KR102366029B1

KR102366029B1 - 표적 항원에 대한 면역응답을 유도하는 항원 결합 분자

Info

Publication number: KR102366029B1
Application number: KR1020217007933A
Authority: KR
Inventors: 도모유키 이가와; 아츠히코 마에다; 겐타 하라야; 다츠히코 다치바나
Original assignee: 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤
Priority date: 2011-09-30
Filing date: 2012-09-28
Publication date: 2022-02-23
Also published as: AU2012317395B2; MX366968B; CN110680920A; MX2019006188A; CN110655578A; KR102239138B1; CA2850322A1; US10556949B2; EP2752200A1; TW201326210A; JP6352634B2; AU2012317395A1; JPWO2013047729A1; MX2014003832A; TWI681970B; CN110627902A; SG10201510341XA; KR20210035312A; CN104093424A; JP2018150378A

Abstract

본 발명자들은 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인 및 pH 중성역의 조건하에서 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 FcRn 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자가 투여된 생체에 있어서, 당해 항원에 대한 면역응답이 유도되고 있는 것을 발견하였다. 또한 본 발명자들은 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인 및 pH 중성역의 조건하에서 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 FcRn 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자가 투여된 생체에 있어서, 당해 항원에 대한 면역응답이 유도되고 있는 동시에 당해 항원 결합 분자가 결합하는 항원을 발현하는 외래 생물종이나 암세포 등에 대한 상해작용 또는 증식 억제작용을 겸비하는 것을 발견하였다.

Description

표적 항원에 대한 면역응답을 유도하는 항원 결합 분자{Antigen-binding molecule inducing immune response to target antigen}

본 발명은 표적 항원에 대한 면역응답을 유도하는 항원 결합 분자를 유효성분으로서 포함하는 의약 조성물 또는 당해 의약 조성물을 사용하는 치료방법을 제공한다. 또한 상기 면역응답을 유도하는 동시에, 표적 항원을 발현하는 세포에 대한 상해작용(세포상해활성) 또는 증식 억제작용(세포증식 저해활성)을 겸비하는 항원 결합 분자를 유효성분으로서 포함하는 의약 조성물 또는 당해 의약 조성물을 사용하는 치료방법을 제공한다.

오늘날까지 종양세포를 위한 복수의 치료 백신의 개발이 시도되고 있다. 생체의 면역계에 의해 인식될 수 있는 종양세포와 정상세포 사이에 있는 것으로 생각되는 질적 또는 양적인 상위가 있기 때문에, 이러한 상위(네오에피토프)를 이용한 백신에 의한 능동적, 특이적인 감작에 의해 자극된 면역계가 종양세포를 인식하여 배제하는 것이 가능할 것으로 생각되고 있기 때문이다.

이러한 항종양 응답을 일으키기 위해서는 적어도 2개의 조건이 충족되지 않으면 안되는 것으로 생각되고 있다. 첫째, 종양세포가 정상세포에는 출현하지 않는 항원이거나 또는 정상세포와 종양세포를 오로지 질적으로 구별할 수 있는 정도의 항원을 발현하고 있지 않으면 안된다. 둘째, 백신 등에 의해 면역계가 목적으로 하는 항원과 반응하기 위해 활성화되지 않으면 안된다. 종양의 면역요법에 있어서의 중대한 장애는 종양의 면역원성이 특히 인간에서는 약한 것으로 생각되고 있다.

최근 들어 면역계의 공격 대상을 구성할 수 있는 이러한 네오에피토프를 포함하는 종양 관련 및 종양 특이적 항원이 발견되고 있다. 그럼에도 불구하고 면역계가 이들 네오에피토프를 발현하고 있는 종양을 배제할 수 없다는 것은 네오에피토프가 존재하지 않기 때문이 아니라 이들 네오에피토프에 대한 면역응답이 불충분하기 때문이라고 생각되고 있다.

세포를 기초로 하는 암의 면역요법을 목적으로 하여 2개의 일반적인 전략이 개발되어 왔다. 하나는 in vitro에서 확대된 종양 반응성 T 림프구가 환자에게 재이입되는 양자 면역요법이고, 다른 하나는 종양 항원에 대해 새롭거나 또는 보다 강한 면역응답을 일으켜, 전신성의 종양응답을 유도하는 것을 목적으로 하여 종양세포가 사용되는 능동 면역요법이다.

능동 면역요법을 기초로 하는 종양 백신은 각종 방법에 의해 조제되고 있다. 종양 항원에 대한 면역응답을 유도하기 위해 칼메트 게랑 간균(Bacillus Calmette Guerin)(BCG)과 같은 면역 자극 애쥬번트와 혼합한 방사선 조사 종양세포(비특허문헌 1), 예를 들면 사이토카인을 생산하도록 유전적으로 개변된 종양세포(비특허문헌 2), 이질화된 자가 종양세포(비특허문헌 3) 등이 조제되어 있다. 그러나, 종양세포의 면역원성은 낮고 그 원인은 종양 항원의 질적인 문제가 아니라 그 양적인 문제라고 생각되고 있다.

한편 항체는 결합한 항원을 항원 제시 세포에 cross presentation함으로써 항원에 대한 액성 면역응답(항원에 대한 항체 생산) 및 세포성 면역응답(항원에 대한 CD8 양성 T세포 생산)을 유도하는 것이 알려져 있어, 항체 투여에 의해 항원에 대한 획득 면역을 유도하는 것이 가능한 것이 보고되어 있다(비특허문헌 4). 최근, 마우스 in vivo 모델에 있어서 HER2에 대한 항체에 의한 항종양 효과는 투여한 항체의 직접 ADCC보다도 항체 투여에 의해 유도되는 HER2 항원에 대한 획득 면역이 중요한 역할을 하고 있는 것이 나타내어져 있다(비특허문헌 5). 실제로 HER2에 대한 IgG1 서브클래스의 항체 의약인 허셉틴(Herceptin)의 임상에 있어서 허셉틴 투여에 의해 획득 면역이 유도되어, HER2에 대한 액성 면역응답이 확인되었다(비특허문헌 6). 허셉틴 투여가 봉공된 환자에 있어서 특히 HER2에 대한 항체가의 상승이 확인된 것으로부터 허셉틴 투여에 의한 획득 면역 유도가 항종양 효과에 중요한 역할을 하고 있는 것으로 생각되었다.

항체는 혈중에서의 안정성이 높고 부작용도 적은 것으로부터 의약품으로서 주목되고 있다(비특허문헌 7, 비특허문헌 8). IgG 클래스의 항체의 이펙터 기능인 항체 의존성 세포상해활성(이하, ADCC로 표기한다), 보체 의존성 세포상해활성(이하, CDC로 표기한다)의 연구는 지금까지 다수 행해져, 인간 IgG 클래스 중에서는 IgG1 서브클래스의 항체가 가장 높은 ADCC 활성, CDC 활성을 갖는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 9). 또한 IgG 클래스의 항체를 매개로 한 표적 세포의 식작용(phagocytosis)인 항체 의존성 세포 개재성 식작용(ADCP)도 항체의 이펙터 기능의 하나로서 시사되어 있다(비특허문헌 10, 비특허문헌 11). IgG1 서브클래스의 항체는 이들 이펙터 기능을 종양에 대해 발휘시키는 것이 가능하기 때문에, 암항원에 대한 대부분의 항체 의약으로서 IgG1 서브클래스의 항체가 사용되고 있다.

IgG 항체가 ADCC, ADCP 활성을 매개하기 위해서는 IgG 항체의 Fc영역과 킬러 세포, 내츄럴 킬러 세포, 활성화된 마크로파지 등의 이펙터 세포 표면 상에 존재하는 항체 수용체(이하, FcγR로 표기한다)의 결합이 필요하다. 인간의 경우는 FcγR의 단백질 패밀리로서 FcγRIa, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa, FcγRIIIb의 아이소폼이 보고되어 있고, 각각의 알로타입도 보고되어 있다(비특허문헌 12).

ADCC와 ADCP 등의 세포상해성의 이펙터 기능의 증강은 항암 항체의 항종양효과를 증강시키기 위한 유망한 수단으로서 주목되고 있다. 항체의 항종양효과를 목적으로 하는 FcγR을 매개로 한 이펙터 기능의 중요성은 마우스 모델을 사용하여 보고되어 있다(비특허문헌 13, 비특허문헌 14). 또한 인간에 있어서의 임상 효과와 FcγRIIIa의 고친화성 다형 알로타입(V158)과 저친화성 다형 알로타입(F158) 사이에는 상관관계가 관찰되었다(비특허문헌 15). 이들 보고로부터 특정 FcγR에 대한 결합이 최적화된 Fc영역을 갖는 항체는 보다 강력한 이펙터 기능을 매개하여, 그것에 의해 효과적인 항종양효과를 발휘하는 것이 시사된다. FcγRIa, FcγRIIa, FcγRIIIa, FcγRIIIb를 포함하는 활성화 수용체, FcγRIIb를 포함하는 저해성 수용체의 각각에 대한 항체의 친화성의 균형은 항체의 이펙터 기능을 최적화하는데 있어서 중요한 요소이다. 활성화 수용체에 대한 친화성을 증강시킴으로써 보다 강력한 이펙터 기능을 매개하는 성질을 항체에 부여할 가능성이 있는 것으로부터(비특허문헌 16), 암항원에 대한 항체 의약의 항종양활성을 증강 또는 향상시키는 항체 엔지니어링의 수법으로서 지금까지 다양한 보고가 되어 있다.

Fc영역과 FcγR의 결합에 대해서는 항체의 힌지영역 및 CH2 도메인 내의 몇 개의 아미노산 잔기 및 CH2 도메인에 결합해 있는 EU 넘버링 297번째의 Asn에 부가되는 당쇄가 중요한 것이 나타내어져 있다(비특허문헌 9, 비특허문헌 17, 비특허문헌 18). 이 결합 개소를 중심으로 지금까지 다양한 FcγR 결합 특성을 갖는 Fc영역의 변이체가 연구되어, 보다 높은 활성화 FcγR에 대한 친화성을 갖는 Fc영역 변이체가 얻어지고 있다(특허문헌 1, 특허문헌 2). 예를 들면 Lazar들은 인간 IgG1의 EU 넘버링 239번째의 Ser, 330의 Ala, 332의 Ile를 각각 Asn, Leu, Glu로 치환함으로써, 인간 FcγRIIIa(V158)에 대한 인간 IgG1의 결합을 약 370배까지 증가시키는 것에 성공하였다(비특허문헌 19, 특허문헌 2). 이 개변체는 야생형과 비교하여 FcγRIIIa와 FcγRIIb에 대한 결합의 비(A/I비)가 약 9배가 되어 있다. 또한 Shinkawa들은 EU 넘버링 297번째의 Asn에 부가되는 당쇄의 푸코오스를 결손시킴으로써 FcγRIIIa에 대한 결합을 약 100배까지 증가시키는 것에 성공하였다(비특허문헌 20). 이들 방법에 의해 천연형 인간 IgG1과 비교하여 인간 IgG1의 ADCC 활성을 대폭 향상시키는 것이 가능하다.

전술한 바와 같이 항체 엔지니어링에 의한 ADCC를 증강시키는 방법은 다수 보고되어 있는데, 지금까지 항체 투여에 의한 획득 면역의 유도를 증강 또는 향상시키는 항체공학의 수법은 보고되어 있지 않았다. 암항원에 대한 획득 면역을 유도하는 방법으로서, 항원 제시 세포에 발현하고 있는 DEC-205나 하이만노오스 수용체에 결합하는 항체에 획득 면역을 유도시키고자 하는 암항원을 융합시킴으로써, 암항원의 항원 제시 세포로의 흡수와 항원 제시를 촉진하는 방법이 보고되어 있는데(비특허문헌 21), 이들 방법은 전술한 항HER2 항체와 같이 항체가 결합하는 표적 암항원은 아니다. 즉, 항체 자신에 융합된 암항원에 대한 획득 면역을 유도하는 방법인 것으로부터, 항체 자신은 암항원에 결합하는 것이 불가능하여 암항원에 대해 직접 작용을 발휘할 수 없다고 하는 결점을 갖는다. 또한 이 방법에서는 항체에 융합된 암항원뿐 아니라 항원 제시 세포에 타겟하기 위한 항체 자신에 대한 획득 면역도 유도하는 것으로부터, 항약제 항체의 출현에 의해 효과의 감약으로 이어지기 때문에, 치료를 목적으로 하기에는 본 방법은 바람직하지 않은 것으로 생각된다.

이상의 사실로부터 표적 항원에 대한 결합 활성을 갖는 항원 결합 분자를 투여함으로써 그 표적 항원에 대한 획득 면역을 유도하는 것이 바람직함에도 불구하고, 이러한 방법으로 획득 면역을 증강 또는 향상시키는 엔지니어링 수법은 보고되어 있지 않았다.

WO2000/042072 WO2006/019447

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본 발명은 상기 정황을 감안하여 이루어진 것으로, 외래성 생물종에 의해 감염되었거나 또는 암을 앓고 있는 대상에 투여함으로써 당해 대상의 면역응답을 유도하는 항원 결합 분자를 유효성분으로서 포함하는 의약 조성물 또는 당해 의약 조성물을 사용하는 치료방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한 상기 면역응답을 유도하는 동시에 감염시킨 외래성 생물종 또는 암세포에 대한 상해작용(세포상해활성) 또는 증식 억제작용(세포증식 저해활성)을 겸비하는 항원 결합 분자를 유효성분으로서 포함하는 의약 조성물 또는 당해 의약 조성물을 사용하는 치료방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인 및 pH 중성역의 조건하에서 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 FcRn 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자가 투여된 생체에 있어서, 당해 항원에 대한 면역응답이 유도되어 있는 것을 발견하였다. 또한 본 발명자들은 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인 및 pH 중성역의 조건하에서 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 FcRn 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자가 투여된 생체에 있어서, 당해 항원에 대한 면역응답이 유도되어 있는 동시에 당해 항원 결합 분자가 결합하는 항원을 발현하는 외래 생물종이나 암세포 등에 대한 상해작용 또는 증식 억제작용을 겸비하는 것이 가능한 것을 발견하였다. 본 발명자들은 이러한 발견을 토대로 본 발명에 따른 항원 결합 분자가 외래성 생물종에 의해 감염되었거나 또는 암을 앓고 있는 대상에 투여함으로써 당해 대상의 면역응답을 유도하는 의약 조성물로서 유용한 것을 명확하게 하였다. 또한 본 발명자들은 본 발명에 따른 항원 결합 분자가 외래성 생물종에 의해 감염되었거나 또는 암을 앓고 있는 대상에 투여함으로써 당해 대상의 면역응답을 유도하는 동시에 당해 외래성 생물종이나 암세포에 대한 상해작용 또는 증식 억제작용을 겸비하는 의약 조성물로서 유용한 것을 명확하게 하였다. 또한 이들 의약 조성물의 제조방법을 발견하였다.

즉, 본 발명은 보다 구체적으로는 아래의 〔1〕~〔47〕을 제공하는 것이다.

〔1〕이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인 및 pH 중성역의 조건하에서 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 FcRn 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자를 유효성분으로서 포함하는 상기 항원에 대한 면역응답을 유도하는 의약 조성물.

〔2〕상기 이온 농도가 칼슘 이온 농도인 〔1〕에 기재된 의약 조성물.

〔3〕상기 항원 결합 도메인이 저칼슘 이온 농도의 조건하에서의 당해 항원에 대한 결합 활성보다도 고칼슘 이온 농도의 조건하에서의 항원에 대한 결합 활성이 높다는 특징을 갖는 항원 결합 도메인인 〔2〕에 기재된 의약 조성물.

〔4〕상기 이온 농도의 조건이 pH의 조건인 〔1〕에 기재된 의약 조성물.

〔5〕상기 항원 결합 도메인이 pH 산성역의 조건하에서의 당해 항원에 대한 결합 활성보다도 pH 중성역의 조건하에서의 항원에 대한 결합 활성이 높다는 특징을 갖는 항원 결합 도메인인 〔4〕에 기재된 의약 조성물.

〔6〕상기 항원 결합 분자가 상기 항원에 대한 중화활성을 갖는 항원 결합 분자인 〔1〕내지〔5〕중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.

〔7〕상기 항원 결합 분자가 상기 항원을 발현하는 세포에 대한 세포상해활성을 갖는 항원 결합 분자인 〔1〕내지〔6〕중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.

〔8〕상기 FcRn 결합도메인이 항체의 Fc영역을 포함하는 〔1〕내지〔7〕중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.

〔9〕상기 Fc영역이 Fc영역의 EU 넘버링으로 표시되는 부위 중 257번 위치, 308번 위치, 428번 위치 및 434번 위치의 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산이 천연형 Fc영역의 대응하는 부위의 아미노산과 상이한 Fc영역인 〔8〕에 기재된 의약 조성물.

〔10〕상기 Fc영역이 Fc영역의 EU 넘버링으로 표시되는；

257번 위치의 아미노산이 Ala,

308번 위치의 아미노산이 Pro,

428번 위치의 아미노산이 Leu, 및

434번 위치의 아미노산이 Tyr

의 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산을 포함하는 Fc영역인 〔8〕 또는 〔9〕에 기재된 의약 조성물.

〔11〕상기 Fc영역의 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 EU 넘버링 297번 위치에 결합한 당쇄가 푸코오스 함유 당쇄인 천연형 인간 IgG의 Fc영역의 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성보다도 높다는 특징을 갖는 〔8〕내지〔10〕중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.

〔12〕상기 Fcγ 수용체가 FcγRIa, FcγRIIa(R), FcγRIIa(H), FcγRIIb, FcγRIIIa(V) 또는 FcγRIIIa(F)인 〔11〕에 기재된 의약 조성물.

〔13〕상기 Fc영역이 Fc영역에 있어서의 EU 넘버링으로 표시되는 부위 중 221번 위치, 222번 위치, 223번 위치, 224번 위치, 225번 위치, 227번 위치, 228번 위치, 230번 위치, 231번 위치, 232번 위치, 233번 위치, 234번 위치, 235번 위치, 236번 위치, 237번 위치, 238번 위치, 239번 위치, 240번 위치, 241번 위치, 243번 위치, 244번 위치, 245번 위치, 246번 위치, 247번 위치, 249번 위치, 250번 위치, 251번 위치, 254번 위치, 255번 위치, 256번 위치, 258번 위치, 260번 위치, 262번 위치, 263번 위치, 264번 위치, 265번 위치, 266번 위치, 267번 위치, 268번 위치, 269번 위치, 270번 위치, 271번 위치, 272번 위치, 273번 위치, 274번 위치, 275번 위치, 276번 위치, 278번 위치, 279번 위치, 280번 위치, 281번 위치, 282번 위치, 283번 위치, 284번 위치, 285번 위치, 286번 위치, 288번 위치, 290번 위치, 291번 위치, 292번 위치, 293번 위치, 294번 위치, 295번 위치, 296번 위치, 297번 위치, 298번 위치, 299번 위치, 300번 위치, 301번 위치, 302번 위치, 303번 위치, 304번 위치, 305번 위치, 311번 위치, 313번 위치, 315번 위치, 317번 위치, 318번 위치, 320번 위치, 322번 위치, 323번 위치, 324번 위치, 325번 위치, 326번 위치, 327번 위치, 328번 위치, 329번 위치, 330번 위치, 331번 위치, 332번 위치, 333번 위치, 334번 위치, 335번 위치, 336번 위치, 337번 위치, 339번 위치, 376번 위치, 377번 위치, 378번 위치, 379번 위치, 380번 위치, 382번 위치, 385번 위치, 392번 위치, 396번 위치, 421번 위치, 427번 위치, 428번 위치, 429번 위치, 434번 위치, 436번 위치 및 440번 위치의 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산이 천연형 Fc영역의 대응하는 부위의 아미노산과 상이한 Fc영역인 〔11〕 또는 〔12〕에 기재된 의약 조성물.

〔14〕상기 Fc영역이 Fc영역에 있어서의 EU 넘버링으로 표시되는 부위 중；

221번 위치의 아미노산이 Lys 또는 Tyr 중 어느 하나,

222번 위치의 아미노산이 Phe, Trp, Glu 또는 Tyr 중 어느 하나,

223번 위치의 아미노산이 Phe, Trp, Glu 또는 Lys 중 어느 하나,

224번 위치의 아미노산이 Phe, Trp, Glu 또는 Tyr 중 어느 하나,

225번 위치의 아미노산이 Glu, Lys 또는 Trp 중 어느 하나,

227번 위치의 아미노산이 Glu, Gly, Lys 또는 Tyr 중 어느 하나,

228번 위치의 아미노산이 Glu, Gly, Lys 또는 Tyr 중 어느 하나,

230번 위치의 아미노산이 Ala, Glu, Gly 또는 Tyr 중 어느 하나,

231번 위치의 아미노산이 Glu, Gly, Lys, Pro 또는 Tyr 중 어느 하나,

232번 위치의 아미노산이 Glu, Gly, Lys 또는 Tyr 중 어느 하나,

233번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

234번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

235번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

236번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

237번 위치의 아미노산이 Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

238번 위치의 아미노산이 Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

239번 위치의 아미노산이 Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

240번 위치의 아미노산이 Ala, Ile, Met 또는 Thr 중 어느 하나,

241번 위치의 아미노산이 Asp, Glu, Leu, Arg, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

243번 위치의 아미노산이 Leu, Glu, Leu, Gln, Arg, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

244번 위치의 아미노산이 His,

245번 위치의 아미노산이 Ala,

246번 위치의 아미노산이 Asp, Glu, His 또는 Tyr 중 어느 하나,

247번 위치의 아미노산이 Ala, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Thr, Val 또는 Tyr 중 어느 하나,

249번 위치의 아미노산이 Glu, His, Gln 또는 Tyr 중 어느 하나,

250번 위치의 아미노산이 Glu 또는 Gln 중 어느 하나,

251번 위치의 아미노산이 Phe,

254번 위치의 아미노산이 Phe, Met 또는 Tyr 중 어느 하나,

255번 위치의 아미노산이 Glu, Leu 또는 Tyr 중 어느 하나,

256번 위치의 아미노산이 Ala, Met 또는 Pro 중 어느 하나,

258번 위치의 아미노산이 Asp, Glu, His, Ser 또는 Tyr 중 어느 하나,

260번 위치의 아미노산이 Asp, Glu, His 또는 Tyr 중 어느 하나,

262번 위치의 아미노산이 Ala, Glu, Phe, Ile 또는 Thr 중 어느 하나,

263번 위치의 아미노산이 Ala, Ile, Met 또는 Thr 중 어느 하나,

264번 위치의 아미노산이 Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

265번 위치의 아미노산이 Ala, Leu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

266번 위치의 아미노산이 Ala, Ile, Met 또는 Thr 중 어느 하나,

267번 위치의 아미노산이 Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

268번 위치의 아미노산이 Asp, Glu, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Thr, Val 또는 Trp 중 어느 하나,

269번 위치의 아미노산이 Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

270번 위치의 아미노산이 Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

271번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

272번 위치의 아미노산이 Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

273번 위치의 아미노산이 Phe 또는 Ile 중 어느 하나,

274번 위치의 아미노산이 Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

275번 위치의 아미노산이 Leu 또는 Trp 중 어느 하나,

276번 위치의 아미노산이 Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

278번 위치의 아미노산이 Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val 또는 Trp 중 어느 하나,

279번 위치의 아미노산이 Ala,

280번 위치의 아미노산이 Ala, Gly, His, Lys, Leu, Pro, Gln, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

281번 위치의 아미노산이 Asp, Lys, Pro 또는 Tyr 중 어느 하나,

282번 위치의 아미노산이 Glu, Gly, Lys, Pro 또는 Tyr 중 어느 하나,

283번 위치의 아미노산이 Ala, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg 또는 Tyr 중 어느 하나,

284번 위치의 아미노산이 Asp, Glu, Leu, Asn, Thr 또는 Tyr 중 어느 하나,

285번 위치의 아미노산이 Asp, Glu, Lys, Gln, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

286번 위치의 아미노산이 Glu, Gly, Pro 또는 Tyr 중 어느 하나,

288번 위치의 아미노산이 Asn, Asp, Glu 또는 Tyr 중 어느 하나,

290번 위치의 아미노산이 Asp, Gly, His, Leu, Asn, Ser, Thr, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

291번 위치의 아미노산이 Asp, Glu, Gly, His, Ile, Gln 또는 Thr 중 어느 하나,

292번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Pro, Thr 또는 Tyr 중 어느 하나,

293번 위치의 아미노산이 Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

294번 위치의 아미노산이 Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

295번 위치의 아미노산이 Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

296번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr 또는 Val 중 어느 하나,

297번 위치의 아미노산이 Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

298번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

299번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

300번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val 또는 Trp 중 어느 하나,

301번 위치의 아미노산이 Asp, Glu, His 또는 Tyr 중 어느 하나,

302번 위치의 아미노산이 Ile,

303번 위치의 아미노산이 Asp, Gly 또는 Tyr 중 어느 하나,

304번 위치의 아미노산이 Asp, His, Leu, Asn 또는 Thr 중 어느 하나,

305번 위치의 아미노산이 Glu, Ile, Thr 또는 Tyr 중 어느 하나,

311번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Asn, Thr, Val 또는 Tyr 중 어느 하나,

313번 위치의 아미노산이 Phe,

315번 위치의 아미노산이 Leu,

317번 위치의 아미노산이 Glu 또는 Gln,

318번 위치의 아미노산이 His, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val 또는 Tyr 중 어느 하나,

320번 위치의 아미노산이 Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Pro, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

322번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Pro, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

323번 위치의 아미노산이 Ile,

324번 위치의 아미노산이 Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

325번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

326번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

327번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

328번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

329번 위치의 아미노산이 Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

330번 위치의 아미노산이 Cys, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

331번 위치의 아미노산이 Asp, Phe, His, Ile, Leu, Met, Gln, Arg, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

332번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

333번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Ser, Thr, Val 또는 Tyr 중 어느 하나,

334번 위치의 아미노산이 Ala, Glu, Phe, Ile, Leu, Pro 또는 Thr 중 어느 하나,

335번 위치의 아미노산이 Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나,

336번 위치의 아미노산이 Glu, Lys 또는 Tyr 중 어느 하나,

337번 위치의 아미노산이 Glu, His 또는 Asn 중 어느 하나,

339번 위치의 아미노산이 Asp, Phe, Gly, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Ser 또는 Thr 중 어느 하나,

376번 위치의 아미노산이 Ala 또는 Val 중 어느 하나,

377번 위치의 아미노산이 Gly 또는 Lys 중 어느 하나,

378번 위치의 아미노산이 Asp,

379번 위치의 아미노산이 Asn,

380번 위치의 아미노산이 Ala, Asn 또는 Ser 중 어느 하나,

382번 위치의 아미노산이 Ala 또는 Ile 중 어느 하나,

385번 위치의 아미노산이 Glu,

392번 위치의 아미노산이 Thr,

396번 위치의 아미노산이 Leu,

421번 위치의 아미노산이 Lys,

427번 위치의 아미노산이 Asn,

428번 위치의 아미노산이 Phe 또는 Leu 중 어느 하나,

429번 위치의 아미노산이 Met,

434번 위치의 아미노산이 Trp,

436번 위치의 아미노산이 Ile, 및

440번 위치의 아미노산이 Gly, His, Ile, Leu 또는 Tyr 중 어느 하나

의 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산을 포함하는 Fc영역인 〔11〕내지〔13〕중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.

〔15〕상기 천연형 Fc영역이 EU 넘버링 297번 위치에 결합한 당쇄가 푸코오스 함유 당쇄인 인간 IgG1, 인간 IgG2, 인간 IgG3 또는 인간 IgG4 중 어느 하나의 Fc영역인 〔11〕내지〔14〕중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.

〔16〕상기 Fc영역이 Fc영역의 EU 넘버링 297번 위치에 결합한 당쇄의 조성이 푸코오스 결손 당쇄를 결합한 Fc영역의 비율이 높아지도록, 또는 바이섹팅 N-아세틸글루코사민이 부가된 Fc영역의 비율이 높아지도록 수식된 Fc영역인 〔11〕내지〔15〕중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.

〔17〕〔1〕내지〔16〕에 기재되는 항원 결합 분자를 생체내에 투여하는 공정을 포함하는 당해 생체의 면역응답을 유도하는 방법.

〔18〕이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자에 포함되는 FcRn 결합 도메인에 pH 중성역의 조건하에서 FcRn에 대한 결합 활성을 부여하는 것을 포함하는 면역응답을 유도하는 항원 결합 분자의 제조방법.

〔19〕상기 이온 농도가 칼슘 이온 농도인 〔18〕에 기재된 방법.

〔20〕상기 항원 결합 도메인이 저칼슘 이온 농도의 조건하에서의 당해 항원에 대한 결합 활성보다도 고칼슘 이온 농도의 조건하에서의 항원에 대한 결합 활성이 높다는 특징을 갖는 항원 결합 도메인인 〔19〕에 기재된 방법.

〔21〕상기 이온 농도의 조건이 pH의 조건인 〔18〕에 기재된 방법.

〔22〕상기 항원 결합 도메인이 pH 산성역 조건하에서의 당해 항원에 대한 결합 활성보다도 pH 중성역 조건하에서의 항원에 대한 결합 활성이 높다는 특징을 갖는 항원 결합 도메인인 〔21〕에 기재된 방법.

〔23〕상기 항원 결합 분자가 상기 항원에 대한 중화활성을 갖는 항원 결합 분자인 〔18〕내지〔22〕중 어느 하나에 기재된 방법.

〔24〕상기 항원 결합 분자가 상기 항원을 발현하는 세포에 대한 세포상해활성을 갖는 항원 결합 분자인 〔18〕내지〔23〕중 어느 하나에 기재된 방법.

〔25〕상기 FcRn 결합 도메인이 항체의 Fc영역을 포함하는 〔18〕내지〔24〕중 어느 하나에 기재된 방법.

〔26〕Fc영역의 EU 넘버링으로 표시되는 부위 중 239번 위치, 252번 위치, 257번 위치, 286번 위치, 307번 위치, 308번 위치, 428번 위치 및 434번 위치의 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산을 치환하는 공정을 포함하는 〔25〕에 기재된 방법.

〔27〕Fc영역의 EU 넘버링으로 표시되는 부위 중；

257번 위치의 아미노산의 Ala로의 치환,

308번 위치의 아미노산의 Pro로의 치환,

428번 위치의 아미노산의 Leu로의 치환, 및

434번 위치의 아미노산의 Tyr로의 치환

의 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 치환을 행하는 공정을 포함하는 〔25〕 또는 〔26〕에 기재된 방법.

〔28〕상기 Fc영역의 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성을 EU 넘버링 297번 위치에 결합한 당쇄가 푸코오스 함유 당쇄인 천연형 인간 IgG의 Fc영역의 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성보다도 증강시키는 공정을 포함하는 〔25〕내지〔27〕중 어느 하나에 기재된 방법.

〔29〕상기 Fcγ 수용체가 FcγRIa, FcγRIIa(R), FcγRIIa(H), FcγRIIb, FcγRIIIa(V) 또는 FcγRIIIa(F)인 〔28〕에 기재된 방법.

〔30〕Fc영역에 있어서의 EU 넘버링으로 표시되는 부위 중 221번 위치, 222번 위치, 223번 위치, 224번 위치, 225번 위치, 227번 위치, 228번 위치, 230번 위치, 231번 위치, 232번 위치, 233번 위치, 234번 위치, 235번 위치, 236번 위치, 237번 위치, 238번 위치, 239번 위치, 240번 위치, 241번 위치, 243번 위치, 244번 위치, 245번 위치, 246번 위치, 247번 위치, 249번 위치, 250번 위치, 251번 위치, 254번 위치, 255번 위치, 256번 위치, 258번 위치, 260번 위치, 262번 위치, 263번 위치, 264번 위치, 265번 위치, 266번 위치, 267번 위치, 268번 위치, 269번 위치, 270번 위치, 271번 위치, 272번 위치, 273번 위치, 274번 위치, 275번 위치, 276번 위치, 278번 위치, 279번 위치, 280번 위치, 281번 위치, 282번 위치, 283번 위치, 284번 위치, 285번 위치, 286번 위치, 288번 위치, 290번 위치, 291번 위치, 292번 위치, 293번 위치, 294번 위치, 295번 위치, 296번 위치, 297번 위치, 298번 위치, 299번 위치, 300번 위치, 301번 위치, 302번 위치, 303번 위치, 304번 위치, 305번 위치, 311번 위치, 313번 위치, 315번 위치, 317번 위치, 318번 위치, 320번 위치, 322번 위치, 323번 위치, 324번 위치, 325번 위치, 326번 위치, 327번 위치, 328번 위치, 329번 위치, 330번 위치, 331번 위치, 332번 위치, 333번 위치, 334번 위치, 335번 위치, 336번 위치, 337번 위치, 339번 위치, 376번 위치, 377번 위치, 378번 위치, 379번 위치, 380번 위치, 382번 위치, 385번 위치, 392번 위치, 396번 위치, 421번 위치, 427번 위치, 428번 위치, 429번 위치, 434번 위치, 436번 위치 및 440번 위치의 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산을 치환하는 공정을 포함하는 〔28〕 또는 〔29〕에 기재된 방법.

〔31〕Fc영역에 있어서의 EU 넘버링으로 표시되는 부위 중；

221번 위치의 아미노산의 Lys 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

222번 위치의 아미노산의 Phe, Trp, Glu 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

223번 위치의 아미노산의 Phe, Trp, Glu 또는 Lys 중 어느 하나로의 치환,

224번 위치의 아미노산의 Phe, Trp, Glu 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

225번 위치의 아미노산의 Glu, Lys 또는 Trp 중 어느 하나로의 치환,

227번 위치의 아미노산의 Glu, Gly, Lys 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

228번 위치의 아미노산의 Glu, Gly, Lys 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

230번 위치의 아미노산의 Ala, Glu, Gly 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

231번 위치의 아미노산의 Glu, Gly, Lys, Pro 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

232번 위치의 아미노산의 Glu, Gly, Lys 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

233번 위치의 아미노산의 Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

234번 위치의 아미노산의 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

235번 위치의 아미노산의 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

236번 위치의 아미노산의 Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

237번 위치의 아미노산의 Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

238번 위치의 아미노산의 Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

239번 위치의 아미노산의 Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

240번 위치의 아미노산의 Ala, Ile, Met 또는 Thr 중 어느 하나로의 치환,

241번 위치의 아미노산의 Asp, Glu, Leu, Arg, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

243번 위치의 아미노산의 Leu, Glu, Leu, Gln, Arg, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

244번 위치의 아미노산의 His로의 치환,

245번 위치의 아미노산의 Ala로의 치환,

246번 위치의 아미노산의 Asp, Glu, His 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

247번 위치의 아미노산의 Ala, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Thr, Val 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

249번 위치의 아미노산의 Glu, His, Gln 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

250번 위치의 아미노산의 Glu 또는 Gln 중 어느 하나로의 치환,

251번 위치의 아미노산의 Phe로의 치환,

254번 위치의 아미노산의 Phe, Met 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

255번 위치의 아미노산의 Glu, Leu 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

256번 위치의 아미노산의 Ala, Met 또는 Pro 중 어느 하나로의 치환,

258번 위치의 아미노산의 Asp, Glu, His, Ser 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

260번 위치의 아미노산의 Asp, Glu, His 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

262번 위치의 아미노산의 Ala, Glu, Phe, Ile 또는 Thr 중 어느 하나로의 치환,

263번 위치의 아미노산의 Ala, Ile, Met 또는 Thr 중 어느 하나로의 치환,

264번 위치의 아미노산의 Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

265번 위치의 아미노산의 Ala, Leu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

266번 위치의 아미노산의 Ala, Ile, Met 또는 Thr 중 어느 하나로의 치환,

267번 위치의 아미노산의 Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

268번 위치의 아미노산의 Asp, Glu, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Thr, Val 또는 Trp 중 어느 하나로의 치환,

269번 위치의 아미노산의 Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

270번 위치의 아미노산의 Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

271번 위치의 아미노산의 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

272번 위치의 아미노산의 Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

273번 위치의 아미노산의 Phe 또는 Ile 중 어느 하나로의 치환,

274번 위치의 아미노산의 Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

275번 위치의 아미노산의 Leu 또는 Trp 중 어느 하나로의 치환,

276번 위치의 아미노산의 Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

278번 위치의 아미노산의 Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val 또는 Trp 중 어느 하나로의 치환,

279번 위치의 아미노산의 Ala로의 치환,

280번 위치의 아미노산의 Ala, Gly, His, Lys, Leu, Pro, Gln, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

281번 위치의 아미노산의 Asp, Lys, Pro 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

282번 위치의 아미노산의 Glu, Gly, Lys, Pro 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

283번 위치의 아미노산의 Ala, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

284번 위치의 아미노산의 Asp, Glu, Leu, Asn, Thr 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

285번 위치의 아미노산의 Asp, Glu, Lys, Gln, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

286번 위치의 아미노산의 Glu, Gly, Pro 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

288번 위치의 아미노산의 Asn, Asp, Glu 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

290번 위치의 아미노산의 Asp, Gly, His, Leu, Asn, Ser, Thr, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

291번 위치의 아미노산의 Asp, Glu, Gly, His, Ile, Gln 또는 Thr 중 어느 하나로의 치환,

292번 위치의 아미노산의 Ala, Asp, Glu, Pro, Thr 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

293번 위치의 아미노산의 Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

294번 위치의 아미노산의 Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

295번 위치의 아미노산의 Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

296번 위치의 아미노산의 Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr 또는 Val 중 어느 하나로의 치환,

297번 위치의 아미노산의 Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

298번 위치의 아미노산의 Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

299번 위치의 아미노산의 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

300번 위치의 아미노산의 Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val 또는 Trp 중 어느 하나로의 치환,

301번 위치의 아미노산의 Asp, Glu, His 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

302번 위치의 아미노산의 Ile로의 치환,

303번 위치의 아미노산의 Asp, Gly 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

304번 위치의 아미노산의 Asp, His, Leu, Asn 또는 Thr 중 어느 하나로의 치환,

305번 위치의 아미노산의 Glu, Ile, Thr 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

311번 위치의 아미노산의 Ala, Asp, Asn, Thr, Val 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

313번 위치의 아미노산의 Phe로의 치환,

315번 위치의 아미노산의 Leu로의 치환,

317번 위치의 아미노산의 Glu 또는 Gln으로의 치환,

318번 위치의 아미노산의 His, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

320번 위치의 아미노산의 Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Pro, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

322번 위치의 아미노산의 Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Pro, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

323번 위치의 아미노산의 Ile로의 치환,

324번 위치의 아미노산의 Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

325번 위치의 아미노산의 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

326번 위치의 아미노산의 Ala, Asp, Glu, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

327번 위치의 아미노산의 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

328번 위치의 아미노산의 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

329번 위치의 아미노산의 Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

330번 위치의 아미노산의 Cys, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

331번 위치의 아미노산의 Asp, Phe, His, Ile, Leu, Met, Gln, Arg, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

332번 위치의 아미노산의 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

333번 위치의 아미노산의 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Ser, Thr, Val 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

334번 위치의 아미노산의 Ala, Glu, Phe, Ile, Leu, Pro 또는 Thr 중 어느 하나로의 치환,

335번 위치의 아미노산의 Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

336번 위치의 아미노산의 Glu, Lys 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,

337번 위치의 아미노산의 Glu, His 또는 Asn 중 어느 하나로의 치환,

339번 위치의 아미노산의 Asp, Phe, Gly, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Ser 또는 Thr 중 어느 하나로의 치환,

376번 위치의 아미노산의 Ala 또는 Val 중 어느 하나로의 치환,

377번 위치의 아미노산의 Gly 또는 Lys 중 어느 하나로의 치환,

378번 위치의 아미노산의 Asp로의 치환,

379번 위치의 아미노산의 Asn으로의 치환,

380번 위치의 아미노산의 Ala, Asn 또는 Ser 중 어느 하나로의 치환,

382번 위치의 아미노산의 Ala 또는 Ile 중 어느 하나로의 치환,

385번 위치의 아미노산의 Glu로의 치환,

392번 위치의 아미노산의 Thr로의 치환,

396번 위치의 아미노산의 Leu로의 치환,

421번 위치의 아미노산의 Lys로의 치환,

427번 위치의 아미노산의 Asn으로의 치환,

428번 위치의 아미노산의 Phe 또는 Leu 중 어느 하나로의 치환,

429번 위치의 아미노산의 Met로의 치환,

434번 위치의 아미노산의 Trp로의 치환,

436번 위치의 아미노산의 Ile로의 치환, 및

440번 위치의 아미노산의 Gly, His, Ile, Leu 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환

의 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 치환을 행하는 공정을 포함하는 〔28〕내지〔30〕중 어느 하나에 기재된 방법.

〔32〕상기 천연형 Fc영역이 EU 넘버링 297번 위치에 결합한 당쇄가 푸코오스 함유 당쇄인 인간 IgG1, 인간 IgG2, 인간 IgG3 또는 인간 IgG4 중 어느 하나의 Fc영역인 〔28〕내지〔31〕중 어느 하나에 기재된 방법.

〔33〕Fc영역의 EU 넘버링 297번 위치에 결합한 당쇄의 조성이 푸코오스 결손 당쇄를 결합한 Fc영역의 비율이 높아지도록, 또는 바이섹팅 N-아세틸글루코사민이 부가된 Fc영역의 비율이 높아지도록, 상기 Fc영역을 수식하는 공정을 포함하는 〔28〕내지〔32〕중 어느 하나에 기재된 방법.

〔34〕아래 (a)~(f)의 공정,

(a) 고칼슘 이온 농도역 조건에 있어서의 항원 결합 도메인의 항원에 대한 결합 활성을 얻는 공정,

(b) 저칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원 결합 도메인의 항원에 대한 결합 활성을 얻는 공정,

(c) (a)에서 얻어진 항원 결합 활성이 (b)에서 얻어진 항원 결합 활성보다 높은 항원 결합 도메인을 선택하는 공정,

(d) (c)에서 선택된 항원 결합 도메인을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 pH 중성역의 조건하에서 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 FcRn 결합 도메인을 코드하는 폴리뉴클레오티드에 연결시키는 공정,

(e) (d)에서 얻어진 폴리뉴클레오티드가 작용 가능하게 연결된 벡터가 도입된 세포를 배양하는 공정, 및

(f) (e)에서 배양된 세포의 배양액으로부터 항원 결합 분자를 회수하는 공정

을 포함하는 면역응답을 유도하는 의약 조성물의 제조방법.

〔35〕아래 (a)~(f)의 공정,

(a) 고칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항체의 항원에 대한 결합 활성을 얻는 공정,

(b) 저칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항체의 항원에 대한 결합 활성을 얻는 공정,

(c) (a)에서 얻어진 항원 결합 활성이 (b)에서 얻어진 항원 결합 활성보다 높은 항체를 선택하는 공정,

(d) (c)에서 선택된 항체의 항원 결합 도메인을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 pH 중성역의 조건하에서 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 FcRn 결합 도메인을 코드하는 폴리뉴클레오티드에 연결시키는 공정,

을 포함하는 면역응답을 유도하는 의약 조성물의 제조방법.

〔36〕아래 (a)~(f)의 공정,

(a) pH 중성역 조건에 있어서의 항원 결합 도메인의 항원에 대한 결합 활성을 얻는 공정,

(b) pH 산성역 조건에 있어서의 항원 결합 도메인의 항원에 대한 결합 활성을 얻는 공정,

을 포함하는 항원 결합 분자의 제조방법.

〔37〕아래 (a)~(f)의 공정,

(a) pH 중성역 조건에 있어서의 항체의 항원에 대한 결합 활성을 얻는 공정,

(b) pH 산성역 조건에 있어서의 항체의 항원에 대한 결합 활성을 얻는 공정,

을 포함하는 항원 결합 분자의 제조방법.

〔38〕상기 항원 결합 분자가 상기 항원에 대한 중화활성을 갖는 항원 결합 분자인 〔34〕내지〔37〕중 어느 하나에 기재된 방법.

〔39〕상기 항원 결합 분자가 상기 항원을 발현하는 세포에 대한 세포상해활성을 갖는 항원 결합 분자인 〔34〕내지〔38〕중 어느 하나에 기재된 방법.

〔40〕상기 FcRn 결합 도메인이 항체의 Fc영역을 포함하는 〔34〕내지〔39〕중 어느 하나에 기재된 방법.

〔41〕상기 Fc영역이 Fc영역의 EU 넘버링으로 표시되는 부위 중 257번 위치, 308번 위치, 428번 위치 및 434번 위치의 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산이 천연형 Fc영역의 대응하는 부위의 아미노산과 상이한 Fc영역인 〔40〕에 기재된 방법.

〔42〕상기 Fc영역이 Fc영역의 EU 넘버링으로 표시되는；

257번 위치의 아미노산이 Ala,

308번 위치의 아미노산이 Pro,

428번 위치의 아미노산이 Leu, 및

434번 위치의 아미노산이 Tyr

의 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산을 포함하는 Fc영역인 〔40〕 또는 〔41〕에 기재된 방법.

〔43〕상기 Fc영역의 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 EU 넘버링 297번 위치에 결합한 당쇄가 푸코오스 함유 당쇄인 천연형 인간 IgG의 Fc영역의 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성보다도 높다는 특징을 갖는 〔40〕내지〔42〕중 어느 하나에 기재된 방법.

〔44〕상기 Fcγ 수용체가 FcγRIa, FcγRIIa(R), FcγRIIa(H), FcγRIIb, FcγRIIIa(V) 또는 FcγRIIIa(F)인 〔43〕에 기재된 방법.

〔45〕상기 Fc영역이 Fc영역에 있어서의 EU 넘버링으로 표시되는 부위 중；

221번 위치의 아미노산이 Lys 또는 Tyr 중 어느 하나,

222번 위치의 아미노산이 Phe, Trp, Glu 또는 Tyr 중 어느 하나,

223번 위치의 아미노산이 Phe, Trp, Glu 또는 Lys 중 어느 하나,

224번 위치의 아미노산이 Phe, Trp, Glu 또는 Tyr 중 어느 하나,

225번 위치의 아미노산이 Glu, Lys 또는 Trp 중 어느 하나,

227번 위치의 아미노산이 Glu, Gly, Lys 또는 Tyr 중 어느 하나,

228번 위치의 아미노산이 Glu, Gly, Lys 또는 Tyr 중 어느 하나,

230번 위치의 아미노산이 Ala, Glu, Gly 또는 Tyr 중 어느 하나,

232번 위치의 아미노산이 Glu, Gly, Lys 또는 Tyr 중 어느 하나,

240번 위치의 아미노산이 Ala, Ile, Met 또는 Thr 중 어느 하나,

244번 위치의 아미노산이 His,

245번 위치의 아미노산이 Ala,

246번 위치의 아미노산이 Asp, Glu, His 또는 Tyr 중 어느 하나,

249번 위치의 아미노산이 Glu, His, Gln 또는 Tyr 중 어느 하나,

250번 위치의 아미노산이 Glu 또는 Gln 중 어느 하나,

251번 위치의 아미노산이 Phe,

254번 위치의 아미노산이 Phe, Met 또는 Tyr 중 어느 하나,

255번 위치의 아미노산이 Glu, Leu 또는 Tyr 중 어느 하나,

256번 위치의 아미노산이 Ala, Met 또는 Pro 중 어느 하나,

260번 위치의 아미노산이 Asp, Glu, His 또는 Tyr 중 어느 하나,

263번 위치의 아미노산이 Ala, Ile, Met 또는 Thr 중 어느 하나,

266번 위치의 아미노산이 Ala, Ile, Met 또는 Thr 중 어느 하나,

273번 위치의 아미노산이 Phe 또는 Ile 중 어느 하나,

275번 위치의 아미노산이 Leu 또는 Trp 중 어느 하나,

279번 위치의 아미노산이 Ala,

281번 위치의 아미노산이 Asp, Lys, Pro 또는 Tyr 중 어느 하나,

286번 위치의 아미노산이 Glu, Gly, Pro 또는 Tyr 중 어느 하나,

288번 위치의 아미노산이 Asn, Asp, Glu 또는 Tyr 중 어느 하나,

301번 위치의 아미노산이 Asp, Glu, His 또는 Tyr 중 어느 하나,

302번 위치의 아미노산이 Ile,

303번 위치의 아미노산이 Asp, Gly 또는 Tyr 중 어느 하나,

305번 위치의 아미노산이 Glu, Ile, Thr 또는 Tyr 중 어느 하나,

313번 위치의 아미노산이 Phe,

315번 위치의 아미노산이 Leu,

317번 위치의 아미노산이 Glu 또는 Gln,

323번 위치의 아미노산이 Ile,

336번 위치의 아미노산이 Glu, Lys 또는 Tyr 중 어느 하나,

337번 위치의 아미노산이 Glu, His 또는 Asn 중 어느 하나,

376번 위치의 아미노산이 Ala 또는 Val 중 어느 하나,

377번 위치의 아미노산이 Gly 또는 Lys 중 어느 하나,

378번 위치의 아미노산이 Asp,

379번 위치의 아미노산이 Asn,

380번 위치의 아미노산이 Ala, Asn 또는 Ser 중 어느 하나,

382번 위치의 아미노산이 Ala 또는 Ile 중 어느 하나,

385번 위치의 아미노산이 Glu,

392번 위치의 아미노산이 Thr,

396번 위치의 아미노산이 Leu,

421번 위치의 아미노산이 Lys,

427번 위치의 아미노산이 Asn,

428번 위치의 아미노산이 Phe 또는 Leu 중 어느 하나,

429번 위치의 아미노산이 Met,

434번 위치의 아미노산이 Trp,

436번 위치의 아미노산이 Ile, 및

의 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산을 포함하는 Fc영역인 〔43〕 또는 〔44〕에 기재된 방법.

〔46〕상기 천연형 Fc영역이 EU 넘버링 297번 위치에 결합한 당쇄가 푸코오스 함유 당쇄인 인간 IgG1, 인간 IgG2, 인간 IgG3 또는 인간 IgG4 중 어느 하나의 Fc영역인 〔43〕내지〔45〕중 어느 하나에 기재된 방법.

〔47〕상기 Fc영역이 Fc영역의 EU 넘버링 297번 위치에 결합한 당쇄의 조성이 푸코오스 결손 당쇄를 결합한 Fc영역의 비율이 높아지도록, 또는 바이섹팅 N-아세틸글루코사민이 부가된 Fc영역의 비율이 높아지도록 수식된 Fc영역인 〔43〕내지〔46〕중 어느 하나에 기재된 방법.

본 발명에 의해 통상의 항체로는 이룰 수 없었던 그 생체내로의 투여에 의해 표적 항원에 대한 약리작용을 발휘할 뿐 아니라 표적 항원에 대한 면역응답을 유도하는 것이 가능한 항원 결합 분자를 포함하는 의약 조성물 및 그의 제조방법이 제공되었다. 이것에 의해 통상의 백신으로는 이룰 수 없었던 표적 항원에 대한 결합 활성 및 표적 세포에 대한 세포상해활성 및 세포증식 억제활성을 가지면서, 표적 항원에 대한 면역응답을 유도함으로써 유효한 암 및 감염증의 치료가 가능해진다.

도 1은 가용형 인간 IL-6 수용체 정상상태 모델(steady-state model)에 있어서의 항마우스 CD4 항체 비투여군과 투여군에 있어서의 마우스 혈장 중 가용형 인간 IL-6 수용체 농도 추이를 나타내는 도면이다. 가로축은 항마우스 CD4 항체 투여로부터의 경과 일수, 세로축은 혈장 중 가용형 인간 IL-6 수용체 농도를 나타낸다.
도 2는 인간 IL-6 수용체 면역관용 정상 마우스 모델(normal mouse model)에 있어서의 통상 항IL-6 수용체 항체 및 pH 의존적 IL-6 수용체 항체 투여군에 있어서의 마우스 혈장 중 가용형 인간 IL-6 수용체 농도 추이를 나타내는 도면이다. 가로축은 항IL-6 수용체 항체의 투여로부터의 경과 일수, 세로축은 혈장 중 가용형 인간 IL-6 수용체 농도를 나타낸다. 검정 동그라미는 대조 마우스의 혈장 중 가용형 인간 IL-6 수용체 농도를 나타낸다. 흰색 동그라미는 H54/L28-IgG1이 투여된 마우스의 혈장 중 가용형 인간 IL-6 수용체 농도, 마름모는 Fv4-IgG1이 투여된 마우스의 혈장 중 가용형 인간 IL-6 수용체 농도를 나타낸다.
도 3은 인간 IL-6 수용체 면역관용 정상 마우스 모델에 있어서의 pH 7.4에 있어서의 FcRn 결합을 증강시킨 통상 항IL-6 수용체 항체 및 pH 7.4에 있어서의 FcRn 결합을 증강시킨 pH 의존적 IL-6 수용체 항체 투여군에 있어서의 마우스 혈장 중 가용형 인간 IL-6 수용체 농도 추이를 나타내는 도면이다. 가로축은 항IL-6 수용체 항체의 투여로부터의 경과 일수, 세로축은 혈장 중 가용형 인간 IL-6 수용체 농도를 나타낸다. 검정 동그라미는 대조 마우스의 혈장 중 가용형 인간 IL-6 수용체 농도를 나타낸다. 흰색 동그라미는 H54/L28-IgG1, 마름모는 Fv4-IgG1, 흰색 세모는 H54/L28-F157, X 및 검정 네모는 Fv4-F157이 각각 투여된 마우스의 혈장 중 가용형 인간 IL-6 수용체 농도를 나타낸다.
도 4는 이온 농도 의존적인 항원 결합 분자의 가용형 항원의 리소좀 이행에 대한 비한정의 작용 모델을 나타내는 도면이다. 혈장 중 이온 농도의 조건하(pH 중성역 또는 고칼슘 이온 농도의 조건하), 혈장 중에서 가용형 항원에 결합한 항원 결합 분자(A)는 비특이적인 엔도시토시스(endocytosis) 등에 의해 세포내에 흡수된(B) 후에, 이행된 산성 엔도솜에 발현하는 FcRn에 FcRn 결합 도메인을 매개로 산성 pH의 조건에 있어서 결합하는 동시에, 엔도솜 내의 이온 농도의 조건하(pH 산성역 또는 저칼슘 이온 농도의 조건하), 항원을 해리한다(C). 해리된 항원은 리소좀으로 이행한 후 분해(D)되는 한편, 항원을 해리한 항원 결합 분자는 FcRn에 결합한 상태에서 세포 표면으로 이행하여 혈장 중의 중성 pH 조건하에서 FcRn으로부터 해리되어 혈장 중으로 되돌아간다(E).
도 5는 pH 7.4에 있어서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 항원 결합 분자의 가용형 항원의 리소좀 이행에 대한 비한정의 작용 모델을 나타내는 도면이다. 혈장 중 이온 농도의 조건하(pH 중성역 또는 고칼슘 이온 농도의 조건하), 혈장 중에서 가용형 항원에 결합한 항원 결합 분자는 FcRn 결합 도메인을 매개로 pH 중성 조건하에서 FcRn에 결합한(A) 후에, 엔도시토시스로 세포내에 흡수된다(B). 산성 엔도솜 내로 이행한 항원 결합 분자는 엔도솜 내의 이온 농도의 조건하(pH 산성역 또는 저칼슘 이온 농도의 조건하)에서 항원을 해리하지 않고(C), 항원을 결합한 항원 결합 분자는 FcRn에 결합한 상태에서 세포 표면 상으로 리사이클된다(D).
도 6은 pH 7.4에 있어서의 FcRn 결합을 증강시킨 이온 농도 의존적인 항원 결합 분자의 가용형 항원의 리소좀 이행에 대한 비한정의 작용 모델을 나타내는 도면이다. 혈장 중 이온 농도의 조건하(pH 중성역 또는 고칼슘 이온 농도의 조건하), 혈장 중에서 가용형 항원에 결합한 항원 결합 분자는 FcRn 결합 도메인을 매개로 pH 중성 조건하에서 FcRn에 결합한(A) 후에, 엔도시토시스로 세포내에 흡수된다(B). 산성 엔도솜 내로 이행된 항원 결합 분자는 엔도솜 내의 이온 농도의 조건하(pH 산성역 또는 저칼슘 이온 농도의 조건하)에서 항원을 해리한다(C). 해리된 항원은 리조솜으로 이행된 후 분해(D)되는 한편, 항원을 해리한 항원 결합 분자는 FcRn에 결합한 상태에서 세포 표면 상으로 리사이클된다(E).
도 7은 시험 1의 3마리의 마우스에 있어서의 Fv4-F157 투여 개체(#7, 8 및 9)의 개체별 혈장 중 가용형 인간 IL-6 수용체 농도 추이 및 마우스 항인간 IL-6 수용체 항체의 항체가 추이를 나타내는 도면이다. 가로축은 항IL-6 수용체 항체의 투여로부터의 경과 일수, 좌측 세로축은 혈장 중 가용형 인간 IL-6 수용체 농도, 우측 세로축은 마우스 항hsIL-6R 항체의 항체가의 지표가 되는 ECL값을 나타낸다. 실선은 혈장 중 가용형 인간 IL-6 수용체 농도, 파선은 ECL값을 나타낸다. 마름모, 흰색 네모 및 세모는 각각 #7, 8 및 9의 개체의 혈장 중 가용형 인간 IL-6 수용체 농도의 추이를 나타내고, X, 검정 네모 및 검정 동그라미는 각각 #7, 8 및 9의 개체에 있어서의 ECL값의 추이를 나타낸다.
도 8은 시험 2의 3마리의 마우스에 있어서의 Fv4-F157 투여 개체(#10, 11 및 12)의 개체별 혈장 중 가용형 인간 IL-6 수용체 농도 추이 및 마우스 항인간 IL-6 수용체 항체의 항체가 추이를 나타내는 도면이다. 가로축은 항IL-6 수용체 항체의 투여로부터의 경과 일수, 좌측 세로축은 혈장 중 가용형 인간 IL-6 수용체 농도, 우측 세로축은 마우스 항인간 IL-6 수용체 항체의 항체가의 지표가 되는 ECL값을 나타낸다. 실선은 혈장 중 가용형 인간 IL-6 수용체 농도, 파선은 ECL값을 나타낸다. 마름모, 흰색 네모 및 세모는 각각 #10, 11 및 12의 개체의 혈장 중 가용형 인간 IL-6 수용체 농도를 나타내고, X, 검정 네모 및 검정 동그라미는 각각 #10, 11 및 12의 개체에 있어서의 ECL값의 추이를 나타낸다.
도 9는 시험 1의 3마리의 마우스에 있어서의 Fv4-F157 투여 개체(#7, 8 및 9)의 개체별 마우스 항hsIL-6R 항체의 항체가 추이 및 마우스 항Fv4-F157 항체의 항체가 추이를 나타내는 도면이다. 가로축은 항IL-6 수용체 항체의 투여로부터의 경과 일수, 세로축은 마우스 항인간 IL-6 수용체 항체의 항체가 및 마우스 항Fv4-F157 항체의 항체가의 지표가 되는 ECL값을 나타낸다. 실선은 마우스 항Fv4-F157 항체의 항체가의 지표가 되는 ECL값의 추이, 파선은 마우스 항인간 IL-6 수용체 항체의 항체가의 지표가 되는 ECL값의 추이를 나타낸다. 마름모, 흰색 네모 및 검정 세모는 각각 #7, 8 및 9의 개체에 있어서의 마우스 항Fv4-F157 항체의 항체가의 지표가 되는 ECL값의 추이를 나타내고, 흰색 네모, 검정 네모 및 흰색 세모는 각각 #7, 8 및 9의 개체에 있어서의 마우스 항인간 IL-6 수용체 항체의 항체가의 지표가 되는 ECL값의 추이를 나타낸다.
도 10은 시험 2의 3마리의 마우스에 있어서의 Fv4-F157 투여 개체(#10, 11 및 12)의 개체별 마우스 항인간 IL-6 수용체 항체의 항체가 추이 및 마우스 항Fv4-F157 항체의 항체가 추이를 나타내는 도면이다. 가로축은 항IL-6 수용체 항체의 투여로부터의 경과 일수, 세로축은 마우스 항인간 IL-6 수용체 항체의 항체가 및 마우스 항Fv4-F157 항체의 항체가의 지표가 되는 ECL값을 나타낸다. 실선은 마우스 항Fv4-F157 항체의 항체가의 지표가 되는 ECL값의 추이, 파선은 마우스 항hsIL-6R 항체의 항체가의 지표가 되는 ECL값의 추이를 나타낸다. 마름모, 흰색 네모 및 검정 세모는 각각 #10, 11 및 12의 개체에 있어서의 마우스 항Fv4-F157 항체의 항체가의 지표가 되는 ECL값의 추이를 나타내고, 흰색 네모, 검정 네모 및 흰색 세모는 각각 #10, 11 및 12의 개체에 있어서의 마우스 항인간 IL-6 수용체 항체의 항체가의 지표가 되는 ECL값의 추이를 나타낸다.
도 11은 표적 항원이 융합된 항체의 암세포 및 항원 제시 세포에 대한 비한정의 작용 메커니즘의 모델을 나타내는 도면이다.
도 12는 pH 중성역에 있어서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖고, 표적 항원에 대해 이온 농도 의존적인 결합 활성을 갖는 항원 결합 분자의 암세포 및 항원 제시 세포에 대한 비한정의 작용 메커니즘의 모델을 나타내는 도면이다.
도 13은 칼슘 의존적 결합 항체의 혈장 중(Ca²⁺ 2 mM)과 엔도솜 내(Ca²⁺ 3 μM)의 항원으로의 상호작용의 양식(i) 및 pH 및 칼슘 의존적 결합 항체의 혈장 중(pH 7.4, Ca²⁺ 2 mM)과 엔도솜 내(pH 6.0, Ca²⁺ 3 μM)의 항원으로의 상호작용의 양식(ii)을 나타내는 도면이다.
도 14는 인간 Vk5-2 서열을 포함하는 항체와 인간 Vk5-2 서열 중의 당쇄 부가 서열이 개변된 hVk5-2_L65 서열을 포함하는 항체의 이온 교환 크로마토그램을 나타내는 도면이다. 실선은 인간 Vk5-2 서열을 포함하는 항체(중쇄：CIM_H, 서열번호：45 및 경쇄：hVk5-2, 서열번호：50)의 크로마토그램, 파선은 hVk5-2_L65 서열을 갖는 항체(중쇄：CIM_H(서열번호：45), 경쇄：hVk5-2_L65(서열번호：53))의 크로마토그램을 나타낸다.
도 15는 Ca 의존적으로 항원에 결합하는 항체 유전자 라이브러리가 도입된 대장균으로부터 단리된 290 클론의 서열정보의 아미노산 분포(Library로 표시된다)와 설계된 아미노산 분포(Design으로 표시된다)의 관계를 나타내는 그래프이다. 가로축은 Kabat 넘버링으로 표시되는 아미노산의 부위가 표시된다. 세로축은 아미노산 분포의 비율이 표시된다.
도 16은 고칼슘 이온 농도의 조건(1.2 mM)하에 있어서의 항IL-6R 항체(토실리주맙), 6RC1IgG_010 항체, 6RC1IgG_012 항체 및 6RC1IgG_019 항체의 센서그램을 나타내는 도면이다.
도 17은 저칼슘 이온 농도의 조건(3 μM)하에 있어서의 항IL-6R 항체(토실리주맙), 6RC1IgG_010 항체, 6RC1IgG_012 항체 및 6RC1IgG_019 항체의 센서그램을 나타내는 도면이다.
도 18은 X선결정구조 해석으로 결정된 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 중쇄 CDR3의 구조를 나타내는 도면이다. (i)은 칼슘 이온이 존재하는 결정화 조건에서 얻어진 결정구조의 중쇄 CDR3, (ii)는 칼슘 이온이 존재하지 않는 결정화 조건에서 얻어진 결정구조의 중쇄 CDR3를 나타내는 도면이다.
도 19는 H54/L28-IgG1 항체, FH4-IgG1 항체 및 6RL#9-IgG1 항체의 정상 마우스의 혈장 중 항체 농도의 추이를 나타내는 도면이다.
도 20은 H54/L28-IgG1 항체, FH4-IgG1 항체 및 6RL#9-IgG1 항체의 정상 마우스의 혈장 중 가용형 인간 IL-6 수용체(hsIL-6R)의 농도 추이를 나타내는 도면이다.
도 21은 H54/L28-N434W 항체, FH4-N434W 항체 및 6RL#9-N434W 항체의 정상 마우스의 혈장 중 항체 농도의 추이를 나타내는 도면이다.
도 22는 H54/L28-N434W 항체, FH4-N434W 항체 및 6RL#9-N434W 항체의 정상 마우스의 혈장 중 가용형 인간 IL-6 수용체(hsIL-6R)의 농도 추이를 나타내는 도면이다.
도 23은 pH 의존적으로 항원에 결합하는 항체 유전자 라이브러리가 도입된 대장균으로부터 단리된 132 클론의 서열정보의 아미노산 분포(Library로 표시된다)와 설계된 아미노산 분포(Design으로 표시된다)의 관계를 나타내는 도면이다. 가로축은 Kabat 넘버링으로 표시되는 아미노산의 부위가 표시된다. 세로축은 아미노산 분포의 비율이 표시된다.
도 24는 항IL-6R 항체(토실리주맙), 6RpH#01 항체, 6RpH#02 항체 및 6RpH#03 항체의 pH 7.4에 있어서의 센서그램을 나타내는 도면이다. 가로축은 시간, 세로축은 RU값을 나타낸다.
도 25는 항IL-6R 항체(토실리주맙), 6RpH#01 항체, 6RpH#02 항체 및 6RpH#03 항체의 pH 6.0에 있어서의 센서그램을 나타내는 도면이다. 가로축은 시간, 세로축은 RU값을 나타낸다.
도 26은 항체 비투여군, Fv4-mIgG1, Fv4-mIgG2a, Fv4-mF3, Fv4-mFa30 및 H54/L28-mF3 투여군의 평균 혈장 중 hsIL-6R 농도 추이를 나타내는 도면이다.
도 27은 Fv4-mIgG1 투여군의 각 개체의 마우스 항인간 IL-6 수용체 항체(항hsIL-6R 항체)의 항체가 추이를 나타내는 도면이다.
도 28은 Fv4-mIgG2a 투여군의 각 개체의 마우스 항인간 IL-6 수용체 항체(항hsIL-6R 항체)의 항체가 추이를 나타내는 도면이다.
도 29는 Fv4-mF3 투여군의 각 개체의 마우스 항인간 IL-6 수용체 항체(항hsIL-6R 항체)의 항체가 추이를 나타내는 도면이다.
도 30은 Fv4-mFa30 투여군의 각 개체의 마우스 항인간 IL-6 수용체 항체(항hsIL-6R 항체)의 항체가 추이를 나타내는 도면이다.
도 31은 H54/L28-mF3 투여군의 각 개체의 마우스 항인간 IL-6 수용체 항체(항hsIL-6R 항체)의 항체가 추이를 나타내는 도면이다.
도 32a는 마우스 인터류킨-6 수용체(Il6ra) 유전자의 게놈 DNA의 구조(1)와 삽입되는 녹인 벡터(knock-in vector)(2)의 관계를 모식적으로 나타내는 도면이다. 녹인 벡터는 완전장 인간 인터류킨-6 수용체(hIL6R) cDNA, hp7 서열, 폴리 A 부가 시그날 및 네오마이신 내성 유전자를 갖는다.
도 32b는 마우스 인터류킨-6 수용체 유전자의 게놈 DNA(a)와 녹인 벡터(b)가 상동성 재조합을 일으켜 녹인된 게놈 DNA(c)가 생성되는 모습을 모식적으로 나타내는 도면이다. 또한 (c)에 재조합 효소 Cre를 작용시켜서 네오마이신 내성 유전자 카세트를 제거함으로써 인간 인터류킨-6 수용체 유전자 녹인 대립유전자(knock-in allele)(d)를 완성시키는 과정을 나타낸다. 도면 중의 화살표는 인간 인터류킨-6 수용체 유전자의 녹인을 검출하기 위해 사용한 프라이머의 설정 위치를 나타낸다.
도 33은 인간 인터류킨-6 수용체 유전자 녹인 마우스의 수립 과정에서 얻어진 각 유전자형을 해석한 PCR의 대표예를 나타낸다.
도 34는 인간 인터류킨-6 수용체 유전자 녹인 마우스 및 야생형 마우스에 있어서의 인터류킨-6 수용체의 유전자 발현 특성을 나타내는 도면이다.
도 35는 호모형 및 헤테로형의 인간 인터류킨-6 수용체 유전자 녹인 마우스 및 야생형 마우스에 있어서의 혈장 중 가용형 인간 인터류킨-6 수용체(hsIL-6R) 농도의 측정결과를 나타내는 그래프이다. KI/KI，KI/+ 및 +/+는 각각 호모형 녹인 마우스, 헤테로형 녹인 마우스 및 야생형을 나타낸다.
도 36은 야생형 마우스 및 호모형의 인간 인터류킨-6 수용체 유전자 녹인 마우스에서의 종 특이적인 인터류킨-6(리간드)에 대한 반응성을 나타낸 그래프이다.

아래의 정의 및 상세한 설명은 본 명세서에 있어서 설명하는 본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해 제공된다.

아미노산

본 명세서에 있어서는 예를 들면 Ala/A, Leu/L, Arg/R, Lys/K, Asn/N, Met/M, Asp/D, Phe/F, Cys/C, Pro/P, Gln/Q, Ser/S, Glu/E, Thr/T, Gly/G, Trp/W, His/H, Tyr/Y, Ile/I, Val/V로 표시되는 바와 같이, 아미노산을 1문자 코드 또는 3문자 코드, 또는 그 양쪽으로 표기한다.

항원

본 명세서에 있어서 항원은 특별히 한정되지 않고, 생체의 면역응답을 유도함으로써 당해 생체의 면역계의 공격 대상이 될 수 있는 분자라면 어떠한 항원이어도 된다. 항원의 예로서는, 예를 들면 종양세포에 특이적으로 발현하고 정상세포에 발현하지 않는 분자(네오에피토프)를 바람직하게 들 수 있다. 또한 세균, 바이러스 등의 생체에 감염시키는 외래성 생물종에 발현하고 생체에 발현하지 않는 분자도 또한 바람직하게 들 수 있다.「종양세포에 특이적으로 발현하고 정상세포에 발현하지 않는」 또는 「생체에 감염시키는 외래성 생물종에 발현하고 생체에 발현하지 않는」다는 것은 「종양세포와 정상세포」 또는 「생체에 감염시키는 외래성 생물종과 생체」 사이에 있어서 분자의 질적 또는 양적인 상위가 있는 것을 나타낸다. 예를 들면, 가령 정상세포에 발현하고 있더라도 종양세포에 발현하는 양이 당해 정상세포에 발현하는 양보다도 훨씬 큰 분자라면, 본 발명에 있어서 당해 분자는 종양세포와 정상세포 사이에 있어서 분자의 양적인 상위가 있다고 할 수 있다. 또한 가령 동일 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드의 종양세포 및 정상세포에 있어서의 발현량이 같은 정도이더라도, 종양세포에 발현하는 폴리펩티드가 인산화 등의 번역 후 수식 등을 받고 있는 것에 대해 정상세포에 발현하는 폴리펩티드가 그러한 수식 등을 받고 있지 않을 때는, 본 발명에 있어서 당해 분자는 종양세포와 정상세포 사이에 있어서 분자의 질적인 상위가 있다고 할 수 있다.

당해 분자로서는 ALK 수용체(플레이오트로핀 수용체), 플레이오트로핀, KS 1/4 췌장암 항원, 난소암 항원(CA125), 전립선산 인산, 전립선 특이적 항원(PSA), 멜라노머 관련 항원 p97, 멜라노머 항원 gp75, 거분자량 멜라노머 항원(HMW-MAA), 전립선 특이적 막 항원, 암성 배 항원(CEA), 다형 상피 뮤신 항원, 인간 유지방구 항원, CEA, TAG-72, CO17-1A, GICA 19-9, CTA-1 및 LEA 등의 결장 직장 종양 관련 항원, 버킷 림프종 항원-38.13, CD19, 인간 B 림프종 항원-CD20, CD33, 강글리오시드 GD2, 강글리오시드 GD3, 강글리오시드 GM2 및 강글리오시드 GM3 등의 멜라노머 특이적 항원, 종양 특이적 이식형 세포 표면 항원(TSTA), T항원, DNA 종양 바이러스 및 RNA 종양 바이러스의 엔벨로프 항원 등의 바이러스에 의해 유도되는 종양 항원, 결장의 CEA, 5T4 암태아 트로포블라스트 당단백질 및 방광 종양 암태아 항원 등의 암태아 항원α-페토프로테인, 인간 폐암 항원 L6 및 L20 등의 분화 항원, 섬유육종의 항원, 인간 백혈병 T세포 항원-Gp37, 신생 당단백질, 스핑고지질, EGFR(상피 증식인자 수용체) 등의 유방암 항원, NY-BR-16, NY-BR-16 및 HER2 항원(p185HER2), 다형 상피 뮤신(PEM), 악성 인간 림프구 항원-APO-1, 태아 적혈구에 확인되는 I항원 등의 분화 항원, 성인 적혈구에 확인되는 초기 내배엽 I항원, 이식전의 배(胚), 위암에 확인되는 I(Ma), 유선 상피에 확인되는 M18, M39, 골수세포에 확인되는 SSEA-1, VEP8, VEP9, Myl, VIM-D5, 결장 직장암에 확인되는 D156-22, TRA-1-85(혈액군 H), 정소 및 난소암에 확인되는 SCP-1, 결장암에 확인되는 C14, 폐암에 확인되는 F3, 위암에 확인되는 AH6, Y 합텐, 배성 암세포에 확인되는 Ley, TL5(혈액군 A), A431 세포에 확인되는 EGF 수용체, 췌장암에 확인되는 E1 시리즈(혈액군 B), 배성 암세포에 확인되는 FC10.2, 위암 항원, 선암에 확인되는 CO-514(혈액군 Lea), 선암에 확인되는 NS-10, CO-43(혈액군 Leb), A431 세포의 EGF 수용체에 확인되는 G49, 결장암에 확인되는 MH2(혈액군 ALeb/Ley), 결장암에 확인되는 19.9, 위암 뮤신, 골수세포에 확인되는 T5A7, 멜라노머에 확인되는 R24, 배성 암세포에 확인되는 4.2, GD3, D1.1, OFA-1, GM2, OFA-2, GD2, 및 M1:22:25:8 및 4~8 세포 단계의 배(胚)에 확인되는 SSEA-3 및 SSEA-4, 피하 T세포 림프종 항원, MART-1 항원, 시알릴 Tn(STn) 항원, 결장암 항원 NY-CO-45, 폐암 항원 NY-LU-12 변이체 A, 선암 항원 ART1, 종양 수반성 관련 뇌-정소암 항원(암신경 항원 MA2, 종양 수반성 신경 항원), 신경암 복부 항원2(NOVA2), 혈액세포암 항원 유전자 520, 종양 관련 항원 CO-029, 종양 관련 항원 MAGE-C1(암/정소 항원 CT7), MAGE-B1(MAGE-XP 항원), MAGE-B2(DAM6), MAGE-2, MAGE-4a, MAGE-4b 및 MAGE-X2, 암-정소 항원(NY-EOS-1), YKL-40 및 상기 폴리펩티드 중 어느 하나의 단편 또는 이들에 대해 수식된 구조 등(상기 수식 인산기나 당쇄 등)을 종양 항원으로서 바람직하게 들 수 있다.

외래성 생물종의 항원으로서는 탄저균(Bacillus anthracis)(탄저균, 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 바리올라 메이저(Variola major)(천연두) 및 다른 폭스 바이러스, 야생 토끼병균(Francisella tularensis)(야생 토끼병), 및 바이러스성 출혈열을 발생시키는 것, LCM, 주닌 바이러스(Junin virus), 마추포 바이러스(Machupo virus), 구아나리토 바이러스(Guanarito virus) 및 라사열을 발생시키는 것 등의 아레나바이러스(Arenavirus), 리프트 계곡열을 발생시키는 것 등의 분야바이러스(Bunyavirus) 및 한타바이러스(Hantavirus), 칼리시바이러스(Calicivirus), A형, B형 및 C형 간염, 웨스트 나일 바이러스(West Nile Virus), 라크로스(LaCrosse), 캘리포니아 뇌염(California encephalitis), VEE, EEE, WEE, 일본뇌염 바이러스(Japanese Encephalitis Virus) 등의 바이러스성 뇌염, 키아사누르 포레스트 질병 바이러스(Kyasanur Forest Virus), 진드기 매개성 출혈열 바이러스(Tickborne hemorrhagic fever virus), 크리미아-콩고 출혈열 바이러스(Crimean-Congo Hemorrhagic fever virus), 진드기 매개성 뇌염 바이러스(Tickborne encephalitis viruses), 황열병(Yellow fever), 다제내성 TB, 인플루엔자, 다른 리케챠 및 광견병, 플라바이러스(Flavirus), 뎅기열(Dengue), 필로바이러스(Filovirus), 에볼라(Ebola), 마버그류 비저균(Marburg Burkholderia pseudomallei), 콕시엘라 브루네티(Coxiella burnetii)(Q열), 브루셀라종(Brucella species)(브루셀라증), 비저균(Burkholderia mallei)(비저), 리신독소(피마자(Ricinus communis) 유래), 클로스트리디움 퍼프린겐스(Clostridium perfringens)의 ε독소, 스타필로코커스 엔테로톡신 B(Staphylococcus enterotoxin B), 발진티푸스(Typhus fever)(발진티푸스 리케챠(Rickettsia prowazekii)), 식품 및 수매개성 병원체, 설사 원성 대장균(Diarrheagenic E.coli), 병원성 비브리오(Pathogenic Vibrios), 시겔라종(Shigella species), 살모넬라(Salmonella), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica) 등의 세균 및 크립토스포리디움 파비움(Cryptosporidium parvum), 시클로스포라 카야타넨시스(Cyclospora cayatanensis), 지아디아 램블리아(Giardia lamblia), 엔타모에바 히스톨리티카(Entamoeba histolytica), 톡소플라스마(Toxoplasma), 미포자충(Microsporidia) 등의 원충에 발현하는 분자가 포함된다.

항원으로서는 하기와 같은 분자；17-IA, 4-1BB, 4Dc, 6-케토-PGF1a, 8-이소-PGF2a, 8-옥소-dG, A1 아데노신 수용체, A33, ACE, ACE-2, 액티빈, 액티빈 A, 액티빈 AB, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 RIA, 액티빈 RIA ALK-2, 액티빈 RIB ALK-4, 액티빈 RIIA, 액티빈 RIIB, ADAM, ADAM10, ADAM12, ADAM15, ADAM17/TACE, ADAM8, ADAM9, ADAMTS, ADAMTS4, ADAMTS5, 아드레신(Addressins), aFGF, ALCAM, ALK, ALK-1, ALK-7, 알파-1-안티트립신, 알파-V/베타-1 안타고니스트, ANG, Ang, APAF-1, APE, APJ, APP, APRIL, AR, ARC, ART, 아르테민, 항Id, ASPARTIC, 심방성 나트륨 이뇨인자, av/b3 인테그린, Axl, b2M, B7-1, B7-2, B7-H, B-림프구 자극인자(BlyS), BACE, BACE-1, Bad, BAFF, BAFF-R, Bag-1, BAK, Bax, BCA-1, BCAM, Bcl, BCMA, BDNF, b-ECGF, bFGF, BID, Bik, BIM, BLC, BL-CAM, BLK, BMP, BMP-2 BMP-2a, BMP-3 오스테오게닌(Osteogenin), BMP-4BMP-2b, BMP-5, BMP-6 Vgr-1, BMP-7(OP-1), BMP-8(BMP-8a, OP-2), BMPR, BMPR-IA(ALK-3), BMPR-IB(ALK-6), BRK-2, RPK-1, BMPR-II(BRK-3), BMP, b-NGF, BOK, 봄베신, 골 유래 신경 영양인자(Bone-derived neurotrophic factor), BPDE, BPDE-DNA, BTC, 보체인자 3(C3), C3a, C4, C5, C5a, C10, CA125, CAD-8, 칼시토닌, cAMP, 암 태아성 항원(CEA), 암 관련 항원, 카텝신 A, 카텝신 B, 카텝신 C/DPPI, 카텝신 D, 카텝신 E, 카텝신 H, 카텝신 L, 카텝신 O, 카텝신 S, 카텝신 V, 카텝신 X/Z/P, CBL, CCI, CCK2, CCL, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9/10, CCR, CCR1, CCR10, CCR10, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CD1, CD2, CD3, CD3E, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD27L, CD28, CD29, CD30, CD30L, CD32, CD33(p67 단백질), CD34, CD38, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD49a, CD52, CD54, CD55, CD56, CD61, CD64, CD66e, CD74, CD80(B7-1), CD89, CD95, CD123, CD137, CD138, CD140a, CD146, CD147, CD148, CD152, CD164, CEACAM5, CFTR, cGMP, CINC, 보툴리눔 독소(Botulinum toxin), 웰치균 독소(Clostridium perfringens toxin), CKb8-1, CLC, CMV, CMV UL, CNTF, CNTN-1, COX, C-Ret, CRG-2, CT-1, CTACK, CTGF, CTLA-4, CX3CL1, CX3CR1, CXCL, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCR, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, 사이토케라틴 종양 관련 항원, DAN, DCC, DcR3, DC-SIGN, 보체 제어인자(Decay accelerating factor), des(1-3)-IGF-I(뇌 IGF-1), Dhh, 디곡신, DNAM-1, Dnase, Dpp, DPPIV/CD26, Dtk, ECAD, EDA, EDA-A1, EDA-A2, EDAR, EGF, EGFR(ErbB-1), EMA, EMMPRIN, ENA, 엔도텔린 수용체, 엔케팔리나제, eNOS, Eot, 에오탁신 1, EpCAM, 에프린 B2/EphB4, EPO, ERCC, E-셀렉틴, ET-1, 팩터 IIa, 팩터 VII, 팩터 VIIIc, 팩터 IX, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP), Fas, FcR1, FEN-1, 페리틴, FGF, FGF-19, FGF-2, FGF3, FGF-8, FGFR, FGFR-3, 피브린, FL, FLIP, Flt-3, Flt-4, 난포 자극 호르몬, 프랙탈카인, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, G250, Gas6, GCP-2, GCSF, GD2, GD3, GDF, GDF-1, GDF-3(Vgr-2), GDF-5(BMP-14, CDMP-1), GDF-6(BMP-13, CDMP-2), GDF-7(BMP-12, CDMP-3), GDF-8(미오스타틴), GDF-9, GDF-15(MIC-1), GDNF, GDNF, GFAP, GFRa-1, GFR-알파1, GFR-알파2, GFR-알파3, GITR, 글루카곤, Glut4, 당단백질IIb/IIIa(GPIIb/IIIa), GM-CSF, gp130, gp72, GRO, 성장 호르몬 방출인자, 합텐(NP-cap 또는 NIP-cap), HB-EGF, HCC, HCMV gB 엔벨로프 당단백질, HCMV gH 엔벨로프 당단백질, HCMV UL, 조혈 성장 인자(HGF), Hep B gp120, 헤파라나제, Her2, Her2/neu(ErbB-2), Her3(ErbB-3), Her4(ErbB-4), 단순 헤르페스 바이러스(HSV) gB 당단백질, HSV gD 당단백질, HGFA, 고분자량 흑색종 관련 항원(HMW-MAA), HIV gp120, HIV IIIB gp 120 V3 루프, HLA, HLA-DR, HM1.24, HMFG PEM, HRG, Hrk, 인간 심장 미오신, 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV), 인간 성장 호르몬(HGH), HVEM, I-309, IAP, ICAM, ICAM-1, ICAM-3, ICE, ICOS, IFNg, Ig, IgA 수용체, IgE, IGF, IGF 결합 단백질, IGF-1R, IGFBP, IGF-I, IGF-II, IL, IL-1, IL-1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-5R, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-18R, IL-23, 인터페론(INF)-알파, INF-베타, INF-감마, 인히빈, iNOS, 인슐린 A쇄, 인슐린 B쇄, 인슐린 유사 증식 인자 1, 인테그린 알파 2, 인테그린 알파 3, 인테그린 알파 4, 인테그린 알파 4/베타 1, 인테그린 알파 4/베타 7, 인테그린 알파 5(알파 V), 인테그린 알파 5/베타 1, 인테그린 알파 5/베타 3, 인테그린 알파 6, 인테그린 베타 1, 인테그린 베타 2, 인터페론 감마, IP-10, I-TAC, JE, 칼리크레인 2, 칼리크레인 5, 칼리크레인 6, 칼리크레인 11, 칼리크레인 12, 칼리크레인 14, 칼리크레인 15, 칼리크레인 L1, 칼리크레인 L2, 칼리크레인 L3, 칼리크레인 L4, KC, KDR, 케라티노사이트 증식 인자(KGF), 라미닌 5, LAMP, LAP, LAP(TGF-1), 잠재적 TGF-1, 잠재적 TGF-1 bp1, LBP, LDGF, LECT2, 레프티, 루이스-Y 항원, 루이스-Y 관련 항원, LFA-1, LFA-3, Lfo, LIF, LIGHT, 리포단백질, LIX, LKN, Lptn, L-셀렉틴, LT-a, LT-b, LTB4, LTBP-1, 폐 표면, 황체 형성 호르몬, 림포톡신 베타 수용체, Mac-1, MAdCAM, MAG, MAP2, MARC, MCAM, MCAM, MCK-2, MCP, M-CSF, MDC, Mer, METALLOPROTEASES, MGDF 수용체, MGMT, MHC(HLA-DR), MIF, MIG, MIP, MIP-1-알파, MK, MMAC1, MMP, MMP-1, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-2, MMP-24, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MPIF, Mpo, MSK, MSP, 뮤신(Muc1), MUC18, 뮬러리안 억제 물질, Mug, MuSK, NAIP, NAP, NCAD, N-C 아드헤린, NCA 90, NCAM, NCAM, 네프릴리신, 뉴로트로핀-3, -4, 또는 -6, 뉴르투린, 신경 성장 인자(NGF), NGFR, NGF-베타, nNOS, NO, NOS, Npn, NRG-3, NT, NTN, OB, OGG1, OPG, OPN, OSM, OX40L, OX40R, p150, p95, PADPr, 부갑상선 호르몬, PARC, PARP, PBR, PBSF, PCAD, P-카드헤린, PCNA, PDGF, PDGF, PDK-1, PECAM, PEM, PF4, PGE, PGF, PGI2, PGJ2, PIN, PLA2, 태반성 알칼리포스파타아제(PLAP), PlGF, PLP, PP14, 프로인슐린, 프로릴랙신(prorelaxin), 프로테인 C, PS, PSA, PSCA, 전립선 특이적 막항원(PSMA), PTEN, PTHrp, Ptk, PTN, R51, RANK, RANKL, RANTES, RANTES, 릴랙신 A쇄, 릴랙신 B쇄, 레닌, 호흡기 다핵체 바이러스(RSV)F, RSV Fgp, Ret, 류머티즘 인자, RLIP76, RPA2, RSK, S100, SCF/KL, SDF-1, SERINE, 혈청 알부민, sFRP-3, Shh, SIGIRR, SK-1, SLAM, SLPI, SMAC, SMDF, SMOH, SOD, SPARC, Stat, STEAP, STEAP-II, TACE, TACI, TAG-72(종양 관련 당단백질-72), TARC, TCA-3, T세포 수용체(예를 들면 T세포 수용체 알파/베타), TdT, TECK, TEM1, TEM5, TEM7, TEM8, TERT, 고환 PLAP 유사 알칼리포스파타아제, TfR, TGF, TGF-알파, TGF-베타, TGF-베타 Pan Specific, TGF-베타RI(ALK-5), TGF-베타RII, TGF-베타RIIb, TGF-베타RIII, TGF-베타1, TGF-베타2, TGF-베타3, TGF-베타4, TGF-베타5, 트롬빈, 흉선 Ck-1, 갑상선 자극 호르몬, Tie, TIMP, TIQ, 조직인자, TMEFF2, Tmpo, TMPRSS2, TNF, TNF-알파, TNF-알파베타, TNF-베타2, TNFc, TNF-RI, TNF-RII, TNFRSF10A(TRAIL R1 Apo-2, DR4), TNFRSF10B(TRAIL R2 DR5, KILLER, TRICK-2A, TRICK-B), TNFRSF10C(TRAIL R3 DcR1, LIT, TRID), TNFRSF10D(TRAIL R4 DcR2, TRUNDD), TNFRSF11A(RANK ODF R, TRANCE R), TNFRSF11B(OPG OCIF, TR1), TNFRSF12(TWEAK R FN14), TNFRSF13B(TACI), TNFRSF13C(BAFF R), TNFRSF14(HVEM ATAR, HveA, LIGHT R, TR2), TNFRSF16(NGFR p75NTR), TNFRSF17(BCMA), TNFRSF18(GITR AITR), TNFRSF19(TROY TAJ, TRADE), TNFRSF19L(RELT), TNFRSF1A(TNF RI CD120a, p55-60), TNFRSF1B(TNF RII CD120b, p75-80), TNFRSF26(TNFRH3), TNFRSF3(LTbR TNF RIII, TNFC R), TNFRSF4(OX40 ACT35, TXGP1 R), TNFRSF5(CD40 p50), TNFRSF6(Fas Apo-1, APT1, CD95), TNFRSF6B(DcR3 M68, TR6), TNFRSF7(CD27), TNFRSF8(CD30), TNFRSF9(4-1BB CD137, ILA), TNFRSF21(DR6), TNFRSF22(DcTRAIL R2 TNFRH2), TNFRST23(DcTRAIL R1 TNFRH1), TNFRSF25(DR3 Apo-3, LARD, TR-3, TRAMP, WSL-1), TNFSF10(TRAIL Apo-2 리간드, TL2), TNFSF11(TRANCE/RANK 리간드 ODF, OPG 리간드), TNFSF12(TWEAK Apo-3 리간드, DR3 리간드), TNFSF13(APRIL TALL2), TNFSF13B(BAFF BLYS, TALL1, THANK, TNFSF20), TNFSF14(LIGHT HVEM 리간드, LTg), TNFSF15(TL1A/VEGI), TNFSF18(GITR 리간드 AITR 리간드, TL6), TNFSF1A(TNF-a 코넥틴(Conectin), DIF, TNFSF2), TNFSF1B(TNF-b LTa, TNFSF1), TNFSF3(LTb TNFC, p33), TNFSF4(OX40 리간드 gp34, TXGP1), TNFSF5(CD40 리간드 CD154, gp39, HIGM1, IMD3, TRAP), TNFSF6(Fas 리간드 Apo-1 리간드, APT1 리간드), TNFSF7(CD27 리간드 CD70), TNFSF8(CD30 리간드 CD153), TNFSF9(4-1BB 리간드 CD137 리간드), TP-1, t-PA, Tpo, TRAIL, TRAIL R, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRANCE, 트랜스페린 수용체, TRF, Trk, TROP-2, TSG, TSLP, 종양 관련 항원 CA125, 종양 관련 항원 발현 루이스 Y 관련 탄수화물, TWEAK, TXB2, Ung, uPAR, uPAR-1, 우로키나아제, VCAM, VCAM-1, VECAD, VE-Cadherin, VE-cadherin-2, VEFGR-1(flt-1), VEGF, VEGFR, VEGFR-3(flt-4), VEGI, VIM, 바이러스 항원, VLA, VLA-1, VLA-4, VNR 인테그린, 폰빌레브란트 인자, WIF-1, WNT1, WNT2, WNT2B/13, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9A, WNT9B, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16, XCL1, XCL2, XCR1, XCR1, XEDAR, XIAP, XPD, HMGB1, IgA, Aβ, CD81, CD97, CD98, DDR1, DKK1, EREG, Hsp90, IL-17/IL-17R, IL-20/IL-20R, 산화 LDL, PCSK9, prekallikrein, RON, TMEM16F, SOD1, Chromogranin A, Chromogranin B, tau, VAP1, 고분자 키니노겐, IL-31, IL-31R, Nav1.1, Nav1.2, Nav1.3, Nav1.4, Nav1.5, Nav1.6, Nav1.7, Nav1.8, Nav1.9, EPCR, C1, C1q, C1r, C1s, C2, C2a, C2b, C3, C3a, C3b, C4, C4a, C4b, C5, C5a, C5b, C6, C7, C8, C9, factor B, factor D, factor H, properdin, sclerostin, fibrinogen, fibrin, prothrombin, thrombin, 조직인자, factor V, factor Va, factor VII, factor VIIa, factor VIII, factor VIIIa, factor IX, factor IXa, factor X, factor Xa, factor XI, factor XIa, factor XII, factor XIIa, factor XIII, factor XIIIa, TFPI, antithrombin III, EPCR, 트롬보모듈린, TAPI, tPA, plasminogen, plasmin, PAI-1, PAI-2, GPC3, Syndecan-1, Syndecan-2, Syndecan-3, Syndecan-4, LPA, S1P, Acetylcholine receptor, AdipoR1, AdipoR2, ADP ribosyl cyclase-1, alpha-4/beta-7 integrin, alpha-5/beta-1 integrin, alpha-v/beta-6 integrin, alphavbeta1 integrin, Angiopoietin ligand-2, Angptl2, Anthrax, Cadherin, Carbonic anhydrase-IX, CD105, CD155, CD158a, CD37, CD49b, CD51, CD70, CD72, Claudin 18, Clostridium difficile toxin, CS1, Delta-like protein ligand 4, DHICA oxidase, Dickkopf-1 ligand, Dipeptidyl peptidase IV, EPOR, F protein of RSV, Factor Ia, FasL, Folate receptor alpha, Glucagon receptor, Glucagon-like peptide 1 receptor, Glutamate carboxypeptidase II, GMCSFR, Hepatitis C virus E2 glycoprotein, Hepcidin, IL-17 receptor, IL-22 receptor, IL-23 receptor, IL-3 receptor, Kit tyrosine kinase, Leucine Rich Alpha-2-Glycoprotein 1 (LRG1), Lysosphingolipid receptor, Membrane glycoprotein OX2, Mesothelin, MET, MICA, MUC-16, Myelin associated glycoprotein, Neuropilin-1, Neuropilin-2, Nogo receptor, PLXNA1, PLXNA2, PLXNA3, PLXNA4A, PLXNA4B, PLXNB1, PLXNB2, PLXNB3, PLXNC1, PLXND1, Programmed cell death ligand 1, Proprotein convertase PC9, P-selectin glycoprotein ligand-1, RAGE, Reticulon 4, RF, RON-8, SEMA3A, SEMA3B, SEMA3C, SEMA3D, SEMA3E, SEMA3F, SEMA3G, SEMA4A, SEMA4B, SEMA4C, SEMA4D, SEMA4F, SEMA4G, SEMA5A, SEMA5B, SEMA6A, SEMA6B, SEMA6C, SEMA6D, SEMA7A, Shiga like toxin II, Sphingosine-1-phosphate receptor-1, ST2, Staphylococcal lipoteichoic acid, Tenascin, TG2, Thymic stromal lymphoprotein receptor, TNF superfamily receptor 12A, Transmembrane glycoprotein NMB, TREM-1, TREM-2, Trophoblast glycoprotein, TSH receptor, TTR, Tubulin, ULBP2, 호르몬 및 성장인자를 위한 수용체가 예시될 수 있다.

에피토프

항원 중에 존재하는 항원 결정기를 의미하는 에피토프는 본 명세서에 있어서 개시되는 항원 결합 분자 중의 항원 결합 도메인이 결합하는 항원 상의 부위를 의미한다. 따라서, 예를 들면, 에피토프는 그 구조에 의해 정의될 수 있다. 또한 당해 에피토프를 인식하는 항원 결합 분자 중의 항원에 대한 결합 활성에 따라서도 당해 에피토프가 정의될 수 있다. 항원이 펩티드 또는 폴리펩티드인 경우에는 에피토프를 구성하는 아미노산 잔기에 의해 에피토프를 특정하는 것도 가능하다. 또한 에피토프가 당쇄인 경우에는 특정 당쇄 구조에 의해 에피토프를 특정하는 것도 가능하다.

직선상 에피토프는 아미노산 1차 서열이 인식된 에피토프를 포함하는 에피토프이다. 직선상 에피토프는 전형적으로는 3개 이상 및 가장 보통으로는 5개 이상, 예를 들면 약 8 내지 약 10개, 6 내지 20개의 아미노산이 고유의 서열에 있어서 포함된다.

입체구조 에피토프는 직선상 에피토프와는 대조적으로 에피토프를 포함하는 아미노산의 1차 서열이 인식된 에피토프의 단일 규정 성분이 아닌 에피토프(예를 들면, 아미노산의 1차 서열이 반드시 에피토프를 규정하는 항체에 의해 인식되는 것은 아닌 에피토프)이다. 입체구조 에피토프는 직선상 에피토프에 대해 증대된 수의 아미노산을 포함할 지도 모른다. 입체구조 에피토프의 인식에 관하여, 항체는 펩티드 또는 단백질의 3차원 구조를 인식한다. 예를 들면, 단백질 분자가 폴딩되어 3차원 구조를 형성하는 경우에는 입체구조 에피토프를 형성하는 어떤 아미노산 및/ 또는 폴리펩티드 주쇄는 병렬로 되어 항체가 에피토프를 인식하는 것을 가능하게 한다. 에피토프의 입체구조를 결정하는 방법에는 예를 들면 X선 결정학, 2차원 핵자기공명 분광학 및 부위 특이적인 스핀 표지 및 전자 상자성 공명 분광학이 포함되는데, 이들에는 한정되지 않는다. 예를 들면, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology(1996), 제66권, Morris(편)를 참조.

결합 활성

하기에 IL-6 수용체에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자에 의한 에피토프에 대한 결합의 확인방법이 예시되는데, IL-6 수용체 이외의 항원에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자에 의한 에피토프에 대한 결합의 확인방법도 하기의 예시에 준하여 적당히 실시될 수 있다.

예를 들면, IL-6 수용체에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자가 IL-6 수용체 분자 중에 존재하는 선상 에피토프를 인식하는 것은, 예를 들면 다음과 같이 하여 확인할 수 있다. 상기 목적을 위해 IL-6 수용체의 세포외 도메인을 구성하는 아미노산 서열로 이루어지는 선상의 펩티드가 합성된다. 당해 펩티드는 화학적으로 합성될 수 있다. 또는 IL-6 수용체의 cDNA 중의 세포외 도메인에 상당하는 아미노산 서열을 코드하는 영역을 이용하여 유전자 공학적 수법에 의해 얻어진다. 다음으로 세포외 도메인을 구성하는 아미노산 서열로 이루어지는 선상 펩티드와 IL-6 수용체에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자의 결합 활성이 평가된다. 예를 들면, 고정화된 선상 펩티드를 항원으로 하는 ELISA에 의해 당해 펩티드에 대한 당해 항원 결합 분자의 결합 활성이 평가될 수 있다. 또는 IL-6 수용체 발현 세포에 대한 당해 항원 결합 분자의 결합에 있어서의 선상 펩티드에 의한 저해 레벨을 토대로 선상 펩티드에 대한 결합 활성이 명확해질 수 있다. 이들 시험에 의해 선상 펩티드에 대한 당해 항원 결합 분자의 결합 활성이 명확해질 수 있다.

또한 IL-6 수용체에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자가 입체구조 에피토프를 인식하는 것은 다음과 같이 하여 확인될 수 있다. 상기 목적을 위해 IL-6 수용체를 발현하는 세포가 조제된다. IL-6 수용체에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자가 IL-6 수용체 발현 세포에 접촉했을 때에 당해 세포에 강하게 결합하는 한편, 당해 항원 결합 분자가 고정화된 IL-6 수용체의 세포외 도메인을 구성하는 아미노산 서열로 이루어지는 선상 펩티드에 대해 실질적으로 결합하지 않을 때 등을 들 수 있다. 여기서 실질적으로 결합하지 않는다는 것은 인간 IL-6 수용체 발현 세포에 대한 결합 활성의 80% 이하, 통상 50% 이하, 바람직하게는 30% 이하, 특히 바람직하게는 15% 이하의 결합 활성을 말한다.

IL-6 수용체에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자의 IL-6 수용체 발현 세포에 대한 결합 활성을 측정하는 방법으로서는 예를 들면, Antibodies A Laboratory Manual 기재의 방법(Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory(1988) 359-420)을 들 수 있다. 즉 IL-6 수용체 발현 세포를 항원으로 하는 ELISA나 FACS(fluorescence activated cell sorting)의 원리에 의해 평가될 수 있다.

ELISA 포맷에 있어서 IL-6 수용체에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자의 IL-6 수용체 발현 세포에 대한 결합 활성은 효소반응에 의해 생성되는 시그날 레벨을 비교함으로써 정량적으로 평가된다. 즉, IL-6 수용체 발현 세포를 고정화한 ELISA 플레이트에 피험 폴리펩티드 회합체를 첨가하여, 세포에 결합한 피험 항원 결합 분자가 피험 항원 결합 분자를 인식하는 효소 표지 항체를 이용하여 검출된다. 또는 FACS에 있어서는 피험 항원 결합 분자의 희석 계열을 제작하여 IL-6 수용체 발현 세포에 대한 항체 결합 역가(titer)를 결정함으로써, IL-6 수용체 발현 세포에 대한 피험 항원 결합 분자의 결합 활성이 비교될 수 있다.

완충액 등에 현탁한 세포 표면 상에 발현되고 있는 항원에 대한 피험 항원 결합 분자의 결합은 플로우 사이토미터에 의해 검출할 수 있다. 플로우 사이토미터로서는 예를 들면, 다음과 같은 장치가 알려져 있다.

FACSCanto^TM II

FACSAria^TM

FACSArray^TM

FACSVantage^TM SE

FACSCalibur^TM(모두 BD Biosciences사의 상품명)

EPICS ALTRA HyPerSort

Cytomics FC 500

EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC

Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC(모두 Beckman Coulter사의 상품명)

예를 들면, IL-6 수용체에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자의 항원에 대한 결합 활성의 적합한 측정방법의 일례로서 다음의 방법을 들 수 있다. 먼저, IL-6 수용체를 발현하는 세포와 반응시킨 피험 항원 결합 분자를 인식하는 FITC 표지한 2차 항체로 염색한다. 피험 항원 결합 분자를 적당히 적합한 완충액으로 희석함으로써, 당해 항원 결합 분자가 목적하는 농도로 조제하여 사용된다. 예를 들면, 10 ㎍/㎖부터 10 ng/㎖까지 사이 중 어느 하나의 농도로 사용될 수 있다. 다음으로 FACSCalibur(BD사)에 의해 형광강도와 세포수가 측정된다. 당해 세포에 대한 항체의 결합량은 CELL QUEST Software(BD사)를 사용하여 해석함으로써 얻어진 형광강도, 즉 Geometric Mean의 값에 반영된다. 즉, 당해 Geometric Mean의 값을 얻음으로써 피험 항원 결합 분자의 결합량으로 표시되는 피험 항원 결합 분자의 결합 활성이 측정될 수 있다.

IL-6 수용체에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자가 어떤 항원 결합 분자와 에피토프를 공유하는 것은 양자의 동일한 에피토프에 대한 경합에 의해 확인될 수 있다. 항원 결합 분자 간의 경합은 교차 블로킹 어세이 등에 의해 검출된다. 예를 들면 경합 ELISA 어세이는 바람직한 교차 블로킹 어세이다.

구체적으로는 교차 블로킹 어세이에 있어서는 마이크로타이터 플레이트의 웰 상에 코트한 IL-6 수용체 단백질이, 후보가 되는 경합 항원 결합 분자의 존재하 또는 비존재하에서 프리인큐베이트된 후에 피험 항원 결합 분자가 첨가된다. 웰 중의 IL-6 수용체 단백질에 결합한 피험 항원 결합 분자의 양은 동일한 에피토프에 대한 결합에 대해 경합하는 후보가 되는 경합 항원 결합 분자의 결합능에 간접적으로 상관하고 있다. 즉 동일 에피토프에 대한 경합 항원 결합 분자의 친화성이 커지면 커질수록, 피험 항원 결합 분자의 IL-6 수용체 단백질을 코트한 웰에 대한 결합 활성은 저하된다.

IL-6 수용체 단백질을 매개로 웰에 결합한 피험 항원 결합 분자의 양은 사전에 항원 결합 분자를 표지해 둠으로써 용이하게 측정될 수 있다. 예를 들면, 비오틴 표지된 항원 결합 분자는 아비딘페록시다아제 콘쥬게이트와 적절한 기질을 사용함으로써 측정된다. 페록시다아제 등의 효소 표지를 이용한 교차 블로킹 어세이는 특히 경합 ELISA 어세이라 불린다. 항원 결합 분자는 검출 또는 측정이 가능한 다른 표지 물질로 표지될 수 있다. 구체적으로는 방사 표지 또는 형광 표지 등이 공지이다.

후보의 경합 항원 결합 분자 회합체의 비존재하에서 실시되는 대조 시험에 있어서 얻어지는 결합 활성과 비교하여, 경합 항원 결합 분자가 IL-6 수용체에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자의 결합을 20% 이상, 바람직하게는 20-50% 이상, 더욱 바람직하게는 50% 이상 블록할 수 있다면, 당해 피험 항원 결합 분자는 경합 항원 결합 분자와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하거나 또는 동일한 에피토프에 대한 결합에 대해 경합하는 항원 결합 분자이다.

IL-6 수용체에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 항원 결합 분자가 결합하는 에피토프의 구조가 동정되어 있는 경우에는 피험 항원 결합 분자와 대조 항원 결합 분자가 에피토프를 공유하는 것은, 당해 에피토프를 구성하는 펩티드에 아미노산 변이를 도입한 펩티드에 대한 양자의 항원 결합 분자의 결합 활성을 비교함으로써 평가될 수 있다.

이러한 결합 활성을 측정하는 방법으로서는 예를 들면, 상기의 ELISA 포맷에 있어서 변이를 도입한 선상의 펩티드에 대한 피험 항원 결합 분자 및 대조 항원 결합 분자의 결합 활성을 비교함으로써 측정될 수 있다. ELISA 이외의 방법으로서는 칼럼에 결합한 당해 변이 펩티드에 대한 결합 활성을, 당해 칼럼에 피험 항원 결합 분자와 대조 항원 결합 분자를 유하(流下)시킨 후에 용출액 중에 용출되는 항원 결합 분자를 정량함으로써도 측정될 수 있다. 변이 펩티드를 예를 들면 GST와의 융합 펩티드로서 칼럼에 흡착시키는 방법은 공지이다.

또한 동정된 에피토프가 입체 에피토프인 경우에는 피험 항원 결합 분자와 대조 항원 결합 분자가 에피토프를 공유하는 것은, 다음의 방법으로 평가될 수 있다. 먼저, IL-6 수용체를 발현하는 세포와 에피토프에 변이가 도입된 IL-6 수용체를 발현하는 세포가 조제된다. 이들 세포가 PBS 등의 적절한 완충액에 현탁된 세포 현탁액에 대해 피험 항원 결합 분자와 대조 항원 결합 분자가 첨가된다. 이어서, 적당히 완충액으로 세정된 세포 현탁액에 대해 피험 항원 결합 분자와 대조 항원 결합 분자를 인식할 수 있는 FITC 표지된 항체가 첨가된다. 표지 항체에 의해 염색된 세포의 형광강도와 세포수가 FACSCalibur(BD사)에 의해 측정된다. 피험 항원 결합 분자와 대조 항원 결합 분자의 농도는 적합한 완충액에 의해 적당히 희석함으로써 목적하는 농도로 조제하여 사용된다. 예를 들면, 10 ㎍/㎖부터 10 ng/㎖까지의 사이 중 어느 하나의 농도로 사용된다. 당해 세포에 대한 표지 항체의 결합량은 CELL QUEST Software(BD사)를 사용하여 해석함으로써 얻어진 형광강도, 즉 Geometric Mean의 값에 반영된다. 즉, 당해 Geometric Mean의 값을 얻음으로써, 표지 항체의 결합량으로 표시되는 피험 항원 결합 분자와 대조 항원 결합 분자의 결합 활성을 측정할 수 있다.

본 방법에 있어서, 예를 들면 「변이 IL-6 수용체 발현 세포에 실질적으로 결합하지 않는」다는 것은 아래의 방법에 의해 판단할 수 있다. 먼저, 변이 IL-6 수용체를 발현하는 세포에 대해 결합한 피험 항원 결합 분자와 대조 항원 결합 분자가 표지 항체로 염색된다. 이어서 세포의 형광강도가 검출된다. 형광 검출에 플로우 사이토메트리로서 FACSCalibur를 사용한 경우, 얻어진 형광강도는 CELL QUEST Software를 사용하여 해석될 수 있다. 폴리펩티드 회합체 존재하 및 비존재하에서의 Geometric Mean의 값으로부터 이 비교값(△Geo-Mean)을 하기의 계산식을 토대로 산출함으로써, 항원 결합 분자의 결합에 의한 형광강도의 증가비율을 구할 수 있다.

△Geo-Mean = Geo-Mean(폴리펩티드 회합체 존재하)/Geo-Mean(폴리펩티드 회합체 비존재하)

해석에 의해 얻어지는 피험 항원 결합 분자의 변이 IL-6 수용체 발현 세포에 대한 결합량이 반영된 Geometric Mean 비교값(변이 IL-6 수용체 분자 △Geo-Mean값)을 피험 항원 결합 분자의 IL-6 수용체 발현 세포에 대한 결합량이 반영된 △Geo-Mean 비교값과 비교한다. 이 경우에 있어서 변이 IL-6 수용체 발현 세포 및 IL-6 수용체 발현 세포에 대한 △Geo-Mean 비교값을 구할 때 사용하는 피험 항원 결합 분자의 농도는 서로 동일 또는 실질적으로 동일 농도로 조제되는 것이 특히 바람직하다. 사전에 IL-6 수용체 중의 에피토프를 인식하고 있는 것이 확인된 항원 결합 분자가 대조 항원 결합 분자로서 이용된다.

피험 항원 결합 분자의 변이 IL-6 수용체 발현 세포에 대한 △Geo-Mean 비교값이 피험 항원 결합 분자의 IL-6 수용체 발현 세포에 대한 △Geo-Mean 비교값의 80% 이상, 바람직하게는 50%, 더욱 바람직하게는 30%, 특히 바람직하게는 15%보다 작으면, 「변이 IL-6 수용체 발현 세포에 실질적으로 결합하지 않는」 것으로 한다. Geo-Mean값(Geometric Mean)을 구하는 계산식은 CELL QUEST Software User's Guide(BD biosciences사)에 기재되어 있다. 비교값을 비교함으로써 그것이 실질적으로 동일하다고 볼 수 있는 정도라면, 피험 항원 결합 분자와 대조 항원 결합 분자의 에피토프는 동일하다고 평가될 수 있다.

항원 결합 도메인

「항원 결합 도메인」은 목적으로 하는 항원에 결합하는 한 어떠한 구조의 도메인도 사용될 수 있다. 그러한 도메인의 예로서 예를 들면, 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변영역, 생체내에 존재하는 세포막 단백인 Avimer에 포함되는 35 아미노산 정도의 A 도메인으로 불리는 모듈(WO2004/044011, WO2005/040229), 세포막에 발현하는 당단백질인 fibronectin 중의 단백질에 결합하는 도메인인 10Fn3 도메인을 포함하는 Adnectin(WO2002/032925), ProteinA의 58 아미노산으로 이루어지는 3개의 헬릭스의 다발(bundle)을 구성하는 IgG 결합 도메인을 scaffold로 하는 Affibody(WO1995/001937), 33 아미노산 잔기를 포함하는 턴과 2개의 역병행 헬릭스 및 루프의 서브유닛이 반복해서 겹쳐진 구조를 갖는 안키린 반복(ankyrin repeat：AR)의 분자 표면에 노출되는 영역인 DARPins(Designed Ankyrin Repeat proteins)(WO2002/020565), 호중구 겔라티나아제 결합 리포칼린(neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL)) 등의 리포칼린 분자에 있어서 고도로 보존된 8개의 역병행 스트랜드가 중앙방향으로 비틀어진 배럴 구조의 편측을 지지하는 4개의 루프영역인 Anticalin 등(WO2003/029462), 칠성장어, 먹장어 등 무악류의 획득 면역 시스템으로서 이뮤노 글로불린의 구조를 갖지 않는 가변성 림프구 수용체(variable lymphocyte receptor(VLR))의 류신 잔기가 풍부한 리피트(leucine-rich-repeat(LRR)) 모듈이 반복해서 겹쳐진 편자모양의 구조 내부의 병행형 시트 구조의 움푹 들어간 영역(WO2008/016854)을 바람직하게 들 수 있다. 본 발명의 항원 결합 도메인의 적합한 예로서, 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변영역을 포함하는 항원 결합 도메인을 들 수 있다. 이러한 항원 결합 도메인의 예로서는 「scFv(single chain Fv)」, 「단일 사슬 항체(single chain antibody)」, 「Fv」, 「scFv2(single chain Fv2)」, 「Fab」 또는 「F(ab')2」 등을 바람직하게 들 수 있다.

본 발명의 항원 결합 분자에 있어서의 항원 결합 도메인은 동일 에피토프에 결합할 수 있다. 여기서 동일 에피토프는 예를 들면, 서열번호：1에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 중에 존재할 수 있다. 또는 본 발명의 항원 결합 분자에 있어서의 항원 결합 도메인은 서로 다른 에피토프에 결합할 수 있다. 여기서 상이한 에피토프는 예를 들면, 서열번호：1에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 중에 존재할 수 있다.

특이적

특이적이란 특이적으로 결합하는 분자의 한쪽 분자가 그 하나 또는 복수의 결합하는 상대방 분자 이외의 분자에 대해서는 전혀 유의한 결합을 나타내지 않는 상태를 말한다. 또한 항원 결합 도메인이 어떤 항원 중에 포함되는 복수의 에피토프 중 특정 에피토프에 대해 특이적인 경우에도 사용된다. 또한 항원 결합 도메인이 결합하는 에피토프가 복수의 상이한 항원에 포함되는 경우에는, 당해 항원 결합 도메인을 갖는 항원 결합 분자는 당해 에피토프를 포함하는 다양한 항원과 결합할 수 있다.

항체

본 명세서에 있어서 항체란 천연의 것이거나 또는 부분적 또는 완전 합성에 의해 제조된 면역글로불린을 말한다. 항체는 그것이 천연으로 존재하는 혈장이나 혈청 등의 천연 자원이나 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 배양상청으로부터 단리될 수 있고, 또는 유전자 재조합 등의 수법을 사용함으로써 부분적으로 또는 완전히 합성될 수 있다. 항체의 예로서는 면역글로불린의 아이소타입 및 그들 아이소타입의 서브클래스를 바람직하게 들 수 있다. 인간의 면역글로불린으로서 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgM의 9종류의 클래스(아이소타입)가 알려져 있다. 본 발명의 항체에는 이들 아이소타입 중 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4가 포함될 수 있다.

목적하는 결합 활성을 갖는 항체를 제작하는 방법은 당업자에 있어서 공지이다. 아래에 IL-6 수용체에 결합하는 항체(항IL-6 수용체 항체)를 제작하는 방법이 예시된다. IL-6 수용체 이외의 항원에 결합하는 항체도 하기의 예시에 준하여 적당히 제작될 수 있다.

항IL-6 수용체 항체는 공지의 수단을 사용하여 다중클론 또는 단일클론 항체로서 취득될 수 있다. 항IL-6 수용체 항체로서는 포유동물 유래의 단일클론 항체가 바람직하게 제작될 수 있다. 포유동물 유래의 단일클론 항체에는 하이브리도마에 의해 생산되는 것 및 유전자 공학적 수법에 의해 항체 유전자를 포함하는 발현 벡터로 형질전환한 숙주세포에 의해 생산되는 것 등이 포함된다. 또한 본 출원 발명의 단일클론 항체에는 「인간화 항체」나 「키메라 항체」가 포함된다.

단일클론 항체 생산 하이브리도마는 공지기술을 사용함으로써, 예를 들면 아래와 같이 제작될 수 있다. 즉, IL-6 수용체 단백질을 감작 항원으로서 사용하여 통상의 면역방법에 따라 포유동물이 면역된다. 얻어지는 면역세포가 통상의 세포융합법에 의해 공지의 친세포와 융합된다. 다음으로 통상의 스크리닝법에 의해 단일클론 항체 생산 세포를 스크리닝함으로써 항IL-6 수용체 항체를 생산하는 하이브리도마가 선택될 수 있다.

구체적으로는 단일클론 항체의 제작은 예를 들면 이하에 나타내는 바와 같이 행해진다. 먼저, 서열번호：2에 그의 뉴클레오티드 서열이 개시된 IL-6 수용체 유전자를 발현함으로써, 항체 취득의 감작 항원으로서 사용되는 서열번호：1로 표시되는 IL-6 수용체 단백질이 취득될 수 있다. 즉, IL-6 수용체를 코드하는 유전자 서열을 공지의 발현 벡터에 삽입함으로써 적당한 숙주세포가 형질전환된다. 당해 숙주세포 중 또는 배양상청 중으로부터 목적하는 인간 IL-6 수용체 단백질이 공지의 방법으로 정제된다. 배양상청 중으로부터 가용형의 IL-6 수용체를 취득하기 위해서는 예를 들면, Mullberg등(J. Immunol. (1994) 152 (10), 4958-4968)에 의해 기재되어 있는 바와 같은 가용형 IL-6 수용체인 서열번호：1로 표시되는 IL-6 수용체 폴리펩티드 서열 중, 1부터 357번째의 아미노산으로 이루어지는 단백질이 서열번호：1로 표시되는 IL-6 수용체 단백질 대신에 발현된다. 또한 정제한 천연의 IL-6 수용체 단백질도 또한 동일하게 감작 항원으로서 사용될 수 있다.

포유동물에 대한 면역에 사용하는 감작 항원으로서 당해 정제 IL-6 수용체 단백질을 사용할 수 있다. IL-6 수용체의 부분 펩티드도 또한 감작 항원으로서 사용할 수 있다. 이때, 당해 부분 펩티드는 인간 IL-6 수용체의 아미노산 서열로부터 화학합성으로도 취득될 수 있다. 또한 IL-6 수용체 유전자의 일부를 발현 벡터에 삽입하여 발현시킴으로써도 취득될 수 있다. 더 나아가서는 단백질 분해효소를 사용하여 IL-6 수용체 단백질을 분해함으로써도 취득될 수 있으나, 부분 펩티드로서 사용하는 IL-6 수용체 펩티드의 영역 및 크기는 특별한 태양에 한정되지 않는다. 바람직한 영역은 서열번호：1의 아미노산 서열에 있어서 20-357번째의 아미노산에 상당하는 아미노산 서열로부터 임의의 서열이 선택될 수 있다. 감작 항원으로 하는 펩티드를 구성하는 아미노산의 수는 적어도 5 이상, 예를 들면 6 이상 또는 7 이상인 것이 바람직하다. 보다 구체적으로는 8~50, 바람직하게는 10~30 잔기의 펩티드가 감작 항원으로서 사용될 수 있다.

또한 IL-6 수용체 단백질의 목적하는 부분 폴리펩티드나 펩티드를 상이한 폴리펩티드와 융합한 융합 단백질이 감작 항원으로서 이용될 수 있다. 감작 항원으로서 사용되는 융합 단백질을 제조하기 위해, 예를 들면, 항체의 Fc 단편이나 펩티드 태그 등이 바람직하게 이용될 수 있다. 융합 단백질을 발현하는 벡터는 목적하는 2종류 또는 그 이상의 폴리펩티드 단편을 코드하는 유전자가 인프레임으로 융합되고, 당해 융합 유전자가 상기와 같이 발현 벡터에 삽입됨으로써 제작될 수 있다. 융합 단백질의 제작방법은 Molecular Cloning 2nd ed. (Sambrook,J et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58(1989)Cold Spring Harbor Lab. press)에 기재되어 있다. 감작 항원으로서 사용되는 IL-6 수용체의 취득방법 및 그것을 이용한 면역방법은 WO2003/000883, WO2004/022754, WO2006/006693 등에도 구체적으로 기재되어 있다.

상기 감작 항원으로 면역되는 포유동물로서는 특정 동물에 한정되는 것은 아니나, 세포융합에 사용하는 친세포와의 적합성을 고려하여 선택하는 것이 바람직하다. 일반적으로는 설치류의 동물, 예를 들면, 마우스, 랫트, 햄스터 또는 토끼, 원숭이 등이 바람직하게 사용된다.

공지의 방법에 따라 상기 동물이 감작 항원에 의해 면역된다. 예를 들면, 일반적인 방법으로서 감작 항원이 포유동물의 복강내 또는 피하에 주사에 의해 투여됨으로써 면역이 실시된다. 구체적으로는 PBS(Phosphate-Buffered Saline)나 생리식염수 등으로 적당한 희석배율로 희석된 감작 항원이 목적하는 바에 따라 통상의 애쥬번트, 예를 들면 프로인트 완전 애쥬번트와 혼합되어 유화된 후에, 그 감작 항원이 포유동물에 4~21일마다 수회 투여된다. 또한 감작 항원의 면역시에는 적당한 담체가 사용될 수 있다. 특히 분자량이 작은 부분 펩티드가 감작 항원으로서 사용되는 경우에는 알부민, 키홀 림펫 헤모시아닌 등의 담체 단백질과 결합한 그 감작 항원 펩티드를 면역하는 것이 바람직한 경우도 있다.

또한 목적하는 항체를 생산하는 하이브리도마는 DNA 면역을 사용하여 아래와 같이 해서도 제작될 수 있다. DNA 면역이란 면역동물 중에서 항원 단백질을 코드하는 유전자가 발현될 수 있는 태양으로 구축된 벡터 DNA가 투여된 당해 면역동물 중에서, 감작 항원이 당해 면역동물의 생체내에서 발현됨으로써 면역자극이 부여되는 면역방법이다. 단백질 항원이 면역동물에 투여되는 일반적인 면역방법과 비교하여 DNA 면역에는 다음과 같은 우위성이 기대된다.

-IL-6 수용체와 같은 막단백질의 구조를 유지하여 면역자극이 부여될 수 있다

-면역항원을 정제할 필요가 없다

DNA 면역에 의해 본 발명의 단일클론 항체를 얻기 위해, 먼저, IL-6 수용체 단백질을 발현하는 DNA가 면역동물에 투여된다. IL-6 수용체를 코드하는 DNA는 PCR 등의 공지의 방법에 의해 합성될 수 있다. 얻어진 DNA가 적당한 발현 벡터에 삽입되어 면역동물에 투여된다. 발현 벡터로서는 예를 들면 pcDNA3.1 등의 시판의 발현 벡터가 바람직하게 이용될 수 있다. 벡터를 생체에 투여하는 방법으로서 일반적으로 사용되고 있는 방법이 이용될 수 있다. 예를 들면, 발현 벡터가 흡착된 금 입자가 gene gun으로 면역동물 개체의 세포내에 도입됨으로써 DNA 면역이 행해진다. 또한 IL-6 수용체를 인식하는 항체의 제작은 국제공개 WO2003/104453에 기재된 방법을 사용해도 제작될 수 있다.

이와 같이 포유동물이 면역되어 혈청 중에 있어서의 IL-6 수용체에 결합하는 항체 역가의 상승이 확인된 후에, 포유동물로부터 면역세포가 채취되어 세포융합에 제공된다. 바람직한 면역세포로서는 특히 비장세포가 사용될 수 있다.

상기 면역세포와 융합되는 세포로서 포유동물의 골수종 세포가 사용된다. 골수종 세포는 스크리닝을 위한 적당한 선택 마커를 구비하고 있는 것이 바람직하다. 선택 마커란 특정 배양 조건하에서 생존할 수 있는(또는 할 수 없는) 형질을 가리킨다. 선택 마커로는 히포크산틴-구아닌-포스포리보실트랜스페라아제 결손(이하 HGPRT 결손으로 생략한다) 또는 티미딘키나아제 결손(이하 TK 결손으로 생략한다) 등이 공지이다. HGPRT나 TK의 결손을 갖는 세포는 히포크산틴-아미노프테린-티미딘 감수성(이하 HAT 감수성으로 생략한다)을 갖는다. HAT 감수성의 세포는 HAT 선택 배지 중에서 DNA 합성을 행할 수 없어 사멸되지만, 정상의 세포와 융합하면 정상 세포의 샐비지 회로를 이용하여 DNA의 합성을 계속할 수 있기 때문에 HAT 선택 배지 중에서도 증식되게 된다.

HGPRT 결손이나 TK 결손의 세포는 각각 6 티오구아닌, 8 아자구아닌(이하 8AG로 생략한다) 또는 5'브로모데옥시우리딘을 포함하는 배지에서 선택될 수 있다. 이들 피리미딘 아날로그를 DNA 중에 흡수하는 정상의 세포는 사멸된다. 한편, 이들 피리미딘 아날로그를 흡수할 수 없는 이들 효소를 결손한 세포는 선택 배지 중에서 생존할 수 있다. 이 밖에 G418 내성으로 불리는 선택 마커는 네오마이신 내성 유전자에 의해 2-데옥시스트렙타민계 항생물질(겐타마이신 유사체)에 대한 내성을 부여한다. 세포융합에 적합한 각종의 골수종 세포가 공지이다.

이러한 골수종 세포로서 예를 들면, P3(P3x63Ag8.653)(J. Immunol.(1979)123 (4), 1548-1550), P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81, 1-7), NS-1(C. Eur. J. Immunol.(1976)6 (7), 511-519), MPC-11(Cell(1976)8 (3), 405-415), SP2/0(Nature(1978)276 (5685), 269-270), FO(J. Immunol. Methods(1980)35 (1-2), 1-21), S194/5.XX0.BU.1(J. Exp. Med.(1978)148 (1), 313-323), R210(Nature(1979)277 (5692), 131-133) 등이 바람직하게 사용될 수 있다.

기본적으로는 공지의 방법, 예를 들면, 쾰러와 밀스테인등의 방법(Methods Enzymol.(1981)73, 3-46) 등에 준하여 상기 면역세포와 골수종 세포의 세포융합이 행해진다.

보다 구체적으로는 예를 들면 세포융합 촉진제의 존재하에서 통상의 영양배양액 중에서, 상기 세포융합이 실시될 수 있다. 융합 촉진제로서는 예를 들면 폴리에틸렌글리콜(PEG), 센다이 바이러스(HVJ) 등이 사용되고, 추가로 융합효율을 높이기 위해 목적하는 바에 따라 디메틸설폭시드 등의 보조제가 첨가되어 사용된다.

면역세포와 골수종 세포의 사용비율은 임의로 설정될 수 있다. 예를 들면, 골수종 세포에 대해 면역세포를 1~10배로 하는 것이 바람직하다. 상기 세포융합에 사용하는 배양액으로서는 예를 들면, 상기 골수종 세포주의 증식에 적합한 RPMI1640 배양액, MEM 배양액, 기타, 이 종의 세포배양에 사용되는 통상의 배양액이 사용되고, 추가로 소태아혈청(FCS) 등의 혈청 보액이 적합하게 첨가될 수 있다.

세포융합은 상기 면역세포와 골수종 세포의 소정량을 상기 배양액 중에서 잘 혼합하고, 사전에 37℃ 정도로 가온된 PEG 용액(예를 들면 평균 분자량 1000~6000 정도)이 통상 30~60%(w/v)의 농도로 첨가된다. 혼합액이 완만하게 혼합됨으로써 목적하는 융합세포(하이브리도마)가 형성된다. 이어서, 상기에 예로 든 적당한 배양액이 축차 첨가되고, 원심하여 상청을 제거하는 조작을 반복함으로써 하이브리도마의 생육에 바람직하지 않은 세포융합제 등이 제거될 수 있다.

이와 같이 하여 얻어진 하이브리도마는 통상의 선택 배양액, 예를 들면 HAT 배양액(히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함하는 배양액)으로 배양함으로써 선택될 수 있다. 목적하는 하이브리도마 이외의 세포(비융합세포)가 사멸되기에 충분한 시간(통상, 이러한 충분한 시간은 수일 내지 수 주간이다) 상기 HAT 배양액을 사용한 배양이 계속될 수 있다. 이어서, 통상의 한계희석법에 의해 목적하는 항체를 생산하는 하이브리도마의 스크리닝 및 단일 클로닝이 실시된다.

이와 같이 하여 얻어진 하이브리도마는 세포융합에 사용된 골수종이 갖는 선택 마커에 따른 선택 배양액을 이용함으로써 선택될 수 있다. 예를 들면 HGPRT나 TK의 결손을 갖는 세포는 HAT 배양액(히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함하는 배양액)으로 배양함으로써 선택될 수 있다. 즉, HAT 감수성의 골수종 세포를 세포융합에 사용한 경우, HAT 배양액 중에서 정상 세포와의 세포융합에 성공한 세포가 선택적으로 증식될 수 있다. 목적하는 하이브리도마 이외의 세포(비융합세포)가 사멸되기에 충분한 시간, 상기 HAT 배양액을 사용한 배양이 계속된다. 구체적으로는 일반적으로 수일 내지 수 주간의 배양에 의해 목적하는 하이브리도마가 선택될 수 있다. 이어서, 통상의 한계희석법에 의해 목적하는 항체를 생산하는 하이브리도마의 스크리닝 및 단일 클로닝이 실시될 수 있다.

목적하는 항체의 스크리닝 및 단일 클로닝이 공지의 항원 항체 반응에 기초하는 스크리닝방법에 의해 바람직하게 실시될 수 있다. 예를 들면, IL-6 수용체에 결합하는 단일클론 항체는 세포 표면에 발현된 IL-6 수용체에 결합할 수 있다. 이러한 단일클론 항체는 예를 들면, FACS(fluorescence activated cell sorting)에 의해 스크리닝될 수 있다. FACS는 형광 항체와 접촉시킨 세포를 레이저광으로 해석하여, 개개의 세포가 발하는 형광을 측정함으로써 세포 표면으로의 항체의 결합을 측정하는 것을 가능하게 하는 시스템이다.

FACS에 의해 본 발명의 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마를 스크리닝하기 위해서는 먼저 IL-6 수용체를 발현하는 세포를 조제한다. 스크리닝하기 위한 바람직한 세포는 IL-6 수용체를 강제 발현시킨 포유동물세포이다. 숙주세포로서 사용한 형질전환되어 있지 않은 포유동물세포를 대조로서 사용함으로써, 세포 표면의 IL-6 수용체에 대한 항체의 결합 활성이 선택적으로 검출될 수 있다. 즉, 숙주세포에 결합하지 않고 IL-6 수용체 강제 발현 세포에 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 선택함으로써, IL-6 수용체 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마가 취득될 수 있다.

또는 고정화한 IL-6 수용체 발현 세포에 대한 항체의 결합 활성이 ELISA의 원리를 토대로 평가될 수 있다. 예를 들면, ELISA 플레이트의 웰에 IL-6 수용체 발현 세포가 고정화된다. 하이브리도마의 배양상청을 웰 내의 고정화 세포에 접촉시켜 고정화 세포에 결합하는 항체가 검출된다. 단일클론 항체가 마우스 유래인 경우, 세포에 결합한 항체는 항마우스 이뮤노 글로불린 항체에 의해 검출될 수 있다. 이들 스크리닝에 의해 선택된 항원에 대한 결합능을 갖는 목적하는 항체를 생산하는 하이브리도마는 한계희석법 등에 의해 클로닝될 수 있다.

이와 같이 하여 제작되는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마는 통상의 배양액 중에서 계대배양될 수 있다. 또한 그 하이브리도마는 액체질소 중에서 장기에 걸쳐 보존될 수 있다.

당해 하이브리도마를 통상의 방법에 따라 배양하고, 그 배양상청으로부터 목적하는 단일클론 항체가 취득될 수 있다. 또는 하이브리도마를 이것과 적합성이 있는 포유동물에 투여하여 증식시키고, 그의 복수로부터 단일클론 항체가 취득될 수 있다. 전자의 방법은 고순도의 항체를 얻기에 적합한 것이다.

당해 하이브리도마 등의 항체 생산 세포로부터 클로닝되는 항체 유전자에 의해 코드되는 항체도 바람직하게 이용될 수 있다. 클로닝한 항체 유전자를 적당한 벡터에 삽입하여 숙주에 도입함으로써 당해 유전자에 의해 코드되는 항체가 발현된다. 항체 유전자의 단리와 벡터로의 도입, 그리고 숙주세포의 형질전환을 위한 방법은 예를 들면, Vandamme등에 의해 이미 확립되어 있다(Eur.J. Biochem.(1990)192 (3), 767-775). 하기에 기술하는 바와 같이 재조합 항체의 제조방법도 또한 공지이다.

예를 들면, 항IL-6 수용체 항체를 생산하는 하이브리도마 세포로부터 항IL-6 수용체 항체의 가변영역(V영역)을 코드하는 cDNA가 취득된다. 그 때문에 통상 먼저 하이브리도마로부터 전체 RNA가 추출된다. 세포로부터 mRNA를 추출하기 위한 방법으로서, 예를 들면 다음과 같은 방법을 이용할 수 있다.

-구아니딘 초원심법(Biochemistry (1979) 18 (24), 5294-5299)

-AGPC법(Anal. Biochem. (1987) 162 (1), 156-159)

추출된 mRNA는 mRNA Purification Kit(GE 헬스케어 바이오사이언스 제조) 등을 사용하여 정제될 수 있다. 또는 QuickPrep mRNA Purification Kit(GE 헬스케어 바이오사이언스 제조) 등과 같이 세포로부터 직접 전체 mRNA를 추출하기 위한 키트도 시판되고 있다. 이러한 키트를 사용하여 하이브리도마로부터 mRNA가 취득될 수 있다. 얻어진 mRNA로부터 역전사효소를 사용하여 항체 V영역을 코드하는 cDNA가 합성될 수 있다. cDNA는 AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit(생화학 공업사 제조) 등에 의해 합성될 수 있다. 또한 cDNA의 합성 및 증폭을 위해 SMART RACE cDNA 증폭 키트(Clontech 제조) 및 PCR을 사용한 5'-RACE법(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85 (23), 8998-9002, Nucleic Acids Res. (1989) 17 (8), 2919-2932)이 적당히 이용될 수 있다. 또한 이러한 cDNA의 합성과정에 있어서 cDNA의 양말단에 후술하는 적절한 제한효소 사이트가 도입될 수 있다.

얻어진 PCR 산물로부터 목적으로 하는 cDNA 단편이 정제되고 이어서 벡터 DNA와 연결된다. 이와 같이 재조합 벡터가 제작되고 대장균 등에 도입되어 콜로니가 선택된 후에, 그 콜로니를 형성한 대장균으로부터 목적하는 재조합 벡터가 조제될 수 있다. 그리고, 그 재조합 벡터가 목적으로 하는 cDNA의 염기서열을 가지고 있는지 여부에 대해서 공지의 방법, 예를 들면, 디데옥시뉴클레오티드 체인 터미네이션법 등에 의해 확인된다.

가변영역을 코드하는 유전자를 취득하기 위해서는 가변영역 유전자 증폭용 프라이머를 사용한 5'-RACE법을 이용하는 것이 간편하다. 먼저 하이브리도마 세포로부터 추출된 RNA를 주형으로 하여 cDNA가 합성되고 5'-RACE cDNA 라이브러리가 얻어진다. 5'-RACE cDNA 라이브러리의 합성에는 SMART RACE cDNA 증폭 키트 등 시판의 키트가 적당히 사용된다.

얻어진 5'-RACE cDNA 라이브러리를 주형으로 하여 PCR법에 의해 항체 유전자가 증폭된다. 공지의 항체 유전자 서열을 토대로 마우스 항체 유전자 증폭용 프라이머가 디자인될 수 있다. 이들 프라이머는 이뮤노 글로불린의 서브클래스별로 상이한 염기서열이다. 따라서, 서브클래스는 사전에 Iso Strip 마우스 단일클론 항체 아이소타이핑 키트(로슈 다이어그노스틱스) 등의 시판 키트를 사용하여 결정해 두는 것이 바람직하다.

구체적으로는 예를 들면 마우스 IgG를 코드하는 유전자의 취득을 목적으로 할 때는 중쇄로서 γ1, γ2a, γ2b, γ3, 경쇄로서 κ쇄와 λ쇄를 코드하는 유전자의 증폭이 가능한 프라이머가 이용될 수 있다. IgG의 가변영역 유전자를 증폭하기 위해서는 일반적으로 3'측의 프라이머에는 가변영역에 가까운 정상영역에 상당하는 부분에 어닐링하는 프라이머가 이용된다. 한편 5'측의 프라이머에는 5'RACE cDNA 라이브러리 제작 키트에 부속되는 프라이머가 이용된다.

이렇게 하여 증폭된 PCR 산물을 이용하여 중쇄와 경쇄의 조합으로 이루어지는 이뮤노 글로불린이 재구성될 수 있다. 재구성된 이뮤노 글로불린의 IL-6 수용체에 대한 결합 활성을 지표로 하여 목적하는 항체가 스크리닝될 수 있다. 예를 들면 IL-6 수용체에 대한 항체의 취득을 목적으로 할 때, 항체의 IL-6 수용체로의 결합은 특이적인 것이 더욱 바람직하다. IL-6 수용체에 결합하는 항체는 예를 들면 다음과 같이 하여 스크리닝될 수 있다；

(1) 하이브리도마로부터 얻어진 cDNA에 의해 코드되는 V영역을 포함하는 항체를 IL-6 수용체 발현 세포에 접촉시키는 공정,

(2) IL-6 수용체 발현 세포와 항체의 결합을 검출하는 공정 및

(3) IL-6 수용체 발현 세포에 결합하는 항체를 선택하는 공정.

항체와 IL-6 수용체 발현 세포의 결합을 검출하는 방법은 공지이다. 구체적으로는 앞서 기술한 FACS 등의 수법에 의해 항체와 IL-6 수용체 발현 세포의 결합이 검출될 수 있다. 항체의 결합 활성을 평가하기 위해 IL-6 수용체 발현 세포의 고정 표본이 적당히 이용될 수 있다.

결합 활성을 지표로 하는 항체의 스크리닝방법으로서 파지 벡터를 이용한 패닝법도 바람직하게 사용된다. 다중클론 항체 발현 세포군으로부터 항체 유전자를 중쇄와 경쇄의 서브클래스의 라이브러리로서 취득한 경우에는 파지 벡터를 이용한 스크리닝방법이 유리하다. 중쇄와 경쇄의 가변영역을 코드하는 유전자는 적당한 링커 서열로 연결함으로써 싱글 체인 Fv(scFv)를 형성할 수 있다. scFv를 코드하는 유전자를 파지 벡터에 삽입함으로써 scFv를 표면에 발현하는 파지가 취득될 수 있다. 이 파지와 목적하는 항원의 접촉 후에 항원에 결합한 파지를 회수함으로써 목적의 결합 활성을 갖는 scFv를 코드하는 DNA가 회수될 수 있다. 이 조작을 필요에 따라 반복함으로써 목적하는 결합 활성을 갖는 scFv가 농축될 수 있다.

목적으로 하는 항IL-6 수용체 항체의 V영역을 코드하는 cDNA가 얻어진 후에, 당해 cDNA의 양말단에 삽입한 제한효소 사이트를 인식하는 제한효소에 의해 그 cDNA가 소화된다. 바람직한 제한효소는 항체 유전자를 구성하는 염기서열에 출현하는 빈도가 낮은 염기서열을 인식하여 소화한다. 또한 1 카피의 소화 단편을 벡터에 바른 방향으로 삽입하기 위해서는 부착 말단을 부여하는 제한효소의 삽입이 바람직하다. 상기와 같이 소화된 항IL-6 수용체 항체의 V영역을 코드하는 cDNA를 적당한 발현 벡터에 삽입함으로써 항체 발현 벡터가 취득될 수 있다. 이때, 항체 정상영역(C영역)을 코드하는 유전자와 상기 V영역을 코드하는 유전자가 인프레임으로 융합되면 키메라 항체가 취득된다. 여기서 키메라 항체란 정상영역과 가변영역의 유래가 상이한 것을 말한다. 따라서, 마우스-인간 등의 이종(異種) 키메라 항체에 더하여 인간-인간 동종(同種) 키메라 항체도 본 발명에 있어서의 키메라 항체에 포함된다. 사전에 정상영역을 갖는 발현 벡터에 상기 V영역 유전자를 삽입함으로써 키메라 항체 발현 벡터가 구축될 수 있다. 구체적으로는 예를 들면, 목적하는 항체 정상영역(C영역)을 코드하는 DNA를 보유한 발현 벡터의 5'측에 상기 V영역 유전자를 소화하는 제한효소의 제한효소 인식서열이 적당히 배치될 수 있다. 동일한 조합의 제한효소로 소화된 양자가 인프레임으로 융합됨으로써 키메라 항체 발현 벡터가 구축된다.

항IL-6 수용체 단일클론 항체를 제조하기 위해 항체 유전자가 발현 제어영역에 의한 제어하에서 발현되도록 발현 벡터에 삽입된다. 항체를 발현하기 위한 발현 제어영역이란 예를 들면, 인핸서나 프로모터를 포함한다. 또한 발현된 항체가 세포외로 분비되도록 적절한 시그날 서열이 아미노 말단에 부가될 수 있다. 뒤에 기재되는 실시예에서는 시그날 서열로서 아미노산 서열 MGWSCIILFLVATATGVHS(서열번호：3)를 갖는 펩티드가 사용되고 있는데, 이것 이외에도 적합한 시그날 서열이 부가된다. 발현된 폴리펩티드는 상기 서열의 카르복실 말단 부분에서 절단되고, 절단된 폴리펩티드가 성숙 폴리펩티드로서 세포외로 분비될 수 있다. 이어서, 이 발현 벡터에 의해 적당한 숙주세포가 형질전환됨으로써 항IL-6 수용체 항체를 코드하는 DNA를 발현하는 재조합 세포가 취득될 수 있다.

항체 유전자 발현을 위해 항체 중쇄(H쇄) 및 경쇄(L쇄)를 코드하는 DNA는 각각 다른 발현 벡터에 삽입된다. H쇄와 L쇄가 삽입된 벡터에 의해 동일 숙주세포에 동시에 형질전환(co-transfect)됨으로써 H쇄와 L쇄를 구비한 항체 분자가 발현될 수 있다. 또는 H쇄 및 L쇄를 코드하는 DNA가 단일 발현 벡터에 삽입됨으로써 숙주세포가 형질전환될 수 있다(국제공개 WO1994/011523을 참조할 것).

단리된 항체 유전자를 적당한 숙주에 도입함으로써 항체를 제작하기 위한 숙주세포와 발현 벡터의 많은 조합이 공지이다. 이들 발현계는 모두 본 발명의 항원 결합 도메인을 단리하는데 응용될 수 있다. 진핵세포가 숙주세포로서 사용되는 경우, 동물세포, 식물세포 또는 진균세포가 적당히 사용될 수 있다. 구체적으로는 동물세포로서는 다음과 같은 세포가 예시될 수 있다.

(1) 포유류세포,：CHO, COS, 골수종, BHK(baby hamster kidney), Hela, Vero, HEK(human embryonic kidney) 293 등

(2) 양서류세포：아프리카 발톱개구리 난모세포 등

(3) 곤충세포：sf9, sf21, Tn5 등

또는 식물세포로서는 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) 등의 니코티아나(Nicotiana)속 유래의 세포에 의한 항체 유전자의 발현계가 공지이다. 식물세포의 형질전환에는 캘러스 배양한 세포가 적당히 이용될 수 있다.

또한 진균세포로서는 다음과 같은 세포를 이용할 수 있다.

-효모：사카로미세스 세레비시애(Saccharomyces serevisiae) 등의 사카로미세스(Saccharomyces)속, 메탄올 자화 효모(Pichia pastoris) 등의 Pichia속

-사상균：아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) 등의 아스퍼질러스(Aspergillus)속

또한 원핵세포를 이용한 항체 유전자의 발현계도 공지이다. 예를 들면, 세균세포를 사용하는 경우, 대장균(E. coli), 고초균 등의 세균세포가 적당히 이용될 수 있다. 이들 세포 중에 목적으로 하는 항체 유전자를 포함하는 발현 벡터가 형질전환에 의해 도입된다. 형질전환된 세포를 in vitro에서 배양함으로써 당해 형질전환 세포의 배양물로부터 목적하는 항체가 취득될 수 있다.

재조합 항체의 생산에는 상기 숙주세포에 더하여 형질전환 동물도 이용될 수 있다. 즉 목적하는 항체를 코드하는 유전자가 도입된 동물로부터 당해 항체를 얻을 수 있다. 예를 들면, 항체 유전자는 유즙 중에 고유하게 생산되는 단백질을 코드하는 유전자의 내부에 인프레임으로 삽입함으로써 융합 유전자로서 구축될 수 있다. 유즙 중에 분비되는 단백질로서 예를 들면, 염소 β카제인 등을 이용할 수 있다. 항체 유전자가 삽입된 융합 유전자를 포함하는 DNA 단편은 염소의 배(胚)로 주입되고, 당해 주입된 배가 암컷의 염소로 도입된다. 배를 수용한 염소로부터 태어나는 형질전환 염소(또는 그의 자손)가 생산하는 유즙으로부터는 목적하는 항체가 유즙 단백질과의 융합 단백질로서 취득될 수 있다. 또한 형질전환 염소로부터 생산되는 목적하는 항체를 포함하는 유즙량을 증가시키기 위해 호르몬이 형질전환 염소에 대해 투여될 수 있다(Bio/Technology (1994), 12 (7), 699-702).

본 명세서에 있어서 기재되는 폴리펩티드 회합체가 인간에게 투여되는 경우, 당해 회합체에 있어서의 항원 결합 도메인으로서, 인간에 대한 이종 항원성을 저하시키는 것 등을 목적으로 하여 인위적으로 개변한 유전자 재조합형 항체 유래의 항원 결합 도메인이 적당히 채용될 수 있다. 유전자 재조합형 항체에는 예를 들면, 인간화(Humanized) 항체 등이 포함된다. 이들 개변 항체는 공지의 방법을 사용하여 적당히 제조된다.

본 명세서에 있어서 기재되는 폴리펩티드 회합체에 있어서의 항원 결합 도메인을 제작하기 위해 사용되는 항체의 가변영역은 통상 4개의 프레임워크 영역(FR) 사이에 끼인 3개의 상보성 결정영역(complementarity-determining region;CDR)으로 구성되어 있다. CDR은 실질적으로 항체의 결합 특이성을 결정하고 있는 영역이다. CDR의 아미노산 서열은 다양성이 풍부하다. 한편 FR을 구성하는 아미노산 서열은 상이한 결합 특이성을 갖는 항체 사이에서도 높은 동일성을 나타내는 것이 많다. 그 때문에 일반적으로 CDR의 이식에 의해 어떤 항체의 결합 특이성을 다른 항체에 이식할 수 있는 것으로 되어 있다.

인간화 항체는 재구성(reshaped) 인간 항체라고도 칭해진다. 구체적으로는 인간 이외의 동물, 예를 들면 마우스 항체의 CDR을 인간 항체에 이식한 인간화 항체 등이 공지이다. 인간화 항체를 얻기 위한 일반적인 유전자 재조합 수법도 알려져 있다. 구체적으로는 마우스의 항체의 CDR을 인간의 FR에 이식하기 위한 방법으로서, 예를 들면 Overlap Extension PCR이 공지이다. Overlap Extension PCR에 있어서는 인간 항체의 FR을 합성하기 위한 프라이머에 이식 대상 마우스 항체의 CDR을 코드하는 염기서열이 부가된다. 프라이머는 4개의 FR의 각각에 대해서 준비된다. 일반적으로 마우스 CDR의 인간 FR로의 이식에 있어서는 마우스의 FR과 동일성이 높은 인간 FR을 선택하는 것이 CDR의 기능 유지에 있어서 유리하다고 되어 있다. 즉, 일반적으로 이식 대상 마우스 CDR에 인접해 있는 FR의 아미노산 서열과 동일성이 높은 아미노산 서열로 이루어지는 인간 FR을 이용하는 것이 바람직하다.

또한 연결되는 염기서열은 서로 인프레임으로 접속되도록 디자인된다. 각각의 프라이머에 의해 인간 FR이 개별적으로 합성된다. 그 결과 각 FR에 마우스 CDR을 코드하는 DNA가 부가된 산물이 얻어진다. 각 산물의 마우스 CDR을 코드하는 염기서열은 서로 오버랩되도록 디자인되어 있다. 계속해서 인간 항체 유전자를 주형으로 하여 합성된 산물의 오버랩된 CDR 부분을 서로 어닐링시켜서 상보가닥 합성반응이 행해진다. 이 반응에 의해 인간 FR이 마우스 CDR의 서열을 매개로 연결된다.

최종적으로 3개의 CDR과 4개의 FR이 연결된 V영역 유전자는 그의 5'말단과 3'말단에 어닐링하여 적당한 제한효소 인식서열이 부가된 프라이머에 의해 그의 전장이 증폭된다. 상기와 같이 얻어진 DNA와 인간 항체 C영역을 코드하는 DNA를 인프레임으로 융합하도록 발현 벡터 중에 삽입함으로써 인간형 항체 발현용 벡터를 제작할 수 있다. 당해 삽입 벡터를 숙주에 도입하여 재조합 세포를 수립한 후에, 당해 재조합 세포를 배양하고, 당해 인간화 항체를 코드하는 DNA를 발현시킴으로써 당해 인간화 항체가 당해 배양세포의 배양물 중에 생산된다(유럽 특허공개 EP239400, 국제공개 WO1996/002576 참조).

상기와 같이 제작된 인간화 항체의 항원에 대한 결합 활성을 정성적 또는 정량적으로 측정하고 평가함으로써, CDR을 매개로 연결되었을 때 그 CDR이 양호한 항원 결합 부위를 형성하는 인간 항체의 FR을 적합하게 선택할 수 있다. 필요에 따라 재구성 인간 항체의 CDR이 적절한 항원 결합 부위를 형성하도록 FR의 아미노산 잔기를 치환하는 것도 가능하다. 예를 들면, 마우스 CDR의 인간 FR로의 이식에 사용한 PCR법을 응용하여 FR에 아미노산 서열의 변이를 도입할 수 있다. 구체적으로는 FR에 어닐링하는 프라이머에 부분적인 염기서열의 변이를 도입할 수 있다. 이러한 프라이머에 의해 합성된 FR에는 염기서열의 변이가 도입된다. 아미노산을 치환한 변이형 항체의 항원에 대한 결합 활성을 상기 방법으로 측정하여 평가함으로써 목적하는 성질을 갖는 변이 FR 서열이 선택될 수 있다(Cancer Res., (1993) 53, 851-856).

또한 인간 항체 유전자의 모든 레퍼토리를 갖는 형질전환 동물(국제공개 WO1993/012227, WO1992/003918, WO1994/002602, WO1994/025585, WO1996/034096, WO1996/033735 참조)을 면역동물로 하여 DNA 면역에 의해 목적하는 인간 항체가 취득될 수 있다.

또한 인간 항체 라이브러리를 사용하여 패닝에 의해 인간 항체를 취득하는 기술도 알려져 있다. 예를 들면, 인간 항체의 V영역이 단일 사슬 항체(scFv)로서 파지 디스플레이법에 의해 파지의 표면에 발현된다. 항원에 결합하는 scFv를 발현하는 파지가 선택될 수 있다. 선택된 파지의 유전자를 해석함으로써 항원에 결합하는 인간 항체의 V영역을 코드하는 DNA 서열을 결정할 수 있다. 항원에 결합하는 scFv의 DNA 서열을 결정한 후, 당해 V영역 서열을 목적하는 인간 항체 C영역의 서열과 인프레임으로 융합시킨 후에 적당한 발현 벡터에 삽입함으로써 발현 벡터가 제작될 수 있다. 당해 발현 벡터를 상기에 예로 든 바와 같은 적합한 발현 세포 중에 도입하고, 그 인간 항체를 코드하는 유전자를 발현시킴으로써 당해 인간 항체가 취득된다. 이들 방법은 이미 공지이다(국제공개 WO1992/001047, WO1992/020791, WO1993/006213, WO1993/011236, WO1993/019172, WO1995/001438, WO1995/015388 참조).

또한 항체 유전자를 취득하는 방법으로서 Bernasconi등(Science (2002) 298, 2199-2202) 또는 WO2008/081008에 기재된 바와 같은 B세포 클로닝(각각의 항체의 코드 서열의 동정 및 클로닝, 그의 단리 및 각각의 항체(특히, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)의 제작을 위한 발현 벡터 구축을 위한 사용 등)의 수법이 상기 외에 적당히 사용될 수 있다.

EU 넘버링 및 Kabat 넘버링

본 발명에서 사용되고 있는 방법에 의하면 항체의 CDR과 FR에 할당되는 아미노산 위치는 Kabat에 따라 규정된다(Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute of Health, Bethesda, Md., 1987년 및 1991년). 본 명세서에 있어서 항원 결합 분자가 항체 또는 항원 결합 단편인 경우, 가변영역의 아미노산은 Kabat 넘버링에 따라 정상영역의 아미노산은 Kabat의 아미노산 위치에 준한 EU 넘버링에 따라 표시된다.

이온 농도의 조건

금속 이온 농도의 조건

본 발명의 비한정의 하나의 태양에서는 이온 농도란 금속 이온 농도를 말한다. 「금속 이온」이란 수소를 제외한 알칼리금속 및 구리족 등의 제I족, 알칼리토류금속 및 아연족 등의 제II족, 붕소를 제외한 제III족, 탄소와 규소를 제외한 제IV족, 철족 및 백금족 등의 제VIII족, V, VI 및 VII족의 각 A아족에 대한 원소와 안티몬, 비스무트, 폴로늄 등의 금속원소의 이온을 말한다. 금속원자는 원자가 전자를 방출하여 양이온이 되는 성질을 가지고 있어 이를 이온화 경향이라 한다. 이온화 경향이 큰 금속은 화학적으로 활성이 풍부하다고 한다.

본 발명에서 적합한 금속 이온의 예로서 칼슘 이온을 들 수 있다. 칼슘 이온은 많은 생명 현상의 조절에 관여하고 있어 골격근, 평활근 및 심근 등의 근육의 수축, 백혈구의 운동 및 탐식 등의 활성화, 혈소판의 변형 및 분비 등의 활성화, 림프구의 활성화, 히스타민의 분비 등의 비만세포의 활성화, 카테콜아민 α수용체나 아세틸콜린 수용체를 매개로 하는 세포의 응답, 엑소시토시스(exocytosis), 뉴런 종말로부터의 전달물질의 방출, 뉴런의 축삭류(axoplasmic flow) 등에 칼슘 이온이 관여하고 있다. 세포내의 칼슘 이온 수용체로서 복수 개의 칼슘 이온 결합 부위를 가지며, 분자 진화상 공통의 기원으로부터 유래된 것으로 생각되는 트로포닌 C, 칼모듈린, 파브알부민, 미오신 경쇄 등이 알려져 있고, 그의 결합 모티브도 많이 알려져 있다. 예를 들면, 카드헤린 도메인, 칼모듈린에 포함되는 EF 핸드, Protein kinase C에 포함되는 C2 도메인, 혈액응고 단백질 Factor IX에 포함되는 Gla 도메인, 아시알로글리코프로테인 수용체나 만노오스 결합 수용체에 포함되는 C형 렉틴, LDL 수용체에 포함되는 A 도메인, 아넥신, 트롬보스폰딘 3형 도메인 및 EGF 유사 도메인이 잘 알려져 있다.

본 발명에 있어서는 금속 이온이 칼슘 이온인 경우에는 칼슘 이온 농도의 조건으로서 저칼슘 이온 농도의 조건과 고칼슘 이온 농도의 조건을 들 수 있다. 칼슘 이온 농도의 조건에 따라 결합 활성이 변화된다는 것은, 저칼슘 이온 농도와 고칼슘 이온 농도의 조건의 차이에 의해 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성이 변화되는 것을 말한다. 예를 들면 저칼슘 이온 농도의 조건하에 있어서의 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성보다도 고칼슘 이온 농도의 조건하에 있어서의 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성 쪽이 높은 경우를 들 수 있다. 또한 고칼슘 이온 농도의 조건하에 있어서의 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성보다도 저칼슘 이온 농도의 조건하에 있어서의 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성 쪽이 높은 경우도 또한 들 수 있다.

본 명세서에 있어서 고칼슘 이온 농도란 특별히 일의적인 수치에 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 100 μM~10 mM로부터 선택되는 농도일 수 있다. 또한 다른 태양에서는 200 μM~5 mM로부터 선택되는 농도일 수도 있다. 또한 상이한 태양에서는 500 μM~2.5 mM로부터 선택되는 농도일 수도 있고, 다른 태양에서는 200 μM~2 mM로부터 선택되는 농도일 수도 있다. 또한 400 μM~1.5 mM로부터 선택되는 농도일 수도 있다. 특히 생체내의 혈장 중(혈중)에서의 칼슘 이온 농도에 가까운 500 μM~2.5 mM로부터 선택되는 농도를 바람직하게 들 수 있다.

본 명세서에 있어서 저칼슘 이온 농도란 특별히 일의적인 수치에 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 0.1 μM~30 μM로부터 선택되는 농도일 수 있다. 또한 다른 태양에서는 0.2 μM~20 μM로부터 선택되는 농도일 수도 있다. 또한 상이한 태양에서는 0.5 μM~10 μM로부터 선택되는 농도일 수도 있고, 다른 태양에서는 1 μM~5 μM로부터 선택되는 농도일 수도 있다. 또한 2 μM~4 μM로부터 선택되는 농도일 수도 있다. 특히 생체내의 조기 엔도솜 내에서의 이온화 칼슘 농도에 가까운 1 μM~5 μM로부터 선택되는 농도를 바람직하게 들 수 있다.

본 발명에 있어서 저칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 고칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮다는 것은, 항원 결합 분자의 0.1 μM~30 μM로부터 선택되는 칼슘 이온 농도에서의 항원에 대한 결합 활성이 100 μM~10 mM로부터 선택되는 칼슘 이온 농도에서의 항원에 대한 결합 활성보다 약한 것을 의미한다. 바람직하게는 항원 결합 분자의 0.5 μM~10 μM로부터 선택되는 칼슘 이온 농도에서의 항원에 대한 결합 활성이 200 μM~5 mM로부터 선택되는 칼슘 이온 농도에서의 항원에 대한 결합 활성보다 약한 것을 의미하고, 특히 바람직하게는 생체내의 조기 엔도솜 내의 칼슘 이온 농도에 있어서의 항원 결합 활성이 생체내의 혈장 중의 칼슘 이온 농도에 있어서의 항원 결합 활성보다 약한 것을 의미하고, 구체적으로는 항원 결합 분자의 1 μM~5 μM로부터 선택되는 칼슘 이온 농도에서의 항원에 대한 결합 활성이 500 μM~2.5 mM로부터 선택되는 칼슘 이온 농도에서의 항원에 대한 결합 활성보다 약한 것을 의미한다.

금속 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성이 변화되고 있는지 여부는, 예를 들면 상기 결합 활성의 항목에서 기재된 바와 같은 공지의 측정방법을 사용함으로써 결정될 수 있다. 예를 들면 저칼슘 이온 농도의 조건하에 있어서의 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성보다도 고칼슘 이온 농도의 조건하에 있어서의 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성 쪽이 높게 변화되는 것을 확인하기 위해서는 저칼슘 이온 농도 및 고칼슘 이온 농도의 조건하에 있어서의 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성이 비교된다.

또한 본 발명에 있어서 「저칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 고칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮다」는 표현은, 항원 결합 분자의 고칼슘 이온 농도 조건하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 저칼슘 이온 농도 조건하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다도 높다고 표현하는 것도 가능하다. 또한 본 발명에 있어서는 「저칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 고칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮다」를 「저칼슘 이온 농도 조건하에 있어서의 항원 결합능이 고칼슘 이온 농도 조건하에 있어서의 항원에 대한 결합능보다 약하다」라고 기재하는 경우도 있고, 또한 「저칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원 결합 활성을 고칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 저하시킨다」를 「저칼슘 이온 농도 조건하에 있어서의 항원 결합능을 고칼슘 이온 농도 조건하에 있어서의 항원에 대한 결합능보다도 약하게 한다」고 기재하는 경우도 있다.

항원에 대한 결합 활성을 측정할 때의 이온화 칼슘 농도 이외의 조건은 당업자가 적당히 선택하는 것이 가능하고, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, HEPES 버퍼, 37℃의 조건에 있어서 측정하는 것이 가능하다. 예를 들면, Biacore(GE Healthcare) 등을 사용하여 측정하는 것이 가능하다. 항원 결합 분자와 항원의 결합 활성의 측정은, 항원이 가용형 항원인 경우는 항원 결합 분자를 고정화한 칩으로 항원을 애널라이트로서 흘림으로써 가용형 항원에 대한 결합 활성을 평가하는 것이 가능하고, 항원이 막형 항원인 경우는 항원을 고정화한 칩으로 항원 결합 분자를 애널라이트로서 흘림으로써 막형 항원에 대한 결합 활성을 평가하는 것이 가능하다.

본 발명의 항원 결합 분자에 있어서 저칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 고칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다도 약한 한, 저칼슘 이온 농도 조건하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성과 고칼슘 이온 농도 조건하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성의 비는 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 항원에 대한 저칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 KD(Dissociation constant：해리상수)와 고칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 KD의 비인 KD(Ca 3 μM)/KD(Ca 2 mM)의 값이 2 이상이고, 더욱 바람직하게는 KD(Ca 3 μM)/KD(Ca 2 mM)의 값이 10 이상이며, 더욱 바람직하게는 KD(Ca 3 μM)/KD(Ca 2 mM)의 값이 40 이상이다. KD(Ca 3 μM)/KD(Ca 2 mM)의 값의 상한은 특별히 한정되지 않고, 당업자의 기술에 있어서 제작 가능한 한 400, 1000, 10000 등 어떠한 값이어도 된다. 또한 KD(Ca 3 μM)/KD(Ca 1.2 mM)의 값으로도 특정될 수 있다. 즉, KD(Ca 3 μM)/KD(Ca 1.2 mM)의 값이 2 이상이고, 더욱 바람직하게는 KD(Ca 3 μM)/KD(Ca 1.2 mM)의 값이 10 이상이며, 더욱 바람직하게는 KD(Ca 3 μM)/KD(Ca 1.2 mM)의 값이 40 이상이다. KD(Ca 3 μM)/KD(Ca 1.2 mM)의 값의 상한은 특별히 한정되지 않고, 당업자의 기술에 있어서 제작 가능한 한 400, 1000, 10000 등 어떠한 값이어도 된다.

항원에 대한 결합 활성의 값으로서 항원이 가용형 항원인 경우는 KD(해리상수)를 사용하는 것이 가능하나, 항원이 막형 항원인 경우는 겉보기 KD(Apparent dissociation constant：겉보기 해리상수)를 사용하는 것이 가능하다. KD(해리상수) 및 겉보기 KD(겉보기 해리상수)는 당업자 공지의 방법으로 측정하는 것이 가능하고, 예를 들면 Biacore(GE healthcare), 스캐차드 플롯, 플로우 사이토미터 등을 사용하는 것이 가능하다.

또한 본 발명의 항원 결합 분자의 저칼슘 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성과 고칼슘 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성의 비를 나타내는 다른 지표로서, 예를 들면, 해리속도상수인 kd(Dissociation rate constant：해리속도상수)도 또한 바람직하게 사용될 수 있다. 결합 활성의 비를 나타내는 지표로서 KD(해리상수) 대신에 kd(해리속도상수)를 사용하는 경우, 항원에 대한 저칼슘 농도의 조건에 있어서의 kd(해리속도상수)와 고칼슘 농도의 조건에 있어서의 kd(해리속도상수)의 비인 kd(저칼슘 농도의 조건)/kd(고칼슘 농도의 조건)의 값은 바람직하게는 2 이상이고, 더욱 바람직하게는 5 이상이며, 더욱 바람직하게는 10 이상이고, 보다 바람직하게는 30 이상이다. kd(저칼슘 농도의 조건)/kd(고칼슘 농도의 조건)의 값의 상한은 특별히 한정되지 않고, 당업자의 기술상식에 있어서 제작 가능한 한 50, 100, 200 등 어떠한 값이어도 된다.

항원 결합 활성의 값으로서 항원이 가용형 항원인 경우는 kd(해리속도상수)를 사용하는 것이 가능하고, 항원이 막형 항원인 경우는 겉보기 kd(Apparent dissociation rate constant：겉보기 해리속도상수)를 사용하는 것이 가능하다. kd(해리속도상수) 및 겉보기 kd(겉보기 해리속도상수)는 당업자 공지의 방법으로 측정하는 것이 가능하고, 예를 들면 Biacore(GE healthcare), 플로우 사이토미터 등을 사용하는 것이 가능하다. 또한 본 발명에 있어서 상이한 칼슘 이온 농도에 있어서의 항원 결합 분자의 항원에 대한 결합 활성을 측정할 때는 칼슘 농도 이외의 조건은 동일하게 하는 것이 바람직하다.

예를 들면 본 발명이 제공하는 하나의 태양인 저칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 고칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인 또는 항체는, 아래의 공정(a)~(c)를 포함하는 항원 결합 도메인 또는 항체의 스크리닝에 의해 취득될 수 있다.

(a) 저칼슘 농도의 조건에 있어서의 항원 결합 도메인 또는 항체의 항원 결합 활성을 얻는 공정,

(b) 고칼슘 농도의 조건에 있어서의 항원 결합 도메인 또는 항체의 항원 결합 활성을 얻는 공정, 및

(c) 저칼슘 농도의 조건에 있어서의 항원 결합 활성이 고칼슘 농도의 조건에 있어서의 항원 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인 또는 항체를 선택하는 공정.

또한 본 발명이 제공하는 하나의 태양인 저칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 고칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인 또는 항체는, 아래의 공정(a)~(c)를 포함하는 항원 결합 도메인 또는 항체 또는 그들의 라이브러리의 스크리닝에 의해 취득될 수 있다.

(a) 고칼슘 농도의 조건에 있어서의 항원 결합 도메인 또는 항체 또는 그들의 라이브러리를 항원에 접촉시키는 공정,

(b) 상기 공정(a)에서 항원에 결합한 항원 결합 도메인 또는 항체를 저칼슘 농도 조건하에 두는 공정, 및

(c) 상기 공정(b)에서 해리된 항원 결합 도메인 또는 항체를 단리하는 공정.

또한 본 발명이 제공하는 하나의 태양인 저칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 고칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인 또는 항체는, 아래의 공정(a)~(d)를 포함하는 항원 결합 도메인 또는 항체 또는 그들의 라이브러리의 스크리닝에 의해 취득될 수 있다.

(a) 저칼슘 농도 조건하에서 항원 결합 도메인 또는 항체의 라이브러리를 항원에 접촉시키는 공정,

(b) 상기 공정(a)에서 항원에 결합하지 않는 항원 결합 도메인 또는 항체를 선택하는 공정,

(c) 상기 공정(b)에서 선택된 항원 결합 도메인 또는 항체를 고칼슘 농도 조건하에서 항원에 결합시키는 공정, 및

(d) 상기 공정(c)에서 항원에 결합한 항원 결합 도메인 또는 항체를 단리하는 공정.

또한 본 발명이 제공하는 하나의 태양인 저칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 고칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인 또는 항체는, 아래의 공정(a)~(c)를 포함하는 스크리닝방법에 의해 취득될 수 있다.

(a) 항원을 고정한 칼럼에 고칼슘 농도 조건하에서 항원 결합 도메인 또는 항체의 라이브러리를 접촉시키는 공정,

(b) 상기 공정(a)에서 칼럼에 결합한 항원 결합 도메인 또는 항체를 저칼슘 농도 조건하에서 칼럼으로부터 용출하는 공정, 및

(c) 상기 공정(b)에서 용출된 항원 결합 도메인 또는 항체를 단리하는 공정.

또한 본 발명이 제공하는 하나의 태양인 저칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 고칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인 또는 항체는, 아래의 공정(a)~(d)를 포함하는 스크리닝방법에 의해 취득될 수 있다.

(a) 항원을 고정한 칼럼에 저칼슘 농도 조건하에서 항원 결합 도메인 또는 항체의 라이브러리를 통과시키는 공정,

(b) 상기 공정(a)에서 칼럼에 결합하지 않고 용출된 항원 결합 도메인 또는 항체를 회수하는 공정,

(c) 상기 공정(b)에서 회수된 항원 결합 도메인 또는 항체를 고칼슘 농도 조건하에서 항원에 결합시키는 공정, 및

(a) 고칼슘 농도 조건하에서 항원 결합 도메인 또는 항체의 라이브러리를 항원에 접촉시키는 공정,

(b) 상기 공정(a)에서 항원에 결합한 항원 결합 도메인 또는 항체를 취득하는 공정,

(c) 상기 공정(b)에서 취득한 항원 결합 도메인 또는 항체를 저칼슘 농도 조건하에 두는 공정, 및

(d) 상기 공정(c)에서 항원 결합 활성이 상기 공정(b)에서 선택한 기준보다 약한 항원 결합 도메인 또는 항체를 단리하는 공정.

또한 상기 공정은 2회 이상 반복되어도 된다. 따라서 본 발명에 의해, 전술한 스크리닝방법에 있어서 (a)~(c) 또는 (a)~(d)의 공정을 2회 이상 반복하는 공정을 추가로 포함하는 스크리닝방법에 의해 취득된 저칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 고칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인 또는 항체가 제공된다. (a)~(c) 또는 (a)~(d)의 공정이 반복되는 횟수는 특별히 한정되지 않으나, 통상 10회 이내이다.

본 발명의 스크리닝방법에 있어서, 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 도메인 또는 항체의 항원 결합 활성은 이온화 칼슘 농도가 0.1 μM~30 μM의 항원 결합 활성이라면 특별히 한정되지 않으나, 바람직한 이온화 칼슘 농도로서 0.5 μM~10 μM의 항원 결합 활성을 들 수 있다. 보다 바람직한 이온화 칼슘 농도로서 생체내의 조기 엔도솜 내의 이온화 칼슘 농도를 들 수 있고, 구체적으로는 1 μM~5 μM에 있어서의 항원 결합 활성을 들 수 있다. 또한 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 도메인 또는 항체의 항원 결합 활성은 이온화 칼슘 농도가 100 μM~10 mM의 항원 결합 활성이라면 특별히 한정되지 않으나, 바람직한 이온화 칼슘 농도로서 200 μM~5 mM의 항원 결합 활성을 들 수 있다. 보다 바람직한 이온화 칼슘 농도로서 생체내의 혈장 중에서의 이온화 칼슘 농도를 들 수 있고, 구체적으로는 0.5 mM~2.5 mM에 있어서의 항원 결합 활성을 들 수 있다.

항원 결합 도메인 또는 항체의 항원 결합 활성은 당업자에게 공지의 방법에 의해 측정하는 것이 가능하고, 이온화 칼슘 농도 이외의 조건에 대해서는 당업자가 적당히 결정하는 것이 가능하다. 항원 결합 도메인 또는 항체의 항원 결합 활성은 KD(Dissociation constant：해리상수), 겉보기 KD(Apparent dissociation constant：겉보기 해리상수), 해리속도인 kd(Dissociation rate：해리속도상수) 또는 겉보기 kd(Apparent dissociation：겉보기 해리속도상수) 등으로서 평가하는 것이 가능하다. 이들은 당업자 공지의 방법으로 측정하는 것이 가능하고, 예를 들면 Biacore(GE healthcare), 스캐차드 플롯, FACS 등을 사용하는 것이 가능하다.

본 발명에 있어서 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다 높은 항원 결합 도메인 또는 항체를 선택하는 공정은, 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인 또는 항체를 선택하는 공정과 동일한 의미이다.

고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다 높은 한, 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성과 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성의 차는 특별히 한정되지 않으나, 바람직하게는 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성의 2배 이상이고, 더욱 바람직하게는 10배 이상이며, 보다 바람직하게는 40배 이상이다.

상기 스크리닝방법에 의해 스크리닝되는 본 발명의 항원 결합 도메인 또는 항체는 어떠한 항원 결합 도메인 또는 항체여도 되고, 예를 들면 전술한 항원 결합 도메인 또는 항체를 스크리닝하는 것이 가능하다. 예를 들면 천연의 서열을 갖는 항원 결합 도메인 또는 항체를 스크리닝해도 되고, 아미노산 서열이 치환된 항원 결합 도메인 또는 항체를 스크리닝해도 된다.

라이브러리

어떤 일태양에 따르면, 본 발명의 항원 결합 도메인 또는 항체는 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 하나 이상의 아미노산 잔기가 항원 결합 도메인에 포함되어 있는 서로 서열이 상이한 복수의 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리로부터 취득될 수 있다. 이온 농도의 예로서는 금속 이온 농도나 수소 이온 농도를 바람직하게 들 수 있다.

본 명세서에 있어서 「라이브러리」란 복수의 항원 결합 분자 또는 항원 결합 분자를 포함하는 복수의 융합 폴리펩티드, 또는 이들의 서열을 코드하는 핵산, 폴리뉴클레오티드를 말한다. 라이브러리 중에 포함되는 복수의 항원 결합 분자 또는 항원 결합 분자를 포함하는 복수의 융합 폴리펩티드의 서열은 단일 서열이 아니라, 서로 서열이 상이한 항원 결합 분자 또는 항원 결합 분자를 포함하는 융합 폴리펩티드이다.

본 명세서에 있어서는 서로 서열이 상이한 복수의 항원 결합 분자라는 기재에 있어서의 「서로 서열이 상이하다」는 용어는 라이브러리 중의 개개의 항원 결합 분자의 서열이 상호 상이한 것을 의미한다. 즉 라이브러리 중에 있어서의 서로 다른 서열의 수는 라이브러리 중의 서열이 상이한 독립 클론의 수가 반영되어 「라이브러리 사이즈」로 지칭되는 경우도 있다. 통상의 파지 디스플레이 라이브러리에서는 10⁶~10¹²이고, 리보솜 디스플레이법 등의 공지의 기술을 적용함으로써 라이브러리 사이즈를 10¹⁴까지 확대하는 것이 가능하다. 그러나 파지 라이브러리의 패닝 선택시에 사용되는 파지 입자의 실제 수는 통상 라이브러리 사이즈보다도 10~10,000배 크다. 이 과잉 배수는 「라이브러리 당량수」라고도 불리는데 동일한 아미노산 서열을 갖는 개개의 클론이 10~10,000 존재할 수 있는 것을 나타낸다. 따라서 본 발명에 있어서의 「서로 서열이 상이하다」는 용어는 라이브러리 당량수가 제외된 라이브러리 중의 개개의 항원 결합 분자의 서열이 상호 상이한 것, 보다 구체적으로는 서로 서열이 상이한 항원 결합 분자가 10⁶~10¹⁴분자, 바람직하게는 10⁷~10¹² 분자, 더욱 바람직하게는 10⁸~10¹¹ 분자, 특히 바람직하게는 10⁸~10¹² 존재하는 것을 의미한다.

또한 본 발명의 복수의 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리라는 기재에 있어서의 「복수의」라는 용어는, 예를 들면 본 발명의 항원 결합 분자, 융합 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 분자, 벡터 또는 바이러스는 통상 그 물질의 2개 이상의 종류의 집합을 가리킨다. 예를 들면 어떤 2개 이상의 물질이 특정 형질에 관하여 서로 상이하다면 그 물질에는 2종류 이상이 존재하는 것을 나타낸다. 예로서는 아미노산 서열 중의 특정 아미노산 위치에서 관찰되는 변이체 아미노산을 들 수 있다. 예를 들면 플렉시블 잔기 이외, 또는 표면에 노출된 매우 다양한 아미노산 위치의 특정 변이체 아미노산 이외는 실질적으로 동일한, 바람직하게는 동일 서열인 본 발명의 2개 이상의 항원 결합 분자가 있는 경우, 본 발명의 항원 결합 분자는 복수 개 존재한다. 다른 실시예에서는 플렉시블 잔기를 코드하는 염기 이외, 또는 표면에 노출된 매우 다양한 아미노산 위치의 특정 변이체 아미노산을 코드하는 염기 이외는 실질적으로 동일한, 바람직하게는 동일 서열인 본 발명의 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 분자가 있다면, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 분자는 복수 개 존재한다.

또한 본 발명의 복수의 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리라는 기재에 있어서의 「로 주로 이루어지는」이라는 용어는 라이브러리 중의 서열이 상이한 독립 클론의 수 중, 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성이 상이한 항원 결합 분자의 수가 반영된다. 구체적으로는 그러한 결합 활성을 나타내는 항원 결합 분자가 라이브러리 중에 적어도 10⁴분자 존재하는 것이 바람직하다. 또한 보다 바람직하게는 본 발명의 항원 결합 도메인은 그러한 결합 활성을 나타내는 항원 결합 분자가 적어도 10⁵ 분자 존재하는 라이브러리로부터 취득될 수 있다. 더욱 바람직하게는 본 발명의 항원 결합 도메인은 그러한 결합 활성을 나타내는 항원 결합 분자가 적어도 10⁶ 분자 존재하는 라이브러리로부터 취득될 수 있다. 특히 바람직하게는 본 발명의 항원 결합 도메인은 그러한 결합 활성을 나타내는 항원 결합 분자가 적어도 10⁷ 분자 존재하는 라이브러리로부터 취득될 수 있다. 또한 바람직하게는 본 발명의 항원 결합 도메인은 그러한 결합 활성을 나타내는 항원 결합 분자가 적어도 10⁸ 분자 존재하는 라이브러리로부터 취득될 수 있다. 다른 표현으로는 라이브러리 중의 서열이 상이한 독립 클론의 수 중, 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성이 상이한 항원 결합 분자의 비율로서도 적합하게 표현될 수 있다. 구체적으로는 본 발명의 항원 결합 도메인은 그러한 결합 활성을 나타내는 항원 결합 분자가 라이브러리 중의 서열이 상이한 독립 클론 수의 0.1%~80%, 바람직하게는 0.5%~60%, 보다 바람직하게는 1%~40%, 더욱 바람직하게는 2%~20%, 특히 바람직하게는 4%~10% 포함되는 라이브러리로부터 취득될 수 있다. 융합 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 분자 또는 벡터의 경우도 상기와 마찬가지로 분자의 수나 분자 전체에 있어서의 비율로 표현될 수 있다. 또한 바이러스의 경우도 상기와 마찬가지로 바이러스 개체의 수나 개체 전체에 있어서의 비율로 표현될 수 있다.

칼슘 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 도메인의 결합 활성이 변화되는 아미노산

상기 스크리닝방법에 의해 스크리닝되는 본 발명의 항원 결합 도메인 또는 항체는 어떻게 조제되어도 되고, 예를 들면 금속 이온이 칼슘 이온 농도인 경우에는 사전에 존재하고 있는 항체, 사전에 존재하고 있는 라이브러리(파지 라이브러리 등), 동물에 대한 면역으로부터 얻어진 하이브리도마나 면역동물로부터의 B세포로부터 제작된 항체 또는 라이브러리, 이들 항체나 라이브러리에 칼슘을 킬레이트 가능한 아미노산(예를 들면 아스파라긴산이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산 변이를 도입한 항체 또는 라이브러리(칼슘을 킬레이트 가능한 아미노산(예를 들면 아스파라긴산이나 글루타민산) 또는 비천연 아미노산의 함유율을 높게 한 라이브러리나 특정 개소에 칼슘을 킬레이트 가능한 아미노산(예를 들면 아스파라긴산이나 글루타민산) 또는 비천연 아미노산 변이를 도입한 라이브러리 등) 등을 사용하는 것이 가능하다.

상기와 같이 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 아미노산의 예로서, 예를 들면 금속 이온이 칼슘 이온인 경우에는 칼슘 결합 모티브를 형성하는 아미노산이라면 그 종류는 불문한다. 칼슘 결합 모티브는 당업자에게 주지로 상세하게 기재되어 있다(예를 들면 Springer등(Cell (2000) 102, 275-277), Kawasaki 및 Kretsinger(Protein Prof. (1995) 2, 305-490), Moncrief등(J. Mol. Evol. (1990) 30, 522-562), Chauvaux등(Biochem. J. (1990) 265, 261-265), Bairoch 및 Cox(FEBS Lett. (1990) 269, 454-456), Davis(New Biol. (1990) 2, 410-419), Schaefer등(Genomics (1995) 25, 638~643), Economou등(EMBO J. (1990) 9, 349-354), Wurzburg등(Structure. (2006) 14, 6, 1049-1058)). 즉, ASGPR, CD23, MBR, DC-SIGN 등의 C형 렉틴 등의 임의의 공지의 칼슘 결합 모티브가 본 발명의 항원 결합 분자에 포함될 수 있다. 이러한 칼슘 결합 모티브의 적합한 예로서, 상기 외에는 서열번호：4, 서열번호：9, 서열번호：10에 기재되는 항원 결합 도메인에 포함되는 칼슘 결합 모티브도 들 수 있다.

또한 칼슘 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성이 변화되는 아미노산의 예로서, 금속 킬레이트 작용을 갖는 아미노산도 적합하게 사용될 수 있다. 금속 킬레이트 작용을 갖는 아미노산의 예로서, 예를 들면 세린(Ser(S)), 트레오닌(Thr(T)), 아스파라긴(Asn(N)), 글루타민(Gln(Q)), 아스파라긴산(Asp(D)) 및 글루타민산(Glu(E)) 등을 바람직하게 들 수 있다.

상기의 아미노산이 포함되는 항원 결합 도메인의 위치는 특정 위치에 한정되지 않고, 칼슘 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 한, 항원 결합 도메인을 형성하는 중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역 중 어느 위치일 수도 있다. 즉 본 발명의 항원 결합 도메인은 칼슘 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 아미노산이 중쇄의 항원 결합 도메인에 포함되어 있는 서로 서열이 상이한 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리로부터 취득될 수 있다. 또한 다른 비한정의 태양에서는 본 발명의 항원 결합 도메인은 당해 아미노산이 중쇄의 CDR3에 포함되어 있는 서로 서열이 상이한 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리로부터 취득될 수 있다. 그 밖의 비한정의 태양에서는 본 발명의 항원 결합 도메인은 당해 아미노산이 중쇄의 CDR3의 Kabat 넘버링으로 표시되는 95번 위치, 96번 위치, 100a번 위치 및/또는 101번 위치에 포함되어 있는 서로 서열이 상이한 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리로부터 취득될 수 있다.

또한 본 발명의 비한정의 일태양에서는 본 발명의 항원 결합 도메인은 칼슘 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 아미노산이 경쇄의 항원 결합 도메인에 포함되어 있는 서로 서열이 상이한 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리로부터 취득될 수 있다. 또한 다른 태양에서는 본 발명의 항원 결합 도메인은 당해 아미노산이 경쇄의 CDR1에 포함되어 있는 서로 서열이 상이한 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리로부터 취득될 수 있다. 그 밖의 태양에서는 본 발명의 항원 결합 도메인은 당해 아미노산이 경쇄의 CDR1의 Kabat 넘버링으로 표시되는 30번 위치, 31번 위치 및/또는 32번 위치에 포함되어 있는 서로 서열이 상이한 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리로부터 취득될 수 있다.

또한 다른 비한정의 태양에서는 본 발명의 항원 결합 도메인은 당해 아미노산 잔기가 경쇄의 CDR2에 포함되어 있는 서로 서열이 상이한 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리로부터 취득될 수 있다. 그 밖의 태양에서는 당해 아미노산 잔기가 경쇄의 CDR2의 Kabat 넘버링으로 표시되는 50번 위치에 포함되어 있는 서로 서열이 상이한 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리가 제공된다.

또 다른 비한정의 태양에서는 본 발명의 항원 결합 도메인은 당해 아미노산 잔기가 경쇄의 CDR3에 포함되어 있는 서로 서열이 상이한 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리로부터 취득될 수 있다. 그 밖의 태양에서는 본 발명의 항원 결합 도메인은 당해 아미노산 잔기가 경쇄의 CDR3의 Kabat 넘버링으로 표시되는 92번 위치에 포함되어 있는 서로 서열이 상이한 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리로부터 취득될 수 있다.

또한 본 발명의 항원 결합 도메인은 당해 아미노산 잔기가 상기에 기재된 경쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3로부터 선택되는 2개 또는 3개의 CDR에 포함되어 있는 서로 서열이 상이한 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리로부터 본 발명의 상이한 태양으로서 취득될 수 있다. 또한 본 발명의 항원 결합 도메인은 당해 아미노산 잔기가 경쇄의 Kabat 넘버링으로 표시되는 30번 위치, 31번 위치, 32번 위치, 50번 위치 및/또는 92번 위치 중 어느 하나 이상에 포함되어 있는 서로 서열이 상이한 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리로부터 취득될 수 있다.

특히 적합한 실시태양에서는 항원 결합 분자의 경쇄 및/또는 중쇄 가변영역의 프레임워크 서열은 인간의 생식세포계 프레임워크 서열을 가지고 있는 것이 바람직하다. 따라서 본 발명의 일태양에 있어서 프레임워크 서열이 완전히 인간의 서열이라면, 인간에게 투여(예를 들면 질병의 치료)된 경우, 본 발명의 항원 결합 분자는 면역원성 반응을 거의 또는 전혀 일으키지 않을 것으로 생각된다. 상기 의미로부터 본 발명의 「생식세포 계열의 서열을 포함한다」는 것은, 본 발명의 프레임워크 서열의 일부가 어느 하나의 인간의 생식세포계 프레임워크 서열의 일부와 동일한 것을 의미한다. 예를 들면 본 발명의 항원 결합 분자의 중쇄 FR2의 서열이 복수의 상이한 인간의 생식세포계 프레임워크 서열의 중쇄 FR2 서열이 조합된 서열인 경우도, 본 발명의 「생식세포 계열의 서열을 포함하는」 항원 결합 분자이다.

프레임워크의 예로서는 예를 들면 V-Base(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) 등의 웹사이트에 포함되어 있는, 현재 알려져 있는 완전히 인간형의 프레임워크 영역의 서열을 바람직하게 들 수 있다. 이들 프레임워크 영역의 서열이 본 발명의 항원 결합 분자에 포함되는 생식세포 계열의 서열로서 적당히 사용될 수 있다. 생식세포 계열의 서열은 그 유사성을 토대로 분류될 수 있다(Tomlinson등(J. Mol. Biol. (1992) 227, 776-798) Williams 및 Winter(Eur. J. Immunol. (1993) 23, 1456-1461) 및 Cox등(Nat. Genetics (1994) 7, 162-168)). 7개의 서브 그룹으로 분류되는 κ, 10의 서브 그룹으로 분류되는 Vλ, 7개의 서브 그룹으로 분류되는 VH로부터 적합한 생식세포 계열의 서열이 적당히 선택될 수 있다.

완전히 인간형의 VH 서열은 하기에만 한정되는 것은 아니나, 예를 들면 VH1 서브 그룹(예를 들면 VH1-2, VH1-3, VH1-8, VH1-18, VH1-24, VH1-45, VH1-46, VH1-58, VH1-69), VH2 서브 그룹(예를 들면 VH2-5, VH2-26, VH2-70), VH3 서브 그룹(VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-72, VH3-73, VH3-74), VH4 서브 그룹(VH4-4, VH4-28, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH4-61), VH5 서브 그룹(VH5-51), VH6 서브 그룹(VH6-1), VH7 서브 그룹(VH7-4, VH7-81)의 VH 서열 등을 바람직하게 들 수 있다. 이들은 공지 문헌(Matsuda등(J. Exp. Med. (1998) 188, 1973-1975)) 등에도 기재되어 있어, 당업자는 이들 서열정보를 토대로 본 발명의 항원 결합 분자를 적당히 설계하는 것이 가능하다. 이들 이외의 완전히 인간형의 프레임워크 또는 프레임워크의 준영역도 적합하게 사용될 수 있다.

완전히 인간형의 VK 서열은 하기에만 한정되는 것은 아니나, 예를 들면 Vk1 서브 그룹으로 분류되는 A20, A30, L1, L4, L5, L8, L9, L11, L12, L14, L15, L18, L19, L22, L23, L24, O2, O4, O8, O12, O14, O18, Vk2 서브 그룹으로 분류되는 A1, A2, A3, A5, A7, A17, A18, A19, A23, O1, O11, Vk3 서브 그룹으로 분류되는 A11, A27, L2, L6, L10, L16, L20, L25, Vk4 서브 그룹으로 분류되는 B3, Vk5 서브 그룹으로 분류되는 B2(본 명세서에 있어서는 Vk5-2라고도 지칭된다)), Vk6 서브 그룹으로 분류되는 A10, A14, A26 등(Kawasaki등(Eur. J. Immunol. (2001) 31, 1017-1028), Schable 및 Zachau(Biol. Chem. Hoppe Seyler (1993) 374, 1001-1022) 및 Brensing-Kuppers등(Gene (1997) 191, 173-181))을 바람직하게 들 수 있다.

완전히 인간형의 VL 서열은 하기에만 한정되는 것은 아니나, 예를 들면 VL1 서브 그룹으로 분류되는 V1-2, V1-3, V1-4, V1-5, V1-7, V1-9, V1-11, V1-13, V1-16, V1-17, V1-18, V1-19, V1-20, V1-22, VL1 서브 그룹으로 분류되는 V2-1, V2-6, V2-7, V2-8, V2-11, V2-13, V2-14, V2-15, V2-17, V2-19, VL3 서브 그룹으로 분류되는 V3-2, V3-3, V3-4, VL4 서브 그룹으로 분류되는 V4-1, V4-2, V4-3, V4-4, V4-6, VL5 서브 그룹으로 분류되는 V5-1, V5-2, V5-4, V5-6 등(Kawasaki등(Genome Res. (1997) 7, 250-261))을 바람직하게 들 수 있다.

통상 이들의 프레임워크 서열은 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 상위함으로 인해 서로 상이하다. 이들 프레임워크 서열은 본 발명의 「이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 하나 이상의 아미노산 잔기」와 함께 사용될 수 있다. 본 발명의 「이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 하나 이상의 아미노산 잔기」와 함께 사용되는 완전히 인간형의 프레임워크의 예로서는 이것에만 한정되는 것이 아니라, 이 밖에도 KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY, POM 등을 들 수 있다(예를 들면 상기의 Kabat등 (1991) 및 Wu등(J. Exp. Med. (1970) 132, 211-250)).

본 발명은 특정 이론에 구속되는 것은 아니나, 생식세포계의 서열의 사용이 대부분인 개인에 있어서 유해한 면역반응을 배제할 것으로 기대되고 있는 하나의 이유는 아래와 같다고 생각되고 있다. 통상의 면역반응 중에 생기는 친화성 성숙 스텝의 결과, 면역글로불린의 가변영역에 체세포의 돌연변이가 빈번하게 생긴다. 이들 돌연변이는 주로 그 서열이 초가변적인 CDR의 주변에 생기는데 프레임워크 영역의 잔기에도 영향을 미친다. 이들 프레임워크의 돌연변이는 생식세포계의 유전자에는 존재하지 않고 또한 환자의 면역원성이 될 가능성은 적다. 한편 통상의 인간의 집단은 생식세포계의 유전자에 의해 발현되는 프레임워크 서열의 대다수에 노출되어 있어, 면역관용의 결과, 이들 생식세포계의 프레임워크는 환자에 있어서 면역원성이 낮거나 또는 비면역원성일 것으로 예상된다. 면역관용의 가능성을 최대로 하기 위해, 가변영역을 코드화하는 유전자가 보통으로 존재하는 기능적인 생식세포계 유전자의 집합으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 칼슘 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 아미노산이 상기 프레임워크 서열에 포함되는 항원 결합 분자를 제작하기 위해 부위 특이적 변이 유발법(Kunkel등(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492))이나 Overlap extension PCR 등의 공지의 방법이 적당히 채용될 수 있다.

예를 들면 칼슘 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 하나 이상의 아미노산 잔기가 사전에 포함되어 있는 프레임워크 서열로서 선택된 경쇄 가변영역과, 랜덤화 가변영역 서열 라이브러리로서 제작된 중쇄 가변영역을 조합시킴으로써 본 발명의 복수의 서로 서열이 상이한 항원 결합 분자를 포함하는 라이브러리가 제작될 수 있다. 이러한 비한정적인 예로서 이온 농도가 칼슘 이온 농도인 경우에는, 예를 들면 서열번호：4(Vk5-2)에 기재된 경쇄 가변영역 서열로 대표되는 Vk5-2 패밀리에 속하는 경쇄 가변영역 서열과 랜덤화 가변영역 서열 라이브러리로서 제작된 중쇄 가변영역을 조합시킨 라이브러리를 바람직하게 들 수 있다.

또한 상기 칼슘 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 하나 이상의 아미노산 잔기가 사전에 포함되어 있는 프레임워크 서열로서 선택된 경쇄 가변영역의 서열에, 당해 아미노산 잔기 이외의 잔기로서 다양한 아미노산이 포함되도록 설계하는 것도 가능하다. 본 발명에 있어서 그러한 잔기는 플렉시블 잔기라 지칭된다. 본 발명의 항원 결합 분자의 항원에 대한 결합 활성이 이온 농도의 조건에 따라 변화되는 한, 당해 플렉시블 잔기의 수 및 위치는 특정 태양에 한정되는 경우는 없다. 즉 중쇄 및/또는 경쇄의 CDR 서열 및/또는 FR 서열에 하나 또는 그 이상의 플렉시블 잔기가 포함될 수 있다. 예를 들면 이온 농도가 칼슘 이온 농도인 경우에는, 서열번호：4(Vk5-2)에 기재된 경쇄 가변영역 서열에 도입되는 플렉시블 잔기의 비한정적인 예로서 표 1 또는 표 2에 기재된 아미노산 잔기를 들 수 있다.

본 명세서에 있어서는 플렉시블 잔기란 공지 및/또는 천연 항체 또는 항원 결합 도메인의 아미노산 서열을 비교한 경우에, 그 위치에서 제시되는 몇 개의 상이한 아미노산을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변영역 상의 아미노산이 매우 다양한 위치에 존재하는 아미노산 잔기의 변형을 말한다. 매우 다양한 위치는 일반적으로 CDR영역에 존재한다. 일태양에서는 공지 및/또는 천연 항체의 매우 다양한 위치를 결정할 때는 Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute of Health Bethesda Md.) (1987년 및 1991년)가 제공하는 데이터가 유효하다. 또한 인터넷 상의 복수의 데이터베이스(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/, http://www.bioinf.org.uk/abs/index.html)에서는 수집된 다수의 인간 경쇄 및 중쇄의 서열과 그의 배치가 제공되고 있어, 이들 서열과 그의 배치의 정보는 본 발명에 있어서의 매우 다양한 위치의 결정에 유용하다. 본 발명에 의하면 아미노산이 어떤 위치에서 바람직하게는 약 2~약 20, 바람직하게는 약 3~약 19, 바람직하게는 약 4~약 18, 바람직하게는 5~17, 바람직하게는 6~16, 바람직하게는 7~15, 바람직하게는 8~14, 바람직하게는 9~13, 바람직하게는 10~12개의 가능한 상이한 아미노산 잔기의 다양성을 갖는 경우는 그 위치는 매우 다양하다고 할 수 있다. 몇개의 실시형태에서는 어떤 아미노산 위치는 바람직하게는 약 2 이상, 바람직하게는 약 4이상, 바람직하게는 약 6 이상, 바람직하게는 약 8 이상, 바람직하게는 약 10, 바람직하게는 약 12의 가능한 상이한 아미노산 잔기의 다양성을 가질 수 있다.

또한 상기 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 하나 이상의 아미노산 잔기가 도입된 경쇄 가변영역과 랜덤화 가변영역 서열 라이브러리로서 제작된 중쇄 가변영역을 조합시킴으로써도, 본 발명의 복수의 서로 서열이 상이한 항원 결합 분자를 포함하는 라이브러리가 제작될 수 있다. 이러한 비한정적인 예로서 이온 농도가 칼슘 이온 농도인 경우에는, 예를 들면 서열번호：5(Vk1), 서열번호：6(Vk2), 서열번호：7(Vk3), 서열번호：8(Vk4) 등의 생식세포 계열의 특정 잔기가, 칼슘 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 하나 이상의 아미노산 잔기로 치환된 경쇄 가변영역 서열과 랜덤화 가변영역 서열 라이브러리로서 제작된 중쇄 가변영역을 조합시킨 라이브러리를 바람직하게 들 수 있다. 당해 아미노산 잔기의 비한정의 예로서 경쇄의 CDR1에 포함되는 아미노산 잔기가 예시된다. 그 밖에도 당해 아미노산 잔기의 비한정의 예로서 경쇄의 CDR2에 포함되는 아미노산 잔기가 예시된다. 또한 당해 아미노산 잔기의 비한정의 다른 예로서 경쇄의 CDR3에 포함되는 아미노산 잔기도 또한 예시된다.

상기와 같이 당해 아미노산 잔기가 경쇄의 CDR1에 포함되는 아미노산 잔기의 비한정의 예로서, 경쇄 가변영역의 CDR1 중의 EU 넘버링으로 표시되는 30번 위치, 31번 위치 및/또는 32번 위치의 아미노산 잔기를 들 수 있다. 또한 당해 아미노산 잔기가 경쇄의 CDR2에 포함되는 아미노산 잔기의 비한정의 예로서, 경쇄 가변영역의 CDR2 중의 Kabat 넘버링으로 표시되는 50번 위치의 아미노산 잔기를 들 수 있다. 또한 당해 아미노산 잔기가 경쇄의 CDR3에 포함되는 아미노산 잔기의 비한정의 예로서, 경쇄 가변영역의 CDR3 중의 Kabat 넘버링으로 표시되는 92번 위치의 아미노산 잔기를 들 수 있다. 또한 이들의 아미노산 잔기가 칼슘 결합 모티브를 형성 및/또는 칼슘 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성이 변화되는 한, 이들 아미노산 잔기가 단독으로 포함될 수 있고, 이들 아미노산이 2개 이상 조합되어 포함될 수 있다. 또한 복수 개의 칼슘 이온 결합 부위를 가지며, 분자 진화상 공통의 기원으로부터 유래된 것으로 생각되는 트로포닌 C, 칼모듈린, 파브알부민, 미오신 경쇄 등이 알려져 있어, 그의 결합 모티브가 포함되도록 경쇄 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3를 설계하는 것도 가능하다. 예를 들면 상기의 목적으로 카드헤린 도메인, 칼모듈린에 포함되는 EF 핸드, Protein kinase C에 포함되는 C2 도메인, 혈액 응고 단백질 FactorIX에 포함되는 Gla 도메인, 아시알로글리코프로테인 수용체나 만노오스 결합 수용체에 포함되는 C형 렉틴, LDL 수용체에 포함되는 A 도메인, 아넥신, 트롬보스폰딘 3형 도메인 및 EGF 유사 도메인이 적당히 사용될 수 있다.

상기 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 하나 이상의 아미노산 잔기가 도입된 경쇄 가변영역과 랜덤화 가변영역 서열 라이브러리로서 제작된 중쇄 가변영역을 조합시키는 경우라도, 상기와 마찬가지로 플렉시블 잔기가 당해 경쇄 가변영역의 서열에 포함되도록 설계하는 것도 가능하다. 본 발명의 항원 결합 분자의 항원에 대한 결합 활성이 이온 농도의 조건에 따라 변화되는 한, 당해 플렉시블 잔기의 수 및 위치는 특정 태양에 한정되는 경우는 없다. 즉 중쇄 및/또는 경쇄의 CDR 서열 및/또는 FR 서열에 하나 또는 그 이상의 플렉시블 잔기가 포함될 수 있다. 예를 들면 이온 농도가 칼슘 이온 농도인 경우에는 경쇄 가변영역 서열에 도입되는 플렉시블 잔기의 비한정적인 예로서 표 1 또는 표 2에 기재된 아미노산 잔기를 들 수 있다.

조합되는 중쇄 가변영역의 예로서 랜덤화 가변영역 라이브러리를 바람직하게 들 수 있다. 랜덤화 가변영역 라이브러리의 제작방법은 공지의 방법이 적절히 조합된다. 본 발명의 비한정의 일태양에서는 특정 항원으로 면역된 동물, 감염증 환자나 백신 접종하여 혈중 항체가가 상승한 인간, 암 환자, 자기 면역 질환의 림프구 유래의 항체 유전자를 토대로 구축된 면역 라이브러리가 랜덤화 가변영역 라이브러리로서 적합하게 사용될 수 있다.

또한 본 발명의 비한정의 일태양에서는 게놈 DNA에 있어서의 V 유전자나 재구축되어 기능적인 V 유전자의 CDR 서열이 적당한 길이의 코돈 세트를 코드하는 서열을 포함하는 합성 올리고뉴클레오티드 세트로 치환된 합성 라이브러리도 또한 랜덤화 가변영역 라이브러리로서 적합하게 사용될 수 있다. 이 경우, 중쇄의 CDR3의 유전자 서열의 다양성이 관찰되는 것으로부터, CDR3의 서열만을 치환하는 것도 또한 가능하다. 항원 결합 분자의 가변영역에 있어서 아미노산의 다양성을 만들어내는 기준은, 항원 결합 분자의 표면에 노출된 위치의 아미노산 잔기에 다양성을 부여하는 것이다. 표면에 노출된 위치란 항원 결합 분자의 구조, 구조 어셈블 및/또는 모델화된 구조에 기초하여 표면 노출이 가능 및/또는 항원과의 접촉이 가능하다고 판단되는 위치를 말하는데, 일반적으로는 그의 CDR이다. 바람직하게는 표면에 노출된 위치는 InsightII 프로그램(Accelrys)과 같은 컴퓨터 프로그램을 사용하여 항원 결합 분자의 3차원 모델로부터의 좌표를 사용하여 결정된다. 표면에 노출된 위치는 당 기술분야에서 공지인 알고리즘(예를 들면 Lee 및 Richards(J.Mol.Biol. (1971) 55, 379-400), Connolly(J.Appl.Cryst. (1983) 16, 548-558))을 사용하여 결정될 수 있다. 표면에 노출된 위치의 결정은 단백질 모델링에 적합한 소프트웨어 및 항체로부터 얻어지는 3차원 구조 정보를 사용하여 행해질 수 있다. 이러한 목적을 위해 이용할 수 있는 소프트웨어로서 SYBYL 생체 고분자 모듈 소프트웨어(Tripos Associates)를 바람직하게 들 수 있다. 일반적으로 또한 바람직하게는 알고리즘이 유저의 입력 사이즈 파라미터를 필요로 하는 경우는 계산에 있어서 사용되는 프로브의 「사이즈」는 반경 약 1.4옹스트롬 이하로 설정된다. 또한 퍼스널 컴퓨터용 소프트웨어를 사용한 표면에 노출된 영역 및 구역의 결정법이Pacios(Comput.Chem. (1994) 18 (4), 377-386 및 J.Mol.Model. (1995) 1, 46-53)에 기재되어 있다.

또한 본 발명의 비한정의 일태양에서는 건강한 정상인의 림프구 유래의 항체 유전자로부터 구축되어, 그 레퍼토리에 바이어스를 포함하지 않는 항체 서열인 나이브 서열로 이루어지는 나이브 라이브러리도 또한 랜덤화 가변영역 라이브러리로서 특히 적합하게 사용될 수 있다(Gejima등(Human Antibodies (2002) 11,121-129) 및 Cardoso등(Scand. J. Immunol. (2000) 51, 337-344)). 본 발명에서 기재되는 나이브 서열을 포함하는 아미노산 서열이란 이러한 나이브 라이브러리로부터 취득되는 아미노산 서열을 말한다.

본 발명의 하나의 태양에서는 「이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 하나 이상의 아미노산 잔기」가 사전에 포함되어 있는 프레임워크 서열로서 선택된 중쇄 가변영역과, 랜덤화 가변영역 서열 라이브러리로서 제작된 경쇄 가변영역을 조합시킴으로써 본 발명의 복수의 서로 서열이 상이한 항원 결합 분자를 포함하는 라이브러리로부터 본 발명의 항원 결합 도메인이 취득될 수 있다. 이러한 비한정적인 예로서 이온 농도가 칼슘 이온 농도인 경우에는, 예를 들면 서열번호：9(6RL#9-IgG1) 또는 서열번호：10(6KC4-1#85-IgG1)에 기재된 중쇄 가변영역 서열과 랜덤화 가변영역 서열 라이브러리로서 제작된 경쇄 가변영역을 조합한 라이브러리를 바람직하게 들 수 있다. 또한 랜덤화 가변영역 서열 라이브러리로서 제작된 경쇄 가변영역 대신에, 생식세포 계열의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 중에서 적당히 선택함으로써 제작될 수 있다. 예를 들면 서열번호：9(6RL#9-IgG1) 또는 서열번호：10(6KC4-1#85-IgG1)에 기재된 중쇄 가변영역 서열과 생식세포 계열의 서열을 갖는 경쇄 가변영역을 조합시킨 라이브러리를 바람직하게 들 수 있다.

또한 상기 「이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 하나 이상의 아미노산 잔기」가 사전에 포함되어 있는 프레임워크 서열로서 선택된 중쇄 가변영역의 서열에 플렉시블 잔기가 포함되도록 설계하는 것도 가능하다. 본 발명의 항원 결합 분자의 항원에 대한 결합 활성이 이온 농도의 조건에 따라 변화되는 한, 당해 플렉시블 잔기의 수 및 위치는 특정 태양으로 한정되는 경우는 없다. 즉 중쇄 및/또는 경쇄의 CDR 서열 및/또는 FR 서열에 하나 또는 그 이상의 플렉시블 잔기가 포함될 수 있다. 예를 들면 이온 농도가 칼슘 이온 농도인 경우에는 서열번호：9(6RL#9-IgG1)에 기재된 중쇄 가변영역 서열에 도입되는 플렉시블 잔기의 비한정적인 예로서, 중쇄 CDR1 및 CDR2의 모든 아미노산 잔기 외에 중쇄 CDR3의 kabat 넘버링으로 표시되는 95번 위치, 96번 위치 및/또는 100a번 위치 이외의 CDR3의 아미노산 잔기를 들 수 있다. 또는 서열번호：10(6KC4-1#85-IgG1)에 기재된 중쇄 가변영역 서열에 도입되는 플렉시블 잔기의 비한정적인 예로서, 중쇄 CDR1 및 CDR2의 모든 아미노산 잔기 외에 중쇄 CDR3의 kabat 넘버링으로 표시되는 95번 위치 및/또는 101번 위치 이외의 CDR3의 아미노산 잔기도 또한 들 수 있다.

또한 상기 「이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 하나 이상의 아미노산 잔기」가 도입된 중쇄 가변영역과 랜덤화 가변영역 서열 라이브러리로서 제작된 경쇄 가변영역 또는 생식세포 계열의 서열을 갖는 경쇄 가변영역을 조합시킴으로써도 복수의 서로 서열이 상이한 항원 결합 분자를 포함하는 라이브러리가 제작될 수 있다. 이러한 비한정적인 예로서, 이온 농도가 칼슘 이온 농도인 경우에는, 예를 들면 중쇄 가변영역의 특정 잔기가 칼슘 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 하나 이상의 아미노산 잔기로 치환된 중쇄 가변영역 서열과 랜덤화 가변영역 서열 라이브러리로서 제작된 경쇄 가변영역 또는 생식세포 계열의 서열을 갖는 경쇄 가변영역을 조합시킨 라이브러리를 바람직하게 들 수 있다. 당해 아미노산 잔기의 비한정의 예로서 중쇄의 CDR1에 포함되는 아미노산 잔기가 예시된다. 그 밖에도, 당해 아미노산 잔기의 비한정의 예로서 중쇄의 CDR2에 포함되는 아미노산 잔기가 예시된다. 또한 당해 아미노산 잔기의 비한정의 다른 예로서 중쇄의 CDR3에 포함되는 아미노산 잔기도 또한 예시된다. 당해 아미노산 잔기가 중쇄의 CDR3에 포함되는 아미노산 잔기의 비한정의 예로서, 중쇄 가변영역의 CDR3 중의 Kabat 넘버링으로 표시되는 95번 위치, 96번 위치, 100a번 위치 및/또는 101번 위치의 아미노산을 들 수 있다. 또한 이들 아미노산 잔기가 칼슘 결합 모티브를 형성 및/또는 칼슘 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성이 변화되는 한, 이들 아미노산 잔기가 단독으로 포함될 수 있고, 이들 아미노산이 2개 이상 조합되어 포함될 수 있다.

상기의 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 하나 이상의 아미노산 잔기가 도입된 중쇄 가변영역과 랜덤화 가변영역 서열 라이브러리로서 제작된 경쇄 가변영역 또는 생식세포 계열의 서열을 갖는 경쇄 가변영역을 조합시키는 경우라도, 상기와 마찬가지로 플렉시블 잔기가 당해 중쇄 가변영역의 서열에 포함되도록 설계하는 것도 가능하다. 본 발명의 항원 결합 분자의 항원에 대한 결합 활성이 이온 농도의 조건에 따라 변화되는 한, 당해 플렉시블 잔기의 수 및 위치는 특정 태양으로 한정되는 경우는 없다. 즉 중쇄의 CDR 서열 및/또는 FR 서열에 하나 또는 그 이상의 플렉시블 잔기가 포함될 수 있다. 또한 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 아미노산 잔기 이외의 중쇄 가변영역의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3의 아미노산 서열로서 램덤화 가변영역 라이브러리도 적합하게 사용될 수 있다. 경쇄 가변영역으로서 생식세포 계열의 서열이 사용되는 경우에는, 예를 들면 서열번호：5(Vk1), 서열번호：6(Vk2), 서열번호：7(Vk3), 서열번호：8(Vk4) 등의 생식세포 계열의 서열을 비한정의 예로서 들 수 있다.

상기의 칼슘 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 아미노산으로서는 칼슘 결합 모티브를 형성하는 한 어느 아미노산도 적합하게 사용될 수 있으나, 그러한 아미노산으로서는 구체적으로 전자 공여성을 갖는 아미노산을 들 수 있다. 이러한 전자 공여성을 갖는 아미노산으로서는 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 아스파라긴산 또는 글루타민산이 바람직하게 예시된다.

수소 이온 농도의 조건

또한 본 발명의 하나의 태양에서는 이온 농도의 조건이란 수소 이온 농도의 조건 또는 pH의 조건을 말한다. 본 발명에서 프로톤 즉 수소원자의 원자핵의 농도의 조건은 수소 지수(pH)의 조건과도 같은 정의로 취급된다. 수용액 중의 수소 이온의 활동량을 aH+로 나타낼 때, pH는 -log10aH+로 정의된다. 수용액 중의 이온 강도가 (예를 들면 10^-3보다) 낮으면 aH+는 수소 이온 강도와 거의 동등하다. 예를 들면 25℃, 1기압에 있어서의 물의 이온곱은 Kw=aH+aOH=10^-14이기 때문에, 순수(純水)의 경우는 aH+=aOH=10^-7이다. 이 경우의 pH=7이 중성이고, pH가 7보다 작은 수용액은 산성, pH가 7보다 큰 수용액은 알칼리성이다.

본 발명에 있어서는 이온 농도의 조건으로서 pH의 조건이 사용되는 경우에는 pH의 조건으로서 고수소 이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역의 조건과 저수소 이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역의 조건을 들 수 있다. pH의 조건에 따라 결합 활성이 변화된다는 것은, 고수소 이온 농도 또는 저pH(pH 산성역)와 저수소 이온 농도 또는 고pH(pH 중성역)의 조건의 차이에 의해 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성이 변화되는 것을 말한다. 예를 들면 pH 산성역 조건에 있어서의 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성보다도 pH 중성역 조건에 있어서의 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성 쪽이 높은 경우를 들 수 있다. 또한 pH 중성역 조건에 있어서의 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성보다도 pH 산성역 조건에 있어서의 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성 쪽이 높은 경우도 또한 들 수 있다.

본 명세서에 있어서 pH 중성역이란 특별히 일의적인 수치에 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 pH 6.7~pH 10.0으로부터 선택될 수 있다. 또한 다른 태양에서는 pH 6.7~pH 9.5로부터 선택될 수 있다. 또한 상이한 태양에서는 pH 7.0~pH 9.0으로부터 선택될 수 있고, 다른 태양에서는 pH 7.0~pH 8.0으로부터 선택될 수 있다. 특히 생체내의 혈장 중(혈중)에서의 pH에 가까운 pH 7.4를 바람직하게 들 수 있다.

본 명세서에 있어서 pH 산성역이란 특별히 일의적인 수치에 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 pH 4.0~pH 6.5로부터 선택될 수 있다. 또한 다른 태양에서는 pH 4.5~pH 6.5로부터 선택될 수 있다. 또한 상이한 태양에서는 pH 5.0~pH 6.5로부터 선택될 수 있고, 다른 태양에서는 pH 5.5~pH 6.5로부터 선택될 수 있다. 특히 생체내의 조기 엔도솜 내에서의 이온화 칼슘 농도에 가까운 pH 5.8을 바람직하게 들 수 있다.

본 발명에 있어서 항원 결합 분자의 고수소 이온 농도 또는 저pH(pH 산성역)의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 저수소 이온 농도 또는 고pH(pH 중성역)의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮다는 것은, 항원 결합 분자의 pH 4.0~pH 6.5로부터 선택되는 pH에서의 항원에 대한 결합 활성이 pH 6.7~pH 10.0으로부터 선택되는 pH에서의 항원에 대한 결합 활성보다 약한 것을 의미한다. 바람직하게는 항원 결합 분자의 pH 4.5~pH 6.5로부터 선택되는 pH에서의 항원에 대한 결합 활성이 pH 6.7~pH 9.5로부터 선택되는 pH에서의 항원에 대한 결합 활성보다 약한 것을 의미하고, 보다 바람직하게는 항원 결합 분자의 pH 5.0~pH 6.5로부터 선택되는 pH에서의 항원에 대한 결합 활성이 pH 7.0~pH 9.0으로부터 선택되는 pH에서의 항원에 대한 결합 활성보다 약한 것을 의미한다. 또한 바람직하게는 항원 결합 분자의 pH 5.5~pH 6.5로부터 선택되는 pH에서의 항원에 대한 결합 활성이 pH 7.0~pH 8.0으로부터 선택되는 pH에서의 항원에 대한 결합 활성보다 약한 것을 의미한다. 특히 바람직하게는 생체내의 조기 엔도솜 내의 pH에 있어서의 항원 결합 활성이 생체내의 혈장 중의 pH에 있어서의 항원 결합 활성보다 약한 것을 의미하고, 구체적으로는 항원 결합 분자의 pH 5.8에서의 항원에 대한 결합 활성이 pH 7.4에서의 항원에 대한 결합 활성보다 약한 것을 의미한다.

pH의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성이 변화되어 있는지 여부는, 예를 들면 상기 결합 활성의 항목에서 기재된 바와 같은 공지의 측정방법을 사용함으로써 결정될 수 있다. 즉 당해 측정방법으로 상이한 pH의 조건하에서의 결합 활성이 측정된다. 예를 들면 pH 산성역 조건하에 있어서의 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성보다도 pH 중성역 조건하에 있어서의 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성 쪽이 높게 변화되는 것을 확인하기 위해서는, pH 산성역 및 pH 중성역 조건하에 있어서의 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성이 비교된다.

또한 본 발명에 있어서 「고수소 이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 저수소 이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮다」고 하는 표현은, 항원 결합 분자의 저수소 이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 고수소 이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다도 높다고 표현하는 것도 가능하다. 또한 본 발명에 있어서는 「고수소 이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 저수소 이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮다」를 「고수소 이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 저수소 이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합능보다도 약하다」라고 기재하는 경우도 있고, 또한 「고수소 이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 저수소 이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 저하시킨다」를 「고수소 이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 저수소 이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합능보다도 약하게 한다」라고 기재하는 경우도 있다.

항원에 대한 결합 활성을 측정할 때의 수소 이온 농도 또는 pH 이외의 조건은 당업자가 적당히 선택하는 것이 가능하고, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면 HEPES 버퍼, 37℃의 조건에 있어서 측정하는 것이 가능하다. 예를 들면 Biacore(GE Healthcare) 등을 사용하여 측정하는 것이 가능하다. 항원 결합 분자와 항원의 결합 활성의 측정은, 항원이 가용형 항원인 경우는 항원 결합 분자를 고정화한 칩으로 항원을 애널라이트로서 흘림으로써 가용형 항원에 대한 결합 활성을 평가하는 것이 가능하고, 항원이 막형 항원인 경우는 항원을 고정화한 칩으로 항원 결합 분자를 애널라이트로서 흘림으로써 막형 항원에 대한 결합 활성을 평가하는 것이 가능하다.

본 발명의 항원 결합 분자에 있어서, 고수소 이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 저수소 이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다도 약한 한, 고수소 이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역 조건하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성과 저수소 이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성의 비는 특별히 한정되지 않으나, 바람직하게는 항원에 대한 고수소 이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역 조건에 있어서의 KD(Dissociation constant：해리상수)와 저수소 이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 KD의 비인 KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)의 값이 2 이상이고, 더욱 바람직하게는 KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)의 값이 10 이상이며, 더욱 바람직하게는 KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)의 값이 40 이상이다. KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)의 값의 상한은 특별히 한정되지 않고, 당업자의 기술에 있어서 제작 가능한 한 400, 1000, 10000 등 어떠한 값이어도 된다.

또한 본 발명의 항원 결합 분자의 고수소 이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성과 저수소 이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성의 비를 나타내는 다른 지표로서, 예를 들면 해리속도상수인 kd(Dissociation rate constant：해리속도상수)도 또한 적합하게 사용될 수 있다. 결합 활성의 비를 나타내는 지표로서 KD(해리상수) 대신에 kd(해리속도상수)를 사용하는 경우, 항원에 대한 고수소 이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역 조건에 있어서의 kd(해리속도상수)와 저수소 이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 kd(해리속도상수)의 비인 kd(pH 산성역 조건에 있어서의)/kd(pH 중성역 조건에 있어서의)의 값은 바람직하게는 2 이상이고, 더욱 바람직하게는 5 이상이며, 더욱 바람직하게는 10 이상이고, 보다 바람직하게는 30 이상이다. Kd(pH 산성역 조건에 있어서의)/kd(pH 중성역 조건에 있어서의)의 값의 상한은 특별히 한정되지 않고, 당업자의 기술 상식에 있어서 제작 가능한 한 50, 100, 200 등 어떠한 값이어도 된다.

항원 결합 활성의 값으로서 항원이 가용형 항원인 경우는 kd(해리속도상수)를 사용하는 것이 가능하고, 항원이 막형 항원인 경우는 겉보기 kd(Apparent dissociation rate constant：겉보기 해리속도상수)를 사용하는 것이 가능하다. kd(해리속도상수) 및 겉보기 kd(겉보기 해리속도상수)는 당업자 공지의 방법으로 측정하는 것이 가능하고, 예를 들면 Biacore(GE healthcare), 플로우 사이토미터 등을 사용하는 것이 가능하다. 또한 본 발명에 있어서 상이한 수소 이온 농도 즉 pH에 있어서의 항원 결합 분자의 항원에 대한 결합 활성을 측정할 때는 수소 이온 농도 즉 pH 이외의 조건은 동일하게 하는 것이 바람직하다.

예를 들면 본 발명이 제공하는 하나의 태양인 고수소 이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 저수소 이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인 또는 항체는, 아래의 공정(a)~(c)를 포함하는 항원 결합 도메인 또는 항체의 스크리닝에 의해 취득될 수 있다.

(a) pH 산성역 조건에 있어서의 항원 결합 도메인 또는 항체의 항원 결합 활성을 얻는 공정,

(b) pH 중성역 조건에 있어서의 항원 결합 도메인 또는 항체의 항원 결합 활성을 얻는 공정, 및

(c) pH 산성역 조건에 있어서의 항원 결합 활성이 pH 중성역 조건에 있어서의 항원 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인 또는 항체를 선택하는 공정.

또한 본 발명이 제공하는 하나의 태양인 고수소 이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 저수소 이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인 또는 항체는, 아래의 공정(a)~(c)를 포함하는 항원 결합 도메인 또는 항체 또는 그들의 라이브러리의 스크리닝에 의해 취득될 수 있다.

(a) pH 중성역 조건에 있어서의 항원 결합 도메인 또는 항체 또는 그들의 라이브러리를 항원에 접촉시키는 공정,

(b) 상기 공정(a)에서 항원에 결합한 항원 결합 도메인 또는 항체를 pH 산성역의 조건에 두는 공정, 및

또한 본 발명이 제공하는 하나의 태양인 고수소 이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 저수소 이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인 또는 항체는, 아래의 공정(a)~(d)를 포함하는 항원 결합 도메인 또는 항체 또는 그들의 라이브러리의 스크리닝에 의해 취득될 수 있다.

(a) pH 산성역의 조건에서 항원 결합 도메인 또는 항체의 라이브러리를 항원에 접촉시키는 공정,

(c) 상기 공정(b)에서 선택된 항원 결합 도메인 또는 항체를 pH 중성역의 조건에서 항원에 결합시키는 공정, 및

또한 본 발명이 제공하는 하나의 태양인 고수소 이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 저수소 이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인 또는 항체는, 아래의 공정(a)~(c)를 포함하는 스크리닝방법에 의해 취득될 수 있다.

(a) 항원을 고정한 칼럼에 pH 중성역의 조건에서 항원 결합 도메인 또는 항체의 라이브러리를 접촉시키는 공정,

(b) 상기 공정(a)에서 칼럼에 결합한 항원 결합 도메인 또는 항체를 pH 산성역의 조건에서 칼럼으로부터 용출하는 공정, 및

또한 본 발명이 제공하는 하나의 태양인 고수소 이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 저수소 이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인 또는 항체는, 아래의 공정(a)~(d)를 포함하는 스크리닝방법에 의해 취득될 수 있다.

(a) 항원을 고정한 칼럼에 pH 산성역의 조건에서 항원 결합 도메인 또는 항체의 라이브러리를 통과시키는 공정,

(c) 상기 공정(b)에서 회수된 항원 결합 도메인 또는 항체를 pH 중성역의 조건에서 항원에 결합시키는 공정, 및

(a) pH 중성역의 조건에서 항원 결합 도메인 또는 항체의 라이브러리를 항원에 접촉시키는 공정,

(c) 상기 공정(b)에서 취득한 항원 결합 도메인 또는 항체를 pH 산성역의 조건에 두는 공정, 및

또한 상기 공정은 2회 이상 반복되어도 된다. 따라서 본 발명에 의해, 전술한 스크리닝방법에 있어서 (a)~(c) 또는 (a)~(d)의 공정을 2회 이상 반복하는 공정을 추가로 포함하는 스크리닝방법에 의해 취득된 pH 산성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 pH 중성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인 또는 항체가 제공된다. (a)~(c) 또는 (a)~(d)의 공정이 반복되는 횟수는 특별히 한정되지 않으나, 통상 10회 이내이다.

본 발명의 스크리닝방법에 있어서, 고수소 이온 농도 조건 또는 저pH 즉 pH 산성역에 있어서의 항원 결합 도메인 또는 항체의 항원 결합 활성은 pH가 4.0~6.5 사이인 항원 결합 활성이라면 특별히 한정되지 않으나, 바람직한 pH로서 pH가 4.5~6.6 사이인 항원 결합 활성을 들 수 있다. 다른 바람직한 pH로서 pH가 5.0~6.5 사이인 항원 결합 활성, 더욱이 pH가 5.5~6.5 사이인 항원 결합 활성을 들 수 있다. 보다 바람직한 pH로서 생체내의 조기 엔도솜 내의 pH를 들 수 있고, 구체적으로는 pH 5.8에 있어서의 항원 결합 활성을 들 수 있다. 또한 저수소 이온 농도 조건 또는 고pH 즉 pH 중성역에 있어서의 항원 결합 도메인 또는 항체의 항원 결합 활성은 pH가 6.7~10 사이인 항원 결합 활성이라면 특별히 한정되지 않으나, 바람직한 pH로서 pH가 6.7~9.5 사이인 항원 결합 활성을 들 수 있다. 다른 바람직한 pH로서 pH가 7.0~9.5 사이인 항원 결합 활성, 더욱이 pH가 7.0~8.0 사이인 항원 결합 활성을 들 수 있다. 보다 바람직한 pH로서 생체내의 혈장 중에서의 pH를 들 수 있고, 구체적으로는 pH가 7.4에 있어서의 항원 결합 활성을 들 수 있다.

항원 결합 도메인 또는 항체의 항원 결합 활성은 당업자에게 공지의 방법에 의해 측정하는 것이 가능하고, 이온화 칼슘 농도 이외의 조건에 대해서는 당업자가 적당히 결정하는 것이 가능하다. 항원 결합 도메인 또는 항체의 항원 결합 활성은 KD(Dissociation constant：해리상수), 겉보기 KD(Apparent dissociation constant：겉보기 해리상수), 해리속도인 kd(Dissociation rate：해리속도상수) 또는 겉보기 kd(Apparent dissociation：겉보기 해리속도상수) 등으로서 평가하는 것이 가능하다. 이들은 당업자 공지의 방법으로 측정하는 것이 가능하고, 예를 들면 Biacore (GE healthcare), 스캐차드 플롯, FACS 등을 사용하는 것이 가능하다.

본 발명에 있어서 저수소 이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 항원 결합 활성이 고수소 이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역 조건에 있어서의 항원 결합 활성보다 높은 항원 결합 도메인 또는 항체를 선택하는 공정은, 고수소 이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역 조건에 있어서의 항원 결합 활성이 저수소 이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 항원 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인 또는 항체를 선택하는 공정과 동일한 의미이다.

저수소 이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 항원 결합 활성이 고수소 이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역 조건에 있어서의 항원 결합 활성보다 높은 한, 저수소 이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 항원 결합 활성과 고수소 이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역 조건에 있어서의 항원 결합 활성의 차는 특별히 한정되지 않으나, 바람직하게는 저수소 이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 항원 결합 활성이 고수소 이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역 조건에 있어서의 항원 결합 활성의 2배 이상이고, 더욱 바람직하게는 10배 이상이며, 보다 바람직하게는 40배 이상이다.

상기 스크리닝방법에 의해 스크리닝되는 본 발명의 항원 결합 도메인 또는 항체는 어떻게 조제되어도 되고, 예를 들면 사전에 존재하고 있는 항체, 사전에 존재하고 있는 라이브러리(파지 라이브러리 등), 동물에 대한 면역으로부터 얻어진 하이브리도마나 면역동물로부터의 B세포로부터 제작된 항체 또는 라이브러리, 이들 항체나 라이브러리에 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산 변이를 도입한 항체 또는 라이브러리(측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산) 또는 비천연 아미노산의 함유율을 높게 한 라이브러리나 특정 개소에 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산) 또는 비천연 아미노산 변이를 도입한 라이브러리 등) 등을 사용하는 것이 가능하다.

동물에 대한 면역으로부터 얻어진 하이브리도마나 면역동물로부터의 B세포로부터 제작된 항원 결합 도메인 또는 항체로부터, 저수소 이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 항원 결합 활성이 고수소 이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역 조건에 있어서의 항원 결합 활성보다 높은 항원 결합 도메인 또는 항체를 취득하는 방법으로서, 예를 들면 WO2009/125825에서 기재되는 바와 같은 항원 결합 도메인 또는 항체 중의 아미노산의 적어도 하나가 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산 변이로 치환되어 있거나 또는 항원 결합 도메인 또는 항체 중에 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산이 삽입되어 있는 항원 결합 분자 또는 항체를 바람직하게 들 수 있다.

측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산의 변이가 도입되는 위치는 특별히 한정되지 않고, 치환 또는 삽입 전과 비교하여 pH 산성역에 있어서의 항원 결합 활성이 pH 중성역에 있어서의 항원 결합 활성보다 약해지는(KD(pH 산성역)/KD(pH 중성역)의 값이 커지거나 또는 kd(pH 산성역)/kd(pH 중성역)의 값이 커지는) 한 어떠한 부위여도 된다. 예를 들면 항원 결합 분자가 항체인 경우에는 항체의 가변영역이나 CDR 등을 바람직하게 들 수 있다. 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산으로 치환되는 아미노산의 수 또는 삽입되는 아미노산의 수는 당업자가 적당히 결정할 수 있고, 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 하나의 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산에 의해 치환될 수 있으며, 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 하나의 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산이 삽입될 수 있고, 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 2개 이상의 복수의 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산에 의해 치환될 수 있으며, 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 2개 이상의 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산이 삽입될 수 있다. 또한 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산으로의 치환 또는 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산의 삽입 이외에, 다른 아미노산의 결실, 부가, 삽입 및/또는 치환 등이 동시에 행해질 수 있다. 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산으로의 치환 또는 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산의 삽입은 당업자 공지의 알라닌 scanning의 알라닌을 히스티딘 등으로 치환한 히스티딘 등 scanning 등의 방법에 의해 랜덤으로 행해질 수 있고, 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산의 치환 또는 삽입의 변이가 랜덤으로 도입된 항원 결합 도메인 또는 항체 중으로부터, 변이 전과 비교하여 KD(pH 산성역)/KD(pH 중성역) 또는 kd(pH 산성역)/kd(pH 중성역)의 값이 커진 항원 결합 분자가 선택될 수 있다.

상기와 같이 그 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산으로의 변이가 행해지고, 또한 pH 산성역에서의 항원 결합 활성이 pH 중성역에서의 항원 결합 활성보다도 낮은 항원 결합 분자의 바람직한 예로서, 예를 들면 그 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산으로의 변이 후의 pH 중성역에서의 항원 결합 활성이, 그 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산으로의 변이 전의 pH 중성역에서의 항원 결합 활성과 동등한 항원 결합 분자를 바람직하게 들 수 있다. 본 발명에 있어서 그 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산의 변이 후의 항원 결합 분자가 그 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산의 변이 전의 항원 결합 분자와 동등한 항원 결합 활성을 갖는다는 것은, 그 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산의 변이 전의 항원 결합 분자의 항원 결합 활성을 100%로 한 경우에, 그 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산의 변이 후의 항원 결합 분자의 항원 결합 활성이 적어도 10% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상인 것을 말한다. 그 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산의 변이 후의 pH 7.4에서의 항원 결합 활성이 그 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산의 변이 전의 pH 7.4에서의 항원 결합 활성보다 높아져도 된다. 그 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산으로의 치환 또는 삽입에 의해 항원 결합 분자의 항원 결합 활성이 낮아진 경우에는 항원 결합 분자 중의 1 또는 복수의 아미노산의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입 등에 의해, 항원 결합 활성이 그 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산의 치환 또는 삽입 전의 항원 결합 활성과 동등하게 될 수 있다. 본 발명에 있어서는 그러한 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산의 치환 또는 삽입 후에 1 또는 복수의 아미노산의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입을 행함으로써 결합 활성이 동등해진 항원 결합 분자도 포함된다.

또한 항원 결합 분자가 항체 정상영역을 포함하는 물질인 경우, pH 산성역에서의 항원 결합 활성이 pH 중성역에서의 항원 결합 활성보다도 낮은 항원 결합 분자의 바람직한 다른 태양으로서, 항원 결합 분자에 포함되는 항체 정상영역이 개변된 방법을 들 수 있다. 개변 후의 항체 정상영역의 구체예로서는 예를 들면 서열번호：11, 12, 13, 또는 14에 기재된 정상영역을 바람직하게 들 수 있다.

수소 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 도메인의 결합 활성을 변화시키는 아미노산

상기 스크리닝방법에 의해 스크리닝되는 본 발명의 항원 결합 도메인 또는 항체는 어떻게 조제되어도 되고, 예를 들면 이온 농도의 조건이 수소 이온 농도의 조건 또는 pH의 조건인 경우에는 사전에 존재하고 있는 항체, 사전에 존재하고 있는 라이브러리(파지 라이브러리 등), 동물에 대한 면역으로부터 얻어진 하이브리도마나 면역동물로부터의 B세포로부터 제작된 항체 또는 라이브러리, 이들 항체나 라이브러리에 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산의 변이를 도입한 항체 또는 라이브러리(측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산의 함유율을 높게 한 라이브러리나 특정 개소에 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산의 변이를 도입한 라이브러리 등) 등을 사용하는 것이 가능하다.

본 발명의 하나의 태양으로서 「수소 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 하나 이상의 아미노산 잔기」가 도입된 경쇄 가변영역과 랜덤화 가변영역 서열 라이브러리로서 제작된 중쇄 가변영역을 조합시킴으로써도, 본 발명의 복수의 서로 서열이 상이한 항원 결합 분자를 포함하는 라이브러리가 제작될 수 있다.

당해 아미노산 잔기의 비한정의 예로서 경쇄의 CDR1에 포함되는 아미노산 잔기가 예시된다. 그 외에도 당해 아미노산 잔기의 비한정의 예로서 경쇄의 CDR2에 포함되는 아미노산 잔기가 예시된다. 또한 당해 아미노산 잔기의 비한정의 다른 예로서 경쇄의 CDR3에 포함되는 아미노산 잔기도 또한 예시된다.

상기와 같이 당해 아미노산 잔기가 경쇄의 CDR1에 포함되는 아미노산 잔기의 비한정의 예로서, 경쇄 가변영역의 CDR1 중의 Kabat 넘버링으로 표시되는 24번 위치, 27번 위치, 28번 위치, 31번 위치, 32번 위치 및/또는 34번 위치의 아미노산 잔기를 들 수 있다. 또한 당해 아미노산 잔기가 경쇄의 CDR2에 포함되는 아미노산 잔기의 비한정의 예로서, 경쇄 가변영역의 CDR2 중의 Kabat 넘버링으로 표시되는 50번 위치, 51번 위치, 52번 위치, 53번 위치, 54번 위치, 55번 위치 및/또는 56번 위치의 아미노산 잔기를 들 수 있다. 또한 당해 아미노산 잔기가 경쇄의 CDR3에 포함되는 아미노산 잔기의 비한정의 예로서, 경쇄 가변영역의 CDR3 중의 Kabat 넘버링으로 표시되는 89번 위치, 90번 위치, 91번 위치, 92번 위치, 93번 위치, 94번 위치 및/또는 95A번 위치의 아미노산 잔기를 들 수 있다. 또한 이들 아미노산 잔기가 수소 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성이 변화되는 한 이들 아미노산 잔기가 단독으로 포함될 수 있고, 이들 아미노산이 둘 이상 조합되어 포함될 수 있다.

상기 「수소 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 하나 이상의 아미노산 잔기」가 도입된 경쇄 가변영역과 랜덤화 가변영역 서열 라이브러리로서 제작된 중쇄 가변영역을 조합시키는 경우라도, 상기와 마찬가지로 플렉시블 잔기가 당해 경쇄 가변영역의 서열에 포함되도록 설계하는 것도 가능하다. 본 발명의 항원 결합 분자의 항원에 대한 결합 활성이 수소 이온 농도의 조건에 따라 변화되는 한, 당해 플렉시블 잔기의 수 및 위치는 특정 태양에 한정되는 경우는 없다. 즉 중쇄 및/또는 경쇄의 CDR 서열 및/또는 FR 서열에 하나 또는 그 이상의 플렉시블 잔기가 포함될 수 있다. 예를 들면 경쇄 가변영역 서열에 도입되는 플렉시블 잔기의 비한정적인 예로서, 표 3 또는 표 4에 기재된 아미노산 잔기를 들 수 있다. 또한 수소 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 아미노산 잔기나 플렉시블 잔기 이외의 경쇄 가변영역의 아미노산 서열로서는, 비한정의 예로서 Vk1(서열번호：5), Vk2(서열번호：6), Vk3(서열번호：7), Vk4(서열번호：8) 등의 생식세포 계열의 서열이 적합하게 사용될 수 있다.

(위치는 Kabat 넘버링을 나타낸다)

(위치는 Kabat 넘버링을 나타낸다)

상기의 수소 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 아미노산 잔기로서는 어느 아미노산 잔기도 적합하게 사용될 수 있으나, 그러한 아미노산 잔기로서는 구체적으로 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산을 들 수 있다. 이러한 전자 공여성을 갖는 아미노산으로서는 히스티딘 또는 글루타민산 등의 천연의 아미노산 외에, 히스티딘 아날로그(US2009/0035836) 또는 m-NO2-Tyr(pKa 7.45), 3,5-Br2-Tyr(pKa 7.21) 또는 3,5-I2-Tyr(pKa 7.38) 등의 비천연의 아미노산(Bioorg. Med. Chem. (2003) 11 (17), 3761-2768이 적합하게 예시된다. 또한 당해 아미노산 잔기의 특히 적합한 예로서는 측쇄의 pKa가 6.0-7.0인 아미노산을 들 수 있다. 이러한 전자 공여성을 갖는 아미노산으로서는 히스티딘이 적합하게 예시된다.

항원 결합 도메인의 아미노산 개변을 위해서는 부위 특이적 변이 유발법(Kunkel등(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492))이나 Overlap extension PCR 등의 공지의 방법이 적당히 채용될 수 있다. 또한 천연의 아미노산 이외의 아미노산으로 치환하는 아미노산의 개변방법으로서, 복수의 공지의 방법도 또한 채용될 수 있다(Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (11), 6353-6357). 예를 들면 종지 코돈의 하나인 UAG 코돈(앰버 코돈)의 상보적 앰버 서프레서 tRNA에 비천연 아미노산이 결합된 tRNA가 포함되는 무세포 번역계 시스템(Clover Direct(Protein Express)) 등도 적합하게 사용될 수 있다.

조합되는 중쇄 가변영역의 예로서 랜덤화 가변영역 라이브러리를 바람직하게 들 수 있다. 랜덤화 가변영역 라이브러리의 제작방법은 공지의 방법이 적당히 조합된다. 본 발명의 비한정의 일태양에서는 특정 항원으로 면역된 동물, 감염증 환자나 백신 접종하여 혈중 항체가가 상승한 인간, 암 환자, 자기 면역 질환의 림프구 유래의 항체 유전자를 토대로 구축된 면역 라이브러리가 랜덤화 가변영역 라이브러리로서 적합하게 사용될 수 있다.

또한 본 발명의 비한정의 일태양에서는 상기와 마찬가지로 게놈 DNA에 있어서의 V 유전자나 재구축되어 기능적인 V 유전자의 CDR 서열이 적당한 길이의 코돈 세트를 코드하는 서열을 포함하는 합성 올리고뉴클레오티드 세트로 치환된 합성 라이브러리도 또한 랜덤화 가변영역 라이브러리로서 적합하게 사용될 수 있다. 이 경우, 중쇄의 CDR3의 유전자 서열의 다양성이 관찰되는 것으로부터 CDR3의 서열만을 치환하는 것도 또한 가능하다. 항원 결합 분자의 가변영역에 있어서 아미노산의 다양성을 만들어 내는 기준은 항원 결합 분자의 표면에 노출된 위치의 아미노산 잔기에 다양성을 부여하는 것이다. 표면에 노출된 위치란 항원 결합 분자의 구조, 구조 어셈블 및/또는 모델화된 구조를 토대로 표면에 노출이 가능 및/또는 항원과의 접촉이 가능하다고 판단되는 위치를 말하나, 일반적으로는 그의 CDR이다. 바람직하게는 표면에 노출된 위치는 InsightII 프로그램(Accelrys)과 같은 컴퓨터 프로그램을 사용하여 항원 결합 분자의 3차원 모델로부터의 좌표를 사용하여 결정된다. 표면에 노출된 위치는 당 기술분야에서 공지인 알고리즘(예를 들면 Lee 및 Richards(J. Mol. Biol. (1971) 55, 379-400), Connolly(J. Appl. Cryst. (1983) 16, 548-558))을 사용하여 결정될 수 있다. 표면에 노출된 위치의 결정은 단백질 모델링에 적합한 소프트웨어 및 항체로부터 얻어지는 3차원 구조 정보를 사용하여 행해질 수 있다. 이러한 목적을 위해 이용할 수 있는 소프트웨어로서 SYBYL 생체 고분자 모듈 소프트웨어(Tripos Associates)를 바람직하게 들 수 있다. 일반적으로 또한 바람직하게는 알고리즘이 유저의 입력 사이즈 파라미터를 필요로 하는 경우, 계산에 있어서 사용되는 프로브의 「사이즈」는 반경 약 1.4옹스트롬 이하로 설정된다. 또한 퍼스널 컴퓨터용 소프트웨어를 사용한 표면에 노출된 영역 및 구역의 결정법이 Pacios(Comput. Chem. (1994) 18 (4), 377-386 및 J. Mol. Model. (1995) 1, 46-53)에 기재되어 있다.

또한 본 발명의 비한정의 일태양에서는 건강한 정상인의 림프구 유래의 항체 유전자로부터 구축되어 그 레퍼토리에 바이어스를 포함하지 않는 항체 서열인 나이브 서열로 이루어지는 나이브 라이브러리도 또한 랜덤화 가변영역 라이브러리로서 특히 적합하게 사용될 수 있다(Gejima등(Human Antibodies (2002) 11,121-129) 및 Cardoso등(Scand. J. Immunol. (2000) 51, 337-344)).

FcRn

면역글로불린 슈퍼패밀리에 속하는 Fcγ 수용체와 달리, FcRn 특히 인간 FcRn은 구조적으로는 주요 조직 부적합성 복합체(MHC) 클래스 I의 폴리펩티드와 구조적으로 유사하여 클래스 I의 MHC 분자와 22~29%의 서열 동일성을 갖는다(Ghetie등，Immunol. Today (1997) 18 (12), 592-598). FcRn은 가용성 β 또는 경쇄(β2 마이크로글로불린)와 복합체화된 막관통 α 또는 중쇄로 이루어지는 헤테로다이머로서 발현된다. MHC와 같이 FcRn의 α쇄는 3개의 세포외 도메인(α1, α2, α3)으로 이루어지고, 짧은 세포질 도메인은 단백질을 세포 표면에 계류한다. α1 및 α2 도메인이 항체의 Fc영역 중의 FcRn 결합 도메인과 상호작용한다(Raghavan등(Immunity (1994) 1, 303-315).

FcRn은 포유동물의 모성 태반 또는 난황낭에서 발현되고 그것은 모친으로부터 태아로의 IgG의 이동에 관여한다. 이에 더하여 FcRn이 발현하는 설치류 신생아의 소장에서는 FcRn이 섭취된 초유 또는 젖으로부터 모성 IgG의 쇄자연(brush border) 상피를 가로지르는 이동에 관여한다. FcRn은 다수의 종에 걸쳐 다수의 다른 조직 및 각종 내피세포계에 있어서 발현되고 있다. 그것은 인간 성인 혈관내피, 근육혈관계 및 간장 동양 모세혈관(hepatic sinusoidal capillaries)에서도 발현된다. FcRn은 IgG에 결합하여 그것을 혈청에 리사이클함으로써 IgG의 혈장 중 농도를 유지하는 역할을 하고 있는 것으로 생각되고 있다. FcRn의 IgG 분자에 대한 결합은 통상 엄격하게 pH에 의존적이며, 최적 결합은 7.0 미만의 pH 산성역에 있어서 확인된다.

서열번호：15로 표시된 시그날 서열을 포함하는 폴리펩티드를 전구체로 하는 인간 FcRn은 생체내에서(서열번호：16에 시그날 서열을 포함하는 그의 폴리펩티드가 기재되어 있는) 인간 β2-마이크로글로불린과의 복합체를 형성한다. 뒤에 참고실시예에서 나타내어지는 바와 같이 β2-마이크로글로불린과 복합체를 형성하고 있는 가용형 인간 FcRn이 통상의 재조합 발현수법을 사용함으로써 제조된다. 이러한 β2-마이크로글로불린과 복합체를 형성하고 있는 가용형 인간 FcRn에 대한 본 발명의 Fc영역의 결합 활성이 평가될 수 있다. 본 발명에 있어서 특별히 기재가 없는 경우는 인간 FcRn은 본 발명의 Fc영역에 결합 가능한 형태인 것을 가리키고, 예로서 인간 FcRn과 인간 β2-마이크로글로불린의 복합체를 들 수 있다.

FcRn 결합 도메인

본 발명의 일태양에서는, 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인 및 pH 중성역의 조건하에서 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 FcRn 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자를 유효성분으로서 포함하는 상기 항원에 대한 면역응답을 유도하는 의약 조성물이 제공된다.

본 발명의 항원 결합 분자는 FcRn 결합 도메인을 갖는다. FcRn 결합 도메인은 항원 결합 분자가 pH 중성역의 조건하에서 FcRn에 대한 결합 활성을 가지고 있으면 특별히 한정되지 않고, 또한 직접 또는 간접적으로 FcRn에 대해 결합 활성을 갖는 도메인이어도 된다. 그러한 도메인으로서는 예를 들면 직접적으로 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 IgG형 면역글로불린의 Fc영역, 알부민, 알부민 도메인 3, 항FcRn 항체, 항FcRn 펩티드, 항FcRn 토대(Scaffold) 분자 등 또는 간접적으로 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 IgG나 알부민에 결합하는 분자 등을 바람직하게 들 수 있다. 항FcRn 토대(scaffold)로서는 FcRn에 결합하는 것을 특징으로 하는 앞서 기재된 항원 결합 도메인 중 어떠한 구조의 도메인도 사용될 수 있다. 본 발명에 있어서는 pH 산성역 및 pH 중성역의 조건하에서 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 도메인이 바람직하다. 당해 도메인은 사전에 pH 중성역의 조건하에서 FcRn에 대한 결합 활성을 가지고 있는 도메인이라면 그대로 적합하게 사용될 수 있다. 당해 도메인이 pH 중성역의 조건하에서 FcRn에 대한 결합 활성이 없거나 또는 약한 경우에는 항원 결합 분자 중의 아미노산을 개변하여 FcRn에 대한 결합 활성을 부여하는 것이 가능하다. 또한 사전에 pH 중성역의 조건하에서 FcRn에 대한 결합 활성을 가지고 있는 도메인 중의 아미노산을 개변하여 FcRn 결합 활성을 높여도 된다. FcRn 결합 도메인의 아미노산의 개변은 아미노산 개변 전과 개변 후의 pH 중성역의 조건하에서 FcRn에 대한 결합 활성을 비교함으로써 목적의 개변을 발견할 수 있다.

또한 본 발명의 다른 일태양에서는, FcRn 결합 도메인은 저칼슘 이온 농도의 조건 및 고칼슘 이온 농도의 조건에 있어서 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 도메인도 적합하게 사용된다. 당해 도메인은 사전에 고칼슘 이온 농도의 조건에 있어서 FcRn에 대한 결합 활성을 가지고 있는 도메인이라면 그대로 적합하게 사용될 수 있다. 당해 도메인이 고칼슘 이온 농도의 조건에 있어서 FcRn에 대한 결합 활성이 없거나 또는 약한 경우에는, 항원 결합 분자 중의 아미노산을 개변하여 FcRn에 대한 결합 활성을 부여하는 것이 가능하다. 또한 사전에 고칼슘 이온 농도의 조건에 있어서 FcRn에 대한 결합 활성을 가지고 있는 도메인 중의 아미노산을 개변하여 FcRn 결합 활성을 높여도 된다. FcRn 결합 도메인의 아미노산의 개변은 아미노산 개변 전과 개변 후의 고칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 FcRn에 대한 결합 활성을 비교함으로써 목적의 개변을 발견할 수 있다. 상기의 이온 농도의 조건 항목에 있어서 예로 든 칼슘 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인의 스크리닝방법 및 제작방법에 준한 방법에 따라 취득될 수 있다. 그러한 FcRn 결합 도메인의 예로서 항FcRn 항체, 항FcRn 펩티드, 항FcRn 토대(Scaffold)분자 등을 들 수 있다.

FcRn 결합 도메인은 직접 FcRn과 결합하는 영역인 것이 바람직하다. FcRn 결합 도메인의 바람직한 예로서 항체의 Fc영역을 들 수 있다. 그러나 알부민이나 IgG 등의 FcRn과의 결합 활성을 갖는 폴리펩티드에 결합 가능한 영역은 알부민이나 IgG 등을 매개로 간접적으로 FcRn과 결합하는 것이 가능하다. 그 때문에 본 발명에 있어서의 FcRn 결합영역으로서는 FcRn과의 결합 활성을 갖는 폴리펩티드에 결합하는 영역이 적합하게 사용될 수 있다. Fc영역은 항체 중쇄의 정상영역에 유래하는 아미노산 서열을 포함한다. Fc영역은 EU 넘버링으로 표시되는 대략 216의 아미노산에 있어서의 파파인 절단부위의 힌지영역의 N말단으로부터 당해 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 항체의 중쇄 정상영역의 부분이다.

본 발명에 있어서의 FcRn 결합 도메인의 FcRn, 특히 인간 FcRn에 대한 결합 활성은 상기 결합 활성의 항목에서 기술되어 있는 바와 같이 당업자에게 공지의 방법에 의해 측정하는 것이 가능하고, pH 이외의 조건에 대해서는 당업자가 적당히 결정하는 것이 가능하다. 항원 결합 분자의 항원 결합 활성과 인간 FcRn 결합 활성은 KD(Dissociation constant：해리상수), 겉보기 KD(Apparent dissociation constant：겉보기 해리상수), 해리속도인 kd(Dissociation rate：해리속도) 또는 겉보기 kd(Apparent dissociation：겉보기 해리속도) 등으로서 평가될 수 있다. 이들은 당업자 공지의 방법으로 측정될 수 있다. 예를 들면 Biacore (GE healthcare), 스캐차드 플롯, 플로우 사이토미터 등이 사용될 수 있다.

FcRn 결합 도메인의 FcRn에 대한 결합 활성을 측정할 때의 pH 이외의 조건은 당업자가 적당히 선택하는 것이 가능하고, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면 WO2009/125825에 기재되어 있는 바와 같이 MES 버퍼, 37℃의 조건에 있어서 측정될 수 있다. 또한 본 발명의 FcRn 결합 도메인의 FcRn에 대한 결합 활성의 측정은 당업자 공지의 방법에 의해 행하는 것이 가능하고, 예를 들면 Biacore(GE Healthcare) 등을 사용하여 측정될 수 있다. FcRn 결합 도메인과 FcRn의 결합 활성의 측정은 FcRn 결합 도메인 또는 FcRn 결합 도메인을 포함하는 본 발명의 항원 결합 분자 또는 FcRn을 고정화한 칩으로, 각각 FcRn 또는 FcRn 결합 도메인 또는 FcRn 결합 도메인을 포함하는 본 발명의 항원 결합 분자를 애널라이트로서 흘림으로써 평가될 수 있다.

본 발명의 항원 결합 분자에 포함되는 FcRn 결합 도메인과 FcRn의 결합 활성을 갖는 조건으로서의 pH 산성역이란 통상 pH 4.0~pH 6.5를 의미한다. 바람직하게는 pH 5.5~pH 6.5를 의미하고, 특히 바람직하게는 생체내의 조기 엔도솜 내의 pH에 가까운 pH 5.8~pH 6.0을 의미한다. 또한 본 발명의 항원 결합 분자에 포함되는 FcRn 결합 도메인과 FcRn의 결합 활성을 갖는 조건으로서의 pH 중성역이란 통상 pH 6.7~pH 10.0을 의미한다. pH 중성역이란 바람직하게는 pH 7.0~pH 8.0의 임의의 pH값으로 나타내어지는 범위이고, 바람직하게는 pH 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9 및 8.0으로부터 선택되며, 특히 바람직하게는 생체내의 혈장 중(혈중)의 pH에 가까운 pH 7.4이다. 인간 FcRn 결합 도메인과 인간 FcRn의 결합 친화성이 pH 7.4로 낮기 때문에 결합 친화성을 평가하는 것이 어려운 경우에는 pH 7.4 대신에 pH 7.0을 사용할 수 있다. 측정 조건에 사용되는 온도로서 FcRn 결합 도메인과 FcRn의 결합 친화성은 10℃~50℃의 임의의 온도에서 평가해도 된다. 바람직하게는 FcRn 결합 도메인과 인간 FcRn의 결합 친화성을 결정하기 위해 15℃~40℃의 온도가 사용된다. 보다 바람직하게는 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34및 35℃ 중 어느 하나와 같은 20℃~35℃에서의 임의의 온도도 마찬가지로, FcRn 결합 도메인과 FcRn의 결합 친화성을 결정하기 위해 사용된다. 25℃라는 온도는 본 발명의 태양의 비한정의 일례이다.

The Journal of Immunology (2009) 182, 7663-7671에 의하면 천연형 인간 IgG1의 인간 FcRn에 대한 결합 활성은 pH 산성역(pH 6.0)에서 KD 1.7 μM인데, pH 중성역에서는 활성을 거의 검출하지 못하고 있다. 따라서 바람직한 태양에 있어서는 pH 산성역에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 활성이 KD 20 μM 또는 그것보다 강하고, pH 중성역에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 활성이 천연형 인간 IgG와 동등한 항원 결합 분자를 포함하는, pH 산성역에 있어서의 조건하에서 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 본 발명의 항원 결합 분자가 사용될 수 있다. 보다 바람직한 태양에 있어서는 pH 산성역에 있어서의 인간 FcRn 결합 활성이 KD 2.0 μM 또는 그것보다 강한 항원 결합 분자를 포함하는 본 발명의 항원 결합 분자가 사용될 수 있다. 더욱이 보다 바람직한 태양에 있어서는 pH 산성역에 있어서의 인간 FcRn 결합 활성이 KD 0.5 μM 또는 그것보다 강한 항원 결합 분자가 사용될 수 있다. 상기 KD값은 The Journal of Immunology (2009) 182: 7663-7671에 기재된 방법(항원 결합 분자를 칩에 고정하고 애널라이트로서 인간 FcRn을 흘린다)에 의해 결정된다.

본 발명에 있어서는 pH 산성역에 있어서 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 Fc영역이 바람직하다. 당해 도메인은 사전에 pH 산성역에 있어서 FcRn에 대한 결합 활성을 가지고 있는 Fc영역이라면 그대로 사용될 수 있다. 당해 도메인이 pH 산성역에 있어서 FcRn에 대한 결합 활성이 없거나 또는 약한 경우에는 항원 결합 분자 중의 아미노산을 개변함으로써 목적하는 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 Fc영역이 취득될 수 있으나, Fc영역 중의 아미노산을 개변함으로써 pH 산성역에 있어서의 목적하는 FcRn에 대한 결합 활성을 갖거나 또는 증강된 Fc영역도 적합하게 취득될 수 있다. 그러한 목적하는 결합 활성을 초래하는 Fc영역의 아미노산 개변은 아미노산 개변 전과 개변 후의 pH 산성역에 있어서의 FcRn에 대한 결합 활성을 비교함으로써 발견될 수 있다. 상기 항원에 대한 결합 활성을 개변하기 위해 사용되는 수법과 동일한 부위 특이적 변이 유발법(Kunkel등(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492))이나 Overlap extension PCR 등의 공지의 방법을 사용하여 당업자는 적당히 아미노산의 개변을 실시할 수 있다.

본 발명의 항원 결합 분자에 포함되는 pH 산성역에 있어서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 Fc영역은 어떠한 방법으로도 취득될 수 있으나, 구체적으로는 출발 Fc영역으로서 사용되는 인간 IgG형 면역글로불린의 아미노산의 개변에 의해 pH 산성역에 있어서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖거나 또는 증강된 FcRn 결합 도메인이 취득될 수 있다. 개변을 위한 바람직한 IgG형 면역글로불린의 Fc영역으로서는 예를 들면 인간 IgG(IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 및 그들의 개변체)의 Fc영역을 들 수 있다. 다른 아미노산으로의 개변은 pH 산성역에 있어서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖거나 또는 산성역에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 높일 수 있는 한, 어떠한 위치의 아미노산도 개변될 수 있다. 항원 결합 분자가 Fc영역으로서 인간 IgG1의 Fc영역을 포함하고 있는 경우, pH 산성역에 있어서의 FcRn에 대한 결합이 인간 IgG1의 출발 Fc영역의 결합 활성보다 증강되는 효과를 초래하는 개변이 포함되어 있는 것이 바람직하다. 그러한 개변이 가능한 아미노산으로서, 예를 들면 WO2000/042072에 기재되어 있는 바와 같이 EU 넘버링으로 표시되는 238번 위치, 252번 위치, 253번 위치, 254번 위치, 255번 위치, 256번 위치, 265번 위치, 272번 위치, 286번 위치, 288번 위치, 303번 위치, 305번 위치, 307번 위치, 309번 위치, 311번 위치, 312번 위치, 317번 위치, 340번 위치, 356번 위치, 360번 위치, 362번 위치, 376번 위치, 378번 위치, 380번 위치, 382번 위치, 386번 위치, 388번 위치, 400번 위치, 413번 위치, 415번 위치, 424번 위치, 433번 위치, 434번 위치, 435번 위치, 436번 위치, 439번 위치 및/또는 447번 위치의 아미노산을 바람직하게 들 수 있다. 마찬가지로 그러한 개변이 가능한 아미노산으로서, 예를 들면 WO2002/060919에 기재되어 있는 바와 같이 EU 넘버링으로 표시되는 251번 위치, 252번 위치, 254번 위치, 255번 위치, 256번 위치, 308번 위치, 309번 위치, 311번 위치, 312번 위치, 385번 위치, 386번 위치, 387번 위치, 389번 위치, 428번 위치, 433번 위치, 434번 위치 및/또는 436번 위치의 아미노산도 바람직하게 들 수 있다. 또한 그러한 개변이 가능한 아미노산으로서 WO2004/092219에 기재되어 있는 바와 같이 EU 넘버링으로 표시되는 250번 위치, 314번 위치 및 428번 위치의 아미노산도 들 수 있다. 또한 그러한 개변이 가능한 아미노산으로서, 예를 들면 WO2010/045193에 기재되어 있는 바와 같이 EU 넘버링으로 표시되는 251번 위치, 252번 위치, 307번 위치, 308번 위치, 378번 위치, 428번 위치, 430번 위치, 434번 위치 및/또는 436번 위치의 아미노산도 바람직하게 들 수 있다. 이들 아미노산의 개변에 의해 IgG형 면역글로불린의 Fc영역의 pH 산성역에 있어서의 FcRn에 대한 결합이 증강된다.

본 발명에 있어서는 pH 중성역에 있어서 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 Fc영역이 바람직하다. 당해 도메인은 사전에 pH 중성역에 있어서 FcRn에 대한 결합 활성을 가지고 있는 Fc영역이라면 그대로 사용될 수 있다. 당해 도메인이 pH 중성역에 있어서 FcRn에 대한 결합 활성이 없거나 또는 약한 경우에는 항원 결합 분자 중의 아미노산을 개변함으로써 목적하는 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 Fc영역이 취득될 수 있는데, Fc영역 중의 아미노산을 개변함으로써 pH 중성역에 있어서의 목적하는 FcRn에 대한 결합 활성을 갖거나 또는 증강된 Fc영역도 적합하게 취득될 수 있다. 그러한 목적하는 결합 활성을 초래하는 Fc영역의 아미노산 개변은 아미노산 개변 전과 개변 후의 pH 중성역에 있어서의 FcRn에 대한 결합 활성을 비교함으로써 발견될 수 있다. 상기 항원에 대한 결합 활성을 개변하기 위해 사용되는 수법과 동일한 부위 특이적 변이 유발법(Kunkel등(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492))이나 Overlap extension PCR 등의 공지의 방법을 사용하여 당업자는 적당히 아미노산의 개변을 실시할 수 있다.

본 발명의 항원 결합 분자에 포함되는 pH 중성역에 있어서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 Fc영역은 어떠한 방법으로도 취득될 수 있으나, 구체적으로는 출발 Fc영역으로서 사용되는 인간 IgG형 면역글로불린의 아미노산의 개변에 의해 pH 중성역에 있어서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖거나 또는 증강된 FcRn 결합 도메인이 취득될 수 있다. 개변을 위한 바람직한 IgG형 면역글로불린의 Fc영역으로서는, 예를 들면 인간 IgG(IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 및 그들의 개변체)의 Fc영역을 들 수 있다. 다른 아미노산으로의 개변은 pH 중성역에 있어서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖거나 또는 중성역에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 높일 수 있는 한 어떠한 위치의 아미노산도 개변될 수 있다. 항원 결합 분자가 Fc영역으로서 인간 IgG1의 Fc영역을 포함하고 있는 경우, pH 중성역에 있어서의 FcRn에 대한 결합이 인간 IgG1의 출발 Fc영역의 결합 활성보다 증강되는 효과를 초래하는 개변이 포함되어 있는 것이 바람직하다. pH 중성역 조건에 있어서의 FcRn에 대한 KD값은 상기와 같이 The Journal of Immunology (2009) 182: 7663-7671에 기재된 방법(항원 결합 분자를 칩에 고정하고 애널라이트로서 인간 FcRn을 흘린다)에 의해 결정된다.

개변을 위한 바람직한 IgG형 면역글로불린의 Fc영역으로서는, 예를 들면 인간 IgG(IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 및 그들의 개변체)의 Fc영역을 들 수 있다. 다른 아미노산으로의 개변은 pH 중성역에 있어서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖거나 또는 중성역에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 높일 수 있는 한 어떠한 위치의 아미노산도 개변될 수 있다. 항원 결합 분자가 Fc영역으로서 인간 IgG1의 Fc영역을 포함하고 있는 경우, pH 중성역에 있어서의 FcRn에 대한 결합이 인간 IgG1의 출발 Fc영역의 결합 활성보다 증강되는 효과를 초래하는 개변이 포함되어 있는 것이 바람직하다. 그러한 개변이 가해진 Fc영역을 제작하는 것을 목적으로, 표 5에 나타내는 다양한 변이가 VH3-IgG1(서열번호：17)에 도입되어 평가가 이루어졌다. 제작된 중쇄와 경쇄인 L(WT)(서열번호：18)을 각각 포함하는 개변체(IgG1-F1~IgG1-F1052)가 참고실시예 1에 기재된 방법에 준하여 발현 및 정제되었다.

항체와 인간 FcRn의 결합이 실시예 3-3에 기재되는 방법에 준하여 해석되었다. 즉, Biacore를 사용한 중성 조건하(pH 7.0)에 있어서의 인간 FcRn에 대한 개변체의 결합 활성을 표 5(표 5-1~표 5-33)에 나타내었다.

[표 5-1]

[표 5-2]

[표 5-3]

[표 5-4]

[표 5-5]

[표 5-6]

[표 5-7]

[표 5-8]

[표 5-9]

[표 5-10]

[표 5-11]

[표 5-12]

[표 5-13]

[표 5-14]

[표 5-15]

[표 5-16]

[표 5-17]

[표 5-18]

[표 5-19]

[표 5-20]

[표 5-21]

[표 5-22]

[표 5-23]

[표 5-24]

[표 5-25]

[표 5-26]

[표 5-27]

[표 5-28]

[표 5-29]

[표 5-30]

[표 5-31]

[표 5-32]

[표 5-33]

본 발명의 비한정의 일태양에서는, Fc영역의 아미노산이 EU 넘버링으로 표시되는 부위 중 257번 위치, 308번 위치, 428번 위치 및 434번 위치의 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산이 천연형 Fc영역의 대응하는 부위의 아미노산과 상이한 Fc영역이 적합하게 사용된다. 그러한 Fc영역의 비한정의 일례로서 Fc영역의 EU 넘버링으로 표시되는；

257번 위치의 아미노산이 Ala,

308번 위치의 아미노산이 Pro,

428번 위치의 아미노산이 Leu, 및

434번 위치의 아미노산이 Tyr

의 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산을 포함하는 Fc영역을 바람직하게 들 수 있다.

Fcγ 수용체

Fcγ 수용체란 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 단일클론항체의 Fc영역에 결합 가능한 수용체를 말하고, 실질적으로 Fcγ 수용체 유전자에 코드되는 단백질의 패밀리의 모든 멤버를 의미한다. 인간의 경우는 이 패밀리에는 아이소폼 FcγRIa, FcγRIb 및 FcγRIc를 포함하는 FcγRI(CD64)；아이소폼 FcγRIIa(알로타입 H131 및 R131을 포함), FcγRIIb(FcγRIIb-1 및 FcγRIIb-2를 포함) 및 FcγRIIc를 포함하는 FcγRII(CD32)；및 아이소폼 FcγRIIIa(알로타입 V158 및 F158을 포함) 및 FcγRIIIb(알로타입 FcγRIIIb-NA1 및 FcγRIIIb-NA2를 포함)를 포함하는 FcγRIII(CD16) 및 어떠한 미발견의 인간 FcγR류 또는 FcγR 아이소폼 또는 알로타입도 포함되나, 이들에 한정되는 것은 아니다. FcγR은 인간, 마우스, 랫트, 토끼 및 원숭이를 포함하나, 이들에 한정되는 것은 아니고 어떠한 생물 유래여도 된다. 마우스 FcγR류에는 FcγRI(CD64), FcγRII(CD32), FcγRIII(CD16) 및 FcγRIII-2(FcγRIV, CD16-2) 및 어떠한 미발견의 마우스 FcγR류 또는 FcγR 아이소폼 또는 알로타입도 포함되나, 이들에 한정되지 않는다. 이러한 Fcγ 수용체의 적합한 예로서는 인간 FcγRI(CD64), FcγRIIa(CD32), FcγRIIb(CD32), FcγRIIIa(CD16) 및/또는 FcγRIIIb(CD16)를 들 수 있다. FcγRI의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 서열번호：19(NM_000566.3) 및 20(NP_000557.1)에 FcγRIIa의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 서열번호：21(BC020823.1) 및 22(AAH20823.1)에 FcγRIIb의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 서열번호：23(BC146678.1) 및 24(AAI46679.1)에 FcγRIIIa의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 서열번호：25(BC033678.1) 및 26(AAH33678.1)에 및 FcγRIIIb의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 서열번호：27(BC128562.1) 및 28(AAI28563.1)에 기재되어 있다(괄호 안은 RefSeq 등록번호를 나타낸다). Fcγ 수용체가 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 단일클론항체의 Fc영역에 결합 활성을 갖는지 여부는 상기에 기재되는 FACS나 ELISA 포맷 외에, ALPHA 스크린(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)이나 표면 플라즈몬 공명(SPR)현상을 이용한 BIACORE법 등에 의해 확인될 수 있다(Proc.Natl.Acad.Sci.USA (2006) 103 (11), 4005-4010).

또한 「Fc 리간드」 또는 「이펙터 리간드」는 항체의 Fc영역에 결합하여 Fc/Fc 리간드 복합체를 형성하는, 임의의 생물에 유래하는 분자, 바람직하게는 폴리펩티드를 의미한다. Fc 리간드의 Fc에 대한 결합은 바람직하게는 하나 또는 그 이상의 이펙터 기능을 야기한다. Fc 리간드에는 Fc 수용체, FcγR, FcαR, FcεR, FcRn, C1q, C3, 만난 결합 렉틴, 만노오스 수용체, 스타필로코커스의 프로테인 A, 스타필로코커스의 단백질 G 및 바이러스의 FcγR이 포함되나, 이들에 한정되지 않는다. Fc 리간드에는 FcγR에 상동인 Fc 수용체의 패밀리인 Fc 수용체 상동체(FcRH)(Davis et al.,(2002)Immunological Reviews 190, 123-136)도 포함된다. Fc 리간드에는 Fc에 결합하는 미발견의 분자도 포함될 수 있다.

FcγRIa, FcγRIb 및 FcγRIc를 포함하는 FcγRI(CD64) 및 아이소폼 FcγRIIIa(알로타입 V158 및 F158을 포함) 및 FcγRIIIb(알로타입 FcγRIIIb-NA1 및 FcγRIIIb-NA2를 포함)를 포함하는 FcγRIII(CD16)는 IgG의 Fc 부분과 결합하는 α쇄와 세포내에 활성화 시그날을 전달하는 ITAM을 갖는 공통 γ쇄가 회합한다. 한편 아이소폼 FcγRIIa(알로타입 H131 및 R131을 포함) 및 FcγRIIc를 포함하는 FcγRII(CD32) 자신의 세포질 도메인에는 ITAM이 포함되어 있다. 이들 수용체는 마크로파지나 마스트 세포, 항원 제시 세포 등의 많은 면역세포에 발현하고 있다. 이들 수용체가 IgG의 Fc 부분에 결합함으로써 전달되는 활성화 시그날에 의해, 마크로파지의 탐식능이나 염증성 사이토카인의 생산, 마스트 세포의 탈과립, 항원 제시 세포의 기능 항진이 촉진된다. 상기와 같이 활성화 시그날을 전달하는 능력을 갖는 Fcγ 수용체는 본 발명에 있어서도 활성형 Fcγ 수용체라 불린다.

한편 FcγRIIb(FcγRIIb-1 및 FcγRIIb-2를 포함) 자신의 세포질내 도메인에는 억제형 시그날을 전달하는 ITIM이 포함되어 있다. B세포에서는 FcγRIIb와 B세포 수용체(BCR)의 가교에 의해 BCR로부터의 활성화 시그날이 억제되는 결과 BCR의 항체 생산이 억제된다. 마크로파지에서는 FcγRIII와 FcγRIIb의 가교에 의해 탐식능이나 염증성 사이토카인의 생산능이 억제된다. 상기와 같이 억제화 시그날을 전달하는 능력을 갖는 Fcγ 수용체는 본 발명에 있어서도 억제형 Fcγ 수용체라 불린다.

Fcγ 수용체에 대한 결합 활성

본 발명의 어느 한 태양에서는, Fc영역의 인간 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 인간 Fcγ 수용체에 대한 인간 IgG의 Fc의 결합 활성보다도 높은 Fc영역이 포함되는 FcRn 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자를 유효성분으로서 포함하는 면역응답을 유도하는 의약 조성물이 제공된다.

Fc영역의 인간 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa 및/또는 FcγRIIIb 중 어느 하나의 인간 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 이들 인간 Fcγ 수용체에 대한 인간 IgG의 Fc의 결합 활성보다도 높은지 여부는 상기에 기재되는 FACS나 ELISA 포맷 외에, ALPHA 스크린(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)이나 표면 플라즈몬 공명(SPR) 현상을 이용한 BIACORE법 등에 의해 확인할 수 있다(Proc.Natl.Acad.Sci.USA (2006) 103 (11), 4005-4010).

ALPHA 스크린은 도너와 액셉터의 2개의 비드를 사용하는 ALPHA 테크놀로지에 의해 하기의 원리를 토대로 실시된다. 도너 비드에 결합한 분자가 액셉터 비드에 결합한 분자와 생물학적으로 상호작용하여 2개의 비드가 근접한 상태일 때만 발광 시그날이 검출된다. 레이저에 의해 여기된 도너 비드 내의 감광제는 주변의 산소를 여기상태의 일중항산소로 변환한다. 일중항산소는 도너 비드 주변에 확산되어 근접해 있는 액셉터 비드에 도달하면 비드 내의 화학 발광반응을 일으켜 최종적으로 빛이 방출된다. 도너 비드에 결합한 분자와 액셉터 비드에 결합한 분자가 상호작용하지 않을 때는 도너 비드가 생산하는 일중항산소가 액셉터 비드에 도달하지 않기 때문에 화학 발광반응은 일어나지 않는다.

예를 들면 도너 비드에 비오틴 표지된 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자가 결합되고, 액셉터 비드에는 글루타티온 S 트랜스페라아제(GST)로 태그화된 Fcγ 수용체가 결합된다. 경합하는 개변 Fc영역을 갖는 항원 결합 분자의 비존재하에서는 야생형 Fc영역을 갖는 폴리펩티드 회합체와 Fcγ 수용체는 상호작용하여 520-620 nm의 시그날을 발생시킨다. 태그화되어 있지 않은 개변 Fc영역을 갖는 항원 결합 분자는 야생형 Fc영역을 갖는 항원 결합 분자와 Fcγ 수용체 간의 상호작용과 경합한다. 경합 결과 나타나는 형광의 감소를 정량함으로써 상대적인 결합 친화성이 결정될 수 있다. 항체 등의 항원 결합 분자를 Sulfo-NHS-비오틴 등을 사용하여 비오틴화하는 것은 공지이다. Fcγ 수용체를 GST로 태그화하는 방법으로서는 Fcγ 수용체를 코드하는 폴리뉴클레오티드와 GST를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 인프레임으로 융합한 융합 유전자가 작용 가능하게 연결된 벡터에 보유된 세포 등에 있어서 발현하고, 글루타티온 칼럼을 사용하여 정제하는 방법 등이 적당히 채용될 수 있다. 얻어진 시그날은 예를 들면 GRAPHPAD PRISM(GraphPad사, San Diego) 등의 소프트웨어를 사용하여 비선형 회귀해석을 이용하는 일부위 경합(one-site competition) 모델에 적합시킴으로써 적합하게 해석된다.

상호작용을 관찰하는 물질의 한쪽(리간드)을 센서칩의 금박막 상에 고정하고, 센서칩의 안쪽으로부터 금박막과 유리의 경계면에서 전반사되도록 빛을 조사하면, 반사광의 일부에 반사강도가 저하된 부분(SPR 시그날)이 형성된다. 상호작용을 관찰하는 물질의 다른 쪽(애널라이트)을 센서칩의 표면에 흘려 리간드와 애널라이트가 결합하면, 고정화되어 있는 리간드 분자의 질량이 증가하여 센서칩 표면의 용매의 굴절률이 변화된다. 이 굴절률의 변화에 의해 SPR 시그날의 위치가 시프트된다(반대로 결합이 해리되면 시그날의 위치는 되돌아간다). Biacore 시스템은 상기 시프트되는 양, 즉 센서칩 표면에서의 질량 변화를 세로축에 취하고, 질량의 시간 변화를 측정 데이터로서 표시한다(센서그램). 센서그램의 커브로부터 키네틱스：결합속도상수(ka)와 해리속도상수(kd)가, 당해 상수의 비로부터 친화성(KD)이 구해진다. BIACORE법에서는 저해 측정법도 적합하게 사용된다. 저해 측정법의 예는 Proc.Natl.Acad.Sci.USA (2006) 103 (11), 4005-4010에 있어서 기재되어 있다.

본 발명의 항원 결합 분자에 포함되는 Fc영역과 Fcγ 수용체의 결합 활성을 측정하는 pH의 조건은 pH 산성역 또는 pH 중성역의 조건이 적당히 사용될 수 있다. 본 발명의 항원 결합 분자에 포함되는 Fc영역과 Fcγ 수용체의 결합 활성을 측정하는 조건으로서의 pH 중성역이란 통상 pH 6.7~pH 10.0을 의미한다. 바람직하게는 pH 7.0~pH 8.0의 임의의 pH값으로 나타내어지는 범위이고, 바람직하게는 pH 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9 및 8.0으로부터 선택되며, 특히 바람직하게는 생체내의 혈장 중(혈중)의 pH에 가까운 pH 7.4이다. 본 발명에 있어서 본 발명의 항원 결합 분자에 포함되는 Fc영역과 Fcγ 수용체의 결합활성을 갖는 조건으로서의 pH 산성역이란 통상 pH 4.0~pH 6.5를 의미한다. 바람직하게는 pH 5.5~pH 6.5를 의미하고, 특히 바람직하게는 생체내의 조기 엔도솜 내의 pH에 가까운 pH 5.8~pH 6.0을 의미한다. 측정 조건에 사용되는 온도로서 Fc영역과 인간 Fcγ 수용체의 결합 친화성은 10℃~50℃의 임의의 온도에서 평가될 수 있다. 바람직하게는 인간 Fc영역과 Fcγ 수용체의 결합 친화성을 결정하기 위해 15℃~40℃의 온도가 사용된다. 보다 바람직하게는 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 및 35℃ 중 어느 하나와 같은 20℃~35℃에서의 임의의 온도도 마찬가지로, Fc영역과 Fcγ 수용체의 결합 친화성을 결정하기 위해 사용된다. 25℃라는 온도는 본 발명의 태양의 비한정의 일례이다.

본 명세서에 있어서, Fc영역의 인간 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa 및/또는 FcγRIIIb 중 어느 하나의 인간 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 이들 인간 Fcγ 수용체에 대한 인간 IgG의 Fc영역의 결합 활성보다도 높다는 것은, 예를 들면 상기 해석방법을 토대로 대조로 하는 인간 IgG의 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자의 결합 활성에 비교하여 피검 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자의 결합 활성이 105% 이상, 바람직하게는 110% 이상, 120% 이상, 130% 이상, 140% 이상, 특히 바람직하게는 150% 이상, 160% 이상, 170% 이상, 180% 이상, 190% 이상, 200% 이상, 250% 이상, 300% 이상, 350% 이상, 400% 이상, 450% 이상, 500% 이상, 750% 이상, 10배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 40배 이상, 50배 이상의 결합 활성을 나타내는 것을 말한다.

Fc영역의 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 Fcγ 수용체에 대한 천연형 Fc영역의 결합 활성보다도 높은 Fc영역은 천연형 Fc영역의 아미노산을 개변함으로써 제작될 수 있다. 여기서 말하는 천연형 Fc영역이란, EU 넘버링 297번 위치의 당쇄가 푸코오스 결합형의 복합형 당쇄인 천연형 Fc영역을 가리킨다. Fc영역의 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 천연형 Fc영역의 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성보다 높은지 여부는 상기 결합 활성 항목에서 기재된 방법을 사용하여 적당히 실시될 수 있다.

본 발명에 있어서 Fc영역의 「아미노산의 개변」 또는 「아미노산 개변」이란 출발 Fc영역의 아미노산 서열과는 상이한 아미노산 서열로 개변하는 것을 포함한다. 출발 Fc영역의 수식 개변체가 pH 중성역에 있어서 인간 Fcγ 수용체에 결합할 수 있는 한, 어느 Fc영역도 출발 도메인으로서 사용될 수 있다. 출발 Fc영역의 예로서는 인간 IgG 항체의 Fc영역, 즉 EU 넘버링 297번 위치의 당쇄가 푸코오스 결합형의 복합형 당쇄인 천연형의 Fc영역을 바람직하게 들 수 있다. 또한 이미 개변이 가해진 Fc영역을 출발 Fc영역으로 하고 추가적인 개변이 가해진 Fc영역도 본 발명의 Fc영역으로서 적합하게 사용될 수 있다. 출발 Fc영역이란 폴리펩티드 그 자체, 출발 Fc영역을 포함하는 조성물, 또는 출발 Fc영역을 코드하는 아미노산 서열을 의미할 수 있다. 출발 Fc영역에는 항체의 항목에서 개설된 재조합에 의해 생산된 공지의 IgG 항체의 Fc영역이 포함될 수 있다. 출발 Fc영역의 기원은 한정되지 않지만 비인간 동물의 임의의 생물 또는 인간으로부터 취득될 수 있다. 바람직하게는 임의의 생물로서는 마우스, 랫트, 기니피그, 햄스터, 황무지쥐, 고양이, 토끼, 개, 염소, 양, 소, 말, 낙타 및 비인간 영장류로부터 선택되는 생물을 바람직하게 들 수 있다. 다른 태양에 있어서 출발 Fc영역은 또한 게잡이원숭이, 마모셋, 빨간털원숭이, 침팬지 또는 인간으로부터 취득될 수 있다. 바람직하게는 출발 Fc영역은 인간 IgG1으로부터 취득될 수 있지만, IgG의 특정 클래스에 한정되는 것도 아니다. 이는 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 Fc영역을 출발 Fc영역으로서 적당히 사용할 수 있는 것을 의미한다. 마찬가지로, 본 명세서에 있어서 상기 임의의 생물로부터의 IgG의 임의의 클래스 또는 서브클래스의 Fc영역을 바람직하게는 출발 Fc영역으로서 사용할 수 있는 것을 의미한다. 천연에 존재하는 IgG의 변이체 또는 조작된 유형의 예는 공지의 문헌(Curr. Opin. Biotechnol. (2009) 20 (6), 685-91, Curr. Opin. Immunol. (2008) 20 (4), 460-470, Protein Eng. Des. Sel. (2010) 23 (4), 195-202, WO2009/086320, WO2008/092117, WO2007/041635 및 WO2006/105338)에 기재되지만 그들에 한정되지 않는다.

개변의 예로서는 하나 이상의 변이, 예를 들면 출발 Fc영역의 아미노산과는 상이한 아미노산 잔기로 치환된 변이, 또는 출발 Fc영역의 아미노산에 대해 하나 이상의 아미노산 잔기의 삽입 또는 출발 Fc영역의 아미노산으로부터 하나 이상의 아미노산의 결실 등이 포함된다. 바람직하게는 개변 후의 Fc영역의 아미노산 서열에는 천연으로 생기지 않는 Fc영역의 부분을 적어도 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 그러한 변종은 필연적으로 출발 Fc영역과 100% 미만의 서열 동일성 또는 유사성을 갖는다. 바람직한 실시형태에 있어서 변종은 출발 Fc영역의 아미노산 서열과 약 75%~100% 미만의 아미노산 서열 동일성 또는 유사성, 보다 바람직하게는 약 80%~100% 미만, 보다 바람직하게는 약 85%~100% 미만, 보다 바람직하게는 약 90%~100% 미만, 가장 바람직하게는 약 95%~100% 미만의 동일성 또는 유사성의 아미노산 서열을 갖는다. 본 발명의 비한정의 일태양에 있어서 출발 Fc영역 및 본 발명의 개변된 Fc영역 사이에는 하나 이상의 아미노산의 차가 있다. 출발 Fc영역과 개변 Fc영역의 아미노산의 차이는 특히 전술한 EU 넘버링으로 특정되는 아미노산 잔기 위치의 특정된 아미노산 차이로도 적합하게 특정 가능하다.

Fc영역의 아미노산의 개변을 위해서는 부위 특이적 변이 유발법(Kunkel등(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492))이나 Overlap extension PCR 등의 공지의 방법이 적당히 채용될 수 있다. 또한 천연의 아미노산 이외의 아미노산으로 치환하는 아미노산의 개변방법으로서 복수의 공지의 방법도 채용될 수 있다(Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (11), 6353-6357). 예를 들면 종지 코돈의 하나인 UAG 코돈(앰버 코돈)의 상보적 앰버 서프레서 tRNA에 비천연 아미노산이 결합된 tRNA가 포함되는 무세포 번역계 시스템(Clover Direct(Protein Express)) 등도 적합하게 사용된다.

본 발명의 항원 결합 분자에 포함되는 pH 중성역에 있어서의 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성을 갖는 Fc영역은 어떠한 방법으로도 취득될 수 있으나, 구체적으로는 출발 Fc영역으로서 사용되는 인간 IgG형 면역글로불린의 아미노산의 개변에 의해 pH 중성역에 있어서의 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성을 갖는 Fc영역이 취득될 수 있다. 개변을 위한 바람직한 IgG형 면역글로불린의 Fc영역으로서는, 예를 들면 인간 IgG(IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 및 그들의 개변체)의 Fc영역을 들 수 있다. 인간 IgG(IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 및 그들의 개변체)의 Fc영역의 적합한 예로서 인간 IgG(IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 및 그들의 개변체)의 Fc영역이 적합하게 사용될 수 있다. 이들 Fc영역의 구조를 서열번호：11(RefSeq 등록번호 AAC82527.1의 N말단에 A 부가), 12(RefSeq 등록번호 AAB59393.1의 N말단에 A 부가), 13(RefSeq 등록번호 CAA27268.1), 14(RefSeq 등록번호 AAB59394.1의 N말단에 A 부가)에 기재하였다. 또한 어떤 특정 아이소타입의 항체를 출발 Fc영역으로 하여 개변된 Fc영역을 갖는 항원 결합 분자를 피검물질로서 사용하는 경우에는 당해 특정 아이소타입의 IgG 단일클론항체의 Fc영역을 갖는 항원 결합 분자를 대조로서 사용함으로써, 당해 개변 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자에 의한 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성에 대한 효과가 검증된다. 상기와 같이 하여 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 높은 것이 검증된 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자가 적절히 선택된다.

다른 아미노산으로의 개변은 pH 중성역에 있어서의 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성을 갖거나 또는 중성역에 있어서의 Fcγ 수용체 결합에 대한 결합 활성을 높일 수 있는 한, 어떠한 위치의 아미노산도 개변될 수 있다. 항원 결합 분자가 인간 Fc영역으로서 인간 IgG1의 Fc영역을 포함하고 있는 경우, pH 중성역에 있어서의 Fcγ 수용체에 대한 결합이 인간 IgG1의 출발 Fc영역의 결합 활성보다 증강되는 효과를 초래하는 개변이 포함되어 있는 것이 바람직하다. pH 중성역의 조건하에서의 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성을 증강시키기 위한 아미노산 개변으로서는 예를 들면 WO2007/024249, WO2007/021841, WO2006/031370, WO2000/042072, WO2004/029207, WO2004/099249, WO2006/105338, WO2007/041635, WO2008/092117, WO2005/070963, WO2006/020114, WO2006/116260 및 WO2006/023403 등에 있어서 보고되어 있다.

그러한 개변이 가능한 아미노산으로서, 예를 들면 EU 넘버링으로 표시되는 221번 위치, 222번 위치, 223번 위치, 224번 위치, 225번 위치, 227번 위치, 228번 위치, 230번 위치, 231번 위치, 232번 위치, 233번 위치, 234번 위치, 235번 위치, 236번 위치, 237번 위치, 238번 위치, 239번 위치, 240번 위치, 241번 위치, 243번 위치, 244번 위치, 245번 위치, 246번 위치, 247번 위치, 249번 위치, 250번 위치, 251번 위치, 254번 위치, 255번 위치, 256번 위치, 258번 위치, 260번 위치, 262번 위치, 263번 위치, 264번 위치, 265번 위치, 266번 위치, 267번 위치, 268번 위치, 269번 위치, 270번 위치, 271번 위치, 272번 위치, 273번 위치, 274번 위치, 275번 위치, 276번 위치, 278번 위치, 279번 위치, 280번 위치, 281번 위치, 282번 위치, 283번 위치, 284번 위치, 285번 위치, 286번 위치, 288번 위치, 290번 위치, 291번 위치, 292번 위치, 293번 위치, 294번 위치, 295번 위치, 296번 위치, 297번 위치, 298번 위치, 299번 위치, 300번 위치, 301번 위치, 302번 위치, 303번 위치, 304번 위치, 305번 위치, 311번 위치, 313번 위치, 315번 위치, 317번 위치, 318번 위치, 320번 위치, 322번 위치, 323번 위치, 324번 위치, 325번 위치, 326번 위치, 327번 위치, 328번 위치, 329번 위치, 330번 위치, 331번 위치, 332번 위치, 333번 위치, 334번 위치, 335번 위치, 336번 위치, 337번 위치, 339번 위치, 376번 위치, 377번 위치, 378번 위치, 379번 위치, 380번 위치, 382번 위치, 385번 위치, 392번 위치, 396번 위치, 421번 위치, 427번 위치, 428번 위치, 429번 위치, 434번 위치, 436번 위치 및 440번 위치의 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산을 들 수 있다. 이들 아미노산의 개변에 의해 IgG형 면역글로불린의 Fc영역의 pH 중성역에 있어서의 Fcγ 수용체에 대한 결합이 증강된다.

본 발명에 사용하기 위해 특히 바람직한 개변으로서는 예를 들면 Fc영역의 EU 넘버링으로 표시되는；

221번 위치의 아미노산이 Lys 또는 Tyr 중 어느 하나,

222번 위치의 아미노산이 Phe, Trp, Glu 또는 Tyr 중 어느 하나,

223번 위치의 아미노산이 Phe, Trp, Glu 또는 Lys 중 어느 하나,

224번 위치의 아미노산이 Phe, Trp, Glu 또는 Tyr 중 어느 하나,

225번 위치의 아미노산이 Glu, Lys 또는 Trp 중 어느 하나,

227번 위치의 아미노산이 Glu, Gly, Lys 또는 Tyr 중 어느 하나,

228번 위치의 아미노산이 Glu, Gly, Lys 또는 Tyr 중 어느 하나,

230번 위치의 아미노산이 Ala, Glu, Gly 또는 Tyr 중 어느 하나,

232번 위치의 아미노산이 Glu, Gly, Lys 또는 Tyr 중 어느 하나,

240번 위치의 아미노산이 Ala, Ile, Met 또는 Thr 중 어느 하나,

244번 위치의 아미노산이 His,

245번 위치의 아미노산이 Ala,

246번 위치의 아미노산이 Asp, Glu, His 또는 Tyr 중 어느 하나,

249번 위치의 아미노산이 Glu, His, Gln 또는 Tyr 중 어느 하나,

250번 위치의 아미노산이 Glu 또는 Gln 중 어느 하나,

251번 위치의 아미노산이 Phe,

254번 위치의 아미노산이 Phe, Met 또는 Tyr 중 어느 하나,

255번 위치의 아미노산이 Glu, Leu 또는 Tyr 중 어느 하나,

256번 위치의 아미노산이 Ala, Met 또는 Pro 중 어느 하나,

260번 위치의 아미노산이 Asp, Glu, His 또는 Tyr 중 어느 하나,

263번 위치의 아미노산이 Ala, Ile, Met 또는 Thr 중 어느 하나,

266번 위치의 아미노산이 Ala, Ile, Met 또는 Thr 중 어느 하나,

273번 위치의 아미노산이 Phe 또는 Ile 중 어느 하나,

275번 위치의 아미노산이 Leu 또는 Trp 중 어느 하나,

279번 위치의 아미노산이 Ala,

281번 위치의 아미노산이 Asp, Lys, Pro 또는 Tyr 중 어느 하나,

286번 위치의 아미노산이 Glu, Gly, Pro 또는 Tyr 중 어느 하나,

288번 위치의 아미노산이 Asn, Asp, Glu 또는 Tyr 중 어느 하나,

301번 위치의 아미노산이 Asp, Glu, His 또는 Tyr 중 어느 하나,

302번 위치의 아미노산이 Ile,

303번 위치의 아미노산이 Asp, Gly 또는 Tyr 중 어느 하나,

305번 위치의 아미노산이 Glu, Ile, Thr 또는 Tyr 중 어느 하나,

313번 위치의 아미노산이 Phe,

315번 위치의 아미노산이 Leu,

317번 위치의 아미노산이 Glu 또는 Gln,

323번 위치의 아미노산이 Ile,

336번 위치의 아미노산이 Glu, Lys 또는 Tyr 중 어느 하나,

337번 위치의 아미노산이 Glu, His 또는 Asn 중 어느 하나,

376번 위치의 아미노산이 Ala 또는 Val 중 어느 하나,

377번 위치의 아미노산이 Gly 또는 Lys 중 어느 하나,

378번 위치의 아미노산이 Asp,

379번 위치의 아미노산이 Asn,

380번 위치의 아미노산이 Ala, Asn 또는 Ser 중 어느 하나,

382번 위치의 아미노산이 Ala 또는 Ile 중 어느 하나,

385번 위치의 아미노산이 Glu,

392번 위치의 아미노산이 Thr,

396번 위치의 아미노산이 Leu,

421번 위치의 아미노산이 Lys,

427번 위치의 아미노산이 Asn,

428번 위치의 아미노산이 Phe 또는 Leu 중 어느 하나,

429번 위치의 아미노산이 Met,

434번 위치의 아미노산이 Trp,

436번 위치의 아미노산이 Ile,

를 들 수 있다. 또한 개변되는 아미노산의 수는 특별히 한정되지 않고, 1개소만의 아미노산이 개변될 수 있고, 2개소 이상의 아미노산이 개변될 수 있다. 2개소 이상의 아미노산의 개변의 조합으로서는 예를 들면 표 6(표 6-1~표 6-3)에 기재되는 바와 같은 조합을 들 수 있다.

[표 6-1]

[표 6-2]

[표 6-3]

당쇄가 수식된 Fc영역

본 발명이 제공하는 Fc영역으로서, 당해 Fc영역에 결합한 당쇄의 조성이 푸코오스 결손 당쇄를 결합한 Fc영역의 비율이 높아지도록, 또는 바이섹팅 N-아세틸글루코사민이 부가된 Fc영역의 비율이 높아지도록 수식된 Fc영역도 포함될 수 있다. 항체 Fc영역에 결합하는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원말단의 N-아세틸글루코사민으로부터 푸코오스 잔기를 제거하면 FcγRIIIa에 대한 친화성이 증강되는 것이 알려져 있다(비특허문헌 20). 이러한 Fc영역을 포함하는 IgG1 항체는 후술하는 ADCC 활성이 증강되어 있는 것이 알려져 있는 것으로부터, 당해 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자는 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항원 결합 분자로서도 유용하다. 항체 Fc영역에 결합하는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원말단의 N-아세틸글루코사민으로부터 푸코오스 잔기가 제거된 항체로서는, 예를 들면 다음과 같은 항체；

글리코실화가 수식된 항체(WO1999/054342 등),

당쇄에 부가하는 푸코오스가 결손된 항체(WO2000/061739, WO2002/031140, WO2006/067913 등),

바이섹팅 GlcNAc를 갖는 당쇄를 갖는 항체(WO2002/079255 등)가 공지이다. 이들 항체의 제조방법은 본 발명의 Fc영역에 결합한 당쇄의 조성이 푸코오스 결손 당쇄를 결합한 Fc영역의 비율이 높아지도록, 또는 바이섹팅 N-아세틸글루코사민이 부가된 Fc영역의 비율이 높아지도록 수식된 개변 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자의 제조방법에도 적용하는 것이 가능하다.

항원 결합 분자

본 발명에 있어서 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인 및 pH 중성역의 조건하에서 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 FcRn 결합 도메인을 포함하는 분자를 나타내는 가장 광의의 의미로서 사용되고 있고, 구체적으로는 그들이 항원에 대한 결합 활성을 나타내는 한, 다양한 분자형이 포함된다. 예를 들면 항원 결합 도메인이 Fc영역과 결합한 분자의 예로서 항체를 들 수 있다. 항체에는 단일의 단일클론항체(아고니스트 및 안타고니스트 항체를 포함), 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체 등이 포함될 수 있다. 또한 항체의 단편으로서 사용되는 경우로서는 항원 결합 도메인 및 항원 결합 단편(예를 들면 Fab, F(ab')2, scFv 및 Fv)을 바람직하게 들 수 있다. 기존의 안정한 α/β 배럴 단백질 구조 등의 입체구조가 scaffold(토대)로서 사용되고, 그 일부분의 구조만이 항원 결합 도메인의 구축을 위해 라이브러리화된 스캐폴드 분자도 본 발명의 항원 결합 분자에 포함될 수 있다.

본 발명의 항원 결합 분자는 FcRn에 대한 결합 및 Fcγ 수용체에 대한 결합을 매개하는 Fc영역의 적어도 부분을 포함할 수 있다. 예를 들면 비한정의 일태양에 있어서 항원 결합 분자는 항체 또는 Fc 융합 단백질일 수 있다. 융합 단백질이란 천연으로는 그것이 자연히 연결되지 않는 제2 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 연결된 제1 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 키메라 폴리펩티드를 말한다. 예를 들면 융합 단백질은 Fc영역의 적어도 부분(예를 들면 FcRn에 대한 결합을 부여하는 Fc영역의 부분이나 Fcγ 수용체에 대한 결합을 부여하는 Fc영역의 부분)을 코드하는 아미노산 서열 및 예를 들면 수용체의 리간드 결합 도메인 또는 리간드의 수용체 결합 도메인을 코드하는 아미노산 서열을 포함하는 비면역글로불린 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 아미노산 서열은 함께 융합 단백질에 운반되는 각각의 단백질에 존재할 수 있거나 또는 그들은 통상은 동일 단백질에 존재할 수 있으나, 융합 폴리펩티드 중의 새로운 재편성에 넣어진다. 융합 단백질은 예를 들면 화학 합성에 의해 또는 펩티드영역이 목적하는 관계로 코드된 폴리뉴클레오티드를 제작하고, 그것을 발현하는 유전자 재조합의 수법에 의해 제작될 수 있다.

본 발명의 각 도메인은 폴리펩티드 결합에 의해 직접 연결될 수 있고 링커를 매개로 연결될 수 있다. 링커로서는 유전자 공학에 의해 도입할 수 있는 임의의 펩티드 링커 또는 합성 화합물 링커(예를 들면 Protein Engineering (1996) 9 (3), 299-305)에 개시되는 링커 등이 사용될 수 있으나 본 발명에 있어서는 펩티드 링커가 바람직하다. 펩티드 링커의 길이는 특별히 한정되지 않고 목적에 따라 당업자가 적당히 선택하는 것이 가능하나, 바람직한 길이는 5 아미노산 이상(상한은 특별히 한정되지 않으나 통상 30 아미노산 이하, 바람직하게는 20 아미노산 이하)이고, 특히 바람직하게는 15 아미노산이다.

예를 들면 펩티드 링커의 경우：

Ser

Gly·Ser

Gly·Gly·Ser

Ser·Gly·Gly

Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호：29)

Ser·Gly·Gly·Gly(서열번호：30)

Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호：31)

Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(서열번호：32)

Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호：33)

Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(서열번호：34)

Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호：35)

Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(서열번호：36)

(Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호：31))n

(Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(서열번호：32))n

［n은 1 이상의 정수이다］등을 바람직하게 들 수 있다. 단, 펩티드 링커의 길이나 서열은 목적에 따라 당업자가 적당히 선택할 수 있다.

합성 화합물 링커(화학 가교제)는 펩티드의 가교에 통상 사용되고 있는 가교제, 예를 들면 N-히드록시숙신이미드(NHS), 디숙신이미딜수베레이트(DSS), 비스(설포숙신이미딜)수베레이트(BS3), 디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)(DSP), 디티오비스(설포숙신이미딜프로피오네이트)(DTSSP), 에틸렌글리콜비스(숙신이미딜숙시네이트)(EGS), 에틸렌글리콜비스(설포숙신이미딜숙시네이트)(설포-EGS), 디숙신이미딜 타르타르산염(DST), 디설포숙신이미딜 타르타르산염(설포-DST), 비스［2-(숙신이미도옥시카르보닐옥시)에틸］설폰(BSOCOES), 비스［2-(설포숙신이미도옥시카르보닐옥시)에틸］설폰(설포-BSOCOES) 등이고, 이들 가교제는 시판되고 있다.

각 도메인을 연결하는 링커가 복수 사용되는 경우에는 모두 동종의 링커가 사용될 수 있고, 이종의 링커도 사용될 수 있다.

또한 상기 기재에서 예시되는 링커 외에, 예를 들면 His 태그, HA 태그, myc 태그, FLAG 태그 등의 펩티드 태그를 갖는 링커도 적당히 사용될 수 있다. 또한 수소 결합, 디설피드 결합, 공유 결합, 이온성 상호작용 또는 이들 결합의 조합에 의해 서로 결합하는 성질도 또한 적합하게 이용될 수 있다. 예를 들면 항체의 CH1과 CL 간의 친화성이 이용되거나, 헤테로 Fc영역의 회합시에 전술한 이중 특이성 항체를 기원으로 하는 Fc영역이 사용되거나 한다. 또한 도메인 간에 형성되는 디설피드 결합도 또한 적합하게 이용될 수 있다.

각 도메인을 펩티드 결합으로 연결하기 위해 당해 도메인을 코드하는 폴리뉴클레오티드가 인프레임으로 연결된다. 폴리뉴클레오티드를 인프레임으로 연결하는 방법으로서는 제한 단편의 라이게이션이나 퓨젼 PCR, 오버랩 PCR 등의 수법이 공지이며, 본 발명의 항원 결합 분자의 제작에도 적당히 이들 방법이 단독 또는 조합으로 사용될 수 있다. 본 발명에서는 용어 「연결되고」, 「융합되고」, 「연결」 또는 「융합」은 상호 교환적으로 사용된다. 이들 용어는 상기 화학 결합 수단 또는 재조합 수법을 포함한 모든 수단에 의해 둘 이상의 폴리펩티드 등의 엘리먼트 또는 성분을 하나의 구조를 형성하도록 연결하는 것을 말한다. 인프레임으로 융합한다는 것은, 둘 이상의 엘리먼트 또는 성분이 폴리펩티드인 경우에, 당해 폴리펩티드의 바른 리딩 프레임을 유지하도록 연속한 보다 긴 리딩 프레임을 형성하기 위한 둘 이상의 리딩 프레임의 단위의 연결을 말한다. 2분자의 Fab가 항원 결합 도메인로서 사용된 경우, 당해 항원 결합 도메인과 Fc영역이 링커를 매개로 하지 않고 펩티드 결합에 의해 인프레임으로 연결된 본 발명의 항원 결합 분자인 항체는 본 출원의 적합한 항원 결합 분자로서 사용될 수 있다.

중화 활성

본 발명의 일태양에서는 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인, 및 pH 중성역에 있어서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 FcRn 결합 도메인을 포함하며, 항원에 대한 중화 활성을 갖는 항원 결합 분자를 유효성분으로서 포함하는 면역응답을 유도하는 의약 조성물이 제공된다. 일반적으로 중화 활성이란 바이러스나 독소 등 세포에 대해 생물학적 활성을 갖는 리간드의 당해 생물학적 활성을 저해하는 활성을 말한다. 즉 중화 활성을 갖는 물질이란 당해 리간드 또는 당해 리간드가 결합하는 수용체에 결합하여 당해 리간드와 수용체의 결합을 저해하는 물질을 가리킨다. 중화 활성에 의해 리간드와의 결합이 저지된 수용체는 당해 수용체를 통한 생물학적 활성을 발휘할 수 없게 된다. 항원 결합 분자가 항체인 경우, 이러한 중화 활성을 갖는 항체는 일반적으로 중화 항체라 불린다. 어떤 피검물질의 중화 활성은 리간드의 존재하에 있어서의 생물학적 활성을 그 피검물질의 존재 또는 비존재하의 조건 사이에서 비교함으로써 측정될 수 있다.

예를 들면 IL-6 수용체의 주요한 리간드로서 생각되고 있는 것은 서열번호：37로 표시되는 IL-6을 바람직하게 들 수 있다. 그 아미노 말단이 세포외 도메인을 형성하는 I형 막단백질인 IL-6 수용체는 IL-6에 의해 이량체화가 유도된 gp130 수용체와 함께 헤테로 4량체를 형성한다(HEINRICH등(Biochem. J. (1998) 334, 297-314)). 당해 헤테로 4량체의 형성에 의해 gp130 수용체에 회합되어 있는 Jak가 활성화된다. Jak는 자기 인산화와 수용체의 인산화를 행한다. 수용체 및 Jak의 인산화 부위는 Stat3와 같은 SH2를 갖는 Stat 패밀리에 속하는 분자나 MAP 키나아제, PI3/Akt, 그 밖의 SH2를 갖는 단백질이나 어댑터에 대해 결합 부위의 역할을 한다. 다음으로 gp130 수용체에 결합한 Stat가 Jak에 의해 인산화. 인산화된 Stat는 이량체를 형성하여 핵내로 이행하고, 표적 유전자의 전사를 조절한다. Jak 또는 Stat는 다른 클래스의 수용체를 매개로 시그날 캐스케이드에 관여하는 것도 가능하다. 탈제어된 IL-6의 시그날 캐스케이드는 자기면역질환의 병태나 염증, 다발성 골수종이나 전립선암 등의 암에서 관찰된다. 암유전자로서 작용할 수 있는 Stat3는 많은 암에 있어서 항상적으로 활성화되어 있다. 전립선암과 다발성 골수종에서는 IL-6 수용체로부터의 시그날 캐스케이드와 상피 성장인자 수용체(EGFR) 패밀리 멤버로부터의 시그날 캐스케이드 사이에 크로스톡(crosstalk)이 있다(Ishikawa등(J. Clin. Exp. Hematopathol. (2006) 46 (2), 55-66)).

이러한 세포내의 시그날 캐스케이드는 세포종별로 상이하기 때문에 목적으로 하는 표적 세포별로 적당히 표적 분자를 설정할 수 있고, 상기 인자에 한정되는 것은 아니다. 생체내 시그날의 활성화를 측정함으로써 중화 활성을 평가할 수 있다. 또한 생체내 시그날 캐스케이드의 하류에 존재하는 표적 유전자에 대한 전사 유도작용을 지표로 하여 생체내 시그날의 활성화를 검출하는 것도 가능하다. 표적 유전자의 전사활성의 변화는 리포터 어세이의 원리에 의해 검출할 수 있다. 구체적으로는 표적 유전자의 전사인자 또는 프로모터영역의 하류에 GFP(Green Fluorescence Protein)나 루시페라아제 등의 리포터 유전자를 배치하고, 그 리포터 활성을 측정함으로써 전사활성의 변화를 리포터 활성으로서 측정할 수 있다. 생체내 시그날의 활성화의 측정 키트는 시판의 것을 적당히 사용할 수 있다(예를 들면 Mercury Pathway Profiling Luciferase System(Clontech) 등).

또한 통상은 세포증식을 촉진시키는 방향으로 작용하는 시그날 캐스케이드에 작용하는 EGF 수용체 패밀리 등의 수용체 리간드의 중화 활성을 측정하는 방법으로서 표적으로 하는 세포의 증식활성을 측정함으로써 중화 항체의 중화 활성을 평가할 수 있다. 예를 들면 HB-EGF 등 그 증식이 EGF 패밀리의 성장인자에 의해 촉진되는 세포의 증식에 대한 항HB-EGF 항체의 중화 활성에 기초하는 억제효과를 평가 또는 측정하는 방법으로서 아래의 방법이 적합하게 사용된다. 시험관 내에 있어서 그 세포증식 억제활성을 평가 또는 측정하는 방법으로서는, 배지 중에 첨가한 [³H] 라벨한 티미딘의 생세포에 의한 흡수를 DNA 복제능력의 지표로서 측정하는 방법이 사용된다. 보다 간편한 방법으로서 트리판 블루 등의 색소를 세포외로 배제하는 능력을 현미경하에서 계측하는 색소 배제법이나 MTT법이 사용된다. 후자는 생세포가 테트라졸륨염인 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)를 청색의 포르마잔 산물로 전환하는 능력을 갖는 것을 이용하고 있다. 보다 구체적으로는 피검세포의 배양액에 리간드와 함께 피검항체를 첨가하여 일정 시간을 경과한 후에 MTT 용액을 배양액에 첨가하고 일정 시간 정치함으로써 MTT를 세포에 흡수시킨다. 그 결과, 황색의 화합물인 MTT가 세포내의 미토콘드리아 내의 숙신산 탈수소효소에 의해 청색의 화합물로 변환된다. 이 청색 생성물을 용해하여 정색(呈色)시킨 후에 그 흡광도를 측정함으로써 생세포 수의 지표로 하는 것이다. MTT 이외에 MTS, XTT, WST-1, WST-8 등의 시약도 시판되고 있어(nacalai tesque 등) 적합하게 사용할 수 있다. 활성의 측정시에는 대조 항체로서 항HB-EGF 항체와 동일한 아이소타입을 갖는 항체로 그 세포증식 억제활성을 갖지 않는 결합 항체를 항HB-EGF 항체와 동일하게 사용하여, 항HB-EGF 항체가 대조 항체보다도 강한 세포증식 억제활성을 나타냄으로써 활성을 판정할 수 있다.

활성을 평가하기 위한 세포로서 예를 들면 그 증식이 HB-EGF에 의해 촉진되는 세포인, 난소암 세포인 RMG-1 세포주나 인간 EGFR의 세포외 도메인과 마우스 GCSF 수용체의 세포내 도메인을 인프레임으로 융합한 융합 단백질인 hEGFR/mG-CSFR을 코드하는 유전자를 발현하도록 결합한 벡터에 의해 형질전환된 마우스 Ba/F3 세포 등도 적합하게 사용될 수 있다. 이와 같이 당업자는 활성을 평가하기 위한 세포를 적당히 선택함으로써 상기 세포증식 활성의 측정에 사용하는 것이 가능하다.

세포상해활성

본 발명의 일태양에서는, 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인 및 pH 중성역에 있어서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 FcRn 결합 도메인을 포함하고, 항원을 발현하는 세포에 대한 세포상해활성을 갖는 항원 결합 분자를 유효성분으로서 포함하는 면역응답을 유도하는 의약 조성물이 제공된다. 본 발명에 있어서 세포상해활성이란, 예를 들면 항체 의존성 세포 개재성 세포상해(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity：ADCC) 활성, 보체 의존성 세포상해(complement-dependent cytotoxicity：CDC) 활성 등을 들 수 있다. 본 발명에 있어서 CDC 활성이란 보체계에 의한 세포상해활성을 의미한다. 한편 ADCC 활성이란 항원을 발현하는 세포의 표면 항원에 특이적 항원 결합 분자가 부착되었을 때, 그 Fc 부분에 Fcγ 수용체를 발현하는 세포(면역세포 등)가 Fcγ 수용체를 매개로 결합하여 표적 세포에 상해를 주는 활성을 의미한다. 목적의 항원 결합 분자가 ADCC 활성을 갖는지 여부 또는 CDC 활성을 갖는지 여부는 공지의 방법에 의해 측정될 수 있다(예를 들면, Current protocols in Immunology, Chapter7. Immunologic studies in humans, Coligan 등 편(1993) 등).

구체적으로는 먼저 이펙터 세포, 보체 용액, 표적 세포의 조제가 실시된다.

(1) 이펙터 세포의 조제

CBA/N 마우스 등으로부터 적출된 비장으로부터 RPMI1640 배지(Invitrogen) 중에서 비장세포가 분리된다. 10% 소태아혈청(FBS, HyClone)을 포함하는 동 배지로 세정된 당해 비장세포의 농도를 5×10⁶/㎖로 조정함으로써 이펙터 세포가 제조될 수 있다.

(2) 보체 용액의 조제

10% FBS 함유 배지(Invitrogen)에 의해 Baby Rabbit Complement(CEDARLANE)를 10배로 희석함으로써 보체 용액이 조제될 수 있다.

(3) 표적 세포의 조제

항원을 발현하는 세포를 0.2 mCi의 ⁵¹Cr-크롬산나트륨(GE 헬스케어 바이오사이언스)과 함께 10% FBS 함유 DMEM 배지 중 37℃에서 1시간 배양함으로써 그 표적 세포가 방사성 표지될 수 있다. 방사성 표지 후, 10% FBS 함유 RPMI1640 배지로 3회 세정된 세포의 농도를 2×10⁵/㎖로 조정함으로써 당해 표적 세포가 조제될 수 있다.

ADCC 활성 또는 CDC 활성은 하기에 기술하는 방법에 의해 측정될 수 있다. ADCC 활성 측정의 경우는 96웰 U 바닥 플레이트(Becton Dickinson)에 첨가된 각 50 ㎕씩의 표적 세포와 항원 결합 분자가 빙상에서 15분간 반응된다. 그 후, 이펙터 세포 100 ㎕가 첨가된 당해 플레이트가 탄산가스 인큐베이터 내에서 4시간 정치된다. 항체의 최종 농도는 예를 들면 0 또는 10 ㎍/㎖ 등의 농도가 설정될 수 있다. 정치 후, 각 웰로부터 회수된 100 ㎕의 상청의 방사활성이 감마 카운터(COBRAII AUTO-GAMMA, MODEL D5005, Packard Instrument Company)를 사용해서 측정된다. 측정값을 사용하여 세포상해활성(%)이 (A-C)/(B-C)×100의 계산식을 토대로 계산될 수 있다. A는 각 시료에 있어서의 방사활성(cpm), B는 1% NP-40(nacalai tesque)을 첨가한 시료에 있어서의 방사활성(cpm), C는 표적 세포만을 포함하는 시료의 방사활성(cpm)을 나타낸다.

한편 CDC 활성 측정의 경우는 96웰 평평한 바닥 플레이트(Becton Dickinson)에 첨가된 각 50 ㎕씩의 표적 세포와 항원 결합 분자가 빙상에서 15분간 반응된다. 그 후, 보체 용액 100 ㎕가 첨가된 당해 플레이트가 탄산가스 인큐베이터 내에서 4시간 정치된다. 항체의 최종 농도는 예를 들면 0 또는 3 ㎍/㎖ 등의 농도가 설정될 수 있다. 정치 후, 각 웰로부터 회수된 100 ㎕의 상청의 방사활성이 감마 카운터를 사용해서 측정된다. 세포상해활성은 ADCC 활성의 측정과 동일하게 계산될 수 있다.

면역응답

본 발명의 비한정의 일태양에 있어서, 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인 및 pH 중성역에 있어서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 FcRn 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자를 유효성분으로서 포함하는 상기 항원에 대한 면역응답을 유도하는 의약 조성물이 제공된다.

면역응답이 유도되었는지 여부는 항원 결합 분자를 유효성분으로서 포함하는 상기 항원에 대한 면역응답을 유도하는 의약 조성물이 투여된 생체의 응답반응을 측정함으로써 평가될 수 있다. 생체의 응답반응으로서는 주로 세포성 면역(MHC 클래스 I에 결합한 항원의 펩티드 단편을 인식하는 세포상해성 T세포의 유도)과 액성 면역(항원에 결합하는 항체 생산의 유도)의 2개의 면역응답을 들 수 있다. 액성 면역의 유도(면역응답)를 평가하는 방법으로서는 in vivo에서 항원에 대한 항체 생산을 평가하는 방법을 들 수 있다.

본 발명의 면역응답을 유도하는 의약 조성물에 의해 액성 면역이 유도되었는지 여부는 당해 의약 조성물이 투여된 생체로부터 해리된 말초혈에 있어서의 당해 의약 조성물에 포함되는 항원 결합 분자의 표적이 되는 항원에 대한 당해 생체 유래 항체의 검출에 의해 평가될 수 있다. 항원에 대한 항체가의 측정법은 당업자 공지의 ELISA, ECL, SPR을 사용한 투여 분자에 대해 특이적으로 결합하는 분자의 측정방법을 응용함으로써 실시 가능하다(J Pharm Biomed Anal. 2011 Jul 15;55(5):878-88).

본 발명의 면역응답을 유도하는 의약 조성물에 의해 세포성 면역이 획득되었는지 여부는 당해 의약 조성물이 투여된 생체로부터 해리된 말초혈에 있어서의 당해 의약 조성물에 포함되는 항원 결합 분자의 표적이 되는 항원에 특이적인 CD8을 발현하는 메메모리형의 표현형을 갖는 T세포 서브세트의 검출에 의해 평가될 수 있다. CD8을 발현하는 세포인 메모리형의 표현형을 갖는 집단은 헤테로 세포집단이다. 즉, 항원에 응답하여 급속히 분열되는 센트럴 메모리 세포와 세포상해 등의 이펙터 기능의 기억을 나타내는 이펙터 메모리 세포를 포함한다. 이들 서브세트는 상호 배타적이지 않다. 즉 세포는 급속히 분열하는 것도 가능하나, 항원을 제시하는 표적 세포를 상해하는 것도 가능하다. 이러한 항원 특이적인 CD8을 발현하는 세포인 메모리형의 표현형을 갖는 T세포의 서브세트가 확대 배양된 결과 생산되는 사이토카인의 검출 키트(Cytokine Secretion Assay-Cell Enrichment and Detection Kit(Miltenyi　Biotec))가 시판되고 있는 동시에, 이러한 항원 특이적인 당해 집단을 단리하기 위한 프로토콜이 제공되어 있다. 이러한 키트를 사용함으로써 항원 특이적인 센트럴 메모리 세포와 이펙터 메모리 T세포의 양자가 효율적으로 시험관 내에 있어서 증식될 수 있다. 이들 T세포의 서브세트의 증식을 자극하는 것이 가능한 항원 제시 세포는 상기 면역응답을 유도하는 의약 조성물이 투여된 생체로부터 취득된 말초혈로부터 단리될 수 있다. 또한 항원에 의해 펄스된 수상세포나 항원에 의해 트랜스펙트된 수상세포(Overes 등(J. Immunother. (2009) 32, 539-551))가 항원 제시 세포로서 사용될 수 있다.

의약 조성물

다른 관점에 있어서는 본 발명은 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인 및 pH 중성역에 있어서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 FcRn 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자를 유효성분으로서 포함하는 상기 항원에 대한 면역응답을 유도하는 의약 조성물을 제공한다. 또한 본 발명의 다른 하나의 태양에서는, 당해 항원 결합 분자를 유효성분으로서 포함하는 상기 항원에 대한 면역응답을 유도하는 세포증식 억제제 또는 항암제에 관한 것이다. 본 발명의 의약 조성물, 세포증식 억제제 또는 항암제는 외래성 생물종의 감염증 또는 암을 앓고 있는 대상 또는 재발할 가능성이 있는 대상에게 투여되는 것이 바람직하다.

또한 본 발명의 일태양에 있어서, 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인 및 pH 중성역의 조건하에서 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 FcRn 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자를 유효성분으로서 포함하는 상기 항원에 대한 면역응답을 유도하는 의약 조성물, 세포증식 억제제 또는 항암제는 당해 의약 조성물, 세포증식 억제제 또는 항암제의 제조에 있어서의 당해 항원 결합 분자의 사용으로 표현하는 것도 가능하다.

또한 본 발명의 다른 태양에 있어서, 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인 및 pH 중성역의 조건하에서 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 FcRn 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자를 유효성분으로서 포함하는 의약 조성물, 세포증식 억제제 및 항암제를 투여하는 공정을 포함하는 상기 항원에 대한 면역응답을 유도하는 방법으로 표현하는 것도 가능하다.

또한 본 발명의 다른 태양에 있어서, 항원에 대한 면역응답의 유도에 있어서 사용하기 위한 이온 농도의 조건에 따라 상기 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인 및 pH 중성역의 조건하에서 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 FcRn 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자로 표현하는 것도 가능하다.

또한 본 발명의 다른 태양에 있어서, 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인 및 pH 중성역의 조건하에서 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 FcRn 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자를 사용하는 단계를 포함하는 상기 항원에 대한 면역응답을 유도하는 의약 조성물, 세포증식 억제제 및 항암제를 제조하기 위한 프로세스로 표현하는 것도 가능하다.

본 발명에 있어서 「이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인 및 pH 중성역의 조건하에서 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 FcRn 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자를 유효성분으로서 포함한다」는 것은, 당해 항원 결합 분자를 주요한 활성 성분으로서 포함한다는 의미이고, 당해 항원 결합 분자의 함유율을 제한하는 것은 아니다. 또한 항원을 결합하지 않는 항원 결합 분자 외에 항원을 사전에 결합한 항원 결합 분자를 유효성분으로서 포함하는 당해 항원에 대한 면역응답을 유도하는 의약 조성물, 세포증식 억제제 및 항암제가 본 발명에 의해 제공될 수 있고, 항원을 결합하지 않는 항원 결합 분자 외에 항원을 사전에 결합한 항원 결합 분자를 투여하는 것을 포함하는 항원에 대한 면역응답을 유도하는 방법도 본 발명에 의해 제공된다.

또한 본 발명에 있어서의 의약 조성물, 세포증식 억제제 또는 항암제에는 필요에 따라 복수 종류의 항원 결합 분자가 배합될 수 있다. 예를 들면 동일 항원에 결합하는 복수의 본 발명의 항원 결합 분자의 칵테일로 함으로써, 당해 항원을 발현하는 세포에 대한 면역응답의 유도작용이나 세포상해활성 또는 중화활성을 강화하는 결과, 당해 항원을 발현하는 세포를 병인으로 하는 질병에 대한 치료효과를 높일 가능성이 있다. 또는 치료의 대상으로 하는 질환의 병인이 되는 세포가 발현되는 어떤 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 본 발명의 항원 결합 분자에 더하여, 동일한 질환의 병인이 되는 세포가 발현하는 다른 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 본 발명의 항원 결합 분자가 배합된 본 발명의 의약 조성물, 세포증식 억제제 또는 항암제를 투여함으로써 당해 질환의 치료효과가 높아진다.

또한 필요에 따라 본 발명의 의약 조성물, 세포증식 억제제 또는 항암제는 마이크로캡슐(히드록시메틸셀룰로오스, 젤라틴, 폴리［메틸메타크릴산］등의 마이크로캡슐)에 봉입되어, 콜로이드 드러그 딜리버리 시스템(리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐 등)으로 될 수 있다("Remington's Pharmaceutical Science 16th edition", Oslo Ed. (1980) 등 참조). 또한 약제를 서방성의 약제로 하는 방법도 공지로, 당해 방법은 본 발명의 의약 조성물, 세포증식 억제제 또는 항암제에 적용될 수 있다(J.Biomed.Mater.Res. (1981) 15, 267-277, Chemtech. (1982) 12, 98-105, 미국특허 제3773719호, 유럽특허 공개공보 EP58481호·EP133988호, Biopolymers (1983) 22, 547-556).

본 발명의 의약 조성물, 세포증식 억제제 또는 항암제는 경구, 비경구 투여 중 어느 하나에 의해 환자에게 투여할 수 있다. 바람직하게는 비경구 투여이다. 이러한 투여방법으로서는 구체적으로는 주사 투여, 경비 투여, 경폐 투여, 경피 투여 등을 들 수 있다. 주사 투여의 예로서는 예를 들면, 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하 주사 등에 의해 본 발명의 의약 조성물, 세포증식 억제제 또는 항암제를 전신 또는 국부적으로 투여할 수 있다. 또한 환자의 연령, 증상에 따라 적당히 투여 방법을 선택할 수 있다. 투여량으로서는 예를 들면, 1회의 투여에 대해 체중 1 ㎏당 0.0001 ㎎~1000 ㎎의 범위에서 투여량을 선택할 수 있다. 또는 예를 들면, 환자당 0.001 ㎎/body~100000 ㎎/body의 범위에서 투여량이 선택될 수 있다. 그러나 본 발명의 의약 조성물, 세포증식 억제제 또는 항암제는 이들 투여량에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 의약 조성물, 세포증식 억제제 또는 항암제는 통상의 방법에 따라 제제화할 수 있고(예를 들면, Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A), 의약적으로 허용되는 담체나 첨가물을 함께 포함하는 것이어도 된다. 예를 들면 계면활성제, 부형제, 착색료, 착향료, 보존료, 안정제, 완충제, 현탁제, 등장화제, 결합제, 붕괴제, 활택제, 유동성 촉진제, 교미제 등을 들 수 있다. 또한 이들에 제한되지 않고, 기타 상용의 담체를 적당히 사용할 수 있다. 구체적으로는 경질 무수 규산, 젖당, 결정 셀룰로오스, 만니톨, 전분, 카르멜로스 칼슘, 카르멜로스 나트륨, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 폴리비닐아세탈디에틸아미노아세테이트, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴, 중쇄 지방산 트리글리세리드, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 60, 백당, 카르복시메틸셀룰로오스, 콘스타치, 무기염류 등을 담체로서 들 수 있다.

또한 본 발명에 기재하는 아미노산 서열에 포함되는 아미노산은 번역 후에 수식(예를 들면 N말단의 글루타민의 피로글루타밀화에 의한 피로글루타민산으로의 수식은 당업자에게 잘 알려진 수식이다)을 받는 경우도 있는데, 그와 같이 아미노산이 번역 후 수식된 경우라도 당연히 본 발명에 기재하는 아미노산 서열에 포함된다.

의약 조성물의 제조방법

본 발명의 비한정의 일태양에서는, 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자에 포함되는 FcRn 결합 도메인에 pH 중성역의 조건하에서 FcRn에 대한 결합 활성을 부여하는 것을 포함하는 면역응답을 유도하는 항원 결합 분자의 제조방법이 제공된다.

본 발명의 제조방법에 있어서는, 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자에 포함되는 FcRn 결합 도메인의 pH 중성역의 조건하에서 FcRn에 대한 결합 활성이 약하거나 또는 확인되지 않는 경우에는, FcRn 결합 도메인에 대해 pH 중성역의 조건하에서 FcRn에 대한 결합 활성을 부여함으로써 본 발명의 항원 결합 분자를 창작하는 것이 가능하다.

예를 들면, FcRn 결합 도메인으로서 항FcRn 항체의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하는 항원 결합 도메인이 사용되는 경우에는, 상기 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인의 취득방법에 준하여 pH 중성역의 조건하에서 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 FcRn 결합 도메인을 취득하는 것이 가능하다. 또한 FcRn 결합 도메인으로서 pH 중성역의 조건하에서 FcRn에 대한 결합 활성이 약하거나 또는 확인되지 않는 Fc영역이 사용되는 경우에는, 항원 결합 분자에 포함되는 Fc영역의 아미노산을 개변함으로써 목적하는 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자가 취득될 수 있다. 그러한 목적하는 결합 활성을 초래하는 Fc영역의 아미노산 개변은 아미노산 개변 전과 개변 후의 pH 중성역에 있어서의 FcRn에 대한 결합 활성을 비교함으로써 발견될 수 있다. 상기 항원에 대한 결합 활성을 개변하기 위해 사용되는 수법과 동일한 부위 특이적 변이 유발법(Kunkel등(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492))이나 Overlap extension PCR 등의 공지의 방법을 사용하여 당업자는 적당히 아미노산의 개변을 실시할 수 있다.

본 발명의 항원 결합 분자에 포함되는 pH 중성역의 조건하에서 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 Fc영역은 어떠한 방법으로도 취득될 수 있으나, 구체적으로는 출발 Fc영역으로서 사용되는 인간 IgG형 면역글로불린의 아미노산 개변에 의해 pH 중성역의 조건하에서 FcRn에 대한 결합 활성을 갖거나 또는 증강된 FcRn 결합 도메인이 취득될 수 있다. 개변을 위한 바람직한 IgG형 면역글로불린의 Fc영역으로서는, 예를 들면 인간 IgG(IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 및 그들의 개변체)의 Fc영역을 들 수 있다. 다른 아미노산으로의 개변은 pH 중성역의 조건하에서 FcRn에 대한 결합 활성을 갖거나 또는 중성역의 조건하에서 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 높일 수 있는 한 어떠한 위치의 아미노산도 개변될 수 있다. 항원 결합 분자가 Fc영역으로서 인간 IgG1의 Fc영역을 포함하고 있는 경우, pH 중성역의 조건하에서 FcRn에 대한 결합이 인간 IgG1의 출발 Fc영역의 결합 활성보다 증강되는 효과를 초래하는 개변이 포함되어 있는 것이 바람직하다. pH 중성역 조건에 있어서의 FcRn에 대한 KD값은 상기와 같이 The Journal of Immunology (2009) 182: 7663-7671에 기재된 방법(항원 결합 분자를 칩에 고정하고 애널라이트로서 인간 FcRn을 흘린다)에 의해 결정된다.

개변을 위한 바람직한 IgG형 면역글로불린의 Fc영역으로서는, 예를 들면 인간 IgG(IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 및 그들의 개변체)의 Fc영역을 들 수 있다. 다른 아미노산으로의 개변은 pH 중성역의 조건하에서 FcRn에 대한 결합 활성을 갖거나 또는 중성역의 조건하에서 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 높일 수 있는 한 어떤 위치의 아미노산도 개변될 수 있다. 항원 결합 분자가 Fc영역으로서 인간 IgG1의 Fc영역을 포함하고 있는 경우, pH 중성역의 조건하에서 FcRn에 대한 결합이 인간 IgG1의 출발 Fc영역의 결합 활성보다 증강되는 효과를 초래하는 개변이 포함되어 있는 것이 바람직하다. 그러한 개변이 가해진 Fc영역으로서 상기 표 5에 예로 들어진 바와 같은 아미노산이 치환되어 pH 중성역에서의 결합 활성을 갖는 개변 Fc영역을 들 수 있다.

본 발명의 비한정의 일태양에서는, 아래 (a)~(f)의 공정,

(a) 고칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원 결합 도메인의 항원에 대한 결합 활성을 얻는 공정,

(d) (c)에서 선택된 항원 결합 도메인을 코드하는 폴리뉴클레오티드를, pH 중성역의 조건하에서 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 FcRn 결합 도메인을 코드하는 폴리뉴클레오티드에 연결시키는 공정,

을 포함하는 면역응답을 유도하는 의약 조성물의 제조방법이 제공된다.

　또한 본 발명의 다른 비한정의 일태양에서는, 아래 (a)~(f)의 공정,

(d) (c)에서 선택된 항체의 항원 결합 도메인을 코드하는 폴리뉴클레오티드를, pH 중성역의 조건하에서 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 FcRn 결합 도메인을 코드하는 폴리뉴클레오티드에 연결시키는 공정,

을 포함하는 면역응답을 유도하는 의약 조성물의 제조방법도 제공된다.

또한 본 발명의 비한정의 일태양에서는, 아래 (a)~(f)의 공정,

을 포함하는 항원 결합 분자의 제조방법이 제공된다.

(b) pH 산성역 조건에 있어서의 항체의 항원에 대한 항원 결합 활성을 얻는 공정,

을 포함하는 항원 결합 분자의 제조방법도 제공된다.

본 발명의 비한정의 일태양에 있어서의 항원 결합 도메인으로서는 항체 단편 라이브러리를 구성하는 복수의 항원 결합 도메인을 바람직하게 들 수 있다. 또한 본 발명의 비한정의 일태양에 있어서의 항체로서는 사전에 단일클론화된 1군의 항체 패널 등을 바람직하게 들 수 있다. 이들의 라이브러리나 항체의 제작방법은 전술한 항체의 항목에 기재되어 있다.

예를 들면, 본 발명의 비한정의 일태양인 고수소 이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 저수소 이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인을 얻는 공정으로서는, 아래의 공정(a)~(c)를 포함하는 항원 결합 도메인을 얻는 공정을 바람직하게 들 수 있다.

(a) pH 중성역 조건에 있어서의 항원 결합 도메인의 라이브러리를 항원에 접촉시키는 공정,

(b) 상기 공정(a)에서 항원에 결합한 항원 결합 도메인의 라이브러리를 pH 산성역의 조건에 두는 공정, 및

(c) 상기 공정(b)에서 해리된 항원 결합 도메인을 단리하는 공정.

예를 들면, 본 발명의 비한정의 일태양인, 저칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 고칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인을 얻는 공정으로서는, 아래의 공정(a)~(c)를 포함하는 항원 결합 도메인을 얻는 공정을 바람직하게 들 수 있다.

(a) 고칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원 결합 도메인의 라이브러리를 항원에 접촉시키는 공정,

(b) 상기 공정(a)에서 항원에 결합한 항원 결합 도메인의 라이브러리를 저칼슘 이온 농도의 조건에 두는 공정, 및

또한 본 발명의 비한정의 일태양인, 고수소 이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 저수소 이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인을 얻는 공정으로서는, 아래의 공정(a)~(c)를 포함하는 항원 결합 도메인을 얻는 공정을 바람직하게 들 수 있다.

(a) 항원을 고정한 칼럼에 pH 중성역의 조건에서 항원 결합 도메인의 라이브러리를 접촉시키는 공정,

(b) 상기 공정(a)에서 칼럼에 결합한 항원 결합 도메인을 pH 산성역의 조건에서 칼럼으로부터 용출하는 공정, 및

(c) 상기 공정(b)에서 용출된 항원 결합 도메인을 단리하는 공정.

또한 본 발명의 비한정의 일태양인, 저칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 고칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인을 얻는 공정으로서는, 아래의 공정(a)~(c)를 포함하는 항원 결합 도메인을 얻는 공정을 바람직하게 들 수 있다.

(a) 항원을 고정한 칼럼에 고칼슘 이온 농도의 조건에서 항원 결합 도메인의 라이브러리를 접촉시키는 공정,

(b) 상기 공정(a)에서 칼럼에 결합한 항원 결합 도메인을 저칼슘 이온 농도의 조건에서 칼럼으로부터 용출하는 공정, 및

또한 본 발명의 비한정의 일태양인, 고수소 이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 저수소 이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인을 얻는 공정으로서는, 아래의 공정(a)~(d)를 포함하는 항원 결합 도메인을 얻는 공정을 바람직하게 들 수 있다.

(a) 항원을 고정한 칼럼에 pH 산성역의 조건에서 항원 결합 도메인의 라이브러리를 통과시키는 공정,

(b) 상기 공정(a)에서 칼럼에 결합하지 않고 용출된 항원 결합 도메인을 회수하는 공정,

(c) 상기 공정(b)에서 회수된 항원 결합 도메인을 pH 중성역의 조건에서 항원에 결합시키는 공정, 및

(d) 상기 공정(c)에서 항원에 결합한 항원 결합 도메인을 단리하는 공정.

또한 본 발명의 비한정의 일태양인, 저칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 고칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인을 얻는 공정으로서는, 아래의 공정(a)~(d)를 포함하는 항원 결합 도메인을 얻는 공정을 바람직하게 들 수 있다.

(a) 항원을 고정한 칼럼에 저칼슘 이온 농도의 조건에서 항원 결합 도메인의 라이브러리를 통과시키는 공정,

(c) 상기 공정(b)에서 회수된 항원 결합 도메인을 고칼슘 이온 농도의 조건에서 항원에 결합시키는 공정, 및

예를 들면, 본 발명의 비한정의 일태양인, 고수소 이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 저수소 이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮은 항체를 얻는 공정으로서는, 아래의 공정(a)~(c)를 포함하는 항체를 얻는 공정을 바람직하게 들 수 있다.

(a) pH 산성역 조건에 있어서의 항체의 항원 결합 활성을 얻는 공정,

(b) pH 중성역 조건에 있어서의 항체의 항원 결합 활성을 얻는 공정, 및

(c) pH 산성역 조건에 있어서의 항원 결합 활성이 pH 중성역 조건에 있어서의 항원 결합 활성보다 낮은 항체를 선택하는 공정.

예를 들면, 본 발명의 비한정의 일태양인, 저칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 고칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮은 항체를 얻는 공정으로서는, 아래의 공정(a)~(c)를 포함하는 항체를 얻는 공정을 바람직하게 들 수 있다.

(a) 저칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항체의 항원 결합 활성을 얻는 공정,

(b) 고칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항체의 항원 결합 활성을 얻는 공정, 및

(c) 저칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원 결합 활성이 고칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원 결합 활성보다 낮은 항체를 선택하는 공정.

또한 본 발명의 비한정의 일태양인, 고수소 이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 저수소 이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮은 항체를 얻는 공정으로서는, 아래의 공정(a)~(d)를 포함하는 항체를 얻는 공정을 바람직하게 들 수 있다.

(a) pH 중성역의 조건에서 항체를 항원에 접촉시키는 공정,

(b) 상기 공정(a)에서 항원에 결합한 항체를 취득하는 공정,

(c) 상기 공정(b)에서 취득한 항체를 pH 산성역의 조건에 두는 공정, 및

(d) 상기 공정(c)에서 항원 결합 활성이 상기 공정(b)에서 선택한 기준보다 약한 항체를 선택하는 공정.

또한 본 발명의 비한정의 일태양인, 저칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 고칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮은 항체를 얻는 공정으로서는, 아래의 공정(a)~(d)를 포함하는 항체를 얻는 공정을 바람직하게 들 수 있다.

(a) 고칼슘 이온 농도의 조건에서 항체를 항원에 접촉시키는 공정,

(b) 상기 공정(a)에서 항원에 결합한 항체를 취득하는 공정,

(c) 상기 공정(b)에서 취득한 항체를 저칼슘 이온 농도의 조건에 두는 공정, 및

또한 상기 공정은 2회 이상 반복되어도 된다. 따라서 본 발명에 의해 전술한 스크리닝방법에 있어서 (a)~(c) 또는 (a)~(d)의 공정을 2회 이상 반복하는 공정을 추가로 포함하는 스크리닝방법에 의해 취득된 pH 산성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 pH 중성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인 또는 항체가 제공된다. (a)~(c) 또는 (a)~(d)의 공정이 반복되는 횟수는 특별히 한정되지 않으나 통상 10회 이내이다.

상기 공정에 있어서 고수소 이온 농도 조건 또는 저pH 즉 pH 산성역에 있어서의 항원 결합 도메인 또는 항체의 항원 결합 활성은 pH가 4.0~6.5 사이인 항원 결합 활성이라면 특별히 한정되지 않으나, 바람직한 pH로서 pH가 4.5~6.5 사이인 항원 결합 활성을 들 수 있다. 다른 바람직한 pH로서 pH가 5.0~6.5 사이인 항원 결합 활성, 또한 pH가 5.5~6.0 사이인 항원 결합 활성을 들 수 있다. 보다 바람직한 pH로서 생체내의 조기 엔도솜 내의 pH를 들 수 있고, 구체적으로는 pH 5.8에 있어서의 항원 결합 활성을 들 수 있다. 또한 저수소 이온 농도 조건 또는 고pH 즉 pH 중성역에 있어서의 항원 결합 도메인 또는 항체의 항원 결합 활성은 pH가 6.7~10 사이인 항원 결합 활성이라면 특별히 한정되지 않으나, 바람직한 pH로서 pH가 6.7~9.5 사이인 항원 결합 활성을 들 수 있다. 다른 바람직한 pH로서 pH가 7.0~9.5 사이인 항원 결합 활성, 또한 pH가 7.0~8.0 사이인 항원 결합 활성을 들 수 있다. 보다 바람직한 pH로서 생체내의 혈장 중에서의 pH를 들 수 있고, 구체적으로는 pH가 7.4에 있어서의 항원 결합 활성을 들 수 있다.

상기 공정에 있어서 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 도메인 또는 항체의 항원 결합 활성은 이온화 칼슘 농도가 0.1 μM~30 μM 사이인 항원 결합 활성이라면 특별히 한정되지 않으나, 바람직한 이온화 칼슘 농도로서 0.2 μM~20 μM 사이인 항원 결합 활성을 들 수 있다. 다른 일태양에서는 0.5 μM~10 μM 사이인 항원 결합 활성을 들 수 있다. 보다 바람직한 이온화 칼슘 농도로서 생체내의 조기 엔도솜 내의 이온화 칼슘 농도를 들 수 있고, 구체적으로는 1 μM~5 μM에 있어서의 항원 결합 활성을 들 수 있으며, 2 μM~4 μM에 있어서의 항원 결합 활성을 들 수 있다. 또한 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 도메인 또는 항체의 항원 결합 활성은 이온화 칼슘 농도가 100 μM~10 mM 사이인 항원 결합 활성이라면 특별히 한정되지 않으나, 바람직한 이온화 칼슘 농도로서 200 μM~5 mM 사이인 항원 결합 활성을 들 수 있다. 또한 다른 태양에서는 500 μM~2.5 mM 사이의 항원 결합 활성을 들 수도 있고, 다른 태양에서는 200 μM~2 mM 사이의 항원 결합 활성을 들 수 있다. 다른 일태양에서는 400 μM~1.5 mM 사이의 항원 결합 활성도 또한 들 수 있다. 보다 바람직한 이온화 칼슘 농도로서 생체내의 혈장 중에서의 이온화 칼슘 농도를 들 수 있고, 구체적으로는 0.5 mM~2.5 mM에 있어서의 항원 결합 활성을 들 수 있다.

pH 중성역의 조건하에서 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 FcRn 결합 도메인 및 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 EU 넘버링 297번 위치의 당쇄에 푸코오스가 결합된 천연형 Fc영역의 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성보다도 높은 개변 Fc영역, 및 당해 FcRn 결합 도메인 및 개변 Fc영역을 포함하는 Fc영역의 제조방법은 상기 FcRn 결합 도메인 및 FcRn 결합 도메인의 항목에 기재된 방법으로 취득된다. 각 도메인을 코드하는 폴리뉴클레오티드는 이 항목에 있어서 후술되는 바와 같이 공지의 유전자 재조합법으로 취득될 수 있다.

본 발명의 각 도메인은 폴리펩티드 결합에 의해 직접 연결될 수 있고, 링커를 매개로 연결될 수 있다. 링커로서는 유전자 공학에 의해 도입 가능한 임의의 펩티드 링커 또는 합성 화합물 링커(예를 들면, Protein Engineering (1996) 9 (3), 299-305)에 개시되는 링커 등이 사용될 수 있으나, 본 발명에 있어서는 펩티드 링커가 바람직하다. 펩티드 링커의 길이는 특별히 한정되지 않고 목적에 따라 당업자가 적당히 선택하는 것이 가능하나, 바람직한 길이는 5 아미노산 이상(상한은 특별히 한정되지 않으나 통상 30 아미노산 이하, 바람직하게는 20 아미노산 이하)이고, 특히 바람직하게는 15 아미노산이다.

예를 들면, 펩티드 링커의 경우：

Ser

Gly·Ser

Gly·Gly·Ser

Ser·Gly·Gly

Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호：29)

Ser·Gly·Gly·Gly(서열번호：30)

Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호：31)

Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(서열번호：32)

Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호：33)

Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(서열번호：34)

Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호：35)

Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(서열번호：36)

(Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호：31))n

(Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(서열번호：32))n

각 도메인을 펩티드 결합으로 연결하기 위해 당해 도메인을 코드하는 폴리뉴클레오티드가 인프레임으로 연결된다. 폴리뉴클레오티드를 인프레임으로 연결하는 방법으로서는 제한 단편의 라이게이션이나 퓨젼 PCR, 오버랩 PCR 등의 수법이 공지이며, 본 발명의 항원 결합 분자의 제작에도 적당히 이들 방법이 단독 또는 조합으로 사용될 수 있다.

각 도메인을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 단리하는 방법도 공지의 방법이 적당히 채용될 수 있다. 예를 들면, 복수의 항원 결합 도메인을 포함하는 라이브러리로부터 목적의 항원 결합 도메인을 제시하는 파지로부터, 라이브러리의 제작에 사용된 프라이머나 라이브러리의 구축에 사용된 파지 벡터의 서열을 갖는 프라이머 등을 사용하는 PCR에 의해 항원 결합 도메인을 코드하는 폴리뉴클레오티드 서열이 단리된다. 또한 항체의 가변영역을 코드하는 유전자를 취득하기 위해서는 가변영역 유전자 증폭용 프라이머를 사용한 5'-RACE법을 이용하는 것이 간편하다. 먼저 하이브리도마 세포로부터 추출된 RNA를 주형으로 하여 cDNA가 합성되고 5'-RACE cDNA 라이브러리가 얻어진다. 5'-RACE cDNA 라이브러리의 합성에는 SMART RACE cDNA 증폭 키트 등 시판의 키트가 적당히 사용된다.

상기와 같이 단리된 본 발명의 항원 결합 도메인 또는 항체의 폴리뉴클레오티드 서열이 결정된 후에, pH 중성역에 있어서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 FcRn 결합 도메인을 코드하는 폴리뉴클레오티드와 인프레임으로 연결된 융합 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드가 제작된다. 제작된 융합 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드는 목적하는 세포에서 발현되도록 적절한 발현 벡터에 작용 가능하게 연결된다.

「세포」, 「세포계」 및 「세포배양」은 본 명세서에서는 동일한 정의로 사용되고, 그러한 호칭에는 세포 또는 세포계의 모든 자손이 포함될 수 있다. 이와 같이, 예를 들면 「형질전환체」 및 「형질전환세포」와 같은 용어에는 계대 수에 관계 없이 그들에 유래하는 1차 대상 세포 및 배양물이 포함된다. 또한 고의 또는 우발적인 돌연변이에 의해 모든 자손에 있어서 DNA의 내용이 정확하게 동일하다는 것은 아닌 것도 또한 이해된다. 당초의 형질전환세포로 스크리닝된 실질적으로 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 변이체의 자손도 포함될 수 있다. 상이한 호칭을 의도하는 기재인 경우는 당해 기재의 전후관계로부터 그러한 의도는 명백해질 것이다.

코드 서열의 발현에 언급하는 경우의 제어 서열이란, 특정 숙주생물에서 작용 가능하게 연결한 코드 서열의 발현을 위해 필요한 DNA 염기서열을 말한다. 예를 들면 원핵생물에 적합한 제어 서열에는 프로모터, 경우에 따라서는 오퍼레이터 서열, 리보솜 결합 부위 및 어쩌면 아직 잘 이해되지 않은 다른 서열이 포함된다. 진핵세포의 경우는 코드 서열의 발현을 위해 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서를 이용하는 것이 공지이다.

핵산에 관하여 「작용 가능하게 연결했다」는 것은, 그 핵산이 다른 핵산서열과 기능적인 관계에 있는 것을 의미한다. 예를 들면 프리시퀀스(presequence) 또는 분비 리더의 DNA는 어떤 폴리펩티드의 분비에 관여하고 있는 전구체 단백질로서 발현하는 경우는, 그 폴리펩티드의 DNA와 작동 가능적으로 결합해 있다. 프로모터 또는 인핸서는 그것이 어떤 코드 서열의 전사에 영향을 미치는 경우는 그 서열과 작용 가능하게 연결되어 있다. 또는 리보솜 결합부는 그것이 번역을 용이하게 하는 위치에 있는 경우는 작용 가능하게 코드서열과 연결되어 있다. 통상 「작용 가능하게 연결되었다」는 것은, 결합한 DNA 서열이 연결되어 있어, 분비 리더의 경우는 연속해서 리딩 프레임 내에 있는 것을 의미한다. 그러나 인핸서는 연속할 필요는 없다. 연결은 적절한 제한부위에서 라이게이션에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 리간드가 종래의 관행에 따라 사용된다. 또한 상기 Overlap Extension PCR의 수법으로도 연결된 핵산이 제작될 수 있다.

「라이게이션」은 2개의 핵산 단편 사이에서 인산 디에스테르 결합을 형성하는 방법이다. 2개의 단편의 라이게이션을 위해 단편의 말단은 서로 적합해 있어야만 한다. 경우에 따라서는 이 말단은 엔도뉴클레아제 소화 후에 바로 적합성을 갖는다. 그러나 라이게이션에 적합시키기 위해 먼저 엔도뉴클레아제 소화 후에 일반적으로 형성되는 부착 말단은 평활 말단으로 바뀌어질 필요가 있다. 평활 말단으로 하기 위해서는 DNA가 적절한 완충액 중에서 15℃에서 적어도 15분간, 4개의 데옥시 리보뉴클레오티드 3인산의 존재하에서 DNA 폴리머라아제 I 또는 T4DNA 폴리머라아제의 클레나우 단편의 약 10단위로 처리된다. 다음으로 DNA가 페놀 클로로포름 추출과 에탄올 침전, 또는 실리카 정제에 의해 정제된다. 연결 대상 DNA 단편이 용액에 등몰량 첨가된다. 이 용액에는 ATP, 리가아제 완충에 더하여 T4DNA 리가아제와 같은 리가아제가 DNA 0.5 ㎍당 약 10단위 포함된다. DNA를 벡터에 연결하는 경우는 벡터는 적당한 제한 엔도뉴클레아제에 의한 소화작용에 의해 먼저 선형상으로 된다. 선형상으로 된 단편을 다음으로 세균의 알칼리포스파타아제 또는 송아지 장관의 포스파타아제로 처리함으로써, 라이게이션의 스텝 사이의 당해 단편의 셀프라이게이션이 예방된다.

본 발명의 항원 결합 분자를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터의 제작, 당해 발현 벡터의 세포로의 도입, 당해 세포에 있어서의 당해 폴리뉴클레오티드의 발현 및 발현된 항원 결합 분자의 당해 세포의 배양액으로부터의 취득방법은 상기 항체의 항목에 기재된 방법에 준하여 실시된다.

또한 본 명세서에 있어서 인용된 모든 선행기술문헌은 참조로써 본 명세서에 포함된다.

실시예

아래에 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명하나, 이들 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

(실시예 1) 인간 IL-6 수용체 면역관용 마우스 모델의 제작

IL-6 수용체는 리간드인 IL-6가 증식인자인 골수종에 고발현하고 있는 것으로부터, 항인간 IL-6 수용체 항체는 인간 골수종의 면역부전 마우스 xenograft 모델에서 항종양효과를 발휘하는 것이 알려져 있다(Eur. J. Immunol. 22, 1989-93 (1992)). 항IL-6 수용체 항체를 마우스에 투여함으로써 마우스 항IL-6 수용체 항체의 생산을 유도시킬 수 있다면, 그 항IL-6 수용체 항체가 획득 면역을 유도하여 그 항IL-6 수용체 항체가 암백신으로서 유용한 것을 나타내는 것이 가능해진다.

그러나 항종양 모델로서 사용되는 면역부전 마우스에 있어서는 마우스의 면역기능이 작용하지 않는 것으로부터 획득 면역을 유도하는 것은 불가능하다. 또한 가용형 인간 IL-6 수용체를 정상 마우스에 투여하더라도 단기간 내에 마우스에 있어 이물질인 인간 IL-6 수용체에 대해 마우스 항인간 IL-6 수용체 항체가 생산된다. 그 때문에 항인간 IL-6 수용체 항체가 미치는 마우스 항인간 IL-6 수용체 항체 생산으로의 영향(인간 IL-6 수용체에 대한 획득 면역)을 평가하는 계(系)로서 정상 마우스는 그대로는 사용할 수 없다.

한편 인간의 임상에 있어서는 항체 분자가 표적으로 하는 항원은 인간 항원이기 때문에 인간은 그 자기의 표적 항원에 대해 면역관용으로 되어 있다. 인간의 임상에 있어서 표적 항원에 대한 항체를 투여함으로써 표적 항원에 대한 자기 항체의 생산이 유도되고 있는 경우, 면역관용이 파괴되어 있는 것이 상정된다.

그 때문에 마우스에 투여된 항체가 당해 마우스에 있어서 표적 인간 항원에 대한 획득 면역을 유도할 수 있는지 여부에 대해서 인간의 임상을 상정한 평가를 행하기 위해서는 마우스가 표적 인간 항원에 대해 면역관용과 유사한 상태로 되어 있어(표적 인간 항원을 마우스에 단순히 투여하는 것만으로는 마우스가 표적 인간 항원에 대한 항체를 생산하지 않음), 표적 항원에 대한 항체를 투여함으로써 그 면역관용에 가까운 상태가 파괴되어 표적 항원에 대한 자기 항체의 생산이 유도되고 있는 것을 평가하는 평가계가 확립될 필요가 있다.

이에 표적 인간 항원의 마우스에 대한 투여에 의해 당해 마우스 중에서 표적 인간 항원에 대한 자기 항체가 생산되지 않도록 하기 위해, 항원 제시로부터 항체 생산을 유도하기 위해 필요한 CD4 양성 T세포가 항마우스 CD4 항체에 의해 충분한 양 제거된 시험계가 구축되었다.

표적 인간 항원인 가용형 인간 IL-6 수용체의 혈장 중 농도를 정상상태(약 20 ng/mL)로 유지하는 모델로서 아래의 시험 모델이 구축되었다. 정상 마우스(C57BL/6J mouse, Charles River Japan)의 배부(背部) 피하에 가용형 인간 IL-6 수용체를 충전한 infusion pump(MINI-OSMOTIC PUMP MODEL2004, alzet)를 매입함으로써 혈장 중 가용형 인간 IL-6 수용체 농도가 정상상태로 유지되는 동물 모델이 제작되었다.

시험은 2군(각 군 N=4)에서 실시되었다. 면역관용이 모방된 군의 마우스에 대해 가용형 인간 IL-6 수용체에 대한 마우스 항체의 생산을 억제하기 위해 monoclonal anti-mouse CD4 antibody(R&D)가 그 꼬리정맥에 20 ㎎/㎏으로 단회 투여된 후, 10일에 1회 동일하게 투여되었다(이하, 항마우스 CD4 항체 투여군이라 불린다). 다른 한쪽의 군은 대조군, 즉 monoclonal anti-mouse CD4 antibody가 투여되지 않는 항마우스 CD4 항체 비투여군으로서 사용되었다다. 그 후, 92.8 ㎍/mL의 가용형 인간 IL-6 수용체가 충전된 infusion pump의 마우스 배부 피하로의 매입이 실시되었다. Infusion pump 매입 후부터 경시적으로 채취된 혈액을 채취 후 바로 4℃, 15,000 rpm으로 15분간 원심분리함으로써 혈장이 얻어졌다. 분리된 혈장은 측정을 실시할 때까지 -20℃ 이하로 설정된 냉동고에 보존되었다. 가용형 인간 IL-6 수용체(hsIL-6R)의 혈장 중 농도는 아래의 방법으로 측정되었다.

마우스의 혈장 중 hsIL-6R 농도는 전기화학 발광법으로 측정되었다. 2000, 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25 pg/mL로 조제된 hsIL-6R 검량선 시료 및 50배 이상 희석된 마우스 혈장 측정시료를 SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)로 루테늄화한 Monoclonal Anti-human IL-6R Antibody(R&D) 및 Biotinylated Anti-human IL-6 R Antibody (R&D) 및 Tocilizumab과 혼합함으로써 37℃에서 하룻밤 반응시켰다. Tocilizumab의 최종 농도는 333 ㎍/mL가 되도록 조제되었다. 그 후, 반응액이 MA400 PR Streptavidin Plate(Meso Scale Discovery)에 분주되었다. 추가로 실온에서 1시간 반응시킨 반응액을 세정 후, Read Buffer T(×4)(Meso Scale Discovery)가 분주되었다. 그 후 바로 SECTOR PR 400 reader(Meso Scale Discovery)로 측정이 행해졌다. hsIL-6R 농도는 검량선의 리스폰스로부터 해석 소프트웨어 SOFTmax PRO(Molecular Devices)를 사용해서 산출되었다. 이 방법으로 측정한 정상 마우스에 있어서의 개체별 혈장 중 hsIL-6R 농도 추이를 도 1에 나타낸다.

그 결과, 항마우스 CD4 항체 비투여군의 모든 마우스에 있어서, infusion pump의 마우스 배부 피하로의 매입 14일 후에는 혈장 중 hsIL-6R 농도의 저하가 확인되었다. 즉, 마우스 항인간 IL-6 수용체 항체가 생산되면 혈장 중 hsIL-6R 농도의 저하가 일어나기 때문에 이들 군에서는 마우스 항인간 IL-6 수용체 항체가 생산되고 있는 것이 나타내어졌다. 한편 항마우스 CD4 항체 투여군의 모든 마우스에 있어서 혈장 중 hsIL-6R 농도의 저하는 관찰되지 않았다. 즉, infusion pump의 유효기간인 28일간을 통해 거의 일정(약 20 ng/mL)한 혈장 중 hsIL-6R 농도를 유지한 것으로부터, 마우스 항인간 IL-6 수용체 항체는 생산되고 있지 않은 것이 나타내어졌다.

상기 결과로부터, 사전에 항마우스 CD4 항체를 투여함으로써 표적 항원인 인간 IL-6 수용체 단독 투여가 정상 마우스에 있어서 획득 면역을 유도하지 않는 것이 확인되었다. 이후의 실시예에 있어서 항마우스 CD4 항체 투여 모델이 항인간 IL-6 수용체 항체 투여에 의한 인간 IL-6 수용체에 대한 획득 면역의 유도를 평가하는 계로서 사용되었다.

(실시예 2) 인간 IL-6 수용체 면역관용 정상 마우스 모델에 있어서의 통상 항IL-6 수용체 항체 및 pH 의존적 항인간 IL-6 수용체 항체에 의한 획득 면역 유도 효과의 비교

표적 항원에 대한 획득 면역을 유도하기 위해서는 항원 제시 세포의 세포내에 흡수된 표적 항원이 당해 세포 중의 리소좀으로 적당하게 분해된 후에, MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II에 결합함으로써 당해 표적 항원의 단편 펩티드가 항원 제시될 필요가 있다. 항원 제시되는 펩티드가 많으면 많을수록 면역이 보다 강하게 유도되는 것으로 생각되는 것으로부터, 표적 항원에 대한 획득 면역의 유도를 증강시키는 방법으로서 항원 제시 세포의 세포내에 보다 많은 표적 항원을 보내는 방법이 방법이 생각되었다.

통상 항원이 항원 제시 세포에 비특이적으로 흡수되면 그대로 엔도솜에서 리소좀으로 이행하기 때문에 단편 펩티드가 항원 제시될 가능성이 있다. 그러나 통상의 IgG 항체가 항원에 결합해 있는 경우, IgG 항체는 FcRn에 결합함으로써 엔도솜 내로부터 세포 표면(혈장 중)으로 리사이클되는 것으로부터, 항체에 결합한 항원도 리소좀으로 이행하지 않고 세포 표면(혈장 중)으로 리사이클될 것으로 생각된다. 그 때문에 통상의 IgG 항체를 투여함으로써 표적 항원의 분해가 억제되어 버린다. 그 결과, 항원 제시 세포 중의 리소좀으로 적당히 분해된 표적 항원의 단편 펩티드가 항원 제시되지 않고, 표적 항원에 대한 획득 면역의 유도가 반대로 저하될 것으로 생각된다. 이에 혈장 중의 pH 7.4에서는 표적 항원에 결합하고, 엔도솜 내의 산성 조건하의 pH 5.0-pH 6.5에서는 항원을 해리하는 pH 의존적 결합 활성을 갖는 IgG 항체(WO2009/125825)가 항원 제시 세포의 산성 엔도솜 내에서 표적 항원을 해리할 수 있기 때문에, 당해 IgG 항체를 사용함으로써 표적 항원만이 항원 제시 세포의 리소좀으로 이행하여, 당해 표적 항원의 단편 펩티드가 항원 제시되고, 항원을 해리한 IgG 항체는 FcRn에 결합함으로써 엔도솜 내로부터 세포 표면(혈장 중)으로 리사이클되어 항원 제시되지 않을 가능성이 있을 것으로 생각되었다.

이에 실시예 1에서 확립된 인간 IL-6 수용체 면역관용 정상 마우스 모델을 사용하여, 통상의 항인간 IL-6 수용체 IgG 항체와 pH 의존적 항인간 IL-6 수용체 IgG 항체의 획득 면역 유도 효과가 검증되었다. 통상의 항인간 IL-6 수용체 IgG 항체로서 WO2009/125825에 기재된 H54-IgG1(서열번호：38) 및 L28-CK(서열번호：39)로 이루어지는 H54/L28-IgG1이 사용되었다. pH 의존적 항인간 IL-6 수용체 IgG 항체로서 VH3-IgG1(서열번호：17)과 VL3-CK(서열번호：40)로 이루어지는 Fv4-IgG1이 사용되었다. 항체의 조제는 참고실시예 1에 기재한 방법을 사용하여 실시되었다.

인간 FcRn 형질전환 마우스(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg line 32 +/+ mouse, Jackson Laboratories(Methods Mol. Biol. (2010) 602, 93-104)로부터 확립된 인간 IL-6 수용체 면역관용 마우스 모델을 사용하여 H54/L28-IgG1 및 Fv4-IgG1의 획득 면역 유도 효과가 검증되었다. H54/L28-IgG1 및 Fv4-IgG1이 인간 IL-6 수용체 면역관용 마우스 모델에 투여되었다. 구체적으로는 실시예 1과 동일하게 Infusion pump 매입이 행해진 3일 후에 항인간 IL-6 수용체 항체가 그 꼬리정맥에 1 ㎎/㎏으로 단회 투여되었다. 항인간 IL-6 수용체 항체의 투여 후 경시적으로 채혈이 행해졌다. 채취된 혈액을 바로 4℃, 15,000 rpm으로 15분간 원심분리함으로써 혈장이 얻어졌다. 분리된 혈장은 측정을 실시할 때까지 -20℃ 이하로 설정된 냉동고에 보존되었다. 혈장 중 hsIL-6R 농도는 실시예 1에 기재한 방법과 동일한 방법으로 측정되었다.

대조(항인간 IL-6 수용체 항체 비투여군), H54/L28-IgG1 및 Fv4-IgG1 투여 후의 각 군의 평균 혈장 중 hsIL-6R 농도의 추이를 도 2에 나타내었다. 대조의 전체 동물에 있어서 실시예 1과 동일하게 혈장 중 hsIL-6R 농도가 거의 일정하게 유지되고 있는 것으로부터, 마우스 항인간 IL-6 수용체 항체는 생산되고 있지 않은 것이 나타내어졌다. H54/L28-IgG1이 투여된 군에 있어서는 대조와 비교하여 전체 동물의 혈장 중 hsIL-6R 농도의 대폭적인 상승이 확인되고, 상승된 상태가 28일간 지속되었다. 이는 hsIL-6R은 비특이적으로 세포에 흡수되면 그대로 리소좀에서 분해되는 것에 대해, IgG 항체에 결합한 hsIL-6R은 FcRn에 의해 항체 항원 복합체로서 혈장 중으로 리사이클되기 때문에 hsIL-6R의 클리어런스가 저하되고, 그에 따라 혈장 중 hsIL-6R 농도가 상승하기 때문인 것으로 생각되었다. 이 상승한 상태가 28일간 지속된 것으로부터 대조와 동일하게 H54/L28-IgG1이 투여된 군에서는 마우스 항인간 IL-6 수용체 항체의 생산이 유도되고 있지 않은 것이 나타내어졌다. Fv4-IgG1이 투여된 군의 전체 동물에 있어서는 대조와 비교하여 혈장 중 hsIL-6R 농도가 상승하였으나, H54/L28-IgG1이 투여된 군보다는 혈장 중 hsIL-6R 농도의 상승 정도가 명확하게 저하되었다. pH 의존적 결합 항체가 엔도솜 내에서 항원을 해리하기 때문에 hsIL-6R의 클리어런스의 저하가 억제되고, 그에 따라 혈장 중 hsIL-6R 농도의 상승도 억제되었기 때문이다. 이 결과로부터 pH 의존적 결합 항체가 통상 항체와 비교하여 보다 많은 표적 항원을 항원 제시 세포의 엔도솜에 있어서 해리하여 리소좀으로의 표적 항원의 이행을 촉진하고 있는 것이 생각되었다. 그러나 hsIL-6R 농도가 상승한 상태가 28일간 지속된 것으로부터 H54/L28-IgG1과 동일하게 Fv4-IgG1은 마우스 항인간 IL-6 수용체 항체의 생산을 유도하고 있지 않은 것이 나타내어졌다.

이 결과로부터 통상의 IgG 항체 및 항원 제시 세포의 엔도솜 내에서 항원을 해리하여 리소좀으로 이행시키는 pH 의존적 결합 IgG 항체를 사용하여 표적 항원에 대한 획득 면역을 유도하는 것은 불가능한 것을 알 수 있었다.

(실시예 3) 인간 IL-6 수용체 면역관용 인간 FcRn 형질전환 마우스 모델에 있어서의 pH 의존적인 IL-6 수용체 결합과 pH 7.4에 있어서의 FcRn 결합 증강이 미치는 획득 면역 유도 효과에 미치는 영향

(3-1) 개요

통상의 IgG1 항체 또는 pH 의존적 결합 IgG1 항체는 표적 항원에 대한 획득 면역을 유도하는 것은 불가능한 것이 실시예 2에 있어서 확인되었다. 한편 T-cell epitope peptide의 면역원성을 증강시키는 방법으로서, T-cell epitope peptide를 Fc와 융합하고 추가로 그 Fc 부분의 FcRn에 대한 pH 7.4에 있어서의 결합을 증강시킴으로써, T-cell epitope peptide를 보다 리소좀으로 이행시키는 방법이 최근 보고되었다(J. Immunol. 181, 7550-61 (2008)). FcRn은 항원 제시 세포에 발현하고 있는 것으로부터 Fc 부분의 FcRn에 대한 pH 7.4에 있어서의 결합을 증강시킴으로써 T-cell epitope peptide의 항원 제시가 촉진될 수 있다. 그러나 이 방법에서 개시된 항원이 되는 펩티드를 직접 Fc에 융합시킨 분자는 항원 결합 분자로서 암항원에 결합할 수 없기 때문에 본 분자가 암세포에 대해 직접 작용을 발휘할 수는 없다. 또한 Fc 부분의 FcRn에 대한 pH 7.4에 있어서의 결합을 증강시키는 방법은 in vitro에 있어서는 T-cell epitope peptide의 면역원성을 증강시키고 있으나, in vivo에 있어서는 반대로 면역원성을 감소시키고 있어 in vivo에 효과는 나타내어지지 않았다. 이와 같이 pH 7.4에 있어서의 FcRn 결합을 증강시킨 Fc와 표적 항원을 직접 융합시킨 분자는 표적 항원에 대한 결합 활성을 나타낼 수 없기 때문에 표적 항원에 대해 직접 작용할 수 없고, 또한 in vivo에 있어서 FcRn 결합을 증강시키는 것이 반대로 면역원성을 감소시키는 결과를 나타내었다.

실시예 2 및 지금까지의 보고를 통해 통상의 IgG1 항체(H54/L28-IgG1)에 대해 pH 7.4에 있어서의 FcRn 결합을 증강시키는 개변을 도입한 항체(H54/L28-F157) 및 pH 의존적 결합 IgG1 항체(Fv4-IgG1)에 대해 pH 7.4에 있어서의 FcRn 결합을 증강시키는 개변을 도입한 항체(Fv4-F157)의 투여에 의해, 표적 항원에 대해 획득 면역을 유도할 수 있는지 여부가 검증되었다.

(3-2) 항체의 제작

FcRn 결합이 증강된 통상의 항인간 IL-6 수용체 IgG 항체로서 H54-F157(서열번호：41) 및 L28-CK(서열번호：39)로 이루어지는 H54/L28-F157이 사용되었다. FcRn 결합이 증강된 pH 의존적 항인간 IL-6 수용체 IgG 항체로서 VH3-F157(서열번호：42)과 VL3-CK(서열번호：40)로 이루어지는 Fv4-F157이 사용되었다. 항체의 조제는 참고실시예 1에 기재한 방법을 사용하여 실시되었다.

(3-3) 인간 FcRn에 대한 친화성의 측정

실시예 2에서 제작된 Fv4-IgG1과 Fv4-F157의 Fc 부분(각각 IgG1과 F157이라 부른다)의 인간 FcRn에 대한 pH 7.0에 있어서의 친화성을 결정하기 위해, VH3-IgG1(서열번호：17)과 L(WT)-CK(서열번호：18)로 이루어지는 VH3/L(WT)-IgG1 및 VH3-F157(서열번호：42)과 L(WT)-CK(서열번호：18)로 이루어지는 VH3/L(WT)-F157의 인간 FcRn에 대한 친화성이 아래에 나타내는 방법으로 측정되었다.

Biacore T100(GE Healthcare)을 사용하여 인간 FcRn과 항체의 속도론적 해석이 행해졌다. Sensor chip CM4(GE Healthcare) 상에 아민커플링법으로 protein L(ACTIGEN)을 적당량 고정화하고, 거기에 목적의 항체를 캡쳐시켰다. 다음으로 FcRn 희석액과 블랭크인 러닝 버퍼를 인젝트하여 센서칩 상에 캡쳐시킨 항체에 인간 FcRn을 상호작용시켰다. 러닝 버퍼로는 50 mmol/L sodium phosphate, 150 mmol/L NaCl, 0.05%(w/v) Tween20, pH 7.0을 사용하고, FcRn의 희석에도 각각의 버퍼가 사용되었다. 센서칩의 재생에는 10 mmol/L Glycine-HCl, pH 1.5가 사용되었다. 측정은 모두 25℃에서 실시되었다. 측정으로 얻어진 센서그램으로부터 산출된 키네틱스 파라미터인 결합속도상수 ka(1/Ms) 및 해리속도상수 kd(1/s)를 토대로 각 항체의 인간 FcRn에 대한 KD(M)(친화성)가 산출되었다. 각 파라미터의 산출에는 Biacore T100 Evaluation Software(GE Healthcare)가 사용되었다.

IgG1과 F157의 인간 FcRn에 대한 친화성을 표 7에 나타내었다. F157의 인간 FcRn으로의 친화성은 IgG1과 비교하여 약 600배 향상되어 있는 것이 확인되었다.

(3-4) 항체의 투여 시험에 있어서의 항원(가용형 인간 IL-6 수용체)의 혈장 중 농도의 추이

다음으로 시험 1에 있어서 인간 FcRn 형질전환 마우스(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg line 32 +/+ mouse, Jackson Laboratories, Methods Mol. Biol. (2010) 602, 93-104)로부터 확립된 인간 IL-6 수용체 면역관용 마우스 모델이 사용되었다. H54/L28-F157 및 Fv4-F157이 인간 IL-6 수용체 면역관용 마우스 모델에 투여되었다. 구체적으로는 실시예 1과 동일하게 Infusion pump 매입이 행해진 3일 후에 항인간 IL-6 수용체 항체가 그 꼬리정맥에 1 ㎎/㎏으로 단회 투여되었다(각 군의 개체 수는 3이다). 마우스에 대한 항인간 IL-6 수용체 항체의 투여 후 경시적으로 채혈이 행해졌다. 또한 시험 2에서는 Fv4-F157만이 동일하게 투여된 후에 경시적으로 채혈이 행해졌다. 채취된 혈액을 바로 4℃, 15,000 rpm으로 15분간 원심분리함으로써 혈장이 얻어졌다. 분리된 혈장은 측정을 실시할 때까지 -20℃ 이하로 설정된 냉동고에 보존되었다. 혈장 중 hsIL-6R 농도는 실시예 1에 기재한 방법과 동일한 방법으로 측정되었다.

시험 1의 H54/L28-F157과 Fv4-F157 및 시험 2의 Fv4-F157의 투여 후의 각 군의 평균 혈장 중 hsIL-6R 농도 추이에 더하여, 실시예 2에서 얻어진 대조(항체 비투여군), H54/L28-IgG1 및 Fv4-IgG1 투여 후의 각 군의 평균 혈장 중 hsIL-6R 농도 추이를 도 3에 나타내었다. H54/L28-F157의 투여군에 있어서는 H54/L28-IgG1의 투여군과 동일하게 혈장 중 hsIL-6R 농도의 상승이 확인되었으나, 그 상승은 일과적으로 13일 후에는 혈장 중 hsIL-6R 농도는 대조군과 동등한 레벨까지 저하되었다. 그 후에도 대조군과 동등한 레벨을 28일간 지속한 것으로부터, H54/L28-IgG1과 마찬가지로 마우스 항인간 IL-6 수용체 항체는 생산되고 있지 않은 것이 나타내어져, pH 7.4에 있어서의 FcRn에 대한 결합의 증강만으로는 표적 항원에 대한 획득 면역을 유도하는 것은 불가능한 것을 알 수 있었다. 이는 J. Immunol. (2008) 181, 7550-7561에 보고되어 있는 바와 같이, pH 7.4에 있어서의 FcRn에 대한 결합이 증강된 Fc영역에 T-cell epitope peptide를 융합한 분자의 경우는 T-cell epitope peptide에 대한 획득 면역의 유도를 증강시킬 수 없는 것과 모순되지 않는다. 이에 대해 Fv4-F157의 투여군에 있어서는 항체의 투여 후에 급격한 혈장 중 hsIL-6R 농도의 저하가 획안되고, 투여 1일 후에는 검출한계 이하(1.56 ng/mL 이하)까지 hsIL-6R 농도가 저하되었다.

특정 이론에 구속되는 것은 아니나, 상기 현상은 아래와 같이 설명할 수 있을 가능성이 있다. 표적 항원에 대한 획득 면역의 증강은 투여한 항체에 의해 항원 제시 세포에 흡수되는 표적 항원의 양에 의존하는 것으로 생각된다. 흡수되는 표적 항원의 양은 혈장 중의 표적 항원 농도가 어느 만큼 저하되었는지에 따라 평가가 가능하다. 세포에 흡수된 후에 pH 의존적 결합 항체(Fv4-IgG1)는 산성 엔도솜 내에서 표적 항원을 해리시키지만, 표적 항원이 결합한 pH 의존적 결합 항체가 세포에 흡수되는 과정은 비특이적인 피노시토시스(pinocytosis)에 의존하고 있어 흡수속도가 느리기 때문에, 혈장 중 표적 항원 농도는 대조보다 낮은 레벨로 저하되지 않는다(도 4). 또한 pH 7.4에 있어서의 FcRn 결합만이 증강된 항체(H54/L28-F157)는 pH 7.4에 있어서의 FcRn에 대한 결합을 이용하여 적극적으로 세포내에 흡수되지만, 표적 항원이 항체 결합한 그대로의 상태, 즉 항체와 표적 항원의 복합체로서 대부분이 그대로 FcRn의 본래의 기능에 의해 세포 표면으로 리사이클되기 때문에, 혈장 중 표적 항원의 농도는 대조보다 낮은 레벨로 저하되지 않는다(도 5). 그에 대해 pH 7.4에 있어서의 FcRn에 대한 결합을 매개로 적극적으로 세포내에 흡수된 pH 7.4에 있어서의 FcRn 결합이 증강된 pH 의존적 결합 항체(Fv4-F157)는 엔도솜 내에서 표적 항원을 해리시키기 때문에, 항원을 리소좀으로 보내는 동시에 표적 항원을 해리한 항체는 FcRn의 본래의 기능에 의해 세포 표면으로 리사이클되어, 재차 표적 항원에 결합하여 동일 표적 항원을 리소좀으로 재차 보내는 것이 가능하다(도 6). 이 사이클을 반복함으로써 pH 7.4에 있어서의 FcRn 결합이 증강된 pH 의존적 결합 항체만이 혈장 중 표적 항원의 농도를 대조보다 대폭으로 낮은 레벨까지 저하시키는 것이 가능할 것으로 생각되었다.

시험 1 및 시험 2에 있어서의 Fv4-F157을 투여한 마우스 6마리의 개체별 혈장 중 hsIL-6R 농도를 각각 도 7 및 도 8에 나타내었다. Fv4-F157이 투여된 6마리의 마우스 중 #7, #8, #10의 3마리의 마우스에 있어서는 13일 후 이후에 hsIL-6R 농도가 상승하여 대조와 동등 레벨까지 되돌아가고, 그 후 대조와 동등한 레벨이 28일간 유지되엇다. 한편 나머지 #9, #11, #12의 3마리의 마우스에 있어서는 hsIL-6R 농도가 되돌아가지 않고 그 후에도 28일간까지 그 낮은 값을 유지한 것으로부터, 이들 3마리의 마우스에 있어서는 마우스 항인간 IL-6 수용체 항체가 생산되어 인간 IL-6 수용체를 혈장 중으로부터 제거하고 있는 것이 생각되었다. 이에 아래에 나타내는 방법으로 Fv4-F157을 투여한 마우스 6마리에 있어서의 마우스 항인간 IL-6 수용체 항체의 항체가가 측정되었다.

(3-4) 항체의 투여 시험에 있어서의 마우스에 의한 항원(가용형 인간 IL-6 수용체)에 대한 마우스 항체(마우스 항인간 IL-6 수용체 항체)의 항체가 추이

마우스 혈장 중 마우스 항인간 IL-6 수용체 항체의 항체가가 전기화학 발광법에 의해 측정되었다. 먼저 인간 IL-6 수용체를 MA100 PR Uncoated Plate(Meso Scale Discovery)에 분주하고 4℃에서 하룻밤 정치함으로써 인간 IL-6 수용체 고상화 플레이트가 제작되었다. 50배 희석된 마우스 혈장 측정시료가 분주된 인간 IL-6 수용체 고상화 플레이트가 4℃에서 하룻밤 정치되었다. 그 후, SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)로 루테늄화한 anti-mouse IgG(whole molecule) (Sigma-Aldrich)를 실온에서 1시간 반응시킨 당해 플레이트가 세정되었다. 당해 플레이트에 Read Buffer T(×4)(Meso Scale Discovery)가 분주된 후에 바로 SECTOR PR 400 reader(Meso Scale Discovery)로 측정이 행해졌다.

Fv4-F157 투여군에 있어서의 마우스 항인간 IL-6 수용체 항체(항hsIL-6R 항체)의 항체가 추이를 도 7 및 도 8에 나타내었다. 그 결과, hsIL-6R 농도가 대조와 동등 레벨까지 되돌아간 #7, #8, #10의 3마리의 마우스에 있어서는 마우스 항인간 IL-6 수용체 항체의 항체가의 상승이 확인되지 않았으나, hsIL-6R 농도가 28일까지 낮은 값을 유지한 #9, #11, #12의 3마리의 마우스에 있어서는 마우스 항인간 IL-6 수용체 항체(항hsIL-6R 항체)의 항체가의 상승이 확인되었다. 상기 결과로부터, FcRn에 대한 결합이 증강된 pH 의존적 항인간 IL-6 수용체 IgG 항체인 Fv4-F157을 인간 IL-6 수용체 면역관용 정상 마우스 모델에 투여함으로써 3/6 예에 있어서 표적 항원인 인간 IL-6 수용체에 대한 획득 면역을 유도하는 것이 가능한 것이 발견되었다. 이 사실로부터, 통상의 IgG 항체(H54/L28-IgG1) 또는 표적 항원에 대해 pH 의존적으로 결합하는 IgG 항체(Fv4-IgG1) 또는 pH 7.4에 있어서의 FcRn에 대한 결합만이 증강된 IgG 항체(H54/L28-IgG1)를 in vivo에 투여해도 표적 항원에 대한 획득 면역을 유도하는 것은 불가능하여, 표적 항원에 대해 pH 의존적으로 결합하고 또한 pH 7.4에 있어서의 FcRn에 대한 결합이 증강된 IgG 항체(Fv4-F157)만이 표적 항원에 대한 획득 면역을 유도하는 것이 가능한 것이 발견되었다.

(3-5) 항체의 투여 시험에 있어서의 마우스에 의한 투여한 항체(Fv4-F157)에 대한 마우스 항체(마우스 항Fv4-F157 항체)의 항체가 추이

표적 항원과 pH 7.4에 있어서의 FcRn 결합을 증강시킨 Fc를 직접 융합시킨 분자를 약제로서 사용하는 전술한 방법(J. Immunol. (2008) 181, 7550-7561)에 의해 가령 표적 항원에 대한 항체의 생산이 가능해졌다 하더라도, 표적 항원에 대한 항체는 약제 자체에 대해서도 결합해 버리기 때문에 항약제 항체로서 작용하여 약제의 작용을 감약시켜 버리는 것으로 이어진다. 그 때문에 표적 항원이 약제에 직접 융합되어 있는 분자(예를 들면 J. Immunol. (2008) 181, 7550-7561이나 J. Immunol. (2011), 186, 1218-1227에 깆된 분자)를 사용하는 것은, 표적 항원에 대한 항체 생산의 유도, 즉 약제의 작용을 감약시켜 버리는 약제 자체에 대한 항약제 항체의 유도를 의미하기 때문에 바람직하지 않은 것으로 생각되었다.

FcRn에 대한 결합이 증강된 pH 의존적 항인간 IL-6 수용체 IgG 항체(Fv4-F157)는 표적 항원인 인간 IL-6 수용체에 pH 의존적으로 결합하는 활성을 갖는 약제로, 직접 표적 항원이 융합된 분자는 아니다. 그 때문에, Fv4-F157은 도 7 및 도 8에 나타낸 바와 같이 표적 항원인 인간 IL-6 수용체에 대해 항체 생산을 유도하였으나, 약제 자체(Fv4-F157)에 대한 항약제 항체는 생산하고 있지 않을 가능성이 있다. 이에 Fv4-F157이 투여된 마우스 6마리에 있어서의 마우스 항Fv4-F157 항체의 항체가가 아래에 나타내는 방법으로 측정되었다.

마우스 혈장 중 항Fv4-F157 항체의 항체가가 전기화학 발광법에 의해 측정되었다. 먼저 항인간 IL-6 수용체 항체를 MA100 PR Uncoated Plate(Meso Scale Discovery)에 분주하고 4℃에서 하룻밤 정치함으로써 항인간 IL-6 수용체 항체 고상화 플레이트가 제작되었다. 50배 희석된 마우스 혈장 측정시료가 분주된 항인간 IL-6 수용체 항체 고상화 플레이트가 4℃에서 하룻밤 정치되었다. 그 후, SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)로 루테늄화한 anti-mouse IgG(whole molecule) (Sigma-Aldrich)를 실온에서 1시간 반응시킨 당해 플레이트가 세정되었다. 당해 플레이트에 Read Buffer T(×4)(Meso Scale Discovery)가 분주된 후에 바로 SECTOR PR 400 reader(Meso Scale Discovery)로 측정이 행해졌다.

Fv4-F157 투여군에 있어서의 마우스 항Fv4-F157 항체의 항체가 추이 및 마우스 항인간 IL-6 수용체 항체(항hsIL-6R 항체)의 항체가 추이를 도 9 및 도 10에 나타내었다. Fv4-F157 투여군에 있어서는 마우스 항인간 IL-6 수용체 항체(항hsIL-6R 항체)의 생산 유무에 상관없이, 어느 마우스에 있어서도 마우스 항Fv4-F157 항체의 생산은 확인되지 않았다. 이 사실로부터 pH 7.4에 있어서의 FcRn에 대한 결합이 증강된 pH 의존적 항인간 IL-6 수용체 IgG 항체(Fv4-F157)는 표적 항원(인간 IL-6 수용체)에 대한 항체 생산을 유도하는 한편으로, 약제 자신(Fv4-F157)에 대한 항체 생산은 유도하지 않은 것으로부터, pH 7.4에 있어서의 FcRn에 대한 결합이 증강된 pH 의존적(항인간 IL-6 수용체) IgG 항체는 표적 항원에 대한 획득 면역을 유도하는 약제로서 매우 유용한 것으로 생각되었다.

지금까지 암항원에 대한 획득 면역을 유도하는 방법으로서, 항원 제시 세포에 발현되고 있는 수용체에 결합하는 항체에 획득 면역을 유도시키고자 하는 암항원을 융합시킨 약제 분자를 사용하는 방법이 보고되어 있다(J. Immunol. (2011) 186, 1218-1227). 이러한 약제 분자는 직접 암항원에 결합하여 작용을 발휘할 수 없다(도 11). 그 때문에 이러한 약제 분자는 종래의 항체 의약과 같이 암항원에 대한 기능 저해작용이나 암세포에 대한 직접적인 세포상해활성 작용을 나타내는 것은 불가능하다. 또한 이러한 분자는 약제 분자 전체가 항원 제시 세포에 흡수되어 분해되기 때문에 약제 분자의 단편 펩티드가 MHC class II 및 MHC class I에 제시된다. 그 때문에 암항원에 대한 액성 면역 및 세포성 면역뿐 아니라 약제 자신에 대한 액성 면역도 유도해 버리는 것으로 생각되어, 용이하게 항약제 항체의 생산에 의한 효과의 감약으로 이어지기 때문에 바람직하지 않은 것으로 생각된다(도 11).

이에 대해 본 실시예에서 발견된 pH 7.4에 있어서의 FcRn에 대한 결합이 증강되고 또한 pH 의존적으로 표적 암항원에 결합하는 항체는 직접 암항원에 결합하여 작용을 발휘하는 것이 가능하다(도 12). 이 때문에 종래의 항체 의약과 같이 암항원에 대한 기능 저해작용이나 암세포에 대한 직접적인 세포상해활성 작용을 나타내는 것이 가능하다. 또한 이러한 항체는 산성 엔도솜 내에서 표적 암항원을 해리하고 항체 자신은 세포 표면으로 리사이클됨으로써, 표적 암항원이 선택적으로 분해되어 표적 항원의 단편 펩티드가 MHC class II 및 MHC class I에 제시되기 때문에, 항체 자신에 대한 항약제 항체의 생산을 유도하지 않고 암항원에 대해 선택적으로 액성 면역 및 세포성 면역을 유도하는 것이 가능하다(도 12).

(실시예 4) 인간 IL-6 수용체 녹인 마우스에 있어서의 pH 의존적인 IL-6 수용체 결합과 pH 7.4에 있어서의 FcRn 결합 증강이 미치는 내인성 인간 IL-6 수용체에 대한 획득 면역의 유도 효과에 미치는 영향

(4-1) 개요

실시예 3에서 나타내어진 바와 같이, 통상의 IgG1 항체(H54/L28-IgG1)에 대해 pH 7.4에 있어서의 FcRn 결합을 증강시키는 개변이 도입된 항체(H54/L28-F157)의 인간 IL-6 수용체 면역관용 인간 FcRn 형질전환 마우스 모델에 대한 투여에 의해, 당해 마우스에 있어서의 표적 항원에 대한 획득 면역이 유도되지 않았으나, pH 의존적 결합 IgG1 항체(Fv4-IgG1)에 대해 pH 7.4에 있어서의 FcRn 결합을 증강시키는 개변이 도입된 항체(Fv4-F157)의 당해 마우스에 대한 투여에 의해, 동 마우스에 있어서의 표적 항원에 대한 획득 면역이 유도되었다.

그러나 상기 모델은 바깥에서 투여된 인간 항원에 대한 획득 면역을 유도하는 모델이지만, 상기 획득 면역 유도의 임상으로의 응용을 검토할 때는 완전히 면역관용으로 되어 있는 내인성 항원에 대해 그 면역관용을 파괴하고 획득 면역이 유도되는지가 확인되는 것이 바람직하다.

이에 인간 IL-6 수용체를 발현하는 인간 IL-6 수용체 녹인 마우스가 내인성 인간 IL-6 수용체에 대해 면역관용인 것을 이용하여, 당해 마우스에 상기 항체를 투여함으로써 내인성 인간 IL-6 수용체에 대해 획득 면역을 유도하는 것이 가능한지 여부가 검증되었다.

(4-2) 항체의 제작

마우스 FcRn에 대한 결합이 증강된 통상의 항인간 IL-6 수용체 항체로서 H54-mF3(서열번호：124) 및 L28-mCK(서열번호：125)를 포함하는 H54/L28-mF3가 제작되었다. pH 의존적 항인간 IL-6 수용체 IgG 항체로서 VH3-mIgG1(서열번호：126)과 VL3-mCK(서열번호：127)를 포함하는 Fv4-mIgG1 및 VH3-mIgG2a(서열번호：128)와 VL3-mCK(서열번호：127)를 포함하는 Fv4-mIgG2a가 제작되었다. 마우스 FcRn에 대한 결합이 증강된 pH 의존적 항인간 IL-6 수용체 IgG 항체로서 VH3-mF3(서열번호：129)와 VL3-mCK(서열번호：127)를 포함하는 Fv4-mF3 및 추가로 마우스 FcγR에 대한 결합도 증강된 VH3-mFa30(서열번호：130)과 VL3-mCK(서열번호：127)를 포함하는 Fv4-mFa30이 제작되었다. 이들 항체는 참고실시예 1에 기재한 방법을 사용하여 조제되었다.

(4-3) 마우스 FcRn 및 마우스 FcγR에 대한 친화성의 측정

(3-3)에서 나타내어진 방법에 준하여 측정된 값을 사용하여 제작된 Fv4-mIgG1, Fv4-mIgG2a, Fv4-mF3, Fv4-mFa30의 Fc 부분인 mIgG1, mIgG2a, mF3 및 mFa30의 마우스 FcRn에 대한 pH 7.0에 있어서의 친화성이 결정되었다.

FcγR의 세포외 도메인이 아래의 방법으로 조제되었다. 먼저 NCBI에 등록되어 있는 서열 정보를 토대로 FcγR의 세포외 도메인의 유전자가 당업자 공지의 방법으로 합성되었다. 구체적으로는 mFcγRI으로서 NCBI의 액세션번호 NP_034316(버젼번호 NP_034316.1), mFcγRII로서 NCBI의 액세션번호 NP_034317(버젼번호 NP_034317.1), FcγRIII로서 NCBI의 액세션번호 NP_034318(버젼번호 NP_034318.2), FcγRIV로서 NCBI의 액세션번호 NP_653142(버젼번호 NP_653142.2)로 표시되는 각 폴리펩티드의 C말단에 His 태그가 부가된 FcγR의 세포외 도메인을 코드하는 각 유전자가 제작되었다.

얻어진 유전자 단편이 동물세포 발현 벡터에 삽입된 발현 벡터가 제작되었다. 당해 발현 벡터가 인간 태아 신장암 세포 유래 FreeStyle293세포(Invitrogen)에 일과성으로 도입되어 목적 단백질이 발현된 형질 도입세포의 배양상청을 0.22 ㎛ 필터를 통과시켜 배양상청이 얻어졌다. 얻어진 배양상청으로부터 각 FcγR의 세포외 도메인이 원칙적으로 다음의 4개의 정제 단계；제1 단계는 이온 교환 칼럼크로마토그래피(제1 단계), His 태그에 대한 친화성 칼럼크로마토그래피(HisTrap HP)(제2 단계), 겔여과 칼럼크로마토그래피(Superdex200)(제3 단계), 무균 여과(제4 단계)에 의해 정제되었다. 제1 단계의 이온 교환 칼럼크로마토그래피의 칼럼으로서 mFcγRI의 정제에서는 Q Sepharose HP, mFcγRII 및 mFcγRIV의 정제에서는 SP Sepharose FF, mFcγRIII의 정제에서는 SP Sepharose HP가 사용되었다. 또한 제3 단계 이후의 정제에서는 용매로서 D-PBS(-)가 사용되었으나, mFcγRIII의 정제에서는 0.1 M 아르기닌을 포함하는 D-PBS(-)가 사용되었다. 정제된 FcγR의 세포외 도메인을 포함하는 용액의 280 nm에서의 흡광도가 분광광도계를 사용하여 측정되었다. PACE 등의 방법에 의해 산출된 흡광계수를 사용하여 상기 흡광도의 측정값으로부터 정제 FcγR의 세포외 도메인의 농도가 산출되었다(Protein Science (1995) 4, 2411-2423).

각 개변 항체와 상기와 같이 조제된 Fcγ 수용체의 세포외 도메인의 상호작용이 Biacore T100(GE 헬스케어), Biacore T200(GE 헬스케어), Biacore A100, Biacore 4000을 사용하여 해석되었다. 러닝 버퍼에는 HBS-EP+(GE 헬스케어)를 사용하고 측정온도는 25℃에서 당해 상호작용이 측정되었다. Series S Sensor Chip CM5(GE 헬스케어) 또는 Series S Sensor Chip CM4(GE 헬스케어)에 아민커플링법에 의해 Protein L(ACTIGEN 또는 BioVision)이 고정화된 칩이 사용되었다.

각 개변 항체를 캡쳐시킨 센서칩에 러닝 버퍼로 희석된 Fcγ 수용체의 세포외 도메인을 작용시켜서 측정된 당해 각 항체에 대한 당해 각 도메인의 결합량이 비교되었다. 단, Fcγ 수용체의 세포외 도메인의 결합량은 센서칩에 캡쳐시킨 항체의 양에 의존하기 때문에 각 항체의 캡쳐량으로 Fcγ 수용체의 세포외 도메인의 결합량을 나눈 보정값이 비교되었다. 또한 10 mM glycine-HCl, pH 1.5를 반응시킴으로써 센서칩에 캡쳐한 항체가 세정되어 재생된 센서칩이 반복해서 사용되었다.

또한 아래의 속도론적 해석방법에 따라 각 개변 항체의 Fcγ 수용체의 세포외 도메인에 대한 KD값이 산출되었다. 상기 센서칩에 목적의 항체를 캡쳐시키고 러닝 버퍼로 희석된 Fcγ 수용체의 세포외 도메인을 상호작용시켜, 얻어진 센서그램에 대해 Biacore Evaluation Software에 의해 측정결과를 1:1 Langmuir binding model로 global fitting시킴으로써 결합속도상수 ka(L/mol/s), 해리속도상수 kd(1/s)가 산출되었다. 그 산출값으로부터 해리상수 KD(mol/L)가 결정되었다.

mIgG1, mIgG2a, mF3 및 mFa30의 마우스 FcRn에 대한 친화성을 표 8, 마우스 FcγR에 대한 친화성을 표 9에 나타내었다.

(4-4) 항체의 투여 시험에 있어서의 항원(가용형 인간 IL-6 수용체)의 혈장 중 농도의 추이

다음으로 Fv4-mIgG1, Fv4-mIgG2a, Fv4-mF3, Fv4-mFa30 및 H54/L28-mF3가 투여된 인간 IL-6 수용체 녹인 마우스(참고실시예 25)로부터 경시적으로 채혈이 행해졌다. 채취된 혈액을 바로 4℃, 15,000 rpm으로 15분간 원심분리함으로써 혈장이 얻어졌다. 분리된 혈장은 측정을 실시할 때까지 -20℃ 이하로 설정된 냉동고에 보존되었다. 혈장 중 hsIL-6R 농도는 실시예 1에 기재한 방법과 동일한 방법으로 측정되었다.

항체 비투여군, Fv4-mIgG1, Fv4-mIgG2a, Fv4-mF3, Fv4-mFa30 및 H54/L28-mF3 투여군의 평균 혈장 중 hsIL-6R 농도 추이를 도 26에 나타내었다. Fv4-mIgG1, Fv4-mIgG2a 투여군의 혈장에 있어서 hsIL-6R 농도의 상승이 확인되었다. 한편 마우스 FcRn에 대한 결합이 증강된 Fv4-mF3, H54/L28-mF3 및 마우스 FcRn과 마우스 FcgR에 대한 결합이 증강된 Fv4-mFa30 투여군의 혈장에서는 항체 비투여군과 비교하여 hsIL-6R 농도의 현저한 감소가 확인되었다.

(4-5) 항체의 투여 시험에 있어서의 마우스에 의한 항원(가용형 인간 IL-6 수용체)에 대한 마우스 항체(마우스 항인간 IL-6 수용체 항체)의 항체가 추이

마우스의 혈장 중 항hsIL-6R 항체가는 전기화학 발광법으로 측정되었다. 50배로 희석된 마우스 혈장 시료와 30 ㎍/mL로 조제된 항Fv4 이디오타입 항체를 혼합하여 실온에서 1시간 반응시켰다. 동 이디오타입 항체는 Fv4-M73(WO2009/125825)을 토끼에 면역한 혈청을 이온 교환 수지로 정제 후, Fv4-M73이 고정화된 칼럼으로 친화성 정제하고, 그 후 인간 고정화 칼럼으로 흡수시켜서 얻어졌다. 상기 혼합용액에 대해 EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin and Biotinylation Kits(Pierce)로 비오틴화된 hsIL-6R을 1 ㎍/mL, SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)로 루테늄화된 SULFO-anti mouse IgG(H+L) antibody(BECKMAN COULTER)를 2 ㎍/mL를 포함하는 용액 50 ㎍/mL가 첨가, 혼합되어 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. 이때 측정시료 중에 포함되는 투여 검체가 hsIL-6R과 결합하여 투여 검체에 대한 ADA가 검출되는 것을 방지하는 것을 목적으로 과잉량의 항Fv4 이디오타입 항체가 시료에 사전에 첨가되었다. 그 후, 상기 반응액이 MA400 PR Streptavidin Plate(Meso Scale Discovery)에 분주되었다. 추가로 25℃에서 1시간 반응시킨 후에 세정된 각 웰에 Read Buffer T(×4)(Meso Scale Discovery)가 분주되고, 바로 각 웰 중의 반응액의 흡광도가 SECTOR PR 400 reader(Meso Scale Discovery)를 사용해서 측정되었다.

항체 비투여군, Fv4-mIgG1, Fv4-mIgG2a, Fv4-mF3, Fv4-mFa30 및 H54/L28-mF3 투여군의 각 개체의 마우스 항인간 IL-6 수용체 항체(항hsIL-6R 항체)의 항체가 추이를 도 27~도 31에 나타내었다. 그 결과, 마우스 FcRn으로의 결합이 증강되어 있지 않은 Fv4-mIgG1과 Fv4-mIgG2a 및 마우스 FcRn으로의 결합은 증강되어 있지만 인간 IL-6 수용체에 대해 pH 의존적으로 결합하지 않는 H54/L28-mF3가 투여된 군 중 어느 개체에 있어서도 마우스 항인간 IL-6 수용체 항체(항hsIL-6R 항체)의 항체가의 상승은 확인되지 않았다. 한편 마우스 FcRn으로의 결합이 증강된 pH 의존적 결합 항체인 Fv4-mF3 및 마우스 FcRn으로의 결합의 증강에 더하여 추가로 마우스 FcgR로의 결합이 증강된 pH 의존적 결합 항체인 Fv4-mFa30이 투여된 군에서는 마우스 항인간 IL-6 수용체 항체(항hsIL-6R 항체)의 항체가의 상승이 확인되는 개체가 존재한 것이 확인되었다.

이상의 사실로부터, 표적 항원에 대해 pH 의존적인 결합 활성을 가지며 또한 pH 7.4에 있어서의 FcRn에 대한 결합이 증강된 항원 결합 분자는 면역관용으로 되어 있는 내인성 표적 항원에 대해서도 획득 면역을 유도할 수 있는 것이 나타내어졌다. 이 사실로부터, 이러한 분자는 자기의 암항원에 대해서도 획득 면역을 유도하는 것이 가능한 것으로 생각되기 때문에 암치료제로서 매우 유망하다.

(참고실시예 1)

항체의 발현은 아래의 방법을 사용해서 행해졌다. 10% Fetal Bovine Serum(Invitrogen)을 포함하는 DMEM배지(Invitrogen)에 현탁된 인간 태아 신장암 세포 유래 HEK293H주(Invitrogen)가 5~6×10⁵세포/mL의 세포밀도로 접착세포용 접시(직경 10 ㎝, CORNING)의 각 접시로 10 mL씩 파종되었다. 당해 세포는 CO₂ 인큐베이터(37℃, 5% CO₂) 내에서 하루 배양된 후에, 배지가 흡인 제거된 당해 접시에 CHO-S-SFM-II(Invitrogen)배지 6.9 mL가 첨가되었다. 조제된 플라스미드가 lipofection법에 의해 세포로 도입되었다. 회수된 배양상청으로부터 원심분리(약 2000 g, 5분간, 실온)에 의해 세포가 제거되었다. 추가로 배양상청을 0.22 ㎛ 필터 MILLEX(R)-GV(Millipore)를 통과시켜 멸균함으로써 배양상청이 얻어졌다. 얻어진 배양상청으로부터 발현된 항체가 rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)를 사용하여 당업자 공지의 방법으로 정제되었다. 정제 항체의 농도는 분광광도계를 사용하여 280 nm에서의 흡광도의 측정값으로부터 Protein Science (1995) 4, 2411-2423에 기재된 방법으로 산출된 흡광계수를 사용하여 항체 농도가 산출되었다.

(참고실시예 2) 칼슘 이온에 결합하는 인간 생식세포 계열 서열의 탐색

(2-1) 칼슘 의존적으로 항원에 결합하는 항체

칼슘 의존적으로 항원에 결합하는 항체(칼슘 의존적 항원 결합 항체)는 칼슘의 농도에 따라 항원과의 상호작용이 변화되는 항체이다. 칼슘 의존적 항원 결합 항체는 칼슘 이온을 매개로 항원에 결합하는 것으로 생각되기 때문에, 항원측의 에피토프를 형성하는 아미노산은 칼슘 이온을 킬레이트하는 것이 가능한 음전하의 아미노산 또는 수소 결합 액셉터가 될 수 있는 아미노산이다. 이러한 에피토프를 형성하는 아미노산의 성질로부터 히스티딘을 도입함으로써 제작되는 pH 의존적으로 항원에 결합하는 결합 분자 이외의 에피토프를 타겟하는 것이 가능해진다. 또한 도 13에 나타내어지는 바와 같이 칼슘 의존성 및 pH 의존성으로 항원에 결합하는 성질을 겸비하는 항원 결합 분자를 사용함으로써 폭 넓은 성질을 갖는 다양한 에피토프를 각각 타겟하는 것이 가능한 항원 결합 분자를 제작하는 것이 가능해질 것으로 생각된다. 이에 칼슘이 결합하는 모티브를 포함하는 분자의 집합(Ca 라이브러리)을 구축하고, 이 분자의 집단으로부터 항원 결합 분자를 취득하면, 칼슘 의존적 항원 결합 항체가 효율적으로 얻어질 것으로 생각된다.

(2-2) 인간 생식세포 계열 서열의 취득

칼슘이 결합하는 모티브를 포함하는 분자 집합의 예로서, 당해 분자가 항체인 예를 생각할 수 있다. 바꿔 말하면 칼슘이 결합하는 모티브를 포함하는 항체 라이브러리가 Ca 라이브러리인 경우를 생각할 수 있다.

인간 생식세포 계열 서열을 포함하는 항체에서 칼슘 이온이 결합하는 것은 지금까지 보고되어 있지 않다. 이에 인간 생식세포 계열 서열을 포함하는 항체가 칼슘 이온과 결합하는지 여부를 판정하기 위해, Human Fetal Spreen Poly RNA(Clontech)로부터 조제된 cDNA를 주형으로 하여 인간 생식세포 계열 서열을 포함하는 항체의 생식세포 계열의 서열이 클로닝되었다. 클로닝된 DNA 단편은 동물세포 발현 벡터에 삽입되었다. 얻어진 발현 벡터의 염기서열이 당업자 공지의 방법으로 결정되고, 그 서열번호를 표 10에 나타내었다. 서열번호：5(Vk1), 서열번호：6(Vk2), 서열번호：7(Vk3), 서열번호：8(Vk4) 및 서열번호：43(Vk5)을 코드하는 폴리뉴클레오티드가 PCR법에 의해 천연형 Kappa쇄의 정상영역(서열번호：44)을 코드하는 폴리뉴클레오티드와 연결된 DNA 단편이 동물세포 발현용 벡터에 삽입되었다. 또한 서열번호：46(Vk1), 서열번호：47(Vk2), 서열번호：48(Vk3), 서열번호：49(Vk4) 및 서열번호：45(Vk5)를 코드하는 폴리뉴클레오티드가 PCR법에 의해 서열번호：11로 표시되는 IgG1의 C말단 2아미노산이 결실된 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드와 연결된 DNA 단편이 동물세포 발현용 벡터에 삽입되었다. 제작된 개변체의 서열은 당업자 공지의 방법으로 확인되었다.

(2-3) 항체의 발현과 정제

취득된 5종류의 인간 생식세포 계열 서열을 포함하는 DNA 단편이 삽입된 동물세포 발현 벡터가 동물세포로 도입되었다. 항체의 발현은 아래의 방법을 사용해서 행해졌다. 인간 태아 신장세포 유래 FreeStyle 293-F주(Invitrogen)가 FreeStyle 293 Expression Medium배지(Invitrogen)에 현탁되어, 1.33×10⁶ 세포/mL의 세포밀도로 6 웰 플레이트의 각 웰로 3 mL씩 파종되었다. 조제된 플라스미드는 리포펙션법에 의해 세포로 도입된다. CO₂ 인큐베이터(37도, 8% CO₂, 90 rpm) 중에서 4일간 배양이 행해졌다. rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)를 사용하고 당업자 공지의 방법을 사용하여 상기에서 얻어진 배양상청으로부터 항체가 정제되었다. 분광광도계를 사용하여 정제된 항체 용액의 280 nm에서의 흡광도가 측정되었다. PACE법에 의해 산출된 흡광계수를 이용함으로써 얻어진 측정값으로부터 항체 농도가 산출되었다(Protein Science (1995) 4, 2411-2423).

(2-4) 인간 생식세포 계열 서열을 포함하는 항체의 칼슘 이온 결합 활성의 평가

정제된 항체의 칼슘 이온 결합 활성이 평가되었다. 항체로의 칼슘 이온의 결합 평가의 지표로서 시차주사형 열량측정(DSC)에 의한 열변성 중간온도(Tm값)가 측정되었다(MicroCal VP-Capillary DSC, MicroCal). 열변성 중간온도(Tm값)는 안정성의 지표로, 칼슘 이온의 결합에 의해 단백질이 안정화되면, 열변성 중간온도(Tm값)는 칼슘 이온이 결합해 있지 않은 경우에 비해 높아진다(J. Biol. Chem. (2008) 283, 37, 25140-25149). 항체 용액 중의 칼슘 이온 농도의 변화에 따른 항체의 Tm값의 변화를 평가함으로써 항체로의 칼슘 이온의 결합 활성이 평가되었다. 정제된 항체가 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl₂(pH 7.4) 또는 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 3 μM CaCl₂(pH 7.4)의 용액을 외액으로 하는 투석(EasySEP, TOMY) 처리에 제공되었다. 투석에 사용된 용액을 사용하여 대략 0.1 ㎎/mL로 조제된 항체 용액을 피험물질로 하여, 20℃부터 115℃까지 240℃/hr의 승온속도로 DSC 측정이 행해졌다. 얻어진 DSC의 변성 곡선을 토대로 산출된 각 항체의 Fab 도메인의 열변성 중간온도(Tm값)를 표 11에 나타내었다.

그 결과 hVk1, hVk2, hVk3, hVk4 서열을 포함하는 항체의 Fab 도메인의 Tm값은 당해 Fab 도메인을 포함하는 용액 중의 칼슘 이온의 농도에 상관없이 변동되지 않았다. 한편으로 hVk5 서열을 포함하는 항체의 Fab 도메인의 Tm값은 당해 Fab 도메인을 포함하는 항체 용액 중의 칼슘 이온의 농도에 따라 변동된 것으로부터, hVk5 서열이 칼슘 이온과 결합하는 것이 나타내어졌다.

(2-5) hVk5-2 서열의 칼슘 결합 평가

참고실시예 2의 (2-2)에 있어서 Vk5-2(서열번호：43에 kppa쇄 정상영역인 서열번호：44가 융합된 서열번호：50) 외에 Vk5-2로 분류되는 Vk5-2 variant1(서열번호：51) 및 Vk5-2 variant2(서열번호：52)가 얻어졌다. 이들 variant의 칼슘 결합 활성도 평가되었다. Vk5-2, Vk5-2 variant1 및 Vk5-2 variant2의 DNA 단편이 각각 동물세포용 발현 벡터에 삽입되었다. 얻어진 발현 벡터의 염기서열은 당업자 공지의 방법으로 결정되었다. Vk5-2, Vk5-2 variant1 및 Vk5-2 variant2의 DNA 단편이 각각 삽입된 동물세포용 발현 벡터는 중쇄로서 CIM_H(서열번호：45)가 발현되도록 삽입된 동물 발현용 벡터와 참고실시예 2의 (2-3)에서 기재한 방법으로 모두 동물세포 중에 도입되어 항체가 정제되었다. 정제된 항체의 칼슘 이온 결합 활성이 평가되었다. 정제된 항체가 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl₂(pH 7.5) 또는 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl(pH 7.5)의 용액(표 12에서는 칼슘 이온 농도 0 mM로 표기)을 외액으로 하는 투석(EasySEP, TOMY) 처리에 제공되었다. 투석에 사용된 용액을 사용하여 대략 0.1 ㎎/mL로 조제된 항체 용액을 피험물질로 하여 20℃부터 115℃까지 240℃/hr의 승온속도로 DSC 측정이 행해졌다. 얻어진 DSC의 변성 곡선을 토대로 산출된 각 항체의 Fab 도메인의 열변성 중간온도(Tm값)를 표 12에 나타내었다.

그 결과, Vk5-2, Vk5-2 variant1 및 Vk5-2 variant2의 서열을 포함하는 항체의 Fab 도메인의 Tm값은 당해 Fab 도메인을 포함하는 항체 용액 중의 칼슘 이온의 농도에 따라 변동된 것으로부터, Vk5-2로 분류되는 서열을 갖는 항체는 칼슘 이온과 결합하는 것이 나타내어졌다.

(참고실시예 3) 인간 Vk5(hVk5) 서열의 평가

(3-1) hVk5 서열

Kabat 데이터베이스 중에는 hVk5 서열로서 hVk5-2 서열만이 등록되어 있다. 이하에서는 hVk5와 hVk5-2는 동일한 정의로 취급된다. WO2010/136598에서는 hVk5-2 서열의 생식세포 계열 서열 중의 존재비는 0.4%로 기재되어 있다. 다른 보고에서도 hVk5-2 서열의 생식세포 계열 서열 중의 존재비는 0~0.06%로 기술되어 있다(J. Mol. Biol. (2000) 296, 57-86, Proc. Natl. Acad. Sci. (2009) 106, 48, 20216-20221). 상기와 같이 hVk5-2 서열은 생식세포 계열 서열 중에서 출현 빈도가 낮은 서열이기 때문에, 인간 생식세포 계열 서열로 구성되는 항체 라이브러리나 인간 항체를 발현하는 마우스로의 면역에 의해 취득된 B세포로부터, 칼슘과 결합하는 항체를 취득하는 것은 비효율적으로 생각되었다. 이에 인간 hVk5-2 서열을 포함하는 Ca 라이브러리를 설계할 가능성이 생각되는데, 보고되어 있는 합성 항체 라이브러리(WO2010/105256이나 WO2010/136598)에서는 hVk5 서열은 포함되어 있지 않았다. 또한 hVk5-2 서열의 물성은 보고되어 있지 않아 그 가능성의 실현은 미지였다.

(3-2) 당쇄 비부가형 hVk5-2 서열의 구축, 발현 및 정제

hVk5-2 서열은 20번 위치(Kabat 넘버링)의 아미노산에 N형 당쇄가 부가되는 서열을 갖는다. 단백질에 부가하는 당쇄에는 이질성(heterogeneity)이 존재하기 때문에 물질의 균일성 관점에서 당쇄는 부가되지 않는 편이 바람직하다. 이에 20번 위치(Kabat 넘버링)의 Asn(N) 잔기가 Thr(T) 잔기로 치환된 개변체 hVk5-2_L65(서열번호：53)가 제작되었다. 아미노산의 치환은 QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)를 사용하는 당업자 공지의 방법으로 행해졌다. 개변체 hVk5-2_L65를 코드하는 DNA가 동물 발현용 벡터에 삽입되었다. 제작된 개변체 hVk5-2_L65의 DNA가 삽입된 동물 발현용 벡터는 중쇄로서 CIM_H(서열번호：45)가 발현되도록 삽입된 동물 발현용 벡터와, 참고실시예 2에서 기재한 방법으로 함께 동물세포 중에 도입되었다. 도입된 동물세포 중에서 발현된 hVk5-2_L65 및 CIM_H를 포함하는 항체가 참고실시예 2에서 기재한 방법으로 정제되었다.

(3-3) 당쇄 비부가형 hVk5-2 서열을 포함하는 항체의 물성 평가

취득된 개변 서열 hVk5-2_L65를 포함하는 항체가 개변에 제공된 원래의 hVk5-2 서열을 포함하는 항체보다도 그 이질성이 감소되어 있는지 여부가 이온 교환 크로마토그래피를 사용해서 분석되었다. 이온 교환 크로마토그래피의 방법을 표 13에 나타내었다. 분석 결과, 도 14에 나타낸 바와 같이 당쇄 부가 부위가 개변된 hVk5-2_L65는 원래의 hVk5-2 서열보다도 이질성이 감소되어 있는 것이 나타내어졌다.

다음으로 이질성이 감소된 hVk5-2_L65 서열을 포함하는 항체가 칼슘 이온과 결합하는지 여부가 참고실시예 2에 기재된 방법을 사용해서 평가되었다. 그 결과 표 14에 나타내어지는 바와 같이, 당쇄 부가 부위가 개변된 hVk5-2_L65를 포함하는 항체의 Fab 도메인의 Tm값도 항체 용액 중의 칼슘 이온의 농도 변화에 따라 변동되었다. 즉, 당쇄 부가 부위가 개변된 hVk5-2_L65를 포함하는 항체의 Fab 도메인에 칼슘 이온이 결합하는 것이 나타내어졌다.

(참고실시예 4) hVk5-2 서열의 CDR 서열을 포함하는 항체 분자에 대한 칼슘 이온의 결합 활성의 평가

(4-1) hVk5-2 서열의 CDR 서열을 포함하는 개변 항체의 제작, 발현 및 정제

hVk5-2_L65 서열은 인간 Vk5-2 서열의 프레임워크에 존재하는 당쇄 부가 부위의 아미노산이 개변된 서열이다. 참고실시예 3에서 당쇄 부가 부위를 개변해도 칼슘 이온이 결합하는 것이 나타내어졌으나, 프레임워크 서열은 생식세포 계열의 서열인 것이 면역원성의 관점에서 일반적으로는 바람직하다. 이에 항체의 프레임워크 서열을 당해 항체에 대한 칼슘 이온의 결합 활성을 유지하면서, 당쇄가 부가되지 않는 생식세포 계열 서열의 프레임워크 서열로 치환하는 것이 가능한지 여부가 검토되었다.

화학 합성된 hVk5-2 서열의 프레임워크 서열이 hVk1, hVk2, hVk3 및 hVk4 서열로 개변된 서열(각각 CaVk1(서열번호：54), CaVk2(서열번호：55), CaVk3(서열번호：56), CaVk4(서열번호：57)를 코드하는 폴리뉴클레오티드가, PCR법에 의해 천연형 Kappa쇄의 정상영역(서열번호：44)을 코드하는 폴리뉴클레오티드와 연결된 DNA 단편이 동물세포 발현용 벡터에 삽입되었다. 제작된 개변체의 서열은 당업자 공지의 방법으로 확인되었다. 상기와 같이 제작된 각 플라스미드는 CIM_H(서열번호：45)를 코드하는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 플라스미드와 함께 참고실시예 2에서 기재된 방법으로 동물세포에 도입되었다. 상기와 같이 도입된 동물세포의 배양액으로부터, 발현된 목적하는 항체 분자가 정제되었다.

(4-2) hVk5-2 서열의 CDR 서열을 포함하는 개변 항체의 칼슘 이온 결합 활성의 평가

hVk5-2 서열 이외의 생식세포 계열 서열(hVk1, hVk2, hVk3, hVk4)의 프레임워크 서열 및 hVK5-2 서열의 CDR 서열을 포함하는 개변 항체에, 칼슘 이온이 결합하는지 여부가 참고실시예 2에 기재된 방법으로 평가되었다. 평가된 결과가 표 15에 나타내어진다. 각 개변 항체의 Fab 도메인의 Tm값은 항체 용액 중의 칼슘 이온 농도의 변화에 따라 변동되는 것이 나타내어졌다. 따라서 hVk5-2 서열의 프레임워크 서열 이외의 프레임워크 서열을 포함하는 항체도 칼슘 이온과 결합하는 것이 나타내어졌다.

또한 hVk5-2 서열 이외의 생식세포 계열 서열(hVk1, hVk2, hVk3, hVk4)의 프레임워크 서열 및 hVK5-2 서열의 CDR 서열을 포함하도록 개변된 각 항체의 Fab 도메인의 열안정성 지표인 열변성 온도(Tm값)는 개변에 제공된 원래의 hVk5-2 서열을 포함하는 항체의 Fab 도메인의 Tm값보다도 증가하는 것이 명확해졌다. 이 결과로부터, hVk1, hVk2, hVk3, hVk4의 프레임워크 서열 및 hVk5-2 서열의 CDR 서열을 포함하는 항체는 칼슘 이온과 결합하는 성질을 가질 뿐 아니라, 열안정성의 관점에서도 우수한 분자인 것이 발견되었다.

(참고실시예 5) 인간 생식세포 계열 hVk5-2 서열에 존재하는 칼슘 이온 결합 부위의 동정

(5-1) hVk5-2 서열의 CDR 서열 중의 변이 부위의 설계

참고실시예 4에 기재한 바와 같이, hVk5-2 서열의 CDR 부분이 다른 생식세포 계열의 프레임워크 서열에 도입된 경쇄를 포함하는 항체도 칼슘 이온과 결합하는 것이 나타내어졌다. 이 결과로부터 hVk5-2에 존재하는 칼슘 이온 결합 부위는 CDR 중에 존재하는 것이 시사되었다. 칼슘 이온과 결합하는 즉, 칼슘 이온을 킬레이트하는 아미노산으로서 음전하의 아미노산 또는 수소 결합의 액셉터가 될 수 있는 아미노산을 들 수 있다. 이에 hVk5-2 서열의 CDR 서열 중에 존재하는 Asp(D) 잔기 또는 Glu(E) 잔기가 Ala(A) 잔기로 치환된 변이 hVk5-2 서열을 포함하는 항체가 칼슘 이온과 결합하는지 여부가 평가되었다.

(5-2) hVk5-2 서열의 Ala 치환체의 제작 및 항체의 발현 및 정제

hVk5-2 서열의 CDR 서열 중에 존재하는 Asp 및/ 또는 Glu 잔기가 Ala 잔기로 개변된 경쇄를 포함하는 항체 분자가 제작되었다. 참고실시예 3에서 기재되는 바와 같이, 당쇄가 부가되지 않는 개변체 hVk5-2_L65는 칼슘 이온 결합을 유지하고 있었던 것으로부터, 칼슘 이온 결합성이라는 관점에서는 hVk5-2 서열과 동등하다고 생각된다. 본 참고실시예에서는 hVk5-2_L65를 템플레이트 서열로 하여 아미노산 치환이 행해졌다. 제작된 개변체를 표 16에 나타내었다. 아미노산의 치환은 QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene), PCR 또는 In fusion Advantage PCR cloning kit(TAKARA) 등의 당업자 공지의 방법에 의해 행해져, 아미노산이 치환된 개변 경쇄의 발현 벡터가 구축되었다.

얻어진 발현 벡터의 염기서열은 당업자 공지의 방법으로 결정되었다. 제작된 개변 경쇄의 발현 벡터를 중쇄 CIM_H(서열번호：45)의 발현 벡터와 함께, 인간 태아 신장 암세포 유래 HEK293H주(Invitrogen), 또는 FreeStyle293세포(Invitrogen)에 일과성으로 도입함으로써 항체를 발현시켰다. 얻어진 배양상청으로부터, rProtein A SepharoseTM Fast Flow(GE헬스케어)를 사용하여 당업자 공지의 방법으로 항체가 정제되었다. 정제된 항체 용액의 280 nm에서의 흡광도가 분광광도계를 사용하여 측정되었다. PACE법에 의해 산출된 흡광계수를 이용함으로써 얻어진 측정값으로부터 항체 농도가 산출되었다(Protein Science (1995) 4, 2411-2423).

(5-3) hVk5-2 서열의 Ala 치환체를 포함하는 항체의 칼슘 이온 결합 활성 평가

얻어진 정제 항체가 칼슘 이온과 결합하는지 여부가 참고실시예 2에 기재된 방법에 의해 판정되었다. 그 결과를 표 17에 나타내었다. hVk5-2 서열의 CDR 서열 중에 존재하는 Asp 또는 Glu 잔기를 칼슘 이온의 결합 또는 킬레이트에 관여할 수 없는 Ala 잔기로 치환함으로써, 항체 용액의 칼슘 이온 농도의 변화에 따라 그 Fab 도메인의 Tm값이 변동되지 않는 항체가 존재하였다. Ala 치환에 의해 Tm값이 변동되지 않는 치환 부위(32번 위치 및 92번 위치(Kabat 넘버링))는 칼슘 이온과 항체의 결합에 특히 중요한 것이 나타내어졌다.

(참고실시예 6) 칼슘 이온 결합 모티브를 갖는 hVk1 서열을 포함하는 항체의 칼슘 이온 결합 활성의 평가

(6-1) 칼슘 이온 결합 모티브를 갖는 hVk1 서열의 제작, 항체의 발현 및 정제

참고실시예 4에서 기재된 Ala 치환체의 칼슘의 결합 활성의 결과로부터, hVk5-2 서열의 CDR 서열 중에서 Asp나 Glu 잔기가 칼슘 결합에 중요한 것이 나타내어졌다. 이에 30번 위치, 31번 위치, 32번 위치, 50번 위치 및 92번 위치(Kabat 넘버링)의 잔기만을 다른 생식세포 계열의 가변영역 서열에 도입해도 칼슘 이온과 결합할 수 있는지 여부가 평가되었다. 구체적으로는 인간 생식세포계 서열인 hVk1 서열의 30번 위치, 31번 위치, 32번 위치, 50번 위치 및 92번 위치(Kabat 넘버링)의 잔기가 hVk5-2 서열의 30번 위치, 31번 위치, 32번 위치, 50번 위치 및 92번 위치(Kabat 넘버링)의 잔기로 치환된 개변체 LfVk1_Ca(서열번호：66)가 제작되었다. 즉, hVk5-2 서열 중의 이들의 5 잔기만이 도입된 hVk1 서열을 포함하는 항체가 칼슘과 결합할 수 있는지 여부가 판정되었다. 개변체의 제작은 참고실시예 5와 동일하게 행해졌다. 얻어진 경쇄 개변체 LfVk1_Ca 및 경쇄 hVk1 서열을 포함하는 LfVk1(서열번호：67)을 중쇄 CIM_H(서열번호：45)와 함께 발현시켰다. 항체의 발현 및 정제는 참고실시예 4와 동일한 방법으로 실시되었다.

(6-2) 칼슘 이온 결합 모티브를 갖는 인간 hVk1 서열을 포함하는 항체의 칼슘 이온 결합 활성의 평가

상기와 같이 얻어진 정제 항체가 칼슘 이온과 결합하는지 여부가 참고실시예 2에 기재된 방법으로 판정되었다. 그 결과를 표 18에 나타낸다. hVk1 서열을 갖는 LfVk1을 포함하는 항체의 Fab 도메인의 Tm값은 항체 용액 중의 칼슘의 농도 변화에 따라서는 변동되지 않는 한편으로, LfVk1_Ca를 포함하는 항체 서열의 Tm값은 항체 용액 중의 칼슘의 농도 변화에 따라 1℃ 이상 변화된 것으로부터, LfVk1_Ca를 포함하는 항체가 칼슘과 결합하는 것이 나타내어졌다. 상기 결과로부터, 칼슘 이온의 결합에는 hVk5-2의 CDR 서열이 모두 필요하지 않고, LfVk1_Ca 서열을 구축할 때 도입된 잔기만으로도 충분한 것이 나타내어졌다.

(참고실시예 7) Ca 농도 의존적으로 항원에 결합하는 결합 항체를 효율적으로 취득할 수 있도록, 칼슘 이온 결합 모티브가 가변영역에 도입된 항체 분자의 집단(Ca 라이브러리)의 설계

칼슘 결합 모티브로서, 예를 들면 hVk5-2 서열이나 그의 CDR 서열, 추가로 잔기가 좁혀진 30번 위치, 31번 위치, 32번 위치, 50번 위치, 92번 위치(Kabat 넘버링)를 바람직하게 들 수 있다. 그 밖에도 칼슘과 결합하는 단백질이 갖는 EF 핸드 모티브(칼모듈린 등)나 C타입 렉틴(ASGPR 등)도 칼슘 결합 모티브에 해당한다.

Ca 라이브러리는 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역으로 구성된다. 중쇄 가변영역은 인간 항체 서열이 사용되고, 경쇄 가변영역에 칼슘 결합 모티브가 도입되었다. 칼슘 결합 모티브가 도입되는 경쇄 가변영역의 템플레이트 서열로서 hVk1 서열이 선택되었다. hVk1 서열에 칼슘 결합 모티브 중 하나인 hVk5-2의 CDR 서열이 도입된 LfVk1_Ca 서열을 포함하는 항체는 참고실시예 5에서 나타낸 바와 같이 칼슘 이온과 결합하는 것이 나타내어졌다. 템플레이트 서열에 복수의 아미노산을 출현시켜서 라이브러리를 구성하는 항원 결합 분자의 다양성이 확대되었다. 복수의 아미노산을 출현시키는 위치는 항원과 상호작용할 가능성이 높은 가변영역의 표면에 노출되는 위치가 선택되었다. 구체적으로는 30번 위치, 31번 위치, 32번 위치, 34번 위치, 50번 위치, 53번 위치, 91번 위치, 92번 위치, 93번 위치, 94번 위치 및 96번 위치(Kabat 넘버링)가 이러한 플렉시블 잔기로서 선택되었다.

다음으로 출현시키는 아미노산 잔기의 종류와 그의 출현율이 설정되었다. Kabat 데이터베이스(KABAT, E.A. ET AL.: 'Sequences of proteins of immunological interest', vol. 91, 1991, NIH PUBLICATION)에 등록되어 있는 hVk1과 hVk3의 서열 중의 플렉시블 잔기에 있어서의 아미노산의 출현 빈도가 해석되었다. 해석 결과를 토대로 각 위치에서 출현 빈도가 높은 아미노산으로부터 Ca 라이브러리에서 출현시키는 아미노산의 종류가 선택되었다. 이때 아미노산의 성질이 치우치지 않도록 해석 결과에서는 출현 빈도가 적은 것으로 판정된 아미노산도 선택되었다. 또한 선택된 아미노산의 출현 빈도는 Kabat 데이터베이스의 해석 결과를 참고로 하여 설정되었다.

이상과 같이 설정된 아미노산 및 출현 빈도를 고려함으로써 Ca 라이브러리로서 칼슘 결합 모티브를 포함하고, 당해 모티브 이외의 각 잔기에서 복수의 아미노산을 포함하는 서열의 다양성이 중시된 Ca 라이브러리가 설계되었다. 표 1 및 2에 Ca 라이브러리의 상세한 디자인을 나타내었다(각 표 중의 위치는 Kabat 넘버링을 나타낸다). 또한 표 1 및 2에서 기재된 아미노산의 출현 빈도는 Kabat 넘버링으로 표시되는 92번 위치가 Asn(N)인 경우 94번 위치는 Ser(S)이 아니라 Leu(L)로 할 수 있다.

(참고실시예 8) Ca 라이브러리의 제작

인간 PBMC로부터 제작한 폴리 A RNA나 시판되고 있는 인간 폴리 A RNA 등을 주형으로 하여 PCR법에 의해 항체 중쇄 가변영역의 유전자 라이브러리가 증폭되었다. 항체 경쇄 가변영역 부분에 대해서는 참고실시예 7에 기재된 바와 같이, 칼슘 결합 모티브를 유지하여 칼슘 농도 의존적으로 항원에 대해 결합 가능한 항체의 출현 빈도를 높인 항체 가변영역 경쇄 부분이 설계되었다. 또한 플렉시블 잔기 중 칼슘 결합 모티브가 도입된 잔기 이외의 아미노산 잔기로서, 천연 인간 항체에서의 아미노산 출현 빈도의 정보((KABAT, E.A. ET AL.: 'Sequences of proteins of immunological interest', vol. 91, 1991, NIH PUBLICATION)가 참고로 되고, 천연 인간 항체의 서열 중에서 출현 빈도가 높은 아미노산을 균등하게 분포시킨 항체 경쇄 가변영역의 라이브러리가 설계되었다. 이와 같이 제작된 항체 중쇄 가변영역의 유전자 라이브러리와 항체 경쇄 가변영역의 유전자 라이브러리의 조합이 파지미드 벡터로 삽입되어, 인간 항체 서열로 이루어지는 Fab 도메인을 제시하는 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리(Methods Mol Biol. (2002) 178, 87-100)가 구축되었다.

항체 유전자 라이브러리가 도입된 대장균으로부터 단리된 항체 유전자 부분에 대한 서열이 확인되었다. 얻어진 290종류의 클론의 서열의 아미노산 분포와 설계한 아미노산 분포를 도 15에 나타내었다.

(참고실시예 9) Ca 라이브러리에 포함되는 분자의 칼슘 이온 결합 활성의 평가

(9-1) Ca 라이브러리에 포함되는 분자의 칼슘 이온 결합 활성

참고실시예 3에 나타낸 바와 같이, 칼슘 이온과 결합하는 것이 나타내어진 hVk5-2 서열은 생식세포 계열 서열 중에서 출현 빈도가 낮은 서열이기 때문에, 인간 생식세포 계열 서열로 구성되는 항체 라이브러리나 인간 항체를 발현하는 마우스로의 면역에 의해 취득된 B세포로부터 칼슘과 결합하는 항체를 취득하는 것은 비효율적이라고 생각되었다. 이에 참고실시예 8에서 Ca 라이브러리가 구축되었다. 구축된 Ca 라이브러리에 칼슘 결합을 나타내는 클론이 존재하는지 평가되었다.

(9-2) 항체의 발현과 정제

Ca 라이브러리에 포함되는 클론이 동물세포 발현용 플라스미드로 도입된다. 항체의 발현은 아래의 방법을 사용해서 행해졌다. 인간 태아 신장세포 유래 FreeStyle 293-F주(Invitrogen)가 FreeStyle 293 Expression Medium배지(Invitrogen)에 현탁되어, 1.33×10⁶ 세포/mL의 세포밀도로 6 웰 플레이트의 각 웰로 3 mL씩 파종되었다. 조제된 플라스미드는 리포펙션법에 의해 세포로 도입되었다. CO₂ 인큐베이터(37℃, 8% CO₂, 90 rpm) 중에서 4일간 배양이 행해졌다. rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)를 사용하고 당업자 공지의 방법을 사용하여 상기에서 얻어진 배양상청으로부터 항체가 정제되었다. 분광광도계를 사용하여 정제된 항체 용액의 280 nm에서의 흡광도가 측정되었다. PACE법에 의해 산출된 흡광계수를 이용함으로써 얻어진 측정값으로부터 항체 농도가 산출되었다(Protein Science (1995) 4, 2411-2423).

(9-3) 취득된 항체로의 칼슘 이온 결합 평가

상기와 같이 얻어진 정제 항체가 칼슘 이온과 결합하는지 여부가 실시예 6에 기재된 방법으로 판정되었다. 그 결과를 표 19에 나타낸다. Ca 라이브러리에 포함되는 복수의 항체의 Fab 도메인의 Tm은 칼슘 이온 농도에 따라 변동되어, 칼슘 이온과 결합하는 분자가 포함되는 것이 나타내어졌다.

(참고실시예 10) Ca 의존적으로 IL-6 수용체에 결합하는 항체의 취득

(10-1) 비드 패닝에 의한 라이브러리로부터의 Ca 의존적으로 항원에 결합하는 항체 단편의 취득

구축된 Ca 의존적으로 IL-6 수용체에 결합하는 항체 라이브러리로부터의 최초의 선발은 항원(IL-6 수용체)으로의 결합능을 갖는 항체 단편만의 농축에 의해 실시되었다.

구축한 파지 디스플레이용 파지미드를 보유한 대장균으로부터 파지 생산이 행해졌다. 파지 생산이 행해진 대장균의 배양액에 2.5 M NaCl/10% PEG를 첨가함으로써 침전시킨 파지의 집단을 TBS로 희석함으로써 파지 라이브러리액이 얻어졌다. 다음으로 파지 라이브러리액에 BSA 및 CaCl₂를 첨가함으로써 최종 농도 4%BSA, 1.2 mM 칼슘 이온이 되도록 조제되었다. 패닝방법으로서 일반적인 방법인 자기 비드에 고정화한 항원을 사용한 패닝방법이 참조되었다(J. Immunol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9, J. Immunol. Methods. (2001) 247 (1-2), 191-203, Biotechnol. Prog. (2002) 18(2) 212-20, Mol. Cell Proteomics (2003) 2 (2), 61-9). 자기 비드로서 NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated) 또는 Streptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)가 사용되었다.

구체적으로는 조제된 파지 라이브러리액에 250 pmol의 비오틴 표지 항원을 첨가함으로써 당해 파지 라이브러리액을 실온에서 60분간 항원과 접촉시켰다. BSA로 블로킹된 자기 비드가 첨가되고 항원과 파지의 복합체를 자기 비드와 실온에서 15분간 결합시켰다. 비드는 1 mL의 1.2 mM CaCl₂/TBST(1.2 mM CaCl₂를 포함하는 TBST)로 3회 세정된 후, 1 mL의 1.2 mM CaCl₂/TBS(1.2 mM CaCl₂를 포함하는 TBS)로 추가로 2회 세정되었다. 그 후, 1 ㎎/mL의 트립신 0.5 mL가 첨가된 비드는 실온에서 15분 현탁된 후, 바로 자기 스탠드를 사용하여 비드가 분리되고 파지용액이 회수되었다. 회수된 파지 용액이 대수증식기(OD600이 0.4-0.7)가 된 10 mL의 대장균주 ER2738에 첨가되었다. 37℃에서 1시간 완만하게 상기 대장균의 교반배양을 행함으로써 파지를 대장균에 감염시켰다. 감염시킨 대장균은 225 mm×225 mm의 플레이트로 파종되었다. 다음으로 파종된 대장균의 배양액으로부터 파지를 회수함으로써 파지 라이브러리액이 조제되었다.

2회째의 패닝에서는 항원 결합능 또는 Ca 의존적 결합능을 지표로 파지의 농축이 행해졌다.

구체적으로는 항원 결합능을 지표로 농축을 행하였을 때는 조제한 파지 라이브러리액에 40 pmol의 비오틴 효지 항원을 첨가함으로써 파지 라이브러리를 실온에서 60분간 항원과 접촉시켰다. BSA로 블로킹된 자기 비드가 첨가되고 항원과 파지의 복합체를 자기 비드와 실온에서 15분간 결합시켰다. 비드는 1 mL의 1.2 mM CaCl₂/TBST로 3회, 1.2 mM CaCl₂/TBS로 2회 세정되었다. 그 후, 1 ㎎/mL의 트립신 0.5 mL가 첨가된 비드는 실온에서 15분 현탁된 후, 바로 자기 스탠드를 사용하여 비드가 분리되고 파지 용액이 회수되었다. 회수된 파지 용액에 100 ㎎/mL의 트립신 5 μL를 첨가함으로써 Fab를 제시하지 않는 파지의 pIII 단백질(헬퍼 파지 유래의 pIII 단백질)이 절단되어 Fab를 제시하지 않는 파지의 대장균에 대한 감염능을 상실시켰다. 회수된 파지 용액이 대수증식기(OD600이 0.4-0.7)가 된 10 mL의 대장균주 ER2738에 첨가되었다. 37℃에서 1시간 완만하게 상기 대장균의 교반배양을 행함으로써 파지를 대장균에 감염시켰다. 감염시킨 대장균은 225 mm×225 mm의 플레이트로 파종되었다. 다음으로 파종된 대장균의 배양액으로부터 파지를 회수함으로써 파지 라이브러리액이 회수되었다.

Ca 의존적 결합능을 지표로 농축을 행하였을 때는 조제한 파지 라이브러리액에 40 pmol의 비오틴 표지 항원을 첨가함으로써 파지 라이브러리를 실온에서 60분간 항원과 접촉시켰다. BSA로 블로킹된 자기 비드가 첨가되고, 항원과 파지의 복합체를 자기 비드와 실온에서 15분간 결합시켰다. 비드는 1 mL의 1.2 mM CaCl₂/TBST와 1.2 mM CaCl₂/TBS로 세정되었다. 그 후, 0.1 mL의 2 mM EDTA/TBS(2 mM의 EDTA를 포함하는 TBS)가 첨가된 비드는 실온에서 현탁된 후 바로 자기 스탠드를 사용하여 비드가 분리되고 파지 용액이 회수되었다. 회수된 파지 용액에 100 ㎎/mL의 트립신 5 μL를 첨가함으로써, Fab를 제시하지 않는 파지의 pIII 단백질(헬퍼 파지 유래의 pIII 단백질)이 절단되어 Fab를 제시하지 않는 파지의 대장균에 대한 감염능을 상실시켰다. 회수된 파지 용액이 대수증식기(OD600이 0.4-0.7)가 된 10 mL의 대장균주 ER2738에 첨가되었다. 37℃에서 1시간 완만하게 상기 대장균의 교반배양을 행함으로써 파지를 대장균에 감염시켰다. 감염시킨 대장균은 225 ㎜×225 ㎜의 플레이트로 파종되었다. 다음으로 파종된 대장균의 배양액으로부터 파지를 회수함으로써 파지 라이브러리액이 회수되었다.

(10-2) 파지 ELISA에 의한 평가

상기 방법에 의해 얻어진 대장균의 싱글 콜로니로부터 통상의 방법(Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145)에 따라 파지 함유 배양상청이 회수되었다.

BSA 및 CaCl₂가 첨가된 파지를 함유하는 배양상청이 아래의 순서로 ELISA에 제공되었다. StreptaWell 96마이크로타이터 플레이트(Roche)가 비오틴 표지 항원을 포함하는 100 μL의 PBS로 하룻밤 코트되었다. 당해 플레이트의 각 웰을 PBST로 세정함으로써 항원이 제거된 후, 당해 웰이 4% BSA-TBS 250 μL로 1시간 이상 블로킹되었다. 4% BSA-TBS가 제거된 각 웰에 조제된 배양상청이 첨가된 당해 플레이트를 37℃에서 1시간 정치함으로써 파지를 제시하는 항체를 각 웰에 존재하는 항원에 결합시켰다. 1.2 mM CaCl₂/TBST로 세정된 각 웰에 1.2 mM CaCl₂/TBS 또는 1 mM EDTA/TBS가 첨가되고, 당해 플레이트는 37℃에서 30분간 정치하고 인큐베이트되었다. 1.2 mM CaCl₂/TBST로 세정된 후에, 이온화 칼슘 농도 1.2 mM로 한 TBS에 의해 희석된 HRP 결합 항M13 항체(Amersham Pharmacia Biotech)가 각 웰에 첨가된 플레이트를 1시간 인큐베이트시켰다. 1.2 mM CaCl₂/TBST로 세정 후, TMB single 용액(ZYMED)이 첨가된 각 웰 중의 용액의 발색반응이 황산의 첨가에 의해 정지된 후, 450 nm의 흡광도에 의해 당해 발색이 측정되었다.

상기 파지 ELISA를 실시한 클론에 대해 특이적인 프라이머를 사용하여 증폭된 유전자의 염기서열 해석이 행해졌다. 파지 ELISA, 서열 해석 결과를 아래의 표20에 나타내었다.

(10-3) 항체의 발현과 정제

파지 ELISA의 결과, Ca 의존적인 항원에 대한 결합능이 있다고 판단된 클론이 동물세포 발현용 플라스미드로 도입되었다. 항체의 발현은 아래의 방법을 사용해서 행해졌다. 인간 태아 신장세포 유래 FreeStyle 293-F주(Invitrogen)가 FreeStyle 293 Expression Medium배지(Invitrogen)에 현탁되고, 1.33×10⁶세포/mL의 세포밀도로 6웰 플레이트의 각 웰로 3 mL씩 파종되었다. 조제된 플라스미드는 리포펙션법으로 세포로 도입되었다. CO₂ 인큐베이터(37도, 8% CO₂, 90 rpm) 중에서 4일간 배양이 행해졌다. rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)를 사용하고 당업자 공지의 방법을 사용하여 상기에서 얻어진 배양상청으로부터 항체가 정제되었다. 분광광도계를 사용하여 정제된 항체 용액의 280 nm에서의 흡광도가 측정되었다. PACE법에 의해 산출된 흡광계수를 사용함으로써 얻어진 측정값으로 항체 농도가 산출되었다(Protein Science (1995) 4, 2411-2423).

(10-4) 취득된 항체의 인간 IL-6 수용체에 대한 Ca 의존적 결합능의 평가

참고실시예 9에서 취득된 항체 6RC1IgG_010(중쇄 서열번호：90, 경쇄 서열번호：91), 6RC1IgG_012(중쇄 서열번호：92, 경쇄 서열번호：93), 및 6RC1IgG_019(중쇄 서열번호：94, 경쇄 서열번호：95)의 인간 IL-6 수용체에 대한 결합 활성이 Ca 의존적인지 여부를 판단하기 위해, 이들 항체와 인간 IL-6 수용체의 상호작용 해석이 Biacore T100(GE Healthcare)을 사용해서 행해졌다. 인간 IL-6 수용체에 대한 Ca 의존성의 결합 활성을 갖지 않는 대조 항체로서 토실리주맙(중쇄 서열번호：96, 경쇄 서열번호：97)이 사용되었다. 고칼슘 이온 농도 및 저칼슘 이온 농도의 조건으로서 각각 1.2 mM 및 3 μM의 칼슘 이온 농도의 용액 중에서 상호작용 해석이 행해졌다. 아민커플링법으로 protein A/G(Invitrogen)가 적당량 고정화된 Sensor chip CM5(GE Healthcare) 상에 목적의 항체가 캡쳐되었다. 러닝 버퍼에는 20 mM ACES, 150 mM NaCl, 0.05% (w/v) Tween20, 1.2 mM CaCl₂(pH 7.4) 또는 20 mM ACES, 150 mM NaCl, 0.05% (w/v) Tween20, 3 μM CaCl₂(pH 7.4)의 2종류의 완충액이 사용되었다. 인간 IL-6 수용체의 희석에도 각각의 버퍼가 사용되었다. 측정은 모두 37℃에서 실시되었다.

대조 항체인 토실리주맙 항체, 6RC1IgG_010 항체, 6RC1IgG_012 항체 및 6RC1IgG_019 항체를 사용한 항원 항체 반응의 상호작용 해석시에, IL-6 수용체의 희석액과 블랭크인 러닝 버퍼를 유속 5 μL/min로 3분간 인젝트함으로써 센서칩 상에 캡쳐시킨 토실리주맙 항체, 6RC1IgG_010 항체, 6RC1IgG_012 항체 및 6RC1IgG_019 항체에 IL-6 수용체를 상호작용시켰다. 그 후, 10 mM Glycine-HCl(pH 1.5)을 유속 30 μL/min로 30초간 인젝트함으로써 센서칩이 재생되었다.

이 방법으로 측정된 고칼슘 이온 농도에 있어서의 센서그램을 도 16에 나타내었다.

저칼슘 이온 농도의 조건하에서의 토실리주맙 항체, 6RC1IgG_010 항체, 6RC1IgG_012 항체 및 6RC1IgG_019 항체에 대한 센서그램도 동일한 방법으로 취득하였다. 저칼슘 이온 농도에 있어서의 센서그램을 도17에 나타내었다.

상기 결과로부터, 6RC1IgG_010 항체, 6RC1IgG_012 항체 및 6RC1IgG_019 항체는 버퍼 중의 칼슘 이온 농도를 1.2 mM 내지 3 μM로 함으로써 IL6 수용체에 대한 결합능이 대폭 저감되는 것이 관찰되었다.

(참고실시예 11) 파지 디스플레이 기술을 사용한 인간 항체 라이브러리로부터의 Ca 의존적으로 IL-6 수용체에 결합하는 항체의 취득

(11-1) 나이브 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리의 제작

인간 PBMC로부터 제작한 폴리 A RNA나 시판되고 있는 인간 폴리 A RNA 등을 주형으로 하여 당업자에게 공지인 방법에 따라 서로 다른 인간 항체 서열의 Fab 도메인을 제시하는 복수의 파지로 이루어지는 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리가 구축되었다.

(11-2) 비드 패닝에 의한 라이브러리로부터의 Ca 의존적으로 항원에 결합하는 항체 단편의 취득

구축된 나이브 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리로부터의 최초의 선발은 항원(IL-6 수용체)으로의 결합능을 갖는 항체 단편만의 농축 또는 Ca 농도 의존적인 항원(IL-6 수용체)으로의 결합능을 지표로 한 항체 단편의 농축에 의해 실시되었다. Ca 농도 의존적인 항원(IL-6 수용체)으로의 결합능을 지표로서 항체 단편의 농축은 Ca 이온을 킬레이트하는 EDTA를 사용하여 Ca 이온 존재하에서 IL-6 수용체와 결합시킨 파지 라이브러리로부터 파지를 용출함으로써 실시되었다. 항원으로서 비오틴 표지된 IL-6 수용체가 사용되었다.

구축한 파지 디스플레이용 파지미드를 보유한 대장균으로부터 파지 생산이 행해졌다. 파지 생산이 행해진 대장균의 배양액에 2.5 M NaCl/10% PEG를 첨가함으로써 침전시킨 파지의 집단을 TBS로 희석함으로써 파지 라이브러리액이 얻어졌다. 다음으로 파지 라이브러리액에 최종농도 4%BSA 및 1.2 mM 칼슘 이온 농도가 되도록 BSA 및 CaCl₂가 첨가되었다. 패닝방법으로서 일반적인 방법인 자기 비드에 고정화한 항원을 사용한 패닝방법이 참조되었다(J. Immunol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9, J. Immunol. Methods. (2001) 247 (1-2), 191-203, Biotechnol. Prog. (2002) 18(2) 212-20, Mol. Cell Proteomics (2003) 2 (2), 61-9). 자기 비드로서 NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated) 또는 Streptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)가 사용되었다.

구체적으로는 조제된 파지 라이브러리액에 250 pmol의 비오틴 표지 항원을 첨가함으로써 당해 파지 라이브러리액을 실온에서 60분간 항원과 접촉시켰다. BSA로 블로킹된 자기 비드가 첨가되고, 항원과 파지의 복합체를 자기 비드와 실온에서 15분간 결합시켰다. 비드는 1 mL의 1.2 mM CaCl₂/TBS(1.2 mM CaCl₂를 포함하는 TBS)로 1회 세정되었다. 그 후 IL-6 수용체로의 결합능을 갖는 항체 단편을 농축하는 경우에는, 일반적인 방법에 의한 용출에 의해 Ca 농도 의존적인 IL-6 수용체로의 결합능을 지표로서 항체 단편을 농축하는 경우에는, 2 mM EDTA/TBS(2mM EDTA를 포함하는 TBS)에 현탁된 비드로부터의 용출에 의해 파지 용액이 회수되었다. 회수된 파지 용액이 대수증식기(OD600이 0.4-0.7)가 된 10 mL의 대장균주 TG1에 첨가되었다. 37℃에서 1시간 완만하게 상기 대장균의 교반배양을 행함으로써 파지를 대장균에 감염시켰다. 감염시킨 대장균은 225 ㎜×225 ㎜의 플레이트로 파종되었다. 다음으로 파종된 대장균의 배양액으로부터 파지를 회수함으로써 파지 라이브러리액이 조제되었다.

2회째 이후의 패닝에서는 Ca 의존적 결합능을 지표로 파지의 농축이 행해졌다. 구체적으로는 조제한 파지 라이브러리액에 40 pmol의 비오틴 표지 항원을 첨가함으로써 파지 라이브러리를 실온에서 60분간 항원과 접촉시켰다. BSA로 블로킹된 자기 비드가 첨가되고, 항원과 파지의 복합체를 자기 비드와 실온에서 15분간 결합시켰다. 비드는 1 mL의 1.2 mM CaCl₂/TBST와 1.2 mM CaCl₂/TBS로 세정되었다. 그 후 0.1 mL의 2 mM EDTA/TBS가 첨가된 비드는 실온에서 현탁된 후, 바로 자기 스탠드를 사용하여 비드가 분리되고 파지 용액이 회수되었다. 회수된 파지 용액이 대수증식기(OD600이 0.4-0.7)가 된 10 mL의 대장균주 TG1에 첨가되었다. 37℃에서 1시간 완만하게 상기 대장균의 교반배양을 행함으로써 파지를 대장균에 감염시켰다. 감염시킨 대장균은 225 ㎜×225 ㎜의 플레이트로 파종되었다. 다음으로 파종된 대장균의 배양액으로부터 파지를 회수함으로써 파지 라이브러리액이 회수되었다. Ca 의존적 결합능을 지표로 하는 패닝이 복수 회 반복되었다.

(11-3) 파지 ELISA에 의한 평가

최종농도 4%BSA 및 1.2 mM 칼슘 이온 농도가 되도록 BSA 및 CaCl₂가 첨가된 파지를 함유하는 배양상청이 아래의 순서로 ELISA에 제공되었다. StreptaWell 96 마이크로타이터 플레이트(Roche)가 비오틴 표지 항원을 포함하는 100 μL의 PBS로 하룻밤 코팅되었다. 당해 플레이트의 각 웰을 PBST로 세정함으로써 항원이 제거된 후, 당해 웰이 1시간 이상 250 μL의 4%BSA-TBS로 블로킹되었다. 4%BSA-TBS가 제거된 각 웰에 조제된 배양상청이 첨가된 당해 플레이트를 37℃에서 1시간 정치함으로써 파지를 제시하는 항체를 각 웰에 존재하는 항원에 결합시켰다. 1.2 mM CaCl₂/TBST로 세정된 각 웰에 1.2 mM CaCl₂/TBS 또는 1 mM EDTA/TBS가 첨가되고, 당해 플레이트는 37℃에서 30분간 정치하여 인큐베이트되었다. 1.2 mM CaCl₂/TBST로 세정된 후에, 최종농도 4%의 BSA 및 1.2 mM의 이온화 칼슘 농도로 한 TBS에 의해 희석된 HRP 결합 항M13 항체(Amersham Pharmacia Biotech)가 각 웰에 첨가된 플레이트를 1시간 인큐베이트시켰다. 1.2 mM CaCl₂/TBST로 세정 후, TMB single 용액(ZYMED)이 첨가된 각 웰 중의 용액의 발색반응이 황산의 첨가에 의해 정지된 후, 450 nm의 흡광도에 의해 당해 발색이 측정되었다.

상기 파지 ELISA의 결과, Ca 의존적인 항원에 대한 결합능이 있다고 판단되는 항체 단편을 주형으로 하여 특이적인 프라이머에 의해 증폭된 유전자의 염기서열 해석이 행해졌다.

(11-4) 항체의 발현과 정제

파지 ELISA의 결과, Ca 의존적인 항원에 대한 결합능이 있다고 판단된 클론이 동물세포 발현용 플라스미드로 도입되었다. 항체의 발현은 아래의 방법을 사용하여 행해졌다. 인간 태아 신장세포 유래 FreeStyle 293-F주(Invitrogen)가 FreeStyle 293 Expression Medium배지(Invitrogen)에 현탁되고, 1.33×10⁶세포/mL의 세포밀도로 6웰 플레이트의 각 웰로 3 mL씩 파종되었다. 조제된 플라스미드는 리포펙션법에 의해 세포로 도입되었다. CO₂ 인큐베이터(37도, 8% CO₂, 90 rpm) 중에서 4일간 배양이 행해졌다. rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)를 사용하고 당업자 공지의 방법을 사용하여 상기에서 얻어진 배양상청으로부터 항체가 정제되었다. 분광광도계를 사용하여 정제된 항체 용액의 280 nm에서의 흡광도가 측정되었다. PACE법에 의해 산출된 흡광계수를 사용함으로써 얻어진 측정값으로 항체 농도가 산출되었다(Protein Science (1995) 4, 2411-2423).

(참고실시예 12) 취득된 항체의 인간 IL-6 수용체에 대한 Ca 의존적 결합능의 평가

참고실시예 11에서 취득된 항체 6RL#9-IgG1(중쇄(서열번호：98에 IgG1 유래 정상영역이 연결된 서열), 경쇄(서열번호：99)) 및 FH4-IgG1(중쇄 서열번호：100, 경쇄 서열번호：101)의 인간 IL-6 수용체에 대한 결합 활성이 Ca 의존적인지 여부를 판단하기 위해, 이들 항체와 인간 IL-6 수용체의 항원 항체 반응의 속도론적 해석이 Biacore T100(GE Healthcare)을 사용하여 행해졌다. 인간 IL-6 수용체에 대한 Ca 의존성 결합 활성을 갖지 않는 대조 항체로서, WO2009/125825에 기재되어 있는 H54/L28-IgG1(중쇄 서열번호：102, 경쇄 서열번호：103)이 사용되었다. 고칼슘 이온 농도 및 저칼슘 이온 농도의 조건으로서, 각각 2 mM 및 3 μM의 칼슘 이온 농도의 용액 중에서 항원 항체 반응의 속도론적 해석이 행해졌다. 아민커플링법으로 protein A(Invitrogen)가 적당량 고정화된 Sensor chip CM4(GE Healthcare) 상에 목적의 항체가 캡쳐되었다. 러닝 버퍼에는 10 mM ACES, 150 mM NaCl, 0.05% (w/v) Tween20, 2 mM CaCl₂(pH 7.4) 또는 10 mM ACES, 150 mM NaCl, 0.05% (w/v) Tween20, 3 μmol/L CaCl₂(pH 7.4)의 2종류의 완충액이 사용되었다. 인간 IL-6 수용체의 희석에도 각각의 버퍼가 사용되었다. 측정은 모두 37℃에서 실시되었다.

H54L28-IgG1 항체를 사용한 항원 항체 반응의 속도론적 해석시에 IL-6 수용체의 희석액과 블랭크인 러닝 버퍼를 유속 20 μL/min로 3분간 인젝트함으로써 센서칩 상에 캡쳐시킨 H54L28-IgG1 항체에 IL-6 수용체를 상호작용시켰다. 그 후 유속 20 μL/min로 10분간 러닝 버퍼를 흘려 IL-6 수용체의 해리가 관찰된 후, 10 mM Glycine-HCl(pH 1.5)을 유속 30 μL/min로 30초간 인젝트함으로써 센서칩이 재생되었다. 측정에서 얻어진 센서그램으로부터 키네틱스 파라미터인 결합속도상수 ka(1/Ms) 및 해리속도상수 kd(1/s)가 산출되었다. 이들 값을 사용하여 H54L28-IgG1 항체의 인간 IL-6 수용체에 대한 해리상수 KD(M)가 산출되었다. 각 파라미터의 산출에는 Biacore T100 Evaluation Software(GE Healthcare)가 사용되었다.

FH4-IgG1 항체 및 6RL#9-IgG1 항체를 사용한 항원 항체 반응의 속도론적 해석시에는 IL-6 수용체의 희석액과 블랭크인 러닝 버퍼를 유속 5 μL/min로 15분간 인젝트함으로써, 센서칩 상에 캡쳐시킨 FH4-IgG1 항체 또는 6RL#9-IgG1 항체에 IL-6 수용체를 상호작용시켰다. 그 후, 10 mM Glycine-HCl(pH 1.5)을 유속 30 μL/min로 30초간 인젝트함으로써 센서칩이 재생되었다. 측정에서 얻어진 센서그램으로부터 steady state affinity model을 사용하여 해리상수 KD(M)가 산출되었다. 각 파라미터의 산출에는 Biacore T100 Evaluation Software(GE Healthcare)가 사용되었다.

이 방법으로 결정된 2 mM CaCl₂ 존재하에 있어서의 각 항체와 IL-6 수용체의 해리상수 KD를 표 21에 나타내었다.

Ca 농도가 3 μM인 조건하에서의 H54/L28-IgG1 항체의 KD는 2 mM Ca 농도 존재하와 동일한 방법으로 산출하는 것이 가능하다. Ca 농도가 3 μM인 조건하에서는 FH4-IgG1 항체 및 6RL#9-IgG1 항체는 IL-6 수용체에 대한 결합은 거의 관찰되지 않았기 때문에 상기 방법에 의한 KD의 산출은 곤란하다. 그러나 하기 식 1(Biacore T100 Software Handbook, BR-1006-48, AE 01/2007)을 사용함으로써, Ca 농도가 3 μM인 조건하에서의 이들 항체의 KD를 예측하는 것이 가능하다.

(식 1)

상기 (식 1) 중의 각 항목의 의미는 하기；

Req(RU): 정상상태 결합 레벨(Steady state binding levels)

Rmax(RU):애널라이트의 표면 결합능(Analyte binding capacity of the surface)

RI(RU):시료 중의 용적 굴절률 기여(Bulk refractive index contribution in the sample)

C(M): 애널라이트 농도(Analyte concentration)

KD(M): 평형 해리상수(Equilibrium dissociation constant)

로 표시된다.

상기 (식 1)을 사용한 Ca 농도가 3 μmol/L인 경우의 각 항체와 IL-6 수용체의 해리상수 KD의 예측되는 개산결과를 표 22에 나타낸다. 표 22 중의 Req, Rmax, RI, C는 측정결과를 토대로 가정된 값이다.

상기 결과로부터 FH4-IgG1 항체 및 6RL#9-IgG1 항체는 버퍼 중의 CaCl₂의 농도를 2 mM로부터 3 μM로 감소시킴으로써, IL-6 수용체에 대한 KD가 각각 약 60배, 약 120배 상승(60배, 120배 이상 친화성이 저감)될 것으로 예측되었다.

표 23에 H54/L28-IgG1, FH4-IgG1, 6RL#9-IgG1의 3종류의 항체의 2 mM CaCl₂ 존재하 및 3 μM CaCl₂ 존재하에 있어서의 KD값 및 KD값의 Ca 의존성에 대해서 정리하였다.

Ca 농도의 차이에 따른 H54/L28-IgG1 항체의 IL-6 수용체에 대한 결합의 차이는 관찰되지 않았다. 그 한편 저농도의 Ca 조건하에서는 FH4-IgG1 항체 및 6RL#9-IgG1 항체의 IL-6 수용체에 대한 결합의 현저한 감약이 관찰되었다(표 23).

(참고실시예 13) 취득된 항체로의 칼슘 이온 결합 평가

다음으로 항체로의 칼슘 이온의 결합 평가의 지표로서, 시차주사형 열량측정(DSC)에 의한 열변성 중간온도(Tm값)가 측정되었다(MicroCal VP-Capillary DSC, MicroCal). 열변성 중간온도(Tm값)는 안정성의 지표로 칼슘 이온의 결합에 의해 단백질이 안정화되면, 열변성 중간온도(Tm값)는 칼슘 이온이 결합해 있지 않은 경우에 비해 높아진다(J. Biol. Chem. (2008) 283, 37, 25140 - 25149). 항체 용액 중의 칼슘 이온 농도의 변화에 따른 항체의 Tm값의 변화를 평가함으로써, 항체로의 칼슘 이온의 결합 활성이 평가되었다. 정제된 항체가 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl₂(pH 7.4) 또는 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 3 μM CaCl₂(pH 7.4)의 용액을 외액으로 하는 투석(EasySEP, TOMY)처리에 제공되었다. 투석에 사용된 용액을 사용하여 대략 0.1 ㎎/mL로 조제된 항체 용액을 피험물질로 하여 20℃부터 115℃까지 240℃/hr의 승온속도로 DSC 측정이 행해졌다. 얻어진 DSC의 변성 곡선을 토대로 산출된 각 항체의 Fab 도메인의 열변성 중간온도(Tm값)를 표 24에 나타내었다.

표 24의 결과로부터 칼슘 의존적 결합능을 나타내는 FH4-IgG1 항체 및 6RL#9-IgG1 항체의 Fab의 Tm값은 칼슘 이온의 농도 변화에 따라 변동되고, 칼슘 의존적 결합능을 나타내지 않는 H54/L28-IgG1 항체의 Fab의 Tm값은 칼슘 이온의 농도 변화에 따라 변동되지 않는 것이 나타내어졌다. FH4-IgG1 항체 및 6RL#9-IgG1 항체의 Fab의 Tm값의 변동은 이들 항체에 칼슘 이온이 결합하여 Fab 부분이 안정화된 것을 나타내고 있다. 상기 결과로부터 FH4-IgG1 항체 및 6RL#9-IgG1 항체에는 칼슘 이온이 결합하는 한편으로 H54/L28-IgG1 항체에는 칼슘 이온이 결합해 있지 않은 것이 나타내어졌다.

(참고실시예 14) 6RL#9 항체의 칼슘 이온 결합 부위의 X선결정구조 해석에 의한 동정

(14-1) X선결정구조 해석

참고실시예 13에 나타내어진 바와 같이, 6RL#9 항체는 칼슘 이온과 결합하는 것이 열변성 온도 Tm값의 측정으로부터 시사되었다. 그러나, 6RL#9 항체의 어느 부위가 칼슘 이온과 결합해 있는지 예상할 수 없었기 때문에, X선결정구조 해석의 수법을 사용함으로써 칼슘 이온이 상호작용하는 6RL#9 항체의 서열 중의 잔기가 특정되었다.

(14-2) 6RL#9 항체의 발현 및 정제

X선결정구조 해석에 사용하기 위해 발현시킨 6RL#9 항체가 정제되었다. 구체적으로는 6RL#9 항체의 중쇄(서열번호：98에 IgG1 유래 정상영역이 연결된 서열)와 경쇄(서열번호：99)를 각각 발현시킬 수 있도록 조제된 동물 발현용 플라스미드가 동물세포에 일과적으로 도입되었다. 최종 세포밀도 1×10⁶세포/mL가 되도록 FreeStyle 293 Expression Medium배지(Invitrogen)로 현탁된 800 mL의 인간 태아 신장세포 유래 FreeStyle 293-F주(Invitrogen)에 리포펙션법에 의해 조제된 플라스미드가 도입되었다. 플라스미드가 도입된 세포는 CO₂ 인큐베이터(37℃, 8% CO₂, 90 rpm) 중에서 5일간 배양되었다. rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)를 사용한 당업자 공지의 방법에 따라 상기와 같이 얻어진 배양상청으로부터 항체가 정제되었다. 분광광도계를 사용하여 정제된 항체 용액의 280 nm에서의 흡광도가 측정되었다. PACE법에 의해 산출된 흡광계수를 이용하여 측정값으로부터 항체 농도가 산출되었다(Protein Science (1995) 4, 2411-2423).

(14-3) 6RL#9 항체로부터의 Fab 프래그먼트의 정제

분자량 분획 사이즈 10000MWCO의 한외여과막을 사용하여 6RL#9 항체가 21 ㎎/mL까지 농축되었다. L-Cystein 4 mM, EDTA 5 mM, 20 mM 인산나트륨 완충액(pH 6.5)을 사용하여 5 ㎎/mL에 의해 희석된 2.5 mL의 당해 항체의 시료가 조제되었다. 0.125 ㎎의 Papain(Roche Applied Science)을 첨가하여 교반된 당해 시료가 35℃에서 2시간 정치되었다. 정치 후, 프로테아제 인히비터 칵테일 미니, EDTA 프리(Roche Applied Science) 1정을 녹인 10 mL의 25 mM MES 완충액(pH 6)을 추가로 당해 시료에 첨가하고 얼음 속에 정치함으로써 Papain에 의한 프로테아제 반응이 정지되었다. 다음으로 당해 시료가 하류에 1 mL 사이즈의 ProteinA 담체 칼럼 HiTrap MabSelect Sure(GE Healthcare)가 직렬로 연결된 25 mM MES 완충액 pH 6으로 평형화된 1 mL 사이즈의 양이온 교환 칼럼 HiTrap SP HP(GE Healthcare)에 첨가되었다. 동 완충액 중 NaCl 농도를 300 mM까지 직선적으로 올려 용출을 행함으로써 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 정제 분획이 얻어졌다. 다음으로 얻어진 정제 분획이 5000MWCO의 한외여과막에 의해 0.8 mL 정도까지 농축되었다. 50 mM NaCl을 포함하는 100 mM HEPES 완충액(pH 8)으로 평형화된 겔여과 칼럼 Superdex 200 10/300 GL(GE Healthcare)에 농축액이 첨가되었다. 결정화용 정제 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트가 동 완충액을 사용하여 칼럼으로부터 용출되었다. 또한 상기의 모든 칼럼조작은 6~7.5℃의 저온하에서 실시되었다.

(14-4) 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 Ca 존재하에서의 결정화

사전에 일반적인 조건 설정으로 6RL#9 Fab 프래그먼트의 종결정이 얻어졌다. 다음으로 5 mM가 되도록 CaCl₂가 첨가된 정제 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트가 5000MWCO의 한외여과막을 사용하여 12 ㎎/mL로 농축되었다. 다음으로 행잉 드롭 증기 확산법으로 상기와 같이 농축된 시료의 결정화가 실시되었다. 리저버 용액으로서 20-29%의 PEG4000을 포함하는 100 mM HEPES 완충액(pH 7.5)이 사용되었다. 커버글래스 상에서 0.8 ㎕의 리저버 용액 및 0.8 ㎕의 상기 농축시료의 혼합액에 대해, 29% PEG4000 및 5 mM CaCl₂를 포함하는 100 mM HEPES 완충액(pH 7.5) 중에서 파쇄된 상기 종결정이 100-10000배로 희석된 희석 계열의 용액 0.2 ㎕를 첨가함으로써 결정화 드롭이 조제되었다. 당해 결정화 드롭을 20℃에 2일 내지 3일 정치함으로써 얻어진 얇은 판상 결정의 X선 회절 데이터가 측정되었다.

(14-5) 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 Ca 비존재하에서의 결정화

정제 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트가 5000MWCO의 한외여과막을 사용하여 15 ㎎/㎖로 농축되었다. 다음으로 행잉 드롭 증기 확산법으로 상기와 같이 농축된 시료의 결정화가 실시되었다. 리저버 용액으로서 18-25%의 PEG4000을 포함하는 100 mM HEPES 완충액(pH 7.5)이 사용되었다. 커버글래스 상에서 0.8 ㎕의 리저버 용액 및 0.8 ㎕의 상기 농축시료의 혼합액에 대해, 25% PEG4000을 포함하는 100 mM HEPES 완충액(pH 7.5) 중에서 파쇄된 Ca 존재하에서 얻어진 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 결정이 100-10000배로 희석된 희석 계열의 용액 0.2 ㎕를 첨가함으로써 결정화 드롭이 조제되었다. 당해 결정화 드롭을 20℃에 2일 내지 3일 정치함으로써 얻어진 얇은 판상 결정의 X선 회절 데이터가 측정되었다.

(14-6) 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 Ca 존재하에서의 결정의 X선 회절 데이터의 측정

35% PEG4000 및 5 mM CaCl₂를 포함하는 100 mM HEPES 완충액(pH 7.5)의 용액에 침지된 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 Ca 존재하에서 얻어진 단결정 하나를, 미소한 나일론 루프가 부착된 핀을 사용하여 외액째로 떠냄으로써, 당해 단결정이 액체질소 중에서 동결되었다. 고에너지 가속기 연구기구의 방사광 시설 포톤 팩토리의 빔라인 BL-17A를 사용하여 상기 동결 결정의 X선 회절 데이터가 측정되었다. 또한 측정 중에는 항상 -178℃의 질소기류 중에 동결 결정을 둠으로써 동결상태가 유지되었다. 빔라인에 비치된 CCD 디텍터 Quantum315r(ADSC)을 사용하여 결정을 1°씩 회전시키면서 토탈 180매의 회절 화상이 수집되었다. 격자상수의 결정, 회절 반점의 지수 부여 및 회절 데이터의 처리가 프로그램 Xia2(CCP4 Software Suite), XDS Package(Walfgang Kabsch) 및 Scala(CCP4 Software Suite)에 의해 행해졌다. 최종적으로 분해능 2.2Å까지의 회절강도 데이터가 얻어졌다. 본 결정은 공간군 P2₁2₁2₁에 속하고, 격자상수 a=45.47Å, b=79.86Å, c=116.25Å, α=90°, β=90°, γ=90°였다.

(14-7) 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 Ca 비존재하에서의 결정의 X선 회절 데이터의 측정

35% PEG4000을 포함하는 100 mM HEPES 완충액(pH 7.5)의 용액에 침지된 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 Ca 비존재하에서 얻어진 단결정 하나를, 미소한 나일론 루프가 부착된 핀을 사용하여 외액째로 떠냄으로써, 당해 단결정이 액체질소 중에서 동결되었다. 고에너지 가속기 연구기구의 방사광 시설 포톤 팩토리의 빔라인 BL-5A를 사용하여 상기 동결 결정의 X선 회절 데이터가 측정되었다. 또한 측정 중에는 항상 -178℃의 질소기류 중에 동결 결정을 둠으로써 동결상태가 유지되었다. 빔라인에 비치된 CCD 디텍터 Quantum210r(ADSC)을 사용하여 결정을 1°씩 회전시키면서 토탈 180매의 회절 화상이 수집되었다. 격자상수의 결정, 회절 반점의 지수 부여 및 회절 데이터의 처리가 프로그램 Xia2(CCP4 Software Suite), XDS Package(Walfgang Kabsch) 및 Scala(CCP4 Software Suite)에 의해 행해졌다. 최종적으로 분해능 2.3Å까지의 회절강도 데이터가 얻어졌다. 본 결정은 공간군 P2₁2₁2₁에 속하고, 격자상수 a=45.40Å, b=79.63Å, c=116.07Å, α=90°, β=90°, γ=90°로, Ca 존재하의 결정과 동형이었다.

(14-8) 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 Ca 존재하에서의 결정의 구조 해석

프로그램 Phaser(CCP4 Software Suite)를 사용한 분자 치환법에 의해, 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 Ca 존재하에서의 결정의 구조가 결정되었다. 얻어진 결정격자의 크기와 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 분자량으로부터, 비대칭 단위 중의 분자 수가 1개라고 예상되었다. 1차 서열 상의 상동성을 토대로 PDB code: 1ZA6의 구조좌표로부터 취출된 A쇄 112-220번 및 B쇄 116-218번의 아미노산 잔기 부분이 CL 및 CH1 영역의 탐색용 모델 분자가 되었다. 다음으로 PDB code: 1ZA6의 구조좌표로부터 취출된 B쇄 1-115번의 아미노산 잔기 부분이 VH 영역의 탐색용 모델 분자가 되었다. 마지막으로 PDB code 2A9M의 구조좌표로부터 취출된 경쇄 3-147번의 아미노산 잔기가 VL 영역의 탐색용 모델 분자가 되었다. 이 순번에 따라 각 탐색용 모델 분자의 결정 격자 내에서의 방향과 위치를 회전 함수 및 병진 함수로부터 결정함으로써, 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 초기 구조 모델이 얻어졌다. 당해 초기 구조 모델에 대해 VH, VL, CH1, CL의 각 도메인을 움직이는 강체 정밀화를 행함으로써, 25-3.0Å의 반사 데이터에 대한 결정학적 신뢰도 인자 R값은 46.9%, Free R값은 48.6%가 되었다. 또한 프로그램 Refmac5(CCP4 Software Suite)를 사용한 구조 정밀화와, 실험적으로 결정된 구조 인자 Fo와 모델로부터 계산된 구조 인자 Fc 및 위상을 사용하여 계산된 2Fo-Fc, Fo-Fc를 계수로 하는 전자 밀도 지도를 참조하면서 모델 수정을 반복하여 프로그램 Coot(Paul Emsley) 상에서 행함으로써 모델의 정밀화가 행해졌다. 마지막으로 2Fo-Fc, Fo-Fc를 계수로 하는 전자 밀도 지도를 토대로 Ca 이온 및 물분자를 모델에 삽입함으로써, 프로그램 Refmac5(CCP4 Software Suite)를 사용하여 정밀화가 행해졌다. 분해능 25-2.2Å의 21020개의 반사 데이터를 사용함으로써, 최종적으로 3440 원자의 모델에 대한 결정학적 신뢰도 인자 R값은 20.0%, Free R값은 27.9%가 되었다.

(14-9) 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 Ca 비존재하에서의 결정의 X선 회절 데이터의 측정

6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 Ca 비존재하에서의 결정의 구조는 동형인 Ca 존재하 결정의 구조를 사용해서 결정되었다. 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 Ca 존재하에서의 결정의 구조좌표로부터 물분자와 Ca 이온 분자가 제외되고, VH, VL, CH1, CL의 각 도메인을 움직이는 강체 정밀화가 행해졌다. 25-3.0Å의 반사 데이터에 대한 결정학적 신뢰도 인자 R값은 30.3%, Free R값은 31.7%가 되었다. 또한 프로그램 Refmac5(CCP4 Software Suite)를 사용한 구조 정밀화와, 실험적으로 결정된 구조 인자 Fo와 모델로부터 계산된 구조 인자 Fc 및 위상을 사용하여 계산된 2Fo-Fc, Fo-Fc를 계수로 하는 전자 밀도 지도를 참조하면서 모델 수정을 반복하여 프로그램 Coot(Paul Emsley) 상에서 행함으로써 모델의 정밀화가 행해졌다. 마지막으로 2Fo-Fc, Fo-Fc를 계수로 하는 전자 밀도 지도를 토대로 물분자를 모델에 삽입함으로써, 프로그램 Refmac5(CCP4 Software Suite)를 사용하여 정밀화가 행해졌다. 분해능 25-2.3Å의 18357개의 반사 데이터를 사용함으로써, 최종적으로 3351 원자의 모델에 대한 결정학적 신뢰도 인자 R값은 20.9%, Free R값은 27.7%가 되었다.

(14-10) 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 Ca 존재 또는 비존재하에서의 결정의 X선 회절 데이터의 비교

6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 Ca 존재하에서의 결정 및 Ca 비존재하에서의 결정의 구조를 비교했더니 중쇄 CDR3에 커다란 변화가 보였다. X선결정구조 해석으로 결정된 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 중쇄 CDR3의 구조를 도 18에 나타내었다. 구체적으로는 Ca 존재하에서의 6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 결정에서는 중쇄 CDR3 루프 부분의 중심 부분에 칼슘 이온이 존재하고 있었다. 칼슘 이온은 중쇄 CDR3의 95번 위치, 96번 위치 및 100a번 위치(Kabat 넘버링)와 상호작용하고 있는 것으로 생각되었다. Ca 존재하에서는 항원과의 결합에 중요한 중쇄 CDR3 루프가 칼슘과 결합함으로써 안정화되어, 항원과의 결합에 최적인 구조로 되어 있는 것이 생각되었다. 항체의 중쇄 CDR3에 칼슘이 결합하는 예는 지금까지 보고되어 있지 않아, 항체의 중쇄 CDR3에 칼슘이 결합한 구조는 신규한 구조이다.

6RL#9 항체의 Fab 프래그먼트의 구조로부터 명확해진 중쇄 CDR3에 존재하는 칼슘 결합 모티브도 참고실시예 7에서 기재되는 바와 같은 Ca 라이브러리 디자인의 새로운 요소가 될 수 있다. 즉 참고실시예 7에서는 경쇄 가변영역에 칼슘 결합 모티브가 도입되었는데, 예를 들면 6RL#9 항체의 중쇄 CDR3를 포함하고, 경쇄를 포함하는 그것 이외의 CDR에 플렉시블 잔기를 포함하는 라이브러리가 생각된다.

(참고실시예 15) 파지 디스플레이 기술을 이용한 인간 항체 라이브러리로부터의 Ca 의존적으로 IL-6에 결합하는 항체의 취득

(15-1) 나이브 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리의 제작

인간 PBMC로부터 제작한 폴리 A RNA나 시판되고 있는 인간 폴리 A RNA 등을 주형으로 하여 당업자에게 공지의 방법에 따라, 서로 다른 인간 항체 서열의 Fab 도메인을 제시하는 복수의 파지로 이루어지는 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리가 구축되었다.

(15-2) 비드 패닝에 의한 라이브러리로부터의 Ca 의존적으로 항원에 결합하는 항체 단편의 취득

구축된 나이브 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리로부터의 최초의 선발은 항원(IL-6)으로의 결합능을 갖는 항체 단편만의 농축에 의해 실시되었다. 항원으로서 비오틴 표지된 IL-6이 사용되었다.

구축된 파지 디스플레이용 파지미드를 보유한 대장균으로부터 파지 생산이 행해졌다. 파지 생산이 행해진 대장균의 배양액에 2.5 M NaCl/10%PEG를 첨가함으로써 침전시킨 파지의 집단을 TBS로 희석함으로써 파지 라이브러리액이 얻어졌다. 다음으로 파지 라이브러리액에 최종농도 4%BSA 및 1.2 mM 칼슘 이온 농도가 되도록 BSA 및 CaCl₂가 첨가되었다. 패닝방법으로서 일반적인 방법인 자기 비드에 고정화한 항원을 사용한 패닝 방법이 참조되었다(J. Immunol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9, J. Immunol. Methods. (2001) 247 (1-2), 191-203, Biotechnol. Prog. (2002) 18 (2) 212-20, Mol. Cell Proteomics (2003) 2 (2), 61-9). 자기 비드로서, NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated) 또는 Streptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)가 사용되었다.

구체적으로는 조제된 파지 라이브러리액에 250 pmol의 비오틴 표지 항원을 첨가함으로써, 당해 파지 라이브러리액을 실온에서 60분간 항원과 접촉시켰다. BSA로 블로킹된 자기 비드가 첨가되고, 항원과 파지의 복합체를 자기 비드와 실온에서 15분간 결합시켰다. 비드는 1.2 mM CaCl₂/TBST(1.2 mM CaCl₂를 포함하는 TBST)로 3회 세정된 후, 1 mL의 1.2 mM CaCl₂/TBS(1.2 mM CaCl₂를 포함하는 TBS)로 추가로 2회 세정되었다. 그 후, 0.5 mL의 1 ㎎/mL의 트립신이 첨가된 비드는 실온에서 15분 현탁된 후, 즉석에서 자기 스탠드를 사용하여 비드가 분리되고 파지 용액이 회수되었다. 회수된 파지 용액이 대수증식기(OD600이 0.4-0.7)가 된 10 mL의 대장균주 TG1에 첨가되었다. 37℃에서 1시간 완만하게 상기 대장균의 교반배양을 행함으로써 파지를 대장균에 감염시켰다. 감염시킨 대장균은 225 ㎜×225 ㎜의 플레이트로 파종되었다. 다음으로 파종된 대장균의 배양액으로부터 파지를 회수함으로써 파지 라이브러리액이 조제되었다.

2회째 이후의 패닝에서는 Ca 의존적 결합능을 지표로 파지의 농축이 행해졌다. 구체적으로는 조제한 파지 라이브러리액에 40 pmol의 비오틴 표지 항원을 첨가함으로써 파지 라이브러리를 실온에서 60분간 항원과 접촉시켰다. BSA로 블로킹된 자기 비드가 첨가되고, 항원과 파지의 복합체를 자기 비드와 실온에서 15분간 결합시켰다. 비드는 1 mL의 1.2 mM CaCl₂/TBST와 1.2 mM CaCl₂/TBS로 세정되었다. 그 후 0.1 mL의 2 mM EDTA/TBS가 첨가된 비드는 실온에서 현탁된 후, 즉석에서 자기 스탠드를 사용하여 비드가 분리되고 파지 용액이 회수되었다. 회수된 파지 용액에 100 ㎎/mL의 트립신 5 μL를 첨가함으로써, Fab를 제시하지 않는 파지의 pIII 단백질(헬퍼 파지 유래의 pIII 단백질)이 절단되어 Fab를 제시하지 않는 파지의 대장균에 대한 감염능을 상실시켰다. 트립신 처리된 파지 용액으로부터 회수된 파지가 대수증식기(OD600이 0.4-0.7)가 된 10 mL의 대장균주 TG1에 첨가되었다. 37℃에서 1시간 완만하게 상기 대장균의 교반배양을 행함으로써 파지를 대장균에 감염시켰다. 감염시킨 대장균은 225 ㎜×225 ㎜의 플레이트로 파종되었다. 다음으로 파종된 대장균의 배양액으로부터 파지를 회수함으로써 파지 라이브러리액이 회수되었다. Ca 의존적 결합능을 지표로 하는 패닝이 3회 반복되었다.

(15-3) 파지 ELISA에 의한 평가

상기 방법에 의해 얻어진 대장균의 싱글 콜로니로부터, 통상의 방법(Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145)에 따라 파지 함유 배양상청이 회수되었다.

최종농도 4%BSA 및 1.2 mM 칼슘 이온 농도가 되도록 BSA 및 CaCl₂가 첨가된 파지를 함유하는 배양상청이 아래의 순서로 ELISA에 제공되었다. StreptaWell 96 마이크로타이터 플레이트(Roche)가 비오틴 표지 항원을 포함하는 100 μL의 PBS로 하룻밤 코트되었다. 당해 플레이트의 각 웰을 PBST로 세정함으로써 항원이 제거된 후, 당해 웰이 1시간 이상 250 μL의 4%BSA-TBS로 블로킹되었다. 4%BSA-TBS가 제거된 각 웰에 조제된 배양상청이 첨가된 당해 플레이트를 37℃에서 1시간 정치함으로써 파지를 제시하는 항체를 각 웰에 존재하는 항원에 결합시켰다. 1.2 mM CaCl₂/TBST로 세정된 각 웰에 1.2 mM CaCl₂/TBS 또는 1 mM EDTA/TBS가 첨가되고, 당해 플레이트는 37℃에서 30분간 정치하고 인큐베이트되었다. 1.2 mM CaCl₂/TBST로 세정된 후에, 최종농도 4%의 BSA 및 1.2 mM의 이온화 칼슘 농도로 한 TBS에 의해 희석된 HRP 결합 항M13 항체(Amersham Pharmacia Biotech)가 각 웰에 첨가된 플레이트를 1시간 인큐베이트시켰다. 1.2 mM CaCl₂/TBST로 세정 후, TMB single 용액(ZYMED)이 첨가된 각 웰 중의 용액의 발색반응이 황산의 첨가에 의해 정지된 후, 450 nm의 흡광도에 의해 당해 발색이 측정되었다.

단리된 96 클론을 사용하여 파지 ELISA를 행함으로써, IL-6에 대한 Ca 의존적인 결합능을 갖는 6KC4-1#85 항체가 얻어졌다. 상기의 파지 ELISA의 결과, Ca 의존적인 항원에 대한 결합능이 있다고 판단되는 항체 단편을 주형으로 하여 특이적인 프라이머에 의해 증폭된 유전자의 염기서열 해석이 행해졌다. 6KC4-1#85 항체의 중쇄 가변영역의 서열은 서열번호：10에, 경쇄 가변영역의 서열은 서열번호：104에 기재하였다. 6KC4-1#85 항체의 중쇄 가변영역(서열번호：10)을 코드하는 폴리뉴클레오티드가, PCR법에 의해 IgG1 유래 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드와 연결된 DNA 단편이 동물세포 발현용 벡터에 삽입되어, 서열번호：105로 표시되는 중쇄를 발현하는 벡터가 구축되었다. 6KC4-1#85 항체의 경쇄 가변영역(서열번호：104)을 코드하는 폴리뉴클레오티드가 PCR법에 의해 천연형 Kappa쇄의 정상영역(서열번호：44)을 코드하는 폴리뉴클레오티드와 연결된 DNA 단편이 동물세포 발현용 벡터에 삽입되었다. 제작된 개변체의 서열은 당업자 공지의 방법으로 확인되었다.

(15-4) 항체의 발현과 정제

파지 ELISA의 결과, Ca 의존적인 항원에 대한 결합능이 있다고 판단된 클론 6KC4-1#85가 동물세포 발현용 플라스미드로 도입되었다. 항체의 발현은 아래의 방법을 사용하여 행해졌다. 인간 태아 신장세포 유래 FreeStyle 293-F주(Invitrogen)가 FreeStyle 293 Expression Medium배지(Invitrogen)에 현탁되어, 1.33×10⁶ 세포/mL의 세포밀도로 6웰 플레이트의 각 웰로 3 mL씩 파종되었다. 조제된 플라스미드는 리포펙션법에 의해 세포로 도입되었다. CO₂ 인큐베이터(37도, 8% CO₂, 90 rpm) 중에서 4일간 배양이 행해졌다. rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)를 사용하고 당업자 공지의 방법을 사용하여 상기에서 얻어진 배양상청으로부터 항체가 정제되었다. 분광광도계를 사용하여 정제된 항체 용액의 280 nm에서의 흡광도가 측정되었다. PACE법에 의해 산출된 흡광계수를 이용함으로써 얻어진 측정값으로부터 항체 농도가 산출되었다(Protein Science (1995) 4, 2411-2423).

(참고실시예 16) 6KC4-1#85 항체의 칼슘 이온 결합 평가

인간 항체 라이브러리로부터 취득된 칼슘 의존적 항원 결합 항체 6KC4-1#85 항체가 칼슘과 결합하는지 평가되었다. 이온화 칼슘 농도가 상이한 조건에서 측정되는 Tm값이 변동되는지 여부가 참고실시예 2에 기재된 방법으로 평가되었다.

6KC4-1#85 항체의 Fab 도메인의 Tm값을 표 25에 나타내었다. 표 25에 나타낸 바와 같이, 6KC4-1#85 항체의 Fab 도메인의 Tm값은 칼슘 이온의 농도에 따라 변동되고 있는 것으로부터, 6KC4-1#85 항체가 칼슘과 결합하는 것이 명확해졌다.

(참고실시예 17) 6KC4-1#85 항체의 칼슘 이온 결합 부위의 동정

참고실시예 16에서 나타내어지는 바와 같이, 6KC4-1#85 항체는 칼슘 이온과 결합하는 것이 나타내어졌으나, 6KC4-1#85는 hVk5-2 서열의 검토로부터 명확해진 칼슘 결합 모티브를 갖지 않는다. 이에 칼슘 이온이 6KC4-1#85 항체의 중쇄에 결합하는 것인지, 경쇄에 결합하는 것인지 또는 양자에 결합하는 것인지를 확인하기 위해, 칼슘 이온과 결합하지 않는 항글리피칸 3 항체(중쇄 서열 GC_H(서열번호：106), 경쇄 서열 GC_L(서열번호：107))의 중쇄와 경쇄와 각각 교환한 개변 항체에 대한 칼슘 이온의 결합이 평가되었다. 참고실시예 2에 나타내어지는 방법에 준하여 측정된 개변 항체의 Tm값을 표 26에 나타내었다. 그 결과, 6KC4-1#85 항체의 중쇄를 갖는 개변 항체의 Tm값이 칼슘 이온의 농도에 따라 변화되기 때문에 6KC4-1#85 항체의 중쇄로 칼슘과 결합해 있는 것으로 생각되었다.

이에 추가로 6KC4-1#85 항체의 중쇄 중 어느 잔기와 칼슘 이온이 결합해 있는지 동정하기 위해, 6KC4-1#85 항체의 CDR에 존재하는 Asp(D) 잔기를 칼슘 이온의 결합 또는 킬레이트에 관여할 수 없는 Ala(A) 잔기로 치환한 개변 중쇄(6_H1-11(서열번호：108), 6_H1-12(서열번호：109), 6_H1-13(서열번호：110), 6_H1-14(서열번호：111), 6_H1-15(서열번호：112)) 및 개변 경쇄(6_L1-5(서열번호：113) 및 6_L1-6(서열번호：114))가 제작되었다. 개변 항체 유전자를 포함하는 발현 벡터가 도입된 동물세포의 배양액으로부터, 개변 항체가 참고실시예 15에 기재된 방법에 따라 정제되었다. 정제된 개변 항체의 칼슘 결합이 참고실시예 2에 기재된 방법에 따라 측정되었다. 측정된 결과를 표 27에 나타내었다. 표 27에 나타낸 바와 같이, 6KC4-1#85 항체의 중쇄 CDR3의 95번 위치 또는 101번 위치(Kabat 넘버링)를 Ala 잔기로 치환함으로써 6KC4-1#85 항체의 칼슘 결합능이 상실되는 것으로부터 이 잔기가 칼슘과의 결합에 중요하다고 생각된다. 6KC4-1#85 항체의 개변 항체의 칼슘 결합성으로부터 명확해진 6KC4-1#85 항체의 중쇄 CDR3의 루프 부착 밑둥 부근에 존재하는 칼슘 결합 모티브도 참고실시예 7에서 기재되는 바와 같은 Ca 라이브러리 디자인의 새로운 요소가 될 수 있다. 즉 참고실시예 7에서는 경쇄 가변영역에 칼슘 결합 모티브가 도입되었으나, 예를 들면 6KC4-1#85 항체의 중쇄 CDR3를 포함하고, 경쇄를 포함하는 그것 이외의 CDR에 플렉시블 잔기를 포함하는 라이브러리가 생각된다.

(참고실시예 18) 정상 마우스를 사용한 Ca 의존성 결합 항체의 항원의 혈장 중 체류성으로의 영향의 평가

(18-1) 정상 마우스를 사용한 in vivo 시험

정상 마우스(C57BL/6J mouse, Charles River Japan)에 hsIL-6R(가용형 인간 IL-6 수용체：참고실시예 21에서 제작)을 단독 투여 또는 hsIL-6R 및 항인간 IL-6 수용체 항체를 동시 투여한 후의 hsIL-6R 및 항인간 IL-6 수용체 항체의 체내동태가 평가되었다. hsIL-6R 용액(5 ㎍/mL) 또는 hsIL-6R과 항인간 IL-6 수용체 항체의 혼합용액이 꼬리정맥에 10 mL/㎏으로 단회 투여되었다. 항인간 IL-6 수용체 항체로서는 상기 H54/L28-IgG1, 6RL#9-IgG1, FH4-IgG1이 사용되었다.

혼합용액 중의 hsIL-6R 농도는 모두 5 ㎍/mL인데 항인간 IL-6 수용체 항체 농도는 항체마다 달라, H54/L28-IgG1은 0.1 ㎎/mL, 6RL#9-IgG1 및 FH4-IgG1은 10 ㎎/mL, 이때 hsIL-6R에 대해 항인간 IL-6 수용체 항체는 충분량 과잉으로 존재하는 것으로부터, hsIL-6R은 대부분이 항체에 결합해 있는 것으로 생각된다. 투여 후 15분, 7시간, 1일, 2일, 4일, 7일, 14일, 21일, 28일의 시점에서 채혈이 행해졌다. 채취된 혈액을 바로 4℃, 12,000 rpm으로 15분간 원심분리함으로써 혈장이 얻어졌다. 분리된 혈장은 측정을 실시할 때까지 -20℃ 이하로 설정된 냉동고에서 보존되었다.

(18-2) ELISA법에 의한 정상 마우스 혈장 중의 항인간 IL-6 수용체 항체 농도의 측정

마우스 혈장 중의 항인간 IL-6 수용체 항체 농도는 ELISA법으로 측정되었다. 먼저 Anti-Human IgG(γ-chain specific) F(ab')2 Fragment of Antibody(SIGMA)를 Nunc-Immuno Plate, MaxiSoup(Nalge nunc International)에 분주하고 4℃에서 하룻밤 정치함으로써 Anti-Human IgG 고상화 플레이트가 제작되었다. 혈장 중 농도로서 0.64, 0.32, 0.16, 0.08, 0.04, 0.02, 0.01 ㎍/mL의 검량선 시료 및 100배 이상 희석된 마우스 혈장 측정시료의 각각이 분주된 Anti-Human IgG 고상화 플레이트가 25℃에서 1시간 인큐베이션되었다. 그 후 Biotinylated Anti-human IL-6 R Antibody(R&D)를 25℃에서 1시간 반응시킨 후에 Streptavidin-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)을 25℃에서 0.5시간 반응시켰다. TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories)를 기질로서 사용하여 발색반응이 행해졌다. 1N-Sulfuric acid(Showa Chemical)에 의해 발색반응이 정지된 후, 마이크로플레이트 리더를 사용하여 발색액의 450 nm에 있어서의 흡광도가 측정되었다. 해석 소프트웨어 SOFTmax PRO(Molecular Devices)를 사용하여 마우스 혈장 중 농도가 검량선의 흡광도를 기준으로 산출되었다. 이 방법으로 측정된 정맥내 투여 후의 정상 마우스에 있어서의 H54/L28-IgG1, 6RL#9-IgG1, FH4-IgG1의 혈장 중의 항체 농도 추이를 도 19에 나타내었다.

(18-3) 전기화학 발광법에 의한 혈장 중의 hsIL-6R 농도의 측정

마우스의 혈장 중 hsIL-6R 농도는 전기화학 발광법으로 측정되었다. 2000, 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25 pg/mL로 조제된 hsIL-6R 검량선 시료 및 50배 이상 희석된 마우스 혈장 측정시료와, SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)로 루테늄화한 Monoclonal Anti-human IL-6R Antibody(R&D) 및 Biotinylated Anti-human IL-6 R Antibody(R&D) 및 토실리주맙(중쇄 서열번호：96, 경쇄 서열번호：97) 용액의 혼합액을 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. 샘플 중의 Free Ca 농도를 저하시키고, 샘플 중의 거의 모든 hsIL-6R이 6RL#9-IgG1 또는 FH4-IgG1으로부터 해리되어, 첨가한 토실리주맙과 결합한 상태로 하기 위해 그때의 Assay buffer에는 10 mM EDTA가 포함되어 있었다. 그 후 당해 반응액이 MA400 PR Streptavidin Plate(Meso Scale Discovery)에 분주되었다. 추가로 25℃에서 1시간 반응시킨 플레이트의 각 웰이 세정된 후, 각 웰에 Read Buffer T(×4)(Meso Scale Discovery)가 분주되었다. 바로 반응액은 SECTOR PR 400 reader(Meso Scale Discovery)를 사용하여 측정되었다. hsIL-6R 농도는 검량선의 리스폰스로부터 해석 소프트웨어 SOFTmax PRO(Molecular Devices)를 사용하여 산출되었다. 상기 방법으로 측정된 정맥내 투여 후의 정상 마우스에 있어서의 혈장 중의 hsIL-6R의 농도 추이를 도 20에 나타내었다.

그 결과 hsIL-6R 단독으로는 매우 빠른 소실을 나타낸 것에 대해, hsIL-6R과 Ca 의존적인 결합이 없는 통상의 항체인 H54/L28-IgG1을 동시에 투여한 경우는, hsIL-6R의 소실을 대폭 지연시켰다. 그것에 대해 hsIL-6R과 100배 이상의 Ca 의존적인 결합을 갖는 6RL#9-IgG1 또는 FH4-IgG1을 동시에 투여한 경우는, hsIL-6R의 소실이 대폭 가속되었다. H54/L28-IgG1을 동시에 투여한 경우와 비교하여, 6RL#9-IgG1 및 FH4-IgG1을 동시에 투여한 경우는, 1일 후의 혈장 중의 hsIL-6R 농도는 각각 39배 및 2배 저감되었다. 이것으로부터 칼슘 의존적 결합 항체가 혈장 중으로부터의 항원의 소실을 가속 가능한 것이 확인되었다.

(참고실시예 19) Ca 의존적 항원 결합 항체의 항원 소실 가속효과의 향상 검토(항체 제작)

(19-1) IgG 항체의 FcRn으로의 결합에 관하여

IgG 항체는 FcRn에 결합함으로써 긴 혈장 중 체류성을 갖는다. IgG와 FcRn의 결합은 산성 조건하(pH6.0)에 있어서만 확인되고, 중성 조건하(pH 7.4)에 있어서 그 결합은 거의 확인되지 않는다. IgG 항체는 비특이적으로 세포에 흡수되는데, 엔도솜 내의 산성 조건하에 있어서 엔도솜 내의 FcRn에 결합함으로써 세포 표면 상으로 되돌아가고 혈장 중 중성 조건하에 있어서 FcRn으로부터 해리된다. IgG의 Fc영역에 변이를 도입하여 산성 조건하에 있어서의 FcRn으로의 결합을 상실시키면 엔도솜 내로부터 혈장 중으로 리사이클되지 않기 때문에 항체의 혈장 중 체류성은 현저히 손상된다.

IgG 항체의 혈장 중 체류성을 개선하는 방법으로서, 산성 조건하에 있어서의 FcRn으로의 결합을 향상시키는 방법이 보고되어 있다. IgG 항체의 Fc영역에 아미노산 치환을 도입하여 산성 조건하의 FcRn으로의 결합을 향상시킴으로써 엔도솜 내로부터 혈장 중으로의 IgG 항체의 리사이클 효율이 상승한다. 그 결과, IgG 항체의 혈장 중 체류성이 개선된다. 아미노산의 치환을 도입할 때 중요하다고 생각되고 있는 것은 중성 조건하에 있어서의 FcRn으로의 결합을 높이지 않는 것이었다. 중성 조건하에 있어서 FcRn에 결합하는 IgG 항체는 엔도솜 내의 산성 조건하에 있어서 FcRn에 결합함으로써 세포 표면 상으로 되돌아가는 것은 가능하더라도 중성 조건하의 혈장 중에 있어서 IgG 항체가 FcRn으로부터 해리되지 않아 혈장 중으로 리사이클되지 않기 때문에, 반대로 IgG 항체의 혈장 중 체류성은 손상되는 것으로 생각되고 있었다.

예를 들면, Dall' Acqua등(J. Immunol. (2002) 169 (9), 5171-5180)에 기재되어 있는 바와 같이, 마우스에 투여된 아미노산 치환을 도입함으로써 중성 조건하(pH 7.4)에 있어서 마우스 FcRn에 대한 결합이 확인되게 된 IgG1 항체의 혈장 중 체류성이 악화되는 것이 보고되어 있다. 또한 Yeung등(J. Immunol. (2009) 182 (12), 7663-7671), Datta-Mannan등(J. Biol. Chem. (2007) 282 (3), 1709-1717), Dall' Acqua등(J. Immunol. (2002) 169 (9), 5171-5180)에 기재되어 있는 바와 같이, 아미노산 치환을 도입함으로써 산성 조건하(pH 6.0)에 있어서의 인간 FcRn의 결합이 향상되는 IgG1 항체 개변체는 동시에 중성 조건하(pH 7.4)에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합이 확인되게 된다. 게잡이원숭이에 투여된 당해 항체의 혈장 중 체류성은 개선되지 않아 혈장 중 체류성에 변화가 확인되지 않은 것이 보고되어 있다. 그 때문에 항체의 기능을 향상시키는 항체 공학 기술에 있어서는 중성 조건하(pH 7.4)에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합을 증가시키지 않고 산성 조건하에 있어서의 인간 FcRn으로의 결합을 증가시킴으로써 항체의 혈장 중 체류성을 개선시키는 것에 주력되고 있었다. 즉, 그 Fc영역에 아미노산 치환을 도입함으로써 중성 조건하(pH 7.4)에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합이 증가된 IgG1 항체의 이점은 지금까지 보고되어 있지 않다.

Ca 의존적으로 항원에 결합하는 항체는 가용형 항원의 소실을 가속시켜 하나의 항체 분자가 복수 회 반복해서 가용형 항원에 결합하는 효과를 갖는 것으로부터 매우 유용하다. 이 항원 소실 가속효과를 더욱 향상시키는 방법으로서 중성 조건하(pH 7.4)에 있어서의 FcRn에 대한 결합을 증강시키는 방법이 검증되었다.

(19-2) 중성 조건하에 있어서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 Ca 의존적 인간 IL-6 수용체 결합 항체의 조제

칼슘 의존적 항원 결합능을 갖는 FH4-IgG1, 6RL#9-IgG1 및 대조로서 사용된 칼슘 의존적 항원 결합능을 갖지 않는 H54/L28-IgG1의 Fc영역에 아미노산 변이를 도입함으로써 중성 조건하(pH 7.4)에 있어서의 FcRn에 대한 결합을 갖는 개변체가 제작되었다. 아미노산 변이의 도입은 PCR을 사용한 당업자 공지의 방법을 사용해서 행해졌다. 구체적으로는 IgG1의 중쇄 정상영역에 대해 EU 넘버링으로 표시되는 434번 위치의 아미노산인 Asn이 Trp로 치환된 FH4-N434W(중쇄 서열번호：115, 경쇄 서열번호：101)와 6RL#9-N434W(중쇄 서열번호：116, 경쇄 서열번호：99) 및 H54/L28-N434W(중쇄 서열번호：117, 경쇄 서열번호：39)가 제작되었다. QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)를 사용하여 첨부 설명서에 기재된 방법을 사용하여 그 아미노산이 치환된 변이체를 코드하는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 동물세포 발현 벡터가 제작되었다. 항체의 발현, 정제, 농도 측정은 참고실시예 11에 기재된 방법에 준하여 실시되었다.

(참고실시예 20) 정상 마우스를 사용한 Ca 의존성 결합 항체의 소실 가속효과의 평가

(20-1) 정상 마우스를 사용한 in vivo 시험

정상 마우스(C57BL/6J mouse, Charles River Japan)에 hsIL-6R(가용형 인간 IL-6 수용체：참고실시예 20에서 제작)이 단독으로 투여되었거나 또는 hsIL-6R 및 항인간 IL-6 수용체 항체가 동시 투여된 후의 hsIL-6R 및 항인간 IL-6 수용체 항체의 체내동태가 평가되었다. hsIL-6R 용액(5 ㎍/mL) 또는 hsIL-6R과 항인간 IL-6 수용체 항체의 혼합용액이 꼬리정맥에 10 mL/㎏으로 단회 투여되었다. 항인간 IL-6 수용체 항체로서 전술한 H54/L28-N434W, 6RL#9-N434W 및 FH4-N434W가 사용되었다.

혼합용액 중의 hsIL-6R 농도는 모두 5 ㎍/mL인데 항인간 IL-6 수용체 항체의 농도는 항체마다 상이하여 H54/L28-N434W는 0.042 ㎎/mL, 6RL#9-N434W는 0.55 ㎎/mL, FH4-N434W는 1 ㎎/mL로 조제되었다. 이때 hsIL-6R에 대해 항인간 IL-6 수용체 항체는 충분량 과잉으로 존재하기 때문에 hsIL-6R의 대부분은 항체에 결합해 있는 것으로 생각되었다. 투여 후 15분, 7시간, 1일, 2일, 4일, 7일, 14일, 21일, 28일의 시점에서 채혈이 행해졌다. 채취된 혈액을 바로 4℃, 12,000 rpm으로 15분간 원심분리함으로써 혈장이 얻어졌다. 분리된 혈장은 측정을 실시할 때까지 -20℃ 이하로 설정된 냉동고에서 보존되었다.

(20-2) ELISA법에 의한 정상 마우스 혈장 중의 항인간 IL-6 수용체 항체의 농도 측정

마우스 혈장 중 항인간 IL-6 수용체 항체 농도는 참고실시예 18과 동일한 ELISA법으로 측정되었다. 이 방법으로 측정된 정맥내 투여 후의 정상 마우스에 있어서의 H54/L28-N434W, 6RL#9-N434W, FH4-N434W 항체의 혈장 중 항체 농도의 추이를 도 21에 나타내었다.

(20-3) 전기화학 발광법에 의한 혈장 중 hsIL-6R 농도 측정

마우스의 혈장 중 hsIL-6R 농도가 전기화학 발광법으로 측정되었다. 2000, 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25 pg/mL로 조제된 hsIL-6R 검량선 시료 및 50배 이상 희석된 마우스 혈장 측정시료와, SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)로 루테늄화한 Monoclonal Anti-human IL-6R Antibody(R&D) 및 Biotinylated Anti-human IL-6 R Antibody (R&D)의 혼합액을 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. 샘플 중의 Free Ca 농도를 저하시키고 샘플 중의 거의 모든 hsIL-6R이 6RL#9-N434W 또는 FH4-N434W로부터 해리되어 프리체로서 존재하는 상태로 하기 위해, 그때의 Assay buffer에는 10 mM EDTA가 포함되어 있었다. 그 후, 당해 반응액이 MA400 PR Streptavidin Plate(Meso Scale Discovery)에 분주되었다. 추가로 25℃에서 1시간 반응시킨 플레이트의 각 웰이 세정된 후, 각 웰에 Read Buffer T(×4)(Meso Scale Discovery)가 분주되었다. 바로 반응액은 SECTOR PR 400 reader(Meso Scale Discovery)를 사용해서 측정되었다. hSIL-6R 농도는 검량선의 리스폰스로부터 해석 소프트웨어 SOFTmax PRO(Molecular Devices)를 사용해서 산출되었다. 상기 방법으로 측정된 정맥내 투여 후의 정상 마우스에 있어서의 혈장 중 hsIL-6R의 농도 추이를 도 22에 나타내었다.

그 결과, pH 7.4에 있어서의 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 한편으로 hsIL-6R에 대한 Ca 의존적인 결합 활성을 갖지 않는 H54/L28-N434W 항체가 동시에 투여된 경우는, hsIL-6R이 단독으로 투여된 경우와 비교하여 hsIL-6R의 소실이 대폭 지연되었다. 이에 대해 hsIL-6R에 대해 100배 이상의 Ca 의존적인 결합을 가져 pH 7.4에 있어서의 FcRn에 대한 결합을 갖는 6RL#9-N434W 항체 또는 FH4-N434W 항체가 동시에 투여된 경우는, hsIL-6R이 단독으로 투여된 경우보다도 hsIL-6R의 소실이 가속되었다. hsIL-6R이 단독으로 투여된 경우와 비교하여 6RL#9-N434W 항체 또는 FH4-N434W 항체가 동시에 투여된 경우는, 투여 후 1일에서의 혈장 중 hsIL-6R 농도가 각각 3배 및 8배 저감되었다. 이 결과, 칼슘 의존적으로 항원에 대해 결합하는 항체에 대해 pH 7.4에 있어서의 FcRn에 대한 결합 활성을 부여함으로써 혈장 중으로부터의 항원의 소실이 더욱 가속될 수 있는 것이 확인되었다.

hsIL-6R에 대한 Ca 의존적인 결합을 갖지 않는 H54/L28-IgG1 항체와 비교하여 hsIL-6R에 대해 100배 이상의 Ca 의존적인 결합 활성을 갖는 6RL#9-IgG1 항체 또는 FH4-IgG1 항체는 hsIL-6R의 소실을 증대시키는 효과가 확인되었다. hsIL-6R에 대해 100배 이상의 Ca 의존적인 결합을 가져 pH 7.4에 있어서의 FcRn에 대한 결합을 갖는 6RL#9-N434W 항체 또는 FH4-N434W 항체는 hsIL-6R의 소실을 hsIL-6R 단독의 투여보다도 가속시키는 것이 확인되었다. 이들 데이터는 pH 의존적으로 항원에 결합하는 항체와 마찬가지로 Ca 의존적으로 항원에 결합하는 항체가 엔도솜 내에서 항원을 해리하는 것을 시사하고 있다.

(참고실시예 21) 가용형 인간 IL-6 수용체(hsIL-6R)의 조제

항원인 인간 IL-6 수용체의 재조합 인간 IL-6 수용체는 아래와 같이 조제되었다. Mullberg 등(J. Immunol. (1994) 152, 4958-4968)에서 보고되어 있는 N말단측 1번째~357번째의 아미노산 서열로 이루어지는 가용형 인간 IL-6 수용체(이하, hsIL-6R)의 CHO 정상 발현주가 당업자 공지의 방법으로 구축되었다. 당해 발현주를 배양함으로써 hsIL-6R이 발현되었다. 얻어진 배양상청으로부터 Blue Sepharose 6 FF 칼럼크로마토그래피, 겔여과 칼럼크로마토그래피에 의해 hsIL-6R이 정제되었다. 최종 공정에 있어서 메인 피크로서 용출된 분획이 최종 정제품으로서 사용되었다.

(참고실시예 22) pH 의존적 결합 항체 라이브러리의 설계

(22-1) pH 의존적 결합 항체의 취득방법

WO2009/125825는 항원 결합 분자에 히스티딘을 도입함으로써 pH 중성영역과 pH 산성영역에서 성질이 변화되는 pH 의존적 항원 결합 항체를 개시하고 있다. 개시된 pH 의존적 결합 항체는 목적하는 항원 결합 분자의 아미노산 서열의 일부를 히스티딘으로 치환하는 개변에 의해 취득되고 있다. 개변하는 대상의 항원 결합 분자를 사전에 얻지 않고, pH 의존적 결합 항체를 보다 효율적으로 취득하기 위해, 히스티딘을 가변영역(보다 바람직하게는 항원 결합에 관여할 가능성이 있는 위치)에 도입된 항원 결합 분자의 집단(His 라이브러리라 부른다)으로부터 목적하는 항원에 결합하는 항원 결합 분자를 취득하는 방법을 생각할 수 있다. His 라이브러리로부터 얻어지는 항원 결합 분자는 통상의 항체 라이브러리보다도 히스티딘이 높은 빈도로 출현하기 때문에, 목적하는 성질을 갖는 항원 결합 분자를 효율적으로 취득할 수 있을 것으로 생각된다.

(22-2) pH 의존적으로 항원에 결합하는 결합 항체를 효율적으로 취득할 수 있도록 히스티딘 잔기가 가변영역에 도입된 항체 분자의 집단(His 라이브러리)의 설계

먼저 His 라이브러리에서 히스티딘을 도입하는 위치가 선택되었다. WO2009/125825에서는 IL-6 수용체 항체, IL-6 항체 및 IL-31 수용체 항체의 서열 중의 아미노산 잔기를 히스티딘으로 치환함으로써 pH 의존적 항원 결합 항체가 제작된 것이 개시되어 있다. 또한 항원 결합 분자의 아미노산 서열을 히스티딘으로 치환함으로써 pH 의존적 항원 결합능을 갖는 항난백 리소자임 항체(FEBS Letter 11483, 309, 1, 85-88) 및 항헵시딘 항체(WO2009/139822)가 제작되어 있다. IL-6 수용체 항체, IL-6 항체, IL-31 수용체 항체, 난백 리소자임 항체 및 헵시딘 항체에서 히스티딘을 도입한 위치를 표 28에 나타내었다. 표 28에 나타낸 위치는 항원과 항체의 결합을 제어할 수 있는 위치의 후보로서 들 수 있다. 또한 표 28에서 나타내어진 위치 이외에도 항원과 접촉할 가능성이 높은 위치도 히스티딘을 도입하는 위치로서 적절한 것으로 생각되었다.

중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역으로 구성되는 His 라이브러리 중 중쇄 가변영역은 인간 항체 서열이 사용되고, 경쇄 가변영역에 히스티딘이 도입되었다. His 라이브러리에서 히스티딘을 도입하는 위치로서 상기에서 예로 들어진 위치와 항원 결합에 관여할 가능성이 있는 위치, 즉 경쇄의 30번 위치, 32번 위치, 50번 위치, 53번 위치, 91번 위치, 92번 위치 및 93번 위치(Kabat 넘버링, Kabat EA et al. 1991. Sequence of Proteins of Immunological Interest. NIH)가 선택되었다. 또한 히스티딘을 도입하는 경쇄 가변영역의 템플레이트 서열로서 Vk1 서열이 선택되었다. 템플레이트 서열에 복수의 아미노산을 출현시켜서 라이브러리를 구성하는 항원 결합 분자의 다양성이 확대되었다. 복수의 아미노산을 출현시키는 위치는 항원과 상호작용할 가능성이 높은 가변영역의 표면에 노출되는 위치가 선택되었다. 구체적으로는 경쇄의 30번 위치, 31번 위치, 32번 위치, 34번 위치, 50번 위치, 53번 위치, 91번 위치, 92번 위치, 93번 위치, 94번 위치 및 96번 위치(Kabat 넘버링, Kabat EA et al. 1991. Sequence of Proteins of Immunological Interest. NIH)가 이러한 플렉시블 잔기로서 선택되었다.

다음으로 출현시키는 아미노산 잔기의 종류와 그의 출현율이 설정되었다. Kabat 데이터베이스(KABAT, E.A. ET AL.: 'Sequences of proteins of immunological interest', vol. 91, 1991, NIH PUBLICATION)에 등록되어 있는 hVk1과 hVk3의 서열 중의 플렉시블 잔기에 있어서의 아미노산의 출현 빈도가 해석되었다. 해석 결과를 토대로 각 위치에서 출현 빈도가 높은 아미노산으로부터 His 라이브러리에서 출현시키는 아미노산의 종류가 선택되었다. 이때 아미노산의 성질이 치우치지 않도록 해석 결과에서는 출현 빈도가 적은 것으로 판정된 아미노산도 선택되었다. 또한 선택된 아미노산의 출현 빈도는 Kabat 데이터베이스의 해석 결과를 참고로 하여 설정되었다.

이상과 같이 설정된 아미노산 및 출현 빈도를 고려함으로써 His 라이브러리로서, 히스티딘이 각 CDR에서 하나 반드시 들어가도록 고정되어 있는 His 라이브러리 1과 His 라이브러리 1보다도 서열의 다양성이 중시된 His 라이브러리 2가 설계되었다. His 라이브러리 1 및 His 라이브러리 2의 상세한 디자인은 표 3 및 표 4에 나타내어져 있다(각 표 중의 위치는 Kabat 넘버링을 나타낸다). 또한 표 3 및 표 4에서 기재되는 아미노산의 출현 빈도는 Kabat 넘버링으로 표시되는 92번 위치가 Asn(N)인 경우는 94번 위치는 Ser(S)을 제외할 수 있다.

(참고실시예 23) pH 의존적으로 항원에 결합하는 항체를 취득하기 위한 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리(His 라이브러리 1)의 제작

인간 PBMC로부터 제작한 폴리 A RNA나 시판되고 있는 인간 폴리 A RNA 등을 주형으로 하여 PCR법에 의해 항체 중쇄 가변영역의 유전자 라이브러리가 증폭되었다. 참고실시예 22에 기재된 His 라이브러리 1로서 설계된 항체 경쇄 가변영역의 유전자 라이브러리가 PCR법을 사용하여 증폭되었다. 이와 같이 제작된 항체 중쇄 가변영역의 유전자 라이브러리와 항체 경쇄 가변영역의 유전자 라이브러리의 조합이 파지미드 벡터로 삽입되어, 인간 항체 서열로 이루어지는 Fab 도메인을 제시하는 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리가 구축되었다. 구축방법으로서 (Methods Mol Biol. (2002) 178, 87-100)이 참고가 되었다. 상기 라이브러리의 구축시에는 파지미드의 Fab와 파지 pIII 단백질을 연결하는 링커 부분 및 헬퍼 파지 pIII 단백 유전자의 N2 도메인과 CT 도메인 사이에 트립신 절단 서열이 삽입된 파지 디스플레이 라이브러리의 서열이 사용되었다. 항체 유전자 라이브러리가 도입된 대장균으로부터 단리된 항체 유전자 부분의 서열이 확인되어 132 클론의 서열정보가 얻어졌다. 설계된 아미노산 분포와 확인된 서열 중 아미노산의 분포를 도 23에 나타내었다. 설계된 아미노산 분포에 대응하는 다양한 서열을 포함하는 라이브러리가 구축되었다.

(참고실시예 24) pH 의존적으로 IL-6R에 결합하는 항체의 취득

(24-1) 비드 패닝에 의한 라이브러리로부터의 pH 의존적으로 항원에 결합하는 항체 단편의 취득

구축된 His 라이브러리 1로부터의 최초의 선발은 항원(IL-6R)으로의 결합능을 갖는 항체 단편만의 농축에 의해 실시되었다.

구축한 파지 디스플레이용 파지미드를 보유한 대장균으로부터 파지 생산이 행해졌다. 파지 생산이 행해진 대장균의 배양액에 2.5 M NaCl/10%PEG를 첨가함으로써 침전시킨 파지의 집단을 TBS로 희석함으로써 파지 라이브러리액이 얻어졌다. 파지 라이브러리액에 BSA 및 CaCl₂를 첨가함으로써 최종 농도 4% BSA, 1.2 mM 칼슘 이온이 되도록 조제되었다. 패닝방법으로서 일반적인 방법인 자기 비드에 고정화한 항원을 사용한 패닝방법이 참조되었다(J. Immunol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9, J. Immunol. Methods. (2001) 247 (1-2), 191-203, Biotechnol. Prog. (2002) 18(2) 212-20, Mol. Cell Proteomics (2003) 2 (2), 61-9). 자기 비드로서 NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated) 또는 Streptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)가 사용되었다.

구체적으로는 조제된 파지 라이브러리액에 250 pmol의 비오틴 표지 항원을 첨가함으로써, 당해 파지 라이브러리액을 실온에서 60분간 항원과 접촉시켰다. BSA로 블로킹된 자기 비드가 첨가되고, 항원과 파지의 복합체를 자기 비드와 실온에서 15분간 결합시켰다. 비드는 1 mL의 1.2 mM CaCl₂/TBST(1.2 mM CaCl₂, 0.1% Tween20을 포함하는 TBS)로 3회 세정된 후, 1 mL의 1.2 mM CaCl₂/TBS(pH 7.6)로 추가로 2회 세정되었다. 그 후, 1 ㎎/mL의 트립신 0.5 mL가 첨가된 비드는 실온에서 15분 현탁된 후, 바로 자기 스탠드를 사용하여 비드가 분리되고 파지 용액이 회수되었다. 회수된 파지 용액이 대수증식기(OD600이 0.4-0.7)가 된 10 mL의 대장균주 ER2738에 첨가되었다. 37℃에서 1시간 완만하게 상기 대장균의 교반배양을 행함으로써 파지를 대장균에 감염시켰다. 감염시킨 대장균은 225 ㎜×225 ㎜의 플레이트로 파종되었다. 다음으로 파종된 대장균의 배양액으로부터 파지를 회수함으로써 파지 라이브러리액이 조제되었다.

2회째 이후의 패닝에서는 항원 결합능 또는 pH 의존적 결합능을 지표로 파지의 농축이 행해졌다. 구체적으로는 조제한 파지 라이브러리액에 40 pmol의 비오틴 표지 항원을 첨가함으로써 파지 라이브러리를 실온에서 60분간 항원과 접촉시켰다. BSA로 블로킹된 자기 비드가 첨가되고, 항원과 파지의 복합체를 자기 비드와 실온에서 15분간 결합시켰다. 비드는 1 mL의 1.2 mM CaCl₂/TBST와 1.2 mM CaCl₂/TBS로 복수 회 세정되었다. 그 후 항원 결합능을 지표로 하여 농축하는 경우는, 1 ㎎/mL의 트립신 0.5 mL가 첨가된 비드는 실온에서 15분 현탁된 후, 바로 자기 스탠드를 사용하여 비드가 분리되고 파지 용액이 회수되었다. pH 의존적 항원 결합능을 지표로 농축하는 경우는 0.1 mL의 50 mM MES/1.2 mM CaCl₂/150 mM NaCl(pH 5.5)이 첨가된 비드는 실온에서 현탁된 후, 바로 자기 스탠드를 사용하여 비드가 분리되고 회수된 파지 용액에 100 ㎎/mL의 트립신 5μL를 첨가함으로써, Fab를 제시하지 않는 파지의 pIII 단백질(헬퍼 파지 유래의 pIII 단백질)이 절단되어 Fab를 제시하지 않는 파지의 대장균에 대한 감염능을 상실시켰다. 회수된 파지가 대수증식기(OD600이 0.4-0.7)가 된 10 mL의 대장균주 ER2738에 첨가되었다. 37℃에서 1시간 완만하게 상기 대장균의 교반배양을 행함으로써 파지를 대장균에 감염시켰다. 감염시킨 대장균은 225 ㎜×225 ㎜의 플레이트로 파종되었다. 다음으로 파종된 대장균의 배양액으로부터 파지를 회수함으로써 파지 라이브러리액이 조제되었다. 항원 결합능 또는 pH 의존적 결합능을 지표로 하는 패닝이 2회 반복되었다.

(24-2) 파지 ELISA에 의한 평가

최종 농도 4%BSA 및 칼슘 이온 농도 1.2 mM가 되도록 BSA 및 CaCl₂가 첨가된 파지를 함유하는 배양상청이 아래의 순서로 ELISA에 제공되었다. StreptaWell 96마이크로타이터 플레이트(Roche)가 비오틴 표지 항원을 포함하는 100 μL의 PBS로 하룻밤 코트되었다. 당해 플레이트의 각 웰을 PBST(0.1%Tween20을 포함하는 PBS)로 세정함으로써 항원이 제거된 후, 당해 웰이 4% BSA-TBS 250 μL로 1시간 이상 블로킹되었다. 4% BSA-TBS가 제거된 각 웰에 조제된 배양상청이 첨가된 당해 플레이트를 37℃에서 1시간 정치함으로써 파지를 제시하는 항체를 각 웰에 존재하는 항원에 결합시켰다. 1.2 mM CaCl₂/TBST로 세정된 각 웰에 1.2 mM CaCl₂/TBS(pH 7.6) 또는 1.2 mM CaCl₂/TBS(pH 5.5)가 첨가되고, 당해 플레이트는 37℃에서 30분간 정치하고 인큐베이트되었다. 1.2 mM CaCl₂/TBST로 세정된 후에 4% BSA 및 이온화 칼슘 농도 1.2 mM로 한 TBS에 의해 희석된 HRP 결합 항M13 항체(Amersham Pharmacia Biotech)가 각 웰에 첨가된 플레이트를 1시간 인큐베이트시켰다. 1.2 mM CaCl₂/TBST로 세정 후, TMB single 용액(ZYMED)이 첨가된 각 웰 중의 용액의 발색반응이 황산의 첨가에 의해 정지된 후 450 nm의 흡광도에 의해 당해 발색이 측정되었다.

항원 결합능을 지표로 농축한 경우, 패닝을 2회 실시한 것에 대해서 파지 ELISA를 실시한 바, 항원 특이적으로 ELISA 양성이 된 것은 96 클론 중 17 클론이었기 때문에 패닝을 3회 실시한 것이 해석되었다. 한편 pH 의존적 항원 결합능을 지표로 농축한 경우, 패닝을 2회 실시한 것에 대해서 파지 ELISA를 실시한 바, ELISA 양성이 된 것은 94 클론 중 70 클론이었기 때문에 패닝을 2회 실시한 것이 해석되었다.

상기 파지 ELISA를 실시한 클론에 대해 특이적인 프라이머를 사용하여 증폭된 유전자의 염기서열이 해석되었다.

파지 ELISA 및 서열 해석 결과를 아래의 표 29에 나타낸다.

동일한 방법으로 나이브 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리로부터 pH 의존적 항원 결합능을 갖는 항체 취득이 행해졌다. 항원 결합능을 지표로 농축한 경우, 88 클론 평가 중 13종류의 pH 의존적 결합 항체가 취득되었다. 또한 pH 의존적 항원 결합능을 지표로 농축한 경우, 83 클론 평가 중 27종류의 pH 의존적 결합 항체가 취득되었다.

이상의 결과로부터, 나이브 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리와 비교하여 His 라이브러리 1 쪽이 얻어지는 pH 의존적 항원 결합능을 갖는 클론의 변형이 많은 것이 확인되었다.

(24-3) 항체의 발현과 정제

파지 ELISA의 결과, pH 의존적인 항원에 대한 결합능이 있다고 판단된 클론이 동물세포 발현용 플라스미드로 도입되었다. 항체의 발현은 아래의 방법을 사용해서 행해졌다. 인간 태아 신장세포 유래 FreeStyle 293-F주(Invitrogen)가 FreeStyle 293 Expression Medium배지(Invitrogen)에 현탁되고, 1.33×10⁶세포/mL의 세포밀도로 6웰 플레이트의 각 웰로 3 mL씩 파종되었다. 조제된 플라스미드는 리포펙션법으로 세포로 도입되었다. CO₂ 인큐베이터(37도, 8% CO₂, 90 rpm) 중에서 4일간 배양이 행해졌다. rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)를 사용하고 당업자 공지의 방법을 사용하여 상기에서 얻어진 배양상청으로부터 항체가 정제되었다. 분광광도계를 사용하여 정제된 항체 용액의 280 nm에서의 흡광도가 측정되었다. PACE법으로 산출된 흡광계수를 사용함으로써 얻어진 측정값으로부터 항체 농도가 산출되었다(Protein Science (1995) 4, 2411-2423).

(24-4) 취득된 항체의 인간 IL-6 수용체에 대한 pH 의존적 결합능의 평가

(24-3)에서 취득된 항체 6RpH#01(중쇄 서열번호：118, 경쇄 서열번호：119), 6RpH#02(중쇄 서열번호：120), 경쇄 서열번호：121), 및 6RpH#03(중쇄 서열번호：122), 경쇄 서열번호：123)의 인간 IL-6 수용체에 대한 결합 활성이 pH 의존적인지 여부를 판단하기 위해, 이들 항체와 인간 IL-6 수용체의 상호작용이 Biacore T100(GE Healthcare)을 사용하여 해석되었다. 인간 IL-6 수용체에 대한 pH 의존성의 결합 활성을 갖지 않는 대조 항체로서 토실리주맙(중쇄 서열번호：60, 경쇄 서열번호：61)이 사용되었다. 중성역 pH 및 산성역 pH의 조건으로서 각각 pH 7.4 및 pH 6.0의 용액 중에서 항원 항체 반응의 상호작용이 해석되었다. 아민커플링법으로 protein A/G(Invitrogen)가 적당량 고정화된 Sensor chip CM5(GE Healthcare) 상에 목적의 항체가 각각 300RU 정도 캡쳐되었다. 러닝 버퍼에는 20 mM ACES, 150 mM NaCl, 0.05% (w/v) Tween20, 1.2 mM CaCl₂(pH 7.4) 또는 20 mM ACES, 150 mM NaCl, 0.05% (w/v) Tween20, 1.2 mM CaCl₂(pH 6.0)의 2종류의 완충액이 사용되었다. 인간 IL-6 수용체의 희석에도 각각의 버퍼가 사용되었다. 측정은 모두 37℃에서 실시되었다.

대조 항체인 토실리주맙 항체, 6RpH#01 항체, 6RpH#02 항체 및 6RpH#03 항체를 사용한 항원 항체 반응의 상호작용의 해석시에, IL-6 수용체의 희석액과 블랭크인 러닝 버퍼를 유속 5 μL/min로 3분간 인젝트함으로써, 센서칩 상에 캡쳐시킨 토실리주맙 항체, 6RpH#01 항체, 6RpH#02 항체 및 6RpH#03 항체에 IL-6 수용체를 상호작용시켰다. 그 후, 10 mM Glycine-HCl(pH 1.5)을 유속 30 μL/min로 30초간 인젝트함으로써 센서칩이 재생되었다.

상기 방법으로 측정된 pH 7.4에 있어서의 센서그램을 도 24에 나타낸다. 또한 동일한 방법으로 취득된 pH 6.0의 조건하에서의 센서그램을 도 25에 나타낸다.

상기 결과로부터 6RpH#01 항체, 6RpH#02 항체 및 6RpH#03 항체는 버퍼 중의 pH를 pH 7.4 내지 pH 6.0으로 함으로써 IL6 수용체에 대한 결합능이 대폭 저감되는 것이 관찰되었다.

(참고실시예 25) 인간 IL-6 수용체 녹인 마우스의 제작

(25-1) 녹인 벡터의 구축

마우스 인터류킨-6 유전자(Il6ra)의 게놈 영역이 클로닝되어 있는 대장균 인공 염색체(BAC) 클론을 사용하였다. 이 BAC 상의 마우스 Il6ra 유전자의 표적 영역에 인간 인터류킨-6 수용체 유전자의 코딩 서열(GeneBank＃NM_000565_), hp7 서열, 폴리 A 부가 시그날, loxP 서열, 네오마이신 내성(neo) 유전자 카세트 및 loxP의 순으로 접속한 DNA 단편을 Red/ET 시스템(GeneBridges)을 이용하여 상동 재조합으로 삽입하였다. 그때, BAC 상의 마우스 Il6ra 유전자의 엑손 1에 존재하는 번역 개시점과 인간 IL6R 유전자의 번역 개시점을 일치시키도록 삽입하고 또한 마우스 Il6ra 유전자의 엑손 1 내부의 번역 개시점 이후의 염기서열을 40 염기쌍만큼 결손시켰다. 또한 약제 내성 유전자인 neo에는 pgk 유전자의 프로모터가 부가되어 있고 ES 세포내에서는 neo 유전자가 발현된다. 그러나 neo 유전자는 상류에 도입한 hIL6R 유전자의 발현을 억제할 가능성이 예측된다. 이에 나중에 neo 유전자를 제거할 수 있도록 neo 유전자의 양측에는 loxP 서열(ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT(서열번호：131))을 배치하였다. Cre를 작용시키는 재조합에 의해 loxP 서열 사이에 끼인 neo 유전자가 제거되는 구조로 되어 있다. 이어서 녹인 벡터를 선상화 가능하게 하기 위해 BAC 상의 마우스 Il6ra 유전자의 5'측 상류의 영역에 제한효소 NotI 인식서열(GCGGCCGC)을 암피실린 내성 유전자와 함께 삽입하였다.

(25-2) ES세포로의 도입

ES세포(129SvEv 마우스 유래)에 상기 hIL6R 녹인 벡터를 전기천공법에 의해 도입하고, G418에 의한 선택배양 후에 얻어진 약제 내성 클론으로부터 상동 재조합체를 PCR법에 의해 스크리닝하였다. 녹인 벡터는 60 ㎍을 NotI로 직쇄상화하고 페놀/클로로포름 추출 후 에탄올 침전시켜 PBS에 용해하여 사용하였다.

스크리닝에서 사용하는 ES세포는 9웰 플레이트에서 배양하고 1웰당 200 ㎕의 PBS 용액으로 2회 세정 후 아래 조성의 세포용액 완충액(5 ㎕의 10×LA 완충액 II(TAKARA　LA　Taq용), 5 ㎕의 5%　NP-40, 4 ㎕의 프로테이나제 K(TAKARA)(20 ㎎/㎖), 36 ㎕의 증류수)를 첨가하여 55℃에서 2시간 처리하고, 계속해서 95℃에서 15분 처리함으로써 프로테이나제 K를 불활성화시켜서 PCR 샘플로 하였다.

PCR 반응 혼합물은 1 ㎕의 샘플, 2.5 ㎕의 10×LA 완충액 II, 2.5 ㎕의 25 mM MgCl₂, 4 ㎕의 dNTP(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP가 각 2.5 mM씩 포함된다), 각 0.2 ㎕의 프라이머(각 50 μM), 0.25 ㎕의 LA Taq(TAKARA) 및 14.35 ㎕의 증류수를 혼합하여 전체량 25 ㎕로 하였다. 또한 PCR 조건은 94℃에서 5분간의 전가열, 98℃에서 10초간, 68℃에서 3분 30초간의 증폭 사이클을 35 사이클 및 68℃에서 7분간의 복가열의 조건으로 하였다.

프라이머로서 P6Ra1(포워드)5'-ACAGGGCCTTAGACTCACAGC-3'(서열번호：132) 및 hRLI6 11638R(리버스)5'-AACTTGCTCCCGACACTACTGG-3'(서열번호：133)가 사용되었다. 프라이머는 P6Ra1을 녹인 벡터 상의 상동 암보다도 5'상류측의 마우스 Il6ra 게놈영역에 배치하고, hRLI6 11638R을 hIL6R cDNA 내에 배치하였다(도 32를 참조). 상동 재조합을 일으킨 ES세포의 샘플에서는 약 2.2 kb의 밴드가 증폭된다.

(3) 녹인 마우스의 제작

상동 재조합 ES 클론을 트립신 처리에 의해 부유시키고 ES세포 배지로 세정하였다. 48시간 간격으로 5IU의 말 융모 성선 자극 호르몬(eCG) 및 인간 융모 성선 자극 호르몬(hCG)을 복강내 투여함으로써, 과잉 배란 처리를 행한 C57BL/6J(B6)의 암컷 마우스를 동 계통의 수컷 마우스와 교배하였다. 암컷 마우스의 플러그가 확인된 날을 0.5일로 하고, 임신 2.5일에 자궁 및 난관을 관류(灌流)하여 8세포기로부터 상실기의 배를 회수하엿다. 회수한 배를 37℃에서 하룻밤 배양하고, 배반포에 발생한 배를 숙주배로서 10~15개의 ES세포를 주입하였다. 주입 후의 배는 거짓 임신 2.5일령의 ICR계의 수용 암컷의 자궁 내에 이식하여 17일 후에 새끼를 얻었다. ES세포의 배반포로의 주입에 의해 얻어진 새끼의 털 색으로의 판별에 의해, 재조합 ES세포(야생색)와 호스트 배반포 유래의 세포(흑색)가 혼재된 키메라 마우스가 얻어졌다. 수컷 키메라 마우스는 성성숙 후에 B6 암컷 마우스와 교배하여 녹인 대립유전자의 차세대 마우스로의 전달을 차세대 마우스의 꼬리로부터 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하여 PCR법으로 확인하였다. PCR은 전술한 상동 재조합 ES세포의 스크리닝시에 이용한 방법으로 실시하였다. 그 결과, 2.2 kb의 시그날이 검출된 개체가 얻어지고 이들 개체에는 녹인 대립유전자가 전달되어 있는 것이 확인되었다.

(4) neo 유전자의 제거

녹인 대립유전자의 전달이 확인된 개체의 번식에 의해 얻은 수정란의 전핵에 재조합 효소 Cre 발현 벡터를 미세주입(microinjection)함으로써 neo 유전자 카세트를 제거하였다. 즉, 일과성으로 Cre를 발현시킴으로써 녹인 대립유전자에 배치한 2개소의 loxP 사이를 재조합이 유도되어 neo 유전자 카세트가 제거되었다. Cre 발현 벡터의 미세주입 후의 수정란은 거짓 임신 0.5일의 ICR계 수용 암컷의 난관 내에 이식하여 19일 후에 새끼를 얻었다. neo 유전자 카세트의 제거는 새끼가 젖을 뗀 후에 채취한 꼬리로부터 추출한 게놈 DNA를 사용하여 PCR법으로 확인되었다.

PCR 반응액 조성은 1 ㎕의 샘플, 12.5 ㎕의 2×GC 완충액 I, 4 ㎕의 dNTP(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP가 각 2.5 mM씩 포함된다), 각 0.25 ㎕의 프라이머(각 50 μM), 0.25 ㎕의 LA Taq(TAKARA) 및 6.75 ㎕의 증류수를 혼합하여 전체량 25 ㎕로 하였다. 또한 PCR 조건은 94℃에서 4분간의 전가열, 94℃에서 30초간, 62℃에서 30초간, 72℃에서 3분간의 증폭 사이클을 35 사이클 및 72℃에서 7분간의 복가열로 하였다.

프라이머의 설정 위치는 도 32b에 나타낸다. 프라이머로서는 mRLI6 10355(5'-TCTGCAGTAGCCTTCAAAGAGC-3'(서열번호：134)) 및 mRLI6 11166R(5'-AACCAGACAGTGTCACATTCC-3'(서열번호：135))을 사용하였다. PCR 반응에 의해 neo 카세트가 제거되기 전의 개체의 샘플에서는 녹인 대립유전자에 유래하는 증폭산물로서 4.2 kb와 야생형 대립유전자 유래의 0.8 kb의 시그날이 검출되는 것에 대해, neo 카세트가 제거된 개체의 샘플에서는 약 2.7 kb와 야생형 대립유전자 유래의 0.8 kb의 시그날이 검출되었다(도 33).

(6) 인간 IL6R 및 마우스 IL6ra의 발현 확인

(6-1) 조직 RNA를 사용한 RT-PCR법으로의 확인

호모 접합체의 녹인 마우스 및 야생형 마우스의 조직 RNA를 사용하여 RT-PCR법으로 인간 IL6R 및 마우스 IL6ra의 발현을 해석하였다. 간장, 비장, 흉선, 신장, 심장 및 폐로부터 조직 RNA를 조제하였다. 각 1 ㎍의 조직 RNA를 주형으로 하여 SuperScript II First Strand cDNA Synthesis Kit(Invitrogen)에 의해 Oligo dT(20) 프라이머를 사용하여 역전사반응을 행함으로써 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 주형으로 하여 PCR을 행함으로써 인간 IL6R 및 마우스 IL6ra를 검출하였다. 인간 IL6R의 검출은 녹인 대립유전자에 있어서의 hIL6R 유전자의 삽입 위치인 번역 개시점보다도 상류측의 5'비번역영역에 설정한 포워드 프라이머 6RIK-s1(5'-CCCGGCTGCGGAGCCGCTCTGC-3'(서열번호：136)) 및 인간 IL6R 특이적인 리버스 프라이머 RLI6-a1(5'-ACAGTGATGCTGGAGGTCCTT-3'(서열번호：137))의 조합을 사용해서 실시하였다. 한편 마우스 IL6ra의 검출은 전술한 포워드 프라이머 6RIK-s1 및 마우스 IL6ra 특이적인 리버스 프라이머 6RLIcA2(5'-AGCAACACCGTGAACTCCTTTG-3'(서열번호：138))의 조합을 사용해서 실시하였다. PCR 반응액의 조성은 12.5 ㎕의 샘플, 12.5 ㎕의 2×GC 완충액 I, 4 ㎕의 dNTP(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP가 각 2.5 mM씩 포함된다), 각 0.25 ㎕의 프라이머(각 50 μM), 0.25 ㎕의 LA Taq(TAKARA) 및 6.75 ㎕의 증류수를 혼합하여 전체량 25 ㎕로 하였다. 또한 PCR 조건은 94℃에서 2분간의 전가열, 94℃에서 30초간, 62℃에서 30초간, 72℃에서 1분간의 증폭 사이클을 30 사이클 및 72℃에서 5분간의 복가열로 하였다. 인간 IL6R의 증폭산물은 880 bp, 마우스 IL6ra의 증폭산물은 846 bp에 검출되지만, 호모 접합체의 hIL6R 녹인 마우스의 각 조직에서는 인간 IL6R만이 검출되고 마우스 IL6ra는 검출되지 않았다. 또한 야생형 마우스의 각 조직으로부터는 인간 IL6R은 검출되지 않고 마우스 IL6ra만이 검출되었다(도 34). 이 결과로부터 디자인대로 녹인 벡터가 상동 재조합을 일으켜 마우스 IL6ra 대신에 인간 IL6R이 발현되는 마우스가 얻어진 것이 확인되었다.

(6-2) 혈장 중 인간 IL-6R 농도의 측정

이소플루란 흡입 마취하에서 개복하고 복부 대정맥으로부터 채취한 혈액으로부터 분리한 혈장 중 가용형 인간 IL-6R 농도를 Quantikin Human IL-6sR Immunoassay Kit(R&D Systems)를 사용해서 측정하였다. 그 결과, 혈장 중 가용형 hIL-6R 농도는 호모형 녹인 마우스에서는 22.1 ± 5.0　ng/㎖, 헤테로형 녹인 마우스에서는 11.5 ± 4.1 ng/㎖로 정량되었다. 또한 야생형 마우스에 있어서는 혈장 중에 가용형 hIL-6R은 검출되지 않았다(도 35). 호모형 녹인 마우스에서는 인간에 있어서 보고되어 있는 혈중 농도와 동등한 농도(Blood (2008) 112, 3959-3969)였다.

(6-3) 종 특이적인 리간드 반응성의 확인

호모형 녹인 마우스 및 야생형 마우스에 4 ㎍/체중 ㎏이 되도록 마우스 IL-6 또는 인간 IL-6를 복강내 투여하고 그 6시간 후에 채혈하여 혈중의 혈청 아밀로이드 A(SAA) 농도를 SAA ELISA Kit(Invitrogen)를 사용해서 정량하였다. 또한 투여용 IL-6의 용매로서는 마우스 혈장이 0.5%가 되도록 인산 완충 생리식염액(PBS)에 첨가한 용액을 사용하여 용매만을 투여하는 대조군을 마련하였다. 그 결과, 호모형 녹인 마우스는 인간 IL-6에만 반응하여 혈장 SAA 레벨의 상승이 확인되었으나, 마우스 IL-6에 대한 반응성은 확인되지 않았다(도 36). 한편 야생형 마우스는 인간 IL-6에도 마우스 IL-6에도 반응하여 혈장 SAA 레벨의 상승이 확인되었다(도 36). 마우스 IL-6ra는 마우스 IL-6에도 인간 IL-6에도 결합하는 한편, 인간 IL-6R은 인간 IL-6에 결합하지만 마우스 IL-6에는 결합하지 않는 것이 알려져 있어, 본 실험의 결과는 이 지견에 합치하는 것이다. 따라서 호모형 녹인 마우스에서는 설계대로 마우스 IL6ra가 발현되지 않고 대신에 인간 IL6R이 발현하며 또한 기능하고 있는 것이 명확해졌다.

본 발명에 있어서의 녹인 대립유전자로부터 전사된 hIL6R 유전자의 mRNA는 스플라이스 아웃되지 않는 구조이기 때문에 NMD 메커니즘에 의해 분해를 받지 않는 한편, 스플라이스 아웃되지 않는 유전자의 발현량은 낮아지는 것이 알려져 있다. 그러나 본 발명의 hIL6R 녹인 마우스에서는 혈중 가용형 hIL-6R 농도가 건강한 정상인에게 있어서의 혈중 농도와 동등하고, 또한 투여한 인간 IL-6에도 충분히 반응하여 SAA를 생산하는 것이 확인되었다. 이는 폴리 A 부가 시그날과 함께 삽입한 hp7이 스플라이스 아웃되지 않는 구조이기 때문에 본래라면 저하되어야 할 hIL6R 발현량의 안정화에 기여한 것을 나타낸다.

SEQUENCE LISTING <110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA <120> Antigen-binding molecules inducing immune responses against target antigens <130> C1-A1110P <150> JP 2011-216958 <151> 2011-09-30 <160> 138 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 468 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Leu Ala Val Gly Cys Ala Leu Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ala Pro 1 5 10 15 Gly Ala Ala Leu Ala Pro Arg Arg Cys Pro Ala Gln Glu Val Ala Arg 20 25 30 Gly Val Leu Thr Ser Leu Pro Gly Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Pro 35 40 45 Gly Val Glu Pro Glu Asp Asn Ala Thr Val His Trp Val Leu Arg Lys 50 55 60 Pro Ala Ala Gly Ser His Pro Ser Arg Trp Ala Gly Met Gly Arg Arg 65 70 75 80 Leu Leu Leu Arg Ser Val Gln Leu His Asp Ser Gly Asn Tyr Ser Cys 85 90 95 Tyr Arg Ala Gly Arg Pro Ala Gly Thr Val His Leu Leu Val Asp Val 100 105 110 Pro Pro Glu Glu Pro Gln Leu Ser Cys Phe Arg Lys Ser Pro Leu Ser 115 120 125 Asn Val Val Cys Glu Trp Gly Pro Arg Ser Thr Pro Ser Leu Thr Thr 130 135 140 Lys Ala Val Leu Leu Val Arg Lys Phe Gln Asn Ser Pro Ala Glu Asp 145 150 155 160 Phe Gln Glu Pro Cys Gln Tyr Ser Gln Glu Ser Gln Lys Phe Ser Cys 165 170 175 Gln Leu Ala Val Pro Glu Gly Asp Ser Ser Phe Tyr Ile Val Ser Met 180 185 190 Cys Val Ala Ser Ser Val Gly Ser Lys Phe Ser Lys Thr Gln Thr Phe 195 200 205 Gln Gly Cys Gly Ile Leu Gln Pro Asp Pro Pro Ala Asn Ile Thr Val 210 215 220 Thr Ala Val Ala Arg Asn Pro Arg Trp Leu Ser Val Thr Trp Gln Asp 225 230 235 240 Pro His Ser Trp Asn Ser Ser Phe Tyr Arg Leu Arg Phe Glu Leu Arg 245 250 255 Tyr Arg Ala Glu Arg Ser Lys Thr Phe Thr Thr Trp Met Val Lys Asp 260 265 270 Leu Gln His His Cys Val Ile His Asp Ala Trp Ser Gly Leu Arg His 275 280 285 Val Val Gln Leu Arg Ala Gln Glu Glu Phe Gly Gln Gly Glu Trp Ser 290 295 300 Glu Trp Ser Pro Glu Ala Met Gly Thr Pro Trp Thr Glu Ser Arg Ser 305 310 315 320 Pro Pro Ala Glu Asn Glu Val Ser Thr Pro Met Gln Ala Leu Thr Thr 325 330 335 Asn Lys Asp Asp Asp Asn Ile Leu Phe Arg Asp Ser Ala Asn Ala Thr 340 345 350 Ser Leu Pro Val Gln Asp Ser Ser Ser Val Pro Leu Pro Thr Phe Leu 355 360 365 Val Ala Gly Gly Ser Leu Ala Phe Gly Thr Leu Leu Cys Ile Ala Ile 370 375 380 Val Leu Arg Phe Lys Lys Thr Trp Lys Leu Arg Ala Leu Lys Glu Gly 385 390 395 400 Lys Thr Ser Met His Pro Pro Tyr Ser Leu Gly Gln Leu Val Pro Glu 405 410 415 Arg Pro Arg Pro Thr Pro Val Leu Val Pro Leu Ile Ser Pro Pro Val 420 425 430 Ser Pro Ser Ser Leu Gly Ser Asp Asn Thr Ser Ser His Asn Arg Pro 435 440 445 Asp Ala Arg Asp Pro Arg Ser Pro Tyr Asp Ile Ser Asn Thr Asp Tyr 450 455 460 Phe Phe Pro Arg 465 <210> 2 <211> 1407 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atgctggccg tcggctgcgc gctgctggct gccctgctgg ccgcgccggg agcggcgctg 60 gccccaaggc gctgccctgc gcaggaggtg gcgagaggcg tgctgaccag tctgccagga 120 gacagcgtga ctctgacctg cccgggggta gagccggaag acaatgccac tgttcactgg 180 gtgctcagga agccggctgc aggctcccac cccagcagat gggctggcat gggaaggagg 240 ctgctgctga ggtcggtgca gctccacgac tctggaaact attcatgcta ccgggccggc 300 cgcccagctg ggactgtgca cttgctggtg gatgttcccc ccgaggagcc ccagctctcc 360 tgcttccgga agagccccct cagcaatgtt gtttgtgagt ggggtcctcg gagcacccca 420 tccctgacga caaaggctgt gctcttggtg aggaagtttc agaacagtcc ggccgaagac 480 ttccaggagc cgtgccagta ttcccaggag tcccagaagt tctcctgcca gttagcagtc 540 ccggagggag acagctcttt ctacatagtg tccatgtgcg tcgccagtag tgtcgggagc 600 aagttcagca aaactcaaac ctttcagggt tgtggaatct tgcagcctga tccgcctgcc 660 aacatcacag tcactgccgt ggccagaaac ccccgctggc tcagtgtcac ctggcaagac 720 ccccactcct ggaactcatc tttctacaga ctacggtttg agctcagata tcgggctgaa 780 cggtcaaaga cattcacaac atggatggtc aaggacctcc agcatcactg tgtcatccac 840 gacgcctgga gcggcctgag gcacgtggtg cagcttcgtg cccaggagga gttcgggcaa 900 ggcgagtgga gcgagtggag cccggaggcc atgggcacgc cttggacaga atccaggagt 960 cctccagctg agaacgaggt gtccaccccc atgcaggcac ttactactaa taaagacgat 1020 gataatattc tcttcagaga ttctgcaaat gcgacaagcc tcccagtgca agattcttct 1080 tcagtaccac tgcccacatt cctggttgct ggagggagcc tggccttcgg aacgctcctc 1140 tgcattgcca ttgttctgag gttcaagaag acgtggaagc tgcgggctct gaaggaaggc 1200 aagacaagca tgcatccgcc gtactctttg gggcagctgg tcccggagag gcctcgaccc 1260 accccagtgc ttgttcctct catctcccca ccggtgtccc ccagcagcct ggggtctgac 1320 aatacctcga gccacaaccg accagatgcc agggacccac ggagccctta tgacatcagc 1380 aatacagact acttcttccc cagatag 1407 <210> 3 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 3 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser <210> 4 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 4 Glu Thr Thr Leu Thr Gln Ser Pro Ala Phe Met Ser Ala Thr Pro Gly 1 5 10 15 Asp Lys Val Asn Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asp Asp Asp 20 25 30 Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Ala Ala Ile Phe Ile Ile 35 40 45 Gln Glu Ala Thr Thr Leu Val Pro Gly Ile Ser Pro Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Asn Ile Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Tyr Tyr Phe Cys Leu Gln His Asp Asn Phe Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 5 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 5 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 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atgtgcttta ctatcgaaat 420 ggcaaagcct ttaagttttt ccactggaat tctaacctca ccattctgaa aaccaacata 480 agtcacaatg gcacctacca ttgctcaggc atgggaaagc atcgctacac atcagcagga 540 atatctgtca ctgtgaaaga gctatttcca gctccagtgc tgaatgcatc tgtgacatcc 600 ccactcctgg aggggaatct ggtcaccctg agctgtgaaa caaagttgct cttgcagagg 660 cctggtttgc agctttactt ctccttctac atgggcagca agaccctgcg aggcaggaac 720 acatcctctg aataccaaat actaactgct agaagagaag actctgggtt atactggtgc 780 gaggctgcca cagaggatgg aaatgtcctt aagcgcagcc ctgagttgga gcttcaagtg 840 cttggcctcc agttaccaac tcctgtctgg tttcatgtcc ttttctatct ggcagtggga 900 ataatgtttt tagtgaacac tgttctctgg gtgacaatac gtaaagaact gaaaagaaag 960 aaaaagtggg atttagaaat ctctttggat tctggtcatg agaagaaggt aatttccagc 1020 cttcaagaag acagacattt agaagaagag ctgaaatgtc aggaacaaaa agaagaacag 1080 ctgcaggaag gggtgcaccg gaaggagccc cagggggcca cgtag 1125 <210> 20 <211> 374 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Met Trp Phe Leu Thr Thr Leu Leu Leu Trp Val Pro Val Asp Gly Gln 1 5 10 15 Val Asp Thr Thr 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Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser 180 185 190 Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser 195 200 205 Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys 210 215 220 Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser 245 250 255 Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp 260 265 270 Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr 275 280 285 Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val 290 295 300 Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu 305 310 315 320 Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val 340 345 350 Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr 355 360 365 Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr 370 375 380 Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys 405 410 415 Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu 420 425 430 Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 129 <211> 443 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 129 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly His Ser Ile Ser His Asp 20 25 30 His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser 195 200 205 Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys 210 215 220 Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro 225 230 235 240 Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Tyr Ile Thr Leu Glu Pro Lys Val Thr 245 250 255 Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser 260 265 270 Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg 275 280 285 Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile 290 295 300 Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn 305 310 315 320 Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys 325 330 335 Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu 340 345 350 Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe 355 360 365 Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala 370 375 380 Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr 385 390 395 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Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser 180 185 190 Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser 195 200 205 Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys 210 215 220 Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Asp Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Tyr Ile Ser 245 250 255 Leu Glu Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp 260 265 270 Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr 275 280 285 Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val 290 295 300 Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu 305 310 315 320 Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Asp Asp Tyr Pro Ala Pro Ile Glu Arg 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val 340 345 350 Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr 355 360 365 Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr 370 375 380 Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys 405 410 415 Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu 420 425 430 Gly Leu Lys Phe His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 131 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 131 ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttat 34 <210> 132 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 132 acagggcctt agactcacag c 21 <210> 133 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 133 aacttgctcc cgacactact gg 22 <210> 134 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 134 tctgcagtag ccttcaaaga gc 22 <210> 135 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 135 aaccagacag tgtcacattc c 21 <210> 136 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 136 cccggctgcg gagccgctct gc 22 <210> 137 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 137 acagtgatgc tggaggtcct t 21 <210> 138 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 138 agcaacaccg tgaactcctt tg 22

Claims

이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자에 포함되는 FcRn 결합 도메인에 pH 7.0~pH 8.0 사이로부터 선택되는 조건하에서 FcRn에 대한 결합 활성을 부여하는 것을 포함하는 면역응답을 유도하는 항원 결합 분자를 포함하는 의약 조성물의 제조방법으로서,
상기 이온 농도 조건이 칼슘 이온 농도 또는 pH의 조건이고,
상기 항원 결합 도메인이
(1) 칼슘 이온 농도 0.1 μM~30 μM 사이로부터 선택되는 조건하에서의 당해 항원에 대한 결합 활성보다도 칼슘 이온 농도 100 μM~10 mM 사이로부터 선택되는 조건하에서의 항원에 대한 결합 활성이 높다는 특징을 갖는 항원 결합 도메인으로서, 금속 킬레이트 작용을 갖는 아미노산이 치환 또는 삽입되어 있는 항체 가변 영역을 포함하거나;
(2) pH 5.5~pH 6.5 사이로부터 선택되는 조건하에서의 당해 항원에 대한 결합 활성보다도 pH 7.0~pH 8.0 사이로부터 선택되는 조건하에서의 항원에 대한 결합 활성이 높다는 특징을 갖는 항원 결합 도메인이고, 히스티딘이 치환 또는 삽입되어 있는 항체 가변 영역을 포함하며,
상기 FcRn 결합 도메인은 Fc영역을 포함하고, 당해 Fc영역은 EU 넘버링 234, 235, 236, 237, 238, 239, 248, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 265, 267, 270, 272, 274, 279, 280, 282, 284, 286, 288, 289, 295, 297, 298, 302, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 332, 334, 338, 340, 345, 360, 361, 362, 375, 376, 378, 380, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 389, 390, 391, 413, 422, 424, 428, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442번 위치로부터 선택되는 적어도 하나의 위치에 있어서 천연형 Fc영역과 상이한 아미노산을 포함하는 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 항원 결합 분자가 상기 항원에 대한 중화활성을 갖는 항원 결합 분자인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 항원 결합 분자가 상기 항원을 발현하는 세포에 대한 세포상해활성을 갖는 항원 결합 분자인 방법.
제1항에 있어서,
Fc영역의 EU 넘버링으로 표시되는 부위 중 239번 위치, 252번 위치, 257번 위치, 286번 위치, 307번 위치, 308번 위치, 428번 위치 및 434번 위치의 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산을 치환하는 공정을 포함하는 방법.
제1항에 있어서,
Fc영역의 EU 넘버링으로 표시되는 부위 중；
257번 위치의 아미노산의 Ala로의 치환,
308번 위치의 아미노산의 Pro로의 치환,
428번 위치의 아미노산의 Leu로의 치환, 및
434번 위치의 아미노산의 Tyr로의 치환
의 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 치환을 행하는 공정을 포함하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 Fc영역의 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성을 EU 넘버링 297번 위치에 결합한 당쇄가 푸코오스 함유 당쇄인 천연형 인간 IgG의 Fc영역의 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성보다도 증강시키는 공정을 포함하는 방법.
제6항에 있어서,
상기 Fcγ 수용체가 FcγRIa, FcγRIIa(R), FcγRIIa(H), FcγRIIb, FcγRIIIa(V) 또는 FcγRIIIa(F)인 방법.
제6항 또는 제7항에 있어서,
Fc영역에 있어서의 EU 넘버링으로 표시되는 부위 중 221번 위치, 222번 위치, 223번 위치, 224번 위치, 225번 위치, 227번 위치, 228번 위치, 230번 위치, 231번 위치, 232번 위치, 233번 위치, 234번 위치, 235번 위치, 236번 위치, 237번 위치, 238번 위치, 239번 위치, 240번 위치, 241번 위치, 243번 위치, 244번 위치, 245번 위치, 246번 위치, 247번 위치, 249번 위치, 250번 위치, 251번 위치, 254번 위치, 255번 위치, 256번 위치, 258번 위치, 260번 위치, 262번 위치, 263번 위치, 264번 위치, 265번 위치, 266번 위치, 267번 위치, 268번 위치, 269번 위치, 270번 위치, 271번 위치, 272번 위치, 273번 위치, 274번 위치, 275번 위치, 276번 위치, 278번 위치, 279번 위치, 280번 위치, 281번 위치, 282번 위치, 283번 위치, 284번 위치, 285번 위치, 286번 위치, 288번 위치, 290번 위치, 291번 위치, 292번 위치, 293번 위치, 294번 위치, 295번 위치, 296번 위치, 297번 위치, 298번 위치, 299번 위치, 300번 위치, 301번 위치, 302번 위치, 303번 위치, 304번 위치, 305번 위치, 311번 위치, 313번 위치, 315번 위치, 317번 위치, 318번 위치, 320번 위치, 322번 위치, 323번 위치, 324번 위치, 325번 위치, 326번 위치, 327번 위치, 328번 위치, 329번 위치, 330번 위치, 331번 위치, 332번 위치, 333번 위치, 334번 위치, 335번 위치, 336번 위치, 337번 위치, 339번 위치, 376번 위치, 377번 위치, 378번 위치, 379번 위치, 380번 위치, 382번 위치, 385번 위치, 392번 위치, 396번 위치, 421번 위치, 427번 위치, 428번 위치, 429번 위치, 434번 위치, 436번 위치 및 440번 위치의 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산을 치환하는 공정을 포함하는 방법.
제6항 또는 제7항에 있어서,
Fc영역에 있어서의 EU 넘버링으로 표시되는 부위 중；
221번 위치의 아미노산의 Lys 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
222번 위치의 아미노산의 Phe, Trp, Glu 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
223번 위치의 아미노산의 Phe, Trp, Glu 또는 Lys 중 어느 하나로의 치환,
224번 위치의 아미노산의 Phe, Trp, Glu 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
225번 위치의 아미노산의 Glu, Lys 또는 Trp 중 어느 하나로의 치환,
227번 위치의 아미노산의 Glu, Gly, Lys 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
228번 위치의 아미노산의 Glu, Gly, Lys 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
230번 위치의 아미노산의 Ala, Glu, Gly 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
231번 위치의 아미노산의 Glu, Gly, Lys, Pro 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
232번 위치의 아미노산의 Glu, Gly, Lys 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
233번 위치의 아미노산의 Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
234번 위치의 아미노산의 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
235번 위치의 아미노산의 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
236번 위치의 아미노산의 Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
237번 위치의 아미노산의 Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
238번 위치의 아미노산의 Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
239번 위치의 아미노산의 Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
240번 위치의 아미노산의 Ala, Ile, Met 또는 Thr 중 어느 하나로의 치환,
241번 위치의 아미노산의 Asp, Glu, Leu, Arg, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
243번 위치의 아미노산의 Leu, Glu, Leu, Gln, Arg, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
244번 위치의 아미노산의 His로의 치환,
245번 위치의 아미노산의 Ala로의 치환,
246번 위치의 아미노산의 Asp, Glu, His 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
247번 위치의 아미노산의 Ala, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Thr, Val 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
249번 위치의 아미노산의 Glu, His, Gln 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
250번 위치의 아미노산의 Glu 또는 Gln 중 어느 하나로의 치환,
251번 위치의 아미노산의 Phe로의 치환,
254번 위치의 아미노산의 Phe, Met 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
255번 위치의 아미노산의 Glu, Leu 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
256번 위치의 아미노산의 Ala, Met 또는 Pro 중 어느 하나로의 치환,
258번 위치의 아미노산의 Asp, Glu, His, Ser 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
260번 위치의 아미노산의 Asp, Glu, His 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
262번 위치의 아미노산의 Ala, Glu, Phe, Ile 또는 Thr 중 어느 하나로의 치환,
263번 위치의 아미노산의 Ala, Ile, Met 또는 Thr 중 어느 하나로의 치환,
264번 위치의 아미노산의 Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
265번 위치의 아미노산의 Ala, Leu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
266번 위치의 아미노산의 Ala, Ile, Met 또는 Thr 중 어느 하나로의 치환,
267번 위치의 아미노산의 Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
268번 위치의 아미노산의 Asp, Glu, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Thr, Val 또는 Trp 중 어느 하나로의 치환,
269번 위치의 아미노산의 Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
270번 위치의 아미노산의 Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
271번 위치의 아미노산의 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
272번 위치의 아미노산의 Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
273번 위치의 아미노산의 Phe 또는 Ile 중 어느 하나로의 치환,
274번 위치의 아미노산의 Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
275번 위치의 아미노산의 Leu 또는 Trp 중 어느 하나로의 치환,
276번 위치의 아미노산의 Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
278번 위치의 아미노산의 Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val 또는 Trp 중 어느 하나로의 치환,
279번 위치의 아미노산의 Ala로의 치환,
280번 위치의 아미노산의 Ala, Gly, His, Lys, Leu, Pro, Gln, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
281번 위치의 아미노산의 Asp, Lys, Pro 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
282번 위치의 아미노산의 Glu, Gly, Lys, Pro 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
283번 위치의 아미노산의 Ala, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
284번 위치의 아미노산의 Asp, Glu, Leu, Asn, Thr 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
285번 위치의 아미노산의 Asp, Glu, Lys, Gln, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
286번 위치의 아미노산의 Glu, Gly, Pro 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
288번 위치의 아미노산의 Asn, Asp, Glu 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
290번 위치의 아미노산의 Asp, Gly, His, Leu, Asn, Ser, Thr, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
291번 위치의 아미노산의 Asp, Glu, Gly, His, Ile, Gln 또는 Thr 중 어느 하나로의 치환,
292번 위치의 아미노산의 Ala, Asp, Glu, Pro, Thr 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
293번 위치의 아미노산의 Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
294번 위치의 아미노산의 Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
295번 위치의 아미노산의 Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
296번 위치의 아미노산의 Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr 또는 Val 중 어느 하나로의 치환,
297번 위치의 아미노산의 Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
298번 위치의 아미노산의 Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
299번 위치의 아미노산의 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
300번 위치의 아미노산의 Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val 또는 Trp 중 어느 하나로의 치환,
301번 위치의 아미노산의 Asp, Glu, His 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
302번 위치의 아미노산의 Ile로의 치환,
303번 위치의 아미노산의 Asp, Gly 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
304번 위치의 아미노산의 Asp, His, Leu, Asn 또는 Thr 중 어느 하나로의 치환,
305번 위치의 아미노산의 Glu, Ile, Thr 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
311번 위치의 아미노산의 Ala, Asp, Asn, Thr, Val 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
313번 위치의 아미노산의 Phe로의 치환,
315번 위치의 아미노산의 Leu로의 치환,
317번 위치의 아미노산의 Glu 또는 Gln으로의 치환,
318번 위치의 아미노산의 His, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
320번 위치의 아미노산의 Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Pro, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
322번 위치의 아미노산의 Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Pro, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
323번 위치의 아미노산의 Ile로의 치환,
324번 위치의 아미노산의 Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
325번 위치의 아미노산의 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
326번 위치의 아미노산의 Ala, Asp, Glu, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
327번 위치의 아미노산의 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
328번 위치의 아미노산의 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
329번 위치의 아미노산의 Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
330번 위치의 아미노산의 Cys, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
331번 위치의 아미노산의 Asp, Phe, His, Ile, Leu, Met, Gln, Arg, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
332번 위치의 아미노산의 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
333번 위치의 아미노산의 Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Ser, Thr, Val 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
334번 위치의 아미노산의 Ala, Glu, Phe, Ile, Leu, Pro 또는 Thr 중 어느 하나로의 치환,
335번 위치의 아미노산의 Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Val, Trp 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
336번 위치의 아미노산의 Glu, Lys 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환,
337번 위치의 아미노산의 Glu, His 또는 Asn 중 어느 하나로의 치환,
339번 위치의 아미노산의 Asp, Phe, Gly, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Ser 또는 Thr 중 어느 하나로의 치환,
376번 위치의 아미노산의 Ala 또는 Val 중 어느 하나로의 치환,
377번 위치의 아미노산의 Gly 또는 Lys 중 어느 하나로의 치환,
378번 위치의 아미노산의 Asp로의 치환,
379번 위치의 아미노산의 Asn으로의 치환,
380번 위치의 아미노산의 Ala, Asn 또는 Ser 중 어느 하나로의 치환,
382번 위치의 아미노산의 Ala 또는 Ile 중 어느 하나로의 치환,
385번 위치의 아미노산의 Glu로의 치환,
392번 위치의 아미노산의 Thr로의 치환,
396번 위치의 아미노산의 Leu로의 치환,
421번 위치의 아미노산의 Lys로의 치환,
427번 위치의 아미노산의 Asn으로의 치환,
428번 위치의 아미노산의 Phe 또는 Leu 중 어느 하나로의 치환,
429번 위치의 아미노산의 Met로의 치환,
434번 위치의 아미노산의 Trp로의 치환,
436번 위치의 아미노산의 Ile로의 치환, 및
440번 위치의 아미노산의 Gly, His, Ile, Leu 또는 Tyr 중 어느 하나로의 치환
의 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 치환을 행하는 공정을 포함하는 방법.
제6항 또는 제7항에 있어서,
상기 천연형 Fc영역이 EU 넘버링 297번 위치에 결합한 당쇄가 푸코오스 함유 당쇄인 인간 IgG1, 인간 IgG2, 인간 IgG3 또는 인간 IgG4 중 어느 하나의 Fc영역인 방법.
제6항 또는 제7항에 있어서,
Fc영역의 EU 넘버링 297번 위치에 결합한 당쇄의 조성이 푸코오스 결손 당쇄를 결합한 Fc영역의 비율이 높아지도록, 또는 바이섹팅 N-아세틸글루코사민이 부가된 Fc영역의 비율이 높아지도록, 상기 Fc영역을 수식하는 공정을 포함하는 방법.