CN105102618B - 异源二聚化多肽 - Google Patents

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Abstract

本发明人通过制作具有由氨基酸序列不同的两种多肽(第一多肽和第二多肽)构成的Fc区的异源二聚化多肽，成功制作了与作为现有技术的Fc区仅由第一多肽构成的同源二聚体或由第二多肽构成的同源二聚体相比功能得到改善的包含Fc区的异源二聚化多肽。

Description

异源二聚化多肽
技术领域
本发明提供由来自天然的抗体恒定区改变了氨基酸序列而得到的抗体恒定区、包含该恒定区的抗体、包含该抗体的药物组合物、以及它们的制备方法。
背景技术
抗体在血中的稳定性高、副作用也少，因此作为药物而受到关注(非专利文献1、非专利文献2)。目前上市的抗体药物基本都是人IgG1亚类的抗体。关于作为IgG类抗体的效应子功能的抗体依赖性细胞毒活性(以下，记作ADCC)、补体依赖性细胞毒活性(以下，记作CDC)，迄今为止进行了许多研究，据报道，在人IgG类中，IgG1亚类的抗体具有最高的ADCC活性、CDC活性(非专利文献3)。另外，作为由IgG类抗体介导的靶细胞的吞噬作用的抗体依赖性细胞介导性吞噬作用(ADCP)也作为抗体的效应子功能之一来显示(非专利文献4、非专利文献5)。
在IgG抗体的ADCC、CDC、ADCP的表达中，需要抗体Fc区与存在于杀伤细胞、天然杀伤细胞、激活的巨噬细胞等效应细胞表面上的抗体受体(以下，记作FcγR)和各种补体成分的结合。在人体内，在FcγR的蛋白家族中，报道了FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa、FcγRIIIb的同工型(isoform)，还报道了各自的异型(allotype) (非专利文献6)。
ADCC、ADCP和CDC等细胞毒性效应子功能的增强，作为用于增强抗体的抗肿瘤效果的有希望的手段而受到关注。有人使用小鼠模型，对FcγR介导的效应子功能在抗体的抗肿瘤效果中的重要性进行了报道(非专利文献7、非专利文献8)。另外，在人体内的临床效果、FcγRIIIa的高亲和性多型异型(V158)和低亲和性多型异型(F158)之间观察到相关性(非专利文献9)。这些报道显示：具有与特定的FcγR的结合最佳化了的Fc区的抗体，其通过更强效的效应子功能，由此发挥有效的抗肿瘤效果。
在使抗体的效应子功能最佳化上，抗体与包含FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIIa、FcγRIIIb的活化受体、包含FcγRIIb的抑制性受体各自的结合活性的平衡是重要因素。通过使用增强与活化受体的结合活性、而减弱与抑制性受体的结合活性的Fc区，有可能可以赋予抗体最佳的效应子功能(非专利文献10)。反之，通过使用维持或降低与活化受体的结合活性、而增强与抑制性受体的结合活性的Fc区，有可能可以赋予抗体免疫抑制作用(非专利文献11)。关于Fc区与FcγR的结合，研究显示：抗体的铰链区和CH2结构域内的若干个氨基酸残基、以及CH2结构域内的EU编号第297位的Asn上加成的糖链比较重要(非专利文献12、非专利文献13、非专利文献14)。以该结合位点为中心，迄今为止研究了具有各种FcγR结合特性的Fc区的突变体，得到了具有更高的活化FcγR结合活性的Fc区突变体(专利文献1、专利文献2)。例如，Lazar等人将人IgG1的EU编号第239位的Ser、第330位的Ala、第332位的Ile分别取代成Asp、Leu、Glu，由此成功地使与人FcγRIIIa (V158)的结合增加至约370倍(非专利文献15、专利文献2)。与野生型相比，该变体与FcγRIIIa和FcγRIIb的结合之比(A/I比)达到约9倍。另外，Lazar等人还成功地使与FcγRIIb的结合增强约430倍(非专利文献16)。Shinkawa等人通过使EU编号第297位的Asn上加成的糖链的岩藻糖缺失，成功地使与FcγRIIIa的结合增加至约100倍(非专利文献17)。
上述的方法是在抗体的两个H链的Fc区导入相同氨基酸改变、或相同糖链修饰。另一方面，有报道称：抗体的Fc区与FcγR以1：1的比例结合，在下铰链和CH2区非对称性地识别FcγR(非专利文献18)。若考虑Fc区与FcγR非对称性地相互作用，则认为在各H链上导入不同的改变可使IgG与FcγR的相互作用更精密地最佳化。基于该构思，也有如下报道：在抗体的各H链的Fc区加入不同的改变，非对称性地修饰Fc区，从而使与FcγR的相互作用最佳化的方法(专利文献5、专利文献6)。但是，已非对称性地最佳化的Fc区，与已对称性地最佳化的Fc区相比，未必一定显示出优异的FcγRIIIa结合活性(专利文献5)。根据导入的改变的种类，通过非对称性地最佳化Fc区，成功地使与FcγRIIIa的结合和天然型IgG相比增强了数十倍，并增强了ADCC活性，另一方面，和从通过现有技术制备的两个H链的N型糖链中除去了岩藻糖(fucose)的无岩藻糖基化(afucosylated)抗体相比，仅显示出ADCC活性为同等程度、或较其弱的活性(专利文献6)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2000/042072；
专利文献2：WO2006/019447；
专利文献3：WO2009/041062；
专利文献4：WO2006/106905；
专利文献5：WO 2012/058768；
专利文献6：WO 2012/125850；
非专利文献
非专利文献1：Nature Biotechnology, 23, 1073-1078 (2005)；
非专利文献2：Eur. J. Pharm. Biopharm, 59(3), 389-96 (2005)；
非专利文献3：Chemical Immunology, 65, 88 (1997)；
非专利文献4：Cancer Res., 68, 8049-8057 (2008)；
非专利文献5：Blood, 113, 3735-3743 (2009)；
非专利文献6：Immunol. Lett. 82, 57-65 (2002)；
非专利文献7：Pro. Nat. Acad. Sci. 95: 652-656 (1998)；
非专利文献8：Nature Medicine, 6: 443-446 (2000)；
非专利文献9：Blood 99: 754-758 (2002)；
非专利文献10：Science, 310, 1510-1512 (2005)；
非专利文献11：Science, 291, 484-486 (2001)；
非专利文献12：Chemical Immunology, 65, 88 (1997)；
非专利文献13：Eur. J. Immunol. 23, 1098 (1993)；
非专利文献14：Immunology, 86, 319 (1995)；
非专利文献15：Pro. Nat. Acad. Sci., 103, 4005-4010 (2006)；
非专利文献16：Mol. Immun. 45, 3926-3933 (2008)；
非专利文献17：J. Biol. Chem., 278, 3466-3473 (2003)；
非专利文献18：J. Biol. Chem., 276: 16469-16477 (2001)。
发明内容
发明所要解决的课题
本发明鉴于上述状况而设，其课题在于提供：与作为现有技术的具有Fc区的同源二聚化多肽相比Fc区的功能得到改善的多肽、含有该多肽的药物组合物、含有该药物组合物的免疫炎症性疾病的治疗药或预防药、各种癌症的治疗药或预防药、以及它们的制备方法。而且，本发明的课题还在于提供：与作为现有技术的具有Fc区的同源二聚化多肽相比改善Fc区的功能的方法。
用于解决课题的手段
本发明人为了解决上述课题进行了深入研究。其结果，本发明人通过制作具有由氨基酸序列不同的两个多肽(第一多肽和第二多肽)构成的Fc区的异源二聚化多肽，成功地制作了：与作为现有技术的Fc区仅由第一多肽构成的同源二聚体或仅由第二多肽构成的同源二聚体相比，功能得到改善的包含Fc区的异源二聚化多肽。
更具体而言，本发明提供下述的[1]～[21]。
[1] 多肽，是以由包含第一多肽和第二多肽的异源二聚体构成为特征的多肽，其特征在于：该第一多肽和第二多肽的任一方包含导入有下述(i)或(ii)所述突变的Fc区，与包含未导入突变的Fc区的多肽相比，Fc区的功能被改变，
(i) EU编号第234位的氨基酸为L、S、F、E、V、D、Q、I、M、T、A、G或H，EU编号第235位的氨基酸为Y或Q，EU编号第236位的氨基酸为W，EU编号第239位的氨基酸为M或I，EU编号第268位的氨基酸为D，以及EU编号第298位的氨基酸为A；
(ii) EU编号第270位的氨基酸为E，EU编号第326位的氨基酸为D，EU编号第330位的氨基酸为A、K、M、F、I、Y或H，以及EU编号第334位的氨基酸为E。
[2] [1]所述的多肽，其特征在于：上述第一多肽和第二多肽的任一方包含导入有下述(i)或(ii)所述突变的Fc区，另一方导入有下述(iii)所述突变，
(i) EU编号第234位的氨基酸为L、S、F、E、V、D、Q、I、M、T、A、G或H，EU编号第235位的氨基酸为Y或Q，EU编号第236位的氨基酸为W，EU编号第239位的氨基酸为M或I，EU编号第268位的氨基酸为D，EU编号第298位的氨基酸为A，以及EU编号第327位的氨基酸为D；
(ii) EU编号第234位的氨基酸为L、S、F、E、V、D、Q、I、M、T、A、G或H，EU编号第235位的氨基酸为Y或Q，EU编号第236位的氨基酸为W，EU编号第239位的氨基酸为M或I，EU编号第268位的氨基酸为D，EU编号第270位的氨基酸为E，以及EU编号第298位的氨基酸为A；
(iii) EU编号第270位的氨基酸为E，EU编号第326位的氨基酸为D，EU编号第330位的氨基酸为A、K、M、F、I、Y或H，以及EU编号第334位的氨基酸为E。
[3] [2]所述的多肽，其中，上述[2] (i)的EU编号第234位的氨基酸为E、D、T或L。
[4] [2]所述的多肽，其中，上述[2] (ii)的EU编号第234位的氨基酸为L、F、E或D。
[5] [2]所述的多肽，其中，上述[2] (i)的EU编号第234位的氨基酸为V、I、T、M或L。
[6] [2]所述的多肽，其中，上述[2] (i)的EU编号第234位的氨基酸为V、E、D、T、I、L或F，以及EU编号第239位的氨基酸为M或I，(iii)的EU编号第330位的氨基酸为A或K。
[7] [2]所述的多肽，其中，上述[2] (ii)的EU编号第234位的氨基酸为F、E、D、S或L，以及EU编号第239位的氨基酸为M或I，(iii)的EU编号第330位的氨基酸为A、F或K。
[8] [1]～[7]中任一项所述的多肽，其特征在于：上述Fc区的功能改变是选自与多肽的Fcγ受体的结合活性增强、结合活性减弱、以及结合活性的选择性提高的至少一个以上的改变。
[9] [8]所述的多肽，其特征在于：上述Fcγ受体为选自FcγRIa、FcγRIIa R、FcγRIIa H、FcγRIIb、FcγRIIIa F和FcγRIIIa V的至少一个以上的受体。
[10] [8]或[9]所述的多肽，其特征在于：上述Fc区的功能改变是指与Fcγ受体的结合活性的选择性提高。
[11] [10]所述的多肽，其特征在于：上述与Fcγ受体的结合活性的选择性提高是指活性型Fcγ受体和抑制型Fcγ受体之间的选择性。
[12] [11]所述的多肽，其特征在于：在上述Fcγ受体中，活性型Fcγ受体为选自FcγRIa、FcγRIIa R、FcγRIIa H、FcγRIIIa F和FcγRIIIa V的至少一个以上的受体，抑制型Fcγ受体为FcγRIIb。
[13] [11]或[12]所述的多肽，其特征在于：和上述与抑制型Fcγ受体的结合活性相比，上述与活性型Fcγ受体的结合活性选择性地增强。
[14] [1]～[13]中任一项所述的多肽，其中，进一步导入有用于对第一多肽和第二多肽的等电点赋予差异的氨基酸改变。
[15] [14]所述的多肽，其中，用于赋予等电点的差异的氨基酸改变的特征在于：在第一多肽和/或第二多肽的氨基酸序列中，在选自EU编号第137位的Gly、第138位的Gly、第139位的Thr、第147位的Lys、第192位的Ser、第193位的Leu、第196位的Gln、第198位的Tyr、第199位的Ile、第203位的Asn、第214位的Lys、第231位的Ala、第233位的Glu、第242位的Leu、第263位的Val、第272位的Glu、第274位的Lys、第278位的Tyr、第288位的Lys、第290位的Lys、第316位的Gly、第317位的Lys、第320位的Lys、第324位的Lys、第335位的Thr、第337位的Ser、第338位的Lys、第340位的Lys、第341位的Gly、第358位的Leu、第360位的Lys、第362位的Gln、第364位的Ser、第383位的Ser、第384位的Asn、第385位的Gly、第386位的Gln、第387位的Pro、第390位的Asn、第397位的Val和第422位的Val的氨基酸位点导入有至少一个氨基酸突变。
[16] [15]所述的多肽，其中，用于赋予等电点的差异的氨基酸改变的特征在于：在第一多肽或第二多肽的任一方多肽的氨基酸序列中，导入有选自EU编号第196位的Gln、第199位的Ile、第231位的Ala、第233位的Glu、第242位的Leu、第263位的Val、第272位的Glu、第316位的Gly、第358位的Leu、第364位的Ser、第383位的Ser、第387位的Pro和第397位的Val的至少一个以上的氨基酸突变；在另一方多肽的氨基酸序列中，导入有选自EU编号第137位的Gly、第138位的Gly、第139位的Thr、第147位的Lys、第192位的Ser、第193位的Leu、第198位的Tyr、第199位的Ile、第203位的Asn、第214位的Lys、第274位的Lys、第278位的Tyr、第288位的Lys、第290位的Lys、第316位的Gly、第317位的Lys、第320位的Lys、第324位的Lys、第335位的Thr、第337位的Ser、第338位的Lys、第340位的Lys、第341位的Gly、第358位的Leu、第360位的Lys、第362位的Gln、第383位的Ser、第384位的Asn、第385位的Gly、第386位的Gln、第390位的Asn和第422位的Val的至少一个氨基酸突变。
[17] [1]～[16]中任一项所述的多肽，其特征在于：上述多肽为抗原结合分子。
[18] [17]所述的多肽，其特征在于：上述抗原结合分子为抗体、双特异性抗体、肽Fc融合蛋白、或支架Fc融合蛋白等Fc融合分子。
[19] 药物组合物，其包含 [1]～[18]中任一项所述的多肽和医学上可接受的载体。
[20] 改变多肽的功能的方法，是改变包含Fc区的多肽的功能的方法，该方法包括下述步骤：通过向构成该Fc区的第一多肽和/或第二多肽中导入氨基酸突变，使该Fc区形成异源二聚体，通过[1]～[7]中任一项所述的氨基酸突变的导入，与该Fc区形成同源二聚体时相比，改变Fc区的功能。
[21] 制备包含Fc区的多肽的方法，是制备包含Fc区的多肽的方法，该方法包括下述步骤：通过向构成该Fc区的第一多肽和/或第二多肽中导入氨基酸突变，使该Fc区形成异源二聚体，通过[1]～[7]中任一项所述的氨基酸突变的导入，与该Fc区形成同源二聚体时相比，改变Fc区的功能。
[22] 治疗或预防癌症的方法，该方法包括：将[1]～[18]中任一项所述的多肽或[19]所述的药物组合物给予对象的步骤。
[23] 用于在癌症的治疗或预防中使用的[1]～[18]中任一项所述的多肽或[19]所述的药物组合物。
[24] [1]～[18]中任一项所述的多肽或[19]所述的药物组合物在制备癌症的治疗药或预防药中的应用。
[25] 用于制备癌症的治疗药或预防药的方法，该方法包括使用[1]～[18]中任一项所述的多肽或[19]所述的药物组合物的步骤。
附图说明
图1是显示Fc区与FcRn的复合体的结构的图。FcRn与抗体的各H链的CH2和CH3结合，相对于抗体整体对称地结合；
图2是显示IgA与作为IgA受体的FcαR的复合体的结构的图。FcαR与IgA的各H链的Cα2和Cα3结合，相对于抗体整体对称性地结合；
图3是显示Fc区与FcγRIII的复合体的结构的图。关于H链、CH2、CH3，面对着图将左侧分别称作HA链、CHA2、CHA3，将右侧分别称作HB链、CHB2、CHB3；
图4是显示各H链中的A327与FcγRIII的相互作用的细节的图。(A)显示CHA2中的A327与FcγRIII的相互作用。(B)显示CHB2HB中的A327与FcγRIII的相互作用。FcγRIII上的颜色分别显示如下。黑色：碱性位点、灰色：中性位点、白：酸性位点；
图5是显示导入了D356K、H435R、K439E的抗体与FcγR的结合活性的比较的图。以GpH7-G1d/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 2、5)与各FcγR的结合活性作为100。评价中使用的样品及其序列如下：GpH7- G1d/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 2、5)、GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0(SEQ ID NO: 3、4、5)、GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 4、5)、GpH7-A5/ GpL16-k0 (SEQID NO: 3、5)；
图6是显示导入了G237A的抗体与FcγR的结合活性的比较的图。以GpH7-G1d/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 2、5)与各FcγR的结合活性作为100。评价中使用的样品及其序列如下：GpH7-G1d/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 2、5)、GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO:3、4、5)、GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 4、5)、GpH7-A5/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3、5)、GpH7-A26/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 6、4、5)、GpH7-A26/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 6、5)；
图7是显示导入了G237L的异源二聚化抗体和同源二聚化抗体与FcγR的结合活性的比较的图。以GpH7-G1d/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 2、5)与各FcγR的结合活性作为100。评价中使用的样品和其序列如下：GpH7-G1d/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 2、5)、GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3、4、5)、GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 4、5)、GpH7-A5/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3、5)、GpH7-A29/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 7、4、5)、GpH7-A29/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 7、5)；
图8是显示导入了L328E的异源二聚化抗体和同源二聚化抗体与FcγR的结合活性的比较的图。以GpH7-G1d/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 2、5)与各FcγR的结合活性作为100。评价中使用的样品和其序列如下：GpH7-G1d/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 2、5)、GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3、4、5)、GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 4、5)、GpH7-A5/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3、5)、GpH7-A42/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 8、4、5)、GpH7-A42/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 8、5)；
图9是显示导入了L328D的异源二聚化抗体和同源二聚化抗体与FcγR的结合活性的比较的图。以GpH7-G1d/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 2、5)与各FcγR的结合活性作为100。评价中使用的样品和其序列如下：GpH7-G1d/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 2、5)、GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3、4、5)、GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 4、5)、GpH7-A5/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3、5)、GpH7-A43/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 9、4、5)、GpH7-A43/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 9、5)；
图10是显示导入了L234E的异源二聚化抗体和同源二聚化抗体与FcγR的结合活性的比较的图。以GpH7-G1d/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 2、5)与各FcγR的结合活性作为100。评价中使用的样品和其序列如下：GpH7-G1d/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 2、5)、GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3、4、5)、GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 4、5)、GpH7-A5/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3、5)、GpH7-A5/ GpH7-B16/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3、10、5)、GpH7-B16/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 10、5)；
图11是显示导入了L234D的异源二聚化抗体和同源二聚化抗体与FcγR的结合活性的比较的图。以GpH7-G1d/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 2、5)与各FcγR的结合活性作为100。评价中使用的样品和其序列如下：GpH7-G1d/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 2、5)、GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3、4、5)、GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 4、5)、GpH7-A5/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3、5)、GpH7-A5/ GpH7-B17/GpL16-k0(SEQ ID NO: 3、11、5)、GpH7-B17/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 11、5)；
图12是显示Fc区中的P329与FcγRIII的相互作用的图。关于H链、CH2、CH3，面对着图将左侧分别称作HA链、CHA2、CHA3，将右侧分别称作HB链、CHB2、CHB3。该图是显示Fc区中的EU编号第329位的Pro和FcγRIII主要通过一个CH2结构域即CHA2发生相互作用的图。关于H链、CH2、CH3，面对着图将左侧分别称作HA链、CHA2、CHA3，将右侧分别称作HB链、CHB2、CHB3；
图13是显示对导入了P329R、P329K、P329D、P329E的异源二聚化抗体和同源二聚化抗体与FcγR的结合活性产生的效果的比较的图。以GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ IDNO: 3、4、5)与各FcγR的结合活性作为100。评价中使用的样品及其序列如下：GpH7- A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3、4、5)、GpH7-A5/GpH7-B12/ GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3、12、5)、GpH7-A5/GpH7-B13/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3、13、5)、GpH7-A5/GpH7-B14/GpL16-k0(SEQ ID NO: 3、14、5)、GpH7-A5/GpH7-B15/ GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3、15、5)、GpH7-B12/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 12、5)、GpH7-B13/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 13、5)、GpH7-B14/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 14、5)、GpH7-B15/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 15、5)；
图14是比较在相同的H链或不同的H链中导入了P329R时，一个H链中导入有G237A的异源二聚化抗体与各FcγR的结合活性的图。以GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ IDNO: 3、4、5)与各FcγR的结合活性作为100。评价中使用的样品及其序列如下：GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3、4、5)、GpH7-A5/GpH7- B12/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3、12、5)、GpH7-A48/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 16、4、5)、GpH7-A26/GpH7-B3/GpL16-k0(SEQ ID NO: 6、4、5)、GpH7- A26/GpH7-B12/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 6、12、5)、GpH7-A45/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 17、4、5)；
图15是比较在相同的H链或不同的H链中导入了P329R时，一个H链中导入有L234D的异源二聚化抗体与各FcγR的结合活性的图。以GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ IDNO: 3、4、5)与各FcγR的结合活性作为100。评价中使用的样品及其序列如下：GpH7-A5/GpH7 -B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3、4、5)、GpH7-A5/GpH7-B12/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3、12、5)、GpH7-A48/GpH7-B3/GpL16- k0 (SEQ ID NO: 16、4、5)、GpH7-A5/GpH7-B17/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3、11、5)、GpH7-A48/GpH7-B17/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 16、11、5)、GpH7-A5/GpH7-B41/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3、18、5)；
图16是比较导入了相同的改变的异源二聚化抗体和同源二聚化抗体与FcγRIa的结合活性的图。横轴显示Ho/Con的值，纵轴显示He/Co的值。He/Con是指，用在一个H链中使用导入了突变的GpH7-B3变体的异源二聚化抗体GpH7-A5/GpH7-B3变体/GpL16-k0与FcγRIa的结合活性除以使用未导入突变的GpH7-B3的异源二聚化抗体GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3、4、5)与FcγRIa的结合活性的商再乘以100而得到的值。Ho/Con是指，用在两个H链中使用导入了突变的GpH7-B3变体的同源二聚化抗体GpH7-B3变体/GpL16-k0与FcγRIa的结合活性值除以使用未导入突变的GpH7-B3的同源二聚化抗体GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 4、5)与FcγRIa的结合活性值的商再乘以100而得到的值；
图17是比较导入了相同的改变的异源二聚化抗体和同源二聚化抗体与FcγRIIaR的结合活性的图。横轴显示Ho/Con的值、纵轴显示He/Co的值。He/Con是指，用在一个H链中使用导入了突变的GpH7-B3变体的异源二聚化抗体GpH7-A5/GpH7-B3变体/GpL16-k0与FcγRIIa R的结合活性除以使用未导入突变的GpH7-B3的异源二聚化抗体GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3、4、5)与FcγRIIa R的结合活性而得到的值。Ho/Con是指，用在两个H链中使用导入了突变的GpH7-B3变体的同源二聚化抗体GpH7-B3变体/GpL16-k0与FcγRIIa R的结合活性值除以使用未导入突变的GpH7-B3的同源二聚化抗体GpH7-B3/GpL16-k0(SEQ ID NO: 4、5)与FcγRIIa R的结合活性值的商再乘以100而得到的值；
图18是比较导入了相同的改变的异源二聚化抗体和同源二聚化抗体与FcγRIIaH的结合活性的图。横轴显示Ho/Con的值，纵轴显示He/Co的值。He/Con是指，用在一个H链中使用导入了突变的GpH7-B3变体的异源二聚化抗体GpH7-A5/GpH7-B3变体/GpL16-k0与FcγRIIa H的结合活性除以使用未导入突变的GpH7-B3的异源二聚化抗体GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3、4、5)与FcγRIIa H的结合活性而得到的值。Ho/Con是指，用在两个H链中使用导入了突变的GpH7-B3变体的同源二聚化抗体GpH7-B3变体/GpL16-k0与FcγRIIa H的结合活性值除以使用未导入突变的GpH7-B3的同源二聚化抗体GpH7-B3/GpL16-k0(SEQ ID NO: 4、5)与FcγRIIa H的结合活性值的商再乘以100而得到的值；
图19是比较导入了相同的改变的异源二聚化抗体和同源二聚化抗体与FcγRIIb的结合活性的图。横轴显示Ho/Con的值，纵轴显示He/Co的值。He/Con是指，用一个H链中使用导入了突变的GpH7-B3变体的异源二聚化抗体GpH7-A5/GpH7-B3变体/GpL16-k0与FcγRIIb的结合活性除以使用未导入突变的GpH7-B3的异源二聚化抗体GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3、4、5)与FcγRIIb的结合活性而得到的值。Ho/Con是指，用在两个H链中使用导入了突变的GpH7-B3变体的同源二聚化抗体GpH7-B3变体/GpL16-k0与FcγRIIb的结合活性值除以使用未导入突变的GpH7-B3的同源二聚化抗体GpH7-B3/GpL16-k0(SEQ ID NO: 4、5)与FcγRIIb的结合活性值的商再乘以100而得到的值；
图20是比较导入了相同的改变的异源二聚化抗体和同源二聚化抗体与FcγRIIIa的结合活性的图。横轴显示Ho/Con的值、纵轴显示He/Co的值。He/Con是指，用在一个H链中使用导入了突变的GpH7-B3变体的异源二聚化抗体GpH7-A5/GpH7-B3变体/GpL16-k0与FcγRIIIa的结合活性除以使用未导入突变的GpH7-B3的异源二聚化抗体GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3、4、5)与FcγRIIIa的结合活性而得到的值。Ho/Con是指，用在两个H链中使用导入了突变的GpH7-B3变体的同源二聚化抗体GpH7-B3变体/GpL16-k0与FcγRIIIa的结合活性值除以使用未导入突变的GpH7-B3的同源二聚化抗体GpH7-B3/GpL16-k0(SEQ ID NO: 4、5)与FcγRIIIa的结合活性值的商再乘以100而得到的值；
图21是比较使用导入了改变的H链的异源二聚化抗体、同源二聚化抗体各自的FcγR结合的概念图。当作图的点包含在i区内时，意味着导入到Fc区的改变具有He/Con>100、Ho/Con<100、He/Con>Ho/Con的效果。当作图的点包含在ii区内时，意味着导入到Fc区的改变具有He/Con>100、Ho/Con>100、He/Con>Ho/Con的效果。当作图的点包含在iii区内时，意味着导入到Fc区的改变具有He/Con>100、Ho/Con>100、He/Con<Ho/Con的效果；
图22是显示将三种改变导入异源二聚化抗体的任一个H链中时的组合数的图。●(黑圆)、▲(黑三角)、■(黑四角)分别是指不同的改变；
图23是显示抗体Fc区中的S239、A330、I332的各残基与FcγRIII的相互作用的图。引自Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103, 4005-4010, 2006；
图24是显示与活性型FcγR和抑制型FcγR的结合活性的比较的图。该图是比较各变体与活性型FcγR和抑制型FcγR的结合活性的概念图。以各变体与活性型FcγR (活化受体)的活性为纵轴、以各变体与抑制型FcγR (抑制受体)的结合活性为横轴，分别以天然型抗体与活性型FcγR和抑制型FcγR的结合活性作为100。将与天然型抗体相比变体与活性型FcγR的结合活性增强、且与抑制型FcγR的结合活性降低的抗体在a区(网纹部分)作图。将与天然型抗体相比变体与抑制型FcγR的结合活性增强、且与活性型FcγR的结合活性降低的抗体在c区(斜线部分)作图；
图25是显示与活性型FcγR和抑制型FcγR的结合活性的比较的图。该图是比较各变体与活性型FcγR和抑制型FcγR的结合活性的概念图。纵轴表示天然型抗体与活性型FcγR (活化受体)的结合活性，横轴表示天然型抗体与抑制型FcγR (抑制受体)的结合活性，分别以天然型抗体与活性型FcγR和抑制型FcγR的结合活性作为100。将用变体与活性型FcγR的结合活性除以与抑制型FcγR的结合活性的值为1.2以上的抗体在b区(网纹部分)内作图。将用变体与活性型FcγR的结合活性除以与抑制型FcγR的结合活性的值为0.8以下的抗体在d区(斜线部分)内作图；
图26是显示异源二聚化抗体与FcγRIa和FcγRIIb的结合活性的比较的图。该图是比较导入了改变的异源二聚化抗体与作为活性型FcγR的FcγRIa和作为抑制型FcγR的FcγRIIb的结合活性的图。横轴显示相对于抑制型FcγR的He/Con的值、纵轴显示相对于活性型FcγR的He/Con的值。He/Con是指用在Fc中导入了突变的异源二聚化抗体GpH7-A5/GpH7-B3变体/GpL16-k0与FcγR的结合活性除以未导入改变的异源二聚体GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3、4、5)与FcγR的结合活性的商再乘以100而得到的值；
图27是显示异源二聚化抗体与FcγRIIa R和FcγRIIb的结合活性的比较的图。该图是比较导入了改变的异源二聚化抗体与作为活性型FcγR的FcγRIIa R和作为抑制型FcγR的FcγRIIb的结合活性的图。横轴显示相对于抑制型FcγR的He/Con的值、纵轴显示相对于活性型FcγR的He/Con的值。He/Con是指，用在Fc中导入了突变的异源二聚化抗体GpH7-A5/GpH7-B3变体/GpL16-k0与FcγR的结合活性除以未导入改变的异源二聚抗体GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3、4、5)与FcγR的结合活性的商再乘以100而得到的值；
图28是显示异源二聚化抗体与FcγRIIa H和FcγRIIb的结合活性的比较的图。该图是比较导入了改变的异源二聚化抗体与作为活性型FcγR的FcγRIIa H和作为抑制型FcγR的FcγRIIb的结合活性的图。横轴显示相对于抑制型FcγR的He/Con的值、纵轴显示相对于活性型FcγR的He/Con的值。He/Con是指，用在Fc中导入了突变的异源二聚化抗体GpH7-A5/GpH7-B3变体/GpL16-k0与FcγR的结合活性除以未导入改变的异源二聚抗体GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3、4、5)与FcγR的结合活性的商再乘以100而得到的值；
图29是显示异源二聚化抗体与FcγRIIIa和FcγRIIb的结合活性的比较的图。该图是比较导入了改变的异源二聚化抗体与作为活性型FcγR的FcγRIIIa和作为抑制型FcγR的FcγRIIb的结合活性的图。横轴显示相对于抑制型FcγR的He/Con的值、纵轴显示相对于活性型FcγR的He/Con的值。He/Con是指，用在Fc中导入了突变的异源二聚化抗体GpH7-A5/ GpH7-B3变体/GpL16-k0与FcγR的结合活性除以未导入改变的异源二聚抗体GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3、4、5)与FcγR的结合活性的商再乘以100而得到的值；
图30是显示L234Y、G236W、S298A与S239D、A330L、I332E组合对抗体热稳定性的影响的比较的图。该图是比较L234Y、G236W、S298A的异源二聚化抗体和同源二聚化抗体、S239D、A330L、I332E的异源二聚化抗体和同源二聚化抗体、在一个H链中导入了L234Y、G236W、S298A、在另一个H链中导入了S239D、A330L、I332E的异源二聚化抗体在热加速试验(40℃、2周或4周)后的单体比率的变化的图。评价中使用的样品及其序列如下：GpH7-G1d/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 2、5)、GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3、4、5)、GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 31、4、5)、GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0 (SEQ IDNO: 3、41、5)、GpH7-TA7/ GpH7-TA45/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 31、32、5)、GpH7-A57/ GpH7-B78/ GpL16-k0 (SEQ ID NO: 40、41、5)、GpH7-TA7/GpH7-B78/ GpL16-k0 (SEQ ID NO:31、41、5)；
图31是显示异源二聚化抗体的ADCC活性的研究结果的图。评价中使用的细胞株为SK-pca13a，E/T比=50。效应细胞为人PBMC。评价中使用的样品及其序列为GpH7-G1d/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 2、5)、GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3、4、5)、GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3、41、5)、GpH7-TA7/GpH7-B3/ GpL16-k0 (SEQ ID NO:31、4、5)、GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 40、41、5)、GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 31、32、5)、GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 31、41、5)。纵轴表示抗体的细胞毒活性，横轴表示抗体的浓度(μg/mL)；
图32是表示构成IgG1 (SEQ ID NO: 76)、IgG2 (SEQ ID NO: 77)、IgG3 (SEQ IDNO: 78)和IgG4 (SEQ ID NO: 79)的Fc区的氨基酸残基与kabat的EU编号(在本说明书中还称作EU INDEX)的关系的图；
图33是显示实施例12中记载的Fc异源二聚化抗体的ADCC活性的研究结果的图。评价中使用的细胞株为SK-pca13a，E/T比=50。效应细胞为人PBMC。评价中使用的样品及其序列为GpH7-G1d/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 2、5)、GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/ GpL16-k0 (SEQID NO: 51、56、5)、GpH7-Kn032/GpH7-Hl032/ GpL16-k0 (SEQ ID NO: 53、58、5)、GpH7-Kn045/GpH7-Hl048/ GpL16-k0 (SEQ ID NO: 54、59、5)、GpH7-Kn056/GpH7-Hl055/ GpL16-k0 (SEQ ID NO: 55、60、5)、GpH7-Kn037/GpH7-Hl036/ GpL16-k0 (SEQ ID NO: 52、57、5)。纵轴表示抗体的细胞毒活性，横轴表示抗体的浓度(μg/mL)；
图34是显示异源二聚化抗体H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0的ADCC活性的研究结果的图。评价中使用的细胞株为SKE18，E/T比=50。效应细胞为人PBMC。评价中使用的样品及其序列为H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0 (SEQ ID NO: 84、85、106)、H240- Kn032/H240-Hl032/L73-k0 (SEQ ID NO: 86、87、106)、H240-Kn061/ H240-Hl071/L73-k0 (SEQID NO: 81、82、106)、H240-无岩藻糖基_G1d (H240-无岩藻糖基_G1d的氨基酸序列与H240-G1d (SEQ ID NO: 83)的相同，但其岩藻糖已被除去)/L73-k0 (SEQ ID NO: 83、106)。纵轴表示抗体的细胞毒活性，横轴表示抗体浓度(μg/mL)；
图35是显示以异源二聚化抗体H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0为模板的点突变体与FcgRI的结合活性的图。纵轴的相对KD表示用相对于FcgRI的H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0的KD(mol/L)除以各变体的KD的商。横轴的数字表示相对KD以升序排列时的排序；
图36是显示以异源二聚化抗体H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0为模板的点突变体与FcgRIIa R的结合活性的图。纵轴的相对KD表示用相对于FcgRIIa R的H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0的KD (mol/L)除以各变体的KD的商。横轴数字表示相对KD以升序排列时的排序；
图37是显示以异源二聚化抗体H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0为模板的点突变体与FcgRIIa H的结合活性的图。纵轴的相对KD表示用相对于FcgRIIa H的H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0的KD (mol/L)除以各变体的KD的商。横轴数字表示相对KD以升序排列时的排序；
图38是显示以异源二聚化抗体H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0为模板的点突变体与FcgRIIb的结合活性的图。纵轴的相对KD表示用相对于FcgRIIb的H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0的KD (mol/L)除以各变体的KD的商。横轴的数字表示相对KD以升序排列时的排序；
图39是显示以异源二聚化抗体H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0为模板的点突变体与FcgRIIIa F的结合活性的图。纵轴的相对KD表示用相对于FcgRIIIa F的H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0的KD (mol/ L)除以各变体的KD的商。横轴的数字表示相对KD以升序排列时的排序；
图40是显示以异源二聚化抗体H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0为模板的点突变体与FcgRIIIa V的结合活性的图。纵轴的相对KD表示用相对于FcgRIIIa V的H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0的KD (mol/ L)除以各变体的KD的商。横轴的数字表示相对KD以升序排列时的排序；
图41是显示异源二聚化抗体H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0的ADCC活性的研究结果的图。评价中使用的细胞株为MIAPaCa-2，E/T比=25。效应细胞为人PBMC。评价中使用的样品及其序列为H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0 (SEQ ID NO: 84、85、106)、H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0 (SEQ ID NO: 81、82、106)、H240-无岩藻糖基_G1d/L73-k0(SEQ ID NO: 83、106)、H240-Kn072 /H240-Hl076/ L73-k0 (SEQ ID NO: 90、91、106)。纵轴表示抗体的细胞毒活性，横轴表示抗体的浓度(μg/mL)；
图42是显示异源二聚化抗体H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0改良抗体的ADCC活性的研究结果的图。评价中使用的细胞株为DLD-1，E/T比=50。效应细胞为人PBMC。评价中使用的样品及其序列为H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0 (SEQ ID NO: 84、85、106)、H240-无岩藻糖基_G1d/L73-k0 (SEQ ID NO: 83、106)、H240-Kn113/ H240-Hl076/L73-k0 (SEQ IDNO: 92、91、106)、H240-Kn115/H240- Hl076/L73-k0 (SEQ ID NO: 93、91、106)、H240-Kn125/H240-Hl076/ L73-k0 (SEQ ID NO: 94、91、106)。纵轴表示抗体的细胞毒活性，横轴表示抗体的浓度(μg/mL)；
图43是显示异源二聚化抗体H240-Kn067/H240-Hl068/L73-k0等的ADCC活性的研究结果的图。评价中使用的细胞株为DLD-1，E/T比=50。效应细胞为人PBMC。评价中使用的样品及其序列为H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0 (SEQ ID NO: 84、85、106)、H240-无岩藻糖基_G1d/L73-k0(SEQ ID NO: 83、106)、H240-Kn067/H240- Hl068/L73-k0 (SEQ ID NO:95、96、106)、H240-Kn120/H240-Hl068/ L73-k0 (SEQ ID NO: 99、96、106)、H240-Kn126/H240-Hl068/L73-k0 (SEQ ID NO: 100、96、106)。纵轴表示抗体的细胞毒活性，横轴表示抗体的浓度(μg/mL)；
图44是Fc(WT)/FcgR2a R型晶体结构(PDB ID=3RY6, J. Imunol. 2011, 187,3208-321)的图。在该结构的Fc与FcgRIIa R型的相互作用界面附近图示FcgRIIa R型和FcgRIIb之间不同的3个残基Gln127、Leu132、Phe160的侧链。需要说明的是，()内是用单字母符号表示FcgRIIb中的对应的氨基酸残基；
图45是通过X射线晶体结构分析确定的Fc(Kn120Hl068)/FcgRIIb胞外区复合体的图。关于CH2结构域、CH3结构域，分别面对着图将左侧作为结构域A、将右侧作为结构域B；
图46是显示在通过X射线晶体结构分析确定的Fc(Kn120/Hl068)/ FcgRIIb胞外区复合体中，FcgRIIb胞外区的Lys127 (在FcgRIIa R型中为Gln)周边的结构的图。需要说明的是，关于Fc(Kn120/Hl068)的Tyr296，没有观测到侧链的电子密度，因此没有进行Cα原子以外的侧链的模型构建；
图47是显示在通过X射线晶体结构分析确定的Fc(Kn120/Hl068)/ FcgRIIb胞外区复合体中，FcgRIIb胞外区的Ser132 (在FcgRIIa R型中为Leu)周边的结构的图。需要说明的是，关于Fc(Kn120/Hl068)的D327，没有观测到侧链的电子密度，因此没有进行Cα原子以外的侧链的模型构建；
图48是显示在通过X射线晶体结构分析确定的Fc(Kn120/Hl068)/ FcgRIIb胞外区复合体中，FcgRIIb胞外区的Tyr160 (在FcgRIIa R型中为Phe)周边的结构的图；
图49是通过X射线晶体结构分析确定的Fc(BP208)/FcgRIIb胞外区复合体的图。关于CH2结构域、CH3结构域，分别面对着图将左侧作为结构域A、将右侧作为结构域B；
图50是在CH2结构域A中比较通过X射线晶体结构分析确定的Fc(BP208)/FcgRIIb胞外区复合体的结构和Fc(WT)/FcgRIIa胞外区复合体的结构(PDB code:3RY6)。图中用粗线描绘的是Fc(BP208)/ FcgRIIb胞外区复合体，用细线描绘的是Fc(WT)/FcgRIIa胞外区复合体的结构。需要说明的是，在Fc(WT)/FcgRIIa胞外区复合体的结构中，仅描绘出CH2结构域A；
图51是显示在通过X射线晶体结构分析确定的Fc(BP208)/ FcgRIIb胞外区复合体中，Fc(BP208) CH2结构域B的Ser239周边的结构的图；
图52是显示在通过X射线晶体结构分析确定的Fc(BP208)/ FcgRIIb胞外区复合体中，Fc(BP208) CH2结构域A的Ser239周边的结构的图；
图53是图示代表性的H240-AK072/H240-BH076/L73-k0改变抗体的分析用阳离子交换层析的结果的图。A: H240-AK072/H240-BH076/ L73-k0、B: H240-FA021/H240-FB084/L73-k0；
图54是图示作为代表性的H240-AK072/H240-BH076/L73-k0改变抗体的H240-FA021/H240-FB084/L73-k0的分离收集(分取)用阳离子交换层析(A)和分离收集的组分的分析用阳离子交换层析(B)的结果的图。
具体实施方式
提供下述定义，以易于理解本说明书中说明的本发明。
本发明提供多肽，该多肽的特征在于：由包含第一多肽和第二多肽的异源二聚体构成，而且该多肽的特征还在于：该第一多肽和第二多肽包含导入有突变的Fc区的多肽与不包含导入有突变的Fc区的多肽相比，Fc区的功能被改变。而且，本发明还提供该多肽的制备方法和改变包含Fc区的多肽的功能的方法等。
在本发明中，“以由包含第一多肽和第二多肽的异源二聚体构成为特征的多肽”可以是由第一多肽和第二多肽、以及其他多个多肽构成的多肽复合体。
在本说明书中，“第一多肽”和“第二多肽”是指构成抗体的Fc区的多肽。“第一多肽”和“第二多肽”是指彼此序列不同，优选至少CH2区的序列不同。作为该多肽，例如可以是构成天然型IgG的Fc区的多肽，也可以是在构成天然型IgG的Fc区的多肽中加入了改变的多肽。
天然型IgG是指，包含与天然发现的IgG相同的氨基酸序列、且属于实质上由免疫球蛋白γ基因编码的抗体的类别的多肽。例如，天然型人IgG是指天然型人IgG1、天然型人IgG2、天然型人IgG3、天然型人IgG4等。天然型IgG还包含由其自然产生的突变体等。
本发明中的“多肽”通常是指具有10个氨基酸左右以上的长度的肽和蛋白。另外，通常是来自生物的多肽，但没有特别限定，例如，可以是由人工设计的序列构成的多肽。另外，还可以是天然多肽、或合成多肽、重组多肽等的任一种。尚需说明的是，本发明中的蛋白分子是指包含该多肽的分子。
作为本发明的多肽的优选例子，可以列举抗体。作为进一步优选的例子，可以列举天然型IgG、特别是天然型人IgG。天然型IgG是指，包含与天然发现的IgG相同的氨基酸序列、且属于实质上由免疫球蛋白γ基因编码的抗体的类别的多肽。例如，天然型人IgG是指天然型人IgG1、天然型人IgG2、天然型人IgG3、天然型人IgG4等。天然型IgG还包括由其自然产生的突变体等。
抗体的轻链恒定区中存在IgK (Kappa、κ链)、IgL1、IgL2、IgL3、IgL6、IgL7(Lambda、λ链)型的恒定区，但可以是任一种轻链恒定区。作为人IgK (Kappa)恒定区和人IgL7 (Lambda)恒定区，遗传多态性的多个异型序列记载在Sequences of proteins ofimmunological interest, NIH Publication No.91-3242中，但在本发明中可以是其中任意一种。而且，在本发明中，轻链恒定区可以是进行了氨基酸的取代、添加、缺失、插入和/或修饰等改变的轻链恒定区。作为抗体的Fc区，例如存在IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM型的Fc区。本发明的抗体的Fc区例如可以使用人IgG抗体的Fc区，优选为人IgG1抗体的Fc区。作为本发明的Fc区，例如可以使用天然型IgG的恒定区，具体而言，可以使用来自以天然型人IgG1为起源的恒定区(SEQ ID NO: 76)、以天然型人IgG2为起源的恒定区(SEQ ID NO: 77)、以天然型人IgG3为起源的恒定区(SEQ ID NO: 78)、以天然型人IgG4为起源的恒定区(SEQ ID NO: 79)的Fc区。图32显示天然型IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的恒定区的序列。天然型IgG的恒定区还包含由其自然产生的突变体等。作为人IgG1、人IgG2、人IgG3、人IgG4抗体的恒定区，其遗传多态性的多个异型序列记载在Sequences of proteinsof immunological interest, NIH Publication No.91-3242中，在本发明中可以是其中的任一种。特别是作为人IgG1的序列，EU编号第356-358位的氨基酸序列可以是DEL也可以是EEM。
另外，据报道，抗体的Fc区与FcγR的相互作用的强度取决于Zn2+离子浓度(Immunology Letters 143 (2012) 60-69)。抗体的Fc区的Zn2+离子浓度越高，则Fc区与FcgR的相互作用就越增强。抗体的Fc区的CH3中存在的His310、His435通过螯合Zn2+，位于远处的Fc区的各CH2结构域开放。由此，CH2结构域和FcgR容易发生相互作用，Fc区与FcgR的相互作用增强。作为本发明的Fc区的非限定的一个方案，可以列举在EU编号表示的310位的His、435位的His、433位的His和/或434位的Asn上螯合有Zn2+的Fc区。
在本发明中，“Fc区”是指抗体分子中的由铰链部或其一部分、CH2、CH3结构域构成的区。IgG类的Fc区是指，以EU编号(在本说明书中，还称作EU INDEX)计，例如第226位的半胱氨酸～C末端、或者第230位的脯氨酸～C末端，但并不限于此。
Fc区可以通过将IgG1、IgG2、IgG3、IgG4单克隆抗体等用胃蛋白酶等蛋白分解酶进行部分消化后，再次洗脱吸附在蛋白A柱或蛋白G柱上的组分而适当获得。作为所述的蛋白分解酶，只要是通过适当设定pH等酶的反应条件，能够以有限制地产生Fab或F(ab’)2的方式消化全长抗体的酶即可，没有特别限定，例如可以例示胃蛋白酶或木瓜蛋白酶等。
在本说明书中，“异源二聚化”是指由氨基酸序列不同的二个多肽构成一个多肽，“异源二聚体”是指由氨基酸序列不同的二个多肽构成的多肽。另外，“同源二聚化”是指由具有相同的氨基酸序列的二个多肽构成一个多肽，“同源二聚体”是指由2个相同的氨基酸序列构成的多肽、或者由除目的在于有效形成异源二聚化的改变或目的在于有效纯化异源二聚体的改变以外相同的氨基酸序列构成的多肽、或者由包含除目的不在于改善Fc功能的改变以外相同的氨基酸的多肽构成的多肽。在本发明中，“异源二聚体”或“同源二聚体”优选关于Fc区的“异源二聚化”或“同源二聚化”，更优选关于Fc区中的CH2的“异源二聚化”或“同源二聚化”。另外，“亲本多肽”是指导入氨基酸突变等改变前的多肽。
本发明的氨基酸突变可以单独使用，也可以多个组合使用。
多个氨基酸突变组合使用时，对组合数没有特别限定，可以在能够实现发明目的的范围内适当设定，例如，2个以上且30个以下，优选为2个以上且15个以下。
当将多个氨基酸突变组合时，可以仅在构成Fc区的2个多肽中的一个多肽中加入该氨基酸突变，也可以在2个多肽的双方中适当地分配加入该氨基酸突变。
另外，在本发明中，为了获得Fc区的更高的功能改变效果，与未导入突变时和在2个多肽的双方的Fc区中导入突变时相比，只向一个Fc区中导入突变时，优选导入至少一个该Fc区的功能提高的氨基酸突变。
被改变的位点只要是Fc区即可，没有特别限定，可以在能够实现本发明目的的范围内适当设定，例如是铰链区、CH2区、CH3区等。
更优选被改变的位点为CH2区。需要说明的是，CH2区是指EU编号第231位～第340位，CH3区是指EU编号第341位～第447位。例如，当向以人IgG1为起源的恒定区的氨基酸序列中导入突变时，可以在选自EU编号118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447的1个以上位点的氨基酸残基中加入改变。
更具体而言，当向人IgG1恒定区的氨基酸序列中导入改变时，可以在选自EU编号226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447的1个以上位点的氨基酸残基中加入改变。
更具体而言，当向人IgG1恒定区的氨基酸序列中导入改变时，可以在选自EU编号226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340的1个以上位点的氨基酸残基中加入改变。
更具体而言，当向人IgG1恒定区的氨基酸序列中导入突变时，可以在选自EU编号231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、265、266、267、268、269、270、271、295、296、298、300、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337的1个以上位点的氨基酸残基中加入改变。
在本发明中，氨基酸的改变是指取代、缺失、添加、插入或修饰中的任一种或它们的组合。在本发明中，氨基酸的改变可以说成是氨基酸的突变，以相同的意义使用。
＜取代＞
取代氨基酸残基时，其目的在于：通过取代成另外的氨基酸残基，例如对下述(a)～(c)等方面进行改变。
(a)片状(β折叠)结构或螺旋结构的区中的多肽的主链结构；(b)靶位点的电荷或疏水性、或(c)侧链的大小。
氨基酸残基根据一般的侧链的特性而分为以下各组：
(1) 疏水性：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；
(2) 中性亲水性：cys、ser、thr、asn、gln；
(3) 酸性：asp、glu；
(4) 碱性：his、lys、arg；
(5) 影响链的取向的残基：gly、pro；以及
(6) 芳族性：trp、tyr、phe。
上述各组内的氨基酸残基的取代称作保守取代，而其他组之间的氨基酸残基的取代称作非保守取代。
本发明中的取代可以是保守取代，也可以是非保守取代，还可以是保守取代与非保守取代的组合。
另外，本发明的多肽中，除了包含根据本发明而导入的氨基酸突变外，还可以进一步包含添加的改变。添加的改变例如可以从氨基酸的取代、缺失或修饰中的任一种、或它们的组合中选择。
例如，在本发明的多肽中，在不对该多肽的目标功能带来实质性变化的范围内，可以进一步任意加入改变。当本发明的多肽为抗体时，可以在重链或轻链中加入改变。例如，这样的突变可以通过氨基酸残基的保守取代来进行。另外，即使是对本发明的多肽的目标功能带来变化的改变，但只要该功能的变化在本发明的目标范围内，也可以进行这样的改变。
本发明中的氨基酸序列的改变包含翻译后修饰。作为具体的翻译后修饰，可以例示糖链的加成或缺失。例如，在IgG1恒定区中，EU编号第297位的氨基酸残基可以是被糖链修饰的残基。对所修饰的糖链结构没有限定。通常，在真核细胞中表达的抗体在恒定区中包含糖链修饰。因此，在下述细胞中表达的抗体通常被任一种糖链修饰。
・哺乳动物的抗体产生细胞
・由包含编码抗体的DNA的表达载体转化的真核细胞
这里所示的真核细胞包括酵母或动物细胞。例如，CHO细胞或HEK293H细胞是用于用包含编码抗体的DNA的表达载体进行转化的代表性的动物细胞。另一方面，本发明的抗体还包括该位点不存在糖链修饰的抗体。恒定区没有被糖链修饰的抗体可以通过使编码抗体的基因在大肠杆菌等原核细胞中表达而得到。
在本发明中，作为添加的改变，更具体而言，例如可以是在Fc区的糖链中添加了唾液酸的改变(MAbs. 2010 Sep-Oct; 2(5): 519-27.)。
当本发明的多肽为抗体时，在抗体恒定区部分可以加入例如提高与FcRn的结合活性的氨基酸取代(J Immunol. 2006 Jan 1; 176(1): 346-56、J Biol Chem. 2006 Aug18; 281(33): 23514-24.、Int Immunol. 2006 Dec; 18(12): 1759-69.、NatBiotechnol. 2010 Feb; 28(2):157-9.、WO/2006/019447、WO/2006/053301、WO/2009/086320)、用于提高抗体的异质性或稳定性的氨基酸取代(WO/2009/041613)。
制作本发明的异源二聚化多肽时，需要使彼此具有不同的氨基酸的多肽之间缔合、或者从其他的同源二聚化多肽中分离目标异源二聚化多肽。
在具有Fc区且具有不同的氨基酸的多肽之间的缔合时，可以应用向抗体H链的第二恒定区(CH2)或H链的第三恒定区(CH3)的界面导入电荷排斥以抑制非目标的H链之间的缔合的技术(WO2006/ 106905)。
在向CH2或CH3的界面导入电荷排斥以抑制并不想要的H链之间的缔合的技术中，作为在H链的其他恒定区的界面进行接触的氨基酸残基，例如可以列举：CH3区中的EU编号第356位的残基、EU编号第439位的残基、EU编号第357位的残基、EU编号第370位的残基、EU编号第399位的残基、EU编号第409位的残基所面对的区。
更具体而言，例如，在包含2种H链CH3区的抗体中，可以形成选自第1 H链CH3区中的下述(1)～(3)所示氨基酸残基组的1组～3组氨基酸残基带有同种电荷的抗体：
(1) H链CH3区中所含的氨基酸残基即EU编号第356位和第439位的氨基酸残基、
(2) H链CH3区中所含的氨基酸残基即EU编号第357位和第370位的氨基酸残基、
(3) H链CH3区中所含的氨基酸残基即EU编号第399位和第409位的氨基酸残基。
而且，可以形成选自不同于上述第1 H链CH3区的第2 H链CH3区中的上述(1)～(3)所示氨基酸残基组的、在上述第1 H链CH3区中带有同种电荷的上述(1)～(3)所示氨基酸残基组所对应的1组～3组氨基酸残基与上述第1 H链CH3区中的对应的氨基酸残基带有相反电荷的抗体。
上述(1)～(3)中记载的各氨基酸残基在缔合时相互接近。关于所期望的H链CH3区或H链恒定区，本领域技术人员通过使用市售软件的同源建模等，可以发现上述(1)～(3)所记载的氨基酸残基所对应的位点，可以适当地将该位点的氨基酸残基进行改变。
在上述抗体中，“带电荷的氨基酸残基”例如优选从下述(X)或(Y)的任一组所含的氨基酸残基中选择；
(X) 谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)、
(Y) 赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)。
在上述抗体中，“带有同种电荷”是指，例如2个以上的氨基酸残基均具有上述(X)或(Y)的任一组所含的氨基酸残基。“带有相反的电荷”是指，例如2个以上的氨基酸残基中的至少一个氨基酸残基具有上述(X)或(Y)的任一组所含的氨基酸残基时，剩余的氨基酸残基具有不同组中所含的氨基酸残基。
在优选方案中，上述抗体的第1 H链CH3区和第2 H链CH3区可以通过二硫键交联。
在本发明中，作为进行改变的氨基酸残基，并不限于上述的抗体可变区或抗体恒定区的氨基酸残基。关于多肽突变体或异源多聚体，本领域技术人员通过使用市售软件的同源建模等，可以发现形成界面的氨基酸残基，可以对该位点的氨基酸残基进行改变使控制缔合。
在本发明的具有Fc区且具有不同的氨基酸的多肽彼此之间缔合时，还可以进一步采用其他公知技术。通过将抗体的一个H链的可变区中存在的氨基酸侧链取代成更大的侧链(knob; 突起)、并将另一个H链所面对的可变区中存在的氨基酸侧链取代成更小的侧链(hole; 空隙)，使突起能够配置在空隙中，从而可以有效引起具有Fc区且具有不同的氨基酸的多肽彼此之间的缔合化(WO1996/027011；Ridgway JB等人, Protein Engineering(1996) 9, 617-621；Merchant AM等人. Nature Biotechnology (1998) 16, 677-681)。
除此以外，在具有Fc区且具有不同的氨基酸的多肽之间的缔合化中，还可以进一步采用其他公知技术。以抗体的一个H链的CH3的一部分作为该部分所对应的来自IgA的序列，使用在另一个H链的CH3的互补部分导入了该部分所对应的来自IgA的序列的链交换工程域CH3，从而可以通过CH3的互补的缔合化有效地引起具有不同序列的多肽的缔合化(Protein Engineering Design & Selection, 23; 195-202, 2010)。即使使用该公知技术，也可以有效地引起具有Fc区且具有不同的氨基酸的多肽之间的缔合化。
此外，还可以采用利用了WO2011/028952中记载的抗体的CH1与CL的缔合化、VH、VL的缔合化的异源二聚化抗体制作技术。
另外，即使是无法有效形成异源二聚化多肽的情形，通过分离、纯化异源二聚化多肽和同源二聚化多肽，也可以得到异源二聚化多肽。制作由序列彼此不同的第一多肽和第二多肽构成的异源二聚化多肽时，仅由2个第一多肽构成的同源二聚化多肽、仅由2个第二多肽构成的同源二聚化多肽作为杂质而混入。作为有效除去这2种同源二聚化多肽的方法，可以使用公知技术。有人报道了下述方法：向2种H链的可变区中导入氨基酸取代，赋予等电点的差异，从而可以通过离子交换层析纯化2种同源二聚体和目标异源二聚化抗体(WO2007114325)。作为纯化异源二聚化抗体的方法，迄今为止，有人报道了：使用蛋白A来纯化由与蛋白A结合的小鼠IgG2a的H链和不与蛋白A结合的大鼠IgG2b的H链构成的异源二聚化抗体的方法(WO98050431, WO95033844)。
另外，通过使用将作为IgG与蛋白A的结合位点的EU编号第435位和第436位的氨基酸残基取代成Tyr、His等与蛋白A的结合力不同的氨基酸的H链，使各H链与蛋白A的相互作用发生变化，通过使用蛋白A柱，也可以有效地只纯化异源二聚化抗体。
可以将多个、例如2个以上的上述取代、技术组合使用。另外，可以在第一多肽和第二多肽中适当加入上述改变。需要说明的是，本发明的多肽可以是以加入了上述改变的多肽为基础制作的多肽。
氨基酸序列的改变可以利用本领域中公知的各种方法来进行。在这些方法中，并不限于下述的方法，但可以利用位点特异性诱变法(Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T,Ogasahara, Y,和Nakagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dualamber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271-275；Zoller, MJ,和Smith, M. (1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments clonedinto M13 vectors. Methods Enzymol. 100, 468-500；Kramer,W, Drutsa,V, Jansen,HW, Kramer, B, Pflugfelder, M, 和Fritz, HJ (1984) The gapped duplex DNAapproach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic AcidsRes. 12, 9441-9456；Kramer W, and Fritz HJ (1987) Oligonucleotide-directedconstruction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154, 350-367；Kunkel, TA (1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis withoutphenotypic selection. Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 488-492)、PCR突变法、盒式突变法等方法来进行。
在本发明中，“Fc区的功能”是指，例如，Fc区与Fcγ受体的结合活性(结合活性增强、或结合活性减弱)、Fc区的Fcγ受体同工型间的选择性(结合活性的选择性提高)、Fc区的物理化学稳定性、ADCC活性、ADCP活性等。这里，Fc区的Fcγ受体同工型间的选择性是指，选择性地与Fcγ受体的特定同工型结合。Fc区的物理化学稳定性是指，例如Fc区的热力学稳定性、对蛋白酶的稳定性、对化学处理的稳定性、对冷冻熔解的稳定性、保存稳定性、酸性条件下的稳定性、光稳定性、对振荡或浓缩所伴随的应激的稳定性、在广泛的溶液条件下的溶解性的维持。另外，Fc区的功能还可以是由Fc区与Fcγ受体的结合活性、Fc区的Fcγ受体同工型间的选择性、Fc区的物理化学稳定性等2种以上组合的功能，例如将Fc区与Fcγ受体的结合活性和Fc区的Fcγ受体同工型间的选择性组合的功能、将Fc区与Fcγ受体的结合活性和Fc区的物理化学稳定性组合的功能、将Fc区的Fcγ受体同工型间的选择性和Fc区的物理化学稳定性组合的功能、将Fc区与Fcγ受体的结合活性、Fc区的Fcγ受体同工型间的选择性以及Fc区的物理化学稳定性组合的功能。
在本发明中，关于“改变Fc区的功能”，例如Fc区的功能显示Fc区与Fcγ受体的结合活性时，是指Fc区与Fcγ受体的结合活性的增强或减弱等。选择性的提高是指，例如一方面增强与某Fcγ受体的结合活性，而另一方面维持或降低与其他Fcγ受体的结合活性。或者，选择性的提高是指，例如一方面降低与某Fcγ受体的结合活性，而另一方面维持或增强与其他Fcγ受体的结合活性。另外，例如Fc区的功能显示Fc区的Fcγ受体亚型间的选择性时，是指Fc区的Fcγ受体亚型间的选择性的提高或降低等。另外，例如Fc区的功能显示Fc区的物理化学稳定性时，是指Fc区的物理化学稳定性的提高或降低、稳定性的降低抑制等，更具体而言，例如是指CH2区的Tm值的升高或降低、Tm值的降低抑制等。
另外，例如将Fc区与Fcγ受体的结合活性、Fc区的Fcγ受体同工型间的选择性和Fc区的物理化学稳定性组合的功能的提高是指，与对照相比，Fc区与Fcγ受体的结合活性、Fc区的Fcγ受体同工型间的选择性和Fc区的物理化学稳定性未必都提高，只要整体上Fc区的功能提高即可。反之，例如将Fc区与Fcγ受体的结合活性、Fc区的Fcγ受体同工型间的选择性和Fc区的物理化学稳定性组合的功能的下降是指，与对照相比，Fc区与Fcγ受体的结合活性、Fc区的Fcγ受体同工型间的选择性和Fc区的物理化学稳定性未必都下降，只要整体上Fc区的功能下降即可。
在本发明中，Fcγ受体(在本说明书中，有时记作Fcγ受体、FcγR或FcgR)是指能够与IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的Fc区结合的受体，实质上还指由Fcγ受体基因编码的蛋白的家族的任何成员。在人体内，该家族还包括：包含同工型FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc的FcγRI(CD64)；包含同工型FcγRIIa (包含异型H131(H型)和R131(R型))、FcγRIIb (包含FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)和FcγRIIc的FcγRII(CD32)；以及包含同工型FcγRIIIa (包含异型V158和F158)和FcγRIIIb (包含异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)的FcγRIII(CD16)、以及任何的未发现的人FcγR类或FcγR同工型或异型，但并不限于这些。FcγR包括来自人、小鼠、大鼠、兔和猴的FcγR，但并不限于这些，可以来自任何生物。小鼠FcγR类还包括FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)和FcγRIII-2(CD16-2或FcγRIV)、以及任何的未发现的小鼠FcγR类或FcγR同工型或异型，但并不限于这些。作为这样的Fcγ受体的优选的例子，可以列举人FcγRI(CD64)、FcRIIa(CD32)、FcγRIIb(CD32)、FcγRIIIa(CD16)和/或FcγRIIIb(CD16)。
FcγR中存在具有免疫受体酪氨酸活化基序(Immunoreceptor tyrosine-basedactivation motif，ITAM)的活性型受体和具有免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptortyrosine-based inhibitory motif，ITIM)的抑制型受体。FcγR被分为FcγRI、FcγRIIaR、FcγRIIa H、FcγRIIIa、FcγRIIIb的活性型FcγR和FcγRIIb的抑制型FcγR。
FcγRI的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载在NM_000566.3和NP_000557.1中、
FcγRIIa的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载在BC020823.1和AAH20823.1中、
FcγRIIb的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载在BC146678.1和AAI46679.1中、
FcγRIIIa的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载在BC033678.1和AAH33678.1中、以及
FcγRIIIb的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载在BC128562.1和AAI28563.1中(RefSeq注册号)。
尚需说明的是，FcγRIIa中存在着FcγRIIa的第131位的氨基酸被取代成组氨酸(H型)或精氨酸(R型)的2种遗传多态性(J. Exp. Med, 172, 19-25, 1990)。另外，FcγRIIb中存在着FcγRIIb的第232位的氨基酸被取代成异亮氨酸(I型)或苏氨酸(T型)的2种遗传多态性(Arthritis. Rheum. 46: 1242-1254 (2002))。另外，FcγRIIIa中存在着FcγRIIIa的第158位的氨基酸被取代成缬氨酸(V型)或苯丙氨酸(F型)的2种遗传多态性(J.Clin. Invest. 100(5): 1059-1070 (1997))。另外，FcγRIIIb中存在着NA1型、NA2型这2种遗传多态性(J. Clin. Invest. 85: 1287-1295 (1990))。
将观察相互作用的物质中的一个(配体)固定在传感器芯片的金薄膜上，从传感器芯片的反侧照射光使其在金薄膜和玻璃的界面发生全反射时，在一部分反射光中形成反射强度降低的部分(SPR信号)。使观察相互作用的物质中的另一个(分析物)在传感器芯片的表面流动，配体与分析物结合时，被固定的配体分子的质量增加，传感器芯片表面的溶剂的折射率发生变化。由于该折射率的变化，SPR信号的位置偏移(反之，若结合解离，则信号的位置复原)。在Biacore系统中，纵轴表示上述的偏移量、即传感器芯片表面的质量变化，将质量的时间变化以测定数据的形式表示(传感图)。由传感图求出分析物与在传感器芯片表面补足的配体的结合量(在使分析物发生相互作用的前后传感图上的响应的变化量)。但是，结合量还取决于配体量，因此在比较时必需在认为配体量本质上相同的条件下进行比较。另外，由传感图的曲线求出动力学参数：结合速度常数(ka)和解离速度常数(kd)，由该常数之比求出亲和性(KD)。在BIACORE法中还优选采用抑制测定法。抑制测定法的例子记载在Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010中。
在本发明中，关于本发明的多肽或Fc区与各种Fcγ受体的结合活性是否增强、或者结合活性是否减少，例如如本实施例所示，可以使用作为利用表面等离振子共振(SPR)现象的相互作用分析仪器的Biacore (GE Healthcare)来测定。Biacore包含Biacore T100、T200、X100、A100、4000、3000、2000、1000、C等所有机型。传感器芯片可以使用CM7、CM5、CM4、CM3、C1、SA、NTA、L1、HPA、Au芯片等所有的Biacore用传感器芯片。运行缓冲液除了使用HBE-EP+以外，还可以使用用HEPES、磷酸、ACES、Tris、枸橼酸等调节至pH7.4等中性附近的pH的缓冲液。测定温度可以在4-37℃的范围内测定。通过胺偶联、二硫化物偶联(disulfidecoupling)、醛偶联等偶联方法，将补充抗体的蛋白A、蛋白G、蛋白L、抗人IgG抗体、抗人IgG-Fab、抗人L链抗体、抗人Fc抗体、抗原蛋白、抗原肽等抗体补充用的蛋白固定在传感器芯片上。让Fcγ受体I、IIa R型、IIa H型、IIb、IIIa F型、V型、IIIb等各种Fcγ受体作为分析物流过该芯片，测定相互作用，获得传感图。此时的Fcγ受体的浓度可以结合测定的样品的KD等相互作用的强度，在数uM～数pM的范围内实施。通过测定，获取其解离常数(KD)，根据KD值是否下降、或者是否增加，可以判断本发明的多肽或Fc区与各种Fcγ受体的结合活性是否增强、或者结合活性是否降低。另外，用固定在传感器芯片上的抗体补充用蛋白捕获时，以相对于传感器芯片上的抗体，使各种Fcγ受体作为分析物流过前后的传感图的值的变化量为指标，根据该值增加的程度，可以判断本发明的多肽或Fc区与各种Fcγ受体的结合活性是否增强、或者结合活性是否降低。另外，还可以将各种Fcγ受体而非抗体固定在传感器芯片上，使欲评价的抗体样品与其发生相互作用。根据由相互作用的传感图算出的KD值的降低或增加、或者使抗体样品发生作用前后的传感图的增加的程度，可以判断本发明的多肽或Fc区与各种Fcγ受体的结合活性是否增强、或者结合活性是否减少。
具体而言，Fc区与Fcγ受体的结合活性，除了可以通过ELISA或FACS (荧光激活细胞分选术，fluorescence activated cell sorting)进行测定外，还可以通过利用ALPHA筛选(光激化学发光免疫分析，Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)或表面等离振子共振(SPR)现象的BIACORE法等来测定(Proc. Natl. Acad. Sci. USA(2006) 103 (11), 4005-4010)。
ALPHA筛选是通过使用供体和受体这两种珠粒的ALPHA技术，根据下述原理实施。与供体珠粒结合的分子和与受体珠粒结合的分子发生生物学相互作用，仅在两种珠粒接近的状态时，检测到发光信号。通过激光激发的供体珠粒内的光敏剂将周边的氧转变成激发状态的单重态氧。单重态氧向供体珠粒周边扩散，到达邻近的受体珠粒时引起珠粒内的化学发光反应，最终放出光。与供体珠粒结合的分子和与受体珠粒结合的分子不发生相互作用时，供体珠粒产生的单重态氧没有到达受体珠粒，因此不会发生化学发光反应。
例如，在供体珠粒上生物素标记的受检多肽与供体珠粒上的链霉亲和素结合，在受体珠粒上结合有用谷胱甘肽S转移酶(GST)标记化的Fcγ受体。在竞争多肽的不存在下，受检多肽和Fcγ受体发生相互作用，产生520-620nm的信号。未被标记化的多肽和受检多肽竞争与Fcγ受体间的相互作用。竞争的结果，通过定量所表现出的荧光的减少，可以确定相对的结合活性。使用Sulfo-NHS-生物素等将多肽生物素化是公知的。作为用GST将Fcγ受体标记化的方法，可以适当采用下述方法：在可表达的载体内携带有将编码Fcγ受体的多核苷酸和编码GST的多核苷酸进行框内融合而得到的融合基因的细胞等中进行表达，再使用谷胱甘肽柱进行纯化的方法等。对于得到的信号，例如使用GRAPHPAD PRISM (GraphPad公司、San Diego)等软件，使其适合于利用非线性回归分析的一位点竞争(one-sitecompetition)模型，从而适当地进行分析。
需要说明的是，标记化并不限于GST，可以使用组氨酸标记、MBP、CBP、Flag标记、HA标记、V5标记、c-myc标记等任何标记，没有限定。另外，关于受检多肽与供体珠粒的结合，并不限于利用生物素ー链霉亲和素反应的结合。特别是，当受检多肽包含抗体、Fc融合多肽等的Fc时，考虑经由供体珠粒上的蛋白A、蛋白G等Fc识别蛋白使受检多肽结合的方法。
与FcγR的结合或与FcγR的结合活性的减弱是指，使进行比较的多肽的量本质上相同而进行测定时，与亲本多肽相比，本质上以更弱的结合活性与FcγR结合。
与FcγR的结合或与FcγR的结合活性减弱、减少或降低的异源二聚化多肽是指，使进行比较的多肽的量本质上相同而进行测定时，与同源二聚化多肽相比本质上以更弱的结合活性与FcγR结合的异源二聚化多肽。
例如，在通过上述测定方法测定的KD值中，KD值比(亲本多肽的KD值/导入了突变的多肽的KD值)优选为0.99以下、0.95以下、0.9以下、0.8以下、0.7以下、0.5以下、0.3以下、0.1以下。进一步优选为0.08以下、0.05以下、0.02以下、0.01以下、0.001以下。尚需说明的是，在本说明书中，KD值比还称作KD比。
另外，在通过上述的测定方法测定的KD值中，优选KD值上升1pM以上，进一步优选上升10pM、100pM、1nM以上、2nM以上、3nM以上、5nM以上、10nM以上、20nM以上、50nM以上、100nM以上、1μM以上。另外，在通过上述测定方法测定的KD值中，优选KD值为1pM以上，优选为10pM以上、100pM以上、1nM以上、10nM以上、100nM以上、500nM以上、1μM以上、3μM以上、5μM以上。
与FcγR的结合或与FcγR的结合活性的增强、上升或提高是指，使进行比较的多肽的量本质上相同而进行测定时，与亲本多肽相比，以本质上更强的结合活性与FcγR结合。
与FcγR的结合或与FcγR的结合活性增强、上升或提高的异源二聚化多肽是指，使进行比较的多肽的量本质上相同而进行测定时，与同源二聚化多肽相比，以本质上更强的结合活性与FcγR结合的异源二聚化多肽。
例如，在通过上述的测定方法测定的KD值中，KD值比(亲本多肽的KD值/导入了突变的多肽的KD值)优选为1.1以上、1.2以上、1.3以上、1.5以上、1．8以上、2以上、3以上。进一步优选为5以上、10以上、100以上、250以上、1000以上。尚需说明的是，在本说明书中，KD值比还称作KD比。
另外，在通过上述测定方法测定的KD值中，优选KD值降低1pM以上，进一步优选降低10pM、100pM、1nM以上、2nM以上、3nM以上、5nM以上、10nM以上、20nM以上、50nM以上、100nM以上、1μM以上。
另外，在通过上述的测定方法测定的KD值中，优选KD值为5μM以下，进一步优选为3μM以下、1μM以下、0.5μM以下、0.1μM以下、0.01μM以下、1nM以下、0.1nM以下、0.001nM以下、1pM以下。
在本发明中，该多肽的Fc区的功能改变是指与Fcγ受体的结合活性增强时，在构成上述Fc区的第一多肽和/或第二多肽的氨基酸序列中，可以导入氨基酸突变。对导入的该氨基酸突变的种类或范围没有特别限定。
另外，有报道称：抗体的Fc区与FcγR的相互作用的强度取决于Zn2+离子浓度(Immunology Letters 143 (2012) 60-69)。抗体的Fc区的Zn2+离子浓度越高，则Fc区与FcgR的相互作用就越增强。通过存在于抗体的Fc区的CH3中的His310、His435螯合Zn2+，位于远处的Fc区的各CH2结构域开放。由此，CH2结构域与FcgR容易发生相互作用，Fc区与FcgR的相互作用增强。作为本发明的抗体的非限定的一个方案，可以列举在用EU编号表示的310位的His、435位的His、433位的His和/或434位的Asn上螯合有Zn2+的Fc区。
该Fcγ受体为FcγRIa时，在构成上述Fc区的第一多肽和/或第二多肽的氨基酸序列中，可以导入选自说明书表2-1和表2-2的区i中记载的氨基酸突变的至少一个以上的氨基酸突变。该Fcγ受体为FcγRIa时，在构成上述Fc区的第一多肽和/或第二多肽的氨基酸序列中，可以导入选自说明书表2-1、表2-2和表2-3的区ii中记载的氨基酸突变的至少一个以上的氨基酸突变。
该Fcγ受体为FcγRIIa R时，在构成上述Fc区的第一多肽和/或第二多肽的氨基酸序列中，可以导入选自说明书表3-1和表3-2的区i中记载的氨基酸突变的至少一个以上的氨基酸突变。该Fcγ受体为FcγRIIa R时，在构成上述Fc区的第一多肽和/或第二多肽的氨基酸序列中，可以导入选自说明书表3-1和表3-2的区ii中记载的氨基酸突变的至少一个以上的氨基酸突变。
该Fcγ受体为FcγRIIa H时，在构成上述Fc区的第一多肽和/或第二多肽的氨基酸序列中，可以导入选自说明书表4的区i中记载的氨基酸突变的至少一个以上的氨基酸突变。该Fcγ受体为FcγRIIa H时，在构成上述Fc区的第一多肽和/或第二多肽的氨基酸序列中，可以导入选自说明书表4的区ii中记载的氨基酸突变的至少一个以上的氨基酸突变。
该Fcγ受体为FcγRIIb时，在构成上述Fc区的第一多肽和/或第二多肽的氨基酸序列中，可以导入选自说明书表5的区i中记载的氨基酸突变的至少一个以上的氨基酸突变。该Fcγ受体为FcγRIIb时，在构成上述Fc区的第一多肽和/或第二多肽的氨基酸序列中，可以导入选自说明书表5的区ii中记载的氨基酸突变的至少一个以上的氨基酸突变。
该Fcγ受体为FcγRIIIa时，在构成上述Fc区的第一多肽和/或第二多肽的氨基酸序列中，可以导入选自说明书表6的区i中记载的氨基酸突变的至少一个以上的氨基酸突变。该Fcγ受体为FcγRIIIa时，在构成上述Fc区的第一多肽和/或第二多肽的氨基酸序列中，可以导入选自说明书表6的区ii中记载的氨基酸突变的至少一个以上的氨基酸突变。该Fcγ受体为FcγRIIIa时，更具体而言，在构成上述Fc区的第一多肽和/或第二多肽的氨基酸序列中，可以导入选自下述氨基酸取代的至少一个以上(例如2个或3个)的氨基酸突变：EU编号第234位的氨基酸L取代成Y、EU编号第235位的氨基酸L取代成Y或Q、EU编号第236位的氨基酸G取代成W、由EU编号第239位的氨基酸S取代成M、由EU编号第268位的氨基酸H取代成D、由EU编号第270位的氨基酸D取代成E、由EU编号第298位的氨基酸S取代成A、由EU编号第326位的氨基酸K取代成D、由EU编号第327位的氨基酸A取代成D、由EU编号第328位的氨基酸L取代成W、由EU编号第330位的氨基酸A取代成M或K、以及由EU编号第334位的氨基酸K取代成E或L。另外，该Fcγ受体为FcγRIIIa时，进一步具体而言，在构成上述Fc区的第一多肽或第二多肽的任一方多肽的氨基酸序列中，可以导入选自下述氨基酸取代的至少一个以上(例如2个或3个)的氨基酸突变：EU编号第239位的氨基酸S取代成D、EU编号第330位的氨基酸A取代成L、以及EU编号第332位的氨基酸I取代成E；
在另一方多肽的氨基酸序列中，可以导入选自下述氨基酸取代的至少一个以上(例如2个或3个)的氨基酸突变：EU编号第234位的氨基酸L取代成Y、EU编号第236位的氨基酸G取代成W、以及EU编号第298位的氨基酸S取代成A。
另外，该Fcγ受体为FcγRIIIa时，进一步具体而言，在构成上述Fc区的第一多肽或第二多肽的任一方多肽的氨基酸序列中，在选自EU编号第234位的Leu、第235位的Leu、第236位的Gly、第239位的Ser、第268位的His、第270位的Asp、第298位的Ser、第327位的Ala、第328位的Leu和第334位的Lys的至少一个以上(例如2个或3个)的氨基酸中可以导入突变，在另一方多肽的氨基酸序列中，在选自EU编号第270位的Asp、第326位的Lys、第330位的Ala和第334位的Lys的至少一个以上(例如2个或3个)的氨基酸中可以导入突变。
被改变的氨基酸可以适当选择，但优选在构成上述Fc区的第一多肽或第二多肽的任一方多肽的氨基酸序列中，可以导入选自下述取代的至少一个以上(例如2个或3个)的氨基酸突变：由EU编号第234位的氨基酸L取代成Y、由EU编号第235位的氨基酸L取代成Y或Q、由EU编号第236位的氨基酸G取代成W、由EU编号第239位的氨基酸S取代成M、由EU编号第268位的氨基酸H取代成D、由EU编号第270位的氨基酸D取代成E、由EU编号第298位的氨基酸S取代成A以及由EU编号第327位的氨基酸A取代成D、由EU编号第328位的氨基酸L取代成W、以及由EU编号第334位的氨基酸K取代成L；在另一方多肽的氨基酸序列中，可以导入选自下述取代的至少一个以上(例如2个或3个)的氨基酸突变：由EU编号第270位的氨基酸D取代成E、由EU编号第326位的氨基酸K取代成D、由EU编号第330位的氨基酸A取代成M或K、由EU编号第334位的氨基酸K取代成E。
更优选在构成上述Fc区的第一多肽或第二多肽的任一方多肽的氨基酸序列中，导入(i)～(vi)的任一个突变，在另一方多肽的氨基酸序列中，可以导入(vii)～(ix)的任一个突变：
(i) 由EU编号第234位的氨基酸L取代成Y、由EU编号第235位的氨基酸L取代成Y、由EU编号第236位的氨基酸G取代成W、由EU编号第268位的氨基酸H取代成D、以及由EU编号第298位的氨基酸S取代成A；
(ii) 由EU编号第234位的氨基酸L取代成Y、由EU编号第235位的氨基酸L取代成Y、由EU编号第236位的氨基酸G取代成W、由EU编号第268位的氨基酸H取代成D、由EU编号第270位的氨基酸D取代成E、以及由EU编号第298位的氨基酸S取代成A；
(iii) 由EU编号第234位的氨基酸L取代成Y、由EU编号第235位的氨基酸L取代成Q、由EU编号第236位的氨基酸G取代成W、由EU编号第239位的氨基酸S取代成M、由EU编号第268位的氨基酸H取代成D、由EU编号第270位的氨基酸D取代成E、以及由EU编号第298位的氨基酸S取代成A；
(iv) 由EU编号第234位的氨基酸L取代成Y、由EU编号第235位的氨基酸L取代成Y、由EU编号第236位的氨基酸G取代成W、由EU编号第268位的氨基酸H取代成D、由EU编号第298位的氨基酸S取代成A、以及由EU编号第327位的氨基酸A取代成D；
(v) 由EU编号第234位的氨基酸L取代成Y、由EU编号第235位的氨基酸L取代成Y、由EU编号第236位的氨基酸G取代成W、由EU编号第239位的氨基酸S取代成M、由EU编号第268位的氨基酸H取代成D、由EU编号第298位的氨基酸S取代成A、以及由EU编号第327位的氨基酸A取代成D；
(vi) 由EU编号第234位的氨基酸L取代成Y、由EU编号第235位的氨基酸L取代成Y、由EU编号第236位的氨基酸G取代成W、由EU编号第239位的氨基酸S取代成M、由EU编号第268位的氨基酸H取代成D、由EU编号第298位的氨基酸S取代成A、由EU编号第327位的氨基酸A取代成D、由EU编号第328位的氨基酸L取代成W、以及由EU编号第334位的氨基酸K取代成L；
(vii) 由EU编号第326位的氨基酸K取代成D、由EU编号第330位的氨基酸A取代成M、以及由EU编号第334位的氨基酸K取代成E；
(viii) 由EU编号第270位的氨基酸D取代成E、由EU编号第326位的氨基酸K取代成D、由EU编号第330位的氨基酸A取代成M、以及由EU编号第334位的氨基酸K取代成E；
(ix) 由EU编号第270位的氨基酸D取代成E、由EU编号第326位的氨基酸K取代成D、由EU编号第330位的氨基酸A取代成K、以及由EU编号第334位的氨基酸K取代成E。
另外，作为增强与活性型Fcγ受体的结合、用于诱起效应子功能优异的异源二聚体，是以由包含第一多肽和第二多肽的异源二聚体构成为特征的多肽，该第一多肽和第二多肽的任一方可以包含导入有下述(i)或(ii)所述突变的Fc区：
(i) EU编号第234位的氨基酸为L、S、F、E、V、D、Q、I、M、T、A、G或H，EU编号第235位的氨基酸为Y或Q，EU编号第236位的氨基酸为W，EU编号第239位的氨基酸为M或I，EU编号第268位的氨基酸为D，以及EU编号第298位的氨基酸为A；
(ii) EU编号第270位的氨基酸为E，EU编号第326位的氨基酸为D，EU编号第330位的氨基酸为A、K、M、F、I、Y或H，以及EU编号第334位的氨基酸为E。
更具体而言，第一多肽和第二多肽的任一方可以是导入有下述(iii)或(iv)所述突变、另一方导入有下述(v)所述突变的Fc区：
(iii) EU编号第234位的氨基酸为L、S、F、E、V、D、Q、I、M、T、A、G或H，EU编号第235位的氨基酸为Y或Q，EU编号第236位的氨基酸为W，EU编号第239位的氨基酸为M或I，EU编号第268位的氨基酸为D，EU编号第298位的氨基酸为A，以及EU编号第327位的氨基酸为D；
(iv) EU编号第234位的氨基酸为L、S、F、E、V、D、Q、I、M、T、A、G或H，EU编号第235位的氨基酸为Y或Q，EU编号第236位的氨基酸为W，EU编号第239位的氨基酸为M或I，EU编号第268位的氨基酸为D，EU编号第270位的氨基酸为E，以及EU编号第298位的氨基酸为A；
(v) EU编号第270位的氨基酸为E，EU编号第326位的氨基酸为D，EU编号第330位的氨基酸为A、K、M、F、I、Y或H，以及EU编号第334位的氨基酸为E。
特别是，为了增强与Fcγ受体IIIa的结合活性，第一多肽和第二多肽的任一方优选为上述(iii)的EU编号第234位的氨基酸为E、D、T或L。另外，为了增强与Fcγ受体IIIa的结合活性、降低与Fcγ受体IIb的结合活性，更优选上述(iv)的EU编号第234位的氨基酸为L、F、E或D。
为了增强与Fcγ受体IIa的结合活性，第一多肽和第二多肽的任一方优选为上述(iii)的EU编号第234位的氨基酸为V、I、T、M或L。其中，优选I、T或L，此时，也可提高与Fcγ受体IIIa的结合活性。
另外，作为增强与活性型Fcγ受体的结合、诱起效应子功能优异的异源二聚体优选为：第一多肽和第二多肽的任一方为上述(iii)的EU编号第234位的氨基酸为V、E、D、T、I、L或F，EU编号第239位的氨基酸为M或I，且另一方为上述(v)的EU编号第330位的氨基酸为A或K的情形；或者，第一多肽和第二多肽的任一方为上述(iv)的EU编号第234位的氨基酸为F、E、D、S或L，EU编号第239位的氨基酸为M或I，且另一方为上述(v)的EU编号第330位的氨基酸为A、F或K的情形。
更具体而言，可以举出实施例中记载的导入氨基酸突变的组合。
关于结合活性的选择性，可以在测定多肽与Fcγ受体的各同工型的结合活性后，通过求出它们的比来测定。作为结合活性的指标，例如可以使用与FcγR的结合量、KD值。
在本说明书中，结合活性的选择性提高是指，例如，与根据上述的测定方法求出的受检多肽的亲本多肽与Fcγ受体同工型的结合活性之比(受检多肽的亲本多肽与第一Fcγ受体同工型的结合活性/受检多肽的亲本多肽与第二Fcγ受体同工型的结合活性)进行比较，受检多肽与Fcγ受体同工型的结合活性之比(受检多肽与第一Fcγ受体同工型的结合活性/受检多肽与第二Fcγ受体同工型的结合活性)的比例提高0.1以上、优选0.2以上、0.5以上、1以上、2以上、3以上、5以上、7以上、8以上、9以上、10以上、15以上、20以上、30以上、50以上、70以上、100以上、150以上、200以上、500以上、1000以上。另外，对Fcγ受体同工型的选择性降低是指，例如，与根据上述测定方法求出的受检多肽的亲本多肽与Fcγ受体同工型的结合活性之比进行比较，受检多肽与Fcγ受体同工型的结合活性之比降低0.1以上、优选0.2以上、0.5以上、1以上、2以上、3以上、5以上、7以上、8以上、9以上、10以上、15以上、20以上、30以上、50以上、70以上、100以上、150以上、200以上、500以上、1000以上。
另外，在本说明书中，作为选择性的指标，例如，可以使用显示与活性型FcγR和抑制型FcγR的结合活性的比率的A/I比。以用受检多肽相对于FcγRIIb的KD除以受检多肽的FcγRIIa H型或R型的KD而得到的值作为各自的A/I比。A/I比优选1.1以上、1.5以上、2以上、3以上、5以上，更优选为6以上、8以上、9以上。
另外，在本说明书中，作为选择性的指标，例如，可以使用用相对于FcγRIIb的KD除以相对于FcγRIIIa F的KD而得到的值即FcγRIIIa F/FcγRIIb比。以用受检多肽相对于FcγRIIb的KD除以受检多肽相对于FcγRIIIa的KD而得到的值作为各自的FcγRIIIa F/FcγRIIb比。FcγRIIIa F/FcγRIIb比优选1.1以上、1.5以上、2以上、3以上、5以上，更优选为10以上、20以上、30以上、40以上、50以上、60以上、70以上、80以上、90以上、100以上、110以上、120以上、130以上、140以上、150以上、200以上、210以上、220以上、230以上、240以上。
在本发明中，当该多肽的Fc区的功能改变是指与Fcγ受体的结合活性的选择性提高时，在构成上述Fc区的第一多肽和/或第二多肽的氨基酸序列中可以导入氨基酸突变。对导入的该氨基酸突变的种类或范围没有特别限定。
当上述活性型Fcγ受体为FcγRIa、上述抑制型Fcγ受体为FcγRIIb、且该选择性的提高是指与FcγRIIb相比与FcγRIa的结合活性选择性地增强时，在构成上述Fc区的第一多肽和/或第二多肽的氨基酸序列中，可以导入选自说明书表19-1、表19-2、表19-3和表19-4的区a中记载的氨基酸突变的至少一个以上的氨基酸突变。另外，当该选择性的提高是指与FcγRIIb相比与FcγRIa的结合活性选择性地增强时，在构成上述Fc区的第一多肽和/或第二多肽的氨基酸序列中，可以导入选自说明书表19-1、表19-2、表19-3、表19-4和表19-5的区b中记载的氨基酸突变的至少一个以上的氨基酸突变。
当上述活性型Fcγ受体为FcγRIa、上述抑制型Fcγ受体为FcγRIIb、且该选择性的提高是指与FcγRIIb相比与FcγRIa的结合活性选择性地减弱时，在构成上述Fc区的第一多肽和/或第二多肽的氨基酸序列中，可以导入选自说明书表23-1和表23-2的区c中记载的氨基酸突变的至少一个以上的氨基酸突变。另外，当该选择性的提高是指与FcγRIIb相比与FcγRIa的结合活性选择性地减弱时，在构成上述Fc区的第一多肽和/或第二多肽的氨基酸序列中，可以导入选自说明书表23-1和表23-2的区d中记载的氨基酸突变的至少一个以上的氨基酸突变。
当上述活性型Fcγ受体为FcγRIIa R、上述抑制型Fcγ受体为FcγRIIb、且该选择性的提高是指与FcγRIIb相比与FcγRIIa R的结合活性选择性地增强时，在构成上述Fc区的第一多肽和/或第二多肽的氨基酸序列中，可以导入选自说明书表20-1的区a中记载的氨基酸突变的至少一个以上的氨基酸突变。另外，当该选择性的提高是指与FcγRIIb相比与FcγRIIa R的结合活性选择性地增强时，在构成上述Fc区的第一多肽和/或第二多肽的氨基酸序列中，可以导入选自说明书表20-1、表20-2和表20-3的区b中记载的氨基酸突变的至少一个以上的氨基酸突变。
当上述活性型Fcγ受体为FcγRIIa R、上述抑制型Fcγ受体为FcγRIIb、该选择性的提高是指与FcγRIIb相比与FcγRIIa R的结合活性选择性地减弱时，在构成上述Fc区的第一多肽和/或第二多肽的氨基酸序列中，可以导入选自说明书表24-1的区c中记载的氨基酸突变的至少一个以上的氨基酸突变。另外，当该选择性的提高是指与FcγRIIb相比与FcγRIIa R的结合活性被选择性地减弱时，在构成上述Fc区的第一多肽和/或第二多肽的氨基酸序列中，可以导入选自说明书表24-1和表24-2的区d中记载的氨基酸突变的至少一个以上的氨基酸突变。
当上述活性型Fcγ受体为FcγRIIa H、上述抑制型Fcγ受体为FcγRIIb、该选择性的提高是指与FcγRIIb相比与FcγRIIa H的结合活性选择性地增强时，在构成上述Fc区的第一多肽和/或第二多肽的氨基酸序列中，可以导入选自说明书表21-1的区a中记载的氨基酸突变的至少一个以上的氨基酸突变。另外，当该选择性的提高是指与FcγRIIb相比与FcγRIIa H的结合活性选择性地增强时，在构成上述Fc区的第一多肽和/或第二多肽的氨基酸序列中，可以导入选自说明书表21-1、表21-2和表21-3的区b中记载的氨基酸突变的至少一个以上的氨基酸突变。
当上述活性型Fcγ受体为FcγRIIa H、上述抑制型Fcγ受体为FcγRIIb、该选择性的提高是指与FcγRIIb相比与FcγRIIa H的结合活性选择性地减弱时，在构成上述Fc区的第一多肽和/或第二多肽的氨基酸序列中，可以导入选自说明书表25-1和表25-2的区c中记载的氨基酸突变的至少一个以上的氨基酸突变。另外，当该选择性的提高是指与FcγRIIb相比与FcγRIIa H的结合活性选择性地减弱时，在构成上述Fc区的第一多肽和/或第二多肽的氨基酸序列中，可以导入选自说明书表25-1、表25-2和表25-3的区d中记载的氨基酸突变的至少一个以上的氨基酸突变。
当上述活性型Fcγ受体为FcγRIIIa、上述抑制型Fcγ受体为FcγRIIb、该选择性的提高是指与FcγRIIb相比与FcγRIIIa的结合活性选择性地增强时，在构成上述Fc区的第一多肽和/或第二多肽的氨基酸序列中，可以导入选自说明书表22-1的区a中记载的氨基酸突变的至少一个以上的氨基酸突变。另外，当该选择性的提高是指与FcγRIIb相比与FcγRIIIa的结合活性选择性地增强时，在构成上述Fc区的第一多肽和/或第二多肽的氨基酸序列中，可以导入选自说明书表22-1、表22-2和表22-3的区b中记载的氨基酸突变的至少一个以上的氨基酸突变。
当上述活性型Fcγ受体为FcγRIIIa、上述抑制型Fcγ受体为FcγRIIb、且该选择性的提高是指与FcγRIIb相比与FcγRIIIa的结合活性选择性地减弱时，在构成上述Fc区的第一多肽和/或第二多肽的氨基酸序列中，可以导入选自说明书表26-1和表26-2的区c中记载的氨基酸突变的至少一个以上的氨基酸突变。另外，当该选择性的提高是指与FcγRIIb相比与FcγRIIIa的结合活性选择性地减弱时，在构成上述Fc区的第一多肽和/或第二多肽的氨基酸序列中，可以导入选自说明书表26-1、表26-2、表26-3和表26-4的区d中记载的氨基酸突变的至少一个以上的氨基酸突变。
这里，与所期望的Fcγ受体的结合活性选择性地增强是指下述任一种情形：
(i) 与所期望的Fcγ受体的结合活性增强，且与所期望的Fcγ受体以外的受体的结合活性不变或减弱；
(ii) 与所期望的Fcγ受体的结合活性增强，且与所期望的Fcγ受体以外的受体的结合活性也增强，但与所期望的Fcγ受体以外的受体的结合活性增强的程度低于与所期望的Fcγ受体的结合活性增强的程度；或者
(iii) 与所期望的Fcγ受体的结合活性减弱，但该结合活性减弱的程度低于与所期望的Fcγ受体以外的Fcγ受体的结合活性减弱的程度。
另外，与所期望的Fcγ受体的结合活性选择性地减弱是指下述任一种情形：
(i) 与所期望的Fcγ受体的结合活性减弱，且与所期望的Fcγ受体以外的受体的结合活性不变或增强；
(ii) 与所期望的Fcγ受体的结合活性减弱，且与所期望的Fcγ受体以外的受体的结合活性也减弱，但与所期望的Fcγ受体以外的受体的结合活性减弱的程度低于与所期望的Fcγ受体的结合活性减弱的程度；或者
(iii) 与所期望的Fcγ受体的结合活性增强，但该结合活性增强的程度低于与所期望的Fcγ受体以外的Fcγ受体的结合活性增强的程度。
在本说明书中，多肽的物理化学稳定性例如是指多肽的热力学稳定性，多肽的热力学稳定性例如可以以CH2区的Tm值等为指标进行判断。Tm值可以通过CD(圆二色性)、DSC(差示扫描型量热量计)、DSF(差示扫描型荧光定量法)来测定。
CD是指，通过观测升温所伴随的平均残基摩尔椭圆率(θ)的变化，算出Tm值。作为测定仪器，例如可以列举圆二色性分散仪(日本分光)。在适当的一个波长(例如208nm或222nm)处边升温边测定CD光谱时，在某温度下θ上升，在其后的温度下达到一定的值。此时，以取低温时的θ与高温时的θ的中点值的温度作为Tm。在测定中，例如可以使用用枸橼酸、Tris、磷酸溶液等制备的蛋白溶液，可以以数百μg/mL的浓度在测定中使用。
DSC是指，通过观测升温所伴随的热量变化，算出Tm值。作为测定仪器，可以列举MicroCal VP-DSC、Micro Cal Capillary DSC (均由DKSH Japan制造)。将蛋白溶液以及缓冲液装在测定盒中，边升温边测定盒间的温度差时，以某温度为界转变成吸热反应。以此时的温度作为Tm。在测定中，例如可以使用用枸橼酸缓冲液、TBS、PBS、组氨酸缓冲液等制备的蛋白溶液，以数十μg/mL～数百μg/mL的浓度在测定中使用。
DSF是指，使用与疏水性残基特异性结合的荧光试剂(例如SYPRO orange)，通过观测升温所伴随的疏水性残基的暴露，算出Tm值。将蛋白溶液和荧光试剂以适当比例混合，使用RT-PCR装置，边升温边测定荧光强度时，在某温度下观测到荧光强度的上升。以此时的温度作为Tm。作为测定仪器，例如可以列举Rotor-Gene Q (QIAGEN)、CFX96实时PCR分析系统(Bio-Rad)。在测定中，例如可以使用用PBS、组氨酸缓冲液等制备的蛋白溶液，以数十μg/mL～数百μg/mL的浓度在测定中使用。
在本说明书中，多肽的物理学稳定性提高是指，例如与根据上述测定方法求出的对照多肽Fc区中的CH2区的Tm值相比，受检多肽Fc区中的CH2区的Tm值提高0.1度以上、优选0.2度以上、0.3度以上、0.4度以上、0.5度以上、1度以上、2度以上、3度以上、4度以上、5度以上、10度以上。另外，多肽的物理学稳定性提高还指多肽的物理学稳定性的降低被抑制，例如，相对于根据上述测定方法求出的对照多肽Fc区中的CH2区的Tm值，受检多肽Fc区中的CH2区的Tm值的降低被抑制0.1度以上、优选0.2度以上、0.3度以上、0.4度以上、0.5度以上、1度以上、2度以上、3度以上、4度以上、5度以上、10度以上。
另外，在本说明书中，多肽的物理学稳定性降低是指，例如与根据上述测定方法求出的对照多肽Fc区中的CH2区的Tm值相比，受检多肽Fc区中的CH2区的Tm值降低0.1度以上、优选0.2度以上、0.3度以上、0.4度以上、0.5度以上、1度以上、2度以上、3度以上、4度以上、5度以上、10度以上。
另外，本发明还包含多肽，是以由包含第一多肽和第二多肽的异源二聚体构成为特征的多肽，其特征在于：该第一多肽和第二多肽包含导入有突变的Fc区、与包含未导入突变的Fc区的多肽相比，Fc区的功能被改变。
在该多肽中，上述Fc区的功能改变除了可以是选自多肽与Fcγ受体的结合活性增强、结合活性减弱和结合活性的选择性提高的至少一种以上的改变外，还可以是物理化学稳定性提高的改变，当上述的任一种功能被改变时，本发明的Fc区的功能可以被改变。
在本发明中，“在第一多肽和第二多肽的双方的Fc区中导入氨基酸突变时，该Fc区的功能不被改变”是指，向第一多肽和第二多肽的双方中均导入相同的氨基酸突变时，所期望的功能没有提高，例如，想要增强多肽与Fcγ受体的结合活性时，该结合活性不变或减弱；想要减弱结合活性时，该结合活性不变或增强；想要提高结合活性的选择性时，该选择性没有提高；想要提高多肽的物理化学稳定性时，该稳定性不变或降低。“仅向一方Fc区中导入氨基酸突变时，该Fc区的功能被改变”是指，仅向第一多肽或第二多肽的任一方中导入氨基酸突变时，所期望的功能提高，例如，想要增强多肽与Fcγ受体的结合活性时，该结合活性增强；想要减弱结合活性时，该结合活性减弱；想要提高结合活性的选择性时，该选择性提高；想要提高多肽的物理化学稳定性时，该稳定性提高。
本发明还包含多肽，其特征在于：与以由仅包含第一多肽的同源二聚体构成为特征的多肽或以由仅包含第二多肽的同源二聚体构成为特征的多肽相比，以上述Fc区由包含第一多肽和第二多肽的异源二聚体构成为特征的多肽具有高的Tm。该多肽可以加入具有高的Tm的物理化学稳定性提高的改变，同时可以进一步加入Fc区的功能的改变。
当进一步添加的Fc区的功能改变是与FcγRIa的结合活性增强时，在构成上述Fc区的第一多肽和/或第二多肽的氨基酸序列中，可以导入选自说明书表31-1、表31-2和表31-3中记载的氨基酸突变的至少一个以上的氨基酸突变。
当进一步添加的Fc区的功能改变是与FcγRIIa R的结合活性增强时，在构成上述Fc区的第一多肽和/或第二多肽的氨基酸序列中，可以导入选自说明书表32-1和表32-2中记载的氨基酸突变的至少一个以上的氨基酸突变。
当进一步添加的Fc区的功能改变是与FcγRIIa H的结合活性增强时，在构成上述Fc区的第一多肽和/或第二多肽的氨基酸序列中，可以导入选自说明书表33-1和表33-2中记载的氨基酸突变的至少一个以上的氨基酸突变。
当进一步添加的Fc区的功能改变是与FcγRIIb的结合活性增强时，在构成上述Fc区的第一多肽和/或第二多肽的氨基酸序列中，可以导入选自说明书表34-1和表34-2中记载的氨基酸突变的至少一个以上的氨基酸突变。
当进一步添加的Fc区的功能改变是与FcγRIIIa的结合活性增强时，在构成上述Fc区的第一多肽和/或第二多肽的氨基酸序列中，可以导入选自说明书表35-1和表35-2中记载的氨基酸突变的至少一个以上的氨基酸突变。
在本发明中，对导入了氨基酸突变的第一多肽和第二多肽的组合没有特别限定，可以例示选自SEQ ID NO: 2～4和SEQ ID NO: 6～60所记载的多肽的不同种类/或相同种类的多肽的组合。另外，作为优选的例子，可以列举本申请的实施例中记载的、包含第一多肽和第二多肽的多肽的组合(2个抗体的H链和1个抗体的L链的组合)。
本发明的多肽可以是抗原结合分子。在本发明中，对抗体结合分子的种类没有特别限定，作为优选的例子，可以例示抗体、双特异性抗体、肽Fc融合蛋白或支架Fc融合蛋白等Fc融合分子。
<抗体>
而且，提供抗体作为本发明的多肽。
本发明中的“抗体”一词以最广泛的意义使用，只要显示出所期望的生物学活性即可，还包括单克隆抗体(包含全长单克隆抗体)、多克隆抗体、抗体突变体、抗体片段、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、嵌合抗体、人源化抗体等任何抗体。
本发明的抗体对抗原的种类、抗体的来源等没有限定，可以是任何抗体。对抗体的来源没有特别限定，可以列举人抗体、小鼠抗体、大鼠抗体、兔抗体等。
制作抗体的方法为本领域技术人员所熟知，例如当为单克隆抗体时，可以利用杂交瘤法(Kohler和Milstein, Nature 256: 495 (1975))、重组方法(美国专利第4,816,567号)来制备。另外，可以从噬菌体抗体文库中分离(Clackson等人, Nature 352: 624-628(1991); Marks等人, J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991))。还可以从单一的B细胞克隆中分离(N. Biotechnol. 28(5): 253-457 (2011))。
人源化抗体也被称作重构(reshaped)人抗体。具体而言，将人以外的动物、例如小鼠抗体的CDR移植到人抗体内而得到的人源化抗体等是公知的。用于得到人源化抗体的普通的基因重组方法也已知。具体而言，作为用于将小鼠抗体的CDR移植到人的FR中的方法，例如重叠延伸PCR是公知的。
将编码连接有3个CDR和4个FR的抗体可变区的DNA和编码人抗体恒定区的DNA插入表达载体中使之在框内融合，从而可以制作人源化抗体表达用载体。将该整合载体导入宿主中，建立重组细胞，之后培养该重组细胞，使编码该人源化抗体的DNA表达，从而在该培养细胞的培养物中产生该人源化抗体(参照欧州专利公开EP 239400、国际公开WO1996/002576)。
根据需要，还可以取代FR的氨基酸残基，使重构人抗体的CDR形成适当的抗原结合位点。例如，可以应用向人FR中移植小鼠CDR时使用的PCR法，向FR中导入氨基酸序列的突变。
以具有人抗体基因的所有组成成分的转基因动物(参照国际公开WO1993/012227、WO1992/003918、WO1994/002602、WO1994/025585、WO1996/034096、WO1996/033735)作为免疫动物，通过DNA免疫可以获得所期望的人抗体。
而且，还已知使用人抗体文库，通过筛选获得人抗体的技术。例如，利用噬菌体展示法使人抗体的V区作为单链抗体(scFv)在噬菌体表面表达。可以选择表达与抗原结合的scFv的噬菌体。通过分析所选择的噬菌体的基因，可以确定编码与抗原结合的人抗体的V区的DNA序列。确定与抗原结合的scFv的DNA序列后，使该V区序列和所期望的人抗体C区的序列在框内融合，之后插入适当的表达载体中，从而可以制作表达载体。将该表达载体导入上述所列举的适当的表达细胞中，使编码该人抗体的基因表达，从而获得该人抗体。这些方法已经众所周知(参照国际公开WO1992/001047、WO1992/020791、WO1993/006213、WO1993/011236、WO1993/019172、WO1995/001438、WO1995/015388)。
构成本发明的抗体的可变区可以是识别任意抗原的可变区。
在本说明书中，对抗原没有特别限定，可以是任何抗原。作为抗原的例子，可以列举：17-IA、4-1 BB、4Dc、6-酮基(keto)-PGF1a、8-异(iso)-PGF2a、8-氧代(oxo)-dG、A1腺苷受体、A33、ACE、ACE-2、激活素、激活素A、激活素AB、激活素B、激活素C、激活素RIA、激活素RIA ALK-2、激活素RIB ALK-4、激活素RIIA、激活素RIIB、ADAM、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAM8、ADAM9、ADAMTS、ADAMTS4、ADAMTS5、地址素、脂连蛋白、ADP核糖基环化酶-1、aFGF、AGE、ALCAM、ALK、ALK-1、ALK-7、变应原、α1-抗胰凝乳蛋白酶、α1-抗胰蛋白酶、α-突触核蛋白、α-V/β-I拮抗物、aminin、支链淀粉、淀粉状蛋白β、淀粉状蛋白免疫球蛋白重链可变区、淀粉状蛋白免疫球蛋白轻链可变区、雄激素、ANG、血管紧张素原、血管生成素配体-2、抗-Id、抗凝血酶III、炭疽、APAF-1、APE、APJ、apo A1、apo血清淀粉状蛋白A、Apo-SAA、APP、APRIL、AR、ARC、ART、Artemin、ASPARTIC、心房钠尿因子、心房钠尿肽、心房钠尿肽A、心房钠尿肽B、心房钠尿肽C、av/b3整联蛋白、Axl、B7-1、B7-2、B7-H、BACE、BACE-1、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)保护性抗原、Bad、BAFF、BAFF-R、Bag-1、BAK、Bax、BCA-1、BCAM、BcI、BCMA、BDNF、b-ECGF、β-2-微球蛋白、β内酰胺酶、bFGF、BID、Bik、BIM、BLC、BL-CAM、BLK、B-淋巴细胞刺激因子(BIyS)、BMP、BMP-2(BMP-2a)、BMP-3(骨生成蛋白)、BMP-4(BMP-2b)、BMP-5、BMP-6(Vgr-1)、BMP-7(OP-1)、BMP-8 (BMP-8a)、BMPR、BMPR-IA(ALK-3)、BMPR-IB(ALK-6)、BMPR-II (BRK-3)、BMPs、BOK、铃蟾素、骨衍生神经营养因子、牛生长激素、BPDE、BPDE-DNA、BRK-2、BTC、B-淋巴细胞细胞粘附分子、C10、C1-抑制剂、C1q、C3、C3a、C4、C5、C5a(补体5a)、CA125、CAD-8、钙粘着蛋白_3、降钙素、cAMP、碳酸酐酶-IX、癌胚抗原（CEA)、癌相关抗原、心肌营养蛋白-I、组织蛋白酶A、组织蛋白酶B、组织蛋白酶C/DPPI、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶H、组织蛋白酶L、组织蛋白酶O、组织蛋白酶S、组织蛋白酶V、组织蛋白酶X/Z/P、CBL、CCI、CCK2、CCL、CCL1/I-309、CCL11/嗜酸细胞活化趋化因子(Eotaxin)、CCL12/MCP-5、CCL13/MCP-4、CCL14/HCC-1、CCL15/HCC-2、CCL16/HCC-4、CCL17/TARC、CCL18/PARC、CCL19/ELC、CCL2/MCP-1、CCL20/MIP-3-α、CCL21/SLC、CCL22/MDC、CCL23/MPIF-1、CCL24/嗜酸细胞活化趋化因子-2、CCL25/TECK、CCL26/嗜酸细胞活化趋化因子-3、CCL27/CTACK、CCL28/MEC、CCL3/M1P-1-α、CCL3Ll/LD-78-β、CCL4/MIP-l-β、CCL5/RANTES、CCL6/C10、CCL7/MCP-3、CCL8/MCP-2、CCL9/10/MTP-1-γ、CCR、CCR1、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CD1、CD10、CD105、CD11a、CD11b、CD11c、CD123、CD13、CD137、CD138、CD14、CD140a、CD146、CD147、CD148、CD15、CD152、CD16、CD164、CD18、CD19、CD2、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD26、CD27L、CD28、CD29、CD3、CD30、CD30L、CD32、CD33(p67蛋白)、CD34、CD37、CD38、CD3E、CD4、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD49a、CD49b、CD5、CD51、CD52、CD54、CD55、CD56、CD6、CD61、CD64、CD66e、CD7、CD70、CD74、CD8、CD80(B7-1)、CD89、CD95、CD105、CD158a、CEA、CEACAM5、CFTR、cGMP、CGRP受体、CINC、CKb8-1、密蛋白18、CLC、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)毒素、艰难梭菌(Clostridium difficile)毒素、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)毒素、c-Met、CMV、CMV UL、CNTF、CNTN-1、补体因子3(C3)、补体因子D、皮质甾类结合球蛋白、集落刺激因子-I受体、COX、C-Ret、CRG-2、CRTH2、CT-1、CTACK、CTGF、CTLA-4、CX3CL1/分形趋化因子(Fractalkine)、CX3CR1、CXCL、CXCL1/Gro-α、CXCL10、CXCL11/I-TAC、CXCL12/ SDF-l-α/β、CXCL13/BCA-1、CXCL14/BRAK、CXCL15/Lungkine.CXCL16、CXCL16、CXCL2/ Gro-β、CXCL3/Gro-γ、CXCL3、CXCL4/PF4、CXCL5/ENA-78、CXCL6/GCP-2、CXCL7/NAP-2、CXCL8/IL-8、CXCL9/Mig、CXCLlO/IP-10、CXCR、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、细胞角蛋白肿瘤相关抗原、DAN、DCC、DcR3、DC-SIGN、衰变加速因子、δ样蛋白质配体4、脱(1-3)-IGF-1(脑IGF-1)、Dhh、DHICA氧化酶、Dickkopf-1、地高辛、二肽基肽酶IV、DKl、DNAM-1、DNA酶、Dpp、DPPIV/CD26、Dtk、ECAD、EDA、EDA-A1、EDA-A2、EDAR、EGF、EGFR(ErbB-1)、含有蛋白质7的EGF样结构域、弹性蛋白酶、弹性蛋白、EMA、EMMPRIN、ENA、ENA-78、内皮唾酸蛋白、内皮素受体、内毒素、脑啡肽酶、eNOS、Eot、嗜酸细胞活化趋化因子、嗜酸细胞活化趋化因子-2、eotaxini、EpCAM、Ephrin B2/EphB4、Epha2酪氨酸激酶受体、表皮生长因子受体（EGFR)、ErbB2受体、ErbB3酪氨酸激酶受体、ERCC、红细胞生成素（EPO)、红细胞生成素受体、E-选择蛋白、ET-1、Exodus-2、RSV的F蛋白、F10、F11、F12、F13、F5、F9、因子Ia、因子IX、因子Xa、因子VII、因子VIII、因子VIIIc、Fas、FcαR、FcepsilonRI、FcγIIb、FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa、FcγRIIIb、FcRn、FEN-1、铁蛋白、FGF、FGF-19、FGF-2、FGF-2受体、FGF-3、FGF-8、FGF-酸性、FGF-碱性、FGFR、FGFR-3、血纤蛋白、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、成纤维细胞生长因子、成纤维细胞生长因子-10、纤连蛋白、FL、FLIP、Flt-3、FLT3配体、叶酸盐受体、促卵泡激素(FSH)、分形趋化因子(CX3C)、游离重链、游离轻链、FZD1、FZD10、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、G250、Gas 6、GCP-2、GCSF、G-CSF、G-CSF受体、GD2、GD3、GDF、GDF-1、GDF-15(MIC-1)、GDF-3(Vgr-2)、GDF-5(BMP-14/CDMP-1)、GDF-6(BMP-13/CDMP-2)、GDF-7(BMP-12/ CDMP-3)、GDF-8(肌生成抑制素(Myostatin))、GDF-9、GDNF、凝溶胶蛋白、GFAP、GF-CSF、GFR-α1、GFR-α2、GFR-α3、GF-β1、gH包膜糖蛋白、GITR、胰高血糖素、胰高血糖素受体、胰高血糖素样肽1受体、Glut 4、谷氨酸羧肽酶II、糖蛋白激素受体、糖蛋白IIb/IIIa(GP IIb/IIIa)、磷脂酰肌醇聚糖-3、GM-CSF、GM-CSF受体、gp130、gp140、gp72、粒细胞-CSF(G-CSF)、GRO/MGSA、生长激素释放因子、GRO-β、GRO-γ、幽门螺杆菌(H. pylori)、半抗原(NP-cap或NIP-cap)、HB-EGF、HCC、HCC 1、HCMV gB包膜糖蛋白、HCMV UL、造血生长因子(HGF)、Hep B gp120、类肝素酶、肝素辅因子II、肝生长因子、炭疽芽孢杆菌保护性抗原、丙型肝炎病毒E2糖蛋白、戊型肝炎、Hepcidin、Her1、Her2/neu(ErbB-2)、Her3(ErbB-3)、Her4(ErbB-4)、单纯疱疹病毒（HSV)gB糖蛋白、HGF、HGFA、高分子量黑素瘤相关抗原(HMW-MAA)、HIV包膜蛋白例如GP120、HIV MIB gp 120 V3环、HLA、HLA-DR、HM1.24、HMFG PEM、HMGB-1、HRG、Hrk、HSP47、Hsp90、HSV gD糖蛋白、人心肌球蛋白、人巨细胞病毒(HCMV)、人生长激素(hGH)、人血清白蛋白、人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)、亨廷顿蛋白(Huntingtin)、HVEM、IAP、ICAM、ICAM-1、ICAM-3、ICE、ICOS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IgA、IgA受体、IgE、IGF、IGF结合蛋白、IGF-1、IGF-1 R、IGF-2、IGFBP、IGFR、IL、IL-1、IL-10、IL-10受体、IL-11、IL-11受体、IL-12、IL-12受体、IL-13、IL-13受体、IL-15、IL-15受体、IL-16、IL-16受体、IL-17、IL-17受体、IL-18(IGIF)、IL-18受体、IL-1α、IL-1β、IL-1受体、IL-2、IL-2受体、IL-20、IL-20受体、IL-21、IL-21受体、IL-23、IL-23受体、IL-2受体、IL-3、IL-3受体、IL-31、IL-31受体、IL-3受体、IL-4、IL-4受体、IL-5、IL-5受体、IL-6、IL-6受体、IL-7、IL-7受体、IL-8、IL-8受体、IL-9、IL-9受体、免疫球蛋白免疫复合体、免疫球蛋白、INF-α、INF-α受体、INF-β、INF-β受体、INF-γ、INF-γ受体、IFN I型、IFN I型受体、流感病毒(influenza)、抑制素、抑制素α、抑制素β、iN0S、胰岛素、胰岛素A-链、胰岛素B-链、胰岛素样生长因子1、胰岛素样生长因子2、胰岛素样生长因子结合蛋白、整联蛋白、整联蛋白α2、整联蛋白α3、整联蛋白α4、整联蛋白α4/β1、整联蛋白α-V/β-3、整联蛋白α-V/β-6、整联蛋白α4/β7、整联蛋白α5/β1、整联蛋白α5/β3、整联蛋白α5/β6、整联蛋白ασ(αV)、整联蛋白αθ、整联蛋白β1、整联蛋白β2、整联蛋白β3(GPIIb-IIIa)、IP-10、I-TAC、JE、kalliklein、激肽释放酶11、激肽释放酶12、激肽释放酶14、激肽释放酶15、激肽释放酶2、激肽释放酶5、激肽释放酶6、激肽释放酶L1、激肽释放酶L2、激肽释放酶L3、激肽释放酶L4、kallistatin、KC、KDR、角质形成细胞生长因子(KGF)、角质形成细胞生长因子-2(KGF-2)、KGF、杀伤细胞免疫球蛋白样受体、kit配体(KL)、Kit酪氨酸激酶、层粘连蛋白5、LAMP、LAPP(支链淀粉、胰岛淀粉样多肽）、LAP(TGF-1)、潜伏期相关肽、潜伏TGF-1、潜伏TGF-1 bp1、LBP、LDGF、LDL、LDL受体、LECT2、Lefty、瘦蛋白、促黄体生成激素（leutinizing hormone) (LH)、路易斯-Y抗原（Lewis-Y antigen)、路易斯-Y相关抗原、LFA-1、LFA-3、LFA-3受体、Lfo、LIF、LIGHT、脂蛋白、LIX、LKN、Lptn、L-选择蛋白、LT-a、LT-b、LTB4、LTBP-1、肺表面活性剂、促黄体激素、淋巴细胞趋化因子、淋巴毒素β受体、溶性鞘脂受体(Lysosphingolipid receptor)、Mac-1、巨噬细胞-CSF(M-CSF)、MAdCAM、MAG、MAP2、MARC、maspin、MCAM、MCK-2、MCP、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-I(MCAF)、M-CSF、MDC、MDC(67 a.a.)、MDC(69 a.a.)、megsin、Mer、MET酪氨酸激酶受体家族、金属蛋白酶、膜糖蛋白OX2、Mesothelin、MGDF受体、MGMT、MHC(HLA-DR)、微生物蛋白、MIF、MIG、MIP、MIP-1α、MIP-1β、MIP-3α、MIP-3β、MIP-4、MK、MMAC1、MMP、MMP-1、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-2、MMP-24、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、单核细胞趋化蛋白(monocyte attractant protein)、单核细胞集落抑制因子、小鼠促性腺激素相关肽、MPIF、Mpo、MSK、MSP、MUC-16、MUC18、粘蛋白(Mud)、Muellerian抑制性物质、Mug、MuSK、髓鞘相关糖蛋白、骨髓祖代抑制因子-1(MPIF-I)、NAIP、纳米体(Nanobody)、NAP、NAP-2、NCA 90、NCAD、N-钙粘着蛋白、NCAM、脑啡肽酶(Neprilysin)、神经细胞粘附分子、神经源性丝氨酸蛋白酶抑制剂(neroserpin)、神经生长因子(NGF)、神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4、神经营养蛋白-6、神经毡蛋白1、Neurturin、NGF-β、NGFR、NKG20、N-甲硫氨酰人生长激素、nNOS、NO、Nogo-A、Nogo受体、丙型肝炎病毒的非结构蛋白3型(NS3)、NOS、Npn、NRG-3、NT、NT-3、NT-4、NTN、OB、OGG1、制癌蛋白M、OP-2、OPG、OPN、OSM、OSM受体、骨诱导因子、骨桥蛋白、OX40L、OX40R、氧化型LDL、p150、p95、PADPr、甲状旁腺激素、PARC、PARP、PBR、PBSF、PCAD、P-钙粘着蛋白、PCNA、PCSK9、PDGF、PDGF受体、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PDGF-D、PDK-1、PECAM、PEDF、PEM、PF-4、PGE、PGF、PGI2、PGJ2、PIGF、PIN、PLA2、胎盘生长因子、胎盘碱性磷酸酶(PLAP)、胎盘催乳激素、纤溶酶原激活物抑制剂-1、血小板生长因子、plgR、PLP、不同大小的聚乙二醇链(例如PEG-20、PEG-30、PEG40)、PP14、前激肽释放酶、朊病毒蛋白质、原降钙素、程序性细胞死亡蛋白1、胰岛素原、催乳素、蛋白原转化酶PC9、松弛素原、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、蛋白A、蛋白C、蛋白D、蛋白S、蛋白Z、PS、PSA、PSCA、PsmAr、PTEN、PTHrp、Ptk、PTN、P-选择蛋白糖蛋白配体-1、R51、RAGE、RANK、RANKL、RANTES、松弛素、松弛素A-链、松弛素B-链、肾素、呼吸道合胞体病毒(RSV)F, Ret、reticulon 4、类风湿因子、RLI P76、RPA2、RPK-1、RSK、RSV Fgp、S100、RON-8、SCF/KL、SCGF、骨硬化蛋白(Sclerostin)、SDF-1、SDF1α、SDF1β、SERINE、血清淀粉状蛋白P、血清白蛋白、sFRP-3、Shh、志贺样毒素II、SIGIRR、SK-1、SLAM、SLPI、SMAC、SMDF、SMOH、SOD、SPARC、鞘氨醇1-磷酸受体1、葡萄球菌脂磷壁酸、Stat、STEAP、STEAP-II、干细胞因子(SCF)、链激酶、过氧化物歧化酶、粘结蛋白聚糖-1、TACE、TACI、TAG-72(肿瘤相关糖蛋白-72)、TARC、TB、TCA-3、T-细胞受体α/β、TdT、TECK、TEM1、TEM5、TEM7、TEM8、生腱蛋白、TERT、睾丸PLAP-样碱性磷酸酶、TfR、TGF、TGF-α、TGF-β、TGF-βPan特异性、TGF-β RII、TGF-β RIIb、TGF-β RIII、TGF-β Rl(ALK-5)、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、TGF-β5、TGF-I、凝血酶、血小板生成素(TPO)、胸腺基质淋巴细胞生成素受体、胸腺Ck-1、促甲状腺激素(TSH)、甲状腺素、甲状腺素结合球蛋白、Tie、TIMP、TIQ、组织因子、组织因子蛋白酶抑制剂、组织因子蛋白、TMEFF2、Tmpo、TMPRSS2、TNF受体I、TNF受体II、TNF-α、TNF-β、TNF-β2、TNFc、TNF-RI、TNF-RII、TNFRSF10A(TRAIL R1 Apo-2/DR4)、TNFRSF10B(TRAIL R2 DR5/KILLER/TRICK-2A/ TRICK-B)、TNFRSF10C(TRAIL R3 DcR1/LIT/TRID)、TNFRSF10D (TRAIL R4 DcR2/TRUNDD)、TNFRSF11A(RANK ODF R/TRANCE R)、TNFRSF11B(OPGOCIF/TR1)、TNFRSF12(TWEAK R FN14)、TNFRSF12A、TNFRSF13B(TACI)、TNFRSF13C(BAFF R)、TNFRSF14 (HVEM ATAR/HveA/LIGHT R/TR2)、TNFRSF16(NGFR p75NTR)、TNFRSF17(BCMA)、TNFRSF18(GITR AITR)、TNFRSF19(TROY TAJ/ TRADE)、TNFRSF19L(RELT)、TNFRSF1A(TNF RlCD120a/p55-60)、TNFRSF1B(TNF RII CD120b/p75-80)、TNFRSF21(DR6)、TNFRSF22(DcTRAIL R2 TNFRH2)、TNFRSF25(DR3 Apo-3/LARD/TR-3/ TRAMP/WSL-1)、TNFRSF26(TNFRH3)、TNFRSF3(LTbR TNF RIII/TNFC R)、TNFRSF4(OX40 ACT35/TXGP1 R)、TNFRSF5(CD40 p50)、TNFRSF6(Fas Apo-1/APT1/CD95)、TNFRSF6B(DcR3 M68/TR6)、TNFRSF7(CD27)、TNFRSF8(CD30)、TNFRSF9(4-1 BB CD137/ILA)、TNFRST23(DcTRAIL R1 TNFRH1)、TNFSF10(TRAIL Apo-2配体/TL2)、TNFSF11(TRANCE/RANK配体 ODF/OPG配体)、TNFSF12 (TWEAKApo-3配体/DR3配体)、TNFSF13(APRIL TALL2)、TNFSF13B(BAFF BLYS/TALL1/THANK/TNFSF20)、TNFSF14(LIGHT HVEM配体/LTg)、TNFSF15(TL1A/VEGI)、TNFSF18(GITR配体 AITR配体/TL6)、TNFSF1A(TNF-a Conectin/DIF/TNFSF2)、TNFSF1B(TNF-b LTa/TNFSF1)、TNFSF3(LTb TNFC/p33)、TNFSF4(OX40配体 gp34/TXGP1)、TNFSF5(CD40配体 CD154/gp39/HIGM1/IMD3/ TRAP)、TNFSF6(Fas配体 Apo-1配体/APT1配体)、TNFSF7(CD27配体 CD70)、TNFSF8(CD30配体 CD153)、TNFSF9(4-1 BB配体 CD137配体)、TNF-α、TNF-β、TNIL-I、毒素代谢物、TP-1、t-PA、Tpo、TRAIL、TRAIL R、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRANCE、运铁蛋白受体、转化生长因子(TGF)例如TGF-α和TGF-β、跨膜糖蛋白NMB、运甲状腺素蛋白、TRF、Trk、TROP-2、滋养层糖蛋白、TSG、TSLP、肿瘤坏死因子(TNF)、肿瘤相关抗原CA 125、肿瘤相关抗原表达路易斯Y相关糖类、TWEAK、TXB2、Ung、uPAR、uPAR-1、尿激酶、VAP-1、血管内皮生长因子(VEGF)、vaspin、VCAM、VCAM-1、VECAD、VE-钙粘着蛋白、VE-钙粘着蛋白-2、VEFGR-1(flt-1)、VEFGR-2、VEGF受体(VEGFR)、VEGFR-3(flt-4)、VEGI、VIM、病毒抗原、VitB12受体、玻连蛋白受体、VLA、VLA-1、VLA-4、VNR整联蛋白、冯维勒布兰德因子(vWF)、WIF-1、WNT1、WNT10A、WNT10B、WNT11、WNT16、WNT2、WNT2B/13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9B、XCL1、XCL2/SCM-l-β、XCLl/淋巴细胞趋化因子、XCR1、XEDAR、XIAP、XPD等。
构成可变区的氨基酸序列只要维持其抗原结合活性即可，允许1个或多个氨基酸残基的改变。改变可变区的氨基酸序列时，对被改变的位点或被改变的氨基酸数目没有特别限定。例如，可以适当改变存在于CDR和/或FR中的氨基酸。改变可变区的氨基酸时，没有特别限定，但优选维持结合活性，例如，与改变前相比，优选具有50%以上、优选80%以上、进一步优选100%以上的结合活性。另外，通过改变氨基酸，结合活性可以提高，例如，与改变前相比，结合活性例如可以达到2倍、5倍、10倍等。在本发明的抗体中，氨基酸序列的改变可以是氨基酸残基的取代、添加、缺失、插入和修饰中的至少一种。
例如，可变区的N末端的谷氨酰胺通过焦谷氨酰化而修饰成焦谷氨酸，这是本领域技术人员所熟知的修饰。因此，本发明的抗体当其重链的N末端为谷氨酰胺时，包含该谷氨酰胺被修饰成焦谷氨酸的可变区。
本发明的抗体的可变区可以是任意序列，可以是小鼠抗体、大鼠抗体、兔抗体、山羊抗体、骆驼抗体、以及将这些非人抗体人源化的人源化抗体、以及人抗体等任何来源的抗体的可变区。“人源化抗体”也称作重构(reshaped)人抗体，是将来自人以外的哺乳动物的抗体、例如小鼠抗体的互补性决定区(CDR; complementarity determining region)移植到人抗体的CDR中而得到的抗体。用于鉴定CDR的方法众所周知(Kabat等人, Sequence ofProteins of Immunological Interest (1987), National Institute of Health,Bethesda, Md.; Chothia等人, Nature (1989) 342: 877)。另外，其普通的基因重组方法也众所周知(参照欧州专利申请公开号EP125023号公报、WO96/02576号公报)。另外，还可以是向这些抗体的可变区中导入了各种氨基酸取代以改善其与抗原的结合、药物动力学、稳定性、抗原性的抗体。本发明的抗体的可变区，由于其与抗原的结合具有pH依赖性，因此可以反复与抗原结合(WO/2009/125825)。
抗体的轻链恒定区中存在着κ链和λ链型的恒定区，但可以是任一种轻链恒定区。而且，在本发明中，轻链恒定区可以是进行了氨基酸的取代、添加、缺失、插入和/或修饰等改变的轻链恒定区。
作为本发明的抗体的重链恒定区，例如可以使用人IgG抗体的重链恒定区，优选为人IgG1抗体的重链恒定区。
构成本发明的抗体的可变区可以是识别任意的抗原的可变区。构成重链可变区的氨基酸序列只要维持其抗原结合活性即可，可以允许1个或多个氨基酸残基的改变。
另外，为了提高结合活性、改善特异性、降低pI、对与抗原的结合赋予pH依赖性、改善结合热稳定性、改善溶解性、改善对化学修饰的稳定性和来自糖链的异质性、回避通过计算机模拟(in silico)预测或者通过使用T细胞的体外测定确认了降低免疫原性的T细胞表位、或者导入激活调节T细胞的T细胞表位等，而实施可变区的改变(mAbs 3: 243-247,2011)。
另外，本发明的多肽可以是使Fc区与其他蛋白、生理活性肽等结合得到的Fc融合蛋白分子(肽Fc融合蛋白)、或者使由胶原蛋白或聚乳酸等高分子构成的细胞外基质等结合得到的Fc融合蛋白分子(支架Fc融合蛋白)。
作为其他的蛋白、生理活性肽，例如可以列举受体、粘附分子、配体、酶，但并不限于这些。
作为本发明的Fc融合蛋白分子的优选的例子，可以列举在与靶结合的受体蛋白中融合有Fc结构域的蛋白，例如，可以列举TNFR-Fc融合蛋白、IL1R-Fc融合蛋白、VEGFR-Fc融合蛋白、CTLA4-Fc融合蛋白等(Nat Med. 2003 Jan; 9(1): 47-52, BioDrugs. 2006; 20(3): 151-60.)。另外，与本发明的多肽融合的蛋白只要与靶分子结合即可，可以是任何分子，例如可以列举scFv分子(WO2005/037989)、单结构域抗体分子(WO2004/058821、WO2003/002609)、抗体样分子(Current Opinion in Biotechnology 2006, 17: 653-658；CurrentOpinion in Biotechnology 2007, 18: 1-10；Current Opinion in Structural Biology1997, 7: 463-469；蛋白Science 2006, 15: 14-27)、例如，DARPins(WO2002/020565)、亲和体(WO1995/001937)、Avimer(WO2004/044011、WO2005/040229)、Adnectin(WO2002/032925)等。另外，抗体和Fc融合蛋白分子可以是与多种靶分子或表位结合的双特异性抗体等多特异性抗体。
另外，本发明的抗体还包括抗体的修饰物。作为抗体修饰物的例子，例如可以列举与聚乙二醇(PEG)或细胞毒性物质等各种分子结合的抗体。这样的抗体修饰物可以通过对本发明的抗体实施化学修饰而得到。抗体的修饰方法在该领域已经确立。
而且，本发明的抗体可以是双特异性抗体(bispecific antibody)。双特异性抗体是指在同一抗体分子内具有识别不同表位的可变区的抗体，但该表位可以存在于不同分子中，也可以存在于同一分子中。
本发明的多肽可以利用本领域技术人员所公知的方法进行制备。例如，可以按照下述方法制作抗体，但并不限于此。
用于通过将所分离的编码多肽的基因导入适当的宿主中来制作抗体的宿主细胞和表达载体的多种组合众所周知。这些表达系统均可用于分离本发明的抗原结合分子。当使用真核细胞作为宿主细胞时，可以适当使用动物细胞、植物细胞或真菌细胞。具体而言，作为动物细胞，可以例示如下所示的细胞。
(1) 哺乳类细胞：CHO(中国仓鼠卵巢细胞株)、COS(猴肾细胞株)、骨髓瘤(Sp2/O、NS0等)、BHK(幼仓鼠肾细胞株)、HEK293(带有剪切腺病毒(Ad)5 DNA的人胚肾细胞株)、PER.C6细胞(用腺病毒5型(Ad5) E1A和E1B基因转化的人胚胎视网膜细胞株)、Hela、Vero等(Current Protocols in Protein Science (May, 2001, Unit 5.9, Table 5.9.1))；
(2) 两栖类细胞：非洲爪蟾卵母细胞等；
(3) 昆虫细胞：sf9、sf21、Tn5等。
使编码抗体重链的DNA、即编码Fc区中的1个或多个氨基酸残基被取代成其他目标氨基酸的重链的DNA和编码抗体轻链的DNA表达。编码Fc区中的1个或多个氨基酸残基被取代成其他目标氨基酸的重链的DNA可如下获得：获取编码天然型重链的DNA的Fc区部分，再适当导入取代，使编码该Fc区中的特定氨基酸的密码子编码其他目标氨基酸，由此即可获得。
另外，还可以通过事先设计编码天然型重链的Fc区中的1个或多个氨基酸残基被取代成其他目标氨基酸的蛋白的DNA，并化学合成该DNA，得到编码Fc区中的1个或多个氨基酸残基被取代成其他目标氨基酸的重链的DNA。对氨基酸的取代位点、取代的种类没有特别限定。另外，对取代也没有限定，可以是缺失、添加、插入或修饰中的任一种、或它们的组合。
另外，编码Fc区中有1个或多个氨基酸残基被取代成其他目标氨基酸的重链的DNA可以分成部分DNA来制备。作为部分DNA的组合，例如可以列举：编码可变区的DNA与编码恒定区的DNA、或编码Fab区的DNA与编码Fc区的DNA等，但并不限于这些组合。编码轻链的DNA也可以同样分成部分DNA来制备。
作为表达上述DNA的方法，可以列举下述方法。例如，将编码重链可变区的DNA和编码重链恒定区的DNA一同插入表达载体中，构建重链表达载体。同样，将编码轻链可变区的DNA和编码轻链恒定区的DNA一同插入表达载体中，构建轻链表达载体。还可以将上述的重链、轻链的基因插入单一载体中。
向表达载体中插入编码目标抗体的DNA时，将DNA插入表达载体中，使抗体在表达调节区、例如增强子、启动子的调节下表达。接下来，通过该表达载体转化宿主细胞，使抗体表达。此时，可以使用适当的宿主与表达载体的组合。
作为载体的例子，可以列举M13系载体、pUC系载体、pBR322、pBluescript、pCR-Script等。另外，为了进行cDNA的亚克隆和切出时，除上述载体外，例如还可以使用pGEM-T、pDIRECT、pT7等。
为了生产本发明的抗体而使用载体时，表达载体特别有效。作为表达载体，例如，以JM109、DH5α、HB101、XL1-Blue等大肠杆菌作为宿主时，必不可少要持有可以在大肠杆菌中高效率地表达的启动子、例如lacZ启动子(Ward等人, Nature (1989) 341, 544-546；FASEB J. (1992) 6, 2422-2427，通过参照将其全体纳入本说明书中)、araB启动子(Better等人, Science (1988) 240, 1041-1043，通过参照将其全体纳入本说明书中)、或T7启动子等。作为这样的载体，除上述载体外，还可以列举pGEX-5X-1(Pharmacia公司制)、“QIAexpress system” (QIAGEN公司制)、pEGFP或pET (此时，宿主优选为表达T7 RNA聚合酶的BL21)等。
另外，载体中可以包含用于多肽分泌的信号序列。作为用于多肽分泌的信号序列，在大肠杆菌的周质中产生多肽时，使用pelB信号序列(Lei, S. P等人, J. Bacteriol.(1987) 169, 4397，通过参照将其全体纳入本说明书中)即可。向宿主细胞内导入载体例如可以利用脂质转染法、磷酸钙法、DEAE-葡聚糖法来进行。
除大肠杆菌表达载体外，例如，作为用于制备本发明的多肽的载体，可以列举：来自哺乳动物的表达载体(例如，pcDNA3 (Invitrogen公司制)或pEGF-BOS (Nucleic Acids.Res.1990, 18(17), 第5322页；通过参照将其全体纳入本说明书中)、pEF、pCDM8)、来自昆虫细胞的表达载体(例如“Bac-to-BAC baculovirus expression system” (GIBCO BRL公司制)、pBacPAK8)、来自植物的表达载体(例如pMH1、pMH2)、来自动物病毒的表达载体(例如pHSV、pMV、pAdexLcw)、来自逆转录病毒的表达载体(例如pZIPneo)、来自酵母的表达载体(例如“Pichia Expression Kit”(Invitrogen公司制)、pNV11、SP-Q01)、来自枯草杆菌的表达载体(例如pPL608、pKTH50)。
为了在CHO细胞、COS细胞、NIH3T3细胞、HEK293细胞等动物细胞中表达时，必不可少要持有在细胞内表达所必需的启动子、例如SV40启动子(Mulligan等人, Nature (1979)277, 108，通过参照将其全体纳入本说明书中)、MMTV-LTR启动子、EF1α启动子(Mizushima等人, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322，通过参照将其全体纳入本说明书中)、CAG启动子(Gene. (1991) 108, 193，通过参照将其全体纳入本说明书中)、CMV启动子等，进一步优选携带用于选择转化细胞的基因(例如，通过药物(新霉素、G418等)可以进行判别的耐药性基因)。作为具有这样的特性的载体，例如可以列举pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13等。为了进一步增加基因的拷贝数，有时还使EBNA1蛋白共表达，但此时使用具有复制起点OriP的载体。(Biotechnol Bioeng. 2001 Oct 20; 75(2): 197-203.,Biotechnol Bioeng. 2005 Sep 20; 91(6): 670-7.)
而且，为了使基因稳定地表达、并且在细胞内扩增基因的拷贝数时，可以列举：向缺失了核酸合成路径的CHO细胞中导入具有补偿该缺失的DHFR基因的载体(例如pCHOI等)，再利用甲氨蝶呤(MTX)使其扩增的方法，另外，为了进行基因的一过性表达时，可以列举：使用染色体上携带表达SV40 T抗原的基因的COS细胞，用具有SV40的复制起点的载体(pcD等)进行转化的方法。作为复制起点，还可以使用来自多瘤病毒、腺病毒、牛乳头瘤病毒(BPV)等的复制起点。而且，为了通过宿主细胞系统扩增基因拷贝数，表达载体可以包含氨基糖苷转移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Ecogpt)基因、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因等作为选择标志物。
抗体的回收例如可以在培养已转化的细胞后，从进行了分子转化的细胞的细胞内或培养液中分离来进行。在抗体的分离、纯化中，可以适当组合离心分离、硫酸铵分级分离、盐析、超滤、1q、FcRn、蛋白A、蛋白G柱、亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等方法来进行。
作为双特异性抗体的有效的制作方法，可以使用Knobs-into-holes技术。具体而言，制作本发明的异源二聚化多肽时，需要使具有互不相同的氨基酸的多肽彼此之间缔合、或者从其他的同源二聚化多肽中分离目标的异源二聚化多肽。
在具有Fc区且具有不同的氨基酸的多肽彼此之间的缔合化中，可以应用在抗体H链的第二恒定区(CH2)或H链的第三恒定区(CH3)的界面导入静电排斥以抑制非目标的H链之间的缔合的技术(WO2006/106905)。
在CH2或CH3的界面导入静电排斥以抑制并不想要的H链之间的缔合的技术中，作为在H链的其他恒定区的界面进行接触的氨基酸残基，例如可以列举：与CH3区中的EU编号第356位的残基、EU编号第439位的残基、EU编号第357位的残基、EU编号第370位的残基、EU编号第399位的残基、EU编号第409位的残基相对的区。
更具体而言，例如，在包含两种H链CH3区的抗体中，可以形成选自第1 H链CH3区中的下述(1)～(3)所示氨基酸残基组的1组～3组氨基酸残基具有同种电荷的抗体：
(1) H链CH3区中所含的氨基酸残基即EU编号第356位和第439位的氨基酸残基；
(2) H链CH3区中所含的氨基酸残基即EU编号第357位和第370位的氨基酸残基；
(3) H链CH3区中所含的氨基酸残基即EU编号第399位和第409位的氨基酸残基。
而且，可以形成选自不同于上述第1 H链CH3区的第2 H链CH3区中的上述(1)～(3)所示氨基酸残基组的氨基酸残基组即在上述第1 H链CH3区中带有同种电荷的上述(1)～(3)所示氨基酸残基组对应的1组～3组氨基酸残基与上述第1 H链CH3区中的对应的氨基酸残基具有相反的电荷的抗体。
上述(1)～(3)所记载的各氨基酸残基在缔合时互相接近。关于所期望的H链CH3区或H链恒定区，本领域技术人员通过使用市售软件进行同源建模等，可以发现与上述(1)～(3)所记载的氨基酸残基对应的位点，可以适当地对该位点的氨基酸残基进行改变。
在上述抗体中，“带电荷的氨基酸残基”例如优选从下述(X)或(Y)的任一组所含的氨基酸残基中选择：
(X) 谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)；
(Y) 赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)。
在上述抗体中，“带有同种电荷”是指，例如，2个以上的氨基酸残基均具有上述(X)或(Y)中任一组所含的氨基酸残基。“带有相反电荷”是指，例如，当2个以上的氨基酸残基中的至少一个氨基酸残基具有上述(X)或(Y)中的任一组所含的氨基酸残基时，剩下的氨基酸残基具有不同组中所含的氨基酸残基。
在优选方案中，上述抗体的第1 H链CH3区和第2 H链CH3区可以通过二硫键进行交联。
在本发明中，作为进行改变的氨基酸残基，并不限于上述的抗体可变区或抗体恒定区的氨基酸残基。关于多肽突变体或异源多聚体，本领域技术人员通过利用市售软件进行同源建模等，可以发现形成界面的氨基酸残基，可以对该位点的氨基酸残基进行改变以控制缔合。
在本发明的具有Fc区且具有不同的氨基酸的多肽之间的缔合化中，还可以进一步使用其他公知技术。将抗体的一个H链的可变区中存在的氨基酸侧链取代成更大的侧链(knob; 突起)，将另一个H链的相对的可变区中存在的氨基酸侧链取代成更小的侧链(hole; 空隙)，从而可以将突起配置在空隙中，由此可以有效引起具有Fc区且具有不同的氨基酸的多肽之间的缔合化(WO1996/027011；Ridgway JB等人, Protein Engineering(1996) 9, 617-621；Merchant AM等人. Nature Biotechnology (1998) 16, 677-681)。
除此之外，在具有Fc区且具有不同的氨基酸的多肽之间的缔合化中，还可以进一步采用其他公知技术。通过使用以抗体的一个H链的CH3的一部分作为与该部分对应的来自IgA的序列、并在另一个H链的CH3的互补部分导入了与该部分对应的来自IgA的序列而得到的链交换工程域CH3，可以通过CH3的互补性缔合化有效地引起具有不同序列的多肽的缔合化(Protein Engineering Design & Selection, 23; 195-202, 2010)。即使利用该公知技术，也可以有效地引起具有Fc区且具有不同的氨基酸的多肽之间的缔合化。
此外，还可以采用利用了WO2011/028952中记载的抗体的CH1与CL的缔合化、VH、VL的缔合化的异源二聚化抗体制作技术。
另外，即使是无法有效形成异源二聚化多肽的情况下，通过将异源二聚化多肽和同源二聚化多肽进行分离、纯化，也可以得到异源二聚化多肽。制作由彼此序列不同的第一多肽和第二多肽构成的异源二聚化多肽时，仅由2个第一多肽构成的同源二聚化多肽、仅由2个第二多肽构成的同源二聚化多肽作为杂质混入。作为有效除去这两种同源二聚化多肽的方法，可以利用公知技术。有人报道了下述方法：向两种H链的可变区中导入氨基酸取代，并赋予等电点的差异，由此通过离子交换层析可以纯化两种同源二聚体和目标异源二聚化抗体的方法(WO2007114325)。
用于赋予等电点的差异的氨基酸改变只要使缔合的2个多肽的等电点产生差异即可，对导入的氨基酸改变没有特别限定，可以包含免疫原性的降低等其他目的的氨基酸改变。被改变的氨基酸优选为对与Fcγ受体的结合活性影响少的位点的氨基酸。另外，可以是提高与所期望的Fcγ受体的结合活性的氨基酸改变。作为这样的用于改变的氨基酸的位点，具体而言，例如优选在第一多肽和/或第二多肽的氨基酸序列中，导入选自EU编号第137位的Gly、第138位的Gly、第139位的Thr、第147位的Lys、第192位的Ser、第193位的Leu、第196位的Gln、第198位的Tyr、第199位的Ile、第203位的Asn、第214位的Lys、第231位的Ala、第233位的Glu、第242位Leu、第263位的Val、第272位的Glu、第274位的Lys、第278位的Tyr、第288位的Lys、第290位的Lys、第316位的Gly、第317位的Lys、第320位的Lys、第324位的Lys、第335位的Thr、第337位的Ser、第338位的Lys、第340位的Lys、第341位的Gly、第358位的Leu、第360位的Lys、第362位的Gln、第364位的Ser、第383位的Ser、第384位的Asn、第385位的Gly、第386位的Gln、第387位的Pro、第390位的Asn、第397位的Val和第422位的Val的至少一个氨基酸突变。进一步优选导入选自EU编号第137位的Gly、第138位的Gly、第139位的Thr、第147位的Lys、第192位的Ser、第193位的Leu、第196位的Gln、第199位的Ile、第203位的Asn、第214位的Lys、第272位的Glu、第274位的Lys、第288位的Lys、第290位的Lys、第358位的Leu、第360位的Lys、第362位的Gln、第383位的Ser、第384位的Asn、第385位的Gly、第386位的Gln、第390位的Asn、第397位的Val和第422位的Val的至少一个氨基酸突变，更进一步优选导入选自EU编号第137位的Gly、第138位的Gly、第147位的Lys、第192位的Ser、第193位的Leu、第196位的Gln、第199位的Ile、第203位的Asn、第214位的Lys、第274位的Lys、第288位的Lys、第358位的Leu、第384位的Asn和第397位的Val的至少一个氨基酸突变。
更具体而言，优选在第一多肽或第二多肽的任一方多肽的氨基酸序列中，导入选自EU编号第196位的Gln、第199位的Ile、第231位的Ala、第233位的Glu、第242位的Leu、第263位的Val、第272位的Glu、第316位的Gly、第358位的Leu、第364位的Ser、第383位的Ser、第387位的Pro和第397位的Val的至少一个氨基酸突变，在另一方多肽的氨基酸序列中导入选自EU编号第137位的Gly、第138位的Gly、第139位的Thr、第147位的Lys、第192位的Ser、第193位的Leu、第198位的Tyr、第199位的Ile、第203位的Asn、第214位的Lys、第274位的Lys、第278位的Tyr、第288位的Lys、第290位的Lys、第316位的Gly、第317位的Lys、第320位的Lys、第324位的Lys、第335位的Thr、第337位的Ser、第338位的Lys、第340位的Lys、第341位的Gly、第358位的Leu、第360位的Lys、第362位的Gln、第383位的Ser、第384位的Asn、第385位的Gly、第386位的Gln、第390位的Asn和第422位的Val的至少一个氨基酸突变。进一步优选在一方多肽的氨基酸序列中，导入选自EU编号第196位的Gln、第199位的Ile、第272位的Glu、第358位的Leu、第383位的Ser和第397位的Val的至少一个氨基酸突变，在另一方多肽的氨基酸序列中导入选自EU编号第137位的Gly、第138位的Gly、第139位的Thr、第147位的Lys、第192位的Ser、第193位的Leu、第199位的Ile、第203位的Asn、第214位的Lys、第274位的Lys、第288位的Lys、第290位的Lys、第358位的Leu、第360位的Lys、第362位的Gln、第383位的Ser、第384位的Asn、第385位的Gly、第386位的Gln、第390位的Asn和第422位的Val的至少一个氨基酸突变。更进一步优选在一方多肽的氨基酸序列中，导入选自EU编号第196位的Gln、第199位的Ile、第358位的Leu和第397位的Val的至少一个氨基酸突变，在另一方多肽的氨基酸序列中导入选自EU编号第137位的Gly、第138位的Gly、第147位的Lys、第192位的Ser、第193位的Leu、第199位的Ile、第203位的Asn、第214位的Lys、第274位的Lys、第288位的Lys和第384位的Asn的至少一个氨基酸突变。
对氨基酸的改变没有特别限定，只要改变成在改变后缔合的2个多肽的等电点产生差异即可。
作为用于提高等电点的优选的改变，例如可以列举：EU编号第196位的氨基酸取代成Lys、第231位的氨基酸取代成Lys、第242位的氨基酸取代成Lys、第263位的氨基酸取代成Lys、第272位的氨基酸取代成Lys、第316位的氨基酸取代成Lys、第364位的氨基酸取代成Lys、第358位的氨基酸取代成Lys、第383位的氨基酸取代成Lys、第387位的氨基酸取代成Lys、第397位的氨基酸取代成Lys。另外，作为用于降低等电点的优选的改变，例如可以列举：EU编号第137位的氨基酸取代成Glu、第138位的氨基酸取代成Glu、第139位的氨基酸取代成Glu、第147位的氨基酸取代成Glu、第198位的氨基酸取代成Glu、第203位的氨基酸取代成Asp、第214位的氨基酸取代成Thr、第274位的氨基酸取代成Gln、第278位的氨基酸取代成Glu、第288位的氨基酸取代成Glu、第290位的氨基酸取代成Glu、第316位的氨基酸取代成Glu、第317位的氨基酸取代成Glu、第320位的氨基酸取代成Glu、第324位的氨基酸取代成Glu、第335位的氨基酸取代成Glu、第337位的氨基酸取代成Asp、第338位的氨基酸取代成Glu、第340位的氨基酸取代成Glu、第341位的氨基酸取代成Glu、第358位的氨基酸取代成Glu、第360位的氨基酸取代成Glu、第362位的氨基酸取代成Glu、第383位的氨基酸取代成Glu、第384位的氨基酸取代成Glu、第385位的氨基酸取代成Glu、第386位的氨基酸取代成Glu、第390位的氨基酸取代成Glu、第422位的氨基酸取代成Glu。
将使等电点产生差异的目的以外的氨基酸改变组合时，例如，在降低免疫原性时，可以将EU编号第138位的氨基酸取代成Ser、第192位的氨基酸取代成Asn、第193位的氨基酸取代成Phe和第199位的氨基酸取代成Thr的取代组合。
在此，免疫原性降低是指，在要给予抗体的个体的至少超过半数中，为了实现治疗效果需要足够的时间，为了使抗体给予的持续效果降低不引起足够量的抗体的产生。
人的免疫原性的水平可以使用MHC class II binding prediction programPropred (http://www.imtech.res.in/raghava/propred)，使用所有等位基因的1%阈值分析进行预测。作为可使用的其他program包含下述的program：
－Rankpep (http://bio.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.html)；
－Epibase (Algonomics proprietary software: algonomics.com)。
减低了免疫原性的多肽，与初期的供体分子相比，不包含预测可与在目标人群中高度表达的MHC class II等位基因结合的肽、或者该肽的数目减低(Flower等人(DrugDiscov. Today (2004) 9(2), 82-90))。
MHC class II结合的功能分析，可以通过生成与该蛋白质对应的重复的肽，试验它们引起T细胞活性化的能力(T细胞增殖分析)；或者通过取代作为报道肽的、已知MHCclass II结合肽来实施 (Hammer等人(J. Exp. Med. (1994) 180, 2353-2358))。
另外，作为纯化异源二聚化抗体的方法，迄今为止，有人报道了使用蛋白A来纯化由与蛋白A结合的小鼠IgG2a的H链和不与蛋白A结合的大鼠IgG2b的H链构成的异源二聚化抗体的方法(WO98050431、WO95033844)。
另外，还可以通过使用将作为IgG与蛋白A的结合位点的EU编号第435位和第436位的氨基酸残基取代成了Tyr、His等与蛋白A的结合力不同的氨基酸的H链，使各H链与蛋白A的相互作用发生变化，再使用蛋白A柱，从而只有效纯化异源二聚化抗体。可以将多个、例如2个以上的上述取代、技术组合使用。另外，可以在第一多肽和第二多肽中分别适当加入这些改变。需要说明的是，本发明的多肽可以是以加入了上述改变的多肽为基础而制作的多肽。
而且，本发明提供制备包含Fc区的多肽的方法，该方法包括下述步骤：通过在构成Fc区的第一多肽和/或第二多肽中导入氨基酸突变，使该Fc区形成异源二聚体，由于氨基酸突变的导入，与该Fc区形成同源二聚体时相比，改变Fc区的功能。
例如可以列举包括下述步骤的制备方法：
步骤(a)，在包含Fc区的多肽中，向构成该Fc区的第一多肽和/或第二多肽中导入氨基酸突变；
步骤(b)，测定由在上述步骤(a)中导入了突变的第一多肽和第二多肽构成的异源二聚体的Fc区的功能；以及
步骤(c)，选择与亲本多肽或由于导入氨基酸突变该Fc区形成同源二聚体时相比Fc区的功能被改变的多肽。
需要说明的是，本制备方法中，可以在步骤(a)之后进行下述步骤：
步骤(d)，使由具有Fc区的第一多肽和第二多肽构成的异源二聚化多肽在已提呈的核糖体、噬菌体、酵母中展示。
作为优选方案，涉及包含Fc区的多肽的制备方法，该方法包括：
步骤(a)，改变编码该多肽的核酸，使与亲本多肽或由于导入氨基酸突变该Fc区形成同源二聚体时相比，Fc区的功能被改变；
步骤(b)，向宿主细胞中导入该核酸，并进行培养使多肽表达；
步骤(c)，从宿主细胞培养物中回收该多肽。
而且，本发明中还包含：通过该制备方法制备的抗体和Fc融合蛋白分子。
对通过本方法导入的氨基酸突变的种类或范围没有特别限定，但可以例示说明书中记载的参与各Fc区的功能改变的氨基酸突变(更具体而言，实施例的表中具体公开的氨基酸突变)。
另外，本发明还提供改变包含Fc区的多肽的功能的方法，该方法包括下述步骤：通过在构成该Fc区的第一多肽和/或第二多肽中导入氨基酸突变，使该Fc区形成异源二聚体，由于氨基酸突变的导入，与该Fc区形成同源二聚体时相比，改变Fc区的功能。
例如，可以列举包含下述步骤的改变方法：
步骤(a)，在包含Fc区的多肽中，向构成该Fc区的第一多肽和/或第二多肽中导入氨基酸突变；
步骤(b)，测定由在上述步骤(a)中导入了突变的第一多肽和第二多肽构成的异源二聚体的Fc区的功能；以及
步骤(c)，选择与亲本多肽或由于导入氨基酸突变该Fc区形成同源二聚体时相比Fc区的功能被改变的多肽。
需要说明的是，本改变方法中，可以在步骤(a)之后进行下述步骤：
步骤(d)，使由具有Fc区的第一多肽和第二多肽构成的异源二聚化多肽在提呈的核糖体、噬菌体、酵母中展示。
作为优选方案，涉及改变包含Fc区的多肽的方法，该方法包括下述步骤：
步骤(a)，改变编码该多肽的核酸，使与亲本多肽或由于导入氨基酸突变该Fc区形成同源二聚体时相比，Fc区的功能被改变；
步骤(b)，向宿主细胞中导入该核酸，并进行培养使多肽表达；
步骤(c)，从宿主细胞培养物中回收该多肽。
而且，本发明中还包含：通过该改变方法改变的抗体和Fc融合蛋白分子。
对通过本方法导入的氨基酸突变的种类或范围没有特别限定，可以例示说明书中记载的参与各Fc区的功能改变的氨基酸突变(更具体而言，在实施例的表中具体公开的氨基酸突变)。
并且，本发明还提供编码多肽的核酸，所述多肽是以由包含第一多肽和第二多肽的异源二聚体构成为特征的多肽，该多肽的特征在于：该第一多肽和第二多肽包含导入有突变的Fc区、与包含未导入突变的Fc区的多肽相比，Fc区的功能被改变。本发明的该核酸可以是DNA、RNA等任何形态。
而且，本发明还提供包含上述本发明的核酸的载体。关于载体的种类，本领域技术人员可以根据将要导入载体的宿主细胞来适当选择，例如可以使用上述的载体。
而且，本发明还涉及通过上述本发明的载体转化的宿主细胞。本领域技术人员可以适当选择宿主细胞，例如可以使用上述的宿主细胞。
<药物组合物>
本发明提供含有本发明的多肽的药物组合物。
本发明的药物组合物，除了导入作为本发明的多肽的抗体或Fc融合蛋白分子外，还可以导入医药上可接受的载体，按照公知的方法制成制剂。例如，以与水或水以外的药学上可接受的溶液的无菌溶液或悬浮液剂的注射剂的形式进行胃肠外使用。例如，与药理学上可接受的载体或介质、具体有灭菌水或生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、香味剂、赋形剂、溶媒、防腐剂、粘合剂等适当组合，以通常承认的制药实施所要求的单位用量形式混和，从而制成制剂。具体而言，作为载体，可以列举轻质硅酸酐、乳糖、结晶纤维素、甘露醇、淀粉、羧甲纤维素钙、羧甲纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯缩醛二乙基氨基乙酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、中链脂肪酸三甘油酯、聚氧乙烯硬化蓖麻油60、蔗糖、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐类等。调整这些制剂中的有效成分量，使得到所指示的范围的适当的容量。
用于注射的无菌组合物，可以使用注射用蒸馏水这样的溶媒，按照通常的制剂实施进行配方。
作为注射用水溶液，例如可以列举生理盐水、包含葡萄糖或其他辅剂的等渗液、例如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化钠，可以和适当的助溶剂、例如醇、具体有乙醇、多元醇、例如丙二醇、聚乙二醇、非离子性表面活性剂、例如聚山梨酯80(TM)、HCO-50结合使用。
作为油性液体，可以列举芝麻油、大豆油，可以和作为助溶剂的苯甲酸苄酯、苄醇结合使用。另外，可以和缓冲剂、例如磷酸盐缓冲液、乙酸钠缓冲液；无痛化剂、例如盐酸普鲁卡因；稳定剂、例如苄醇、苯酚；抗氧剂混合。所制备的注射液通常填充在适当的安瓿瓶中。
给药优选为胃肠外给药，具体可以列举：注射剂型、经鼻给药剂型、经肺给药剂型、经皮给药剂型等。作为注射剂型的例子，例如可以通过静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等进行全身或局部给药。
另外，根据患者的年龄、症状，可以选择适当的给药方法。作为含有多肽或编码多肽的多核苷酸的药物组合物的给药量，例如，可以在每次每1kg体重0.0001mg～1000mg的范围内选择。或者，例如可以在每名患者0.001～100000mg/体重的范围内选择给药量，但未必限于上述数值。给药量、给药方法根据患者的体重或年龄、症状等而变动，本领域技术人员可以适当选择。
在本发明中，上述含有本发明的多肽的药物组合物作为癌症、免疫炎症性疾病等的治疗药或预防药的有效成分是有效的。
需要说明的是，本说明书中使用的氨基酸的三字母符号和单字母符号的对应如下：
丙氨酸：Ala：A；
精氨酸：Arg：R；
天冬酰胺：Asn：N；
天冬氨酸：Asp：D；
半胱氨酸：Cys：C；
谷氨酰胺：Gln：Q；
谷氨酸：Glu：E；
甘氨酸：Gly：G；
组氨酸：His：H；
异亮氨酸：Ile：I；
亮氨酸：Leu：L；
赖氨酸：Lys：K；
甲硫氨酸：Met：M；
苯丙氨酸：Phe：F；
脯氨酸：Pro：P；
丝氨酸：Ser：S；
苏氨酸：Thr：T；
色氨酸：Trp：W；
酪氨酸：Tyr：Y；
缬氨酸：Val：V。
需要说明的是，本说明书中引用的所有现有技术文献均作为参照而纳入本说明书。
实施例
以下，通过实施例来进一步具体说明本发明，但本发明并不限于这些实施例。
[实施例1] 通过异源二聚化抗体来提高FcγR识别能力的构想的说明
抗体经由Fc区与FcRn、FcγR、补体等各种分子进行相互作用。由于各1分子的作为Fc的配体之一的FcRn与抗体的各H链(重链)结合，因此2分子的FcRn与1分子的抗体结合(图1)。在生物体内FcRn在细胞膜上表达，因此在生物体内抗体经由各H链的相同部分对照性地识别2分子的FcRn (Nature, 372: 379-383, 1994)。另外，与IgG属于相同的免疫球蛋白家族的IgA，也同IgG和FcRn的关系一样，1分子的IgA对称地识别2分子的作为IgA受体的FcαR(图2) (Nature, 423: 614-620, 2003)。
但是，与FcRn等不同，仅有1分子的FcγR与1分子的抗体结合(图3) (JBC, 276:16469-16477, 2001)。IgG经由两个H链的CH2结构域识别FcγR，但与FcγR发生相互作用的位点在各H链中是不同的。例如，以图3左侧的H链作为HA链、以右侧的H链作为HB链时，EU编号第327位的Ala在HA链、HB链的各链中与FcγR进行相互作用，但各H链中发生相互作用的伙伴侧的残基的性质不同(图4)。在HA链中FcγRIII与EU编号第87位和EU编号第110位的Trp发生疏水性相互作用，但在HB链中其与EU编号第131位的His发生相互作用。因此，将EU编号第327位的Ala取代成Trp等疏水性高的氨基酸时，即使在HA链中具有提高HA链与FcγR的结合活性的效果，但在HB链中也有可能降低HB链与FcγR的结合活性。由此认为：为了通过氨基酸改变使IgG的Fc区与FcγR的相互作用最佳化，需要考虑各H链中的与FcγR的不对称效果。尽管如此，在现有技术中，使IgG的Fc区与FcγR的相互作用最佳化时，向两个H链中导入了相同的改变(WO2006/019447、WO2000/042072)。但是，若考虑IgG的Fc区与FcγR不对称地进行相互作用，则认为在各H链中导入了不同的改变时，可以更精确地使IgG与FcγR的相互作用最佳化。即，通过使用为了使Fc区与FcγR的相互作用最佳化而在各H链中加入了不同的改变的抗体即异源二聚化抗体，与通过现有技术实施的在各H链中加入了相同的改变的抗体即同源二聚化抗体相比，有可能可以使与FcγR的相互作用进一步最佳化。
[实施例2] 通过异源二聚化抗体来提高FcγR识别能力的构想的证明
研究通过使用在抗体的各H链中导入了不同的改变的异源二聚化抗体，与作为现有技术的同源二聚化抗体相比，是否可以使抗体与FcγR的结合活性进一步最佳化。
以往，通过使用在抗体的各H链中导入了相同的改变的同源二聚化抗体，来探索与FcγR的结合增强的改变。但是，如实施例1中所述，由于抗体和FcγR不对称地发生相互作用，由此在两个H链中导入相同的改变时，该改变有可能在其中一个H链中增强与FcγR的结合活性、而在另一个H链中抑制结合。在两个H链中导入了这样的改变的同源二聚化抗体中，未必增强与FcγR的结合活性，而在仅向一个H链中导入了改变的异源二聚化抗体中，则有可能增强与FcγR的结合活性。
为了验证该假说，比较异源二聚化抗体和同源二聚化抗体与FcγR的结合，所述异源二聚化抗体由仅在一个H链中导入了认为会改变与FcγR的结合活性的改变的第一多肽和没有加入该改变的第二多肽构成，所述同源二聚化抗体由仅在一个H链中导入了认为会改变与FcγR的结合活性的改变的第一多肽构成。根据以往的想法，当该改变增强与FcγR的结合活性时，应该是同源二聚化抗体必定较异源二聚化抗体优异。但是，假如抗体的Fc不对称地识别FcγR，则根据改变的种类，与同源二聚化抗体相比，应该是异源二聚化抗体对FcγR显示出强的结合活性。
作为抗体H链可变区，使用WO2009/041062中公开的血浆中动力学得到改善的包含抗磷脂酰肌醇聚糖3抗体的pH7的CDR的磷脂酰肌醇聚糖3抗体的可变区，将其称作GpH7(SEQ ID NO: 1)。作为抗体H链恒定区，使用以下的H链恒定区，将其与GpH7组合使用。需要说明的是，将抗体H链恒定区的名称定为H1时，可变区中具有GpH7的抗体的H链所对应的序列称作GpH7-H1。需要说明的是，显示氨基酸的改变时，如D356K所示。最初的字母(相当于D356K的D)是指用单字母符号表记改变前的氨基酸残基时的字母，其后的数字(相当于D356K的356)是指该改变位点的EU编号，最后的字母(相当于D356K的K)是指用单字母符号显示改变后的氨基酸残基时的字母。按照参考实施例1的方法，制备除去了可变区中具有GpH7的IgG1的C末端的Gly和Lys的GpH7-G1d (SEQ ID NO: 2)、在GpH7-G1d中导入了D356K和H435R的突变的GpH7-A5 (SEQ ID NO: 3)、在GpH7-G1d中导入了K439E的突变的GpH7-B3(SEQ ID NO: 4)。导入到各H链中的D356K和K439E的突变，其目的是为了在生产由2个H链构成的异源二聚化抗体时有效形成各H链的异源二聚体(WO2006/106905)而导入。H435R是妨碍与蛋白A的结合的改变，为了有效分离异源二聚体和同源二聚体而将其导入(参照参考实施例3、4、5)。同样，抗体的L链使用WO2009/041062中公开的血浆中动力学得到改善的磷脂酰肌醇聚糖3抗体的L链即GpL16-k0 (SEQ ID NO: 5)。
以GpH7-A5、GpH7-B3作为亲本多肽，向其中导入用于证明异源二聚化抗体的构想的突变，制备变体，进行评价。按照参考实施例1的方法，将已制作的表达载体用于转染FreeStyle293细胞(invitrogen)。已表达的抗体按照参考实施例1的方法进行纯化。使同源二聚化抗体表达时，使用插入有作为抗体L链的GpL16-k0的表达载体和插入有一种抗体H链序列的表达载体。使异源二聚化抗体表达时，作为抗体L链，与同源二聚化抗体一样，使用插入有GpL16-k0的表达载体，作为抗体的一个H链，使用插入有在导入了D356K的改变的GpH7-A5中进一步加入了改变的序列的表达载体，作为抗体的另一个H链，使用插入有在导入了K439E的改变的GpH7-B3中进一步导入了改变的序列的表达载体，使异源二聚化抗体有效率地表达。关于表达后进行纯化而得到的抗体，例如当异源二聚化抗体的表达中使用的抗体H链所对应的表达载体之一为GpH7-H1、另一个抗体H链为GpH7-H2、抗体L链所对应的表达载体为GpL16-k0时，将其记作GpH7-H1/GpH7-H2/GpL16-k0。此时，使导入有D356K、H435R的改变的序列与H1对应，使导入有K439E的改变的序列与H2对应。例如，在同源二聚化抗体的表达中使用的抗体H链所对应的表达载体为GpH7-H1、抗体L链所对应的表达载体为GpL16-k0的同源二聚化抗体的情况下，记作GpH7-H1/GpL16-k0。使用制备的抗体，按照参考实施例2记载的方法测定其与FcγR的结合活性。
首先，最初，评价为了形成、纯化异源二聚体而导入到GpH7-A5中的D356K和H435R、以及导入到GpH7-B3中的K439E的改变与天然型IgG相比是否对与FcγR的结合活性产生影响。作为对照，使用插入了GpH7-G1d作为抗体H链、插入了GpL16-k0作为抗体L链的质粒，按照参考实施例1的方法表达、纯化GpH7-G1d/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 2、5)。进行相同的操作，制作在两个H链中导入了D356K和H435R的同源二聚化抗体GpH7-A5/GpL16-k0 (SEQ IDNO: 3、5)、在两个H链中导入了K439E的同源二聚化抗体GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO:4、5)、以及在一个H链中导入了D356K和H435R、在另一个H链中导入了K439E的异源二聚化抗体GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3、4、5)。按照参考实施例2的方法，比较这些抗体和它们与各FcγR的结合活性，结果汇总在图5中。
测定的结果，比较GpH7-G1d/GpL16-k0和GpH7-A5/GpH7-B3/ GpL16-k0时，两者在与各FcγR的结合活性方面均未观察到大的变化。另外，与GpH7-G1d/GpL16-k0相比，GpH7-A5/GpL16-k0和GpH7-B3/ GpL16-k0对于所有的FcγR均维持至少80%左右的结合活性。根据上述结果判断：与GpH7-G1d/GpL16-k0相比，GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16- k0、GpH7-A5/GpL16-k0、GpH7-B3/GpL16-k0与FcγR的结合均未受到明显损害，可以比较在这些抗体的各H链中导入了突变而得到的变体与各FcγR的结合活性。
接下来，按照参考实施例1的方法制作在GpH7-A5中导入了G237A的突变的GpH7-A26 (SEQ ID NO: 6)。使用GpH7-A26、GpH7-B3作为H链、使用GpL16-k0作为L链，按照参考实施例1的方法使仅在一个H链中导入了G237A的异源二聚化抗体GpH7-A26/GpH7-B3/ GpL16-k0 (SEQ ID NO: 6、4、5)表达。进行相同的操作，使用GpH7-A26作为H链、使用GpL16-k0作为L链，按照参考实施例1的方法使在两个H链中导入了G237A的同源二聚化抗体GpH7-A26/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 6、5)表达。按照参考实施例2的方法，评价这些抗体与各FcγR的结合活性(图6)。其结果，与GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0相比，在异源二聚化抗体GpH7-A26/GpH7-B3/GpL16-k0中与FcγRIIa R、FcγRIIb的结合活性增强。尽管如此，但与GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16- k0相比，在两个H链中加入了相同的改变的同源二聚化抗体GpH7- A26/GpL16-k0与FcγRIIa R、FcγRIIb的结合活性减弱。由此明确了：G237A是一种导入到两个H链中时减弱与 FcγRIIa R、FcγRIIb的结合活性、而仅导入到一个H链中时增强与FcγRIIa R、FcγRIIb的结合活性的改变。
接下来，按照参考实施例1的方法制作在GpH7-A5中导入了G237L的突变的GpH7-A29 (SEQ ID NO: 7)。使用GpH7-A29、GpH7-B3作为H链、使用GpL16-k0作为L链，按照参考实施例1的方法使仅在一个H链中导入了G237L的异源二聚化抗体GpH7-A29/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 7、4、5)表达。进行相同的操作，使用GpH7-A29作为H链、使用GpL16-k0作为L链，按照参考实施例1的方法使在两个H链中导入了G237L的同源二聚化抗体GpH7-A29/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 7、5)表达。按照参考实施例2的方法，评价这些抗体和它们与各FcγR的结合活性(图7)。与GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0相比，在异源二聚化抗体GpH7-A29/GpH7-B3/GpL16-k0中与FcγRIIa R、FcγRIIb的结合活性增强。尽管如此，但与GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16- k0相比，在两个H链中加入了相同的改变的同源二聚化抗体GpH7- A29/GpL16-k0与FcγRIIa R、FcγRIIb的结合活性减弱。由此明确了：G237L是一种具有导入到两个H链中时减弱与 FcγRIIa R、FcγRIIb的结合活性、而仅导入到一个H链中时增强与FcγRIIa R、FcγRIIb的结合活性的效果的改变。
接下来，按照参考实施例1的方法制作在GpH7-A5中导入了L328E的突变的GpH7-A42 (SEQ ID NO: 8)。使用GpH7-A42、GpH7-B3作为H链、使用GpL16-k0作为L链，按照参考实施例1的方法使仅在一个H链中导入了L328E的异源二聚化抗体GpH7-A42/GpH7-B3/ GpL16-k0 (SEQ ID NO: 8、4、5)表达。进行相同的操作，使用GpH7-A42作为H链、使用GpL16-k0作为L链，按照参考实施例1的方法使在两个H链中导入了L328E的同源二聚化抗体GpH7-A42/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 8、5)表达。按照参考实施例2的方法，评价这些抗体与各FcγR的结合活性(图8)。与GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0相比，在异源二聚化抗体GpH7-A42/GpH7-B3/GpL16-k0中与FcγRIIa R、FcγRIIb的结合活性增强。而在两个H链中加入了相同的改变的同源二聚化抗体GpH7-A42/GpL16-k0中，与GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0相比，与FcγRIIa R的结合活性减弱，与FcγRIIb的结合活性增强，但就其增强程度而言，仅在一个H链中导入了L328E的GpH7-A42/ GpH7-B3/GpL16-k0中的增强程度大。由此明确了：L328E是一种与导入到两个H链中时相比，仅导入到一个H链中时增强与FcγRIIa R、FcγRIIb的结合活性的效果高的改变。
接下来，按照参考实施例1的方法制作在GpH7-A5中导入了L328D的突变的GpH7-A43 (SEQ ID NO: 9)。使用GpH7-A43、GpH7-B3作为H链、使用GpL16-k0作为L链，按照参考实施例1的方法使仅在一个H链中导入了L328D的异源二聚化抗体GpH7-A43/GpH7-B3/ GpL16-k0 (SEQ ID NO: 9、4、5)表达。进行相同的操作，使用GpH7-A43作为H链、使用GpL16-k0作为L链，按照参考实施例1的方法使在两个H链中导入了L328D的同源二聚化抗体GpH7-A43/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 9、5)表达。按照参考实施例2的方法，评价这些抗体与各FcγR的结合活性(图9)。与GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0相比，在异源二聚化抗体GpH7-A43/GpH7-B3/GpL16-k0中与FcγRIIa R、FcγRIIb的结合活性增强。而在两个H链中加入了相同的改变的同源二聚化抗体GpH7-A43/GpL16-k0中，与GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0相比，与FcγRIIa R的结合活性减弱，与FcγRIIb的结合活性增强，但就其增强的程度而言，仅在一个H链中导入了L328D的GpH7-A43/ GpH7-B3/GpL16-k0中的增强程度大。由此明确了：L328D是一种具有与导入到两个H链中时相比，仅导入到一个H链中时增强与FcγRIIa R、FcγRIIb的结合活性的效果的改变。
接下来，按照参考实施例1的方法制作在GpH7-B3中导入了L234E的突变的GpH7-B16 (SEQ ID NO: 10)。使用GpH7-A5、GpH7-B16作为H链、使用GpL16-k0作为L链，按照参考实施例1的方法使仅在一个H链中导入了L234E的异源二聚化抗体GpH7-A5/ GpH7-B16/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3、10、5)表达。进行相同的操作，使用GpH7-B16作为H链、使用GpL16-k0作为L链，按照参考实施例1的方法使在两个H链中导入了L234E的同源二聚化抗体GpH7- B16/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 10、5)表达。按照参考实施例2的方法，评价这些抗体与各FcγR的结合活性(图10)。与GpH7-A5/GpH7-B3/ GpL16-k0相比，在异源二聚化抗体GpH7-A5/GpH7-B16/GpL16-k0中与FcγRIIIa F、FcγRIIb的结合活性增强。尽管如此，但与GpH7-A5/ GpH7-B3/GpL16-k0相比，在两个H链中加入了相同的改变的同源二聚化抗体GpH7-B16/GpL16-k0与FcγRIIIa F、FcγRIIb的结合活性减弱。由此明确了：L234E是一种具有导入到两个H链中时减弱与FcγRIIIa F、FcγRIIb的结合、而仅导入到一个H链中时增强与FcγRIIIa F、FcγRIIb的结合活性的效果的改变。
接下来，按照参考实施例1的方法制作在GpH7-B3中导入了L234D的突变的GpH7-B17 (SEQ ID NO: 11)。使用GpH7-A5、GpH7-B17作为H链、使用GpL16-k0作为L链，按照参考实施例1的方法使仅在一个H链中导入了L234D的异源二聚化抗体GpH7-A5/ GpH7-B17/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3、11、5)表达。进行相同的操作，使用GpH7-B17作为H链、使用GpL16-k0作为L链，按照参考实施例1的方法使在两个H链中导入了L234D的同源二聚化抗体GpH7- B17/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 11、5)表达。按照参考实施例2的方法，评价这些抗体与各FcγR的结合活性(图11)。与GpH7-A5/GpH7-B3/ GpL16-k0相比，在异源二聚化抗体GpH7-A5/GpH7-B17/GpL16-k0中与FcγRIIa R、FcγRIIb的结合活性增强。尽管如此，但与GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0相比，在两个H链中加入了相同的改变的同源二聚化抗体GpH7-B17/GpL16-k0与FcγRIIa R、FcγRIIb的结合活性减弱。由此明确了：L234D是一种具有导入到两个H链中时减弱与FcγRIIa R、FcγRIIb的结合活性、而仅导入到一个H链中时增强与FcγRIIa R、FcγRIIb的结合活性的效果的改变。
由上述结果明确了：即使是在两个H链中导入了相同的改变的同源二聚化抗体中与FcγR的结合活性减弱的情形，通过制作仅在抗体的一个H链中导入了该改变的异源二聚化抗体，也可以增强与FcγR的结合活性。
即，由上述结果明确了：通过使用在抗体的各H链中加入了不同的改变的异源二聚化抗体，与作为现有方法的在2个H链中导入相同的改变的同源二聚化抗体相比，可以赋予更优异的抗体的Fc区与FcγR的结合特性。
[实施例3] 确认异源二聚化抗体的FcγR识别方向
如实施例2所示，明确了通过使用异源二聚化抗体，与同源二聚化抗体相比，与FcγR的结合活性增强。在抗体的两个H链中导入实施例2的改变时，与天然型抗体相比，与FcγR的结合活性反而减弱。由该结果认为：导入到异源二聚化抗体中的改变在被导入一个H链中时，其增强与FcγR的结合活性，但将其导入两个链中时，在结合有FcγR的状态下，在一个链中改变后的残基增强结合，但在另一个链中，抑制与FcγR的相互作用。即，将图3的FcγR从图的内侧开始结合的状态称为“来自X方向的结合”、与此相反，将来自图的外侧的结合称为“来自Y方向的结合”时，认为同源二聚化抗体使来自X方向、Y方向的两个方向的与FcγR的结合活性同样地变化，但异源二聚化抗体偏向于来自X方向、Y方向的任一方向的结合而改变与FcγR的结合活性。
为了通过实验验证该假说，发现了主要只从X方向、Y方向中的任一个方向抑制与FcγR的结合的改变，向任意一个H链中导入此处发现的改变，在相同的H链、或者不同的另一个H链中导入增强与FcγR的结合活性的改变，从而验证是如何抑制与FcγR的结合活性的。研究了与该改变组合的方法。根据立体结构信息探索虽然参与抗体与FcγR的结合、但仅在一个H链中参与结合的改变，发现了P329作为其候选。HA链的P329与FcγRIII的第87位和第110位的Trp形成疏水核心，但HB链的P329并不与FcγRIII直接发生相互作用(Nature,372: 379-383, 1994) (图12)。例如，若将HA链的P329取代成带有电荷的残基，则该疏水核心崩解，认为图12所表示的来自X方向的结合被抑制，但没有参与来自相反的Y方向的结合的HB链的P329没有被取代而保持原状，因此预料对来自Y方向的结合没有大的影响。
按照参考实施例1中记载的方法，制作插入有在GpH7-B3的P329中分别导入了带有电荷的R、K、D、E的突变而得到的序列GpH7-B12、GpH7-B13、GpH7-B14、GpH7-B15 (SEQ IDNO: 12～15)的表达载体。所制作的表达载体分别与GpH7-A5、GpL16-k0组合，作为异源二聚化抗体来表达，或者不与其他的H链组合而仅与GpL16-k0组合，作为同源二聚化抗体按照参考实施例1的方法进行表达、纯化。进行纯化而得到的抗体如下：作为异源二聚化抗体的GpH7-A5/GpH7-B12/ GpL16-k0、GpH7-A5/GpH7-B13/GpL16-k0、GpH7-A5/GpH7-B14/ GpL16-k0、GpH7-A5/GpH7-B15/GpL16-k0；作为同源二聚化抗体的GpH7-B12/GpL16-k0、GpH7-B13/GpL16-k0、GpH7-B14/GpL16-k0、GpH7-B15/GpL16-k0。使用已制备的抗体，按照参考实施例2中记载的方法测定与各FcγR的结合，其结果见图13。
导入了P329R、P329K的异源二聚化抗体GpH7-A5/GpH7-B12/ GpL16-k0、GpH7-A5/GpH7-B13/GpL16-k0与FcγR的结合活性是GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0与各FcγR的结合活性的1/5～1/4左右，在同源二聚化抗体GpH7-B12/GpL16-k0、GpH7-B13/GpL16-k0中没有观察到与FcγR的结合。另外，关于导入了P329D、P329E的异源二聚化抗体GpH7-A5/GpH7-B14/GpL16-k0、 GpH7-A5/GpH7-B15/ GpL16-k0与FcγR的结合活性，就FcγRIa而言，达到GpH7-A5/GpH7- B3/GpL16-k0与各FcγR的结合活性的1/5～1/4左右，就FcγRIa 以外的FcγR而言，维持在GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0与各FcγR的结合活性的1/2以上。在同源二聚化抗体GpH7-B14/GpL16-k0、GpH7-B15/GpL16-k0中仅残留与FcγRIa的结合活性，但该结合活性为GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0与FcγRIa的结合活性的1/5以下。由于在GpH7-B12、GpH7-B13中导入有碱性残基、在GpH7-B14、GpH7- B15中导入有酸性残基，因此认为P329被取代成Arg、Lys等碱性残基时，更强效地抑制与FcγR的结合活性。这次，仅在一个H链中导入改变时，残留有与FcγR的结合活性，但在两个链中导入相同的改变时，几乎没有观察到结合，认为该结果支持下述假说：将一个H链的P329取代成亲水性残基时，来自一个方向的结合被抑制，但来自另一个方向的结合得以维持。
接下来，关于实施例2中发现的通过进行异源二聚化而增强与FcγR的结合活性的改变G237A、L234D是否偏向于一个方向增强与FcγR的相互作用，制作将各改变与P329R的改变组合得到的变体，比较各变体与各Fc的结合活性，由此进行验证。按照参考实施例1中记载的方法，制作插入有下述序列的表达载体：向GpH7-B3中导入P329R的突变以使P329R的突变被导入与K439E相同的H链中而得到的序列GpH7-B12 (SEQ ID NO: 12)、向GpH7-A5中导入P329R以使P329R的突变被导入与D356K、H435R相同的H链中而得到的序列GpH7-A48(SEQ ID NO: 16)、向GpH7-A5中导入G237A和P329R的突变而得到的序列GpH7-A45 (SEQ IDNO: 17)、向GpH7-B5中导入L234D和P329R的突变而得到的序列GpH7-B41 (SEQ ID NO:18)。按照参考实施例1的方法，使用这些表达载体和作为与抗体L链对应的表达载体的GpL16-k0使抗体表达，以使G237A或L234D和P329R被导入任一个H链中(表1)。
[表1]
样品栏中显示抗体的名称，H1、H2栏中显示各抗体的H链恒定区的名称，突变位点栏中显示与GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0相比不同的突变(特别是没有突变时记作“-”)。同时显示各抗体的H链、L链所对应的氨基酸序列的SEQ ID NO。
在G237A与P329R的组合的评价中，使用GpH7-A5/GpH7-B3/ GpL16-k0作为导入改变的多肽，使用GpH7-A5/GpH7-B12/GpL16-k0和GpH7-A48/GpH7-B3/GpL16-k0作为仅在一个H链中导入了P329R的变体，使用GpH7-A45/GpH7-B3/GpL16-k0作为在与P329R相同的H链中导入了G237A的变体，使用GpH7-A26/GpH7-B12/GpL16-k0作为在与P329R不同的H链中导入了G237A的变体，按照参考实施例2的方法，比较它们与各FcγR的结合活性(图14)。
比较在单方的H链中导入了P329R的GpH7-A5/GpH7-B12/ GpL16-k0和GpH7-A48/GpH7-B3/GpL16-k0时，在与FcγR的结合图形中没有观察到大的差异。由此认为：即使向导入了D356K、H435R的H链中导入P329R、向导入了K439E的H链中导入P329R，也不会对与FcγR的结合产生影响。
接下来，与GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0相比，作为仅在一个H链中导入了G237A的异源二聚化抗体的GpH7-A26/GpH7-B3/ GpL16-k0与FcγRIIa R、IIb的结合增强。但是，与仅在一个H链中导入了P329R的GpH7-A5/GpH7-B12/GpL16-k0相比，在另一个H链中导入了G237A的GpH7-A26/GpH7-B12/GpL16-k0中，与FcγR的结合减弱，没有观察到G237A的增强与FcγRIIa R、IIb的结合的效果。另一方面，与仅在一个H链中导入了P329R的GpH7-A48/GpH7-B3/ GpL16-k0相比，在与P329R相同的H链中导入了G237A的GpH7-A45/ GpH7-B3/GpL16-k0中，与FcγRIIa R、IIb的结合增强，观察到了G237A的增强与FcγRIIa R、IIb的结合的效果。该结果显示：若将G237A导入与导入了P329R的链不同的链中，则抗体与FcγR的结合被强力抑制，因此将导入到GpH7-A5中的G237A和导入到GpH7-B3中的P329R组合时，在相同方向识别抗体与FcγR的结合。
关于L234D的改变，也进行同样的评价(图15)。与GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0相比，作为仅在一个H链中导入了L234D的异源二聚化抗体的GpH7-A5/GpH7-B17/GpL16-k0与FcγRIIa R、IIb的结合增强。但是，与在一个H链中仅导入了P329R的GpH7-A48/GpH7-B3/GpL16-k0相比，在另一个H链中导入了L234D的GpH7-A48/GpH7-B17/GpL16-k0中，与FcγRIa以外的FcγR的结合减弱，没有观察到L234D的增强与FcγRIIa R、IIb的结合的效果。另一方面，与在一个H链中仅导入了P329R的GpH7-A5/GpH7-B12/ GpL16-k0相比，在与P329R相同的H链中导入了L234D的GpH7-A5/ GpH7-B41/GpL16-k0中，与FcγRIIa R、IIb的结合增强，观察到了L234D的增强与FcγRIIa R、IIb的结合的效果。该结果显示：若将L234D导入与导入了P329R的链不同的链中，则抗体与FcγR的结合被强力抑制，因此将导入到GpH7-B3中的L234D和导入到GpH7-A5中的P329R组合，则在相同方向识别抗体与FcγR的结合。
即，G237A和L234D均与P329R在相同方向增强(/减弱)抗体与FcγR的结合活性。
这样，异源改变偏向于X方向、Y方向中的任一个方向增强与FcγR的结合。该结果显示：异源二聚化抗体不对称地增强与FcγR的相互作用。
[实施例4] 比较异源二聚化抗体和同源二聚化抗体的与FcγR的结合
由实施例2发现：通过在抗体的两个H链中加入不同的改变，与在两个H链中加入相同的改变相比，可以增强抗体的由其Fc区介导的与FcγR的结合。因此，为了找到具有这样的性质的改变，进行以下的实验。
在实施例2中制作的GpH7-B3 (SEQ ID NO: 4)中，将认为参与与FcγR的结合的氨基酸和其周边的氨基酸、具体有EU编号第234位的Leu、EU编号第235位的Leu、EU编号第236位的Gly、EU编号第237位的Gly、EU编号第238位的Pro、EU编号第329位的Ser、EU编号第265位的Asp、EU编号第266位的Val、EU编号第267位的Ser、EU编号第268位的His、EU编号第269位的Glu、EU编号第270位的Asp、EU编号第271位的Pro、EU编号第295位的Gln、EU编号第296位的Tyr、EU编号第298位的Ser、EU编号第300位的Tyr、EU编号第324位的Ser、EU编号第325位的Asn、EU编号第326位的Lys、EU编号第327位的Ala、EU编号第328位的Leu、EU编号第329位的Pro、EU编号第330位的Ala、EU编号第331位的Pro、EU编号第位的、EU编号第332位的Ile、EU编号第333位的Glu、EU编号第334位的Lys、EU编号第335位的Thr、EU编号第336位的Ile、EU编号第337位的Ser的部分分别取代成除原始氨基酸和半胱氨酸以外的18种氨基酸，由此制得GpH7-B3变体。各GpH7-B3变体的名称表示为A_B，在A中用单文字符号记载进行改变的残基的EU编号、氨基酸种类的信息，B中显示取代后的氨基酸的信息。例如，将EU编号第234位的Leu取代成Gly而得到的B3_变体命名为L234_01G。需要说明的是，关于取代后的氨基酸的信息，在单字母符号之前方便地记载该氨基酸特有的数值。具体而言，当为Gly时使用记号01G、当为Ala时使用记号02A、当为Val时使用记号03V、当为Phe时使用记号04F、当为Pro时使用记号05P、当为Met时使用记号06M、当为Ile时使用记号07I、当为Leu时使用记号08L、当为Asp时使用记号09D、当为Glu时使用记号10E、当为Lys时使用记号11K、当为Arg时使用记号12R、当为Ser时使用记号13S、当为Thr时使用记号14T、当为Tyr时使用记号15Y、当为His时使用记号16H、当为Asn时使用记号18N、当为Gln时使用记号19Q、当为Trp时使用记号20W。
在两个H链中导入了突变的同源二聚化抗体按照以下的程序来制作。在抗体的表达中，使用GpH7-B3变体作为H链、使用GpL16-k0 (SEQ ID NO: 5)作为L链，按照参考实施例1的方法制备抗体。将如此操作而制备的、在两个H链中导入了突变的同源二聚化抗体称作Ho Ab。
仅在一个H链中导入了突变的异源二聚化抗体按照以下的程序来制备。在抗体的表达中，使用GpH7-B3变体、GpH7-A5 (SEQ ID NO: 3)作为H链、使用GpL16-k0 (SEQ ID NO:5)作为L链，按照参考实施例1的方法制备抗体。将如此操作而制备的、仅在一个H链中导入了突变的异源二聚化抗体称作He Ab。
作为同源二聚化抗体的对照，按照参考实施例1的方法制备H链使用GpH7-B3 (SEQID NO: 4)、L链使用GpL16-k0 (SEQ ID NO: 5)而制备的抗体GpH7-B3/GpL16-k0。将作为该同源二聚化抗体的对照的抗体称作HoCon Ab。如实施例2中研究的那样，与天然型IgG1相比，HoCon Ab与各FcγR的结合活性没有大的变化。
作为异源二聚化抗体的对照，按照参考实施例1的方法制备H链使用GpH7-A5 (SEQID NO: 3)、GpH7-B3 (SEQ ID NO: 4)、L链使用GpL16-k0 (SEQ ID NO: 5)而制备的抗体GpH7-A5/GpH7-B3/ GpL16-k0。将作为该异源二聚化抗体的对照的抗体称作HeCon Ab。如实施例2中研究的那样，与天然型IgG1相比，HeCon Ab与各FcγR的结合没有大的变化。
使用制备的Ho Ab、He Ab、HeCon Ab和HoCon Ab，按照参考实施例2的方法测定它们与FcγRIa、FcγRIIa(R)、FcγRIIa(H)、FcγRIIb、FcγRIIIa的结合活性。关于各FcγR的测定结果，按照下述方法作图。用He Ab与各FcγR的结合活性除以HeCon Ab与各FcγR的结合活性，再乘以100而得到的值作为He/Con。用Ho Ab与各FcγR的结合活性除以HoCon Ab与各FcγR的结合活性，在乘以100而得到的值作为Ho/Con。关于使用包含目标改变的GpH7-B3变体制作的同源二聚化抗体、异源二聚化抗体，横轴为Ho/Con的值、纵轴为He/Con的值。关于FcγRIa、FcγRIIa(R)、FcγRIIa(H)、FcγRIIb、FcγRIIIa的各FcγR的结果汇总在图16、图17、图18、图19、图20中。关于各改变，可以根据He/Con和Ho/Con的值进行如下解释。
1. He/Con和Ho/Con的值为100时：意味着包含导入了该突变的GpH7-B3变体的异源二聚化抗体He Ab、同源二聚化抗体Ho Ab与FcγR的结合活性分别和异源二聚化抗体的对照、同源二聚化抗体的对照与FcγR的结合活性同等。
2. He/Con、Ho/Con的值为100以下时：意味着包含导入了该突变的GpH7-B3变体的异源二聚化抗体He Ab、同源二聚化抗体Ho Ab与FcγR的结合活性分别较异源二聚化抗体的对照、同源二聚化抗体的对照与FcγR的结合活性弱。
3. He/Con、Ho/Con的值为100以上时：意味着包含导入了该突变的GpH7-B3变体的异源二聚化抗体He Ab、同源二聚化抗体Ho Ab与FcγR的结合活性分别较异源二聚化抗体的对照、同源二聚化抗体的对照与FcγR的结合活性强。
4. He/Con的值大于Ho/Con的值时：意味着包含导入了该突变的GpH7-B3变体的异源二聚化抗体He Ab与FcγR的结合活性较同源二聚化抗体Ho Ab与FcγR的结合活性强。
5. He/Con的值小于Ho/Con的值时：意味着包含导入了突变的GpH7-B3变体的异源二聚化抗体He Ab与FcγR的结合活性较包含导入了突变的GpH7-B3变体的同源二聚化抗体Ho Ab与FcγR的结合活性弱。
根据该1～5的解释，可以将图16～图20的各图的点象图21那样进行分类。
该改变存在于图21的i区中时，意味着该改变具有下述效果：在两个H链中导入了该改变的同源二聚化抗体中，减弱与FcγR的结合；而仅在一个H链中导入了相同的改变的异源二聚化抗体中，增强与FcγR的结合。即，该改变是只在异源二聚化抗体中增强与FcγR的结合的改变。关于各FcγR，将i区中所含的改变汇总在表2 (表2-1～2-3)、表3 (表3-1和3-2)、表4、表5、表6中。
该改变存在于图21的ii区中时，意味着该点所对应的改变在两个H链中导入有该改变的同源二聚化抗体、仅在一个H链中导入有相同的改变的异源二聚化抗体中均增强与FcγR的结合，但在异源二聚化抗体中该结合增强效果大。即，该区内的改变是与同源二聚化抗体相比在异源二聚化抗体中增强与FcγR的结合的效果高的改变。关于各FcγR，将ii区中所含的改变汇总在表2 (表2-1～2-3)、表3 (表3-1和3-2)、表4、表5、表6中。
需要说明的是，在各表中，有关与FcγRIa、FcγRIIa H、FcγRIIa R、FcγRIIb、FcγRIIIa的结合活性的He/Con分别记作He/Con_1a、He/Con_2aH、He/Con_2aR、He/Con_2b、He/Con_3a，有关与FcγRIa、FcγRIIa H、FcγRIIa R、FcγRIIb、FcγRIIIa的结合活性的Ho/Con分别记作Ho/Con_1a、Ho/Con_2aH、Ho/Con_2aR、Ho/Con_2b、Ho/Con_3a。
当该改变存在于图21的iii区中时，意味着该点所对应的改变在两个H链中导入有该改变的同源二聚化抗体、仅在一个H链中导入有相同的改变的异源二聚化抗体中均增强与FcγR的结合，但在同源二聚化抗体中该结合增强效果大。即，该区内的改变是与异源二聚化抗体相比在同源二聚化抗体中增强与FcγR的结合的效果高的改变。
尚需说明的是，在以下的表中显示氨基酸的改变时，如A327_03V所示。最初的字母(相当于A327_03V的A)是指用单字母符号表示改变前的氨基酸残基时的字母。其后续的数字(相当于A327_03V的327)是指该改变位点的EU编号。最后的数字+字母(相当于A327_03V的03V)是指用单字母符号显示改变后的氨基酸残基时的字母(显示氨基酸的种类的数字+字母)。分别用01G(Gly)、02A(Ala)、03V(Val)、04F(Phe)、05P(Pro)、06M(Met)、07I(Ile)、08L(Leu)、09D(Asp)、10E(Glu)、11K(Lys)、12R(Arg)、13S(Ser)、14T(Thr)、15Y(Tyr)、16H(His)、17C(Cys)、18N(Asn)、19Q(Gln)、20W(Trp)表示。由以上可知：例如，“A327_03V”是指“EU编号第327位的氨基酸A取代成V”。
[表2-1]
[表2-2]
[表2-3]
关于FcγRIa，显示i、ii区(图21)中所含的改变。
[表3-1]
[表3-2]
关于FcγRIIa R，显示i、ii区(图21)中所含的改变。
[表4]
关于FcγRIIa H，显示i、ii区(图21)中所含的改变。
[表5]
关于FcγRIIb，显示i、ii区(图21)中所含的改变。
[表6]
关于FcγRIIIa，显示i、ii区(图21)中所含的改变。
认为本实施例中和实施例2中发现的改变支持下述构想：即通过实施例1中显示的异源二聚化抗体提高FcγR识别能力。处于图21的i区中的改变，认为其象以往那样导入到2个H链的双方中时会减弱与FcγR的结合活性，还没有被识别作为增强结合的改变。但是，通过仅在两个H链的一个链中导入该改变，成功地发现这样的改变也会提高与FcγR的结合活性。
[实施例5] 异源二聚化抗体的改变的组合的确定方法
如实施例3中所示，在异源二聚化抗体中，某改变对与FcγR的结合产生的效果根据改变而呈不同方向。因此，在异源二聚化抗体中，将多个改变组合，以进一步增强或减弱与FcγR的结合时，必需使各改变对与FcγR的结合产生的效果的方向一致。假如在两个改变对抗体与FcγR的结合产生的增强效果的方向以不同的状态导入各改变时，各改变的效果相互抵消，尽管将增强与FcγR的结合的改变组合，认为也不会观察到结合增强效果。但是，通常并不存在事先区分应该将各改变导入到哪一个H链中的方法，因此为了找到适当的组合方法，必须制备在相同的H链或不同的H链中导入了目标改变的抗体，并比较它们与FcγR的结合活性。例如，在同源二聚化抗体的情况下，当将3种不同的改变全部导入时，只要制作一种在两个H链中导入了各改变的抗体即可。但是，在异源二聚化抗体的情况下，必需判断是否将各改变导入到任一个H链中。此时，如图22所示，最多需要尝试4种组合。即，在研究改变的组合时，应该制作的变体的数目变得很大，没有效率。因此，研究通过将仅从单方向抑制抗体与FcγR的结合的P329R和将要研究导入的改变组合，来找出该改变对抗体与FcγR的结合产生影响的方向的方法。
将实施例4中发现的在异源二聚化抗体中增强与FcγRIIIa的结合的改变即L234Y、G236W、S298A分别导入与导入有P329R的H链相同或不同的H链中时，评价与FcγRIIIa的结合是如何变化的。首先，使用在导入了P329R改变的GpH7-B12中分别导入了L234Y、G236W、S298A而得到的GpH7-HA5 (SEQ ID NO: 19)、GpH7-HA6 (SEQ ID NO: 20)、GpH7-HA11 (SEQ ID NO: 21)作为H链，使用GpH7-A5作为另一个H链，使用GpL16-k0作为L链，按照参考实施例1的方法表达、制备目标变体。另外，使用在GpH7-B3中分别导入了L234Y、G236W、S298A的GpH7-B3-01-15Y (SEQ ID NO: 22)、GpH7-B3-03-20W (SEQ ID NO:23)、GpH7-B3-15-02A (SEQ ID NO: 24)作为H链，使用在GpH7-A5中导入了P329R的GpH7-A48 (SEQ ID NO: 16)作为另一个H链，使用GpL16-k0作为L链，按照参考实施例1的方法表达、制备目标抗体。将这里得到的抗体分别作为GpH7-A5/GpH7-HA5/ GpL16-k0 (SEQ IDNO: 3、19、5)、GpH7-A5/GpH7-HA6/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3、20、5)、GpH7-A5/GpH7-HA11/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3、21、5)、GpH7-A48/GpH7-B3-01-15Y/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 16、22、5)、GpH7-A48/GpH7-B3-03-20W/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 16、23、5)、GpH7-A48/GpH7-B3-15-02A/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 16、24、5)。按照参考实施例2的方法，比较各变体与FcγRIIIa的结合活性，L234Y、G236W、S298A与P329R组合的效果汇总在表7中。
[表7]
样品栏中显示抗体的名称，H1、H2栏中显示各抗体的H链恒定区的名称，突变位点栏中显示与GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0相比不同的突变(特别是没有突变时记作“-”)、与FcγRIIIa的结合活性是显示以GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3、4、5)与FcγRIIIa的结合为100时的相对结合活性。同时显示各抗体的H链、L链所对应的氨基酸序列的SEQ ID NO。
由该结果可知：关于各改变，将各改变导入与P329R相同的H链中时、导入不同的H链中时，比较与FcγRIIIa的结合活性。当为L234Y时，前者所对应的GpH7-A5/GpH7-HA5/GpL16-k0的结合活性为60、后者所对应的GpH7-A48/GpH7-B3-01-15Y/GpL16-k0的结合活性为11，在与P329R不同的H链中导入改变时，抑制了与FcγR的结合。当为G236W时，前者所对应的GpH7-A5/GpH7-HA6/GpL16-k0的结合活性为56、后者所对应的GpH7-A48/GpH7-B3-03-20W/GpL16-k0的结合活性为13，在与P329R不同的H链中导入改变时，与FcγR的结合被抑制。当为S298A时，前者所对应的GpH7-A5/GpH7-HA11/ GpL16-k0的结合活性为84、后者所对应的GpH7-A48/GpH7-B3-15- 02A/GpL16-k0的结合活性为47，在与P329R不同的H链中导入改变时，抑制了与FcγR的结合活性。所有的改变均在后者的与P329R不同的H链中导入改变时抑制与FcγRIIIa的结合。假设导入了P329R的H链对应于图3的HA链，则认为P329R抑制来自X方向的结合。结合被显著抑制的组合出现在将L234Y、G236W、S298A导入与P329R不同的H链中时，因此此时将这些改变导入到了HB链中。L234Y、G236W、S298A这些改变均在导入到与P329R不同的H链中时显著抑制与FcγRIIIa的结合增强效果，由此认为：导入到HB链中时，所有的改变均增强来自P329R抑制FcγRIIIa的结合的X方向的结合。因此，通过将这些改变导入相同的H链中，认为可以进一步增强与FcγRIIIa的结合。
通过将L234Y、G236W、S298A中的2个分别导入相同或不同的H链中，评价与FcγR的结合是否增强，来验证上述的假说。按照参考实施例1的方法，制作插入有将L234Y、G236W、S298A分别导入GpH7-A5中得到的GpH7-TA1 (SEQ ID NO: 25)、GpH7-TA2 (SEQ ID NO:26)、GpH7-TA3 (SEQ ID NO: 27)和将L234Y、G236W、S298A分别导入GpH7-B3中得到的GpH7-B3-01-15Y (SEQ ID NO: 22)、GpH7- B3-03-20W (SEQ ID NO: 23)、GpH7-B3-15-02A (SEQID NO: 24)的表达载体。另外，制作插入有将L234Y和G236W导入GpH7-A5中得到的GpH7-TA4(SEQ ID NO: 28)、将L234Y和S298A导入GpH7-A5中得到的GpH7-TA5 (SEQ ID NO: 29)、将G236W和S298A导入GpH7-A5中得到的GpH7-TA6 (SEQ ID NO: 30)的表达载体。将它们如表8那样组合，在各个组合中加入GpL16-k0作为L链，按照参考实施例1的方法进行目标抗体的表达、制备。关于已表达的样品的H链、突变位点的信息、抗体与FcγRIIIa的结合的测定结果汇总在表8中。
[表8]
样品栏中显示抗体的名称，H1、H2栏中显示各抗体的H链恒定区的名称，突变位点栏中显示与GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0相比不同的突变(特别是没有突变时记作“-”)，与FcγRIIIa的结合活性是显示以GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0与FcγRIIIa的结合为100时的相对结合活性。各抗体的H链、L链所对应的氨基酸序列的SEQ ID NO也一并显示。
根据表8的结果，对L234Y和G236W的组合效果进行了验证。将L234Y和G236W导入不同的H链中得到的GpH7-TA2/GpH7-B3 -01-15Y/GpL16-k0与FcγRIIIa的结合活性为130，与仅导入L234Y的GpH7-A5/GpH7-B3-01-15Y/GpL16-k0的结合活性131相比没有增加，与仅导入G236W的GpH7-A5/GpH7-B3-03-20W/GpL16-k0的结合活性140相比有所减少。但是，将L234Y和G236W导入相同的H链中得到的GpH7-TA4/GpH7-B3/GpL16-k0的结合活性为168，与仅导入L234Y的GpH7-A5/GpH7-B3-01-15Y/GpL16-k0、仅导入G236W的GpH7-A5/GpH7-B3-03-20W/GpL16-k0相比，结合活性增加。由该结果明确了：如预测的那样，通过将L234Y和G236W导入相同的H链中，进一步增强了与FcγRIIIa的结合活性。
接下来，根据表8对L234Y和S298A的组合效果进行了验证。将L234Y和S298A导入不同的H链中得到的GpH7-TA1/GpH7- B3-15-02A/GpL16-k0与FcγRIIIa的结合活性为142，与仅导入L234Y的GpH7-A5/GpH7-B3-01-15Y/GpL16-k0的结合活性131相比有所增加，但较仅导入S298A的GpH7-A5/GpH7-B3-15-02A/GpL16-k0的结合活性163有所减少。即，GpH7-TA1/GpH7-B3-15-02A/GpL16-k0与仅导入S298A时相比结合活性没有增强，因此可以说：将S298A和L234Y导入不同的H链中，并不能赋予进一步增强与FcγRIIIa的结合活性的效果。但是，将L234Y和S298A导入相同的H链中得到的GpH7-TA5/GpH7-B3/GpL16-k0的结合活性为208，与仅导入L234Y的GpH7-A5/GpH7-B3-01-15Y/GpL16-k0、仅导入S298A的GpH7-A5/ GpH7-B3-15-02A/GpL16-k0中的任一个相比，与FcγRIIIa的结合活性均增加。由该结果明确了：如预测的那样，通过将L234Y和S298A导入相同的H链中，进一步增强了与FcγRIIIa的结合活性。
接下来，根据表8对G236W和S298A的组合效果进行了验证。将G236W和S298A导入不同的H链中得到的GpH7-TA3/GpH7-B3- 03-20W/GpL16-k0与FcγRIIIa的结合活性为70，与仅导入G236W的GpH7-A5/GpH7-B3-03-20W/GpL16-k0的结合活性140相比有所减少，与仅导入S298A的GpH7-A5/GpH7-B3-15-02A/GpL16-k0的结合活性163相比也有所减少。但是，将G236W和S298A导入相同的H链中得到的GpH7-TA6/GpH7-B3/GpL16-k0的结合活性为228，与仅导入G236W的GpH7-A5/GpH7-B3-03-20W/GpL16-k0、仅导入S298A的GpH7-A5/GpH7-B3-15-02A/GpL16-k0中的任一个相比，结合活性均增加。由该结果明确了：如预测的那样，通过将G236W和S298A导入相同的H链中，进一步增强了与FcγRIIIa的结合活性。
上述结果显示出：如最初预测的那样，只在将L234Y、G236W、S298A分别导入相同的H链中时结合才增强。这是支持在L234Y、G236W、S298A存在于相同的链中时从相同方向增强与FcγR的结合的数据。即，根据将各改变和P329R组合、并比较与FcγRIIIa的结合活性的结果预测的结果，可以确定适当组合两个改变的方法。即，与P329R的组合是预测异源二聚化抗体中的改变的组合方法的有效方法，通过使用该方法，可以明确其他有效的改变的组合。
由将各改变与P329R组合、并比较与FcγRIIIa的结合活性的结果明确了：考虑两个以上的改变的组合时，将L234Y和G236W、G236W和S298A、S298A和L234Y导入相同的H链中时，分别从相同方向增强与FcγRIIIa的相互作用。即，由该结果认为：L234Y、G236W、S298A均从相同的方向增强与FcγRIIIa的结合活性，因此预测将这些改变导入相同的H链中时，与FcγRIIIa的结合活性变得最强。为了验证该假说，将L234Y和G236W、L234Y和S298A、G236W和S298A的各改变组导入GpH7-A5中得到GpH7-TA4、GpH7-TA5、GpH7-TA6，并将L234Y、G236W、S298A分别导入GpH7-B3中得到GpH7-B3-01- 15Y、GpH7-B3-03-20W、GpH7-B3-15-02A，根据参考实施例1制备插入有上述序列的表达载体，将L234Y、G236W、S298A这3个改变组合起来使其被导入到任一个H链中，再加入GpL16-k0作为L链，按照参考实施例1的方法表达、纯化目标抗体。另外，制作在GpH7-A5中导入了L234Y、G236W、S298A这3个改变的GpH7-TA7 (SEQ ID NO: 31)，与GpH7-B3、GpL16-k0合并，按照参考实施例1的方法表达、纯化目标抗体。这里制备的抗体的列表和各抗体与FcγRIIIa的结合活性的比较结果汇总在表9中。
[表9]
样品栏中显示抗体的名称，H1、H2栏中显示各抗体的H链恒定区的名称，突变位点栏中显示与GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0相比不同的突变(特别是没有突变时记作“-”)，与FcγRIIIa的结合活性是显示以GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0与FcγRIIIa的结合活性为100时的相对结合活性。各抗体的H链、L链所对应的氨基酸序列的SEQ ID NO也一并显示。
其结果，如由将各改变和P329R组合、并比较与FcγRIIIa的结合活性的结果预测的那样，将L234Y、G236W、S298A导入相同的H链中得到的GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0与FcγRIIIa的结合最为增强。即，由该结果明确了：通过将各改变与P329R组合，并比较与FcγRIIIa的结合活性，可以预料2个以上的改变的适当的组合方法。
[实施例6] 异源二聚化抗体中的现有的同源二聚化抗体与新的异源二聚化抗体的比较
实施例5的表7、表8、表9的结果显示出：通过将单独增强与FcγRIIIa的结合活性的异种改变适当组合，可以进一步增强与FcγRIIIa的结合。具体而言，通过将L234Y、G236W、S298A导入相同的H链中，显示出与FcγR的结合活性进一步增强。
接下来，确认即使将多个改变组合，当导入了对应的多个改变时，是否维持着异源二聚化抗体的性质、即与同源二聚化抗体相比异源二聚化抗体与FcγR的结合增强。具体而言，按照参考实施例1的方法，制作分别向GpH7-A5、GpH7-B3中导入L234Y、G236W、S298A而得到的GpH7-TA7和GpH7-TA45 (SEQ ID NO: 32)，如表10所示，按照参考实施例1的方法，表达、纯化仅在一个H链中导入了L234Y、G236W、S298A的异源二聚化抗体GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0和GpH7-A5/GpH7-TA45/GpL16-k0、以及在两个H链中导入了L234Y、G236W、S298A的同源二聚化抗体GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0。按照参考实施例2的方法，比较它们与该FcγRIIIa的结合(表10)。
[表10]
样品栏中显示抗体的名称，H1、H2栏中显示各抗体的H链恒定区的名称，突变位点栏中显示与GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0相比不同的突变(特别是没有突变时记作“-”)，与FcγRIIIa的结合活性是显示以GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0与FcγRIIIa的结合活性为100时的相对结合活性。各抗体的H链、L链所对应的氨基酸序列的SEQ ID NO也一并显示。
由表10的结果可知：与仅在一个H链中导入了L234Y、G236W、S298A的异源二聚化抗体GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0和GpH7-A5/GpH7-TA45/GpL16-k0中的任一个相比，在两个H链中导入了L234Y、G236W、S298A的同源二聚化抗体GpH7-TA7/GpH7-TA45/ GpL16-k0与FcγRIIIa的结合减少。由此明确了：即使将多个改变组合时，也维持着L234Y、G236W、S298A各改变的性质：即在异源二聚化抗体中增强与FcγR的结合活性，而在同源二聚化抗体中减弱与FcγR的结合活性。
接下来，验证在仅向一个H链中导入了L234Y、G236W、S298A的异源二聚化抗体中，是否维持着在实施例3中考察的与FcγRIIIa的结合的方向性。
按照参考实施例1的方法，制作分别向GpH7-TA7、GpH7-B3中导入P329R而得到的GpH7-TA8 (SEQ ID NO: 33)、GpH7-B12 (SEQ ID NO: 12)，如表11所示，按照参考实施例1的方法，制备将L234Y、G236W、S298A和P329R导入相同的H链中得到的异源二聚化抗体GpH7-TA8/GpH7-B3/GpL16-k0和导入不同的链中得到的异源二聚化抗体GpH7-TA7/GpH7-B12/GpL16-k0。按照参考实施例2的方法，比较上述抗体和在一个H链中导入了L234Y、G236W、S298A的异源二聚化抗体GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0与FcγRIII的结合活性(表11)。
[表11]
样品栏中显示抗体的名称，H1、H2栏中显示各抗体的H链恒定区的名称，突变位点栏中显示与GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0相比不同的突变(特别是没有突变时记作“-”)，与FcγRIIIa的结合活性是显示以GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0与FcγRIIIa的结合为100时的相对结合活性。各抗体的H链、L链所对应的氨基酸序列的SEQ ID NO也一并显示。
表11的结果，与GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0相比，将L234Y、G236W、S298A的改变组导入与P329R相同的H链中得到的异源二聚化抗体GpH7-TA8/GpH7-B3/GpL16-k0和将L234Y、G236W、S298A的改变组导入不同于P329R的H链中得到的异源二聚化抗体GpH7-TA7/GpH7-B12/GpL16-k0与FcγRIIIa的结合活性均减弱，在GpH7-TA7/GpH7-B12/GpL16-k0中，与FcγRIIIa的结合活性为11，与GpH7-TA8/GpH7-B3/GpL16-k0的150相比明显减弱。由该结果观察到与实施例3中在L234Y、G236W、S298A的各改变的情况下观察到的性质相同的性质：即，即使将L234Y、G236W、S298A的改变导入到多个H链中，在导入到与P329R不同的H链中时，与FcγR的结合活性也明显被减弱。
由上述结果明确了：通过将增强与FcγR的结合的改变适当组合，维持异源二聚化抗体的性质不变，还可以进一步增强与FcγR的结合活性。
[实施例7] 与现有技术的比较：增强FcγRIIIa结合的氨基酸改变抗体与异源二聚化变体的比较
迄今为止，还已知通过增强与FcγRIIIa的结合来增强ADCC活性的改变。例如，已知S239D、I332E、A330L的改变是导入到抗体的两个H链中时最增强与FcγRIIIa的结合的改变(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103, 4005-4010, 2006)。由于抗体依赖性的细胞毒(ADCC)活性增强，因此显示出抗体的抗肿瘤活性增强，增强抗体与FcγRIIIa的结合，这是用于提高抗体的作为药品的有用性的有效手段。但是，如之前的实施例所示，认为使用同源二聚化抗体来增强与FcγR的结合活性存在限制，认为通过异种改变，可以进一步增强与FcγR的结合活性。
如实施例1中所述，抗体的Fc区和FcγR不对称地发生相互作用。当为导入了S239D、I332E、A330L的改变的抗体时，根据其立体结构，认为在HA链中S239D、I332E、A330L的被改变的所有残基均参与增强与FcγR的相互作用，但在HB链中S239D以外的残基不与FcγR接触，无助于增强与FcγR的结合活性(图23)。即，若考虑到Fc区与FcγR的相互作用的不对称性，则通过现有的抗体改变技术导入的各改变与FcγR无法充分进行相互作用，不足以使抗体与FcγR的相互作用最佳化。例如，当为上述的S239D、I332E、A330L的改变时，认为通过向HB链中导入从HB链侧增强与FcγRIIIa的相互作用的改变以代替上述改变，可以进一步增强与FcγRIIIa的结合。即，通过使用在抗体的各H链中加入不同的改变的本发明的制作异源二聚化抗体的技术(以下，在本说明书中称作“异源二聚化抗体技术”)，与在抗体的各H链中加入相同的改变的技术(以下，在本说明书中称作“现有技术”或“同源二聚化抗体技术”)相比，有可能进一步增强与FcγR的结合。
根据Fc和FcγRIIIa的复合体的立体结构，认为与S239D、I332E、A330L相反，S298和FcγR只在图23的HB链中进行相互作用(JBC, 276: 16469-16477, 2001)。由此认为：在S298中导入改变时，被取代的突变也在HB链侧与FcγRIIIa进行相互作用。如实施例5中所见，认为L234Y、G236W从与S298A相同的方向增强与FcγR的相互作用。即，在相同的H链中导入S239D、A330L、I332E，而在相反的H链中导入L234Y、G236W、S298A时，导入的所有改变均可以同时与FcγR进行相互作用，其结果，认为可以进一步增强与FcγR的相互作用。
为了验证该假说，进行以下的实验。利用分别导入了L234Y、G236W、S298A、S239D、A330L、I332E的改变的H链和在相同或不同的H链中导入了P329R的抗体，按照实施例5的方法确定各改变识别FcγR的方向。按照参考实施例1的方法，制作插入有下述序列的表达载体：GpH7-A5、在GpH7-A5中导入了P329R的GpH7-A48 (SEQ ID NO: 16)、在GpH7-B3中导入了S239D和P329R的GpH7-HA7 (SEQ ID NO: 34)、在GpH7-B3中导入了A330L和P329R的GpH7-HA15 (SEQ ID NO: 35)、在GpH7-B3中导入了I332E和P329R的GpH7-HA18 (SEQ ID NO:36)、在GpH7-B3中导入了L234Y和P329R的GpH7-HA5 (SEQ ID NO: 19)、在GpH7-B3中导入了G236W和P329R的GpH7-HA6 (SEQ ID NO: 20)、在GpH7-B3中导入了S298A和P329R的GpH7-HA11 (SEQ ID NO: 21)、在GpH7-B3中导入了S239D的GpH7-B3-06-09D (SEQ ID NO: 37)、在GpH7-B3中导入了A330L的GpH7-B3-20-08L (SEQ ID NO: 38)、在GpH7-B3中导入了I332E的GpH7-B3-22-10E (SEQ ID NO: 39)、在GpH7-B3中导入了L234Y的GpH7-B3-01-15Y (SEQID NO: 22)、在GpH7-B3中导入了G236W的GpH7-B3-03-20W (SEQ ID NO: 23)、在GpH7-B3中导入了S298A的GpH7-B3-15-02A (SEQ ID NO: 24)。组合各H链所对应的表达载体，使L234Y、G236W、S298A、S239D、A330L、I332E的各改变和P329R存在于相同或不同的H链中，再与L链所对应的表达载体的GpL16-k0组合，按照参考实施例1的方法表达、制备目标抗体。使用所制备的抗体，测定与FcγRIIIa的结合活性，使用P329R研究L234Y、G236W、S298A，S239D、A330L、I332E的FcγRIIIa识别方向，结果汇总在表12中。
[表12]
样品栏中显示抗体的名称，H1、H2栏中显示各抗体的H链恒定区的名称，突变位点栏中显示与GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0相比不同的突变(特别是没有突变时记作“-”)，与FcγRIIIa的结合活性是显示以GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0与FcγRIIIa的结合活性为100时的相对结合活性。各抗体的H链、L链所对应的氨基酸序列的SEQ ID NO也一并显示。
根据该结果，关于各改变，在将各改变导入与P329R相同的H链中时、导入与P329R不同的H链中时，比较与FcγRIIIa的结合活性。当为S239D时，前者所对应的GpH7-A5/GpH7-HA7/GpL16-k0的结合活性为3、后者所对应的GpH7-A48/GpH7-B3-06-09D/GpL16-k0的结合活性为123，在与P329R相同的H链中导入改变时，与FcγRIIIa的结合被抑制。当为A330L时，前者所对应的GpH7-A5/GpH7- HA15/GpL16-k0的结合活性为32、后者所对应的GpH7-A48/GpH7- B3-20-08L/GpL16-k0的结合活性为60，在与P329R相同的H链中导入改变时，与FcγRIIIa的结合被抑制。当为I332E时，前者所对应的GpH7-A5/GpH7-HA18/GpL16-k0的结合活性为35、后者所对应的GpH7-A48/GpH7-B3-22-10E/GpL16-k0的结合活性为189，在与P329R相同的H链中导入改变时，与FcγRIIIa的结合被抑制。关于所有的改变，均在前者的P329R被导入相同的H链中时，与FcγRIIIa的结合被抑制。若假定导入有P329R的H链与图23的HA链对应，则认为P329R抑制来自X方向的结合。结合被明显抑制的组合是将S239D、A330L、I332E导入与P329R相同的H链中时，因此在这种情况下，将这些改变导入HA链中。将S239D、A330L、I332E的所有改变均导入与P329R相同的H链中时，与FcγRIIIa的结合增强效果被显著抑制，因此认为导入HA链中时，所有的改变均增强来自P329R抑制FcγRIIIa的结合的X方向的结合。因此，认为通过将这些改变导入相同的H链中，可以进一步增强与FcγRIIIa的结合。由实施例5观察到：L234Y、G236W、S298A均导入HB链中时，增强来自X方向的结合。如实施例5、实施例6中考察的那样，通过与P329R组合，可以找到适当组合各改变的方法。根据这次的结果，认为为了增强图3的来自X方向的与FcγRIIIa的结合，需要将S239D、A330L、I332E导入HA链中，并将L234Y、G236W、S298A导入HB链中，通过将各改变组导入不同的H链中，可以进一步增强来自X方向的与FcγRIIIa的结合。
为了验证该假说，按照参考实施例1的方法，制备插入有下述序列的表达载体：将S239D、A330L、I332E全部导入GpH7-A5中得到的GpH7-A57 (SEQ ID NO: 40)和导入GpH7-B3中得到的GpH7-B78 (SEQ ID NO: 41)、以及将L234Y、G236W、S298A全部导入GpH7-A5中得到的GpH7-TA7 (SEQ ID NO: 31)和导入GpH7-B3中得到的GpH7-TA45 (SEQ ID NO: 32)。使用这些表达载体和GpH7-A5、GpH7-B3、GpL16-k0，按照参考实施例1的方表达、制备下述抗体：在一个H链中导入了L234Y、G236W、S298A，而在另一个H链中导入了S239D、A330L、I332E的异源GpH7-TA7/GpH7-B78/ GpL16-k0；在一个H链中仅导入了L234Y、G236W、S298A的GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0；在两个H链中导入了L234Y、G236W、S298A的GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0；在一个H链中仅导入了S239D、A330L、I332E的GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0；在两个H链中导入了S239D、A330L、I332E的GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0。关于制备的抗体，以按照参考实施例2的方法测定的相对于FcγRIIIa的KD为指标，比较其与FcγRIIIa的结合活性，L234Y、G236W、S298A和S239D、A330L、I332E的组合的效果的验证结果汇总在表13中。
[表13]
样品栏中显示抗体的名称，H1、H2栏中显示各抗体的H链恒定区的名称，突变位点栏中显示与GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0相比不同的突变(特别是没有突变时记作“-”)。以用GpH7-G1d/GpL16-k0相对于FcγRIIIa的KD除以各抗体的KD而得到的值作为KD比1，以用GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0相对于FcγRIIIa的KD除以各抗体的KD而得到的值作为KD比2。各抗体的H链、L链所对应的氨基酸序列的SEQ ID NO也一并显示。
根据表13的结果，比较作为天然型IgG1的GpH7-G1d/GpL16-k0和在一个H链中分别导入了D356K、H435R和K439E的GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0时，该与FcγRIIIa的结合活性的变化为0.75倍，没有观察到大的差异。由此认为：D356K、H435R和K439E的改变对与FcγRIIIa的结合活性没有影响。
关于使用现有技术的同源二聚化抗体，验证各改变的效果。与GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0相比，在两个H链中导入了S239D、A330L、I332E的同源二聚化抗体GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0中与FcγRIIIa的结合活性增强约260倍，相反，在两个H链中导入了L234Y、G236W、S298A的同源二聚化抗体GpH7-TA7/GpH7-TA45/ GpL16-k0中减弱至0.49倍。由该结果明确了：在同源二聚化抗体中，仅S239D、A330L、I332E的改变组具有与FcγRIIIa的结合活性增强效果。
关于仅在一个H链中导入了各改变组的异源二聚化抗体，验证各改变组的效果。与GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0相比，在一个H链中导入了S239D、A330L、I332E的异源二聚化抗体GpH7-A5/GpH7-B78/ GpL16-k0中与FcγRIIIa的结合活性增强30倍，在一个H链中导入了L234Y、G236W、S298A的异源二聚化抗体GpH7-TA7/GpH7-B3/ GpL16-k0中增强5.1倍。由该结果明确了：S239D、A330L、I332E的改变组与FcγRIIIa的结合活性增强效果高。
验证各改变组在同源二聚化抗体和异源二聚化抗体中的效果的不同。关于S239D、A330L、I332E，与GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0相比，在其异源二聚化抗体中与FcγRIIIa的结合活性增强30倍，在同源二聚化抗体中增强约260倍，明确了将改变组导入同源二聚化抗体中时进一步提高了与FcγRIIIa的结合活性的增强。另一方面，关于L234Y、G236W、S298A，与GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0相比，尽管在其异源二聚化抗体中与FcγRIIIa的结合活性增强5.1倍，但在同源二聚化抗体中减弱至0.49倍。该结果显示：与实施例5中考察的一样，L234Y、G236W、S298A的改变组仅在异源二聚化抗体中表现出与FcγRIIIa的结合活性增强效果。
在同源二聚化抗体中，只有S239D、A330L、I332E的改变组显示出与FcγRIIIa的结合增强效果，在异源二聚化抗体中，S239D、A330L、I332E的改变组显示出与FcγRIIIa的结合增强高。根据上述结果预测：考虑将S239D、A330L、I332E的改变组和L234Y、G236W、S298A的改变组组合时，根据现有的想法来考虑时，在异源二聚化抗体、同源二聚化抗体中，只将与FcγRIIIa的结合增强高的S239D、A330L、I332E的改变组导入两个H链中而得到的同源二聚化抗体GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0与FcγRIIIa的结合增强效果均最高。但是，与GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0相比，在一个H链中导入S239D、A330L、I332E、在另一个H链中导入L234Y、G236W、S298A而得到的异源二聚化抗体GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0与FcγRIIIa的结合活性增强约350倍，显示出较在两个H链中导入了S239D、A330L、I332E的同源二聚化抗体高的结合增强效果。认为这是证实下述假说的结果：即，通过将S239D、A330L、I332E的改变组和L234Y、G236W、S298A的改变组导入不同的H链中，导入的所有改变从HA链、HB链的双方增强与FcγRIIIa的结合活性，发挥比在两个H链中导入S239D、A330L、I332E的改变组时高的效果。
即，结果显示出：与使用现有的同源二聚化抗体相比，通过使用异源二聚化抗体，可以进一步使Fc区与FcγRIIIa的不对称的相互作用最佳化，可以设计具有更高的结合活性的Fc区。
由图23认为：虽然A330L、I332E只在HA链中与FcγR发生相互作，但S239D在HA链、HB链中均与FcγR发生相互作用。实际上，在仅在一个H链中导入了S239D、A330L、I332E的异源二聚化抗体GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0中，相对于FcγRIIIa的KD为5.4E-8，但在同源二聚化抗体GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0中，KD为6.2E-9，与FcγRIIIa的结合活性增强8.7倍。若认为该结合活性的差异起源于S239D从两个H链参与结合增强，则考虑通过在两个H链中导入S239D来消除此差异。为了验证该假说，制作在GpH7-A5中导入了S239D的GpH7-A53(SEQ ID NO: 42)，并与导入了S239D、A330L、I332E的GpH7-B78组合，按照参考实施例1的方法进行表达、制备，再按照参考实施例2的方法比较S239D、A330L、I332E的异源二聚化抗体和同源二聚化抗体与FcγRIIIa的结合，进行S239D与S239D、A330L、I332E的组合的效果验证(表14)。
[表14]
样品栏中显示抗体的名称，H1、H2栏中显示各抗体的H链恒定区的名称，突变位点栏中显示与GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0相比不同的突变(特别是没有突变时记作“-”)。以用GpH7-A5/GpH7-B78/ GpL16-k0相对于FcγRIIIa的KD除以各抗体的KD而得到的值作为KD比。各抗体的H链、L链所对应的氨基酸序列的SEQ ID NO也一并显示。
由表14可知：在一个H链中导入了S239D、A330L、I332E、在另一个H链中导入了S239D的GpH7-A53/GpH7-B78/GpL16-k0中，与仅在其中一个H链中导入了S239D、A330L、I332E的GpH7-A5/ GpH7-B78/GpL16-k0相比，与FcγRIIIa的结合活性增强4.9倍，与在两个H链中导入了S239D、A330L、I332E的GpH7-A57/GpH7-B78/ GpL16-k0相比，与FcγRIIIa的结合活性减弱1.8倍。由该结果认为：如上述的假说所述，S239D在两个H链中与FcγRIIIa发生相互作用，通过导入该改变，可以进一步增强与FcγRIIIa的相互作用。
验证通过向一个H链中导入有L234Y、G236W、S298A、另一个H链中导入有S239D、A330L、I332E的异源二聚化抗体GpH7-TA7/ GpH7-B78/GpL16-k0中导入S239D，是否可以进一步增强与FcγRIIIa的结合活性。按照参考实施例1的方法，制备插入有向GpH7-TA7中导入S239D而得到的GpH7-TA22 (SEQ ID NO: 43)的表达载体，与在GpH7-B3中导入了S239D、A330L、I332E的GpH7-B78、GpL16-k0合并，表达、制备目标抗体。而且，制备在一个H链中导入了L234Y、G236W、S239D、S298A、在另一个H链中导入了S239D、A330L、I332E的异源二聚化抗体GpH7-TA22/GpH7-B78/ GpL16-k0。按照参考实施例2的方法，比较与FcγR IIIa的结合活性，进行S239D与S239D、A330L、I332E的组合的效果的验证(表15)。
[表15]
样品栏中显示抗体的名称，H1、H2栏中显示各抗体的H链恒定区的名称，突变位点栏中显示与GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0相比不同的突变(特别是没有突变时记作“-”)。以用GpH7-TA7/ GpH7-B78/GpL16-k0相对于FcγRIIIa的KD除以各抗体的KD而得到的值作为KD比。各抗体的H链、L链所对应的氨基酸序列的SEQ ID NO也一并显示。
由表15可知：在一个H链中导入有L234Y、G236W、S298A、另一个H链中导入有S239D、A330L、I332E的异源二聚化抗体GpH7- TA7/GpH7-B78/GpL16-k0中，与GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0相比，在不含S239D的一侧的链中导入了S239D的GpH7-TA22/GpH7- B78/GpL16-k0中结合活性增强3.2倍。该结果显示出：通过使用S239D，可以进一步增强与FcγRIIIa的结合。
接下来，实施下述研究：进一步加入实施例4中发现的作为与FcγRIIIa的结合增强改变之一的Y296W、K334G。
首先，研究是否将Y296W导入任一个H链中。制作在GpH7-TA7中导入了Y296W的突变的GpH7-TA52 (SEQ ID NO: 44)，与GpH7-B78组合，按照参考实施例1的方法进行表达、制备。另外，制作在GpH7-B78中导入了Y296W的GpH7-TA58 (SEQ ID NO: 45)，与GpH7-TA22组合，按照参考实施例1的方法进行表达、制备。关于制备的抗体，按照参考实施例2的方法比较它们与FcγRIIIa的结合活性，进行Y296W的组合效果的验证(表16)。
[表16]
样品栏中显示抗体的名称，H1、H2栏中显示各抗体的H链恒定区的名称，突变位点栏中显示与GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0相比不同的突变(特别是没有突变时记作“-”)。以用GpH7-TA7/ GpH7-B78/GpL16-k0相对于FcγRIIIa的KD除以各抗体的KD而得到的值作为KD比。各抗体的H链、L链所对应的氨基酸序列的SEQ ID NO也一并显示。
由该结果可知：将Y296W导入不同于L234Y、G236W、S298A的H链中时，在导入前后与FcγRIIIa的结合活性仅增强1.2倍，但将其导入相同的H链中时，与GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0相比，与FcγRIIIa的结合活性增强1.8倍。由该结果认为：通过将Y296W导入与L234Y、G236W、S298A相同的H链中，具有与FcγRIIIa的结合增强效果。
接下来，制作在GpH7-TA22中导入了Y296W的GpH7-TA54 (SEQ ID NO: 46)，与GpH7-B78组合，按照参考实施例1的方法进行表达、制备。另外，制作在GpH7-B78中导入了Y296W的GpH7-TA58 (SEQ ID NO: 45)，与GpH7-TA22组合，按照参考实施例1的方法进行表达、制备。关于制备的抗体，按照参考实施例2的方法，比较它们与FcγRIIIa的结合活性，进行Y296W的组合效果的验证(表17)。
[表17]
样品栏中显示抗体的名称，H1、H2栏中显示各抗体的H链恒定区的名称，突变位点栏中显示与GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0相比不同的突变(特别是没有突变时记作“-”)。以用GpH7-TA22/GpH7- B78/GpL16-k0相对于FcγRIIIa的KD除以各抗体的KD而得到的值作为KD比。各抗体的H链、L链所对应的氨基酸序列的SEQ ID NO也一并显示。
由表17的结果可知：将Y296W导入不同于L234Y、G236W、S298A的H链中时，在导入前后与FcγRIIIa的结合活性没有变化，但导入相同的H链中时，与GpH7-TA22/GpH7-B78/GpL16-k0相比，与FcγRIIIa的结合活性增强1.3倍。由该结果认为：通过将Y296W导入与L234Y、G236W、S298A相同的H链中，具有与FcγRIIIa的结合活性增强效果。
接下来，对于K334G也进行同样的研究。制作在GpH7-TA7中导入了K334G的GpH7-TA40 (SEQ ID NO: 47)，与GpH7-B78组合，按照参考实施例1的方法进行表达、制备。另外，制作在GpH7-B78中导入了K334G的GpH7-TA50 (SEQ ID NO: 48)，与GpH7-TA7组合，按照参考实施例1的方法进行表达、制备。关于制备的抗体，按照参考实施例2的方法，比较它们与FcγRIIIa的结合，进行K334G的组合效果的验证(表18)。
[表18]
样品栏中显示抗体的名称，H1、H2栏中显示各抗体的H链恒定区的名称，突变位点栏中显示与GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0相比不同的突变(特别是没有突变时记作“-”)。以用GpH7-TA7/GpH7- B78/GpL16-k0相对于FcγRIIIa的KD除以各抗体的KD而得到的值作为KD比。各抗体的H链、L链所对应的氨基酸序列的SEQ ID NO也一并显示。
由表18的结果可知：将K334G导入与L234Y、G236W、S298A相同的H链中时，在导入前后与FcγRIIIa的结合活性降低一半，但导入不同的H链中时，与GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0相比，与FcγRIIIa的结合活性增强1.2倍。由该结果认为：通过将K334G导入不同于L234Y、G236W、S298A的H链中，具有与FcγRIIIa的结合活性增强效果。
[实施例8] 对活性型FcγR和抑制型FcγR的选择性的提高
FcγR中存在具有ITAM的活性型和不具有ITIM的抑制型。作为代表性的活性型FcγR (活化受体)，可以列举FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIIa，作为代表性的抑制型FcγR(Inhibitory receptor)，可以列举FcγRIIb。在以癌症为靶的抗体中，认为与作用机制中具有ADCC活性或抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)活性的活性型FcγR的结合活性和与抑制型FcγR的结合活性的比例发挥重要作用(Nature Medicine, 6: 443-446, 2000)。
认为希望以癌症为靶的抗体增强与活性型FcγR的结合活性、而减弱与抑制型FcγR的结合活性。具体而言，如图24所示的a区中所含的改变那样，希望是与天然型抗体相比与活性型FcγR强力结合，且与天然型抗体相比与抑制型FcγR微弱结合，即选择性地增强与活性型FcγR的结合的改变。另外，如图25所示的位于b区中的改变那样，希望是与天然型抗体相比与活性型FcγR和抑制型FcγR的结合活性的比例变大的改变。这样的改变可以说是与抑制型FcγR相比选择性地增强与活性型FcγR的结合活性的改变。
根据实施例4的方法，测定在一个H链中导入了改变的异源二聚化抗体He Ab与各活性型FcγR和抑制型FcγR的结合活性。为了评价各异源二聚化抗体与各活性型FcγR和抑制型FcγR的结合活性的比例，将其结果汇总在图26、图27、图28、图29中。图26的活性型FcγR为FcγRIa，图27的活性型FcγR为FcγRIIa(R)，图28的活性型FcγR为FcγRIIa(H)，图29的活性型FcγR为FcγRIIIa。
在图26中，将图24、图25的a和b所对应的区中存在的改变汇总在表19 (表19-1～19-5)中。进行相同的操作，关于FcγRIIa(R) (图27)、FcγRIIa(H) (图28)、FcγRIIIa(图29)，也将a和b所对应的区中存在的改变的列表分别汇总在表20 (表20-1～20-3)、表21(表21-1～21-3)、表22 (表22-1～22-3)中。
[表19-1]
[表19-2]
[表19-3]
[表19-4]
[表19-5]
显示与FcγRIIb相比选择性地增强与FcγRIa的结合的改变的列表。
[表20-1]
[表20-2]
[表20-3]
显示与FcγRIIb相比选择性地增强与FcγRIIa(R)的结合的改变的列表。
[表21-1]
[表21-2]
[表21-3]
显示与FcγRIIb相比选择性地增强与FcγRIIa(H)的结合的改变的列表。
[表22-1]
[表22-2]
[表22-3]
显示与FcγRIIb相比选择性地增强与FcγRIIIa的结合的改变的列表。
另一方面，作为唯一的抑制型FcγR的FcγRIIb在自身免疫疾病或炎症性疾病中发挥重要作用(J.Exp.Med., 203, 2157-2164, 2006、J.immunol., 178, 3272-3280,2007)。还显示出具有增强与FcγRIIb的结合活性的Fc区的抗体对B细胞引起的自身免疫疾病的治疗有效的可能性(Mol. Immunology 45, 3926-3933, 2008)。当为以治疗自身免疫疾病或炎症性疾病为目的的抗体时，由活性型FcγR介导的ADCC活性或ADCP活性有可能使病情恶化，因此希望与活性型FcγR的结合活性尽可能减弱，并增强与抑制型FcγR的结合活性。具体而言，希望象图24的c区中存在的改变那样，具有与天然型抗体相比增强与抑制型FcγR的结合活性、而减弱与活性型FcγR的结合活性的效果。这样的改变可以说具有选择性地增强与抑制型FcγR的结合的效果。另外，希望象图25的d区中存在的改变那样，具有与天然型抗体相比与抑制型FcγR的结合活性和与活性型FcγR的结合活性的比例增大的效果。这样的改变可以说是与活性型FcγR相比选择性地增强与抑制型FcγR的结合活性的改变。
因此，使用评价上述各异源二聚化抗体与抑制型FcγR和活性型FcγR的结合活性的比例的图26、图27、图28、图29，关于各图中的改变，将图24、图25的c和d所对应的区中存在的改变列表分别汇总在表23 (表23-1和23-2)、表24 (表24-1和24-2)、表25 (表25-1～25-3)、表26 (表26-1～26-4)中。
[表23-1]
[表23-2]
显示与FcγRIa相比选择性地增强与FcγRIIb的结合的改变的列表。
[表24-1]
[表24-2]
显示与FcγRIIa(R)相比选择性地增强与FcγRIIb的结合的改变的列表。
[表25-1]
[表25-2]
[表25-3]
显示与FcγRIIa(H)相比选择性地增强与FcγRIIb的结合的改变的列表。
[表26-1]
[表26-2]
[表26-3]
[表26-4]
显示与FcγRIIIa相比选择性地增强与FcγRIIb的结合的改变的列表。
[实施例9] 异源二聚化抗体的物理化学稳定性评价
开发抗体作为药品时，还期待着具有高度的物理化学稳定性。例如，据报道，当为上述言及的在抗体的两个链中导入了S239D、A330L、I332E的改变时，若导入该改变，则抗体的Fc区在热力学方面不稳定，热稳定性的降低使作为药品的开发变得困难(MolecularImmunology, 45, 1872-1882, 2008)。为了提高抗体的作为药品的有效性和开发的容易性，增强与FcγR的结合活性，而维持物理化学稳定性也是重要的。在同源二聚化抗体中，由于在两个H链中导入改变，因此若导入1种改变，则每一分子的抗体导入2处改变。但是，在异源二聚化抗体中，由于可以选择是否向各H链中导入改变，因此即使导入1种改变，也可只限于在每1分子的抗体中导入1处改变。如实施例7中考察的那样，根据改变的种类，关于与FcγRIIIa的结合活性的增强效果，有时在一个H链中导入改变时效果并不充分。反之，当该改变具有降低抗体的物理化学稳定性的效果时，认为通过仅在一个H链中导入该改变，可以赋予与FcγRIIIa的结合活性增强效果，另一方面，可以使抗体的物理化学不稳定化停留在最低限度。
为了验证该假说，研究实际上是S239D、A330L、I332E中的哪个残基有助于CH2区的不稳定化。按照参考实施例1的方法，制作插入有在GpH7-B3中分别导入了S239D、A330L、I332E的改变而得到的GpH7-B3-06-09D (SEQ ID NO: 37)、GpH7-B3-20-08L (SEQ ID NO:38)、GpH7-B3-22-10E (SEQ ID NO: 39)的表达载体，使用GpL16-k0作为L链，按照参考实施例1的方法表达、制备目标抗体。另外，作为对照，使用没有加入改变的GpH7-B3和GpL16-k0，表达、制备目标抗体。按照参考实施例5的方法，通过热转移分析(Thermal shift assay)比较各抗体的CH2区的Tm (表27)。需要说明的是，以下只要没有特别说明，则Tm是指CH2区的Tm。
[表27]
样品栏中显示抗体的名称，H栏中显示各抗体的H链恒定区的名称，突变位点栏中显示与GpH7-B3/GpL16-k0相比不同的突变(特别是没有突变时记作“-”)，Tm栏中显示各抗体的Tm，△Tm栏中显示各抗体的Tm与GpH7-B3/GpL16-k0的Tm之差。各抗体的H链、L链所对应的氨基酸序列的SEQ ID NO也一并显示。
比较导入了S239D的同源二聚化抗体GpH7-B3-06-09D/GpL16-k0、导入了A330L的同源二聚化抗体GpH7-B3-20-08L/GpL16-k0、导入了I332E的同源二聚化抗体GpH7-B3-22-10E/GpL16-k0和GpH7-B3/GpL16-k0时，Tm分别减少3℃、1℃、8℃。由该结果认为：在这3个改变中，I332E减少CH2的Tm的效果最高，I332E在导入有S239D、A330L、I332E的改变组的抗体中也最有助于Tm的减少。
I332E的侧链周围被V240、V323、L328等疏水性氨基酸包围。在导入有I332E的抗体中，由于由疏水性高的Ile取代成了亲水性高的Glu，因此认为与周边残基的疏水性相互作用消失，有助于Fc区的不稳定化。另一方面，如实施例7中考察的那样，I332E只在一个H链中与FcγRIIIa发生相互作用。因此，关于不参与与FcγRIIIa的相互作用的另一个H链的I332，直接形成Ile，由此可以赋予与FcγRIIIa的结合的增强效果，同时维持热力学稳定性。因此，验证通过仅在一个H链中导入I332E，与在两个链中导入I332E时相比Tm是否上升。制作插入有在GpH7-A5中导入了I332E的GpH7-A44 (SEQ ID NO: 49)、在GpH7-B3中导入了I332E的GpH7-B80 (SEQ ID NO: 50)的表达载体，与GpH7-B3、GpH7-A5、GpL16-k0合并，按照参考实施例1的方法，分别表达、制备仅在一个H链中导入了I332E的异源二聚化抗体GpH7-A5/GpH7-B80/GpL16-k0、GpH7-A44/GpH7-B3/GpL16-k0、以及在两个H链中导入了I332E的同源二聚化抗体GpH7-A44/GpH7- B80/GpL16-k0。作为对照，制备GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0。按照参考实施例2的方法评价各抗体与FcγRIIIa的结合活性。另外，按照参考实施例5的方法，通过热转移分析比较各抗体的CH2区的Tm (表28和表29)。
[表28]
样品栏中显示抗体的名称，H1、H2栏中显示各抗体的H链恒定区的名称，突变位点栏中显示与GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0相比不同的突变(特别是没有突变时记作“-”)。以用GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16 -k0相对于FcγRIIIa的KD除以各抗体的KD而得到的值作为KD比。各抗体的H链、L链所对应的氨基酸序列的SEQ ID NO也一并显示。
[表29]
显示在一个H链中取代了I332E而得到的抗体和在两个链中取代了I332E而得到的抗体的CH2的Tm。
样品栏中显示抗体的名称，H1、H2栏中显示各抗体的H链恒定区的名称，突变位点栏中显示与GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0相比不同的突变(特别是没有突变时记作“-”)，Tm栏中显示各抗体的Tm，△Tm栏中显示各抗体的Tm与GpH7-B3/GpL16-k0的Tm之差。各抗体的H链、L链所对应的氨基酸序列的SEQ ID NO也一并显示。
由表28的结果可知：与GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0相比，在仅在一个H链中导入了I332E的异源二聚化抗体GpH7-A5/GpH7-B80/ GpL16-k0中与FcγRIIIa的结合活性增强约3倍，在GpH7-A44/GpH7- B3/GpL16-k0中增强约4倍。由此认为：即使在GpH7-A5或GpH7-B3的任一个中导入I332E，I332E的FcγRIIIa结合活性增强效果也不会变大。另外，与GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0相比，在两个H链中导入了I332E的GpH7-A44/GpH7-B80/GpL16-k0中与FcγRIIIa的结合活性增强约7倍。由上述结果明确了：如根据I332E的立体结构考察的那样，即使不向两个H链中导入I332E、而只是仅向一个H链中导入I332E，也充分具有与FcγRIIIa的结合活性增强效果。
接下来，根据表29的结果，仅在一个H链中导入了I332E的异源二聚化抗体GpH7-A5/GpH7-B80/GpL16-k0和 GpH7-A44/GpH7-B3/ GpL16-k0中，与作为其亲本Fc分子的GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0相比Tm均减少4℃，由此认为即使在GpH7-A5或GpH7-B3的任一个中导入I332E，I332E对抗体的Tm的影响也没有发生变化。另一方面，在两个H链中导入了I332E的同源二聚化抗体GpH7-A44/GpH7- B80/GpL16-k0中，与GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0相比Tm减少10℃。与在两个H链中导入了I332E的同源二聚化抗体相比，仅在一个H链中导入了I332E的异源二聚化抗体的Tm高水平地维持在6℃。由该结果明确了：通过使用不是向两个H链中而是仅向一个H链中导入了I332E的异源二聚化抗体，可以抑制Tm的降低。显示出异源二聚化抗体是对维持抗体的物理化学稳定性也有效的技术。
I332E的改变虽然在与FcγRIIIa的结合增强效果方面优异，但使用现有的同源二聚化抗体时会明显损及热力学稳定性，认为在使用抗体作为药品时会成为问题。但表28和表29的结果显示：通过使用异源二聚化抗体，在利用I332E的与FcγRIIIa的结合增强活性的同时，可以维持抗体的物理化学稳定性。由该结果认为：异源二聚化抗体是用于更精确地调整抗体的FcγR结合活性和抗体的物理化学稳定性的优异的技术。
由于GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0仅在一个H链中具有S239D、A330L、I332E，所以与在两个H链中具有S239D、A330L、I332E的GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0相比，有可能维持Tm在高水平。因此，按照参考实施例5中记载的方法，测定实施例7所示的分别组合L234Y、G236W、S298A的改变组和S239D、A330L、I332E的改变组而得到的异源二聚化抗体、同源二聚化抗体的Tm。
为了验证这一点，按照参考实施例1的方法制备下述抗体：在一个H链中导入了L234Y、G236W、S298A的改变组、在另一个H链中导入了S239D、A330L、I332E的改变组的异源二聚化抗体GpH7- TA7/GpH7-B78/GpL16-k0；只将L234Y、G236W、S298A的改变组导入一个H链中得到的异源二聚化抗体GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0和导入两个H链中得到的同源二聚化抗体GpH7-TA7/GpH7-TA45/ GpL16-k0；只将S239D、A330L、I332E导入一个H链中得到的异源二聚化抗体GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0和导入两个H链中得到的同源二聚化抗体GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0。按照参考实施例5的方法，通过热转移分析比较各抗体的CH2区的Tm，研究L234Y、G236W、S298A与S239D、A330L、I332E的组合对Tm的影响(表30)。
[表30]
样品栏中显示抗体的名称，H1、H2栏中显示各抗体的H链恒定区的名称，突变位点栏中显示与GpH7-G1d/GpL16-k0相比不同的突变(特别是没有突变时记作“-”)，Tm栏中显示各抗体的Tm，△Tm栏中显示各抗体的Tm与GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0的Tm之差。各抗体的H链、L链所对应的氨基酸序列的SEQ ID NO也一并显示。
比较导入了提高异源二聚化抗体形成效率的改变D356K/H435R和K439E而得到的GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0和作为天然型IgG1的GpH7-G1d/GpL16-k0时，CH2的Tm降低1℃。
关于作为现有技术的同源二聚化抗体，验证各改变组的效果。与GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0相比，在两个H链中导入了S239D、A330L、I332E的同源二聚化抗体GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0中 Tm下降20℃，在两个H链中导入了L234Y、G236W、S298A的改变组的同源二聚化抗体GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0中没有观察到Tm的降低，由此认为：在同源二聚化抗体中，L234Y、G236W、S298A的改变组本身不具有降低Tm的效果。
关于仅在一个H链中导入了各改变组的异源二聚化抗体，验证各改变组的效果。与GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0相比，在一个H链中导入了S239D、A330L、I332E的异源二聚化抗体GpH7-A5/GpH7-B78/ GpL16-k0中Tm降低8℃，在一个H链中导入了L234Y、G236W、S298A的异源二聚化抗体GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0中没有观察到Tm的降低。由该结果认为：在异源二聚化抗体中，L234Y、G236W、S298A的改变组本身也不具有降低Tm的效果。
与天然型IgG1相比，在两个H链中导入了S239D、A330L、I332E的GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0中Tm降低21℃，但仅在一个H链中具有S239D、A330L、I332E的改变的GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0中Tm为60℃，与同源二聚化抗体相比，维持着10℃以上的高Tm。根据实施例7的表13，与S239D、A330L、I332E的异源二聚化抗体相比，S239D、A330L、I332E的同源二聚化抗体与FcγRIIIa的结合增强约9倍。通过在两个H链中导入S239D、A330L、I332E，大幅增强与FcγRIIIa的结合，但也使Tm显著降低。
接下来，与天然型抗体相比，在两个H链中导入了L234Y、G236W、S298A的GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0中Tm仅降低1℃，认为这不是由L234Y、G236W、S298A引起的Tm的减少，而是如之前考察的那样，是为了制作异源二聚化抗体而使用的D356K/H435R和K439E的影响。在一个H链中导入了L234Y、G236W、S298A的GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0中Tm也同样仅减少1℃，这也证实了上述结果。
最后，与天然型抗体相比，在一个H链中具有L234Y、G236W、S298A、在另一个H链中具有S239D、A330L、I332E的GpH7-TA7/ GpH7-B78/GpL16-k0的Tm降低10℃，与在一个H链中导入了S239D、A330L、I332E的GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0基本相同。但是，根据实施例7的表13，与GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0相比，GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0与FcγRIIIa的结合增强10倍以上。
即，明确了：通过使用在一个H链中导入了L234Y、G236W、S298A、在另一个H链中导入了S239D、A330L、I332E的异源二聚化抗体GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0，与S239D、A330L、I332E的同源二聚化抗体GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0相比，可以增强与FcγRIIIa的结合，而且还可以使Tm升高10℃以上。
接下来，对于进行了上述Tm测定的样品，进一步通过参考实施例6中记载的热加速试验(40℃ 2周或4周)来评价热力学稳定性(图30)。
比较GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0和天然型抗体GpH7-G1d/ GpH7-G1d/GpL16-k0时，4周后前者的单体比例减少1.27%、后者的单体比例减少1.86%，没有确认到大的差异。即，认为用于制备异源二聚化抗体的改变D356K/H435R和K439E对热加速试验中的单体比例的变化几乎没有影响。
在两个H链中导入了S239D、A330L、I332E的GpH7-A57/GpH7- B78/GpL16-k0中，四周后单体比例减少约16%，相对于此，仅在一个H链中具有S239D、A330L、I332E的改变的GpH7-A5/GpH7-B78/ GpL16-k0中，4周后单体比例减少9.63%。即，明确了：通过使用仅在一个H链中导入了S239D、A330L、I332E的异源二聚化抗体，具有更稳定地维持单体比例的效果。
接下来，在两个H链中导入了L234Y、G236W、S298A的GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0和在一个H链中导入了L234Y、G236W、S298A的GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0中，4周后单体比例只是减少1.78%、1.42%，与天然型抗体相比，均无法在单体比例的变化上发现明确的差异。即，认为L234Y、G236W、S298A无论是导入一个H链中还是导入两个链中，对热加速试验中的单体比例均没有影响。
最后，在一个H链中具有L234Y、G236W、S298A、在另一个H链中具有S239D、A330L、I332E的GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0中，4周后单体比例减少2.47%，与天然型抗体的1.86%相比，单体比例只是稍有减少。即，明确了：通过使用在一个H链中导入了L234Y、G236W、S298A、在另一个H链中导入了S239D、A330L、I332E的异源二聚化抗体GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0，与S239D、A330L、I332E的同源二聚化抗体GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0相比，可以增强与FcγRIIIa的结合，而且在热加速试验中，还可以带来维持单体比例在高水平的效果。
即，与普通的同源二聚化抗体相比，异源二聚化抗体不仅可以增强与FcγR的结合，还可以改善稳定性，由此显示：与同源二聚化抗体相比，异源二聚化抗体是可以进一步提高抗体的作为药品的价值的技术。
[实施例10] 探索与FcγR的结合增强且不降低稳定性的改变
如实施例9所述，若在H链中导入改变，则增强与FcγR的结合活性，但有可能降低CH2的物理化学稳定性、即Tm。但是，如实施例9所述，特别是使用抗体作为药品时，这样的性质并不优选。如实施例9所述，为了增强与FcγR的结合活性、而又抑制CH2的不稳定化，使用仅在一个H链中导入改变的异源二聚化抗体是有效的。即，关于尽管在相当于图21的ii和iii区的现有的同源二聚化抗体中也观察到了与FcγR的结合活性增强、但在同源二聚化抗体中Tm降低的改变，通过将其异源二聚化，与天然型抗体相比，增强了与FcγR的结合活性，而且与同源二聚化抗体相比可以提高Tm。
为了找到这样的改变，按照参考实施例5的方法测定图21的ii、iii中存在的区的同源二聚化抗体的Tm，与天然型抗体相比Tm降低的改变的列表汇总在表31～35中。
表31 (表31-1～31-3)中显示在区ii、iii中Tm为68℃以下的Ia的数据，表32 (表32-1和32-2)中显示在区ii、iii中Tm为68℃以下的IIaR的数据，表33 (表33-1和33-2)中显示在区ii、iii中Tm为68℃以下的IIaH的数据，表34 (表34-1和表34-2)中显示在区ii、iii中Tm为68℃以下的IIb的数据，表35 (表35-1和35-2)中显示在区ii、iii中Tm为68℃以下的IIIa的数据。
通过使用仅在一个H链中导入了上述改变的异源二聚化抗体，有可能可以制作与天然型抗体相比与FcγR的结合增强、且稳定性没有大幅降低的抗体。
[表31-1]
[表31-2]
[表31-3]
[表32-1]
[表32-2]
[表33-1]
[表33-2]
[表34-1]
[表34-2]
[表35-1]
[表35-2]
[实施例11] 对FcγRIIIa的识别能力提高的异源二聚化抗体的ADCC活性的测定
如实施例7中考察的那样，通过使用异源二聚化抗体，与利用现有的同源二聚化抗体技术研发的变体相比，成功地增强了与FcγRIIIa的结合活性。抗体经由FcγRIIIa诱导NK细胞，对表达靶抗原的细胞发挥抗体依赖性的细胞毒活性。为了确认在异源二聚化抗体中不仅与FcγRIIIa的结合活性增强、ADCC活性也同样增强，对于实施例7的表13中记载的与FcγRIIIa的结合活性升高的异源二聚化抗体、同源二聚化抗体和天然型IgG1，按照参考实施例7的方法测定ADCC活性。其结果见图31。
由图31的结果可知：比较作为天然型IgG1的GpH7-G1d/GpL16-k0和在一个H链中分别导入了D356K、H435R和K439E的GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0时，在该ADCC活性上没有观察到大的差异。由此认为：D356K、H435R和K439E的改变对ADCC活性没有影响。
接下来，象以往那样，关于在抗体的两个H链中同样地导入了增强与FcγRIIIa的结合活性的改变的同源二聚化抗体，验证在ADCC活性方面是否也观察到与该结合增强效果相同的倾向。比较在两个H链中导入了L234Y、G236W、S298A的GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0和在两个H链中导入了S239D、A330L、I332E的GpH7-A57/GpH7-B78/ GpL16-k0。关于与FcγRIIIa的结合活性，与GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16- k0相比，在GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0中结合明显增强，但在GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0中结合降低。在ADCC活性方面，GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0较GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0有所上升，但GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0较GpH7-A5/GpH7-B3/ GpL16-k0有所减少。如上所述，关于同源二聚化抗体，在与FcγRIIIa的结合活性强度和ADCC活性强度之间观察到相关性。
接下来，关于仅在抗体的一个H链中导入了增强与FcγRIIIa的结合活性的改变的异源二聚化抗体，验证在ADCC活性方面是否也观察到了与其结合增强效果相同的倾向。比较在一个H链中导入了L234Y、G236W、S298A的GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0和在一个H链中导入了S239D、A330L、I332E的GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0。关于与FcγRIIIa的结合活性，与GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0相比，GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0和GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0均增强，关于ADCC活性，也观察到同样的倾向。除此之外，与GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0相比，GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0与FcγRIIIa的结合活性增强，但在ADCC活性方面则保持相同的倾向，与同源二聚化抗体一样，在异源二聚化抗体中也显示出与FcγRIIIa的结合活性强度和ADCC活性强度相关。
接下来，关于L234Y、G236W、S298A和S239D、A330L、I332E的各改变组，验证在各自的异源二聚化抗体、同源二聚化抗体中在与FcγRIIIa的结合活性和ADCC活性增强效果上是否观察到相关性。首先，比较仅在一个H链中导入了S239D、A330L、I332E的改变组的异源二聚化抗体即GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0和在两个H链中导入了S239D、A330L、I332E的改变组的同源二聚化抗体即GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0时，关于与FcγRIIIa的结合活性，与异源二聚化抗体相比，同源二聚化抗体增强结合的效果高，但关于ADCC活性，则没有确认到差异。接下来，比较仅在一个H链中导入了L234Y、G236W、S298A的改变组的异源二聚化抗体即GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0和在两个H链中导入了L234Y、G236W、S298A的改变组的同源二聚化抗体即GpH7-TA7/ GpH7-TA45/GpL16-k0时，关于与FcγRIIIa的结合活性，与GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0相比，异源二聚化抗体增强结合，相对于此，在同源二聚化抗体中结合减弱。关于ADCC活性，也观察到了相同的倾向。由此认为：L234Y、G236W、S298A的改变组所具有的仅从单方向增强与FcγRIIIa的结合活性的效果在ADCC活性中也被反映出来。根据上述结果认为：仅在一个H链中导入了某改变组的异源二聚化抗体和在两个H链中导入了某改变组的同源二聚化抗体的与FcγRIIIa的结合活性强度和ADCC活性强度相关。
接下来，比较在一个H链中导入了L234Y、G236W、S298A、在另一个H链中导入了S239D、A330L、I332E的异源二聚化抗体即GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0和在两个H链中导入了S239D、A330L、I332E的同源二聚化抗体即GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0。关于与FcγRIIIa的结合活性，与GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16- k0相比均显著增强，在ADCC活性中也观察到同样的倾向。除此之外，与GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0相比，GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16- k0与FcγRIIIa的结合活性增强，在ADCC活性方面，GpH7-TA7/GpH7- B78/GpL16-k0也显示出强的ADCC活性。
如上所述，关于L234Y、G236W、S298A和S239D、A330L、I332E的各改变组，分别导入一个H链中时以及分别导入两个H链中时，观察到后者的S239D、A330L、I332E的改变组进一步增强ADCC活性的效果。但是，通过将L234Y、G236W、S298A和S239D、A330L、I332E的各改变组导入不同的H链中，与将在各异源二聚化抗体和同源二聚化抗体中ADCC活性增强效果高的S239D、A330L、I332E加入到两个H链中时相比，显示出ADCC活性增强效果。
即，在异源二聚化抗体彼此之间的比较、异源二聚化抗体与同源二聚化抗体的比较中，均同样观察到了在作为现有技术的同源二聚化抗体中可以观察到的与FcγRIIIa的结合活性强度和ADCC活性强度的相关性。由此明确了：通过利用异源二聚化抗体技术，可以研制具有较现有技术优异的ADCC活性的抗体。
[实施例12] 现有的同源二聚化抗体和新型异源二聚化抗体在FcγRIIa方面的比较
如实施例1中所述，认为FcγRIIIa在抗体药物的药效中发挥重要作用。而且，除FcγRIIIa外，FcγRIIa在来自IgG1的抗体药物的药效中所发挥的作用也受到关注。
在FcγRIIa中存在着第131位的氨基酸为Arg或His的分别被称作R型、H型的异型，各自与人IgG2的结合活性不同(Tissue Antigens 2003: 61: 189-202)。已知由于该FcγRIIa的异型的不同，罹患感染症的容易度也不同(Tissue Antigens 2003: 61: 189-202)。认为这是由于：由于异型不同，FcγRIIa与IgG2的结合活性也不同，其结果，对由IgG2介导的病原体的抵抗机制不同的缘故(Infection and Immunitiy 1995: 63: 73-81)。另外，已知小鼠FcγRIV的表达细胞与人FcγRIIa的表达细胞对应，但有报道称，该FcγRIV对抗CD20抗体在小鼠模型中的药效发挥重要作用。由此推测：FcγRIIa在人体内也发挥同样的作用(The Journal of Experimental Medicine 2004: 199: 1659-1669；The Journal ofExperimental Medicine 2006: 203: 743-753；Immunity 2005: 23: 41-51)。实际上，据报道，与IgG1相比，抗体的Fc区与FcγRIIa的结合活性较IgG1有所增强的抗体增强由巨噬细胞介导的抗体依赖性细胞吞噬活性(ADCP活性) (Molecular Cancer Therapeutics2008: 7: 2517-2527)。另外，具有ADCP增强的Fc区的抗CD19抗体在小鼠异种移植模型中也显示出较IgG1强的抗肿瘤效果(Nature Medicine 2000: 6: 443-446)。据报道，该抗体的Fc区还增强与猴的FcγRIIa的结合活性。虽然CD19在B细胞表面表达，但若对猴给予该抗体，则与具有IgG1的Fc区的抗CD19抗体相比，B细胞的消失增强(Science 2005: 310:1510-1512)。
根据上述的报道，除增强与FcγRIIIa的结合活性外，还增强与FcγRIIa的结合活性，由此期待着抗体药物的药效、特别是抗肿瘤效果的进一步提高。以前利用现有技术制作了具有上述特征的抗体 (Molecular Cancer Therapeutics 2008: 7: 2517-2527)。但是，认为FcγRIIa也与抗体的Fc区不对称地结合，因此认为与实施例11中考察的一样，通过采用异源二聚化抗体技术，可以更进一步增强与FcγRIIa的结合活性。为了验证这一点，根据实施例4的结果，选择与天然型IgG相比与FcγRIIIa和FcgRIIa R型、H型的结合活性均增强的改变，将它们组合以导入与FcγRIIIa和FcgRIIa R型、H型的结合活性均增强的突变，制作将与FcγR的结合不同的H链组合得到的异源二聚化抗体，评价其与各FcγR的结合活性。
另外，与这些活性型FcγR形成对照，作为抑制型FcγR的FcγRIIb诱发抑制免疫反应的细胞内信号。据报道，在敲除了FcγRIIb的小鼠中，抗体的抗肿瘤效果亢进(NatureMedicine 2000: 6: 443-446)、或者由抗体介导的B细胞的消失促进(The Journal ofExperimental Medicine 2006: 203: 743-753)，由此显示：FcγRIIb对抗体在生物体内的药效发挥重要作用。另外，在小鼠IgG亚类的抗肿瘤效果和各IgG亚类与活性型FcγR和抑制型FcγR的结合比例(A/I比)之间观察到相关性(Science 2005: 310: 1510-1512)。根据这些报道，认为A/I比对由抗体的免疫介导的效应子功能是重要的。即，认为如果研制A/I比高的抗体，则其效应子功能增强，是有效的。但是，作为活性型FcγR的FcγRIIa和作为抑制型FcγR的FcγRIIb在其胞外区中有93%的序列同源性，序列同源性极高，因此预测：在增强与FcγRIIa的结合活性的同时，不增强与FcγRIIb的结合活性，而是提高A/I比，这是非常困难的。认为与FcγRIIIa、FcγRIIa一样，FcγRIIb和抗体的Fc区不对称地结合。若为现有技术，则通过在抗体的两个H链中导入相同的改变，可以控制与FcγR的相互作用，但若使用异源二聚化抗体技术，则认为可以进行更精确的控制，进而还可以提高序列极为类似的FcγRIIa与FcγRIIb的A/I比。因此，关于这一点，也验证异源二聚化抗体技术是否较现有技术优异。
在此处的研究中，为了有效形成异源二聚化抗体，在抗体H链恒定区中采用Knobs-into-Holes技术。Knobs-into-Holes技术是指，通过将一个H链的CH3区中存在的氨基酸侧链取代成更大的侧链(knob; 突起)、将另一个H链的CH3区中存在的氨基酸侧链取代成更小的侧链(hole; 空隙)，使突起配置在空隙内，以促进H链的异源二聚化，可以有效获得目标异源二聚化抗体的技术(Nature, 372: 379-383 (1994))。将在恒定区中导入了目的在于使位于CH3区的氨基酸侧链变得更大的Y349C、T366W的改变而得到的H链称作Knob链，关于向其中进一步导入了改变而得到的恒定区，其H链恒定区的名称以Kn的记号开始，在其后带上三位数字，以Kn001的方式称呼。将在恒定区中导入了目的在于使位于CH3区的氨基酸侧链变得更小的D356C、T366S、L368A、Y407V的Hole改变而得到的H链称作Hole链，关于向其中进一步导入了改变而得到的恒定区，其H链恒定区的名称以Hl的记号开始，在其后带上三位数字，以Hl001的方式称呼。另外，抗体H链恒定区的名称分别为Kn001、Hl001时，可变区中具有GpH7的抗体的H链所对应的序列称作GpH7-Kn001、GpH7-Hl001。关于表达后进行纯化而得到的抗体，例如在用于表达异源二聚化抗体的抗体H链所对应的序列为GpH7-Kn001、另一个抗体H链所对应的序列为GpH7-Hl001、抗体L链所对应的序列为GpL16-k0时，将其记作GpH7-Kn001/GpH7-Hl001/GpL16-k0。
首先，按照参考实施例1的方法，对于GpH7-G1d，制备在恒定区中导入了Y349C、T366W的改变的GpH7-Kn033 (SEQ ID NO: 51)；对于GpH7-G1d，制备在恒定区中导入了D356C、T366S、L368A、Y407V的改变的GpH7-Hl033 (SEQ ID NO: 56)。使异源二聚化抗体表达时，使用下述表达载体以有效表达异源二聚化抗体：对于抗体L链，使用插入有GpL16-k0的表达载体；对于抗体的一个H链，使用插入有在导入了Y349C、T366W的改变的GpH7-Kn033(SEQ ID NO: 51)中进一步加入改变而得到的序列的表达载体；对于抗体的另一个H链，使用插入有在导入了D356C、T366S、L368A、Y407V的改变的GpH7-Hl033 (SEQ ID NO: 56)中进一步导入改变而得到的序列的表达载体。
根据实施例4中得到的有关各改变对抗体与各FcγR的结合产生的影响的信息，如下制作谋求与FcγRIIIa、FcγRIIa R型、H型的结合均增强的抗体。在抗体的各H链的恒定区中导入不同的改变时，使用GpH7-Kn033、GpH7-Hl033作为亲本多肽。按照参考实施例1的方法制作在GpH7-Kn033中导入了L234Y、L235Y、G236A、H268D、S298A的GpH7-Kn045 (SEQ IDNO: 54)和导入了L234Y、L235Y、G236A、H268D、Q295L、S298A的GpH7-Kn056 (SEQ ID NO:55)、以及在GpH7- Hl033中导入了G236A、S239D、A330K、I332E的GpH7-Hl048 (SEQ ID NO:59)和导入了G236A、S239D、Q295L、A330M、I332E的GpH7-Hl055 (SEQ ID NO: 60)。
接下来，如下组合各H链，按照参考实施例1使抗体表达。使用GpH7-Kn033、GpH7-Hl033作为H链，使用GpL16-k0作为L链，使对G1d仅应用了Knobs-into-Holes技术而得到的GpH7-Kn033/GpH7- Hl033/GpL16-k0表达。使用GpH7-Kn045、GpH7-Hl048作为H链、使用GpL16-k0作为L链，使作为异源二聚化抗体的GpH7-Kn045/ GpH7-Hl048/GpL16-k0表达。使用GpH7-Kn045、GpH7-Hl055作为H链、使用GpL16-k0作为L链，使作为异源二聚化抗体的GpH7-Kn045/ GpH7-Hl055/GpL16-k0表达。使用GpH7-Kn056、GpH7-Hl055作为H链、使用GpL16-k0作为L链，使作为异源二聚化抗体的GpH7-Kn056/ GpH7-Hl055/GpL16-k0表达。
以(Pro. Nat. Acad. Sci., 103, 4005-4010 (2006))为参考，如下制备利用了作为比较对象的现有技术的抗体。向GpH7-Kn033、GpH7-Hl033中分别导入据报道与FcγRIIIa、FcγRIIa R型、H型的结合均增强的改变G236A/S239D/I332E，制作GpH7-Kn037 (SEQID NO: 52)、GpH7-Hl036 (SEQ ID NO: 57)。另外，向GpH7-Kn033、GpH7-Hl033中分别导入据报道与FcγRIIIa的结合增强的改变S239D/A330L/I332E，制作GpH7-Kn032 (SEQ ID NO:53)、GpH7-Hl032 (SEQ ID NO: 58)。将这些H链组合，按照参考实施例1使抗体表达。使用GpH7-Kn037、GpH7-Hl036作为H链、使用GpL16-k0作为L链，使在对G1d仅应用了Knobs-into-Holes技术而得到的分子即GpH7-Kn033/GpH7- Hl033/GpL16-k0的两个H链中导入了G236A/S239D/I332E的同源二聚化抗体GpH7-Kn037/GpH7-Hl036/GpL16-k0表达。使用GpH7-Kn032、GpH7-Hl032作为H链、使用GpL16-k0作为L链，使在对G1d仅应用了Knobs-into-Holes技术而得到的分子即GpH7-Kn033/ GpH7-Hl033/GpL16-k0的两个H链中导入了S239D/A330L/I332E的同源二聚化抗体GpH7-Kn032/GpH7-Hl032/GpL16-k0表达。
关于这些抗体，按照参考实施例2的方法，评价它们与各FcγR的结合活性，其结果汇总在表36中。另外，各抗体的KD比汇总在表37中，作为相对于FcγRIIIa的KD的比例的A/I比汇总在表38中。
[表36]
显示与FcγRIIa、IIIa的结合增强的异源二聚化抗体与各FcγR的结合活性。
样品栏中显示抗体的名称，Kn、Hl栏中分别显示各抗体的Knob链、Hole链恒定区的名称，突变位点栏中显示与GpH7-Kn033/GpH7- Hl033/GpL16-k0相比不同的突变(特别是没有突变时记作“-”)。
[表37]
显示与FcγRIIa、IIIa的结合增强的异源二聚化抗体与各FcγR的结合活性。
样品栏中显示抗体的名称、Kn、Hl栏中分别显示各抗体的Knob链、Hole链恒定区的名称，突变位点栏中显示与GpH7-Kn033/GpH7- Hl033/GpL16-k0相比不同的突变(特别是没有突变时记作“-”)。以用GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0相对于FcγR的KD除以各抗体的KD而得到的值作为KD比。各抗体的H链、L链所对应的氨基酸序列的SEQ ID NO也一并显示。
[表38]
显示与活性型FcγR和抑制型FcγR的结合活性的比例。
样品栏中显示抗体的名称，Kn、Hl栏中分别显示各抗体的Knob链、Hole链恒定区的名称，突变位点栏中显示与GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0相比不同的突变(特别是没有突变时记作“-”)。以用GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0相对于FcγRIIb的KD除以各抗体的FcγRIIa H型、R型的KD而得到的值作为各自的A/I比。各抗体的H链、L链所对应的氨基酸序列的SEQ ID NO也一并显示。
由表36和37的结果可知：与对G1d仅应用了Knobs-into-Holes技术而得到的分子即GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0相比，在两个H链中导入了G236A/S239D/I332E而得到的GpH7-Kn037/GpH7- Hl036/GpL16-k0与FcγRIIa H型的结合增强至22倍、与FcγRIIa R型的结合增强至43倍、与FcγRIIIa F的结合增强至161倍。另外，由表38的结果可知：GpH7-Kn037/GpH7-Hl036/GpL16-k0相对于FcγRIIa H型的A/I比为8.6、相对于FcγRIIa R型的A/I比为13，与GpH7-Kn033/ GpH7-Hl033/GpL16-k0的6.2、4.9相比有所提高。
由表36和37的结果可知：与对G1d仅应用了Knobs-into-Holes技术而得到的分子即GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0相比，在两个H链中导入了S239D/A330L/I332E而得到的GpH7-Kn032/GpH7- Hl032/GpL16-k0与FcγRIIa H型的结合增强至1.2倍、与FcγRIIa R型的结合增强至3.0倍、与FcγRIIIa F的结合增强至381倍。另外，由表38的结果可知：GpH7-Kn032/GpH7-Hl032/GpL16-k0相对于FcγRIIa H型的A/I比为0.93、相对于FcγRIIaR型的A/I比为1.8，与GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0相比有所降低。
由表36和37的结果可知：与对G1d仅应用了Knobs-into-Holes技术而得到的分子即GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0相比，在一个H链中导入了L234Y/L235Y/G236A/H268D/S298A、在另一个H链中导入了G236A/S239D/A330K/I332E而得到的GpH7-Kn045/GpH7- Hl048/GpL16-k0与FcγRIIa H型的结合增强至52倍、与FcγRIIa R型的结合增强至154倍、与FcγRIIIa F的结合增强至419倍。另外，由该结果可知：与在两个H链中导入了G236A/S239D/I332E的作为现有技术的同源二聚化抗体GpH7-Kn037/GpH7-Hl036/GpL16-k0相比，与FcγRIIa的结合活性在H型、R型中均增强。除此之外，与在两个H链中导入了S239D/A330L/I332E的作为现有技术的同源二聚化抗体GpH7-Kn032/GpH7-Hl032/GpL16-k0相比，与FcγRIIIa F的结合活性也略有增强。由表38的结果可知：GpH7-Kn045/GpH7-Hl048/GpL16-k0相对于FcγRIIa H型的A/I比为9.5、相对于FcγRIIa R型的A/I比为22，与GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0、GpH7-Kn037/GpH7-Hl036/ GpL16-k0、GpH7-Kn032/GpH7-Hl032/GpL16-k0相比均有所提高。该结果显示：与现有技术相比，通过使用异源二聚化抗体技术，GpH7-Kn045/GpH7-Hl048/GpL16-k0与FcγRIIa、FcγRIIIa F的结合活性均增强，同时更具选择性地与活性型FcγR结合。
由表36和37的结果可知：与对G1d仅应用了Knobs-into-Holes技术而得到的分子即GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0相比，在一个H链中导入L234Y/L235Y/G236A/H268D/S298A、在另一个H链中导入G236A/S239D/Q295L/A330M/I332E而得到的GpH7-Kn045/ GpH7-Hl055/GpL16-k0与FcγRIIa H型的结合增强至21倍、与FcγRIIa R型的结合增强至56倍、与FcγRIIIa F的结合增强至985倍。另外，由该结果可知：对于与FcγRIIa的H型、R型的结合增强活性也和两个H链中导入有G236A/S239D/I332E的作为现有技术的同源二聚化抗体GpH7-Kn037/GpH7-Hl036/GpL16-k0相比几乎同等。与在两个H链中导入有S239D/A330L/I332E的作为现有技术的同源二聚化抗体GpH7-Kn032/GpH7-Hl032/GpL16-k0相比，与FcγRIIIa F的结合活性增强。由表38的结果可知：GpH7-Kn045/GpH7-Hl055/GpL16-k0相对于FcγRIIa H型的A/I比为8.3、相对于FcγRIIa R型的A/I比为18，较GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0、GpH7-Kn032/GpH7- Hl032/ GpL16-k0有所提高，与GpH7-Kn037/GpH7-Hl036/GpL16-k0相比，相对于FcγRIIa H型的A/I比几乎同等，相对于FcγRIIa R型的A/I比有所提高。该结果显示：与现有技术相比，通过使用异源二聚化抗体技术，GpH7-Kn045/GpH7-Hl055/GpL16-k0与FcγRIIa的结合活性相同程度地提高，同时与FcγRIIIa的结合活性进一步增强，同时更具选择性地与活性型FcγR结合。
由表36和37的结果可知：与对G1d仅应用了Knobs-into-Holes技术而得到的分子即GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0相比，在一个H链中导入L234Y/L235Y/G236A/H268D/Q295L/ S298A、在另一个H链中导入G236A/S239D/Q295L/A330M/I332E而得到的GpH7-Kn056/GpH7-Hl055/GpL16-k0与FcγRIIa H型的结合增强至20倍、与FcγRIIa R型的结合增强至44倍、与FcγRIIIa F的结合增强至1114倍。另外，由该结果可知：对于与FcγRIIa的H型、R型的结合增强活性和在两个H链中导入有G236A/S239D/I332E的作为现有技术的同源二聚化抗体GpH7-Kn037/GpH7-Hl036/GpL16-k0相比几乎同等。与在两个H链中导入有S239D/A330L/I332E的作为现有技术的同源二聚化抗体GpH7-Kn032/GpH7-Hl032/GpL16-k0相比，与FcγRIIIa F的结合活性增强。由表38的结果可知：GpH7-Kn056/GpH7-Hl055/GpL16-k0相对于FcγRIIa H型的A/I比为8.7、相对于FcγRIIa R型的A/I比为16，较GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0、GpH7-Kn032/GpH7-Hl032/ GpL16-k0均有所提高，与GpH7-Kn037/GpH7-Hl036/GpL16-k0相比，相对于FcγRIIa H型的A/I比几乎同等，相对于FcγRIIa R型的A/I比有所提高。该结果结显示：与现有技术相比，通过使用异源二聚化抗体技术，GpH7-Kn056/GpH7-Hl055/GpL16-k0与FcγRIIa的结合活性相同程度地提高，同时与FcγRIIIa的结合活性也进一步增强，同时更具选择性地与活性型FcγR结合。
[实施例13] 与现有技术的比较：与FcγRIIa、FcγRIIIa的结合活性增强的异源二聚化抗体的热稳定性的评价
如实施例9所示，利用现有技术得到的同源二聚化抗体与FcγR的结合活性增强，但物理化学性质不稳定，因此损害了作为药品的价值。但是，已经明确了异源二聚化抗体技术容易控制各改变在与FcγR的结合活性增强效果和物理化学方面的影响，可以增强与FcγR的结合活性，而不损及物理化学稳定性。在该实施例中，关于与作为活性型FcγR的FcγRIIa和FcγRIIIa的结合活性增强的抗体，也同样地验证物理化学稳定性、特别是热力学稳定性是否降低。关于在实施例11中评价了与FcγR的结合活性的抗体，按照参考实施例5的方法，测定各抗体的CH2区的Tm，其结果汇总在表39中。
[表39]
显示与FcγRIIa、FcγRIIIa的结合活性增强的抗体的Tm。
由表39的结果可知：与作为现有技术的同源二聚化抗体GpH7- Kn037/GpH7-Hl036/GpL16-k0、GpH7-Kn032/GpH7-Hl032/GpL16-k0相比，作为异源二聚化抗体的GpH7-Kn045/GpH7-Hl048/GpL16-k0、GpH7-Kn045/GpH7-Hl055/GpL16-k0、GpH7-Kn056/GpH7-Hl055/ GpL16-k0均维持高的Tm。如实施例11所述，与现有的同源二聚化抗体相比，这些异源二聚化抗体具有更适合发挥由FcγR介导的效应子功能的性质。即，由该结果明确了：通过使用异源二聚化抗体技术，不会损及抗体的物理化学稳定性，可以精确地控制与FcγR的结合。
[实施例14] 对作为活性型FcγR的FcγRIIIa F的选择性提高的改变的组合的效果
如实施例8中所述，提高对活性型FcγR和抑制型FcγR的选择性的技术是有效的。这里，验证异源二聚化对于提高实施例8中发现的与作为活性型Fcγ的FcγRIIIa F的结合和与作为抑制型FcγR的FcγRIIb的结合的比例、即选择性的提高是否有效。具体而言，将提高与作为活性型Fcγ的FcγRIIIa F的结合和与作为抑制型FcγR的FcγRIIb的结合的比例的改变即L234Y、G236W、S298A (表22-1区a)和实施例7中研究的S239D、A330L、I332E组合，与同源二聚化抗体相比，验证在异源二聚化抗体中是否会得到选择性提高的效果。
为了验证这一点，按照参考实施例1的方法，制备插入有下述序列的表达载体：将S239D、A330L、I332E全部导入GpH7-A5中得到的GpH7-A57 (SEQ ID NO: 40)和导入GpH7-B3中得到的GpH7-B78 (SEQ ID NO: 41)；以及将L234Y、G236W、S298A全部导入GpH7-A5中得到的GpH7-TA7 (SEQ ID NO: 31)和导入GpH7-B3中得到的GpH7-TA45 (SEQ ID NO: 32)。使用这些表达载体和GpH7-A5、GpH7-B3、GpL16-k0，按照参考实施例1的方法表达、制备下述抗体：在一个H链中导入有L234Y、G236W、S298A、在另一个H链中导入有S239D、A330L、I332E的异源GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0；在一个H链中仅导入了L234Y、G236W、S298A的GpH7-TA7/ GpH7-B3/GpL16-k0；在两个H链中导入了L234Y、G236W、S298A的GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0；在一个H链中仅导入了S239D、A330L、I332E的GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0；在两个H链中导入了S239D、A330L、I332E的GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0。按照参考实施例2的方法，测定所制备的抗体相对于FcγRIIIa的KD和相对于FcγRIIb的KD。以用各抗体相对于FcγRIIb的KD除以其相对于FcγRIIIa的KD而得到的值即FcγRIIIa/FcγRIIb比为指标，验证各抗体与FcγRIIIa的结合的选择性是否提高。验证结果汇总在表40中。
[表40]
样品栏中显示抗体的名称，H1、H2栏中显示各抗体的H链恒定区的名称，突变位点栏中显示与GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0相比不同的突变(特别是没有突变时记作“-”)。以用各抗体相对于FcγRIIb的KD除以其相对于FcγRIIIa F的KD而得到的值作为FcγRIIIaF/FcγRIIb比。各抗体的H链、L链所对应的氨基酸序列的SEQ ID NO也一并显示。
由表40的可知：比较作为天然型IgG1的GpH7-G1d/GpL16-k0和在一个H链中分别导入了D356K、H435R和K439E的GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0时，FcγRIIIa/FcγRIIb比分别为2.5、1.9，没有观察到大的差异。由此认为：D356K、H435R和K439E的改变对于与FcγRIIIa的结合的选择性没有影响。
关于使用了现有技术的同源二聚化抗体，验证了各改变的效果。在两个H链中导入了S239D、A330L、I332E的同源二聚化抗体GpH7- A57/GpH7-B78/GpL16-k0中，FcγRIIIa/FcγRIIb比为100，与GpH7-A5/ GpH7-B3/GpL16-k0相比有所提高。另一方面，在两个H链中导入了L234Y、G236W、S298A的同源二聚化抗体GpH7-TA7/GpH7-TA45/ GpL16-k0中，FcγRIIIa/FcγRIIb比为5.3，明确了在同源二聚化抗体中S239D、A330L、I332E组合提高与FcγRIIIa的结合活性的选择性的效果高。
接下来，关于仅在一个H链中导入了各改变组的异源二聚化抗体，验证了各改变组的效果。在一个H链中导入了S239D、A330L、I332E的异源二聚化抗体GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0中，FcγRIIIa/FcγRIIb比为7.9，与GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0相比有所提高。另一方面，在一个H链中导入了L234Y、G236W、S298A的异源二聚化抗体GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0中，FcγRIIIa/FcγRIIb比为14。由该结果明确了：在异源二聚化抗体中，L234Y、G236W、S298A的改变组提高与FcγRIIIa的结合活性的选择性的效果高。
验证了各改变组在同源二聚化抗体和异源二聚化抗体中的效果的不同。关于S239D、A330L、I332E，在其异源二聚化抗体中FcγRIIIa/FcγRIIb比为7.9，在同源二聚化抗体中FcγRIIIa/FcγRIIb比为100。由该结果明确了：对于S239D、A330L、I332E，若进行异源二聚化，则具有提高与FcγRIIIa的结合活性的选择性的效果，但若进行同源二聚化，则该效果进一步增强。相反，关于L234Y、G236A、S298A，在其异源二聚化抗体中FcγRIIIa/FcγRIIb比为14，在同源二聚化抗体中FcγRIIIa/FcγRIIb比为5.3。由该结果明确了：关于L234Y、G236A、S298A，若进行异源二聚化，则具有提高与FcγRIIIa的结合活性的选择性的效果，但若进行同源二聚化，则该效果减弱。由上述结果明确了：在同源二聚化抗体中，与L234Y、G236A、S298A的改变组相比，S239D、A330L、I332E的改变组提高与FcγRIIIa的结合活性的选择性的效果高，但在异源二聚化抗体中，与S239D、A330L、I332E的改变组相比，L234Y、G236A、S298A的改变组提高与FcγRIIIa的结合活性的选择性的效果高。
在将L234Y、G236A、S298A的改变组和S239D、A330L、I332E的改变组组合得到的异源二聚化抗体GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0中，FcγRIIIa/FcγRIIb比为244，与仅在一个H链中具有L234Y、G236A、S298A的改变组的异源二聚化抗体GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0、在两个H链中具有L234Y、G236A、S298A的改变组的同源二聚化抗体GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0、仅在一个H链中具有S239D、A330L、I332E的改变组的异源二聚化抗体GpH7-A5/GpH7-B78/ GpL16-k0、在两个H链中具有S239D、A330L、I332E的改变组的同源二聚化抗体GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0中的任一个相比，提高与FcγRIIIa的结合活性的选择性的效果高。认为该结果是将L234Y、G236A、S298A的改变组在异源二聚化抗体中的提高与FcγRIIIa的结合活性的选择性的效果和S239D、A330L、I332E的改变组在异源二聚化抗体中的效果组合而得到的结果。即明确了：与同源二聚化抗体相比，在异源二聚化抗体中观察到了优异的提高与FcγRIIIa的结合活性的选择性的效果。
即，通过使用异源二聚化抗体，与使用现有的同源二聚化抗体相比，可以进一步使Fc区与FcγRIIIa的不对称的相互作用最佳化，显示出可以设计具有更高的与FcγRIIIa的结合活性的选择性的Fc区。
[实施例15] FcgRIIa结合增强的异源二聚化抗体的ADCC活性的测定
关于实施例12中制备的GpH7-G1d/GpL16-k0、GpH7-Kn033/ GpH7-Hl033/GpL16-k0、GpH7-Kn037/GpH7-Hl036/GpL16-k0、GpH7- Kn032/GpH7-Hl032/GpL16-k0、GpH7-Kn045/GpH7-Hl048/GpL16-k0、GpH7-Kn056/GpH7-Hl055/GpL16-k0，按照参考实施例7的方法评价ADCC活性，其结果汇总在图33中。
在图33中，比较GpH7-G1d/GpL16-k0和GpH7-Kn033/GpH7- Hl033/GpL16-k0的ADCC活性时，两者具有几乎同等的活性。由该结果明确了：即使在抗体的Fc区中导入Knobs-into-Holes，对与FcgR的结合以及ADCC活性也没有影响。
实施例12中记载的异源二聚化抗体GpH7-Kn045/GpH7-Hl048/ GpL16-k0、GpH7-Kn056/GpH7-Hl055/GpL16-k0与改变导入前的抗体GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0相比均显示出更强的ADCC活性。另外，异源二聚化抗体GpH7-Kn045/GpH7-Hl048/GpL16-k0、GpH7- Kn056/GpH7-Hl055/GpL16-k0显示出与下述抗体同等程度的ADCC活性：两个H链中具有据报道增强与FcgRIIa R和FcgRIIa H的结合、且增强ADCP活性的G236A/S239D/I332E的改变的同源二聚化抗体GpH7-Kn037/GpH7-Hl036/GpL16-k0和作为应用现有的ADCC活性增强而得到的抗体的GpH7-Kn032/GpH7-Hl032/GpL16-k0。
即，如实施例12所示，GpH7-Kn045/GpH7-Hl048/GpL16-k0、GpH7-Kn056/GpH7-Hl055/GpL16-k0与FcgRIIa R和FcgRIIa H的结合较现有技术进一步增强，而且与现有的ADCC活性增强技术相比也具有同等的ADCC活性增强效果。即，认为这里评价的异源二聚化抗体在ADCC活性增强效果方面具有与现有技术相同程度的效果，而且在具有与FcgRIIa H和FcgRIIa R的结合增强方面也较现有技术优异。
[实施例16] 与FcgRIIIa的结合增强的异源二聚化抗体H240-Kn061/ H240-Hl071/L73-k0的研制
另外，如实施例11所示，明确了与FcγRIIIa的结合活性增强的异源二聚化抗体其ADCC活性也增强。在实施例11中，在抗GPC3抗体中确认到了该效果，但为了确认在其他抗原中是否也可观察到同样的效果，使用抗外调蛋白(anti-epiregulin) (EREG)抗体进行同样的实验。这里，抗EREG抗体的H链可变区序列为H240 (SEQ ID NO: 80)、包含可变区、恒定区的L链序列为L73-k0 (SEQ ID NO: 106)。
根据实施例4的结果，制作新的具有与FcgRIIIa的结合增强的H链的变体。这里，作为异源二聚化技术，使用实施例12中记载的Knobs-into-Holes技术。具体而言，按照参考实施例1的方法，制备在H240-G1d (SEQ ID NO: 83)的恒定区中导入了Y349C、T366W的改变的H240-Kn033 (SEQ ID NO: 84)和在H240-G1d的恒定区中导入了D356C、T366S、L368A、Y407V的改变的H240-Hl033 (SEQ ID NO: 85)。接下来，在H240-Kn033 (SEQ ID NO: 84)中导入L234Y、L235Y、G236W、H268D、S298A，按照参考实施例1的方法制作H240-Kn061 (SEQ ID NO:81)，在H240-Hl033 (SEQ ID NO: 85)中导入K326D、A330M、K334E，按照参考实施例1的方法制作H240-Hl071 (SEQ ID NO: 82)。组合H240-Kn061、H240-Hl071、L73-k0，按照参考实施例1的方法使异源二聚化抗体H240-Kn061/H240- Hl071/L73-k0表达。
与实施例12一样，制作导入了据报道增强与FcgRIIIa的结合的S239D、A330L、I332E的变体，以将其用作比较对象。具体而言，按照参考实施例1的方法，制作分别在H240-Kn033 (SEQ ID NO: 84)、H240-Hl033 (SEQ ID NO: 85)中导入了S239D、A330L、I332E的H240- Kn032(SEQ ID NO: 86)、H240-Hl032 (SEQ ID NO: 87)。组合H240-Kn032、H240-Hl032、L73-k0，按照参考实施例1的方法使同源二聚化抗体H240-Kn032/H240-Hl032/L73-k0表达。
接下来，为了进行比较，制作据报道增强与FcgRIIIa的结合(Glycobiol. 第17卷,no.1, 第104-118页(2006)等)的岩藻醣化抗体。在人为抑制两个相同染色体上的岩藻糖转运基因的表达的细胞中，岩藻糖转运功能被抑制。通过使用该细胞，可以得到缺失岩藻糖的抗体(WO2006/067913等)。另外，即使在β1,4-N-乙酰葡糖胺基转移酶III和Golgi α-甘露糖苷酶II被强制表达的细胞中产生抗体，也可以得到缺失岩藻糖的抗体(Ferrara等人,Biotechnol. Bioeng. (2006) 93 (5), 851-861)。利用上述本领域技术人员所公知的方法，将H240-G1d(SEQ ID NO: 83)和L73-k0 (SEQ ID NO: 106)组合起来使之表达，得到了将H240-G1d/L73-k0岩藻醣化的抗体H240-无岩藻糖基_G1d/L73-k0 (SEQ ID NO: 83、106)。
另外，作为对照，按照参考实施例1的方法将H240-Kn033 (SEQ ID NO: 84)、H240-Hl033 (SEQ ID NO: 85)、L73-k0 (SEQ ID NO: 106)组合，使H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0表达。
关于这些抗体，按照参考实施例8的方法，评价它们与各FcgR的结合活性，其结果汇总在表41中。
[表41]
由表41的结果可知：与H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0相比，异源二聚化抗体H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0特别是与FcgRIIIa F、FcgRIIIa V的结合增强。由于异源二聚化抗体H240-Kn061/H240- Hl071/L73-k0是在H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0中导入L234Y/ L235Y/G236W/H268D/S298A和K326D/A330M/K334E而得到的变体，因此可以说所导入的这些改变与FcgR的结合被增强。
由表41的结果可知：与应用现有的ADCC活性增强技术得到的H240-无岩藻糖基_G1d/L73-k0和H240-Kn032/H240-Hl032/L73-k0相比，异源二聚化抗体H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0与FcgRIIIa F、FcgRIIIa V的结合增强。由该结果明确了：与基于现有的同源二聚化抗体的ADCC活性增强技术和基于岩藻醣化的ADCC活性增强技术相比，异源二聚化抗体的增强与FcgRIIIa的结合的效果高。
此外，在异源二聚化抗体中，关于认为对ADCP活性增强较为重要的与FcgRIIa的结合，其中与FcgRIIa H的结合较两个抗体有所增强，与FcgRIIa R的结合较H240-无岩藻糖基_G1d/L73-k0有所增强，而与H240-Kn032/H240-Hl032/L73-k0程度相同。
接下来，确认异源二聚化抗体H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0是否具有异源二聚化抗体的特征：即与由其各H链构成的同源二聚化抗体相比增强与FcgR的结合活性。在异源二聚化抗体H240-Kn061/ H240-Hl071/L73-k0中，在作为一个H链的H240-Kn061中导入L234Y/ L235Y/G236W/H268D/S298A，在作为另一个H链的H240-Hl071中导入K326D/A330M/K334E。与由各H链构成的同源二聚化抗体相比，确认该异源二聚化抗体是否对各FcgR具有更强的结合活性。具体而言，按照参考实施例1的方法制作在H240-Hl033中导入了L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298A的H240-Hl134 (SEQ ID NO: 88)和在H240-Kn033中导入了K326D/A330M/K334E的H240-Kn132 (SEQ ID NO: 89)。使用该表达载体，按照参考实施例1的方法，使两个H链中具有L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298A的同源二聚化抗体H240-Kn061/H240-Hl134/L73-k0表达，并使两个H链中具有K326D/ A330M/K334E的同源二聚化抗体H240-Kn132/H240-Hl071/L73-k0表达。按照参考实施例8的方法测定上述同源二聚化抗体和各H链中具有L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298A、K326D/A330M/K334E的异源二聚化抗体H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0与FcgRIIIaF和FcgRIIIa V的结合。其结果汇总在表42中。
[表42]
由表42的结果确认：与两个H链在具有L234Y/L235Y/G236W/ H268D/S298A的同源二聚化抗体H240-Kn061/H240-Hl134/L73-k0和两个H链中具有K326D/A330M/K334E的同源二聚化抗体H240-Kn132/H240-Hl071/L73-k0中的任一个相比，在一个H链中具有L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298A、在另一个H链中具有K326D/A330M/K334E的异源二聚化抗体H240-Kn061/H240-Hl071/ L73-k0具有与FcgRIIIa F和FcgRIIIa V的强的结合活性。即，明确了H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0具有异源二聚化抗体的特征：即与由其各H链构成的同源二聚化抗体相比增强与FcgR的结合活性。
接下来，按照参考实施例9的方法，比较H240-Kn033/H240-Hl033/ L73-k0、H240-Kn032/H240-Hl032/L73-k0、H240-无岩藻糖基_G1d/L73- k0、H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0的ADCC活性，其结果汇总在图34中。
由图34的结果可知：与H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0相比，H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0显示出明显强的ADCC活性。除此以外，与应用现有的ADCC活性增强技术而得到的H240-Kn032/H240- Hl032/L73-k0和H240-无岩藻糖基_G1d/L73-k0相比，也显示出强的ADCC活性。即，明确了：关于ADCC活性，H240-Kn061/H240-Hl071/ L73-k0也显示出较现有的ADCC活性增强技术强的ADCC活性。
[实施例17] 以异源二聚化抗体H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0为模板制作更优异的变体并对其进行评价
在之前的实施例16中，发现了显示出优异的ADCC活性的H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0。为了找到具有更优异的活性的变体，以H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0为模板，按照参考实施例1的方法，制备总计约420种将H240-Kn061和H240-Hl071的各H链的EU编号第231位～第242位分别取代成除Cys和原始氨基酸以外的不同的18种氨基酸的变体，评价它们与各FcgR的结合。具体而言，按照参考实施例8中记载的方法，分别算出各变体相对于FcgRI、FcgRIIa R、FcgRIIa H、FcgRIIb、FcgRIIIa F、FcgRIIIa V的KD值，以用H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0相对于FcgRI、FcgRIIa R、FcgRIIa H、FcgRIIb、FcgRIIIa F、FcgRIIIaV的KD值除以上述的KD值的商作为相对KD，作为评价的指标。即，以H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0的KD值为1时，以各变体相对于各FcgR的KD值变化了多少倍作为评价的指标。相对KD越大，则与H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0相比，该变体与各FcgR的结合就越增强。
以各变体相对于FcgRI、FcgRIIa R、FcgRIIa H、FcgRIIb、FcgRIIIa F、FcgRIIIa V的相对KD为纵轴、以相对KD按升序排列时的排序为横轴进行作图，分别见图35、图36、图37、图38、图39、图40。
通过上述结果的分析，发现了与H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0相比，与FcgRIIb的结合没有增强、但与FcgRIIa R、FcgRIIIa F、FcgRIIIa V中的任一个或几个的结合增强的变体。导入有该改变的H链及其改变汇总在表43 (不增强与FcgRIIb的结合、而增强与FcgRIIa R和FcgRIIIa的结合的改变)中。选择相对于FcgRIIb的相对KD为1以下、相对于FcgRIIa R、FcgRIIIa F、FcgRIIIa V中的任一个或几个的相对KD为1.3以上的改变。
[表43]
上述表43中的数值表示各变体相对于各FcgR的相对KD。
这些改变具有不增强与作为抑制型FcgR的FcgRIIb的结合、而增强对ADCP活性发挥重要作用的与FcgRIIa的结合或对ADCC活性发挥重要作用的与FcgRIIIa的结合的效果。因此，通过导入上述改变，不增强抗体的免疫抑制作用、而增强ADCC活性或ADCP活性，期待着发挥更强的抗肿瘤活性。
接下来，发现了与H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0相比不减弱与FcgRIIIa的结合、而增强与FcgRIIa H和FcgRIIa R的结合的变体。导入了该改变的H链及其改变汇总在表44 (不减弱与FcgRIIIa的结合、而增强与FcgRIIa的结合的改变)中。选择相对于FcgRIIIaF和FcgRIIIa V的相对KD为0.7以上、相对于FcgRIIa H和FcgRIIa R的相对KD为1.5以上的改变。
[表44]
上述表44中的数值表示各变体相对于各FcgR的相对KD。
这些改变不减弱对ADCC活性发挥重要作用的与FcgRIIIa的结合，且通过改变增强与FcgRIIIa的结合、并增强对ADCP活性发挥重要作用的与FcgRIIa的结合。因此，通过导入该改变，使ADCC活性和ADCP活性、ADCC活性或ADCP活性增强，期待着发挥更强的抗肿瘤活性。
接下来，发现了与H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0相比不减弱与FcgRIIIa的结合、而减弱与FcgRIIb的结合的变体。导入有该改变的H链及其改变汇总在表45 (保持与FcgRIIIa的结合不变、且减弱与FcgRIIb的结合的改变)中。选择相对于FcgRIIIa F和FcgRIIIa V的相对KD为1以上、且相对于FcgRIIb的相对KD为0.5以下的改变。
[表45]
上述表45中的数值表示各变体相对于各FcgR的相对KD。
这些改变不减弱对ADCC活性发挥重要作用的与FcgRIIIa的结合，而减弱与作为抑制型FcgR的FcgRIIb的结合。因此，通过导入该改变，不会降低ADCC活性、而是降低抗体的免疫抑制作用，因此期待着发挥更强的抗肿瘤活性。
另外，由于异源二聚化抗体H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0具有与由各H链构成的同源二聚化抗体相比与FcgR强力结合的这种异源二聚化抗体的性质，因此认为在H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0中导入了这些改变而得到的变体也具有同样的异源二聚化抗体的性质。
[实施例18] 导入到异源二聚化抗体H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0中的改变和可取代的改变
根据实施例17中得到的图35、图36、图37、图38、图39、图40的结果，验证是否可以将异源二聚化抗体H240-Kn061/H240- Hl071/L73-k0的这些改变位点取代成其他的改变。这里，可取代的改变是指，通过导入该改变，与导入前相比，与FcgRIIIa F和FcgRIIIa V的结合为0.7倍以上、而与FcgRIIb的结合为1.3倍以下的改变。
实施例17中制备的变体在抗体的EU编号第231位～第242位的氨基酸中导入有改变。由于在异源二聚化抗体H240-Kn061/H240- Hl071/L73-k0的H240-Kn061的H链中导入有L234Y/L235Y/G236W/ H268D/S298A、在H240-Hl071的H链中导入有K326D/A330M/K334E，因此可以根据实施例17的结果，验证在导入到H240-Kn061的H链中的改变中L234Y、L235Y、G236W能否取代成其他氨基酸。
改变位点不包含导入到作为H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0的一个H链的H240-Hl071中的改变位点，而包含作为另一个H链的H240-Kn061的H链的EU编号第234位、第235位、第236位。这次制备的变体中，作为在H240-Kn061的H链的EU编号第234位、第235位、第236位中导入改变而得到的变体，认为与H240-Kn061/ H240-Hl071/L73-k0相比，与FcgRIIIa F和FcgRIIIa V的结合为0.7倍以上、与FcgRIIb的结合为1.3倍以下的变体具有与H240-Kn061/H240- Hl071/L73-k0同等或更优异的活性，因此认为可以在不损及异源二聚化抗体H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0的优异性质的情况下进行取代。关于满足这样的条件的改变，进行导入的H链及其改变汇总在表46 (维持与H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0同等的活性、或者赋予更优异的性质的改变)中。
[表46]
上述表46中的“导入了改变的H链”是指，H240-Kn061/ H240-Hl071/L73-k0的H链中，在任意一个H链中是否可以取代；“改变”中的数字表示以EU编号显示时的残基编号，最初的字母表示H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0的该残基编号所对应的氨基酸，最后的字母表示可取代的氨基酸。
由该结果认为：在导入到H240-Kn061的H链恒定区中的改变中，可取代的位点和可取代的氨基酸汇总如表47 (在维持与H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0同等的活性不变的情况下可取代的H240-Kn061的改变位点和可取代的氨基酸)所示。
[表47]
上述表47中的“改变位点”表示H240-Kn061的以EU编号表示时的残基番号，可取代的氨基酸表示即使将该位点取代成表中的氨基酸，也具有与H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0同等的活性、即可取代的氨基酸。
在导入到H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0中的改变中，关于H240-Kn061的H268D、S298A和H240-Hl071的K326D、A330M、K334E，在实施例17中在对应的位点没有导入改变。以下，关于这些位点，也根据实施例4的结果考察了是否存在可取代的改变。具体而言，在实施例4的结果中，选择仅在一个H链中导入了改变的异源二聚化抗体中，作为与FcgRIIIa F的结合的指标的He/Con_3aF与改变导入前相比增强1.3倍以上、即He/Con_3aF的值为130以上、且在该位点显示出最强的效果的3个改变。汇总该结果如表48 (H240-Kn061/ H240-Hl071/L73-k0的改变H268D、S298A、K326D、A330M、K334E和可取代的改变的改变位点、可取代的氨基酸、及其与FcgRIIIa F的结合活性)。
[表48]
上述表48中的“改变位点”表示以EU编号表示时的残基编号。“可取代的氨基酸”表示在实施例4中仅在一个H链中导入了改变的异源二聚化抗体中，作为与FcgRIIIa F的结合的指标的He/Con_3aF与改变导入前相比增强1.3倍以上、且在该位点显示出最强的效果的3个改变。“He/Con_3aF”是实施例4中定义的值。
根据表48的结果汇总每一个改变位点的可取代的氨基酸时，如表49 (H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0的改变H268D、S298A、K326D、A330M、K334E的可取代的改变位点和可取代的氨基酸)所示。
[表49]
根据表49，在H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0中，即使用E或A取代H268D中的D，认为也会发挥同等的活性。进行相同的操作，即使当K326D中的D为T或I、或者即使当A330M中的M为P或F、或者即使当K334D中的D为E或I，认为也会发挥同等的活性。另一方面，即使对S298A进行改变，也无法找到认为发挥同等活性的改变。
另外，由于异源二聚化抗体H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0具有与由各H链构成的同源二聚化抗体相比增强与FcgR的结合活性的这种异源二聚化抗体的特征，因此认为在H240-Kn061/H240-Hl071/L73- k0中导入上述改变而得到的变体也同样具有异源二聚化抗体的性质。
[实施例19] 向异源二聚化抗体H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0中导入D270E并对其进行评价
接下来，为了进一步改良H240-Kn061/H240-Hl071，尝试着进一步增强认为增强ADCC活性的与FcgRIIIa的结合，并进一步减弱认为通过免疫抑制信号降低抗体的抗肿瘤活性的与FcgRIIb的结合。具体而言，将实施例4中发现的作为增强与FcgRIIIa的结合、且减弱与FcgRIIb的结合的改变的D270E导入H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0的两个H链中。将分别向H240-Kn061、H240-Hl071中导入D270E而得到的序列分别作为H240-Kn072 (SEQ IDNO: 90)、H240-Hl076 (SEQ ID NO: 91)，按照实施例1的方法与L73-k0组合，以表达、制备异源二聚化抗体H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0。按照参考实施例8的方法评价该抗体和H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0、H240-Kn032/H240- Hl032/L73-k0、H240-无岩藻糖基_G1d/L73-k0、H240-Kn061/H240- Hl071/L73-k0与各FcgR的结合活性，其结果汇总在表50中。
[表50]
由表50可知：和H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0一样，与应用现有的ADCC活性增强技术而得到的H240-Kn032/H240-Hl032/ L73-k0和H240-无岩藻糖基_G1d/L73-k0相比，H240-Kn072/H240- Hl076/L73-k0与FcgRIIIa F和FcgRIIIa V强力结合，而且与H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0相比结合也强。与利用现有的ADCC活性增强技术制作的H240-Kn032/H240-Hl032/L73-k0和H240-无岩藻糖基_G1d/L73-k0相比，H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0与FcgRIIb的结合减弱，而且与H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0相比结合也减弱。
即，通过导入D270E，增强ADCC活性的与FcgRIIIa的结合被增强，因此期待着具有更强的ADCC活性，而传递免疫抑制信号的与FcgRIIb的结合被减弱，因此期待着降低抗体的免疫抑制作用，因此认为与H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0相比，H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0发挥优异的抗肿瘤效果。
接下来，将H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0的ADCC活性与H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0、H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0和H240-无岩藻糖基_G1d/L73-k0的ADCC活性进行比较。结果见图41。
图41的结果显示：H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0显示出较H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0明显强的ADCC活性。另外，H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0显示出较应用现有的ADCC活性增强技术而得到的岩藻醣化抗体H240-无岩藻糖基_G1d/L73-k0强的ADCC活性，显示出与H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0相同程度的ADCC活性。
由该结果可知：异源二聚化抗体H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0具有较现有的ADCC活性增强技术强的ADCC活性，而且也较与FcgRIIb的结合也减弱的现有技术优异。
另外，由于异源二聚化抗体H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0具有与由各H链构成的同源二聚化抗体相比与FcgR强力结合的这种异源二聚化抗体的性质，因此认为在H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0的两个H链中导入D270E而得到的H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0也同样具有优异的异源二聚化抗体的性质。
[实施例20] 异源二聚化抗体H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0的进一步改良
尝试着进一步改良实施例19中发现的H240-Kn072/H240-Hl076/ L73-k0。具体而言，将实施例18中发现的通过导入H240-Kn061中而赋予H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0更优异的性质的改变Y234E、Y235N、Y235Q、S239M和H240-Kn072/H240-Hl076/ L73-k0组合。
按照参考实施例1的方法，制作在H240-Kn072中导入了Y234E、Y235N的H240-Kn113(SEQ ID NO: 92)、在H240-Kn072中导入了S239M的H240-Kn115 (SEQ ID NO: 93)、在H240-Kn072中导入了Y235Q、S239M的H240-Kn125 (SEQ ID NO: 94)。按照参考实施例1的方法，将作为一个H链的H240-Hl076、作为L链的L73-k0和作为另一个H链的H240-Kn113、H240-Kn115、H240-Kn125分别组合，制备H240-Kn113/H240-Hl076/L73-k0、H240-Kn115/H240-Hl076/L73- k0、H240-Kn125/H240-Hl076/L73-k0。按照参考实施例8的方法，同时评价上述抗体以及作为天然型IgG1的H240-G1d/L73-k0、对其进行Knobs-into-Holes修饰得到的H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0、作为现有的ADCC活性增强技术的岩藻醣化抗体H240-无岩藻糖基_G1d/L73-k0和在两个H链中导入作为ADCC活性增强改变的S239D/ A330L/I332E而得到的同源二聚化抗体H240-Kn032/H240-Hl032/L73- k0与各FcgR的结合，结果汇总在表51中。
[表51]
与H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0相比，H240-Kn113/H240- Hl076/L73-k0与作为抑制型FcgR的FcgRIIb的结合维持在同等程度，并且与对ADCC活性发挥重要作用的FcgRIIIa和FcgRIIIa V的结合增强。关于与作为抑制型FcgR的FcgRIIb的结合，与作为天然型抗体的IgG1相比结合为同等程度。关于FcgRIIIa，与FcgRIIIa F和FcgRIIIa V的结合与作为现有的ADCC活性增强技术的岩藻醣化抗体H240-无岩藻糖基_G1d/L73-k0和在两个H链中导入作为ADCC活性增强改变的S239D/A330L/I332E而得到的同源二聚化抗体H240-Kn032/H240-Hl032/L73-k0相比有所增强。由此可知：有可能H240-Kn113/H240-Hl076/L73-k0与天然型的IgG1相比免疫抑制作用并没有增强，并且具有在应用现有的ADCC活性增强改变而得到的岩藻醣化抗体、同源二聚化抗体以上的强的抗肿瘤效果。
H240-Kn115/H240-Hl076/L73-k0与H240-Kn113/H240-Hl076/L73- k0相比，与对ADCC活性发挥重要作用的FcgRIIIa F和FcgRIIIa V的结合进一步增强。而且，与作为天然型IgG1的H240-G1d/L73-k0、对其进行Knobs-into-Holes修饰得到的H240-Kn033/H240-Hl033/L73- k0、作为现有的ADCC活性增强技术的岩藻醣化抗体H240-无岩藻糖基_G1d/L73-k0和在两个H链中导入作为ADCC活性增强改变的S239D/A330L/I332E而得到的同源二聚化抗体H240-Kn032/H240- Hl032/L73-k0相比，与对ADCP活性发挥重要作用的FcgRIIa R和FcgRIIa H的结合也有所增强。
和H240-Kn113/H240-Hl076/L73-k0一样，H240-Kn125/H240- Hl076/L73-k0与作为抑制型FcgR的FcgRIIb的结合维持在与IgG1相同的程度，与对ADCC活性发挥重要作用的FcgRIIIa F和FcgRIIIa V的结合增强至H240-Kn115/H240-Hl076/L73-k0以上。与作为现有的ADCC活性增强技术的岩藻醣化抗体H240-无岩藻糖基_G1d/L73-k0和在两个H链中导入作为ADCC活性增强改变的S239D/A330L/I332E而得到的同源二聚化抗体H240-Kn032/H240-Hl032/L73-k0相比时，与作为FcgRIIa的异型之一的FcgRIIa H的结合进一步增强，与FcgRIIb的结合减弱，与FcgRIIIa的两个异型的结合增强，由此期待着H240-Kn125/H240-Hl076/L73-k0的ADCP活性和ADCC活性增强至应用现有的ADCC活性增强改变而得到的岩藻醣化抗体、同源二聚化抗体以上，而且可以期待着免疫抑制作用减弱。
接下来，将H240-Kn113/H240-Hl076/L73-k0、H240-Kn115/H240- Hl076/L73-k0、H240-Kn125/H240-Hl076/L73-k0的ADCC活性与H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0、作为现有的ADCC活性增强技术的岩藻醣化抗体H240-无岩藻糖基_G1d/L73-k0的ADCC活性进行比较。其结果见图42。
图42表明：所有的异源二聚化抗体均显示出较作为现有的ADCC活性增强技术的岩藻醣化抗体优异的ADCC活性。
由与各FcgR的结合的断面图、以及与现有技术比较的ADCC活性的结果可知：这次导入H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0的H240-Kn072中的Y234E、Y235N、Y235Q、S239M是赋予H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0更优异的性质的改变。
由于异源二聚化抗体H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0具有与由各H链构成的同源二聚化抗体相比与FcgR强力结合的这种异源二聚化抗体的性质，由此认为：在H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0的两个H链中导入D270E而得到的H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0也同样具有异源二聚化抗体的性质，在其中进一步导入了改变的H240-Kn113/H240-Hl076/L73-k0、H240-Kn115/H240-Hl076/L73-k0、H240-Kn125/H240-Hl076/L73-k0也同样具有异源二聚化抗体的性质。
[实施例21] 与FcgRIIa、FcgRIIIa的结合增强的异源二聚化抗体的制作
根据实施例4的结果，制作具有与FcgRIIIa和FcgRIIa的结合增强的H链的变体。具体而言，按照参考实施例1的方法，向H240-Kn033 (SEQ ID NO: 84)中导入L234Y、L235Y、G236W、H268D、S298A、A327D，制作H240-Kn067 (SEQ ID NO: 95)，向H240-Hl033 (SEQ IDNO: 85)中导入D270E、K326D、A330K、K334E，制作H240-Hl068 (SEQ ID NO: 96)。组合H240-Kn067、H240-Hl068、L73-k0，按照参考实施例1的方法使异源二聚化抗体H240-Kn067/H240-Hl068/L73-k0表达。
首先，确认该异源二聚化抗体H240-Kn067/H240-Hl068/L73-k0是否具有与由该各H链构成的同源二聚化抗体相比增强与FcgR的结合活性的异源二聚化抗体的特征。向作为异源二聚化抗体H240-Kn067/H240-Hl068/L73-k0的一个H链的H240-Kn067中导入L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298A/A327D，在作为另一个H链的H240-Hl068中导入D270E/K326D/A330K/K334E。于是，按照参考实施例1的方法制作在H240-Hl033中导入了L234Y/L235Y/G236W/ H268D/S298A/A327D的H240-Hl136 (SEQ ID NO: 97)和在H240-Kn033中导入了D270E/K326D/A330K/K334E的H240-Kn133 (SEQ ID NO: 98)。使用该表达载体，按照参考实施例1的方法，使在两个H链中具有L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298A/A327D的同源二聚化抗体H240-Kn067/H240-Hl136/L73-k0、在两个H链中具有D270E/K326D/A330K/K334E的同源二聚化抗体H240-Kn113/H240- Hl068/L73-k0表达。按照参考实施例8的方法测定这些同源二聚化抗体和在一个H链中具有L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298A/A327D、在另一个H链中具有D270E/K326D/A330K/K334E的异源二聚化抗体H240-Kn067/H240-Hl068/L73-k0与FcgRIIa H、FcgRIIa R、FcgRIIIaF和FcgRIIIa V的结合。其结果汇总在表52中。
[表52]
而且，对于该变体，将实施例18中发现的通过导入H240-Kn061中而赋予H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0更优异的性质的改变Y235Q、S239M和H240-Kn067/H240-Hl068/L73-k0组合。具体而言，按照参考实施例1的方法，制作在H240-Kn067中导入了S239M的H240-Kn120 (SEQ ID NO: 99)、在H240-Kn120中导入了Y235Q的H240-Kn126 (SEQ ID NO:100)。按照参考实施例1的方法，将作为一个H链的H240-Hl068、作为L链的L73-k0、作为另一个H链的H240-Kn067、H240-Kn120、H240-Kn126分别组合，制备H240-Kn067/H240-Hl068/L73-k0、H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0、H240-Kn126/H240-Hl068/L73-k0。关于这些抗体，按照参考实施例8的方法，评价与各FcgR的结合，结果汇总在表53中。
[表53]
由该结果可知：与作为现有的ADCC活性增强抗体的H240-无岩藻糖基_G1d/L73-k0和H240-Kn032/H240-Hl032/L73-k0相比，H240-Kn067/H240-Hl068/L73-k0、H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0、H240-Kn126/H240-Hl068/L73-k0与FcgRIIIa的结合均同等或增强至其以上。另外，与任一种现有技术相比，与对ADCP活性发挥重要作用的FcgRIIa R和FcgRIIaH的结合也增强。由此暗示：这次制作的异源二聚化抗体H240-Kn067/H240-Hl068/L73-k0、H240-Kn120/H240- Hl068/L73-k0、H240-Kn126/H240-Hl068/L73-k0有可能均具有与现有技术同等或其以上的ADCC活性，并且具有较其优异的ADCP活性的可能性。
特别是，与两个H链中具有据报道增强与FcgRIIa R和FcgRIIa H的结合、并增强ADCP活性的G236A/S239D/I332E的改变的同源二聚化抗体H240-Kn037/H240-Hl036/L73-k0相比，H240-Kn120/H240- Hl068/L73-k0与FcgRIIa H和FcgRIIa R的结合也进一步增强。即，与使用现有的ADCC活性增强技术的抗体相比，H240-Kn120/H240- Hl068/L73-k0增强与FcgRIIIa F和FcgRIIIa V的结合，并且与使用现有的ADCP活性增强技术而得到的抗体相比，与FcgRIIa R和FcgRIIa H的结合也增强。因此，H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0是有可能具有在使用了现有技术的抗体以上的强的ADCC活性和ADCP活性的优异的抗体。
接下来，按照参考实施例9，将各变体的ADCC活性与作为现有的ADCC活性增强技术的岩藻醣化抗体H240-无岩藻糖基_G1d/L73-k0的ADCC活性进行比较。其结果见图43。
图43的结果表明：这次制作的异源二聚化抗体均显示出与作为现有的ADCC活性增强技术的岩藻醣化抗体同等或其以上优异的ADCC活性。
与各FcgR的结合的断面图和与现有技术比较的ADCC活性的结果表明：这次制备的H240-Kn067/H240-Hl068/L73-k0、H240-Kn120/ H240-Hl068/L73-k0、H240-Kn126/H240-Hl068/L73-k0均为具有与现有的ADCC活性增强技术同等程度或其以上的ADCC活性、同时由FcgRIIa结合介导的ADCP活性也增强的可能性高的异源二聚化抗体。
[实施例22] 异源二聚化抗体H240-AK072/H240-BH076/L73-k0与各FcgR的结合活性、ADCC活性的评价
迄今为止，评价了作为利用了Knobs-into-Holes的异源二聚化抗体的H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0与各FcgR的结合、ADCC活性。这里，确认即使在使用作为其他的异源二聚化抗体制作技术的D356K、H435R和K439E时，由不同的两个H链构成的异源二聚化抗体与由其各H链构成的同源二聚化抗体相比，是否也同样观察到增强与FcgR的结合活性的这种异源二聚化抗体的特征。
首先，将被导入作为H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0的单个H链的H240-Kn072中的改变即L234Y/L235Y/G236W/H268D/D270E/ S298A导入到在作为H240-G1d (SEQ ID NO:83)的异型的H240-G1dE (SEQ ID NO: 101)中导入D356K、H435R而得到的H240-A5E (SEQID NO: 102)中，制作H240-AK072 (SEQ ID NO: 104)。接下来，将被导入作为另一个H链的H240-Hl076中的D270E/K326D/A330M/K334E导入到在H240-G1DE中导入K439E而得到的H240-B3E (SEQ ID NO: 103)中，制作H240-BH076 (SEQ ID NO: 105)。按照实施例1的方法，组合H240-AK072、H240-BH076、L73-k0，表达、制备异源二聚化抗体H240-AK072/H240-BH076/L73-k0。进行相同的操作，将H240-AK072和L73-k0、H240-BH076和L73-k0分别组合，表达、制备同源二聚化抗体H240-AK072/L73-k0、H240-BH076/L73-k0。按照参考实施例8的方法比较这些抗体与各FcgR的结合活性，结果汇总在表54中。
[表54]
由该结果确认了：异源二聚化抗体H240-AK072/H240-BH076/L73 -k0具有与由其各H链构成的同源二聚化抗体H240-AK072/L73-k0、H240-BH076/L73-k0中的任一个相比与FcgR强力结合的这种异源二聚化抗体的特征。
接下来，按照参考实施例1的方法，将H240-A5E、H240-B3E、L73-k0组合进行表达，制备H240-A5E/H240-B3E/L73-k0。按照参考实施例8的方法，评价H240-G1d/L73-k0、H240-A5E/H240-B3E/L73-k0、H240-无岩藻糖基_G1d/L73-k0、异源二聚化抗体H240-AK072/H240-BH076/L73-k0与各FcgR的结合，其结果汇总在表55中。
[表55]
其结果，与H240-G1d/L73-k0和作为现有的ADCC活性增强技术的岩藻糖基抗体H240-无岩藻糖基_G1d/L73-k0相比，在H240-AK072/ H240-BH076/L73-k0中与FcgRIIIa F、FcgRIIIa V的结合增强。另外，由于H240-G1d/L73-k0和H240-A5E/H240-B3E/L73-k0与FcgR的结合活性同等，由此认为：H240-AK072/H240-BH076/L73-k0的结合活性的增强来源于导入各H链中的L234Y/L235Y/G236W/H268D/D270E/ S298A和D270E/K326D/A330M/K334E的改变。
[实施例23] Fc(Kn120/Hl068)与FcgRIIb胞外区的复合体的X射线晶体结构分析
实施例21中制作的H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0不仅增强与FcgRIIIa和FcgRIIa H型以及作为异型的FcgRIIa R型的结合活性，同时还观察到增强与作为抑制型受体的FcgRIIb的结合活性。认为与FcgRIIb的结合增强还带来免疫抑制效果，因此通过降低与该FcgRIIb的结合，有可能可以进一步增强作为本发明的目的的ADCC活性。
但是，FcgRIIa和FcgRIIb的胞外区的93%的氨基酸序列一致，具有非常高的同源性。而且，根据天然型IgG1的Fc (以下记作Fc(WT))与FcgRIIa R型的胞外区复合体的晶体结构(J. Imunol. 2011, 187, 3208-3217)进行分析时，在两者的相互作用界面附近，FcgRIIa R型与FcgRIIb相比仅在微少的3个氨基酸(Gln127、Leu132、Phe160)中发现了不同(图44)。因此，预测在维持与FcgRIIa R型的结合活性的同时只减弱与FcgRIIb的结合活性是非常困难的。因此，认为通过获得H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0的Fc部分(Fc(Kn120/Hl068))与FcgRIIb胞外区的复合体的晶体结构信息，并更详细地研究导入的氨基酸突变，找到选择性地降低与FcgRIIb的结合活性的改变的可能性会更高，进行了Fc(Kn120/Hl068)与FcgRIIb胞外区的复合体的X射线晶体结构分析。
其结果，关于Fc(Kn120/Hl068)/FcgRIIb胞外区复合体，通过X射线晶体结构分析，成功地在分解能2.78Å处确定了立体结构。该分析的结果获得的结构见图45。明确了：FcgRIIb胞外区以夹持在两个Fc CH2结构域之间的方式结合，与迄今为止分析的Fc(WT)与FcgRIIIa (Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 2011, 108, 12669-126674)、FcgRIIIb (Nature,2000, 400, 267-273; J. Biol. Chem. 2011, 276, 16469-16477)、FcgRIIa的各胞外区的复合体的立体结构类似。
接下来，显示位于与Fc的结合面附近、且在FcgRIIa R型和FcgRIIb之间不同的3个氨基酸残基周边的结构。图46显示Lys127 (在FcgRIIa R型中为Gln)周边的结构。最近的FcgRIIb的残基是图46所示的位于Fc的CH2结构域B的EU编号第298位的Ala，但该残基在结合界面与FcgRIIb直接接触，因此认为难以导入可与Lys127发生相互作用的大的残基。周围的其他氨基酸残基也距该Lys127远，无法找到可以直接进行相互作用的突变。图47显示Ser132 (在FcgRIIa R型中为Leu)周边的结构。该残基也距Fc远，仍然无法找到可以与该Ser直接进行相互作用的突变。最后，图48显示Tyr160 (在FcgRIIa R型中为Phe)周边的结构。该Tyr与位于Fc的CH2结构域A的EU编号第236位的Gly的主链羰基氧形成氢键。因此，在EU编号第236位的Gly236中导入突变，若该突变可以改变环结构、并因此消除该氢键，则有可能只降低与FcgRIIb的结合活性。另外，在EU编号第236位的Gly的位置导入侧链大的突变时，预测该侧链与FcgRIIa和FcgRIIb的第160位的侧链直接发生相互作用，认为利用FcgR2aR型的Phe160与FcgRIIb的Tyr160的不同，有可能可以选择性地降低与FcgRIIb的结合活性。
实验方法
[Fc(Kn0120/Hl068)的表达纯化]
Fc(Kn0120/Hl068)的制备如下进行。首先，将H240-Kn120 (SEQ ID NO: 99)和H240-Hl068 (SEQ ID NO: 96)的EU编号第220位的Cys取代成Ser，之后通过PCR克隆EU编号第236位的Glu到其C末端，再使用得到的被克隆的基因序列Fc(Kn0120)和Fc(Hl068)，按照参考例1中记载的方法进行表达载体的制作、表达、纯化。需要说明的是，EU编号第220位的Cys在普通的IgG1中与L链的Cys形成二硫键，但在仅制备Fc时，不使L链共表达，因此将上述的Cys取代成Ser，以避免形成不需要的二硫键。
[FcgRIIb胞外区的表达纯化]
按照参考例8的方法进行制备。
[Fc(Kn120/Hl068)/FcgRIIb胞外区复合体的纯化]
在得到的用于结晶化的1.5mg FcgRIIb胞外区样品中，加入0.15mg从大肠杆菌中表达纯化的Endo F1 (Protein Science 1996, 5, 2617-2622)作为谷胱甘肽S-转移酶的融合蛋白，在0.1M Bis-Tris pH6.5的缓冲液条件下、在室温下静置3天，从而切断N型糖链，而留下与Asn直接结合的N-乙酰基葡糖胺。接下来，实施了该糖链切断处理的FcgRIIb胞外区样品通过10000MWCO的超滤膜浓缩，再通过用20mM HEPES pH7.5、0.1M NaCl平衡的凝胶过滤柱层析(Superdex200 10/300)进行纯化。再向得到的糖链切断FcgRIIb胞外区组分中加入Fc (Kn0120/Hl068)，使以摩尔比计FcgRIIb胞外区稍微过剩，用10000 MWCO的超滤膜浓缩后，通过用25mM HEPES pH7.5、0.1M NaCl平衡的凝胶过滤柱层析(Superdex200 10/300)进行纯化，得到Fc(Kn0120/ Hl068)/FcgRIIb胞外区复合体的样品。
[Fc(Kn120/Hl068)/FcgRIIb复合体胞外区复合体的结晶化]
将Fc(Kn120/Hl068)/FcgRIIb胞外区复合体的样品用10000MWCO的超滤膜浓缩至约10mg/ml，在悬滴蒸汽扩散法中结合使用接种法进行结晶化。结晶化中使用VDXm板(Hampton Research)，相对于0.1M Bis-Tris pH6.0、14.4% PEG3350、0.2M硫酸铵的储备溶液，以储备溶液：结晶化样品＝0.85μl：0.85μl进行混合，制成结晶化液滴，再使用SeedingTool (Hampton Research)，从在相同条件下得到的该复合体的晶体中进行移植晶种的划线接种，在20℃下静置时，成功得到了柱状的晶体。
[来自Fc(Kn120/Hl068)/FcgRIIb胞外区复合体晶体的X射线衍射数据的测定]
将得到的Fc(Kn120/Hl068)/FcgRIIb胞外区复合体的一个单晶浸在0.1M Bis-Tris pH6.0、17.5% PEG3350、0.2M硫酸铵、16%(v/v)甘油的溶液中，之后用带有微小尼龙环的大头针将其从溶液中捞出，在液氮中冷冻，在高能量加速器研究机制的放射光设施Photon Factory BL-17A中测定X射线衍射数据。需要说明的是，测定中，经常放置在-178℃的氮气流中以维持冷冻状态，使用带有光束线的CCD检测器Quantum 315r (ADSC)，使晶体每次旋转0.5˚，收集总计360张X射线衍射图像。在由得到的衍射图像进行晶格常数的确定、衍射斑点的指数标定以及衍射数据的处理中，使用程序Xia2 (J. Appl. Cryst. 2010,43, 186-190)、XDS Package (Acta Cryst. 2010, D66, 125-132)以及Scala (ActaCryst. 2006, D62, 72-82)，最终得到分解能达到2.78Å的衍射强度数据。本晶体属于空间组P41212，晶格常数a＝152.94Å、b＝152.94Å、c＝82.24Å、α＝90˚、β＝90˚、γ＝90˚。
[Fc(Kn120/Hl068)/FcgRIIb胞外区复合体的X射线晶体结构分析]
结构确定通过使用程序Phaser (J. Appl. Cryst. 2007, 40, 658-674)的分子取代法来进行。根据得到的晶格大小和Fc(Kn120/Hl068)/FcgRIIb胞外区复合体的分子量，预测非对称单元中的复合体数为一个。从作为Fc(WT)/FcgRIIIa胞外区复合体的结晶结构的PDB code: 3SGJ的结构坐标中，抽取A链第239-340位以及B链第239-340位的氨基酸残基部分作为其他坐标，分别作为Fc CH2结构域的探索用模型。同样从PDB code: 3SGJ的结构坐标中抽取A链第341-444位和B链第341-443位的氨基酸残基部分作为一个坐标，作为FcCH3结构域的探索用模型。最后，从作为FcgRIIb胞外区的晶体结构的PDB code: 2FCB的结构坐标中抽取A链第6-178位的氨基酸残基部分，作为FcgRIIb的探索用模型。由旋转函数和平移函数确定Fc CH3结构域、FcgRIIb胞外区、Fc CH2结构域在各探索用模型的晶格内的方向和位置，得到Fc(Kn120/Hl068)/FcgRIIb胞外区复合体晶体结构的初期模型。对于得到的初期模型进行移动2个Fc的CH2结构域、2个Fc的CH3结构域以及FcgRIIb胞外区的刚体精密化时，此时相对于25-3.0Å的衍射强度数据，晶体学的可靠度因子R值为41.4%、Free R值为42.6%。再通过程序Coot (Acta Cryst. 2010, D66, 486-501)进行使用了程序REFMAC5(Acta Cryst. 2011, D67, 355-367)的结构精密化和用于观察电子密度图的模型修正，所述电子密度图以根据通过实验确定的结构因子Fo和由模型计算的结构因子Fc以及由模型计算的位相算出的2Fo-Fc、Fo-Fc为系数，通过反复进行上述操作，进行模型的精密化。最后，根据以2Fo-Fc、Fo-Fc为系数的电子密度图，将水分子插入模型中，进行精密化，从而最终使用分解能25-2.78Å的24274个衍射强度数据，相对于包含4964个非氢原子的模型，晶体学的可靠度因子R值为22.8%、Free R值为27.7%。
[实施例24] 维持或增强与FcgRIIaR的结合活性、且降低与FcgRIIb的结合活性的抗体的制作
实施例21中发现的变体H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0增强与对ADCP活性重要的FcgRIIaR、FcgRIIaH的结合活性，同时与抑制型的FcgRIIb的结合活性也较天然型IgG1增强约50倍。为了显示出高的ADCP活性，优选可以尽可能地降低与抑制型FcgRIIb的结合活性。因此，探索维持与活性型FcgRIIaR、FcgRIIaH的结合活性不变、而可以降低与FcgRIIb的结合活性的改变。如实施例23所示，由H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0的Fc与FcgRIIb胞外区的复合体的晶体结构分析结果显示出：在FcgRIIb的Tyr160和存在于Fc(Kn120/Hl068)的CH2结构域A内的Gly236的主链羰基氧之间形成了氢键。在FcgRIIaR、FcgRIIaH中，该位点被Phe160占据，认为不存在上述的相互作用，因此如果可以在Gly236中导入改变，消除Tyr160与FcgRIIb的相互作用，则在维持与FcgRIIa R型的结合活性的同时降低与FcgRIIb的结合活性、即有可能可以选择性地降低与FcgRIIb的结合活性。具体而言，认为通过将来自在H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0与FcgRIIb的结合中与FcgRIIb的Y160发生相互作用的H240-Hl068的H链中存在的G236取代成Ser、Val、Ile、Thr，使G236翻转，改变环结构，可以消除与Y160的相互作用。另外，FcgRIIb的Lys127和Fc(Kn120/Hl068)的CH2结构域A的E294虽然距离远但有可能发生静电相互作用。因此，认为通过将E294取代成带有正电荷的Lys、Arg，有可能引起静电排斥，可以减弱与FcgRIIb的相互作用。
按照参考实施例1的方法，制作在H240-Kn120 (SEQ ID NO: 99)中分别导入了E294R、E294K的H240-Kn179 (SEQ ID NO: 107)、H240-Kn180 (SEQ ID NO: 108)以及在H240-Hl068 (SEQ ID NO: 96)中分别导入了G236S、G236V、G236I、G236T的H240-Hl073(SEQ ID NO: 109)、H240-Hl085 (SEQ ID NO: 110)、H240-Hl086 (SEQ ID NO: 111)、H240-Hl089 (SEQ ID NO: 112)。按照参考实施例1的方法，将作为一个H链的H240-Kn120、H240-Kn180、作为L链的L73-k0、作为另一个H链的H240-Hl073、H240-Hl085、H240-Hl086、H240-Hl089分别组合，制备H240-Kn120/H240-Hl073/L73-k0、H240-Kn120/H240- Hl085/L73-k0、H240-Kn120/H240-Hl086/L73-k0、H240-Kn120/H240- Hl089/L73-k0、H240-Kn179/H240-Hl068/L73-k0、H240-Kn180/H240- Hl068/L73-k0。按照参考实施例8的方法评价这些变体与FcgR的结合，结果见表56。需要说明的是，由于此时相对于FcgRIa的kd在本测定中使用的Biacore4000的解离常数(kd)的可测定范围5x10-5s-1～1s-1之外显示出小于测定限5x10-5s-1的值，因此表中涂成灰色的H240-Kn120/H240-Hl073/L73-k0的KD是指将该kd视为5×10-5s-1以下而算出的KD。
[表56]
另外，用H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0相对于FcgRIIaR、FcgRIIaH、FcgRIIb的各KD除以各变体的KD而得到的值、以H240- Kn120/H240-Hl068/L73-k0相对于FcgRIIaR、FcgRIIaH、FcgRIIb的KD为1时的相对的KD即相对KD见表57。
[表57]
这些结果显示出：与H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0相比，本研究中制作的6种改变均维持或增强与FcgRIIaR、FcgRIIaH的结合活性，减弱与FcgRIIb的结合活性。
接下来，通过组合表57中研究的改变，尝试着进一步减弱与FcgRIIb的结合活性。这里，通过结合使用向H240-Kn120中导入E294K或E294R、和向H240-Hl068中导入G236T，尝试着进一步抑制与FcgRIIb的结合活性。如表57所示，这些改变均减弱与FcgRIIIaF、FcgRIIIaV的结合活性。因此，除导入这些改变外，还导入据报道增强与FcgRIIIa的结合活性的I332E和实施例18中所示的增强与FcgRIIIa的结合活性的改变即Y235N，尝试着进一步抑制与FcgRIIb的结合活性和增强与FcgRIIIa的结合活性。
按照参考实施例1的方法，制作在H240-Kn120 (SEQ ID NO: 99)中导入了Y235N和E294K的H240-Kn192 (SEQ ID NO: 113)、导入了Y235N和E294R的H240-Kn193 (SEQ ID NO:114)、以及在H240-Hl068 (SEQ ID NO: 96)中导入了G236T和I332E的H240-Hl204 (SEQ IDNO: 115)。按照参考实施例1的方法，将作为一个H链的H240-Kn192、H240-Kn193、作为L链的L73-k0、作为另一个H链的H240-Hl089、H240-Hl204分别组合，制备H240-Kn179/H240-Hl089/ L73-k0、H240- Kn180/H240-Hl089/L73-k0、H240-Kn192/H240-Hl204/ L73-k0、H240- Kn193/H240-Hl204/L73-k0。按照参考实施例8的方法评价这些变体与FcgR的结合活性，结果见表58。需要说明的是，由于此时相对于FcgRIa的kd在本测定中使用的Biacore4000的解离常数(kd)的可测定范围5x10-5s-1～1s-1之外显示出小于测定限5×10- 5s-1的值，因此表中用灰色遮掩的H240-Kn120/H240-Hl073/L73-k0的KD是指将kd视为5×10-5s-1以下而算出的KD。
[表58]
另外，用H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0相对于FcgRIIaR、FcgRIIaH、FcgRIIb的各KD除以各变体的KD而得到的值、以H240- Kn120/H240-Hl068/L73-k0相对于FcgRIIaR、FcgRIIaH、FcgRIIb的KD为1时的相对的KD即相对KD见表59。
[表59]
与H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0相比，在H240-Kn120中导入E294K或E294R、在H240-Hl068中导入G236T而得到的H240-Kn179/ H240-Hl089/L73-k0和H240-Kn180/H240-Hl089/L73-k0均增强与FcgRIIaR、FcgRIIaH的结合，同时与FcgRIIb的结合降低至0.4倍。另外，与只在其中一个链中具有各改变的H240-Kn120/H240-Hl089/ L73-k0、H240-Kn179/H240-Hl068/L73-k0、H240-Kn180/H240-Hl068/ L73-k0相比，显示出1.5倍～2倍的与FcgRIIb的结合降低效果。
在这些变体中进一步导入I332E和Y235N而得到的H240-Kn192/ H240-Hl204/L73-k0和H240-Kn193/H240-Hl204/L73-k0，与改变导入前的H240-Kn179/H240-Hl089/L73-k0和H240-Kn180/H240-Hl089/ L73-k0相比，均可维持与FcgRIIaR、FcgRIIaH、FcgRIIb的结合不变，且与FcgRIIIaF的结合提高至2倍、与FcgRIIIaV的结合提高至约8倍。
[实施例25] 异源二聚化抗体H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0与活性型FcgR的结合活性的增强
在实施例24中，通过向H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0中导入改变，制作维持或增强与FcgRIIaR、FcgRIIaH的结合、并降低与抑制型FcgRIIb的结合活性的变体。在本研究中，尝试着增强与作为活性型FcgR的FcgRIIaR、FcgRIIaH、FcgRIIIaF、FcgRIIIaV的结合活性。
按照参考实施例1的方法，制作在H240-Kn120中导入了L328W的H240-Kn138 (SEQID NO: 116)、导入了I332Q的H240-Kn173 (SEQ ID NO: 117)、导入了K334Y的H240-Kn178(SEQ ID NO: 118)、导入了L328A的H240-Kn166 (SEQ ID NO: 119)、导入了I332M的H240-Kn172 (SEQ ID NO: 120)、导入了L328W和K334L的H240-Kn149 (SEQ ID NO: 121)。另外，作为另一个H链，制作在H240-Hl068中导入了L328W的H240-Hl147 (SEQ ID NO: 122)、导入了L328A的H240-Hl170 (SEQ ID NO: 123)、导入了I332E的H240-Hl174 (SEQ ID NO:124)、导入了I332T的H240-Hl150 (SEQ ID NO: 125)、导入了A231H的H240- Hl182 (SEQID NO: 126)、导入了I332Q的H240-Hl177 (SEQ ID NO: 127)。按照参考实施例1的方法，作为单个的H链，使用H240-Kn138 (SEQ ID NO: 116)、H240-Kn173 (SEQ ID NO: 117)、H240-Kn178 (SEQ ID NO: 118)H240-Kn149 (SEQ ID NO: 121)、H240-Kn166 (SEQ ID NO:119)、H240-Kn172 (SEQ ID NO: 120)，作为另一个H链，使用H240- Hl170 (SEQ ID NO:123)、H240-Hl150 (SEQ ID NO: 125)、H240-Hl174 (SEQ ID NO: 124)、H240-Hl182 (SEQID NO: 126)、H240-Hl147 (SEQ ID NO: 122)、H240-Hl177 (SEQ ID NO: 127)，作为L链，使用L73-k0 (SEQ ID NO: 106)，制备H240-Kn120/H240-Hl170/L73-k0、H240-Kn120/H240-Hl150/L73-k0、H240-Kn138/H240-Hl068/L73-k0、H240-Kn120/ H240-Hl174/L73-k0、H240-Kn173/H240-Hl068/L73-k0、H240-Kn178/ H240-Hl068/L73-k0、H240-Kn120/H240-Hl182/L73-k0、H240-Kn138/ H240-Hl147/L73-k0、H240-Kn166/H240-Hl170/L73-k0、H240-Kn172/ H240-Hl177/L73-k0、H240-Kn149/H240-Hl068/L73-k0。按照参考实施例8的方法评价这些变体与FcgR的结合，结果见表60。
[表60]
另外，用H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0相对于FcgRIa FcgRIIaR、FcgRIIaH、FcgRIIb、FcgRIIa F、FcgRIIIa V的各KD除以各变体的KD而得到的值和以H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0相对于FcgRIIaR、FcgRIIaH、FcgRIIb的各KD为1时的相对的KD即相对KD见表61。
[表61]
这里显示的变体是与H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0相比，与FcgRIIaR、FcgRIIaH、FcgRIIIaF、FcgRIIIaV中的至少一个FcgR的结合增强的变体。
与H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0相比，在作为H240-Kn120/ H240-Hl068/L73-k0的一个H链的H240-Hl068中导入L328A而得到的H240-Kn120/H240-Hl170/L73-k0与FcgRIIaR、FcgRIIaH的结合活性提高了2.3倍。
与H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0相比，在作为H240-Kn120/ H240-Hl068/L73-k0的一个H链的H240-Hl068中导入I332T而得到的H240-Kn120/H240-Hl150/L73-k0与FcgRIIaR的结合活性维持不变，与FcgRIIaH的结合活性提高了1.2倍。
与H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0相比，在作为H240-Kn120/ H240-Hl068/L73-k0的一个H链的H240-Kn120中导入L328W而得到的H240-Kn138/H240-Hl068/L73-k0与FcgRIIaR的结合活性维持不变，与FcgRIIaH的结合活性提高至1.6倍。
与H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0相比，在作为H240-Kn120/ H240-Hl068/L73-k0的一个H链的H240-Hl068中导入I332E而得到的H240-Kn120/H240-Hl174/L73-k0与FcgRIIIaF的结合活性提高了4.3倍、与FcgRIIIaV的结合活性提高了10倍。
与H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0相比，在作为H240-Kn120/ H240-Hl068/L73-k0的一个H链的H240-Kn120中导入I332Q而得到的H240-Kn173/H240-Hl068/L73-k0与FcgRIIIaV的结合活性维持不变，与FcgRIIIaF的结合活性提高了1.2倍。
与H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0相比，在作为H240-Kn120/ H240-Hl068/L73-k0的一个H链的H240-Kn120中导入K334Y而得到的H240-Kn178/H240-Hl068/L73-k0与FcgRIIIaF的结合活性提高至1.6倍、与FcgRIIIaV的结合活性提高至1.9倍。
与H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0相比，在作为H240-Kn120/ H240-Hl068/L73-k0的一个H链的H240-Hl068中导入A231H而得到的H240-Kn120/H240-Hl182/L73-k0与FcgRIIIaV的结合活性提高至1.2倍。
与H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0相比，在H240-Kn120/H240- Hl068/L73-k0的两个H链中导入L328W而得到的H240-Kn138/H240- Hl147/L73-k0与FcgRIIaR的结合活性提高1.8倍。
与H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0相比，在H240-Kn120/H240- Hl068/L73-k0的两个H链中导入L328A而得到的H240-Kn166/H240- Hl170/L73-k0与FcgRIIaH的结合活性提高1.9倍。
与H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0相比，在作为H240-Kn120/ H240-Hl068/L73-k0的一个H链的H240-Kn120中导入I332M、在作为另一个H链的H240-Hl068中导入I332Q而得到的H240-Kn172/ H240-Hl177/L73-k0与FcgRIIIaF的结合活性维持不变，与FcgRIIIaV的结合活性提高1.6倍。
与H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0相比，在作为H240-Kn120/ H240-Hl068/L73-k0的一个H链的H240-Kn120中导入L328W、K334L而得到的H240-Kn149/H240-Hl068/L73-k0与FcgRIIaR、FcgRIIIaV的结合活性维持不变，与FcgRIIaH的结合活性提高1.6倍。
由上述结果认为：与H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0相比，上述变体具有高的ADCP活性或ADCC活性。
[实施例26] 与FcgRIIb的结合活性增强的异源二聚化抗体的研制
在人体内，在FcγR的蛋白家族中报道了FcγRIa(CD64A)、FcγRIIa(CD32A)、FcγRIIb(CD32B)、FcγRIIIa(CD16A)、FcγRIIIb (CD16B)的同工型，还报道了各自的异型(Immunol Lett, 82(1-2), 57-65, 2002)。FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIIa具有免疫活性功能，因此被称为活性型FcγR；FcγRIIb具有免疫抑制的功能，被称作抑制型FcγR (NatRev Immunol, 10, 328-343, 2010)。
FcγRIIb是唯一在B细胞中表达的FcγR (Eur J Immunol 19, 1379-1385,1989)。据报道，由于抗体的Fc区与FcγRIIb发生相互作用，因此B细胞的初次免疫被抑制(JExp Med 129, 1183-1201, 1969)。还有报道称：当B细胞上的FcγRIIb与B细胞受体(Bcell receptor：BCR)经由血中的免疫复合体进行交联时，B细胞的活化被抑制，B细胞的抗体产生被抑制(Immunol Lett 88, 157-161, 2003)。在由该BCR和FcγRIIb介导的免疫抑制信号的传递中，FcγRIIb的胞内区所含的免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptortyrosine-based inhibitory motif，ITIM)是必需的(Science, 256, 1808-1812, 1992；Nature, 368, 70-73, 1994)。当信号进入、ITIM被磷酸化时，含SH2的肌醇多磷酸5-磷酸酶(SHIP)被征集，阻碍其他活性型FcγR的信号级联的传递，抑制炎症性免疫反应(Science,290, 84-89, 2000)。另外，据报道，通过仅缔合FcgRIIb，不会BCR非依赖性地发生产生IgM的B细胞的细胞凋亡，也可一过性地抑制由B细胞的增殖和BCR的交联引起的钙流入(JImunol, 181, 5350-5359, 2008)。
另外，FcγRIIb还在树状细胞、巨噬细胞、活化的嗜中性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞中表达。在这些细胞中，FcγRIIb抑制吞噬或炎症性细胞因子的释放等活性型FcγR的功能，抑制炎症性免疫反应(Nat Rev Immunol, 10, 328-343, 2010)。
关于FcγRIIb的免疫抑制功能的重要性，迄今为止，通过使用FcγRIIb敲除小鼠的研究已经明确。据报道，在FcγRIIb敲除小鼠中，体液免疫没有被适当调节(J Immunol,163, 618-622, 1999)，对胶原蛋白诱导关节炎(CIA)的敏感性增加(J Exp Med, 189,187-194, 1999)，或者呈现狼疮(lupus)样症状，或者呈现肺出血-肾炎(Goodpasture)综合征样症状(J Exp Med, 191, 899-906, 2000)。
另外，据报道，FcγRIIb的调节不全还与人自身免疫疾病有关。例如，有人报道了FcγRIIb的启动子区或跨膜区内的遗传多态性与全身性红斑狼疮(SLE)的发病频率的关联(Hum, Genet, 117, 220-227, 2005；J Biol Chem, 282, 1738-1746, 2007；ArthritisRheum, 54, 3908-3917, 2006；Nat Med, 11, 1056-1058, 2005；J Immunol, 176, 5321-5328, 2006)或者在SLE患者的B细胞表面FcγRIIb的表达下降(J Exp Med, 203, 2157-2164, 2006；J Immunol. 178, 3272-3280, 2007)。
这样，由小鼠模型和临床上的认知认为：FcγRIIb以参与B细胞为中心，发挥控制自身免疫疾病、炎症性疾病的作用，其是用于控制自身免疫疾病、炎症性疾病的有希望的靶分子。
已知主要用作市售抗体药物的IgG1不仅与FcγRIIb还与活性型FcγR强力结合(Blood, 113, 3716-3725, 2009)。通过利用与FcγRIIb的结合增强、或者与活性型FcγR相比与FcγRIIb的结合活性的选择性提高的Fc区，认为有可能开发与IgG1相比具有免疫抑制性质的抗体药物。例如，通过利用具有与BCR结合的可变区和与FcγRIIb的结合增强的Fc的抗体，暗示有可能抑制B细胞的活化(Mol Immunol, 45, 3926-3933, 2008)。通过使B细胞上的FcγRIIb和与B细胞受体结合的IgE交联，抑制B细胞向浆细胞分化，其结果引起IgE的产生抑制，在移植有人PBMC的小鼠中维持人IgG或IgM浓度，但人IgE浓度降低(AcadNews, doi: 10.1016, jaci. 2011.11.029)。据报道，不仅IgE，当形成B细胞受体复合体的CD79b和FcgRIIB通过抗体交联时，在体外B细胞的增殖被抑制，在胶原蛋白关节炎模型中症状缓和(Arthritis Rheum, 62, 1933-1943, 2010)。
据报道，除B细胞外，通过使用将与作为IgE受体的FcεRI结合的IgE的Fc部分和与FcgRIIb的结合增强的IgG的Fc部分融合得到的分子，将肥大细胞上的FcεRI和FcgRIIb交联，从而引起FcgRIIb的磷酸化，抑制FcεRI依赖性的钙流入，这暗示：通过增强与FcgRIIb的结合，可以抑制由FcgRIIb的刺激介导的脱颗粒(Immunol let, doi: 10.1016/j. imlet.2012. 01. 008)。
由此暗示：具有与FcγRIIb的结合活性提高的Fc的抗体有望作为自身免疫疾病等炎症性疾病的治疗药。
还暗示：与FcgRIIb的结合增强的突变体除有望作为自身免疫疾病等炎症性疾病的治疗药外，还有望作为癌症治疗药。迄今为止，明确了FcgRIIb在针对抗TNF受体家族的激动剂抗体的激动活性中也发挥重要作用。具体而言，暗示在抗TNF受体家族所含的CD40、DR4、DR5、CD30、CD137的抗体的激动活性中，与FcgRIIb的相互作用是必需的(Science,333, 1030-1034, 2011；Cancer Cell 19, 101-1113, 2011；J Clin Invest 2012; doi:10.1172/JCI61226；J Immunol 171, 562-, 2003；Blood, 108, 705-, 2006；J Immunol166, 4891, 2001)。在非专利文献(Science, 333, 1030-1034, 2011)中显示：通过使用与FcgRIIb的结合增强的抗体，增强抗CD40抗体的抗肿瘤效果。由此期待着：与FcgRIIb的结合增强的抗体具有增强以针对抗TNF受体家族的抗体为代表的激动抗体的激动作用的效果。
迄今为止，有人对具有与FcγRIIb的结合活性提高的Fc的抗体进行了报道(MolImmunol, 45, 3926-3933, 2008)。在该文献中，通过在抗体的Fc区中加入S267E/L328F、G236D/S267E、S239D/S267E等改变，与FcγRIIb的结合活性提高。在该文献中，导入了S267E/L328F的突变的抗体与FcγRIIb的结合最强。通过进一步增强与该FcγRIIb的结合，可以期待着进一步增强由上述的FcγRIIb介导的作用。
另外，导入了S267E/L328F的突变的抗体与FcγRIa和FcγRIIa的H型的结合维持在与天然型IgG1相同的程度。但是，根据其他报道，该改变使与FcγRIIa的R型的结合和与FcγRIIb的结合相同程度地增强数百倍，与FcγRIIa R型相比时，与FcγRIIb结合活性的选择性没有提高(Eur J Immunol 23, 1098-1104, 1993)。
即使与IgG1相比与FcγRIIb的结合增强，但认为不是与FcγRIIb的结合的增强、而只有与FcγRIIa的结合的增强效果才影响着不表达FcγRIIb而表达FcγRIIa的血小板这样的细胞(Nat Rev Immunol, 10, 328-343, 2010)。例如，在给予了作为抗VEGF抗体的贝伐单抗的患者组中，已知血栓栓塞症的风险上升(J Natl Cancer Inst, 99, 1232-1239, 2007)。另外，在抗CD40配体的抗体的临床开发试验中，也同样观察到血栓栓塞症，临床试验被中止(Arthritis Rheum, 48, 719-727, 2003)。当为上述任一种抗体时，通过使用动物模型等的之后的研究，暗示所给予的抗体经由与血小板上的FcgRIIa的结合使血小板凝集，形成血栓(J Thromb Haemost, 7, 171-181, 2008；J Immunol, 185, 1577-1583,2010)。有报道称：在作为自身免疫疾病之一的全身性红斑狼疮中，通过FcγRIIa依赖性机制激活血小板，血小板的激活与重症度有关(Sci Transl Med, 第2卷, 第47期, 47-63,2010)。对于这样的发生血栓栓塞症的风险本来就高的患者给予使与FcgRIIa的结合增强的抗体，即使假设与FcgRIIb的结合增强，但血栓栓塞症的发病风险也会进一步提高，这是极其危险的。
另外，有报道称：使与FcgRIIa的结合增强的抗体增强由巨噬细胞介导的抗体依赖性吞噬活性(ADCP) (Mol Cancer Ther 7, 2517-2527, 2008)。若抗体的抗原被巨噬细胞吞噬，则抗体本身也同时被吞噬，但这种情况下，认为来自该抗体的肽片段也被抗原提呈，抗原性变高，认为针对抗体的抗体(抗抗体)的产生风险上升。即，若增强与FcgRIIa的结合，则提高了抗抗体的抗体的产生风险，显著降低作为药品的价值。
即，若增强与FcgRIIa的结合，则提高由血小板凝集介导的血栓形成的风险，另外抗原性变高，提高了抗抗体产生的风险，因此会显著降低作为药品的价值。
从上述观点考虑，观察之前的与FcgRIIb的结合增强的Fc时，其与FcgRIIa R型的结合较天然型IgG1明显增强，因此在保有FcgRIIa R型的患者中，其作为药品价值显著降低。在高加索人或非裔美国人中以大致相同的频率观察到FcγRIIa的H型和R型(J ClinInvest, 97, 1348-1354, 1996；Arthritis Rheum, 41, 1181-1189, 1998)。由此可知：在自身免疫疾病的治疗中使用该Fc时，在享受作为药品的效果的同时可以安全使用的患者数有限。
另外，据报道，在缺失FcgRIIb的树状细胞、或者通过抗FcgRIIb抗体抑制FcgRIIb与抗体的Fc部分的相互作用的树状细胞中，自发地发生树状细胞的成熟(J Clin Invest115, 2914-2923, 2005；Proc Natl Acad Sci USA, 102, 2910-2915, 2005)。该报道暗示：在未发生炎症等的通常状态下，FcgRIIb积极地抑制树状细胞的成熟。在树状细胞表面，除FcgRIIb外还有FcgRIIa在表达，例如即使增强与抑制型FcgRIIb的结合，但是与活性型FcgRIIa等的结合也被增强时，其结果，认为促进了树状细胞的成熟。即，认为不仅改善与FcgRIIb的结合活性还改善相对于与FcgRIIa的结合活性的与FcgRIIb的结合活性比例，这在对抗体产生免疫抑制作用方面是重要的。
由此认为：在考虑研发利用了由FcgRIIb的结合介导的免疫抑制作用的药品时，寻求不仅增强与FcgRIIb的结合活性，与FcgRIIa H型、R型中的任一个遗传多态性的结合也维持在与天然型IgG1相同程度或减弱至其以下的Fc。
相对于此，迄今为止，有人报道了通过在Fc区中导入氨基酸改变，使与FcγRIIb结合活性的选择性上升的例子(Mol Immunol, 40, 585-593, 2003)。但是，该文献中报道的与FcγRIIb的选择性得到改善的任一个突变体中，与天然型IgG1相比与FcγRIIb的结合均减少。因此，认为这些突变体实际上难以引起IgG1以上的由FcγRIIb介导的免疫抑制反应。
另外，FcgRIIb在之前所述的激动抗体中也发挥重要作用，因此通过增强其结合活性，还期待着激动活性的增强。但是，若与FcgRIIa的结合也同样增强，则发挥了非目标的ADCC活性或ADCP活性等，有可能产生副作用。从这样的观点考虑，也优选可以选择性地增强与FcgRIIb的结合活性。
由上述结果可知：研制利用了FcγRIIb的以自身免疫疾病治疗或癌症的治疗为目的的抗体药物时，与天然型IgG相比，与FcγRIIa的任一个遗传多态性的结合活性均维持或减少、并且与FcγRIIb的结合活性增强是重要的。但是，FcγRIIb与作为活性型FcγR之一的FcγRIIa有93%的胞外区的序列是一致的，结构极为类似，而且在FcγRIIa中，作为遗传多态性，存在着第131位的氨基酸为His的H类型(H型)和为Arg的R类型(R型)，在各型中与抗体的相互作用不同(J Exp Med, 172, 19-25, 1990)。因此，研制选择性地与FcγRIIb结合的Fc区时，区别这些类似的序列，赋予抗体的Fc区选择性地提高与FcγRIIb的结合活性的性质、即不增加或者是减少与FcγRIIa的各遗传多态性的结合活性，另一方面增加与FcγRIIb的结合活性，认为这是最难的课题，迄今为止，还未得到对FcgRIIb具有充分的选择性的突变体。在US2009/0136485中，还报道了与FcγRIIb的结合活性增强的突变体，但其程度弱，人们要求开发具有上述性质的突变体。
在本研究中，使用异源二聚化抗体，研究增强FcgRIIb选择性结合活性的变体的制作。作为抗体H链可变区，使用WO2009/125825中公开的作为抗人白介素6受体的抗体的可变区的IL6R的可变区IL6R (SEQ ID NO: 128)。另外，制作具有除去了人IgG1的C末端的Gly和Lys的G1d的IL6R-G1d (SEQ ID NO: 129)。接下来，制作在IL6R-G1d中导入了K439E的IL6R-B3 (SEQ ID NO: 130)。并且制作在IL6R-B3中导入了E233D、G237D、P238D、H268D、P271G、A330R的IL6R-BP208 (SEQ ID NO: 131)。另外，在IL6R-B3中导入S267E、L328F，制作具有现有的FcgRIIb结合活性增强的Fc的IL6R-BP253 (SEQ ID NO: 132)。作为抗体L链，共通使用作为tocilizumab的L链的IL6R-L(SEQ ID NO: 133)，与各H链一并，按照参考实施例1的方法制作同源二聚体IL6R-B3/IL6R-L、IL6R-BP208/IL6R-L、IL6R-BP253/IL6R-L。按照参考实施例8中记载的方法，评价这些变体与FcgR Ia、FcgR IIaR、FcgR IIaH、FcgR IIb、FcgRIIIaV的结合活性，结果见表62。需要说明的是，表62中涂成灰色的单元被判断为FcgR与IgG的结合微弱，以至于在动力学分析中无法正确地进行分析。这样，当判断为各改变抗体与FcgR的相互作用微弱，以至于在上述的动力学分析中无法正确进行分析时，关于其相互作用，利用Biacore T100软件手册BR1006-48版AE中记载的下述1:1结合模型算式算出KD。
按照1:1结合模型进行相互作用的分子在Biacore上的行为可以通过以下的式1来表示。
[式1]
Req：相对于分析物浓度的稳定状态结合水平图；
C：浓度；
RI：样品中本体折射率的贡献；
Rmax：表面的分析物结合能力。
若将该式变形，则KD可以如以下的式2所示。
[式2]
通过在该式中代入Rmax、RI、C的值，可以算出KD。关于RI、C，可以由测定结果的传感图、测定条件求出其值。关于Rmax的计算，按照以下的方法进行。对于在该次测定中同时评价的作为比较对象的相互作用充分强的抗体，用按照上述的1:1 Langmuir结合模型进行整体拟合时得到的Rmax值除以作为比较对象的抗体在传感器芯片上的捕获量，再乘以欲评价的改变抗体的捕获量而得到的值作为Rmax。
[表62]
另外，用IL6R-B3/IL6R-L相对于FcgRIa FcgRIIaR、FcgRIIaH、FcgRIIb的各KD除以各变体所对应的KD而得到的值、以及以IL6R-B3/IL6R-L相对于FcgRIIaR、FcgRIIaH、FcgRIIb的各KD为1时的相对的KD即相对KD见表63。
[表63]
如表63所示，与改变导入前的人IgG1型的抗体(IL6R-B3/IL6R-L)相比，作为现有的FcgRIIb结合活性增强的抗体的IL6R-BP253/IL6R-L与FcgRIIb的结合活性增强约350倍，同时与FcgRIIaR的结合活性也增强约500倍。另一方面，IL6R-BP208/IL6R-L与FcgRIIb的结合活性增强约100倍，不及现有的FcgRIIb结合活性增强的抗体，但与IgG1型相比其与FcgRIIaR的结合活性为1.3倍，保持了相同程度的结合活性，是对FcgRIIb的选择性优异的抗体。
接下来，为了谋求对FcgR2b的活性增强和选择性提高，认为需要获取作为IL6R-BP208/IL6R-L的Fc的Fc(BP208)与FcgRIIb胞外区的复合体的晶体结构信息，更详细地研究将要导入的氨基酸突变，按照以下的实验方法，进行Fc(BP208)与FcgRIIb胞外区的复合体的X射线晶体结构分析。
[Fc(BP208)的表达纯化]
Fc(BP208)的制备如下进行。首先，对于将IL6R-BP208的EU编号第220位的Cys取代成Ser、且通过PCR克隆EU编号第236位的Glu～其C末端而得到的基因序列Fc(BP208)，按照参考例1中记载的方法进行表达载体的制作、表达、纯化。需要说明的是，EU编号第220位的Cys在普通的IgG1中与L链的Cys形成二硫键，但在仅制备Fc时不使L链共表达，因此将Cys取代成Ser，以避免形成不需要的二硫键。
[FcgRIIb胞外区的表达纯化]
按照参考例8的方法进行制备。
[Fc(BP208)/FcgRIIb胞外区复合体的纯化]
向得到的用于结晶化的1.5mg FcgRIIb胞外区样品中加入从大肠杆菌中表达纯化的0.15mg Endo F1 (Protein Science 1996, 5, 2617-2622)作为谷胱甘肽S-转移酶的融合蛋白，在0.1M Bis-Tris pH6.5的缓冲液条件下，在室温下静置3天，从而切断N型糖链而留下与Asn直接结合的N-乙酰基葡糖胺。接下来，将进行了该糖链切断处理的FcgRIIb胞外区样品用5000MWCO的超滤膜进行浓缩，通过用20mM HEPES pH7.5、0.1M NaCl平衡的凝胶过滤柱层析(Superdex200 10/300)进行纯化。再向得到的糖链切断FcgRIIb胞外区组分中加入Fc(BP208)，使以摩尔比计FcgRIIb胞外区稍微过剩，用10000MWCO的超滤膜浓缩后，通过用25mM HEPES pH7.5、0.1M NaCl平衡的凝胶过滤柱层析(Superdex200 10/300)纯化，得到Fc(BP208)/FcgRIIb胞外区复合体的样品。
[Fc(BP208)/FcgRIIb胞外区复合体的结晶化]
将Fc(BP208)/FcgRIIb胞外区复合体的样品用10000MWCO的超滤膜浓缩至约10mg/ml，在悬滴液蒸汽扩散法中结合使用接种法，进行结晶化。在结晶化中，使用VDXm板(Hampton Research)，相对于0.1M Bis-Tris pH6.5、19% PEG3350、0.2M磷酸氢二钾的储备溶液，以储备溶液：结晶化样品＝0.85μl：0.85μl进行混合，制成结晶化液滴，用Seed Bead(Hampton Research)破碎在相同条件下得到的该复合体晶体以制备晶种溶液，将0.15ul由该晶种溶液制成的稀释溶液添加到上述结晶化液滴中，之后密封在加入有储备液的孔中，在20℃下静置时，成功得到了板状的晶体。
[来自Fc(BP208)/FcgRIIb胞外区复合体晶体的X射线衍射数据的测定]
将得到的Fc(BP208)/FcgRIIb胞外区复合体的单一晶体浸在0.1M Bis-TrispH6.5、24% PEG3350、0.2M磷酸氢二钾、乙二醇20%(v/v)的溶液中，之后使用带有微小尼龙环的大头针将其从溶液中捞出，将其在液氮中冷冻，在Spring-8的BL32XU中进行X射线衍射数据的测定。需要说明的是，测定中经常放置在-178℃的氮气流中以维持冻结状态，使用具备光束线的CCD检测器MX-225HE (RAYONIX)，使晶体每次旋转0.6˚，收集总计300张的X射线衍射图像。在根据得到的衍射图像进行晶格常数的确定、衍射斑点的指数标定、以及衍射数据的处理中，使用程序Xia2 (J. Appl. Cryst. 2010, 43, 186-190)、XDS Package (ActaCryst. 2010, D66, 125-132)以及Scala (Acta Cryst. 2006, D62, 72-82)，最终得到分解能达到2.81Å的衍射强度数据。本晶体属于空间组C2221，晶格常数a＝156.69Å、b＝260.17Å、c＝56.85Å，α＝90˚、β＝90˚、γ＝90˚。
[Fc(BP208)/FcgRIIb胞外区复合体的X射线晶体结构分析]
结构确定通过使用程序Phaser (J. Appl. Cryst. 2007, 40, 658-674)的分子取代法来进行。由得到的晶格大小和Fc(BP208)/FcgRIIb胞外区复合体的分子量，预测每一个非对称单元中的复合体的数目为一个。从作为Fc(WT)/FcgRIIIa胞外区复合体的晶体结构的PDB code:3SGJ的结构坐标中抽取A链第239-340位以及B链第239-340位的氨基酸残基部分作为另一个坐标，分别作为Fc的CH2结构域的探索用模型。同样从PDB code:3SGJ的结构坐标中抽取A链第341-444位和B链第341-443位的氨基酸残基部分作为一个坐标，作为FcCH3结构域的探索用模型。最后，从作为FcgRIIb胞外区的晶体结构的PDB code:2FCB的结构坐标中抽取A链第6-178位的氨基酸残基部分，作为Fc(BP208)的探索用模型。打算由旋转函数和平移函数确定Fc CH3结构域、FcgRIIb胞外区、Fc CH2结构域在各探索用模型的晶格内的方向和位置时，其中有一个CH2结构域，其定位无法顺利进行。因此，对于根据由剩下的3个部分计算的位相计算的电子密度图，边参考Fc(WT)/FcgRIIIa胞外区复合体的晶体结构，边确定最后的CH2结构域A的位置，得到Fc(BP208)/FcgRIIb胞外区复合体晶体结构的初期模型。对得到的初期模型进行移动两个Fc的CH2结构域、2个Fc的CH3结构域以及FcgRIIb胞外区的刚体精密化时，此时对于25-3.0Å的衍射强度数据，晶体学的可靠度因子R值为42.6%、Free R值为43.7%。再通过程序Coot (Acta Cryst. 2010, D66, 486-501)进行使用了程序REFMAC5 (Acta Cryst. 2011, D67, 355-367)的结构精密化和用于观察电子密度图的模型修正，所述电子密度图以根据通过实验确定的结构因子Fo和由模型计算的结构因子Fc以及由模型计算的位相算出的2Fo-Fc、Fo-Fc为系数，通过反复进行上述操作，进行模型的精密化。最后，根据以2Fo-Fc、Fo-Fc为系数的电子密度图，将水分子插入模型中，进行精密化，从而最终使用分解能为25-2.81Å的27259个衍射强度数据，相对于包含4794个非氢原子的模型，晶体学的可靠度因子R值为24.4%、Free R值为27.9%。
结构分析的结果，在分解能2.81Å确定Fc(BP208)/FcgRIIb胞外区复合体的立体结构，该分析的结果，得到的结构见图49。FcgRIIb胞外区以在2个Fc CH2结构域之间夹持的方式结合，与迄今为止分析的作为天然型IgG的Fc的Fc(WT)与FcgRIIIa (Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 2011, 108, 12669-126674)、FcgRIIIb (Nature, 2000, 400, 267-273；J.Biol. Chem. 2011, 276, 16469-16477)、FcgRIIa的各胞外区的复合体的立体结构类似。
但是，观察细部时，由于G237D以及P238D的突变导入的影响，和与FcgRIIa结合的Fc(WT)相比，Fc(BP208)在CH2结构域A中从铰链区起之后的233-239的环结构发生了变化(图50)。其结果，确认在Fc(BP208)的G237主链的酰胺和FcgRIIb的Tyr160侧链之间形成强固的氢键。在FcgRIIa中该Tyr160是Phe，无法形成氢键，由此认为：该氢键对于提高与FcgRIIb的结合活性以及降低与FcgRIIa的结合的选择性的获得上给予了重要帮助。
根据本结构分析结果，精查瞄准进一步提高活性的改变的可能性时，作为改变导入位点的候选之一，发现了S239。如图51所示，FcgRIIb的Lys117从结构上看，该CH2结构域B的Ser239位于以自然形态延伸的方向。但是，在这次的分析中没有观察到FcgRIIb的Lys117的电子密度，由此认为：没有形成恒定的结构，现实状况是认为该Lys117对与Fc(BP208)的相互作用的影响有限，但将该CH2结构域B的S239改变成带有负电荷的D或E时，期待着与带正电荷的FcgRIIb的Lys117之间发生静电相互作用，其结果，期待着与FcgRII的结合活性提高。
另一方面，观察CH2结构域A中的S239的结构时，本氨基酸侧链与G236的主链形成氢键，从铰链区起，认为使从包含与FcgRIIb Tyr160侧链形成氢键的D237的第233位到第239位的环结构稳定(图52)。使环结构在结合时的构象中稳定，这会抑制结合所伴随的熵的降低，结果，导致结合自由能增加即结合活性提高。另一方面，将该CH2结构域A的S239改变成D或E时，与G236主链形成的氢键消失，导致环结构不稳定。而且，还有可能导致与眼前存在的D265产生静电排斥，认为会使环结构更加不稳定。该不稳定化的部分的能量使与FcgRIIb的相互作用能量减少，结果，导致结合活性降低。即，在两个H链中导入有S239D或S239E的同源二聚化抗体中，与CH2结构域B中的FcgRIIb的Lys117的静电相互作用所产生的结合活性增强的效果被CH2结构域A中的环结构的不稳定所产生的结合活性降低的效果抵消，有可能不会导致结合活性增强，但是当为仅在一个H链中导入S239D或S239E的异源二聚化抗体时，维持由CH2结构域A的S239引起的环结构稳定化不变，因此认为只有通过导入CH2结构域B中的S239D或S239E而新形成的与FcgRIIb的Lys117的静电相互作用才有可能增强结合活性。
为了验证该假说，接下来，以IL6R-BP208/IL6R-L为模板，通过仅在一个H链的Fc区中导入S239D或S239E的改变，研究与FcgRIIb的结合活性进一步增强的抗体的制作。作为抗体H链，制作在IL6R-BP208中导入了S239D的IL6R-BP256 (SEQ ID NO: 134)和导入了S239E的IL6R-BP257 (SEQ ID NO: 135)。另外，作为另一个H链，制作在IL6R-G1d中导入了D356K和H435R的突变的IL6R-A5 (SEQ ID NO: 136)，并制作向其中进一步导入E233D、G237D、P238D、H268D、P271G、A330R而得到的IL6R-AP002 (SEQ ID NO: 137)。作为抗体L链，共通使用作为tocilizumab的L链的IL6R-L (SEQ ID NO: 133)，与各H链一并，按照参考实施例1的方法制作同源二聚化抗体IL6R-B3/IL6R-L、IL6R-BP208/IL6R-L、IL6R-BP253/IL6R-L、IL6R- BP256/IL6R-L、IL6R-BP257/IL6R-L和异源二聚化抗体IL6R-AP002/ IL6R-BP256/IL6R-L、IL6R-AP002/IL6R-BP257/IL6R-L。按照参考实施例8中记载的方法，评价这些变体与FcgRIa、FcgRIIaR、FcgRIIaH、FcgR IIb的结合活性，结果见表64。
[表64]
需要说明的是，表64中涂成灰色的单元判断为FcgR与IgG的结合微弱，以至于在动力学分析中无法正确进行分析。这样，当判断为各改变抗体与FcgR的相互作用微弱而在上述动力学分析中无法正确分析时，关于其相互作用，使用Biacore T100软件手册BR1006-48版AE中记载的下述1:1结合模型算式来计算KD。
按照1:1结合模型进行相互作用的分子在Biacore上的行为可以通过以下的式1来表示。
[式1]
Req：相对于分析物浓度的稳定状态结合水平图；
C：浓度；
RI：样品中本体折射率的贡献；
Rmax：表面的分析物结合能力。
若将该式变形，则KD可以如下式2所示。
[式2]
通过向该式中代入Rmax、RI、C的值，可以算出KD。关于RI、C，可以由测定结果的传感图、测定条件求出其值。关于Rmax的计算按照下述方法进行。关于本次测定中同时评价的作为比较对象的相互作用充分强的抗体，用按照上述的1:1 Langmuir结合模型进行整体拟合时得到的Rmax值除以作为比较对象的抗体在传感器芯片上的捕获量，再乘以想要评价的改变抗体的捕获量而得到的值作为Rmax。
另外，用IL6R-B3/IL6R-L相对于FcgRIa FcgRIIaR、FcgRIIaH、FcgRIIb的各KD除以各变体的KD而得到的值、以IL6R-B3/IL6R-L相对于FcgRIIaR、FcgRIIaH、FcgRIIb的各KD为1时的相对的KD即相对KD、以及用各变体相对于FcgRIIaR的KD除以相对于FcgRIIb的KD而得到的值见表65。
[表65]
如表65所示，在向IL6R-BP208/IL6R-L的两个H链中导入了S239D或S239E的IL6R-BP256/IL6R-L、IL6R-BP257/IL6R-L中，与导入前的变体IL6R-BP208/IL6R-L相比，与FcgRIIb的结合活性、与FcgRIIaR的结合活性均减弱。另一方面，在IL6R-BP208/IL6R-L的一个H链中导入了S239D或S239E的IL6R-AP002/IL6R-BP256/IL6R-L、IL6R-AP002/IL6R-BP257/IL6R-L中，与FcgRIIb的结合分别提高至752倍、657倍，显示出较现有技术高的与FcgRIIb的结合活性。另外，与FcgRIIaR的结合活性也由IL6R-BP208/IL6R-L的1.3倍分别增加至7.7倍、8.3倍。这里，表中的KD(IIaR)/KD(IIb)是指用各变体相对于FcgRIIaR的KD除以相对于FcgRIIb的KD而得到的值，该值越大，则显示与FcgRIIb的选择性越高。作为现有的FcgRIIb结合活性增强的抗体的IL6R-BP253/IL6R-L该值为0.3，与IgG1型相比选择性没有改善，相对于此，IL6R-BP208/IL6R-L具有高达26.3的FcgRIIb选择性。这次，在IL6R-BP208/IL6R-L的一个H链中导入了S239D或S239E而得到的IL6R-AP002/IL6R-BP256/IL6R-L、IL6R-AP002/IL6R-BP257/ IL6R-L中，KD(IIaR)/KD(IIb)的值分别为34.3和27.7，较IL6R-BP208/IL6R-L有所改善。
这里，在实施例4中进行的以IgG1型(GpH7-B3/GpL16-k0)为模板的全面变体的评价结果中，S239D、S239E的效果如表66所示。表中的Ho/Con_2aR和Ho/Con_2b显示以同源二聚化抗体的对照为100时与FcgRIIaR和FcgRIIb的结合活性的强度的程度。另外，He/Con_2aR和He/Con_2b显示以异源二聚化抗体的对照为100时与FcgRIIaR和FcgRIIb的结合强度的程度。
[表66]
由表66可知：这次导入的S239D和S239E，尽管将其导入了两个链中或导入一个链中，但将其导入天然型IgG1中时，增强与FcgRIIaR和FcgRIIb的结合。但是，若将这些改变导入IL6R-BP208/IL6R-L的两个H链中，则与FcgRIIaR、FcgRIIb的结合活性减弱，只向一个H链中导入的情况下，与FcgRIIaR、FcgRIIb的结合活性增强。该结果与以IgG1型为模板时得到的改变的效果不同，初次明确了这些改变导入IL6R-BP208/IL6R-L中会具有上述效果。
[实施例27] 瞄向提高同源二聚体和异源二聚体的分离纯化能力的恒定区氨基酸序列的设计
[残基取代位点的选择]
在异源二聚化抗体的制备中，使两种H链(分别作为A链和B链)共表达时，生成作为各H链的A链发生二聚化的同源二聚化抗体和B链发生二聚化的同源二聚化抗体、以及作为不同的两个H链的A链、B链发生二聚化的异源二聚化抗体。作为有效地分离纯化目标异源二聚化抗体的方法，已知有对各可变区进行氨基酸残基取代、并控制抗体的等电点和离子交换柱中的保留能力和分离能力的方法(WO2007/ 114325)。但是，每个抗体其可变区、特别是CDR区的序列不同，所以认为该技术的通用性有限。因此，作为用于异源二聚化抗体纯化的更通用的抗体残基取代方法，研究通过仅对抗体恒定区进行残基取代来控制等电点和离子交换柱中的保持能力和分离能力的方法。
通常，认为离子交换柱中的分离依赖于分子表面的电荷，往往是研究考虑到了目标分子的等电点的分离条件。因此，在本实施例中，也通过取代构成抗体恒定区的氨基酸残基，使想要分离的同源二聚化抗体和异源二聚化抗体的等电点产生差异，期待着离子交换柱中的分离有所改善。
需要说明的是，研究显示：离子交换层析中的分离不仅与纯粹的离子交换模式有关，还与疏水性相互作用有关(Peng Liu等人, J Chromatogr A. 2009 Oct 30; 1216(44): 7497-504)。因此，在采用上述方法的分离纯化中，除利用离子交换层析外，还可以利用疏水层析。
作为改变等电点的残基取代，有将中性残基取代成碱性残基或酸性残基、以及将碱性残基或酸性残基取代成中性残基的方法。作为更有效的对策，有将带正电荷的残基取代成带负电荷的残基、以及将带负电荷的残基取代成带正电荷的残基的方法。
根据上述方法，抗体序列的所有部分均成为能够改变等电点的残基取代位点的候选。但是，随机取代成非天然序列存在着提高免疫原性风险的危险性，考虑到作为药品的应用时并不是适当的方法。
为了尽可能不增加免疫原性风险，考虑以与免疫原性有关的T细胞表位数尽量减少的方式进行残基取代的方法。作为一种方法，可以列举IgG亚类序列的利用。人IgG的亚类中存在IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。根据WO2007/114325中公开的方法，通过将抗体序列的一部分取代成不同亚类的序列，可以在抑制T细胞表位增加的同时改变等电点。
作为其他方法，可以利用Epibase等预测T细胞表位的计算机模拟工具。
Epibase Light(Lonza)是采用FASTER算法(Expert Opin Biol Ther. 2007 Mar;7(3):405-18.)计算9-mer肽与主要DRB1等位基因的结合能力的计算机模拟工具。本工具可以鉴定作为与MHC类II强结合和中等程度结合的T细胞表位。
在计算中反映出DRB1异型的存在比，其中可以使用以下所示的高加索人中的存在比。
DRB1*1501(24.5%)、DRB1*0301(23.7%)、DRB1*0701(23.3%)、DRB1*0101(15.0%)、DRB1*1101(11.6%)、DRB1*1302(8.2%)、DRB1* 1401/1454(4.9%)、DRB1*0901(2.3%)、DRB1*1502(0.5%)、DRB1*1202 (0.1%)
利用FASTER算法求出各改变抗体序列中所含的强结合和中等程度结合的所有表位后，除人种系序列和可变区与恒定区的边界序列以外的表位作为关键性表位被提呈。通过利用本工具的随机分配功能，对于任意序列中所含的每一个残基，分别算出取代成任意的氨基酸残基时的T细胞表位增加数。由此，虽然等电点发生变化，但可以选择T细胞表位不会增加的残基取代位点。
关于H240-AK072 (SEQ ID NO: 104)和H240-BH076 (SEQ ID NO: 105)，利用Epibase进行分析。表67显示H240-AK072中通过任意的残基取代能够发生变化的T细胞表位数，表68显示H240-BH076中通过任意的残基取代能够发生变化的T细胞表位数。根据该结果，可以选择不使T细胞表位增加、且使等电点发生变化的残基取代。
[表67-1]
[表67-2]
[表67-3]
[表67-4]
[表67-5]
[表67-6]
[表68-1]
[表68-2]
[表68-3]
[表68-4]
[表68-5]
[表68-6]
通过以上的方法及其组合，作为用于改变等电点的残基取代位点，设计以下所示的H240-AK072和H240-BH076变体(表69、70)。
[表69]
[表70]
[H240-AK072/H240-BH076/L73-k0改变抗体表达用载体的构建]
首先，为了制作H240-AK072/H240-BH076/L73-k0的改变抗体的cDNA，以H240-AK072或H240-BH076为模板，分别设计合成寡DNA，使所选择的各氨基酸残基发生突变。接下来，使用各合成寡DNA，按照参考实施例1的方法，制作携带目标基因的动物细胞表达载体。
[H240-AK072/H240-BH076/L73-k0改变抗体的表达、纯化]
为了评价H240-AK072/H240-BH076/L73-k0的改变抗体，使在H240-AK072或H240-BH076中导入有改变的各H链(将在H240-AK072中导入了改变的H链称作A链、将在H240-BH076中导入了改变的H链称作B链)和L链(L73-k0、SEQ ID NO: 106)以任意的组合进行共表达，从而按照参考实施例1的方法得到A链和B链形成任意的组合的改变抗体。代表性的A链和B链的SEQ ID NO见表71。
[表71]
[实施例28] H240-AK072/H240-BH076/L73-k0变体的物理化学评价
[阳离子交换层析的保留时间差的测定]
对于各抗体，在下述条件下实施测定。
流动相A：20mM的MES-NaOH，pH6.0；
流动相B：20mM的MES-NaOH，200mM的NaCl，pH6.0；
柱：Bio Pro SP-F (YMC)；
流速：0.5mL/分钟；
梯度：10%B (0-5分钟)，10-60%B (5-55分钟)；
检测：Abs. 280nm。
图53显示代表性的色谱图。在洗脱时间短的位置出现的峰来自B链-B链的同源二聚化抗体，主峰来自A链-B链的异源二聚化抗体。A链中导入有减弱与蛋白A的结合的残基取代(H435R)，这里使用的抗体在按照参考实施例1的方法进行制备的过程中通过rProtein ASepharoseTM Fast Flow (GE Healthcare)的纯化过程被除去，因此在本条件下几乎检测不到A链-A链同源二聚化抗体。作为评价异源二聚化抗体和同源二聚化抗体的分离的指标，算出保留时间差ΔRT (分钟)＝(异型抗体峰的保留时间)-(B链同型抗体峰的保留时间)。表72显示各种变体的评价结果。以上结果显示：由于设计的残基取代的导入及其组合，异型抗体与同型抗体的保留时间差扩大。
[利用凝胶过滤层析法来评价缔合体含量]
通过使用ACQUITY UPLC H-Class系统(Waters)的SEC分析，评价纯化抗体中的缔合体含量。流动相使用包含300mM氯化钠的50mM磷酸缓冲液(pH7.0) (伊势久)，分析柱使用BEH200 SEC (waters)，在215nm波长下测定。使用Empower 2 (Waters)进行数据分析，与单体相比在高分子量侧洗脱的成分，统统作为缔合体计算其含量。表72显示各种变体的评价结果。由此认为：与改变前的H240-AK072/H240- BH076/L73-k0相比，各种变体的缔合体量并没有大幅增加，确保了与缔合化有关的稳定性。
[利用差示扫描型荧光定量法来评价改变抗体的热变性中点(Tm)]
采用使用了Rotor-Gene Q (QIAGEN)的差示扫描型荧光定量法来测定抗体的热变性中点(Tm)，由此评价热稳定性。需要说明的是，已有报道称，该方法与作为抗体的热稳定性评价方法而广为人知的使用差示扫描型量热计的Tm评价显示出良好的相关性(Journalof Pharmaceutical Science 2010; 4: 1707-1720)。
用PBS (Sigma)稀释5000倍浓度的SYPRO orange (Molecular Probes)后，与抗体溶液混和，由此制备测定样品。将每20μL的各样品放入测定用管中，从30℃升温至99℃。升温0.4℃，静止约6秒后，在470nm (激发波长)/555nm (荧光波长)下检测荧光强度。
就数据而言，使用Rotor-Gene Q系列软件(QIAGEN)，算出确认到荧光迁移的温度，以该值作为Tm值。如Molecular Immunology 37 (2000) 697-706等中报道的那样，以CH2结构域的Tm值作为相当于第一次迁移的Tm1。而在已研究的抗体中，CH3与Fab的Tm值接近，判断难以对它们进行分离的比较，本评价中使用的Tm值采用Tm1的值。表72显示各种变体的评价结果。由此认为：与改变前的H240-AK072/ H240-BH076/L73-k0相比，各种变体的Tm值并没有大幅降低，维持着结构稳定性。
[表72]
[离子交换层析纯化中的分离的评价]
在使用AKTA avant25 (GE healthcare)的离子交换层析纯化法中，评价各样本的分离。流动相使用20mM的MES缓冲液(pH6.0)以及含有500mM氯化钠的20mM的MES缓冲液(pH6.0)，柱使用Hi Trap SP HP 1mL (GE healthcare)，通过两种液体混合梯度法进行纯化。在280nm的波长下获取纯化数据，使用Unicorn 6.1 (GE healthcare)评价洗脱结果。图54显示H240-FA021/H240-BF084/L73-k0变体的评价结果。由此显示：通过使用在大规模中使用的柱载体进行纯化，并导入本研究中新发现的残基取代，可以分离纯化同源二聚化抗体和异源二聚化抗体。
[实施例29] H240-AK072/H240-BH076/L73-k0变体的免疫学评价
[利用表面等离振子散射法来评价与FcγR的结合活性]
按照参考实施例8的方法，进行目标抗体与FcgR的相互作用分析。
各种变体的评价结果见表73。由此确认：在图54中确认到分离的H240-FA021/H240-BF084/L73-k0变体与FcγR的结合能力与改变前的H240-AK072/H240-BH076/L73-k0同等。
[表73]
[使用计算机模拟免疫原性预测工具Epibase进行免疫原性风险评价]
临床中抗体药品的有效性和药效会受到抗药品抗体(ADAs)的限制。ADAs会对抗体药品的药效和动力学产生影响，有时会产生严重的副作用。报道了多种对免疫原性产生影响的因素，但特别重要的是抗原中包含T细胞表位。作为预测该T细胞表位的计算机模拟工具，可以利用Epibase (Lonza)、iTope/TCED (Antitope)和EpiMatrix (EpiVax)等。有报道称，通过使用这些工具，可以预测目标蛋白中存在的包含T细胞表位的序列(Expert OpinBiol Ther. 2007 Mar;7(3): 405-18.)。
Epibase Light (Lonza)是使用FASTER算法(Expert Opin Biol Ther. 2007Mar; 7(3): 405-18.)，计算9-mer肽与主要的DRB1等位基因的结合能力的计算机模拟工具。本工具可以鉴定与MHC类II形成强结合和中等程度结合的T细胞表位。
各改变抗体的计算机模拟免疫原性分数通过Epibase Light (Lonza)系统内的下述算式(式4)来计算。
(式4)
免疫原性分数=Sum (每一个DRB1异型种群频率×关键性表位数)
计算中反映出DRB1异型的存在比，其中可以使用以下所述的高加索人中的存在比。
DRB1*1501(24.5%)、DRB1*0301(23.7%)、DRB1*0701(23.3%)、DRB1*0101(15.0%)、DRB1*1101(11.6%)、DRB1*1302(8.2%)、DRB1* 1401/1454(4.9%)、DRB1*0901(2.3%)、DRB1*1502(0.5%)、DRB1*1202 (0.1%)
通过FASTER算法求出各改变抗体序列中所含的强结合和中等程度结合的所有表位后，将除人种系序列和可变区与恒定区的边界序列以外的表位作为关键性表位，用于计算免疫原性分数。分数越低，则认为其是免疫原性风险越小的序列。表74显示关于H240-AK072和H240-BH076、以及它们的变体而计算的风险分数。由此，通过选择A链和B链的任意组合，可以制作与H240-AK072/H240-BH076/L73-k0相比同源二聚体与异源二聚体的分离纯化能力提高、且免疫原性的风险没有变大的变体。
[表74]
[实施例30]
在实施例20和实施例21中，发现了增强与活性型FcgR结合的异源二聚化抗体H240-Kn125/H240-Hl076/L73-k0、H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0。因此，在这些异源二聚化抗体所使用的改变中，通过将H240-Kn125和H240-Kn120的第234位、第239位、以及H240-Hl076的第330位取代成其它氨基酸，进一步验证了是否可以得到优异的异源二聚化抗体。
(30-1) 第234位的氨基酸的研究
按照参考实施例1的方法，制作了将H240-Kn125和H240-Kn120所含的EU编号第234位的Y取代成天然型的L和V、D、Q、I、M、T、A、G、H、S、F、E，作为另一个链具有H240-Hl076和H240-Hl068的异源二聚化变体。为了与现有技术相比，制作了无岩藻糖基化抗体(H240-afucosyl_G1d/L73-k0)和两个链具有S239D/A330L/I332E的H240-Kn032/H240-Hl032/L73-k0。而且，在WO2012/125850记载的变体中，分别制作了被认为对FcγRIIIa的亲和力最高、最优异的改变的W187(一个H链具有S239D/A330M/K334V、另一个H链具有L234Y/K290Y/Y296W的变体)、M81(一个H链具有S239D/K334V、另一个H链具有L234Y/Y296W/S298C的变体)所对应的变体。具体而言，按照参考实施例1的方法，制作了向H240-Kn033中导入有L234Y/K290Y/Y296W的H240-Kn204、向H240-Hl033中导入有S239D/A330M/K334V的H240-Hl211、向H240-Kn033中导入有L234Y/Y296W/S298C的H240-Kn205、向H240-Hl033中导入有S239D/K334V的H240-Hl212。按照参考实施例1的方法，将作为一个H链为H240-Kn204、作为L链为L73-k0、作为另一个H链为H240-Hl211，以及作为一个H链为H240-Kn205、作为L链为L73-k0、作为另一个H链为H240-Hl212分别组合并表达，调制了H240-Kn204/H240-Hl211/L73-k0、H240-Kn205/H240-Hl212/L73-k0。制作的变体与FcgRIa、FcgRIIaR、FcgRIIaH、FcgRIIb、FcgRIIIaF、FcgRIIIaV的结合，按照参考实施例８的方法进行了测定。这些测定结果汇总在表75中。
[表75]
在表75中，在模板(template)中，表示取代第234位的氨基酸时作为模板的链为H240-Kn125或H240-Kn120的任一个。而且，“第234位的氨基酸”表示将H240-Kn125或H240-Kn120的EU编号第234位的氨基酸取代之后的氨基酸的种类。“fold 2aR”、“fold 2aH”、“fold 2b”、“fold 3aF”、“fold 3aV”分别表示：将向天然型IgG1上加入了仅用于促进异源二聚化抗体形成的改变的变体H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0与FcgRIIaR、FcgRIIaH、FcgRIIb、FcgRIIIaF、FcgRIIIaV的结合活性设为1时的、各变体的相对结合活性。具体而言，为用H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0相对于各FcgR的KD除以各变体相对于各FcgR的KD而得到的值。
和加入了仅为了促进与IgG1形成异源二聚化抗体的改变的H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0相比，无岩藻糖基化抗体(H240-afucosyl_G1d/L73-k0)与FcgRIIIaF的结合增强了4倍、与FcgRIIIaV的结合增强了7倍。而且，两个链具有S239D/A330L/I332E的H240-Kn032/H240-Hl032/L73-k0与FcgRIIIaF的结合增强了32倍、与FcgRIIIaV的结合增强了16倍。作为现有的异源二聚化抗体的H240-Kn204/H240-Hl211(一个H链具有S239D/A330M/K334V、另一个H链具有L234Y/K290Y/Y296W的变体)与FcgRIIIaF的结合增强了21倍、与FcgRIIIaV的结合增强了7倍，H240-Kn205/H240-Hl212(一个H链具有S239D/K334V、另一个H链具有L234Y/ Y296W/S298C的变体)与FcgRIIIaF的结合增强了24倍、与FcgRIIIaV的结合增强了11倍。另一方面，本研究中制作的变体与FcgRIIIaF的结合增强了69倍～223倍、与FcgRIIIaV的结合增强了60倍～185倍，所有变体均相比现有技术具有高的FcgRIIIa结合活性。其中，与FcgRIIIaF的结合最高者是将H240-Kn125/H240-Hl076/L73-k0的H240-Kn125的EU编号第234位取代成天然型的L的H240-Kn198/H240-Hl076/L73-k0，与H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0相比，为193倍的结合活性。而且，与FcgRIIIaV的结合最高者是将H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0的H240-Kn120的第234位取代成E的H240-Kn184/H240-Hl068/L73-k0，与H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0相比，为141倍的结合活性。与H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0相比，与FcgRIIIaF、FcgRIIIaV均具有100倍以上结合活性的变体是：将H240-Kn125/H240-Hl076/L73-k0的H240-Kn125的第234位取代成F的H240-Kn201/H240-Hl076/L73-k0、取代成E的H240-Kn202/H240-Hl076/L73-k0、取代成D的H240-Kn208/H240-Hl076/L73-k0，将H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0的H240-Kn120的第234位取代成E的H240-Kn184/H240-Hl068/L73-k0、取代成D的H240-Kn217/H240-Hl068/L73-k0、取代成T的H240-Kn221/H240-Hl068/L73-k0、取代成L的H240-Kn199/H240-Hl068/L73-k0。在这些中，将H240-Kn125/H240-Hl076/L73-k0的H240-Kn125的第234位取代成L的H240-Kn198/H240-Hl076/L73-k0、取代成F的H240-Kn201/H240-Hl076/L73-k0、取代成E的H240-Kn202/H240-Hl076/L73-k0、取代成D的H240-Kn208/H240-Hl076/L73-k0与抑制性FcgRIIb的结合，与H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0相比，均抑制为同等以下，它们是在诱起效应子功能方面优异的异源二聚化抗体。
而且，显示出高于作为现有的FcgRIIa结合增强技术的H240-Kn037/H240-Kn036/L73-k0与FcgRIIaR、FcgRIIaH的结合活性的变体是：将H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0的第234位取代成V的H240-Kn216/H240-Hl068/L73-k0、取代成I的H240-Kn219/H240-Hl068/L73-k0、取代成T的H240-Kn221/H240-Hl068/L73-k0、取代成M的H240-Kn220/H240-Hl068/L73-k0、取代成L的H240-Kn199/H240-Hl068/L73-k0。其中，取代成I的H240-Kn219/H240-Hl068/L73-k0、取代成T的H240-Kn221/H240-Hl068/L73-k0、取代成L的H240-Kn199/H240-Hl068/L73-k0与FcgRIIIa的结合活性也高、是优异的变体。
以上的结果显示出：在此所研究的变体与FcgRIIIa的结合均高于现有技术，而且，多数的变体与FcgRIIb的结合活性不增强、或者与FcgRIIa的结合活性高于现有技术，它们是在诱起抗体的效应子功能方面优于现有技术的异源二聚化抗体。
(30-2) 第330位的氨基酸的研究
接下来，进行了第330位的氨基酸的研究。在H240-Kn125/H240-Hl076/L73-k0的H240-Hl076中导入了A330M改变。按照参考实施例1的方法，制作了将该第330位的氨基酸取代成Ala(天然型)、Phe、Pro、Ile、Tyr、His的链，与H240-Kn125组合进行表达。作为抗体L链，共通使用了L73-k0。制作的变体与FcgRIa、FcgRIIaR、FcgRIIaH、FcgRIIb、FcgRIIIaF、FcgRIIIaV的结合按照参考实施例８的方法进行了测定。这些测定结果汇总在表76中。
[表76]
表中的“第330位的氨基酸”表示H240-Hl076的第330位取代之后的氨基酸的种类。而且，“fold 2aR”、“fold 2aH”、“fold 2b”、“fold 3aF”、“fold 3aV”分别表示：将向天然型IgG1上加入了仅用于促进异源二聚化抗体形成的改变的变体H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0与FcgRIIaR、FcgRIIaH、FcgRIIb、FcgRIIIaF、FcgRIIIaV的结合活性设为1时的、各变体的相对结合活性。具体而言，为用H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0相对于各FcgR的KD除以各变体相对于各FcgR的KD而得到的值。
本研究中制作的各变体相比现有的FcgRIIIa结合增强技术也均具有高的FcgRIIIa结合活性，在研究之中，将第330位取代成Phe的H240-Kn125/H240-Hl214/L73-k0与FcgRIIIaF的结合最高，将第330位取代成Y的H240-Kn125/H240-Hl217/L73-k0与FcgRIIIaV的结合最高。关于与FcgRIIb的结合，本次研究的变体中结合活性最低者是将第330位取代成Ile的H240-Kn125/H240-Hl216/L73-k0、是向天然型IgG1上加入了仅用于促进异源二聚化抗体形成的改变的变体H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0的0.4倍，结合活性最高者是将第330位取代成His的H240-Kn125/H240-Hl218/L73-k0、为1.1倍，均为和H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0与FcgRIIb的结合活性为同等或降低的结果。关于FcgRIIaR，H240-Kn125/H240-Hl076/L73-k0是H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0的1.8倍，相对于此，本次研究的变体中结合活性最低者是将第330位取代成Ile的H240-Kn125/H240-Hl216/L73-k0、为1.0倍，结合活性最高者是将第330位取代成His的H240-Kn125/H240-Hl218/L73-k0、为2.4倍。另外，关于FcgRIIaH，将第330位取代成Ile的H240-Kn125/H240-Hl216/L73-k0最低、为2.5倍，将第330位取代成His的H240-Kn125/H240-Hl218/L73-k0最高、为4.7倍。以上的结果显示出：将H240-Kn125/H240-Hl076/L73-k0的H240-Hl076的第330位取代成Ala、Phe、Ile、Tyr、His的变体与FcgRIIIa的结合均高于现有技术，且与FcgRIIb的结合活性不增强，而且，对于多数的变体而言，与FcgRIIa的结合活性也均高于现有技术，它们是在诱起抗体的效应子功能方面优于现有技术的异源二聚化抗体。
(30-3) 第239位的氨基酸的研究
H240-Kn125、H240-Kn120中均导入了将第239位的Ser取代成Met的改变。在本研究中，研究了该Met是否可以取代成Ile。第239位取代成Ile，如实施例17的表44所示，尽管相比Met增强了与FcgRIIb的结合，但该取代是与FcgRIIa和FcgRIIIa的结合具有更高的增强效果的改变。
具体而言，按照参考实施例１记载的方法，制作了将H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0的H240-Kn120、H240-Kn125/H240-Hl076/L73-k0的H240-Kn125的第239位分别取代成Ile的H240-Kn229/H240-Hl068/L73-k0和H240-Kn225/H240-Hl076/L73-k0。制作的变体与FcgRIa、FcgRIIaR、FcgRIIaH、FcgRIIb、FcgRIIIaF、FcgRIIIaV的结合按照参考实施例８的方法进行了测定。这些测定结果汇总在表77中。
[表77]
表中的“fold 2aR”、“fold 2aH”、“fold 2b”、“fold 3aF”、“fold 3aV”分别表示：将向天然型IgG1上加入了仅用于促进异源二聚化抗体形成的改变的变体H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0与FcgRIIaR、FcgRIIaH、FcgRIIb、FcgRIIIaF、FcgRIIIaV的结合活性设为1时的、各变体的相对结合活性。具体而言，是用H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0相对于各FcgR的KD除以各变体相对于各FcgR的KD而得到的值。
H240-Kn125/H240-Hl076/L73-k0的H240-Kn125的第239位取代成Ile的H240-Kn225/H240-Hl076/L73-k0与FcgRIIIaF、FcgRIIIaV的结合，与H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0相比，分别增强了264倍、253倍。而且，与FcgRIIb的结合也抑制为H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0的0.6倍。H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0的H240-Kn120的第239位取代成Ile的H240-Kn229/H240-Hl068/L73-k0，与H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0相比，与FcgRIIIaF、FcgRIIIaV的结合分别提高了138倍、62倍，本研究制作的二种类的变体均优于现有的FcgRIIIa结合增强技术。而且，H240-Kn229/H240-Hl068/L73-k0与FcgRIIaR、FcgRIIaH的结合，与H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0相比，分别为46倍、13倍，高于增强与FcgRIIa结合的现有技术H240-Kn037/H240-Hl036/L73-k0。
(30-4) 组合改变的研究
迄今为止的研究中，对H240-Kn125、H240-Kn120的第234位、第239位的氨基酸、和H240-Hl076的第330位的氨基酸进行了研究。因此，在本研究中，研究了将迄今为止得到的变体之中被认为在增强抗体的效应子功能方面显示高的效果的改变彼此进行组合、制作更优异的异源二聚化抗体。
具体而言，制作了在H240-Kn125的第234位中导入有F、E、D、S、L，在第239位中导入有I或M的抗体重链基因。而且，制作了在H240-Kn120的第234位中导入有V、E、D、T、I、L、F，在第239位中导入有M或I的抗体重链。作为另一个抗体H链，使用了在H240-Hl076的第330位中导入有A或F所得的链、或H240-Hl068。作为抗体L链，共通使用了L73-k0。制作的变体与FcgRIa、FcgRIIaR、FcgRIIaH、FcgRIIb、FcgRIIIaF、FcgRIIIaV的结合按照参考实施例８的方法进行了测定。这些测定结果汇总在表78中。
[表78]
表中的“Kn模板”表示加入改变时以H240-Kn120或H240-Kn125的任一个作为模板，“Hl模板”表示以H240-Hl068或H240-Hl076的任一个作为模板。而且，“Hl模板”涂成灰色的变体，作为一个H链使用了H240-Hl068。“第234位的氨基酸”和“第239位的氨基酸”表示Kn链的第234位、第239位的氨基酸，“第330位的氨基酸”表示Hl链的第330位的氨基酸取代之后的氨基酸的种类。“fold 2aR”、“fold 2aH”、“fold 2b”、“fold 3aF”、“fold 3aV”分别表示：将向天然型IgG1上加入了仅用于促进异源二聚化抗体形成的改变的变体H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0与FcgRIIaR、FcgRIIaH、FcgRIIb、FcgRIIIaF、FcgRIIIaV的结合活性设为1时的、各变体的相对结合活性。具体而言，是用H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0相对于各FcgR的KD除以各变体相对于各FcgR的KD而得到的值。
本研究中制作的变体与FcgRIIIaF的结合活性，和加入了仅用于促进与天然型IgG1形成异源二聚化抗体的改变的变体H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0相比，为51倍～161倍，而且，与FcgRIIIaV的结合活性，为34倍～107倍，各变体与现有的FcgRIIIa结合增强技术相比也均具有高的结合活性。与FcgRIIIaF的结合活性最强者是将H240-Kn125的第234位取代成E、第239位取代成I、H240-Hl076的第330位取代成F的H240-Kn227/H240-Hl214/L73-k0。与FcgRIIIaV的结合活性最强者是将H240-Kn120的第234位取代成F、H240-Hl076的第330位取代成A的H240-Kn203/H240-Hl210/L73-k0。作为与FcgRIIIaF、FcgRIIIaV的结合活性同时增强的变体可以举出：H240-Kn226/H240-Hl214/L73-k0 (H240-Kn125的第234位取代成F、第239位取代成I、H240-Hl076的第330位取代成F)、H240-Kn227/H240-Hl214/L73-k0 (H240-Kn125的第234位取代成E、第239位取代成I、H240-Hl076的第330位取代成F)、H240-Kn228/H240-Hl214/L73-k0 (H240-Kn125的第234位取代成D、第239位取代成I、H240-Hl076的第330位取代成F)。关于这些变体与FcgRIIb的结合，也均维持在与H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0为同等程度 (1.0倍～1.4倍)。
与FcgRIIaR的结合活性，与天然型的H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0相比，为0.9倍～83倍，而且，与FcgRIIaH的结合活性为1.2倍～33倍，结合活性最强者是将H240-Kn120的第234位和第239位取代成I的H240-Kn231/H240-Hl068/L73-k0。和现有的导入有与FcgRIIa的结合增强改变的H240-Kn037/H240-Kn036/L73-k0相比，与FcgRIIaR、FcgRIIaH的结合活性均增强的变体是：H240-Kn230/H240-Hl068/L73-k0 (H240-Kn120的第234位取代成V、第239位取代成I)、H240-Kn236/H240-Hl068/L73-k0 (H240-Kn120的第234位取代成T、第239位取代成I)、H240-Kn231/H240-Hl068/L73-k0 (H240-Kn120的第234位取代成I、第239位取代成I)、H240-Kn232/H240-Hl068/L73-k0 (H240-Kn120的第234位取代成L、第239位取代成I)、H240-Kn235/H240-Hl068/L73-k0 (H240-Kn120的第234位取代成F、第239位取代成I)。
以上的结果显示出：在此所研究的变体，与FcgRIIIa的结合活性均高于现有技术，且多数的变体与FcgRIIa的结合活性也高于现有技术，它们是在诱起抗体的效应子功能方面优于现有技术的异源二聚化抗体。
在此所研究的变体的H链的SEQ ID NO显示在表79中。
[表79]
[参考实施例1] 抗体的表达载体的制作以及抗体的表达和纯化
氨基酸取代的导入使用QuikChange位点特异性诱变试剂盒(Stratagene)、PCR或In fusion Advantage PCR克隆试剂盒(TAKARA)等，按照本领域技术人员公知的方法进行，构建表达载体。得到的表达载体的核苷酸序列按照本领域技术人员公知的方法进行确定。将所制作的质粒一过性地导入来自人胚肾癌细胞的HEK293H株(Invitrogen)或FreeStyle293细胞(Invitrogen公司)中，进行抗体的表达。使用rProtein A SepharoseTMFast Flow (GE Healthcare)，按照本领域技术人员公知的方法，从所得的培养上清中纯化抗体。关于纯化抗体浓度，使用分光光度计测定280nm下的吸光度，使用由所得的值通过PACE法算出的吸光系数，算出抗体浓度(Protein Science 1995; 4: 2411-2423)。
[参考实施例2] FcγR的制备和与FcγR的结合活性的评价
按照下述方法制备FcgR的胞外区。首先，按照本领域技术人员公知的方法实施FcgR的胞外区的基因合成。此时，各FcgR的序列根据NCBI中所录入的信息来制作。具体而言，FcgRI根据NCBI检索号NM_000566.3的序列进行制作，FcgRIIa根据NCBI检索号NM_001136219.1的序列来制作，FcgRIIb根据NCBI检索号NM_004001.3的序列来制作、FcgRIIIa根据NCBI检索号NM_001127593.1的序列来制作、FcgRIIIb根据NCBI检索号NM_000570.3的序列来制作，在C末端添加His标记。另外，关于FcgRIIa、FcgRIIIa、FcgRIIIb，它们的多态性已成为已知，关于多态性位点，FcgRIIa的多态性位点参考J. Exp. Med., 1990, 172: 19-25来制作，FcgRIIIa的多态性位点参考J. Clin. Invest., 1997, 100 (5): 1059-1070来制作，FcgRIIIb的多态性位点参考J. Clin. Invest., 1989, 84, 1688-1691来制作。
将得到的基因片段插入动物细胞表达载体中，制作表达载体。将制作的表达载体一过性地导入来自人胚肾癌细胞的FreeStyle293细胞(Invitrogen公司)中，使目标蛋白表达。需要说明的是，关于晶体结构分析中使用的FcgRIIb，在终浓度为10μg/mL的Kifunesine的存在下使目标蛋白表达，使FcgRIIb中所添加的糖链变成高甘露糖型。进行培养，回收得到的培养上清，之后通过0.22μm滤器，得到培养上清。得到的培养上清原则上通过下述4个步骤进行纯化。步骤1进行阳离子交换柱层析(SP Sepharose FF)、步骤2对His标记进行亲和柱层析(HisTrap HP)、步骤3进行凝胶过滤柱层析(Superdex200)、步骤4进行无菌过滤。但是，关于FcgRI，在步骤1中使用Q sepharose FF进行阴离子交换柱层析。对于纯化的蛋白，使用分光光度计测定280nm的吸光度，使用通过PACE等方法由所得的值算出的吸光系数，算出纯化蛋白的浓度(Protein Science 1995; 4: 2411-2423)。
使用Biacore T100 (GE Healthcare)，进行目标抗体与FcγR的相互作用分析。运行缓冲液使用HBS-EP+(GE Healthcare)，测定温度为25℃。使用通过胺偶联法在S系列传感器芯片CM5 (Series S Sencor Chip CM5) (GE Healthcare)上固定了抗原肽的芯片、或者使预先进行了生物素化的抗原肽与S系列传感器芯片SA (certified) (GE Healthcare)发生相互作用并固定在其上的芯片。将目标抗体捕捉到固定有抗原肽的芯片上，与用运行缓冲液稀释的各FcγR发生相互作用。通过使10mM的甘氨酸-HCl (pH1.5)发生反应，清洗捕捉到芯片上的抗体，将芯片再生后反复使用。
关于各抗体与FcγR的结合活性，主要以与FcγR的结合活性和与FcγR的解离常数为指标进行评价。
与FcγR的结合活性是指相对于FcγR的相对结合活性。关于相对于FcγR的相对结合活性，以各测定时作为对照的样品的结合活性为100(%)，算出其他抗体的结合活性。这里所说的结合活性，采用用反映使FcγR与捕获的抗体发生相互作用前后的传感图的变化量除以各抗体的捕获量而得到的值。这是由于FcγR的结合活性取决于所捕获的抗体的量的缘故。
关于各抗体与FcγR的解离常数，通过对Biacore的测定结果进行动力学分析而算出。具体而言，将利用Biacore评价软件进行测定得到的传感图按照1:1 Langmuir结合模型进行整体拟合，由此算出结合速度常数ka (L/mol/s)、解离速度常数kd (1/s)，由该值算出解离常数KD (mol/L)。
[参考实施例3] 异源二聚化抗体基因表达载体的制作和各抗体的表达
作为抗体H链可变区，使用下述可变区。Q153 (抗人F.IX抗体的H链可变区、SEQ IDNO: 61)、Q407 (抗人F.IX抗体的H链可变区、SEQ ID NO: 62)、J142 (抗人F.X抗体的H链可变区、SEQ ID NO: 63)、J300 (抗人F.X抗体的H链可变区、SEQ ID NO: 64)、MRA-VH (抗人白介素-6受体抗体的H链可变区、SEQ ID NO: 65)。
作为抗体L链，使用下述的L链。L180-k (抗人F.IX抗体/抗人F.X抗体共通L链、SEQID NO: 66)、L210-k (抗人F.IX抗体/抗人F.X抗体共通L链、SEQ ID NO: 67)、MRA-k (抗人白介素-6受体抗体的L链、SEQ ID NO: 68)。
作为抗体H链恒定区，使用下述的恒定区：在IgG4中导入由EU编号第228位的Ser取代成Pro的突变、并除去了C末端的Gly和Lys而得到的G4d (SEQ ID NO: 69)；在G4d中导入由EU编号第435位的His取代成Arg的突变、由EU编号第436位的Tyr取代成Phe的突变和由EU编号第445位的Leu取代成Pro的突变而得到的z72 (SEQ ID NO: 70)；在G4d中导入由EU编号第356位的Glu取代成Lys的突变而得到的z7 (SEQ ID NO: 71)；在z72中导入由EU编号第439位的Lys取代成Glu的突变而得到的z73 (SEQ ID NO: 72)；在z7中导入由EU编号第196位的Lys取代成Gln的突变、由EU编号第296位的Phe取代成Tyr的突变和由EU编号第409位的Arg取代成Lys的突变而得到的z106 (SEQ ID NO: 73)；在z73中导入由EU编号第196位的Lys取代成Gln的突变、由EU编号第296位的Phe取代成Tyr的突变、由EU编号第409位的Arg取代成Lys的突变和由EU编号第436位的Phe取代成Tyr的突变而得到的z107 (SEQ ID NO:74)；除去IgG1的C末端的Gly和Lys而得到的G1d (SEQ ID NO: 75)。由EU编号第356位的Glu取代成Lys的突变和由EU编号第439位的Lys取代成Glu的突变用于在产生异型抗体时有效形成各H链的杂分子((WO2006/106905) PROCESS FOR PRODUCTION OF POLYPEPTIDE BYREGULATION OF ASSEMBLY)。
通过在Q153的下游连接G4d或z7，制作抗人F.IX抗体H链基因Q153-G4d或Q153-z7。通过在Q407的下游连接z106，制作抗人F.IX抗体H链基因Q407-z106。通过在J142的下游连接G4d、z72或z73，制作抗人F.X抗体H链基因J142-G4d、J142-z72或J142-z73。通过在J300的下游连接z107，制作抗人F.X抗体H链基因J300-z107。通过在MRA-VH的下游连接G1d、z106或z107，制作抗人白介素-6受体抗体H链基因MRA-G1d、MRA-z106或MRA-z107。
将各抗体基因(Q153-G4d、Q153-z7、Q407-z106、J142-G4d、J142-z72、J142-z73、J300-z106、MRA-G1d、MRA-z106、MRA-z107、L180-k、L210-k、MRA-k)插入动物细胞表达载体中。
使用制作的表达载体，将下述抗体转染到FreeStyle293细胞(invitrogen)中，使其一过性表达。如下所示，即将转染的多个抗体基因排列并以抗体名称的形式表示。
MRA-G1d/MRA-k；
MRA-z106/MRA-z107/MRA-k；
Q153-G4d/J142-G4d/L180-k；
Q153-G4d/J142-z72/L180-k；
Q153-z7/J142-z73/L180-k；
Q407-z106/J300-z107/L210-k。
[参考实施例4] 异源二聚化抗体的蛋白A亲和层析的洗脱条件的研究和分离纯化
将使Q153-G4d/J142-G4d/L180-k和Q153-G4d/J142-z72/L180-k一过性表达而得到的FreeStyle293细胞培养液(以下，简记为CM)作为样品，研究蛋白A亲和层析的洗脱条件。在用D-PBS平衡的rProtein A Sepharose Fast Flow柱(GE Healthcare)上负载用φ0.22μm滤器过滤的CM，阶段性地进行表80所示的清洗1、2、洗脱1～5。调节CM的负载量，使负载到柱上的抗体量达到20mg/mL resine。分离收集各条件的洗脱组分，通过阳离子交换层析分析鉴定各洗脱组分中所含的成分。在对照中，将各CM负载到rProtein G SepharoseFast Flow树脂(GE Healthcare)上，使用通过分批洗脱而纯化的样品。由于蛋白G与抗体的Fab部分结合，因此通过使用蛋白G，可以与蛋白A的结合活性无关地纯化CM中存在的所有抗体(两种目标H链进行异源缔合而得到的双特异性抗体(异型抗体)和杂质的1种H链发生同源缔合而得到的单特异性的同型抗体)。
[表80]
平衡化 D-PBS
清洗1 400mM的Arg-HCl/D-PBS
清洗2 20mM的柠檬酸钠，pH5.0
洗脱1 20mM的柠檬酸钠，pH4.0
洗脱2 20mM的柠檬酸钠，pH3.8
洗脱3 20mM的柠檬酸钠，pH3.6
洗脱4 20mM的柠檬酸钠，pH3.4
洗脱5 20mM的柠檬酸钠，pH3.2
进行使Q153-G4d/J142-G4d/L180-k和Q153-G4d/J142-z72/L180-k表达的CM的蛋白A柱的各洗脱组分(洗脱1～5)的阳离子交换层析分析。判明了：在Q153-G4d/J142-G4d/L180-k中，随着从洗脱1组分变成洗脱5组分、即随着洗脱中使用的溶剂的pH的降低，各组分中所含的抗体成分按照从同型抗体J142-G4d/L180-k到异型抗体Q153-G4d/J142-G4d/L180-k、然后是同型抗体Q153-G4d/L180-k的顺序变化。认为洗脱的顺序基于与蛋白A的结合力的强度。即，与在高pH下洗脱的同源二聚体J142-G4d/L180-k (抗FX同型抗体)相比，直至变为低pH仍保持着结合的同型抗体Q153-G4d/L180-k与蛋白A的结合力强。可知可变区J142是不与蛋白A结合的序列。即，同源二聚体J142-G4d/L180-k (抗FX同型抗体)与蛋白A的结合位点有2处，异型抗体Q153-G4d/J142-G4d/L180-k与蛋白A的结合位点有3处，同型抗体Q153-G4d/L180-k (抗FIX同型抗体)与蛋白A的结合位点有4处。因此判明：与蛋白A结合的位点数越多，则与蛋白A的结合就越强，洗脱所必需的pH就越降低。
另一方面，判明了：在Q153-G4d/J142-z72/L180-k中，随着从洗脱1组分变成洗脱5组分，各组分中所含的抗体成分按照异型抗体Q153-G4d/J142-z72/L180-k、然后是同型抗体Q153-G4d/L180-k的顺序变化。在各洗脱组分中几乎没有检测到同型抗体J142-z72/L180-k (抗FX同型抗体)，因此显示与蛋白A的结合缺失。认为是由于导入到J142-z72中的由EU编号第435位的His取代成Arg的突变，所以与蛋白A的结合消失。同型抗体J142-z72/L180-k (抗FX同型抗体)不存在与蛋白A结合的位点，异型抗体Q153-G4d/J142-z72/L180-k有2处，同型抗体Q153-G4d/L180-k (抗FIX同型抗体)有4处。同型抗体J142-z72/L180-k(抗FX同型抗体)没有与蛋白A结合而直接通过，因此在各洗脱组分中均未检测到，另外，Q153-G4d/J142-G4d/L180-k和Q153-G4d/J142-z72/L180-k均显示出在pH3.6及其以下的pH下可以分离异型抗体和同型抗体Q153-G4d/L180-k (抗FIX同型抗体)的可能性。
利用上述研究的纯化条件，使用蛋白A柱层析进行异源二聚化抗体的纯化。
使用以下所示的抗体的CM作为样品：
・Q153-G4d/J142-G4d/L180-k；
・Q153-G4d/J142-z72/L180-k；
・Q153-z7/J142-z73/L180-k；
・Q407-z106/J300-z107/L210-k。
在用D-PBS平衡的rProtein A Sepharose Fast Flow柱(GE Healthcare)上负载用φ0.22μm滤器过滤的CM，进行表81所示的清洗1、2、洗脱1、2 (Q407-z106/J300-z107/L210-k只进行洗脱1)。洗脱条件参考上述的结果。调节CM的负载量，使负载的抗体量达到20mg/mL resine。分离收集各条件的洗脱组分，通过阳离子交换层析分析鉴定各洗脱组分中所含的成分。与上述结果一样，对照使用将各CM负载到rProtein G Sepharose FastFlow树脂(GE Healthcare)上，并通过分批洗脱而纯化的样品。
[表81]
平衡化 D-PBS
清洗1 400mM的Arg-HCl/D-PBS
清洗2 20mM的柠檬酸钠，pH5.0
洗脱1 20mM的柠檬酸钠，pH3.6
洗脱2 20mM的柠檬酸钠，pH2.7
各洗脱组分的阳离子交换层析分析的结果见下表82～85。值是以百分比表示洗脱峰的面积。在Q153-G4d/J142-G4d/L180-k以外的抗体中，在所有洗脱组分中均未检测到抗FX的同型抗体。判明：不仅同型抗体J142-z72 (抗FX的同型抗体)、就连同型抗体J142-z73和J300-z107 (抗FX的同型抗体)也没有与蛋白A结合。认为这是由于：由于导入到抗FX抗体的H链恒定区中的由EU编号第435位的His取代成Arg的突变，所以在抗FX同型抗体中失去了与蛋白A的结合性的缘故。在洗脱1组分中检测到大部分的作为目标双特异性抗体的异型抗体，在洗脱1组分中还检测到微量的抗FIX同型抗体，但大部分在洗脱2中洗脱。与Q153-G4d/J142-z72/L180-k相比，在Q153-z7/J142-z73/L180-k和Q407-z106/J300-z107/L210-k中，作为pH3.6洗脱组分的目标双特异性抗体的异型抗体的比例大幅提高。明确了：除导入由EU编号第435位的His取代成Arg的突变外，还导入用于有效形成各H链的杂分子的由EU编号第356位的Glu取代成Lys的突变和由EU编号第439位的Lys取代成Glu的突变，从而只通过蛋白A纯化步骤，即可将作为目标双特异性抗体的异型抗体纯化至98%以上的纯度。
由上述结果发现：利用同型抗体和异型抗体的蛋白A结合位点数的差异，仅利用蛋白A层析步骤，即可高纯度且有效地分离纯化异型抗体。
[表82]
[表83]
[表84]
[表85]
[参考实施例5] 利用差示扫描型荧光定量法来评价改变抗体的Tm
在本研究中，利用使用Rotor-Gene Q (QIAGEN)的差示扫描型荧光定量法，评价改变抗体的Tm。需要说明的是，已有报道称：本方法与作为抗体的热稳定性评价方法而广为人知的使用差示扫描型量热计的Tm评价显示出良好的相关性(Journal of PharmaceuticalScience 2010; 4: 1707-1720)。
用PBS (Sigma)稀释5000倍浓度的SYPRO orange (Molecular Probes)，之后与抗体溶液混和，从而制备测定样品。将各20μL的各样品加入到测定用管中，以240℃/小时的升温速度从30℃升温至99℃。在470nm (激发波长)/555nm (荧光波长)下检测升温所伴随的荧光变化。
就数据而言，使用Rotor-Gene Q系列软件(QIAGEN)，算出确认到荧光迁移的温度，以该值作为Tm值。
[参考实施例6] 被改变的异型抗体的加速试验
对本实施例中的抗体实施加速试验，进行保存稳定性的比较。
使用包含0.2mM盐酸的PBS，将蛋白A纯化后的各抗体调整至1.0mg/mL，在40℃的恒温槽中保存。在保存开始时、保存2周后、保存4周后，使用G3000 SWXL柱对各抗体进行尺寸排阻层析，观察单体含量。
[参考实施例7] 使用人外周血单核细胞作为效应细胞的各受检抗体的ADCC活性
对于通过仅在抗体单侧的H链中导入改变而使与FcγR的结合活性增强的变体，按照下述方法测定ADCC活性。
使用人外周血单核细胞(以下称作人PBMC。)作为效应细胞，如下测定各受检抗体的ADCC活性。
(1) 人PBMC溶液的制备
使用预先注入了200μl 1000单位/ml的肝素溶液(注射用Novo-Heparin 5000单位；Novo Nordisk)的注射器，自中外制药株式会社所属的健康志愿者(成人男性)采集50ml外周血。将用PBS(-)稀释至2倍的该外周血4等分，之后加入到预先注入15ml Ficoll-PaquePLUS并进行了离心操作的Leucosep淋巴细胞分离管(Greiner bio-one)中。将该分别注入了外周血的分离管以2150rpm的速度在室温下进行10分钟的离心分离操作，之后分离收集单核细胞组分层。用包含10%FBS的Dulbecco’s Modified Eagle’s培养基(SIGMA) (以下称作10%FBS/D-MEM。)清洗该各分层中所含的细胞1次，之后将该细胞悬浮在10%FBS/D-MEM中，使其细胞密度达到5×106个细胞/ml。以该细胞悬浮液作为人PBMC溶液，供给以后的实验。
(2) 靶细胞的制备
从培养皿上剥离使人磷脂酰肌醇聚糖3在SK-Hep-1中强制表达的SK-pca13a，向3×106个细胞中加入1.85MBq的Cr-51。将加入了Cr-51的细胞在5%二氧化碳培养箱中、在37℃下培养1小时，之后用10%FBS/D-MEM清洗细胞1次，将该细胞悬浮在10%FBS/D-MEM中，使其细胞密度达到2×105个细胞/ml。以该细胞悬浮液作为靶细胞，供给以后的实验。
(3) 铬游离试验(ADCC活性)
根据铬释放法的特异性铬游离率评价ADCC活性。首先，在96孔U底板的各孔中分别添加50μl调整成各浓度(0、0.004、0.04、0.4、4、40μg/ml)的抗体溶液。接下来，接种各50μl的(2)中制备的靶细胞(1×104个细胞/孔)，在室温下静置15分钟。将在各孔中加入了各100μl (5×105个细胞/孔) (1)中制备的人PBMC溶液的该板在5%二氧化碳培养箱中、在37℃下静置4小时，之后进行离心操作。使用γ计数器测定该板的各孔中的100μl培养上清的放射活性。根据下式求出特异性铬游离率。
特异性铬游离率(%)＝(A-C)×100/(B-C)
在上式中，A表示各孔中的100μl培养上清的放射活性(cpm)的平均值。B表示在靶细胞中添加了100μl 2%NP-40水溶液(Nonidet P-40、Nacalai Tesques)和50μl 10%FBS/D-MEM培养基的孔中的100μl培养上清的放射活性(cpm)的平均值。而且，C表示在靶细胞中添加了150μl 10%FBS/D-MEM培养基的孔中的100μl培养上清的放射活性(cpm)的平均值。用三份样品进行试验，算出反映各受检抗体的ADCC活性的上述试验中的特异性铬游离率(%)的平均值和标准偏差。
[参考实施例8] FcγR的制备和与FcγR的结合活性的评价
按照下述方法制备FcgR的胞外区。首先，按照本领域技术人员公知的方法进行FcgR的胞外区的基因合成。此时，各FcgR的序列根据录入NCBI中的信息进行制作。具体而言，FcgRI根据NCBI检索号NM_000566.3的序列来制作，FcgRIIa根据NCBI检索号NM_001136219.1的序列来制作，FcgRIIb根据NCBI检索号NM_004001.3的序列来制作，FcgRIIIa根据NCBI检索号NM_001127593.1的序列来制作，FcgRIIIb根据NCBI检索号NM_000570.3的序列来制作，在C末端添加His标记。另外，关于FcgRIIa、FcgRIIIa、FcgRIIIb，它们的多态性已成为已知，关于多态性位点，FcgRIIa的多态性位点参考J. Exp. Med., 1990, 172: 19-25来制作，FcgRIIIa的多态性位点参考J. Clin. Invest., 1997, 100 (5): 1059-1070来制作，FcgRIIIb的多态性位点参考J. Clin. Invest., 1989, 84, 1688-1691来制作。
将得到的基因片段插入动物细胞表达载体中，制作表达载体。所制作的表达载体一过性地导入来自人胚肾癌细胞的FreeStyle293细胞(Invitrogen公司)中，使目标蛋白表达。需要说明的是，关于用于晶体结构分析的FcgRIIb，在终浓度为10μg/mL的Kifunesine的存在下使目标蛋白表达，使添加在FcgRIIb中的糖链形成高甘露糖型。进行培养，回收所得的培养上清，之后通过0.22μm滤器，得到培养上清。得到的培养上清原则上通过以下4个步骤进行纯化。步骤1进行阳离子交换柱层析(SP Sepharose FF)、步骤2对His标记进行亲和柱层析(HisTrap HP)、步骤3进行凝胶过滤柱层析(Superdex200)、步骤4进行无菌过滤。其中，关于FcgRI，在步骤1中进行使用Q sepharose FF的阴离子交换柱层析。关于已纯化的蛋白，使用分光光度计测定280nm的吸光度，使用通过PACE等方法由所得的值算出的吸光系数，算出纯化蛋白的浓度(蛋白Science 1995; 4: 2411-2423)。
使用Biacore T100、Biacore T200、Biacore A100或Biacore 4000 (GEHealthcare)，进行目标抗体与FcγR的相互作用分析。运行缓冲液使用HBS-EP+(GEHealthcare)，测定温度为25℃。传感器芯片使用通过胺偶联法将抗原肽固定在S系列传感器芯片CM5 (GE Healthcare)上而得到的芯片、使预先进行了生物素化的抗原肽与S系列传感器芯片SA (certified) (GE Healthcare)发生相互作用并固定在其上而得到的芯片、将蛋白L (ACTIGEN, BioVision)固定在S系列传感器芯片CM5 (GE Healthcare)上而得到的芯片、或者将蛋白A/G (Thermo Scientific)固定在S系列传感器芯片CM5 (GEHealthcare)上而得到的芯片。将目标抗体捕获到这些芯片上，使经运行缓冲液稀释的各FcγR与其发生相互作用。通过使10mM的甘氨酸-HCl (pH1.5)发生反应，清洗芯片上所捕获的抗体，将芯片再生后反复利用。
关于各抗体与FcγR的结合活性，主要以与FcγR的结合活性和与FcγR的解离常数为指标进行评价。
与FcγR的结合活性是指相对于FcγR的相对结合活性。关于相对于FcγR的相对结合活性，以各测定时作为对照的样品的结合活性为100(%)，算出其他抗体的结合活性。这里所说的结合活性，采用用反映使FcγR与捕获的抗体相互作用前后的传感图的变化量除以各抗体的捕获量而得到的值。这是由于FcγR的结合活性取决于所捕获的抗体的量。
各抗体与FcγR的解离常数通过对Biacore的测定结果进行动力学分析而算出。具体而言，将通过Biacore评价软件测定得到的传感图按照1:1 Langmuir结合模型进行整体拟合，由此算出结合速度常数ka (L/mol/s)、解离速度常数kd (1/s)，由其值算出解离常数KD (mol/L)。
[参考实施例9] 使用人外周血单核细胞作为效应细胞的各受检抗体的ADCC活性
关于应用了Fc改变的各变体，按照下述方法测定ADCC活性。
使用人外周血单核细胞(以下称作人PBMC。)作为效应细胞，如下测定各受检抗体的ADCC活性。
(1) 人PBMC溶液的制备
使用预先注入了200μl 1000单位/ml的肝素溶液(注射用Novo- Heparin 5000单位；Novo Nordisk)的注射器，自中外制药株式会社所属的健康志愿者(成人男性)体采集50ml外周血。将用PBS(-)稀释至2倍的该外周血4等分，之后加入到预先注入15ml Ficoll-Paque PLUS并进行了离心操作的Leucosep淋巴细胞分离管(Greiner bio-one)中。分别注入有该外周血的分离管以2150rpm的速度在室温下进行10分钟的离心分离操作，之后分离收集单核细胞组分层。用包含10%FBS的Dulbecco’s Modified Eagle’s培养基(SIGMA) (以下称作10%FBS/D-MEM。)清洗该各分层中所含的细胞1次，之后将该细胞悬浮在10%FBS/D-MEM中，使其细胞密度达到5×106个细胞/ml或2.5×106细胞/ml。以该细胞悬浮液作为人PBMC溶液，供给以后的实验。
(2) 靶细胞的制备
从培养皿上剥离使人外调蛋白在SK-Hep-1中强制表达的SK-pca13a或SKE18或人大肠癌株DLD-1或人胰腺癌细胞株MIAPaCa-2，每1×106个细胞中加入200μL 0.2mg/mL的钙黄绿素溶液或者在3×106个细胞中加入1.85MBq的Cr-51。将加入了钙黄绿素溶液或Cr-51的细胞在5%二氧化碳培养箱中、在37℃下培养1-2小时，之后用10%FBS/D-MEM清洗细胞1次，将该细胞悬浮在10%FBS/D-MEM中，使其细胞密度达到2×105个细胞/ml。将该细胞悬浮液作为靶细胞，供给以后的实验。
(3-1) 钙黄绿素或铬游离试验(ADCC活性)
根据钙黄绿素或铬释放法的特异性钙黄绿素或铬游离率，评价ADCC活性。首先，在96孔U底板的各孔中添加各50μl调整至各浓度(0、0.004、0.04、0.4、4、40μg/ml)的抗体溶液。接下来，接种各50μl的(2)中制备的靶细胞(1×104个细胞/孔)，在室温下静置15分钟。将各孔中加入有各100μl的(1)中制备的人PBMC溶液(5×105个细胞/孔或2.5×105个细胞/孔)的该板在5%二氧化碳培养箱中、在37℃下静置4小时，之后进行离心操作。使用吸光光度计或γ计数器测定该板的各孔中的100μl培养上清的钙黄绿素荧光或放射活性。根据下式求出特异性的钙黄绿素或铬游离率。
特异性的钙黄绿素或铬游离率(%)＝(A-C)×100/(B-C)
在上式中，A表示各孔中的100μl培养上清的钙黄绿素荧光(激发波长为485nm、荧光波长为535nm)或放射活性(cpm)的平均值。另外，B表示在靶细胞中添加了100μl 2%NP-40水溶液(Nonidet P-40、Nacalai Tesques)和50μl 10%FBS/D-MEM培养基的孔中的100μl培养上清的钙黄绿素荧光(激发波长为485nm、荧光波长为535nm)或放射活性(cpm)的平均值。而且，C表示在靶细胞中添加了150μl 10%FBS/D-MEM培养基的孔中的100μl培养上清的钙黄绿素荧光(激发波长为485nm、荧光波长为535nm)或放射活性(cpm)的平均值。用三份样品进行试验，算出反映各受检抗体的ADCC活性的上述试验中的特异性的钙黄绿素或铬游离率(%)的平均值和标准偏差。
产业实用性
根据本发明，可以提供通过改变抗体的恒定区的氨基酸序列，使得结合活性得以改变、以及物性(例如、安全性、均匀性)得以改善的适合用于医药品的多肽。

Claims (16)

1.多肽，是以由包含第一多肽和第二多肽的异源二聚体构成为特征的多肽，其中上述第一多肽和第二多肽的任一方包含导入有下述(i)或(ii)所述突变的Fc区，另一方导入有下述(iii)所述突变，与包含未导入突变的Fc区的多肽相比，Fc区的功能被改变，
(i)EU编号第234位的氨基酸为L、S、F、E、V、D、Q、I、M、T、A、G或H，EU编号第235位的氨基酸为Y或Q，EU编号第236位的氨基酸为W，EU编号第239位的氨基酸为M或I，EU编号第268位的氨基酸为D，EU编号第298位的氨基酸为A，以及EU编号第327位的氨基酸为D；
(ii)EU编号第234位的氨基酸为L、S、F、E、V、D、Q、I、M、T、A、G或H，EU编号第235位的氨基酸为Y或Q，EU编号第236位的氨基酸为W，EU编号第239位的氨基酸为M或I，EU编号第268位的氨基酸为D，EU编号第270位的氨基酸为E，以及EU编号第298位的氨基酸为A；
(iii)EU编号第270位的氨基酸为E，EU编号第326位的氨基酸为D，EU编号第330位的氨基酸为A、K、M、F、I、Y或H，以及EU编号第334位的氨基酸为E，并且
其中，所述第一多肽和所述第二多肽中的任一个包含导入有选自下述(a)至(aj)的突变组合的Fc区，
(a)根据EU编号,第234位的氨基酸是E；第235位的氨基酸是Y；第236位的氨基酸是W；第239位的氨基酸是M；第268位的氨基酸是D；第298位的氨基酸是A；并且第327位的氨基酸是D；
(b)根据EU编号,第234位的氨基酸是S；第235位的氨基酸是Y；第236位的氨基酸是W；第239位的氨基酸是M；第268位的氨基酸是D；第298位的氨基酸是A；并且第327位的氨基酸是D；
(c)根据EU编号,第234位的氨基酸是L；第235位的氨基酸是Q；第236位的氨基酸是W；第239位的氨基酸是M；第268位的氨基酸是D；第270位的氨基酸是E；并且第298位的氨基酸是A；
(d)根据EU编号,第234位的氨基酸是L；第235位的氨基酸是Y；第236位的氨基酸是W；第239位的氨基酸是M；第268位的氨基酸是D；第298位的氨基酸是A；并且第327位的氨基酸是D；
(e)根据EU编号,第234位的氨基酸是S；第235位的氨基酸是Q；第236位的氨基酸是W；第239位的氨基酸是M；第268位的氨基酸是D；第270位的氨基酸是E；并且第298位的氨基酸是A；
(f)根据EU编号,第234位的氨基酸是F；第235位的氨基酸是Q；第236位的氨基酸是W；第239位的氨基酸是M；第268位的氨基酸是D；第270位的氨基酸是E；并且第298位的氨基酸是A；
(g)根据EU编号,第234位的氨基酸是E；第235位的氨基酸是Q；第236位的氨基酸是W；第239位的氨基酸是M；第268位的氨基酸是D；第270位的氨基酸是E；并且第298位的氨基酸是A；
(h)根据EU编号,第234位的氨基酸是F；第235位的氨基酸是Y；第236位的氨基酸是W；第239位的氨基酸是M；第268位的氨基酸是D；第298位的氨基酸是A；并且第327位的氨基酸是D；
(i)根据EU编号,第234位的氨基酸是V；第235位的氨基酸是Q；第236位的氨基酸是W；第239位的氨基酸是M；第268位的氨基酸是D；第270位的氨基酸是E；并且第298位的氨基酸是A；
(j)根据EU编号,第234位的氨基酸是D；第235位的氨基酸是Q；第236位的氨基酸是W；第239位的氨基酸是M；第268位的氨基酸是D；第270位的氨基酸是E；并且第298位的氨基酸是A；
(k)根据EU编号,第234位的氨基酸是Q；第235位的氨基酸是Q；第236位的氨基酸是W；第239位的氨基酸是M；第268位的氨基酸是D；第270位的氨基酸是E；并且第298位的氨基酸是A；
(l)根据EU编号,第234位的氨基酸是I；第235位的氨基酸是Q；第236位的氨基酸是W；第239位的氨基酸是M；第268位的氨基酸是D；第270位的氨基酸是E；并且第298位的氨基酸是A；
(m)根据EU编号,第234位的氨基酸是M；第235位的氨基酸是Q；第236位的氨基酸是W；第239位的氨基酸是M；第268位的氨基酸是D；第270位的氨基酸是E；并且第298位的氨基酸是A；
(n)根据EU编号,第234位的氨基酸是T；第235位的氨基酸是Q；第236位的氨基酸是W；第239位的氨基酸是M；第268位的氨基酸是D；第270位的氨基酸是E；并且第298位的氨基酸是A；
(o)根据EU编号,第234位的氨基酸是A；第235位的氨基酸是Q；第236位的氨基酸是W；第239位的氨基酸是M；第268位的氨基酸是D；第270位的氨基酸是E；并且第298位的氨基酸是A；
(p)根据EU编号,第234位的氨基酸是G；第235位的氨基酸是Q；第236位的氨基酸是W；第239位的氨基酸是M；第268位的氨基酸是D；第270位的氨基酸是E；并且第298位的氨基酸是A；
(q)根据EU编号,第234位的氨基酸是H；第235位的氨基酸是Q；第236位的氨基酸是W；第239位的氨基酸是M；第268位的氨基酸是D；第270位的氨基酸是E；并且第298位的氨基酸是A；
(r)根据EU编号,第234位的氨基酸是V；第235位的氨基酸是Y；第236位的氨基酸是W；第239位的氨基酸是M；第268位的氨基酸是D；第298位的氨基酸是A；并且第327位的氨基酸是D；
(s)根据EU编号,第234位的氨基酸是D；第235位的氨基酸是Y；第236位的氨基酸是W；第239位的氨基酸是M；第268位的氨基酸是D；第298位的氨基酸是A；并且第327位的氨基酸是D；
(t)根据EU编号,第234位的氨基酸是Q；第235位的氨基酸是Y；第236位的氨基酸是W；第239位的氨基酸是M；第268位的氨基酸是D；第298位的氨基酸是A；并且第327位的氨基酸是D；
(u)根据EU编号,第234位的氨基酸是I；第235位的氨基酸是Y；第236位的氨基酸是W；第239位的氨基酸是M；第268位的氨基酸是D；第298位的氨基酸是A；并且第327位的氨基酸是D；
(v)根据EU编号,第234位的氨基酸是M；第235位的氨基酸是Y；第236位的氨基酸是W；第239位的氨基酸是M；第268位的氨基酸是D；第298位的氨基酸是A；并且第327位的氨基酸是D；
(w)根据EU编号,第234位的氨基酸是T；第235位的氨基酸是Y；第236位的氨基酸是W；第239位的氨基酸是M；第268位的氨基酸是D；第298位的氨基酸是A；并且第327位的氨基酸是D；
(x)根据EU编号,第234位的氨基酸是A；第235位的氨基酸是Y；第236位的氨基酸是W；第239位的氨基酸是M；第268位的氨基酸是D；第298位的氨基酸是A；并且第327位的氨基酸是D；
(y)根据EU编号,第234位的氨基酸是G；第235位的氨基酸是Y；第236位的氨基酸是W；第239位的氨基酸是M；第268位的氨基酸是D；第298位的氨基酸是A；并且第327位的氨基酸是D；
(z)根据EU编号,第234位的氨基酸是H；第235位的氨基酸是Y；第236位的氨基酸是W；第239位的氨基酸是M；第268位的氨基酸是D；第298位的氨基酸是A；并且第327位的氨基酸是D；
(aa)根据EU编号,第234位的氨基酸是F；第235位的氨基酸是Q；第236位的氨基酸是W；第239位的氨基酸是I；第268位的氨基酸是D；第270位的氨基酸是E；并且第298位的氨基酸是A；
(ab)根据EU编号,第234位的氨基酸是E；第235位的氨基酸是Q；第236位的氨基酸是W；第239位的氨基酸是I；第268位的氨基酸是D；第270位的氨基酸是E；并且第298位的氨基酸是A；
(ac)根据EU编号,第234位的氨基酸是D；第235位的氨基酸是Q；第236位的氨基酸是W；第239位的氨基酸是I；第268位的氨基酸是D；第270位的氨基酸是E；并且第298位的氨基酸是A；
(ad)根据EU编号,第234位的氨基酸是V；第235位的氨基酸是Y；第236位的氨基酸是W；第239位的氨基酸是I；第268位的氨基酸是D；第298位的氨基酸是A；并且第327位的氨基酸是D；
(ae)根据EU编号,第234位的氨基酸是I；第235位的氨基酸是Y；第236位的氨基酸是W；第239位的氨基酸是I；第268位的氨基酸是D；第298位的氨基酸是A；并且第327位的氨基酸是D；
(af)根据EU编号,第234位的氨基酸是L；第235位的氨基酸是Y；第236位的氨基酸是W；第239位的氨基酸是I；第268位的氨基酸是D；第298位的氨基酸是A；并且第327位的氨基酸是D；
(ag)根据EU编号,第234位的氨基酸是E；第235位的氨基酸是Y；第236位的氨基酸是W；第239位的氨基酸是I；第268位的氨基酸是D；第298位的氨基酸是A；并且第327位的氨基酸是D；
(ah)根据EU编号,第234位的氨基酸是D；第235位的氨基酸是Y；第236位的氨基酸是W；第239位的氨基酸是I；第268位的氨基酸是D；第298位的氨基酸是A；并且第327位的氨基酸是D；
(ai)根据EU编号,第234位的氨基酸是F；第235位的氨基酸是Y；第236位的氨基酸是W；第239位的氨基酸是I；第268位的氨基酸是D；第298位的氨基酸是A；并且第327位的氨基酸是D；和
(aj)根据EU编号,第234位的氨基酸是T；第235位的氨基酸是Y；第236位的氨基酸是W；第239位的氨基酸是I；第268位的氨基酸是D；第298位的氨基酸是A；并且第327位的氨基酸是D；
并且另一条多肽导入有选自下述(ak)至(aq)的突变组合：
(ak)根据EU编号,第270位的氨基酸是E；第326位的氨基酸是D；第330位的氨基酸是K；并且第334位的氨基酸是E；
(al)根据EU编号,第270位的氨基酸是E；第326位的氨基酸是D；第330位的氨基酸是M；并且第334位的氨基酸是E；
(am)根据EU编号,第270位的氨基酸是E；第326位的氨基酸是D；第330位的氨基酸是A；并且第334位的氨基酸是E；
(an)根据EU编号,第270位的氨基酸是E；第326位的氨基酸是D；第330位的氨基酸是F；并且第334位的氨基酸是E；
(ao)根据EU编号,第270位的氨基酸是E；第326位的氨基酸是D；第330位的氨基酸是I；并且第334位的氨基酸是E；
(ap)根据EU编号,第270位的氨基酸是E；第326位的氨基酸是D；第330位的氨基酸是Y；并且第334位的氨基酸是E；和
(aq)根据EU编号,第270位的氨基酸是E；第326位的氨基酸是D；第330位的氨基酸是H；并且第334位的氨基酸是E。
2.权利要求1所述的多肽，其中所述多肽是以下(A)至(D)中任一个：
(A)所述第一多肽和所述第二多肽中的任一个包含导入有选自权利要求1中(a)至(h)、(r)至(z)和(ad)至(aj)的突变组合的Fc区；并且另一条多肽导入有权利要求1中的突变组合(ak)；
(B)所述第一多肽和所述第二多肽中的任一个包含导入有选自权利要求1中(f),(g),(j),(aa),(ab),和(ac)的突变组合的Fc区；并且另一条多肽导入有权利要求1中的突变组合(an)；
(C)所述第一多肽和所述第二多肽中的任一个包含导入有选自权利要求1中(c),(e)至(g),和(i)至(q)的突变组合的Fc区；并且另一条多肽导入有权利要求1中的突变组合(al)；或
(D)所述第一多肽和所述第二多肽中的任一个包含导入有选自权利要求1中(c),(e)至(h),和(aa)至(ac)的突变组合的Fc区；并且另一条多肽导入有权利要求1中的突变组合(am)。
3.权利要求1或2所述的多肽，其特征在于：上述Fc区的功能改变是选自与多肽的Fcγ受体的结合活性增强、结合活性减弱、以及结合活性的选择性提高的至少一个以上的改变。
4.权利要求3所述的多肽，其特征在于：上述Fcγ受体为选自FcγRIa、FcγRIIa R、FcγRIIa H、FcγRIIb、FcγRIIIa F和FcγRIIIa V的至少一个以上的受体。
5.权利要求3或4所述的多肽，其特征在于：上述Fc区的功能改变是指与Fcγ受体的结合活性的选择性提高。
6.权利要求5所述的多肽，其特征在于：上述与Fcγ受体的结合活性的选择性提高是指活性型Fcγ受体和抑制型Fcγ受体之间的选择性。
7.权利要求6所述的多肽，其特征在于：在上述Fcγ受体中，活性型Fcγ受体为选自FcγRIa、FcγRIIa R、FcγRIIa H、FcγRIIIa F和FcγRIIIa V的至少一个以上的受体，抑制型Fcγ受体为FcγRIIb。
8.权利要求6或7所述的多肽，其特征在于：和上述与抑制型Fcγ受体的结合活性相比，上述与活性型Fcγ受体的结合活性选择性地增强。
9.权利要求1～8中任一项所述的多肽，其中，进一步导入有用于对第一多肽和第二多肽的等电点赋予差异的氨基酸改变。
10.权利要求9所述的多肽，其中，用于赋予等电点的差异的氨基酸改变的特征在于：在第一多肽和/或第二多肽的氨基酸序列中，在选自EU编号第137位的Gly、第138位的Gly、第139位的Thr、第147位的Lys、第192位的Ser、第193位的Leu、第196位的Gln、第198位的Tyr、第199位的Ile、第203位的Asn、第214位的Lys、第231位的Ala、第233位的Glu、第242位的Leu、第263位的Val、第272位的Glu、第274位的Lys、第278位的Tyr、第288位的Lys、第290位的Lys、第316位的Gly、第317位的Lys、第320位的Lys、第324位的Lys、第335位的Thr、第337位的Ser、第338位的Lys、第340位的Lys、第341位的Gly、第358位的Leu、第360位的Lys、第362位的Gln、第364位的Ser、第383位的Ser、第384位的Asn、第385位的Gly、第386位的Gln、第387位的Pro、第390位的Asn、第397位的Val和第422位的Val的氨基酸位点导入有至少一个氨基酸突变。
11.权利要求10所述的多肽，其中，用于赋予等电点的差异的氨基酸改变的特征在于：在第一多肽或第二多肽的任一方多肽的氨基酸序列中，导入有选自EU编号第196位的Gln、第199位的Ile、第231位的Ala、第233位的Glu、第242位的Leu、第263位的Val、第272位的Glu、第316位的Gly、第358位的Leu、第364位的Ser、第383位的Ser、第387位的Pro和第397位的Val的至少一个以上的氨基酸突变；在另一方多肽的氨基酸序列中，导入有选自EU编号第137位的Gly、第138位的Gly、第139位的Thr、第147位的Lys、第192位的Ser、第193位的Leu、第198位的Tyr、第199位的Ile、第203位的Asn、第214位的Lys、第274位的Lys、第278位的Tyr、第288位的Lys、第290位的Lys、第316位的Gly、第317位的Lys、第320位的Lys、第324位的Lys、第335位的Thr、第337位的Ser、第338位的Lys、第340位的Lys、第341位的Gly、第358位的Leu、第360位的Lys、第362位的Gln、第383位的Ser、第384位的Asn、第385位的Gly、第386位的Gln、第390位的Asn和第422位的Val的至少一个氨基酸突变。
12.权利要求1～11中任一项所述的多肽，其特征在于：上述多肽为抗原结合分子。
13.权利要求12所述的多肽，其特征在于：上述抗原结合分子为抗体、双特异性抗体、肽Fc融合蛋白、或支架Fc融合蛋白等Fc融合分子。
14.药物组合物，其包含权利要求1～13中任一项所述的多肽和医学上可接受的载体。
15.改变多肽的功能的方法，是改变包含Fc区的多肽的功能的方法，该方法包括下述步骤：通过向构成该Fc区的第一多肽和/或第二多肽中导入氨基酸突变，使该Fc区形成异源二聚体，通过权利要求1或2所述的氨基酸突变的导入，与该Fc区形成同源二聚体时相比，改变Fc区的功能。
16.制备包含Fc区的多肽的方法，是制备包含Fc区的多肽的方法，该方法包括下述步骤：通过向构成该Fc区的第一多肽和/或第二多肽中导入氨基酸突变，使该Fc区形成异源二聚体，通过权利要求1或2所述的氨基酸突变的导入，与该Fc区形成同源二聚体时相比，改变Fc区的功能。
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