JP2016537406A - システイニルロイコトリエン(cysLT)との結合のための疾病治療用組成物およびその方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、一つ以上のcysLTの異常な数値と関連された炎症性疾病および喘息を含む疾病治療用の一つ以上のシステイニルロイコトリエン(cysteinyl leukotrienes、cysLT)と結合する抗体を使用する方法に関するものである。また、本発明は、抗−cysLT抗体および抗原に結合する前記抗体の断片、および前記抗体および前記抗体断片を含む組成物に関するものである。
Description
本発明はシステイニルロイコトリエン(cysteinyl−leukotrienes、cysLTs)と結合する抗体を使用して気道炎症に代表される疾病を含む疾病を治療する方法に関するものである。また、本発明は一つ以上のcysLTと結合する抗体、具体的には、単クローン抗体に関するものである。
序列目録
本出願書は電子出願システムによって2014年10月24日付で提出された序列目録を含み、前記序列目録全体が本明細書に参照として含まれる。2014年10月24日付けで生成されたASCII写本はLPT3500PC.txtと命名され、大きさは40、640バイトである。
本出願書は電子出願システムによって2014年10月24日付で提出された序列目録を含み、前記序列目録全体が本明細書に参照として含まれる。2014年10月24日付けで生成されたASCII写本はLPT3500PC.txtと命名され、大きさは40、640バイトである。
1.序論
後述される説明は本発明を理解するにおいて有用な情報を含む。本明細書で提供されるすべての情報または本明細書で具体的にまたは内在的に参照される従来のすべての公開文書が本発明の請求項と関連するものとして許与されるものではない。
後述される説明は本発明を理解するにおいて有用な情報を含む。本明細書で提供されるすべての情報または本明細書で具体的にまたは内在的に参照される従来のすべての公開文書が本発明の請求項と関連するものとして許与されるものではない。
2.背景技術
生理活性信号脂質
現在、脂質およびこれらの誘導体は、細胞膜の単なる構造的要素またはβ−酸化、該当作用またはその他の代謝過程のエネルギー源としてではなく、医学研究のための重要な対象と認識される。具体的には、ある生理活性脂質は動物および人間の疾病で重要な信号調節者として機能する。たとえ、原形質膜の多くの脂質が構造的な役割だけを遂行するものであるとしても、これらのうちの少数は細胞外刺激を細胞内に伝達することに関与する。このような脂質は「生理活性脂質」または「生理活性信号脂質」と言及される。「脂質信号」は第2伝令(messenger)として細胞膜脂質を使う数多くのすべての細胞の信号伝達経路を意味するだけでなく、この特定受容体を有する脂質信号分子の直接的な相互作用を意味する。脂質信号経路は成長因子および炎症性サイトカイン(inflammatory cytokines)を含む数多くの細胞外刺激によって活性化され、老化、分化、および増殖のような細胞運命決定を調節する。生理活性脂質信号に対する研究は、より多くの生理活性脂質が確認され、これらの機能が糾明されるほどこれに対する科学的探求はさらに深化される。
生理活性信号脂質
現在、脂質およびこれらの誘導体は、細胞膜の単なる構造的要素またはβ−酸化、該当作用またはその他の代謝過程のエネルギー源としてではなく、医学研究のための重要な対象と認識される。具体的には、ある生理活性脂質は動物および人間の疾病で重要な信号調節者として機能する。たとえ、原形質膜の多くの脂質が構造的な役割だけを遂行するものであるとしても、これらのうちの少数は細胞外刺激を細胞内に伝達することに関与する。このような脂質は「生理活性脂質」または「生理活性信号脂質」と言及される。「脂質信号」は第2伝令(messenger)として細胞膜脂質を使う数多くのすべての細胞の信号伝達経路を意味するだけでなく、この特定受容体を有する脂質信号分子の直接的な相互作用を意味する。脂質信号経路は成長因子および炎症性サイトカイン(inflammatory cytokines)を含む数多くの細胞外刺激によって活性化され、老化、分化、および増殖のような細胞運命決定を調節する。生理活性脂質信号に対する研究は、より多くの生理活性脂質が確認され、これらの機能が糾明されるほどこれに対する科学的探求はさらに深化される。
システイニルロイコトリエン(cysteinyl leukotrienes、cysLT)
ロイコトリエンは、アラキドン酸5−リポキシゲナーゼ(arachidonate 5−lipoxygenase)によるアラキドン酸(arachidonic acid)の酸化によって白血球から生成される炎症のエイコサノイド(eicosanoid)脂質調節者の群(family)である。このような化合物は四個の二重結合を有し、これらのうち三個は結合されている(したがって、「ロイコトリエン」と命名される)。ロイコトリエンはロイコトリエンA4(LTA4)、ロイコトリエンB4(LTB4)、ロイコトリエンC4(LTC4)、ロイコトリエンD4(LTD4)、およびロイコトリエンE4(LTE4)だけでなく、ロイコトリエンF4(LTF4)を含み、これらは現在、合成によって生産される(LTF4 Product Information Sheet、Item no. 20520、Cayman Chemical、Ann Arbor MI)。また、ロイコトリエンG4(LTG4)はLTE4のアミノ基転移(transamination)による体外疾患でのみ確認され、本来の動物組織または体液では発見されていない(LTG4 Product Information Sheet、Item no. 20610、Cayman Chemical、Ann Arbor MI)。
ロイコトリエンは、アラキドン酸5−リポキシゲナーゼ(arachidonate 5−lipoxygenase)によるアラキドン酸(arachidonic acid)の酸化によって白血球から生成される炎症のエイコサノイド(eicosanoid)脂質調節者の群(family)である。このような化合物は四個の二重結合を有し、これらのうち三個は結合されている(したがって、「ロイコトリエン」と命名される)。ロイコトリエンはロイコトリエンA4(LTA4)、ロイコトリエンB4(LTB4)、ロイコトリエンC4(LTC4)、ロイコトリエンD4(LTD4)、およびロイコトリエンE4(LTE4)だけでなく、ロイコトリエンF4(LTF4)を含み、これらは現在、合成によって生産される(LTF4 Product Information Sheet、Item no. 20520、Cayman Chemical、Ann Arbor MI)。また、ロイコトリエンG4(LTG4)はLTE4のアミノ基転移(transamination)による体外疾患でのみ確認され、本来の動物組織または体液では発見されていない(LTG4 Product Information Sheet、Item no. 20610、Cayman Chemical、Ann Arbor MI)。
システイニルロイコトリエン(cysLT)は、これらの構造内のシステイン残基によってこのように命名される。LTC4、LTD4、LTE4およびLTF4はシステイニルロイコトリエンである。LTF4は自然的に発生するものとは見えないため、疾病および治療学的脈絡で、一般的に「cysLT」は、LTC4、LTD4およびLTE4を言及する。本発明の脈絡で、「cysLT」または「cysLT」は、自然的に発生し、疾病またはその他の健康に有害な疾患と関連性があるか関連された一つ以上のシステイニルロイコトリエンを意味する。具体的に、好ましくは、cysLTターゲットはLTC4、LTD4およびLTE4を含み、これらの構造は下記で図示される。
図示されたように、このようなcysLTの極性頭部基(head group)は互いに異なるが、非極性の炭化水素の尻尾部(各図面の左側に図示される)は前記三個のすべての化合物で同一である。
cysLTの合成
cysLTは早く生成されるが、例えば、炎症部分で、次のような一連の反応はアラキドン酸の放出を引き起こす。5−リポキシゲナーゼ(5−Lipoxygenase、5−LO)はアラキドン酸を5−ヒドロペルオキシエイコサテトラエン酸(5−hydroperoxyeicosatetraenoic acid、5−HPETE)に転換するために5−LO活性蛋白質(5−LO Activating Protein、FLAP)を使用し、これは自然発生的に5−ヒドロオキシエイコサテトラエン酸(5−hydroxyeicosatetraenoic acid、5−HETE)に還元する。5−LO酵素は5−HETEをロイコトリエンA4(5S、6S−エポキシ−7E、9E、11Z、14Z−エイコサテトラエン酸(5S、12R−ジヒドロキシ−6Z、8E、10E、14Z−eicosatetraenoic acid)、LTA4)に転換するために5−HETEを転換するが、このような反応は不安定である。LTA4はLTA4加水分解酵素によってジヒドロキシ酸ロイコトリエンB4(5S、12R−ジヒドロキシ−6Z、8E、10E、14Z−エイコサテトラエン酸(5S、12R−dihydroxy−6Z、8E、10E、14Z−eicosatetraenoic acid、LTB4)に転換される。LTB4は好中性白血球用化学走化性因子(chemoattractant)である。
cysLTは早く生成されるが、例えば、炎症部分で、次のような一連の反応はアラキドン酸の放出を引き起こす。5−リポキシゲナーゼ(5−Lipoxygenase、5−LO)はアラキドン酸を5−ヒドロペルオキシエイコサテトラエン酸(5−hydroperoxyeicosatetraenoic acid、5−HPETE)に転換するために5−LO活性蛋白質(5−LO Activating Protein、FLAP)を使用し、これは自然発生的に5−ヒドロオキシエイコサテトラエン酸(5−hydroxyeicosatetraenoic acid、5−HETE)に還元する。5−LO酵素は5−HETEをロイコトリエンA4(5S、6S−エポキシ−7E、9E、11Z、14Z−エイコサテトラエン酸(5S、12R−ジヒドロキシ−6Z、8E、10E、14Z−eicosatetraenoic acid)、LTA4)に転換するために5−HETEを転換するが、このような反応は不安定である。LTA4はLTA4加水分解酵素によってジヒドロキシ酸ロイコトリエンB4(5S、12R−ジヒドロキシ−6Z、8E、10E、14Z−エイコサテトラエン酸(5S、12R−dihydroxy−6Z、8E、10E、14Z−eicosatetraenoic acid、LTB4)に転換される。LTB4は好中性白血球用化学走化性因子(chemoattractant)である。
好酸球(eosinophils)、好塩球(basophils)、肥満細胞(mast cells)、および肺胞大食細胞(alveolar macrophages)のようなLTC4シンターゼ(synthase)を発現する細胞で、LTA4はトリペプチドグルタチオン(tripeptide glutathione)と結合してcysLTの中の最初のLTC4(5S−ヒドロキシ−6R−(S−グルタチオニル)−7E、9E、11Z、14Z−エイコサテトラエン酸(5S−hydroxy−6R−(S−glutathionyl)−7E、9E、11Z、14Z−eicosatetraenoic acid))を形成する。細胞外部では、LTC4は随所に存在する酵素(ubiquitous enzymes)により転換され、グルタミン酸モイエティ(moiety)の切断によって引き続きLTD4(5S−ヒドロキシ−6R−(S−システインイルグリシニル)−7E、9E、11Z、14Z−エイコサテトラエン酸(5S−hydroxy−6R−(S−cysteinylglycinyl)−7E、9E、11Z、14Z−eicosatetraenoic acid))を形成する。LTD4はグリシンモイエティの切断によってLTE4(5S−ヒドロキシ−6R−(S−システイニル)−7E、9E、11Z、14Z−エイコサテトラエン酸(5S−hydroxy−6R−(S−cysteinyl)−7E、9E、11Z、14Z−eicosatetraenoic acid))に転換され得る。LTC4、LTD4およびLTE4は生物学的活性を有し、LTE4はこれら三種類の化合物のうち最も安定で豊富なものと見なされる。
cysLT受容体
cysLTは、炎症性疾病の病理生理学での強力な生物学的調節者であり、細胞表面受容体との特定の相互作用によって収縮性の炎症過程を誘導し、G蛋白質共役受容体の上科(superfamily)に属する。現在、二つのcysLT受容体が人間と実験ネズミで同定されており、cysLT1およびcysLT2と命名される。このような二つの受容体は、構造的に相異し、実験ネズミと人間のcysLT1およびcysLT2のアミノ酸相同性は40%未満である(Kanaoka、Y. およびJ.A. Boyce、J Immunol 173:1503−1510、2004年)。cysLT1受容体は、脾臓および末梢血白血球で最も強く発現され、肺、小腸、結腸、膵臓および胎盤それよりは弱く発現されると見なされ、喘息を含む気道炎症に関連されたものと知られている。cysLT1受容体のようにcysLT2受容体は脾臓および末梢血白血球で発現されるが、cysLT2受容体だけが心臓、脳、および副腎で発現されるものと見なされる(検討のための参照文献、Singhなど、2010年、Pharmacol 85:336−349)。
cysLTは、炎症性疾病の病理生理学での強力な生物学的調節者であり、細胞表面受容体との特定の相互作用によって収縮性の炎症過程を誘導し、G蛋白質共役受容体の上科(superfamily)に属する。現在、二つのcysLT受容体が人間と実験ネズミで同定されており、cysLT1およびcysLT2と命名される。このような二つの受容体は、構造的に相異し、実験ネズミと人間のcysLT1およびcysLT2のアミノ酸相同性は40%未満である(Kanaoka、Y. およびJ.A. Boyce、J Immunol 173:1503−1510、2004年)。cysLT1受容体は、脾臓および末梢血白血球で最も強く発現され、肺、小腸、結腸、膵臓および胎盤それよりは弱く発現されると見なされ、喘息を含む気道炎症に関連されたものと知られている。cysLT1受容体のようにcysLT2受容体は脾臓および末梢血白血球で発現されるが、cysLT2受容体だけが心臓、脳、および副腎で発現されるものと見なされる(検討のための参照文献、Singhなど、2010年、Pharmacol 85:336−349)。
前記二つのcysLT受容体は、異なる特徴を有すると見られる。人間cysLT1Rは、LTD4に対する高親和力(high−affinity)受容体である反面、人間cysLT2RはLTC4およびLTD4に対して同じ親和力を有するが、いかなる受容体もLTE4に対する相当な親和力を有さない。LTE4に対する選好度を有する追加的なcys−LT受容体の存在が長い間推測されてきたが、明確に確認されたことはない。アデノシンジホスフェート(adenosine diphosphate、ADP)−反応性プリン(reactive purinergic、P2Y12)受容体は、LTE4の機能に必要なものと提案されてきた(Paruchuriなど、2009年、J Exp Med 206:2543−2555)。また、分離されたLTE4受容体の存在がMaekawaなどによって報告された(2008年、Proc Natl Acad Sci 105:16695−16700)。
cysLT1受容体拮抗物質(antagonists、例えば、モンテルカスト(montelukast、SINGULAIR TM)、ザフィルルカスト(zafirlukast)、およびプランルカスト(pranlukast))が開発され、喘息、運動誘発性気管支収縮、およびアレルギー性鼻炎の予防および長期間治療のために広く処方される。モンテルカストの作用メカニズム(すなわち、cysLT1R上でLTD4だけでなく、LTC4およびLTE4の作用を遮断する)により、モンテルカストは一般的に喘息急性期治療のために提供されず、むしろ、時々吸入されたコルチコステロイド(corticosteroid)に対する補完的治療として提供される。しかし、急性喘息で高容量のモンテルカスト投薬が提案されてきた(Wuなど、2003年、Clin & Exp Allergy 33:359-366)。
疾病状態でcysLT
cysLTは病理生理学的疾病、具体的には、喘息、アレルギー性鼻炎、およびその他のアレルギーのような呼吸器系疾病および疾患を含む炎症性疾病および疾患で作用し、気道過敏症疾患(airway hyperresponsiveness)、心血管疾患、脳血管疾患、癌、胃腸疾患、およびアトピー性皮膚炎、蕁麻疹を含む皮膚疾患を含む疾患と関連されたものと思われてきた。cysLTは強力な血管収縮神経剤(vasoconstrictor)である(Capraなど、2007年、Med Res Rev、27:469−527、Riccioniなど、2008年、J. Leukocyte Biol J. Leukocyte Biol 84:1374−1378. Riccioni、GおよびM Back. ScientificWorldJournal、2012年5月1日付にオンライン上に公開される。doi:10.1100/2012/490968. Singh、2010年、Pharmacol 85:336?349)。
cysLTは病理生理学的疾病、具体的には、喘息、アレルギー性鼻炎、およびその他のアレルギーのような呼吸器系疾病および疾患を含む炎症性疾病および疾患で作用し、気道過敏症疾患(airway hyperresponsiveness)、心血管疾患、脳血管疾患、癌、胃腸疾患、およびアトピー性皮膚炎、蕁麻疹を含む皮膚疾患を含む疾患と関連されたものと思われてきた。cysLTは強力な血管収縮神経剤(vasoconstrictor)である(Capraなど、2007年、Med Res Rev、27:469−527、Riccioniなど、2008年、J. Leukocyte Biol J. Leukocyte Biol 84:1374−1378. Riccioni、GおよびM Back. ScientificWorldJournal、2012年5月1日付にオンライン上に公開される。doi:10.1100/2012/490968. Singh、2010年、Pharmacol 85:336?349)。
cysLT数値は疾病で上昇すると見られてきた。例えば、cysLT過生成は好酸球活性化(eosinophilic activation)の誘導で核心因子であると見なされた。AERD患者で、小便、痰、末梢血、および吐き出された呼吸におけるcysLT数値上昇がアスピリン(aspirin)投与後に観察された。ロイコトリエンE4は、他のcysLTよりさらに強力で、ヒスタミン誘導性気道反応(histamine−induced airway responsiveness)の増加、好酸性物質補充、およびこれによる血管透過性の増加に寄与すると見られてきた(Palikheなど、2009年、Yonsei Med J 50:744−750)。cysLTは喘息および鼻炎の両方で見られる炎症に積極的に関与される。LTE4吸入剤は非常に強力な気管支収縮因子であり、組織内に炎症細胞、特に好酸球の補充を誘導する。喘息患者の痰は鼻炎患者または健康な正常の人と比較して高い数値のCys−LTを含む(Tuvfessonなど、2007年、Clin & Exp Allergy 37:1067−1073)。cysLTの分泌は冠状動脈疾病である可変性狭心症および急性心筋梗塞の繰り返される症状発現後に、冠状動脈迂迴路術後に、また、アトピー性皮膚炎、リューマチ性関節炎、クローン病(Crohn’s disease)、および悪性星細胞種(astrocytoma)患者で報告されてきた(Capra、ibid. 「Slow−reacting substance of anaphylaxis(SRS−A) is a mixture of LTC4、LTD4、およびLTE4. Samuelsson、B、1983年、Science 220:568−575)。
中枢神経系で、cysLTは、脳卒中および外傷性脳損傷(traumatic brain負傷、TBI)のような数多くの急性脳損傷に対する反応で生成される。cysLT受容体拮抗物質は、脳卒中実験動物モデルで実験による脳動脈閉塞後に梗塞部の大きさを減少させると見られた。LTC4およびLTD4数値はTBIラットモデルで上昇し、傷発生後、約1時間程度で最高値となる(Fariasなど、2009年、J Neurotrauma 26:1977−1986)。
また、cysLTは心血管問題および疾病に関連される。例えば、小便でLTE4数値は睡眠性無呼吸および急性冠動脈症候群患者で増加し、急性低酸素ストレスの間モンテルカストを使う治療によるcys−LT信号抑制は、Apoe‐/‐実験ネズミの心筋低酸素の部分を正常酸素条件下で観察された数値に下げる(Nobiliなど、2012年、PLoS One 7:e41786)。
内皮障壁は血管および組織恒常性を厳格に維持し、したがって血管透過性は全体機関の随所で血管形成、免疫反応、および動的交換のような数多くの生理的過程を調節する。cysLT1受容体によって作用をするcysLTは、先天および後天免疫のすべてを有する動物モデルで増加した血管透過性の調節に重要な役割をする(KanaokaおよびBoyce、2004年、J Immunol 173:1503−1510)。内皮障壁は血管および組織恒常性を厳格に調節し、したがって血管透過性は全体器官の至る所で血管形成、免疫反応、および動的交換のような数多くの生理的過程を調節する(Azziなど、2013年、Front. Oncol.、3:1−14、論文211)。したがって、cysLT(入る)の抑制剤は、非制限的な例として、炎症性疾患およびアレルギー性疾患を含む異常な血管透過性の特徴を有する疾病に対して有効なものと考えられる。
喘息およびアスピリン過敏性(aspirin−exacerbated)呼吸器系疾病(AERD)
cysLTは、気道炎症を誘導し、喘息、具体的には、特異的な喘息表現型であるアスピリン過敏性呼吸器系疾病(AERD)またはアスピリン中毒喘息(aspirin−intolerant asthma、ATA)の発病に関連した強い脂質調節者である。これは慢性的な鼻炎、副鼻腔炎、再発性ポリープ、および喘息を引き起こす上下部気道の慢性的な深刻な炎症に関連された臨床症候群である。AERDは一般的に炎症調節者およびアラキドン酸生合成発現の異常後に発生する。上下部気道好酸球浸潤はAERDの核心的な特徴であるが、このような慢性的な好酸球性炎症の正確なメカニズムは完全に理解されていない状態である。cysLT過生成は好酸球活性化を誘導するにあたって核心的な要素であり得る。cysLTで最も豊富な代謝産物であるロイコトリエンE4(Leukotiene E4、LTE4)は肺の好酸球補充の強い誘導因子/増幅因子である(Palikheなど、2009年、AERD症状の臨床的管理が要求されている。AERD患者はアスピリン耐性喘息(aspirin−tolerant asthma、ATA)患者らと比較して非可逆的気流閉塞症および頻繁な病状悪化を含むさらに深刻な喘息表現型を示し得る。また、アスピリン投薬は顕著な罹患率(morbidity)および死亡率に帰結され得、患者にアスピリンの危険性と関連して注意を与えなければならない。
cysLTは、気道炎症を誘導し、喘息、具体的には、特異的な喘息表現型であるアスピリン過敏性呼吸器系疾病(AERD)またはアスピリン中毒喘息(aspirin−intolerant asthma、ATA)の発病に関連した強い脂質調節者である。これは慢性的な鼻炎、副鼻腔炎、再発性ポリープ、および喘息を引き起こす上下部気道の慢性的な深刻な炎症に関連された臨床症候群である。AERDは一般的に炎症調節者およびアラキドン酸生合成発現の異常後に発生する。上下部気道好酸球浸潤はAERDの核心的な特徴であるが、このような慢性的な好酸球性炎症の正確なメカニズムは完全に理解されていない状態である。cysLT過生成は好酸球活性化を誘導するにあたって核心的な要素であり得る。cysLTで最も豊富な代謝産物であるロイコトリエンE4(Leukotiene E4、LTE4)は肺の好酸球補充の強い誘導因子/増幅因子である(Palikheなど、2009年、AERD症状の臨床的管理が要求されている。AERD患者はアスピリン耐性喘息(aspirin−tolerant asthma、ATA)患者らと比較して非可逆的気流閉塞症および頻繁な病状悪化を含むさらに深刻な喘息表現型を示し得る。また、アスピリン投薬は顕著な罹患率(morbidity)および死亡率に帰結され得、患者にアスピリンの危険性と関連して注意を与えなければならない。
ロイコトリエン受容体拮抗物質は、長期間AERD管理および副鼻腔炎に有用である。アスピリン脱感覚(desensitization)はAERD患者での上下部気道症状を軽減させるのに必要であり得る。増加したcysLTは、AERD発病において強い前−炎症性調節者(pro−inflammatory mediators)および気管支収縮因子である。小便、痰、末梢血、および吐き出された呼吸でCys−LT数値増加はAERD患者でアスピリン投与後にすでに観察されたところがある(Hamadなど、2004年、Drugs64:2417−2432(抄録の部分に限る、Palikheの前半部に引用される)。AERD患者はさらに高い吐き出された酸化窒素数値およびさらに高いベースライン水準(ベースライン数値) cysLT(具体的には、唾液、痰、体外血液、および小便でのLTE4はAERD患者からより高い)を有する(Gaberなど、2008年、Thorax 63:1076−1082)。
喘息のような呼吸器系疾病を有する実験動物モデルは広く利用される。急性および慢性的なアレルゲン(allergen)すべてを有する試験動物モデルが知られている(参照、例えば、NialsおよびUddin、2008年、Dis Model Mech. 1:213‐220)。誘導された喘息を有する卵アルブミン(ovalbumin)動物モデルが一般的に使われ、これらは急性喘息モデル(例えば、Wuなど(2003)、Clin & Exp Allergy 33:359‐366)または慢性的な喘息モデル(例えば、Temelkovskiなど(1998)、Thorax 53:849‐856)で改質され得る。ダニおよびゴキブリ抽出物のような自然のアレルゲンによって誘導された気道炎症実験ネズミモデルも開発された(Johnsonなど、2004年、Am J Respir Crit Care Med. 169:378‐385;およびSarpongなど、2003年、Int Arch Allergy Immunol 132、346‐354)。この他に、重要な末端合成酵素(terminal synthetic enzyme)(すなわち、マイクロ綿(microsomal) PGE2シンターゼ(mPGES)−1(ptges(‐/‐)実験ネズミまたはPGE2シンターゼ−1欠乏実験ネズミ))が足りない実験ネズミは好酸球性肺炎症動物モデルでAERDと類似の表現型で表れ、アスピリンによるPGE2シンターゼ−1欠乏実験ネズミは肺肥満細胞(MC)活性およびcysLT過生成と共に気道抵抗の持続的な増加を示すと報告された(Liuなど、2013年、Proc Natl Acad Sci U S A. 110:16987−92)。
喘息を治療するにあたって、抗体の使用は知られている。オマリズマブ(Omalizumab、XOLAIR、Genentech)はアレルゲン特異性とは無関係に循環するIgEに結合する再調合人間化IgG1単クローン抗−IgE抗体である。概念立証研究によって、オマリズマブはアレルゲン吸入投与後に初期および後期段階の喘息反応を減少させることが確認された(StrunkおよびBloomberg、2006年、N Engl J Med 354:2689−2695)。オマリズマブは多年性空気アレルゲン(perennial aeroallergen)に対する陽性皮膚テストまたは体外反応性を有志、吸入用コルチコステロイドによる症状調節が適切になされない重症〜深刻な難治性喘息がある成人および青少年に投薬処方される。
cysLTの抗体は知られている。例えば、システイニルロイコトリエンELISAキットは(ジョージア州、アトランタ(製品番号:ABIN930368、antibodies−online、Inc.で購入可能)人間(製品番号:ABIN626393)、ラット、実験ネズミ、ギニー・ピッグ、ウサギcysLT、およびその他のcysLTに対して特徴的である。人間LTE4探知のために敏感度および特異性を有するELISAキットも前記メーカーで購入可能である(製品番号:ABIN366715)。LTE4 ELISAキット(製品番号:MBS161552、MBS722103、およびMBS703833、他のcysLTに対する結合と関連して、ある特異的なデータが前記で提供されない)は、MyBioSource Inc.(カリフォルニア州、サンディエゴ所在)で購入可能である。人間LTD4である別途のELISAキットも前記メーカーで購入可能である(製品番号. MBS260801);他のcysLTに対する交差反応性に対する、ある特異的なデータが提供されない。
専売単クローン抗体を使うシステイニルロイコトリエンEIA(酵素免疫分析(enzymatic immunoassay))キットは、Cayman Chemical社で(ミシガン州、アンアボ所在、アイテム番号:500390)で購入可能である。前記システイニルロイコトリエンEIA単クローン抗体単独でも購買可能である(Cayman Chemical社、アイテム番号:500390)。前記抗体はLTC4およびLTD4に対して100%、LTE4に対して79%、および5、6−diHETE、LTB4、5−HETE、およびアラキドン酸に対して4%未満の相対的な特異性を有するものと目録化されている。LTC4に対する単クローン抗体(mAbLTC)が説明された。前記抗体はLTD4およびLTE4それぞれに対して5.4%および0.5%の交差反応性を見せると知られており、他のエイコサノイドとの反応性テストはなされなかった。Kawakamiなどは(2010年、BBRC 392:421‐425)前記抗体がLTC4内のグルタチオン(glutathione)モイエティのグルタミン(glutamate)残基を認識することを提示する。前記抗体の多様な領域を含む単鎖変数フラグメント(single−chain variable fragment、scFvLTC)が製造され、完全な単クローン抗体に対するこれの親和力および結合特異性が確認された。ScFvLTCは単クローン母抗体と比較してLTC4に対する高い親和力を見せ、LTC4結合と比較してLTD4およびLTE4とそれぞれ48%および17%反応性で結合し、LTB4に対しては親和力が殆どない。以後、KawakamiなどはmAbLTCおよびscFvLTCがcysLT1受容体(cysLT1R)およびcysLT2受容体(cysLT2R)に対するLTC4またはLTD4の結合を抑制することを見せてくれ、したがって、これらの受容体に対するこれらの結合を完成することによってLTの生物学的活性を中和するものと考えられた。興味深く、mAbLTCもcysLT2R拮抗物質(HAMI3379、BaycysLT2)と結合したが、cysLT1R拮抗物質(プランルカスト、MK−571)とは結合せず、これによってKawakamiなどは前記受容体位置と前記抗体のLT認識位置間の構造的類似性を提案する。mAbLTC投与によって喘息がある卵アルブミン(OVA)−誘導ネズミ科動物モデルで肺好酸球性浸潤および杯状細胞過形成(goblet cell hyperplasia)が減少された(Kawakamiなど、2014年、Biochim et Biophys Acta 1840:1625−1633)。
1A−IDR1と命名されるスルフィドペプチドロイコトリエン(sulfidopeptide leukotrienes)に対するネズミ科単クローン抗体が説明されている。mAbは、LTC4、LTD4、LTE4、およびNac−LTE4のそれぞれに対して95.7%、100%、88.7%、および89.7%の反応性を見せると報告された。LTB4、アラキドン酸、またはl−システインまたはグルタチオンのようなLTペプチド(peptide chain)の成分に対する交差反応に対する観察は記録されたことがない(Reinkeなど、1991年、Biochim et Biophys Acta、Lipids and Lipid Metabolism、1081:274−278)。
HoppeなどはBSAと接合された(conjugated)LTE4またはLTC4に対して免疫化されたウサギが多クローン性の抗血清を生産することを報告した。LTE4コンジュゲート(conjugate)に対して免疫化されたウサギ由来の抗血清は、LTC4、LTD4、およびLTE4のそれぞれに対して46.32%、12.55%、および100%、そしてLTB4に対して0.79%の相対的な特異性を有すると報告された。他のligandに対する結合は有意でないと報告された。LTC4コンジュゲートで免疫化されたウサギ由来の抗血清は285 pgで抗体に対するラベル(lable)の結合を50%抑制し、したがって、LTC4を最もよく認識する物と知られた(Hoppeなど、1986年、FEBS Lett 208:26−30)。
Westcottなど(2007年、Anal Biochem 248、202−210)はPerSeptive BioResearch Products社(メサチュセツジュ、ケンブリッジ所在)で購入したマウス単クローン抗体がLTC4(55%)、LTD4(100%)、LTE4(51%)、およびN−アセチルLTE4に対して有意な交差反応性を有することを報告した。
本発明の出願人は一つ以上のcysLTの異常な数値と関連されるかこれで特徴づけられる疾病または疾患治療用方法および組成物を提供する。前記方法は一つ以上のcysLTに結合するかこれの効果的な濃度を減少させる(中和)単クローン抗体および人間化単クローン抗体を含む抗体を使う。cysLT受容体拮抗物質が治療的に使われる。反面、cysLTを使う直接的な妨害は有利な受容体基盤接近方法であると考えられるが、これはすべてのcysLTの中和はすべてのcysLT受容体を沈黙化すると考えられるためである。前述されたように、前記cysLT受容体拮抗物質は互いに異なる特異性を有し、典型的にただ一つのcysLT受容体(モンテルカストおよびその他の通常的に使われるcysLT受容体拮抗物質の場合はcysLT1)をターゲットする。これはLTEに対する他の受容体を信号に対して自由にさせ、ひいてはおそらく優勢にさせる。また、前述されたように、LTE4に対する受容体は、確認されておらず、受容体作用物質(agonist)によるLTE4の調節は不可能であるのが実状である。
発明の要約
本発明の目的は一つ以上のcysLTの異常な数値と関連された疾病または疾患治療用方法および組成物に関するものである。このような方法は、治療がなされるように典型的に効果的な容量の一つ以上のcysLTと結合する抗体または抗原に結合する抗体フラグメントを前記疾病または疾患がある人間被験者のような被験者に投与する段階を含む。
本発明の目的は一つ以上のcysLTの異常な数値と関連された疾病または疾患治療用方法および組成物に関するものである。このような方法は、治療がなされるように典型的に効果的な容量の一つ以上のcysLTと結合する抗体または抗原に結合する抗体フラグメントを前記疾病または疾患がある人間被験者のような被験者に投与する段階を含む。
一つ以上のcysLTの異常な数値と関連された疾病または疾患を治療する方法が提供され、前記方法は一つ以上のcysLTと結合する抗体またはこれのフラグメントを効果的な容量で前記疾病または疾患がある被験者に投与する段階を含む。前記疾病または疾患は、例えば、炎症性疾病、アレルギー、心血管疾病または疾患、異常な血管透過性で特徴づけられる疾病または疾患、中枢神経系疾病または疾患、癌、皮膚疾患、胃腸疾患、リューマチ性関節炎、または喘息、アスピリン過敏性呼吸器系疾病(AERD)、気道過敏症、およびアレルギー性鼻炎を含む呼吸器系疾病または疾患であり得る。
一つ以上のcysLTを効果的な濃度に下げる抗体および抗原に結合する抗体フラグメントは前記で目録化されたもののようなcysLTの異常な数値と関連された疾病および疾患の治療方法に有用なものと考えられる。具体的には、一つ以上のcysLTと結合する前記抗体(および抗原に結合する抗体フラグメント)はAERDを含む喘息のような呼吸器系疾病および疾患を含むアレルギー性および炎症性疾病および疾患の治療に有用なものと考えられる。一部の具体例において、cysLTに対する前記の抗体は単クローン抗体である。一部の具体例において、前記抗体は優先的に一つ以上のcysLTに結合する。他の具体例において、前記抗体はLTC4、LTD4、およびLTE4に結合する汎−cysLT抗体(pan−cysLT antibodies)である。前記の抗体または前記抗体のフラグメントが一つ以上のcysLTと結合する時、前記抗体が前記cysLTに対して同じ効果を有することは要求されない。さらに他の具体例において、前記抗体(または抗原に結合する抗体フラグメント)は人間化され得る。
前述されたように、被験者の気道に影響を与える炎症を改善する方法も提供され、前記方法は効果的な容量の一つ以上のcysLTと結合する前記の抗体または前記抗体のフラグメントを前記被験者に投与する段階を含む。
また、分離された抗体またはこれらのcysLTと結合するフラグメント、これらを含む薬学的組成物、およびこれらを利用したELISAキットが提供される。また、免疫原または試薬(reagent)で使われ得る組成物が提供される。
本発明の前述された様態およびその他の様態は下記の詳細な説明および請求範囲によってさらに明確になるであろう。特に定義されない限り、本明細書で使われるすべての技術的かつ科学的な用語は本発明が属する当分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で説明されるものと類似またはこれに相応する方法および材料は本発明を実施またはテストするのに使われ得るが、適切な方法および材料は下記で説明される。本明細書で言及されるすべての公開文献、特許出願書、特許、その他の文献の全体内容は参照として本発明に含まれる。衝突がある場合、定義を含む本明細書がこれを調節する。また、本明細書に記載された材料、方法、および実施例は単に説明のためのものであり、本発明はこれに限定されるものではない。
本特許出願は有色で図示された少なくとも一つの図面を含む。有色の図面を含む本特許または特許出願公開の写本は官庁の要求によって必要な手数料支払い時に提供されるであろう。
図1A〜1Cは、抗−LTE4抗体の存在と関連された三匹の実験ネズミ由来の血清試料に対する直接的なELISA検査結果を示す三つの線グラフを連続的に図示する。実験ネズミはLTE4およびBCPのBS3−促進されたコンジュゲートであらかじめ免疫化された。図1Aには実験ネズミF4に対する結果を図示し、図1Bは実験ネズミE2に対する結果を図示し、図1Cは実験ネズミF3に対する結果を図示する。
図2A〜2Eは、高い抗体力価を表わす実験ネズミの脾臓から準備された5つのハイブリードマ(hybridoma)由来の培養上澄み液内の抗−LTE4抗体の存在と関連された直接的なELISA検査結果を示す5つの線グラフを連続的に図示する。図2Aは9B12ハイブリードマに対する結果を図示し、図2Bは2G9ハイブリードマに対する結果を図示し、図2Cはハイブリードマ10G4に対する結果を図示し、図2Dは14H3ハイブリードマに対する結果を図示し、図2Eは2F9ハイブリードマに対する結果を図示する。
図3A〜3Bは、LTC4、LTD4、LTE4、LTB4、14、15−LTE4、および5S−HETEに対する単クローン抗体である9B12(図3A)および10G4(図3B)の特異性を確認するための競争的(competition) ELISA結果を示す二つの線グラフを連続的に図示する。
賦形剤(1% DMSO)、LTC4を含む陰性対照群抗体であるLT1017、LTC4を含む抗−cysLT単クローン抗体である9B12、およびLTC4を含む抗−cysLT単クローン抗体である10G4を比較しながら、実験ネズミにおける血管透過性研究に対する予備結果を示す棒グラフを図示する。
塩水単独、1:1の割合で非特異的対照群(NS)抗体と事前培養されたLTC4、および抗−cysLT抗体2G9と(1:1または1:5の割合で)事前培養されたLTC4を比較し、実験ネズミにおける血管透過性に対するネズミ科の抗−cysLT抗体2G9の効果を示す散布図を図示する。前記の抗−cysLT抗体は(染料血管外漏出(dye extravasation)により測定されたものであって)血管透過性に対するLTC4の影響を中和した。
単に塩水だけを投与した実験ネズミ、LTC4処理24時間前に10G4抗体または非特異的対照群抗体(NS)の皮下注射で事前処理された実験ネズミ、および抗−cysLT抗体10G4と(1:1の割合で)事前培養されたLTC4が腹腔注射された実験ネズミを比較しながら、血管透過性に対するネズミ科の抗−cysLT抗体である10G4aの影響を示す散布図を図示する。前記の抗−cysLT抗体は24時間前に投与された時にも(染料血管外漏出によって測定されたものであって)血管の透過性に対するLTC4の影響を中和した。IPおよびSC投与経路の両方とも効果的であった。
静脈注射(i.v.)後、時間による実験ネズミの血漿でのネズミ科の抗−cysLT単クローン抗体である9B12(赤色)および10G4(緑色)の薬物動力学を示す線グラフを図示する。
腹腔内注射(i.p.)後、時間による実験ネズミ血漿でのネズミ科の抗−cysLT単クローン抗体である2G9(青色)および10G4(緑色)の薬物動力学を示す線グラフを図示する。
骨格領域(framework region)内に復帰突然変異(backmutation)がないか(LC、O12−0;HC、4−59.0)、全体セットの復帰突然変異(LC、O12.0;HC、4−59.0)を有する人間化10G4変異体に対する直接的なLTE4−結合ELISAデータを示す線グラフを図示する。
人間化10G4抗体変異体の直接的なLTE4−結合ELISAを示す線グラフを図示するもので、前記人間化10G4抗体変異体それぞれは一つの軽鎖復帰突然変異を有し、重鎖復帰突然変異は有さない(重鎖変異体4−59.0)。
人間化10G4抗体変異体の直接的なLTE4−結合ELISAを示す線グラフを図示するもので、前記人間化10G4抗体変異体それぞれは一つの軽鎖復帰突然変異および6つの重鎖復帰突然変異を有する(重鎖変異体4−59.6)。
人間化10G4抗体変異体の直接的なLTE4−結合ELISAを示す線グラフを図示するもので、前記人間化10G4抗体変異体それぞれは一つの重鎖復帰突然変異および四個の軽鎖復帰突然変異を有する(軽鎖変異体O12.5)。
人間化10G4変異体の直接的なLTE4−結合ELISAを示す線グラフを図示するもので、前記人間化10G4変異体それぞれは一つの重鎖復帰突然変異およびO12.1軽鎖を有する(単一復帰突然変異)。
人間化10G4変異体の直接的なLTE4−結合ELISAを示す線グラフを図示するもので、前記人間化10G4変異体それぞれは一つの重鎖復帰突然変異およびO12.2軽鎖を有する(単一復帰突然変異)。
人間化10G4変異体の直接的なLTE4−結合ELISAを示す線グラフを図示するもので、前記人間化10G4変異体それぞれは一つの重鎖復帰突然変異およびO12.3軽鎖を有する(単一復帰突然変異)。
人間化10G4変異体の直接的なLTE4−結合ELISAを示す線グラフを図示するもので、前記人間化10G4変異体それぞれは一つの重鎖復帰突然変異およびO12.4軽鎖を有する(単一復帰突然変異)。
賦形剤、陽性対照群(シクロスポリン(Cyclosporin A)またはCsA)、ネズミ科の抗−cysLT抗体10G4および2G9、または非特異的抗体対照群で処置した後で、DSSによって誘発された大腸炎がある実験ネズミの疾病活性指数(disease activity index、DAI)を示す線グラフを図示する。賦形剤および非特異的抗体(LT1014)で処置されたグループは最高値のDAIを有し、抗−cysLT抗体10G4および陽性対照群シクロスポリンA(CsA)で処置された動物は最低値のDAIを有した。多重t−testに基づいた10G4対賦形剤に対する統計的有意性が図示された(* P<0.05、** P<0.01、*** P<0.001)。
卵アルブミン(ovalbumin、OVA)により誘発された急性喘息がある実験ネズミにおける気道過敏症(ベースラインに対する百分率として「enhanced pause」または「Penh」で測定される)を示す線グラフを図示する。予想されたように、喘息が誘導された前記実験ネズミは最高値のPenhを示し、OVAが投与されない実験ネズミは最低値のPenhを示した。抗−cysLT抗体である10G4はPenhを陽性対照群であるデキサメタゾン(dexamethasone)のPenhとほぼ同等に下げた。抗体9B12はPenhを中間数値に下げた。
LT1017(非特異的対照群抗体)、抗−cysLT抗体9B12、または抗−cysLT抗体10G4で処置した後で、OVAによって誘発された急性喘息がある実験ネズミ由来の気管支肺胞洗浄(bronchoalveolar lavage、BAL)液内の総細胞数を示す棒グラフを図示する。
定義
本段落で定義された用語の他に、その他の用語は必要に応じて本明細書で定義される。本明細書で特に明確に定義されない限り、本明細書で使われる当分野の用語は当分野で知られている意味を有する。
本段落で定義された用語の他に、その他の用語は必要に応じて本明細書で定義される。本明細書で特に明確に定義されない限り、本明細書で使われる当分野の用語は当分野で知られている意味を有する。
用語「cysLT」は、システイニルロイコトリエン(cysteinyl leukotriene)の略語である。生理学的に重要なcysLTは、ロイコトリエンC4(LTC4)、ロイコトリエンD4(LTD4)、およびロイコトリエンE4(LTE4)を含む。本発明の脈絡で、「cysLT」または「cysLT」は疾病またはその他の健康に有害な疾患と関連されるか関わりのある自然的に発生するシステイニルロイコトリエンを意味する。好ましいcysLTは、LTC4、LTD4、およびLTE4である。
用語「異常な」は、例えば、蛋白質または生理活性脂質のような細胞のターゲットの数値または効果的な濃度と関連して過度であるか望んでいないことを意味する。
用語「抗体」(「Ab」)または「免疫グロブリン」(Ig)は、抗原または抗原決定部(epitope)と結合できる免疫グロブリン遺伝子またはこれのフラグメント由来である(またはこれらに倣って製造されるかこれらによって暗号化される)すべての形態のペプチド、ポリペプチドを意味する(参照、例えば、IMMUNOBIOLOGY、第5版、Janewayなど、Garland Publishing(修正本)、2001年)。用語「抗体」は、本明細書で最も広い範囲で使われ、単クローン、多クローン性のまたは多価特異性(multispecific)抗体、ミニボディ(minibodies)、ヘテロコンジュゲート(heteroconjugates)、二重体(diabodies)、三重体(triabodies)、キメラ(chimeric)、抗体、合成抗体、抗原結合活性を保有した抗体フラグメント、および母抗体の相補性決定部位(CDR)を利用する結合剤を含む。本明細書で、抗体は母抗体の少なくとも一つの所望の活性を保有するものとして定義される。前記所望の活性は抗原に対する結合能力、抗原と優先的に結合する能力、および体外でサイトカインプロフィールを変える能力を含むことができる。
天然そのままの抗体(天然そのままの免疫グロブリン)は、常に約150,000ダルトン(dalton)であり、典型的に二つの同じ軽鎖および二つの同じ重鎖からなる異形糸合体である糖蛋白質(heterotetrameric glycoprotein)である。前記重鎖の大きさは約50kDであり、前記軽鎖は約25kDaである。それぞれの軽鎖は典型的に一つの二硫化共有結合によって重鎖に連結され、このとき異なる免疫グロブリン同種型(isotype)の重鎖での二硫化結合の数は異なる。また、それぞれの重鎖および軽鎖は規則的に離隔した鎖間二硫化物橋状結合を有する。それぞれの重鎖は一つの末端に数多くの繰返しドメインが繋がれた可変ドメイン(VH)を有する。それぞれの軽鎖は一つの末端に(VL)一つの可変ドメインと他の一つの末端に一つの繰返しドメインを有する。前記軽鎖の繰返しドメインは前記重鎖の第1繰返しドメインと並んで序列され、前記軽鎖可変ドメインは前記重鎖の可変ドメインと並んで序列される。特定アミノ酸残基は前記軽鎖鎖可変ドメインらと前記重鎖鎖可変ドメインの間に接点を形成するものと考えられる。
すべての脊椎動物由来の抗体(免疫グロブリン)の軽鎖はこれらの繰返しドメインのアミノ酸序列を基礎にしてカッパ(kappa、κ)およびラムダ(lambda、λ)と命名される二つの明確に異なる形態の中の一つの形態を有する。 前記二つの軽鎖形態の比率は種により異なる。例えば、実験ネズミでλに対するκの平均比率は20:1である反面、人間では2:1、牛では1:20である。
すべての脊椎動物由来の抗体(免疫グロブリン)の軽鎖はこれらの繰返しドメインのアミノ酸序列を基礎にしてカッパ(kappa、κ)およびラムダ(lambda、λ)と命名される二つの明確に異なる形態の中の一つの形態を有する。 前記二つの軽鎖形態の比率は種により異なる。例えば、実験ネズミでλに対するκの平均比率は20:1である反面、人間では2:1、牛では1:20である。
これらのうち重鎖の繰返しドメインのアミノ酸序列にしたがって、免疫グロブリンは互いに異なるグループに分かれる。五個の主要な免疫グロブリングループが存在する:IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgM。これらの免疫グロブリングループのうち一部は下位グループ(同種型)に(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、およびIgA2)さらに分けることができる。免疫グロブリンの異なるグループに該当する前記重鎖の繰返しドメインはそれぞれアルファ(alpha)、デルタ(delta)、イプシロン(epsilon)、ガンマー(gamma)、およびミュー(mu)と命名される。前記免疫グロブリンの異なるグループの下位単位構造および3次元構造は良く知られている。
抗体は前記の抗体序列内の一つ以上のアミノ酸残基の付加、削除および/または置換によって同じ抗原に誘導され、母抗体の少なくとも一つの活性を保有するさらに他の抗体(時々「母(parent)」または「天然そのままの(native)」抗体とも言及される)のアミノ酸序列から設計されるかおよび/または製造され得る。好ましい活性は、前記抗原と特異的に結合する能力、増殖体外での増殖を抑制する能力、体内で血管形成を抑制する能力、および体外でサイトカインプロフィールを変える能力を含むことができる。前記アミノ酸変更はFc領域、Fab領域、CH1ドメイン、CH2ドメイン、CH3ドメイン、およびヒンジ(hinge)領域を含む軽鎖および/または重鎖の可変領域または繰返し領域内で行われ得る。一つの具体例において、一つ以上のアミノ酸置換は母抗体の一つ以上の初可変(hypervariable)領域で作られる。例えば、母抗体と比較して、一つ以上の初可変領域に少なくとも一つの、例えば、約1〜約10個の、好ましくは、約2〜5個の、置換がある。大慨は、アミノ酸変更は母抗体重鎖または軽鎖可変ドメイン序列と少なくとも50%アミノ酸序列同一性、さらに好ましくは少なくとも65%、さらに好ましくは80%、さらに好ましくは少なくとも85%、さらに好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%の同一性または相同性を有する新しい抗体アミノ酸序列に帰結される。本明細書で、前記序列と関連して同一性または相同性は、必要な場合、最大の序列同一性百分率を得るために序列を羅列してギャップ(gap)を導入した後で、母抗体残基のような序列候補内のアミノ酸残基の百分率として定義される。前記の抗体序列に対するN−末端、C−末端、または内部の延長、削除、または挿入中のいずれも序列同一性または相同性に影響を与えるように製作されてはならない。
本明細書で使われるように、「抗体フラグメント」は、本来の抗体の抗原結合位置または可変領域を含む本来の抗体の一部分を意味するもので、前記一部分は前記本来の抗体のFc領域の繰り返される重鎖ドメイン(例えば、CH2、CH3、およびCH4)を含まないこともあり得る。また、前記繰り返される重鎖ドメインの一部分は(例えば、CH2、CH3、およびCH4)前記の抗体フラグメントに導入され得る。抗体フラグメントは抗原−結合能力を保有することができ、Fab、Fab´、F(ab´)2、Fd、およびFvフラグメント;二重体;三重体;単鎖抗体分子(sc−Fv);抗体フラグメントから形成されたミニボディ、ナノボディ(nanobodies)、および多価特異性抗体を含むことができる。抗体のパパイン浸漬( Papain digestion)によって、それぞれ一つの抗原−結合位置を有する「Fab」フラグメントおよび容易に結晶化する能力が名前に反映された「Fc」フラグメント残基と命名される二つの同じ抗原と結合する前記抗体のフラグメントが生成される。ペプシン(pepsin)処理によって、二つの抗原結合位置を有して依然として抗原を架橋できるF(ab´)2フラグメントが生成される。例えば、Fabフラグメントまた軽鎖の繰返しドメインおよび重鎖の第1繰返しドメイン(CH1)を含む。「Fv」は完璧な抗原−認識および−結合位置を含む最小限の抗体フラグメントである。前記領域は密着して非共有関係にある一つの重鎖および一つの軽鎖可変ドメインのダイマー(dimer)である。このような構造で、各可変ドメインの三個の初可変領域(または相補性決定部位または「CDR」)がVH−VLダイマーの表面の上に抗原−結合位置を決めるために相互作用をする。総合すれば、6個の初可変領域が前記抗体に抗原−結合特異性を付与する。しかし、さらに一つの可変ドメインが(またはFv中の半分は抗原に単に特異的な3個の初可変領域を含む)、全体結合位置より低い親和力ではあるが、抗原を認識して抗原と結合する能力を有する。「単鎖Fv」または「sFv」抗体フラグメントは、抗体のVHおよびVLドメインを含み、このようなドメインは一つのポリペプチド鎖に存在する。一般的に、FvポリペプチドはsFvが抗原結合のための好ましい構造を形成することができるようにするVH および VLドメインの間にポリペプチドリンカー(linker)をさらに含む。sFvの検討のために次の文献を参考にすることができる(Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies、vol. 113、RosenburgおよびMoore eds. Springer−Verlag、New York、269〜315、1994年)。
Fabフラグメントも前記軽鎖の繰返しドメインおよび前記重鎖の第1繰返しドメイン(CH1)を含む。Fab´フラグメントは前記抗体ヒンジ領域由来の一つ以上のシステインを含む重鎖CH1ドメインのカルボキシル(carboxyl)末端への若干の残基の付加によって、Fabフラグメントとは異なる。本明細書で、Fab´−SHは、繰返しドメインのシステイン残基が自由ジオール基を含むことを特徴とするFab´を意味する。F(ab´)2抗体フラグメントは本来Fab´フラグメントペアとして生成されたもので、前記Fab´フラグメントペア間にヒンジシステインが存在する。抗体フラグメントのその他の化学的結合も知られている。
Fabフラグメントも前記軽鎖の繰返しドメインおよび前記重鎖の第1繰返しドメイン(CH1)を含む。Fab´フラグメントは前記抗体ヒンジ領域由来の一つ以上のシステインを含む重鎖CH1ドメインのカルボキシル(carboxyl)末端への若干の残基の付加によって、Fabフラグメントとは異なる。本明細書で、Fab´−SHは、繰返しドメインのシステイン残基が自由ジオール基を含むことを特徴とするFab´を意味する。F(ab´)2抗体フラグメントは本来Fab´フラグメントペアとして生成されたもので、前記Fab´フラグメントペア間にヒンジシステインが存在する。抗体フラグメントのその他の化学的結合も知られている。
「抗−cysLT抗体」または「cysLTに対して反応性である免疫由来モイエティ」は一つ以上のcysLT、好ましくは一つ以上のLTC4、LTD4、およびLTE4と結合するすべての抗体または抗体由来分子を意味する。このような定義によって理解されるように、抗体または免疫由来モイエティは多クローンまたは単クローンであり得、多様な方法によって生産され得、人間被験者を含む動物から分離され得る。
「生理活性脂質」は脂質信号分子を意味する。生理活性脂質は細胞外および/または細胞内の信号を調節し、したがって分化、移動、増殖、分泌、生存、およびその他の過程を調節することによって多くの種類の細胞の機能を調節することに関与するという点で、構造的脂質(例えば、膜結合である脂質)とは異なる。体内で、生理活性脂質は細胞外液体で発見され得るが、前記細胞外液体で生理活性脂質は他の分子(例えば、アルブミン(albumin)のような血清蛋白質および脂質蛋白質)と複合体を形成するか、自由な形態で、すなわち、他の分子と複合体を形成しない形態で存在することができる。細胞外調節者として、一部生理活性脂質は細胞の機能または生存に帰結される複雑な信号システムを順次活性化する膜結合イオンチャネルまたはGPCRsまたは酵素または因子を活性化することによって、細胞の信号を変更する。細胞内の調節者として、生理活性脂質は酵素、イオンチャネル、またはアクチン(actin)のような構造敵要素のような細胞内成分と直接的に相互作用することによって自分たちの機能を遂行することができる。
生理活性脂質の例は、セラミド(ceramide)、セラミド−1−ホスフェート(ceramide−1−phosphate,、C1P)、スフィンゴシン(sphingosine)、スフィンガニン(sphinganine)、スフィンゴシルホスフォリルコリン(sphingosylphosphorylcholine、SPC)、およびスフィンゴシン−1−ホスフェート(sphingosine−1−phosphate,、S1P)のようなスフィンゴ脂質(sphingolipid)を含む。スフィンゴ脂質およびこれらの誘導体および代謝産物はスフィンゴイド(sphingoid)バックボーン(backbone)(スフィンゴミエリン(sphingomyelin)で由来する)により特徴づけられる。スフィンゴ脂質およびこれらの誘導体および代謝産物は重要な細胞の過程に多面発現性(pleiotropic)効果を有する一つの集団の細胞外および細胞内の信号分子を表わす。これらはサルファタイド(sulfatides)、ガングリオシド(ganglioside)、およびセレブロシド(cerebroside)を含む。この他の生理活性脂質はグリセロール(glycerol)系列のバックボーン(例えば、リゾホスファチジルコリン(lysophosphatidyl choline、LPC)および多様なリゾホスファチド酸(lysophosphatidic acids、LPA)のようなリゾリン脂質(lysophospholipid)、ホスファチジルイノシトール(phosphatidylinositol、PI)、ホスファチジルエタノールアミン(phosphatidylethanolamine、PEA)、ホスファチド酸(phosphatidic acid)、血小板活性因子(platelet activating factor、PAF)、カルジオリピン(cardiolipin)、ホスファチジルグリセロール(phosphatidylglycerol、PG)、およびジアシルグリセリド(diacylglyceride、DG))により特徴づけられる。この他の生理活性脂質はアラキドン酸由来であり、これらはエイコサノイド、HETE、カンナビノイド(cannabinoids)、ロイコトリエン(leukotrienes)、プロスタグランジン(prostaglandins)、リポキシン(lipoxins)、エポキシエイコサトリエン酸(epoxyeicosatrienoic acids)、およびイソエイコサノイド(isoeicosanoids)、および非−エイコサノイドカンナビノイド調節者(non−eicosanoid cannabinoid mediators)のようなエイコサノイド代謝産物を含む。他の燐脂質およびこれらの誘導体を含む他の生理活性脂質も使われ得る。
細胞膜の内部および/または外部小葉(leaflet)の構造的要素として優先的に機能をするホスファチジルコリン(phosphatidylcholine)、ホスファチジルセリン(phosphatidylserine)、および代謝産物およびこれらの誘導体のような脂質は本明細書で定義された生理活性脂質に明確に含まれない。
抗体または抗体フラグメントの脈絡で、用語「生物学的に活性である」は所望の抗原決定部と結合でき、このような方式で生物学的効果を展示する抗体または抗体フラグメントを意味する。前記生物学的効果は、非制限的な例で、成長信号の調節、抗−老化信号の調節、老化信号の調節、作用者機能カスケード(effector function cascade)の調節、およびこの他のリガンド相互作用の調節を含む。
「生物指標」は疾病の発達または治療効果を測定するのに有用にさせる特定分子的特徴を有する生体内の特定生化学的物質である。例えば、S1Pはある過増殖性(hyperproliferative)および/または心血管疾患に対する生物学的指標である。
「運搬体」はハプテン(hapten)に対する接合(conjugation)に適合したモイエティを意味するもので、これによってハプテン免疫原を提供する。代表的な、非制限的な運搬体のグループは蛋白質であり、前記蛋白質の例はアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン(keyhole limpet hemocyanin)、ヘマグルチニン(hemaglutanin)、テタヌス(tetanus)、およびジフテリアトキソイド(diptheria toxoid)を含む。この他の運搬体の適切なグループおよび例が当分野に知られている。それだけでなく、以降発見されるか、自然に発生または合成された運搬体が本記載にしたがって適用されるために使われ得る。
本明細書で使われるように、用語「細胞」「細胞株」および「細胞培養」は相互交換的に使われ、このようなすべての名称は所産物を含む。したがって、用語「形質転換体(transformants)」および「形質転換された細胞」は継代回数とは無関係に本来の1次細胞およびこれら細胞由来の培養物を含む。また、意図的変異または意図していない変異によって、すべての所産物が正確に同じDNA含有量を有さないこともある。最初の形質転換された細胞で調査されたのと同じ機能または生物学的活性を有する変異された所産物が含まれる。明確に別途表示されている場合には前記の内容とは無関係であろう。
用語「併用治療」は、所望の治療効果を提供するために少なくとも二つの別個の治療の提供に関連された治療療法を意味する。例えば、併用治療は二つのまたはそれ以上の化学的に別個の活性成分(例えば、速効性(fast−acting)コルチコステロイド剤および抗−脂質抗体、または二つの異なる抗体)の投与を含むことができる。また、併用治療は放射線治療および/または手術のような他の治療の進行と共に抗−脂質抗体の適用を含む。また、併用治療は一つ以上の他の生物学的製剤(例えば、コルチコステロイド)、抗−炎症性製剤、および/または放射線照射および/または手術のようなさらに他の治療とともに抗−脂質抗体の投与を含むことができる。二つのまたはそれ以上の化学的に別個の活性成分の投与と関連して、前記活性成分は同じ組成物の一部または異なる組成物で投与され得る。別個の組成物で投与される時、異なる活性成分を含む前記組成物は、特定要求事項および担当医師の決定により、同一時間または異なる時間帯に、同じまたは異なる経路で、同じまたは異なる投薬法で投与され得る。同様に、一つ以上の抗−脂質抗体種(単独でまたは一つ以上の化学治療剤と一緒)が、例えば、放射線照射および/または手術と共に併用される時、前記薬物は手術または放射線照射治療前または以後に投与され得る。
用語「繰返しドメイン」は、抗体重鎖または軽鎖のC−末端領域を意味する。一般的に、前記繰返しドメインは抗原に対する抗体分子の結合特性と直接的に関連することはないが、抗体による細胞毒性での前記抗体の参与のような多様な作用者機能(effector function)を表わす。ここで、「作用者機能」は、Fcドメインと免疫系蛋白質間の分子的相互作用による免疫細胞の補充によって調節される抗体の異なる生理的効果(例えば、オプソニン作用(opsonization)、細胞溶解、肥満細胞、好塩球および好酸球顆粒消失(degranulation)、およびこの他の過程)を意味する。重鎖の同種型は前記抗体の機能的特徴を決める。これらの特異的な機能的特徴は前記重鎖のカルボキシル−末端の部分によって付与されて、これらは軽鎖きては関係がない。
「誘導された生理活性脂質」は分子との反応のために(例えば、運搬体に対する接合のために)生理活性脂質を活性させる反応基(例えば、スルプヒドリル)(チオール)基 (sulfhydryl (thiol) group) 、カルボキシル酸基、シアノ基(cyano group)、エステル、水酸基、アルケン(alkene)、アルキン(alkyne)、酸クロリド(acid chloride)基、またはハロゲン原子)を使うことによって誘導される生理活性脂質(例えば、cysLT)である。好ましくは、前記反応基は抗原決定部が接近できるように配置される(すなわち、前記反応基によって邪魔されない)。一部の具体例において、前記反応基は天然そのままの脂質の一部や誘導体化(derivatization)を目的に付加され得る炭化水素鎖のような脂質上に柔軟な「尻尾(tail)」の末端に位置する。例えば、スフィンゴシン−1−ホスフェートの場合、チオール基が前記分子の炭化水素鎖のオメガ炭素(omega carbon)(末端)に位置することによって、 極性の頭部基が抗原決定部のように接近できるようにする(参照、例えば、アメリカ特許第8,067,549号(本発明に全体的に含まれる))。
「生理活性脂質コンジュゲート(bioactive lipid conjugate)」は、運搬体と共有結合された生理活性脂質を意味する。前記脂質は接合に対して反応性があるように前述のように誘導され得るか、前記天然そのままの脂質は運搬体に前記脂質を接合させるために使われ得る反応基を含むことができる。前記運搬体は蛋白質分子であるか、ポリエチレングリコール(polyethylene glycol)、コロイド質金(colloidal gold)、補剤(adjuvant)、またはシリコンビーズ(silicone bead)のような非−蛋白質性モイエティであり得る。生理活性脂質コンジュゲートは本記載にしたがって抗体反応を引き起こす免疫原として使われ、したがって同一であるか異なる生理活性脂質コンジュゲートは前記の抗体探知用試薬として使われ得る。一部の具体例において、前記誘導された生理活性脂質コンジュゲートは、探知のために使われる時、固体支持体に付着する。
「効果的な濃度」は、例えば、ある望まない生理活性脂質の絶対的な、相対的な、および/または利用可能な濃度および/または活性を意味する。言い換えれば、生理活性脂質の効果的な濃度はこの生物学的機能を遂行するかこのために利用可能な脂質の容量である。本記載で、例えば、生理活性脂質に誘導される単クローン抗体のような免疫由来モイエティは前記脂質に結合して前記脂質が自身の生物学的機能を遂行できないようにすることによって、前記脂質の有効な濃度を低くすることができる。このような例において、前記脂質自体は依然として存在するが(すなわち、前記抗体によって分解されない)、下位段階の効果を引き起こす、この受容体または他のターゲットとそれ以上結合しない。したがって、絶対的な濃度よりは効果的な濃度が適切な測定方法である。生理活性脂質の効果的な濃度を直接的におよび/または間接的に測定する方法および分析が存在する。
「抗原決定部」または「抗原決定基(antigenic determinant)」は抗体由来である抗体抗原−結合部分と反応する抗原の一部を意味する。
「完全人間型抗体(fully human antibody)」は免疫原と共に提供される時遺伝的に改質された(すなわち、形質転換)実験ネズミ(例えば、ニュージャージー州、プリンストン所在Medarex Inc.社のHUMAB−MOUSE)で生産される抗体を意味し得、CDRクラフティング(Grafting)を必須的に要求しない人間抗体を生産することができる。このような抗体は非−人間抗体遺伝子が抑制され、人間抗体遺伝子発現で交替させられた試験ネズミのような動物由来の完全に人間化された抗体である。本出願人は関連されたCDRのために人間の構造フレームを生産できる遺伝的に改質された実験ネズミまたはその他の動物に提供される時生理活性脂質に対する抗体が提供され得ると考えた。
「完全人間型抗体(fully human antibody)」は免疫原と共に提供される時遺伝的に改質された(すなわち、形質転換)実験ネズミ(例えば、ニュージャージー州、プリンストン所在Medarex Inc.社のHUMAB−MOUSE)で生産される抗体を意味し得、CDRクラフティング(Grafting)を必須的に要求しない人間抗体を生産することができる。このような抗体は非−人間抗体遺伝子が抑制され、人間抗体遺伝子発現で交替させられた試験ネズミのような動物由来の完全に人間化された抗体である。本出願人は関連されたCDRのために人間の構造フレームを生産できる遺伝的に改質された実験ネズミまたはその他の動物に提供される時生理活性脂質に対する抗体が提供され得ると考えた。
「ハプテン」は非−免疫原性であり、抗体由来である抗体または抗原−結合部分と反応できる物質である。言い換えれば、ハプテンは抗原性を有するが免疫原性を有さない。ハプテンは一般的に単に運搬体(例えば、蛋白質、ポリエチレングリコール(PEG)、コロイド質金、またはシリコンビーズ、など)に付着する時、殆どの環境で免疫反応(すなわち、抗原として機能)を誘導できる小さい分子である。前記運搬体は自ら免疫反応を誘導できないものであり得る。代表的な非制限的なハプテン分子のグループは蛋白質であり、前記蛋白質の例はアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、ヘマグルチニン、テタヌス、およびジフテリアトキソイドを含む。ハプテン分子の他のグループおよび例が当分野に知られている。それだけでなく、以降発見されるか、自然に発生または合成されたハプテンが本記載にしたがって適用されるために使われ得る。
用語「ヘテロコンジュゲート抗体」は二つの共有結合された抗体を意味し得る。このような抗体は架橋剤を使う合成蛋白質化学で知られている方法を使って生産され得る。本明細書で使われるように、用語「コンジュゲート」は一つ以上の高分子に一つ以上の抗体フラグメントまたは結合モイエティを共有結合することで形成された分子を意味する。
非−人間(例えば、ネズミ科)抗体の「人間化された「形態は非−人間免疫グロブリン由来の序列を最小限で含むキメラ抗体である。さらに他の観点で、人間化抗体は人間序列の代わりに非−人間(例えば、ネズミ科)抗体由来である選択された序列を含む人間抗体である。人間化抗体は前記抗体の結合および/または生物学的活性を大きく変えない同一であるか異なる種由来である保存されたアミノ酸置換または本来存在していない残基を含む。このような抗体は非−人間免疫グロブリン由来である最小序列を含むキメラ抗体である。多くの場合で、人間化抗体は人間免疫グロブリン(授与抗体(recipient antibody))であり、前記人間免疫グロブリンで授与抗体の相補性決定領域(complementary−determining region、CDR)の残基は、所望の特性を有する実験ネズミ、ラット、ラクダ、牛、ヤギ、またはウサギのような非−人間種(供与抗体(donor antibody))のCDR由来である残基で交替される。一部例として、前記人間免疫グロブリンの骨格領域(framework region、FR)残基は非−人間母抗体由来である相応する残基で交替される(それぞれの置換は「復帰突然変異」と命名される)。
さらに、人間化抗体は授与抗体または導入されたCDRまたは骨格序列(framework sequences)で発見されない残基を含む。このような改質は抗体性能をさらに改善して最大化するために作られる。したがって、一般的に、人間化抗体は少なくとも一つの、一つの様態で二つの、可変ドメインすべてを含むもので、 前記可変ドメインですべてのまたは実質的にすべての初可変形ループ(loops)は非−人間免疫グロブリンのループに相応し、すべてのまたは実質的にすべての骨格領域は人間免疫グロブリン序列の領域である。また、前記人間化抗体は選択的に免疫グロブリン繰返し領域(Fc)の少なくとも一部または人間免疫グロブリンの少なくとも一部を含むことができる(参照、例えば、Cabillyなど、アメリカ特許第4,816,567号;Cabillyなど、ヨーロッパ特許第0,125,023 B1号;Bossなど、アメリカ特許第4,816,397号;Bossなど、ヨーロッパ特許第0,120,694 B1号;Neubergerなど、国際特許第86/01533号;Neubergerなど、ヨーロッパ特許第0、194、276 B1号;Winter、アメリカ特許第5,225,539号;Winter、ヨーロッパ特許第0,239,400 B1号;Padlanなど、ヨーロッパ特許出願第0,519,596 A1号;Queenなど(1989)、Proc. Nat´l Acad. Sci. USA、vol. 86:10029−10033)。もう少し詳細な参照文献:Jonesなど、Nature 321:522−525,1986年;Reichmannなど、Nature 332:323−329、1988年;Presta、Curr Op Struct Biol 2:593−596,1992年;およびHansen、国際特許第WO2006105062号. 人間化された抗体は人間で使われる非人間抗体に対して好ましいこともあるが、これは人体は外来物質と見える非人間抗体に対する免疫反応ができるためである。人間抗−マウス抗体(HAMA)反応はマウス抗体治療が提供された患者中のかなりの患者で観察された。
「免疫由来モイエティ」は、すべての抗体(Ab)または免疫グロブリン(Ig)を含み、免疫グロブリン遺伝子、または抗原または抗原決定部と結合できるペプチドまたはポリペプチドのフラグメント由来であるか、前記ペプチドまたはポリペプチドに倣って製造されたものや、これらによって暗号化されたすべての形態のペプチドまたはポリペプチドを意味する(参照、例えば、Immunobiology、第5版、Janeway、Travers、Walport、Shlomchiked.(編集長)、Garland Publishing、2001年)。本記載で、前記抗原は生理活性脂質分子のような脂質分子である。
「免疫原」は、特定免疫反応、具体的には、免疫原が投与された動物での抗体反応を誘導できる分子である。本記載で、前記免疫原は運搬体に接合された誘導された生理活性脂質、すなわち、 「誘導された生理活性脂質コンジュゲート」である。免疫原で使われる前記誘導された生理活性脂質コンジュゲートは免疫原に対する反応で生成された抗体の探知のための捕獲物質として使われ得る。したがって、前記免疫原は探知試薬で使われることもある。また、捕獲物質として使われる前記誘導された生理活性脂質コンジュゲートは、異なる免疫原内の生理活性脂質コンジュゲート由来である異なるリンカーおよび/または運搬体モイエティを有することができる。
「抑制」、具体的には、生物学的現象の脈絡で「抑制」は減少、真圧または遅延を意味する。例えば、「炎症抑制」を可能にする治療は炎症が発生しないか、治療されない対照群と比較して、炎症がゆっくり発達するか炎症範囲が減少することを意味し得る。
「分離された」抗体は、自然環境の成分から分離されるかおよび/または回復した抗体である。前記抗体の自然環境の汚染成分は前記抗体での診断および治療を妨害できる物質であり、酵素、ホルモン、および他の蛋白質性または非蛋白質性溶質を含むことができる。好ましい具体例において、前記抗体は(1)ローリー法(Lowry method)により決定されるものであって、95重量%、最も好ましくは99重量%、(2)スピン型カップ序列分析器(spinning cup sequenator)を使って少なくとも15個残基のN−末端または内部のアミノ酸序列を収得するのに十分な程度、または(3)クマシーブルー(Coomassie blue)または好ましくは銀汚染(silver stain)を使って還元または悲還元条件下でSDS−PAGEによる同質性で精製されるであろう。抗体の自然環境の少なくとも一つの成分は存在しないため、分離された抗体は再調合細胞の元の位置に存在する抗体を含む。しかし、大慨は、分離された抗体は少なくとも一つの精製工程によって製造されるであろう。
本明細書で使われる用語「標識(label)」は、前記抗体に直接的にまたは間接的に接合されるような探知可能な化合物または組成物を意味する。標識自体が自ら探知可能であるか(例えば、放射性同位元素標識または蛍光性標識)、酵素標識の場合、探知可能な基材化合物または組成物の化学的変化を促進することができる。
「リガンド」は、生物学的目的を提供するために生体分子に結合して前記生体分子と複合体を形成できる物質である。したがって、抗原は抗原が結合できる抗体のリガンドと説明され得る。
「分離された」核酸分子は、抗体核酸の天然供給源とほとんどが関連された少なくとも一つの汚染物質核酸分子から同定されて分離された核酸分子である。分離された核酸分子は自然で発見される形態または設定とは異なる。したがって、分離された核酸分子は自然細胞で存在する核酸分子とは区別される。しかし、分離された核酸分子は大慨は抗体を発現する核酸分子を含み、例えば、前記核酸分子は自然細胞とは異なる染色体位置に存在する。
「液体組成物」は、固体とは反対の液体または溶液を意味するもので、前記液体組成物は調製(された最終形態で製造業者から最終使用者(例えば、医師または看護婦)に提供される。ここで、「固体」は液体または溶液でない組成物を意味する。例えば、固体は凍結乾燥(lyophilization)、冷凍乾燥(freeze−drying)、沈殿、およびこれと類似の工程によって製造された乾燥された組成物を含む。
本出願書で使われる用語「線形抗体(linear antibody)」はZapataなど(Protein Eng 8(10):1057−1062、1995年)により説明された抗体を意味する。要約すれば、このような抗体は一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムFdセグメント(tandem Fd segment、VH−CH1−VH−CH1)を含む。線形抗体は二重特異的または単一特異的であり得る。
用語「代謝産物」は、提供されたcysLTが生成され、cysLTの分解を引き起こす化合物(すなわち、cysLT物質代謝経路と関連された化合物)を意味する。用語「物質代謝前駆体」は、提供されたcysLTが生産される化合物を意味し得る。
本明細書で使われるように、用語「単クローン抗体」(mAb)は、実質的に同質である抗体の群集から収得された抗体または抗体の前記群集を意味する。前記群集を含むそれぞれの抗体は、少量で存在できる自然的に発生する変異体を除いて、必ず同一である。単クローン抗体は一つの抗原位置に対して提供されるもので非常に特異的である。さらに、異なる決定部(抗原決定部)に対して提供される異なる抗体を典型的に含む慣例的な(多クローン性の)抗体製造と照らし合わせ、それぞれの単クローン抗体は抗原上の一つの決定部に対して提供される。改質された形態である「単クローン」は、実質的に同質である抗体の群集から収得される抗体の特徴を意味するもので、ある特定方法による前記抗体の生産が要求されるものとは理解されない。例えば、本記載により使われる前記単クローン抗体は、Kohlerなど(Nature 256:495、1975年)により初めて紹介されたハイブリードマ方法(hybridoma method)により製造されるか、再調合DNA方法(参照、例えば、アメリカ特許第4、816、567号)により生産され得る。また、前記「単クローン抗体」は、Clacksonなど(Nature、1991年、352:624−628)およびMarksなど(1991年、J Mol Biol 222:581−597)により説明された技術を使ってファージ抗体ライブラリー(phage antibody libraries)から分離されるか、例えば、当分野に知られている他の方法によって分離することができる。本明細書の単クローン抗体は、具体的には、キメラ抗体を含むもので、前記キメラ抗体で重鎖および/または軽鎖の部分は、所望の生物学的活性を表わす限り、特定種由来であるか特定抗体下位集合に属する抗体の相応する序列と同一であるか相同である反面、前記鎖の残りはさらに他の種由来であるかさらに他の抗体下位集合体属する抗体の相応する序列と同一であるか相同である(アメリカ特許第4、816、567;およびMorrisonなど、1984年、Proc Natl Acad Sci USA 81:6851−6855)。
「単独治療」は、単独投薬または時間による複数回の投薬でなされる一つの治療的に効果的な化合物の伝達に基づいた治療療法を意味する。
用語「多価特異性抗体」は、少なくとも二つの異なる抗原決定部の結合特性を有する抗体または単クローン抗体を意味する。一つの具体例において、前記抗原決定部は同じ抗原由来である。さらに他の具体例において、前記抗原決定部は、二つのまたはそれ以上の異なる抗原由来である。多価特異性抗体製造方法は当分野で知られている。多価特異性抗体は二重特異性抗体(二つの抗原決定部に対する結合特性を有する)、三重特異性抗体(三個の抗原決定部)、などを含む。例えば、多価特異性抗体は二つのまたはそれ以上の免疫グロブリン重鎖/軽鎖ペアの共同発現を使って再調合することによって生産され得る。また、多価特異性抗体は化学的結合を使って生産され得る。当業者はこのような方法または当分野で知られている他の方法を使って多価特異性抗体を生産することができる。多価特異性抗体は、多価特異性抗体フラグメントを含む。多価特異性(この場合、二重特異性)抗体の一つの例は、S1P抗原決定部およびLTE4抗原決定部に対して結合特性を有し、S1PおよびLTE4をすべて 認識し、これらのすべてと結合する抗体である。二重特異性抗体のさらに他の例は生理活性脂質由来の抗原決定部および細胞表面抗体由来の抗原決定部に対して結合特性を有する抗体である。したがって、前記抗体は(例えば、目的対象を的中するために)生理活性脂質を認識し、これと結合でき、細胞を認識して細胞と結合することができる。
「腫瘍形成」または「癌」は、非正常的で、制御されない細胞成長を意味する。「新生物(neoplasm)」、腫瘍、または癌は非正常的で、調節されない無秩序な細胞増殖であり、一般的に癌と言及される。新生物は陽性か悪性であり得る。新生物が破壊的な成長、侵入力、および転移性を有するのであれば、これらは陽性か癌であり得る。侵入力は周辺組織の浸潤または破壊による新生物の位置的拡散を意味するもので、典型的に組織の境界を決める基底板を通過して時々体内循環系に入る。転移は典型的にリンパ管または血管による腫瘍細胞の拡散を意味する。また、転移は腸液空間または クモ膜の下またはその他の空間を通した直接的な拡散による腫瘍細胞の移動を意味する。転移によって、体内の他の領域での腫瘍細胞移動により本来の発現位置から遠く離れた領域で新生物が生成される。
「新血管形成」は新しい血管の形成を意味する。
核酸はさらに他の核酸序列と機能的関係にある時、「機能的に連結」される。例えば、前序列(presequence)または分泌性リーダー(secretory leader)に該当するDNAがポリペプチドの分泌に参与する前蛋白質(preprotein)で発現される場合、前記DNAが機能的にポリペプチド用DNAに連結されるか;プロモーター(promoter)またはエンハンサー(enhancer)がコーディング序列の転写に影響を与える場合、前記コーディング序列に機能的に連結されるか;リボソーム結合位置が転写を促進するために位置される場合、コーディング序列に機能的に連結される。一般的に、「機能的に連結された」は、連結されたDNA序列が隣接し、分泌性リーダーの場合、隣接してリーディングフェーズ (reading phase)であることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも隣接する必要はない。連結は手軽な制限酵素位置連結によって行われ得る。制限酵素位置が存在しない場合、従来の方法により合成オリゴヌクレオチドアダプタ(oligonucleotide adaptor)またはリンカーが使われる。
用語「薬学的に許容可能な塩」は、剤形で使われる塩を意味するもので、前記塩は製剤および製剤の化合物の生物学的効果および物性を保有し、生物学的であるか好ましい形態である。多くの場合、本明細書に記載された製剤および化合物は極性基、例えば、極性のアミノ基および/またはカルボキシル基またはこれらと類似した基の存在によって酸および/または塩基塩を形成することができる。薬学的に許容可能な酸付加塩は無機酸および有機酸から製造され得る反面、薬学的に許容可能な塩基付加塩は無機塩および有機塩から製造され得る。薬学的に許容可能な塩は次の文献で検討され得る:Bergeなど、1977年、J Pharm Sci、vol. 66、1−19.
「複数」は、一つ超過を意味する。
用語「プロモーター」は、細胞のコーディング序列の転写を誘導できるすべての序列を含む。したがって、構造物で使われるプロモーターは遺伝子転写時点および/または速度を調節するのに関与するシース作用転写制御要素(cis−acting transcriptional control element)および調節序列を含むことができる。例えば、プロモーターは転写調節に関連されたエンハンサー、プロモーター、転写終結因子(transcription terminator)、複製原点(origin of replication)、a染色体統合序列(chromosomal integration sequence)、5´および3´非翻訳(untranslated)領域、またはイントロン序列を含むシース作用転写制御要素であり得る。使用に適切な転写調節領域は、非制限的な例で、人間サイトメガロ(CMV)急初期エンハンサー/プロモーター(human cytomegalovirus(CMV)immediate−early enhancer/promoter)、SV40初期エンハンサー/プロモーター、E. coli lacまたはtrpプロモーター、および原核細胞または真核細胞またはこれらのウイルスの遺伝子の発現を制御するものと知られているプロモーターを含む。
用語「再調合DNA」は、研究者によって操作されるか、生産されるか、改質された核酸または前記核酸由来の遺伝子産物を意味する。「再調合」ポリペプチドまたは蛋白質は(例えば、所望のポリペプチドまたは蛋白質を暗号化する外因性(exogenous)DNA構造物によって変形された細胞から)DNA再調合技術によって生産されたポリペプチドまたは蛋白質である。
用語「分離された」、「精製された」、「分離された」、などは試料が入れられた試料の一つ以上の成分が容器内の一つ以上の他の試料成分から除去されるか前記一つ以上の他の試料成分の存在下で希釈されることを意味する。分離または精製段階の間除去されるか希釈され得る試料成分は化学的反応産物、未反応された化学物質、蛋白質、炭水化物、脂質、および結合されていない分子を含む。
用語「固体相」は、抗体が付着できるような非−水性母体(matrix)を意味する。本明細書で含まれる固体相の例は 部分的にまたは全体的に (例えば、調節孔隙ガラス(controlled pore glass))、多糖類(例えば、アガロース(agarose))、ポリアクリルアミド(polyacrylamide)、ポリスチレン(polystyrene)、ポリビニルアルコール(polyvinyl alcohol)、およびシリコン(silicone)で形成されたものを含む。一部の具体例において、文脈にしたがって、固体相は分析用実験皿(assay plate)のウェル(well)を含み、他の場合、固体相は精製コラム(purification column、例えば、親和性クロマトグラフィーコラム(affinity chromatography column))である。また、固体相はアメリカ特許第4、275、149号に記載されたように離散粒子(discrete particles)の不連続的な固体相を含む。
用語「種(speices)」は、本明細書で多様な範囲(例えば、システイニルロイコトリエン(cysLT)の特定種(例えば、LTC4、LTD4、LTE4、およびLTF4))で使われる。各文脈で、前記用語「種」は、特定文脈で言及される類型の化学的に不明な分子の集団を意味する。
抗体−抗原相互作用の脈絡で用語「特定の」または「特異性」は、抗体と前記抗体のターゲット抗原決定部間の選択的で非−無作為的な相互作用を意味する。ここで、用語「抗原」は、抗体分子または他の免疫由来モイエティによって認識されて結合される分子を意味する。抗体によって結合される抗原の特定の部分は「抗原決定部」と命名される。このような相互作用は分子間の適切な化学的または分子的相互作用を可能にする構造的、疏水性/親水性、および/または静電気特徴により異なる。したがって、抗体は通常的に前記抗体のターゲット抗原の抗原決定部と「結合」(または「特異的に結合」)するか「反応」(または「特異的に反応)するか、同一に、「反応性である」(または「特異的に反応性」)であると表現される。当分野で、抗体は、抗原に対する抗体結合を減らし、通常的にこれらの抗原に「対抗する」または「対する」ものと説明される。したがって、「LTE4と結合する抗体」、「LTE4に対して反応性である抗体」、「LTE4と反応性である抗体」、「LTE4に対する抗体」、および「抗−LTE4抗体」はすべて当分野に同じ意味を有する。抗体分子は与えられた条件下で関連ない抗原または類似の抗原または抗原混合物に対する結合に対して前記所望の抗原に対する結合を比較することによって結合特異性がテストされ得る。好ましくは、抗体は関連ない抗原に対して非常に欠乏した結合を有することで、前記抗体がターゲット抗原の一つ以上の類似物に対する特異的な結合が欠乏した方が好ましい。「特異的に関連された」および「特異的な関連」、などは分子間の適切な化学的または分子的相互作用を可能にする構造的、疏水性/親水性、および/または静電気特徴により異なる二つの分子間の特定の、非−無作為的な相互作用を意味する。
ここで、「安定した」は、分子が所望の目的または操作のために維持されるように十分に安定した二つの分子(例えば、ペプチドおよびTLR分子)間の相互作用を意味する。例えば、ペプチドおよびTLR分子間の「安定した」相互作用はペプチドが所望の効果を表わすのに十分な期間の間TLR分子と関連して関連されたまま維持されることを意味する。
「被験者」または「患者」は、本明細書に記載された組成物によって影響を受けることができる治療が必要な動物を意味する。治療され得る動物は牛、犬、馬、猫、ヤギ、豚、および特に好ましい例である霊長類(人間および非−人間霊長類)のような哺乳動物を含む脊椎動物である。
「代理標識(surrogate marker))」は、疾病状態に対する治療効果を間接的に見せる身体内の生物学的活性の実験的な測定である。過増殖性および/または心血管疾患に対する代理標識の例はSPHKおよび/またはS1PRを含む。
「治療剤」は、非制限的な例で、COX抑制剤および他のNSAIDSを含む抗−炎症性薬品、抗−血管新生薬品、前記で定義された化学療法用薬品、心血管剤、免疫仲裁剤(immunomodulatory agents)、神経病性障害を治療するために使われる薬剤、目薬、抗−繊維増剤、などを含む治療効果を提供することを意図した薬物または化合物を意味する。
「治療的に効果的な容量」(または「効果的な容量」)は治療が必要な被験者に投与される時治療効果を表わすのに十分な活性成分の容量を意味する。したがって、組成物の治療的に効果的な容量は当分野の技術者によって容易に決定され得る。癌治療と関連して、「治療的に効果的な容量」は、特定岩に関連された一つ以上の遺伝子の発現の増加または減少、腫瘍大きさ減少、癌細胞溶解、生物学的試料(例えば、全血(whole blood)、血小、血清、小便、などのような体液の組織バイオプシー(biopsy)および部分標本(aliquot))内の一つ以上の癌細胞死滅標識者探知、老化または他の細胞死滅経路の誘導、などを含む癌細胞生存または物質代謝と関連された一つ以上のパラメーターで客観的に測定された変化を表わす容量である。もちろん、治療的に効果的な容量は、当分野の技術者によって容易に決定され得る、治療される特定被験者および疾患、被験者の体重および年齢、疾病の深刻度、使われる化合物の種類、後続される投薬処方、投与時間、投与方法、などにより相異なるであろう。併用治療と関連された特定活性成分の治療的に効果的な容量は単独治療(すなわち、活性成分でただ一つの化学的物質を使う治療療法)で投与される前記活性成分の治療的に効果的な容量とは相異なる可能性があることを理解できるはずである。
本明細書で説明される組成物は生理活性脂質基盤の治療方法で使われる。本明細書で使われるように、用語「治療」および「治療上」は、疾病、疾患または身体的外傷の予防および/または治療の全領域を含む。「治療」薬剤は危険な状態にあると確認され得る(例えば、薬品遺伝学によって)個人を治療するために考案された手続きを含むものなどを含む予防(prophylacticまたはpreventive)する方式で機能するか自然的に改善されるか治る方式で機能するか治療される疾病または疾患の少なくとも一つの症状の進展の速度または範囲を低くするように作用するか必要な時間、疾病、疾患、または身体的外傷からの回復に関連されたいかなる不便または痛み、または物理的限界の発生または範囲を最小化するように機能するか他の治療剤に対する補剤として使われ得る。
用語「治療」または「治療する」は、疾病または疾患を予防するかこれから保護し(すなわち、臨床症状が現れないようにする);疾病または疾患を抑制し(すなわち、臨床症状の勃発を中断させるか、延期するか、抑制する);および/または疾病または疾患の軽減すること(臨床症状の退行を引き起こす)を含む疾病または疾患のすべての形態の治療を意味する。窮極的に誘導される現象または現象が知られていないか潜伏しているため、疾病または疾患の予防と抑制を区分することが常に可能ではないことが理解できるであろう。「治療が必要な」被験者は、すでに疾病がある被験者だけでなく、予防が必要な疾患がある被験者を含む。したがって、用語「疾病予防(prophylaxis)」は、予防および抑制を含む治療の形態と見なされることが理解できるであろう。したがって、用語「保護(protection)」は、「疾病予防」を含む。
用語「治療療法」は、化学療法制および細胞毒性制を使うすべての疾病および疾患治療、放射線治療、手術、遺伝子治療、DNAワクチンおよび治療、siRNA治療、抗−血管新生治療、免疫治療、骨髄移植、アプタマー(aptamer)および抗体および抗体フラグメントのようなその他の生物製剤、おとり受容体(receptor decoy)、およびその他の蛋白質系治療剤を意味する。
抗体の「可変形」領域は骨格(framework)および相補性決定部位(CDR、初可変領域としても知られている)を含む。可変性は抗体の可変ドメイン随所に全体にかけて等しく分配されない。可変性は6個のCDRセグメントに集中し、軽鎖および重鎖可変ドメインそれぞれに3個のCDRセグメントがある。さらに高く補助された可変ドメインの部分は骨格領域(framework region、FR)と命名される。天然そのままの重鎖および軽鎖の可変ドメインそれぞれは三個の初可変領域によって連結されてベータ−シート(beta−sheet)構造を連結する(一部の場合で、前記ベータ−シート構造の一部を形成する)ループを形成するベータ−シート構造を主に利用し、四個のFR(FR1、FR2、FR3、およびFR4それぞれ)を含む。本発明で使われる用語「初可変領域 」は、抗原結合の原因になる抗体のアミノ酸残基を意味する。初可変領域は、「相補性決定部位」または「CDR「(例えば、軽鎖可変ドメイン内の残基である24−34(L1)、50−56(L2)および89−97(L3)、および重鎖可変ドメイン内の31−35(H1)、50−65(H2)、および95−102(H3))由来のアミノ酸残基(Kabatなど、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版. Public Health Service、メリーランド州ペデスタ所在のNational Institutes of Health、1991年、647〜669面)、および/または「初可変形ループ「(例えば、軽鎖可変ドメイン内の残基26−32(L1)、50−52(L2)、および91−96(L3)および重鎖可変ドメイン内の26−32(H1)、53−55(H2)、および96−101(H3))由来のアミノ酸残基(ChothiaおよびLesk J.、Mol. Biol. 196:901−917、1987年)を含む。「骨格」または「FR」残基は本明細書で定義されたように初可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
当分野ではアミノ酸残基を計数する一つ超過のシステムが通常的に使われることを参考しなければならない。前記でCDRが説明され、カバット計数技法(Kabat numbering scheme、Kabatなど、前述される)により計数されるが、他の技法または序列計数法が使われ得る。一部の場合で、序列計数およびカバット計数は同一である。
各鎖内の初可変領域はFRによって非常に近く位置し、他の鎖の初可変領域と共に抗体の抗原結合位置の形成に寄与する(参照、Kabatなど、前述される)。繰返しドメインは抗原に対する抗体の結合に直接的に関与しないが、抗体と関連された細胞毒性で抗体の沈殿のような多様な作用者機能を表わす。
「ベクター」または「プラスミド」または「発現ベクター」は、一つ以上の再調合遺伝子の発現に影響を与えるために細胞内に一時的にまたは安定的に維持され得る核酸を意味する。ベクターは核酸を単独で含むか他の化合物と複合化された核酸を含むことができる。ベクターは選択的にウイルスまたはバクテリア核酸および/または蛋白質、および/または膜を含む。ベクターは、非制限的な例で、DNAのフラグメントが付着して複製され得るレプリコン(replicon)(例えば、RNAレプリコン、バクテリオファージ)を含む。したがって、ベクターは、非制限的な例で、RNA、自主的に複製する円形のまたは線形のDNAまたはRNAを含み、発現プラスミドおよび非−発現プラスミドすべてを含む。プラスミドは購買可能であるか、制限なしに公開的に利用可能であるか、公開されたプロトコルに記録された利用可能なプラスミドから製作され得る。また、発現ベクターは真核細胞培養のためのジヒドロ葉酸レダクターゼ(dihydrofolate reductase)またはネオマイシン(neomycin)抵抗性、またはE. coliでテトラシクリン(tetracycline)またはアンピシリン抵抗性のような形質転換された宿主細胞の選別のための形質を提供者は遺伝子を含むことができる。
単クローン抗体(mAbs)は安全で効果的な治療剤と確認されてきた。数十個の治療用単クローン抗体はFDAによって臨床用に承認され、追加的な単クローン抗体が多様な形態の癌を的中するために多く発病する数多くの疾病に対して多様な臨床的開発段階にある。一般的に、単クローン抗体は非−人間哺乳動物で生産される。人間患者がネズミ科の抗体に対して主に抗体反応始めるという事実によって、ネズミ科単クローン抗体の治療用での使用は制限される。いわゆるHAMA(human anti−mouse antibody、人間抗−マウス抗体)反応と呼ばれるこのような反応はネズミ科単クローン抗体の最終的な中和および早い除去を招く。このような除去はネズミ科の抗体に対する「人間化」と呼ばれる工程の発達で克服されてきた。人間化は投与された治療用単クローン抗体に対する免疫反応の発達を大きく減らすことによって、HAMAによる半減期および治療効能の減少を防止する。普通、前記人間化過程は人間免疫グロブリンの骨格領域(FRs)内にネズミ科の相補性決定領域(CDR)を組み合わせることを含む。このような戦略は「CDRクラフティング」と言及される。FR内の選択された残基のネズミ科アミノ酸残基に対する「復帰突然変異」は、時々初期の接合された構造物で消失した親和力を回復するために要求される。また、完全人間型抗体は人間免疫グロブリン遺伝子を有する再調合実験ネズミから生産され得る。
人間抗体または人間化抗体は典型的に次の式によって示されるアミノ酸序列を含む重鎖可変ドメインを有する:FR1−CDRH1−FR2−CDRH2−FR3−CDRH3−FR4.前記式で、「FR1−4」は、四個の骨格領域を示し、「CDRH1−3」は、抗−cysLT抗体可変形重い(heavy) ドメインの三個の初可変領域を示す。FR1−4は下記の実施例のように「共通序列「(例えば、人間免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の部類、下位部類、または下位集団の最も一般的なアミノ酸)で由来するか、それぞれの人間抗体骨格領域または異なる骨格領域序列の組合で由来することができる。数多くの人間抗体骨格領域序列が編集されている(Kabatなど、前述される)。例えば。一つの具体例において、前記可変形重いFRは前述されたKabatなどの文献によって編集されたように人間免疫グロブリン下位集団の共通序列によって提供される。
前記人間可変形重いFR序列は内部に置換を有することができる。前記人間FR残基は上昇する非人間残基(「相応する非人間残基」は、人間序列および非人間序列が整列(aligned)される時に関心対象である人間残基のようなカバット位置係数を有する非人間残基を意味する)により交替されるが、非人間残基での交替は必須のものではない。例えば、前記相応する非人間残基他にFR残基交替はファージディスプレイ(phage display)により選択され得る。
また、抗体は典型的に次の式によって示されるアミノ酸序列を含むアミノ酸軽鎖可変ドメインを有する:FR1−CDRL1−FR2−CDRL2−FR3−CDRL3−FR4.前記式で、「FR1−4」は、四個の骨格領域を示し、「CDRL1−3」は、抗−cysLT抗体可変形軽いドメインの三個の初可変領域を示す。FR1−4は下記の実施例でのように「共通序列」(例えば、人間免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の部類、下位部類、または下位集団の最も一般的なアミノ酸)で由来するか、それぞれの人間抗体骨格領域または異なる骨格領域序列の組合で由来することができる。一つの好ましい具体例において、前記可変形軽いFRは前述されたKabatなどの文献によって編集されたように人間免疫グロブリン下位集団の共通序列によって提供される。
前記人間可変形重いFR序列は内部に置換を有することができる。例えば、前記人間FR残基は相応する実験ネズミの残基で交替されるが、非人間残基で交替は必須のものではない。例えば、前記相応する非人間残基他に、交替残基はファージディスプレイによって選択され得る。
前記人間可変形重いFR序列は内部に置換を有することができる。例えば、前記人間FR残基は相応する実験ネズミの残基で交替されるが、非人間残基で交替は必須のものではない。例えば、前記相応する非人間残基他に、交替残基はファージディスプレイによって選択され得る。
単クローン抗体の製造は、蛋白質自らの多様性による複雑な工程である。単クローン抗体の多様性は蛋白質バックボーンおよび/または炭水化物モイエティで位置することができる。操作は通常的に向上した安定性、蛋白質分解酵素に対する抵抗性、集合挙動(aggregation behavior)などのような物性を向上させ、異種起源(heterologous)システムでの発現数値を改善するために抗体分子に適用され得る。
効果的な濃度の一つ以上のcysLTを低くする抗体のような製剤は炎症を減少させ、アレルギー性、心血管、および神経疾患だけでなく、喘息、癌、炎症性疾病および疾患、および一つ以上のcysLTの望んでいない、過度な、または異常な数値と関連された疾病または疾患を含む疾病および疾患の治療に有用なものと考えられる。
好ましい具体例において、前記の抗体は単クローン抗体である。このような具体例の一部で、前記抗体はLTE4、LTC4、および/またはLTD4の中の一つ以上の効果的な濃度を低くする。さらに他の具体例において、前記抗体はLTE4、LTC4、およびLTD中の一つ以上の効果的な濃度を低くする。このような三個のcysLTの中の一つ以上の効果的な濃度は異なる範囲で減少するか、実質的に同一に減少することができる。このような具体例中の好ましいものは治療される疾病の状態により異なり得る。
本発明の治療方法および組成物は一つ以上のcysLTの相対的な、絶対的な、または利用可能な濃度を変更するために意図された。患者で望んでいないcysLTの量を調節するための一つの方法は、有利な(free)cysLTの数値を低くする治療的「スポンジ(sponge)」として作用するように抗−cysLT抗体、抗体フラグメントまたはアプタマーのような一つ以上のcysLT結合剤を含む組成物を提供することである。また、このような効果的な濃度のcysLTの減少は、cysLT「中和」とも言及される。化合物が「ガラス(free)」であると言及されるとき、前記化合物がこれら化合物の望まない効果を表わす位置または位置にいかなる方法で到達するかは制限されない。典型的に、ガラス化合物は血液および組織に存在し、前記血液または組織はガラス化合物の作用位置や前記作用位置を含み、化合物は前記血液または組織でこれらの作用位置に自由に移動することができる。また、ガラス化合物は化合物を望んでいない化合物に転換するある酵素によって作動するように利用され得る。
cys−LTの抗体
本発明は抗−cysLT単クローン抗体および抗原と結合する前記抗体のフラグメントと関連された組成物および方法を提供する。抗体は典型的に多クローン性または単クローンであると説明される。前記の抗−cysLT抗体は(またはこれの抗原と結合する前記抗体のフラグメント)疾病、疾患、または身体的外傷の治療を含む数多くの目的に有用な薬学的組成物で剤形化できる。一つ以上の抗−cysLT抗体を含む薬学的組成物をこのような治療のためのキットおよび医療装置に含まれ得る。医療装置は治療が必要な患者に本発明の薬学的組成物を投与するkとに使われ得る。一部の具体例にしたがって、このような装置を含むキットが提供される。このような装置およびキットは本発明の薬学的組成物の自家投与を含む日常的な投与用に考案され得る。また、このような装置およびキットは応急治療用で(例えば、救急車または応急室内に、または手術の間、または負傷または疾病がある活動の場合で(例えば、喘息「アタック(attack)」の場合も可能であるが全体的な治療が直ちになされないこともあり得る(例えば、ハイキングおよびキャンピング、またはスポーツまたは戦争の状況も考えられる))。
本発明は抗−cysLT単クローン抗体および抗原と結合する前記抗体のフラグメントと関連された組成物および方法を提供する。抗体は典型的に多クローン性または単クローンであると説明される。前記の抗−cysLT抗体は(またはこれの抗原と結合する前記抗体のフラグメント)疾病、疾患、または身体的外傷の治療を含む数多くの目的に有用な薬学的組成物で剤形化できる。一つ以上の抗−cysLT抗体を含む薬学的組成物をこのような治療のためのキットおよび医療装置に含まれ得る。医療装置は治療が必要な患者に本発明の薬学的組成物を投与するkとに使われ得る。一部の具体例にしたがって、このような装置を含むキットが提供される。このような装置およびキットは本発明の薬学的組成物の自家投与を含む日常的な投与用に考案され得る。また、このような装置およびキットは応急治療用で(例えば、救急車または応急室内に、または手術の間、または負傷または疾病がある活動の場合で(例えば、喘息「アタック(attack)」の場合も可能であるが全体的な治療が直ちになされないこともあり得る(例えば、ハイキングおよびキャンピング、またはスポーツまたは戦争の状況も考えられる))。
また、抗−cysLT抗体(およびこれらの抗原と結合する前記抗体のフラグメント)は診断試薬および研究用試薬に有用であり、これに伴い剤形化されておよび/または包装され得る。抗−cysLT抗体は研究用または診断用で固体支持体に付着することができる。前記固体紙遅滞の例としてコラム、玉、およびELISA皿がある。
抗体生産および特徴説明
cysLTに対する単クローン抗体は下記の実施例で説明されたように製造され得る。一つの具体例において、cysLTに対する前記単クローン抗体は一つ以上のcysLTに対して強い結合親和力を有する。抗体親和力は後述される実施例で説明されるように決定され得る。一つのcysLT、例えば、LTC4、LTD4、またはLTE4に対して優先的なまたは特定の親和力を有する抗体を選択することが好ましいこともある。他の具体例において、前述されたcysLTの中の一つ超過または三個のcysLTすべてに対して親和力を有する抗体を選択することが好ましいこともある。前記抗体は異なる親和力を有する多数のcysLTらと結合することができる。また、治療観点で他の有益な物性を有するキメラまたは人間化抗体または抗原に結合する抗体フラグメントを選択することが好ましいこともある。例えば、前記抗体は炎症性反応または血管形成を減少させるものであり得る。
cysLTに対する単クローン抗体は下記の実施例で説明されたように製造され得る。一つの具体例において、cysLTに対する前記単クローン抗体は一つ以上のcysLTに対して強い結合親和力を有する。抗体親和力は後述される実施例で説明されるように決定され得る。一つのcysLT、例えば、LTC4、LTD4、またはLTE4に対して優先的なまたは特定の親和力を有する抗体を選択することが好ましいこともある。他の具体例において、前述されたcysLTの中の一つ超過または三個のcysLTすべてに対して親和力を有する抗体を選択することが好ましいこともある。前記抗体は異なる親和力を有する多数のcysLTらと結合することができる。また、治療観点で他の有益な物性を有するキメラまたは人間化抗体または抗原に結合する抗体フラグメントを選択することが好ましいこともある。例えば、前記抗体は炎症性反応または血管形成を減少させるものであり得る。
好ましくは、前記人間化抗体またはこれのフラグメントは人間患者に治療的に効果的な容量の前記抗体の投与時免疫反応を誘導することを失敗した。免疫反応が誘導されると、好ましくは前記反応は前記抗体が前記抗体で治療される患者に治療的利点を依然として提供するように存在するであろう。
A. 抗体製造
単クローン抗体を含む抗−cysLT抗体を生産する方法が下記の実施例で説明される。このような非人間抗体および母抗体を生産するための代表的な方法が下記の段落で説明されるであろう。
単クローン抗体を含む抗−cysLT抗体を生産する方法が下記の実施例で説明される。このような非人間抗体および母抗体を生産するための代表的な方法が下記の段落で説明されるであろう。
(i)抗原製造
抗体を生産するのに使われる抗原は、例えば、本来のcysLTまたはcysLTの一部(例えば、所望の天然そのままの抗原決定部を含むcysLTフラグメント)であり得る。一つの具体例において、前記抗原は運搬体に接合されたcysLTであるため、抗体コンジュゲートを形成する。抗体を生産するのに有用なcysLT抗原のさらに他の形態は当分野の技術者に明確であろう。
抗体を生産するのに使われる抗原は、例えば、本来のcysLTまたはcysLTの一部(例えば、所望の天然そのままの抗原決定部を含むcysLTフラグメント)であり得る。一つの具体例において、前記抗原は運搬体に接合されたcysLTであるため、抗体コンジュゲートを形成する。抗体を生産するのに有用なcysLT抗原のさらに他の形態は当分野の技術者に明確であろう。
(ii)多クローン抗体
多クローン抗体は典型的に関連された抗原および補剤の皮下(subcutaneous、sc)または腹腔内(intraperitoneal、ip)注射のような多数の注射によって動物で生産される。典型的に、このような方法を使用し、前記脂質抗原が免疫化される種で免疫原性が蛋白質のような運搬体(例えば、2作用剤(bifunctional agent)または誘導剤(リンカーにも言及される)を使ってキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、卵アルブミン(OVA)、血清アルブミン、牛のタイログロブリン(bovine thyroglobulin)、または豆トリプシン抑制剤(soybean trypsin inhibitor)(例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(maleimidobenzoyl sulfosuccinimide ester、システイン残基によって接合される)、N−ヒドロキシスクシンイミド(N−hydroxysuccinimide、リシン(lysine)残基によって接合される)、グルタルアルデヒド(glutaraldehyde)、琥珀酸無水物(succinic anhydride)、SOCl2、またはR1N=C=NR(前記式で、RおよびR1は異なるアルキルグループである)))に連結される。当分野で知られている以外のリンカーは次のような一次アミン基およびスルフヒドリル基と結合する次にのような異形二重機能架橋剤(Thermo Scientific、マサチュセッツ州、ワールサム所在)を含む。スクシンイミジル4−[N−マレイミドメチル]シクロヘキサン−1−カルボキシレート(succinimidyl 4−[N−maleimidomethyl]cyclohexane−1−carboxylate、SMCC)、スクシンイミジルヨードアセテート(succinimidyl iodoacetate、SIA)、およびスクシンイミジル(4−ヨードアセチル)アミドベンゾエート(succinimidyl(4−iodoacetyl)aminobenzoate、SIAB)。前記天然そのままのcysLT更には架橋剤1−エチル−3−[3−ジメチルアミノプロフィール]カルボジイミドヒドロクロライド(1−ethyl−3−[3−dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride(EDC)、Thermo Scientific、メサチュセチュジュワ−ルサム所在)を使って運搬体蛋白質に直接的に接合され得、例えば、抗−cysLT抗体に対するスクリーン分析に使われ得る。非−蛋白質運搬体(例えば、コロイド質金、ポリエチレングリコール、シリコンビーズ)更には抗体生産に使われるものと当分野で知られている。
多クローン抗体は典型的に関連された抗原および補剤の皮下(subcutaneous、sc)または腹腔内(intraperitoneal、ip)注射のような多数の注射によって動物で生産される。典型的に、このような方法を使用し、前記脂質抗原が免疫化される種で免疫原性が蛋白質のような運搬体(例えば、2作用剤(bifunctional agent)または誘導剤(リンカーにも言及される)を使ってキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、卵アルブミン(OVA)、血清アルブミン、牛のタイログロブリン(bovine thyroglobulin)、または豆トリプシン抑制剤(soybean trypsin inhibitor)(例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(maleimidobenzoyl sulfosuccinimide ester、システイン残基によって接合される)、N−ヒドロキシスクシンイミド(N−hydroxysuccinimide、リシン(lysine)残基によって接合される)、グルタルアルデヒド(glutaraldehyde)、琥珀酸無水物(succinic anhydride)、SOCl2、またはR1N=C=NR(前記式で、RおよびR1は異なるアルキルグループである)))に連結される。当分野で知られている以外のリンカーは次のような一次アミン基およびスルフヒドリル基と結合する次にのような異形二重機能架橋剤(Thermo Scientific、マサチュセッツ州、ワールサム所在)を含む。スクシンイミジル4−[N−マレイミドメチル]シクロヘキサン−1−カルボキシレート(succinimidyl 4−[N−maleimidomethyl]cyclohexane−1−carboxylate、SMCC)、スクシンイミジルヨードアセテート(succinimidyl iodoacetate、SIA)、およびスクシンイミジル(4−ヨードアセチル)アミドベンゾエート(succinimidyl(4−iodoacetyl)aminobenzoate、SIAB)。前記天然そのままのcysLT更には架橋剤1−エチル−3−[3−ジメチルアミノプロフィール]カルボジイミドヒドロクロライド(1−ethyl−3−[3−dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride(EDC)、Thermo Scientific、メサチュセチュジュワ−ルサム所在)を使って運搬体蛋白質に直接的に接合され得、例えば、抗−cysLT抗体に対するスクリーン分析に使われ得る。非−蛋白質運搬体(例えば、コロイド質金、ポリエチレングリコール、シリコンビーズ)更には抗体生産に使われるものと当分野で知られている。
一つの典型的なプロトコルで、実験動物たちは(例えば、実験ネズミまたはウサギs)、例えば、100 ugまたは5 ugの蛋白質またはコンジュゲート(ウサギまたは実験ネズミそれぞれに対して)を3倍体積のプロイント完全補強剤(Freund´s complete adjuvant)と混合して混合された溶液を皮膚内の多数位置で注射することによってcysLT免疫原(例えば、抗原、免疫原性コンジュゲート、または誘導体)に対して免疫化される。典型的に、約一ヶ月後に、前記実験動物たちは多数の位置で皮下注射によってプロイント完全補強剤内のペプチドまたはコンジュゲートの本来の容量の1/5〜1/10で投与される。7〜14日後に、前記実験動物たちは採血され、血清は抗体力価分析される。動物たちは力価安定期(titer plateaus)まで飼育される。好ましくは、実験動物は同じ抗原のコンジュゲートで投与されるが、異なる蛋白質に対して接合されでおよび/または異なる架橋試薬によって接合される。免疫反応を改善するために明礬(alum)のような凝集剤が適切に使われ得る。コンジュゲート更には蛋白質融合のような再調合細胞培養で生産され得る。
(iii)単クローン抗体.
単クローン抗体製造方法が当分野に知られている。例えば、単クローン抗体はKohlerなど(1975年、Nature、256:495)により初めて説明されたハイブリードマ方法(hybridoma method)により生産されるか、または再調合DNA方法(アメリカ特許第4、816、567号)により生産され得る。ハイブリードマ方法で、実験ネズミ、ウサギまたはハムスターまたは短い尻尾猿のようなこの他の適切な宿主動物たちは化のために使われる前記蛋白質に特異的に結合することになる抗体を生産するか生産できるリンパ球を誘導するために前述されたように免疫化される。また、リンパ球は体外で免疫化され得る。この後、前記リンパ球はハイブリードマ細胞を形成するためにポリエチレングリコールのような適切な融合剤を使って骨髓細胞と融合することができる(Goding、Monoclonal Antibodies:Principles and Practice、59〜103面、Academic Press、1986年)。
単クローン抗体製造方法が当分野に知られている。例えば、単クローン抗体はKohlerなど(1975年、Nature、256:495)により初めて説明されたハイブリードマ方法(hybridoma method)により生産されるか、または再調合DNA方法(アメリカ特許第4、816、567号)により生産され得る。ハイブリードマ方法で、実験ネズミ、ウサギまたはハムスターまたは短い尻尾猿のようなこの他の適切な宿主動物たちは化のために使われる前記蛋白質に特異的に結合することになる抗体を生産するか生産できるリンパ球を誘導するために前述されたように免疫化される。また、リンパ球は体外で免疫化され得る。この後、前記リンパ球はハイブリードマ細胞を形成するためにポリエチレングリコールのような適切な融合剤を使って骨髓細胞と融合することができる(Goding、Monoclonal Antibodies:Principles and Practice、59〜103面、Academic Press、1986年)。
このように生産されたハイブリードマ細胞は好ましくは、融合しない某骨髓細胞の成長または生存を抑制する一つ以上の物質を含有する適切な培養培地に接種されて培養される。例えば、母骨髓細胞でヒポキサンチングアニンフォ スフォ リボシル トランスフェラーゼ(hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase、HGPRTまたはHPRT)が欠乏となる時、前記ハイブリードマ用培養培地はHGPRT−欠乏細胞の成長を抑制する物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン(HAT培地)を一般的に含むであろう。
好ましい骨髓細胞は効率的に融合し、選択された抗体生産細胞によって安定した高い数値の抗体生産を支持し、HAT培地のような培地に敏感な細胞である。このような骨髓細胞のうち、好ましい骨髓細胞株はSalk Institute Cell Distribution Center(アメリカ、カリフォルニア州、サンディエゴ所在)で利用可能なMOP−21およびM.C.−11実験ネズミ腫瘍由来である細胞、およびAmerican Type Culture Collection(アメリカ、メリーランド州、ロクビル所在)で利用可能なSP−2またはX63−Ag8−653細胞のようなネズミ科骨髄種(myeloma)細胞株である。人間骨髄腫細胞週および実験ネズミ−人間ヘテロ骨髓細胞株更には人間単クローン抗体生産と関連して説明されている(Kozbor、J. Immunol.、133:3001、1984年;Brodeurなど、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications、51〜63面、Marcel Dekker、Inc.、ニューヨーク所在、1987年)。
ハイブリードマ細胞が培養される培養培地は前記抗原に対して提供される単クローン抗体の生産のために分析される。好ましくは、ハイブリードマ細胞によって生産された単クローン抗体の結合特異性は免疫沈降(immunoprecipitation)または放射線免疫測定法(radioimmunoassay、RIA)または酵素標識免疫検査法(enzyme−linked immunoabsorbant assay、ELISA)のような体外結合分析によって決定される。前記単クローン抗体の結合親和力は、例えば、スキャッチャード(Scatchard)分析(Munsonなど、Anal. Biochem.、107:220、1980年)により決定され得る。
所望の特異性、親和力、および/または活性を有する抗体を生産するハイブリードマ細胞を同定した後に、クローン(clone)は限界希釈法(limiting dilution procedure)により亜クローン(subclone)となり、標準方法によって培養され得る(Goding、単クローン抗体:Principles and Practice、59〜103面、Academic Press、1986年)。このような目的のための適切な培養培地は、例えば、D−MEMまたはRPMI−1640培地を含む。また、前記ハイブリードマ細胞は複数腫瘍で動物体内で成長することができる。
前記クローンによって分泌される単クローン抗体は、例えば、蛋白質A−セファロース(protein A−Sepharose)、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析(dialysis)、または親和力クロマトグラフィーのような従来の免疫グロブリン手続きによって培養培地、複数液体(ascites fluid)、または血清から適切に分離される。
前記単クローン抗体を暗号化するDNAは従来の手続きを使って(例えば、単クローン抗体の重鎖および軽鎖を暗号化する遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使うことによって)容易に分離して序列分析される。前記ハイブリードマ細胞はこのようなDNAの好ましい供給源として機能する。前記DNAは分離すると同時に発現ベクター内に位置されて、以後再調合宿主細胞内で単クローン抗体の合成がなされるように、免疫グロブリン蛋白質を生産しないE coli細胞、猿COS細胞、中国ハムスター卵巣(Chinese hamster ovary、CHO)細胞、または骨髓細胞のような宿主細胞内に形質導入される。再調合による抗体生産は下記でさらなる詳細に説明されるであろう。
(iv)人間化およびアミノ酸序列変異
本発明の一部の好ましい具体例は一つ以上のcysLTに対して人間化抗体を使う。抗体を人間化する一般的な方法は例えば次の文献に説明されている:アメリカ特許第5861155号、アメリカ特許第6479284号、アメリカ特許第6407213号、アメリカ特許第6639055号、アメリカ特許第6500931号、アメリカ特許第5530101号、アメリカ特許第5585089号、アメリカ特許第5693761号、アメリカ特許第5693762号、アメリカ特許第6180370号、アメリカ特許第5714350号、アメリカ特許第6350861号、アメリカ特許第5777085号、アメリカ特許第5834597号、アメリカ特許第5882644号、アメリカ特許第5932448号、アメリカ特許第6013256号、アメリカ特許第6129914号、アメリカ特許第6210671号、アメリカ特許第6329511号、アメリカ特許第2003166871号、アメリカ特許第5225539号、アメリカ特許第6548640号、およびアメリカ特許第5624821号.一部の具体例において、最初に収得された人間化抗体(母抗体)と比較して、(具体的には、前記抗体の結合親和力またはその他の生物学的物性を改善する)アミノ酸序列変異を有する抗体を生産することが好ましいこともある。これは母抗体の最適化と言及されることもあり得る。
本発明の一部の好ましい具体例は一つ以上のcysLTに対して人間化抗体を使う。抗体を人間化する一般的な方法は例えば次の文献に説明されている:アメリカ特許第5861155号、アメリカ特許第6479284号、アメリカ特許第6407213号、アメリカ特許第6639055号、アメリカ特許第6500931号、アメリカ特許第5530101号、アメリカ特許第5585089号、アメリカ特許第5693761号、アメリカ特許第5693762号、アメリカ特許第6180370号、アメリカ特許第5714350号、アメリカ特許第6350861号、アメリカ特許第5777085号、アメリカ特許第5834597号、アメリカ特許第5882644号、アメリカ特許第5932448号、アメリカ特許第6013256号、アメリカ特許第6129914号、アメリカ特許第6210671号、アメリカ特許第6329511号、アメリカ特許第2003166871号、アメリカ特許第5225539号、アメリカ特許第6548640号、およびアメリカ特許第5624821号.一部の具体例において、最初に収得された人間化抗体(母抗体)と比較して、(具体的には、前記抗体の結合親和力またはその他の生物学的物性を改善する)アミノ酸序列変異を有する抗体を生産することが好ましいこともある。これは母抗体の最適化と言及されることもあり得る。
アミノ酸序列変異を有する抗体は、前記の抗体DNA内に適切なヌクレオチド変更(変異)を導入するかペプチド合成によって製造され得る。このような変異は、例えば、前記アミノ酸序列内残基の削除、挿入、および/または置換を含む。削除、挿入、および置換のいかなる組合が最終構造物を生産のためにまされ、これによって所望の特性を有する最終構造物が提供される。また、このようなアミノ酸変更はグリコシル化(glycosylation)地点の個数変化または位置変化のような抗体の転写後過程を変えることができる。蛋白質(抗体を含む)のすべての種類の転写後過程は酵素的過程で哺乳動物細胞で分離された単クローン抗体およびこの他の再調合蛋白質で非常に一般的な脱アミド化、非酵素的過程、およびC−末端リシンまたはアルギニン(arginine)チピング(clipping)を含む(Harris RJ.、1995年、J Chromatogr A 705:129‐134)。本明細書のアミノ酸序列は与えられた疾病下で引き起こされるか引き起こされないことがあるすべての可能な転写後改質とは関係なく提供される。
突然変異化のために好ましい位置である前記抗体のある残基または領域の同定のための有用な方法は、CunninghamおよびWells(1989年、Science、244:1081−1085)により説明されたように「アラニンスキャン突然変異化(alanine scanning muタグenesis)」と命名される。ここで、ターゲット残基の残基または基(例えば、arg、asp、his、lys、およびgluのような電荷された残基)が同定され、前記抗原と抗体間の相互作用に影響を及ぼすように中性や陰電荷されたアミノ酸(最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン)により交替される。この後、前記置換に対して機能的な敏感度を表わす抗体内のこのようなアミノ酸位置は置換位置にまたは置換位置に対して追加的なまたは他の置換または改質を導入することによって定義される。したがって、アミノ酸序列変異を導入するための位置があらかじめ決定される反面、変異自らの性質があらかじめ決定されることが必要なものではない。例えば、与えられた位置で変異の有無を分析するために、alaスキャニングまたは無作為的突然変異化がターゲットコドンまたは領域でなされ、生産された抗体が発現して所望の活性に対してスクリーンされる。アミノ酸序列挿入は一つの残基〜数百個またはそれ以上の残基を含むポリペプチド長さ 範囲のアミノ−末端融合および/またはカルボキシル−末端融合だけでなく、一つのまたは多数のアミノ酸残基の序列内挿入を含む。ことば端部挿入の例はN−末端メティオニル残基または抗原決定部タグ(epitope tag)と融合した抗体を含む。この他の挿入の例は前記抗体のN−末端またはC−末端に対する抗体の血清半減期を向上させる酵素またはポリペプチドの融合を含む。
抗体変異のさらに他の形態はアミノ酸置換である。このような変異された抗体は前記の抗体分子から除去された少なくとも一つのアミノ酸残基およびその位置に挿入された異なる残基を有する。置換型突然変異化のための最も興味深い位置は初可変領域を含むが、骨格変化更には考慮される。保全的置換(conservative substitution)が好ましいが、このような置換が生物学的活性変化を引き起こす場合にはもう少し実質的な(substantial)置換が導入され、結果産物はスクリーンされる。このような置換およびこれらの保存性程度は当分野で良く知られている。
前記抗体の生物学的物性の実質的な改質(Substantial modification)は(a)置換領域内のポリペプチドバックボーン構造を維持するにあたってこれらの効果を有意的に変更する置換を(例えば、シート形態または螺旋形態として)、(b)ターゲット位置にある分子の電荷または疏水性、または(c)大量の側鎖を選択することによってなされる。自然的に発生する残基は一般的な側鎖物性によって下記のグループに分類される:
(1)疏水性:ノルロイシン(norleucine)、met、ala、val、leu、ile;
(2)中性親水性(neutral hydrophilic):cys、ser、thr;
(3)酸性:asp、glu;
(4)塩基性:asn、gln、his、lys、arg;
(5)鎖配向に影響を及ぼす残基:gly、pro;および
(6)芳香族:trp、tyr、phe.
(1)疏水性:ノルロイシン(norleucine)、met、ala、val、leu、ile;
(2)中性親水性(neutral hydrophilic):cys、ser、thr;
(3)酸性:asp、glu;
(4)塩基性:asn、gln、his、lys、arg;
(5)鎖配向に影響を及ぼす残基:gly、pro;および
(6)芳香族:trp、tyr、phe.
非保全性置換によって、このようなグループの中の一つのグループの構成員はさらに他のグループに属することになる。
分子の酸化的安定性を改善して異常な架橋結合を予防するために、前記抗体の適切な形態を維持するのと関連されないすべてのシステイン残基が置換され得る。反対に、抗体の安定性を改善するために、システイン結合が抗体に付加され得る(具体的には、前記抗体はFvフラグメントのような抗体フラグメントだ)。
一つの置換形態は母抗体(例えば、人間化抗体または人間抗体)の一つ以上の初可変領域 残基の置換を含む。一般的に、追加的な改良のために選択された抗体産物はこれらの起源である母抗体より相対的に改善された物性を有し、時々「最適化」抗体と言及される。このような置換を有する抗体生産する便利な方法で、ファージディスプレイを利用する親和度成熟(affinity maturation)がある。要約すれば、いくつかの初可変領域位置(例えば、6〜7個の位置)がそれぞれの位置ですべての可能なアミノ酸置換をなすために変異される。このように生産された各粒子内に包装された(packaged)M13の遺伝子IIII産物に対する融合物として糸状ファージ(filamentous phage)粒子から1価の方式で展示される。前記ファージ−展示された抗体の生物学的活性(例えば、結合親和力)がスクリーンされる。改質のための候補初可変領域位置を同定するために、抗原結合に明確に寄与する初可変領域残基を確認するアラニンスキャン突然変異化が実行され得る。また、前記抗体と抗原の間の接触点を確認するために抗原−抗体複合体の結晶構造を分析することが有用であり得る。このような接触残基および隣り合った残基は本発明で説明される技術にしたがって置換される候補者である。このような置換を有する抗体が生産されると同時に、このような抗体は本明細書に記載されたようにスクリーンされ得、一つ以上の関連された分析で確認された優秀な物性を有する抗体が追加的な開発のために選択され得る。
前記抗体のさらに他の形態のアミノ酸変更は前記抗体の本来のグリコシル化パターンを変更する。「変更」は、前記抗体で発見される一つ以上の炭水化物モイエティの削除および/または前記抗体で発見されない一つ以上のグリコシル化位置の添加を意味する。
抗体のグリコシル化は典型的にN−結合型および/またはまたはO−結合型である。N−結合型はアスパラギン(asparagine)残基の側鎖で炭水化物モイエティの付着を意味する。トリペプチド(tripeptide)序列であるアスパラギン−X−セリン(asparagine−X−serine)およびアスパラギン−X−スレオニン(asparagine−X−threonine)(ここで、Xはプロリン(proline)を除いたすべてのアミノ酸である)はアスパラギン側鎖で炭水化物モイエティの酵素的付着のための最も一般的な認識序列である。したがって、ポリペプチド内にこのようなトリペプチド序列のうちいずれか一つの存在は強制的なグリコシル化位置を生成する。O−結合型グリコシル化はヒドロキシアミノ酸(最も一般的にセリンまたはスレオニン)に対して(5−ヒドロキシプロリンまたは5−ヒドロキシリシンが使われることもできるが)糖(sugar)であるN−アセチルガラクトースまたは、ガラクトース、またはキシロースの中の一つの付着を意味する。
抗体のグリコシル化は典型的にN−結合型および/またはまたはO−結合型である。N−結合型はアスパラギン(asparagine)残基の側鎖で炭水化物モイエティの付着を意味する。トリペプチド(tripeptide)序列であるアスパラギン−X−セリン(asparagine−X−serine)およびアスパラギン−X−スレオニン(asparagine−X−threonine)(ここで、Xはプロリン(proline)を除いたすべてのアミノ酸である)はアスパラギン側鎖で炭水化物モイエティの酵素的付着のための最も一般的な認識序列である。したがって、ポリペプチド内にこのようなトリペプチド序列のうちいずれか一つの存在は強制的なグリコシル化位置を生成する。O−結合型グリコシル化はヒドロキシアミノ酸(最も一般的にセリンまたはスレオニン)に対して(5−ヒドロキシプロリンまたは5−ヒドロキシリシンが使われることもできるが)糖(sugar)であるN−アセチルガラクトースまたは、ガラクトース、またはキシロースの中の一つの付着を意味する。
従来に前記抗体に対するグリコシル化位置の付加は前記抗体が前述されたトリペプチド序列(N−結合型グリコシル化位置に対して)の中の一つ以上の含むようにアミノ酸序列を変更することによってなされる。また、前記変更は本来の抗体の序列に対する(O−結合型グリコシル化位置に対して)一つ以上のセリンまたはスレオニン残基の付加または前記一つ以上のセリンまたはスレオニン残基による置換によって行われ得る。
抗体アミノ酸序列を暗号化する核酸分子は当分野で知られている数多くの方法によって製造され得る。このような方法は、非制限的な例で、さらに早く製造された抗体のオリゴヌクレオチドによって調節された(または位置−指向性(site−directed))突然変異、PCR突然変異、およびカセット(cassette)突然変異による天然供給源または調製用物質からの分離を含む。
(v)人間抗体
人間化のためのさらに他の方法として、人間抗体が生産され得る。例えば、現在の来生の免疫グロブリン生産なしに免疫措置によって全体人間抗体目録を生産できる形質転換動物(例えば、実験ネズミ)を生産することが可能である。例えば、キメラ実験ネズミおよび生殖細胞系列突然変異実験ネズミの抗体重鎖結合領域(heavy−chain joining region、JH)遺伝子の同型の削除は内生抗体生産の完ぺきな抑制を引き起こすということが説明されてきた。このような生殖細胞系列突然変異実験ネズミで人間生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子集合体の移動は抗原攻撃時人間抗体の生産を可能にするであろう(参照、例えば、Jakobovitsなど、1993年、Proc. Natl. Acad. Sci. アメリカ、90:2551;Jakobovitsなど、1993年、Nature、362:255−258;Bruggermannなど、1993年、Year in Immuno.、7:33;およびアメリカ特許第5、591、669号、第5、589、369号および第5、545、807号)。また、人間抗体はファージ−ディスプレイ ライブラリー(phage−display libraries、Hoogenboomなど、1991年、J. Mol. Biol.、227:381;Marksなど、1991年、J. Mol. Biol.、222:581−597;およびアメリカ特許第5、565、332号および第5、573、905号)から誘導され得る。先立って議論されたように、人間抗体は体外活性化したB細胞によって生産され得る(参照、アメリカ特許第5、567、610号および第5、229、275号)。
人間化のためのさらに他の方法として、人間抗体が生産され得る。例えば、現在の来生の免疫グロブリン生産なしに免疫措置によって全体人間抗体目録を生産できる形質転換動物(例えば、実験ネズミ)を生産することが可能である。例えば、キメラ実験ネズミおよび生殖細胞系列突然変異実験ネズミの抗体重鎖結合領域(heavy−chain joining region、JH)遺伝子の同型の削除は内生抗体生産の完ぺきな抑制を引き起こすということが説明されてきた。このような生殖細胞系列突然変異実験ネズミで人間生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子集合体の移動は抗原攻撃時人間抗体の生産を可能にするであろう(参照、例えば、Jakobovitsなど、1993年、Proc. Natl. Acad. Sci. アメリカ、90:2551;Jakobovitsなど、1993年、Nature、362:255−258;Bruggermannなど、1993年、Year in Immuno.、7:33;およびアメリカ特許第5、591、669号、第5、589、369号および第5、545、807号)。また、人間抗体はファージ−ディスプレイ ライブラリー(phage−display libraries、Hoogenboomなど、1991年、J. Mol. Biol.、227:381;Marksなど、1991年、J. Mol. Biol.、222:581−597;およびアメリカ特許第5、565、332号および第5、573、905号)から誘導され得る。先立って議論されたように、人間抗体は体外活性化したB細胞によって生産され得る(参照、アメリカ特許第5、567、610号および第5、229、275号)。
(vi)抗体フラグメント
一部の具体例において、前記の抗−cysLT製剤は抗原に結合する抗体フラグメントである。抗原に結合する抗体フラグメント生産のための多様な技術が開発されてきた。伝統的に、このようなフラグメントは本来の抗体の蛋白質加水分解によって誘導される(参照、例えば、Morimotoなど、1992年、Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107−117、およびBrennanなど、1985年、Science 229:81)。しかし、現在このようなフラグメントは再調合宿主細胞によって直接的に生産され得る。例えば、Fab´−SHフラグメントはF(ab´)2フラグメントを形成するために、E. coliから直接的に回復して化学的に結合されることができる(Carterなど、1992年、Bio/Technology 10:163−167)。さらに他の具体例において、前記F(ab´)2はF(ab´)2分子の組み立てを促進するためにロイシンジッパー(leucine zipper)GCN4を使って形成される。さらに他の接近法により、Fv、FabまたはF(ab´)2フラグメントが再調合宿主細胞培養から直接的に分離することができる。抗体フラグメント生産のためのこの他の技術は当業者には明確であろう。
一部の具体例において、前記の抗−cysLT製剤は抗原に結合する抗体フラグメントである。抗原に結合する抗体フラグメント生産のための多様な技術が開発されてきた。伝統的に、このようなフラグメントは本来の抗体の蛋白質加水分解によって誘導される(参照、例えば、Morimotoなど、1992年、Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107−117、およびBrennanなど、1985年、Science 229:81)。しかし、現在このようなフラグメントは再調合宿主細胞によって直接的に生産され得る。例えば、Fab´−SHフラグメントはF(ab´)2フラグメントを形成するために、E. coliから直接的に回復して化学的に結合されることができる(Carterなど、1992年、Bio/Technology 10:163−167)。さらに他の具体例において、前記F(ab´)2はF(ab´)2分子の組み立てを促進するためにロイシンジッパー(leucine zipper)GCN4を使って形成される。さらに他の接近法により、Fv、FabまたはF(ab´)2フラグメントが再調合宿主細胞培養から直接的に分離することができる。抗体フラグメント生産のためのこの他の技術は当業者には明確であろう。
B.ベクター、宿主細胞、および再調合方法
抗体再調合体生産のために、前記抗体を暗号化する核酸が分離されて追加的なクローニング(cloning)(DNA増幅)または発現用である複製可能なベクターに挿入され得る。さらに他の具体例において、前記抗体は例えば、本明細書で参照として具体的には、含まれるアメリカ特許第5、204、244号に説明されたように相同再調合によって生産され得る。単クローン抗体を暗号化するDNAは従来の手続き(例えば、前記抗体の重鎖および軽鎖を暗号化する遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使うことによって)を使って容易に分離して序列分析される。数多くのベクターが利用可能である。前記ベクター成分は一般的に、非制限的な例で、例えば、本明細書に参照として具体的には、含まれるアメリカ特許第5、534、615号に説明されたように次の中一つ以上を含む:信号序列、複製原点、一つ以上の標識者遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、および転写終結序列。
抗体再調合体生産のために、前記抗体を暗号化する核酸が分離されて追加的なクローニング(cloning)(DNA増幅)または発現用である複製可能なベクターに挿入され得る。さらに他の具体例において、前記抗体は例えば、本明細書で参照として具体的には、含まれるアメリカ特許第5、204、244号に説明されたように相同再調合によって生産され得る。単クローン抗体を暗号化するDNAは従来の手続き(例えば、前記抗体の重鎖および軽鎖を暗号化する遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使うことによって)を使って容易に分離して序列分析される。数多くのベクターが利用可能である。前記ベクター成分は一般的に、非制限的な例で、例えば、本明細書に参照として具体的には、含まれるアメリカ特許第5、534、615号に説明されたように次の中一つ以上を含む:信号序列、複製原点、一つ以上の標識者遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、および転写終結序列。
本発明のベクター内DNAのクローニングまたは発現のための適切な宿主細胞は、前述された原核細胞、酵母細胞、または高等真核細胞である。このような目的のための適切な原核細胞はグラム陰性菌またはグラム陽性菌(例えば、大腸菌の中(Escherichia)(例えば、E. coli)、エンテロバクター(Enterobacter)、エルビニア(Erwinia)、クレブシエラ(Klebsiella)、プロテウス(Proteus)、サルモネラの中(Salmonella、例えば、サルモネラティフィムリウム(Salmonella typhimurium))、セラチア属(Serratia、例えば、セラシアマルセセンス(Serratia marcescans))、およびシゲラ(Shigella)だけでなく、バチルスズブチリス(B. subtilis)およびバチルスリチニポミス(B. licheniformis)のような桿菌(例えば、1989年4月12日付けで公開されたDD 266、710に記載されたB. licheniformis 41P)、シュドモナスアエルギノサ(P. aeruginosa)のようなシュドモナス属(Pseudomonas)、およびストラプトミセス属(Streptomyces)のような場内細菌(Enterobacteriaceae))のような真正細菌(eubacteria)を含む。E. coli B、E. coli X1776(ATCC 31、537)、およびE. coli W3110(ATCC 27、325)のような菌株が適切だが、一つの好ましいE. coliクローニング宿主はE. coli 294(ATCC 31、446)である。このような例は制限するためにというよりは説明のためのものである。
原核細胞の他に、真核、糸状菌またはイーストのような真核微生物が抗体暗号化ベクターに対する適切なクローニングまたは発現宿主である。サッカロミセスセレビシエ (Saccharomyces cerevisiae)または通常のパンイーストが低級の(lower)真核細胞宿主固体中で最も一般的に使われる。しかし、本発明で シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe);例えば、 クルイベロミセス・ラクチス (K. lactis)、クルイベロミセスフラギリス(K. fragilis、ATCC 12、424)、クルイベロミセスブルガリクス(K. bulgaricus、ATCC 16、045)、クルイベロミセスウィッケラミ(K. wickeramii、ATCC 24、178)、クルイベロミセスワルチイ(K. waltii、ATCC 56、500)、クルイベロミセストロソピラルム(K. drosophilarum、ATCC 36、906)、クルイベロミセステルモトレランス(K. thermotolerans)、およびクルイベロミセスマルシアヌス(K. marxianus)のようなクルイベロミセス(Kluyveromyces)宿主;ヤロイヤこれが(yarrowia、ヨーロッパ特許第402、226号);ピヒアパストリス(Pichia pastoris、ヨーロッパ特許第183、070号);カンジダ(Candida);トリコデルマレエシア(Trichoderma reesia、ヨーロッパ特許第244、234号);ニュロスポラクラッサ(Neurospora crassa);シェバンニオミセスオキシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)のようなシェバンニオミセス(Schwanniomyces);および例えば、ニュロスポーラ(Neurospora)、ペニシリウム(Penicillium)、トリポクラジウム(Tolypocladium)、およびアスペルギルスニドランス(A. nidulans)およびアスペルギルスニガー(A. niger)のようなアスペルギルス宿主のような糸状菌のような数多くの他の属、種、および菌株が一般的に利用可能で有用である。
グリコシル化された抗体の発現のために適合した宿主細胞は、多細胞生物由来である。無脊椎動物細胞の例は植物細胞および昆虫細胞を含む。スポドプテラプルギペルダ(Spodoptera frugiperda、幼虫)、森蚊(Aedes aegypti、蚊)、ヒトスジシマカ(Aedes albopictus、蚊)、 キイロショウジョウバエ (Drosophila melanogaster、リンゴ汁ハエ)、および蚕蛾のような宿主由来である数多くのパキュロビラル(baculoviral)菌株および変異体および相応する複製可能な昆虫宿主細胞が同定された。トランスファクション(transfection)のための数多くのウイルス菌株が公開的に利用可能である。具体的には、スポドプテラプルギペルダ細胞のトランスファクションのために、例えば、アウトグラパカリポニカ(Autographa californica) NPVのL−1変異体および蚕蛾(Bombyx mori)NPVのBm−5菌株、およびこのようなウイルスが使われ得る。植物細胞培養s of綿、とうもろこし、ジャガイモ、豆、ペチュニア(petunia)、トマト、およびタバコのような植物の細胞培養また、宿主として利用され得る。
しかし、脊椎動物細胞に対する関心が最も大きく、培養(組織培養)で脊椎動物細胞の増殖は日常的な手続きとなってきた。有用な哺乳動物宿主細胞株の例はSV40によって変形された猿身長由来細胞株CV1(COS−7、ATCC CRL 1651);人間胚胎身長細胞株(懸濁培養液で成長のために亜クローンとなった293または293細胞、Grahamなど、1977年、J. Gen Virol. 36:59);ハムスター子身長細胞(BHK、ATCC CCL 10);中国ハムスター卵巣細胞/−DHFR(CHO、Urlaubなど、1980年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、77:4216);マウスセプトルリ(Sertoli)細胞(TM4、Mather、1980年、Biol. Reprod. 23:243−251);猿身長細胞(CV1 ATCC CCL 70);アフリカ サバンナ猿身長細胞(VERO−76、ATCC CRL−1587);人間頸癌細胞(HELA、ATCC CCL 2);犬腎臟細胞(MDCK、ATCC CCL 34);バッファローラット(buffalo rat)肝細胞(BRL 3A、ATCC CRL 1442);人間肺細胞(W138、ATCC CCL 75);人間肝細胞(Hep G2、HB 8065);マウス乳腺腫瘍(MMT 060562、ATCC CCL51);TRI細胞(Matherなど、1982年、Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44−68);MRC 5細胞;FS4細胞;および人間肝癌細胞株(Hep G2)である。
宿主細胞は、抗体生産のために前述された発現またはクローニングベクターに変形され、プロモーターを誘導するか、形質転換剤を選別するか、または所望の序列を暗号化する遺伝子を増幅するのに適切に改質された従来の培養器(nutrient media)で培養され得る。
抗体を生産するのに使われる宿主細胞は数多くの培地で培養され得る。Ham´s F10(Sigma)、非常に低いEssential Medium Medium (MEM)、(Sigma)、RPMI−1640(Sigma)、およびDulbecco´s Modified Eagle´s培地((DMEM)、Sigma)のような商業的に利用可能な培地は宿主細胞を培養するのに適合する。また、Hamなど(1979年、Meth. Enz. 58:44)、Barnesなど(1980年、Anal. Biochem. 102:255)、アメリカ特許第4、767、704号;第4、657、866号;第4、927、762号;第4、560、655号;または第5、122、469号;国際公開特許第WO90/03430号;第WO 87/00195号;またはアメリカ特許再審第30、985号で説明されるすべての培地が前記宿主細胞の培養培地として使われ得る。このような培地中あるものは必要に応じてホルモンおよび/またはその他の成長因子(インスリン、トランスフェリン(transferrin)、または表皮成長因子)、塩(塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、および燐酸塩)、バッファー(HEPES)、ヌクレオチド(アデノシン(adenosine)およびチミジン(thymidine))、抗生剤(GENTAMYCIN TM)、微量元素(常にマイクロモール範囲の最終濃度で存在する無機化合物で定義される)、およびグルコースまたは相応するエネルギー源で補充され得る。また、すべての以外の必要な補充物が当分野の技術者に知られている適切な濃度で含まれ得る。温度、pHなどのような培養条件は発現のために選択された宿主細胞ですでに使われたもので、当業者には明確であろう。
再調合技術を使う時、前記抗体は原形質周囲空間で細胞内に生産されるか培地内に直接的に分泌され得る。前記抗体が細胞内に生産される時、第1段階として、微粒子残骸物、すなわち、宿主細胞または分解されたフラグメントが、例えば、遠心分離または限外ろ過膜によって、除去される。Carterなど(1992年、Bio/Technology 10:163−167)はE. coliの原形質周囲空間で分泌される抗体を分離する手続きを説明する。要約すれば、細胞塊り(cell paste)は30分の間ソジウムアセテート(sodium acetate、pH3.5)、EDTA、およびフェニルメチルスルフォニルフルオライド(phenylmethylsulfonylfluoride、PMSF)の存在下で解凍された。細胞残骸物は遠心分離によって除去され得る。前記抗体が培地内に分泌される時、このような発現システム由来の上澄み液は一般的に商業的に利用可能な蛋白質濃度フィルタ(例えば、アミコン(Amicon)またはミリポアペリコン(Millipore Pellicon)限外ろ過膜装置を使って優先的に濃縮される。PMSFのような蛋白質分解酵素抑制剤は蛋白質加水分解を抑制する前記のすべての段階中のいずれかの段階に含まれ得、偶発的な汚染物質の成長を予防するために抗生剤が含まれ得る。
細胞から製造された前記の抗体組成物は好ましい精製技術者親和力クロマトグラフィーとともに、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、および親和力クロマトグラフィーを使って精製され得る。親和性リガンドとして蛋白質Aの適合さは前記抗体に存在するある免疫グロブリンFcドメインの種および同種型により異なる。蛋白質Aは人間のうち重鎖を基盤とする抗体を精製するのに使われ得る(Lindmarkなど、1983年、J. Immunol. Meth. 62:1−13)。蛋白質Gはすべての実験ネズミ同種型および人間‐3に対して推薦される(Gussなど、1986年、EMBO J. 5:15671575)。親和性リガンドが付着する母体は最も頻繁にアガロースであるが、他の母体も利用可能である。調節孔隙ガラスまたはポリ(スチレンジビニル)ベンゼンのような機械的に安定した母体はアガロースによる場合よりもさらに高い流速およびさらに短い処理時間を可能にする。前記抗体がCH3ドメインを含む時、Bakerbond ABXTM樹脂(J. T. Baker、ニュージャージー州、フィリップスバグ所在)は精製のために有用である。イオン交換コラム上で分類、エタノール沈殿、逆相(Reverse Phase)HPLC、シリカ上のクロマトグラフィー、heparin(heparin)SEPHAROSETM上のクロマトグラフィー、(ポリアスパルト酸(polyaspartic acid)コラムのような)陰イオン交換樹脂または陽イオン交換樹脂上のクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング(chromatofocusing)、SDS−PAGE、および硫酸アンモニウム(ammonium sulfate)沈殿のような蛋白質精製のための他の技術も回収される抗体により異ならせて適用しながら利用可能である。
ある予備精製段階後に、関心対象である抗体および汚染物質を含む混合物は約2.5〜4.5のpHを有する溶離バッファーを使って(好ましくは低い塩濃度で(例えば、約0〜0.25Mの塩))低pH疏水性相互作用クロマトグラフィー(low pHhydrophobic interaction chromatography)される。
C.薬学的剤形
前記抗体の治療用剤形は冷凍乾燥された剤形または水性溶液の形態で所望の程度の純度を有する前記抗体を選択的な生理学的に許容可能な運搬体、添加剤または安定剤(Remington´s Pharmaceutical Sciences、第16版、Osol、A. Ed.、1980年)と混合することによって製造される。前記許容可能な運搬体、添加剤、または安定剤の使われる投与量および濃度は被験者に非毒性で、燐酸塩、クエン酸塩、およびその他の有機酸のようなバッファー;アスコルビン酸およびメチオニン(methionine)を含む抗酸化剤;(オク・タデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド(octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride)、ヘキサメトニウムクロライド(hexamethonium chloride);ベンザルコニウムクロライド(benzalkonium chloride);ペンゼトニウムクロライド(benzethonium chloride);フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール;メチルパラベン(methyl paraben)またはプロピルパラベンのようなアルキルパラベン;カテコール(catechol);レゾルシノール(resorcinol);シクロヘキサノール(cyclohexanol);3−ペンタノール(3−pentanol);およびm−クレゾール(m−cresol)のような)防腐剤;低分子量(10個の残基未満の)ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン(gelatin)、またはグロブリンのような蛋白質;ポリビニルピロリドン(polyvinylpyrrolidone)のような親水性高分子;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリシンのようなアミノ酸;単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース(mannose)、またはデキストリン(dextrin)を含むその他の炭水化物;EDTAのようなキレート化剤(chelating agent);(蔗糖 、マンニトール(mannitol)、トレハロース(trehalose)またはソルビトール(sorbitol)のような糖;ソジウムのような塩形成反対イオン(salt−forming counter−ions);金属複合体(例えば、Zn−蛋白質複合体);および/またはTWEENTM、PLURONICSTMまたはポリエチレングリコール(polyethylene glycol、PEG)のような非イオン性界面活性剤を含む。
前記抗体の治療用剤形は冷凍乾燥された剤形または水性溶液の形態で所望の程度の純度を有する前記抗体を選択的な生理学的に許容可能な運搬体、添加剤または安定剤(Remington´s Pharmaceutical Sciences、第16版、Osol、A. Ed.、1980年)と混合することによって製造される。前記許容可能な運搬体、添加剤、または安定剤の使われる投与量および濃度は被験者に非毒性で、燐酸塩、クエン酸塩、およびその他の有機酸のようなバッファー;アスコルビン酸およびメチオニン(methionine)を含む抗酸化剤;(オク・タデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド(octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride)、ヘキサメトニウムクロライド(hexamethonium chloride);ベンザルコニウムクロライド(benzalkonium chloride);ペンゼトニウムクロライド(benzethonium chloride);フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール;メチルパラベン(methyl paraben)またはプロピルパラベンのようなアルキルパラベン;カテコール(catechol);レゾルシノール(resorcinol);シクロヘキサノール(cyclohexanol);3−ペンタノール(3−pentanol);およびm−クレゾール(m−cresol)のような)防腐剤;低分子量(10個の残基未満の)ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン(gelatin)、またはグロブリンのような蛋白質;ポリビニルピロリドン(polyvinylpyrrolidone)のような親水性高分子;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリシンのようなアミノ酸;単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース(mannose)、またはデキストリン(dextrin)を含むその他の炭水化物;EDTAのようなキレート化剤(chelating agent);(蔗糖 、マンニトール(mannitol)、トレハロース(trehalose)またはソルビトール(sorbitol)のような糖;ソジウムのような塩形成反対イオン(salt−forming counter−ions);金属複合体(例えば、Zn−蛋白質複合体);および/またはTWEENTM、PLURONICSTMまたはポリエチレングリコール(polyethylene glycol、PEG)のような非イオン性界面活性剤を含む。
本明細書で剤形は治療される特定症状のために必要な一つの活性化合物、好ましくは互いに不利となるように影響を与えない詳報的な活性を有する活性化合物も含むことができる。このような分子は意図的目的のために効果的な容量で、組合せとして適合に存在する。
また、前記活性成分は、例えば、コロイド質薬品伝達システム(例えば、リポソーム(liposome)、アルブミンマイクロスフェア(albumin microsphere)、マイクロエマルジョン(microemulsion)、ナノ粒子、およびナノカプセル)またはマクロエマルジョン(macroemulsion)でコアセルベーション(coacervation)技術または界面重合(例えば、ヒドロキシメチルセルロース(hydroxymethylcellulose)またはゼラチン−微小カプセルおよびポリ(メチルメタクリレ−ト)微小カプセル、それぞれ)により微小カプセルに含まれ得る。このような技術は次の文献に記載されている:Remington´s Pharmaceutical Sciences、第16版、Osol、A. Ed.、1980年。
体内投与のために使われる剤形は滅菌されなければならない。例えば、滅菌は滅菌されたフィルタ膜を通した濾過によって容易に行われ得る。
持効性(sustained−release)調製用物質が製造され得る。持効性調製用物質の適切な例は前記の抗体を含む固体疏水性分子の半透性母体を含み、前記母体は成形体形態(例えば、フィルムまたは微小カプセル)である。持効性母体の例はポリエステル、ハイドロゲル(hydrogel)(例えば、ポリ(2−ヒドロキシエチル−メタクリレート)(poly(2−hydroxyethyl−methacrylate))、またはポリ(ビニルアルコール)(poly(vinyl alcohol)))、ポリラクタイド(polylactides、アメリカ特許第3、773、919号)、L−グルタミン酸(L−glutamic acid)およびガンマーエチル−L−グルタミン(gamma ethyl−L−glutamate)の共重合体、非−分解性エチレン−ビニルアセテート(ethylene−vinyl acetate)、Lupron Depot.TM.(乳酸−グリコール酸共重合体およびロイプロリドアセテート(leuprolide acetate))からなる注射可能なマイクロスフェア(microspheres))のような分解性乳酸−グリコール酸共重合体、およびポリ−D−(−)−3−ヒドロキシ酪酸(poly−D−(−)−3−hydroxybutyric acid)を含む。エチレン−ビニルアセテートおよび乳酸−グリコール酸のような高分子が100日間分子を放出できる反面、いかなるハイドロゲルはさらに短い時間の間蛋白質を放出する。カプセル化された抗体が長い時間の間体内に残留する時、これらは37°Cで水分に露出する時分解されるか凝集し、生物学的活性の消失および免疫原性において可能な変化が引き起こされる。関連メカニズムにより安定化のために合理的な戦略が考案され得る。例えば、凝集メカニズムがチオ−ジスルフィド(thio−disulfide)交換による分子間S‐S結合形成であるものと確認されると、安定化はスルフィドリル残基を改質し、酸性溶液から凍結乾燥し、水分含有量を調節し、適切な添加剤を使用し、特定の高分子母体組成物を開発することによって行われ得る。
また、多様な添加剤が治療効果を向上させるか、さらなる便利な治療がなされるようにするか、剤形化された抗体が意図されて承認された目的だけのために使われるのを明確に保障するために前記剤形化された抗体で添加され得る。添加剤の例はpHを調節する化学物質、抗微生物剤、抗体効能の消失を予防するための防腐剤、単に気道用である剤形の識別のための染料、剤形内の抗体濃度を増加するための可溶化剤、経皮吸収促進剤、および等長度および/または粘度調節用製剤を含む。必要な場合、例えば、前記抗体の半減期を延長するために蛋白質分解酵素の抑制剤が添加され得る。
持効性(sustained−release)調製用物質が製造され得る。持効性調製用物質の適切な例は前記の抗体を含む固体疏水性分子の半透性母体を含み、前記母体は成形体形態(例えば、フィルムまたは微小カプセル)である。持効性母体の例はポリエステル、ハイドロゲル(hydrogel)(例えば、ポリ(2−ヒドロキシエチル−メタクリレート)(poly(2−hydroxyethyl−methacrylate))、またはポリ(ビニルアルコール)(poly(vinyl alcohol)))、ポリラクタイド(polylactides、アメリカ特許第3、773、919号)、L−グルタミン酸(L−glutamic acid)およびガンマーエチル−L−グルタミン(gamma ethyl−L−glutamate)の共重合体、非−分解性エチレン−ビニルアセテート(ethylene−vinyl acetate)、Lupron Depot.TM.(乳酸−グリコール酸共重合体およびロイプロリドアセテート(leuprolide acetate))からなる注射可能なマイクロスフェア(microspheres))のような分解性乳酸−グリコール酸共重合体、およびポリ−D−(−)−3−ヒドロキシ酪酸(poly−D−(−)−3−hydroxybutyric acid)を含む。エチレン−ビニルアセテートおよび乳酸−グリコール酸のような高分子が100日間分子を放出できる反面、いかなるハイドロゲルはさらに短い時間の間蛋白質を放出する。カプセル化された抗体が長い時間の間体内に残留する時、これらは37°Cで水分に露出する時分解されるか凝集し、生物学的活性の消失および免疫原性において可能な変化が引き起こされる。関連メカニズムにより安定化のために合理的な戦略が考案され得る。例えば、凝集メカニズムがチオ−ジスルフィド(thio−disulfide)交換による分子間S‐S結合形成であるものと確認されると、安定化はスルフィドリル残基を改質し、酸性溶液から凍結乾燥し、水分含有量を調節し、適切な添加剤を使用し、特定の高分子母体組成物を開発することによって行われ得る。
また、多様な添加剤が治療効果を向上させるか、さらなる便利な治療がなされるようにするか、剤形化された抗体が意図されて承認された目的だけのために使われるのを明確に保障するために前記剤形化された抗体で添加され得る。添加剤の例はpHを調節する化学物質、抗微生物剤、抗体効能の消失を予防するための防腐剤、単に気道用である剤形の識別のための染料、剤形内の抗体濃度を増加するための可溶化剤、経皮吸収促進剤、および等長度および/または粘度調節用製剤を含む。必要な場合、例えば、前記抗体の半減期を延長するために蛋白質分解酵素の抑制剤が添加され得る。
D.抗体の非治療的用途
本明細書に記載された抗体は親和性精製剤(affinity purification agent)として使われ得る。このような工程で、前記の抗体は当分野で良く知られた方法を使ってセファデックス樹脂(Sephadex resin)またはフィルタ紙のような固体上に固定される。固定された抗体は精製されるcysLTを含有して試料と接触した後、支持体は固定された抗体に結合されたcys−LTを除いた試料内のすべての物質を実質的に除去する適切な溶媒で洗浄される。最後に、前記支持体は前記抗体でcysLTを放出する、例えば、pH3〜pH5.0のグリシンバッファーのようなさらに他の適切な溶媒で洗浄される。
本明細書に記載された抗体は親和性精製剤(affinity purification agent)として使われ得る。このような工程で、前記の抗体は当分野で良く知られた方法を使ってセファデックス樹脂(Sephadex resin)またはフィルタ紙のような固体上に固定される。固定された抗体は精製されるcysLTを含有して試料と接触した後、支持体は固定された抗体に結合されたcys−LTを除いた試料内のすべての物質を実質的に除去する適切な溶媒で洗浄される。最後に、前記支持体は前記抗体でcysLTを放出する、例えば、pH3〜pH5.0のグリシンバッファーのようなさらに他の適切な溶媒で洗浄される。
また、抗−cysLT抗体はcysLTに対する診断分析(例えば、特定の細胞、組織、または体液でcysLTの発現を探知する)に有用であり得る。このような診断方法診断、具体的には、初期診断(例えば、気道疾病または気道疾患)に有用であり得る。
診断で使用のために、前記抗体は探知可能なモイエティで標識サレウル。一般的に下記の種類でグループ化される数多くの標識が利用可能だ:
(a)35S、14C、125I、3H、および131Iのようなラジオアイソトープ。前記の抗体は、次の文献で説明された技術を使ってラジオアイソトープで標識できる:Current Protocols in Immunology、Volumes 1 and 2、Coligenなど(編集者)、Wiley−Interscience、ニューヨーク州、ニューヨーク所在、1991年公開。例えば、放射能は閃光カウンティング(scintillation counting)を使って測定され得る。
(b)希土類キレート(ユーロピウムキレート(europium chelates))またはプルオレセイン(fluorescein)およびこれの誘導体、rhodamine(rhodamine)およびこれの誘導体、ダンシル(dansyl)、リサミン(Lissamine)、phycoerythrin(phycoerythrin)およびTexas Redのような蛍光性標識が利用可能である。前記蛍光性標識は次の文献で知られている技術を使って前記抗体に接合され得る:Current Protocols in Immunology(前述される)、例えば。蛍光発光は蛍光測定機を使って数量化され得る。
(c)多様な酵素−基材標識が利用可能で、アメリカ特許第4、275、149号はこれらのうちの一部をレビューする。前記酵素は一般的に多様な技法を使って測定され得る発色する記載の化学的変化を促進する。例えば、前記酵素は分光光度法によって測定され得る記載での色変化を促進する。また、前記酵素は記載の蛍光発光または化学発光を変更する。蛍光発光の変化を数値化する技術は前述される。前記化学発光性記載は化学的反応によって電子的に活性化した後、測定され得る(例えば、化学発光分析器(chemiluminometer)により)光を放出するか蛍光性受容器でエネルギーを提供する。酵素標識の例はルシフェラーゼ(luciferases)(例えば、ファイアフライルシファーレイズ(firefly luciferase)およびルシフェラーゼ(bacterial luciferase)(アメリカ特許第4、737、456号))、ルシフェリン(luciferin)、2、3−ジヒドロフタルアジネジオン(2、3−dihydrophthalazinediones)、マレートジヒドロゲナーゼ(malate dehydrogenase)、ウレアーゼ(urease)、ホースラディッシュペロキシダーゼ(horseradish peroxidase、HRPO)のようなペロキシダーゼ、アルカラインフォスファターゼ(alkaline phosphatase)、ベータ−ガラクトシダーゼ(beta−galactosidase)、グルコアミラーゼ(glucoamylase)、ライソザイム(lysozyme)、サッカライドオキシダーゼ(saccharide oxidases、例えば、グルコースオキシダーゼ(glucose oxidase)、ガラクトースオキシダーゼ(galactose oxidase)、およびグルコース−6−ホスフェートジヒドロゲナーゼ(glucose−6−phosphate dehydrogenase))、(ウリカーゼ(uricase)およびキサンチンオキシダーゼ(xanthine oxidase)のような)ヘテロサイクリックオキシダーゼ(heterocyclicoxidases)、ラクトペロキシダーゼ(lactoperoxidase)、マイクロペロキシダーゼ(microperoxidase)などを含む。抗体に酵素を接合する技術が次の論文に説明される:O´Sullivanなど、1981年、Methods for the Preparation of Enzyme−Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay、Methods in Enzym.(J. Langone & H. Van Vunakis(編集者)、Academic press、ニューヨーク所在、73:147−166。
(a)35S、14C、125I、3H、および131Iのようなラジオアイソトープ。前記の抗体は、次の文献で説明された技術を使ってラジオアイソトープで標識できる:Current Protocols in Immunology、Volumes 1 and 2、Coligenなど(編集者)、Wiley−Interscience、ニューヨーク州、ニューヨーク所在、1991年公開。例えば、放射能は閃光カウンティング(scintillation counting)を使って測定され得る。
(b)希土類キレート(ユーロピウムキレート(europium chelates))またはプルオレセイン(fluorescein)およびこれの誘導体、rhodamine(rhodamine)およびこれの誘導体、ダンシル(dansyl)、リサミン(Lissamine)、phycoerythrin(phycoerythrin)およびTexas Redのような蛍光性標識が利用可能である。前記蛍光性標識は次の文献で知られている技術を使って前記抗体に接合され得る:Current Protocols in Immunology(前述される)、例えば。蛍光発光は蛍光測定機を使って数量化され得る。
(c)多様な酵素−基材標識が利用可能で、アメリカ特許第4、275、149号はこれらのうちの一部をレビューする。前記酵素は一般的に多様な技法を使って測定され得る発色する記載の化学的変化を促進する。例えば、前記酵素は分光光度法によって測定され得る記載での色変化を促進する。また、前記酵素は記載の蛍光発光または化学発光を変更する。蛍光発光の変化を数値化する技術は前述される。前記化学発光性記載は化学的反応によって電子的に活性化した後、測定され得る(例えば、化学発光分析器(chemiluminometer)により)光を放出するか蛍光性受容器でエネルギーを提供する。酵素標識の例はルシフェラーゼ(luciferases)(例えば、ファイアフライルシファーレイズ(firefly luciferase)およびルシフェラーゼ(bacterial luciferase)(アメリカ特許第4、737、456号))、ルシフェリン(luciferin)、2、3−ジヒドロフタルアジネジオン(2、3−dihydrophthalazinediones)、マレートジヒドロゲナーゼ(malate dehydrogenase)、ウレアーゼ(urease)、ホースラディッシュペロキシダーゼ(horseradish peroxidase、HRPO)のようなペロキシダーゼ、アルカラインフォスファターゼ(alkaline phosphatase)、ベータ−ガラクトシダーゼ(beta−galactosidase)、グルコアミラーゼ(glucoamylase)、ライソザイム(lysozyme)、サッカライドオキシダーゼ(saccharide oxidases、例えば、グルコースオキシダーゼ(glucose oxidase)、ガラクトースオキシダーゼ(galactose oxidase)、およびグルコース−6−ホスフェートジヒドロゲナーゼ(glucose−6−phosphate dehydrogenase))、(ウリカーゼ(uricase)およびキサンチンオキシダーゼ(xanthine oxidase)のような)ヘテロサイクリックオキシダーゼ(heterocyclicoxidases)、ラクトペロキシダーゼ(lactoperoxidase)、マイクロペロキシダーゼ(microperoxidase)などを含む。抗体に酵素を接合する技術が次の論文に説明される:O´Sullivanなど、1981年、Methods for the Preparation of Enzyme−Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay、Methods in Enzym.(J. Langone & H. Van Vunakis(編集者)、Academic press、ニューヨーク所在、73:147−166。
酵素−基材調合物の例は、例えば、次を含む:
(i)基材としてハイドロジェンペロキシダーゼ(hydrogen peroxidase)を有するホースラディッシュペロキシダーゼ(horseradish peroxidase、HRPO)(前記ハイドロゲンペロキシダーゼは染料前駆体(例えば、オルトフェニレンジアミン(orthophenylene diamine、OPD)または3、3´、5、5´−テトラメチルベンジジンヒドロクロライド(3、3´、5、5´−tetramethyl benzidine hydrochloride、TMB))を酸化する);
(ii)発色する基材としてパラ−ニトロフェニルホスフェート(para−Nitrophenyl phosphate)を有するアルカラインフォスファターゼ(alkaline phosphatase、AP);および
(iii)発色する基材(例えば、p−ニトロフェニル−‐−D−ガラクトシダーゼ)または蛍光源性基材である4−メチルウンベリフェリル−ベータ−D−ガラクトシダーゼ(4−methylumbelliferyl−beta−D−galactosidase)を有するベータ−D−ガラクトシダーゼ(beta−D−galactosidase、beta−D−Gal)。
(i)基材としてハイドロジェンペロキシダーゼ(hydrogen peroxidase)を有するホースラディッシュペロキシダーゼ(horseradish peroxidase、HRPO)(前記ハイドロゲンペロキシダーゼは染料前駆体(例えば、オルトフェニレンジアミン(orthophenylene diamine、OPD)または3、3´、5、5´−テトラメチルベンジジンヒドロクロライド(3、3´、5、5´−tetramethyl benzidine hydrochloride、TMB))を酸化する);
(ii)発色する基材としてパラ−ニトロフェニルホスフェート(para−Nitrophenyl phosphate)を有するアルカラインフォスファターゼ(alkaline phosphatase、AP);および
(iii)発色する基材(例えば、p−ニトロフェニル−‐−D−ガラクトシダーゼ)または蛍光源性基材である4−メチルウンベリフェリル−ベータ−D−ガラクトシダーゼ(4−methylumbelliferyl−beta−D−galactosidase)を有するベータ−D−ガラクトシダーゼ(beta−D−galactosidase、beta−D−Gal)。
この他の数多くの酵素−基材調合物が当分野の技術者によって利用可能である。これに対する一般的な検討のためには次の文献を参照する:アメリカ特許第4、275、149号および第4、318、980号.
時々、前記標識は前記抗体で間接的に接合される。当業者はこれを実現するための多様な技術を認知しているであろう。例えば、前記抗体はビオチンと接合され得、前述された3部類の標識すべてがアビダンまたはこれとは反対に接合され得る。ビオチンは選択的にアビダンに結合し、したがって、前記標識は間接的な方法で前記抗体と接合することができる。また、前記抗体と前記標識の直接的な接合をなすために、前記抗体は小さいハプテン(例えば、ジゴキシン(digoxin))と接合され、前述された異なる形態の標識の中の一つが抗−ハプテン抗体(例えば、抗−ジゴキシン抗体)と接合される。したがって、前記抗体と前記標識の間接的な接合が行われ得る。
さらに他の具体例において、前記の抗−cysLT抗体は標識となることが要求されず、このとき、前記の抗−cysLT抗体は探知され得る。例えば、前記の抗−cysLT抗体に結合する表示された抗体が使われる。
本明細書に記載された抗体は競合結合測定法(competitive binding assay)、直接的で間接的なサンドイッチ測定法(direct and indirect sandwich assays)、および免疫沈降分析法(immunoprecipitation assays)のような良く知られた分析方法で使われ得る(Zola、1987年、Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques、147〜158面、CRC Press、Inc)。
競合結合測定法は限定された容量の抗体との結合のための試験試料分析物質と競争するための表示された標準(labeled standard)の能力により異なる。試験試料内cysLTの容量は、前記抗体に結合される標準の容量に反比例する。結合される標準の容量決定を促進するために、前記抗体に結合する標準および分析物質が未結合されたまま残留する標準および分析物質から便利に分離するように、前記抗体は一般的に競争前または競争後に溶解しない。
サンドイッチ測定法の場合、二つの抗体を使用し、前記抗体はそれぞれ探知される蛋白質の異なる免疫原性の部分または抗原決定部に結合することができる。サンドイッチ測定法で、前記試験試料分析物質は固体支持体に固定された第1抗体によって結合され、以後第2抗体が前記分析物質に結合し、不溶性の三部分からなる複合体を形成する(参照、例えば、アメリカ特許第4、376、110号)。前記第2抗体それ自体が探知可能なモイエティで標識となるか(直接的なサンドイッチ測定法)、探知可能なモイエティで表示された抗−免疫グロブリン抗体を使用して測定され得る(間接的なサンドイッチ測定法)。例えば、サンドイッチ測定法の一種類でELISA分析があって、前記ELISA分析で探知可能なモイエティは酵素である。
免疫組織化学のために、血液試料または組織試料は新鮮な状態または冷凍状態や、例えば、パラフィン(paraffin)に挟んで入れられるかホルマリン(formalin)のような防腐剤で固定され得る。
また、前記の抗体は体内診断分析のために使われ得る。一般的に、前記抗体は結合されたターゲット分子が免疫映像(immunoscintigraphy)を使って固定されるように(111In、99Tc、14C、131I、125I、3H、32P、または35Sのような)放射性核種で表示される。
E.診断キド
便利のために、本明細書に記載された抗体はELISAキット(例えば、診断分析のための説明書とともに所定の容量で包装された試薬調合物)のようなキットで提供され得る。前記抗体が酵素で表示される時、前記キットは基材および酵素によって要求される共同因子を(例えば、探知可能な発色団(chromophore)または蛍光団(fluorophore)を提供する基材前駆体)含むであろう。また、安定剤、バッファー(例えば、aブロックバッファー(block buffer)または溶解バッファー(lysis buffer))などのような添加剤が含まれ得る。前記多様な試薬の相対的な容量は分析の敏感度を実質的に最適化する濃度で試薬の溶液に提供されるように多様化され得る。具体的には、前記試薬は融解時適切な濃度を有する試薬溶液を提供する添加剤を含んで乾燥粉末(普通冷凍乾燥される)として提供され得る。
便利のために、本明細書に記載された抗体はELISAキット(例えば、診断分析のための説明書とともに所定の容量で包装された試薬調合物)のようなキットで提供され得る。前記抗体が酵素で表示される時、前記キットは基材および酵素によって要求される共同因子を(例えば、探知可能な発色団(chromophore)または蛍光団(fluorophore)を提供する基材前駆体)含むであろう。また、安定剤、バッファー(例えば、aブロックバッファー(block buffer)または溶解バッファー(lysis buffer))などのような添加剤が含まれ得る。前記多様な試薬の相対的な容量は分析の敏感度を実質的に最適化する濃度で試薬の溶液に提供されるように多様化され得る。具体的には、前記試薬は融解時適切な濃度を有する試薬溶液を提供する添加剤を含んで乾燥粉末(普通冷凍乾燥される)として提供され得る。
F.前記抗体の治療的利用
治療的適用のために、本明細書で説明される前記の抗−cysLT抗体(およびcysLT−結合抗体フラグメント)は前述されたような薬学的に許容可能な投与形態で(一回分または一定期間の間の連続的な注入として人間静脈注射、または筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑膜内、脊椎腔内、鼻腔内、口腔、局所、眼球、目の周囲、ガラス体内、または吸入経路による投与を含む)哺乳動物、好ましくは人間に投与される。後者の場合、抗体は気道に(例えば、スペーサー(spacer)、粉末式吸入器、a呼吸作動式定量吸入器(breath−actuated metered dose inhaler)、または噴霧器)を含むか含まない定量吸入器(metered dose inhaler)を使うことによって)伝達され得る。
治療的適用のために、本明細書で説明される前記の抗−cysLT抗体(およびcysLT−結合抗体フラグメント)は前述されたような薬学的に許容可能な投与形態で(一回分または一定期間の間の連続的な注入として人間静脈注射、または筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑膜内、脊椎腔内、鼻腔内、口腔、局所、眼球、目の周囲、ガラス体内、または吸入経路による投与を含む)哺乳動物、好ましくは人間に投与される。後者の場合、抗体は気道に(例えば、スペーサー(spacer)、粉末式吸入器、a呼吸作動式定量吸入器(breath−actuated metered dose inhaler)、または噴霧器)を含むか含まない定量吸入器(metered dose inhaler)を使うことによって)伝達され得る。
疾病の予防および治療のために、前記抗体の適切な投与量は前述されたように治療される疾病の種類、疾病の深刻度および経過(前記抗体が予防または治療目的で投与される時)、以前の治療、前記抗体に対する患者の病歴および反応、および担当医師の裁量により相異なるであろう。前記抗体は適切に一回でまたは連続的な治療で患者に投与される。
疾病の種類および深刻度にしたがって、一回以上の分離された投与または連続的な注入による場合で、約1μg/kg〜約50mg/kg(例えば、0.1−20mg/kg)の抗体が患者に投与される最初の候補投与量である。典型的な一日または一週間投与量は、前述された因子により異ならせつつ、約1‐g/kg〜約20mg/kgまたはそれ以上であり得る。数日またはそれ以上の期間にわたった繰り返される投与のために、疾病症状の所望の抑制がなされる時まで、疾病により異ならせつつ、治療が繰り返される。しかし、この他の投与療法が有用であり得る。本治療の進行は、例えば、放射線写真を含む従来の技術および分析によって容易に観察される。体液または組織内cysLT数値を決めるために前記抗体を使う探知方法は治療抗体に対する患者の露出を最適化するために使われ得る。
さらに他の具体例にしたがって、疾病を予防するか治療するにあたって前記抗体の効果は前記抗体を連続的にまたは本発明の目的のために癌治療用化学療法薬品または眼球疾病治療用薬品のような効果的なさらに他の薬剤と組み合わせて投与することによって向上することができる。この他の製剤は投与される組成物内に存在するか別途投与され得る。また、前記抗体は連続的にまたは他の薬剤または方式(例えば、癌治療のための化学療法用薬品または放射線照射)と組み合わせて適切に投与される。
G.製造品
さらに他の具体例において、前述された疾患を治療するのに有用な物質を含有する製造品が提供される。前記製造品は容器および標識(label)を含む。適合した容器は、例えば、疾病、ガラス瓶、注射器、および試験管を含む。前記容器はガラスまたはプラスチックのような多様な材料で製造され得る。前記容器は前記疾病を治療するのに効果的な組成物を含有し、滅菌された接近ポート(access port、例えば、前記容器は静脈注射溶液バック、皮下注射針によって貫通することができる栓を有するガラス瓶、または点滴瓶(dropper bottle)であり得る)を有することができる。前記組成物内の活性剤は前記の抗−cysLT抗体であり得る。前記容器の上のまたはこれと関連された標識は前記組成物が選択された疾患を治療するのに使われる可能性があることを示す。また、前記製造品は燐酸塩−緩衝された塩水、Ringer´s溶液、およびデキストロース(dextrose)溶液のような薬学的に許容可能なバッファーを含む第2容器を含むことができる。また、前記製造品は商業的、使用者観点で好ましいその他の材料を(他のバッファー、希釈剤、フィルタ、注射針、注射器、および使用説明書がある包装内容物を含む)含むことができる。気道投与の場合、噴霧器または吸入器のような装置が使われ、前記吸入器は液体または乾燥粉末薬品投与のために考案され得る。また、前記製造品はcysLT(例えば、体液で)の探知のためのcysLT抗体を利用するELISAキットのようなキットであり得る。
さらに他の具体例において、前述された疾患を治療するのに有用な物質を含有する製造品が提供される。前記製造品は容器および標識(label)を含む。適合した容器は、例えば、疾病、ガラス瓶、注射器、および試験管を含む。前記容器はガラスまたはプラスチックのような多様な材料で製造され得る。前記容器は前記疾病を治療するのに効果的な組成物を含有し、滅菌された接近ポート(access port、例えば、前記容器は静脈注射溶液バック、皮下注射針によって貫通することができる栓を有するガラス瓶、または点滴瓶(dropper bottle)であり得る)を有することができる。前記組成物内の活性剤は前記の抗−cysLT抗体であり得る。前記容器の上のまたはこれと関連された標識は前記組成物が選択された疾患を治療するのに使われる可能性があることを示す。また、前記製造品は燐酸塩−緩衝された塩水、Ringer´s溶液、およびデキストロース(dextrose)溶液のような薬学的に許容可能なバッファーを含む第2容器を含むことができる。また、前記製造品は商業的、使用者観点で好ましいその他の材料を(他のバッファー、希釈剤、フィルタ、注射針、注射器、および使用説明書がある包装内容物を含む)含むことができる。気道投与の場合、噴霧器または吸入器のような装置が使われ、前記吸入器は液体または乾燥粉末薬品投与のために考案され得る。また、前記製造品はcysLT(例えば、体液で)の探知のためのcysLT抗体を利用するELISAキットのようなキットであり得る。
本発明のこの他の製品は適切な容器(例えば、表示されたガラス瓶またはアンプル(ampule))内に(好ましくは前記組成物の使用のための説明書(例えば、薬剤製品包装内容物)を含む容器内に包装される)本発明の薬学的組成物を含有するキットを含む。
本発明は下記の実施例を参照することによってさらに容易に理解されるもので、下記の実施例は単に本発明を実施するにあたって現在の最高の方法を説明するためである。本発明の範囲はこれら実施例に制限されるものではない。
実施例
実施例1:免疫原(LTE4−蛋白質複合体)の合成
免疫原として使用するためのLTE4−蛋白質複合体は、ビス(スルホスクシンイミジル)−スベレート(bis(sulfosuccinimidyl)−suberate)およびホモ二官能性(homobifunctional)アミン−対−アミン架橋剤を使用して、LTE4のヘッド基(head group)に位置するアミンによってLTE4を蛋白質運搬体に架橋結合することによって製造される。0.22mgのシステイニルロイコトリエンE4(LTE4;Cayman Chemical Company、製品番号:20410)は、室温で2時間90%PBS/10%DMSOで2.5mgのImject Blue Carrier Protein(BCP;Thermo Scientific、製品番号:77130)および2.9mgのビス(スルホスクシンイミジル)スベレート(BS3;Thermo Scientific、製品番号:21580)と培養された後、Imject精製バッファー(Thermo Scientific、部品番号:77159)で平衡化された脱塩カラム(Thermo Scientific、部品番号:89882)を使用して蛋白質−脂質コンジュゲート精製された。
免疫原として使用するためのLTE4−蛋白質複合体は、ビス(スルホスクシンイミジル)−スベレート(bis(sulfosuccinimidyl)−suberate)およびホモ二官能性(homobifunctional)アミン−対−アミン架橋剤を使用して、LTE4のヘッド基(head group)に位置するアミンによってLTE4を蛋白質運搬体に架橋結合することによって製造される。0.22mgのシステイニルロイコトリエンE4(LTE4;Cayman Chemical Company、製品番号:20410)は、室温で2時間90%PBS/10%DMSOで2.5mgのImject Blue Carrier Protein(BCP;Thermo Scientific、製品番号:77130)および2.9mgのビス(スルホスクシンイミジル)スベレート(BS3;Thermo Scientific、製品番号:21580)と培養された後、Imject精製バッファー(Thermo Scientific、部品番号:77159)で平衡化された脱塩カラム(Thermo Scientific、部品番号:89882)を使用して蛋白質−脂質コンジュゲート精製された。
実施例2:抗体生産
9匹の6〜8週齢の雌性スイスウェブスター(Swiss Webster)実験ネズミは、完全フロイントアジュバント(complete Freund´s adjuvant)で乳化された免疫原(LTE4およびBCPのBS3促進されたコンジュゲート)0.025mg(合計0.05mg)の2回の皮下注射によって免疫化された。21日後に、実験ネズミは、不完全フロイントアジュバント(IFA)内に乳化された0.05mgの免疫原で1回腹腔内(IP)注射された。その後、前記実験ネズミは、追加的な8週の期間の間に毎週1回IFAに乳化された0.05mgの免疫原でIP注射された。2回目、3回目、5回目、9回目注射後に、血清試料を採血し、抗−LTE4抗体の存在を確認するために、後述するように。直接的なELISAによってスクリーンされた(図1)。その後、ハイブリードマを生産するために、the ClonaCell(R)−HYハイブリードマクローニングキット(Stemcell Technologies、製品番号:03800)を使用しつつ、高い抗体力価を示す実験ネズミの脾臓を使用した。ハイブリードマが密集して増殖される次第に、ELISA分析のために細胞上澄み液を回収した(図2)。
9匹の6〜8週齢の雌性スイスウェブスター(Swiss Webster)実験ネズミは、完全フロイントアジュバント(complete Freund´s adjuvant)で乳化された免疫原(LTE4およびBCPのBS3促進されたコンジュゲート)0.025mg(合計0.05mg)の2回の皮下注射によって免疫化された。21日後に、実験ネズミは、不完全フロイントアジュバント(IFA)内に乳化された0.05mgの免疫原で1回腹腔内(IP)注射された。その後、前記実験ネズミは、追加的な8週の期間の間に毎週1回IFAに乳化された0.05mgの免疫原でIP注射された。2回目、3回目、5回目、9回目注射後に、血清試料を採血し、抗−LTE4抗体の存在を確認するために、後述するように。直接的なELISAによってスクリーンされた(図1)。その後、ハイブリードマを生産するために、the ClonaCell(R)−HYハイブリードマクローニングキット(Stemcell Technologies、製品番号:03800)を使用しつつ、高い抗体力価を示す実験ネズミの脾臓を使用した。ハイブリードマが密集して増殖される次第に、ELISA分析のために細胞上澄み液を回収した(図2)。
実施例3:ELISAスクリーニング
血清および細胞上澄み液は、直接的なELISAを使用してLTE4−特定した結合特性を有する抗体に対しスクリーンされた。LTE4に架橋結合された牛血清アルブミン(BSA;Thermo Scientific、製品番号:77110)よりなる抗原−特異的な蛋白質−脂質コンジュゲートおよびオレイルアミン(oleylamine(OA)、Sigma、製品番号:07805)に架橋結合されたBSAよりなる抗原−非特異的蛋白質−脂質コンジュゲートが製造され、前記二つのコンジュゲートすべてでリンカーとしてbis(スクシンイミジル)ペンタ(エチレングリコール)(bis(succinimidyl)penta(ethylene glycol))(BSPEG5、Thermo Scientific、製品番号:21581)が使用された。対象試料を0.015ugの前記抗原−特異的コンジュゲートまたは抗原−非特異的コンジュゲートでコーティングされた384ウェル(well)の高結合能培養皿(Greiner Bio−One、製品番号:781061)の隣り合うウェルに適用し、1時間培養し、PBSで洗浄した。結合されたIgGは、ヤギ抗−マウスIgG1−特定したHRP−接合された抗体(goat anti−mouse IgG1−specific HRP−conjugated antibody、Southern Biotech、製品番号:1030−05)を使用して探知し、テトラメチルベンジジン(tetramethylbenzidine(TMB)、Invitrogen、製品番号:SB02)で現像した。比色分析の読み取りは、培養皿読み取り機上でA450(450nmの波長で吸収)で行われ、A450より高い波長は、血清または上澄み液試料上にさらに多くの抗体があることを示す。LTE4−コーティングされたウェル(抗原−特異的)で高い信号を示し、OA−コーティングされたウェル(非特異的)では、背景信号より高い信号を示さない試料は、抗原−特異的結合特性に対して陽性として判断された(表1)。理解され得るように、免疫原に使用されるものとは完全に異なる(リンカーおよび蛋白質すべてが異なる)コンジュゲートの一部であるLTE4を使用するスクリーニングは、前記脂質自体よりはかえって前記免疫原のリンカーまたは蛋白質に結合する抗体に帰結され得る偽陽性(false positives)を除去する。
血清および細胞上澄み液は、直接的なELISAを使用してLTE4−特定した結合特性を有する抗体に対しスクリーンされた。LTE4に架橋結合された牛血清アルブミン(BSA;Thermo Scientific、製品番号:77110)よりなる抗原−特異的な蛋白質−脂質コンジュゲートおよびオレイルアミン(oleylamine(OA)、Sigma、製品番号:07805)に架橋結合されたBSAよりなる抗原−非特異的蛋白質−脂質コンジュゲートが製造され、前記二つのコンジュゲートすべてでリンカーとしてbis(スクシンイミジル)ペンタ(エチレングリコール)(bis(succinimidyl)penta(ethylene glycol))(BSPEG5、Thermo Scientific、製品番号:21581)が使用された。対象試料を0.015ugの前記抗原−特異的コンジュゲートまたは抗原−非特異的コンジュゲートでコーティングされた384ウェル(well)の高結合能培養皿(Greiner Bio−One、製品番号:781061)の隣り合うウェルに適用し、1時間培養し、PBSで洗浄した。結合されたIgGは、ヤギ抗−マウスIgG1−特定したHRP−接合された抗体(goat anti−mouse IgG1−specific HRP−conjugated antibody、Southern Biotech、製品番号:1030−05)を使用して探知し、テトラメチルベンジジン(tetramethylbenzidine(TMB)、Invitrogen、製品番号:SB02)で現像した。比色分析の読み取りは、培養皿読み取り機上でA450(450nmの波長で吸収)で行われ、A450より高い波長は、血清または上澄み液試料上にさらに多くの抗体があることを示す。LTE4−コーティングされたウェル(抗原−特異的)で高い信号を示し、OA−コーティングされたウェル(非特異的)では、背景信号より高い信号を示さない試料は、抗原−特異的結合特性に対して陽性として判断された(表1)。理解され得るように、免疫原に使用されるものとは完全に異なる(リンカーおよび蛋白質すべてが異なる)コンジュゲートの一部であるLTE4を使用するスクリーニングは、前記脂質自体よりはかえって前記免疫原のリンカーまたは蛋白質に結合する抗体に帰結され得る偽陽性(false positives)を除去する。
3回の融合後に、Kinetic Exclusion Assay(KinExA、Sapidyne Instruments、アイダホ州、ボイシ所在)を使用して、5個のハイブリードマ(9B12、10G4、2F9、2G9、14H3)由来の上澄み液は、すべての三つのcysLT(LTC4、LTD4、およびLTE4)に対して高い親和性結合を示すことが確認され(表2)、前記上澄み液に対する2回の限界希釈クローニング(limiting dilution cloning)が行われた(ウェル当たり0.三つの細胞)。各限界希釈クローニング段階で、6〜8個のサブクローンは、ELISA分析された。すべてのサブクローンは、抗−cysLT抗体の生産に対して陽性であると確認された。前記すべての抗体は、IgG1カッパ同種型として確認された。このような抗体に対する解離定数は、表2に示す。
実施例4:抗体特異性
cysLT(LTC4、LTD4およびLTE4)だけでなく、LTB4、14、15−LTE4および5S−HETEの抗原団に対する単クローン抗体である9B12および10G4の結合特異性が分析された。要約すれば、384−ウェルの高結合能マイクロリットル培養皿を炭酸塩バッファー(pH 9.5)を使用して1ug/mLの最終濃度で希釈された15uLのLTE4−PEG5−BSAコンジュゲート(直接的なELISAで使用されたものと同じコンジュゲート)でコーティングした。37℃で1時間前記培養皿を培養した後に、前記培養皿の各ウェルは、PBSで4回洗浄され、1%BSA(Calbiochem、製品番号:126575)および0.1% Tween−20を含む50uLのPBSを添加することによってブロック(block)され、室温で1時間培養された。培養する間に、0.1mg/mLのBSAを含むPBS内に50ng/mLの9B12または10G4を含む溶液が準備され、次のような天然そのままのロイコトリエン脂質の30マイクロモル溶液を滴定するために(3倍の連続的な希釈)使用した:LTB4(Cayman Chemical Company、製品番号:20110)、LTC4(Cayman Chemical Company、製品番号:20210)、LTD4(Cayman Chemical Company、製品番号:20310)、LTE4(Cayman Chemical Company、製品番号:20410)、14、15−LTE4(Cayman Chemical Company、製品番号:10011362)、および5S−HETE(Cayman Chemical Company、製品番号:34230)。前記ブロッキング溶液を除去し、前記培養皿をPBSで4回洗浄した後に、15uLの滴定試料をマイクロリットル培養皿の重複した2個のウェルで点滴し(pipette)、室温で3時間培養した。培養後に、前記抗体−脂質試料を除去し、前記培養皿をPBSで4回洗浄した。前記固定されたコンジュゲートに固定されたまま残っているIgGは、ヤギ抗−マウスIgG1−特定のHRP−接合された抗体(Southern Biotech、製品番号:1030−05)を使用して探知し、テトラメチルベンジジン(TMB;Invitrogen、製品番号:SB02)で現像し、A450で読み取った。このような競争的ELISAの結果は、図3に示す。
cysLT(LTC4、LTD4およびLTE4)だけでなく、LTB4、14、15−LTE4および5S−HETEの抗原団に対する単クローン抗体である9B12および10G4の結合特異性が分析された。要約すれば、384−ウェルの高結合能マイクロリットル培養皿を炭酸塩バッファー(pH 9.5)を使用して1ug/mLの最終濃度で希釈された15uLのLTE4−PEG5−BSAコンジュゲート(直接的なELISAで使用されたものと同じコンジュゲート)でコーティングした。37℃で1時間前記培養皿を培養した後に、前記培養皿の各ウェルは、PBSで4回洗浄され、1%BSA(Calbiochem、製品番号:126575)および0.1% Tween−20を含む50uLのPBSを添加することによってブロック(block)され、室温で1時間培養された。培養する間に、0.1mg/mLのBSAを含むPBS内に50ng/mLの9B12または10G4を含む溶液が準備され、次のような天然そのままのロイコトリエン脂質の30マイクロモル溶液を滴定するために(3倍の連続的な希釈)使用した:LTB4(Cayman Chemical Company、製品番号:20110)、LTC4(Cayman Chemical Company、製品番号:20210)、LTD4(Cayman Chemical Company、製品番号:20310)、LTE4(Cayman Chemical Company、製品番号:20410)、14、15−LTE4(Cayman Chemical Company、製品番号:10011362)、および5S−HETE(Cayman Chemical Company、製品番号:34230)。前記ブロッキング溶液を除去し、前記培養皿をPBSで4回洗浄した後に、15uLの滴定試料をマイクロリットル培養皿の重複した2個のウェルで点滴し(pipette)、室温で3時間培養した。培養後に、前記抗体−脂質試料を除去し、前記培養皿をPBSで4回洗浄した。前記固定されたコンジュゲートに固定されたまま残っているIgGは、ヤギ抗−マウスIgG1−特定のHRP−接合された抗体(Southern Biotech、製品番号:1030−05)を使用して探知し、テトラメチルベンジジン(TMB;Invitrogen、製品番号:SB02)で現像し、A450で読み取った。このような競争的ELISAの結果は、図3に示す。
図3aは、LTC4、LTD4およびLTE4には結合するが、LTB4、14、15−LTE4または5S−HETEには結合しない9B12抗体を示す。LTC4、LTD4およびLTE4と関連して、前記三つの抗原は、前記抗体によって非常に類似に結合される(各々15%、65%、および100%)。図3bは、10G4抗体またLTC4、LTD4およびLTE4に結合するが(各々、100%、29%、および4%)、LTB4、14、15−LTE4または5S−HETEには結合しないことを示す。2F9、2G9、および14H3抗体は、同じ方式でテストされ、三つの抗体がすべてLTC4、LTD4およびLTE4と結合したが、次のような異なる特異性様相を有する:2F9:LTE4結合>LTD4結合>LTC4結合(100%/18%/6%);2G9:LTE4結合>LTD4結合>LTC4結合(100%/37%/21%);14H3:LTE4結合>LTD4結合>LTC4結合(100%/68%/42%)]。2F9、2G9または14H3のいずれもLTB4、14、15−LTE4または5S−HETEと結合しなかった。
本実施例から、cysLT単一クローン抗体は、一つのcysLTまたは二つのcysLTに対して優先的に結合するか、三つのcysLTすべてに対して良好に結合するように開発されたことを確認できる。LTE4またはLTC4(各々2F9または10G4のような)に優先的に結合する抗体が一部の例で好ましいことがある;このように、他の例では、汎−cysLT抗体が好ましいことがある。さらに他の例で、二つのcysLT(例えば、9B12抗体)に対して優先的に結合する抗体が好ましいことがある。このような選好度は、例えば、治療される疾患または疾患、または探知目的で使用されるとき、一つのcysLT、二つのcysLT、または三つのcysLTすべてが探知されるかによって相異に適用され得る。
本実施例から、cysLT単一クローン抗体は、一つのcysLTまたは二つのcysLTに対して優先的に結合するか、三つのcysLTすべてに対して良好に結合するように開発されたことを確認できる。LTE4またはLTC4(各々2F9または10G4のような)に優先的に結合する抗体が一部の例で好ましいことがある;このように、他の例では、汎−cysLT抗体が好ましいことがある。さらに他の例で、二つのcysLT(例えば、9B12抗体)に対して優先的に結合する抗体が好ましいことがある。このような選好度は、例えば、治療される疾患または疾患、または探知目的で使用されるとき、一つのcysLT、二つのcysLT、または三つのcysLTすべてが探知されるかによって相異に適用され得る。
実施例5:抗体アミノ酸序列
ネズミ科mAbsのクローニング:
抗−cysLTハイブリードマ細胞株である9B12:3H10および10G4:1G2各々から由来したクローンは、まず、Stemcell’s Medium Eで培養された後、Gibco FBSおよびCellgro補充物(ペニシリン/ストレプトマイシンを含まない)を含むIscove’s DMEM(Corning Cellgro、メサチュセツ洲、トクスベリ所在)に移されて培養された。無血清条件のために、クローンは、Cellgro補充物(ペニシリン/ストレプトマイシンを含まない)を含むSFM4MAb−utility(Thermo Fisher Hyclone、メサチュセツ洲、ウォルサム所在)に培養された。全体RNAは、NucleoSpin RNAキット(Macherey−Nagel、ペンシルバニア州、ベツレヘム所在)を基盤とする手続を使用してハイブリードマ細胞5E6から分離された。mRNAは、オリゴdT(25)磁性ビーズ(oligo dT(25) magnetic beads、New England Biolabs、メサチュセツ州、イプスウィッチ所在)を使用して全体RNAから分離された。前記mRNAは、5’RACEクローニング(Invitrogen、Carlsbad CA)のための製造社のプロトコルにより、第1cDNAストランドで生産された後、TdTテイリング(tailing)およびPCR増幅するのに使用された。
ネズミ科mAbsのクローニング:
抗−cysLTハイブリードマ細胞株である9B12:3H10および10G4:1G2各々から由来したクローンは、まず、Stemcell’s Medium Eで培養された後、Gibco FBSおよびCellgro補充物(ペニシリン/ストレプトマイシンを含まない)を含むIscove’s DMEM(Corning Cellgro、メサチュセツ洲、トクスベリ所在)に移されて培養された。無血清条件のために、クローンは、Cellgro補充物(ペニシリン/ストレプトマイシンを含まない)を含むSFM4MAb−utility(Thermo Fisher Hyclone、メサチュセツ洲、ウォルサム所在)に培養された。全体RNAは、NucleoSpin RNAキット(Macherey−Nagel、ペンシルバニア州、ベツレヘム所在)を基盤とする手続を使用してハイブリードマ細胞5E6から分離された。mRNAは、オリゴdT(25)磁性ビーズ(oligo dT(25) magnetic beads、New England Biolabs、メサチュセツ州、イプスウィッチ所在)を使用して全体RNAから分離された。前記mRNAは、5’RACEクローニング(Invitrogen、Carlsbad CA)のための製造社のプロトコルにより、第1cDNAストランドで生産された後、TdTテイリング(tailing)およびPCR増幅するのに使用された。
ハイブリードマサブクローンは、イソストリップ(isostrips、Roche、インディアナ州、インディアナポリス所在)で培養液上澄み液をテストすることによって、マウスIgG1k同種型であると認められた。免疫グロブリン重鎖可変領域(immunoglobulin heavy chain variable region、VH)cDNAは、同種型特異的なプライマー[RACEMOG1:5’−TATGCAAGGCTTACAACCACA−3’(序列番号1)]を使用して生産された。TdT−tailed cDNAは、ネストされた(nested)3’プライマー[MOCG1:5’−CACAATTTTCTTGTCCACCTTGGTGC−3’(序列番号3)]と一緒に、5’アンカー(anchor)プライマー[AAP:5’−GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG−3’(序列番号2)]を使用してPCRによって増幅された。反応産物は、NucleoSpin GelおよびPCR精製キット(Macherey−Nagel)を使用して精製され、逆方向(reverse)プライマー[CHIg−rev:5’−CCTTGACCAGGCATCCCA −3’(序列番号4)]を使用して序列分析された。その後、重鎖の可変ドメインを増幅し、pFUSE−10G4−mG1およびpFUSE−9B12−mG1を生産するために、Age IおよびAfe I断片として挿入され、hEF1−HTLVプロモーターを含むpFUSE−CHIg−mG1発現ベクター(Invivogen、カリフォルニア州、サンディエゴ所在)およびガンマー−1不変部に連結された。
同様に、免疫グロブリンカッパ鎖可変領域 (immunoglobulin kappa chain variable region、VK)は、同種型特異的なプライマー[RACEMOCK 5’− CTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAAT−3’(序列番号5)]を使用して増幅された。TdT−tailed cDNAは、VHと同じ5’アンカープライマーとともにカッパ鎖ネストされた3’プライマー[CKMO:5’−CTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAATGGG−3’(序列番号6)]を使用してPCRで増幅された。反応産物は、NucleoSpin GelおよびPCR精製キット(Macherey−Nagel)を使用して精製され、逆方向プライマー[CLIg−rev:5’−AGTTGTTCAAGAAGCACACGA−3’(序列番号7)]を使用して序列分析された。その後、軽鎖の可変ドメインが増幅され、pFUSE2−10G4−mKおよびpFUSE−9B12−mKを生産するために、Age IおよびBstAP I断片として挿入され、hEF1−HTLVプロモーターを含むpFUSE2−CLIg−mK発現ベクター(Invivogen)およびカッパ不変部内に連結された。このような挿入をRetrogen Inc.(カリフォルニア州、サンディエゴ所在)により序列分析された。
9B12、10G4、2F9、2G9および14H3抗体の推測されたCDRアミノ酸序列は、表3〜表7に示した。このような抗体の可変ドメイン序列は、表8〜表12に示した。可変ドメイン自体の一部ではないが、可変ドメイン序列(例えば、ベクター内の可変ドメイン序列)を取り囲むものと確認され得るカット位置(cut site)のようなリーダー(leaders)およびその他序列は示さなかった。2F9および2G9抗体は、同じ重鎖序列を共有することを注目すべきである。
前記5個の単一クローン抗体のCDR序列を比較することによって、LTE4に対して優先的に結合する4個の抗体、具体的に2F9、2G9および14H3は、これらのCDRの各々で有意的な序列同一性を共有するが、LTC4に優先的に結合する10G4抗体のCDRは、あまり類似していないことが確認され得る。これは、下記の表8に示され、下記の表8で、前記5個の抗体の6個のCDR序列の各々を比較した(参照として2G9序列を使用する)。
また、表8は、10G4抗体由来であることを排除しつつ、各CDRに対する共通序列を示し、9B12、2F9、2G9、14H3抗体由来の各CDRのアミノ酸序列間の同じ序列の位置を示す(*=前記抗体の間に異なるアミノ酸の位置である)。また、表8で、2F9、2G9および14H3抗体のCDRが少なくとも76%(76%〜100%)序列同一性を示すことによって、特に類似していることを確認できる。
実施例6:血管透過性に対する抗−cysLT抗体の効果
気道(具体的に気管(trachea)および気管支(bronchiole))炎症は、喘息の特徴である。気管支の壁で炎症細胞浸潤の他に、気道内の脈管構造と関連した構造的で且つ機能的な変化が発生する。これは、気道の壁内での血管の増殖(血管形成)、増加した血流、増加した微細血管透過性、および浮腫形成を含む。このような血管の変化は、空気流れの制限および気管支過敏反応性を含む喘息深刻度と関連しているため、臨床的に重要である(HorvathおよびWanner、2006年、Eur. Respir. J. 27:172−187)。前記cysLT各々は、血管透過性を増大するものと知られている(Leeなど、2009年、J. Allergy. Clin. Immunol. 124:417−421)。
気道(具体的に気管(trachea)および気管支(bronchiole))炎症は、喘息の特徴である。気管支の壁で炎症細胞浸潤の他に、気道内の脈管構造と関連した構造的で且つ機能的な変化が発生する。これは、気道の壁内での血管の増殖(血管形成)、増加した血流、増加した微細血管透過性、および浮腫形成を含む。このような血管の変化は、空気流れの制限および気管支過敏反応性を含む喘息深刻度と関連しているため、臨床的に重要である(HorvathおよびWanner、2006年、Eur. Respir. J. 27:172−187)。前記cysLT各々は、血管透過性を増大するものと知られている(Leeなど、2009年、J. Allergy. Clin. Immunol. 124:417−421)。
血管透過性は、標準方法を使用しつつ予備研究で評価された。要約すれば、実験ネズミは、4℃で一晩一緒に前培養されたLTC4および抗体(LT1017同種型対照群または抗−cysLT抗体(9B12または10G4)各々の1.5 nanomoleの腹腔内の注射前にエバンスブルー(Evan´s blue)染料で静脈注射された。15分後、実験ネズミは麻酔され、腹膜洗浄液を収得した。400×gで10分間遠心分離後に、前記ブルー染料が前記脈管構造からどの程度管外に流れ出たかを確認するために、分光光度計を使用して洗浄液上澄み液のOD610を読み取った。図4に示されたように、実験動物が賦形剤単独(1% DMSO)でi.p.注射されるとき、腹膜腔内への染料漏出はなかった。LTC4が関連ない対照群抗体とともに注射されるとき、明白な染料漏出があった。反対に、LTC4が抗−cysLT 10G4抗体とともに注射されるとき、染料漏出は最小であり、これは、本研究で前記の抗−cys抗体が血管透過性に対するLTC4の効果を中和したことを示す。このような予備実験で、抗−cysLT 9B12抗体による結果は不明確であった。9B12抗体は、10G4抗体よりLTC4に対してさらに低い親和力を有することを注目しなければならない。
実施例7:卵アルブミンによって誘導された急性喘息で抗−cysLT抗体の効果
Wuなど(2003年、Clin.&Exp.Allergy 33:359−366)により説明されたように、9B12および10G4抗体は、急性喘息動物モデルでテストされた。
Wuなど(2003年、Clin.&Exp.Allergy 33:359−366)により説明されたように、9B12および10G4抗体は、急性喘息動物モデルでテストされた。
6週齢〜8週齢BALB/c実験ネズミは、三つの治療群に分離された。食塩水および抗体グループは、0、7および14日頃に50μgのOVA(Sigma、ミズーリ州、セントルイス所在)および100μLのミョウバン(Pierce Thermo Fisher Scientific、イリノイス州、ロクポド所在)で腹腔内(i.p.)注射によって免疫化された。21日目に、前記マウスは、10×18×25cmのサイズのポリプロピレン(polypropylene)チャンバーに移動され、30分間OVA(10mg/mL)噴霧溶液で1回処置された。陰性対照群の場合、0日および7日目にミョウバンと共にOVAを注射し、14日目に食塩水を注射し、21日目に噴霧された食塩水で処置された。
投薬量−反応を決定するために、多様な投薬量の抗体または食塩水を尾静脈内に19日から23日目から毎日注射し、動物は、OVA処置72時間後に犠牲された。このような動物に対して、気管支肺胞洗浄液白血球百分率算定(Bronchoalveolar lavage(BAL) fluid differential cell count)および肺組織分析が行われた。
本研究の残りの部分のために、動物に19日から21日目から静脈注射で(i.v.)抗体または食塩水を投与した。OVA処置24時間後に、前記実験ネズミは、0.2mLのペントバルビタールナトリウム(60mg/kg)をi.p.注射によって犠牲された。これらの肺は、1.2mLの食塩水を使用して気管支を介して洗浄された。少なくとも200個の細胞の白血球百分率算定が行われた。
本研究の残りの部分のために、動物に19日から21日目から静脈注射で(i.v.)抗体または食塩水を投与した。OVA処置24時間後に、前記実験ネズミは、0.2mLのペントバルビタールナトリウム(60mg/kg)をi.p.注射によって犠牲された。これらの肺は、1.2mLの食塩水を使用して気管支を介して洗浄された。少なくとも200個の細胞の白血球百分率算定が行われた。
cysLTに対する抗体は、OVA処置後にBAL液体内の炎症細胞数を減少させることが期待される。
実施例8:卵アルブミンによって誘導された慢性的な喘息で抗−cysLT抗体の効果
慢性的な動物モデルで喘息抗体9B12および10G4抗体をテストする(Temelkovskiなど、1998年、Thorax 53:849−856)。
慢性的な動物モデルで喘息抗体9B12および10G4抗体をテストする(Temelkovskiなど、1998年、Thorax 53:849−856)。
感作化:8〜10週齢の病原菌がない雌性BALB/c実験ネズミを吸入露出21日前に全身に対する免疫措置なしに卵アルブミンに対する吸入露出によって感作化されるか、10μgのミョウバン沈殿された卵アルブミンを(V等級、純度:>98%、Sigma、ミズーリ州、セントルイス所在)腹腔内注射し、吸入露出7日前に補強注射することによって感作化する(「補強された」実験ネズミ)。
吸入露出:実験ネズミは、普通2週間隔で反応を評価しつつ、最大8週間毎週3日間噴霧される卵アルブミンで露出する。実験群は、各時点で6匹の実験ネズミを含む。露出は、全身吸入露出システムで行われる(Unifab Corp.、ミシガン州、カラマジュ所在)。前記露出中に動物は、ワイヤ貫流(flow−through)ケージ棚に収容され、濾過された空気は、250L/minの流速で0.5m3吸入チャンバーを介して流入される。温度および相対湿度は、各々20〜25℃および40〜60%に維持される。生理食塩水内の2.5%卵アルブミン溶液は、側流ジェット噴霧器(side stream jet nebulizer)で圧縮された空気を伝達することによって噴霧化され、チャンバーに注入される前に気流で注入される。
治療:cysLTに対する静脈注射で投与された抗体に対する気道反応性測定は、最後の吸入露出48時間後に行う。繰り返される圧力下で酸素供給される麻酔された実験ネズミで多様な容量で静脈注射される抗体の累積した投与中に気道収縮を確認するために、気管支けいれん変換器(bronchospasm transducer)[Ugo Basil 7020;Ugo Basile、Varese、Italy)]を使用する。各実験動物に対し、抗体治療によって誘発された呼吸氾濫容量(respiratory overflow volume)は、気管カニューレ(tracheal cannula)を閉塞することによって得られる最大氾濫の百分率として示す。治療群を比較するために、このような容量による反応データは、気道閉塞(肺抵抗性)において基線未満に減少を引き起こす濃度を計算するのに使用される。このような研究のための対照群は、アジュバント単独で模擬で免疫化された実験ネズミおよび補強された実験ネズミであり、前記二種類の実験ネズミは、いずれも、噴霧される生理食塩水に露出される。
実施例9:AERDで抗−cysLT抗体の効果
PGE2シンターゼ−1−欠乏実験ネズミ(Uematsuなど、2002年、J Immunol 168:5811−5816)は、好酸球性肺炎症動物モデルでの明確なAERD−類似表現型で発達する。イエダニ種類であるコナヒョウヒダニ(Dermatophagoides farina、Df)の抽出物が鼻腔内((i.n.)に投与されたmPGES−1(ptges−/−実験ネズミ)欠乏実験ネズミは、野生型対照群動物と比較して、明確な好酸球性気管支血管炎症を示す(Liu、2012年)。Dfで処置されたptges−/−実験ネズミは、cysLT生産およびcysLTによる空気流れ閉鎖およびアスピリンに対する反応で肺肥満細胞活性を示す(Liu、2013年)。肺抵抗性は、外科的肺機能制御器(invasive pulmonary function device、Buxco社、ノースカロライナ州、ウィルミントン所在)を使用して評価する。要約すれば、実験ネズミの気管切除手術を行い、酸素を供給する。肺抵抗性が安定した基線に到達するようにした後に、Dfまたは食塩水の最後投与24時間後に、噴霧器を使用してLys−アスピリン(Lys−ASA)、12μLの100mg/mL溶液、または希釈物単独を肺に伝達されるようにし、45分間肺抵抗性を記録する。結果は、基線から肺抵抗性の百分率変化で示す。肺抵抗性は、WT実験ネズミおよび食塩水で処置されたptges−/−対照群と比較するとき、Lys−ASAで実験されたDfで処置されたptges−/−実験ネズミにおいて明確に増加する。このような増加は、cysLT(9B12または10G4)に対する抗体で処置された動物において減少するものと期待される。
PGE2シンターゼ−1−欠乏実験ネズミ(Uematsuなど、2002年、J Immunol 168:5811−5816)は、好酸球性肺炎症動物モデルでの明確なAERD−類似表現型で発達する。イエダニ種類であるコナヒョウヒダニ(Dermatophagoides farina、Df)の抽出物が鼻腔内((i.n.)に投与されたmPGES−1(ptges−/−実験ネズミ)欠乏実験ネズミは、野生型対照群動物と比較して、明確な好酸球性気管支血管炎症を示す(Liu、2012年)。Dfで処置されたptges−/−実験ネズミは、cysLT生産およびcysLTによる空気流れ閉鎖およびアスピリンに対する反応で肺肥満細胞活性を示す(Liu、2013年)。肺抵抗性は、外科的肺機能制御器(invasive pulmonary function device、Buxco社、ノースカロライナ州、ウィルミントン所在)を使用して評価する。要約すれば、実験ネズミの気管切除手術を行い、酸素を供給する。肺抵抗性が安定した基線に到達するようにした後に、Dfまたは食塩水の最後投与24時間後に、噴霧器を使用してLys−アスピリン(Lys−ASA)、12μLの100mg/mL溶液、または希釈物単独を肺に伝達されるようにし、45分間肺抵抗性を記録する。結果は、基線から肺抵抗性の百分率変化で示す。肺抵抗性は、WT実験ネズミおよび食塩水で処置されたptges−/−対照群と比較するとき、Lys−ASAで実験されたDfで処置されたptges−/−実験ネズミにおいて明確に増加する。このような増加は、cysLT(9B12または10G4)に対する抗体で処置された動物において減少するものと期待される。
実施例10:血管透過性で抗−cysLT抗体である2G9および10G4および多様な投与方法の効果
血管の透過性は、実施例6のように、標準方法を使用しつつ予備研究で評価された。要約すれば、実験ネズミは、4℃で一晩一緒に前培養されたLTC4(Cayman、製品番号:20210)および抗体(LT1017同種型対照群または2G9抗−cysLT抗体各々の1.5 nanomoleの腹腔内注射前にエバンスブルー(Evan´s blue)染料で静脈注射された。15分後、実験ネズミは、麻酔され、腹膜洗浄液を収得した。400×gで10分間遠心分離後に、前記ブルー染料が前記脈管構造からどの程度管外に流れ出たかを確認するために、分光光度計を使用して洗浄液上澄み液のOD610を読み取った。図5に示されたように、実験動物が、1:1のLTC4:抗体のモル比で、食塩水単独でIP注射されるとき、 腹膜腔内への染料漏出はなかった。LTC4が関連ない対照群抗体(NS)とともに注射されるとき、明白な染料漏出があった。反対に、LTC4が抗−cysLT抗体である2G9(1:1または1:5のLTC4:抗体)とともに注射されたとき、染料漏出は、ほぼ対照群(食塩水)数値に血管外への流出を低減する1:5混合物を使用して、容量依存的に減少する。これは、本研究で、前記の抗−cys抗体である2G9が血管透過性に対するLTC4の効果を中和したことを示す。星印は、非特異的陰性対照群(NS)抗体と比較するとき、統計的に有意的な差異を示す:NS(1:1)グループと統計的に異なる***P=0.0002、****P<0.0001(ダネットの複数比較試験(Dunnett’s multiple comparison test)による一元変量分析(one−way ANOVA))。
血管の透過性は、実施例6のように、標準方法を使用しつつ予備研究で評価された。要約すれば、実験ネズミは、4℃で一晩一緒に前培養されたLTC4(Cayman、製品番号:20210)および抗体(LT1017同種型対照群または2G9抗−cysLT抗体各々の1.5 nanomoleの腹腔内注射前にエバンスブルー(Evan´s blue)染料で静脈注射された。15分後、実験ネズミは、麻酔され、腹膜洗浄液を収得した。400×gで10分間遠心分離後に、前記ブルー染料が前記脈管構造からどの程度管外に流れ出たかを確認するために、分光光度計を使用して洗浄液上澄み液のOD610を読み取った。図5に示されたように、実験動物が、1:1のLTC4:抗体のモル比で、食塩水単独でIP注射されるとき、 腹膜腔内への染料漏出はなかった。LTC4が関連ない対照群抗体(NS)とともに注射されるとき、明白な染料漏出があった。反対に、LTC4が抗−cysLT抗体である2G9(1:1または1:5のLTC4:抗体)とともに注射されたとき、染料漏出は、ほぼ対照群(食塩水)数値に血管外への流出を低減する1:5混合物を使用して、容量依存的に減少する。これは、本研究で、前記の抗−cys抗体である2G9が血管透過性に対するLTC4の効果を中和したことを示す。星印は、非特異的陰性対照群(NS)抗体と比較するとき、統計的に有意的な差異を示す:NS(1:1)グループと統計的に異なる***P=0.0002、****P<0.0001(ダネットの複数比較試験(Dunnett’s multiple comparison test)による一元変量分析(one−way ANOVA))。
抗−cysLT 10G4抗体に対する効果も、“予備投薬(pre−dose)”皮下(SC)実験で評価され、LTC4(1.5 nanomoles、I.P)の投与24時間前に前記実験で10G4または非特異的対照群抗体であるLT1017(NS)を実験ネズミに投与した(30mg/kg SC)。本研究は、10G4 IPグループをも含み、前記グループで30 mg/kg投薬量(〜0.6mgまたは〜4nanomoles)に対する相当する抗体容量が1.5 nanomolesのLTC4とあらかじめ混合され、製造された混合物は、I.P.注射された。
予備研究のように、食塩水単独の場合、染料漏出は引き起こされなかった。LTC4投与が後続する非特異的対照群抗体(NS)の皮下投与は、染料漏出を引き起こした。反対に、LTC4による漏出(血管透過性)は、抗−cysLT 10G4抗体皮下注射で前処置された動物で有意的に減少した。このような結果は、図6に示される。星印は、非特異的陰性対照群(NS)抗体と比較して統計的に有意的な差異を示す:****P<0.0001 statistically異なるfrom NS(SC)グループ(ダネットの複数比較試験による一元変量分析)。
本実施例は、抗−cysLT抗体が、投与経路とは関係なく、LTC4によって誘導された血管透過性を抑制できたことを示す。また、このような血管透過性抑制は、LTC4 24時間前に抗体が投与されたときにも観察された。
実施例11:実験ネズミで抗−cysLT mAbの薬物動態学(PK)評価
16匹の雌性BALB/c実験ネズミは、(6〜8週齢)腹腔内(I.P.)または静脈注射(I.V.)により1回分の容量である30mg/kgの抗−cysLT抗体(9B12、2G9または10G4)で1回投与された。前記実験ネズミは、無作為的に4個のグループに分類された(各グループ毎に4匹が割り当てられる)。投薬した多様な時間帯で(1、3、6、9、24、72、144、192、336および504時間)、浅側頭静脈または心穿刺技術を使用して一つの実験ネズミ(N=4)グループで採血した。血漿は、ETDAを含有するチューブを使用してCAPIJECT毛細血管血液採血システム(Terumo、Somerset NJ、製品番号:T−MQK)により分離された。
16匹の雌性BALB/c実験ネズミは、(6〜8週齢)腹腔内(I.P.)または静脈注射(I.V.)により1回分の容量である30mg/kgの抗−cysLT抗体(9B12、2G9または10G4)で1回投与された。前記実験ネズミは、無作為的に4個のグループに分類された(各グループ毎に4匹が割り当てられる)。投薬した多様な時間帯で(1、3、6、9、24、72、144、192、336および504時間)、浅側頭静脈または心穿刺技術を使用して一つの実験ネズミ(N=4)グループで採血した。血漿は、ETDAを含有するチューブを使用してCAPIJECT毛細血管血液採血システム(Terumo、Somerset NJ、製品番号:T−MQK)により分離された。
分離された実験ネズミ血漿試料内の−cysLT抗体数値は、直接的な−結合ELISAを使用して数値化した。要約すれば、血漿試料は、ブロッキングバッファー(1XPBS、10 mg/mL BSA、0.05% tween−20)を使用して1:100、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000および1:16000で希釈し、各希釈物の100uLの部分標本をあらかじめ0.1ugのLTE4−BSAコンジュゲートでコーティングされ、ブロッキングバッファーでブロックされた96−ウェルELISA培養皿(Greiner Bio−One、Monroe NC、製品番号:655061)に2回繰り返して投与した。1時間培養した後に、培養皿を洗浄し、ヤギ抗−マウスIgG−HRP抗体(SouthernBiotech、アラバマ州、バーミンガム所在、製品番号:1030−05)および3、3´、5、5’−テトラメチルベンジジン(TMB)基材(Invitrogen、カリフォルニア州、サンディエゴ所在、製品番号:SB02)を使用して前記培養皿に付着した抗−cysLT抗体を探知した。前記血漿試料での前記の抗−cysLT抗体濃度を決定するために、450nMでの吸収を測定し、精製された抗体物質を使用して作られた標準曲線と比較した。前記の抗体濃度は、3相指数関数(3−phase exponential function)を使用して投薬後に時間に対してグラフ化し、曲線適合化した(curve−fit)(図7及び図8)。図7に示されたように、静脈注射によって投与されたネズミ科の抗−cysLT抗体である9B12および10G4の薬物動態学的プロフィールは、事実上、同一である。
図8に示されたように、腹腔内に投与されたネズミ科の抗−cysLT抗体である10G4および2G9の薬物動態学的プロフィールは、事実上、同一である。IV(図7)およびIP(図8)で投与された10G4を比較してみれば、これらの薬物動態学プロフィールは、投与経路とは大きく関係がないことを示す。
実施例12:ネズミ科の10G4抗体の人間化
ネズミ科の抗−cysLT単クローン抗体である10G4の可変ドメインであるVHおよびVLは、一つ以上のcysLTに対して高い親和力、特異性、結合能を保有する抗体を生産するために、人間骨格領域(FR)内にネズミ科のCDRを接合化されることによって人間化された(Lefranc、M.P、2003年、Nucleic Acids Res、31:307−10;Martin、A.C.およびJ.M.Thornton、1996年、J Mol Biol、1996、263:800−15;Morea、V.、A.M.LeskおよびA.Tramontano、2000年、Methods、20:267−79;Foote、J.およびG.Winter、1992年、J Mol Biol、224:487−99;Chothia、C.など、1985年、J Mol Biol、186:651−63).
ネズミ科の抗−cysLT単クローン抗体である10G4の可変ドメインであるVHおよびVLは、一つ以上のcysLTに対して高い親和力、特異性、結合能を保有する抗体を生産するために、人間骨格領域(FR)内にネズミ科のCDRを接合化されることによって人間化された(Lefranc、M.P、2003年、Nucleic Acids Res、31:307−10;Martin、A.C.およびJ.M.Thornton、1996年、J Mol Biol、1996、263:800−15;Morea、V.、A.M.LeskおよびA.Tramontano、2000年、Methods、20:267−79;Foote、J.およびG.Winter、1992年、J Mol Biol、224:487−99;Chothia、C.など、1985年、J Mol Biol、186:651−63).
生命工学情報を提供する米国国立保健院(NIH)の有料オンラインツール(tool)であるIgBLASTを使用して適合な受容子である人間骨格序列を選択した。人間免疫グロブリン重い可変形4−59(接近番号第AB019438号)は、10G4重鎖可変ドメインの人間化されたバージョンを人間骨格(human framework)を基盤とするために人間骨格として選択され、JH6(接近番号第J00256)は、重鎖J領域のために使用された。前記重鎖のCDRは、ネズミ科の抗体のCDRであった。
前記軽鎖と関連して、VKI O12(接近番号第X59315号)は、10G4軽鎖可変ドメインの人間化バージョンを人間骨格を基盤とするために人間骨格として選択された。JK2(接近番号第J00242)は、J領域に使用された。CDR序列は、ネズミ科の10G4抗体のCDR序列であった。
10G4抗体の初めて人間化されたバージョンの序列は(先立って命名された人間骨格で10G4接合されるCDR、復帰突然変異がない)、下記の表13および表14に示す。これは、10G4人間化抗体鋳型と言及される。
前記重鎖可変形(VH)鋳型のDNA序列およびアミノ酸序列(人間骨格内の10G4重鎖CDR)は、表14に示す。CDRは、太い字体であり;前記可変ドメインを暗号化しない序列(すなわち、信号序列、繰り返されるドメイン序列)は、下線を引く。含まれた6〜24のアミノ酸位置は、4〜59の人間骨格リーダー(leader)である:
VL鋳型(人間骨格内の10G4軽鎖CDR)のDNA序列およびアミノ酸序列は、表15に示す。CDRは、太い字体であり、前記可変ドメインをコーディングしない序列(すなわち、信号序列、繰り返されるドメイン序列)は、下線を引く。含まれる6〜27のアミノ酸位置は、人間O12骨格リーダー序列でる:
前記の軽鎖可変ドメインのアミノ酸序列のコーディング領域は、次の通りである:
前記の重鎖および軽鎖(全体の人間骨格内に接合されたネズミ科CDR)を含む人間化抗体鋳型は、ヒト胎児腎臓細胞株であるHEK293細胞(FreeStyleTM 293−F Cells、Life Technologies、製品番号:R790−07、FreeStyleTM 293発現培地(Life Technologies、製品番号:12338−018)および細胞形質転換試薬である293fectinTM(Life Technologies、製品番号:12347−019)を使用する)で全体長さの(full−length)IgG抗体として発現した。一時的な発現後に、上澄み液は回収され、ELISAによってIgGを数値化した。活性は、直接的なELISAによってテストされ、前記人間化鋳型(全体人間骨格でネズミ科CDR)は、復帰突然変異の不在下に非活性のものと確認された。
実施例13:変異体の人間化10G4−最適化の復帰突然変異
10G4人間化軽鎖可変領域および重鎖領域の変異体連続物が連続的に生産された。生産された重鎖変異体は、表16に示し、前記軽鎖変異体は、表17に示す。多数の復帰突然変異の他の組合を有する変異体をも示した。CDR変異を有する二つの変異体が製造されたことを注目すべきである:重鎖変異体である10G4/4−59.8は、単一復帰突然変異およびCDRH1で変異(S30bG)を有すれば、軽鎖変異体である10G4/O12.8は、四個の復帰突然変異だけでなく、二つのCDR変異(CDRL1でE28SおよびCDRL3でS93R)を有する。
10G4人間化軽鎖可変領域および重鎖領域の変異体連続物が連続的に生産された。生産された重鎖変異体は、表16に示し、前記軽鎖変異体は、表17に示す。多数の復帰突然変異の他の組合を有する変異体をも示した。CDR変異を有する二つの変異体が製造されたことを注目すべきである:重鎖変異体である10G4/4−59.8は、単一復帰突然変異およびCDRH1で変異(S30bG)を有すれば、軽鎖変異体である10G4/O12.8は、四個の復帰突然変異だけでなく、二つのCDR変異(CDRL1でE28SおよびCDRL3でS93R)を有する。
前記表の変異体可変ドメインは、分離されたベクター内にクローニングされ、HEK293ヒト胎児腎臓細胞株(FreeStyleTM 293−F Cells,Life Technologies、製品番号:R790−07,FreeStyleTM 293発現培地(Life Technologies、製品番号:12338−018)および細胞形質転換試薬である293fectinTM(Life Technologies、製品番号:12347−019)を使用する)内に多様な重鎖および軽鎖組合で一時的に形質導入された。一時的な形質発現後、上澄み液を回収し、ELISAによってIgGを数値化した。(BSAで接合された)LTE4に対する各変異体の結合活性は、最初に直接的なELISAを使用して測定した。ELISAで結合を示す変異体は、KinExAを使用して結合天然そのままのcyLTに対して結合測定された。
テストされた重鎖(HC)および軽鎖(LC)の組合は、下記の表18に示す。各可変ドメインの骨格(FW)内の復帰突然変異の数を示す。
初めに、復帰突然変異(完全な人間骨格)がない人間化可変ドメインまたは多数の復帰突然変異を有するLTE4人間化可変ドメインを含む抗体を使用して、「すべてまたはなし」スクリーニング(表18でセット1)を行い、LTE4との結合能をテストした。図9は、セット1の人間化10G4変異体に対する直接的なLTE4−結合ELISAデータを示するもので、軽鎖可変領域であるO12.5または重鎖可変領域である4−59.6に復帰突然変異がないか、二つの鎖に複数個の復帰突然変異を(軽鎖可変領域であるO12.0および重鎖可変領域である4−59.0)を有するか、または、一つの鎖は、復帰突然変異がなく、一つの鎖は、多数の復帰突然変異を有する。復帰突然変異(O12.0)を含まない変異体軽鎖を有する抗体は、重鎖とは関係なく、不活性であることを確認でき、したがって、前記人間軽鎖骨格内の一つ以上の復帰突然変異は、活性のために必要なものと考えられる。しかし、人間化抗体の重鎖が復帰突然変異(5−59.0、青色ライン)を含まない人間化抗体は、依然として軽鎖骨格変異なしに抗原に結合できた。
セット2(表18)の人間化された変異体も、直接的なELISAによってLTE4結合に対してテストされた。可変ドメイン内に単一復帰突然変異を有する軽鎖人間化変異体各々は、完全な人間(fully human、復帰突然変異なし)の重鎖人間化変異体4−59.0とともに抗体内に注入された。比較のために、軽鎖可変ドメインであるO12.5および重鎖可変ドメインである4−59.0を有するセット1の抗体が含まれる。図10に示されたように、前記すべての抗体は、LTE4に対する多少の結合活性を示したが、軽鎖変異体O12.2(単一復帰突然変異であるP44I)を有する抗体は、最も弱い結合を示した。このような復帰突然変異は、2回目の実験の変異体では省略された(参照として、軽鎖変異体であるO12.7は、このような変異が欠乏されているが、O12.5に存在する他の三つの復帰突然変異を含む)。本実験のように、完全な人間の重鎖変異体である4−59.0と組合わせられるとき、LTE4結合に対して最も活性である抗体は、O12.5およびO12.1軽鎖を有する抗体であった。
表18のセット3の人間化された変異体は、LTE4−BSAを使用して直接的なELISAによってcysLT結合に対してテストされた。単一復帰突然変異を有する人間化された10G4軽鎖変異体可変ドメインは、4−59.6重鎖可変ドメイン(6個の復帰突然変異)と共に発現した。また、O12.5軽鎖(四個の復帰突然変異)は、4−59.6重鎖と組み合わせて発現された。前記すべての抗体は、LTE4に対する多少の結合活性を示したが、P44I(O12.2)位置に一つの軽鎖復帰突然変異を有する抗体は、また、最も弱い結合を示した。このような復帰突然変異は、2回目の実験の変異体で省略された(参照として、軽鎖変異体であるO12.7は、このような変異が欠乏されているが、O12.5に存在する他の三つの復帰突然変異を有する)。このスクリーンでLTE4結合に対して最も活性である抗体は、図11に示されたように、また、O12.5およびO12.1軽鎖を有する抗体であった。
その後、人間化10G4抗体重鎖変異体である4−59.1、4−59.2、4−59.3、4−59.4および4−59.5(これらは、各々一つの復帰突然変異を有し、4−59.3は、隣接する一対の変異を有する)は、軽鎖であるO12.5(四個の復帰突然変異)とともに発現され、直接的なLTE4−結合ELISAによってテストされた。図12に示されたように、4−59.3変異体重鎖(VT67/68IS復帰突然変異)を有する抗体は、どんな探知可能な結合を示さなく、重鎖変異体である4−59.1、4−59.2および4−59.5を有する抗体は、高い結合活性を示し、4−59.3重鎖を有する抗体は、LTE4に対して中間の結合活性を示した。O12.5軽鎖可変領域 および4−59.6重鎖可変領域 (6個の復帰突然変異)を有する抗体は、優れたLTE4結合活性を示した。
最後に、セット4(表18)の人間化10G4抗体変異体をテストし、前記人間化10G4抗体変異体の重鎖変異体および軽鎖変異体は、各々一つの変異を有し(または重鎖4−59.3の場合、一対の隣接する復帰突然変異を有する)、前記人間化10G4抗体変異体は、多様な組合で一緒に発現され、生成された人間化LTE4結合活性に対してELISAによってテストされた。図13は、O12.1軽鎖可変ドメインおよび異なる重鎖可変ドメイン(4−59.1、4−59.2、4−59.3、4−59.4または4−59.5)を有する抗体のLTE4結合を示す。このような抗体のうち三つの抗体が(重鎖として4−59.1、4−59.2および4−59.3を有する)LTE4に対する高い結合活性を示した。残りの抗体は、普通の結合を示した。これは、O12.1軽鎖を有する抗体が最も活性である傾向を示す前記の発見と一致する。
図14は、O12.2軽鎖可変ドメインおよび異なる重鎖可変ドメインを有する抗体のLTE4結合を示す。このような抗体で、単に一つの抗体(4−59.4重鎖)が高い結合活性を有し、残りの抗体は、非常に低い結合を示した。図15は、O12.3軽鎖可変ドメインおよび異なる重鎖可変ドメインを有する抗体のLTE4結合を示す。4−59.2重鎖を有する前記抗体は、前記の抗体のうち最も優れた結合を示し、4−59.5重鎖を有する抗体は、非常に低い結合を示し、残りの抗体は、普通の結合を示した。
図15は、O12.4軽鎖可変ドメインおよび異なる重鎖可変ドメインを有する抗体のLTE4結合を示す。4−59.4重鎖を有する抗体は、優れた結合を示し、4−59.1抗体は、普通の結合を示し、残りの抗体は、非常に低い結合を示した。
実施例14:ネズミ科cysLT 10G4抗体の追加的に最適化された人間化変異体
前記データを基礎にして、追加的な重鎖および軽鎖可変ドメイン変異体(前記表15および表16で示した序列)を下記の表19で示した重鎖および軽鎖可変ドメインを使用して生産した。以前のスクリーニングで結合活性をほとんどまたは全く示さない復帰突然変異は、新しい変異体から省略された。下記の2回目の実験の変異体において軽鎖復帰突然変異であるP44Iは省略した(新しい軽鎖変異体であるO12.7は、このような変異が欠乏されているが、活性変異体であるO12.5に存在する他の三つの復帰突然変異を有する)。重鎖復帰突然変異であるVT67および68ISも、下記の2回目の実験の変異で省略された(新しい重鎖変異体である4−59.7は、このような変異が欠乏されているが、4−59.6に存在する復帰突然変異であるL20V、P40F、V71R、R94Nを有する)。
前記データを基礎にして、追加的な重鎖および軽鎖可変ドメイン変異体(前記表15および表16で示した序列)を下記の表19で示した重鎖および軽鎖可変ドメインを使用して生産した。以前のスクリーニングで結合活性をほとんどまたは全く示さない復帰突然変異は、新しい変異体から省略された。下記の2回目の実験の変異体において軽鎖復帰突然変異であるP44Iは省略した(新しい軽鎖変異体であるO12.7は、このような変異が欠乏されているが、活性変異体であるO12.5に存在する他の三つの復帰突然変異を有する)。重鎖復帰突然変異であるVT67および68ISも、下記の2回目の実験の変異で省略された(新しい重鎖変異体である4−59.7は、このような変異が欠乏されているが、4−59.6に存在する復帰突然変異であるL20V、P40F、V71R、R94Nを有する)。
可変ドメイン序列を前記表15および表16に示し、以前の実施例で説明されたように、生産された変異を有するこのような追加的な序列変異を含む抗体の結合能力は、表20で比較される。
天然そのままのLTC4、LTD4およびLTE4に対する抗体の結合は、Kinetic Exclusion Assay(KinExA、Sapidyne Instr
uments、アイダホ州、ボイシ所在)を使用して確認された。
uments、アイダホ州、ボイシ所在)を使用して確認された。
前記表で示したように、LT5013およびLT5014抗体は、非常に活性であり、結合プロフィールで類似している。LT5013(O12.7軽鎖、4−59.6重鎖)は、合計9個の復帰突然変異を有し、LT5014(O12.7軽鎖、4−59.7重鎖)は、合計7個の復帰突然変異を有する。本研究のためにLT5014を選択した。
合計三つのCDR変異(CDRH1:GYSITSGYSWN、序列番号74;CDRL1、RASQSISGYLGW、序列番号;75;およびCDRL3、LQYARFPRT、序列番号76)および5個の骨格復帰突然変異を有するLT5015抗体は、LT5010(復帰突然変異は同一であり、CDR変異はない)と比較された。このような抗体は、直接的なELISAで優れたcysLT結合を示したが、LT5010と比較して天然そのままのcysLTに対して向上した結合活性を有するものと確認されなかった。
実施例15:炎症性腸疾患のネズミ科動物モデルでネズミ科の抗−cysLT抗体である2G9および10G4の活性
デキストラン硫酸ナトリウム(dextran sulfate sodium)により誘導された大腸炎(DSS−大腸炎)動物モデルは、炎症性腸疾患と関連して広く受容される動物モデルである[参照として、例えば、Deguchiなど、2006年、Oncology Reports 16:699−703]。ネズミ科cys−LT抗体である2G9および10G4は、このような動物モデルで評価された。実験ネズミは、(10/group)研究の開始日である0日目から6日間1.5%デキストラン硫酸ナトリウム(dextran sodium sulfate、DSS)を含有する食水で提供され、その後、4日間きれいな水を供給した。抗体(PBS内に30mg/kg)は、本研究の0日目、3日目、および6日目に提供された。各動物の体重、便の硬さおよび便に少量で存在するか、目視で確認可能な血液の存在の有無を毎日観察した。これから、複合疾患活動指標(composite disease activity index. DAI)点数を計算した。DAIが0であるとき、正常であり(体重減少なし、便に血液なし、正常な便の硬さ)、DAI点数が最高値であるとき、四個の症状が存在する(>1 5%の体重減少、下痢、便に目視で観察される血液)。シクロスポリンA(Cyclos porine A)は、陽性対照群として使用され、LT1014非特異的対照群抗体である。対照群実験ネズミは、DSSを適用されなかった。
デキストラン硫酸ナトリウム(dextran sulfate sodium)により誘導された大腸炎(DSS−大腸炎)動物モデルは、炎症性腸疾患と関連して広く受容される動物モデルである[参照として、例えば、Deguchiなど、2006年、Oncology Reports 16:699−703]。ネズミ科cys−LT抗体である2G9および10G4は、このような動物モデルで評価された。実験ネズミは、(10/group)研究の開始日である0日目から6日間1.5%デキストラン硫酸ナトリウム(dextran sodium sulfate、DSS)を含有する食水で提供され、その後、4日間きれいな水を供給した。抗体(PBS内に30mg/kg)は、本研究の0日目、3日目、および6日目に提供された。各動物の体重、便の硬さおよび便に少量で存在するか、目視で確認可能な血液の存在の有無を毎日観察した。これから、複合疾患活動指標(composite disease activity index. DAI)点数を計算した。DAIが0であるとき、正常であり(体重減少なし、便に血液なし、正常な便の硬さ)、DAI点数が最高値であるとき、四個の症状が存在する(>1 5%の体重減少、下痢、便に目視で観察される血液)。シクロスポリンA(Cyclos porine A)は、陽性対照群として使用され、LT1014非特異的対照群抗体である。対照群実験ネズミは、DSSを適用されなかった。
図17に示されたように、予想されたように、対照群実験ネズミは、どんな疾患も有しなかった。賦形剤および非特異的抗体(LT1014)で処置されたグループは、最も高いDAIを有し、抗−cysLT 10G4抗体および陽性対照群シクロスポリンA(CsA)で処置された動物は、最も低いDAIを有した。多重t−テスト(multiple t−tests)を基盤として、10G4 vs賦形剤に対する統計的有意度を示した(* P<0.05、** P<0.01、*** P<0.001)。
実施例16:アレルギー性喘息ネズミ科動物モデルでネズミ科の抗−cysLT抗体である9B12および10G4の活性
気道過敏反応性、肺炎症、および肺組織病理の改善と関連して、抗−cysLT抗体は、急性喘息OVA動物モデル(PharmaLegacy Laboratories、中国、上海所在)で評価された。
試薬:卵アルブミン(Ovalbumin、OVA):V等級、Sigma、ミズーリ州、セントルイス所在。製品番号:A5503;
イムジェクトミョウバン水酸化物溶液(Imject Alum hydroxide solution):Pierce、イリノイス州、ロクポド所在、製品番号:77161;ソジウムカルボキシメチルセルロース(Sodium carboxymethyl cellulose、CMC、MW=800−1200)、Sinopharm Chemical Reagent Co.、Ltd、中国、上海所在、製品番号:30036365;および
リン酸緩衝食塩水(Phosphate buffered saline、PBS):Dycent Biotech(Shanghai) CO.、Ltd. 製品番号:BJ141.
気道過敏反応性、肺炎症、および肺組織病理の改善と関連して、抗−cysLT抗体は、急性喘息OVA動物モデル(PharmaLegacy Laboratories、中国、上海所在)で評価された。
試薬:卵アルブミン(Ovalbumin、OVA):V等級、Sigma、ミズーリ州、セントルイス所在。製品番号:A5503;
イムジェクトミョウバン水酸化物溶液(Imject Alum hydroxide solution):Pierce、イリノイス州、ロクポド所在、製品番号:77161;ソジウムカルボキシメチルセルロース(Sodium carboxymethyl cellulose、CMC、MW=800−1200)、Sinopharm Chemical Reagent Co.、Ltd、中国、上海所在、製品番号:30036365;および
リン酸緩衝食塩水(Phosphate buffered saline、PBS):Dycent Biotech(Shanghai) CO.、Ltd. 製品番号:BJ141.
動物群:雌性BALB/c実験ネズミを体重により無作為的にグループ化し、一つのグループ当たり10匹の実験ネズミを配当した:対照群(模擬で感作化される、PBS賦形剤単独、i.v.);モデル(PBS賦形剤単独、i.v.);0.1 mg/Ml濃度で0.5%CMC−Na内のデキサメタゾン(SPGC Sine Pharma Laboratories)、経口投与される(陽性対照群);PBS内に9B12(30mg/kg、i.v.);PBS内に10G4群(30 mg/kg、i.v.)。対照群の実験ネズミをi.p.注射によってただ100μLのPBS(PH=7.2)を投与した。他のすべてのグループの実験ネズミは、1日目および14日目に感作化溶液(PBSに20μgの卵アルブミンおよび2mgのミョウバンを含有する)を注射することによって(実験ネズミごとに0.1 mL、i.p.)敏感化された。
OVA処置:28日目、29日目、および30日目に、実験ネズミ(対照群銀除く)は、大量投薬システム(mass dosing system、Buxco/DSI、St. Paul MN)を使用して30分間PBS(PH=7.2)(処置溶液)内の1% OVAで処置された。対照群の実験ネズミは、PBS(PH=7.2)で処置した。
投薬:
対照群:27日目および29日目(OVA処置2時間前)、および31日目(気道過敏反応性(AHR)テスト2時間前)に静脈注射によって賦形剤を投与した。
実験動物群:27日目および29日目(OVA処置2時間前)、および31日目(気道過敏反応性(AHR)テスト2時間前)に静脈注射によって賦形剤を投与した。
デキサメタゾン陽性対照群:0.5%CMC−Na内に1.0mg/kgのデキサメタゾンを27、28、29、30(各投薬日のOVA処置の2時間前)および31日目に一日に一度経口投与した。
LT1017:非特異的抗体対照群は27および29日目(OVA処置2時間前)、および31日目(気道過敏反応性(AHR)テスト2時間前)に静脈注射で投与した。
9B12抗体:抗体は、27および29日目(OVA処置2時間前)、および31日目(気道過敏反応性(AHR)テスト2時間前)に静脈注射で投与した。
10G4抗体:抗体は27および29日目(OVA処置2時間前)、および31日目(気道過敏反応性(AHR)テスト2時間前)に静脈注射で投与した。
対照群:27日目および29日目(OVA処置2時間前)、および31日目(気道過敏反応性(AHR)テスト2時間前)に静脈注射によって賦形剤を投与した。
実験動物群:27日目および29日目(OVA処置2時間前)、および31日目(気道過敏反応性(AHR)テスト2時間前)に静脈注射によって賦形剤を投与した。
デキサメタゾン陽性対照群:0.5%CMC−Na内に1.0mg/kgのデキサメタゾンを27、28、29、30(各投薬日のOVA処置の2時間前)および31日目に一日に一度経口投与した。
LT1017:非特異的抗体対照群は27および29日目(OVA処置2時間前)、および31日目(気道過敏反応性(AHR)テスト2時間前)に静脈注射で投与した。
9B12抗体:抗体は、27および29日目(OVA処置2時間前)、および31日目(気道過敏反応性(AHR)テスト2時間前)に静脈注射で投与した。
10G4抗体:抗体は27および29日目(OVA処置2時間前)、および31日目(気道過敏反応性(AHR)テスト2時間前)に静脈注射で投与した。
気道過敏反応性:31日目に(最後の処置24時間後に)、基線に比較して「エンハンスドポーズ」または“Penh”で測定された気道過敏反応性は、全体体重プレチスモグラフ(whole body plethysmograph、Buxco)により全体実験動物で確認され、実験動物を噴霧される一般PBS(PH=7.2)で処置した後、1.5625、3.125、6.25、12.5、25、および50mg/mLのメタコリンを連続的に処置した。結果は、図18に示される。予想したように、喘息が誘導された前記実験ネズミは、最も高いPenhを示し、OVA処置が行われない実験ネズミは、最も低いPenhを示した。抗−cysLT 10G4抗体は、ほぼ陽性対照群(デキサメタゾン)の水準にPenhを低減した。9B12抗体および非特異的対照群抗体は、中間数値にPenhを低減した。データは、mean±SEMで示す。
気管支肺胞洗浄液および白血球計数:32日目に、すべての動物は、1%ペントバルビタールナトリウム(pentobarbital sodium、60 mg/kg)の腹腔内注射によって麻酔された。血液試料は、眼窩後方(retro−orbital)出血によって採血され、血漿は、EDTAを使用して分離された。肺は、0.5mLのPBS(PH=7.2)(1% FBS含有)で気管カニューレによってまず洗浄された。その後、毎度0.5mLのPBS(PH=7.2)(1% FBS含有)を使用して前記過程を2回繰り返した。すべての洗浄溶液を一緒に混ぜた。細胞数を計数するために、細胞を1.5mL PBS(PH=7.2)(1% FBS含有)に再浮遊した。BAL液体内の総細胞数は、血球計算機(hemocytometer)を使用して計数した。
BAL液体を4℃、300gで5分間遠心分離し、細胞を0.3mLのPBS(PH=7.2)(1% FBS含有)で再浮遊した。区別された細胞計数(リンパ球、好酸球、大食細胞、および好中球性白血球)は、ライト−ギムザ染色法(Wright−Giemsa)で染色した後に行われた。全体細胞の計数結果は、図19に示される。データは、平均±SEMである(##p<0.01:対照群に対して比較される(対応のないt−test)、**p<0.01:実験動物群に対して比較される(一元変量分析/ダネット))。区別された細胞計数結果は、下記の表21に示す。
データは、平均±SEMである(#p<0.05、##p<0.01:対照群(対応のないt−test)に対して比較される、**p<0.01:実験動物群(一元変量分析/ダネット)に対して比較される).
予想されたように、喘息誘導された実験ネズミ(「動物モデル」)は、BAL液体内に最も多い数の(すべての種類の細胞の)細胞を有し、喘息が誘導されなかった実験ネズミ(「対照群」)は、最も低い細胞数を有する。抗−cysLT 10G4抗体は、陽性対照群であるデキサメタゾンと比較して細胞数を低減したが、抗−cysLT 9B12抗体は、さらに低いか、類似した効果を有する。興味深いことに、非特異的抗体対照群であるLT1017も、BAL液体内で細胞数を非常に減少させた。
実施例17:抗−cysLT単一クローン抗体の交差反応性
表22で、ネズミ科の単一クローン抗体である2G9および10G4および人間化単クローン抗体であるLT5014(10G4の人間化バージョン)は、cysLTであるLTC4、LTD4、LTE4、LTF4、およびLTB4、改質されたロイコトリエン、cysLT受容体拮抗物質、および追加的な化合物と結合するこれらの能力を確認するために、競争ELISAによってテストされた。
表22で、ネズミ科の単一クローン抗体である2G9および10G4および人間化単クローン抗体であるLT5014(10G4の人間化バージョン)は、cysLTであるLTC4、LTD4、LTE4、LTF4、およびLTB4、改質されたロイコトリエン、cysLT受容体拮抗物質、および追加的な化合物と結合するこれらの能力を確認するために、競争ELISAによってテストされた。
コンジュゲート:LTE4(Cayman #20410)およびLTC4(Cayman #20210)各々の150 nanomoleをアルゴン(argon)の下で乾燥した。各々の脂質は、製造社の説明によりPierce EZ−link NHS−LC−LC−Biotinキット(Thermo #21343)を使用して20:1のビオチン:脂質の比率でビオチニル化した。
ELISA:96−ウェルELISA培養皿(Greiner #655061)は、pH 9.5の0.1M炭酸塩バッファー内の0.5μg/mLの捕獲抗体#109−005−09(5014:ヤギ抗−人間IgG、Fcγ特異的である、Jackson ImmunoResearch(ペンシルバニア州、ウェストグローブ所在);10G4および2G9(ヤギ抗−マウスIgG(Fcγ特異的である、Jackson #115−005−071)を100μL/ウェルの容量でコーティングした。培養皿は、感熱接着剤で密封され、4℃で一晩培養された。培養皿は、0.05% Tween−20(Sigma # P1379)を含む1XPBS(OmniPur、Thomas Scientific、ニュージャージー州、スウェデスボロ所在、製品番号:650)4で3回洗浄された後、室温で1時間1% BSA(Calbiochem、カリフォルニア州、サンディエゴ所在、# 126575)および0.1% Tween−20を含む1XPBSの150μL/ウェルでブロックされた。前記培養皿を洗浄し、1XPBS(LT5014:100ng/mL、Lot LP121468;10G4:50ng/mL、Lot 121429;2G9:50ng/mL、Lot LP121453)内の抗−cysLT抗体を100μL/ウェル容量で前記培養皿に添加し、室温で1時間培養した。その後、前記培養皿を1XPBS+0.05% Tween−20で3回洗浄した。L−システイン(Pierce #44889)およびL−システイン−L−グリシン(Sigma #C0166−25MG)を除いたすべてのレファレンスおよび試験競争剤は、Cayman Chemicalsで購入した。12地点で、1uM LTC4または10uM LTE4から始まるレファレンス競争剤の3倍希釈物は、10G4/LT5014または2G9各々のために使用した。12地点で、30uMから始まる試験競争剤の3倍希釈物は、三つのすべての抗体、すなわち、2G9、10G4およびLT5014の交差反応性を評価するために使用した。すべての競争反応混合物は、0.5x PBS+1mg/mL BSA内に0.5nMコンジュゲート(LTC4−LC−LC−biotin、10G4およびLT5014;LTE4−LC−LC−ビオチン、2G9)を含む。100μL/ウェルの希釈された競争剤/コンジュゲート溶液を培養皿に適用し、室温で21時間培養した。前記培養皿を洗浄し、ブロッキング溶液内の第2抗体(ペルオキシダーゼ−接合されたストレプトアビジン、Jackson #016−030−084)の1:60K希釈物を100μL/ウェルの容量で前記培養皿に添加し、15分間培養した。前記培養皿を洗浄し、100μL/ウェル冷たいTMB(Invitrogen #T0440−1L)を前記培養皿に添加し、約5分間培養することによって現像した。1.0M H2SO4を100μL/ウェルの容量で添加することによって、反応を中断した。培養皿は、Perkin Elmer(Akron OH)培養皿読み取り機(#1420)上で450nmで読み取られた。結果は、レファレンス競争剤(LTC4、LTD4またはLTE4)のIC50に対するテスト競争剤のIC50の比率として計算した。
表22は、LTC4、LTC4およびLTE4に対する結合の百分率として表現される、抗−cysLT抗体であるLT5014、10G4および2G9、多数のロイコトリエン、および他の潜在的なリガンドの交差活性を要約する。
表22は、LTC4、LTC4およびLTE4に対する結合の百分率として表現される、抗−cysLT抗体であるLT5014、10G4および2G9、多数のロイコトリエン、および他の潜在的なリガンドの交差活性を要約する。
前記人間化抗体であるLT5014は、ネズミ科母抗体であるp10G4と類似の交差反応性プロフィールを有することを確認できる。反対に、ネズミ科の抗体である2G9は、LTC4、LTD4、およびLTE4に対して異なる結合プロフィールを有し、以前の実施例で記載されたように、LTC4またはLTD4と関連して、LTE4に対し強い優先的な結合を示す。驚くべきことに、2G9は、LTE4に対して結合することより、高い親和力でN−アセチルロイコトリエンE4およびロイコトリエンF4と結合することが確認された。N−アセチルLTE4は、胆汁で発見されたLTE4の代謝産物であり、LTC4より生物学的に活性が低いものと考えられる。前記三つの抗体は、いずれも、cysLT受容体拮抗物質(モンテルカスト、プランルカスト、BaycysLT2、HAMI3379、Bay−u9773、ザフィルルカスト、MK571)、ロイコトリエンB、HETEs、プロスタグランジンE、L−システインまたはL−グルタチオンに対して非常に低いか、探知不可能な結合を示した。
したがって、前記単一クローン抗体である10G4およびその人間化バージョンであるLT5014は、LTC4、LTD4、およびLTE4と結合するcysLT抑制剤であり、LTE4と優先的に結合する(LT5014に対する相対的な親和力100:4.1:0.6%)。また、相当な範囲でLTF4と結合し、N−アセチルLTE4とも結合する。反対に、2G9抗体は、cysLT(LTC4:LTD4:LTE4 =100:5.4:3.8)のうちLTE4と優先的に結合するが、驚くべきことに、一層高い親和力でLTF4およびN−アセチルLTE4に結合するものと確認された。
本発明で説明され主張されるすべての組成物および方法は、本発明の観点で過度な実験なしに製造されるか、実施され得る。本発明の組成物および方法が好ましい具体例の形態として説明されたが、前記組成物および方法が修正され得ることは、当業者には自明である。当分野の技術者に明確なこのようなすべての置換および修正は、添付の請求範囲に定義されるように、本発明の原理および概念に含まれるものと見なされる。
本明細書で言及されるすべての特許文書、特許出願文書、および公開物は、本発明の属する分野における一般技術者の観点を示す。すべての特許文書、特許出願文書、および公開物およびこれら文献に対する優先権またはその他利益を主張する文献は、これら各文献が具体的に個別的に参照として含まれるもので表示されたように、同じ程度で参照として本発明に含まれる。
本明細書に例として適切に説明される本発明は、本明細書に具体的に記載されない要素の不在下で実施され得る。したがって、例えば、本明細書の各々の例で、用語“含む”、“必須的によりなる”、および“よりなる”のうちいずれか一つの用語は、他の二つの用語のうちいずれか一つで置換され得る。使用される用語および表現は、説明のためのものであって、これらへの制限のために使用されるものではなく、前記用語および表現は、図示され説明された特徴またはこれらの一部のすべての等価物を排除することを意図したものではなく、主張される本発明の範囲内で多様な変形が可能になるものと認識される。したがって、本発明が好ましい具体例または選択的な特徴によって具体的に説明されるが、当分野の技術者によって本明細書に記載された概念の変形および多様化が行われることができ、このような変形および多様化は、添付の請求範囲で定義されるように本発明の範囲に含まれるものと見なされる。
Claims (20)
- 異常な数値の一つ以上のシステイニルロイコトリエン(cysteinyl leukotriene、cysLT)種と関連された疾病または疾患がある被験者に一つ以上のcysLT種と結合する抗体またはその断片を効果的な容量で投与して前記疾病または疾患を治療することを特徴とする、異常な数値の一つ以上のcysLT種と関連された疾病または疾患の治療方法。
- 前記疾病または疾患は炎症性疾病または疾患、アレルギー、心血管疾病または疾患、呼吸器系疾病または疾患、中枢神経系疾病または疾患、癌、皮膚疾患、胃腸疾患、およびリューマチ性関節炎からなる群から選択されることを特徴とする、請求項1に記載の異常な数値の一つ以上のcysLT種と関連された疾病または疾患の治療方法。
- 前記皮膚疾患は、蕁麻疹またはアトピー性皮膚炎であるか、前記胃腸疾患は大腸炎であるか、前記呼吸器系疾病または疾患は喘息、アスピリン過敏性呼吸器系疾病(aspirin−exacerbated respiratory disease、AERD)、気道過敏症、またはアレルギー性鼻炎であるか、前記心血管疾病は異常な血管透過性であるか、前記中枢神経系疾病または疾患は脳卒中または外傷性脳損傷であることを特徴とする、請求項2に記載の異常な数値の一つ以上のcysLT種と関連された疾病または疾患の治療方法。
- 前記抗体または前記抗体の断片は、多クローン抗体、単クローン抗体、および前記多クローン抗体および単クローン抗体の中のいずれか一つのcysLT結合断片からなる群から選択されることを特徴とする、請求項1に記載の異常な数値の一つ以上のcysLT種と関連された疾病または疾患の治療方法。
- 前記抗体または前記抗体の断片は、LTC4、LTD4、またはLTE4の中の一つ以上と結合することを特徴とする、請求項1に記載の異常な数値の一つ以上のcysLT種と関連された疾病または疾患の治療方法。
- 前記抗体またはその断片は、感知可能にLTC4、LTD4、およびLTE4と結合することを特徴とする、請求項5に記載の異常な数値の一つ以上のcysLT種と関連された疾病または疾患の治療方法。
- 前記抗体またはその断片は、優先的にLTC4またはLTE4と結合することを特徴とする、請求項5に記載の異常な数値の一つ以上のcysLT種と関連された疾病または疾患の治療方法。
- 一つ以上のcysLT種と結合する抗体または前記抗体の断片を効果的な容量で被験者に投与して炎症を改善させることを特徴とする、被験者の炎症を改善する方法。
- 前記炎症は患者の気道、皮膚、胃腸管、神経系、関節、または血管に影響を及ぼすことを特徴とする、請求項8に記載の被験者の炎症を改善する方法。
- 生理的条件下で一つ以上のシステイニルロイコトリエン(cysLT)種と結合し、少なくとも一つの免疫グロブリン(immunoglobulin)重鎖可変ドメイン(heavy chain variable domain)および少なくとも一つの免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン(light chain variable domain)を含む分離された抗体または抗原と結合する前記抗体の断片であって、
前記免疫グロブリン重鎖可変ドメインそれぞれは第1、第2、および第3重鎖相補性決定領域(complementarity determining regions、CDR)を含み、前記第1重鎖CDRは序列番号8、14、15、16、22、23、24、31、および74からなる群から選択されるアミノ酸序列を含み、前記アミノ酸序列は序列番号24または31に対して少なくとも約76%の同一性を有することを特徴とし、前記第2重鎖CDRは序列番号9、17、25、および32からなる群から選択されるアミノ酸序列を含み、前記アミノ酸序列は序列番号25または32に対して少なくとも約76%の同一性を有することを特徴とし、そして前記第3重鎖CDRは序列番号10、18、26、および33からなる群から選択されるアミノ酸序列を含み、前記アミノ酸序列は序列番号26または33に対して少なくとも約76%の同一性を有することを特徴とし、そして
前記免疫グロブリン軽鎖可変ドメインそれぞれは第1、第2、および第3軽鎖CDRを含み、前記第1軽鎖CDRは序列番号11、19、27、30、34、および75からなる群から選択されるアミノ酸序列を含み、前記アミノ酸序列は序列番号27、30、または34に対して少なくとも約76%の同一性を有することを特徴とし、前記第2軽鎖CDRは序列番号12、20、28、および35からなる群から選択されるアミノ酸序列を含み、前記アミノ酸序列は序列番号28または35に対して少なくとも約76%の同一性を有することを特徴とし、そして前記第3軽鎖CDRは序列番号13、21、29、36、および76からなる群から選択されるアミノ酸序列を含み、前記アミノ酸序列は序列番号29または36に対して少なくとも約76%の同一性を有することを特徴とする。 - 前記免疫グロブリン重鎖可変ドメインそれぞれは序列番号43、45、47、50、54、58、59、61、62、63、64、および65からなる群から選択されるアミノ酸序列を含み、前記免疫グロブリン軽鎖可変ドメインそれぞれは序列番号44、46、48、49、51、66、68、69、70、71、72、および73からなる群から選択されるアミノ酸序列を含むことを特徴とする、請求項10に記載の前記分離された抗体または前記抗原と結合する抗体の断片。
- 前記分離された抗体または前記抗原と結合する抗体の断片は、単クローン抗体、人間化(humanized)単クローン抗体、または前記抗体の中のいずれか一つの抗原と結合する前記抗体の断片であることを特徴とする、請求項10に記載の前記分離された抗体または前記抗原と結合する抗体の断片。
- 薬学的に許容可能な運搬体内に存在することを特徴とする、請求項10に記載の前記分離された抗体または前記抗原と結合する抗体の断片。
- 請求項10に記載された抗−cysLT抗体またはその断片を含むことを特徴とする、ELISAキット。
- 青色タンパク質運搬体に共有結合されたロイコトリエンE4(leukotriene 4、LTE4)を含む、組成物。
- 請求項15に記載された前記組成物を含む免疫原で免疫適格(immune−competent)哺乳動物を免疫化することによって生成された、抗体。
- 第1、第2、および第3重鎖相補性決定領域(CDR)を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメインを暗号化する分離された核酸であって、前記免疫グロブリン重鎖可変ドメインそれぞれは第1、第2、および第3重鎖相補性決定領域(complementarity determining regions、CDR)を含み、前記第1重鎖CDRは序列番号8、14、15、16、22、23、24、31、および74からなる群から選択されるアミノ酸序列を含み、前記アミノ酸序列は序列番号24または31に対して少なくとも約76%の同一性を有することを特徴とし、前記第2重鎖CDRは序列番号9、17、25、および32からなる群から選択されるアミノ酸序列を含み、前記アミノ酸序列は序列番号25または32に対して少なくとも約76%の同一性を有することを特徴とし、そして前記第3重鎖CDRは序列番号10、18、26、および33からなる群から選択されるアミノ酸序列を含み、前記アミノ酸序列は序列番号26または33に対して少なくとも約76%の同一性を有することを特徴とする。
- 第1、第2、および第3軽鎖CDRを含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを暗号化する分離された核酸であって、前記免疫グロブリン軽鎖可変ドメインそれぞれは第1、第2、および第3軽鎖CDRを含み、前記第1軽鎖CDRは序列番号11、19、27、30、34、および75からなる群から選択されるアミノ酸序列を含み、前記アミノ酸序列は序列番号27、30、または34に対して少なくとも約76%の同一性を有することを特徴とし、前記第2軽鎖CDRは序列番号12、20、28、および35からなる群から選択されるアミノ酸序列を含み、前記アミノ酸序列は序列番号28または35に対して少なくとも約76%の同一性を有することを特徴とし、そして前記第3軽鎖CDRは序列番号13、21、29、36、および76からなる群から選択されるアミノ酸序列を含み、前記アミノ酸序列は序列番号29または36に対して少なくとも約76%の同一性を有することを特徴とする。
- 請求項17および請求項18の一つ以上による前記分離された核酸を含む、ベクターまたは宿主細胞。
- 抗体または抗原と結合する前記抗体の断片の合成がなされる条件下で、請求項19項による前記宿主細胞を培養して前記抗体または前記抗原と結合する抗体の断片を製造することを特徴とし、前記製造された抗体または前記抗原と結合する抗体の断片を分離する段階を選択的にさらに含むことを特徴とする前記抗体または前記抗原と結合する抗体の断片の製造方法。
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