TWI681970B - 包含依離子濃度之條件對抗原之結合活性會改變之抗原結合分域、及於pH中性之條件下對FcRn有結合活性之FcRn結合分域、且誘導對標的抗原的免疫反應之抗原結合分子 - Google Patents

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Abstract

本案發明人等發現在投予包含依離子濃度之條件對抗原之結合活性會改變之抗原結合分域及於pH中性域之條件下對FcRn有結合活性之FcRn結合分域之抗原結合分子之活體中，會誘導對該抗原之免疫反應。再者，本案發明人等發現在投予包含依離子濃度之條件對抗原之結合活性會改變之抗原結合分域及在pH中性域之條件下對FcRn有結合活性之FcRn結合分域之抗原結合分子之活體中，會誘導對該抗原之免疫反應，而且也具有對表現該抗原結合分子所結合之抗原之外來生物種或癌細胞等之傷害作用或增殖抑制作用。

Description

包含依離子濃度之條件對抗原之結合活性會改變之抗原結合分域、及於pH中性之條件下對FcRn有結合活性之FcRn結合分域、且誘導對標的抗原的免疫反應之抗原結合分子
本發明提供以誘導對於標的抗原之免疫反應之抗原結合分子作為有效成分之醫藥組成物或使用該醫藥組成物之治療方法。又，提供含有誘導上述免疫反應且同時具有對表現標的抗原之細胞之傷害作用(細胞妨礙活性)或增殖抑制作用(細胞增殖抑制活性)之抗原結合分子作為有效成分之醫藥組成物或使用該醫藥組成物之治療方法。
至今日為止，已有人嘗試針對腫瘤細胞之多數治療疫苗的開發。原因在於：由活體之免疫系能認識、在腫瘤細胞與正常細胞之間有質的或量不同，據認為利用如此之不同(新抗原決定基(neoepitope)之疫苗所為之主動的、專一性的感作所刺激之免疫系，能認識腫瘤細胞並予以排除。
為了引起如此之抗腫瘤應答，據認為至少必需滿足2個條件。第一，腫瘤細胞必需表現在正常細胞不出現之抗 原、或表現正常細胞與腫瘤細胞能夠絕對實質的區別之程度之抗原。第二，必須利用疫苗等使免疫系活化使與目的抗原反應。腫瘤之免疫療法中的重大妨礙，據認為係腫瘤之免疫原性，尤其在人類弱。
近年已發現來能成為免疫系之攻擊對象的如此之含新抗原決定基之腫瘤關連及腫瘤專一性的抗原。儘管如此，免疫系之所以無法排除表現該等新抗原決定基之腫瘤，據認為並非不存在新抗原決定基，而是因為對於該等新抗原決定基之免疫反應不足的原故。
就以細胞為基礎之癌症之免疫療法為目的，已開發了二種一般的策略。其中之一為將在體外擴增的腫瘤反應性T淋巴球再移入患者之被動免疫療法(免疫細胞療法)，另一者係對於腫瘤抗原引起新或更強的免疫反應，以導入全身性腫瘤應答為目的而使用腫瘤細胞之主動免疫療法。
以主動免疫療法為基礎之腫瘤疫苗可利用各種方法製備。為了誘導對於腫瘤抗原之免疫反應，有人製備與如減毒活性卡介苗菌(Bacillus Calmette Guerin)(BCG)之免疫刺激佐劑混合的放射線照射腫瘤細胞(非專利文獻1)、例如經基因改變而產生細胞激素之腫瘤細胞(非專利文獻2)、經異質化之自體腫瘤細胞(非專利文獻3)等。但是腫瘤細胞之免疫原性低，其原因並非腫瘤抗原之質的問題，據認為是其量的問題。
另一方面，抗體藉由將結合的抗原對抗原表現細胞交叉表現(cross presentation)，已知會誘導對抗原的液性 免疫反應(產生對抗抗原之抗體)及細胞性免疫反應(產生對抗抗原之CD8陽性T細胞)，據報告利用抗體投予可誘導對抗抗原之獲得免疫(非專利文獻4)。最近，在小鼠體內模型，對HER2之抗體所為之抗腫瘤效果，比起投予之抗體之直接ADCC，利用抗體投予所誘導之對抗HER2抗原之獲得免疫顯示有更重要的效果(非專利文獻5)。實際上，於為對抗HER2之IgG1次類之抗體醫藥即Herceptin在臨床，觀察到藉由Herceptin投予而誘導獲得免疫，並有對HER2之液性免疫反應(非專利文獻6)。在Herceptin投予奏效的患者尤認為對HER2之抗體價上升，因此Herceptin投予所致之獲得免疫誘導據認為對於抗腫瘤效果發揮重要作用。
抗體在血中之安定性高、副作用也少，因此作為醫藥品受到重視(非專利文獻7、非專利文獻8)。IgG類別之抗體的效應子機能亦即抗體依存性細胞傷害活性(以下記載為ADCC)、補體依存性細胞傷害活性(以下記載為CDC)的研究至今已有多數被進行，在人類IgG類別之中，據報告IgG1次類別之抗體有最高的ADCC活性、CDC活性(非專利文獻9)。又，經由IgG類別之抗體為媒介的標的細胞的胞吞作用即抗體依存性細胞媒介性胞吞作用(ADCP)也啟示係抗體的一種效應子機能(非專利文獻10、非專利文獻11)。IgG1次類別之抗體，由於可將該等之效應子機能對腫瘤發揮，故幾乎對癌抗原的所有抗體醫藥均使用IgG1次類別的抗體。
IgG抗體為了媒介ADCC、ADCP活性，IgG抗體之Fc區必須與殺手細胞、天然殺手細胞、經活化之巨噬細胞等的效應子細胞表面上所存在的抗體受體(以下記載為FcγR)結合。在人類，FcγR之蛋白質家族已有人報告FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa、FcγRIIIb之同型異構物(isoform)，其個別的副型(allotype)也有人報告(非專利文獻12)。
ADCC與ADCP等細胞傷害性之效應子機能之增強，作為用於增強抗癌抗體之抗腫瘤效果之有前景的方法受到重視。以抗體之抗腫瘤效果為目的之經FcγR媒介之效應子機能之重要性，已有人使用小鼠模式報告(非專利文獻13、非專利文獻14)。又，在人類之臨床效果、與FcγRIIIa之高親和性多型(V158)與低親和性多型(F158)之間，觀察到相關性(非專利文獻15)。從該等報告，啟示具有對於特定之FcγR之結合為最適化之Fc區的抗體，會媒介較強力之效應子機能，且藉此能發揮更有效的抗腫瘤效果。抗體對於包括FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIIa、FcγRIIIb之活化受體、包括FcγRIIb之抑制性受體各別之親和性之平衡，在最佳化抗體之效應子機能方面是重要的要素。藉由增強對於活化受體之親和性，能對於抗體賦予媒介更強力效應子機能之性質(非專利文獻16)，所以至今已有各種使對抗癌抗原之抗體醫藥之抗腫瘤活性增強或提高之抗體工程的方法被提出報告。
針對Fc區與FcγR之結合，抗體之鉸鏈區及CH2分域 內中幾個胺基酸殘基及與CH2分域所結合之EU編號297號之Asn上附加之糖鏈，顯示有重要性(非專利文獻9、非專利文獻17、非專利文獻18)。以該結合部位為中心，至今已有各種帶有FcγR結合特性之Fc區之改變體被人研究，已獲得了對於活化FcγR有更高親和性之Fc區改變體(專利文獻1、專利文獻2)。例如Lazar等人，藉由將人類IgG1之EU編號表示之239位之Ser、330位之Ala、332位之Ile分別取代為Asp、Leu、Glu，而成功地使人類IgG1對於人類FcγRIIIa(V158)之結合增加達約370倍(非專利文獻19、專利文獻2)。該改變體相較於天然型，對於FcγRIIIa以及FcγRIIb之結合之比(A/I比)成為約9倍，Shinkawa等人藉由使EU編號表示之297位之Asn上附加之糖鏈之岩藻糖缺損，而成功地使對於FcγRIIIa之結合增加達約100倍(非專利文獻20)。藉由該等方法，能使人類IgG1相較於天然型人類IgG1之ADCC活性大幅提高。
如上述已有多數利用抗體工程使ADCC增強之方法被提出報告，但至今為止尚未有利用抗體投予而使獲得免疫之誘導增強或提高的抗體工程的手法被提出報告。作為誘導對抗癌抗原之獲得免疫之方法，有人報告在抗原表現細胞表現之DEC-205或高甘露聚糖受體所結合之抗體使欲誘導獲得免疫之癌抗原融合，藉此促進癌抗原攝入抗原表現細胞及抗原表現之方法(非專利文獻21)，但是該等方法並非如上述抗HER2抗體為抗體所結合之標的癌抗原。亦即， 由於係誘導對於抗體本身融合之癌抗原的獲得免疫的方法，所以抗體本身無法與癌抗原結合，有無法對癌抗原發揮直接作用的缺點。又，該方法不僅是誘導對抗與抗體融合之癌抗原，也誘導對抗用於標靶於抗原表現細胞之抗體本身的獲得免疫，所以可能造成由於抗藥劑抗體之出現而減弱效果，所以據認為本發明不適於以治療為目的。
由以上，儘管希望有藉由投予對標的抗原有結合活性之抗原結合分子而誘導對該標的抗原之獲得免疫，但以如此之方法使獲得免疫增強或提高的工程手法尚無人報告。
【先行技術文獻】 【專利文獻】
【專利文獻1】WO2000/042072
【專利文獻2】WO2006/019447
【非專利文獻】
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【非專利文獻5】Park S, Jiang Z, Mortenson ED, Deng L, Radkevich-Brown O, Yang X, Sattar H, Wang Y, Brown NK, Greene M, Liu Y, Tang J, Wang S, Fu YX., The therapeutic effect of anti-HER2/neu antibody depends on both innate and adaptive immunity., Cancer Cell (2010) 18, 160-170 (2010)
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【非專利文獻14】Clynes RA, Towers TL, Presta LG, Ravetch JV., Inhibitory Fc receptors modulate in vivo cytoxicity against tumor targets., Nat. Med. (2000) 6, 443-446
【非專利文獻15】Cartron G, Dacheux L, Salles G, Solal-Celigny P, Bardos P, Colombat P, Watier H., Therapeutic activity of humanized anti-CD20 monoclonal antibody and polymorphism in IgG Fc receptor FcgammaRIIIa gene., Blood (2002) 99, 754-758
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【非專利文獻17】Greenwood J, Clark M, Waldmann H., Structural motifs involved in human IgG antibody effector functions., Eur. J. Immunol. 23, 1098-1104 (1993)
【非專利文獻18】Morgan A, Jones ND, Nesbitt AM, Chaplin L, Bodmer MW, Emtage JS., The N-terminal end of the CH2 domain of chimeric human IgG1 anti-HLA-DR is necessary for C1q, Fc gamma RI and Fc gamma RIII binding., Immunology (1995) 86, 319-324
【非專利文獻19】Lazar GA, Dang W, Karki S, Vafa O, Peng JS, Hvun L, Chan C, Chung HS, Eivazi A, Yoder SC, Vielmetter J, Carmichael DF, Hayes RJ, Dahiyat BI., Engineered antibody Fc variants with enhanced effector function., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (2006) 103, 4005-4010
【非專利文獻20】 Shinkawa T, Nakamura K, Yamane N, Shoji-Hosaka E, Kanda Y, Sakurada M, Uchida K, Anazawa H, Satoh M, Yamasaki M, Hanai N, Shitara K., The absence of fucose but not the presence of galactose or bisecting N-acetylglucosamine of human IgG1 complex-type oligosaccharides shows the critical role of enhancing antibody-dependent cellular cytotoxicity., J. Biol. Chem. (2003) 278, 3466-3473
【非專利文獻21】 Tsuji T, Matsuzaki J, Kelly MP, Ramakrishna V, Vitale L, He LZ, Keler T, Odunsi K, Old LJ, Ritter G, Gnjatic S., Antibody-Targeted NY-ESO-1 to Mannose Receptor or DEC-205 In Vitro Elicits Dual Human CD8+ and CD4+ T Cell Responses with Broad Antigen Specificity., J. Immunol. (2011) 186, 1218-1827
本發明係有鑑於上述情況而生，目的在於提供一種醫 藥組成物，其係含有抗原結合分子作為有效成分，藉由投予給受外來性生物種感染或罹癌之對象，而誘導該對象之免疫反應。並提供使用該醫藥組成物之治療方法。又，目的為提供一種醫藥組成物，其係含有抗原結合分子作為有效成分，誘導上述免疫反應且同時具有對抗經感染之外來性生物種或對癌細胞之傷害作用(細胞妨礙活性)或增殖抑制作用(細胞增殖抑制活性)，或提供使用該醫藥組成物之治療方法。
本案發明人等發現：在投予了包含依離子濃度之條件對抗原之結合活性會改變之抗原結合分域及在pH中性域之條件下對FcRn有結合活性之FcRn結合分域之抗原結合分子的活體中，會誘導對該抗原之免疫反應。再者，本案發明人等發現：在在投予了包含依離子濃度之條件對抗原之結合活性會改變之抗原結合分域及在pH中性域之條件下對FcRn有結合活性之FcRn結合分域之抗原結合分子的活體中，會誘導對該抗原之免疫反應，且同時該抗原結合分子可同時具有對於表現結合之抗原之外來生物種或癌細胞等之傷害作用或增殖抑制作用。本案發明人等基於該見解，明白：本發明之抗原結合分子作為藉由對於受外來性生物種感染或罹癌之對象投予而誘導該對象之免疫反應的醫藥組成物為有用。又，本案發明人等明白：本發明之抗原結合分子作為藉由對於受外來性生物種感染或罹癌之對象投予，會誘導該對象之免疫反應，而且同時具有對該外來性 生物種或癌細胞之傷害作用或增殖抑制作用的醫藥組成物為有用。又，發現該等醫藥組成物之製造方法。
亦即，本發明更具體而言，提供以下[1]~[47]。
[1]一種誘導對抗原之免疫反應之醫藥組成物，其係包含抗原結合分子作為有效成分，該抗原結合分子包含：依離子濃度之條件對該抗原之結合活性會改變之抗原結合分域、及在pH中性域之條件下對FcRn有結合活性之FcRn結合分域。
[2]如[1]之誘導對抗原之免疫反應之醫藥組成物，其中，該離子濃度為鈣離子濃度。
[3]如[2]之誘導對抗原之免疫反應之醫藥組成物，其中，該抗原結合分域在高鈣離子濃度之條件下對抗原之結合活性高於在低鈣離子濃度之條件下對該抗原之結合活性。
[4]如[1]之誘導對抗原之免疫反應之醫藥組成物，其中，該離子濃度之條件為pH之條件。
[5]如[4]之誘導對抗原之免疫反應之醫藥組成物，其中，該抗原結合分域在pH中性域之條件下對抗原之結合活性高於在pH酸性域之條件下對該抗原之結合活性。
[6]如[1]至[5]中任一項之誘導對抗原之免疫反應之醫藥組成物，其中，該抗原結合分子對該抗原有中和活性。
[7]如[1]至[6]中任一項之誘導對抗原之免疫反應之醫藥組成物，其中，該抗原結合分子對於表現該抗原之細胞有細胞傷害活性。
[8]如[1]至[7]中任一項之誘導對抗原之免疫反應之醫藥 組成物，其中，該FcRn結合分域包含抗體之Fc區。
[9]如[8]之誘導對抗原之免疫反應之醫藥組成物，其中，該Fc區，在Fc區之EU編號表示之部位當中選自於257位、308位、428位及434位之群中至少1個以上之胺基酸與天然型Fc區之對應部位之胺基酸不同。
[10]如[8]或[9]之誘導對抗原之免疫反應之醫藥組成物，其中，該Fc區，包含選自Fc區之EU編號表示之；257位之胺基酸為Ala、308位之胺基酸為Pro、428位之胺基酸為Leu、及434位之胺基酸為Tyr、之群中至少1個以上的胺基酸。
[11]如[8]至[10]中任一項之誘導對抗原之免疫反應之醫藥組成物，其中，該Fc區對Fcγ受體之結合活性，高於結合於EU編號297位之糖鏈係含岩藻糖之糖鏈的天然型人類IgG之Fc區對Fcγ受體之結合活性。
[12]如[11]之誘導對抗原之免疫反應之醫藥組成物，其中，該Fcγ受體為FcγRIa、FcγRIIa(R)、FcγRIIa(H)、FcγRIIb、FcγRIIIa(V)、或FcγRIIIa(F)。
[13]如[11]或[12]之醫藥組成物，其中，該Fc區，在選自於Fc區中之EU編號表示之部位當中221位、222位、223位、224位、225位、227位、228位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、243位、244位、245位、246位、 247位、249位、250位、251位、254位、255位、256位、258位、260位、262位、263位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、271位、272位、273位、274位、275位、276位、278位、279位、280位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、288位、290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304位、305位、311位、313位、315位、317位、318位、320位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、336位、337位、339位、376位、377位、378位、379位、380位、382位、385位、392位、396位、421位、427位、428位、429位、434位、436位及440位之群中至少1個以上的胺基酸，與天然型Fc區之對應部位之胺基酸不同。
[14]如[11]至[13]中之任一項之誘導對抗原之免疫反應之醫藥組成物，其中，該Fc區，包含Fc區之EU編號表示之部位當中選自以下群中至少1個以上的胺基酸；221位之胺基酸為Lys或Tyr中之任一者、222位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中之任一者、223位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Lys中之任一者、224位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中之任一者、225位之胺基酸為Glu、Lys或Trp中之任一者、227位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、228位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、 230位之胺基酸為Ala、Glu、Gly或Tyr中之任一者、231位之胺基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中之任一者、232位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、233位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、234位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、235位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、236位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、237位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、238位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、239位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、 240位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、241位之胺基酸為Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中之任一者、243位之胺基酸為Leu、Glu、Leu、Gln、Arg、Trp或Tyr中之任一者、244位之胺基酸為His、245位之胺基酸為Ala、246位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、247位之胺基酸為Ala、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Thr、Val或Tyr中之任一者、249位之胺基酸為Glu、His、Gln或Tyr中之任一者、250位之胺基酸為Glu或Gln中之任一者、251位之胺基酸為Phe、254位之胺基酸為Phe、Met或Tyr中之任一者、255位之胺基酸為Glu、Leu或Tyr中之任一者、256位之胺基酸為Ala、Met或Pro中之任一者、258位之胺基酸為Asp、Glu、His、Ser或Tyr中之任一者、260位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、262位之胺基酸為Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中之任一者、263位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、264位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、265位之胺基酸為Ala、Leu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、 Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Val、Trp或Tyr中之任一者、266位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、267位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、268位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Trp中之任一者、269位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、270位之胺基酸為Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、271位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、272位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、273位之胺基酸為Phe或Ile中之任一者、274位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、275位之胺基酸為Leu或Trp中之任一者、276位之胺基酸為、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、 278位之胺基酸為Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中之任一者、279位之胺基酸為Ala、280位之胺基酸為Ala、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gln、Trp或Tyr中之任一者、281位之胺基酸為Asp、Lys、Pro或Tyr中之任一者、282位之胺基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中之任一者、283位之胺基酸為Ala、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg或Tyr中之任一者、284位之胺基酸為Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中之任一者、285位之胺基酸為Asp、Glu、Lys、Gln、Trp或Tyr中之任一者、286位之胺基酸為Glu、Gly、Pro或Tyr中之任一者、288位之胺基酸為Asn、Asp、Glu或Tyr中之任一者、290位之胺基酸為Asp、Gly、His、Leu、Asn、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、291位之胺基酸為Asp、Glu、Gly、His、Ile、Gln或Thr中之任一者、292位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中之任一者、293位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、294位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、 Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、295位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、296位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr或Val中之任一者、297位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、298位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、299位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中之任一者、300位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中之任一者、301位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、302位之胺基酸為Ile、303位之胺基酸為Asp、Gly或Tyr中之任一者、304位之胺基酸為Asp、His、Leu、Asn或Thr中之任一者、305位之胺基酸為Glu、Ile、Thr或Tyr中之任一者、311位之胺基酸為Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中之任一者、 313位之胺基酸為Phe、315位之胺基酸為Leu、317位之胺基酸為Glu或Gln、318位之胺基酸為His、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Tyr中之任一者、320位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、322位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、323位之胺基酸為Ile、324位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、325位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、326位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、327位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、328位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、329位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、 Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、330位之胺基酸為Cys、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、331位之胺基酸為Asp、Phe、His、Ile、Leu、Met、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、332位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、333位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Ser、Thr、Val或Tyr中之任一者、334位之胺基酸為Ala、Glu、Phe、Ile、Leu、Pro或Thr中之任一者、335位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中之任一者、336位之胺基酸為Glu、Lys或Tyr中之任一者、337位之胺基酸為Glu、His或Asn中之任一者、339位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser或Thr中之任一者、376位之胺基酸為Ala或Val中之任一者、377位之胺基酸為Gly或Lys中之任一者、378位之胺基酸為Asp、379位之胺基酸為Asn、 380位之胺基酸為Ala、Asn或Ser中之任一者、382位之胺基酸為Ala或Ile中之任一者、385位之胺基酸為Glu、392位之胺基酸為Thr、396位之胺基酸為Leu、421位之胺基酸為Lys、427位之胺基酸為Asn、428位之胺基酸為Phe或Leu中之任一者、429位之胺基酸為Met、434位之胺基酸為Trp、436位之胺基酸為Ile、及440位之胺基酸為Gly、His、Ile、Leu或Tyr中之任一者。
[15]如[11]至[14]中任一項之誘導對抗原之免疫反應之醫藥組成物，其中，該天然型Fc區，為結合於EU編號297位之糖鏈係含岩藻糖之糖鏈之人類IgG1、人類IgG2、人類IgG3或人類IgG4中之任一者之Fc區。
[16]如[11]至[15]中任一項之誘導對抗原之免疫反應之醫藥組成物，其中，該Fc區，係經修飾成為使得Fc區之結合於EU編號297位之糖鏈之組成為結合有岩藻糖缺損糖鏈之Fc區之比例提高、或附加有二分化N-乙醯基葡萄糖胺之Fc區之比例提高的Fc區。
[17]一種誘導活體之免疫反應之方法，包括將如[1]至[16]中任一項之抗原結合分子對該活體內投予之步驟。
[18]一種誘導免疫反應之抗原結合分子之製造方法，包括 對於含有依離子濃度之條件對抗原之結合活性會改變之抗原結合分域之抗原結合分子所含之FcRn結合分域，賦予在在pH中性域之條件下對FcRn之結合活性。
[19]如[18]之誘導免疫反應之抗原結合分子之製造方法，其中，該離子濃度為鈣離子濃度。
[20]如[19]之誘導免疫反應之抗原結合分子之製造方法，其中，該抗原結合分域在高鈣離子濃度之條件下對抗原之結合活性高於在低鈣離子濃度之條件下對該抗原之結合活性。
[21]如[18]之誘導免疫反應之抗原結合分子之製造方法，其中，該離子濃度之條件為pH之條件。
[22]如[21]之誘導免疫反應之抗原結合分子之製造方法，其中，該抗原結合分域在pH中性域之條件下對抗原之結合活性高於在pH酸性域之條件下對該抗原之結合活性。
[23]如[18]至[22]中任一項之誘導免疫反應之抗原結合分子之製造方法，其中，該抗原結合分子對該抗原有中和活性。
[24]如[18]至[23]中任一項之誘導免疫反應之抗原結合分子之製造方法，其中，該抗原結合分子對於表現該抗原之細胞有細胞傷害活性。
[25]如[18]至[24]中任一項之誘導免疫反應之抗原結合分子之製造方法，其中，該FcRn結合分域包含抗體之Fc區。
[26]如[25]之誘導免疫反應之抗原結合分子之製造方 法，其中，包含將Fc區之EU編號表示之部位當中選自於239位、252位、257位、286位、307位、308位、428位及434位之群中至少1個以上的胺基酸取代的步驟。
[27]如[25]或[26]之誘導免疫反應之抗原結合分子之製造方法，其中，包含進行Fc區之EU編號表示之部位當中選自於以下之群中至少1個以上的胺基酸取代之步驟：257位之胺基酸取代為Ala、308位之胺基酸取代為Pro、428位之胺基酸取代為Leu、及434位之胺基酸取代為Tyr。
[28]如[25]至[27]中任一項之誘導免疫反應之抗原結合分子之製造方法，其中，包含使該Fc區對Fcγ受體之結合活性，比起結合於EU編號297位之糖鏈係含岩藻糖之糖鏈之天然型人類IgG之Fc區對Fcγ受體之結合活性增強之步驟。
[29]如[28]之誘導免疫反應之抗原結合分子之製造方法，其中，該Fcγ受體為FcγRIa、FcγRIIa(R)、FcγRIIa(H)、FcγRIIb、FcγRIIIa(V)、或FcγRIIIa(F)。
[30]如[28]或[29]之誘導免疫反應之抗原結合分子之製造方法，其中，包含將Fc區中之EU編號表示之部位當中選自以下之群中之至少1個以上的胺基酸取代的步驟：221位、222位、223位、224位、225位、227位、228位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、243位、244位、 245位、246位、247位、249位、250位、251位、254位、255位、256位、258位、260位、262位、263位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、271位、272位、273位、274位、275位、276位、278位、279位、280位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、288位、290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304位、305位、311位、313位、315位、317位、318位、320位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、336位、337位、339位、376位、377位、378位、379位、380位、382位、385位、392位、396位、421位、427位、428位、429位、434位、436位及440位。
[31]如[28]至[30]中任一項之誘導免疫反應之抗原結合分子之製造方法，其中，包含進行Fc區之EU編號表示之部位當中選自以下群中至少1個以上的胺基酸取代之步驟；221位之胺基酸取代為Lys或Tyr中之任一者、222位之胺基酸取代為Phe、Trp、Glu或Tyr中之任一者、223位之胺基酸取代為Phe、Trp、Glu或Lys中之任一者、224位之胺基酸取代為Phe、Trp、Glu或Tyr中之任一者、225位之胺基酸取代為Glu、Lys或Trp中之任一者、227位之胺基酸取代為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、228位之胺基酸取代為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、 230位之胺基酸取代為Ala、Glu、Gly或Tyr中之任一者、231位之胺基酸取代為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中之任一者、232位之胺基酸取代為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、233位之胺基酸取代為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、234位之胺基酸取代為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、235位之胺基酸取代為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、236位之胺基酸取代為Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、237位之胺基酸取代為Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、238位之胺基酸取代為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、239位之胺基酸取代為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或 Tyr中之任一者、240位之胺基酸取代為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、241位之胺基酸取代為Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中之任一者、243位之胺基酸取代為Leu、Glu、Leu、Gln、Arg、Trp或Tyr中之任一者、244位之胺基酸取代為His、245位之胺基酸取代為Ala、246位之胺基酸取代為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、247位之胺基酸取代為Ala、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Thr、Val或Tyr中之任一者、249位之胺基酸取代為Glu、His、Gln或Tyr中之任一者、250位之胺基酸取代為Glu或Gln中之任一者、251位之胺基酸取代為Phe、254位之胺基酸取代為Phe、Met或Tyr中之任一者、255位之胺基酸取代為Glu、Leu或Tyr中之任一者、256位之胺基酸取代為Ala、Met或Pro中之任一者、258位之胺基酸取代為Asp、Glu、His、Ser或Tyr中之任一者、260位之胺基酸取代為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、262位之胺基酸取代為Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中之任一者、263位之胺基酸取代為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、264位之胺基酸取代為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、 Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、265位之胺基酸取代為Ala、Leu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Val、Trp或Tyr中之任一者、266位之胺基酸取代為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、267位之胺基酸取代為Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、268位之胺基酸取代為Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Trp中之任一者、269位之胺基酸取代為Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、270位之胺基酸取代為Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、271位之胺基酸取代為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、272位之胺基酸取代為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、273位之胺基酸取代為Phe或Ile中之任一者、274位之胺基酸取代為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、 Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、275位之胺基酸取代為Leu或Trp中之任一者、276位之胺基酸取代為、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、278位之胺基酸取代為Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中之任一者、279位之胺基酸取代為Ala、280位之胺基酸取代為Ala、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gln、Trp或Tyr中之任一者、28I位之胺基酸取代為Asp、Lys、Pro或Tyr中之任一者、282位之胺基酸取代為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中之任一者、283位之胺基酸取代為Ala、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg或Tyr中之任一者、284位之胺基酸取代為Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中之任一者、285位之胺基酸取代為Asp、Glu、Lys、Gln、Trp或Tyr中之任一者、286位之胺基酸取代為Glu、Gly、Pro或Tyr中之任一者、288位之胺基酸取代為Asn、Asp、Glu或Tyr中之任一者、290位之胺基酸取代為Asp、Gly、His、Leu、Asn、Ser、 Thr、Trp或Tyr中之任一者、291位之胺基酸取代為Asp、Glu、Gly、His、Ile、Gln或Thr中之任一者、292位之胺基酸取代為Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中之任一者、293位之胺基酸取代為Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、294位之胺基酸取代為Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、295位之胺基酸取代為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、296位之胺基酸取代為Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr或Val中之任一者、297位之胺基酸取代為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、298位之胺基酸取代為Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、299位之胺基酸取代為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、 Trp或Tyr中之任一者、300位之胺基酸取代為Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中之任一者、301位之胺基酸取代為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、302位之胺基酸取代為Ile、303位之胺基酸取代為Asp、Gly或Tyr中之任一者、304位之胺基酸取代為Asp、His、Leu、Asn或Thr中之任一者、305位之胺基酸取代為Glu、Ile、Thr或Tyr中之任一者、311位之胺基酸取代為Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中之任一者、313位之胺基酸取代為Phe、315位之胺基酸取代為Leu、317位之胺基酸取代為Glu或Gln、318位之胺基酸取代為His、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Tyr中之任一者、320位之胺基酸取代為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、322位之胺基酸取代為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、323位之胺基酸取代為Ile、324位之胺基酸取代為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、 325位之胺基酸取代為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、326位之胺基酸取代為Ala、Asp、Glu、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、327位之胺基酸取代為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、328位之胺基酸取代為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、329位之胺基酸取代為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、330位之胺基酸取代為Cys、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、331位之胺基酸取代為Asp、Phe、His、Ile、Leu、Met、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、332位之胺基酸取代為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、333位之胺基酸取代為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、 Ile、Leu、Met、Pro、Ser、Thr、Val或Tyr中之任一者、334位之胺基酸取代為Ala、Glu、Phe、Ile、Leu、Pro或Thr中之任一者、335位之胺基酸取代為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中之任一者、336位之胺基酸取代為Glu、Lys或Tyr中之任一者、337位之胺基酸取代為Glu、His或Asn中之任一者、339位之胺基酸取代為Asp、Phe、Gly、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser或Thr中之任一者、376位之胺基酸取代為Ala或Val中之任一者、377位之胺基酸取代為Gly或Lys中之任一者、378位之胺基酸取代為Asp、379位之胺基酸取代為Asn、380位之胺基酸取代為Ala、Asn或Ser中之任一者、382位之胺基酸取代為Ala或Ile中之任一者、385位之胺基酸取代為Glu、392位之胺基酸取代為Thr、396位之胺基酸取代為Leu、421位之胺基酸取代為Lys、427位之胺基酸取代為Asn、428位之胺基酸取代為Phe或Leu中之任一者、429位之胺基酸取代為Met、434位之胺基酸取代為Trp、436位之胺基酸取代為Ile、及 440位之胺基酸取代為Gly、His、Ile、Leu或Tyr中之任一者。
[32]如[28]至[31]中任一項之誘導免疫反應之抗原結合分子之製造方法，其中，該天然型Fc區，為結合於EU編號297位之糖鏈係含岩藻糖之糖鏈之人類IgG1、人類IgG2、人類IgG3或人類IgG4中之任一者之Fc區。
[33]如[28]至[32]中任一項之誘導免疫反應之抗原結合分子之製造方法，其中，包含將該Fc區修飾成為使得Fc區之結合於EU編號297位之糖鏈之組成為結合有岩藻糖缺損糖鏈之Fc區之比例提高、或附加有二分化N-乙醯基葡萄糖胺之Fc區之比例提高的Fc區的步驟。
[34]一種誘導免疫反應之醫藥組成物之製造方法，包含以下(a)~(f)之步驟：(a)獲得在高鈣離子濃度之條件下抗原結合分域對抗原之結合活性、(b)獲得在低鈣離子濃度之條件下抗原結合分域對抗原之結合活性、(c)選擇(a)獲得之抗原結合活性高於(b)獲得之抗原結合活性之抗原結合分域、(d)將編碼為(c)選擇之抗原結合分域之聚核苷酸，連結於編碼為在pH中性域之條件下對FcRn有結合活性之FcRn結合分域之聚核苷酸、(e)培養導入有(d)獲得之聚核苷酸以可作用地連結之載體的細胞、及 (f)從(e)培養細胞之培養液將抗原結合分子回收。
[35]一種誘導免疫反應之醫藥組成物之製造方法，包含以下(a)~(f)之步驟：(a)獲得於高鈣離子濃度之條件下抗體對抗原之結合活性、(b)獲得於低鈣離子濃度之條件下抗體對抗原之結合活性、(c)選擇在(a)獲得之抗原結合活性高於(b)獲得之抗原結合活性之抗體、(d)將編碼為(c)選擇之抗體之抗原結合分域之聚核苷酸，連結於編碼為在pH中性域之條件下對FcRn有結合活性之FcRn結合分域之聚核苷酸、(e)培養導入有(d)獲得之聚核苷酸以可作用地連結之載體的細胞、及(f)從(e)培養細胞之培養液將抗原結合分子回收。
[36]一種抗原結合分子之製造方法，包含以下(a)~(f)之步驟：(a)獲得在pH中性域之條件下抗原結合分域對抗原之結合活性、(b)獲得在pH酸性域之條件下抗原結合分域對抗原之結合活性、(c)選擇在(a)獲得之抗原結合活性高於(b)獲得之抗原結合活性之抗原結合分域、(d)將編碼為(c)選擇之抗原結合分域之聚核苷酸，連結於 編碼為在pH中性域之條件下對FcRn有結合活性之FcRn結合分域之聚核苷酸、(e)培養導入有(d)獲得之聚核苷酸以可作用地連結之載體的細胞、及(f)從(e)培養細胞之培養液將抗原結合分子回收。
[37]一種抗原結合分子之製造方法，包含以下(a)~(f)之步驟：(a)獲得在pH中性域之條件下抗體對抗原之結合活性、(b)獲得在pH酸性域之條件下抗體對抗原之結合活性、(c)選擇在(a)獲得之抗原結合活性高於(b)獲得之抗原結合活性之抗體、(d)將編碼為(c)選擇之抗體之抗原結合分域之聚核苷酸，連結於編碼為在pH中性域之條件下對FcRn有結合活性之FcRn結合分域之聚核苷酸、(e)培養導入有(d)獲得之聚核苷酸以可作用地連結之載體的細胞、及(f)從(e)培養細胞之培養液將抗原結合分子回收。
[38]如[34]至[37]中任一項之方法，其中，該抗原結合分子係對該抗原有中和活性之抗原結合分子。
[39]如[34]至[38]中任一項之方法，其中，該抗原結合分子對於表現該抗原之細胞有細胞傷害活性。
[40]如[34]至[39]中任一項之方法，其中，該FcRn結合分域包含抗體之Fc區。
[41]如[40]之方法，其中，該Fc區，在Fc區之EU編號 表示之部位當中選自於257位、308位、428位及434位之群中至少1個以上之胺基酸與天然型Fc區之對應部位之胺基酸不同。
[42]如[40]或[41]之方法，其中，該Fc區，包含選自Fc區之EU編號表示；257位之胺基酸為Ala、308位之胺基酸為Pro、428位之胺基酸為Leu、及434位之胺基酸為Tyr、之群中至少1個以上的胺基酸。
[43]如[40]至[42]中任一項之方法，其中，該Fc區對Fcγ受體之結合活性，高於結合於EU編號297位之糖鏈係含岩藻糖之糖鏈的天然型人類IgG之Fc區對Fcγ受體之結合活性。
[44]如[43]之方法，其中，該Fcγ受體為FcγRIa、FcγRIIa(R)、FcγRIIa(H)、FcγRIIb、FcγRIIIa(V)、或FcγRIIIa(F)。
[45]如[43]或[44]之方法，其中，該Fc區，包含Fc區之EU編號表示之部位當中選自以下群中至少1個以上的胺基酸；221位之胺基酸為Lys或Tyr中之任一者、222位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中之任一者、223位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Lys中之任一者、224位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中之任一者、 225位之胺基酸為Glu、Lys或Trp中之任一者、227位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、228位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、230位之胺基酸為Ala、Glu、Gly或Tyr中之任一者、231位之胺基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中之任一者、232位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、233位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、234位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、235位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、236位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、237位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、238位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、 239位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、240位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、241位之胺基酸為Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中之任一者、243位之胺基酸為Leu、Glu、Leu、Gln、Arg、Trp或Tyr中之任一者、244位之胺基酸為His、245位之胺基酸為Ala、246位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、247位之胺基酸為Ala、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Thr、Val或Tyr中之任一者、249位之胺基酸為Glu、His、Gln或Tyr中之任一者、250位之胺基酸為Glu或Gln中之任一者、251位之胺基酸為Phe、254位之胺基酸為Phe、Met或Tyr中之任一者、255位之胺基酸為Glu、Leu或Tyr中之任一者、256位之胺基酸為Ala、Met或Pro中之任一者、258位之胺基酸為Asp、Glu、His、Ser或Tyr中之任一者、260位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、262位之胺基酸為Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中之任一者、263位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、264位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、 Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、265位之胺基酸為Ala、Leu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Val、Trp或Tyr中之任一者、266位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、267位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、268位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Trp中之任一者、269位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、270位之胺基酸為Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、271位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、272位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、273位之胺基酸為Phe或Ile中之任一者、274位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、 275位之胺基酸為Leu或Trp中之任一者、276位之胺基酸為、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、278位之胺基酸為Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中之任一者、279位之胺基酸為Ala、280位之胺基酸為Ala、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gln、Trp或Tyr中之任一者、281位之胺基酸為Asp、Lys、Pro或Tyr中之任一者、282位之胺基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中之任一者、283位之胺基酸為Ala、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg或Tyr中之任一者、284位之胺基酸為Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中之任一者、285位之胺基酸為Asp、Glu、Lys、Gln、Trp或Tyr中之任一者、286位之胺基酸為Glu、Gly、Pro或Tyr中之任一者、288位之胺基酸為Asn、Asp、Glu或Tyr中之任一者、290位之胺基酸為Asp、Gly、His、Leu、Asn、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、291位之胺基酸為Asp、Glu、Gly、His、Ile、Gln或Thr中之任一者、292位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中之任一者、 293位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、294位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、295位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、296位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr或Val中之任一者、297位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、298位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、299位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中之任一者、300位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中之任一者、301位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、302位之胺基酸為Ile、303位之胺基酸為Asp、Gly或Tyr中之任一者、304位之胺基酸為Asp、His、Leu、Asn或Thr中之任一者、 305位之胺基酸為Glu、Ile、Thr或Tyr中之任一者、311位之胺基酸為Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中之任一者、313位之胺基酸為Phe、315位之胺基酸為Leu、317位之胺基酸為Glu或Gln、318位之胺基酸為His、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Tyr中之任一者、320位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、322位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、323位之胺基酸為Ile、324位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、325位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、326位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、327位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、328位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、 Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、329位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、330位之胺基酸為Cys、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、331位之胺基酸為Asp、Phe、His、Ile、Leu、Met、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、332位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、333位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Ser、Thr、Val或Tyr中之任一者、334位之胺基酸為Ala、Glu、Phe、Ile、Leu、Pro或Thr中之任一者、335位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中之任一者、336位之胺基酸為Glu、Lys或Tyr中之任一者、337位之胺基酸為Glu、His或Asn中之任一者、339位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser或Thr中之任一者、376位之胺基酸為Ala或Val中之任一者、 377位之胺基酸為Gly或Lys中之任一者、378位之胺基酸為Asp、379位之胺基酸為Asn、380位之胺基酸為Ala、Asn或Ser中之任一者、382位之胺基酸為Ala或Ile中之任一者、385位之胺基酸為Glu、392位之胺基酸為Thr、396位之胺基酸為Leu、421位之胺基酸為Lys、427位之胺基酸為Asn、428位之胺基酸為Phe或Leu中之任一者、429位之胺基酸為Met、434位之胺基酸為Trp、436位之胺基酸為Ile、及440位之胺基酸為Gly、His、Ile、Leu或Tyr中之任一者、
[46]如[43]至[45]中之任一項之方法，其中，該天然型Fc區，為結合於EU編號297位之糖鏈係含岩藻糖之糖鏈之人類IgG1、人類IgG2、人類IgG3或人類IgG4中之任一者之Fc區。
[47]如[43]至[46]中之任一項之方法，其中，該Fc區，係經修飾成為使得Fc區之結合於EU編號297位之糖鏈之組成為結合有岩藻糖缺損糖鏈之Fc區之比例提高、或附加有二分化N-乙醯基葡萄糖胺之Fc區之比例提高的Fc區。
依本發明，提供包含通常抗體無法獲得之藉由將其對活體內投予可發揮對標的抗原藥理作用而且可誘導對標的抗原之免疫反應之抗原結合分子之醫藥組成物、及其製造方法。藉此，藉由誘導通常的疫苗未能獲得之有對標的抗原之結合活性及對標的細胞之細胞傷害活性及細胞增殖抑制活性而且誘導對標的抗原之免疫反應，能有效治療癌及感染症。
【實施發明之形態】
以下定義及詳細說明係為了容易理解在本說明書說明之本發明而提供。
胺基酸
本說明書中，以例如Ala/A、Leu/L、Arg/R、Lys/K、Asn/N、Met/M、Asp/D、Phe/F、Cys/C、Pro/P、Gln/Q、Ser/S、Glu/E、Thr/T、Gly/G、Trp/W、His/H、Tyr/Y、Ile/I、Val/V之方式，將胺基酸以單字母碼或3字母碼、或其兩者表示。
抗原
本說明書中，抗原不特別限定，只要藉由誘導活體之免疫反應而能成為該活體之免疫系之攻擊對象的分子即可，可為任意抗原。抗原，例如例如在腫瘤細胞專一性表現且在正常細胞不表現之分子(新抗原決定基)為理想例。又，在細菌、病毒等感染活體之外來性生物種表現且於活體不表現之分子亦為理想例。「在腫瘤細胞專一性表現且 在正常細胞不表現」或「在感染活體之外來性生物種表現且於活體不表現」，係指「腫瘤細胞與正常細胞」或「感染活體之外來性生物種與活體」之間，有分子之質的或量的差異。例如若為假定在正常細胞表現但在腫瘤細胞表現之量遠大於在該正常細胞表現之量之分子，則在本發明可說該分子在腫瘤細胞與正常細胞之間有分子之量的差異。又，假設即使由相同之胺基酸序列構成之多胜肽在腫瘤細胞及正常細胞的表現量為同程度，但在腫瘤細胞表現之多胜肽受磷酸化等轉譯後修飾等而在正常細胞表現之多胜肽未受如此之修飾等時，在本發明中可說該分子在腫瘤細胞與正常細胞之間有分子的質的不同。
該分子可列舉：ALK受體(Pleiotrophin受體)、Pleiotrophin、KS 1/4胰臟癌抗原、卵巢癌抗原(CA125)、前列腺酸磷酸、前列腺專一性抗原(PSA)、黑色素瘤關連抗原p97、黑色素瘤抗原gp75、高分子量黑色素瘤抗原(HMW-MAA)、前列腺專一性膜抗原、癌性胚抗原(CEA)、多型上皮黏蛋白抗原、人類乳脂肪球抗原、CEA、TAG-72、CO17-1A、GICA 19-9、CTA-1及LEA等結腸直腸腫瘤關連抗原、Burkitt’s淋巴瘤抗原-38.13、CD19、人類B淋巴瘤抗原-CD20、CD33、神經節苷酯GD2、神經節苷酯GD3、神經節苷酯GM2及神經節苷酯GM3等黑色素瘤專一性抗原、腫瘤專一性移植型細胞表面抗原(TSTA)、T抗原、DNA腫瘤病毒及RNA腫瘤病毒之外套膜抗原等由病毒誘導之腫瘤抗原、結腸之CEA、5T4癌胎兒滋養母細胞糖蛋白及膀胱 腫瘤癌胎兒抗原等癌胎兒抗原α-fetoprotein、人類肺癌抗原L6及L20等分化抗原、纖維肉瘤之抗原、人類白血病T細胞抗原-Gp37、新生糖蛋白、鞘脂質、EGFR(上皮增殖因子受體)等乳癌抗原、NY-BR-16、NY-BR-16及HER2抗原(p185HER2)、多型上皮黏蛋白(PEM)、惡性人類淋巴球抗原-APO-1、胎兒紅血球觀察到的I抗原等分化抗原、成人紅血球觀察到之初期內胚葉I抗原、移植前之胚、胃癌觀察到之I(Ma)、乳腺上皮觀察到之M18、M39、骨髓細胞觀察到之SSEA-1、VEP8、VEP9、Myl、VIM-D5、結腸直腸癌觀察到之D156-22、TRA-1-85(血液群H)、精囊及卵巢癌觀察到之SCP-1、結腸癌觀察到之C14、肺癌觀察到之F3、胃癌觀察到之AH6、Y hapten、胚性癌細胞觀察到之Ley、TL5(血液群A)、A431細胞觀察到之EGF受體、胰臟癌觀察到之E1系列(血液群B)、胚性癌細胞觀察到之FC10.2、胃癌抗原、腺癌觀察到之CO-514(血液群Lea)、腺癌觀察到之NS-10、CO-43(血液群Leb)、A431細胞之EGF受體觀察到之G49、結腸癌觀察到之MH2(血液群ALeb/Ley)、結腸癌觀察到之19.9、胃癌黏蛋白、骨髓細胞觀察到之T5A7、黑色素瘤觀察到之R24、胚性癌細胞觀察到之4.2、GD3、D1.1、OFA-1、GM2、OFA-2、GD2、及M1：22：25：8及4~8細胞階段之胚觀察到之SSEA-3及SSEA-4、皮下T細胞淋巴瘤抗原、MART-1抗原、唾液酸化Tn(STn)抗原、結腸癌抗原NY-CO-45、肺癌抗原NY-LU-12變異體A、腺癌抗原ART1、腫瘤伴隨性關連腦-精囊癌抗原(癌神經抗原MA2、 腫瘤伴隨性神經抗原)、神經癌腹部抗原2(NOVA2)、血液細胞癌抗原基因520、腫瘤關連抗原CO-029、腫瘤關連抗原MAGE-C1(癌/精囊抗原CT7)、MAGE-B1(MAGE-XP抗原)、MAGE-B2(DAM6)、MAGE-2、MAGE-4a、MAGE-4b及MAGE-X2、癌-精囊抗原(NY-EOS-1)、YKL-40及上述多胜肽中之任一者之片段或對該等修飾後之構造等(前述修飾磷酸基或糖鏈等)可理想地作為腫瘤抗原。
作為外來性生物種之抗原，可列舉炭疽菌(Bacillus anthracis)、肉毒桿菌(Clostridium botulinum)、Yersinia pestis(Yersinia pestis)，(Variola major(Variola major)(天然痘)及其他痘病毒、野兔病菌(Francisella tularensis)(野兔病)及產生病毒性出血熱者、LCM、朱寧病毒(Junin virus)、馬丘波病毒(Machupo virus)、瓜納里托病毒(Guanarito virus)及產生拉薩熱者等沙粒病毒(Arenavirus)、布尼亞病毒(Bunyavirus)、產生裂谷熱者等、漢他病毒(Hantavirus)、A型、B型及C型肝炎、西尼羅病毒(West Nile Virus)、LaCrosse(LaCrosse)、加州腦炎(California encephalitis)、VEE、EEE、WEE、日本腦炎病毒(Japanese Encephalitis Virus)等病毒性腦炎、基薩諾爾森林病病毒(Kyasanur Forest Virus)、壁蝨媒介性出血熱病毒(Tickborne hemorrhagic fever virus)、克里米亞-剛果出血熱病毒(Crimean-Congo Hemorrhagic fever virus)、壁蝨媒介性腦炎病毒(Tickborne encephalitis viruses)、黃熱病(Yellow fever)、多劑耐性TB、流感、其他的立克次體及狂犬病、黃病毒(Flavirus)、登革熱(Dengue)、絲狀病毒(Filovirus)、伊波拉(Ebola)、類鼻疽假單孢菌(Marburg Burkholderia pseudomallei)、貝氏考克斯菌(Coxiella burnetii)(Q熱)、布魯氏菌(Brucella species)(布魯氏症)、鼻疽菌(Burkholderia mallei)(鼻疽)、篦麻毒素(來自篦麻(Ricinus communis))、產氣莢膜梭狀芽孢桿菌(Clostridium perfringens)之ε毒素、金黃色葡萄球菌內毒素B(Staphylococcus enterotoxin B)、斑疹傷寒(Typhus fever)(斑疹傷寒(Rickettsia prowazekii))、食品及水媒介性病原體、下痢原性大腸菌(Diarrheagenic E.coli)、病原性弧菌(Pathogenic Vibrios)、志賀氏菌(Shigella species)、沙門氏菌(Salmonella)、李斯特單胞菌(Listeria monocytogenes)、曲狀桿菌(Campylobacter jejuni)、耶辛尼氏腸炎桿菌(Yersinia enterocolitica)等細菌及小隱孢子球菌(Cryptosporidium parvum)、卡晏環孢子球蟲(Cyclospora cayatanensis)、梨型鞭毛蟲(Giardia lamblia)、痢疾阿米巴原蟲(Entamoeba histolytica)、弓漿蟲(Toxoplasma)、微胞子蟲(Microsporidia)等原蟲中發現的分子。
抗原，可列舉：17-IA、17-IA、4-1BB、4Dc、6-keto-PGF1a、8-iso-PGF2a、8-oxo-dG、A1 Adenosine受體、A33、ACE、ACE-2、Activin、Activin A、Activin AB、Activin B、Activin C、Activin RIA、Activin RIA ALK-2、Activin RIB ALK-4、Activin RIIA、Activin RIIB、ADAM、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAM8、ADAM9、ADAMTS、ADAMTS4、ADAMTS5、Addressin、aFGF、ALCAM、ALK、ALK-1、ALK-7、alpha-1-antitrypsin、alpha-V/beta-1拮抗劑、ANG、Ang、APAF-1、APE、APJ、APP、APRIL、AR、ARC、ART、Artemin、抗Id、ASPARTIC、心房性鈉利尿因子、av/b3細胞黏合素、Axl、b2M、B7-1、B7-2、B7-H、B-淋巴球刺激因子(BlyS)、BACE、BACE-1、Bad、BAFF、BAFF-R、Bag-1、BAK、Bax、BCA-1、BCAM、Bcl、BCMA、BDNF、b-ECGF、bFGF、BID、Bik、BIM、BLC、BL-CAM、BLK、BMP、BMP-2BMP-2a、BMP-3 Osteogenin、BMP-4 BMP-2b、BMP-5、BMP-6 Vgr-1、BMP-7(OP-1)、BMP-8(BMP-8a、OP-2)、BMPR、BMPR-IA(ALK-3)、BMPR-IB(ALK-6)、BRK-2、RPK-1、BMPR-II(BRK-3)、BMP、b-NGF、BOK、Bombesin、骨來源神經營養因子、BPDE、BPDE-DNA、BTC、補體因子3(C3)、C3a、C4、C5、C5a、C10、CA125、CAD-8、calcitonin、cAMP、癌胎兒抗原(CEA)、癌關連抗原、CathepsinA、CathepsinB、CathepsinC/DPPI、CathepsinD、CathepsinE、CathepsinH、CathepsinL、CathepsinO、CathepsinS、CathepsinV、CathepsinX/Z/P、CBL、CCI、CCK2、CCL、CCL1、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、 CCL9/10、CCR、CCR1、CCR10、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CD1、CD2、CD3、CD3E、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27L、CD28、CD29、CD30、CD30L、CD32、CD33(p67蛋白質)、CD34、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD49a、CD52、CD54、CD55、CD56、CD61、CD64、CD66e、CD74、CD80(B7-1)、CD89、CD95、CD123、CD137、CD138、CD140a、CD146、CD147、CD148、CD152、CD164、CEACAM5、CFTR、cGMP、CINC、肉毒桿菌(Clostridium botulinum)毒素、Clostridium perfringens(Clostridium perfringens)毒素、CKb8-1、CLC、CMV、CMV UL、CNTF、CNTN-1、COX、C-Ret、CRG-2、CT-1、CTACK、CTGF、CTLA-4、CX3CL1、CX3CR1、CXCL、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCR、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、cytokeratin腫瘤關連抗原、DAN、DCC、DcR3、DC-SIGN、補體控制因子(Decay accelerating factor)、des(1-3)-IGF-I(腦IGF-1)、Dhh、Digoxin、DNAM-1、Dnase、Dpp、DPPIV/CD26、Dtk、ECAD、EDA、EDA-A1、EDA-A2、EDAR、EGF、EGFR(ErbB-1)、EMA、EMMPRIN、ENA、endothelin受體、enkephalinase、eNOS、Eot、eotaxin 1、EpCAM、Ephrin B2/EphB4、EPO、ERCC、E-selectin、ET-1、第IIa因子、第VII因子、第VIIIc 因子、第IX因子、纖維母細胞活化蛋白質、Fas、FcR1、FEN-1、ferritin、FGF、FGF-19、FGF-2、FGF3、FGF-8、FGFR、FGFR-3、fibrin、FL、FLIP、Flt-3、Flt-4、卵泡刺激荷爾蒙、fractalkine、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、G250、Gas6、GCP-2、GCSF、GD2、GD3、GDF、GDF-1、GDF-3(Vgr-2)、GDF-5(BMP-14、CDMP-1)、GDF-6(BMP-13、CDMP-2)、GDF-7(BMP-12、CDMP-3)、GDF-8(myostatin)、GDF-9、GDF-15(MIC-1)、GDNF、GDNF、GFAP、GFRa-1、GFR-alpha1、GFR-alpha2、GFR-alpha3、GITR、升糖素、Glut4、糖蛋白IIb/IIIa(GPIIb/IIIa)、GM-CSF、gp130、gp72、GRO、成長荷爾蒙釋放因子、半抗原(NP-cap或NIP-cap)、HB-EGF、HCC、HCMV gB外被糖蛋白、HCMV gH外被糖蛋白、HCMV UL、造血成長因子(HGF)、Hep B gp120、heparanase、Her2、Her2/neu(ErbB-2)、Her3(ErbB-3)、Her4(ErbB-4)、單純皰疹病毒(HSV)gB糖蛋白、HSV gD糖蛋白、HGFA、高分子量黑色素瘤關連抗原(HMW-MAA)、HIV gp120、HIV IIIB gp 120 V3環圈、HLA、HLA-DR、HM1.24、HMFG PEM、HRG、Hrk、人類心肌肌凝蛋白、人類細胞巨病毒(HCMV)、人類成長荷爾蒙(hGH)、HVEM、I-309、IAP、ICAM、ICAM-1、ICAM-3、ICE、ICOS、IFNg、Ig、IgA受體、IgE、IGF、IGF結合蛋白質、IGF-1R、IGFBP、IGF-I、IGF-II、IL、IL-1、IL-1R、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-5R、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-18R、IL-23、 干擾素(INF)-alpha、INF-beta、INF-gamma、inhibin、iNOS、胰島素A鏈、胰島素B鏈、胰島素狀增殖因子1、細胞黏合素alpha2、細胞黏合素(integrin)alpha3、細胞黏合素alpha4、細胞黏合素alpha4/beta1、細胞黏合素alpha4/beta7、細胞黏合素alpha5(alphaV)、細胞黏合素alpha5/beta1、細胞黏合素alpha5/beta3、細胞黏合素alpha6、細胞黏合素beta1、細胞黏合素beta2、干擾素gamma、IP-10、I-TAC、JE、kallikrein2、kallikrein5、kallikrein6、kallikreinl1、kallikreinl2、kallikreinl4、kallikreinl5、kallikreinL1、kallikreinL2、kallikreinL3、kallikreinL4、KC、KDR、角質化細胞增殖因子(KGF)、laminin 5、LAMP、LAP、LAP(TGF-1)、潛在型TGF-1、潛在型TGF-1 bp1、LBP、LDGF、LECT2、lefty、Lewis-Y抗原、Lewis-Y關連抗原、LFA-1、LFA-3、Lfo、LIF、LIGHT、脂蛋白、LIX、LKN、Lptn、L-selectin、LT-a、LT-b、LTB4、LTBP-1、肺界面活性劑、黃體形成荷爾蒙、lympotoxin beta受體、Mac-1、MAdCAM、MAG、MAP2、MARC、MCAM、MCAM、MCK-2、MCP、M-CSF、MDC、Mer、METALLOPROTEASES、MGDF受體、MGMT、MHC(HLA-DR)、MIF、MIG、MIP、MIP-1-alpha、MK、MMAC1、MMP、MMP-1、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-2、MMP-24、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MPIF、Mpo、MSK、MSP、黏蛋白(Mucl)、MUCl8、Muller管抑制物質、Mug、MuSK、NAIP、NAP、NCAD、N-Cadherin、 NCA 90、NCAM、NCAM、neprilysin、neurotrophin-3、-4、或-6、neurturin、神經成長因子(NGF)、NGFR、NGF-beta、nNOS、NO、NOS、Npn、NRG-3、NT、NTN、OB、OGG1、OPG、OPN、OSM、OX40L、OX40R、p150、p95、PADPr、副甲狀腺荷爾蒙、PARC、PARP、PBR、PBSF、PCAD、P-Cadherin、PCNA、PDGF、PDGF、PDK-1、PECAM、PEM、PF4、PGE、PGF、PGI2、PGJ2、PIN、PLA2、胎盤性鹼性磷解酶(PLAP)、P1GF、PLP、PP14、胰島素前體、prorelaxin、proteinC、PS、PSA、PSCA、前列腺專一性膜抗原(PSMA)、PTEN、PTHrp、Ptk、PTN、R51、RANK、RANKL、RANTES、RANTES、relaxinA鏈、relaxinB鏈、腎素(renin)、呼吸器多核體病毒(RSV)F、RSV Fgp、Ret、風濕因子、RLIP76、RPA2、RSK、S100、SCF/KL、SDF-1、SERINE、血清白蛋白、sFRP-3、Shh、SIGIRR、SK-1、SLAM、SLPI、SMAC、SMDF、SMOH、SOD、SPARC、Stat、STEAP、STEAP-II、TACE、TACI、TAG-72(腫瘤關連糖蛋白-72)、TARC、TCA-3、T細胞受體(例如T細胞受體alpha/beta)、TdT、TECK、TEM1、TEM5、TEM7、TEM8、TERT、睾丸PLAP狀鹼性磷解酶、TfR、TGF、TGF-alpha、TGF-beta、TGF-beta Pan Specific、TGF-betaRI(ALK-5)、TGF-betaRII、TGF-betaRIIb、TGF-betaRIII、TGF-beta1、TGF-beta2、TGF-beta3、TGF-beta4、TGF-beta5、凝血酶(thrombin)、胸腺Ck-1、甲狀腺刺激荷爾蒙、Tie、TIMP、TIQ、組織因子、TMEFF2、Tmpo、TMPRSS2、TNF、TNF-alpha、TNF-alphabeta、TNF-beta2、TNFc、TNF-RI、TNF-RII、 TNFRSF10A(TRAIL R1 Apo-2、DR4)、TNFRSF10B(TRAIL R2 DR5、KILLER、TRICK-2A、TRICK-B)、TNFRSF10C(TRAIL R3 DcR1、LIT、TRID)、TNFRSF10D(TRAIL R4 DcR2、TRUNDD)、TNFRSF11A(RANK ODF R、TRANCE R)、TNFRSF11B(OPG OCIF、TR1)、TNFRSF12(TWEAK R FN14)、TNFRSF13B(TACI)、TNFRSF13C(BAFF R)、TNFRSF14(HVEM ATAR、HveA、LIGHT R、TR2)、TNFRSF16(NGFR p75NTR)、TNFRSF17(BCMA)、TNFRSF18(GITR AITR)、TNFRSF19(TROY TAJ、TRADE)、TNFRSF19L(RELT)、TNFRSF1A(TNF RI CD120a、p55-60)、TNFRSF1B(TNF RII CD120b、p75-80)、TNFRSF26(TNFRH3)、TNFRSF3(LTbR TNF RIII、TNFC R)、TNFRSF4(OX40 ACT35、TXGP1 R)、TNFRSF5(CD40 p50)、TNFRSF6(Fas Apo-1、APT1、CD95)、TNFRSF6B(DcR3 M68、TR6)、TNFRSF7(CD27)、TNFRSF8(CD30)、TNFRSF9(4-1BB CD137、ILA)、TNFRSF21(DR6)、TNFRSF22(DcTRAIL R2 TNFRH2)、TNFRST23(DcTRAIL R1 TNFRH1)、TNFRSF25(DR3 Apo-3、LARD、TR-3、TRAMP、WSL-1)、TNFSF10(TRAIL Apo-2配體、TL2)、TNFSF11(TRANCE/RANK配體ODF、OPG配體)、TNFSF12(TWEAK Apo-3配體、DR3配體)、TNFSF13(APRIL TALL2)、TNFSF13B(BAFF BLYS、TALL1、THANK、TNFSF20)、TNFSF14(LIGHT HVEM配體、LTg)、TNFSF15(TL1A/VEGI)、TNFSF18(GITR配體AITR配體、TL6)、TNFSF1A(TNF-a Conectin、DIF、TNFSF2)、TNFSF1B(TNF-b LTa、TNFSF1)、TNFSF3(LTb TNFC、p33)、TNFSF4(OX40配體gp34、TXGP1)、TNFSF5(CD40配體 CD154、gp39、HIGM1、IMD3、TRAP)、TNFSF6(Fas配體Apo-1配體、APT1配體)、TNFSF7(CD27配體CD70)、TNFSF8(CD30配體CD153)、TNFSF9(4-1BB配體CD137配體)、TP-1、t-PA、Tpo、TRAIL、TRAIL R、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRANCE、transferrin受體、TRF、Trk、TROP-2、TSG、TSLP、腫瘤關連抗原CA125、腫瘤關連抗原表現LewisY關連碳水化合物、TWEAK、TXB2、Ung、uPAR、uPAR-1、尿激酶、VCAM、VCAM-1、VECAD、VE-Cadherin、VE-cadherin-2、VEFGR-1(flt-1)、VEGF、VEGFR、VEGFR-3(flt-4)、VEGI、VIM、病毒抗原、VLA、VLA-1、VLA-4、VNR細胞黏合素、Von Willebrand因子、WIF-1、WNT1、WNT2、WNT2B/13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNT11、WNT16、XCL1、XCL2、XCR1、XCR1、XEDAR、XIAP、XPD、HMGB1、IgA、A β、CD81,CD97,CD98,DDR1,DKK1,EREG、Hsp90,IL-17/IL-17R、IL-20/IL-20R、氧化LDL,PCSK9,prekallikrein,RON,TMEM16F、SOD1,Chromogranin A,Chromogranin B、tau,VAP1、高分子kininogen、IL-31、IL-31R、Nav1.1、Nav1.2、Nav1.3、Nav1.4、Nav1.5、Nav1.6、Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9、EPCR、C1,C1q,C1r,C1s,C2,C2a,C2b,C3,C3a,C3b,C4,C4a,C4b,C5,C5a,C5b,C6,C7,C8,C9,factor B,factor D,factor H,properdin、sclerostin、fibrinogen,fibrin,prothrombin,thrombin,組織因子,factor V,factor Va, factor VII,factor VIIa,factor VIII,factor VIIIa,factor IX,factor IXa,factor X,factor Xa,factor XI,factor XIa,factor XII,factor XIIa,factor XIII,factor XIIIa,TFPI,antithrombin III,EPCR,thrombomodulin、TAPI,tPA,plasminogen,plasmin,PAI-1,PAI-2、GPC3、Syndecan-1、Syndecan-2、Syndecan-3、Syndecan-4、LPA、S1P、Acetylcholine受體、AdipoR1、AdipoR2、ADP ribosyl cyclase-1、alpha-4/beta-7細胞黏合素、alpha-5/beta-1細胞黏合素、alpha-v/beta-6細胞黏合素、alphavbeta1細胞黏合素、Angiopoietin ligand-2、Angptl2、Anthrax、Cadherin、Carbonic anhydrase-IX、CD105、CD155、CD158a、CD37、CD49b、CD51、CD70、CD72、Claudin 18、Clostridium difficile toxin、CS1、Delta-like protein ligand 4、DHICA oxidase、Dickkopf-1 ligand、Dipeptidyl peptidase IV、EPOR、F protein of RSV、Factor Ia、FasL、Folate受體alpha、Glucagon受體、Glucagon-like peptide 1受體、Glutamate carboxypeptidase II、GMCSFR、Hepatitis C virus E2糖蛋白、Hepcidin、IL-17受體、IL-22受體、IL-23受體、IL-3受體、Kit tyrosine kinase、Leucine Rich Alpha-2-Glycoprotein 1(LRG1)、Lysosphingolipid受體、膜糖蛋白OX2、Mesothelin、MET、MICA、MUC-16、Myelin associated糖蛋白、Neuropilin-1、Neuropilin-2、Nogo受體、PLXNA1、 PLXNA2、PLXNA3、PLXNA4A、PLXNA4B、PLXNB1、PLXNB2、PLXNB3、PLXNC1、PLXND1、程式化細胞死亡配體1、Proprotein convertase PC9、P-selectin糖蛋白ligand-1、RAGE、Reticulon 4、RF、RON-8、SEMA3A、SEMA3B、SEMA3C、SEMA3D、SEMA3E、SEMA3F、SEMA3G、SEMA4A、SEMA4B、SEMA4C、SEMA4D、SEMA4F、SEMA4G、SEMA5A、SEMA5B、SEMA6A、SEMA6B、SEMA6C、SEMA6D、SEMA7A、Shiga like toxin II、Sphingosine-1-phosphate受體-1、ST2、Staphylococcal lipoteichoic acid、Tenascin、TG2、Thymic stromal lymphoprotein受體、TNF超級家族受體12A、穿膜糖蛋白NMB、TREM-1、TREM-2、Trophoblast糖蛋白、TSH受體、TTR、Tubulin、ULBP2及激素及成長因子用之受體。
抗原決定部位
意指抗原中存在之抗原決定基之抗原決定部位，係本說明書揭示之抗原結合分子中之抗原結合分域所結合之抗原上之部位。因此，例如：抗原決定部位可由其構造定義。又，該抗原決定部位也可由認識該抗原決定部位之抗原結合分子中對於抗原之結合活性定義。抗原為胜肽或多胜肽時，也可利用構成抗原決定部位之胺基酸殘基指定抗原決定部位。又，抗原決定部位為糖鏈時，也可利用特定糖鏈構造來指定抗原決定部位。
直線狀抗原決定部位，係包含認識胺基酸一次序列的抗原決定部位的抗原決定部位。直線狀抗原決定部位典型在固有序列中至少含有3個，且最普通為至少5個，例如 約8至約10個，6至20個胺基酸。
立體構造抗原決定部位，與直線狀抗原決定部位相對照，係指含有抗原決定部位之胺基酸之一次序列並非所認識之抗原決定部位之單一規定成分的抗原決定部位(例如：胺基酸之一次序列不一定由規定抗原決定部位之抗體所認識之抗原決定部位)。立體構造抗原決定部位，可能包含對於直線狀抗原決定部位為更多之數之胺基酸。關於立體構造抗原決定部位之認識，抗體認識胜肽或蛋白質之三維構造。例如：蛋白質分子折疊形成三維構造時，形成立體構造抗原決定部位之某個胺基酸及/或多胜肽主鏈，可以並排，抗體可認識抗原決定部位。決定抗原決定部位之立體構造之方法，包含例如X射線結晶學、二維核磁共振分光學及部位專一性旋轉標誌及電磁常磁性共振分光學，但不限於該等。例如參考：Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology(1996)、第66卷、Morris(編)。
結合活性
以下例示確認含有對抗IL-6受體之抗原結合分域的待驗抗原結合分子其對於抗原決定部位之結合的確認方法，但是確認含有對抗IL-6受體以外之抗原的抗原結合分域之待驗抗原結合分子其對於抗原決定部位之結合的確認方法，也可依照下列例示適當實施。
例如：含有對抗IL-6受體之抗原結合分域的待驗抗原結合分子會認識IL-6受體分子中存在之線狀抗原決定部位之情事，例如可以如下方式確認。為了上述目的，合成 由構成IL-6受體之細胞外分域之胺基酸序列構成的線狀胜肽。該胜肽可化學合成。或，利用IL-6受體之cDNA中之編碼為相當於細胞外分域之胺基酸序列之區域，以基因工程方法可獲得。其次，評價由構成細胞外分域之胺基酸序列所構成的線狀胜肽與含有對於IL-6受體之抗原結合分域的待驗抗原結合分子間的結合活性。例如，利用以經固定化之線狀胜肽為抗原之ELISA，可評價該抗原結合分子對於該胜肽之結合活性。或，依據IL-6受體表現細胞中，該抗原結合分子之結合時由於線狀胜肽所致抑制的水平，可以明確獲得對於線狀胜肽之結合活性。利用該等試驗，可以明確獲得該抗原結合分子對於線狀胜肽之結合活性。
例如：含有對抗IL-6R之抗原結合分域的待驗抗原結合分子會認識IL-6R分子中存在之線狀抗原決定部位之情事，例如可以如下方式確認。為了上述目的，合成由構成IL-6R之細胞外分域之胺基酸序列構成的線狀胜肽。該胜肽可化學合成。或，利用IL-6R之cDNA中之編碼為相當於細胞外分域之胺基酸序列之區域，以基因工程方法可獲得。其次，評價由構成細胞外分域之胺基酸序列所構成的線狀胜肽與含有對於IL-6R之抗原結合分域的待驗抗原結合分子間的結合活性。例如，利用以經固定化之線狀胜肽為抗原之ELISA，可評價該抗原結合分子對於該胜肽之結合活性。或，依據IL-6R表現細胞中，該抗原結合分子之結合時由於線狀胜肽所致抑制的水平，可以明確獲得對於 線狀胜肽之結合活性。利用該等試驗，可以明確獲得該抗原結合分子對於線狀胜肽之結合活性。
又，含有對抗IL-6受體之抗原結合分域的待驗抗原結合分子會認識立體構造抗原決定部位之情事，可由以下方式確認。為了上述目的，製備表現IL-6受體之細胞。含有對抗IL-6受體之抗原結合分域的待驗抗原結合分子接觸IL-6受體表現細胞時，會強力結合於該細胞，另一方面，對於固定化有該抗原結合分子之由構成IL-6受體之細胞外分域的胺基酸序列而成的線狀胜肽，實質上不結合時等。在此，實質上不結合，係指對於人類IL-6受體表現細胞之結合活性之80%以下、通常50%以下，較佳為30%以下，尤佳為15%以下之結合活性。
包含對抗IL-6受體之抗原結合分域之待驗抗原結合分子其對於IL-6受體表現細胞之結合活性之測定方法，例如：Antibodies A Laboratory Manual記載之方法(Ed Harlow,David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)359-420)。亦即，可利用以IL-6受體表現細胞為抗原之ELISA或FACS(fluorescence activated cell sorting)之原理評價。
ELISA格式中，包含對抗IL-6受體之抗原結合分域之待驗抗原結合分子其對於IL-6受體表現細胞之結合活性，可利用比較酵素反應所生成之信號水平而定量評價。亦即，在固定化有IL-6受體表現細胞之ELISA板添加待驗抗原結合分子，利用認識待驗抗原結合分子之酵素標記檢 測結合於抗體細胞之待驗抗原結合分子。或FACS中，製作待驗抗原結合分子之稀釋系列，決定對於IL-6受體表現細胞之抗體結合力價(titer)，藉此可比較待驗抗原結合分子對於IL-6受體表現細胞之結合活性。
待驗抗原結合分子對於在懸浮於緩衝液等之細胞表面上表現之抗原之結合，可利用流式細胞計數器檢測。流式細胞計數器已知例如如下裝置。
FACSCantoTM II
FACSAriaTM
FACSArrayTM
FACSVantageTM SE
FACSCaliburTM(均為BD Biosciences公司的商品名)
EPICS ALTRA HyPerSort
Cytomics FC 500
EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC
Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC(均為Beckman Coulter公司之商品名)
例如：包含對抗IL-6R之抗原結合分域之待驗抗原結合分子其對於抗原之結合活性之理想測定方法，例如以下方法。首先，以認識與表現IL-6R之細胞反應之待驗抗原結合分子的經FITC標定的二次抗體染色。將待驗抗原結合分子以適當理想的緩衝液稀釋，可將該抗原結合分子製成所望濃度。例如可使用10μg/ml至10 ng/ml之間的任一濃度。其次，以FACSCalibur(BD公司)測定螢光強度及細 胞數。抗體對於該細胞之結合量，反映於使用CELL QUEST軟體(BD公司)解析所得之螢光強度，亦即幾何平均值(幾何平均)。亦即，藉由獲得該幾何平均之值，可測定待驗抗原結合分子之結合量所代表之待驗抗原結合分子之結合活性。
包含對抗IL-6R之抗原結合分域之待驗抗原結合分子與某抗原結合分子共有抗原決定基之情事，可藉由兩者對於相同抗原決定基之彼此競爭而確認。抗原結合分子間之彼此競爭，可利用交叉阻斷試驗等檢測。例如彼此競爭ELISA試驗為較佳的交叉阻斷試驗。
具體而言，交叉阻斷試驗中，塗覆在微滴定板之井上的IL-6R蛋白質，於候選的彼此競爭抗原結合分子存在下或非存在下，預備溫育後，添加待驗抗原結合分子。井中之IL-6R蛋白質所結合之待驗抗原結合分子之量，間接相關於成為彼此競爭之候選的彼此競爭抗原結合分子對於相同抗原決定基之結合之結合能力。亦即，彼此競爭抗原結合分子對於相同抗原決定基之親和性愈大，則對於塗覆有待驗抗原結合分子之IL-6R蛋白質之井的結合活性愈低。
經由IL-6R蛋白質而結合於井之待驗抗原結合分子之量，可藉由預先標記抗原結合分子而輕易測定。例如，經生物素標記之抗原結合分子，可藉由抗生物素蛋白過氧化酶接合體及適當基質測定。利用過氧化酶等酵素標記之交叉阻斷試驗，尤其稱為彼此競爭ELISA試驗。抗原結合分子可以用能檢測或測定之其他標記物質予以標記。具體而 言，放射標記或螢光標記等為公知。
比起於不存在候選之彼此競爭抗原結合分子下實施之對照試驗中獲得之結合活性，彼此競爭抗原結合分子若能阻斷包含對抗IL-6R之抗原結合分域之待驗抗原結合分子之結合至少20%，較佳為至少20-50%，更佳為至少50%，則該待驗抗原結合分子係與彼此競爭抗原結合分子實質上結合於相同抗原決定基，或對於相同抗原決定基之結合為彼此競爭之抗原結合分子。
包含對抗IL-6R之抗原結合分域之待驗抗原結合分子所結合之抗原決定基在鑑定構造時，待驗抗原結合分子與對照抗原結合分子共有抗原決定基之情事，可藉由比較兩者之抗原結合分子對於構成該抗原決定基之胜肽導入有胺基酸變異而成之胜肽之結合活性而予以評價。
如此測定結合活性之方法，例如可藉由比較前述ELISA格式中，待驗抗原結合分子及對照抗原結合分子對於導入有變異的線狀胜肽的結合活性而測定。就ELISA以外之方法而言，也可藉由將對於結合於管柱之該變異胜肽的結合活性，以使待驗抗原結合分子與對照抗原結合分子流下該管柱後溶出到溶出液中之抗原結合分子進行定量而測定。使變異胜肽例如與GST之融合胜肽吸附於管柱之方法為公知。
又，當鑑定的抗原決定部位為立體抗原決定部位時，待驗抗原結合分子與對照抗原結合分子共有抗原決定部位之情事，可藉由以下方法評價。首先，製備表現IL-6R之 細胞以及表現對於抗原決定基導入有變異之IL-6R的細胞。對於該等細胞懸浮於PBS等適當緩衝液而成的細胞懸浮液添加待驗IL-6R與對照IL-6R。其次，對於經適當緩衝液洗滌的細胞懸浮液，添加能夠認識待驗IL-6R與對照IL-6R的經FITC標記的抗體。利用FACSCalibur(BD公司)測定標記抗體所染色之細胞之螢光強度及細胞數。將待驗IL-6R與對照IL-6R之濃度以適當緩衝液適當稀釋以製備為所望濃度後使用。例如可使用10μg/ml至10 ng/ml之間的任一濃度。標記抗體對於該細胞之結合量，反映於使用CELL QUEST軟體(BD公司)解析所獲得之螢光強度，亦即幾何平均值。亦即藉由獲得該幾何平均值，可以測定以標記抗體之結合量所代表之待驗抗原結合分子與對照抗原結合分子之結合活性。
本方法中，例如「實質上不結合於變異IL-6R表現細胞」之情事，可藉由以下方法判斷。首先，將已對於表現變異IL-6R之細胞結合之待驗抗原結合分子與對照抗原結合分子以標記抗體染色。接著，檢測細胞之螢光強度。螢光檢測使用FACSCalibur當做流式細胞計數儀時，獲得之螢光強度可以使用CELL QUEST軟體解析。從抗原結合分子存在下及非存在下之幾何平均值，將其比較值(△幾何平均)依下列計算式計算，可以求得抗原結合分子之結合所致之螢光強度之增加比例。
△幾何平均值=幾何平均值(抗原結合分子存在下)/幾何平均值(抗原結合分子非存在下)
將由解析獲得之反映待驗抗原結合分子對於變異IL-6R表現細胞之結合量的幾何平均比較值(變異IL-6R分子△幾何平均值)，與反映待驗抗原結合分子對於IL-6R表現細胞之結合量的△幾何平均值比較值進行比較。於該情形，求取對於變異IL-6R表現細胞及IL-6R表現細胞之△幾何平均比較值時使用之待驗抗原結合分子之濃度調整為彼此相同或實質上為相同濃度尤佳。可利用預先確認認識IL-6R中之抗原決定部位的抗原結合分子當做對照抗原結合分子。
待驗抗原結合分子對於變異IL-6R表現細胞之△幾何平均比較值，若比起待驗抗原結合分子對於IL-6R表現細胞之△幾何平均比較值之至少80%、較佳為50%、更佳為30%、尤佳為15%還小，則判定為「實質上不結合於變異IL-6R表現細胞」。求取幾何平均值(Geometric Mean)之計算式，記載於CELL QUEST Software User’s Guide(BD biosciences公司)。若比較比較值而其實質上可視為相同之程度，則可評價待驗抗原結合分子與對照抗原結合分子之抗原決定部位為相同。
抗原結合分域
本說明書中，「抗原結合分域」只要能結合於目的之抗原則可使用任意構造之分域。如此的分域，例如：抗體之重鏈及輕鏈之可變區、存在於活體內之細胞膜蛋白質Avimer所含之約35個胺基酸之稱為A分域之模組(WO2004/044011、WO2005/040229)、包含於細胞膜表現之 糖蛋白質fibronectin中之蛋白質所結合之域10Fn3分域之Adnectin(WO2002/032925)、以構成由ProteinA之58個胺基酸構成的3個螺旋束(bundle)的IgG結合分域為支架(scaffold)的Affibody(WO1995/001937)、具含33個胺基酸殘基之轉彎(turn)與2個反向並行之螺旋以及迴圈的次單元返覆層疊的構造的ankyrin返覆(ankyrin repeat：AR)之分子表面所露出之區DARPins(Designed Ankyrin Repeat proteins)(WO2002/020565)、將嗜中性球明膠酶結合lipocalin(neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL))等lipocalin分子中高度保守的8個反向並行的股中央方向扭曲成的活塞桶(barrel)構造的單側予以支撐的4個迴圈區Anticalin等(WO2003/029462)、就八目鰻、沼田鰻等無顎類之獲得免疫系統而言不具免疫球蛋白之構造的可變性淋巴球受體(variable lymphocyte receptor(VLR))之富含白胺酸殘基之返覆(leucine-rich-repeat(LRR))模組返覆疊層而獲得之馬蹄形構造之內部之平行型片構造之中空區(WO2008/016854)為佳。本發明之抗原結合分域之較佳例，例如含抗體之重鏈及輕鏈之可變區的抗原結合分域。如此的抗原結合分域，例如「scFv(single chain Fv)」、「單鏈抗體(single chain antibody)」、「Fv」、「scFv2(single chain Fv 2)」、「Fab」或「F(ab’)2」等為較佳。
本發明之抗原結合分子中，抗原結合分域可以結合於相同的抗原決定基。在此，相同之抗原決定部位可存在於 由例如：序列編號：1記載之胺基酸序列構成的蛋白質中。或，本發明之抗原結合分子中，抗原結合分域可以結合於彼此不同的抗原決定部位。在此，不同的抗原決定基，可存在於由例如：序列編號：1記載之胺基酸序列構成的蛋白質中。
專一性
專一性係指專一性結合之其中之一的分子對於其一或多數之結合對象的分子以外之分子未顯示任何顯著結合之狀態。又，抗原結合分域也可用在對於某抗原中所含之多數抗原決定部位當中特定抗原決定部位為專一性的情形。又，抗原結合分域所結合之抗原決定部位包含在多數不同抗原時，具該抗原結合分域之抗原結合分子可以與含該抗原決定部位之各種抗原結合。
抗體
本說明書中，抗體係指天然者或部分或完全合成所製造之免疫球蛋白。抗體可從其天然存在之血漿或血清等天然資源或產生抗體之融合瘤細胞之培養上清單離，或可使用基因重組等方法部分或完全合成。抗體例如免疫球蛋白之構造同型(isotype)及此等構造同型之次類(subclass)為較佳例。人類免疫球蛋白已知有IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgM9種類型(構造同型)。本發明之抗體在該等構造同型之中，可含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。
製作具有所望結合活性之抗體之方法於該技術領域之具有通常知識者為公知。以下列舉製作與IL-6結合之抗體 (抗IL-6R抗體)之方法。與IL-6R以外之抗原結合的抗體也可依據下列例示適當製作。
抗IL-6R抗體可使用公知方法以多株或單株抗體之形式取得。抗IL-6R抗體，宜製作哺乳動物來源的單株抗體。哺乳動物來源的單株抗體，包含由融合瘤產生者，及由以基因工程的方法以含抗體基因之表現載體轉形而得之寄主細胞所產生者等。本發明之單株抗體包括「人類化抗體」或「嵌合抗體」。
單株抗體產生融合瘤，可使用公知技術依例如以下方式製作。亦即，使用IL-6R蛋白質當做感作抗原，依通常之免疫方法將哺乳動物免疫。將獲得之免疫細胞以通常的細胞融合法與公知之親代細胞融合。其次依照通常之篩選法，篩選單株抗體產生細胞，可選擇產生抗IL-6R抗體之融合瘤。
具體而言，單株抗體之製作係依例如以下所示方式實行。首先，藉由表現在序列編號：2揭示其核苷酸序列之IL-6R基因，取得當做抗體取得之感作抗原使用的以序列編號：1表示的IL-6R蛋白質。亦即，藉由將編碼為IL-6R之基因序列插入公知之表現載體，而將適當的寄主細胞轉形。從該寄主細胞中或培養上清中以公知方法精製所望之人類IL-6R蛋白質。為了從培養上清中取得可溶型之IL-6R，例如可使Mullberg等人(J.Immunol.(1994)152(10),4958-4968)記載之序列編號：1表示之IL-6R多胜肽序列當中1至357號之胺基酸構成之蛋白質表現，以代 替表現以序列編號：1表示之IL-6R蛋白質。又，經精製的天然IL-6R蛋白質也同樣可當做感作抗原使用。
對於哺乳動物免疫時使用之感作抗原，可使用該精製IL-6R蛋白質。IL-6R之部分胜肽也可當做感作抗原使用。於此時，該部分胜肽可利用人類IL-6R之胺基酸序列以化學合成取得。又，也可將IL-6R基因之一部分納入表現載體使表現而取得。再者，使用蛋白質分解酵素將IL-6R蛋白質分解也可取得，但是當做部分胜肽使用之IL-6R胜肽之區域及大小不限於特別之態樣。較佳區域可從序列編號：1之胺基酸序列當中相當於20-357號胺基酸之胺基酸序列選擇任意序列。構成當做感作抗原之胜肽的胺基酸的數目至少為5以上，例如6以上或7以上較佳。更具體而言，可將8~50、較佳為10~30個殘基之胜肽當做感作抗原使用。
又，將IL-6R蛋白質之所望之部分多胜肽或胜肽與不同的多胜肽融合成的融合蛋白質可利用為感作抗原。為了製造當做感作抗原使用之融合蛋白質，例如可適當利用抗體之Fc片段或胜肽標籤(tag)等。表現融合蛋白質之載體，可藉由將編碼為所望之二種或更多種多胜肽片段之基因於同一讀框(inframe)融合，並將該融合基因以前述方式插入表現載體而製作。融合蛋白質之製作方法記載於Molecular Cloning 2nd ed.(Sambrook,J et al.,Molecular Cloning 2nd ed.,9.47-9.58(1989)Cold Spring Harbor Lab.press)。可當做感作抗原使用之IL-6R 之取得方法及使用其之免疫方法，在WO2003/000883、WO2004/022754、WO2006/006693等亦有具體記載。
以該感作抗原免疫之哺乳動物不限於特定動物，宜考慮與細胞融合使用之親代細胞之間的適合性選擇。一般的囓齒類動物例如小鼠、大鼠、倉鼠，或兔、猴等較佳。
依公知方法將上述動物以感作抗原免疫。例如就一般方法而言，係藉由將感作抗原對於哺乳動物之腹腔內或皮下注射而投予以實施免疫。具體而言，將以PBS(Phosphate-Buffered Saline)或生理食鹽水等以適當稀釋倍率稀釋過的感作抗原，視所望與通常的佐劑例如佛洛依德完全佐劑混合並乳化後，將該感作抗原對於哺乳動物每4至21日投予數次。又，感作抗原免疫時可以使用適當擔體。尤其使用小分子量之部分胜肽當做感作抗原時，有時以結合有白蛋白、血藍蛋白(keyhole lympet hemocyanin)等擔體蛋白質的該感作抗原胜肽進行免疫為理想。
又，產生所望抗體之融合瘤可使用DNA免疫並依以下方式製作。DNA免疫，係指在免疫動物中投予以能表現編碼為抗原蛋白質之基因的態樣構建之載體DNA的該免疫動物中，藉由感作抗原在該免疫動物之活體內表現，能提供免疫刺激之免疫方法。比起對於免疫動物投予蛋白質抗原之一般免疫方法，DNA免疫可期待如下的優越性。
-可維持如IL-6R之膜蛋白質之構造而提供免疫刺激
-無需精製免疫抗原
為了以DNA免疫獲得本發明之單株抗體，首先將表現 IL-6R蛋白質之DNA對於免疫動物投予。編碼為IL-6R之DNA可利用PCR等公知方法合成。將獲得之DNA插入適當表現載體並對於免疫動物投予。表現載體例如可以理想地利用pcDNA3.1等市售表現載體。將載體對於活體投予之方法，可使用一般使用之方法。例如，可藉由將吸附有表現載體之金粒子以基因槍導入免疫動物個體之細胞內而實施DNA免疫。再者，認識IL-6R之抗體之製作也可使用國際公開WO2003/104453記載之方法製作。
以此方式將哺乳動物免疫，確認血清中與IL-6R結合之抗體力價上升後，從哺乳動物採取免疫細胞以供細胞融合。較佳之免疫細胞尤佳為使用脾細胞。
與前述免疫細胞融合之細胞，可使用哺乳動物之骨髓瘤細胞。骨髓瘤細胞宜具有為了篩選的適當選擇標記。選擇標記，係指能於特定培養條件下生存之(或無法生存)之形質。選擇標記中，次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase)缺損(以下簡稱為HGPRT缺損)、或胸腺嘧啶激酶缺損(以下簡稱為TK缺損)等為公知。具HGPRT或TK缺損之細胞，具有次黃嘌呤-胺基喋呤-胸腺嘧啶感受性(以下簡稱為HAT感受性)。HAT感受性之細胞在HAT選擇培養基中無法合成DNA會死滅，但若與正常細胞融合則會利用正常細胞之補救合成路徑(salvage pathway)繼續合成DNA，故能在HAT選擇培養基中增殖。
HGPRT缺損或TK缺損之細胞，各可以含6硫鳥嘌呤 (thioguanine)、8氮雜鳥嘌呤(以下簡稱為8AG)、或5’溴去氧尿嘧啶之培養基選擇。於DNA中納入該等嘧啶類似物之正常細胞會死滅。另一方面，未納入該等嘧啶類似物之該等酵素缺損之細胞，能在選擇培養基中生存。其他稱為G418耐受性之選擇標記，係利用新黴素耐受性基因提供對於2-去氧鏈黴胺(streptamine)系抗生物質(慶大黴素(gentamycin類似體)之耐受性。對細胞融合為理想的各種骨髓瘤細胞為公知。
如此的骨髓瘤細胞例如可理想地使用P3(P3x63Ag8.653)(J.Immunol.(1979)123(4),1548-1550)、P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81,1-7)、NS-1(C.Eur.J.Immunol.(1976)6(7),511-519)、MPC-11(Cell(1976)8(3),405-415)、SP2/0(Nature(1978)276(5685),269-270)、FO(J.Immunol.Methods(1980)35(1-2),1-21)、S194/5.XX0.BU.1(J.Exp.Med.(1978)148(1),313-323)、R210(Nature(1979)277(5692),131-133)等。
基本上可依照公知方法例如Keller與Milstein等人的方法(Methods Enzymol.(1981)73,3-46)等，實施前述免疫細胞與骨髓瘤細胞之細胞融合。
更具體而言，可於例如細胞融合促進劑存在下於通常的營養培養液中實施前述細胞融合。融合促進劑可使用例如聚乙二醇(PEG)、仙台病毒(HVJ)等，為更提高融合效率，可視所望添加使用二甲基亞碸等輔助劑。
免疫細胞與骨髓瘤細胞之使用比例可任意設定。例如相對於骨髓瘤細胞將免疫細胞定為1至10倍較佳。前述細胞融合使用之培養液，例如適於前述骨髓瘤細胞株增殖之RPMI1640培養液、MEM培養液、此外，可使用該種細胞培養使用之通常之培養液，再者，可理想地添加胎牛血清(FCS)等血清補液。
細胞融合係將前述免疫細胞與骨髓瘤細胞以既定量於前述培養液中充分混合，並且將預先加溫至約37℃之PEG溶液(例如平均分子量1000至6000左右)以通常30至60%(w/v)之濃度添加。藉由將混合液緩慢混合，會形成所望之融合細胞(融合瘤)。接著，逐次添加上述列舉之適當培養液，反複實施離心並去除上清之操作，可將對於融合瘤之生長不利的細胞融合劑等除去。
以如此方式獲得之融合瘤，可藉由於通常之選擇培養液，例如HAT培養液(含次黃嘌呤、胺基喋呤、胸腺嘧啶之培養液)培養而選擇。為了使所望之融合瘤以外之細胞(非融合細胞)死滅，可使繼續進行使用上述HAT培養液之培養足夠時間(通常該足夠時間為數日至數週)。其次，以通常之極限稀釋法，實施產生所望抗體之融合瘤之篩選及單一選殖。
以如此方式獲得之融合瘤，可利用因應細胞融合使用之骨髓瘤具有之選擇標記的選擇培養液而選擇。例如具HGPRT或TK缺損之細胞，可藉由以HAT培養液(含次黃嘌呤、胺基喋呤及胸腺嘧啶之培養液)培養而選擇。亦即，當 使用HAT感受性骨髓瘤細胞於細胞融合時，可在HAT培養液中將成功與正常細胞細胞融合的細胞選擇性增殖。為了使所望融合瘤以外之細胞(非融合細胞)死滅，可以繼續使用上述HAT培養液之培養足夠時間。具體而言，一般可藉由數日至數週的培養而選擇所望之融合瘤。其次可利用通常之極限稀釋法，實施產生所望之抗體的融合瘤的篩選及單一選殖。
所望之抗體之篩選及單一選殖，可依照基於公知抗原抗體反應之篩選方法而理想地實施。例如，結合於IL-6受體之單株抗體可以結合於在細胞表面表現的IL-6受體。如此的單株抗體例如可藉由FACS(fluorescence activated cell sorting)篩選。FACS係將與螢光抗體接觸之細胞以雷射光解析，並測定各個細胞發出之螢光，而可測定抗體對於細胞表面之結合的系統。
為了利用FACS篩選產生本發明之單株抗體的融合瘤，首先要製備表現IL-6受體之細胞。用於篩選之較佳細胞為使IL-6受體強制表現之哺乳動物細胞。藉由以當做寄主細胞之未經轉形之哺乳動物細胞為對照，可以選擇性檢測抗體對於細胞表面之IL-6受體的結合活性。亦即，藉由選擇產生未結合於寄主細胞而結合於IL-6受體強制表現細胞的抗體的融合瘤，可以取得產生IL-6受體單株抗體之融合瘤。
或抗體對於經固定化之IL-6受體表現細胞的結合活性可依據ELISA之原理評價。例如，將IL-6受體表現細胞 固定化在ELISA平板的井。使融合瘤之培養上清接觸井內之固定化細胞，以檢測結合於固定化細胞的抗體。單株抗體為小鼠來源時，與細胞結合之抗體可利用抗小鼠免疫球蛋白抗體檢測。該等篩選所選擇之產生具有對於抗原之結合能力的所望抗體的融合瘤，可利用極限稀釋法等選殖。
以此方式製作之產生單株抗體之融合瘤可在通常之培養液中繼代培養。而且，該融合瘤可於液態氮中長期保存。
將該融合瘤依照通常方法培養，可從其培養上清取得所望之單株抗體。或可將融合瘤對於與其具適合性之哺乳動物投予使增殖，並從其腹水獲取單株抗體。前者之方法對於獲得高純度抗體為適當。
從該融合瘤等抗體產生細胞選殖的抗體基因所編碼之抗體也可適當利用。藉由將經選殖的抗體基因納入適當載體並導入寄主，可以表現該基因所編碼的抗體。抗體基因之單離與對於載體之導入、及用於將寄主細胞轉形之方法，例如已由Vandamme等人確立(Eur.J.Biochem.(1990)192(3),767-775)。下列所述重組抗體之製造方法亦為公知。
例如，可從產生抗GPC3抗體之融合瘤細胞取得編碼為抗IL-6受體抗體之可變區(V區)之cDNA。為此，通常首先從融合瘤萃取全體RNA。用於從細胞萃取mRNA之方法，例如可利用如下方法。
-胍(guanidine)超離心法(Biochemistry(1979)18(24),5294-5299)
-AGPC法(Anal.Biochem.(1987)162(1),156-159)
萃取到的mRNA可使用mRNA Purification Kit(GE Health care bioscience製)等精製。或如QuickPrep mRNA Purification Kit(GE Health care bioscience製)等，也有用於從細胞直接萃取全體mRNA之市售套組。使用如此的套組，可從融合瘤取得mRNA。從獲得之mRNA使用反轉錄酵素可合成編碼為抗體V區之cDNA。cDNA可利用AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit(生化學工業社製)等合成。又，為了cDNA之合成及放大，可適當利用SMART RACE cDNA放大套組(Clontech製)及使用PCR之5’-RACE法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85(23),8998-9002、Nucleic Acids Res.(1989)17(8),2919-2932)。又，在如此的cDNA合成之過程中，可在cDNA的兩末端導入後述適當的限制酶部位。
從獲得之PCR產物精製目的之cDNA片段，其次與載體DNA連結。以如此方式製作重組載體，並導入大腸菌等，選擇群落(colony)後，從形成有該群落之大腸菌製備所望之重組載體。並且針對該重組載體是否具有目的cDNA之鹼基序列，可使用公知之方法例如二去氧核苷酸鏈終結法等確認。
為了取得編碼為可變區之基因，利用使用可變區基因放大用引子之5’-RACE法係屬簡便。首先，以從融合瘤細胞萃取之RNA當做模板，合成cDNA，獲得5’-RACE cDNA庫。5’-RACE cDNA庫之合成可適當使用SMART RACE cDNA 放大套組等市售套組。
以獲得之5’-RACE cDNA庫為模板，以PCR法將抗體基因放大。依據公知之抗體基因序列可設計小鼠抗體基因放大用之引子。此等引子為依免疫球蛋白之次類而各不相同的鹼基序列。因此，次類理想為預先使用Iso Strip小鼠單株抗體同種型決定套組(Roche diagnostics)等市售套組決定。
具體而言，當目的為取得例如編碼為小鼠IgG之基因時，可利用能將編碼為當做重鏈之γ 1、γ 2a、γ 2b、γ 3、當做輕鏈之κ鏈與λ鏈的基因放大的引子。為了放大IgG之可變區基因，一般係利用於3’側之引子黏合有相當於接近可變區之固定區之部分的引子。另一方面，5’側之引子係利用5’ RACE cDNA庫製作套組所附帶的引子。
利用如此放大之PCR產物，可再構成由重鏈與輕鏈之組合而成的免疫球蛋白。以再構成之免疫球蛋白對於IL-6受體之結合活性當做指標，可以篩選所望之抗體。例如目的為取得對抗IL-6受體之抗體時，抗體對於IL-6受體之結合，更佳為專一性的。與IL-6受體結合之抗體可藉由例如以下方式篩選；(1)使從融合瘤獲得之含有由cDNA編碼之V區的抗體接觸IL-6受體表現細胞之步驟、(2)檢測IL-6受體表現細胞與抗體之間的結合之步驟、及(3)選擇與IL-6受體表現細胞結合之抗體之步驟。
檢測抗體與IL-6受體表現細胞之間的結合的方法為公知。具體而言，可利用先前所述FACS等方法，檢測抗體與IL-6受體表現細胞間之結合。為了評價抗體之結合活性，可適當利用IL-6受體表現細胞之固定標本。
以結合活性為指標之抗體之篩選方法，亦宜使用利用噬菌體載體之淘選法。從多株抗體表現細胞群，以重鏈與輕鏈之次類之庫的形式取得抗體基因時，利用噬菌體載體之篩選方法係屬有利。編碼為重鏈與輕鏈之可變區之基因，可藉由以適當連結子序列連結，而形成單鏈Fv(scFv)。藉由將編碼為scFv之基因插入噬菌體載體，可取得於表面表現scFv之噬菌體。該噬菌體與所望抗原接觸後，藉由回收與抗原結合之噬菌體，可以回收編碼為具目的結合活性之scFv的DNA。該操作可視需要反複實施，而將具所望之結合活性之scFv濃縮。
獲得編碼為目的抗IL-6受體抗體之V區的cDNA後，將該cDNA以認識插入於該cDNA之兩末端的限制酶部位之限制酶消化者。較佳之限制酶，係認識構成抗體基因之鹼基序列中出現頻度低之鹼基序列並消化。再者，為了將1副本的消化片段以正確方向插入載體，宜插入提供附著末端之限制酶。藉由將以上述方式經消化之編碼為抗IL-6受體抗體之V區的cDNA插入適當表現載體，可以取得抗體表現載體。此時，若將編碼為抗體固定區(C區)之基因、與編碼為前述V區之基因於框架內融合，則可取得嵌合抗體。在此，嵌合抗體係指固定區與可變區之來源不同者。 因此，除了小鼠-人類等的異種嵌合抗體，人類-人類同種嵌合抗體也包含在本發明之嵌合抗體。藉由預先在具固定區之表現載體插入前述V區基因，可以構建嵌合抗體表現載體。具體而言，可於例如保持有編碼為所望之抗體固定區(C區)之DNA的表現載體之5’側，適當配置消化前述V區基因之限制酶之限制酶認識序列。藉由將以相同組合之限制酶消化過的兩者於框架內融合，可以構建嵌合抗體表現載體。
為了製造抗IL-6受體單株抗體，可以將抗體基因於由表現控制區控制之下表現的方式納入表現載體。用於表現抗體之表現控制區，包含例如增強子或啟動子。又，也可在胺基末端附加適當的信號序列，以使表現的抗體分泌到細胞外。後面記載之實施例係使用具胺基酸序列MGWSCIILFLVATATGVHS(序列編號：3)之胜肽當做信號序列，但是也可附加其他適當的信號序列。將表現的多胜肽在上述序列之羧基末端部分切斷，切斷的多胜肽可以成熟多胜肽之形式分泌到細胞外。其次，藉由以該表現載體將適當的寄主細胞轉形，可以取得表現編碼為抗IL-6受體抗體之DNA的重組細胞。
為了表現抗體基因，可將編碼為抗體重鏈(H鏈)及輕鏈(L鏈)之DNA納入分別的表現載體。藉由納入有H鏈與L鏈之載體，對於相同寄主細胞同時轉形(co-transfect)，可以表現具備H鏈與L鏈之抗體分子。或可將編碼為H鏈及L鏈之DNA納入單一的表現載體，而將寄主細胞轉形(參 照國際公開WO 94/11523)。
用以藉由將經單離之抗體基因導入適當寄主而製作抗體之寄主細胞與表現載體的多數組合為公知。該等表現系均可應用於單離本發明之抗原結合分域。真核細胞當做寄主細胞時，可適當使用動物細胞、植物細胞、或真菌細胞。具體而言，動物細胞例如以下細胞。
(1)哺乳類細胞、：CHO、COS、骨髓瘤、BHK(baby hamster kidney)、Hela、Vero、HEK(human embryonic kidney)293等
(2)兩生類細胞：非洲爪蟾卵母細胞等
(3)昆蟲細胞：sf9、sf21、Tn5等
或植物細胞以煙草(Nicotiana tabacum)等煙草(Nicotiana)屬來源之細胞而得之抗體基因表現系為公知。植物細胞之轉形可以適當利用癒傷組織培養之細胞。
又，真菌細胞可以利用如下的細胞。
酵母：啤酒酵母(Saccharomyces serevisiae)等糖化酵母(Saccharomyces)屬、甲醇同化酵母(Pichia pastoris)等Pichia屬
絲狀菌：黑麴黴(Aspergillus niger)等麴菌(Aspergillus)屬
又，利用原核細胞之抗體基因之表現系亦為公知。例如使用細菌細胞時，可以適當利用大腸菌(E.coli)、枯草菌等細菌細胞。於該等細胞中，以轉形導入含有目的抗體基因之表現載體。藉由將經轉形之細胞於體外培養，可從 該轉形細胞之培養物獲取所望之抗體。
重組抗體之產生，除了上述寄主細胞，尚可利用基因轉殖動物。亦即，從導入有編碼為所望抗體之基因的動物，可獲取該抗體。例如，抗體基因藉由於框架內插入編碼為乳汁中固有產生之蛋白質的基因內部，可以構建融合基因。乳汁中分泌之蛋白質，例如可利用山羊β酪蛋白等。將含有插入有抗體基因之融合基因的DNA片段注入山羊胚，並將該經注入之胚胎導入雌山羊體內。從接受胚胎的山羊產生之基因轉殖山羊(或其子孫)所產之乳汁，可以取得所望之抗體與乳汁蛋白質之融合蛋白質。又，為了增加從基因轉殖山羊產生之含所望之抗體之乳汁量，可對於基因轉殖山羊投予荷爾蒙(Bio/Technology(1994),12(7),699-702)。
本說明書記載之抗原結合分子對於人類投予時，該分子中之抗原結合分域，可適當採用以降低對於人類之異種抗原性等為目的經人為改變過的基因重組型抗體來源的抗原結合分域。基因重組型抗體例如包含人類化(Humanized)抗體等。該等改變抗體可使用公知方法適當製造。
本說明書記載之用於製作抗原結合分子中的抗原結合分域所使用之抗體之可變區，通常由插入在4個框架區(FR)的3個互補性決定區(complementarity-determining region；CDR)構成。CDR係實質上決定抗體之結合專一性之區域。CDR之胺基酸序列富有多樣性。另一方面，構成FR之胺基酸序列，即使在具有不同之結合專一性的抗體之 間也常會顯示高度同一性。所以，一般可利用CDR之移植而將某抗體之結合專一性移植到其他抗體。
人類化抗體也稱為再構成(reshaped)人類抗體。具體而言，將人類以外之動物例如小鼠抗體之CDR移植到人類抗體而成之人類化抗體等為公知。為了獲得人類化抗體之一般基因重組方法亦為已知。具體而言，就將小鼠抗體之CDR移植到人類FR的方法而言，例如Overlap Extension PCR為公知。於Overlap Extension PCR，係對於用於合成人類抗體FR之引子中，附加編碼為待移植之小鼠抗體之CDR的鹼基序列。引子係針對4個FR各別準備。一般將小鼠CDR移植到人類FR時，選擇與小鼠之FR具高同一性之人類FR時，對於維持CDR機能為有利。亦即，一般較佳為利用與相鄰於待移植之小鼠CDR的FR之胺基酸序列為高同一性之胺基酸序列構成之人類FR。
又，連結之鹼基序列可設計為彼此於框架內連接。藉由各引子，可個別合成人類FR。其結果，可獲得於各FR附加有編碼為小鼠CDR之DNA的產物。各產物之編碼為小鼠CDR之鹼基序列，可設計成彼此重疊。接著，使以人類抗體基因為模板而合成之產物之重疊的CDR部分彼此黏合，進行互補鏈合成反應。利用該反應，人類FR經由小鼠CDR之序列而連結。
最後，將連結有3個CDR與4個FR之V區基因，利用黏合在其5’末端與3’末端並附加有適當之限制酶認識序列的引子，將其全長放大。藉由將以上述方式獲得之DNA 與編碼為人類抗體C區之DNA以於框架內融合之方式插入於表現載體中，藉此可製作人類型抗體表現用載體。將該重組載體導入寄主並樹立重組細胞後，培養該重組細胞，使編碼為該人類化抗體之DNA表現，藉此使該培養細胞之培養物中產生該人類化抗體(參照歐洲專利公開EP 239400、國際公開WO1996/002576)。
以定性或定量測定以上述方式製作之人類化抗體對於抗原之結合活性並進行評價，可以理想地選擇當經由CDR連結時該CDR會形成良好之抗原結合部位的人類抗體之FR。視需要，可以將FR之胺基酸殘基取代，使再構成人類抗體之CDR能形成適當的抗原結合部位。例如，應用將小鼠CDR移植到人類FR時使用之PCR法，可對於FR導入胺基酸序列之變異。具體而言，可對於與FR黏合之引子導入部分的鹼基序列的變異。以如此的引子合成之FR，導入有鹼基序列之變異。以上述方法測定並評價將胺基酸取代過的變異型抗體對於抗原之結合活性，可以選擇具所望性質之變異FR序列(Cancer Res,1993,53,851-856)。
又，可以將具有人類抗體基因所有曲目的基因轉殖動物(參照國際公開WO1993/012227、WO1992/003918、WO1994/002602、WO1994/025585、WO1996/034096、WO1996/033735)當做免疫動物，以DNA免疫取得所望之人類抗體。
再者，使用人類抗體庫以淘選取得人類抗體之技術亦為已知。例如，將人類抗體之V區以單鏈抗體(scFv)之形 式，以噬菌體呈現法使表現在噬菌體之表面。可以選擇表現與抗原結合之scFv的噬菌體。藉由解析選擇之噬菌體之基因，可以決定編碼為與抗原結合之人類抗體之V區的DNA序列。決定與抗原結合之scFv之DNA序列後，將該V區序列與所望之人類抗體C區之序列於框架內融合後插入適當表現載體，可以製作表現載體。將該表現載體導入上述列舉之適當表現細胞中，並使編碼為該人類抗體之基因表現，可取得該人類抗體。該等方法已為公知(參照國際公開WO1992/001047、WO1992/020791、WO1993/006213、WO1993/011236、WO1993/019172、WO1995/001438、WO1995/015388)。
用於取得抗體基因之方法，可適當使用Bernasconi等人(Science(2002)298,2199-2202)或WO2008/081008記載之B細胞選殖(各抗體之編碼序列之鑑定及選殖、其單離、及各抗體(尤其IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)之製作用之表現載體構建之用途等)之方法，除上述以外也可適當使用。
EU編號及Kabat編號
依本發明使用之方法，分配抗體之CDR與FR之胺基酸位置，係依Kabat規定(Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute of Health,Bethesda,Md.,1987年及1991年)。本說明書中，抗原結合分子為抗體或抗原結合片段的情形，可變區之胺基酸依Kabat編號、不變區之胺基酸依Kabat之胺基酸位置為 準的EU編號表示。
離子濃度之條件 金屬離子濃度之條件
本發明之一非限定態樣中。離子濃度係指金屬離子濃度。「金屬離子」係指氫以外的鹼金屬及銅族等之第I族、鹼土類金屬及鋅族等之第II族、硼以外的第III族、碳與矽以外的第IV族、鐵族及鉑族等第VIII族、V、VI及VII族之各A亞族所屬之元素、及銻、鉍、釙等金屬元素之離子。金屬原子具有釋出原子價電子而成為陽離子之性質，該等稱為游離化傾向。離子化傾向大的金屬，富有化學活性。
本發明理想的金屬離子，例如鈣離子。鈣離子涉及許多生命現象的調節，涉及骨骼肌、平滑肌及心肌等肌肉的收縮、白血球的運動及吞噬等的活化、血小板的變形及分泌等之活化、淋巴球之活化、組織胺之分泌等的肥胖細胞的活化、經由兒茶酚胺α受體或乙醯膽鹼受體之細胞之回應、胞吐作用、由神經原末端釋出傳遞物質、神經原之軸策流等。細胞內之鈣離子受體，已知有具多個鈣離子結合部位，且據認為在分子進化上來自共通起源之TroponinC、Calmodulin、parvalbumin、肌球蛋白輕鏈等，其結合模體(motif)已有多數已知。例如，Cadherin分域、Calmodulin所含之EF手、Protein kinase C所含之C2分域、血液凝固蛋白質FactorIX所含之G1a分域、脫唾液酸糖蛋白(asialoglvcoprotein)受體或甘露糖結合受體所含之C型 lectin、LDL受體所含之A分域、annexin、thrombospondin 3型分域及EGF狀分域為人所熟知。
本發明中，金屬離子為鈣離子之情形，鈣離子濃度之條件可列舉低鈣離子濃度之條件與高鈣離子濃度之條件。依據鈣離子濃度之條件而使結合活性改變，係指由於低鈣離子濃度與高鈣離子濃度之條件之不同而使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變。例如，比起在低鈣離子濃度之條件下之抗原結合分子對於抗原之結合活性，在高鈣離子濃度之條件下之抗原結合分子對於抗原之結合活性較高之情形。又，例如比起在高鈣離子濃度之條件下之抗原結合分子對於抗原之結合活性，在低鈣離子濃度之條件下之抗原結合分子對於抗原之結合活性較高之情形。
本說明書中，高鈣離子濃度並非特別限於單值的數值，較佳可為從100μM至10 mM之間選擇之濃度。又，另一態樣中，可為從200μM至5 mM之間選擇之濃度。又，於不同態樣，可為從500μM至2.5 mM之間選擇之濃度，另一態樣中，可為從200μM至2 mM之間選擇之濃度。又，也可為從400μM至1.5 mM之間選擇之濃度。尤其，接近在活體內之血漿中(血中)之鈣離子濃度的從500μM至2.5 mM之間選擇之濃度為理想。
本說明書中，低鈣離子濃度並非特別限於單值的數值，較佳為可從0.1μM至30μM之間選擇之濃度。又，另一態樣中，可為從0.2μM至20μM之間選擇之濃度。又，於不同態樣中，也可為從0.5μM至10μM之間選擇之濃 度，於另一態樣中，也可為從1μM至5μM之間選擇之濃度。再者，也可為從2μM至4μM之間選擇之濃度。尤其，宜為接近活體內之早期內體內之游離鈣濃度之從1μM至5μM之間選擇之濃度。
本發明中，在低鈣離子濃度之條件對於抗原之結合活性比起在高鈣離子濃度之條件對於抗原之結合活性低，係指抗原結合分子在從0.1μM至30μM之間選擇之鈣離子濃度對於抗原之結合活性，弱於在從100μM至10 mM之間選擇之鈣離子濃度對於抗原之結合活性。較佳為，抗原結合分子在從0.5μM至10μM之間選擇之鈣離子濃度對於抗原之結合活性，弱於在從200μM至5 mM之間選擇之鈣離子濃度對於抗原之結合活性，尤佳為在活體內之早期內體內的鈣離子濃度之抗原結合活性比起在活體內之血漿中之鈣離子濃度之抗原結合活性弱，具體而言，抗原結合分子在從1μM至5μM之間選擇之鈣離子濃度對於抗原之結合活性，弱於在從500μM至2.5 mM之間選擇之鈣離子濃度對於抗原之結合活性。
依金屬離子濃度之條件，抗原結合分子對於抗原之結合活性是否會變化，例如可依在前述結合活性之項目記載之公知測定方法而決定。例如，為了確認比起在低鈣離子濃度之條件下抗原結合分子對於抗原之結合活性，在高鈣離子濃度之條件下抗原結合分子對於抗原之結合活性變化為較高，係比較在低鈣離子濃度及高鈣離子濃度之條件下之抗原結合分子對於抗原之結合活性。
又，本發明中，「在低鈣離子濃度之條件對於抗原之結合活性低於在高鈣離子濃度之條件對於抗原之結合活性」之表現方式，也可表達為抗原結合分子在高鈣離子濃度條件下對於抗原之結合活性高於在低鈣離子濃度條件下對於抗原之結合活性。又，本發明中，有時將「在低鈣離子濃度之條件對於抗原之結合活性低於在高鈣離子濃度之條件對於抗原之結合活性」記載為「在低鈣離子濃度條件下之抗原結合能力弱於在高鈣離子濃度條件下對於抗原之結合能力」，又，有時將「使在低鈣離子濃度之條件下抗原結合活性低於在高鈣離子濃度之條件對於抗原之結合活性」，記載為「使在低鈣離子濃度條件下之抗原結合能力弱於在高鈣離子濃度條件下對於抗原之結合能力」。
測定對於抗原之結合活性時，鈣離子濃度以外之條件可由該技術領域中具有通常知識者適當選擇，不特別限定。例如可於HEPES緩衝液、37℃的條件測定。例如可使用Biacore(GE Healthcare)等測定。抗原結合分子與抗原之結合活性之測定，於抗原為可溶型抗原之情形，可藉由以抗原作為分析物流過固定有抗原結合分子之晶片以評價對於可溶型抗原之結合活性，當抗原為膜型抗原時，可藉由以抗原結合分子作為分析物，使流過固定有抗原之晶片以評價對於膜型抗原之結合活性。
本發明之抗原結合分子中，只要在低鈣離子濃度之條件對於抗原之結合活性弱於在高鈣離子濃度之條件對於抗原之結合活性即可，在低鈣離子濃度條件下對於抗原之結 合活性與在高鈣離子濃度條件下對於抗原之結合活性之比不特別限定，但較佳對於抗原，在低鈣離子濃度之條件之KD(Dissociation constant：解離常數)與在高鈣離子濃度之條件之KD之比，即KD(Ca 3μM)/KD(Ca 2 mM)之值為2以上，較佳為KD(Ca 3μM)/KD(Ca 2 mM)之值為10以上，又更佳為KD(Ca 3μM)/KD(Ca 2 mM)之值為40以上。KD(Ca 3μM)/KD(Ca 2 mM)之值之上限不特別限定，只要該技術領域中具有通常知識者之技術可製作即可，可為400、1000、10000等各種值。又，KD(Ca3μM)/KD(Ca 1.2 mM)之值也能指定。亦即，KD(Ca 3μM)/KD(Ca 1.2 mM)之值為2以上，更佳為KD(Ca 3μM)/KD(Ca 1.2 mM)之值為10以上，又更佳為KD(Ca 3μM)/KD(Ca 1.2 mM)之值為40以上。KD(Ca 3μM)/KD(Ca 1.2 mM)之值之上限不特別限定，只要在該技術領域中具有通常知識者之技術可製作即可，可為400、1000、10000等各種值。
對於抗原之結合活性之值，於抗原為可溶型抗原之情形，可使用KD(解離常數)，於抗原為膜型抗原之情形，可使用視KD(Apparent dissociation constant：視解離常數)。KD(解離常數)、及視KD(視解離常數)可依該技術領域中具有通常知識者公知之方法測定，例如可使用Biacore(GE healthcare)、scatchard plot、流式細胞計數器等。
又，代表本發明之抗原結合分子在低鈣濃度之條件對於抗原之結合活性與在高鈣濃度之條件對於抗原之結合活 性之比之其他指標，例如也可理想地使用解離速度常數kd(Dissociation rate constant：解離速度常數)。代表結合活性之比之指標，使用kd(解離速度常數)代替KD(解離常數)時，對於抗原在低鈣濃度之條件之kd(解離速度常數)與在高鈣濃度之條件之kd(解離速度常數)之比，即kd(低鈣濃度之條件)/kd(高鈣濃度之條件)之值，較佳為2以上，更佳為5以上，又更佳為10以上，再更佳為30以上。Kd(低鈣濃度之條件)/kd(高鈣濃度之條件)之值之上限不特別限定，只要該技術領域中具有通常知識者之技術常識可製作即可，可為50、100、200等各種值。
抗原結合活性之值，於抗原為可溶型抗原之情形，可使用kd(解離速度常數)，於抗原為膜型抗原之情形，可使用視kd(Apparent dissociation rate constant：視解離速度常數)。kd(解離速度常數)、及視kd(視解離速度常數)，可使用該技術領域中具有通常知識者公知之方法測定，例如可使用Biacore(GE healthcare)、流式細胞計數器等。又，本發明中，當測定不同鈣離子濃度時抗原結合分子對於抗原之結合活性時，宜將鈣濃度以外之條件設為相同。
例如本發明提供之一個態樣，即在低鈣離子濃度之條件對於抗原之結合活性低於在高鈣離子濃度之條件對於抗原之結合活性之抗原結合分域或抗體，可依包含以下步驟(a)~(c)之抗原結合分域或抗體之篩選取得。
(a)獲得在低鈣濃度之條件下抗原結合分域或抗體之 抗原結合活性；(b)獲得在高鈣濃度之條件下抗原結合分域或抗體之抗原結合活性；及(c)選擇在低鈣濃度之條件下抗原結合活性低於在高鈣濃度之條件下抗原結合活性之抗原結合分域或抗體。
又，本發明提供之一個態樣，即在低鈣離子濃度之條件對於抗原之結合活性低於在高鈣離子濃度之條件對於抗原之結合活性之抗原結合分域或抗體，可依包含以下步驟(a)~(c)之抗原結合分域或抗體或此等庫之篩選而取得。
(a)在高鈣濃度之條件使抗原結合分域或抗體或此等之庫接觸抗原；(b)將於前述步驟(a)與抗原結合之抗原結合分域或抗體放置在低鈣濃度條件下；及(c)將在前述步驟(b)解離之抗原結合分域或抗體單離。
又，本發明提供之一個態樣，即在低鈣離子濃度之條件對於抗原之結合活性低於在高鈣離子濃度之條件對於抗原之結合活性之抗原結合分域或抗體，可依包含以下步驟(a)~(d)之抗原結合分域或抗體或此等之庫之篩選取得。
(a)於低鈣濃度條件下使抗原結合分域或抗體之庫接觸抗原；(b)選擇在前述步驟(a)未與抗原結合之抗原結合分域或抗體；(c)使於前述步驟(b)選擇之抗原結合分域或抗體於高 鈣濃度條件下與抗原結合；及(d)將在前述步驟(c)與抗原結合之抗原結合分域或抗體單離。
再者，本發明提供之一個態樣，即在低鈣離子濃度之條件對於抗原之結合活性低於在高鈣離子濃度之條件對於抗原之結合活性之抗原結合分域或抗體，可依包含以下步驟(a)~(c)之篩選方法取得。
(a)在高鈣濃度條件下使抗原結合分域或抗體之庫接觸固定有抗原之管柱；(b)將在前述步驟(a)與管柱結合之抗原結合分域或抗體於低鈣濃度條件下從管柱溶出；及(c)將在前述步驟(b)溶出之抗原結合分域或抗體單離。
又，本發明提供之一個態樣，即在低鈣離子濃度之條件對於抗原之結合活性低於在高鈣離子濃度之條件對於抗原之結合活性之抗原結合分域或抗體，可依包含以下步驟(a)~(d)之篩選方法取得。
(a)於低鈣濃度條件下使抗原結合分域或抗體之庫通過固定有抗原之管柱；(b)回收在前述步驟(a)未與管柱結合而溶出之抗原結合分域或抗體；(c)使於前述步驟(b)回收之抗原結合分域或抗體於高鈣濃度條件下與抗原結合；及(d)將在前述步驟(c)與抗原結合之抗原結合分域或抗 體單離。
又，本發明提供之一個態樣，即在低鈣離子濃度之條件對於抗原之結合活性低於在高鈣離子濃度之條件對於抗原之結合活性之抗原結合分域或抗體，可依包含以下步驟(a)~(d)之篩選方法取得。
(a)在高鈣濃度條件下使抗原結合分域或抗體之庫接觸抗原；(b)取得在前述步驟(a)與抗原結合之抗原結合分域或抗體；(c)將於前述步驟(b)取得之抗原結合分域或抗體放置在低鈣濃度條件下；及(d)將在前述步驟(c)之抗原結合活性弱於在前述步驟(b)選擇之基準之抗原結合分域或抗體單離。
又，前述步驟也可重複2次以上。因此，依本發明，可提供利用上述篩選方法中，更包含重複(a)~(c)或(a)~(d)之步驟2次以上之篩選方法取得之在低鈣離子濃度之條件對於抗原之結合活性低於在高鈣離子濃度之條件對於抗原之結合活性之抗原結合分域或抗體。(a)~(c)或(a)~(d)之步驟重複的次數不特別限定，通常為10次以內。
本發明之篩選方法中，低鈣濃度條件下之抗原結合分域或抗體之抗原結合活性，只要是游離鈣濃度為0.1μM~30μM之間之抗原結合活性即不特別限定，理想之游離鈣濃度例如0.5μM~10μM之間之抗原結合活性。更佳的游離鈣濃度，例如活體內之早期內體內之游離鈣濃度，具體 而言，例如1μM~5μM之抗原結合活性。又，於高鈣濃度條件下之抗原結合分域或抗體之抗原結合活性，只要是游離鈣濃度為100μM~10 mM之間之抗原結合活性即不特別限定，理想之游離鈣濃度為例如200μM~5 mM之間之抗原結合活性。更佳的游離鈣濃度，可舉在活體內之血漿中之游離鈣濃度，具體而言可舉於0.5 mM~2.5 mM之抗原結合活性。
抗原結合分域或抗體之抗原結合活性，可利用該技術領域中具有通常知識者公知之方法測定，針對游離鈣濃度以外之條件可由該技術領域中具有通常知識者適當決定。抗原結合分域或抗體之抗原結合活性，可就KD(Dissociation constant：解離常數)、視KD(Apparent dissociation constant：視解離常數)、解離速度kd(Dissociation rate：解離速度常數)、或視kd(Apparent dissociation：視解離速度常數)等評價。此等可利用該技術領域中具有通常知識者公知之方法測定，例如可使用Biacore(GE healthcare)、Scatchard作圖法、FACS等。
本發明中，選擇在高鈣濃度條件下之抗原結合活性高於在低鈣濃度條件下之抗原結合活性之抗原結合分域或抗體之步驟，係與選擇在低鈣濃度條件下之抗原結合活性低於在高鈣濃度條件下之抗原結合活性的抗原結合分域或抗體之步驟含意相同。
只要在高鈣濃度條件下之抗原結合活性高於在低鈣濃度條件下之抗原結合活性即可，在高鈣濃度條件下之抗原 結合活性與在低鈣濃度條件下之抗原結合活性之差不特別限定，較佳為在高鈣濃度條件下之抗原結合活性為在低鈣濃度條件下之抗原結合活性之2倍以上，更佳為10倍以上，又更佳為40倍以上。
依前述篩選方法篩選之本發明之抗原結合分域或抗體可為各種抗原結合分域或抗體，例如可選擇上述抗原結合分域或抗體。例如可篩選具有天然序列之抗原結合分域或抗體，也可篩選胺基酸序列經取代之抗原結合分域或抗體。
庫
依某一態樣，本發明之抗原結合分域或抗體，可由依據離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之至少一個胺基酸殘基係含於抗原結合分域之彼此序列互異之多數抗原結合分子為主而得之庫取得。離子濃度之例，可理想地列舉金屬離子濃度或氫離子濃度。
本說明書中，「庫」係指包含多數抗原結合分子或抗原結合分子之多數融合多胜肽、或編碼為該等序列之核酸、聚核苷酸。庫中所含之多數抗原結合分子或含有抗原結合分子之多數融合多胜肽之序列，並非單一序列，而是序列彼此互異之抗原結合分子或含有抗原結合分子之融合多胜肽。
本說明書中，序列彼此互異之多數抗原結合分子的記載中，用語「序列彼此互異」，係指庫中之各個抗原結合分子的序列彼此相異。亦即庫中彼此相異之序列之數目，反映出庫中之序列不同之獨立選殖體之數目，有時也稱為 「庫大小」。通常的噬菌體表現庫為106至1012，可使用核糖體表現法(ribosome display)等公知技術，將庫大小擴大到1014。但，噬菌體庫之淘選選擇時使用之噬菌體粒子實際數目，通常比起庫大小大10至10,000倍。該過大倍數也稱為「庫當量數」，代表可能存在10至10,000個有相同胺基酸序列之各個選殖體。是以，本發明之「序列彼此互異」之用語，意指排除當量數之庫中之各個抗原結合分子之序列彼此不同，更具體而言，意指存在序列彼此互異之抗原結合分子106至1014個分子，較佳為107至1012個分子，更佳為108至1011個分子，尤佳為108至1012。
又，本發明記載之以多數抗原結合分子為主而成之庫中之用語「多數」，例如本發明之抗原結合分子、融合多胜肽、聚核苷酸分子、載體或病毒通常為其物質之2個以上種類的集合。例如若為某2個以上之物質就特定形質互異，則代表該物質有存在2種以上。舉例來說，在胺基酸序列中之特定胺基酸位置觀察到的改變體胺基酸。例如，柔性殘基以外、或露出於表面之非常多樣的胺基酸位置的特定改變體胺基酸以外係實質相同，較佳為有相同序列之本發明之2個以上抗原結合分子時，本發明之抗原結合分子存在多個。其他實施例中，若編碼為柔性殘基之鹼基以外、或編碼為露出於表面之非常多樣之胺基酸位置之特定改變體胺基酸之鹼基以外為實質相同，較佳為有相同序列之本發明之2個以上之聚核苷酸分子，則本發明之聚核苷酸分子有多個存在。
再者，本發明之以多數抗原結合分子為主而成之庫中記載之用語「以其為主而成」，係反映庫中之序列相異之獨立選殖體之數目當中，依離子濃度之條件不同，抗原結合分子對於抗原之結合活性相異之抗原結合分子之數目。具體而言，宜在庫中至少存在顯示如此之結合活性之抗原結合分子104個分子。又，更佳為，能從至少存在如此之顯示結合活性之抗原結合分子有105個分子之庫取得本發明之抗原結合分域。又更佳為，可從顯示如此之結合活性之抗原結合分子至少有106個分子存在之庫取得本發明之抗原結合分域。尤佳為可從顯示如此之結合活性之抗原結合分子至少有107個分子存在之庫取得本發明之抗原結合分域。又，再更佳為可從顯示如此之結合活性之抗原結合分子至少有108個分子存在之庫取得本發明之抗原結合分域。其他表達方式中，也可以庫中之序列相異之獨立選殖體之數目當中，依離子濃度之條件，抗原結合分子對於抗原之結合活性相異之抗原結合分子之比例的形式理想地表現。具體而言，本發明之抗原結合分域，可從顯示如此之結合活性之抗原結合分子在庫中之序列相異之獨立選殖體之數含有0.1%至80%，較佳為0.5%至60%，更佳為1%至40%，又更佳為2%至20%，尤佳為4%至10%之庫取得。融合多胜肽、聚核苷酸分子或載體之情形，亦與上述相同，可以用分子數或在分子全體之比例表現。又，於病毒之情形，也與上述相同，可以用病毒個體之數或在個體全體比例表現。
依鈣離子濃度之條件，抗原結合分域對於抗原之結合活性會改變之胺基酸
依前述篩選方法篩選之本發明之抗原結合分域或抗體可以用任意方式製備，例如當金屬離子為鈣離子濃度時，可使用預先存在之抗體、預先存在之庫(噬菌體庫等)、由對於動物免疫獲得之融合瘤或從來自免疫動物之B細胞製作之抗體或庫、對於該等抗體或庫導入可螯合鈣之胺基酸(例如天冬胺酸或麩胺酸)或導入有非天然胺基酸變異而得之抗體或庫(可螯合鈣之胺基酸(例如天冬胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸之含有率提高之庫或於特定部位導入有可螯合鈣之胺基酸(例如天冬胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸變異之庫等)等。
如前述依離子濃度之條件，使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之胺基酸，例如，金屬離子為鈣離子時，只要是形成鈣結合模體之胺基酸即可，其種類不限。鈣結合模體對於該技術領域中具有通常知識者為周知並已有詳細記載(例如Springer等人(Cell(2000)102,275-277)、Kawasaki及Kretsinger(Protein Prof.(1995)2,305-490)、Moncrief等人(J.Mol.Evol.(1990)30,522-562)、Chauvaux等人(Biochem.J.(1990)265,261-265)、Bairoch及Cox(FEBS Lett.(1990)269,454-456)、Davis(New Biol.(1990)2,410-419)、Schaefer等人(Genomics(1995)25,638~643)、Economou等人(EMBO J.(1990)9,349-354)、Wurzburg等人(Structure. (2006)14,6,1049-1058))。亦即ASGPR、CD23、MBR、DC-SIGN等C型外源凝集素(lectin)等任意公知之鈣結合模體，包括在本發明之抗原結合分子。如此之鈣結合模體之理想例，除了上述以外，也可列舉序列編號：4、序列編號：9、序列編號：10記載之抗原結合分域所含之鈣結合模體。
又，依照鈣離子濃度之條件，抗原結合分子對於抗原之結合活性會變化之胺基酸，例如具有金屬螯合作用之胺基酸亦為理想。有金屬螯合作用之胺基酸，例如絲胺酸(Ser(S))、蘇胺酸(Thr(T))、天冬醯胺酸(Asn(N))、麩醯胺酸(Gln(Q))、天冬胺酸(Asp(D))及麩胺酸(Glu(E))等。
前述之胺基酸所含之抗原結合分域之位置不限定於特定位置，只要依鈣離子濃度之條件會使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變即可，可為形成抗原結合分域之重鏈可變區或輕鏈可變區中之任意位置。亦即，本發明之抗原結合分域，可從由依鈣離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之胺基酸係包含在重鏈之抗原結合分域之序列彼此互異之抗原結合分子為主而成庫取得者。又，其他非限定態樣中，本發明之抗原結合分域，係從該胺基酸係包含在重鏈CDR3之序列彼此互異之抗原結合分子為主而成之庫取得。其他非限定態樣中，本發明之抗原結合分域，可從該胺基酸為重鏈CDR3之以Kabat編號表示之95位、96位、100a位及/或101位所含之序列彼此互異之抗原結合分子為主而成之庫取得。
又，本發明之一非限定態樣中，本發明之抗原結合分域，可能依鈣離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之胺基酸係包含在輕鏈之抗原結合分域之序列彼此互異之抗原結合分子為主而成之庫取得。又，於其他態樣中，本發明之抗原結合分域，可從該胺基酸係包含在輕鏈CDR1之序列彼此互異之抗原結合分子為主之庫取得。其他態樣中，本發明之抗原結合分域，可從該胺基酸係包含在輕鏈之CDR1以Kabat編號表示之30位、31位及/或32位之序列彼此互異之抗原結合分子為主而成之庫取得。
又，其他非限定態樣中，本發明之抗原結合分域，可從該胺基酸殘基係包含在輕鏈之CDR2之序列彼此互異之抗原結合分子為主之庫取得。其他態樣中，提供由該胺基酸殘基係包含在輕鏈CDR2之以Kabat編號表示之50位之序列彼此互異之抗原結合分子為主之庫。
又，於其他非限定態樣中，本發明之抗原結合分域，可從該胺基酸殘基係包含在輕鏈CDR3之序列彼此互異之抗原結合分子為主而成之庫取得。於其他態樣中，本發明之抗原結合分域，可從該胺基酸殘基係包含在輕鏈CDR3之以Kabat編號表示之92位之序列彼此互異之抗原結合分子為主而成之庫取得。
又，本發明之抗原結合分域，可從該胺基酸殘基包含在前述記載之輕鏈之CDR1、CDR2及CDR3中選出的2個或3個CDR之序列彼此互異之抗原結合分子為主而成之庫取 得作為本發明之不同態樣。再者，本發明之抗原結合分域，可從該胺基酸殘基包含在輕鏈之以Kabat編號表示之30位、31位、32位、50位及/或92位中之任一者以上的序列彼此互異之抗原結合分子為主而成之庫取得。
尤理想的實施形態中，抗原結合分子之輕鏈及/或重鏈可變區之框架序列，以具有人類之生殖細胞系框架序列為理想。因此，於本發明之一態樣中，若框架序列完全為人類序列，且對於人類投予(例如疾病之治療)時，可認為本發明之抗原結合分子幾乎或完全不會引起免疫原性反應。由上述含意，本發明之「含有生殖細胞系列之序列」，係指本發明之框架序列的一部分與任一人類之生殖細胞系框架序列的一部分為相同。例如，當本發明之抗原結合分子之重鏈FR2之序列與多數不同之人類之生殖細胞系框架序列之重鏈FR2序列組合而得之序列時，亦為本發明之「含有生殖細胞系列之序列」抗原結合分子。
框架，例如V-Base(http：//vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)等網站包括的現在已知之完全人類型之框架區之序列為理想。
該等框架區之序列可適當使用作為在本發明之抗原結合分子包含之生殖細胞系列之序列。生殖細胞系列之序列，也可依其類似性分類(Tomlinson等人(J.Mol.Biol.(1992)227,776-798)Williams及Winter(Eur.J.Immunol.(1993)23,1456-1461)及Cox等人(Nat.Genetics(1994)7,162-168))。可從分類為7個次群之 V κ、分類為10個次群之V λ、分類為7個次群之VH適當選擇理想的生殖細胞系列之序列。
完全人類型之VH序列不僅限定於下列，但可舉例如VH1次群(例如，VH1-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH1-24、VH1-45、VH1-46、VH1-58、VH1-69)、VH2次群(例如，VH2-5、VH2-26、VH2-70)、VH3次群(VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-33、VH3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-72、VH3-73、VH3-74)、VH4次群(VH4-4、VH4-28、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-59、VH4-61)、VH5次群(VH5-51)、VH6次群(VH6-1)、VH7次群(VH7-4、VH7-81)之VH序列等為理想例。該等在公知文獻(Matsuda等人(J.Exp.Med.(1998)188,1973-1975))等也有記載，該技術領域中具有通常知識者可依據該等序列資訊適當設計本發明之抗原結合分子。該等以外之完全人類型之框架或框架之準區也可理想地使用。
完全人類型之VK序列，不僅限定於下列，例如可舉分類於Vk1次群之A20、A30、L1、L4、L5、L8、L9、L11、L12、L14、L15、L18、L19、L22、L23、L24、O2、O4、O8、O12、O14、O18、分類於Vk2次群之A1、A2、A3、A5、A7、A17、A18、A19、A23、O1、O11、分類於Vk3次群之A11、A27、L2、L6、L10、L16、L20、L25、分類於Vk4次群之B3、分類於Vk5次群之B2(本說明書中，也記載為Vk5-2))、分類於VK6次群之A10、A14、A26等(Kawasaki等人(Eur. J.Immunol.(2001)31,1017-1028)、Schable及Zachau(Biol.Chem.Hoppe Seyler(1993)374,1001-1022)及Brensing-Kuppers等人(Gene(1997)191,173-181))。
完全人類型之VL序列不僅限定於下列，例如可舉分類於VL1次群之V1-2、V1-3、V1-4、V1-5、V1-7、V1-9、V1-11、V1-13、V1-16、V1-17、V1-18、V1-19、V1-20、V1-22、分類於VL1次群之V2-1、V2-6、V2-7、V2-8、V2-11、V2-13、V2-14、V2-15、V2-17、V2-19、分類於VL3次群之V3-2、V3-3、V3-4、分類於VL4次群之V4-1、V4-2、V4-3、V4-4、V4-6、分類於VL5次群之V5-1、V5-2、V5-4、V5-6等(Kawasaki等人(Genome Res.(1997)7,250-261))為理想。
通常該等框架序列由於一個或更多胺基酸殘基的不同而彼此互異。該等框架序列可以與本發明之「依離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之至少一個胺基酸殘基」一起使用。與本發明之「依離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之至少一個胺基酸殘基」一起使用之完全人類型之框架之例，不僅限定於此，其他也有比如KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY、POM等(例如前述Kabat等人(1991)及Wu等人(J.Exp.Med.(1970)132,211-250))。
本發明不拘於特定理論，在使用生殖細胞系序列能期待排除幾乎於個人的有害免疫反應之理由之一，據認為係如下所述。由於在通常之免疫反應中發生之親和性成熟步 驟，會在免疫球蛋白之可變區頻繁地發活體細胞之突變。該等突變主要產生於其序列為超可變的CDR的周邊，但也會影響到框架區的殘基。該等框架的突變在生殖細胞系之基因不存在，成為患者之免疫原性的可能性少。據推論此係通常之人類族群係已暴露於由生殖細胞系之基因表現的框架序列中的大多數，而有免疫寬容，結果該等生殖細胞系之框架在患者為低免疫原性或非免疫原性。為了使免疫寬容之可能性最大，可從普通存在之機能性生殖細胞系基因之集合選擇編碼為可變區之基因。
本發明之依鈣離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之胺基酸，為了製作包含前述框架序列之抗原結合分子，可適當採用部位專一性的變異誘發法(Kunkel等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82,488-492))或Overlap extension PCR等公知方法。
例如，可藉由將選擇預先含有依鈣離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之至少1個胺基酸殘基之作為框架序列之輕鏈可變區、及製作為隨機化可變區序列庫之重鏈可變區予以組合，而製作本發明之含有多數序列彼此互異之抗原結合分子之庫。如此之非限定例，離子濃度為鈣離子濃度時，例如可舉序列編號：4(Vk5-2)記載之輕鏈可變區序列為代表之屬於Vk5-2家族之輕鏈可變區序列與製作為隨機化可變區序列庫之重鏈可變區組合而得之庫。
又，在選擇預先含有前述依鈣離子濃度之條件使抗原 結合分子對於抗原之結合活性改變之至少一個胺基酸殘基之作為框架序列之輕鏈可變區之序列中，也可設計使得含有多樣的胺基酸作為該胺基酸殘基以外之殘基。本發明中，如此之殘基稱為柔性殘基。本發明之抗原結合分子對於抗原之結合活性，只要會依離子濃度之條件改變即可，該柔性殘基之數目及位置不限定於特定態樣。亦即重鏈及/或輕鏈之CDR序列及/或FR序列可包括一個或更多柔性殘基。例如，離子濃度為鈣離子濃度時，導入於序列編號：4(Vk5-2)記載之輕鏈可變區序列之柔性殘基之非限定例，可舉表1或表2記載之胺基酸殘基。
Figure 101135762-A0202-02-0108-1
Figure 101135762-A0202-02-0109-2
本說明書中，柔性殘基係指當比較公知之及/或天然抗體或抗原結合分域之胺基酸序列時，在該位置表現之幾個具有不同胺基酸之輕鏈及重鏈可變區上之胺基酸為非常多樣的位置所存在之胺基酸殘基的變化(variation)。非常多樣的位置一般存在於CDR區。於一態樣中，當決定公知之及/或天然抗體之非常多樣的位置時，Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute of Health Bethesda Md.)(1987年及1991年)提供之資料係為有效。又，在網路上的許多資料庫(http：//vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/、http：//www.bioinf.org.uk/abs/index.html)，提供收集的多數人類輕鏈及重鏈序列及其配置，該等序列及其配置的資訊在決定本發明中之非常多樣的位置時有用。依本發明，當胺基酸位在的位置較佳有約2至約20，更佳為約3至約19，較佳為約4至約18、較佳為5至17、較佳為6至16、較佳為7至15、較佳為8至14、較佳為9至13、較佳為10至12個可能的不同胺基酸殘基的多樣性時，其位置可稱為非常多樣。在一些實施形態中，有些胺基酸位置，可具有較佳為至少約2、較佳為至少約4、較佳為至少約6、較佳為至少約8、較佳為約10、較佳為約12之可能的相異胺基酸殘基的多樣性。
又，藉由組合導入有前述依離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之至少一個胺基酸殘基而得之輕鏈可變區及製作為作為隨機化可變區序列庫之重鏈可變區，也能製作本發明之含有多數序列彼此互異之抗原結合分子之庫。如此之非限定例，當離子濃度為鈣離子濃度時，例如組合序列編號：5(Vk1)、序列編號：6(Vk2)、序列編號：7(Vk3)、序列編號：8(Vk4)等生殖細胞系列之特定殘基取代為依鈣離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之至少一個胺基酸殘基而得之輕鏈可變區序列與作為隨機化可變區序列庫而製作之重鏈可變區 而得之庫為理想例。該胺基酸殘基之非限定例，例如輕鏈之CDR1包含之胺基酸殘基。此外，該胺基酸殘基之非限定例，可舉輕鏈之CDR2所含之胺基酸殘基。又，該胺基酸殘基之非限定之另一例，可舉輕鏈之CDR3所含之胺基酸殘基。
如前述，該胺基酸殘基係在輕鏈之CDR1所含之胺基酸殘基之非限定例，可舉輕鏈可變區之CDR1中之Kabat編號表示之30位、31位、及/或32位之胺基酸殘基。又，該胺基酸殘基在輕鏈之CDR2所含之胺基酸殘基之非限定例，可舉輕鏈可變區之CDR2中之Kabat編號表示之50位之胺基酸殘基。又，該胺基酸殘基係在輕鏈之CDR3所含胺基酸殘基之非限定例，可舉輕鏈可變區之CDR3中之Kabat編號表示之92位之胺基酸殘基。又，該等胺基酸殘基，只要可形成鈣結合模體，及/或依照鈣離子濃度之條件，抗原結合分子對於抗原之結合活性會變化即可，該等胺基酸殘基可單獨含有，也可組合該等胺基酸二個以上含有。又，已知有具多個鈣離子結合部位且據認為在分子進化上來自於共通起源之TroponinC、Calmodulin、parvalbumin、肌球蛋白輕鏈等，也可設計輕鏈CDR1、CDR2及/或CDR3使含有其結合模體。例如可以上述目的適當使用Cadherin分域、Calmodulin所含之EF手、Protein kinase C所含之C2分域、血液凝固蛋白質FactorIX所含之G1a分域、脫唾液酸糖蛋白(asialoglycoprotein)受體或甘露糖結合受體所含之C型外源凝集素、LDL受體所含之A分域、 annexin、thrombospondin 3型分域及EGF狀分域。
於組合導入有前述依離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之至少一個胺基酸殘基而得之輕鏈可變區以及製作為隨機化可變區序列庫之重鏈可變區時，亦與前述同樣，可設計使柔性殘基含於該輕鏈可變區之序列。本發明之抗原結合分子對於抗原之結合活性，只要會依離子濃度之條件變化即可，該柔性殘基之數及位置不限於特定態樣。亦即，重鏈及/或輕鏈之CDR序列及/或FR序列中可含有一個或更多柔性殘基。例如，離子濃度為鈣離子濃度時，導入於輕鏈可變區序列之柔性殘基之非限定例，可舉表1或表2記載之胺基酸殘基。
組合之重鏈可變區之例，可理想地舉隨機化可變區庫。隨機化可變區庫之製作方法，可適當組合公知之方法。本發明之一非限定態樣中，由依據經特定抗原免疫之動物、感染症患者或接種疫苗而使血中抗體價升高之人類、癌患者、自體免疫疾病之淋巴球來源之抗體基因而構建的免疫庫，可理想地作為隨機化可變區庫。
又，本發明之一非限定態樣中，基因體DNA中之V基因或再構建且有功能的V基因之CDR序列取代為含有編碼為適當長度之密碼組之序列之合成寡核苷酸組而得之合成庫，也可理想地作為隨機化可變區庫。於該等情形，由觀察重鏈之CDR3之基因序列之多樣性，也可僅取代CDR3序列。於抗原結合分子之可變區生出胺基酸之多樣性的基準，係使露出於抗原結合分子表面之位置之胺基酸殘基帶 有多樣性。露出於表面之位置，係指可基於抗原結合分子之構造、構造整體、及/或模式化的構造而判斷可露出表面，及/或與可抗原接觸之位置，一般為其CDR。較佳為露出表面之位置，係使用來自如InsightII程式(Accelrys)之電腦程式，使用來自抗原結合分子之三維模型之座標決定。露出表面之位置，可使用在該技術領域公知之演算法(例如，Lee及Richards(J.Mol.Biol.(1971)55,379-400)、Connolly(J.Appl.Cryst.(1983)16,548-558))決定。露出表面之位置之決定，可使用適於蛋白質模型化之軟體及從抗體獲得之三維構造資訊進行。為了如此的目的可利用之軟體，可列舉SYBYL活體高分子模組軟體(Tripos Associates)。一般而言，又較佳為當演算法需要使用者輸入的大小參數時，將計算使用之探針的「大小」設為半徑約1.4埃以下。再者，使用個人電腦用軟體決定露出於表面之區及面積之方法，記載於Pacios(Comput.Chem.(1994)18(4),377-386及J.Mol.Model.(1995)1,46-53)。
又，本發明之一非限定態樣中，尤佳為使用從健康正常人之淋巴球來源的抗體基因所構建，在其曲目不含偏差(bias)之抗體序列即未改變序列構成之未改變庫作為隨機化可變區庫(Gejima等人(Human Antibodies(2002)11,121-129)及Cardoso等人(Scand.J.Immunol.(2000)51,337-344))。本發明記載之含有未改變序列之胺基酸序列，係指從如此之未改變庫取得的胺基酸序列。
本發明之一態樣中，係從組合選擇預先含有「依離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之至少一個胺基酸殘基」之作為框架序列之重鏈可變區、及作為隨機化可變區序列庫製作之輕鏈可變區而含有本發明之多數序列彼此互異之抗原結合分子之庫，獲得本發明之抗原結合分域。如此之非限定例，當離子濃度為鈣離子濃度時，例如組合序列編號：9(6RL#9-IgG1)或序列編號：10(6KC4-1#85-IgG1)記載之重鏈可變區序列及製作為隨機化可變區序列庫之輕鏈可變區而得之庫為理想例。又，可將製作為隨機化可變區序列庫之輕鏈可變區，替換為從具有生殖細胞系列之序列之輕鏈可變區之中適當選擇而製作。例如組合序列編號：9(6RL#9-IgG1)或序列編號：10(6KC4-1#85-IgG1)記載之重鏈可變區序列以及具有生殖細胞系列之序列之輕鏈可變區而得之庫為理想例。
又，也可設計使得選擇預先含有前述「依離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之至少一個胺基酸殘基」之作為框架序列的重鏈可變區之序列，含有柔性殘基。本發明之抗原結合分子對於抗原之結合活性，只要能依離子濃度之條件改變即可，該柔性殘基之數目及位置不限定於特定態樣。亦即重鏈及/或輕鏈之CDR序列及/或FR序列可含有一個或更多的柔性殘基。例如，當離子濃度為鈣離子濃度時，導入於序列編號：9(6RL#9-IgG1)記載之重鏈可變區序列之柔性殘基之非限定例，比如重鏈CDR1及CDR2之全部胺基酸殘基以外，重鏈CDR3之95位、 96位及/或100a位以外之CDR3之胺基酸殘基。或導入於序列編號：10(6KC4-1#85-IgG1)之重鏈可變區序列之柔性殘基之非限定例，可舉重鏈CDR1及CDR2之全部胺基酸殘基以外，重鏈CDR3之95位及/或101位以外之CDR3之胺基酸殘基。
又，藉由將前述導入有「依離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之至少一個胺基酸殘基」之重鏈可變區及製作為隨機化可變區序列庫之輕鏈可變區或有生殖細胞系列之序列之輕鏈可變區組合，也能製作含有多數序列彼此互異之抗原結合分子之庫。如此之非限定例，於離子濃度為鈣離子濃度時，例如將重鏈可變區之特定殘基取代為依鈣依離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之至少一個胺基酸殘基而得之重鏈可變區序列及製作為隨機化可變區序列庫之輕鏈可變區或有生殖細胞系列之序列之輕鏈可變區予以組合而得之庫。該胺基酸殘基之非限定例可列舉重鏈之CDR1所含之胺基酸殘基。此外，就該胺基酸殘基之非限定例可列舉重鏈之CDR2所含之胺基酸殘基。又，該胺基酸殘基之另一非限定例可列舉重鏈之CDR3所含之胺基酸殘基。該胺基酸殘基為重鏈之CDR3包含之胺基酸殘基之非限定例，可列舉重鏈可變區之CDR3中之Kabat編號表示之95位、96位、100a位及/或101位之胺基酸。又，此等胺基酸殘基，只要能形成鈣結合模體，及/或鈣依照離子濃度之條件，抗原結合分子對於抗原之結合活性會變化即可，該等胺基酸殘基可單獨含 有，也可組合該等胺基酸二個以上並含有。
前述將導入有依離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之至少一個胺基酸殘基之重鏈可變區以及製作為隨機化可變區序列庫之輕鏈可變區或有生殖細胞系列之序列之輕鏈可變區組合時，也與前述同樣，可設計使柔性殘基含於該重鏈可變區之序列。本發明之抗原結合分子對於抗原之結合活性，只要可依離子濃度之條件改變即可，該柔性殘基之數目及位置不限定於特定態樣。亦即重鏈之CDR序列及/或FR序列可含一個或更多柔性殘基。又，依離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之胺基酸殘基以外之重鏈可變區之CDR1、CDR2及/或CDR3之胺基酸序列，也可使用隨機化可變區庫。輕鏈可變區使用生殖細胞系列之序列時，例如序列編號：5(Vk1)、序列編號：6(Vk2)、序列編號：7(Vk3)、序列編號：8(Vk4)等生殖細胞系列之序列為非限定例。
前述，依鈣離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之胺基酸，只要能形成鈣結合模體即可，且任一胺基酸均能理想地使用，但如此之胺基酸具體而言可舉有電子提供性之胺基酸。如此之具有電子提供性之胺基酸，可舉絲胺酸、蘇胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、天冬胺酸或麩胺酸。
氫離子濃度之條件
又，本發明之一態樣中，離子濃度之條件係指氫離子濃度之條件或pH之條件。本發明中，質子亦即氫原子之原 子核之濃度條件，可以與氫指數(pH)之條件同樣處理。水溶液中之氫離子之活動量若以aH+表示，pH定義為-log10aH+。水溶液中之離子強度若(例如比10-3低)低，aH+大約等於氫離子強度。例如於25℃、1大氣壓，水之離子積為Kw=aH+aOH=10-14，所以純水中，aH+=aOH=10-7。此時之pH=7為中性，pH小於7的水溶液為酸性，pH大於7之水溶液為鹼性。
本發明中，離子濃度之條件使用pH的條件時，pH之條件可列舉高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件，與低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件。依pH之條件，結合活性改變，係指由於高氫離子濃度或低pH(pH酸性域)與低氫離子濃度或高pH(pH中性域)之條件不同，抗原結合分子對於抗原之結合活性改變。例如，比起於pH酸性域之條件抗原結合分子對於抗原之結合活性，在pH中性域之條件抗原結合分子對於抗原之結合活性較高的情形。又，也可列舉pH酸性域之條件下抗原結合分子對於抗原之結合活性高於在pH中性域之條件下抗原結合分子對於抗原之結合活性的情形。
本說明書中，pH中性域並不限於單值的數值，理想者為從pH6.7至pH10.0之間選擇。又，其他態樣中，可從pH6.7至pH9.5之間選擇。又，不同態樣中，可從pH7.0至pH9.0之間選擇，其他態樣中，可從pH7.0至pH8.0之間選擇。尤其，在活體內之血漿中(血中)的pH附近的pH7.4為理想。
本說明書中，pH酸性域並非限於單值的數值，宜從pH4.0至pH6.5之間選擇。又，另一態樣中，可從pH4.5至pH6.5之間選擇。又，不同態樣中，可從pH5.0至pH6.5之間選擇，其他態樣中，可從pH5.5至pH6.5之間選擇。尤以接近活體內之早期內體內之游離鈣濃度之pH5.8較理想。
本發明中，抗原結合分子在高氫離子濃度或低pH(pH酸性域)之條件對於抗原之結合活性低於在低氫離子濃度或高pH(pH中性域)之條件對於抗原之結合活性，係指抗原結合分子在從pH4.0至pH6.5之間選擇之pH對於抗原之結合活性，弱於在從pH6.7至pH10.0之間選擇之pH對於抗原之結合活性之意。較佳為，抗原結合分子在從pH4.5至pH6.5之間選擇之pH對於抗原之結合活性，弱於在從pH6.7至pH9.5之間選擇之pH對於抗原之結合活性，更佳為抗原結合分子在從pH5.0至pH6.5之間選擇之pH對於抗原之結合活性，弱於在從pH7.0至pH9.0之間選擇之pH對於抗原之結合活性。又，較佳為抗原結合分子在從pH5.5至pH6.5之間選擇之pH對於抗原之結合活性，弱於在從pH7.0至pH8.0之間選擇之pH對於抗原之結合活性。尤佳為，在活體內之早期內體內之pH之抗原結合活性弱於在活體內之血漿中之pH之抗原結合活性，具體而言，抗原結合分子在pH5.8對於抗原之結合活性弱於在pH7.4對於抗原之結合活性。
抗原結合分子對於抗原之結合活性是否依pH之條件 而改變，例如可使用在前述結合活性之項目記載之公知之測定方法決定。亦即，依該測定方法測定在不同pH之條件下之結合活性。例如，為了確認在pH中性域之條件下抗原結合分子對於抗原之結合活性高於在pH酸性域之條件下抗原結合分子對於抗原之結合活性，比較在pH酸性域及pH中性域之條件下，抗原結合分子對於抗原之結合活性。
又本發明中，「在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件對於抗原之結合活性，低於在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件對於抗原之結合活性」之表達方式，也可表達為：抗原結合分子在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件對於抗原之結合活性，高於在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件對於抗原之結合活性。又，本發明中，有時將「在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件對於抗原之結合活性低於在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件對於抗原之結合活性」記載為「在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件對於抗原之結合活性弱於在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件對於抗原之結合能力」，又，有時將「使在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件對於抗原之結合活性，低於低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件對於抗原之結合活性」記載為「使在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件對於抗原之結合活性，弱於在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件對於抗原之結合能力」。
對於測定抗原之結合活性時之氫離子濃度或pH以外 之條件，可由該技術領域中具有通常知識者適當選擇，不特別限定。例如，可於HEPES緩衝液、37℃之條件測定。例如可使用Biacore(GE Healthcare)等測定。抗原結合分子與抗原之結合活性之測定，當抗原為可溶型抗原的情形，可藉由將抗原作為分析物流過固定有抗原結合分子之晶片，而評價對於可溶型抗原之結合活性，於抗原為膜型抗原之情形，可藉由將抗原結合分子作為分析物，使流過固定有抗原之晶片，而評價對於膜型抗原之結合活性。
本發明之抗原結合分子，只要在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件對於抗原之結合活性弱於低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件對於抗原之結合活性即可，在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件下對於抗原之結合活性與在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件下對於抗原之結合活性之比不特別限定，較佳為對於抗原在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件之KD(Dissociation constant：解離常數)與低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件之KD之比KD(pH5.8)/KD(pH7.4)之值為2以上，更佳為KD(pH5.8)/KD(pH7.4)之值為10以上，又更佳為KD(pH5.8)/KD(pH7.4)之值為40以上。KD(pH5.8)/KD(pH7.4)之值之上限不特別限定，只要是該技術領域中具有通常知識者之技術可製作即可，可為400、1000、10000等任意值。
對於抗原之結合活性之值，於抗原為可溶型抗原之情形，可使用KD(解離常數)，於抗原為膜型抗原之情形，可 使用視KD(Apparent dissociation constant：視解離常數)。KD(解離常數)、及視KD(視解離常數)，可以用該技術領域中具有通常知識者公知之方法測定，例如可使用Biacore(GE healthcare)、Scatchard作圖法、流式細胞計數器等。
又，代表本發明之抗原結合分子在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件對於抗原之結合活性與在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件對於抗原之結合活性之比之其他指標，例如也可理想地使用解離速度常數kd(Dissociation rate constant：解離速度常數)。代表結合活性之比之指標，使用kd(解離速度常數)代替KD(解離常數)時，對於抗原在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件之kd(解離速度常數)與在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件之kd(解離速度常數)之比，即kd(pH酸性域之條件)/kd(pH中性域之條件)之值，較佳為2以上，更佳為5以上，又更佳為10以上，再更佳為30以上。Kd(pH酸性域之條件)/kd(pH中性域之條件)之值之上限不特別限定，只要該技術領域中具有通常知識者之技術常識可製作即可，可為50、100、200等各種值。
抗原結合活性之值，於抗原為可溶型抗原之情形，可使用kd(解離速度常數)，於抗原為膜型抗原之情形，可使用視kd(Apparent dissociation rate constant：視解離速度常數)。kd(解離速度常數)、及視kd(視解離速度常數)，可使用該技術領域中具有通常知識者公知之方法測 定，例如可使用Biacore(GE healthcare)、流式細胞計數器等。又，本發明中，當測定不同氫離子濃度亦即pH時抗原結合分子對於抗原之結合活性時，宜將氫離子濃度亦即pH以外之條件設為相同。
例如本發明提供之一個態樣，即在氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件對於抗原之結合活性低於在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件對於抗原之結合活性之抗原結合分域或抗體，可依包含以下步驟(a)~(c)之抗原結合分域或抗體之篩選取得。
(a)獲得在pH酸性域之條件下抗原結合分域或抗體之抗原結合活性；(b)獲得在pH中性域之條件下抗原結合分域或抗體之抗原結合活性；及(c)選擇在pH酸性域之條件下抗原結合活性低於在pH中性域之條件下抗原結合活性之抗原結合分域或抗體。
又，本發明提供之一個態樣，即在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件對於抗原之結合活性低於在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件對於抗原之結合活性之抗原結合分域或抗體，可依包含以下步驟(a)~(c)之抗原結合分域或抗體或此等之庫之篩選而取得。
(a)在pH中性域之條件使抗原結合分域或抗體或此等之庫接觸抗原；(b)將於前述步驟(a)與抗原結合之抗原結合分域或抗體放置在pH酸性域之條件下；及 (c)將在前述步驟(b)解離之抗原結合分域或抗體單離。
又，本發明提供之一個態樣，即在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件對於抗原之結合活性低於在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件對於抗原之結合活性之抗原結合分域或抗體，可依包含以下步驟(a)~(d)之抗原結合分域或抗體或此等之庫之篩選取得。
(a)於pH酸性域之條件下使抗原結合分域或抗體之庫接觸抗原；(b)選擇在前述步驟(a)未與抗原結合之抗原結合分域或抗體；(c)使於前述步驟(b)選擇之抗原結合分域或抗體於pH中性域之條件與抗原結合；及(d)將在前述步驟(c)與抗原結合之抗原結合分域或抗體單離。
再者，本發明提供之一個態樣，即在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件對於抗原之結合活性低於在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件對於抗原之結合活性之抗原結合分域或抗體，可依包含以下步驟(a)~(c)之篩選方法取得。
(a)在pH中性域之條件使抗原結合分域或抗體之庫接觸固定有抗原之管柱；(b)將在前述步驟(a)與管柱結合之抗原結合分域或抗體於pH酸性域之條件從管柱溶出；及 (c)將在前述步驟(b)溶出之抗原結合分域或抗體單離。
又，本發明提供之一個態樣，即在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件對於抗原之結合活性低於在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件對於抗原之結合活性之抗原結合分域或抗體，可依包含以下步驟(a)~(d)之篩選方法取得。
(a)於pH酸性域之條件使抗原結合分域或抗體之庫通過固定有抗原之管柱；(b)回收在前述步驟(a)未與管柱結合而溶出之抗原結合分域或抗體；(c)使於前述步驟(b)回收之抗原結合分域或抗體於pH中性域之條件與抗原結合；及(d)將在前述步驟(c)與抗原結合之抗原結合分域或抗體單離。
又，本發明提供之一個態樣，即在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件對於抗原之結合活性低於在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件對於抗原之結合活性之抗原結合分域或抗體，可依包含以下步驟(a)~(d)之篩選方法取得。
(a)在pH中性域之條件使抗原結合分域或抗體之庫接觸抗原；(b)取得在前述步驟(a)與抗原結合之抗原結合分域或抗體； (c)將於前述步驟(b)取得之抗原結合分域或抗體放置在pH酸性域之條件；及(d)將在前述步驟(c)之抗原結合活性弱於在前述步驟(b)選擇之基準之抗原結合分域或抗體單離。
又，前述步驟也可重複2次以上。因此，依本發明，可提供利用上述篩選方法中，更包含重複(a)~(c)或(a)~(d)之步驟2次以上之篩選方法取得之在pH酸性域之條件對於抗原之結合活性低於在pH中性域之條件對於抗原之結合活性之抗原結合分域或抗體。(a)~(c)或(a)~(d)之步驟重複的次數不特別限定，通常為10次以內。
本發明之篩選方法中，高氫離子濃度條件或低pH亦即pH酸性域之抗原結合分域或抗體之抗原結合活性，只要是pH為4.0~6.5之間之抗原結合活性即不特別限定，理想之pH例如pH為4.5~6.6之間之抗原結合活性。更佳的pH，例如pH為5.0~6.5之間之抗原結合活性，更佳為pH為5.5~6.5之間之抗原結合活性。更佳之pH例如活體內之早期內體內之pH，具體而言例如於pH5.8之抗原結合活性。又，於低氫離子濃度條件或高pH亦即pH中性域之抗原結合分域或抗體之抗原結合活性，只要是pH為6.7~10之間之抗原結合活性即不特別限定，理想之pH為例如pH為6.7~9.5之間之抗原結合活性。其他理想的pH可列舉pH為7.0~9.5之間之抗原結合活性，更佳為pH為7.0~8.0之間之抗原結合活性。更佳的pH，可舉在活體內之血漿中之pH，具體而言可舉於pH為7.4之抗原結合活性。
抗原結合分域或抗體之抗原結合活性，可利用該技術領域中具有通常知識者公知之方法測定，針對游離鈣濃度以外之條件可由該技術領域中具有通常知識者適當決定。抗原結合分域或抗體之抗原結合活性，可就KD(Dissociation constant：解離常數)、視KD(Apparent dissociation constant：視解離常數)、解離速度kd(Dissociation rate：解離速度常數)、或視kd(Apparent dissociation：視解離速度常數)等評價。此等可利用該技術領域中具有通常知識者公知之方法測定，例如可使用Biacore(GE healthcare)、Scatchard作圖法、FACS等。
本發明中，選擇在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件下抗原結合活性高於在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件下抗原結合活性之抗原結合分域或抗體之步驟，係與選擇在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件下抗原結合活性低於在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之抗原結合活性的抗原結合分域或抗體之步驟含意相同。
只要在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件下抗原結合活性高於在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件下抗原結合活性即可，在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件下抗原結合活性與在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件下抗原結合活性之差不特別限定，較佳為在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件下抗原結合活性為在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域 之條件下抗原結合活性之2倍以上，更佳為10倍以上，又更佳為40倍以上。
依前述篩選方法篩選之本發明之抗原結合分域或抗體可為各種抗原結合分域或抗體，例如可選擇上述抗原結合分域或抗體。例如可篩選具有天然序列之抗原結合分域或抗體，也可篩選胺基酸序列經取代之抗原結合分域或抗體。
依前述篩選方法篩選之本發明之抗原結合分域或抗體可以用任意方式製備，例如可使用預先存在之抗體、預先存在之庫(噬菌體庫等)、由對於動物免疫獲得之融合瘤或從來自免疫動物之B細胞製作之抗體或庫、對於該等抗體或庫導入側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸變異而得之抗體或庫或非天然胺基酸之含有率提高之庫或於特定部位導入有側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸變異之庫等)等。
從對於動物免疫獲得之融合瘤或從來自免疫動物之B細胞製作之抗原結合分域或抗體，取得在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件下抗原結合活性高於在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件下抗原結合活性之抗原結合分域或抗體之方法，例如將如WO2009/125825記載之抗原結合分域或抗體中之胺基酸之至少一個取代為側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或取代為非天然胺基酸變異或抗原結合分域或抗體中，插入側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天 然胺基酸之抗原結合分子或抗體為理想例。
側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸之變異導入之位置不特別限定，只要比起取代或插入前，在pH酸性域之抗原結合活性比在pH中性域之抗原結合活性弱(KD(pH酸性域)/KD(pH中性域)之值增大、或kd(pH酸性域)/kd(pH中性域)之值為增大)即可，可在任意部位。例如，於抗原結合分子為抗體之情形，抗體之可變區或CDR等為理想例。取代為側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸之胺基酸之數目、或插入之胺基酸之數目可由該技術領域中具有通常知識者適當決定，可由側鏈之pKa為4.0-8.0的1個胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸取代，可插入側鏈之pKa為4.0-8.0的1個胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸，可由側鏈之pKa為4.0-8.0之2個以上之多數胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸取代，可插入側鏈之pKa為4.0-8.0之2個以上之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸。又，取代為側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸或插入側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸以外，可同時進行其他胺基酸之缺失、附加、插入及/或取代等。取代為側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸或插入側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸，可由該技術領域中具有通常知 識者之公知之將丙胺酸掃描之丙胺酸取代為組胺酸等之組胺酸等掃描等的方法隨機進行，可從側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸之取代或插入之變異經隨機導入之抗原結合分域或抗體之中，選擇比起變異前，KD(pH酸性域)/KD(pH中性域)或kd(pH酸性域)/kd(pH中性域)之值變大的抗原結合分子。
如前述，該側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸之變異已進行且於pH酸性域之抗原結合活性低於在pH中性域之抗原結合活性之抗原結合分子之理想例，例如變異為其側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸後在pH中性域之抗原結合活性，與變異為其側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸前在pH中性域之抗原結合活性為同等的抗原結合分子為理想例。本發明中，變異為其側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸之後之抗原結合分子，具有與變異為其側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸之抗原結合分子有同等抗原結合活性，係指變異為其側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸前之抗原結合分子之抗原結合活性定為100%時，變異為其側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸後之抗原結合分子之抗原結合活性至少為10%以上，較佳為50%以上，更佳為80%以上，又較佳為90%以上。變異為其側鏈之 pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸後，於pH7.4之抗原結合活性，也可高於變異為其側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸之前在pH7.4之抗原結合活性。藉由取代為或插入其側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸而使抗原結合分子之抗原結合活性減低時，可藉由將抗原結合分子中之1或多數胺基酸進行取代、缺失、附加及/或插入等，使得抗原結合活性與取代為或插入其側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸前之抗原結合活性為同等。本發明中，如此之側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸之取代或插入後，藉由進行1或多數胺基酸之取代、缺失、附加及/或插入使得結合活性成為同等的抗原結合分子，也包括在內。
又，抗原結合分子為包含抗體不變區之物質時，在pH酸性域之抗原結合活性低於在pH中性域之抗原結合活性之抗原結合分子之另一理想態樣，可列舉改變抗原結合分子所含之抗體不變區之方法。改變後之抗體不變區之具體例，例如序列編號：11、12、13、或14記載之不變區為理想例。
使抗原結合分域對於抗原之結合活性依氫離子濃度之條件改變之胺基酸
依前述篩選方法篩選之本發明之抗原結合分域或抗體可以用任意方式製備，例如當離子濃度之條件為氫離子濃 度之條件或pH之條件時，可使用預先存在之抗體、預先存在之庫(噬菌體庫等)、由對於動物免疫獲得之融合瘤或從來自免疫動物之B細胞製作之抗體或庫、對於該等抗體或庫導入側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸變異而得之抗體或庫(側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸之含有率提高之庫或於特定部位導入有側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸(例如組胺酸或麩胺酸)或非天然胺基酸變異之庫等)等。
就本發明之一非限定態樣而言，藉由組合導入有「依氫離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之至少一個胺基酸殘基」之輕鏈可變區及製作為隨機化可變區序列庫之重鏈可變區，也可製作包含本發明之多數序列彼此互異之抗原結合分子之庫。
該胺基酸殘基之非限定例，可列舉輕鏈之CDR1所含之胺基酸殘基。此外，該胺基酸殘基之非限定例，可列舉輕鏈之CDR2所含之胺基酸殘基。又，該胺基酸殘基之另一非限定例，也可列舉輕鏈之CDR3所含之胺基酸殘基。
如前述，該胺基酸殘基為輕鏈之CDR1所含之胺基酸殘基之非限定例，可列舉輕鏈可變區之CDR1中之Kabat編號表示之24位、27位、28位、31位、32位及/或34位之胺基酸殘基。又，該胺基酸殘基為輕鏈之CDR2所含之胺基酸殘基之非限定例，可列舉輕鏈可變區之CDR2中之Kabat編號表示之50位、51位、52位、53位、54位、55位及/或 56位之胺基酸殘基。又，該胺基酸殘基為輕鏈之CDR3所含之胺基酸殘基之非限定例，可列舉輕鏈可變區之CDR3中之Kabat編號表示之89位、90位、91位、92位、93位、94位及/或95A位之胺基酸殘基。又，該等胺基酸殘基，只要是依氫離子濃度之條件，抗原結合分子對於抗原之結合活性會變化即可，該等胺基酸殘基可單獨含有也可組合2種以上該等胺基酸而含有。
前述組合導入有「依氫離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之至少一個胺基酸殘基」之輕鏈可變區及製作為隨機化可變區序列庫之重鏈可變區之情形，亦與前述同樣，可設定為使柔性殘基含於該輕鏈可變區之序列。本發明之抗原結合分子對於抗原之結合活性，只要會依氫離子濃度之條件改變即可，該柔性殘基之數目及位置不限定於特定態樣。亦即，重鏈及/或輕鏈之CDR序列及/或FR序列可含一個或更多柔性殘基。例如，導入於輕鏈可變區序列之柔性殘基之非限定例，可列舉表3或表4記載之胺基酸殘基。又，依氫離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之胺基酸殘基或柔性殘基以外之輕鏈可變區之胺基酸序列，就非限定例可理想地使用Vk1(序列編號：5)、Vk2(序列編號：6)、Vk3(序列編號：7)、Vk4(序列編號：8)等生殖細胞系列之序列。
Figure 101135762-A0202-02-0133-4
 (位置表示Kabat編號)
Figure 101135762-A0202-02-0134-5
 (位置表示Kabat編號)
前述依氫離子濃度之條件使抗原結合分子對於抗原之結合活性改變之胺基酸殘基，任一胺基酸殘基均可理想地使用，但如此之胺基酸殘基，具體而言可舉側鏈之pKa為4.0-8.0之胺基酸。如此之具有電子提供性之胺基酸，除了組胺酸或麩胺酸等天然胺基酸以外，也可列舉組胺酸類似物(US20090035836)或m-NO2-Tyr(pKa 7.45)、3,5-Br2-Tyr(pKa 7.21)或3,5-I2-Tyr(pKa 7.38)等非天 然的胺基酸(Bioorg.Med.Chem.(2003)11(17),3761-2768。又，該胺基酸殘基之特佳例，可列舉側鏈之pKa為6.0-7.0之胺基酸。如此之有電子提供性之胺基酸，例如組胺酸。
為了改變抗原結合分域之胺基酸，可適當採用部位專一性的變異誘發法(Kunkel等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82,488-492))或Overlap extension PCR等公知之方法。又，就取代為天然胺基酸以外之胺基酸之胺基酸改變方法，可採用多數公知之方法(Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.(2006)35,225-249、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2003)100(11),6353-6357)。例如於含有為終止密碼子的1個UAG密碼子(amber codon)的互補amber suppressor tRNA結合有非天然胺基酸之tRNA的無細胞轉譯系系統(Clover Direct(Protein Express))等也可理想地使用。
組合之重鏈可變區之例，以隨機化可變區庫為理想例。隨機化可變區庫之製作方法，可適當組合公知方法。本發明之一非限定態樣中，依據以特定抗原免疫之動物、感染症患者或接種疫苗而使血中抗體價升高之人類、癌患者、自體免疫疾病之淋巴球來源之抗體基因構建之免疫庫，可理想地作為隨機化可變區庫。
又，本發明之一非限定態樣中，與前述同樣，基因體DNA中之V基因或再構建且有功能的V基因之CDR序列取代為含有編碼為適當長度之密碼組之序列之合成寡核苷酸 組而得之合成庫，也可理想地作為隨機化可變區庫。於該等情形，由觀察重鏈之CDR3之基因序列之多樣性，也可僅取代CDR3序列。於抗原結合分子之可變區生出胺基酸之多樣性的基準，係使露出於抗原結合分子表面之位置之胺基酸殘基帶有多樣性。露出於表面之位置，可基於抗原結合分子之構造、構造整體、及/或模式化的構造而判斷可露出表面，及/或與抗原接觸之位置，一般為其CDR。較佳為露出表面之位置，係使用來自如InsightII程式(Accelrys)之電腦程式，使用抗原結合分子之三維模型之座標決定。露出表面之位置，可使用在該技術領域公知之演算法(例如，Lee及Richards(J.Mol.Biol.(1971)55,379-400)、Connolly(J.Appl.Cryst.(1983)16,548-558))決定。露出表面之位置之決定，可使用適於蛋白質模型化之軟體及從抗體獲得之三維構造資訊獲得。為了如此的目的可利用之軟體，可列舉SYBYL活體高分子模組軟體(Tripos Associates)。一般而言，又較佳為當演算法需要使用者輸入的大小參數時，將計算使用之探針的「大小」設為半徑約1.4埃以下。再者，使用個人電腦用軟體決定露出於表面之區及面積之方法，記載於Pacios(Comput.Chem.(1994)18(4),377-386及J.Mol.Model.(1995)1,46-53)。
又，本發明之一非限定態樣中，尤佳為使用從健康正常人之淋巴球來源的抗體基因所構建，在其曲目不含偏差(bias)之抗體序列即未改變序列構成之未改變庫作為隨機化可變區庫(Gejima等人(Human Antibodies(2002) 11,121-129)及Cardoso等人(Scand.J.Immunol.(2000)51,337-344))。
FcRn
與屬於免疫球蛋白超級家族之Fcγ受體不同，FcRn尤其是人類FcRn，在構造上與主要組織不適合性複合體(MHC)第I類之多胜肽在構造相類似，且與第I類之MHC分子有22至29%之序列同一性(Ghetie等人，Immunol.Today(1997)18(12),592-598)。FcRn，係由與可溶性β或輕鏈(β 2微球蛋白)複合體化之穿膜α或重鏈構成的異二聚體的形式表現。如MHC，FcRn之α鏈係由3個細胞外分域(α 1、α 2、α 3)構成，且短的細胞質域係將蛋白質留在細胞表面。α 1及α 2域會與抗體之Fc區中之FcRn結合分域交互作用(Raghavan等人(Immunity(1994)1,303-315)。
FcRn係於哺乳動物之母性胎盤或卵黃嚢表現，其涉及IgG從母親移動到胎兒。此外，於表現FcRn之囓齒類新生兒的小腸中，涉及母體IgG從攝取FcRn之初乳或乳橫切移動到刷子緣上皮。FcRn有多數種類，在多數其他組織、及各種內皮細胞系表現。其在人類成人血管內皮、肌肉血管系、及肝臟洞狀毛細血管也有表現。FcRn會與IgG結合，並且再循環到血清，而據認為有維持IgG之血漿中濃度之作用。FcRn對於IgG分子之結合，通常係嚴格依存於pH，最適結合據認為是小於7.0之pH酸性域。
以含序列編號：15表示之信號序列之多胜肽當做前驅 體之人類FcRn，於活體內(序列編號：16記載包含信號序列之其多胜肽)會與人類β 2-微球蛋白形成複合體。如後述參考實施例所示，β 2-微球蛋白形成複合體之可溶型人類FcRn可使用通常之重組表現方法製造。可以評價本發明之FcRn結合分域對於與如此的與β 2-微球蛋白形成複合體之可溶型人類FcRn的結合活性。本發明中，未特別記載時，人類FcRn指能與本發明之FcRn結合分域結合之形態者，例如人類FcRn與人類β 2-微球蛋白之複合體。
FcRn結合分域
本發明之一態樣中，提供一種誘導對抗原之免疫反應之醫藥組成物，其係包含抗原結合分子作為有效成分，該抗原結合分子包含：依離子濃度之條件對抗原之結合活性會變化之抗原結合分域、及在pH中性域之條件下對FcRn有結合活性之FcRn結合分域。
本發明之抗原結合分子具有FcRn結合分域。FcRn結合分域，只要是抗原結合分子在中性pH域具有FcRn結合活性即不特別限定、又，也可為直接或間接對於FcRn具結合活性之域。如此的域，例如：直接對於FcRn具結合活性之IgG型免疫球蛋白之Fc區、白蛋白、白蛋白domain3、抗FcRn抗體、抗FcRn胜肽、抗FcRn Scaffold分子等、或間接對於人類FcRn具結合活性之與IgG或白蛋白結合之分子等。本發明中，宜具於pH酸性域及pH中性域具FcRn結合活性之域為較佳。該域只要是預先在pH中性域具FcRn結合活性之域，即可直接使用。該域在pH中性域沒有FcRn 結合活性或弱時，可改變抗原結合分子中之胺基酸而賦予FcRn結合活性。又，也可預先將在中性域的條件對於FcRn有結合活性的分域中的胺基酸改變而提高FcRn結合活性。FcRn結合分域之胺基酸改變，可藉由比較胺基酸改變前與改變後在pH中性域的FcRn結合活性，而找出目的之改變。
又，本發明之一不同態樣中，使用FcRn結合分域為在低鈣離子濃度之條件及高鈣離子濃度之條件對FcRn有結合活性之分域亦為理想。該分域若為預先具有在高鈣離子濃度之條件對FcRn有結合活性之分域，則可直接理想地使用。該分域在高鈣離子濃度之條件對FcRn無結合活性或弱時，可將抗原結合分子中之胺基酸改變而賦予對FcRn之結合活性。又，也可預先改變在高鈣離子濃度之條件對FcRn有結合活性之分域中之胺基酸，提高FcRn結合活性。FcRn結合分域之胺基酸改變，可藉由比較胺基酸改變前與改變後在高鈣離子濃度之條件對FcRn之結合活性而找出目的改變。比如可依前述離子濃度之條件之項目列舉之依鈣離子濃度之條件對抗原之結合活性會變化之抗原結合分域之篩選方法及製作方法的方法取得。如此的FcRn結合分域，例如抗FcRn抗體、抗FcRn胜肽、抗FcRn支架(Scaffold)分子等。
人類FcRn結合分域，宜為直接與FcRn結合之區。FcRn結合區之較佳例，例如抗體之Fc區。但是能與白蛋白或IgG等具有與FcRn之結合活性之多胜肽結合之區，也可經 由白蛋白或IgG等而間接結合於FcRn。所以，本發明之FcRn結合區，也可為具與FcRn結合活性之多胜肽結合之區。Fc區包括來自於抗體重鏈之不變區的胺基酸序列。Fc區，係EU編號表示之約216之胺基酸之木瓜酶切斷部位之鉸鏈區之N末端起含有該鉸鏈、CH2及CH3分域之抗體之重鏈不變區之部分。
本發明中，FcRn結合分域對於FcRn尤其對於人類FcRn之結合活性，可由在前述結合活性之項目述及之方式，依照該技術領域之人士所公知之方法測定，針對pH以外之條件，可由該技術領域之人士適當決定。抗原結合分子之抗原結合活性與人類FcRn結合活性，可就KD(Dissociation constant：解離常數)、視KD(Apparent dissociation constant：視解離常數)、解離速度kd(Dissociation rate：解離速度常數)、或視kd(Apparent dissociation：視解離速度常數)等評價。該等可由該技術領域之人士公知之方法測定，例如可使用Biacore(GE healthcare)、Scatchard作圖法、流式細胞計數器等。
測定FcRn結合分域對於FcRn之結合活性時之pH以外之條件，可由該技術領域中具有通常知識者適當選擇，不特別限定。例如可如WO2009/125825記載，於MES緩衝液、37℃之條件測定。又，本發明之FcRn結合分域對於FcRn之結合活性之測定，可依該技術領域中具有通常知識者公知之方法進行，例如可使用Biacore(GE Healthcare)等測定。FcRn結合分域與FcRn之結合活性之測定，可藉由分 別以FcRn或FcRn結合分域或含FcRn結合分域之本發明之抗原結合分子作為分析物流過固定有FcRn結合分域或含FcRn結合分域之本發明之抗原結合分子或FcRn的晶片而評價。
作為本發明之抗原結合分子所含之FcRn結合分域與FcRn有結合活性之條件的pH酸性域，通常指pH4.0~pH6.5。較佳指pH5.5~pH6.5，尤佳為接近活體內之早期內體內之pH的pH5.8~pH6.0。作為本發明之抗原結合分子或該分子所含之FcRn結合分域與FcRn有結合活性之條件的pH中性域，通常指pH6.7~pH10.0。pH中性域較佳為pH7.0~pH8.0之任意pH值所示之範圍，較佳為從pH7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、及8.0選擇，尤佳為接近活體內之血漿中(血中)之pH之pH7.4。由於在pH7.4時人類FcRn結合分域或含該分域之抗原結合分子與人類FcRn之結合親和性低，所以當難評價其結合親和性時，可將pH7.4替換為使用pH7.0。就測定條件使用之溫度而言，FcRn結合分域與FcRn之結合親和性可於10℃~50℃之任意溫度評價。較佳為為了決定FcRn結合分域與人類FcRn之結合親和性，使用15℃~40℃之溫度。更佳為與從20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、及35℃中之任一者之20℃至35℃的任意溫度，也同樣用於決定FcRn結合分域與FcRn之結合親和性而可使用。25℃的溫度為本發明之態樣之一非限定例。
依The Journal of Immunology(2009)182：7663-7671， 天然型人類IgG1對於人類FcRn之結合活性，在pH酸性域(pH6.0)KD為1.7μM，但於pH中性域幾乎未能檢測到活性。是以良好態樣中，可使用包括在pH酸性域之條件下對於人類FcRn之結合活性為KD 20μM或更強，在pH中性域之條件下對於人類FcRn之結合活性與天然型人類IgG為同等之抗原結合分子且在pH酸性域之條件下對於人類FcRn有結合活性之本發明之抗原結合分子。更佳的態樣中，可使用包括在pH酸性域之條件下對人類FcRn結合活性為KD2.0μM或更強之抗原結合分子的本發明之抗原結合分子。又更佳的態樣中，可使用在pH酸性域之條件下對人類FcRn結合活性為KD 0.5μM或更強之抗原結合分子。上述KD值，可依The Journal of Immunology(2009)182：7663-7671記載之方法(將抗原結合分子固定在晶片，並流過作為分析物之人類FcRn)決定。
本發明中，在pH酸性域之條件下對FcRn有結合活性之Fc區較理想。該分域若要是預先在pH酸性域之條件下對於FcRn有結合活性之Fc區則可直接使用。該分域在pH酸性域之條件下對於FcRn無結合活性或結合活性弱的情形，可藉由改變抗原結合分子中之胺基酸而取得對所望之FcRn有結合活性之Fc區，但藉由改變Fc區中之胺基酸，也可理想地取得在pH酸性域之條件下對所望之FcRn有結合活性之Fc區或活性有增強之Fc區。帶來如此之所望結合活性之Fc區之胺基酸改變，可藉由比較胺基酸改變前與改變後在pH酸性域之條件下對於FcRn之結合活性而找 到。可使用與前述之用於改變對於Fcγ受體之結合活性使用之方法為同樣的部位專一性變異誘發法(Kunkel等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82,488-492))或Overlap extension PCR等公知手法，由該技術領域中具有通常知識者實施適當胺基酸之改變。
本發明之抗原結合分子所含之在pH酸性域之條件下對FcRn有結合活性之Fc區可由任一方法取得，但具體而言，可藉由將作為初始Fc區使用之人類IgG型免疫球蛋白之胺基酸改變，而取得在pH酸性域之條件下對FcRn有結合活性之FcRn結合分域或結合活性有增強的FcRn結合分域。用於改變的理想的IgG型免疫球蛋白之Fc區，例如人類IgG(IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4、及此等之改變體)之Fc區。改變為其他胺基酸之改變，只要可在pH酸性域之條件下對FcRn有結合活性、或可提高於酸性域之條件下對於人類FcRn之結合活性即可，可將任一位置之胺基酸改變。抗原結合分子含有作為Fc區之人類IgG1之Fc區的情形，pH酸性域之條件下對於FcRn之結合包括帶來使人類IgG1之初始Fc區之結合活性更增強之效果之改變為理想。可為如此之改變之胺基酸，例如WO2000/042072所記載，EU編號表示之238位、252位、253位、254位、255位、256位、265位、272位、286位、288位、303位、305位、307位、309位、311位、312位、317位、340位、356位、360位、362位、376位、378位、380位、382位、386位、388位、400位、413位、415位、424位、433位、434 位、435位、436位、439位及/或447位之胺基酸為理想。同樣地，可為如此之改變之胺基酸，例如WO2002/060919所記載，EU編號表示之251位、252位、254位、255位、256位、308位、309位、311位、312位、385位、386位、387位、389位、428位、433位、434位及/或436位之胺基酸為理想。又，可為如此之改變之胺基酸，可舉WO2004/092219所記載之EU編號表示之250位、314位及428位之胺基酸。又，可為如此之改變之胺基酸，例如WO2010/045193所記載，EU編號表示之251位、252位、307位、308位、378位、428位、430位、434位及/或436位之胺基酸為理想。利用該等胺基酸之改變，IgG型免疫球蛋白之Fc區在pH酸性域之條件下對於FcRn之結合會增強。
本發明中，在pH中性域之條件下對FcRn有結合活性之Fc區較佳。該分域若為預先在pH中性域之條件下對於FcRn有結合活性之Fc區則可直接使用。該分域在pH中性域之條件下對於FcRn無結合活性或結合活性弱的情形，可藉由改變抗原結合分子中之胺基酸而獲得對所望之FcRn有結合活性之Fc區，但藉由改變Fc區中之胺基酸，也可理想地取得在pH中性域之條件下對所望之FcRn有結合活性之Fc區、或結合活性有增強之Fc區。帶來如此之所望結合活性之Fc區之胺基酸改變，可藉由比較胺基酸改變前與改變後在pH中性域之條件下對於FcRn之結合活性而找出。可使用與前述之用於改變對於Fcγ受體之結合活性而 使用的手法為同樣之部位專一性變異誘發法(Kunkel等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82,488-492))或Overlap extension PCR等公知手法，由該技術領域中具有通常知識者實施適當胺基酸之改變。
本發明之抗原結合分子所含之在pH中性域對FcRn有結合活性之Fc區可以用任意方法取得，但具體而言，可藉由將作為初始Fc區使用之人類IgG型免疫球蛋白之胺基酸改變而取得在pH中性域對FcRn有結合活性、或活性增強之FcRn結合分域。用以改變之理想IgG型免疫球蛋白之Fc區，例如人類IgG(IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4、及此等之改變體)之Fc區。其他的胺基酸改變，只要在pH中性域對FcRn有結合活性、或在中性域對人類FcRn之結合活性能提高即可，可將任意位置之胺基酸改變。抗原結合分子係含人類IgG1之Fc區作為Fc區的情形，宜包含在pH中性域對FcRn之結合比起人類IgG1之初始Fc區之結合活性更增強之效果的改變。在pH中性域之條件對FcRn之KD值，係如前述依The Journal of Immunology(2009)182：7663-7671記載之方法(將抗原結合分子固定在晶片，流過作為分析物之人類FcRn)決定。
用於改變之理想IgG型免疫球蛋白之Fc區，例如人類IgG(IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4、及此等之改變體)之Fc區。其他的胺基酸改變，只要在pH中性域對FcRn有結合活性、或在中性域對人類FcRn之結合活性提高即可，可將任意位置的胺基酸改變。抗原結合分子含有人類IgG1之 Fc區作為Fc區的情形，宜包含在pH中性域對FcRn之結合比起人類IgG1之初始Fc區之結合活性更增強之效果的改變。為了製作施加有如此之改變之Fc區，導入如表5所示之各種變異於VH3-IgG1(序列編號：17)並評價。將包含製作的重鏈及輕鏈L(WT)(序列編號：18)的各改變體(IgG1-F1至IgG1-F1052)，依參考實施例1記載之方法表現及精製。
抗體與人類FcRn之結合，係依實施例3-3記載之方法解析。亦即，使用Biacore之在中性條件下(pH7.0)之改變體對人類FcRn之結合活性，如表5(表5-1~表5-33)。
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本發明之一非限定態樣中，宜使用Fc區之胺基酸在EU編號表示之部位當中從257位、308位、428位及434位之群選出之至少一個以上之胺基酸係與天然型Fc區之對應部位之胺基酸為相異之Fc區。如此之Fc區之一非限定例，可舉包含Fc區之EU編號表示之從；257位之胺基酸為Ala、308位之胺基酸為Pro、428位之胺基酸為Leu、及434位之胺基酸為Tyr、之群選出之至少一個以上胺基酸之Fc區。
Fcγ受體
Fcγ受體，係指能與IgG1、IgG2、IgG3、IgG4單株抗體之Fc區結合的受體，實質上意指由Fcγ受體基因編碼之蛋白質之家族的任一成員。人類中，該家族包括含同型異構物FcγRIa、FcγRIb及FcγRIc之FcγRI(CD64)；含同型異構物FcγRIIa(包括副型H131及R131)、FcγRIIb(包括FcγRIIb-1及FcγRIIb-2)及FcγRIIc之FcγRII(CD32)；及含同型異構物FcγRIIIa(包括副型V158及F158)及FcγRIIIb(包括副型FcγRIIIb-NA1及FcγRIIIb-NA2)之FcγRIII(CD16)，以及任意未曾發現的人類FcγR類或FcγR同型異構物或副型，但不限定於該等。FcγR，包括人類、小鼠、大鼠、兔及猴來源者，但不限定於此等，可為任意生物來源。小鼠FcγR類，包括FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)及 FcγRIII-2(FcγRIV、CD16-2)、及任意未曾發現的小鼠FcγR類或FcγR同型異構物或副型，但不限定於該等。如此的Fcγ受體之理想例，可舉人類FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)、FcγRIIb(CD32)、FcγRIIIa(CD16)及/或FcγRIIIb(CD16)。人類FcγRI之聚核苷酸序列及胺基酸序列各記載於序列編號：16(NM_000566.3)及17(NP_000557.1)，人類FcγRIIa(副型H131)之聚核苷酸序列及胺基酸序列各記載於序列編號：18(BC020823.1)及19(AAH20823.1)(副型R131為序列編號：19之166號之胺基酸取代為Arg之序列)、FcγRIIb之聚核苷酸序列及胺基酸序列各記載於序列編號：20(BC146678.1)及21(AAI46679.1)，FcγRIIIa之聚核苷酸序列及胺基酸序列各記載於序列編號：22(BC033678.1)及23(AAH33678.1)，FcγRIIIb之聚核苷酸序列及胺基酸序列各記載於序列編號：24(BC128562.1)及25(AAI28563.1)(括弧內代表RefSeq註冊編號)。Fcγ受體是否有與IgG1、IgG2、IgG3、IgG4單株抗體之Fc區結合之活性，除了上述記載之FACS或ELISA格式以外，也可利用ALPHA篩選(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)或利用表面電漿子共振(SPR)現象之BIACORE法等確認(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2006)103(11),4005-4010)。
又，「Fc配體」或「效應子配體」，係指與抗體之Fc區結合並形成Fc/Fc配體複合體之來自任意生物之分子，較佳為多胜肽。Fc配體對於Fc之結合，較佳為引起1個 或更多效應子機能。Fc配體包括Fc受體、FcγR、FcαR、Fcε R、FcRn、C1q、C3、甘露聚糖結合外源凝集素、甘露糖受體、葡萄球菌屬(staphylococcus)的ProteinA、葡萄球菌屬之蛋白質G及病毒之FcγR，但不限定於該等。Fc配體中，也包括與FcγR相同之Fc受體之家族即Fc受體相同體(FcRH)(Davis et al.,(2002)Immunological Reviews 190,123-136)或FCRL(Annu Rev Immunol,2007；25：525-60)。Fc配體也包括與Fc結合之未曾發現的分子。
包括FcγRIa、FcγRIb及FcγRIc之FcγRI(CD64)及包括同型異構物FcγRIIIa(包括副型V158及F158)及FcγRIIIb(包括副型FcγRIIIb-NA1及FcγRIIIb-NA2)之FcγRIII(CD16)，會與IgG之Fc部分結合之α鏈及在細胞內傳遞活化信號之有ITAM之共通γ鏈組合。另一方面，含有同型異構物FcγRIIa(包括副型H131及R131)及FcγRIIc之FcγRII(CD32)本身的細胞質分域，包括ITAM。該等受體在巨噬細胞或肥胖細胞(mast cell)、抗原表現細胞等許多免疫細胞表現。該等受體藉由與IgG之Fc部分結合而傳遞的活化信號，促進巨噬細胞之吞噬能力或發炎性細胞激素產生、肥胖細胞之脫顆粒、抗原表現細胞之機能亢進。如上述，具有傳遞活化信號之能力之Fcγ受體，在本發明也稱為活性型Fcγ受體。
另一方面，FcγRIIb(包括FcγRIIb-1及FcγRIIb-2)本身的細胞質內分域包括傳遞抑制型信號之ITIM。B細胞中，由於FcγRIIb與B細胞受體(BCR)的交聯，抑制來自 BCR之活化信號。結果使BCR之抗體產生受抑制。巨噬細胞中，由於FcγRIII與FcγRIIb之交聯使吞噬能力或發炎性細胞激素的產生能力受抑制。如上述有傳遞抑制化信號之能力之Fcγ受體，在本發明也稱為抑制型Fcγ受體。
對於Fcγ受體之結合活性
本發明之一態樣中，提供一種誘導免疫反應之醫藥組成物，其係包含含有Fc區對人類Fcγ受體之結合活性高於人類IgG之Fc對人類Fcγ受體之結合活性的Fc區的FcRn結合分域的抗原結合分子作為有效成分。
本發明之抗原結合分子所含之FcγR結合分域之FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa及/或FcγRIIIb中之任一者對於人類Fcγ受體之結合活性，可利用如上記載之FACS或ELISA格式確認，此外也可利用ALPHA篩選(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)或利用表面電漿子共振(SPR)現象之BIACORE法等確認(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2006)103(11),4005-4010)。
ALPHA篩選，係利用使用提供者與接受者的2種珠之ALPHA技術，依下列之原理實施。接近於提供者珠之分子會與結合於接受者珠之分子以生物學交互作用，僅在2珠接近的狀態檢測出發光信號。由雷射激發的提供者珠內的光敏劑將周邊的氧變換為激發狀態的單態氧。單態氧擴散到提供者珠周邊，到達接近的接受者珠時會引起珠內之化學發光反應，最終發出光。與提供者珠結合之分子及結合於接受者珠之分子彼此未交互作用時，提供者珠產生之單 態氧未到達接受者珠，故不起化學發光反應。
例如。於提供者珠結合有包括經生物素標記之Fc區之抗原結合分子，於接受者珠結合有以麩胱甘肽S轉移酶(GST)標籤化的Fcγ受體。競爭的含Fc區改變體之抗原結合分子不存在時，有天然型Fc區之抗原結合分子與Fcγ受體會交互作用並產生520-620 nm的信號。含有未標籤化的Fc區改變體之抗原結合分子，會與有天然型Fc區之抗原結合分子在與Fcγ受體間之交互作用競爭。將競爭結果表示之螢光減少予以定量，可決定相對的結合親和性。抗體等抗原結合分子使用Sulfo-NHS-生物素等予以生物素化係為公知。將Fcγ受體以GST予以標籤化之方法，可適當採用將編碼為Fcγ受體之聚核苷酸與編碼為GST之聚核苷酸於同一讀框融合而得之融合基因連結於保持有可作用之載體的細胞等中表現，並使用麩胱甘肽管柱精製之方法等。獲得之信號可藉由使用例如GRAPHPAD PRISM(GraphPad公司、San Diego)等的軟體以非線性回歸解析之一部位競合(one-site competition)模型擬合(fitting)而理想地解析。
將觀察交互作用之物質的其中之一(配體)固定在感應晶片之金薄膜上，並從感應晶片的背側照射光使在金薄膜與玻璃的交界面發生全反射，則反射光的一部分會形成反射強度下降的部分(SPR信號)。將觀察交互作用之物質的其中另一者(分析物)流過感應晶片的表面並使配體與分析物結合，則經固定化之配體分子的質量增加，感應晶片表 面之溶劑之折射率會改變。藉由該折射率的變化，SPR信號的位置會偏移(反之，結合若解離，則回到信號位置)。Biacore系統取上述偏移量，亦即感應晶片表面之質量變化作為縱軸，將質量之時間變化作為測定資料表示(感應圖)。從感應圖的曲線，求出動力學：結合速度常數(ka)與解離速度常數(kd)，由該常數之比求出親和性(KD)。BIACORE法也可理想地使用於抑制測定法。抑制測定法，例如Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2006)103(11),4005-4010。
測定本發明之抗原結合分子所含之Fc區與Fcγ受體之結合活性的pH條件，可適當使用pH酸性域或pH中性域之條件。作為測定本發明之抗原結合分子所含之Fc區與Fcγ受體之結合活性的條件的pH中性域，通常意指pH6.7~pH10.0。較佳為以pH7.0~pH8.0之任意pH值代表的範圍，更佳為選自pH7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、及8.0，尤佳為接近活體內血漿中(血中)之pH的pH7.4。本發明中，作為本發明之抗原結合分子所含之Fc區與Fcγ受體有結合活性之條件的pH酸性域，通常意指pH4.0~pH6.5。較佳為意指pH5.5~pH6.5，尤佳為意指接近活體內早期內體內之pH的pH5.8~pH6.0。在測定條件使用之溫度，Fc區與人類Fcγ受體之結合親和性可於10℃~50℃之任意溫度評價。較佳為，為了決定人類Fc區與Fcγ受體之結合親和性，使用15℃~40℃之溫度。更佳為將如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、 30、31、32、33、34、及35℃中之任一者之20℃至35℃之任意溫度，同樣用在決定Fc區與Fcγ受體之結合親和性。25℃的溫度為本發明之態樣之一非限定例。
本說明書中，Fc區對人類Fcγ受體之結合活性，即於FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa及/或FcγRIIIb中之任一者之人類Fcγ受體之結合活性，高於人類IgG之Fc區對於該等人類Fcγ受體之結合活性，係指依據例如上述解析方法，比起作為對照之含人類IgG之Fc區之抗原結合分子之結合活性，含待測Fc區之抗原結合分子之結合活性顯示105%以上，較佳為110%以上、120%以上、130%以上、140%以上，尤佳為150%以上、160%以上、170%以上、180%以上、190%以上、200%%以上、250%以上、300%以上、350%以上、400%以上、450%以上、500%以上、750%以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上之結合活性。
Fc區對Fcγ受體之結合活性高於天然型Fc區對Fcγ受體之結合活性的Fc區，可藉由將天然型Fc區之胺基酸改變以製作。在此所指天然型Fc區，係指EU編號297位之糖鏈為岩藻糖結合型之複合型糖鏈的天然型Fc區。Fc區對Fcγ受體之結合活性是否高於天然型Fc區對Fcγ受體之結合活性，可使用在前述結合活性項目記載之方法適當實施。
本發明中，Fc區之「胺基酸之改變」或「胺基酸改變」，包括改變為與初始Fc區之胺基酸序列相異之胺基酸序 列。初始Fc區之修飾改變體只要在pH中性域能與人類Fcγ受體結合即可，可使用任一Fc區當作初始Fc區。初始Fc區，例如人類IgG抗體之Fc區，亦即EU編號297位之糖鏈為岩藻糖結合型之複合型糖鏈的天然型Fc區為理想例。又，將已有改變之Fc區作為初始Fc區並更施加改變而得之Fc區也可理想地作為本發明之Fc區。初始Fc區，可意指多胜肽本身、包括初始Fc區之組成物、或編碼為初始Fc區之胺基酸序列。初始Fc區中，包括在抗體之項目概說之以重組產生的公知之Fc區。初始Fc區之起源不限定，可從非人類動物之任意生物或人類取得。較佳為，任意生物為從小鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠、長爪沙鼠、貓、兔、狗、山羊、綿羊、牛、馬、駱駝、及非人類靈長類選出的生物為理想例。其他態樣中，初始Fcγ受體結合分域也可從食蟹猴、狨猴、獼猴、黑猩猩、或人類取得。較佳為，初始Fc區從人類IgG1取得，且不限定於IgG之特定類別。其意指人類IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4之Fc區可理想地作為初始Fcγ受體結合分域使用。同樣，本說明書中，前述來自任意生物之IgG之任意類別或次類別之Fc區較佳為可作為初始Fc區。天然存在之IgG之改變體或操作之型之例，記載於公知文獻(Curr.Opin.Biotechnol.(2009)20(6),685-91、Curr.Opin.Immunol.(2008)20(4),460-470、Protein Eng.Des.Sel.(2010)23(4),195-202、WO2009/086320、WO2008/092117、WO2007/041635、及WO2006/105338)，但不限於此等。
改變例如包括：一個以上之變異，例如，取代為與初始Fc區之胺基酸相異之胺基酸殘基之變異、或對於初始Fc區之胺基酸插入一個以上之胺基酸殘基或使初始Fc區之胺基酸有一個以上胺基酸缺失等。較佳為，改變後之Fc區之胺基酸序列中包括至少一部分非天然之Fc區之胺基酸序列。如此的變種必然與初始Fc區有少於100%之序列同一性或類似性。理想之實施形態中，變種與初始Fc區之胺基酸序列有約75%~少於100%之胺基酸序列同一性或類似性，更佳為約80%~少於100%，又更佳為約85%~少於100%之，再更佳為約90%~少於100%，最佳為約95%~少於100%之同一性或類似性之胺基酸序列。本發明之一非限定態樣中，初始Fc區及本發明之經改變之Fc區之間，有至少1個胺基酸之差異。初始Fc區與改變Fc區之胺基酸之不同，尤其以前述EU編號指定之胺基酸殘基之位置之經指定之胺基酸之差異也可理想地指定。
為了改變Fc區之胺基酸，可適當採用部位專一性的變異誘發法(Kunkel等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82,488-492))或Overlap extension PCR等公知之方法。又，取代為天然胺基酸以外之胺基酸之胺基酸之改變方法，也可採用多數公知之方法(Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.(2006)35,225-249、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2003)100(11),6353-6357)。例如於含有為終止密碼子的1個UAG密碼子(amber codon)的互補amber suppressor tRNA結合有非天然胺基酸之tRNA的無 細胞轉譯系系統(Clover Direct(Protein Express))等也可理想地使用。
本發明之抗原結合分子所含之在pH中性域對Fcγ受體有結合活性之Fc區，可以用任意方法取得，具體而言，可藉由將作為初始Fc區使用之人類IgG型免疫球蛋白之胺基酸改變，而獲得在pH中性域對Fcγ受體有結合活性之Fc區。用於改變之理想IgG型免疫球蛋白之Fc區，例如人類IgG(IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4、及此等之改變體)之Fc區。人類IgG(IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4、及此等之改變體)之Fc區之理想例，可理想地使用人類IgG(IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4、及此等之改變體)之Fc區。該等Fc區之構造記載於序列編號：11(RefSeq登錄編號AAC82527.1之N末端有A附加)、12(RefSeq登錄編號AAB59393.1之N末有A附加)、13(RefSeq登錄編號CAA27268.1)、14(RefSeq登錄編號AAB59394.1之N末有A附加)。又，當使用某特定同種型(isotype)之抗體作為初始Fc區而具有經改變之Fc區之抗原結合分子為待測物質使用的情形，藉由將具有該特定同種型之IgG單株抗體之Fc區的抗原結合分子作為對照，可驗證含該改變Fc區之抗原結合分子對Fcγ受體之結合活性的效果。如上述方式，可適當選擇含驗證了對Fcγ受體之結合活性高的Fc區的抗原結合分子。
改變為其他胺基酸之改變，只要能使在pH中性域對於Fcγ受體有結合活性、或在中性域對於Fcγ受體結合之 結合活性提高即可，任一位置之胺基酸均可改變。抗原結合分子包括作為人類Fc區之人類IgG1之Fc區的情形，在pH中性域對於Fcγ受體之結合，宜包括能帶來增強人類IgG1之初始Fc區之結合活性的效果的改變較佳。為了在pH中性域之條件下對於Fcγ受體之結合活性增強之胺基酸改變，例如WO2007/024249、WO2007/021841、WO2006/031370、WO2000/042072、WO2004/029207、WO2004/099249、WO2006/105338、WO2007/041635、WO2008/092117、WO2005/070963、WO2006/020114、WO2006/116260及WO2006/023403等已有報告。
可如此改變之胺基酸，例如EU編號表示之221位、222位、223位、224位、225位、227位、228位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、243位、244位、245位、246位、247位、249位、250位、251位、254位、255位、256位、258位、260位、262位、263位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、271位、272位、273位、274位、275位、276位、278位、279位、280位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、288位、290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304位、305位、311位、313位、315位、317位、318位、320位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335 位、336位、337位、339位、376位、377位、378位、379位、380位、382位、385位、392位、396位、421位、427位、428位、429位、434位、436位及440位之群中選出之至少1個以上之胺基酸。藉由此等的胺基酸之改變，IgG型免疫球蛋白之Fc區在pH中性域之條件下對於Fcγ受體之結合會增強。
為了在本發明使用，尤佳改變例如Fc區之EU編號表示之；221位之胺基酸為Lys或Tyr中之任一者、222位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中之任一者、223位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Lys中之任一者、224位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中之任一者、225位之胺基酸為Glu、Lys或Trp中之任一者、227位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、228位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、230位之胺基酸為Ala、Glu、Gly或Tyr中之任一者、231位之胺基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中之任一者、232位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、233位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、234位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、 Trp或Tyr中之任一者、235位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、236位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、237位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、238位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、239位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、240位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、241位之胺基酸為Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中之任一者、243位之胺基酸為Leu、Glu、Leu、Gln、Arg、Trp或Tyr中之任一者、244位之胺基酸為His、245位之胺基酸為Ala、246位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、 247位之胺基酸為Ala、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Thr、Val或Tyr中之任一者、249位之胺基酸為Glu、His、Gln或Tyr中之任一者、250位之胺基酸為Glu或Gln中之任一者、251位之胺基酸為Phe、254位之胺基酸為Phe、Met或Tyr中之任一者、255位之胺基酸為Glu、Leu或Tyr中之任一者、256位之胺基酸為Ala、Met或Pro中之任一者、258位之胺基酸為Asp、Glu、His、Ser或Tyr中之任一者、260位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、262位之胺基酸為Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中之任一者、263位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、264位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、265位之胺基酸為Ala、Leu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Val、Trp或Tyr中之任一者、266位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、267位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、 268位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Trp中之任一者、269位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、270位之胺基酸為Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、271位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、272位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、273位之胺基酸為Phe或Ile中之任一者、274位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、275位之胺基酸為Leu或Trp中之任一者、276位之胺基酸為、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、278位之胺基酸為Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中之任一者、 279位之胺基酸為Ala、280位之胺基酸為Ala、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gln、Trp或Tyr中之任一者、281位之胺基酸為Asp、Lys、Pro或Tyr中之任一者、282位之胺基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中之任一者、283位之胺基酸為Ala、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg或Tyr中之任一者、284位之胺基酸為Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中之任一者、285位之胺基酸為Asp、Glu、Lys、Gln、Trp或Tyr中之任一者、286位之胺基酸為Glu、Gly、Pro或Tyr中之任一者、288位之胺基酸為Asn、Asp、Glu或Tyr中之任一者、290位之胺基酸為Asp、Gly、His、Leu、Asn、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、291位之胺基酸為Asp、Glu、Gly、His、Ile、Gln或Thr中之任一者、292位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中之任一者、293位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、294位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、 295位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、296位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr或Val中之任一者、297位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、298位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、299位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中之任一者、300位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中之任一者、301位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、302位之胺基酸為Ile、303位之胺基酸為Asp、Gly或Tyr中之任一者、304位之胺基酸為Asp、His、Leu、Asn或Thr中之任一者、305位之胺基酸為Glu、Ile、Thr或Tyr中之任一者、 311位之胺基酸為Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中之任一者、313位之胺基酸為Phe、315位之胺基酸為Leu、317位之胺基酸為Glu或Gln、318位之胺基酸為His、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Tyr中之任一者、320位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、322位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、323位之胺基酸為Ile、324位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、325位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、326位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、327位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、328位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、 Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、329位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、330位之胺基酸為Cys、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、331位之胺基酸為Asp、Phe、His、Ile、Leu、Met、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、332位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、333位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Ser、Thr、Val或Tyr中之任一者、334位之胺基酸為Ala、Glu、Phe、Ile、Leu、Pro或Thr中之任一者、335位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中之任一者、336位之胺基酸為Glu、Lys或Tyr中之任一者、337位之胺基酸為Glu、His或Asn中之任一者、339位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser或Thr中之任一者、376位之胺基酸為Ala或Val中之任一者、 377位之胺基酸為Gly或Lys中之任一者、378位之胺基酸為Asp、379位之胺基酸為Asn、380位之胺基酸為Ala、Asn或Ser中之任一者、382位之胺基酸為Ala或Ile中之任一者、385位之胺基酸為Glu、392位之胺基酸為Thr、396位之胺基酸為Leu、421位之胺基酸為Lys、427位之胺基酸為Asn、428位之胺基酸為Phe或Leu中之任一者、429位之胺基酸為Met、434位之胺基酸為Trp、436位之胺基酸為Ile、440位之胺基酸為Gly、His、Ile、Leu或Tyr中之任一者、之群中選出之至少1個以上的胺基酸之改變。又，改變的胺基酸之數目不特別限定，可僅有一處之胺基酸改變，也可有二處以上之胺基酸改變。二處以上之胺基酸之改變之組合，例如表6(表6-1~表6-3)記載的組合。
Figure 101135762-A0202-02-0199-39
Figure 101135762-A0202-02-0200-40
Figure 101135762-A0202-02-0201-41
糖鏈經修飾之Fc區
本發明提供之Fc區，可包括以結合於該Fc區之糖鏈之組成係結合岩藻糖缺損糖鏈之Fc區之比例提高之方式、或附加有二分化N-乙醯基葡萄糖胺之Fc區之比例提高之方式修飾過的Fc區。若從抗體Fc區所結合之N-配糖體結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡萄糖胺將岩藻糖殘基去除，已知會使對FcγRIIIa之親和性增強(非專 利文獻20)。含有如此之Fc區之IgG1抗體，已知後述ADCC活性會增強，所以含該Fc區之抗原結合分子作為本發明之醫藥組成物所含之抗原結合分子也有用。從抗體Fc區結合之N-配糖體結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡萄糖胺去除了岩藻糖殘基之抗體，例如以下抗體；經糖化修飾之抗體(WO1999/054342等)、糖鏈所附加之岩藻糖有缺損之抗體(WO2000/061739、WO2002/031140、WO2006/067913等)、具有二分化GlcNAc之糖鏈之抗體(WO2002/079255等)為公知。該等抗體之製造方法也可應用含有以使本發明之Fc區所結合之糖鏈之組成為結合岩藻糖缺損糖鏈之Fc區之比例提高之方式、或使附加有二分化N-乙醯基葡萄糖胺之Fc區之比例提高之方式修飾過的改變Fc區之抗原結合分子之製造方法。
抗原結合分子
本發明中，包含依離子濃度之條件對抗原之結合活性會改變之抗原結合分域、及在pH中性域之條件下對FcRn有結合活性之FcRn結合分域之分子，係以最廣含意使用，具體而言，此等只要顯示對於抗原之結合活性即可，包括各種分子型。例如，抗原結合分域與Fc區結合之分子，例如抗體。抗體包括單一單株抗體(含致效劑及拮抗劑抗體)、人類抗體、人類化抗體、嵌合抗體等。又，當作抗體之片段使用時，抗原結合分域及抗原結合片段(例如，Fab、F(ab’)2、scFv及Fv)為理想例。將既有之安定的α/β筒 狀蛋白質構造等立體構造作為支架(scaffold)，僅將其一部分構造用於建構抗原結合分域而庫化之支架分子，也包括在本發明之抗原結合分子。
本發明之抗原結合分子，可包含媒介對FcRn之結合及對Fcγ受體之結合之Fc區之至少一部分。例如，於非限定之一態樣中，抗原結合分子可為抗體或Fc融合蛋白質。融合蛋白質，係指含有與在天然在具有其自然不連結之第二胺基酸序列之多胜肽連結之第一胺基酸序列之多胜肽的嵌合多胜肽。例如，融合蛋白質可包括編碼為Fc區之至少部分(例如賦予對FcRn之結合之Fc區之部分或賦予對Fcγ受體之結合之Fc區之部分)之胺基酸序列、及編碼為例如受體之配體結合分域或配體之受體結合分域之胺基酸序列之非免疫球蛋白多胜肽。胺基酸序列也可存在於一起運到融合蛋白質之其他蛋白質，或此等通常存在於相同蛋白質但會重新再編入融合多胜肽中。融合蛋白質例如可依化學合成，或製作編碼為所望胜肽區之聚核苷酸並以表現其之基因重組的方法製作。
本發明之各分域可利用多胜肽鍵直接連結，並可經由連結子連結。連結子，可使用能依基因工程導入之任意胜肽連結子、或合成化合物連結子(例如Protein Engineering(1996)9(3),299-305)揭示之連結子等，但本發明以胜肽連結子較理想。胜肽連結子之長度不特別限定，可視目的由該技術領域中具有通常知識者適當選擇，但理想長度為5個胺基酸以上(上限不特別限定，通常 為30個胺基酸以下，較佳為20個胺基酸以下)，尤佳為15個胺基酸。
例如，胜肽連結子之情形，可理想地列舉：Ser
Gly‧Ser
Gly‧Gly‧Ser
Ser‧Gly‧Gly
Gly‧Gly‧Gly‧Ser(序列編號：26)
Ser‧Gly‧Gly‧Gly(序列編號：27)
Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Ser(序列編號：28)
Ser‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly(序列編號：29)
Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Ser(序列編號：30)
Ser‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly(序列編號：31)
Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Ser(序列編號：32)
Ser‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly(序列編號：33)
(Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Ser(序列編號：28))n
(Ser‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly(序列編號：29))n
[n為1以上之整數]等為理想例。惟，胜肽連結子之長度或序列可視目的由該技術領域中具有通常知識者適當選擇。
合成化學物連結子(化學交聯劑)，為胜肽交聯通常使用之交聯劑，例如N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)、辛二酸二琥珀醯亞胺酯(DSS)、辛二酸二(硫琥珀醯亞胺基)酯(BS 3)、二硫雙(琥珀醯亞胺基丙酸酯)(DSP)、二硫雙(硫琥珀醯亞 胺基丙酸酯)(DTSSP)、乙二醇雙(琥珀醯亞胺基琥珀酸酯)(EGS)、乙二醇雙(硫琥珀醯亞胺基琥珀酸酯)(硫-EGS)、二琥珀醯亞胺基酒石酸鹽(DST)、二硫琥珀醯亞胺基酒石酸鹽(硫-DST)、雙[2-(琥珀醯亞胺氧羰基氧)乙基]碸(BSOCOES)、雙[2-(硫琥珀醯亞胺氧羰基氧)乙基]碸(硫-BSOCOES)等，該等交聯劑在市面上可購得。
連結各分域之連結子使用多個時，可均使用同種連結子，也可使用異種連結子。
又，上述記載例示之連結子以外，也可適當使用有例如His標籤、HA標籤、myc標籤、FLAG標籤等胜肽標籤之連結子。又，氫鍵、雙硫鍵、共價鍵、離子性交互作用或該等結合之組合而彼此結合之性質也可適當利用。例如利用抗體之CH1與CL間之親和性、利用與異Fc區組合時以前述雙專一性抗體為起源之Fc區。再者，在分域間形成之雙硫鍵也可適當地利用。
為了將各分域以胜肽鍵連結，將編碼為該分域之聚核苷酸於同一讀框連結。聚核苷酸於同一讀框連結之方法，以限制片段之接合或融合PCR、重疊PCR等方法為公知，本發明之抗原結合分子之製作也可適當單獨或組合使用該等方法。本發明中，用語「經連結」、「經融合」、「連結」或「融合」可相互交換的使用。該等用語，指利用包含上述化學結合手段或重組方法之所有方法將二個以上之多胜肽等的要素或成分形成為單一構造的方式進行連結。於同一讀框融合，當二以上之要素或成分為多胜肽時，係 指以維持該多胜肽之正確讀取框之方式，為了形成連續的較長的讀取框之二個以上讀取框單位之連結。當二分子之Fab作為抗原結合分域使用時，該抗原結合分域與Fc區未經連結子而以胜肽鍵於同一讀框連結而得之本發明之抗原結合分子抗體，可作為本申請案之理想抗原結合分子使用。
中和活性
本發明之一態樣中，提供一種誘導免疫反應之醫藥組成物，其係包含抗原結合分子作為有效成分，該抗原結合分子包含：依離子濃度之條件對於抗原之結合活性會變化之抗原結合分域、及於pH中性域之條件下對於FcRn有結合活性之FcRn結合分域；且對於抗原有中和活性。一般而言，中和活性係指抑制對於病毒或毒素等對細胞有生物學活性之配體之該生物學活性之活性。亦即，有中和活性之物質，係指結合於該配體或該配體所結合之受體，並抑制該配體與受體之結合之物質。利用中和活性使與配體結合受抑制之受體，不能發揮經由該受體媒介之生物學活性。抗原結合分子為抗體之情形，具有如此之中和活性之抗體，一般稱為中和抗體。某待驗物質之中和活性，係藉由將在配體之存在下其生物學活性在待驗物質存在或非存在下之條件之間比較而測定。
例如，作為IL-6R之主要配體考量者，以序列編號：37表示之IL-6為理想例。其胺基末端形成細胞外分域之I型膜蛋白質IL-6R，會與因IL-6而誘導二聚物化之gp130受體一起形成異四聚物(HEINRICH等人(Biochem.J.(1998) 334,297-314))。由於該異四聚物之形成，組合於gp130受體之Jak活化。Jak進行自磷酸化及受體之磷酸化。受體及Jak之磷酸化部位，對於屬於如Stat3之有SH2之Stat家族之分子、或MAP激酶、PI3/Akt、其他具SH2之蛋白質或適應子(adaptor)，發揮結合部位之作用。其次，結合於gp130受體之Stat由於Jak而磷酸化。經磷酸化之Stat形成二聚物並移到核內，調整標的基因之轉錄。Jak或Stat經由其他類別之受體而涉及信號的串流。脫離控制的IL-6之信號串流，會觀察到自體免疫疾病之病態或發炎、多發性骨髓癌或前列腺癌等癌。能作為癌基因之Stat3，在許多癌中係持續地被活化。前列腺癌與多發性骨髓瘤中，來自IL-6R之信號串流與來自上皮成長因子受體(EGFR)家族成員之信號串流之間有串音(crosstalk)(Ishikawa等人(J.Clin.Exp.Hematopathol.(2006)46(2),55-66))。
如此之細胞內之信號串流對每一細胞種類不同，可因應目的標的細胞適當設定標的分子，不限定於上述因子。藉由測定活體內信號之活化，可評價中和活性。又，以對於存在活體內信號串流之下游的標的基因的轉錄誘導作用作為指標，可檢測活體內信號之活化。標的基因之轉錄活性之改變，可利用報告子試驗法的原理檢測。具體而言，在標的基因之轉錄因子或起動子區之下游配置GFP(Green Fluorescence Protein)或發光酶等報告子基因，並測定其報告子活性，可就轉錄活性之改變測定作為報告子活性。活體內信號活化之測定套組，也可適當使用市售品(例如， Mercury Pathway Profiling Luciferase System(Clontech)等)。
再者，通常就測定作用於促進細胞增殖之方向之作用於信號串流的EGF受體家族等受體配體之中和活性的方法而言，可藉由測定標的細胞之增殖活性而評價中和抗體之中和活性。例如，將抗HB-EGF抗體基於中和活性對於例如HB-EGF等其增殖受EGF家族之成長因子而促進之細胞增殖之抑制效果予以評價或測定之方法而言，可理想地使用以下方法。在試管內評價或測定該細胞增殖抑制活性之方法，可使用測定培養基中添加之[3H]標記胸腺嘧啶由活細胞之攝入作為DNA複製能力指標的方法。就更簡便的方法，有於顯微鏡下計測將trypan blue等色素排除到細胞外之能力的色素排除法、或MTT法。後者係利用活細胞有將四唑鎓鹽MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)轉換為藍色的formazan產物的能力。更具體而言，在待驗細胞的培養液中同時加入配體及待驗抗體並經過一定時間後，將MTT溶液加入培養液並靜置一定時間以使細胞攝入MTT。其結果黃色化合物MTT由於細胞內之粒腺體內的琥珀酸脫氫酵素而變換為藍色的化合物。使該藍色生成物溶解並呈色後測定其吸光度，作為活細胞數的指標。MTT以外，也有MTS、XTT、WST-1、WST-8等試藥有市售(nacalai tesque等)，可理想地使用。活性測定時，作為對照抗體，將與抗HB-EGF抗體有相同之構造同型之抗體且不具有該細胞增殖抑制活性之結合抗體 與抗HB-EGF抗體同樣地使用，藉由抗HB-EGF抗體顯示比對照抗體強的細胞增殖抑制活性，可判定活性。
用於評價活性之細胞，例如其增殖受HB-EGF促進之細胞、比如卵巢癌細胞RMG-1細胞株、係利用將以編碼為人類EGFR之細胞外分域與小鼠GCSF受體之細胞內分域於同一讀框融合而得之融合蛋白質hEGFR/mG-CSFR之基因表現之方式結合之載體轉形之小鼠Ba/F3細胞等可理想地使用。如此，該技術領域中具有通常知識者可適當選擇用於評價活性之細胞而使用於測定前述細胞增殖活性。
細胞傷害活性
本發明之一態樣中，提供一種誘導免疫反應之醫藥組成物，其係包含抗原結合分子作為有效成分，該抗原結合分子包含：依離子濃度之條件對抗原之結合活性會變化之抗原結合分域；及在pH中性域對FcRn有結合活性之FcRn結合分域，且對表現抗原之細胞有細胞傷害活性。本發明中，細胞傷害活性，例如抗體依存性細胞媒介性細胞傷害(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity：ADCC)活性、補體依存性細胞傷害(complement-dependent cytotoxicity：CDC)活性等。本發明中，CDC活性係指利用補體系之細胞傷害活性。另一方面，ADCC活性係指當在表現抗原之細胞之表面對抗原有專一性之抗原結合分子附著時，於該Fc部分，表現Fcγ受體之細胞(免疫細胞等)介由Fcγ受體媒介而結合且提供傷害標的細胞之活性。目的抗原結合分子是否有ADCC活性，或是否有CDC活性，可 依公知方法測得(例如Current protocols in Immunology,Chapter7.Immunologic studies in humans、Coligan等人編(1993)等)。
具體而言，首先製備效應子細胞、補體溶液、標的細胞。
(1)效應子細胞之製備
從CBA/N小鼠等摘出之脾臟，在RPMI1640培養基(Invitrogen)中將脾臟細胞分離。以含10%胎牛血清(FBS、HyClone)之同培養基洗滌過的該脾臟細胞之濃度調整為5×106/ml，可製備效應子細胞。
(2)補體溶液之製備
以含10% FBS之培養基(Invitrogen)將Baby Rabbit Complement(CEDARLANE)稀釋為10倍，可製備補體溶液。
(3)標的細胞之製備
將表現抗原之細胞與0.2 mCi之51Cr-鉻酸鈉(GEhealthcare bioscience)一起在含10% FBS之DMEM培養基中，於37℃培養1小時，將該標的細胞做放射性標記。放射性標記後，以含10% FBS之RPMI1640培養基洗滌3次後的細胞濃度調整為2×105/ml，可製備該標的細胞。
ADCC活性、或CDC活性依下列所述方法測定。測定ADCC活性的情形，在加到96井U底板(Becton Dickinson)各50μl的標的細胞與抗原結合分子在冰上反應15分鐘。之後，將加有效應子細胞100μl之該板在二氧化碳培養箱內靜置4小時。抗體之終濃度可設為例如0或10μg/ml等的 濃度。靜置後，使用gamma計數器(COBRAII AUTO-GAMMA、MODEL D5005、Packard Instrument Company)測定從各井回收的100μl上清的放射活性。使用測定值依(A-C)/(B-C)x 100之計算式可計算細胞傷害活性(%)。A係表示在各試樣之放射活性(cpm)、B係表示在加有1% NP-40(nacalai tesque)之試樣之放射活性(cpm)、C係表示在僅含標的細胞之試樣之放射活性(cpm)。
另一方面，測定CDC活性的情形。係將在96井平底板(Becton Dickinson)加入的各50μl的標的細胞與抗原結合分子加在冰上反應15分鐘。之後，將加有補體溶液100μl之該板於二氧化碳培養箱靜置4小時。抗體之終濃度可設為例如0或3μg/ml等濃度。靜置後使用gamma計數器測定從各井回收之100μl之上清之放射活性。細胞傷害活性與ADCC活性測定以同樣方式可計算。
免疫反應
本發明之一非限定態樣中，提供一種誘導對抗前述抗原之免疫反應之醫藥組成物，其係包含抗原結合分子作為有效成分，該抗原結合分子包含：依離子濃度之條件對抗原之結合活性會改變之抗原結合分域、及在pH中性域對FcRn有結合活性FcRn結合分域。
是否會誘導免疫反應，可藉由測定投予含有抗原結合分子作為有效成分之誘導對抗前述抗原之免疫反應之醫藥組成物後之活體之應答反應以評價。活體之應答反應，主要可列舉細胞性免疫(認識結合於MHC類別I之抗原之胜肽 片段的細胞妨礙性T細胞之誘導)及液性免疫(結合於抗原之抗體產生之誘導)二種免疫反應。液性免疫之誘導(免疫反應)之評價方法，可列舉評價在體內產生對抗抗原之抗體之方法。
是否由本發明之誘導免疫反應之醫藥組成物會誘導液性免疫，可藉由檢測從投予了該醫藥組成物之活體單離之末梢血中，從該活體而來之對抗成為該醫藥組成物所含抗原結合分子之標的之抗原的抗體以評價。對抗抗原之抗體價之測定法，可應用該技術領域中之人士公知之使用ELISA、ECL、SPR對投予分子專一性結合之分子之測定方法而實施(J Pharm Biomed Anal.2011 Jul 15；55(5)：878-88)。
由本發明之誘導免疫反應之醫藥組成物是否會獲得細胞性免疫，可藉由檢測從投予了該醫藥組成物之活體單離之末梢血中，表現成為對該醫藥組成物所含之抗原結合分子之標的的抗原為專一性之CD8之記憶型表現型之T細胞次組以評價。為表現CD8之細胞的有記憶型表現型之集團，為異質細胞集團。亦即，包括應答於抗原而急速分裂的中央記憶細胞及顯示細胞傷害等效應子機能之記憶之效應子記憶細胞。該等次組並非相互排斥。亦即，細胞也可急速分裂，也可傷害表現抗原之標的細胞。如此之表現抗原專一性CD8之細胞亦即有記憶型表現型之T細胞之次組經擴大培養結果產生之細胞激素之檢測套組(Cytokine Secretion Assay-Cell Enrichment and Detection Kit(Miltenyi Biotec))係有市售，而且有提供用以將如此之抗原專一性集團單離的實驗步驟。藉由使用如此的套組，可將抗原專一性中央記憶細胞與效應子記憶T細胞兩者有效率的在試管內增殖。可刺激該等T細胞次組增殖之抗原表現細胞，可從投予了前述誘導免疫反應之醫藥組成物之活體取得的末梢血單離。又，可將以抗原脈衝刺激的樹狀細胞或以抗原而轉染的樹狀細胞(Overes等人(J.Immunother.(2009)32,539-551))作為抗原表現細胞。
醫藥組成物
在另一觀點，本發明提供含有抗原結合分子作為有效成分之誘導對抗前述抗原之免疫反應之醫藥組成物，該抗原結合分子包含：依離子濃度之條件對抗原之結合活性會改變之抗原結合分域、及在pH中性域對FcRn有結合活性FcRn結合分域。又，本發明之一不同態樣中，係關於含有該抗原結合分子作為有效成分之誘導對抗前述抗原之免疫反應之細胞增殖抑制劑或抗癌劑。本發明之醫藥組成物、細胞增殖抑制劑或抗癌劑，宜對於外來性生物種之感染症或罹癌之對象或有再發可能性之對象投予。
又，本發明之一態樣中，含有抗原結合分子作為有效成分且該抗原結合分子包含依離子濃度之條件對抗原之結合活性會改變之抗原結合分域、及在pH中性域之條件下對FcRn有結合活性之FcRn結合分域之誘導對抗前述抗原之免疫反應之醫藥組成物、細胞增殖抑制劑或抗癌劑，也可在該醫藥組成物、細胞增殖抑制劑或抗癌劑製造時使用與 表現該抗原結合分子。
又，本發明之另一態樣中，提供一種誘導對抗前述抗原之免疫反應之方法，包括以下步驟：投予含有抗原結合分子作為有效成分之醫藥組成物、細胞增殖抑制劑及抗癌劑，該抗原結合分子包含；依離子濃度之條件對抗原之結合活性會改變之抗原結合分域、及在pH中性域之條件下對FcRn有結合活性之FcRn結合分域。
又，本發明之另一態樣中，提供一種抗原結合分子，其係用以誘導對抗抗原之免疫反應，包含在依離子濃度之條件對前述抗原之結合活性會變化之抗原結合分域、及在pH中性域之條件下對FcRn有結合活性之FcRn結合分域。
又，本發明之另一態樣中，可提供用於製造誘導對抗前述抗原之免疫反應之醫藥組成物、細胞增殖抑制劑及抗癌劑之處理，包含使用包含依離子濃度之條件對抗原之結合活性會改變之抗原結合分域、及在pH中性域之條件下對FcRn有結合活性之FcRn結合分域之抗原結合分子之步驟。
本發明中「包含含依離子濃度之條件對抗原之結合活性會改變之抗原結合分域、及在pH中性域之條件下對FcRn有結合活性之FcRn結合分域之抗原結合分子作為有效成分」，係指含有該抗原結合分子作為主要活性成分，該抗原結合分子之含有率無限制。又，本發明可以提供未與抗原結合之抗原結合分子，此外並提供含有預先與抗原結合之抗原結合分子作為有效成分之誘導對抗該抗原之免疫反應之醫藥組成物、細胞增殖抑制劑及抗癌劑，且投予未結 合抗原之抗原結合分子以外，包含投予預先結合抗原之抗原結合分子之誘導對抗抗原之免疫反應之方法，也可由本發明提供。
再者，本發明中，在醫藥組成物、細胞增殖抑制劑或抗癌劑中視需要可以摻合多種類抗原結合分子。例如可藉由將與同一抗原結合之多數本發明之抗原結合分子以雞尾酒式混合，而強化對表現該抗原之細胞之免疫反應之誘導作用或細胞傷害活性或中和活性，結果可能提高表現該抗原之細胞為病因之疾病的治療效果。或藉由投予除了摻合包含與成為治療對象之疾病病因之細胞所表現之某抗原結之抗原結合分域之本發明之抗原結合分子以外，也摻合包含成為相同疾病病因之細胞所表現之其他抗原所結合之抗原結合分域的本發明之抗原結合分子之本發明之醫藥組成物、細胞增殖抑制劑或抗癌劑，可提高該疾病之治療效果。
又，視需要也可將本發明之醫藥組成物、細胞增殖抑制劑或抗癌劑封入微膠囊(羥基甲基纖維素、明膠、聚〔甲基甲基丙烯酸〕等微膠囊)，成為膠體藥物傳送系統(微脂體、白蛋白微球體、微乳劑、奈米粒子及奈米膠囊等)(參照" Remington’s Pharmaceutical Science 16th edition",Oslo Ed.(1980)等)。再者，將藥劑適成緩釋性藥劑之方法為公知，該方法可應用在本發明之醫藥組成物、細胞增殖抑制劑或抗癌劑(J.Biomed.Mater.Res.(1981)15,267-277、Chemtech.(1982)12,98-105、美國專利第3773719號、歐洲專利公開公報EP58481號‧EP133988號、 Biopolymers(1983)22,547-556)。
本發明之醫藥組成物、細胞增殖抑制劑或抗癌劑，可經口、非經口投予中之任一者對患者投予。較佳為非經口投予。該投予方法具體而言，可列舉注射投予、經鼻投予、經肺投予、經皮投予等。注射投予，例如可利用靜脈內注射、肌肉內注射、腹腔內注射、皮下注射等將本發明之醫藥組成物、細胞增殖抑制劑或抗癌劑對全身或局部投予。又，可因應患者年齡、症狀選擇適當投予方法。投予量例如每次就體重1kg以0.0001mg至1000mg之範圍選擇投予量。或例如每名患者以0.001mg/體重至100000mg/體重之範圍選擇投予量。但是本發明之醫藥組成物、細胞增殖抑制劑或抗癌劑，不限於該等投予量。
本發明之醫藥組成物、細胞增殖抑制劑或抗癌劑，可依常法製劑化(例如Remington’s Pharmaceutical Science,latest edition,Mark Publishing Company,Easton,U.S.A)，可同時含有醫藥上可容許的擔體或添加物。例如界面活性劑、賦形劑、著色料、著香料、保存劑、安定劑、緩衝劑、懸浮劑、等張化劑、黏結劑、崩散劑、潤滑劑、流動性促進劑、矯味劑等。又，不限於該等，可適當其他常用擔體。具體而言，可使用輕質無水矽酸、乳糖、結晶纖維素、甘露醇、澱粉、羧甲基纖維素鈣、羧甲基纖維素鈉、羥基丙基纖維素、羥基丙基甲基纖維素、聚乙烯基乙縮醛二乙基胺基乙酸酯、聚乙烯基吡咯烷酮、明膠、中鏈脂肪酸三甘油酯、聚氧乙烯硬化篦麻子油60、白糖、羧甲 基纖維素、玉米澱粉、無機鹽類等作為擔體。
又，本發明記載之胺基酸序列所含之胺基酸有時會受到轉譯後修飾(例如N末端的麩醯胺酸因為焦麩醯胺基化而變成焦麩胺酸之修飾為該技術領域中具有通常知識者熟知的修飾)，但如此方式胺基酸經轉譯後修飾的情形，也當然包括在本發明記載之胺基酸序列。
醫藥組成物之製造方法
本發明之一非限定態樣中，提供一種誘導免疫反應之抗原結合分子之製造方法，包含對於含依離子濃度之條件對抗原之結合活性會改變之抗原結合分域之抗原結合分子所含之FcRn結合分域賦與在pH中性域之條件下對FcRn之結合活性。
本發明之製造方法中，當包含依離子濃度之條件對抗原之結合活性會改變之抗原結合分域之抗原結合分子所含之FcRn結合分域在pH中性域之條件下對FcRn之結合活性弱、或未確認活性的情形，可藉由對FcRn結合分域賦予在pH中性域之條件下對FcRn之結合活性，而創製本發明之抗原結合分子。
例如作為FcRn結合分域係使用含抗FcRn抗體之重鏈可變區及輕鏈可變區之抗原結合分域的情形，可依前述依離子濃度之條件對抗原之結合活性會改變之抗原結合分域之取得方法，而取得在pH中性域之條件下對FcRn有結合活性之FcRn結合分域。又，作為FcRn結合分域係使用在pH中性域之條件下對FcRn之結合活性弱、或未確認活性 之Fc區的情形，可藉由將抗原結合分子所含之Fc區之胺基酸改變而取得之含有對所望FcRn有結合活性之Fc區之抗原結合分子。帶來如此之所望結合活性之Fc區之胺基酸改變，可藉由比起胺基酸改變前與改變後在pH中性域對FcRn之結合活性而找出。可與為了改變前述對抗原之結合活性使用之方法使用同樣的部位專一性變異誘發法(Kunkel等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82,488-492))或Overlap extension PCR等公知方法，由該技術領域中具有通常知識者實施適當胺基酸的改變。
本發明之抗原結合分子所含之在pH中性域之條件下對FcRn有結合活性之Fc區，可利用任意方法取得，但具體而言，可藉由將作為初始Fc區使用之人類IgG型免疫球蛋白之胺基酸改變，而取得在pH中性域之條件下對FcRn有結合活性之、或活性增強之FcRn結合分域。用於改變之理想IgG型免疫球蛋白之Fc區，例如人類IgG(IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4、及此等之改變體)之Fc區。改變為其他胺基酸之改變，只要在pH中性域之條件下對FcRn有結合活性、或在中性域之條件下對人類FcRn之結合活性提高即可，可將任意位置之胺基酸改變。抗原結合分子係含有人類IgG1之Fc區作為Fc區的情形，含有帶來在pH中性域之條件下對FcR之結合比起人類IgG1之初始Fc區之結合活性增強之效果之改變為較理想。在pH中性域之條件對FcRn之KD值，可如前述，依The Journal of Immunology(2009)182：7663-7671記載之方法(將抗原結合分子固定 在晶片，流過作為分析物之人類FcRn)決定。
用於改變之理想IgG型免疫球蛋白之Fc區，例如人類IgG(IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4、及此等之改變體)之Fc區。改變為其他胺基酸之改變，只要是在pH中性域之條件下對FcRn有結合活性、或在中性域之條件下對人類FcRn之結合活性提高即可，可將任意位置之胺基酸改變。抗原結合分子係含有人類IgG1之Fc區作為Fc區的情形，含有帶來在pH中性域之條件下對FcRn之結合比起人類IgG1之初始Fc區之結合活性為增強之效果之改變較佳。作為施有如此之改變之Fc區，可列舉在前述表5所舉之胺基酸經取代之在pH中性域有結合活性之改變Fc區。
本發明之一非限定態樣，提供一種誘導免疫反應之醫藥組成物之製造方法，包含以下(a)~(f)之步驟：(a)獲得在高鈣離子濃度之條件下抗原結合分域對抗原之結合活性、(b)獲得在低鈣離子濃度之條件下抗原結合分域對抗原之結合活性、(c)選擇(a)獲得之抗原結合活性高於(b)獲得之抗原結合活性之抗原結合分域、(d)將編碼為(c)選擇之抗原結合分域之聚核苷酸，連結於編碼為在pH中性域之條件下對FcRn有結合活性之FcRn結合分域之聚核苷酸、(e)培養導入有(d)獲得之聚核苷酸以可作用地連結之載體的細胞、及 (f)從(e)培養細胞之培養液將抗原結合分子回收。
又，本發明之另一非限定態樣，提供一種誘導免疫反應之醫藥組成物之製造方法，包含以下(a)~(f)之步驟：(a)獲得於高鈣離子濃度之條件下抗體對抗原之結合活性、(b)獲得於低鈣離子濃度之條件下抗體對抗原之結合活性、(c)選擇在(a)獲得之抗原結合活性高於(b)獲得之抗原結合活性之抗體、(d)將編碼為(c)選擇抗體之抗原結合分域之聚核苷酸，連結於編碼為在pH中性域之條件下對FcRn有結合活性之FcRn結合分域之聚核苷酸、(e)培養導入有(d)獲得之聚核苷酸以可作用地連結之載體的細胞、及(f)從(e)培養細胞之培養液將抗原結合分子回收。
再者，於本發明之一非限定態樣中，提供一種抗原結合分子之製造方法，包含以下(a)~(f)之步驟、(a)獲得在pH中性域之條件下抗原結合分域對抗原之結合活性、(b)獲得在pH酸性域之條件下抗原結合分域對抗原之結合活性、(c)選擇在(a)獲得之抗原結合活性高於(b)獲得之抗原結合活性之抗原結合分域、(d)將編碼為(c)選擇之抗原結合分域之聚核苷酸，連 結於編碼為在pH中性域之條件下對FcRn有結合活性之FcRn結合分域之聚核苷酸、(e)培養導入有(d)獲得之聚核苷酸以可作用地連結之載體的細胞、及(f)從(e)培養細胞之培養液將抗原結合分子回收。
又，本發明之另一非限定態樣中，提供一種抗原結合分子之製造方法，包含以下(a)~(f)之步驟：(a)獲得在pH中性域之條件下抗體對抗原之結合活性、(b)獲得在pH酸性域之條件下抗體對抗原之結合活性、(c)選擇在(a)獲得之抗原結合活性高於(b)獲得之抗原結合活性之抗體、(d)將編碼為(c)選擇之抗體之抗原結合分域之聚核苷酸，連結於編碼為在pH中性域之條件下對FcRn有結合活性之FcRn結合分域之聚核苷酸、(e)培養導入有(d)獲得之聚核苷酸以可作用地連結之載體的細胞、及(f)從(e)培養細胞之培養液將抗原結合分子回收。
本發明之一非限定態樣中，抗原結合分域可舉構成抗體片段庫之多數抗原結合分域為理想例。又，本發明之一非限定態樣中，抗體可舉預先經單一選殖體化之一群抗體調查對象等。該等庫或抗體之製作方法，記載於前述抗體之項目。
例如本發明之一非限定態樣，就獲得在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件對抗原之結合活性低於在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件對抗原之結合活性之抗原結合分域之步驟而言，可舉包含以下之步驟(a)~(c)之獲得抗原結合分域之步驟為理想例。
(a)在pH中性域之條件使抗原結合分域之庫接觸抗原、(b)將在前述步驟(a)結合於抗原之抗原結合分域之庫放置在pH酸性域之條件、及(c)將在前述步驟(b)解離之抗原結合分域單離。
例如本發明之一非限定態樣，獲得在低鈣離子濃度之條件對抗原之結合活性低於在高鈣離子濃度之條件對抗原之結合活性之抗原結合分域之步驟，可列舉包含以下之步驟(a)~(c)之獲得抗原結合分域之步驟為理想例。
(a)在高鈣離子濃度之條件使抗原結合分域之庫接觸抗原、(b)將在前述步驟(a)結合於抗原之抗原結合分域之庫放置於低鈣離子濃度之條件、及(c)將在前述步驟(b)解離之抗原結合分域單離。
再者，本發明之一非限定態樣之獲得在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件對抗原之結合活性低於在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件對抗原之結合活性之抗原結合分域之步驟，可舉包含以下之步驟(a)~(c)之獲得抗原結合分域之步驟為理想例。
(a)使固定有抗原之管柱在pH中性域之條件接觸抗原結合分域之庫、(b)將在前述步驟(a)結合於管柱之抗原結合分域於pH酸性域之條件從管柱溶出、及(c)將在前述步驟(b)溶出之抗原結合分域單離。
再者，本發明之一非限定態樣之獲得在低鈣離子濃度之條件對抗原之結合活性低於在高鈣離子濃度之條件對抗原之結合活性之抗原結合分域之步驟，可舉包含以下之步驟(a)~(c)之獲得抗原結合分域之步驟為理想例。
(a)使固定有抗原之管柱在高鈣離子濃度之條件接觸抗原結合分域之庫、(b)將在前述步驟(a)結合於管柱之抗原結合分域於低鈣離子濃度之條件從管柱溶出、及(c)將在前述步驟(b)溶出之抗原結合分域單離。
再者，本發明之一非限定態樣之獲得在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件對抗原之結合活性低於在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件對抗原之結合活性之抗原結合分域之步驟，可舉包含以下之步驟(a)~(d)之獲得抗原結合分域之步驟為理想例。
(a)在pH酸性域之條件使抗原結合分域之庫通過固定有抗原之管柱、(b)回收在前述步驟(a)未與管柱結合而溶出之抗原結合分域、(c)使在前述步驟(b)回收之抗原結合分域於pH中性 域之條件結合於抗原、及(d)將在前述步驟(c)結合於抗原之抗原結合分域單離。
再者，本發明之一非限定態樣之獲得在低鈣離子濃度之條件對抗原之結合活性低於在高鈣離子濃度之條件對抗原之結合活性之抗原結合分域之步驟，可舉包含以下之步驟(a)~(d)之獲得抗原結合分域之步驟為理想例。
(a)在低鈣離子濃度之條件使抗原結合分域之庫通過固定有抗原之管柱、(b)回收在前述步驟(a)未與管柱結合而溶出之抗原結合分域、(c)使在前述步驟(b)回收之抗原結合分域於高鈣離子濃度之條件結合於抗原、及(d)將在前述步驟(c)結合於抗原之抗原結合分域單離。
例如本發明之一非限定態樣之獲得在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件對抗原之結合活性低於在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件對抗原之結合活性之抗體之步驟，可舉包含以下之步驟(a)~(c)之獲得抗體之步驟為理想例。
(a)獲得在pH酸性域之條件下抗體之抗原結合活性、(b)獲得在pH中性域之條件下抗體之抗原結合活性、及(c)選擇在pH酸性域之條件下抗原結合活性低於在 pH中性域之條件下抗原結合活性之抗體。
例如本發明之一非限定態樣之獲得在低鈣離子濃度之條件對抗原之結合活性低於在高鈣離子濃度之條件對抗原之結合活性之抗體之步驟，可舉包含以下之步驟(a)~(c)之獲得抗體之步驟為理想例。
(a)獲得在低鈣離子濃度之條件下抗體之抗原結合活性、(b)獲得在高鈣離子濃度之條件下抗體之抗原結合活性、及(c)選擇在低鈣離子濃度之條件下抗原結合活性低於在高鈣離子濃度之條件下抗原結合活性之抗體。
又，本發明之一非限定態樣之獲得在高氫離子濃度或低pH亦即pH酸性域之條件對抗原之結合活性低於在低氫離子濃度或高pH亦即pH中性域之條件對抗原之結合活性之抗體之步驟，可舉包含以下之步驟(a)~(d)之獲得抗體之步驟。
(a)在pH中性域之條件使抗體接觸抗原、(b)取得在前述步驟(a)結合於抗原之抗體、(c)將在前述步驟(b)取得之抗體放置在pH酸性域之條件、及(d)選擇在前述步驟(c)之抗原結合活性弱於在前述步驟(b)選擇之基準之抗體。
又，本發明之一非限定態樣之獲得在低鈣離子濃度之條件對抗原之結合活性低於在高鈣離子濃度之條件對抗原 之結合活性之抗體之步驟，可舉包含以下之步驟(a)~(d)之獲得抗體之步驟為理想例。
(a)在高鈣離子濃度之條件使抗體接觸抗原、(b)取得在前述步驟(a)結合於抗原之抗體、(c)將在前述步驟(b)取得之抗體放置在低鈣離子濃度之條件、及(d)選擇在前述步驟(c)之抗原結合活性弱於在前述步驟(b)選擇之基準之抗體。
又，前述步驟可重複2次以上。因此，依本發明提供更包含在上述篩選方法中(a)~(c)或(a)~(d)之步驟重複2次以上之步驟的篩選方法取得的在pH酸性域之條件對抗原之結合活性低於在pH中性域之條件對抗原之結合活性的抗原結合分域或抗體。(a)~(c)或(a)~(d)之步驟重複次數不特別限定，通常為10次以內。
前述之步驟中在低氫離子濃度條件或低pH亦即pH酸性域，抗原結合分域或抗體之抗原結合活性，只要是pH4.0~6.5間之抗原結合活性即可，不特別限定，理想的pH可舉pH4.5~6.5之間之抗原結合活性。其他理想pH，可舉pH5.0~6.5之間之抗原結合活性，更佳為pH5.5~6.0之間之抗原結合活性。更理想的pH，可舉活體內早期內體內之pH，具體而言，可舉在pH5.8之抗原結合活性。又，在高氫離子濃度條件或高pH亦即pH中性域之抗原結合分域或抗體之抗原結合活性，只要是pH6.7~10之間之抗原結合活性即可，不特別限定，理想的pH可舉pH6.7~9.5之 間之抗原結合活性。其他理想的pH，可舉pH7.0~9.5之間之抗原結合活性，較佳為pH7.0~8.0之間之抗原結合活性。更理想的pH，可舉活體內之血漿中的pH，具體而言可舉pH7.4之抗原結合活性。
前述之步驟中在低鈣濃度條件下，抗原結合分域或抗體之抗原結合活性只要是游離鈣濃度為0.1μM~30μM之間之抗原結合活性即可，不特別限定，理想的游離鈣濃度可舉0.2μM~20μM之間之抗原結合活性。其他態樣可舉0.5μM~10μM之間之抗原結合活性。更理想的游離鈣濃度，可舉活體內之早期內體內之游離鈣濃度，具體而言可舉1μM~5μM之抗原結合活性，且可舉在2μM~4μM之抗原結合活性。又，在高鈣濃度條件下，抗原結合分域或抗體之抗原結合活性，只要是游離鈣濃度100μM~10 mM之間之抗原結合活性即可，不特別限定，較理想的游離鈣濃度可舉200μM~5 mM之間之抗原結合活性。又，不同態樣中，可舉500μM~2.5 mM之間之抗原結合活性，另一態樣可舉200μM~2 mM之間之抗原結合活性。相異態樣中，可舉400μM~1.5 mM之間之抗原結合活性。更理想的游離鈣濃度，可舉在活體內血漿中之游離鈣濃度，具體而言，可舉在0.5 mM~2.5 mM之抗原結合活性。
在pH中性域之條件下對FcRn有結合活性之FcRn結合分域、及對Fcγ受體之結合活性比起EU編號297位之糖鏈有岩藻糖結合之天然型Fc區對Fcγ受體之結合活性高之改變Fc區、及包含該FcRn結合分域及改變Fc區之Fc 區之製造方法，可依前述FcRn結合分域及FcRn結合分域之項目記載之方法取得。編碼為各分域之聚核苷酸，可依在該項目中如後述公知之基因重組法取得。
本發明之各分域可利用多胜肽鍵直接連結，也可經由連結子連結。連結子可使用可利用基因工程導入之任意胜肽連結子、或合成化合物連結子(例如Protein Engineering(1996)9(3),299-305)揭示之連結子等，但本發明以胜肽連結子較佳。胜肽連結子的長度不特別限定，可視目的由該技術領域中具有通常知識者適當選擇，較佳長度為5個胺基酸以上(上限不特別限定，通常為30個胺基酸以下，較理想為20個胺基酸以下)，尤佳為15個胺基酸。
例如，胜肽連結子之情形，可理想地列舉：Ser
Gly‧Ser
Gly‧Gly‧Ser
Ser‧Gly‧Gly
Gly‧Gly‧Gly‧Ser(序列編號：26)
Ser‧Gly‧Gly‧Gly(序列編號：27)
Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Ser(序列編號：28)
Ser‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly(序列編號：29)
Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Ser(序列編號：30)
Ser‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly(序列編號：31)
Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Ser(序列編號：32)
Ser‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly(序列編號：33)
(Gly‧Gly‧Gly‧Gly‧Ser(序列編號：28))n
(Ser‧Gly‧Gly‧Gly‧Gly(序列編號：29))n
[n為1以上之整數]等為理想例。惟，胜肽連結子之長度或序列可視目的由該技術領域中具有通常知識者適當選擇。
合成化學物連結子(化學交聯劑)，為胜肽交聯通常使用之交聯劑，例如N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)、辛二酸二琥珀醯亞胺酯(DSS)、辛二酸二(硫琥珀醯亞胺基)酯(BS 3)、二硫雙(琥珀醯亞胺基丙酸酯)(DSP)、二硫雙(硫琥珀醯亞胺基丙酸酯)(DTSSP)、乙二醇雙(琥珀醯亞胺基琥珀酸酯)(EGS)、乙二醇雙(硫琥珀醯亞胺基琥珀酸酯)(硫-EGS)、二琥珀醯亞胺基酒石酸鹽(DST)、二硫琥珀醯亞胺基 酒石酸鹽(硫-DST)、雙[2-(琥珀醯亞胺氧羰基氧)乙基]碸(BSOCOES)、雙[2-(硫琥珀醯亞胺氧羰基氧)乙基]碸(硫-BSOCOES)等，該等交聯劑在市面上可購得。
連結各分域之連結子使用多個時，可均使用同種連結子，也可使用異種連結子。
又，上述記載例示之連結子以外，也可適當使用有例如His標籤、HA標籤、myc標籤、FLAG標籤等胜肽標籤之連結子。又，氫鍵、雙硫鍵、共價鍵、離子性交互作用或該等結合之組合而彼此結合之性質也可適當利用。例如利用抗體之CH1與CL間之親和性、利用與異Fc區組合時以前述雙專一性抗體為起源之Fc區。再者，在分域間形成之 雙硫鍵也可適當地利用。
為了將各分域以胜肽鍵連結，將編碼為該分域之聚核苷酸於同一讀框連結。聚核苷酸於同一讀框連結之方法，以限制片段之接合或融合PCR、重疊PCR等方法為公知，本發明之抗原結合分子之製作也可適當單獨或組合使用該等方法。
將編碼為各分域之聚核苷酸單離之方法也可適當採用公知方法。例如從含有多數抗原結合分域之庫從表現目的抗原結合分域之噬菌體，利用庫之製作使用之引子或庫之構建使用之具有噬菌體載體之序列之引子等的PCR，將編碼為抗原結合分域之聚核苷酸序列單離。為了取得編碼為可變區之基因，利用使用可變區基因放大用引子之5’-RACE法係屬簡便。首先，以從融合瘤細胞萃取之RNA當做模板，合成cDNA，獲得5’-RACE cDNA庫。5’-RACE cDNA庫之合成可適當使用SMART RACE cDNA放大套組等市售套組。
以獲得之5’-RACE cDNA庫為模板，以PCR法將抗體基因放大。依據公知之抗體基因序列可設計小鼠抗體基因放大用之引子。此等引子為依免疫球蛋白之次類而各不相同的鹼基序列。因此，次類理想為預先使用Iso Strip小鼠單株抗體同種型決定套組(Roche diagnostics)等市售套組決定。
具體而言，當目的為取得例如編碼為小鼠IgG之基因時，可利用將編碼為當做重鏈之γ 1、γ 2a、γ 2b、γ 3、 當做輕鏈之κ鏈與λ鏈的基因放大的引子。為了放大IgG之可變區基因，一般係利用於3’側之引子黏合有相當於接近可變區之不變區之部分的引子。另一方面，5’側之引子係利用5’ RACE cDNA庫製作套組所附帶的引子。
如前述，將單離之本發明之抗原結合分域或抗體之聚核苷酸序列定序後，製作包含編碼為pH中性域對FcRn有結合活性之FcRn結合分域之聚核苷酸及於同一讀框連結之融合基因的聚核苷酸。製作之含融合基因之聚核苷酸，以可於所望細胞表現之方式，以可作用地連結於適當的表現載體。
「細胞」、「細胞系」及「細胞培養」在本說明書以相同含意使用，如此之稱呼可包括細胞或細胞系的所有子孫。如此，例如「轉形」及「轉形細胞」之用語，無論繼代數，包括由此等而來之一次對象細胞及培養物。又，可理解由於故意或偶發的突變，並非所有子孫中的DNA的內容正確地為相同。也可包括以當初之轉形細胞篩選之實質上有相同機能或生物學的活性之改變體之子孫。當記載為相異之名稱時，從該記載之前後關係，可明白如此之意圖。
提及編碼序列之表現之情形，控制序列係指為了能在特定寄主生物作用地連結之編碼序列之表現所必要之DNA鹼基序列。例如原核生物之理想控制序列，包括起動子、視情形之操作子(operon)序列、核糖體結合部位、及可能尚未非常了解的其他序列。為了在真核細胞表現編碼序列，利用起動子、聚腺苷化信號及增強子係為公知。
關於核酸「可作用地連結」，係指該核酸與其他核酸序列在機能方面有關係。例如，前驅序列(presequence)或分泌前導的DNA，當就某多胜肽之分泌以前驅體蛋白質的形式表現的情形，與該多胜肽之DNA以可作動地結合。起動子或增強子，在其影響某編碼序列之轉錄的情形，與其序列以可作用地連結。或核糖體結合部，在位於其容易轉譯的位置的情形，以可作用地與編碼序列連結。通常，「可作用地連結」，係指結合之DNA序列連續，且為分泌前導的情形，連續且位於讀取框內。但增強子不需連續。連結可藉由以適當的限制部位接合而達成。不存在如此之部位之情形，合成寡核苷酸適應子(adaptor)或連結子可依習知的慣用方式使用。又，依前述Overlap Extensipn PCR之方法也可製作連結的核酸。
「接合」係在2個核酸片段之間形成磷酸二酯鍵之方法。為了將2個片段接合，必需使片段的末端彼此搭配。視情形，該末端在核酸內切酶消化之後立即可有搭配性。但為了適於接合，首先在核酸內切酶消化之後需將一般形成之附著末端改為平滑末端。為了成為平滑末端，將DNA於適當緩衝液中於15℃、於4種去氧核糖核苷酸三磷酸之存在下，以DNA聚合酶I或T4DNA聚合酶之Klenow片段的約10單位處理至少15分鐘。其次將DNA以酚氯仿萃取與乙醇沉澱、或二氧化矽精製精製。待連結之DNA片段係以等莫耳量加到溶液中。在該溶液中，加入ATP、接合酶緩衝液，以外，如T4DNA接合酶之接合酶係就DNA0.5 μg含 有約10單位。將DNA連結到載體的情形，載體首先由適當的限制核酸內切酶以消化作用使成線狀。成為線狀之片段其次以細菌之鹼性磷解酶或小牛腸管之磷解酶處理，而預防在接合之步驟之間之該片段自行接合。
包含編碼為本發明之抗原結合分子之聚核苷酸之表現載體之製作、該表現載體對細胞之導入、在該細胞之該聚核苷酸之表現、及從該細胞之培養液取得所表現之抗原結合分子之取得方法，依前述抗體之項目記載之方法實施。
又，本說明書引用之所有先前技術文獻，納入於本說明書作為參考。
【實施例】
以下將本發明以實施例更具體說明，但本發明不受該等實施例限制。
(實施例1)人類IL-6受體免疫寬容小鼠模型之製作
IL-6受體在配體IL-6為增殖因子之骨髓瘤有高表現，所以已知抗人類IL-6受體抗體在人類骨髓瘤之免疫不全小鼠異種移殖(xenograft)模型發揮抗腫瘤效果(Eur.J.Immunol.22,1989-93(1992))。若能藉由將抗IL-6受體抗體對小鼠投予而誘導小鼠抗IL-6受體抗體之產生，則該抗IL-6受體抗體可誘導獲得免疫，且該抗IL-6受體抗體顯示作為癌疫苗為有用。
但是由於作為抗腫瘤模型使用之免疫不全小鼠中，小鼠的免疫機能無作用，故無法誘導獲得免疫。而且即使將可溶型人類IL-6受體對正常小鼠投予，在短期間當中，會 產生對抗對於小鼠而言為異物之人類IL-6受體的小鼠抗人類IL-6受體抗體。所以，正常小鼠不能直接利用於作為評價抗人類IL-6受體抗體對小鼠抗人類IL-6受體抗體產生之影響(對抗人類IL-6受體之獲得免疫)之系統。
另一方面，人類臨床中抗體分子成為標的之抗原係人類抗原，故人類對該自體之標的抗原為免疫寬容。在人類臨床中藉由投予對抗標的抗原之抗體，會誘導對抗標的抗原之自體抗體產生的情形，係假定免疫寬容遭破壞。
所以，針對投予給小鼠之抗體是否在該小鼠能誘導對抗標的人類抗原之獲得免疫，為了進行假定人類臨床之評價，係成為近似於小鼠對於標的人類抗原為免疫寬容的狀態(僅單獨將標的人類抗原對小鼠投予時，小鼠不會產生對抗標的人類抗原的抗體)，有必要確立用以評價藉由投予對抗標的抗原之抗體，其近似免疫寬容之狀態受破壞，並誘導產生對抗標的抗原之自體抗體之試驗系。
而為了使藉由將標的人類抗原對小鼠投予不會在該小鼠中產生對抗標的人類抗原之自體抗體，構建將對於從抗原表現誘導抗體產生為必要之CD4陽性T細胞利用抗小鼠CD4抗體除去足夠量的試驗系。
作為係標的人類抗原之可溶型人類IL-6受體之血漿中濃度維持穩定狀態(約20ng/mL)之模型，構建以下試驗模型。在正常小鼠(C57BL/6J mouse、Charles River Japan)之背部皮下埋入填充有可溶型人類IL-6受體之輸液泵浦(MINI-OSMOTIC PUMP MODEL2004、alzet)，以製作血漿中 可溶型人類IL-6受體濃度維持穩定狀態的動物模型。
試驗以2群(各群N=4)實施。對於仿效免疫寬容的群的小鼠，為了抑制產生對抗可溶型人類IL-6受體之小鼠抗體，將抗小鼠CD4單株抗體(R&D)對其尾靜脈以20mg/kg單次投予，之後每10日1次同樣投予(以下稱為抗小鼠CD4抗體投予群)。另一群為對照群，亦即作為未投予抗小鼠CD4單株抗體之抗小鼠CD4抗體非投予群。之後，在小鼠背部皮下埋入填充有92.8μg/mL之可溶型人類IL-6受體之輸液泵浦。將埋入輸液泵浦後經時採取的血液立刻於4℃以15,000 rpm進行15分鐘離心分離以獲得血漿。將分離的血漿直到實施測定為止保存在設定為-20℃以下之冷凍庫。可溶型人類IL-6受體(hsIL-6R)之血漿中濃度依以下方法測定。
小鼠之血漿中hsIL-6R濃度，係以電化學發光法測定。製備調整為2000、1000、500、250、125、62.5、31.25 pg/mL之hsIL-6R檢量線試樣及稀釋50倍以上之小鼠血漿測定試樣，與SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)釕化之Monoclonal Anti-human IL-6R Antibody(R&D)及Biotinylated Anti-human IL-6 R Antibody(R&D)及tocilizumab混合，於37℃使反應1晚。製備成Tocilizumab之終濃度成為333μg/mL。之後，將反應液分注到MA400 PR Streptavidin Plate(Meso Scale Discovery)。再於室溫使反應1小時並洗滌反應液後，分注Read Buffer T(×4)(Meso Scale Discovery)。之後立即以SECTOR PR 400 reader(Meso Scale Discovery)進行測定。人類IL-6受體濃度係由檢量線之回應，使用解析軟體SOFTmax PRO(Molecular Devices)計算。該方法測定之在正常小鼠之個體別之血漿中hsIL-6R濃度變動如圖1。
其結果，抗小鼠CD4抗體非投予群的所有小鼠中，輸液泵浦在小鼠背部皮下埋入14日後，未認有血漿中hsIL-6R濃度下降。亦即，若產生小鼠抗人類IL-6受體抗體，血漿中hsIL-6R濃度會下降，故顯示該等群產生了小鼠抗人類IL-6受體抗體。另一方面，抗小鼠CD4抗體投予群的所有小鼠中，未觀察到血漿中hsIL-6R濃度下降。亦即，在輸液泵浦之有效期間28日間中，大約維持固定(約20ng/mL)的血漿中hsIL-6R濃度，故顯示未產生小鼠抗人類IL-6受體抗體。
由上述結果，可確認藉由事前投予抗小鼠CD4抗體，單獨投予為標的抗原之人類IL-6受體在正常小鼠未誘導獲得免疫。以後之實施例中，抗小鼠CD4抗體投予模型係當作評價利用抗人類IL-6受體抗體投予來誘導對人類IL-6受體之獲得免疫之誘導之系統。
(實施例2)在人類IL-6受體免疫寬容正常小鼠模型中，通常抗IL-6受體抗體及pH依存性的抗人類IL-6受體抗體所為之獲得免疫誘導效果之比較
為了誘導對抗標的抗原之獲得免疫，必需將攝入抗原表現細胞之細胞內之標的抗原由該細胞中之溶體適度分解之後，藉由結合於MHC類別I或MHC類別II而使該標的 抗原之片段胜肽被抗原表現。被抗原表現之胜肽愈多，據認為免疫會更強誘導，所以增強對抗標的抗原之獲得免疫之誘導之方法，據認為有在抗原表現細胞之細胞內送入更多標的抗原之方法。
通常，若抗原以非專一性的送入抗原表現細胞，會直接從內體移動到溶體，所以能將片段胜肽做抗原表現。但，於通常之IgG抗體結合於抗原的情形，由於IgG抗體會與FcRn結合而從內體內再循環到細胞表面(血漿中)，所以，據認為與抗體結合之抗原也不會移到溶體而是再循環到細胞表面(血漿中)。所以，藉由投予通常的IgG抗體，會使標的抗原之分解受抑制。其結果，在抗原表現細胞中之溶體經適度分解之標的抗原之片段胜肽不會被抗原表現，據認為反而使對標的抗原之獲得免疫之誘導下降。而，在血漿中之pH7.4與標的抗原結合且於內體內之酸性條件下之pH5.0-pH6.5將抗原解離之有pH依存的結合活性的IgG抗體(WO2009/125825)，由於能在抗原表現細胞之酸性內體內將標的抗原解離，所以藉由使用該IgG抗體僅使標的抗原移到抗原表現細胞之溶體並使該標的抗原之片段胜肽被抗原表現，據認為可藉由使將抗原解離的IgG抗體與FcRn結合，而從內體內再循環到細胞表面(血漿中)，而不做抗原表現。
而，使用在實施例1確立的人類IL-6受體免疫寬容正常小鼠模型，驗證通常之抗人類IL-6受體IgG抗體與pH依存的抗人類IL-6受體IgG抗體之獲得免疫誘導效果。作 為通常之抗人類IL-6受體IgG抗體，使用由WO2009/125825記載之H54-IgG1(序列編號：38)及L28-CK(序列編號：39)構成的H54/L28-IgG1。作為pH依存的抗人類IL-6受體IgG抗體，使用由VH3-IgG1(序列編號：17)與VL3-CK(序列編號：40)構成的Fv4-IgG1。抗體之製備使用參考實施例1記載之方法實施。
使用由人類FcRn基因轉殖小鼠(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg line 32 +/+ mouse、Jackson Laboratories(Methods Mol.Biol.(2010)602,93-104)確立之人類IL-6受體免疫寬容小鼠模型，驗證H54/L28-IgG1及Fv4-IgG1之獲得免疫誘導效果。將H54/L28-IgG1及Fv4-IgG1對人類IL-6受體免疫寬容小鼠模型投予。具體而言，與實施例1同樣埋入輸液泵浦3日後，將抗人類IL-6受體抗體對於其尾靜脈以I mg/kg單次投予。抗人類IL-6受體抗體之投予後經時採血。將採取的血液立刻於4℃以15,000 rpm進行15分鐘離心分離以獲得血漿。將分離的血漿直到實施測定為止保存在設定為-20℃以下之冷凍庫。血漿中hsIL-6R之血漿中濃度依與實施例1記載之方法為相同方法測定。
對照(抗人類IL-6受體抗體非投予群)、H54/L28-IgG1及Fv4-IgG1投予後，各群之平均血漿中hsIL-6R濃度之變動如圖2。對照之全部動物中與實施例1同樣，血漿中hsIL-6R濃度大致維持為一定，顯示未產生小鼠抗人類IL-6受體抗體。於投予了H54/L28-IgG1之群中，相較於對照，全部動物之血漿中hsIL-6R濃度認為有大幅上升， 上升狀態持續28日。此據認為係由於hsIL-6R以非專一性攝入細胞後被直接在溶體分解，相對於此結合於IgG抗體之hsIL-6R會由於FcRn而以抗體抗原複合體的形式再循環到血漿中，所以hsIL-6R之清除下降，因而血漿中hsIL-6R濃度上升。由於該上升狀態持續28日，故與對照同樣，顯示投予了H54/L28-IgG1之群中，未誘導小鼠抗人類IL-6受體抗體之產生。於投予了Fv4-IgG1之群之全部動物中，相較於對照，血漿中hsIL-6R濃度上升，但比起投予H54/L28-IgG1之群，血漿中hsIL-6R濃度上升的程度明顯低落。此係由於pH依存的結合抗體在內體內將抗原解離，所以hsIL-6R之清除下降受抑制，因而血漿中hsIL-6R濃度之上升亦受抑制。由該結果，可認為：pH依存的結合抗體比起通常抗體，會有更多標的抗原在抗原表現細胞之內體解離並促進標的抗原移到溶體。但由於hsIL-6R濃度上升的狀態持續28日，所以與H54/L28-IgGI同樣，顯示Fv4-IgG1未誘導小鼠抗人類IL-6受體抗體之產生。
從該結果可知：使用通常IgG抗體、及在抗原表現細胞之內體內將抗原解離並使移到溶體之pH依存的結合IgG抗體，未能誘導對抗標的抗原之獲得免疫。
(實施例3)在人類IL-6受體免疫寬容人類FcRn基因轉殖小鼠模型中，pH依存的IL-6受體結合及在pH7.4之FcRn結合增強所帶來之獲得免疫誘導效果的影響 (3-1)概要
通常的IgG1抗體或pH依存性結合IgG1抗體，未能誘 導對抗標的抗原之獲得免疫在實施例2中已確認。另一方面，作為使T-cell epitope peptide之免疫原性增強之方法，藉由將T-cell epitope peptide與Fc融合，並將其Fc部分對FcRn在pH7.4之結合增強，使T-cell epitope peptide更移到溶體之方法，最近已有人報告(J.Immunol.181,7550-61(2008))。FcRn係在抗原表現細胞表現，所以藉由使Fc部分對FcRn在pH7.4之結合增強，能促進T-cell epitope peptide之抗原表現。但是該方法揭示之成為抗原之胜肽直接與Fc融合而得之分子，未能作為抗原結合分子與癌抗原結合，所以該分子無法對癌細胞直接發揮作用。再者，增強Fc部分對FcRn在pH7.4之結合之方法，雖然在體外會使T-cell epitope peptide之免疫原性增強，但在體內反而會使免疫原性減少，在體內未顯示效果。如此，將在pH7.4與FcRn結合增強之Fc及標的抗原直接融合而得之分子，未能顯示對標的抗原之結合活性，所以未能對標的抗原直接作用，而且在體內使FcRn結合增強反而會顯示使免疫原性減少的結果。
由實施例2及至今為止的報告，驗證藉由投予對通常的IgG1抗體(H54/L28-IgG1)導入使在pH7.4之FcRn結合增強之改變而得之抗體(H54/L28-F157)、及對pH依存的結合IgG1抗體(Fv4-IgG1)導入使在pH7.4FcRn結合增強之改變而得之抗體(Fv4-F157)，是否能誘導對抗標的抗原之獲得免疫。
(3-2)抗體之製作
作為FcRn結合有增強之通常的抗人類IL-6受體IgG抗體，使用由H54-F157(序列編號：41)及L28-CK(序列編號：39)構成的H54/L28-F157。作為FcRn結合有增強之pH依存的抗人類IL-6受體IgG抗體，使用由VH3-F157(序列編號：42)與VL3-CK(序列編號：40)構成的Fv4-FI57。抗體之製備使用參考實施例1記載的方法實施。
(3-3)對於人類FcRn之親和性之測定
為了決定實施例2製作之Fv4-IgG1與Fv4-F157之Fc部分(各稱為IgG1與F157)對人類FcRn在pH7.0之親和性，依以下方法測定由VH3-IgG1(序列編號：17)與L(WT)-CK(序列編號：18)構成之VH3/L(WT)-IgG1，及由VH3-F157(序列編號：42)與L(WT)-CK(序列編號：18)構成之VH3/L(WT)-F157對人類FcRn之親和性。
使用Biacore T100(GE Healthcare)，進行人類FcRn與抗體之動力理論解析。在以胺偶聯法適量固定protein L(ACTIGEN)之Sensor chip CM4(GE Healthcare)上，使目的抗體被捕捉。其次注入FcRn稀釋液及作為空白之運行緩衝液，使捕捉在感應晶片上的抗體與人類FcRn相互作用。運行緩衝液使用50 mmol/L sodium phosphate、150 mmol/L NaCl、0.05%(w/v)Tween20、pH7.0，FcRn的稀釋也使用各自的緩衝液。感應晶片之再生使用10 mmol/L Glycine-HCl,pH1.5。測定均在25℃實施。依據從測定獲得之感應圖算得之為動力學參數之結合速度常數ka(1/Ms)、及解離速度常數kd(1/s)，記算各抗體對人類 FcRn之KD(M)(親和性)。各參數之計算，使用Biacore T100 Evaluation軟體(GE Healthcare)。
IgG1與F157對人類FcRn之親和性如表7。F157對人類FcRn之親和性，相較於IgG1確認約有600倍提高。
Figure 101135762-A0202-02-0242-42
(3-4)在抗體之投予試驗中，抗原(可溶型人類IL-6受體)之血漿中濃度之變動
然後，使用在試驗1中從人類FcRn基因轉殖小鼠(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg line 32 +/+ mouse、Jackson Laboratories、Methods Mol.Biol.(2010)602,93-104)確立的人類IL-6受體免疫寬容小鼠模型。將H54/L28-F157及Fv4-F157對於人類IL-6受體免疫寬容小鼠模型投予。具體而言，與實施例1同樣，進行輸液泵浦埋入3日後，將抗人類IL-6受體抗體對其尾靜脈以1 mg/kg單次投予(各群之個體數為3)。對小鼠投予抗人類IL-6受體抗體後經時採血。再者，於試驗2僅同樣投予Fv4-F157後經時採血。將採取的血液立即於4℃以15,000 rpm離心15分鐘而得血漿。分離的血漿直到實施測定為止保存在設定為-20℃以下的冷凍庫。血漿中hsIL-6R濃度依與實施例1記載之方法為相同方法測定。
試驗1之H54/L28-F157與Fv4-F157及試驗2之Fv4-F157投予後，各群之平均血漿中hsIL-6R濃度變動， 以及實施例2獲得之對照(抗體非投予群)、H54/L28-IgG1及Fv4-IgG1投予後，各群平均血漿中hsIL-6R濃度變動，如圖3。H54/L28-F157之投予群中，與H54/L28-IgG1之投予群同樣，認為血漿中hsIL-6R濃度上升，但其上升為暫時的，在13日後，血漿中hsIL-6R濃度與對照下降至為同等水平。之後亦維持與對照為同等水平28日，故與H54/L28-IgG1同樣顯示未產生小鼠抗人類IL-6受體抗體，可知僅增強在pH7.4對FcRn之結合，未能誘導對抗標的抗原之獲得免疫。此係如J.Immunol.(2008)181,7550-7561報告，在pH7.4對FcRn之結合有增強之Fc區融合T-cell epitope peptide而得之分子，未能增強對抗T-cell epitope peptide之獲得免疫之誘導並不矛盾。相對於此，在Fv4-F157之投予群中，抗體之投予後認為血漿中hsIL-6R濃度急劇下降，投予1日後下降hsIL-6R濃度到檢測極限以下(1.56ng/mL以下)。
雖未受特定理論拘束，但上述現象可能由以下說明。對抗標的抗原之獲得免疫之增強，據認為依存於由於投予之抗體而攝入抗原表現細胞之標的抗原之量。攝入之標的抗原的量，可利用血漿中之標的抗原濃度是下降多少來評價。攝入細胞後，pH依存的結合抗體(Fv4-IgG1)雖在酸性內體內將標的抗原解離，但是標的抗原所結合之pH依存的結合抗體在攝入細胞之過程是取決於非專一性胞飲作用，攝入速度慢，所以血漿中標的抗原濃度未下降到比對照低的水平(圖4)。又，僅增強在pH7.4之FcRn結合的抗體 (H54/L28-F157)，雖在pH7.4利用對FcR之結合而被積極的攝入細胞內，但是由於標的抗原以維持與抗體結合之狀態，亦即以抗體與標的抗原之複合體的形式，大部分由維持FcRn原本的機能而再循環到細胞表面，所以血漿中之標的抗原之濃度未下降至比對照低的水平(圖5)。相對於此，在pH7.4經由對於FcRn之結合為媒介而被積極的攝入細胞內之在pH7.4之FcRn結合有增強之pH依存的結合抗體(Fv4-F157)，在內體內會將標的抗原解離，所以能將抗原送入溶體，且同時已將標的抗原解離之抗體會由於FcRn原本的機能而再循環到細胞表面，再度與標的抗原結合，可將同樣的標的抗原再送入溶體(圖6)。藉由反複該周期，僅增強於pH7.4之FcRn結合的pH依存的結合抗體，能將血漿中之標的抗原之濃度比對照大幅下降至較低水平。
試驗1及試驗2中，投予Fv4-F157之6隻小鼠之個體別之血漿中hsIL-6R濃度，各如圖7及圖8。投予Fv4-F157之6隻小鼠中，#7、#8、#10之3隻小鼠在13日以後hsIL-6R濃度上升，回到與對照為同等水平，之後維持與對照同等水平28日。另一方面，其餘的#9、#11、#12的3隻小鼠，hsIL-6R濃度未回復，之後也維持28日為該低值，所以據認為該等3隻小鼠中，產生小鼠抗人類IL-6受體抗體，且人類IL-6受體從血漿中被除去。而，依以下方法測定投予了Fv4-F157之6隻小鼠的小鼠抗人類IL-6受體抗體之抗體價。
(3-4)抗體之投予試驗中，小鼠所產生之對抗抗原(可 溶型人類IL-6受體)之小鼠抗體(小鼠抗人類IL-6受體抗體)之抗體價之變動
小鼠之血漿中小鼠抗人類IL-6受體抗體之抗體價，係以電化學發光法測定。首先將人類IL-6受體分注到MA100 PR Uncoated Plate(Meso Scale Discovery)，於4℃靜置1晚，製成人類IL-6受體固相化板。將分注有經稀釋50倍之小鼠血漿測定試樣的人類IL-6受體固相化板於4℃靜置1晚。之後，將以SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)釕化的anti-mouse IgG(whole molecule)(Sigma-Aldrich)於室溫反應1小時後的該板洗淨。在該板分注Read Buffer T(×4)(Meso Scale Discovery)後，立刻以SECTOR PR 400 reader(Meso Scale Discovery)進行測定。
Fv4-F157投予群中，小鼠抗人類IL-6受體抗體(抗hsIL-6R抗體)之抗體價之變動如圖7及圖8。其結果，hsIL-6R濃度回到與對照為同等水平的#7、#8、#10的3隻小鼠中，未認為小鼠抗人類IL-6受體抗體之抗體價上升，但hsIL-6R濃度維持28日為低值之#9、#11、#12之3隻小鼠中，認為小鼠抗人類IL-6受體抗體(抗hsIL-6R抗體)之抗體價上升。由上述結果，發現：藉由將對FcRn之結合有增強之pH依存的抗人類IL-6受體IgG抗體即Fv4-F157對於人類IL-6受體免疫寬容正常小鼠模型投予，能在3/6例誘導對抗標的抗原人類IL-6受體之獲得免疫。由此，發現：即使在體內將通常的IgG抗體(H54/L28-IgG1)、或對標 的抗原為pH依存的結合的IgG抗體(Fv4-IgG1)、或僅增強在pH7.4對FcRn之結合之IgG抗體(H54/L28-IgG1)投予，仍未能誘導對抗標的抗原之獲得免疫，而只有對標的抗原為pH依存的結合而且在pH7.4對FcRn之結合有增強之IgG抗體(Fv4-F157)，可誘導對抗標的抗原之獲得免疫。
(3-5)抗體之投予試驗中，由小鼠產生之對抗被投予之抗體(Fv4-F157)之小鼠抗體(小鼠抗Fv4-F157抗體)之抗體價之變動
利用將標的抗原與使在pH7.4之FcRn結合增強之Fc直接融合而得之分子作為藥劑之上述方法(J.Immunol.(2008)181,7550-7561)，假定可產生對抗標的抗原之抗體，但對抗標的抗原之抗體會對藥劑自體也結合，所以會作為抗藥劑抗體作用，造成藥劑作用減弱。所以，據認為使用標的抗原與藥劑直接融合之分子(例如J.Immunol.(2008)181,7550-7561或J.Immunol.(2011),186,1218-1227記載之分子)，意指會誘導對抗標的抗原之抗體產生，亦即誘導使藥劑作用減弱之對抗藥劑本身的抗藥劑抗體，所以並不理想。
對FcRn之結合有增強之pH依存的抗人類IL-6受體IgG抗體(Fv4-F157)，為具有對於為標的抗原之人類IL-6受體以pH依存的結合之活性的藥劑，並非直接將標的抗原融合而得之分子。所以，Fv4-F157如圖7及圖8所示，會有誘導對抗標的抗原人類IL-6受體之抗體產生，但不產生對抗藥劑本身(Fv4-F157)之抗藥劑抗體的可能性。而投予 了Fv4-F157之6隻小鼠中，小鼠抗Fv4-F157抗體之抗體價依以下方法測定。
小鼠之血漿中抗Fv4-F157抗體之抗體價，係以電化學發光法測定。首先將人類IL-6受體分注到MA100 PR Uncoated Plate(Meso Scale Discovery)，於4℃靜置1晚，製成人類IL-6受體固相化板。將分注有經稀釋50倍之小鼠血漿測定試樣的人類IL-6受體固相化板於4℃靜置1晚。之後，將以SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)釕化的anti-mouse IgG(whole molecule)(Sigma-Aldrich)於室溫反應1小時後的該板洗淨。在該板分注Read Buffer T(×4)(Meso Scale Discovery)後，立刻以SECTOR PR 400 reader(Meso Scale Discovery)進行測定。
Fv4-F157投予群中，小鼠抗Fv4-F157抗體之抗體價之變動及小鼠抗人類IL-6受體抗體(抗hsIL-6R抗體)之抗體價之變動如圖9及圖10。Fv4-F157投予群中，不論是否有小鼠抗人類IL-6受體抗體(抗hsIL-6R抗體)產生，任一小鼠均未認為有小鼠抗Fv4-F157抗體之產生。由此，在pH7.4對FcRn之結合有增強之pH依存的抗人類IL-6受體IgG抗體(Fv4-F157)，會誘導對抗標的抗原(人類IL-6受體)之抗體產生，另一方面，不會誘導對抗藥劑自身(Fv4-F157)之抗體產生，所以據認為在pH7.4對FcRn之結合有增強之pH依存的(抗人類IL-6受體)IgG抗體作為誘導對抗標的抗原之獲得免疫之藥劑極有用。
至今為止，作為誘導對抗癌抗原之獲得免疫之方法，據報告有：使用使抗原表現細胞表現之受體所結合之抗體與欲誘導獲得免疫之癌抗原融合而得之藥劑分子之方法(J.Immunol.(2011)186,1218-1227)。如此的藥劑分子無法直接與癌抗原結合並發揮作用(圖11)。所以，如此的藥劑分子無法如習知之抗體醫藥對癌抗原顯示機能抑制作用或對癌細胞顯示直接的細胞傷害活性作用。再者，如此的分子，藥劑分子全體會攝入抗原表現細胞並被分解，所以藥劑分子的片段胜肽係被表現給MHC class II及MHC class I。所以，據認為不僅會誘導對抗癌抗原之液性免疫及細胞性免疫，還誘導對抗藥劑自身之液性免疫，據認為容易因為抗藥劑抗體之產生造成效果減弱，故不理想(圖11)。
相對於此，本實施例找到的於pH7.4對FcRn之結合增強且以pH依存性的與標的癌抗原結合之抗體，可直接與癌抗原結合並發揮作用(圖12)。所以，如習知之抗體醫藥能對癌抗原顯示機能抑制作用或對癌細胞顯示直接的細胞傷害活性作用。再者，如此的抗體，在酸性內體內將標的癌抗原解離並且抗體自身再循環到細胞表面，可選擇性將標的癌抗原分解，且標的抗原之片段胜肽對MHC class II及MHC class I表現，所以不會誘導產生對抗抗體自身之抗藥劑抗體，而可對於癌抗原誘導選擇性的液性免疫及細胞性免疫(圖12)。
(實施例4)人類IL-6受體基因敲入(knock in)小鼠中，pH依存的IL-6受體結合與在pH7.4之FcRn結合增強 所造成對於內因性人類IL-6受體之獲得免疫之誘導效果之影響 (4-1)概要
如實施例3，藉由將對於通常的IgG1抗體(H54/L28-IgG1)導入在pH7.4使FcRn結合增強之改變之抗體(H54/L28-F157)對於人類IL-6受體免疫寬容人類FcRn基因轉殖小鼠模型投予，不會在該小鼠誘導對抗標的抗原之獲得免疫，但藉由將對pH依存的結合IgG1抗體(Fv4-IgGI)導入於pH7.4之FcRn結合增強之改變的抗體(Fv4-F157)對該小鼠投予，能誘導同小鼠對抗標的抗原之獲得免疫。
但前述模型係誘導對抗從外投予之人類抗原的獲得免疫的模型，但當探討前述獲得免疫之誘導應用在臨床時，宜確認是否會對於成為完全免疫寬容之內因性之抗原破壞其免疫寬容而誘導獲得免疫。
而，利用表現人類IL-6受體之人類IL-6受體基因敲入小鼠對於內因性人類IL-6受體為免疫寬容，藉由對該小鼠投予前述抗體，來驗證是否可誘導對抗內因性人類IL-6受體之獲得免疫。
(4-2)抗體之製作
作為對小鼠FcRn之結合有增強之通常的抗人類IL-6受體抗體，製作包含H54-mF3(序列編號：124)及L28-mCK(序列編號：125)之H54/L28-mF3。作為pH依存的抗人類IL-6受體IgG抗體，製作包含VH3-mIgG1(序列編 號：126)與VL3-mCK(序列編號：127)之Fv4-mIgG1、及包含VH3-mIgG2a(序列編號：128)與VL3-mCK(序列編號：127)之Fv4-mIgG2a。作為對小鼠FcRn之結合有增強之pH依存的抗人類IL-6受體IgG抗體，製作包含VH3-mF3(序列編號：129)與VL3-mCK(序列編號：127)之Fv4-mF3、及對小鼠FcγR之結合也增強之包含VH3-mFa30(序列編號：130)與VL3-mCK(序列編號：127)之Fv4-mFa30。該等抗體使用參考實施例1記載之方法製備。
(4-3)對小鼠FcRn及小鼠FcγR之親和性之測定
使用依(3-3)所示方法測定之值，決定製作之Fv4-mIgG1、Fv4-mIgG2a、Fv4-mF3、Fv4-mFa30之Fc部分即mIgG1、mIgG2a、mF3及mFa30對小鼠FcRn在pH7.0之親和性。
FcγR之細胞外分域依以下方法製備。首先，依NCBI登錄的序列資訊，將FcγR之細胞外分域之基因以該技術領域中具有通常知識者公知的方法合成。具體而言，製作編碼為作為mFcγRI之NCBI之存取編號NP_034316(版本編號NP_034316.1)、作為mFcγRII之NCBI之存取編號NP_034317(版本編號NP_034317.1)、作為FcγRIII之NCBI之存取編號NP_034318(版本編號NP_034318.2)、作為FcγRIV之NCBI之存取編號NP_653142(版本編號NP_653142.2)表示之各多胜肽之C末端附加有His標籤的FcγR之細胞外分域的各基因。
製作將獲得之基因片段插入於動物細胞表現載體而得 之表現載體。將製作之表現載體對於來自人類胎腎癌細胞之FreeStyle293細胞(Invitrogen公司)過渡性導入，將表現目的蛋白質之轉形導入細胞之培養上清以通過0.22μm濾器獲得培養上清。從獲得之培養上清將各FcγR之細胞外分域原則依其次4步驟精製。第1步驟為離子交換管柱層析(第1步驟)、第2步驟為對His標籤之親和性管柱層析(HisTrap HP)(第2步驟)、第3步驟為凝膠過濾管柱層析(Superdex200)(第3步驟)、第4步驟為無菌過濾(第4步驟)。第1步驟之離子交換管柱層析之管柱，在mFcγRI之精製使用Q Sepharose HP、mFcγRII及mFcγRIV之精製使用SP Sepharose FF、mFcγRIII之精製使用SP Sepharose HP。又，在第3步驟以後之精製，溶劑使用D-PBS(-)，但mFcγRIII之精製使用含0.1M精胺酸之D-PBS(-)。經精製之含FcγR之細胞外分域之溶液於280 nm之吸光度使用分光光度計測定，使用依PACE等方法算得之吸光係數，從前述測定值計算精製FcγR之細胞外分域之濃度(Protein Science(1995)4,2411-2423)。
各改變抗體與上述中製備之Fcγ受體之細胞外分域間之交互作用，使用Biacore T100(GEhealthcare)、Biacore T200(GEhealthcare)、Biacore A100、Biacore 4000解析。運行緩衝液中，使用HBS-EP+(GEhealthcare)，於測定之溫度25℃測定該交互作用。使用在Series S Sensor Chip CM5(GEhealthcare)或Series S sensor Chip CM4(GEhealthcare)以胺偶聯法固定有Protein L(ACTIGEN 或BioVision)之晶片。
使該等之感應晶片捕捉目的抗體，使與以運行緩衝液稀釋之Fcγ受體之細胞外分域交互作用，比較該各分域對各抗體之結合量。惟，Fcγ受體之細胞外分域結合量依存於捕捉在感應晶片之抗體之量，故比較Fcγ受體之細胞外分域之結合量除以各抗體之捕捉量得到之校正值。又，使10 mM glycine-HCl、pH1.5反應，將捕捉到感應晶片之抗體洗滌，將感應晶片再生並反複使用。
又，各改變抗體對Fcγ受體之細胞外分域之KD值依以下之方法解析動力理論。首先，使上述感應晶片捕捉目的抗體，使與以運行緩衝液稀釋之Fcγ受體交互作用，從對於獲得之感應圖以Biacore Evaluation軟體將測定結果以1：1 Langmuir binding model進行global fitting而計算之結合速度常數ka(L/mol/s)、及解離速度常數kd(1/s)之值，從其計算得計算解離常數KD(mol/L)。
mIgG1、mIgG2a、mF3及mFa30對小鼠FcRn之親和性如表8、對小鼠FcγR之親和性如表9。
Figure 101135762-A0202-02-0252-43
Figure 101135762-A0202-02-0253-44
(4-4)在抗體之投予試驗中，抗原(可溶型人類IL-6受體)之血漿中濃度之變動
其次，從投予了Fv4-mIgG1、Fv4-mIgG2a、Fv4-mF3、Fv4-mFa30及H54/L28-mF3之人類IL-6受體基因敲入小鼠(參考實施例25)經時採血。將採取的血液立即於4℃以15,000 rpm離心15分鐘分離獲得血漿。將分離的血漿，直到實施測定為止保存在設定為-20℃以下之冷凍庫。血漿中hsIL-6R濃度，與實施例1記載之方法以同方法測定。
抗體非投予群、Fv4-mIgG1、Fv4-mIgG2a、Fv4-mF3、Fv4-mFa30及H54/L28-mF3投予群之平均血漿中hsIL-6R濃度變動如圖26。Fv4-mIgG1、Fv4-mIgG2a之投予群之血漿中hsIL-6R濃度認有上升。另一方面，對小鼠FcRn之結合有增強之Fv4-mF3、H54/L28-mF3，及對小鼠FcRn及小鼠FcgR之結合有增強之Fv4-mFa30之投予群之血漿中，比起抗體非投予群，hsIL-6R濃度有顯著減少。
(4-5)抗體之投予試驗中，由小鼠產生之對抗抗原(可溶型人類IL-6受體)之小鼠抗體(小鼠抗人類IL-6受體抗體)之抗體價之變動
小鼠血漿中之抗hsIL-6R抗體價係以電科學發光法測 定。首先，將稀釋50倍之小鼠血漿試樣於調整為30μg/mL之抗Fv4個體遺傳型(idiotype)抗體混合，於室溫反應1晚。同個體遺傳型抗體係將Fv4-M73(WO2009/125825)對兔免疫而得之血清以離子交換樹脂精製後，以固定有Fv4-M73之管柱進行親和性精製，之後以人類固定化管柱吸收而得。對前述混合溶液添加含有以EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin and Biotinylation Kits(Pierce)生物素化的hsIL-6R 1μg/mL、以SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)釕化的SULFO-anti mouse IgG(H+L)antibody(BECKMAN COULTER)2μg/mL的溶液50μg/mL並混合，於4℃反應1晚。此時，為了防止測定試樣中所含之投予檢體與hsIL-6R結合，而檢測到對抗投予檢體之ADA，預先將過量之抗Fv4個體遺傳型抗體添加到試樣。之後，將前述反應液分注到MA400 PR Streptavidin Plate(Meso Scale Discovery)。再於25℃反應1小時後洗淨的各井中，分注Read Buffer T(×4)(Meso Scale Discovery)，立即使用SECTOR PR 400 reader(Meso Scale Discovery)測定各井中之反應液之吸光度。
抗體非投予群、Fv4-mIgG1、Fv4-mIgG2a、Fv4-mF3、Fv4-mFa30及H54/L28-mF3投予群之各個體之小鼠抗人類IL-6受體抗體(抗hsIL-6R抗體)之抗體價之變動，如圖27至圖31。其結果，投予了對小鼠FcRn之結合未增強之Fv4-mIgG1與Fv4-mIgG2a、及對小鼠FcRn之結合增強但對人類IL-6受體未有DH依存的結合的H54/L28-mF3之群之 任一個體，均未有小鼠抗人類IL-6受體抗體(抗hsIL-6R抗體)之抗體價之上升。另一方面，投予了對小鼠FcRn之結合有增強之pH依存的結合抗體即Fv4-mF3、及對小鼠FcRn之結合增強且對小鼠FcgR之結合有增強之pH依存的結合抗體即Fv4-mFa30之群，確認有小鼠抗人類IL-6受體抗體(抗hsIL-6R抗體)之抗體價上升之個體存在。
由以上顯示：對標的抗原有pH依存的結合活性且於pH7.4對FcRn之結合有增強之抗原結合分子，能誘導對抗成為免疫寬容之內因性標的抗原的獲得免疫。由此，據認為如此的分子對自體之癌抗原也能誘導獲得免疫，故作為癌治療藥極有前景。
(參考實施例1)
抗體之表現使用以下之方法進行。將人類胎兒腎癌細胞來源HEK293H株(Invitrogen)懸浮於含10%胎牛血清(Invitrogen)之DMEM培養基(Invitrogen)，以5~6× 105細胞/mL之細胞密度各接種10 mL到黏著細胞用培養皿(直徑10 cm,CORNING)之各皿，於CO2培養箱(37℃、5% CO2)內培養一日夜後，吸走培養基，添加CHO-S-SFM-II(Invitrogen)培養基6.9 mL。將製備的質體以脂轉染法導入到細胞。回收獲得之培養上清後，進行離心分離(約2000 g、5分鐘、室溫)，去除細胞，再通過0.22μm濾器MILLEX(R)-GV(Millipore)滅菌並獲得培養上清。從獲得之培養上清使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)依該技術領域中具有通常知識者 公知之方法精製表現的抗體。精製抗體濃度使用分光光度計測定於280 nm之吸光度。從獲得之值使用依Protein Science(1995)4,2411-2423記載之方法算出之吸光係數計算抗體濃度。
(參考實施例2)與鈣離子結合之人類生殖細胞系列序列之探索 (2-1)鈣依存性地結合於抗原之抗體
以鈣依存性地結合於抗原之抗體(鈣依存性抗原結合抗體)，係由於鈣之濃度使與抗原之交互作用變化之抗體。鈣依存性抗原結合抗體，據認為係介由鈣離子之媒介而結合於抗原，所以形成抗原側之抗原決定部位之胺基酸，係能成為可螯合鈣離子之負電荷之胺基酸或氫鍵接受者之胺基酸。從形成如此之抗原決定部位之胺基酸之性質，可導向藉由導入組胺酸製作之以pH依存性地結合於抗原之結合分子以外之抗原決定部位。再者，如圖13所示，藉由使用併具鈣依存性及以pH依存性地結合於抗原之性質之抗原結合分子，能製作可分別導向有廣泛性質之多樣抗原決定部位之抗原結合分子。而據認為若能構建含鈣結合模體之分子之集合(Ca庫)，且從該分子之集團取得抗原結合分子，能有效率地取得鈣依存性抗原結合抗體。
(2-2)人類生殖細胞系列序列之取得
含有鈣結合模體之分子之集合之例可舉該分子為抗體之例。換言之，可考慮含鈣結合模體之抗體庫為Ca庫之情形。
至今為止無人報告以含人類生殖細胞系列序列之抗體與鈣離子結合之情事。所以，為了判定含人類生殖細胞系列序列之抗體是否會與鈣離子結合，選殖包含以從Human Fetal Spreen Poly RNA(Clontech)製備之cDNA當做模板之人類生殖細胞系列序列的抗體之生殖細胞系列的序列。將經選殖之DNA片段插入動物細胞表現載體。將獲得之表現載體之鹼基序列依該技術領域之人士公知之方法決定，其序列編號如表10。編碼為序列編號：5(Vk1)、序列編號：6(Vk2)、序列編號：7(Vk3)、序列編號：8(Vk4)及序列編號：43(Vk5-2)之聚核苷酸，與利用PCR法編碼為天然型Kappa鏈之不變區(序列編號：44)之聚核苷酸連結成的DNA片段，納入動物細胞表現用載體。又，編碼為序列編號：46(Vk1)、序列編號：47(Vk2)、序列編號：48(Vk3)及序列編號：49(Vk4)及序列編號：117(Vk5)之聚核苷酸，與編碼為利用PCR法之序列編號：11表示之IgG1之C末端2個胺基酸缺失之多胜肽之聚核苷酸連結之DNA片段，納入動物細胞表現用載體。製作之改變體之序列經以該技術領域之人士公知之方法確認。
Figure 101135762-A0202-02-0257-45
(2-3)抗體之表現與精製
將插入有取得之5種人類生殖細胞系列序列的DNA片段的動物細胞表現載體導入動物細胞。抗體之表現係以以下方法進行。將人類胎兒腎細胞來源FreeStyle 293-F株(Invitrogen)懸浮於FreeStyle 293 Expression Medium培養基(Invitrogen)，以1.33 x 106細胞/mL之細胞密度對於6井板之各井接種3 mL。製備之質體以脂轉染法導入細胞。於CO2培養箱(37度、8%CO2、90 rpm)中進行4日培養。使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)並使用該技術領域之人士公知之方法，從上述獲得之培養上清精製抗體。使用分光光度計精製之抗體溶液測定於280 nm之吸光度。使用依PACE法計算之吸光係數，可從獲得之測定值計算抗體濃度(Protein Science(1995)4,2411-2423)。
(2-4)含人類生殖細胞系列序列之抗體之鈣離子結合活性之評價
評價經精製之抗體之鈣離子結合活性。作為鈣離子對抗體之結合之評價指標，測定由示差掃描型熱量測定(DSC)所得之熱變性中間溫度(Tm值)(MicroCal VP-Capillary DSC、MicroCal)。熱變性中間溫度(Tm值)為安定性之指標，若由於鈣離子之結合使蛋白質安定化，熱變性中間溫度(Tm值)會比起鈣離子未結合之情形提高(J.Biol.Chem.(2008)283,37,25140-25149)。利用評價抗體溶液中之因鈣離子濃度之變化之抗體之Tm值之變化，來評價鈣離子對抗體之結合活性。將經精製之抗體提供給以20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、2 mM CaCl2(pH7.4)或20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl,3μM CaCl2(pH7.4)之溶液為外液之透析(EasySEP、TOMY)處理。使用供透析之溶液及製備為0.1 mg/mL之抗體溶液當做待驗物質，從20℃至115℃以240℃/hr之升溫速度進行DSC測定。依據獲得之DSC之變性曲線計算之各抗體之Fab域之熱變性中間溫度(Tm值)，如表11。
Figure 101135762-A0202-02-0259-46
其結果，含hVk1、hVk2、hVk3、hVk4序列之抗體之Fab域之Tm值，不依存於含該Fab域之溶液中之鈣離子濃度，不變動。另一方面，含hVk5序列之抗體之Fab域之Tm值，會由於含該Fab域之抗體溶液中之鈣離子濃度而變動，因此顯示hVk5序列會與鈣離子結合。
(2-5)hVk5-2序列之鈣結合評價
獲得於參考實施例2之(2-2)之Vk5-2(序列編號：43融合有為kappa鏈不變區之序列編號：44而成的序列編號：50))以外，分類為Vk5-2之Vk5-2改變體1(序列編號：51)及Vk5-2改變體2(序列編號：52)。針對該等之改變體也進行鈣結合評價。將Vk5-2、Vk5-2改變體1及Vk5-2改 變體2之DNA片段分別納入動物細胞用表現載體。獲得之表現載體之鹼基序列依該技術領域中具有通常知識者公知之方法決定。Vk5-2、Vk5-2改變體1及Vk5-2改變體2之DNA片段分別被納入之動物細胞用表現載體，與表現作為重鏈之CIM_H(序列編號：45)之方式納入之動物表現用之載體，依參考實施例2之(2-3)記載之方法一起導入動物細胞中並將抗體精製。評價經精製之抗體之鈣離子結合活性。將經精製之抗體供以20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、2 mM CaCl2(pH7.5)或20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl(pH7.5)之溶液(表12記為鈣離子濃度0mM)作為外液之透析(EasySEP、TOMY)處理。使用在透析之溶液將製備為約0.1 mg/mL之抗體溶液作為待驗物質，從20℃至115℃以240℃/hr之升溫速度進行DSC測定。依據獲得之DSC之變性曲線計算之各抗體之Fab分域之熱變性中間溫度(Tm值)如表12所示。
Figure 101135762-A0202-02-0260-47
其結果，含Vk5-2、Vk5-2改變體1及Vk5-2改變體2之序列之抗體之Fab分域之Tm值，會隨含該Fab分域之抗體溶液中之鈣離子之濃度變動，所以顯示帶有分類為Vk5-2之序列之抗體會與鈣離子結合。
(參考實施例3)人類Vk5(hVk5)序列之評價 (3-1)hVk5序列
Kabat資料庫中，hVk5序列僅有hVk5-2序列登載。以下將hVk5與hVk5-2以相同含意處理。WO2010/136598中，記載hVk5-2序列之生殖細胞系列序列中之存在比為0.4%。其他報告中，記載hVk5-2序列之生殖細胞系列序列中之存在比為0~0.06%(J.Mol.Biol.(2000)296,57-86、Proc.Natl.Acad.Sci.(2009)106,48,20216-20221)。如上所述，hVk5-2序列為生殖細胞系列序列中出現頻度低的序列，所以據認為從以人類生殖細胞系列序列構成之抗體庫或從藉由對表現人類抗體之小鼠免疫取得之B細胞，來取得與鈣結合之抗體並非有效率。而，有人考慮設計含有人類hVk5-2序列之Ca庫之可能性，但據報告之合成抗體庫(WO2010/105256或WO2010/136598)未含hVk5序列。而且，hVk5-2序列之物性未有人報告，其實現之可能性為未知。
(3-2)糖鏈非附加型hVk5-2序列之構建、表現及精製
hVk5-2序列在20位(Kabat編號)之胺基酸具有附加N型糖鏈之序列。對於蛋白質附加之糖鏈由於存在異質性，故由物質均勻性之觀點，以不附加糖鏈為理想。而，製作20位(Kabat編號)之Asn(N)殘基取代為Thr(T)殘基之改變體hVk5-2_L65(序列編號：53)。胺基酸之取代，係使用QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)之該技術領域之人士公知之方法進行。將編碼為改變體 hVk5-2_L65之DNA納入動物表現用載體。納入有製作之改變體hVk5-2_L65之DNA的動物表現用載體，與納入有表現當做重鏈之CIM_H(序列編號：45)的動物表現用載體，以參考實施例2記載之方法一起導入到動物細胞中。於導入之動物細胞中表現之含hVk5-2_L65及CIM_H之抗體，以參考實施例2記載之方法精製。
(3-3)含糖鏈非附加型hVk5-2序列之抗體之物性評價
經取得之含改變序列hVk5-2_L65之抗體，是否比起為供改變之基礎的hVk5-2序列之抗體，其異質性有所減少之情事，係使用離子交換層析分析。離子交換層析之方法如表13所示。分析結果如圖14所示，顯示糖鏈附加部位經改變之hVk5-2_L65，比起原本的hVk5-2序列，異質性有所減少。
Figure 101135762-A0202-02-0262-48
其次，將含有異質性減少之hVk5-2_L65序列的抗體是否會與鈣離子結合之情事，使用參考實施例2記載之方法評價。其結果，如表14所示，含有糖鏈附加部位經改變之hVk5-2_L65之抗體之Fab域之Tm值，也會由於抗體溶液 中之鈣離子濃度之變化而變動。亦即，顯示含糖鏈附加部位經改變之hVk5-2_L65之抗體之Fab域，會有鈣離子結合。
Figure 101135762-A0202-02-0263-49
(參考實施例4)對於含hVk5-2序列之CDR序列之抗體分子之鈣離子結合活性之評價 (4-1)含hVk5-2序列之CDR序列之改變抗體之製作、表現及精製
hVk5-2_L65序列，係存在於人類Vk5-2序列之框架的糖鏈附加部位之胺基酸受改變之序列。於參考實施例3顯示即使改變糖鏈附加部位，鈣離子仍會結合，但是一般而言，框架序列為生殖細胞系列之序列從免疫原性之觀點為理想。所以，探討是否可能將抗體之框架序列取代為未附加糖鏈之生殖細胞系列序列之框架序列而維持對於該抗體之鈣離子之結合活性。
將編碼為經化學合成之hVk5-2序列之框架序列改變為hVk1、hVk2、hVk3及hVk4序列之序列(各為CaVk1(序列編號：54)、CaVk2(序列編號：55)、CaVk3(序列編號：56)、CaVk4(序列編號：57)的聚核苷酸，以PCR法與編碼為天然型Kappa鏈之不變區(序列編號：44)之聚核苷酸連結成的DNA片段，納入動物細胞表現用載體。經製作之改變體之序列以該技術領域之人士公知之方法確認。以上述 方式製作之各質體，與納入有編碼為CIM_H(序列編號：45)之聚核苷酸之質體，一起以參考實施例2記載之方法導入動物細胞。從以上述方式導入之動物細胞之培養液，精製表現之所望之抗體分子。
(4-2)含hVk5-2序列之CDR序列之改變抗體之鈣離子結合活性之評價
以參考實施例2記載之方法評價鈣離子是否會結合於含hVk5-2序列以外之生殖細胞系列序列(hVk1、hVk2、hVk3、hVk4)之框架序列及hVK5-2序列之CDR序列的改變抗體。評價結果如表15。各改變抗體之Fab域之Tm值，顯示會由於抗體溶液中之鈣離子濃度變化而變動。是以，顯示含hVk5-2序列之框架序列以外的框架序列的抗體也會與鈣離子結合。
Figure 101135762-A0202-02-0264-50
再者，可知：改變為含有hVk5-2序列以外之生殖細胞系列序列(hVk1、hVk2、hVk3、hVk4)之框架序列及hVK5-2序列之CDR序列的各抗體之Fab域之熱安定性之指標熱變性溫度(Tm值)，比以含有當做供改變之基礎的hVk5-2序 列的抗體之Fab域之Tm值為增加。從該結果，發現：含hVk1、hVk2、hVk3、hVk4之框架序列及hVk5-2序列之CDR序列的抗體，具有與鈣離子結合之性質，此外，於熱安定性之觀點也為優異之分子。
(參考實施例5)人類生殖細胞系列hVk5-2序列存在之鈣離子結合部位之鑑定 (5-1)hVk5-2序列之CDR序列中之變異部位之設計
如參考實施例4記載，含hVk5-2序列之CDR部分導入於其他生殖細胞系列之框架序列之輕鏈之抗體也會顯示與鈣離子結合。由此結果，啟示hVk5-2存在之鈣離子結合部位在CDR之中存在。與鈣離子結合，亦即螯合鈣離子之胺基酸，例如負電荷之胺基酸或能成為氫鍵之接受者之胺基酸。所以，評價含有hVk5-2序列之CDR序列中存在之Asp(D)殘基或Glu(E)殘基取代為Ala(A)殘基之變異hVk5-2序列的抗體是否會與鈣離子結合。
(5-2)hVk5-2序列之Ala取代體之製作及抗體之表現及精製
製作含有hVk5-2序列之CDR序列中存在之Asp及/或Glu殘基改變為Ala殘基之輕鏈的抗體分子。如參考實施例3記載，由於未附加糖鏈之改變體hVk5-2_L65維持與鈣離子結合，故由鈣離子結合性之觀點，可認為與hVk5-2序列為同等。本實施例中，以hVk5-2_L65為模板序列，進行胺基酸取代。製作之改變體如表16。胺基酸之取代使用QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)、 PCR或In fusion Advantage PCR cloning kit(TAKARA)等該技術領域之人士公知之方法進行，構建胺基酸經取代之改變輕鏈之表現載體。
Figure 101135762-A0202-02-0266-51
獲得之表現載體之鹼基序列以該技術領域之人士公知之方法決定。將製作之改變輕鏈之表現載體與重鏈CIM_H(序列編號：45)之表現載體，一起暫時性導入人類胎兒腎癌細胞來源HEK293H株(Invitrogen)、或FreeStyle293細胞(Invitrogen)，以使抗體表現。從獲得之培養上清，使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(GE Healthcare)，以該技術領域之人士公知之方法精製抗體。經精製之抗體溶液於280 nm之吸光度，使用分光光度計測定。藉由使用PACE法計算之吸光係數，從獲得之測定值計算抗體濃度(Protein Science(1995)4,2411-2423)。
(5-3)含hVk5-2序列之Ala取代體的抗體之鈣離子結合活性評價
判定獲得之精製抗體是否會與鈣離子結合係依參考實施例2記載之方法判定。其結果如表17所示。藉由將hVk5-2序列之CDR序列中存在之Asp或Glu殘基取代為與鈣離子之結合或螯合無關的Ala殘基，存在由於抗體溶液之鈣離子濃度之變化其Fab域之Tm值不會變動之抗體。顯示由於Ala取代而Tm值不變動之取代部位(32位及92位(Kabat編號))，對於鈣離子與抗體之結合特別重要。
Figure 101135762-A0202-02-0267-52
(參考實施例6)含具鈣離子結合模體之hVk1序列之抗體之評價 (6-1)具鈣離子結合模體之hVk1序列之製作及抗體之表現及精製
從參考實施例4記載之Ala取代體之鈣之結合活性之結果，顯示hVk5-2序列之CDR序列之中，Asp或Glu殘基對於鈣結合為重要。所以，評價是否僅將30位、31位、32位、50位及92位(Kabat編號)之殘基導入其他生殖細 胞系列之可變區序列，仍能與鈣離子結合。具體而言，製作人類生殖細胞系序列hVk1序列之30位、31位、32位、50位及92位(Kabat編號)之殘基取代為hVk5-2序列之30位、31位、32位、50位及92位(Kabat編號)之殘基之改變體LfVk1_Ca(序列編號：66)。亦即，判定是否含有僅導入有hVk5-2序列中之該等5殘基的hVk1序列的抗體能與鈣結合。改變體之製作與參考實施例5同樣進行。將獲得之輕鏈改變體LfVk1_Ca與含輕鏈hVk1序列之LfVk1(序列編號：67)，與重鏈CIM_H(序列編號：45)一起表現。抗體之表現及精製與參考實施例4以同樣方法實施。
(6-2)含具鈣離子結合模體之人類hVk1序列之抗體之鈣離子結合活性之評價
以參考實施例2記載之方法判定如上述獲得之精製抗體是否會與鈣離子結合。其結果如表18。含有具hVk1序列之LfVk1的抗體之Fab域之Tm值不會隨抗體溶液中之鈣濃度變化而變動，另一方面，含有LfVk1_Ca之抗體序列之Tm值會隨抗體溶液中之鈣濃度之變化而變化1℃以上，因此，顯示含LfVk1_Ca之抗體會與鈣結合。由上述結果，鈣離子之結合，完全不需要hVk5-2之CDR序列，僅在構建LfVk1_Ca序列時導入之殘基也就足夠。
Figure 101135762-A0202-02-0268-53
(參考實施例7)為了以良好效率取得以Ca濃度依存性地結合於抗原之結合抗體，將鈣離子結合模體導入於可變區之抗體分子之集團(Ca庫)之設計
鈣結合模體，例如hVk5-2序列或其CDR序列，再者，殘基受擠的30位、31位、32位、50位、92位(Kabat編號)為理想例。以外，具有與鈣結合之蛋白質之EF手模體(calmodulin等)或C型外源凝集素(ASGPR等)也該當於鈣結合模體。
Ca庫係由重鏈可變區與輕鏈可變區構成。重鏈可變區使用人類抗體序列，並對輕鏈可變區導入鈣結合模體。選擇hVk1序列作為導入有鈣結合模體之輕鏈可變區之模板序列。含對hVk1序列導入有鈣結合模體之其中一hVk5-2之CDR序列的LfVk1_Ca序列之抗體，如參考實施例5所示，顯示與鈣離子結合。於模板序列出現多數胺基酸，構成庫之抗原結合分子之多樣性擴大。多數胺基酸出現之位置，選擇在與抗原交互作用之可能性高之可變區之表面露出之位置。具體而言，選擇30位、31位、32位、34位、50位、53位、91位、92位、93位、94位及96位(Kabat編號)作為如此的柔性殘基。
然後設定出現之胺基酸殘基之種類及其出現率。解析於Kabat資料庫(KABAT,E.A.ET AL.：’Sequences of proteins of immunological interest’,vol.91,1991,NIH PUBLICATION)登載的hVk1與hVk3之序列中，在柔性殘基之胺基酸之出現頻度。依解析結果，從各位置出現頻 度高之胺基酸，選擇在Ca庫出現之胺基酸之種類。此時，為了使胺基酸之性質不偏向也選擇判定在解析結果出現頻度少的胺基酸。又，經選擇之胺基酸之出現頻度，係參考Kabat資料庫之解析結果設定。
考慮如以上設定之胺基酸及出現頻度，作為Ca庫，設計含鈣結合模體且重視該模體以外之各殘基含有多數胺基酸之序列之多樣性的Ca庫。表1及2記載Ca庫之詳細設計(各表中之位置表示Kabat編號)。又，表1及2記載之胺基酸之出現頻度，於Kabat編號表示之92位為Asn(N)之情形，94位不是Ser(S)而是Leu(L)。
(參考實施例8)Ca庫之製作
以從人類PBMC製作之polyA RNA或市售人類polyA RNA等當做模板，以PCR法將抗體重鏈可變區之基因庫放大。針對抗體輕鏈可變區部分，依參考實施例7所記載，設計維持鈣結合模體且以鈣濃度依存性對於抗原結合之抗體之出現頻度提高的抗體可變區輕鏈部分。又，柔性殘基當中，導入有鈣結合模體之殘基以外之胺基酸殘基，係參考在天然人類抗體之胺基酸出現頻度之資訊((KABAT,E.A.ET AL.：’Sequences of proteins of immunological interest’,vol.91,1991,NIH PUBLICATION)，且設計在天然人類抗體之序列中出現頻度高之胺基酸均等分布而得之抗體輕鏈可變區之庫。將以此方式製作之抗體重鏈可變區之基因庫與抗體輕鏈可變區之基因庫之組合插入噬粒載體，構建表現由人類抗體序列構成之Fab分域之人類抗 體噬菌體表現庫(Methods Mol Biol.(2002)178,87-100)。
確認針對從導入由抗體基因庫之大腸菌單離之抗體基因部分之序列。獲得之290種選殖體之序列之胺基酸分布、及設計之胺基酸分布，如圖15所示。
(參考實施例9)Ca庫所含之分子之鈣離子結合活性之評價 (9-1)Ca庫所含之分子之鈣離子結合活性
如參考實施例3所示，顯示與鈣離子結合之hVk5-2序列係在生殖細胞系列序列中出現頻度低之序列，故從以人類生殖細胞系列序列構成之抗體庫或從對表現人類抗體之小鼠之免疫取得之B細胞取得與鈣結合之抗體並非有效率。而構建Ca庫。而於參考實施例8構建Ca庫。評價構建的Ca庫是否存在與鈣結合之選殖體。
(9-2)抗體之表現與精製
將Ca庫所含之選殖體對於動物細胞表現用質體的導入。抗體之表現係使用以下方法進行。將人類胎腎細胞來源的FreeStyle 293-F株(Invitrogen)懸浮於FreeStyle 293 Expression Medium培養基(Invitrogen)，以1.33×106個/mL的細胞密度在6井盤的各井各接種3 mL，以脂轉染法將製備的質體導入細胞。於CO2培養箱(37度、8%CO2,90 rpm)培養4日，從獲得之培養上清，使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)，以該技術領域之人士公知之方法精製抗體。精製抗體濃度，使用 分光光度計測定於280 nm之吸光度。從獲得之值，以PACE法使用計算之吸光係數，計算抗體濃度(Protein Science 1995；4：2411-2423)。
(9-3)鈣離子對於取得之抗體之結合評價
如上所述獲得之精製抗體是否與鈣離子結合，係依實施例6記載之方法判定。其結果如表19所示。Ca庫所含之多數抗體之Fab分域之Tm依鈣離子濃度變動，顯示含有與鈣離子結合之分子。
Figure 101135762-A0202-02-0272-54
(參考實施例10)以Ca依存性地結合於IL-6受體之抗 體之取得 (10-1)從珠淘選所得之庫取得以Ca依存性地結合於抗原之抗體片段
從構建之以Ca依存性地與IL-6受體結合之抗體庫最初之篩選，係藉由濃縮成僅具對於抗原(IL-6受體)之結合能力之抗體片段而實施。
從保持有經構建之噬菌體呈現用噬粒(phagemid)之大腸菌生產噬菌體。藉由對於進行噬菌體之大腸菌之培養液添加2.5 M NaCl/10%PEG，使沉澱的噬菌體的集團以TBS稀釋，藉此獲得噬菌體庫液。其次，對於噬菌體庫液添加BSA及CaCl2，使終濃度成為4%BSA及1.2mM鈣離子濃度。淘選方法，係參照一般方法即使用固定化於磁性珠之抗原的淘選方法(J.Immunol.Methods.(2008)332(1-2),2-9、J.Immunol.Methods.(2001)247(1-2),191-203、Biotechnol.Prog.(2002)18(2)212-20、Mol.Cell Proteomics(2003)2(2),61-9)。磁性珠可使用NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或Streptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)。
具體而言，於製備的噬菌體庫液添加250 pmol之生物素標記抗原，藉此使該噬菌體庫液於室溫接觸抗原60分鐘。添加以BSA阻斷的磁性珠，將抗原與噬菌體之複合體於室溫結合於磁性珠15分鐘。將珠以1.2 mM CaCl2/TBST(含1.2 mM CaCl2之TBST)洗滌3次後，以1 mL之1.2 mM CaCl2/TBS(含1.2 mM CaCl2之TBS)再洗滌2次。之後，將添加有0.5 mL之1 mg/mL之胰蛋白酶之珠於室溫懸浮15分鐘後，立即使用磁座分離珠，將噬菌體溶液回收。將回收的噬菌體溶液，添加到處於對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10 mL之大腸菌株ER2738。於37℃緩慢攪拌，培養上述大腸菌1小時，藉此使噬菌體感染大腸菌。將經感染之大腸菌，接種到225 mm x 225 mm的板。其次，從經接種之大腸菌之培養液回收噬菌體，以製備噬菌體庫液。
第2次後之淘選，係以抗原結合能力或Ca依存性結合能力為指標，實施噬菌體之濃縮。
具體而言，進行以抗原結合能力為指標之濃縮時，係於製備的噬菌體庫液添加40 pmol之生物素標記抗原，藉此使噬菌體庫於室溫與抗原接觸60分鐘。添加經BSA阻斷的磁性珠，使抗原與噬菌體之複合體於室溫結合於磁性珠15分鐘。珠以1 mL之1.2 mM CaCl2/TBST與1.2 mM CaCl2/TBS洗滌。之後，將添加有0.1 mL之2 mM EDTA/TBS的珠於室溫懸浮15分鐘後，立即使用磁座分離珠，並回收噬菌體溶液。於回收之噬菌體溶液添加100 mg/mL之胰蛋白酶5μL，藉此切斷未呈現Fab之噬菌體之pIII蛋白質(幫助者(helper)噬菌體來源之pIII蛋白質)，使未呈現Fab之噬菌體失去對於大腸菌之感染能力。將從經胰蛋白酶處理之噬菌體溶液回收之噬菌體，添加到處於對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10 mL之大腸菌株ER2738。於37℃緩慢攪拌進行1小時上述大腸菌之攪拌培養，使噬菌體感染大腸 菌。將感染的大腸菌接種在225 mm x 225 mm之板。其次，從接種的大腸菌的培養液回收噬菌體，藉此回收噬菌體庫液。
以Ca依存性結合能力作為指標濃縮時，係在經製備之噬菌體庫液施加40 pmol之生物素標記抗原，並使噬菌體庫於室溫與抗原接觸60分鐘。加入經BSA阻斷的磁珠，將抗原與噬菌體之複合體以磁珠於室溫進行15分鐘結合。珠以1 mL1.2 mM CaCl2/TBST與1.2 mM CaCl2/TBS洗滌。之後，將加有0.1 mL之2 mM EDTA/TBS(包括2 mM之EDTA之TBS)之珠於室溫懸浮後，立即使用磁性台將珠分離，回收噬菌體溶液
Figure 101135762-A0202-02-0275-442
回收。回收之噬菌體溶液，由於加入了100 mg/mL的胰蛋白酶5μL，可切斷未表現Fab之噬菌體之pIII蛋白質(幫手噬菌體來源的pIII蛋白質)，使大腸菌失去對使用Fab之噬菌體之感染能力。回收之噬菌體溶液，添加於成為對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10 mL大腸菌株ER2738，上述大腸菌於37℃緩慢培養1小時，進行攪拌培養，使噬菌體感染大腸菌。將感染的大腸菌接種於225 mm x 225 mm之板。其次從接種的大腸菌培養液回收噬菌體，以回收噬菌體庫液。
(10-2)利用噬菌體ELISA之評價
從依上述方法獲得之大腸菌單一菌落，參考(Methods Mol Biol.2002；178：133-145.)回收含噬菌體之培養上清。
將已添加BSA、CaCl2之含噬菌體之培養上清依以下程序供ELISA。將StreptaWell 96微滴定板(Roche)以含 生物素標記抗原之PBS 100μL塗覆一晚。以PBS洗滌該板之各井以去除抗原後，將該井以4% BSA-TBS 250μL阻斷1小時以上。去除4% BSA-TBS，於各井添加製備的培養上清，將該板於37℃靜置1小時，使表現噬菌體之抗體結合於在各井存在的抗原。於以1.2 mM CaCl2/TBST洗滌之各井添加1.2 mM CaCl2/TBS或1 mM EDTA/TBS，將該板於37℃靜置30分鐘並溫育。以1.2 mM CaCl2/TBST洗滌後，以游離鈣濃度1.2 mM之TBS稀釋成的HRP結合抗M13抗體(Amersham Parmacia Biotech)添加於各井的板溫育1小時。以1.2 mM CaCl2/TBST洗滌後，將添加有TMB single solution(ZYMED)之各井中之溶液之發色反應藉由硫酸之添加使反應停止後，測定450 nm之吸光度以測定該發色。
對於已實施上述噬菌體ELISA之選殖體，進行使用專一性引子放大之基因之鹼基序列解析。噬菌體ELISA、序列解析之結果如以下表20所示。
Figure 101135762-A0202-02-0276-55
(10-3)抗體之表現與精製
噬菌體ELISA之結果，對判斷有Ca依存性的對抗原的結合能力的選殖體，進行對於動物細胞表現用質體的導 入。抗體之表現係使用以下方法進行。將人類胎腎細胞來源的FreeStyle 293-F株(Invitrogen)懸浮於FreeStyle 293 Expression Medium培養基(Invitrogen)，以1.33×106個/mL的細胞密度在6井盤的各井各接種3 mL，以脂轉染法將製備的質體導入細胞。於CO2培養箱(37度、8%CO2,90 rpm)培養4日，從獲得之培養上清，使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)，以該技術領域之人士公知之方法精製抗體。精製抗體濃度，使用分光光度計測定於280 nm之吸光度。從獲得之值，以PACE法使用計算之吸光係數，計算抗體濃度(Protein Science 1995；4：2411-2423)。
(10-4)取得之抗體對於人類IL-6受體之Ca依存性的結合能力之評價
為了判斷參考實施例9取得之抗體6RC1IgG_010(重鏈序列編號：90、輕鏈序列編號：91)、及6RC1IgG_012(重鏈序列編號：92、輕鏈序列編號：93)、及6RC1IgG_019(重鏈序列編號：94、輕鏈序列編號：95)對IL-6受體之結合活性是否為Ca依存性，使用Biacore T100(GE Healthcare)解析該等抗體與人類IL-6受體之交互作用。作為對於人類IL-6受體不具Ca依存性之結合活性之對照抗體，使用tocilizumab(重鏈序列編號：96、輕鏈序列編號：97)。作為高鈣離子濃度及低鈣離子濃度之條件，各於1.2 mM及3μM之鈣離子濃度之溶液中進行交互作用解析。在以胺基偶聯法將重組型protein A/G(Invitrogen)適量固定化後 之Sensor chip CM4(GE Healthcare)上，捕捉抗體。運行緩衝液使用20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05%(w/v)Tween20、1.2 mM CaCl2(pH7.4)或20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05%(w/v)Tween20、3μM CaCl2(pH7.4)之2種緩衝液。人類IL-6受體之稀釋也使用各緩衝液，測定均於37℃進行。
進行使用對照抗體tocilizumab抗體、6RC1IgG_010抗體及6RC1IgG_012抗體及6RC1IgG_019抗體之抗原抗體反應之交互作用解析時，藉由以流速5μL/min注入IL-6受體之稀釋液與為空白之行緩衝液3分鐘，使捕捉於感應晶片上之tocilizumab抗體、6RC1IgG_010抗體及6RC1IgG_012抗體及6RC1IgG_019抗體與IL-6受體交互作用。之後，以流速30μL/min注入10 mM Glycine-HCl(pH1.5)30秒使感應晶片再生。
依此方法測定之高鈣離子濃度中之感應圖如圖16所示。
針對低鈣離子濃度之條件下之tocilizumab抗體、6RC1IgG_010抗體及6RC1IgG_012抗體及6RC1IgG_019抗體之感應圖，也依同樣方法取得。低鈣離子濃度之感應圖如圖17所示。
從上述結果，6RC1IgG_010抗體及6RC1IgG_012抗體及6RC1IgG_019抗體，藉由使緩衝液中之鈣離子濃度從1.2mM減少到3μM，觀察到對IL6受體之結合能力大幅減少。
(參考實施例11)使用噬菌體表現技術從人類抗體庫取得Ca依存性的結合於IL-6受體的抗體 (11-1)未改變(naïve)人類抗體噬菌體表現庫之製作
以從人類PBMC製作之polyA RNA或市售人類polyA RNA等當做模板，參考該技術領域中具有通常知識者公知的方法，構建由表現彼此相異之人類抗體序列之Fab分域之多數噬菌體構成之人類抗體噬菌體表現庫。
(11-2)利用珠淘選由庫取得Ca依存性的結合於抗原之抗體片段
從構建之未經改變的人類抗體噬菌體表現庫之最初之選拔，係僅濃縮具備對於抗原(IL-6受體)之結合能力之抗體片段、或濃縮具有Ca濃度依存性的對抗原(IL-6受體)之結合能力為指標之抗體片段。以Ca濃度依存性的對抗原(IL-6受體)之結合能力作為指標之抗體片段之濃縮，係使用螯合Ca離子之EDTA，在Ca離子存在下從與IL-6受體結合之噬菌體庫將噬菌體溶出以實施。抗原使用經生物素標記的IL-6受體。
由保持以上述方式構建之噬菌體表現用噬粒之大腸菌產生噬菌體，對已進行噬菌體產生之大腸菌之培養液以2.5 M NaCl/10%PEG而沉澱的噬菌體之集團以TBS稀釋，製成噬菌體庫液。對於噬菌體庫液添加BSA,CaCl2，製成使終濃度4% BSA，游離鈣濃度1.2 mM。淘選係參考一般方法，即使用固定化於磁性珠之抗原之淘選方法(J Immunol Methods.2008 Mar 20；332(1-2)：2-9.、J Immunol Methods. 2001 Jan 1；247(1-2)：191-203.、Biotechnol Prog.2002 Mar-Apr；18(2)：212-20.、Mol Cell Proteomics.2003 Feb；2(2)：61-9.)。磁性珠使用NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或Streptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)。
具體而言，於製備的噬菌體庫液添加250 pmol之生物素標記抗原，藉此使該噬菌體庫液於室溫接觸抗原60分鐘。添加以BSA阻斷的磁性珠，將抗原與噬菌體之複合體於室溫結合於磁性珠15分鐘。將珠以1 mL之1.2 mM CaCl2/TBS(含1.2 mM CaCl2之TBS)洗滌1次。之後，於將具有對IL-6受體之結合能力之抗體片段濃縮的情形，利用一般的方法使溶出，於將以Ca濃度依存性對IL-6受體之結合能力作為指標將抗體片段濃縮的情形，利用從懸浮於2 mM EDTA/TBS(含2mMEDTA之TBS)之珠溶出，將噬菌體溶液回收。將回收的噬菌體溶液，添加到處於對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10 mL之大腸菌株TG1。於37℃緩慢攪拌培養上述大腸菌1小時，藉此使噬菌體感染大腸菌。將經感染之大腸菌，接種到225 mm x 225 mm的板。其次，從經接種之大腸菌之培養液回收噬菌體，以製備噬菌體庫液。
第2次後之淘選，係以Ca依存性結合能力為指標，實施噬菌體之濃縮。具體而言，係於製備的噬菌體庫液添加40 pmol之生物素標記抗原，藉此使噬菌體庫於室溫與抗 原接觸60分鐘。添加經BSA阻斷的磁性珠，使抗原與噬菌體之複合體於室溫結合於磁性珠15分鐘。珠以1 mL之1.2 mM CaCl2/TBST與1.2 mM CaCl2/TBS洗滌。之後，將添加有0.1 mL之2 mM EDTA/TBS的珠於室溫懸浮後，立即使用磁座分離珠，並回收噬菌體溶液。於回收之噬菌體溶液添加100 mg/mL之胰蛋白酶5μL，藉此切斷未呈現Fab之噬菌體之pIII蛋白質(幫助者(helper)噬菌體來源之pIII蛋白質)，使未呈現Fab之噬菌體失去對於大腸菌之感染能力。將從經胰蛋白酶處理之噬菌體溶液回收之噬菌體，添加到處於對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10 mL之大腸菌株TG1。於37℃緩慢攪拌進行1小時上述大腸菌之攪拌培養，使噬菌體感染大腸菌。將感染的大腸菌接種在225 mm x 225 mm之板。其次，從接種的大腸菌的培養液回收噬菌體，藉此回收噬菌體庫液。以Ca依存性結合能力為指標之淘選重覆數次。
(11-3)利用噬菌體ELISA所為之評價
從依照上述方法獲得之大腸菌之單一菌落，參考常法(Methods Mol.Biol.(2002)178,133-145)回收含噬菌體之培養上清。
將添加有BSA及CaCl2使終濃度為4%BSA及1.2 mM鈣離子濃度之含噬菌體之培養上清，以下列步驟供ELISA。將StreptaWell 96微滴定板(Roche)以含生物素標記抗原之100μL之PBS塗覆一晚。將該板之各井以PBST洗滌，以去除抗原後，將該井以250μL之4%BSA-TBS阻斷1小時 以上。將已去除4%BSA-TBS之各井中添加有製備之培養上清的該板，於37℃靜置1小時，藉此使呈現噬菌體之抗體結合於各井存在之抗原。於以1.2 mM CaCl2/TBST洗滌之各井中，添加1.2 mM CaCl2/TBS或1 mM EDTA/TBS，將該板於37℃靜置30分鐘並溫育。以1.2 mM CaCl2/TBST洗滌後，將以設為終濃度4%BSA及1.2 mM游離鈣濃度之TBS稀釋過的HRP結合抗M13抗體(Amersham Pharmacia Biotech)添加到各井之板溫育1小時。以1.2 mM CaCl2/TBST洗滌後，使添加有TMB single溶液(ZYMED)之各井中之溶液之發色反應藉由添加硫酸而停止後，從450 nm之吸光度測定該發色。
上述噬菌體ELISA之結果，以判斷為有以Ca依存性的對抗原結合之能力的抗體片段作為模板，解析以專一性引子放大之基因之鹼基序列。
(11-4)抗體之表現與精製
將噬菌體ELISA之結果判斷為具有對於Ca依存性抗原之結合能力之選殖體導入動物細胞表現用質體。抗體之表現係使用以下方法實施。將人類胎兒腎細胞來源FreeStyle 293-F株(Invitrogen)懸浮於FreeStyle 293 Expression Medium培養基(Invitrogen)，以1.33 x 106細胞/mL之細胞密度對於6井板之各井各接種3 mL。製備之質體，以脂轉染法導入細胞。於CO2培養箱(37度、8%CO2、90 rpm)中培養4日。使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)，以該技術領域之人士公知 之方法，從上述獲得之培養上清精製抗體。使用分光光度計測定經精製之抗體溶液於280 nm之吸光度。藉由使用PACE法計算之吸光係數，從得到之測定值計算抗體濃度(Protein Science(1995)4,2411-2423)。
(參考實施例12)取得之抗體對人類IL-6受體之Ca依存性結合能力之評價
為了判斷參考實施例11取得之抗體6RL#9-IgG1(重鏈(序列編號：98連接著來自IgG1之不變區之序列)、輕鏈序列編號：99)、及FH4-IgG1(重鏈序列編號：100、輕鏈序列編號：101)對人類IL-6受體之結合活性是否為Ca依存性，將該等抗體與人類IL-6受體之抗原抗體反應之動力理論解析使用Biacore T100(GE Healthcare)進行。就對於人類IL-6受體無Ca依存性之結合活性之對照抗體，使用WO2009125825記載之H54/L28-IgG1(重鏈序列編號：102、輕鏈序列編號：103)。作為高鈣離子濃度及低鈣離子濃度之條件，各於2 mM及3μM之鈣離子濃度之溶液中進行抗原抗體反應之動力理論解析。在以胺偶聯法適量固定protein A(Invitrogen)之Sensor chip CM4(GE Healthcare)上，使目的抗體被捕捉。運行緩衝液使用10 mM ACES、150 mM NaCl、0.05%(w/v)Tween20、2 mM CaCl2(pH7.4)或10 mM ACES、150 mM NaCl、0.05%(w/v)Tween20、3μmol/L CaCl2(pH7.4)之2種緩衝液。人類IL-6受體之稀釋也使用各自的緩衝液。測定均在37℃實施。
當進行使用H54L28-IgG1抗體之抗原抗體反應之動力 理論解析，將IL-6受體之稀釋液與為空白之行緩衝液以流速20μL/min注入3分鐘，使在感應晶片上捕捉的H54L28-IgG1抗體與IL-6受體交互作用。之後，以流速20μL/min流入10分鐘運行緩衝液，觀察到IL-6受體之解離後，將10 mM Glycine-HCl(pH1.5)以流速30μL/min注入30秒，使感應晶片再生。從測定獲得之感應圖，計算動力理論參數結合速度常數ka(1/Ms)、及解離速度常數kd(1/s)。使用該等值，計算H54L28-IgG1抗體對人類IL-6受體之解離常數KD(M)。各參數之計算使用Biacore T100 Evaluation軟體(GE Healthcare)。
在實施使用FH4-IgG1抗體及6RL#9-IgG1抗體之抗原抗體反應之動力理論解析時，將IL-6受體之稀釋液與為空白之行緩衝液以流速5μL/min注入15分鐘，使在感應晶片上捕捉之FH4-IgG1抗體或6RL#9-IgG1抗體與IL-6受體交互作用。之後，將10 mM Glycine-HCl(pH1.5)以流速30μL/min注入30秒，使感應晶片再生。從測定獲得之成應圖使用steady state親和性model計算解離常數KD(M)。各參數之計算使用Biacore T100 Evaluation軟體(GE Healthcare)。
依該方法決定之在2 mM CaCl2存在下各抗體與IL-6受體之解離常數KD如表21。
Figure 101135762-A0202-02-0284-56
Ca濃度為3μM之條件下之H54/L28-IgG1抗體之KD，可與2 mM Ca濃度存在下以同樣之方法計算。Ca濃度為3μM之條件下，FH4-IgG1抗體及6RL#9-IgG1抗體對IL-6受體幾乎未觀察到結合，所以難以依上述方法計算KD。但使用下列之式3(Biacore T100 Software Handbook,BR-1006-48,AE 01/2007)，可預測於Ca濃度為3μM之條件下該等之抗體之KD。
(式1)Req=C x Rmax/(KD+C)+RI
上(式1)中之各項目之含意如下；Req(RU)：不變狀態結合水平(Steady state binding levels)
Rmax(RU)：分析物之表面結合能力(Analyte binding capacity of the surface)
RI(RU)：試樣中之容積折射率貢獻(Bulk refractive index contribution in the sample)
C(M)：分析物濃度(Analyte concentration)
KD(M)：平衡解離常數(Equilibrium dissociation constant)。
使用上述(式1)之Ca濃度為3μmol/L之情形之各抗體與IL-6受體間之解離常數KD之預測概算結果如表22。表22中之Req、Rmax、RI、C，係依測定結果假定之值。
Figure 101135762-A0202-02-0286-57
從上述結果，可預測：FH4-IgG1抗體及6RL#9-IgG1抗體，藉由使緩衝液中之CaCl2之濃度從2 mM減少為3μM，對IL-6受體之KD各有約60倍、約120倍上升(60倍、120倍以上親和性減少)。
表23整理H54/L28-IgG1、FH4-IgG1、6RL#9-IgG1之3種抗體在2 mM CaCl2存在下及3μM CaCl2存在下之KD值、及KD值之Ca依存性。
Figure 101135762-A0202-02-0286-58
未觀察到由於Ca濃度之差異所致H54/L28-IgG1抗體對IL-6受體之結合之差異。另一方面，在低濃度Ca條件下，觀察到FH4-IgG1抗體及6RL#9-IgG1抗體對IL-6受體之結合顯著減弱(表23)。
(參考實施例13)對於取得之抗體之鈣離子結合評價
其次，作為評價鈣離子對於抗體之結合之指標，利用差示掃描型熱量測定(DSC)測定熱變性中間溫度(Tm值)(MicroCal VP-Capillary DSC、MicroCal製)。熱變性中 間溫度(Tm值)係安定性之指標，若鈣離子結合而蛋白質安定化，則熱變性中間溫度(Tm值)比起鈣離子未結合時會增高(J Bio Chem.2008 Sep 12；Vol.283；No.37：pp 25140-25149)。藉由評價抗體溶液中之鈣離子濃度之變化所因應之抗體之Tm值之變化，可評價鈣離子對抗體之結合活性。將經精製之抗體供以20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、2 mM CaCl2(pH7.4)或20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl,3μM CaCl2(pH7.4)之溶液作為外液之透析(EasySEP、TOMY)處理。將使用透析用之溶液製備為約0.1 mg/mL之抗體溶液當作待驗物質，於20℃至115℃之240℃/hr之升溫速度測定DSC。依據獲得之DSC之變性曲線，計算各抗體之Fab域之熱變性中間溫度(Tm值)，如表24。
Figure 101135762-A0202-02-0287-59
從表24之結果，顯示鈣依存性結合能力之FH4-IgG1抗體及6RL#9-IgG1抗體之Fab之Tm值會依鈣離子之濃度之變化而變動，未顯示鈣依存性結合能力之H54/L28-IgG1抗體之Fab之Tm值不會依鈣離子之濃度之變化變動。FH4-IgG1抗體及6RL#9-IgG1抗體之Fab之Tm值之變動，顯示該等之抗體有鈣離子結合且Fab部分安定化。由上述結果顯示：FH4-IgG1抗體及6RL#9-IgG1抗體會與鈣離子結 合，另一方面H54/L28-IgG1抗體不與鈣離子結合。
(參考實施例14)利用6RL#9抗體之鈣離子結合部位之X射線結晶構造解析之鑑定 (14-1)X射線結晶構造解析
如參考實施例13所示，6RL#9抗體與鈣離子結合，係由熱變性溫度Tm值之測定所啟示。但是由於無法預測6RL#9抗體之哪個部位與鈣離子結合，因此，藉由使用X射線結晶結構解析之方法，指定鈣離子所交互作用之6RL#9抗體之序列中之殘基。
(14-2)6RL#9抗體之表現及精製
將為了X射線結晶結構解析使用而使表現之6RL#9抗體予以精製。具體而言，將各能表現6RL#9抗體之重鏈(在序列編號：98連結有IgG1來源之不變區之序列)與輕鏈(序列編號：99)之方式製備之動物表現用質體，暫時導入動物細胞。對於懸浮於FreeStyle 293 Expression Medium培養基(Invitrogen)，使得最終細胞密度成為1 x 106細胞/mL之800 mL之人類胎兒腎細胞來源FreeStyle 293-F株(Invitrogen)，導入以脂轉染法製備的質體。將導入有質體之細胞，於CO2培養箱(37℃、8%CO2、90 rpm)中培養5日。依照使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)之該技術領域之人士公知之方法，從如上述獲得之培養上清精製抗體。使用分光光度計測定精製之抗體溶液於280 nm之吸光度。使用依PACE法計算之吸光係數，由測定值計算抗體濃度(Protein Science(1995)4,2411-2423)。
(14-3)從6RL#9抗體精製Fab片段
使用分子量區分尺寸10000MWCO之超過濾膜，將6RL#9抗體濃縮至21 mg/mL。使用L-Cystein 4 mM、EDTA 5 mM、20 mM磷酸鈉緩衝液(pH 6.5)，製備以5 mg/mL稀釋而得之2.5 mL之該抗體之試樣。添加0.125 mg之Papain(Roche Applied Science)，並將經攪拌之該試樣於35℃靜置2小時。靜置後，溶解蛋白酶抑制劑cocktail mini，再將溶有無EDTA(Roche Applied Science)1錠之10 mL之25 mM MES緩衝液(pH6)添加到該試樣，於冰中靜置，藉此，以Papain停止蛋白酶反應。其次，將該試樣添加到於下游串聯連結之1 mL尺寸之ProteinA擔體管柱HiTrap MabSelect Sure(GE Healthcare)之經25 mM MES緩衝液pH6平衡化之1 mL尺寸之陽離子交換管柱HiTrap SP HP(GE Healthcare)。同緩衝液中之NaCl濃度藉由直線上升到300 mM並進行溶出可獲得6RL#9抗體之Fab片段之精製區分。其次，將獲得之精製區分以5000MWCO超過濾膜濃縮為約0.8 mL。於以含50 mM NaCl之100 mM HEPES緩衝液(pH 8)平衡化之凝膠過濾管柱Superdex 200 10/300 GL(GE Healthcare)中，添加濃縮液。結晶化用之精製6RL#9抗體之Fab片段使用同緩衝液從管柱溶出。又，上述所有的管柱操作係於6至7.5℃之低溫下實施。
(14-4)6RL#9抗體之Fab片段於Ca存在下之結晶化
預先以一般的條件設定獲得6RL#9 Fab片段之種結 晶。其次，使用以使成為5 mM之方式添加有CaCl2之精製6RL#9抗體之Fab片段，使用5000MWCO之超過濾膜濃縮為12 mg/mL。其次，利用hanging-drop蒸氣擴散法，實施如前述方式濃縮之試樣之結晶化。貯存溶液，使用含20-29% PEG4000之100 mM HEPES緩衝液(pH7.5)。在蓋玻片上對於0.8μl之貯存溶液及0.8μl之前述濃縮試樣之混合液，添加含29% PEG4000及5 mM CaCl2之於100 mM HEPES緩衝液(pH7.5)中破碎之前述種結晶稀釋成100-10000倍之稀釋系列之溶液0.2μl，藉此製備結晶化滴劑。將該結晶化滴劑於20℃靜置2日至3日，測定藉此獲得之薄板狀結晶之X射線繞射數據。
(14-5)6RL#9抗體之Fab片段於Ca非存在下之結晶化
精製6RL#9抗體之Fab片段使用5000MWCO之超過濾膜，濃縮為15 mg/ml。其次，利用hanging-drop蒸氣擴散法，實施以前述方式濃縮之試樣之結晶化。貯存溶液使用含18-25%之PEG4000之100 mM HEPES緩衝液(pH7.5)。在蓋玻片上對於0.8μl之貯存溶液及0.8μl之前述濃縮試樣之混合液，添加以含25% PEG4000之100 mM HEPES緩衝液(pH7.5)中破碎之Ca存在下獲得之6RL#9抗體之Fab片段之結晶稀釋為100-10000倍而得之稀釋系列之溶液0.2μl，製備結晶化滴劑。將該結晶化滴劑於20℃靜置2日至3日，測定藉此獲得之薄板狀之結晶之X射線繞射數據。
(14-6)6RL#9抗體之Fab片段於Ca存在下之結晶X 射線繞射數據之測定
將浸於含35% PEG4000及5 mM CaCl2之100mM HEPES緩衝液(pH7.5)之溶液而得之6RL#9抗體之Fab片段於Ca存在下獲得之單結晶，使用微小的附尼龍環的銷，將各外液鏟出，而使該單結晶於液態氮中凍結。使用高能量加速器研究機構之放射光設施Phonton Factory之束線BL-17A，測定前述冷凍結晶之X射線繞射數據。又，測定中藉由一直於-178℃之氮氣流中放置冷凍結晶，維持冷凍狀態。使用束線具備並安裝的CCD偵測器Quantum315r(ADSC)，使結晶每次旋轉1°，收集總共180張繞射影像。晶格常數之決定、對於繞射斑點賦予指數、及繞射數據之處理，係以程式Xia2(CCP4 Software Suite)、XDS Package(Walfgang Kabsch)及Scala(CCP4 Software Suite)進行。最終，獲得解析能力至多2.2埃之繞射強度數據。本結晶，屬於空間群P212121，晶格常數a=45.47埃、b=79.86埃、c=116.25埃、α=90°、β=90°、γ=90°。
(14-7)6RL#9抗體之Fab片段於Ca非存在下之結晶之X射線繞射數據之測定
將浸於含35% PEG4000之100 mM HEPES緩衝液(pH7.5)之溶液的6RL#9抗體之Fab片段於Ca非存在下獲得之單結晶之一，藉由使用附微小的尼龍環的的銷，將外液鏟出，使該單結晶於液態氮中冷凍。使用高能量加速器研究機構之放射光設施Phonton Factory之束線BL-5A，測定前述冷凍結晶之X射線繞射數據。又，測定中一直將冷凍結晶 放置在-178℃之氮氣流中，藉此維持冷凍狀態。使用束線具備並安裝的CCD偵測器Quantum210r(ADSC)，使結晶每次旋轉1°，收集總共180張繞射影像。晶格常數之決定、對於繞射斑點賦予指數、及繞射數據之處理，係以程式Xia2(CCP4 Software Suite)、XDS Package(Walfgang Kabsch)及Scala(CCP4 Software Suite)進行。最終，獲得解析能力至多2.3埃之繞射強度數據。本結晶，屬於空間群P212121，晶格常數a=45.40埃、b=79.63埃、c=116.07埃、α=90°、β=90°、γ=90°，與Ca存在下之結晶為同型。
(14-8)6RL#9抗體之Fab片段於Ca存在下之結晶之結構解析
利用使用程式Phaser(CCP4 Software Suite)之分子取代法，決定6RL#9抗體之Fab片段於Ca存在下之結晶之結構。從獲得之結晶格子之大小以及6RL#9抗體之Fab片段之分子量，預測非對稱單元中之分子數為一個。依據一次序列上之相同性，將從PDB code：1ZA6之結構座標取出之A鏈112-220號及B鏈116-218號之胺基酸殘基部分當做CL及CH1區之探索用模型分子。其次，將從PDB code：1ZA6之結構座標取出之B鏈1-115號之胺基酸殘基部分，當做VH區之探索用模型分子。最後，將從PDB code 2A9M之結構座標取出之輕鏈3-147號之胺基酸殘基，當做VL區之探索用模型分子。依照該順序，從旋轉函數及並進函數決定各探索用模型分子於結晶格子內之走向與位置，而獲 得6RL#9抗體之Fab片段之初始結構模型。對於該初始結構模型，進行使VH、VL、CH1、CL之各域移動的剛體精密化，對於25-3.0埃之反射數據，結晶學的可靠度因子R值為46.9%、Free R值為48.6%。又，一面參考利用使用程式Refmac5(CCP4 Software Suite)之結構精密化、與由實驗決定之結構因子Fo與從模型計算之結構因子Fc及使用位相計算之以2Fo-Fc、Fo-Fc當做係數之電子密度輿圖，一面反複進行於程式Coot(Paul Emsley)上進行模型修正，藉此進行模型之精密化。最後，依據以2Fo-Fc、Fo-Fc當做係數之電子密度輿圖，將Ca離子及水分子納入模型，以使用程式Refmac5(CCP4 Software Suite)進行精密化。藉由使用解析能力為25-2.2埃之21020個反射數據，最終，對於3440個原子之模型，結晶學的可靠度因子R值為20.0%、Free R值為27.9%。
(14-9)6RL#9抗體之Fab片段於Ca非存在下之結晶之X射線繞射數據之測定
6RL#9抗體之Fab片段於Ca非存在下之結晶之結構，係使用同型Ca存在下結晶之結構決定。從6RL#9抗體之Fab片段於Ca存在下之結晶之結構座標，窺視水分子與Ca離子分子，進行使VH、VL、CH1、CL之各域移動之剛體精密化。對於25-3.0埃之反射數據，結晶學的可靠度因子R值為30.3%、Free R值為31.7%。再者，一面參考利用使用程式Refmac5(CCP4 Software Suite)之結構精密化、與由實驗決定之結構因子Fo與從模型計算之結構因子Fc及 使用位相計算之以2Fo-Fc、Fo-Fc當做係數之電子密度輿圖，一面反複進行於程式Coot(Paul Emsley)上進行模型修正，藉此進行模型之精密化。最後，依據以2Fo-Fc、Fo-Fc當做係數之電子密度輿圖，將水分子納入模型，以使用程式Refmac5(CCP4 Software Suite)進行精密化。藉由使用解析能力為25-2.3埃之18357個反射數據，最終，對於3351個原子之模型，結晶學的可靠度因子R值為20.9%、Free R值為27.7%。
(14-10)6RL#9抗體之Fab片段於Ca存在或非存在下之結晶之X射線繞射數據之比較
若比較6RL#9抗體之Fab片段於Ca存在下之結晶及Ca非存在下之結晶之結構，可觀察到重鏈CDR3有重大變化。圖18顯示由X射線結晶結構解析決定之6RL#9抗體之Fab片段之重鏈CDR3之結構。具體而言，於Ca存在下之6RL#9抗體之Fab片段之結晶中，重鏈CDR3環圈部分之中心部分存在有鈣離子。鈣離子，據認為會與重鏈CDR3之95位、96位及100a位(Kabat編號)交互作用。Ca存在下時，與抗原之結合會由於重要重鏈CDR3環圈與鈣結合而安定化，據認為成為對與抗原之結合最適之結構。抗體之重鏈CDR3有鈣結合之例，至今為止無人報告，抗體之重鏈CDR3有鈣結合之結構為新穎結構。
從6RL#9抗體之Fab片段之構造得知之在重鏈CDR3存在之鈣結合模體，能成為取得參考實施例7記載之Ca庫的設計的新要素。亦即在參考實施例7係在輕鏈可變區導入 了鈣結合模體，但例如可為含6RL#9抗體之重鏈CDR3且在含輕鏈以外之CDR含柔性殘基之庫。
(參考實施例15)使用噬菌體表現技術從人類抗體庫取得Ca依存性的結合於IL-6的抗體 (15-1)未改變(naïve)人類抗體噬菌體表現庫之製作
以從人類PBMC製作之polyA RNA或市售人類polyA RNA等當做模板，參考(Methods Mol Biol.2002；178：87-100.)，構建由表現彼此相異之人類抗體序列之Fab分域之多數噬菌體構成之人類抗體噬菌體表現庫。
(15-2)利用珠淘選由庫取得Ca依存性的結合於抗原之抗體片段
從構建之未經改變的人類抗體噬菌體表現庫之最初之選拔，係僅濃縮具備對於抗原(IL-6)之結合能力之抗體片段。抗原使用經生物素標記之人類IL-6。
由保持以上述方式構建之噬菌體表現用噬粒之大腸菌產生噬菌體，對已進行噬菌體產生之大腸菌之培養液以2.5 M NaCl/10%PEG而沉澱的噬菌體之集團以TBS稀釋，製成噬菌體庫液。對於噬菌體庫液添加BSA,CaCl2，製成使終濃度4% BSA，游離鈣濃度1.2 mM。淘選係參考一般方法，即使用固定化於磁性珠之抗原之淘選方法(J Immunol Methods.2008 Mar 20；332(1-2)：2-9.、J Immunol Methods.2001 Jan 1；247(1-2)：191-203.、Biotechnol Prog.2002 Mar-Apr；18(2)：212-20.、Mol Cell Proteomics.2003 Feb；2(2)：61-9.)。磁性珠使用NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或Streptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)。
具體而言，於製備的噬菌體庫液添加250 pmol之生物素標記抗原，藉此使該噬菌體庫液於室溫接觸抗原60分鐘。添加以BSA阻斷的磁性珠，將抗原與噬菌體之複合體於室溫結合於磁性珠15分鐘。將珠以1.2 mM CaCl2/TBST(含1.2 mM CaCl2之TBST)洗滌3次後，以1 mL之1.2 mM CaCl2/TBS(含1.2 mM CaCl2之TBS)再洗滌2次。之後，將添加有0.5 mL之1 mg/mL之胰蛋白酶之珠於室溫懸浮15分鐘後，立即使用磁座分離珠，將噬菌體溶液回收。將回收的噬菌體溶液，添加到處於對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10 mL之大腸菌株TG1。於37℃緩慢攪拌，培養上述大腸菌1小時，藉此使噬菌體感染大腸菌。將經感染之大腸菌，接種到225 mm x 225 mm的板。其次，從經接種之大腸菌之培養液回收噬菌體，以製備噬菌體庫液。
第2次後之淘選，係以Ca依存性結合能力為指標，實施噬菌體之濃縮。具體而言，係於製備的噬菌體庫液添加40 pmol之生物素標記抗原，藉此使噬菌體庫於室溫與抗原接觸60分鐘。添加經BSA阻斷的磁性珠，使抗原與噬菌體之複合體於室溫結合於磁性珠15分鐘。珠以1 mL之1.2 mM CaCl2/TBST與1.2 mM CaCl2/TBS洗滌。之後，將添加有0.1 mL之2 mM EDTA/TBS的珠於室溫懸浮後，立即使用磁座分離珠，並回收噬菌體溶液。於回收之噬菌體溶液添 加100 mg/mL之胰蛋白酶5μL，藉此切斷未呈現Fab之噬菌體之pIII蛋白質(幫助者(helper)噬菌體來源之pIII蛋白質)，使未呈現Fab之噬菌體失去對於大腸菌之感染能力。將從經胰蛋白酶處理之噬菌體溶液回收之噬菌體，添加到處於對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10 mL之大腸菌株TG1。於37℃緩慢攪拌進行1小時上述大腸菌之攪拌培養，使噬菌體感染大腸菌。將感染的大腸菌接種在225 mm x 225 mm之板。其次，從接種的大腸菌的培養液回收噬菌體，藉此回收噬菌體庫液。以Ca依存性結合能力為指標之淘選，重覆3次。
(15-3)利用噬菌體ELISA所為之評價
從依照上述方法獲得之大腸菌之單一菌落，參考常法(Methods Mol.Biol.(2002)178,133-145)回收含噬菌體之培養上清。將添加有BSA及CaCl2使終濃度為4%BSA及1.2 mM鈣離子濃度之含噬菌體之培養上清，以下列步驟供ELISA。將StreptaWell 96微滴定板(Roche)以含生物素標記抗原之100μL之PBS塗覆一晚。將該板之各井以PBST洗滌，以去除抗原後，將該井以250μL之4%BSA-TBS阻斷1小時以上。將已去除4%BSA-TBS之各井中添加有製備之培養上清的該板，於37℃靜置1小時，藉此使呈現噬菌體之抗體結合於各井存在之抗原。於以1.2 mM CaCl2/TBST洗滌之各井中，添加1.2 mM CaCl2/TBS或1 mM EDTA/TBS，將該板於37℃靜置30分鐘並溫育。以1.2 mM CaCl2/TBST洗滌後，將以設為終濃度4%BSA及1.2 mM游離 鈣濃度之TBS稀釋過的HRP結合抗M13抗體(Amersham Pharmacia Biotech)添加到各井之板溫育1小時。以1.2 mM CaCl2/TBST洗滌後，使添加有TMB single溶液(ZYMED)之各井中之溶液之發色反應藉由添加硫酸而停止後，從450 nm之吸光度測定該發色。
使用經單離之96選殖體進行噬菌體ELISA，獲得對於IL-6具有Ca依存性結合能力之6KC4-1#85抗體。由上述噬菌體ELISA之結果，進行判斷為具有對於Ca依存性抗原之結合能力的抗體片段為模板，而以專一性引子放大之基因之鹼基序列解析。6KC4-1#85抗體之重鏈可變區之序列記載於序列編號：10，及輕鏈可變區之序列記載於序列編號：104。將編碼為6KC4-1#85抗體之重鏈可變區(序列編號：10)之聚核苷酸，以PCR法與編碼為IgG1來源序列之聚核苷酸連結成之DNA片段，納入動物細胞表現用載體，構建表現序列編號：105表示之重鏈之載體。將編碼為6KC4-1#85抗體之輕鏈可變區(序列編號：104)之聚核苷酸、以PCR法與編碼為天然型Kappa鏈之不變區(序列編號：44)之聚核苷酸連結成之序列之DNA片段，納入動物細胞表現用載體。製作之改變體之序列，經該技術領域之人士公知之方法確認。製作之改變體之序列，經該技術領域之人士公知之方法確認。
(15-4)抗體之表現與精製
將噬菌體ELISA之結果判斷為具有對於Ca依存性抗原之結合能力之選殖體6KC4-1#85，導入動物細胞表現用質 體。抗體之表現係使用以下方法實施。將人類胎兒腎細胞來源FreeStyle 293-F株(Invitrogen)懸浮於FreeStyle 293 Expression Medium培養基(Invitrogen)，以1.33 x 106細胞/mL之細胞密度對於6井板之各井各接種3 mL。製備之質體，以脂轉染法導入細胞。於CO2培養箱(37度、8%CO2、90 rpm)中培養4日。使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)，以該技術領域之人士公知之方法，從上述獲得之培養上清精製抗體。使用分光光度計測定經精製之抗體溶液於280 nm之吸光度。藉由使用PACE法計算之吸光係數，從得到之測定值計算抗體濃度(Protein Science(1995)4,2411-2423)。
(參考實施例16)6KC4-1#85抗體之鈣離子結合評價
評價從人類抗體庫取得之鈣依存性的抗原結合抗體6KC4-1#85抗體是否會與鈣結合。以游離鈣濃度不同之條件，依參考實施例2記載之方法評價所測定之Tm值是否有變動。
6KC4-1#85抗體之Fab分域之Tm值如表25。如表25，6KC4-1#85抗體之Fab分域之Tm值會依鈣離子濃度而變動，故顯示6KC4-1#85抗體與鈣結合。
Figure 101135762-A0202-02-0299-60
(參考實施例17)6KC4-1#85抗體之鈣離子結合部位之 鑑定
參考實施例16顯示6KC4-1#85抗體會與鈣離子結合，但是6KC4-1#85不具有從後述hVk5-2序列之探討可知不具鈣結合模體。所以，為了鑑定鈣離子是否與6KC4-1#85抗體之重鏈還是輕鏈還是兩者結合，評價鈣離子對於各交換為不與鈣離子結合之抗Glypican3抗體(重鏈序列GC_H(序列編號：106)、輕鏈序列GC_L(序列編號：107))之重鏈與輕鏈之改變抗體之結合。依參考實施例2之方法測得之改變抗體之Tm值如表26所示。其結果，帶有6KC4-1#85抗體之重鏈之改變抗體之Tm值會依鈣離子之濃度變化，故可認為以6KC4-1#85抗體之重鏈與鈣結合。
Figure 101135762-A0202-02-0300-61
而為了鑑定鈣離子是否與6KC4-1#85抗體之重鏈之哪一個殘基有鈣離子結合，製作6KC4-1#85抗體之CDR所存在之Asp(D)殘基取代為與鈣離子之結合或螯合無關的Ala(A)殘基之改變重鏈(6_H1-11(序列編號：108)、6_H1-12(序列編號：109)、6_H1-13(序列編號：110)、6_H1-14(序列編號：56)、6_H1-15(序列編號：112))、及改變輕鏈(6_L1-5(序列編號：113)及6_L1-6(序列編號：114))。從導入有含改變抗體基因之表現載體的動物細胞的 培養液，依參考實施例15記載之方法精製改變抗體。經精製之改變抗體之鈣結合，依參考實施例2記載之方法測定。測定結果如表27。如表27所示，藉由將6KC4-1#85抗體之重鏈CDR3之95位或101位(Kabat編號)取代為Ala殘基，6KC4-1#85抗體會失去鈣結合能力，因此可認為該殘基對於與鈣之結合為重要。從6KC4-1#85抗體之改變抗體之鈣結合性可知，6KC4-1#85抗體之重鏈CDR3之環圈基部附近存在之鈣結合模體，也可利用為取得本發明之抗原結合分子所包含之依離子濃度對抗抗原之抗原結合分域時使用之Ca庫設計的新要素。後述參考實施例7係於輕鏈可變區導入鈣結合模體，但例如據認為含有6KC4-1#85抗體之重鏈CDR3、且含有輕鏈之此以外之CDR含有柔性殘基之庫。
Figure 101135762-A0202-02-0302-62
(參考實施例18)使用正常小鼠之Ca依存性結合抗體對抗原之血漿中滯留性之影響之評價 (18-1)使用正常小鼠之體內試驗
評價對於正常小鼠(C57BL/6J mouse、Charles River Japan)將hsIL-6R(可溶型人類IL-6受體：於參考實施例21製作)單獨投予或將hsIL-6R及抗人類IL-6受體抗體同時投予後之hsIL-6R及抗人類IL-6受體抗體之體內動態。將hsIL-6R溶液(5μg/mL)、或hsIL-6R與抗人類IL-6受體抗體之混合溶液對於尾靜脈以10 mL/kg單次投予。抗人類IL-6受體抗體，使用上述H54/L28-IgG1、6RL#9-IgG1、 FH4-IgG1。
混合溶液中之hsIL-6R濃度均為5μg/mL，但抗人類IL-6受體抗體濃度因應各抗體而不同，H54/L28-IgG1為0.1 mg/mL、6RL#9-IgG1及FH4-IgG1為10 mg/mL。此時，由於對於hsIL-6R之抗人類IL-6受體抗體係有足量過剩，故可認為hsIL-6R大部分與抗體結合。投予後15分鐘、7小時、1日、2日、4日、7日、14日、21日、28日進行採血。將採取之血液立即於4℃以12,000 rpm進行15分鐘離心分離，獲得血漿。分離之血漿直到實施測定為止，保存在設定為-20℃以下之冷凍庫。
(18-2)利用ELISA法測定正常小鼠血漿中之抗人類IL-6受體抗體濃度
小鼠血漿中之抗人類IL-6受體抗體濃度以ELISA法測定。首先，將Anti-Human IgG(γ-chain specific)F(ab’)2 Fragment of Antibody(SIGMA)分注於Nunc-Immuno Plate,MaxiSoup(Nalge nunc International)，於4℃靜置1晚，製作Anti-Human IgG固相化板。將血漿中濃度為0.64、0.32、0.16、0.08、0.04、0.02、0.01μg/mL之檢量線試樣及稀釋100倍以上之小鼠血漿測定試樣，分注到Anti-Human IgG固相化板，於25℃溫育1小時。之後，使Biotinylated Anti-human IL-6 R Antibody(R&D)於25℃反應1小時，再將Streptavidin-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)於25℃反應0.5小時，使用TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories)為基質進行發色反應，以1N-硫酸(Showa Chemical)使反應停止後，以微板讀取儀測定450 nm之吸光度。小鼠血漿中濃度，係從檢量線之吸光度使用解析軟體SOFTmax PRO(Molecular Devices)計算。該方法測定之靜脈內投予後之正常小鼠中的H54/L28-IgG1、6RL#9-IgG1、FH4-IgG1之血漿中抗體濃度變化如圖19。
(18-3)利用電化學發光法測定血漿中hsIL-6R濃度
小鼠之血漿中hsIL-6R濃度，以電化學發光法測定。製備調整為2000、1000、500、250、125、62.5、及31.25 pg/mL之濃度的hsIL-6R檢量線試樣及稀釋50倍以上之小鼠血漿測定試樣。將試樣與以SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)釕化之單株抗人類IL-6R抗體(R&D)、生物素化抗人類IL-6 R抗體(R&D)、及tocilizumab(重鏈序列編號：96、輕鏈序列編號：97)溶液之混合液於4℃反應1晚。為了使樣本中之游離Ca濃度下降，樣本中幾乎所有的hsIL-6R從6RL#9-IgG1或FH4-IgG1解離，且成為與添加之tocilizumab結合之狀態，此時之Assay buffer含有10 mM EDTA。之後，將該反應液分注到MA400 PR Streptavidin Plate(Meso Scale Discovery)。再將於25℃反應1小時之板之各井洗滌後，在各井分注Read Buffer T(×4)(Meso Scale Discovery)。立即將反應液使用SECTOR PR 400 reader(Meso Scale Discovery)測定。hSIL-6R濃度係使用檢量線之應答使用解析軟體SOFTmax PRO (Molecular Devices)計算。以前述方法測定之靜脈內投予後之正常小鼠血漿中之hsIL-6R之濃度變動如圖20所示。
其結果，hsIL-6R單獨非常快消失，相對於此同時投予hsIL-6R及無Ca依存性結合之通常之抗體H54/L28-IgG1的情形，hsIL-6R之消失大幅減慢。相對於此，同時投予hsIL-6R及有100倍以上之Ca依存性結合之6RL#9-IgG1或FH4-IgG1的情形，hsIL-6R之消失大幅加速。比起同時投予H54/L28-IgG1之情形，同時投予6RL#9-IgG1及FH4-IgG1的情形，一日後之血漿中之hsIL-6R濃度各減少39倍及2倍。藉此可確認鈣依存性結合抗體能加速抗原從血漿中消失。
(參考實施例19)提高Ca依存性的抗原結合抗體之抗原消失加速效果之探討(抗體製作) (19-1)關於IgG抗體對FcRn之結合
IgG抗體藉由與FcRn結合而有長血漿中滯留性。IgG與FcRn之結合僅在酸性條件下(pH6.0)被觀測到，在中性條件下(pH7.4)其幾乎未觀測到結合。IgG抗體係以非專一的攝入細胞，但於內體內之酸性條件下藉由於內體(endosome)內之FcRn結合而回到細胞表面上，在血漿中之中性條件下從FcRn解離。若對於IgG之Fc區導入變異，使於pH酸性域之條件下對於FcRn失去結合，則不會從內體內再循環到血漿中，抗體之血漿中滯留性會顯著受損。
就改善IgG抗體之血漿中滯留性之方法而言，有人報告提高於酸性條件下對於FcRn之結合之方法。藉由對於 IgG抗體之Fc區導入胺基酸取代並使在酸性條件下對於FcRn之結合提高，使從內體內向血漿中之再循環效率升高，結果，IgG抗體之血漿中滯留性改善。在導入胺基酸取代時被認為係重要者，係不提高在中性條件下對FcRn之結合。在中性條件下結合於FcRn之IgG抗體，雖可藉由在內體內之酸性條件下結合於FcRn而回到細胞表面上，但在中性條件下之血漿中，IgG抗體不會從FcRn解離而不會再循環到血漿中，反而有損IgG抗體之血漿中滯留性。
例如Dall’Acqua等人(J.Immunol.(2002)169(9),5171-5180)之記載，藉由對小鼠投予、導入胺基酸取代，在中性條件下(pH7.4)會觀測到對小鼠FcRn之結合之IgG1抗體之血漿中滯留性惡化。又，如Yeung等人(J.Immunol.(2009)182(12),7663-7671)、Datta-Mannan等人(J.Biol.Chem.(2007)282(3),1709-1717)、Dall’Acqua等人(J.Immunol.(2002)169(9),5171-5180)之記載，藉由導入胺基酸取代，在酸性條件下(pH6.0)對人類FcRn之結合提高之IgG1抗體改變體，同時在中性條件下(pH7.4)對人類FcRn會認為有結合。據報告對於食蟹猴投予之該抗體之血漿中滯留性未改善，血漿中滯留性也無變化。所以，在使抗體之機能提高之抗體工程技術，重視不使在中性條件下(pH7.4)對人類FcRn之結合增加，而增加在酸性條件下對人類FcRn之結合而改善抗體之血漿中滯留性。亦即，藉由對於其Fc區導入胺基酸取代，而增強在中性條件下(pH7.4)對人類FcRn之結合的IgG1抗體之優點至今尚無人 報告。
以Ca依存性的與抗原結合之抗體，由於有使可溶型抗原消失加速、一個抗體分子重複多次與可溶型抗原之效果，故極有用。使該抗原消失加速效果更提高的方法，有人驗證在中性條件下(pH7.4)對FcRn之結合增強之方法。
(19-2)在中性條件下對FcRn有結合活性之Ca依存性的人類IL-6受體結合抗體之製備
藉由對於具有鈣依存性的抗原結合能力之FH4-IgG1、6RL#9-IgG1、及作為對照之不具鈣依存性的抗原結合能力的H54/L28-IgG1的Fc區導入胺基酸變異，製作在中性條件下(pH7.4)對FcRn有結合的改變體。胺基酸變異之導入係利用使用PCR之該技術領域中具有通常知識者公知之方法實行。具體而言，製作對IgG1之重鏈不變區，將EU編號表示之434位之胺基酸Asn取代為Trp之FH4-N434W(重鏈序列編號：115、輕鏈序列編號：101)與6RL#9-N434W(重鏈序列編號：116、輕鏈序列編號：99)與H54/L28-N434W(重鏈序列編號：117、輕鏈序列編號：39)。使用QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)，使用附帶的說明書記載的方法，製作插入有編碼為該胺基酸經取代之變異體的聚核苷酸的動物細胞表現載體。抗體之表現、精製、濃度測定，依參考實施例11記載之方法實施。
(參考實施例20)使用正常小鼠之Ca依存性結合抗體之消失加速效果之評價 (20-1)使用正常小鼠之體內試驗
評價對於正常小鼠(C57BL/6J mouse、Charles River Japan)將hsIL-6R(可溶型人類IL-6受體：於參考實施例20製作)單獨投予或將hsIL-6R及抗人類IL-6受體抗體同時投予後之hsIL-6R及抗人類IL-6受體抗體之體內動態。將hsIL-6R溶液(5μg/mL)、或hsIL-6R與抗人類IL-6受體抗體之混合溶液對於尾靜脈以10 mL/kg單次投予。抗人類IL-6受體抗體，使用上述H54/L28-N434W、6RL#9-N434W、FH4-N434W。
混合溶液中之hsIL-6R濃度均為5μg/mL，但抗人類IL-6受體抗體濃度因應各抗體而不同，H54/L28-N434W為0.042 mg/mL、6RL#9-N434W為0.55 mg/mL、FH4-N434W為1 mg/mL。此時，由於對於hsIL-6R之抗人類IL-6受體抗體係有足量過剩，故可認為hsIL-6R大部分與抗體結合。投予後15分鐘、7小時、1日、2日、4日、7日、14日、21日、28日進行採血。將採取之血液立即於4℃以12,000 rpm進行15分鐘離心分離，獲得血漿。分離之血漿直到實施測定為止，保存在設定為-20℃以下之冷凍庫。
(20-2)利用ELISA法測定正常小鼠血漿中之抗人類IL-6受體抗體濃度
小鼠血漿中之抗人類IL-6受體抗體濃度與參考實施例18同樣以ELISA法測定。該方法測定之靜脈內投予後之正常小鼠中的H54/L28-N434W、6RL#9-N434W、FH4-N434W抗體之血漿中抗體濃度變化如圖21。
(20-3)利用電化學發光法測定血漿中hsIL-6R濃度
小鼠之血漿中hsIL-6R濃度，以電化學發光法測定。製備調整為2000、1000、500、250、125、62.5、及31.25 pg/mL之濃度的hsIL-6R檢量線試樣及稀釋50倍以上之小鼠血漿測定試樣。將試樣與以SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)釕化之單株抗人類IL-6R抗體(R&D)、生物素化抗人類IL-6R抗體(R&D)之混合液於4℃反應1晚。為了使樣本中之游離Ca濃度下降，樣本中幾乎所有的hsIL-6R從6RL#9-N434W或FH4-N434W解離，且成為以游離體存在之狀態，此時之Assay buffer含有10 mM EDTA。之後，將該反應液分注到MA400 PR Streptavidin Plate(Meso Scale Discovery)。再將於25℃反應1小時之板之各井洗滌後，在各井分注Read Buffer T(×4)(Meso Scale Discovery)。立即將反應液使用SECTOR PR 400 reader(Meso Scale Discovery)測定。hSIL-6R濃度係使用檢量線之應答使用解析軟體SOFTmax PRO(Molecular Devices)計算。以前述方法測定之靜脈內投予後之正常小鼠血漿中之hsIL-6R之濃度變動如圖22所示。
其結果，在pH7.4對FcRn有結合活性且另一方面對hsIL-6R無Ca依存的結合活性之H54/L28-N434W抗體同時投予的情形，比起將hsIL-6R單獨投予的情形，hsIL-6R的消失大幅延遲，相對於此，將相對於hsIL-6R有100倍以上的Ca依存的結合且於pH7.4對FcRn有結合之6RL#9-N434W抗體或FH4-N434W抗體同時投予的情形，比起單獨投予hsIL-6R的情形，hsIL-6R的消失加速。比起 單獨投予hsIL-6R之情形，同時投予6RL#9-N434W抗體或FH4-N434W抗體的情形，一日後之血漿中之hsIL-6R濃度各減少3倍及8倍。其結果可確認對於鈣依存的對抗原結合之抗體賦予在pH7.4對FcRn之結合活性，能更加速抗原從血漿中消失。
比起對hsIL-6R無Ca依存的結合的H54/L28-IgG1抗體，對hsIL-6R有100倍以上之Ca依存的結合活性之6RL#9-IgG1抗體或FH4-IgG1抗體，確認有使hsIL-6R之消失增大的效果。對hsIL-6R有100倍以上之Ca依存的結合且於pH7.4對FcRn有結合之6RL#9-N434W抗體或FH4-N434W抗體，確認比起單獨投予hsIL-6R，使hsIL-6R消失更加快。該等資料啟示，與pH依存的結合於抗原之抗體同樣，Ca依存的結合於抗原之抗體在內體內將抗原解離。
(參考實施例21)可溶型人類IL-6受體(hsIL-6R)之製備
為抗原之人類IL-6受體之重組人類IL-6受體，以下列方式製備。以該技術領域之人士公知之方法構建並培養穩定表現由Mullberg等人(J.Immunol.152,4958-4968(1994))報告之N末端側1號至357號之胺基酸序列構成的可溶型人類IL-6受體(以下稱為hsIL-6R)之CHO穩定表現株，使hsIL-6R表現。從獲得之該CHO株之培養上清，以Blue Sepharose 6 FF管柱層析、凝膠過濾管柱層析精製hsIL-6R。於最終步驟，以溶出為主要峰部之區分當做最終精製品。
(參考實施例22)pH依存性結合抗體庫之設計 (22-1)pH依存性結合抗體之取得方法
WO2009/125825揭示藉由對於抗原結合分子導入組胺酸，而在pH中性區與pH酸性區性質變化之pH依存性抗原結合抗體。所揭示之pH依存性結合抗體，係藉由將所望之抗原結合分子之胺基酸序列之一部分取代為組胺酸而取得。為了不預先獲得改變對象之抗原結合分子而更有效率的獲得pH依存性結合抗體，考慮從組胺酸導入於可變區(更佳為有涉及抗原結合之可能性之位置)之抗原結合分子之集團(稱為His庫)取得所望之結合於抗原之抗原結合分子。從His庫獲得之抗原結合分子比通常之抗體庫，組胺酸以較高頻度出現，所以據認為能有效率地取得具有所望性質之抗原結合分子。
(22-2)為了能以良好效率取得以pH依存性地結合於抗原之結合抗體，將組胺酸殘基導入於可變區之抗體分子之集團(His庫)之設計
首先以His庫選擇導入組胺酸之位置。WO2009/125825中，揭示藉由將IL-6受體抗體、IL-6抗體及IL-31受體抗體之序列中之胺基酸殘基取代為組胺酸而製作pH依存性抗原結合抗體。然後，將抗原結合分子之胺基酸序列取代為組胺酸，製作有pH依存性抗原結合能力之抗蛋白溶菌酶抗體(FEBS Letter 11483,309,1,85-88)及抗hepcidin抗體(WO2009/139822)。在IL-6受體抗體、IL-6抗體、IL-31受體抗體、蛋白溶菌酶抗體及hepcidin抗體導入組胺酸之 位置如表28所示。表28所示之位置，可列舉能控制抗原與抗體之結合之位置之候選者。再者，以表28表示之位置以外，只要與抗原接觸之可能性高之位置也可適當考慮作為導入組胺酸之位置。
Figure 101135762-A0202-02-0312-63
在由重鏈可變區與輕鏈可變區構成之His庫中，重鏈可變區使用人類抗體序列，對輕鏈可變區導入組胺酸。於His庫導入組胺酸之位置，選擇上列舉之位置、可能涉及抗原結合之位置，亦即輕鏈之30位、32位、50位、53位、91位、92位及93位(Kabat編號、Kabat EA et al.1991.Sequence of Proteins of Immunological Interest.NIH)。又，作為導入組胺酸之輕鏈可變區之模板序列，選擇Vk1序列。使模板序列出現多數胺基酸，擴大構成庫之抗原結合分子之多樣性。出現多數胺基酸之位置，選擇在與抗原交互作用之可能性高之可變區之表面露出之位置。具體而言，選擇輕鏈之30位、31位、32位、34位、50位、53位、91位、92位、93位、94位及96位(Kabat編號、 Kabat EA et al.1991.Sequence of Proteins of Immunological Interest.NIH)作為如此的柔性殘基。
然後設定使出現之胺基酸殘基種類及其出現率。解析在Kabat資料庫(KABAT,E.A.ET AL.：’Sequences of proteins of immunological interest’,vol.91,1991,NIH PUBLICATION)登載的hVk1及hVk3之序列中之柔性殘基中之胺基酸之出現頻度。依解析結果，從各位置出現頻度高的胺基酸挑選在His庫出現之胺基酸之種類。此時，為了使胺基酸之性質不會不均勻，也選擇解析結果判定為出現頻度少之胺基酸。又，選擇之胺基酸之出現頻度，參考Kabat資料庫之解析結果設定。
考慮如以上設定之胺基酸及出現頻度，作為His庫，設計組胺酸在各CDR固定一定會有一個的His庫1，及比His庫1更重視序列之多樣性之His庫2。His庫1及His庫2之詳細設計如表3及表4(各表中之位置表示Kabat編號)。又，表3及4記載之胺基酸之出現頻度，於Kabat編號表示之92位為Asn(N)之情形，94位可排除Ser(S)。
(參考實施例23)用於取得以pH依存性地結合於抗原之抗體之人類抗體噬菌體表現庫(His庫1)之製作
以從人類PBMC製作之polyA RNA、或市售之人類polyA RNA等作為模板，以PCR法將抗體重鏈可變區之基因庫放大。將參考實施例22記載之設計作為His庫1之抗體輕鏈可變區之基因庫使用PCR法放大。將以此方式製作之抗體重鏈可變區之基因庫與抗體輕鏈可變區之基因庫組合插入 噬粒載體，構建表現由人類抗體序列構成之Fab分域之人類抗體噬菌體表現庫。構建方法參考(Methods Mol Biol.(2002)178,87-100)。當上述庫之構建時，使用連結噬粒之Fab與噬菌體pIII蛋白質之連結子部分、及在幫手噬菌體pIII蛋白質基因之N2分域與CT分域之間插入有胰蛋白酶切斷序列之噬菌體表現庫之序列。確認從導入有抗體基因庫之大腸菌單離之抗體基因部分之序列，獲得132個選殖體之序列資訊。設計之胺基酸分布、確認之序列中之胺基酸之分布，如圖23所示。構建含有與設計之胺基酸分布對應之多樣序列之庫。
(參考實施例24)以pH依存性地結合於IL-6R之抗體之取得 (24-1)利用珠淘選由庫取得pH依存性的結合於抗原之抗體片段
從構建之His庫1之最初之選拔，係僅濃縮具備對於抗原(IL-6R)之結合能力之抗體片段以實施。
由保持以上述方式構建之噬菌體表現用噬粒之大腸菌產生噬菌體。藉由對於進行噬菌體產生之大腸菌之培養液添加2.5 M NaCl/10%PEG，使沉澱的噬菌體的集團以TBS稀釋，藉此獲得噬菌體庫液。其次，對於噬菌體庫液添加BSA及CaCl2，使終濃度成為4%BSA及1.2mM鈣離子濃度。淘選方法，係參照一般方法即使用固定化於磁性珠之抗原的淘選方法(J.Immunol.Methods.(2008)332(1-2),2-9、J.Immunol.Methods.(2001)247(1-2),191-203、 Biotechnol.Prog.(2002)18(2)212-20、Mol.Cell Proteomics(2003)2(2),61-9)。磁性珠可使用NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或Streptavidin coated beads (Dynabeads M-280 Streptavidin)。
具體而言，於製備的噬菌體庫液添加250 pmol之生物素標記抗原，藉此使該噬菌體庫液於室溫接觸抗原60分鐘。添加以BSA阻斷的磁性珠，將抗原與噬菌體之複合體於室溫結合於磁性珠15分鐘。將珠以1.2 mM CaCl2/TBST(含1.2 mM CaCl2、0.1% Tween20之TBS)1 mL洗滌3次後，再以1 mL之1.2 mM CaCl2/TBS(pH7.6)洗滌2次。之後，將添加有0.5 mL之1 mg/mL之胰蛋白酶之珠於室溫懸浮15分鐘後，立即使用磁座分離珠，將噬菌體溶液回收。將回收的噬菌體溶液，添加到處於對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10 mL之大腸菌株ER2738。於37℃緩慢攪拌，培養上述大腸菌1小時，藉此使噬菌體感染大腸菌。將經感染之大腸菌，接種到225 mm x 225 mm的板。其次，從經接種之大腸菌之培養液回收噬菌體，以製備噬菌體庫液。
第2次後之淘選，係以抗原結合能力或pH依存性結合能力為指標，實施噬菌體之濃縮。具體而言，係於製備的噬菌體庫液添加40 pmol之生物素標記抗原，藉此使噬菌體庫於室溫與抗原接觸60分鐘。添加經BSA阻斷的磁性珠，使抗原與噬菌體之複合體於室溫結合於磁性珠15分鐘。珠以1 mL之1.2 mM CaCl2/TBST與1.2 mM CaCl2/TBS 洗滌數次。之後，將添加有0.5mL之1 mg/mL胰蛋白酶的珠於室溫懸浮15分鐘後，立即使用磁座分離珠，並回收噬菌體溶液。之後於以抗原結合能力作為指標進行濃縮時，將加有1mg/mL之胰蛋白酶0.5mL之珠於室溫懸浮15分鐘後立即以磁座將珠分離並回收噬菌體溶液。於以pH依存性抗原結合能力作為指標濃縮的情形，將加有0.1mL50mM MES/1.2 mM CaCl2/150mM NaCl(pH5.5)之珠於室溫懸浮後，立刻以磁座分離珠，於回收的噬菌體溶液加入100mg/mL的胰蛋白酶5μL，將未表現Fab之噬菌體之pIII蛋白質(來自幫手噬菌體之pIII蛋白質)切斷，使未表現Fab之噬菌體喪失對大腸菌之感染能力。將回收之噬菌體，添加到處於對數增殖期(OD600為0.4-0.7)之10 mL之大腸菌株ER2738。於37℃緩慢攪拌進行1小時上述大腸菌之攪拌培養，使噬菌體感染大腸菌。將感染的大腸菌接種在225 mm x 225 mm之板。其次，從接種的大腸菌的培養液回收噬菌體，藉此回收噬菌體庫液。以抗原結合能力或pH依存性結合能力為指標之淘選，重覆2次。
(24-2)利用噬菌體ELISA之評價
從依上述方法獲得之大腸菌單一菌落，依常法(Methods Mol Biol.2002；178：133-145.)回收含噬菌體之培養上清。
將已添加BSA、CaCl2使終濃度為終濃度4%BSA及鈣離子濃度1.2 mM之含噬菌體之培養上清依以下程序供ELISA。將StreptaWell 96微滴定板(Roche)以含生物素標 記抗原之PBS 100μL塗覆一晚。以PBST(含0.1%Tween20之PBS)洗滌該板之各井以去除抗原後，將該井以4% BSA-TBS 250μL阻斷1小時以上。去除4% BSA-TBS，於已去除4% BSA-TBS之各井添加製備的培養上清，將該板於37℃靜置1小時，使表現噬菌體之抗體結合於在各井存在的抗原。於以1.2 mM CaCl2/TBST洗滌之各井添加1.2 mM CaCl2/TBS(pH7.6)或1.2 mM CaCl2/TBS(pH5.5)，將該板於37℃靜置30分鐘並溫育。以1.2 mM CaCl2/TBST洗滌後，以4% BSA及游離鈣濃度1.2 mM之TBS稀釋成的HRP結合抗M13抗體(Amersham Parmacia Biotech)添加於各井的板溫育1小時。以1.2 mM CaCl2/TBST洗滌後，將添加有TMB single solution(ZYMED)之各井中之溶液之發色反應藉由硫酸之添加使反應停止後，測定450 nm之吸光度以測定該發色。
以抗原結合能力作為指標進行濃縮之情形，針對已實施淘選2次者實施噬菌體ELISA，結果成為抗原專一性的ELISA陽性者在96個選殖體中有17個選殖體，所以解析經淘選3次者。另一方面，於以pH依存性抗原結合能力作為指標進行濃縮之情形，針對經淘選2次者實施噬菌體ELISA，成為ELISA陽性者在94個選殖體中有70個選殖體，所以解析經淘選2次者。
對已實施上述噬菌體ELISA之選殖體，解析使用專一性引子放大之基因之鹼基序列。
噬菌體ELISA及序列解析之結果如以下之表29所示。
Figure 101135762-A0202-02-0318-64
依同樣之方法，從未經改變之人類抗體噬菌體表現庫取得具有pH依存性抗原結合能力之抗體。以抗原結合能作為指標進行濃縮之情形，在88個選殖體評價中取得I3種pH依存性結合抗體。又，以pH依存性抗原結合能力作為指標進行濃縮之情形，在83個選殖體評價中取得27種pH依存性結合抗體。
由以上結果，比起未經改變之人類抗體噬菌體表現庫，確認從His庫1獲得之具有pH依存性抗原結合能力之選殖體之多樣性較多。
(24-3)抗體之表現與精製
將噬菌體ELISA之結果判斷為具有對於pH依存性抗原之結合能力之選殖體，導入動物細胞表現用質體。抗體之表現係使用以下方法實施。將人類胎兒腎細胞來源FreeStyle 293-F株(Invitrogen)懸浮於FreeStyle 293 Expression Medium培養基(Invitrogen)，以1.33 x 106細胞/mL之細胞密度對於6井板之各井各接種3 mL。製備之質體，以脂轉染法導入細胞。於CO2培養箱(37度、8%CO2、90 rpm)中培養4日。使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)，以該技術領域之人士公知之方法，從上述獲得之培養上清精製抗體。使用分光光度計測定經精製之抗體溶液於280 nm之吸光度。藉由使用PACE法計算之吸光係數，從得到之測定值計算抗體濃度(Protein Science(1995)4,2411-2423)。
(24-4)取得之抗體對人類IL-6受體之pH依存性結合能力之評價
為了判斷(24-3)取得之抗體6RpH#01(重鏈序列編號：118、輕鏈序列編號：119)、及6RpH#02(重鏈序列編號：120)、輕鏈序列編號：121)、及6RpH#03(重鏈序列編號：122)、輕鏈序列編號：123)對人類IL-6受體之結合活性是否為pH依存性，將該等抗體與人類IL-6受體之抗原抗體反應之動力理論解析使用Biacore T100(GE Healthcare)進行。就對於人類IL-6受體無pH依存性之結合活性之對照抗體，使用tocilizumab(重鏈序列編號：60)、輕鏈序列編號：61)。作為中性域pH及酸性域pH之條件，各於pH7.4及pH6.0之溶液中進行抗原抗體反應之交互作用解析。在以胺偶聯法適量固定protein A/G(Invitrogen)之Sensor chip CM5(GE Healthcare)上，使目的抗體被捕捉約300RU。運行緩衝液使用20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05%(w/v)Tween20、1.2 mM CaCl2(pH7.4)或20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05%(w/v)Tween20、1.2mM CaCl2(pH6.0)之2種緩衝液。人類IL-6受體之稀釋也使用各自的緩衝液。測定均在37℃實施。
當進行使用對照抗體tocilizumab抗體、6RpH#01抗體及6RpH#02抗體及6RpH#03抗體之抗原抗體反應之交互作用之解析，將IL-6受體之稀釋液與為空白之行緩衝液以流速5μL/min注入3分鐘，使在感應晶片上捕捉的tocilizumab抗體、6RpH#01抗體及6RpH#02抗體及6RpH#03抗體與IL-6受體交互作用。之後，以流速30μL/min將10 mM Glycine-HCl(pH1.5)以流速30μL/min注入30秒，使感應晶片再生。
依前述方法測得之於pH7.4之感應圖如圖24所示。又依同樣方法取得之在pH6.0之條件下之感應圖如圖25所示。
從前述結果，6RpH#01抗體、6RpH#02抗體及6RpH#03抗體，藉由使在緩衝液中之pH從pH7.4改為pH6.0，觀察到對IL6受體之結合能力大幅減少。
(參考實施例25)人類IL-6受體基因敲入小鼠之製作 (25-1)基因敲入載體之構建
使用選殖了小鼠介白素-6基因(Il6ra)之基因體區的大腸菌人工染色體(BAC)選殖體。將在該BAC上之小鼠Il6ra基因之標的區依序將連接人類介白素-6受體基因之編碼序列(GeneBank # NM_000565_)、hp7序列、poly A附加信號、loxP序列、新黴素耐性(neo)基因匣及loxP的DNA片段，利用Red/ET系統(GeneBridges)以相同重組插入。此時，以使BAC上之小鼠Il6ra基因之外顯子1存在之轉譯開始點與人類IL6R基因之轉譯開始點為一致之方式插 入，並使小鼠Il6ra基因之外顯子1內部之轉譯開始點以後鹼基序列缺損40個鹼基對。又，在藥劑耐性基因neo附加有pgk基因之啟動子，且在ES細胞內有neo基因表現。但是預測neo基因可能抑制導入於上游之hIL6R基因表現。為了而後能除去neo基因，在neo基因的兩側配置loxP序列(ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT(序列編號：131))。藉由使Cre作用及重組，成為將夾於loxP序列之間的neo基因除去之組成。其次為了使基因敲入載體線狀化，在BAC上之小鼠Il6ra基因之5’側上游區同時插入限制酶NotI認識序列(GCGGCCGC)及安比西林耐性基因。
(25-2)對ES細胞之導入
對ES細胞(129SvEv小鼠來源)將上述hIL6R基因敲入載體以電穿孔法導入，利用以G418選擇培養後獲得之藥劑耐性選殖體，以PCR法篩選相同重組體。基因敲入載體60μg以NotI直鏈狀化，經酚/氯仿萃取後，以乙醇使沉澱溶於PBS後使用。
篩選用之ES細胞以96孔板培養，在每1井以200μl的PBS溶液洗滌2次後，加入以下組成之細胞溶解緩衝液(5μl之10xLA緩衝液II(TAKARA LA Taq用)、5μl之5% NP-40、4μl之蛋白酶K(TAKARA)(20mg/ml)、36μl之蒸餾水)，於55℃處理2小時再於95℃處理15分鐘，使蛋白酶K失活，製作PCR樣本。
PCR反應混合物，係將1μl樣本、2.5μl之10xLA緩衝液II、2.5μl之25 mM MgCl2、4μl之dNTP(各含dATP、 dCTP、dGTP及dTTP2.5 mM)、各0.2μl之引子(各50μM)、0.25μl之LA Taq(TAKARA)、及14.35μl之蒸餾水混合，使全量為25μl。又，PCR條件係進行於94℃進行5分鐘前加熱、於98℃ 10秒、68℃ 3分30秒之放大周期共35個周期，及68℃ 7分鐘之複加熱之條件。
引子使用P6Ra1(往前)5’-ACAGGGCCTTAGACTCACAGC-3’(序列編號：132)及hRLI6 11638R(往後)5’-AACTTGCTCCCGACACTACTGG-3’(序列編號：133)。引子，將P6Ra1配置在比基因敲入載體上之相同臂更5’上游側之小鼠Il6ra基因體區，將hRLI6 11638R配置在hIL6R cDNA內(參照圖32)。發生相同重組之ES細胞之樣本，有約2.2kb的譜帶放大。
(3)基因敲入小鼠之製作
將相同重組ES選殖體以胰蛋白酶處理使浮游，以ES細胞培養基清洗。使以48小時間隔將5IU之馬絨毛促性腺素(eCG)及人類絨毛促性腺素(hCG)對腹腔內投予而施以過度排卵處理C57BL/6J(B6)之雌小鼠與同系統之雄小鼠交配。以確認雌小鼠之插塞(plug)之日為0.5日，於妊娠2.5日將子宮及輸卵管灌流，從8細胞期回收桑椹期之胚。將回收的胚於37℃培養一晚，將在胚盤胞產生之胚作為宿主胚，注入10~15個ES細胞。注入後之胚移到偽妊娠2.5日大的ICR系受容雌子宮內，於17日後產仔。藉由判別ES細胞對胚盤胞注入獲得之產仔之毛色，獲得混雜重組ES細胞(野生色)與寄主胚盤胞來源之細胞(黑色)的嵌合小 鼠。雄嵌合小鼠在性成熟後與B6雌小鼠交配，以從次世代小鼠之尾抽取之基因體DNA作為模板，以PCR法確認基因敲入對偶基因已傳到次世代小鼠。PCR利用與在上述相同重組ES細胞篩選時利用之方法實施。其結果，獲得檢測到2.2kb之信號的個體，該等個體確認已傳入基因敲入對偶基因。
(4)neo基因之除去
對於利用已確認傳入基因敲入對偶基因之個體之繁殖獲得之受精卵之前核以顯微注射重組酵素Cre表現載體，將neo基因匣除去。亦即，藉由使Cre暫時表現，在配置基因敲入對偶基因之2處的loxP間誘導重組，並去除neo基因匣。Cre表現載體顯微注入後之受精卵，移到偽妊娠0.5日之ICR系受容雌輸卵管內，19日後產仔。neo基因匣之除去，係使用從產仔之離乳後採取之尾抽取的基因體DNA以PCR法確認。
PCR反應液組成，係將1μl之樣本、12.5μl之2xGC緩衝液I、4μl之dNTP(dATP、dCTP、dGTP及dTTP各2.5 mM)、各0.25μl之引子(各50μM)、0.25μl之LA Taq(TAKARA)、及6.75μl之蒸餾水混合使全量為25μl。 又，PCR條件係進行於94℃進行4分鐘前加熱、於94℃ 30秒、於62℃ 30秒、於72℃ 3分鐘之放大周期共35個周期、及於72℃ 7分鐘之複加熱。
引子之設定位置如圖32B。引子使用mRLI6 10355(5’-TCTGCAGTAGCCTTCAAAGAGC-3’(序列編號：134))及 mRLI6 11166R(5’-AACCAGACAGTGTCACATTCC-3’(序列編號：135))。利用PCR反應，將neo匣除去前之個體之樣本，檢驗出來自基因敲入對偶基因之放大產物4.2 kb及來自野生型對偶基因之0.8 kb之信號，相對於此，neo匣經除去之個體之樣本檢驗出約2.7 kb與野生型對偶基因來源之0.8 kb之信號(圖33)。
(6)人類IL6R及小鼠IL6ra之表現確認 (6-1)使用組織RNA以RT-PCR法確認
使用同質接合體之基因敲入小鼠及野生型小鼠之組織RNA，以RT-PCR法解析人類IL6R及小鼠IL6ra之表現。從肝臟、脾臟、胸腺、腎臟、心臟及肺製備組織RNA。以各1μg之組織RNA作為模板，利用SuperScript II First Strand cDNA Synthesis Kit(Invitrogen)，使用Oligo dT(20)引子進行反轉錄反應以合成cDNA。以合成的cDNA作為模板進行PCR，檢測人類IL6R及小鼠IL6ra。人類IL6R之檢測，係使用在基因敲入對偶基因之hIL6R基因之插入位置即轉譯開始點起算更上游側之5’非轉譯區所設定之往前引子6RIK-s1(5’-CCCGGCTGCGGAGCCGCTCTGC-3’(序列編號：136))及人類IL6R專一性往後引子RLI6-a1(5’-ACAGTGATGCTGGAGGTCCTT-3’(序列編號：137))之組合實施。另一方面，小鼠IL6ra之檢測係使用上述往前引子6RIK-s1及小鼠IL6ra專一性往後引子6RLIcA2(5’-AGCAACACCGTGAACTCCTTTG-3’(序列編號：138))之組合實施。PCR反應液之組成，係將12.5μl之樣本、12.5μl 之2xGC緩衝液I、4μl之dNTP(dATP、dCTP、dGTP及dTTP各2.5 mM)、各0.25μl之引子(各50μM)、0.25μl之LA Taq(TAKARA)、及6.75μl之蒸餾水混合使全量為25μl。又，PCR條件係進行於94℃進行2分鐘前加熱、94℃ 30秒、62℃ 30秒、72℃ 1分鐘之放大周期共30個周期、及72℃ 5分鐘之複加熱。檢測到人類IL6R之放大產物880 bp、小鼠IL6ra之放大產物846 bp，但同質接合體之hIL6R基因敲入小鼠之各組織僅檢測到人類IL6R，未檢測到小鼠IL6ra。又，從野生型小鼠之各組織未檢測到人類IL6R，僅檢測到小鼠IL6ra(圖34)。由該結果，如設計，基因敲入載體起相同重組且可確認獲得未表現小鼠IL6ra而表現人類IL6R之小鼠。
(6-2)血漿中之人類IL-6R濃度之測定
於isoflurane吸入麻醉下開腹，使用Quantikin Human IL-6sR Immunoassay Kit(R&D Systems)測定從腹部大靜脈採取之血液分離之血漿中之可溶型人類IL-6R濃度。其結果，血漿中可溶型hIL-6R濃度，在同型之基因敲入小鼠定量為22.1+5.0 ng/ml、異型基因敲入小鼠定量為11.5+4.1 ng/ml。又，在野生型小鼠之血漿中未檢測到可溶型hIL-6R(圖35)。同型基因敲入小鼠中，與在人類報告之血中濃度為同等濃度(Blood(2008)112,3959-3969)。
(6-3)種專一性的配體反應性的確認
對同型基因敲入小鼠及野生型小鼠將劑量4μg/體重kg之小鼠IL-6或人類IL-6進行腹腔內投予，6小時後採 血，使用SAA ELISA Kit(Invitrogen)定量血中之血清amyloidA(SAA)濃度。又，投予用IL-6之溶劑，使用使小鼠血漿成為0.5%之方式添加於磷酸緩衝生理食鹽液(PBS)的溶液，並設計僅投予溶劑的對照群。其結果，同型基因敲入小鼠僅與人類IL-6反應而認有血漿SAA水平上升，但對小鼠IL-6未認有反應性(圖36)。另一方面，野生型小鼠，與人類IL-6、小鼠IL-6均反應並認有血漿SAA水平上升(圖36)。小鼠IL-6ra與小鼠IL-6、人類IL-6均會結合，另一方面，人類IL-6R已知會與人類IL-6結合，但不與小鼠IL-6結合，本實驗之結果與該見解一致。因此可知，同型基因敲入小鼠如設計，不表現小鼠IL6ra，而表現人類IL6R且有機能。
本發明中，由基因敲入對偶基因轉錄的hIL6R基因之mRNA，由於為未切出的構造，所以不會由NMD機構分解，但另一方面已知未切出之基因之表現量低。但是，本發明之hIL6R基因敲入小鼠中，血中之可溶型hIL-6R濃度與健常人之血中濃度為同等，且確認與投予之人類IL-6會充分反應並產生SAA。此係顯示與poly A附加信號一起插入的hp7，有助於由於為未切出構造原本應會下降的hIL6R表現量之安定化。
圖1顯示在可溶型人類IL-6受體穩定狀態模型中，抗小鼠CD4抗體非投予群與投予群中之小鼠血漿中可溶型人 類IL-6受體濃度變動。橫軸代表自抗小鼠CD4抗體投予起經過的日數、縱軸代表血漿中可溶型人類IL-6受體濃度。
圖2顯示在人類IL-6受體免疫寬容正常小鼠模型中，通常抗IL-6受體抗體及pH依存的IL-6受體抗體投予群中之小鼠血漿中可溶型人類IL-6受體濃度變動。橫軸代表自抗IL-6受體抗體之投予起經過之日數、縱軸代表血漿中可溶型人類IL-6受體濃度。黑圓代表對照小鼠之血漿中可溶型人類IL-6受體濃度。白空心圓代表投予了H54/L28-IgGI之小鼠之血漿中可溶型人類IL-6受體濃度、菱形代表投予了Fv4-IgG1之小鼠之血漿中可溶型人類IL-6受體濃度。
圖3顯示在人類IL-6受體免疫寬容正常小鼠模型中，於pH7.4之FcRn結合增強之通常抗IL-6受體抗體及在pH7.4之FcRn結合增強之pH依存性IL-6受體抗體投予群中的小鼠血漿中可溶型人類IL-6受體濃度變動。橫軸代表自抗IL-6受體抗體之投予經過的日數、縱軸代表血漿中可溶型人類IL-6受體濃度。黑圓代表對照小鼠之血漿中可溶型人類IL-6受體濃度。白空心圓代表投予H54/L28-IgG1、菱形代表投予Fv4-IgG1、白空心三角代表投予H54/L28-F157、X及黑四角代表投予Fv4-F157之小鼠之血漿中可溶型人類IL-6受體濃度。
圖4顯示離子濃度依存的抗原結合分子對可溶型抗原之溶體移動之非限定作用模型。在血漿中之離子濃度之條件下(pH中性域、或高鈣離子濃度之條件下)，在血漿中結合於可溶型抗原之抗原結合分子(A)利用非專一性內吞作 用等而被攝入細胞內(B)後，對於在移動的酸性內體表現之FcRn經由FcRn結合分域之媒介於酸性pH之條件結合，且同時於內體內之離子濃度之條件下(pH酸性域、或低鈣離子濃度之條件下)將抗原解離(C)。經解離之抗原移到溶體後被分解(D)。另一方面，將抗原解離後之抗原結合分子以結合於FcRn之狀態移到細胞表面，並於血漿中之中性pH條件下從FcRn解離並回到血漿中(E)。
圖5顯示在pH7.4對FcRn有結合活性之抗原結合分子對可溶型抗原之溶體移動之非限定作用模型。在血漿中離子濃度之條件下(pH中性域、或高鈣離子濃度之條件下)，於血漿中結合於可溶型抗原之抗原結合分子經由FcRn結合分域之媒介而於pH中性性條件下與FcRn結合(A)後，利用內吞作用被攝入細胞內(B)。移到酸性內體內之抗原結合分子在內體內之離子濃度之條件下(pH酸性域、或低鈣離子濃度之條件下不將抗原解離(C)，而將已與抗原結合之抗原結合分子以結合在FcRn之狀態再循環到細胞表面上(D)。
圖6顯示在pH7.4對FcRn結合增強之離子濃度依存的抗原結合分子對可溶型抗原之溶體移行之非限定作用模型。在血漿中離子濃度之條件下(pH中性域、或高鈣離子濃度之條件下)，於血漿中結合於可溶型抗原之抗原結合分子經由FcRn結合分域之媒介，於pH中性性條件下與FcRn結合(A)後，以內吞作用被攝入細胞內(B)。移到酸性內體內之抗原結合分子在內體內之離子濃度之條件下(pH酸性 域、或低鈣離子濃度之條件下將抗原解離(C)。已解離之抗原移到溶體後被分解(D)，另一方面，已將抗原解離之抗原結合分子以結合於FcRn之狀態再循環到細胞表面上(E)。
圖7顯示試驗1之3隻小鼠中之Fv4-F157投予個體(#7、8及9)之個體別之血漿中可溶型人類IL-6受體濃度變動及小鼠抗人類IL-6受體抗體之抗體價變動。橫軸代表自抗IL-6受體抗體之投予之經過日數、左縱軸代表血漿中可溶型人類IL-6受體濃度、右縱軸代表成為小鼠抗hsIL-6R抗體之抗體價指標之ECL值。實線代表血漿中可溶型人類IL-6受體濃度、虛線代表ECL值。菱形、白空心四角及三角各代表#7、8及9之個體之血漿中之可溶型人類IL-6受體濃度之變動，X、黑四角及黑圓各代表#7、8及9之個體中之ECL值之變動。
圖8顯示試驗2之3隻小鼠中之Fv4-F157投予個體(#10、11及12)之個體別之血漿中可溶型人類IL-6受體濃度變動及小鼠抗人類IL-6受體抗體之抗體價變動。橫軸代表自抗IL-6受體抗體之投予起之經過日數、左縱軸代表血漿中可溶型人類IL-6受體濃度、右縱軸代表成為小鼠抗人類IL-6受體抗體之抗體價之指標之ECL值。實線代表血漿中可溶型人類IL-6受體濃度、虛線代表ECL值。菱形、白空心四角及三角各代表#10、11及12之個體之血漿中可溶型人類IL-6受體濃度，X、黑四角及黑圓各代表#10、11及12之個體之ECL值之變動。
圖9顯示試驗1之3隻中之Fv4-F157投予個體(#7、8 及9)之個體別之小鼠抗hsIL-6R抗體之抗體價變動及小鼠抗Fv4-F157抗體之抗體價變動。橫軸代表自抗IL-6受體抗體之投予之經過日數、縱軸代表成為小鼠抗人類IL-6受體抗體之抗體價及小鼠抗Fv4-F157抗體之抗體價之指標的ECL值。實線代表成為小鼠抗Fv4-F157抗體之抗體價之指標之ECL值之變動、虛線代表成為小鼠抗人類IL-6受體抗體之抗體價之指標之ECL值之變動。菱形、白空心四角及黑三角各代表於#7、8及9之個體中之成為小鼠抗Fv4-F157抗體之抗體價之指標之ECL值之變動，且白空心四角、黑四角及白空心三角各代表於#7、8及9之個體之成為小鼠抗人類IL-6受體抗體之抗體價之指標之ECL值之變動。
圖10顯示試驗2之3隻小鼠中之Fv4-F157投予個體(#10、11及12)之個體別之小鼠抗人類IL-6受體抗體之抗體價變動及小鼠抗Fv4-F157抗體之抗體價變動。橫軸代表自抗IL-6受體抗體之投予之經過日數、縱軸代表成為小鼠抗人類IL-6受體抗體之抗體價及小鼠抗Fv4-F157抗體之抗體價之指標之ECL值。實線代表成為小鼠抗Fv4-F157抗體之抗體價之指標之ECL值之變動、虛線代表成為小鼠抗hsIL-6R抗體之抗體價之指標之ECL值之變動。菱形、白空心四角及黑三角各代表在#10、11及12之個體中之成為小鼠抗Fv4-F157抗體之抗體價之指標之ECL值之變動，、白空心四角、黑四角及白空心三角各代表在#10、11及12之個體中成為小鼠抗人類IL-6受體抗體之抗體價之指標 之ECL值之變動。
圖11顯示已融合標的抗原之抗體對癌細胞及抗原表現細胞之非限定作用機制之模型。
圖12顯示在pH中性域對FcRn有結合活性且對標的抗原有離子濃度依存的結合活性的抗原結合分子對於癌細胞及抗原表現細胞之非限定作用機制模型。
圖13顯示鈣依存性結合抗體在血漿中(Ca2+ 2mM)與內體內(Ca2+ 3μM)對抗原之交互作用之樣式(i)及pH及鈣依存性結合抗體在血漿中(pH7.4、Ca2+ 2mM)與內體內(pH6.0、Ca2+ 3μM)對抗原之交互作用之樣式(ii)。
圖14顯示含人類Vk5-2序列之抗體、及含人類Vk5-2序列中之糖鏈附加序列經改變之hVk5-2_L65序列之抗體之離子交換層析。實線代表含人類Vk5-2序列之抗體(重鏈：CIM_H、序列編號：45及輕鏈：hVk5-2、序列編號：50)之層析圖、虛線代表具有hVk5-2_L65序列之抗體(重鏈：CIM_H(序列編號：45)、輕鏈：hVk5-2_L65(序列編號：53))之層析圖。
圖15顯示從導入有以Ca依存性地結合於抗原之抗體基因庫之大腸菌單離之290個選殖體之序列資訊之胺基酸分布(以Library表示)及所設計之胺基酸分布(以Design表示)間之關係。橫軸表示Kabat編號表示之胺基酸部位。縱軸表示胺基酸分布之比率。
圖16顯示在高鈣離子濃度之條件(1.2 mM)下之抗IL-6R抗體(tocilizumab)、6RC1IgG_010抗體、 6RC1IgG_012抗體及6RC1IgG_019抗體之感應圖。
圖17顯示在低鈣離子濃度之條件(3μM)下之抗IL-6R抗體(tocilizumab)、6RC1IgG_010抗體、6RC1IgG_012抗體及6RC1IgG_019抗體之感應圖。
圖18顯示以X射線結晶構造解析決定之6RL#9抗體之Fab片段之重鏈CDR3之構造。(i)表示於鈣離子存在之結晶化條件獲得之結晶構造之重鏈CDR3、(ii)表示於鈣離子不存在之結晶化條件獲得之結晶構造之重鏈CDR3。
圖19顯示H54/L28-IgG1抗體、FH4-IgG1抗體、及、6RL#9-IgG1抗體在正常小鼠之血漿中之抗體濃度之變動。
圖20顯示H54/L28-IgG1抗體、FH4-IgG1抗體、及、6RL#9-IgG1抗體在正常小鼠之血漿中之可溶型人類IL-6受體(hsIL-6R)之濃度變動。
圖21顯示H54/L28-N434W抗體、FH4-N434W抗體、及、6RL#9-N434W抗體在正常小鼠之血漿中之抗體濃度之變動。
圖22顯示H54/L28-N434W抗體、FH4-N434W抗體、及、6RL#9-N434W抗體在正常小鼠之血漿中之可溶型人類IL-6受體(hsIL-6R)之濃度變動。
圖23顯示從導入有以pH依存性地結合於抗原之抗體基因庫之大腸菌單離之132個選殖體之序列資訊之胺基酸分布(以Library表示)及所設計之胺基酸分布(以Design表示)間之關係。橫軸表示Kabat編號表示之胺基酸部位。縱軸表示胺基酸分布之比率。
圖24顯示抗IL-6R抗體(tocilizumab)、6RpH#01抗 體、6RpH#02抗體及6RpH#03抗體在pH7.4之感應圖。橫軸代表時間、縱軸代表RU值。
圖25顯示抗IL-6R抗體(tocilizumab)、6RpH#01抗體、6RpH#02抗體及6RpH#03抗體在pH6.0之感應圖。橫軸代表時間、縱軸代表RU值。
圖26顯示抗體非投予群、Fv4-mIgG1、Fv4-mIgG2a、Fv4-mF3、Fv4-mFa30及H54/L28-mF3投予群之平均血漿中hsIL-6R濃度變動。
圖27顯示Fv4-mIgG1投予群之各個體之小鼠抗人類IL-6受體抗體(抗hsIL-6R抗體)之抗體價之變動。
圖28顯示Fv4-mIgG2a投予群之各個體之小鼠抗人類IL-6受體抗體(抗hsIL-6R抗體)之抗體價之變動。
圖29顯示Fv4-mF3投予群之各個體之小鼠抗人類IL-6受體抗體(抗hsIL-6R抗體)之抗體價之變動。
圖30顯示Fv4-mFa30投予群之各個體之小鼠抗人類IL-6受體抗體(抗hsIL-6R抗體)之抗體價之變動。
圖31顯示H54/L28-mF3投予群之各個體之小鼠抗人類IL-6受體抗體(抗hsIL-6R抗體)之抗體價之變動。
圖32A顯示小鼠介白素-6受體(Il6ra)基因之基因體DNA構造(1)與被插入之基因敲入載體(2)間的關係示意圖。基因敲入載體有完全長度的人類介白素-6受體(hIL6R)cDNA、hp7序列、polyA附加信號、及新黴素耐性基因。
圖32B顯示將小鼠介白素-6受體基因之基因體DNA(a) 與基因敲入載體(b)進行相同性重組，生成經基因敲入之基因體DNA(c)之狀態的示意圖。又，使重組酵素Cre作用於(c)，將新黴素耐性基因匣除去，以完成人類介白素-6受體基因基因敲入對偶基因(d)之過程。圖中的箭頭顯示為了檢測人類介白素-6受體基因之基因敲入所使用之引子之設定位置。
圖33顯示解析在人類介白素-6受體基因基因敲入小鼠之樹立過程獲得之各基因型之PCR之代表例。
圖34顯示人類介白素-6受體基因基因敲入小鼠及野生型小鼠中之介白素-6受體之基因表現特性。
圖35顯示同型及異型人類介白素-6受體基因基因敲入小鼠及野生型小鼠中之血漿中之可溶型人類介白素-6受體(hsIL-6R)濃度之測定結果。KI/KI，KI/+及+/+各代表同型基因敲入小鼠、異型基因敲入小鼠及野生型。
圖36顯示野生型小鼠及同型人類介白素-6受體基因基因敲入小鼠對種專一性介白素-6(配體)之反應性。
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<400> 20
Figure 101135762-A0202-02-0364-112
Figure 101135762-A0202-02-0365-113
Figure 101135762-A0202-02-0366-114
<210> 21
<211> 951
<212> DNA
<213> 人類
<400> 21
Figure 101135762-A0202-02-0366-115
Figure 101135762-A0202-02-0367-116
<210> 22
<211> 316
<212> PRT
<213> 人類
<400> 22
Figure 101135762-A0202-02-0367-117
Figure 101135762-A0202-02-0368-118
Figure 101135762-A0202-02-0369-119
<210> 23
<211> 876
<212> DNA
<213> 人類
<400> 23
Figure 101135762-A0202-02-0369-120
Figure 101135762-A0202-02-0370-121
<210> 24
<211> 291
<212> PRT
<213> 人類
<400> 24
Figure 101135762-A0202-02-0370-122
Figure 101135762-A0202-02-0371-123
<210> 25
<211> 765
<212> DNA
<213> 人類
<400> 25
Figure 101135762-A0202-02-0372-124
<210> 26
<211> 254
<212> PRT
<213> 人類
<400> 26
Figure 101135762-A0202-02-0372-125
Figure 101135762-A0202-02-0373-126
Figure 101135762-A0202-02-0374-127
<210> 27
<211> 702
<212> DNA
<213> 人類
<400> 27
Figure 101135762-A0202-02-0374-128
<210> 28
<211> 233
<212> PRT
<213> 人類
<400> 28
Figure 101135762-A0202-02-0375-129
Figure 101135762-A0202-02-0376-130
<210> 29
<211> 4
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 29
Figure 101135762-A0202-02-0376-132
<210> 30
<211> 4
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 30
Figure 101135762-A0202-02-0376-131
<210> 31
<211> 5
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 31
Figure 101135762-A0202-02-0377-133
<210> 32
<211> 5
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 32
Figure 101135762-A0202-02-0377-134
<210> 33
<211> 6
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 33
Figure 101135762-A0202-02-0377-135
<210> 34
<211> 6
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 34
Figure 101135762-A0202-02-0378-136
<210> 35
<211> 7
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 35
Figure 101135762-A0202-02-0378-137
<210> 36
<211> 7
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 36
Figure 101135762-A0202-02-0378-138
<210> 37
<211> 107
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 37
Figure 101135762-A0202-02-0379-140
<210> 38
<211> 447
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 38
Figure 101135762-A0202-02-0379-139
Figure 101135762-A0202-02-0380-141
Figure 101135762-A0202-02-0381-142
Figure 101135762-A0202-02-0382-143
<210> 39
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 39
Figure 101135762-A0202-02-0382-144
Figure 101135762-A0202-02-0383-145
<210> 40
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 40
Figure 101135762-A0202-02-0383-146
Figure 101135762-A0202-02-0384-147
Figure 101135762-A0202-02-0385-148
<210> 41
<211> 447
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 41
Figure 101135762-A0202-02-0385-149
Figure 101135762-A0202-02-0386-150
Figure 101135762-A0202-02-0387-151
<210> 42
<211> 447
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 42
Figure 101135762-A0202-02-0388-152
Figure 101135762-A0202-02-0389-153
Figure 101135762-A0202-02-0390-154
<210> 43
<211> 107
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 43
Figure 101135762-A0202-02-0390-155
Figure 101135762-A0202-02-0391-156
<210> 44
<211> 107
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 44
Figure 101135762-A0202-02-0391-157
Figure 101135762-A0202-02-0392-158
<210> 45
<211> 445
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 45
Figure 101135762-A0202-02-0392-159
Figure 101135762-A0202-02-0393-160
Figure 101135762-A0202-02-0394-161
<210> 46
<211> 128
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 46
Figure 101135762-A0202-02-0395-162
<210> 47
<211> 122
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 47
Figure 101135762-A0202-02-0395-163
Figure 101135762-A0202-02-0396-164
<210> 48
<211> 124
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 48
Figure 101135762-A0202-02-0396-165
Figure 101135762-A0202-02-0397-166
<210> 49
<211> 119
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 49
Figure 101135762-A0202-02-0397-167
Figure 101135762-A0202-02-0398-168
<210> 50
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 50
Figure 101135762-A0202-02-0398-169
Figure 101135762-A0202-02-0399-171
<210> 51
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 51
Figure 101135762-A0202-02-0400-172
Figure 101135762-A0202-02-0401-173
<210> 52
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 52
Figure 101135762-A0202-02-0401-174
Figure 101135762-A0202-02-0402-175
<210> 53
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 53
Figure 101135762-A0202-02-0403-176
Figure 101135762-A0202-02-0404-177
<210> 54
<211> 107
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 54
Figure 101135762-A0202-02-0404-178
<210> 55
<211> 107
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 55
Figure 101135762-A0202-02-0405-179
<210> 56
<211> 107
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 56
Figure 101135762-A0202-02-0406-180
<210> 57
<211> 107
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 57
Figure 101135762-A0202-02-0406-181
Figure 101135762-A0202-02-0407-182
<210> 58
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 58
Figure 101135762-A0202-02-0407-183
Figure 101135762-A0202-02-0408-184
<210> 59
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 59
Figure 101135762-A0202-02-0409-185
Figure 101135762-A0202-02-0410-186
<210> 60
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 60
Figure 101135762-A0202-02-0410-187
Figure 101135762-A0202-02-0411-188
<210> 61
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 61
Figure 101135762-A0202-02-0412-189
Figure 101135762-A0202-02-0413-190
<210> 62
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 62
Figure 101135762-A0202-02-0413-191
Figure 101135762-A0202-02-0414-193
<210> 63
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 63
Figure 101135762-A0202-02-0414-194
Figure 101135762-A0202-02-0415-195
Figure 101135762-A0202-02-0416-196
<210> 64
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 64
Figure 101135762-A0202-02-0416-197
Figure 101135762-A0202-02-0417-198
<210> 65
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 65
Figure 101135762-A0202-02-0417-199
Figure 101135762-A0202-02-0418-200
<210> 66
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 66
Figure 101135762-A0202-02-0419-201
Figure 101135762-A0202-02-0420-202
<210> 67
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 67
Figure 101135762-A0202-02-0420-203
Figure 101135762-A0202-02-0421-204
<210> 68
<211> 456
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 68
Figure 101135762-A0202-02-0422-205
Figure 101135762-A0202-02-0423-206
Figure 101135762-A0202-02-0424-207
<210> 69
<211> 452
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 69
Figure 101135762-A0202-02-0424-208
Figure 101135762-A0202-02-0425-209
Figure 101135762-A0202-02-0426-210
Figure 101135762-A0202-02-0427-211
<210> 70
<211> 447
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 70
Figure 101135762-A0202-02-0427-212
Figure 101135762-A0202-02-0428-213
Figure 101135762-A0202-02-0429-214
<210> 71
<211> 449
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 71
Figure 101135762-A0202-02-0430-215
Figure 101135762-A0202-02-0431-216
Figure 101135762-A0202-02-0432-217
<210> 72
<211> 452
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 72
Figure 101135762-A0202-02-0432-218
Figure 101135762-A0202-02-0433-219
Figure 101135762-A0202-02-0434-220
Figure 101135762-A0202-02-0435-222
<210> 73
<211> 454
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 73
Figure 101135762-A0202-02-0435-223
Figure 101135762-A0202-02-0436-224
Figure 101135762-A0202-02-0437-225
Figure 101135762-A0202-02-0438-226
<210> 74
<211> 450
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 74
Figure 101135762-A0202-02-0438-227
Figure 101135762-A0202-02-0439-228
Figure 101135762-A0202-02-0440-229
<210> 75
<211> 449
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 75
Figure 101135762-A0202-02-0441-230
Figure 101135762-A0202-02-0442-231
Figure 101135762-A0202-02-0443-232
<210> 76
<211> 447
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 76
Figure 101135762-A0202-02-0443-233
Figure 101135762-A0202-02-0444-234
Figure 101135762-A0202-02-0445-235
Figure 101135762-A0202-02-0446-236
<210> 77
<211> 450
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 77
Figure 101135762-A0202-02-0446-237
Figure 101135762-A0202-02-0447-238
Figure 101135762-A0202-02-0448-239
Figure 101135762-A0202-02-0449-403
<210> 78
<211> 449
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 78
Figure 101135762-A0202-02-0449-240
Figure 101135762-A0202-02-0450-241
Figure 101135762-A0202-02-0451-242
<210> 79
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 79
Figure 101135762-A0202-02-0452-243
Figure 101135762-A0202-02-0453-245
<210> 80
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 80
Figure 101135762-A0202-02-0453-246
Figure 101135762-A0202-02-0454-247
<210> 81
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 81
Figure 101135762-A0202-02-0454-248
Figure 101135762-A0202-02-0455-250
Figure 101135762-A0202-02-0456-251
<210> 82
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 82
Figure 101135762-A0202-02-0456-252
Figure 101135762-A0202-02-0457-253
<210> 83
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 83
Figure 101135762-A0202-02-0457-254
Figure 101135762-A0202-02-0458-255
<210> 84
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 84
Figure 101135762-A0202-02-0459-256
Figure 101135762-A0202-02-0460-257
<210> 85
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 85
Figure 101135762-A0202-02-0460-258
Figure 101135762-A0202-02-0461-259
<210> 86
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 86
Figure 101135762-A0202-02-0462-260
Figure 101135762-A0202-02-0463-261
<210> 87
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 87
Figure 101135762-A0202-02-0463-262
Figure 101135762-A0202-02-0464-263
<210> 88
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 88
Figure 101135762-A0202-02-0464-264
Figure 101135762-A0202-02-0465-265
Figure 101135762-A0202-02-0466-266
<210> 89
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 89
Figure 101135762-A0202-02-0466-267
Figure 101135762-A0202-02-0467-268
<210> 90
<211> 455
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 90
Figure 101135762-A0202-02-0467-269
Figure 101135762-A0202-02-0468-270
Figure 101135762-A0202-02-0469-271
Figure 101135762-A0202-02-0470-272
<210> 91
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 91
Figure 101135762-A0202-02-0470-273
Figure 101135762-A0202-02-0471-274
<210> 92
<211> 453
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 92
Figure 101135762-A0202-02-0472-275
Figure 101135762-A0202-02-0473-276
Figure 101135762-A0202-02-0474-277
<210> 93
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 93
Figure 101135762-A0202-02-0474-278
Figure 101135762-A0202-02-0475-279
<210> 94
<211> 454
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 94
Figure 101135762-A0202-02-0476-280
Figure 101135762-A0202-02-0477-281
Figure 101135762-A0202-02-0478-282
<210> 95
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 95
Figure 101135762-A0202-02-0478-283
Figure 101135762-A0202-02-0479-284
Figure 101135762-A0202-02-0480-285
<210> 96
<211> 449
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 96
Figure 101135762-A0202-02-0480-286
Figure 101135762-A0202-02-0481-287
Figure 101135762-A0202-02-0482-289
<210> 97
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 97
Figure 101135762-A0202-02-0483-290
Figure 101135762-A0202-02-0484-291
<210> 98
<211> 449
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 98
Figure 101135762-A0202-02-0484-292
Figure 101135762-A0202-02-0485-293
Figure 101135762-A0202-02-0486-294
<210> 99
<211> 217
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 99
Figure 101135762-A0202-02-0487-295
Figure 101135762-A0202-02-0488-296
<210> 100
<211> 455
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 100
Figure 101135762-A0202-02-0488-297
Figure 101135762-A0202-02-0489-298
Figure 101135762-A0202-02-0490-300
Figure 101135762-A0202-02-0491-301
<210> 101
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 101
Figure 101135762-A0202-02-0491-303
Figure 101135762-A0202-02-0492-304
<210> 102
<211> 449
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 102
Figure 101135762-A0202-02-0492-305
Figure 101135762-A0202-02-0493-306
Figure 101135762-A0202-02-0494-307
Figure 101135762-A0202-02-0495-308
<210> 103
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 103
Figure 101135762-A0202-02-0495-311
Figure 101135762-A0202-02-0496-310
<210> 104
<211> 213
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 104
Figure 101135762-A0202-02-0497-312
Figure 101135762-A0202-02-0498-313
<210> 105
<211> 454
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 105
Figure 101135762-A0202-02-0498-314
Figure 101135762-A0202-02-0499-315
Figure 101135762-A0202-02-0500-316
<210> 106
<211> 443
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 106
Figure 101135762-A0202-02-0501-317
Figure 101135762-A0202-02-0502-318
Figure 101135762-A0202-02-0503-319
<210> 107
<211> 219
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 107
Figure 101135762-A0202-02-0503-320
Figure 101135762-A0202-02-0504-321
Figure 101135762-A0202-02-0505-322
<210> 108
<211> 454
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 108
Figure 101135762-A0202-02-0505-323
Figure 101135762-A0202-02-0506-324
Figure 101135762-A0202-02-0507-325
<210> 109
<211> 454
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 109
Figure 101135762-A0202-02-0508-326
Figure 101135762-A0202-02-0509-327
Figure 101135762-A0202-02-0510-328
<210> 110
<211> 454
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 110
Figure 101135762-A0202-02-0510-329
Figure 101135762-A0202-02-0511-330
Figure 101135762-A0202-02-0512-331
Figure 101135762-A0202-02-0513-332
<210> 111
<211> 454
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 111
Figure 101135762-A0202-02-0513-333
Figure 101135762-A0202-02-0514-334
Figure 101135762-A0202-02-0515-335
Figure 101135762-A0202-02-0516-336
<210> 112
<211> 454
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 112
Figure 101135762-A0202-02-0516-337
Figure 101135762-A0202-02-0517-338
Figure 101135762-A0202-02-0518-339
<210> 113
<211> 213
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 113
Figure 101135762-A0202-02-0519-340
Figure 101135762-A0202-02-0520-341
<210> 114
<211> 213
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 114
Figure 101135762-A0202-02-0520-342
Figure 101135762-A0202-02-0521-343
<210> 115
<211> 453
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 115
Figure 101135762-A0202-02-0521-344
Figure 101135762-A0202-02-0522-345
Figure 101135762-A0202-02-0523-346
Figure 101135762-A0202-02-0524-347
<210> 116
<211> 449
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 116
Figure 101135762-A0202-02-0524-348
Figure 101135762-A0202-02-0525-349
Figure 101135762-A0202-02-0526-350
Figure 101135762-A0202-02-0527-351
<210> 117
<211> 447
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 117
Figure 101135762-A0202-02-0527-352
Figure 101135762-A0202-02-0528-353
Figure 101135762-A0202-02-0529-354
<210> 118
<211> 458
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 118
Figure 101135762-A0202-02-0530-355
Figure 101135762-A0202-02-0531-356
Figure 101135762-A0202-02-0532-357
<210> 119
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 119
Figure 101135762-A0202-02-0532-358
Figure 101135762-A0202-02-0533-359
<210> 120
<211> 447
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 120
Figure 101135762-A0202-02-0534-360
Figure 101135762-A0202-02-0535-361
Figure 101135762-A0202-02-0536-362
<210> 121
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 121
Figure 101135762-A0202-02-0536-363
Figure 101135762-A0202-02-0537-364
Figure 101135762-A0202-02-0538-365
<210> 122
<211> 451
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 122
Figure 101135762-A0202-02-0538-366
Figure 101135762-A0202-02-0539-368
Figure 101135762-A0202-02-0540-369
<210> 123
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 123
Figure 101135762-A0202-02-0541-370
Figure 101135762-A0202-02-0542-371
<210> 124
<211> 443
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 124
Figure 101135762-A0202-02-0542-372
Figure 101135762-A0202-02-0543-373
Figure 101135762-A0202-02-0544-374
<210> 125
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 125
Figure 101135762-A0202-02-0545-375
Figure 101135762-A0202-02-0546-376
<210> 126
<211> 443
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 126
Figure 101135762-A0202-02-0546-377
Figure 101135762-A0202-02-0547-378
Figure 101135762-A0202-02-0548-379
<210> 127
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 127
Figure 101135762-A0202-02-0549-380
Figure 101135762-A0202-02-0550-381
<210> 128
<211> 449
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 128
Figure 101135762-A0202-02-0550-382
Figure 101135762-A0202-02-0551-383
Figure 101135762-A0202-02-0552-385
Figure 101135762-A0202-02-0553-386
<210> 129
<211> 443
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 129
Figure 101135762-A0202-02-0553-387
Figure 101135762-A0202-02-0554-388
Figure 101135762-A0202-02-0555-389
<210> 130
<211> 449
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 130
Figure 101135762-A0202-02-0556-390
Figure 101135762-A0202-02-0557-391
Figure 101135762-A0202-02-0558-392
<210> 131
<211> 34
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 131
Figure 101135762-A0202-02-0558-393
<210> 132
<211> 21
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 132
Figure 101135762-A0202-02-0559-395
<210> 133
<211> 22
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 133
Figure 101135762-A0202-02-0559-396
<210> 134
<211> 22
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 134
Figure 101135762-A0202-02-0559-397
<210> 135
<211> 21
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 135
Figure 101135762-A0202-02-0559-399
<210> 136
<211> 22
<212> DNA
<213> 人造序列
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<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 136
Figure 101135762-A0202-02-0560-400
<210> 137
<211> 21
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 137
Figure 101135762-A0202-02-0560-401
<210> 138
<211> 22
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 138
Figure 101135762-A0202-02-0560-402

Claims (40)

  1. 一種誘導對抗原之免疫反應之醫藥組成物，其係包含抗體作為有效成分，該抗體包含：依鈣離子濃度之條件對該抗原之結合活性會改變之抗原結合分域，及在pH7.0~pH8.0之條件下對FcRn有結合活性之FcRn結合分域，其中該抗原結合分域在鈣離子濃度為100μM至10mM之間的條件下對抗原之結合活性高於在鈣離子濃度為0.1μM至30μM之間的條件下對該抗原之結合活性，其中該抗原結合分域係包含可變區，其中選自重鏈可變區之95位、96位、100a位及101位以及輕鏈可變區之30位、31位、32位、50位及92位(Kabat編號)的至少一胺基酸為具有金屬螯合作用之胺基酸，及其中該FcRn結合分域包含抗體之Fc區，該Fc區來自IgG的Fc區，其中，該Fc區，在選自於Fc區中之EU編號表示之部位當中的234位、235位、236位、237位、238位、239位、248位、250位、251位、252位、253位、254位、255位、256位、257位、258位、259位、265位、267位、270位、272位、274位、279位、280位、282位、284位、286位、288位、289位、295位、297位、298位、302位、303位、304位、305位、307位、308位、309位、311位、312位、313位、314位、315位、316位、317位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、332位、334位、338位、340位、345位、360位、361位、362位、375位、376位、378位、380位、382位、383位、384位、385位、386位、387位、 389位、390位、391位、413位、422位、424位、428位、433位、434位、435位、436位、437位、438位、439位、440位、441位及442位之群中至少1個以上的胺基酸，與天然型1gG之Fc區之對應部位之胺基酸不同。
  2. 一種誘導對抗原之免疫反應之醫藥組成物，其係包含抗體作為有效成分，該抗體包含：依pH條件對該抗原之結合活性會改變之抗原結合分域，及在pH7.0~pH8.0之條件下對FcRn有結合活性之FcRn結合分域，其中該抗原結合分域在pH7.0~pH8.0的條件下對抗原之結合活性高於在pH5.5~pH6.5的條件下對該抗原之結合活性，其中該抗原結合分域係包含可變區，其中選自輕鏈可變區之24位、27位、28位、31位、32位、34位、50位、51位、52位、53位、54位、55位、56位、89位、90位、91位、92位、93位、94位及95A位(Kabat編號)的至少一胺基酸為組胺酸，及其中該FcRn結合分域包含抗體之Fc區，該Fc區來自IgG的Fc區，其中，該Fc區，在選自於Fc區中之EU編號表示之部位當中的234位、235位、236位、237位、238位、239位、248位、250位、251位、252位、253位、254位、255位、256位、257位、258位、259位、265位、267位、270位、272位、274位、279位、280位、282位、284位、286位、288位、289位、295位、297位、298位、302位、303位、304位、305位、307位、308位、309位、311位、312位、313位、314位、315位、 316位、317位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、332位、334位、338位、340位、345位、360位、361位、362位、375位、376位、378位、380位、382位、383位、384位、385位、386位、387位、389位、390位、391位、413位、422位、424位、428位、433位、434位、435位、436位、437位、438位、439位、440位、441位及442位之群中至少1個以上的胺基酸，與天然型IgG之Fc區之對應部位之胺基酸不同。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之誘導對抗原之免疫反應之醫藥組成物，其中，該免疫為獲得性免疫(adaptive immunization)。
  4. 如申請專利範圍第1或2項之誘導對抗原之免疫反應之醫藥組成物，其中，該抗體對該抗原有中和活性。
  5. 如申請專利範圍第1或2項之誘導對抗原之免疫反應之醫藥組成物，其中，該抗體對於表現該抗原之細胞有細胞傷害活性。
  6. 如申請專利範圍第1或2項之誘導對抗原之免疫反應之醫藥組成物，其中，該Fc區，在Fc區之EU編號表示之部位當中選自於257位、308位、428位及434位之群中至少1個以上之胺基酸與天然型Fc區之對應部位之胺基酸不同。
  7. 如申請專利範圍第1或2項之誘導對抗原之免疫反應之醫藥組成物，其中，該Fc區，包含選自Fc區之EU編號表示之： 257位之胺基酸為Ala、308位之胺基酸為Pro、428位之胺基酸為Leu、及434位之胺基酸為Tyr、之群中至少1個以上的胺基酸。
  8. 如申請專利範圍第1或2項之誘導對抗原之免疫反應之醫藥組成物，其中，該Fc區對Fcγ受體之結合活性高於天然型人類IgG之Fc區對Fcγ受體之結合活性，且於該天然型人類IgG之Fc區中，結合於EU編號297位之糖鏈係含岩藻糖之糖鏈。
  9. 如申請專利範圍第8項之誘導對抗原之免疫反應之醫藥組成物，其中，該Fcγ受體為FcγRIa、FcγRIIa(R)、FcγRIIa(H)、FcγRIIb、FcγRIIIa(V)、或FcγRIIIa(F)。
  10. 如申請專利範圍第8項之醫藥組成物，其中，該Fc區，在選自於Fc區中之EU編號表示之部位當中221位、222位、223位、224位、225位、227位、228位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、243位、244位、245位、246位、247位、249位、250位、251位、254位、255位、256位、258位、260位、262位、263位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、271位、272位、273位、274位、275位、276位、278位、279位、280位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、288位、 290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304位、305位、311位、313位、315位、317位、318位、320位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、336位、337位、339位、376位、377位、378位、379位、380位、382位、385位、392位、396位、421位、427位、428位、429位、434位、436位及440位之群中至少1個以上的胺基酸，與天然型Fc區之對應部位之胺基酸不同。
  11. 如申請專利範圍第8項之誘導對抗原之免疫反應之醫藥組成物，其中，該Fc區，包含Fc區之EU編號表示之部位當中選自以下群中至少1個以上的胺基酸；221位之胺基酸為Lys或Tyr中之任一者、222位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中之任一者、223位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Lys中之任一者、224位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中之任一者、225位之胺基酸為Glu、Lys或Trp中之任一者、227位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、228位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、230位之胺基酸為Ala、Glu、Gly或Tyr中之任一者、231位之胺基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中之任一者、232位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、 233位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、234位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、235位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、236位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、237位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、238位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、239位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、240位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、241位之胺基酸為Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中之任一者、 243位之胺基酸為Leu、Glu、Leu、Gln、Arg、Trp或Tyr中之任一者、244位之胺基酸為His、245位之胺基酸為Ala、246位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、247位之胺基酸為Ala、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Thr、Val或Tyr中之任一者、249位之胺基酸為Glu、His、Gln或Tyr中之任一者、250位之胺基酸為Glu或Gln中之任一者、251位之胺基酸為Phe、254位之胺基酸為Phe、Met或Tyr中之任一者、255位之胺基酸為Glu、Leu或Tyr中之任一者、256位之胺基酸為Ala、Met或Pro中之任一者、258位之胺基酸為Asp、Glu、His、Ser或Tyr中之任一者、260位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、262位之胺基酸為Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中之任一者、263位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、264位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、265位之胺基酸為Ala、Leu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、 Val、Trp或Tyr中之任一者、266位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、267位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、268位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Trp中之任一者、269位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、270位之胺基酸為Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、271位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、272位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、273位之胺基酸為Phe或Ile中之任一者、274位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、275位之胺基酸為Leu或Trp中之任一者、276位之胺基酸為、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、 Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、278位之胺基酸為Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中之任一者、279位之胺基酸為Ala、280位之胺基酸為Ala、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gln、Trp或Tyr中之任一者、281位之胺基酸為Asp、Lys、Pro或Tyr中之任一者、282位之胺基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中之任一者、283位之胺基酸為Ala、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg或Tyr中之任一者、284位之胺基酸為Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中之任一者、285位之胺基酸為Asp、Glu、Lys、Gln、Trp或Tyr中之任一者、286位之胺基酸為Glu、Gly、Pro或Tyr中之任一者、288位之胺基酸為Asn、Asp、Glu或Tyr中之任一者、290位之胺基酸為Asp、Gly、His、Leu、Asn、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、291位之胺基酸為Asp、Glu、Gly、His、Ile、Gln或Thr中之任一者、292位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中之任一者、 293位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、294位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、295位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、296位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr或Val中之任一者、297位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、298位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、299位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中之任一者、300位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中之任一者、301位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、 302位之胺基酸為Ile、303位之胺基酸為Asp、Gly或Tyr中之任一者、304位之胺基酸為Asp、His、Leu、Asn或Thr中之任一者、305位之胺基酸為Glu、Ile、Thr或Tyr中之任一者、311位之胺基酸為Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中之任一者、313位之胺基酸為Phe、315位之胺基酸為Leu、317位之胺基酸為Glu或Gln、318位之胺基酸為His、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Tyr中之任一者、320位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、322位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、323位之胺基酸為Ile、324位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、325位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、326位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任 一者、327位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、328位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、329位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、330位之胺基酸為Cys、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、331位之胺基酸為Asp、Phe、His、Ile、Leu、Met、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、332位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、333位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Ser、Thr、Val或Tyr中之任一者、334位之胺基酸為Ala、Glu、Phe、Ile、Leu、Pro或Thr中之任一者、335位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中之任一者、 336位之胺基酸為Glu、Lys或Tyr中之任一者、337位之胺基酸為Glu、His或Asn中之任一者、339位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser或Thr中之任一者、376位之胺基酸為Ala或Val中之任一者、377位之胺基酸為Gly或Lys中之任一者、378位之胺基酸為Asp、379位之胺基酸為Asn、380位之胺基酸為Ala、Asn或Ser中之任一者、382位之胺基酸為Ala或Ile中之任一者、385位之胺基酸為Glu、392位之胺基酸為Thr、396位之胺基酸為Leu、421位之胺基酸為Lys、427位之胺基酸為Asn、428位之胺基酸為Phe或Leu中之任一者、429位之胺基酸為Met、434位之胺基酸為Trp、436位之胺基酸為Ile、及440位之胺基酸為Gly、His、Ile、Leu或Tyr中之任一者。
  12. 如申請專利範圍第8項之誘導對抗原之免疫反應之醫藥組成物，其中，該天然型Fc區，為結合於EU編號297位之糖鏈係含岩藻糖之糖鏈之人類IgG1、人類IgG2、 人類IgG3或人類IgG4中之任一者之Fc區。
  13. 如申請專利範圍第8項之誘導對抗原之免疫反應之醫藥組成物，其中，該Fc區係經修飾使得Fc區中EU編號297位之結合有岩藻糖缺損糖鏈之Fc區之比例提高、或使得Fc區中EU編號297位之附加有二分化N-乙醯基葡萄糖胺之Fc區之比例提高。
  14. 一種包含誘導免疫反應之抗體之醫藥組成物的體外製造方法，包括對於含有依鈣離子濃度之條件對抗原之結合活性會改變之抗原結合分域之抗體所含之FcRn結合分域，賦予在pH7.0~pH8.0之條件下對FcRn之結合活性，其中該抗原結合分域在鈣離子濃度為100μM至10mM之間的條件下對抗原之結合活性高於在鈣離子濃度為0.1μM至30μM之間的條件下對該抗原之結合活性，其中該抗原結合分域係包含可變區，其中選自重鏈可變區之95位、96位、100a位及101位以及輕鏈可變區之30位、31位、32位、50位及92位(Kabat編號)的至少一胺基酸為具有金屬螯合作用之胺基酸，及其中該FcRn結合分域包含抗體之Fc區，該Fc區來自IgG的Fc區，且該方法包括將在選自於Fc區中之EU編號表示之部位當中的234位、235位、236位、237位、238位、239位、248位、250位、251位、252位、253位、254位、255位、256位、257位、258位、259位、265位、267位、270位、272位、274位、279位、280位、282位、284位、286位、288位、289位、295位、297位、298位、302位、303位、304位、305 位、307位、308位、309位、311位、312位、313位、314位、315位、316位、317位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、332位、334位、338位、340位、345位、360位、361位、362位、375位、376位、378位、380位、382位、383位、384位、385位、386位、387位、389位、390位、391位、413位、422位、424位、428位、433位、434位、435位、436位、437位、438位、439位、440位、441位及442位之群中至少1個以上的胺基酸，以與天然型IgG之Fc區之對應部位之胺基酸不同的胺基酸取代之步驟。
  15. 一種包含誘導免疫反應之抗體之醫藥組成物的體外製造方法，包括對於含有依pH條件對抗原之結合活性會改變之抗原結合分域之抗體所含之FcRn結合分域，賦予在pH7.0~pH8.0之條件下對FcRn之結合活性，其中該抗原結合分域在pH7.0~pH8.0的條件下對抗原之結合活性高於在pH5.5~pH6.5的條件下對該抗原之結合活性，其中該抗原結合分域係包含可變區，其中選自輕鏈可變區之24位、27位、28位、31位、32位、34位、50位、51位、52位、53位、54位、55位、56位、89位、90位、91位、92位、93位、94位及95A位(Kabat編號)的至少一胺基酸為組胺酸，及其中該FcRn結合分域包含抗體之Fc區，該Fc區來自IgG的Fc區，且該方法包括將在選自於Fc區中之EU編號表示之部位當中的234位、235位、 236位、237位、238位、239位、248位、250位、251位、252位、253位、254位、255位、256位、257位、258位、259位、265位、267位、270位、272位、274位、279位、280位、282位、284位、286位、288位、289位、295位、297位、298位、302位、303位、304位、305位、307位、308位、309位、311位、312位、313位、314位、315位、316位、317位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、332位、334位、338位、340位、345位、360位、361位、362位、375位、376位、378位、380位、382位、383位、384位、385位、386位、387位、389位、390位、391位、413位、422位、424位、428位、433位、434位、435位、436位、437位、438位、439位、440位、441位及442位之群中至少1個以上的胺基酸，以與天然型IgG之Fc區之對應部位之胺基酸不同的胺基酸取代之步驟。
  16. 如申請專利範圍第14或15項之包含誘導免疫反應之抗體之醫藥組成物的體外製造方法，其中，該免疫為獲得性免疫。
  17. 如申請專利範圍第14或15項之包含誘導免疫反應之抗體之醫藥組成物的體外製造方法，其中，該抗體對該抗原有中和活性。
  18. 如申請專利範圍第14或15項之包含誘導免疫反應之抗體之醫藥組成物的體外製造方法，其中，該抗體對於表現該抗原之細胞有細胞傷害活性。
  19. 如申請專利範圍第14或15項之包含誘導免疫反應之抗體之醫藥組成物的體外製造方法，其中，包含將Fc區之EU編號表示之部位當中選自於239位、252位、257位、286位、307位、308位、428位及434位之群中至少1個以上的胺基酸取代的步驟。
  20. 如申請專利範圍第14或15項之包含誘導免疫反應之抗體之醫藥組成物的體外製造方法，其中，包含進行Fc區之EU編號表示之部位當中選自於以下之群中至少1個以上的胺基酸取代之步驟：257位之胺基酸取代為Ala、308位之胺基酸取代為Pro、428位之胺基酸取代為Leu、及434位之胺基酸取代為Tyr。
  21. 如申請專利範圍第14或15項之包含誘導免疫反應之抗體之醫藥組成物的體外製造方法，其中，包含使該Fc區對Fcγ受體之結合活性，比起結合於EU編號297位之糖鏈係含岩藻糖之糖鏈之天然型人類IgG之Fc區對Fcγ受體之結合活性增強之步驟。
  22. 如申請專利範圍第21項之包含誘導免疫反應之抗體之醫藥組成物的體外製造方法，其中，該Fcγ受體為FcγRIa、FcγRIIa(R)、FcγRIIa(H)、FcγRIIb、FcγRIIIa(V)、或FcγRIIIa(F)。
  23. 如申請專利範圍第21項之包含誘導免疫反應之抗體之醫藥組成物的體外製造方法，其中，包含將Fc區中 之EU編號表示之部位當中選自以下之群中之至少1個以上的胺基酸取代的步驟：221位、222位、223位、224位、225位、227位、228位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、243位、244位、245位、246位、247位、249位、250位、251位、254位、255位、256位、258位、260位、262位、263位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、271位、272位、273位、274位、275位、276位、278位、279位、280位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、288位、290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304位、305位、311位、313位、315位、317位、318位、320位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、336位、337位、339位、376位、377位、378位、379位、380位、382位、385位、392位、396位、421位、427位、428位、429位、434位、436位及440位。
  24. 如申請專利範圍第21項之包含誘導免疫反應之抗體之醫藥組成物的體外製造方法，其中，包含進行Fc區之EU編號表示之部位當中選自以下群中至少1個以上的胺基酸取代之步驟；221位之胺基酸取代為Lys或Tyr中之任一者、 222位之胺基酸取代為Phe、Trp、Glu或Tyr中之任一者、223位之胺基酸取代為Phe、Trp、Glu或Lys中之任一者、224位之胺基酸取代為Phe、Trp、Glu或Tyr中之任一者、225位之胺基酸取代為Glu、Lys或Trp中之任一者、227位之胺基酸取代為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、228位之胺基酸取代為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、230位之胺基酸取代為Ala、Glu、Gly或Tyr中之任一者、231位之胺基酸取代為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中之任一者、232位之胺基酸取代為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、233位之胺基酸取代為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、234位之胺基酸取代為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、235位之胺基酸取代為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、 Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、236位之胺基酸取代為Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、237位之胺基酸取代為Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、238位之胺基酸取代為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、239位之胺基酸取代為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、240位之胺基酸取代為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、241位之胺基酸取代為Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中之任一者、243位之胺基酸取代為Leu、Glu、Leu、Gln、Arg、Trp或Tyr中之任一者、244位之胺基酸取代為His、245位之胺基酸取代為Ala、246位之胺基酸取代為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、 247位之胺基酸取代為Ala、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Thr、Val或Tyr中之任一者、249位之胺基酸取代為Glu、His、Gln或Tyr中之任一者、250位之胺基酸取代為Glu或Gln中之任一者、251位之胺基酸取代為Phe、254位之胺基酸取代為Phe、Met或Tyr中之任一者、255位之胺基酸取代為Glu、Leu或Tyr中之任一者、256位之胺基酸取代為Ala、Met或Pro中之任一者、258位之胺基酸取代為Asp、Glu、His、Ser或Tyr中之任一者、260位之胺基酸取代為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、262位之胺基酸取代為Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中之任一者、263位之胺基酸取代為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、264位之胺基酸取代為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、265位之胺基酸取代為Ala、Leu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Val、Trp或Tyr中之任一者、266位之胺基酸取代為Ala、Ile、Met或Thr中之任 一者、267位之胺基酸取代為Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、268位之胺基酸取代為Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Trp中之任一者、269位之胺基酸取代為Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、270位之胺基酸取代為Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、271位之胺基酸取代為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、272位之胺基酸取代為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、273位之胺基酸取代為Phe或Ile中之任一者、274位之胺基酸取代為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、275位之胺基酸取代為Leu或Trp中之任一者、276位之胺基酸取代為、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr 中之任一者、278位之胺基酸取代為Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中之任一者、279位之胺基酸取代為Ala、280位之胺基酸取代為Ala、Gly、His、Lys、Leu、Prp、Gln、Trp或Tyr中之任一者、281位之胺基酸取代為Asp、Lys、Pro或Tyr中之任一者、282位之胺基酸取代為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中之任一者、283位之胺基酸取代為Ala、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg或Tyr中之任一者、284位之胺基酸取代為Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中之任一者、285位之胺基酸取代為Asp、Glu、Lys、Gln、Trp或Tyr中之任一者、286位之胺基酸取代為Glu、Gly、Pro或Tyr中之任一者、288位之胺基酸取代為Asn、Asp、Glu或Tyr中之任一者、290位之胺基酸取代為Asp、Gly、His、Leu、Asn、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、291位之胺基酸取代為Asp、Glu、Gly、His、Ile、Gln 或Thr中之任一者、292位之胺基酸取代為Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中之任一者、293位之胺基酸取代為Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、294位之胺基酸取代為Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、295位之胺基酸取代為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、296位之胺基酸取代為Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr或Val中之任一者、297位之胺基酸取代為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、298位之胺基酸取代為Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、299位之胺基酸取代為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中之任一者、300位之胺基酸取代為Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、 Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中之任一者、301位之胺基酸取代為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、302位之胺基酸取代為Ile、303位之胺基酸取代為Asp、Gly或Tyr中之任一者、304位之胺基酸取代為Asp、His、Leu、Asn或Thr中之任一者、305位之胺基酸取代為Glu、Ile、Thr或Tyr中之任一者、311位之胺基酸取代為Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中之任一者、313位之胺基酸取代為Phe、315位之胺基酸取代為Leu、317位之胺基酸取代為Glu或Gln、318位之胺基酸取代為His、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Tyr中之任一者、320位之胺基酸取代為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、322位之胺基酸取代為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、323位之胺基酸取代為Ile、324位之胺基酸取代為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、 325位之胺基酸取代為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、326位之胺基酸取代為Ala、Asp、Glu、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、327位之胺基酸取代為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、328位之胺基酸取代為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、329位之胺基酸取代為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、330位之胺基酸取代為Cys、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、331位之胺基酸取代為Asp、Phe、His、Ile、Leu、Met、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、332位之胺基酸取代為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、333位之胺基酸取代為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、 Ile、Leu、Met、Pro、Ser、Thr、Val或Tyr中之任一者、334位之胺基酸取代為Ala、Glu、Phe、Ile、Leu、Pro或Thr中之任一者、335位之胺基酸取代為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中之任一者、336位之胺基酸取代為Glu、Lys或Tyr中之任一者、337位之胺基酸取代為Glu、His或Asn中之任一者、339位之胺基酸取代為Asp、Phe、Gly、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser或Thr中之任一者、376位之胺基酸取代為Ala或Val中之任一者、377位之胺基酸取代為Gly或Lys中之任一者、378位之胺基酸取代為Asp、379位之胺基酸取代為Asn、380位之胺基酸取代為Ala、Asn或Ser中之任一者、382位之胺基酸取代為Ala或Ile中之任一者、385位之胺基酸取代為Glu、392位之胺基酸取代為Thr、396位之胺基酸取代為Leu、421位之胺基酸取代為Lys、427位之胺基酸取代為Asn、428位之胺基酸取代為Phe或Leu中之任一者、429位之胺基酸取代為Met、434位之胺基酸取代為Trp、436位之胺基酸取代為Ile、及 440位之胺基酸取代為Gly、His、Ile、Leu或Tyr中之任一者。
  25. 如申請專利範圍第21項之誘導免疫反應之抗體之製造方法，其中，該天然型Fc區，為結合於EU編號297位之糖鏈係含岩藻糖之糖鏈之人類IgG1、人類IgG2、人類IgG3或人類IgG4中之任一者之Fc區。
  26. 如申請專利範圍第21項之包含誘導免疫反應之抗體之醫藥組成物的體外製造方法，其中，包含將該Fc區修飾使得Fc區中EU編號297位之結合有岩藻糖缺損糖鏈之Fc區之比例提高、或使得Fc區中EU編號297位之附加有二分化N-乙醯基葡萄糖胺之Fc區之比例提高的步驟。
  27. 一種誘導免疫反應之醫藥組成物之體外製造方法，包含以下(a)~(f)之步驟：(a)獲得在鈣離子濃度為100μM至10mM之間之條件下抗原結合分域對抗原之結合活性、(b)獲得在鈣離子濃度為0.1μM至30μM之間之條件下抗原結合分域對抗原之結合活性、(c)選擇(a)獲得之抗原結合活性高於(b)獲得之抗原結合活性之抗原結合分域、(d)將編碼為(c)選擇之抗原結合分域之聚核苷酸，連結於編碼為在pH7.0~pH8.0之條件下對FcRn有結合活性之FcRn結合分域之聚核苷酸，其中該FcRn結合分域包含抗體之Fc區，該Fc區來自IgG的Fc區，其中，該Fc區，在選自於Fc區中之EU編號表示之部位當中的234位、235 位、236位、237位、238位、239位、248位、250位、251位、252位、253位、254位、255位、256位、257位、258位、259位、265位、267位、270位、272位、274位、279位、280位、282位、284位、286位、288位、289位、295位、297位、298位、302位、303位、304位、305位、307位、308位、309位、311位、312位、313位、314位、315位、316位、317位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、332位、334位、338位、340位、345位、360位、361位、362位、375位、376位、378位、380位、382位、383位、384位、385位、386位、387位、389位、390位、391位、413位、422位、424位、428位、433位、434位、435位、436位、437位、438位、439位、440位、441位及442位之群中至少1個以上的胺基酸，與天然型IgG之Fc區之對應部位之胺基酸不同、(e)培養導入有(d)獲得之聚核苷酸以可作用地連結之載體的細胞、及(f)從(e)培養細胞之培養液將抗原結合分子回收。
  28. 一種誘導免疫反應之醫藥組成物之體外製造方法，包含以下(a)~(f)之步驟：(a)獲得於鈣離子濃度為100μM至10mM之間之條件下抗體對抗原之結合活性、(b)獲得於鈣離子濃度為0.1μM至30μM之間之條件下抗體對抗原之結合活性、(c)選擇在(a)獲得之抗原結合活性高於(b)獲得之抗 原結合活性之抗體、(d)將編碼為(c)選擇之抗體之抗原結合分域之聚核苷酸，連結於編碼為在pH7.0~pH8.0之條件下對FcRn有結合活性之FcRn結合分域之聚核苷酸，其中該FcRn結合分域包含抗體之Fc區，該Fc區來自IgG的Fc區，其中，該Fc區，在選自於Fc區中之EU編號表示之部位當中的234位、235位、236位、237位、238位、239位、248位、250位、251位、252位、253位、254位、255位、256位、257位、258位、259位、265位、267位、270位、272位、274位、279位、280位、282位、284位、286位、288位、289位、295位、297位、298位、302位、303位、304位、305位、307位、308位、309位、311位、312位、313位、314位、315位、316位、317位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、332位、334位、338位、340位、345位、360位、361位、362位、375位、376位、378位、380位、382位、383位、384位、385位、386位、387位、389位、390位、391位、413位、422位、424位、428位、433位、434位、435位、436位、437位、438位、439位、440位、441位及442位之群中至少1個以上的胺基酸，與天然型IgG之Fc區之對應部位之胺基酸不同、(e)培養導入有(d)獲得之聚核苷酸以可作用地連結之載體的細胞、及(f)從(e)培養細胞之培養液將抗原結合分子回收。
  29. 一種抗原結合分子之體外製造方法，包含以下(a) ~(f)之步驟：(a)獲得在pH7.0~pH8.0之條件下抗原結合分域對抗原之結合活性、(b)獲得在pH5.5~pH6.5之條件下抗原結合分域對抗原之結合活性、(c)選擇在(a)獲得之抗原結合活性高於(b)獲得之抗原結合活性之抗原結合分域、(d)將編碼為(c)選擇之抗原結合分域之聚核苷酸，連結於編碼為在pH7.0~pH8.0之條件下對FcRn有結合活性之FcRn結合分域之聚核苷酸，其中該FcRn結合分域包含抗體之Fc區，該Fc區來自IgG的Fc區，其中，該Fc區，在選自於Fc區中之EU編號表示之部位當中的234位、235位、236位、237位、238位、239位、248位、250位、251位、252位、253位、254位、255位、256位、257位、258位、259位、265位、267位、270位、272位、274位、279位、280位、282位、284位、286位、288位、289位、295位、297位、298位、302位、303位、304位、305位、307位、308位、309位、311位、312位、313位、314位、315位、316位、317位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、332位、334位、338位、340位、345位、360位、361位、362位、375位、376位、378位、380位、382位、383位、384位、385位、386位、387位、389位、390位、391位、413位、422位、424位、428位、433位、434位、435位、436位、437位、438位、439位、440位、441 位及442位之群中至少1個以上的胺基酸，與天然型IgG之Fc區之對應部位之胺基酸不同、(e)培養導入有(d)獲得之聚核苷酸以可作用地連結之載體的細胞、及(f)從(e)培養細胞之培養液將抗原結合分子回收。
  30. 一種抗原結合分子之體外製造方法，包含以下(a)~(f)之步驟：(a)獲得在pH7.0~pH8.0之條件下抗體對抗原之結合活性、(b)獲得在pH5.5~pH6.5之條件下抗體對抗原之結合活性、(c)選擇在(a)獲得之抗原結合活性高於(b)獲得之抗原結合活性之抗體、(d)將編碼為(c)選擇之抗體之抗原結合分域之聚核苷酸，連結於編碼為在pH7.0~pH8.0之條件下對FcRn有結合活性之FcRn結合分域之聚核苷酸，其中該FcRn結合分域包含抗體之Fc區，該Fc區來自IgG的Fc區，其中，該Fc區，在選自於Fc區中之EU編號表示之部位當中的234位、235位、236位、237位、238位、239位、248位、250位、251位、252位、253位、254位、255位、256位、257位、258位、259位、265位、267位、270位、272位、274位、279位、280位、282位、284位、286位、288位、289位、295位、297位、298位、302位、303位、304位、305位、307位、308位、309位、311位、312位、313位、 314位、315位、316位、317位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、332位、334位、338位、340位、345位、360位、361位、362位、375位、376位、378位、380位、382位、383位、384位、385位、386位、387位、389位、390位、391位、413位、422位、424位、428位、433位、434位、435位、436位、437位、438位、439位、440位、441位及442位之群中至少1個以上的胺基酸，與天然型IgG之Fc區之對應部位之胺基酸不同、(e)培養導入有(d)獲得之聚核苷酸以可作用地連結之載體的細胞、及(f)從(e)培養細胞之培養液將抗原結合分子回收。
  31. 如申請專利範圍第27至30項中任一項之方法，其中，該免疫為獲得性免疫。
  32. 如申請專利範圍第27至30項中任一項之方法，其中，該抗原結合分子係對該抗原有中和活性之抗原結合分子。
  33. 如申請專利範圍第27至30項中任一項之方法，其中，該抗原結合分子對於表現該抗原之細胞有細胞傷害活性。
  34. 如申請專利範圍第27至30項中任一項之方法，其中，該Fc區，在Fc區之EU編號表示之部位當中選自於257位、308位、428位及434位之群中至少1個以上之胺基酸與天然型Fc區之對應部位之胺基酸不同。
  35. 如申請專利範圍第27至30項中任一項之方法， 其中，該Fc區，包含選自Fc區之EU編號表示；257位之胺基酸為Ala、308位之胺基酸為Pro、428位之胺基酸為Leu、及434位之胺基酸為Tyr、之群中至少1個以上的胺基酸。
  36. 如申請專利範圍第27至30項中任一項之方法，其中，該Fc區對Fcγ受體之結合活性高於天然型人類IgG之Fc區對Fcγ受體之結合活性，且於該天然型人類IgG之Fc區中，結合於EU編號297位之糖鏈係含岩藻糖之糖鏈。
  37. 如申請專利範圍第36項之方法，其中，該Fcγ受體為FcγRIa、FcγRIIa(R)、FcγRIIa(H)、FcγRIIb、FcγRIIIa(V)、或FcγRIIIa(F)。
  38. 如申請專利範圍第36項之方法，其中，該Fc區，包含Fc區之EU編號表示之部位當中選自以下群中至少1個以上的胺基酸；221位之胺基酸為Lys或Tyr中之任一者、222位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中之任一者、223位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Lys中之任一者、224位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中之任一者、225位之胺基酸為Glu、Lys或Trp中之任一者、227位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、228位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、 230位之胺基酸為Ala、Glu、Gly或Tyr中之任一者、231位之胺基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中之任一者、232位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、233位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、234位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、235位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、236位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、237位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、238位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、239位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或 Tyr中之任一者、240位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、241位之胺基酸為Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中之任一者、243位之胺基酸為Leu、Glu、Leu、Gln、Arg、Trp或Tyr中之任一者、244位之胺基酸為His、245位之胺基酸為Ala、246位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、247位之胺基酸為Ala、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Thr、Val或Tyr中之任一者、249位之胺基酸為Glu、His、Gln或Tyr中之任一者、250位之胺基酸為Glu或Gln中之任一者、251位之胺基酸為Phe、254位之胺基酸為Phe、Met或Tyr中之任一者、255位之胺基酸為Glu、Leu或Tyr中之任一者、256位之胺基酸為Ala、Met或Pro中之任一者、258位之胺基酸為Asp、Glu、His、Ser或Tyr中之任一者、260位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、262位之胺基酸為Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中之任一者、263位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、264位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、 Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、265位之胺基酸為Ala、Leu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Val、Trp或Tyr中之任一者、266位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、267位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、268位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Trp中之任一者、269位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、270位之胺基酸為Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、271位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、272位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、273位之胺基酸為Phe或Ile中之任一者、274位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、 Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、275位之胺基酸為Leu或Trp中之任一者、276位之胺基酸為、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、278位之胺基酸為Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中之任一者、279位之胺基酸為Ala、280位之胺基酸為Ala、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gln、Trp或Tyr中之任一者、281位之胺基酸為Asp、Lys、Pro或Tyr中之任一者、282位之胺基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中之任一者、283位之胺基酸為Ala、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg或Tyr中之任一者、284位之胺基酸為Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中之任一者、285位之胺基酸為Asp、Glu、Lys、Gln、Trp或Tyr中之任一者、286位之胺基酸為Glu、Gly、Pro或Tyr中之任一者、288位之胺基酸為Asn、Asp、Glu或Tyr中之任一者、290位之胺基酸為Asp、Gly、His、Leu、Asn、Ser、 Thr、Trp或Tyr中之任一者、291位之胺基酸為Asp、Glu、Gly、His、Ile、Gln或Thr中之任一者、292位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中之任一者、293位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、294位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、295位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、296位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr或Val中之任一者、297位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、298位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、299位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中之任一者、 300位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中之任一者、301位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、302位之胺基酸為Ile、303位之胺基酸為Asp、Gly或Tyr中之任一者、304位之胺基酸為Asp、His、Leu、Asn或Thr中之任一者、305位之胺基酸為Glu、Ile、Thr或Tyr中之任一者、311位之胺基酸為Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中之任一者、313位之胺基酸為Phe、315位之胺基酸為Leu、317位之胺基酸為Glu或Gln、318位之胺基酸為His、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Tyr中之任一者、320位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、322位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、323位之胺基酸為Ile、324位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、325位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、 Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、326位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、327位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、328位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、329位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、330位之胺基酸為Cys、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、331位之胺基酸為Asp、Phe、His、Ile、Leu、Met、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、332位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、333位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Ser、Thr、Val或Tyr中之任一者、 334位之胺基酸為Ala、Glu、Phe、Ile、Leu、Pro或Thr中之任一者、335位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中之任一者、336位之胺基酸為Glu、Lys或Tyr中之任一者、337位之胺基酸為Glu、His或Asn中之任一者、339位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser或Thr中之任一者、376位之胺基酸為Ala或Val中之任一者、377位之胺基酸為Gly或Lys中之任一者、378位之胺基酸為Asp、379位之胺基酸為Asn、380位之胺基酸為Ala、Asn或Ser中之任一者、382位之胺基酸為Ala或Ile中之任一者、385位之胺基酸為Glu、392位之胺基酸為Thr、396位之胺基酸為Leu、421位之胺基酸為Lys、427位之胺基酸為Asn、428位之胺基酸為Phe或Leu中之任一者、429位之胺基酸為Met、434位之胺基酸為Trp、436位之胺基酸為Ile、及440位之胺基酸為Gly、His、Ile、Leu或Tyr中之任 一者。
  39. 如申請專利範圍第36項之方法，其中，該天然型Fc區，為結合於EU編號297位之糖鏈係含岩藻糖之糖鏈之人類IgG1、人類IgG2、人類IgG3或人類IgG4中之任一者之Fc區。
  40. 如申請專利範圍第36項之方法，其中，該Fc區係經修飾使得Fc區中EU編號297位之結合有岩藻糖缺損糖鏈之Fc區之比例提高、或使得Fc區中EU編號297位之附加有二分化N-乙醯基葡萄糖胺之Fc區之比例提高。
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The Journal of Immunology, vol.182, no.12,p.7663-7671。

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