CN111315772A - 抗apoc3抗体及其使用方法 - Google Patents

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CN111315772A CN201880071223.3A CN201880071223A CN111315772A CN 111315772 A CN111315772 A CN 111315772A CN 201880071223 A CN201880071223 A CN 201880071223A CN 111315772 A CN111315772 A CN 111315772A
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P.达西尔瓦-贾尔丁
H.德哈德
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Stayton Biotechnology Co Ltd
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Abstract

本公开提供了与ApoC3(例如，人ApoC3)特异性结合并拮抗ApoC3功能的抗体。还提供了包括这些抗体的药物组合物、对这些抗体进行编码的核酸、用于制备这些抗体的表达载体和宿主细胞以及使用这些抗体治疗受试者的方法。

Description

抗APOC3抗体及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年10月31日提交的美国临时申请第62/579,449号的权益，所述申请通过引用整体并入本文。
技术领域
本公开涉及与ApoC3(例如，人ApoC3)特异性结合的抗体以及使用所述抗体的方法。
背景技术
血液中甘油三酯水平升高(高甘油三酯血症)是动脉粥样硬化的病因，并增加了心血管事件(如心血管死亡、心绞痛、心肌梗塞和中风)的风险。
ApoC3是一种以非常高的浓度(大于10μM)在血液中循环的蛋白质，其主要与富含甘油三酯的脂蛋白(TRL)、TRL残留物和高密度脂蛋白结合。ApoC3似乎是血液甘油三酯水平的重要调节剂。例如，已显示人的ApoC3水平与血液甘油三酯水平呈正相关，其中ApoC3水平的升高与高甘油三酯血症相关。此外，已显示ApoC3抑制脂蛋白脂肪酶(一种水解TRL中的甘油三酯的酶)的活性，并且还抑制肝脏对TRL残留物的摄取，这两者都会引起血液甘油三酯水平的升高。
几种疗法已被批准用于治疗高甘油三酯血症，如贝特类、烟酸和ω-3脂肪酸。然而，这些疗法在降低血浆甘油三酯方面仅是适度有效的。因此，在本领域中需要改进的用于降低血浆甘油三酯的疗法。
发明内容
本公开提供了与ApoC3(例如，人ApoC3)特异性结合并抑制ApoC3功能的抗体。还提供了包括这些抗体的药物组合物、对这些抗体进行编码的核酸、用于制备这些抗体的表达载体和宿主细胞以及使用这些抗体治疗受试者的方法。
在某些实施例中，当施用于受试者时，本文所公开的抗ApoC3抗体可以减弱ApoC3抑制肝细胞摄取TRL的能力，并且可以引起ApoC3和ApoB的血清水平快速且持续降低。因此，公开的抗ApoC3抗体可用于治疗和预防高甘油三酯血症和相关疾病(例如，心血管疾病和胰腺炎)。
因此，在一方面，本公开提供了一种分离的抗体，其以pH 7.4下的第一解离常数(KD)和pH 5.5下的第二KD与ApoC3特异性结合，其中所述第二KD与所述第一KD之间的比率至少约为5、10、20、或50。在某些实施例中，所述第一KD小于10、5、2、1、0.5、0.2或0.1nM。在某些实施例中，所述抗体在表达ApoC3的小鼠中的半衰期为至少约3天、7天、14天、21天或28天。
在某些实施例中，所述抗体减弱了ApoC3抑制极低密度脂蛋白(VLDL)的肝细胞摄取的能力。在某些实施例中，所述抗体能够增加受试者血液中ApoC3的清除率。在某些实施例中，所述抗体能够增加受试者血液中ApoB的清除率。在某些实施例中，所述抗体能够降低受试者血液中的ApoC3水平。在某些实施例中，所述抗体能够将受试者血液中的ApoC3水平降低至少40％，持续至少2周。在某些实施例中，所述抗体能够降低受试者血液中的ApoB水平。在某些实施例中，所述抗体能够将受试者血液中的ApoB水平降低至少20％，持续至少2周。在某些实施例中，所述抗体能够抑制受试者的餐后血脂。在某些实施例中，所述抗体能够与脂质结合型ApoC3结合。
在某些实施例中，所述抗体与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列内的表位结合。在某些实施例中，所述表位包括SEQ ID NO:2的位置2、5、6、8或10处的氨基酸中的至少一个氨基酸。在某些实施例中，所述表位包括SEQ ID NO:2的位置5和6处的氨基酸。在某些实施例中，所述表位包括SEQ ID NO:2的位置2、5、6和8处的氨基酸。在某些实施例中，所述表位包括SEQ ID NO:2的位置10处的氨基酸。在某些实施例中，所述表位包括SEQ ID NO:2的位置6、8和10处的氨基酸。在某些实施例中，所述表位包括SEQ ID NO:2的位置6和8处的氨基酸。
在某些实施例中，所述抗体(例如，人源化抗体)包括具有互补决定区CDRH1、CDRH2和CDRH3的重链可变区以及具有互补决定区CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区，并且其中：
(a)CDRH1包括氨基酸序列TYSMR(SEQ ID NO:3)；
(b)CDRH2包括氨基酸序列SIHTX1X2GGTAYRDSVKG，其中X1是G、E或D，并且X2是G或A(SEQ ID NO:87)；
(c)CDRH3包括氨基酸序列AGYSD(SEQ ID NO:10)；
(d)CDRL1包括氨基酸序列KTSQGLVHSXGKTYFY，其中X是D或G(SEQ ID NO:88)；
(e)CDRL2包括氨基酸序列QVSNRAS(SEQ ID NO:7)；并且
(f)CDRL3包括氨基酸序列AXGTYYPHT，其中X是Q或H(SEQ ID NO:8)，并且任选地，其中所述抗体的CDRH1、CDRH2和CDRH3分别不是SEQ ID NO:3、9、10；3、11、10；3、9、12；或3、11、12。
在某些实施例中，CDRH2包括氨基酸序列SIHTGGGGTAYRDSVKG(SEQ ID NO:36)、SIHTEAGGTAYRDSVKG(SEQ ID NO:37)、SIHTDAGGTAYRDSVKG(SEQ ID NO:38)或SIHTEGGGTAYRDSVKG(SEQ ID NO:39)。在某些实施例中，CDRL1包括氨基酸序列KTSQGLVHSDGKTYFY(SEQ ID NO:6)或KTSQGLVHSGGKTYFY(SEQ ID NO:40)。在某些实施例中，CDRL3包括氨基酸序列AHGTYYPHT(SEQ ID NO:14)或AQGTYYPHT(SEQ ID NO:13)。
在某些实施例中，所述CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包括SEQ IDNO:3、36、10、6、7和14；3、37、10、40、7和14；3、38、10、40、7和14；3、38、10、6、7和14；3、39、10、6、7和14；或3、37、10、40、7和13中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述重链可变区包括选自由SEQ ID NO:42-53组成的组的氨基酸序列。在某些实施例中，所述轻链可变区包括选自由SEQ ID NO:54-65组成的组的氨基酸序列。在某些实施例中，所述重链可变区和所述轻链可变区分别包括SEQ ID NO:42和54、43和55、44和56、45和57、46和58、46和54、47和58、47和54、48和58、48和54、49和59、49和60，50和59、50和60、51和61、52和62、53和62、43和63、44和64或45和65中所示的氨基酸序列。
在某些实施例中，所述抗体包括具有互补决定区CDRH1、CDRH2和CDRH3的重链可变区以及具有互补决定区CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区，并且其中：
(a)CDRH1包括氨基酸序列TYSMR(SEQ ID NO:3)；
(b)CDRH2包括氨基酸序列SIX1TDGGGTAYRDSVKG，其中X1是S或H(SEQ ID NO:4)；
(c)CDRH3包括氨基酸序列X2GYSD，其中X2是A或H(SEQ ID NO:5)；
(d)CDRL1包括氨基酸序列KTSQGLVHSDGKTYFY(SEQ ID NO:6)；
(e)CDRL2包括氨基酸序列QVSNRAS(SEQ ID NO:7)；并且
(f)CDRL3包括氨基酸序列AX3GTYYPHT，其中X3是Q或H(SEQ ID NO:8)，
并且其中X1、X2和X3中的至少一个是H。
在某些实施例中，所述CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包括SEQ IDNO:3、11、10、6、7和13；3、9、12、6、7和13；3、9、10、6、7和14；3、11、10、6、7和14；3、9、12、6、7和14；3、11、12、6、7和13；或3、11、12、6、7和13中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述重链可变区包括选自由SEQ ID NO:16-18组成的组的氨基酸序列。在某些实施例中，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述重链可变区和所述轻链可变区分别包括SEQ ID NO:16和19、17和19、18和19、15和20、16和20、17和20、或18和20中分别所示的氨基酸序列。
在另一方面，本公开提供了一种与ApoC3特异性结合的分离的抗体(例如，人源化抗体)，所述分离的抗体包括具有互补决定区CDRH1、CDRH2和CDRH3的重链可变区以及具有互补决定区CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区，其中：
(a)CDRH1包括氨基酸序列TYSMR(SEQ ID NO:3)；
(b)CDRH2包括氨基酸序列SIHTX1X2GGTAYRDSVKG，其中X1是G、E或D，并且X2是G或A(SEQ ID NO:87)；
(c)CDRH3包括氨基酸序列AGYSD(SEQ ID NO:10)；
(d)CDRL1包括氨基酸序列KTSQGLVHSXGKTYFY，其中X是D或G(SEQ ID NO:88)；
(e)CDRL2包括氨基酸序列QVSNRAS(SEQ ID NO:7)；并且
(f)CDRL3包括氨基酸序列AXGTYYPHT，其中X是Q或H(SEQ ID NO:8)。
在某些实施例中，CDRH2包括氨基酸序列SIHTGGGGTAYRDSVKG(SEQ ID NO:36)、SIHTEAGGTAYRDSVKG(SEQ ID NO:37)、SIHTDAGGTAYRDSVKG(SEQ ID NO:38)或SIHTEGGGTAYRDSVKG(SEQ ID NO:39)。在某些实施例中，CDRL1包括氨基酸序列KTSQGLVHSDGKTYFY(SEQ ID NO:6)或KTSQGLVHSGGKTYFY(SEQ ID NO:40)。在某些实施例中，CDRL3包括氨基酸序列AHGTYYPHT(SEQ ID NO:14)或AQGTYYPHT(SEQ ID NO:13)。在某些实施例中，所述CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包括SEQ ID NO:3、36、10、6、7和14；3、37、10、40、7和14；3、38、10、40、7和14；3、38、10、6、7和14；3、39、10、6、7和14；或3、37、10、40、7和13中所示的氨基酸序列。
在另一方面，本公开提供了一种与ApoC3特异性结合的分离的抗体(例如，人源化抗体)，所述抗体包括重链可变区，所述重链可变区包括选自由SEQ ID NO:42-53组成的组的氨基酸序列。
在另一方面，本公开提供了一种与ApoC3特异性结合的分离的抗体(例如，人源化抗体)，所述抗体包括轻链可变区，所述轻链可变区包括选自由SEQ ID NO:54-65组成的组的氨基酸序列。
在另一方面，本公开提供了一种与ApoC3特异性结合的分离的抗体(例如，人源化抗体)，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区和所述轻链可变区分别包括SEQ ID NO:42和54、43和55、44和56、45和57、46和58、46和54、47和58、47和54、48和58、48和54、49和59、49和60，50和59、50和60、51和61、52和62、53和62、43和63、44和64或45和65中所示的氨基酸序列。
在另一方面，本公开提供了一种与ApoC3特异性结合的分离的抗体，所述分离的抗体包括具有互补决定区CDRH1、CDRH2和CDRH3的重链可变区以及具有互补决定区CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区，其中：
(a)CDRH1包括氨基酸序列TYSMR(SEQ ID NO:3)；
(b)CDRH2包括氨基酸序列SIX1TDGGGTAYRDSVKG，其中X1是S或H(SEQ ID NO:4)；
(c)CDRH3包括氨基酸序列X2GYSD，其中X2是A或H(SEQ ID NO:5)；
(d)CDRL1包括氨基酸序列KTSQGLVHSDGKTYFY(SEQ ID NO:6)；
(e)CDRL2包括氨基酸序列QVSNRAS(SEQ ID NO:7)；并且
(f)CDRL3包括氨基酸序列AX3GTYYPHT，其中X3是Q或H(SEQ ID NO:8)，
并且其中X1、X2和X3中的至少一个是H。
在某些实施例中，所述CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包括SEQ IDNO:3、11、10、6、7和13；3、9、12、6、7和13；3、9、10、6、7和14；3、11、10、6、7和14；3、9、12、6、7和14；3、11、12、6、7和13；或3、11、12、6、7和13中所示的氨基酸序列。
在另一方面，本公开提供了一种与ApoC3特异性结合的分离的抗体，所述抗体包括重链可变区，所述重链可变区包括选自由SEQ ID NO:16-18组成的组的氨基酸序列。
在另一方面，本公开提供了一种与ApoC3特异性结合的分离的抗体，所述抗体包括轻链可变区，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列。
在另一方面，本公开提供了一种与ApoC3特异性结合的分离的抗体，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区和所述轻链可变区分别包括SEQ ID NO:16和19、17和19、18和19、15和20、16和20、17和20或18和20中分别所示的氨基酸序列。
在前述方面中任一项的某些实施例中，所述抗体进一步包括人或人源化恒定区。在某些实施例中，所述恒定区是野生型人免疫球蛋白重链恒定区的变体，并且其中相对于野生型人免疫球蛋白重链恒定区在pH 6下对人新生儿Fc受体(FcRn)的亲和力，所述变体人免疫球蛋白重链恒定区在pH 6下对人FcRn具有增加的亲和力。在某些实施例中，所述恒定区是人IgG的重链恒定区。在某些实施例中，所述恒定区是人IgG1、IgG2或IgG4的重链恒定区。
在某些实施例中，所述恒定区包括分别位于EU位置433、434和436处的氨基酸K、F和Y。在某些实施例中，所述恒定区包括分别位于EU位置252、254和256处的氨基酸Y、T和E。在某些实施例中，所述恒定区包括分别位于EU位置428和434处的氨基酸L和S。在某些实施例中，所述恒定区包括选自由SEQ ID NO:22-24、76-78和81-86组成的组的氨基酸序列。
在某些实施例中，所述分离的抗体包括重链，所述重链包括选自由SEQ ID NO:66-73组成的组的氨基酸序列。在某些实施例中，所述分离的抗体包括轻链，所述轻链包括SEQID NO:74中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述分离的抗体包括重链和轻链，其中所述重链和所述轻链分别包括SEQ ID NO:66和74、67和74、68和74、69和74、70和74、71和74、72和74或73和74中分别所示的氨基酸序列。
在另一方面，本公开提供了一种药物组合物，其包括如本文所公开的抗体和药学上可接受的载剂。
在另一方面，本公开提供了一种多核苷酸，其对如本文所公开的抗体的重链可变区或轻链可变区进行编码。在另一方面，本公开提供了一种表达载体，其包括如本文所公开的多核苷酸。在另一方面，本公开提供了一种宿主细胞，其包括如本文所公开的表达载体。
在另一方面，本公开提供了一种用于产生与ApoC3结合的抗体的方法，所述方法包括在允许表达所述抗体的条件下培养如本文所公开的宿主细胞。
在另一方面，本公开提供了一种用于抑制受试者中ApoC3活性的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如本文所公开的抗体或药物组合物。在另一方面，本公开提供了一种用于降低受试者血液中的甘油三酯水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如本文所公开的抗体或药物组合物。在另一方面，本公开提供了一种用于抑制受试者的餐后血脂的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如本文所公开的抗体或药物组合物。在另一方面，本公开提供了一种用于治疗受试者的高甘油三酯血症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如本文所公开的抗体或药物组合物。在另一方面，本公开提供了一种用于治疗受试者的乳糜微粒血症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如本文所公开的抗体或药物组合物。
在另一方面，本公开提供了一种用于降低患有高甘油三酯血症的受试者患心血管疾病的风险的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如本文所公开的抗体或药物组合物。在某些实施例中，所述心血管疾病是心肌梗塞。在某些实施例中，所述心血管疾病是心绞痛。在某些实施例中，所述心血管疾病是中风。在某些实施例中，所述心血管疾病是动脉粥样硬化。
在涉及治疗方法的前述方面的某些实施例中，所述抗体降低所述受试者血液中乳糜微粒或乳糜微粒残留物的水平。在某些实施例中，所述受试者正在接受另外的降脂剂。在某些实施例中，所述另外的降脂剂是HMG-CoA还原酶抑制剂。在某些实施例中，所述HMG-CoA还原酶抑制剂是阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀或辛伐他汀。在某些实施例中，所述另外的降脂剂是PCSK9抑制剂。在某些实施例中，所述PCSK9抑制剂是阿利库单抗(alirocumab)、依洛尤单抗(evolocumab)或博科西单抗(bococizumab)。在某些实施例中，所述另外的降脂剂是依泽替米贝(ezetimibe)。在某些实施例中，所述另外的降脂剂是依泽替米贝和HMG-CoA还原酶抑制剂的组合。在某些实施例中，所述另外的降脂剂是依泽替米贝、HMG-CoA还原酶抑制剂和PCSK9抑制剂的组合。
附图说明
图1A、1B和1C是表明5E5WT(图1A)、5E5VH5_VL8(图1B)以及5E5VHWT_VL8(“VL8”)、5E5VH12_VLWT(“VH12”)、5E5VH5_VLWT(“VH5”)和5E5VH5_VL8(“VH5_VL8”)(图1C)抗体减弱了ApoC3抑制HepG2细胞摄取极低密度脂蛋白(VLDL)的能力的一系列图表。如图所示，将HepG2细胞与DiI VLDL和纯化的ApoC3一起单独孵育或在存在抗ApoC3抗体的情况下孵育。通过DiI染料的荧光光谱法测量HepG2细胞摄取的DiI VLDL。与单独的DiI VLDL(“VLDL”)一起孵育的HepG2细胞充当阳性对照，而在不存在抗ApoC3抗体(“ApoC3”)的情况下与DiIVLDL和纯化的ApoC3一起孵育的HepG2细胞充当阴性对照。
图2A是示出在AAV8-人ApoC3小鼠模型中注射两种抗ApoC3抗体5E5和5E5VH5_VL8以及抗鸡蛋溶酶体人IgG1抗体(HyHEL5)后不同时间的血清水平的图。
图2B是示出在AAV8-人ApoC3小鼠模型中5E5和5E5VH5_VL8对循环性人ApoC3的水平的影响的图。
图2C是示出在AAV8-人ApoC3小鼠模型中5E5和5E5VH5_VL8对循环性ApoB的水平的影响的图。
图3是一系列表面等离振子共振(SPR)传感图，其示出了当将人ApoC3固定在生物传感器芯片上时，二十种人源化抗ApoC3抗体(mAb1到mAb20)对人ApoC3的结合动力学。用虚线和实线表示的传感图分别对应于测定pH值7.4和5.5。作为参考，每张图中均包含了在25nM浓度下对应于5E5VH5_VL8的传感图(pH7.4下为虚线而pH5.5下为长虚线)。
图4是一系列SPR传感图，其示出了当将ApoC3抗体固定在生物传感器芯片上时，二十种人源化抗ApoC3抗体(mAb1到mAb20)对人ApoC3的结合动力学。用虚线和实线表示的传感图分别对应于测定pH值7.4和5.5。作为参考，每张图中均包含了在600nM目标nhuApoC3浓度下对应于5E5VH5_VL8的传感图(pH7.4下的虚线和pH5.5下的长虚线)。
图5A-C是示出相对于在4℃下孵育1小时的相应抗体的活性，在所示温度下将抗体孵育1小时后，所选人源化抗体和5E5VH5_VL8的活性百分比的图。在图5A中将活性测量为缔合速率，并且在图5B和5C中将活性测量为RU最大值(R0)。
具体实施方式
本公开提供了与ApoC3(例如，人ApoC3)特异性结合并抑制ApoC3功能的抗体。还提供了包括这些抗体的药物组合物、对这些抗体进行编码的核酸、用于制备这些抗体的表达载体和宿主细胞以及使用这些抗体治疗受试者的方法。在某些实施例中，当施用于受试者时，本文所公开的抗ApoC3抗体可以减弱ApoC3抑制肝细胞摄取TRL的能力，并且可以引起ApoC3和ApoB的血清水平快速且持续降低。因此，公开的抗ApoC3抗体可用于治疗和预防高甘油三酯血症和相关疾病(例如，心血管疾病和胰腺炎)。
1.定义
如本文所使用的，术语“ApoC3”是指载脂蛋白C3蛋白。在某些实施例中，ApoC3是人ApoC3。示例性人ApoC3氨基酸序列在RefSeq登录号NP_000031.1中示出。NP_000031.1的成熟氨基酸序列如下：
SEAEDASLLSFMQGYMKHATKTAKDALSSVQESQVAQQARGWVTDGFSSLKDYWSTVKDKFSEFWDLDPEVRPTSAVAA(SEQ ID NO:1)。
如本文所使用的，术语“抗体(antibody/antibodies)”包含全长抗体、全长抗体的抗原结合片段以及包括抗体CDR、VH区或VL区的分子。抗体的实例包含单克隆抗体、重组产生的抗体、单特异性抗体、多特异性抗体(包含双特异性抗体)、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、免疫球蛋白、合成抗体、包括两个重链分子和两个轻链分子的四聚体抗体、抗体轻链单体、抗体重链单体、抗体轻链二聚体、抗体重链二聚体、抗体轻链-抗体重链对、胞内抗体、异种缀合抗体、单结构域抗体、单价抗体、单链抗体或单链Fv(scFv)、scFv-Fc、驼类抗体(例如，羊驼抗体)、驼峰化(camelized)抗体、亲合体(affybody)、Fab片段、F(ab')2片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、抗独特型(抗Id)抗体(包含例如抗-抗Id抗体)以及上述任何一种的抗原结合片段。在某些实施例中，本文所公开的抗体是指多克隆抗体群。抗体可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY)、任何类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、或IgA2)或任何亚类(例如，IgG2a或IgG2b)的免疫球蛋白分子。在某些实施例中，本文所公开的抗体是IgG抗体、或其类别(例如，人IgG1或IgG4)或其亚类。在具体实施例中，抗体是人源化单克隆抗体。
如本文所使用的，术语“分离的抗体”是指已经从其天然环境的至少一种组分中鉴定和分离和/或回收的抗体。术语“分离的抗体”包含重组宿主细胞内的原位抗体。
如本文所使用的，术语“CDR”或“互补决定区”是指在重链和轻链多肽的可变区内均存在的非连续抗原结合位点。这些特定的区域已由以下文献描述：Kabat等人,《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》252,6609-6616(1977)和Kabat等人,《具有免疫学意义的蛋白质序列(Sequences of protein of immunological interest)》(1991)、Chothia等人,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》196:901-917(1987)和MacCallum等人,《分子生物学杂志》262:732-745(1996)，所有这些文献均通过引用整体并入，其中所述定义包含彼此比较时氨基酸残基的重叠或子集。在某些实施例中，术语“CDR”是通过以下文献所定义的CDR：Kabat等人,《生物化学杂志》252,6609-6616(1977)和Kabat等人,《具有免疫学意义的蛋白质序列》(1991)。CDRH1、CDRH2和CDRH3表示重链CDR，而CDRL1、CDRL2和CDRL3表示轻链CDR。
如本文所使用的，术语“框架(FR)氨基酸残基”是指免疫球蛋白链的框架区中的氨基酸。如本文所使用的，术语“框架区”或“FR区”包含作为可变区的一部分但不作为CDR的一部分的氨基酸残基(例如，使用CDR的Kabat定义)。
如本文所使用的，术语“可变区”和“可变结构域”可互换使用并且在本领域中是常见的。可变区通常是指抗体的一部分，一般指轻链或重链的一部分，通常在成熟重链中为氨基末端约110到120个氨基酸或110到125个氨基酸，而在成熟轻链中为约90到115个氨基酸，其在抗体之间的序列差异很大，并且用于特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。序列的变异性集中在被称为互补决定区(CDR)的区域中，而可变结构域中保守性更高的区域被称为框架区(FR)。不希望受任何特定机制或理论的束缚，据信轻链和重链的CDR主要负责抗体与抗原的相互作用和特异性。在某些实施例中，可变区是人可变区。在某些实施例中，可变区包括啮齿动物或鼠CDR以及人框架区(FR)。在特定实施例中，可变区是灵长类(例如，非人灵长类)可变区。在某些实施例中，可变区包括啮齿动物或鼠CDR以及灵长类(例如，非人灵长类)框架区(FR)。
术语“VL”和“VL结构域”可互换使用，以指代抗体的轻链可变区。
术语“VH”和“VH结构域”可互换使用，以指代抗体的重链可变区。
如本文所使用的，术语“恒定区”和“恒定结构域”可互换并且在本领域中是常见的。恒定区是抗体部分，例如，轻链或重链的羧基末端部分，其不直接参与抗体与抗原的结合，但是可以表现出多种效应子功能，如与Fc受体的相互作用。相对于免疫球蛋白可变结构域，免疫球蛋白分子的恒定区通常具有更保守的氨基酸序列。
如本文所使用的，基于恒定结构域的氨基酸序列，术语“重链”在用于抗体时可以指任何不同的类型，例如，α(α)、δ(δ)、ε(ε)、γ(γ)和μ(μ)，这些类型分别产生IgA、IgD、IgE、IgG和IgM类抗体，包含IgG的亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)。
如本文所使用的，基于恒定结构域的氨基酸序列，术语“轻链”在用于抗体时可以指任何不同的类型，例如，κ(κ)或λ(λ)。轻链氨基酸序列是本领域众所周知的。在具体实施例中，轻链是人轻链。
如本文中所使用的，术语“EU位置”是指根据EU编号约定的抗体恒定区的氨基酸位置，如以下文献所述：Edelman,G.M.等人,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.USA)》,63,78-85(1969)和Kabat等人,《具有免疫学意义的蛋白质序列》,美国卫生与人类服务部,第5版,1991，所述文献中的每一个文献均通过引用整体并入本文。
如本文所使用的，术语“特异性结合”是指抗体以小于约1x 10～6M、1x 10-7M、1x10-8M、1x 10-9M、1x 10-10M、1x 10-11M、1x 10-12M或更小的解离常数(KD)与抗原结合的能力，或以至少比其对非特异性抗原的亲和力大两倍的亲和力与抗原结合的能力。
如本文所使用的，“表位”是指抗体可以特异性结合的抗原的局部区域。表位可以例如是多肽的连续氨基酸(线性或连续的表位)，或者表位可以例如由一个或多个多肽的两个或更多个非连续区域形成(构象的、非线性、非连续或不连续的表位)。在某些实施例中，可以通过例如NMR光谱法、X射线衍射晶体学研究、ELISA测定法、氢/氘交换结合质谱法(例如，液相色谱电喷雾质谱法)、肽扫描法或诱变作图(例如，定点诱变作图)来确定抗体所结合的表位。
如本文所使用的，术语“治疗(treat/treating/treatment)”是指本文所公开的治疗性或预防性措施。“治疗”方法采用向患有疾病或病症或易患这种疾病或病症的受试者施用抗ApoC3抗体，其目的是为了预防所述疾病或病症或复发性疾病或病症的一种或多种症状、治愈所述一种或多种症状、延缓所述一种或多种症状、降低所述一种或多种症状的严重性、减少患所述一种或多种症状的风险或改善所述一种或多种症状，或者是为了延长受试者的存活期使其超过在不使用这种治疗的情况下所预期的时间。
如本文所使用的，在向受试者施用治疗的背景下，术语“有效量”是指达到所期望的预防或治疗效果的治疗的量。
如本文所使用的，术语“受试者”包含任何人或非人动物。
如本文所使用的，术语“或”是指和/或。
如本文所使用的，当用于修饰数值或数值范围时，术语“约(about/approximately)”表明所叙述的值或范围之上5％到10％和之下5％至10％的偏差仍在该值或范围的预期范围内。
2.抗ApoC3抗体
本公开提供了与ApoC3(例如，人ApoC3)特异性结合并抑制ApoC3功能的分离的抗体(例如，人源化抗体)。
在某些实施例中，分离的抗体与哺乳动物的ApoC3蛋白结合。在某些实施例中，分离的抗体与人ApoC3结合。在某些实施例中，分离的抗体与食蟹猴(Macacafascicularis)ApoC3结合。
在某些实施例中，与酸性pH(例如，pH 5.5到pH 6)相比，分离的抗体在生理pH(例如，pH 7.4)下以更高的亲和力与ApoC3(例如，人ApoC3)结合。产生这种pH依赖性抗体的方法是本领域众所周知的。例如，在一种示例性方法中，抗ApoC3抗体的重链和/或轻链CDR中的一个或多个氨基残基被组氨酸残基取代，如以下文献所述：Igawa等人,《自然生物技术(Nat Biotechnol.)》(2010)28(11):1203-1207；Chaparro-Riggers等人,《生物化学杂志》(2012)287(14):11090-11097；美国专利第9,096,651号和美国专利公开号US20110111406A1，所述文献中的每一个文献均通过引用整体并入本文。然而，尽管这样的方法在本领域中是众所周知的，但是技术人员将理解，对于任何给定的抗体，只能凭经验确定可以突变为组氨酸以实现与抗原的pH依赖性结合而不破坏抗体对抗原的亲和力的精确CDR氨基酸(参见例如，Edgcomb和Murphy,《蛋白质(Proteins)》(2002)49:1-6，所述文献通过引用整体并入本文)。
本领域技术人员将理解，抗体对抗原的亲和力可以通过解离常数(KD)表示，其中较小的KD表示较高的亲和力。因此，在某些实施例中，抗ApoC3抗体以pH 7.4下的第一KD和pH5.5下的第二KD与ApoC3(例如，人ApoC3)结合，其中所述第二KD与所述第一KD之间的比率至少为1(例如，至少为1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100)。
在某些实施例中，所述第一KD小于100nM(例如，小于50、20、10、5、2、1、0.5、0.2或0.1nM)。在某些实施例中，所述第二KD大于1nM(例如，大于2、5、10、20或50nM，或大于0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50或100μM)。在某些实施例中，所述第一KD小于100nM(例如，小于50、20、10、5、2、1、0.5、0.2或0.1nM)，并且抗体在表达ApoC3(例如，人ApoC3)的动物(例如，人或小鼠)中的半衰期为至少约1天(例如，至少约2天、3天、4天、5天、6天或7天，或大于约1周、2周、3周、4周、6周或8周)。在某些实施例中，ApoC3是人ApoC3，并且表达ApoC3的动物是人。在某些实施例中，ApoC3是人ApoC3，并且表达ApoC3的动物是表达人ApoC3的小鼠。
在某些实施例中，本文所公开的分离的抗体减弱了ApoC3抑制肝细胞摄取TRL(例如，VLDL)或TRL残余物(体内或体外)的能力。在某些实施例中，本文所公开的分离的抗体使ApoC3抑制肝细胞摄取TRL(例如，VLDL)或TRL残余物的能力减弱至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，如通过本文所公开的方法或通过本领域技术人员已知的方法所评估的。在某些实施例中，本文所公开的分离的抗体使ApoC3抑制肝细胞摄取TRL(例如，VLDL)或TRL残余物的能力减弱至少约1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，如通过本文公开的方法或通过本领域技术人员已知的方法所评估的。
在某些实施例中，当在饭前、饭中或饭后施用于受试者时，本文所公开的分离的抗体能够抑制受试者的餐后血脂。在某些实施例中，本文所公开的抗ApoC3抗体能够将受试者的餐后血脂抑制至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，如通过本文所公开的方法或通过本领域技术人员已知的方法所评估的。在某些实施例中，本文所公开的抗ApoC3抗体能够将受试者的餐后血脂抑制至少约1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，如通过本文公开的方法或通过本领域技术人员已知的方法所评估的。
在某些实施例中，当在饭前、饭中或饭后施用于受试者时，本文所公开的分离的抗体能够降低受试者的餐后乳糜微粒或乳糜微粒残留物的水平。在某些实施例中，本文所公开的抗ApoC3抗体能够将受试者的餐后乳糜微粒或乳糜微粒残留物的水平降低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，如通过本文所公开的方法或通过本领域技术人员已知的方法所评估的。在某些实施例中，本文所公开的抗ApoC3抗体能够将受试者的餐后乳糜微粒或乳糜微粒残留物的水平降低至少约1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，如通过本文公开的方法或通过本领域技术人员已知的方法所评估的。
在某些实施例中，本文所公开的分离的抗体能够增加受试者血液中ApoC3和/或ApoB(例如，ApoB48和/或ApoB100)的清除率。在某些实施例中，抗ApoC3抗体能够将受试者血液中ApoC3和/或ApoB(例如，ApoB48和/或ApoB100)的清除率增加至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，如通过本文所公开的方法或通过本领域技术人员已知的方法所评估的。在某些实施例中，本文所公开的抗ApoC3抗体能够将受试者血液中ApoC3和/或ApoB(例如，ApoB48和/或ApoB100)的清除率增加至少约1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，如通过本文公开的方法或通过本领域技术人员已知的方法所评估的。用于评估ApoC3和/或ApoB(例如，ApoB48和/或ApoB100)的清除率的方法包含但不限于同位素示踪剂技术，其中同位素可以是放射性的或稳定的。
在某些实施例中，本文所公开的分离的抗体能够降低受试者血液中ApoC3和/或ApoB(例如，ApoB48和/或ApoB100)的水平。在某些实施例中，抗ApoC3抗体能够将受试者血液中ApoC3和/或ApoB(例如，ApoB48和/或ApoB100)的水平降低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，如通过本文所公开的方法或通过本领域技术人员已知的方法所评估的。在某些实施例中，本文所公开的抗ApoC3抗体能够将受试者血液中ApoC3和/或ApoB(例如，ApoB48和/或ApoB100)的水平降低至少约1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，如通过本文公开的方法或通过本领域技术人员已知的方法所评估的。在某些实施例中，受试者血液中ApoC3和/或ApoB(例如，ApoB48和/或ApoB100)水平的降低维持至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天、30天、35天、40天、45天或50天，或至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周。
在某些实施例中，本文所公开的分离的抗体能够与脂质结合型ApoC3(例如，结合到甘油三酯、TRL(例如，VLDL)或TRL残余物的ApoC3)结合。在某些实施例中，本文所公开的分离的抗体不抑制ApoC3与脂质或脂蛋白的结合。在某些实施例中，本文所公开的抗体不与脂质或脂蛋白争相结合ApoC3。在某些实施例中，脂质包括脂肪酸链。在某些实施例中，脂质包括磷脂酰基团。在某些实施例中，脂质包括磷脂酰胆碱(例如，DMPC)、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇或磷脂酰甘油。在某些实施例中，脂质是甘油三酯。在某些实施例中，脂蛋白是TRL(例如，VLDL)或TRL残余物。在某些实施例中，在本文所公开的抗ApoC3抗体存在的情况下，ApoC3结合脂质和脂蛋白(例如，甘油三酯、TRL(例如，VLDL)或TRL残余物)的能力是在不存在抗ApoC3的情况下ApoC3结合相同脂质和脂蛋白的能力的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，如通过本文所公开的方法或通过本领域技术人员已知的方法所评估的。
在某些实施例中，本文所公开的分离的抗体减弱了ApoC3抑制肝细胞摄取TRL(例如，VLDL)或TRL残余物的能力。在某些实施例中，与不存在抗ApoC3的情况下肝细胞(例如，HepG2细胞)对TRL(例如，VLDL)或TRL残余物的摄取相比，在本文所公开的抗ApoC3抗体存在的情况下，肝细胞(例如，HepG2细胞)对TRL(例如，VLDL)或TRL残余物的摄取高出至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5倍。
在某些实施例中，本文所公开的分离的抗体减弱了ApoC3抑制肝细胞摄取TRL(例如，VLDL)或TRL残余物的能力，并且能够与脂质结合型ApoC3(例如，结合到甘油三酯、TRL(例如，VLDL)或TRL残余物的ApoC3)结合。
在某些实施例中，本文所公开的分离的抗体与氨基酸序列FSEFWDLDPE(SEQ IDNO:2)内的ApoC3的表位结合。在某些实施例中，所述表位包括SEQ ID NO:2内的至少一个氨基酸，并且任选地包括与SEQ ID NO:2邻接的来自SEQ ID NO:1的一个或多个氨基酸。在某些实施例中，所述表位包括SEQ ID NO:2的位置2、5、6、8或10处的氨基酸中的至少一个氨基酸。在某些实施例中，所述表位包括SEQ ID NO:2的位置2、5、6、8或10处的氨基酸中的至少两个氨基酸。在某些实施例中，所述表位包括SEQ ID NO:2的位置2、5、6、8或10处的氨基酸中的至少三个氨基酸。在某些实施例中，所述表位包括SEQ ID NO:2的位置2、5、6、8或10处的氨基酸中的至少四个氨基酸。在某些实施例中，所述表位包括SEQ ID NO:2的位置5和6处的氨基酸。在某些实施例中，所述表位包括SEQ ID NO:2的位置2、5和6处的氨基酸。在某些实施例中，所述表位包括SEQ ID NO:2的位置2、5和8处的氨基酸。在某些实施例中，所述表位包括SEQ ID NO:2的位置2、5、6和8处的氨基酸。在某些实施例中，所述表位包括SEQ IDNO:2的位置10处的氨基酸。在某些实施例中，所述表位包括SEQ ID NO:2的位置6和10处的氨基酸。在某些实施例中，所述表位包括SEQ ID NO:2的位置8和10处的氨基酸。在某些实施例中，所述表位包括SEQ ID NO:2的位置6和8处的氨基酸。在某些实施例中，所述表位包括SEQ ID NO:2的位置6、8和10处的氨基酸。在某些实施例中，所述抗体能够与脂质结合型ApoC3(例如，结合到甘油三酯、TRL(例如，VLDL)或TRL残余物的ApoC3)结合。在某些实施例中，所述抗体不能够减弱ApoC3抑制脂蛋白脂肪酶介导的TRL(例如，VLDL)脂解的能力。在某些实施例中，所述抗体还减弱了ApoC3抑制肝细胞摄取TRL(例如，VLDL)或TRL残余物的能力。在某些实施例中，当在饭前、饭中或饭后施用于受试者时，所述抗体还能够抑制受试者的餐后血脂。在某些实施例中，当在饭前、饭中或饭后施用于受试者时，本文所公开的抗体还能够降低受试者的餐后乳糜微粒或乳糜微粒残留物的水平。
可以使用任何合适的测定法测量本文所公开的抗体的前述功能性活性。示例性测定法包含但不限于本文实例中所公开的功能性测定法。
示例性抗ApoC3抗体的氨基酸序列在本文表1-13中示出。
表1.示例性抗ApoC3抗体的重链CDR氨基酸序列。
Figure BDA0002475284060000201
表2.示例性抗ApoC3抗体的轻链CDR氨基酸序列。
Figure BDA0002475284060000211
表3.示例性抗ApoC3抗体的VH氨基酸序列。
Figure BDA0002475284060000212
表4.示例性抗ApoC3抗体的VL氨基酸序列。
Figure BDA0002475284060000213
表5.示例性抗ApoC3抗体的VH和VL序列。
抗体 VH SEQ ID NO VL SEQ ID NO
5E5WT 5E5VHWT 15 5E5VLWT 19
5E5VH5_VLWT 5E5VH5 16 5E5VLWT 19
5E5VH12_VLWT 5E5VH12 17 5E5VLWT 19
5E5VH5VH12_VLWT 5E5VH5VH12 18 5E5VLWT 19
5E5VHWT_VL8 5E5VHWT 15 5E5VL8 20
5E5VH5_VL8 5E5VH5 16 5E5VL8 20
5E5VH12_VL8 5E5VH12 17 5E5VL8 20
5E5VH5VH12_VL8 5E5VH5VH12 18 5E5VL8 20
表6.示例性重链和轻链恒定区的序列。
Figure BDA0002475284060000221
Figure BDA0002475284060000231
Figure BDA0002475284060000241
表7.示例性抗ApoC3抗体的完整重链和轻链序列。
Figure BDA0002475284060000251
Figure BDA0002475284060000261
示例性人源化抗ApoC3抗体的氨基酸序列在本文表8-13中示出。表8.示例性人源化抗ApoC3抗体的重链CDR氨基酸序列。
Figure BDA0002475284060000271
表9.示例性人源化抗ApoC3抗体的轻链CDR氨基酸序列。
Figure BDA0002475284060000281
表10.示例性人源化抗ApoC3抗体的VH氨基酸序列。
Figure BDA0002475284060000282
Figure BDA0002475284060000291
Figure BDA0002475284060000301
表11.示例性人源化抗ApoC3抗体的VL氨基酸序列。
Figure BDA0002475284060000302
Figure BDA0002475284060000311
表12.示例性人源化抗ApoC3抗体的VH和VL序列。
抗体 VH SEQ ID NO VL SEQ ID NO
mAb1 mAb1_VH 46 mAb1_VL 58
mAb2 mAb2_VH 46 mAb2_VL 54
mAb3 mAb3_VH 47 mAb3_VL 58
mAb4 mAb4_VH 47 mAb4_VL 54
mAb5 mAb5_VH 48 mAb5_VL 58
mAb6 mAb6_VH 48 mAb6_VL 54
mAb7 mAb7_VH 42 mAb7_VL 54
mAb8 mAb8_VH 49 mAb8_VL 59
mAb9 mAb9_VH 49 mAb9_VL 60
mAb10 mAb10_VH 50 mAb10_VL 59
mAb11 mAb11_VH 50 mAb11_VL 60
mAb12 mAb12_VH 51 mAb12_VL 61
mAb13 mAb13_VH 52 mAb13_VL 62
mAb14 mAb14_VH 53 mAb14_VL 62
mAb15 mAb15_VH 43 mAb15_VL 63
mAb16 mAb16_VH 43 mAb16_VL 55
mAb17 mAb17_VH 44 mAb17_VL 64
mAb18 mAb18_VH 44 mAb18_VL 56
mAb19 mAb19_VH 45 mAb19_VL 65
mAb20 mAb20_VH 45 mAb20_VL 57
表13.示例性人源化抗ApoC3抗体的完整重链和轻链序列。
Figure BDA0002475284060000321
Figure BDA0002475284060000331
Figure BDA0002475284060000341
在某些实施例中，本公开提供了一种与ApoC3(例如，人ApoC3)特异性结合的分离的抗体，所述抗体包括VH结构域，所述VH结构域包括本文表3或10中示出的VH结构域中的一个、两个或全部三个CDR。在某些实施例中，所述抗体包括表3或10中示出的VH结构域之一中的CDRH1。在某些实施例中，所述抗体包括表3或10中示出的VH结构域之一中的CDRH2。在某些实施例中，所述抗体包括表3或10中示出的VH结构域之一中的CDRH3。
在某些实施例中，本公开提供了一种与ApoC3(例如，人ApoC3)特异性结合的分离的抗体，所述抗体包括VL结构域，所述VL结构域包括本文表4或11中所公开的VL结构域中的一个、两个或全部三个CDR。在某些实施例中，所述抗体包括表4或11中示出的VL结构域之一中的CDRL1。在某些实施例中，所述抗体包括表4或11中示出的VL结构域之一中的CDRL2。在某些实施例中，所述抗体包括表4或11中示出的VL结构域之一中的CDRL3。
在某些实施例中，本公开提供了一种与ApoC3(例如，人ApoC3)特异性结合的分离的抗体，所述抗体包括具有互补决定区CDRH1、CDRH2和CDRH3的重链可变区以及具有互补决定区CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区，其中CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包括表5或12中示出的抗体的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3区的氨基酸序列。
在某些实施例中，可以根据以下文献确定抗体的CDR：Kabat等人,《生物化学杂志》252,6609-6616(1977)和Kabat等人,《具有免疫学意义的蛋白质序列》(1991)。在某些实施例中，根据Kabat确定抗体的轻链CDR，并且根据MacCallum(同上)确定抗体的重链CDR。
在某些实施例中，可以根据Chothia编号方案确定抗体的CDR，所述Chothia编号方案是指免疫球蛋白结构环的位置(参见例如，Chothia C和Lesk AM,(1987),《分子生物学杂志》196:901-917；Al-Lazikani B等人,(1997)《分子生物学杂志》273:927-948；Chothia C等人,(1992)《分子生物学杂志》227:799-817；Tramontano A等人,(1990)《分子生物学杂志》215(1):175-82；和美国专利第7,709,226号)。通常，使用Kabat编号约定时，ChothiaCDRH1环存在于重链氨基酸26至32处、33处或34处，Chothia CDRH2环存在于重链氨基酸52至56处，并且Chothia CDRH3环存在于重链氨基酸95至102处，而Chothia CDRL1环存在于轻链氨基酸24至34处，Chothia CDRL2环存在于轻链氨基酸50至56处，并且Chothia CDRL3环存在于轻链氨基酸89至97处。使用Kabat编号约定对Chothia CDRH1环的末尾进行编号时，所述末尾根据环的长度在H32和H34之间变化(这是因为Kabat编号方案将插入放在H35A和H35B处；如果35A和35B都不存在，则环在32处结束；如果只存在35A，则环在33处结束；如果同时存在35A和35B，则环在34处结束)。
在某些实施例中，可以根据以下文献中所述的IMGT编号系统确定抗体的CDR：Lefranc M-P,(1999)《免疫学者(The Immunologist)》7:132-136和Lefranc M-P等人,(1999)《核酸研究(Nucleic Acids Res)》27:209-212。根据IMGT编号方案，CDRH1位于26至35位，CDRH2位于51至57位，CDRH3位于93至102位，CDRL1位于27至32位，CDRL2位于50至52位，并且CDRL3位于在第89至97位。
在某些实施例中，可以根据AbM编号方案确定抗体的CDR，所述AbM编号方案是指AbM高变区，其代表Kabat CDR和Chothia结构环之间的折衷，并且用于牛津分子AbM抗体建模软件(牛津分子科技集团(Oxford Molecular Group,Inc.))。
在某些实施例中，可以根据MacCallum RM等人,(1996)《分子生物学杂志》262:732-745确定抗体的CDR。还参见，例如，Martin A.“抗体可变结构域的蛋白序列和结构分析(Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains)”,《抗体工程(Antibody Engineering)》,Kontermann和Dübel编辑,第31章,第422-439页,施普林格(Springer-Verlag),柏林(2001)。
在某些实施例中，本公开提供了一种与ApoC3(例如，人ApoC3)特异性结合的分离的抗体，其中所述抗体包括重链可变区，所述重链可变区包括表3中所示的VH结构域的CDRH1、CDRH2和CDRH3区氨基酸序列，以及轻链可变区，所述轻链可变区包括表4中所示的VL结构域的CDRL1、CDRL2和CDRL3区氨基酸序列，其中每个CDR根据如本文所公开的CDR的Kabat、Chothia、IMGT、MacCallum或AbM定义独立地进行定义。
在某些实施例中，本公开提供了一种与ApoC3(例如，人ApoC3)特异性结合的分离的抗体(例如，人源化抗体)，所述抗体包括具有互补决定区CDRH1、CDRH2和CDRH3的重链可变区以及具有互补决定区CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区，其中：
(a)CDRH1包括氨基酸序列TYSMR(SEQ ID NO:3)；
(b)CDRH2包括氨基酸序列SIX1TX2X3GGTAYRDSVKG，其中X1是S或H，X2是G、E或D，并且X3是G或A(SEQ ID NO:93)；
(c)CDRH3包括氨基酸序列X4GYSD，其中X4是A或H(SEQ ID NO:5)；
(d)CDRL1包括氨基酸序列KTSQGLVHSX5GKTYFY，其中X5是D或G(SEQ ID NO:88)；
(e)CDRL2包括氨基酸序列QVSNRAS(SEQ ID NO:7)；并且
(f)CDRL3包括氨基酸序列AX6GTYYPHT，其中X6是Q或H(SEQ ID NO:8)，
并且其中X1、X4和X6中的至少一个是H。
在某些实施例中，CDRH2包括氨基酸序列SIHTGGGGTAYRDSVKG(SEQ ID NO:36)、SIHTEAGGTAYRDSVKG(SEQ ID NO:37)、SIHTDAGGTAYRDSVKG(SEQ ID NO:38)、SIHTEGGGTAYRDSVKG(SEQ ID NO:39)、SISTDGGGTAYRDSVKG(SEQ ID NO:9)或SIHTDGGGTAYRDSVKG(SEQ ID NO:11)。
在某些实施例中，CDRH3包括氨基酸序列AGYSD(SEQ ID NO:10)或HGYSD(SEQ IDNO:12)。
在某些实施例中，CDRL1包括氨基酸序列KTSQGLVHSDGKTYFY(SEQ ID NO:6)或KTSQGLVHSGGKTYFY(SEQ ID NO:40)。
在某些实施例中，CDRL3包括氨基酸序列AHGTYYPHT(SEQ ID NO:14)或AQGTYYPHT(SEQ ID NO:13)。
在某些实施例中，本公开提供了一种与ApoC3(例如，人ApoC3)特异性结合的分离的抗体(例如，人源化抗体)，其中所述抗体包括VH结构域，所述VH结构域包括分别在SEQ IDNO:3、36和10；3、37和10；3、38和10；3、39和10；3、9和10；3、11和10；3、9和12；或3、11和12中示出的CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列。
在某些实施例中，本公开提供了一种与ApoC3(例如，人ApoC3)特异性结合的分离的抗体，其中所述抗体包括VL结构域，所述VL结构域包括分别在SEQ ID NO:6、7和14；40、7和14；40、7和13；或6、7和13中示出的CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列。
在某些实施例中，本公开提供了一种与ApoC3(例如，人ApoC3)特异性结合的分离的抗体(例如，人源化抗体)，所述分离的抗体包括重链可变区，所述重链可变区包括与SEQID NO:42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、15、16、17或18中所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％或100％(例如，至少86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％)同一性的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO:42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、15、16、17或18中所示的氨基酸序列。
在某些实施例中，本公开提供了一种与ApoC3(例如，人ApoC3)特异性结合的分离的抗体(例如，人源化抗体)，所述分离的抗体包括轻链可变区，所述轻链可变区包括与SEQID NO:54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、19或20中所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％或100％(例如，至少86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％)同一性的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、19或20中所示的氨基酸序列。
在某些实施例中，本公开提供了一种与ApoC3(例如，人ApoC3)特异性结合的分离的抗体(例如，人源化抗体)，所述分离的抗体包括重链可变区，所述重链可变区包括与SEQID NO:42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、15、16、17或18中所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％或100％(例如，至少86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％)同一性的氨基酸序列，以及轻链可变区，所述轻链可变区包括与SEQ IDNO:54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、19或20中所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％或100％(例如，至少86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％)同一性的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO:42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、15、16、17或18中所示的氨基酸序列，以及轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、19或20中所示的氨基酸序列。
在某些实施例中，本公开提供了一种与ApoC3(例如，人ApoC3)特异性结合的分离的抗体(例如，人源化抗体)，所述抗体包括具有互补决定区CDRH1、CDRH2和CDRH3的重链可变区以及具有互补决定区CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区，其中：
(a)CDRH1包括氨基酸序列TYSMR(SEQ ID NO:3)；
(b)CDRH2包括氨基酸序列SIHTX1X2GGTAYRDSVKG，其中X1是G、E或D，并且X2是G或A(SEQ ID NO:87)；
(c)CDRH3包括氨基酸序列AGYSD(SEQ ID NO:10)；
(d)CDRL1包括氨基酸序列KTSQGLVHSXGKTYFY，其中X是D或G(SEQ ID NO:88)；
(e)CDRL2包括氨基酸序列QVSNRAS(SEQ ID NO:7)；并且
(f)CDRL3包括氨基酸序列AXGTYYPHT，其中X是Q或H(SEQ ID NO:8)。
在某些实施例中，本公开提供了一种与ApoC3(例如，人ApoC3)特异性结合的分离的抗体(例如，人源化抗体)，所述抗体包括具有互补决定区CDRH1、CDRH2和CDRH3的重链可变区以及具有互补决定区CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区，其中：
(a)CDRH1包括氨基酸序列TYSMR(SEQ ID NO:3)；
(b)CDRH2包括氨基酸序列SIHTGGGGTAYRDSVKG(SEQ ID NO:36)、SIHTEAGGTAYRDSVKG(SEQ ID NO:37)、SIHTDAGGTAYRDSVKG(SEQ ID NO:38)或SIHTEGGGTAYRDSVKG(SEQ ID NO:39)；
(c)CDRH3包括氨基酸序列AGYSD(SEQ ID NO:10)；
(d)CDRL1包括氨基酸序列KTSQGLVHSDGKTYFY(SEQ ID NO:6)或KTSQGLVHSGGKTYFY(SEQ ID NO:40)；
(e)CDRL2包括氨基酸序列QVSNRAS(SEQ ID NO:7)；并且
(f)CDRL3包括氨基酸序列AHGTYYPHT(SEQ ID NO:14)或AQGTYYPHT(SEQ ID NO:13)。
在某些实施例中，CDRH2包括氨基酸序列SIHTGGGGTAYRDSVKG(SEQ ID NO:36)、SIHTEAGGTAYRDSVKG(SEQ ID NO:37)、SIHTDAGGTAYRDSVKG(SEQ ID NO:38)或SIHTEGGGTAYRDSVKG(SEQ ID NO:39)。在某些实施例中，CDRH2包括氨基酸序列SIHTGGGGTAYRDSVKG(SEQ ID NO:36)、SIHTEAGGTAYRDSVKG(SEQ ID NO:37)或SIHTDAGGTAYRDSVKG(SEQ ID NO:38)。在某些实施例中，CDRH2包括氨基酸序列SIHTGGGGTAYRDSVKG(SEQ ID NO:36)。在某些实施例中，CDRH2包括氨基酸序列SIHTEAGGTAYRDSVKG(SEQ ID NO:37)。在某些实施例中，CDRH2包括氨基酸序列SIHTDAGGTAYRDSVKG(SEQ ID NO:38)。在某些实施例中，CDRH2包括氨基酸序列SIHTEGGGTAYRDSVKG(SEQ ID NO:39)。
在某些实施例中，CDRL1包括氨基酸序列KTSQGLVHSDGKTYFY(SEQ ID NO:6)或KTSQGLVHSGGKTYFY(SEQ ID NO:40)。在某些实施例中，CDRL1包括氨基酸序列KTSQGLVHSDGKTYFY(SEQ ID NO:6)。在某些实施例中，CDRL1包括氨基酸序列KTSQGLVHSGGKTYFY(SEQ ID NO:40)。
在某些实施例中，CDRL3包括氨基酸序列AHGTYYPHT(SEQ ID NO:14)或AQGTYYPHT(SEQ ID NO:13)。在某些实施例中，CDRL3包括氨基酸序列AHGTYYPHT(SEQ ID NO:14)。在某些实施例中，CDRL3包括氨基酸序列AQGTYYPHT(SEQ ID NO:13)。
在某些实施例中，本公开提供了一种与ApoC3(例如，人ApoC3)特异性结合的分离的抗体(例如，人源化抗体)，其中所述抗体包括VH结构域，所述VH结构域包括分别在SEQ IDNO:3、36和10；3、37和10；3、38和10；或3、39和10中示出的CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列。在某些实施例中，所述VH结构域包括分别在SEQ ID NO:3、36和10中示出的CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列。在某些实施例中，所述VH结构域包括分别在SEQ ID NO:3、37和10中示出的CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列。在某些实施例中，所述VH结构域包括分别在SEQ IDNO:3、38和10中示出的CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列。
在某些实施例中，本公开提供了一种与ApoC3(例如，人ApoC3)特异性结合的分离的抗体，其中所述抗体包括VL结构域，所述VL结构域包括分别在SEQ ID NO:6、7和14；40、7和14；或40、7和13中示出的CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列。在某些实施例中，所述VL结构域包括分别在SEQ ID NO:6、7和14中示出的CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列。在某些实施例中，所述VL结构域包括分别在SEQ ID NO:40、7和14中示出的CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列。
在某些实施例中，本公开提供了一种与ApoC3(例如，人ApoC3)特异性结合的分离的抗体(例如，人源化抗体)，其中所述抗体包含包括CDRH1、CDRH2和CDRH3区的重链可变区以及包括CDRL1、CDRL2和CDRL3区的轻链可变区，其中所述CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3区分别包括SEQ ID NO:3、36、10、6、7和14；3、37、10、40、7和14；3、38、10、40、7和14；3、39、10、6、7和14；3、37、10、40、7和13；或3、38、10、40、7和13中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3区分别包括SEQ ID NO:3、36、10、6、7和14中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3区分别包括SEQ ID NO:3、37、10、40、7和14中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3区分别包括SEQ ID NO:3、38、10、40、7和14中所示的氨基酸序列。
在某些实施例中，本公开提供了一种与ApoC3(例如，人ApoC3)特异性结合的分离的抗体(例如，人源化抗体)，所述分离的抗体包括重链可变区，所述重链可变区包括与SEQID NO:42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、89或90中所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％或100％(例如，至少86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％)同一性的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO:42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、89或90中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO:42中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括重链可变区，所述重链可变区具有SEQ IDNO:43中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO:44中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO:45中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO:46中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO:47中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO:48中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO:49中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO:50中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO:51中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO:52中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO:53中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO:89中所示的氨基酸序列，任选地，其中所述重链可变区不包括SEQ ID NO:15、16、17或18中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO:90中所示的氨基酸序列，任选地，其中所述重链可变区不包括SEQ ID NO:15、16、17或18中所示的氨基酸序列。
在某些实施例中，本公开提供了一种与ApoC3(例如，人ApoC3)特异性结合的分离的抗体(例如，人源化抗体)，所述分离的抗体包括轻链可变区，所述轻链可变区包括与SEQID NO:54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、91或92中所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％或100％(例如，至少86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％)同一性的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、91或92中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:54中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQ IDNO:55中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:56中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:57中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:58中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:59中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:60中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:61中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:62中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:63中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:64中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:65中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:91中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:92中所示的氨基酸序列。
在某些实施例中，本公开提供了一种与ApoC3(例如，人ApoC3)特异性结合的分离的抗体(例如，人源化抗体)，所述分离的抗体包括重链可变区，所述重链可变区包括与SEQID NO:42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、89或90中所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％或100％(例如，至少86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％)同一性的氨基酸序列，以及轻链可变区，所述轻链可变区包括与SEQ ID NO:54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、91或92中所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％或100％(例如，至少86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％)同一性的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO:42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、89或90中所示的氨基酸序列，以及轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、91或92中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:42和54、43和55、44和56、45和57、46和58、46和54、47和58、47和54、48和58、48和54、49和59、49和60，50和59、50和60、51和61、52和62、53和62、43和63、44和64、45和65、89和91或90和92中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:42和54中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:43和55中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区分别具有SEQID NO:44和56中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:45和57中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:46和58中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:46和54中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:47和58中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:47和54中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:48和58中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:48和54中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:49和59中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区分别具有SEQID NO:49和60中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:50和59中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:50和60中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:51和61中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:52和62中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:53和62中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:43和63中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:44和64中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:45和65中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区分别具有SEQID NO:89和91中所示的氨基酸序列，任选地，其中所述重链可变区不包括SEQ ID NO:15、16、17或18中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:90和92中所示的氨基酸序列，任选地，其中所述重链可变区不包括SEQ ID NO:15、16、17或18中所示的氨基酸序列。
在某些实施例中，本公开提供了一种与ApoC3(例如，人ApoC3)特异性结合的分离的抗体，所述抗体包括具有互补决定区CDRH1、CDRH2和CDRH3的重链可变区以及具有互补决定区CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区，并且其中：
(a)所述CDRH1包括氨基酸序列TYSMR(SEQ ID NO:3)；
(b)所述CDRH2包括氨基酸序列SIX1TDGGGTAYRDSVKG，其中X1是S或H(SEQ ID NO:4)；
(c)所述CDRH3包括氨基酸序列X2GYSD，其中X2是A或H(SEQ ID NO:5)；
(d)所述CDRL1包括氨基酸序列KTSQGLVHSDGKTYFY(SEQ ID NO:6)；
(e)所述CDRL2包括氨基酸序列QVSNRAS(SEQ ID NO:7)；和/或
(f)所述CDRL3包括氨基酸序列AX3GTYYPHT，其中X3是Q或H(SEQ ID NO:8)。
在某些实施例中，本公开提供了一种与ApoC3(例如，人ApoC3)特异性结合的分离的抗体，所述抗体包括具有互补决定区CDRH1、CDRH2和CDRH3的重链可变区以及具有互补决定区CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区，并且其中：
(a)所述CDRH1包括氨基酸序列TYSMR(SEQ ID NO:3)；
(b)所述CDRH2包括氨基酸序列SIX1TDGGGTAYRDSVKG，其中X1是S或H(SEQ ID NO:4)；
(c)所述CDRH3包括氨基酸序列X2GYSD，其中X2是A或H(SEQ ID NO:5)；
(d)所述CDRL1包括氨基酸序列KTSQGLVHSDGKTYFY(SEQ ID NO:6)；
(e)所述CDRL2包括氨基酸序列QVSNRAS(SEQ ID NO:7)；并且
(f)所述CDRL3包括氨基酸序列AX3GTYYPHT，其中X3是Q或H(SEQID NO:8)，
并且其中X1、X2和X3中的至少一个是H。
在某些实施例中，本公开提供了一种与ApoC3(例如，人ApoC3)特异性结合的分离的抗体，所述抗体包括：
(a)CDRH1，其包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列；
(b)CDRH2，其包括SEQ ID NO:9或11的氨基酸序列；
(c)CDRH3，其包括SEQ ID NO:10或12的氨基酸序列；
(d)CDRL1，其包括SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)CDRL2，其包括SEQ ID NO:7的氨基酸序列；和/或
(f)CDRL3，其包括SEQ ID NO:13或14的氨基酸序列。
在某些实施例中，本公开提供了一种与ApoC3(例如，人ApoC3)特异性结合的分离的抗体，所述抗体包括：
(a)CDRH1，其包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列；
(b)CDRH2，其包括SEQ ID NO:9或11的氨基酸序列；
(c)CDRH3，其包括SEQ ID NO:10或12的氨基酸序列；
(d)CDRL1，其包括SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)CDRL2，其包括SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及
(f)CDRL3，其包括SEQ ID NO:13或14的氨基酸序列，
并且其中所述分离的抗体不包括分别在SEQ ID NO:3、9、10、6、7和13中示出的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3序列。
在某些实施例中，本公开提供了一种与ApoC3(例如，人ApoC3)特异性结合的分离的抗体，其中所述抗体包括VH结构域，所述VH结构域包括分别在SEQ ID NO:3、9和10；3、11和10；3、9和12；或3、11和12中示出的CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列。在某些实施例中，所述VH结构域包括分别在SEQ ID NO:3、11和10中示出的CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列。在某些实施例中，所述VH结构域包括分别在SEQ ID NO:3、9和12中示出的CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列。在某些实施例中，所述VH结构域包括分别在SEQ ID NO:3、11和12中示出的CDRH1、CDRH2和CDRH3氨基酸序列。
在某些实施例中，本公开提供了一种与ApoC3(例如，人ApoC3)特异性结合的分离的抗体，其中所述抗体包括VL结构域，所述VL结构域包括分别在SEQ ID NO:6、7和13；或6、7和14中示出的CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列。在某些实施例中，所述VL结构域包括分别在SEQ ID NO:6、7和14中示出的CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列。
在某些实施例中，本公开提供了一种与ApoC3(例如，人ApoC3)特异性结合的分离的抗体，其中所述抗体包含包括CDRH1、CDRH2和CDRH3区的重链可变区以及包括CDRL1、CDRL2和CDRL3区的轻链可变区，其中所述CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3区分别包括SEQ ID NO:3、11、10、6、7和13；3、9、12、6、7和13；3、9、10、6、7和14；3、11、10、6、7和14；3、9、12、6、7和14；3、11、12、6、7和13；或3、11、12、6、7和13中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3区分别包括SEQ ID NO:3、11、10、6、7和14中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3区分别包括SEQ ID NO:3、9、12、6、7和14中所示的氨基酸序列。
在某些实施例中，本公开提供了一种与ApoC3(例如，人ApoC3)特异性结合的分离的抗体，所述分离的抗体包括重链可变区，所述重链可变区包括与SEQ ID NO:15、16、17或18中所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％或100％(例如，至少86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％)同一性的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO:15、16、17或18中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO:16中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括重链可变区，所述重链可变区具有SEQ IDNO:17中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列。
在某些实施例中，本公开提供了一种与ApoC3(例如，人ApoC3)特异性结合的分离的抗体，所述分离的抗体包括轻链可变区，所述轻链可变区包括与SEQ ID NO:19或20中所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％或100％(例如，至少86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％)同一性的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列。
在某些实施例中，本公开提供了一种与ApoC3(例如，人ApoC3)特异性结合的分离的抗体，所述分离的抗体包括重链可变区，所述重链可变区包括与SEQ ID NO:15、16、17或18中所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％或100％(例如，至少86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％)同一性的氨基酸序列，以及轻链可变区，所述轻链可变区包括与SEQ ID NO:19或20中所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％或100％(例如，至少86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％)同一性的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括重链可变区，所述重链可变区具有SEQ IDNO:15、16、17或18中所示的氨基酸序列，以及轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:19或20中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:16和19、17和19、18和19、15和20、16和20、17和20或18和20中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:16和20中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:17和20中所示的氨基酸序列。
本文所公开的分离的抗体可以使用任何Ig恒定区。在某些实施例中，Ig恒定区是人IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY免疫球蛋白(Ig)分子的恒定区，和/或任何类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或任何亚类(例如，IgG2a和IgG2b)的免疫球蛋白分子的恒定区。在某些实施例中，Ig恒定区是人或人源化Ig恒定区。
在某些实施例中，恒定区是野生型人Ig(例如，IgG)重链恒定区的变体，并且其中相对于酸性pH(例如，pH 5.5到pH 6)下相应野生型人Ig重链恒定区对人新生儿Fc受体(FcRn)的亲和力，在相同条件下所述变体人Ig重链恒定区对人FcRn具有增加的亲和力(例如，增加至少1.5、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20倍)。在某些实施例中，相对于生理pH(例如，pH 7.4)下野生型人Ig重链恒定区对人新生儿Fc受体(FcRn)的亲和力，在相同条件下所述变体人Ig重链恒定区对人FcRn具有相似或降低的亲和力(例如，增加不超过1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2倍，或减少)。在某些实施例中，所述恒定区包括来自野生型Ig(例如，IgG)恒定结构域或其FcRn结合片段(例如，Fc或铰链Fc结构域片段)的一个、两个或更多个氨基酸(例如，具有一个或多个取代、插入或缺失)。在某些实施例中，具有变体恒定区的抗体在体内的半衰期相对于具有野生型恒定结构域或其FcRn结合片段的相应抗体在体内的半衰期增加。将增加抗体体内半衰期的突变的实例参见例如，国际公开号WO 02/060919；WO 98/23289；和WO 97/34631；以及美国专利第5,869,046号、第6,121,022号、第6,277,375号、第6,165,745号、第8,088,376号和第8,163,881号，所述文献均通过引用整体并入本文。在某些实施例中，一个或多个不同氨基酸位于第二恒定(CH2)结构域(人IgG1的残基231-340)和/或第三恒定(CH3)结构域(人IgG1的残基341-447)中，根据EU编号系统进行编号。在某些实施例中，本文所公开的抗体的IgG(例如，IgG1、IgG2或IgG4)的恒定区包括分别位于位置252、254和256处的氨基酸酪氨酸(Y)苏氨酸(T)和谷氨酸(E)，根据EU编号系统进行编号。参见美国专利第7,658,921号，所述美国专利通过引用整体并入本文。与相同抗体的野生型相比，已显示这种类型的IgG(被称为“YTE IgG”)表现出四倍延长的半衰期(参见Dall'Acqua WF等人,(2006)《生物化学杂志》281:23514-24，其通过引用整体并入本文)。在某些实施例中，本文所公开的抗体的IgG(例如，IgG1)的恒定区包括位置434处的氨基酸丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、酪氨酸(Y)或苯丙氨酸(F)，根据EU编号系统进行编号。在某些实施例中，本文所公开的抗体的IgG(例如，IgG1、IgG2或IgG4)的恒定区包括分别位于位置433、434和436处的氨基酸赖氨酸(K)、苯丙氨酸(F)和酪氨酸(Y)，根据EU编号系统进行编号。在某些实施例中，本文所公开的抗体的IgG(例如，IgG1、IgG2或IgG4)的恒定区包括分别位于位置428和434处的氨基酸亮氨酸(L)和丝氨酸(S)，根据EU编号系统进行编号。以下文献中描述了在酸性条件下对FcRn的亲和力可能增加的另外的IgG恒定区：Ward等人,《分子免疫学(Mol.Immunol.)》(2015)67(200):131-41，所述文献通过引用整体并入本文。在某些实施例中，抗体包括IgG恒定结构域，所述IgG恒定结构域包括位置251-257、285-290、308-314、385-389和428-436处的氨基酸残基的一个、两个、三个或更多个氨基酸取代，根据EU编号系统进行编号。在某些实施例中，本文所公开的分离的抗体包括重链恒定区，所述重链恒定区包括SEQ ID NO:21、22、23、24、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85或86中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，本文所公开的分离的抗体包括轻链恒定区，所述轻链恒定区包括SEQ ID NO:25或26中所示的氨基酸序列。
在某些实施例中，本公开提供了一种与ApoC3(例如，人ApoC3)特异性结合的分离的抗体，所述分离的抗体包括重链，所述重链包括SEQ ID NO:66、67、68、69、70、71、72或73中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，本公开提供了一种与ApoC3(例如，人ApoC3)特异性结合的分离的抗体，所述分离的抗体包括轻链，所述轻链包括SEQ ID NO:74中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，本公开提供了一种与ApoC3(例如，人ApoC3)特异性结合的分离的抗体，所述分离的抗体包括重链和轻链，所述重链和轻链分别包括SEQ ID NO:66和74、67和74、68和74、69和74、70和74、71和74、72和74或73和74中所示的氨基酸序列。
在某些实施例中，本公开提供了一种与ApoC3(例如，人ApoC3)特异性结合的分离的抗体，所述分离的抗体包括重链，所述重链包括SEQ ID NO:27、28、29、30、31、32、33或34中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，本公开提供了一种与ApoC3(例如，人ApoC3)特异性结合的分离的抗体，所述分离的抗体包括轻链，所述轻链包括SEQ ID NO:35中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，本公开提供了一种与ApoC3(例如，人ApoC3)特异性结合的分离的抗体，所述分离的抗体包括重链和轻链，所述重链和轻链分别包括SEQ ID NO:27和35、28和35、29和35、30和35、31和35、32和35、33和35或34和35中所示的氨基酸序列。
3.使用方法
ApoC3抑制肝细胞对TRL(例如，VLDL)和TRL残余物的摄取和清除，并抑制脂蛋白脂肪酶介导的TRL(例如，VLDL)的脂解，从而起到增加受试者血液中的甘油三酯水平的作用。在某些实施例中，本文所公开的抗ApoC3抗体可以减弱ApoC3抑制肝细胞摄取和清除TRL(例如，VLDL)和TRL残余物的能力，或者减弱ApoC3抑制脂蛋白脂肪酶介导的TRL(例如，VLDL)脂解的能力。因此，在某些实施例中，本公开提供了一种用于抑制受试者血液中ApoC3活性的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所公开的抗ApoC3抗体或药物组合物。在某些实施例中，ApoC3活性是抑制肝细胞对TRL(例如，VLDL)和TRL残余物的摄取和清除。在某些实施例中，ApoC3活性是抑制脂蛋白脂肪酶介导的TRL脂解。在某些实施例中，ApoC3活性是抑制肝细胞对TRL(例如，VLDL)和TRL残余物的摄取和清除，以及抑制脂蛋白脂肪酶介导的TRL脂解。
本文所公开的抗ApoC3抗体可用于增加受试者血液中ApoC3和/或ApoB(例如，ApoB48和/或ApoB100)的清除率。因此，在某些实施例中，本公开提供了一种用于增加受试者血液中ApoC3和/或ApoB(例如，ApoB48和/或ApoB100)的清除率的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所公开的抗ApoC3抗体或药物组合物。
本文所公开的抗ApoC3抗体可用于降低受试者血液中ApoC3和/或ApoB(例如，ApoB48和/或ApoB100)的水平。因此，在某些实施例中，本公开提供了一种用于降低受试者血液中ApoC3和/或ApoB(例如，ApoB48和/或ApoB100)的水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所公开的抗ApoC3抗体或药物组合物。在某些实施例中，所述方法将受试者血液中ApoC3和/或ApoB(例如，ApoB48和/或ApoB100)的水平降低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，如通过本文所公开的方法或通过本领域技术人员已知的方法所评估的。在某些实施例中，所述方法将受试者血液中ApoC3和/或ApoB(例如，ApoB48和/或ApoB100)的水平降低至少约1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，如通过本文公开的方法或通过本领域技术人员已知的方法所评估的。在某些实施例中，受试者血液中ApoC3和/或ApoB(例如，ApoB48和/或ApoB100)水平的降低维持至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天、30天、35天、40天、45天或50天，或至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周。
本文所公开的抗ApoC3抗体可用于降低受试者血液中的甘油三酯水平。因此，在某些实施例中，本公开提供了一种用于降低受试者血液中的甘油三酯水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所公开的抗ApoC3抗体或药物组合物。
本文所公开的抗ApoC3抗体可用于治疗高甘油三酯血症。因此，在某些实施例中，本公开提供了一种用于治疗受试者的高甘油三酯血症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所公开的抗ApoC3抗体或药物组合物。在某些实施例中，本公开提供了一种用于治疗受试者的乳糜微粒血症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所公开的抗ApoC3抗体或药物组合物。在某些实施例中，本公开提供了一种用于治疗受试者的乳糜微粒血症综合征的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所公开的抗ApoC3抗体或药物组合物。
本文所公开的抗ApoC3抗体可用于治疗和预防受试者的餐后血脂。因此，在某些实施例中，本公开提供了一种用于抑制受试者的餐后血脂的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所公开的抗ApoC3抗体或药物组合物。可以在饭前、饭中或饭后将抗ApoC3抗体施用于受试者。
不希望受到理论的束缚，申请人相信，在某些实施例中，当在饭前、饭中或饭后施用于受试者时，本文所公开的抗体能够降低受试者的餐后乳糜微粒或乳糜微粒残留物的水平。因此，在某些实施例中，本公开提供了一种用于降低受试者的餐后乳糜微粒或乳糜微粒残余物的水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所公开的抗ApoC3抗体或药物组合物。可以在饭前、饭中或饭后将抗ApoC3抗体施用于受试者。
高甘油三酯血症患者血液中甘油三酯水平的降低可以降低患胰腺炎的风险。因此，在某些实施例中，本公开提供了一种用于降低患有高甘油三酯血症的受试者患胰腺炎的风险的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所公开的抗ApoC3抗体或药物组合物
本文所公开的抗ApoC3抗体可用于降低受试者患心血管疾病的风险。因此，在某些实施例中，本公开提供了一种用于降低患有高甘油三酯血症的受试者患心血管疾病的风险的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所公开的抗ApoC3抗体或药物组合物。通过施用本文所公开的抗ApoC3抗体或药物组合物，可以降低患与高甘油三酯血症或过多的餐后血脂相关或由其引起的任何心血管疾病的风险。可以降低风险的心血管疾病包含但不限于冠状动脉疾病、动脉粥样硬化、心绞痛、心肌梗塞和中风。
本文所公开的抗ApoC3抗体或药物组合物可以单独施用或与另外的治疗剂一起组合施用。在某些实施例中，所述另外的治疗剂是另一种降脂剂。任何一种或多种降脂剂可以与本文所公开的抗ApoC3抗体或药物组合物一起组合使用。合适的降脂剂包含但不限于HMG-CoA还原酶抑制剂(例如，阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀或辛伐他汀)、贝特类、烟酸，胆汁酸螯合剂(例如，考来烯胺(cholestyramine)和考来替泊(colestipol)和考来维仑(colesevelam))、膳食胆固醇吸收抑制剂(例如，依泽替米贝)、微粒体甘油三酯转移蛋白(MTP)抑制剂(例如，洛美他派(lomitapide))、植物甾醇、胰脂肪酶抑制剂(例如，奥利司他(orlistat))、胆固醇酯转移蛋白抑制剂、角鲨烯合酶抑制剂(例如，TAK-475、萨拉哥酸(zaragozic acid)和RPR 107393)、ApoA-1Milano、琥珀布可(succinobucol)(AGI-1067)、血清载脂蛋白-B抑制剂(例如，米泊美生(Mipomersen))和前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型(PCSK9)抑制剂(例如，阿利库单抗、依洛尤单抗和博科西单抗)。在某些实施例中，所述另外的降脂剂是依泽替米贝和HMG-CoA还原酶抑制剂的组合。在某些实施例中，所述降脂剂是依泽替米贝、HMG-CoA还原酶抑制剂和PCSK9抑制剂的组合。
可以通过多种途径将本文所公开的抗ApoC3抗体或药物组合物递送至受试者。这些途径包含但不限于肠胃外、皮内、肌内、腹膜内、静脉内和皮下途径。在某些实施例中，皮下或静脉内递送本文所公开的抗体或药物组合物。
将在治疗或预防病症中有效的本文所公开的抗ApoC3抗体或药物组合物的量将取决于疾病的性质，并且可以通过标准临床技术凭经验确定。组合物中采用的精确剂量还将取决于施用途径和由其造成的感染或疾病的严重性，并且应当根据从业者的判断和各个受试者的情况决定。例如，有效剂量还可以根据施用方式、目标部位、患者的生理状态(包含年龄、体重和健康)、患者是人类还是动物、施用的其它药物或治疗是预防性的还是治疗性的而变化。可以任何频率(例如，大约每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次或每两个月一次)施用本文所公开的抗ApoC3抗体或药物组合物。通常，患者是人类，但也可以治疗非人哺乳动物(包含转基因哺乳动物)。可以将治疗剂量和方案以最佳方式滴定，从而优化安全性和疗效。
本文所公开的抗ApoC3抗体也可以用于使用本领域技术人员已知的经典免疫组织学方法来测定生物样品中的ApoC3(例如，人ApoC3)蛋白水平，所述经典免疫组织学方法包含免疫测定，如酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫沉淀或蛋白质印迹。合适的抗体测定标记物是本领域中已知的，并且包含：酶标记物，如葡萄糖氧化酶；放射性同位素，如碘(125I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(121In)和锝(99Tc))；发光标记物，如鲁米诺；和荧光标记物，如荧光素和罗丹明；以及生物素。此类标记物可以用于标记本文所公开的抗体。可替代地，可以标记识别本文所公开的抗ApoC3抗体的第二抗体，并将所述第二抗体与抗ApoC3抗体组合使用，以检测ApoC3(例如，人ApoC3)蛋白水平。
测定ApoC3(例如，人ApoC3)蛋白的表达水平旨在包含直接(例如，通过确定或估计绝对蛋白水平)或相对地(例如，通过与第二生物样品中的疾病相关蛋白水平进行比较)对第一生物样品中的ApoC3(例如，人ApoC3)蛋白的水平进行定性或定量测量或估计。可以测量或估计第一生物样品中的ApoC3(例如，人ApoC3)多肽的表达水平并将其与标准ApoC3(例如，人ApoC3)蛋白水平进行比较，所述标准取自从未患病的个体获得的第二生物样品或通过对由未患病的个体群体的水平进行平均来确定。如本领域将理解的，一旦已知“标准”ApoC3(例如，人ApoC3)多肽水平，则可以将所述标准水平重复用作比较标准。
如本文所使用的，术语“生物样品”是指从潜在表达ApoC3(例如，人ApoC3)的受试者、细胞系、组织或其它细胞来源获得的任何生物样品。用于从动物(例如，人类)获得组织活检和体液的方法是本领域众所周知的。生物样品包含外周血单核细胞。
本文所公开的抗ApoC3抗体可以用于预后、诊断、监测和筛查应用，包含对于本领域技术人员而言众所周知和标准的并且基于本说明书的体外和体内应用。用于体外评估和评价免疫系统状态或免疫应答的预后、诊断、监测和筛查测定以及试剂盒可以用于预测、诊断并且监测以评估患者样本(包含已知具有或怀疑具有升高的ApoC3活性的患者样本)。在一实施例中，抗ApoC3抗体可以用于活检样品的免疫组织化学。在另一个实施例中，抗ApoC3抗体可以用于检测ApoC3(例如，人ApoC3)的水平，然后可以将所述水平与某些疾病症状相关。本文所公开的抗ApoC3抗体可以带有可检测的或功能性的标记物。当使用荧光标记物时，可以利用本领域中已知的目前可获得的显微镜检查法和荧光活化细胞分选器分析(FACS)或这两种方法程序的组合来鉴定和量化特异性结合成员。本文所公开的抗ApoC3抗体可以带有荧光标记物。示例性荧光标记物包含例如反应性和缀合探针，例如，氨基香豆素、荧光素及德克萨斯红、亚历克萨荧光染料、Cy染料以及DyLight染料。抗ApoC3抗体可以携带放射性标记物，如同位素3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、67Cu、90Y、99Tc、111In、117Lu、121I、124I、125I、131I、198Au、211At、213Bi、225Ac和186Re。当使用放射性标记物时，可以利用本领域中已知的目前可获得的计数程序来鉴定和量化抗ApoC3抗体与ApoC3(例如，人ApoC3)的特异性结合。在标记物是酶的情况下，可以如本领域中已知的通过目前利用的比色、分光光度、荧光分光光度、电流滴定或气体定量技术中的任何一种技术来完成检测。这可以通过在允许抗体与ApoC3(例如，人ApoC3)之间形成复合物的条件下使样品或对照样品与抗ApoC3抗体接触来实现。检测在抗体与ApoC3(例如，人ApoC3)之间形成的任何复合物，并将所述复合物在样品和对照中进行比较。本文所公开的抗体还可以用于通过免疫亲和纯化来纯化ApoC3(例如，人ApoC3)。本文还包含可以测试试剂盒的形式制备的测定系统，所述测定系统用于对例如ApoC3(例如，人ApoC3)的存在程度进行定量分析。所述系统或测试试剂盒可以包括带标记的组分(例如，带标记的ApoC3抗体)以及一种或多种另外的免疫化学试剂。
4.药物组合物
本文提供了药物组合物，所述药物组合物包括呈生理上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂形式的具有期望浓度的本文所公开的抗ApoC3抗体(《雷明登氏药学全书(Remington's Pharmaceutical Sciences)》(1990)麦克出版公司(Mack PublishingCo.),伊斯顿,宾夕法尼亚州)。可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在所用剂量和浓度下对接受者无毒，并且包含：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包含抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包含葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反离子，如钠；金属络合物(例如，锌-蛋白络合物)；或非离子表面活性剂，如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
在具体实施例中，药物组合物包括本文所公开的抗ApoC3抗体，以及任选的一种或多种另外的预防剂或治疗剂(呈药学上可接受的载剂形式)。在具体实施例中，药物组合物包括有效量的本文所公开的抗体，以及任选的一种或多种另外的预防剂或治疗剂(呈药学上可接受的载剂形式)。在一些实施例中，所述抗体是药物组合物中包含的唯一活性成分。本文所公开的药物组合物可用于抑制ApoC3活性和治疗如癌症或传染病等病症。
在肠胃外制剂中使用的药学上可接受的载剂包含水性媒剂、非水性媒剂、抗微生物剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、局部麻醉剂、悬浮剂和分散剂、乳化剂、隔绝剂或螯合剂以及其它药学上可接受的物质。水性媒剂的实例含氯化钠注射剂、林格注射剂、等渗右旋糖注射剂、无菌水注射剂、右旋糖和乳酸林格注射剂。非水性肠胃外媒剂包含植物来源的不挥发性油(fixed oil)、棉籽油、玉米油、芝麻油和花生油。可以将抗菌或抑菌浓度的抗微生物剂添加到以多剂量容器形式包装的肠胃外制剂中，所述多剂量容器包含苯酚或甲酚、汞、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯扎氯铵和苄索氯铵。等渗剂包含氯化钠和葡萄糖。缓冲剂包含磷酸盐和柠檬酸盐。抗氧化剂包含硫酸氢钠。局部麻醉剂包含盐酸普鲁卡因。悬浮剂和分散剂包含羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。乳化剂包含聚山梨酯80(
Figure BDA0002475284060000601
80)。金属离子的隔绝剂或螯合剂包含EDTA。药物载剂还包含用于水溶性媒剂的乙醇、聚乙二醇和丙二醇；以及用于pH调节的氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。
可以针对受试者的任何施用途径配制药物组合物。施用途径的具体实例包含鼻内、口服、肺、透皮、皮内和肠胃外。本文还考虑了以皮下、肌内或静脉内注射为特征的肠胃外施用。可以以常规形式(液体溶液或悬浮液、适于在注射前溶解或悬浮于液体中的固体形式或乳剂形式)制备注射剂。注射剂、溶液和乳剂也含有一种或多种赋形剂。合适的赋形剂例如为水、盐水、右旋糖、甘油或乙醇。另外，如果需要，待施用的药物组合物还以可含有少量的无毒辅助物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂、增溶剂和其它此类试剂(如例如，醋酸钠、脱水山梨糖醇单月桂酸酯，三乙醇胺油酸酯和环糊精)。
用于肠胃外施用抗体的制剂包含准备注射的无菌溶液、准备在使用前与溶剂组合的无菌干燥可溶性产品(如冻干粉末，包含皮下注射片剂)、准备注射的无菌悬浮液、准备在使用前与媒剂混合的无菌干燥的不溶性产品以及无菌乳剂。溶液可以是水性或非水性的。
如果静脉内施用，则合适的载剂包含生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)，以及含有增稠剂和增溶剂的溶液，如葡萄糖、聚乙二醇、聚丙二醇及其混合物等。
如针对局部和全身施用所述的那样制备包括抗体的局部混合物。所得混合物可以是溶液、悬浮液、乳剂等，并且可以被配制成乳膏、凝胶、软膏、乳剂、溶液、酏剂、洗剂、悬浮液、酊剂、糊剂、泡沫、气雾剂、冲洗液、喷雾剂、栓剂、绷带、皮肤贴剂或任何其它适合于局部施用的调配物。
可以将本文所公开的抗ApoC3抗体配制成用于局部应用(如通过吸入)的气雾剂(参见例如美国专利第4,044,126号、第4,414,209号和第4,364,923号，所述专利描述了用于递送用于治疗炎性疾病(尤其是哮喘)的类固醇的气雾剂)。这些用于呼吸道施用的调配物可以呈雾化器的气雾剂形式或溶液形式，或者呈用于吹入的微细粉形式，所述形式单独使用或与惰性载剂(如乳糖)组合使用。在这种情况下，调配物的颗粒的直径在一个实施例中小于50微米，在一个实施例中小于10微米。
可以将本文所公开的抗ApoC3抗体配制成用于局部或局部施用，如以凝胶、乳膏和洗剂的形式用于皮肤和粘膜(如眼睛)的局部施用，并用于眼部应用或用于颅内或脊柱内应用。考虑了用于透皮递送以及用于眼睛或粘膜施用或用于吸入疗法的局部施用。也可以施用单独抗体或所述抗体与其它药学上可接受的赋形剂的组合的鼻溶液。
透皮贴剂(包含离子电渗疗法和电泳装置)是本领域技术人员众所周知的，并且可以用于施用抗体。例如，在美国专利第6,267,983号、第6,261,595号、第6,256,533号、第6,167,301号、第6,024,975号、第6,010715号、第5,985,317号、第5,983,134号、第5,948,433号和第5,860,957号中公开了这种贴剂。
在某些实施例中，包括本文所公开的抗体的药物组合物是冻干粉末，可以重构所述冻干粉末，从而以溶液、乳剂和其它混合物的形式进行施用。也可以将所述冻干粉末重构并配制成固体或凝胶形式。通过将本文所公开的抗体或其药学上可接受的衍生物溶解在合适的溶剂中来制备冻干粉末。在一些实施例中，冻干粉末是无菌的。溶剂可以含有赋形剂，所述赋形剂可改善粉末或由粉末制备的重构溶液的稳定性或其它药理学成分。可以使用的赋形剂包含但不限于葡萄糖、山梨糖醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其它合适的试剂。溶剂还可以含有缓冲剂，如柠檬酸盐、磷酸钠或磷酸钾或本领域技术人员已知的其它此类缓冲剂，在一个实施例中，所述缓冲剂为中性pH。随后对溶液进行无菌过滤，然后在本领域技术人员已知的标准条件下冻干，从而提供期望的调配物。在一实施例中，将所得溶液分配到小瓶中以冻干。每个小瓶将含有单剂量或多剂量的化合物。可以在适当的条件下(如在约4℃至室温下)储存冻干粉末。用注射用水将所述冻干粉末复溶，从而提供用于肠胃外施用的调配物。为了进行重构，将冻干粉末添加到无菌水或其它合适的载剂中。精确量取决于所选的化合物。可以凭经验确定该量。
还可以将本文所公开的抗ApoC3抗体和本文提供的其它组合物配制成靶向待治疗受试者的特定组织、受体或身体的其它区域。许多此类靶向方法是本领域技术人员众所周知的。本文考虑了本发明组合物中使用的所有此类靶向方法。对于靶向方法的非限制性实例，参见例如美国专利第6,316,652号、第6,274,552号、第6,271,359号、第6,253,872号、第6,139,865号、第6,131,570号、第6,120,751号、第6,071,495号、第6,060,082号、第6,048,736号、第6,039,975号、第6,004,534号、第5,985,307号、第5,972,366号、第5,900,252号、第5,840,674号、第5,759,542号和第5,709,874。
用于体内施用的组合物可以是无菌的。这通过例如无菌过滤膜过滤而容易地实现。
5.多核苷酸、载体和产生抗ApoC3抗体的方法
在另一方面，本文提供了包括对本文所公开的抗ApoC3抗体进行编码的核苷酸序列(例如，轻链可变区或重链可变区)的多核苷酸，以及载体，例如包括此类多核苷酸的用于在宿主细胞(例如，大肠杆菌和哺乳动物细胞)中重组表达的载体。
如本文所使用的，“分离的”多核苷酸或核酸分子是从核酸分子的天然来源(例如，小鼠或人类)中存在的其它核酸分子中分离出来的分子。此外，当通过重组技术产生时，“分离的”核酸分子(如cDNA分子)可以基本上不含其它细胞材料或培养基，或者当化学合成时，所述分子可以基本上不含化学前体或其它化学品。例如，术语“基本上不含”包含具有少于约15％、10％、5％、2％、1％、0.5％或0.1％(特别是少于约10％)的其它材料(例如，细胞材料、培养基、其它核酸分子、化学前体或其它化学品)的多核苷酸或核酸分子的制剂。在具体实施例中，分离或纯化对本文所公开的抗体进行编码的一个或多个核酸分子。
在特定方面，本文提供了包括对以下抗体进行编码的核苷酸序列的多核苷酸：与ApoC3(例如，人ApoC3)多肽特异性结合且包括本文所公开的氨基酸序列的抗体，以及与此类抗体争相结合ApoC3(例如，人ApoC3)多肽(例如，以剂量依赖性方式)的抗体，或结合到与此类抗体的表位相同的表位的抗体。
在某些方面，本文提供了包括对本文所公开的抗体的轻链或重链进行编码的核苷酸序列的多核苷酸。所述多核苷酸可以包括对本文所公开的抗体的VH、VL或CDR进行编码的核苷酸序列(参见例如本文的表1-4)。
本文还提供了对例如通过密码子/RNA优化、用异源信号序列替换以及消除mRNA不稳定元件而优化的抗ApoC3抗体进行编码的多核苷酸。因此，可以通过调整以下专利中所述的优化方法来实施通过在mRNA中引入密码子变化和/或消除抑制区来生成对抗ApoC3抗体(例如，轻链、重链、VH结构域或VL结构域)进行编码的用于重组表达的经优化的核酸的方法：例如，美国专利第5,965,726号；第6,174,666号；第6,291,664号；第6,414,132号；和第6,794,498号。例如，可以在不改变由核酸序列编码的氨基酸的情况下对RNA中的潜在剪接位点和不稳定元素(例如，富含A/T或A/U的元素)进行突变，以增加用于重组表达的RNA的稳定性。所述改变利用遗传密码的简并性，例如，对相同氨基酸使用替代密码子。在一些实施例中，可能期望改变一个或多个密码子以对保守突变(例如，具有与原始氨基酸类似的化学结构和性质或功能的氨基酸)进行编码。与由未经优化的多核苷酸编码的抗ApoC3抗体的表达相比，这种方法可以将抗ApoC3的表达增加至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、或100倍或更多。
在某些实施例中，对本文所公开的抗ApoC3抗体(例如，VL结构域或VH结构域)进行编码的经优化的多核苷酸序列可以与对本文所公开的抗ApoC3抗体(例如，VL结构域或VH结构域)进行编码的未经优化的多核苷酸序列的反义(例如，互补)多核苷酸杂交。在具体实施例中，对本文所公开的抗ApoC3抗体或片段进行编码的经优化的核苷酸序列在高严格性条件下与对本文所公开的抗ApoC3抗体进行编码的未经优化的多核苷酸序列的反义多核苷酸杂交。在具体实施例中，对本文所公开的抗ApoC3抗体进行编码的经优化的核苷酸序列在高严格性、中等或较低严格性杂交条件下与对本文所公开的抗ApoC3抗体进行编码的未经优化的核苷酸序列的反义多核苷酸杂交。已经描述了关于杂交条件的信息，参见例如美国专利申请第US 2005/0048549号(例如，第72-73段)，所述美国专利申请通过引用并入本文。
可以通过本领域中已知的任何方法获得多核苷酸并确定多核苷酸的核苷酸序列。可以使用本领域众所周知的方法来确定对本文所公开的抗体(例如，表1中描述的抗体以及这些抗体的经过修饰的版本)进行编码的核苷酸序列，即，以这种方式组装已知对特定氨基酸进行编码的核苷酸密码子，从而生成对抗体进行编码的核酸。对抗体进行编码的这种多核苷酸可以由化学合成的寡核苷酸组装而成(例如，如Kutmeier G等人,(1994),《生物技术(BioTechniques)》17:242-6中所述)，简言之，这涉及合成含有对抗体进行编码的序列的一部分的重叠寡核苷酸、对所述寡核苷酸进行退火和连接以及然后通过PCR对连接的寡核苷酸进行扩增。
可替代地，可以使用本领域众所周知的方法(例如，PCR和其它分子克隆方法)由来自合适来源(例如，杂交瘤)的核酸生成对本文所公开的抗体进行编码的多核苷酸。例如，可以使用从产生所关注抗体的杂交瘤细胞获得的基因组DNA来执行使用可与已知序列的3'端和5'端杂交的合成引物进行的PCR扩增。这种PCR扩增方法可以用于获得包括对抗体的轻链或重链进行编码的序列的核酸。这种PCR扩增方法可以用于获得包括对抗体的可变轻链区或可变重链区进行编码的序列的核酸。可以将扩增的核酸克隆到载体中以在宿主细胞中表达并进一步克隆，例如，从而生成嵌合抗体和人源化抗体。
如果无法获得含有对特定抗体进行编码的核酸的克隆子，但抗体分子的序列是已知的，则可以通过使用可与序列的3'端和5'端杂交的合成引物进行PCR扩增或通过使用特异于特定基因序列的寡核苷酸探针进行克隆来化学合成或从合适的来源(例如，抗体cDNA文库或由从表达所述抗体的任何组织或细胞(如被选择用于表达本文所公开的抗体的杂交瘤细胞)分离的核酸(优选为poly A+RNA)生成的cDNA文库)获得对免疫球蛋白进行编码的核酸，从而鉴定例如来自对所述抗体进行编码的cDNA文库的cDNA克隆子。然后可以使用本领域众所周知的任何方法将通过PCR生成的扩增的核酸克隆到可复制的克隆载体中。
可以使用常规程序(例如，通过使用能够与对抗ApoC3(例如，人ApoC3)抗体的重链和轻链进行编码的基因特异性结合的寡核苷酸探针)容易地分离和测序对本文所公开的抗ApoC3(例如，人ApoC3)抗体进行编码的DNA。杂交瘤细胞可以充当这种DNA的来源。一旦被分离，就可以将DNA置于表达载体中，然后将所述表达载体转染到不以其它方式产生疫球蛋白蛋白的宿主细胞中，如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(例如，来自CHO GS SystemTM(龙沙集团(Lonza))的CHO细胞)或骨髓瘤细胞中，以便在重组宿主中合成抗ApoC3(例如，人ApoC3)抗体。
为了生成完整抗体，可以使用包含VH或VL核苷酸序列、限制位点和保护所述限制位点的侧翼序列的PCR引物来扩增scFv克隆中的VH或VL序列。利用本领域技术人员已知的克隆技术，可以将PCR扩增的VH结构域克隆到表达重链恒定区(例如，人γ4恒定区)的载体中，并且可以将PCR扩增的VL结构域克隆到表达轻链恒定区(例如，人κ或λ恒定区)的载体中。在某些实施例中，用于表达VH或VL结构域的载体包括EF-1α启动子、分泌信号、可变区的克隆位点、恒定结构域和选择标志物(如新霉素)。也可以将VH和VL结构域克隆到表达必要恒定区的一个载体中。然后，使用本领域技术人员已知的技术将重链转化载体和轻链转化载体共转染到细胞系中，从而生成表达全长抗体(例如，IgG)的稳定或瞬时细胞系。
还可以通过以下方式修饰DNA：例如，用人重链和轻链恒定结构域的编码序列代替鼠序列，或使非免疫球蛋白多肽的编码序列的全部或一部分与免疫球蛋白编码序列共价连接。
还提供了在高严格性、中等或较低严格性杂交条件下与对本文所公开的抗体进行编码的多核苷酸杂交的多核苷酸。在具体实施例中，本文所公开的多核苷酸在高严格性、中等或较低严格性杂交条件下与对本文所提供的VH结构域或VL结构域进行编码的多核苷酸杂交。
杂交条件已经在本领域中描述，并且是本领域技术人员已知的。例如，严格条件下的杂交可以涉及在约45℃下在6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中与滤膜结合型DNA杂交，然后在约50-65℃下在0.2xSSC/0.1％SDS中洗涤一次或多次；高严格性条件下的杂交可以涉及在约45℃下在6xSSC中与滤膜结合型核酸杂交，然后在约68℃下在0.1xSSC/0.2％SDS中洗涤一次或多次。其它严格杂交条件下的杂交是本领域技术人员已知的并且已经被描述过，参见例如，Ausubel FM等人编,(1989),《当代分子生物学实验指南(Current Protocols inMolecular Biology)》,第I卷,纽约格林出版协会有限公司(Green PublishingAssociates,Inc.)与约翰威利父子出版公司(John Wiley&Sons,Inc.),第6.3.1-6.3.6和2.10.3页。
在某些方面，本文提供了表达(例如，重组地)与ApoC3(例如，人ApoC3)特异性结合的本文所公开的抗体的细胞(例如，宿主细胞)以及相关的多核苷酸和表达载体。本文提供了包括多核苷酸的用于在宿主细胞中(优选地在哺乳动物细胞中)重组表达的载体(例如，表达载体)，所述多核苷酸包括对抗ApoC3(例如，人ApoC3)抗体或片段进行编码的核苷酸序列。本文还提供了包括此类载体的宿主细胞，所述载体用于重组表达本文所公开的抗ApoC3(例如，人ApoC3)抗体(例如，人或人源化抗体)。在特定方面，本文提供了用于产生本文所公开的抗体的方法，所述方法包括从宿主细胞表达此类抗体。
与ApoC3(例如，人ApoC3)特异性结合的本文所公开的抗体(例如，全长抗体、抗体的重链或轻链或本文所公开的单链抗体)的重组表达涉及构建含有对所述抗体进行编码的多核苷酸的表达载体。一旦获得了对本文所公开的抗体分子、抗体的重链或轻链(例如，重链或轻链可变区)进行编码的多核苷酸，就可以使用本领域众所周知的技术通过重组DNA技术产生用于产生抗体分子的载体。因此，本文公开了用于通过表达含有对核苷酸序列进行编码的抗体或抗体片段(例如，轻链或重链)的多核苷酸来制备蛋白质的方法。可以使用本领域技术人员众所周知的方法构建含有抗体或抗体片段(例如，轻链或重链)编码序列的表达载体以及适当的转录和翻译控制信号。这些方法包含例如体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。还提供了可复制的载体，其包括可操纵地连接至启动子的对本文所公开的抗体分子、抗体的重链或轻链、抗体的重链或轻链可变区或重链或轻链CDR进行编码的核苷酸序列。此类载体可以例如包含对抗体分子的恒定区进行编码的核苷酸序列(参见例如，国际公开号WO 86/05807和WO 89/01036；以及美国专利第5,122,464号)，并且可以将抗体的可变区克隆到此类载体中，以表达整个重链、整个轻链或整个重链和轻链两者。
可以通过常规技术将表达载体转移至细胞(例如，宿主细胞)，然后可以通过常规技术培养所得细胞，从而产生本文所公开的抗体。因此，本文提供了宿主细胞，其含有可操作地连接至启动子以在宿主细胞中表达此类序列的对本文所公开的抗体、或其重链或轻链、或其片段或本文所公开的单链抗体进行编码的多核苷酸。在某些实施例中，为了表达双链抗体，可以在宿主细胞中共表达分别对重链和轻链进行编码的载体，从而表达整个免疫球蛋白分子，如下文中详细描述的。在某些实施例中，宿主细胞含有包括对本文所公开的抗体的重链和轻链两者进行编码的多核苷酸的载体。在具体实施例中，宿主细胞含有两种不同的载体，第一载体包括对本文所公开的抗体的重链或重链可变区或其片段进行编码的多核苷酸，而第二载体包括对本文所公开的轻链或轻链可变区或其片段进行编码的多核苷酸。在其它实施例中，第一宿主细胞包括第一载体，所述第一载体包括对本文所公开的抗体的重链或重链可变区或其片段进行编码的多核苷酸，而第二宿主细胞包括第二载体，所述第二载体包括对本文所公开的抗体的轻链或轻链可变区进行编码的多核苷酸。在具体实施例中，由第一细胞表达的重链/重链可变区与第二细胞的轻链/轻链可变区缔合，从而形成本文所公开的抗ApoC3抗体。在某些实施例中，本文提供了包括这种第一宿主细胞和这种第二宿主细胞的宿主细胞群。
在特定实施例中，本文提供了包括第一载体和第二载体的载体群，所述第一载体包括对本文所公开的抗ApoC3抗体的轻链/轻链可变区进行编码的多核苷酸，所述第二载体包括对本文所公开的抗ApoC3抗体的重链/重链可变区进行编码的多核苷酸。
可以利用各种宿主表达载体系统来表达本文所公开的抗体分子(参见例如，美国专利第5,807,715号)。这种宿主表达系统代表可以借以产生并随后纯化所关注的编码序列的媒剂，还代表在用适当的核苷酸编码序列转化或转染时可以原位表达本文所公开的抗体分子的细胞。这些系统包含但不限于微生物，如用含有抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)；用含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如，酿酒酵母(Saccharomyces)、毕赤酵母(Pichia))；被含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；被重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒(Chlamydomonas reinhardtii)CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染或用含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统(例如，绿藻，如莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii))；或包含重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如，COS(例如，COS1或COS)、CHO、BHK、MDCK、HEK 293、NS0、PER.C6、VERO、CRL7O3O、HsS78Bst、HeLa、和NIH3T3、HEK-293T、HepG2、SP210、R1.1、B-W、L-M、BSC1、BSC40、YB/20和BMT10细胞)，所述重组表达构建体含有源自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或源自哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)。在具体实施例中，用于表达本文所公开的抗体的细胞是CHO细胞，例如来自CHO GS SystemTM(龙沙集团)的CHO细胞。在特定实施例中，用于表达本文所公开的抗体的细胞是人细胞，例如，人细胞系。在具体实施例中，哺乳动物表达载体是pOptiVECTM或pcDNA3.3。在特定实施例中，特别是对于整个重组抗体分子的表达，使用如大肠杆菌等细菌细胞或真核细胞(例如，哺乳动物细胞)来表达重组抗体分子。例如，与载体(如来自人巨细胞病毒的主要中间早期基因启动子元件)连接的哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)是抗体的有效表达系统(Foecking MK和Hofstetter H(1986)《基因(Gene)》45:101-5；以及Cockett MI等人,(1990)《生物技术(Biotechnology)》8(7):662-7)。在某些实施例中，本文所公开的抗体由CHO细胞或NS0细胞产生。在具体实施例中，通过组成型启动子、诱导型启动子或组织特异性启动子调节对与ApoC3(例如，人ApoC3)特异性结合的本文所公开的抗体进行编码的核苷酸序列的表达。
在细菌系统中，根据被表达的抗体分子的预期用途，可以有利地选择许多表达载体。例如，当要产生大量这种抗体时，为了生成抗体分子的药物组合物，可能需要指导易于纯化的融合蛋白产物的高水平表达的载体。这种载体包含但不限于：大肠杆菌表达载体pUR278(Ruether U和Mueller-Hill B(1983)《欧洲分子生物学组织杂志(EMBO J)》2:1791-1794)，其中可以将抗体编码序列单独连接到与lac Z编码区使用相同读框的载体中，从而产生融合蛋白；pIN载体(Inouye S和Inouye M(1985)《核酸研究(Nuc Acids Res)》13:3101-3109；Van Heeke G和Schuster SM(1989)《生物化学杂志》24:5503-5509)；等。例如，pGEX载体还可以用于将外来多肽表达为具有谷胱甘肽5-转移酶(GST)的融合蛋白。一般来说，这种融合蛋白是可溶的并且可以通过以下步骤从溶解的细胞中容易地纯化：吸附并与基质谷胱甘肽琼脂糖珠结合，然后在存在游离谷胱甘肽存在的情况下洗脱。这些pGEX载体被设计成包含凝血酶或因子Xa蛋白酶裂解位点，从而使得克隆的靶基因产物可以从GST部分释放。
在昆虫系统中，例如可以将苜蓿银纹夜蛾(Autographacalifornica)核型多角体病毒(AcNPV)作为载体来表达外来基因。病毒在草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞中生长。可以将抗体编码序列单独地克隆到病毒的非必需区(例如多角体蛋白基因)中，并置于AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)的控制下。
在哺乳动物宿主细胞中，可以利用许多基于病毒的表达系统。在将腺病毒用作表达载体的情况下，可以将所关注的抗体编码序列与腺病毒转录/翻译控制复合物(例如，晚期启动子和三联前导序列)连接。然后可以通过体外或体内重组将这个嵌合基因插入到腺病毒基因组中。插入到病毒基因组的非必需区(例如，El或E3区)将产生可存活并且能够在受感染的宿主中表达抗体分子的重组病毒(例如，参见Logan J和Shenk T(1984)《美国国家科学院院刊(PNAS)》81(12):3655-9)。为了高效地转译插入的抗体编码序列，还可能需要特异性起始信号。这些信号包含ATG起始密码子和邻近序列。此外，起始密码子必须与期望的编码序列的读框同相，以确保转译整个插入物。这些外源翻译控制信号和起始密码子可以具有多种来源，天然的和合成的。通过包含适当的转录增强子元件、转录终止子等，可以增强表达效率(参见例如，Bitter G等人,(1987)《酶学方法(Methods Enzymol)》153:516-544)。
另外，可以选择调节所插入序列的表达或以期望的特异性方式修饰和处理基因产物的宿主细胞株。蛋白质产物的这种修饰(例如，糖基化)和加工(例如，切割)对于蛋白质的功能来说可能是重要的。不同的宿主细胞具有用于对蛋白质和基因产物进行转译后加工和修饰的特征性和特异性机制。可以选择适当的细胞系或宿主系统以确保正确修饰和加工所表达的外来蛋白。为此，可以使用具有用于对初级转录物进行适当加工、对基因产物进行糖基化和磷酸化的细胞机制的真核宿主细胞。这种哺乳动物宿主细胞包含但不限于CHO、VERO、BHK、Hela、MDCK、HEK 293、NIH 3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O和T47D、NS0(不会内源性地产生任何免疫球蛋白链的鼠类骨髓瘤细胞系)、CRL7O3O、COS(例如，COS1或COS)、PER.C6、VERO、HsS78Bst、HEK-293T、HepG2、SP210、R1.1、B-W、L-M、BSC1、BSC40、YB/20、BMT10和HsS78Bst细胞。在某些实施例中，在哺乳动物细胞(如CHO细胞)中产生本文所公开的抗ApoC3(例如，人ApoC3)抗体。
在具体实施例中，本文所公开的抗体具有降低的岩藻糖含量或没有岩藻糖含量。可以使用本领域技术人员已知的技术来产生此类抗体。例如，可以在欠缺或缺乏岩藻糖基化能力的细胞中表达抗体。在具体实例中，可以使用具有α1,6-岩藻糖基转移酶的两个等位基因敲除的细胞系来产生岩藻糖含量降低的抗体。
Figure BDA0002475284060000721
系统(龙沙集团)是可用于产生岩藻糖含量降低的抗体的此类系统的实例。
为了长期高产量地生产重组蛋白，可以生成稳定的表达细胞。例如，可以对稳定表达本文所公开的抗ApoC3抗体的细胞系进行工程化。在具体实施例中，本文提供的细胞稳定表达轻链/轻链可变区和重链/重链可变区，所述轻链/轻链可变区和重链/重链可变区缔合形成本文所公开的抗体。
在某些方面，可以使用由适当的表达控制元件(例如，启动子、增强子、序列、转录终止子、多腺苷酸化位点等)控制的DNA以及可选标志物来转化宿主细胞，而不使用含有病毒复制起点的表达载体来转化宿主细胞。在引入外来DNA/多核苷酸后，可以使工程化的细胞在富集的培养基中生长1-2天，然后切换到选择性培养基。重组质粒中的可选标志物赋予对选择的抗性，并且允许细胞将质粒稳定地整合到其染色体中并生长形成病灶，进而可以将所述病灶克隆并且扩展到细胞系中。可以有利地使用所述方法对表达本文所公开的抗ApoC3抗体的细胞系进行工程化。这种工程化的细胞系对筛选和评估与抗体分子直接或间接相互作用的组合物特别有用。
可以使用许多选择系统，包含但不限于分别位于于tk细胞、hgprt细胞或aprt细胞中的单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler M等人,(1977),《细胞(Cell)》11(1):223-32)、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska EH和Szybalski W(1962)《美国国家科学院刊》48(12):2026-2034)和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy I等人,(1980)《细胞》22(3):817-23)基因。此外，抗代谢物抗性可以用作选择以下基因的基础：dhfr，其赋予对甲氨蝶呤的抗性(Wigler M等人,(1980)《美国国家科学院院刊》77(6):3567-70；O'Hare K等人,(1981)《美国国家科学院院刊》78:1527-31)；gpt，其赋予对麦考酚酸的抗性(Mulligan RC和Berg P(1981)《美国国家科学院院刊》78(4):2072-6)；neo，其赋予对氨基糖苷G-418的抗性(Wu GY和Wu CH(1991)《生物疗法(Biotherapy)》3:87-95；Tolstoshev P(1993)《药理学和毒理学的年度评论(Ann Rev PharmacolToxicol)》32:573-596；Mulligan RC(1993)《科学(Science)》260:926-932；以及Morgan RA和Anderson WF(1993)《生物化学年鉴(Ann RevBiochem)》62:191-217；Nabel GJ和Felgner PL(1993)《生物技术趋势(TrendsBiotechnol)》11(5):211-5)；和hygro，其赋予对潮霉素的抗性(Santerre RF等人,(1984)《基因(Gene)》30(1-3):147-56)。可以常规地应用重组DNA技术领域中已知的方法来选择期望的重组克隆，并且此类方法描述于以下文献中：例如，Ausubel FM等人,(编辑),《当代分子生物学实验指南》,约翰威利父子出版社(John Wiley&Sons),纽约(1993)；Kriegler M,《基因转移和表达，实验室手册(Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manua)》,斯托克顿出版社(Stockton Press),纽约(1990)；以及Dracopoli NC等人,(编辑),《当代人类遗传学实验指南(Current Protocols in Human Genetics)》,第12章和第13章,约翰威利父子出版社,纽约(1994)；Colbère-Garapin F等人,(1981)《分子生物学杂志》150:1-14，所述文献通过引用整体并入本文。
通过载体扩增，可以增加抗体分子的表达水平(综述参见Bebbington CR和Hentschel CCG,《基于基因扩增的载体在DNA克隆中在哺乳动物细胞中表达克隆基因的用途(The use of vectors based on gene amplification for the expression ofcloned genes in mammalian cells in DNA cloning)》,第3卷(学术出版社(AcademicPress),纽约,1987))。当载体系统中表达抗体的标志物可扩增时，宿主细胞培养物中存在的抑制剂水平的增加将增加标志物基因的拷贝数。由于扩增的区域与抗体基因缔合，因此抗体的产生也将增加(Crouse GF等人,(1983)《分子细胞生物学(Mol Cell Biol)》3:257-66)。
宿主细胞可以与本文所公开的两种或更多种表达载体一起共转染，其中第一载体对重链衍生的多肽进行编码，而第二载体对轻链衍生的多肽进行编码。这两种载体可以含有相同的可选标志物，所述可选标志物使重链多肽和轻链多肽能够相等地表达。宿主细胞可以与不同量的两种或更多种表达载体一起共转染。例如，宿主细胞可以与以下比率中的任何一种比率下的第一表达载体和第二表达载体一起共转染：1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:12、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45或1:50。
可替代地，可以使用对重链多肽和轻链多肽两者进行编码并且能够表达重链多肽和轻链多肽两者的单个载体。在这种情况下，应将轻链放在重链之前，以避免过量的无毒重链(Proudfoot NJ(1986)《自然(Nature)》322:562-565；和
Figure BDA0002475284060000741
G(1980)《美国国家科学院院刊》77:2197-2199)。重链和轻链的编码序列可以包括cDNA或基因组DNA。表达载体可以是单顺反子或多顺反子。多顺反子核酸构建体可以对2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个或者2-5个、5-10个或10-20个范围内的基因/核苷酸序列进行编码。例如，双顺反子核酸构建体可以按以下顺序包括启动子、第一基因(例如，本文所公开的抗体的重链)和第二基因(例如，本文所公开的抗体的轻链)。在这种表达载体中，这两个基因的转录可以由启动子驱动，而来自第一基因的mRNA的翻译可以通过帽依赖性扫描机制驱动，并且来自第二基因的mRNA的翻译可以通过非帽依赖性机制(例如，通过IRES)驱动。
一旦通过重组表达产生了本文所公开的抗体分子，就可以通过本领域中已知的用于纯化免疫球蛋白分子的任何方法将所述抗体分子纯化，例如，通过色谱法(例如，离子交换、亲和力(特别是蛋白A后对特定抗原的亲和力)和分级柱色谱法)、离心、差别溶解或通过用于蛋白质纯化的任何其它标准技术。进一步地，本文所公开的抗体可以与本文所公开的或本领域已知的异源多肽序列融合，以促进纯化。
在具体实施例中，分离或纯化本文所公开的抗体。通常，分离的抗体是基本上不含与所述分离的抗体相比具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体。例如，在特定实施例中，本文所公开的抗体制剂基本上不含细胞材料或化学前体。术语“基本上不含细胞材料”包含抗体的制剂，在所述制剂中，抗体与从其中分离或重组产生所述抗体的细胞的细胞组分分离。因此，基本上不含细胞材料的抗体包含具有少于约30％、20％、10％、5％、2％、1％、0.5％或0.1％(按干重计)异源蛋白(本文中也被称为“污染蛋白”)的抗体制剂或抗体的变体，例如，抗体的不同翻译后修饰形式或抗体的其它不同版本(例如，抗体片段)。当重组产生抗体时，所述抗体通常还基本上不含培养基，即，培养基占蛋白质制剂体积的小于约20％、10％、2％、1％、0.5％或0.1％。当通过化学合成产生抗体时，所述抗体通常基本上不含化学前体或其它化学品，即，所述抗体与合成蛋白质时涉及的化学前体或其它化学品分离。因此，除了所关注的抗体外，这种抗体制剂具有少于约30％、20％、10％或5％(按干重计)的化学前体或化合物。在具体实施例中，分离或纯化本文所公开的抗体。
可以通过本领域中已知的用于合成抗体的任何方法产生与ApoC3(例如，人ApoC3)特异性结合的抗体，例如，通过化学合成或通过重组表达技术。除非另有指示，否则本文所公开的方法采用分子生物学、微生物学、遗传分析、重组DNA、有机化学、生物化学、PCR、寡核苷酸合成与修饰、核酸杂交以及本领域技术范围内的相关领域的常规技术。这些技术描述于例如本文所引用的参考文献中，并且在文献中进行了充分解释。参见例如，Maniatis T等人,(1982)《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》,冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Sambrook J等人,(1989)《分子克隆：实验室手册》,第二版,冷泉港实验室出版社；Sambrook J等人,(2001)《分子克隆：实验室手册》,冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约；Ausubel FM等人,《当代分子生物学实验指南》,约翰威利父子出版社(1987年和年度更新)；《当代免疫学实验指南(CurrentProtocols in Immunology)》,约翰威利父子出版社(1987年和年度更新)Gait(编辑)(1984)《寡核苷酸合成：一种实用方法(Oligonucleotide Synthesis:A PracticalApproach)》,IRL出版社；Eckstein(编辑)(1991)《寡核苷酸和类似物：一种实用方法(Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach)》,IRL出版社；Birren B等人,(编辑)(1999)《基因组分析：实验室手册(Genome Analysis:A Laboratory Manual)》,冷泉港实验室出版社。
在具体实施例中，本文所公开的抗体是通过涉及产生的任何方式(例如，通过DNA序列的合成、基因工程化)制备、表达、产生或分离的抗体(例如，重组抗体)。在某些实施例中，这种抗体包括并非天然存在于动物或哺乳动物(例如，人类)体内的抗体种系谱内的序列(例如，DNA序列或氨基酸序列)。
在一方面，本文提供了一种制备与ApoC3(例如，人ApoC3)特异性结合的抗体的方法，所述方法包括培养本文所公开的细胞或宿主细胞。在某个方面，本文提供了一种制备与ApoC3(例如，人ApoC3)特异性结合的抗体的方法，所述方法包括使用本文所公开的细胞或宿主细胞(例如，包括对本文所公开的抗体进行编码的多核苷酸的细胞或宿主细胞)表达(例如，重组表达)所述抗体。在特定实施例中，细胞是分离的细胞。在特定实施例中，已经将外源多核苷酸引入到细胞中。在特定实施例中，所述方法进一步包括纯化从细胞或宿主细胞获得的抗体的步骤。
用于产生多克隆抗体的方法是本领域已知的(参见例如，《精编分子生物学实验指南(Short Protocols in Molecular Biology)》,(2002)第5版,第11章,Ausubel FM等人编辑,约翰威利父子出版社,纽约)。
可以使用本领域中已知的多种技术来制备单克隆抗体，包含使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术或其组合。例如，可以使用杂交瘤技术来产生单克隆抗体，包含本领域已知的和在以下文献中教导的杂交瘤技术：例如，Harlow E和Lane D,《抗体：实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual)》(冷泉港实验室出版社,第2版1988)；Hammerling GJ等人,《单克隆抗体和T细胞杂交瘤(Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas)》563 681(爱思唯尔(Elsevier),纽约,1981)。如本文所使用的，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。例如，单克隆抗体可以由外源表达本文所公开的抗体(例如，该抗体的轻链或重链)的宿主细胞重组产生。
在具体实施例中，如本文所使用的，“单克隆抗体”是由单细胞(例如，产生重组抗体的杂交瘤或宿主细胞)产生的抗体，其中所述抗体与ApoC3(例如，人ApoC3)特异性结合，如通过例如ELISA或本领域或本文提供的实例中已知的其它抗原结合或竞争性结合测定所确定的。在特定实施例中，单克隆抗体可以是嵌合抗体或人源化抗体。在某些实施例中，单克隆抗体是单价抗体或多价(例如，二价)抗体。在特定实施例中，单克隆抗体是单特异性或多特异性抗体(例如，双特异性抗体)。例如，可以通过如Kohler G和Milstein C(1975)《自然》256:495中所述的杂交瘤方法制备本文所公开的单克隆抗体，或者可以例如使用本文所公开的技术从噬菌体文库中分离所述单克隆抗体。用于制备克隆细胞系和由其表达的单克隆抗体的其它方法是本领域众所周知的(参见例如，《精编分子生物学实验指南》,(2002)第5版,第11章,Ausubel FM等人,同上)。
用于使用杂交瘤技术产生和筛选特异性抗体的方法是常规的并且是本领域众所周知的。例如，在杂交瘤方法中，对小鼠或其它合适的宿主动物(如绵羊、山羊、兔子、大鼠、仓鼠或猕猴)进行免疫，从而诱导产生或能够产生与用于免疫的蛋白质(例如，ApoC3(例如，人ApoC3))特异性结合的抗体的淋巴细胞。可替代地，可以在体外对淋巴细胞进行免疫。然后使用合适的融合剂(如聚乙二醇)将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，从而形成杂交瘤细胞(Goding JW(编辑),《分子抗体：原理和实践(Monoclonal Antibodies：Principles andPractice)》,第59-103页(学术出版社,1986))。另外，可以使用RIMMS(重复免疫多位点)技术来对动物进行免疫(Kilpatrick KE等人,(1997)《杂交瘤(Hybridoma)》16:381-9，通过引用整体并入)。
在一些实施例中，可以用抗原(例如，ApoC3(例如，人ApoC3))对小鼠(或其它动物，如大鼠、猴子、驴、猪、绵羊、仓鼠或狗)进行免疫，并且一旦检测到免疫应答，例如在小鼠血清中检测到对抗原特异的抗体，就收获小鼠脾脏并分离脾细胞。然后通过众所周知的技术将脾细胞与任何合适的骨髓瘤细胞(例如来自美国典型培养物保藏中心
Figure BDA0002475284060000781
(马纳萨斯，弗吉尼亚洲)的细胞系SP20的细胞)融合，从而形成杂交瘤。选择杂交瘤并通过有限稀释进行克隆。在某些实施例中，收获免疫小鼠的淋巴结并将其与NS0骨髓瘤细胞融合。
将由此制备的杂交瘤细胞播种并在合适的培养基中生长，所述培养基优选地含有一种或多种抑制未融合的亲代骨髓瘤细胞的生长或存活的物质。例如，如果亲代骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤的培养基通常将包含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质可阻止缺乏HGPRT的细胞的生长。
具体实施例采用有效融合、支持所选抗体产生型细胞稳定地高-水平产生抗体并且对培养基敏感(如HAT培养基)的骨髓瘤细胞。这些骨髓瘤细胞系中存在鼠类骨髓瘤系，如NS0细胞系，或衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的细胞系(可从美国加利福尼亚州圣地亚哥的Salk研究所细胞分布中心获得)，以及可从美国马里兰州罗克维尔的美国典型培养物保藏中心获得的SP-2或X63-Ag8.653细胞。还已经描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源性骨髓瘤细胞系(Kozbor D(1984)《免疫学杂志(J Immunol)》133:3001-5；Brodeur等人,《单克隆抗体生产技术与应用(Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications)》,第51-63页(马塞尔德克尔公司(Marcel Dekker,Inc),纽约,1987))。
测定生长杂交瘤细胞的培养基中针对ApoC3(例如，人ApoC3)的单克隆抗体的产生。通过本领域已知的方法(例如，免疫沉淀)或通过体外结合测定法(如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA))来确定杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。
在鉴定出产生具有期望的特异性、亲和力或活性的抗体的杂交瘤细胞之后，可以通过有限的稀释程序对克隆子进行亚克隆，并通过标准方法生长(Goding JW(编辑),《单克隆抗体：原理和实践,同上)。用于此目的的合适的培养基包含例如D-MEM或RPMI 1640培养基。另外，在动物中，杂交瘤细胞可以作为腹水肿瘤在体内生长。
通过常规免疫球蛋白纯化程序(如例如，蛋白A-Sepharose、羟磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析或亲和色谱法)适当地将亚克隆所分泌的单克隆抗体与培养基、腹水或血清分离。
本文所公开的抗体包含识别特异性ApoC3(例如，人ApoC3)的抗体片段，并且可以通过本领域技术人员已知的任何技术来生成。例如，可以通过使用酶对免疫球蛋白分子进行蛋白水解切割来产生本文所公开的Fab和F(ab')2片段，如木瓜蛋白酶(产生Fab片段)或胃蛋白酶(产生F(ab')2片段)。Fab片段对应于抗体分子的两个相同臂之中的一个臂，并且含有与重链的VH和CH1结构域配对的完整轻链。F(ab')2片段含有通过铰链区中的二硫键连接的抗体分子的两个抗原结合臂。
进一步地，还可以使用本领域中已知的各种噬菌体展示法生成本文所公开的抗体。在噬菌体展示法中，将功能性抗体结构域展示在携带对其进行编码的多核苷酸序列的噬菌体颗粒的表面上。具体地说，从动物cDNA文库(例如，受影响组织的人类或鼠类cDNA文库)中扩增对VH结构域和VL结构域进行编码的DNA序列。通过PCR将对VH结构域和VL结构域进行编码的DNA与scFv接头重组在一起，并将其克隆到噬菌粒载体中。载体被电穿孔到大肠杆菌中，并且用辅助噬菌体对大肠杆菌进行感染。在这些方法中使用的噬菌体通常是丝状噬菌体，包含fd和M13，并且VH结构域和VL结构域通常与噬菌体基因III或基因VIII重组地融合。可以用抗原(例如，使用标记的抗原或结合或捕获至固体表面或珠子的抗原)选择或鉴定表达与特定抗原结合的抗原结合结构域的噬菌体。可用于制备本文所公开的抗体的噬菌体展示法的实例包含以下文献中所描述的噬菌体展示法：Brinkman U等人,(1995)《免疫学方法杂志(J Immunol Methods)》182:41-50；Ames RS等人,(1995)《免疫学方法杂志》184:177-186；Kettleborough CA等人,(1994)《欧洲免疫学杂志(Eur J Immunol)》24:952-958；Persic L等人,(1997)《基因》187:9-18；Burton DR和Barbas CF(1994)《免疫学进展(Advan Immunol)》57:191-280；PCT申请号PCT/GB91/001134；国际公开号WO 90/02809、WO91/10737、WO 92/01047、WO 92/18619、WO 93/1 1236、WO 95/15982、WO 95/20401和WO 97/13844；以及美国专利第5,698,426号、第5,223,409号、第5,403,484号、第5,580,717号、第5,427,908号、第5,750,753号、第5,821,047号、第5,571,698号、第5,427,908号、第5,516,637号、第5,780,225号、第5,658,727号、第5,733,743号和第5,969,108号。
如以上参考文献中所述，在噬菌体选择之后，可以分离出来自噬菌体的抗体编码区，并将所述抗体编码区用于生成完整抗体(包含人抗体或任何其它期望的抗原结合片段)，并在任何期望的宿主(包含哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌)中表达，例如，如下所述。还可以采用使用本领域已知的方法重组产生抗体片段(如Fab、Fab'和F(ab')2片段)的技术，如以下文献中所公开的方法：PCT公开号WO 92/22324；Mullinax RL等人,(1992)《生物技术》12(6):864-9；Sawai H等人,(1995)《美国生殖免疫学杂志(Am JReprod Immunol)》34:26-34；以及Better M等人,(1988)《科学》240:1041-1043。
在某些实施例中，为了生成完整抗体，可以使用包含VH或VL核苷酸序列、限制位点和保护所述限制位点的侧翼序列的PCR引物来扩增来自模板(例如，scFv克隆)的VH或VL序列。利用本领域技术人员已知的克隆技术，可以将PCR扩增的VH结构域克隆到表达VH恒定区的载体中，并且可以将PCR扩增的VL结构域克隆到表达VL恒定区(例如，人κ或λ恒定区)的载体中。也可以将VH和VL结构域克隆到表达必要恒定区的一个载体中。然后，使用本领域技术人员已知的技术将重链转化载体和轻链转化载体共转染到细胞系中，从而生成表达全长抗体(例如，IgG)的稳定或瞬时细胞系。
嵌合抗体是其中抗体的不同部分衍生自不同免疫球蛋白分子的分子。例如，嵌合抗体可以含有与人抗体的恒定区融合的小鼠或大鼠单克隆抗体的可变区。用于产生嵌合抗体的方法是本领域已知的。参见例如，Morrison SL(1985)《科学》229:1202-7；Oi VT和Morrison SL(1986)《生物技术》4:214-221；Gillies SD等人,(1989)《免疫学方法杂志》125:191-202；以及美国专利第5,807,715号、第4,816,567号、第4,816,397号和第6,331,415号。
人源化抗体能够与预定抗原结合，并且所述预定抗原包括人基本上具有免疫球蛋白氨基酸序列的框架区和基本上具有非人免疫球蛋白(例如，鼠免疫球蛋白)氨基酸序列的CDR。在特定实施例中，人源化抗体还包括免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。所述抗体还可以包含重链的CH1、铰链、CH2、CH3和CH4区。人源化抗体可以选自任何类别的免疫球蛋白，包含IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，以及任何同种型，包含IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。可以使用本领域中已知的多种技术来产生人源化抗体，所述技术包含但不限于CDR移植(欧洲专利号EP 239400；国际公开号WO 91/09967；以及美国专利第5,225,539号、第5,530,101号和第5,585,089号)、饰面或表面重修(欧洲专利号EP592106和EP 519596；Padlan EA(1991)《分子免疫学(Mol Immunol)》28(4/5):489-498；Studnicka GM等人,(1994)《蛋白质工程(Prot Engineering)》7(6):805-814；以及RoguskaMA等人,(1994)《美国国家科学院院刊》91:969-973)、链改组(美国专利第5,565,332号)以及以下文献中所公开的技术：；例如，美国专利第6,407,213号、美国专利第5,766,886号、国际公开号WO 93/17105；Tan等人,(2002)《免疫学杂志》169:1119-25；Caldas C等人,(2000)《蛋白质工程(Protein Eng.)》13(5):353-60；Morea V等人,(2000)《方法(Methods)》20(3):267-79；Baca等人,(1997)《生物化学杂志》272(16):10678-84；Roguska MA等人,(1996)《蛋白质工程》9(10):895 904；Couto JR等人,(1995)《癌症研究(Cancer Res.)》55(23Supp):5973s-5977s；Couto JR等人,(1995)《癌症研究》55(8):1717-22；Sandhu JS(1994)《基因》150(2):409-10和Pedersen JT等人,(1994)《分子生物学杂志》235(3):959-73。还参见美国专利申请公开号US 2005/0042664A1(2005年2月24日)，其通过引用整体并入本文。
已经描述了用于制备多特异性(例如，双特异性抗体)的方法，参见例如，美国专利第7,951,917号；第7,183,076号；第8,227,577号；第5,837,242号；第5,989,830号；第5,869,620号；第6,132,992号和第8,586,713号。
可以通过本领域众所周知的方法产生单结构域抗体，例如，缺乏轻链的抗体。参见Riechmann L和Muyldermans S(1999)《免疫学杂志》231:25-38；Nuttall SD等人,(2000)《当代药物生物技术(Curr Pharm Biotechnol)》1(3):253-263；Muyldermans S,(2001)《生物技术杂志(J Biotechnol)》74(4):277-302；美国专利第6,005,079号；以及国际公开号WO94/04678、WO 94/25591和WO 01/44301。
进一步地，可以使用本领域技术人员众所周知的技术，进而使用与ApoC3(例如，人ApoC3)特异性结合的抗体来生成“模拟”抗原的抗独特型抗体。(参见例如，Greenspan NS和Bona CA(1989)《实验生物学学会联合会杂志(FASEBJ)》7(5):437-444；和Nissinoff A(1991)《免疫学杂志》147(8):2429-2438)。
在特定实施例中，与本文所公开的抗ApoC3(例如，人ApoC3)抗体结合相同的ApoC3表位的本文所公开的抗体是人抗体。在特定实施例中，竞争性地阻断(例如，以剂量依赖性方式)本文所公开的任何一种抗体与ApoC3(例如，人ApoC3)结合的本文所公开的抗体是人抗体。可以使用本领域已知的任何方法来产生人抗体。例如，可以使用无法表达功能性内源性免疫球蛋白但可以表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠。具体地说，可以将人重链和轻链免疫球蛋白基因复合物随机引入或通过同源重组引入到小鼠胚胎干细胞中。可替代地，除人重链和轻链基因外，还可以将人可变区、恒定区和多样性区引入到小鼠胚胎干细胞中。在通过同源重组将小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因引入人免疫球蛋白基因座时，可以使所述小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因分别或同时变为无功能。具体地说，JH区的纯合缺失阻止内源性抗体产生。将经过修饰的胚胎干细胞扩展并显微注射到胚泡中，从而产生嵌合小鼠。然后，饲养嵌合小鼠，以产生表达人抗体的纯合后代。用所选抗原(例如，抗原(例如，ApoC3(例如，人ApoC3))的全部或一部分)以正常方式对转基因小鼠进行免疫。可以使用常规的杂交瘤技术从免疫的转基因小鼠中获得针对抗原的单克隆抗体。转基因小鼠携带的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化过程中会重排，随后进行类别转换和体细胞突变。因此，使用这种技术，可以产生治疗上有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。有关用于产生人抗体的这项技术的概述，请参见Lonberg N和Huszar D(1995)《免疫学国际综述(Int Rev Immunol)》13:65-93。有关用于产生人抗体和人单克隆抗体的这项技术以及用于产生此类抗体的方案的详细讨论，参见例如，国际公开号WO 98/24893、WO 96/34096和WO 96/33735；以及美国专利第5,413,923号、第5,625,126号、第5,633,425号、第5,569,825号、第5,661,016号、第5,545,806号、第5,814,318号和第5,939,598号。能够产生人抗体的小鼠的实例包含XenomouseTM(安进公司(Abgenix,Inc.)；美国专利第6,075,181号和第6,150,184号)、HuAb-MouseTM(Mederex,Inc./Gen Pharm；美国专利第5,545,806号和第5,569,825号)、TransChromo MouseTM(Kirin)和KM MouseTM(Medarex/Kirin)。
可以通过本领域已知的多种方法来制备与ApoC3(例如，人ApoC3)特异性结合的人抗体，包含使用衍生自人免疫球蛋白序列的抗体文库的上述噬菌体展示方法。还参见美国专利第4,444,887号、第4,716,111号和第5,885,793号；以及国际公开号WO 98/46645、WO98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735和WO 91/10741。
在一些实施例中，可以使用小鼠-人杂交瘤产生人抗体。例如，可以将用爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)转化的人外周血淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，以产生分泌人单克隆抗体的小鼠-人杂交瘤，并且可以筛选这些小鼠-人类杂交瘤，从而确定分泌与靶抗原(例如，ApoC3(例如，人ApoC3))特异性结合的人单克隆抗体的杂交瘤。这种方法在本领域中是已知的并且进行了描述，参见例如，Shinmoto H等人,(2004)《细胞技术学(Cytotechnology)》46:19-23；NaganawaY等人,(2005)《人抗体(Human Antibodies)》14:27-31。
6.试剂盒
还提供了试剂盒，所述试剂盒包括一种或多种本文所公开的抗体或其药物组合物或缀合物。在具体实施例中，本文提供了一种药物包装或试剂盒，所述药物包装或试剂盒包括一个或多个填充有本文所公开的药物组合物的一种或多种成分(如本文提供的一种或多种抗体)的容器。在一些实施例中，所述试剂盒含有本文所公开的药物组合物以及任何预防剂或治疗剂，如本文所公开的预防剂或治疗剂。任选地，与这样一个或多个容器相关联的可以是由管理药物或生物制品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的公告，所述公告反映了该机构对针对人类施用的制造、使用或销售的许可。
还提供了可以在上述方法中使用的试剂盒。在一个实施例中，试剂盒在一个或多个容器中包括本文所公开的抗体，优选为经过纯化的抗体。在具体实施例中，本文所公开的试剂盒含有基本上分离的ApoC3(例如，人ApoC3)抗原作为对照。在另一个具体实施例中，本文所公开的试剂盒进一步包括不与ApoC3(例如，人ApoC3)抗原反应的对照抗体。在另一个具体实施例中，本文所公开的试剂盒含有一个或多个用于检测抗体与ApoC3(例如，人ApoC3)抗原的结合的元件(例如，可以将抗体与如荧光化合物、酶底物、放射性化合物或发光化合物等可检测底物缀合，或者可以将识别第一抗体的第二抗体与可检测底物缀合)。在具体实施例中，本文所提供的试剂盒可以包含重组产生的或化学合成的ApoC3(例如，人ApoC3)抗原。也可以将试剂盒中提供的ApoC3(例如，人ApoC3)抗原连接到固体支撑物上。在更具体的实施例中，上述试剂盒的检测装置包含ApoC3(例如，人ApoC3)抗原所连接的固体支撑物。这种试剂盒还可以包含未连接的报道分子标记的抗人抗体或抗小鼠/大鼠抗体。在这个实施例中，可以通过所述报道分子标记的抗体的结合来检测抗体与ApoC3(例如，人ApoC3)抗原的结合。
实例
先前鉴定的抗体克隆子5E5在pH 7.4下以高亲和力与ApoC3结合，而在pH 5.5下亲和力略有降低(参见美国临时申请62/360,084)。本公开提供了克隆子5E5的新型衍生物，与5E5相比，所述新型衍生物在pH 7.4下对ApoC3具有高亲和力结合，但在pH 5.5下对ApoC3的亲和力大大降低。以下实例描述了新型5E5衍生物的表征。5E5的氨基酸序列在美国临时申请62/360,084中示出，并且新型5E5衍生物的氨基酸序列在本文表1-7中示出。
提供本节中的实例是为了进一步阐明本申请的优点和特征，但并不旨在限制本申请的范围。实例仅用于说明目的。
实例1：抗ApoC3 scFv-Fc抗体的体外表征。
该实例描述了基于表面等离子体共振(SPR)的实验，以确定抗ApoC3scFv-Fc抗体在pH 7.4和pH 5.5下的抗原结合动力学。
通过用组氨酸取代5E5的VH和/或VL中的一个或多个CDR氨基酸，生成了一组抗体克隆子5E5的新型衍生物。使用下文示出的基于SPR的方法评估了每个5E5衍生物在pH 7.4和pH 5.5下的抗原结合动力学，并且选择了与5E5相比在pH 7.4下对ApoC3具有高亲和力结合，但在pH 5.5下对ApoC3的亲和力大大降低的克隆子，以进行进一步表征。表14示出了示例性5E5衍生物5E5VH5_VLWT、5E5VH12_VLWT和5E5VHWT_VL8的结合动力学。
在50ml小规模培养基中，从转染的HEK293细胞中产生测试抗体，并使用
Figure BDA0002475284060000861
纯色谱系统通过蛋白A色谱法纯化所述测试抗体。通过分光光度法并通过SDS-PAGE确定经纯化的抗体片段的质量和产率。
采用了基于SPR的方法，在所述方法中，将生物素化的人ApoC3捕获在链霉亲和素(SA)包被的芯片上，并在pH 7.4和pH 5.5下测量测试抗体对包被的芯片的结合动力学。简言之，以10μg/ml的浓度注入20μl生物素化的人ApoC3，以达到约500RU的表面密度。将60μl每个测试抗体稀释于HBS-EP缓冲液(GE，目录号BR-1008-26；0.010M HEPES，0.150M NaCl，3mM EDTA，0.05％(v/v)表面活性剂P20，pH 7.4)中，并以1-100nM的浓度注入。将测试抗体以30μl/分钟的流速通过流通池，然后在pH 7.4或pH 5.5下进行解离率洗涤，持续5分钟。使用BIAevaluation 4.1软件采用Langmuir 1:1结合模型分析所得的传感图，从而得出结合动力学。将数据调零，并减去参考细胞传感图。
表14.抗ApoC3 scFv-Fc抗体在pH 7.4和pH 5.5下的结合动力学
Figure BDA0002475284060000871
所有测试的scFv-Fc抗体在pH 7.4下对ApoC3的亲和力均高于pH 5.5下的亲和力，其中抗体5E5VH12_VLWT表现出最明显的pH依赖性结合(参见表14)。在酸性条件下，pH依赖性结合的大小与解离速率呈正相关。
实例2：抗ApoC3人IgG1抗体的体外表征。
基于实例1中的结果，生成了人IgG1抗体形式的测试scFv-Fc抗体。采用了基于SPR的测定法，在所述测定法中，将人ApoC3蛋白固定在CM5芯片上，并在pH 7.4和pH 5.5下测量测试抗体对包被芯片的结合动力学。简言之，制备50μg/ml天然人ApoC3于10mM乙酸盐缓冲液中的溶液(pH 4.5)，并注入所述溶液，直至表面密度达到约500RU。将60μl每个测试抗体稀释于HBS-EP缓冲液(GE，目录号BR-1008-26；0.010M HEPES，0.150M NaCl，3mM EDTA，0.05％(v/v)表面活性剂P20，pH 7.4)中，并以表9中的描述的浓度注入。将测试抗体以30μl/分钟的流速通过流通池，然后在pH 7.4或pH 5.5下进行解离率洗涤，持续5分钟。使用BIAevaluation 4.1软件采用Langmuir 1:1结合模型分析所得的传感图，从而得出结合动力学。将数据调零，并减去参考细胞传感图。
表15.抗ApoC3人IgG1抗体在pH 7.4和pH 5.5下的结合动力学
Figure BDA0002475284060000881
所有测试的抗体在pH 7.4下与人ApoC3结合，并且在pH 5.5下对ApoC3的亲和力降低(参见表15)。5E5VH5_VLWT、5E5VH12_VLWT、5E5VH5_VL8和5E5VH12_VL8显示出特别明显的pH依赖性。
实例3：抗ApoC3抗体对肝细胞摄取VLDL的影响。
在该实例中，确定了抗ApoC3抗体减弱肝细胞摄取VLDL的能力。
简言之，将HepG2细胞(ATCC HB-8065)在补充有10％FCS的完全基本必需培养基(MEM)中在聚d-赖氨酸涂覆的表面上培育24小时，并在补充有0.0125％牛血清白蛋白的完全MEM(MEM-BSA培养基)中再培育24小时。将细胞与3μM人ApoC3蛋白(Athens Research andTechnology)和3μM IgG1形式的测试抗体一起在新鲜MEM-BSA培养基中预孵育15分钟，并将30μg/mL消耗ApoC3的DiI标记的VLDL(Kalen Biomedical，LLC#770130-9)添加到培养基中。孵育4小时后，将细胞进一步与补充有1％英脱利匹特(intralipid)的新鲜完整MEM一起孵育20分钟。通过以下步骤确定细胞所摄取的DiI标记的VLDL的量：在室温下将细胞用异丙醇裂解15分钟、测量裂解物中DiI标记的荧光(ex＝520nm；em＝580)、使用标准曲线计算DiI标记的VLDL的量并基于裂解物中总蛋白质的数量对数据进行归一化。使用GraphPad Prism 6将数据作图，并记录为平均值+/-SEM。使用GraphPad Prism 6计算具有多项比较的单向ANOVA。
如图1A、1B和1C所示，5E5WT、5E5VHWT_VL8、5E5VH5_VLWT、5E5VH12_VLWT和5E5VH5_VL8抗体增加了HepG2细胞对VLDL的摄取。具体地说，在ApoC3存在的情况下，5E5VHWT_VL8、5E5VH5_VLWT、5E5VH12_VLWT和5E5VH5_VL8抗体均完全恢复了VLDL摄取。
实例4：抗ApoC3抗体的药代动力学和药效学。
该实例描述了5E5VH5_VL8抗体的体内表征，所述实例使用由于人ApoC3的转基因表达而具有受损的甘油三酯清除率的小鼠模型。
4.1小鼠模型的生成
通过腹膜内施用将维持标准饮食的60-63天龄的野生型C57BL/6雄性小鼠用3x1011AAV8载体的病毒颗粒感染，所述载体携带可操作地连接到甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子(RegenXBio)的人ApoC3基因。施用后的第十二天，从眶后窦收集血液样品，并使用第一抗ApoC3抗体(Abcam兔多克隆抗人ApoC3#ab21032)和第二抗ApoC3抗体(Abcam山羊多克隆生物素缀合物ApoC3#ab21024)通过ELISA测量血液样品中人ApoC3的水平。在感染的小鼠中，人ApoC3的平均血清水平为9.9μM。禁食四个小时后，这些小鼠的平均循环性甘油三酯水平为163mg/dL，而对照小鼠的平均循环性甘油三酯水平为109mg/dL(p＝0.0065)。
然后将小鼠分组，以使所有组在第12天具有相似的平均ApoC3水平。在AAV感染后的第十四天，从眶后窦收集血液样品以建立基线(T＝0)ApoC3水平。通过注射到背部皮下间隙向每只小鼠施用25mg/kg测试抗ApoC3人IgG1抗体。将抗鸡蛋溶酶体人IgG1抗体(HyHEL5)用作同种型对照。在施用测试抗体后第0小时、第2小时、第4小时、第8小时和第24小时，从眼眶后窦收集血液样品，此后大约每2天收集一次，持续30天。所有动物研究均按照美国国立卫生研究院《实验动物的护理和使用指南(Guide for the Care and Use of LaboratoryAnimals)》中的建议进行。所有程序均已由Vascumab,LLC的机构动物护理和使用委员会批准。
4.2抗ApoC3抗体的药代动力学
如4.1节所述，生成了表达人ApoC3的小鼠并对小鼠进行处理。用ELISA测定法确定人IgG1抗体的血浆水平。具体地说，在4℃下将96孔板(Griener#655061)用稀释于PBS中的50μL第一IgG抗体(Fitzgerald 41-XG57山羊抗人IgG Fc多克隆)涂覆过夜。将板用200μLTBS-T洗涤4次，并在30℃下用PBS中的200μL封闭缓冲液封闭90分钟，所述封闭缓冲液由3％BSA(不含Roche BSA组分V蛋白酶#03117332001)和清澈的牛奶(Pierce Clear MilkBlocker#37587)组成。除去封闭缓冲液，加入稀释于封闭缓冲液中的50μL测试样品，并在室温下以300rpm旋转孵育2小时。将板用200μL TBS-T洗涤四次，加入稀释于封闭缓冲液中的50μL二抗(Abcam山羊抗人IgG-Fc(生物素)多克隆#ab97223)，并在室温下以300rpm旋转孵育1小时。将板用TBS-T洗涤一次，加入在PBS中稀释100倍的50μL SA-HRP(Abcam#64269)，并在室温下以300rpm旋转孵育30分钟。然后将板用200μL TBS-T洗涤4次，并用80μLTMB显影。用50μL 0.5N HCL终止显色反应。在450nm的波长处读取吸光度。由使用经纯化的测试抗体构建的标准曲线(美谷分子仪器(Molecular Devices))的4参数拟合计算出测试孔中人IgG的量。此方法特异性地检测人ApoC3，并且不会与小鼠ApoC3交叉反应。
如图2A所示，在表达人ApoC3的小鼠中，5E5抗体被迅速降解。这可以通过摄取含ApoC3的脂质颗粒快速转换ApoC3来解释。在较低pH下对ApoC3的亲和力降低的5E5VH5_VL8抗体可在酸性细胞器中与ApoC3分离，并通过内体再循环返回血液。5E5VH5_VL8的半衰期约为一周，与同型对照抗体HyHel5(一种不与小鼠中的特定抗原结合的抗体)的半衰期相似。注射后约一个月，5E5VH5_VL8的血浆水平恢复到基线。5E5VH5_VL8的延长的半衰期使该抗体成为临床应用的优秀候选者，因为维持血清中抗体的治疗水平所需的施用频率较低。
4.3抗ApoC3抗体的药效学
如4.1节所述，生成了表达人ApoC3的小鼠并对小鼠进行处理。用ELISA测定法确定人ApoC3和ApoB的血浆水平。具体地说，在4℃下将96孔板(Griener#655061)用稀释于PBS中的50μL第一ApoC3抗体(Abcam兔多克隆抗人ApoC3#ab21032)或50μL第一ApoB抗体(Meridian Life Sciences山羊多克隆抗人ApoB#K45253G)涂覆过夜。将板用200μL TBS-T洗涤4次，并在30℃下用200μL封闭缓冲液(Pierce Clear Milk Blocker#37587，于PBS中)封闭90分钟。除去封闭缓冲液，加入稀释于封闭缓冲液中的50μL测试样品，并在室温下以300rpm旋转孵育2小时。将板用200μL TBS-T洗涤四次，加入稀释于封闭缓冲液中的50μL第二ApoC3抗体(Abcam山羊多克隆生物素缀合物ApoC3#ab21024)或第二ApoB抗体(MeridianLife Sciences山羊多克隆生物素缀合物ApoB48/100#34003G)，并在室温下以300rpm旋转孵育1小时。将板用TBS-T洗涤一次，加入在PBS中稀释100倍的50μL SA-HRP(Abcam#64269)，并在室温下以300rpm旋转孵育30分钟。然后将板用200μL TBS-T洗涤4次，并先后用80μLTMB(Thermo Ultra-TMB ELISA#34028)和50μL 0.5N HCL显影。在450nm处读取吸光度。由使用经纯化的ApoC3(Athens Research and Technology)构建的标准曲线(美谷分子仪器)的4参数拟合计算出测试孔中ApoC3的量。由使用通过离心分离的小鼠VLDL构建的标准曲线(美谷分子仪器)的4参数拟合计算出测试孔中ApoB的量(假定ApoB含量为总蛋白质含量的20％)。计算数据并将其绘制成相对于用HyHel5对照抗体处理的小鼠中相应水平的百分比值。
如图2B和2C所示，5E5抗体最初降低了人ApoC3和ApoB的血浆水平，但约2天后所述水平恢复正常。相比之下，5E5VH5_VL8降低了人ApoC3和ApoB的血浆水平，持续约一个月。这种长期疗效与5E5VH5_VL8的长半衰期相一致，并证实了5E5VH5_VL8将是出色的临床候选者。
实例5：抗ApoC3抗体的人源化
根据WO 2012123586A1中所述的“萌发”方法生成5E5VH5_VL8的人源化变体。简言之，通过与已知的人种系基因序列进行比较，鉴定出具有相同规范折叠结构且与5E5VH5_VL8的VH和VL区具有最高氨基酸序列同一性的人种系基因片段。最接近的人重链和轻链种系序列分别是人IGHV3-23*01和人IGKV2-28*01。构建了5E5VH5_VL8变体的噬菌体展示Fab文库，所述文库在与人IGHV3-23*01和IGKV2-28*01种系序列不同的5E5VH5_VL8氨基酸残基处掺入人源化突变，其中每个目标位置处的美洲驼和人残基在文库中平均分配。文库中还掺入了去除序列责任基序DG、DS、NR或M的突变。经过几轮亲和力驱动的噬菌体展示选择后，鉴定出具有最佳靶标结合特性(例如，在pH 7.4下对ApoC3的具有高亲和力结合，但pH 5.5下对ApoC3的亲和力大大降低)的人源化5E5VH5_VL8变体。
从上述的初始选择和筛选中鉴定出二十种保留高亲和力和pH依赖性结合的人源化抗ApoC3抗体。将这些抗体的VH和Vκ编码序列克隆到表达载体中，并在ExpiCHO-S细胞中以全长IgG1分子的形式产生。然后使用
Figure BDA0002475284060000921
Pure系统上的HitrapMabSelect Sure色谱柱(GE，目录号11-0034-94)纯化抗体。用1.0ml的0.1M柠檬酸盐缓冲液(pH 3.0)洗脱抗体，并将洗脱的馏分收集在含有0.1ml Tris-HCl pH 9.0的试管中进行中和。将含抗体的馏分合并，并使用
Figure BDA0002475284060000931
Pure系统上的HiTrap脱盐柱在1x磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS；NaCl137mM，KCl 3mM，Na2HPO4 8mM，KH2PO4 15mM，pH7.4)中脱盐。通过测量280nm处的吸光度并通过消光系数进行如下校正来确定蛋白质浓度：(A280nm-A340nm)/ε(消光系数，单位为g/L)。在还原和非还原条件下，通过SDS-PAGE检查经纯化的样品，从而确认样品的正确大小和纯度。
进行了两种不同的表面等离子体共振(SPR)测定法，以评估人源化抗ApoC3抗体的pH依赖性缔合和解离参数。两种测定的方法和结果描述如下。
5.1人源化抗ApoC3抗体与固定的ApoC3结合的SPR分析
根据Biacore提供的方法，通过注射20μl 10μg/ml生物素化的天然人ApoC3，在pH7.4下将生物素化的天然人ApoC3捕获在链霉亲和素包被的SPR芯片(通用电气医疗集团(GEHealthcare)，目录号BR100032)上，从而达到约500RU的表面密度。注射稀释于HBS-EP缓冲液(GE，目录号BR-1008-26；0.010M HEPES，0.150M NaCl，3mM EDTA，0.05％(v/v)表面活性剂P20，pH 7.4)中的60μL 1-50nM范围内的测试抗体，并将所述测试抗体以30μl/分钟的流速通过流通池，然后在pH7.4下进行解离率洗涤，持续5分钟。解离后，通过在pH1.5下注入10μl的10mM NaOH/1M NaCl和10μl的10mM甘氨酸来使流通池表面再生。使用相同的通用方案在pH5.5下重复测定，其中将运行和样品稀释缓冲液替换为补充有柠檬酸盐缓冲液的HBS-EP缓冲液，至终浓度为10mM，并将pH值调节至5.5。
使用BIAevaluation 4.1软件使用Langmuir 1:1结合模型分析所得的传感图，从而得出结合动力学。将数据调零，并减去参考细胞传感图。传感图被双重引用至不含分析物的空白测定。如果解离率值低于设备的kd检测极限：1×10-61/s，则认为拟合参数不适用。
表16给出了所生成的人源化抗体的计算出的动力学参数的概述。图3示出了在两个测定pH值(均一的25nMmAb浓度)下每个生成的人源化mAb的重叠传感图。
表16.人源化ApoC3抗体与固定的ApoC3结合的SPR分析
Figure BDA0002475284060000941
*pH7.4条件下的测定会导致解离率读数低于设备的检测极限
n.a不适用
如图3所示，mAb1至mAb6在pH 7.4和pH5.5下均显示出非常低的解离率。相对于5E5VH5_VL8，它们在pH5.5下的表观亲和力得到了改善，并且未观察到pH依赖性靶标结合。mAb7抗体pH 5.5下显示出清晰的pH依赖性靶标结合，具有高解离率。但是，在两个pH值下，结合相的Rmax值均高于5E5VH5_VL8。mAb8至mAb12抗体在pH 7.4下显示出非常低的解离率，并且与pH 7.4相比，在pH5.5下显示出较高的Rmax水平。相对于5E5VH5_VL8，它们在pH5.5下的表观亲和力得到了改善，并且未观察到pH依赖性靶标结合。mAb13和mAb14抗体是通过将HCDR和LCDR序列移植到最接近的人种系框架序列中而生成的，并显示出清晰的pH依赖性靶标结合特征，然而，在pH 7.4下，相对于5E5VH5_VL8，它们对人ApoC3的亲和力降低。mAb15、mAb17和mAb19抗体在LCDR3(Q90H)处不包含组氨酸残基，但在屏幕上显示出期望的pH依赖性靶标结合特征。mAb16、mAb18和mAb20抗体的序列分别与mAb15、mAb17和mAb19相同，除了对应于H90 5E5VH5_VL8的残基是组氨酸。如图3所示，由于在pH 5.5下对靶标的亲和力降低而在pH 7.4下解离率提高，mAb16、mAb18和mAb20显示出清晰的pH依赖性靶标结合。
5.2ApoC3与固定的人源化抗ApoC3抗体结合的SPR分析
设计了反向SPR测定法，在所述测定法中，将测试抗体捕获在SPR芯片上，注射人ApoC3蛋白，并测量ApoC3与抗体的结合。具体地说，将山羊抗人IgG Fcγ特异性抗体(Jackson ImmunoResearch，目录号109-005-098)固定在CM5芯片表面(通用电气医疗集团，目录号BR100012)上。使用NHS/EDC试剂盒(Biacore AB，目录号BR-1000-50)按照Biacore/GE提供的方法进行固定：芯片活化后，制备30μg/ml抗-人Fcγ抗体于10mM乙酸盐缓冲液中的溶液(pH5.0)，并注入所述溶液，直至表面密度达到约10000RU。分析循环包括以下步骤：
(1)抗体捕获：在pH7.4或pH5.5下，以50nM的浓度注射稀释于HBS-EP缓冲液(GE，目录号BR-1008-26；0.010M HEPES，0.150M NaCl，3mM EDTA，0.05％(v/v)表面活性剂P20，pH7.4)中的抗体，并使其被高达800RU的高亲和力抗huFcγ抗体捕获；
(2)基线稳定：以30μl/ml的流速注射100μl HBS-EP缓冲液；
(3)靶标结合：以400nM、200nM、100nM和50nM的浓度注射稀释于HBS-EP缓冲液中的60μl目标ApoC3蛋白；
(4)解离率洗涤：以30μl/ml流速注射HBS-EP缓冲液，持续5分钟，以评估解离相；
(5)通过在pH1.5下注射20μl的10mM甘氨酸来使芯片再生。
使用BIAevaluation 4.1软件使用Langmuir 1:1结合模型分析所得的传感图，从而得出结合动力学。将数据调零，减去参考细胞传感图，并使用不含分析物的空白测定来两次参考对应于分析物注射的传感图。解离和缔合相传感图分别拟合了4个不同的浓度曲线。如果达到的最大RU值低于设备的检测极限(<5RU)，Biacore 3000(Biacore AB)，则从拟合中排除传感图。
表17给出了所生成的人源化抗体的计算出的动力学参数的概述。图4示出了生成的变体的结合特征。在这种设置中，由于靶蛋白的呈现方式不同，每种抗体的解离率都增加了。
表17.ApoC3与固定的人源化抗ApoC3抗体结合的SPR分析。
Figure BDA0002475284060000971
从传感图中减去空白通道，并双重引用至不含分析物的空白测定。
n/a:不适用
*除了400nM的传感图
**除了200nM的传感图
如图4所示，mAb1至mAb6在pH7.4下显示出改善的对ApoC3的表观亲和力，并且观察到pH依赖性靶标结合。mAb7抗体在两个pH值下均显示出清晰的pH依赖性靶标结合，具有高解离率。相对于5E5VH5_VL8，缔合相中的Rmax值在pH 5.5下增加。mAb8至mAb12抗体在pH7.4下的解离率低于5E5VH5_VL8，在pH5.5下的Rmax水平高于pH 7.4下的水平，在pH5.5下的解离率高于5E5VH5_VL8，并且显示出pH依赖性靶标结合。mAb13和mAb14抗体(通过将HCDR和LCDR序列移植到最接近的人种系构架序列中而生成)在两个pH值下均失去结合，因此未计算pH5.5下的亲和力值。由于在pH 5.5下对靶标的亲和力降低，因此mAb16、mAb18和mAb20抗体显示出清晰的pH依赖性靶标结合，然而，它们在pH 7.4下的解离率也会提高。
总之，根据SPR测定的结果，针对人源化抗体鉴定出以下结合谱图组：
组1：mAb1、2、3、4、5、6、8、9、10、11和12；
组2：mAb15、17和19；
组3：mAb16、18和20；
组4含有mAb7；以及
组5：mAb13和14。
在每组中，所有变体均显示出相似的SPR缔合和解离谱图。因此，根据最高人类同源性百分比的标准，从每组中选择代表性抗体来评估其耐热性，作为抗体可开发性参数之一。
5.3选定的人源化抗ApoC3抗体的耐热性表征
在56至68℃的不同温度下孵育1小时后，评估人源化抗体的耐热性。在SPR测定中确定抗体的活性，在所述测定中，将500RU天然huApoC3蛋白固定在CM5芯片(通用电气医疗集团，目录号BR100012)上。使用NHS/EDC试剂盒(Biacore AB)按照Biacore提供的方法进行固定：芯片活化后，制备60μg/ml人ApoC3于10mM乙酸盐缓冲液中的溶液(pH 4.5)，并注入所述溶液，直至表面密度达到约500RU。
注射稀释于HBS-EP缓冲液(GE，目录号BR-1008-26；0.010M HEPES，0.150M NaCl，3mM EDTA，0.05％(v/v)表面活性剂P20，pH 7.4)中的100μL 10nM测试抗体，并将所述测试抗体以30μl/分钟的流速通过流通池，然后在pH7.4下用HBS-EP缓冲液进行解离率洗涤，持续10分钟。解离后，通过在pH1.5下注入10μl的10mM NaOH/1M NaCl和10μl的10mM甘氨酸来使流通池表面再生。
测量结合阶段中达到的缔合率和最大RU值作为读出参数。在长达200秒的初始结合阶段评估缔合速率(斜率)，并在345秒的解离阶段开始时读取RU最大值(R0)。基于设定为100％的参照(在4℃下孵育的样品)计算功能性抗体的百分比。将每种抗体的解链温度确定为活性与温度曲线的拐点。
如图5A和5B所示，并且如表18中所列出的，与亲本克隆子5E5VH5_VL8相比，测试的大多数人源化抗体显示出显著改善的解链温度。然而，mAb14的解链温度明显低于5E5VH5_VL8。
表18.人源化抗ApoC3抗体的解链温度。
抗ApoC3抗体 解链温度℃(EC50)
5E5VH5_VL8 62.9
mAb7 64.2
mAb9 65.9
mAb14 57.1
mAb17 65.9
mAb18 61.8
在前述测定中还评估了mAb13的耐热性，以确定观察到的耐热性变化是否与用于变体13和14的CDR移植的种系构架序列有关。在扩展的温度范围内进行该测定，以涵盖了人源化抗体和5E5VH5_VL8(作为对照)的预期溶解温度。如图5C所示，mAb13和mAb14具有相似的耐热曲线，并且二者显示出的溶解温度约为57℃，比5E5VH5_VL8的溶解温度低约6℃。
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本发明的范围不受本文所公开的具体实施例限制。实际上，根据前文的描述和附图，除了所描述的修改之外的本发明的各种修改对于本领域技术人员来说将变得显而易见。此类修改旨在落入所附权利要求书的范围内。
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其它实施例在以下权利要求书内。

Claims (45)

1.一种与ApoC3特异性结合的分离的抗体，所述抗体包含包括互补决定区CDRH1、CDRH2和CDRH3的重链可变区以及包括互补决定区CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区，其中：
(a)CDRH1包括氨基酸序列TYSMR(SEQ ID NO:3)；
(b)CDRH2包括氨基酸序列SIHTX1X2GGTAYRDSVKG，其中X1是G、E或D，并且X2是G或A(SEQID NO:87)；
(c)CDRH3包括氨基酸序列AGYSD(SEQ ID NO:10)；
(d)CDRL1包括氨基酸序列KTSQGLVHSXGKTYFY，其中X是D或G(SEQ ID NO:88)；
(e)CDRL2包括氨基酸序列QVSNRAS(SEQ ID NO:7)；并且
(f)CDRL3包括氨基酸序列AXGTYYPHT，其中X是Q或H(SEQ ID NO:8)，并且
其中所述抗体的CDRH1、CDRH2和CDRH3分别不是SEQ ID NO:3、9、10；3、11、10；3、9、12；或3、11、12。
2.根据权利要求1所述的分离的抗体，其中CDRH2包括氨基酸序列SIHTGGGGTAYRDSVKG(SEQ ID NO:36)、SIHTEAGGTAYRDSVKG(SEQ ID NO:37)、SIHTDAGGTAYRDSVKG(SEQ ID NO:38)或SIHTEGGGTAYRDSVKG(SEQ ID NO:39)。
3.根据权利要求1或2所述的分离的抗体，其中CDRL1包括氨基酸序列KTSQGLVHSDGKTYFY(SEQ ID NO:6)或KTSQGLVHSGGKTYFY(SEQ ID NO:40)。
4.根据权利要求1到3中任一项所述的分离的抗体，其中CDRL3包括氨基酸序列AHGTYYPHT(SEQ ID NO:14)或AQGTYYPHT(SEQ ID NO:13)。
5.根据权利要求1到4中任一项所述的分离的抗体，其中所述CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包括SEQ ID NO:3、36、10、6、7和14；3、37、10、40、7和14；3、38、10、40、7和14；3、38、10、6、7和14；3、39、10、6、7和14；或3、37、10、40、7和13中所示的氨基酸序列。
6.一种与ApoC3特异性结合的分离的抗体，所述抗体包括重链可变区，所述重链可变区包括选自由SEQ ID NO:42-53组成的组的氨基酸序列。
7.一种与ApoC3特异性结合的分离的抗体，所述抗体包括轻链可变区，所述轻链可变区包括选自由SEQ ID NO:54-65组成的组的氨基酸序列。
8.一种与ApoC3特异性结合的分离的抗体，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区和所述轻链可变区分别包括SEQ ID NO:42和54、43和55、44和56、45和57、46和58、46和54、47和58、47和54、48和58、48和54、49和59、49和60，50和59、50和60、51和61、52和62、53和62、43和63、44和64或45和65中所示的氨基酸序列。
9.根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体是人源化抗体。
10.根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体进一步包括人恒定区。
11.根据权利要求10所述的分离的抗体，其中所述恒定区是野生型人免疫球蛋白重链恒定区的变体，并且其中相对于野生型人免疫球蛋白重链恒定区在pH 6下对人新生儿Fc受体(FcRn)的亲和力，所述变体人免疫球蛋白重链恒定区在pH 6下对人FcRn具有增加的亲和力。
12.根据权利要求10或11所述的分离的抗体，其中所述恒定区是人IgG的重链恒定区。
13.根据权利要求12所述的分离的抗体，其中所述恒定区是人IgG1、IgG2或IgG4的重链恒定区。
14.根据权利要求10到13中任一项所述的分离的抗体，其中所述恒定区包括分别位于EU位置433、434和436处的氨基酸K、F和Y。
15.根据权利要求10到13中任一项所述的分离的抗体，其中所述恒定区包括分别位于EU位置252、254和256处的氨基酸Y、T和E。
16.根据权利要求10到13中任一项所述的分离的抗体，其中所述恒定区包括分别位于EU位置428和434处的氨基酸L和S。
17.根据权利要求10到13中任一项所述的分离的抗体，其中所述恒定区包括选自由SEQID NO:22-24、76-78和81-86组成的组的氨基酸序列。
18.根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗体，所述分离的抗体包括重链，所述重链包括选自由SEQ ID NO:66-73组成的组的氨基酸序列。
19.根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗体，所述分离的抗体包括轻链，所述轻链包括SEQ ID NO:74中所示的氨基酸序列。
20.根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗体，所述分离的抗体包括重链和轻链，其中所述重链和所述轻链分别包括SEQ ID NO:66和74、67和74、68和74、69和74、70和74、71和74、72和74或73和74中分别所示的氨基酸序列。
21.根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗体，其中所述ApoC3是人ApoC3。
22.一种药物组合物，所述药物组合物包括根据前述权利要求中任一项所述的抗体和药学上可接受的载剂。
23.一种多核苷酸，所述多核苷酸对根据权利要求1到21中任一项所述的抗体的重链可变区和/或轻链可变区进行编码。
24.一种表达载体，所述表达载体包括根据权利要求23所述的多核苷酸。
25.一种宿主细胞，所述宿主细胞包括根据权利要求23所述的多核苷酸或根据权利要求24所述的表达载体。
26.一种用于产生与ApoC3结合的抗体的方法，所述方法包括在允许表达所述抗体的条件下培养根据权利要求25所述的宿主细胞。
27.一种用于抑制受试者中ApoC3活性的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1到22中任一项所述的抗体或药物组合物。
28.一种用于降低受试者血液中的甘油三酯水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1到22中任一项所述的抗体或药物组合物。
29.一种用于抑制受试者的餐后血脂的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1到22中任一项所述的抗体或药物组合物。
30.一种用于治疗受试者的高甘油三酯血症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1到22中任一项所述的抗体或药物组合物。
31.一种用于治疗受试者的乳糜微粒血症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1到22中任一项所述的抗体或药物组合物。
32.一种用于降低患有高甘油三酯血症的受试者患心血管疾病的风险的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1到22中任一项所述的抗体或药物组合物。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述心血管疾病是心肌梗塞。
34.根据权利要求32所述的方法，其中所述心血管疾病是心绞痛。
35.根据权利要求32所述的方法，其中所述心血管疾病是中风。
36.根据权利要求32所述的方法，其中所述心血管疾病是动脉粥样硬化。
37.根据权利要求27到36中任一项所述的方法，其中所述抗体降低所述受试者血液中乳糜微粒或乳糜微粒残留物的水平。
38.根据权利要求27到36中任一项所述的方法，其中所述受试者正在接受另外的降脂剂。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述另外的降脂剂是HMG-CoA还原酶抑制剂。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述HMG-CoA还原酶抑制剂是阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀或辛伐他汀。
41.根据权利要求38所述的方法，其中所述另外的降脂剂是PCSK9抑制剂。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述PCSK9抑制剂是阿利库单抗(alirocumab)、依洛尤单抗(evolocumab)或博科西单抗(bococizumab)。
43.根据权利要求38所述的方法，其中所述另外的降脂剂是依泽替米贝(ezetimibe)。
44.根据权利要求38所述的方法，其中所述另外的降脂剂是依泽替米贝和HMG-CoA还原酶抑制剂的组合。
45.根据权利要求38所述的方法，其中所述另外的降脂剂是依泽替米贝、HMG-CoA还原酶抑制剂和PCSK9抑制剂的组合。
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