
淘選係利用負選擇法回收對於犬尿胺酸專一性地結合之噬菌體。對於實施例(9-3)合成之3種生物素化犬尿胺酸(化合物028、029、及036)，分別實施淘選。具體而言，於經BSA阻斷的磁珠(Dynabeads MyOne StreptAvidin T1)加入製備 的噬菌體資料庫液0.8mL，於室溫使其結合30分鐘。之後，於4℃使其結合30分鐘。使用磁座將珠分離以回收未結合於珠之噬菌體。再重複此作業。使另外準備的經BSA阻斷的磁珠(Dynabeads MyOne StreptAvidin T1)與6nmol的生物素化犬尿胺酸於室溫反應30分鐘，對於磁珠固定生物素化犬尿胺酸。藉由對於固定有經以TBST洗滌3次的生物素化犬尿胺酸的磁珠加入回收之噬菌體，使噬菌體資料庫於室溫與生物素化犬尿胺酸接觸30分鐘。之後，於4℃使其接觸30分鐘。將珠於1mL之冰TBST洗滌2次，以冰TBS洗滌1次。之後將已加入最終濃度1mg/mL之含胰蛋白酶之TBS 0.5mL的珠於室溫懸浮15分鐘後，立即使用磁座分離珠，將噬菌體溶液回收。將以胰蛋白酶溶液溶出之噬菌體添加到成為對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之60mL之大腸菌株ER2738。於37℃緩慢地實施上述大腸菌之攪拌培養1小時以使噬菌體感染大腸菌。將感染的大腸菌接種到3片225mm x 225mm的板。然後使hyperphage感染接種的大腸菌的培養液，於30℃培養一晚，回收抗體多價提示噬菌體資料庫液。
於第2次淘選中，和第1次同樣利用負選擇法回收對於犬尿胺酸專一性地結合之噬菌體，但係對於3種生物素化犬尿胺酸分別實施。具體而言，先將磁珠(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)以添加了5mg/mL之StreptAvidin recombinant(Roche)5μL的2%脫脂乳-TBS阻斷。對於經TBST洗滌3次的磁珠，加入經4% BSA阻斷之噬菌體資料庫液0.8mL，於室溫使其結合30分鐘。使用磁座將 珠分離以回收未結合於珠之噬菌體。再重複此作業。經另外準備的經以5mg/mL之StreptAvidin recombinant(Roche)5μL的2%脫脂乳-TBS阻斷的磁珠(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)與10nmol之生物素化犬尿胺酸於室溫反應30分鐘、於4℃反應30分鐘，以使生物素化犬尿胺酸固定於磁珠。藉由對於經TBST洗滌3次的已固定有生物素化犬尿胺酸的磁珠加入回收的噬菌體，使噬菌體資料庫於室溫和生物素化犬尿胺酸接觸30分鐘。之後，於4℃使其接觸30分鐘。將珠以1mL的冰TBST洗3次、以冰TBS洗2次。之後將已加入最終濃度1mg/mL之含胰蛋白酶之TBS 0.5mL的珠於室溫懸浮15分鐘後，立即使用磁座分離珠，將噬菌體溶液回收。將以胰蛋白酶溶液溶出之噬菌體0.5mL中的50μL添加到成為對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之60mL之大腸菌株ER2738。於37℃緩慢地實施上述大腸菌之攪拌培養1小時以使噬菌體感染大腸菌。將已感染的大腸菌接種到3片225mm x 225mm的板。
(9-4-2)利用噬菌體ELISA評價對於生物素化犬尿胺酸之結合活性
從實施例(9-4-1)獲得之大腸菌之單一群落，依常法(Methods Mol.Biol.(2002)178,133-145)回收含噬菌體之培養上清。使用hyperphage作為幫助者噬菌體，回收抗體多價提示噬菌體供ELISA使用。將StreptaWell 96微滴定板(Roche)以含有3種生物素化犬尿胺酸(將化合物028、029及036各等量混合)之80μL之TBS包被1小時以上。將該板之各井以TBST 洗滌以去除未結合於板的生物素化犬尿胺酸後，將該井以250μL之2%脫脂乳-TBS阻斷1小時以上。去除2%脫脂乳-TBS，之後，將已於各井加入製備之精製噬菌體的該板於室溫靜置1小時以使提示噬菌體之抗體結合於各井存在之生物素化犬尿胺酸。於經TBST洗滌之各井，加入經TBS稀釋之HRP結合抗M13抗體(Amersham Pharmacia Biotech)後，將此板溫育1小時。以TBST洗滌後，利用添加硫酸使已添加TMB single溶液(ZYMED)之各井中之溶液之發色反應停止，之後利用450nm之吸光度測定該發色。其結果，確認有複數個對於生物素化犬尿胺酸結合之抗體。噬菌體ELISA之結果示於表32。
(9-4-3)生物素化犬尿胺酸結合抗體的序列解析
解析從實施例(9-4-2)所示之噬菌體ELISA之結果中判斷為對於犬尿胺酸有專一的結合活性的選殖體使用專一的引子(序列編號：79及80)放大之基因之鹼基序列。解析之結果，判斷為對於犬尿胺酸有結合活性之選殖體的序列係各自獨立。
(9-5)利用對於犬尿胺酸之淘選的犬尿胺酸開關抗體取得用資料庫之構建
從重鏈、輕鏈可變區噬菌體展示資料庫各自取得之對於抗原(犬尿胺酸)結合之噬菌體，係具有向犬尿胺酸之結合能力之 集團，故可預測藉由此兩者組合而製作之Fab提示噬菌體資料庫含有複數個維持成為開關之犬尿胺酸結合的選殖體，據認為可製作能以更良好效率取得犬尿胺酸開關抗體之資料庫。
從感染實施例(9-4)取得之重鏈、輕鏈各自之噬菌體資料庫的大腸菌依該技術領域中有通常知識者公知之方法萃取基因。將重鏈中取得之基因之集合體(重鏈可變區資料庫)作為模板，利用各能將重鏈可變區放大之引子(序列編號：98及99)將基因資料庫放大。從輕鏈中之取得之基因之集合體(輕鏈可變區資料庫)將F02h011/F021098之重鏈可變區序列(資料庫模板序列：序列編號：95)以限制酶處理剔除，製備含有輕鏈可變區資料庫基因、人IgG來源輕鏈不變區序列及人IgG來源CH1序列之噬粒載體。於製備之含輕鏈可變區資料庫基因之噬粒載體插入重鏈可變區資料庫基因，以建構導入了人抗體重鏈/輕鏈可變區資料庫基因的噬粒載體。藉由將此噬粒載體利用電穿孔向大腸菌導入，建構能取得提示由人抗體可變區-不變區構成之Fab分域，且將犬尿胺酸作為開關而能結合於抗原之抗體的設計資料庫。如上，由具多樣之犬尿胺酸結合活性之H鏈及L鏈構成之設計資料庫，據認為作為含有能以良好效率取得對於任意抗原之犬尿胺酸開關抗體的人抗體的資料庫有用。又，如實施例(7-6)，6RNMSC1-2_F02不只結合於犬尿胺酸，也會結合於其代謝物3-羥基犬尿胺酸、3-羥基-DL-犬尿胺酸及RO0635389-000-001、RO0635390-000-001這些犬尿胺酸衍生物，所以本資料庫據認為對於取得因應犬尿胺酸、犬尿胺酸代謝物、犬尿胺酸衍生物中任一者以上之低分子之有無而 改變對於任意目標抗原之結合活性的開關抗體有用。
實施例(9-6)利用噬菌體ELISA評價資料庫所含之選殖體之犬尿胺酸結合能力
於實施例(9-5)構建之資料庫係經過對於犬尿胺酸之淘選製作，故預測此資料庫中含有複數個對於犬尿胺酸有結合能力的選殖體。從構建之資料庫獲得之噬菌體選殖體對於生物素化犬尿胺酸之結合評價係利用噬菌體ELISA實施。
從具構建之資料庫基因之大腸菌之單一群落依常法(Methods Mol.Biol.(2002)178,133-145)進行噬菌體的培養。使用hyperphage作為幫助者噬菌體，回收含抗體多價提示噬菌體之培養上清。使用NucleoFast96(MACHERY-NAGEL)，將回收的噬菌體培養上清進行超過濾。將培養上清各200μL加到NucleoFast96之各井，進行6,000g、45分鐘離心分離，去除未吸附物(flow-through)。加入H2O 200μL，以6,000g、30分鐘離心分離實施洗滌。之後，加入TBS 200μL，於室溫靜置5分鐘後，回收上清所含之噬菌體液。
將已加有TBS之精製噬菌體以和實施例(9-4-1)使用之方法同樣方法供ELISA使用。其結果，確認有複數個對於生物素化犬尿胺酸結合之抗體。解析之初級資料庫來源之噬菌體選殖體當中，約49%顯示犬尿胺酸結合能力。噬菌體ELISA之結果示於表33。
[實施例10]將非活體來源低分子作為開關之抗原結合蛋白質之評價
針對由對於ATP、腺苷結合之抗體ATNLSA1-4_D12構建之資料庫取得之在ATP或腺苷存在下會對於人IL-6受體(hIL-6R)顯示結合能力之抗體(後述參考實施例3)，就於非活體來源低分子存在下對於人IL-6受體之結合能力進行評價。
(10-1)從資料庫取得之ATP/腺苷開關抗體之製備
將後述參考實施例3取得之判斷於ATP或腺苷存在下具有結合於生物素標識hIL-6R之結合活性的選殖體6RAD2C1-4_001、6RAD2C1-4_005、6RAD2C1-4_011、6RAD2C1-4_026、6RAD2C1-4_030、6RAD2C1-4_042、6RAD2C1-4_076、6RDL3C1-4_085、6RDL3C5-4_011之重鏈及輕鏈之可變區序列，各插入到具有重鏈抗體不變區(序列編號：46)或輕鏈Lambda不變區序列(序列編號：100)之人IgG1/Lambda之動物表現用質體。使用以下方法使抗體表現。對於在FreeStyle 293 Expression Medium培養基(Invitrogen)使1.33 x 106細胞/mL之細胞密度懸浮並於6井板之各井各接種3mL之人胎兒腎細胞來源FreeStyle 293-F株(Invitrogen)，利用脂轉染法(lipofection)導入製備的質體。從於CO2培養箱(37℃、8%CO2,90rpm)培養了4日的培養上清，使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)依該技術領域中有通常知識者公知之方法將抗體精製。使用分光光度計測定精製之抗體溶液於280nm之吸光度。使用從獲得之測定值依PACE法算出之吸光係數，計算精製之抗體之濃度(Protein Science(1995)4,2411-2423)。
(10-2)利用表面電漿子共振評價各種低分子所致對於人IL-6受體結合之影響
使用Biacore T200(GE Healthcare)，評價在從資料庫取得之ATP/腺苷依存性抗體9種選殖體(6RAD2C1-4_001、6RAD2C1-4_005、6RAD2C1-4_011、6RAD2C1-4_026、6RAD2C1-4_030、6RAD2C1-4_042、6RAD2C1-4_076、6RDL3C1-4_085、6RDL3C5-4_011)與hIL-6R之抗原抗體反應中，各種低分子之影響。運行緩衝液使用20mmol/L ACES、150mmol/L NaCl、0.05%(w/v)Tween20、pH7.4，於25℃測定。在感應晶片CM5上利用胺偶聯將hIL-6R固定化，將抗體作為分析物，使其進行120秒交互作用，並觀察其結合量之變化。抗體之稀釋，係使用於運行緩衝液及於運行緩衝液添加了ATP、ADP、AMP、cAMP、或腺苷(ADO)中之任一者的緩衝液，製成各低分子之終濃度為1mM、抗體之終濃度為1μM。又，於1mM ATP條件下，測定數階段抗體之濃度系列，從對於抗體濃度之平衡值之圖，計算各選殖體對於hIL-6R之解離常數KD(mol/L)。參數之計算使用Biacore T200 Evaluation Software(GE Healthcare)。各選殖體於1mM ATP存在下之解離常數KD示於表34。
【表34】
此測定取得之1mM之各低分子存在下、或不存在下，各選殖體對於hIL-6R之結合量示於第37圖。如第37圖，各選殖體於1mM ATP存在下觀察到結合於hIL-6R但於ATP不存在下未觀察到對於hIL-6R之結合。由此可確認：具有將ATP惰為開關而結合於hIL-6R之性質。ATP以外之低分子中，全部選殖體在ADP存在下觀察到結合，一部分的選殖體中，於AMP及cAMP存在下也觀察到結合。於ADO(腺苷)存在下未觀察到向hIL-6R之結合。
(10-3)利用Octet評價各種低分子所致對於人IL-6受體之結合之影響
使用Octet(PRIMETECH)，評價在從資料庫取得之ATP/腺苷依存性抗體9種選殖體(6RAD2C1-4_001、6RAD2C1-4_005、6RAD2C1-4_011、6RAD2C1-4_026、6RAD2C1-4_030、6RAD2C1-4_042、6RAD2C1-4_076、6RDL3C1-4_085、6RDL3C5-4_011)與hIL-6R之抗原抗體反應中，各種低分子之影響。測定緩衝液使用TBS、pH7.4，於30℃測定。使生物素化hIL-6R固定於鏈黴抗生物素蛋白感應晶片上，使抗體交互 作用，並觀察其結合量之變化。抗體之稀釋，使用測定緩衝液及於測定緩衝液各添加ATP、ADP、AMP、cAMP、ADO或ATP-gamma-S中之任一者之緩衝液，製備成各低分子之終濃度為1mM、抗體之終濃度為10μg/mL。
在此測定中取得之1mM之各低分子存在下、或不存在下各選殖體對於hIL-6R之結合性之評價結果，全部選殖體中，確認於1mM ATP存在下結合於hIL-6R，於ATP不存在下未觀察到對於hIL-6R之結合。由此Octet也可確認：具有將ATP作為開關而結合於hIL-6R之性質。又，全部選殖體中，也觀察到於ATP-gamma-S存在下之結合。評價獲得之ATP或ATP-gamma-S 1mM存在下或不存在下之IL6R之結合量，示於第38圖。由以上可知：可從資料庫取得將ATP及衍生物(活體外分子)作為開關之hIL-6R結合抗體。
[實施例11]從利用對於犬尿胺酸之淘選而得之犬尿胺酸開關抗體取得用資料庫(犬尿胺酸資料庫Ver.A)，取得於犬尿胺酸存在下結合於人IL-6受體之抗體
(11-1)從抗體資料庫，取得於犬尿胺酸存在下對於人IL-6受體顯示結合活性且於犬尿胺酸不存在下不顯示結合之抗體
從實施例9構建之利用對於犬尿胺酸之淘選而得之犬尿胺酸開關抗體取得用噬菌體展示資料庫(稱為犬尿胺酸資料庫Ver.A)，篩選於犬尿胺酸存在下對於人IL-6受體(hIL-6R)顯示結合活性之抗體。亦即，回收提示對於在珠捕捉之hIL-6R，於犬尿胺酸存在下顯示結合活性且於犬尿胺酸不存在之條件從珠溶出之抗體的噬菌體。本取得方法中，抗原使用經生物素標 識之hIL-6R。
對於保持已構建之噬菌體展示噬粒載體之大腸菌，使M13KO7△pIII(稱為hyperphage)(PROGEN Biotechnik)感染，從於30℃培養一晚培養之上清回收噬菌體。將藉由在實施噬菌體產生之大腸菌之培養液添加2.5M NaCl/10% PEG而沉澱之噬菌體之集團以TBS稀釋，以製備抗體多價提示噬菌體資料庫液。然後於該噬菌體資料庫液添加BSA使終濃度成為4%。使用固定於磁珠之抗原實施淘選。磁珠使用NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或Streptavidin coated beads(Dynabeads MyOne Streptavidin T1)。
於第1次淘選，進行只於犬尿胺酸存在下可對於抗原結合之噬菌體之濃縮。具體而言，於製備之噬菌體資料庫液0.5mL同時加入250pmol之生物素標識抗原及終濃度500μM之犬尿胺酸，使噬菌體資料庫於室溫和抗原及犬尿胺酸接觸15分鐘。之後，於4℃使其接觸45分鐘。加入經BSA阻斷之磁珠(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)，使抗原與噬菌體之複合體和磁珠於4℃結合15分鐘。將珠以0.5mL的冰犬尿胺酸/TBST洗2次、以冰犬尿胺酸/TBS洗1次。之後將加有0.25mL之TBS之珠於室溫懸浮後，立即使用磁座分離珠，將噬菌體溶液回收。再重複此作業後，將分2次溶出的噬菌體液混合。於回收之噬菌體溶液加入100mg/mL之胰蛋白酶5μL以切斷Fab，經胰蛋白酶處理之噬菌體對於大腸菌之感染能力有所改善。將經胰蛋白酶處理之噬菌體添加到成為對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10mL之大腸菌株ER2738。於37℃ 緩慢地實施上述大腸菌之攪拌培養1小時以使噬菌體感染大腸菌。將已感染的大腸菌接種到225mm x 225mm之板。然後使hyperphage感染已接種之大腸菌之培養液，於30℃培養一晚，從上清回收噬菌體，製備成抗體多價提示噬菌體資料庫液。
於第2次淘選，於製備之噬菌體資料庫液0.4mL同時加入250pmol之生物素標識抗原及終濃度500μM之犬尿胺酸，以使噬菌體資料庫於室溫和抗原及犬尿胺酸接觸60分鐘。加入經BSA阻斷之磁珠(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)，使抗原與噬菌體之複合體和磁珠於室溫結合15分鐘。將珠以0.5mL之犬尿胺酸/TBST洗2次、以犬尿胺酸/TBS洗1次。之後經已加有0.25mL之TBS之珠於室溫懸浮後，立即使用磁座分離珠，將噬菌體溶液回收。再重複此作業後，將分2次溶出的噬菌體液混合。於回收之噬菌體溶液加入100mg/mL之胰蛋白酶5μL以切斷Fab，經胰蛋白酶處理之噬菌體對於大腸菌之感染能力有所改善。將經胰蛋白酶處理之噬菌體添加到成為對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之20mL之大腸菌株ER2738。於37℃緩慢地實施上述大腸菌之攪拌培養1小時以使噬菌體感染大腸菌。將已感染的大腸菌接種到225mm x 225mm之板。然後使hyperphage感染已接種大腸菌之培養液，於30℃培養一晚後從上清回收噬菌體以製備抗體多價提示噬菌體資料庫液。
於第3次淘選中，對於製備之噬菌體資料庫液0.2mL同時加入100pmol之生物素標識抗原及終濃度500μM之犬尿胺酸，以使噬菌體資料庫於室溫和抗原及犬尿胺酸接觸60 分鐘。加入經BSA阻斷之磁珠(Dynabeads MyOne Streptavidin T1)，使抗原與噬菌體之複合體和磁珠於4℃結合30分鐘。將珠以0.4mL之犬尿胺酸/TBST洗3次、以犬尿胺酸/TBS洗2次。之後將加有0.25mL之TBS之珠於室溫懸浮後，立即使用磁座分離珠，將噬菌體溶液回收。再重複此作業後，將分2次溶出的噬菌體液混合。於回收之噬菌體溶液加入100mg/mL之胰蛋白酶5μL以切斷Fab，經胰蛋白酶處理之噬菌體對於大腸菌之感染能力有所改善。將經胰蛋白酶處理之噬菌體添加到成為對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之20mL之大腸菌株ER2738。於37℃緩慢地實施上述大腸菌之攪拌培養1小時以使噬菌體感染大腸菌。將已感染的大腸菌接種到225mm x 225mm之板。然後使hyperphage感染已接種大腸菌之培養液，於30℃培養一晚後從上清回收噬菌體以製備抗體多價提示噬菌體資料庫液。
於第4次淘選中，利用和第3次淘選為同樣條件實施淘選。
(11-2)利用負選擇法從抗體資料庫取得於犬尿胺酸存在下結合於hIL-6R之抗體
從實施例9構建之犬尿胺酸資料庫Ver.A篩選於犬尿胺酸存在下對於抗原顯示結合活性之抗體。為了篩選，首先使抗體噬菌體展示資料庫於犬尿胺酸不存在下接觸生物素標識抗原-鏈黴抗生物素蛋白，以去除提示即使於犬尿胺酸不存在下仍對於抗原有結合活性之抗體的噬菌體。然後，於犬尿胺酸存在之條件下同樣進行淘選，以實施只於犬尿胺酸存在之條件下對於 抗原有結合活性之抗體之篩選。
使M13KO7△pIII(稱為hyperphage)(PROGEN Biotechnik)感染保持構建之噬菌體展示噬粒載體的大腸菌，，從於30℃培養一晚的上清回收噬菌體。將對於實施噬菌體產生之大腸菌之培養液添加2.5M NaCl/10% PEG以使其沉澱之噬菌體之集團以TBS稀釋，製備成抗體多價提示噬菌體資料庫液。然後於該噬菌體資料庫液添加BSA使終濃度成為4%。使用固定於磁珠之抗原實施淘選。磁珠使用NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或Streptavidin coated beads(Dynabeads MyOne Streptavidin T1)。
於第1次淘選，利用負選擇法實施只於犬尿胺酸存在下可結合於抗原之噬菌體之濃縮。具體而言，於經BSA阻斷之Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated加入500pmol之生物素化抗原，於室溫使其結合15分鐘。對於已用TBS洗滌3次的珠，加入經BSA阻斷之噬菌體資料庫液0.5mL，於室溫使其結合1小時。使用磁座將珠分離以回收未結合於抗原及珠之噬菌體。對於回收之噬菌體加入250pmol之生物素標識抗原以及終濃度500μM之犬尿胺酸，以使噬菌體資料庫於室溫和抗原以及犬尿胺酸接觸15分鐘。之後，於4℃使其接觸45分鐘。然後於該標識抗原以及犬尿胺酸與噬菌體資料庫之混合液加入經BSA阻斷之磁珠，於4℃使抗原與噬菌體之複合體和磁珠結合15分鐘。珠以0.5mL之冰犬尿胺酸/TBST洗2次、以冰犬尿胺酸/TBS洗1次。之後將1mg/mL之Trypsin溶液0.5mL加到該混合液。將該混合液於室溫攪拌15分鐘 後，從使用磁座分離之珠回收噬菌體。將回收的噬菌體加到成為對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10mL之大腸菌株ER2738。於37℃緩慢地實施上述大腸菌之攪拌培養1小時以使噬菌體感染大腸菌。將已感染的大腸菌接種到225mm x 225mm之板。然後使hyperphage感染已接種之大腸菌之培養液，於30℃培養一晚後從上清回收噬菌體以製備抗體多價提示噬菌體資料庫液。
於第2次以後的淘選中，實施只於犬尿胺酸存在下對於抗原可結合之噬菌體之濃縮。具體而言，以和實施例(11-1)所示之第2次以後之淘選方法為同樣之方法，實施直到第4次的淘選。
(11-3)從利用對於成為開關之分子之淘選而得之抗體資料庫取得於犬尿胺酸存在下結合於hIL-6R之抗體
從實施例9構建之稱為犬尿胺酸資料庫Ver.A，篩選於犬尿胺酸存在下對於抗原顯示結合活性之抗體。為了篩選，首先對於生物素化犬尿胺酸(化合物028、029及036)實施淘選，回收提示對於犬尿胺酸有結合活性之抗體的噬菌體。然後，於犬尿胺酸存在下實施對於生物素標識抗原之淘選，以篩選於犬尿胺酸存在之條件下對於抗原有結合活性之抗體。
使M13KO7△pIII(稱為hyperphage)(PROGEN Biotechnik)感染保持構建之噬菌體展示噬粒載體之大腸菌，從於30℃培養一晚的上清回收噬菌體。將對於實施噬菌體產生之大腸菌之培養液添加2.5M NaCl/10% PEG以使其沉澱之噬菌體之集團以TBS稀釋，以製備抗體多價提示噬菌體資料庫液。 然後於該噬菌體資料庫液添加BSA使其終濃度成為4%。使用固定於磁珠之抗原實施淘選。磁珠使用NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或Streptavidin coated beads(Dynabeads MyOne Streptavidin T1)。
於第1次淘選，實施對於生物素化犬尿胺酸(化合物028、029及036之混合物)可結合之噬菌體之濃縮。具體而言，於經BSA阻斷之珠(Dynabeads MyOne Streptavidin T1)加入將化合物028、029及036等量混合而得之生物素化犬尿胺酸混合物4000pmol，於室溫使其結合30分鐘。對於經TBS洗滌3次的珠，加入經BSA阻斷之噬菌體資料庫液0.8mL，於室溫使生物素化犬尿胺酸接觸30分鐘。之後，於4℃使其接觸30分鐘。將珠以1mL之冰TBST洗3次，以冰TBS洗2次。之後，將1mg/mL之胰蛋白酶溶液0.5mL加到該混合液。將該混合液於室溫懸浮15分鐘後，立即使用磁座分離珠，將噬菌體溶液回收。將回收的噬菌體加到成為對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之100mL之大腸菌株ER2738。於37℃緩慢地實施上述大腸菌之攪拌培養1小時以使噬菌體感染大腸菌。將已感染的大腸菌接種到5片225mm x 225mm的板。然後使hyperphage感染已接種大腸菌之培養液，於30℃培養一晚後從上清回收噬菌體以製備抗體多價提示噬菌體資料庫液。
於第2次以後的淘選，實施只於犬尿胺酸存在下可對於抗原結合之噬菌體之濃縮。具體而言，以和實施例(11-1)所示之第2次以後的淘選方法為同樣方法實施直到第4次的淘選。
(11-4)利用噬菌體ELISA評價於犬尿胺酸存在下之結合活性
從(11-1)、(11-2)、(11-3)獲得之大腸菌之單一群落依常法(Methods Mol.Biol.(2002)178,133-145)實施噬菌體之培養。使用hyperphage作為幫助者噬菌體，回收含抗體多價提示噬菌體之培養上清。使用NucleoFast96(MACHERY-NAGEL)將回收之噬菌體培養上清進行超過濾。將培養上清各200μL加到NucleoFast96之各井，實施6,000g、45分鐘離心分離，去除未附著物。加入H2O 200μL，以6,000g、30分鐘離心分離實施洗滌。之後，加入TBS 200μL，於室溫靜置5分鐘後，回收上清所含之噬菌體液。
將已加有TBS或500μM犬尿胺酸/TBS之精製噬菌體依以下程序供ELISA使用。將StreptaWell 96微滴定板(Roche)以含生物素標識hIL-6R之100μL之TBS包被1小時以上。將該板之各井以TBST洗滌以去除未結合於板的生物素標識hIL-6R後，將該井以250μL之2%脫脂乳-TBS阻斷1小時以上。去除2%脫脂乳-TBS，之後，將已於各井加入製備之精製噬菌體的該板於室溫靜置1小時以使提示噬菌體之抗體於犬尿胺酸不存在/存在下結合於各井存在之生物素標識hIL-6R。將已於經TBST或犬尿胺酸/TBST洗滌之各井加入利用TBS或犬尿胺酸/TBS稀釋之HRP結合抗M13抗體(Amersham Pharmacia Biotech)後，將此板溫育1小時。以TBST或犬尿胺酸/TBST洗滌後，利用添加硫酸使已添加TMB single溶液(ZYMED)之各井中之溶液之發色反應停止，之後利用450 nm之吸光度測定該發色。其結果，確認複數個於犬尿胺酸存在下結合於人IL-6受體之抗體。噬菌體ELISA之結果示於表35。如前述實施例6所示，從人未改變抗體資料庫也可取得於犬尿胺酸存在下結合於人IL-6受體之抗體，但在此能以進一步非常高的效率取得對於人IL-6受體之開關抗體。實施例6-2實施之噬菌體ELISA之結果示於表36。
(11-5)因應犬尿胺酸之有無而改變對於抗原之結合活性之開關抗體的序列解析
將由實施例(11-4)所示之噬菌體ELISA之結果判斷為於犬尿胺酸存在之條件下對於抗原有結合活性之選殖體使用專一的引子(序列編號：79及80)放大而得之基因之鹼基序列進行解析。解析之結果，取得於實施例(11-1)、(11-2)及(11-3)的所有條件，判斷為於犬尿胺酸存在下對於生物素標識hIL-6R有結合活性之複數個選殖體。從取得之選殖體中，針對挑選的6個 選殖體，於以下表37顯示取得之淘選條件(表中，記載為來源)及胺基酸序列。
(11-6)結合於hIL-6R之抗體之表現與精製
將實施例(11-5)記載之6個選殖體之重鏈及輕鏈之可變區序列分別插入具有重鏈抗體不變區(序列編號：113)或輕鏈kappa不變區序列(序列編號：47)之動物表現用質體。依後述參考實施例1記載之方法實施抗體之表現及精製。
(11-7)取得之抗體對於hIL-6R之結合活性評價
將挑選的6種抗體與6RNMSC1-2_F02抗體以表38所示條件供ELISA使用。
先將StreptaWell 96微滴定板(Roche)以含有生物素標識hIL-6R之100μL之TBS於室溫包被1小時以上。將該板之各井以TBST洗滌以去除未結合於板的生物素標識hIL-6R 後，將該井以阻斷緩衝液(2%脫脂乳/TBS)250μL阻斷1小時以上。於已去除阻斷緩衝液之各井，加入以表38之條件以TBS製備為2.5μg/mL之精製IgG各100μL，之後將該板於室溫靜置1小時以使各IgG與各井存在之生物素標識hIL-6R結合。於經稀釋成表38所示之終濃度的TBST洗滌的各井，添加以含同低分子之TBS稀釋過的HRP結合抗人IgG抗體(BIOSOURCE)，之後將板溫育1小時。以調整成如表38所示終濃度之TBST洗滌後，添加硫酸以停止已添加TMB single溶液(ZYMED)之各井中之溶液之發色反應，利用450nm之吸光度測定該發色。測定結果示於第39圖。
挑選的6種抗體，和6RNMSC1-2_F02抗體同樣，比起條件1之吸光度，條件2或條件3之吸光度顯著較低。由此，確認：挑選的6種抗體，於IgG型也於犬尿胺酸存在下對於生物素標識hIL-6R有專一的結合活性。又，由條件4之吸光度相較於條件2之吸光度未觀察到顯著差別，確認：挑選之6種抗體在色胺酸存在下對於生物素標識hIL-6R沒有結合活性。由以上，顯示：可從利用對於犬尿胺酸之淘選獲得之犬尿胺酸開關抗體取得用資料庫(犬尿胺酸資料庫Ver.A)取得複數個將犬尿胺酸作為開關之hIL-6R結合抗體。又，如後述參考實施例4，參考實施例2中，可從構建之將結合於ATP之抗體作為模板之合理設計資料庫，取得於ATP不存在下結合於目標抗原且於ATP存在下不結合於目標抗原之抗體，同樣地，從犬尿胺酸開關抗體取得用資料庫也可取得於犬尿胺酸不存在下結合於目標抗原，於犬尿胺酸存在下則不結合於目標抗原之抗 體。
[實施例12]從利用對於犬尿胺酸之淘選而得之犬尿胺酸開關抗體取得用資料庫(犬尿胺酸資料庫Ver.A)，取得於犬尿胺酸存在下結合於人IgA-Fc(hIgA-Fc)之抗體
(12-1)從抗體資料庫取得於犬尿胺酸存在下對於hIgA-Fc顯示結合活性且於犬尿胺酸不存在下不顯示結合之抗體
從實施例9構建之犬尿胺酸資料庫Ver.A，篩選於犬尿胺酸存在下對於人IgA-Fc(hIgA-Fc)顯示結合活性之抗體。亦即，回收提示對於在珠捕捉之hIgA-Fc，於犬尿胺酸存在下顯示結合活性且於犬尿胺酸不存在之條件從珠溶出之抗體的噬菌體。本取得方法中，抗原使用以參考實施例5記載之方法製備之生物素標識hIgA-Fc(序列編號：146)。
對於保持已構建之噬菌體展示噬粒載體之大腸菌，使M13KO7△pIII(稱為hyperphage)(PROGEN Biotechnik)感染，從於30℃培養一晚培養之上清回收噬菌體。將藉由在實施噬菌體產生之大腸菌之培養液添加2.5M NaCl/10% PEG而沉澱之噬菌體之集團以TBS稀釋，以製備抗體多價提示噬菌體資料庫液。然後於該噬菌體資料庫液添加BSA使終濃度成為4%。使用固定於磁珠之抗原實施淘選。磁珠使用NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或Streptavidin coated beads(Dynabeads MyOne Streptavidin T1)。
淘選係實施只於犬尿胺酸存在下對於抗原可結合之噬菌體之濃縮。具體而言，以和實施例(11-1)所示方法為同樣方法，將抗原量於第1次及第2次變更為500pmol、於第3 次及第4次變更為200pmol，實質直到第4次的淘選。
(12-2)利用負選擇法從抗體資料庫取得於犬尿胺酸存在下結合於hIgA-Fc之抗體
從實施例9構建之犬尿胺酸資料庫Ver.A)，篩選於犬尿胺酸存在下對於抗原顯示結合活性之抗體。為了篩選，首先使抗體噬菌體展示資料庫於犬尿胺酸不存在下接觸生物素標識抗原-鏈黴抗生物素蛋白，以去除提示即使於犬尿胺酸不存在下仍對於抗原有結合活性之抗體的噬菌體。然後，於犬尿胺酸存在之條件下同樣進行淘選，以實施只於犬尿胺酸存在之條件下對於抗原有結合活性之抗體之篩選。
使M13KO7△pIII(稱為hyperphage)(PROGEN Biotechnik)感染保持構建之噬菌體展示噬粒載體的大腸菌，從於30℃培養一晚的上清回收噬菌體。將對於實施噬菌體產生之大腸菌之培養液添加2.5M NaCl/10% PEG以使其沉澱之噬菌體之集團以TBS稀釋，製備成抗體多價提示噬菌體資料庫液。然後於該噬菌體資料庫液添加BSA使終濃度成為4%。使用固定於磁珠之抗原實施淘選。磁珠使用NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或Streptavidin coated beads(Dynabeads MyOne Streptavidin T1)。
於第1次淘選，利用負選擇法實施只於犬尿胺酸存在下可結合於抗原之噬菌體之濃縮。具體而言，於經BSA阻斷之Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated加入1000pmol之生物素化抗原，於室溫使其結合15分鐘。對於已用TBS洗滌3次的珠，加入經BSA阻斷之噬菌體資料庫液0.5mL， 於室溫使其結合1小時。使用磁座將珠分離以回收未結合於抗原及珠之噬菌體。對於回收之噬菌體加入500pmol之生物素標識抗原以及終濃度500μM之犬尿胺酸，以使噬菌體資料庫於室溫和抗原以及犬尿胺酸接觸15分鐘。之後，於4℃使其接觸45分鐘。然後於該標識抗原以及犬尿胺酸與噬菌體資料庫之混合液加入經BSA阻斷之磁珠，於4℃使抗原與噬菌體之複合體和磁珠結合15分鐘。珠以0.5mL之冰犬尿胺酸/TBST洗2次、以冰犬尿胺酸/TBS洗1次。之後將1mg/mL之Trypsin溶液0.5mL加到該混合液。將該混合液於室溫攪拌15分鐘後，從使用磁座分離之珠回收噬菌體。將回收的噬菌體加到成為對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10mL之大腸菌株ER2738。於37℃緩慢地實施上述大腸菌之攪拌培養1小時以使噬菌體感染大腸菌。將已感染的大腸菌接種到225mm x 225mm之板。然後使hyperphage感染已接種之大腸菌之培養液，於30℃培養一晚後從上清回收噬菌體以製備抗體多價提示噬菌體資料庫液。
於第2次以後的淘選中，實施只於犬尿胺酸存在下對於抗原可結合之噬菌體之濃縮。具體而言，以和實施例(11-1)所示之第2次以後之淘選方法為同樣之方法，於第2次變更抗原量為500pmol、第3次及第4次變更為200pmol，實施直到第4次的淘選。
(12-3)從利用對於成為開關之分子之淘選而得之抗體資料庫，取得於犬尿胺酸存在下結合於hIgA-Fc之抗體
從實施例9構建之稱為犬尿胺酸資料庫Ver.A，篩選於犬 尿胺酸存在下對於抗原顯示結合活性之抗體。為了篩選，首先對於生物素化犬尿胺酸(化合物028、029及036)實施淘選，回收提示對於犬尿胺酸有結合活性之抗體的噬菌體。然後，於犬尿胺酸存在下實施對於生物素標識抗原之淘選，以篩選於犬尿胺酸存在之條件下對於抗原有結合活性之抗體。
使M13KO7△pIII(稱為hyperphage)(PROGEN Biotechnik)感染保持構建之噬菌體展示噬粒載體之大腸菌，從於30℃培養一晚的上清回收噬菌體。將對於實施噬菌體產生之大腸菌之培養液添加2.5M NaCl/10% PEG以使其沉澱之噬菌體之集團以TBS稀釋，以製備抗體多價提示噬菌體資料庫液。然後於該噬菌體資料庫液添加BSA使其終濃度成為4%。使用固定於磁珠之抗原實施淘選。磁珠使用NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或Streptavidin coated beads(Dynabeads MyOne Streptavidin T1)。
於第1次淘選，實施對於生物素化犬尿胺酸(化合物028、029及036之混合物)可結合之噬菌體之濃縮。具體而言，於經BSA阻斷之珠(Dynabeads MyOne Streptavidin T1)加入將化合物028、029及036等量混合而得之生物素化犬尿胺酸混合物4000pmol，於室溫使其結合30分鐘。對於經TBS洗滌3次的珠，加入經BSA阻斷之噬菌體資料庫液0.8mL，於室溫使生物素化犬尿胺酸接觸30分鐘。之後，於4℃使其接觸30分鐘。將珠以1mL之冰TBST洗3次，以冰TBS洗2次。之後，將1mg/mL之胰蛋白酶溶液0.5mL加到該混合液。將該混合液於室溫懸浮15分鐘後，立即使用磁座分離珠，將 噬菌體溶液回收。將回收的噬菌體加到成為對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之100mL之大腸菌株ER2738。於37℃緩慢地實施上述大腸菌之攪拌培養1小時以使噬菌體感染大腸菌。將已感染的大腸菌接種到5片225mm x 225mm的板。然後使hyperphage感染已接種大腸菌之培養液，於30℃培養一晚後從上清回收噬菌體以製備抗體多價提示噬菌體資料庫液。
於第2次以後的淘選，實施只於犬尿胺酸存在下可對於抗原結合之噬菌體之濃縮。具體而言，以和實施例(11-1)所示之第2次以後的淘選方法為同樣方法，並將抗原量於第2次變更為500pmol、第3次及第4次變更為200pmol，實施直到第4次的淘選。
(12-4)利用噬菌體ELISA評價於犬尿胺酸存在下之結合活性
從(12-1)、(12-2)、(12-3)獲得之大腸菌之單一群落依常法(Methods Mol.Biol.(2002)178,133-145)實施噬菌體之培養。使用hyperphage作為幫助者噬菌體，回收含抗體多價提示噬菌體之培養上清。將依實施例(11-4)記載之方法精製之精製噬菌體依以下程序供ELISA使用。將StreptaWell 96微滴定板(Roche)以含生物素標識hIgA-Fc之100μL之TBS包被1小時以上。將該板之各井以TBST洗滌以去除未結合於板之生物素標識hIgA-Fc後，將該井以250μL之2%脫脂乳-TBS阻斷1小時以上。去除2%脫脂乳-TBS，之後，將已於各井加入製備之精製噬菌體的該板於室溫靜置1小時以使提示噬菌體之抗體於犬尿胺酸不存在/存在下結合於各井存在之生物素標識 hIgA-Fc。於已在經TBST或犬尿胺酸/TBST洗滌之各井添加經TBS或犬尿胺酸/TBS稀釋之HRP結合抗M13抗體(Amersham Pharmacia Biotech)後，將板溫育1小時。以TBST或犬尿胺酸/TBST洗滌後，藉由添加硫酸使已添加TMB single溶液(ZYMED)之各井中之溶液之發色反應停止，之後，利用450nm之吸光度測定該發色。其結果，確認有複數個對於人IgA-Fc於犬尿胺酸存在時結合之抗體。噬菌體ELISA之結果示於表39。
(12-5)因應犬尿胺酸之有無而改變對於抗原之結合活性之開關抗體的序列解析
將由實施例(12-4)所示之噬菌體ELISA之結果判斷為於犬尿胺酸存在之條件下對於抗原有結合活性之選殖體使用專一的引子(序列編號：79及80)放大而得之基因之鹼基序列進行解析。解析之結果，取得於實施例(12-1)、(12-2)及(12-3)的所有條件，判斷為於犬尿胺酸存在下對於生物素標識hIgA-Fc有結合活性之複數個選殖體。從取得之選殖體中，針對挑選的6個選殖體，於以下表40顯示取得之淘選條件(表中，記載為來源)及胺基酸序列。
【表40】
(12-6)結合於hIgA-Fc之抗體之表現與精製
將實施例(12-5)記載之6個選殖體之重鏈及輕鏈之可變區序列分別插入具有重鏈抗體不變區(序列編號：113)或輕鏈kappa不變區序列(序列編號：47)之動物表現用質體。依後述參考實施例1記載之方法實施抗體之表現及精製。
(12-7)取得之抗體對於hIgA-Fc之結合活性評價
將挑選的6種抗體以表41所示條件供ELISA使用。
先將StreptaWell 96微滴定板(Roche)以含有生物素標識hIgA-Fc之100μL之TBS於室溫包被1小時以上。將該板之各井以TBST洗滌以去除未結合於板的生物素標識hIgA-Fc後，將該井以阻斷緩衝液(2%脫脂乳/TBS)250μL阻斷1小時以上。於已去除阻斷緩衝液之各井，加入以表41之條件以TBS製備為2.5μg/mL之精製IgG各100μL，之後將該板於室溫靜置1小時以使各IgG與各井存在之生物素標識 hIgA-Fc結合。於經稀釋成表41所示之終濃度的TBST洗滌的各井，添加以含同低分子之TBS稀釋過的HRP結合抗人IgG抗體(BIOSOURCE)，之後將板溫育1小時。以調整成如表41所示終濃度之TBST洗滌後，添加硫酸以停止已添加TMB single溶液(ZYMED)之各井中之溶液之發色反應，利用450nm之吸光度測定該發色。測定結果示於第40圖。
挑選的6種抗體，比起條件1之吸光度，條件2或條件3之吸光度顯著較低。由此，確認：挑選的6種抗體，於IgG型也於犬尿胺酸存在下對於生物素標識hIgA-Fc有專一的結合活性。又，由條件4之吸光度相較於條件2之吸光度未觀察到顯著差別，確認：挑選之6種抗體在色胺酸存在下對於生物素標識hIgA-Fc沒有結合活性。由以上，顯示：可從利用對於犬尿胺酸之淘選獲得之犬尿胺酸開關抗體取得用資料庫(犬尿胺酸資料庫Ver.A)取得複數個將犬尿胺酸作為開關之hIgA-Fc結合抗體。
[實施例13]從利用對於犬尿胺酸之淘選而得之犬尿胺酸開關抗體取得用資料庫(犬尿胺酸資料庫Ver.A)，取得於犬尿胺酸存在下結合於人IL-6(hIL-6)之抗體
(13-1)從抗體資料庫，取得於犬尿胺酸存在下對於hIL-6顯示結合活性且於犬尿胺酸不存在下不顯示結合之抗體
從實施例9構建之犬尿胺酸資料庫Ver.A，篩選於犬尿胺酸存在下對於人IL-6(hIL-6)顯示結合活性之抗體。亦即，回收提示對於在珠捕捉之hIL-6，於犬尿胺酸存在下顯示結合活性且於犬尿胺酸不存在之條件從珠溶出之抗體的噬菌體。本取得 方法中，抗原使用經生物素標識之hIL-6。
對於保持已構建之噬菌體展示噬粒載體之大腸菌，使M13KO7△pIII(稱為hyperphage)(PROGEN Biotechnik)感染，從於30℃培養一晚培養之上清回收噬菌體。將藉由在實施噬菌體產生之大腸菌之培養液添加2.5M NaCl/10% PEG而沉澱之噬菌體之集團以TBS稀釋，以製備抗體多價提示噬菌體資料庫液。然後於該噬菌體資料庫液添加BSA使終濃度成為4%。使用固定於磁珠之抗原實施淘選。磁珠使用NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或Streptavidin coated beads(Dynabeads MyOne Streptavidin T1)。
淘選係實施只於犬尿胺酸存在下可對於抗原結合之噬菌體之濃縮。以和實施例(11-1)所示之方法為同樣的方法，實施直到第4次之淘選。
(13-2)利用負選擇法從抗體資料庫取得於犬尿胺酸存在下結合於hIL-6之抗體
從實施例9構建之犬尿胺酸資料庫Ver.A篩選於犬尿胺酸存在下對於抗原顯示結合活性之抗體。為了篩選，首先使抗體噬菌體展示資料庫於犬尿胺酸不存在下接觸生物素標識抗原-鏈黴抗生物素蛋白，以去除提示即使於犬尿胺酸不存在下仍對於抗原有結合活性之抗體的噬菌體。然後，於犬尿胺酸存在之條件下同樣進行淘選，以實施只於犬尿胺酸存在之條件下對於抗原有結合活性之抗體之篩選。
使M13KO7△pIII(稱為hyperphage)(PROGEN Biotechnik)感染保持構建之噬菌體展示噬粒載體的大腸菌，， 從於30℃培養一晚的上清回收噬菌體。將對於實施噬菌體產生之大腸菌之培養液添加2.5M NaCl/10% PEG以使其沉澱之噬菌體之集團以TBS稀釋，製備成抗體多價提示噬菌體資料庫液。然後於該噬菌體資料庫液添加BSA使終濃度成為4%。使用固定於磁珠之抗原實施淘選。磁珠使用NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或Streptavidin coated beads(Dynabeads MyOne Streptavidin T1)。
於第1次淘選，利用負選擇法實施只於犬尿胺酸存在下可結合於抗原之噬菌體之濃縮。具體而言，於經BSA阻斷之Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated加入500pmol之生物素化抗原，於室溫使其結合15分鐘。對於已用TBS洗滌3次的珠，加入經BSA阻斷之噬菌體資料庫液0.5mL，於室溫使其結合1小時。使用磁座將珠分離以回收未結合於抗原及珠之噬菌體。對於回收之噬菌體加入250pmol之生物素標識抗原以及終濃度500μM之犬尿胺酸，以使噬菌體資料庫於室溫和抗原以及犬尿胺酸接觸15分鐘。之後，於4℃使其接觸45分鐘。然後於該標識抗原以及犬尿胺酸與噬菌體資料庫之混合液加入經BSA阻斷之磁珠，於4℃使抗原與噬菌體之複合體和磁珠結合15分鐘。珠以0.5mL之冰犬尿胺酸/TBST洗2次、以冰犬尿胺酸/TBS洗1次。之後將1mg/mL之Trypsin溶液0.5mL加到該混合液。將該混合液於室溫攪拌15分鐘後，從使用磁座分離之珠回收噬菌體。將回收的噬菌體加到成為對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10mL之大腸菌株ER2738。於37℃緩慢地實施上述大腸菌之攪拌培養1小時以 使噬菌體感染大腸菌。將已感染的大腸菌接種到225mm x 225mm之板。然後使hyperphage感染已接種之大腸菌之培養液，於30℃培養一晚後從上清回收噬菌體以製備抗體多價提示噬菌體資料庫液。
於第2次以後的淘選中，實施只於犬尿胺酸存在下對於抗原可結合之噬菌體之濃縮。具體而言，以和實施例(11-1)所示之第2次以後之淘選方法為同樣之方法，實施直到第4次的淘選。
(13-3)從利用對於成為開關之分子之淘選而得之抗體資料庫，取得於犬尿胺酸存在下結合於hIL-6之抗體
從實施例9構建之稱為犬尿胺酸資料庫Ver.A，篩選於犬尿胺酸存在下對於抗原顯示結合活性之抗體。為了篩選，首先對於生物素化犬尿胺酸(化合物028、029及036)實施淘選，回收提示對於犬尿胺酸有結合活性之抗體的噬菌體。然後，於犬尿胺酸存在下實施對於生物素標識抗原之淘選，以篩選於犬尿胺酸存在之條件下對於抗原有結合活性之抗體。
使M13KO7△pIII(稱為hyperphage)(PROGEN Biotechnik)感染保持構建之噬菌體展示噬粒載體之大腸菌，從於30℃培養一晚的上清回收噬菌體。將對於實施噬菌體產生之大腸菌之培養液添加2.5M NaCl/10% PEG以使其沉澱之噬菌體之集團以TBS稀釋，以製備抗體多價提示噬菌體資料庫液。然後於該噬菌體資料庫液添加BSA使其終濃度成為4%。使用固定於磁珠之抗原實施淘選。磁珠使用NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或 Streptavidin coated beads(Dynabeads MyOne Streptavidin T1)。
於第1次淘選，實施對於生物素化犬尿胺酸(化合物028、029及036之混合物)可結合之噬菌體之濃縮。具體而言，於經BSA阻斷之珠(Dynabeads MyOne Streptavidin T1)加入將化合物028、029及036等量混合而得之生物素化犬尿胺酸混合物4000pmol，於室溫使其結合30分鐘。對於經TBS洗滌3次的珠，加入經BSA阻斷之噬菌體資料庫液0.8mL，於室溫使生物素化犬尿胺酸接觸30分鐘。之後，於4℃使其接觸30分鐘。將珠以1mL之冰TBST洗3次，以冰TBS洗2次。之後，將1mg/mL之胰蛋白酶溶液0.5mL加到該混合液。將該混合液於室溫懸浮15分鐘後，立即使用磁座分離珠，將噬菌體溶液回收。將回收的噬菌體加到成為對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之100mL之大腸菌株ER2738。於37℃緩慢地實施上述大腸菌之攪拌培養1小時以使噬菌體感染大腸菌。將已感染的大腸菌接種到5片225mm x 225mm的板。然後使hyperphage感染已接種大腸菌之培養液，於30℃培養一晚後從上清回收噬菌體以製備抗體多價提示噬菌體資料庫液。
於第2次以後的淘選，實施只於犬尿胺酸存在下可對於抗原結合之噬菌體之濃縮。具體而言，以和實施例(11-1)所示之第2次以後的淘選方法為同樣方法實施直到第4次的淘選。
(13-4)利用噬菌體ELISA評價於犬尿胺酸存在下之結合活性
從(13-1)、(13-2)、(13-3)獲得之大腸菌之單一群落依常法 (Methods Mol.Biol.(2002)178,133-145)實施噬菌體之培養。將依參考實施例(11-4)記載之方法精製之精製噬菌體依以下程序供ELISA使用。將StreptaWell 96微滴定板(Roche)以含生物素標識hIL-6之100μL之TBS包被1小時以上。將該板之各井以TBST洗滌以去除未結合於板之生物素標識hIL-6後，將該井以80μL之2%脫脂乳-TBS阻斷1小時以上。去除2%脫脂乳-TBS，之後，將已於各井加入製備之精製噬菌體的該板於室溫靜置1小時以使提示噬菌體之抗體於犬尿胺酸不存在/存在下結合於各井存在之生物素標識hIL-6。於已在經TBST或犬尿胺酸/TBST洗滌之各井添加經TBS或犬尿胺酸/TBS稀釋之HRP結合抗M13抗體(Amersham Pharmacia Biotech)後，將板溫育1小時。以TBST或犬尿胺酸/TBST洗滌後，藉由添加硫酸使已添加TMB single溶液(ZYMED)之各井中之溶液之發色反應停止，之後，利用450nm之吸光度測定該發色。其結果，確認有複數個對於hIL-6於犬尿胺酸存在時結合之抗體。噬菌體ELISA之結果示於表42。
(13-5)因應犬尿胺酸之有無而改變對於抗原之結合活性之開關抗體的序列解析
將由實施例(13-4)所示之噬菌體ELISA之結果判斷為於犬尿胺酸存在之條件下對於抗原有結合活性之選殖體使用專一的引子(序列編號：79及80)放大而得之基因之鹼基序列進行解析。解析之結果，取得於實施例(13-1)、(13-2)或(13-3)的所有條件，判斷為於犬尿胺酸存在下對於生物素標識hIL-6有結合活性之複數個選殖體。從取得之選殖體中，針對挑選的6個選殖體，於以下表43顯示取得之淘選條件(表中，記載為來源)及胺基酸序列。
(13-6)結合於hIL-6之抗體之表現與精製
將實施例(13-5)記載之6個選殖體之重鏈及輕鏈之可變區序列分別插入具有重鏈抗體不變區(序列編號：113)或輕鏈kappa不變區序列(序列編號：47)之動物表現用質體。依後述參考實施例1記載之方法實施抗體之表現及精製。
(13-7)取得之抗體對於hIL-6之結合活性評價
將挑選的6種抗體以表44所示條件供ELISA使用。
【表44】
先將StreptaWell 96微滴定板(Roche)以含有生物素標識hIL-6之100μL之TBS於室溫包被1小時以上。將該板之各井以TBST洗滌以去除未結合於板的生物素標識hIgA-Fc後，將該井以阻斷緩衝液(2%脫脂乳/TBS)250μL阻斷1小時以上。於已去除阻斷緩衝液之各井，加入以表44之條件以TBS製備為2.5μg/mL之精製IgG各100μL，之後將該板於室溫靜置1小時以使各IgG與各井存在之生物素標識hIL-6結合。於經稀釋成表44所示之終濃度的TBST洗滌的各井，添加以含同低分子之TBS稀釋過的HRP結合抗人IgG抗體(BIOSOURCE)，之後將板溫育1小時。以調整成如表44所示終濃度之TBST洗滌後，添加硫酸以停止已添加TMB single溶液(ZYMED)之各井中之溶液之發色反應，利用450nm之吸光度測定該發色。測定結果示於第41圖。
挑選的6種抗體，比起條件1之吸光度，條件2或條件3之吸光度顯著較低。由此，確認：挑選的6種抗體，於IgG型也於犬尿胺酸存在下對於生物素標識hIL-6有專一的結合活性。又，由條件4之吸光度相較於條件2之吸光度未觀察到顯著差別，確認：挑選之6種抗體在色胺酸存在下對於生物素標識hIL-6沒有結合活性。由以上，顯示：可從利用對於犬尿胺酸之淘選獲得之犬尿胺酸開關抗體取得用資料庫(犬尿胺酸資料庫Ver.A)取得複數個將犬尿胺酸作為開關之hIL-6結合 抗體。
[參考實施例1]從使用噬菌體展示技術之人抗體資料庫取得結合於腺苷及/或ATP之抗體
(1-1)未改變人抗體噬菌體展示資料庫之製作
將從人類PBMC製成之Poly A RNA、或市售之人類Poly A RNA等作為模板，依該技術領域中具有通常知識者公知之方法，建構由展示彼此互異之人類抗體序列之Fab分域之複數個噬菌體構成的人類抗體噬菌體展示資料庫。
(1-2)利用珠淘選由資料庫取得結合於腺苷及/或ATP之抗體
從參考實施例(1-1)建構之未改變人類抗體噬菌體展示資料庫，進行對於抗原顯示結合活性之抗體之篩選。亦即，收集提示對於捕捉在珠之抗原顯示結合活性之抗體的噬菌體。抗原使用ATP-PEG-Biotin、2'-Adenosine-PEG-Biotin、及5'-Adenosine-PEG-Biotin。ATP-PEG-Biotin係購買Jena Bioscience公司、型錄號碼NU-926-BIO並使用。2'-Adenosine-PEG-Biotin、及5'-Adenosine-PEG-Biotin使用於實施例(2-2-11)構建者。
由保持已構建之噬菌體提示用噬粒之大腸菌產生之噬菌體，係依一般的方法精製。之後，獲得經TBS透析處理之噬菌體資料庫液。對於噬菌體資料庫液添加BSA，使終濃度為4%。實施使用於磁珠固定化之抗原的淘選。磁珠使用NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或Streptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)。
具體而言，加入製備的噬菌體資料庫液與250pmol之生物素化ATP、2'-Adenosine-PEG-Biotin、及5'-Adenosine-PEG-Biotin，藉此使該噬菌體資料庫液與腺苷及ATP於室溫接觸60分鐘。於噬菌體資料庫液添加以BSA阻斷的磁珠，將腺苷及/或ATP與噬菌體之複合體於室溫結合於磁珠15分鐘。將珠以TBS洗滌1次。之後，將添加有0.5mL之1mg/mL之胰蛋白酶之珠於室溫懸浮15分鐘後，立即使用磁座分離珠，將噬菌體溶液回收。將回收的噬菌體溶液，添加到處於對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10mL之大腸菌株ER2738。於37℃緩慢攪拌，培養上述大腸菌1小時，藉此使噬菌體感染大腸菌。將經感染之大腸菌，接種到225mm x 225mm的板。其次，從經接種之大腸菌之培養液回收噬菌體，以製備噬菌體資料庫液。
於第2次淘選也實施對於腺苷及/或ATP可結合之噬菌體之濃縮。於獲得之噬菌體資料庫液加入各50pmol之生物素化ATP、2’-Adenosine-PEG-Biotin、及5’-Adenosine-PEG-Biotin以使該噬菌體資料庫液和腺苷及ATP於室溫接觸60分鐘。然後於噬菌體資料庫液加入經BSA阻斷的磁珠，使腺苷及/或ATP與噬菌體之複合體和磁珠於室溫結合15分鐘。將珠以TBST洗3次，以TBS洗2次。之後，使已加入1mg/mL之胰蛋白酶溶液0.5mL的珠於室溫懸浮15分鐘後，立即使用磁座分離珠，將噬菌體溶液回收。將回收的噬菌體溶液加到成為對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10mL之大 腸菌株ER2738。於37℃緩慢地實施上述大腸菌之攪拌培養1小時以使噬菌體感染大腸菌。將已感染的大腸菌接種在225mm x 225mm之板。然後從已接種的大腸菌的培養液回收噬菌體以製備噬菌體資料庫液。
依同樣程序重複實施3次取得可結合於腺苷及/或ATP之抗體之淘選。第4次淘選以TBST和TBS實施5次洗滌。
(1-3)利用噬菌體ELISA評價腺苷及ATP結合性
從上述實施例所示之淘選法獲得之大腸菌之單一群落依常法(Methods Mol.Biol.(2002)178,133-145)回收含噬菌體之培養上清。使用NucleoFast96(MACHERY-NAGEL)將回收之噬菌體培養上清進行超過濾。將培養上清各100μL加到NucleoFast96之各井，實施4,500g、45分鐘離心分離，去除未附著物。加入H2O 100μL，再以4,500g、30分鐘離心分離實施洗滌。之後，加入TBS100μL，於室溫靜置5分鐘後，回收上清所含之噬菌體液。
將已加有TBS之精製噬菌體依以下程序供ELISA使用。將StreptaWell 96微滴定板(Roche)以含生物素標識生物素標識抗原(將2'-Adenosine-PEG-biotin、5'-Adenosine-PEG-biotin、及ATP-PEG-biotin各等量混合)之100μL之TBS包被1小時以上。將該板之各井以TBST(含0.1%Tween20之TBS)洗滌以去除抗原後，將該井以250μL之2%脫脂乳-TBS阻斷1小時以上。去除2%脫脂乳-TBS，之後，將已於各井加入製備之精製噬菌體的該板於室溫靜置1小時以使提示噬菌體之抗體結合於各井存在之抗原。將已於經TBST 洗滌之各井加入利用TBS或犬尿胺酸/TBS稀釋之HRP結合抗M13抗體(Amersham Pharmacia Biotech)後，將此板溫育1小時。以TBST洗滌後，利用添加硫酸使已添加TMB single溶液(ZYMED)之各井中之溶液之發色反應停止，之後利用450nm之吸光度測定該發色。
從已實施噬菌體ELISA的192個選殖體之中，獲得對於2'-Adenosine-PEG-biotin、5'-Adenosine-PEG-biotin、ATP-PEG-biotin中之任一者、任2者、或3個全部有結合能力的106個選殖體。
然後，為了確認該等選殖體對於2'-Adenosine-PEG-biotin,5'-Adenosine-PEG-biotin、ATP-PEG-biotin中的哪個抗原有結合能力，將同精製噬菌體以TBS稀釋之後，依以下程序功ELISA使用。將StreptaWell 96微滴定板(Roche)以含有生物素標識抗原(2'-Adenosine-PEG-biotin,5'-Adenosine-PEG-biotin、ATP-PEG-biotin)中任一者的100μL之TBS於室溫包被1小時。將該板之各井以TBST洗滌藉此去除抗原後，將該井以250μL之2%脫脂乳-TBS阻斷1小時以上。去除2%脫脂乳-TBS，之後於各井加入製備的精製噬菌體後，將該板於室溫靜置1小時以使提示抗體的噬菌體結合於各井存在的抗原。在經TBST洗滌之各井加入經TBS稀釋之HRP結合抗M13抗體(Amersham Pharmacia Biotech)後，將此板溫育1小時。以TBST洗滌後，藉由添加硫酸使已加入有TMB single溶液(ZYMED)之各井中之溶液之發色反應停止後，利用450nm之吸光度測 定該發色。噬菌體ELISA之結果記載於以下表45。
實施噬菌體ELISA之選殖體之中，確認對於二種類以上之抗原結合者有1個選殖體，將此抗體片段作為模板，實施基因之鹼基序列解析。此選殖體係對於5'-Adenosine-PEG-biotin,ATP-PEG-biotin之二者具結合能力之選殖體，命名為ATNLSA1-4_D12。ATNLSAI-4_D12抗體之重鏈可變區的序列記載於序列編號：48，輕鏈可變區的序列記載於序列編號：49。
(1-4)利用噬菌體競爭ELISA評價腺苷或ATP結合性
於噬菌體ELISA之結果判斷為對於5'-Adenosine-PEG-biotin及ATP-biotin之兩者有結合能力之選殖體，即ATNLSA1-4_D12(重鏈可變區序列：序列編號：48、輕鏈序列：序列編號：49)，可能認識5'-Adenosine-PEG-biotin、ATP-PEG-biotin之結構上之生物素標籤或PEG區域。為了顯示不是認識生物素標籤、PEG之抗體，以噬菌體ELISA確認使用ATNLSA1-4_D12及準備作為負對照的hIL-6R結合選殖體 PF1(重鏈序列：序列編號：50、輕鏈序列：序列編號：51)是否會因腺苷或ATP妨礙和抗原之結合。將ATNLSA1-4_D12及PF1各以TBS稀釋，依以下程序供ELISA使用。
將StreptaWell 96微滴定板(Roche)以含生物素標識抗原(5'-Adenosine-PEG-biotin、ATP-PEG-biotin之混合)之100μL之TBS於室溫包被1小時。將該板之各井以TBST洗滌以去除抗原後，將該井以250μL之2%脫脂乳-TBS阻斷1小時以上。去除2%脫脂乳-TBS，之後於各井加入製備之精製噬菌體後，將該板於室溫靜置1小時以使噬菌體所提示之抗體結合於各井存在之抗原。然後，將無抗原之TBS、以及含有抗原與等量ATP至含有抗原與10,000倍量之ATP之一系列稀釋之TBS加到該井。將該板於室溫靜置1小時，使固定化之抗原和ATP競爭。之後，於經TBST洗滌之各井添加經TBS稀釋之HRP結合抗M13抗體(Amersham Pharmacia Biotech)，之後將板溫育1小時。以TBST洗滌後，藉由添加硫酸使已加入有TMB single溶液(ZYMED)之各井中之溶液之發色反應停止後，利用450nm之吸光度測定該發色。
測定結果示於第42圖。確認ATNLSA1-4_D12隨著ATP濃度增高，於過量ATP存在下的發色值減小，會依存於ATP濃度，妨礙ATNLSA1-4_D12與抗原之結合。又作為負對照之比較實驗的PF1則無論ATP濃度，未確認到和抗原之結合。由此確認：ATNLSA1-4_D12是有ATP結合能力之抗體，且不是認識生物素標籤、PEG之抗體。
(1-5)結合於ATP及腺苷之抗體之表現與精製
將編碼為ATNLSA1-4_D12之可變區之基因插入到人IgG1/Lambda之動物表現用質體。使用以下方法使抗體表現。對於在FreeStyle 293 Expression Medium培養基(Invitrogen)以1.33 x 106細胞/mL之細胞密度懸浮，並對於6井板之各井各接種3mL之人胎兒腎細胞來源FreeStyle 293-F株(Invitrogen)，將製備之質體利用脂轉染法法導入。從已於CO2培養箱(37℃、8%CO2,90rpm)培養4日之培養上清，使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)依該技術領域中有通常知識者公知之方法將抗體精製。使用分光光度計，測定精製之抗體溶液於280nm之吸光度。從獲得之測定值依PACE法算出吸光係數，使用此吸光係數計算精製之抗體之濃度(Protein Science(1995)4,2411-2423)。
(1-6)使用表面電漿子共振評價ATP、腺苷結合抗體之ATP、腺苷結合
使用Biacore T200(GE Healthcare)，解析對於ATP及腺苷有結合活性之選殖體ATNLSA1-4_D12之可變區連結於IgG之不變區而得之D12之抗原抗體反應之交互作用。使目的抗體捕捉於經胺偶聯法適量固定proteinA(Life technologies)之Sensor chip CM5或CM4(GE Healthcare)，使抗原ATP(Wako)、腺苷(Wako)、ADP(adenosine diphosphate)(Wako)交互作用。運行緩衝液使用50mM Tris-HCl(Takara,T903),500mM NaCl,0.01%(w/v)Tween20。使抗原以流速30μL/min交互作用30秒，並使其進行30秒解離。與抗原之交互作用，於15℃測定，抗原之稀釋使用與運行緩衝液為相同之緩衝液。
依從測定獲得之感測圖算出之動力學參數結合速度常數ka(1/Ms)、及解離速度常數kd(1/s)，計算解離常數KD(M)。或，使用穩定狀態解析法(Steady state analysis)計算解離常數KD(M)。各參數之計算，係使用Biacore T200 Evaluation Software(GE Healthcare)。
為了計算對於腺苷之KD，取得於20μmol/L ADP存在下及不存在下之各濃度之腺苷存在下之結合回應，又另取得於20μmol/L ADP存在下之結合回應。藉由將推定為非專一性結合成分之ADP存在下對於各濃度腺苷之結合回應減去在ADP單獨存在下之回應而得之值，從ADP不存在下對於腺苷之結合回應之值減去，取得對於腺苷之專一性結合回應(R)。對於以腺苷濃度為X軸、從式2算出之R為Y軸作圖之曲線，套用Office Excel2007(Microsoft)之求解機能適用最小平方法，決定對於腺苷之KD值。
(式2)R=Rmax×conc/(KD+conc)
式2中，conc代表腺苷濃度(mol/L)，Rmax為對於抗體，腺苷最多結合時期待之回應值。為了抽取實測之回應值，採用Scrubber2(BioLogics.Inc)。
在此測定取得之D12對於ATP之KD，為8.5μmol/L、對於ADP之KD為0.25μmol/L、對於腺苷之KD為1100μmol/。由此可認為：D12對於ATP、ADP、腺苷有結合活性，且對於AMP(adenosine monophosphate)及cAMP(cyclinc adenosine monophosphate)也有結合活性。
[參考實施例2]利用抗ATP/腺苷抗體之ATP/腺苷開關抗體取得用之資料庫之設計
癌組織及發炎性組織中，已知不僅腺苷，ATP之濃度也高。所以，不僅是只將腺苷或ATP中之任一者當作開關之抗體，能將腺苷及ATP兩者(本實施例中，記載為ATP/腺苷)利用為開關之抗體(亦即腺苷或ATP哪一個以高濃度存在，則會與抗原結合的抗體)也有用。參考實施例1-4所示之ATNLSA1-4_D12，為與ATP/腺苷結合之抗體，該抗體，如第43圖所示，可認為包含ATP/腺苷夾於抗體與目標抗原之間，且包含與目標抗原接觸之抗體可變區。而，藉由將能與目標抗原接觸，能保持對於ATP/腺苷之結合之抗體可變區部分予以資料庫化，據認為可製作能取得對於任意之抗原因為ATP/腺苷之有無而使對於任意抗原之結合活性改變之ATP/腺苷開關抗體的合成抗體資料庫。
於參考實施例1-4由人類抗體資料庫取得之ATP/腺苷抗體ATNLSA1-4_D12與ATP之複合體之結晶結構已經過解析。從結晶結構解析之結果，鑑別該抗體認識之腺苷(及ATP)之認識樣式、及設定未與腺苷(及ATP)之結合有大相關之抗體可變區之胺基酸殘基。經鑑別，主要涉及對於腺苷(ATP)之結合之胺基酸殘基，係在重鏈之Ser52、Ser52a、Arg53、Gly96、Leu100a、Trp100c(Kabat編號)。
在資料庫設計時，係選擇滿足以下條件至少其中之一之部位作為可資料庫化部位。
條件1)與對於ATP之結合無大相關之部位、或即使涉及 結合但不會使對於ATP之結合下降之天然序列以外之胺基酸存在之部位；條件2)在人類抗體之資料庫存有某程度胺基酸出現頻度多樣性之部位；條件3)對於典型結構之形成不重要之部位。
製作重鏈、輕鏈均滿足上述條件之部位且ATNLSA1-4_D12之序列含有之部位之中關於CDR1及CDR2之部位在生殖細胞系列之出現頻度為2%以上之胺基酸、關於CDR3之部位在生殖細胞系列之出現頻度為1%以上之胺基酸進行全面性取代，以製作組合該等取代之多個ATNLSA1-4_D12之改變體。
重鏈之部位之中，經改變之部位(表中，記為「Kabat」之Kabat編號表示之部位)以及該部位之中，改變前之胺基酸(表中，記為「天然序列」之胺基酸)及改變後之胺基酸(表中記為「改變胺基酸」之胺基酸)，如表46。
【表46】
輕鏈之部位之中，經改變之部位(表中，記載為「Kabat」之Kabat編號表示之部位)以及該部位中改變前之胺基酸(表中，記為「天然序列」之胺基酸)及改變後之胺基酸(表中記為「改變胺基酸」之胺基酸)，如表47。
以參考實施例1-1所示方法表現及精製之各改變體對於ATP及腺苷之結合，依與參考實施例1-6所示之使用Biacore之測定方法為相同方法實施測定。測定結果，計算各改變體對於ATP之親和性作為KD值。作為重鏈之部位，由於改變使ATP結合能力未下降ATNLSA1-4_D12之1/5之結合能力者(亦即KD值小於42.5μmol/L者)、及作為輕鏈之部位，ATNLSA1-4_D12之結合能力提高者(亦即KD值小於8.5μmol/L者)，判定為可改變部位，於該部位經取代之胺基酸，判定為可資料庫化之胺基酸(資料庫出現之柔性殘基)。
從各改變體對ATP結合能力之評價結果，可預測藉由將各部位予以資料庫化，對於ATP之結合能力下降。而，藉由將推測涉及與ATP之結合之部位之周邊部位取代，並組合該等取代而得之各種改變體予以全面性評價，來驗證是否可鑑別期待使對於ATP之結合能力增強之效果的改變。如此之經改變之部位(表中，記為「Kabat」之Kabat編號表示之部位)以及該部位改變前之胺基酸(表中，記載為「天然序列」之胺基酸)及改變後之胺基酸(表中，記為「改變胺基酸」之胺基酸)，如表48。
【表48】
將以參考實施例1-1所示方法表現及精製而得之各改變體對於ATP及腺苷之結合，使用與參考實施例1-6所示之使用Biacore之測定方法為相同方法測定。測定結果，期待對於ATP及腺苷之結合增強之改變為Kabat編號表示之56位、100位等部位(例如Tyr56His、Asn100bLeu等胺基酸之改變)，於該部位取代之胺基酸判定為可資料庫化之胺基酸(資料庫出現之柔性殘基)。
藉由設計ATNLSA1-4_D12之CDR之部位中，含有從前述改變體之解析選出之可資料庫化胺基酸(資料庫出現之胺基酸柔性殘基)及該胺基酸改變前之胺基酸(亦即，ATNLSA1-4_D12之天然序列含有之胺基酸)之胺基酸資料庫存及含該資料庫存之部位，建構ATP/腺苷開關抗體取得用之資 料庫。以使胺基酸資料庫存含有之各胺基酸之出現頻度為相等的方式(例如：胺基酸資料庫存為10種之情形，使各胺基酸各出現10%)，建構資料庫。
重鏈中，含有胺基酸資料庫存之部位(表中，記為「Kabat」之Kabat編號表示之部位)以及該部位之胺基酸資料庫存，如表49。輕鏈中，含胺基酸資料庫存之部位(表中，記為「Kabat」之Kabat編號表示之部位)以及該部位之胺基酸資料庫存，如表50。
【表50】
從序列解析之結果，推測ATNLSA1-4_D12之框架係從VH3-21生殖細胞系列而來。而，為了提高抗體之安定性，為了使ATNLSA1-4_D12之框架序列回到VH3-21生殖細胞序列，對於ATNLSA1-4_D12之框架序列導入Gln01Glu、Gln05Val、Asp10Gly、Asn30Ser、Leu48Val、Asn58Tyr(數字代表Kabat編號)之改變。以DSC測定參考實施例1-1所示之方法表現及精製之ATNLSA1-4_D12之改變體之Tm。利用DSC之測定，係依該技術領域中具有通常知識者公眾所知之方法實施。施以該等改變之ATNLSA1-4_D12之改變體之Tm，從74.37℃大幅上升為81.44℃，可承認其結構安定化。有時抗體資料庫也宜使用高安定性之框架，所以施以前述改變之框架序列，作為資料庫框架序列使用。資料庫使用之框架，如表51。
【表51】
合成以如此設計之資料庫含有之包含各個序列之基因(DNA2.0)，將該等各個基因之集合體(資料庫)作為模板，利用可分別放大VH及VL之引子將基因資料庫放大。又，VL放大用引子之序列，記載於序列編號：81及82，VH放大用引子之序列記載於序列編號：83及84。將經放大之合理設計之人類抗體重鏈可變區之基因資料庫與人類抗體輕鏈可變區之基因資料庫對於具有人類IgG來源℃H1序列及人類IgG來源輕鏈不變區序列兩者之適當噬粒載體導入。將此噬粒載體利用電穿孔法對於大腸菌導入，以建構能取得提示由人類抗體可變區-不變區構成Fab分域且能將腺苷或ATP作為開關而與抗原結合之抗體的合理設計資料庫。如此，從具有多樣腺苷或ATP結合活性之H鏈及L鏈構成之合理設計資料庫，如第43圖所示，據認為以良好效率取得作為含有腺苷或ATP夾於抗體與抗原之間且對抗任意抗原之ATP/腺苷開關抗體的人類抗體的資料庫為有用。又，如上述，ATNLSA1-4_D12不僅對於腺苷與ATP結合，也會對ADP結合，故可預料對於ATP、ADP及腺苷的結構類似之AMP及cAMP也有結合活性。所以，該 資料庫據認為對於取得因為對於ATP、ADP、AMP、cAMP、或腺苷中之任一以上之低分子之有無而使對於任意目標抗原之結合活性改變之開關抗體為有用。
[參考實施例3]從使用噬菌體展示技術之抗體資料庫取得於腺苷、ATP存在下結合於抗原之抗體
(3-1)利用腺苷及ATP之混合物，從資料庫取得於低分子存在下結合於抗原之抗體
從建構之合理設計抗體噬菌體展示資料庫，取得於腺苷、及/或ATP存在條件下對於抗原顯示結合活性之抗體。為了取得，回收提示於腺苷、及ATP存在下對於捕捉在珠之抗原顯示結合能力之抗體的噬菌體，之後從於腺苷、及ATP不存在條件下從珠溶出之溶出液中回收噬菌體。
使保持建構之噬菌體展示用噬粒之大腸菌生產噬菌體。對於產生噬菌體之大腸菌之培養液添加2.5M NaCl/10%PEG，將沉澱之噬菌體之集團以TBS稀釋，獲得噬菌體資料庫液。然後，於該噬菌體資料庫液添加BSA使終濃度成為4%。使用固定於磁珠之抗原實施淘選。磁珠，使用NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或Streptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)。抗原使用生物素化之人IL-6受體。
於製備之噬菌體資料庫液，加入500pmol之生物素標記抗原、以及各終濃度1mM之ATP-Na及腺苷，以使該噬菌體資料庫液於室溫與抗原及腺苷、及ATP接觸60分鐘。於該噬菌體資料庫液加入經BSA阻斷的磁珠，使抗原與噬菌 體之複合體與磁珠在室溫進行15分鐘結合。將珠以溶有ATP及腺苷之TBS洗滌1次。之後，將已加入1mg/mL胰蛋白酶0.5mL之珠於室溫懸浮15分鐘後，即時使用磁座分離珠，從珠回收噬菌體溶液。將回收之噬菌體溶液添加到對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10mL大腸菌株ER2738。於37℃緩慢進行1小時上述大腸菌之攪拌培養，使噬菌體感染大腸菌。感染之大腸菌，接種到225mm x 225mm之板。然後，從接種之大腸菌之培養液回收噬菌體，以製備噬菌體資料庫液。
第1次淘選係回收於腺苷及ATP存在下可對抗原結合之噬菌體，但第2次以後之淘選，係濃縮僅在腺苷及ATP存在下可對抗原結合之噬菌體。具體而言，藉由在製備之噬菌體資料庫液加入40pmol生物素標記抗原以及各終濃度1mM之腺苷及ATP，以使噬菌體資料庫於室溫與抗原以及腺苷及ATP接觸60分鐘。加入經BSA阻斷之磁珠，使抗原與噬菌體之複合體與磁珠在室溫結合15分鐘。將珠以溶有1mL腺苷及ATP之TBST(以下稱為(腺苷+ATP)/TBST)及溶有腺苷、腺苷及ATP之TBS(以下稱為(腺苷+ATP)/TBS)洗滌。之後，將已加入0.5mL TBS之珠於室溫懸浮後，即時使用磁座分離珠，從珠回收噬菌體溶液。在重複此作業後，將分2次溶出之噬菌體液混合。於回收之噬菌體溶液加入100mg/mL之胰蛋白酶5μL，使未提示Fab之噬菌體之pIII蛋白質(幫助者噬菌體來源之pIII蛋白質)被切斷，未提示Fab之噬菌體對於大腸菌失去感染能力。從經胰蛋白酶處理之噬菌體溶液回收之噬菌體，對於成為對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10mL大腸菌株 ER2738添加。於37℃緩慢進行1小時上述大腸菌之攪拌培養以使噬菌體感染大腸菌。將已感染之大腸菌接種於225mm x 225mm之板。然後從接種之大腸菌之培養液回收噬菌體，以回收噬菌體資料庫液。取得於腺苷及ATP存在下對於抗原有結合活性之抗體之淘選，重複3次。
(3-2)利用負選擇法從抗體資料庫取得於腺苷、ATP存在下與抗原結合之抗體
從合理設計抗體噬菌體展示資料庫，篩選對於抗原於腺苷及/或ATP存在之條件下顯示對於抗原之結合活性之抗體。為了篩選，首先使抗體噬菌體展示資料庫於腺苷及ATP不存在下與生物素標記抗原-鏈黴親和素接觸，去除提示即使腺苷及ATP不存在下也對於抗原有結合活性之抗體之噬菌體。然後，於腺苷及ATP存在之條件下同樣淘選，實施於腺苷及ATP存在之條件下對於抗原有結合活性之抗體之篩選。
使保持建構之噬菌體展示用噬粒之大腸菌生產噬菌體。對於產生噬菌體之大腸菌之培養液添加2.5M NaCl/10%PEG，將沉澱之噬菌體之集團以TBS稀釋，獲得噬菌體資料庫液。然後，於該噬菌體資料庫液添加BSA使終濃度成為4%。使用固定於磁珠之抗原實施淘選。磁珠，使用NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或Streptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)，並使用固定於磁珠之抗原實施淘選。
於製備之噬菌體資料庫液，加入250pmol之生物素標記抗原、以及各終濃度1mM之腺苷及ATP之混合液， 以使該噬菌體資料庫液於室溫與抗原及腺苷、及ATP接觸60分鐘。然後於該噬菌體資料庫液加入經BSA阻斷的磁珠，使抗原與噬菌體之複合體與磁珠在室溫進行15分鐘結合。將珠以(腺苷+ATP)/TBS洗滌1次。之後，將已加入1mg/mL胰蛋白酶0.5mL之珠於室溫懸浮15分鐘後，即時使用磁座分離珠，從珠回收噬菌體溶液。將回收之噬菌體溶液添加到對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10mL大腸菌株ER2738。於37℃緩慢進行1小時上述大腸菌之攪拌培養，使噬菌體感染大腸菌。感染之大腸菌，接種到225mm x 225mm之板。然後使幫助者噬菌體M13KO7(Takarabio)、或M13KO7△pIII(稱為hyperphage)(PROGEN Biotechnik)感染已接種之大腸菌之培養液，於30℃培養一晚後從上清回收噬菌體以分別製備成抗體一價提示噬菌體資料庫及抗體多價提示噬菌體資料庫液。
第1次淘選係回收於腺苷及ATP存在下可對抗原結合之噬菌體，但第2次以後之淘選，係濃縮僅在腺苷及ATP存在下可對抗原結合之噬菌體。具體而言，藉由在經BSA阻斷之Sera-Mag NeutrAvidin珠加入250pmol生物素化抗原，於室溫使結合15分鐘。對於以TBS洗滌過3次珠，加入經BSA阻斷之噬菌體資料庫液，於室溫進行1小時結合。使用磁座分離珠，從珠回收未與抗原及珠結合之噬菌體。對於回收之噬菌體，加入40pmol生物素標記抗原以及各終濃度1mM之腺苷及ATP，以使噬菌體資料庫於室溫與抗原以及腺苷及ATP接觸60分鐘。然後在該標記抗原以及腺苷及ATP與噬菌體資料庫之混合液中加入經BSA阻斷之磁珠，於室溫使抗原與噬菌體 之複合體與磁珠結合15分鐘。珠以1mL腺苷+ATP)/TBST與(腺苷+ATP)/TBS洗滌。之後將1mg/mL之Trypsin溶液0.5mL加到該混合液。該混合液於室溫進行20分鐘攪拌後，使用磁座分離珠，從珠回收噬菌體。回收之噬菌體加到對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10mL大腸菌株ER2738。於37℃緩慢進行1小時上述大腸菌之攪拌培養以使噬菌體感染大腸菌。將已感染之大腸菌接種於225mm x 225mm之板。取得於腺苷及ATP存在之條件下對於抗原有結合活性之抗體的淘選係重複3次。
(3-3)利用噬菌體ELISA評價於腺苷及/或ATP存在下及不存在下之結合活性
從依上述方法獲得之大腸菌單一菌落，參考常法(Methods Mol Biol.2002；178：133-145.)回收含噬菌體之培養上清。使用NucleoFast 96(MACHEREY-NAGEL)，將回收之培養上清進行超過濾。將已將培養上清各100μL對於各井塗用之NucleoFast 96進行離心分離(4,500g,45分鐘)，以去除未附著物。將100μL之H2O已加到各井之該NucleoFast 96再度離心分離(4,500g,30分鐘離心)以洗滌。最後，加入TBS 100μL，回收於室溫靜置5分鐘之該NucleoFast 96之各井之上清含有之噬菌體液。
已加入TBS、或(腺苷+ATP)/TBS之精製噬菌體依以下程序供ELISA。將StreptaWell 96微滴定板(Roche)以含生物素標記抗原之TBS 100μL包被一晚。以TBST洗滌該板之各井以去除抗原後，將該井以250μL之2%脫脂奶-TBS阻斷1小時以上。去除2%脫脂奶-TBS，於各井添加製備的精製噬菌體， 將該板於37℃靜置1小時，使提示抗體之噬菌體於腺苷及/或ATP不存在/存在下結合於在各井存在的抗原。於以TBST或(腺苷+ATP)/TBST洗滌之各井添加經TBS或(腺苷+ATP)/TBS稀釋之HRP結合抗M13抗體(Amersham Pharmacia Biotech)，將該板於溫育1小時。以TBST或(腺苷+ATP)/TBST洗滌後，將添加有TMB single溶液(ZYMED)之各井中之溶液之發色反應藉由硫酸之添加使反應停止後，測定450nm之吸光度以測定該發色。其結果，確認對於人IL-6受體，於ATP或腺苷存在下結合之多個抗體。噬菌體ELISA之結果示於表52。
(3-4)因腺苷及ATP之有無而改變對於抗原之結合活性之開關抗體之序列解析
由參考實施例(3-3)表示之噬菌體ELISA之結果，解析從判斷為於腺苷或ATP存在之條件下對於抗原有結合活性之選殖體使用專一性的引子(序列編號：79及80)放大之基因之鹼基序列。解析之結果，取得判斷為於ATP或腺苷存在下對於生物素標識hIL-6R有結合活性之選殖體6RAD2C1-4_001、6RAD2C1-4_005、6RAD2C1-4_011、6RAD2C1-4_026、6RAD2C1-4_030、6RAD2C1-4_042、6RAD2C1-4_076、6RDL3C1-4_085、6RDL3C5-4_011(表53)。
[參考實施例4]從使用噬菌體展示技術之抗體資料庫取得於腺苷、ATP不存在下結合於抗原之抗體
(4-1)利用腺苷及ATP之混合物，從資料庫取得於低分子存在下妨礙對於抗原之結合之抗體
上述參考實施例3中，已取得於成為開關之低分子存在下結合於目標抗原之抗體。本參考實施例中，嘗試取得於低分子不存在下結合於目標抗原之抗體。
從參考實施例2建構之合理設計抗體噬菌體展示資料庫，取得於腺苷、及/或ATP不存在條件下對於抗原顯示結合活性之抗體且於存在下結合能力衰減之抗體。為了取得，首先使抗體噬菌體展示資料庫與生物素化腺苷及ATP-NeutrAvidin接觸，回收與腺苷及/或ATP結合之抗體噬菌體展示資料庫。然後使該抗體噬菌體展示資料庫於腺苷及ATP不存在條件下與生物素化抗原-鏈黴親和素接觸，回收於腺苷及ATP不存在下與抗原結合之抗體。藉由交替進行如此之淘 選，篩選具有與腺苷及/或ATP、及抗原兩者有結合活性之抗體。帶有如此性質之抗體，於腺苷及ATP存在下，藉由抗體與腺苷及/或ATP結合，可期待抑制抗體對於抗原之結合。
使保持參考實施例2之建構之噬菌體展示用噬粒之大腸菌生產噬菌體。對於產生噬菌體之大腸菌之培養液添加2.5M NaCl/10%PEG，將沉澱之噬菌體之集團以TBS稀釋，獲得噬菌體資料庫液。然後，於該噬菌體資料庫液添加BSA使終濃度成為4%。使用固定於磁珠之抗原實施淘選。磁珠，使用NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或Streptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)，並使用固定於磁珠之抗原實施淘選。
於製備之噬菌體資料庫液，加入500pmol之生物素化ATP、2'-Adenosine-PEG-Biotin、及5'-Adenosine-PEG-Biotin，以使該噬菌體資料庫液於室溫與腺苷、及ATP接觸60分鐘。於該噬菌體資料庫液加入經BSA阻斷的磁珠，使腺苷及/或ATP與噬菌體之複合體與磁珠在室溫進行15分鐘結合。將珠以TBS洗滌1次。之後，加入1mg/mL胰蛋白酶0.5mL。將珠於室溫懸浮15分鐘後，即時使用磁座分離珠，從珠回收噬菌體溶液。將回收之噬菌體溶液添加到對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10mL大腸菌株ER2738。於37℃緩慢進行1小時上述大腸菌之攪拌培養，使噬菌體感染大腸菌。感染之大腸菌，接種到225mm x 225mm之板。然後，從接種之大腸菌之培養液回收噬菌體，以製備噬菌體資料庫液。
第2次之淘選，係濃縮在腺苷及ATP不存在下可 對生物素化抗原結合之噬菌體。具體而言，藉由在製備之噬菌體資料庫液加入250pmol生物素化抗原以使噬菌體資料庫於室溫與抗原接觸60分鐘。於噬菌體資料庫液加入經BSA阻斷之磁珠，使抗原與噬菌體之複合體與磁珠在室溫結合15分鐘。將珠以TBST洗滌2次、以TBS洗1次。之後，將已加入1mg/mL胰蛋白酶溶液0.5mL之珠於室溫懸浮15分鐘後，即時使用磁座分離珠，從珠回收噬菌體溶液。將回收之噬菌體溶液加入對於成為對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10mL大腸菌株ER2738。於37℃緩慢進行1小時上述大腸菌之攪拌培養以使噬菌體感染大腸菌。將已感染之大腸菌接種於225mm x 225mm之板。然後從接種之大腸菌之培養液回收噬菌體，以回收噬菌體資料庫液。
之後，在第奇數次淘選中，以與第1次淘選為相同條件反複實施淘選。惟，以TBST及TBS進行之珠洗滌，各增為3次、2次實施。
之後，於第偶數次淘選中，重複實施與第2次淘選為相同條件之淘選。惟，第4次以後的淘選，將生物素化抗原減為40pmol，利用TBST及TBS進行之珠之洗滌各增為3次、2次。
(4-2)利用噬菌體ELISA評價低分子存在下之結合活性
從依上述方法獲得之大腸菌單一菌落，參考常法(Methods Mol Biol.2002；178：133-145.)回收含噬菌體之培養上清。使用NucleoFast 96(MACHEREY-NAGEL)，將回收之培養上清進行 超過濾。將已將培養上清各100μL對於各井塗用之NucleoFast 96進行離心分離(4,500g,45分鐘)，以去除未附著物。將100μL之H2O已加到各井之該NucleoFast 96再度離心分離(4,500g,30分鐘離心)以洗滌。最後，加入TBS 100μL，回收於室溫靜置5分鐘之該NucleoFast 96之各井之上清含有之噬菌體液。
已加入TBS、或ATP及腺苷/TBS之精製噬菌體依以下程序供ELISA。將StreptaWell 96微滴定板(Roche)以含生物素標記抗原之TBS 100μL包被一晚。以TBST洗滌該板之各井以去除抗原後，將該井以250μL之2%脫脂奶-TBS阻斷1小時以上。去除2%脫脂奶-TBS，於各井添加製備的精製噬菌體，將該板於37℃靜置1小時，使提示噬菌體之抗體於腺苷及/或ATP10mM存在下或不存在下結合於在各井存在的抗原。於以TBST或10mM ATP及腺苷/TBST洗滌之各井添加經TBS或10mM ATP及腺苷/TBS稀釋之HRP結合抗M13抗體(Amersham Pharmacia Biotech)，將該板於溫育1小時。以TBST或10mM ATP及腺苷/TBST洗滌後，將添加有TMB single溶液(ZYMED)之各井中之溶液之發色反應藉由硫酸之添加使反應停止後，測定450nm之吸光度以測定該發色。
使用經單離之96個選殖體進行噬菌體ELISA，從合理設計抗體資料庫獲得於ATP及腺苷不存在下顯示對於係抗原之人類IL-6有結合活性之選殖體「I6RLSA1-6_011」、於ATP及腺苷不存在下對於抗原人類血清白蛋白(HSA)顯示結合活性之選殖體「HSADSA1-6_020」、及於ATP及腺苷不存在下顯示對人類IL-6 receptor有結合活性之選殖體 「6RRLSA1-6_037」、「6RRLSA1-6_045」((第44、45、46圖)。
(4-3)將腺苷及ATP作為開關之抗體之序列解析
解析從(4-2)表示之噬菌體ELISA之結果，判斷在腺苷或ATP之不存在條件下對於抗原有結合活性之選殖體使用專一性的引子(序列編號：79及80)放大之基因之鹼基序列。針對解析結果，於以下表54表示胺基酸序列。
[參考實施例5]生物素化人IgA-Fc之製備
作為人IgA，使用天然存在之人IgA序列中的Fc部分(人IgA-Fc)。為了於人IgA-Fc之C末端附加biotin，介由連結子來連結編碼為利用生物素連接酶附加生物素之專一的序列(AviTag序列、序列編號：147)的基因片段。將編碼為人IgA-Fc與AviTag序列已連結之蛋白質(序列編號：146)的基因片段納入動物細胞表現用載體，將已構建之質體載體使用293Fectin(Invitrogen)導入到FreeStyle293細胞(Invitrogen)。此時將表現EBNA1(序列編號：148)之基因及表現生物素連接酶(BirA、序列編號：149)之基因同時導入，並添加為了將人IgA-Fc進行生物素標識之生物素。將依前述程序已導入基因之細胞於37℃、8% CO2培養6日，使目的蛋白質分泌到培養上清中。
將含目的之生物素化人IgA-Fc之細胞培養液以0.22μm瓶頂濾器過濾，獲得培養上清。在經20mM Tris-HCl,pH7.4平衡化的HiTrap Q HP(GE Healthcare)加入經同溶液稀釋之培養上清，利用NaCl之濃度梯度使目的之生物素化人IgA-Fc溶出。然後於經50mM Tris-HCl,pH8.0平衡化之SoftLink Avidin管柱(Promega)，加入經同溶液稀釋之前述HiTrap Q HP溶出液，於5mM生物素，150mM NaCl,50mM Tris-HCl,pH8.0的條件使目的之生物素化人IgA-Fc溶出。之後，利用Superdex200(GE Healthcare)進行凝膠過濾層析，去除目的外之雜質組合體，獲得緩衝液取代成20mM Histidine-HCl,150mM NaCl,pH6.0之精製生物素化人IgA-Fc。
[產業利用性]
本發明之因應低分子化合物之濃度而改變對於抗原之結合活性之抗原結合分域或含有抗原結合分域之抗原結合分子、以及含此之醫藥組合物，在正常組織、血液中不全身性作用，在為目標組織之病變部位即癌、發炎部位可逆地作用，藉此能避免副作用且發揮藥效，能治療起因於該目標組織之病症。又，若能取得可因應於非天然化合物之濃度而控制向抗原之結合之抗體，則就該抗體可藉由投予在病變部位活化之外來性化合物、或能非侵入式投予之外來性化合物以控制抗體之活性、藥理作用，故極有用。
再者，若使用本發明之含有序列互異之複數個因應低分子化合物之濃度而改變對於抗原之結合活性之抗原結合分域或含有抗原結合分域之抗原結合分子的資料庫，能於短時間以良 好效率取得對於組織專一的病症的治療有用的各種抗原結合分子。
<110> 中外製藥股份有限公司(CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA)
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<130> C1-A1313-TW
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<223> 人工合成序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
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<223> 人工合成序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成引子序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成引子序列
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<211> 27
<212> DNA
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<223> 人工合成引子序列
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<210> 83
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<212> DNA
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<212> DNA
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
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<220>
<223> 人工合成序列
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<220>
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<220>
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<212> PRT
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<220>
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<220>
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<220>
<223> 人工合成序列
<400> 130
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 131
<210> 132
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 132
<210> 133
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
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<211> 123
<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 135
<210> 136
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
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<210> 137
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 137
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<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 138
<210> 139
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 139
<210> 140
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 140
<210> 141
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 141
<210> 142
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 142
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<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
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<210> 144
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 144
<210> 145
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 145
<210> 146
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 146
<210> 147
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 147
<210> 148
<211> 641
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 148
<210> 149
<211> 321
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成序列
<400> 149

Claims (19)

  1. 一種資料庫，係由以下(i)或(ii)為主而成，(i)序列互不相同之複數個抗原結合分域或含有抗原結合分域之抗原結合分子；或(ii)編碼為該序列互不相同之複數個抗原結合分域或含有抗原結合分域之抗原結合分子之核酸；該抗原結合分子分域或抗原結合分子係因應低分子化合物之濃度而改變對於抗原之結合活性之抗原結合分域或含抗原結合分域之抗原結合分子。
  2. 如申請專利範圍第1項之資料庫，係以包括下列(a)及(b)之步驟的方法製造：(a)在因應低分子化合物之濃度而改變對於抗原之結合活性之抗原結合分域或對於低分子化合物有結合活性之抗原結合分域中，指定滿足以下(i)至(iii)中任一者以上之胺基酸部位之步驟；(i)未涉及對該低分子化合物之結合的1或複數個胺基酸部位；(ii)就親代抗原結合分域所屬之動物種之抗體之資料庫存(repertory)而言，胺基酸出現頻度有多樣性的1或複數個胺基酸部位；(iii)對於典型結構之形成不重要的1或複數個胺基酸部位；及(b)設計含有該抗原結合分域中之編碼為未改變體之核酸及編碼為步驟(a)指定之1或複數個胺基酸部位有改變之序 列互異之該抗原結合分域或含有抗原結合分域之抗原結合分子之複數個改變體的核酸的資料庫之步驟。
  3. 如申請專利範圍第2項之資料庫，係以包括下列(a)至(d)之步驟的方法製造：(a)在因應低分子化合物之濃度而改變對於抗原之結合活性之抗原結合分域或對於低分子化合物有結合活性之抗原結合分域中，指定滿足以下(i)至(iii)中任一者以上之胺基酸部位之步驟；(i)未涉及對該低分子化合物之結合的1或複數個胺基酸部位；(ii)就親代抗原結合分域所屬之動物種之抗體之資料庫存而言，胺基酸出現頻度有多樣性的1或複數個胺基酸部位；(iii)對於典型結構之形成不重要的1或複數個胺基酸部位；(b)製作於步驟(a)指定之1或複數個胺基酸部位有改變之序列互異之該抗原結合分域或含有抗原結合分域之抗原結合分子之複數個改變體之步驟；(c)指定該各改變體之對於該低分子化合物之結合活性實質上不帶來變化之1或複數個胺基酸之改變之步驟；及(d)製造含有編碼為未改變體之核酸及編碼為含有於步驟(c)指定之1或複數個胺基酸有改變之序列互異之該抗原結合分域或含有抗原結合分域之抗原結合分子之複數個改變體的核酸的資料庫。
  4. 如申請專利範圍第1項之資料庫，係以包含以下1)及2)之步驟的方法製造： 1)使含有複數個對於低分子化合物有結合活性之抗原結合分子的資料庫與低分子化合物接觸之步驟；及2)從該資料庫將編碼為對於低分子化合物有結合活性之抗原結合分子之複數個改變體的核酸予以濃縮之步驟。
  5. 如申請專利範圍第4項之資料庫，其中，該抗原結合分子係含有抗體之重鏈可變區及輕鏈可變區的抗原結合分子，依包含以下1)至3)中任一步驟之方法製造；1)如申請專利範圍第4項之資料庫包含編碼為位在重鏈可變區之胺基酸改變的1或複數個改變體的核酸，從該資料庫將編碼為對於低分子化合物有結合活性之抗原結合分子之複數個改變體之核酸予以濃縮並設計資料庫；2)如申請專利範圍第4項之資料庫包含編碼為位在輕鏈可變區之胺基酸改變的1或複數個改變體的核酸，從該資料庫將編碼為對於低分子化合物有結合活性之抗原結合分子之複數個改變體之核酸予以濃縮並設計資料庫；3)將編碼為從步驟1)及步驟2)之各可變區資料庫濃縮的抗原結合分子的核酸予以組合以設計資料庫。
  6. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之資料庫，其中，該抗原結合分子係抗原結合分域與病毒外殼蛋白質之至少一部分的融合多胜肽。
  7. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之資料庫，其中，該抗原結合分子係含有抗體之重鏈及輕鏈之抗原結合分子，更包含設計該重鏈及/或輕鏈之合成資料庫的步驟。
  8. 如申請專利範圍第7項之資料庫，其中，該抗體之重鏈及/ 或輕鏈含有來自生殖細胞系列之框架序列。
  9. 如申請專利範圍第1至8項中任一項之資料庫，其中，該低分子化合物為目標組織專一的化合物或非天然化合物。
  10. 如申請專利範圍第1至9項中任一項之資料庫，其中，該目標組織為癌組織或發炎性組織。
  11. 如申請專利範圍第10項之資料庫，其中，該癌組織專一的化合物係選自於由具有嘌呤環結構之核苷、胺基酸及其代謝產物、脂質及其代謝產物、糖代謝之一次代謝產物、以及菸鹼醯胺及其代謝產物構成之群組中之至少1種化合物。
  12. 如申請專利範圍第1至11項中任一項之資料庫，其中，該低分子化合物為犬尿胺酸(kynurenine)、腺苷、腺苷1磷酸、腺苷2磷酸、或腺苷3磷酸。
  13. 如申請專利範圍第1至12項中任一項之資料庫，其中，未涉及與該低分子化合物之結合之胺基酸部位係從以下選擇的任一者以上之胺基酸以外：H鏈：97、100c、101、94、95、100d、100e、33、50、52、56、57、58、99、100、100a、54、55(Kabat編號)；L鏈：49、55、95c、96、95a、95b(Kabat編號)。
  14. 一種抗原結合分子之製造方法，該抗原結合分子含有因應低分子化合物之濃度而改變對於抗原之結合活性之抗原結合分域，包含以下(a)至(g)之步驟：(a)於低分子化合物非存在下使如申請專利範圍第1至13項中任一項之資料庫與抗原接觸； (b)選擇於該步驟(a)未結合於抗原之抗原結合分域；(c)將該步驟(b)選擇的抗原結合分域於低分子化合物存在下與抗原接觸；(d)選擇該步驟(c)結合於抗原之抗原結合分域；(e)將編碼為該步驟(d)選擇的抗原結合分域的多核苷酸連結於編碼為含Fc區之多胜肽的多核苷酸；(f)培養已導入以可作用地連結該步驟(e)獲得之多核苷酸的載體的細胞；及(g)從該步驟(f)培養之細胞之培養液回收抗原結合分子。
  15. 一種抗原結合分子之製造方法，該抗原結合分子含有因應低分子化合物之濃度而改變對於抗原之結合活性之抗原結合分域，包含以下(a)至(e)之步驟：(a)將如申請專利範圍第1至13項中任一項之資料庫於低分子化合物存在下與抗原接觸；(b)以比該步驟(a)更低濃度的低分子化合物使抗原結合分域解離並回收；(c)使編碼為該步驟(b)回收之抗原結合分域的多核苷酸連結於編碼為含Fc區之多胜肽的多核苷酸；(d)培養已導入以可作用地連結該步驟(c)獲得之多核苷酸的載體的細胞；及(e)從該步驟(d)培養之細胞之培養液回收抗原結合分子。
  16. 如申請專利範圍第14或15項之含有因應低分子化合物之濃度而改變對於抗原之結合活性之抗原結合分域之抗原結合分子之製造方法，更包含以下(a)至(b)之步驟： (a)將如申請專利範圍第1至13項中任一項之資料庫與低分子化合物接觸；及(b)選擇該步驟(a)回收之抗原結合分域；
  17. 如申請專利範圍第14至16項中任一項之抗原結合分子之製造方法，其中，該低分子化合物為犬尿胺酸、腺苷、腺苷1磷酸、腺苷2磷酸、或腺苷3磷酸。
  18. 一種抗原結合分子，含有因應非天然化合物之濃度而改變對抗原之結合活性之抗原結合分域。
  19. 一種醫藥組合物，含有如申請專利範圍第18項之抗原結合分子。
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