KR102454360B1 - 화합물의 농도에 따라 항원 결합능이 변화되는 항원 결합 분자 및 그의 라이브러리 - Google Patents

화합물의 농도에 따라 항원 결합능이 변화되는 항원 결합 분자 및 그의 라이브러리 Download PDF

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Abstract

본 발명은 표적 조직 특이적인 항원 결합 분자, 비천연 화합물 농도에 따라 항원 결합 활성이 변화되는 항원 결합 분자, 각각 상이한 복수의 그 항원 결합 분자를 포함하는 라이브러리, 당해 항원 결합 분자를 포함하는 의약 조성물, 당해 항원 결합 분자를 스크리닝하는 방법 및 이를 제조하는 방법 등을 제공하는 것을 과제로 한다. 본 발명자들은 저분자 화합물의 농도에 의존하여 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자를 창작하고, 더 나아가서는 각각 상이한 복수의 그 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인을 포함하는 라이브러리를 창작하여, 그 라이브러리를 사용함으로써 상기 과제를 해결할 수 있는 것을 발견하였다. 본원 발명의 항원 결합 분자를 사용함으로써 표적 조직에 기인하는 각종 질환을 표적 조직 특이적으로 치료하는 것이 가능해진다.

Description

화합물의 농도에 따라 항원 결합능이 변화되는 항원 결합 분자 및 그의 라이브러리{Antigen-binding molecules, the antigen-binding activity of which varies according to the concentration of compounds, and libraries of said molecules}
본 발명은 저분자 화합물의 농도에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자의 라이브러리에 관한 것이다. 본 발명은 또한 비천연 화합물의 농도에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자, 당해 항원 결합 분자의 제조방법 및 스크리닝방법, 및 당해 항원 결합 분자를 포함하는 의약 조성물에 관한 것이다.
항체는 혈장 중에서의 안정성이 높고, 부작용도 적은 것으로부터 의약품으로서 주목되고 있다. 그 중에서도 IgG형 항체 의약은 다수 시판되고 있고, 현재도 수 많은 항체 의약이 개발되고 있다(비특허문헌 1 및 비특허문헌 2).
항체 의약을 사용한 암치료제로서 지금까지의 CD20 항원에 대한 리툭산, EGFR 항원에 대한 세툭시맵, HER2 항원에 대한 허셉틴 등이 승인되어 있다(비특허문헌 3). 이들 항체 분자는 암세포에 발현되고 있는 항원에 대해 결합하여 ADCC 등에 의해 암세포에 대한 상해 활성을 발휘한다. 이러한 ADCC 등에 의한 세포 상해 활성은 치료용 항체의 표적 세포에 발현되는 항원의 수에 의존하는 것이 알려져 있기 때문에(비특허문헌 4), 표적이 되는 항원의 발현량이 높은 것이 치료용 항체의 효과의 관점에서는 바람직하다. 그러나 항원의 발현량이 높아도 정상 조직에 항원이 발현되고 있으면 정상 세포에 대해 ADCC 등의 상해 활성을 발휘하게 되기 때문에 부작용이 커다란 문제가 된다. 이 때문에 암치료제로서 치료용 항체가 표적으로 하는 항원은 암세포에 특이적으로 발현되고 있는 것이 바람직하다. 예를 들면 암항원으로서 알려져 있는 EpCAM 항원에 대한 항체 분자는 암치료제로서 유망할 것으로 생각되고 있었으나, EpCAM 항원은 췌장에도 발현되고 있는 것이 알려져 있고, 실제로 임상시험에 있어서 항EpCAM 항체를 투여함으로써 췌장에 대한 세포 상해 활성에 의해 췌장염의 부작용이 보이는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 5).
ADCC 활성에 의한 세포 상해 활성을 발휘하는 항체 의약의 성공으로 인해, 천연형 인간 IgG1의 Fc영역의 N형 당쇄의 푸코오스를 제거하는 것에 의한 ADCC 활성의 증강(비특허문헌 6), 천연형 인간 IgG1의 Fc영역의 아미노산 치환에 의해 FcγRIIIa로의 결합을 증강시키는 것에 의한 ADCC 활성의 증강(비특허문헌 7) 등에 의해 강력한 세포 상해 활성을 발휘하는 제2 세대의 개량 항체 분자가 보고되어 있다. 전술한 NK세포가 개재하는 ADCC 활성 이외의 메커니즘으로 암세포에 상해 활성을 발휘하는 항체 의약으로서, 강력한 세포 상해 활성이 있는 약물을 항체와 콘쥬게이트한 항체 약물 복합체(Antibody Drug Conjugate;ADC)(비특허문헌 8) 및 T세포를 암세포에 리쿠르트함으로써 암세포에 대한 상해 활성을 발휘하는 저분자 항체(비특허문헌 9) 등의 보다 강력한 세포 상해 활성을 발휘하는 개량 항체 분자도 보고되어 있다.
이러한 보다 강력한 세포 상해 활성을 발휘하는 항체 분자는 항원의 발현이 많지는 않은 암세포에 대해서도 세포 상해 활성을 발휘하는 것이 가능한 한편으로, 항원의 발현이 적은 정상 조직에 대해서도 마찬가지로 세포 상해 활성을 발휘하게 된다. 실제로 EGFR 항원에 대한 천연형 인간 IgG1인 세툭시맵과 비교하여, CD3와 EGFR에 대한 이중특이성 항체인 EGFR-BiTE는 T세포를 암세포에 리쿠르트함으로써 암세포에 대해 강력한 세포 상해 활성을 발휘하여 항종양 효과를 발휘할 수 있다. 한편으로 EGFR은 정상 조직에 있어서도 발현되고 있기 때문에, EGFR-BiTE를 게잡이원숭이에 투여했을 때에 심각한 부작용이 나타나는 것도 확인되고 있다(비특허문헌 10). 또한 암세포에서 고발현되고 있는 CD44v6에 대한 항체에 메르탄신(mertansine)을 결합시킨 ADC인 비바투주맙 메르탄신(bivatuzumab mertansine)은 CD44v6가 정상 조작에 있어서도 발현되고 있는 것으로부터 임상에 있어서 심각한 피부 독성 & 간 독성이 확인되고 있다(비특허문헌 11).
이와 같이 항원의 발현이 적은 암세포에 대해서도 강력한 세포 상해 활성을 발휘하는 것이 가능한 항체를 사용한 경우, 표적 항원이 매우 암 특이적으로 발현되고 있을 필요가 있는데, 허셉틴의 표적 항원인 HER2나 세툭시맵의 표적 항원인 EGFR은 정상 조직에도 발현되고 있는 바와 같이, 극도로 암 특이적으로 발현되고 있는 암항원의 수는 한정되어 있는 것으로 생각된다. 이 때문에 암에 대한 세포 상해 활성을 강화시키는 것은 가능하지만 정상 조직에 대한 세포 상해 작용에 의한 부작용이 문제가 될 수 있다.
또한 최근 암에 있어서의 면역 억제에 기여하고 있는 CTLA4를 저해함으로써 종양면역을 증강시키는 이필리무맵(ipilimumab)이 전이성 흑색종에 대해 전체 생존율(Overall survival)을 연장시키는 것이 나타내어졌다(비특허문헌 12). 그러나 이필리무맵은 CTLA4를 전신적으로 저해하기 때문에 종양 면역이 증강되는 한편으로, 전신적으로 면역이 활성화되는 것에 의한 자기면역질환과 유사한 심각한 부작용을 나타내는 것이 문제가 되고 있다(비특허문헌 13).
한편 암 이외의 질환에 대한 항체 의약으로서 염증성·자기면역질환에 있어서 염증 사이토카인을 저해함으로써 치료효과를 발휘하는 항체 의약이 알려져 있다(비특허문헌 14). 예를 들면 TNF를 표적으로 하는 레미케이드(Remicade)나 휴미라(Humira) 및 IL-6R을 표적으로 하는 액템라(Actemra)는 류머티스성 관절염에 대해 높은 치료효과를 발휘하는 한편, 이들 사이토카인을 전신적으로 중화함으로써 감염증의 부작용이 보이는 것도 알려져 있다(비특허문헌 15).
제2 세대의 항체 의약에 적용 가능한 기술로서 다양한 기술이 개발되어 있어 이펙터 기능, 항원 결합능, 약물동태, 안정성을 향상시키거나 또는 면역원성 리스크를 저감시키는 기술 등이 보고되어 있는데(비특허문헌 16), 상기와 같은 부작용을 해결하기 위한 항체 의약을 표적 조직에 특이적으로 작용 가능하게 하는 기술은 거의 보고되어 있지 않다. 예를 들면 암조직이나 염증성 조직과 같은 병변 부위에 대해서는 이들 표적 조직에 있어서의 pH가 산성 조건인 것을 이용한 pH 의존성 항체가 보고되어 있다(특허문헌 1, 및 2). 그러나 암조직이나 염증성 조직에 있어서의 정상 조직과 비교한 pH의 저하(즉, 수소이온 농도의 상승)는 미미하여, 분자량이 매우 작은 수소이온 농도의 미미한 상승을 검지하여 작용하는 항체를 제작하는 것은 곤란한 동시에, 파골세포 골흡수와영역(osteoclastic bone resorption region) 등 정상 조직이나 대상으로 하는 병변 이외의 조직에서도 pH가 산성 조건인 경우도 있어, pH의 조건을 병변 부위에 특이적인 환경 인자로서 이용하기에는 많은 과제가 있는 것으로 생각되었다. 한편 암조직이나 염증성 조직과 같은 병변 부위에서 발현되는 프로테아제로 절단됨으로써 비로소 항원 결합 활성을 발휘하는 항체를 제작하는 방법이 보고되어 있다(특허문헌 3). 그러나 프로테아제에 의한 항체의 절단은 불가역적이기 때문에, 당해 병변 부위에서 절단된 항체가 정상 조직에 혈류를 타고 되돌아감으로써 정상 조직에서도 항원에 결합하게 되어 버리는 것이 과제로 생각되었다. 또한 이러한 프로테아제의 암 특이성에도 과제가 있다고 생각되었다. 이 때문에 부작용을 회피하면서 약효를 발휘하기 위해, 정상 조직이나 혈액 중에 있어서 전신적으로 작용하지 않고 병변 부위인 암이나 염증 부위에 있어서 가역적으로 작용하는 기술은 알려져 있지 않다. 또한 항체의 활성이나 약리작용을 외래성 화합물의 비침습 투여에 의해 조절하는 방법도 알려져 있지 않다.
국제공개 제WO2003/105757호 국제공개 제WO2012/033953호 국제공개 제WO2010/081173호
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전술한 배경을 감안하면, 표적 조직에 있어서 특이적으로 존재 또는 생산되는 저분자의 농도에 따라 표적 항원으로의 결합이 제어되는 항체(이하, 본 출원 명세서에 있어서는 「저분자 스위치 항체」(Small molecule switch antibody)라 칭하는 경우도 있음)를 취득할 수 있으면, 이러한 항체는 종양 부위나 염증 부위 등의 병변 부위에 있어서 가역적으로 작용하여 부작용을 회피할 수 있는 것으로부터 매우 유용하다. 또한 비천연 화합물의 농도에 따라 항원으로의 결합이 제어되는 항체를 취득할 수 있으면, 이러한 항체는 항체의 활성이나 약리작용을 병변 부위에서 활성화하는 외래성 화합물이나 또는 비침습 투여 가능한 외래성 화합물의 투여에 의해 조절할 수 있기 때문에 매우 유용하다.
그러나, 이러한 항체가 종래의 방법인 비인간 동물을 항원으로 면역하는 방법이나, 인간 및 비인간 동물 유래의 항체 라이브러리를 이용하는 방법으로 취득되었다고 하는 것은 전혀 보고되어 있지 않다.
따라서, 표적 조직에 있어서 특이적으로 존재 또는 생산되는 저분자, 또는 비천연 화합물의 농도에 따라 임의의 표적 항원으로의 결합이 제어되는 항체(저분자 스위치 항체)를 제공하며, 더 나아가서는 이러한 항체를 단기간에 효율적으로 취득하는 방법의 제공이 강하게 요망되고 있다.
본 발명자들은 상기 목적을 달성하기 위해 예의 연구를 진행시킨 결과, 표적 조직 특이적인 화합물의 농도에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자를 창작하였다. 또한 본 발명자들은 당해 항원 결합 분자 또는 당해 항원 결합 분자를 포함하는 의약 조성물이 표적 조직에 기인하는 질환의 치료에 유용한 것을 발견하는 동시에, 당해 항원 결합 분자를 투여하는 것을 포함하는 표적 조직에 기인하는 질환의 치료에 유용한 것, 및 표적 조직에 기인하는 질환의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서 당해 항원 결합 분자가 유용한 것을 발견하였다.
본 발명자들은 또한 생체 내의 환경 요소의 상위에 따라 또는 비천연 화합물의 투여에 따라 항원 결합 분자의 항원에 대한 결합 활성을 변화시킬 수 있는 저분자와의 결합에 관여하는 아미노산 잔기가 항원 결합 도메인에 포함되어 있는 서로 서열이 다른 복수의 항원 결합 분자를 포함하는 라이브러리의 제작에 성공하는 동시에, 당해 라이브러리를 사용하여 당해 항원 결합 분자를 스크리닝 및 제조하는 방법을 창작하여 본 발명을 완성시켰다.
본 발명은 이러한 지견(知見)에 기초하는 것으로, 구체적으로는 아래에 예시적으로 기재하는 태양을 포함하는 것이다.
〔태양 1〕
(i) 서로 서열이 다른 복수의 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자；또는
(ii) 당해 서로 서열이 다른 복수의 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자를 코드하는 핵산
으로 주로 이루어지는 라이브러리로서, 상기 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자는 저분자 화합물의 농도에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자인 것을 특징으로 하는 라이브러리.
〔태양 2〕
아래의 (a) 및 (b)의 공정：
(a) 저분자 화합물의 농도에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인 또는 저분자 화합물에 대해 결합 활성을 갖는 항원 결합 도메인에 있어서, 아래의 (i) 내지 (iii) 중 어느 하나 이상을 만족시키는 아미노산 부위를 특정하는 공정；
(i) 당해 저분자 화합물에 대한 결합에 관여하고 있지 않은 1 또는 복수의 아미노산 부위；
(ii) 부모 항원 결합 도메인(parent antigen-binding domain)이 속하는 동물종의 항체의 레퍼토리로서 아미노산 출현 빈도의 다양성이 있는 1 또는 복수의 아미노산 부위；
(iii) 표준 구조(canonical structure)의 형성에 중요하지 않은 1 또는 복수의 아미노산 부위；및
(b) 상기 항원 결합 도메인에 있어서, 미개변체를 코드하는 핵산 및 공정 (a)에서 특정된 1 또는 복수의 아미노산 부위에 개변을 갖는, 서로 서열이 다른 상기 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자의 복수의 개변체 각각을 코드하는 핵산을 포함하는 라이브러리를 설계하는 공정
을 포함하는 방법에 의해 제조되는, 태양〔1〕에 기재된 라이브러리.
〔태양 3〕
아래의 (a) 내지 (d)의 공정：
(a) 저분자 화합물의 농도에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인 또는 저분자 화합물에 대해 결합 활성을 갖는 항원 결합 도메인에 있어서, 아래의 (i) 내지 (iii) 중 어느 하나 이상을 만족시키는 아미노산 부위를 특정하는 공정；
(i) 당해 저분자 화합물에 대한 결합에 관여하고 있지 않은 1 또는 복수의 아미노산 부위；
(ii) 부모 항원 결합 도메인이 속하는 동물종의 항체의 레퍼토리로서 아미노산 출현 빈도의 다양성이 있는 1 또는 복수의 아미노산 부위；
(iii) 표준 구조의 형성에 중요하지 않은 1 또는 복수의 아미노산 부위,
(b) 공정 (a)에서 특정된 1 또는 복수의 아미노산 부위에 개변을 갖는, 서로 서열이 다른 상기 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자의 복수의 개변체를 제작하는 공정,
(c) 상기 각각의 개변체의 당해 저분자 화합물에 대한 결합 활성에 실질적으로 변화를 초래하지 않는 1 또는 복수의 아미노산의 개변을 특정하는 공정；및
(d) 미개변체를 코드하는 핵산 및 공정 (c)에서 특정된 1 또는 복수의 아미노산에 개변을 갖는, 서로 서열이 다른 상기 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자의 복수의 개변체를 코드하는 핵산을 포함하는 라이브러리를 제조하는 공정
을 포함하는 방법에 의해 제조되는, 태양〔2〕에 기재된 라이브러리.
〔태양 4〕
아래의 1) 및 2)의 공정：
1) 저분자 화합물에 대한 결합 활성을 갖는 항원 결합 분자를 복수 포함하는 라이브러리와 저분자 화합물을 접촉시키는 공정, 및
2) 상기 라이브러리로부터 저분자 화합물에 대해 결합 활성을 갖는 항원 결합 분자의 복수의 개변체를 코드하는 핵산을 농축하는 공정
을 포함하는 방법에 의해 제조되는, 태양〔1〕에 기재된 라이브러리.
〔태양 5〕
상기 항원 결합 분자가 항체의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하는 항원 결합 분자로서, 아래의 1) 내지 3) 중 어느 하나의 공정을 포함하는 방법에 의해 제조되는, 태양〔4〕에 기재된 라이브러리；
1) 태양〔4〕에 기재된 라이브러리가 중쇄 가변영역에 위치하는 아미노산이 개변된 1 또는 복수의 개변체를 코드하는 핵산을 포함하는 라이브러리로서, 상기 라이브러리로부터 저분자 화합물에 대해 결합 활성을 갖는 항원 결합 분자의 복수의 개변체를 코드하는 핵산을 농축하여 라이브러리를 설계하는 공정；
2) 태양〔4〕에 기재된 라이브러리가 경쇄 가변영역에 위치하는 아미노산이 개변된 1 또는 복수의 개변체를 코드하는 핵산을 포함하는 라이브러리로서, 상기 라이브러리로부터 저분자 화합물에 대해 결합 활성을 갖는 항원 결합 분자의 복수의 개변체를 코드하는 핵산을 농축하여 라이브러리를 설계하는 공정；
3) 공정 1) 및 공정 2)의 각각의 가변영역 라이브러리로부터 농축된 항원 결합 분자를 코드하는 핵산을 조합함으로써 라이브러리를 설계하는 공정.
〔태양 6〕
상기 항원 결합 분자가 항원 결합 도메인과 바이러스 코트 단백질의 적어도 일부의 융합 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는, 태양〔1〕내지〔5〕중 어느 한 항에 기재된 라이브러리.
〔태양 7〕
상기 항원 결합 분자가 항체의 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항원 결합 분자이고, 상기 중쇄 및/또는 경쇄의 합성 라이브러리를 설계하는 공정을 추가로 포함하는, 태양〔1〕내지〔5〕중 어느 한 항에 기재된 라이브러리.
〔태양 8〕
상기 항체의 중쇄 및/또는 경쇄가 생식세포계열 유래의 프레임워크 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 태양〔7〕에 기재된 라이브러리.
〔태양 9〕
상기 저분자 화합물이 표적 조직 특이적인 화합물 또는 비천연 화합물인, 태양〔1〕내지〔8〕중 어느 한 항에 기재된 라이브러리.
〔태양 10〕
상기 표적 조직이 암조직 또는 염증성 조직인, 태양〔1〕내지〔9〕중 어느 한 항에 기재된 라이브러리.
〔태양 11〕
상기 암조직 특이적 화합물이 푸린 고리 구조를 갖는 뉴클레오시드, 아미노산 및 그의 대사산물, 지질 및 그의 대사산물, 당대사의 1차 대사산물, 및 니코틴아미드 및 그의 대사산물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물인, 태양〔10〕에 기재된 라이브러리.
〔태양 12〕
상기 저분자 화합물이 키누레닌, 아데노신, 아데노신 1인산, 아데노신 2인산 또는 아데노신 3인산인, 태양〔1〕내지〔11〕중 어느 한 항에 기재된 라이브러리.
〔태양 13〕
상기 저분자 화합물과의 결합에 관여하고 있지 않은 아미노산 부위가 아래로부터 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산 이외인, 태양〔1〕내지〔12〕중 어느 한 항에 기재된 라이브러리：
H쇄：97, 100c, 101, 94, 95, 100d, 100e, 33, 50, 52, 56, 57, 58, 99, 100, 100a, 54, 55(Kabat 넘버링)；
L쇄：49, 55, 95c, 96, 95a, 95b(Kabat 넘버링).
〔태양 14〕
아래의 (a) 내지 (g)의 공정：
(a) 저분자 화합물의 비존재하에서 태양〔1〕내지〔13〕중 어느 한 항에 기재된 라이브러리를 항원에 접촉시키는 공정,
(b) 상기 공정 (a)에서 항원에 결합하지 않는 항원 결합 도메인을 선택하는 공정；
(c) 상기 공정 (b)에서 선택된 항원 결합 도메인을 저분자 화합물의 존재하에서 항원에 접촉시키는 공정；
(d) 상기 공정 (c)에서 항원에 결합한 항원 결합 도메인을 선택하는 공정；
(e) 상기 공정 (d)에서 선택된 항원 결합 도메인을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드에 연결시키는 공정；
(f) 상기 공정 (e)에서 얻어진 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된 벡터가 도입된 세포를 배양하는 공정；및
(g) 상기 공정 (f)에서 배양된 세포의 배양액으로부터 항원 결합 분자를 회수하는 공정
을 포함하는 저분자 화합물의 농도에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자의 제조방법.
〔태양 15〕
아래의 (a) 내지 (e)의 공정：
(a) 태양〔1〕내지〔13〕중 어느 한 항에 기재된 라이브러리를 저분자 화합물의 존재하에서 항원에 접촉시키는 공정；
(b) 상기 공정 (a)보다 저농도의 저분자 화합물로 항원 결합 도메인을 해리시켜 회수하는 공정；
(c) 상기 공정 (b)에서 회수된 항원 결합 도메인을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드에 연결시키는 공정；
(d) 상기 공정 (c)에서 얻어진 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된 벡터가 도입된 세포를 배양하는 공정；및
(e) 상기 공정 (d)에서 배양된 세포의 배양액으로부터 항원 결합 분자를 회수하는 공정
을 포함하는 저분자 화합물의 농도에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자의 제조방법.
〔태양 16〕
아래의 (a) 내지 (b)의 공정：
(a) 태양〔1〕내지〔13〕중 어느 한 항에 기재된 라이브러리를 저분자 화합물에 접촉시키는 공정；및
(b) 상기 공정 (a)에서 회수된 항원 결합 도메인을 선택하는 공정；
을 추가로 포함하는, 태양〔14〕또는〔15〕에 기재된 저분자 화합물의 농도에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자의 제조방법.
〔태양 17〕
상기 저분자 화합물이 키누레닌, 아데노신, 아데노신 1인산, 아데노신 2인산 또는 아데노신 3인산인, 태양〔14〕내지〔16〕중 어느 한 항에 기재된 항원 결합 분자의 제조방법.
〔태양 18〕
비천연 화합물의 농도에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자.
〔태양 19〕
태양〔18〕에 기재된 항원 결합 분자를 포함하는 의약 조성물.
상기의 1 또는 복수의 태양을 임의로 조합시킨 것도 당업자의 기술상식에 기초하여 기술적으로 모순되지 않는 한 본 발명에 포함되는 것이 당업자에게는 당연히 이해될 것이다.
본 발명의 저분자 화합물의 농도에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자 및 이를 포함하는 의약 조성물은 정상 조직이나 혈액 중에 있어서 전신적으로 작용하지 않고, 표적 조직에 있어서의 병변 부위인 암이나 염증 부위에 있어서 가역적으로 작용함으로써, 부작용을 회피하면서 약효를 발휘하여 당해 표적 조직에 기인하는 질환을 치료할 수 있다.
또한 본 발명의 서로 서열이 다른 복수의 저분자 화합물의 농도에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자를 포함하는 라이브러리를 사용하면, 전술한 바와 같은 조직 특이적인 질환의 치료에 유용한 다양한 항원 결합 분자를 단시간에 효율적으로 취득하는 것이 가능하다.
이러한 본 발명의 라이브러리의 일태양에 있어서는 저분자 화합물에 대한 결합에 관여하고 있지 않은 항원 결합 도메인의 아미노산 부위를 특정하여, 당해 부위의 아미노산이 1~수 종류의 아미노산이 되도록 서로 서열이 다른 항원 결합 도메인을 코드하는 핵산이 포함되는 라이브러리를 설계하는 것을 특징으로 하고, 이에 의해 비인간 포유동물의 면역에 의한 방법이나 인간 또는 비인간 동물 유래 항체 라이브러리를 이용하는 것보다도, 화합물 존재하에서 항원으로의 결합능이 변화되는 항원 결합 분자를 효율적으로 취득 가능한 라이브러리가 제공된다.
도 1은 저분자가 존재하지 않는 정상의 환경에 있어서는 저분자 스위치 항체(Small molecule switch antibody)가 항원에 결합하지 않고, 저분자가 고농도로 존재하는 표적 조직에서는 항원에 결합하는 것을 나타내는 도면이다.
도 2는 저분자 항체와 항원의 복합체 사이에 끼임으로써 저분자가 스위치 기능을 하는 것을 나타내는 도면이다. 저분자가 존재하지 않으면 항체와 항원의 상호작용이 불충분해져 항체는 항원에 결합하는 것이 불가능하나, 저분자가 존재하면 항체와 항원 사이에 끼임으로써 항체는 항원에 결합하는 것이 가능해진다.
도 3은 토끼에 대한 면역에 사용한 아데노신 아날로그인 2'-아데노신-PEG-펩티드의 구조를 나타내는 도면이다.
도 4는 토끼에 대한 면역에 사용한 아데노신 아날로그인 5'-아데노신-PEG-펩티드의 구조를 나타내는 도면이다.
도 5는 토끼에 대한 면역에 사용한 아데노신 아날로그의 펩티드 부분을 비오틴으로 치환한 2'-아데노신-PEG-비오틴의 구조를 나타내는 도면이다.
도 6은 토끼에 대한 면역에 사용한 아데노신 아날로그의 펩티드 부분을 비오틴으로 치환한 5'-아데노신-PEG-비오틴의 구조를 나타내는 도면이다.
도 7은 토끼 B세포 클로닝으로부터 얻어진 각 항체의 2'-아데노신-PEG-비오틴에 대한 결합 활성의 비교 결과를 나타내는 도면이다. 각 항체를 2'-아데노신-PEG-비오틴과 상호작용시켰을 때의 결합량을 각 항체의 캡쳐량(RU)으로 나눈 값(N_binding_100)을 세로축에, 2'-아데노신-PEG-비오틴의 상호작용 후에 각 항체로부터 2'-아데노신-PEG-비오틴이 해리된 60초 후의 값을 각 항체의 캡쳐량(RU)으로 나눈 값(N_stability_100)을 가로축에 나타낸다.
도 8a는 클론 SMB0002가 아데노신에 결합하는 것(상호작용)을 나타내는 표면 플라즈몬 공명 분석의 센서그램이다. 센서그램은 위로부터 순서대로 100(Duplicate), 50, 25, 12.5, 6.25, 3.13 nM의 아데노신과 SMB0002의 상호작용을 나타내고 있다.
도 8b는 클론 SMB0002가 ATP에 결합하는 것(상호작용)을 나타내는 표면 플라즈몬 공명 분석의 센서그램이다. 센서그램은 위로부터 순서대로 5000, 1250, 313, 78.1 nM의 ATP와 SMB0002의 상호작용을 나타내고 있다.
도 9는 클론 SMB0002가 아데노신 및 ATP에 결합하는 것을 나타태는 경합 ELISA의 결과를 나타내는 도면이다.
도 10a는 클론 SMB0002가 AMP에 결합하는 것(상호작용)을 나타내는 표면 플라즈몬 공명 분석의 센서그램이다. 센서그램은 위로부터 순서대로 500, 250(Duplicate), 125, 62.5, 31.3, 15.6, 7.81 μM의 AMP와 SMB0002의 상호작용을 나타내고 있다.
도 10b는 클론 SMB0002가 ADP에 결합하는 것(상호작용)을 나타내는 표면 플라즈몬 공명 분석의 센서그램이다. 센서그램은 위로부터 순서대로 2000, 1000(Duplicate), 500, 250, 125, 62.5, 31.3 μM의 ADP와 SMB0002의 상호작용을 나타내고 있다.
도 11a는 SMB0002 항체와 아데노신의 아데닌 고리 부분의 결합 양식을 나타내는 도면이다. 도면 중 당해 항체의 H쇄를 굵은 선으로, L쇄를 가는 선으로, 아데노신을 공-막대 모형으로 나타낸다. 아데닌 고리로부터 3.8Å 이내의 아미노산 잔기를 막대 모형으로 나타내었다. 파선은 당해 항체와 아데닌 고리 부분 사이에 있어서 3.2Å 이내의 거리에 있는 수소결합을 나타내고 있다.
도 11b는 SMB0002 항체와 아데노신의 리보오스 부분으로의 결합 양식을 나타내는 도면이다. 도면 중 당해 항체의 H쇄를 굵은 선으로, L쇄를 가는 선으로, 아데노신을 공-막대 모형으로 나타낸다. 리보오스 부분으로부터 3.8Å 이내의 아미노산 잔기를 막대 모형으로 나타내었다. 파선은 당해 항체와 리보오스 부분 사이에 있어서 3.2Å 이내의 거리에 있는 수소결합을 나타내고 있다. 점선영역 내는 AMP 결합 시에 예상되는 인산기의 존재영역을 나타낸다.
도 12는 인간화 SMB0002가 아데노신에 결합하는 것(상호작용)을 나타내는 표면 플라즈몬 공명 분석의 센서그램이다. 센서그램은 위로부터 순서대로 200, 100, 50(duplicate), 25, 12.5, 6.25, 3.125 nM의 아데노신과 인간화 SMB0002의 상호작용을 나타내고 있다.
도 13은 인간화 SMB0002가 AMP에 결합하는 것(상호작용)을 나타내는 표면 플라즈몬 공명 분석의 센서그램이다. 센서그램은 위로부터 순서대로 500, 250, 125(duplicate), 62.5, 31.3, 15.6, 7.8 μM의 AMP와 인간화 SMB0002의 상호작용을 나타내고 있다.
도 14는 인간화 SMB0002가 ADP에 결합하는 것(상호작용)을 나타내는 표면 플라즈몬 공명 분석의 센서그램이다. 센서그램은 위로부터 순서대로 1000(duplicate), 500, 250, 125, 62,5 μM의 ADP와 인간화 SMB0002의 상호작용을 나타내고 있다.
도 15는 인간화 SMB0002가 ATP에 결합하는 것(상호작용)을 나타내는 표면 플라즈몬 공명 분석의 센서그램이다. 센서그램은 위로부터 순서대로 1000(duplicate), 500, 250, 125, 62.5 μM의 ATP와 인간화 SMB0002의 상호작용을 나타내고 있다.
도 16은 클론 6RNMSC1-2_F02의 인간 IL-6R에 대한 결합 ELISA의 결과를 나타내는 도면이다. 세로축은 각 저분자의 유무에 따라 항체의 인간 IL-6R로의 결합 활성을 평가한 흡광도의 값이다.
도 17은 클론 6RNMSC1-3_G02의 인간 IL-6R에 대한 결합 ELISA의 결과를 나타내는 도면이다. 세로축은 각 저분자의 유무에 따라 항체의 인간 IL-6R로의 결합 활성을 평가한 흡광도의 값이다.
도 18은 항체의 인간 IL-6R에 대한 결합 ELISA의 결과를 나타내는 도면이다. 세로축은 각 아미노산 또는 아미노산 대사물의 유무에 따라 항체의 인간 IL-6R로의 결합 활성을 평가한 흡광도의 값이다.
도 19는 100 μmol/L 키누레닌(kynurenine) 존재하, 10 mmol/L ATP 존재하, 키누레닌, ATP 비존재하에 있어서의 6RNMSC1-2_F02와 1 μmol/L IL-6R의 상호작용의 센서그램이다. 실선은 키누레닌 존재하의 상호작용, 점선은 ATP 존재하의 상호작용 및 파선은 이들 비존재하의 상호작용을 나타낸다.
도 20은 센서칩 CM5에 고정화한 IL-6R에 대해 100 μmol/L 키누레닌 존재하에서 6RNMSC1-2_F02를 상호작용시키고, 그 후 100 μmol/L 키누레닌을 포함하는 버퍼 또는 키누레닌을 포함하지 않는 버퍼 조건하에 있어서의 6RNMSC1-2_F02의 IL-6R로부터의 해리를 관찰한 그래프이다. 도면의 세로축은 100 μmol/L 키누레닌 존재하에서의 6RNMSC1-2_F02의 결합량을 100으로 하여 정규화한 값을, 가로축은 상호작용 개시 후로부터의 경과시간(초)을 나타낸다. 실선은 키누레닌 존재하에 있어서의 6RNMSC1-2_F02의 IL-6R로부터의 해리, 점선은 키누레닌 비존재하에 있어서의 6RNMSC1-2_F02의 IL-6R로부터의 해리를 나타낸다.
도 21은 5 ㎍/L의 6RNMSC1-2_F02를 애널라이트로서 180초간 상호작용시키고, 센서칩 CM5 상에 고정화한 IL-6R에 대한 리스폰스를 평가한 그래프이다. 세로축은 6RNMSC1-2_F02를 상호작용시킨 전후에서의 리스폰스의 변화(RU), 가로축은 용액 중에 포함되는 키누레닌 농도(μmol/L)를 나타낸다.
도 22는 클론 6RNMSC1-2_F02가 키누레닌에 결합하는 것(상호작용)을 나타내는 표면 플라즈몬 공명 분석의 센서그램이다. 센서그램은 위로부터 순서대로 1.25, 0.625, 0.313, 0.156, 0.078, 0.039 mM의 키누레닌과 6RNMSC1-2_F02의 상호작용을 나타내고 있다. 또한 키네틱 파라미터는 ka=709(1/s), kd=0.17(1/s), KD=0.239(mmol/L)이다.
도 23은 클론 6RNMSC1-2_F02가 3-히드록시-DL-키누레닌에 결합하는 것(상호작용)을 나타내는 표면 플라즈몬 공명 분석의 센서그램이다. 센서그램은 위로부터 순서대로 0.625, 0.313, 0.156, 0.078, 0.039 mM의 3-히드록시-DL-키누레닌과 6RNMSC1-2_F02의 상호작용을 나타내고 있다.
도 24는 클론 6RNMSC1-2_F02가 화합물 RO0635389-000-001에 결합하는 것(상호작용)을 나타내는 표면 플라즈몬 공명 분석의 센서그램이다. 센서그램은 위로부터 순서대로 0.625, 0.313, 0.156 mM의 화합물 RO0635389-000-001과 6RNMSC1-2_F02의 상호작용을 나타내고 있다.
도 25는 클론 6RNMSC1-2_F02가 화합물 RO0635390-000-001에 결합하는 것(상호작용)을 나타내는 표면 플라즈몬 공명 분석의 센서그램이다. 센서그램은 위로부터 순서대로 0.625, 0.313, 0.156 mM의 화합물 RO0635390-000-001과 6RNMSC1-2_F02의 상호작용을 나타내고 있다.
도 26은 클론 6RNMSC1-2_F02가 키누레닌의 존재하(실선) 비존재하(파선)에 따라 IL6R로의 결합(상호작용)이 변화되는 것을 나타내는 옥텟(Octet)의 센서그램이다. 세로축은 IL6R에 대한 리스폰스를 나타낸다.
도 27은 클론 6RNMSC1-2_F02가 3-히드록시-DL-키누레닌의 존재하(실선) 비존재하(파선)에 따라 IL6R로의 결합(상호작용)이 변화되는 것을 나타내는 옥텟의 센서그램이다. 세로축은 IL6R에 대한 리스폰스를 나타낸다.
도 28은 클론 6RNMSC1-2_F02가 화합물 RO0635389-000-001의 존재하(실선) 비존재하(파선)에 따라 IL6R로의 결합(상호작용)이 변화되는 것을 나타내는 옥텟의 센서그램이다. 세로축은 IL6R에 대한 리스폰스를 나타낸다.
도 29는 클론 6RNMSC1-2_F02가 화합물 RO0635390-000-001의 존재하(실선) 비존재하(파선)에 따라 IL6R로의 결합(상호작용)이 변화되는 것을 나타내는 옥텟의 센서그램이다. 세로축은 IL6R에 대한 리스폰스를 나타낸다.
도 30은 6RNMSC1-2_F02 Fab 프래그먼트와 키누레닌의 결합 양식을 나타내는 도면이다. 도면 중 당해 항체의 H쇄를 굵은 선으로, L쇄를 가는 선으로, 키누레닌을 공-막대 모형으로 나타낸다. 키누레닌으로부터 3.8Å 이내의 아미노산 잔기를 막대 모형으로 나타내었다. 파선은 당해 항체와 키누레닌 사이에 있어서 3.3Å 이내의 거리에 있는 수소결합 정전상호작용을 나타내고 있다.
도 31은 클론 6RNMSC1-2_F02의 H49Y 개변체가 키누레닌에 결합하는 것(상호작용)을 나타내는 표면 플라즈몬 공명 분석의 센서그램이다. 센서그램은 위로부터 순서대로 1.25, 0.625, 0.313, 0.156, 0.078, 0.039 mM의 키누레닌과 6RNMSC1-2_F02H49Y의 상호작용을 나타내고 있다. 또한 키네틱스 파라미터는 ka=2543(1/s), kd=0.24(1/s), KD=0.095(mmol/L)이다.
도 32는 6RNMSC1-2_F02의 프레임워크 서열에 대해 생식세포계열 서열로 되돌리기 위한 변이가 도입된 클론 F02h011/F02l003이 키누레닌에 결합하는 것(상호작용)을 나타내는 표면 플라즈몬 공명 분석의 센서그램이다. 센서그램은 위로부터 순서대로 1000, 500, 250, 125, 62.5 μM의 키누레닌과 F02h011/F02l003의 상호작용을 나타내고 있다.
도 33은 F02h011/F02l003에 대해 키누레닌으로의 결합을 증강시키는 개변이 도입된 클론 F02h011/F02l098이 키누레닌에 결합하는 것(상호작용)을 나타내는 표면 플라즈몬 공명 분석의 센서그램이다. 센서그램은 위로부터 순서대로 500, 250, 125, 62.5, 31.3, 15.6 μM의 키누레닌과 F02h011/F02l098의 상호작용을 나타내고 있다.
도 34는 6RNMSC1-2_F02 Fab 프래그먼트와 키누레닌의 결합 양식을 나타내는 도면이다. 도면 중 당해 항체의 중쇄를 검정색 굵은 선으로, 경쇄를 회색 가는 선으로, 키누레닌을 공-막대 모형으로 나타낸다. 키누레닌으로부터 4.2Å 이내의 아미노산 잔기를 막대 모형으로 나타내었다.
도 35는 6RNMSC1-2_F02 Fab 프래그먼트와 키누레닌의 결합 양식을 나타내는 도면이다. 도면 중 당해 항체의 중쇄를 검정색 굵은 선으로, 경쇄를 회색 가는 선으로, 키누레닌을 공-막대 모형으로 나타낸다. 경쇄 Ser56(kabat 넘버링)을 막대 모형으로 나타내었다. 파선과 파선 상의 숫자는 경쇄 Ser56과 키누레닌 사이의 비수소원자 간의 최단거리를 나타내고 있다.
도 36은 6RNMSC1-2_F02 Fab 프래그먼트와 키누레닌의 결합 양식을 나타내는 도면이다. 도면 중 당해 항체의 중쇄를 검정색 굵은 선으로, 경쇄를 회색 가는 선으로, 키누레닌을 공-막대 모형으로 나타낸다. 중쇄 Gly50 및 경쇄 Asp28(kabat 넘버링)을 막대 모형으로 나타내었다.
도 37은 센서칩 CM5 상에 고정화한 IL-6R에 대한 각 저분자 1 mM 존재하·비존재하에서 각 클론 1 μM를 120초간 상호작용시켰을 때의 결합량(Binding response(RU))을 나타내는 그래프이다.
도 38은 옥텟 센서 상에 고정화한 IL-6R에 대한 각 저분자 1 mM 존재하·비존재하에서 각 클론 10 ㎍/mL를 120초간 상호작용시켰을 때의 결합량(Binding response(RU))을 나타내는 그래프이다.
도 39는 키누레닌 라이브러리 Ver.A로부터 취득된 클론 6RFHm12-4_040, 6RFHm12-4_078, 6RFHm14-4_087, 6RFHm14-4_093, 6RFHm17-4_006, 6RFHm17-4_010의 hIL-6R에 대한 각 조건하에서의 ELISA의 결과를 나타내는 도면이다. 양성 대조(Positive control)로서 6RNMSC1-2_F02를 사용하였다. 세로축은 항체의 hIL-6R로의 결합 활성을 평가한 흡광도의 값이다. 각 조건의 상세는 표 38에 나타내었다.
도 40은 키누레닌 라이브러리 Ver.A로부터 취득된 클론 hIAFHm12-4_018, hIAFHm12-4_061, hIAFHm14-4_001, hIAFHm14-4_041, hIAFHm17-4_026, hIAFHm17-4_072의 hIgA-Fc에 대한 각 조건하에서의 ELISA의 결과를 나타내는 도면이다. 세로축은 항체의 hIgA-Fc로의 결합 활성을 평가한 흡광도의 값이다. 각 조건의 상세는 표 41에 나타내었다.
도 41은 키누레닌 라이브러리 Ver.A로부터 취득된 클론 I6FHm12-4_068, I6FHm12-4_094, I6FHm14-4_007, I6FHm14-4_030, I6FHm17-4_016, I6FHm17-4_036의 hIL-6에 대한 각 조건하에서의 ELISA의 결과를 나타내는 도면이다. 세로축은 항체의 hIL-6으로의 결합 활성을 평가한 흡광도의 값이다. 각 조건의 상세는 표 44에 나타내었다.
도 42는 ATNLSA1-4_D12의 비오틴 표지 항원(5'-아데노신-PEG-비오틴, ATP-PEG-비오틴의 혼합) 결합에 대한 ATP에 의한 저해능을 평가한 도면이다.
도 43은 스위치가 되는 저분자가 항체와 항원 사이에 끼이고, 항원과 접하는 항체 가변영역 부분을 라이브러리화함으로써 임의의 항원에 대해 저분자 스위치 항체를 취득할 수 있는 합리적으로 설계된 항체 라이브러리(rationally designed antibody library)의 개념을 나타내는 도면이다.
도 44는 ATP/아데노신에 결합하는 항체를 주형으로 한 합리적으로 설계된 항체 라이브러리로부터 얻어진 클론 I6RLSA1-6_011의 인간 IL-6에 대한 ATP 및 아데노신 10 mM의 존재/비존재하에 있어서의 ELISA의 결과를 나타내는 도면이다. 세로축은 항체의 인간 IL-6으로의 결합 활성을 평가한 흡광도의 값이다. 양성 대조로는 합리적으로 설계된 항체 라이브러리로부터 얻어진 저분자의 존재/비존재에 상관없이 인간 IL-6에 결합 활성을 나타내는 클론을 사용하였다. 음성 대조(Negative Control)로는 M13KO7 헬퍼 파지를 사용하였다.
도 45는 ATP/아데노신에 결합하는 항체를 주형으로 한 합리적으로 설계된 항체 라이브러리로부터 얻어진 클론 6RRLSA1-6_037, 6RRLSA1-6_045의 인간 IL-6 수용체에 대한 ATP 및 아데노신 10 mM의 존재/비존재하에 있어서의 ELISA의 결과를 나타내는 도면이다. 세로축은 항체의 인간 IL-6 수용체로의 결합 활성을 평가한 흡광도의 값이다. 음성 대조(도면 중 nega로 기재)로는 M13KO7 헬퍼 파지를 사용하였다.
도 46은 합리적으로 설계된 항체 라이브러리로부터 얻어진 클론 HSADSA1-6_020의 HSA에 대한 ATP 및 아데노신 10 mM의 존재 또는 비존재하에 있어서의 ELISA의 결과를 나타내는 도면이다. 세로축은 항체의 HSA로의 결합 활성을 평가한 흡광도의 값이다. 양성 대조로는 합리적으로 설계된 항체 라이브러리로부터 얻어진 저분자의 존재/비존재에 상관없이 HSA에 결합 활성을 나타내는 클론을 사용하였다. 음성 대조로는 M13KO7 헬퍼 파지를 사용하였다.
아래의 정의 및 상세한 설명은 본 명세서에 있어서 설명하는 본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해 제공된다.
아미노산
본 명세서에 있어서 예를 들면 Ala/A, Leu/L, Arg/R, Lys/K, Asn/N, Met/M, Asp/D, Phe/F, Cys/C, Pro/P, Gln/Q, Ser/S, Glu/E, Thr/T, Gly/G, Trp/W, His/H, Tyr/Y, Ile/I, Val/V로 나타내어지는 바와 같이, 아미노산은 1문자 코드 또는 3문자 코드, 또는 그 양쪽으로 표기되고 있다.
아미노산의 개변
항원 결합 분자의 아미노산 서열 중의 아미노산의 개변을 위해서는 부위 특이적 변이 유발법(Kunkel 등(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492))이나 중복 연장 PCR(Overlap extension PCR) 등의 공지의 방법이 적절히 채용될 수 있다. 또한 천연 아미노산 이외의 아미노산으로 치환하는 아미노산의 개변방법으로서, 복수의 공지의 방법도 또한 채용될 수 있다(Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100(11), 6353-6357). 예를 들면 종지 코돈의 하나인 UAG 코돈(앰버 코돈)의 상보적 앰버 서프레서 tRNA에 비천연 아미노산이 결합된 tRNA가 포함되는 무세포 번역계 시스템(Clover Direct(Protein Express)) 등도 적합하게 사용된다.
본 명세서에 있어서 아미노산의 개변 부위를 나타낼 때 사용되는 「및/또는」이라는 용어의 의의는 「및」과 「또는」이 적절히 조합된 모든 조합을 포함한다. 구체적으로는, 예를 들면 「33번 위치, 55번 위치 및/또는 96번 위치의 아미노산이 치환되어 있는」이란 아래의 아미노산의 개변의 변형이 포함된다；
(a) 33번 위치, (b) 55번 위치, (c) 96번 위치, (d) 33번 위치 및 55번 위치, (e) 33번 위치 및 96번 위치, (f) 55번 위치 및 96번 위치, (g) 33번 위치, 55번 위치 및 96번 위치.
본 명세서에 있어서 또한 아미노산의 개변을 나타내는 표현으로서, 특정 위치를 나타내는 숫자 앞뒤에 개변 전과 개변 후의 아미노산의 1문자 코드 또는 3문자 코드를 병기한 표현이 적절히 사용될 수 있다. 예를 들면 항체 가변영역에 포함되는 아미노산의 치환을 가할 때에 사용되는 N100bL 또는 Asn100bLeu라는 개변은 Kabat 넘버링으로 표시되는 100b 위치의 Asn의 Leu로의 치환을 나타낸다. 즉, 숫자는 Kabat 넘버링으로 표시되는 아미노산의 위치를 나타내고, 그 앞에 기재되는 아미노산의 1문자 코드 또는 3문자 코드는 치환 전의 아미노산, 그 뒤에 기재되는 아미노산의 1문자 코드 또는 3문자 코드는 치환 후의 아미노산을 나타낸다. 마찬가지로 항체 불변영역에 포함되는 Fc영역에 아미노산의 치환을 가할 때에 사용되는 P238D 또는 Pro238Asp라는 개변은 EU 넘버링으로 표시되는 238번 위치의 Pro의 Asp로의 치환을 나타낸다. 즉, 숫자는 EU 넘버링으로 표시되는 아미노산의 위치를 나타내고, 그 앞에 기재되는 아미노산의 1문자 코드 또는 3문자 코드는 치환 전의 아미노산, 그 뒤에 기재되는 아미노산의 1문자 코드 또는 3문자 코드는 치환 후의 아미노산을 나타낸다.
항원
본 명세서에 있어서 「항원」은 항원 결합 도메인이 결합하는 에피토프를 포함하는 한 그 구조는 특정 구조에 한정되지 않는다. 다른 의미로는 항원은 무기물일 수도 있고 유기물일 수도 있다. 항원으로서는 하기와 같은 분자；17-IA, 4-1 BB, 4Dc, 6-케토-PGF1a, 8-이소-PGF2a, 8-옥소-dG, A1 아데노신 수용체, A33, ACE, ACE-2, 액티빈, 액티빈 A, 액티빈 AB, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 RIA, 액티빈 RIA ALK-2, 액티빈 RIB ALK-4, 액티빈 RIIA, 액티빈 RIIB, ADAM, ADAM10, ADAM12, ADAM15, ADAM17/TACE, ADAM8, ADAM9, ADAMTS, ADAMTS4, ADAMTS5, 아드레신(Addressins), aFGF, ALCAM, ALK, ALK-1, ALK-7, 알파-1-안티트립신, 알파-V/베타-1 안타고니스트, ANG, Ang, APAF-1, APE, APJ, APP, APRIL, AR, ARC, ART, 아르테민, 항Id, ASPARTIC, 심방성 나트륨 이뇨인자, av/b3 인테그린, Axl, b2M, B7-1, B7-2, B7-H, B-림프구 자극인자(BlyS), BACE, BACE-1, Bad, BAFF, BAFF-R, Bag-1, BAK, Bax, BCA-1, BCAM, Bcl, BCMA, BDNF, b-ECGF, bFGF, BID, Bik, BIM, BLC, BL-CAM, BLK, BMP, BMP-2 BMP-2a, BMP-3 오스테오게닌(Osteogenin), BMP-4 BMP-2b, BMP-5, BMP-6 Vgr-1, BMP-7(OP-1), BMP-8(BMP-8a, OP-2), BMPR, BMPR-IA(ALK-3), BMPR-IB(ALK-6), BRK-2, RPK-1, BMPR-II(BRK-3), BMP, b-NGF, BOK, 봄베신, 뼈 유래 신경 영양인자(Bone-derived neurotrophic factor), BPDE, BPDE-DNA, BTC, 보체인자 3(C3), C3a, C4, C5, C5a, C10, CA125, CAD-8, 칼시토닌, cAMP, 암 태아성 항원(CEA), 암 관련 항원, 카텝신 A, 카텝신 B, 카텝신 C/DPPI, 카텝신 D, 카텝신 E, 카텝신 H, 카텝신 L, 카텝신 O, 카텝신 S, 카텝신 V, 카텝신 X/Z/P, CBL, CCI, CCK2, CCL, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9/10, CCR, CCR1, CCR10, CCR10, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CD1, CD2, CD3, CD3E, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD27L, CD28, CD29, CD30, CD30L, CD32, CD33(p67 단백질), CD34, CD38, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD49a, CD52, CD54, CD55, CD56, CD61, CD64, CD66e, CD74, CD80(B7-1), CD89, CD95, CD123, CD137, CD138, CD140a, CD146, CD147, CD148, CD152, CD164, CEACAM5, CFTR, cGMP, CINC, 보툴리눔 독소(Botulinum toxin), 웰치균 독소(Clostridium perfringens toxin), CKb8-1, CLC, CMV, CMV UL, CNTF, CNTN-1, COX, C-Ret, CRG-2, CT-1, CTACK, CTGF, CTLA-4, PD1, PDL1, LAG3, TIM3, 갈렉틴-9(galectin-9), CX3CL1, CX3CR1, CXCL, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCR, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, 사이토케라틴 종양 관련 항원, DAN, DCC, DcR3, DC-SIGN, 보체 제어인자(Decay accelerating factor), des(1-3)-IGF-I(뇌 IGF-1), Dhh, 디곡신, DNAM-1, Dnase, Dpp, DPPIV/CD26, Dtk, ECAD, EDA, EDA-A1, EDA-A2, EDAR, EGF, EGFR(ErbB-1), EMA, EMMPRIN, ENA, 엔도텔린 수용체, 엔케팔리나제, eNOS, Eot, 에오탁신 1, EpCAM, 에프린 B2/EphB4, EPO, ERCC, E-셀렉틴, ET-1, 팩터 IIa, 팩터 VII, 팩터 VIIIc, 팩터 IX, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP), Fas, FcR1, FEN-1, 페리틴, FGF, FGF-19, FGF-2, FGF3, FGF-8, FGFR, FGFR-3, 피브린, FL, FLIP, Flt-3, Flt-4, 난포 자극 호르몬, 프랙탈카인, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, G250, Gas6, GCP-2, GCSF, GD2, GD3, GDF, GDF-1, GDF-3(Vgr-2), GDF-5(BMP-14, CDMP-1), GDF-6(BMP-13, CDMP-2), GDF-7(BMP-12, CDMP-3), GDF-8(미오스타틴), GDF-9, GDF-15(MIC-1), GDNF, GDNF, GFAP, GFRa-1, GFR-알파 1, GFR-알파 2, GFR-알파 3, GITR, 글루카곤, Glut4, 당단백질IIb/IIIa(GPIIb/IIIa), GM-CSF, gp130, gp72, GRO, 성장 호르몬 방출인자, 합텐(NP-cap 또는 NIP-cap), HB-EGF, HCC, HCMV gB 엔벨로프 당단백질, HCMV gH 엔벨로프 당단백질, HCMV UL, 조혈 성장 인자(HGF), Hep B gp120, 헤파라나제, Her2, Her2/neu(ErbB-2), Her3(ErbB-3), Her4(ErbB-4), 단순 헤르페스 바이러스(HSV) gB 당단백질, HSV gD 당단백질, HGFA, 고분자량 흑색종 관련 항원(HMW-MAA), HIV gp120, HIV IIIB gp 120 V3 루프, HLA, HLA-DR, HM1.24, HMFG PEM, HRG, Hrk, 인간 심장 미오신, 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV), 인간 성장 호르몬(HGH), HVEM, I-309, IAP, ICAM, ICAM-1, ICAM-3, ICE, ICOS, IFNg, Ig, IgA 수용체, IgE, IGF, IGF 결합 단백질, IGF-1R, IGFBP, IGF-I, IGF-II, IL, IL-1, IL-1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-5R, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-18R, IL-21, IL-23, IL-27, 인터페론(INF)-알파, INF-베타, INF-감마, 인히빈, iNOS, 인슐린 A쇄, 인슐린 B쇄, 인슐린 유사 증식 인자 1, 인테그린 알파 2, 인테그린 알파 3, 인테그린 알파 4, 인테그린 알파 4/베타 1, 인테그린 알파 4/베타 7, 인테그린 알파 5(알파 V), 인테그린 알파 5/베타 1, 인테그린 알파 5/베타 3, 인테그린 알파 6, 인테그린 베타 1, 인테그린 베타 2, 인터페론 감마, IP-10, I-TAC, JE, 칼리크레인 2, 칼리크레인 5, 칼리크레인 6, 칼리크레인 11, 칼리크레인 12, 칼리크레인 14, 칼리크레인 15, 칼리크레인 L1, 칼리크레인 L2, 칼리크레인 L3, 칼리크레인 L4, KC, KDR, 케라티노사이트 증식 인자(KGF), 라미닌 5, LAMP, LAP, LAP(TGF-1), 잠재적 TGF-1, 잠재적 TGF-1 bp1, LBP, LDGF, LECT2, 레프티, 루이스-Y 항원, 루이스-Y 관련 항원, LFA-1, LFA-3, Lfo, LIF, LIGHT, 리포단백질, LIX, LKN, Lptn, L-셀렉틴, LT-a, LT-b, LTB4, LTBP-1, 폐 표면, 황체 형성 호르몬, 림포톡신 베타 수용체, Mac-1, MAdCAM, MAG, MAP2, MARC, MCAM, MCAM, MCK-2, MCP, M-CSF, MDC, Mer, METALLOPROTEASES, MGDF 수용체, MGMT, MHC(HLA-DR), MIF, MIG, MIP, MIP-1-알파, MK, MMAC1, MMP, MMP-1, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-2, MMP-24, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MPIF, Mpo, MSK, MSP, 뮤신(Muc1), MUC18, 뮬러리안 억제 물질, Mug, MuSK, NAIP, NAP, NCAD, N-C 아드헤린, NCA 90, NCAM, NCAM, 네프릴리신, 뉴로트로핀-3, -4, 또는 -6, 뉴르투린, 신경 성장 인자(NGF), NGFR, NGF-베타, nNOS, NO, NOS, Npn, NRG-3, NT, NTN, OB, OGG1, OPG, OPN, OSM, OX40L, OX40R, p150, p95, PADPr, 부갑상선 호르몬, PARC, PARP, PBR, PBSF, PCAD, P-카드헤린, PCNA, PDGF, PDGF, PDK-1, PECAM, PEM, PF4, PGE, PGF, PGI2, PGJ2, PIN, PLA2, 태반성 알칼리포스파타아제(PLAP), PlGF, PLP, PP14, 프로인슐린, 프로릴랙신(prorelaxin), 프로테인 C, PS, PSA, PSCA, 전립선 특이적 막항원(PSMA), PTEN, PTHrp, Ptk, PTN, R51, RANK, RANKL, RANTES, RANTES, 릴랙신 A쇄, 릴랙신 B쇄, 레닌, 호흡기 다핵체 바이러스(RSV)F, RSV Fgp, Ret, 류머티즘 인자, RLIP76, RPA2, RSK, S100, SCF/KL, SDF-1, SERINE, 혈청 알부민, sFRP-3, Shh, SIGIRR, SK-1, SLAM, SLPI, SMAC, SMDF, SMOH, SOD, SPARC, Stat, STEAP, STEAP-II, TACE, TACI, TAG-72(종양 관련 당단백질-72), TARC, TCA-3, T세포 수용체(예를 들면 T세포 수용체 알파/베타), TdT, TECK, TEM1, TEM5, TEM7, TEM8, TERT, 고환 PLAP 유사 알칼리포스파타아제, TfR, TGF, TGF-알파, TGF-베타, TGF-베타 Pan Specific, TGF-베타RI(ALK-5), TGF-베타RII, TGF-베타RIIb, TGF-베타RIII, TGF-베타 1, TGF-베타 2, TGF-베타 3, TGF-베타 4, TGF-베타 5, 트롬빈, 흉선 Ck-1, 갑상선 자극 호르몬, Tie, TIMP, TIQ, 조직인자, TMEFF2, Tmpo, TMPRSS2, TNF, TNF-알파, TNF-알파베타, TNF-베타 2, TNFc, TNF-RI, TNF-RII, TNFRSF10A(TRAIL R1 Apo-2, DR4), TNFRSF10B(TRAIL R2 DR5, KILLER, TRICK-2A, TRICK-B), TNFRSF10C(TRAIL R3 DcR1, LIT, TRID), TNFRSF10D(TRAIL R4 DcR2, TRUNDD), TNFRSF11A(RANK ODF R, TRANCE R), TNFRSF11B(OPG OCIF, TR1), TNFRSF12(TWEAK R FN14), TNFRSF13B(TACI), TNFRSF13C(BAFF R), TNFRSF14(HVEM ATAR, HveA, LIGHT R, TR2), TNFRSF16(NGFR p75NTR), TNFRSF17(BCMA), TNFRSF18(GITR AITR), TNFRSF19(TROY TAJ, TRADE), TNFRSF19L(RELT), TNFRSF1A(TNF RI CD120a, p55-60), TNFRSF1B(TNF RII CD120b, p75-80), TNFRSF26(TNFRH3), TNFRSF3(LTbR TNF RIII, TNFC R), TNFRSF4(OX40 ACT35, TXGP1 R), TNFRSF5(CD40 p50), TNFRSF6(Fas Apo-1, APT1, CD95), TNFRSF6B(DcR3 M68, TR6), TNFRSF7(CD27), TNFRSF8(CD30), TNFRSF9(4-1BB CD137, ILA), TNFRSF21(DR6), TNFRSF22(DcTRAIL R2 TNFRH2), TNFRST23(DcTRAIL R1 TNFRH1), TNFRSF25(DR3 Apo-3, LARD, TR-3, TRAMP, WSL-1), TNFSF10(TRAIL Apo-2 리간드, TL2), TNFSF11(TRANCE/RANK 리간드 ODF, OPG 리간드), TNFSF12(TWEAK Apo-3 리간드, DR3 리간드), TNFSF13(APRIL TALL2), TNFSF13B(BAFF BLYS, TALL1, THANK, TNFSF20), TNFSF14(LIGHT HVEM 리간드, LTg), TNFSF15(TL1A/VEGI), TNFSF18(GITR 리간드 AITR 리간드, TL6), TNFSF1A(TNF-a 코넥틴(Conectin), DIF, TNFSF2), TNFSF1B(TNF-b LTa, TNFSF1), TNFSF3(LTb TNFC, p33), TNFSF4(OX40 리간드 gp34, TXGP1), TNFSF5(CD40 리간드 CD154, gp39, HIGM1, IMD3, TRAP), TNFSF6(Fas 리간드 Apo-1 리간드, APT1 리간드), TNFSF7(CD27 리간드 CD70), TNFSF8(CD30 리간드 CD153), TNFSF9(4-1BB 리간드 CD137 리간드), TP-1, t-PA, Tpo, TRAIL, TRAIL R, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRANCE, 트랜스페린 수용체, TRF, Trk, TROP-2, TLR1(Toll-like receptor 1), TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TSG, TSLP, 종양 관련 항원 CA125, 종양 관련 항원 발현 루이스 Y 관련 탄수화물, TWEAK, TXB2, Ung, uPAR, uPAR-1, 우로키나아제, VCAM, VCAM-1, VECAD, VE-카드헤린, VE-카드헤린-2, VEFGR-1(flt-1), VEGF, VEGFR, VEGFR-3(flt-4), VEGI, VIM, 바이러스 항원, VLA, VLA-1, VLA-4, VNR 인테그린, 폰빌레브란트 인자, WIF-1, WNT1, WNT2, WNT2B/13, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9A, WNT9B, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16, XCL1, XCL2, XCR1, XCR1, XEDAR, XIAP, XPD, HMGB1, IgA, Aβ, CD81, CD97, CD98, DDR1, DKK1, EREG, Hsp90, IL-17/IL-17R, IL-20/IL-20R, 산화 LDL, PCSK9, 프리칼리크레인(prekallikrein), RON, TMEM16F, SOD1, 크로모그라닌 A(Chromogranin A), 크로모그라닌 B, tau, VAP1, 고분자 키니노겐, IL-31, IL-31R, Nav1.1, Nav1.2, Nav1.3, Nav1.4, Nav1.5, Nav1.6, Nav1.7, Nav1.8, Nav1.9, EPCR, C1, C1q, C1r, C1s, C2, C2a, C2b, C3, C3a, C3b, C4, C4a, C4b, C5, C5a, C5b, C6, C7, C8, C9, 팩터 B, 팩터 D, 팩터 H, 프로퍼딘(properdin), 스클레로스틴(sclerostin), 피브리노겐(fibrinogen), 피브린(fibrin), 프로트롬빈(prothrombin), 트롬빈(thrombin), 조직인자, 팩터 V, 팩터 Va, 팩터 VII, 팩터 VIIa, 팩터 VIII, 팩터 VIIIa, 팩터 IX, 팩터 IXa, 팩터 X, 팩터 Xa, 팩터 XI, 팩터 XIa, 팩터 XII, 팩터 XIIa, 팩터 XIII, 팩터 XIIIa, TFPI, 안티트롬빈 III(antithrombin III), EPCR, 트롬보모듈린, TAPI, tPA, 플라스미노겐(plasminogen), 플라스민(plasmin), PAI-1, PAI-2, GPC3, 신데칸-1(Syndecan-1), 신데칸-2, 신데칸-3, 신데칸-4, LPA, S1P, 호르몬 및 성장인자를 위한 수용체가 예시될 수 있다. 항원으로서는 암조직 또는 염증성 조직에 있어서의 암세포·면역세포·스트로마 세포 등에 발현하는 항원이 바람직하다.
상기 항원의 예시에는 수용체도 기재되나, 이들 수용체가 생체액 중에 가용형으로 존재하는 경우에도 본 발명의 저분자 화합물(예를 들면 표적 조직 특이적인 화합물)의 농도에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자가 결합하는 항원으로서 사용될 수 있다. 이러한 가용형 수용체의 비한정의 일태양으로서, 예를 들면 멀버그(Mullberg) 등(J. Immunol. (1994) 152 (10), 4958-4968)에 의해 기재되어 있는 가용형 IL-6R인 서열번호：1로 표시되는 IL-6R 폴리펩티드 서열 중 1 내지 357번째 아미노산으로 이루어지는 단백질이 예시될 수 있다.
상기 항원의 예시에는 세포막에 발현하는 막형 분자 및 세포로부터 세포 외로 분비되는 가용형 분자가 포함된다. 본 발명의 표적 조직 특이적인 화합물의 농도에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자가 세포로부터 분비된 가용형 분자에 결합하는 경우, 당해 항원 결합 분자로서는 후술되는 바와 같이 중화 활성을 가지고 있는 것이 적합하다.
가용형 분자가 존재하는 용액에 한정은 없고 생체액, 즉 생체 내의 맥관 또는 조직·세포 사이를 채우는 모든 액체에 본 가용형 항원은 존재할 수 있다. 비한정의 일태양에서는 본 발명의 항원 결합 분자가 결합하는 가용형 분자는 세포외액에 존재할 수 있다. 세포외액이란 척추동물에서는 혈장, 조직간액, 림프액, 빽빽한 결합조직, 뇌척수액, 수액, 천자액 또는 관절액 등의 뼈 및 연골 중의 성분, 폐포액(기관지 폐포 세정액), 복수, 흉수, 심낭수, 낭포액 또는 수양액(aqueous humor) 등의 세포 투과액(세포의 능동 수송·분비 활동의 결과 생긴 각종 선강(glandular cavities) 내액 및 소화관강 기타 체강내액)의 총칭을 말한다.
본 발명의 저분자 화합물(예를 들면 표적 조직 특이적인 화합물)의 농도에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자가 세포막에 발현하는 막형 분자에 결합하는 경우, 당해 항원 결합 분자의 적합한 예로서, 후술되는 바와 같이 세포 상해 활성을 가지고 있거나 또는 세포 상해성 물질을 결합하거나 또는 결합하는 능력을 가지고 있는 항원 결합 분자를 적합하게 들 수 있다. 또한 세포 상해 활성을 가지고 있거나 또는 세포 상해성 물질을 결합하거나 또는 결합하는 능력을 가지고 있다고 하는 성질 대신에, 또는 당해 성질에 더하여 중화 활성을 가지고 있는 항원 결합 분자도 또한 비한정의 일태양으로서 적합하게 들 수 있다.
에피토프
항원 중에 존재하는 항원 결정기를 의미하는 에피토프는 본 명세서에 있어서 개시되는 항원 결합 분자 중의 항원 결합 도메인이 결합하는 항원 상의 부위를 의미한다. 따라서, 예를 들면 에피토프는 그 구조에 의해 정의될 수 있다. 또한 당해 에피토프를 인식하는 항원 결합 분자 중의 항원에 대한 결합 활성에 따라서도 당해 에피토프가 정의될 수 있다. 항원이 펩티드 또는 폴리펩티드인 경우에는 에피토프를 구성하는 아미노산 잔기에 의해 에피토프를 특정하는 것도 가능하다. 또한 에피토프가 당쇄인 경우에는 특정 당쇄 구조에 의해 에피토프를 특정하는 것도 가능하다.
직선상 에피토프는 아미노산 1차 서열이 인식된 에피토프를 포함하는 에피토프이다. 직선상 에피토프는 전형적으로는 적어도 3개 및 가장 보통으로는 적어도 5개, 예를 들면 약 8 내지 약 10개, 6 내지 20개의 아미노산이 고유의 서열에 있어서 포함된다.
입체구조 에피토프는 직선상 에피토프와는 대조적으로, 에피토프를 포함하는 아미노산의 1차 서열이 인식된 에피토프의 단일 규정 성분이 아닌 에피토프(예를 들면 아미노산의 1차 서열이 반드시 에피토프를 규정하는 항체에 의해 인식되는 것은 아닌 에피토프)이다. 입체구조 에피토프는 직선상 에피토프에 대해 증대된 수의 아미노산을 포함할 지도 모른다. 입체구조 에피토프의 인식에 관하여 항체는 펩티드 또는 단백질의 3차원 구조를 인식한다. 예를 들면 단백질 분자가 폴딩되어 3차원 구조를 형성하는 경우에는, 입체구조 에피토프를 형성하는 어떤 아미노산 및/또는 폴리펩티드 주쇄는 병렬로 되어 항체가 에피토프를 인식하는 것을 가능하게 한다. 에피토프의 입체구조를 결정하는 방법에는, 예를 들면 X선 결정학, 2차원 핵자기공명 분광학 및 부위 특이적인 스핀 표지 및 전자 상자성 공명 분광학이 포함되는데 이들에는 한정되지 않는다. 예를 들면 Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology(1996), 제66권, Morris(편)을 참조.
에피토프에 결합하는 항원 결합 도메인의 구조는 파라토프(paratope)라 불린다. 에피토프와 파라토프 사이에 작용하는 수소 결합, 정전기력, 반데르발스의 힘, 소수 결합 등에 의해 에피토프와 파라토프는 안정하게 결합한다. 이 에피토프와 파라토프 사이의 결합력은 어피니티(affinity)로 불린다. 복수의 항원과 복수의 항원 결합 분자가 결합할 때의 결합력의 총합은 어비디티(avidity)로 불린다. 복수의 항원 결합 도메인을 포함하는(즉, 다가의) 항체 등이 복수의 에피토프에 결합할 때에는 결합력(affinity)이 상승적으로 작용하기 때문에 어비디티는 어피니티보다도 높아진다.
결합 활성
아래에 IL-6R에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자에 의한 에피토프로의 결합의 확인방법이 예시되는데, IL-6R 이외의 항원에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자에 의한 에피토프로의 결합의 확인방법도 아래의 예시에 준하여 적절히 실시될 수 있다.
예를 들면 IL-6R에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자가 IL-6R 분자 중에 존재하는 선상 에피토프를 인식하는 것은 예를 들면 다음과 같이 하여 확인할 수 있다. 상기 목적을 위해 IL-6R의 세포 외 도메인을 구성하는 아미노산 서열로 이루어지는 선상의 펩티드가 합성된다. 당해 펩티드는 화학적으로 합성될 수 있다. 또는 IL-6R의 cDNA 중의 세포 외 도메인에 상당하는 아미노산 서열을 코드하는 영역을 이용하여 유전자 공학적 수법에 의해 얻어진다. 다음으로, 세포 외 도메인을 구성하는 아미노산 서열로 이루어지는 선상 펩티드와 IL-6R에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자의 결합 활성이 평가된다. 예를 들면 고정화된 선상 펩티드를 항원으로 하는 ELISA에 의해 당해 펩티드에 대한 당해 항원 결합 분자의 결합 활성이 평가될 수 있다. 또는 IL-6R 발현 세포에 대한 당해 항원 결합 분자의 결합에 있어서의 선상 펩티드에 의한 저해 레벨을 토대로 선상 펩티드에 대한 결합 활성이 명확해질 수 있다. 이들 시험에 의해 선상 펩티드에 대한 당해 항원 결합 분자의 결합 활성이 명확해질 수 있다.
또한 IL-6R에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자가 입체구조 에피토프를 인식하는 것은 다음과 같이 하여 확인될 수 있다. 상기 목적을 위해 IL-6R을 발현하는 세포가 조제된다. IL-6R에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자가 IL-6R 발현 세포에 접촉했을 때에 당해 세포에 강하게 결합하는 한편으로, 당해 항원 결합 분자가 고정화된 IL-6R의 세포 외 도메인을 구성하는 아미노산 서열로 이루어지는 선상 펩티드에 대해 실질적으로 결합하지 않을 때 등을 들 수 있다. 여기서 실질적으로 결합하지 않는다는 것은 인간 IL-6R 발현 세포에 대한 결합 활성의 80% 이하, 통상 50% 이하, 바람직하게는 30% 이하, 특히 바람직하게는 15% 이하의 결합 활성을 말한다.
IL-6R에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자의 IL-6R 발현 세포에 대한 결합 활성을 측정하는 방법으로서는, 예를 들면 Antibodies A Laboratory Manual에 기재된 방법(Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory(1988) 359-420)을 들 수 있다. 즉 IL-6R 발현 세포를 항원으로 하는 ELISA나 FACS(fluorescence activated cell sorting)의 원리에 의해 평가될 수 있다.
ELISA 포맷에 있어서 IL-6R에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자의 IL-6R 발현 세포에 대한 결합 활성은 효소반응에 의해 생성되는 신호 레벨을 비교함으로써 정량적으로 평가된다. 즉, IL-6R 발현 세포를 고정화한 ELISA 플레이트에 피험 폴리펩티드 회합체를 첨가하여, 세포에 결합한 피험 항원 결합 분자가 피험 항원 결합 분자를 인식하는 효소 표지 항체를 이용하여 검출된다. 또는 FACS에 있어서는 피험 항원 결합 분자의 희석계열을 제작하여 IL-6R 발현 세포에 대한 항체 결합 역가(titer)를 결정함으로써, IL-6R 발현 세포에 대한 피험 항원 결합 분자의 결합 활성이 비교될 수 있다.
완충액 등에 현탁한 세포 표면 상에 발현되고 있는 항원에 대한 피험 항원 결합 분자의 결합은 플로우 사이토미터에 의해 검출할 수 있다. 플로우 사이토미터로서는 예를 들면 다음과 같은 장치가 알려져 있다.
FACSCantoTM II
FACSAriaTM
FACSArrayTM
FACSVantageTM SE
FACSCaliburTM(모두 BD Biosciences사의 상품명)
EPICS ALTRA HyPerSort
Cytomics FC 500
EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC
Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC(모두 Beckman Coulter사의 상품명)
예를 들면 IL-6R에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자의 항원에 대한 결합 활성의 적합한 측정방법의 일례로서 다음의 방법을 들 수 있다. 먼저, IL-6R을 발현하는 세포와 반응시킨 피험 항원 결합 분자를 인식하는 FITC 표지한 2차 항체로 염색한다. 피험 항원 결합 분자를 적당히 적합한 완충액으로 희석함으로써 당해 항원 결합 분자가 목적하는 농도로 조제하여 사용된다. 예를 들면 10 ㎍/㎖부터 10 ng/㎖까지 사이 중 어느 하나의 농도로 사용될 수 있다. 다음으로, FACSCalibur(BD사)에 의해 형광강도와 세포수가 측정된다. 당해 세포에 대한 항체의 결합량은 CELL QUEST Software(BD사)를 사용하여 해석함으로써 얻어진 형광강도, 즉 기하평균(Geometric Mean) 값에 반영된다. 즉, 당해 기하평균 값을 얻음으로써 피험 항원 결합 분자의 결합량으로 표시되는 피험 항원 결합 분자의 결합 활성이 측정될 수 있다.
IL-6R에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자가 어떤 항원 결합 분자와 에피토프를 공유하는 것은 양자의 동일한 에피토프에 대한 경합에 의해 확인될 수 있다. 항원 결합 분자 간의 경합은 교차 블로킹 어세이 등에 의해 검출된다. 예를 들면 경합 ELISA 어세이는 바람직한 교차 블로킹 어세이이다.
구체적으로는, 교차 블로킹 어세이에 있어서는 마이크로타이터 플레이트의 웰 상에 코트한 IL-6R 단백질이 후보가 되는 경합 항원 결합 분자의 존재하 또는 비존재하에서 프리인큐베이트된 후에 피험 항원 결합 분자가 첨가된다. 웰 중의 IL-6R 단백질에 결합한 피험 항원 결합 분자의 양은 동일한 에피토프로의 결합에 대해 경합하는 후보가 되는 경합 항원 결합 분자의 결합능에 간접적으로 상관하고 있다. 즉 동일 에피토프에 대한 경합 항원 결합 분자의 친화성이 커지면 커질수록, 피험 항원 결합 분자의 IL-6R 단백질을 코트한 웰에 대한 결합 활성은 저하된다.
IL-6R 단백질을 매개로 웰에 결합한 피험 항원 결합 분자의 양은 사전에 항원 결합 분자를 표지해 둠으로써 용이하게 측정될 수 있다. 예를 들면 비오틴 표지된 항원 결합 분자는 아비딘/페록시다아제 콘쥬게이트와 적절한 기질을 사용함으로써 측정된다. 페록시다아제 등의 효소 표지를 이용한 교차 블로킹 어세이는 특히 경합 ELISA 어세이라 불린다. 항원 결합 분자는 검출 또는 측정이 가능한 다른 표지 물질로 표지될 수 있다. 구체적으로는 방사 표지 또는 형광 표지 등이 공지이다.
후보의 경합 항원 결합 분자 회합체의 비존재하에서 실시되는 대조 시험에 있어서 얻어지는 결합 활성과 비교하여, 경합 항원 결합 분자가 IL-6R에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자의 결합을 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 20-50%, 더욱 바람직하게는 적어도 50% 블록할 수 있다면, 당해 피험 항원 결합 분자는 경합 항원 결합 분자와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하거나 또는 동일한 에피토프로의 결합에 대해 경합하는 항원 결합 분자이다.
IL-6R에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자가 결합하는 에피토프의 구조가 동정되어 있는 경우에는, 피험 항원 결합 분자와 대조 항원 결합 분자가 에피토프를 공유하는 것은 당해 에피토프를 구성하는 펩티드에 아미노산 변이를 도입한 펩티드에 대한 양자의 항원 결합 분자의 결합 활성을 비교함으로써 평가될 수 있다.
이러한 결합 활성을 측정하는 방법으로서는, 예를 들면 상기의 ELISA 포맷에 있어서 변이를 도입한 선상의 펩티드에 대한 피험 항원 결합 분자 및 대조 항원 결합 분자의 결합 활성을 비교함으로써 측정될 수 있다. ELISA 이외의 방법으로서는, 칼럼에 결합한 당해 변이 펩티드에 대한 결합 활성을 당해 칼럼에 피험 항원 결합 분자와 대조 항원 결합 분자를 유하(流下)시킨 후에 용출액 중에 용출되는 항원 결합 분자를 정량함으로써도 측정될 수 있다. 변이 펩티드를 예를 들면 GST와의 융합 펩티드로서 칼럼에 흡착시키는 방법은 공지이다.
또한 동정된 에피토프가 입체 에피토프인 경우에는, 피험 항원 결합 분자와 대조 항원 결합 분자가 에피토프를 공유하는 것은 다음의 방법으로 평가될 수 있다. 먼저, IL-6R을 발현하는 세포와 에피토프에 변이가 도입된 IL-6R을 발현하는 세포가 조제된다. 이들 세포가 PBS 등의 적절한 완충액에 현탁된 세포 현탁액에 대해 피험 항원 결합 분자와 대조 항원 결합 분자가 첨가된다. 이어서, 적당히 완충액으로 세정된 세포 현탁액에 대해 피험 항원 결합 분자와 대조 항원 결합 분자를 인식할 수 있는 FITC 표지된 항체가 첨가된다. 표지 항체에 의해 염색된 세포의 형광강도와 세포수가 FACSCalibur(BD사)에 의해 측정된다. 피험 항원 결합 분자와 대조 항원 결합 분자의 농도는 적합한 완충액에 의해 적당히 희석함으로써 목적하는 농도로 조제하여 사용된다. 예를 들면 10 ㎍/㎖부터 10 ng/㎖까지 사이 중 어느 하나의 농도로 사용된다. 당해 세포에 대한 표지 항체의 결합량은 CELL QUEST Software(BD사)를 사용하여 해석함으로써 얻어진 형광강도, 즉 기하평균 값에 반영된다. 즉, 당해 기하평균 값을 얻음으로써 표지 항체의 결합량으로 표시되는 피험 항원 결합 분자와 대조 항원 결합 분자의 결합 활성을 측정할 수 있다.
본 방법에 있어서, 예를 들면 「변이 IL-6R 발현 세포에 실질적으로 결합하지 않는」 것은, 아래의 방법에 의해 판단할 수 있다. 먼저 변이 IL-6R을 발현하는 세포에 대해 결합한 피험 항원 결합 분자와 대조 항원 결합 분자가 표지 항체로 염색된다. 이어서 세포의 형광강도가 검출된다. 형광 검출에 플로우 사이토메트리로서 FACSCalibur를 사용한 경우, 얻어진 형광강도는 CELL QUEST Software를 사용하여 해석될 수 있다. 폴리펩티드 회합체 존재하 및 비존재하에서의 기하평균 값으로부터 이 비교값(△Geo-Mean)을 하기의 식 1을 토대로 산출함으로써, 항원 결합 분자의 결합에 의한 형광강도의 증가비율을 구할 수 있다.
(식 1)
△Geo-Mean＝Geo-Mean(폴리펩티드 회합체 존재하)/Geo-Mean(폴리펩티드 회합체 비존재하)
해석에 의해 얻어지는 피험 항원 결합 분자의 변이 IL-6R 발현 세포에 대한 결합량이 반영된 기하평균 비교값(변이 IL-6R 분자 △Geo-Mean값)을, 피험 항원 결합 분자의 IL-6R 발현 세포에 대한 결합량이 반영된 △Geo-Mean 비교값과 비교한다. 이 경우에 있어서, 변이 IL-6R 발현 세포 및 IL-6R 발현 세포에 대한 △Geo-Mean 비교값을 구할 때 사용하는 피험 항원 결합 분자의 농도는 서로 동일 또는 실질적으로 동일한 농도로 조제되는 것이 특히 바람직하다. 사전에 IL-6R 중의 에피토프를 인식하고 있는 것이 확인된 항원 결합 분자가 대조 항원 결합 분자로서 이용된다.
피험 항원 결합 분자의 변이 IL-6R 발현 세포에 대한 △Geo-Mean 비교값이 피험 항원 결합 분자의 IL-6R 발현 세포에 대한 △Geo-Mean 비교값의 80% 이상, 바람직하게는 50%, 더욱 바람직하게는 30%, 특히 바람직하게는 15%보다 작으면 「변이 IL-6R 발현 세포에 실질적으로 결합하지 않는」 것으로 한다. Geo-Mean값(Geometric Mean)을 구하는 계산식은 CELL QUEST Software User's Guide(BD biosciences사)에 기재되어 있다. 비교값을 비교함으로써 그것이 실질적으로 동일하다고 볼 수 있는 정도라면 피험 항원 결합 분자와 대조 항원 결합 분자의 에피토프는 동일하다고 평가될 수 있다.
표적 조직
본 명세서 중에서 사용되는 용어 「표적 조직」이란, 본 발명의 항원 결합 분자가 저분자 화합물 농도에 따라 결합하는 항원이 존재하는 세포를 포함하는 조직으로서, 당해 항원 결합 분자의 당해 세포에 발현되고 있는 막형 분자에 대한 결합 또는 당해 조직에 존재하는 가용형 분자에 대한 결합이 당해 조직을 포함하는 생체에 있어서 양의 약리작용을 초래하는 조직을 말한다. 이 경우에 있어서 「양의 약리작용」이란, 표적 조직을 포함하는 병적 부위가 당해 조직을 포함하는 생체에 대해 초래하는 증상의 경감, 완화, 관해 또는 치유를 초래하는 작용을 말한다. 이러한 약리작용을 초래하는 비한정 메커니즘의 일태양으로서, 예를 들면 암 등의 악성 종양이 초래하는 증상의 경우에는 암세포에 대한 세포 상해 활성, 증식 억제 및 암조직에 있어서의 면역 활성화 등이 예시된다. 이러한 비한정 메커니즘의 일태양으로서, 예를 들면 염증성 질환의 경우에는 염증 조직에 있어서의 염증성 사이토카인의 작용의 차단 활성이나 면역 억제 등이 예시된다.
암조직 특이적 화합물
본 명세서 중에서 사용되는 용어 「암조직 특이적인 화합물(암조직 특이적 화합물)」이란, 비-암조직과 비교하여 암조직 중에 차별적으로(differentially) 존재하는 화합물을 말한다. 본 명세서에 있어서 「암」이라는 용어는 일반적으로 악성 신생물을 나타내기 위해 사용되고, 이는 전이성 또는 비전이성이어도 된다. 예를 들면 소화관이나 피부 등의 상피 조직으로부터 발생한 암종의 비한정의 예로서 뇌종양, 피부암, 경두부암, 식도암, 폐암, 위암, 십이지장암, 유방암, 전립선암, 자궁경부암, 자궁체암, 췌장암, 간장암, 대장암, 결장암, 방광암 및 난소암 등이 예시된다. 또한 근육 등의 비상피성 조직(간질)으로부터 발생한 육종의 비한정의 예로서 골육종, 연골육종, 횡문근육종, 평활근육종, 지방육종 및 혈관육종 등이 예시된다. 또한 조혈기 유래의 혈액암의 비한정의 예로서, 호지킨림프종(Hodgkin's lymphoma) 및 비호지킨림프종(non Hodgkin's lymphoma)을 포함하는 악성 림프종, 급성 골수성 백혈병(acute myelocytic leukemia) 또는 만성 골수성 백혈병(chronic myelocytic leukemia), 급성 림프성 백혈병(acute lymphatic leukemia) 또는 만성 림프성 백혈병(chronic lymphatic leukemia)을 포함하는 백혈병, 및 다발성 골수종(multiple myeloma)이 예시된다. 본 명세서에서 널리 사용되는 「신생물」이라는 용어는 새롭게 생성된 모든 병적 조직 종양을 의미한다. 본 발명에 있어서는 신생물은 종양의 형성을 발생시키고, 이는 부분적으로 혈관 형성을 특징으로 한다. 신생물은 예를 들면 혈관종, 신경교종, 기형종 등의 양성(良性) 또는 예를 들면 암종, 육종, 교세포종, 성상 교세포종, 신경아세포종, 망막아종 등의 악성일 수 있다.
용어 「암조직」이란 하나 이상의 암세포를 포함하는 조직을 의미한다. 따라서 예를 들면 암조직이 암세포와 혈관을 포함하고 있는 바와 같이, 암세포 및 내피세포를 포함하는 종유(腫瘤, tumor mass)의 형성에 기여하는 모든 세포형을 말한다. 본 명세서에 있어서 종유란 종양 조직 병소(a foci of tumor tissue)를 말한다. 「종양」이라는 용어는 일반적으로 양성 신생물 또는 악성 신생물을 의미하기 위해 사용된다.
예를 들면 몇 가지 실시형태에서는 암조직 특이적 화합물은 암조직에 존재하나 비-암조직에는 존재하지 않거나 또는 암조직에는 존재하지 않으나 비-암조직에는 존재하고 있는 등의 정성적(定性的)인 암조직 특이성으로 규정되는 화합물일 수 있다. 다른 실시형태에서는 암조직 특이적 화합물은 비-암조직과 비교하여 상이한 농도(예를 들면 고농도 또는 저농도)로 암조직에 존재하고 있는 등의 정량적인 암조직 특이성으로 규정되는 화합물일 수 있다. 예를 들면 암조직 특이적 화합물은 임의의 농도로 차별적으로 존재한다. 그러나 일반적으로 암조직 특이적 화합물은 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 100%, 적어도 110%, 적어도 120%, 적어도 130%, 적어도 140%, 적어도 150%, 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 103배, 적어도 104배, 적어도 105배, 적어도 106배 또는 그 이상으로서, 무한대(즉, 비-암조직에 존재하지 않는 경우)까지 증가하는 농도로 존재하는 것이 가능하며, 또는 일반적으로 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 100%(즉, 존재하지 않음을 나타냄)까지 감소하는 농도로 존재하는 것이 가능하다. 암조직 특이적 화합물은 통계적으로 유의한 농도(즉, 웰치의 t검정 또는 윌콕슨의 순위합 검정 중 어느 하나를 사용하여 결정되는 바와 같이, p값은 0.05 미만 및/또는 q값은 0.10 미만)로, 바람직하게는 차별적으로 존재한다. 암조직 특이적 화합물의 비한정의 일태양으로서는 아래와 같은 암조직에 포함되는 암세포, 면역세포, 스트로마 세포에 특유의 대사 활성에 의해 생산된 암조직 특이적인 대사산물(암조직 특이적 대사산물；암세포 특이적 대사산물, 암조직에 침윤되어 있는 면역세포 특이적인 대사산물, 암 스트로마 세포 특이적 대사산물)인 화합물이 예시될 수 있다.
본 명세서 중에서 사용되는 용어 「비천연 화합물」이란 비천연 유래의 화학물질 및 그의 대사물을 말한다. 발명의 일태양으로서는 생체 외로부터 생체 내로 투여된 후에, 표적 조직에 집적되는 성질을 갖는 비천연 유래의 화학물질 및 그의 대사물이다. 비천연 화합물로서는, (1) 카페시타빈(Capecitabine (Xeloda))과 그의 대사물인 5-FU(fluorouracil) 및 (2) TH-302와 브로모이소포스파미드마스터드(Br-IPM) 등이 예시된다. 5-FU는 카페시타빈(Capecitabine (Xeloda)의 대사물로, 암조직 특이적인 대사효소인 시티딘 데아미나제(cytidine deaminase)와 티미딘 포스포릴라아제(thymidine phosphorylase)에 의해 대사되는 것이 알려져 있다(Desmoulin F. et al. Drug Metab Dispos. 2002). 또한 TH-302는 암조직 주변과 같이 저효소의 조건하에서 환원됨으로써 Br-IPM으로 변환되는 것이 알려져 있다(Duan JX, et al. J Med Chem. 2008). 예를 들면 카페시타빈(capecitabine (xeloda))을 투여하면 암 특이적인 대사효소 등에 의해 5-FU로 대사되기 때문에, 암 국소에 있어서의 5-FU의 농도가 높아지기 때문에(Desmoulin F. et al. Drug Metab Dispos. 2002), 5-FU를 스위치로 하는 항체에 의해 암 국소에서만 선택적으로 표적 항원에 결합하는 것이 가능해지는 것으로 생각된다. 또한 대사효소 이외에도 암에 특이적인 저효소 환경이나 산성 환경하에 의해 생성되는 분자를 스위치로서 사용하는 것도 가능할 것으로 생각된다. 예를 들면 TH-302(Duan JX, et al. J Med Chem. 2008)는 저효소 조건하에 있어서 Br-IPM으로 대사되기 때문에 Br-IPM을 스위치로 하는 항체에 의해 암 국소에서만 선택적으로 표적 항원에 결합하는 것이 가능해지는 것으로 생각된다. 예를 들면 비천연 화합물을 생체에 투여하는 방법으로서는 경구 투여, 점안 투여, 경피 투여, 경비 투여, 경정맥 투여, 경폐 투여 등 공지의 투여방법을 들 수 있는데, 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서 중에서 사용되는 용어 「비천연 화합물」의 다른 일태양으로서는 표적 조직에 집적되는 성질을 갖는 화학물질 및 그의 대사물 이외에도, 스위치가 되는 비천연 화합물을 예를 들면 경구 투여함으로써 항체의 작용을 경구제의 복용으로 조절할 수 있는 화학물질 등도 포함한다. 즉, 어떤 경구 등의 비침습 투여 가능한 비천연 화합물을 스위치로 하여, 어떤 항원에 대해 결합을 나타내는 스위치 항체를 정맥 내 또는 피하 투여 등의 침습 투여해 두고, 스위치가 되는 외래성 화합물을 경구 등의 비침습 투여에 의해 그 항체의 작용을 조절할 수 있는 화학물질 등이다. 이러한 화합물질로서，예를 들면 ATPγS나 키누레닌 대사물 등을 들 수 있는데, 이것에 한정되는 것은 아니다.
항체 의약은 반감기가 긴 것으로부터 부작용이 생긴 경우는 그 작용이 지속되어버리는 것이 결점이나, 이와 같이 항체의 작용을 비천연 화합물을 경구 등의 비침습 투여에 의해 조절할 수 있다면, 부작용이 생겼을 때 스위치 분자의 투여를 멈춤으로써 약의 작용을 멈추게 할 수 있다. 또한 사전에 스위치 항체를 투여해 둠으로써 질환에 따라 증상이 생겼을 때만 스위치 분자를 투여하는 것, 필요할 때만 경구 등의 비침습 투여에 의해 약리작용을 발휘하는 것이 가능하다.
본 발명에 있어서의 「비천연 화합물의 농도에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자」는 생체에 투여되었을 때 양의 약리작용을 초래할 수 있다.
암조직 특이적 대사산물
용어 「대사」는 생물의 조직 내에서 발생하는 화학변화를 말하고, 「동화(同化)」 및 「이화(異化)」가 포함된다. 동화란 분자의 생합성 또는 축적을 말하고, 이화는 분자의 분해를 말한다. 「대사산물」은 물질대사에 기인하는 중간체 또는 생성물이다. 「1차 대사산물」이란 세포 또는 생물의 성장 또는 번식 과정에 직접 관여하는 대사산물을 가리키고, 「2차 대사산물」이란 그들의 성장 또는 번식 과정에는 직접 관여하지 않고, 세포 또는 생물에 공통인 생명현상에 직접 관여하지 않는 물질을 생합성하는 대사의 결과 생성되는 항생물질이나 색소 등의 생산물을 말한다. 대사산물은 「생체 고분자」의 대사산물일 수도 있고, 「저분자」의 대사산물일 수도 있다. 「생체 고분자」란 1종류 이상의 반복 단위로 이루어지는 고분자이다. 생체 고분자는 일반적으로 생물계에서 발견되며, 생물을 조직하는 세포 및 그것에 부착되는 세포 간 매트릭스, 조직 간 매트릭스 등의 구조물을 형성하는 분자량이 대략 5,000 이상인 분자, 특히 다당류(탄수화물 등) 및 펩티드(이 용어는 폴리펩티드 및 단백질을 포함하도록 하여 사용됨) 및 폴리뉴클레오티드, 마찬가지로 그들의 유사체, 예를 들면 아미노산 유사체 또는 비아미노산기로 구성 또는 포함하는 그들의 화합물을 들 수 있다.
본 명세서 중에서 사용되는 용어 「저분자」는 생체에 존재하는 「생체 고분자」 이외의 천연 유래의 화학물질 또는 비천연 유래의 화학물질을 말한다. 바람직하게는 표적 조직 특이적인 화합물 또는 비천연 화합물이나, 이것에 한정되는 것은 아니다. 본 명세서에 기재되는 비한정의 일태양인 암조직 특이적 대사산물로서 암세포 특이적인 저분자 대사산물을 적합하게 들 수 있다(Eva Gottfried, Katrin Peter and Marina P. Kreutz, From Molecular to Modular Tumor Therapy (2010) 3 (2), 111-132). 더 나아가서는 암조직에 침윤되는 면역세포가 높게 생산되는 대사산물이나 암세포의 생존 및/또는 성장을 서포트하는 스트로마 세포(암 스트로마 세포 또는 암 간질 섬유아세포(CAF))가 높게 생산되는 대사산물도 포함된다. 침윤되는 면역세포로서는 수상세포(dendritic cells), 억제성 수상세포, 억제성 T세포, 피폐 T세포(exhausted T cell), 골수계 유래 억제세포(myeloma derived suppressor cell, MDSC) 등이 예시된다. 또한 본 발명에 있어서의 대사산물에는 암조직에 존재하는 세포(암세포, 면역세포, 스트로마 세포)가 아포토시스나 네크로시스 등에 의해 세포사되었을 때에 세포 내로부터 세포 외로 방출되는 화합물도 포함된다.
암세포 특이적 대사산물을 동정하기 위해 트랜스크립톰 레벨(transcriptome-level)에서의 해석(예를 들면 Dhanasekaran 등(Nature (2001) 412, 822-826), Lapointe 등(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2004) 101, 811-816 또는 Perou 등(Nature (2000) 406, 747-752 등이 예시됨) 또는 프로테옴 레벨(proteome-level)에서의 해석(예를 들면 Ahram 등(Mol. Carcinog. (2002) 33, 9-15, Hood 등(Mol. Cell. Proteomics (2005) 4, 1741-1753) 외에, 대사학적 프로파일링을 중심으로 하는 대사학(metabolomics) 해석이 적절히 사용된다. 즉, 피검시료 중의 대사산물을 동정하기 위해 고압 액체크로마토그래피(HPLC), 핵자기공명(NMR)(Brindle 등(J. Mol. Recognit. (1997) 10, 182-187), 질량분석법(Gates 및 Sweeley(Clin. Chem. (1978) 24, 1663-1673)(GC/MS 및 LC/MS)) 및 ELISA 등을 단독으로 및/또는 조합해서 사용하는 대사학적 프로파일링이 적절히 사용될 수 있다.
이들 연구에 의해 암세포가 낮은 산소압 조건하에서 성육하는 것을 가능하게 하는 대사산물(예를 들면 포도당 또는 산소) 및 생장인자의 농도 구배를 변경함으로써 구성된 종양 내의 이질성이 명확해졌다(Dang 및 Semenza(Trends Biochem. Sci. (1999) 24, 68-72)). 이들 연구에 있어서는 종양의 악성도가 상이한 정도에 따른 에너지 이용 경로의 변화를 이해하기 위해 세포주 모델도 사용되고 있다(Vizan 등(Cancer Res. (2005) 65, 5512-5515). 대사학 플랫폼의 기술적 구성요소의 비한정의 일태양으로서 Lawton 등(Pharmacogenomics (2008) 9, 383)에 기재된 시료 추출, 분리, 검출, 분광분석, 데이터 정규화, 클래스 특이적 대사산물의 묘사, 경로 맵핑, 확인 및 후보 대사산물의 기능적 특징 부여가 예시된다. 이들 방법에 의해 목적하는 암조직에 있어서의 암세포 특이적 대사산물을 동정하는 것이 가능하다.
본 발명에서 사용되는 암조직 특이적 화합물 또는 암조직 특이적 대사산물의 비한정의 일태양으로서 아래의 화합물로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 적합하게 들 수 있다. 하나 이상의 화합물이란, 후술하는 동일 항원 결합 도메인에 의한 항원에 대한 결합 활성이 일종의 암조직 특이적 화합물 또는 암조직 특이적 대사산물에 의존적일 뿐 아니라, 복수의 종류의 암조직 특이적 화합물 또는 암조직 특이적 대사산물에 의존적인 경우를 포함하는 것을 의미한다.
(1) 락트산, 숙신산, 구연산 등의 해당계(glycolytic system) 또는 크레브스 회로(Krebs cycle)의 1차 대사산물
본 발명에서 사용되는 암조직 특이적 화합물, 특히 암세포 특이적 대사산물의 비한정의 일태양으로서 락트산, 숙신산, 구연산 등의 주위에 존재하는 비-암부 조직보다도 암조직에 있어서 고농도로 존재하는 글루코오스 대사의 결과 생성되는 1차 대사산물을 적합하게 들 수 있다. 피루빈산키나아제, 헥소키나아제 및 락트산 탈수소효소(LDH) 등의 해당계(Embden-Myerhof 경로) 효소의 상방 조절(업레귤레이션)로서 특징 지어지는 해당계 표현형은 바르부르크 효과(Warburg effect)로서 고형 종양의 특징인 것이 종래부터 알려져 있다.
즉, 종양세포의 경우는 M1 아이소타입이 아니라 혐기 조건하에서의 해당(erobic glycolysis)에 필요한 M2 아이소타입의 피루빈산키나아제가 고발현되고 있는 것으로부터, 생체 내에 있어서의 종양세포의 생육에 유리하게 작용하고 있는 것으로 생각되고 있다(Christofk 등(Nature (2008) 452, 230-233). 피루빈산키나아제에 의해 생성된 피루빈산은 혐기 조건하에 있어서의 락트산 탈수소효소(LDH)에 의한 평형반응의 결과 생성되는 락트산에 의해 피드백 저해를 받는다. 당해 피드백 저해에 의해 미토콘드리아에 있어서의 호흡(크레브스 회로)의 촉진 및 세포 증식 억제가 생기기 때문에 LDH, 헥소키나아제 및 글루코오스트랜스포터(GLUT)의 상방 조절이 종양세포의 증식에 중요한 역할을 하고 있는 것으로 알려져 있다(Fantin 등(Cancer Cell (2006) 9, 425-434)). 글루코오스는 해당계에서 대사되고, 그 최종 대사산물인 락트산이 종양의 주위에 프로톤과 함께 공수송되는 결과, 종양 주변 조직의 pH는 산성 조건으로 변화하는 것으로 알려져 있다. 해당계의 최종 산물인 락트산, 미토콘드리아에 있어서의 호흡의 촉진에 의해 생성되는 숙신산 및 구연산이 암조직에 있어서 축적되어 있는 것이 알려져 있다(Teresa 등(Mol. Cancer (2009) 8, 41-59)). 본 발명에서 사용되는 암조직 특이적 화합물, 특히 암세포 특이적 대사산물의 비한정의 일태양으로서 이러한 해당계의 대사에 의해 생성되는 1차 대사산물인 락트산, 숙신산, 구연산 등을 적합하게 들 수 있다. 또한 세포사에 의해 세포 내에 고농도로 존재하는 숙신산이 세포 외로 누출되는 것이 알려져 있다(Nature Immunology, (2008) 9, 1261-1269). 이 때문에 세포사가 빈번하게 일어나고 있는 암조직에 있어서 숙신산의 농도가 상승하고 있는 것으로 생각된다.
(2) 알라닌, 글루타민산, 아스파라긴산 등의 아미노산
전술된 글루코오스 대사 이외에도 혐기 조건하에 있어서의 생체 고분자의 생합성에 필요한 필수 아미노산 및 비필수 아미노산의 연속 공급이 필요한 종양세포의 경우는 아미노산 대사도 변화되고 있는 것이 알려져 있다. 글루타민은 그 측쇄에 2개의 질소를 포함하는 질소 운반체로서 작용하는, 생체에 있어서 가장 광범위하게 분포하는 아미노산이다. 글루타민의 세포 내로의 흡수속도가 상승되어 있는 종양세포는 글루타민 트랩(glutamine trap)으로서 기능하고 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 글루타민의 흡수와 글루타민산 및 락트산으로 변환되는 활성의 상승은 「글루타민 분해(glutaminolysis)」로 불리며, 형질전환된 (종양)세포의 특징으로 생각되고 있다(Mazurek 및 Eigenbrodt(Anticancer Res. (2003) 23, 1149-1154, 및 Mazurek 등(J. Cell. Physiol. (1999) 181, 136-146)). 그 결과, 암환자는 혈장 중의 글루타민 레벨이 감소되는 한편으로 글루타민산 농도의 증대를 나타낸다(Droge 등(Immunobiology (1987) 174, 473-479). 그리고 폐암조직의 13C 방사 표지된 글루코오스의 대사 연구에 의해 13C 표지 숙신산, 13C 표지 알라닌, 13C 표지 글루타민산, 및 13C 표지 구연산의 농도 간에서 상관관계가 관찰되었다. 본 발명에서 사용되는 암조직 특이적 화합물의 비한정의 일태양으로서 이러한 글루타민 분해 등에 의해 암조직에 있어서 고농도로 축적되는 알라닌, 글루타민산, 아스파라긴산 등을 적합하게 들 수 있다.
(3) 키누레닌(kynurenine) 등의 아미노산의 대사산물
인돌아민 2,3-디옥시게나아제(IDO)는 흑색종, 결장암 및 신장암 등의 많은 암에서 고발현되고 있는 트립토판 대사효소로(Uyttenhove 등(Nat. Med. (2003) 9, 1269-127), 2개의 아이소폼이 존재하는 것이 알려져 있다(Lob 등(CancerImmunol. Immunother. (2009) 58, 153-157)). IDO는 트립토판의 키누레닌(화학식 1로 표시됨)으로의 변환을 촉매하여 니코틴아미드 뉴클레오티드(NAD) 신생경로의 최초의 효소이다. 또한 IDO를 발현하지 않는 신경교종의 경우는 간장의 트립토판 2,3-디옥시게나아제(TDO)에 의해 트립토판으로부터 키누레닌이 생성된다(Opitz 등(Nature (2011) 478, 7368, 197-203)). 또한 IDO는 암조직에 침윤되어 있는 수상세포에도 발현되고 있어 수상세포도 키누레닌을 생산한다(J. Immunol. (2008) 181, 5396-5404). 또한 IDO는 암조직의 골수계 유래 억제 세포(MDSC)에도 발현되고 있어 MDSC도 키누레닌을 생산한다(Yu 등(J. Immunol. (2013) 190, 3783-3797)).
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키누레닌은 동종 T세포 응답을 억제하는 것이 알려져 있어(Frumento 등(J. Exp. Med. (2002) 196, 459-468), 이러한 억제를 통해 종양세포가 항종양 면역응답을 빠져나가는 동시에, 신경교종에 발현하는 알릴 탄화수소 수용체의 내인성 리간드로서 키누레닌이 작용하는 오토크라인 증식 메커니즘을 통해 신경교종 세포의 증식이 촉진되는 메커니즘이 제창되어 있다(Opitz 등(위에 게재)). 키누레닌은 키누레니다아제에 의해 안트라닐산(화학식 2로 표시됨)으로, 키누레닌 3-히드록실라아제에 의해 3-히드록시키누레닌(화학식 3으로 표시됨)으로 변환된다. 안트라닐산 및 3-히드록시키누레닌은 모두 NAD의 전구체가 되는 3-히드록시안트라닐산으로 변환된다.
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키누레닌은 키누레닌아미노트랜스페라아제에 의해 키누렌산(화학식 4로 표시됨)으로 변환된다. 본 발명에서 사용되는 암조직 특이적 화합물, 특히 암세포 특이적 대사산물의 비한정의 일태양으로서, 이러한 키누레닌 및 그의 대사산물인 안트라닐산, 3-히드록시키누레닌 및 키누렌산 등의 아미노산의 대사산물을 적합하게 들 수 있다.
Figure 112021085263630-pat00004
(4) 프로스타글란딘 E2(Prostaglandin E2) 등의 아라키돈산의 대사산물
프로스타글란딘 E2(PGE2)(화학식 5)는 시클로옥시게나아제(COX)-1/2에 의해 합성되는 프로스타글란딘 및 트롬복산을 포함하는 프로스타노이드(prostanoid)라 불리는 아라키돈산의 대사물이다(Warner 및 Mitchell(FASEB J. (2004) 18, 790-804)). PGE2 결장암 세포의 증식을 촉진하여 그의 아포토시스를 억제한다(Sheng 등(Cancer Res. (1998) 58, 362-366)). 많은 암세포에서는 시클로옥시게나아제의 발현이 변화되어 있는 것이 알려져 있다. 즉, COX-1은 거의 모든 조직에 있어서 구성적으로 발현되고 있는 것에 대해 COX-2는 종양에 있어서 어떤 종의 염증성 사이토카인 및 암 유전자에 의해 유도되는 것이 주로 발견되고 있다(Warner 및 Mitchell(앞에 게재)). COX-2의 과잉 발현은 유방암의 예후의 나쁨(Denkert 등(Clin. Breast Cancer (2004) 4, 428-433) 및 난소암의 급속한 질환의 진행(Denker 등(Mod. Pathol. (2006) 19, 1261-1269)과 관련성이 있는 것도 보고되어 있다. 또한 암조직에 침윤되어 있는 억제성 T세포도 프로스타글란딘 E2를 생산하고 있다(Curr. Med. Chem. (2011) 18, 5217-5223). 아라키돈산의 대사물인 프로스타글란딘, 류코트리엔 등의 저분자가 암의 오토크라인 및/또는 파라크라인 증식을 제어하는 자극 인자로서 작용하고 있는 것이 알려져 있다(Nat. Rev. Cancer (2012) 12 (11) 782-792). 본 발명에서 사용되는 암조직 특이적 화합물, 특히 암세포 특이적 대사산물이나 암조직에 침윤되어 있는 면역세포 특이적 대사물의 비한정의 일태양으로서, 이러한 프로스타글란딘 E2 등의 아라키돈산의 대사산물을 적합하게 들 수 있다. 프로스타글란딘 E2 이외에도 트롬복산 A2(TXA2)가 대장암 등의 암조직에서 생산이 항진되어 있어(J. Lab. Clin. Med. (1993) 122, 518-523), 본 발명의 아라키돈산 대사산물의 비한정의 일태양으로서 적합하게 들 수 있다.
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(5) 아데노신, 아데노신 3인산(ATP), 아데노신 2인산(ADP), 아데노신 1인산(AMP) 등의 푸린 고리 구조를 갖는 뉴클레오시드
암세포가 세포사되면 세포 내의 대량의 ATP가 세포 외로 누출되는 것이 알려져 있다. 이 때문에 암조직에 있어서의 ATP 농도는 정상 조직과 비교하여 현저히 높다(PLoS One. (2008) 3, e2599). 복수 타입의 세포가 ATP, ADP 및 AMP 형태의 아데닌 뉴클레오티드를 유리(遊離)한다. 세포 외-5'-뉴클레오티다아제(eco-5'-nucleotidase)(CD73)와 같은 세포 표면의 세포 외 효소에 의해 대사된다(Resta 및 Thompson(Immunol. Rev. (1998) 161, 95-109) 및 Sadej 등(Melanoma Res. (2006) 16, 213-222). 아데노신은 저농도로 세포 외 환경에 구성적으로 존재하는 푸린 뉴클레오시드인데, 고형암에서 발견되는 저산소 조직에서는 세포 외 아데노신 농도의 현저한 증가가 보고되어 있다(Blay 및 Hoskin(Cancer Res. (1997) 57, 2602-2605). CD73는 종양 및 면역세포의 표면에 발현되고 있어(Kobie 등(J. Immunol. (2006) 177, 6780-6786), 유방암(Canbolat 등(Breast Cancer Res. Treat. (1996) 37, 189-193), 위암(Durak 등(Cancer Lett. (1994) 84, 199-202), 췌장암(Flocke 및 Mannherz(Biochim. Biophys. Acta (1991) 1076, 273-281) 및 신경교아종(glioblastoma)(Bardot 등(Br. J. Cancer (1994) 70, 212-218))에 있어서 활성의 상승이 발견되고 있다. 암조직에 있어서의 아데노신의 축적은 세포질의 5'-뉴클레오티다아제에 의한 AMP의 탈인산에 의해 세포 내 아데노신 생성이 증가하는 것에 기인하고 있을 가능성이 제창되고 있다(Headrick 및 Willis(Biochem. J. (1989) 261, 541-550). 또한 암조직에 침윤되어 있는 억제성 T세포 등도 ATP 분해효소를 발현하고 있어 아데노신을 생산하고 있다(Proc. Natl. Acad. Sci. (2006) 103 (35), 13132-13137, Curr. Med. Chem. (2011) 18, 5217-5223). 생산된 아데노신은 A2A 수용체 등의 아데노신 수용체를 매개로 암조직을 면역 억제적인 환경으로 하고 있는 것으로 생각되고 있다(Curr. Med. Chem. (2011),18,5217-23). 본 발명에서 사용되는 암조직 특이적 화합물의 비한정의 일태양으로서, 이러한 ATP 등의 푸린 뉴클레오티드의 대사에 의해 암조직에 있어서 고농도로 축적되는 ATP, ADP, AMP 또는 아데노신 등을 적합하게 들 수 있다. 또한 아데노신은 아데노신 데아미나아제에 의해 이노신으로 분해되기 때문에 이노신이 고농도로 축적된다.
(6) 요산
요산은 생체 내에 있어서의 푸린 뉴클레오시드의 대사경로의 산물로, 혈액 또는 간질강 등의 세포 외로 유리된다. 또한 최근 들어서는 암조직 등의 병변 부위에 존재하는 사세포로부터 유리되는 것이 명확해져 있다(Nat. Med. (2007) 13, 851-856). 본 발명에서 사용되는 암조직 특이적 화합물의 비한정의 일태양으로서, 이러한 ATP 등의 푸린 뉴클레오티드의 대사에 의해 암조직에 있어서 고농도로 축적되는 요산도 적합하게 들 수 있다.
(7) 1-메틸 니코틴아미드
복수의 인간 암조직에 있어서 효소 니코틴아미드 N-메틸트랜스페라아제가 고발현되고 있는 것이 알려져 있다. 본 효소가 니코틴아미드로부터 안정적인 대사물인 1-메틸 니코틴아미드를 생산할 때, 메틸 공여체가 되는 S-아데노실메티오닌(SAM)의 메틸기를 소비하기 위해, 암세포에 있어서의 SAM 농도의 감소에 수반된 DNA의 메틸화능을 손상시키는 메커니즘을 통해 니코틴아미드 N-메틸트랜스페라아제의 고발현이 종양화(tumorigenesis)에 기여하고 있는 것이 제창되고 있다(Ulanovskaya 등(Nat. Chem. Biol. (2013) 9 (5) 300-306)). 본 효소의 안정적인 대사산물인 1-메틸 니코틴아미드는 암세포의 세포 외로 분비되는 것이 알려져 있어(Yamada 등(J. Nutr. Sci. Vitaminol. (2010) 56, 83-86)), 본 발명에서 사용되는 암조직 특이적 화합물의 비한정의 일태양으로서, 이러한 니코틴아미드의 대사에 의해 암조직에 있어서 고농도로 축적되는 1-메틸 니코틴아미드 등도 적합하게 들 수 있다.
염증 조직 특이적 화합물
본 명세서 중에서 사용되는 용어 「염증 조직 특이적인 화합물(염증 조직 특이적 화합물)」이란 비-염증 조직과 비교하여 염증 조직 중에 차별적으로 존재하는 화합물을 말한다. 본 명세서에 있어서 「염증 조직」이란, 예를 들면 아래의 것을 예시적으로 들 수 있다.
·류머티스성 관절염이나 변형성 관절증에 있어서의 관절
·기관지천식이나 COPD에 있어서의 폐(폐포)
·염증성 장질환이나 클론병이나 궤양성 대장염에 있어서의 소화기관
·간장, 신장, 폐에 있어서의 섬유화증에 있어서의 섬유화 조직
·장기 이식에 있어서의 거부반응이 일어난 조직
·동맥경화나 심부전에 있어서의 혈관, 심장(심근)
·대사증후군에 있어서의 내장지방
·아토피성 피부염, 기타 피부염에 있어서의 피부 조직
·추간판 탈출증이나 만성 요통에 있어서의 척수신경
염증 조직 특이적 대사산물
염증 조직 특이적 대사산물이란 염증성 조직에 침윤되어 있는 면역세포가 높게 생산되는 대사산물 및 염증 조직에 있어서 상해를 받고 있는 정상 세포가 특이적으로 높게 생산되는 대사산물이다. 침윤되는 면역세포로서는 이펙터 T세포, 성숙 수상세포, 호중구, 과립세포(비만세포), 호염기구 등이 예시된다. 또한 본 발명에 있어서의 대사산물에는 염증 조직에 존재하는 세포(면역세포, 정상 세포)가 아포토시스나 네크로시스 등에 의해 세포사했을 때, 세포 내로부터 세포 외로 방출되는 화합물도 포함된다.
본 발명에서 사용되는 염증 조직 특이적 화합물 또는 염증 조직 특이적 대사산물의 비한정의 일태양으로서 아래의 화합물로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 적합하게 들 수 있다. 하나 이상의 화합물이란 후술하는 동일 항원 결합 도메인에 의한 항원에 대한 결합 활성이 1종의 염증 조직 특이적 화합물 또는 염증 조직 특이적 대사산물에 의존적일 뿐 아니라, 복수 종류의 염증 조직 특이적 화합물 또는 염증 조직 특이적 대사산물에 의존적인 경우를 포함하는 것을 의미한다.
(1) 프로스타글란딘 E2(Prostaglandin E2) 등의 아라키돈산의 대사산물
류머티스성 관절염이나 변형성 관절증에 있어서 PGE2 농도가 높은 것이 알려져 있다(Eur. J. Clin. Pharmacol. (1994) 46, 3-7., Clin. Exp. Rheumatol. (1999) 17, 151-160, Am. J. Vet. Res. (2004) 65, 1269-1275.). 본 발명에서 사용되는 염증 조직 특이적 화합물, 특히 염증세포 특이적 대사산물이나 염증 조직에 침윤되는 면역세포 특이적 대사물의 비한정의 일태양으로서, 이러한 프로스타글란딘 E2 등의 아라키돈산의 대사산물을 적합하게 들 수 있다.
(2) 아데노신, 아데노신 3인산(ATP), 아데노신 2인산(ADP), 아데노신 1인산(AMP) 등의 푸린 고리 구조를 갖는 뉴클레오시드
기관지천식에 기인하는 염증이 일어난 폐포에 있어서 ATP 농도가 높은 것이 알려져 있다(Nat. Med. (2007) 13, 913-919). 또한 COPD에 기인하는 염증이 일어난 폐포에 있어서 ATP 농도가 높은 것도 또한 알려져 있다(Am. J. Respir. Crit. Care Med. (2010) 181, 928-934). 또한 류머티스성 관절염 환자의 관절액 중에서 아데노신 농도가 높은 것이 관찰되고 있다(Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis (2004) 36 877-882). 또한 GVHD에 의해 거부반응이 일어난 조직에 있어서 ATP 농도가 높은 것이 알려져 있다(Nat. Med. (2010) 16, 1434-1438). 또한 폐, 간장, 신장에 있어서의 섬유화 조직에 있어서 아데노신 농도가 항진되어 있는 것도 알려져 있다(FASEB J. (2008) 22, 2263-2272, J. Immunol. (2006) 176, 4449-4458, J. Am. Soc. Nephrol. (2011) 22 (5), 890-901, PLoS ONE J. (2010) 5 (2), e9242). 또한 폐 섬유증 환자의 섬유화 조직에 있어서 ATP 농도가 상승되어 있는 것이 관찰되어 있다(Am. J. Respir. Crit. Care Med. (2010) 182, 774-783). 본 발명에서 사용되는 염증성 조직 특이적 화합물의 비한정의 일태양으로서, 이러한 ATP 등의 푸린 뉴클레오티드의 대사에 의해 염증 조직에 있어서 고농도로 축적되는 ATP, ADP, AMP 또는 아데노신 등을 적합하게 들 수 있다. 또한 아데노신은 아데노신 데아미나아제에 의해 이노신으로 분해되기 때문에 이노신이 고농도로 축적된다.
(3) 요산
요산은 생체 내에 있어서의 푸린 뉴클레오시드의 대사경로의 산물로, 혈액 또는 간질강 등의 세포 외로 유리된다. 또한 최근 들어서는 괴사(necrosis)를 진행시키는 세포로부터 유리되는 요산이 염증성 응답을 촉진시키는 것이 명확해져 있다(J. Clin. Invest. (2010) 120 (6), 1939-1949). 본 발명에서 사용되는 염증 조직 특이적 화합물의 비한정의 일태양으로서, 이러한 ATP 등의 푸린 뉴클레오티드의 대사에 의해 염증성 조직에 있어서 고농도로 축적되는 요산도 적합하게 들 수 있다.
항원 결합 도메인
본 명세서에 있어서 「항원 결합 도메인」은 목적으로 하는 항원에 결합하는 한 어떠한 구조의 도메인도 사용될 수 있다. 이러한 도메인의 예로서, 예를 들면 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변영역, 생체 내에 존재하는 세포막 단백인 아비머(Avimer)에 포함되는 35 아미노산 정도의 A 도메인으로 불리는 모듈(국제공개 WO2004/044011, WO2005/040229), 세포막에 발현하는 당단백질인 피브로넥틴(fibronectin) 중의 단백질에 결합하는 도메인인 10Fn3 도메인을 포함하는 아드넥틴(Adnectin)(국제공개 WO2002/032925), Protein A의 58 아미노산으로 이루어지는 3개의 헬릭스의 다발(bundle)을 구성하는 IgG 결합 도메인을 스캐폴드(scaffold)로 하는 어피바디(Affibody)(국제공개 WO1995/001937), 33 아미노산 잔기를 포함하는 턴과 2개의 역병행 헬릭스 및 루프의 서브유닛이 반복해서 겹쳐 쌓아진 구조를 갖는 안키린 반복(ankyrin repeat：AR)의 분자 표면에 노출되는 영역인 DARPins(Designed Ankyrin Repeat proteins)(국제공개 WO2002/020565), 호중구 겔라티나아제 결합 리포칼린(neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL)) 등의 리포칼린 분자에 있어서 고도로 보존된 8개의 역병행 스트랜드가 중앙방향으로 꼬인 배럴 구조의 편측을 지지하는 4개의 루프영역인 안티칼린(Anticalin) 등(국제공개 WO2003/029462), 칠성장어, 먹장어 등 무악류의 획득 면역 시스템으로서 면역글로불린의 구조를 갖지 않는 가변성 림프구 수용체(variable lymphocyte receptor(VLR))의 류신 잔기가 풍부한 리피트(leucine-rich-repeat(LRR)) 모듈이 반복해서 겹쳐 쌓아진 편자모양의 구조 내부의 병행형 시트 구조의 움푹 들어간 영역(국제공개 WO2008/016854)을 바람직하게 들 수 있다.
본 발명의 항원 결합 도메인의 적합한 예로서, 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변영역을 포함하는 항원 결합 도메인을 들 수 있다. 이러한 항원 결합 도메인의 예로서는, 「scFv(single chain Fv)」, 「단일 사슬 항체(single chain antibody)」, 「Fv」, 「scFv2(single chain Fv 2)」, 「Fab」 또는 「F(ab')2」 등을 적합하게 들 수 있다.
본 발명의 항원 결합 분자에 있어서의 항원 결합 도메인은 동일 에피토프에 결합할 수 있다. 여기서 동일 에피토프는, 예를 들면 서열번호：1에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 중에 존재할 수 있다. 또는 본 발명의 항원 결합 분자에 있어서의 항원 결합 도메인은 서로 다른 에피토프에 결합할 수 있다. 여기서 다른 에피토프는, 예를 들면 서열번호：1에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 중에 존재할 수 있다.
특이적
특이적이란 특이적으로 결합하는 분자의 한쪽 분자가 그 하나 또는 복수의 결합하는 상대방 분자 이외의 분자에 대해서는 실질적으로 결합하지 않는 상태를 말한다. 또한 항원 결합 도메인이 어떤 항원 중에 포함되는 복수의 에피토프 중 특정 에피토프에 대해 특이적인 경우에도 사용된다. 또한 항원 결합 도메인이 결합하는 에피토프가 복수의 상이한 항원에 포함되는 경우에는, 당해 항원 결합 도메인을 갖는 항원 결합 분자는 당해 에피토프를 포함하는 다양한 항원과 결합할 수 있다. 여기서 실질적으로 결합하지 않는다는 것은 상기 결합 활성의 항목에서 기재한 방법에 준하여 결정되며, 상기 상대방 이외의 분자에 대한 특이적 결합 분자의 결합 활성이 상기 상대방 분자에 대한 결합 활성의 80% 이하, 통상 50% 이하, 바람직하게는 30% 이하, 특히 바람직하게는 15% 이하의 결합 활성을 나타내는 것을 말한다.
세포 상해 활성
본 발명의 비한정의 일태양에서는 저분자 화합물(예를 들면 암조직 특이적 화합물, 염증 조직 특이적 화합물 또는 그들의 대사물)의 농도에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인을 포함하고, 막형 분자를 그 세포막에 발현하는 세포에 대한 세포 상해 활성을 갖는 항원 결합 분자, 및 당해 항원 결합 분자를 유효 성분으로서 포함하는 의약 조성물이 제공된다. 본 발명에 있어서 세포 상해 활성이란, 예를 들면 항체 의존성 세포 개재성 세포 상해(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity：ADCC) 활성, 보체 의존성 세포 상해(complement-dependent cytotoxicity：CDC) 활성 및 T세포에 의한 세포 상해 활성 등을 들 수 있다. 본 발명에 있어서 CDC 활성이란 보체계에 의한 세포 상해 활성을 의미한다. 한편 ADCC 활성이란 표적 세포의 세포막에 발현된 막형 분자에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자의 Fc영역에 면역세포 등이 당해 면역세포에 발현된 Fcγ 수용체를 매개로 결합하여 당해 면역세포가 표적 세포에 상해를 주는 활성을 의미한다. 목적의 항원 결합 분자가 ADCC 활성을 갖는지 여부 또는 CDC 활성을 갖는지 여부는 공지의 방법으로 측정될 수 있다(예를 들면 Current protocols in Immunology, Chapter7. Immunologic studies in humans, Coligan 등 편저(1993) 등).
구체적으로는, 먼저 이펙터 세포, 보체 용액, 표적 세포의 조제가 실시된다.
(1) 이펙터 세포의 조제
CBA/N 마우스 등으로부터 적출된 비장으로부터 RPMI1640배지(Invitrogen) 중에서 비장세포가 분리된다. 10% 소 태아 혈청(FBS, HyClone)을 포함하는 동 배지에서 세정된 당해 비장세포의 농도를 5×106 cells/mL로 조제함으로써 이펙터 세포가 조제될 수 있다.
(2) 보체 용액의 조제
10% FBS 함유 배지(Invitrogen)에 의해 Baby Rabbit Complement(CEDARLANE)를 10배로 희석함으로써 보체 용액이 조제될 수 있다.
(3) 표적 세포의 조제
항원을 발현하는 세포를 0.2 mCi의 51Cr-크롬산나트륨(GE 헬스케어 바이오사이언스)과 함께 10% FBS 함유 DMEM 배지 중에서 37℃로 1시간 배양함으로써 그 표적 세포가 방사성 표지될 수 있다. 방사성 표지 후, 10% FBS 함유 RPMI1640 배지에서 3회 세정된 세포의 농도를 2×105 cells/mL로 조제함으로써 당해 표적 세포가 조제될 수 있다.
ADCC 활성 또는 CDC 활성은 하기에 기술하는 방법으로 측정될 수 있다. ADCC 활성 측정의 경우는 96웰 U바닥 플레이트(Becton Dickinson)에 첨가된 각 50 ㎕씩의 표적 세포와 항원 결합 분자가 실온에서 15분간 반응된다. 그 후, 이펙터 세포 100 ㎕가 첨가된 당해 플레이트가 탄산가스 인큐베이터 내에서 4시간 정치된다. 항원 결합 분자의 최종 농도는 예를 들면 0 또는 10 ㎍/㎖ 등의 농도가 설정될 수 있다. 정치 후, 각 웰로부터 회수된 100 ㎕의 상청의 방사 활성이 감마 카운터(COBRAII AUTO-GAMMA, MODEL D5005, Packard Instrument Company)를 사용해서 측정된다. 측정값을 사용하여 세포 상해 활성(%)이 (A-C)/(B-C)×100의 계산식을 토대로 계산될 수 있다. A는 각 시료에 있어서의 방사 활성(cpm), B는 1% NP-40(nacalai tesque)을 첨가한 시료에 있어서의 방사 활성(cpm), C는 표적 세포만을 포함하는 시료의 방사 활성(cpm)을 나타낸다.
한편 CDC 활성 측정의 경우는, 96웰 바닥이 평평한 플레이트(Becton Dickinson)에 첨가된 각 50 ㎕씩의 표적 세포와 항원 결합 분자가 빙상에서 15분간 반응된다. 그 후, 보체 용액 100 ㎕가 첨가된 당해 플레이트가 탄산가스 인큐베이터 내에서 4시간 정치된다. 항원 결합 분자의 최종 농도는 예를 들면 0 또는 3 ㎍/mL 등의 농도가 설정될 수 있다. 정치 후, 각 웰로부터 회수된 100 ㎕의 상청의 방사 활성이 감마 카운터를 사용해서 측정된다. 세포 상해 활성은 ADCC 활성의 측정과 동일하게 계산될 수 있다.
또한 후술되는 화학요법제, 독성 펩티드 또는 방사성 화학물질 등의 세포 상해성 물질이 결합된 수식 항원 결합 분자 수식물도 본 발명의 세포 상해 활성을 갖는 항원 결합 분자로서 적합하게 사용될 수 있다. 이러한 수식 항원 결합 분자(이하, 항원 결합 분자 약물 콘쥬게이트라 칭한다.)는 얻어진 항원 결합 분자를 화학적으로 수식함으로써 취득될 수 있다. 또한 항원 결합 분자의 수식방법으로서 항체 약물 콘쥬게이트 등의 분야에 있어서 이미 확립되어 있는 방법이 적절히 사용될 수 있다. 또한 독성 펩티드가 결합된 수식 항원 결합 분자는 당해 독성 펩티드를 코드하는 유전자와 본 발명의 항원 결합 분자를 코드하는 유전자가 인프레임으로 연결된 융합 유전자를 적절한 숙주세포 중에서 발현시킨 후에, 당해 세포의 배양액으로부터 단리함으로써 취득될 수 있다.
중화 활성
본 발명의 비한정의 일태양에서는 저분자 화합물(예를 들면 암조직 특이적 화합물, 염증 조직 특이적 화합물, 그들의 대사물 등)의 농도에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인을 포함하고, 당해 막형 분자에 대한 중화 활성을 갖는 항원 결합 분자를 유효성분으로서 포함하는 면역응답을 유도하는 의약 조성물이 제공된다. 본 발명의 비한정의 다른 일태양에서는, 저분자 화합물(예를 들면 암조직 특이적 화합물, 염증 조직 특이적 화합물, 그들의 대사물 등)의 농도에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인을 포함하고, 막형 분자를 그의 세포막에 발현하는 세포에 대한 세포 상해 활성에 더하여, 당해 막형 분자에 대한 중화 활성을 갖는 항원 결합 분자를 유효성분으로서 포함하는 면역응답을 유도하는 의약 조성물이 제공된다. 일반적으로 중화 활성이란 바이러스나 독소 등 세포에 대해 생물학적 활성을 갖는 리간드의 당해 생물학적 활성을 저해하는 활성을 말한다. 즉, 중화 활성을 갖는 물질이란 당해 리간드 또는 당해 리간드가 결합하는 수용체에 결합하여 당해 리간드와 수용체의 결합을 저해하는 물질을 가리킨다. 중화 활성에 의해 리간드와의 결합을 저지당한 수용체는 당해 수용체를 통한 생물학적 활성을 발휘할 수 없게 된다. 항원 결합 분자가 항체인 경우, 이러한 중화 활성을 갖는 항체는 일반적으로 중화 항체라 불린다. 어떤 피검물질의 중화 활성은 리간드의 존재하에 있어서의 생물학적 활성을 그 피검물질의 존재 또는 비존재하의 조건 간에 비교함으로써 측정될 수 있다.
예를 들면 IL-6 수용체의 주요한 리간드로서 생각되고 있는 것은 서열번호：27로 표시되는 IL-6를 적합하게 들 수 있다. 그 아미노 말단이 세포 외 도메인을 형성하는 I형 막단백질인 IL-6 수용체는 IL-6에 의해 이량체화가 유도된 gp130 수용체와 함께 헤테로 사량체를 형성한다(Heinrich 등(Biochem. J. (1998) 334, 297-314)). 당해 헤테로 사량체의 형성에 의해 gp130 수용체에 회합되어 있는 Jak가 활성화된다. Jak는 자기 인산화와 수용체의 인산화를 행한다. 수용체 및 Jak의 인산화 부위는 Stat3와 같은 SH2를 갖는 Stat 패밀리에 속하는 분자나 MAP 키나아제, PI3/Akt, 그 밖의 SH2를 갖는 단백질이나 어댑터에 대해 결합 부위의 역할을 한다. 다음으로 gp130 수용체에 결합한 Stat가 Jak에 의해 인산화된다. 인산화된 Stat는 이량체를 형성하고 핵내로 이행하여 표적 유전자의 전사를 조절한다. Jak 또는 Stat는 다른 클래스의 수용체를 매개로 신호 캐스케이드에 관여하는 것도 가능하다. 탈제어된 IL-6의 신호 캐스케이드는 자기 면역 질환의 병태나 염증, 다발성 골수종이나 전립선암 등의 암에서 관찰된다. 암 유전자로서 작용할 수 있는 Stat3는 많은 암에 있어서 항상적으로 활성화되어 있다. 전립선암과 다발성 골수종에서는 IL-6 수용체로부터의 신호 캐스케이드와 상피 성장인자 수용체(EGFR) 패밀리 멤버로부터의 신호 캐스케이드 사이에 크로스토크가 있다(Ishikawa 등(J. Clin. Exp. Hematopathol. (2006) 46 (2), 55-66)).
이러한 세포 내의 신호 캐스케이드는 세포종별로 상이하기 때문에 목적으로 하는 표적 세포별로 적절히 표적분자를 설정할 수 있고, 상기 인자에 한정되는 것은 아니다. 생체 내 신호의 활성화를 측정함으로써 중화 활성을 평가할 수 있다. 또한 생체 내 신호 캐스케이드의 하류에 존재하는 표적 유전자에 대한 전사 유도 작용을 지표로 하여 생체 내 신호의 활성화를 검출하는 것도 가능하다. 표적 유전자의 전사 활성의 변화는 리포터 어세이의 원리에 의해 검출할 수 있다. 구체적으로는, 표적 유전자의 전사인자 또는 프로모터 영역의 하류에 GFP(Green Fluorescence Protein)나 루시페라아제 등의 리포터 유전자를 배치하고, 그 리포터 활성을 측정함으로써 전사 활성의 변화를 리포터 활성으로서 측정할 수 있다. 생체 내 신호의 활성화 측정 키트는 시판의 것을 적절히 사용할 수 있다(예를 들면 Mercury Pathway Profiling Luciferase System(Clontech) 등).
또한 통상은 세포 증식을 촉진하는 방향으로 작용하는 신호 캐스케이드에 작용하는 EGF 수용체 패밀리 등의 수용체 리간드의 중화 활성을 측정하는 방법으로서, 표적으로 하는 세포의 증식 활성을 측정함으로써 항원 결합 분자의 중화 활성을 평가할 수 있다. 예를 들면 HB-EGF 등 그 증식이 EGF 패밀리의 성장 인자에 의해 촉진되는 세포의 증식에 대한 항HB-EGF 항체의 중화 활성에 기초하는 억제 효과를 평가 또는 측정하는 방법으로서, 아래의 방법이 적합하게 사용된다. 시험관 내에 있어서 당해 세포 증식 억제 활성을 평가 또는 측정하는 방법으로서는, 배지 중에 첨가한 [3H] 라벨한 티미딘의 생세포에 의한 흡수를 DNA 복제능력의 지표로서 측정하는 방법이 사용된다. 보다 간편한 방법으로서 트리판블루 등의 색소를 세포 외로 배제하는 능력을 현미경하에서 계측하는 색소 배제법이나 MTT법이 사용된다. 후자는 생세포가 테트라졸륨염인 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)를 청색의 포르마잔 산물로 전환하는 능력을 갖는 것을 이용하고 있다. 보다 구체적으로는, 피검세포의 배양액에 리간드와 함께 피검항체를 첨가하여 일정 시간 경과 후에, MTT 용액을 배양액에 첨가하여 일정 시간 정치함으로써 MTT를 세포에 흡수시킨다. 그 결과, 황색 화합물인 MTT가 세포 내의 미토콘드리아 내의 숙신산 탈수소효소에 의해 청색의 화합물로 변환된다. 이 청색 생성물을 용해하여 정색(呈色)시킨 후에 그 흡광도를 측정함으로써 생세포 수의 지표로 하는 것이다. MTT 이외에 MTS, XTT, WST-1, WST-8 등의 시약도 시판되고 있어(nacalai tesque 등) 적합하게 사용할 수 있다. 활성의 측정시에는 대조 항체로서 항HB-EGF 항체와 동일 아이소타입을 갖는 항체로 당해 세포 증식 억제 활성을 갖지 않는 결합 항체를 항HB-EGF 항체와 동일하게 사용하여 항HB-EGF 항체가 대조 항체보다도 강한 세포 증식 억제 활성을 나타냄으로써 활성을 판정할 수 있다.
활성을 평가하기 위한 세포로서, 예를 들면 그 증식이 HB-EGF에 의해 촉진되는 세포인, 난소암세포인 RMG-1 세포주나 인간 EGFR의 세포 외 도메인과 마우스 G-CSF 수용체의 세포 내 도메인을 인프레임 융합한 융합 단백질인 hEGFR/mG-CSFR을 코드하는 유전자를 발현하도록 결합한 벡터에 의해 형질전환된 마우스 Ba/F3세포 등도 적합하게 사용될 수 있다. 이와 같이 당업자는 활성을 평가하기 위한 세포를 적절히 선택함으로써 상기 세포 증식 활성의 측정에 사용하는 것이 가능하다.
항체
본 명세서에 있어서 항체란, 천연의 것이거나 또는 부분적 또는 완전 합성에 의해 제조된 면역글로불린을 말한다. 항체는 그것이 천연으로 존재하는 혈장이나 혈청 등의 천연 자원이나 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 배양상청으로부터 단리될 수 있고, 또는 유전자 재조합 등의 수법을 사용함으로써 부분적으로 또는 완전히 합성될 수 있다. 항체의 예로서는 면역글로불린의 아이소타입 및 그들 아이소타입의 서브클래스를 적합하게 들 수 있다. 인간의 면역글로불린으로서, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgM의 9종류의 클래스(아이소타입)가 알려져 있다. 본 발명의 항체에는, 이들 아이소타입 중 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4가 포함될 수 있다. 인간 IgG1, 인간 IgG2, 인간 IgG3, 인간 IgG4 불변영역으로서는 유전자 다형에 의한 복수의 알로타입 서열이 Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242에 기재되어 있는데, 본 발명에 있어서는 그 중 어느 것이어도 된다. 특히 인간 IgG1의 서열로서는 EU 넘버링으로 표시되는 356-358번 위치의 아미노산 서열이 DEL이어도 되고 EEM이어도 된다. 또한 인간 Igκ(Kappa) 불변영역과 인간 Igλ(Lambda) 불변영역으로서는 유전자 다형에 의한 복수의 알로타입 서열이 Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242에 기재되어 있는데, 본 발명에 있어서는 그 중 어느 것이어도 된다.
목적하는 결합 활성을 갖는 항체를 제작하는 방법은 당업자에게 있어서 공지이다. 아래에 IL-6R에 결합하는 항체(항IL-6R 항체)를 제작하는 방법이 예시된다. IL-6R 이외의 항원에 결합하는 항체도 하기의 예시에 준하여 적당히 제작될 수 있다.
항IL-6R 항체는 공지의 수단을 사용하여 다중클론 또는 단일클론 항체로서 취득될 수 있다. 항IL-6R 항체로서는, 포유동물 유래의 단일클론 항체가 적합하게 제작될 수 있다. 포유동물 유래의 단일클론 항체에는, 하이브리도마에 의해 생산되는 것 및 유전자 공학적 수법에 의해 항체 유전자를 포함하는 발현 벡터로 형질전환한 숙주세포에 의해 생산되는 것 등이 포함된다. 또한 본원 발명의 단일클론 항체에는 「인간화 항체」나 「키메라 항체」가 포함된다.
단일클론 항체 생산 하이브리도마는 공지기술을 사용함으로써, 예를 들면 아래와 같이 제작될 수 있다. 즉, IL-6R 단백질을 감작 항원으로서 사용하여 통상의 면역방법에 따라 포유동물이 면역된다. 얻어지는 면역세포가 통상의 세포융합법에 의해 공지의 친세포와 융합된다. 다음으로, 통상의 스크리닝법에 의해, 단일클론 항체 생산 세포를 스크리닝함으로써 항IL-6R 항체를 생산하는 하이브리도마가 선택될 수 있다.
구체적으로는, 단일클론 항체의 제작은 예를 들면 아래에 나타내는 바와 같이 행해진다. 먼저, 서열번호：2에 그의 뉴클레오티드 서열이 개시된 IL-6R 유전자를 발현함으로써, 항체 취득의 감작 항원으로서 사용되는 서열번호：1로 표시되는 IL-6R 단백질이 취득될 수 있다. 즉, IL-6R을 코드하는 유전자 서열을 공지의 발현 벡터에 삽입함으로써 적당한 숙주세포가 형질전환된다. 당해 숙주세포 중 또는 배양상청 중으로부터 목적하는 인간 IL-6R 단백질이 공지의 방법으로 정제된다. 배양상청 중으로부터 가용형의 IL-6R을 취득하기 위해서는, 예를 들면 멀버그 등(J. Immunol. (1994) 152 (10), 4958-4968)에 의해 기재되어 있는 바와 같은 가용형 IL-6R인, 서열번호：1로 표시되는 IL-6R 폴리펩티드 서열 중 1부터 357번째 아미노산으로 이루어지는 단백질이 서열번호：1로 표시되는 IL-6R 단백질 대신에 발현된다. 또한 정제한 천연의 IL-6R 단백질도 또한 동일하게 감작 항원으로서 사용될 수 있다.
포유동물에 대한 면역에 사용하는 감작 항원으로서 당해 정제 IL-6R 단백질을 사용할 수 있다. IL-6R의 부분 펩티드도 또한 감작 항원으로서 사용할 수 있다. 이때, 당해 부분 펩티드는 인간 IL-6R의 아미노산 서열로부터 화학합성으로도 취득될 수 있다. 또한 IL-6R 유전자의 일부를 발현 벡터에 삽입하여 발현시킴으로써도 취득될 수 있다. 더 나아가서는 단백질 분해효소를 사용하여 IL-6R 단백질을 분해함으로써도 취득될 수 있으나, 부분 펩티드로서 사용되는 IL-6R 펩티드의 영역 및 크기는 특별한 태양에 한정되지 않는다. 바람직한 영역은 서열번호：1의 아미노산 서열에 있어서 20-357번째 아미노산에 상당하는 아미노산 서열로부터 임의의 서열이 선택될 수 있다. 감작 항원으로 하는 펩티드를 구성하는 아미노산의 수는 적어도 5 이상, 예를 들면 6 이상, 또는 7 이상인 것이 바람직하다. 보다 구체적으로는 8~50, 바람직하게는 10~30 잔기의 펩티드가 감작 항원으로서 사용될 수 있다.
또한 IL-6R 단백질의 목적하는 부분 폴리펩티드나 펩티드를 상이한 폴리펩티드와 융합한 융합 단백질이 감작 항원으로서 이용될 수 있다. 감작 항원으로서 사용되는 융합 단백질을 제조하기 위해, 예를 들면 항체의 Fc 단편이나 펩티드 태그 등이 적합하게 이용될 수 있다. 융합 단백질을 발현하는 벡터는 목적하는 2종류 또는 그 이상의 폴리펩티드 단편을 코드하는 유전자가 인프레임 융합되고, 당해 융합 유전자가 상기와 같이 발현 벡터에 삽입됨으로써 제작될 수 있다. 융합 단백질의 제작방법은 Molecular Cloning 2nd ed. (Sambrook,J et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58 (1989) Cold Spring Harbor Lab. press)에 기재되어 있다. 감작 항원으로서 사용되는 IL-6R의 취득방법 및 그것을 이용한 면역방법은 국제공개 WO2003/000883, WO2004/022754, WO2006/006693 등에도 구체적으로 기재되어 있다.
당해 감작 항원으로 면역되는 포유동물로서는 특정 동물에 한정되는 것은 아니나, 세포융합에 사용하는 친세포와의 적합성을 고려하여 선택하는 것이 바람직하다. 일반적으로는 설치류의 동물, 예를 들면 마우스, 랫트, 햄스터 또는 토끼, 원숭이 등이 적합하게 사용된다.
공지의 방법에 따라 상기 동물이 감작 항원에 의해 면역된다. 예를 들면 일반적인 방법으로서, 감작 항원이 포유동물의 복강 내 또는 피하에 주사에 의해 투여됨으로써 면역이 실시된다. 구체적으로는, PBS(Phosphate-Buffered Saline)나 생리식염수 등으로 적당한 희석배율로 희석된 감작 항원이 목적하는 바에 따라 통상의 애쥬번트, 예를 들면 프로인트 완전 애쥬번트와 혼합되어 유화된 후에, 그 감작 항원이 포유동물에 4~21일마다 수회 투여된다. 또한 감작 항원의 면역 시에는 적당한 담체가 사용될 수 있다. 특히 분자량이 작은 부분 펩티드가 감작 항원으로서 사용되는 경우에는, 알부민, 키홀 림펫 헤모시아닌 등의 담체 단백질과 결합한 그 감작 항원 펩티드를 면역하는 것이 바람직한 경우도 있다.
또한 목적하는 항체를 생산하는 하이브리도마는 DNA 면역을 사용하여 아래와 같이 해서도 제작될 수 있다. DNA 면역이란, 면역동물 중에서 항원 단백질을 코드하는 유전자가 발현될 수 있는 태양으로 구축된 벡터 DNA가 투여된 당해 면역동물 중에서 감작 항원이 당해 면역동물의 생체 내에서 발현됨으로써 면역자극이 부여되는 면역방법이다. 단백질 항원이 면역동물에 투여되는 일반적인 면역방법과 비교하여 DNA 면역에는 다음과 같은 우위성이 기대된다.
-IL-6R과 같은 막단백질의 구조를 유지하여 면역자극이 부여될 수 있다
-면역항원을 정제할 필요가 없다
DNA 면역에 의해 본 발명의 단일클론 항체를 얻기 위해 먼저 IL-6R 단백질을 발현하는 DNA가 면역동물에 투여된다. IL-6R을 코드하는 DNA는 PCR 등의 공지의 방법에 의해 합성될 수 있다. 얻어진 DNA가 적당한 발현 벡터에 삽입되어 면역동물에 투여된다. 발현 벡터로서는, 예를 들면 pcDNA3.1 등의 시판의 발현 벡터가 적합하게 이용될 수 있다. 벡터를 생체에 투여하는 방법으로서 일반적으로 사용되고 있는 방법이 이용될 수 있다. 예를 들면 발현 벡터가 흡착된 금 입자가 유전자 총(gene gun)으로 면역동물 개체의 세포 내에 도입됨으로써 DNA 면역이 행해진다. 또한 IL-6R을 인식하는 항체의 제작은 국제공개 WO2003/104453에 기재된 방법을 사용해도 제작될 수 있다.
이와 같이 포유동물이 면역되고, 혈청 중에 있어서의 IL-6R에 결합하는 항체 역가의 상승이 확인된 후에, 포유동물로부터 면역세포가 채취되어 세포융합에 제공된다. 바람직한 면역세포로서는, 특히 비장세포가 사용될 수 있다.
상기 면역세포와 융합되는 세포로서 포유동물의 골수종 세포가 사용된다. 골수종 세포는 스크리닝을 위한 적당한 선택 마커를 구비하고 있는 것이 바람직하다. 선택 마커란, 특정 배양 조건하에서 생존할 수 있는(또는 할 수 없는) 형질을 가리킨다. 선택 마커로는, 히포크산틴-구아닌-포스포리보실트랜스페라아제 결손(이하 HGPRT 결손으로 생략함) 또는 티미딘키나아제 결손(이하 TK 결손으로 생략함) 등이 공지이다. HGPRT나 TK의 결손을 갖는 세포는 히포크산틴-아미노프테린-티미딘 감수성(이하 HAT 감수성으로 생략함)을 갖는다. HAT 감수성의 세포는 HAT 선택 배지 중에서 DNA 합성을 행할 수 없어 사멸되지만, 정상의 세포와 융합하면 정상 세포의 샐비지 회로를 이용하여 DNA의 합성을 계속할 수 있기 때문에 HAT 선택 배지 중에서도 증식되게 된다.
HGPRT 결손이나 TK 결손의 세포는 각각 6 티오구아닌, 8 아자구아닌(이하 8AG로 생략함) 또는 5'브로모데옥시우리딘을 포함하는 배지에서 선택될 수 있다. 이들의 피리미딘 아날로그를 DNA 중에 흡수하는 정상의 세포는 사멸된다. 한편, 이들의 피리미딘 아날로그를 흡수할 수 없는 이들의 효소를 결손한 세포는 선택 배지 중에서 생존할 수 있다. 이 밖에 G418 내성으로 불리는 선택 마커는 네오마이신 내성 유전자에 의해 2-데옥시스트렙타민계 항생물질(겐타마이신 유사체)에 대한 내성을 부여한다. 세포융합에 적합한 각종의 골수종 세포가 공지이다.
이러한 골수종 세포로서, 예를 들면 P3(P3x63Ag8.653)(J. Immunol.(1979)123 (4), 1548-1550), P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81, 1-7), NS-1(C. Eur. J. Immunol.(1976)6 (7), 511-519), MPC-11(Cell(1976)8 (3), 405-415), SP2/0(Nature(1978)276 (5685), 269-270), FO(J. Immunol. Methods(1980)35 (1-2), 1-21), S194/5.XX0.BU.1(J. Exp. Med.(1978)148 (1), 313-323), R210(Nature(1979)277 (5692), 131-133) 등이 적합하게 사용될 수 있다.
기본적으로는 공지의 방법, 예를 들면 쾰러와 밀스테인 등의 방법(Methods Enzymol.(1981)73, 3-46) 등에 준하여 상기 면역세포와 골수종 세포의 세포융합이 행해진다.
보다 구체적으로는, 예를 들면 세포융합 촉진제의 존재하에서 통상의 영양배양액 중에서 상기 세포융합이 실시될 수 있다. 융합 촉진제로서는, 예를 들면 폴리에틸렌글리콜(PEG), 센다이 바이러스(HVJ) 등이 사용되고, 추가로 융합효율을 높이기 위해 목적하는 바에 따라 디메틸설폭시드 등의 보조제가 첨가되어 사용된다.
면역세포와 골수종 세포의 사용비율은 임의로 설정될 수 있다. 예를 들면 골수종 세포에 대해 면역세포를 1~10배로 하는 것이 바람직하다. 상기 세포융합에 사용하는 배양액으로서는, 예를 들면 상기 골수종 세포주의 증식에 적합한 RPMI1640 배양액, MEM 배양액, 기타, 이 종의 세포배양에 사용되는 통상의 배양액이 사용되고, 추가로 소 태아 혈청(FCS) 등의 혈청 보액이 적합하게 첨가될 수 있다.
세포융합은 상기 면역세포와 골수종 세포의 소정량을 상기 배양액 중에서 잘 혼합하여, 사전에 37℃ 정도로 가온된 PEG 용액(예를 들면 평균 분자량 1,000~6,000 정도)이 통상 30~60%(w/v)의 농도로 첨가된다. 혼합액이 완만하게 혼합됨으로써 목적하는 융합세포(하이브리도마)가 형성된다. 이어서, 상기에 예로 든 적당한 배양액이 축차 첨가되고, 원심하여 상청을 제거하는 조작을 반복함으로써 하이브리도마의 생육에 바람직하지 않은 세포융합제 등이 제거될 수 있다.
이와 같이 하여 얻어진 하이브리도마는 통상의 선택 배양액, 예를 들면 HAT 배양액(히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함하는 배양액)으로 배양함으로써 선택될 수 있다. 목적하는 하이브리도마 이외의 세포(비융합세포)가 사멸되기에 충분한 시간(통상, 이러한 충분한 시간은 수일 내지 수 주간임) 상기 HAT 배양액을 사용한 배양이 계속될 수 있다. 이어서, 통상의 한계희석법에 의해 목적하는 항체를 생산하는 하이브리도마의 스크리닝 및 단일 클로닝이 실시된다.
이와 같이 하여 얻어진 하이브리도마는 세포융합에 사용된 골수종이 갖는 선택 마커에 따른 선택 배양액을 이용함으로써 선택될 수 있다. 예를 들면 HGPRT나 TK의 결손을 갖는 세포는 HAT 배양액(히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함하는 배양액)으로 배양함으로써 선택될 수 있다. 즉, HAT 감수성의 골수종 세포를 세포융합에 사용한 경우, HAT 배양액 중에서 정상 세포와의 세포융합에 성공한 세포가 선택적으로 증식될 수 있다. 목적하는 하이브리도마 이외의 세포(비융합세포)가 사멸되기에 충분한 시간, 상기 HAT 배양액을 사용한 배양이 계속된다. 구체적으로는, 일반적으로 수일 내지 수 주간의 배양에 의해 목적하는 하이브리도마가 선택될 수 있다. 이어서, 통상의 한계희석법에 의해 목적하는 항체를 생산하는 하이브리도마의 스크리닝 및 단일 클로닝이 실시될 수 있다.
목적하는 항체의 스크리닝 및 단일 클로닝이 공지의 항원 항체 반응에 기초하는 스크리닝방법에 의해 적합하게 실시될 수 있다. 예를 들면 IL-6R에 결합하는 단일클론 항체는 세포 표면에 발현된 IL-6R에 결합할 수 있다. 이러한 단일클론 항체는, 예를 들면 FACS(fluorescence activated cell sorting)에 의해 스크리닝될 수 있다. FACS는 형광 항체와 접촉시킨 세포를 레이저광으로 해석하여, 개개의 세포가 발하는 형광을 측정함으로써 세포 표면에 대한 항체의 결합을 측정하는 것을 가능하게 하는 시스템이다.
FACS에 의해 본 발명의 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마를 스크리닝하기 위해서는 먼저 IL-6R을 발현하는 세포를 조제한다. 스크리닝하기 위한 바람직한 세포는 IL-6R을 강제 발현시킨 포유동물세포이다. 숙주세포로서 사용한 형질전환되어 있지 않은 포유동물세포를 대조로서 사용함으로써 세포 표면의 IL-6R에 대한 항체의 결합 활성이 선택적으로 검출될 수 있다. 즉, 숙주세포에 결합하지 않고 IL-6R 강제 발현 세포에 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 선택함으로써 IL-6R 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마가 취득될 수 있다.
또는 고정화한 IL-6R 발현 세포에 대한 항체의 결합 활성이 ELISA의 원리를 토대로 평가될 수 있다. 예를 들면 ELISA 플레이트의 웰에 IL-6R 발현 세포가 고정화된다. 하이브리도마의 배양상청을 웰 내의 고정화 세포에 접촉시켜 고정화 세포에 결합하는 항체가 검출된다. 단일클론 항체가 마우스 유래인 경우, 세포에 결합한 항체는 항마우스 면역글로불린 항체에 의해 검출될 수 있다. 이들의 스크리닝에 의해 선택된 항원에 대한 결합능을 갖는 목적하는 항체를 생산하는 하이브리도마는 한계희석법 등에 의해 클로닝될 수 있다.
이와 같이 하여 제작되는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마는 통상의 배양액 중에서 계대배양될 수 있다. 또한 당해 하이브리도마는 액체질소 중에서 장기에 걸쳐 보존될 수 있다.
당해 하이브리도마를 통상의 방법에 따라 배양하고, 그 배양상청으로부터 목적하는 단일클론 항체가 취득될 수 있다. 또는 하이브리도마를 이것과 적합성이 있는 포유동물에 투여하여 증식시켜 그의 복수로부터 단일클론 항체가 취득될 수 있다. 전자의 방법은 고순도의 항체를 얻기에 적합한 것이다.
당해 하이브리도마 등의 항체 생산 세포로부터 클로닝되는 항체 유전자에 의해 코드되는 항체도 적합하게 이용될 수 있다. 클로닝한 항체 유전자를 적당한 벡터에 삽입하여 숙주에 도입함으로써, 당해 유전자에 의해 코드되는 항체가 발현된다. 항체 유전자의 단리와 벡터로의 도입, 그리고 숙주세포의 형질전환을 위한 방법은 예를 들면 반담(Vandamme) 등에 의해 이미 확립되어 있다(Eur.J. Biochem.(1990)192 (3), 767-775). 하기에 기술하는 바와 같이 재조합 항체의 제조방법도 또한 공지이다.
예를 들면 항IL-6R 항체를 생산하는 하이브리도마 세포로부터 항IL-6R 항체의 가변영역(V 영역)을 코드하는 cDNA가 취득된다. 이 때문에 통상 먼저 하이브리도마로부터 전체 RNA가 추출된다. 세포로부터 mRNA를 추출하기 위한 방법으로서, 예를 들면 다음과 같은 방법을 이용할 수 있다.
-구아니딘 초원심법(Biochemistry (1979) 18 (24), 5294-5299)
-AGPC법(Anal. Biochem. (1987) 162 (1), 156-159)
추출된 mRNA는 mRNA Purification Kit(GE 헬스케어 바이오사이언스 제조) 등을 사용하여 정제될 수 있다. 또는 QuickPrep mRNA Purification Kit(GE 헬스케어 바이오사이언스 제조) 등과 같이 세포로부터 직접 전체 mRNA를 추출하기 위한 키트도 시판되고 있다. 이러한 키트를 사용하여 하이브리도마로부터 mRNA가 취득될 수 있다. 얻어진 mRNA로부터 역전사효소를 사용하여 항체 V 영역을 코드하는 cDNA가 합성될 수 있다. cDNA는 AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit(생화학 공업사 제조) 등에 의해 합성될 수 있다. 또한 cDNA의 합성 및 증폭을 위해 SMART RACE cDNA 증폭 키트(Clontech 제조) 및 PCR을 사용한 5'-RACE법(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85 (23), 8998-9002, Nucleic Acids Res. (1989) 17 (8), 2919-2932)이 적당히 이용될 수 있다. 또한 이러한 cDNA의 합성과정에 있어서 cDNA의 양말단에 후술하는 적절한 제한효소 사이트가 도입될 수 있다.
얻어진 PCR 산물로부터 목적으로 하는 cDNA 단편이 정제되고, 이어서 벡터 DNA와 연결된다. 이와 같이 재조합 벡터가 제작되고, 대장균 등에 도입되어 콜로니가 선택된 후에, 그 콜로니를 형성한 대장균으로부터 목적하는 재조합 벡터가 조제될 수 있다. 그리고, 당해 재조합 벡터가 목적으로 하는 cDNA의 염기서열을 가지고 있는지 여부에 대해서 공지의 방법, 예를 들면 디데옥시뉴클레오티드 체인 터미네이션법 등에 의해 확인된다.
가변영역을 코드하는 유전자를 취득하기 위해서는 가변영역 유전자 증폭용 프라이머를 사용한 5'-RACE법을 이용하는 것이 간편하다. 먼저 하이브리도마 세포로부터 추출된 RNA를 주형으로 하여 cDNA가 합성되고, 5'-RACE cDNA 라이브러리가 얻어진다. 5'-RACE cDNA 라이브러리의 합성에는 SMART RACE cDNA 증폭 키트 등 시판의 키트가 적당히 사용된다.
얻어진 5'-RACE cDNA 라이브러리를 주형으로 하여 PCR법에 의해 항체 유전자가 증폭된다. 공지의 항체 유전자 서열을 토대로 마우스 항체 유전자 증폭용 프라이머가 디자인될 수 있다. 이들 프라이머는 면역글로불린의 서브클래스별로 상이한 염기서열이다. 따라서, 서브클래스는 사전에 Iso Strip 마우스 단일클론 항체 아이소타이핑 키트(로슈 다이어그노스틱스) 등의 시판 키트를 사용하여 결정해 두는 것이 바람직하다.
구체적으로는, 예를 들면 마우스 IgG를 코드하는 유전자의 취득을 목적으로 할 때는, 중쇄로서 γ1, γ2a, γ2b, γ3, 경쇄로서 κ쇄와 λ쇄를 코드하는 유전자의 증폭이 가능한 프라이머가 이용될 수 있다. IgG의 가변영역 유전자를 증폭하기 위해서는, 일반적으로 3'측의 프라이머에는 가변영역에 가까운 불변영역에 상당하는 부분에 어닐링하는 프라이머가 이용된다. 한편 5'측의 프라이머에는 5'RACE cDNA 라이브러리 제작 키트에 부속되는 프라이머가 이용된다.
이렇게 하여 증폭된 PCR 산물을 이용하여 중쇄와 경쇄의 조합으로 이루어지는 면역글로불린이 재구성될 수 있다. 재구성된 면역글로불린의 IL-6R에 대한 결합 활성을 지표로 하여 목적하는 항체가 스크리닝될 수 있다. 예를 들면 IL-6R에 대한 항체의 취득을 목적으로 할 때, 항체의 IL-6R에 대한 결합은 특이적인 것이 더욱 바람직하다. IL-6R에 결합하는 항체는, 예를 들면 다음과 같이 하여 스크리닝될 수 있다；
(1) 하이브리도마로부터 얻어진 cDNA에 의해 코드되는 V 영역을 포함하는 항체를 IL-6R 발현 세포에 접촉시키는 공정,
(2) IL-6R 발현 세포와 항체의 결합을 검출하는 공정, 및
(3) IL-6R 발현 세포에 결합하는 항체를 선택하는 공정.
항체와 IL-6R 발현 세포의 결합을 검출하는 방법은 공지이다. 구체적으로는, 앞서 기술한 FACS 등의 수법에 의해 항체와 IL-6R 발현 세포의 결합이 검출될 수 있다. 항체의 결합 활성을 평가하기 위해 IL-6R 발현 세포의 고정 표본이 적당히 이용될 수 있다.
결합 활성을 지표로 하는 항체의 스크리닝방법으로서 파지 벡터를 이용한 패닝법도 적합하게 사용된다. 다중클론 항체 발현 세포군으로부터 항체 유전자를 중쇄와 경쇄의 서브클래스의 라이브러리로서 취득한 경우에는, 파지 벡터를 이용한 스크리닝방법이 유리하다. 중쇄와 경쇄의 가변영역을 코드하는 유전자는 적당한 링커 서열로 연결함으로써 싱글 체인 Fv(scFv)를 형성할 수 있다. scFv를 코드하는 유전자를 파지 벡터에 삽입함으로써 scFv를 표면에 발현하는 파지가 취득될 수 있다. 이 파지와 목적하는 항원의 접촉 후에 항원에 결합한 파지를 회수함으로써 목적의 결합 활성을 갖는 scFv를 코드하는 DNA가 회수될 수 있다. 이 조작을 필요에 따라 반복함으로써 목적하는 결합 활성을 갖는 scFv가 농축될 수 있다.
목적으로 하는 항IL-6R 항체의 V 영역을 코드하는 cDNA가 얻어진 후에, 당해 cDNA의 양말단에 삽입한 제한효소 사이트를 인식하는 제한효소에 의해 그 cDNA가 소화된다. 바람직한 제한효소는 항체 유전자를 구성하는 염기서열에 출현하는 빈도가 낮은 염기서열을 인식하여 소화한다. 또한 1 카피의 소화 단편을 벡터에 바른 방향으로 삽입하기 위해서는 부착 말단을 부여하는 제한효소의 삽입이 바람직하다. 상기와 같이 소화된 항IL-6R 항체의 V 영역을 코드하는 cDNA를 적당한 발현 벡터에 삽입함으로써 항체 발현 벡터가 취득될 수 있다. 이때, 항체 불변영역(C 영역)을 코드하는 유전자와 상기 V 영역을 코드하는 유전자가 인프레임 융합되면 키메라 항체가 취득된다. 여기서 키메라 항체란, 불변영역과 가변영역의 유래가 상이한 것을 말한다. 따라서, 마우스-인간 등의 이종(異種) 키메라 항체에 더하여 인간-인간 동종(同種) 키메라 항체도 본 발명에 있어서의 키메라 항체에 포함된다. 사전에 불변영역을 갖는 발현 벡터에 상기 V 영역 유전자를 삽입함으로써 키메라 항체 발현 벡터가 구축될 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면 목적하는 항체 불변영역(C 영역)을 코드하는 DNA를 보유한 발현 벡터의 5'측에, 상기 V 영역 유전자를 소화하는 제한효소의 제한효소 인식서열이 적당히 배치될 수 있다. 동일한 조합의 제한효소로 소화된 양자가 인프레임 융합됨으로써 키메라 항체 발현 벡터가 구축된다.
항IL-6R 단일클론 항체를 제조하기 위해 항체 유전자가 발현 제어영역에 의한 제어하에서 발현되도록 발현 벡터에 삽입된다. 항체를 발현하기 위한 발현 제어영역이란, 예를 들면 인핸서나 프로모터를 포함한다. 또한 발현된 항체가 세포 외로 분비되도록 적절한 신호 서열이 아미노 말단에 부가될 수 있다. 후술되는 실시예에서는 신호 서열로서 아미노산 서열 MGWSCIILFLVATATGVHS(서열번호：3)를 갖는 펩티드가 사용되고 있는데, 이것 이외에도 적합한 신호 서열이 부가된다. 발현된 폴리펩티드는 상기 서열의 카르복실 말단 부분에서 절단되고, 절단된 폴리펩티드가 성숙 폴리펩티드로서 세포 외로 분비될 수 있다. 이어서, 이 발현 벡터에 의해 적당한 숙주세포가 형질전환됨으로써 항IL-6R 항체를 코드하는 DNA를 발현하는 재조합 세포가 취득될 수 있다.
항체 유전자 발현을 위해, 항체 중쇄(H쇄) 및 경쇄(L쇄)를 코드하는 DNA는 각각 다른 발현 벡터에 삽입된다. H쇄와 L쇄가 삽입된 벡터에 의해 동일 숙주세포에 동시에 형질전환(co-transfect)됨으로써 H쇄와 L쇄를 구비한 항체 분자가 발현될 수 있다. 또는 H쇄 및 L쇄를 코드하는 DNA가 단일의 발현 벡터에 삽입됨으로써 숙주세포가 형질전환될 수 있다(국제공개 WO1994/011523을 참조할 것).
단리된 항체 유전자를 적당한 숙주에 도입함으로써 항체를 제작하기 위한 숙주세포와 발현 벡터의 많은 조합이 공지이다. 이들의 발현계는, 모두 본 발명의 항원 결합 도메인을 단리하는데 응용될 수 있다. 진핵세포가 숙주세포로서 사용되는 경우 동물세포, 식물세포 또는 진균세포가 적당히 사용될 수 있다. 구체적으로는, 동물세포로서는 다음과 같은 세포가 예시될 수 있다.
(1) 포유류세포：CHO(Chinese hamster ovary cell line), COS(Monkey kidney cell line), 골수종(Sp2/0, NS0 등), BHK (baby hamster kidney cell line), Hela, Vero, HEK293(human embryonic kidney cell line with sheared adenovirus (Ad)5 DNA), PER.C6 cell (human embryonic retinal cell line transformed with the Adenovirus Type 5 (Ad5) E1A and E1B genes) 등(Current Protocols in Protein Science (May, 2001, Unit 5.9, Table 5.9.1))
(2) 양서류세포：아프리카 발톱개구리 난모세포 등
(3) 곤충세포：sf9, sf21, Tn5 등
또는 식물세포로서는, 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) 등의 니코티아나(Nicotiana)속 유래의 세포에 의한 항체 유전자의 발현계가 공지이다. 식물세포의 형질전환에는 캘러스 배양한 세포가 적당히 이용될 수 있다.
또한 진균세포로서는, 다음과 같은 세포를 이용할 수 있다.
-효모：사카로미세스 세레비시애(Saccharomyces serevisiae) 등의 사카로미세스(Saccharomyces)속, 메탄올 자화 효모(Pichia pastoris) 등의 피키아(Pichia)속
-사상균：아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) 등의 아스퍼질러스(Aspergillus)속
또한 원핵세포를 이용한 항체 유전자의 발현계도 공지이다. 예를 들면 세균세포를 사용하는 경우, 대장균(E. coli), 고초균 등의 세균세포가 적당히 이용될 수 있다. 이들 세포 중에, 목적으로 하는 항체 유전자를 포함하는 발현 벡터가 형질전환에 의해 도입된다. 형질전환된 세포를 인 비트로에서 배양함으로써 당해 형질전환 세포의 배양물로부터 목적하는 항체가 취득될 수 있다.
재조합 항체의 생산에는 상기 숙주세포에 더하여 형질전환 동물도 이용될 수 있다. 즉 목적하는 항체를 코드하는 유전자가 도입된 동물로부터 당해 항체를 얻을 수 있다. 예를 들면 항체 유전자는 유즙 중에 고유하게 생산되는 단백질을 코드하는 유전자 내부에 인프레임으로 삽입함으로써 융합 유전자로서 구축될 수 있다. 유즙 중에 분비되는 단백질로서, 예를 들면 염소 β카제인 등을 이용할 수 있다. 항체 유전자가 삽입된 융합 유전자를 포함하는 DNA 단편은 염소의 배(胚)로 주입되고, 당해 주입된 배가 암컷의 염소로 도입된다. 배를 수용한 염소로부터 태어나는 형질전환 염소(또는 그의 자손)가 생산하는 유즙으로부터는, 목적하는 항체가 유즙 단백질과의 융합 단백질로서 취득될 수 있다. 또한 형질전환 염소로부터 생산되는 목적하는 항체를 포함하는 유즙량을 증가시키기 위해 호르몬이 형질전환 염소에 대해 투여될 수 있다(Bio/Technology (1994), 12 (7), 699-702).
본 명세서에 있어서 기재되는 항원 결합 분자가 인간에게 투여되는 경우, 당해 항원 결합 분자에 있어서의 항원 결합 도메인으로서, 인간에 대한 이종 항원성을 저하시키는 것 등을 목적으로 인위적으로 개변한 유전자 재조합형 항체 유래의 항원 결합 도메인이 적당히 채용될 수 있다. 유전자 재조합형 항체에는, 예를 들면 인간화(Humanized) 항체 등이 포함된다. 이들 개변 항체는 공지의 방법을 사용하여 적당히 제조된다.
본 명세서에 있어서 기재되는 항원 결합 분자에 있어서의 항원 결합 도메인을 제작하기 위해 사용되는 항체의 가변영역은 통상 4개의 프레임워크 영역(FR) 사이에 끼인 3개의 상보성 결정영역(complementarity-determining region;CDR)으로 구성되어 있다. CDR은 실질적으로 항체의 결합 특이성을 결정하고 있는 영역이다. CDR의 아미노산 서열은 다양성이 풍부하다. 한편 FR을 구성하는 아미노산 서열은 상이한 결합 특이성을 갖는 항체 사이에서도 높은 동일성을 나타내는 것이 많다. 이 때문에 일반적으로 CDR의 이식에 의해 어떤 항체의 결합 특이성을 다른 항체에 이식할 수 있는 것으로 되어 있다.
인간화 항체는 재구성(reshaped) 인간 항체라고도 칭해진다. 구체적으로는, 인간 이외의 동물, 예를 들면 마우스 항체의 CDR을 인간 항체에 이식한 인간화 항체 등이 공지이다. 인간화 항체를 얻기 위한 일반적인 유전자 재조합 수법도 알려져 있다. 구체적으로는, 마우스 항체의 CDR을 인간의 FR에 이식하기 위한 방법으로서, 예를 들면 중복 연장 PCR이 공지이다. 중복 연장 PCR에 있어서는, 인간 항체의 FR을 합성하기 위한 프라이머에 이식 대상 마우스 항체의 CDR을 코드하는 염기서열이 부가된다. 프라이머는 4개의 FR의 각각에 대해서 준비된다. 일반적으로 마우스 CDR의 인간 FR에 대한 이식에 있어서는 마우스의 FR과 동일성이 높은 인간 FR을 선택하는 것이 CDR의 기능 유지에 있어서 유리하다고 되어 있다. 즉, 일반적으로 이식 대상 마우스 CDR에 인접해 있는 FR의 아미노산 서열과 동일성이 높은 아미노산 서열로 이루어지는 인간 FR을 이용하는 것이 바람직하다.
또한 연결되는 염기서열은 서로 인프레임으로 접속되도록 디자인된다. 각각의 프라이머에 의해 인간 FR이 개별적으로 합성된다. 그 결과, 각 FR에 마우스 CDR을 코드하는 DNA가 부가된 산물이 얻어진다. 각 산물의 마우스 CDR을 코드하는 염기서열은 서로 중복되도록 디자인되어 있다. 계속해서, 인간 항체 유전자를 주형으로 하여 합성된 산물의 중복된 CDR 부분을 서로 어닐링시켜서 상보가닥 합성반응이 행해진다. 이 반응에 의해 인간 FR이 마우스 CDR의 서열을 매개로 연결된다.
최종적으로 3개의 CDR과 4개의 FR이 연결된 V 영역 유전자는 그의 5'말단과 3'말단에 어닐링하여 적당한 제한효소 인식서열이 부가된 프라이머에 의해 그의 전장이 증폭된다. 상기와 같이 얻어진 DNA와 인간 항체 C 영역을 코드하는 DNA를 인프레임 융합하도록 발현 벡터 중에 삽입함으로써 인간형 항체 발현용 벡터를 제작할 수 있다. 당해 삽입 벡터를 숙주에 도입하여 재조합 세포를 수립한 후에, 당해 재조합 세포를 배양하고 당해 인간화 항체를 코드하는 DNA를 발현시킴으로써 당해 인간화 항체가 당해 배양세포의 배양물 중에 생산된다(유럽 특허공개 EP239400, 국제공개 WO1996/002576호 참조).
상기와 같이 제작된 인간화 항체의 항원에 대한 결합 활성을 정성적 또는 정량적으로 측정하고, 평가함으로써 CDR을 매개로 연결되었을 때 그 CDR이 양호한 항원 결합 부위를 형성하는 인간 항체의 FR을 적합하게 선택할 수 있다. 필요에 따라, 재구성 인간 항체의 CDR이 적절한 항원 결합 부위를 형성하도록 FR의 아미노산 잔기를 치환하는 것도 가능하다. 예를 들면 마우스 CDR의 인간 FR에 대한 이식에 사용한 PCR법을 응용하여 FR에 아미노산 서열의 변이를 도입할 수 있다. 구체적으로는, FR에 어닐링하는 프라이머에 부분적인 염기서열의 변이를 도입할 수 있다. 이러한 프라이머에 의해 합성된 FR에는 염기서열의 변이가 도입된다. 아미노산을 치환한 변이형 항체의 항원에 대한 결합 활성을 상기 방법으로 측정하여 평가함으로써 목적하는 성질을 갖는 변이 FR 서열이 선택될 수 있다(Cancer Res., (1993) 53, 851-856).
또한 인간 항체 유전자의 모든 레퍼토리를 갖는 형질전환 동물(국제공개 WO1993/012227, WO1992/003918, WO1994/002602, WO1994/025585, WO1996/034096, WO1996/033735 참조)을 면역동물로 하여 DNA 면역에 의해 목적하는 인간 항체가 취득될 수 있다.
또한 인간 항체 라이브러리를 사용하여 패닝에 의해 인간 항체를 취득하는 기술도 알려져 있다. 예를 들면 인간 항체의 V 영역이 단일 사슬 항체(scFv)로서 파지디스플레이법에 의해 파지의 표면에 발현된다. 항원에 결합하는 scFv를 발현하는 파지가 선택될 수 있다. 선택된 파지의 유전자를 해석함으로써 항원에 결합하는 인간 항체의 V 영역을 코드하는 DNA 서열을 결정할 수 있다. 항원에 결합하는 scFv의 DNA 서열을 결정한 후, 당해 V 영역 서열을 목적하는 인간 항체 C 영역의 서열과 인프레임 융합시킨 후에 적당한 발현 벡터에 삽입함으로써 발현 벡터가 제작될 수 있다. 당해 발현 벡터를 상기에 예로 든 바와 같은 적합한 발현 세포 중에 도입하고, 그 인간 항체를 코드하는 유전자를 발현시킴으로써 당해 인간 항체가 취득된다. 이들 방법은 이미 공지이다(국제공개 WO1992/001047, WO1992/020791, WO1993/006213, WO1993/011236, WO1993/019172, WO1995/001438, WO1995/015388 참조).
파지 디스플레이법 이외에도 인간 항체 라이브러리를 사용하여 패닝에 의해 인간 항체를 취득하는 기술로서 무세포 번역계를 사용하는 기술, 세포 또는 바이러스 표면에 항원 결합 분자를 제시하는 기술, 에멀젼을 사용하는 기술 등이 알려져 있다. 예를 들면 무세포 번역계를 사용한 기술로서는, 종지 코돈의 제거 등에 의해 리보솜을 매개로 mRNA와 번역된 단백질의 복합체를 형성시키는 리보솜 디스플레이법, 퓨로마이신 등의 화합물을 사용하여 유전자 서열과 번역된 단백질을 공유 결합시키는 cDNA 디스플레이법, mRNA 디스플레이법이나, 핵산에 대한 결합 단백질을 사용하여 유전자와 번역된 단백질의 복합체를 형성시키는 CIS 디스플레이법 등이 사용될 수 있다. 또한 세포 또는 바이러스 표면에 항원 결합 분자를 제시하는 기술로서는, 파지 디스플레이법 이외에도 E. coli 디스플레이법, 그람 양성균 디스플레이법, 효모 디스플레이법, 포유류세포 디스플레이법, 바이러스 디스플레이법 등이 사용될 수 있다. 에멀젼을 사용하는 기술로서는, 에멀젼 중에 유전자 및 번역 관련 분자를 내포시키는 것에 의한 인비트로 바이러스 디스플레이법 등이 사용될 수 있다. 이들 방법은 이미 공지이다(Nat Biotechnol. 2000 Dec;18(12):1287-92, Nucleic Acids Res. 2006;34(19):e127, Proc Natl Acad Sci USA. 2004 Mar 2;101(9):2806-10, Proc Natl Acad Sci USA. 2004 Jun 22;101(25):9193-8, Protein Eng Des Sel. 2008 Apr;21(4):247-55, Proc Natl Acad Sci USA. 2000 Sep 26;97(20):10701-5, MAbs. 2010 Sep-Oct;2(5):508-18, Methods Mol Biol. 2012;911:183-98).
또한 항체 유전자를 취득하는 방법으로서 베르나스코니(Bernasconi)등(Science (2002) 298, 2199-2202) 또는 국제공개 WO2008/081008에 기재된 바와 같은 B세포 클로닝(각각의 항체의 코드 서열의 동정 및 클로닝, 그의 단리 및 각각의 항체(특히, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)의 제작을 위한 발현 벡터 구축을 위한 사용 등)의 수법이 상기 외에 적절히 사용될 수 있다.
또한 본 발명에 있어서의 항체의 비한정의 일태양으로서는, T세포 수용체 대신에 항원을 인식하는 항체 또는 그의 프래그먼트와, T세포의 신호 도메인의 융합체가 T세포에 삽입된 키메라형 항원 수용체(Chimeric antigen receptor) 및 그 키메라형 항원 수용체가 삽입된 T세포도 들 수 있는데, 이것에 한정되는 것은 아니다.
EU 넘버링 및 Kabat 넘버링
본 발명에서 사용되고 있는 방법에 의하면, 항체의 CDR과 FR에 할당되는 아미노산 위치는 Kabat에 따라 규정된다(Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute of Health, Bethesda, Md., 1987년 및 1991년)). 본 명세서에 있어서 항원 결합 분자가 항체 또는 항원 결합 단편인 경우, 가변영역의 아미노산은 Kabat 넘버링에 따라, 불변영역의 아미노산은 Kabat의 아미노산 위치에 준한 EU 넘버링에 따라 표시된다.
저분자 화합물 농도에 따라 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인
저분자 화합물로서, 예를 들면 표적 조직 특이적인 화합물 또는 비천연 화합물을 들 수 있다. 아래에 표적 조직 특이적인 화합물에 의존적인 항원 결합 도메인의 선택방법 등이 예시되는데, 표적 조직 특이적인 화합물 이외의 저분자 화합물에 의존적인 항원 결합 도메인의 선택방법 등도 하기의 예에 준하여 적절히 실시될 수 있다. 표적 조직 특이적인 화합물의 농도에 따라, 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인(또는 당해 도메인을 포함하는 항원 결합 분자)을 취득하기 위해 상기 결합 활성의 항목에서 제시된 수법 등이 적절히 적용될 수 있다. 비한정의 일태양으로서 아래에 그 구체예가 몇 가지 예시된다. 예를 들면 표적 조직 특이적인 화합물의 비존재하에 있어서의 항원에 대한 항원 결합 도메인(또는 당해 도메인을 포함하는 항원 결합 분자)의 결합 활성보다도 당해 화합물의 존재하에 있어서의 항원에 대한 항원 결합 도메인(또는 당해 도메인을 포함하는 항원 결합 분자)의 결합 활성쪽이 높게 변화되는 것을 확인하기 위해서는, 표적 조직 특이적인 화합물의 비존재하 및 존재하에 있어서의, 또는 저농도 존재하 및 고농도 존재하에 있어서의 항원에 대한 항원 결합 도메인(또는 당해 도메인을 포함하는 항원 결합 분자)의 결합 활성이 비교된다. 다른 비한정의 일태양에서는, 예를 들면 표적 조직 특이적인 화합물의 저농도 존재하에 있어서의 항원에 대한 항원 결합 도메인(또는 당해 도메인을 포함하는 항원 결합 분자)의 결합 활성보다도 당해 화합물의 고농도 존재하에 있어서의 항원에 대한 항원 결합 도메인(또는 당해 도메인을 포함하는 항원 결합 분자)의 결합 활성쪽이 높게 변화되는 것을 확인하기 위해서는, 표적 조직 특이적인 화합물의 저농도 존재하 및 고농도 존재하에 있어서의 항원에 대한 항원 결합 도메인(또는 당해 도메인을 포함하는 항원 결합 분자)의 결합 활성이 비교된다.
또한 본 발명에 있어서 「표적 조직 특이적인 화합물의 존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 당해 화합물의 비존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다도 높다」는 표현은, 「항원 결합 도메인(또는 당해 도메인을 포함하는 항원 결합 분자)의 표적 조직 특이적인 화합물의 비존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 당해 화합물의 존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다도 낮다」고 표현하는 것도 가능하다. 또한 본 발명에 있어서는 「항원 결합 도메인(또는 당해 도메인을 포함하는 항원 결합 분자)의 표적 조직 특이적인 화합물의 비존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 당해 화합물의 존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다도 낮다」를 「항원 결합 도메인(또는 당해 도메인을 포함하는 항원 결합 분자)의 표적 조직 특이적인 화합물의 비존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 당해 화합물의 존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다도 약하다」고 기재하는 경우도 있다.
또한 본 발명에 있어서 「표적 조직 특이적인 화합물의 고농도 존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 당해 화합물의 저농도 존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다도 높다」는 표현은, 「항원 결합 도메인(또는 당해 도메인을 포함하는 항원 결합 분자)의 표적 조직 특이적인 화합물의 저농도 존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 당해 화합물의 고농도 존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다도 낮다」고 표현하는 것도 가능하다. 또한 본 발명에 있어서는 「항원 결합 도메인(또는 당해 도메인을 포함하는 항원 결합 분자)의 표적 조직 특이적인 화합물의 저농도 존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 당해 화합물의 고농도 존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다도 낮다」를 「항원 결합 도메인(또는 당해 도메인을 포함하는 항원 결합 분자)의 표적 조직 특이적인 화합물의 저농도 존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 당해 화합물의 고농도 존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다도 약하다」고 기재하는 경우도 있다.
항원에 대한 결합 활성을 측정할 때의 표적 조직 특이적인 화합물의 농도 이외의 조건은 당업자가 적절히 선택하는 것이 가능하고 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면 HEPES 버퍼, 37℃의 조건에 있어서 측정하는 것이 가능하다. 예를 들면 비아코어(Biacore)(GE Healthcare) 등을 사용해서 측정하는 것이 가능하다. 항원 결합 도메인(또는 당해 도메인을 포함하는 항원 결합 분자)과 항원의 결합 활성의 측정은 항원이 가용형 분자인 경우는 항원 결합 도메인(또는 당해 도메인을 포함하는 항원 결합 분자)을 고정화한 칩으로 항원을 애널라이트로서 주입함으로써 가용형 분자에 대한 결합 활성을 평가하는 것이 가능하고, 항원이 막형 분자인 경우는 항원을 고정화한 칩으로 항원 결합 도메인(또는 당해 도메인을 포함하는 항원 결합 분자)을 애널라이트로서 주입함으로써 막형 분자에 대한 결합 활성을 평가하는 것이 가능하다.
본 발명의 항원 결합 분자에 포함되는 항원 결합 도메인(또는 당해 도메인을 포함하는 항원 결합 분자)의 표적 조직 특이적인 화합물의 비존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 표적 조직 특이적인 화합물의 존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다도 약한 한, 당해 화합물의 비존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성과 당해 화합물의 존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성의 비는 특별히 한정되지 않으나, 바람직하게는 항원에 대한 표적 조직 특이적인 화합물의 비존재하에 있어서의 KD(Dissociation constant：해리상수)와 존재하에 있어서의 KD의 비인 KD(화합물 비존재하)/KD(화합물 존재하)의 값이 2 이상이고, 더욱 바람직하게는 KD(화합물 비존재하)/KD(화합물 존재하)의 값이 10 이상이며, 더욱 바람직하게는 KD(화합물 비존재하)/KD(화합물 존재하)의 값이 40 이상이다. KD(화합물 비존재하)/KD(화합물 존재하)의 값의 상한은 특별히 한정되지 않고, 당업자의 기술에 있어서 제작 가능한 한 400, 1,000, 10,000 등 어떠한 값이어도 된다. 표적 조직 특이적인 화합물의 비존재하에 있어서 항원에 대한 결합 활성이 관찰되지 않는 경우에는 이 상한은 무한대의 수치가 된다.
본 발명의 항원 결합 분자에 포함되는 항원 결합 도메인(또는 당해 도메인을 포함하는 항원 결합 분자)의 표적 조직 특이적인 화합물의 저농도 존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 표적 조직 특이적인 화합물의 고농도 존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다도 약한 한, 당해 화합물의 저농도 존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성과 당해 화합물의 고농도 존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성의 비는 특별히 한정되지 않으나, 바람직하게는 항원에 대한 표적 조직 특이적인 화합물의 저농도 존재하에 있어서의 KD(Dissociation constant：해리상수)와 고농도 존재하에 있어서의 KD의 비인 KD(화합물 저농도 존재하)/KD(화합물 고농도 존재하)의 값이 2 이상이고, 더욱 바람직하게는 KD(화합물 저농도 존재하)/KD(화합물 고농도 존재하)의 값이 10 이상이며, 더욱 바람직하게는 KD(화합물 저농도 존재하)/KD(화합물 고농도 존재하)의 값이 40 이상이다. KD(화합물 저농도 존재하)/KD(화합물 고농도 존재하)의 값의 상한은 특별히 한정되지 않고, 당업자의 기술에 있어서 제작 가능한 한 400, 1,000, 10,000 등 어떠한 값이어도 된다. 표적 조직 특이적인 화합물의 저농도 존재하에 있어서 항원에 대한 결합 활성이 관찰되지 않는 경우에는 이 상한은 무한대의 수치가 된다.
항원에 대한 결합 활성의 값으로서 항원이 가용형 분자인 경우는 KD(해리상수)를 사용하는 것이 가능한데, 항원이 막형 분자인 경우는 겉보기 KD(Apparent dissociation constant：겉보기 해리상수)를 사용하는 것이 가능하다. KD(해리상수) 및 겉보기 KD(겉보기 해리상수)는 당업자 공지의 방법으로 측정하는 것이 가능하며, 예를 들면 비아코어(GE healthcare), 스캐차드 플롯, 플로우 사이토미터 등을 사용하는 것이 가능하다.
또한 본 발명의 항원 결합 도메인(또는 당해 도메인을 포함하는 항원 결합 분자)의 표적 조직 특이적인 화합물의 비존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성과 존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성의 비를 나타내는 다른 지표로서, 예를 들면 해리속도상수인 kd(Dissociation rate constant：해리속도상수)도 또한 적합하게 사용될 수 있다. 결합 활성의 비를 나타내는 지표로서 KD(해리상수) 대신에 kd(해리속도상수)를 사용하는 경우, 표적 조직 특이적인 화합물의 비존재하에 있어서의 항원에 대한 kd(해리속도상수)와 당해 화합물의 존재하에 있어서의 kd(해리속도상수)의 비인 kd(화합물 비존재하)/kd(화합물 존재하)의 값은 바람직하게는 2 이상이고, 더욱 바람직하게는 5 이상이며, 더욱 바람직하게는 10 이상이고, 보다 바람직하게는 30 이상이다. Kd(화합물 비존재하)/kd(화합물 존재하)의 값의 상한은 특별히 한정되지 않고 당업자의 기술상식에 있어서 제작 가능한 한 50, 100, 200 등 어떠한 값이어도 된다. 표적 조직 특이적인 화합물의 비존재하에 있어서 항원에 대한 결합 활성이 관찰되지 않는 경우에는 해리도 발생하지 않기 때문에 이 상한은 무한대의 수치가 된다.
또한 본 발명의 항원 결합 도메인(또는 당해 도메인을 포함하는 항원 결합 분자)의 표적 조직 특이적인 화합물의 저농도 존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성과 고농도 존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성의 비를 나타내는 다른 지표로서, 예를 들면 해리속도상수인 kd(Dissociation rate constant：해리속도상수)도 또한 적합하게 사용될 수 있다. 결합 활성의 비를 나타내는 지표로서 KD(해리상수) 대신에 kd(해리속도상수)를 사용하는 경우, 표적 조직 특이적인 화합물의 저농도 존재하에 있어서의 항원에 대한 kd(해리속도상수)와 당해 화합물의 고농도 존재하에 있어서의 kd(해리속도상수)의 비인 kd(화합물 저농도 존재하)/kd(화합물 고농도 존재하)의 값은 바람직하게는 2 이상이고, 더욱 바람직하게는 5 이상이며, 더욱 바람직하게는 10 이상이고, 보다 바람직하게는 30 이상이다. Kd(화합물 저농도 존재하)/kd(화합물 고농도 존재하)의 값의 상한은 특별히 한정되지 않고, 당업자의 기술상식에 있어서 제작 가능한 한 50, 100, 200 등 어떠한 값이어도 된다. 표적 조직 특이적인 화합물의 저농도 존재하에 있어서 항원에 대한 결합 활성이 관찰되지 않는 경우에는 해리도 발생하지 않기 때문에 이 상한은 무한대의 수치가 된다.
항원 결합 활성의 값으로서 항원이 가용형 분자인 경우는 kd(해리속도상수)를 사용하는 것이 가능하고, 항원이 막형 분자인 경우는 겉보기 kd(Apparent dissociation rate constant：겉보기 해리속도상수)를 사용하는 것이 가능하다. kd(해리속도상수) 및 겉보기 kd(겉보기 해리속도상수)는 당업자 공지의 방법으로 측정하는 것이 가능하고, 예를 들면 비아코어(GE healthcare), 플로우 사이토미터 등을 사용하는 것이 가능하다. 또한 본 발명에 있어서 표적 조직 특이적인 화합물의 어떤 농도에 있어서의 항원 결합 도메인(또는 당해 도메인을 포함하는 항원 결합 분자)의 항원에 대한 결합 활성을 측정할 때는 당해 화합물의 농도 이외의 조건은 동일하게 하는 것이 바람직하다.
예를 들면 본 발명이 제공하는 하나의 태양인, 표적 조직 특이적인 화합물의 비존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 당해 화합물의 존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다도 낮은 항원 결합 도메인(또는 당해 도메인을 포함하는 항원 결합 분자)은, 아래의 공정 (a) 내지 (c)를 포함하는 항원 결합 도메인(또는 항원 결합 분자)의 스크리닝에 의해 취득될 수 있다.
(a) 표적 조직 특이적인 화합물의 비존재하에 있어서의 항원 결합 도메인(또는 항원 결합 분자)의 항원 결합 활성을 얻는 공정,
(b) 표적 조직 특이적인 화합물의 존재하에 있어서의 항원 결합 도메인(또는 항원 결합 분자)의 항원 결합 활성을 얻는 공정,
(c) 표적 조직 특이적인 화합물의 비존재하에 있어서의 항원 결합 활성이 당해 화합물의 존재하에 있어서의 항원 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인(또는 항원 결합 분자)을 선택하는 공정.
예를 들면 본 발명이 제공하는 하나의 태양인, 표적 조직 특이적인 화합물의 저농도 존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 당해 화합물의 고농도 존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다도 낮은 항원 결합 도메인(또는 당해 도메인을 포함하는 항원 결합 분자)은, 아래의 공정 (a) 내지 (c)를 포함하는 항원 결합 도메인(또는 항원 결합 분자)의 스크리닝에 의해 취득될 수 있다.
(a) 표적 조직 특이적인 화합물의 저농도 존재하에 있어서의 항원 결합 도메인(또는 항원 결합 분자)의 항원 결합 활성을 얻는 공정,
(b) 표적 조직 특이적인 화합물의 고농도 존재하에 있어서의 항원 결합 도메인(또는 항원 결합 분자)의 항원 결합 활성을 얻는 공정,
(c) 표적 조직 특이적인 화합물의 저농도 존재하에 있어서의 항원 결합 활성이 당해 화합물의 고농도 존재하에 있어서의 항원 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인(또는 항원 결합 분자)을 선택하는 공정.
또한 본 발명이 제공하는 하나의 태양인, 표적 조직 특이적인 화합물의 비존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 당해 화합물의 존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다도 낮은 항원 결합 도메인(또는 당해 도메인을 포함하는 항원 결합 분자)은, 아래의 공정 (a) 내지 (c)를 포함하는 항원 결합 도메인(또는 항원 결합 분자) 또는 그들의 라이브러리의 스크리닝에 의해 취득될 수 있다.
(a) 표적 조직 특이적인 화합물의 존재하에 있어서의 항원 결합 도메인(또는 항원 결합 분자) 또는 그들의 라이브러리를 항원에 접촉시키는 공정,
(b) 상기 공정 (a)에서 항원에 결합한 항원 결합 도메인(또는 항원 결합 분자)을 당해 화합물의 비존재하에 두는 공정,
(c) 상기 공정 (b)에서 해리된 항원 결합 도메인(또는 항원 결합 분자)을 단리하는 공정.
또한 본 발명이 제공하는 하나의 태양인, 표적 조직 특이적인 화합물의 저농도 존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 당해 화합물의 고농도 존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다도 낮은 항원 결합 도메인(또는 당해 도메인을 포함하는 항원 결합 분자)은, 아래의 공정 (a) 내지 (c)를 포함하는 항원 결합 도메인(또는 항원 결합 분자) 또는 그들의 라이브러리의 스크리닝에 의해 취득될 수 있다.
(a) 표적 조직 특이적인 화합물의 고농도 존재하에 있어서의 항원 결합 도메인(또는 항원 결합 분자) 또는 그들의 라이브러리를 항원에 접촉시키는 공정,
(b) 상기 공정 (a)에서 항원에 결합한 항원 결합 도메인(또는 항원 결합 분자)을 당해 화합물의 저농도 존재하에 두는 공정,
(c) 상기 공정 (b)에서 해리된 항원 결합 도메인(또는 항원 결합 분자)을 단리하는 공정.
또한 본 발명이 제공하는 하나의 태양인, 표적 조직 특이적인 화합물의 비존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 당해 화합물의 존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다도 낮은 항원 결합 도메인(또는 당해 도메인을 포함하는 항원 결합 분자)은, 아래의 공정 (a) 내지 (d)를 포함하는 항원 결합 도메인(또는 항원 결합 분자) 또는 그들의 라이브러리의 스크리닝에 의해 취득될 수 있다.
(a) 표적 조직 특이적인 화합물의 비존재하에서 항원 결합 도메인(또는 항원 결합 분자)의 라이브러리를 항원에 접촉시키는 공정,
(b) 상기 공정 (a)에서 항원에 결합하지 않는 항원 결합 도메인(또는 항원 결합 분자)을 선택하는 공정,
(c) 상기 공정 (b)에서 선택된 항원 결합 도메인(또는 항원 결합 분자)을 당해 화합물의 존재하에서 항원에 결합시키는 공정,
(d) 상기 공정 (c)에서 항원에 결합한 항원 결합 도메인(또는 항원 결합 분자)을 단리하는 공정.
또한 본 발명이 제공하는 하나의 태양인, 표적 조직 특이적인 화합물의 저농도 존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 당해 화합물의 고농도 존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다도 낮은 항원 결합 도메인(또는 당해 도메인을 포함하는 항원 결합 분자)은, 아래의 공정 (a) 내지 (d)를 포함하는 항원 결합 도메인(또는 항원 결합 분자) 또는 그들의 라이브러리의 스크리닝에 의해 취득될 수 있다.
(a) 표적 조직 특이적인 화합물의 저농도 존재하에서 항원 결합 도메인(또는 항원 결합 분자)의 라이브러리를 항원에 접촉시키는 공정,
(b) 상기 공정 (a)에서 항원에 결합하지 않는 항원 결합 도메인(또는 항원 결합 분자)을 선택하는 공정,
(c) 상기 공정 (b)에서 선택된 항원 결합 도메인(또는 항원 결합 분자)을 당해 화합물의 고농도 존재하에서 항원에 결합시키는 공정,
(d) 상기 공정 (c)에서 항원에 결합한 항원 결합 도메인(또는 항원 결합 분자)을 단리하는 공정.
또한 본 발명이 제공하는 하나의 태양인, 표적 조직 특이적인 화합물의 비존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 당해 화합물의 존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다도 낮은 항원 결합 도메인(또는 당해 도메인을 포함하는 항원 결합 분자)은, 아래의 공정 (a) 내지 (c)를 포함하는 스크리닝방법에 의해 취득될 수 있다.
(a) 항원을 고정한 칼럼에 표적 조직 특이적인 화합물의 존재하에서 항원 결합 도메인(또는 항원 결합 분자)의 라이브러리를 접촉시키는 공정,
(b) 상기 공정 (a)에서 칼럼에 결합한 항원 결합 도메인(또는 항원 결합 분자)을 당해 화합물의 비존재하에서 칼럼으로부터 용출하는 공정,
(c) 상기 공정 (b)에서 용출된 항원 결합 도메인(또는 항원 결합 분자)을 단리하는 공정.
또한 본 발명이 제공하는 하나의 태양인, 표적 조직 특이적인 화합물의 저농도 존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 당해 화합물의 고농도 존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다도 낮은 항원 결합 도메인(또는 당해 도메인을 포함하는 항원 결합 분자)은, 아래의 공정 (a) 내지 (c)를 포함하는 스크리닝방법에 의해 취득될 수 있다.
(a) 항원을 고정한 칼럼에 표적 조직 특이적인 화합물의 고농도 존재하에서 항원 결합 도메인(또는 항원 결합 분자)의 라이브러리를 접촉시키는 공정,
(b) 상기 공정 (a)에서 칼럼에 결합한 항원 결합 도메인(또는 항원 결합 분자)을 당해 화합물의 저농도 존재하에서 칼럼으로부터 용출하는 공정,
(c) 상기 공정 (b)에서 용출된 항원 결합 도메인(또는 항원 결합 분자)을 단리하는 공정.
또한 본 발명이 제공하는 하나의 태양인, 표적 조직 특이적인 화합물의 비존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 당해 화합물의 존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다도 낮은 항원 결합 도메인(또는 당해 도메인을 포함하는 항원 결합 분자)은, 아래의 공정 (a) 내지 (d)를 포함하는 스크리닝방법에 의해 취득될 수 있다.
(a) 항원을 고정한 칼럼에 표적 조직 특이적인 화합물의 비존재하에서 항원 결합 도메인(또는 항원 결합 분자)의 라이브러리를 통과시키는 공정,
(b) 상기 공정 (a)에서 칼럼에 결합하지 않고 용출된 항원 결합 도메인(또는 항원 결합 분자)을 회수하는 공정,
(c) 상기 공정 (b)에서 회수된 항원 결합 도메인(또는 항원 결합 분자)을 당해 화합물의 존재하에서 항원에 결합시키는 공정,
(d) 상기 공정 (c)에서 항원에 결합한 항원 결합 도메인(또는 항원 결합 분자)을 단리하는 공정.
또한 본 발명이 제공하는 하나의 태양인, 표적 조직 특이적인 화합물의 저농도 존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 당해 화합물의 고농도 존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다도 낮은 항원 결합 도메인(또는 당해 도메인을 포함하는 항원 결합 분자)은, 아래의 공정 (a) 내지 (d)를 포함하는 스크리닝방법에 의해 취득될 수 있다.
(a) 항원을 고정한 칼럼에 표적 조직 특이적인 화합물의 저농도 존재하에서 항원 결합 도메인(또는 항원 결합 분자)의 라이브러리를 통과시키는 공정,
(b) 상기 공정 (a)에서 칼럼에 결합하지 않고 용출된 항원 결합 도메인(또는 항원 결합 분자)을 회수하는 공정,
(c) 상기 공정 (b)에서 회수된 항원 결합 도메인(또는 항원 결합 분자)을 당해 화합물의 고농도 존재하에서 항원에 결합시키는 공정,
(d) 상기 공정 (c)에서 항원에 결합한 항원 결합 도메인(또는 항원 결합 분자)을 단리하는 공정.
또한 본 발명이 제공하는 하나의 태양인, 표적 조직 특이적인 화합물의 비존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 당해 화합물의 존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다도 낮은 항원 결합 도메인(또는 당해 도메인을 포함하는 항원 결합 분자)은, 아래의 공정 (a) 내지 (d)를 포함하는 스크리닝방법에 의해 취득될 수 있다.
(a) 표적 조직 특이적인 화합물의 존재하에서 항원 결합 도메인(또는 항원 결합 분자)의 라이브러리를 항원에 접촉시키는 공정,
(b) 상기 공정 (a)에서 항원에 결합한 항원 결합 도메인(또는 항원 결합 분자)을 취득하는 공정,
(c) 상기 공정 (b)에서 취득한 항원 결합 도메인(또는 항원 결합 분자)을 화합물의 비존재하에 두는 공정,
(d) 상기 공정 (c)에서 항원 결합 활성이 상기 공정 (b)에서 선택한 기준보다 약한 항원 결합 도메인(또는 항원 결합 분자)을 단리하는 공정.
또한 본 발명이 제공하는 하나의 태양인, 표적 조직 특이적인 화합물의 저농도 존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 당해 화합물의 고농도 존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다도 낮은 항원 결합 도메인(또는 당해 도메인을 포함하는 항원 결합 분자)은, 아래의 공정 (a) 내지 (d)를 포함하는 스크리닝방법에 의해 취득될 수 있다.
(a) 표적 조직 특이적인 화합물의 고농도 존재하에서 항원 결합 도메인(또는 항원 결합 분자)의 라이브러리를 항원에 접촉시키는 공정,
(b) 상기 공정 (a)에서 항원에 결합한 항원 결합 도메인(또는 항원 결합 분자)을 취득하는 공정,
(c) 상기 공정 (b)에서 취득한 항원 결합 도메인(또는 항원 결합 분자)을 화합물의 저농도 존재하에 두는 공정,
(d) 상기 공정 (c)에서 항원 결합 활성이 상기 공정 (b)에서 선택한 기준보다 약한 항원 결합 도메인(또는 항원 결합 분자)을 단리하는 공정.
또한 상기 공정은 2회 이상 반복되어도 된다. 따라서 본 발명에 의해 전술한 스크리닝방법에 있어서 (a) 내지 (c) 또는 (a) 내지 (d)의 공정을 2회 이상 반복하는 공정을 추가로 포함하는 스크리닝방법에 의해 취득된, 표적 조직 특이적인 화합물의 비존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 당해 화합물의 존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다도 낮은 항원 결합 도메인(또는 당해 도메인을 포함하는 항원 결합 분자) 또는 표적 조직 특이적인 화합물의 저농도 존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 당해 화합물의 고농도 존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다도 낮은 항원 결합 도메인(또는 당해 도메인을 포함하는 항원 결합 분자)이 제공된다. (a) 내지 (c) 또는 (a) 내지 (d)의 공정이 반복되는 횟수는 특별히 한정되지 않으나, 통상 10회 이내이다.
본 발명의 스크리닝방법에 있어서 표적 조직 특이적 화합물은 비표적 조직과 비교하여 상이한 농도(예를 들면 고농도 또는 저농도)로 표적 조직에 존재하고 있는 등의 정량적인 표적 조직 특이성으로 규정되는 화합물일 수 있다. 예를 들면 표적 조직 특이적 화합물은 임의의 농도로 차별적으로 존재한다. 그러나 일반적으로 표적 조직 특이적 화합물은 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 100%, 적어도 110%, 적어도 120%, 적어도 130%, 적어도 140%, 적어도 150%, 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 103배, 적어도 104배, 적어도 105배, 적어도 106배 또는 그 이상이며, 무한대(즉, 비표적 조직에 존재하지 않는 경우)까지의 증가하는 농도로 존재하는 것이 가능하다.
저농도 및 고농도를 구별하는 역치는 화합물에 따라 적절히 설정하는 것이 가능하다. 예를 들면 ATP 또는 아데노신의 역치의 비한정의 일태양에서는 역치로서 저농도 조건은 10 nM, 1 nM, 100 pM, 10 pM, 1 pM 또는 0 M의 값으로부터 적절히 설정될 수 있다. 설정된 역치에 따라 고농도 조건은 각 역치의 적어도 110%, 적어도 120%, 적어도 130%, 적어도 140%, 적어도 150%, 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 103배, 적어도 104배, 적어도 105배, 적어도 106배의 값으로부터 적절히 설정될 수 있다. 또한 PGE2의 비한정의 일태양에서는 역치로서 저농도 조건은 10 pM, 1 pM, 100 fM, 10 fM, 1 fM 또는 0 M의 값으로부터 적절히 설정될 수 있다. 설정된 역치에 따라 고농도 조건은 각 역치의 적어도 110%, 적어도 120%, 적어도 130%, 적어도 140%, 적어도 150%, 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 103배, 적어도 104배, 적어도 105배, 적어도 106배의 값으로부터 적절히 설정될 수 있다. 또한 키누레닌의 비한정의 일태양에서는 역치로서 저농도 조건은 10 μM, 1 μM, 100 nM, 10 nM, 1 nM 또는 0 M의 값으로부터 적절히 설정될 수 있다. 설정된 역치에 따라 고농도 조건은 각 역치의 적어도 110%, 적어도 120%, 적어도 130%, 적어도 140%, 적어도 150%, 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 103배, 적어도 104배, 적어도 105배, 적어도 106배의 값으로부터 적절히 설정될 수 있다.
항원 결합 도메인(또는 항원 결합 분자)의 항원 결합 활성은 당업자에게 공지의 방법으로 측정하는 것이 가능하고, 표적 조직 특이적인 화합물의 농도 이외의 조건에 대해서는 당업자가 적절히 결정하는 것이 가능하다. 항원 결합 도메인(또는 항원 결합 분자)의 항원 결합 활성은 KD(Dissociation constant：해리상수), 겉보기 KD(Apparent dissociation constant：겉보기 해리상수), 해리속도인 kd(Dissociation rate：해리속도상수) 또는 겉보기 kd(Apparent dissociation：겉보기 해리속도상수) 등으로서 평가하는 것이 가능하다. 이들은 당업자 공지의 방법으로 측정하는 것이 가능하며, 예를 들면 비아코어(GE healthcare), 스캐차드 플롯, FACS 등을 사용하는 것이 가능하다.
본 발명에 있어서 표적 조직 특이적인 화합물의 존재하에 있어서의 항원 결합 활성이 당해 화합물의 비존재하에 있어서의 항원 결합 활성보다 높은 항원 결합 도메인 또는 항체를 선택하는 공정은, 표적 조직 특이적인 화합물의 비존재하에 있어서의 항원 결합 활성이 당해 화합물의 존재하에 있어서의 항원 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인 또는 항체를 선택하는 공정과 같은 의미이다.
또한 본 발명에 있어서 표적 조직 특이적인 화합물의 고농도 존재하에 있어서의 항원 결합 활성이 당해 화합물의 저농도 존재하에 있어서의 항원 결합 활성보다 높은 항원 결합 도메인 또는 항체를 선택하는 공정은, 표적 조직 특이적인 화합물의 비존재하에 있어서의 항원 결합 활성이 당해 화합물의 존재하에 있어서의 항원 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인 또는 항체를 선택하는 공정과 같은 의미이다.
표적 조직 특이적인 화합물의 비존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 당해 화합물의 존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다도 낮은 한, 당해 화합물의 존재하에 있어서의 항원 결합 활성과 비존재하에 있어서의 항원 결합 활성의 차는 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 당해 화합물의 존재하에 있어서의 항원 결합 활성이 비존재하에 있어서의 항원 결합 활성의 2배 이상이고, 더욱 바람직하게는 10배 이상이며, 보다 바람직하게는 40배 이상이다. 당해 항원 결합 활성의 차의 상한은 특별히 한정되지 않고, 당업자의 기술에 있어서 제작 가능한 한 400배, 1,000배, 10,000배 등 어떠한 값이어도 된다. 표적 조직 특이적인 화합물의 비존재하에 있어서 항원에 대한 결합 활성이 관찰되지 않는 경우에는 이 상한은 무한대의 수치가 된다.
상기 스크리닝방법에 의해 스크리닝되는 본 발명의 항원 결합 도메인(또는 당해 도메인을 포함하는 항원 결합 분자)은 어떠한 항원 결합 도메인(또는 항원 결합 분자)이어도 되고, 예를 들면 전술한 항원 결합 도메인(또는 항원 결합 분자)을 스크리닝하는 것이 가능하다. 예를 들면 천연의 서열을 갖는 항원 결합 도메인(또는 항원 결합 분자)을 스크리닝해도 되고, 아미노산 서열이 치환된 항원 결합 도메인(또는 항원 결합 분자)을 스크리닝해도 된다.
라이브러리
어떤 일태양에 의하면, 본 발명의 항원 결합 도메인(또는 당해 도메인을 포함하는 항원 결합 분자)은 저분자 화합물의 농도에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 하나 이상의 아미노산 잔기가 항원 결합 도메인에 포함되어 있는 서로 서열이 다른 복수의 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리로부터 취득될 수 있다. 저분자 화합물의 비한정의 일태양으로서, 표적 조직 특이적인 화합물 또는 비천연 화합물을 들 수 있다. 표적 조직 특이적인 화합물의 예로서는 (1) 락트산, 숙신산, 구연산 등의 해당계, 또는 크레브스 회로의 1차 대사산물, (2) 알라닌, 글루타민산, 또는 아스파라긴산 등의 아미노산, (3) 키누레닌 및 그의 대사산물인 안트라닐산, 3-히드록시키누레닌 및 키누렌산 등의 아미노산의 대사산물, (4) 프로스타글란딘 E2 등의 아라키돈산의 대사산물, 및 (5) 아데노신, 아데노신 3인산(ATP), 아데노신 2인산(ADP), 아데노신 1인산(AMP) 등의 푸린 고리 구조를 갖는 뉴클레오시드 등이 예시된다. 이하에서는 이러한 표적 조직 특이적 화합물로서의 아데노신 및/또는 ATP에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 하나 이상의 아미노산 잔기가 항원 결합 도메인에 포함되어 있는 서로 서열이 다른 복수의 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리에 대해서 예시되는데, 아데노신 및/또는 ATP 이외의 저분자 화합물의 농도에 따라 항원에 대한 결합 활성을 변화시키는 항원 결합 분자의 라이브러리에도 하기의 예에 준하여 적절히 적용될 수 있다.
본 명세서에 있어서 「라이브러리」란 각각 다른 서열을 갖는 복수의 항원 결합 분자 또는 항원 결합 분자를 포함하는 복수의 융합 폴리펩티드, 또는 이들의 분자 또는 폴리펩티드를 코드하는 핵산 또는 폴리뉴클레오티드의 세트를 말한다. 라이브러리 중에 포함되는 복수의 항원 결합 분자 또는 항원 결합 분자를 포함하는 복수의 융합 폴리펩티드의 서열은 단일 서열이 아니라 서로 서열이 다른 항원 결합 분자 또는 항원 결합 분자를 포함하는 융합 폴리펩티드이다.
본 명세서에 있어서의 「라이브러리」의 태양으로서, 저분자 존재하에서 표적 항원에 결합하고, 저분자 비존재하에서는 표적 항원에 결합하지 않는 항원 결합 분자를 효율적으로 취득할 수 있는 라이브러리(저분자 의존성)를 제공할 뿐 아니라, 저분자 비존재하에서 표적 항원에 결합하고 저분자 존재하에서는 표적 항원에 결합하지 않는 항체를 효율적으로 취득할 수 있는 라이브러리(저분자 역의존성)도 제공할 수 있다.
본 발명에 있어서의 일실시형태에서는 본 발명의 항원 결합 분자와 이종(異種) 폴리펩티드의 융합 폴리펩티드가 제작될 수 있다. 어떤 실시형태에서는 융합 폴리펩티드는 바이러스 코트 단백질, 예를 들면 pIII, pVIII, pVII, pIX, Soc, Hoc, gpD, pVI 및 그의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스 코트 단백질의 적어도 일부와 융합될 수 있다.
어떤 실시형태에서는 본 발명의 항원 결합 분자는 ScFv, Fab 단편, F(ab)2 또는 F(ab')2일 수 있기 때문에, 다른 일실시형태에서는 이들 항원 결합 분자와 이종 폴리펩티드의 융합 폴리펩티드로서 서로 서열이 다른 복수의 융합 폴리펩티드로 주로 이루어지는 라이브러리가 제공된다. 구체적으로는 이들 항원 결합 분자와 바이러스 코트 단백질, 예를 들면 pIII, pVIII, pVII, pIX, Soc, Hoc, gpD, pVI 및 그의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스 코트 단백질의 적어도 일부와 융합된 융합 폴리펩티드로서 서로 서열이 다른 복수의 융합 폴리펩티드로 주로 이루어지는 라이브러리가 제공된다. 본 발명의 항원 결합 분자는 추가로 이량체화 도메인을 포함할 수 있다. 어떤 실시형태에서는 상기 이량체화 도메인은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 가변영역과 바이러스 코트 단백질의 적어도 일부 사이에 존재할 수 있다. 이 이량체화 도메인에는 이량체화 서열의 하나 이상 및/또는 하나 또는 복수의 시스테인 잔기를 포함하는 서열이 포함될 수 있다. 이 이량체화 도메인은 바람직하게는 중쇄 가변영역 또는 불변영역의 C말단과 연결될 수 있다. 이량체화 도메인은 상기 항체 가변영역이 바이러스의 코트 단백질 성분과의 융합 폴리펩티드 성분으로서 제작되어 있는지(이량체화 도메인 뒤에 앰버 종지 코돈을 갖는지) 여부에 따라, 또는 상기 항체 가변영역이 주로 바이러스 코트 단백질 성분을 포함하지 않고 제작되어 있는지(예를 들면 이량체화 도메인 뒤에 앰버 종지 코돈을 갖는지) 여부에 따라 다양한 구조를 취하는 것이 가능하다. 상기 항체 가변영역이 주로 바이러스의 코트 단백질 성분과의 융합 폴리펩티드로서 제작될 때는, 하나 또는 복수의 디설피드 결합 및/또는 단일의 이량체화 서열에 의해 2가 제시가 초래된다.
본 명세서에 있어서는 서로 서열이 다른 복수의 항원 결합 분자라는 기재에 있어서의 「서로 서열이 다른」이라는 용어는 라이브러리 중의 개개의 항원 결합 분자의 서열이 서로 다른 것을 의미한다. 즉, 라이브러리 중에 있어서의 서로 다른 서열의 수는 라이브러리 중의 서열이 다른 독립 클론의 수가 반영되어 「라이브러리 사이즈」로 지칭되는 경우도 있다. 통상의 파지 디스플레이 라이브러리의 경우는 106 내지 1012이고, 리보솜 디스플레이법 등의 공지의 기술을 적용함으로써 라이브러리 사이즈를 1014까지 확대하는 것이 가능하다. 그러나 파지 라이브러리의 패닝 선택 시에 사용되는 파지 입자의 실제 수는 통상 라이브러리 사이즈보다도 10 내지 10,000배 크다. 이 과잉 배수는 「라이브러리 당량수」로도 불리는데, 같은 아미노산 서열을 갖는 개개의 클론이 10 내지 10,000 존재할 수 있는 것을 나타낸다. 따라서 본 발명에 있어서의 「서로 서열이 다른」이라는 용어는 라이브러리 당량수가 제외된 라이브러리 중의 개개의 항원 결합 분자의 서열이 서로 다른 것, 보다 구체적으로는 서로 서열이 다른 항원 결합 분자가 106 내지 1014분자, 바람직하게는 107 내지 1012분자, 더욱 바람직하게는 108 내지 1011분자, 특히 바람직하게는 108 내지 1010분자 존재하는 것을 의미한다.
또한 본 발명의 복수의 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리라는 기재에 있어서의 「복수의」라는 용어는, 예를 들면 본 발명의 항원 결합 분자, 융합 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 분자, 벡터 또는 바이러스는 통상 그 물질의 2개 이상의 종류의 집합을 가리킨다. 예를 들면 어떤 2개 이상의 물질이 특정 형질에 관하여 서로 다르다면, 그 물질에는 2종류 이상이 존재하는 것을 나타낸다. 예로서는, 아미노산 서열 중의 특정 아미노산 위치에서 관찰되는 변이체 아미노산을 들 수 있다. 예를 들면 플렉시블 잔기 이외 또는 표면에 노출된 매우 다양한 아미노산 위치의 특정 변이체 아미노산 이외는 실질적으로 동일한, 바람직하게는 동일 서열인 본 발명의 2개 이상의 항원 결합 분자가 있는 경우, 본 발명의 항원 결합 분자는 복수 개 존재한다. 다른 예에서는 플렉시블 잔기를 코드하는 염기 이외 또는 표면에 노출된 매우 다양한 아미노산 위치의 특정 변이체 아미노산을 코드하는 염기 이외는 실질적으로 동일한, 바람직하게는 동일 서열인 본 발명의 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 분자가 있다면, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 분자는 복수 개 존재한다.
또한 본 발명의 복수의 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리라는 기재에 있어서의 「로 주로 이루어지는」이라는 용어는 라이브러리 중 서열이 다른 독립 클론의 수 중 저분자 화합물(예를 들면 표적 조직 특이적 화합물)의 농도 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성이 상이한 항원 결합 분자의 수가 반영된다. 구체적으로는, 이러한 결합 활성을 나타내는 항원 결합 분자가 라이브러리 중에 적어도 104분자 존재하는 것이 바람직하다. 또한 보다 바람직하게는 본 발명의 항원 결합 도메인은 이러한 결합 활성을 나타내는 항원 결합 분자가 적어도 105분자 존재하는 라이브러리로부터 취득될 수 있다. 더욱 바람직하게는 본 발명의 항원 결합 도메인은 이러한 결합 활성을 나타내는 항원 결합 분자가 적어도 106분자 존재하는 라이브러리로부터 취득될 수 있다. 특히 바람직하게는 본 발명의 항원 결합 도메인은 이러한 결합 활성을 나타내는 항원 결합 분자가 적어도 107분자 존재하는 라이브러리로부터 취득될 수 있다. 또한 바람직하게는 본 발명의 항원 결합 도메인은 이러한 결합 활성을 나타내는 항원 결합 분자가 적어도 108분자 존재하는 라이브러리로부터 취득될 수 있다. 다른 표현으로는 라이브러리 중 서열이 다른 독립 클론 수 중 아데노신 및/또는 ATP의 존재 또는 비존재에 따라 항원에 대한 항원 결합 도메인의 결합 활성이 상이한 항원 결합 분자의 비율로서도 적합하게 표현될 수 있다. 구체적으로는, 본 발명의 항원 결합 도메인은 이러한 결합 활성을 나타내는 항원 결합 분자가 라이브러리 중 서열이 다른 독립 클론 수의 10-6%~80%, 바람직하게는 10-5%~60%, 보다 바람직하게는 10-4%~40% 포함되는 라이브러리로부터 취득될 수 있다. 융합 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 분자 또는 벡터의 경우도 상기와 마찬가지로 분자의 수나 분자 전체에 있어서의 비율로 표현될 수 있다. 또한 바이러스의 경우도 상기와 마찬가지로 바이러스 개체의 수나 개체 전체에 있어서의 비율로 표현될 수 있다. 본 발명의 비한정의 일태양으로서 복수의 항원 결합 분자가 결합하는 항원이 1종류인 경우, 이러한 결합 활성을 나타내는 항원 결합 분자가 라이브러리 중에 적어도 10분자, 100분자, 1,000분자, 104분자, 105분자, 106분자, 107분자 또는 108분자 존재하는 것이 바람직하다. 또한 보다 바람직하게는 본 발명의 항원 결합 도메인은 이러한 결합 활성을 나타내는 항원 결합 분자가 적어도 10분자 존재하는 라이브러리로부터 취득될 수 있다. 더욱 바람직하게는 본 발명의 항원 결합 도메인은 이러한 결합 활성을 나타내는 항원 결합 분자가 적어도 100분자 존재하는 라이브러리로부터 취득될 수 있다. 특히 바람직하게는 본 발명의 항원 결합 도메인은 이러한 결합 활성을 나타내는 항원 결합 분자가 적어도 1,000분자 존재하는 라이브러리로부터 취득될 수 있다.
본 발명의 일태양으로서, 아래의 (a) 및 (b)의 공정：
(a) 저분자 화합물의 농도에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인 또는 저분자 화합물에 대해 결합 활성을 갖는 항원 결합 도메인에 있어서, 아래의 (i) 내지 (iii) 중 어느 하나 이상을 만족시키는 아미노산 부위를 특정하는 공정；
(i) 당해 저분자 화합물에 대한 결합에 관여하고 있지 않은 1 또는 복수의 아미노산 부위；
(ii) 부모 항원 결합 도메인이 속하는 동물종의 항체의 레퍼토리로서 아미노산 출현 빈도의 다양성이 있는 1 또는 복수의 아미노산 부위；
(iii) 표준 구조의 형성에 중요하지 않은 1 또는 복수의 아미노산 부위；및
(b) 상기 항원 결합 도메인에 있어서, 미개변체를 코드하는 핵산 및 공정 (a)에서 특정된 1 또는 복수의 아미노산 부위에 개변을 갖는, 서로 서열이 다른 상기 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자의 복수의 개변체 각각을 코드하는 핵산을 포함하는 라이브러리를 설계하는 공정
을 포함하는 방법에 의해 제조되는 라이브러리가 제공된다.
본 발명에 있어서의 「저분자 화합물에 대한 결합에 관여하고 있지 않은 1 또는 복수의 아미노산 부위」는 저분자 화합물과 항체의 복합체의 결정구조 해석, NMR을 사용한 입체구조 해석, 또는 아미노산의 변이 도입 등의 수법에 의해 동정할 수 있다. 본 발명의 비한정의 일태양으로서 저분자와 항체의 복합체의 결정구조 해석으로부터 저분자와의 결합에 관여하고 있지 않은 항체의 잔기를 동정할 수 있다. 여기서 「저분자와의 결합에 관여」란, 항체의 H쇄 또는 L쇄를 형성하는 아미노산에 있어서의 측쇄 또는 주쇄의 원자와 저분자 화합물의 원자가 결합 활성에 효과를 미칠 수 있는 거리에서 분자간 상호작용을 형성하고 있는 상태, 또는 어떤 아미노산 잔기가 CDR 루프 등의 입체구조를 저분자 화합물이 결합할 때의 구조로 안정화시키는 등의 간접적인 영향을 포함하는 저분자 화합물의 결합에 기여하고 있는 상태, 및 그 양쪽을 만족시키는 상태를 말한다.
본 명세서에 있어서의 「분자간 상호작용을 형성하고 있는 상태」에 대해서는, 예를 들면 저분자와 항체의 복합체의 결정구조 해석으로부터 항체의 H쇄 또는 L쇄를 형성하는 아미노산의 측쇄 또는 주쇄를 구성하는 비수소원자와 저분자 화합물을 구성하는 비수소원자의 원자간 거리를 토대로 판정할 수 있다. 예를 들면 상기 원자간 거리는 3.0Å, 3.2Å, 3.4Å, 3.6Å, 3.8Å, 4.0Å, 4.2Å, 4.4Å, 4.6Å, 4.8Å 또는 5.0Å 이내가 바람직하나 이것에 한정되는 것은 아니다. 더욱 바람직한 상기 원자간 거리는 3.6Å, 3.8Å, 4.0Å 또는 4.2Å 이내이다.
보다 상세하게는 입체구조 상에서의 원자간 거리와 형성되는 분자간 상호작용의 종류 및 원자의 종류의 정보를 토대로 직접적으로 상호작용하고 있을 가능성을 판정할 수 있다. 더욱 정확하게는 Ala나 Gly로의 개변 등의 아미노산 잔기의 변이 도입이 저분자 화합물의 활성에 주는 영향으로부터 판단할 수 있으나 이것에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에 있어서의 「간접적으로 영향을 미치고 있는 상태」에 대해서도, 예를 들면 저분자와 항체의 복합체의 입체구조로부터 각 아미노산 잔기의 구조나 주위 잔기와의 분자간 상호작용의 상황을 상세하게 해석함으로써 저분자의 결합에 간접적으로 영향을 미치고 있는지 여부를 추정할 수 있는데, 보다 정확하게는 Ala나 Gly로의 개변 등의 아미노산 잔기의 변이 도입이 저분자 화합물의 활성에 미치는 영향으로부터 판단할 수 있다.
본 발명의 일태양으로서 저분자의 결합에 관여하고 있지 않은 것으로 동정된 잔기를 다른 아미노산으로 치환해도 화합물로의 결합을 적절한 정도로 유지할 수 있는 아미노산을 선택할 수 있다. 이에 의해, 선택된 잔기에 있어서 선택된 아미노산이 출현하는 라이브러리를 설계할 수 있다. 이 경우에 있어서, 저분자 화합물의 결합에 관여하고 있지 않은 것으로 동정된 잔기가 서로 다른 아미노산으로 치환된 항원 결합 분자의 집합이 되도록, 복수의 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리를 설계하는 것이 가능하다.
다른 일태양에서는 저분자 화합물에 대한 결합에 관여하고 있지 않은 아미노산 부위의 판정은, 저분자 화합물과의 결합에 관여하고 있는 아미노산 부위 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산 부위 이외의 아미노산 부위라고도 생각할 수 있다.
본 발명에 있어서의 비한정의 일태양으로서 「저분자 화합물에 대한 결합에 관여하고 있지 않은 1 또는 복수의 아미노산 부위」는 아미노산의 변이 도입방법에 의해 동정할 수 있다. 예를 들면 가변영역의 아미노산을 망라적으로 개변하여 개개의 개변체의 저분자로의 결합이 비아코어 등을 사용한 공지의 방법으로 측정되고, 개개의 개변체의 저분자에 대한 결합 활성(어피니티)이 KD값으로서 산출된다. 당해 KD값이 부모 서열(parent sequence)인 미개변체의 KD값과 비교되어, 일정 기준을 윗도는 결합을 나타내는 개변 개소가 저분자 화합물에 대한 결합에 관여하고 있지 않은 아미노산 부위로 판정된다. 예를 들면 비아코어 등의 공지의 방법을 사용한 측정 결과, 각각의 개변체의 저분자에 대한 결합 활성(어피니티)이 KD값으로 산출되고, 중쇄의 부위로서는 개변에 의해 저분자 결합능이 미개변체의 1/100, 1/50, 1/10, 1/9, 1/8, 1/7, 1/6, 1/5, 1/4, 1/3 또는 1/2의 결합능을 밑돌지 않는 것, 및 경쇄의 부위로서는 개변에 의해 저분자 결합능이 미개변체의 1/100, 1/50, 1/10, 1/9, 1/8, 1/7, 1/6, 1/5, 1/4, 1/3 또는 1/2의 결합능을 밑돌지 않는 것이 저분자 화합물에 대한 결합에 관여하고 있지 않은 아미노산 부위로 판정되는데, 상기 기준에 한정되는 것은 아니다. 또는 부모 서열인 미개변체의 KD값과의 비교가 아닌 각각의 개변체의 저분자에 대한 결합 활성(어피니티)이 KD값으로서 산출되고, 중쇄의 부위로서는 10 mM, 1 mM, 100 uM, 10 uM, 1 uM, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM, 10 pM 또는 1 pM의 결합능을 밑돌지 않는 것, 및 경쇄의 부위로서는 10 mM, 1 mM, 100 uM, 10 uM, 1 uM, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM, 10 pM 또는 1 pM의 결합능을 밑돌지 않는 것이 저분자 화합물에 대한 결합에 관여하고 있지 않은 아미노산 부위로 판정되는데, 상기 기준에 한정되는 것은 아니다.
미개변 및 개변체의 저분자에 대한 결합 활성의 측정은 당업자 공지의 방법(Biacore, ELISA, ECL 등)으로부터 적절히 선택해서 실시할 수 있다.
다른 일태양에서는, 저분자 화합물에 대한 결합에 관여하고 있지 않은 아미노산 부위의 판정은 저분자 화합물과의 결합에 관여하고 있는 아미노산 부위 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산 부위 이외의 아미노산 부위라고도 생각할 수 있다.
본 발명에 있어서의 「서로 서열이 다른 상기 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자의 복수의 개변체 각각을 코드하는 핵산을 포함하는 라이브러리를 설계한다」는 것은, 예를 들면 NNK나 TRIM 라이브러리 등(Gonzalez-Munoz A et al. MAbs 2012, Lee CV et al. J Mol Biol. 2004, Knappik A. et al. J Mol Biol. 2000, Tiller T et al. MAbs 2013)의 공지의 라이브러리 기술을 이용하여 특정 부위의 아미노산을 목적하는 아미노산으로 개변되어 있는 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자의 복수의 개변체를 포함하는 라이브러리를 설계하는 것이 포함되는데, 특별히 이 태양에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서의 「1 또는 복수의 아미노산」이란, 특별히 아미노산의 수를 한정하는 것은 아니고, 2종류 이상의 아미노산, 5종류 이상의 아미노산, 10종류 이상의 아미노산, 15종류 이상의 아미노산 또는 20종류의 아미노산이어도 된다.
본 발명에 있어서의 「아미노산 출현빈도의 다양성이 있는 아미노산 부위」란, 부모 항체(부모 항원 결합 도메인)가 속하는 동물종의 항체의 레퍼토리로서 1% 이상의 출현빈도로 존재가 확인되는 아미노산의 종류로서 2종 이상이 확인되는 아미노산 부위를 말한다.
본 발명에 있어서의 「부모 항원 결합 도메인」이란, 라이브러리 제작의 주형이 되는 저분자 화합물의 농도에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인, 또는 저분자 화합물에 대해 결합 활성을 갖는 항원 결합 도메인을 말한다.
본 발명에 있어서의 「부모 항원 결합 도메인이 속하는 동물종의 항체의 레퍼토리」란, 해당하는 부모 항원 결합 도메인이 유래하는 동물종에 있어서 유전자 상에서 확인되는 항체 유전자 서열의 레퍼토리를 말한다. 일례로서 이것에 한정되는 것은 아니지만, 해당하는 부모 항원 결합 도메인이 인간 유래인 경우, 부모 항원 결합 도메인이 속하는 동물종의 항체의 레퍼토리란, 인간의 유전자 상에 있어서 확인되는 항체 유전자 서열의 레퍼토리를 가리키고, 해당하는 부모 항원 결합 도메인이 토끼 유래인 경우는 부모 항원 결합 도메인이 속하는 동물종의 항체의 레퍼토리란, 토끼의 유전자 상에 있어서 확인되는 항체 유전자 서열의 레퍼토리를 가리킨다. 단, 유전자 상에 존재했다 하더라도 종결/개시 코돈의 존재나 프레임 시프트에 의해 실제로 항체로서 발현되는 경우가 없는 서열은 포함되지 않는다.
해당하는 부모 항원 결합 도메인이 비인간 동물 유래인 경우 통상의 방법에 따라 이를 인간화하는 것이 가능하고, 이 수법에 대해서는 당업자에게 널리 공지이다(유럽 특허공개 EP239400, 국제공개 WO1996/002576, WO1993/012227, WO1992/003918, WO1994/002602, WO1994/025585, WO1996/034096, WO1996/033735, WO1992/001047, WO1992/020791, WO1993/006213, WO1993/011236, WO1993/019172, WO1995/001438, WO1995/015388, Cancer Res., (1993) 53, 851-856, BBRC., (2013)436(3):543-50 등). 해당하는 부모 항원 결합 도메인을 통상의 방법에 따라 인간화한 후에 라이브러리화를 실시하는 경우, 본 발명에 있어서의 「부모 항원 결합 도메인이 속하는 동물종의 항체의 레퍼토리」에 있어서는 인간화를 실시하기 전의 항원 결합 도메인과 인간화한 후의 항원 결합 도메인 양쪽을 부모 항원 결합 도메인으로서 취급할 수 있고, 이에 수반하여 동일 동물종으로서 인간화를 실시하기 전의 항원 결합 도메인이 유래하는 동물종과 인간 양쪽의 레퍼토리를 적용할 수 있다. 일례로서 이것에 한정되는 것은 아니지만, 인간화를 실시하기 전의 항원 결합 도메인이 토끼에 유래하는 경우, 부모 항원 결합 도메인이 속하는 동물종의 항체의 레퍼토리란, 인간 및/또는 토끼의 유전자 상에 있어서 확인되는 항체 유전자 서열의 레퍼토리를 가리킨다. 단, 유전자 상에 존재하였다 하더라도 종결/개시 코돈의 존재나 프레임 시프트에 의해 실제로 항체로서 발현되는 경우가 없는 서열은 포함되지 않는다.
부모 항원 결합 도메인이 속하는 동물종의 항체의 레퍼토리는 일례로서 이것에 한정되는 것은 아니지만, 기지의 데이터 베이스를 참조함으로써 조사가 가능하다. 아미노산 출현빈도의 다양성이 있는 부위는 일반적으로 CDR영역에 존재한다. 일태양에서는 공지의 및/또는 천연 항체의 매우 다양한 위치를 결정할 때는 Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute of Health Bethesda Md.)(1987년 및 1991년)가 제공하는 데이터가 유효하다. 또한 인터넷 상의 복수의 데이터 베이스(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/, http://www.bioinf.org.uk/abs/index.html)에서는 수집된 다수의 인간 경쇄 및 중쇄의 서열과 그의 배치가 제공되고 있어, 이들 서열과 그의 배치 정보는 본 발명에 있어서의 매우 다양한 위치의 결정에 유용하다.
또한 다른 일태양으로서는 부모 항원 결합 도메인이 속하는 동물종의 항체의 레퍼토리는 해당하는 생물종으로부터 취득한 항체 유전자를 클로닝하여 서열을 해석함으로써도 조사가 가능하다. 일례로서 이것에 한정되는 것은 아니지만, 인간의 항체 레퍼토리에 대해서는 건강한 정상인의 림프구 유래의 항체 유전자로 구축되고, 그 레퍼토리에 바이어스를 포함하지 않는 항체 서열인 나이브 서열로 이루어지는 나이브 라이브러리의 서열을 해석함으로써 조사될 수 있다(Gejima 등(Human Antibodies (2002) 11,121-129) 및 Cardoso 등(Scand. J. Immunol. (2000) 51, 337-344)). 레퍼토리의 조사 시에는 적어도 100종류, 바람직하게는 200종류, 더욱 바람직하게는 400종류 이상의 서열에 대해서 해석이 행해지는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서의 부모 항원 결합 도메인이 속하는 동물종의 항체의 레퍼토리는 보다 바람직하게는 이것에 한정되는 것은 아니지만, 부모 항원 결합 도메인이 속하는 생식세포계열의 서브그룹에 대해서 조사가 실시되는 것이 바람직하다. 프레임워크의 예로서는, 예를 들면 V-Base(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) 등의 웹사이트에 포함되어 있는, 현재 알려져 있는 완전히 인간형의 프레임워크 영역의 서열이 본 발명의 항원 결합 분자에 포함되는 생식세포계열의 서열로서 적절히 사용될 수 있다. 생식세포계열의 서열은 그 유사성에 기초하여 서브그룹으로 분류될 수 있다(Tomlinson 등(J. Mol. Biol. (1992)227, 776-798) Williams 및 Winter(Eur. J. Immunol.(1993)23, 1456-1461) 및 Cox 등(Nat. Genetics(1994)7, 162-168)). 일례로서 인간의 항체에 있어서는 중쇄 가변영역에 대해서는 7개의 서브그룹, Vκ에 대해서는 7개의 서브그룹, Vλ에 대해서는 10종류의 서브그룹이 보고되어 있고, 각 아미노산 부위에 대해서 부모 항원 결합 도메인이 속해 있는 서브그룹 내에 있어서의 아미노산의 레퍼토리를 해석함으로써 조사될 수 있는데, 특별히 이 태양에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서의 「표준 구조(canonical structure)의 형성에 중요하지 않은 아미노산 부위」에 있어서, 항체의 표준 구조란 항체 중쇄 및 경쇄의 주로 CDR1, 2의 입체구조의 클러스터링(clustering)을 나타내고 있고, 구조는 항체의 서브그룹이나 CDR의 길이나 서열에 의해 분류될 수 있다. 각 표준 구조에 있어서 구조의 유지에 중요한 잔기는 이미 공지이며, 초티아(Chothia) 등(J. Mol. Biol. (1992) 227, 799-817), 알-라지카니(Al-Lazikani) 등(J. Mol. Biol. (1997) 273, 927-948), 톰린손(Tomlinson) 등(J. Mol. Biol.(1992) 227, 776-798)의 보고를 참조함으로써, 해당하는 부모 항원 결합 분자가 분류되는 표준 구조 및 그의 구조에 중요한 잔기를 특정하는 것이 가능하다.
또한 항체 이외의 항원 결합 도메인에 있어서도 구조의 유지에 중요한 잔기가 존재하고 있는 것은 공지이며, 이것에 한정되는 것은 아니지만, 제작한 변이체의 구조 해석 등에 의해 개개의 항원 결합 도메인에 있어서 표준 구조의 형성에 중요하지 않은 아미노산 부위를 동정하는 것이 가능하다.
본 발명의 라이브러리의 다른 하나의 태양으로서는 아래의 라이브러리를 들 수 있다.
아래의 (a) 내지 (d)의 공정：
(a) 저분자 화합물의 농도에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인 또는 저분자 화합물에 대해 결합 활성을 갖는 항원 결합 도메인에 있어서, 아래의 (i) 내지 (iii) 중 어느 하나 이상을 만족시키는 아미노산 부위를 특정하는 공정；
(i) 당해 저분자 화합물에 대한 결합에 관여하고 있지 않은 1 또는 복수의 아미노산 부위；
(ii) 부모 항원 결합 도메인이 속하는 동물종의 항체의 레퍼토리로서 아미노산 출현 빈도의 다양성이 있는 1 또는 복수의 아미노산 부위；
(iii) 표준 구조의 형성에 중요하지 않은 1 또는 복수의 아미노산 부위,
(b) 공정 (a)에서 특정된 1 또는 복수의 아미노산 부위에 개변을 갖는, 서로 서열이 다른 상기 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자의 복수의 개변체를 제작하는 공정,
(c) 상기 각각의 개변체의 당해 저분자 화합물에 대한 결합 활성에 실질적으로 변화를 초래하지 않는 1 또는 복수의 아미노산의 개변을 특정하는 공정；및
(d) 미개변체를 코드하는 핵산 및 공정 (c)에서 특정된 1 또는 복수의 아미노산에 개변을 갖는, 서로 서열이 다른 상기 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자의 복수의 개변체를 코드하는 핵산을 포함하는 라이브러리를 제조하는 공정
을 포함하는 방법에 의해 제조되는 라이브러리.
본 발명에 있어서의 「서로 서열이 다른 상기 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자의 복수의 개변체를 제작하는 공정」에 있어서, 공정 (a)에서 특정된 아미노산 부위 중 CDR1 및 CDR2의 부위에 관해서는 생식세포계열에서의 출현빈도가 10% 이상, 9% 이상, 8% 이상, 7% 이상, 6% 이상, 5% 이상, 4% 이상, 3% 이상, 2% 이상 또는 1% 이상의 아미노산으로 치환할 수 있고, CDR3의 부위에 관해서는 생식세포계열에서의 출현빈도가 10% 이상, 9% 이상, 8% 이상, 7% 이상, 6% 이상, 5% 이상, 4% 이상, 3% 이상, 2% 이상 또는 1% 이상의 아미노산으로 치환하여 개개의 개변체를 제작하는 것도 가능하나, 이것에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서의 「복수의 개변체」란, 부모 서열인 항원 결합 도메인의 미개변체에 대해 적어도 1 또는 그 이상의 아미노산이 치환되어 있는 항원 결합 도메인의 각각 다른 개변체를 말한다.
본 발명에 있어서의 「각각의 개변체의 당해 저분자 화합물에 대한 결합 활성에 실질적으로 변화를 초래하지 않는 1 또는 복수의 아미노산의 개변을 특정하는 공정」이란, 아래와 같은 의미를 갖는다. 예를 들면 각각의 개변체의 저분자로의 결합이 비아코어 등을 사용한 공지의 방법으로 측정되어, 각각의 개변체의 저분자에 대한 결합 활성(어피니티)이 KD값으로서 산출된다. 당해 KD값이 부모 서열인 미개변체의 KD값과 비교되어, 일정 기준을 윗도는 결합을 나타내는 개변 개소가 개변 가능 부위로 판정되고, 당해 부위에 있어서 치환된 아미노산은 라이브러리화가 가능한 아미노산(라이브러리에 있어서 출현시키는 플렉시블 잔기)으로 판정할 수 있는데, 이것에 한정되는 것은 아니다. 또는 부모 서열인 미개변체의 KD값과의 비교가 아니라 각각의 개변체의 KD값이 일정 기준을 윗도는 결합을 나타내는 개변 개소가 개변 가능 부위로 판정되고, 당해 부위에 있어서 치환된 아미노산은 라이브러리화가 가능한 아미노산(라이브러리에 있어서 출현시키는 플렉시블 잔기)으로 판정할 수 있는데, 이것에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서의 라이브러리화가 가능한 아미노산을 판정할 때의 「일정 기준을 윗도는 결합을 나타내는 개변 개소」란, 아래와 같은 의미를 갖는다. 예를 들면 비아코어 등의 공지의 방법을 사용하여 측정한 결과, 각각의 개변체의 저분자에 대한 결합 활성(어피니티)이 KD값으로서 산출되고, 중쇄의 부위로서는 개변에 의해 저분자 결합능이 미개변체의 1/100, 1/50, 1/10, 1/9, 1/8, 1/7, 1/6, 1/5, 1/4, 1/3 또는 1/2의 결합능을 밑돌지 않는 것, 및 경쇄의 부위로서는 개변에 의해 저분자 결합능이 미개변체의 1/100, 1/50, 1/10, 1/9, 1/8, 1/7, 1/6, 1/5, 1/4, 1/3 또는 1/2의 결합능을 밑돌지 않는 것이 개변 가능 부위로 판정되고, 당해 부위에 있어서 치환된 아미노산은 라이브러리화가 가능한 아미노산 개소로 판정하는 것이 가능한데, 상기 기준에 한정되는 것은 아니다. 또는 부모 서열인 미개변체의 KD값과의 비교가 아니라 각각의 개변체의 저분자에 대한 결합 활성(어피니티)이 KD값으로서 산출되고, 중쇄의 부위로서는 10 mM, 1 mM, 100 uM, 10 uM, 1 uM, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM, 10 pM 또는 1 pM의 결합능을 밑돌지 않는 것, 및 경쇄의 부위로서는 10 mM, 1 mM, 100 uM, 10 uM, 1 uM, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM, 10 pM 또는 1 pM의 결합능을 밑돌지 않는 것이 개변 가능 부위로 판정되고, 당해 부위에 있어서 치환된 아미노산은 라이브러리화가 가능한 아미노산 개소로 판정하는 것이 가능한데, 상기 기준에 한정되는 것은 아니다.
미개변 및 개변체의 저분자에 대한 결합 활성의 측정은 당업자 공지의 방법(Biacore, ELISA, ECL 등)으로부터 적절히 선택해서 실시할 수 있다.
다른 일태양에서는 저분자 화합물에 대한 결합에 관여하고 있지 않은 아미노산 부위의 판정은 저분자 화합물과의 결합에 관여하고 있는 아미노산 부위 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산 부위 이외의 아미노산 부위라고도 생각할 수 있다.
본 발명에 있어서의 「미개변체를 코드하는 핵산 및 공정 (d)에서 특정된 1 또는 복수의 아미노산에 개변을 갖는, 서로 서열이 다른 상기 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자의 복수의 개변체를 포함하는 라이브러리를 제조하는 공정」이란, 공정 (d)에서 특정된 각 아미노산의 특정 부위에 있어서의 아미노산 출현빈도가 동일해지도록(예를 들면 아미노산 레퍼토리가 10종류인 경우는 각 아미노산은 10% 출현하도록) 라이브러리를 구축하는 태양을 포함하는데, 이것에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 라이브러리의 다른 일태양으로서는 아래의 라이브러리를 들 수 있다.
아래의 1) 및 2)의 공정：
1) 저분자 화합물에 대한 결합 활성을 갖는 항원 결합 분자를 복수 포함하는 라이브러리와 저분자 화합물을 접촉시키는 공정, 및
2) 상기 라이브러리로부터 저분자 화합물에 대해 결합 활성을 갖는 항원 결합 분자의 복수의 개변체를 코드하는 핵산을 농축하는 공정
을 포함하는 방법에 의해 제조되는 라이브러리.
또 다른 태양으로서 상기 라이브러리는 항원 결합 분자가 항체의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하는 항원 결합 분자인 라이브러리로서, 아래의 1) 내지 3) 중 어느 하나의 공정을 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다.
1) 상기 라이브러리가 중쇄 가변영역에 위치하는 아미노산이 개변된 1 또는 복수의 개변체를 코드하는 핵산을 포함하는 라이브러리로서, 상기 라이브러리로부터 저분자 화합물에 대해 결합 활성을 갖는 항원 결합 분자의 복수의 개변체를 코드하는 핵산을 농축하여 라이브러리를 설계하는 공정；
2) 상기 라이브러리가 경쇄 가변영역에 위치하는 아미노산이 개변된 1 또는 복수의 개변체를 코드하는 핵산을 포함하는 라이브러리로서, 상기 라이브러리로부터 저분자 화합물에 대해 결합 활성을 갖는 항원 결합 분자의 복수의 개변체를 코드하는 핵산을 농축하여 라이브러리를 설계하는 공정；
3) 공정 1) 및 공정 2)의 각각의 가변영역 라이브러리로부터 농축된 항원 결합 분자를 코드하는 핵산을 조합함으로써 라이브러리를 설계하는 공정.
본 발명에 있어서의 「농축하는」이란, 농축 작업 실시 전의 라이브러리와의 비교에 있어서 목적의 활성을 갖는 개변체를 코드하는 핵산의 존재 비율을 상승시키는 것을 말한다. 일례로서 이것에 한정되는 것은 아니지만, 저분자 화합물에 대해 결합 활성을 갖는 항원 결합 분자의 개변체를 코드하는 핵산을 농축한다는 것은, 패닝에 의해 저분자 화합물에 대해 결합 활성을 갖는 항원 결합 분자의 개변체를 코드하는 핵산의 존재 비율을 상승시킴으로써 달성 가능하다. 보다 구체적으로는, 일례로서 복수의 항원 결합 분자를 포함하는 라이브러리가 파지 디스플레이법에 의해 표면에 제시된 파지를 상기 저분자 화합물과 접촉시키고, 세정 작업에 의해 결합 활성을 가지고 있지 않은 분자를 제시하고 있는 파지 및 분자를 제시하고 있지 않은 파지를 제거한 후, 결합을 유지하고 있는 항원 결합 분자를 제시하고 있는 파지만을 회수함으로써, 패닝에 의해 저분자 화합물에 대해 결합 활성을 갖는 항원 결합 분자의 개변체를 코드하는 핵산의 존재 비율을 상승시키는 것이 가능하나, 이것에 한정되는 것은 아니다. 보다 구체적으로는, 목적의 활성을 갖는 개변체를 코드하는 핵산의 존재 비율이 농축 작업 실시 전의 라이브러리의 비교에 있어서 1.1배 이상 상승하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 목적의 활성을 갖는 개변체를 코드하는 핵산의 존재 비율을 1.2배 이상, 1.5배 이상, 2배 이상, 4배 이상, 10배 이상, 25배 이상, 100배 이상 상승시킴으로써 본 발명에 기재된 라이브러리를 제조하는 것이 가능하다.
라이브러리의 제조방법
본원 발명은 또한 상기에 설명한 본원 발명에 포함되는 다양한 태양의 「라이브러리」를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본원 발명의 「라이브러리의 제조방법」은 아래에 예시하는 바와 같은 어느 하나의 특정 방법에 한정되는 것이 아니라, 전술한 본원 발명의 「라이브러리」를 제조할 수 있는 방법이라면 어느 방법도 포함된다.
본원 발명의 「라이브러리의 제조방법」으로서는, 예를 들면 아래에 예시하는 바와 같은 방법을 들 수 있다.
또한 아래에 예시하는 「라이브러리의 제조방법」에 있어서의 각 특정 사항은 상기에서 본원 발명의 「라이브러리」에 대해서 상세하게 설명한 대로의 기술적 의의를 갖는다.
(예 1)
아래의 (a) 및 (b)의 공정을 포함하는,
(i) 서로 서열이 다른 복수의 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자；또는
(ii) 당해 서로 서열이 다른 복수의 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자를 코드하는 핵산
으로 주로 이루어지는 라이브러리로서, 상기 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자는 저분자 화합물의 농도에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자인 것을 특징으로 하는 라이브러리
를 제조하는 방법：
(a) 저분자 화합물의 농도에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인 또는 저분자 화합물에 대해 결합 활성을 갖는 항원 결합 도메인에 있어서, 아래의 (i) 내지 (iii) 중 어느 하나 이상을 만족시키는 아미노산 부위를 특정하는 공정；
(i) 당해 저분자 화합물에 대한 결합에 관여하고 있지 않은 1 또는 복수의 아미노산 부위；
(ii) 부모 항원 결합 도메인이 속하는 동물종의 항체의 레퍼토리로서 아미노산 출현 빈도의 다양성이 있는 1 또는 복수의 아미노산 부위；
(iii) 표준 구조의 형성에 중요하지 않은 1 또는 복수의 아미노산 부위；및
(b) 상기 항원 결합 도메인에 있어서, 미개변체를 코드하는 핵산 및 공정 (a)에서 특정된 1 또는 복수의 아미노산 부위에 개변을 갖는, 서로 서열이 다른 상기 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자의 복수의 개변체 각각을 코드하는 핵산을 포함하는 라이브러리를 설계하는 공정.
(예 2)
아래의 (a) 내지 (d)의 공정을 포함하는,
(i) 서로 서열이 다른 복수의 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자；또는
(ii) 당해 서로 서열이 다른 복수의 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자를 코드하는 핵산
으로 주로 이루어지는 라이브러리로서, 상기 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자는 저분자 화합물의 농도에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자인 것을 특징으로 하는 라이브러리
를 제조하는 방법：
(a) 저분자 화합물의 농도에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인 또는 저분자 화합물에 대해 결합 활성을 갖는 항원 결합 도메인에 있어서, 아래의 (i) 내지 (iii) 중 어느 하나 이상을 만족시키는 아미노산 부위를 특정하는 공정；
(i) 당해 저분자 화합물에 대한 결합에 관여하고 있지 않은 1 또는 복수의 아미노산 부위；
(ii) 부모 항원 결합 도메인이 속하는 동물종의 항체의 레퍼토리로서 아미노산 출현 빈도의 다양성이 있는 1 또는 복수의 아미노산 부위；
(iii) 표준 구조의 형성에 중요하지 않은 1 또는 복수의 아미노산 부위,
(b) 공정 (a)에서 특정된 1 또는 복수의 아미노산 부위에 개변을 갖는, 서로 서열이 다른 상기 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자의 복수의 개변체를 제작하는 공정,
(c) 상기 각각의 개변체의 당해 저분자 화합물에 대한 결합 활성에 실질적으로 변화를 초래하지 않는 1 또는 복수의 아미노산의 개변을 특정하는 공정；및
(d) 미개변체를 코드하는 핵산 및 공정 (c)에서 특정된 1 또는 복수의 아미노산에 개변을 갖는, 서로 서열이 다른 상기 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자의 복수의 개변체를 코드하는 핵산을 포함하는 라이브러리를 제조하는 공정.
(예 3)
아래의 1) 및 2)의 공정을 포함하는,
(i) 서로 서열이 다른 복수의 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자；또는
(ii) 당해 서로 서열이 다른 복수의 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자를 코드하는 핵산
으로 주로 이루어지는 라이브러리로서, 상기 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자는 저분자 화합물의 농도에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자인 것을 특징으로 하는 라이브러리
를 제조하는 방법：
1) 저분자 화합물에 대한 결합 활성을 갖는 항원 결합 분자를 복수 포함하는 라이브러리와 저분자 화합물을 접촉시키는 공정, 및
2) 상기 라이브러리로부터 저분자 화합물에 대해 결합 활성을 갖는 항원 결합 분자의 복수의 개변체를 코드하는 핵산을 농축하는 공정.
(예 4)
아래의 1) 내지 3) 중 어느 하나의 공정을 포함하는,
(i) 서로 서열이 다른 복수의 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자；또는
(ii) 당해 서로 서열이 다른 복수의 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자를 코드하는 핵산
으로 주로 이루어지는 라이브러리로서, 상기 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자는 저분자 화합물의 농도에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자인 것을 특징으로 하는 라이브러리
를 제조하는 방법：
1) 상기 (예 3)에 기재된 라이브러리가 중쇄 가변영역에 위치하는 아미노산이 개변된 1 또는 복수의 개변체를 코드하는 핵산을 포함하는 라이브러리로서, 상기 라이브러리로부터 저분자 화합물에 대해 결합 활성을 갖는 항원 결합 분자의 복수의 개변체를 코드하는 핵산을 농축하여 라이브러리를 설계하는 공정；
2) 상기 (예 3)에 기재된 라이브러리가 경쇄 가변영역에 위치하는 아미노산이 개변된 1 또는 복수의 개변체를 코드하는 핵산을 포함하는 라이브러리로서, 상기 라이브러리로부터 저분자 화합물에 대해 결합 활성을 갖는 항원 결합 분자의 복수의 개변체를 코드하는 핵산을 농축하여 라이브러리를 설계하는 공정；
3) 공정 1) 및 공정 2)의 각각의 가변영역 라이브러리로부터 농축된 항원 결합 분자를 코드하는 핵산을 조합함으로써 라이브러리를 설계하는 공정.
(예 5)
상기 (예 1) 내지 (예 4) 중 어느 하나에 기재된 라이브러리의 제조방법으로서, 항원 결합 분자가 항원 결합 도메인과 바이러스 코트 단백질의 적어도 일부와의 융합 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 라이브러리의 제조방법.
(예 6)
상기 (예 1) 내지 (예 4) 중 어느 하나에 기재된 라이브러리의 제조방법으로서, 상기 항원 결합 분자가 항체의 중쇄 및경쇄를 포함하는 항원 결합 분자이고, 상기 중쇄 및/또는 경쇄의 합성 라이브러리를 설계하는 공정을 추가로 포함하는 라이브러리의 제조방법.
(예 7)
상기 항체의 중쇄 및/또는 경쇄가 생식세포계열 유래의 프레임워크 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 상기 (예 6)에 기재된 라이브러리의 제조방법.
(예 8)
상기 저분자 화합물이 표적 조직 특이적인 화합물 또는 비천연 화합물인, 상기 (예 1) 내지 (예 7) 중 어느 하나에 기재된 라이브러리의 제조방법.
(예 9)
상기 표적 조직이 암조직 또는 염증성 조직인, 상기 (예 1) 내지 (예 8) 중 어느 하나에 기재된 라이브러리의 제조방법.
(예 10)
상기 암조직 특이적 화합물이 푸린 고리 구조를 갖는 뉴클레오시드, 아미노산 및 그의 대사산물, 지질 및 그의 대사산물, 당대사의 1차 대사산물, 및 니코틴 아미드 및 그의 대사산물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물인, 상기 (예 9)에 기재된 라이브러리의 제조방법.
(예 11)
상기 저분자 화합물이 키누레닌, 아데노신, 아데노신 1인산, 아데노신 2인산 또는 아데노신 3인산인, 상기 (예 1) 내지 (예 10) 중 어느 하나에 기재된 라이브러리의 제조방법.
(예 12)
상기 저분자 화합물과의 결합에 관여하고 있지 않은 아미노산 부위가 아래로부터 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산 이외인, 상기 (예 1) 내지 (예 11) 중 어느 하나에 기재된 라이브러리의 제조방법：
H쇄：97, 100c, 101, 94, 95, 100d, 100e, 33, 50, 52, 56, 57, 58, 99, 100, 100a, 54, 55(Kabat 넘버링)；
L쇄：49, 55, 95c, 96, 95a, 95b(Kabat 넘버링).
라이브러리(기타 태양)
본 발명에 있어서의 저분자 화합물의 농도에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인을 취득할 수 있는 라이브러리의 일태양으로서는 아래의 라이브러리를 들 수 있다.
(i) 서로 서열이 다른 복수의 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자；또는
(ii) 당해 서로 서열이 다른 복수의 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자를 코드하는 핵산
으로 주로 이루어지는 라이브러리로서, 상기 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자는 저분자 화합물에 대한 결합 활성을 갖는 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자인 것을 특징으로 하는 라이브러리.
본 태양의 라이브러리로서는 1.2×108 이상의 다양성을 갖는 것이 바람직하다.
본 태양에 있어서의 복수의 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리라는 기재에 있어서의 「로 주로 이루어지는」의 용어는, 라이브러리 중 서열이 다른 독립 클론의 수 중 저분자 화합물(예를 들면 표적 조직 특이적 화합물)에 결합 활성을 갖는 항원 결합 분자의 수가 반영된다. 구체적으로는, 이러한 결합 활성을 나타내는 항원 결합 분자가 라이브러리 중에 적어도 104분자 존재하는 것이 바람직하다. 다른 표현으로는 라이브러리 중 서열이 다른 독립 클론 수 중 저분자의 존재 또는 비존재에 따라 항원에 대한 항원 결합 도메인의 결합 활성이 상이한 항원 결합 분자의 비율로서도 적합하게 표현될 수 있다. 구체적으로는, 본 발명의 항원 결합 도메인은 이러한 결합 활성을 나타내는 항원 결합 분자가 라이브러리 중 서열이 다른 독립 클론 수의 10-6%~80% 또는 10-5%~60%, 바람직하게는 10-4%~40%, 보다 바람직하게는 10-3%~40%, 더욱 바람직하게는 10-2%~40% 포함되는 라이브러리로부터 취득될 수 있다. 융합 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 분자 또는 벡터의 경우도 상기와 동일하게 분자의 수나 분자 전체에 있어서의 비율로 표현될 수 있다. 또한 바이러스의 경우도 상기와 동일하게 바이러스 개체의 수나 개체 전체에 있어서의 비율로 표현될 수 있다.
본 발명에 있어서의 저분자 화합물의 농도에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인을 취득할 수 있는 라이브러리의 일태양으로서는 아래의 라이브러리를 들 수 있다.
(i) 서로 서열이 다른 복수의 항체 분자；또는
(ii) 당해 서로 서열이 다른 복수의 항체 분자를 코드하는 핵산
으로 주로 이루어지는 라이브러리로서, 상기 항체 분자는 저분자 화합물에 대한 결합 활성을 갖는 항체 분자로, 아래의 (i) 내지 (vi) 중 어느 하나 이상을 만족시키는 다양성；
(i) 중쇄 CDR1의 다양성이 13 이상
(ii) 중쇄 CDR2의 다양성이 129 이상
(iii) 중쇄 CDR3의 다양성이 5 이상
(iv) 경쇄 CDR1의 다양성이 193 이상
(v) 경쇄 CDR2의 다양성이 7 이상
(vi) 경쇄 CDR3의 다양성이 17 이상
을 갖는 것을 특징으로 하는 라이브러리.
본 태양에 있어서의 복수의 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리라는 기재에 있어서의 「로 주로 이루어지는」의 용어는, 라이브러리 중의 서열이 다른 독립 클론 수 중 저분자 화합물(예를 들면 표적 조직 특이적 화합물)에 결합 활성을 갖는 항원 결합 분자의 수가 반영된다. 구체적으로는, 이러한 결합 활성을 나타내는 항원 결합 분자가 라이브러리 중에 적어도 104분자 존재하는 것이 바람직하다. 다른 표현으로는 라이브러리 중의 서열이 다른 독립 클론 수 중 저분자의 존재 또는 비존재에 따라 항원에 대한 항원 결합 도메인의 결합 활성이 상이한 항원 결합 분자의 비율로서도 적합하게 표현될 수 있다. 구체적으로는, 본 발명의 항원 결합 도메인은 이러한 결합 활성을 나타내는 항원 결합 분자가 라이브러리 중 서열이 다른 독립 클론 수의 10-6%~80% 또는 10-5%~60%, 바람직하게는 10-4%~40%, 보다 바람직하게는 10-3%~40%, 더욱 바람직하게는 10-2%~40% 포함되는 라이브러리로부터 취득될 수 있다. 융합 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 분자 또는 벡터의 경우도 상기와 동일하게 분자의 수나 분자 전체에 있어서의 비율로 표현될 수 있다. 또한 바이러스의 경우도 상기와 동일하게 바이러스 개체의 수나 개체 전체에 있어서의 비율로 표현될 수 있다.
본 발명에 있어서의 저분자 화합물의 농도에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인을 취득할 수 있는 라이브러리의 일태양으로서는 아래의 라이브러리를 들 수 있다.
(i) 서로 서열이 다른 복수의 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자；또는
(ii) 당해 서로 서열이 다른 복수의 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자를 코드하는 핵산
으로 주로 이루어지는 라이브러리로서, 상기 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자는 저분자 화합물에 대한 결합 활성을 갖는 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자이고, 저분자 화합물의 농도에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자를 취득하기 위한 라이브러리.
본 태양에 있어서의 복수의 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리라는 기재에 있어서의 「로 주로 이루어지는」의 용어는, 라이브러리 중의 서열이 다른 독립 클론 수 중 저분자 화합물(예를 들면 표적 조직 특이적 화합물)에 결합 활성을 갖는 항원 결합 분자의 수가 반영된다. 구체적으로는, 이러한 결합 활성을 나타내는 항원 결합 분자가 라이브러리 중에 적어도 104분자 존재하는 것이 바람직하다. 다른 표현으로는, 라이브러리 중의 서열이 다른 독립 클론 수 중 저분자의 존재 또는 비존재에 따라 항원에 대한 항원 결합 도메인의 결합 활성이 상이한 항원 결합 분자의 비율로서도 적합하게 표현될 수 있다. 구체적으로는, 본 발명의 항원 결합 도메인은 이러한 결합 활성을 나타내는 항원 결합 분자가 라이브러리 중 서열이 다른 독립 클론 수의 10-6%~80% 또는 10-5%~60%, 바람직하게는 10-4%~40%, 보다 바람직하게는 10-3%~40%, 더욱 바람직하게는 10-2%~40% 포함되는 라이브러리로부터 취득될 수 있다. 융합 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 분자 또는 벡터의 경우도, 상기와 동일하게 분자의 수나 분자 전체에 있어서의 비율로 표현될 수 있다. 또한 바이러스의 경우도, 상기와 동일하게 바이러스 개체의 수나 개체 전체에 있어서의 비율로 표현될 수 있다.
저분자의 존재 또는 비존재에 따라 항원에 대한 항원 결합 도메인의 결합 활성을 변화시키는 아미노산
본 발명에 있어서 라이브러리를 제조할 때 사용되는 주형 템플레이트(저분자 화합물의 농도에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인 또는 저분자 화합물에 대해 결합 활성을 갖는 항원 결합 도메인)의 취득방법(스크리닝방법)에 관하여, 이들 항원 결합 도메인 등은 어떻게 조제되어도 되고, 사전에 존재하고 있는 항원 결합 도메인 또는 항체, 사전에 존재하고 있는 라이브러리(파지 라이브러리 등), 동물로의 면역으로부터 얻어진 하이브리도마나 면역동물로부터의 B세포로부터 제작된 항체 또는 라이브러리, 예를 들면 이것에 한정되는 것은 아니지만, 저분자 화합물의 일태양으로서의 아데노신 또는 ATP와 적절히 연결된 면역원성이 높은 T세포 에피토프 펩티드와 같은 애쥬번트 작용제와의 연결제(conjugate)에 의해 면역된 동물의 B세포 등의 면역세포로부터 제작된 항체 또는 라이브러리 등을 사용하는 것이 가능하다. 당해 T세포 에피토프 펩티드의 비한정의 일례로서 파상풍 독소(Tetanus toxin) 유래의 p30 헬퍼 펩티드(서열번호：4로 표시되고, Fragment C(FrC)로도 지칭됨) 등을 적합하게 들 수 있다.
상기 스크리닝방법에 의해 취득되는 본 발명의 항원 결합 도메인 또는 항체의 조제법의 비한정의 일태양으로서 생체 내에 존재하는 세포막 단백인 아비머(Avimer)에 포함되는 35 아미노산 정도의 A 도메인으로 불리는 모듈, 세포막에 발현하는 당단백질인 피브로넥틴 중의 단백질에 결합하는 도메인인 10Fn3 도메인을 포함하는 아드넥틴, Protein A의 58 아미노산으로 이루어지는 3개의 헬릭스 다발(bundle)을 구성하는 IgG 결합 도메인을 스캐폴드로 하는 어피바디, 33 아미노산 잔기를 포함하는 턴과 2개의 역병행 헬릭스 및 루프의 서브유닛이 반복해서 겹쳐진 구조를 갖는 안키린 반복(ankyrin repeat：AR)의 분자 표면에 노출되는 영역인 DARPins(Designed Ankyrin Repeat proteins), 호중구 겔라티나아제 결합 리포칼린(neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL)) 등의 리포칼린 분자에 있어서 고도로 보존된 8개의 역병행 스트랜드가 중앙방향으로 꼬인 배럴 구조의 편측을 지지하는 4개의 루프영역인 안티칼린 등, 칠성장어, 먹장어 등 무악류의 획득 면역 시스템으로서 면역글로불린의 구조를 갖지 않는 가변성 림프구 수용체(variable lymphocyte receptor(VLR))의 류신 잔기가 풍부한 리피트(leucine-rich-repeat(LRR)) 모듈이 반복해서 겹쳐진 말굽형 구조 내부의 병행형 시트 구조의 우묵하게 들어간 영역 등으로 이루어지는 라이브러리를 사용하는 것이 가능하다.
본 발명의 항원 결합 도메인의 적합한 예로서, 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변영역을 포함하는 항원 결합 도메인을 들 수 있다. 이러한 항원 결합 도메인의 예로서는, 「scFv(single chain Fv)」, 「경쇄 항체(single chain antibody)」, 「Fv」, 「scFv2(single chain Fv 2)」, 「Fab」 또는 「F(ab')2」 또는 IgG 등을 적합하게 들 수 있고, 이들로 이루어지는 라이브러리를 사용하는 것도 가능하다.
또한 상기 스크리닝방법에 의해 취득되는 본 발명의 항원 결합 도메인 또는 항체의 조제법의 비한정의 일태양으로서 상기 라이브러리를 사용하고, 패닝에 의해 저분자 화합물에 대해 결합 활성을 갖는 항원 결합 도메인 또는 항체를 조제하는 수법을 사용하는 것이 가능하다. 라이브러리로서는 이것에 한정되지 않으나, 파지 디스플레이 라이브러리, 리보솜 디스플레이 라이브러리, mRNA 디스플레이 라이브러리, cDNA 디스플레이 라이브러리, CIS 디스플레이 라이브러리, E. coli 디스플레이 라이브러리, 그람 양성균 디스플레이 라이브러리, 효모 디스플레이 라이브러리, 포유류세포 디스플레이 라이브러리, 바이러스 디스플레이 라이브러리, 인비트로 바이러스 디스플레이 라이브러리 등을 사용하는 것이 가능하다.
상기 패닝에 의해 저분자 화합물에 대해 결합 활성을 갖는 항원 결합 도메인 또는 항체를 조제하는 수법의 일태양으로서 비드 등의 담체에 고상화된 저분자 화합물을 사용하는 것이 가능하다. 고상화된 저분자 화합물은 화학적으로 링커를 매개로 비오틴과 접속된 상태로 합성된 저분자 화합물을 스트렙트아비딘이나 뉴트르아비딘이 고상화된 비드 또는 플레이트와 접촉시키는 수법이나, 소 혈청 알부민(BSA) 등의 애쥬번트와 공유 결합에 의해 접속된 저분자 화합물을, 소수 상호작용에 의해 비드 또는 플레이트에 접착시키는 수법 등에 의해 제작하는 것이 가능하나 이것에 한정되지 않는다. 이들 방법은 이미 공지이다(J Immunol Methods. 2003 Sep;280(1-2):139-55, BMC Biotechnol. 2009 Jan 29;9:6. doi: 10.1186/1472-6750-9-6). 이들의 고상화된 저분자 화합물에 대해 결합 활성을 갖는 항원 결합 도메인 또는 항체를 회수함으로써 저분자 화합물에 대해 결합 활성을 갖는 항원 결합 도메인 또는 항체를 조제하는 것이 가능해진다.
또는 상기 패닝에 의해 저분자 화합물에 대해 결합 활성을 갖는 항원 결합 도메인 또는 항체를 조제하는 수법의 다른 일태양으로서 형광 표지된 저분자 화합물이나 비오틴 표지된 저분자 화합물과 형광 표지된 스트렙트아비딘(또는 뉴트르아비딘 또는 아비딘)을 사용하는 것이 가능하다. 세포 등의 표면에 제시된 라이브러리에 대해 당해 형광 표지된 저분자 화합물, 또는 비오틴 표지된 저분자 화합물과 형광 표지된 스트렙트아비딘(또는 뉴트르아비딘 또는 아비딘)을 접촉시킨 후에, FACS(fluorescence activated cell sorting)법을 사용함으로써 당해 저분자 화합물에 대해 결합 활성을 갖는 항원 결합 도메인 또는 항체를 조제하는 것이 가능해진다. 이들 방법은 이미 공지이다(Proc Natl Acad Sci USA. 2000 Sep 26;97(20):10701-5.).
또한 상기 스크리닝방법에 의해 취득되는 본 발명의 항원 결합 도메인 또는 항체의 조제법의 비한정의 일태양으로서 사전에 존재하고 있는 저분자 화합물에 결합 활성을 갖는 항원 결합 도메인을 사용하는 것이 가능하다. 예를 들면 이것에 한정되는 것은 아니지만, 아데노신 및/ATP를 예로 한 경우, ATP에 결합 활성을 갖는 키나아제 패밀리에 속하는 분자를 항원 결합 도메인으로서 사용할 수 있고, 또한 아데노신에 결합 활성을 갖는 아데노신 데아미나제 패밀리에 속하는 분자를 항원 결합 도메인으로서 사용할 수 있다. 이들 ATP 내지는 아데노신의 결합에 관여하지 않는 부분을 라이브러리화함으로써, ATP 내지는 아데노신 농도 의존적으로 항원에 결합하는 항원 결합 분자를 취득하는 것이 가능하다.
비항체 유사 단백질을 사용한 항원 결합 도메인의 취득법으로서, 이것에 한정되는 것은 아니지만 이 비항체 유사 단백질의 루프 형성 부위나, α헬릭스의 표면 잔기 등을 사용한 라이브러리를 사용하는 것이 가능하다. 이러한 라이브러리의 구축법은 이미 공지이다(Nat Biotechnol. 2004 May;22(5):575-82, J Mol Biol. 1998 Dec 11;284(4):1141-51., Nat Biotechnol. 1997 Aug;15(8):772-7). 또한 상기와 같이 구축된 라이브러리를 사용하여 패닝에 의해 저분자 화합물에 대해 결합 활성을 갖는 항원 결합 도메인을 취득하는 기술도 공지이다. 일례로서 구축된 라이브러리가 파지 디스플레이법에 의해 파지의 표면에 발현된다. 소 혈청 알부민이나 비오틴 등과 접속된 저분자 화합물에 결합하는 결합 도메인을 발현하는 파지가 비드나 이뮤노튜브, 플레이트 등을 사용하여 선택될 수 있다. 이러한 저분자 화합물에 결합 활성을 갖는 비항체 유사 항원 결합 도메인의 취득법은 이미 공지이다(Proc Natl Acad Sci USA. 1999 Mar 2;96(5):1898-903). 또한 이들 저분자 화합물에 대해 결합 활성을 갖는 항원 결합 도메인에 대해, 이것에 한정되지 않으나 결정구조를 해석하는 것이나 변이체를 제작하여 결합 활성을 평가함으로써, 저분자 화합물로의 결합에 관여하고 있지 않은 아미노산 부위나 표준 구조의 형성에 중요하지 않은 아미노산 부위를 특정하는 것이 가능하다(J Mol Biol. 2003 Jul 4;330(2):385-96, Proteins. 2003 Oct 1;53(1):121-9). 이와 같이 하여 특정된 아미노산 부위에 대해 다양성을 도입함으로써 본 발명에 기재된 라이브러리를 구축하는 것이 가능하다. 또한 본 발명에 있어서의 다른 일태양으로서 아미노산 부위를 한정한 라이브러리를 사용하는 것도 가능하다. 일례로서 이것에 한정되는 것은 아니지만, 비항체 유사 항원 결합 도메인으로서 보고되어 있는 호중구 겔라티나아제 결합 리포칼린(neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL)) 등의 리포칼린 분자에 있어서 고도로 보존된 8개의 역병행 스트랜드가 중앙방향으로 꼬인 배럴 구조의 편측을 지지하는 4개의 루프영역인 안티칼린에 있어서는, 저분자 화합물에 대한 결합에 사용되는 아미노산 부위와 단백질에 대한 결합에 사용되는 아미노산 부위가 상이한 것이 알려져 있어, 각각에 대한 결합에 관여할 수 있는 아미노산 부위를 개변한 서로 다른 라이브러리가 사용 가능한 것이 공지이다(FEBS Lett. 2014 Jan 21;588(2):213-8). 이 때문에 저분자 화합물에 대한 결합 도메인을 취득 가능한 라이브러리로부터 그 저분자 화합물에 대해 결합 활성을 갖는 항원 결합 도메인을 취득한 후, 취득한 그 저분자 화합물에 대해 결합 활성을 갖는 항원 결합 도메인에 대해, 단백질에 대해 결합 활성을 갖는 항원 결합 도메인을 취득하기 위해 사용되고 있는 아미노산 부위에 다양성을 도입함으로써 본 발명의 라이브러리를 구축하는 것이 가능하다. 보다 구체적으로는, 인간 리포칼린2(Human lipocalin2, Lcn2)에 있어서는 V33, L36, I41, Y52, T54, S68, L70, W79, R81, K134, T136, Y138 각 아미노산 부위가 저분자 화합물 결합 도메인 취득용 라이브러리의 다양성 도입 부위로서 사용하는 것이 가능하며(J Am Chem Soc. 2009 Mar 18;131(10):3565-76), 또한 동일하게 A40, L42, E44, K46, D47, Q49, K50, L70, R72, K73, D77, W79, P101, G102, L103, K125, S127, Q128, R130, Y132 각 아미노산 부위가 단백질 결합 도메인 취득용 라이브러리의 다양성 도입 부위로서 사용하는 것이 가능한 것이 공지이다(Proc Natl Acad Sci USA. 2009 May 19;106(20):8198-203). 이 때문에 먼저 V33, L36, I41, Y52, T54, S68, L70, W79, R81, K134, T136, Y138 각 아미노산 부위에 다양성을 부여한 항원 결합 도메인을 포함하는 라이브러리를 사용하여 그 저분자 화합물에 대해 결합 활성을 갖는 항원 결합 도메인을 취득한 후, 취득한 그 저분자 화합물에 대해 결합 활성을 갖는 항원 결합 도메인에 대해 A40, L42, E44, K46, D47, Q49, K50, R72, K73, D77, P101, G102, L103, K125, S127, Q128, R130, Y132 각 아미노산 부위에 다양성을 도입함으로써 본 발명에 기재된 라이브러리를 구축하는 것이 가능하나 이것에 한정되는 것은 아니다. 리포칼린 분자 이외의 비항체 유사 항원 결합 도메인 및 항체에 관해서도 전술한 라이브러리의 구축방법을 적절히 참조함으로써 당업자가 본 발명에 있어서의 라이브러리를 제조하는 것이 가능하다. 또한 다른 일태양으로서는, 저분자 화합물에 대해 결합 활성을 갖는 항원 결합 도메인을 이용하는 것이 가능하다. 일례로서 ATP, ADP, AMP 및 아데노신에 대해 결합 활성을 갖는 것이 공지인, 리포칼린 패밀리에 속하는 RPAI-1(Rhodnius prolixus aggregation inhibitor1)을 이용하는 것이 가능하다(J Biol Chem. 2000 Apr 28;275(17):12639-50, Biochemistry. 2002 Mar 19;41(11):3810-8). 이것에 한정되지 않으나 상기 항원 결합 도메인의 결정구조를 해석하는 것이나, 변이체를 제작하여 결합 활성을 평가함으로써 저분자 화합물로의 결합에 관여하고 있지 않은 아미노산 부위나 표준 구조의 형성에 중요하지 않은 아미노산 부위를 특정하는 것이 가능하다. 이와 같이 하여 특정된 아미노산 부위에 다양성을 도입함으로써 본 발명에 기재된 라이브러리를 구축하는 것이 가능하다. ATP, ADP, AMP 및 아데노신 외에도 히스타민이나 세로토닌, 아드레날린, 노르아드레날린 등 다양한 저분자 화합물에 대해 결합 활성을 갖는 리포칼린 패밀리에 속하는 항원 결합 도메인의 존재가 공지로(J Biol Chem. 2003 Feb 14;278(7):4611-7, Expert Rev Clin Immunol. 2007 Jul;3(4):491-501), 이들을 이용함으로써 각종 저분자 화합물에 대해 결합 활성을 갖는 항원 결합 도메인을 사용한 본 발명에 기재된 라이브러리를 구축하는 것이 가능하나 이것에 한정되는 것은 아니다.
그 밖의 비항체 유사 항원 결합 도메인 및 항체에 관하여도 전술한 라이브러리의 구축방법을 적절히 참조함으로써 당업자가 본 발명에 있어서의 라이브러리를 제조하는 것이 가능하다.
본 발명의 비한정의 일태양으로서, 아데노신 및/또는 ATP를 예로 하여 아래에 상세하게 설명하나, 아데노신 및/또는 ATP 이외의 저분자에 관해서도 하기 예에 준하여 적절히 적용된다. 상기와 같이 아데노신 및/또는 ATP의 존재 또는 비존재에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 아미노산으로서는, 아데노신 및/또는 ATP 결합 모티브를 형성하는 아미노산이 예시될 수 있다. 상기 아미노산이 포함되는 항원 결합 도메인 중의 아미노산의 위치는 특정 위치에 한정되지 않고, 아데노신 및/또는 ATP의 존재 또는 비존재에 따라 항원에 대한 항원 결합 도메인의 결합 활성을 변화시키는 한, 항원 결합 도메인을 형성하는 중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역 중 어느 위치일 수도 있다. 즉, 본 발명의 항원 결합 도메인은 아데노신 및/또는 ATP의 존재 또는 비존재에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 아미노산이 중쇄의 항원 결합 도메인에 포함되어 있는 서로 서열이 다른 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리로부터 취득될 수 있다. 비한정의 일태양에서는 본 발명의 항원 결합 도메인은 아데노신 및/또는 ATP의 존재 또는 비존재에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 아미노산이 중쇄의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3에 포함되어 있는 서로 서열이 다른 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리로부터 취득될 수 있다. 비한정의 다른 일태양에서는, 본 발명의 항원 결합 도메인은 아데노신 및/또는 ATP의 존재 또는 비존재에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 아미노산이 중쇄의 FR1, FR2, FR3 및/또는 FR4에 포함되어 있는 서로 서열이 다른 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리로부터 취득될 수 있다.
또한 본 발명의 일태양에서는, 본 발명의 항원 결합 도메인은 아데노신 및/또는 ATP의 존재 또는 비존재에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 아미노산이 중쇄 및/또는 경쇄의 항원 결합 도메인에 포함되어 있는 서로 서열이 다른 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리로부터 취득될 수 있다. 비한정의 일태양에서는 본 발명의 항원 결합 도메인은 아데노신 및/또는 ATP의 존재 또는 비존재에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 아미노산이 중쇄 및/또는 경쇄의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3에 포함되어 있는 서로 서열이 다른 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리로부터 취득될 수 있다. 비한정의 다른 일태양에서는, 본 발명의 항원 결합 도메인은 아데노신 및/또는 ATP의 존재 또는 비존재에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 아미노산이 중쇄 및/또는 경쇄의 FR1, FR2, FR3 및/또는 FR4에 포함되어 있는 서로 서열이 다른 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리로부터 취득될 수 있다.
이러한 아미노산의 비한정의 일태양으로서, 중쇄 가변영역에 포함되는 52번 위치, 52a 위치, 53번 위치, 96번 위치, 100a 위치 또는 100c 위치의 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산 등이 예시될 수 있다. 또한 이러한 아미노산의 비한정의 일태양으로서, 중쇄 가변영역에 포함되는 52번 위치의 Ser, 52a 위치의 Ser, 53번 위치의 Arg, 96번 위치의 Gly, 100a 위치의 Leu, 100c 위치의 Trp 등의 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 예시될 수 있다.
항원 결합 분자의 경쇄 및/또는 중쇄 가변영역의 프레임워크 서열은 아데노신 및/또는 ATP의 존재 또는 비존재에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 아미노산이 중쇄 및/또는 경쇄의 항원 결합 도메인에 포함되어 있는 한, 어떠한 프레임워크 서열도 사용될 수 있다. 프레임워크 서열의 기원은 한정되지 않으나 비인간 동물의 임의의 생물 또는 인간으로부터 취득될 수 있다. 바람직하게는 임의의 생물로서는 마우스, 랫트, 기니피그, 햄스터, 게르빌루스쥐, 고양이, 토끼, 개, 염소, 양, 소, 말, 낙타 및 비인간 영장류로부터 선택되는 생물을 적합하게 들 수 있다. 특히 적합한 실시형태에서는, 항원 결합 분자의 경쇄 및/또는 중쇄 가변영역의 프레임워크 서열은 인간의 생식세포계 프레임워크 서열을 가지고 있는 것이 바람직하다. 따라서 본 발명의 일태양에 있어서 프레임워크 서열이 완전히 인간의 서열이라면, 인간에게 투여(예를 들면 질병의 치료)된 경우, 본 발명의 항원 결합 분자는 면역원성반응을 거의 또는 전혀 일으키지 않을 것으로 생각된다. 상기의 의미로부터 본 발명의 「생식세포계열의 서열을 포함한다」는 것은, 본 발명의 프레임워크 서열의 일부가 어느 하나의 인간의 생식세포계 프레임워크 서열의 일부와 동일한 것을 의미한다. 구체적으로는, 본 발명의 프레임워크 서열은 생식세포계열의 서열과 적어도 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 100% 이상의 상동성을 갖는 것이 바람직하다. 예를 들면 본 발명의 항원 결합 분자의 중쇄 FR2의 서열이 복수의 상이한 인간의 생식세포계 프레임워크 서열의 중쇄 FR2 서열이 조합된 서열인 경우도, 본 발명의 「생식세포계열의 서열을 포함하는」 항원 결합 분자이다. 또한 본 발명의 항원 결합 분자의 프레임워크 서열이 치환되어 있는 서열인 경우도, 본 발명의 「생식세포계열의 서열을 포함하는」 항원 결합 분자이다. 이러한 치환되어 있는 서열의 예로서, 특히 인간의 생식세포계 프레임워크 서열의 일부 아미노산이 아데노신 및/또는 ATP의 존재 또는 비존재에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 아미노산으로 치환되어 있는 서열을 들 수 있다.
프레임워크의 예로서는, 예를 들면 V-Base(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) 등의 웹사이트에 포함되어 있는 현재 알려져 있는 완전히 인간형의 프레임워크 영역의 서열을 적합하게 들 수 있다. 이들 프레임워크 영역의 서열이 본 발명의 항원 결합 분자에 포함되는 생식세포계열의 서열로서 적절히 사용될 수 있다. 생식세포계열의 서열은 그 유사성을 토대로 분류될 수 있다(Tomlinson 등(J. Mol. Biol. (1992) 227, 776-798) Williams 및 Winter(Eur. J. Immunol. (1993) 23, 1456-1461) 및 Cox 등(Nat. Genetics (1994) 7, 162-168)). 7개의 서브그룹으로 분류되는 Vκ, 10개의 서브그룹으로 분류되는 Vλ, 7개의 서브그룹으로 분류되는 VH로부터 적합한 생식세포계열의 서열이 적절히 선택될 수 있다.
완전히 인간형의 VH 서열은 하기로만 한정되는 것은 아니나, 예를 들면 VH1서브그룹(예를 들면 VH1-2, VH1-3, VH1-8, VH1-18, VH1-24, VH1-45, VH1-46, VH1-58, VH1-69), VH2 서브그룹(예를 들면 VH2-5, VH2-26, VH2-70), VH3 서브그룹(VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-72, VH3-73, VH3-74), VH4 서브그룹(VH4-4, VH4-28, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH4-61), VH5 서브그룹(VH5-51), VH6 서브그룹(VH6-1), VH7 서브그룹(VH7-4, VH7-81)의 VH서열 등을 적합하게 들 수 있다. 이들은 공지 문헌(Matsuda 등(J. Exp. Med. (1998) 188, 1973-1975)) 등에도 기재되어 있어, 당업자는 이들 서열정보를 토대로 본 발명의 항원 결합 분자를 적절히 설계하는 것이 가능하다. 이들 이외의 완전히 인간형의 프레임워크 또는 프레임워크의 준영역도 적합하게 사용될 수 있다.
완전히 인간형의 Vκ서열은 하기로만 한정되는 것은 아니나, 예를 들면 Vk1 서브그룹으로 분류되는 A20, A30, L1, L4, L5, L8, L9, L11, L12, L14, L15, L18, L19, L22, L23, L24, O2, O4, O8, O12, O14, O18, Vk2 서브그룹으로 분류되는 A1, A2, A3, A5, A7, A17, A18, A19, A23, O1, O11, Vk3 서브그룹으로 분류되는 A11, A27, L2, L6, L10, L16, L20, L25, Vk4 서브그룹으로 분류되는 B3, Vk5 서브그룹으로 분류되는 B2(본 명세서에 있어서는 Vk5-2로도 지칭됨)), Vk6 서브그룹으로 분류되는 A10, A14, A26 등(Kawasaki 등(Eur. J. Immunol. (2001) 31, 1017-1028), Schable 및 Zachau(Biol. Chem. Hoppe Seyler (1993) 374, 1001-1022) 및 Brensing-Kuppers 등(Gene (1997) 191, 173-181))을 적합하게 들 수 있다.
완전히 인간형의 Vλ서열은 하기로만 한정되는 것은 아니나, 예를 들면 VL1 서브그룹으로 분류되는 V1-2, V1-3, V1-4, V1-5, V1-7, V1-9, V1-11, V1-13, V1-16, V1-17, V1-18, V1-19, V1-20, V1-22, VL1 서브그룹으로 분류되는 V2-1, V2-6, V2-7, V2-8, V2-11, V2-13, V2-14, V2-15, V2-17, V2-19, VL3 서브그룹으로 분류되는 V3-2, V3-3, V3-4, VL4 서브그룹으로 분류되는 V4-1, V4-2, V4-3, V4-4, V4-6, VL5 서브그룹으로 분류되는 V5-1, V5-2, V5-4, V5-6 등(Kawasaki 등(Genome Res. (1997) 7, 250-261))을 적합하게 들 수 있다.
통상 이들의 프레임워크 서열은 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 상위로 인해 서로 다르다. 이들 프레임워크 서열은 본 발명의 「아데노신 및/또는 ATP의 존재 또는 비존재에 따라 항원에 대한 항원 결합 도메인의 결합 활성을 변화시키는 하나 이상의 아미노산 잔기」와 함께 사용될 수 있다. 본 발명의 「아데노신 및/또는 ATP의 존재 또는 비존재에 따라 항원에 대한 항원 결합 도메인의 결합 활성을 변화시키는 하나 이상의 아미노산 잔기」와 함께 사용되는 완전히 인간형의 프레임워크의 예로서는 이들에만 한정되는 것은 아니나, 그 밖에도 KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY, POM 등을 들 수 있다(예를 들면 상기 Kabat 등(1991) 및 Wu 등(J. Exp. Med. (1970) 132, 211-250)).
본 발명은 특정 이론에 구속되는 것은 아니나, 생식세포계 서열의 사용이 대부분의 개인에 있어서 유해한 면역반응을 배제할 것으로 기대되고 있는 하나의 이유는, 아래와 같다고 생각하고 있다. 통상의 면역반응 중에 발생하는 친화성 성숙 스텝의 결과, 면역글로불린의 가변영역에 체세포의 돌연변이가 빈번하게 생긴다. 이들 돌연변이는 주로 그 서열이 초가변적인 CDR의 주변에 생기는데 프레임워크 영역의 잔기에도 영향을 미친다. 이들 프레임워크의 돌연변이는 생식세포계 유전자에는 존재하지 않고, 또한 환자의 면역원성이 될 가능성은 적다. 한편 통상의 인간 집단은 생식세포계 유전자에 의해 발현되는 프레임워크 서열의 대다수에 노출되어 있어, 면역관용의 결과, 이들 생식세포계 프레임워크는 환자에게 있어서 면역원성이 낮거나 또는 비면역원성인 것으로 예상된다. 면역관용의 가능성을 최대로 하기 위해 가변영역을 코드화하는 유전자가 보통으로 존재하는 기능적인 생식세포계 유전자의 집합으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 아데노신 및/또는 ATP의 존재 또는 비존재에 따라 항원에 대한 항원 결합 도메인의 결합 활성을 변화시키는 아미노산이 상기 가변영역의 서열, 중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역의 서열, 또는 CDR서열 또는 프레임워크 서열에 포함되는 항원 결합 분자를 제작하기 위해 부위 특이적 변이유발법(Kunkel 등(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1985) 82, 488-492))이나 중복 연장 PCR 등의 공지의 방법이 적절히 채용될 수 있다.
예를 들면 아데노신 및/또는 ATP의 존재 또는 비존재에 따라 항원에 대한 항원 결합 도메인의 결합 활성을 변화시키는 하나 이상의 아미노산 잔기가 사전에 포함되어 있는 CDR서열 및/또는 프레임워크 서열로서 선택된 경쇄 가변영역과, 랜덤화 가변영역 서열 라이브러리로서 제작된 중쇄 가변영역을 조합시킴으로써 본 발명의 복수의 서로 서열이 다른 항원 결합 분자를 포함하는 라이브러리가 제작될 수 있다.
또한 상기 아데노신 또는 ATP의 존재 또는 비존재에 따라 항원에 대한 항원 결합 도메인의 결합 활성을 변화시키는 하나 이상의 아미노산 잔기가 사전에 포함되어 있는 CDR서열 및/또는 프레임워크 서열로서 선택된 중쇄 및/또는 경쇄 가변영역의 서열에, 당해 아미노산 잔기 이외의 잔기로서 다양한 아미노산이 포함되도록 설계하는 것도 가능하다. 본 발명에 있어서 이러한 잔기는 플렉시블 잔기로 지칭된다. 본 발명의 항원 결합 분자의 항원에 대한 결합 활성이 조직 특이적 화합물의 농도 조건에 따라 변화되는 한, 당해 플렉시블 잔기의 수 및 위치는 특정 태양으로 한정되는 경우는 없다. 즉, 중쇄 및/또는 경쇄의 CDR서열 및/또는 FR서열에 하나 또는 그 이상의 플렉시블 잔기가 포함될 수 있다. 플렉시블 잔기 및 그 잔기를 다른 어떤 아미노산으로 치환하여 라이브러리화할 수 있는지는 아데노신 및/또는 ATP와 항체의 복합체의 결정구조 해석이나 변이 도입에 의해 동정할 수 있다. 예를 들면 아데노신 및/또는 ATP와 항체의 복합체의 결정구조 해석으로부터 아데노신 및/또는 ATP의 결합에 관여하고 있지 않은 항체의 잔기를 동정할 수 있다. 아데노신 및/또는 ATP의 결합에 관여하고 있지 않은 것으로 동정된 잔기를 다른 아미노산으로 치환해도 화합물로의 결합을 적절한 정도로 유지할 수 있는 아미노산을 선택할 수 있다. 이에 의해 선택된 잔기에 있어서 선택된 아미노산이 출현하는 라이브러리를 설계할 수 있다. 이 경우에 있어서, 아데노신 및/또는 ATP의 결합에 관여하고 있지 않은 것으로 동정된 잔기가 서로 다른 아미노산으로 치환된 항원 결합 분자의 집합이 되도록, 복수의 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리를 설계하는 것이 가능하다. 즉, 서로 다른 아미노산으로 치환된 개개의 플렉시블 잔기를 조합함으로써 당해 플렉시블 잔기가 포함되는 항원 결합 분자의 서열의 다양성이 초래된다.
또한 아데노신 및/또는 ATP의 결합에 관여하는 것으로 동정된 잔기의 적어도 하나는 당해 잔기 및 당해 잔기와 상이한 잔기로부터 선택되는 임의의 잔기가 되도록, 이들 잔기를 포함하는 항원 결합 분자가 디자인될 수 있다. 아데노신 및/또는 ATP의 결합에 관여하는 것으로 동정되는 아미노산의 비한정의 일태양으로서, 중쇄 가변영역에 포함되는 52번 위치, 52a 위치, 53번 위치, 96번 위치, 100a 위치 또는 100c 위치의 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산 등이 예시될 수 있다. 또한 이러한 아미노산의 비한정의 일태양으로서, 중쇄 가변영역에 포함되는 52번 위치의 Ser, 52a 위치의 Ser, 53번 위치의 Arg, 96번 위치의 Gly, 100a 위치의 Leu, 100c 위치의 Trp 등의 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 예시될 수 있다. 예를 들면 상기 100a 위치의 Leu가 아데노신 및/또는 ATP의 결합에 관여하는 것으로 동정되는 경우, 라이브러리에 포함되는 항원 결합 분자의 100a 위치의 아미노산 잔기는 Leu에 더하여 His, Met, Leu, Arg, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나의 플렉시블 잔기로부터 선택되는 아미노산 잔기일 수 있다.
상기 플렉시블 잔기의 비한정의 일태양으로서, 중쇄 가변영역에 포함되는 31번 위치, 32번 위치, 33번 위치, 35번 위치, 50번 위치, 55번 위치, 56번 위치, 57번 위치, 58번 위치, 59번 위치, 95번 위치, 96번 위치, 97번 위치, 98번 위치, 99번 위치, 100번 위치, 100a 위치 및 100b 위치의 아미노산이 예시될 수 있다. 이러한 아미노산의 다른 비한정의 일태양으로서, 경쇄 가변영역에 포함되는 26번 위치, 27번 위치, 27a 위치, 27b 위치, 27c 위치, 28번 위치, 29번 위치, 31번 위치, 32번 위치, 50번 위치, 51번 위치, 52번 위치, 53번 위치, 54번 위치, 55번 위치, 89번 위치, 90번 위치, 91번 위치, 92번 위치, 93번 위치, 94번 위치, 95a 위치, 96번 위치 및 97번 위치의 아미노산이 예시될 수 있다.
상기 플렉시블 잔기의 비한정의 일태양으로서, 중쇄 가변영역에 포함되는 아미노산으로서；
31번 위치의 아미노산이 Asp, Gly, Asn, Ser, Arg 또는 Thr 중 어느 하나,
32번 위치의 아미노산이 Ala, Phe, His, Asn, Ser 또는 Tyr 중 어느 하나,
33번 위치의 아미노산이 Ala, Glu, Asp, Gly, Phe, Ile, His, Lys, Met, Leu, Asn, Gln, Pro, Ser, Arg, Trp, Val, Tyr 또는 Thr 중 어느 하나,
35번 위치의 아미노산이 His, Ser, Thr, Tyr 또는 Asn 중 어느 하나,
50번 위치의 아미노산이 Ala, Glu, Asp, Gly, Phe, Ile, His, Lys, Met, Leu, Asn, Gln, Pro, Arg, Thr, Trp, Val, Tyr 또는 Ser 중 어느 하나,
55번 위치의 아미노산이 Ala, Glu, Asp, Gly, Leu, Thr, Ser, Arg 또는 Asn 중 어느 하나,
56번 위치의 아미노산이 Ala, Glu, Asp, Gly, Phe, Ile, His, Lys, Met, Leu, Gln, Pro, Ser, Thr, Trp, Val 또는 Tyr 중 어느 하나,
57번 위치의 아미노산이 Ala, Lys, Arg, Thr 또는 Ile 중 어느 하나,
58번 위치의 아미노산이 Asp, Gly, Phe, His, Ser, Thr, Tyr 또는 Asn 중 어느 하나,
59번 위치의 아미노산이 Leu 또는 Tyr 중 어느 하나,
95번 위치의 아미노산이 Ala, Ile, Lys, Met, Leu, Arg, Trp, Val, Tyr 또는 Phe 중 어느 하나,
96번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Asn 또는 Ser 중 어느 하나,
97번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Gly, Ile, His, Lys, Met, Leu, Asn, Ser, Val, Tyr 또는 Arg 중 어느 하나,
98번 위치의 아미노산이 Ala, Glu, Asp, Gly, Phe, Ile, His, Met, Leu, Asn, Gln, Pro, Ser, Arg, Thr, Trp, Val, Tyr 또는 Lys 중 어느 하나,
99번 위치의 아미노산이 Ala, Glu, Asp, Phe, His, Lys, Asn, Gln, Ser, Arg, Trp, Val, Tyr 또는 Gly 중 어느 하나,
100번 위치의 아미노산이 Ala, Glu, Gly, Phe, Ile, His, Lys, Met, Leu, Asn, Gln, Pro, Ser, Arg, Thr, Trp, Val, Tyr 또는 Asp 중 어느 하나,
100a 위치의 아미노산이 Ala, Phe, Ile, His, Lys, Met, Arg, Trp, Val 또는 Tyr 중 어느 하나, 또는
100b 위치의 아미노산이 Ala, Glu, Asp, Gly, Phe, Ile, His, Lys, Met, Leu, Gln, Pro, Ser, Arg, Thr, Trp, Val, Tyr 또는 Asn 중 어느 하나
의 아미노산이 예시될 수 있다.
상기 플렉시블 잔기의 비한정의 일태양으로서, 경쇄 가변영역에 포함되는 아미노산으로서；
26번 위치의 아미노산이 Ala, Ser 또는 Thr 중 어느 하나,
27번 위치의 아미노산이 Thr 또는 Ser 중 어느 하나,
27a 위치의 아미노산이 Gly, Asn, Thr 또는 Ser 중 어느 하나,
27b 위치의 아미노산이 Asn 또는 Asp 중 어느 하나,
27c 위치의 아미노산이 Ile 또는 Val 중 어느 하나,
28번 위치의 아미노산이 Asp 또는 Gly 중 어느 하나,
29번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Phe, Ser, Arg, Thr, Tyr 또는 Gly 중 어느 하나,
31번 위치의 아미노산이 Glu, Asp, Lys 또는 Asn 중 어느 하나,
32번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Ser, Thr 또는 Tyr 중 어느 하나,
50번 위치의 아미노산이 Asp, Gly, Lys, Asn, Gln, Ser, Arg, Tyr 또는 Glu 중 어느 하나,
51번 위치의 아미노산이 Asp, Gly, Lys, Asn, Thr 또는 Val 중 어느 하나,
52번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Asn, Thr 또는 Ser 중 어느 하나,
53번 위치의 아미노산이 Glu, Asp, His, Asn, Gln, Ser, Tyr 또는 Lys 중 어느 하나,
54번 위치의 아미노산이 Lys 또는 Arg 중 어느 하나,
55번 위치의 아미노산이 Leu 또는 Pro 중 어느 하나,
89번 위치의 아미노산이 Ala, Gly, Phe, Leu, Asn, Gln, Thr, Val, Tyr 또는 Ser 중 어느 하나,
90번 위치의 아미노산이 Ala, Leu, Thr, Val 또는 Ser 중 어느 하나,
91번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Phe, His, Lys, Asn, Ser, Arg, Thr, Trp, Val 또는 Tyr 중 어느 하나,
92번 위치의 아미노산이 Glu, Asp, Ser, Arg, Thr, Val, Tyr 또는 Ala 중 어느 하나,
93번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Ile, Asn, Ser, Arg, Thr, Val, Tyr 또는 Gly 중 어느 하나,
94번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Gly, Ile, Asn, Arg, Thr 또는 Ser 중 어느 하나,
95번 위치의 아미노산이 Ala, Glu, Asp, Gly, Phe, Ile, His, Lys, Met, Leu, Gln, Pro, Ser, Arg, Thr, Trp, Val, Tyr 또는 Asn 중 어느 하나,
95a 위치의 아미노산이 Ala, Glu, Asp, Gly, Ile, His, Lys, Leu, Gln, Pro, Ser, Arg, Thr, Tyr 또는 Asn 중 어느 하나,
96번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Gly, Phe, His, Lys, Leu, Asn, Gln, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val 중 어느 하나, 또는
97번 위치의 아미노산이 Ala, Gly, Ile, Met, Leu, Ser 또는 VaL 중 어느 하나
의 아미노산이 예시될 수 있다.
본 발명의 일태양으로서 저분자 화합물이 키누레닌인 경우, 플렉시블 잔기 및 그 잔기를 다른 어느 아미노산으로 치환하여 라이브러리화할 수 있는지는, 키누레닌과 항체의 복합체의 결정구조 해석이나 변이 도입에 의해 동정할 수 있다. 예를 들면 키누레닌과 항체의 복합체의 결정구조 해석으로부터 키누레닌의 결합에 관여하고 있지 않은 항체의 잔기를 동정할 수 있다. 키누레닌의 결합에 관여하고 있지 않은 것으로 동정된 잔기를 다른 아미노산과 치환해도 화합물로의 결합을 적절한 정도로 유지할 수 있는 아미노산을 선택할 수 있다. 이에 의해 선택된 잔기에 있어서 선택된 아미노산이 출현하는 라이브러리를 설계할 수 있다. 이 경우에 있어서, 키누레닌의 결합에 관여하고 있지 않은 것으로 동정된 잔기가 서로 다른 아미노산으로 치환된 항원 결합 분자의 집합이 되도록 복수의 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리를 설계하는 것이 가능하다. 즉, 서로 다른 아미노산으로 치환된 개개의 플렉시블 잔기를 조합함으로써 당해 플렉시블 잔기가 포함되는 항원 결합 분자의 서열의 다양성이 초래된다.
또한 키누레닌의 결합에 관여하는 것으로 동정된 잔기의 하나 이상은 당해 잔기 및 당해 잔기와 상이한 잔기로부터 선택되는 임의의 잔기가 되도록 이들 잔기를 포함하는 항원 결합 분자가 디자인될 수 있다. 키누레닌의 결합에 관여하는 것으로 동정되는 아미노산의 비한정의 일태양으로서, 키누레닌과의 결합에 그 측쇄가 관여하고 있는 아미노산 잔기로서 H쇄：P97, R100c, D101(Kabat 넘버링), L쇄：H49, F55(Kabat 넘버링)의 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 예시될 수 있다. 또한 주쇄 부분에서 키누레닌과의 결합에 크게 관여하고 있는 아미노산 잔기로서 H쇄：R94, D95, R100c, G100d, A100e의 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 예시될 수 있다. 또한 X선 결정구조로부터 H쇄 CDR3의 구조를 키누레닌과의 결합 구조로 유지하는 데 있어서 중요한 잔기로서 H쇄：P97, P100b, G100d의 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노노산이 예시될 수 있다.
본 발명에 있어서의 저분자가 키누레닌인 경우의 플렉시블 잔기의 비한정의 일태양으로서 중쇄 가변영역에 포함되는 24번 위치, 26번 위치, 27번 위치, 28번 위치, 29번 위치, 30번 위치, 31번 위치, 32번 위치, 33번 위치, 50번 위치, 51번 위치, 52번 위치, 52a 위치, 53번 위치, 54번 위치, 55번 위치, 56번 위치, 58번 위치, 73번 위치, 95번 위치, 96번 위치, 97번 위치, 98번 위치, 99번 위치, 100번 위치, 100a 위치, 100b 위치, 100c 위치, 100d 위치, 100e 위치, 100f 위치 및 102번 위치의 아미노산이 예시될 수 있다. 이러한 아미노산의 다른 비한정의 일태양으로서 경쇄 가변영역에 포함되는 27d 위치, 27e 위치, 28번 위치, 29번 위치, 32번 위치, 46번 위치, 49번 위치, 50번 위치, 51번 위치, 52번 위치, 53번 위치, 54번 위치, 55번 위치, 92번 위치, 93번 위치 및 94번 위치의 아미노산이 예시될 수 있다.
상기 플렉시블 잔기의 비한정의 일태양으로서 중쇄 가변영역에 포함되는 아미노산으로서；
24번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
26번 위치의 아미노산이 Gly, Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
27번 위치의 아미노산이 Gly, Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
28번 위치의 아미노산이 Thr, Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
29번 위치의 아미노산이 Phe, Ile, Leu, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
30번 위치의 아미노산이 Ser, Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
31번 위치의 아미노산이 Ser, Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Gln, Arg, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
32번 위치의 아미노산이 Tyr, Phe 또는 His 중 어느 하나,
33번 위치의 아미노산이 Ala, Gly, Ile, Lys, Gln, Arg, Ser, Thr, Val 또는 Trp 중 어느 하나,
50번 위치의 아미노산이 Gly, Ala, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
51번 위치의 아미노산이 Ile, Ala, Gly, Lys, Leu, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
52번 위치의 아미노산이 Ile, Ala, Glu, Phe, His, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
52a 위치의 아미노산이 Pro, Ala, Gly, Ser, Thr 또는 Trp 중 어느 하나,
53번 위치의 아미노산이 Ile, Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
54번 위치의 아미노산이 Phe, Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
55번 위치의 아미노산이 Gly, Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
56번 위치의 아미노산이 Thr, Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
58번 위치의 아미노산이 Asn, Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
73번 위치의 아미노산이 Glu, Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val 또는 Tyr 중 어느 하나,
95번 위치의 아미노산이 Asp 또는 Gly 중 어느 하나,
96번 위치의 아미노산이 Ala, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
97번 위치의 아미노산이 Pro, Ala, Asn 또는 Ser 중 어느 하나,
98번 위치의 아미노산이 Val, Leu 또는 Thr 중 어느 하나,
99번 위치의 아미노산이 Val, Ala, Asp, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr 또는 Tyr 중 어느 하나,
100번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
100a 위치의 아미노산이 Arg, Ala, Asp, Glu, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr 또는 Val 중 어느 하나,
100b 위치의 아미노산이 Pro, Ala, Lys, Asn, Gln, Arg 또는 Ser 중 어느 하나,
100c 위치의 아미노산이 Arg, His, Lys 또는 Gln 중 어느 하나,
100d 위치의 아미노산이 Gly 또는 Asn 중 어느 하나,
100e 위치의 아미노산이 Ala, Gly 또는 Ser 중 어느 하나,
100f 위치의 아미노산이 Phe 또는 Leu 중 어느 하나, 또는
102번 위치의 아미노산이 Ile, Ala, Asp, Glu, Phe, His, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나의 아미노산이 예시될 수 있다.
상기 플렉시블 잔기의 비한정의 일태양으로서 경쇄 가변영역에 포함되는 아미노산으로서；
27d 위치의 아미노산이 His, Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
27e 위치의 아미노산이 Ser, Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
28번 위치의 아미노산이 Asp, Ala, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
29번 위치의 아미노산이 Gly, Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
32번 위치의 아미노산이 Tyr, Ala, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Pro, Gln, Arg, Val 또는 Trp 중 어느 하나,
46번 위치의 아미노산이 Leu, Ile, Met, Asn 또는 Val 중 어느 하나,
49번 위치의 아미노산이 Tyr, Phe, His 또는 Trp 중 어느 하나,
50번 위치의 아미노산이 Glu, Ala, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Gln, Ser, Thr, Val 또는 Tyr 중 어느 하나,
51번 위치의 아미노산이 Ile, Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, Lys, Leu, Met, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
52번 위치의 아미노산이 Ser, Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Gln, Arg, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
53번 위치의 아미노산이 Asn, Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
54번 위치의 아미노산이 Arg, Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
55번 위치의 아미노산이 Phe, Leu, Met, Arg 또는 Tyr 중 어느 하나,
92번 위치의 아미노산이 Thr, Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Gln, Arg, Ser, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
93번 위치의 아미노산이 Gln, Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Asn, Arg, Ser, Thr, Val 또는 Tyr 중 어느 하나, 또는
94번 위치의 아미노산이 Phe, His, Ile, Lys, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나의 아미노산이 예시될 수 있다.
본 발명에 있어서의 저분자가 키누레닌인 경우의 플렉시블 잔기의 비한정의 다른 일태양으로서 중쇄 가변영역에 포함되는 28번 위치, 31번 위치, 33번 위치, 50번 위치, 51번 위치, 52번 위치, 54번 위치, 55번 위치, 56번 위치, 58번 위치, 96번 위치, 97번 위치, 99번 위치, 100번 위치, 100a 위치, 100b 위치 및 100c 위치의 아미노산이 예시될 수 있다. 이러한 아미노산의 다른 비한정의 일태양으로서 경쇄 가변영역에 포함되는 27d 위치, 27e 위치, 28번 위치, 29번 위치, 32번 위치, 52번 위치, 53번 위치, 54번 위치, 56번 위치, 92번 위치 및 93번 위치의 아미노산이 예시될 수 있다.
본 발명의 일태양으로서 저분자 화합물이 아데노신인 경우, 플렉시블 잔기 및 그 잔기를 다른 어느 아미노산으로 치환하여 라이브러리화할 수 있는지는 아데노신과 항체의 복합체의 결정구조 해석이나 변이 도입에 의해 동정할 수 있다. 예를 들면 아데노신과 항체의 복합체의 결정구조 해석으로부터 아데노신의 결합에 관여하고 있지 않은 항체의 잔기를 동정할 수 있다. 아데노신의 결합에 관여하고 있지 않은 것으로 동정된 잔기를 다른 아미노산으로 치환해도 화합물로의 결합을 적절한 정도로 유지할 수 있는 아미노산을 선택할 수 있다. 이에 의해, 선택된 잔기에 있어서 선택된 아미노산이 출현하는 라이브러리를 설계할 수 있다. 이 경우에 있어서, 아데노신의 결합에 관여하고 있지 않은 것으로 동정된 잔기가 서로 다른 아미노산으로 치환된 항원 결합 분자의 집합이 되도록 복수의 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리를 설계하는 것이 가능하다. 즉, 서로 다른 아미노산으로 치환된 개개의 플렉시블 잔기를 조합함으로써 당해 플렉시블 잔기가 포함되는 항원 결합 분자의 서열의 다양성이 초래된다.
또한 아데노신의 결합에 관여하는 것으로 동정된 잔기의 하나 이상은 당해 잔기 및 당해 잔기와 상이한 잔기로부터 선택되는 임의의 잔기가 되도록 이들 잔기를 포함하는 항원 결합 분자가 디자인될 수 있다. 아데노신의 결합에 관여하는 것으로 동정되는 아미노산의 비한정의 일태양으로서 H쇄：A33, I50, G52, S56, T57, W58, G99, Y100, T100a(Kabat 넘버링), L쇄：Y95c, N96(Kabat 넘버링)의 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 예시될 수 있다.
본 발명에 있어서의 저분자가 아데노신인 경우의 플렉시블 잔기의 비한정의 일태양으로서, 중쇄 가변영역에 포함되는 31번 위치, 32번 위치, 53번 위치, 54번 위치, 55번 위치, 56번 위치, 57번 위치, 59번 위치, 61번 위치, 62번 위치, 65번 위치, 96번 위치, 97번 위치, 98번 위치, 100번 위치, 100a 위치, 101번 위치 및 102번 위치의 아미노산이 예시될 수 있다. 이러한 아미노산의 다른 비한정의 일태양으로서, 경쇄 가변영역에 포함되는 28번 위치, 29번 위치, 32번 위치, 93번 위치, 94번 위치, 95번 위치, 95a 위치, 95b 위치 및 95c 위치의 아미노산이 예시될 수 있다.
상기 플렉시블 잔기의 비한정의 일태양으로서 중쇄 가변영역에 포함되는 아미노산으로서；
31번 위치의 아미노산이 Asn, Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
32번 위치의 아미노산이 Tyr, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val 또는 Trp 중 어느 하나,
53번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val 또는 Tyr 중 어느 하나,
54번 위치의 아미노산이 Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Gln, Ser, Thr, Val 또는 Tyr 중 어느 하나,
55번 위치의 아미노산이 Ser, Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Gln, Arg, Thr, Val 또는 Tyr 중 어느 하나,
56번 위치의 아미노산이 Ser, Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Gln, Arg, Thr 또는 Val 중 어느 하나,
57번 위치의 아미노산이 Thr, Ala, Ile, Lys, Leu, Asn, Gln, Arg, Ser 또는 Val 중 어느 하나,
59번 위치의 아미노산이 Tyr, Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Gln, Arg, Ser, Thr, Val 또는 Trp 중 어느 하나,
61번 위치의 아미노산이 Ser, Ala, Phe, His, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
62번 위치의 아미노산이 Trp, Ala, Asp, Glu, Phe 또는 Gly 중 어느 하나,
65번 위치의 아미노산이 Gly, Ala, Asp, Glu, Phe, Ile, Lys, Leu, Asn, Gln, Arg, Thr, Val 또는 Trp 중 어느 하나,
96번 위치의 아미노산이 Arg, Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Asn, Gln, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
97번 위치의 아미노산이 Phe, Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
98번 위치의 아미노산이 Val, Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser 또는 Thr 중 어느 하나,
100번 위치의 아미노산이 Tyr 또는 Phe 중 어느 하나,
100a 위치의 아미노산이 Thr, Ser 또는 Val 중 어느 하나,
101번 위치의 아미노산이 Asp, Ala, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나, 또는
102번 위치의 아미노산이 Pro, Asp 또는 Asn 중 어느 하나의 아미노산이 예시될 수 있다.
상기 플렉시블 잔기의 비한정의 일태양으로서 경쇄 가변영역에 포함되는 아미노산으로서；
28번 위치의 아미노산이 Trp, Ala, Phe, His, Lys, Asn, Ser, Thr, Val 또는 Tyr 중 어느 하나,
29번 위치의 아미노산이 Asn, Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
32번 위치의 아미노산이 Tyr, Ala, Asp, Phe, Gly 또는 His 중 어느 하나,
93번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Leu, Gln, Arg, Ser, Thr, Val 또는 Tyr 중 어느 하나,
94번 위치의 아미노산이 Asn, Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
95번 위치의 아미노산이 Ser, Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
95a 위치의 아미노산이 Gly, Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
95b 위치의 아미노산이 Trp, Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val 또는 Tyr 중 어느 하나, 또는
95c 위치의 아미노산이 Tyr, Phe, His, Lys, Leu, Asn 또는 Val 중 어느 하나의 아미노산이 예시될 수 있다.
본 발명의 일태양으로서 저분자 화합물이 아데노신 1인산인 경우, 플렉시블 잔기 및 그 잔기를 다른 어느 아미노산으로 치환하여 라이브러리화할 수 있는지는 아데노신 1인산과 항체의 복합체의 결정구조 해석 및 유사 화합물인 아데노신과 항체의 복합체의 결정구조로부터의 모델링이나 변이 도입에 의해 동정할 수 있다. 예를 들면 아데노신과 항체의 복합체의 결정구조 해석을 이용한 모델링으로부터 아데노신 1인산의 결합에 관여하고 있지 않은 항체의 잔기를 동정할 수 있다. 아데노신 1인산의 결합에 관여하고 있지 않은 것으로 동정된 잔기를 다른 아미노산으로 치환해도 화합물로의 결합을 적절한 정도로 유지할 수 있는 아미노산을 선택할 수 있다. 이에 의해 선택된 잔기에 있어서 선택된 아미노산이 출현하는 라이브러리를 설계할 수 있다. 이 경우에 있어서, 아데노신 1인산의 결합에 관여하고 있지 않은 것으로 동정된 잔기가 서로 다른 아미노산으로 치환된 항원 결합 분자의 집합이 되도록 복수의 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리를 설계하는 것이 가능하다. 즉 서로 다른 아미노산으로 치환된 개개의 플렉시블 잔기를 조합함으로써 당해 플렉시블 잔기가 포함되는 항원 결합 분자의 서열의 다양성이 초래된다.
또한 아데노신 1인산의 결합에 관여하는 것으로 동정된 잔기의 하나 이상은 당해 잔기 및 당해 잔기와 상이한 잔기로부터 선택되는 임의의 잔기가 되도록 이들 잔기를 포함하는 항원 결합 분자가 디자인될 수 있다. 아데노신 1인산의 아데닌 고리 부분 및 리보오스 부분과의 결합에 관여하는 것으로 동정되는 아미노산은 아데노신과 동일하며, 비한정의 일태양으로서 H쇄：A33, I50, G52, S56, T57, W58, G99, Y100, T100a(Kabat 넘버링), L쇄：Y95c, N96(Kabat 넘버링)의 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 예시될 수 있다. 또한 아데노신 1인산의 인산기 부분과의 결합에 관여하는 것으로 동정되는 아미노산의 비한정의 일태양으로서 H쇄 CDR2의 D54, S55, S56, T57, W58 및 L쇄 CDR3의 G95a, W95b, Y95c(Kabat 넘버링)의 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 예시될 수 있다.
상기 플렉시블 잔기의 비한정의 일태양으로서 중쇄 가변영역에 포함되는 아미노산으로서；
31번 위치의 아미노산이 Asn, Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
32번 위치의 아미노산이 Tyr, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val 또는 Trp 중 어느 하나,
53번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val 또는 Tyr 중 어느 하나,
54번 위치의 아미노산이 Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Gln, Ser, Thr, Val 또는 Tyr 중 어느 하나,
55번 위치의 아미노산이 Ser, Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Gln, Arg, Thr, Val 또는 Tyr 중 어느 하나,
56번 위치의 아미노산이 Ser, Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Gln, Arg, Thr 또는 Val 중 어느 하나,
57번 위치의 아미노산이 Thr, Ala, Ile, Lys, Leu, Asn, Gln, Arg, Ser 또는 Val 중 어느 하나,
59번 위치의 아미노산이 Tyr, Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Gln, Arg, Ser, Thr, Val 또는 Trp 중 어느 하나,
61번 위치의 아미노산이 Ser, Ala, Phe, His, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
62번 위치의 아미노산이 Trp, Ala, Asp, Glu, Phe 또는 Gly 중 어느 하나,
65번 위치의 아미노산이 Gly, Ala, Asp, Glu, Phe, Ile, Lys, Leu, Asn, Gln, Arg, Thr, Val 또는 Trp 중 어느 하나,
96번 위치의 아미노산이 Arg, Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Asn, Gln, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
97번 위치의 아미노산이 Phe, Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
98번 위치의 아미노산이 Val, Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser 또는 Thr 중 어느 하나,
100번 위치의 아미노산이 Tyr 또는 Phe 중 어느 하나,
100a 위치의 아미노산이 Thr, Ser 또는 Val 중 어느 하나,
101번 위치의 아미노산이 Asp, Ala, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나, 또는
102번 위치의 아미노산이 Pro, Asp 또는 Asn 중 어느 하나의 아미노산이 예시될 수 있다.
상기 플렉시블 잔기의 비한정의 일태양으로서 경쇄 가변영역에 포함되는 아미노산으로서；
28번 위치의 아미노산이 Trp, Ala, Phe, His, Lys, Asn, Ser, Thr, Val 또는 Tyr 중 어느 하나,
29번 위치의 아미노산이 Asn, Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
32번 위치의 아미노산이 Tyr, Ala, Asp, Phe, Gly 또는 His 중 어느 하나,
93번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Leu, Gln, Arg, Ser, Thr, Val 또는 Tyr 중 어느 하나,
94번 위치의 아미노산이 Asn, Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
95번 위치의 아미노산이 Ser, Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
95a 위치의 아미노산이 Gly, Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
95b 위치의 아미노산이 Trp, Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val 또는 Tyr 중 어느 하나, 또는
95c 위치의 아미노산이 Tyr, Phe, His, Lys, Leu, Asn 또는 Val 중 어느 하나의 아미노산이 예시될 수 있다.
본 발명의 일태양으로서 저분자 화합물이 아데노신 2인산 또는 아데노신 3인산인 경우, 플렉시블 잔기 및 그 잔기를 다른 어느 아미노산으로 치환하여 라이브러리화할 수 있는지는 아데노신 2인산 또는 아데노신 3인산과 항체의 복합체의 결정구조 해석 및 유사 화합물인 아데노신과 항체의 복합체의 결정구조로부터의 모델링이나 변이 도입에 의해 동정할 수 있다. 예를 들면 아데노신 2인산 또는 아데노신 3인산과 항체의 복합체의 결정구조 해석을 이용한 모델링으로부터 아데노신 2인산 또는 아데노신 3인산의 결합에 관여하고 있지 않은 항체의 잔기를 동정할 수 있다. 아데노신 2인산 또는 아데노신 3인산의 결합에 관여하고 있지 않은 것으로 동정된 잔기를 다른 아미노산으로 치환해도 화합물로의 결합을 적절한 정도로 유지할 수 있는 아미노산을 선택할 수 있다. 이에 의해 선택된 잔기에 있어서 선택된 아미노산이 출현하는 라이브러리를 설계할 수 있다. 이 경우에 있어서, 아데노신 2인산 또는 아데노신 3인산의 결합에 관여하고 있지 않은 것으로 동정된 잔기가 서로 다른 아미노산으로 치환된 항원 결합 분자의 집합이 되도록 복수의 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리를 설계하는 것이 가능하다. 즉 서로 다른 아미노산으로 치환된 개개의 플렉시블 잔기를 조합함으로써 당해 플렉시블 잔기가 포함되는 항원 결합 분자의 서열의 다양성이 초래된다.
또한 아데노신 2인산 또는 아데노신 3인산의 결합에 관여하는 것으로 동정된 잔기의 하나 이상은 당해 잔기 및 당해 잔기와 상이한 잔기로부터 선택되는 임의의 잔기가 되도록 이들 잔기를 포함하는 항원 결합 분자가 디자인될 수 있다. 아데노신 2인산 또는 아데노신 3인산의 아데닌 고리 부분 및 리보오스 부분과의 결합에 관여하는 것으로 동정되는 아미노산은 아데노신과 동일하며, 비한정의 일태양으로서 H쇄：A33, I50, G52, S56, T57, W58, G99, Y100, T100a(Kabat 넘버링), L쇄：Y95c, N96(Kabat 넘버링)의 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 예시될 수 있다. 아데노신 2인산 또는 아데노신 3인산의 인산기 부분과의 결합에 관여하는 것으로 동정되는 아미노산은 결정구조를 토대로 상기와 동일한 고찰을 행함으로써, 아데노신 2인산 또는 아데노신 3인산으로의 결합을 증강시킬 수 있는 개변도 예측할 수 있다.
본 명세서에 있어서는 플렉시블 잔기란 공지의 및/또는 천연 항체 또는 항원 결합 도메인의 아미노산 서열을 비교한 경우에, 그 위치에서 제시되는 몇 가지의 상이한 아미노산을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변영역 상의 아미노산이 매우 다양한 위치에 존재하는 아미노산 잔기의 변형을 말한다. 매우 다양한 위치는 일반적으로 CDR영역에 존재한다. 일태양에서는 공지의 및/또는 천연 항체의 매우 다양한 위치를 결정할 때는 Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute of Health Bethesda Md.) (1987년 및 1991년)가 제공하는 데이터가 유효하다. 또한 인터넷 상의 복수의 데이터베이스(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/, http://www.bioinf.org.uk/abs/index.html)에서는 수집된 다수의 인간 경쇄 및 중쇄의 서열과 그의 배치가 제공되어 있어, 이들 서열과 그의 배치 정보는 본 발명에 있어서의 매우 다양한 위치의 결정에 유용하다. 본 발명에 따르면, 아미노산이 어떤 위치에서 바람직하게는 약 2 내지 약 20, 바람직하게는 약 3 내지 약 19, 바람직하게는 약 4 내지 약 18, 바람직하게는 5 내지 17, 바람직하게는 6 내지 16, 바람직하게는 7 내지 15, 바람직하게는 8 내지 14, 바람직하게는 9 내지 13, 바람직하게는 10 내지 12개의 가능한 상이한 아미노산 잔기의 다양성을 갖는 경우는, 그 위치는 매우 다양하다고 할 수 있다. 몇 가지의 실시형태에서는, 어떤 아미노산 위치는 바람직하게는 적어도 약 2, 바람직하게는 적어도 약 4, 바람직하게는 적어도 약 6, 바람직하게는 적어도 약 8, 바람직하게는 약 10, 바람직하게는 약 12의 가능한 상이한 아미노산 잔기의 다양성을 가질 수 있다.
또한 상기 저분자의 존재 또는 비존재에 따라 항원에 대한 항원 결합 도메인의 결합 활성을 변화시키는 하나 이상의 아미노산 잔기가 도입된 경쇄 가변영역과 랜덤화 가변영역 서열 라이브러리로서 제작된 중쇄 가변영역을 조합시킴으로써도 본 발명에 있어서의 복수의 서로 서열이 다른 항원 결합 분자를 포함하는 라이브러리가 제작될 수 있다. 마찬가지로 상기 저분자의 존재 또는 비존재에 따라 항원에 대한 항원 결합 도메인의 결합 활성을 변화시키는 하나 이상의 아미노산 잔기가 도입되고, 그 이외의 아미노산 잔기를 플렉시블 잔기로서 설계된 중쇄 가변영역과 조합시킴으로써도 본 발명에 있어서의 복수의 서로 서열이 다른 항원 결합 분자를 포함하는 라이브러리가 제작될 수 있다.
상기 저분자 화합물의 농도 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 하나 이상의 아미노산 잔기가 도입된 경쇄 가변영역과 랜덤화 가변영역 서열 라이브러리로서 제작된 중쇄 가변영역을 조합시키는 경우에도, 상기와 마찬가지로 플렉시블 잔기가 당해 경쇄 가변영역의 서열에 포함되도록 설계하는 것도 가능하다. 본 발명의 항원 결합 분자의 항원에 대한 결합 활성이 아데노신 및/또는 ATP의 존재 또는 비존재에 따라 변화되는 한, 당해 플렉시블 잔기의 수 및 위치는 특정 태양에 한정되는 경우는 없다. 즉, 중쇄 및/또는 경쇄의 CDR서열 및/또는 FR서열에 하나 또는 그 이상의 플렉시블 잔기가 포함될 수 있다.
조합되는 중쇄 가변영역의 예로서, 랜덤화 가변영역 라이브러리를 적합하게 들 수 있다. 랜덤화 가변영역 라이브러리의 제작방법은 공지의 방법이 적절히 조합된다. 본 발명의 비한정의 일태양에서는 특정 항원으로 면역된 동물, 감염증 환자나 백신을 접종하여 혈중 항체가가 상승한 인간, 암 환자, 자기면역질환의 림프구 유래의 항체 유전자를 토대로 구축된 면역 라이브러리가 랜덤화 가변영역 라이브러리로서 적합하게 사용될 수 있다.
또한 본 발명의 비한정의 일태양에서는 게놈 DNA에 있어서의 V 유전자나 재구축되어 기능적인 V 유전자의 CDR서열이 적당한 길이의 코돈 세트를 코드하는 서열을 포함하는 합성 올리고 뉴클레오티드 세트로 치환된 합성 라이브러리도 또한 랜덤화 가변영역 라이브러리로서 적합하게 사용될 수 있다. 이 경우, 중쇄의 CDR3의 유전자 서열의 다양성이 관찰되는 것으로부터, CDR3의 서열만을 치환하는 것도 또한 가능하다. 항원 결합 분자의 가변영역에 있어서 아미노산의 다양성을 만들어내는 기준은 항원 결합 분자의 표면에 노출된 위치의 아미노산 잔기에 다양성을 부여하는 것이다. 표면에 노출된 위치란 항원 결합 분자의 구조, 구조 어셈블 및/또는 모델화된 구조에 기초하여 표면 노출이 가능 및/또는 항원과의 접촉이 가능하다고 판단되는 위치를 말하는데, 일반적으로는 그의 CDR이다. 바람직하게는 표면에 노출된 위치는 InsightII 프로그램(Accelrys)과 같은 컴퓨터 프로그램을 사용하여 항원 결합 분자의 3차원 모델로부터의 좌표를 사용하여 결정된다. 표면에 노출된 위치는 당 기술분야에서 공지인 알고리즘(예를 들면 Lee 및 Richards(J. Mol. Biol. (1971) 55, 379-400), Connolly(J. Appl. Cryst. (1983) 16, 548-558))을 사용하여 결정될 수 있다. 표면에 노출된 위치의 결정은 단백질 모델링에 적합한 소프트웨어 및 항체로부터 얻어지는 3차원 구조 정보를 사용하여 행해질 수 있다. 이러한 목적을 위해 이용할 수 있는 소프트웨어로서 SYBYL 생체 고분자 모듈 소프트웨어(Tripos Associates)를 적합하게 들 수 있다. 일반적으로 또한 바람직하게는 알고리즘이 유저의 입력 사이즈 파라미터를 필요로 하는 경우는, 계산에 있어서 사용되는 프로브의 「사이즈」는 반지름 약 1.4 옹스트롬 이하로 설정된다. 또한 PC용 소프트웨어를 사용한 표면에 노출된 영역 및 에어리어의 결정법이 파시오스(Pacios)(Comput. Chem. (1994) 18 (4), 377-386 및 J. Mol. Model. (1995) 1, 46-53)에 기재되어 있다.
또한 본 발명의 비한정의 일태양에서는 항체의 안정성을 향상시키기 위해 CDR영역 및/또는 프레임워크 영역을 포함하는 가변영역의 아미노산을 적절히 개변하는 것도 가능하다. 이러한 아미노산의 비한정의 일태양으로서 1번 위치, 5번 위치, 10번 위치, 30번 위치, 48번 위치, 58번 위치의 아미노산이 예시될 수 있다. 보다 구체적으로는 1번 위치의 Gln, 5번 위치의 Gln, 10번 위치의 Asp, 30번 위치의 Asn, 48번 위치의 Leu, 58번 위치의 Asn이 예시될 수 있다. 항체의 안정성을 향상시키기 위해 이들 아미노산을 생식세포계열의 서열에 포함되어 있는 대응하는 아미노산으로 치환하는 것이 가능하다. 이러한 생식세포계열의 비한정의 일태양의 서열로서 VH3-21의 서열이 예시될 수 있다. 이 경우에 있어서 1번 위치의 Gln이 Glu로, 5번 위치의 Gln이 Val로, 10번 위치의 Asp가 Gly로, 30번 위치의 Asn이 Ser로, 48번 위치의 Leu가 Val로, 58번 위치의 Asn이 Tyr로 치환될 수 있다.
또한 본 발명의 비한정의 일태양에서는 건강한 정상인의 림프구 유래의 항체 유전자로부터 구축되고, 그 레퍼토리에 바이어스를 포함하지 않는 항체 서열인 나이브 서열로 이루어지는 나이브 라이브러리도 또한 랜덤화 가변영역 라이브러리로서 특히 적합하게 사용될 수 있다(Gejima 등(Human Antibodies (2002) 11, 121-129) 및 Cardoso 등(Scand. J. Immunol. (2000) 51, 337-344)). 본 발명에서 기재되는 나이브 서열을 포함하는 아미노산 서열이란 이러한 나이브 라이브러리로부터 취득되는 아미노산 서열을 말한다.
Fc영역
Fc영역은 항체 중쇄의 불변영역에 유래하는 아미노산 서열을 포함한다. Fc영역은 EU 넘버링으로 표시되는 대략 216번 위치의 아미노산에 있어서의 파파인 절단 부위의 힌지영역의 N말단으로부터 당해 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 항체의 중쇄 불변영역의 부분이다. Fc영역은 인간 IgG1으로부터 취득될 수 있는데, IgG의 특정 서브클래스에 한정되는 것도 아니다. 당해 Fc영역의 적합한 예로서, 후술되는 바와 같이 pH 산성역에 있어서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 Fc영역을 들 수 있다. 또한 당해 Fc영역의 적합한 예로서, 후술되는 바와 같이 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성을 갖는 Fc영역을 들 수 있다. 이러한 Fc영역의 비한정의 일태양으로서 인간 IgG1(서열번호：5), IgG2(서열번호：6), IgG3(서열번호：7) 또는 IgG4(서열번호：8)로 표시되는 Fc영역이 예시된다.
Fcγ 수용체(FcγR)
Fcγ 수용체(FcγR로도 기재됨)란 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 단일클론 항체의 Fc영역에 결합할 수 있는 수용체를 말하고, 실질적으로 Fcγ 수용체 유전자에 코드되는 단백질의 패밀리 모든 멤버를 의미한다. 인간의 경우는, 이 패밀리에는 아이소폼 FcγRIa, FcγRIb 및 FcγRIc를 포함하는 FcγRI(CD64)；아이소폼 FcγRIIa(알로타입 H131 및 R131을 포함한다. 즉, FcγRIIa (H) 및 FcγRIIa (R)), FcγRIIb(FcγRIIb-1 및 FcγRIIb-2를 포함함) 및 FcγRIIc를 포함하는 FcγRII(CD32)；및 아이소폼 FcγRIIIa(알로타입 V158 및 F158을 포함한다. 즉, FcγRIIIa (V) 및 FcγRIIIa (F)) 및 FcγRIIIb(알로타입 FcγRIIIb-NA1 및 FcγRIIIb-NA2를 포함함)를 포함하는 FcγRIII(CD16), 및 어떠한 미발견의 인간 FcγR류 또는 FcγR 아이소폼 또는 알로타입도 포함되는데 이들에 한정되는 것은 아니다. FcγR은 인간, 마우스, 랫트, 토끼 및 원숭이를 포함하는데 이들에 한정되는 것은 아니고, 어떠한 생물 유래여도 된다. 마우스 FcγR류에는 FcγRI(CD64), FcγRII(CD32), FcγRIII(CD16) 및 FcγRIII-2(FcγRIV, CD16-2), 및 어떠한 미발견의 마우스 FcγR류 또는 FcγR 아이소폼 또는 알로타입도 포함되는데 이들에 한정되지 않는다. 이러한 Fcγ 수용체의 적합한 예로서는 인간 FcγRI(CD64), FcγRIIa(CD32), FcγRIIb(CD32), FcγRIIIa(CD16) 및/또는 FcγRIIIb(CD16)를 들 수 있다. 인간 FcγRI의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 서열번호：9(NM_000566.3) 및 10(NP_000557.1)에, 인간 FcγRIIa(알로타입 H131)의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 서열번호：11(BC020823.1) 및 12(AAH20823.1)에(알로타입 R131은 서열번호：12의 166번째 아미노산이 Arg로 치환되어 있는 서열임), FcγRIIb의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 서열번호：13(BC146678.1) 및 14(AAI46679.1)에, FcγRIIIa의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 서열번호：15(BC033678.1) 및 16(AAH33678.1)에, 및 FcγRIIIb의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 서열번호：17(BC128562.1) 및 18(AAI28563.1)에 기재되어 있다(괄호 안은 RefSeq 등의 데이터베이스 등록번호를 나타낸다). Fcγ 수용체가 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 단일클론 항체의 Fc영역에 결합 활성을 갖는지 여부는 상기에 기재되는 FACS나 ELISA 포맷 외에 ALPHA 스크린(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)이나 표면 플라즈몬 공명(SPR) 현상을 이용한 비아코어법 등에 의해 확인될 수 있다(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2006) 103 (11), 4005-4010).
FcγRIa, FcγRIb 및 FcγRIc를 포함하는 FcγRI(CD64) 및 아이소폼 FcγRIIIa(알로타입 V158 및 F158을 포함함) 및 FcγRIIIb(알로타입 FcγRIIIb-NA1 및 FcγRIIIb-NA2를 포함함)를 포함하는 FcγRIII(CD16)는 IgG의 Fc영역과 결합하는 α쇄와 세포 내에 활성화 신호를 전달하는 ITAM을 갖는 공통 γ쇄가 회합한다. 한편 아이소폼 FcγRIIa(알로타입 H131 및 R131을 포함함) 및 FcγRIIc를 포함하는 FcγRII(CD32) 자신의 세포질 도메인에는 ITAM이 포함되어 있다. 이들 수용체는 마크로파지나 마스트 세포, 항원 제시 세포 등의 많은 면역세포에 발현되고 있다. 이들 수용체가 IgG의 Fc영역에 결합함으로써 전달되는 활성화 신호에 의해, 마크로파지의 탐식능이나 염증성 사이토카인의 생산, 마스트 세포의 탈과립, 항원 제시 세포의 기능 항진이 촉진된다. 상기와 같이 활성화 신호를 전달하는 능력을 갖는 Fcγ 수용체는 본 명세서에 있어서 활성형 Fcγ 수용체라 불린다.
한편 FcγRIIb(FcγRIIb-1 및 FcγRIIb-2를 포함함) 자신의 세포질 내 도메인에는 억제형 신호를 전달하는 ITIM이 포함되어 있다. B세포에서는 FcγRIIb와 B세포 수용체(BCR)의 가교에 의해 BCR로부터의 활성화 신호가 억제되는 결과 BCR의 항체 생산이 억제된다. 마크로파지의 경우는 FcγRIII와 FcγRIIb의 가교에 의해 탐식능이나 염증성 사이토카인의 생산능이 억제된다. 상기와 같이 억제화 신호를 전달하는 능력을 갖는 Fcγ 수용체는 본 명세서에 있어서 억제형 Fcγ 수용체라 불린다.
FcγR에 대한 Fc영역의 결합 활성
전술한 바와 같이, 본 발명의 항원 결합 분자에 포함되는 Fc영역으로서 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성을 갖는 Fc영역을 들 수 있다. 이러한 Fc영역의 비한정의 일태양으로서 인간 IgG1(서열번호：5), IgG2(서열번호：6), IgG3(서열번호：7) 또는 IgG4(서열번호：8)로 표시되는 Fc영역이 예시된다. Fcγ 수용체가 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 단일클론 항체의 Fc영역에 결합 활성을 갖는지 여부는 상기에 기재되는 FACS나 ELISA 포맷 외에 ALPHA 스크린(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)이나 표면 플라즈몬 공명(SPR) 현상을 이용한 비아코어법 등에 의해 확인될 수 있다(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2006) 103 (11), 4005-4010).
ALPHA 스크린은 도너와 억셉터의 2개의 비드를 사용하는 ALPHA 테크놀로지에 의해 하기 원리를 토대로 실시된다. 도너 비드에 결합한 분자가 억셉터 비드에 결합한 분자와 생물학적으로 상호작용하여 2개의 비드가 근접한 상태일 때만 발광 신호가 검출된다. 레이저에 의해 여기된 도너 비드 내의 감광제(photosensitizer)는 주변의 산소를 여기상태의 일중항산소로 변환한다. 일중항산소는 도너 비드 주변에 확산되어 근접해 있는 억셉터 비드에 도달하면 비드 내의 화학발광 반응을 일으켜 최종적으로 빛이 방출된다. 도너 비드에 결합한 분자와 억셉터 비드에 결합한 분자가 상호작용하지 않을 때는 도너 비드가 생산하는 일중항산소가 억셉터 비드에 도달하지 않기 때문에 화학발광 반응은 일어나지 않는다.
예를 들면 도너 비드에 비오틴 표지된 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자가 결합되고, 억셉터 비드에는 글루타티온 S 트랜스페라아제(GST)로 태그화된 Fcγ 수용체가 결합된다. 경합하는 Fc영역 개변체를 포함하는 항원 결합 분자의 비존재하에서는 천연형 Fc영역을 갖는 항원 결합 분자와 Fcγ 수용체는 상호작용하여 520-620 nm의 신호를 발생시킨다. 태그화되어 있지 않은 Fc영역 개변체를 포함하는 항원 결합 분자는 천연형 Fc영역을 갖는 항원 결합 분자와 Fcγ 수용체 간의 상호작용과 경합한다. 경합 결과 나타나는 형광의 감소를 정량함으로써 상대적인 결합 친화성이 결정될 수 있다. 항체 등의 항원 결합 분자를 Sulfo-NHS-비오틴 등을 사용하여 비오틴화하는 것은 공지이다. Fcγ 수용체를 GST로 태그화하는 방법으로서는 Fcγ 수용체를 코드하는 폴리뉴클레오티드와 GST를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 인프레임 융합한 융합 유전자가 작동 가능하게 연결된 벡터에 보유된 세포 등에 있어서 발현되고, 글루타티온 칼럼을 사용하여 정제하는 방법 등이 적절히 채용될 수 있다. 얻어진 신호는 예를 들면 GRAPHPAD PRISM(GraphPad사, San Diego) 등의 소프트웨어를 사용하여 비선형 회귀 해석을 이용하는 1부위 경합(one-site competition) 모델에 적합시킴으로써 적합하게 해석된다.
상호작용을 관찰하는 물질의 한쪽(리간드)을 센서칩의 금박막 상에 고정하고, 센서칩의 뒤쪽으로부터 금박막과 유리의 경계면에서 전반사되도록 빛을 조사하면, 반사광의 일부에 반사강도가 저하된 부분(SPR 신호)이 형성된다. 상호작용을 관찰하는 물질의 다른 쪽(애널라이트)을 센서칩의 표면에 주입하여 리간드와 애널라이트가 결합하면, 고정화되어 있는 리간드 분자의 질량이 증가하여 센서칩 표면의 용매의 굴절률이 변화된다. 이 굴절률의 변화에 의해 SPR 신호의 위치가 시프트된다(반대로 결합이 해리되면 신호의 위치는 되돌아간다). 비아코어 시스템은 상기의 시프트되는 양, 즉 센서칩 표면에서의 질량 변화를 세로축에 취하고, 질량의 시간 변화를 측정 데이터로서 표시한다(센서그램). 센서그램의 커브로부터 키네틱스：결합속도상수(ka)와 해리속도상수(kd)가, 당해 상수의 비로부터 어피니티(KD)가 구해진다. 비아코어법에서는 저해 측정법도 적합하게 사용된다. 저해 측정법의 예는 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2006) 103 (11), 4005-4010에 기재되어 있다.
Fcγ 수용체(FcγR) 결합 개변 Fc영역
본 발명이 포함하는 Fc영역으로서 인간 IgG1(서열번호：5), IgG2(서열번호：6), IgG3(서열번호：7) 또는 IgG4(서열번호：8)로 표시되는 Fc영역 외에, 천연형 인간 IgG의 Fc영역의 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성보다도 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 높은 FcγR 결합 개변 Fc영역도 적절히 사용될 수 있다. 본 명세서에 있어서 「천연형 인간 IgG의 Fc영역」이란, 서열번호：5, 6, 7 또는 8로 예시되는 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 Fc영역의 EU 넘버링 297번 위치에 결합한 당쇄가 푸코오스 함유 당쇄인 Fc영역을 의미한다. 이러한 FcγR 결합 개변 Fc영역은 천연형 인간 IgG의 Fc영역의 아미노산을 개변함으로써 제작될 수 있다. FcγR 결합 개변 Fc영역의 FcγR에 대한 결합 활성이 천연형 인간 IgG의 Fc영역의 FcγR에 대한 결합 활성보다 높은지 여부는 상기 결합 활성 항목에서 기재된 방법을 사용하여 적절히 실시될 수 있다.
본 발명에 있어서 Fc영역의 「아미노산의 개변」 또는 「아미노산 개변」이란, 출발 Fc영역의 아미노산 서열과는 다른 아미노산 서열로 개변하는 것을 포함한다. 출발 Fc영역의 수식 개변체가 pH 중성역에 있어서 인간 Fcγ 수용체에 결합하는 것이 가능한 한, 어느 Fc영역도 출발 Fc영역으로서 사용될 수 있다. 또한 이미 개변이 가해진 Fc영역을 출발 Fc영역으로 하여 추가적인 개변이 가해진 Fc영역도 본 발명의 Fc영역으로서 적합하게 사용될 수 있다. 출발 Fc영역이란, 폴리펩티드 그 자체, 출발 Fc영역을 포함하는 조성물 또는 출발 Fc영역을 코드하는 아미노산 서열을 의미할 수 있다. 출발 Fc영역에는 항체 항목에서 개설된 재조합에 의해 생산된 공지의 Fc영역이 포함될 수 있다. 출발 Fc영역의 기원은 한정되지 않지만 비인간 동물의 임의의 생물 또는 인간으로부터 취득될 수 있다. 바람직하게는 임의의 생물로서는 마우스, 랫트, 기니피그, 햄스터, 게르빌루스쥐, 고양이, 토끼, 개, 염소, 양, 소, 말, 낙타 및 비인간 영장류로부터 선택되는 생물을 적합하게 들 수 있다. 다른 태양에 있어서 출발 Fc영역은 또한 게잡이원숭이, 마모셋, 빨간털원숭이, 침팬지 또는 인간으로부터 취득될 수 있다. 바람직하게는 출발 Fc영역은 인간 IgG1으로부터 취득될 수 있는데, IgG의 특정 클래스에 한정되는 것도 아니다. 이는 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 Fc영역을 출발 Fc영역으로서 적절히 사용할 수 있는 것을 의미한다. 마찬가지로 본 명세서에 있어서 상기 임의의 생물로부터의 IgG의 임의의 클래스 또는 서브클래스의 Fc영역을 바람직하게는 출발 Fc영역으로서 사용할 수 있는 것을 의미한다. 천연에 존재하는 IgG의 변형체(variant) 또는 조작된 형태의 예는 공지의 문헌(Curr. Opin. Biotechnol. (2009) 20 (6), 685-91, Curr. Opin. Immunol. (2008) 20 (4), 460-470, Protein Eng. Des. Sel. (2010) 23 (4), 195-202, 국제공개 WO2009/086320, WO2008/092117, WO2007/041635 및 WO2006/105338)에 기재되는데 그것들에 한정되지 않는다.
개변의 예로서는 하나 이상의 변이, 예를 들면 출발 Fc영역의 아미노산과는 다른 아미노산 잔기로 치환된 변이, 또는 출발 Fc영역의 아미노산에 대해 하나 이상의 아미노산 잔기의 삽입 또는 출발 Fc영역의 아미노산으로부터 하나 이상의 아미노산의 결실 등이 포함된다. 바람직하게는 개변 후의 Fc영역의 아미노산 서열에는 천연으로 생기지 않는 Fc영역의 적어도 부분을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 변종은 필연적으로 출발 Fc영역과 100% 미만의 서열 동일성 또는 유사성을 갖는다. 바람직한 실시형태에 있어서 변종은 출발 Fc영역의 아미노산 서열과 약 75%~100% 미만의 아미노산 서열 동일성 또는 유사성, 보다 바람직하게는 약 80%~100% 미만, 보다 바람직하게는 약 85%~100% 미만, 보다 바람직하게는 약 90%~100% 미만, 가장 바람직하게는 약 95%~100% 미만의 동일성 또는 유사성의 아미노산 서열을 갖는다. 본 발명의 비한정의 일태양에 있어서 출발 Fc영역 및 본 발명의 FcγR 결합 개변 Fc영역 사이에는 하나 이상의 아미노산의 차가 있다. 출발 Fc영역과 본 발명의 FcγR 결합 개변 Fc영역의 아미노산의 차이는 특히 전술한 EU 넘버링으로 특정되는 아미노산 잔기의 위치가 특정된 아미노산의 차이로도 적합하게 특정 가능하다. 이러한 변종의 제작방법은 「아미노산의 개변」의 항목에 예시되어 있다.
본 발명의 항원 결합 분자에 포함되는 천연형 인간 IgG의 Fc영역의 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성보다도 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 높은 FcγR 결합 개변 Fc영역(FcγR 결합 개변 Fc영역)은 어떠한 방법으로도 취득될 수 있는데, 구체적으로는 출발 Fc영역으로서 사용되는 인간 IgG형 면역글로불린의 아미노산의 개변에 의해 당해 FcγR 결합 개변 Fc영역이 취득될 수 있다. 개변을 위한 바람직한 IgG형 면역글로불린의 Fc영역으로서는, 예를 들면 서열번호：5, 6, 7 또는 8로 예시되는 인간 IgG(IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 및 그들의 개변체)의 Fc영역을 들 수 있다.
다른 아미노산으로의 개변은 천연형 인간 IgG의 Fc영역의 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성보다도 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 높은 한, 어떠한 위치의 아미노산도 개변될 수 있다. 항원 결합 분자가 인간 Fc영역으로서 인간 IgG1의 Fc영역을 포함하고 있는 경우, EU 넘버링 297번 위치에 결합한 당쇄가 푸코오스 함유 당쇄인 천연형 인간 IgG의 Fc영역의 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성보다도 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 높은 효과를 초래하는 개변이 포함되어 있는 것이 바람직하다. 이러한 아미노산의 개변으로서는, 예를 들면 국제공개 WO2007/024249, WO2007/021841, WO2006/031370, WO2000/042072, WO2004/029207, WO2004/099249, WO2006/105338, WO2007/041635, WO2008/092117, WO2005/070963, WO2006/020114, WO2006/116260 및 WO2006/023403 등에 보고되어 있다.
본 발명의 항원 결합 분자에 포함되는 Fcγ 수용체 결합 도메인과 Fcγ 수용체의 결합 활성을 측정하는 pH의 조건은 pH 산성역 내지 pH 중성역의 조건이 적절히 사용될 수 있다. 본 발명의 항원 결합 분자에 포함되는 Fcγ 수용체 결합 도메인과 Fcγ 수용체의 결합 활성을 측정하는 조건으로서의 pH 산성역 내지 pH 중성역이란, 통상 pH 5.8~pH 8.0을 의미한다. 바람직하게는 pH 6.0~pH 7.4의 임의의 pH값으로 나타내어지는 범위이고, 바람직하게는 pH 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3 및 7.4로부터 선택되며, 특히 바람직하게는 암조직의 pH에 가까운 pH 6.15~7.4이다(Vaupel 등(Cancer Res. (1989) 49, 6449-6665)). 측정 조건에 사용되는 온도로서 Fcγ 수용체 결합 도메인과 인간 Fcγ 수용체의 결합 어피니티는 10℃~50℃의 임의의 온도에서 평가될 수 있다. 바람직하게는 인간 Fcγ 수용체 결합 도메인과 Fcγ 수용체의 결합 어피니티를 결정하기 위해 15℃~40℃의 온도가 사용된다. 보다 바람직하게는 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 및 35℃ 중 어느 하나인 20℃에서 35℃까지의 임의의 온도도 마찬가지로 Fcγ 수용체 결합 도메인과 Fcγ 수용체의 결합 어피니티를 결정하기 위해 사용된다. 25℃라는 온도는 본 발명의 태양의 비한정의 일례이다.
본 명세서에 있어서 FcγR 결합 개변 Fc영역의 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 천연형 Fc영역의 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성보다도 높다는 것은, FcγR 결합 개변 Fc영역의 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa 및/또는 FcγRIIIb 중 어느 하나의 인간 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 이들 인간 Fcγ 수용체에 대한 천연형 Fc영역의 결합 활성보다도 높은 것을 말한다. 예를 들면 상기 해석방법을 토대로 대조로 하는 인간 IgG의 천연형 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자의 결합 활성과 비교하여 FcγR 결합 개변 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자의 결합 활성이 105% 이상, 바람직하게는 110% 이상, 115% 이상, 120% 이상, 125% 이상, 특히 바람직하게는 130% 이상, 135% 이상, 140% 이상, 145% 이상, 150% 이상, 155% 이상, 160% 이상, 165% 이상, 170% 이상, 175% 이상, 180% 이상, 185% 이상, 190% 이상, 195% 이상, 2배 이상, 2.5배 이상, 3배 이상, 3.5배 이상, 4배 이상, 4.5배 이상, 5배 이상, 7.5배 이상, 10배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 40배 이상, 50배 이상, 60배 이상, 70배 이상, 80배 이상, 90배 이상, 100배 이상의 결합 활성을 나타내는 것을 말한다. 천연형 Fc영역으로서는 출발 Fc영역도 사용될 수 있고, 동일한 서브클래스의 항체의 천연형 Fc영역도 사용될 수 있다.
본 발명에서는 대조로 하는 인간 IgG의 천연형 Fc영역으로서 EU 넘버링으로 표시되는 297번 위치의 아미노산에 결합한 당쇄가 푸코오스 함유 당쇄인 천연형 인간 IgG의 Fc영역이 적합하게 사용된다. EU 넘버링으로 표시되는 297번 위치의 아미노산에 결합한 당쇄가 푸코오스 함유 당쇄인지 여부는 기지의 수법이 사용될 수 있다(Non-fucosylated therapeutic antibodies as next-generation therapeutic antibodies. Satoh M, Iida S, Shitara K., Expert Opin. Biol. Ther. (2006) 6 (11), 1161-1173). 예를 들면 하기와 같은 방법으로 천연형 인간 IgG의 Fc영역에 결합한 당쇄가 푸코오스 함유 당쇄인지 여부를 판정하는 것이 가능하다. 피험 천연형 인간 IgG에 N-글리코시다아제 F(Roche diagnostics)를 반응시킴으로써 피험 천연형 인간 IgG로부터 당쇄가 유리된다(Weitzhandler 등(J. Pharma. Sciences (1994) 83, 12, 1670-1675). 다음으로 에탄올을 반응시켜 단백질이 제거된 반응액(Schenk 등(J. Clin. Investigation (2001) 108 (11) 1687-1695)의 농축 건고물이 2-아미노피리딘에 의해 형광 표지된다(Bigge 등(Anal. Biochem. (1995) 230 (2) 229-238). 셀룰로오스 카트리지를 사용한 고상 추출에 의해 탈시약된, 형광 표지된 2-AB화 당쇄가 순상(normal phase) 크로마토그래피에 의해 해석된다. 검출되는 크로마토그램의 피크를 관찰함으로써 인간 IgG의 천연형 Fc영역에 결합한 당쇄가 푸코오스 함유 당쇄인지 여부를 판정하는 것이 가능하다.
대조로 하는 동일한 서브클래스의 항체의 천연형 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자로서는 IgG 단일클론 항체의 Fc영역을 갖는 항원 결합 분자가 적절히 사용될 수 있다. 당해 Fc영역의 구조는 서열번호：5(데이터베이스 등록번호 AAC82527.1의 N말단에 A 부가), 6(데이터베이스 등록번호 AAB59393.1의 N말단에 A 부가), 7(데이터베이스 등록번호 CAA27268.1) 및 8(데이터베이스 등록번호 AAB59394.1의 N말단에 A 부가)에 기재한다. 또한 어떤 특정 아이소타입 항체의 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자를 피검물질로서 사용하는 경우에는, 당해 특정 아이소타입의 IgG 단일클론 항체의 Fc영역을 갖는 항원 결합 분자를 대조로서 사용함으로써 피험 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자에 의한 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성의 효과가 검증된다. 상기와 같이 하여 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 높은 것이 검증된 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자가 적절히 선택된다.
선택적인 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성을 갖는 Fc영역
또한 본 발명에 있어서 적합하게 사용되는 Fcγ 수용체 결합 도메인의 예로서, 특정 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 그 밖의 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성보다도 높은 성질을 갖는 Fcγ 수용체 결합 도메인(선택적인 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성을 갖는 Fcγ 수용체 결합 도메인)도 또한 적합하게 들 수 있다. 항원 결합 분자로서 항체가(Fcγ 수용체 결합 도메인으로서 Fc영역이) 사용되는 경우에는, 1분자의 항체는 1분자의 Fcγ 수용체와만 결합할 수 있기 때문에 1분자의 항원 결합 분자는 억제형 Fcγ 수용체에 결합한 상태로 다른 활성형 FcγR에 결합하는 것은 불가능하고, 활성형 Fcγ 수용체에 결합한 상태로 다른 활성형 Fcγ 수용체나 억제형 Fcγ 수용체에 결합하는 것은 불가능하다.
활성형 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 억제형 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성보다도 높은 Fc영역
상기한 바와 같이, 활성형 Fcγ 수용체로서는 FcγRIa, FcγRIb 및 FcγRIc를 포함하는 FcγRI(CD64), FcγRIIa 및 FcγRIIIa(알로타입 V158 및 F158을 포함함) 및 FcγRIIIb(알로타입 FcγRIIIb-NA1 및 FcγRIIIb-NA2를 포함함)를 포함하는 FcγRIII(CD16)를 적합하게 들 수 있다. 또한 FcγRIIb(FcγRIIb-1 및 FcγRIIb-2를 포함함)를 억제형 Fcγ 수용체의 적합한 예로서 들 수 있다.
본 명세서에 있어서 특정 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 그 이외의 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성보다도 높은 예로서, 예를 들면 활성형 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 억제형 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성보다도 높은 경우를 들 수 있다. 이 경우, Fc영역의 FcγRIa, FcγRIIa, FcγRIIIa 및/또는 FcγRIIIb 중 어느 하나의 인간 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 FcγRIIb에 대한 결합 활성보다도 높은 것을 말한다. 예를 들면 상기의 해석방법을 토대로, Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자의 FcγRIa, FcγRIIa, FcγRIIIa 및/또는 FcγRIIIb 중 어느 하나의 인간 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 FcγRIIb에 대한 결합 활성의 105% 이상, 바람직하게는 110% 이상, 120% 이상, 130% 이상, 140% 이상, 특히 바람직하게는 150% 이상, 160% 이상, 170% 이상, 180% 이상, 190% 이상, 200% 이상, 250% 이상, 300% 이상, 350% 이상, 400% 이상, 450% 이상, 500% 이상, 750% 이상, 10배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 40배 이상, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배 이상의 결합 활성을 나타내는 것을 말한다. 활성형 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 억제형 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성보다도 높은 Fc영역은 항원 결합 도메인이 막형 분자에 결합하는 본 발명의 항원 결합 분자에 적합하게 포함될 수 있다. 이러한 Fc영역을 포함하는 IgG1 항체는 후술하는 ADCC 활성이 증강되어 있는 것이 알려져 있는 것으로부터, 당해 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자는 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항원 결합 분자로서도 유용하다.
본 발명의 비한정의 일태양에서는 활성형 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 억제형 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성보다도 높은(억제형 Fcγ 수용체에 대한 선택적인 결합 활성을 갖는) Fc영역의 예로서, 전술된 EU 넘버링으로 표시되는 221번 위치, 222번 위치, 223번 위치, 224번 위치, 225번 위치, 227번 위치, 228번 위치, 230번 위치, 231번 위치, 232번 위치, 233번 위치, 234번 위치, 235번 위치, 236번 위치, 237번 위치, 238번 위치, 239번 위치, 240번 위치, 241번 위치, 243번 위치, 244번 위치, 245번 위치, 246번 위치, 247번 위치, 249번 위치, 250번 위치, 251번 위치, 254번 위치, 255번 위치, 256번 위치, 258번 위치, 260번 위치, 262번 위치, 263번 위치, 264번 위치, 265번 위치, 266번 위치, 267번 위치, 268번 위치, 269번 위치, 270번 위치, 271번 위치, 272번 위치, 273번 위치, 274번 위치, 275번 위치, 276번 위치, 278번 위치, 279번 위치, 280번 위치, 281번 위치, 282번 위치, 283번 위치, 284번 위치, 285번 위치, 286번 위치, 288번 위치, 290번 위치, 291번 위치, 292번 위치, 293번 위치, 294번 위치, 295번 위치, 296번 위치, 297번 위치, 298번 위치, 299번 위치, 300번 위치, 301번 위치, 302번 위치, 303번 위치, 304번 위치, 305번 위치, 311번 위치, 313번 위치, 315번 위치, 317번 위치, 318번 위치, 320번 위치, 322번 위치, 323번 위치, 324번 위치, 325번 위치, 326번 위치, 327번 위치, 328번 위치, 329번 위치, 330번 위치, 331번 위치, 332번 위치, 333번 위치, 334번 위치, 335번 위치, 336번 위치, 337번 위치, 339번 위치, 376번 위치, 377번 위치, 378번 위치, 379번 위치, 380번 위치, 382번 위치, 385번 위치, 392번 위치, 396번 위치, 421번 위치, 427번 위치, 428번 위치, 429번 위치, 434번 위치, 436번 위치 및 440번 위치의 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산이 천연형 Fc영역과 다른 아미노산으로 개변되어 있는 Fc영역을 적합하게 들 수 있다.
억제형 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 활성형 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성보다도 높은 Fc영역
본 명세서에 있어서 특정 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 그 이외의 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성보다도 높은 예로서, 예를 들면 억제형 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 활성형 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성보다도 높은 경우를 들 수 있다. 이 경우, Fc영역의 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 FcγRIa, FcγRIIa, FcγRIIIa 및/또는 FcγRIIIb 중 어느 하나의 인간 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성보다도 높은 것을 말한다. 예를 들면 상기의 해석방법을 토대로, Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자의 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 FcγRIa, FcγRIIa, FcγRIIIa 및/또는 FcγRIIIb 중 어느 하나의 인간 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성의 105% 이상, 바람직하게는 110% 이상, 120% 이상, 130% 이상, 140% 이상, 특히 바람직하게는 150% 이상, 160% 이상, 170% 이상, 180% 이상, 190% 이상, 200% 이상, 250% 이상, 300% 이상, 350% 이상, 400% 이상, 450% 이상, 500% 이상, 750% 이상, 10배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 40배 이상, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배 이상의 결합 활성을 나타내는 것을 말한다. 억제형 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 활성형 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성보다도 높은 Fc영역은 항원 결합 도메인이 가용형 분자에 결합하는 본 발명의 항원 결합 분자에 적합하게 포함될 수 있다.
본 발명의 비한정의 일태양에서는 억제형 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 활성형 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성보다도 높은(억제형 Fcγ 수용체에 대한 선택적인 결합 활성을 갖는) Fc영역의 예로서, 상기 Fc영역의 아미노산 중 EU 넘버링으로 표시되는 238 또는 328의 아미노산이 천연형 Fc영역과 다른 아미노산으로 개변되어 있는 Fc영역을 적합하게 들 수 있다.
또한 본 발명의 비한정의 일태양에서는 억제형 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 활성형 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성보다도 높은(억제형 Fcγ 수용체에 대한 선택적인 결합 활성을 갖는) Fc영역의 예로서, 상기 Fc영역의 EU 넘버링으로 표시되는 아미노산으로서 EU 넘버링으로 표시되는 238의 아미노산이 Asp 또는 328의 아미노산이 Glu 중 어느 하나 이상으로 개변되어 있는 Fc영역을 적합하게 들 수 있다. 또한 억제형 Fcγ 수용체에 대한 선택적인 결합 활성을 갖는 Fc영역으로서 US2009/0136485에 기재되어 있는 Fc영역 또는 개변도 적절하게 선택할 수 있다.
또한 본 발명의 비한정의 일태양에서는, 상기 Fc영역의 EU 넘버링으로 표시되는 아미노산으로서 EU 넘버링으로 표시되는 238의 아미노산이 Asp 또는 328의 아미노산이 Glu 중 어느 하나 이상으로 개변되어 있는 Fc영역을 적합하게 들 수 있다.
또한 본 발명의 비한정의 일태양에서는, PCT/JP2012/054624에서 예시되는 EU 넘버링으로 표시되는 238번 위치의 Pro의 Asp로의 치환 및 EU 넘버링으로 표시되는 237번 위치의 아미노산이 Trp, EU 넘버링으로 표시되는 237번 위치의 아미노산이 Phe, EU 넘버링으로 표시되는 267번 위치의 아미노산이 Val, EU 넘버링으로 표시되는 267번 위치의 아미노산이 Gln, EU 넘버링으로 표시되는 268번 위치의 아미노산이 Asn, EU 넘버링으로 표시되는 271번 위치의 아미노산이 Gly, EU 넘버링으로 표시되는 326번 위치의 아미노산이 Leu, EU 넘버링으로 표시되는 326번 위치의 아미노산이 Gln, EU 넘버링으로 표시되는 326번 위치의 아미노산이 Glu, EU 넘버링으로 표시되는 326번 위치의 아미노산이 Met, EU 넘버링으로 표시되는 239번 위치의 아미노산이 Asp, EU 넘버링으로 표시되는 267번 위치의 아미노산이 Ala, EU 넘버링으로 표시되는 234번 위치의 아미노산이 Trp, EU 넘버링으로 표시되는 234번 위치의 아미노산이 Tyr, EU 넘버링으로 표시되는 237번 위치의 아미노산이 Ala, EU 넘버링으로 표시되는 237번 위치의 아미노산이 Asp, EU 넘버링으로 표시되는 237번 위치의 아미노산이 Glu, EU 넘버링으로 표시되는 237번 위치의 아미노산이 Leu, EU 넘버링으로 표시되는 237번 위치의 아미노산이 Met, EU 넘버링으로 표시되는 237번 위치의 아미노산이 Tyr, EU 넘버링으로 표시되는 330번 위치의 아미노산이 Lys, EU 넘버링으로 표시되는 330번 위치의 아미노산이 Arg, EU 넘버링으로 표시되는 233번 위치의 아미노산이 Asp, EU 넘버링으로 표시되는 268번 위치의 아미노산이 Asp, EU 넘버링으로 표시되는 268번 위치의 아미노산이 Glu, EU 넘버링으로 표시되는 326번 위치의 아미노산이 Asp, EU 넘버링으로 표시되는 326번 위치의 아미노산이 Ser, EU 넘버링으로 표시되는 326번 위치의 아미노산이 Thr, EU 넘버링으로 표시되는 323번 위치의 아미노산이 Ile, EU 넘버링으로 표시되는 323번 위치의 아미노산이 Leu, EU 넘버링으로 표시되는 323번 위치의 아미노산이 Met, EU 넘버링으로 표시되는 296번 위치의 아미노산이 Asp, EU 넘버링으로 표시되는 326번 위치의 아미노산이 Ala, EU 넘버링으로 표시되는 326번 위치의 아미노산이 Asn, EU 넘버링으로 표시되는 330번 위치의 아미노산이 Met 중 어느 하나 이상으로 개변되어 있는 Fc영역을 적합하게 들 수 있다.
당쇄가 수식된 Fc영역
본 발명이 제공하는 항원 결합 분자에 포함되는 Fc영역으로서, Fc영역에 결합한 당쇄의 조성이 푸코오스 결손 당쇄를 결합한 Fc영역의 비율이 높아지도록, 또는 바이섹팅 N-아세틸글루코사민이 부가된 Fc영역의 비율이 높아지도록 수식된 Fc영역도 포함될 수 있다. 항체 Fc영역에 결합하는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민으로부터 푸코오스 잔기를 제거하면 FcγRIIIa에 대한 친화성이 증강되는 것이 것이 알려져 있다(비특허문헌 6). 이러한 Fc영역을 포함하는 IgG1 항체는 후술하는 ADCC 활성이 증강되어 있는 것이 알려져 있는 것으로부터, 당해 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자는 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항원 결합 분자로서도 유용하다. 항체 Fc영역에 결합하는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민으로부터 푸코오스 잔기가 제거된 항체로서는, 예를 들면 다음과 같은 항체；
글리코실화가 수식된 항체(국제공개 WO1999/054342 등),
당쇄에 부가하는 푸코오스가 결손된 항체(국제공개 WO2000/061739, WO2002/031140, WO2006/067913 등),
보다 구체적으로는 항체 Fc영역에 결합하는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민으로부터 푸코오스 잔기가 제거된 항체의 다른 비한정의 일태양으로서, 당쇄에 부가하는 푸코오스가 결손된 항체(국제공개 WO2000/061739, WO2002/031140, WO2006/067913 등)를 제작하기 위해, 당쇄 수식을 받는 폴리펩티드의 당쇄 구조를 형성하는 활성이 개변된 결과, 당쇄에 푸코오스를 부가하는 능력이 낮은 숙주세포가 제작된다. 당해 숙주세포에 있어서 목적하는 항체 유전자를 발현시킴으로써, 당해 숙주세포의 배양액으로부터 그 당쇄 중의 푸코오스가 결손된 당해 항체가 회수될 수 있다. 폴리펩티드의 당쇄 구조를 형성하는 활성으로서 푸코실트랜스페라아제(EC 2.4.1.152), 푸코오스 트랜스포터(SLC35C1), GMD(GDP-만노오스 4,6-디히드라타아제)(EC 4.2.1.47), Fx(GDP-케토-6-데옥시만노오스 3,5-에피머라아제, 4-리덕타아제)(EC 1.1.1.271) 및 GFPP(GDP-β-L-푸코오스 피로포스포릴라아제)(EC 2.7.7.30)로 이루어진 군으로부터 선택되는 효소 또는 트랜스포터의 활성을 비한정의 적합한 예로서 들 수 있다. 이들 효소 또는 트랜스포터는 그 활성을 발휘할 수 있다면 반드시 그 구조가 특정되는 것은 아니다. 본 명세서에 있어서는 이들 활성을 발휘하는 것이 가능한 단백질을 기능성 단백질이라 한다. 이들 활성을 개변하는 방법의 비한정의 일태양으로서 이들 활성의 결실을 들 수 있다. 이들 활성이 결실된 숙주세포를 제작하기 위해 이들 기능성 단백질의 유전자를 기능 불능으로 파괴하는 방법 등 공지의 방법이 적절히 채용될 수 있다(국제공개 WO2000/061739, WO2002/031140, WO2006/067913 등). 이러한 활성이 결실된 숙주세포는 CHO세포, BHK세포, NS0세포, SP2/0세포, YO 골수종세포, P3X63 마우스 골수종세포, PER세포, PER.C6세포, HEK293세포 또는 하이브리도마 세포 등에 내재성인 이들 기능성 단백질의 유전자를 기능 불능으로 파괴하는 방법 등에 의해 제작될 수 있다.
바이섹팅 GlcNAc을 갖는 당쇄를 갖는 항체(국제공개 WO2002/079255 등)가 공지이다. 비한정의 일태양에서는 바이섹팅 GlcNAc을 갖는 당쇄를 갖는 항체를 제작하기 위해, GnTIII(β-1,4-만노실-글리코프로테인, 4-β-N-아세틸글루코사미닐트랜스페라아제)(EC 2.4.1.144) 활성 또는 GalT(β-1,4-갈락토실트랜스페라아제)(EC 2.4.1.38) 활성을 갖는 기능성 단백질을 코드하는 유전자를 발현하는 숙주세포가 제작된다. 다른 비한정의 적합한 일태양에서는 상기 기능성 단백질에 더하여 인간 ManII(만노시다아제 II)(3.2.1.114) 활성을 갖는 기능성 단백질을 코드하는 유전자, GnTI(β-1,2-아세틸글루코사미닐트랜스페라아제 I)(EC 2.4.1.94) 활성을 갖는 기능성 단백질을 코드하는 유전자, GnTII(β-1,2-아세틸글루코사미닐트랜스페라아제 II)(EC 2.4.1.143) 활성을 갖는 기능성 단백질을 코드하는 유전자, ManI(만노시다아제)(EC 3.2.1.113) 활성을 갖는 기능성 단백질을 코드하는 유전자 및 α-1,6-푸코실트랜스페라아제(EC 2.4.1.68)와 공발현하는 숙주세포가 제작된다(국제공개 WO2004/065540).
상기와 같은 당쇄에 푸코오스를 부가하는 능력이 낮은 숙주세포 및 바이섹팅 GlcNAc 구조를 포함하는 당쇄를 형성하는 활성을 갖는 숙주세포에 항체 유전자를 포함하는 발현 벡터를 형질 도입함으로써, 항체 Fc영역에 결합하는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민으로부터 푸코오스 잔기가 제거된 항체 및 바이섹팅 GlcNAc을 갖는 당쇄를 갖는 항체가 각각 제작될 수 있다. 이들 항체의 제조방법은 본 발명의 Fc영역에 결합한 당쇄의 조성이 푸코오스 결손 당쇄를 결합한 Fc영역의 비율이 높아지도록, 또는 바이섹팅 N-아세틸글루코사민이 부가된 Fc영역의 비율이 높아지도록 수식된 개변 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자의 제조방법에도 적용하는 것이 가능하다. 이러한 제조방법에 의해 제작된 본 발명의 항원 결합 분자에 포함되는 Fc영역에 결합한 당쇄의 조성은 상기 「Fcγ 수용체(FcγR) 결합 개변 Fc영역」에서 기재된 방법에 의해 확인될 수 있다.
다중특이성 항원 결합 분자 또는 다중 파라토픽 항원 결합 분자(multiparatopic antigen-binding molecules)
그 하나 이상의 항원 결합 도메인이 항원 분자 중의 제1 에피토프에 결합하고, 그 하나 이상의 다른 항원 결합 도메인이 항원 분자 중의 제2 에피토프에 결합하는 특징을 갖는 2개 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자는 그 반응의 특이성이라는 관점에서 다중특이성 항원 결합 분자라 불린다. 1분자의 항원 결합 분자에 포함되는 2종류의 항원 결합 도메인에 의해 당해 항원 결합 분자가 2개의 상이한 에피토프에 결합하는 경우, 당해 항원 결합 분자는 이중특이성 항원 결합 분자라 불린다. 또한 1분자의 항원 결합 분자에 포함되는 3종류의 항원 결합 도메인에 의해 당해 항원 결합 분자가 3개의 상이한 에피토프에 결합하는 경우, 당해 항원 결합 분자는 삼중특이성 항원 결합 분자라 불린다.
항원 분자 중의 제1 에피토프에 결합하는 항원 결합 도메인 중의 파라토프와 제1 에피토프와 구조가 상이한 제2 에피토프에 결합하는 항원 결합 도메인 중의 파라토프는 그 구조가 서로 다르다. 이 때문에 그 하나 이상의 항원 결합 도메인이 항원 분자 중의 제1 에피토프에 결합하고, 그 하나 이상의 다른 항원 결합 도메인이 항원 분자 중의 제2 에피토프에 결합하는 특징을 갖는 2개 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자는 그 구조의 특이성이라는 관점에서 다중 파라토픽 항원 결합 분자라 불린다. 1분자의 항원 결합 분자에 포함되는 2종류의 항원 결합 도메인에 의해 당해 항원 결합 분자가 2개의 상이한 에피토프에 결합하는 경우, 당해 항원 결합 분자는 이중 파라토픽 항원 결합 분자라 불린다. 또한 1분자의 항원 결합 분자에 포함되는 3종류의 항원 결합 도메인에 의해 당해 항원 결합 분자가 3개의 상이한 에피토프에 결합하는 경우, 당해 항원 결합 분자는 삼중 파라토픽 항원 결합 분자라 불린다.
하나 또는 복수의 항원 결합 도메인을 포함하는 다가의 다중특이성 또는 다중 파라토픽 항원 결합 분자와 그의 조제방법은 콘라트(Conrath) 등(J.Biol.Chem. (2001) 276 (10) 7346-7350), 묄더만스(Muyldermans)(Rev. Mol. Biotech. (2001) 74, 277-302) 및 콘터만(Kontermann) R.E. (2011) Bispecific Antibodies(Springer-Verlag) 등의 비특허문헌 및 국제공개 WO1996/034103 또는 WO1999/023221 등의 특허문헌 등에도 기재되어 있다. 이들에 기재된 다중특이성 또는 다중 파라토픽 항원 결합 분자와 그의 조제방법을 사용함으로써, 본 발명의 항원 결합 분자를 제작하는 것이 가능하다.
이중특이성 항체와 그의 제작방법
상기와 같은 다중특이성 또는 다중 파라토픽 항원 결합 분자와 그의 조제방법의 일태양으로서, 이중특이성 항체와 그의 제작방법이 하기에 예시된다. 이중특이성 항체란, 상이한 에피토프에 대해 특이적으로 결합하는 2종류의 가변영역을 포함하는 항체이다. IgG형의 이중특이성 항체는 IgG 항체를 생산하는 하이브리도마 2종을 융합함으로써 생성되는 하이브리드 하이브리도마(quadroma)에 의해 분비시키는 것이 가능하다(Milstein 등(Nature (1983) 305, 537-540).
이중특이성 항체를 상기 항체의 항목에서 기재된 바와 같은 재조합 수법을 사용하여 제조하는 경우, 목적의 2종의 가변영역을 포함하는 중쇄를 코드하는 유전자를 세포에 도입하여 그들을 공발현시키는 방법이 채용될 수 있다. 그러나 이러한 공발현시키는 방법에 있어서의 중쇄의 조합을 고려하는 것만으로도, (i) 제1 에피토프에 결합하는 가변영역을 포함하는 중쇄와 제2 에피토프에 결합하는 가변영역을 포함하는 중쇄가 한쌍이 된 중쇄의 조합, (ii) 제1 에피토프에 결합하는 가변영역을 포함하는 중쇄만이 한쌍이 된 중쇄의 조합, (iii) 제2 에피토프에 결합하는 가변영역을 포함하는 중쇄만이 한쌍이 된 중쇄의 조합이 2：1：1의 분자 수의 비율로 존재하는 혼합물이 된다. 이들 3종류의 중쇄의 조합의 혼합물로부터 목적의 중쇄의 조합을 포함하는 항원 결합 분자를 정제하는 것은 곤란하다.
이러한 재조합 수법을 사용하여 이중특이성 항체를 제조할 때, 중쇄를 구성하는 CH3 도메인에 적당한 아미노산 치환의 개변을 가함으로써 헤테로 조합의 중쇄를 포함하는 이중특이성 항체가 우선적으로 분비될 수 있다. 구체적으로는, 한쪽 중쇄의 CH3 도메인에 존재하는 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄(knob(「돌기」의 의미))로 치환하고, 다른 한쪽 중쇄의 CH3 도메인에 존재하는 아미노산 측쇄를 보다 작은 측쇄(hole(「공극」의 의미))로 치환함으로써, 돌기가 공극 내에 배치될 수 있도록 하여 이종(異種)의 중쇄 형성의 촉진 및 동종(同種)의 중쇄 형성의 저해를 일으키는 방법이다(국제공개 WO1996027011, Ridgway 등(Protein Engineering (1996) 9, 617-621), Merchant 등(Nat. Biotech. (1998) 16, 677-681)).
또한 폴리펩티드의 회합 또는 폴리펩티드에 의해 구성되는 이종 다량체 회합의 제어방법을 중쇄의 회합에 이용함으로써 이중특이성 항체를 제작하는 기술도 알려져 있다. 즉, 중쇄 내의 계면을 형성하는 아미노산 잔기를 개변함으로써 동일 서열을 갖는 중쇄의 회합이 저해되어, 서열이 다른 2개의 중쇄가 형성되도록 제어하는 방법이 이중특이성 항체의 제작에 채용될 수 있다(국제공개 WO2006/106905). 이러한 방법도 이중특이성 항체를 제조할 때 채용될 수 있다.
본 발명의 비한정의 일태양에 있어서의 항원 결합 분자에 포함되는 Fc영역으로서는, 상기 이중특이성 항체를 기원으로 하는 Fc영역을 형성하는 2개의 폴리펩티드가 적절히 사용될 수 있다. 보다 구체적으로는, Fc영역을 형성하는 2개의 폴리펩티드로서 그 한쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링으로 표시되는 349의 아미노산이 Cys, 366의 아미노산이 Trp이고, 다른 쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링으로 표시되는 356의 아미노산이 Cys, 366의 아미노산이 Ser, 368의 아미노산이 Ala, 407의 아미노산이 Val인 것을 특징으로 하는 2개의 폴리펩티드가 적합하게 사용된다.
그 밖의 본 발명의 비한정의 일태양에 있어서의 Fc영역으로서는, Fc영역을 형성하는 2개의 폴리펩티드로서 그 한쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링으로 표시되는 409의 아미노산이 Asp이고, 다른 쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링으로 표시되는 399의 아미노산이 Lys인 것을 특징으로 하는 2개의 폴리펩티드가 적합하게 사용된다. 상기 태양에서는 409의 아미노산은 Asp 대신에 Glu, 399의 아미노산은 Lys 대신에 Arg일 수도 있다. 또한 399의 아미노산인 Lys에 더하여 360의 아미노산으로서 Asp 또는 392의 아미노산으로서 Asp도 적합하게 추가될 수 있다.
본 발명의 다른 비한정의 일태양에 있어서의 Fc영역으로서는, Fc영역을 형성하는 2개의 폴리펩티드로서 그 한쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링으로 표시되는 370의 아미노산이 Glu이고, 다른 쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링으로 표시되는 357의 아미노산이 Lys인 것을 특징으로 하는 2개의 폴리펩티드가 적합하게 사용된다.
본 발명의 또 다른 비한정의 일태양에 있어서의 Fc영역으로서는, Fc영역을 형성하는 2개의 폴리펩티드로서 그 한쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링으로 표시되는 439의 아미노산이 Glu이고, 다른 쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링으로 표시되는 356의 아미노산이 Lys인 것을 특징으로 하는 2개의 폴리펩티드가 적합하게 사용된다.
본 발명의 다른 비한정의 일태양에 있어서의 Fc영역으로서는, 이들이 조합된 아래의 태양 중 어느 하나；
(i) Fc영역을 형성하는 2개의 폴리펩티드로서 그 한쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링으로 표시되는 409의 아미노산이 Asp, 370의 아미노산이 Glu이고, 다른 쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링으로 표시되는 399의 아미노산이 Lys, 357의 아미노산이 Lys인 것을 특징으로 하는 2개의 폴리펩티드(본 태양에서는 EU 넘버링으로 표시되는 370의 아미노산인 Glu 대신에 Asp여도 되고, EU 넘버링으로 표시되는 370의 아미노산인 Glu 대신에 392의 아미노산인 Asp여도 된다),
(ii) Fc영역을 형성하는 2개의 폴리펩티드로서 그 한쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링으로 표시되는 409의 아미노산이 Asp, 439의 아미노산이 Glu이고, 다른 쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링으로 표시되는 399의 아미노산이 Lys, 356의 아미노산이 Lys인 것을 특징으로 하는 2개의 폴리펩티드(본 태양에서는 EU 넘버링으로 표시되는 439의 아미노산인 Glu 대신에 360의 아미노산인 Asp, EU 넘버링으로 표시되는 392의 아미노산인 Asp 또는 439의 아미노산인 Asp여도 된다),
(iii) Fc영역을 형성하는 2개의 폴리펩티드로서 그 한쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링으로 표시되는 370의 아미노산이 Glu, 439의 아미노산이 Glu이고, 다른 쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링으로 표시되는 357의 아미노산이 Lys, 356의 아미노산이 Lys인 것을 특징으로 하는 2개의 폴리펩티드, 또는
Fc영역을 형성하는 2개의 폴리펩티드로서 그 한쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링으로 표시되는 409의 아미노산이 Asp, 370의 아미노산이 Glu, 439의 아미노산이 Glu이고, 다른 쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링으로 표시되는 399의 아미노산이 Lys, 357의 아미노산이 Lys, 356의 아미노산이 Lys인 것을 특징으로 하는 2개의 폴리펩티드(본 태양에서는 EU 넘버링으로 표시되는 370의 아미노산을 Glu로 치환하지 않아도 되고, 또한 370의 아미노산을 Glu로 치환하지 않고 439의 아미노산인 Glu 대신에 Asp 또는 439의 아미노산인 Glu 대신에 392의 아미노산인 Asp여도 된다.)
가 적합하게 사용된다.
또한 본 발명의 다른 비한정의 일태양에 있어서, Fc영역을 형성하는 2개의 폴리펩티드로서 그 한쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링으로 표시되는 356의 아미노산이 Lys이고, 다른 쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링으로 표시되는 435의 아미노산이 Arg, 439의 아미노산이 Glu인 것을 특징으로 하는 2개의 폴리펩티드도 적합하게 사용된다.
또한 본 발명의 다른 비한정의 일태양에 있어서, Fc영역을 형성하는 2개의 폴리펩티드로서 그 한쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링으로 표시되는 356의 아미노산이 Lys, 357의 아미노산이 Lys이고, 다른 쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링으로 표시되는 370의 아미노산이 Glu, 435의 아미노산이 Arg, 439의 아미노산이 Glu인 것을 특징으로 하는 2개의 폴리펩티드도 적합하게 사용된다.
또한 상기 이종의 중쇄의 회합기술 외에, 제1 에피토프에 결합하는 가변영역을 형성하는 경쇄 및 제2 에피토프에 결합하는 가변영역을 형성하는 경쇄를 각각 제1 에피토프에 결합하는 가변영역을 형성하는 중쇄 및 제2 에피토프에 결합하는 가변영역을 형성하는 중쇄에 회합시키는 이종의 경쇄의 회합기술로서 알려지는 CrossMab 기술(Scaefer 등(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. (2011) 108, 11187-11192))도 본 발명이 제공하는 다중특이성 또는 다중 파라토픽 항원 결합 분자를 제작하기 위해 사용될 수 있다. 또한 상이한 IgG4의 중쇄끼리의 교환이 일어나는 것을 이용하여 제1 에피토프에 결합하는 가변영역을 형성하는 중쇄 및 제2 에피토프에 결합하는 가변영역을 형성하는 중쇄를 회합시키는 이종의 중쇄의 회합기술로서 알려지는 Fab-Arm Exchange(Labrijn 등(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2013) 110, 5145-5150), WO2008119353)도 본 발명이 제공하는 다중특이성 또는 다중 파라토픽 항원 결합 분자를 제작하기 위해 사용될 수 있다.
이펙터 세포(Effector cells)
본 발명에 있어서 「이펙터 세포」란, T세포(CD4+(헬퍼 림프구) T세포 및/또는 CD8+(세포 상해성) T세포), 다핵 백혈구(호중구, 호산구, 호염기구, 비만세포), 단구, 마크로파지, 조직구 또는 내츄럴 킬러세포(NK세포), NK 유사 T세포, 쿠퍼세포, 랑게르한스 세포 또는 림포카인 활성화 킬러세포(LAK세포) 등의 백혈구, B 림프구 또는 수상세포 또는 마크로파지 등의 항원 제시 세포를 포함하는 가장 넓은 의미로 사용될 수 있는데, 적합한 이펙터 세포의 예로서는 CD8+(세포 상해성) T세포, NK세포 또는 마크로파지를 들 수 있다. 이펙터 세포의 세포막에 발현하는 막형 분자라면, 본 발명의 항원 결합 분자에 포함되는 하나 이상의 항원 결합 도메인이 결합하는 항원으로서 사용될 수 있는데, 적합한 막형 분자로서는 TCR을 구성하는 폴리펩티드, CD3, CD2, CD28, CD44, CD16, CD32, CD64 또는 NKG2D 또는 NK세포 활성화 리간드가 비한정의 예로서 예시될 수 있다.
세포 상해성 물질
본 발명의 항원 결합 분자가 암세포에 결합하여 세포 상해 활성을 발휘하기 위해 항원 결합 분자에 세포 상해성 물질이 결합되어 있어도 된다. 세포 상해성 물질로서는 아래에 예시되는 화학요법제여도 되고, 또한 Curr Opin Chem Biol (2010) 14, 529-37이나 국제공개 2009/140242에 개시되어 있는 화합물이어도 되며, 이들 화합물이 적절한 링커 등으로 항원 결합 분자에 결합된다. 본 발명의 항원 결합 분자가 의약 조성물로서 사용되는 경우, 대상(피험자, 환자 등)에 당해 항원 결합 분자를 투여하기 전에 이들 세포 상해성 물질을 결합시키는 것도 가능하고, 투여 전후 또는 동시에 투여하는 것도 가능하다.
또한 후술되는 화학요법제, 독성 펩티드 또는 방사성 화학물질 등의 세포 상해성 물질이 결합된 수식 항원 결합 분자 수식물도 본 발명의 세포 상해 활성을 갖는 항원 결합 분자로서 적합하게 사용될 수 있다. 이러한 수식 항원 결합 분자(이하, 항원 결합 분자 약물 콘쥬게이트라 칭한다.)는 얻어진 항원 결합 분자를 화학적으로 수식함으로써 취득될 수 있다. 또한 항원 결합 분자의 수식방법으로서 항체 약물 콘쥬게이트 등의 분야에 있어서 이미 확립되어 있는 방법이 적절히 사용될 수 있다. 또한 독성 펩티드가 결합된 수식 항원 결합 분자는 당해 독성 펩티드를 코드하는 유전자와 본 발명의 항원 결합 분자를 코드하는 유전자가 인프레임으로 연결된 융합 유전자를 적절한 숙주세포 중에서 발현시킨 후에, 당해 세포의 배양액으로부터 단리함으로써 취득될 수 있다.
본 발명의 항원 결합 분자에 결합되는 화학요법제가 예시될 수 있다：아자리빈(azaribine), 아나스트로졸(anastrozole), 아자시티딘(azacytidine), 블레오마이신(bleomycin), 보르테조밉(bortezomib), 브리오스타틴-1(bryostatin-1), 부설판(busulfan), 캄토테신(camptothecin), 10-히드록시캄토테신(10-hydroxycamptothecin), 카르무스틴(carmustine), 셀레브렉스(celebrex), 클로람부실(chlorambucil), 시스플라틴(cisplatin), 이리노테칸(irinotecan), 카르보플라틴(carboplatin), 클라드리빈(cladribine), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 시타라빈(cytarabine), 다카르바진(dacarbazine), 도세탁셀(docetaxel), 닥티노마이신(dactinomycin), 다우노마이신 글루쿠로니드(daunomycin glucuronide), 다우노루비신(daunorubicin), 덱사메타손(dexamethasone), 디에틸스틸베스트롤(diethylstilbestrol), 독소루비신(doxorubicin), 독소루비신 글루쿠로니드(doxorubicin glucuronide), 에피루비신(epirubicin), 에티닐 에스트라디올(ethinyl estradiol), 에스트라무스틴(estramustine), 에토포시드(etoposide), 에토포시드 글루쿠로니드(etoposide glucuronide), 플록수리딘(floxuridine), 플루다라빈(fludarabine), 플루타미드(flutamide), 플루오로우라실(fluorouracil), 플루옥시메스테론(fluoxymesterone), 겜시타빈(gemcitabine), 히드록시프로게스테론 카프로에이트(hydroxyprogesterone caproate), 히드록시우레아(hydroxyurea), 이다루비신(idarubicin), 이포스파미드(ifosfamide), 류코보린(leucovorin), 롬스틴(lomustine), 마이탄시노이드(maytansinoid), 메클로레타민(mechlorethamine), 메드록시프로게스테론 아세테이트(medroxyprogesterone acetate), 메게스테롤 아세테이트(megestrol acetate), 멜팔란(melphalan), 메르캅토푸린(mercaptopurine), 메토트렉세이트(methotrexate), 미톡산트론(mitoxantrone), 미트라마이신(mithramycin), 미토마이신(mitomycin), 미토탄(mitotane), 페닐부티레이트(phenylbutyrate), 프레드니손(prednisone), 프로카르바진(procarbazine), 파클리탁셀(paclitaxel), 펜토스타틴(pentostatin), 세무스틴(semustine), 스트렙토조신(streptozocin), 타목시펜(tamoxifen), 탁산류(taxanes), 탁솔(taxol), 테스토스테론 프로피오네이트(testosterone propionate), 탈리도마이드(thalidomide), 티오구아닌(thioguanine), 티오테파(thiotepa), 테니포시드(teniposide), 토포테칸(topotecan), 우라실 머스타드(uracil mustard), 빈블라스틴(vinblastine), 비노렐빈(vinorelbine), 빈크리스틴(vincristine).
본 발명에 있어서 바람직한 화학요법제는 저분자의 화학요법제이다. 저분자의 화학요법제는 본 발명의 항원 결합 분자가 결합한 후에도 항원 결합 분자의 기능에 간섭할 가능성이 낮다. 본 발명에 있어서 저분자의 화학요법제는 통상 100~2,000, 바람직하게는 200~1,000의 분자량을 갖는다. 여기에 예시한 화학요법제는 모두 저분자의 화학요법제이다. 이들 본 발명에 있어서의 화학요법제는 생체 내에서 활성인 화학요법제로 변환되는 프로드러그를 포함한다. 프로드러그의 활성화는 효소적인 변환일 수 있고, 비효소적인 변환일 수도 있다.
또한 본 발명의 항원 결합 분자에 결합되는 세포 상해성 물질로서는, 슈도모나스 외독소 A(Pseudomonas exotoxin A), 사포린-s6(Saporin-s6), 디프테리아 독소(Diphtheria toxin), 무척추동물 독소(Cnidarian toxin) 등의 독성 펩티드(독소)나 방사성 요오드(Radioiodine), 감광제(Photosensitizer)도 예시될 수 있다. 독성 펩티드의 예로서는, 예를 들면 다음의 것을 적합하게 들 수 있다.
디프테리아 독소 A쇄(Diphtheria toxin A Chain)(Langone 등(Methods in Enzymology (1983) 93, 307-308))；
슈도모나스 외독소(Pseudomonas Exotoxin)(Nature Medicine (1996) 2, 350-353)；
리신 사슬(Ricin A Chain)(Fulton 등(J. Biol. Chem. (1986) 261, 5314-5319), Sivam 등(Cancer Res. (1987) 47, 3169-3173), Cumber 등, (J. Immunol. Methods (1990) 135,15-24, Wawrzynczak 등(Cancer Res. (1990) 50, 7519-7562) 및 Gheeite 등(J. Immunol.Methods (1991) 142,223-230))；
무당쇄 리신 A쇄(Deglicosylated Ricin A Chain)(Thorpe 등(Cancer Res. (1987) 47, 5924-5931))；
아브린 A쇄(Abrin A Chain)(Wawrzynczak 등(Br. J. Cancer (1992) 66, 361-366), Wawrzynczak 등(Cancer Res. (1990) 50, 7519-7562), Sivam 등(Cancer Res. (1987) 47, 3169-3173) 및 Thorpe 등(Cancer Res. (1987) 47, 5924-5931))；
겔로닌(Gelonin)(Sivam 등(Cancer Res. (1987) 47, 3169-3173), Cumber 등(J. Immunol. Methods (1990) 135, 15-24), Wawrzynczak 등(Cancer Res., (1990) 50, 7519-7562) 및 Bolognesi 등(Clin. exp. Immunol. (1992) 89, 341-346))；
포크위드 항바이러스 단백(PAP-s; Pokeweed anti-viral protein fromseeds)(Bolognesi 등(Clin. exp. Immunol. (1992) 89, 341-346))；
브리오딘(Briodin)(Bolognesi 등(Clin. exp. Immunol. (1992) 89, 341-346))；
사포린(Saporin)(Bolognesi 등(Clin. exp. Immunol. (1992) 89, 341-346))；
모모르딘(Momordin)(Cumber 등(J. Immunol. Methods (1990) 135, 15-24)；Wawrzynczak 등(Cancer Res. (1990) 50, 7519-7562) 및 Bolognesi 등(Clin. exp. Immunol. (1992) 89, 341-346))；
모모르코킨(Momorcochin)(Bolognesi 등(Clin. exp. Immunol. (1992) 89, 341-346))；
디안틴 32(Dianthin 32)(Bolognesi 등(Clin. exp. Immunol. (1992) 89, 341-346))；
디안틴 30(Dianthin 30)(Stirpe F., Barbieri L.(FEBS letter (1986) 195, 1-8))；
모덱신(Modeccin)(Stirpe F., Barbieri L.(FEBS letter (1986) 195, 1-8))；
비스쿠민(Viscumin)(Stirpe F., Barbieri L.(FEBS letter (1986) 195, 1-8))；
볼케신(Volkesin)(Stirpe F., Barbieri L.(FEBS letter (1986) 195, 1-8))；
도데칸드린(Dodecandrin)(Stirpe F., Barbieri L.(FEBS letter (1986) 195, 1-8))；
트리틴(Tritin)(Stirpe F., Barbieri L.(FEBS letter (1986) 195, 1-8))；
루핀(Luffin)(Stirpe F., Barbieri L.(FEBS letter (1986) 195, 1-8))；및
트리코키린(Trichokirin)(Casellas 등(Eur. J. Biochem. (1988) 176, 581-588) 및 Bolognesi 등(Clin. exp. Immunol., (1992) 89, 341-346)).
항원 결합 분자
본 발명에 있어서 저분자 화합물(예를 들면 표적 조직 특이적인 화합물)의 존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 당해 화합물의 비존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다도 높은 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자는 가장 넓은 의미로서 사용되고 있고, 구체적으로는, 그들이 항원에 대한 결합 활성을 나타내는 한 다양한 분자형이 포함된다. 예를 들면 항원 결합 도메인이 Fc영역과 결합한 분자의 예로서 항체를 들 수 있다. 항체에는 단일의 단일클론 항체(아고니스트 및 안타고니스트 항체를 포함함), 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체 등이 포함될 수 있다. 또한 항체의 단편으로서 사용되는 경우로서는 항원 결합 도메인 및 항원 결합 단편(예를 들면 Fab, F(ab')2, scFv 및 Fv)을 적합하게 들 수 있다. 기존의 안정한 α/β 배럴 단백질 구조 등의 입체구조가 토대(scaffold)로서 사용되고, 그 일부분의 구조만이 항원 결합 도메인의 구축을 위해 라이브러리화된 스캐폴드 분자도 본 발명의 항원 결합 분자에 포함될 수 있다.
본 발명의 항원 결합 분자는 Fcγ 수용체에 대한 결합 및/또는 FcRn에 대한 결합을 매개하는 Fc영역의 적어도 부분을 포함할 수 있다. 예를 들면 비한정의 일태양에서는 항원 결합 분자는 항체 또는 Fc융합 단백질일 수 있다. 융합 단백질이란 천연에서는 그것이 자연히 연결되지 않는 제2 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 연결된 제1 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 키메라 폴리펩티드를 말한다. 예를 들면 융합 단백질은 Fc영역의 적어도 부분(예를 들면 Fcγ 수용체에 대한 결합을 부여하는 Fc영역의 부분 및/또는 FcRn에 대한 결합을 부여하는 Fc영역의 부분)을 코드하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 아미노산 서열은 함께 융합 단백질에 운반되는 각각의 단백질에 존재할 수 있거나 또는 그들은 통상은 동일 단백질에 존재할 수 있는데, 융합 폴리펩티드 중의 새로운 재편성에 들어간다. 융합 단백질은 예를 들면 화학합성에 의해 또는 펩티드영역이 목적하는 관계로 코드된 폴리뉴클레오티드를 제작하고, 그것을 발현하는 유전자 재조합 수법에 의해 제작될 수 있다.
본 발명의 각 도메인은 폴리펩티드 결합에 의해 직접 연결될 수 있고, 링커를 매개로 연결될 수 있다. 링커로서는 유전자공학에 의해 도입 가능한 임의의 펩티드 링커 또는 합성 화합물 링커(예를 들면 Holliger 등(Protein Engineering (1996) 9 (3), 299-305))에 개시되는 링커 등이 사용될 수 있는데, 본 발명에 있어서는 펩티드 링커가 바람직하다. 펩티드 링커의 길이는 특별히 한정되지 않고, 목적에 따라 당업자가 적절히 선택하는 것이 가능한데, 바람직한 길이는 5 아미노산 이상(상한은 특별히 한정되지 않으나, 통상 30 아미노산 이하, 바람직하게는 20 아미노산 이하)이고, 특히 바람직하게는 15 아미노산이다.
예를 들면 펩티드 링커의 경우：
Ser
Gly·Ser
Gly·Gly·Ser
Ser·Gly·Gly
Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호：19)
Ser·Gly·Gly·Gly(서열번호：20)
Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호：21)
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(서열번호：22)
Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호：23)
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(서열번호：24)
Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호：25)
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(서열번호：26)
(Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호：21))n
(Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(서열번호：22))n
［n은 1 이상의 정수이다］등을 적합하게 들 수 있다. 단, 펩티드 링커의 길이나 서열은 목적에 따라 당업자가 적절히 선택할 수 있다.
합성 화학물 링커(화학 가교제)는 펩티드의 가교에 통상 사용되고 있는 가교제, 예를 들면 N-히드록시숙신이미드(NHS), 디숙신이미딜수베레이트(DSS), 비스(설포숙신이미딜)수베레이트(BS3), 디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)(DSP), 디티오비스(설포숙신이미딜프로피오네이트)(DTSSP), 에틸렌글리콜비스(숙신이미딜숙시네이트)(EGS), 에틸렌글리콜비스(설포숙신이미딜숙시네이트)(설포-EGS), 디숙신이미딜 타르타르산염(DST), 디설포숙신이미딜 타르타르산염(설포-DST), 비스［2-(숙신이미드옥시카르보닐옥시)에틸］설폰(BSOCOES), 비스［2-(설포숙신이미드옥시카르보닐옥시)에틸］설폰(설포-BSOCOES) 등이며, 이들 가교제는 시판되고 있다.
각 도메인을 연결하는 링커가 복수 사용되는 경우에는, 모두 동종의 링커가 사용될 수 있고, 이종의 링커도 사용될 수 있다. 또한 상기 기재에서 예시되는 링커 외에, 예를 들면 His 태그, HA 태그, myc 태그, FLAG 태그 등의 펩티드 태그를 갖는 링커도 적절히 사용될 수 있다. 또한 수소 결합, 디설피드 결합, 공유 결합, 이온성 상호작용 또는 이들 결합의 조합에 의해 서로 결합하는 성질도 또한 적합하게 이용될 수 있다. 예를 들면 항체의 CH1과 CL 간의 친화성이 이용되거나, 헤테로 Fc영역의 회합시에 전술한 이중특이성 항체를 기원으로 하는 Fc영역이 사용되거나 한다. 또한 도메인 간에 형성되는 디설피드 결합도 또한 적합하게 이용될 수 있다.
각 도메인을 펩티드 결합으로 연결하기 위해 당해 도메인을 코드하는 폴리뉴클레오티드가 인프레임으로 연결된다. 폴리뉴클레오티드를 인프레임으로 연결하는 방법으로서는, 제한 단편의 라이게이션이나 퓨전 PCR, 중복 연장 PCR 등의 수법이 공지이고, 본 발명의 항원 결합 분자의 제작에도 적절히 이들 방법이 단독 또는 조합으로 사용될 수 있다. 본 발명에서는 용어 「연결되고」, 「융합되고」, 「연결」 또는 「융합」은 상호 교환적으로 사용된다. 이들 용어는 상기의 화학 결합 수단 또는 재조합 수법을 포함한 모든 수단에 의해 둘 이상의 폴리펩티드 등의 엘리먼트 또는 성분을 하나의 구조를 형성하도록 연결하는 것을 말한다. 인프레임 융합이란, 둘 이상의 엘리먼트 또는 성분이 폴리펩티드인 경우에 당해 폴리펩티드의 바른 해독틀(reading frame)을 유지하도록 연속된 보다 긴 해독틀을 형성하기 위한 둘 이상의 해독틀 단위의 연결을 말한다. 두 분자의 Fab가 항원 결합 도메인으로서 사용된 경우, 당해 항원 결합 도메인과 Fc영역을 포함하는 불변영역이 링커를 매개로 하지 않고 펩티드 결합에 의해 인프레임으로 연결된 본 발명의 항원 결합 분자인 항체는 본 발명의 적합한 항원 결합 분자로서 사용될 수 있다.
저분자화 항체
본 발명에서 사용되는 항체는 항체의 전장 분자에 한정되지 않고, 저분자화 항체 또는 그의 수식물이어도 된다. 저분자화 항체는 전장 항체(예를 들면 whole IgG 등의 whole antibody)의 일부분이 결손되어 있는 항체 단편을 포함하고, 항원에 대한 결합 활성을 가지고 있으면 특별히 한정되지 않는다. 본 발명의 저분자화 항체는 전장 항체의 일부분이라면 특별히 한정되지 않으나, 중쇄 가변영역(VH) 또는/및 경쇄 가변영역(VL)을 포함하고 있는 것이 바람직하다. VH 또는 VL의 아미노산 서열은 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입되어 있어도 된다. 또한 항원에 대한 결합 활성을 갖는 한, VH 또는/및 VL의 일부를 결손시켜도 된다. 또한 가변영역은 키메라화나 인간화되어 있어도 된다. 항체 단편의 구체예로서는, 예를 들면 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 등을 들 수 있다. 또한 저분자화 항체의 구체예로서는, 예를 들면 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv(single chain Fv), 디아바디(Diabody), sc(Fv)2(single chain (Fv)2) 등을 들 수 있다. 이들 항체의 다량체(예를 들면 다이머, 트리머, 테트라머, 폴리머)도 본 발명의 저분자화 항체에 포함된다.
항체 단편은 항체를 효소, 예를 들면 파파인, 펩신으로 처리함으로써 생성될 수 있고, 또는 이들 항체 단편을 코드하는 유전자를 구축하고 이를 발현 벡터에 도입한 후, 적당한 숙주세포에서 발현될 수 있다(예를 들면 Co 등(J. Immunol.(1994)152, 2968-2976), Better 및 Horwitz(Methods in Enzymology(1989)178, 476-496), Plueckthun 및 Skerra 등(Methods in Enzymology(1989)178, 476-496), Lamoyi(Methods in Enzymology(1989)121, 652-663), Rousseaux 등(Methods in Enzymology(1989)121, 663-669) 및 Bird 등(TIBTECH(1991)9, 132-137)을 참조).
디아바디는 유전자 융합에 의해 구축된 2가(bivalent)의 저분자화 항체를 가리킨다(Holliger 등(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6444-6448 (1993), 유럽 공개공보 EP404097 및 PCT 공개공보 WO1993/011161 등). 디아바디는 2개의 폴리펩티드 사슬로 구성되는 다이머로, 통상 폴리펩티드 사슬은 각각 같은 사슬 중에서 VL 및 VH가 서로 결합 불가능한 정도로 짧은, 예를 들면 5잔기 정도의 링커에 의해 결합되어 있다. 동일 폴리펩티드 사슬 상에 코드되는 VL과 VH는 그 사이의 링커가 짧아 경쇄 가변영역 프래그먼트를 형성하는 것이 불가능하여 이량체를 형성하기 때문에, 디아바디는 2개의 항원 결합부위를 갖게 된다.
scFv는 항체의 H쇄 V영역과 L쇄 V영역을 연결함으로써 얻어진다. 이 scFv에 있어서 H쇄 V영역과 L쇄 V영역은 링커, 바람직하게는 펩티드 링커를 매개로 연결된다(Huston 등(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883). scFv에 있어서의 H쇄 V영역 및 L쇄 V영역은 본 명세서에 항체로서 기재된 것 중 어느 항체 유래여도 된다. V영역을 연결하는 펩티드 링커로서는 특별히 제한은 없지만, 예를 들면 3 내지 25잔기 정도로 이루어지는 임의의 단일 사슬 펩티드, 또한 후술하는 펩티드 링커 등을 사용할 수 있다. V영역의 연결방법으로서는 상기와 같은 PCR법을 이용할 수 있다. 상기 항체의 H쇄 또는 H쇄 V영역을 코드하는 DNA 서열 및 L쇄 또는 L쇄 V영역을 코드하는 DNA 서열 중 전부 또는 목적하는 아미노산 서열을 코드하는 DNA 부분을 주형으로 하여, 그 양단의 서열에 대응하는 서열을 갖는 프라이머의 한쌍을 사용한 PCR법에 의해 scFv를 코드하는 DNA를 증폭할 수 있다. 이어서 펩티드 링커 부분을 코드하는 DNA 및 그 양단이 각각 H쇄, L쇄와 연결되도록 설계된 서열을 갖는 프라이머의 한쌍을 조합하여 PCR 반응을 행함으로써 목적하는 서열을 갖는 DNA를 취득할 수 있다. 또한 일단 scFv를 코드하는 DNA가 제작되면 그들을 함유하는 발현 벡터 및 당해 발현 벡터에 의해 형질전환된 재조합 세포를 통상의 방법에 따라 취득할 수 있으며, 또한 그 결과 얻어지는 재조합 세포를 배양하여 당해 scFv를 코드하는 DNA를 발현시킴으로써 당해 scFv를 취득할 수 있다.
sc(Fv)2는 2개의 VH 및 2개의 VL을 링커 등으로 결합하여 단일 사슬로 한 저분자화 항체이다(Hudson 등(J. Immunol. Methods (1999) 231, 177-189)). sc(Fv)2는 예를 들면 scFv를 링커로 연결함으로써 제작할 수 있다.
또한 2개의 VH 및 2개의 VL이 단일 사슬 폴리펩티드의 N말단측을 기점으로 하여 VH, VL, VH, VL(［VH］링커［VL］링커［VH］링커［VL］)의 순으로 나열되어 있는 것을 특징으로 하는 항체가 바람직하다. 2개의 VH와 2개의 VL의 순서는 특별히 상기 배치에 한정되지 않고, 어떠한 순서로 나열되어 있어도 된다. 예를 들면 아래와 같은 배치도 들 수 있다.
-［VL］링커［VH］링커［VH］링커［VL］
-［VH］링커［VL］링커［VL］링커［VH］
-［VH］링커［VH］링커［VL］링커［VL］
-［VL］링커［VL］링커［VH］링커［VH］
-［VL］링커［VH］링커［VL］링커［VH］
항체의 가변영역을 결합하는 링커로서는, 상기 항원 결합 분자의 항목에서 기재된 링커와 동일한 링커가 사용될 수 있다. 예를 들면 본 발명에 있어서 특히 바람직한 sc(Fv)2의 태양으로서는, 예를 들면 아래의 sc(Fv)2를 들 수 있다.
-［VH］펩티드 링커(15 아미노산)［VL］펩티드 링커(15 아미노산)［VH］펩티드 링커(15 아미노산)［VL］
4개의 항체 가변영역을 결합하는 경우에는 통상 3개의 링커가 필요해지는데, 모두 동일한 링커를 사용해도 되고, 상이한 링커를 사용해도 된다. 본 발명에 있어서 비한정의 저분자화 항체의 일태양으로서, 서로 다른 파라토프로서 한쪽 파라토프가 암세포나 염증 조직에 침윤되어 있는 세포 등의 세포막에 결합하는 막형 분자에 존재하는 에피토프에 결합하고, 다른 한쪽 파라토프가 이펙터 세포의 세포막에 발현하는 막형 분자 중에 존재하는 에피토프에 결합하는 디아바디 또는 sc(Fv)2가 예시될 수 있다. 상기 디아바디 또는 sc(Fv)2에서는 암세포나 염증 조직에 침윤되어 있는 세포 등의 세포막에 결합하는 막형 분자에 존재하는 에피토프에 대한 한쪽 파라토프의 결합 활성이 저분자 화합물(예를 들면 암조직 특이적 화합물, 염증 조직 특이적 화합물, 비천연 화합물)에 의존적일 수 있고, 이펙터 세포의 세포막에 결합하는 막형 분자에 존재하는 에피토프에 대한 한쪽 파라토프의 결합 활성이 저분자 화합물(예를 들면 암조직 특이적 화합물, 염증 조직 특이적 화합물, 비천연 화합물)에 의존적일 수 있으며, 또한 양쪽 파라토프의 결합 활성이 저분자 화합물(예를 들면 암조직 특이적 화합물, 염증 조직 특이적 화합물, 비천연 화합물)에 의존적일 수 있다.
본 발명에 있어서 비한정의 저분자화 항체의 일태양으로서, 서로 다른 파라토프로서 한쪽 파라토프가 암세포나 염증 조직에 침윤되어 있는 세포 등의 세포막에 결합하는 막형 분자에 존재하는 에피토프에 결합하고, 다른 한쪽 파라토프가 세포 상해성 물질에 존재하는 에피토프에 결합하는 디아바디 또는 sc(Fv)2가 예시될 수 있다. 상기 디아바디 또는 sc(Fv)2에서는 암세포나 염증 조직에 침윤되어 있는 세포 등의 세포막에 결합하는 막형 분자에 존재하는 에피토프에 대한 한쪽 파라토프의 결합 활성이 저분자 화합물(예를 들면 암조직 특이적 화합물, 염증 조직 특이적 화합물, 비천연 화합물)에 의존적일 수 있고, 세포 상해성 물질에 존재하는 에피토프에 대한 한쪽 파라토프의 결합 활성이 저분자 화합물(예를 들면 암조직 특이적 화합물, 염증 조직 특이적 화합물, 비천연 화합물)에 의존적일 수 있으며, 또한 양쪽 파라토프의 결합 활성이 암조직 특이적 화합물에 의존적일 수 있다.
이러한 저분자화 항체를 얻기 위해서는 항체를 효소, 예를 들면 파파인, 펩신 등으로 처리하여 항체 단편을 생성시키거나 또는 이들 항체 단편 또는 저분자화 항체를 코드하는 DNA를 구축하고, 이를 발현 벡터에 도입한 후, 적당한 숙주세포에서 발현시키면 된다(예를 들면 Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976 ; Better, M. and Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496 ; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515 ; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663 ; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669 ; Bird, R. E. and Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137 참조).
FcRn
면역글로불린 슈퍼패밀리에 속하는 Fcγ 수용체와 달리, 인간 FcRn은 구조적으로는 주요 조직 부적합성 복합체(MHC) 클래스 I의 폴리펩티드와 구조적으로 유사하여 클래스 I의 MHC 분자와 22 내지 29%의 서열 동일성을 갖는다(Ghetie 등, Immunol. Today (1997) 18 (12), 592-598). FcRn은 가용성 β 또는 경쇄(β2 마이크로글로불린)와 복합체화된 막관통 α 또는 중쇄로 이루어지는 헤테로다이머로서 발현된다. MHC와 같이 FcRn의 α쇄는 3개의 세포 외 도메인(α1, α2, α3)으로 이루어지고, 짧은 세포질 도메인은 단백질을 세포 표면에 표면에 계류시킨다. α1 및 α2도메인이 항체의 Fc영역 중의 FcRn 결합 도메인과 상호작용한다(Raghavan 등(Immunity (1994) 1, 303-315).
FcRn은 포유동물의 모성 태반 또는 난황낭에서 발현되고, 그것은 모친으로부터 태아로의 IgG의 이동에 관여한다. 이에 더하여 FcRn이 발현되는 설치류 신생아의 소장에서는, FcRn이 섭취된 초유 또는 젖으로부터 모성 IgG의 쇄자연(brush border) 상피를 가로지르는 이동에 관여한다. FcRn은 다수의 종에 걸쳐 다수의 다른 조직 및 각종 내피세포계에 있어서 발현되고 있다. 그것은 인간 성인 혈관내피, 근육혈관계 및 간장 동양 모세혈관(hepatic sinusoidal capillaries)에서도 발현된다. FcRn은 IgG에 결합하여 그것을 혈청에 리사이클함으로써, IgG의 혈장 중 농도를 유지하는 역할을 하고 있는 것으로 생각되고 있다. FcRn의 IgG 분자로의 결합은 통상 엄격하게 pH에 의존적이며, 최적 결합은 7.0 미만의 pH 산성역에 있어서 확인된다.
서열번호：28로 표시된 신호 서열을 포함하는 폴리펩티드를 전구체로 하는 인간 FcRn은, 생체 내에서(서열번호：29에 신호 서열을 포함하는 그의 폴리펩티드가 기재되어 있는) 인간 β2-마이크로글로불린과의 복합체를 형성한다. β2-마이크로글로불린과 복합체를 형성하고 있는 가용형 인간 FcRn이 통상의 재조합 발현수법을 사용함으로써 제조된다. 이러한 β2-마이크로글로불린과 복합체를 형성하고 있는 가용형 인간 FcRn에 대한 본 발명의 Fc영역의 결합 활성이 평가될 수 있다. 본 발명에 있어서 특별히 기재가 없는 경우는, 인간 FcRn은 본 발명의 Fc영역에 결합 가능한 형태인 것을 가리키고, 예로서 인간 FcRn과 인간 β2-마이크로글로불린의 복합체를 들 수 있다.
본 발명과 불변영역 개변 기술 조합의 태양으로서 산성 pH에서의 FcRn 결합 증강 개변 Fc 기술(WO2002060919, WO2004035752, WO2000042072), 중성 pH에서의 FcRn 결합 증강 개변 Fc 기술(WO2011122011, WO2012133782), 억제형 Fcγ 수용체 선택적 결합 증강 기술(WO2012115241, WO2013125667), 활성형 Fcγ 수용체 선택적 결합 증강 기술(ADCC 활성 증강 기술)(WO2013002362), 류머티즘 인자(Rheumatoid factor)로의 결합 활성을 저하시키는 기술(WO2013046704) 등의 항체 개변 기술의 조합을 들 수 있다.
본 발명과 가변영역 개변 기술의 비한정의 조합의 태양으로서는, pH 의존성 항체(WO2009125825), 칼슘 의존성 항체(WO2012073992) 등의 개변 기술의 조합을 들 수 있다.
2분자의 FcRn 및 1분자의 활성형 Fcγ 수용체의 4자를 포함하는 헤테로 복합체
FcRn과 IgG 항체의 결정학적 연구에 의해 FcRn-IgG 복합체는 2분자의 FcRn에 대해 1분자의 IgG로부터 구성되고, IgG의 Fc영역의 양측에 위치하는 CH2 및 CH3 도메인의 접촉면 부근에 있어서 2분자의 결합이 일어나는 것으로 생각되고 있다(Burmeister 등(Nature (1994) 372, 336-343). 한편 PCT/JP2012/058603의 실시예 3에 있어서 확인된 바와 같이, 항체의 Fc영역이 2분자의 FcRn 및 1분자의 활성형 Fcγ 수용체의 4자를 포함하는 복합체를 형성할 수 있는 것이 명확해졌다(PCT/JP2012/058603). 이 헤테로 복합체의 형성은 pH 중성역의 조건하에서 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자의 성질에 대해서 해석을 진행한 결과 명확해진 현상이다.
본 발명은 특정 이론에 구속되는 것은 아니나, 항원 결합 분자에 포함되는 Fc영역과 2분자의 FcRn 및 1분자의 활성형 Fcγ 수용체의 4자를 포함하는 헤테로 복합체의 형성에 의해 항원 결합 분자가 생체 내에 투여되었을 때의 항원 결합 분자의 당해 생체 내에 있어서의 약물동태(혈장 중 체류성) 및 투여된 항원 결합 분자에 대한 면역응답(면역원성)에 대해 아래와 같은 영향이 초래되는 것도 생각할 수 있다. 면역세포 상에는 각종 활성형 Fcγ 수용체에 더하여 FcRn이 발현되고 있어, 항원 결합 분자가 면역세포 상에서 이러한 4자 복합체를 형성하는 것은 면역세포에 대한 친화성을 향상시키고, 또한 세포 내 도메인을 회합화시킴으로써 내재화 신호를 증강시켜, 면역세포로의 흡수가 촉진되는 것이 시사된다. 항원 제시 세포에 있어서도 마찬가지로, 항원 제시 세포의 세포막 상에서 4자 복합체를 형성함으로써 항원 결합 분자가 항원 제시 세포로 흡수되기 쉬워질 가능성이 시사된다. 일반적으로 항원 제시 세포에 흡수된 항원 결합 분자는 항원 제시 세포 내의 리소좀에 있어서 분해되어 T세포로 제시된다. 결과적으로 항원 제시 세포의 세포막 상에서 상기 4자 복합체를 형성함으로써, 항원 결합 분자에 대한 항원 제시 세포로의 흡수가 촉진되어 항원 결합 분자의 혈장 중 체류성이 악화될 가능성도 있다. 또한 마찬가지로 면역응답이 유기될(더 악화될) 가능성이 있다.
이 때문에 이러한 4자 복합체를 형성하는 능력이 저하된 항원 결합 분자가 생체에 투여된 경우, 당해 항원 결합 분자의 혈장 중 체류성이 향상되고, 당해 생체에 의한 면역응답의 유기가 억제되는 것으로 생각될 수 있다. 이러한 항원 제시 세포를 포함하는 면역세포 상에 있어서의 당해 복합체의 형성을 저해하는 항원 결합 분자의 바람직한 양태로서 아래의 3종류를 들 수 있다.
헤테로 복합체의 형성을 저해하는 항원 결합 분자
(양태 1) pH 중성역 조건하에서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖고, 활성형 FcγR에 대한 결합 활성이 천연형 Fc영역의 활성형 FcγR에 대한 결합 활성보다 낮은 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자
양태 1의 항원 결합 분자는 2분자의 FcRn에 결합함으로써 3자 복합체를 형성하나, 활성형 FcγR을 포함한 복합체는 형성하지 않는다. 활성형 FcγR에 대한 결합 활성이 천연형 Fc영역의 활성형 FcγR에 대한 결합 활성보다 낮은 Fc영역은 상기와 같이 천연형 Fc영역의 아미노산을 개변함으로써 제작될 수 있다. 개변 Fc영역의 활성형 FcγR에 대한 결합 활성이 천연형 Fc영역의 활성형 FcγR에 대한 결합 활성보다 낮은지 여부는 상기 결합 활성의 항목에서 기재된 방법을 사용하여 적절히 실시될 수 있다.
활성형 Fcγ 수용체로서는 FcγRIa, FcγRIb 및 FcγRIc를 포함하는 FcγRI(CD64), FcγRIIa(알로타입 R131 및 H131을 포함함) 및 아이소폼 FcγRIIIa(알로타입 V158 및 F158을 포함함) 및 FcγRIIIb(알로타입 FcγRIIIb-NA1 및 FcγRIIIb-NA2를 포함함)를 포함하는 FcγRIII(CD16)를 적합하게 들 수 있다.
본 명세서에 있어서 Fc영역 개변체의 활성형 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 천연형 Fc영역의 활성형 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성보다도 낮다는 것은, Fc영역 개변체의 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIIa 및/또는 FcγRIIIb 중 어느 하나의 인간 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 이들 인간 Fcγ 수용체에 대한 천연형 Fc영역의 결합 활성보다도 낮은 것을 말한다. 예를 들면 상기의 해석방법을 토대로, 대조로 하는 천연형 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자의 결합 활성과 비교하여 Fc영역 개변체를 포함하는 항원 결합 분자의 결합 활성이 95% 이하, 바람직하게는 90% 이하, 85% 이하, 80% 이하, 75% 이하, 특히 바람직하게는 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 6% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1% 이하의 결합 활성을 나타내는 것을 말한다. 천연형 Fc영역으로서는 출발 Fc영역도 사용될 수 있고, 야생형 항체의 상이한 아이소타입의 Fc영역도 사용될 수 있다.
또한 천연형의 활성형 FcγR에 대한 결합 활성이란 인간 IgG1의 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성인 것이 바람직하고, Fcγ 수용체에 대한 결합 활성을 저감시키기 위해서는 상기 개변 이외에도 인간 IgG2, 인간 IgG3, 인간 IgG4에 아이소타입을 변경하는 것으로도 달성할 수 있다. 또한 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성을 저하시키는 것은 상기 개변 이외에도 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성을 갖는 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자를 대장균 등의 당쇄를 부가하지 않는 숙주에서 발현시킴으로써도 얻을 수 있다.
대조로 하는 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자로서는, IgG 단일클론 항체의 Fc영역을 갖는 항원 결합 분자가 적절히 사용될 수 있다. 당해 Fc영역의 구조는 서열번호：5(RefSeq 등록번호 AAC82527.1의 N말단에 A 부가), 6(RefSeq 등록번호 AAB59393.1의 N말단에 A 부가), 7(RefSeq 등록번호 CAA27268.1), 8(RefSeq 등록번호 AAB59394.1의 N말단에 A 부가)에 기재되어 있다. 또한 어떤 특정 아이소타입 항체의 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자를 피검물질로서 사용하는 경우에는 당해 특정 아이소타입의 IgG 단일클론 항체의 Fc영역을 갖는 항원 결합 분자를 대로조서 사용함으로써 당해 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자에 의한 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성의 효과가 검증된다. 상기와 같이 하여 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 높은 것이 검증된 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자가 적절히 선택된다.
본 발명의 비한정의 일태양에서는, 활성형 FcγR에 대한 결합 활성이 천연형 Fc영역의 활성형 FcγR에 대한 결합 활성보다 낮은 Fc영역의 예로서, 상기 Fc영역의 아미노산 중 EU 넘버링으로 표시되는 234, 235, 236, 237, 238, 239, 270, 297, 298, 325, 328 및 329 중 어느 하나 이상의 아미노산이 천연형 Fc영역과 다른 아미노산으로 개변되어 있는 Fc영역을 적합하게 들 수 있는데, Fc영역의 개변은 상기 개변에 한정되지 않고, 예를 들면 Cur. Opin. in Biotech. (2009) 20 (6), 685-691에 기재되어 있는 탈당쇄(N297A, N297Q), IgG1-L234A/L235A, IgG1-A325A/A330S/P331S, IgG1-C226S/C229S, IgG1-C226S/C229S/E233P/L234V/L235A, IgG1-L234F/L235E/P331S, IgG1-S267E/L328F, IgG2-V234A/G237A, IgG2-H268Q/V309L/A330S/A331S, IgG4-L235A/G237A/E318A, IgG4-L236E 등의 개변 및 국제공개 WO2008/092117에 기재되어 있는 G236R/L328R, L235G/G236R, N325A/L328R, N325L/L328R 등의 개변 및 EU 넘버링 233번 위치, 234번 위치, 235번 위치, 237번 위치에 있어서의 아미노산의 삽입, 국제공개 WO2000/042072에 기재되어 있는 개소의 개변이어도 된다.
또한 본 발명의 비한정의 일태양에서는, 상기 Fc영역의 EU 넘버링으로 표시되는 아미노산으로서；
234번 위치의 아미노산을 Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr 또는 Trp 중 어느 하나,
235번 위치의 아미노산을 Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Met, Pro, Ser, Thr, Val 또는 Arg 중 어느 하나,
236번 위치의 아미노산을 Arg, Asn, Gln, His, Leu, Lys, Met, Phe, Pro 또는 Tyr 중 어느 하나,
237번 위치의 아미노산을 Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, His, Ile, Leu, Lys, Met, Pro, Ser, Thr, Val, Tyr 또는 Arg 중 어느 하나,
238번 위치의 아미노산을 Ala, Asn, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Thr, Trp 또는 Arg 중 어느 하나,
239번 위치의 아미노산을 Gln, His, Lys, Phe, Pro, Trp, Tyr 또는 Arg 중 어느 하나,
265번 위치의 아미노산을 Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val 중 어느 하나,
266번 위치의 아미노산을 Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
267번 위치의 아미노산을 Arg, His, Lys, Phe, Pro, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
269번 위치의 아미노산을 Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val 중 어느 하나,
270번 위치의 아미노산을 Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val 중 어느 하나,
271번 위치의 아미노산을 Arg, His, Phe, Ser, Thr, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
295번 위치의 아미노산을 Arg, Asn, Asp, Gly, His, Phe, Ser, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
296번 위치의 아미노산을 Arg, Gly, Lys 또는 Pro 중 어느 하나,
297번 위치의 아미노산을 Ala,
298번 위치의 아미노산을 Arg, Gly, Lys, Pro, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,
300번 위치의 아미노산을 Arg, Lys 또는 Pro 중 어느 하나,
324번 위치의 아미노산을 Lys 또는 Pro 중 어느 하나,
325번 위치의 아미노산을 Ala, Arg, Gly, His, Ile, Lys, Phe, Pro, Thr, Trp, Tyr 또는 Val 중 어느 하나,
327번 위치의 아미노산을 Arg, Gln, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val 중 어느 하나,
328번 위치의 아미노산을 Arg, Asn, Gly, His, Lys 또는 Pro 중 어느 하나,
329번 위치의 아미노산을 Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val 또는 Arg 중 어느 하나,
330번 위치의 아미노산을 Pro 또는 Ser 중 어느 하나,
331번 위치의 아미노산을 Arg, Gly 또는 Lys 중 어느 하나, 또는
332번 위치의 아미노산을 Arg, Lys 또는 Pro 중 어느 하나
중 어느 하나 이상으로 개변되어 있는 Fc영역을 적합하게 들 수 있다.
(양태 2) pH 중성역 조건하에서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖고, 억제형 FcγR에 대한 결합 활성이 활성형 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성보다도 높은 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자
양태 2의 항원 결합 분자는 2분자의 FcRn과 1분자의 억제형 FcγR에 결합함으로써 이들 4자를 포함하는 복합체를 형성할 수 있다. 그러나 1분자의 항원 결합 분자는 1분자의 FcγR과만 결합할 수 있기 때문에, 1분자의 항원 결합 분자는 억제형 FcγR에 결합한 상태로 다른 활성형 FcγR에 결합하는 것은 불가능하다. 또한 억제형 FcγR에 결합한 상태로 세포 내로 흡수된 항원 결합 분자는 세포막 상으로 리사이클되어 세포 내에서의 분해를 회피하는 것이 보고되어 있다(Immunity (2005) 23, 503-514). 즉, 억제형 FcγR에 대한 선택적 결합 활성을 갖는 항원 결합 분자는 면역응답의 원인이 되는 활성형 FcγR 및 2분자의 FcRn을 포함한 헤테로 복합체를 형성할 수 없는 것으로 생각된다.
활성형 Fcγ 수용체로서는 FcγRIa, FcγRIb 및 FcγRIc를 포함하는 FcγRI(CD64), FcγRIIa(알로타입 R131 및 H131을 포함함) 및 아이소폼 FcγRIIIa(알로타입 V158 및 F158을 포함함) 및 FcγRIIIb(알로타입 FcγRIIIb-NA1 및 FcγRIIIb-NA2를 포함함)를 포함하는 FcγRIII(CD16)를 적합하게 들 수 있다. 또한 FcγRIIb(FcγRIIb-1 및 FcγRIIb-2를 포함함)를 억제형 Fcγ 수용체의 적합한 예로서 들 수 있다.
본 명세서에 있어서 억제형 FcγR에 대한 결합 활성이 활성형 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성보다도 높다는 것은, Fc영역 개변체의 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIIa 및/또는 FcγRIIIb 중 어느 하나의 인간 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성보다도 높은 것을 말한다. 예를 들면 상기의 해석방법을 토대로, Fc영역 개변체를 포함하는 항원 결합 분자의 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIIa 및/또는 FcγRIIIb 중 어느 하나의 인간 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성의 105% 이상, 바람직하게는 110% 이상, 120% 이상, 130% 이상, 140% 이상, 특히 바람직하게는 150% 이상, 160% 이상, 170% 이상, 180% 이상, 190% 이상, 200% 이상, 250% 이상, 300% 이상, 350% 이상, 400% 이상, 450% 이상, 500% 이상, 750% 이상, 10배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 40배 이상, 50배 이상의 결합 활성을 나타내는 것을 말한다.
FcγRIIb에 대한 결합 활성이 FcγRIa, FcγRIIa(알로타입 R131 및 H131을 포함함) 및 FcγRIIIa(알로타입 V158 및 F158을 포함함)보다도 모두 높은 것이 가장 바람직하다. FcγRIa는 천연형 IgG1에 대한 어피니티가 매우 높은 것으로부터, 생체 내에 있어서는 대량의 내인성 IgG1에 의해 결합이 포화되어 있는 것으로 생각되기 때문에, FcγRIIb에 대한 결합 활성은 FcγRIIa 및 FcγRIIIa보다도 높고, FcγRIa보다는 낮아도 당해 복합체의 형성 저해는 가능할 것으로 생각된다.
대조로 하는 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자로서는 IgG 단일클론 항체의 Fc영역을 갖는 항원 결합 분자가 적절히 사용될 수 있다. 당해 Fc영역의 구조는 서열번호：5(RefSeq 등록번호 AAC82527.1의 N말단에 A 부가), 6(RefSeq 등록번호 AAB59393.1의 N말단에 A 부가), 7(RefSeq 등록번호 CAA27268.1), 8(RefSeq 등록번호 AAB59394.1의 N말단에 A 부가)에 기재되어 있다. 또한 어떤 특정 아이소타입 항체의 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자를 피검물질로서 사용하는 경우에는, 당해 특정 아이소타입의 IgG 단일클론 항체의 Fc영역을 갖는 항원 결합 분자를 대조로서 사용함으로써 당해 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자에 의한 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성의 효과가 검증된다. 상기와 같이 하여, Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 높은 것이 검증된 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자가 적절히 선택된다.
본 발명의 비한정의 일태양에서는, 억제형 FcγR에 대한 선택적인 결합 활성을 갖는 Fc영역의 예로서, 상기 Fc영역의 아미노산 중 EU 넘버링으로 표시되는 238 또는 328의 아미노산이 천연형 Fc영역과 다른 아미노산으로 개변되어 있는 Fc영역을 적합하게 들 수 있다. 또한 억제형 Fcγ 수용체에 대한 선택적인 결합 활성을 갖는 Fc영역으로서 US2009/0136485에 기재되어 있는 Fc영역 또는 개변도 적절히 선택할 수 있다.
또한 본 발명의 비한정의 일태양에서는, 상기 Fc영역의 EU 넘버링으로 표시되는 아미노산으로서 EU 넘버링으로 표시되는 238의 아미노산이 Asp 또는 328의 아미노산이 Glu 중 어느 하나 이상으로 개변되어 있는 Fc영역을 적합하게 들 수 있다.
또한 본 발명의 비한정의 일태양에서는, EU 넘버링으로 표시되는 238번 위치의 Pro의 Asp로의 치환 및 EU 넘버링으로 표시되는 237번 위치의 아미노산이 Trp, EU 넘버링으로 표시되는 237번 위치의 아미노산이 Phe, EU 넘버링으로 표시되는 267번 위치의 아미노산이 Val, EU 넘버링으로 표시되는 267번 위치의 아미노산이 Gln, EU 넘버링으로 표시되는 268번 위치의 아미노산이 Asn, EU 넘버링으로 표시되는 271번 위치의 아미노산이 Gly, EU 넘버링으로 표시되는 326번 위치의 아미노산이 Leu, EU 넘버링으로 표시되는 326번 위치의 아미노산이 Gln, EU 넘버링으로 표시되는 326번 위치의 아미노산이 Glu, EU 넘버링으로 표시되는 326번 위치의 아미노산이 Met, EU 넘버링으로 표시되는 239번 위치의 아미노산이 Asp, EU 넘버링으로 표시되는 267번 위치의 아미노산이 Ala, EU 넘버링으로 표시되는 234번 위치의 아미노산이 Trp, EU 넘버링으로 표시되는 234번 위치의 아미노산이 Tyr, EU 넘버링으로 표시되는 237번 위치의 아미노산이 Ala, EU 넘버링으로 표시되는 237번 위치의 아미노산이 Asp, EU 넘버링으로 표시되는 237번 위치의 아미노산이 Glu, EU 넘버링으로 표시되는 237번 위치의 아미노산이 Leu, EU 넘버링으로 표시되는 237번 위치의 아미노산이 Met, EU 넘버링으로 표시되는 237번 위치의 아미노산이 Tyr, EU 넘버링으로 표시되는 330번 위치의 아미노산이 Lys, EU 넘버링으로 표시되는 330번 위치의 아미노산이 Arg, EU 넘버링으로 표시되는 233번 위치의 아미노산이 Asp, EU 넘버링으로 표시되는 268번 위치의 아미노산이 Asp, EU 넘버링으로 표시되는 268번 위치의 아미노산이 Glu, EU 넘버링으로 표시되는 326번 위치의 아미노산이 Asp, EU 넘버링으로 표시되는 326번 위치의 아미노산이 Ser, EU 넘버링으로 표시되는 326번 위치의 아미노산이 Thr, EU 넘버링으로 표시되는 323번 위치의 아미노산이 Ile, EU 넘버링으로 표시되는 323번 위치의 아미노산이 Leu, EU 넘버링으로 표시되는 323번 위치의 아미노산이 Met, EU 넘버링으로 표시되는 296번 위치의 아미노산이 Asp, EU 넘버링으로 표시되는 326번 위치의 아미노산이 Ala, EU 넘버링으로 표시되는 326번 위치의 아미노산이 Asn, EU 넘버링으로 표시되는 330번 위치의 아미노산이 Met 중 어느 하나 이상으로 개변되어 있는 Fc영역을 적합하게 들 수 있다.
(양태 3) Fc영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드의 한쪽이 pH 중성역 조건하에서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖고, 다른 쪽이 pH 중성역 조건하에서의 FcRn에 대한 결합능 활성을 갖지 않는 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자
양태 3의 항원 결합 분자는 1분자의 FcRn과 1분자의 FcγR에 결합함으로써 3자 복합체를 형성할 수 있는데, 2분자의 FcRn과 1분자의 FcγR의 4자를 포함하는 헤테로 복합체는 형성하지 않는다. 본 양태 3의 항원 결합 분자에 포함되는 Fc영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드의 한쪽이 pH 중성역 조건하에서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖고, 다른 쪽의 폴리펩티드가 pH 중성역 조건하에서의 FcRn에 대한 결합능 활성을 갖지 않는 Fc영역으로서 이중특이성 항체(bispecific antibody)를 기원으로 하는 Fc영역도 적절히 사용될 수 있다. 이중특이성 항체란 상이한 항원에 대해 특이성을 갖는 2종류의 항체이다. IgG형의 이중특이성 항체는 IgG 항체를 생산하는 하이브리도마 2종을 융합함으로써 생성되는 하이브리드 하이브리도마(quadroma)에 의해 분비시키는 것이 가능하다(Milstein 등(Nature (1983) 305, 537-540).
상기 양태 3의 항원 결합 분자를 상기 항체의 항목에서 기재된 바와 같은 재조합 수법을 사용하여 제조하는 경우, 목적의 2종의 Fc영역을 구성하는 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 세포에 도입하여 그들을 공발현시키는 방법이 채용될 수 있다. 그러나 제조되는 Fc영역은 Fc영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드의 한쪽이 pH 중성역 조건하에서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖고, 다른 쪽의 폴리펩티드가 pH 중성역 조건하에서의 FcRn에 대한 결합능 활성을 갖지 않는 Fc영역과, Fc영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드의 양쪽이 pH 중성역 조건하에서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 Fc영역과, Fc영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드의 양쪽이 pH 중성역 조건하에서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖지 않는 Fc영역이 2：1：1의 분자 수의 비율로 존재하는 혼합물이 된다. 3종류의 IgG로부터 목적의 조합의 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자를 정제하는 것은 곤란하다.
이러한 재조합 수법을 사용하여 양태 3의 항원 결합 분자를 제조할 때, Fc영역을 구성하는 CH3 도메인에 적당한 아미노산 치환의 개변을 가함으로써 헤테로 조합의 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자가 우선적으로 분비될 수 있다. 구체적으로는, 한쪽 중쇄의 CH3 도메인에 존재하는 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄(knob(「돌기」의 의미))로 치환하고, 다른 한쪽 중쇄의 CH3 도메인에 존재하는 아미노산 측쇄를 보다 작은 측쇄(hole(「공극」의 의미))로 치환함으로써 돌기가 공극 내에 배치될 수 있도록 하여 이종 H쇄 형성의 촉진 및 동종 H쇄 형성의 저해를 일으키는 방법이다(국제공개 WO1996027011, Ridgway 등(Protein Engineering (1996) 9, 617-621), Merchant 등(Nat. Biotech. (1998) 16, 677-681)).
또한 폴리펩티드의 회합 또는 폴리펩티드에 의해 구성되는 이종 다량체 회합의 제어방법을 Fc영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드의 회합에 이용함으로써 이중특이성 항체를 제작하는 기술도 알려져 있다. 즉, Fc영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드 내의 계면을 형성하는 아미노산 잔기를 개변함으로써 동일 서열을 갖는 Fc영역을 구성하는 폴리펩티드의 회합이 저해되어, 서열이 다른 2개의 Fc영역을 구성하는 폴리펩티드 회합체가 형성되도록 제어하는 방법이 이중특이성 항체의 제작에 채용될 수 있다(국제공개 WO2006/106905). 구체적으로는 상기 이중특이성 항체와 그의 제작방법의 항목에서 기재된 방법이 본 발명의 양태 3의 항원 결합 분자를 제조할 때 비한정의 일태양으로서 채용될 수 있다.
이들 양태 1~3의 항원 결합 분자는 4자 복합체를 형성 가능한 항원 결합 분자와 비교하여 모두 면역원성을 저하시키고, 또한 혈장 중 체류성을 향상시키는 것이 가능할 것으로 기대된다.
항원 결합 도메인의 제조방법
본 발명은 저분자 화합물의 존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 당해 화합물의 비존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다도 높은 항원 결합 도메인의 제조방법을 제공한다.
즉, 본 발명은 아래의 (a) 내지 (e)의 공정；
(a) 저분자 화합물의 비존재하에 있어서의 항원 결합 도메인의 항원 결합 활성을 얻는 공정,
(b) 저분자 화합물의 존재하에 있어서의 항원 결합 도메인의 항원 결합 활성을 얻는 공정,
(c) 저분자 화합물의 비존재하에 있어서의 항원 결합 활성이 당해 화합물의 존재하에 있어서의 항원 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인을 선택하는 공정,
(d) (c)에서 선택된 항원 결합 도메인을 코드하는 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된 벡터가 도입된 세포를 배양하는 공정, 및
(e) (d)에서 배양된 세포의 배양액으로부터 항원 결합 도메인을 회수하는 공정
을 포함하는 항원 결합 도메인의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 아래의 (a) 내지 (e)의 공정；
(a) 저분자 화합물의 저농도 존재하에 있어서의 항원 결합 도메인의 항원 결합 활성을 얻는 공정,
(b) 저분자 화합물의 고농도 존재하에 있어서의 항원 결합 도메인의 항원 결합 활성을 얻는 공정,
(c) 저분자 화합물의 저농도 존재하에 있어서의 항원 결합 활성이 당해 화합물의 고농도 존재하에 있어서의 항원 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인을 선택하는 공정,
(d) (c)에서 선택된 항원 결합 도메인을 코드하는 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된 벡터가 도입된 세포를 배양하는 공정, 및
(e) (d)에서 배양된 세포의 배양액으로부터 항원 결합 도메인을 회수하는 공정
을 포함하는 항원 결합 도메인의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 아래의 (a) 내지 (e)의 공정；
(a) 저분자 화합물의 존재하에 있어서의 항원 결합 도메인 또는 그들의 라이브러리를 항원에 접촉시키는 공정,
(b) 상기 공정 (a)에서 항원에 결합한 항원 결합 도메인을 당해 화합물의 비존재하에 두는 공정,
(c) 상기 공정 (b)에서 해리된 항원 결합 도메인을 단리하는 공정,
(d) (c)에서 선택된 항원 결합 도메인을 코드하는 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된 벡터가 도입된 세포를 배양하는 공정, 및
(e) (d)에서 배양된 세포의 배양액으로부터 항원 결합 도메인을 회수하는 공정
을 포함하는 항원 결합 도메인의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 아래의 (a) 내지 (e)의 공정；
(a) 저분자 화합물의 고농도 존재하에 있어서의 항원 결합 도메인 또는 그들의 라이브러리를 항원에 접촉시키는 공정,
(b) 상기 공정 (a)에서 항원에 결합한 항원 결합 도메인을 당해 화합물의 저농도 존재하에 두는 공정,
(c) 상기 공정 (b)에서 해리된 항원 결합 도메인을 단리하는 공정,
(d) (c)에서 선택된 항원 결합 도메인을 코드하는 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된 벡터가 도입된 세포를 배양하는 공정, 및
(e) (d)에서 배양된 세포의 배양액으로부터 항원 결합 도메인을 회수하는 공정
을 포함하는 항원 결합 도메인의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 아래의 (a) 내지 (f)의 공정；
(a) 저분자 화합물의 비존재하에서 항원 결합 도메인의 라이브러리를 항원에 접촉시키는 공정,
(b) 상기 공정 (a)에서 항원에 결합하지 않는 항원 결합 도메인을 선택하는 공정,
(c) 상기 공정 (b)에서 선택된 항원 결합 도메인을 당해 화합물의 존재하에서 항원에 결합시키는 공정,
(d) 상기 공정 (c)에서 항원에 결합한 항원 결합 도메인을 단리하는 공정,
(e) (d)에서 선택된 항원 결합 도메인을 코드하는 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된 벡터가 도입된 세포를 배양하는 공정, 및
(f) (e)에서 배양된 세포의 배양액으로부터 항원 결합 도메인을 회수하는 공정
을 포함하는 항원 결합 도메인의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 아래의 (a) 내지 (f)의 공정；
(a) 저분자 화합물의 저농도 존재하에서 항원 결합 도메인의 라이브러리를 항원에 접촉시키는 공정,
(b) 상기 공정 (a)에서 항원에 결합하지 않는 항원 결합 도메인을 선택하는 공정,
(c) 상기 공정 (b)에서 선택된 항원 결합 도메인을 당해 화합물의 고농도 존재하에서 항원에 결합시키는 공정,
(d) 상기 공정 (c)에서 항원에 결합한 항원 결합 도메인을 단리하는 공정,
(e) (d)에서 선택된 항원 결합 도메인을 코드하는 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된 벡터가 도입된 세포를 배양하는 공정, 및
(f) (e)에서 배양된 세포의 배양액으로부터 항원 결합 도메인을 회수하는 공정
을 포함하는 항원 결합 도메인의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 아래의 (a) 내지 (e)의 공정；
(a) 항원을 고정한 칼럼에 저분자 화합물의 존재하에서 항원 결합 도메인의 라이브러리를 접촉시키는 공정,
(b) 상기 공정 (a)에서 칼럼에 결합한 항원 결합 도메인을 당해 화합물의 비존재하에서 칼럼으로부터 용출하는 공정,
(c) 상기 공정 (b)에서 용출된 항원 결합 도메인을 단리하는 공정,
(d) (c)에서 선택된 항원 결합 도메인을 코드하는 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된 벡터가 도입된 세포를 배양하는 공정, 및
(e) (d)에서 배양된 세포의 배양액으로부터 항원 결합 도메인을 회수하는 공정
을 포함하는 항원 결합 도메인의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 아래의 (a) 내지 (e)의 공정；
(a) 항원을 고정한 칼럼에 저분자 화합물의 고농도 존재하에서 항원 결합 도메인의 라이브러리를 접촉시키는 공정,
(b) 상기 공정 (a)에서 칼럼에 결합한 항원 결합 도메인을 당해 화합물의 저농도 존재하에서 칼럼으로부터 용출하는 공정,
(c) 상기 공정 (b)에서 용출된 항원 결합 도메인을 단리하는 공정,
(d) (c)에서 선택된 항원 결합 도메인을 코드하는 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된 벡터가 도입된 세포를 배양하는 공정, 및
(e) (d)에서 배양된 세포의 배양액으로부터 항원 결합 도메인을 회수하는 공정
을 포함하는 항원 결합 도메인의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 아래의 (a) 내지 (f)의 공정；
(a) 항원을 고정한 칼럼에 저분자 화합물의 비존재하에서 항원 결합 도메인의 라이브러리를 통과시키는 공정,
(b) 상기 공정 (a)에서 칼럼에 결합하지 않고 용출된 항원 결합 도메인을 회수하는 공정,
(c) 상기 공정 (b)에서 회수된 항원 결합 도메인을 당해 화합물의 존재하에서 항원에 결합시키는 공정,
(d) 상기 공정 (c)에서 항원에 결합한 항원 결합 도메인을 단리하는 공정,
(e) (d)에서 선택된 항원 결합 도메인을 코드하는 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된 벡터가 도입된 세포를 배양하는 공정, 및
(f) (e)에서 배양된 세포의 배양액으로부터 항원 결합 도메인을 회수하는 공정
을 포함하는 항원 결합 도메인의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 아래의 (a) 내지 (f)의 공정；
(a) 항원을 고정한 칼럼에 저분자 화합물의 저농도 존재하에서 항원 결합 도메인의 라이브러리를 통과시키는 공정,
(b) 상기 공정 (a)에서 칼럼에 결합하지 않고 용출된 항원 결합 도메인을 회수하는 공정,
(c) 상기 공정 (b)에서 회수된 항원 결합 도메인을 당해 화합물의 고농도 존재하에서 항원에 결합시키는 공정,
(d) 상기 공정 (c)에서 항원에 결합한 항원 결합 도메인을 단리하는 공정,
(e) (d)에서 선택된 항원 결합 도메인을 코드하는 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된 벡터가 도입된 세포를 배양하는 공정, 및
(f) (e)에서 배양된 세포의 배양액으로부터 항원 결합 도메인을 회수하는 공정
을 포함하는 항원 결합 도메인의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 아래의 (a) 내지 (f)의 공정；
(a) 저분자 화합물의 존재하에서 항원 결합 도메인의 라이브러리를 항원에 접촉시키는 공정,
(b) 상기 공정 (a)에서 항원에 결합한 항원 결합 도메인을 취득하는 공정,
(c) 상기 공정 (b)에서 취득한 항원 결합 도메인을 화합물의 비존재하에 두는 공정,
(d) 상기 공정 (c)에서 항원 결합 활성이 상기 공정 (b)에서 선택한 기준보다 약한 항원 결합 도메인을 단리하는 공정,
(e) (d)에서 선택된 항원 결합 도메인을 코드하는 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된 벡터가 도입된 세포를 배양하는 공정, 및
(f) (e)에서 배양된 세포의 배양액으로부터 항원 결합 도메인을 회수하는 공정
을 포함하는 항원 결합 도메인의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 아래의 (a) 내지 (f)의 공정；
(a) 저분자 화합물의 고농도 존재하에서 항원 결합 도메인의 라이브러리를 항원에 접촉시키는 공정,
(b) 상기 공정 (a)에서 항원에 결합한 항원 결합 도메인을 취득하는 공정,
(c) 상기 공정 (b)에서 취득한 항원 결합 도메인을 화합물의 저농도 존재하에 두는 공정,
(d) 상기 공정 (c)에서 항원 결합 활성이 상기 공정 (b)에서 선택한 기준보다 약한 항원 결합 도메인을 단리하는 공정,
(e) (d)에서 선택된 항원 결합 도메인을 코드하는 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된 벡터가 도입된 세포를 배양하는 공정, 및
(f) (e)에서 배양된 세포의 배양액으로부터 항원 결합 도메인을 회수하는 공정
을 포함하는 항원 결합 도메인의 제조방법을 제공한다.
「세포」, 「세포계」 및 「세포배양」은 본 명세서에서는 동일한 정의로 사용되고, 이러한 호칭에는 세포 또는 세포계의 모든 자손이 포함될 수 있다. 이와 같이, 예를 들면 「형질전환체」 및 「형질전환 세포」와 같은 용어에는 계대 수에 관계없이 그들에 유래하는 1차 대상 세포 및 배양물이 포함된다. 또한 고의 또는 우발적인 돌연변이에 의해 모든 자손에 있어서 DNA의 내용이 정확하게 동일하다는 것은 아닌 것도 또한 이해된다. 당초의 형질전환 세포에서 스크리닝된 바와 같은 실질적으로 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 변이체의 자손도 포함될 수 있다. 상이한 호칭을 의도하는 기재인 경우는, 당해 기재의 전후관계로부터 이러한 의도는 명백해질 것이다. 사용되는 세포로서는 전술한 「항체」의 항목에서 기재된 세포 중에서 적절한 것이 적절히 선택된다.
코드 서열의 발현에 언급하는 경우의 제어서열이란, 특정 숙주생물에서 작동 가능하게 연결한 코드 서열의 발현을 위해 필요한 DNA 염기서열을 말한다. 예를 들면 원핵생물에 적합한 제어서열로는 프로모터, 경우에 따라서는 오퍼레이터 서열, 리보솜 결합 부위 및 아마도 아직 잘 이해되지 않은 다른 서열이 포함된다. 진핵세포에서는 코드 서열의 발현을 위해 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서를 이용하는 것이 공지이다.
핵산에 관하여 「작동 가능하게 연결했다」는 것은 그 핵산이 다른 핵산 서열과 기능적인 관계에 있는 것을 의미한다. 예를 들면 프리시퀀스(presequence) 또는 분비 리더의 DNA는 어떤 폴리펩티드의 분비에 관여하고 있는 전구체 단백질로서 발현하는 경우는, 그 폴리펩티드의 DNA와 작동 가능하게 결합되어 있다. 프로모터 또는 인핸서는 그것이 어떤 코드 서열의 전사에 영향을 미치는 경우는 그 서열과 작동 가능하게 연결되어 있다. 또는 리보솜 결합부는 그것이 번역을 용이하게 하는 위치에 있는 경우는 작동 가능하게 코드 서열과 연결되어 있다. 통상 「작동 가능하게 되었다」는 것은 결합된 DNA 서열이 연속되어 있어, 분비 리더의 경우는 연속해서 해독틀 내에 있는 것을 의미한다. 그러나 인핸서는 연속될 필요는 없다. 연결은 적절한 제한부위에서 라이게이션에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고 뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 종래의 관행에 따라 사용된다. 또한 상기 중복 연장 PCR의 수법으로도 연결된 핵산이 제작될 수 있다.
「라이게이션」은 2개의 핵산 단편 사이에서 인산 디에스테르 결합을 형성하는 방법이다. 2개의 단편의 라이게이션을 위해 단편의 말단은 서로 적합해 있어야만 한다. 경우에 따라서는 이 말단은 엔도뉴클레아제 소화 후에 바로 적합성을 갖는다. 그러나 라이게이션에 적합하게 하기 위해 먼저 엔도뉴클레아제 소화 후에 일반적으로 형성되는 부착 말단은 평활 말단으로 바뀌어질 필요가 있다. 평활 말단으로 하기 위해서는 DNA가 적절한 완충액 중에서 15℃에서 적어도 15분간, 4개의 데옥시리보뉴클레오티드 3인산의 존재하에서 DNA 폴리머라아제 I 또는 T4DNA 폴리머라아제의 클레노우 단편의 약 10 단위로 처리된다. 다음으로 DNA가 페놀클로로포름 추출과 에탄올 침전 또는 실리카 정제에 의해 정제된다. 연결해야 하는 DNA 단편이 용액에 등몰량 첨가된다. 이 용액에는 ATP, 리가아제 완충에 더하여 T4DNA 리가아제와 같은 리가아제가 DNA 0.5 ㎍에 대해 약 10 단위 포함된다. DNA를 벡터에 연결하는 경우는 벡터는 적당한 제한 엔도뉴클레아제에 의한 소화작용으로 먼저 선형상이 된다. 선형상으로 된 단편을 다음으로 세균의 알칼리포스파타아제 또는 송아지 장관의 포스파타아제로 처리함으로써 라이게이션의 스텝 사이의 당해 단편의 셀프라이게이션이 예방된다.
본 발명의 제조방법에 있어서는 상기 「저분자 화합물에 의존적인 항원 결합 도메인」의 항목에서 설명되는 방법에 의해 선택된, 저분자 화합물의 존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 당해 화합물의 비존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다도 높은 항원 결합 도메인이 단리된다. 예를 들면 이와 같이 단리된 항원 결합 도메인이 라이브러리로부터 선택된 경우에는, 후술하는 실시예에 기재되어 있는 바와 같이, 당해 항원 결합 도메인을 코드하는 폴리뉴클레오티드는 파지 등의 바이러스로부터 통상의 유전자 증폭에 의해 단리된다. 또한 이와 같이 단리된 항원 결합 도메인 또는 항체가 하이브리도마 등의 세포의 배양액으로부터 선택된 경우에는, 상기 항체의 항목에서 나타낸 바와 같이 당해 세포로부터 항체 유전자 등이 통상의 유전자 증폭에 의해 단리된다.
항원 결합 분자의 제조방법
본 발명은 저분자 화합물의 존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 당해 화합물의 비존재하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다도 높은 항원 결합 분자의 제조방법을 제공한다.
즉, 본 발명은 아래의 (a) 내지 (f)의 공정；
(a) 저분자 화합물의 비존재하에 있어서의 항원 결합 도메인의 항원 결합 활성을 얻는 공정,
(b) 저분자 화합물의 존재하에 있어서의 항원 결합 도메인의 항원 결합 활성을 얻는 공정,
(c) 저분자 화합물의 비존재하에 있어서의 항원 결합 활성이 당해 화합물의 존재하에 있어서의 항원 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인을 선택하는 공정,
(d) (c)에서 선택된 항원 결합 도메인을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드에 연결시키는 공정,
(e) (d)에서 얻어진 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된 벡터가 도입된 세포를 배양하는 공정, 및
(f) (e)에서 배양된 세포의 배양액으로부터 항원 결합 분자를 회수하는 공정
을 포함하는 항원 결합 분자의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 아래의 (a) 내지 (f)의 공정；
(a) 저분자 화합물의 저농도 존재하에 있어서의 항원 결합 도메인의 항원 결합 활성을 얻는 공정,
(b) 저분자 화합물의 고농도 존재하에 있어서의 항원 결합 도메인의 항원 결합 활성을 얻는 공정,
(c) 저분자 화합물의 저농도 존재하에 있어서의 항원 결합 활성이 당해 화합물의 고농도 존재하에 있어서의 항원 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인을 선택하는 공정,
(d) (c)에서 선택된 항원 결합 도메인을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드에 연결시키는 공정,
(e) (d)에서 얻어진 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된 벡터가 도입된 세포를 배양하는 공정, 및
(f) (e)에서 배양된 세포의 배양액으로부터 항원 결합 분자를 회수하는 공정
을 포함하는 항원 결합 분자의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 아래의 (a) 내지 (f)의 공정；
(a) 저분자 화합물의 존재하에 있어서의 항원 결합 도메인 또는 그들의 라이브러리를 항원에 접촉시키는 공정,
(b) 상기 공정 (a)에서 항원에 결합한 항원 결합 도메인을 당해 화합물의 비존재하에 두는 공정,
(c) 상기 공정 (b)에서 해리된 항원 결합 도메인을 단리하는 공정,
(d) (c)에서 선택된 항원 결합 도메인을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드에 연결시키는 공정,
(e) (d)에서 얻어진 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된 벡터가 도입된 세포를 배양하는 공정, 및
(f) (e)에서 배양된 세포의 배양액으로부터 항원 결합 분자를 회수하는 공정
을 포함하는 항원 결합 분자의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 아래의 (a) 내지 (f)의 공정；
(a) 저분자 화합물의 고농도 존재하에 있어서의 항원 결합 도메인 또는 그들의 라이브러리를 항원에 접촉시키는 공정,
(b) 상기 공정 (a)에서 항원에 결합한 항원 결합 도메인을 당해 화합물의 저농도 존재하에 두는 공정,
(c) 상기 공정 (b)에서 해리된 항원 결합 도메인을 단리하는 공정,
(d) (c)에서 선택된 항원 결합 도메인을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드에 연결시키는 공정,
(e) (d)에서 얻어진 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된 벡터가 도입된 세포를 배양하는 공정, 및
(f) (e)에서 배양된 세포의 배양액으로부터 항원 결합 분자를 회수하는 공정
을 포함하는 항원 결합 분자의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 아래의 (a) 내지 (g)의 공정；
(a) 저분자 화합물의 비존재하에서 항원 결합 도메인의 라이브러리를 항원에 접촉시키는 공정,
(b) 상기 공정 (a)에서 항원에 결합하지 않는 항원 결합 도메인을 선택하는 공정,
(c) 상기 공정 (b)에서 선택된 항원 결합 도메인을 당해 화합물의 존재하에서 항원에 결합시키는 공정,
(d) 상기 공정 (c)에서 항원에 결합한 항원 결합 도메인을 단리하는 공정,
(e) (d)에서 선택된 항원 결합 도메인을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드에 연결시키는 공정,
(f) (e)에서 얻어진 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된 벡터가 도입된 세포를 배양하는 공정, 및
(g) (f)에서 배양된 세포의 배양액으로부터 항원 결합 분자를 회수하는 공정
을 포함하는 항원 결합 분자의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 아래의 (a) 내지 (g)의 공정；
(a) 저분자 화합물의 저농도 존재하에서 항원 결합 도메인의 라이브러리를 항원에 접촉시키는 공정,
(b) 상기 공정 (a)에서 항원에 결합하지 않는 항원 결합 도메인을 선택하는 공정,
(c) 상기 공정 (b)에서 선택된 항원 결합 도메인을 당해 화합물의 고농도 존재하에서 항원에 결합시키는 공정,
(d) 상기 공정 (c)에서 항원에 결합한 항원 결합 도메인을 단리하는 공정,
(e) (d)에서 선택된 항원 결합 도메인을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드에 연결시키는 공정,
(f) (e)에서 얻어진 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된 벡터가 도입된 세포를 배양하는 공정, 및
(g) (f)에서 배양된 세포의 배양액으로부터 항원 결합 분자를 회수하는 공정
을 포함하는 항원 결합 분자의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 아래의 (a) 내지 (f)의 공정；
(a) 항원을 고정한 칼럼에 저분자 화합물의 존재하에서 항원 결합 도메인의 라이브러리를 접촉시키는 공정,
(b) 상기 공정 (a)에서 칼럼에 결합한 항원 결합 도메인을 당해 화합물의 비존재하에서 칼럼으로부터 용출하는 공정,
(c) 상기 공정 (b)에서 용출된 항원 결합 도메인을 단리하는 공정,
(d) (c)에서 선택된 항원 결합 도메인을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드에 연결시키는 공정,
(e) (d)에서 얻어진 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된 벡터가 도입된 세포를 배양하는 공정, 및
(f) (e)에서 배양된 세포의 배양액으로부터 항원 결합 분자를 회수하는 공정
을 포함하는 항원 결합 분자의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 아래의 (a) 내지 (f)의 공정；
(a) 항원을 고정한 칼럼에 저분자 화합물의 고농도 존재하에서 항원 결합 도메인의 라이브러리를 접촉시키는 공정,
(b) 상기 공정 (a)에서 칼럼에 결합한 항원 결합 도메인을 당해 화합물의 저농도 존재하에서 칼럼으로부터 용출하는 공정,
(c) 상기 공정 (b)에서 용출된 항원 결합 도메인을 단리하는 공정,
(d) (c)에서 선택된 항원 결합 도메인을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드에 연결시키는 공정,
(e) (d)에서 얻어진 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된 벡터가 도입된 세포를 배양하는 공정, 및
(f) (e)에서 배양된 세포의 배양액으로부터 항원 결합 분자를 회수하는 공정
을 포함하는 항원 결합 분자의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 아래의 (a) 내지 (g)의 공정；
(a) 항원을 고정한 칼럼에 저분자 화합물의 비존재하에서 항원 결합 도메인의 라이브러리를 통과시키는 공정,
(b) 상기 공정 (a)에서 칼럼에 결합하지 않고 용출된 항원 결합 도메인을 회수하는 공정,
(c) 상기 공정 (b)에서 회수된 항원 결합 도메인을 당해 화합물의 존재하에서 항원에 결합시키는 공정,
(d) 상기 공정 (c)에서 항원에 결합한 항원 결합 도메인을 단리하는 공정,
(e) (d)에서 선택된 항원 결합 도메인을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드에 연결시키는 공정,
(f) (e)에서 얻어진 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된 벡터가 도입된 세포를 배양하는 공정, 및
(g) (f)에서 배양된 세포의 배양액으로부터 항원 결합 분자를 회수하는 공정
을 포함하는 항원 결합 분자의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 아래의 (a) 내지 (g)의 공정；
(a) 항원을 고정한 칼럼에 저분자 화합물의 저농도 존재하에서 항원 결합 도메인의 라이브러리를 통과시키는 공정,
(b) 상기 공정 (a)에서 칼럼에 결합하지 않고 용출된 항원 결합 도메인을 회수하는 공정,
(c) 상기 공정 (b)에서 회수된 항원 결합 도메인을 당해 화합물의 고농도 존재하에서 항원에 결합시키는 공정,
(d) 상기 공정 (c)에서 항원에 결합한 항원 결합 도메인을 단리하는 공정,
(e) (d)에서 선택된 항원 결합 도메인을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드에 연결시키는 공정,
(f) (e)에서 얻어진 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된 벡터가 도입된 세포를 배양하는 공정, 및
(g) (f)에서 배양된 세포의 배양액으로부터 항원 결합 분자를 회수하는 공정
을 포함하는 항원 결합 분자의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 아래의 (a) 내지 (g)의 공정；
(a) 저분자 화합물의 존재하에서 항원 결합 도메인의 라이브러리를 항원에 접촉시키는 공정,
(b) 상기 공정 (a)에서 항원에 결합한 항원 결합 도메인을 취득하는 공정,
(c) 상기 공정 (b)에서 취득한 항원 결합 도메인을 화합물의 비존재하에 두는 공정,
(d) 상기 공정 (c)에서 항원 결합 활성이 상기 공정 (b)에서 선택한 기준보다 약한 항원 결합 도메인을 단리하는 공정,
(e) (d)에서 선택된 항원 결합 도메인을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드에 연결시키는 공정,
(f) (e)에서 얻어진 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된 벡터가 도입된 세포를 배양하는 공정, 및
(g) (f)에서 배양된 세포의 배양액으로부터 항원 결합 분자를 회수하는 공정
을 포함하는 항원 결합 분자의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 아래의 (a) 내지 (g)의 공정；
(a) 저분자 화합물의 고농도 존재하에서 항원 결합 도메인의 라이브러리를 항원에 접촉시키는 공정,
(b) 상기 공정 (a)에서 항원에 결합한 항원 결합 도메인을 취득하는 공정,
(c) 상기 공정 (b)에서 취득한 항원 결합 도메인을 화합물의 저농도 존재하에 두는 공정,
(d) 상기 공정 (c)에서 항원 결합 활성이 상기 공정 (b)에서 선택한 기준보다 약한 항원 결합 도메인을 단리하는 공정,
(e) (d)에서 선택된 항원 결합 도메인을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드에 연결시키는 공정,
(f) (e)에서 얻어진 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된 벡터가 도입된 세포를 배양하는 공정, 및
(g) (f)에서 배양된 세포의 배양액으로부터 항원 결합 분자를 회수하는 공정
을 포함하는 항원 결합 분자의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 아래의 (a) 내지 (g)의 공정：
(a) 저분자 화합물의 비존재하에서 본 발명의 라이브러리를 항원에 접촉시키는 공정,
(b) 상기 공정 (a)에서 항원에 결합하지 않는 항원 결합 도메인을 선택하는 공정；
(c) 상기 공정 (b)에서 선택된 항원 결합 도메인을 저분자 화합물의 존재하에서 항원에 접촉시키는 공정；
(d) 상기 공정 (c)에서 항원에 결합한 항원 결합 도메인을 선택하는 공정；
(e) 상기 공정 (d)에서 선택된 항원 결합 도메인을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드에 연결시키는 공정；
(f) 상기 공정 (e)에서 얻어진 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된 벡터가 도입된 세포를 배양하는 공정；및
(g) 상기 공정 (f)에서 배양된 세포의 배양액으로부터 항원 결합 분자를 회수하는 공정
을 포함하는 저분자 화합물의 농도에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자의 제조방법을 제공한다.
또한 상기 태양에 더하여 아래의 (a) 내지 (b)의 공정：
(a) 본 발명의 라이브러리를 저분자 화합물에 접촉시키는 공정；및
(b) 상기 공정 (a)에서 회수된 항원 결합 도메인을 선택하는 공정；
을 추가로 포함하는, 저분자 화합물의 농도에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자의 제조방법도 제공된다.
또한 본 발명은 아래의 (a) 내지 (e)의 공정：
(a) 본 발명의 라이브러리를 저분자 화합물의 존재하에서 항원에 접촉시키는 공정；
(b) 상기 공정 (a)보다 저농도의 저분자 화합물로 항원 결합 도메인을 해리시켜 회수하는 공정；
(c) 상기 공정 (b)에서 회수된 항원 결합 도메인을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드에 연결시키는 공정；
(d) 상기 공정 (c)에서 얻어진 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된 벡터가 도입된 세포를 배양하는 공정；및
(e) 상기 공정 (d)에서 배양된 세포의 배양액으로부터 항원 결합 분자를 회수하는 공정
을 포함하는 저분자 화합물의 농도에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자의 제조방법을 제공한다.
또한 상기 태양에 더하여 아래의 (a) 내지 (b)의 공정：
(a) 본 발명의 라이브러리를 저분자 화합물에 접촉시키는 공정；및
(b) 상기 공정 (a)에서 회수된 항원 결합 도메인을 선택하는 공정；
을 추가로 포함하는, 저분자 화합물의 농도에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자의 제조방법도 제공된다.
항원 결합 도메인을 코드하는 폴리뉴클레오티드에 대해 그 폴리뉴클레오티드 서열이 연결되는 Fc영역의 비한정의 일태양으로서, 인간 IgG1(서열번호：5), IgG2(서열번호：6), IgG3(서열번호：7) 또는 IgG4(서열번호：8)로 표시되는 항체의 불변영역에 포함되는 Fc영역이 예시된다. Fc영역은 EU 넘버링으로 표시되는 대략 216번 위치의 아미노산에 있어서의 파파인 절단부위의 힌지영역의 N말단으로부터 당해 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 항체의 중쇄 불변영역의 부분이다. Fc영역은 인간 IgG1으로부터 취득될 수 있는데, IgG의 특정 서브클래스에 한정되는 것도 아니다.
항원 결합 도메인을 코드하는 폴리뉴클레오티드에 대해 그 폴리뉴클레오티드 서열이 연결되는 Fc영역의 비한정의 일태양으로서, 활성형 FcγR에 대한 결합 활성이 천연형 Fc영역의 활성형 FcγR에 대한 결합 활성보다 낮은 Fc영역이 예시된다. 당해 Fc영역의 비한정의 다른 일태양으로서, EU 넘버링으로 표시되는 234, 235, 236, 237, 238, 239, 270, 297, 298, 325, 328 및 329 중 어느 하나 이상의 아미노산이, 예를 들면 서열번호：5, 6, 7 또는 8로 표시되는 천연형 Fc영역과 다른 아미노산으로 개변되어 있는 Fc영역을 적합하게 들 수 있는데, Fc영역의 개변은 상기 개변에 한정되지 않고, 예를 들면 Cur. Opin. in Biotech. (2009) 20 (6), 685-691에 기재되어 있는 탈당쇄(N297A, N297Q), IgG1-L234A/L235A, IgG1-A325A/A330S/P331S, IgG1-C226S/C229S, IgG1-C226S/C229S/E233P/L234V/L235A, IgG1-L234F/L235E/P331S, IgG1-S267E/L328F, IgG2-V234A/G237A, IgG2-H268Q/V309L/A330S/A331S, IgG4-L235A/G237A/E318A, IgG4-L236E 등의 개변 및 국제공개 WO2008/092117에 기재되어 있는 G236R/L328R, L235G/G236R, N325A/L328R, N325L/L328R 등의 개변 및 EU 넘버링 233번 위치, 234번 위치, 235번 위치, 237번 위치에 있어서의 아미노산의 삽입, 국제공개 WO2000/042072에 기재되어 있는 개소의 개변이어도 된다.
본 발명의 항원 결합 분자에 포함되는 Fc영역이 당해 Fc영역에 결합한 당쇄의 조성이 푸코오스 결손 당쇄를 결합한 Fc영역의 비율이 높아지도록, 또는 바이섹팅 N-아세틸글루코사민이 부가된 Fc영역의 비율이 높아지도록 수식된 Fc영역인 경우, 상기 형질전환된 세포로서, 당쇄 수식을 받는 폴리펩티드의 당쇄 구조를 형성하는 활성이 개변된 결과, 당쇄에 푸코오스를 부가하는 능력이 낮은 숙주세포가 적절히 사용된다(국제공개 WO2000/061739, WO2002/031140, WO2006/067913 등). 당해 숙주세포의 비한정의 일태양으로서, 푸코실트랜스페라아제(EC 2.4.1.152), 푸코오스 트랜스포터(SLC35C1), GMD(GDP-만노오스 4,6-디히드라타아제)(EC 4.2.1.47), Fx(GDP-케토-6-데옥시만노오스 3,5-에피머라아제, 4-리덕타아제)(EC 1.1.1.271) 및 GFPP(GDP-β-L-푸코오스 피로포스포릴라아제)(EC 2.7.7.30)로 이루어진 군으로부터 선택되는 효소 또는 트랜스포터의 활성이 결실된 숙주세포가 적절히 사용된다(국제공개 WO2000/061739, WO2002/031140, WO2006/067913 등). 이러한 활성이 결실된 숙주세포는 CHO세포, BHK세포, NS0세포, SP2/0세포, YO 골수종세포, P3X63 마우스 골수종세포, PER세포, PER.C6세포, HEK293세포 또는 하이브리도마 세포 등에 내재성인 이들 기능성 단백질의 유전자를 기능 불능으로 파괴하는 방법 등에 의해 제작될 수 있다.
본 발명의 항원 결합 분자에 포함되는 Fc영역이 바이섹팅 GlcNAc을 갖는 당쇄를 갖는 Fc영역인 경우, 상기 형질전환된 세포로서 바이섹팅 GlcNAc을 갖는 당쇄를 갖는 항체를 제작하기 위해 GnTIII(β-1,4-만노실-글리코프로테인, 4-β-N-아세틸글루코사미닐트랜스페라아제)(EC 2.4.1.144) 활성 또는 GalT(β-1,4-갈락토실트랜스페라아제)(EC 2.4.1.38) 활성을 갖는 기능성 단백질을 코드하는 유전자를 발현하는 숙주세포가 적절히 사용된다(국제공개 WO2002/079255 등). 다른 비한정의 적합한 일태양에서는 상기 기능성 단백질에 더하여 인간 ManII(만노시다아제 II)(3.2.1.114) 활성을 갖는 기능성 단백질을 코드하는 유전자, GnTI(β-1,2-아세틸글루코사미닐트랜스페라아제 I)(EC 2.4.1.94) 활성을 갖는 기능성 단백질을 코드하는 유전자, GnTII(β-1,2-아세틸글루코사미닐트랜스페라아제 II)(EC 2.4.1.143) 활성을 갖는 기능성 단백질을 코드하는 유전자, ManI(만노시다아제)(EC 3.2.1.113) 활성을 갖는 기능성 단백질을 코드하는 유전자 및 α-1,6-푸코실트랜스페라아제(EC 2.4.1.68)와 공발현하는 숙주세포가 적절히 사용된다(국제공개 WO2004/065540).
상기 세포의 배양액으로부터 단리하는 등의 상기 항체의 항목에서 기재된 항체의 제조방법에 준한 방법을 사용하여 본 발명의 항원 결합 분자가 제조된다. 상기 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드의 비한정의 일태양으로서, 예를 들면 서열번호：5, 6, 7 또는 8로 표시되는 항체의 불변영역이 예시된다. 또한 본 발명의 항원 결합 분자의 비한정의 일태양으로서 전장 항체 분자를 들 수 있다.
의약 조성물
본 발명에 의해 부작용을 회피하면서 약효를 발휘하기 위해 정상 조직이나 혈액 중에 있어서 전신적으로 작용하지 않고, 병변 부위인 암이나 염증 부위에 있어서 작용하는 항원 결합 분자를 포함하는 의약 조성물이 제공된다. 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항원 결합 분자는 표적 조직에 있어서 특이적으로 존재 또는 생산되는 표적 조직 특이적 화합물 및/또는 그 조직에 집적되는 비천연 화합물의 농도에 따라 표적 항원으로의 결합이 제어되는 것으로부터, 예를 들면 상기 항원 결합 분자가 암조직이나 염증 조직에 있어서의 항원을 표적으로 하는 경우, 암조직에 있어서의 암세포·면역세포·스트로마 세포 등에 발현하는 항원, 암조직에 분비되고 있는 항원 또는 염증성 조직에 있어서의 면역세포 등에 발현하는 항원, 염증성 조직에 분비되고 있는 항원에 결합하고, 정상 조직에 발현되고 있는 항원에 결합하는 것이 불가능하기 때문에, 정상 조직에 대한 세포 상해 작용이나 중화 작용 등에 의한 부작용을 회피하면서, 암에 대한 강력한 세포 상해 작용이나 증식억제 작용, 면역항진 작용 등 또는 염증성 조직에 있어서의 염증성 세포에 대한 면역억제 효과 등을 발휘한다. 예를 들면 암조직 특이적 화합물에 의존적으로 T세포에 발현하는 CD3에 결합하는 항원 결합 도메인과, 암세포에 발현하는 EGFR에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자 또는 이중 파라토픽 항원 결합 분자는 정상 조직에 발현하는 EGFR에 결합하지 않고, 암세포에 발현되고 있는 EGFR에 결합하기 때문에 부작용을 회피하면서 강력한 항종양 효과를 발휘한다. 즉, 암세포 근방에 있는 T세포에 발현되고 있는 CD3에는 암조직 특이적 화합물에 의존적으로 결합하는데, 암세포 근방 이외에 있는 T세포에 발현되고 있는 CD3에 결합하지 않기 때문에, 암세포 근방에 있는 T세포를 활성화하여 부작용을 회피하면서 강력한 항종양 효과를 발휘한다.
이와 같이 표적 조직에 있어서 항원에 결합하고, 그 이외의 정상 조직이나 혈액 중에서는 항원에 결합하지 않는 항원 결합 분자는 부작용을 회피하면서 약효를 발휘한다. 본 발명이 제공하는 생체 내의 표적 조직에 있어서 고농도로 존재하는 저분자를 스위치로서 항원에 결합하는 항원 결합 분자, 즉, 저분자 스위치 항원 결합 분자(Small molecule switch antigen binding molecule)는 당해 저분자가 존재하지 않는 정상의 환경에서는 항원에 결합하지 않고, 당해 저분자가 고농도로 존재하는 표적 조직에서는 항원에 결합하는 것이 가능하다.
이러한 저분자 스위치 항원 결합 분자의 비한정의 일태양으로서, 먼저 암조직이나 염증성 조직에 있어서 고농도로 존재하고, 스위치로서 기능할 수 있는 암조직 또는 염증성 조직 특이적 화합물인 아데노신(adenosine), 아데노신 3인산(adenosine 5'-triphosphate; ATP), 이노신(inosine), 키누레닌(kynurenine), 프로스타글란딘 E2(prostaglandin E2; PGE2), 숙신산(succinic acid), 락트산(lactic acid)이 본 발명의 항원 결합 분자(에 포함되는 파라토프)와 항원(에 포함되는 에피토프) 사이에 끼이거나, 또는 본 발명의 항원 결합 분자에 결합함으로써 항원 결합 분자의 항원에 대한 파라토프의 구조에 변화를 일으켜 스위치 기능을 하는 암조직 또는 염증성 조직 특이적인 화합물 의존적인 항원 결합 분자가 예시된다. 당해 화합물이 존재하지 않으면 본 발명의 항원 결합 분자에 포함되는 파라토프와 항원에 포함되는 에피토프의 상호작용이 불충분해져 본 발명의 항원 결합 분자는 항원에 결합하는 것이 불가능하나, 당해 화합물이 존재하면 본 발명의 항원 결합 분자에 포함되는 파라토프와 항원에 포함되는 에피토프 사이에 끼이거나, 또는 파라토프의 구조를 변화시킴으로써 당해 화합물이 고농도로 존재하는 암조직 또는 염증성 조직 등의 표적 조직에 있어서 항원에 결합한 당해 항원 결합 분자가 당해 항원을 발현하는 세포에 대해 약효를 발휘하는 것이 가능하다. 또한 이 스위치가 되는 화합물의 결합은 가역적이기 때문에 이들 화합물의 스위치에 의한 본 발명의 항원 결합 분자의 항원에 대한 결합의 제어는 가역적이라 생각된다. 이와 같이 암조직 또는 염증성 조직 등의 병변 부위에 있어서 암조직 또는 염증성 조직에 있어서의 암세포나 면역세포 등의 병적 세포에 결합하거나 또는 암조직 또는 염증성 조직에 있어서 분비된 항원에 결합하여 약효를 발휘하는 것이 가능한 본 발명의 항원 결합 분자는 의약 조성물로서 유용하다. 본 발명의 의약 조성물에는 의약적으로 허용되는 담체가 포함될 수 있다.
본 발명에 있어서 의약 조성물이란 통상 질환의 치료 또는 예방, 또는 검사·진단을 위한 약제를 말한다. 또한 본 발명에 있어서 「저분자 화합물의 농도에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 분자를 포함하는 의약 조성물」(여기서 저분자 화합물은 표적 조직 특이적 화합물, 비천연 화합물 등)이라는 용어는, 「저분자 화합물의 농도에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 분자를 치료 대상에 투여하는 것을 포함하는 질환의 치료방법」으로 바꿔말하는 것이 가능하고, 「질환을 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서의 저분자 화합물의 농도에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 분자의 사용」으로 바꿔말하는 것도 가능하다. 또한 「저분자 화합물의 농도에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 분자를 포함하는 의약 조성물」이라는 용어를, 「질환을 치료하기 위한 저분자 화합물의 농도에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 분자의 사용」으로 바꿔말하는 것도 가능하다.
본 발명의 의약 조성물은 당업자에게 공지의 방법을 사용하여 제제화될 수 있다. 예를 들면 물 또는 그 이외의 약학적으로 허용 가능한 액과의 무균성 용액 또는 현탁액제의 주사제의 형태로 비경구적으로 사용될 수 있다. 예를 들면 약리학상 허용되는 담체 또는 매체, 구체적으로는 멸균수나 생리식염수, 식물유, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 향미제, 부형제, 비히클, 방부제, 결합제 등과 적절히 조합하여 일반적으로 확인된 제약 실시에 요구되는 단위 용량 형태로 혼화함으로써 제제화될 수 있다. 이들 제제에 있어서의 유효 성분량은 지시된 범위의 적당한 용량이 얻어지도록 설정된다.
주사를 위한 무균 조성물은 주사용 증류수와 같은 비히클을 사용하여 통상의 제제 실시에 따라 처방될 수 있다. 주사용 수용액으로서는, 예를 들면 생리식염수, 포도당이나 기타 보조제(예를 들면 D-소르비톨, D-만노오스, D-만니톨, 염화나트륨)를 포함하는 등장액을 들 수 있다. 적절한 용해 보조제, 예를 들면 알코올(에탄올 등), 폴리알코올(프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 등), 비이온성 계면활성제(폴리소르베이트 80(TM), HCO-50 등)가 병용될 수 있다.
유성액으로서는 참기름, 대두유를 들 수 있고, 용해 보조제로서 안식향산벤질 및/또는 벤질알코올도 병용될 수 있다. 또한 완충제(예를 들면 인산염 완충액 및 초산나트륨 완충액), 무통화제(예를 들면 염산프로카인), 안정제(예를 들면 벤질알코올 및 페놀), 산화방지제와 배합될 수 있다. 조제된 주사액은 통상 적절한 앰플에 충전된다.
본 발명의 의약 조성물은 바람직하게는 비경구 투여에 의해 투여된다. 예를 들면 주사제형, 경비 투여제형, 경폐 투여제형, 경피 투여형의 조성물이 투여된다. 예를 들면 정맥 내 주사, 근육 내 주사, 복강 내 주사, 피하 주사 등에 의해 전신 또는 국부적으로 투여될 수 있다.
투여방법은 환자의 연령, 증상에 따라 적절히 선택될 수 있다. 항원 결합 분자를 함유하는 의약 조성물의 투여량은, 예를 들면 1회에 대해 체중 1 ㎏당 0.0001 ㎎~1,000 ㎎의 범위로 설정될 수 있다. 또는 예를 들면 환자당 0.001~100,000 ㎎의 투여량이 설정될 수 있는데, 본 발명은 이들 수치에 반드시 제한되는 것은 아니다. 투여량 및 투여방법은 환자의 체중, 연령, 증상 등에 따라 변동되는데, 당업자라면 그들 조건을 고려하여 적당한 투여량 및 투여방법을 설정하는 것이 가능하다.
또한 본 발명에 기재하는 아미노산 서열에 포함되는 아미노산은 번역 후에 수식(예를 들면 N말단의 글루타민의 피로글루타밀화에 의한 피로글루타민산으로의 수식은 당업자에게 잘 알려진 수식임)을 받는 경우도 있는데, 이와 같이 아미노산이 번역 후 수식된 경우라도 당연히 본 발명에 기재하는 아미노산 서열에 포함된다.
본 명세서에 기재된 1 또는 복수의 태양을 임의로 조합한 것도 당업자의 기술상식에 기초하여 기술적으로 모순되지 않는 한 본 발명에 포함되는 것이 당업자에게 당연히 이해될 것이다.
또한 본 명세서에 있어서 인용된 모든 선행기술문헌은 참조로써 본 명세서에 포함된다.
아래에 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하나, 본 발명은 이들 실시예에 제한되는 것은 아니다.
실시예
〔실시예 1〕표적 조직에 있어서 고농도로 존재하는 저분자를 스위치로서 항원에 결합하는 항체의 콘셉트 및 취득 전략
(1-1) 표적 조직 특이적 화합물 존재하에서 항원으로의 결합능이 변화되는 스위치 항체의 콘셉트
부작용을 회피하면서 약효를 발휘하기 위해, 정상 조직이나 혈액 중에 있어서 전신적으로 작용하지 않고 병변 부위인 암이나 염증 부위에 있어서 작용하는 창약기술이 요구되고 있다. 투여된 후에 암세포에 발현되고 있는 항원에 결합하고 정상 조직에 발현되고 있는 항원에 결합하는 것이 불가능한 항체 분자는 정상 조직에 대한 세포 상해 작용에 의한 부작용을 회피하면서 암에 대한 강력한 세포 상해 작용을 발휘하는 것이 가능하다. 예를 들면 상기 EGFR-BiTE(비특허문헌 9)가 개변된 항원 결합 분자로서, 정상 조직에 발현하는 EGFR에는 결합하지 않고 암세포에 발현되고 있는 EGFR에 결합하는 것이 가능한 분자는 부작용을 회피하면서 강력한 항종양 효과를 발휘하는 것이 가능하다. 또한 BiTE는 CD3를 매개로 T세포를 리쿠르트하여 활성화함으로써 항종양 효과를 발휘하기(비특허문헌 8) 때문에, EGFR-BiTE에 대해 암세포 근방에 있는 T세포에 발현되고 있는 CD3에는 결합하지만 암세포 근방 이외에 있는 T세포에 발현되고 있는 CD3에 결합하지 않는 성질을 부여할 수 있다면, 이러한 성질을 부여받은 개변 EGFR-BiTE는 암에 있어서 T세포를 활성화하는 것이 가능하여 부작용을 회피하면서 강력한 항종양 효과를 발휘하는 것이 가능해진다.
암에 대한 항체 의약에 한정되지 않고, 항체 분자가 류머티스성 관절염에 있어서 염증이 일어난 관절의 활액 중에서 사이토카인에 결합하여 그 작용을 저해하고 전신적으로는 저해하지 않는다면, 전신적인 사이토카인의 중화에 의한 감염증 리스크의 증대를 회피하면서 류머티스성 관절염 등의 염증성 질환·자기면역질환에 대해 높은 치료효과를 발휘하는 것이 가능할 것으로 생각되었다.
이와 같이 암조직에 있어서 항원에 결합하고 그 이외의 정상 조직이나 혈액 중에서는 항원에 결합하지 않는 항체는 부작용을 회피하면서 약효를 발휘하는 것이 가능하다. 그러나 지금까지 이러한 특성을 갖는 이상적인 항체는 보고되어 있지 않다. 이에 생체 내의 암조직에 있어서 고농도로 존재하는 저분자, 또는 생체에 투여한 후 암조직에 집적되는 성질을 갖는 화합물을 스위치로서 항원에 결합하는 항체 분자, 즉, 저분자 스위치 항체(Small molecule switch antibody)는 도 1에 나타내는 바와 같이 저분자가 존재하지 않는 환경에서는 항원에 결합하지 않고 저분자가 고농도로 존재하는 표적 조직에서는 항원에 결합하는 것이 가능하다.
이러한 저분자 스위치 항체를 창제하는데 있어서, 먼저 암조직에 있어서 고농도로 존재하고 스위치로서 사용할 수 있을 것으로 생각되는 저분자가 탐색되었다. 그 결과, 아데노신(adenosine), 아데노신 3인산(adenosine 5'-triphosphate; ATP), 이노신(inosine), 키누레닌(kynurenine), 프로스타글란딘 E2(prostaglandin E2; PGE2), 숙신산(succinic acid), 락트산(lactic acid)이 스위치로서 유망하였다. 이들 저분자는 모두 암세포 자체로부터 생산되거나 또는 세포사된 암세포로부터 방출되거나 또는 암조직에 침윤되어 있는 면역세포 등으로부터 생산됨으로써 암조직에 있어서 고농도로 존재하며, 정상 조직이나 혈액 중에서는 암조직과 비교하여 저농도로 존재하고 있다.
다음으로 생체에 투여된 후, 암조직에 집적되는 성질을 갖는 분자가 탐색되었다. Xeloda나 TH302 등의 프로드러그는 생체 내에 투여된 후, 암조직에 발현되고 있는 대사효소에 의해 대사되어 스위치가 될 수 있는 저분자를 생산한다. 즉 5-FU(fluorouracil)나 Br-IPM 등이 스위치로서 유망할 것으로 생각되었다. 5-FU는 카페시타빈(Xeloda)의 대사물로 암조직 특이적인 대사효소인 시티딘 데아미나제(cytidine deaminase)와 티미딘 포스포릴라아제(thymidine phosphorylase)에 의해 대사되는 것이 알려져 있다(Desmoulin F. et al. Drug Metab Dispos. 2002). 또한 TH-302는 암조직 주변과 같이 저효소의 조건하에서 환원됨으로써 Br-IPM으로 변환되는 것이 알려져 있다(Duan JX, et al. J Med Chem. 2008). 이들 사실로부터 프로드러그는 생체 내에 투여된 후, 암조직에서 발현되고 있는 대사효소로 대사됨으로써 고농도로 존재하고, 정상 조직이나 혈액 중에서는 암조직과 비교하여 저농도로 존재하고 있는 것으로 생각된다.
이들 저분자가 도 2에 나타내는 바와 같이 항체와 항원의 복합체 사이에 끼이는 것이 가능하다면, 당해 저분자는 스위치 기능을 하는 것이 가능하다. 또는 이들 저분자가 항체에 결합함으로써 항체의 항원 결합 부위의 입체구조를 변화시켜, 그로 인해 항원으로의 결합능을 변화시킬 수 있다면 당해 저분자는 스위치 기능을 할 수 있다. 즉, 저분자가 존재하지 않으면 항체와 항원의 상호작용이 불충분해져 항체는 항원에 결합하는 것이 불가능하나, 저분자가 존재하면 항체는 항원에 결합하는 것이 가능해진다. 바꿔말하면 저농도의 저분자 존재하에서는 항체와 항원의 상호작용이 불충분해져 항체는 항원에 결합하는 것이 불가능하나, 고농도의 저분자 존재하에서는 항체는 항원에 결합하는 것이 가능해진다. 또한 이 스위치가 되는 저분자의 결합은 가역적이기 때문에, 이들 저분자 스위치에 의한 항원 결합의 제어는 가역적이다.
또한 스위치가 되는 외래성 화합물을 경구 투여함으로써 항체의 작용을 경구제를 복용함으로써 조절하는 것도 가능하다. 즉, 어떤 경구 등의 비침습 투여 가능한 외래성 화합물을 스위치로 하여 어떤 항원에 대해 결합을 나타내는 스위치 항체를 정맥 내 또는 피하 투여 등의 침습 투여해 두고, 스위치가 되는 외래성 화합물을 경구 등의 비침습 투여함으로써 그 항체의 작용을 조절하는 것이 가능하다. 항체 의약은 반감기가 긴 것으로부터 부작용이 발생한 경우는 그 작용이 지속되어 버리는 것이 결점이나, 이와 같이 항체의 작용을 외래성 화합물의 경구 등의 비침습 투여에 의해 조절할 수 있으면, 부작용이 발생하였을 때 스위치 분자의 투여를 멈춤으로써 약의 작용을 멈추는 것이 가능하다. 또한 사전에 스위치 항체를 투여해 둠으로써 질환에 따라 증상이 발생하였을 때만 스위치 분자를 투여하여 필요할 때만 경구 등의 비침습 투여에 의해 약리작용을 발휘하는 것이 가능하다.
(1-2) 표적 조직 특이적 화합물 존재하에서 항원으로의 결합능이 변화되는 스위치 항체의 취득 전략
표적 조직 특이적 화합물의 존재 유무로 가역적으로 항원과 결합하는 스위치 항체를 보다 효율적으로 창제하기 위한 방법으로서 라이브러리 기술을 이용한 방법이 있다. 표적 조직 특이적 화합물과의 결합을 유지하고 있는 항체를 주형으로 화합물과의 결합에 관여하지 않는 가변영역을 라이브러리화함으로써 통상의 항체 라이브러리보다도 고빈도로 화합물과 결합 가능한 항체가 출현되기 때문에, 목적하는 성질을 갖는 항원 결합 분자를 효율적으로 취득할 수 있을 것으로 생각된다. 이에 먼저 라이브러리의 주형 서열이 되는 항체를 취득하기 위해 암세포에서 고농도로 존재하는 것이 알려져 있는 아데노신 또는 ATP에 대한 결합 항체의 취득이 시도되었다.
〔실시예 2〕토끼 B세포 클로닝에 의한 항아데노신 항체의 취득
(2-1) 아데노신 결합 라이브러리 제작을 위한 면역원의 디자인
토끼에 면역하는 면역원으로서 도 3에 나타낸 2'-아데노신-PEG-파상풍 독소 p30 헬퍼 펩티드(2'-Adenosine-PEG-peptide) 및 도 4에 나타낸 5'-아데노신-PEG-파상풍 독소 p30 헬퍼 펩티드(5'-Adenosine-PEG-peptide)가 사용되었다. 파상풍 독소 p30 헬퍼 펩티드는 FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(서열번호：4)의 아미노산 서열로 이루어지고, 헬퍼 T세포 상에 발현하는 T세포 수용체의 에피토프로서 동정된 펩티드이다(Eur. J. Immunol. (1989) 19, 2237-2242). 항체 생산을 활성화하는 것이 알려져 있어(J. Immunol. (1992) 149, 717-721), 아데노신과 연결시킴으로써 애쥬번트로서 작용하여 아데노신에 대한 항체 생산을 항진시키는 것이 기대된다. 생산되는 항체의 에피토프가 아데노신과 함께 파상풍 독소 p30 헬퍼 펩티드를 포함하기 어렵도록, 아데노신과 파상풍 독소 p30 헬퍼 펩티드의 연결에는 PEG를 매개로 하도록 디자인되었다. 아데노신은 ATP의 대사물인데, ATP의 인산기는 아데노신의 5' 위치 수산기에 부가되어 있는 것으로부터, 아데노신의 5' 위치 수산기를 에피토프로 하지 않는 항체는 아데노신에 더하여 ATP에도 결합할 가능성이 생각된다. 즉, 5'-아데노신-PEG-파상풍 독소 p30 헬퍼 펩티드를 면역원으로서 사용함으로써 아데노신과 ATP 양쪽에 결합할 수 있는 항체가 얻어지기 쉬워져, 2'-아데노신-PEG-파상풍 독소 p30 헬퍼 펩티드를 면역원으로서 사용함으로써 아데노신에 결합하고 ATP에는 결합하지 않는 항체가 얻어지기 쉬워질 것으로 상정되는 것으로부터, 아데노신의 2' 위치 또는 5' 위치에 연결하는 파상풍 독소 p30 헬퍼 펩티드를 포함하는 2종류의 면역원이 (2-2)에 기재된 바와 같이 제작되었다.
이에 더하여 파상풍 독소 p30 헬퍼 펩티드 대신에 비오틴을 콘쥬게이트시킨 2'-아데노신-PEG-비오틴(도 5) 및 5'-아데노신-PEG-비오틴(도 6)이 아래와 같이 제작되었다. 이들 2종류의 아데노신-PEG-비오틴에 대한 결합을 검증함으로써, 파상풍 독소 p30 헬퍼 펩티드를 에피토프로서 포함하는 항체가 아닌 것을 판별하는 것이 가능해진다.
(2-2) 아데노신 결합 라이브러리 제작을 위한 면역원의 합성
2'-아데노신-PEG-펩티드(adenosine 2'-PEG-peptide conjugate 또는 2'-(PEG-peptide)adenosine) 및 2'-아데노신-PEG-비오틴(adenosine 2'-PEG-biotin conjugate 또는 2'-(PEG-biotin)adenosine)은 아래와 같이 합성되었다. 또한 합성된 2'-아데노신-PEG-펩티드 또는 2'-아데노신-PEG-비오틴은 아래의 조건으로 분석 또는 분취되었다.
LCMS의 분석 조건은 하기와 같다.
Figure 112021085263630-pat00006
HPLC의 분취 조건은 하기와 같다.
Figure 112021085263630-pat00007
(2-2-1) 화합물 006(Boc-Phe-Asn-Asn-Phe-Thr(tBu)-Val-Ser(tBu)-Phe-Trp(Boc)-Lue-Arg(Pbf)-Val-Pro-Lys(Boc)-Val-Ser(tBu)-Ala-Ser(tBu)-His(Trt)-Leu-Glu(tBu)-OH)의 합성
Figure 112021085263630-pat00008
펩티드 합성기(Multipep RS; Intavis)를 사용하여 Fmoc법에 의해 펩티드 합성이 행해졌다. 모든 Fmoc 아미노산은 와타나베 화학 공업으로부터 구입되었다. 또한 조작의 상세한 순서는 합성기 부속 매뉴얼에 따랐다.
합성기에 C말단의 Fmoc-Glu(tBu)-OH가 결합한 2-클로로트리틸 레진(1칼럼당 250 ㎎, 30 칼럼, 11.7 mmol)과, 각종 Fmoc 아미노산(0.6 mol/L)과 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸(0.375 mol/L)의 N,N-디메틸포름아미드 용액과, 디이소프로필카르보디이미드의 N,N-디메틸포름아미드 용액(10% v/v)을 세팅하고, Fmoc 탈보호 용액으로서 5%(wt/v)의 요소를 포함하는 피페리딘의 N,N-디메틸포름아미드 용액(20% v/v)을 사용하여 합성반응이 행해졌다. 레진은 N,N-디메틸포름아미드로 세정한 후, Fmoc 탈보호에 이어서 Fmoc 아미노산의 축합반응을 1사이클로 하여, 이 사이클을 반복함으로써 레진 표면 상에 펩티드를 신장시켰다. 신장 종료 후, 레진을 트리플루오로에탄올로 세정하고, 트리플루오로에탄올/디클로로메탄(＝1/1)을 첨가하여, 레진으로부터 펩티드의 잘라내기를 행해서 화합물 006(7.2 g)이 조생성물(crude product)로서 얻어졌다.
LCMS(ESI) m/z ＝1185(M+3H)3+
유지시간：1.24분(분석 조건 SQDAA05)
(2-2-2) 화합물 007의 합성
Figure 112021085263630-pat00009
0℃로 냉각된 아데노신(2.00 g, 7.48 mmol)의 N,N-디메틸포름아미드(40 ㎖) 현탁액에, 60% 수소화나트륨(0.42 g, 10.48 mol)이 첨가된 반응액이 0℃에서 1시간 교반되었다. 브로모초산메틸(0.76 ㎖, 8.01 mmol)이 첨가된 당해 반응액이 실온에서 5시간 교반되었다. 초산(1 ㎖) 및 메탄올(3 ㎖)이 첨가된 반응 혼합물이 감압 농축되었다. 얻어진 잔사가 순상(normal phase) 실리카겔 칼럼크로마토그래피(디클로로메탄/메탄올)로 정제되어 화합물 007(0.93 g, 37%)이 얻어졌다.
LCMS(ESI) m/z ＝ 340 (M+H)+
유지시간：0.27분(분석 조건 SQDFA05)
(2-2-3) 화합물 008의 합성
Figure 112021085263630-pat00010
t-부틸디메틸실릴클로라이드(999 ㎎, 6.63 mol) 및 이미다졸(722 ㎎, 10.61 mol)이 첨가된 화합물 007(900 ㎎, 2.65 mmol)의 피리딘(8 ㎖) 용액이 실온에서 4시간 교반되었다. 반응 혼합물로부터 초산에틸/물로 추출된 유기층이 포화식염수로 세정되었다. 무수 황산나트륨으로 건조된 유기층이 여과 후 감압 농축되었다. 얻어진 잔사가 순상 실리카겔 칼럼크로마토그래피(디클로로메탄/메탄올)로 정제되어 화합물 008(1.17 g, 78%)이 얻어졌다.
LCMS(ESI) m/z ＝ 568 (M+H)+
유지시간：1.10분(분석 조건 SQDFA05)
(2-2-4) 화합물 009의 합성
Figure 112021085263630-pat00011
물(0.17 ㎖)에 용해시킨 수산화리튬(61 ㎎, 2.55 mol)이 첨가된 화합물 008(290 ㎎, 0.511 mmol)의 메탄올(0.34 ㎖)/테트라히드로푸란(0.34 ㎖) 용액이 실온에서 30분간 교반되었다. 1 M 염산으로 중화된 반응 혼합물이 감압 농축되었다. 농축 잔사로부터 초산에틸/물로 추출된 유기층이 포화식염수로 세정되었다. 무수 황산나트륨으로 건조시킨 유기층은 여과 후 감압 농축되어 화합물 009(319 ㎎, 90%)이 얻어졌다.
LCMS(ESI) m/z ＝ 552(M-H)-
유지시간：0.97분(분석 조건 SQDFA05)
(2-2-5) 화합물 010 및 화합물 011의 합성
Figure 112021085263630-pat00012
Figure 112021085263630-pat00013
1-히드록시벤조트리아졸(75 ㎎, 0.553 mol) 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염(106 ㎎, 0.553 mol)이 첨가된 화합물 009(255 ㎎, 0.460 mmol)의 N,N-디메틸포름아미드(1.5 ㎖) 용액이 실온에서 3분간 교반되었다. O-(2-아미노에틸)-O'-2-아지도에틸)노나에틸렌글리콜(291 ㎎, 0.553 mmol)이 첨가된 반응액이 실온에서 3시간 교반되었다. 감압 농축된 반응 혼합물의 잔사가 역상(reverse phase) 실리카겔 칼럼크로마토그래피(10 mM 초산암모늄 수용액/메탄올)로 정제되어 화합물 010(177 ㎎, 42%) 및 011(72 ㎎, 19%)이 얻어졌다.
화합물 010
LCMS(ESI) m/z ＝ 1063(M+H)+
유지시간：0.98분(분석 조건 SQDFA05)
화합물 011
LCMS(ESI) m/z ＝ 949(M+H)+
유지시간：0.67분(분석 조건 SQDFA05)
(2-2-6) 화합물 012의 합성
Figure 112021085263630-pat00014
10% 팔라듐탄소(34 ㎎)가 첨가된 화합물 010(170 ㎎, 0.160 mmol)의 에탄올(1 ㎖) 용액이 수소 분위기하 2시간 교반되었다. 추가로 10% 팔라듐탄소(34 ㎎)를 첨가하고 수소 분위기하에서 2시간 교반하여 반응을 완결시켰다. 반응액의 여액이 감압 농축되어 화합물 012(34 ㎎, 95%)가 얻어졌다.
LCMS(ESI) m/z ＝ 1037 (M+H)+
유지시간：0.70분(분석 조건 SQDFA05)
(2-2-7) 화합물 013 및 화합물 014의 합성
Figure 112021085263630-pat00015
Figure 112021085263630-pat00016
화합물 006(354 ㎎, 0.110 mmol), 1-히드록시벤조트리아졸(13 ㎎, 0.100 mol) 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염(19 ㎎, 0.100 mol)이 첨가된 화합물 012(86 ㎎, 0.083 mmol)의 N,N-디메틸포름아미드(1.5 ㎖) 용액이 실온에서 2시간 교반되었다. 반응 혼합물의 여액이 표 2에 기재된 분취 조건 A로 정제되어 화합물 013 및 014의 혼합물(72 ㎎)이 얻어졌다.
화합물 013
LCMS(ESI) m/z ＝ 1525(M+3H)3+, 1144(M+4H)4+
유지시간：1.13분(분석 조건 SQDAA50)
화합물 014
LCMS(ESI) m/z ＝ 1444(M+3H)3+, 1083(M+4H)4+
유지시간：1.02분(분석 조건 SQDAA50)
(2-2-8) 2'-아데노신-PEG-펩티드(adenosine 2'-PEG-peptide conjugate 또는 2'-(PEG-peptide)adenosine)(화합물 015)의 합성
Figure 112021085263630-pat00017
트리플루오로초산(16 ㎖), 디클로로메탄(8 ㎖), 물(1.3 ㎖) 및 테트라이소프로필실란(1.3 ㎖)이 첨가된 화합물 013 및 014의 혼합물(42 ㎎)이 실온에서 6시간 교반되었다. 감압 농축된 반응 혼합물의 잔사가 표 2에 기재된 분취 조건 B로 정제되어 화합물 015(10 ㎎)가 얻어졌다.
LCMS(ESI) m/z ＝ 1090(M+3H)3+, 818(M+4H)4+
유지시간：0.52분(분석 조건 SQDAA50)
(2-2-9) 화합물 016의 합성
Figure 112021085263630-pat00018
10% 팔라듐탄소(34 ㎎)가 첨가된 화합물 011(70 ㎎, 0.074 mmol)의 에탄올(1 ㎖) 용액이 수소 분위기하 5시간 교반되었다. 반응액의 여액이 감압 농축되어 화합물 016(58 ㎎, 85%)이 얻어졌다.
LCMS(ESI) m/z ＝ 923(M+H)+
유지시간：0.50분(분석 조건 SQDFA05)
(2-2-10) 화합물 017의 합성
Figure 112021085263630-pat00019
D-비오틴 N-숙신이미딜(24 ㎎, 0.069 mmol) 및 트리에틸아민(13 ㎕, 0.094 mol)이 첨가된 화합물 016(58 ㎎, 0.063 mmol)의 N,N-디메틸포름아미드(1 ㎖) 용액이 실온에서 2시간 교반되었다. 추가로 D-비오틴 N-숙신이미딜(5 ㎎, 0.015 mmol)이 첨가된 후, 실온에서 1.5시간 교반시켜 반응을 완결시켰다. 반응 혼합물이 역상 실리카겔 칼럼크로마토그래피(10 mM 초산암모늄 수용액/메탄올)로 정제되어 화합물 017(50 ㎎, 69%)이 얻어졌다.
LCMS(ESI) m/z ＝ 1149(M+H)+
유지시간：1.04분(분석 조건 SQDFA05)
(2-2-11) 2'-아데노신-PEG-비오틴(adenosine 2'-PEG-biotin conjugate 또는 2'-(PEG-biotin)adenosine)(화합물 018)의 합성
Figure 112021085263630-pat00020
1 M 불화테트라-n-부틸암모늄테트라히드로푸란 용액(65 ㎕, 0.065 mmol)이 첨가된 화합물 017(62 ㎎, 0.054 mmol)의 테트라히드로푸란(2 ㎖) 용액이 실온에서 1시간 교반되었다. 추가로 1 M 불화테트라-n-부틸암모늄테트라히드로푸란 용액(20 ㎕, 0.020 mmol)을 첨가하고, 실온에서 1시간 교반시켜 반응을 완결시켰다. 감압 농축된 반응액의 잔사가 역상 실리카겔 칼럼크로마토그래피(0.1% 포름산 수용액/0.1% 포름산 아세토니트릴)로 정제되어 화합물 018(12 ㎎, 21%)이 얻어졌다.
LCMS(ESI) m/z ＝ 1035(M+H)+
유지시간：0.71분(분석 조건 SQDAA05)
또한 5'-아데노신-PEG-펩티드 및 5'-아데노신-PEG-비오틴도 동일한 반응을 이용해서 합성되었다.
(2-3) 동물에 의한 아데노신 결합 항체 제작 및 항체의 스크리닝
토끼가 통상의 방법으로 2'-아데노신-PEG-펩티드 및/또는 5'-아데노신-PEG-펩티드로 면역되었다. autoMACS Pro Separator와 FACSAria(BD)를 사용한 아데노신-PEG-비오틴 결합성과 토끼 IgG의 발현을 지표로 면역된 토끼의 혈액으로부터 채취된 세포 현탁액으로부터 아데노신 결합 활성을 갖는 세포의 후보가 선발되었다. 다음으로 선발된 세포의 배양상청 중에 분비된 항체가 스크리닝되었다. 스크리닝으로서 아데노신-PEG-비오틴에 대한 결합 활성을 갖는지 여부가 ELISA법으로 평가되었다. 또한 아데노신을 아데노신-PEG-비오틴과 함께 1,000배 이상 첨가하면 아데노신-PEG-비오틴에 대한 결합이 억제되는지 여부도 ELISA법으로 평가되었다. 아데노신-PEG-비오틴에 대한 결합 활성을 가져 아데노신-PEG-비오틴과 함께 아데노신을 첨가한 경우에 아데노신-PEG-비오틴에 대한 결합이 억제되는 것을 지표로 하여 선발된 세포로부터 PCR법을 사용하여 H쇄 가변영역 및 L쇄 가변영역이 취득되었다. 취득된 가변영역을 인간 IgG1 중쇄 불변영역 및 인간 경쇄 불변영역과 조합해서 발현시켰다.
〔실시예 3〕토끼 B세포 클로닝으로부터 얻어진 클론의 평가
(3-1) 토끼 B세포 클로닝으로부터 얻어진 클론의 2'-아데노신-PEG-비오틴에 대한 결합 활성의 평가
토끼 B세포 클로닝법에 의해 얻어진 클론의 아데노신에 대한 결합 활성이 SPR법을 사용해서 평가되었다. 비아코어 4000(GE Healthcare)을 사용하여 상기 클론과 2'-아데노신-PEG-비오틴의 항원 항체 반응이 속도론적으로 해석되었다. 아민 커플링법으로 적절한 양의 protein A/G(Invitrogen)가 고정화된 센서칩 CM5(GE Healthcare)에 목적의 항체를 캡쳐시켰다. 다음으로 애널라이트로로서 100 nmol/L의 2'-아데노신-PEG-비오틴을 60초간 상호작용시킨 후, 애널라이트의 해리가 60초간 추적 측정되었다. 러닝 버퍼에는 HBS-P+(GE Healthcare)가 사용되었다. 측정은 모두 25℃에서 실시되고, 애널라이트의 희석에는 러닝 버퍼가 사용되었다.
2'-아데노신-PEG-비오틴을 상호작용시켰을 때의 결합량을 각 항체의 캡쳐량(RU)으로 나눈 값(N_binding_100)과, 2'-아데노신-PEG-비오틴의 상호작용 후에 각 항체로부터 2'-아데노신-PEG-비오틴이 해리된 60초 후의 값을 각 항체의 캡쳐량(RU)으로 나눈 값(N_stability_100)을 지표로 함으로써 각 항체의 2'-아데노신-PEG-비오틴에 대한 결합 활성이 비교되었다. 단, 캡쳐량이 1,500 RU 이하인 항체는 결합을 충분히 관찰할 수 없었기 때문에 검토 대상에서 제외되었다. 이 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7의 결과로부터, B 세포 클로닝법에 의해 아데노신에 대해 다양한 어피니티(affinity)로 결합하는 클론이 취득된 것이 명확해졌다.
(3-2) 2'-아데노신-PEG-비오틴 결합 클론의 아데노신 및 ATP에 대한 결합 활성의 평가 및 그의 서열 해석
2'-아데노신-PEG-비오틴에 대한 결합이 확인된 클론의 아데노신 또는 ATP에 대한 결합이 SPR법 및 경합 ELISA법에 의해 평가되었다.
(3-2-1) 2'-아데노신-PEG-비오틴 결합 클론의 SPR법에 의한 아데노신에 대한 결합의 평가
비아코어 T200(GE Healthcare)을 사용하여 B 세포 클로닝법에 의해 얻어진 항체 SMB0002의 아데노신과의 항원 항체 반응의 상호작용이 해석되었다. 센서칩 CM5(GE Healthcare) 상에 아민 커플링법으로 적절한 양 고정화된 protein A(Invitrogen)에 목적의 항체를 캡쳐시키고, 항원인 아데노신을 상호작용시켰다. 러닝 버퍼에는 50 mmol/L TrisHCl, 150 mmol/L NaCl, 0.02% (w/v) Tween20, pH 7.6이 사용되었다. 측정은 모두 25℃에서 실시되고, 항원의 희석에는 러닝 버퍼가 사용되었다.
SMB0002에 대해서는 항원 희석액과 블랭크인 러닝 버퍼를 유속 30 μL/min로 75초간 첨가하고, 센서칩 상에 캡쳐시킨 항체에 각 항원을 상호작용시켰다. 그 후, 유속 30 μL/min로 4분간 러닝 버퍼를 주입하여 항원의 항체로부터의 해리가 관찰되었다. 그 후, 10 mmol/L 글리신-HCl, pH 1.5를 유속 30 μL/min로 30초간 첨가하여 센서칩이 재생되었다. 측정에서 얻어진 센서그램으로부터 키네틱스 파라미터인 결합속도상수 ka(1/Ms) 및 해리속도상수 kd(1/s)가 산출되었다. 이들 상수를 토대로 해리상수 KD(M)가 산출되었다. 각 파라미터의 산출에는 비아코어 T200 평가 소프트웨어(GE Healthcare)가 사용되었다.
그 결과, SMB0002는 아데노신에 대해 결합하는 것이 발견되었다. 클론을 아데노신, 100(Duplicate), 50, 25, 12.5, 6.25, 3.13 nM의 농도로 결합을 평가했을 때 관찰된 센서그램을 도 8a에 정리하였다. SMB0002의 아데노신에 대한 KD는 1.5×10-8(mol/L)이었다.
(3-2-2) 2'-아데노신-PEG-비오틴 결합 클론의 SPR법에 의한 ATP에 대한 결합의 평가
비아코어 T200(GE Healthcare)을 사용하여 ATP와의 항원 항체 반응의 상호작용이 해석되었다. 센서칩 CM5(GE Healthcare) 상에 아민 커플링법으로 적절한 양 고정화된 protein A/G(Invitrogen)에 목적의 항체를 캡쳐시키고, 항원인 ATP를 상호작용시켰다. 러닝 버퍼에는 10 mmol/L ACES, 150 mmol/L NaCl, 0.05% (w/v) Tween20, pH 7.4가 사용되었다. 측정은 모두 25℃에서 실시되고, 항원의 희석에는 러닝 버퍼가 사용되었다.
SMB0002는 항원 희석액과 블랭크인 러닝 버퍼를 유속 20 μL/min로 2분간 주입하여 센서칩 상에 캡쳐시킨 항체에 각 항원을 상호작용시켰다 그 후, 유속 20 μL/min로 3분간 러닝 버퍼를 주입하여 항원의 항체로부터의 해리가 관찰되었다. 그 후, 10 mmol/L 글리신-HCl, pH 1.5를 유속 30 μL/min로 30초간 주입하여 센서칩이 재생되었다. 측정에서 얻어진 센서그램으로부터 키네틱스 파라미터인 결합속도상수 ka(1/Ms) 및 해리속도상수 kd(1/s)가 산출되었다. 이들 상수를 토대로 해리상수 KD(M)가 산출되었다. 각 파라미터의 산출에는 비아코어 T200 평가 소프트웨어(GE Healthcare)가 사용되었다.
그 결과, SMB0002는 ATP에 대해서도 결합하는 것이 발견되었다. 각 클론을 ATP 5000, 1250, 313, 78.1 nM의 농도로 결합을 평가했을 때 관찰된 센서그램을 도 8b에 정리하였다. 도 8a 및 8b에 나타내는 바와 같이, SMB0002는 아데노신과 ATP 양쪽에 대한 결합이 확인되었다. SMB0002의 아데노신에 대한 KD는 1.5E-8(mol/L)이고, SMB0002의 ATP에 대한 KD는 1.0E-5(mol/L)이었다.
(3-2-3) 2'-아데노신-PEG-비오틴 결합 클론의 경합 ELISA법에 의한 아데노신 및 ATP로의 결합 평가
2'-아데노신-PEG-비오틴에 대한 결합이 확인된 항체를 1 ㎍/mL가 되도록 PBS로 희석하여 384 well의 MAXISorp(Nunc)의 각 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 이상 방치하여 플레이트에 결합시켰다. 플레이트의 각 웰 중의 PBS로 희석한 항체가 제거된 후, 1% BSA를 포함하는 TBS가 첨가된 당해 플레이트는 1시간 이상 방치되었다. 그 후, 1% BSA를 포함하는 TBS pH 7.4를 제거하고, PBS로 희석한 50 nM의 2'-아데노신-PEG-비오틴, PBS로 희석한 50 nM의 2'-아데노신-PEG-비오틴과 500 μM의 아데노신의 혼합물, PBS로 희석한 50 nM의 2'-아데노신-PEG-비오틴과 500 μM의 ATP의 혼합물, 또는 PBS만 중 어느 하나가 첨가된 당해 플레이트가 실온에서 1시간 방치되었다. 그 후, 당해 플레이트의 각 웰이 0.05% Tween-20을 포함하는 PBS 80 μL로 3회 세정되었다. 그 후, PBS로 20,000배로 희석된 스트렙트아비딘-HRP(Thermo fisher scientific)가 각 웰에 첨가된 플레이트는 실온에서 1시간 이상 방치되었다. 0.05% Tween-20을 포함하는 PBS 80 μL로 3회 세정된 당해 플레이트의 각 웰에 발색기질(ABTS peroxidase substrate)이 첨가되었다. 1시간 당해 플레이트가 인큐베이트된 후에, 각 웰 중의 용액의 발색이 Molecular Device사 제조 SpectraMax로 405 nm의 흡광도가 측정되었다.
그 결과, 도 9에 나타내는 바와 같이 SMB0002는 아데노신과 ATP를 과잉량 첨가함으로써 2'-아데노신-PEG-비오틴에 대한 결합이 저해된 것으로부터, 이들 클론은 2'-아데노신-PEG-비오틴뿐 아니라 아데노신과 ATP 양쪽에 결합하는 항체인 것이 확인되었다.
(3-2-4) 아데노신 및 ATP 결합 클론의 서열 해석
아데노신과 ATP 양쪽에 대해 결합이 확인된 클론 SMB0002의 아미노산 서열은 표 3에 나타내는 바와 같았다.
Figure 112021085263630-pat00021
〔실시예 4〕항ATP/아데노신 항체를 이용한 망라적 개변에 의한 AMP/ADP/ATP/아데노신 스위치 항체 취득용 라이브러리의 설계
암조직 및 염증성 조직에 있어서는 아데노신 및 ATP의 농도가 높은 것이 알려져 있다. 후술하는 참고 실시예 2에 있어서 구축한 ATP에 결합하는 항체를 주형으로 한 합리적으로 설계된 라이브러리로부터 ATP 존재하에서만 항원에 결합능을 나타내는 항체가 다수 취득된 것으로부터, 마찬가지로 아데노신이나 AMP, ADP, ATP에 결합능을 나타내는 항체를 주형으로 한 라이브러리를 구축함으로써 아데노신이나 AMP, ADP, ATP 존재하에서만 항원에 결합능을 나타내는 항체가 취득 가능해지는 것으로 생각되었다.
(4-1) SPR법에 의한 아데노신 결합 항체 SMB0002의 AMP 및 ADP로의 결합 평가
후술하는 참고 실시예 1에서 나타내어진 방법으로 발현 및 정제된 SMB0002의 AMP로의 결합이 실시예 3-2에서 나타내어진 비아코어를 사용한 측정방법과 동일한 방법으로 측정되었다. SMB0002를 AMP 500, 250(Duplicate), 125, 62.5, 31.25, 15.625, 7.8125 μM의 농도로 결합을 평가했을 때 관찰된 센서그램을 도 10a에 나타내었다. 도 10a에 나타내는 바와 같이, SMB0002의 AMP에 대한 결합이 확인되었다. SMB0002의 AMP에 대한 KD는 5.9×10-5(mol/L)이었다.
또한 ADP로의 결합이 실시예 3-2에서 나타내어진 비아코어를 사용한 측정방법과 동일한 방법으로 NaCl 농도만 600 mM로 변경하여 측정되었다. SMB0002에 대해 ADP 2000, 1,000(Duplicate), 500, 250, 250, 125, 62.5, 31.3 μM의 농도로 결합을 평가했을 때 관찰된 센서그램을 도 10b에 나타내었다. 도 10b에 나타내는 바와 같이, SMB0002의 ADP에 대한 결합이 확인되었다. SMB0002의 ADP에 대한 KD는 2.4×10-4(mol/L)이었다.
(4-2) 아데노신 결합 항체 SMB0002의 X선 결정구조 해석
실시예 3에 있어서 면역된 토끼로부터 취득된 아데노신 결합 항체 SMB0002와 아데노신 복합체의 입체구조가 X선 결정구조 해석에 의해 해명되었다.
(4-2-1) 결정화용 SMB0002 전장 항체의 조제
결정화용 SMB0002 전장 항체의 조제 및 정제는 당업자 공지의 방법으로 행해졌다.
(4-2-2) 전장 항체로부터의 SMB0002 Fab 프래그먼트의 조제
얻어진 SMB0002 전장 항체를 분자량 분획 사이즈 10000MWCO의 한외여과막에 의해 농축 후, 4 mM L-시스테인, 5 mM EDTA, 25 mM MES pH 6.5로 1.5 ㎎/㎖로 희석한 샘플을 조제하고, 이것에 전장 항체에 대해 질량비로 백분의 1 양의 파파인(Roche Applied Science)을 첨가하고, 35℃에 2시간 정치하였다. 그 후, 프로테아제 인히비터 칵테일 미니, EDTA 프리(Roche Applied Science) 1정을 녹인 20 ㎖의 25 mM 초산나트륨 완충액 pH 5.0을 첨가함으로써 반응을 정지하였다. 다음으로 이 샘플을 25 mM 초산나트륨 완충액 pH 5.0으로 평형화한 1 ㎖ 사이즈의 양이온 교환 칼럼 HiTrap SP HP(GE Healthcare)의 하류에 1 ㎖ 사이즈의 Protein A 담체 칼럼 HiTrap MabSelect Sure(GE Healthcare)를 직렬로 연결한 칼럼에 첨가하고, 동 완충액 중 NaCl 농도를 직선적으로 올려서 용출을 행함으로써 SMB0002 항체의 Fab 프래그먼트의 정제 분획을 얻었다. 다음으로 얻어진 정제 분획을 5000MWCO의 한외여과막에 의해 농축하고, 이를 25 mM HEPES 완충액 pH 7.0, 100 mM NaCl로 평형화한 겔여과 칼럼 Superdex 200 16/60 prep grade(GE Healthcare)에 첨가하고, 동 완충액에 의해 칼럼으로부터 용출하여 결정화용 SMB0002의 Fab 프래그먼트를 얻었다. 또한 모든 칼럼 조작은 저온하에서 실시하였다.
(4-2-3) SMB0002 Fab 프래그먼트와 아데노신 복합체의 결정화
상기 방법으로 정제한 결정화용 SMB0002_Fab 샘플을 5000MWCO의 한외여과막에 의해 A280=22.3까지 농축하였다. 그 후 아데노신을 최종 농도 0.9 mM가 되도록 첨가하고, 시팅 드롭 증기 확산법으로 결정화를 행하였다. 결정화에는 Hydra II Plus One(MATRIX)을 사용하고, 20% PEG3350, 0.2 M 구연산이암모늄(Ammonium citrate dibasic)의 리저버 용액에 대해 리저버 용액：결정화 샘플＝0.2 ㎕：0.2 ㎕로 혼합하여 결정화 드롭을 제작하고, 20℃에 정치한 바 판형상의 결정을 얻는 것에 성공하였다.
(4-2-4) SMB0002 Fab 프래그먼트와 아데노신 복합체 결정으로부터의 X선 회절 데이터의 측정
얻어진 SMB0002 Fab 프래그먼트와 아데노신 복합체의 단결정 하나를 0.2 M 구연산이암모늄，0.025 M HEPES pH 7，25% PEG3350，0.1 M NaCl，1 mM 아데노신，16% 글리세롤의 용액에 침지한 후, 미소한 나일론 루프 부착 핀으로 용액째 떠서 액체 질소 중에서 동결시키고, 고에너지 가속기 연구기구의 방사광시설 포톤팩토리의 BL-17A에서 X선 회절 데이터의 측정을 행하였다. 또한 측정 중에는 항상 -178℃의 질소기류 중에 둠으로써 동결상태를 유지하고, 빔라인 장착 CCD 디텍터 Quantum 315r(ADSC)에 의해 결정을 0.6°씩 회전시키면서 합계 300매의 X선 회절 화상을 수집하였다. 얻어진 회절 화상으로부터의 격자상수의 결정, 회절 반점의 인덱싱 및 회절 데이터의 처리에는 프로그램 Xia2(J. Appl. Cryst. (2010) 43, 186-190), XDS Package(Acta Cryst. (2010) D66, 125-132) 및 Scala(Acta Cryst. (2006) D62, 72-82)를 사용하여, 최종적으로 분해능 1.76Å까지의 회절 강도 데이터를 얻는 것에 성공하였다. 본 결정은 공간군 P1에 속하고, 격자상수 a＝49.960Å, b＝105.730Å, c＝106.166Å, α＝62.58°, β＝77.29°, γ＝77.49°였다.
(4-2-5) SMB0002 Fab 프래그먼트와 아데노신 복합체의 X선 결정구조 해석
SMB0002 Fab 프래그먼트와 아데노신 복합체 결정의 구조 결정을 위해 프로그램 Phaser(J. Appl. Cryst. (2007) 40, 658-674)를 사용하여 분자 치환법을 실시하였다. 얻어진 결정 격자의 크기와 SMB0002 Fab 프래그먼트의 분자량으로부터 비대칭 단위 중의 복합체의 수는 4개로 예상되었다. Discovery Studio3.5(Accelrys)를 사용하여 당해 항체의 호모로지 모델을 제작하고, 이 모델을 가변영역과 불변영역 부분으로 나눠 각각의 구조 좌표를 탐색용 모델로서 사용하여, 당해 결정의 격자 내에서의 방향과 위치를 회전 함수 및 병진 함수로부터 결정하였다. 또한 얻어진 초기 구조 모델에 대해 가변영역과 불변영역 부분을 독립적으로 움직이는 강체 정밀화를 행한 바, 25-3.0Å의 회절 강도 데이터에 대한 결정학적 신뢰도 인자 R값은 46.36%, Free R값은 46.10%가 되었다. 또한 프로그램 REFMAC5(Acta Cryst. (2011) D67, 355-367)를 사용한 구조 정밀화와, 실험적으로 결정된 구조 인자 Fo와 모델로부터 계산된 구조 인자 Fc 및 모델로부터 계산된 위상을 토대로 산출된 2Fo-Fc, Fo-Fc를 계수로 하는 전자밀도 지도를 보면서 당해 구조 모델의 수정을 프로그램 Coot(Acta Cryst. (2010) D66, 486-501)를 사용하여 실시하고, 이들 작업을 반복함으로써 구조 모델의 정밀화를 행하였다. 최종적으로는 분해능 25-1.76Å의 168160개의 회절 강도 데이터를 사용하여 14681개의 비수소원자를 포함하는 구조 모델의 결정학적 신뢰도 인자 R값은 19.82%, Free R값은 23.15%가 되었다.
(4-2-6) SMB0002와 아데노신의 상호작용 부위의 동정
최종적으로 SMB0002_Fab 프래그먼트와 아데노신 복합체의 결정 구조는 분해능 1.76Å에서 결정되었다. 본 결정의 비대칭 단위 중에는 4개의 SMB0002_Fab 프래그먼트가 존재하고, 그 모두에 아데노신이 결합되며, 그 결합 양식은 모두 거의 동일하였다. 본 결정구조로부터 아데노신은 당해 항체의 Fab 프래그먼트의 H쇄와 L쇄 사이에 형성되는 포켓에 아데닌 고리가 포켓 속을 향하는 형태로 결합하는 것을 알 수 있었다.
도 11a에 나타내는 바와 같이, 아데노신의 아데닌 고리 부분은 당해 항체의 H쇄 A33, I50, W58, Y100, L쇄 Y95c, N96의 각 측쇄 및 H쇄 G99, T100a의 각 주쇄에 의해 인식된다. 특히 L쇄 N96 측쇄는 아데노신 1번 위치의 N 및 6번 위치의 NH2와 2개의 수소 결합을 형성하고, 또한 H쇄 T100a 주쇄의 카르보닐 산소 및 아미드 NH기와, 아데닌 고리의 6번 위치의 NH2 및 7번 위치의 N 사이에 각각 수소 결합이 형성됨으로써 강고하게 인식되는 것을 알 수 있었다. 또한 아데닌 고리는 당해 항체의 H쇄 A33, I50, W58, Y100 및 L쇄 Y95c의 각 측쇄에 의해 둘러싸여, 이들 잔기와 반데르발스 상호작용과 CH-π 상호작용을 형성하고 있다. H쇄 G99, T100a는 모두 주쇄 부분에서 아데닌 고리와 상호작용을 형성하고 있는데, G99는 라마찬드란 조사구(Ramachandran plot) 상에서 Gly에 특유의 φ-Ψ각을 갖는 것으로부터, 아데노신과 결합할 때의 H쇄 CDR3의 루프 구조의 유지에 중요한 것으로 생각된다. 또한 T100a 측쇄도 H쇄 CDR3의 다른 잔기와 상호작용을 형성함으로써 아데노신과 결합할 때의 H쇄 CDR3 루프 구조의 유지에 중요한 역할을 하고 있는 것으로 생각된다. 도 11b에 나타내는 바와 같이, 아데노신의 리보오스 부분은 H쇄 S56, W58, L쇄 Y95c의 각 측쇄 및 T57의 주쇄, H쇄 G52에 의해 인식되어 있다. 이들 잔기와의 상호작용은 주로 반데르발스 상호작용에 의한 것이나, H쇄 S56은 측쇄와 리보오스의 3' 위치 OH 사이에는 약하게나마 수소 결합의 형성이 보인다. H쇄 G52는 그 Cα원자도 포함하여 리보오스 부분과 복수의 반데르발스 상호작용을 형성하고 있어 아데노신의 인식에 중요한 역할을 하고 있는 것으로 생각된다. 한편으로 H쇄 T57은 주쇄만으로 리보오스 부분과 상호작용하고 측쇄는 결합에는 직접 관여하고 있지 않다.
실시예 4-1에서 나타낸 바와 같이, 당해 항체는 아데노신뿐 아니라 결합 활성은 떨어지나 AMP에도 결합한다. 본 결정구조에서는 아데노신의 리보오스 5' 위치 OH가 아데닌 고리 부분 3번 위치의 N과 분자 내 상호작용을 형성하고 있는데 AMP에 있어서는 본 결합을 형성하는 것은 불가능하여, 5'번 위치의 O는 그 위치를 조금 변경하여 결과적으로 AMP의 인산기는 도 11b에 나타낸 점선 안의 영역에 존재할 것으로 추찰된다. 본 영역은 H쇄 CDR2 및 L쇄 CDR3의 잔기와 상호작용 가능한 위치에 있어, H쇄 CDR2 및 L쇄 CDR3에 적절한 변이를 도입함으로써 AMP로의 결합 증강을 기대할 수 있다.
이상의 결과로부터, 당해 항체에 의한 아데노신의 인식 양식이 명확해지는 동시에 아데노신과의 결합에 크게 관여하는 항체 가변영역의 아미노산 잔기가 동정되었다. 아데노신과의 결합에 크게 관여하고 있는 아미노산 잔기로서 H쇄：A33, I50, G52, S56, T57, W58, G99, Y100, T100a(Kabat 넘버링), L쇄：Y95c, N96(Kabat 넘버링)을 들 수 있다. 또한 AMP의 5' 위치 인산기의 근방에 위치할 가능성이 있는 잔기로서 H쇄 CDR2의 D54, S55, S56, T57, W58 및 L쇄 CDR3의 G95a, W95b, Y95c가 예측되고, 이들 잔기로의 개변은 AMP와의 결합 증강으로 이어질 가능성이 있다.
또한 ADP, ATP에 대해서도 결정구조를 토대로 동일한 고찰을 행함으로써 ADP, ATP로의 결합을 증강시킬 수 있는 개변도 예측할 수 있다.
(4-3) 토끼 유래 항체 SMB0002의 인간화
SMB0002는 토끼 유래의 항체이기 때문에 인간 항체 라이브러리의 제작에 있어서 서열의 인간화가 당업자 공지의 방법으로 실시되었다(유럽 특허공개 EP239400, 국제공개 WO1996/002576, WO1993/012227, WO1992/003918, WO1994/002602, WO1994/025585, WO1996/034096, WO1996/033735, WO1992/001047, WO1992/020791, WO1993/006213, WO1993/011236, WO1993/019172, WO1995/001438, WO1995/015388, Cancer Res., (1993) 53, 851-856, BBRC., (2013)436(3):543-50 등).
인간화 SMB0002(중쇄 가변영역 서열：서열번호：85, 경쇄 가변영역 서열：서열번호：86은 참고 실시예 1-1에서 나타내어진 방법으로 발현 및 정제되었다. 인간화 SMB0002와 아데노신 및 AMP의 결합이 비아코어 T200(GE Healthcare)을 사용한 방법으로 측정되고, 해석되었다. 센서칩 CM5(GE Healthcare) 상에 아민 커플링법으로 적절한 양 고정화된 protein A(Invitrogen)에 목적의 항체가 캡쳐되고, 항원인 아데노신 또는 AMP, ADP, ATP와의 상호작용이 관찰되었다. 러닝 버퍼에는 아데노신 또는 AMP인 경우에는 50 mM TrisHCl, 150 mM NaCl, 0.02% (w/v) Tween20, pH 7.6이, ADP 또는 ATP인 경우에는 50 mM TrisHCl, 150 mM NaCl, 0.02% (w/v) Tween20, 2 mM MgCl2, pH 7.6이 사용되었다. 측정은 모두 25℃에서 실시되고, 항원의 희석에는 러닝 버퍼가 사용되었다.
센서칩 상에 캡쳐된 항체에 대해 항원 희석액과 블랭크인 러닝 버퍼가 유속 30 μL/min로 75초간 첨가되어 항원과 항체의 결합이 관찰되었다. 그 후, 유속 30 μL/min로 5분간 러닝 버퍼가 주입되고 항원의 항체로부터의 해리가 관찰되었다. 그 후, 10 mM 글리신-HCl, pH 1.5가 유속 30 μL/min로 30초간 첨가되어 센서칩이 재생되었다. 측정에서 얻어진 센서그램으로부터 키네틱스 파라미터인 결합속도상수 ka(1/Ms) 및 해리속도상수 kd(1/s)가 산출되었다. 이들 상수를 토대로 해리상수 KD(M)가 산출되었다. 각 파라미터의 산출에는 비아코어 T200 평가 소프트웨어(GE Healthcare)가 사용되었다.
그 결과, 인간화 SMB0002는 아데노신, AMP, ADP, ATP에 대해 결합하는 것이 발견되었다. 클론에 대해 아데노신 농도 200, 100, 50(duplicate), 25, 12.5, 6.25, 3.125 nM의 시료가 상호작용했을 때에 관찰된 센서그램을 도 12에 정리하였다. 인간화 SMB0002의 아데노신에 대한 KD는 7.5×10-9 M이었다. 다음으로 클론에 대해 AMP 농도 500, 250, 125(duplicate), 62.5, 31.3, 15.6, 7.8 μM의 시료가 상호작용했을 때에 관찰된 센서그램을 도 13에 정리하였다. 인간화 SMB0002의 AMP에 대한 KD는 3.5×10-5 M이었다. 다음으로 클론에 대해 ADP 농도 1,000(duplicate), 500, 250, 125, 62.5 μM의 시료가 상호작용했을 때에 관찰된 센서그램을 도 14에 정리하였다. 인간화 SMB0002의 ADP에 대한 KD는 7.9×10-5 M이었다. 마지막으로 클론에 대해 ATP 농도 1,000(duplicate), 500, 250, 125, 62.5 μM의 시료가 상호작용했을 때에 관찰된 센서그램을 도 15에 정리하였다. 인간화 SMB0002의 ATP에 대한 KD는 1.4×10-4 M이었다. 인간화 SMB0002가 아데노신 및 AMP, ADP, ATP에 대해 결합 활성을 가지고 있었던 것으로부터, 이 서열이 인간 항체 라이브러리 구축의 주형 서열로서 사용되었다.
(4-4) X선 결정구조 해석 결과를 토대로 한 라이브러리 설계를 위한 망라적 개변체 평가
실시예 (4-2)에 있어서 아데노신 결합 항체 SMB0002와 아데노신 복합체의 결정구조가 해석되었다. 결정구조 해석 결과로부터, 당해 항체가 인식하는 아데노신(및 AMP)의 인식 양식 및 아데노신(및 AMP)으로의 결합에 크게 관여하고 있지 않은 것으로 상정되는 항체 가변영역의 아미노산 잔기가 추정되었다. 아데노신 인식부위 근방에 존재하는 잔기가 각 아미노산으로 치환된 개변체를 망라적으로 평가함으로써, 라이브러리화 가능 부위 및 라이브러리화 가능 아미노산의 판정이 가능해지는 것으로 생각되었다. 즉, 아데노신 또는 AMP, ADP, ATP에 대한 결합에 크게 관여하고 있지 않은 부위, 또는 결합에 관여하고 있더라도 아데노신 또는 AMP, ADP, ATP에 대한 결합을 대폭으로는 저하시키지 않는(결합을 제로로 하지 않는) 천연서열 이외의 아미노산이 존재하는 부위 및 아미노산을 판정함으로써, 라이브러리화 가능 부위 및 라이브러리화 가능 아미노산의 판정이 가능해지는 것으로 생각되었다. 실시예 (4-3)에서 제작된 인간화 SMB0002에 대해 이들 잔기에 개변을 도입한 개변체가 복수 제작되었다.
중쇄 부위 중 개변된 부위(표 중 「Kabat」로 기재되는 Kabat 넘버링으로 표시되는 부위) 및 당해 부위에 있어서의 개변 전의 아미노산(표 중 「천연서열」로 기재되는 아미노산) 및 개변 후의 아미노산(표 중 「개변 아미노산」으로 기재되는 아미노산)은 표 4에 나타내었다.
Figure 112021085263630-pat00022
경쇄 부위 중 개변된 부위(표 중 「Kabat」로 기재되는 Kabat 넘버링으로 표시되는 부위) 및 당해 부위에 있어서의 개변 전의 아미노산(표 중 「천연서열」로 기재되는 아미노산) 및 개변 후의 아미노산(표 중 「개변 아미노산」으로 기재되는 아미노산)은 표 5에 나타내었다.
Figure 112021085263630-pat00023
후술하는 참고 실시예 1에서 나타내어진 방법으로 발현 및 정제되는 각 개변체의 아데노신 및 AMP로의 결합이 실시예 4-3에서 나타내어진 비아코어를 사용한 방법으로 MgCl2 농도만 2 mM로 변경하여 측정되었다. 측정 결과, 각 개변체의 아데노신 및 AMP에 대한 어피니티(Affinity)가 KD값으로서 산출되었다. 중쇄에 있어서의 각 개변체와 부모 서열인 인간화 SMB0002의 아데노신에 대한 KD값의 비교 결과를 표 6, AMP에 대한 KD값의 비교 결과를 표 7에 나타내었다. 경쇄에 있어서의 각 개변체와 인간화 SMB0002의 아데노신에 대한 KD값의 비교 결과를 표 8에, AMP에 대한 KD값의 비교 결과를 표 9에 나타내었다.
Figure 112021085263630-pat00024
Figure 112021085263630-pat00025
Figure 112021085263630-pat00026
Figure 112021085263630-pat00027
(4-5) 망라적 개변체 평가 결과를 토대로 한 라이브러리 설계
라이브러리의 설계에 있어서 실시예 4-4에서 얻어진 정보를 토대로 아래의 조건 중 하나 이상을 만족시키는 부위가 라이브러리화 가능 부위로서 선정되었다.
조건 1) 아데노신 또는 AMP, ADP, ATP에 대한 결합에 크게 관여하고 있지 않은 부위, 또는 결합에 관여하고 있더라도 아데노신 또는 AMP, ADP, ATP에 대한 결합을 대폭으로는 저하시키지 않는(결합을 제로로 하지 않는) 천연서열 이외의 아미노산이 존재하는 부위,
조건 2) 항체의 레퍼토리로서 어느 정도 아미노산 출현빈도의 다양성이 있는 부위,
조건 3) 표준 구조의 형성에 중요하지 않은 부위.
실시예 (4-4)의 평가 결과로부터, 아데노신 및 AMP에 대한 KD값이 모두 부모 서열(인간화 SMB0002)의 아데노신 및 AMP에 대한 KD값의 20%를 윗도는 결합을 나타내는 개변체가 적어도 하나 이상 존재하는 개소가 상기 조건을 만족시키는 개변 가능 부위로 판정되었다. 당해 부위에 있어서 치환된 아미노산 중 아데노신 및 AMP에 대한 KD값이 모두 부모 서열(인간화 SMB0002)의 아데노신 및 AMP에 대한 KD값의 20%를 윗도는 결합을 나타내는 아미노산은 라이브러리화가 가능한 아미노산(라이브러리에 있어서 출현시키는 것이 가능한 플렉시블 잔기)으로 판정되었다. 인간화 SMB0002의 CDR 부위에 있어서 판정된 개변 가능 부위에 상기 개변체의 해석으로부터 선출된 라이브러리화 가능 아미노산(라이브러리에 있어서 출현시키는 것이 가능한 플렉시블 잔기) 및 미개변체의 아미노산(즉 인간화 SMB0002의 천연서열에 포함되는 아미노산)을 포함하는 아미노산 레퍼토리에 포함되는 아미노산 중 적어도 어느 하나 이상의 아미노산이 출현하는 라이브러리를 설계함으로써 ATP/AMP/ADP/아데노신 스위치 항체 취득용 라이브러리가 구축된다. 중쇄에 있어서의 아미노산 레퍼토리를 포함하는 부위 및 당해 부위에 있어서의 아미노산 레퍼토리는 표 10에 나타내었다. 경쇄에 있어서의 아미노산 레퍼토리를 포함하는 부위 및 당해 부위에 있어서의 아미노산 레퍼토리는 표 11에 나타내었다. 표 중 「Kabat」로 기재되는 Kabat 넘버링으로 표시되는 부위는 개변 가능 부위를, 「천연서열」로 기재되는 아미노산은 당해 부위에 있어서의 미개변체의 아미노산을, 「라이브러리화 가능 아미노산」으로 기재되는 아미노산은 당해 부위에 있어서의 라이브러리화 가능 아미노산을 각각 나타낸다. 각 개변 가능 부위에 있어서 선출된 아미노산 레퍼토리에 포함되는 아미노산 중 적어도 어느 하나가 출현하는 라이브러리가 설계되었다.
Figure 112021085263630-pat00028
Figure 112021085263630-pat00029
이렇게 설계된 라이브러리에 포함되는 개개의 서열을 포함하는 유전자가 합성되고, 이들 개개의 유전자의 집합체(라이브러리)를 주형으로서 사용하여 VH 및 VL을 각각 증폭시키는 것이 가능한 프라이머에 의해 유전자 라이브러리가 증폭된다. 증폭된 합리적으로 설계된 인간 항체 중쇄 가변영역의 유전자 라이브러리와 인간 항체 경쇄 가변영역의 유전자 라이브러리는 인간 IgG 유래 CH1 서열 및 인간 IgG 유래 경쇄 불변영역 서열 양쪽을 갖는 적절한 파지미드 벡터로 도입된다. 이 파지미드 벡터를 전기천공법으로 대장균에 도입함으로써 인간 항체 가변영역-불변영역으로 이루어지는 Fab 도메인을 제시하고, 아데노신 또는 AMP, ADP, ATP를 스위치로 하여 항원에 결합할 수 있는 항체를 취득할 수 있는 합리적으로 설계된 라이브러리가 구축된다. 이렇게 다양한 아데노신 또는 AMP, ADP, ATP 결합 활성을 갖는 H쇄 및 L쇄로 구성된 합리적으로 설계된 라이브러리는 도 43에 나타낸 바와 같이 아데노신 또는 AMP, ADP, ATP가 항체와 항원 사이에 끼어, 임의의 항원에 대한 AMP/ADP/ATP/아데노신 스위치 항체를 효율적으로 취득할 수 있는 인간 항체가 포함되는 라이브러리로서 유용할 것으로 생각된다. 또한 전술한 바와 같이 SMB0002는 아데노신과 AMP뿐 아니라 ADP나 ATP에도 결합하는 것으로부터 AMP, ADP, ATP 및 아데노신에 그 구조가 유사한 cAMP 및 ATP-gamma-S에도 결합 활성을 가질 것으로 예상된다. 이 때문에 본 라이브러리는 ATP, ADP, AMP, cAMP, 아데노신 또는 ATP-gamma-S 중 어느 하나 이상의 저분자 유무에 따라 임의의 표적 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 스위치 항체의 취득에 유용할 것으로 생각된다.
〔실시예 5〕스위치가 되는 분자에 의한 패닝을 이용한 AMP/ADP/ATP/아데노신 스위치 항체 취득용 라이브러리 설계
실시예 4에서 망라적 개변에 의해 라이브러리화 부위의 설계를 행하고, 아데노신이나 AMP, ADP, ATP에 결합능을 나타내는 항체를 주형으로 한 라이브러리를 구축하는 방법을 기재하였다. 라이브러리 제작방법으로서 다른 어프로치법으로서 스위치가 되는 분자에 대한 패닝을 이용한 방법도 유용하다.
(5-1) 아데노신 결합 항체 SMB0002의 X선 결정구조 해석
실시예 4-2에 있어서 아데노신 결합 항체 SMB0002와 아데노신 복합체의 결정구조가 해석되었다. 결정구조 해석 결과로부터, 당해 항체가 인식하는 아데노신(및 AMP)의 인식 양식 및 아데노신(및 AMP)으로의 결합에 크게 관여하고 있지 않은 것으로 상정되는 항체 가변영역의 아미노산 잔기가 추정되었다.
SMB0002는 토끼 유래의 항체이기 때문에 인간 항체 라이브러리를 제작함에 있어서 서열의 인간화가 당업자 공지의 방법으로 실시되었다(상기와 동일).
라이브러리의 설계에 있어서 아래의 조건 중 하나 이상을 만족시키는 부위가 라이브러리화 가능 부위로서 선정된다.
조건 1) 아데노신 또는 AMP, ADP, ATP에 대한 결합에 크게 관여하고 있지 않은 부위, 또는 결합에 관여하고 있더라도 아데노신 또는 AMP, ADP, ATP에 대한 결합을 대폭으로는 저하시키지 않는(결합을 제로로 하지 않는) 천연서열 이외의 아미노산이 존재하는 부위,
조건 2) 항체의 레퍼토리로서 어느 정도 아미노산 출현빈도의 다양성이 있는 부위,
조건 3) 표준 구조의 형성에 중요하지 않은 부위.
먼저 중쇄에 있어서 상기 조건을 만족시키는 부위로서, 인간화 SMB0002의 서열에 포함되는 부위 중 CDR1, CDR2, CDR3의 부위에 관하여 아데노신 또는 AMP, ADP, ATP에 대한 결합에 크게 관여하고 있지 않은 부위의 아미노산을 어느 일정 염기로만 출현을 한정한 라이브러리를 설계한다. 예를 들면 NNK나 TRIM 라이브러리 등(Gonzalez-Munoz A et al. MAbs 2012, Lee CV et al. J Mol Biol. 2004, Knappik A. et al. J Mol Biol. 2000, Tiller T et al. MAbs 2013)을 들 수 있다. 설계된 유전자 서열의 집합체는 유전자 합성되어(중쇄 가변영역 라이브러리) 인간화 SMB0002의 경쇄 가변영역 서열(부모 서열, 서열번호：86)과 조합되고, 인간 IgG 유래 CH1서열 및 인간 IgG 유래 경쇄 불변영역 서열을 갖는 적절한 파지미드 벡터에 도입된다. 이 파지미드 벡터를 전기천공법으로 대장균에 도입함으로써 아데노신, AMP, ADP, ATP 중 어느 하나를 스위치로 하여 항원에 결합할 수 있는 인간 항체 중쇄 가변영역 파지 디스플레이 라이브러리가 구축된다.
다음으로 경쇄에 있어서 상기 조건을 만족시키는 부위로서, 인간화 SMB0002의 서열에 포함되는 부위 중 CDR1, CDR2, CDR3의 부위에 관하여 아데노신 또는 AMP, ADP, ATP에 대한 결합에 크게 관여하고 있지 않은 부위의 아미노산을 어느 일정 염기로만 출현을 한정한 라이브러리를 설계한다. 예를 들면 NNK나 TRIM 라이브러리 등을 들 수 있다. 설계된 유전자 서열의 집합체는 유전자 합성되어(경쇄 가변영역 라이브러리) 인간화 SMB0002의 중쇄 가변영역 서열(부모 서열, 서열번호：85)과 조합되고, 인간 IgG 유래 CH1서열 및 인간 IgG 유래 경쇄 불변영역 서열을 갖는 적절한 파지미드 벡터에 도입된다. 이 파지미드 벡터를 전기천공법으로 대장균에 도입함으로써 아데노신, AMP, ADP, ATP 중 어느 하나를 스위치로 하여 항원에 결합할 수 있는 인간 항체 경쇄 가변영역 파지 디스플레이 라이브러리가 구축된다.
구축된 중쇄, 경쇄 가변영역 각각의 파지 디스플레이 라이브러리로부터 ATP, ADP, AMP 또는 아데노신에 특이적으로 결합하는 항체 집단을 취득하기 위해 비오틴화 ATP, 비오틴화 ADP, 비오틴화 AMP 또는 비오틴화 아데노신에 대한 패닝이 실시된다.
비오틴화 아데노신은 실시예 2-2-11에 기재된 방법으로 조제되었다. ATP-PEG-비오틴은 제나 바이오사이언스(Jena Bioscience)사, 카탈로그번호 NU-926-BI0를 구입하여 사용할 수 있다. AMP, ADP는 ATP와 마찬가지로 아데노신의 5' 위치 수산기에 인산기가 부가되어 있는 구조이기 때문에 비오틴화 ATP와 마찬가지로 인산기로부터 적절한 링커(PEG 링커 등)를 결합하고, 그 말단에 비오틴을 부가하는 것이 바람직하다.
구축된 파지 디스플레이용 파지미드를 보유하는 대장균으로부터 파지가 생산된다. 파지 생산이 행해지는 대장균의 배양액에 2.5 M NaCl/10% PEG를 첨가하여 침전시킨 파지의 집단을 TBS로 희석함으로써 파지 라이브러리액이 얻어진다. 다음으로 당해 파지 라이브러리액에 최종 농도 4%가 되도록 BSA가 첨가된다. 자기 비드에 고정화된 항원을 사용하여 패닝이 실시된다. 자기 비드로서 뉴트르아비딘 코팅된 비드(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated) 또는 스트렙트아비딘 코팅된 비드(Dynabeads M-280 Streptavidin)가 사용된다.
패닝의 경우는 아데노신, AMP, ADP 또는 ATP에 대해 결합 가능한 파지의 회수가 행해진다. 구체적으로는, 조제된 파지 라이브러리액에 비오틴 표지 항원을 첨가함으로써 파지 라이브러리를 실온에서 60분간 아데노신, AMP, ADP 또는 ATP와 접촉시킨다. BSA로 블로킹된 자기 비드가 첨가되어, 항원과 파지의 복합체를 자기 비드와 실온에서 15분간 결합시킨다. 비드는 1 mL의 TBST와 TBS로 세정된다. 그 후 최종 농도 1 ㎎/mL의 트립신이 들어 있는 TBS가 첨가된 비드가 실온에서 15분 현탁된 후, 즉시 자기 스탠드를 사용하여 분리된 비드로부터 파지 용액이 회수된다. 트립신의 첨가에 의해 Fab를 제시하지 않는 파지의 pIII 단백질(헬퍼 파지 유래의 pIII 단백질)이 절단되어, Fab를 제시하지 않는 파지의 대장균에 대한 감염능이 상실된다. 트립신 용액으로 용출된 파지가 대수증식기(OD600이 0.4-0.7)가 된 10 mL의 대장균주 ER2738에 첨가된다. 37℃에서 1시간 완만하게 상기 대장균의 교반 배양을 행함으로써 파지를 대장균에 감염시킨다. 감염시킨 대장균은 225 ㎜×225 ㎜의 플레이트에 파종된다. 다음으로 파종된 대장균의 배양액으로부터 파지를 회수함으로써 파지 라이브러리액이 회수된다. 동일한 패닝이 복수회 실시되어 아데노신, AMP, ADP 또는 ATP로 결합하는 파지 집단이 얻어진다.
중쇄, 경쇄 가변영역 파지 디스플레이 라이브러리 각각으로부터 취득된 항원(아데노신, AMP, ADP 또는 ATP)에 대한 결합 파지는 항원으로의 결합능을 갖는 집단이기 때문에, 그 양자의 조합에 의해 제작되는 Fab 제시 파지 라이브러리에는 스위치가 되는 저분자 결합을 유지하고 있는 클론이 다수 포함되는 것이 예상되어, 보다 효율적으로 스위치 항체를 취득할 수 있는 라이브러리를 제작할 수 있을 것으로 생각된다.
중쇄, 경쇄 각각의 파지 라이브러리에 감염된 대장균은 당업자 공지의 방법으로 유전자가 추출된다. 이렇게 하여 취득된 개개의 유전자의 집합체(라이브러리)를 주형으로서 사용하여 VH 및 VL을 각각 증폭시키는 것이 가능한 프라이머에 의해 유전자 라이브러리가 증폭된다. 증폭된 인간 항체 중쇄 가변영역의 유전자 라이브러리와 인간 항체 경쇄 가변영역의 유전자 라이브러리는 인간 IgG 유래 CH1서열 및 인간 IgG 유래 경쇄 불변영역 서열 양쪽을 갖는 적절한 파지미드 벡터로 도입된다. 이 파지미드 벡터를 전기천공법으로 대장균에 도입함으로써 인간 항체 가변영역-불변영역으로 이루어지는 Fab 도메인을 제시하고, 아데노신 또는 AMP, ADP, ATP를 스위치로 하여 항원에 결합할 수 있는 항체를 취득할 수 있는 디자인 라이브러리가 구축된다. 이와 같이 다양한 아데노신 또는 AMP, ADP, ATP 결합 활성을 갖는 H쇄 및 L쇄로 구성된 디자인 라이브러리는 도 43에 나타낸 바와 같이 아데노신 또는 AMP, ADP, ATP가 항체와 항원 사이에 끼어, 임의의 항원에 대한 AMP/ADP/ATP/아데노신 스위치 항체를 효율적으로 취득할 수 있는 인간 항체가 포함되는 라이브러리로서 유용할 것으로 생각된다. 또한 전술한 바와 같이 SMB0002는 아데노신과 AMP뿐 아니라 ADP, ATP에도 결합하는 것으로부터 ATP, AMP, ADP 및 아데노신에 그 구조가 유사한 cAMP 및 ATP-gamma-S에도 결합 활성을 가질 것으로 예상된다. 이 때문에 라이브러리는 ATP, ADP, AMP, cAMP, 아데노신 또는 ATP-gamma-S 중 어느 하나 이상의 저분자의 유무에 따라 임의의 표적 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 스위치 항체를 취득하기에 유용할 것으로 생각된다.
〔실시예 6〕파지 디스플레이 기술을 이용한 인간 항체 라이브러리로부터의 저분자 존재하에 있어서 인간 IL-6 수용체(hIL-6R)에 결합하는 항체의 취득
(6-1) 비드 패닝에 의한 나이브 인간 항체 라이브러리로부터의 저분자 존재하에 있어서 hIL-6R에 결합하는 항체의 취득
후술하는 참고 실시예 1에서 구축된 나이브 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리로부터 저분자 존재하에서 인간 IL-6 수용체(hIL-6R)에 대한 결합 활성을 나타내는 항체가 스크리닝되었다. 즉, 비드에 캡쳐된 hIL-6R에 대해 저분자 존재하에서 결합 활성을 나타내는 항체를 제시하고 있는 파지가 모아졌다. 저분자 비존재의 조건에서 비드로부터 용출된 파지 용출액으로부터 파지가 회수되었다. 본 취득방법에서는 항원으로서 비오틴 표지된 hIL-6R이 사용되었다.
구축된 파지 디스플레이용 파지미드를 보유한 대장균으로부터 생산된 파지는 일반적인 방법으로 정제되었다. 그 후 TBS로 투석 처리된 파지 라이브러리액이 얻어졌다. 다음으로 파지 라이브러리액에 최종 농도 4%가 되도록 BSA가 첨가되었다. 자기 비드에 고정화된 항원을 사용한 패닝이 실시되었다. 자기 비드로서 뉴트르아비딘 코팅된 비드(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated) 또는 스트렙트아비딘 코팅된 비드(Dynabeads M-280 Streptavidin)가 사용되었다.
암조직에 있어서 스위치의 역할을 할 수 있는 저분자에 의존적인 저분자 스위치 항체를 효율적으로 취득하기 위해, 하기 각종 저분자(아데노신(adenosine), 아데노신 3인산(adenosine 5'-triphosphate; ATP), 이노신(inosine), 키누레닌(kynurenine), 프로스타글란딘 E2(prostaglandin E2; PGE2), 숙신산(succinic acid), 락트산(lactic acid))의 혼합액(이하, SC(small molecule cocktail)로 표기됨)의 존재하에서 항원에 결합하고, SC 비존재하에서는 항원에 결합하지 않는 항체를 농축하는 패닝이 실시되었다.
구체적으로는, 조제된 파지 라이브러리액에 250 pmol의 비오틴 표지 항원과 함께 각 최종 농도가 1 mM인 아데노신 3인산 나트륨염(ATP-Na), 아데노신(adenosine), 이노신(Inosine), 숙신산(Succinic acid) 및 락트산(Lactic acid), 최종 농도가 1 μM인 프로스타글란딘 E2(PGE2) 및 최종 농도가 100 μM인 키누레닌으로 이루어지고 NaOH에 의해 그 pH가 7.4로 조제된 SC를 당해 파지 라이브러리액과 실온에서 60분간 접촉시켰다. 다음으로 파지 라이브러리액에 BSA로 블로킹된 자기 비드가 첨가되어, 항원과 파지의 복합체를 자기 비드와 실온에서 15분간 결합시켰다. 비드는 SC/TBS(SC를 포함하는 TBS)로 1회 세정되었다. 그 후, 1 ㎎/mL의 트립신 용액 0.5 mL가 첨가된 비드는 실온에서 15분 현탁된 후, 즉시 자기 스탠드를 사용하여 분리된 비드로부터 파지 용액이 회수되었다. 회수된 파지 용액이 대수증식기(OD600이 0.4-0.7)가 된 10 mL의 대장균주 ER2738에 첨가되었다. 37℃에서 1시간 완만하게 상기 대장균의 교반 배양을 행함으로써 파지를 대장균에 감염시켰다. 감염시킨 대장균은 225 ㎜×225 ㎜의 플레이트에 파종되었다. 다음으로 파종된 대장균의 배양액으로부터 파지를 회수함으로써 파지 라이브러리액이 조제되었다.
1회째 패닝에서는 저분자 존재하에서 결합 가능한 파지의 회수가 행해졌으나, 2회째 이후의 패닝에서는 SC 존재하에서만 항원에 대해 결합 가능한 파지의 농축이 행해졌다. 구체적으로는, 조제한 파지 라이브러리액에 40 pmol의 비오틴 표지 항원 및 SC, NaOH를 첨가함으로써 파지 라이브러리를 실온에서 60분간 항원 및 저분자와 접촉시켰다. BSA로 블로킹된 자기 비드가 첨가되어, 항원과 파지의 복합체를 자기 비드와 실온에서 15분간 결합시켰다. 비드는 1 mL의 SC/TBST와 SC/TBS로 세정되었다. 그 후 0.5 mL의 TBS가 첨가된 비드는 실온에서 현탁된 후, 즉시 자기 스탠드를 사용하여 분리된 비드로부터 파지 용액이 회수되었다. 이 작업이 재차 반복된 후, 2회로 나눠 용출된 파지액이 혼합되었다. 회수된 파지 용액에 100 ㎎/mL의 트립신 5 μL를 첨가함으로써 Fab를 제시하지 않는 파지의 pIII 단백질(헬퍼 파지 유래의 pIII 단백질)이 절단되어, Fab를 제시하지 않는 파지의 대장균에 대한 감염능이 상실되었다. 트립신 처리된 파지 용액으로부터 회수된 파지가 대수증식기(OD600이 0.4-0.7)가 된 10 mL의 대장균주 ER2738에 첨가되었다. 37℃에서 1시간 완만하게 상기 대장균의 교반 배양을 행함으로써 파지를 대장균에 감염시켰다. 감염시킨 대장균은 225 ㎜×225 ㎜의 플레이트에 파종되었다. 다음으로 파종된 대장균의 배양액으로부터 파지를 회수함으로써 파지 라이브러리액이 회수되었다. SC 존재하에서 항원에 대한 결합 활성을 갖는 항체를 취득하는 패닝이 3회 반복되었다.
(6-2) 파지 ELISA에 의한 저분자 존재하에 있어서의 결합 활성의 평가
(6-1)에서 얻어진 대장균의 싱글 콜로니로부터 통상의 방법(Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145)에 따라 파지 함유 배양상청이 회수되었다. 참고 실시예 (1-3)에 기재된 방법으로 정제된 정제 파지가 아래의 절차로 ELISA에 제공되었다. StreptaWell 96 마이크로타이터 플레이트(Roche)가 비오틴 표지 hIL-6R을 포함하는 100 μL의 TBS로 하룻밤 코트되었다. 당해 플레이트의 각 웰을 TBST로 세정함으로써 플레이트에 결합되어 있지 않은 비오틴 표지 hIL-6R이 제거된 후, 당해 웰이 250 μ의 2% 스킴밀크-TBS로 1시간 이상 블로킹되었다. 2% 스킴밀크-TBS를 제거한 후, 각 웰에 조제된 정제 파지가 첨가된 당해 플레이트를 실온에서 1시간 정치함으로써 파지를 제시하는 항체를 각 웰에 존재하는 비오틴 표지 hIL-6R에 SC 비존재/존재하에 있어서 결합시켰다. TBST 또는 SC/TBST로 세정된 각 웰에 TBS 또는 SC/TBS에 의해 희석된 HRP 결합 항M13 항체(Amersham Pharmacia Biotech)가 첨가된 플레이트를 1시간 인큐베이트시켰다. TBST 또는 SC/TBST로 세정 후, TMB single 용액(ZYMED)이 첨가된 각 웰 중의 용액의 발색반응이 황산의 첨가에 의해 정지된 후, 450 nm의 흡광도에 의해 당해 발색이 측정되었다.
단리된 960클론을 사용하여 파지 ELISA를 행함으로써 저분자 혼합물 존재하에서 항원인 hIL-6R에 대해 결합 활성을 갖는 클론 6RNMSC1-2_F02 및 6RNMSC1-3_G02가 얻어졌다.
(6-3) hIL-6R에 결합하는 항체의 발현과 정제
(6-2)에서 기재된 파지 ELISA에서 나타내어진 SC 존재하에서 비오틴 표지 hIL-6R에 대한 결합 활성을 갖는 것으로 판단된 클론 6RNMSC1-2_F02 및 6RNMSC1-3_G02로부터 특이적인 프라이머(서열번호：78 및 80)를 사용하여 증폭된 유전자의 염기서열이 해석되었다(6RNMSC1-2_F02：중쇄의 서열은 서열번호：32 및 경쇄의 서열은 서열번호：33, 6RNMSC1-3_G02：중쇄의 서열은 서열번호：34 및 경쇄의 서열은 서열번호：35로 표시된다). 6RNMSC1-2_F02, 6RNMSC1-3_G02 및 음성 대조인 항인간 글리피칸3 항체 GC413(중쇄는 서열번호：36, 경쇄는 서열번호：37)의 가변영역을 코드하는 유전자는 인간 IgG1/Kappa의 동물 발현용 플라스미드에 삽입되었다. 발현된 항체는 후술하는 참고 실시예 1에 기재된 방법으로 정제되었다.
(6-4) 취득된 항체의 hIL-6R에 대한 결합에 필요한 저분자의 동정
취득된 6RNMSC1-2_F02, 6RNMSC1-3_G02 및 GC413의 3종류의 항체가 표 12에 나타내는 9 조건하에서 ELISA에 제공되었다. 또한 표 13에 나타내는 버퍼(Buffer)로 각 저분자가 표 12에 나타내어지는 농도로 적절히 조제되었다. 항원으로서 비오틴 표지된 hIL-6R이 사용되었다.
Figure 112021085263630-pat00030
Figure 112021085263630-pat00031
먼저 StreptaWell 96 마이크로타이터 플레이트(Roche)가 비오틴 표지 hIL-6R을 포함하는 100 μL의 PBS로 실온에서 1시간 이상 코트되었다. 당해 플레이트의 각 웰을 TBST로 세정함으로써 플레이트에 결합되어 있지 않은 비오틴 표지 hIL-6R이 제거된 후, 당해 웰이 블로킹 버퍼(2% 스킴밀크/TBS) 250 μL로 1시간 이상 블로킹되었다. 블로킹 버퍼가 제거된 각 웰에 표 12의 최종 농도로 저분자를 포함하는 샘플 버퍼로 2.5 ㎍/mL로 조제된 정제 IgG의 각 100 μL가 첨가된 당해 플레이트를 실온에서 1시간 정치함으로써 각 IgG를 각 웰에 존재하는 비오틴 표지 hIL-6R에 결합시켰다. 표 12의 최종 농도로 저분자를 포함하는 세정 버퍼로 세정한 후, 동일 저분자가 들어 있는 샘플 버퍼로 희석된 HRP 결합 항인간 IgG 항체(BIOSOURCE)가 각 웰에 첨가된 플레이트가 1시간 인큐베이트되었다. 각 저분자를 포함하는 세정 버퍼로 세정 후, TMB single 용액(ZYMED)이 첨가된 각 웰 중의 용액의 발색반응이 황산의 첨가에 의해 정지된 후, 450 nm의 흡광도에 의해 당해 발색이 측정되었다. 또한 버퍼로서는 표 13에 기재된 조성을 포함하는 버퍼가 사용되었다.
측정된 결과를 도 16과 도 17에 나타내었다. 6RNMSC1-2_F02 및 6RNMSC1-3_G02가 사용된 경우, 조건 8(모든 저분자 칵테일 용액)에 있어서의 흡광도와 비교하여 조건 9(저분자 없음)에 있어서의 흡광도는 현저히 낮다는 결과가 얻어졌다. 이 결과로부터, 6RNMSC1-2_F02 및 6RNMSC1-3_G02는 저분자의 유무에 따라 항원의 결합이 변화되는 성질을 갖는 것이 확인되었다. 또한 6RNMSC1-2_F02가 사용된 경우, 조건 7(키누레닌 100 uM)에 있어서 조건 8과 동등한 흡광도를 나타내고, 그 밖의 조건하에서는 흡광도가 현저히 낮은 결과였던 것으로부터, 6RNMSC1-2_F02는 키누레닌 존재하에서 항원인 hIL-6R과 결합하는 항체인 것이 나타내어졌다(도 16). 또한 6RNMSC1-3_G02가 사용된 경우, 조건 1(ATP-Na 1 mM)에 있어서 조건 8과 동등한 흡광도를 나타내고, 그 밖의 조건하에서는 흡광도가 현저히 낮은 결과였던 것으로부터, 6RNMSC1-3_G02는 ATP 존재하에서 항원인 hIL-6R과 결합하는 항체인 것이 나타내어졌다(도 17). 이러한 방법을 사용함으로써, 상이한 저분자의 존재하에서 항원으로의 결합능이 변화되는 항체를 한번에 복수 취득하는 것이 가능한 것이 나타내어졌다.
〔실시예 7〕6RNMSC1-2_F02 항체의 특성화(Characterization)
(7-1) ELISA에 의한 키누레닌 이외의 아미노산 및 아미노산 대사물 존재하에 있어서의 hIL-6R에 대한 결합 활성의 평가
실시예 6에서 취득된 저분자 존재하에서 hIL-6R에 결합하는 항체 6RNMSC1-2_F02는 키누레닌 존재하에서 hIL-6R에 결합하는 항체이다. 일련의 트립토판 대사물 등의 아미노산 대사물이 본 발명에서 사용되는 암조직 특이적 화합물, 특히 암세포 특이적 대사산물의 비한정의 일태양으로서 적합한지 여부가 검증되었다.
실시예 6에서 나타내어진 키누레닌 존재하에서 항원에 대한 결합 활성을 갖는 항체 6RNMSC1-2_F02 및 음성 대조로서 GC413은 표 14에 나타내는 7 조건하에서 ELISA에 제공되었다. 또한 표 13에 나타내는 버퍼를 각 아미노산 및 그의 대사물이 표 14에 나타내어지는 농도로 적절히 조제되었다. 항원으로서 비오틴 표지된 hIL-6R이 사용되었다.
Figure 112021085263630-pat00032
먼저 StreptaWell 96 마이크로타이터 플레이트(Roche)가 비오틴 표지 항원을 포함하는 100 μL의 PBS로 실온에서 1시간 이상 코트되었다. 당해 플레이트의 각 웰을 TBST로 세정함으로써 플레이트에 결합되어 있지 않은 항원이 제거된 후, 당해 웰이 블로킹 버퍼(2% 스킴밀크/TBS) 250 μL로 1시간 이상 블로킹되었다. 블로킹 버퍼가 제거된 각 웰에 표 14의 최종 농도로 저분자를 포함하는 샘플 버퍼로 2.5 ㎍/mL로 조제된 정제 IgG의 각 100 μL가 첨가된 당해 플레이트를 실온에서 1시간 정치함으로써 각 IgG를 각 웰에 존재하는 항원에 결합시켰다. 표 14의 최종 농도로 아미노산 및 아미노산 대사물을 포함하는 세정 버퍼로 세정된 후에, 아미노산 및 아미노산 대사물을 포함하는 샘플 버퍼로 희석된 HRP 결합 항인간 IgG 항체(BIOSOURCE)각 각 웰에 첨가된 플레이트가 1시간 인큐베이트되었다. 각 아미노산 및 아미노산 대사물을 포함하는 세정 버퍼로 세정 후, TMB single 용액(ZYMED)이 첨가된 각 웰 중의 용액의 발색반응이 황산의 첨가에 의해 정지된 후, 450 nm의 흡광도에 의해 당해 발색이 측정되었다. 또한 버퍼로서는 표 13에 기재된 조성을 포함하는 버퍼가 사용되었다.
측정된 결과를 도 18에 나타내었다. 6RNMSC1-2_F02가 사용된 경우, 조건 1(키누레닌 용액)에 있어서의 흡광도와 비교하여 조건 7(저분자 없음)에 있어서의 흡광도는 현저히 낮았다. 또한 마찬가지로 조건 5(3-히드록시키누레닌 용액)에 있어서의 흡광도도 조건 1과 동등한 높은 흡광도를 나타낸 것으로부터, 6RNMSC1-2_F02는 키누레닌뿐 아니라 키누레닌의 대사물 존재하에서도 항원인 hIL-6R에 결합하는 항체인 것이 나타내어졌다. 또한 그 밖의 조건에서는 현저히 낮은 흡광도였던 것으로부터, 6RNMSC1-2_F02는 키누레닌의 전구체인 트립토판이 존재하고 있더라도 항원인 hIL-6R에 결합하지 않는 항체인 것이 나타내어졌다. 암 미소 환경에 있어서는 트립토판을 대사하여 키누레닌을 생산하는 효소인 IDO의 발현이 상승하고 있는 것으로부터, 트립토판 존재하에서는 항원에 결합하지 않고 키누레닌 및 그의 대사물 존재하에서 항원에 결합하는 항체인 것이 암 미소 환경하에 있어서만 항원에 결합하는 항체로서 중요한 것으로 생각되었다. 또한 이 사실로부터 동일한 방법을 사용함으로써 1종류의 아미노산 대사물뿐 아니라 구조가 상이한 복수의 종류의 아미노산 대사물 존재하에 있어서 목적의 항원에 결합하는 항체를 취득하는 것이 가능한 것이 생각되었다.
이와 같이 암 특이적인 효소(본 실시예에서는 IDO 및 그 하류의 대사효소)에 의해 대사되어 암 국소에서 생산되는 분자를 스위치로 하는 항체는 암 국소에서만 선택적으로 표적 항원에 결합하는 것이 가능한 것으로 생각된다. 본 실시예에 있어서는 내인성 분자인 트립토판의 암 특이적인 대사효소에 의한 대사산물을 스위치로서 사용하고 있는데, 밖으로부터 경구 또는 정맥 내 투여 등에 의해 투여되는 인공적인 분자(비천연 분자) 또는 내인성 분자의 암 특이적인 대사효소에 의한 대사산물을 스위치로서 사용하는 것도 가능한 것으로 생각된다. 예를 들면 실시예 1에 기재한 바와 같이, 카페시타빈(xeloda)을 투여하면 암 특이적인 대사효소 등에 의해 5-FU로 대사되기 때문에, 암 국소에 있어서의 5-FU의 농도가 높아지기 때문에(Desmoulin F. et al. Drug Metab Dispos. 2002), 5-FU를 스위치로 하는 항체에 의해 암 국소에서만 선택적으로 표적 항원에 결합하는 것이 가능해질 것으로 생각된다. 또한 대사효소 이외에도 암에 특이적인 저효소 환경이나 산성 환경하에 의해 생성되는 분자를 스위치로서 사용하는 것도 가능할 것으로 생각된다. 예를 들면 TH-302(Duan JX, et al. J Med Chem. 2008)는 저효소 조건하에 있어서 Br-IPM으로 대사되기 때문에 Br-IPM을 스위치로 하는 항체에 의해 암 국소에서만 선택적으로 표적 항원에 결합하는 것이 가능해질 것으로 생각된다.
(7-2) 표면 플라즈몬 공명에 의한 인간 IL6 수용체에 대한 결합의 키누레닌 영향의 평가
비아코어 T200(GE Healthcare)을 사용하여 6RNMSC1-2_F02와 인간 IL-6 수용체(hIL-6R)의 항원 항체 반응의 상호작용이 해석되었다. 아민 커플링법으로 protein A(Invitrogen)가 적당량 고정화된 센서칩 CM5(GE Healthcare)에 목적의 항체를 캡쳐시키고, 항원인 hIL-6R을 상호작용시켰다. 러닝 버퍼에는 20 mmol/L ACES, 150 mmol/L NaCl, 0.05% (w/v) Tween20, pH 7.4가 사용되었다. 항원인 hIL-6R과의 상호작용은 25℃에서 측정되고, hIL-6R의 희석에는 러닝 버퍼, 러닝 버퍼에 100 μmol/L 키누레닌을 첨가한 버퍼, 또한 비교 대조를 위해 러닝 버퍼에 10 mmol/L ATP를 첨가한 버퍼가 사용되었다.
hIL-6R 희석액과 블랭크인 러닝 버퍼를 유속 10 μL/min로 1 분간 주입하여 센서칩 상에 캡쳐시킨 6RNMSC1-2_F02에 hIL-6R을 상호작용시켰다. 그 후, 유속 10 μL/min로 1 분간 러닝 버퍼를 주입하여 hIL-6R의 항체로부터 해리가 관찰된 후, 10 mmol/L 글리신-HCl, pH 1.5를 유속 30 μL/min로 30초간 주입하여 센서칩이 재생되었다. 측정에서 얻어진 센서그램으로부터 산출된 키네틱스 파라미터인 결합속도상수 ka(1/Ms) 및 해리속도상수 kd(1/s)를 토대로 6RNMSC1-2_F02의 hIL-6R에 대한 해리상수 KD(M)가 산출되었다. 각 파라미터의 산출에는 비아코어 T200 평가 소프트웨어(GE Healthcare)가 사용되었다.
이 측정에서 취득된 100 μmol/L 키누레닌 존재하, 10 mmol/L ATP 존재하, 또는 비존재하에 있어서의 6RNMSC1-2_F02와 1 μmol/L의 hIL-6R의 상호작용의 센서그램을 도 19에 나타내었다. 도 19에 나타내어진 바와 같이, 6RNMSC1-2_F02는 100 μmol/L의 키누레닌 존재하에서는 hIL-6R에 결합하나, 키누레닌 비존재하에서는 hIL-6R에 대한 결합이 관찰되지 않았다. 이 사실로부터 6RNMSC1-2_F02는 키누레닌을 스위치로 하여 hIL-6R에 결합하는 성질을 갖는 것이 확인되었다. 또한 100 μmol/L 키누레닌 존재하에서의 6RNMSC1-2_F02의 해리상수 KD는 1.5 μmol/L였다.
(7-3) 항체의 hIL-6R로부터의 해리에 대한 키누레닌 스위치의 효과
비아코어 T200(GE Healthcare)을 사용하여 키누레닌 존재하에서 hIL-6R에 대해 결합한 6RNMSC1-2_F02가 키누레닌 존재하에서 키누레닌 농도 의존적으로 해리되는지가 평가되었다. 러닝 버퍼로서 20 mmol/L ACES, 150 mmol/L NaCl, 0.05% (w/v) Tween20, pH 7.4 및 20 mmol/L ACES, 150 mmol/L NaCl, 0.05% (w/v) Tween20, pH 7.4, 100 μmol/L 키누레닌이 사용되고 25℃에서 측정되었다. 아민 커플링으로 hIL-6R이 고정화된 센서칩 CM5에 100 μmol/L의 키누레닌을 포함하는 20 mmol/L ACES, 150 mmol/L NaCl, 0.05% (w/v) Tween20, pH 7.4로 희석된 5 ㎍/mL의 6RNMSC1-2_F02를 애널라이트로서 180초간 상호작용시킨 후, 각 러닝 버퍼 조건하에 있어서의 hIL-6R의 해리의 모습이 관찰되었다. 각 러닝 버퍼 조건하에서의 해리 정도를 비교하기 위해, 100 μmol/L 키누레닌 존재하에서의 hIL-6R에 대한 6RNMSC1-2_F02의 결합량을 100으로서 표준화(normalize)된 값이 비교되었다. 이 표준화된 후의 6RNMSC1-2_F02와 hIL-6R의 상호작용의 모습을 나타낸 센서그램을 도 20에 나타내었다. 도 20의 결과로부터, 6RNMSC1-2_F02는 키누레닌 존재하에서 hIL-6R과 결합한 후, 키누레닌이 존재하지 않게 되면 hIL-6R을 신속하게 해리하는 성질을 갖는 것이 명확해졌다. 즉, 항체의 hIL-6R에 대한 결합에 미치는 키누레닌에 의한 제어는 가역적인 것이 확인되었다.
(7-4) hIL-6R 결합에 대한 키누레닌 농도가 미치는 영향의 평가
다음으로 비아코어 T200(GE Healthcare)을 사용하여 6RNMSC1-2_F02와 hIL-6R의 항원 항체 반응에 있어서의 키누레닌 농도의 영향이 평가되었다. 러닝 버퍼로서 20 mmol/L ACES, 150 mmol/L NaCl, 0.05% (w/v) Tween20, pH 7.4가 사용되고, 6RNMSC1-2_F02와 인간 IL-6R의 항원 항체 반응이 25℃에서 측정되었다. 센서칩 CM5 상에 아민 커플링으로 hIL-6R을 고정화하고, 각종 농도로 조제된 키누레닌을 포함하는 20 mmol/L ACES, 150 mmol/L NaCl, 0.05% (w/v) Tween20, pH 7.4로 희석된 1 ㎍/mL의 6RNMSC1-2_F02를 애널라이트로서 180초간 상호작용시켜, 그 결합량의 변화가 관찰되었다. 그 결과를 도 21에 나타내었다. 이 결과로부터, 스위치가 되는 키누레닌 농도가 높을수록 6RNMSC1-2_F02는 hIL-6R에 대해 보다 많이 결합하는 것이 명확해졌다.
또한 이 평가계에서는 hIL-6R이 센서칩 상에 고정화되어 있기 때문에 6RNMSC1-2_F02가 2가로 결합하는 것으로 생각된다. 이러한 6RNMSC1-2_F02가 hIL-6R을 2가로 인식하는 평가계에 있어서도 키누레닌 농도가 높을수록 6RNMSC1-2_F02의 hIL-6R의 결합량이 증가하는 것이 관찰되었다. 이 결과로부터, 2가로의 결합에 있어서도 6RNMSC1-2_F02가 IL-6R에 대해 키누레닌을 스위치로서 결합하는 성질을 갖는 것이 명확해졌다.
이들 결과로부터, 6RNMSC1-2_F02는 키누레닌을 스위치로 하여 키누레닌 존재하에서 hIL-6R에 결합하고, 키누레닌 비존재하에서는 hIL-6R로부터 해리되는 항체인 것이 명확해졌다. 또한 6RNMSC1-2_F02는 키누레닌 비존재하에서는 hIL-6R에 결합 활성을 나타내지 않는 완전한 ON/OFF 제어가 가능한 것이 확인되어, 스위치 기능을 다하고 있는 것이 확인되었다.
(7-5) 6RNMSC1-2_F02의 키누레닌의 유도체에 대한 결합능 평가
비아코어 T200(GE Healthcare)을 사용하여 라이브러리로부터 취득된 키누레닌 의존성 항체 6RNMSC1-2_F02와 키누레닌 및 그의 유도체의 결합이 평가되었다. 유도체로서 아래의 7 분자가 평가되었다. 키누레닌의 이성체 D-키누레닌, 유도체인 3-히드록시-DL-키누레닌, 4-(4-메틸페닐)-4-옥소부티르산, RO0447436-000-001, RO0635389-000-001, RO0438566-001-001, RO0635390-000-001이다. 각각의 화합물의 화학구조는 아래에 나타낸다.
Figure 112021085263630-pat00033
Figure 112021085263630-pat00034
Figure 112021085263630-pat00035
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Figure 112021085263630-pat00037
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센서칩 CM4(GE Healthcare) 상에 아민 커플링법으로 적절한 양 고정화된 protein A(Invitrogen)에 목적의 항체를 캡쳐시키고, 항원인 키누레닌 및 유도체를 상호작용시켰다. 러닝 버퍼에는 50 mmol/L TrisHCl, 150 mmol/L NaCl, 0.02% (w/v) Tween20, 5% DMSO, pH 7.6이 사용되었다. 측정은 모두 15℃에서 실시되고, 항원의 희석에는 러닝 버퍼가 사용되었다.
6RNMSC1-2_F02에 대해서는 항원 희석액과 블랭크인 러닝 버퍼를 유속 30 μL/min로 60초간 첨가하고, 센서칩 상에 캡쳐시킨 항체에 각 항원을 상호작용시켰다. 그 후, 유속 30 μL/min로 60초간 러닝 버퍼를 주입하여 항원의 항체로부터의 해리가 관찰되었다. 측정에서 얻어진 센서그램으로부터 키네틱스 파라미터인 결합속도상수 ka(1/Ms) 및 해리속도상수 kd(1/s)가 산출되었다. 이들 상수를 토대로 해리상수 KD(M)가 산출되었다. 각 파라미터의 산출에는 비아코어 T200 평가 소프트웨어(GE Healthcare)가 사용되었다.
평가 결과, 키누레닌과 6RNMSC1-2_F02 상호작용의 키네틱스 파라미터는 ka=709(1/s), kd=0.17(1/s), KD=0.239(mmol/L)로 결정되었다. 또한 평가 결과 얻어진 센서그램을 도 22에 나타내었다. 또한 유도체와의 결합 결과를 나타내는 센서그램은 도 23：3-히드록시-DL-키누레닌, 도 24：RO0635389-000-001, 도 25：RO0635390-000-001에 나타내었다. 센서그램의 표시에는 Scrubber2(Biologic software) 및 Microsoft Office Excel 2007이 사용되었다. 이 결과로부터 6RNMSC1-2_F02는 키누레닌뿐 아니라 3-히드록시-DL-키누레닌 및 RO0635389-000-001, RO0635390-000-001 등의 일부 키누레닌 유도체에 대해 결합 가능한 것이 명확해졌다.
(7-6) 6RNMSC1-2_F02의 비천연 저분자에 대한 응답성 평가
옥텟(PRIMETECH)을 사용하여 라이브러리로부터 취득된 키누레닌 스위치 항체 6RNMSC1-2_F02와 hIL-6R의 항원 항체 반응에 있어서의 각종 저분자의 영향이 평가되었다. 저분자로서 키누레닌 및 유도체로 실시예 (7-5)에 나타내어진 전체 8 분자가 평가되었다. 측정 버퍼로서 TBS, pH 7.4가 사용되고, 30℃에서 측정되었다. 스트렙트아비딘 센서칩 상에 비오틴화 hIL-6R을 고정화하고, 항체를 상호작용시켜 그 결합량의 변화가 관찰되었다. 항체의 희석은 측정 버퍼 및 측정 버퍼에 각 저분자 중 어느 하나가 각각 첨가된 버퍼가 사용되고, 각 저분자의 최종 농도가 100 uM, 항체의 최종 농도가 10 ㎍/mL가 되도록 조제되었다.
이 측정에서 취득된 100 uM의 각 저분자 존재하 또는 비존재하에 있어서의 6RNMSC1-2_F02의 hIL-6R에 대한 결합성을 도 26：키누레닌, 도 27：3-히드록시-DL-키누레닌, 도 28：RO0635389-000-001, 도 29：RO0635390-000-001에 나타내었다. 도 26에 나타내어진 바와 같이, 6RNMSC1-2_F02는 100 uM 키누레닌 존재하에서 hIL-6R에 결합하고, 키누레닌 비존재하에서는 hIL-6R에 대한 결합이 관찰되지 않았다. 이 사실로부터, 키누레닌을 스위치로서 hIL-6R에 결합하는 성질을 갖는 것이 옥텟에서 확인되었다. 또한 도 27-29에서 나타내어진 바와 같이 키누레닌 이외의 저분자인 3-히드록시-DL-키누레닌 및 RO0635389-000-001, RO0635390-000-001 등의 6RNMSC1-2_F02로 결합 가능한 키누레닌 유도체에 대해서도 저분자 존재하에서의 결합이 관찰되고, 이들 저분자 비존재하에서는 hIL-6R로의 결합은 관찰되지 않았다. 이상의 사실로부터 키누레닌과 그의 유도체(비천연 화합물)가 스위치로서 기능하는 hIL-6R 항체가 라이브러리로부터 취득 가능한 것이 나타내어졌다.
실시예 7-3에 있어서는 내인성 분자를 스위치로서 사용하고 있는 것이 나타내어졌으나, 본 실시예에 의해 인공적인 분자(비천연 분자)를 스위치로서 사용하는 것이 가능한 것도 나타내어졌다. 즉, 밖으로부터 경구 또는 정맥 내 투여 등에 의해 투여되는 인공적인 분자(비천연 분자)가 암 특이적인 대사효소에 의해 생산하는 비천연의 대사산물을 스위치로서 사용한 항체도 제작 가능한 것이 나타내어졌다.
〔실시예 8〕키누레닌 스위치 항hIL-6R 항체를 이용한 망라적 개변에 의한 키누레닌 스위치 항체 취득용 라이브러리의 설계
암조직에 있어서는 키누레닌의 농도가 높은 것이 알려져 있다. 참고 실시예 2에 있어서 구축한 ATP에 결합하는 항체를 주형으로 한 합리적으로 설계된 라이브러리로부터 ATP 존재하에서만 항원에 결합능을 나타내는 항체가 다수 취득된 것으로부터, 동일하게 키누레닌에 결합능을 나타내는 항체를 주형으로 한 라이브러리를 구축함으로써 키누레닌 존재하에서만 항원에 결합능을 나타내는 항체가 취득 가능해질 것으로 생각되었다.
(8-1) 키누레닌을 스위치로 하는 hIL-6R 결합 항체 6RNMSC1-2_F02의 X선 결정구조 해석
실시예 7에 있어서 라이브러리로부터 취득된 키누레닌을 스위치로 하는 hIL-6R 결합 항체 6RNMSC1-2_F02와 키누레닌의 복합체의 입체구조가 X선 결정구조 해석에 의해 해명되었다.
(8-1-1) 결정화용 6RNMSC1-2_F02 전장 항체의 조제
결정화용 6RNMSC1-2_F02 전장 항체의 조제 및 정제는 당업자 공지의 방법으로 행해졌다.
(8-1-2) 전장 항체로부터의 6RNMSC1-2_F02 Fab 프래그먼트의 조제
얻어진 6RNMSC1-2_F02 항체를 분자량 분획 사이즈 10000MWCO의 한외여과막에 의해 농축 후, 100 mM Tris 완충액 pH 8.0으로 2 ㎎/㎖로 희석한 샘플을 조제하고, 이것에 전장 항체에 대해 질량비로 400분의 1양의 Endoproteinase Lys-C Sequencing Grade(Roche Applied Science)를 첨가하고 35℃에 45분간 정치하였다. 그 후, 프로테아제 인히비터 칵테일 미니, EDTA 프리(Roche Applied Science) 1정을 녹인 20 ㎖의 25 mM 초산나트륨 완충액 pH 5.0을 첨가함으로써 반응을 정지하였다. 다음으로 이 샘플을 25 mM 초산나트륨 완충액 pH 5.0으로 평형화한 1 ㎖ 사이즈의 양이온 교환 칼럼 HiTrap SP HP(GE Healthcare)의 하류에 1 ㎖ 사이즈의 Protein A 담체 칼럼 HiTrap MabSelect Sure(GE Healthcare)를 직렬로 연결한 칼럼에 첨가하고, 동 완충액 중 NaCl 농도를 직선적으로 올려 용출을 행함으로써 6RNMSC1-2_F02 항체의 Fab 프래그먼트의 정제 분획을 얻었다. 이를 25 mM HEPES 완충액 pH 7.5, 100 mM NaCl로 평형화한 겔여과 칼럼 Superdex 200 16/60 prep grade(GE Healthcare)에 첨가하고, 동 완충액으로 칼럼으로부터 용출하여, 결정화용 6RNMSC1-2_F02의 Fab 프래그먼트를 얻었다. 또한 모든 칼럼 조작은 저온하에서 실시하였다.
(8-1-3) 6RNMSC1-2_F02 Fab 프래그먼트와 키누레닌 복합체 결정의 제작
상기 방법으로 정제한 결정화용 6RNMSC1-2_F02의 Fab 프래그먼트의 샘플을 5000MWCO의 한외여과막에 의해 A280=24.1까지 농축하였다. 그 후, 100% DMSO에 용해한 50 mM 키누레닌을 최종 농도 2 mM가 되도록 첨가하고, 시팅 드롭 증기 확산법으로 결정화를 행하였다. 결정화에는 Hydra II Plus One(MATRIX)을 사용하고, 0.2 M 황산리튬 일수화물, 30.0 %w/v PEG 3350, 0.1 M Tris pH 8.5의 리저버 용액에 대해 리저버 용액：결정화 샘플＝0.2 ㎕：0.2 ㎕로 혼합하여 결정화 드롭을 제작하고 20℃에 정치한 바, 가느다란 기둥 형상의 결정을 얻는 것에 성공하였다. 또한 얻어진 결정 하나를 0.18 M 황산리튬 일수화물, 27.3% PEG3350, 0.09 M HEPES pH 7.5, 18.2% 에틸렌글리콜, 4.5 mM 키누레닌, 9% DMSO의 용액에 실온에서 30분간 침지하여, 6RNMSC1-2_F02 Fab 프래그먼트와 키누레닌 복합체의 결정을 얻었다.
(8-1-4) 6RNMSC1-2_F02 Fab 프래그먼트와 키누레닌 복합체의 결정으로부터의 X선 회절 데이터의 측정
상기 방법으로 얻어진 6RNMSC1-2_F02 Fab 프래그먼트와 키누레닌 복합체의 결정의 단결정 하나를 미소한 나일론 루프 부착 핀으로 용액째 떠서 액체 질소 중에서 동결시키고, 고에너지 가속기 연구기구의 방사광시설 포톤팩토리의 BL-5A에서 X선 회절 데이터의 측정을 행하였다. 또한 측정 중에는 항상 -178℃의 질소기류 중에 둠으로써 동결상태를 유지하고, 빔라인 장착 CCD 디텍터 Quantum 315r(ADSC)에 의해 결정을 0.5°씩 회전시키면서 합계 360매의 X선 회절 화상을 수집하였다. 얻어진 회절 화상으로부터의 격자상수의 결정, 회절 반점의 인덱싱 및 회절 데이터의 처리에는 프로그램 Xia2(J. Appl. Cryst. (2010) 43, 186-190), XDS Package(Acta Cryst. (2010) D66, 125-132) 및 Scala(Acta Cryst. (2006) D62, 72-82)를 사용하여, 최종적으로 분해능 2.33Å까지의 회절 강도 데이터를 얻는 것에 성공하였다. 본 결정은 공간군 P1에 속하고, 격자상수 a＝55.830Å, b＝56.040Å, c＝80.340Å, α＝87.81°, β＝82.88°, γ＝65.54°였다.
(8-1-5) 6RNMSC1-2_F02 Fab 프래그먼트와 키누레닌 복합체의 X선 결정구조 해석
6RNMSC1-2_F02 Fab 프래그먼트와 키누레닌 복합체의 구조결정을 위해 프로그램 Phaser(J. Appl. Cryst. (2007) 40, 658-674)를 사용하여 분자 치환법을 실시하였다. 얻어진 결정 격자의 크기와 6RNMSC1-2_F02 Fab 프래그먼트의 분자량으로부터 비대칭 단위 중의 복합체의 수는 2개로 예상되었다. Discovery Studio3.5(Accelrys)를 사용하여 당해 항체의 호모로지 모델을 제작하고, 이 Fab의 모델을 가변영역과 불변영역 부분으로 나누어 각각의 구조 좌표를 탐색용 모델로서 사용하여 당해 결정의 격자 내에서의 방향과 위치를 회전함수 및 병진함수로부터 결정하였다. 또한 얻어진 초기 구조 모델에 대해 가변영역과 불변영역을 독립적으로 움직이는 강체 정밀화를 행한 바, 25-3.0Å의 회절 강도 데이터에 대한 결정학적 신뢰도 인자 R값은 40.57%, Free R값은 38.91%가 되었다. 또한 프로그램 REFMAC5(Acta Cryst. (2011) D67, 355-367)를 사용한 구조 정밀화와 실험적으로 결정된 구조 인자 Fo와 모델로부터 계산된 구조 인자 Fc 및 모델로부터 계산된 위상을 토대로 산출된 2Fo-Fc, Fo-Fc를 계수로 하는 전자밀도 지도를 보면서 당해 구조 모델의 수정을 프로그램 Coot(Acta Cryst. (2010) D66, 486-501)를 사용하여 실시하고, 이들 작업을 반복함으로써 구조 모델의 정밀화를 행하였다. 최종적으로는 분해능 25-2.33Å의 34135개의 회절 강도 데이터를 사용하여 7019개의 비수소원자를 포함하는 구조 모델의 결정학적 신뢰도 인자 R값은 20.4%, Free R값은 26.56%가 되었다.
(8-1-6) 6RNMSC1-2_F02와 키누레닌의 상호작용 부위의 동정
최종적으로 실시예 7에 있어서 라이브러리로부터 취득된 키누레닌을 스위치로 하는 hIL-6R 결합 항체 6RNMSC1-2-F02의 Fab 프래그먼트와 키누레닌의 복합체의 결정구조는 분해능 2.33Å에서 결정되었다.
본 결정의 비대칭 단위 중에는 당해 항체의 Fab 프래그먼트가 2분자 존재하고 있고, 그 한쪽에만 키누레닌의 결합이 확인되었다. 키누레닌은 주로 당해 항체의 H쇄 CDR3에 의해 인식되는데, 이때 통상의 항원과의 결합에 사용되는 부분으로부터 조금 벗어난 위치에서 당해 항체와 결합하는 것을 알 수 있었다.
도 30에 나타내는 바와 같이 키누레닌 분자는 당해 항체의 H쇄 P97, R100c, D101, L쇄 H49, F55의 각 측쇄 및 H쇄 R94, D95, R100c, G100d, A100e의 각 주쇄에 의해 인식되고 있다. 또한 키누레닌의 아미노산 골격 중의 아미노기는 중성에서는 양전하를 가지며, H쇄 D95, R94, A100e의 각 주쇄의 카르보닐산소 및 D101 측쇄의 카르복시기 사이에 복수의 수소결합 및 정전상호작용이 확인된다. 또한 음전하를 갖는 키누레닌의 카르복시기는 H쇄 G100d, R100c의 각 주쇄의 아미드 NH기와 복수의 수소결합을 형성하고 있다. 이들 강고한 수소결합 및 정전상호작용의 네트워크는 당해 항체에 의한 키누레닌의 인식에 중요한 역할을 하고 있는 것으로 생각된다. 또한 H쇄 R100c의 측쇄는 키누레닌의 벤젠 고리 부분과 양이온-π상호작용을 형성시키고, 이에 더하여 키누레닌의 벤젠 고리 부분은 L쇄 H49나 F55 및 H쇄 D101에 의해 둘러싸여 있어, 이들 잔기와 반데르발스 상호작용을 형성함으로써 키누레닌과의 결합 인식에 기여하고 있다. 또한 L쇄 H49의 측쇄는 키누레닌의 방향족 고리 상의 NH2기 사이에 약하게나마 수소결합이 형성되어 있는 것이 확인되었다.
이상의 결과로부터, 당해 항체에 의한 키누레닌의 인식 양식이 명확해지는 동시에, 키누레닌과의 결합에 크게 관여하는 항체 가변영역의 아미노산 잔기가 동정되었다. 키누레닌과의 결합에 그 측쇄가 크게 관여하고 있는 아미노산 잔기로서 H쇄：P97, R100c, D101(Kabat 넘버링), L쇄：H49, F55(Kabat 넘버링)를 들 수 있다. 또한 주쇄 부분에서 키누레닌과의 결합에 크게 관여하는 잔기로서 H쇄 R94, D95, R100c, G100d, A100e를 들 수 있다. 또한 P97이나 P100b, G100d 등의 잔기는 그 구조적인 특징으로부터 H쇄 CDR3의 구조를 키누레닌과의 결합에 필요한 구조로 유지함으로써 간접적으로 키누레닌과의 결합에 크게 기여하고 있을 가능성이 생각된다.
(8-2) 6RNMSC1-2_F02의 개변체에 있어서의 키누레닌에 대한 결합능 평가
(8-2-1) 6RNMSC1-2_F02의 중쇄 개변체에 있어서의 키누레닌에 대한 결합능 평가
전술한 바와 같이, 결정구조 해석으로부터 키누레닌과의 결합에 중요한 작용을 하고 있을 가능성이 있는 잔기로서 중쇄의 P97, P100b, R100c, G100d, D101 등이 발견되었다. 이에 이들 중 몇 개의 잔기에 대해서 실제로 개변체를 제작하여 키누레닌과의 결합능을 평가하였다. 제작한 개변체는 아래와 같다. P97A, P97G, P100bG, R100cA, G100dA, G100dV, D101A(표 15).
Figure 112021085263630-pat00040
후술하는 참고 실시예 1에 나타내어진 방법으로 발현, 정제된 6RNMSC1-2_F02의 각종 개변체는 실시예 (7-5)에서 나타내어진 비아코어와 동일한 방법으로 키누레닌으로의 결합이 평가되었다. 그 결과, 6RNMSC1-2_F02는 키누레닌으로의 결합이 재차 확인되었으나, 그 밖의 모든 개변체는 키누레닌으로의 결합능이 감약 또는 대폭 감약되었다. 즉 결정구조로부터 유도된 키누레닌과의 결합에 중요한 잔기는 확실히 결합에 관여하고 있는 것이 명확해져, 결정구조 해석 결과를 뒷받침하는 결과가 되었다.
(8-2-2) 6RNMSC1-2_F02의 H49Y 개변체에 있어서의 키누레닌에 대한 결합능 평가
결정구조 해석으로부터 키누레닌과 중요한 상호작용을 하고 있는 경쇄의 아미노산 잔기는 H49(Kabat 넘버링)뿐으로 생각되었다. 또한 서열 해석 결과로부터, 6RNMSC1-2_F02의 프레임워크는 VLkappa-2 생식세포계열 유래인 것으로 추찰되었다. Kabat 넘버링 49번째 아미노산은 VLkappa-2 생식세포계열에서는 그 대부분이 Tyr로 매우 보존성이 높다. 이에 His49를 Tyr로 치환한 개변체를 제작하여 키누레닌과의 상호작용에 대한 His의 기여도를 검증하였다.
후술하는 참고 실시예 1에서 나타내어진 방법으로 발현, 정제된 6RNMSC1-2_F02의 his49Tyr 개변체(중쇄 서열번호：32, 경쇄 서열번호：45)는 실시예 (7-5)에서 나타내어진 비아코어와 동일한 방법으로 키누레닌으로의 결합이 평가되었다. 그 결과, H49Y는 키누레닌으로의 결합을 유지하고 있는 것이 명확해졌다. 또한 키네틱스 파라미터는 ka=2543(1/s), kd=0.24(1/s), KD=0.095(mmol/L)로 결정되었다. 평가 결과를 나타내는 센서그램은 도 31에 나타내었다.
(8-2-3) 6RNMSC1-2_F02의 생식세포계 프레임워크 서열로의 개변
서열 해석 결과로부터, 6RNMSC1-2_F02의 VH 프레임워크는 VH1-69 생식세포계열 유래인 것으로 추찰되었다. 또한 6RNMSC1-2_F02의 VL 프레임워크는 Vκ2-28 생식세포계열 유래인 것으로 추찰되었다. 이에 항체의 안정성 향상을 목적으로 6RNMSC1-2_F02의 프레임워크 서열을 생식세포계 프레임워크 서열로 되돌리기 위해 VH_Met108Leu, VL_Thr07Ser, VL_Ser11Leu, VL_Leu15Pro, VL_Gln17Glu, VL_Leu36Tyr, VL_Gln37Leu, VL_Arg39Lys, VL_Pro43Ser, VL_Arg45Gln, VL_His49Tyr, VL_Ala67Ser, VL_Asn70Asp(숫자는 Kabat 넘버링을 나타냄)의 개변이 6RNMSC1-2_F02의 프레임워크 서열에 도입되고, F02h011/F02l003(중쇄 가변영역 서열：서열번호：95, 경쇄 가변영역 서열：서열번호：96)으로 명명되었다. 참고 실시예 1-1에서 나타내어진 방법으로 발현 및 정제된 F02h011/F02l003의 Tm이 DSC에 의해 측정되었다. DSC에 의한 측정은 당업자 공지의 방법으로 실시되었다. 이들 개변이 첨가된 6RNMSC1-2_F02의 개변체의 Tm은 82.9℃에서 85.2℃로 향상되어 그 구조의 안정화가 확인되었다. 또한 F02h011/F02l003과 키누레닌의 결합이 실시예 (7-5)에서 나타내어진 비아코어를 사용한 방법 중 항원 희석액 및 블랭크인 러닝 버퍼의 첨가시간이 30초간으로 변경된 조건에서 측정되어 키누레닌으로의 결합을 유지하고 있는 것이 확인되었다. 키누레닌 결합의 키네틱스 파라미터는 ka=3664(1/s), kd=0.40(1/s), KD=0.11(mmol/L)로 결정되고, 평가 결과를 나타내는 센서그램은 도 32에 나타내어졌다. 항체 라이브러리로서 안정성이 높은 프레임워크를 사용하는 것도 바람직한 경우가 있는 것으로부터, F02h011/F02l003이 후술하는 실시예 (8-2-3) 및 실시예 (9-2)의 프레임워크 서열로서 사용되었다. 프레임워크 서열은 표 16에 나타내었다.
Figure 112021085263630-pat00041
(8-2-4) F02h011/F02l003의 키누레닌으로의 결합 증강 개변의 탐색
실시예 (8-1), (8-2-1)의 결과로부터, 6RNMSC1-2_F02의 키누레닌으로의 결합에 관여하고 있는 것으로 추찰되는 잔기가 예측되었다. 또한 이들 잔기에 더하여 개변에 의해 키누레닌으로의 결합 증강을 기대할 수 있는 가능성이 있는 잔기의 탐색을 행하였다.
구체적으로는, 당해 항체의 Fab 프래그먼트와 키누레닌의 복합체의 결정구조로부터 도 34에 나타내는 바와 같이 키누레닌으로부터 4.2Å 이내에 존재하는 아미노산 잔기를 선별하였다. 그 결과, 중쇄 Tyr32, Arg100a, (kabat 넘버링), 경쇄 Leu46(kabat 넘버링)이 새로 발견되었다. 또한 중쇄 CDR3는 키누레닌의 결합에 가장 크게 기여하는 CDR 루프로, 이 루프 상의 잔기로의 개변에 의해 간접적으로 키누레닌으로의 결합에 영향을 미칠 가능성도 생각되는 것으로부터, 가급적 많은 잔기 위치에서 아미노산 잔기의 개변을 행하는 것으로 하였다. 그러나, 경쇄 Arg96과 강고한 수소결합을 형성하여 루프의 구조를 규정하는 중쇄 Asp95, 경쇄 Glu50과 수소결합을 형성하여 루프의 구조를 규정하는 중쇄 Arg100a, 측쇄가 키누레닌과는 반대 방향을 향하여 개변을 도입하더라도 키누레닌과는 상호작용의 형성을 기대할 수 없는 중쇄 Pro100b는 개변 잔기 부위의 후보로부터 제외되었다. 또한 경쇄 Ser56은 도 35에 나타내는 바와 같이 키누레닌으로부터의 거리는 멀지만 측쇄는 키누레닌의 방향을 향하도록 존재하여 Ser보다도 보다 큰 길이의 아미노산 잔기로 개변함으로써 키누레닌과의 상호작용을 형성할 가능성이 있어 개변 잔기 부위로서 선별하였다. 또한 후술하는 실시예 (9-2)의 결과로부터, 중쇄 Gly50 및 경쇄 Asp28은 Ala로 치환함으로써 키누레닌으로의 결합 활성의 증강이 나타내어졌다. 이들 잔기 부위는 직접 키누레닌과 상호작용 가능한 위치는 아니기 때문에(도 36), 키누레닌에 결합할 때의 Fab 전체의 구조를 안정화하여 간접적인 기여를 한 것으로 추찰된다. 또한 이들 잔기 부위에 대해서는 Ala 이외로의 개변에 의해 추가로 키누레닌으로의 결합이 증강될 가능성도 생각되기 때문에, 당해 잔기 위치도 망라적 개변 부위로서 선별되었다. 이들 잔기가 각 아미노산으로 치환된 개변체를 망라적으로 평가함으로써 키누레닌으로의 결합능을 증강시키는 효과가 기대되는 개변을 동정하는 것이 가능한지 검증되었다.
실시예 (8-2-3)에서 제작된 F02h011/F02l003에 대해 이와 같이 개변된 부위(표 중 「Kabat」로 기재되는 Kabat 넘버링으로 표시되는 부위) 및 당해 부위에 있어서의 개변 전의 아미노산(표 중 「천연서열」로 기재되는 아미노산) 및 개변 후의 아미노산(표 중 「개변 아미노산」으로 기재되는 아미노산)은 표 17에 나타내었다.
Figure 112021085263630-pat00042
후술하는 참고 실시예 1에서 나타내어진 방법으로 발현 및 정제된 각 개변체의 키누레닌으로의 결합이 실시예 (7-5)에서 나타내어진 비아코어를 사용한 방법 중 항원 희석액 및 블랭크인 러닝 버퍼의 첨가시간이 30초간으로 변경된 조건으로 측정되었다. 또한 일부 개변체에 대해서는 Protein A가 고정화되는 센서칩의 종류가 센서칩 시리즈 S CM3(GE Healthcare)로 변경된 조건으로 측정되었다. 키누레닌의 해리가 빨라 해리속도상수를 결정할 수 없는 경우에는 각 항원을 상호작용시키고 있는 동안(결합상)에 있어서의 결합 리스폰스의 크기를 토대로 한 평형값 해석에 의해 해리상수 KD(M)가 산출되었다. 이 경우에도 파라미터의 산출에는 비아코어 T200 평가 소프트웨어(GE Healthcare)가 사용되었다. 측정 결과, 각 개변체의 키누레닌에 대한 어피니티(Affinity)가 KD값으로서 산출되었다. 각 개변체와 F02h011/F02l003의 키누레닌에 대한 KD값의 비교 결과를 표 18에 나타내었다.
Figure 112021085263630-pat00043
키누레닌으로의 결합 증강이 기대되는 개변 중 Lch_Ser56Tyr의 개변이 첨가된 서열이 F02h011/F02l098(중쇄 가변영역 서열：서열번호：95, 경쇄 가변영역 서열：서열번호：97)로 명명되어 라이브러리의 주형 서열로서 사용되었다. F02h011/F02l098과 키누레닌의 결합이 실시예 (7-5)에서 나타내어진 비아코어를 사용한 방법 중 항원 희석액 및 블랭크인 러닝 버퍼의 첨가시간이 30초간으로, Protein A가 고정화되는 센서칩의 종류가 센서칩 시리즈 S CM3(GE Healthcare)로 각각 변경된 조건으로 측정되었다. F02h011/F02l098에 대한 키누레닌 결합의 키네틱스 파라미터는 ka=3686(1/s), kd=0.26(1/s), KD=0.072(mmol/L)로 결정되었다. 평가 결과를 나타내는 센서그램은 도 33에 나타내어졌다.
(8-3) X선 결정구조 해석 결과를 토대로 한 라이브러리 설계를 위한 망라적 개변체 평가
실시예 (8-1)에 있어서 6RNMSC1-2_F02와 키누레닌의 복합체의 결정구조가 해석되었다. 결정구조 해석 결과로부터, 당해 항체가 인식하는 키누레닌의 인식 양식 및 키누레닌으로의 결합에 크게 관여하고 있지 않은 것으로 상정되는 항체 가변영역의 아미노산 잔기가 동정되었다. 아래에 나타내는 잔기가 각 아미노산으로 치환된 개변체를 망라적으로 평가함으로써 라이브러리화 가능 부위 및 라이브러리화 가능 아미노산의 판정이 가능해질 것으로 생각되었다. 즉, 키누레닌에 대한 결합에 크게 관여하고 있지 않은 부위, 또는 결합에 관여하고 있더라도 키누레닌에 대한 결합을 대폭으로는 저하시키지 않는(결합을 제로로 하지 않는) 천연서열 이외의 아미노산이 존재하는 부위 및 아미노산을 판정함으로써, 라이브러리화 가능 부위 및 라이브러리화 가능 아미노산의 판정이 가능해질 것으로 생각되었다. 실시예 (8-2-4)에서 제작된 키누레닌에 대한 결합을 증강시키는 개변이 첨가된 F02h011/F02l098에 대해 이들 잔기에 개변을 도입한 개변체가 복수 제작되었다.
중쇄 부위 중 개변된 부위(표 중 「Kabat」로 기재되는 Kabat 넘버링으로 표시되는 부위) 및 당해 부위에 있어서의 개변 전의 아미노산(표 중 「천연서열」로 기재되는 아미노산) 및 개변 후의 아미노산(표 중 「개변 아미노산」으로 기재되는 아미노산)은 표 19에 나타내었다.
Figure 112021085263630-pat00044
경쇄 부위 중 개변된 부위(표 중 「Kabat」로 기재되는 Kabat 넘버링으로 표시되는 부위) 및 당해 부위에 있어서의 개변 전의 아미노산(표 중 「천연서열」로 기재되는 아미노산) 및 개변 후의 아미노산(표 중 「개변 아미노산」으로 기재되는 아미노산)은 표 20에 나타내었다.
Figure 112021085263630-pat00045
후술하는 참고 실시예 1에서 나타내어진 방법으로 발현 및 정제된 각 개변체의 키누레닌으로의 결합이 실시예 (7-5)에서 나타내어진 비아코어를 사용한 방법 중 항원 희석액 및 블랭크인 러닝 버퍼의 첨가시간이 30초간으로 변경된 조건으로 측정되었다. 또한 일부 개변체에 대해서는 Protein A가 고정화되는 센서칩의 종류가 센서칩 시리즈 S CM3(GE Healthcare)로 변경된 조건으로 측정되었다. 키누레닌의 해리가 빨라 해리속도상수를 결정할 수 없는 경우에는, 각 항원을 상호작용시키고 있는 동안(결합상)에 있어서의 결합 리스폰스의 크기를 토대로 한 평형값 해석에 의해 해리상수 KD(M)가 산출되었다. 이 경우에도, 파라미터의 산출에는 비아코어 T200 평가 소프트웨어(GE Healthcare)가 사용되었다. 측정 결과, 각 개변체의 키누레닌에 대한 어피니티(Affinity)가 KD값으로서 산출되었다. 중쇄에 있어서의 각 개변체와 부모 서열인 F02h011/F02l098의 키누레닌에 대한 KD값의 비교 결과를 표 21에 나타내었다. 경쇄에 있어서의 각 개변체와 부모 서열인 F02h011/F02l098의 키누레닌에 대한 KD값의 비교 결과를 표 22에 나타내었다.
Figure 112021085263630-pat00046
Figure 112021085263630-pat00047
(8-4) 망라적 개변체 평가 결과를 토대로 한 라이브러리 설계
라이브러리의 설계에 있어서 실시예 (8-2-4), (8-3) 및 후술하는 실시예 (9-2)에서 얻어진 정보를 토대로 아래의 조건 중 하나 이상을 만족시키는 부위가 라이브러리화 가능 부위로서 선정되었다.
조건 1) 키누레닌에 대한 결합에 크게 관여하고 있지 않은 부위, 또는 결합에 관여하고 있더라도 키누레닌에 대한 결합을 대폭으로 저하시키지 않는 천연서열 이외의 아미노산이 존재하는 부위,
조건 2) 항체의 레퍼토리로서 어느 정도 아미노산 출현빈도의 다양성이 있는 부위,
조건 3) 표준 구조의 형성에 중요하지 않은 부위.
실시예 (8-2-4), (8-3) 및 후술하는 실시예 (9-2)에서 실시된 평가 결과로부터, 각 평가에 있어서의 부모 서열의 키누레닌에 대한 KD값의 20%를 윗도는 결합을 나타내는 개변체가 적어도 하나 이상 존재하는 개소가 상기 조건을 만족시키는 개변 가능 부위로 판정되었다. 당해 부위에 있어서 치환된 아미노산 중 각 평가에 있어서의 부모 서열의 키누레닌에 대한 KD값의 20%를 윗도는 결합을 나타내는 아미노산은 라이브러리화가 가능한 아미노산(라이브러리에 있어서 출현시키는 것이 가능한 플렉시블 잔기)으로 판정되었다. 실시예 (8-2-4)에서 제작된 키누레닌에 대한 결합을 증강시키는 개변이 첨가된 F02h011/F02l098에 있어서, 판정된 각 개변 가능 부위에 개변체의 해석에 의해 선출된 라이브러리화 가능 아미노산(라이브러리에 있어서 출현시키는 것이 가능한 플렉시블 잔기) 및 미개변체의 아미노산(즉 F02h011/F02l098의 천연서열에 포함되는 아미노산)을 포함하는 아미노산 레퍼토리에 포함되는 아미노산 중 적어도 어느 하나 이상의 아미노산이 출현하는 라이브러리를 설계함으로써 키누레닌 스위치 항체 취득용 라이브러리가 구축된다. 중쇄에 있어서의 아미노산 레퍼토리를 포함하는 부위 및 당해 부위에 있어서의 아미노산 레퍼토리는 표 23에 나타내었다. 경쇄에 있어서의 아미노산 레퍼토리를 포함하는 부위 및 당해 부위에 있어서의 아미노산 레퍼토리는 표 24에 나타내었다. 표 중 「Kabat」로 기재되는 Kabat 넘버링으로 표시되는 부위는 개변 가능 부위를, 「천연서열」로 기재되는 아미노산은 당해 부위에 있어서의 미개변체의 아미노산을, 「라이브러리화 가능 아미노산」으로 기재되는 아미노산은 당해 부위에 있어서의 라이브러리화 가능 아미노산을 각각 나타낸다. 각 개변 가능 부위에 있어서 선출된 아미노산 레퍼토리에 포함되는 아미노산 중 적어도 어느 하나가 출현하는 라이브러리가 설계되었다.
Figure 112021085263630-pat00048
Figure 112021085263630-pat00049
이렇게 설계된 라이브러리에 포함되는 개개의 서열을 포함하는 유전자가 합성되어, 이들 개개의 유전자의 집합체(라이브러리)를 주형으로서 사용하여 VH 및 VL을 각각 증폭시키는 것이 가능한 프라이머에 의해 유전자 라이브러리가 증폭된다. 증폭된 합리적으로 설계된 인간 항체 중쇄 가변영역의 유전자 라이브러리와 인간 항체 경쇄 가변영역의 유전자 라이브러리는 인간 IgG 유래 CH1서열 및 인간 IgG 유래 경쇄 불변영역 서열 양쪽을 갖는 적절한 파지미드 벡터로 도입된다. 이 파지미드 벡터를 전기천공법으로 대장균에 도입함으로써 인간 항체 가변영역-불변영역으로 이루어지는 Fab 도메인을 제시하고, 키누레닌을 스위치로 하여 항원에 결합 가능한 항체를 취득할 수 있는 합리적으로 설계된 라이브러리가 구축된다. 이와 같이 다양한 키누레닌 결합 활성을 갖는 H쇄 및 L쇄로 구성된 합리적으로 설계된 라이브러리는 임의의 항원에 대한 키누레닌 스위치 항체를 효율적으로 취득할 수 있는 인간 항체가 포함되는 라이브러리로서 유용할 것으로 생각된다. 또한 실시예 (7-6)에서 나타내어지는 바와 같이, 6RNMSC1-2_F02는 키누레닌뿐 아니라 키누레닌의 대사물인 3―히드록시키누레닌이나 RO0635389-000-001을 비롯한 키누레닌 유도체에도 결합하는 것으로부터, 키누레닌과 그 구조가 유사한 그 밖의 유도체에도 결합 활성을 가질 것으로 예상된다. 이 때문에 본 라이브러리는 키누레닌이나 키누레닌 대사물, 더 나아가서는 생체 외 분자인 키누레닌 유도체 중 어느 하나 이상의 저분자 유무에 따라 임의의 표적 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 스위치 항체의 취득에 유용할 것으로 생각된다.
〔실시예 9〕스위치가 되는 분자에 의한 패닝을 이용한 키누레닌 스위치 항체 취득용 라이브러리 설계
실시예 8에서 망라적 개변에 의해 라이브러리화 부위의 설계를 행하여 키누레닌에 결합능을 나타내는 항체를 주형으로 한 라이브러리를 구축하는 방법을 기재하였다. 라이브러리 제작방법으로서 상이한 어프로치법으로서 스위치가 되는 분자에 대한 패닝을 이용한 방법도 유용하다.
(9-1) 키누레닌을 스위치로 하는 hIL-6R 결합 항체 6RNMSC1-2_F02의 X선 결정구조 해석
실시예 (8-1)에 있어서 6RNMSC1-2_F02와 키누레닌의 복합체의 결정구조가 해석되었다. 결정구조 해석 결과로부터, 당해 항체가 인식하는 키누레닌의 인식 양식 및 키누레닌으로의 결합에 크게 관여하고 있지 않은 것으로 상정되는 항체 가변영역의 아미노산 잔기가 동정되었다.
(9-2) 라이브러리화 가능 부위 선정 평가 및 라이브러리 설계
실시예 (8-2-2)에서 제작된 F02h011/F02l003(중쇄 가변영역 서열：서열번호：95, 경쇄 가변영역 서열：서열번호：96)에 대해 결정구조 해석 결과를 토대로 선발된 각 부위를 Ala 또는 Val로 치환한 개변체의 평가를 행함으로써 라이브러리화 가능 부위의 선정이 가능해질 것으로 생각되었다.
(9-2-1) 중쇄 가변영역의 라이브러리화 가능 부위 선정 평가 및 라이브러리 설계
먼저 중쇄에 있어서 F02h011/F02l003의 중쇄 서열에 포함되는 부위 중 결정구조 해석 결과를 토대로 선발된 각 부위에 관하여 Ala 또는 Val로 치환한 각 개변체가 제작되었다. 개변된 부위(표 중 「Kabat」로 기재되는 Kabat 넘버링으로 표시되는 부위) 및 당해 부위에 있어서의 개변 전의 아미노산(표 중 「천연서열」로 기재되는 아미노산) 및 개변 후의 아미노산(표 중 「개변 아미노산」으로 기재되는 아미노산)은 표 25에 나타내었다.
Figure 112021085263630-pat00050
후술하는 참고 실시예 1에서 나타내어진 방법으로 발현 및 정제된 각 개변체의 키누레닌으로의 결합이, 실시예 (7-5)에서 나타내어진 비아코어를 사용한 방법 중 항원 첨가시간이 30초간으로 변경된 조건으로 측정되었다. 키누레닌의 해리가 빨라 해리속도상수를 결정할 수 없는 경우에는, 각 항원을 상호작용시키고 있는 동안(결합상)에 있어서의 결합 리스폰스의 크기를 토대로 한 평형값 해석에 의해 해리상수 KD(M)가 산출되었다. 이 경우에도, 파라미터의 산출에는 비아코어 T200 평가 소프트웨어(GE Healthcare)가 사용되었다. 측정 결과, 각 개변체의 키누레닌에 대한 어피니티(Affinity)가 KD값으로서 산출되었다. 각 개변체와 부모 항체인 F02h011/F02l003의 키누레닌에 대한 KD값의 비교 결과를 표 26에 나타내었다.
Figure 112021085263630-pat00051
라이브러리의 설계에 있어서 상기 개변체 평가 및 실시예 (8-2-4)의 평가에서 얻어진 정보를 토대로 아래의 조건 중 하나 이상을 만족시키는 부위가 라이브러리화 가능 부위로서 선정되었다.
조건 1) 키누레닌에 대한 결합에 크게 관여하고 있지 않은 부위, 또는 결합에 관여하고 있더라도 키누레닌에 대한 결합을 대폭으로는 저하시키지 않는(결합을 제로로 하지 않는) 천연서열 이외의 아미노산이 존재하는 부위,
조건 2) 항체의 레퍼토리로서 어느 정도 아미노산 출현빈도의 다양성이 있는 부위,
조건 3) 표준 구조의 형성에 중요하지 않은 부위.
실시예 (8-2-4)에서 제작된 키누레닌으로의 결합 증강 개변이 도입된 F02h011/F02l098의 중쇄 서열(서열번호：95)에 있어서, 상기 조건으로 선출된 부위의 아미노산을 어느 일정 염기로만 출현을 한정한 라이브러리가 설계되었다. 예를 들면 NNK나 TRIM 라이브러리 등(Gonzalez-Munoz A et al. MAbs 2012, Lee CV et al. J Mol Biol. 2004, Knappik A. et al. J Mol Biol. 2000, Tiller T et al. MAbs 2013)을 들 수 있다. 평가가 실시된 각 부위에 있어서, 부모 서열인 F02h011/F02l003의 키누레닌에 대한 KD값의 20%를 윗도는 결합을 나타내는 개변 개소가 상기 조건을 만족시키는 개변 가능 부위로서 판정되었다. 또한 이것에 포함되는 부위더라도 구조 상 중요한 잔기로 판단된 부위는 라이브러리화 부위로부터 제외되거나, 또는 출현하는 아미노산을 한정하여 라이브러리화되었다. NNK 코돈을 사용한 라이브러리화 부위(표 중 ○로 표시), 천연서열에 고정하는 부위(표 중 ×로 표시) 및 출현하는 아미노산을 한정하는 경우는 그 아미노산을 표 27에 나타내었다.
Figure 112021085263630-pat00052
설계된 유전자 서열은 라이브러리화 부위에 NNK 코돈 또는 한정한 아미노산이 출현하는 코돈을 사용한 프라이머를 사용하여 유전자 합성되어(중쇄 가변영역 라이브러리), F02h011/F02l098의 경쇄 가변영역 서열(부모 서열, 서열번호：97)과 조합되고, 인간 IgG 유래 CH1서열 및 인간 IgG 유래 경쇄 불변영역 서열을 갖는 적절한 파지미드 벡터에 도입되었다. 이 파지미드 벡터를 전기천공법으로 대장균에 도입함으로써 키누레닌을 스위치로 하여 항원에 결합할 수 있는 인간 항체 중쇄 가변영역 파지 디스플레이 라이브러리가 구축되었다.
(9-2-2) 경쇄 가변영역의 라이브러리화 가능 부위 선정 평가 및 라이브러리 설계
다음으로 경쇄에 있어서 F02h011/F02l003의 경쇄 서열에 포함되는 부위 중 결정구조 해석 결과를 토대로 선발된 각 부위에 관하여 Ala 또는 Val로 치환한 각 개변체가 제작되었다. 개변된 부위(표 중 「Kabat」로 기재되는 Kabat 넘버링으로 표시되는 부위) 및 당해 부위에 있어서의 개변 전의 아미노산(표 중 「천연서열」로 기재되는 아미노산) 및 개변 후의 아미노산(표 중 「개변 아미노산」으로 기재되는 아미노산)은 표 28에 나타내었다.
Figure 112021085263630-pat00053
후술하는 참고 실시예 1에서 나타내어진 방법으로 발현 및 정제된 각 개변체의 키누레닌으로의 결합이 실시예 (7-5)에서 나타내어진 비아코어를 사용한 방법 중 항원 첨가시간이 30초간으로 변경된 조건으로 측정되었다. 키누레닌의 해리가 빨라 해리속도상수를 결정할 수 없는 경우에는 각 항원을 상호작용시키고 있는 동안(결합상)에 있어서의 결합 리스폰스의 크기를 토대로 한 평형값 해석에 의해 해리상수 KD(M)가 산출되었다. 이 경우에도, 파라미터의 산출에는 비아코어 T200 평가 소프트웨어(GE Healthcare)가 사용되었다. 측정 결과, 각 개변체의 키누레닌에 대한 어피니티(Affinity)가 KD값으로서 산출되었다. 각 개변체와 부모 서열인 F02h011/F02l003의 키누레닌에 대한 KD값의 비교 결과를 표 29에 나타내었다.
Figure 112021085263630-pat00054
라이브러리의 설계에 있어서 상기 개변체 평가 및 실시예 (8-2-4)의 평가에서 얻어진 정보를 토대로 아래의 조건 중 하나 이상을 만족시키는 부위가 라이브러리화 가능 부위로서 선정되었다.
조건 1) 키누레닌에 대한 결합에 크게 관여하고 있지 않은 부위, 또는 결합에 관여하고 있더라도 키누레닌에 대한 결합을 대폭으로는 저하시키지 않는(결합을 제로로 하지 않는) 천연서열 이외의 아미노산이 존재하는 부위,
조건 2) 항체의 레퍼토리로서 어느 정도 아미노산 출현빈도의 다양성이 있는 부위,
조건 3) 표준 구조의 형성에 중요하지 않은 부위.
실시예 (8-2-4)에서 제작된 키누레닌으로의 결합 증강 개변이 도입된 F02h011/F02l098의 경쇄 서열(서열번호：97)에 있어서, 상기 조건에 의해 선출된 부위의 아미노산을 어느 일정 염기로만 출현을 한정한 라이브러리가 설계되었다. 예를 들면 NNK나 TRIM 라이브러리 등을 들 수 있다. 평가가 실시된 각 부위에 있어서, 부모 서열인 F02h011/F02l003의 키누레닌에 대한 KD값의 20%를 윗도는 결합을 나타내는 개변 개소가 상기 조건을 만족시키는 개변 가능 부위로서 판정되었다. 또한 이것에 포함되는 부위더라도 구조 상 중요한 잔기로 판단된 부위는 라이브러리화 부위로부터 제외되거나, 또는 출현하는 아미노산을 한정하여 라이브러리화되었다. NNK 코돈을 사용한 라이브러리화 부위(표 중 ○로 표시), 천연서열에 고정하는 부위(표 중 ×로 표시) 및 출현하는 아미노산을 한정하는 경우는 그 아미노산을 표 30에 나타내었다.
Figure 112021085263630-pat00055
설계된 유전자 서열은 라이브러리화 부위에 NNK 코돈 또는 한정한 아미노산이 출현하는 코돈을 사용한 프라이머를 사용하여 유전자 합성되어(경쇄 가변영역 라이브러리), F02h011/F02l098의 중쇄 가변영역 서열(부모 서열, 서열번호：95)과 조합되고, 인간 IgG 유래 CH1서열 및 인간 IgG 유래 경쇄 불변영역 서열을 갖는 적절한 파지미드 벡터에 도입되었다. 이 파지미드 벡터를 전기천공법으로 대장균에 도입함으로써 키누레닌을 스위치로 하여 항원에 결합할 수 있는 인간 항체 경쇄 가변영역 파지 디스플레이 라이브러리가 구축되었다.
(9-3) 키누레닌 결합 라이브러리 제작을 위한 비오틴화 키누레닌의 합성
실시예 (7-6)에서 나타내어진 바와 같이, 6RNMSC1-2_F02에 있어서는 키누레닌의 유도체라도 스위치로서 기능한다. 이들 유도체는 모두 키누레닌의 3번 위치 4번 위치 5번 위치 중 어느 하나가 치환된 구조인 것과, 또한 6RNMSC1-2_F02와 키누레닌의 복합체의 결정구조 해석 결과로부터 키누레닌의 3번 위치 4번 위치 또는 5번 위치로의 비오틴의 도입은 6RNMSC1-2_F02와 항원인 hIL-6R의 결합을 방해하지 않을 것으로 예측되기 때문에, 3번 위치 4번 위치 5번 위치 중 어느 하나로부터 적절한 링커(PEG 링커 등)를 결합하고 그 말단에 비오틴을 부가하는 것이 바람직하다.
아래에 본 발명의 비오틴화 키누레닌의 실시예를 나타낸다. 본 발명의 비오틴화 키누레닌은 다양한 방법으로 합성할 수 있는데, 그 일부를 아래의 스킴으로 설명한다. 스킴은 예시로, 본 발명은 명시된 화학반응 및 조건으로만 제한되지 않는다. 본 발명의 대표적 화합물은 적절한 중간체, 공지의 화합물 및 시약을 사용하여 합성할 수 있다.
(9-3-1) 키누레닌의 4번 위치에 링커를 장착한 비오틴 화합물의 합성
아래에 기재된 방법으로 비오틴화 키누레닌 화합물 028 및 029를 조제할 수 있다. 또한 비오틴화 키누레닌 화합물 및 합성 중간체는 아래의 조건으로 분석되었다.
LCMS의 분석 조건은 하기와 같다.
Figure 112021085263630-pat00056
Figure 112021085263630-pat00057
Figure 112021085263630-pat00058
5-브로모-2-요오도아닐린(화합물 019, 4.90 g, 16.5 mmol, COMBI-BLOCKS)과 이탄산디-t-부틸(7.54 g, 41.1 mmol)의 테트라히드로푸란(100 ㎖) 용액에 질소 기류하 0℃에서 나트륨비스(트리메틸실릴)아미드(38% 테트라히드로푸란 용액, 1.9 mol/L, 21.6 ㎖, 41.1 mmol)가 15분에 걸쳐 첨가되어, 0℃에서 30분, 실온에서 18시간 교반되었다. 반응액이 초산에틸(300 ㎖)로 희석되고, 1 M 염산, 포화중조수용액 및 포화식염수로 세정 후, 황산나트륨으로 건조되어 감압 농축되었다. 얻어진 잔사가 순상 실리카겔 칼럼크로마토그래피(초산에틸/헥산)로 정제되어 화합물 020(6.14 g, 90%)이 얻어졌다.
LCMS(ESI) m/z ＝ 342, 344 (M-Bu+H)+
유지시간：0.97분(분석 조건 H)
Figure 112021085263630-pat00059
N-t-부톡시-(5-브로모-2-요오도페닐)카바메이트(화합물 020, 12.0 g, 30.2 mmol)의 테트라히드로푸란(120 ㎖) 용액에 질소 기류하 -78℃에서 메틸마그네슘브로마이드(1 M, 33.2 ㎖, 33.2 mmol)가 첨가되어 같은 온도에서 1시간 교반되었다. 이어서 n-부틸리튬(2.5 M, 13.3 ㎖, 33.3 mmol)이 첨가된 후, -78℃에서 2시간 교반되었다. 이 용액에 (2S)-2-[[ｔ-부톡시카르보닐]아미노]-4-옥소부타노에이트(화합물 021, 4.20 g, 15.4 mmol, Roberts 등, Bioorg. Med. Chem. Letters, 13 (2), 265-267 (2003))의 테트라히드로푸란(15 ㎖) 용액이 -78℃에서 30분에 걸쳐 첨가되어, 추가로 같은 온도에서 2시간 교반되었다. 반응액에 1 M 염산이 첨가되어 초산에틸로 3회 추출되었다. 모은 유기층이 1 M 염산, 포화중조수용액 및 포화식염수로 세정 후 감압 농축되었다. 얻어진 잔사가 순상 실리카겔 칼럼크로마토그래피(초산에틸/석유 에테르)로 정제되어 화합물 022(7.50 g, 89%)가 얻어졌다.
LCMS(ESI) m/z ＝ 569(M+Na)+
유지시간：1.93분(분석 조건 A)
Figure 112021085263630-pat00060
화합물 022(7.50 g, 13.8 mmol)의 디클로로메탄(100 ㎖) 용액에 25℃에서 데스-마틴 퍼아이오디난(11.7 g, 27.6 mmol)이 첨가되어 2시간 교반되었다. 반응 혼합물의 초산에틸 희석 용액이 티오황산나트륨 수용액, 탄산수소나트륨 수용액, 포화식염수로 세정되고 감압 농축되었다. 얻어진 잔사가 순상 실리카겔 칼럼크로마토그래피(초산에틸/석유 에테르)로 정제되어 화합물 023(5.80 g, 78%)이 얻어졌다.
LCMS(ESI) m/z ＝ 565(M+Na)+
유지시간：1.78분(분석 조건 A)
Figure 112021085263630-pat00061
화합물 023(2.50 g, 4.58 mmol), 요오드화구리(I)(438 ㎎, 2.30 mmol), (1R,2R)-(-)-N,N'-디메틸시클로헥산-1,2-디아민(654 ㎎, 4.60 mmol), 요오드화나트륨(1.40 g, 9.34 mmol)의 디옥산(60 ㎖) 용액이 질소 분위기하 120℃에서 16시간 교반되었다. 감압 농축된 반응 혼합액의 잔사가 순상 실리카겔 칼럼크로마토그래피(초산에틸/석유 에테르)로 정제되어 화합물 024(1.60 g, 59%)가 얻어졌다.
LCMS(ESI) m/z ＝ 613 (M+Na)+
유지시간：1.95분(분석 조건 B)
Figure 112021085263630-pat00062
화합물 024(1.60 g, 2.71 mmol), 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(627 ㎎, 0.54 mmol), 요오드화구리(103 ㎎, 0.54 mmol), 비스(2-프로피오닐)에테르(893 ㎎, 9.49 mmol), 트리아틸아민(960 ㎎, 9.49 mmol)의 테트라히드로푸란(20 ㎖) 용액이 질소 분위기하 25℃에서 16시간 교반되었다. 감압 농축된 반응 혼합액의 잔사가 순상 실리카겔 칼럼크로마토그래피(초산에틸/석유 에테르)로 정제되어 화합물 025(700 ㎎, 46%)가 얻어졌다.
LCMS(ESI) m/z ＝ 579(M+Na)+
유지시간：2.68분(분석 조건 B)
Figure 112021085263630-pat00063
화합물 025(60.0 ㎎, 0.11 mmol), 비오틴-PEG4-N3(화합물 026, 60.0 ㎎, 0.13 mmol), 황산구리·5 수화물(10.0 ㎎, 0.040 mmol), 1 M 아스코르빈산나트륨 수용액(5방울)의 테트라히드로푸란(2.0 ㎖)과 t-부탄올(2.0 ㎖) 혼합용액이 25℃에서 16시간 교반되었다. 감압 농축된 반응 혼합액의 잔사가 순상 실리카겔 칼럼크로마토그래피(메탄올/디클로로메탄)로 정제되어 화합물 027(100 ㎎, 91%)이 얻어졌다.
LCMS(ESI) m/z ＝ 1001(M+H)+
유지시간：1.40분(분석 조건 C)
Figure 112021085263630-pat00064
화합물 027(100 ㎎, 0.10 mmol)의 디클로로메탄(10 ㎖) 용액에 트리플루오로초산(2.0 ㎖)이 첨가되어 25℃에서 2시간 교반되었다. 감압 농축된 반응 혼합액의 잔사가 고속액체 크로마토그래피로 정제되어 화합물 028(27.8 ㎎, 37%)이 얻어졌다.
LCMS(ESI) m/z ＝ 745(M+H)+
유지시간：2.14분(분석 조건 D)
Figure 112021085263630-pat00065
화합물 027(100 ㎎, 0.10 mmol), 팔라듐/탄소(20 ㎎)의 메탄올(10 ㎖) 용액에 수소가스가 5시간에 걸쳐 불어넣어졌다. 반응 혼합물을 여과 후 감압 농축하고, 잔사의 디클로로메탄(10 ㎖) 용액에 트리플루오로초산(1.0 ㎖)이 첨가되어 25℃에서 1시간 교반되었다. 감압 농축된 반응 혼합액의 잔사가 고속액체 크로마토그래피로 정제되어 화합물 029(13.5 ㎎, 18%)가 얻어졌다.
LCMS(ESI) m/z ＝ 749(M+H)+
유지시간：1.20분(분석 조건 B)
(9-3-2) 키누레닌의 5번 위치에 링커를 장착한 비오틴 화합물의 합성
아래에 기재된 방법으로 비오틴화 키누레닌 화합물 036을 조제할 수 있다.
Figure 112021085263630-pat00066
Figure 112021085263630-pat00067
N-t-부톡시-(4-브로모-2-요오도페닐)카바메이트(Wensbo 등, Tetrahedron, 51 (37), 10323-10342 (1995))(화합물 030, 7.50 g, 18.8 mmol)의 테트라히드로푸란(80 ㎖) 용액에 질소 기류하 -78℃에서 메틸마그네슘브로마이드(1 M, 20 ㎖, 20 mmol)가 첨가되어 같은 온도에서 20분 교반되었다. 이어서 n-부틸리튬(2.5 M, 10 ㎖, 25 mmol)이 첨가된 후 -78℃에서 30분 교반되었다. 이 용액에 (2S)-2-[[t-부톡시카르보닐]아미노]-4-옥소부타노에이트(화합물 021, 2.57 g, 9.40 mmol)의 테트라히드로푸란(20 ㎖) 용액이 -78℃에서 30분에 걸쳐 첨가되어, 추가로 같은 온도에서 1시간 교반되었다. 반응액에 1 M 염산이 첨가되어 초산에틸로 3회 추출되었다. 모은 유기층이 1 M 염산, 포화중조수용액 및 포화식염수로 세정되고 황산나트륨으로 건조 후 감압 농축되었다. 얻어진 잔사가 순상 실리카겔 칼럼크로마토그래피(초산에틸/석유 에테르)로 정제되어 화합물 031(4.56 g, 89%)이 얻어졌다.
LCMS(ESI) m/z ＝ 569(M+Na)+
유지시간：1.78분(분석 조건 A)
Figure 112021085263630-pat00068
화합물 031(4.56 g, 8.36 mmol)의 디클로로메탄(100 ㎖) 용액에 25℃에서 데스-마틴 퍼아이오디난(8.89 g, 21.0 mmol)이 첨가되어 3시간 교반되었다. 반응 혼합물에 티오황산나트륨 수용액이 첨가된 후, 디클로로메탄으로 3회 추출되었다. 합한 유기층이 탄산수소나트륨 수용액으로 세정된 후, 황산나트륨으로 건조하고 감압 농축되었다. 얻어진 잔사가 순상 실리카겔 칼럼크로마토그래피(초산에틸/석유 에테르)로 정제되어 화합물 032(3.60 g, 79%)가 얻어졌다.
LCMS(ESI) m/z ＝ 567(M+H)+
유지시간：1.90분(분석 조건 E)
Figure 112021085263630-pat00069
화합물 032(3.60 g, 6.62 mmol), 요오드화구리(I)(650 ㎎, 3.41 mmol), (1R,2R)-(-)-N,N'-디메틸시클로헥산-1,2-디아민(940 ㎎, 6.61 mmol), 요오드화나트륨(1.98 g, 13.2 mmol)의 디옥산(60 ㎖) 용액이 질소 분위기하 120℃에서 16시간 교반되었다. 감압 농축된 반응 혼합액의 잔사가 순상 실리카겔 칼럼크로마토그래피(초산에틸/석유 에테르)로 정제되어 화합물 033(3.10 g, 79%)이 얻어졌다.
LCMS(ESI) m/z ＝ 613(M+Na)+
유지시간：1.33분(분석 조건 E)
Figure 112021085263630-pat00070
화합물 033(3.10 g, 5.25 mmol), 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(1.21 g, 1.05 mmol), 요오드화구리(200 ㎎, 1.05 mmol), 비스(2-프로피오닐)에테르(1.73 ㎎, 18.4 mmol), 트리아틸아민(1.86 g, 18.4 mmol)의 테트라히드로푸란(20 ㎖) 용액이 질소 분위기하 25℃에서 16시간 교반되었다. 감압 농축된 반응 혼합액의 잔사가 순상 실리카겔 칼럼크로마토그래피(초산에틸/석유 에테르)로 정제되어 화합물 034(1.00 g, 34%)가 얻어졌다.
LCMS(ESI) m/z ＝ 579(M+Na)+
유지시간：1.28분(분석 조건 E)
Figure 112021085263630-pat00071
화합물 034(90.0 ㎎, 0.20 mmol), 비오틴-PEG4-N3(화합물 026, 90.0 ㎎, 0.16 mmol), 황산구리·5 수화물(10 ㎎, 0.040 mmol), 1 M 아스코르빈산나트륨 수용액(10방울)의 테트라히드로푸란(2 ㎖)과 t-부탄올(2 ㎖) 혼합용액이 25℃에서 16시간 교반되었다. 감압 농축된 반응 혼합액의 잔사가 순상 실리카겔 칼럼크로마토그래피(메탄올/디클로로메탄)로 정제되어 화합물 035(155 ㎎, 76%)가 얻어졌다.
LCMS(ESI) m/z ＝ 1001(M+H)+
유지시간：1.13분(분석 조건 F)
Figure 112021085263630-pat00072
화합물 035(85.0 ㎎, 0.080 mmol), 팔라듐/탄소(10 ㎎)의 메탄올(10 ㎖) 용액에 수소가스가 4시간에 걸쳐 불어넣어졌다. 반응 혼합물을 여과 후 감압 농축하고, 잔사의 디클로로메탄(5.0 ㎖) 용액에 트리플루오로초산(1.0 ㎖)이 첨가되어 25℃에서 1시간 교반되었다. 감압 농축된 반응 혼합액의 잔사가 고속액체 크로마토그래피로 정제되어 화합물 036(18.9 ㎎, 31.6%)이 얻어졌다.
LCMS(ESI) m/z ＝ 749(M+H)+
유지시간：0.70분(분석 조건 G)
(9-4) 중쇄 및 경쇄 가변영역 파지 디스플레이 라이브러리를 사용한 키누레닌에 결합하는 항체 집단의 취득
실시예 (9-2-1) 및 (9-2-2)에서 설계, 구축된 중쇄, 경쇄 가변영역 각각의 파지 디스플레이 라이브러리로부터 키누레닌에 특이적으로 결합하는 항체 집단을 취득하기 위해 실시예 (9-3)에서 합성된 비오틴화 키누레닌에 대한 패닝이 실시되었다. 이를 위해 먼저 항체 파지 디스플레이 라이브러리를 비오틴화 키누레닌 비존재하에서 자기 비드와 접촉시키고, 비오틴화 키누레닌 비존재하에서도 자기 비드에 대해 결합 활성을 갖는 항체를 제시하고 있는 파지가 제거되었다. 이어서 비오틴화 키누레닌이 존재하는 조건하에서 동일하게 패닝을 행함으로써 비오틴화 키누레닌에 대해 특이적인 결합 활성을 갖는 항체의 스크리닝이 실시되었다.
구축된 파지 디스플레이 파지미드 벡터를 보유하는 대장균에 대해 M13KO7△pIII(하이퍼 파지라 불림)(PROGEN Biotechnik)를 감염시키고 30℃에서 하룻밤 배양한 상청으로부터 파지가 회수되었다. 파지 생산이 행해진 대장균의 배양액에 2.5 M NaCl/10% PEG를 첨가하여 침전시킨 파지의 집단을 TBS로 희석함으로써 항체 다가 제시 파지 라이브러리액이 조제되었다. 다음으로 당해 파지 라이브러리액에 최종 농도 4%가 되도록 BSA가 첨가되었다. 자기 비드에 고정화된 항원을 사용하여 패닝이 실시되었다. 자기 비드로서 뉴트르아비딘 코팅된 비드(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated) 또는 스트렙트아비딘 코팅된 비드(Dynabeads MyOne StreptAvidin T1)가 사용되었다.
패닝의 경우는, 음성 선별법을 이용한 키누레닌에 특이적으로 결합하는 파지의 회수가 행해졌다. 실시예 (9-3)에서 합성된 3종류의 비오틴화 키누레닌(화합물 028, 029 및 036)에 대해 각각 따로 따로 패닝이 실시되었다. 구체적으로는, BSA로 블로킹된 자기 비드(Dynabeads MyOne StreptAvidin T1)에 조제된 파지 라이브러리액 0.8 mL를 첨가하여 실온에서 30분간 결합시켰다. 그 후, 4℃에서 30분간 결합시켰다. 자기 스탠드를 사용하여 비드를 분리함으로써 비드에 결합하지 않는 파지가 회수되었다. 이 작업이 재차 반복되었다. 별도로 준비된 BSA로 블로킹된 자기 비드(Dynabeads MyOne StreptAvidin T1)와 6 nmol의 비오틴화 키누레닌을 실온에서 30분간 반응시킴으로써 자기 비드에 대해 비오틴화 키누레닌이 고상화되었다. TBST로 3회 세정된 비오틴화 키누레닌이 고상화된 자기 비드에 회수된 파지를 첨가함으로써 파지 라이브러리를 실온에서 30분간 비오틴화 키누레닌과 접촉시켰다. 그 후, 4℃에서 30분간 접촉시켰다. 비드는 1 mL의 빙랭된 TBST로 2회, 빙랭된 TBS로 1회 세정되었다. 그 후 최종 농도 1 ㎎/mL의 트립신이 들어 있는 TBS 0.5 mL가 첨가된 비드가 실온에서 15분 현탁된 후, 즉시 자기 스탠드를 사용하여 분리된 비드로부터 파지용액이 회수되었다. 트립신 용액으로 용출된 파지가 대수증식기(OD600이 0.4-0.7)가 된 60 mL의 대장균주 ER2738에 첨가되었다. 37℃에서 1시간 완만하게 상기 대장균의 교반 배양을 행함으로써 파지를 대장균에 감염시켰다. 감염시킨 대장균은 225 ㎜×225 ㎜의 플레이트 3매에 파종되었다. 다음으로 파종된 대장균의 배양액에 대해 하이퍼 파지를 감염시키고 30℃에서 하룻밤 배양함으로써 항체 다가 제시 파지 라이브러리액이 회수되었다.
2회째 패닝에서는 1회째와 동일하게 음성 선별법을 이용한 키누레닌에 특이적으로 결합하는 파지의 회수가 3종류의 비오틴화 키누레닌에 대해 따로 따로 실시되었다. 구체적으로는, 먼저 자기 비드(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)가 5 ㎎/mL의 스트렙트아비딘 리콤비넌트(Roche) 5 μL가 첨가된 2% 스킴밀크-TBS로 블로킹되었다. TBST로 3회 세정된 자기 비드에 4% BSA로 블로킹된 파지 라이브러리액 0.8 mL를 첨가하고 실온에서 30분간 결합시켰다. 자기 스탠드를 사용하여 비드를 분리함으로써 비드에 결합하지 않는 파지가 회수되었다. 이 작업이 재차 반복되었다. 별도로 준비된 5 ㎎/mL의 스트렙트아비딘 리콤비넌트(Roche) 5 μL가 첨가된 2% 스킴밀크-TBS로 블로킹된 자기 비드(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)와 10 nmol의 비오틴화 키누레닌을 실온에서 30분간, 4℃에서 30분간 반응시킴으로써 자기 비드에 대해 비오틴화 키누레닌이 고상화되었다. TBST로 3회 세정된 비오틴화 키누레닌이 고상화된 자기 비드에 회수된 파지를 첨가함으로써 파지 라이브러리를 실온에서 30분간 비오틴화 키누레닌과 접촉시켰다. 그 후, 4℃에서 30분간 접촉시켰다. 비드는 1 mL의 빙랭된 TBST로 3회, 빙랭된 TBS로 2회 세정되었다. 그 후 최종 농도 1 ㎎/mL의 트립신이 들어 있는 TBS 0.5 mL가 첨가된 비드가 실온에서 15분 현탁된 후, 즉시 자기 스탠드를 사용하여 분리된 비드로부터 파지용액이 회수되었다. 트립신 용액으로 용출된 파지 0.5 mL 중 50 μL가 대수증식기(OD600이 0.4-0.7)가 된 60 mL의 대장균주 ER2738에 첨가되었다. 37℃에서 1시간 완만하게 상기 대장균의 교반 배양을 행함으로써 파지를 대장균에 감염시켰다. 감염시킨 대장균은 225 ㎜×225 ㎜의 플레이트 3매에 파종되었다.
(9-4-2) 파지 ELISA에 의한 비오틴화 키누레닌에 대한 결합 활성의 평가
실시예 (9-4-1)에서 얻어진 대장균의 싱글 콜로니로부터 통상의 방법(Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145)에 따라 파지 함유 배양상청이 회수되었다. 헬퍼 파지로서 하이퍼 파지를 사용함으로써 항체 다가 제시 파지가 회수되어 ELISA에 제공되었다. StreptaWell 96 마이크로타이터 플레이트(Roche)가 3종류의 비오틴화 키누레닌(화합물 028, 029 및 036을 등략씩 혼합)을 포함하는 80 μL의 TBS로 1시간 이상 코트되었다. 당해 플레이트의 각 웰을 TBST로 세정함으로써 스트렙트아비딘에 결합되어 있지 않은 비오틴화 키누레닌이 제거된 후, 당해 웰이 250 μL의 2% 스킴밀크-TBS로 1시간 이상 블로킹되었다. 2% 스킴밀크-TBS를 제거한 후, 각 웰에 조제된 정제 파지가 첨가된 당해 플레이트를 실온에서 1시간 정치함으로써 파지를 제시하는 항체를 각 웰에 존재하는 비오틴화 키누레닌에 결합시켰다. TBST로 세정된 각 웰에 TBS에 의해 희석된 HRP 결합 항M13 항체(Amersham Pharmacia Biotech)가 첨가된 플레이트를 1시간 인큐베이트시켰다. TBST로 세정 후, TMB single 용액(ZYMED)이 첨가된 각 웰 중의 용액의 발색반응이 황산의 첨가에 의해 정지된 후, 450 nm의 흡광도에 의해 당해 발색이 측정되었다. 그 결과, 비오틴화 키누레닌에 대해 결합하는 항체가 복수 확인되었다. 파지 ELISA의 결과를 표 32에 나타내었다.
Figure 112021085263630-pat00073
(9-4-3) 비오틴화 키누레닌 결합 항체의 서열 해석
실시예 (9-4-2)에서 나타내어지는 파지 ELISA의 결과, 키누레닌에 대해 특이적인 결합 활성이 있는 것으로 판단된 클론으로부터, 특이적인 프라이머(서열번호：79 및 80)를 사용하여 증폭된 유전자의 염기서열이 해석되었다. 해석 결과, 키누레닌에 대해 결합 활성을 갖는 것으로 판단된 클론의 서열은 각각 독립적이었다.
(9-5) 키누레닌에 대한 패닝을 이용한 키누레닌 스위치 항체 취득용 라이브러리의 구축
중쇄, 경쇄 가변영역 파지 디스플레이 라이브러리 각각으로부터 취득된 항원(키누레닌)에 대한 결합 파지는 키누레닌으로의 결합능을 갖는 집단이기 때문에, 그 양자의 조합에 의해 제작되는 Fab 제시 파지 라이브러리에는 스위치가 되는 키누레닌 결합을 유지하고 있는 클론이 다수 포함될 것으로 예상되어, 보다 효율적으로 키누레닌 스위치 항체를 취득할 수 있는 라이브러리가 제작 가능할 것으로 생각되었다.
실시예 (9-4)에서 취득된 중쇄, 경쇄 각각의 파지 라이브러리가 감염된 대장균으로부터 당업자 공지의 방법으로 유전자가 추출되었다. 중쇄에 있어서는 취득된 유전자의 집합체(중쇄 가변영역 라이브러리)를 주형으로 사용하여 중쇄 가변영역을 각각 증폭시키는 것이 가능한 프라이머(서열번호：98 및 99)에 의해 유전자 라이브러리가 증폭되었다. 경쇄에 있어서는 취득된 유전자의 집합체(경쇄 가변영역 라이브러리)로부터 F02h011/F02l098의 중쇄 가변영역 서열(라이브러리 주형 서열：서열번호：95)을 제한효소 처리에 의해 빼내 경쇄 가변영역 라이브러리 유전자, 인간 IgG 유래 경쇄 불변영역 서열 및 인간 IgG 유래 CH1서열을 포함하는 파지미드 벡터가 조제되었다. 조제된 경쇄 가변영역 라이브러리 유전자를 포함하는 파지미드 벡터에 중쇄 가변영역 라이브러리 유전자를 도입함으로써, 인간 항체 중쇄/경쇄 가변영역 라이브러리 유전자가 도입된 파지미드 벡터가 구축되었다. 이 파지미드 벡터를 전기천공법으로 대장균에 도입함으로써 인간 항체 가변영역-불변영역으로 이루어지는 Fab 도메인을 제시하고, 키누레닌을 스위치로 하여 항원에 결합할 수 있는 항체를 취득 가능한 디자인 라이브러리가 구축되었다. 이와 같이 다양한 키누레닌 결합 활성을 갖는 H쇄 및 L쇄로 구성된 디자인 라이브러리는 임의의 항원에 대한 키누레닌 스위치 항체를 효율적으로 취득할 수 있는 인간 항체가 포함되는 라이브러리로서 유용할 것으로 생각된다. 또한 실시예 (7-6)에서 나타내어지는 바와 같이, 6RNMSC1-2_F02는 키누레닌뿐 아니라 그의 대사물인 3-히드록시키누레닌이나 3-히드록시-DL-키누레닌 및 RO0635389-000-001, RO0635390-000-001 등의 키누레닌 유도체에도 결합하는 것으로부터, 본 라이브러리는 키누레닌, 키누레닌 대사물, 키누레닌 유도체 중 어느 하나 이상의 저분자의 유무에 따라 임의의 표적 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 스위치 항체의 취득에 유용할 것으로 생각된다.
실시예 (9-6) 파지 ELISA에 의한 라이브러리에 포함되는 클론의 키누레닌 결합능의 평가
실시예 (9-5)에서 구축된 라이브러리는 키누레닌에 대한 패닝을 거쳐 제작되고 있기 때문에, 그 라이브러리 중에는 키누레닌에 대한 결합능을 갖는 클론이 다수 포함되어 있는 것이 예상되었다. 구축한 라이브러리로부터 얻어진 파지 클론의 비오틴화 키누레닌에 대한 결합 평가가 파지 ELISA에 의해 실시되었다.
구축된 라이브러리 유전자를 갖는 대장균의 싱글 콜로니로부터 통상의 방법(Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145)에 따라 파지의 배양이 행해졌다. 헬퍼 파지로서 하이퍼 파지를 사용함으로써 항체 다가 제시 파지 함유 배양상청이 회수되었다. NucleoFast96(MACHERY-NAGEL)을 사용하여 회수된 파지 배양상청이 한외여과되었다. 배양상청 각 200 μL가 NucleoFast96의 각 웰에 어플라이되어 6,000 g, 45분간 원심분리를 행하여 통과액이 제거되었다. H2O 200 μL를 첨가하여 6,000 g, 30분간 원심분리에 의한 세정이 행해졌다. 그 후, TBS 200 μL를 첨가하여 실온에서 5분간 정치한 후, 상청에 포함되는 파지액이 회수되었다.
TBS가 첨가된 정제 파지가 실시예 (9-4-1)에서 사용한 방법과 동일한 방법으로 ELISA에 제공되었다. 그 결과, 비오틴화 키누레닌에 대해 결합하는 항체가 복수 확인되었다. 해석한 프라이머리 라이브러리 유래의 파지 클론 중 약 49%가 키누레닌 결합능을 나타내었다. 파지 ELISA의 결과를 표 33에 나타내었다.
Figure 112021085263630-pat00074
〔실시예 10〕비생체 유래 저분자를 스위치로 하는 항원 결합 단백질의 평가
ATP, 아데노신에 대해 결합하는 항체ATNLSA1-4_D12로부터 구축된 라이브러리로부터 취득된 ATP 또는 아데노신 존재하에 있어서 인간 IL-6 수용체(hIL-6R)에 대해 결합능을 나타내는 항체(후술하는 참고 실시예 3)에 대해서, 비생체 유래 저분자 존재하에서의 인간 IL-6 수용체에 대한 결합능에 대해서 평가를 행하였다.
(10-1) 라이브러리로부터 취득된 ATP/아데노신 스위치 항체의 조제
후술하는 참고 실시예 3에서 취득된 ATP 또는 아데노신 존재하에서 비오틴 표지 hIL-6R에 대한 결합 활성을 갖는 것으로 판단된 클론 6RAD2C1-4_001, 6RAD2C1-4_005, 6RAD2C1-4_011, 6RAD2C1-4_026, 6RAD2C1-4_030, 6RAD2C1-4_042, 6RAD2C1-4_076, 6RDL3C1-4_085, 6RDL3C5-4_011의 중쇄 및 경쇄의 가변영역 서열은 중쇄 항체 불변영역(서열번호：46) 또는 경쇄 Lambda 불변영역 서열(서열번호：100)을 갖는 인간 IgG1/Lambda의 동물 발현용 플라스미드로 각각 삽입되었다. 아래의 방법을 사용하여 항체가 발현되었다. FreeStyle 293 Expression Medium 배지(Invitrogen)에 1.33×106 세포/mL의 세포밀도로 현탁되어 6well plate의 각 웰로 3 mL씩 파종된 인간 태아 신장세포 유래 FreeStyle 293-F주(Invitrogen)에 대해 조제된 플라스미드가 리포펙션법에 의해 도입되었다. CO2 인큐베이터(37℃, 8%CO2, 90 rpm)에서 4일간 배양된 배양상청으로부터, rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)를 사용하여 당업자 공지의 방법으로 항체가 정제되었다. 분광광도계를 사용하여 정제된 항체용액의 280 nm에서의 흡광도가 측정되었다. 얻어진 측정값으로부터 PACE법으로 산출된 흡광계수를 사용하여 정제된 항체의 농도가 산출되었다(Protein Science (1995) 4, 2411-2423).
(10-2) 표면 플라즈몬 공명에 의한 인간 IL-6 수용체에 대한 결합의 각종 저분자의 영향 평가
비아코어 T200(GE Healthcare)을 사용하여 라이브러리로부터 취득된 ATP/아데노신 의존성 항체 9클론(6RAD2C1-4_001, 6RAD2C1-4_005, 6RAD2C1-4_011, 6RAD2C1-4_026, 6RAD2C1-4_030, 6RAD2C1-4_042, 6RAD2C1-4_076, 6RDL3C1-4_085, 6RDL3C5-4_011)과 hIL-6R의 항원 항체 반응에 있어서의 각종 저분자의 영향이 평가되었다. 러닝 버퍼로서 20 mmol/L ACES, 150 mmol/L NaCl, 0.05% (w/v) Tween20, pH 7.4가 사용되고 25℃에서 측정되었다. 센서칩 CM5 상에 아민 커플링으로 hIL-6R을 고정화하고 항체를 애널라이트로서 120초간 상호작용시켜 그 결합량의 변화가 관찰되었다. 항체의 희석은 러닝 버퍼 및 러닝 버퍼에 ATP, ADP, AMP, cAMP 또는 아데노신(ADO) 중 어느 하나가 각각 첨가된 버퍼가 사용되고, 각 저분자의 최종 농도가 1 mM, 항체의 최종 농도가 1 μM가 되도록 조제되었다. 또한 1 mM ATP 조건하에서는 여러 단계의 항체의 농도계열을 측정하여 항체 농도에 대한 평형값의 플롯으로부터 각 클론의 hIL-6R에 대한 해리상수 KD(mol/L)가 산출되었다. 파라미터의 산출에는 비아코어 T200 평가 소프트웨어(GE Healthcare)가 사용되었다. 1 mM ATP 존재하에서의 각 클론의 해리상수 KD를 표 34에 나타내었다.
Figure 112021085263630-pat00075
이 측정에서 취득된 1 mM의 각 저분자 존재하 또는 비존재하에 있어서의 각 클론의 hIL-6R에 대한 결합량을 도 37에 나타내었다. 도 37에 나타내어진 바와 같이 각 클론은 1 mM ATP 존재하에서는 hIL-6R에 결합하나, ATP 비존재하에서는 hIL-6R에 대한 결합이 관찰되지 않았다. 이 사실로부터 ATP를 스위치로 하여 hIL-6R에 결합하는 성질을 갖는 것이 확인되었다. ATP 이외의 저분자에 있어서는 전체 클론에 있어서 ADP 존재하에서 결합이 관찰되고, 일부 클론에 있어서 AMP 및 cAMP 존재하에서의 결합도 관찰되었다. ADO(아데노신) 존재하에서는 hIL-6R로의 결합은 관찰되지 않았다.
(10-3) 옥텟에 의한 인간 IL-6 수용체에 대한 결합의 각종 저분자의 영향 평가
옥텟(PRIMETECH)을 사용하여 라이브러리로부터 취득된 ATP/아데노신 의존성 항체 9클론(6RAD2C1-4_001, 6RAD2C1-4_005, 6RAD2C1-4_011, 6RAD2C1-4_026, 6RAD2C1-4_030, 6RAD2C1-4_042, 6RAD2C1-4_076, 6RDL3C1-4_085, 6RDL3C5-4_011)과 hIL-6R의 항원 항체 반응에 있어서의 각종 저분자의 영향이 평가되었다. 측정 버퍼로서 TBS, pH 7.4가 사용되고 30℃에서 측정되었다. 스트렙트아비딘 센서칩 상에 비오틴화 hIL-6R을 고정화하고 항체를 상호작용시켜 그의 결합량의 변화가 관찰되었다. 항체의 희석은 측정 버퍼 및 측정 버퍼에 ATP, ADP, AMP, cAMP, ADO 또는 ATP-gamma-S 중 어느 하나가 각각 첨가된 버퍼가 사용되고 각 저분자의 최종 농도가 1 mM, 항체의 최종 농도가 10 ㎍/mL가 되도록 조제되었다.
이 측정에서 취득된 1 mM의 각 저분자 존재하 또는 비존재하에 있어서의 각 클론의 hIL-6R에 대한 결합성을 평가한 결과, 모든 클론에 있어서 1 mM ATP 존재하에서 hIL-6R에 결합하는 것이 확인되고, ATP 비존재하에서는 hIL-6R에 대한 결합이 관찰되지 않았다. 이 사실로부터, ATP를 스위치로 하여 hIL-6R에 결합하는 성질을 갖는 것이 옥텟에서도 확인되었다. 또한 모든 클론에 있어서 ATP-gamma-S 존재하에서의 결합도 관찰되었다. 평가에서 얻어진 ATP 또는 ATP-gamma-S 1 mM 존재하 또는 비존재하의 IL6R로의 결합량은 도 38에 나타내었다. 이상의 사실로부터 ATP와 유도체(생체 외 분자)가 스위치로서 기능하는 hIL-6R 결합 항체가 라이브러리로부터 취득 가능한 것이 나타내어졌다.
〔실시예 11〕키누레닌에 대한 패닝을 이용한 키누레닌 스위치 항체 취득용 라이브러리(키누레닌 라이브러리 Ver.A)로부터의 키누레닌 존재하에 있어서 인간 IL-6 수용체에 결합하는 항체의 취득
(11-1) 항체 라이브러리로부터의 키누레닌 존재하에서 인간 IL-6 수용체에 결합 활성을 나타내고, 키누레닌 비존재하에 있어서 결합을 나타내지 않는 항체의 취득
실시예 9에서 구축된 키누레닌에 대한 패닝을 이용한 키누레닌 스위치 항체 취득용 파지 디스플레이 라이브러리(키누레닌 라이브러리 Ver.A로 호칭함)로부터 키누레닌 존재하에서 인간 IL-6 수용체(hIL-6R)에 대한 결합 활성을 나타내는 항체가 스크리닝되었다. 즉, 비드에 캡쳐된 hIL-6R에 대해 키누레닌 존재하에서 결합 활성을 나타내고, 키누레닌 비존재하의 조건에서는 비드로부터 용출되는 항체를 제시하고 있는 파지가 회수되었다. 본 취득방법에서는 항원으로서 비오틴 표지된 hIL-6R이 사용되었다.
구축된 파지 디스플레이 파지미드 벡터를 보유하는 대장균에 대해 M13KO7△pIII(하이퍼 파지라 불림)(PROGEN Biotechnik)를 감염시키고 30℃에서 하룻밤 배양한 상청으로부터 파지가 회수되었다. 파지 생산이 행해진 대장균의 배양액에 2.5 M NaCl/10% PEG를 첨가하여 침전시킨 파지의 집단을 TBS로 희석함으로써 항체 다가 제시 파지 라이브러리액이 조제되었다. 다음으로 당해 파지 라이브러리액에 최종 농도 4%가 되도록 BSA가 첨가되었다. 자기 비드에 고정화된 항원을 사용한 패닝이 실시되었다. 자기 비드로서 뉴트르아비딘 코팅된 비드(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated) 또는 스트렙트아비딘 코팅된 비드(Dynabeads MyOne Streptavidin T1)가 사용되었다.
1회째 패닝에서는 키누레닌 존재하에서만 항원에 대해 결합 가능한 파지의 농축이 행해졌다. 구체적으로는, 조제한 파지 라이브러리액 0.5 mL에 250 pmol의 비오틴 표지 항원과 함께 최종 농도 500 μM의 키누레닌을 첨가함으로써 파지 라이브러리를 실온에서 15분간 항원 및 키누레닌과 접촉시켰다. 그 후, 4℃에서 45분간 접촉시켰다. BSA로 블로킹된 자기 비드(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)가 첨가되어 항원과 파지의 복합체를 자기 비드와 4℃에서 15분간 결합시켰다. 비드는 0.5 mL의 빙랭된 키누레닌/TBST로 2회, 빙랭된 키누레닌/TBS로 1회 세정되었다. 그 후 0.25 mL의 TBS가 첨가된 비드는 실온에서 현탁된 후, 즉시 자기 스탠드를 사용하여 분리된 비드로부터 파지용액이 회수되었다. 이 작업이 재차 반복된 후, 2회로 나눠 용출된 파지액이 혼합되었다. 회수된 파지용액에 100 ㎎/mL의 트립신 5 μL를 첨가함으로써 Fab가 절단되고, 트립신 처리된 파지의 대장균에 대한 감염능이 개선되었다. 트립신 처리된 파지가 대수증식기(OD600이 0.4-0.7)가 된 10 mL의 대장균주 ER2738에 첨가되었다. 37℃에서 1시간 완만하게 상기 대장균의 교반 배양을 행함으로써 파지를 대장균에 감염시켰다. 감염시킨 대장균은 225 ㎜×225 ㎜의 플레이트에 파종되었다. 다음으로 파종된 대장균의 배양액에 대해 하이퍼 파지를 감염시키고 30℃에서 하룻밤 배양한 상청으로부터 파지를 회수함으로써 항체 다가 제시 파지 라이브러리액이 조제되었다.
2회째 패닝에서는 조제한 파지 라이브러리액 0.4 mL에 250 pmol의 비오틴 표지 항원과 함께 최종 농도 500 μM의 키누레닌을 첨가함으로써 파지 라이브러리를 실온에서 60분간 항원 및 키누레닌과 접촉시켰다. BSA로 블로킹된 자기 비드(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)가 첨가되어 항원과 파지의 복합체를 자기 비드와 실온에서 15분간 결합시켰다. 비드는 0.5 mL의 키누레닌/TBST로 2회, 키누레닌/TBS로 1회 세정되었다. 그 후 0.25 mL의 TBS가 첨가된 비드는 실온에서 현탁된 후, 즉시 자기 스탠드를 사용하여 분리된 비드로부터 파지용액이 회수되었다. 이 작업이 재차 반복된 후, 2회로 나눠 용출된 파지액이 혼합되었다. 회수된 파지용액에 100 ㎎/mL의 트립신 5 μL를 첨가함으로써 Fab가 절단되고, 트립신 처리된 파지의 대장균에 대한 감염능이 개선되었다. 트립신 처리된 파지가 대수증식기(OD600이 0.4-0.7)가 된 20 mL의 대장균주 ER2738에 첨가되었다. 37℃에서 1시간 완만하게 상기 대장균의 교반 배양을 행함으로써 파지를 대장균에 감염시켰다. 감염시킨 대장균은 225 ㎜×225 ㎜의 플레이트에 파종되었다. 다음으로 파종된 대장균의 배양액에 대해 하이퍼 파지를 감염시키고 30℃에서 하룻밤 배양한 상청으로부터 파지를 회수함으로써 항체 다가 제시 파지 라이브러리액이 조제되었다.
3회째 패닝에서는 조제한 파지 라이브러리액 0.2 mL에 100 pmol의 비오틴 표지 항원과 함께 최종 농도 500 μM의 키누레닌을 첨가함으로써 파지 라이브러리를 실온에서 60분간 항원 및 키누레닌과 접촉시켰다. BSA로 블로킹된 자기 비드(Dynabeads MyOne Streptavidin T1)가 첨가되어 항원과 파지의 복합체를 자기 비드와 4℃에서 30분간 결합시켰다. 비드는 0.4 mL의 키누레닌/TBST로 3회, 키누레닌/TBS로 2회 세정되었다. 그 후 0.25 mL의 TBS가 첨가된 비드는 실온에서 현탁된 후, 즉시 자기 스탠드를 사용하여 분리된 비드로부터 파지용액이 회수되었다. 이 작업이 재차 반복된 후, 2회로 나눠 용출된 파지액이 혼합되었다. 회수된 파지용액에 100 ㎎/mL의 트립신 5 μL를 첨가함으로써 Fab가 절단되고, 트립신 처리된 파지의 대장균에 대한 감염능이 개선되었다. 트립신 처리된 파지가 대수증식기(OD600이 0.4-0.7)가 된 20 mL의 대장균주 ER2738에 첨가되었다. 37℃에서 1시간 완만하게 상기 대장균의 교반 배양을 행함으로써 파지를 대장균에 감염시켰다. 감염시킨 대장균은 225 ㎜×225 ㎜의 플레이트에 파종되었다. 다음으로 파종된 대장균의 배양액에 대해 하이퍼 파지를 감염시키고 30℃에서 하룻밤 배양한 상청으로부터 파지를 회수함으로써 항체 다가 제시 파지 라이브러리액이 조제되었다.
4회째 패닝에서는 3회째 패닝과 동일한 조건에 의한 패닝이 실시되었다.
(11-2) 음성 선별법을 이용한 항체 라이브러리로부터의 키누레닌 존재하에 있어서 hIL-6R에 결합하는 항체의 취득
실시예 9에서 구축된 키누레닌 라이브러리 Ver.A로부터 항원에 대해 키누레닌이 존재하는 조건하에서 항원에 대한 결합 활성을 나타내는 항체의 스크리닝이 행해졌다. 스크리닝을 위해 먼저 항체 파지 디스플레이 라이브러리를 키누레닌 비존재하에서 비오틴 표지 항원-스트렙트아비딘과 접촉시켜, 키누레닌 비존재하에서도 항원에 대해 결합 활성을 갖는 항체를 제시하고 있는 파지가 제거되었다. 이어서 키누레닌이 존재하는 조건하에서 동일하게 패닝을 행함으로써 키누레닌이 존재하는 조건하에서만 항원에 대해 결합 활성을 갖는 항체의 스크리닝이 실시되었다.
구축된 파지 디스플레이 파지미드 벡터를 보유하는 대장균에 대해 M13KO7△pIII(하이퍼 파지라 불림)(PROGEN Biotechnik)를 감염시키고 30℃에서 하룻밤 배양한 상청으로부터 파지가 회수되었다. 파지 생산이 행해진 대장균의 배양액에 2.5 M NaCl/10% PEG를 첨가하여 침전시킨 파지의 집단을 TBS로 희석함으로써 항체 다가 제시 파지 라이브러리액이 조제되었다. 다음으로 당해 파지 라이브러리액에 최종 농도 4%가 되도록 BSA가 첨가되었다. 자기 비드에 고정화된 항원을 사용한 패닝이 실시되었다. 자기 비드로서 뉴트르아비딘 코팅된 비드(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated) 또는 스트렙트아비딘 코팅된 비드(Dynabeads MyOne Streptavidin T1)가 사용되었다.
1회째 패닝에서는 음성 선별법을 이용한 키누레닌 존재하에서만 항원에 대해 결합 가능한 파지의 농축이 행해졌다. 구체적으로는, BSA로 블로킹된 뉴트르아비딘 코팅된 비드(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)에 500 pmol의 비오틴화 항원을 첨가하고 실온에서 15분간 결합시켰다. TBS로 3회 세정된 비드에 대해 BSA로 블로킹이 행해진 파지 라이브러리액 0.5 mL를 첨가하고 실온에서 1시간 결합시켰다. 자기 스탠드를 사용하여 비드를 분리함으로써 항원 및 비드에 결합하지 않는 파지가 회수되었다. 회수된 파지에 대해 250 pmol의 비오틴 표지 항원 및 최종 농도 500 μM의 키누레닌을 첨가함으로써 파지 라이브러리를 실온에서 15분간 항원 및 키누레닌과 접촉시켰다. 그 후, 4℃에서 45분간 접촉시켰다. 다음으로 당해 표지 항원 및 키누레닌과 파지 라이브러리의 혼합액에 BSA로 블로킹된 자기 비드를 첨가하고 4℃에서 15분간, 항원과 파지의 복합체를 자기 비드와 결합시켰다. 비드는 0.5 mL의 빙랭된 키누레닌/TBST로 2회, 빙랭된 키누레닌/TBS로 1회 세정되었다. 그 후 1 ㎎/mL의 트립신 용액 0.5 mL가 당해 혼합액에 첨가되었다. 당해 혼합액은 실온에서 15분간 교반된 후, 자기 스탠드를 사용하여 분리된 비드로부터 파지가 회수되었다. 회수된 파지는 대수증식기(OD600이 0.4-0.7)가 된 10 mL의 대장균주 ER2738에 첨가되었다. 37℃에서 1시간 완만하게 상기 대장균의 교반 배양을 행함으로써 파지를 대장균에 감염시켰다. 감염시킨 대장균은 225 ㎜×225 ㎜의 플레이트에 파종되었다. 다음으로 파종된 대장균의 배양액에 대해 하이퍼 파지를 감염시키고 30℃에서 하룻밤 배양한 상청으로부터 파지를 회수함으로써 항체 다가 제시 파지 라이브러리액이 조제되었다.
2회째 이후의 패닝에서는 키누레닌 존재하에서만 항원에 대해 결합 가능한 파지의 농축이 행해졌다. 구체적으로는, 실시예 (11-1)에 나타내어진 2회째 이후의 패닝방법과 동일한 방법으로 4회째 패닝까지 실시되었다.
(11-3) 스위치가 되는 분자에 대한 패닝을 이용한 항체 라이브러리로부터의 키누레닌 존재하에 있어서 hIL-6R에 결합하는 항체의 취득
실시예 9에서 구축된 키누레닌 라이브러리 Ver.A로부터 항원에 대해 키누레닌이 존재하는 조건하에서 항원에 대한 결합 활성을 나타내는 항체의 스크리닝이 행해졌다. 스크리닝을 위해 먼저 비오틴화 키누레닌(화합물 028, 029 및 036)에 대해 패닝을 행하여 키누레닌에 대해 결합 활성을 갖는 항체를 제시하고 있는 파지가 회수되었다. 이어서 키누레닌 존재하에서 비오틴 표지 항원에 대한 패닝을 행함으로써 키누레닌이 존재하는 조건하에서 항원에 대해 결합 활성을 갖는 항체의 스크리닝이 실시되었다.
구축된 파지 디스플레이 파지미드 벡터를 보유하는 대장균에 대해 M13KO7△pIII(하이퍼 파지라 불림)(PROGEN Biotechnik)를 감염시키고 30℃에서 하룻밤 배양한 상청으로부터 파지가 회수되었다. 파지 생산이 행해진 대장균의 배양액에 2.5 M NaCl/10% PEG를 첨가하여 침전시킨 파지의 집단을 TBS로 희석함으로써 항체 다가 제시 파지 라이브러리액이 조제되었다. 다음으로 당해 파지 라이브러리액에 최종 농도 4%가 되도록 BSA가 첨가되었다. 자기 비드에 고정화된 항원을 사용한 패닝이 실시되었다. 자기 비드로서 뉴트르아비딘 코팅된 비드(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated) 또는 스트렙트아비딘 코팅된 비드(Dynabeads MyOne Streptavidin T1)가 사용되었다.
1회째 패닝에서는 비오틴화 키누레닌(화합물 028, 029 및 036의 혼합물)에 대해 결합 가능한 파지의 농축이 행해졌다. 구체적으로는, BSA로 블로킹된 비드(Dynabeads MyOne Streptavidin T1)에 화합물 028, 029 및 036을 등량씩 혼합한 비오틴화 키누레닌 혼합물 4,000 pmol을 첨가하고 실온에서 30분간 결합시켰다. TBS로 3회 세정된 비드에 대해 BSA로 블로킹이 행해진 파지 라이브러리액 0.8 mL를 첨가하고 실온에서 30분간 비오틴화 키누레닌과 접촉시켰다. 그 후, 4℃에서 30분간 접촉시켰다. 비드는 1 mL의 빙랭된 TBST로 3회, 빙랭된 TBS로 2회 세정되었다. 그 후, 1 ㎎/mL의 트립신 용액 0.5 mL가 당해 혼합액에 첨가되었다. 당해 혼합액은 실온에서 15분 현탁된 후, 즉시 자기 스탠드를 사용하여 분리된 비드로부터 파지용액이 회수되었다. 회수된 파지가 대수증식기(OD600이 0.4-0.7)가 된 100 mL의 대장균주 ER2738에 첨가되었다. 37℃에서 1시간 완만하게 상기 대장균의 교반 배양을 행함으로써 파지를 대장균에 감염시켰다. 감염시킨 대장균은 225 ㎜×225 ㎜의 플레이트 5매에 파종되었다. 다음으로 파종된 대장균의 배양액에 대해 하이퍼 파지를 감염시키고 30℃에서 하룻밤 배양한 상청으로부터 파지를 회수함으로써 항체 다가 제시 파지 라이브러리액이 조제되었다.
2회째 이후의 패닝에서는 키누레닌 존재하에서만 항원에 대해 결합 가능한 파지의 농축이 행해졌다. 구체적으로는, 실시예 (11-1)에 나타내어진 2회째 이후의 패닝방법과 동일한 방법으로 4회째 패닝까지 실시되었다.
(11-4) 파지 ELISA에 의한 키누레닌 존재하에 있어서의 결합 활성의 평가
(11-1), (11-2), (11-3)에서 얻어진 대장균의 싱글 콜로니로부터 통상의 방법(Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145)에 따라 파지의 배양이 행해졌다. 헬퍼 파지로서 하이퍼 파지를 사용함으로써 항체 다가 제시 파지 함유 배양상청이 회수되었다. NucleoFast96(MACHERY-NAGEL)을 사용하여 회수된 파지 배양상청이 한외여과되었다. 배양상청 각 200 μL가 NucleoFast96의 각 웰에 어플라이되어 6,000 g, 45분간 원심분리를 행하여 통과액이 제거되었다. H2O 200 μL를 첨가하고 6,000 g, 30분간 원심분리에 의한 세정이 행해졌다. 그 후, TBS 200 μL를 첨가하고 실온에서 5분간 정치한 후, 상청에 포함되는 파지액이 회수되었다.
TBS 또는 500 μM 키누레닌/TBS가 첨가된 정제 파지가 아래의 절차로 ELISA에 제공되었다. StreptaWell 96 마이크로타이터 플레이트(Roche)가 비오틴 표지 hIL-6R을 포함하는 100 μL의 TBS로 1시간 이상 코트되었다. 당해 플레이트의 각 웰을 TBST로 세정함으로써 플레이트에 결합되어 있지 않은 비오틴 표지 hIL-6R이 제거된 후, 당해 웰이 250 μL의 2% 스킴밀크-TBS로 1시간 이상 블로킹되었다. 2% 스킴밀크-TBS를 제거한 후, 각 웰에 조제된 정제 파지가 첨가된 당해 플레이트를 실온에서 1시간 정치함으로써 파지를 제시하는 항체를 각 웰에 존재하는 비오틴 표지 hIL-6R에 키누레닌 비존재/존재하에 있어서 결합시켰다. TBST 또는 키누레닌/TBST로 세정된 각 웰에 TBS 또는 키누레닌/TBS에 의해 희석된 HRP 결합 항M13 항체(Amersham Pharmacia Biotech)가 첨가된 플레이트를 1시간 인큐베이트시켰다. TBST 또는 키누레닌/TBST로 세정 후, TMB single 용액(ZYMED)이 첨가된 각 웰 중의 용액의 발색반응이 황산의 첨가에 의해 정지된 후, 450 nm의 흡광도에 의해 당해 발색이 측정되었다. 그 결과, 인간 IL-6 수용체에 대해 키누레닌 존재하에서 결합하는 항체가 복수 확인되었다. 파지 ELISA의 결과를 표 35에 나타내었다. 전술한 실시예 6에 나타내어진 바와 같이, 인간 나이브 항체 라이브러리로부터도 키누레닌 존재하에서 인간 IL-6 수용체에 결합하는 항체는 취득되고 있는데, 그것보다도 매우 높은 효율로 인간 IL-6 수용체에 대한 스위치 항체를 취득할 수 있었다. 실시예 6-2에서 실시된 파지 ELISA의 결과를 표 36에 나타내었다.
Figure 112021085263630-pat00076
Figure 112021085263630-pat00077
(11-5) 키누레닌의 유무에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 스위치 항체의 서열 해석
실시예 (11-4)에서 나타내어지는 파지 ELISA의 결과, 키누레닌이 존재하는 조건하에서 항원에 대한 결합 활성이 있는 것으로 판단된 클론으로부터 특이적인 프라이머(서열번호：79 및 80)를 사용하여 증폭된 유전자의 염기서열이 해석되었다. 해석 결과, 실시예 (11-1), (11-2) 및 (11-3)의 모든 조건으로부터, 키누레닌 존재하에서 비오틴 표지 hIL-6R에 대한 결합 활성을 갖는 것으로 판단된 클론이 복수 취득되었다. 취득된 클론 중 선발된 6클론에 대해서 아래의 표 37에 취득된 패닝 조건(표 중 유래로 표기) 및 아미노산 서열을 나타내었다.
Figure 112021085263630-pat00078
(11-6) hIL-6R에 결합하는 항체의 발현과 정제
실시예 (11-5)에 기재된 6클론의 중쇄 및 경쇄의 가변영역 서열은 중쇄 항체 불변영역(서열번호：113) 또는 경쇄 kappa 불변영역 서열(서열번호：47)을 갖는 동물 발현용 플라스미드로 각각 삽입되었다. 후술하는 참고 실시예 1에 기재된 방법으로 항체의 발현 및 정제가 실시되었다.
(11-7) 취득된 항체의 hIL-6R에 대한 결합 활성 평가
선발된 6종류의 항체와 6RNMSC1-2_F02 항체가 표 38에 나타낸 조건으로 ELISA에 제공되었다.
Figure 112021085263630-pat00079
먼저 StreptaWell 96 마이크로타이터 플레이트(Roche)가 비오틴 표지 hIL-6R을 포함하는 100 μL의 TBS로 실온에서 1시간 이상 코트되었다. 당해 플레이트의 각 웰을 TBST로 세정함으로써 플레이트에 결합되어 있지 않은 비오틴 표지 hIL-6R이 제거된 후, 당해 웰이 블로킹 버퍼(2% 스킴밀크/TBS) 250 μL로 1시간 이상 블로킹되었다. 블로킹 버퍼가 제거된 각 웰에 표 38의 조건에서 TBS로 2.5 ㎍/mL로 조제된 정제 IgG 각 100 μL가 첨가된 당해 플레이트를 실온에서 1시간 정치함으로써 각 IgG를 각 웰에 존재하는 비오틴 표지 hIL-6R에 결합시켰다. 표 38에 나타낸 최종 농도가 되도록 조제된 TBST로 세정된 각 웰에 같은 저분자가 들어 있는 TBS에 의해 희석된 HRP 결합 항인간 IgG 항체(BIOSOURCE)가 첨가된 플레이트를 1시간 인큐베이트시켰다. 표 38에 나타낸 최종 농도가 되도록 조제된 TBST로 세정 후, TMB single 용액(ZYMED)이 첨가된 각 웰 중의 용액의 발색반응이 황산의 첨가에 의해 정지된 후, 450 nm의 흡광도에 의해 당해 발색이 측정되었다. 측정된 결과를 도 39에 나타내었다.
선발된 6종류의 항체는 6RNMSC1-2_F02 항체와 동일하게 조건 1의 흡광도와 비교하여 조건 2 또는 조건 3의 흡광도는 현저히 낮았다. 이 사실로부터, 선발된 6종류의 항체는 IgG형에 있어서도 키누레닌 존재하에서 비오틴 표지 hIL-6R에 대해 특이적인 결합 활성을 갖는 것이 확인되었다. 또한 조건 4의 흡광도와 비교하여 조건 2의 흡광도에 현저한 차가 보이지 않는 것으로부터, 선발된 6종류의 항체에 트립토판 존재하에서의 비오틴 표지 hIL-6R에 대한 결합 활성이 없는 것도 확인되었다. 이상의 사실로부터, 키누레닌에 대한 패닝을 이용한 키누레닌 스위치 항체 취득용 라이브러리(키누레닌 라이브러리 Ver.A)로부터 키누레닌이 스위치로서 기능하는 hIL-6R 결합 항체가 복수 취득 가능한 것이 나타내어졌다. 또한 후술하는 참고 실시예 4에서 나타내어지는 바와 같이, 참고 실시예 2에 있어서 구축된 ATP에 결합하는 항체를 주형으로 한 합리적으로 설계된 라이브러리로부터 ATP 비존재하에 있어서 표적 항원에 결합하고, ATP 존재하에서는 표적 항원에 결합하지 않는 항체가 취득된 것으로부터, 마찬가지로 키누레닌 스위치 항체 취득용 라이브러리로부터 키누레닌 비존재하에 있어서 표적 항원에 결합하고, 키누레닌 존재하에서는 표적 항원에 결합하지 않는 항체의 취득도 가능할 것으로 생각된다.
〔실시예 12〕키누레닌에 대한 패닝을 이용한 키누레닌 스위치 항체 취득용 라이브러리(키누레닌 라이브러리 Ver.A)로부터의 키누레닌 존재하에 있어서 인간 IgA-Fc(hIgA-Fc)에 결합하는 항체의 취득
(12-1) 항체 라이브러리로부터의 키누레닌 존재하에서 hIgA-Fc에 결합 활성을 나타내고, 키누레닌 비존재하에 있어서 결합을 나타내지 않는 항체의 취득
실시예 9에서 구축된 키누레닌 라이브러리 Ver.A로부터 키누레닌 존재하에서 인간 IgA-Fc(hIgA-Fc)에 대한 결합 활성을 나타내는 항체가 스크리닝되었다. 즉, 비드에 캡쳐된 hIgA-Fc에 대해 키누레닌 존재하에서 결합 활성을 나타내고, 키누레닌 비존재하의 조건에서는 비드로부터 용출되는 항체를 제시하고 있는 파지가 회수되었다. 본 취득방법에서는 항원으로서 참고 실시예 5에 기재된 방법으로 조제된 비오틴 표지 hIgA-Fc(서열번호：146)가 사용되었다.
구축된 파지 디스플레이 파지미드 벡터를 보유하는 대장균에 대해 M13KO7△pIII(하이퍼 파지라 불림)(PROGEN Biotechnik)를 감염시키고 30℃에서 하룻밤 배양한 상청으로부터 파지가 회수되었다. 파지 생산이 행해진 대장균의 배양액에 2.5 M NaCl/10% PEG를 첨가하여 침전시킨 파지의 집단을 TBS로 희석함으로써 항체 다가 제시 파지 라이브러리액이 조제되었다. 다음으로 당해 파지 라이브러리액에 최종 농도 4%가 되도록 BSA가 첨가되었다. 자기 비드에 고정화된 항원을 사용한 패닝이 실시되었다. 자기 비드로서 뉴트르아비딘 코팅된 비드(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated) 또는 스트렙트아비딘 코팅된 비드(Dynabeads MyOne Streptavidin T1)가 사용되었다.
패닝에서는 키누레닌 존재하에서만 항원에 대해 결합 가능한 파지의 농축이 행해졌다. 구체적으로는, 실시예 (11-1)에 나타내어진 방법과 동일한 방법으로 항원량을 1회째 및 2회째에서 500 pmol, 3회째 및 4회째에서 200 pmol로 변경하여 4회째까지의 패닝이 실시되었다.
(12-2) 음성 선별법을 이용한 항체 라이브러리로부터의 키누레닌 존재하에 있어서 hIgA-Fc에 결합하는 항체의 취득
실시예 9에서 구축된 키누레닌 라이브러리 Ver.A로부터 항원에 대해 키누레닌이 존재하는 조건하에서 항원에 대한 결합 활성을 나타내는 항체의 스크리닝이 행해졌다. 스크리닝을 위해 먼저 항체 파지 디스플레이 라이브러리를 키누레닌 비존재하에서 비오틴 표지 항원-스트렙트아비딘과 접촉시켜 키누레닌 비존재하에서도 항원에 대해 결합 활성을 갖는 항체를 제시하고 있는 파지가 제거되었다. 이어서 키누레닌이 존재하는 조건하에서 동일하게 패닝을 행함으로써 키누레닌이 존재하는 조건하에서만 항원에 대해 결합 활성을 갖는 항체의 스크리닝이 실시되었다.
구축된 파지 디스플레이 파지미드 벡터를 보유하는 대장균에 대해 M13KO7△pIII(하이퍼 파지라 불림)(PROGEN Biotechnik)를 감염시키고 30℃에서 하룻밤 배양한 상청으로부터 파지가 회수되었다. 파지 생산이 행해진 대장균의 배양액에 2.5 M NaCl/10% PEG를 첨가하여 침전시킨 파지의 집단을 TBS로 희석함으로써 항체 다가 제시 파지 라이브러리액이 조제되었다. 다음으로 당해 파지 라이브러리액에 최종 농도 4%가 되도록 BSA가 첨가되었다. 자기 비드에 고정화된 항원을 사용한 패닝이 실시되었다. 자기 비드로서 뉴트르아비딘 코팅된 비드(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated) 또는 스트렙트아비딘 코팅된 비드(Dynabeads MyOne Streptavidin T1)가 사용되었다.
1회째 패닝에서는 음성 선별법을 이용한 키누레닌 존재하에서만 항원에 대해 결합 가능한 파지의 농축이 행해졌다. 구체적으로는, BSA로 블로킹된 뉴트르아비딘 코팅된 비드(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)에 1,000 pmol 비오틴화 항원을 첨가하고 실온에서 15분간 결합시켰다. TBS로 3회 세정된 비드에 대해 BSA로 블로킹이 행해진 파지 라이브러리액 0.5 mL를 첨가하고 실온에서 1시간 결합시켰다. 자기 스탠드를 사용하여 비드를 분리함으로써 항원 및 비드에 결합하지 않는 파지가 회수되었다. 회수된 파지에 대해 500 pmol의 비오틴 표지 항원 및 최종 농도 500 μM의 키누레닌을 첨가함으로써 파지 라이브러리를 실온에서 15분간 항원 및 키누레닌과 접촉시켰다. 그 후, 4℃에서 45분간 접촉시켰다. 다음으로 당해 표지 항원 및 키누레닌과 파지 라이브러리의 혼합액에 BSA로 블로킹된 자기 비드를 첨가하고 4℃에서 15분간, 항원과 파지의 복합체를 자기 비드와 결합시켰다. 비드는 0.5 mL의 빙랭된 키누레닌/TBST로 2회, 빙랭된 키누레닌/TBS로 1회 세정되었다. 그 후 1 ㎎/mL의 트립신 용액 0.5 mL가 당해 혼합액에 첨가되었다. 당해 혼합액은 실온에서 15분간 교반된 후, 자기 스탠드를 사용하여 분리된 비드로부터 파지가 회수되었다. 회수된 파지는 대수증식기(OD600이 0.4-0.7)가 된 10 mL의 대장균주 ER2738에 첨가되었다. 37℃에서 1시간 완만하게 상기 대장균의 교반 배양을 행함으로써 파지를 대장균에 감염시켰다. 감염시킨 대장균은 225 ㎜×225 ㎜의 플레이트에 파종되었다. 다음으로 파종된 대장균의 배양액에 대해 하이퍼 파지를 감염시키고 30℃에서 하룻밤 배양한 상청으로부터 파지를 회수함으로써 항체 다가 제시 파지 라이브러리액이 조제되었다.
2회째 이후의 패닝에서는 키누레닌 존재하에서만 항원에 대해 결합 가능한 파지의 농축이 행해졌다. 구체적으로는, 실시예 (11-1)에 나타내어진 2회째 이후의 패닝방법과 동일한 방법으로 항원량을 2회째에서 500 pmol, 3회째 및 4회째에서 200 pmol로 변경하여 4회째 패닝까지 실시되었다.
(12-3) 스위치가 되는 분자에 대한 패닝을 이용한 항체 라이브러리로부터의 키누레닌 존재하에 있어서 hIgA-Fc에 결합하는 항체의 취득
실시예 9에서 구축된 키누레닌 라이브러리 Ver.A로부터 항원에 대해 키누레닌이 존재하는 조건하에서 항원에 대한 결합 활성을 나타내는 항체의 스크리닝이 행해졌다. 스크리닝을 위해 먼저 비오틴화 키누레닌(화합물 028, 029 및 036)에 대해 패닝을 행하고 키누레닌에 대해 결합 활성을 갖는 항체를 제시하고 있는 파지가 회수되었다. 이어서 키누레닌 존재하에서 비오틴 표지 항원에 대한 패닝을 행함으로써 키누레닌이 존재하는 조건하에서 항원에 대해 결합 활성을 갖는 항체의 스크리닝이 실시되었다.
구축된 파지 디스플레이 파지미드 벡터를 보유하는 대장균에 대해 M13KO7△pIII(하이퍼 파지라 불림)(PROGEN Biotechnik)를 감염시키고 30℃에서 하룻밤 배양한 상청으로부터 파지가 회수되었다. 파지 생산이 행해진 대장균의 배양액에 2.5 M NaCl/10% PEG를 첨가하여 침전시킨 파지의 집단을 TBS로 희석함으로써 항체 다가 제시 파지 라이브러리액이 조제되었다. 다음으로 당해 파지 라이브러리액에 최종 농도 4%가 되도록 BSA가 첨가되었다. 자기 비드에 고정화된 항원을 사용한 패닝이 실시되었다. 자기 비드로서 뉴트르아비딘 코팅된 비드(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated) 또는 스트렙트아비딘 코팅된 비드(Dynabeads MyOne Streptavidin T1)가 사용되었다.
1회째 패닝에서는 비오틴화 키누레닌(화합물 028, 029 및 036의 혼합물)에 대해 결합 가능한 파지의 농축이 행해졌다. 구체적으로는, BSA로 블로킹된 비드(Dynabeads MyOne Streptavidin T1)에 화합물 028, 029 및 036을 등량씩 혼합한 비오틴화 키누레닌 혼합물 4,000 pmol을 첨가하고 실온에서 30분간 결합시켰다. TBS로 3회 세정된 비드에 대해 BSA로 블로킹이 행해진 파지 라이브러리액 0.8 mL를 첨가하고 실온에서 30분간 비오틴화 키누레닌과 접촉시켰다. 그 후, 30분간 4℃에서 접촉시켰다. 비드는 1 mL의 빙랭된 TBST로 3회, 빙랭된 TBS로 2회 세정되었다. 그 후, 1 ㎎/mL의 트립신 용액 0.5 mL가 당해 혼합액에 첨가되었다. 당해 혼합액은 실온에서 15분 현탁된 후, 즉시 자기 스탠드를 사용하여 분리된 비드로부터 파지용액이 회수되었다. 회수된 파지가 대수증식기(OD600이 0.4-0.7)가 된 100 mL의 대장균주 ER2738에 첨가되었다. 37℃에서 1시간 완만하게 상기 대장균의 교반 배양을 행함으로써 파지를 대장균에 감염시켰다. 감염시킨 대장균은 225 ㎜×225 ㎜의 플레이트 5매에 파종되었다. 다음으로 파종된 대장균의 배양액에 대해 하이퍼 파지를 감염시키고 30℃에서 하룻밤 배양한 상청으로부터 파지를 회수함으로써 항체 다가 제시 파지 라이브러리액이 조제되었다.
2회째 이후의 패닝에서는 키누레닌 존재하에서만 항원에 대해 결합 가능한 파지의 농축이 행해졌다. 구체적으로는, 실시예 (11-1)에 나타내어진 2회째 이후의 패닝방법과 동일한 방법으로 항원량을 2회째에서 500 pmol, 3회째 및 4회째에서 200 pmol로 변경하여 4회째 패닝까지 실시되었다.
(12-4) 파지 ELISA에 의한 키누레닌 존재하에 있어서의 결합 활성의 평가
(12-1), (12-2), (12-3)에서 얻어진 대장균의 싱글 콜로니로부터 통상의 방법(Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145)에 따라 파지의 배양이 행해졌다. 헬퍼 파지로서 하이퍼 파지를 사용함으로써 항체 다가 제시 파지 함유 배양상청이 회수되었다. 실시예 (11-4)에 기재된 방법으로 정제된 정제 파지가 아래의 절차로 ELISA에 제공되었다. StreptaWell 96 마이크로타이터 플레이트(Roche)가 비오틴 표지 hIgA-Fc를 포함하는 100 μL의 TBS로 1시간 이상 코트되었다. 당해 플레이트의 각 웰을 TBST로 세정함으로써 플레이트에 결합되어 있지 않은 비오틴 표지 hIgA-Fc가 제거된 후, 당해 웰이 250 μL의 2% 스킴밀크-TBS로 1시간 이상 블로킹되었다. 2% 스킴밀크-TBS를 제거한 후, 각 웰에 조제된 정제 파지가 첨가된 당해 플레이트를 실온에서 1시간 정치함으로써 파지를 제시하는 항체를 각 웰에 존재하는 비오틴 표지 hIgA-Fc에 키누레닌 비존재/존재하에 있어서 결합시켰다. TBST 또는 키누레닌/TBST로 세정된 각 웰에 TBS 또는 키누레닌/TBS에 의해 희석된 HRP 결합 항M13 항체(Amersham Pharmacia Biotech)가 첨가된 플레이트를 1시간 인큐베이트시켰다. TBST 또는 키누레닌/TBST로 세정 후, TMB single 용액(ZYMED)이 첨가된 각 웰 중의 용액의 발색반응이 황산의 첨가에 의해 정지된 후, 450 nm의 흡광도에 의해 당해 발색이 측정되었다. 그 결과, 인간 IgA-Fc에 대해 키누레닌 존재하에서 결합하는 항체가 복수 확인되었다. 파지 ELISA의 결과를 표 39에 나타내었다.
Figure 112021085263630-pat00080
(12-5) 키누레닌의 유무에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 스위치 항체의 서열 해석
실시예 (12-4)에서 나타내어지는 파지 ELISA의 결과, 키누레닌이 존재하는 조건하에서 항원에 대한 결합 활성이 있는 것으로 판단된 클론으로부터 특이적인 프라이머(서열번호：79 및 80)를 사용하여 증폭된 유전자의 염기서열이 해석되었다. 해석 결과, 실시예 (12-1), (12-2) 및 (12-3)의 모든 조건으로부터 키누레닌 존재하에서 비오틴 표지 hIgA-Fc에 대한 결합 활성을 갖는 것으로 판단된 클론이 복수 취득되었다. 취득된 클론 중 선발된 6클론에 대해서 아래의 표 40에 취득된 패닝 조건(표 중 유래로 표기) 및 아미노산 서열을 나타내었다.
Figure 112021085263630-pat00081
(12-6) hIgA-Fc에 결합하는 항체의 발현과 정제
실시예 (12-5)에 기재된 6클론의 중쇄 및 경쇄의 가변영역 서열은 중쇄 항체 불변영역(서열번호：113) 또는 경쇄 kappa 불변영역 서열(서열번호：47)을 갖는 동물 발현용 플라스미드로 각각 삽입되었다. 후술하는 참고 실시예 1에 기재된 방법으로 항체의 발현 및 정제가 실시되었다.
(12-7) 취득된 항체의 hIgA-Fc에 대한 결합 활성의 평가
취득된 6종류의 항체가 표 41에 나타내어진 조건으로 ELISA에 제공되었다.
Figure 112021085263630-pat00082
먼저 StreptaWell 96 마이크로타이터 플레이트(Roche)가 비오틴 표지 hIgA-Fc를 포함하는 100 μL의 TBS로 실온에서 1시간 이상 코트되었다. 당해 플레이트의 각 웰을 TBST로 세정함으로써 플레이트에 결합되어 있지 않은 비오틴 표지 hIgA-Fc가 제거된 후, 당해 웰이 블로킹 버퍼(2% 스킴밀크/TBS) 250 μL로 1시간 이상 블로킹되었다. 블로킹 버퍼가 제거된 각 웰에 표 41의 조건으로 TBS로 2.5 ㎍/mL로 조제된 정제 IgG 각 100 μL가 첨가된 당해 플레이트를 실온에서 1시간 정치함으로써 각 IgG를 각 웰에 존재하는 비오틴 표지 hIgA-Fc에 결합시켰다. 표 41에 나타낸 최종 농도가 되도록 조제된 TBST로 세정된 각 웰에 같은 저분자가 들어 있는 TBS로 희석된 HRP 결합 항인간 IgG 항체(BIOSOURCE)가 첨가된 플레이트를 1시간 인큐베이트시켰다. 표 41에 나타낸 최종 농도가 되도록 조제된 TBST로 세정 후, TMB single 용액(ZYMED)이 첨가된 각 웰 중의 용액의 발색반응이 황산의 첨가에 의해 정지된 후, 450 nm의 흡광도에 의해 당해 발색이 측정되었다. 측정된 결과를 도 40에 나타내었다.
선발된 6종류의 항체는 조건 1의 흡광도와 비교하여 조건 2 또는 조건 3의 흡광도는 현저히 낮았다. 이 사실로부터 선발된 6종류의 항체는 IgG형에 있어서도 키누레닌 존재하에서 비오틴 표지 hIgA-Fc에 대해 특이적인 결합 활성을 갖는 것이 확인되었다. 또한 조건 4의 흡광도와 비교하여 조건 2의 흡광도에 현저한 차가 보이지 않는 것으로부터 선발된 6종류의 항체에 트립토판 존재하에서의 비오틴 표지 hIgA-Fc에 대한 결합 활성이 없는 것도 확인되었다. 이상의 사실로부터 키누레닌에 대한 패닝을 이용한 키누레닌 스위치 항체 취득용 라이브러리(키누레닌 라이브러리 Ver.A)로부터 키누레닌이 스위치로서 기능하는 hIgA-Fc 결합 항체가 복수 취득 가능한 것이 나타내어졌다.
〔실시예 13〕키누레닌에 대한 패닝을 이용한 키누레닌 스위치 항체 취득용 라이브러리(키누레닌 라이브러리 Ver.A)로부터의 키누레닌 존재하에 있어서 인간 IL-6(hIL-6)에 결합하는 항체의 취득
(13-1) 항체 라이브러리로부터의 키누레닌 존재하에서 hIL-6에 결합 활성을 나타내고, 키누레닌 비존재하에 있어서 결합을 나타내지 않는 항체의 취득
실시예 9에서 구축된 키누레닌 라이브러리 Ver.A로부터 키누레닌 존재하에서 인간 IL-6(hIL-6)에 대한 결합 활성을 나타내는 항체가 스크리닝되었다. 즉, 비드에 캡쳐된 hIL-6에 대해 키누레닌 존재하에서 결합 활성을 나타내고, 키누레닌 비존재하의 조건에서는 비드로부터 용출되는 항체를 제시하고 있는 파지가 회수되었다. 본 취득방법에서는 항원으로서 비오틴 표지된 hIL-6가 사용되었다.
구축된 파지 디스플레이 파지미드 벡터를 보유하는 대장균에 대해 M13KO7△pIII(하이퍼 파지라 불림)(PROGEN Biotechnik)를 감염시키고 30℃에서 하룻밤 배양한 상청으로부터 파지가 회수되었다. 파지 생산이 행해진 대장균의 배양액에 2.5 M NaCl/10% PEG를 첨가하여 침전시킨 파지의 집단을 TBS로 희석함으로써 항체 다가 제시 파지 라이브러리액이 조제되었다. 다음으로 당해 파지 라이브러리액에 최종 농도 4%가 되도록 BSA가 첨가되었다. 자기 비드에 고정화된 항원을 사용한 패닝이 실시되었다. 자기 비드로서 뉴트르아비딘 코팅된 비드(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated) 또는 스트렙트아비딘 코팅된 비드(Dynabeads MyOne Streptavidin T1)가 사용되었다.
패닝에서는 키누레닌 존재하에서만 항원에 대해 결합 가능한 파지의 농축이 행해졌다. 실시예 (11-1)에 나타내어진 방법과 동일한 방법으로 4회째까지의 패닝이 실시되었다.
(13-2) 음성 선별법을 이용한 항체 라이브러리로부터의 키누레닌 존재하에 있어서 hIL-6에 결합하는 항체의 취득
실시예 9에서 구축된 키누레닌 라이브러리 Ver.A로부터 항원에 대해 키누레닌이 존재하는 조건하에서 항원에 대한 결합 활성을 나타내는 항체의 스크리닝이 행해졌다. 스크리닝을 위해 먼저 항체 파지 디스플레이 라이브러리를 키누레닌 비존재하에서 비오틴 표지 항원-스트렙트아비딘과 접촉시켜 키누레닌 비존재하에서도 항원에 대해 결합 활성을 갖는 항체를 제시하고 있는 파지가 제거되었다. 이어서 키누레닌이 존재하는 조건하에서 동일하게 패닝을 행함으로써 키누레닌이 존재하는 조건하에서 항원에 대해 결합 활성을 갖는 항체의 스크리닝이 실시되었다.
구축된 파지 디스플레이 파지미드 벡터를 보유하는 대장균에 대해 M13KO7△pIII(하이퍼 파지라 불림)(PROGEN Biotechnik)를 감염시키고 30℃에서 하룻밤 배양한 상청으로부터 파지가 회수되었다. 파지 생산이 행해진 대장균의 배양액에 2.5 M NaCl/10% PEG를 첨가하여 침전시킨 파지의 집단을 TBS로 희석함으로써 항체 다가 제시 파지 라이브러리액이 조제되었다. 다음으로 당해 파지 라이브러리액에 최종 농도 4%가 되도록 BSA가 첨가되었다. 자기 비드에 고정화된 항원을 사용한 패닝이 실시되었다. 자기 비드로서 뉴트르아비딘 코팅된 비드(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated) 또는 스트렙트아비딘 코팅된 비드(Dynabeads MyOne Streptavidin T1)가 사용되었다.
1회째 패닝에서는 음성 선별법을 이용한 키누레닌 존재하에서만 항원에 대해 결합 가능한 파지의 농축이 행해졌다. 구체적으로는, BSA로 블로킹된 뉴트르아비딘 코팅된 비드(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)에 500 pmol의 비오틴화 항원을 첨가하여 실온에서 15분간 결합시켰다. TBS로 3회 세정된 비드에 대해 BSA로 블로킹이 행해진 파지 라이브러리액 0.5 mL를 첨가하여 실온에서 1시간 결합시켰다. 자기 스탠드를 사용하여 비드를 분리함으로써 항원 및 비드에 결합하지 않는 파지가 회수되었다. 회수된 파지에 대해 250 pmol의 비오틴 표지 항원 및 최종 농도 500 μM의 키누레닌을 첨가함으로써 파지 라이브러리를 실온에서 15분간 항원 및 키누레닌과 접촉시켰다. 그 후, 4℃에서 45분간 접촉시켰다. 다음으로 당해 표지 항원 및 키누레닌과 파지 라이브러리의 혼합액에 BSA로 블로킹된 자기 비드를 첨가하고 4℃에서 15분간, 항원과 파지의 복합체를 자기 비드와 결합시켰다. 비드는 0.5 mL의 빙랭된 키누레닌/TBST로 2회, 빙랭된 키누레닌/TBS로 1회 세정되었다. 그 후 1 ㎎/mL의 트립신 용액 0.5 mL가 당해 혼합액에 첨가되었다. 당해 혼합액은 실온에서 15분간 교반된 후, 자기 스탠드를 사용하여 분리된 비드로부터 파지가 회수되었다. 회수된 파지는 대수증식기(OD600이 0.4-0.7)가 된 10 mL의 대장균주 ER2738에 첨가되었다. 37℃에서 1시간 완만하게 상기 대장균의 교반 배양을 행함으로써 파지를 대장균에 감염시켰다. 감염시킨 대장균은 225 ㎜×225 ㎜의 플레이트에 파종되었다. 다음으로 파종된 대장균의 배양액에 대해 하이퍼 파지를 감염시키고 30℃에서 하룻밤 배양한 상청으로부터 파지를 회수함으로써 항체 다가 제시 파지 라이브러리액이 조제되었다.
2회째 이후의 패닝에서는 키누레닌 존재하에서만 항원에 대해 결합 가능한 파지의 농축이 행해졌다. 구체적으로는, 실시예 (11-1)에 나타내어진 2회째 이후의 패닝방법과 동일한 방법으로 4회째 패닝까지 실시되었다.
(13-3) 스위치가 되는 분자에 대한 패닝을 이용한 항체 라이브러리로부터의 키누레닌 존재하에 있어서 hIL-6에 결합하는 항체의 취득
실시예 9에서 구축된 키누레닌 라이브러리 Ver.A로부터 항원에 대해 키누레닌이 존재하는 조건하에서 항원에 대한 결합 활성을 나타내는 항체의 스크리닝이 행해졌다. 스크리닝을 위해 먼저 비오틴화 키누레닌(화합물 028, 029 및 036)에 대해 패닝을 행하고, 키누레닌에 대해 결합 활성을 갖는 항체를 제시하고 있는 파지가 회수되었다. 이어서 키누레닌 존재하에서 비오틴 표지 항원에 대한 패닝을 행함으로써 키누레닌이 존재하는 조건하에서 항원에 대해 결합 활성을 갖는 항체의 스크리닝이 실시되었다.
구축된 파지 디스플레이 파지미드 벡터를 보유하는 대장균에 대해 M13KO7△pIII(하이퍼 파지라 불림)(PROGEN Biotechnik)를 감염시키고 30℃에서 하룻밤 배양한 상청으로부터 파지가 회수되었다. 파지 생산이 행해진 대장균의 배양액에 2.5 M NaCl/10% PEG를 첨가하여 침전시킨 파지의 집단을 TBS로 희석함으로써 항체 다가 제시 파지 라이브러리액이 조제되었다. 다음으로 당해 파지 라이브러리액에 최종 농도 4%가 되도록 BSA가 첨가되었다. 자기 비드에 고정화된 항원을 사용한 패닝이 실시되었다. 자기 비드로서 뉴트르아비딘 코팅된 비드(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated) 또는 스트렙트아비딘 코팅된 비드(Dynabeads MyOne Streptavidin T1)가 사용되었다.
1회째 패닝에서는 비오틴화 키누레닌(화합물 028, 029 및 036의 혼합물)에 대해 결합 가능한 파지의 농축이 행해졌다. 구체적으로는, BSA로 블로킹된 비드(Dynabeads MyOne Streptavidin T1)에 화합물 028, 029 및 036을 등량씩 혼합한 비오틴화 키누레닌 혼합물 4,000 pmol을 첨가하여 실온에서 30분간 결합시켰다. TBS로 3회 세정된 비드에 대해 BSA로 블로킹이 행해진 파지 라이브러리액 0.8 mL를 첨가하여 실온에서 30분간 비오틴화 키누레닌과 접촉시켰다. 그 후, 30분간 4℃에서 접촉시켰다. 비드는 1 mL의 빙랭된 TBST로 3회, 빙랭된 TBS로 2회 세정되었다. 그 후, 1 ㎎/mL의 트립신 용액 0.5 mL가 당해 혼합액에 첨가되었다. 당해 혼합액은 실온에서 15분 현탁된 후, 즉시 자기 스탠드를 사용하여 분리된 비드로부터 파지용액이 회수되었다. 회수된 파지가 대수증식기(OD600이 0.4-0.7)가 된 100 mL의 대장균주 ER2738에 첨가되었다. 37℃에서 1시간 완만하게 상기 대장균의 교반 배양을 행함으로써 파지를 대장균에 감염시켰다. 감염시킨 대장균은 225 ㎜×225 ㎜의 플레이트 5매에 파종되었다. 다음으로 파종된 대장균의 배양액에 대해 하이퍼 파지를 감염시키고 30℃에서 하룻밤 배양한 상청으로부터 파지를 회수함으로써 항체 다가 제시 파지 라이브러리액이 조제되었다.
2회째 이후의 패닝에서는 키누레닌 존재하에서만 항원에 대해 결합 가능한 파지의 농축이 행해졌다. 구체적으로는, 실시예 (11-1)에 나타내어진 2회째 이후의 패닝방법과 동일한 방법으로 4회째 패닝까지 실시되었다.
(13-4) 파지 ELISA에 의한 키누레닌 존재하에 있어서의 결합 활성의 평가
(13-1), (13-2), (13-3)에서 얻어진 대장균의 싱글 콜로니로부터 통상의 방법(Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145)에 따라 파지의 배양이 행해졌다. 헬퍼 파지로서 하이퍼 파지를 사용함으로써 항체 다가 제시 파지 함유 배양상청이 회수되었다. 참고 실시예 (11-4)에 기재된 방법으로 정제된 정제 파지가 아래의 절차로 ELISA에 제공되었다. 스트렙트아비딘 코팅된 384 웰 마이크로플레이트(384 well Microplates Streptavidin-coated)(Greiner Bio-One)가 비오틴 표지 hIL-6를 포함하는 10 μL의 TBS로 1시간 이상 코트되었다. 당해 플레이트의 각 웰을 TBST로 세정함으로써 플레이트에 결합되어 있지 않은 비오틴 표지 hIL-6가 제거된 후, 당해 웰이 80 μL의 2% 스킴밀크-TBS로 1시간 이상 블로킹되었다. 2% 스킴밀크-TBS를 제거한 후, 각 웰에 조제된 정제 파지가 첨가된 당해 플레이트를 실온에서 1시간 정치함으로써 파지를 제시하는 항체를 각 웰에 존재하는 비오틴 표지 hIL-6에 키누레닌 비존재/존재하에 있어서 결합시켰다. TBST 또는 키누레닌/TBST로 세정된 각 웰에 TBS 또는 키누레닌/TBS에 의해 희석된 HRP 결합 항M13 항체(Amersham Pharmacia Biotech)가 첨가된 플레이트를 1시간 인큐베이트시켰다. TBST 또는 키누레닌/TBST로 세정 후, TMB single 용액(ZYMED)이 첨가된 각 웰 중의 용액의 발색반응이 황산의 첨가에 의해 정지된 후, 450 nm의 흡광도에 의해 당해 발색이 측정되었다. 그 결과, hIL-6에 대해 키누레닌 존재하에서 결합하는 항체가 복수 확인되었다. 파지 ELISA의 결과를 표 42에 나타내었다.
Figure 112021085263630-pat00083
(13-5) 키누레닌의 유무에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 스위치 항체의 서열 해석
실시예 (13-4)에서 나타내어지는 파지 ELISA의 결과, 키누레닌이 존재하는 조건하에서 항원에 대한 결합 활성이 있는 것으로 판단된 클론으로부터 특이적인 프라이머(서열번호：79 및 80)를 사용하여 증폭된 유전자의 염기서열이 해석되었다. 해석 결과, 실시예 (13-1), (13-2) 또는 (13-3)의 모든 조건으로부터 키누레닌 존재하에서 비오틴 표지 hIL-6에 대한 결합 활성을 갖는 것으로 판단된 클론이 복수 취득되었다. 취득된 클론 중 선발된 6클론에 대해서 아래의 표 43에 취득된 패닝 조건(표 중 유래로 표기) 및 아미노산 서열을 나타내었다.
Figure 112021085263630-pat00084
(13-6) hIL-6에 결합하는 항체의 발현과 정제
실시예 (13-5)에 기재된 6클론의 중쇄 및 경쇄의 가변영역 서열은 중쇄 항체 불변영역(서열번호：113) 또는 경쇄 kappa 불변영역 서열(서열번호：47)을 갖는 동물 발현용 플라스미드로 각각 삽입되었다. 후술하는 참고 실시예 1에 기재된 방법으로 항체의 발현 및 정제가 실시되었다.
(13-7) 취득된 항체의 hIL-6에 대한 결합 활성 평가
취득된 6종류의 항체가 표 44에 나타내어진 조건으로 ELISA에 제공되었다.
Figure 112021085263630-pat00085
먼저 StreptaWell 96 마이크로타이터 플레이트(Roche)가 비오틴 표지 hIL-6를 포함하는 100 μL의 TBS로 실온에서 1시간 이상 코트되었다. 당해 플레이트의 각 웰을 TBST로 세정함으로써 플레이트에 결합되어 있지 않은 비오틴 표지 hIL-6가 제거된 후, 당해 웰이 블로킹 버퍼(2% 스킴밀크/TBS) 250 μL로 1시간 이상 블로킹되었다. 블로킹 버퍼가 제거된 각 웰에 표 44의 조건으로 TBS로 2.5 ㎍/mL로 조제된 정제IgG 각 100 μL가 첨가된 당해 플레이트를 실온에서 1시간 정치함으로써 각 IgG를 각 웰에 존재하는 비오틴 표지 hIL-6에 결합시켰다. 표 44에 나타낸 최종 농도가 되도록 조제된 TBST로 세정된 각 웰에 같은 저분자가 들어 있는 TBS에 의해 희석된 HRP 결합 항인간 IgG 항체(BIOSOURCE)가 첨가된 플레이트를 1시간 인큐베이트시켰다. 표 44에 나타낸 최종 농도가 되도록 조제된 TBST로 세정 후, TMB single 용액(ZYMED)이 첨가된 각 웰 중의 용액의 발색반응이 황산의 첨가에 의해 정지된 후, 450 nm의 흡광도에 의해 당해 발색이 측정되었다. 측정된 결과를 도 41에 나타내었다.
선발된 6종류의 항체는 조건 1의 흡광도와 비교하여 조건 2 또는 조건 3의 흡광도는 현저히 낮았다. 이 사실로부터, 선발된 6종류의 항체는 IgG형에 있어서도 키누레닌 존재하에서 비오틴 표지 hIL-6에 대해 특이적인 결합 활성을 갖는 것이 확인되었다. 또한 조건 4의 흡광도와 비교하여 조건 2의 흡광도에 현저한 차가 보이지 않는 것으로부터 선발된 6종류의 항체에 트립토판 존재하에서의 비오틴 표지 hIL-6에 대한 결합 활성이 없는 것도 확인되었다. 이상의 사실로부터 키누레닌에 대한 패닝을 이용한 키누레닌 스위치 항체 취득용 라이브러리(키누레닌 라이브러리 Ver.A)로부터 키누레닌이 스위치로서 기능하는 hIL-6 결합 항체가 복수 취득 가능한 것이 나타내어졌다.
〔참고 실시예 1〕파지 디스플레이 기술을 사용한 인간 항체 라이브러리로부터의 아데노신 및/또는 ATP에 결합하는 항체의 취득
(1-1) 나이브 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리의 제작
인간 PBMC로부터 제작한 폴리 A RNA나 시판되고 있는 인간 폴리 A RNA 등을 주형으로 하여 당업자에게 공지의 방법에 따라, 서로 다른 인간 항체 서열의 Fab 도메인을 제시하는 복수의 파지로 이루어지는 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리가 구축되었다.
(1-2) 비드 패닝에 의한 라이브러리로부터의 아데노신 및/또는 ATP에 결합하는 항체의 취득
참고 실시예 (1-1)에서 구축된 나이브 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리로부터 항원에 대한 결합 활성을 나타내는 항체의 스크리닝이 행해졌다. 즉, 비드에 캡쳐된 항원에 대해 결합 활성을 나타내는 항체를 제시하고 있는 파지가 모아졌다. 항원으로서 ATP-PEG-비오틴, 2'-아데노신-PEG-비오틴 및 5'-아데노신-PEG-비오틴이 사용되었다. ATP-PEG-비오틴은 제나 바이오사이언스(Jena Bioscinece)사, 카탈로그 넘버 NU-926-BIO를 구입하여 사용하였다. 2'-아데노신-PEG-비오틴 및 5'-아데노신-PEG-비오틴은 실시예(2-2-11)에 있어서 구축된 것을 사용하였다.
구축된 파지 디스플레이용 파지미드를 보유한 대장균으로부터 생산된 파지는 일반적인 방법에 의해 정제되었다. 그 후 TBS로 투석 처리된 파지 라이브러리액이 얻어졌다. 다음으로 파지 라이브러리액에 최종 농도 4%가 되도록 BSA가 첨가되었다. 자기 비드에 고정화된 항원을 사용한 패닝이 실시되었다. 자기 비드로서 뉴트르아비딘 코팅된 비드(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated) 또는 스트렙트아비딘 코팅된 비드(Dynabeads M-280 Streptavidin)가 사용되었다.
그 후 조제된 파지 라이브러리액과 250 pmol의 비오틴화 ATP, 2'-아데노신-PEG-비오틴 및 5'-아데노신-PEG-비오틴을 첨가함으로써 당해 파지 라이브러리액과 아데노신 및 ATP를 실온에서 60분간 접촉시켰다. 다음으로 파지 라이브러리액에 BSA로 블로킹된 자기 비드가 첨가되어, 아데노신 및/또는 ATP와 파지의 복합체를 자기 비드와 실온에서 15분간 결합시켰다. 비드는 TBS로 1회 세정되었다. 그 후 1 ㎎/mL의 트립신 용액 0.5 mL가 첨가된 비드는 실온에서 15분 현탁된 후, 즉시 자기 스탠드를 사용하여 분리된 비드로부터 파지용액이 회수되었다. 회수된 파지용액이 대수증식기(OD600이 0.4-0.7)가 된 10 mL의 대장균주 ER2738에 첨가되었다. 37℃에서 1시간 완만하게 상기 대장균의 교반 배양을 행함으로써 파지를 대장균에 감염시켰다. 감염시킨 대장균은 225 ㎜×225 ㎜의 플레이트에 파종되었다. 다음으로 파종된 대장균의 배양액으로부터 파지를 회수함으로써 파지 라이브러리액이 조제되었다.
2회째의 패닝에 있어서도 아데노신 및/또는 ATP에 대해 결합 가능한 파지의 농축이 행해졌다. 얻어진 파지 라이브러리액에 각 50 pmol의 비오틴화 ATP, 2'-아데노신-PEG-비오틴 및 5'-아데노신-PEG-비오틴을 첨가함으로써 당해 파지 라이브러리액을 아데노신 및 ATP와 실온에서 60분간 접촉시켰다. 다음으로 파지 라이브러리액에 BSA로 블로킹된 자기 비드가 첨가되어, 아데노신 및/또는 ATP와 파지의 복합체를 자기 비드와 실온에서 15분간 결합시켰다. 비드는 TBST로 3회, TBS로 2회 세정되었다. 그 후 1 ㎎/mL의 트립신 용액 0.5 mL가 첨가된 비드는 실온에서 15분 현탁된 후, 즉시 자기 스탠드를 사용하여 분리된 비드로부터 파지용액이 회수되었다. 회수된 파지용액이 대수증식기(OD600이 0.4-0.7)가 된 10 mL의 대장균주 ER2738에 첨가되었다. 37℃에서 1시간 완만하게 상기 대장균의 교반 배양을 행함으로써 파지를 대장균에 감염시켰다. 감염시킨 대장균은 225 ㎜×225 ㎜의 플레이트에 파종되었다. 다음으로 파종된 대장균의 배양액으로부터 파지를 회수함으로써 파지 라이브러리액이 조제되었다.
동일한 절차로 아데노신 및/또는 ATP에 대해 결합 가능한 항체를 취득하는 패닝이 3회 반복되었다. 4회째의 패닝은 TBST, TBS 모두 5회 세정이 실시되었다.
(1-3) 파지 ELISA에 의한 아데노신 및 ATP 결합성의 평가
전술한 실시예에서 나타내어진 패닝법에 의해 얻어진 대장균의 싱글 콜로니로부터 통상의 방법(Method Mol. Biol. (2002) 178, 133-145)에 따라 파지 함유 배양상청이 회수되었다. NucleoFast 96(MACHERY-NAGEL)을 사용하여 회수된 배양상청이 한외여과되었다. 배양상청 각 100 μL가 NucleoFast 96의 각 웰에 어플라이되고, 4,500 g, 45분간 원심분리를 행하여 통과액이 제거되었다. H2O 100 μL를 첨가하고 재차 4,500 g, 30분간 원심분리에 의한 세정이 행해졌다. 그 후 TBS 100 μL를 첨가하고 실온에서 5분간 정치한 후 상청에 포함되는 파지액이 회수되었다.
TBS가 첨가된 정제 파지가 아래의 절차로 ELISA에 제공되었다. StreptaWell 96 마이크로타이터 플레이트(Roche)가 비오틴 표지 항원(2'-아데노신-PEG-비오틴, 5'-아데노신-PEG-비오틴 및 ATP-PEG-비오틴을 등량씩 혼합)을 포함하는 100 μL의 TBS로 실온에서 1시간 코트되었다. 당해 플레이트의 각 웰을 TBST(0.1% Tween20을 포함하는 TBS)로 세정함으로써 항원이 제거된 후, 당해 웰이 1시간 이상 250 μL의 2% 스킴밀크-TBS로 블로킹되었다. 2% 스킴밀크-TBS를 제거한 후, 각 웰에 조제된 정제 파지가 첨가된 당해 플레이트를 실온에서 1시간 정치함으로써 항체를 제시한 파지를 각 웰에 존재하는 항원에 결합시켰다. TBST로 세정된 각 웰에 TBS에 의해 희석된 HRP 결합 항M13 항체(Amersham Pharmacia Biotech)가 첨가된 플레이트를 1시간 인큐베이트시켰다. TBST로 세정 후, TMB single 용액(ZYMED)이 첨가된 각 웰 중의 용액의 발색반응이 황산의 첨가에 의해 정지된 후, 450 nm의 흡광도에 의해 당해 발색이 측정되었다.
파지 ELISA를 실시한 192 클론 중에서 2'-아데노신-PEG-비오틴, 5'-아데노신-PEG-비오틴, ATP-PEG-비오틴 중 어느 하나, 어느 둘 또는 3개 모두에 결합능을 갖는 106의 클론이 얻어졌다.
다음으로 이들 클론이 2'-아데노신-PEG-비오틴, 5'-아데노신-PEG-비오틴, ATP-PEG-비오틴 중 어느 항원에 대해 결합능을 가지고 있는지를 확인할 목적으로 같은 정제 파지가 TBS로 희석된 후에 아래의 절차로 ELISA에 제공되었다. StreptaWell 96 마이크로타이터 플레이트(Roche)가 비오틴 표지 항원(2'-아데노신-PEG-비오틴, 5'-아데노신-PEG-비오틴, ATP-PEG-비오틴) 중 어느 하나를 포함하는 100 μL의 TBS로 실온에서 1시간 코트되었다. 당해 플레이트의 각 웰을 TBST로 세정함으로써 항원이 제거된 후, 당해 웰이 1시간 이상 250 μL의 2% 스킴밀크-TBS로 블로킹되었다. 2% 스킴밀크-TBS를 제거한 후, 각 웰에 조제된 정제 파지가 첨가된 당해 플레이트를 실온에서 1시간 정치함으로써 항체를 제시한 파지를 각 웰에 존재하는 항원에 결합시켰다. TBST로 세정된 각 웰에 TBS에 의해 희석된 HRP 결합 항M13 항체(Amersham Pharmacia Biotech)가 첨가된 플레이트를 1시간 인큐베이트시켰다. TBST로 세정 후, TMB single 용액(ZYMED)이 첨가된 각 웰 중의 용액의 발색반응이 황산의 첨가에 의해 정지된 후, 450 nm의 흡광도에 의해 당해 발색이 측정되었다. 파지 ELISA의 결과가 아래의 표 45에 기재되어 있다.
Figure 112021085263630-pat00086
파지 ELISA를 실시한 클론 중 항원 2종류 이상에 결합이 확인된 것은 1 클론으로, 본 항체 단편을 주형으로 하여 유전자의 염기서열 해석이 행해졌다. 본 클론은 5'-아데노신-PEG-비오틴, ATP-PEG-비오틴의 2자에 결합능을 갖는 클론으로, ATNLSA1-4_D12로 명명되었다. ATNLSA1-4_D12 항체의 중쇄 가변영역의 서열은 서열번호：48에, 경쇄 가변영역의 서열은 서열번호：49에 기재되어 있다.
(1-4) 파지 경합 ELISA에 의한 아데노신 또는 ATP 결합성의 평가
파지 ELISA의 결과, 5'-아데노신-PEG-비오틴 및 ATP-비오틴의 양자에 결합능이 있는 것으로 판단된 클론, ATNLSA1-4_D12(중쇄 가변영역 서열：48, 경쇄 서열：49)는 5'-아데노신-PEG-비오틴, ATP-PEG-비오틴의 구조상, 비오틴 태그 또는 PEG영역을 인식하고 있을 가능성이 남아 있다. 이에 비오틴 태그나 PEG 인식 항체가 아닌 것을 나타내기 때문에, ATNLSA1-4_D12 및 음성 대조(Negative control)로서 준비된 hIL-6R 결합 클론 PF1(중쇄 서열：50, 경쇄 서열：51)을 사용하여 아데노신 또는 ATP로 항원과의 결합이 저해되는지 여부가 파지 ELISA로 확인되었다. ATNLSA1-4_D12 및 PF1은 각각 TBS로 희석되어 아래의 절차로 ELISA에 제공되었다.
StreptaWell 96 마이크로타이터 플레이트(Roche)가 비오틴 표지 항원(5'-아데노신-PEG-비오틴, ATP-PEG-비오틴의 혼합)을 포함하는 100 μL의 TBS로 실온에서 1시간 코트되었다. 당해 플레이트의 각 웰을 TBST로 세정함으로써 항원이 제거된 후, 당해 웰이 1시간 이상 250 μL의 2% 스킴밀크-TBS로 블로킹되었다. 2% 스킴밀크-TBS를 제거한 후, 각 웰에 조제된 정제 파지가 첨가된 당해 플레이트를 실온에서 1시간 정치함으로써 파지가 제시하는 항체를 각 웰에 존재하는 항원에 결합시켰다. 다음으로 항원 없음 및 항원과 등량 내지 10,000배량까지의 ATP의 희석 계열을 포함하는 TBS가 당해 웰에 첨가되었다. 실온에서 1시간 당해 플레이트를 정치함으로써 고정화되어 있는 항원과 ATP가 경합되었다. 그 후 TBST로 세정된 각 웰에 TBS에 의해 희석된 HRP 결합 항M13 항체(Amersham Pharmacia Biotech)가 첨가된 플레이트를 1시간 인큐베이트시켰다. TBST로 세정 후, TMB single 용액(ZYMED)이 첨가된 각 웰 중의 용액의 발색반응이 황산의 첨가에 의해 정지된 후, 450 nm의 흡광도에 의해 당해 발색이 측정되었다.
측정된 결과를 도 42에 나타내었다. ATNLSA1-4_D12는 ATP 농도가 높아짐에 따라 과잉량의 ATP 존재하에서 발색값이 작아져 있는 것이 확인되어, ATP 농도 의존적으로 ATNLSA1-4_D12와 항원의 결합이 저해되어 있는 것이 확인되었다. 또한 음성 대조로서 비교실험이 행해진 PF1은 ATP 농도에 관계없이 항원과의 결합은 확인되지 않았다. 이 사실로부터 ATNLSA1-4_D12는 ATP 결합능을 갖는 항체로, 비오틴 태그나 PEG를 인식하는 항체가 아닌 것이 확인되었다.
(1-5) ATP 및 아데노신에 결합하는 항체의 발현과 정제
ATNLSA1-4_D12의 가변영역을 코드하는 유전자는 인간 IgG1/Lambda의 동물 발현용 플라스미드로 삽입되었다. 아래의 방법을 사용하여 항체가 발현되었다. FreeStyle 293 Expression Medium 배지(Invitrogen)에 1.33×106 세포/mL의 세포밀도로 현탁되어 6 well plate의 각 웰로 3 mL씩 파종된 인간 태아 신장세포 유래 FreeStyle 293-F주(Invitrogen)에 대해 조제된 플라스미드가 리포펙션법에 의해 도입되었다. CO2 인큐베이터(37℃, 8% CO2, 90 rpm)에서 4일간 배양된 배양상청으로부터, rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)를 사용하여 당업자 공지의 방법으로 항체가 정제되었다. 분광광도계를 사용하여 정제된 항체용액의 280 nm에서의 흡광도가 측정되었다. 얻어진 측정값으로부터 PACE법에 의해 산출된 흡광계수를 사용하여 정제된 항체의 농도가 산출되었다(Protein Science (1995) 4, 2411-2423).
(1-6) 표면 플라즈몬 공명을 이용한 ATP, 아데노신 결합 항체의 ATP, 아데노신 결합의 평가
비아코어 T200(GE Healthcare)을 사용하여 ATP 및 아데노신 결합 활성이 있는 클론 ATNLSA1-4_D12의 가변영역이 IgG의 불변영역에 연결된 D12의 항원 항체 반응의 상호작용이 해석되었다. 아민 커플링법으로 적절한 양의 protein A(Life technologies)가 고정화된 센서칩 CM5 또는 CM4(GE Healthcare)에 목적의 항체를 캡쳐시켜 항원인 ATP(Wako), 아데노신(Wako), ADP(adenosine diphosphate)(Wako)를 상호작용시켰다. 러닝 버퍼에는 50 mM Tris-HCl(Takara, T903), 500 mM NaCl, 0.01%(w/v) Tween20이 사용되었다. 항원은 유속 30 μL/min로 30초간 상호작용시키고, 30초간 해리시켰다. 항원과의 상호작용은 15℃에서 측정되고, 항원의 희석에는 러닝 버퍼와 동일한 버퍼가 사용되었다.
측정에서 얻어진 센서그램으로부터 산출된 키네틱스 파라미터인 결합속도상수 ka(1/Ms) 및 해리속도상수 kd(1/s)를 토대로 해리상수 KD(M)가 산출되었다. 또는 평형상태 해석법(Steady state analysis)을 사용하여 해리상수 KD(M)가 산출되었다. 각 파라미터의 산출에는 비아코어 T200 평가 소프트웨어(GE Healthcare)가 사용되었다.
아데노신에 대한 KD를 산출하기 위해 각 농도의 아데노신 존재하에서의 결합 리스폰스가 20 μmol/L ADP 존재하 및 비존재하에 있어서 취득되고, 또한 별도로 20 μmol/L ADP 존재하에서의 결합 리스폰스가 취득되었다. 비특이적 결합 성분으로 추정되는 ADP 존재하에 있어서의 각 농도의 아데노신에 대한 결합 리스폰스로부터 ADP 단독 존재하에서의 리스폰스를 뺀 값을 ADP 비존재하에 있어서의 아데노신에 대한 결합 리스폰스의 값으로부터 뺌으로써, 아데노신에 대한 특이적 결합의 리스폰스(R)가 취득되었다. 아데노신 농도가 X축에, 식 2에 의해 산출되는 R이 Y축에 플롯된 곡선에 대해 최소제곱법을 Office Excel 2007(Microsoft)의 솔버기능을 사용해서 적용함으로써 아데노신에 대한 KD값이 결정되었다.
(식 2)
Figure 112021085263630-pat00087
식 2에 있어서, conc는 아데노신 농도(mol/L)를 의미하고, Rmax는 항체에 대해 아데노신이 가장 결합되었을 때에 기대되는 리스폰스의 값을 의미한다. 실측된 리스폰스의 값의 추출에는 Scrubber2(BioLogics. Inc)가 사용되었다.
이 측정에서 취득된 D12의 ATP에 대한 KD는 8.5 μmol/L, ADP에 대한 KD는 0.25 μmol/L, 아데노신에 대한 KD는 1,100 μmol/L였다. 이 사실로부터 D12는 ATP, ADP, 아데노신에 대해 결합 활성을 갖고, 또한 AMP(adenosine monophosphate) 및 cAMP(cyclinc adenosine monophosphate)에 대해서도 결합 활성을 갖는 것으로 생각되었다.
〔참고 실시예 2〕항ATP/아데노신 항체를 이용한 ATP/아데노신 스위치 항체 취득용 라이브러리의 설계
암조직 및 염증성 조직에 있어서는 아데노신뿐 아니라 ATP의 농도도 높은 것이 알려져 있다. 이 때문에 아데노신 또는 ATP 중 어느 하나만을 스위치로서 이용하는 항체뿐 아니라, 아데노신 및 ATP의 양자(본 실시예에 있어서 ATP/아데노신으로 기재됨)를 스위치로서 이용할 수 있는 항체(즉, 아데노신 또는 ATP 중 어느 쪽인가가 고농도로 존재하고 있으면 항원에 결합할 수 있는 항체)도 유용하다. 참고 실시예 1-4에 나타내어진 ATNLSA1-4_D12는 ATP/아데노신에 결합하는 항체로, 당해 항체는 도 43에 나타낸 바와 같이 ATP/아데노신이 항체와 표적 항원 사이에 끼어 표적 항원과 접하는 항체 가변영역을 포함하는 것으로 생각되었다. 이에 이와 같이 표적 항원과 접할 수 있어 ATP/아데노신으로의 결합을 유지할 수 있는 항체 가변영역 부분을 라이브러리화함으로써 임의의 항원에 대해 ATP/아데노신의 유무에 따라 임의의 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 ATP/아데노신 스위치 항체를 취득할 수 있는 합성 항체 라이브러리를 제작할 수 있을 것으로 생각되었다.
참고 실시예 1-4에 있어서 인간 항체 라이브러리로부터 취득된 ATP/아데노신 항체 ATNLSA1-4_D12와 ATP의 복합체의 결정구조가 해석되었다. 결정구조 해석 결과로부터 당해 항체가 인식하는 아데노신(및 ATP)의 인식 양식 및 아데노신(및 ATP)으로의 결합에 크게 관여하고 있지 않은 것으로 상정되는 항체 가변영역의 아미노산 잔기가 동정되었다. 아데노신(ATP)으로의 결합에 주로 관여하고 있는 아미노산 잔기는 중쇄에 있어서의 Ser52, Ser52a, Arg53, Gly96, Leu100a, Trp100c(Kabat 넘버링)로 동정되었다.
라이브러리의 설계에 있어서 아래의 조건 중 적어도 하나를 만족시키는 부위가 라이브러리화 가능 부위로서 선정되었다.
조건 1) ATP에 대한 결합에 크게 관여하고 있지 않은 부위 또는 결합에 관여하고 있더라도 ATP에 대한 결합을 저하시키지 않는 천연서열 이외의 아미노산이 존재하는 부위,
조건 2) 인간 항체의 레퍼토리로서 어느 정도 아미노산 출현 빈도의 다양성이 있는 부위,
조건 3) 표준 구조의 형성에 중요하지 않은 부위.
중쇄, 경쇄 모두 상기 조건을 만족시키는 부위로서, ATNLSA1-4_D12의 서열에 포함되는 부위 중 CDR1 및 CDR2의 부위에 관하여는 생식세포계열에서의 출현 빈도가 2% 이상인 아미노산으로, CDR3의 부위에 관하여는 생식세포계열에서의 출현 빈도가 1% 이상인 아미노산으로 망라적으로 치환되어, 이들 치환이 조합된 ATNLSA1-4_D12의 개변체가 복수 제작되었다.
중쇄 부위 중 개변된 부위(표 중 「Kabat」로 기재되는 Kabat 넘버링으로 표시되는 부위) 및 당해 부위에 있어서의 개변 전의 아미노산(표 중 「천연서열」로 기재되는 아미노산) 및 개변 후의 아미노산(표 중 「개변 아미노산」으로 기재되는 아미노산)은 표 46에 나타내었다.
Figure 112021085263630-pat00088
경쇄 부위 중 개변된 부위(표 중 「Kabat」로 기재되는 Kabat 넘버링으로 표시되는 부위) 및 당해 부위에 있어서의 개변 전의 아미노산(표 중 「천연서열」로 기재되는 아미노산) 및 개변 후의 아미노산(표 중 「개변 아미노산」으로 기재되는 아미노산)은 표 47에 나타내었다.
Figure 112021085263630-pat00089
참고 실시예 1-1에서 나타내어진 방법으로 발현 및 정제된 각 개변체의 ATP 및 아데노신으로의 결합이 참고 실시예 1-6에서 나타내어진 비아코어를 사용한 측정방법과 동일한 방법으로 측정되었다. 측정 결과, 각 개변체의 ATP에 대한 어피니티(Affinity)가 KD값으로서 산출되었다. 중쇄의 부위로서는 개변에 의해 ATP 결합능이 ATNLSA1-4_D12의 1/5의 결합능을 밑돌지 않는 것(즉, KD값이 42.5 μmol/L보다 작은 것) 및 경쇄의 부위로서는 ATNLSA1-4_D12의 결합능을 윗도는 것(즉, KD값이 8.5 μmol/L보다 작은 것)이 개변 가능 부위로 판정되어, 당해 부위에 있어서 치환된 아미노산은 라이브러리화가 가능한 아미노산(라이브러리에 있어서 출현시키는 플렉시블 잔기)으로 판정되었다.
각 개변체의 ATP 결합능의 평가 결과로부터 각 부위를 라이브러리화함으로써 ATP로의 결합능은 저하될 것이 예상되었다. 이에 ATP로의 결합에 관여하고 있는 것으로 추찰되는 부위의 주변 부위가 치환되고, 이들 치환이 조합된 각종 개변체를 망라적으로 평가함으로써, ATP로의 결합능을 증강시키는 효과가 기대되는 개변을 동정하는 것이 가능한지 여부가 검증되었다. 이와 같이 개변된 부위(표 중 「Kabat」로 기재되는 Kabat 넘버링으로 표시되는 부위) 및 당해 부위에 있어서의 개변 전의 아미노산(표 중 「천연서열」로 기재되는 아미노산) 및 개변 후의 아미노산(표 중 「개변 아미노산」으로 기재되는 아미노산)은 표 48에 나타내었다.
Figure 112021085263630-pat00090
참고 실시예 1-1에서 나타내어진 방법으로 발현 및 정제된 각 개변체의 ATP 및 아데노신으로의 결합이 참고 실시예 1-6에서 나타내어진 비아코어를 사용한 측정방법과 동일한 방법으로 측정되었다. 측정 결과, ATP 및 아데노신으로의 결합 증강이 기대되는 개변은 Kabat 넘버링으로 표시되는 56번 위치, 100번 위치 등의 부위(예를 들면 Tyr56His, Asn100bLeu 등의 아미노산의 개변)로, 당해 부위에 있어서 치환된 아미노산도 라이브러리화가 가능한 아미노산(라이브러리에 있어서 출현시키는 플렉시블 잔기)으로 판정되었다.
ATNLSA1-4_D12의 CDR의 부위에 있어서, 상기 개변체의 해석으로부터 선출된 라이브러리화 가능 아미노산(라이브러리에 있어서 출현하는 플렉시블 잔기) 및 당해 아미노산으로 개변 전의 아미노산(즉, ATNLSA1-4_D12의 천연서열에 포함되는 아미노산)을 포함하는 아미노산 레퍼토리와 당해 레퍼토리를 포함하는 부위를 설계함으로써, ATP/아데노신 스위치 항체 취득용 라이브러리가 구축되었다. 아미노산 레퍼토리에 포함되는 각 아미노산의 출현 빈도는 동일해지도록(예를 들면 아미노산 레퍼토리가 10종류인 경우는 각 아미노산은 각각 10% 출현하도록) 라이브러리가 구축되었다.
중쇄에 있어서의 아미노산 레퍼토리를 포함하는 부위(표 중 「Kabat」로 기재되는 Kabat 넘버링으로 표시되는 부위) 및 당해 부위에 있어서의 아미노산 레퍼토리는 표 49에 나타내었다. 경쇄에 있어서의 아미노산 레퍼토리를 포함하는 부위(표 중 「Kabat」로 기재되는 Kabat 넘버링으로 표시되는 부위) 및 당해 부위에 있어서의 아미노산 레퍼토리는 표 50에 나타내었다.
Figure 112021085263630-pat00091
Figure 112021085263630-pat00092
서열 해석 결과로부터 ATNLSA1-4_D12의 프레임워크는 VH3-21 생식세포계열 유래인 것으로 추찰되었다. 이에 항체의 안정성 향상을 목적으로 ATNLSA1-4_D12의 프레임워크 서열을 VH3-21 생식세포계열 서열로 되돌리기 위해 Gln01Glu, Gln05Val, Asp10Gly, Asn30Ser, Leu48Val, Asn58Tyr(숫자는 Kabat 넘버링을 나타냄)의 개변이 ATNLSA1-4_D12의 프레임워크 서열에 도입되었다. 참고 실시예 1-1에서 나타내어진 방법으로 발현 및 정제된 ATNLSA1-4_D12의 개변체의 Tm이 DSC에 의해 측정되었다. DSC에 의한 측정은 당업자 공지의 방법으로 실시되었다. 이들의 개변이 가해진 ATNLSA1-4_D12의 개변체의 Tm은 74.37℃에서 81.44℃로 대폭 향상되어, 그 구조의 안정화가 확인되었다. 항체 라이브러리로서 안정성이 높은 프레임워크를 사용하는 것도 바람직한 경우가 있는 것으로부터, 상기 개변이 가해진 프레임워크 서열이 라이브러리의 프레임워크 서열로서 사용되었다. 라이브러리에 사용된 프레임워크는 표 51에 나타내었다.
Figure 112021085263630-pat00093
이렇게 하여 설계된 라이브러리에 포함되는 개개의 서열을 포함하는 유전자가 합성되고(DNA2.0), 이들 개개의 유전자의 집합체(라이브러리)를 주형으로서 사용하여 VH 및 VL을 각각 증폭시키는 것이 가능한 프라이머에 의해 유전자 라이브러리가 증폭되었다. 또한 VL 증폭용 프라이머의 서열은 서열번호：81 및 82에 기재되고, VH 증폭용 프라이머의 서열은 서열번호：83 및 84에 각각 기재되어 있다. 증폭된 합리적으로 설계된 인간 항체 중쇄 가변영역의 유전자 라이브러리와 인간 항체 경쇄 가변영역의 유전자 라이브러리는 인간 IgG 유래 CH1서열 및 인간 IgG 유래 경쇄 불변영역 서열 양쪽을 갖는 적절한 파지미드 벡터로 도입되었다. 이 파지미드 벡터를 전기천공법에 의해 대장균에 도입함으로써 인간 항체가변영역-불변영역으로 이루어지는 Fab 도메인을 제시하고, 아데노신 또는 ATP를 스위치로서 항원에 결합할 수 있는 항체를 취득할 수 있는 합리적으로 설계된 라이브러리가 구축되었다. 이와 같이 다양한 아데노신 또는 ATP 결합 활성을 갖는 H쇄 및 L쇄로 구성된 합리적으로 설계된 라이브러리는 도 43에 나타낸 바와 같이 아데노신 또는 ATP가 항체와 항원 사이에 끼어, 임의의 항원에 대한 ATP/아데노신 스위치 항체를 효율적으로 취득할 수 있는 인간 항체가 포함되는 라이브러리로서 유용할 것으로 생각되었다. 또한 전술한 바와 같이 ATNLSA1-4_D12는 아데노신과 ATP뿐 아니라 ADP에도 결합하는 것으로부터 ATP, ADP 및 아데노신에 그 구조가 유사한 AMP 및 cAMP에도 결합 활성을 가질 것으로 예상되었다. 이 때문에 본 라이브러리는 ATP, ADP, AMP, cAMP 또는 아데노신 중 어느 하나 이상의 저분자의 유무에 따라 임의의 표적 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 스위치 항체를 취득하는 것에 유용할 것으로 생각되었다.
〔참고 실시예 3〕파지 디스플레이 기술을 사용한 항체 라이브러리로부터의 아데노신, ATP 존재하에 있어서 항원에 결합하는 항체의 취득
(3-1) 아데노신 및 ATP의 혼합물을 이용한 라이브러리로부터의 저분자 존재하에 있어서 항원에 결합하는 항체의 취득
구축된 합리적으로 설계된 항체 파지 디스플레이 라이브러리로부터 아데노신 및/또는 ATP 존재 조건하에서 항원에 대한 결합 활성을 나타내는 항체가 취득되었다. 취득을 위해 아데노신 및 ATP 존재하에서 비드에 캡쳐된 항원에 대해 결합능을 나타내는 항체를 제시하고 있는 파지가 회수되고, 그 후 아데노신 및 ATP의 비존재 조건하에서 비드로부터 용출된 용출액 중에 파지가 회수되었다.
구축된 파지 디스플레이용 파지미드를 보유하는 대장균으로부터 파지가 생산되었다. 파지 생산이 행해진 대장균의 배양액에 2.5 M NaCl/10% PEG를 첨가하여 침전시킨 파지의 집단을 TBS로 희석함으로써 파지 라이브러리액이 얻어졌다. 다음으로 당해 파지 라이브러리액에 최종 농도 4%가 되도록 BSA가 첨가되었다. 자기 비드에 고정화된 항원을 사용하여 패닝이 실시되었다. 자기 비드로서 뉴트르아비딘 코팅된 비드(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated) 또는 스트렙트아비딘 코팅된 비드(Dynabeads M-280 Streptavidin)가 사용되었다. 항원으로서 비오틴화된 인간 IL-6 수용체가 사용되었다.
조제된 파지 라이브러리액에 500 pmol의 비오틴 표지 항원, 각 최종 농도 1 mM의 ATP-Na 및 아데노신을 첨가함으로써 당해 파지 라이브러리액을 실온에서 60분간 항원, 아데노신 및 ATP와 접촉시킨다. 당해 파지 라이브러리액에 BSA로 블로킹된 자기 비드가 첨가되어, 항원과 파지의 복합체를 자기 비드와 실온에서 15분간 결합시켰다. 비드는 ATP 및 아데노신을 용해한 TBS로 1회 세정되었다. 그 후 1 ㎎/mL의 트립신 0.5 mL가 첨가된 비드는 실온에서 15분 현탁된 후, 즉시 자기 스탠드를 사용하여 분리된 비드로부터 파지용액이 회수되었다. 회수된 파지용액이 대수증식기(OD600이 0.4-0.7)가 된 10 mL의 대장균주 ER2738에 첨가되었다. 37℃에서 1시간 완만하게 상기 대장균의 교반 배양을 행함으로써 파지를 대장균에 감염시켰다. 감염시킨 대장균은 225 ㎜×225 ㎜의 플레이트에 파종되었다. 다음으로 파종된 대장균의 배양액으로부터 파지를 회수함으로써 파지 라이브러리액이 조제되었다.
1회째의 패닝에서는 아데노신 및 ATP 존재하에서 항원에 대해 결합 가능한 파지의 회수가 행해졌는데, 2회째 이후의 패닝에서는 아데노신 및 ATP 존재하에서만 항원에 대해 결합 가능한 파지의 농축이 행해졌다. 구체적으로는, 조제된 파지 라이브러리액에 40 pmol의 비오틴 표지 항원, 각 최종 농도 1 mM의 아데노신 및 ATP를 첨가함으로써 파지 라이브러리를 실온에서 60분간 항원, 아데노신 및 ATP와 접촉시켰다. BSA로 블로킹된 자기 비드가 첨가되어, 항원과 파지의 복합체를 자기 비드와 실온에서 15분간 결합시켰다. 비드는 1 mL의 아데노신 및 ATP를 용해한 TBST(이하, (아데노신＋ATP)/TBST라 불림)와 아데노신, 아데노신 및 ATP를 용해하는 TBS(이하, (아데노신＋ATP)/TBS라 불림)로 세정되었다. 그 후 0.5 mL의 TBS가 첨가된 비드가 실온에서 현탁된 후, 즉시 자기 스탠드를 사용하여 분리된 비드로부터 파지용액이 회수되었다. 이 작업이 재차 반복된 후 2회로 나눠 용출된 파지액이 혼합되었다. 회수된 파지용액에 100 ㎎/mL의 트립신 5 μL를 첨가함으로써 Fab를 제시하지 않는 파지의 pIII 단백질(헬퍼 파지 유래의 pIII 단백질)이 절단되고, Fab를 제시하지 않는 파지의 대장균에 대한 감염능이 상실되었다. 트립신 처리된 파지용액으로부터 회수되는 파지가 대수증식기(OD600이 0.4-0.7)가 된 10 mL의 대장균주 ER2738에 첨가되었다. 37℃에서 1시간 완만하게 상기 대장균의 교반 배양을 행함으로써 파지를 대장균에 감염시켰다. 감염시킨 대장균은 225 ㎜×225 ㎜의 플레이트에 파종되었다. 다음으로 파종된 대장균의 배양액으로부터 파지를 회수함으로써 파지 라이브러리액이 회수되었다. 아데노신 및 ATP 존재하에서 항원에 대한 결합 활성을 갖는 항체를 취득하는 패닝이 3회 반복되었다.
(3-2) 음성 선별법을 이용한 항체 라이브러리로부터의 아데노신, ATP 존재하에 있어서 항원에 결합하는 항체의 취득
합리적으로 설계된 항체 파지 디스플레이 라이브러리로부터, 항원에 대해 아데노신 및/또는 ATP가 존재하는 조건하에서 항원에 대한 결합 활성을 나타내는 항체의 스크리닝이 행해졌다. 스크리닝을 위해 먼저 항체 파지 디스플레이 라이브러리를 아데노신 및 ATP 비존재하에서 비오틴 표지 항원-스트렙트아비딘과 접촉시켜, 아데노신 및 ATP 비존재하에서도 항원에 대해 결합 활성을 갖는 항체를 제시하고 있는 파지가 제거되었다. 계속해서 아데노신 및 ATP가 존재하는 조건하에서 동일하게 패닝을 행함으로써 아데노신 및 ATP가 존재하는 조건하에서 항원에 대해 결합 활성을 갖는 항체의 스크리닝이 실시되었다.
구축한 파지 디스플레이용 파지미드를 보유한 대장균으로부터 파지가 생산되었다. 파지 생산이 행해진 대장균의 배양액에 2.5 M NaCl/10% PEG를 첨가하여 침전시킨 파지의 집단을 TBS로 희석함으로써 파지 라이브러리액이 얻어졌다. 다음으로 파지 라이브러리액에 최종 농도 4%가 되도록 BSA가 첨가되었다. 자기 비드로서 뉴트르아비딘 코팅된 비드(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated) 또는 스트렙트아비딘 코팅된 비드(Dynabeads M-280 Streptavidin)를 사용하고, 자기 비드에 고정화되는 항원을 사용하는 패닝이 실시되었다.
조제된 파지 라이브러리액에 250 pmol의 비오틴 표지 항원과 함께 각 최종 농도가 1 mM인 아데노신 및 ATP의 혼합액을 첨가함으로써 당해 파지 라이브러리액과 항원, 아데노신 및 ATP를 실온에서 60분간 접촉시켰다. 다음으로 파지 라이브러리액에 BSA로 블로킹된 자기 비드가 첨가되어, 항원과 파지의 복합체를 자기 비드와 실온에서 15분간 결합시켰다. 비드는 (아데노신＋ATP)/TBS로 1회 세정되었다. 그 후 1 ㎎/mL의 트립신 용액 0.5 mL가 첨가된 비드는 실온에서 15분 현탁된 후, 즉시 자기 스탠드를 사용하여 분리된 비드로부터 파지용액이 회수되었다. 회수된 파지용액이 대수증식기(OD600이 0.4-0.7)가 된 10 mL의 대장균주 ER2738에 첨가되었다. 37℃에서 1시간 완만하게 상기 대장균의 교반 배양을 행함으로써 파지를 대장균에 감염시켰다. 감염시킨 대장균은 225 ㎜×225 ㎜의 플레이트에 파종되었다. 다음으로 파종된 대장균의 배양액에 대해 헬퍼 파지 M13K07(다카라바이오) 또는 M13KO7△pIII(하이퍼 파지라 불림)(PROGEN Biotechnik)를 감염시키고 30℃에서 하룻밤 배양한 상청으로부터 파지를 회수함으로써, 각각 항체 1가 제시 파지 라이브러리액 및 항체 다가 제시 파지 라이브러리액이 조제되었다.
1회째의 패닝에서는 아데노신 및 ATP 존재하에서 결합 가능한 파지의 회수가 행해지는데, 2회째 이후의 패닝에서는 아데노신 및 ATP 존재하에서만 항원에 대해 결합 가능한 파지의 농축이 행해졌다. 구체적으로는, BSA로 블로킹된 Sera-Mag 뉴트르아비딘 비드에 250 pmol 비오틴화 항원을 첨가하고 실온에서 15분간 결합시켰다. TBS로 3회 세정된 비드에 대해 BSA로 블로킹이 행해진 파지 라이브러리액을 첨가하여 실온에서 1시간 결합시켰다. 자기 스탠드를 사용하여 비드를 분리함으로써 항원 및 비드에 결합하지 않는 파지가 회수되었다. 회수된 파지에 대해 40 pmol의 비오틴 표지 항원, 각 최종 농도 1 mM의 아데노신 및 ATP를 첨가함으로써 파지 라이브러리를 실온에서 60분간 항원, 아데노신 및 ATP와 접촉시켰다. 다음으로 당해 표지 항원, 아데노신 및 ATP와 파지 라이브러리의 혼합액에 BSA로 블로킹된 자기 비드를 첨가하여 실온에서 15분간 항원과 파지의 복합체를 자기 비드와 결합시켰다. 비드는 1 mL의 (아데노신＋ATP)/TBST와 (아데노신＋ATP)/TBS로 세정되었다. 그 후 1 ㎎/mL의 트립신 용액 0.5 mL가 당해 혼합액에 첨가되었다. 당해 혼합액은 실온에서 20분간 교반된 후, 자기 스탠드를 사용하여 분리된 비드로부터 파지가 회수되었다. 회수된 파지는 대수증식기(OD600이 0.4-0.7)가 된 10 mL의 대장균주 ER2738에 첨가되었다. 37℃에서 1시간 완만하게 상기 대장균의 교반 배양을 행함으로써 파지를 대장균에 감염시켰다. 감염시킨 대장균은 225 ㎜×225 ㎜의 플레이트에 파종되었다. 아데노신 및 ATP가 존재하는 조건하에서 항원에 대한 결합 활성을 갖는 항체를 취득하는 패닝이 3회 반복되었다.
(3-3) 파지 ELISA에 의한 아데노신 및/또는 ATP의 존재하 및 비존재하에 있어서의 결합 활성 평가
상기 방법에 의해 얻어진 대장균의 싱글 콜로니로부터 통상의 방법(Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145)에 따라 파지 함유 배양상청이 회수되었다. NucleoFast 96(MACHEREY-NAGEL)을 사용하여 회수된 배양상청이 한외여과되었다. 배양상청 각 100 μL가 각 웰에 어플라이된 NucleoFast 96을 원심분리(4,500 g, 45분간)함으로써 통과액이 제거되었다. 100 ㎕의 H2O가 각 웰에 첨가된 당해 NucleoFast 96이 재차 원심분리(4,500 g, 30분간)에 의해 세정되었다. 마지막으로 TBS 100 ㎕가 첨가되어, 실온에서 5분간 정치된 당해 NucleoFast 96의 각 웰의 상청에 포함되는 파지액이 회수되었다.
TBS 또는 (아데노신＋ATP)/TBS가 첨가된 정제 파지가 아래의 절차로 ELISA에 제공되었다. StreptaWell 96 마이크로타이터 플레이트(Roche)가 비오틴 표지 항원을 포함하는 100 μL의 TBS로 하룻밤 코트되었다. 당해 플레이트의 각 웰을 TBST로 세정함으로써 항원이 제거된 후, 당해 웰이 250 μL의 2% 스킴밀크-TBS로 1시간 이상 블로킹되었다. 2% 스킴밀크-TBS를 제거한 후, 각 웰에 조제된 정제 파지가 첨가된 당해 플레이트를 37℃에서 1시간 정치함으로써, 항체를 제시한 파지를 각 웰에 존재하는 항원에 아데노신 및/또는 ATP의 비존재하 및 존재하에 있어서 결합시켰다. TBST 또는 (아데노신＋ATP)/TBST로 세정된 각 웰에 TBS 또는 (아데노신＋ATP)/TBS에 의해 희석된 HRP 결합 항M13 항체(Amersham Pharmacia Biotech)가 첨가된 플레이트를 1시간 인큐베이트시켰다. TBST 또는 (아데노신＋ATP)/TBST로 세정 후, TMB single 용액(ZYMED)이 첨가된 각 웰 중의 용액의 발색반응이 황산의 첨가에 의해 정지된 후, 450 nm의 흡광도에 의해 당해 발색이 측정되었다. 그 결과, 인간 IL-6 수용체에 대해 ATP 또는 아데노신 존재하에서 결합하는 항체가 복수 확인되었다. 파지 ELISA의 결과를 표 52에 나타내었다.
Figure 112021085263630-pat00094
(3-4) 아데노신 및 ATP의 유무에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 스위치 항체의 서열 해석
참고 실시예 (3-3)에서 나타내어지는 파지 ELISA의 결과, 아데노신 또는 ATP가 존재하는 조건하에서 항원에 대한 결합 활성이 있는 것으로 판단된 클론으로부터 특이적인 프라이머(서열번호：79 및 80)를 사용하여 증폭된 유전자의 염기서열이 해석되었다. 해석 결과, ATP 또는 아데노신 존재하에서 비오틴 표지 hIL-6R에 대한 결합 활성을 갖는 것으로 판단된 클론 6RAD2C1-4_001, 6RAD2C1-4_005, 6RAD2C1-4_011, 6RAD2C1-4_026, 6RAD2C1-4_030, 6RAD2C1-4_042, 6RAD2C1-4_076, 6RDL3C1-4_085, 6RDL3C5-4_011이 취득되었다(표 53).
Figure 112021085263630-pat00095
〔참고 실시예 4〕파지 디스플레이 기술을 사용한 항체 라이브러리로부터의 아데노신, ATP 비존재하에 있어서 항원에 결합하는 항체의 취득
(4-1) 아데노신 및 ATP의 혼합물을 이용한 라이브러리로부터의 저분자 존재하에 있어서 항원으로의 결합이 저해되는 항체의 취득
전술한 참고 실시예 3에 있어서 스위치가 되는 저분자의 존재하에서 표적 항원에 결합하는 항체가 취득되었다. 본 참고 실시예에 있어서는 저분자 비존재하에 있어서 표적 항원에 결합하는 항체의 취득이 시도되었다.
참고 실시예 2에서 구축된 합리적으로 설계된 항체 파지 디스플레이 라이브러리로부터, 항원에 대해 아데노신 및/또는 ATP 비존재 조건하에서 항원에 대한 결합 활성을 나타내고 존재하에서 결합능이 감쇠하는 항체가 취득되었다. 취득을 위해 먼저 항체 파지 디스플레이 라이브러리를 비오틴화 아데노신 및 비오틴화 ATP와 접촉시켜, 아데노신 및/또는 ATP에 결합하는 항체 파지 디스플레이 라이브러리가 회수되었다. 다음으로 당해 항체 파지 디스플레이 라이브러리를 아데노신 및 ATP 비존재 조건하에서 비오틴화 항원-스트렙트아비딘과 접촉시켜, 아데노신 및 ATP 비존재하에서 항원에 결합하는 항체가 회수되었다. 이러한 패닝을 번갈아 행함으로써 아데노신 및/또는 ATP와, 항원의 양자에 대해 결합 활성을 갖는 항체가 스크리닝되었다. 이러한 성질을 갖는 항체는 아데노신 및 ATP 존재하에 있어서는 아데노신 및/또는 ATP의 항체로의 결합에 의해 항체의 항원으로의 결합이 저해되는 것이 기대되었다.
참고 실시예 2에서 구축된 파지 디스플레이용 파지미드를 보유하는 대장균으로부터 파지가 생산되었다. 파지 생산이 행해진 대장균의 배양액에 2.5 M NaCl/10% PEG를 첨가하여 침전시킨 파지의 집단을 TBS로 희석함으로써 파지 라이브러리액이 얻어졌다. 다음으로 파지 라이브러리액에 최종 농도 4%가 되도록 BSA가 첨가되었다. 자기 비드로서 뉴트르아비딘 코팅된 비드(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated) 또는 스트렙트아비딘 코팅된 비드(Dynabeads M-280 Streptavidin)를 사용하고, 자기 비드에 고정화된 항원을 사용하는 패닝이 실시되었다.
조제된 파지 라이브러리액에 500 pmol의 비오틴화 ATP, 2'-아데노신-PEG-비오틴 및 5'-아데노신-PEG-비오틴을 첨가함으로써 당해 파지 라이브러리액과 아데노신 및 ATP를 실온에서 60분간 접촉시켰다. 다음으로 파지 라이브러리액에 BSA로 블로킹된 자기 비드가 첨가되어, 아데노신 및/또는 ATP와 파지의 복합체를 자기 비드와 실온에서 15분간 결합시켰다. 비드는 TBS로 1회 세정되었다. 그 후 1 ㎎/mL의 트립신 용액 0.5 mL가 첨가되었다. 비드는 실온에서 15분 현탁된 후, 즉시 자기 스탠드를 사용하여 분리된 비드로부터 파지용액이 회수되었다. 회수된 파지용액이 대수증식기(OD600이 0.4-0.7)가 된 10 mL의 대장균주 ER2738에 첨가되었다. 37℃에서 1시간 완만하게 상기 대장균의 교반 배양을 행함으로써 파지를 대장균에 감염시켰다. 감염시킨 대장균은 225 mm×225 mm의 플레이트에 파종되었다. 다음으로 파종된 대장균의 배양액으로부터 파지를 회수함으로써 파지 라이브러리액이 조제되었다.
2회째의 패닝에서는 아데노신 및 ATP 비존재 조건하에서 비오틴화 항원에 대해 결합 가능한 파지의 농축이 행해졌다. 구체적으로는, 조제된 파지 라이브러리액에 250 pmol의 비오틴화 항원을 첨가함으로써 당해 파지 라이브러리액을 항원과 실온에서 60분간 접촉시켰다. 다음으로 파지 라이브러리액에 BSA로 블로킹된 자기 비드가 첨가되어, 항원과 파지의 복합체를 자기 비드와 실온에서 15분간 결합시켰다. 비드는 TBST로 2회, TBS로 1회 세정되었다. 그 후 1 ㎎/mL의 트립신 용액 0.5 mL가 첨가된 비드는 실온에서 15분 현탁된 후, 즉시 자기 스탠드를 사용하여 분리된 비드로부터 파지용액이 회수되었다. 회수된 파지용액이 대수증식기(OD600이 0.4-0.7)가 된 10 mL의 대장균주 ER2738에 첨가되었다. 37℃에서 1시간 완만하게 상기 대장균의 교반 배양을 행함으로써 파지를 대장균에 감염시켰다. 감염시킨 대장균은 225 mm×225 mm의 플레이트에 파종되었다. 다음으로 파종된 대장균의 배양액으로부터 파지를 회수함으로써 파지 라이브러리액이 조제되었다.
그 후, 홀수 회째의 패닝에 있어서는 1회째의 패닝과 동일한 조건에 의한 패닝이 반복 실시되었다. 다만 TBST 및 TBS에 의한 비드의 세정은 각각 3회, 2회로 늘려 실시되었다.
그 후, 짝수 회째의 패닝에 있어서는 2회째의 패닝과 동일한 조건에 의한 패닝이 반복 실시되었다. 다만 4회째 이후의 패닝에서는 비오틴화 항원을 40 pmol로 줄이고, TBST 및 TBS에 의한 비드의 세정은 각각 3회, 2회로 늘려 실시되었다.
(4-2) 파지 ELISA에 의한 저분자 존재하에 있어서의 결합 활성의 평가
상기 방법에 의해 얻어진 대장균의 싱글 콜로니로부터 통상의 방법(Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145)에 따라 파지 함유 배양상청이 회수되었다. 회수된 배양상청은 NucleoFast 96(MACHEREY-NAGEL)을 사용하여 한외여과되었다. 배양상청 각 100 μL가 각 웰에 어플라이된 NucleoFast 96을 원심분리(4,500 g, 45분간)함으로써 통과액이 제거되었다. 100 μL의 H2O가 각 웰에 첨가된 당해 NucleoFast 96이 재차 원심분리(4,500 g, 30분간 원심)에 의해 세정되었다. 마지막으로 TBS 100 μL가 첨가되어, 실온에서 5분간 정치된 당해 NucleoFast 96의 각 웰의 상청에 포함되는 파지액이 회수되었다.
TBS 또는 ATP 및 아데노신/TBS가 첨가된 정제 파지가 아래의 절차로 ELISA에 제공되었다. StreptaWell 96 마이크로타이터 플레이트(Roche)가 비오틴 표지 항원을 포함하는 100 μL의 TBS로 하룻밤 코트되었다. 당해 플레이트의 각 웰을 TBST로 세정함으로써 스트렙트아비딘에 결합되어 있지 않은 항원이 제거된 후, 당해 웰이 250 μL의 2% 스킴밀크-TBS로 1시간 이상 블로킹되었다. 2% 스킴밀크-TBS를 제거한 후, 각 웰에 조제된 정제 파지가 첨가된 당해 플레이트를 37℃에서 1시간 정치함으로써, 파지를 제시하는 항체를 각 웰에 존재하는 항원에 아데노신 및 ATP 10 mM 존재하 또는 비존재하에 있어서 결합시켰다. TBST 또는 10 mM ATP 및 아데노신/TBST로 세정된 각 웰에 TBS 또는 10 mM ATP 및 아데노신/TBS에 의해 해석된 HRP 결합 항M13 항체(Amersham Pharmacia Biotech)가 첨가된 플레이트를 1시간 인큐베이트시켰다. TBST 또는 10 mM ATP 및 아데노신/TBST로 세정 후, TMB single 용액(ZYMED)이 첨가된 각 웰 중의 용액의 발색반응이 황산의 첨가에 의해 정지된 후, 450 nm의 흡광도에 의해 당해 발색이 측정되었다.
단리된 96 클론을 사용하여 파지 ELISA를 행함으로써 합리적으로 설계된 항체 라이브러리로부터, ATP 및 아데노신 비존재하에서 항원인 인간 IL-6에 대해 결합 활성을 나타내는 클론 「I6RLSA1-6_011」, ATP 및 아데노신 비존재하에서 항원인 인간 혈청 알부민(Human Serum Albumin;HSA)에 대해 결합 활성을 나타내는 클론 「HSADSA1-6_020」, ATP 및 아데노신 비존재하에서 인간 IL-6 수용체에 대해 결합 활성을 나타내는 클론 「6RRLSA1-6_037」, 「6RRLSA1-6_045」가 얻어졌다(도 44, 45, 46).
(4-3) 아데노신 및 ATP를 스위치로 하는 항체의 서열 해석
(4-2)에서 나타내어진 파지 ELISA의 결과, 아데노신 또는 ATP의 비존재 조건하에서 항원에 대한 결합 활성이 있는 것으로 판단된 클론으로부터 특이적인 프라이머(서열번호：79 및 80)를 사용하여 증폭된 유전자의 염기서열이 해석되었다. 해석 결과에 대해서 아래의 표 54에 아미노산 서열을 나타내었다.
Figure 112021085263630-pat00096
〔참고 실시예 5〕비오틴화 인간 IgA-Fc의 조제
인간 IgA로서 천연에 존재하는 인간 IgA서열 중 Fc 부분을 사용하였다(인간 IgA-Fc). 인간 IgA-Fc의 C말단에 비오틴을 부가하기 위해 비오틴 리가아제에 의해 비오틴이 부가되는 특이적인 서열(AviTag 서열, 서열번호：147)을 코드하는 유전자 단편을 링커를 매개로 연결시켰다. 인간 IgA-Fc와 AviTag 서열이 연결된 단백질(서열번호：146)을 코드하는 유전자 단편을 동물세포 발현용 벡터에 삽입하고, 구축된 플라스미드 벡터를 293Fectin(Invitrogen)을 사용하여 FreeStyle293세포(Invitrogen)에 도입하였다. 이때 EBNA1(서열번호：148)을 발현하는 유전자 및 비오틴 리가아제(BirA, 서열번호：149)를 발현하는 유전자를 동시에 도입하고, 또한 인간 IgA-Fc를 비오틴 표지할 목적으로 비오틴을 첨가하였다. 전술한 절차에 따라 유전자가 도입된 세포를 37℃, 8% CO2로 6일간 배양하여 목적의 단백질을 배양상청 중에 분비시켰다.
목적의 비오틴화 인간 IgA-Fc를 포함하는 세포 배양액을 0.22 ㎛ 보틀 탑 필터로 여과하여 배양상청을 얻었다. 20 mM Tris-HCl, pH 7.4로 평형화된 HiTrap Q HP(GE 헬스케어)에 같은 용액으로 희석된 배양상청을 어플라이하고, NaCl의 농도 구배로 목적의 비오틴화 인간 IgA-Fc를 용출시켰다. 다음으로 50 mM Tris-HCl, pH 8.0으로 평형화된 SoftLink Avidin 칼럼(Promega)에 같은 용액으로 희석된 상기 HiTrap Q HP 용출액을 어플라이하고, 5 mM 비오틴, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0으로 목적의 비오틴화 인간 IgA-Fc를 용출시켰다. 그 후, Superdex200(GE 헬스케어)을 사용한 겔여과 크로마토그래피로 목적 외의 불순물인 회합체를 제거하고, 버퍼가 20 mM 히스티딘-HCl, 150 mM NaCl, pH 6.0으로 치환된 정제 비오틴화 인간 IgA-Fc를 얻었다.
본 발명의 저분자 화합물의 농도에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자 및 이를 포함하는 의약 조성물은 정상 조직이나 혈액 중에 있어서 전신적으로 작용하지 않고, 표적 조직에 있어서의 병변 부위인 암이나 염증 부위에 있어서 가역적으로 작용함으로써 부작용을 회피하면서 약효를 발휘하여 그 표적 조직에 기인하는 질환을 치료할 수 있다. 또한 비천연 화합물의 농도에 따라 항원으로의 결합이 제어되는 항체가 취득 가능하면 이러한 항체는 항체의 활성이나 약리 작용을 병변 부위에서 활성화하는 외래성 화합물이나 또는 비침습 투여 가능한 외래성 화합물의 투여에 의해 조절할 수 있기 때문에 매우 유용하다.
또한 본 발명의 서로 서열이 다른 복수의 저분자 화합물의 농도에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자를 포함하는 라이브러리를 사용하면, 조직 특이적인 질환의 치료에 유용한 다양한 항원 결합 분자를 단시간에 효율적으로 취득하는 것이 가능하다.
SEQUENCE LISTING <110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA <120> ANTIGEN BINDING-MOLECULES THAT ANTIGEN BINDING-CAPACITIES CHANGE DEPENDING ON CONCENTRATION OF COMPOUNDS AND LIBRARIES THEREOF <130> C1-A1313P <150> JP 2013-251537 <151> 2013-12-04 <160> 149 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 468 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Leu Ala Val Gly Cys Ala Leu Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ala Pro 1 5 10 15 Gly Ala Ala Leu Ala Pro Arg Arg Cys Pro Ala Gln Glu Val Ala Arg 20 25 30 Gly Val Leu Thr Ser Leu Pro Gly Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Pro 35 40 45 Gly Val Glu Pro Glu Asp Asn Ala Thr Val His Trp Val Leu Arg Lys 50 55 60 Pro Ala Ala Gly Ser His Pro Ser Arg Trp Ala Gly Met Gly Arg Arg 65 70 75 80 Leu Leu Leu Arg Ser Val Gln Leu His Asp Ser Gly Asn Tyr Ser Cys 85 90 95 Tyr Arg Ala Gly Arg Pro Ala Gly Thr Val His Leu Leu Val Asp Val 100 105 110 Pro Pro Glu Glu Pro Gln Leu Ser Cys Phe Arg Lys Ser Pro Leu Ser 115 120 125 Asn Val Val Cys Glu Trp Gly Pro Arg Ser Thr Pro Ser Leu Thr Thr 130 135 140 Lys Ala Val Leu Leu Val Arg Lys Phe Gln Asn Ser Pro Ala Glu Asp 145 150 155 160 Phe Gln Glu Pro Cys Gln Tyr Ser Gln Glu Ser Gln Lys Phe Ser Cys 165 170 175 Gln Leu Ala Val Pro Glu Gly Asp Ser Ser Phe Tyr Ile Val Ser Met 180 185 190 Cys Val Ala Ser Ser Val Gly Ser Lys Phe Ser Lys Thr Gln Thr Phe 195 200 205 Gln Gly Cys Gly Ile Leu Gln Pro Asp Pro Pro Ala Asn Ile Thr Val 210 215 220 Thr Ala Val Ala Arg Asn Pro Arg Trp Leu Ser Val Thr Trp Gln Asp 225 230 235 240 Pro His Ser Trp Asn Ser Ser Phe Tyr Arg Leu Arg Phe Glu Leu Arg 245 250 255 Tyr Arg Ala Glu Arg Ser Lys Thr Phe Thr Thr Trp Met Val Lys Asp 260 265 270 Leu Gln His His Cys Val Ile His Asp Ala Trp Ser Gly Leu Arg His 275 280 285 Val Val Gln Leu Arg Ala Gln Glu Glu Phe Gly Gln Gly Glu Trp Ser 290 295 300 Glu Trp Ser Pro Glu Ala Met Gly Thr Pro Trp Thr Glu Ser Arg Ser 305 310 315 320 Pro Pro Ala Glu Asn Glu Val Ser Thr Pro Met Gln Ala Leu Thr Thr 325 330 335 Asn Lys Asp Asp Asp Asn Ile Leu Phe Arg Asp Ser Ala Asn Ala Thr 340 345 350 Ser Leu Pro Val Gln Asp Ser Ser Ser Val Pro Leu Pro Thr Phe Leu 355 360 365 Val Ala Gly Gly Ser Leu Ala Phe Gly Thr Leu Leu Cys Ile Ala Ile 370 375 380 Val Leu Arg Phe Lys Lys Thr Trp Lys Leu Arg Ala Leu Lys Glu Gly 385 390 395 400 Lys Thr Ser Met His Pro Pro Tyr Ser Leu Gly Gln Leu Val Pro Glu 405 410 415 Arg Pro Arg Pro Thr Pro Val Leu Val Pro Leu Ile Ser Pro Pro Val 420 425 430 Ser Pro Ser Ser Leu Gly Ser Asp Asn Thr Ser Ser His Asn Arg Pro 435 440 445 Asp Ala Arg Asp Pro Arg Ser Pro Tyr Asp Ile Ser Asn Thr Asp Tyr 450 455 460 Phe Phe Pro Arg 465 <210> 2 <211> 1407 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atgctggccg tcggctgcgc gctgctggct gccctgctgg ccgcgccggg agcggcgctg 60 gccccaaggc gctgccctgc gcaggaggtg gcgagaggcg tgctgaccag tctgccagga 120 gacagcgtga ctctgacctg cccgggggta gagccggaag acaatgccac tgttcactgg 180 gtgctcagga agccggctgc aggctcccac cccagcagat gggctggcat gggaaggagg 240 ctgctgctga ggtcggtgca gctccacgac tctggaaact attcatgcta ccgggccggc 300 cgcccagctg ggactgtgca cttgctggtg gatgttcccc ccgaggagcc ccagctctcc 360 tgcttccgga agagccccct cagcaatgtt gtttgtgagt ggggtcctcg gagcacccca 420 tccctgacga caaaggctgt gctcttggtg aggaagtttc agaacagtcc ggccgaagac 480 ttccaggagc cgtgccagta ttcccaggag tcccagaagt tctcctgcca gttagcagtc 540 ccggagggag acagctcttt ctacatagtg tccatgtgcg tcgccagtag tgtcgggagc 600 aagttcagca aaactcaaac ctttcagggt tgtggaatct tgcagcctga tccgcctgcc 660 aacatcacag tcactgccgt ggccagaaac ccccgctggc tcagtgtcac ctggcaagac 720 ccccactcct ggaactcatc tttctacaga ctacggtttg agctcagata tcgggctgaa 780 cggtcaaaga cattcacaac atggatggtc aaggacctcc agcatcactg tgtcatccac 840 gacgcctgga gcggcctgag gcacgtggtg cagcttcgtg cccaggagga gttcgggcaa 900 ggcgagtgga gcgagtggag cccggaggcc atgggcacgc cttggacaga atccaggagt 960 cctccagctg agaacgaggt gtccaccccc atgcaggcac ttactactaa taaagacgat 1020 gataatattc tcttcagaga ttctgcaaat gcgacaagcc tcccagtgca agattcttct 1080 tcagtaccac tgcccacatt cctggttgct ggagggagcc tggccttcgg aacgctcctc 1140 tgcattgcca ttgttctgag gttcaagaag acgtggaagc tgcgggctct gaaggaaggc 1200 aagacaagca tgcatccgcc gtactctttg gggcagctgg tcccggagag gcctcgaccc 1260 accccagtgc ttgttcctct catctcccca ccggtgtccc ccagcagcct ggggtctgac 1320 aatacctcga gccacaaccg accagatgcc agggacccac ggagccctta tgacatcagc 1380 aatacagact acttcttccc cagatag 1407 <210> 3 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 3 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser <210> 4 <211> 21 <212> PRT <213> Clostridium sp. <400> 4 Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser 1 5 10 15 Ala Ser His Leu Glu 20 <210> 5 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 5 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 6 <211> 326 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 6 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 115 120 125 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 130 135 140 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 145 150 155 160 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn 165 170 175 Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp 180 185 190 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 195 200 205 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu 210 215 220 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 225 230 235 240 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 245 250 255 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 260 265 270 Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 275 280 285 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 290 295 300 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 305 310 315 320 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 7 <211> 377 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro 100 105 110 Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg 115 120 125 Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys 130 135 140 Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro 145 150 155 160 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 165 170 175 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 180 185 190 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr 195 200 205 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 210 215 220 Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 225 230 235 240 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 245 250 255 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln 260 265 270 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 275 280 285 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 290 295 300 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn 305 310 315 320 Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 325 330 335 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile 340 345 350 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln 355 360 365 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 370 375 <210> 8 <211> 327 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 8 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 9 <211> 1125 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(1125) <400> 9 atg tgg ttc ttg aca act ctg ctc ctt tgg gtt cca gtt gat ggg caa 48 Met Trp Phe Leu Thr Thr Leu Leu Leu Trp Val Pro Val Asp Gly Gln 1 5 10 15 gtg gac acc aca aag gca gtg atc act ttg cag cct cca tgg gtc agc 96 Val Asp Thr Thr Lys Ala Val Ile Thr Leu Gln Pro Pro Trp Val Ser 20 25 30 gtg ttc caa gag gaa acc gta acc ttg cac tgt gag gtg ctc cat ctg 144 Val Phe Gln Glu Glu Thr Val Thr Leu His Cys Glu Val Leu His Leu 35 40 45 cct ggg agc agc tct aca cag tgg ttt ctc aat ggc aca gcc act cag 192 Pro Gly Ser Ser Ser Thr Gln Trp Phe Leu Asn Gly Thr Ala Thr Gln 50 55 60 acc tcg acc ccc agc tac aga atc acc tct gcc agt gtc aat gac agt 240 Thr Ser Thr Pro Ser Tyr Arg Ile Thr Ser Ala Ser Val Asn Asp Ser 65 70 75 80 ggt gaa tac agg tgc cag aga ggt ctc tca ggg cga agt gac ccc ata 288 Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Arg Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Pro Ile 85 90 95 cag ctg gaa atc cac aga ggc tgg cta cta ctg cag gtc tcc agc aga 336 Gln Leu Glu Ile His Arg Gly Trp Leu Leu Leu Gln Val Ser Ser Arg 100 105 110 gtc ttc acg gaa gga gaa cct ctg gcc ttg agg tgt cat gcg tgg aag 384 Val Phe Thr Glu Gly Glu Pro Leu Ala Leu Arg Cys His Ala Trp Lys 115 120 125 gat aag ctg gtg tac aat gtg ctt tac tat cga aat ggc aaa gcc ttt 432 Asp Lys Leu Val Tyr Asn Val Leu Tyr Tyr Arg Asn Gly Lys Ala Phe 130 135 140 aag ttt ttc cac tgg aat tct aac ctc acc att ctg aaa acc aac ata 480 Lys Phe Phe His Trp Asn Ser Asn Leu Thr Ile Leu Lys Thr Asn Ile 145 150 155 160 agt cac aat ggc acc tac cat tgc tca ggc atg gga aag cat cgc tac 528 Ser His Asn Gly Thr Tyr His Cys Ser Gly Met Gly Lys His Arg Tyr 165 170 175 aca tca gca gga ata tct gtc act gtg aaa gag cta ttt cca gct cca 576 Thr Ser Ala Gly Ile Ser Val Thr Val Lys Glu Leu Phe Pro Ala Pro 180 185 190 gtg ctg aat gca tct gtg aca tcc cca ctc ctg gag ggg aat ctg gtc 624 Val Leu Asn Ala Ser Val Thr Ser Pro Leu Leu Glu Gly Asn Leu Val 195 200 205 acc ctg agc tgt gaa aca aag ttg ctc ttg cag agg cct ggt ttg cag 672 Thr Leu Ser Cys Glu Thr Lys Leu Leu Leu Gln Arg Pro Gly Leu Gln 210 215 220 ctt tac ttc tcc ttc tac atg ggc agc aag acc ctg cga ggc agg aac 720 Leu Tyr Phe Ser Phe Tyr Met Gly Ser Lys Thr Leu Arg Gly Arg Asn 225 230 235 240 aca tcc tct gaa tac caa ata cta act gct aga aga gaa gac tct ggg 768 Thr Ser Ser Glu Tyr Gln Ile Leu Thr Ala Arg Arg Glu Asp Ser Gly 245 250 255 tta tac tgg tgc gag gct gcc aca gag gat gga aat gtc ctt aag cgc 816 Leu Tyr Trp Cys Glu Ala Ala Thr Glu Asp Gly Asn Val Leu Lys Arg 260 265 270 agc cct gag ttg gag ctt caa gtg ctt ggc ctc cag tta cca act cct 864 Ser Pro Glu Leu Glu Leu Gln Val Leu Gly Leu Gln Leu Pro Thr Pro 275 280 285 gtc tgg ttt cat gtc ctt ttc tat ctg gca gtg gga ata atg ttt tta 912 Val Trp Phe His Val Leu Phe Tyr Leu Ala Val Gly Ile Met Phe Leu 290 295 300 gtg aac act gtt ctc tgg gtg aca ata cgt aaa gaa ctg aaa aga aag 960 Val Asn Thr Val Leu Trp Val Thr Ile Arg Lys Glu Leu Lys Arg Lys 305 310 315 320 aaa aag tgg gat tta gaa atc tct ttg gat tct ggt cat gag aag aag 1008 Lys Lys Trp Asp Leu Glu Ile Ser Leu Asp Ser Gly His Glu Lys Lys 325 330 335 gta att tcc agc ctt caa gaa gac aga cat tta gaa gaa gag ctg aaa 1056 Val Ile Ser Ser Leu Gln Glu Asp Arg His Leu Glu Glu Glu Leu Lys 340 345 350 tgt cag gaa caa aaa gaa gaa cag ctg cag gaa ggg gtg cac cgg aag 1104 Cys Gln Glu Gln Lys Glu Glu Gln Leu Gln Glu Gly Val His Arg Lys 355 360 365 gag ccc cag ggg gcc acg tag 1125 Glu Pro Gln Gly Ala Thr 370 <210> 10 <211> 374 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Trp Phe Leu Thr Thr Leu Leu Leu Trp Val Pro Val Asp Gly Gln 1 5 10 15 Val Asp Thr Thr Lys Ala Val Ile Thr Leu Gln Pro Pro Trp Val Ser 20 25 30 Val Phe Gln Glu Glu Thr Val Thr Leu His Cys Glu Val Leu His Leu 35 40 45 Pro Gly Ser Ser Ser Thr Gln Trp Phe Leu Asn Gly Thr Ala Thr Gln 50 55 60 Thr Ser Thr Pro Ser Tyr Arg Ile Thr Ser Ala Ser Val Asn Asp Ser 65 70 75 80 Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Arg Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Pro Ile 85 90 95 Gln Leu Glu Ile His Arg Gly Trp Leu Leu Leu Gln Val Ser Ser Arg 100 105 110 Val Phe Thr Glu Gly Glu Pro Leu Ala Leu Arg Cys His Ala Trp Lys 115 120 125 Asp Lys Leu Val Tyr Asn Val Leu Tyr Tyr Arg Asn Gly Lys Ala Phe 130 135 140 Lys Phe Phe His Trp Asn Ser Asn Leu Thr Ile Leu Lys Thr Asn Ile 145 150 155 160 Ser His Asn Gly Thr Tyr His Cys Ser Gly Met Gly Lys His Arg Tyr 165 170 175 Thr Ser Ala Gly Ile Ser Val Thr Val Lys Glu Leu Phe Pro Ala Pro 180 185 190 Val Leu Asn Ala Ser Val Thr Ser Pro Leu Leu Glu Gly Asn Leu Val 195 200 205 Thr Leu Ser Cys Glu Thr Lys Leu Leu Leu Gln Arg Pro Gly Leu Gln 210 215 220 Leu Tyr Phe Ser Phe Tyr Met Gly Ser Lys Thr Leu Arg Gly Arg Asn 225 230 235 240 Thr Ser Ser Glu Tyr Gln Ile Leu Thr Ala Arg Arg Glu Asp Ser Gly 245 250 255 Leu Tyr Trp Cys Glu Ala Ala Thr Glu Asp Gly Asn Val Leu Lys Arg 260 265 270 Ser Pro Glu Leu Glu Leu Gln Val Leu Gly Leu Gln Leu Pro Thr Pro 275 280 285 Val Trp Phe His Val Leu Phe Tyr Leu Ala Val Gly Ile Met Phe Leu 290 295 300 Val Asn Thr Val Leu Trp Val Thr Ile Arg Lys Glu Leu Lys Arg Lys 305 310 315 320 Lys Lys Trp Asp Leu Glu Ile Ser Leu Asp Ser Gly His Glu Lys Lys 325 330 335 Val Ile Ser Ser Leu Gln Glu Asp Arg His Leu Glu Glu Glu Leu Lys 340 345 350 Cys Gln Glu Gln Lys Glu Glu Gln Leu Gln Glu Gly Val His Arg Lys 355 360 365 Glu Pro Gln Gly Ala Thr 370 <210> 11 <211> 951 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(951) <400> 11 atg act atg gag acc caa atg tct cag aat gta tgt ccc aga aac ctg 48 Met Thr Met Glu Thr Gln Met Ser Gln Asn Val Cys Pro Arg Asn Leu 1 5 10 15 tgg ctg ctt caa cca ttg aca gtt ttg ctg ctg ctg gct tct gca gac 96 Trp Leu Leu Gln Pro Leu Thr Val Leu Leu Leu Leu Ala Ser Ala Asp 20 25 30 agt caa gct gct ccc cca aag gct gtg ctg aaa ctt gag ccc ccg tgg 144 Ser Gln Ala Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Pro Trp 35 40 45 atc aac gtg ctc cag gag gac tct gtg act ctg aca tgc cag ggg gct 192 Ile Asn Val Leu Gln Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Gln Gly Ala 50 55 60 cgc agc cct gag agc gac tcc att cag tgg ttc cac aat ggg aat ctc 240 Arg Ser Pro Glu Ser Asp Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn Leu 65 70 75 80 att ccc acc cac acg cag ccc agc tac agg ttc aag gcc aac aac aat 288 Ile Pro Thr His Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn 85 90 95 gac agc ggg gag tac acg tgc cag act ggc cag acc agc ctc agc gac 336 Asp Ser Gly Glu Tyr Thr Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser Asp 100 105 110 cct gtg cat ctg act gtg ctt tcc gaa tgg ctg gtg ctc cag acc cct 384 Pro Val His Leu Thr Val Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln Thr Pro 115 120 125 cac ctg gag ttc cag gag gga gaa acc atc atg ctg agg tgc cac agc 432 His Leu Glu Phe Gln Glu Gly Glu Thr Ile Met Leu Arg Cys His Ser 130 135 140 tgg aag gac aag cct ctg gtc aag gtc aca ttc ttc cag aat gga aaa 480 Trp Lys Asp Lys Pro Leu Val Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn Gly Lys 145 150 155 160 tcc cag aaa ttc tcc cat ttg gat ccc acc ttc tcc atc cca caa gca 528 Ser Gln Lys Phe Ser His Leu Asp Pro Thr Phe Ser Ile Pro Gln Ala 165 170 175 aac cac agt cac agt ggt gat tac cac tgc aca gga aac ata ggc tac 576 Asn His Ser His Ser Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr 180 185 190 acg ctg ttc tca tcc aag cct gtg acc atc act gtc caa gtg ccc agc 624 Thr Leu Phe Ser Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Val Pro Ser 195 200 205 atg ggc agc tct tca cca atg ggg gtc att gtg gct gtg gtc att gcg 672 Met Gly Ser Ser Ser Pro Met Gly Val Ile Val Ala Val Val Ile Ala 210 215 220 act gct gta gca gcc att gtt gct gct gta gtg gcc ttg atc tac tgc 720 Thr Ala Val Ala Ala Ile Val Ala Ala Val Val Ala Leu Ile Tyr Cys 225 230 235 240 agg aaa aag cgg att tca gcc aat tcc act gat cct gtg aag gct gcc 768 Arg Lys Lys Arg Ile Ser Ala Asn Ser Thr Asp Pro Val Lys Ala Ala 245 250 255 caa ttt gag cca cct gga cgt caa atg att gcc atc aga aag aga caa 816 Gln Phe Glu Pro Pro Gly Arg Gln Met Ile Ala Ile Arg Lys Arg Gln 260 265 270 ctt gaa gaa acc aac aat gac tat gaa aca gct gac ggc ggc tac atg 864 Leu Glu Glu Thr Asn Asn Asp Tyr Glu Thr Ala Asp Gly Gly Tyr Met 275 280 285 act ctg aac ccc agg gca cct act gac gat gat aaa aac atc tac ctg 912 Thr Leu Asn Pro Arg Ala Pro Thr Asp Asp Asp Lys Asn Ile Tyr Leu 290 295 300 act ctt cct ccc aac gac cat gtc aac agt aat aac taa 951 Thr Leu Pro Pro Asn Asp His Val Asn Ser Asn Asn 305 310 315 <210> 12 <211> 316 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Met Thr Met Glu Thr Gln Met Ser Gln Asn Val Cys Pro Arg Asn Leu 1 5 10 15 Trp Leu Leu Gln Pro Leu Thr Val Leu Leu Leu Leu Ala Ser Ala Asp 20 25 30 Ser Gln Ala Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Pro Trp 35 40 45 Ile Asn Val Leu Gln Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Gln Gly Ala 50 55 60 Arg Ser Pro Glu Ser Asp Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn Leu 65 70 75 80 Ile Pro Thr His Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn 85 90 95 Asp Ser Gly Glu Tyr Thr Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser Asp 100 105 110 Pro Val His Leu Thr Val Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln Thr Pro 115 120 125 His Leu Glu Phe Gln Glu Gly Glu Thr Ile Met Leu Arg Cys His Ser 130 135 140 Trp Lys Asp Lys Pro Leu Val Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn Gly Lys 145 150 155 160 Ser Gln Lys Phe Ser His Leu Asp Pro Thr Phe Ser Ile Pro Gln Ala 165 170 175 Asn His Ser His Ser Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr 180 185 190 Thr Leu Phe Ser Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Val Pro Ser 195 200 205 Met Gly Ser Ser Ser Pro Met Gly Val Ile Val Ala Val Val Ile Ala 210 215 220 Thr Ala Val Ala Ala Ile Val Ala Ala Val Val Ala Leu Ile Tyr Cys 225 230 235 240 Arg Lys Lys Arg Ile Ser Ala Asn Ser Thr Asp Pro Val Lys Ala Ala 245 250 255 Gln Phe Glu Pro Pro Gly Arg Gln Met Ile Ala Ile Arg Lys Arg Gln 260 265 270 Leu Glu Glu Thr Asn Asn Asp Tyr Glu Thr Ala Asp Gly Gly Tyr Met 275 280 285 Thr Leu Asn Pro Arg Ala Pro Thr Asp Asp Asp Lys Asn Ile Tyr Leu 290 295 300 Thr Leu Pro Pro Asn Asp His Val Asn Ser Asn Asn 305 310 315 <210> 13 <211> 876 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(876) <400> 13 atg gga atc ctg tca ttc tta cct gtc ctt gcc act gag agt gac tgg 48 Met Gly Ile Leu Ser Phe Leu Pro Val Leu Ala Thr Glu Ser Asp Trp 1 5 10 15 gct gac tgc aag tcc ccc cag cct tgg ggt cat atg ctt ctg tgg aca 96 Ala Asp Cys Lys Ser Pro Gln Pro Trp Gly His Met Leu Leu Trp Thr 20 25 30 gct gtg cta ttc ctg gct cct gtt gct ggg aca cct gca gct ccc cca 144 Ala Val Leu Phe Leu Ala Pro Val Ala Gly Thr Pro Ala Ala Pro Pro 35 40 45 aag gct gtg ctg aaa ctc gag ccc cag tgg atc aac gtg ctc cag gag 192 Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Gln Trp Ile Asn Val Leu Gln Glu 50 55 60 gac tct gtg act ctg aca tgc cgg ggg act cac agc cct gag agc gac 240 Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Arg Gly Thr His Ser Pro Glu Ser Asp 65 70 75 80 tcc att cag tgg ttc cac aat ggg aat ctc att ccc acc cac acg cag 288 Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn Leu Ile Pro Thr His Thr Gln 85 90 95 ccc agc tac agg ttc aag gcc aac aac aat gac agc ggg gag tac acg 336 Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Thr 100 105 110 tgc cag act ggc cag acc agc ctc agc gac cct gtg cat ctg act gtg 384 Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser Asp Pro Val His Leu Thr Val 115 120 125 ctt tct gag tgg ctg gtg ctc cag acc cct cac ctg gag ttc cag gag 432 Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln Thr Pro His Leu Glu Phe Gln Glu 130 135 140 gga gaa acc atc gtg ctg agg tgc cac agc tgg aag gac aag cct ctg 480 Gly Glu Thr Ile Val Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asp Lys Pro Leu 145 150 155 160 gtc aag gtc aca ttc ttc cag aat gga aaa tcc aag aaa ttt tcc cgt 528 Val Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn Gly Lys Ser Lys Lys Phe Ser Arg 165 170 175 tcg gat ccc aac ttc tcc atc cca caa gca aac cac agt cac agt ggt 576 Ser Asp Pro Asn Phe Ser Ile Pro Gln Ala Asn His Ser His Ser Gly 180 185 190 gat tac cac tgc aca gga aac ata ggc tac acg ctg tac tca tcc aag 624 Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr Thr Leu Tyr Ser Ser Lys 195 200 205 cct gtg acc atc act gtc caa gct ccc agc tct tca ccg atg ggg atc 672 Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Ala Pro Ser Ser Ser Pro Met Gly Ile 210 215 220 att gtg gct gtg gtc act ggg att gct gta gcg gcc att gtt gct gct 720 Ile Val Ala Val Val Thr Gly Ile Ala Val Ala Ala Ile Val Ala Ala 225 230 235 240 gta gtg gcc ttg atc tac tgc agg aaa aag cgg att tca gcc aat ccc 768 Val Val Ala Leu Ile Tyr Cys Arg Lys Lys Arg Ile Ser Ala Asn Pro 245 250 255 act aat cct gat gag gct gac aaa gtt ggg gct gag aac aca atc acc 816 Thr Asn Pro Asp Glu Ala Asp Lys Val Gly Ala Glu Asn Thr Ile Thr 260 265 270 tat tca ctt ctc atg cac ccg gat gct ctg gaa gag cct gat gac cag 864 Tyr Ser Leu Leu Met His Pro Asp Ala Leu Glu Glu Pro Asp Asp Gln 275 280 285 aac cgt att tag 876 Asn Arg Ile 290 <210> 14 <211> 291 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Met Gly Ile Leu Ser Phe Leu Pro Val Leu Ala Thr Glu Ser Asp Trp 1 5 10 15 Ala Asp Cys Lys Ser Pro Gln Pro Trp Gly His Met Leu Leu Trp Thr 20 25 30 Ala Val Leu Phe Leu Ala Pro Val Ala Gly Thr Pro Ala Ala Pro Pro 35 40 45 Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Gln Trp Ile Asn Val Leu Gln Glu 50 55 60 Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Arg Gly Thr His Ser Pro Glu Ser Asp 65 70 75 80 Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn Leu Ile Pro Thr His Thr Gln 85 90 95 Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Thr 100 105 110 Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser Asp Pro Val His Leu Thr Val 115 120 125 Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln Thr Pro His Leu Glu Phe Gln Glu 130 135 140 Gly Glu Thr Ile Val Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asp Lys Pro Leu 145 150 155 160 Val Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn Gly Lys Ser Lys Lys Phe Ser Arg 165 170 175 Ser Asp Pro Asn Phe Ser Ile Pro Gln Ala Asn His Ser His Ser Gly 180 185 190 Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr Thr Leu Tyr Ser Ser Lys 195 200 205 Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Ala Pro Ser Ser Ser Pro Met Gly Ile 210 215 220 Ile Val Ala Val Val Thr Gly Ile Ala Val Ala Ala Ile Val Ala Ala 225 230 235 240 Val Val Ala Leu Ile Tyr Cys Arg Lys Lys Arg Ile Ser Ala Asn Pro 245 250 255 Thr Asn Pro Asp Glu Ala Asp Lys Val Gly Ala Glu Asn Thr Ile Thr 260 265 270 Tyr Ser Leu Leu Met His Pro Asp Ala Leu Glu Glu Pro Asp Asp Gln 275 280 285 Asn Arg Ile 290 <210> 15 <211> 765 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(765) <400> 15 atg tgg cag ctg ctc ctc cca act gct ctg cta ctt cta gtt tca gct 48 Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala 1 5 10 15 ggc atg cgg act gaa gat ctc cca aag gct gtg gtg ttc ctg gag cct 96 Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro 20 25 30 caa tgg tac agg gtg ctc gag aag gac agt gtg act ctg aag tgc cag 144 Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln 35 40 45 gga gcc tac tcc cct gag gac aat tcc aca cag tgg ttt cac aat gag 192 Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu 50 55 60 agc ctc atc tca agc cag gcc tcg agc tac ttc att gac gct gcc aca 240 Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr 65 70 75 80 gtt gac gac agt gga gag tac agg tgc cag aca aac ctc tcc acc ctc 288 Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu 85 90 95 agt gac ccg gtg cag cta gaa gtc cat atc ggc tgg ctg ttg ctc cag 336 Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln 100 105 110 gcc cct cgg tgg gtg ttc aag gag gaa gac cct att cac ctg agg tgt 384 Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys 115 120 125 cac agc tgg aag aac act gct ctg cat aag gtc aca tat tta cag aat 432 His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn 130 135 140 ggc aaa ggc agg aag tat ttt cat cat aat tct gac ttc tac att cca 480 Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro 145 150 155 160 aaa gcc aca ctc aaa gac agc ggc tcc tac ttc tgc agg ggg ctt gtt 528 Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val 165 170 175 ggg agt aaa aat gtg tct tca gag act gtg aac atc acc atc act caa 576 Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln 180 185 190 ggt ttg tca gtg tca acc atc tca tca ttc ttt cca cct ggg tac caa 624 Gly Leu Ser Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln 195 200 205 gtc tct ttc tgc ttg gtg atg gta ctc ctt ttt gca gtg gac aca gga 672 Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly 210 215 220 cta tat ttc tct gtg aag aca aac att cga agc tca aca aga gac tgg 720 Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp 225 230 235 240 aag gac cat aaa ttt aaa tgg aga aag gac cct caa gac aaa tga 765 Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys 245 250 <210> 16 <211> 254 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala 1 5 10 15 Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro 20 25 30 Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln 35 40 45 Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu 50 55 60 Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr 65 70 75 80 Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu 85 90 95 Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln 100 105 110 Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys 115 120 125 His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn 130 135 140 Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro 145 150 155 160 Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val 165 170 175 Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln 180 185 190 Gly Leu Ser Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln 195 200 205 Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly 210 215 220 Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp 225 230 235 240 Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys 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cat atc ggc tgg ctg ttg ctc cag 336 Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln 100 105 110 gcc cct cgg tgg gtg ttc aag gag gaa gac cct att cac ctg agg tgt 384 Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys 115 120 125 cac agc tgg aag aac act gct ctg cat aag gtc aca tat tta cag aat 432 His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn 130 135 140 ggc aaa gac agg aag tat ttt cat cat aat tct gac ttc cac att cca 480 Gly Lys Asp Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe His Ile Pro 145 150 155 160 aaa gcc aca ctc aaa gat agc ggc tcc tac ttc tgc agg ggg ctt gtt 528 Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val 165 170 175 ggg agt aaa aat gtg tct tca gag act gtg aac atc acc atc act caa 576 Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln 180 185 190 ggt ttg gca gtg tca acc atc tca tca ttc tct cca cct ggg tac caa 624 Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Ser Pro Pro Gly Tyr Gln 195 200 205 gtc tct ttc tgc ttg gtg atg gta ctc ctt ttt gca gtg gac aca gga 672 Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly 210 215 220 cta tat ttc tct gtg aag aca aac att tga 702 Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile 225 230 <210> 18 <211> 233 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala 1 5 10 15 Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro 20 25 30 Gln Trp Tyr Ser Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln 35 40 45 Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu 50 55 60 Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr 65 70 75 80 Val Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu 85 90 95 Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln 100 105 110 Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys 115 120 125 His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn 130 135 140 Gly Lys Asp Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe His Ile 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<400> 23 Gly Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 24 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 24 Ser Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 25 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 26 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 26 Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 27 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 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sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 122 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Arg Phe Ser Leu Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ser Val Leu Pro Ile Asn Ser Ala Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Ser Pro Val Val His His Pro His Gly Ala Phe Asp Ile 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 123 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 123 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Phe Ala 20 25 30 Arg Ser Asn Thr Phe Leu Ser Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Glu 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synthesized sequence <400> 128 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Met Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ala Ile Val Pro Ile Thr Gly Leu Ala Leu Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Leu Pro Val Tyr Ala Tyr Pro His Gly Ala Phe Asp Ile 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 129 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 129 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Asp His 20 25 30 Tyr Arg Asn Thr Tyr Val Ser Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Glu Ile Tyr Lys Arg Phe Tyr Gly Val Pro 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artificially synthesized sequence <400> 131 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Ser Ser 20 25 30 Arg Ser Asn Thr Phe Val Ser Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Glu Ile Phe Lys Arg Phe Tyr Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala 85 90 95 Gln Gln Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 132 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 132 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Ile Phe Ser Glu Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Phe Ala Pro Ile Leu Gly Ile Ala Ala Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr 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Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Arg Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Val Glu Pro Ile Trp Gly Ile Ala Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Ala Pro Val Phe Lys Arg Pro His Gly Ala Phe Asp Ile 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 135 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 135 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Ser Ser 20 25 30 Gly Gly Asn Thr Phe Leu Ser Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Glu Ile Gln Thr Arg Phe Tyr Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser 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Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Ser Ser 20 25 30 Ser Gly Asn Thr Phe Leu Ser Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Glu Ile His Lys Arg Phe Tyr Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala 85 90 95 Phe Trp Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 138 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 138 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Gly Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Arg Ser Ser His Ile Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Phe Gly Arg Lys Tyr Arg Met Asn Trp Val Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 139 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 139 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Thr Asp Val Gly Phe Tyr 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Ser Thr Val Thr Gly Ile 85 90 95 Trp Ser Val Gly Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 140 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 140 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Gly Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Arg Ser Asn His Ala Thr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Phe Gly Lys Lys Gly Arg Tyr Leu Trp Val Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 141 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 141 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Asp Tyr 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Tyr Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Ser Leu Thr Thr Asp Ser 85 90 95 Leu Asn Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 142 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 142 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Gly Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Arg Ser Gly His Arg His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Gly Lys Lys Gly Asn Arg Asn Trp Val Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 143 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 143 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Thr Asp Val Gly Gly Tyr 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Ser Thr Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Ser Thr Thr Thr Tyr Ala 85 90 95 Lys Asn Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 144 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 144 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Gly Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Arg Ser Asn His Arg Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Phe Gly Lys Arg Phe Asp Arg Asn Trp Val Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 145 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 145 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Thr Asp Val Gly Thr Tyr 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Lys Thr Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Ser Ser Arg Arg Tyr Arg 85 90 95 Arg Ser Leu Ser Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 146 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 146 Cys His Pro Arg Leu Ser Leu His Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu Leu 1 5 10 15 Leu Gly Ser Glu Ala Asn Leu Thr Cys Thr Leu Thr Gly Leu Arg Asp 20 25 30 Ala Ser Gly Val Thr Phe Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Ser Ala 35 40 45 Val Gln Gly Pro Pro Glu Arg Asp Leu Cys Gly Cys Tyr Ser Val Ser 50 55 60 Ser Val Leu Pro Gly Cys Ala Glu Pro Trp Asn His Gly Lys Thr Phe 65 70 75 80 Thr Cys Thr Ala Ala Tyr Pro Glu Ser Lys Thr Pro Leu Thr Ala Thr 85 90 95 Leu Ser Lys Ser Gly Asn Thr Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu Pro 100 105 110 Pro Pro Ser Glu Glu Leu Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr Leu Thr Cys 115 120 125 Leu Ala Arg Gly Phe Ser Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu Gln 130 135 140 Gly Ser Gln Glu Leu Pro Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Ala Ser Arg 145 150 155 160 Gln Glu Pro Ser Gln Gly Thr Thr Thr Phe Ala Val Thr Ser Ile Leu 165 170 175 Arg Val Ala Ala Glu Asp Trp Lys Lys Gly Asp Thr Phe Ser Cys Met 180 185 190 Val Gly His Glu Ala Leu Pro Leu Ala Phe Thr Gln Lys Thr Ile Asp 195 200 205 Arg Leu Ala Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe 210 215 220 Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu 225 230 <210> 147 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 147 Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu 1 5 10 15 <210> 148 <211> 641 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 148 Met Ser Asp Glu Gly Pro Gly Thr Gly Pro Gly Asn Gly Leu Gly Glu 1 5 10 15 Lys Gly Asp Thr Ser Gly Pro Glu Gly Ser Gly Gly Ser Gly Pro Gln 20 25 30 Arg Arg Gly Gly Asp Asn His Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly 35 40 45 Arg Gly Gly Gly Arg Pro Gly Ala Pro Gly Gly Ser Gly Ser Gly Pro 50 55 60 Arg His Arg Asp Gly Val Arg Arg Pro Gln Lys Arg Pro Ser Cys Ile 65 70 75 80 Gly Cys Lys Gly Thr His Gly Gly Thr Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly 85 90 95 Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly 100 105 110 Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly 115 120 125 Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala 130 135 140 Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly 145 150 155 160 Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly 165 170 175 Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly 180 185 190 Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly 195 200 205 Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala 210 215 220 Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala 225 230 235 240 Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly 245 250 255 Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly 260 265 270 Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly 275 280 285 Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly 290 295 300 Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly 305 310 315 320 Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Gly Arg Gly Arg Gly Gly Ser Gly Gly 325 330 335 Arg Gly Arg Gly Gly Ser Gly Gly Arg Gly Arg Gly Gly Ser Gly Gly 340 345 350 Arg Arg Gly Arg Gly Arg Glu Arg Ala Arg Gly Gly Ser Arg Glu Arg 355 360 365 Ala Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Glu Lys Arg Pro Arg Ser Pro 370 375 380 Ser Ser Gln Ser Ser Ser Ser Gly Ser Pro Pro Arg Arg Pro Pro Pro 385 390 395 400 Gly Arg Arg Pro Phe Phe His Pro Val Gly Glu Ala Asp Tyr Phe Glu 405 410 415 Tyr His Gln Glu Gly Gly Pro Asp Gly Glu Pro Asp Val Pro Pro Gly 420 425 430 Ala Ile Glu Gln Gly Pro Ala Asp Asp Pro Gly Glu Gly Pro Ser Thr 435 440 445 Gly Pro Arg Gly Gln Gly Asp Gly Gly Arg Arg Lys Lys Gly Gly Trp 450 455 460 Phe Gly Lys His Arg Gly Gln Gly Gly Ser Asn Pro Lys Phe Glu Asn 465 470 475 480 Ile Ala Glu Gly Leu Arg Ala Leu Leu Ala Arg Ser His Val Glu Arg 485 490 495 Thr Thr Asp Glu Gly Thr Trp Val Ala Gly Val Phe Val Tyr Gly Gly 500 505 510 Ser Lys Thr Ser Leu Tyr Asn Leu Arg Arg Gly Thr Ala Leu Ala Ile 515 520 525 Pro Gln Cys Arg Leu Thr Pro Leu Ser Arg Leu Pro Phe Gly Met Ala 530 535 540 Pro Gly Pro Gly Pro Gln Pro Gly Pro Leu Arg Glu Ser Ile Val Cys 545 550 555 560 Tyr Phe Met Val Phe Leu Gln Thr His Ile Phe Ala Glu Val Leu Lys 565 570 575 Asp Ala Ile Lys Asp Leu Val Met Thr Lys Pro Ala Pro Thr Cys Asn 580 585 590 Ile Arg Val Thr Val Cys Ser Phe Asp Asp Gly Val Asp Leu Pro Pro 595 600 605 Trp Phe Pro Pro Met Val Glu Gly Ala Ala Ala Glu Gly Asp Asp Gly 610 615 620 Asp Asp Gly Asp Glu Gly Gly Asp Gly Asp Glu Gly Glu Glu Gly Gln 625 630 635 640 Glu <210> 149 <211> 321 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 149 Met Lys Asp Asn Thr Val Pro Leu Lys Leu Ile Ala Leu Leu Ala Asn 1 5 10 15 Gly Glu Phe His Ser Gly Glu Gln Leu Gly Glu Thr Leu Gly Met Ser 20 25 30 Arg Ala Ala Ile Asn Lys His Ile Gln Thr Leu Arg Asp Trp Gly Val 35 40 45 Asp Val Phe Thr Val Pro Gly Lys Gly Tyr Ser Leu Pro Glu Pro Ile 50 55 60 Gln Leu Leu Asn Ala Lys Gln Ile Leu Gly Gln Leu Asp Gly Gly Ser 65 70 75 80 Val Ala Val Leu Pro Val Ile Asp Ser Thr Asn Gln Tyr Leu Leu Asp 85 90 95 Arg Ile Gly Glu Leu Lys Ser Gly Asp Ala Cys Ile Ala Glu Tyr Gln 100 105 110 Gln Ala Gly Arg Gly Arg Arg Gly Arg Lys Trp Phe Ser Pro Phe Gly 115 120 125 Ala Asn Leu Tyr Leu Ser Met Phe Trp Arg Leu Glu Gln Gly Pro Ala 130 135 140 Ala Ala Ile Gly Leu Ser Leu Val Ile Gly Ile Val Met Ala Glu Val 145 150 155 160 Leu Arg Lys Leu Gly Ala Asp Lys Val Arg Val Lys Trp Pro Asn Asp 165 170 175 Leu Tyr Leu Gln Asp Arg Lys Leu Ala Gly Ile Leu Val Glu Leu Thr 180 185 190 Gly Lys Thr Gly Asp Ala Ala Gln Ile Val Ile Gly Ala Gly Ile Asn 195 200 205 Met Ala Met Arg Arg Val Glu Glu Ser Val Val Asn Gln Gly Trp Ile 210 215 220 Thr Leu Gln Glu Ala Gly Ile Asn Leu Asp Arg Asn Thr Leu Ala Ala 225 230 235 240 Met Leu Ile Arg Glu Leu Arg Ala Ala Leu Glu Leu Phe Glu Gln Glu 245 250 255 Gly Leu Ala Pro Tyr Leu Ser Arg Trp Glu Lys Leu Asp Asn Phe Ile 260 265 270 Asn Arg Pro Val Lys Leu Ile Ile Gly Asp Lys Glu Ile Phe Gly Ile 275 280 285 Ser Arg Gly Ile Asp Lys Gln Gly Ala Leu Leu Leu Glu Gln Asp Gly 290 295 300 Ile Ile Lys Pro Trp Met Gly Gly Glu Ile Ser Leu Arg Ser Ala Glu 305 310 315 320 Lys

Claims (15)

  1. 아래의 (a) 및 (b)의 공정：
    (a) 저분자 화합물의 농도에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인에 있어서, 아래의 (i) 내지 (iii) 중 어느 하나 이상을 만족시키는 아미노산 부위를 특정하는 공정:
    (i) 당해 저분자 화합물에 대한 결합에 관여하고 있지 않은 1 또는 복수의 아미노산 부위；
    (ii) 부모 항원 결합 도메인(parent antigen-binding domain)이 속하는 동물종의 항체의 레퍼토리로서 아미노산 출현 빈도의 다양성이 있는 1 또는 복수의 아미노산 부위；
    (iii) 표준 구조(canonical structure)의 형성에 중요하지 않은 1 또는 복수의 아미노산 부위, 및
    (b) (i) 공정 (a)의 항원 결합 도메인을 코드하는 핵산 및 공정 (a)에서 특정된 1 또는 복수의 아미노산 부위에 개변을 갖는, 서로 서열이 다른 공정 (a)의 항원 결합 도메인의 복수의 개변체 각각을 코드하는 핵산을 포함하는 라이브러리를 설계하는 공정, 또는
    (ii-a) 공정 (a)에서 특정된 1 또는 복수의 아미노산 부위에 개변을 갖는, 서로 서열이 다른 공정 (a)의 항원 결합 도메인의 복수의 개변체를 제작하는 공정;
    (ii-b) 상기 각각의 개변체의 당해 저분자 화합물에 대한 결합 활성에 실질적으로 변화를 초래하지 않는 1 또는 복수의 아미노산의 개변을 특정하는 공정; 및
    (ii-c) 항원 결합 도메인의 미개변체를 코드하는 핵산 및 공정 (ii-b)에서 특정된 1 또는 복수의 아미노산에 개변을 갖는, 서로 서열이 다른 공정 (a)의 항원 결합 도메인의 복수의 개변체를 코드하는 핵산을 포함하는 라이브러리를 제조하는 공정
    을 포함하는 라이브러리의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 저분자 화합물이 표적 조직 특이적인 화합물 또는 비천연 화합물인, 라이브러리의 제조방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 표적 조직이 암조직 또는 염증성 조직인, 라이브러리의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 저분자 화합물은 푸린 고리 구조를 갖는 뉴클레오시드, 아미노산 및 그의 대사산물, 지질 및 그의 대사산물, 당대사의 1차 대사산물, 및 니코틴아미드 및 그의 대사산물로 이루어진 군으로부터 선택되는 암조직 특이적 화합물인, 라이브러리의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 저분자 화합물이 키누레닌, 아데노신, 아데노신 1인산, 아데노신 2인산, 아데노신 3인산 또는 이노신인, 라이브러리의 제조방법.
  6. 제1항의 방법으로 제조된 라이브러리.
  7. 제6항의 라이브러리에서 핵산이 코드하는 복수의 항원 결합 도메인 또는 제6항의 라이브러리에서 핵산이 코드하는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자를 포함하는 라이브러리.
  8. 제7항의 라이브러리에서 복수의 항원 결합 분자를 코드하는 핵산을 포함하는 라이브러리.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서,
    상기 항원 결합 분자가 항원 결합 도메인과 바이러스 코트 단백질의 적어도 일부의 융합 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는, 라이브러리.
  10. 제7항 또는 제8항에 있어서,
    상기 항원 결합 분자는 항체의 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항원 결합 분자인, 라이브러리.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 항체의 중쇄 및/또는 경쇄가 생식세포계열 유래의 프레임워크 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 라이브러리.
  12. 아래의 (a) 내지 (g)의 공정：
    (a) 저분자 화합물의 비존재하에서 제7항의 라이브러리를 항원에 접촉시키는 공정;
    (b) 상기 공정 (a)에서 항원에 결합하지 않는 항원 결합 도메인을 선택하는 공정；
    (c) 상기 공정 (b)에서 선택된 항원 결합 도메인을 저분자 화합물의 존재하에서 항원에 접촉시키는 공정；
    (d) 상기 공정 (c)에서 항원에 결합한 항원 결합 도메인을 선택하는 공정；
    (e) 상기 공정 (d)에서 선택된 항원 결합 도메인을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드에 연결시키는 공정；
    (f) 상기 공정 (e)에서 얻어진 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된 벡터가 도입된 세포를 배양하는 공정； 및
    (g) 상기 공정 (f)에서 배양된 세포의 배양액으로부터 항원 결합 분자를 회수하는 공정
    을 포함하는, 저분자 화합물의 농도에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자의 제조방법.
  13. 아래의 (a) 내지 (e)의 공정：
    (a) 저분자 화합물의 존재하에서 제7항의 라이브러리를 항원에 접촉시키는 공정；
    (b) 상기 공정 (a)보다 저농도의 저분자 화합물로 항원 결합 도메인을 해리시켜 회수하는 공정；
    (c) 상기 공정 (b)에서 회수된 항원 결합 도메인을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드에 연결시키는 공정；
    (d) 상기 공정 (c)에서 얻어진 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된 벡터가 도입된 세포를 배양하는 공정； 및
    (e) 상기 공정 (d)에서 배양된 세포의 배양액으로부터 항원 결합 분자를 회수하는 공정
    을 포함하는, 저분자 화합물의 농도에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자의 제조방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서,
    제12항 또는 제13항에 기재된 공정에 앞서
    아래의 (i) 및 (ii) 공정:
    (i) 제7항의 라이브러리를 저분자 화합물에 접촉시키는 공정; 및
    (ii) 저분자 화합물에 결합한 항원 결합 도메인을 선택하는 공정
    의 수행을 추가로 포함하는, 저분자 화합물의 농도에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자의 제조방법.
  15. 삭제
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