CN112969503A

CN112969503A - 对人类和食蟹猕猴apoc3具有特异性的抗体和其使用方法

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Publication number: CN112969503A
Application number: CN201980072472.9A
Authority: CN
Inventors: P·达席尔瓦-亚尔迪内; H·德哈德
Original assignee: Staten Biotechnology BV
Current assignee: Staten Biotechnology BV
Priority date: 2018-10-03
Filing date: 2019-10-03
Publication date: 2021-06-15
Also published as: AU2019352017A1; CA3113575A1; WO2020070678A3; KR20210070300A; EP3860713A2; JP2022504287A; US20210347865A1; MA53811A; WO2020070678A2

Abstract

本公开提供了特异性结合至ApoC3(例如，人类或食蟹猕猴ApoC3)并拮抗ApoC3功能的抗体。还提供了包含这些抗体的医药组合物、编码这些抗体的核酸、用于制备这些抗体的表达载体和宿主细胞以及使用这些抗体治疗受试者的方法。

Description

对人类和食蟹猕猴APOC3具有特异性的抗体和其使用方法

相关申请案

本申请案主张2018年10月3日申请的美国临时申请案第62/740,798号的权益，所述美国临时申请案以全文引用的方式并入本文中。

技术领域

本公开涉及特异性结合至人类和食蟹猕猴ApoC3的抗体和其使用方法。

背景技术

血液中三酸甘油酯水平升高(高三酸甘油酯血症)是动脉粥样硬化的病因，并增加了心血管事件(诸如心血管死亡、心绞痛、心肌梗塞和中风)的风险。

ApoC3是以极高浓度(超过10μM)在血液中循环的蛋白质，其主要结合至富含三酸甘油酯的脂蛋白(TRL)、TRL残余物和高密度脂蛋白。ApoC3表达为血液三酸甘油酯水平的重要调节剂。例如，人体内的ApoC3水平已经显示与血液三酸甘油酯水平正相关，其中升高的ApoC3水平与高三酸甘油酯血症相关联。此外，已显示ApoC3抑制脂蛋白脂肪酶(一种水解TRL中的三酸甘油酯的酶)的活性，并且还抑制肝脏对TRL残余物的吸收，这两者都会引起血液三酸甘油酯水平的升高。

已经批准若干疗法用于治疗高三酸甘油酯血症，诸如贝特类药(fibrate)、烟酸和Ω-3脂肪酸。然而，这些疗法在降低血浆三酸甘油酯方面仅是适度有效的。因此，在本领域中需要改良的降低血浆三酸甘油酯的疗法。

发明内容

本公开提供了特异性结合至ApoC3(例如，人类或食蟹猕猴ApoC3)并抑制ApoC3功能的抗体。还提供了包含这些抗体的医药组合物、对这些抗体进行编码的核酸、用于制备这些抗体的表达载体和宿主细胞以及使用这些抗体治疗受试者的方法。本文所公开的抗体能够结合至人类和食蟹猕猴ApoC3，并且尤其有利的是其可以减弱ApoC3抑制肝细胞的TRL吸收的能力，并且可以在向人类或食蟹猕猴受试者投予时引起ApoC3的血清水平快速和持续降低。因此，所公开的抗ApoC3抗体适用于治疗和预防高三酸甘油酯血症和相关疾病(例如心血管疾病和胰脏炎)。

因此，在一个方面，本公开提供特异性结合至人类和食蟹猕猴ApoC3的分离抗体，其中所述抗体特异性结合至氨基酸序列FSEFWDLDP(SEQ ID NO:3)内的抗原决定基。在某些实施例中，抗体特异性结合至氨基酸序列LSGFWDLNP(SEQ ID NO:4)内的抗原决定基。在某些实施例中，抗体在以下位置处特异性结合至氨基酸中的至少一者：SEQ ID NO:3的位置2、5或6。在某些实施例中，抗体在以下位置处特异性结合至氨基酸：(a)SEQ ID NO:3的位置2和5；(b)SEQ ID NO:3的位置2和6；(c)SEQ ID NO:3的位置5和6；或(d)SEQ ID NO:3的位置2、5和6。

在另一方面，本公开提供了一种特异性结合至人类和食蟹猕猴ApoC3的分离抗体，所述抗体包括包含互补决定区CDRH1、CDRH2和CDRH3的重链可变区以及包含互补决定区CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区，其中：

(a)CDRH1包含氨基酸序列TYSMR(SEQ ID NO:5)；

(b)CDRH2包含氨基酸序列SISTDGGGTAYRDSVKG(SEQ ID NO:6)；

(c)CDRH3包含氨基酸序列AGYSD(SEQ ID NO:7)；

(d)CDRL1包含氨基酸序列X1AX2QX3LX4X5X6X7GX8TYLY(SEQ ID NO:22)，其中

X1为K或T；

X2为G、S或T；

X3为N或S；

X4为V或R；

X5为H或Y；

X6为I、P或S；

X7为D或N；以及

X8为K或R；

(e)CDRL2包含氨基酸序列X1VSX2RX3S(SEQ ID NO:23)，其中

X1为D或G；

X2为N或T；以及

X3为D、G或P；以及

(f)CDRL3包含氨基酸序列AQX1TYX2X3X4T(SEQ ID NO:24)，其中

X1为D或G；

X2为S、W或Y；

X3为P或T；

X4为K或L。

在某些实施例中：(a)CDRL1包含选自由SEQ ID NO:8、9、10、11、12和13组成的群组的氨基酸序列；(b)CDRL2包含选自由SEQ ID NO:14、15、16、17和18组成的群组的氨基酸序列；和/或(c)CDRL3包含选自由SEQ ID NO:19、20和21组成的群组的氨基酸序列。

在另一方面，本公开提供了一种特异性结合至人类和食蟹猕猴ApoC3的分离抗体，所述抗体包括包含互补决定区CDRH1、CDRH2和CDRH3的重链可变区以及包含互补决定区CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区，其中CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:5、6、7、8、14和19；5、6、7、9、15和19；5、6、7、10、14和19；5、6、7、11、16和20；5、6、7、12、17和21；5、6、7、13、15和19；或5、6、7、10、18和20中所阐述的氨基酸序列。在某些实施例中，抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含选自由SEQ ID NO:27至33组成的群组的氨基酸序列。

在另一方面，本公开提供了一种特异性结合至ApoC3的分离抗体，所述抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含选自由SEQ ID NO:27至33组成的群组的氨基酸序列。

在另一方面，本公开提供了一种特异性结合至ApoC3的分离抗体，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区和所述轻链可变区分别包含SEQ ID NO:25和27、25和28、25和29、25和30、25和31、25和32或25和33中所阐述的氨基酸序列。

在某些实施例中，抗体包含人类λ或人类κ轻链恒定区。在某些实施例中，抗体包含轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:50、51、52、53、54、55或56中所阐述的氨基酸序列。

在某些实施例中，抗体包含重链恒定区，任选地人类IgG1、IgG2或IgG4恒定区。在某些实施例中，恒定区是野生型人类免疫球蛋白重链恒定区的变体，并且其中相对于对应的野生型人类免疫球蛋白重链恒定区在pH 6下对人类新生儿Fc受体(FcRn)的亲和力，所述可变人类免疫球蛋白重链恒定区在pH 6下对人类FcRn具有增加的亲和力。

在某些实施例中，重链恒定区分别在EU位置433、434和436处包含氨基酸K、F和Y。在某些实施例中，重链恒定区分别在EU位置252、254和256处包含氨基酸Y、T和E。在某些实施例中，重链恒定区分别在EU位置428和434处包含氨基酸L和S。在某些实施例中，重链恒定区是包含在EU位置228处的氨基酸P的IgG4恒定区。在某些实施例中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49中所阐述的氨基酸序列。

在另一方面，本公开提供了一种特异性结合至ApoC3的分离抗体，所述抗体包含重链和轻链，其中所述重链和所述轻链的氨基酸序列分别包含或分别由以下中所阐述的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:34和50、35和50、36和50、37和50、38和50、39和50、40和50、41和50、42和50、43和50、44和50、45和50、46和50、47和50、48和50或49和50。

在某些实施例中，抗体能够结合至脂质结合型ApoC3。在某些实施例中，抗体减弱了ApoC3抑制极低密度脂蛋白(VLDL)的肝细胞吸收的能力。在某些实施例中，抗体能够增加受试者血液中ApoC3的清除率。在某些实施例中，抗体能够降低受试者血液中ApoC3的水平。在某些实施例中，抗体能够抑制受试者的餐后脂血症。

在另一方面，本公开提供了一种医药组合物，其包含如本文所公开的抗体和医药学上可接受的载剂。

在另一方面，本公开提供了一种聚核苷酸，其对如本文所公开的抗体的重链可变区和/或轻链可变区进行编码。在另一方面，本公开提供了一种表达载体，其包含本文所公开的聚核苷酸。在另一方面，本公开提供了一种宿主细胞，其包含如本文所公开的表达载体。

在另一方面，本公开提供了一种用于产生结合至ApoC3的抗体的方法，所述方法包含在允许表达所述抗体的条件下培养如本文所公开的宿主细胞。

在另一方面，本公开提供了一种用于抑制受试者的血液中ApoC3的活性的方法，所述方法包含向所述受试者投予有效量的本文所公开的抗体或医药组合物。

在另一方面，本公开提供了一种用于降低受试者血液中的三酸甘油酯水平的方法，所述方法包含向所述受试者投予有效量的如本文所公开的抗体或医药组合物。在另一方面，本公开提供了一种用于抑制受试者的餐后脂血症的方法，所述方法包含向所述受试者投予有效量的本文所公开的抗体或医药组合物。在另一方面，本公开提供了一种用于治疗受试者的高三酸甘油酯血症的方法，所述方法包含向所述受试者投予有效量的如本文所公开的抗体或医药组合物。在另一方面，本公开提供了一种用于治疗受试者的乳糜微粒血症的方法，所述方法包含向所述受试者投予有效量的如本文所公开的抗体或医药组合物。

在另一方面，本公开提供了一种用于降低患有高三酸甘油酯血症的受试者的心血管疾病风险的方法，所述方法包含向所述受试者投予有效量的如本文所公开的抗体或医药组合物。在某些实施例中，心血管疾病是心肌梗塞。在某些实施例中，心血管疾病是心绞痛。在某些实施例中，心血管疾病是中风。在某些实施例中，心血管疾病是动脉粥样硬化。

在涉及治疗方法的前述方面的某些实施例中，所述抗体降低所述受试者血液中乳糜微粒或乳糜微粒残余物的水平。在某些实施例中，受试者正在接受额外的降脂剂。在某些实施例中，额外的降脂剂是HMG-CoA还原酶抑制剂。在某些实施例中，HMG-CoA还原酶抑制剂是阿托伐他汀(atorvastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、匹伐他汀(pitavastatin)、普伐他汀(pravastatin)、瑞舒伐他汀(rosuvastatin)或辛伐他汀(simvastatin)。在某些实施例中，额外的降脂剂是PCSK9抑制剂。在某些实施例中，PCSK9抑制剂是阿利库单抗(alirocumab)、依伏库单抗(evolocumab)或博可珠单抗(bococizumab)。在某些实施例中，额外的降脂剂是依泽替米贝(ezetimibe)。在某些实施例中，额外的降脂剂是依泽替米贝和HMG-CoA还原酶抑制剂的组合。在某些实施例中，额外的降脂剂是依泽替米贝、HMG-CoA还原酶抑制剂和PCSK9抑制剂的组合。

附图说明

图1A和1B是展示用Hyhel5对照抗体、预生殖系、pH依赖性5E5VH5_VL8抗体和29A06测试抗体处理的AAV8-huApoC3小鼠模型中的人类ApoC3水平的图。图1A展示抗体投予后人类ApoC3水平的变化百分比。图1B展示小鼠血浆中的人类ApoC3水平(μM)。

图2是展示用Hyhel5对照抗体、预生殖系、pH依赖性5E5VH5_VL8抗体和29A06测试抗体处理的AAV8-huApoC3小鼠模型中的小鼠ApoC3水平的变化百分比的图。

图3A和3B是展示用Hyhel5对照抗体、预生殖系、pH依赖性5E5VH5_VL8抗体和29A06测试抗体处理的AAV8-huApoC3小鼠模型中的血浆三酸甘油酯水平的图。图3A展示抗体投予后三酸甘油酯水平的变化百分比。图3B展示小鼠血浆中的三酸甘油酯水平(mg/dL)。

图4是展示用Hyhel5对照抗体、预生殖系、pH依赖性5E5VH5_VL8抗体和29A06测试抗体处理的AAV8-huApoC3小鼠模型中的IgG水平(μg/mL)的变化百分比的图。

图5A和5B是展示用三个剂量的29A06-NHance抗体处理的食蟹猕猴中的ApoC3水平的图。图5A展示抗体投予后食蟹猕猴ApoC3水平的变化百分比。图5B展示血浆中的食蟹猕猴ApoC3水平(μM)。

图6是展示用三个剂量的29A06-NHance抗体处理的动物中的食蟹猕猴ApoB水平(mg/dL)的图。

图7A和7B是展示用三个剂量的29A06-NHance抗体处理的食蟹猕猴中的血清三酸甘油酯水平的图。图7A展示抗体投予后三酸甘油酯水平的变化百分比。图7B展示食蟹猕猴血清中的三酸甘油酯水平(mg/dL)。

图8是展示用三个剂量的29A06-NHance抗体处理的食蟹猕猴中的IgG水平(μg/mL)的图。

具体实施方式

本公开提供了特异性结合至人类和食蟹猕猴ApoC3并抑制ApoC3功能的抗体。还提供了包含这些抗体的医药组合物、对这些抗体进行编码的核酸、用于制备这些抗体的表达载体和宿主细胞以及使用这些抗体治疗受试者的方法。本文所公开的抗体能够结合至人类和食蟹猕猴ApoC3，并且尤其有利的是其可以减弱ApoC3抑制肝细胞的TRL吸收的能力，并且可以在向人类或食蟹猕猴受试者投予时引起ApoC3的血清水平快速和持续降低。因此，所公开的抗ApoC3抗体适用于治疗和预防高三酸甘油酯血症和相关疾病(例如心血管疾病和胰脏炎)。

1.定义

如本文所用，术语“ApoC3”是指载脂蛋白C3蛋白质。在某些实施例中，ApoC3是人类ApoC3。示例性人类ApoC3氨基酸序列阐述于RefSeq登录号NP_000031.1中。NP_000031.1的成熟氨基酸序列如下：SEAEDASLLSFMQGYMKHATKTAKDALSSVQESQVAQQAR

GWVTDGFSSLKDYWSTVKDKFSEFWDLDPEVRPTSAVAA(SEQ ID NO:1)。在某些实施例中，ApoC3是食蟹猕猴ApoC3。示例性食蟹猕猴ApoC3氨基酸序列阐述于RefSeq登录号XP_005579787.1中。XP_005579787.1的成熟氨基酸序列如下：MQPRVLLVAALLSLLASARASEAEDTSLLGFMQGYMQHATKTAKDALTSVQESQVAQQARGWVTDGFSSLKDYWSTVKDKLSGFWDLNPEAKPTLAEAA(SEQID NO:2)。

如本文所用，术语“抗体(antibody/antibodies)”包括全长抗体、全长抗体的抗原结合片段以及包含抗体CDR、VH区或VL区的分子。抗体的实例包括单克隆抗体、重组产生的抗体、单特异性抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、人类抗体、人类化抗体、嵌合抗体、免疫球蛋白、合成抗体、包含两个重链分子和两个轻链分子的四聚体抗体、抗体轻链单体、抗体重链单体、抗体轻链二聚体、抗体重链二聚体、抗体轻链-抗体重链对、胞内抗体、异种缀合抗体、单结构域抗体、单价抗体、单链抗体或单链Fv(scFv)、scFv-Fc、驼类抗体(例如，羊驼抗体)、骆驼化(camelized)抗体、亲合体(affybody)、Fab片段、F(ab')₂片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、抗独特型(抗Id)抗体(包括例如抗-抗Id抗体)以及上述任何一种的抗原结合片段。在某些实施例中，本文所公开的抗体是指多克隆抗体群。抗体可以属于免疫球蛋白分子的任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY)、任何类别(例如，IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁或IgA₂)或任何亚类(例如，IgG_2a或IgG_2b)。在某些实施例中，本文所公开的抗体是IgG抗体、或其类别(例如，人类IgG₁或IgG₄)或其亚类。在具体实施例中，抗体是人类化单克隆抗体。

如本文所用，术语“分离抗体”是指已经从其天然环境的至少一种组分中鉴定和分离和/或回收的抗体。术语“分离抗体”包括原位在重组宿主细胞内的抗体。

如本文所用，术语“CDR”或“互补决定区”是指在重链和轻链多肽的可变区内均存在的非连续抗原结合位点。这些特定区域已由以下描述：卡巴特(Kabat)等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)252，6609-6616(1977)；和卡巴特等人，免疫学相关的蛋白质的序列(Sequences of protein of immunological interest.)(1991)；科西亚(Chothia)等人，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)196:901-917(1987)；以及麦卡勒姆(MacCallum)等人，分子生物学杂志262:732-745(1996)，这些文献全部以全文引用的方式并入本文中，其中定义包括相互比较时氨基酸残基的重叠或亚群。在某些实施例中，术语“CDR”是通过以下文献所定义的CDR：卡巴特等人，生物化学杂志252，6609-6616(1977)和卡巴特等人，免疫学相关的蛋白质的序列(1991)。CDRH1、CDRH2和CDRH3表示重链CDR，并且CDRL1、CDRL2和CDRL3表示轻链CDR。

如本文所用，术语“框架(FR)氨基酸残基”是指在免疫球蛋白链的框架区中的那些氨基酸。如本文所用，术语“框架区”或“FR区”包括作为可变区的一部分但不作为CDR的一部分的氨基酸残基(例如，使用CDR的卡巴特定义)。

如本文所用，术语“可变区”和“可变结构域”可互换使用并且在本领域中是常见的。可变区通常是指抗体的一部分，一般是轻链或重链的一部分，通常是成熟重链中的约氨基末端110至120个氨基酸或110至125个氨基酸和成熟轻链中的约90至115个氨基酸，其在抗体之间在序列上有很大差异并被用于特定抗体对其特定抗原的结合和特异性中。序列的变异性集中在被称为互补决定区(CDR)的那些区域中，而可变结构域中保守性更高的区域被称为框架区(FR)。不希望受任何特定机制或理论的束缚，相信轻链和重链的CDR主要负责抗体与抗原的相互作用和特异性。在某些实施例中，可变区是人类可变区。在某些实施例中，可变区包含啮齿动物或鼠CDR和人类框架区(FR)。在特定实施例中，可变区是灵长类(例如，非人类灵长类)可变区。在某些实施例中，可变区包含啮齿动物或鼠CDR和灵长类(例如，非人类灵长类)框架区(FR)。

术语“VL”和“VL结构域”可互换使用以指代抗体的轻链可变区。

术语“VH”和“VH结构域”可互换使用以指代抗体的重链可变区。

如本文所用，术语“恒定区”和“恒定结构域”是可互换的并且是本领域中常见的。恒定区是抗体部分，例如，轻链或重链的羧基末端部分，其不直接参与抗体与抗原的结合，但是可以表达出多种效应子功能，如与Fc受体的相互作用。相对于免疫球蛋白可变结构域，免疫球蛋白分子的恒定区通常具有更保守的氨基酸序列。

如本文所用，术语“重链”当关于抗体使用时可以指代基于恒定结构域的氨基酸序列的任何不同类型，例如阿尔法(α)、德耳塔(δ)、厄普西隆(ε)、伽马(γ)以及谬(μ)，其分别产生抗体的IgA、IgD、IgE、IgG和IgM类别，包括IgG的亚类，例如IgG₁、IgG₂、IgG₃和IgG₄。

如本文所用，术语“轻链”当关于抗体使用时可以指代基于恒定结构域的氨基酸序列的任何独特类型，例如，卡帕(κ)或拉姆达(λ)。轻链氨基酸序列是本领域众所周知的。在具体实施例中，轻链是人类轻链。

如本文所用，术语“EU位置”是指根据EU编号约定的抗体恒定区的氨基酸位置，如以下文献中所述：埃德尔曼,G.M.(Edelman,G.M.)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.USA)，63，78-85(1969)和卡巴特等人，具有免疫学意义的蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，美国卫生与人类服务部，第5版，1991，所述文献中的每一个文献均通过引用整体并入本文。

如本文所用，术语“特异性结合至”是指抗体能够以小于约1×10^-6M、1×10^-7M、1×10^-8M、1×10^-9M、1×10^-10M、1×10^-11M、1×10^-12M或更少的解离常数(K_D)结合至抗原，或以超过对非特异性抗原的亲和力至少两倍的亲和力结合至抗原。

如本文所用，“抗原决定基”是指抗体可以特异性结合的抗原的局部区域。抗原决定基可以例如是多肽的连续氨基酸(线性或连续的抗原决定基)，或抗原决定基可以例如由一个或多个多肽的两个或更多个非连续区域形成(构象的、非线性、不连续或非连续的抗原决定基)。在某些实施例中，可以通过例如NMR光谱法、X射线衍射晶体学研究、ELISA测定法、氢/氘交换结合质谱法(例如，液相色谱电喷雾质谱法)、肽扫描法或诱变作图(例如，定点诱变作图)来确定抗体所结合的抗原决定基。

如本文所用，术语“治疗(treat/treating/treatment)”是指本文所公开的治疗性或预防性措施。“治疗”方法采用向患有疾病或病症或易患这种疾病或病症的受试者投予抗ApoC3抗体，其目的是为了预防所述疾病或病症或复发性疾病或病症的一种或多种症状、治愈所述一种或多种症状、延缓所述一种或多种症状、降低所述一种或多种症状的严重性、减少患所述一种或多种症状的风险或改善所述一种或多种症状，或是为了延长受试者的存活期使其超过在不使用这种治疗的情况下所预期的时间。

如本文所用，在向受试者投予疗法的背景下，术语“有效量”是指达到所期望的预防或治疗效果的疗法的量。

如本文所用，术语“受试者”包括任何人类或非人类动物(例如食蟹猕猴)。

如本文所用，术语“或”是指和/或。

如本文所用，当用于修饰数值或数值范围时，术语“约”和“大约”表明所叙述的值或范围之上5％至10％和之下5％至10％的偏差仍在该值或范围的预期范围内。

2.抗ApoC3抗体

在一个方面，本公开提供了一种特异性结合至人类和食蟹猕猴(食蟹猴(Macacafascicularis))ApoC3的分离抗体，其中所述抗体特异性结合至人类ApoC3氨基酸序列FSEFWDLDP(SEQ ID NO:3)内的抗原决定基。在某些实施例中，抗体在以下位置处特异性结合至氨基酸中的至少一者：SEQ ID NO:3的位置2、5或6。例如，在某些实施例中，抗体特异性地结合至SEQ ID NO:3的位置2和5。在某些实施例中，抗体特异性结合至SEQ ID NO:3的位置2和6。在某些实施例中，抗体特异性结合至SEQ ID NO:3的位置5和6。在某些实施例中，抗体特异性结合至SEQ ID NO:3的位置2、5和6。在某些实施例中，抗体在以下位置处特异性结合至氨基酸中的至少一者：SEQ ID NO:4的位置2、5或6。在某些实施例中，抗体特异性结合至食蟹猕猴氨基酸序列LSGFWDLNP(SEQ ID NO:4)内的抗原决定基。例如，在某些实施例中，抗体特异性地结合至SEQ ID NO:4的位置2和5。在某些实施例中，抗体特异性结合至SEQ IDNO:4的位置2和6。在某些实施例中，抗体特异性结合至SEQ ID NO:4的位置5和6。在某些实施例中，抗体特异性结合至SEQ ID NO:4的位置2、5和6。

示例性抗ApoC3抗体的氨基酸序列阐述于本文表1至5中。

表1.示例性抗ApoC3抗体的重链CDR氨基酸序列。

克隆体

CDRH1

SEQ ID NO

CDRH2

SEQ ID NO

CDRH3

SEQ ID NO

5E5

TYSMR

5

SISTDGGGTAYRDSVKG

6

AGYSD

7

表2.示例性抗ApoC3抗体的轻链CDR氨基酸序列。

表3.轻链CDR共同氨基酸序列

表4.示例性抗ApoC3抗体的VH和VL氨基酸序列。

表5.示例性抗ApoC3抗体的完整重链和轻链序列。

在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合至ApoC3(例如，人类或食蟹猕猴ApoC3)的分离抗体，所述抗体包含VH结构域，所述VH结构域包含本文表4中所阐述的VH结构域中的一个、两个或全部三个CDR。在某些实施例中，抗体包含表4中所阐述的VH结构域的CDRH1。在某些实施例中，抗体包含表4中所阐述的VH结构域的CDRH2。在某些实施例中，抗体包含表4中所阐述的VH结构域的CDRH3。

在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合至ApoC3(例如，人类或食蟹猕猴ApoC3)的分离抗体，所述抗体包含VL结构域，所述VL结构域包含本文表4中所公开的VL结构域中的一个、两个或全部三个CDR。在某些实施例中，抗体包含表4中所阐述的其中一个VL结构域的CDRL1。在某些实施例中，抗体包含表4中所阐述的其中一个VL结构域的CDRL2。在某些实施例中，抗体包含表4中所阐述的其中一个VL结构域的CDRL3。

在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合至ApoC3(例如，人类或食蟹猕猴ApoC3)的分离抗体，所述抗体包含具有互补决定区CDRH1、CDRH2和CDRH3的重链可变区以及具有互补决定区CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区，其中CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含表1至4中所阐述的抗体的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3区的氨基酸序列。

在某些实施例中，可以根据以下文献确定抗体的CDR：卡巴特等人，生物化学杂志252，6609-6616(1977)和卡巴特等人，具有免疫学意义的蛋白质序列(1991)。在某些实施例中，根据卡巴特确定抗体的轻链CDR，并且根据麦卡勒姆(同上)确定抗体的重链CDR。

在某些实施例中，可以根据科西亚编号方案确定抗体的CDR，所述科西亚编号方案是指免疫球蛋白结构环的位置(参见例如，科西亚C(Chothia C)和莱斯克AM(Lesk AM)，(1987)，分子生物学杂志196:901-917；Al-垃兹卡尼B(Al-Lazikani B)等人，(1997)分子生物学杂志273：927-948；科西亚C等人，(1992)分子生物学杂志227:799-817；特拉蒙塔诺A(Tramontano A)等人，(1990)分子生物学杂志215(1):175-82；和美国专利第7,709,226号)。通常，当使用卡巴特编号约定时，科西亚CDRH1环存在于重链氨基酸26至32、33或34处，科西亚CDRH2环存在于重链氨基酸52至56处，并且科西亚CDRH3环存在于重链氨基酸95至102处，而科西亚CDRL1环存在于轻链氨基酸24至34处，科西亚CDRL2环存在于轻链氨基酸50至56处，并且科西亚CDRL3环存在于轻链氨基酸89至97处。当使用卡巴特编号约定编号时，科西亚CDRH1环的末端在H32与H34之间变化，这取决于环的长度(这是因为卡巴特编号方案将插入放在H35A和H35B；如果35A和35B都不存在，那么环末端在32；如果仅存在35A，那么环末端在33；如果35A和35B都存在，那么环末端在34)。

在某些实施例中，可以根据以下文献中所述的IMGT编号系统确定抗体的CDR：乐弗兰克M-P(Lefranc M-P)，(1999)免疫学者(The Immunologist)7:132-136和乐弗兰克M-P等人，(1999)核酸研究(Nucleic Acids Res)27:209-212。根据IMGT编号方案，CDRH1在位置26至35处，CDRH2在位置51至57处，CDRH3在位置93至102处，CDRL1在位置27至32处，CDRL2在位置50至52处，并且CDRL3在位置89至97处。

在某些实施例中，可以根据AbM编号方案确定抗体的CDR，所述AbM编号方案是指AbM高变区，其代表卡巴特CDR和科西亚结构环之间的折衷，并且用于牛津分子AbM抗体建模软件(牛津分子科技集团(Oxford Molecular Group,Inc.))。

在某些实施例中，可以根据以下文献确定抗体的CDR：麦卡勒姆RM等人，(1996)分子生物学杂志262:732-745。还参见例如马丁A(Martin A).“抗体可变结构域的蛋白序列和结构分析(Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody VariableDomains)”，抗体工程(Antibody Engineering)，孔特曼(Kontermann)和杜贝尔(Dübel)编辑，第31章，第422-439页，施普林格(Springer-Verlag)，柏林(2001)。

在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合至ApoC3(例如，人类和食蟹猕猴ApoC3)的分离抗体，其中所述抗体包括包含表4中所阐述的VH结构域的CDRH1、CDRH2和CDRH3区氨基酸序列的重链可变区以及包含表2中所阐述的VL结构域的CDRL1、CDRL2和CDRL3区氨基酸序列的轻链可变区，其中每个CDR根据如本文所公开的CDR的卡巴特、科西亚、IMGT、麦卡勒姆或AbM定义独立地进行定义。

在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合至ApoC3(例如，人类和食蟹猕猴ApoC3)的分离抗体，所述抗体包含具有互补决定区CDRH1、CDRH2和CDRH3的重链可变区以及具有互补决定区CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区，其中：

(a)CDRH1包含氨基酸序列TYSMR(SEQ ID NO:5)；

(b)CDRH2包含氨基酸序列SISTDGGGTAYRDSVKG(SEQ ID NO:6)；

(c)CDRH3包含氨基酸序列AGYSD(SEQ ID NO:7)；

(d)CDRL1包含氨基酸序列X₁AX₂QX₃LX₄X₅X₆X₇GX₈TYLY，其中

X₁为K或T；X₂为G、S或T；X₃为N或S；X₄为V或R；X₅为H或Y；X₆为I、P或S；X₇为D或N；以及X₈为K或R(SEQ ID NO:22)；

(e)CDRL2包含氨基酸序列X₁VSX₂RX₃S，其中X₁为D或G；X₂为N或T；以及X₃为D、G或P(SEQ ID NO:23)；以及

(f)CDRL3包含氨基酸序列AQX₁TYX₂X₃X₄T，其中X₁为D或G；X₂为S、W或Y；X₃为P或T；X₄为K或L(SEQ ID NO:24)。

在某些实施例中，CDRL1包含氨基酸序列KAGQNLVHPDGKTYLY(SEQ ID NO:8)、KASQNLVHSNGKTYLY(SEQ ID NO:9)、KASQSLVYSDGKTYLY(SEQ ID NO:10)、KATQSLVHIDGKTYLY(SEQ ID NO:11)、TASQSLRHSDGRTYLY(SEQ ID NO:12)或KASQSLVHPDGKTYLY(SEQ ID NO:13)。

在某些实施例中，CDRL2包含氨基酸序列QVSNRDS(SEQ ID NO:14)、QVSNRGS(SEQID NO:15)、QVSTRDS(SEQ ID NO:16)、RVSTRDP(SEQ ID NO:17)或QVSNRPS(SEQ ID NO:18)。

在某些实施例中，CDRL3包含氨基酸序列AQGTYWPKT(SEQ ID NO:19)、AQDTYSTKT(SEQ ID NO:20)或AQGTYYPLT(SEQ ID NO:21)。

在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合至ApoC3(例如，人类或食蟹猕猴ApoC3)的分离抗体，其中所述抗体包含VH结构域，所述VH结构域包含分别在SEQ ID NO:5、6和7中所阐述的CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列。

在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合至ApoC3(例如，人类或食蟹猴动物ApoC3)的分离抗体，其中所述抗体包含VL结构域，所述VL结构域包含分别在SEQ ID NO:8、14和19；9、15和19；10、14和19；11、16和20；12、17和21；13、15和19或10、18和20中所阐述的CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列。在某些实施例中，VL结构域包含分别在SEQ ID NO:8、14和19中所阐述的CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列。在某些实施例中，VL结构域包含分别在SEQ ID NO:9、15和19中所阐述的CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列。在某些实施例中，VL结构域包含分别在SEQ ID NO:10、14和19中所阐述的CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列。在某些实施例中，VL结构域包含分别在SEQ ID NO:11、16和20中所阐述的CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列。在某些实施例中，VL结构域包含分别在SEQ ID NO:12、17和21中所阐述的CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列。在某些实施例中，VL结构域包含分别在SEQ ID NO:13、15和19中所阐述的CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列。在某些实施例中，VL结构域包含分别在SEQ ID NO:10、18和20中所阐述的CDRL1、CDRL2和CDRL3氨基酸序列。

在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合至ApoC3(例如，人类和食蟹猕猴ApoC3)的分离抗体，其中所述抗体包括包含CDRH1、CDRH2和CDRH3区的重链可变区以及包含CDRL1、CDRL2和CDRL3区的轻链可变区，其中CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3区分别包含SEQ ID NO:5、6、7、8、14和19；5、6、7、9、15和19；5、6、7、10、14和19；5、6、7、11、16和20；5、6、7、12、17和21；5、6、7、13、15和19；或5、6、7、10、18和20中所阐述的氨基酸序列。在某些实施例中，CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3区包含分别在SEQ ID NO:5、6、7、8、14和19中所阐述的氨基酸序列。在某些实施例中，CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3区包含分别在SEQ ID NO:5、6、7、9、15和19中所阐述的氨基酸序列。在某些实施例中，CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3区包含分别在SEQ ID NO:5、6、7、10、14和19中所阐述的氨基酸序列。在某些实施例中，CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3区包含分别在SEQ ID NO:5、6、7、11、16和20中所阐述的氨基酸序列。在某些实施例中，CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3区包含分别在SEQ ID NO:5、6、7、12、17和21中所阐述的氨基酸序列。在某些实施例中，CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3区包含分别在SEQ IDNO:5、6、7、13、15和19中所阐述的氨基酸序列。在某些实施例中，CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3区包含分别在SEQ ID NO:5、6、7、10、18和20中所阐述的氨基酸序列。

在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合至ApoC3(例如，人类或食蟹猕猴ApoC3)的分离抗体，所述抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:25中所阐述的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％或100％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)一致性的氨基酸序列。在某些实施例中，抗体包含重链可变区,所述重链可变区包含SEQ ID NO:25中所阐述的氨基酸序列。

在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合至ApoC3(例如，人类或食蟹猕猴ApoC3)分离抗体，所述分离抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:27、28、29、30、31、32或33中所阐述的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％或100％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)一致性的氨基酸序列。在某些实施例中，抗体包含轻链可变区,所述轻链可变区包含SEQ ID NO:27、28、29、30、31、32或33中所阐述的氨基酸序列。在某些实施例中，抗体包含轻链可变区,所述轻链可变区包含SEQ ID NO:27中所阐述的氨基酸序列。在某些实施例中，抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:28中所阐述的氨基酸序列。在某些实施例中，抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:29中所阐述的氨基酸序列。在某些实施例中，抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:30中所阐述的氨基酸序列。在某些实施例中，抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:31中所阐述的氨基酸序列。在某些实施例中，抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ IDNO:32中所阐述的氨基酸序列。在某些实施例中，抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:33中所阐述的氨基酸序列。

在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合至ApoC3(例如，人类或食蟹猕猴ApoC3)的分离抗体，所述抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:25中所阐述的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％或100％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)一致性的氨基酸序列，以及轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:27、28、29、30、31、32或33中所阐述的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％或100％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)一致性的氨基酸序列。在某些实施例中，抗体包括包含SEQ ID NO:25中所阐述的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:27、28、29、30、31、32或33中所阐述的氨基酸序列的轻链可变区。在某些实施例中，抗体包含分别包含SEQ ID NO:25和27、25和28、25和29、25和30、25和31、25和32或25和33中所阐述的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区。在某些实施例中，抗体包含分别包含SEQ ID NO:25和27中所阐述的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区。在某些实施例中，抗体包含分别包含SEQ ID NO:25和28中所阐述的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区。在某些实施例中，抗体包含分别包含SEQ ID NO:25和29中所阐述的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区。在某些实施例中，抗体包含分别包含SEQ ID NO:25和30中所阐述的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区。在某些实施例中，抗体包含分别包含SEQ ID NO:25和31中所阐述的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区。在某些实施例中，抗体包含分别包含SEQ ID NO:25和32中所阐述的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区。在某些实施例中，抗体包含分别包含SEQ ID NO:25和33中所阐述的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区。

本文所公开的分离抗体可以使用任何Ig恒定区。在某些实施例中，Ig恒定区是人类IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY免疫球蛋白(Ig)分子的恒定区，和/或免疫球蛋白分子的任何类别(例如，IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁和IgA₂)或任何亚类(例如，IgG2_a和IgG2_b)的恒定区。在某些实施例中，Ig恒定区是人类或人类化Ig恒定区。

在某些实施例中，恒定区是野生型人类Ig(例如，IgG)重链恒定区的变体，并且其中相对于酸性pH(例如，pH 5.5至pH 6)下相应野生型人类Ig重链恒定区对人类新生儿Fc受体(FcRn)的亲和力，在相同条件下所述变体人类Ig重链恒定区对人类FcRn具有增加的亲和力(例如，增加至少1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍或20倍)。在某些实施例中，相对于生理pH(例如，pH 7.4)下野生型人类Ig重链恒定区对人类新生儿Fc受体(FcRn)的亲和力，在相同条件下所述变体人类Ig重链恒定区对人类FcRn具有相似或降低的亲和力(例如，增加不超过1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍或2倍，相等或减少)。在某些实施例中，恒定区包含来自野生型Ig(例如，IgG)恒定结构域或其FcRn结合片段(例如，Fc或铰链Fc结构域片段)的一个、两个或更多个氨基酸(例如，具有一个或多个取代、插入或缺失)。在某些实施例中，具有变体恒定区的抗体在体内的半衰期相对于具有野生型恒定结构域或其FcRn结合片段的相应抗体在体内的半衰期增加。关于将增加抗体在体内的半衰期的突变的实例，参见例如国际公开第WO 02/060919号、第WO 98/23289号和第WO 97/34631号以及美国专利第5,869,046号、第6,121,022号、第6,277,375号、第6,165,745号、第8,088,376号和第8,163,881号，所述文献全部以全文引用的方式并入本文中。在某个实施例中，一个或多个不同氨基酸是在第二恒定(CH2)结构域(人类IgG₁的残基231至340)和/或第三恒定(CH3)结构域(人类IgG₁的残基341至447)，其根据EU编号系统编号。在某些实施例中，本文所公开的抗体的IgG(例如，IgG₁、IgG₂或IgG₄)的恒定区包含分别在位置252、254和256处的氨基酸酪氨酸(Y)苏氨酸(T)和谷氨酸(E)，其根据EU编号系统编号。参见美国专利第7,658,921号，所述美国专利以全文引用的方式并入本文。已经显示，与相同抗体的野生型型式相比，这一类型的IgG(称作“YTE IgG”)展现增加四倍的半衰期(参见道尔阿卡WF(Dall'Acqua WF)等人，(2006)生物化学杂志281:23514-24，其以全文引用的方式并入本文)。在某些实施例中，本文所公开的抗体的IgG(例如，IgG₁)的恒定区包含在位置434处的氨基酸丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、酪氨酸(Y)或苯丙氨酸(F)，其根据EU编号系统编号。在某些实施例中，本文所公开的抗体的IgG(例如，IgG₁、IgG₂或IgG₄)的恒定区包含分别在位置433、434和436处的氨基酸离氨酸(K)、苯丙氨酸(F)和酪氨酸(Y)，其根据EU编号系统编号。在某些实施例中，本文所公开的抗体的IgG(例如，IgG₁、IgG₂或IgG₄)的恒定区包含分别在位置428和434处的氨基酸亮氨酸(L)和丝氨酸(S)，其根据EU编号系统编号。在酸性条件下对FcRn的亲和力可能增加的额外IgG恒定区描述于沃德(Ward)等人，分子免疫学(Mol.Immunol.)(2015)67(200):131-41中，所述文献以全文引用的方式并入本文。在某些实施例中，抗体包含IgG恒定结构域，其在位置251至257、285至290、308至314、385至389和428至436处包含氨基酸残基的一个、两个、三个或更多个氨基酸取代，其根据EU编号系统编号。

在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合至ApoC3(例如，人类或食蟹猴动物ApoC3)的分离抗体，所述抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49中所阐述的氨基酸序列。

在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合至ApoC3(例如，人类或食蟹猴动物ApoC3)的分离抗体，所述抗体包含轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:50、51、52、53、54、55或56中所阐述的氨基酸序列。

在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合至ApoC3的分离抗体，所述抗体包含重链和轻链，其中所述重链和所述轻链的氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:34和50、35和50、36和50、37和50、38和50、39和50、40和50、41和50、42和50、43和50、44和50、45和50、46和50、47和50、48和50或49和50中所阐述的氨基酸序列。

在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合至ApoC3的分离抗体，所述抗体包含重链和轻链，其中所述重链和所述轻链的氨基酸序列分别包含以下，或由以下组成：SEQID NO:34和50、35和50、36和50、37和50、38和50、39和50、40和50、41和50、42和50、43和50、44和50、45和50、46和50、47和50、48和50或49和50中所阐述的氨基酸序列。

在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合至ApoC3(例如，人类或食蟹猕猴ApoC3)的分离抗体，所述抗体包含重链和轻链，其中：所述重链的氨基酸序列包含SEQ IDNO:34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49中所阐述的氨基酸序列；并且所述轻链的氨基酸序列包含SEQ ID NO:51中所阐述之氨基酸序列或由其组成。

在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合至ApoC3(例如，人类或食蟹猕猴ApoC3)的分离抗体，所述抗体包含重链和轻链，其中：所述重链的氨基酸序列包含SEQ IDNO:34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49中所阐述的氨基酸序列；并且所述轻链的氨基酸序列包含SEQ ID NO:52中所阐述的氨基酸序列或由其组成。

在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合至ApoC3(例如，人类或食蟹猕猴ApoC3)的分离抗体，所述抗体包含重链和轻链，其中：所述重链的氨基酸序列包含SEQ IDNO:34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49中所阐述的氨基酸序列；并且所述轻链的氨基酸序列包含SEQ ID NO:53中所阐述之氨基酸序列或由其组成。

在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合至ApoC3(例如，人类或食蟹猕猴ApoC3)的分离抗体，所述抗体包含重链和轻链，其中：所述重链的氨基酸序列包含SEQ IDNO:34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49中所阐述的氨基酸序列；并且所述轻链的氨基酸序列包含SEQ ID NO:54中所阐述之氨基酸序列或由其组成。

在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合至ApoC3(例如，人类或食蟹猕猴ApoC3)的分离抗体，所述抗体包含重链和轻链，其中：所述重链的氨基酸序列包含SEQ IDNO:34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49中所阐述的氨基酸序列；并且所述轻链的氨基酸序列包含SEQ ID NO:55中所阐述之氨基酸序列或由其组成。

在某些实施例中，本公开提供了一种特异性结合至ApoC3(例如，人类或食蟹猕猴ApoC3)的分离抗体，所述抗体包含重链和轻链，其中：所述重链的氨基酸序列包含SEQ IDNO:34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49中所阐述的氨基酸序列；并且所述轻链的氨基酸序列包含SEQ ID NO:56中所阐述之氨基酸序列或由其组成。

在某些实施例中，本文所公开的分离抗体减弱了ApoC3抑制肝细胞吸收TRL(例如，VLDL)或TRL残余物(体内或体外)的能力。在某些实施例中，本文所公开的分离抗体使ApoC3抑制肝细胞吸收TRL(例如，VLDL)或TRL残余物的能力减弱至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，如通过本文所公开的方法或通过本领域技术人员已知的方法所评估的。在某些实施例中，本文所公开的分离抗体使ApoC3抑制肝细胞吸收TRL(例如，VLDL)或TRL残余物的能力减弱至少约1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，如通过本文所公开的方法或通过本领域技术人员已知的方法所评估的。

在某些实施例中，当在饭前、饭中或饭后向受试者投予时，本文所公开的分离抗体能够抑制受试者的餐后脂血症。在某些实施例中，本文所公开的抗ApoC3抗体能够抑制受试者的餐后脂血症至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，如通过本文所公开的方法或通过本领域技术人员已知的方法所评估的。在某些实施例中，本文所公开的抗ApoC3抗体能过抑制受试者的餐后脂血症至少约1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，如通过本文所公开的方法或通过本领域技术人员已知的方法所评估的。

在某些实施例中，当在饭前、饭中或饭后向受试者投予时，本文所公开的分离抗体能够降低受试者的餐后乳糜微粒或乳糜微粒残余物的水平。在某些实施例中，本文所公开的抗ApoC3抗体能够降低受试者的餐后乳糜微粒或乳糜微粒残余物的水平至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，如通过本文所公开的方法或通过本领域技术人员已知的方法所评估的。在某些实施例中，本文所公开的抗ApoC3抗体能过降低受试者的餐后乳糜微粒或乳糜微粒残余物至少约1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，如通过本文所公开的方法或通过本领域技术人员已知的方法所评估的。

在某些实施例中，本文所公开的分离抗体能够增加受试者血液中ApoC3的清除率。在某些实施例中，本文所公开的抗ApoC3抗体能够增加受试者血液中ApoC3的清除率至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，如通过本文所公开的方法或通过本领域技术人员已知的方法所评估的。在某些实施例中，本文所公开的抗ApoC3抗体能够增加受试者血液中ApoC3的清除率至少约1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，如通过本文所公开的方法或通过本领域技术人员已知的方法所评估的。评估ApoC3的清除率的方法包括(但不限于)同位素示踪技术，其中所述同位素可以是放射性或稳定的。

在某些实施例中，本文所公开的分离抗体能够降低受试者血液中ApoC3的水平。在某些实施例中，本文所公开的抗ApoC3抗体能够降低受试者血液中ApoC3的水平至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，如通过本文所公开的方法或通过本领域技术人员已知的方法所评估的。在某些实施例中，本文所公开的抗ApoC3抗体能过降低受试者血液中ApoC3的水平至少约1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，如通过本文所公开的方法或通过本领域技术人员已知的方法所评估的。在某些实施例中，受试者血液中ApoC3的水平的降低维持至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天、30天、35天、40天、45天或50天，或至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周。

在某些实施例中，本文所公开的分离抗体能够结合至脂质结合型ApoC3(例如，结合至三酸甘油酯、TRL(例如，VLDL)或TRL残余物的ApoC3)。在某些实施例中，本文所公开的分离抗体并不抑制ApoC3结合至脂质或脂蛋白。在某些实施例中，本文所公开的抗体并不与脂质或脂蛋白竞争结合ApoC3。在某些实施例中，脂质包含脂肪酸链。在某些实施例中，脂质包含磷脂酰基。在某些实施例中，脂质包含磷脂酰胆碱(例如，DMPC)、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇或磷脂酰甘油。在某些实施例中，脂质是三酸甘油酯。在某些实施例中，脂蛋白是TRL(例如，VLDL)或TRL残余物。在某些实施例中，在本文所公开的抗ApoC3抗体存在的情况下，ApoC3结合至脂质和脂蛋白(例如，三酸甘油酯、TRL(例如，VLDL)或TRL残余物)的能力是在不存在抗ApoC3抗体的情况下ApoC3结合至相同脂质和脂蛋白的能力的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，如通过本文所公开的方法或通过本领域技术人员已知的方法所评估的。

在某些实施例中，本文所公开的分离抗体减弱了ApoC3抑制肝细胞吸收TRL(例如，VLDL)或TRL残余物的能力。在某些实施例中，与不存在抗ApoC3抗体的情况下肝细胞(例如，HepG2细胞)吸收TRL(例如，VLDL)或TRL残余物相比，在本文所公开的抗ApoC3抗体存在的情况下，肝细胞(例如，HepG2细胞)吸收TRL(例如，VLDL)或TRL残余物高出至少1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍或5倍。

在某些实施例中，本文所公开的分离抗体减弱了ApoC3抑制肝细胞吸收TRL(例如，VLDL)或TRL残余物的能力，并且能够结合至脂质结合型ApoC3(例如，结合至三酸甘油酯、TRL(例如，VLDL)或TRL残余物的ApoC3)。

3.使用方法

ApoC3抑制肝细胞吸收和清除TRL(例如，VLDL)和TRL残余物，并抑制脂蛋白脂肪酶介导的脂解TRL(例如，VLDL)，从而起到增加受试者血液中的三酸甘油酯水平的作用。在某些实施例中，本文所公开的抗ApoC3抗体可以减弱ApoC3抑制肝细胞吸收和清除TRL(例如，VLDL)和TRL残余物的能力，或者减弱ApoC3抑制脂蛋白脂肪酶介导的脂解TRL(例如，VLDL)的能力。因此，在某些实施例中，本公开提供了一种用于抑制受试者血液中ApoC3的活性的方法，所述方法包含向所述受试者投予有效量的本文所公开的抗ApoC3抗体或医药组合物。在某些实施例中，ApoC3活性是抑制肝细胞吸收和清除TRL(例如，VLDL)和TRL残余物。在某些实施例中，ApoC3活性是抑制脂蛋白脂肪酶介导的脂解TRL。在某些实施例中，ApoC3活性是抑制肝细胞吸收和清除TRL(例如，VLDL)和TRL残余物，以及抑制脂蛋白脂肪酶介导的脂解TRL。

本文所公开的抗ApoC3抗体适用于增加受试者血液中ApoC3的清除率。因此，在某些实施例中，本公开提供了一种用于增加受试者血液中ApoC3的活性的方法，所述方法包含向所述受试者投予有效量的本文所公开的抗ApoC3抗体或医药组合物。

本文所公开的抗ApoC3抗体适用于降低受试者血液中ApoC3的水平。因此，在某些实施例中，本公开提供了一种用于降低受试者血液中ApoC3的水平的方法，所述方法包含向所述受试者投予有效量的本文所公开的抗ApoC3抗体或医药组合物。在某些实施例中，所述方法降低受试者血液中ApoC3的水平至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，如通过本文所公开的方法或通过本领域技术人员已知的方法所评估的。在某些实施例中，所述方法降低受试者血液中ApoC3的水平至少约1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍，如通过本文所公开的方法或通过本领域技术人员已知的方法所评估的。在某些实施例中，受试者血液中ApoC3的水平的降低维持至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天、30天、35天、40天、45天或50天，或至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周。

本文所公开的抗ApoC3抗体适用于降低受试者血液中三酸甘油酯的水平。因此，在某些实施例中，本公开提供了一种用于降低受试者血液中三酸甘油酯的水平的方法，所述方法包含向所述受试者投予有效量的本文所公开的抗ApoC3抗体或医药组合物。

本文所公开的抗ApoC3抗体适用于治疗高三酸甘油酯血症。因此，在某些实施例中，本公开提供了一种用于处理受试者的高三酸甘油酯血症的方法，所述方法包含向所述受试者投予有效量的如本文所公开的抗ApoC3抗体或医药组合物。在某些实施例中，本公开提供了一种用于处理受试者的乳糜微粒血症的方法，所述方法包含向所述受试者投予有效量的如本文所公开的抗ApoC3抗体或医药组合物。在某些实施例中，本公开提供了一种用于处理受试者的乳糜微粒血症候群的方法，所述方法包含向所述受试者投予有效量的如本文所公开的抗ApoC3抗体或医药组合物。

本文所公开的抗ApoC3抗体适用于治疗和预防受试者的餐后脂血症。因此，在某些实施例中，本公开提供了一种用于抑制受试者的餐后脂血症的方法，所述方法包含向所述受试者投予有效量的如本文所公开的抗ApoC3抗体或医药组合物。抗ApoC3抗体可以在饭前、饭中或饭后向受试者投予。

不希望受到理论的束缚，申请人相信，在某些实施例中，当在饭前、饭中或饭后向受试者投予时，本文所公开的抗体能够降低受试者的餐后乳糜微粒或乳糜微粒残余物的水平。因此，在某些实施例中，本公开提供了一种用于降低受试者餐后乳糜微粒或乳糜微粒残余物的水平的方法，所述方法包含向所述受试者投予有效量的本文所公开的抗ApoC3抗体或医药组合物。抗ApoC3抗体可以在饭前、饭中或饭后向受试者投予。

高甘油三酯血症患者血液中三酸甘油酯水平的降低可降低患胰脏炎的风险。因此，在某些实施例中，本公开提供了一种用于降低患有高三酸甘油酯血症的受试者的胰脏炎风险的方法，所述方法包含向所述受试者投予有效量的如本文所公开的抗ApoC3抗体或医药组合物。

本文所公开的抗ApoC3抗体适用于降低受试者的心血管疾病风险。因此，在某些实施例中，本公开提供了一种用于降低患有高三酸甘油酯血症的受试者的心血管疾病风险的方法，所述方法包含向所述受试者投予有效量的如本文所公开的抗ApoC3抗体或医药组合物。患上与高三酸甘油酯血症或过度餐后脂血症相关联或由高甘油三酯血症或过度餐后脂血症引起的任何心血管疾病的风险可通过投予本文所公开的抗ApoC3抗体或医药组合物来降低。风险可以降低的心血管疾病包括但不限于冠状动脉疾病、动脉粥样硬化、心绞痛、心肌梗塞和中风。

本文所公开的抗ApoC3抗体或医药组合物可以单独投予或与额外的治疗剂一起组合投予。在某些实施例中，额外的治疗剂是另一种降脂剂。任何一种或多种降脂剂可以与本文所公开的抗ApoC3抗体或医药组合物一起组合使用。合适的降脂剂包括但不限于HMG-CoA还原酶抑制剂(例如阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀或辛伐他汀)、贝特类药、烟酸、胆汁酸螯合剂(例如消胆胺、考来替泼(colestipol)和考来维仑(colesevelam))、膳食胆固醇吸收抑制剂(例如依泽替米贝)、微粒体三酸甘油酯转运蛋白(MTP)抑制剂(例如洛美他派(lomitapide))、植物固醇、胰腺脂肪酶抑制剂(例如奥利司他(orlistat)、胆固醇酯转移蛋白抑制剂、角鲨烯合成酶抑制剂(例如TAK-475、萨拉哥酸(zaragozic acid)和RPR 107393)、ApoA-1Milano、琥珀布可(succinobucol)(AGI-1067)、脱辅基蛋白-B抑制剂(例如米泊美生(Mipomersen))和前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/克新类型9(PCSK9)抑制剂(例如阿利库单抗、依伏库单抗和博可珠单抗)。在某些实施例中，额外的降脂剂是依泽替米贝和HMG-CoA还原酶抑制剂的组合。在某些实施例中，降脂剂是依泽替米贝、HMG-CoA还原酶抑制剂和PCSK9抑制剂的组合。

可以通过多种途径将本文所公开的抗ApoC3抗体或医药组合物递送至受试者。这些途径包括但不限于不经肠、皮内、肌内、腹膜内、静脉内和皮下途径。在某些实施例中，皮下或静脉内递送本文所公开的抗体或医药组合物。

将在治疗或预防病症中有效的本文所公开的抗ApoC3抗体或医药组合物的量将取决于疾病的性质，并且可以通过标准临床技术凭经验确定。组合物中采用的精确剂量还将取决于投予途径和由其造成的感染或疾病的严重性，并且应当根据从业者的判断和各个受试者的情况决定。例如，有效剂量还可以取决于投予方式、目标部位、患者的生理状态(包括年龄、体重和健康状况)、患者是人类还是动物、所投予的其它药剂、或治疗是预防性的还是治疗性的而变化。可以任何频率(例如，大约每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次或每两个月一次)投予本文所公开的抗ApoC3抗体或医药组合物。通常，患者是人类，但也可以治疗非人类哺乳动物(包括转基因哺乳动物)。可以将治疗剂量和方案以最佳方式滴定，从而优化安全性和疗效。

本文所公开的抗ApoC3抗体也可以用于使用本领域技术人员已知的经典免疫组织学方法来测定生物样品中的ApoC3(例如，人类或食蟹猕猴ApoC3)蛋白水平，所述经典免疫组织学方法包括免疫测定，如酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫沉淀或蛋白质印迹。合适的抗体分析法标记是本领域中已知的，并且包括酶标记，如葡萄糖氧化酶；放射性同位素，如碘(¹²⁵I、¹²¹I)、碳(¹⁴C)、硫(³⁵S)、氚(³H)、铟(¹²¹In)和锝(⁹⁹Tc)；发光标记，如鲁米诺(luminol)；和荧光标记，如荧光素和若丹明，和生物素。此类标记可以用于标记本文所公开的抗体。可替代地，可以标记识别本文所公开的抗ApoC3抗体的第二抗体，并将所述第二抗体与抗ApoC3抗体组合使用，以检测ApoC3(例如，人类或食蟹猕猴ApoC3)蛋白水平。

测定ApoC3(例如，人类或食蟹猕猴ApoC3)蛋白的表达水平旨在包括直接(例如，通过确定或估计绝对蛋白水平)或相对地(例如，通过与第二生物样品中的疾病相关蛋白水平进行比较)对第一生物样品中的ApoC3(例如，人类或食蟹猕猴ApoC3)蛋白的水平进行定性或定量测量或估计。可以测量或估计第一生物样品中的ApoC3(例如，人类或食蟹猕猴ApoC3)多肽的表达水平并将其与标准ApoC3(例如，人类或食蟹猕猴ApoC3)蛋白水平进行比较，所述标准取自从未患病的个体获得的第二生物样品或通过对由未患病的个体群体的水平进行平均来确定。如本领域将理解的，一旦已知“标准”ApoC3(例如，人类或食蟹猕猴ApoC3)多肽水平，则可以将所述标准水平重复用作比较标准。

如本文所用，术语“生物样品”是指从潜在表达ApoC3(例如，人类或食蟹猕猴ApoC3)的受试者、细胞系、组织或其它细胞来源获得的任何生物样品。用于从动物(例如，人类)获得组织活检和体液的方法是本领域众所周知的。生物样品包括外周血单核细胞。

本文所公开的抗ApoC3抗体可以用于预后、诊断、监测和筛查应用，包括对于本领域技术人员而言众所周知和标准的并且基于本说明书的体外和体内应用。用于体外评估和评价免疫系统状态或免疫应答的预后、诊断、监测和筛查测定以及试剂盒可以用于预测、诊断并且监测以评估患者样品(包括已知具有或怀疑具有升高的ApoC3活性的患者样品)。在一实施例中，抗ApoC3抗体可以用于活检样品的免疫组织化学。在另一个实施例中，抗ApoC3抗体可以用于检测ApoC3(例如，人类或食蟹猕猴ApoC3)的水平，然后可以将所述水平与某些疾病症状相关。本文所公开的抗ApoC3抗体可以带有可检测的或功能性的标记。当使用荧光标记时，本领域中已知的目前可用的显微术和荧光激活细胞分选仪分析(FACS)或两种方法程序的组合可以用于鉴别和定量特异性结合成员。本文所公开的抗ApoC3抗体可以带有荧光标记。示例性荧光标记包括例如反应性和缀合探针，例如氨基香豆素(Aminocoumarin)、荧光素(Fluorescein)和德克萨斯红(Texas red)，Alexa Fluor染料、Cy染料和DyLight染料。抗ApoC3抗体可携带放射性标记，如同位素³H、¹⁴C、³²P、³⁵S、³⁶Cl、⁵¹Cr、⁵⁷Co、⁵⁸Co、⁵⁹Fe、⁶⁷Cu、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹¹¹In、¹¹⁷Lu、¹²¹I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I、¹⁹⁸Au、²¹¹At、²¹³Bi、²²⁵Ac和¹⁸⁶Re。当使用放射性标记时，可以利用本领域中已知的目前可获得的计数程序来鉴定和量化抗ApoC3抗体与ApoC3(例如，人类或食蟹猕猴ApoC3)的特异性结合。在标记是酶的情况下，检测可以通过如本领域中已知的当前所用比色、分光光度、荧光分光光度、安培或气体定量技术中的任一种实现。这可以通过在允许抗体与ApoC3(例如，人类或食蟹猕猴ApoC3)之间形成复合物的条件下使样品或对照样品与抗ApoC3抗体接触来实现。检测在抗体与ApoC3(例如，人类或食蟹猕猴ApoC3)之间形成的任何复合物，并将所述复合物在样品和对照中进行比较。本文所公开的抗体还可以用于通过免疫亲和纯化来纯化ApoC3(例如，人类或食蟹猕猴ApoC3)。本文还包括可以测试试剂盒的形式制备的测定系统，所述测定系统用于对例如ApoC3(例如，人类或食蟹猕猴ApoC3)的存在程度进行定量分析。所述系统或测试试剂盒可以包含带标记的组分(例如，带标记的ApoC3抗体)以及一种或多种额外的免疫化学试剂。

4.医药组合物

本文提供了医药组合物，所述医药组合物包含呈生理上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂形式的具有期望浓度的本文所公开的抗ApoC3抗体(雷明登氏药学全书(Remington'sPharmaceutical Sciences)(1990)麦克出版公司(Mack Publishing Co.)，伊斯顿，宾夕法尼亚州)。可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在所用剂量和浓度下对接受者无毒，并且包括：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反离子，如钠；金属络合物(例如，锌-蛋白络合物)；或非离子表面活性剂，如TWEEN^TM、PLURONICS^TM或聚乙二醇(PEG)。

在具体实施例中，医药组合物包含本文所公开的抗ApoC3抗体，以及任选的呈医药学上可接受的载剂形式的一种或多种额外的预防剂或治疗剂。在具体实施例中，医药组合物包含有效量的本文所公开的抗体，以及任选的呈医药学上可接受的载剂形式的一种或多种另外的预防剂或治疗剂。在一些实施例中，抗体是医药组合物中所包括的唯一活性成分。本文所公开的医药组合物可以用于抑制ApoC3活性和治疗如癌症或传染病等病症。

用于不经肠制剂中的医药学上可接受的载体包括水性媒剂、非水性媒剂、抗微生物剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、局部麻醉剂、悬浮剂和分散剂、乳化剂、螯合剂(sequestering agent或chelating agent)和其它医药学上可接受的物质。水性媒剂的实例包括氯化钠注射剂、林格氏注射剂(Ringers Injection)、等渗右旋糖注射剂、无菌注射用水、右旋糖和乳酸化的林格氏注射剂。非水性不经肠媒剂包括植物来源的不挥发性油(fixed oil)、棉籽油、玉米油、芝麻油和花生油。可以向封装于多剂量容器中的不经肠制剂中添加抑制细菌或抑制真菌浓度的抗微生物剂，所述多剂量容器包括苯酚或甲酚、汞剂、苯甲醇、氯丁醇、甲基和丙基对羟基苯甲酸酯、硫柳汞、苯扎氯铵和苄索氯铵。等渗剂包括氯化钠和葡萄糖。缓冲剂包括磷酸盐和柠檬酸盐。抗氧化剂包括硫酸氢钠。局部麻醉剂包括盐酸普鲁卡因(procaine hydrochloride)。悬浮剂和分散剂包括羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。乳化剂包括聚山梨酯80(

80)。金属离子的螯合剂包括EDTA。医药载体还包括用于水可混溶的媒剂的乙醇、聚乙二醇和丙二醇；和用于pH调整的氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。

可以针对向受试者投予的任何途径来调配医药组合物。投予途径的具体实例包括鼻内、经口、经肺、经皮、皮内和不经肠。本文还涵盖不经肠投予，其特征在于皮下、肌内或静脉内注射。可注射剂可以按常规形式制备，呈液体溶液或悬浮液、适合于在注射之前在液体中形成溶液或悬浮液的固体形式，或呈乳液形式。可注射剂、溶液和乳液还含有一种或多种赋形剂。合适的赋形剂是例如水、盐水、右旋糖、甘油或乙醇。另外，必要时，待投予的医药组合物还可以含有少量的无毒辅助物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂、溶解度增强剂和其它此类试剂，如乙酸钠、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯和环糊精。

用于不经肠投予抗体的制剂包括准备注射的无菌溶液、准备在使用前与溶剂组合的无菌干燥可溶性产品(如冻干粉末，包括皮下注射片剂)、准备注射的无菌悬浮液、准备在使用前与媒剂混合的无菌干燥的不溶性产品以及无菌乳剂。溶液可以是水性或非水性的。

如果静脉内投予，那么合适的载体包括生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)，以及含有增稠剂和增溶剂的溶液，所述增稠剂和增溶剂例如葡萄糖、聚乙二醇和聚丙二醇和及其混合物。

如关于局部和全身投予所述制备包含抗体的局部混合物。所得混合物可以是溶液、悬浮液、乳液等并且可以被调配成乳膏、凝胶、软膏、乳液、溶液、酏剂、洗剂、悬浮液、酊剂、糊剂、泡沫剂、气雾剂、冲洗剂、喷雾剂、栓剂、绷带、皮肤贴片或任何其它适合局部投予的调配物。

可以将本文所公开的抗ApoC3抗体调配成用于局部应用(如通过吸入)的气雾剂(参见例如美国专利第4,044,126号、第4,414,209号和第4,364,923号，所述专利描述了用于递送用于治疗炎性疾病(尤其是哮喘)的类固醇的气雾剂)。用于向呼吸道投予的这些调配物可以呈用于喷雾器的气雾剂或溶液的形式，或呈用于吹入的微细粉末形式，单独的或与如乳糖的惰性载剂组合。在这种情况下，调配物的颗粒将具有在一个实施例中小于50微米，在一个实施例中小于10微米的直径。

可以将本文所公开的抗ApoC3抗体调配成用于局部或局部投予，如以凝胶、乳膏和洗剂的形式用于皮肤和粘膜(如眼睛)的局部投予，并用于眼部应用或用于颅内或脊柱内应用。预期局部投予用于经皮递送以及用于投予至眼睛或粘膜，或用于吸入疗法。也可以投予单独抗体或所述抗体与其它医药学上可接受的赋形剂的组合的鼻溶液。

经皮贴片，包括离子导入和电泳装置，是本领域的普通技术人员众所周知的，并且可用于投予抗体。例如，这种贴片公开于美国专利第6,267,983号、第6,261,595号、第6,256,533号、第6,167,301号、第6,024,975号、第6,010715号、第5,985,317号、第5,983,134号、第5,948,433号和第5,860,957号中。

在某些实施例中，包含本文所公开的抗ApoC3抗体的医药组合物是冻干粉末，可以重构所述冻干粉末，从而以溶液、乳剂和其它混合物的形式进行投予。也可以将所述冻干粉末重构并调配成固体或凝胶形式。通过将本文所公开的抗体或其医药学上可接受的衍生物溶解在合适的溶剂中来制备冻干粉末。在一些实施例中，冻干粉末是无菌的。溶剂可含有能够提升粉剂或由粉剂制备的复水溶液的稳定性或其它药理学组分的赋形剂。可使用的赋形剂包括但不限于葡萄糖、山梨糖醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其它合适的试剂。溶剂还可含有缓冲剂，如柠檬酸盐、磷酸钠或磷酸钾、或本领域的技术人员已知的其它这类缓冲剂，在一个实施例中，缓冲剂约呈中性pH。随后对溶液进行无菌过滤，然后在本领域技术人员已知的标准条件下冻干，从而提供期望的调配物。在一个实施例中，将所得溶液分配到小瓶中进行冻干。每一小瓶中含有单次剂量或多次剂量的化合物。可以将冻干粉末储存在适当的条件下，如在约4℃到室温下。用注射用水重构这种冻干粉末，得到用于不经肠投予的调配物。为了进行重构，将冻干粉末添加到无菌水或其它合适的载剂中。精确量取决于所选的化合物。可以凭经验确定此量。

还可以将本文所公开的抗ApoC3抗体和本文所提供的其它组合物调配成靶向待治疗受试者的特定组织、受体或身体的其它区域。许多此类靶向方法是本领域技术人员众所周知的。本文考虑了本公开组合物中使用的所有此类靶向方法。对于靶向方法的非限制性实例，参见例如美国专利第6,316,652号、第6,274,552号、第6,271,359号、第6,253,872号、第6,139,865号、第6,131,570号、第6,120,751号、第6,071,495号、第6,060,082号、第6,048,736号、第6,039,975号、第6,004,534号、第5,985,307号、第5,972,366号、第5,900,252号、第5,840,674号、第5,759,542号和第5,709,874号。

用于体内投予的组合物可以是无菌的。这易于通过例如无菌过滤膜过滤来完成。

5.聚核苷酸、载体和产生抗ApoC3抗体的方法

在另一方面，本文提供了包含对本文所公开的抗ApoC3抗体进行编码的核苷酸序列(例如，轻链可变区或重链可变区)的聚核苷酸，以及载体，例如包含此类聚核苷酸的用于在宿主细胞(例如，大肠杆菌和哺乳动物细胞)中重组表达的载体。

如本文所用，“分离”聚核苷酸或核酸分子是从核酸分子的天然来源(例如，小鼠或人类)中存在的其它核酸分子中分离出来的分子。此外，当通过重组技术产生时，“分离”核酸分子(如cDNA分子)可以基本上不含其它细胞材料或培养基，或者当化学合成时，所述分子可以基本上不含化学前体或其它化学品。例如，措辞“基本上不含”包括具有少于约15％、10％、5％、2％、1％、0.5％或0.1％(特别是少于约10％)的其它材料(例如，细胞材料、培养基、其它核酸分子、化学前体或其它化学品)的聚核苷酸或核酸分子的制剂。在具体实施例中，分离或纯化对本文所公开的抗体进行编码的一个或多个核酸分子。

在特定方面，本文提供了包含对以下抗体进行编码的核苷酸序列的聚核苷酸：特异性结合至ApoC3(例如，人类或食蟹猕猴ApoC3)多肽且包含本文所公开的氨基酸序列的抗体，以及与此类抗体竞争结合至ApoC3(例如，人类或食蟹猕猴ApoC3)多肽(例如，以剂量依赖性方式)的抗体，或结合至与此类抗体的抗原决定基相同的抗原决定基的抗体。

在某些方面，本文提供了包含对本文所公开的抗体的轻链或重链进行编码的核苷酸序列的聚核苷酸。所述聚核苷酸可以包含对本文所公开的抗体的VH、VL或CDR进行编码的核苷酸序列(参见例如本文的表1至4)。

本文还提供了对例如通过密码子/RNA优化、用异源信号序列替换以及消除mRNA不稳定元件而优化的抗ApoC3抗体进行编码的聚核苷酸。因此，可以通过调整以下专利中所述的优化方法来实施通过在mRNA中引入密码子变化和/或消除抑制区来生成对抗ApoC3抗体(例如，轻链、重链、VH结构域或VL结构域)进行编码的用于重组表达的经优化的核酸的方法：例如，美国专利第5,965,726号；第6,174,666号；第6,291,664号；第6,414,132号；和第6,794,498号。例如，可以在不改变由核酸序列编码的氨基酸的情况下对RNA中的潜在剪接位点和不稳定元素(例如，富含A/T或A/U的元素)进行突变，以增加用于重组表达的RNA的稳定性。所述改变利用遗传密码的简并，例如，将替代密码子用于相同的氨基酸。在一些实施例中，可能期望改变一个或多个密码子以对保守突变(例如，具有与原始氨基酸类似的化学结构和性质或功能的氨基酸)进行编码。与由未经优化的聚核苷酸编码的抗ApoC3抗体的表达相比，这种方法可以将抗ApoC3的表达增加至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、或100倍或更多。

在某些实施例中，对本文所公开的抗ApoC3抗体(例如，VL结构域或VH结构域)进行编码的经优化的聚核苷酸序列可以与对本文所公开的抗ApoC3抗体(例如，VL结构域或VH结构域)进行编码的未经优化的聚核苷酸序列的反义(例如，互补)聚核苷酸杂交。在具体实施例中，对本文所公开的抗ApoC3抗体或片段进行编码的经优化的核苷酸序列在高严格性条件下与对本文所公开的抗ApoC3抗体进行编码的未经优化的聚核苷酸序列的反义聚核苷酸杂交。在具体实施例中，对本文所公开的抗ApoC3抗体进行编码的经优化的核苷酸序列在高严格性、中等或较低严格性杂交条件下与对本文所公开的抗ApoC3抗体进行编码的未经优化的核苷酸序列的反义聚核苷酸杂交。关于杂交条件的信息已经有所描述，参见例如，以引用的方式并入本文中的美国专利申请公开第US 2005/0048549号(例如，第72至73段)。

可以通过本领域中已知的任何方法获得聚核苷酸并确定聚核苷酸的核苷酸序列。可以使用本领域中众所周知的方法测定编码本文所公开的抗体(例如表1至5中所描述的抗体)和这些抗体的经修饰形式的核苷酸序列，即已知编码特定氨基酸的核苷酸密码子以产生对抗体进行编码的核酸的方式组装。对抗体进行编码的这种聚核苷酸可以由化学合成的寡核苷酸组装而成(例如，如库特弥尔G(Kutmeier G)等人，(1994)，生物技术(BioTechniques)17:242-6中所述)，简言之，这涉及合成含有对抗体进行编码的序列的一部分的重叠寡核苷酸、对所述寡核苷酸进行退火和连接以及然后通过PCR对连接的寡核苷酸进行扩增。

可替代地，可以使用本领域众所周知的方法(例如，PCR和其它分子克隆方法)由来自合适来源(例如，杂交瘤)的核酸生成对本文所公开的抗体进行编码的聚核苷酸。例如，可以使用从产生所关注抗体的杂交瘤细胞获得的基因组DNA来执行使用可与已知序列的3'端和5'端杂交的合成引物进行的PCR扩增。这种PCR扩增方法可以用于获得包含对抗体的轻链或重链进行编码的序列的核酸。这种PCR扩增方法可以用于获得包含对抗体的可变轻链区或可变重链区进行编码的序列的核酸。可以将扩增的核酸克隆到载体中以在宿主细胞中表达并进一步克隆，例如，从而生成嵌合抗体和人类化抗体。

如果无法获得含有对特定抗体进行编码的核酸的克隆子，但抗体分子的序列是已知的，则可以通过使用可与序列的3'端和5'端杂交的合成引物进行PCR扩增或通过使用特异于特定基因序列的寡核苷酸探针进行克隆来化学合成或从合适的来源(例如，抗体cDNA文库或由从表达所述抗体的任何组织或细胞(如被选择用于表达本文所公开的抗体的杂交瘤细胞)分离的核酸(优选为poly A+RNA)生成的cDNA文库)获得对免疫球蛋白进行编码的核酸，从而鉴定例如来自对所述抗体进行编码的cDNA文库的cDNA克隆子。通过PCR产生的扩增的核酸然后可以使用本领域中熟知的任何方法克隆到可复制克隆载体中。

可以使用常规程序(例如，通过使用能够与对抗ApoC3(例如，人类或食蟹猕猴ApoC3)抗体的重链和轻链进行编码的基因特异性结合的寡核苷酸探针)容易地分离和测序对本文所公开的抗ApoC3(例如，人类或食蟹猕猴ApoC3)抗体进行编码的DNA。杂交瘤细胞可以充当这种DNA的来源。一旦被分离，就可以将DNA置于表达载体中，然后将所述表达载体转染到不以其它方式产生疫球蛋白蛋白的宿主细胞中，如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(例如，来自CHO GS System^TM(龙沙集团(Lonza))的CHO细胞)或骨髓瘤细胞中，以便在重组宿主中合成抗ApoC3(例如，人类或食蟹猕猴ApoC3)抗体。

为了产生全抗体，包括VH或VL核苷酸序列、限制位点和保护限制位点的侧翼序列的PCR引物可以用于扩增scFv克隆中的VH或VL序列。利用本领域技术人员已知的克隆技术，可以将PCR扩增的VH结构域克隆到表达重链恒定区(例如，人类γ4恒定区)的载体中，并且可以将PCR扩增的VL结构域克隆到表达轻链恒定区(例如，人类κ或λ恒定区)的载体中。在某些实施例中，用于表达VH或VL结构域的载体包含EF-1α启动子、分泌信号、可变区的克隆位点、恒定结构域和选择标志物(如新霉素)。VH和VL结构域也可以克隆到表达必需恒定区的一个载体中。接着使用本领域技术人员已知的技术将重链转换载体和轻链转换载体共转染至细胞系中，产生表达全长抗体，例如IgG的稳定或短暂细胞株。

还可以通过以下方式修饰DNA：例如，用人类重链和轻链恒定结构域的编码序列代替鼠序列，或使非免疫球蛋白多肽的编码序列的全部或一部分与免疫球蛋白编码序列共价连接。

还提供了在高严格性、中等或较低严格性杂交条件下与对本文所公开的抗体进行编码的聚核苷酸杂交的聚核苷酸。在具体实施例中，本文所公开的聚核苷酸在高严格性、中等或较低严格性杂交条件下与对本文所提供的VH结构域或VL结构域进行编码的聚核苷酸杂交。

杂交条件已经在本领域中描述并且是本领域技术人员已知的。例如，在严格条件下的杂交可以包括在约45℃下6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中与过滤器结合的DNA杂交，随后在约50-65℃下0.2×SSC/0.1％SDS中的一个或多个洗涤；在高度严格条件下的杂交可以包括在约45℃下6×SSC中与过滤器结合的核酸杂交，随后在约68℃下0.1×SSC/0.2％SDS中的一个或多个洗涤。在其它严格杂交条件下的杂交是本领域技术人员已知的并且已经描述过，参见例如，奥斯贝FM(Ausubel FM)等人编辑(1989)，当代分子生物学实验指南(CurrentProtocols in Molecular Biology)第I卷，第6.3.1-6.3.6页和2.10.3页，格林出版协会有限公司(Green Publishing Associates,Inc)以及纽约约翰威立父子公司(John Wiley&Sons,Inc)。

在某些方面，本文提供了表达(例如，重组地)特异性结合至ApoC3(例如，人类或食蟹猕猴ApoC3)的本文所公开的抗体的细胞(例如，宿主细胞)以及相关的聚核苷酸和表达载体。本文提供了包含聚核苷酸的用于在宿主细胞中(优选地在哺乳动物细胞中)重组表达的载体(例如，表达载体)，所述聚核苷酸包含对抗ApoC3(例如，人类或食蟹猕猴ApoC3)抗体或片段进行编码的核苷酸序列。本文还提供了包含此类载体的宿主细胞，所述载体用于重组表达本文所公开的抗ApoC3(例如，人类或食蟹猕猴ApoC3)抗体(例如，人类或人类化抗体)。在特定方面，本文提供了用于产生本文所公开的抗体的方法，所述方法包含从宿主细胞表达此类抗体。

特异性结合至ApoC3(例如，人类或食蟹猕猴ApoC3)的本文所公开的抗体(例如，全长抗体、抗体的重链或轻链或本文所公开的单链抗体)的重组表达涉及构建含有对所述抗体进行编码的聚核苷酸的表达载体。一旦获得了对本文所公开的抗体分子、抗体的重链或轻链(例如，重链或轻链可变区)进行编码的聚核苷酸，就可以使用本领域众所周知的技术通过重组DNA技术产生用于产生抗体分子的载体。因此，本文公开了用于通过表达含有对核苷酸序列进行编码的抗体或抗体片段(例如，轻链或重链)的聚核苷酸来制备蛋白质的方法。本领域技术人员熟知的方法可以用于构建含有抗体或抗体片段(例如，轻链或重链)编码序列和适宜的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。还提供了可复制的载体，其包含可操纵地连接至启动子的对本文所公开的抗体分子、抗体的重链或轻链、抗体的重链或轻链可变区或重链或轻链CDR进行编码的核苷酸序列。此类载体可以例如包括对抗体分子的恒定区进行编码的核苷酸序列(参见例如，国际公开号WO 86/05807和WO 89/01036；以及美国专利第5,122,464号)，并且可以将抗体的可变区克隆到此类载体中，以表达整个重链、整个轻链或整个重链和轻链两者。

可以通过常规技术将表达载体转移至细胞(例如，宿主细胞)，然后可以通过常规技术培养所得细胞，从而产生本文所公开的抗体。因此，本文提供了宿主细胞，其含有可操作地连接至启动子以在宿主细胞中表达此类序列的对本文所公开的抗体、或其重链或轻链、或其片段或本文所公开的单链抗体进行编码的聚核苷酸。在某些实施例中，为了表达双链抗体，单独地编码重链和轻链两者的载体可以在宿主细胞中共表达以表达整个免疫球蛋白分子，如以下所详述。在某些实施例中，宿主细胞含有包含对本文所公开的抗体的重链和轻链两者进行编码的聚核苷酸的载体。在具体实施例中，宿主细胞含有两种不同的载体，第一载体包含对本文所公开的抗体的重链或重链可变区或其片段进行编码的聚核苷酸，而第二载体包含对本文所公开的抗体的轻链或轻链可变区或其片段进行编码的聚核苷酸。在其它实施例中，第一宿主细胞包含第一载体，所述第一载体包含对本文所公开的抗体的重链或重链可变区或其片段进行编码的聚核苷酸，而第二宿主细胞包含第二载体，所述第二载体包含对本文所公开的抗体的轻链或轻链可变区进行编码的聚核苷酸。在具体实施例中，由第一细胞表达的重链/重链可变区与第二细胞的轻链/轻链可变区缔合，从而形成本文所公开的抗ApoC3抗体。在某些实施例中，本文提供了包含这种第一宿主细胞和这种第二宿主细胞的宿主细胞群。

在特定实施例中，本文提供了包含第一载体和第二载体的载体群，所述第一载体包含对本文所公开的抗ApoC3抗体的轻链/轻链可变区进行编码的聚核苷酸，所述第二载体包含对本文所公开的抗ApoC3抗体的重链/重链可变区进行编码的聚核苷酸。

可以利用各种宿主表达载体系统来表达本文所公开的抗体分子(参见例如，美国专利第5,807,715号)。这种宿主表达系统代表可以借以产生并随后纯化所关注的编码序列的媒剂，还代表在用适当的核苷酸编码序列转化或转染时可以原位表达本文所公开的抗体分子的细胞。这些系统包括但不限于微生物，如用含有抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)；用含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如，酿酒酵母(Saccharomyces)、毕赤酵母(Pichia))；被含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；被重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus)，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染或用含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统(例如，绿藻，如莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii))；或包含重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如，COS(例如，COS1或COS)、CHO、BHK、MDCK、HEK 293、NS0、PER.C6、VERO、CRL7O3O、HsS78Bst、HeLa、和NIH 3T3、HEK-293T、HepG2、SP210、R1.1、B-W、L-M、BSC1、BSC40、YB/20和BMT10细胞)，所述重组表达构建体含有源自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或源自哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)。在具体实施例中，用于表达本文所公开的抗体的细胞是CHO细胞，例如来自CHO GS System^TM(龙沙集团)的CHO细胞。在特定实施例中，用于表达本文所公开的抗体的细胞是人类细胞，例如，人类细胞系。在具体实施例中，哺乳动物表达载体是pOptiVEC^TM、pcDNA3.3或pCDNA3.1Neo。在具体实施例中，尤其用于表达完整重组抗体分子的细菌细胞如大肠杆菌或真核细胞(如哺乳动物细胞)用于表达重组抗体分子。例如，与载体(如来自人类巨细胞病毒的主要中间早期基因启动子元件)连接的哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)是抗体的有效表达系统(Foecking MK和Hofstetter H(1986)基因(Gene)45:101-5；以及科克特MI(Cockett MI)等人，(1990)生物技术(Biotechnology)8(7):662-7)。在某些实施例中，本文所公开的抗体由CHO细胞或NS0细胞产生。在具体实施例中，通过组成型启动子、诱导型启动子或组织特异性启动子调节对特异性结合至ApoC3(例如，人类或食蟹猕猴ApoC3)的本文所公开的抗体进行编码的核苷酸序列的表达。

在细菌系统中，多种表达载体可以有利地取决于所表达抗体分子预期的用途来选择。例如，当要产生大量这种抗体时，为了生成抗体分子的医药组合物，可能需要指导易于纯化的融合蛋白产物的高水平表达的载体。这种载体包括但不限于：大肠杆菌表达载体pUR278(卢瑟U(Ruether U)和米勒希尔B(Mueller-Hill B)(1983)欧洲分子生物学组织杂志(EMBO J)2:1791-1794)，其中可以将抗体编码序列单独连接到与lac Z编码区使用相同读框的载体中，从而产生融合蛋白；pIN载体(井上S(Inouye S)和井上M(Inouye M)(1985)核酸研究(Nuc Acids Res)13:3101-3109；凡希克G(Van Heeke G)和舒斯特SM(SchusterSM)(1989)生物化学杂志24:5503-5509)；等等。例如，pGEX载体还可以用于将外来多肽表达为具有谷胱甘肽5-转移酶(GST)的融合蛋白。一般来说，这种融合蛋白是可溶的并且可以通过以下步骤从溶解的细胞中容易地纯化：吸附并与基质谷胱甘肽琼脂糖珠结合，然后在存在游离谷胱甘肽存在的情况下洗脱。这些pGEX载体被设计成包括凝血酶或因子Xa蛋白酶裂解位点，从而使得克隆的靶基因产物可以从GST部分释放。

在昆虫系统中，例如，苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核多角体病毒(AcNPV)可以用作表达外源基因的载体。病毒在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中生长。抗体编码序列可以单独地克隆到病毒的非必需区(例如多角体蛋白基因)中并且放在AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)的控制下。

在哺乳动物宿主细胞中，可以使用多种基于病毒的表达系统。在腺病毒用作表达载体的情况下，所关注的抗体编码序列可以连接至腺病毒转录/翻译控制复合物，例如晚期启动子和三联体前导序列。然后可以通过体外或体内重组将这个嵌合基因插入到腺病毒基因组中。插入到病毒基因组的非必需区(例如，El或E3区)将产生可存活并且能够在受感染的宿主中表达抗体分子的重组病毒(例如，参见洛根J(Logan J)和申克T(Shenk T)(1984)美国国家科学院院刊(PNAS)81(12):3655-9)。为了高效地转译插入的抗体编码序列，还可能需要特异性起始信号。这些信号包括ATG起始密码子和邻近序列。此外，起始密码子必须与所需编码序列的阅读框同相以确保整个插入片段的翻译。这些外源翻译控制信号和起始密码子可以是天然和合成的多种起源。通过包含适当的转录增强子元件、转录终止子等，可以增强表达效率(参见例如，比特G(Bitter G)等人，(1987)，酶学方法(Methods Enzymol).153:516-544)。

另外，可以选择调节所插入序列的表达或以期望的特异性方式修饰和加工基因产物的宿主细胞株。蛋白质产物的此类修饰(例如，糖基化)和加工(例如，切割)对于蛋白质的功能来说可是重要的。不同的宿主细胞具有用于蛋白质和基因产物的转译后加工和修饰的特征性和特异性机制。可以选择适当的细胞系或宿主系统以确保正确修饰和加工所表达的外来蛋白。为此，可以使用具有用于对初级转录物进行适当加工、对基因产物进行糖基化和磷酸化的细胞机制的真核宿主细胞。此类哺乳动物宿主细胞包括(但不限于)CHO、VERO、BHK、Hela、MDCK、HEK 293、NIH 3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O和T47D、NS0(不内源性地产生任何免疫球蛋白链的鼠类骨髓瘤细胞系)、CRL7O3O、COS(例如，COS1或COS)、PER.C6、VERO、HsS78Bst、HEK-293T、HepG2、SP210、R1.1、B-W、L-M、BSC1、BSC40、YB/20、BMT10和HsS78Bst细胞。在某些实施例中，在哺乳动物细胞(如CHO细胞)中产生本文所公开的抗ApoC3(例如，人类或食蟹猕猴ApoC3)抗体。

在具体实施例中，本文所公开的抗体具有降低的岩藻糖含量或没有岩藻糖含量。可以使用本领域技术人员已知的技术来产生此类抗体。例如，可以在欠缺或缺乏岩藻糖基化能力的细胞中表达抗体。在具体实例中，可以使用具有α1,6-岩藻糖基转移酶的两个等位基因敲除的细胞系来产生岩藻糖含量降低的抗体。

系统(龙沙集团)是可用于产生岩藻糖含量降低的抗体的此类系统的实例。

对于重组蛋白的长期、高产率的产生，可以生成稳定表达细胞。例如，可以对稳定表达本文所公开的抗ApoC3抗体的细胞系进行工程化。在具体实施例中，本文提供的细胞稳定表达轻链/轻链可变区和重链/重链可变区，所述轻链/轻链可变区和重链/重链可变区缔合以形成本文所公开的抗体。

在某些方面，替代使用含有病毒复制起点的表达载体，宿主细胞可以用通过适宜的表达控制元件(例如启动子、增强子、序列、转录终止子、多腺苷酸化位点等)控制的DNA和可选标志物转化。在引入外来DNA/聚核苷酸后，可以允许工程化细胞在富集的培养基中生长1至2天并且然后切换到选择性培养基。重组质粒中的可选标志物赋予对选择的抗性，并且允许细胞将质粒稳定地整合到其染色体中并生长形成病灶，进而可以将所述病灶克隆并且扩展成细胞系。可以有利地使用所述方法对表达本文所公开的抗ApoC3抗体的细胞系进行工程化。这种工程化的细胞系对筛选和评估与抗体分子直接或间接相互作用的组合物特别有用。

可以使用许多选择系统，包括但不限于分别位于tk细胞、hgprt细胞或aprt细胞中的单纯疱疹病毒胸苷激酶(威格勒M(Wigler M)等人，(1977)，细胞(Cell)11(1):223-32)、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(齐巴尔斯卡EH(Szybalska EH)和齐巴尔斯基W(Szybalski W)(1962)美国国家科学院刊48(12):2026-2034)和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(洛维I(Lowy I)等人，(1980)细胞22(3):817-23)基因。此外，抗代谢物抗性可以用作选择以下基因的基础：dhfr，其赋予对甲氨蝶呤的抗性(威格勒M等人，(1980)美国国家科学院院刊77(6):3567-70；奥黑尔K(O'Hare K)等人，(1981)美国国家科学院院刊78:1527-31)；gpt，其赋予对麦考酚酸的抗性(马利根RC(Mulligan RC)和伯格P(Berg P)(1981)美国国家科学院院刊78(4):2072-6)；neo，其赋予对氨基糖苷G-418的抗性(Wu GY和Wu CH(1991)生物疗法(Biotherapy)3:87-95；托尔斯泰夫P(Tolstoshev P)(1993)药理学和毒理学的年度评论(Ann Rev Pharmacol Toxicol)32:573-596；马利根RC(1993)科学(Science)260:926-932；以及摩尔根RA(Morgan RA)和安德森WF(Anderson WF)(1993)生物化学年鉴(Ann RevBiochem)62:191-217；纳贝尔GJ(Nabel GJ)和费格纳PL(Felgner PL)(1993)生物技术趋势(Trends Biotechnol)11(5):211-5)；和hygro，其赋予对潮霉素的抗性(桑特雷RF(Santerre RF)等人，(1984)基因30(1-3):147-56)。可以常规地应用重组DNA技术领域中已知的方法来选择期望的重组克隆，并且此类方法描述于以下文献中：例如，奥斯贝FM(Ausubel FM)等人，(编辑)，当代分子生物学实验指南，约翰威利父子出版社(John Wiley&Sons)，纽约(1993)；克里格勒M(Kriegler M)，基因转移和表达，实验室手册(GeneTransfer and Expression,A Laboratory Manual)，斯托克顿出版社(Stockton Press)，纽约(1990)；以及德拉科波利NC(Dracopoli NC)等人，(编辑)，当代人类遗传学实验指南(Current Protocols in Human Genetics)，第12章和第13章，约翰威利父子出版社，纽约(1994)；科伯乐-卡拉并F(Colbère-Garapin F)等人，(1981)分子生物学杂志150:1-14，所述文献以全文引用的方式并入本文。

通过载体扩增，可以增加抗体分子的表达水平(综述参见巴宾顿CR(BebbingtonCR)和亨舍尔CCG(Hentschel CCG)，基于基因扩增的载体在DNA克隆中在哺乳动物细胞中表达克隆基因的用途(The use of vectors based on gene amplification for theexpression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning)，第3卷(学术出版社(Academic Press)，纽约，1987))。当载体系统中表达抗体的标志物可扩增时，宿主细胞培养物中存在的抑制剂水平的增加将增加标志物基因的复本数。由于扩增的区域与抗体基因缔合，因此抗体的产生也将增加(克劳斯GF(Crouse GF)等人，(1983)分子细胞生物学(Mol Cell Biol)3:257-66)。

宿主细胞可以用本文所述的两种或更多种表达载体共转染，第一载体编码重链衍生的多肽并且第二载体编码轻链衍生的多肽。这两种载体可以含有相同的可选标志物，所述可选标志物使重链多肽和轻链多肽能够相等地表达。宿主细胞可以与不同量的两种或更多种表达载体一起共转染。例如，宿主细胞可以与以下比率中的任何一种比率下的第一表达载体和第二表达载体一起共转染：1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:12、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45或1:50。

可替代地，可以使用对重链多肽和轻链多肽两者进行编码并且能够表达重链多肽和轻链多肽两者的单个载体。在这种情况下，应将轻链放在重链之前，以避免过量的无毒重链(普洛德弗NJ(Proudfoot NJ)(1986)自然(Nature)322:562-565；和科勒G(

G)(1980)美国国家科学院院刊77:2197-2199)。重链和轻链的编码序列可以包含cDNA或基因组DNA。表达载体可以是单顺反子或多顺反子。多顺反子核酸构建体可以对2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个或者2至5个、5至10个或10至20个范围内的基因/核苷酸序列进行编码。例如，双顺反子核酸构建体可以按以下顺序包含启动子、第一基因(例如，本文所公开的抗体的重链)和第二基因(例如，本文所公开的抗体的轻链)。在这种表达载体中，这两个基因的转录可以由启动子驱动，而来自第一基因的mRNA的翻译可以通过帽依赖性扫描机制驱动，并且来自第二基因的mRNA的翻译可以通过非帽依赖性机制(例如，通过IRES)驱动。

一旦通过重组表达产生了本文所公开的抗体分子，就可以通过本领域中已知的用于纯化免疫球蛋白分子的任何方法将所述抗体分子纯化，例如，通过色谱法(例如，离子交换、亲和力(特别是蛋白A后对特定抗原的亲和力)和分级柱色谱法)、离心、差别溶解或通过用于蛋白质纯化的任何其它标准技术。进一步地，本文所公开的抗体可以与本文所公开的或本领域已知的异源多肽序列融合，以促进纯化。

在具体实施例中，分离或纯化本文所公开的抗体。一般来说，分离抗体是基本上不含具有与分离抗体不同的抗原特异性的其它抗体的抗体。例如，在特定实施例中，本文所公开的抗体制剂基本上不含细胞材料或化学前体。措辞“基本上不含细胞材料”包括抗体的制剂，其中抗体与分离的或以重组方式产生的细胞的细胞组分分离。因此，基本上不含细胞材料的抗体包括具有少于约30％、20％、10％、5％、2％、1％、0.5％或0.1％(按干重计)异源蛋白(本文中也被称为“污染蛋白”)的抗体制剂或抗体的变体，例如，抗体的不同翻译后修饰形式或抗体的其它不同版本(例如，抗体片段)。当重组产生抗体时，所述抗体通常还基本上不含培养基，即，培养基占蛋白质制剂体积的小于约20％、10％、2％、1％、0.5％或0.1％。当抗体通过化学合成产生时，它通常基本上不含化学前体或其它化学物质，即它与参与蛋白质合成的化学前体或其它化学物质分离。因此，此类抗体制剂具有少于约30％、20％、10％或5％(以干重计)的除目标抗体以外的化学前体或化合物。在具体实施例中，分离或纯化本文所公开的抗体。

可以通过本领域中已知的用于合成抗体的任何方法产生特异性结合至ApoC3(例如，人类或食蟹猕猴ApoC3)的抗体，例如，通过化学合成或通过重组表达技术。除非另有指示，否则本文所公开的方法采用分子生物学、微生物学、遗传分析、重组DNA、有机化学、生物化学、PCR、寡核苷酸合成与修饰、核酸杂交以及本领域技术范围内的相关领域的常规技术。这些技术描述在例如本文所引用的参考文献中并且在文献中进行了充分解释。参见例如，马尼亚迪斯T(Maniatis T)等人，(1982)分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)；萨布鲁克J(Sambrook J)等人，(1989)分子克隆：实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社；萨布鲁克J等人，(2001)《分子克隆：实验室手册》，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约；奥斯贝FM等人，《当代分子生物学实验指南》，约翰威利父子出版社(1987年和年度更新)；《当代免疫学实验指南(Current Protocols in Immunology)》，约翰威利父子出版社(1987年和年度更新)盖特(Gait)(编辑)(1984)寡核苷酸合成：一种实用方法(OligonucleotideSynthesis:A Practical Approach)，IRL出版社；埃克斯坦(Eckstein)(编辑)(1991)寡核苷酸和类似物：一种实用方法(Oligonucleotides and Analogues:A PracticalApproach)，IRL出版社；Birren B等人，(编辑)(1999)基因组分析：实验室手册(GenomeAnalysis:A Laboratory Manual)，冷泉港实验室出版社。

在具体实施例中，本文所公开的抗体是通过涉及产生的任何方式(例如，通过DNA序列的合成、基因工程化)制备、表达、产生或分离的抗体(例如，重组抗体)。在某些实施例中，这类抗体包含不天然存在于动物或哺乳动物(例如，人类)体内的抗体胚系谱中的序列(例如，DNA序列或氨基酸序列)。

在一方面，本文提供了一种制备特异性结合至ApoC3(例如，人类或食蟹猕猴ApoC3)的抗体的方法，所述方法包含培养本文所公开的细胞或宿主细胞。在某个方面，本文提供了一种制备特异性结合至ApoC3(例如，人类或食蟹猕猴ApoC3)的抗体的方法，所述方法包含使用本文所公开的细胞或宿主细胞(例如，包含对本文所公开的抗体进行编码的聚核苷酸的细胞或宿主细胞)表达(例如，重组表达)所述抗体。在特定实施例中，细胞是分离细胞。在特定实施例中，已经将外源聚核苷酸引入到细胞中。在特定实施例中，所述方法进一步包含纯化从细胞或宿主细胞获得的抗体的步骤。

用于产生多克隆抗体的方法是本领域已知的(参见例如，精编分子生物学实验指南(Short Protocols in Molecular Biology)，(2002)第5版，第11章，奥斯贝FM等人编辑，约翰威利父子出版社，纽约)。

单克隆抗体可以使用本领域中已知的各种技术制备，包括使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术或其组合。例如，单克隆抗体可以使用杂交瘤技术产生，包括本领域中已知和例如哈洛E(Harlow E)&莱恩D(Lane D)，抗体实验指南(Antibodies:A LaboratoryManual)，(冷泉港实验室出版社，第2版1988)；哈默林GJ(Hammerling GJ)等人，单克隆抗体和T细胞杂交瘤(Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas)563 681(纽约州爱思唯尔(Elsevier，N.Y.)，1981)中所教导的那些技术。如本文所用的术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。例如，单克隆抗体可以由外源表达本文所公开的抗体(例如，所述抗体的轻链或重链)的宿主细胞重组产生。

在具体实施例中，如本文所用，“单克隆抗体”是由单细胞(例如，产生重组抗体的杂交瘤或宿主细胞)产生的抗体，其中所述抗体特异性结合至ApoC3(例如，人类或食蟹猕猴ApoC3)，如通过例如ELISA或本领域或本文提供的实例中已知的其它抗原结合或竞争性结合测定所确定的。在特定实施例中，单克隆抗体可以是嵌合抗体或人类化抗体。在某些实施例中，单克隆抗体是单价抗体或多价(例如，二价)抗体。在特定实施例中，单克隆抗体是单特异性或多特异性抗体(例如双特异性抗体)。例如，可以通过如科勒G(Kohler G)和米尔斯坦C(Milstein C)(1975)自然256:495中所述的杂交瘤方法制备本文所公开的单克隆抗体，或者可以例如使用本文所公开的技术从噬菌体文库中分离所述单克隆抗体。由此表达的单克隆抗体的克隆细胞系的其它制备方法是本领域中众所周知的(参见例如精编分子生物学实验指南第11章，(2002)第5版，奥斯贝FM等人，同上)。

使用杂交瘤技术制造和筛选特异性抗体的方法在本领域中是常规的和众所周知的。例如，在杂交瘤方法中，对小鼠或其它合适的宿主动物(如绵羊、山羊、兔子、大鼠、仓鼠或猕猴)进行免疫，从而诱导产生或能够产生特异性结合至用于免疫的蛋白质(例如，ApoC3(例如，人类或食蟹猕猴ApoC3))的抗体的淋巴细胞。可替代地，可在体外免疫淋巴细胞。淋巴细胞接着可以使用合适的融合剂(例如聚乙二醇)与骨髓瘤细胞融合，形成融合瘤细胞(戈丁JW(Goding JW)(编辑)单克隆抗体：原理和实践(Monoclonal Antibodies:Principles and Practice)，第59页-第103页(学术出版社(Academic Press),1986))。另外，可以使用RIMMS(重复免疫多位点)技术来对动物进行免疫(基尔帕特里克KE(Kilpatrick KE)等人，(1997)杂交瘤(Hybridoma)16:381-9，通过引用整体并入本文)。

在一些实施例中，可以用抗原(例如，ApoC3(例如，人类或食蟹猕猴ApoC3))对小鼠(或其它动物，如大鼠、猴子、驴、猪、绵羊、仓鼠或狗)进行免疫，并且一旦检测到免疫应答，例如在小鼠血清中检测到对抗原特异的抗体，就收获小鼠脾脏并分离脾细胞。脾细胞然后通过熟知技术与任何合适的骨髓瘤细胞融合，例如与来自可从美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection，

)(弗吉尼亚州马纳萨斯(Manassas，VA))获得的细胞系SP20的细胞融合，形成杂交瘤。选择杂交瘤并通过有限稀释进行克隆。在某些实施例中，收集已免疫小鼠的淋巴结并将其与NS0骨髓瘤细胞融合。

将由此制备的杂交瘤细胞播种并在合适的培养基中生长，所述培养基优选地含有一种或多种抑制未融合的亲代骨髓瘤细胞的生长或存活的物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，那么杂交瘤的培养基通常将包括次黄嘌呤、氨基喋呤(aminopterin)和胸苷(HAT培养基)，这些物质防止HGPRT缺陷型细胞的生长。

具体实施例采用有效融合、支持所选抗体产生型细胞稳定地高-水平产生抗体并且对培养基敏感(如HAT培养基)的骨髓瘤细胞。在这些骨髓瘤细胞系中有鼠类骨髓瘤系，如NS0细胞系，或来源于可从美国加利福尼亚州圣地亚哥(San Diego，CA，USA)的索尔克研究所细胞分配中心(Salk Institute Cell Distribution Center)获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的骨髓瘤细胞系，以及可从美国马里兰州罗克维尔(Rockville，MD，USA)的美国菌种保藏中心获得的SP-2或X63-Ag8.653细胞。人类骨髓瘤和小鼠-人类杂交骨髓瘤细胞系也已被描述用于产生人类单克隆抗体(科兹博D(Kozbor D)(1984)免疫学杂志133:3001-5；布罗德(Brodeur)等人，单克隆抗体产生技术和应用(Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications)，第51-63页(马塞尔德克公司(Marcel Dekker公司)，纽约，1987))。

测定生长杂交瘤细胞的培养基中针对ApoC3(例如，人类或食蟹猕猴ApoC3)的单克隆抗体的产生。通过本领域已知的方法(例如，免疫沉淀)或通过体外结合测定法(如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA))来确定杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。

在鉴定出产生具有期望的特异性、亲和力或活性的抗体的杂交瘤细胞之后，可以通过有限的稀释程序对克隆子进行亚克隆，并通过标准方法生长(戈丁JW(Goding JW)(编辑)，单克隆抗体：原理和实践，同上)。用于这一目的的合适的培养基包括例如D-MEM或RPMI1640培养基。另外，融合瘤细胞可以在动物中体内生长成腹水肿瘤。

可以通过常规免疫球蛋白纯化程序，例如蛋白质A-琼脂糖凝胶、羟磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析或亲和色谱法，将亚克隆分泌的单克隆抗体与培养基、腹水液或血清适当地分离。

本文所公开的抗体包括识别特异性ApoC3(例如，人类或食蟹猕猴ApoC3)的抗体片段，并且可以通过本领域技术人员已知的任何技术来生成。例如，可以通过使用酶对免疫球蛋白分子进行蛋白水解切割来产生本文所公开的Fab和F(ab')₂片段，如木瓜蛋白酶(产生Fab片段)或胃蛋白酶(产生F(ab')₂片段)。Fab片段对应于抗体分子的两个相同臂之中的一个臂，并且含有与重链的VH和CH1结构域配对的完整轻链。F(ab')₂片段含有通过铰链区中的二硫键连接的抗体分子的两个抗原结合臂。

进一步地，还可以使用本领域中已知的各种噬菌体展示方法生成本文所公开的抗体。在噬菌体展示方法中，将功能性抗体结构域展示在携带对其进行编码的聚核苷酸序列的噬菌体颗粒的表面上。具体来说，编码VH和VL结构域的DNA序列从动物cDNA文库(例如受影响组织的人类或鼠类cDNA文库)扩增。通过PCR将对VH结构域和VL结构域进行编码的DNA与scFv接头重组在一起，并将其克隆到噬菌粒载体中。载体被电穿孔到大肠杆菌中，并且用辅助噬菌体对大肠杆菌进行感染。在这些方法中使用的噬菌体通常是丝状噬菌体，包括fd和M13，并且VH结构域和VL结构域通常与噬菌体基因III或基因VIII重组地融合。表达结合至特定抗原的抗原结合结构域的噬菌体可以用抗原，例如，使用标记的抗原或者结合或捕获到固体表面或珠粒的抗原，进行选择或鉴别。可用于制备本文所公开的抗体的噬菌体展示方法的实例包括以下文献中所描述的噬菌体展示方法：布林克曼U(Brinkman U)等人，(1995)免疫学方法杂志(J Immunol Methods)182:41-50；艾姆斯RS(Ames RS)等人，(1995)免疫学方法杂志184:177-186；凯勒伯夫CA(Kettleborough CA)等人，(1994)《欧洲免疫学杂志(Eur J Immunol)》24:952-958；普利司可L(Persic L)等人，(1997)基因187:9-18；伯顿DR(Burton DR)和巴巴斯Cf(Barbas CF)(1994)免疫学进展(Advan Immunol)57:191-280；PCT申请号PCT/GB91/001134；国际公开号WO 90/02809、WO 91/10737、WO 92/01047、WO92/18619、WO 93/1 1236、WO 95/15982、WO 95/20401和WO 97/13844；以及美国专利第5,698,426号、第5,223,409号、第5,403,484号、第5,580,717号、第5,427,908号、第5,750,753号、第5,821,047号、第5,571,698号、第5,427,908号、第5,516,637号、第5,780,225号、第5,658,727号、第5,733,743号和第5,969,108号。

如以上参考文献中所描述，在噬菌体选择之后，来自噬菌体的抗体编码区可以分离并用于产生全抗体(包括人类抗体)，或任何其它所需抗原结合片段，并且在任何所需宿主(包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌)中表达，例如如下文所描述。还可以采用使用本领域已知的方法重组产生抗体片段(如Fab、Fab'和F(ab')₂片段)的技术，如以下文献中所公开的方法：PCT公开号WO 92/22324；马利纳克斯RL(Mullinax RL)等人，(1992)生物技术12(6):864-9；沙怀H(Sawai H)等人，(1995)美国生殖免疫学杂志(Am JReprod Immunol)34:26-34；以及贝特尔M(Better M)等人，(1988)科学240:1041-1043。

在某些实施例中，为了产生全抗体，包括VH或VL核苷酸序列、限制位点和保护限制位点的侧翼序列的PCR引物可以用于从模板(例如，scFv克隆)扩增VH或VL序列。利用本领域技术人员已知的克隆技术，可以将PCR扩增的VH结构域克隆到表达VH恒定区的载体中，并且可以将PCR扩增的VL结构域克隆到表达VL恒定区(例如，人类κ或λ恒定区)的载体中。VH和VL结构域也可以克隆到表达必需恒定区的一个载体中。接着使用本领域技术人员已知的技术将重链转换载体和轻链转换载体共转染至细胞系中，产生表达全长抗体，例如IgG的稳定或短暂细胞株。

嵌合抗体是抗体的不同部分来源于不同免疫球蛋白分子的分子。例如，嵌合抗体可以含有融合到人类抗体的恒定区的小鼠或大鼠单克隆抗体的可变区。用于产生嵌合抗体的方法是本领域已知的。参见例如莫里森SL(Morrison SL)(1985)科学229:1202-7；Oi VT&莫里森SL(1986)生物技术4:214-221；吉利斯SD(Gillies SD)等人，(1989)免疫学方法杂志125:191-202；以及美国专利第5,807,715号、第4,816,567号、第4,816,397号和第6,331,415号。

人类化抗体能够结合至预定抗原，并且所述预定抗原包含基本上具有人类免疫球蛋白氨基酸序列的框架区和基本上具有非人类免疫球蛋白(例如，鼠免疫球蛋白)氨基酸序列的CDR。在特定实施例中，人类化抗体还包含免疫球蛋白恒定区((Fc)的至少一部分，典型地人类免疫球蛋白的恒定区的一部分。抗体还可以包括重链的CH1、铰链、CH2、CH3和CH4区。人类化抗体可以选自免疫球蛋白的任何类别，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，和任何同种型，包括IgG₁、IgG₂、IgG₃和IgG₄。人源化抗体可以使用本领域中已知的多种技术产生，包括(但不限于)CDR-移植(欧洲专利第EP 239400号；国际公开第WO 91/09967号；和美国专利第5,225,539号、第5,530,101号和第5,585,089号)、镶嵌(veneering)或表面重塑(resurfacing)(欧洲专利第EP 592106号和第EP 519596号；派得兰EA(Padlan EA)(1991)分子免疫学28(4/5):489-498；司徒尼卡GM(Studnicka GM)等人，(1994)蛋白质工程(ProtEngineering)7(6):805-814；和罗古斯卡MA(Roguska MA)等人，(1994)PNAS 91:969-973)、链改组(美国专利第5,565,332号)和例如，美国专利第6,407,213号、美国专利第5,766,886号、国际公开第WO 93/17105号；Tan P等人，(2002)免疫学杂志169:1119-25；卡尔达C(Caldas C)等人，(2000)蛋白质工程13(5):353-60；莫雷亚V(Morea V)等人，(2000)方法20(3):267-79；巴卡M(Baca M)等人，(1997)生物化学杂志272(16):10678-84；罗古斯卡MA等人，(1996)蛋白质工程9(10):895 904；库托JR(Couto JR)等人，(1995)癌症研究.55(23增刊):5973s-5977s；库托JR等人，(1995)癌症研究55(8):1717-22；桑胡JS(Sandhu JS)(1994)基因150(2):409-10；和佩德森JT(Pedersen JT)等人，(1994)分子生物学杂志235(3):959-73中公开的技术。还参见美国专利公开案第US 2005/0042664 Al(2005年2月24)，所述文献全部引用整体并入本文。

已经描述了用于制备多特异性(例如，双特异性抗体)的方法，参见例如，美国专利第7,951,917号；第7,183,076号；第8,227,577号；第5,837,242号；第5,989,830号；第5,869,620号；第6,132,992号和第8,586,713号。

单结构域抗体，例如缺乏轻链的抗体，可以通过本领域中众所周知的方法产生。参见莱克曼L(Riechmann L)&穆德曼S(Muyldermans S)(1999)免疫学杂志231:25-38；努塔尔SD(Nuttall SD)等人，(2000)当今药物生物技术(Curr Pharm Biotechnol)1(3):253-263；穆德曼S，(2001)《生物技术杂志》(J Biotechnol)74(4):277-302；美国专利第6,005,079号；以及国际公开第WO 94/04678号、第WO 94/25591号和第WO 01/44301号。

进一步地，可以使用本领域技术人员众所周知的技术，进而使用特异性结合至ApoC3(例如，人类或食蟹猕猴ApoC3)的抗体来生成“模拟”抗原的抗独特型抗体。(参见例如，格林斯潘NS(Greenspan NS)和博纳CA(Bona CA)(1989)实验生物学学会联合会杂志(FASEB J)7(5):437-444；和尼西诺夫A(Nissinoff A)(1991)《免疫学杂志》147(8):2429-2438)。

在特定实施例中，与本文所公开的抗ApoC3(例如，人类或食蟹猕猴ApoC3)抗体结合相同的ApoC3抗原决定基的本文所公开的抗体是人类抗体。在特定实施例中，竞争性地阻断(例如，以剂量依赖性方式)本文所公开的任何一种抗体与ApoC3(例如，人类或食蟹猕猴ApoC3)结合的本文所公开的抗体是人类抗体。人类抗体可以使用本领域中已知的任何方法产生。例如，可以使用不能表达功能性内源免疫球蛋白但可以表达人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠。具体来说，人类重链和轻链免疫球蛋白基因复合物可以随机地或通过同源重组引入小鼠胚胎干细胞中。可替代地，除人类重链和轻链基因外，还可以将人类可变区、恒定区和多样性区引入到小鼠胚胎干细胞中。在通过同源重组将小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因引入人类免疫球蛋白基因座时，可以使所述小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因分别或同时变为无功能。确切地说，J_H区域的纯合缺失将防止产生内源性抗体。将经过修饰的胚胎干细胞扩展并显微注射到胚泡中，从而产生嵌合小鼠。然后，饲养嵌合小鼠，以产生表达人类抗体的纯合后代。用所选抗原(例如，抗原(例如，ApoC3(例如，人类或食蟹猕猴ApoC3))的全部或一部分)以正常方式对转基因小鼠进行免疫。可以使用常规的杂交瘤技术从免疫的转基因小鼠中获得针对抗原的单克隆抗体。转基因小鼠携带的人类免疫球蛋白转基因在B细胞分化过程中会重排，随后进行类别转换和体细胞突变。因此，使用此类技术，有可能产生治疗上有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。有关用于产生人类抗体的这项技术的概述，请参见隆伯格N(Lonberg N)和胡萨尔D(Huszar D)(1995)免疫学国际综述(Int Rev Immunol)13:65-93。关于人类抗体和人类单克隆抗体的这种制造技术和这类抗体的制造方案的详细论述，参见例如国际公开第WO 98/24893号、第WO 96/34096号和第WO 96/33735号；以及美国专利第5,413,923号、第5,625,126号、第5,633,425号、第5,569,825号、第5,661,016号、第5,545,806号、第5,814,318号和第5,939,598号。能够产生人类抗体的小鼠的实例包括Xenomouse^TM(安根尼克斯公司(Abgenix,Inc.)；美国专利第6,075,181号和第6,150,184号)、HuAb-Mouse^TM(美达瑞公司(Mederex,Inc.)/吉恩药业(Gen Pharm)；美国专利第5,545,806号和第5,569,825号)、Trans Chromo Mouse^TM(麒麟(Kirin))以及KM Mouse^TM(美达瑞/麒麟)。

可以通过本领域已知的多种方法来制备特异性结合至ApoC3(例如，人类或食蟹猕猴ApoC3)的人类抗体，包括使用衍生自人类免疫球蛋白序列的抗体文库的上述噬菌体展示方法。还参见美国专利第4,444,887号、第4,716,111号和第5,885,793号；以及国际公开第WO 98/46645号、第WO 98/50433号、第WO 98/24893号、第WO 98/16654号、第WO 96/34096号、第WO 96/33735号和第WO 91/10741号。

在一些实施例中，人类抗体可以使用小鼠-人类杂交瘤产生。例如，可以将用爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)转化的人类外周血淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，以产生分泌人类单克隆抗体的小鼠-人杂交瘤，并且可以筛选这些小鼠-人类杂交瘤，从而确定分泌特异性结合至靶抗原(例如，ApoC3(例如，人类或食蟹猕猴ApoC3))的人类单克隆抗体的杂交瘤。这种方法在本领域中是已知的并且进行了描述，参见例如，新本H(Shinmoto H)等人，(2004)细胞技术学(Cytotechnology)46:19-23；长绳Y(Naganawa)Y等人，(2005)人类抗体(HumanAntibodies)14:27-31。

6.试剂盒

还提供了试剂盒，所述试剂盒包含一种或多种本文所公开的抗体或其医药组合物或缀合物。在具体实施例中，本文提供了一种医药包装或试剂盒，所述医药包装或试剂盒包含一个或多个填充有本文所公开的医药组合物的一种或多种成分(如本文所提供的一种或多种抗体)的容器。在一些实施例中，所述试剂盒含有本文所公开的医药组合物以及任何预防剂或治疗剂，如本文所公开的预防剂或治疗剂。任选地与这样的容器相关的可以是呈由管理医药或生物产品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的注意事项，所述注意事项反映了所述机构对用于人类投予的制造、使用或销售的批准。

还提供了可以在上述方法中使用的试剂盒。在一个实施例中，试剂盒在一个或多个容器中包含本文所公开的抗体，优选地为经纯化的抗体。在具体实施例中，本文所公开的试剂盒含有基本上分离的ApoC3(例如，人类或食蟹猕猴ApoC3)抗原作为对照。在另一个具体实施例中，本文所公开的试剂盒进一步包含不与ApoC3(例如，人类或食蟹猕猴ApoC3)抗原反应的对照抗体。在另一个具体实施例中，本文所公开的试剂盒含有一个或多个用于检测抗体与ApoC3(例如，人类或食蟹猕猴ApoC3)抗原的结合的元件(例如，可以将抗体与如荧光化合物、酶底物、放射性化合物或发光化合物等可检测底物缀合，或者可以将识别第一抗体的第二抗体与可检测底物缀合)。在具体实施例中，本文所提供的试剂盒可以包括重组产生的或化学合成的ApoC3(例如，人类或食蟹猕猴ApoC3)抗原。也可以将试剂盒中提供的ApoC3(例如，人类或食蟹猕猴ApoC3)抗原连接到固体支撑物上。在更具体的实施例中，上述试剂盒的检测装置包括ApoC3(例如，人类或食蟹猕猴ApoC3)抗原所连接的固体支撑物。这种试剂盒还可以包括未连接的报道分子标记的抗人类抗体或抗小鼠/大鼠抗体。在这个实施例中，可以通过所述报道分子标记的抗体的结合来检测抗体与ApoC3(例如，人类或食蟹猕猴ApoC3)抗原的结合。

实例

申请人先前已经鉴别出特异性结合至人类ApoC3但不展现明显结合至食蟹猕猴ApoC3的单克隆抗体(克隆体5E5，阐述于WO/2018/007999中)。本公开提供来源于克隆体5E5的新颖抗ApoC3抗体，所述抗体特异性结合至人类和食蟹猕猴ApoC3两者。以下实例描述这些新颖抗体的产生和表征。新颖抗体的氨基酸序列阐述于本文表1至5中。

提供本节中的实例是为了进一步阐明本申请的优点和特征，但并不旨在限制本申请的范围。

实例1：鉴别结合至人类和食蟹猕猴ApoC3两者的抗体

1.1产生和筛选轻链改组期文库

如WO/2018/007999中所描述，抗Apoc3抗体克隆体5E5先前从来源于用人类ApoC3免疫的骆驼的噬菌体文库分离(下文称为“5E5文库”)。为了鉴别特异性结合至人类和食蟹猕猴ApoC3两者的新颖抗体，产生新颖scFv噬菌体文库，其中来自5E5文库的VL的编码序列与5E5 VH的编码序列一起亚克隆到pSC1噬菌粒载体的ApaLI和AscI限制位点中，使得所得噬菌体文库的个别成员经编码的scFv包含5E5 VH以及不同VL的组合。文库具有大于10⁸的多样性。

为了富集结合至人类和食蟹猕猴ApoC3两者的scFv，使用上文所描述的轻链改组噬菌体呈现文库的噬菌体展示选择在原生人类和/或重组食蟹猕猴ApoC3(分别为nhuApoC3和rcyApoC3)两者上进行。采用两个单独的选择策略。在第一策略中，在对nhuApoC3的第一回合平移选择中选择噬菌体展示文库，接着对中性抗生物素蛋白捕获的生物素标记的rcyApoC3进行连续两个回合的选择。在第二策略中，在对中性抗生物素蛋白捕获的生物素标记的rcyApoC3的两个连续回合中选择噬菌体展示文库。对于所有选择，用胰蛋白酶在中性pH 7.4下进行洗脱。作为对照，对原生huApoC3的选择与对rcyApoC3的所有选择回合并行地进行。对噬菌体输入和输出进行滴定和点样以测定噬菌体效价和输出大小。计算增浓且将其与阴性对照选择(未涂布的孔/PBS)进行比较。

在上文所描述的噬菌体增浓之后，将受噬菌体感染的大肠杆菌TG1的个别菌落拾取到96孔的主培养板(MPs)中。由两种MPs(MP29和MP30)制备周质萃取物(含有可溶单克隆scFv)。通过ELISA测定scFv在涂布有中性抗生物素蛋白的孔中在10nM下捕获的生物素标记的nhuApoC3抗原和rcyApoC3抗原的能力。以1:5000稀释使用抗c-myc HRP缀合抗体(贝瑟尔(Bethyl)#A190-105P))检测scFv。来自MP29的总共30个克隆体和来自MP30的76个克隆体对于rcyApoC3结合为阳性的(对于rcyApoC3，OD450nm值大于0.100)。

然后使用SPR筛选来自上文所描述的ELISA分析的阳性scFv克隆体以评估其目标缔合和解离特征。根据制造商说明书，在pH 7.4下在涂布有抗生蛋白链菌素的芯片(SACHIP；通用电气医疗集团(GE Healthcare)#BR-100398)上捕获生物素标记的huApoC3和rcyApoc3。简单来说，注射20μl的10μg/ml生物素标记的抗原以达到大约500RU的表面密度。将周质萃取物在HBS-EP缓冲液(pH 7.4)(通用电气医疗集团#BR-1008-26)中稀释1:5倍，并且注射60μl的这些经稀释的提取物中的每一者且使其以30μl/分钟穿过流槽。在pH 7.4下进行解离速率洗涤5分钟。在解离之后，通过注射10μl的10mM NaOH/1M NaCl，接着在pH 1.5下注射10μl的10mM甘氨酸来重新生成流槽表面。

使用BIAevaluation 4.1软件，应用朗格缪尔1:1(Langmuir 1:1)结合模型分析所得传感图，以导出解离速率参数。将数据调零，并减去参考细胞传感图。使用传感器图的解离阶段估计解离速率值，且将其与不同抗原的每一克隆体相比较。所选择的抗体的结合特征展示于表6中。

表6.SPR亲和性测量

如果rcyApoC3的R0值高于45RU(即，是WT 5E5克隆体的R0值的三倍)，那么结合nhuApoC3的克隆体被视为也结合rcyApoC3。对结合至人类和食蟹猕猴ApoC3两者的克隆体进行测序以分析可变轻链的多样性。示例性人类和食蟹猕猴ApoC3结合抗体的序列阐述于本文的表1至5中。

实例2：IgG抗体产生和纯化

基于来自实例1中所描述的ELISA结合分析和SPR分析的数据，选择表6中的scFv克隆体用于IgG格式化和小规模蛋白质产生。通过将每个可变区克隆到pCDNA3.1Neo哺乳动物表达载体的BsmBI位点中，将scFv克隆体重新格式化成IgG。

对于抗体产生，用40μg VH和VL pCDNA3.1 Neo质粒DNA转染50ml ExpiCHO-S细胞并且培养8天。然后通过离心去除细胞并且在4℃下储存上清液。

使用

纯系统上的HiTrap MabSelect SuRe柱(GE#11-0034-94)纯化IgG。使用0.1M柠檬酸盐缓冲剂在pH 3.0下洗脱IgG，并且在含有0.1ml Tris-HCl pH 9.0的试管中收集为1.0ml馏分用于中和。将含有抗体的馏分合并，并使用

纯系统上的HiTrap脱盐柱在1x磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS；NaCl 137mM，KCl 3mM，Na2HPO4 8mM，KH2PO4 15mM，pH7.4)中脱盐。通过测量280nm处的吸光度并使用消光系数进行如下校正来确定蛋白质浓度：(A280nm-A340nm)/ε(消光系数，单位为g/L)。通过SDS-PAGE在还原和非还原条件下确认样品的大小和纯度。

实例3：抗ApoC3 IgG抗体的结合特征的分析

在此实例中，对实例2中所描述的全长IgG进行SPR分析以评估新颖轻链抗体与人类和食蟹猕猴ApoC3的结合特征。以三种形式呈现目标：固定抗原、捕获的抗原和捕获的mAb。

3.1使用固定抗原的SPR

原生huApoC3蛋白质固定在CM5芯片上(通用电气医疗集团#BR100012)。使用NHS/EDC试剂盒(Biacore AB)根据由Biacore提供的方法进行固定。简单来说，在芯片活化之后，在pH 4.5下注射60μg/ml的人类ApoC3于10mM乙酸盐缓冲液中的溶液直到表面密度达到大约500RU。然后，注射60μL的于HBS-EP缓冲液(GE#BR-1008-26；0.010M HEPES，0.150M NaCl，3mM EDTA，0.05％(v/v)表面活性剂P20，pH 7.4)中的1至100nM的测试抗体且使其以30μl/分钟穿过流槽。在pH 7.4下进行解离速率洗涤5分钟。在解离之后，通过注射10μl的10mMNaOH/1M NaCl，并且在pH 1.5下注射10μl的10mM甘氨酸来重新生成流槽表面。

使用BIAevaluation 4.1软件，使用朗格缪尔1:1结合模型分析所得传感图，以导出结合动力学。将数据调零，并减去参考细胞传感图。表7给出了所测试的IgG克隆体的计算出的动力学参数的概述。总的来说，克隆体具有对于人类目标的高亲和力(以与WT参考5E5IgG相同的顺序)和低解离速率(kd<1.0E-4 1/秒)值。对于所测试的大部分IgG克隆体，观察到特异性结合至食蟹猕猴目标，所述IgG克隆体具有可变解离速率值。

表7.使用固定抗原的分析的SPR结果

传感图减去空白通道并且双重引用至无分析物空白分析；n/a：不适用；低于kd的检测极限：1E06 1/秒；NS：无结合曲线对齐

3.2使用捕获的抗原的SPR

对于捕获的抗原途径，在pH 7.4下，在涂布有抗生蛋白链菌素的芯片(通用电气医疗医疗集团#BR100032)上捕获生物素标记的原生人类ApoC3。根据Biacore提供的方法，注射20μl的10μg/ml生物素标记的人类ApoC3直到表面密度达到大约500RU。遵循SPR方法和数据分析，如实例2.1中所描述。还使用具有29A06-N弧抗体作为捕获的抗原的这些方法进行SPR。29A06-N弧抗体包含SEQ ID NO:38中所阐述的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:50中所阐述的轻链氨基酸序列。

表8和9给出了所测试的IgG克隆体的计算出的动力学参数的概述。类似于固定抗原方法，大部分克隆具有对于人类目标的高亲和力和低解离速率值。另外，对于所测试的大部分IgG克隆体，观察到特异性结合至食蟹猕猴目标，所述IgG克隆体具有可变解离速率值。

表8.使用捕获的抗原的分析的SPR结果

表9.使用29A6-N弧作为捕获的抗原的分析的SPR结果

3.3使用捕获的抗体的SPR

使用反转分析方法，在CM5芯片(通用电气医疗集团#BR100012)上固定山羊抗人类IgG Fcγ特异性抗体(杰克逊免疫研究(Jackson ImmunoResearch)#109-005-098))。在NHS/EDC试剂盒(Biacore AB)中根据由Biacore提供的方法进行固定。简单来说，在芯片活化之后，在pH 5.0下注射30μg/ml的人类Fcγ抗体于10mM乙酸盐缓冲液中的溶液直到表面密度达到大约10,000RU。然后，注射于HBS-EP缓冲液(GE#BR-1008-26；0.010M HEPES，0.150M NaCl，3mM EDTA，0.05％(v/v)表面活性剂P20，pH 7.4)中的50nM的抗体且由处于至多800RU的密度的高亲和力抗huFcγ抗体捕获。在抗体捕获之后，注射100μl的HBSl-EP缓冲液且使其以30μl/分钟穿过流槽。为了结合目标，注射60μl的400nM、200nM、100nM或50nMApoC3蛋白质于HBS-EP缓冲液中。通过以30μl/分钟注射HBS-EP缓冲液进行解离速率洗涤5分钟。在解离之后，通过在pH 1.5下注射20μl的10mM甘氨酸来重新生成流槽表面。

使用BIAevaluation 4.1软件，使用朗格缪尔1:1结合模型分析所得传感图，以导出结合动力学。将数据调零，并减去参考细胞传感图。无分析物空白分析用于双重引用对应于nhuApoC3和rcyApoC3注射的传感图。解离和缔合阶段传感图分别拟合了4个不同的浓度曲线。如果RU最大值低于检测极限(即，<5RU)，那么从拟合排除传感图。表10给出了所测试的IgG克隆体的计算出的动力学参数的概述。SPR信号过低而无法计算所测试的所有mAb的动力学参数。然而，如使用固定抗原和捕获的抗原方法所观察到，大部分克隆体具有对于人类ApoC3的高亲和力和低解离速率值。另外，对于所测试的数个轻链IgG克隆体，观察到对食蟹猕猴ApoC3的特异性结合。

表10.使用捕获的抗体的分析的SPR结果

传感图减去空白通道，并双重引用至无分析物空白分析；n/a：不适用

实例4：在AAV8-huApoC3小鼠模型中抗ApoC3抗体29A06的药物动力学和药效动力学

此实例描述了小鼠模型中的抗ApoC3抗体29A06的体内表征，所述小鼠模型由于人类ApoC3的转基因表达而具有受损的三酸甘油酯清除率。

4.1小鼠模型的产生

将四十只63天大的称重为20至25g的雄性C57Bl6小鼠以12小时的白天/黑夜循环关养在玉米芯垫料上，每笼容纳5只。给小鼠喂养标准啮齿动物食物，并且允许自由饮水。对于人类ApoC3的过度表达，用250μL(3.5×1011个基因组复本)血清型8腺苷相关病毒载体腹膜内注射小鼠，所述病毒载体在肝脏特异性甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子下表达人类ApoC3。载体获自宾夕法尼亚州载体核心(Penn Vector Core)(宾夕法尼亚州大学的基因理论程序(Gene Therapy Program of the University of Pennsylvania))。投予后十四天，基于人类ApoC3水平的水平将小鼠分配到6组。经由后眼窝窦给小鼠抽血以建立t＝0给药前ApoC3水平。然后立即给小鼠皮下注射30mg/kg Hyhel5对照抗体、30mg/kg预生殖系、pH依赖性5E5VH5_VL8抗体(描述于PCT/IB2018/052780中)或10、25或50mg/kg 29A06测试抗体。经由后眼窝窦给小鼠抽血以获得在80μL 0.125％EDTA生理食盐水中的25μl全血样品。样品用于在给药后0小时、8小时、1天和2天分析人类ApoC3、小鼠ApoC3、三酸甘油酯和29A06抗体的水平。

4.2抗ApoC3抗体29A06的药效动力学

人类ApoC3 ELISA

96孔板(葛莱娜(Greiner)#655061)涂布有50μL的在PBS中的0.8μg/mL原发性ApoC3抗体(阿布凯姆兔多克隆抗人类ApoC3(Abcam rabbit polyclonal anti-humanApoC3)#ab21032)，并且在4℃下培育过夜。然后用200μL TBS-T(0.1％Tween-20)洗涤板4次，并且用200μL PBS/透明乳汁/BSA阻断缓冲液(皮尔斯透明乳汁阻断剂(Pierce ClearMilk Blocker)#37587加3％罗奇BSA馏份V(Roche BSA fraction V)、PBS中的无蛋白酶#03117332001或细胞科学原生BSA Cohn馏分V#CSI14635)在30℃下阻断90分钟。去除阻断缓冲液并且添加50μl的测试样品，所述测试样品在阻断缓冲液中以1:1200稀释。将板在混合下以300rpm室温培育2小时。在培育之后，用200μL的TBS-T洗涤板四次。接着，添加50μL的于阻断缓冲液中的0.10μg/mL二级抗体(阿布凯姆山羊多克隆生物素缀合物ApoC3(Abcamgoat polyclonal biotin-conjugate ApoC3)#ab21024)且将板在室温下以300rpm混合培育1小时。将板用TBS-T洗涤一次，添加在PBS中稀释100倍的50μL SA-HRP(阿布凯姆(Abcam)#34028)，并在室温下以300rpm混合培育30分钟。接着将板用200μL TBS-T洗涤4次，用80μL TMB(赛默超-TMB ELISA(Thermo Ultra-TMB ELISA)#34028)显影，然后用50μL0.5N HCl封端显影。使用在450nm下的分光光度计(SpectraMax M5，分子仪器公司(Molecular Devices))进行检测。样品中ApoC3的量由使用来自人类血浆的纯化ApoC3(阿森斯研究和技术(Athens Research and Technology))构建的标准曲线(SoftMax Pro软件，分子仪器公司)的4参数拟合计算。

如图1A和1B中所示，投予29A06抗体使得小鼠中人类ApoC3的剂量依赖性降低。对于10、25和50mg/kg的抗体剂量，在12小时内分别观察到大约25％、50％和75％的最大降低。当与pH依赖性5E5VH5_VL8抗体比较时，29A06具有较短作用持续时间。例如，用25mg/kg29A06处理的小鼠在给药后2天具有降低的功效，而30mg/kg剂量的5E5VH5_VL8持续降低ApoC3水平。

小鼠ApoC3 ELISA

如上文所描述，在具有以下修改的这个实例中遵循ELISA方法：以0.5μg/mL使用原发性ApoC3抗体(圣克鲁兹生物技术兔多克隆抗ApoC3(Santa Cruz Biotechnology rabbitpolyclonal anti-ApoC3)#SC50378)，将测试样品稀释为1:100，并且以0.6μg/mL使用二次抗体(阿布凯姆山羊多克隆生物素缀合物ApoC3#ab21024)。样品中小鼠ApoC3的量由使用重组小鼠ApoC3(蓝色天空生物服务(Blue Sky Bioservices))构建的标准曲线(SoftMax Pro软件，分子仪器公司)的4参数拟合计算。

人类和食蟹猕猴结合29A06抗体使得小鼠ApoC3蛋白质的剂量依赖性降低，如图2中所示。对于10、25和50mg/kg 29A06的剂量，在给药8小时后小鼠ApoC3水平分别减少了16％、24％和49％。在给药后24小时时，水平仍分别减少15％、36％和40％，且在给药后2天持续减少10％至24％。

血浆三酸甘油酯分析

通过使10μL经稀释的血浆与180μL赛默科技公司^TM(Thermo Scientific^TM)三酸甘油酯试剂(#TR22421)在96孔板(康宁科斯塔(Corning Costar)#9017)上一起培育来分析三酸甘油酯。在37℃下10分钟之后，在Spectramax M2(分子仪器公司)上读取540nm下的吸光度，并由甘油标准曲线的线性拟合(SoftMax Pro，分子仪器公司)计算三酸甘油酯浓度。

如图3A和3B中所示，在29A06抗体处理后血浆三酸甘油酯水平降低。在给药后8小时，对于10、25和50mg/kg的29A06的剂量，三酸甘油酯水平分别减少63％、18％和71％。在50mg/kg剂量的29A06的情况下观察到的三酸甘油酯含量降低71％对应于降低大约150mg/dL。用30mg/kg Hyhel5对照抗体处理的小鼠在给药后8小时经历三酸甘油酯水平降低大约34％。然而，给药后24小时将水平返回到基线。给药后8至24小时VH5VL8使三酸甘油酯水平降低大约22％，但水平在给药后2天返回到基线。

4.3抗ApoC3抗体29A06的药物动力学

如上文所描述，在具有以下修改的这个实例中，遵循ELISA方法：以2.0μg/mL使用原发性IgG抗体(菲茨杰拉德山羊抗人类IgG Fc多克隆(Fitzgerald goat anti-human IgGFc polyclonal)#41-XG57)，将测试样品稀释为1:1200，并且以0.05μg/mL使用二次抗体(阿布凯姆山羊抗人类IgG-Fc(生物素)多克隆(Abcam goat anti-human IgG-Fc(biotin)polyclonal)#ab97223)。由使用经纯化的测试抗体构建的标准曲线(SoftMax Pro，分子仪器公司)的4参数拟合计算出样品中IgG的量。如图4中所示，IgG水平在给药后约8小时增加并且达到峰值，并且然后降低。

实例5：在食蟹猕猴模型中的抗ApoC3抗体29A06-N弧的药物动力学和药效动力学

本实例描述食蟹猕猴模型中抗ApoC3抗体29A06-N弧的体内表征。29A06-N弧抗体包含SEQ ID NO:38中所阐述的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:50中所阐述的轻链氨基酸序列。

在本研究中包括五个3至4kg的非年幼雄性食蟹猕猴(食蟹猴)，并且可以先前以小分子给药。在治疗之前，仅使用两个动物确定循环ApoC3的水平。动物保持其原始笼型或群组，用自动浇水系统关养(至多3/性别/群组/笼型)于不锈钢笼中。维持关养条件，除非查士利华(Charles River)的研究指导和/或现场兽医认为不适当。在指定程序期间分离动物。在研究完成之后，所有动物都返回到测试设施群体以用于在适合的清除和恢复时段之后的进一步使用。将动物每日两次喂养PMI营养国际认证的灵长类食物(NutritionInternational Certified Primate Chow)No.5048。如临床征象或其它变化所批准，向动物提供补充饮食。在研究时，在前一天中在食物去除7PM的情况下将动物禁食过夜。在所有血液收集(包括研究前收集)之前，使禁食维持10至12小时，且接着重新调节早餐。根据测试设施标准操作程序提供晚餐。在第1天、第8天和第22天给药29A06-N弧抗体之前进行称重并且记录体重。剂量如表11中所示投予。

表11.用29A06-N弧抗体给药的食蟹猕猴

*仅对于研究前血液收集，^仅收集一次。

从未用于静脉内给药的外周静脉收集所有血液样品。在以下每个时间点处收集大约1mL的全血：研究前，给药后0小时、24小时、48小时、72小时、96小时、120小时、144小时和168小时。将全血样品储存在室温下至少30分钟并且不长于60分钟。在75分钟收集内冷冻血清并且在储存-80℃下直到分析为止。

5.1抗ApoC3抗体29A06-N弧的药效动力学

食蟹猕猴ApoC3 ELISA

如具有以下修改的实例4中所描述，遵循ELISA方法：以1.5μg/mL使用原发性ApoC3抗体(自产的抗人类食蟹猕猴结合；类别14C07)，将测试样品稀释为1:15000，并且以0.25μg/mL使用二次抗体(阿布凯姆山羊多克隆生物素缀合物ApoC3#ab21024)。样品中ApoC3的量由使用重组食蟹猕猴ApoC3(蓝色天空生物服务)构建的标准曲线(SoftMax Pro软件，分子仪器公司)的4参数拟合计算。

ApoC3的血清含量在投予29A06-N弧之后降低，如图5A和5B中所示。在第一次给药后24小时观察到降低44％。然而，ApoC3水平在给药后5天与6天之间返回给药前水平。在第8天投予第二给药之后，在给药后24小时，ApoC3的血清水平降低72％。再次，ApoC3水平在给药后5天返回到基线。类似地，在第22天的第三给药后，血清ApoC3水平在给药后24小时降低55％，其中所述水平在给药后3天与4天之间返回到基线。

食蟹猕猴ApoB ELISA

如具有以下修改的实例4中所描述，遵循ELISA方法：以2.0μg/mL使用原发性ApoB抗体(子午线生命科学山羊多克隆抗人类ApoB(Meridian Life Sciences goatpolyclonal anti-human ApoB)#K45253G)，将测试样品稀释为1:2000，并且以0.75μg/mL使用二次抗体(子午线生命科学山羊多克隆生物素缀合物ApoB 48/100#34003G)。样品中小鼠ApoB的量由使用小鼠VLDL(使用OptiPrep方法自产制备)构造的标准曲线(SoftMax Pro软件，分子仪器公司)的4参数拟合计算，假设ApoB为总VLDL重量的20％。血清ApoB水平与其基线、给药前值而不发生变化，如图6中所示。

血浆三酸甘油酯分析

遵循如实例4中所描述的方法。如图7A和7B中所示，分别给药后24至48小时，血清三酸甘油酯水平分别降低了三个剂量中的每一个的52％、40％和33％。然而，这些变化并不显著，可能归因于此有限数目的动物中的可变的给药前水平。

5.2抗ApoC3抗体29A06-N弧的药物动力学

如具有以下修改的实例3中所描述，遵循ELISA方法：以1.5μg/mL使用原发性IgG抗体(阿布凯姆Ab99771、小鼠单克隆4E3抗人类IgG1铰链重链)，将测试样品稀释为1:9000，并且以0.1μg/mL使用二次抗体(阿布凯姆山羊F(ab')2抗人类IgG-Fc(HRP)，吸收前((ab98595)))。由使用经纯化的测试抗体构建的标准曲线(SoftMax Pro，分子仪器公司)的4参数拟合计算出样品中IgG的量。

在第一次给药后24小时，29A06-N弧IgG的血清水平为473μg/mL。水平保持约100μg/mL直到给药后6天，然后下降到约71μg/mL，如图8中所示。在第8天给药2之后，血清水平在给药后24小时为291μg/mL。在给药后7天内保持高于100μg/mL。类似地，在第22天给药3后24小时，血清IgG含量为456μg/mL并且水平维持在约100μg/mL。

Claims

1.一种特异性结合至人类和食蟹猕猴ApoC3的分离抗体，其中所述抗体特异性结合至氨基酸序列FSEFWDLDP(SEQ ID NO:3)内的抗原决定基。

2.根据权利要求1所述的分离抗体，其中所述抗体特异性地结合至氨基酸序列LSGFWDLNP(SEQ ID NO:4)内的抗原决定基。

3.根据权利要求1所述的分离抗体，其中所述抗体在以下位置处特异性结合至氨基酸中的至少一者：SEQ ID NO:3的位置2、5或6。

4.根据权利要求1所述的分离抗体，其中所述抗体在以下位置处特异性结合至氨基酸：

(a)SEQ ID NO:3的位置2和5；

(b)SEQ ID NO:3的位置2和6；

(c)SEQ ID NO:3的位置5和6；或

(d)SEQ ID NO:3的位置2、5和6。

5.一种特异性结合至人类和食蟹猕猴ApoC3的分离抗体，所述抗体包括包含互补决定区CDRH1、CDRH2和CDRH3的重链可变区和包含互补决定区CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区，其中：

(a)CDRH1包含氨基酸序列TYSMR(SEQ ID NO:5)；

(b)CDRH2包含氨基酸序列SISTDGGGTAYRDSVKG(SEQ ID NO:6)；

(c)CDRH3包含氨基酸序列AGYSD(SEQ ID NO:7)；

(d)CDRL1包含氨基酸序列X₁AX₂QX₃LX₄X₅X₆X₇GX₈TYLY(SEQ ID NO:22)，其中

X₁为K或T；

X₂为G、S或T；

X₃为N或S；

X₄为V或R；

X₅为H或Y；

X₆为I、P或S；

X₇为D或N；以及

X₈为K或R；

(e)CDRL2包含氨基酸序列X₁VSX₂RX₃S(SEQ ID NO:23)，其中

X₁为D或G；

X₂为N或T；以及

X₃为D、G或P；以及

(f)CDRL3包含氨基酸序列AQX₁TYX₂X₃X₄T(SEQ ID NO:24)，其中

X₁为D或G；

X₂为S、W或Y；

X₃为P或T；

X₄为K或L。

6.根据权利要求5所述的分离抗体，其中：

(a)CDRL1包含选自由SEQ ID NO:8、9、10、11、12和13组成的群组的氨基酸序列；

(b)CDRL2包含选自由SEQ ID NO:14、15、16、17和18组成的群组的氨基酸序列；以及

(c)CDRL3包含选自由SEQ ID NO:19、20和21组成的群组的氨基酸序列。

7.一种特异性结合至人类和食蟹猕猴ApoC3的分离抗体，所述抗体包括包含互补决定区CDRH1、CDRH2和CDRH3的重链可变区以及包含互补决定区CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区，其中CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:5、6、7、8、14和19；5、6、7、9、15和19；5、6、7、10、14和19；5、6、7、11、16和20；5、6、7、12、17和21；5、6、7、13、15和19；或5、6、7、10、18和20中所阐述的氨基酸序列。

8.根据前述权利要求中任一权利要求所述的分离抗体，其中所述抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含选自由SEQ ID NO:27至33组成的群组的氨基酸序列。

9.一种特异性结合至ApoC3的分离抗体，所述抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含选自由SEQ ID NO:27至33组成的群组的氨基酸序列。

10.一种特异性结合至ApoC3的分离抗体，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区和所述轻链可变区分别包含SEQ ID NO:25和27、25和28、25和29、25和30、25和31、25和32或25和33中所阐述的氨基酸序列。

11.根据前述权利要求中任一权利要求所述的分离抗体，其中所述抗体包含人类λ或人类κ轻链恒定区。

12.根据权利要求11所述的分离抗体，其中所述抗体包含轻链，所述轻链包含SEQ IDNO:50、51、52、53、54、55或56中所阐述的氨基酸序列。

13.根据前述权利要求中任一权利要求所述的分离抗体，其中所述抗体包含重链恒定区，任选地人类IgG₁、IgG₂或IgG₄恒定区。

14.根据权利要求13所述的分离抗体，其中所述恒定区是野生型人类免疫球蛋白重链恒定区的变体，并且其中相对于对应的野生型人类免疫球蛋白重链恒定区在pH 6下对人类新生儿Fc受体(FcRn)的亲和力，所述变体人类免疫球蛋白重链恒定区在pH 6下对人类FcRn具有增加的亲和力。

15.根据权利要求13所述的分离抗体，其中所述重链恒定区分别在EU位置433、434和436处包含氨基酸K、F和Y。

16.根据权利要求13所述的分离抗体，其中所述重链恒定区分别在EU位置252、254和256处包含氨基酸Y、T和E。

17.根据权利要求11所述的分离抗体，其中所述重链恒定区分别在EU位置428和434处包含氨基酸L和S。

18.根据权利要求13至17中任一权利要求所述的分离抗体，其中所述重链恒定区是在EU位置228处包含氨基酸P的IgG₄恒定区。

19.根据前述权利要求中任一权利要求所述的分离抗体，其中所述抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49中所阐述的氨基酸序列。

20.一种特异性结合至ApoC3的分离抗体，所述抗体包含重链和轻链，其中所述重链和所述轻链的氨基酸序列分别包含以下中所阐述的氨基酸序列或分别由以下中所阐述的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:34和50、35和50、36和50、37和50、38和50、39和50、40和50、41和50、42和50、43和50、44和50、45和50、46和50、47和50、48和50或49和50。

21.根据前述权利要求中任一权利要求所述的分离抗体，其中所述抗体能够结合至脂质结合型ApoC3。

22.根据前述权利要求中任一权利要求所述的分离抗体，其中所述抗体减弱ApoC3抑制极低密度脂蛋白VLDL的肝细胞吸收的能力。

23.根据前述权利要求中任一权利要求所述的分离抗体，其中所述抗体能够增加受试者血液中ApoC3的清除率。

24.根据前述权利要求中任一权利要求所述的分离抗体，其中所述抗体能够降低受试者血液中ApoC3的水平。

25.根据前述权利要求所述的分离抗体，其中所述抗体能够抑制受试者的餐后脂血症。

26.一种医药组合物，其包含根据前述权利要求中任一权利要求所述的抗体和医药学上可接受的载剂。

27.一种聚核苷酸，其对根据前述权利要求中任一权利要求所述的抗体的重链可变区和/或轻链可变区进行编码。

28.一种表达载体，其包含根据权利要求27所述的聚核苷酸。

29.一种宿主细胞，其包含根据权利要求28所述的表达载体。

30.一种用于产生结合至ApoC3的抗体的方法，所述方法包含在允许所述抗体表达的条件下培养根据权利要求29所述的宿主细胞。

31.一种用于抑制受试者的血液中ApoC3的活性的方法，所述方法包含向所述受试者投予有效量的根据权利要求1至26中任一权利要求所述的抗体或医药组合物。

32.一种用于降低受试者血液中的三酸甘油酯水平的方法，所述方法包含向所述受试者投予有效量的根据权利要求1至26中任一权利要求所述的抗体或医药组合物。

33.一种用于抑制受试者的餐后脂血症的方法，所述方法包含向所述受试者投予有效量的根据权利要求1至26中任一权利要求所述的抗体或医药组合物。

34.一种用于治疗受试者的高三酸甘油酯血症的方法，所述方法包含向所述受试者投予有效量的根据权利要求1至26中任一权利要求所述的抗体或医药组合物。

35.一种用于治疗受试者的乳糜微粒血症的方法，所述方法包含向所述受试者投予有效量的根据权利要求1至26中任一权利要求所述的抗体或医药组合物。

36.一种用于降低患有高三酸甘油酯血症的受试者的心血管疾病风险的方法，所述方法包含向所述受试者投予有效量的根据权利要求1至26中任一权利要求所述的抗体或医药组合物。

37.根据权利要求36所述的方法，其中所述心血管疾病是心肌梗塞。

38.根据权利要求36所述的方法，其中所述心血管疾病是心绞痛。

39.根据权利要求36所述的方法，其中所述心血管疾病是中风。

40.根据权利要求36所述的方法，其中所述心血管疾病是动脉粥样硬化。

41.根据权利要求30至40中任一权利要求所述的方法，其中所述抗体降低所述受试者血液中乳糜微粒或乳糜微粒残余物的水平。

42.根据权利要求30至40中任一权利要求所述的方法，其中所述受试者正在接受额外的降脂剂。

43.根据权利要求42所述的方法，其中所述额外的降脂剂是HMG-CoA还原酶抑制剂。

44.根据权利要求43所述的方法，其中所述HMG-CoA还原酶抑制剂是阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀或辛伐他汀。

45.根据权利要求42所述的方法，其中所述额外的降脂剂是PCSK9抑制剂。

46.根据权利要求45所述的方法，其中所述PCSK9抑制剂是阿利库单抗、依伏库单抗或博可珠单抗。

47.根据权利要求42所述的方法，其中所述额外的降脂剂是依泽替米贝。

48.根据权利要求42所述的方法，其中所述额外的降脂剂是依泽替米贝和HMG-CoA还原酶抑制剂的组合。

49.根据权利要求42所述的方法，其中所述额外的降脂剂是依泽替米贝、HMG-CoA还原酶抑制剂和PCSK9抑制剂的组合。