KR20150097786A - 헤테로이량화 폴리펩티드 - Google Patents

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Abstract

본 발명자들은 아미노산 서열이 상이한 2개의 폴리펩티드(제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드)로 이루어지는 Fc영역을 갖는 헤테로이량화 폴리펩티드를 제작함으로써, 종래기술인 Fc영역이 제1 폴리펩티드만으로 이루어지는 호모이량화체 또는 제2 폴리펩티드만으로 이루어지는 호모이량화체와 비교하여 기능이 개선된 Fc영역을 포함하는 헤테로이량화 폴리펩티드를 제작하는 것에 성공하였다.

Description

헤테로이량화 폴리펩티드{Heterodimerized polypeptide}
본 발명은 천연 유래의 항체 불변영역으로부터 아미노산 서열이 개변된 항체 불변영역, 그 불변영역을 포함하는 항체, 그 항체를 포함하는 의약 조성물 및 그들의 제조방법을 제공한다.
항체는 혈중에서의 안정성이 높고 부작용도 적은 것으로부터 의약품으로서 주목되고 있다(비특허문헌 1, 비특허문헌 2). 현재 시판되고 있는 항체 의약의 대부분이 인간 IgG1 서브클래스의 항체이다. IgG 클래스의 항체의 이펙터 기능인 항체 의존성 세포상해활성(이하, ADCC로 표기한다), 보체 의존성 세포상해활성(이하, CDC로 표기한다)에 대해서는 지금까지 다수의 연구가 행해져, 인간 IgG 클래스에서는 IgG1 서브클래스의 항체가 가장 높은 ADCC 활성, CDC 활성을 갖는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 3). 또한 IgG 클래스의 항체를 매개로 한 표적 세포의 식세포작용(phagocytosis)인 항체 의존성 세포 개재성 식세포작용(ADCP)도 항체의 이팩터 기능의 하나로서 나타내어져 있다(비특허문헌 4, 비특허문헌 5).
IgG 항체의 ADCC, CDC, ADCP의 발현에는 항체 Fc영역과, 킬러 세포, 내츄럴킬러 세포, 활성화된 마크로파지 등의 이펙터 세포 표면 상에 존재하는 항체 수용체(이하, FcγR로 표기한다) 및 각종 보체 성분의 결합이 필요하다. 인간의 경우는 FcγR의 단백질 패밀리에는 FcγRIa, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa, FcγRIIIb의 아이소폼이 보고되어 있고, 각각의 알로타입도 보고되어 있다(비특허문헌 6).
ADCC, ADCP 및 CDC 등의 세포상해성 이펙터 기능의 증강은 항체의 항종양효과를 증강시키기 위한 유망한 수단으로서 주목되고 있다. 항체의 항종양효과를 위한 FcγR을 매개로 한 이펙터 기능의 중요성은 마우스 모델을 사용하여 보고되어 있다(비특허문헌 7, 비특허문헌 8). 또한 인간에 있어서의 임상효과와 FcγRIIIa의 고친화성 다형 알로타입(V158)과 저친화성 다형 알로타입(F158) 사이에는 상관관계가 관찰되었다(비특허문헌 9). 이들 보고로부터, 특정 FcγR에 대한 결합을 최적화한 Fc영역을 갖는 항체는 보다 강력한 이펙터 기능을 매개하여 그것에 의해 효과적인 항종양효과를 발휘하는 것이 나타내어진다.
FcγRIa, FcγRIIa, FcγRIIIa, FcγRIIIb로 이루어지는 활성화 수용체, FcγRIIb로 이루어지는 저해성 수용체의 각각에 대한 항체의 결합활성의 균형은 항체의 이펙터 기능을 최적화하는 데 있어서 중요한 요소이다. 활성화 수용체에 대한 결합활성을 증강시키고 저해성 수용체에 대해서는 결합활성을 저감시킨 Fc영역을 사용함으로써, 최적의 이펙터 기능을 항체에 부여할 수 있을 가능성이 있다(비특허문헌 10). 또한 반대로 활성화 수용체에 대한 결합활성을 유지 또는 저감시키고 저해성 수용체에 대해서는 결합활성을 증강시킨 Fc영역을 사용함으로써, 면역 억제작용을 항체에 부여할 수 있을 가능성이 있다(비특허문헌 11). Fc영역과 FcγR의 결합에 대해서는 항체의 힌지영역 및 CH2 도메인 내의 몇개의 아미노산 잔기 및 CH2 도메인 내의 EU 넘버링 297번째의 Asn에 부가되는 당쇄가 중요한 것이 나타내어져 있다(비특허문헌 12, 비특허문헌 13, 비특허문헌 14). 이 결합 개소를 중심으로 지금까지 다양한 FcγR 결합특성을 갖는 Fc영역의 변이체가 연구되어, 보다 높은 활성화 FcγR 결합활성을 갖는 Fc영역 변이체가 얻어지고 있다(특허문헌 1, 특허문헌 2). 예를 들면 Lazar들은 인간 IgG1의 EU 넘버링 239번째의 Ser, 330의 Ala, 332의 Ile를 각각 Asp, Leu, Glu로 치환함으로써, 인간 FcγRIIIa(V158)로의 결합을 약 370배까지 증가시키는 것에 성공하고 있다(비특허문헌 15, 특허문헌 2). 이 개변체는 야생형과 비교하여 FcγRIIIa와 FcγRIIb에 대한 결합의 비(A/I비)가 약 9배가 되어 있다. 또한 Lazar들은 FcγRIIb에 대한 결합을 약 430배 증강시키는 것에도 성공하고 있다(비특허문헌 16). Shinkawa들은 EU 넘버링 297번째의 Asn에 부가되는 당쇄인 푸코오스를 결손시킴으로써 FcγRIIIa에 대한 결합을 약 100배까지 증가시키는 것에 성공하고 있다(비특허문헌 17).
전술한 방법은 항체의 양 H쇄의 Fc영역에 동일한 아미노산 개변 또는 동일한 당쇄 수식을 도입하고 있다. 그 한편으로 항체의 Fc영역은 FcγR과 1:1로 결합하여 FcγR을 lower hinge 및 CH2영역에서 비대칭으로 인식하고 있는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 18). Fc영역이 FcγR과 비대칭으로 상호작용하는 것을 고려하면, 각 H쇄에 상이한 개변을 도입한 쪽이 IgG와 FcγR의 상호작용을 보다 정밀하게 최적화하는 것이 가능하다고 생각된다. 이 착상을 토대로 항체의 각 H쇄의 Fc영역에 상이한 개변을 가하고 비대칭으로 Fc영역을 수식함으로써 FcγR과의 상호작용을 최적화하는 방법도 보고되어 있다(특허문헌 5, 특허문헌 6). 그러나 비대칭으로 최적화된 Fc영역은 대칭으로 최적화된 Fc영역과 비교하여 반드시 우수한 FcγRIIIa 결합활성을 나타내고 있지는 않다(특허문헌 5). 도입하는 개변의 종류에 따라서는 비대칭으로 Fc영역을 최적화함으로써 FcγRIIIa에 대한 결합을 천연형 IgG와 비교하여 수십 배 증강시켜 ADCC 활성을 증강시키는 것에 성공하고 있는 한편, 종래기술에 의해 제작된 양 H쇄의 N형 당쇄로부터 푸코오스를 제거한 아푸코실화 항체와 비교하여 ADCC 활성은 같은 정도거나 또는 그보다도 약한 활성만 나타내고 있다(특허문헌 6).
WO 2000/042072 WO 2006/019447 WO 2009/041062 WO 2006/106905 WO 2012/058768 WO 2012/125850
Nature Biotechnology, 23, 1073 - 1078(2005) Eur. J. Pharm. Biopharm, 59(3), 389-96(2005) Chemical Immunology, 65, 88(1997) Cancer Res., 68, 8049-8057(2008) Blood, 113, 3735-3743(2009) Immunol. Lett. 82, 57-65(2002) Pro. Nat. Acad. Sci. 95:652-656(1998) Nature Medicine, 6: 443-446(2000) Blood 99:754-758(2002) Science, 310, 1510-1512(2005) Science, 291, 484-486(2001) Chemical Immunology, 65, 88(1997) Eur. J. Immunol. 23, 1098(1993) Immunology, 86, 319(1995) Pro. Nat. Acad. Sci., 103, 4005-4010(2006) Mol. Immun. 45, 3926-3933(2008) J. Biol. Chem., 278, 3466-3473(2003) J. Biol. Chem., 276: 16469-16477(2001)
본 발명은 이러한 상황을 감안하여 이루어진 것으로, 그 과제는 종래기술인 Fc영역을 갖는 호모이량화 폴리펩티드와 비교하여 Fc영역의 기능이 개선된 폴리펩티드, 그 폴리펩티드를 함유하는 의약 조성물, 그 의약 조성물을 함유하는 면역 염증성 질환의 치료제 또는 예방제, 각종 암의 치료제 또는 예방제 및 이들의 제조방법을 제공하는 것에 있다. 또한 본 발명의 과제는 종래기술인 Fc영역을 갖는 호모이량화 폴리펩티드와 비교하여 Fc영역의 기능을 개선하는 방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구를 행하였다. 그 결과, 본 발명자들은 아미노산 서열이 상이한 2개의 폴리펩티드(제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드)로 이루어지는 Fc영역을 갖는 헤테로이량화 폴리펩티드를 제작함으로써, 종래기술인 Fc영역이 제1 폴리펩티드만으로 이루어지는 호모이량화체 또는 제2 폴리펩티드만으로 이루어지는 호모이량화체와 비교하여 기능이 개선된 Fc영역을 포함하는 헤테로이량화 폴리펩티드를 제작하는 것에 성공하였다.
본 발명은 보다 구체적으로는 아래의 〔1〕내지〔25〕를 제공하는 것이다.
〔1〕제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 헤테로이량화체에 의해 구성되어 있는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드로서, 그 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드 중 어느 한쪽이 (i) 또는 (ii)에 기재된 변이가 도입되어 있는 Fc영역을 포함하고, 변이가 도입되어 있지 않은 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 Fc영역의 기능이 개변되어 있는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드：
(i) EU 넘버링 234번째의 아미노산이 L, S, F, E, V, D, Q, I, M, T, A, G 또는 H, 235번째의 아미노산이 Y 또는 Q, 236번째의 아미노산이 W, 239번째의 아미노산이 M 또는 I, 268번째의 아미노산이 D 및 298번째의 아미노산이 A
(ii) EU 넘버링 270번째의 아미노산이 E, 326번째의 아미노산이 D, 330번째의 아미노산이 A, K, M, F, I, Y 또는 H 및 334번째의 아미노산이 E
〔2〕상기 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드 중 어느 한쪽이 (i) 또는 (ii)에 기재된 변이가 도입되어 있는 Fc영역을 포함하고, 다른 한쪽이 (iii)에 기재된 변이가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는, 〔1〕에 기재된 폴리펩티드：
(i) EU 넘버링 234번째의 아미노산이 L, S, F, E, V, D, Q, I, M, T, A, G 또는 H, 235번째의 아미노산이 Y 또는 Q, 236번째의 아미노산이 W, 239번째의 아미노산이 M 또는 I, 268번째의 아미노산이 D, 298번째의 아미노산이 A 및 327번째의 아미노산이 D
(ii) EU 넘버링 234번째의 아미노산이 L, S, F, E, V, D, Q, I, M, T, A, G 또는 H, 235번째의 아미노산이 Y 또는 Q, 236번째의 아미노산이 W, 239번째의 아미노산이 M 또는 I, 268번째의 아미노산이 D, 270번째의 아미노산이 E 및 298번째의 아미노산이 A
(iii) EU 넘버링 270번째의 아미노산이 E, 326번째의 아미노산이 D, 330번째의 아미노산이 A, K, M, F, I, Y 또는 H 및 334번째의 아미노산이 E
〔3〕상기〔2〕(i)의 EU 넘버링 234번째의 아미노산이 E, D, T 또는 L인, 〔2〕에 기재된 폴리펩티드.
〔4〕상기〔2〕(ii)의 EU 넘버링 234번째의 아미노산이 L, F, E 또는 D인, 〔2〕에 기재된 폴리펩티드.
〔5〕상기〔2〕(i)의 EU 넘버링 234번째의 아미노산이 V, I, T, M 또는 L인, 〔2〕에 기재된 폴리펩티드.
〔6〕상기〔2〕(i)의 EU 넘버링 234번째의 아미노산이 V, E, D, T, I, L 또는 F 및 239번째의 아미노산이 M 또는 I이고, (iii)의 EU 넘버링 330번째의 아미노산이 A 또는 K인, 〔2〕에 기재된 폴리펩티드.
〔7〕상기〔2〕(ii)의 EU 넘버링 234번째의 아미노산이 F, E, D, S 또는 L 및 239번째의 아미노산이 M 또는 I이고, (iii)의 EU 넘버링 330번째의 아미노산이 A, F 또는 K인, 〔2〕에 기재된 폴리펩티드.
〔8〕상기 Fc영역의 기능의 개변이 폴리펩티드의 Fcγ 수용체에 대한 결합활성의 증강, 결합활성의 약화 및 결합활성의 선택성의 향상으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 개변인 것을 특징으로 하는, 〔1〕내지〔7〕중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드.
〔9〕상기 Fcγ 수용체가 FcγRIa, FcγRIIa R, FcγRIIa H, FcγRIIb, FcγRIIIaF 및 FcγRIIIaV로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 수용체인 것을 특징으로 하는, 〔8〕에 기재된 폴리펩티드.
〔10〕상기 Fc영역의 기능의 개변이 Fcγ 수용체에 대한 결합활성의 선택성의 향상인 것을 특징으로 하는, 〔8〕또는〔9〕에 기재된 폴리펩티드.
〔11〕상기 Fcγ 수용체에 대한 결합활성의 선택성의 향상이 활성형 Fcγ 수용체와 저해형 Fcγ 수용체 사이의 선택성인 것을 특징으로 하는, 〔10〕에 기재된 폴리펩티드.
〔12〕상기 Fcγ 수용체에 있어서 활성형 Fcγ 수용체가 FcγRIa, FcγRIIa R, FcγRIIa H, FcγRIIIaF 및 FcγRIIIaV로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 수용체이고, 저해형 Fcγ 수용체가 FcγRIIb인 것을 특징으로 하는, 〔11〕에 기재된 폴리펩티드.
〔13〕상기 활성형 Fcγ 수용체에 대한 결합활성이 상기 저해형 Fcγ 수용체에 대한 결합활성에 비해 선택적으로 증강된 것을 특징으로 하는, 〔11〕또는〔12〕에 기재된 폴리펩티드.
〔14〕추가로 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드의 등전점에 차를 부여하기 위한 아미노산 개변이 도입되어 있는, 〔1〕내지〔13〕중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드.
〔15〕등전점의 차를 부여하기 위한 아미노산 개변이 제1 폴리펩티드 및/또는 제2 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, EU 넘버링 137번째의 Gly, 138번째의 Gly, 139번째의 Thr, 147번째의 Lys, 192번째의 Ser, 193번째의 Leu, 196번째의 Gln, 198번째의 Tyr, 199번째의 Ile, 203번째의 Asn, 214번째의 Lys, 231번째의 Ala, 233번째의 Glu, 242번째의 Leu, 263번째의 Val, 272번째의 Glu, 274번째의 Lys, 278번째의 Tyr, 288번째의 Lys, 290번째의 Lys, 316번째의 Gly, 317번째의 Lys, 320번째의 Lys, 324번째의 Lys, 335번째의 Thr, 337번째의 Ser, 338번째의 Lys, 340번째의 Lys, 341번째의 Gly, 358번째의 Leu, 360번째의 Lys, 362번째의 Gln, 364번째의 Ser, 383번째의 Ser, 384번째의 Asn, 385번째의 Gly, 386번째의 Gln, 387번째의 Pro, 390번째의 Asn, 397번째의 Val 및 422번째의 Val로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 부위에 있어서 하나 이상의 아미노산 변이가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는, 〔14〕에 기재된 폴리펩티드.
〔16〕등전점의 차를 부여하기 위한 아미노산 개변이 제1 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드 중 어느 한쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, EU 넘버링 196번째의 Gln, 199번째의 Ile, 231번째의 Ala, 233번째의 Glu, 242번째의 Leu, 263번째의 Val, 272번째의 Glu, 316번째의 Gly, 358번째의 Leu, 364번째의 Ser, 383번째의 Ser, 387번째의 Pro 및 397번째의 Val로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 변이가 도입되어 있고, 다른 한쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, EU 넘버링 137번째의 Gly, 138번째의 Gly, 139번째의 Thr, 147번째의 Lys, 192번째의 Ser, 193번째의 Leu, 198번째의 Tyr, 199번째의 Ile, 203번째의 Asn, 214번째의 Lys, 274번째의 Lys, 278번째의 Tyr, 288번째의 Lys, 290번째의 Lys, 316번째의 Gly, 317번째의 Lys, 320번째의 Lys, 324번째의 Lys, 335번째의 Thr, 337번째의 Ser, 338번째의 Lys, 340번째의 Lys, 341번째의 Gly, 358번째의 Leu, 360번째의 Lys, 362번째의 Gln, 383번째의 Ser, 384번째의 Asn, 385번째의 Gly, 386번째의 Gln, 390번째의 Asn 및 422번째의 Val로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 변이가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는, 〔15〕에 기재된 폴리펩티드.
〔17〕상기 폴리펩티드가 항원 결합 분자인 것을 특징으로 하는, 〔1〕내지〔16〕중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드.
〔18〕상기 항원 결합 분자가 항체, 이중 특이성 항체, 펩티드 Fc 융합 단백질, 또는 스캐폴드 Fc 융합 단백질 등의 Fc 융합 분자인 것을 특징으로 하는, 〔17〕에 기재된 폴리펩티드.
〔19〕〔1〕내지〔18〕중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드 및 의학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 의약 조성물.
〔20〕Fc영역을 포함하는 폴리펩티드의 기능을 개변하는 방법으로서, 그 Fc영역을 구성하는 제1 폴리펩티드 및/또는 제2 폴리펩티드에 아미노산 변이를 도입함으로써 그 Fc영역을 헤테로이량체로 하고, 〔1〕내지〔7〕중 어느 하나에 기재된 아미노산 변이의 도입에 의해 그 Fc영역이 호모이량체가 된 경우에 비해 Fc영역의 기능을 개변하는 공정을 포함하는, 폴리펩티드의 기능을 개변하는 방법.
〔21〕Fc영역을 포함하는 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서, 그 Fc영역을 구성하는 제1 폴리펩티드 및/또는 제2 폴리펩티드에 아미노산 변이를 도입함으로써 그 Fc영역을 헤테로이량체로 하고, 〔1〕내지〔7〕중 어느 하나에 기재된 아미노산 변이의 도입에 의해 그 Fc영역이 호모이량체가 된 경우에 비해 Fc영역의 기능을 개변하는 공정을 포함하는, Fc영역을 포함하는 폴리펩티드를 제조하는 방법.
〔22〕〔1〕내지〔18〕중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드 또는〔19〕에 기재된 의약 조성물을 대상에 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료 또는 예방하는 방법.
〔23〕암의 치료 또는 예방에 있어서 사용하기 위한 〔1〕내지〔18〕중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드 또는〔19〕에 기재된 의약 조성물.
〔24〕암의 치료제 또는 예방제의 제조에 있어서의 〔1〕내지〔18〕중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드 또는〔19〕에 기재된 의약 조성물의 사용.
〔25〕〔1〕내지〔18〕중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드 또는〔19〕에 기재된 의약 조성물을 사용하는 단계를 포함하는, 암의 치료제 또는 예방제를 제조하기 위한 프로세스.
도 1은 Fc영역과 FcRn의 복합체의 구조를 나타내는 도면이다. FcRn은 항체의 각 H쇄의 CH2 및 CH3에 결합하고, 항체 전체에 대해서는 대칭적으로 결합해 있다.
도 2는 IgA와 IgA receptor인 FcαR의 복합체의 구조를 나타내는 도면이다. FcαR은 IgA의 각 H쇄의 Cα2 및 Cα3에 결합하고, 항체 전체에 대해서는 대칭적으로 결합해 있다.
도 3은 Fc영역과 FcγRIII의 복합체의 구조를 나타내는 도면이다. H쇄, CH2, CH3의 각각에 대해서 도면을 향하여 좌측을 HA쇄, CHA2, CHA3, 우측을 HB쇄, CHB2, CHB3라 부른다.
도 4는 각 H쇄에 있어서의 A327의 FcγRIII와의 상호작용의 상세를 나타내는 도면이다. (A)는 CHA2에 있어서의 A327과 FcγRIII의 상호작용을 나타낸다. (B)는 CHB2HB에 있어서의 A327과 FcγRIII의 상호작용을 나타낸다. FcγRIII 상의 색은 각각 흑색：염기성 부위, 회색：중성 부위, 백색：산성 부위를 나타낸다.
도 5는 D356K, H435R, K439E를 도입한 항체의 FcγR에 대한 결합활성의 비교를 나타내는 도면이다. GpH7-G1d/GpL16-k0(서열번호：2, 5)의 각 FcγR에 대한 결합활성을 100으로 하였다. 평가에 사용한 샘플과 그의 서열은 GpH7-G1d/GpL16-k0(서열번호：2, 5), GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0(서열번호：3, 4, 5), GpH7-B3/GpL16-k0(서열번호：4, 5), GpH7-A5/GpL16-k0(서열번호：3, 5)이다.
도 6은 G237A를 도입한 항체의 FcγR에 대한 결합활성의 비교를 나타내는 도면이다. GpH7-G1d/GpL16-k0(서열번호：2, 5)의 각 FcγR에 대한 결합활성을 100으로 하였다. 평가에 사용한 샘플과 그의 서열은 GpH7-G1d/GpL16-k0(서열번호：2, 5), GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0(서열번호：3, 4, 5), GpH7-B3/GpL16-k0(서열번호：4, 5), GpH7-A5/GpL16-k0(서열번호：3, 5), GpH7-A26/GpH7-B3/GpL16-k0(서열번호：6, 4, 5), GpH7-A26/GpL16-k0(서열번호：6, 5)이다.
도 7은 G237L을 도입한 헤테로이량화 항체와 호모이량화 항체의 FcγR에 대한 결합활성의 비교를 나타내는 도면이다. GpH7-G1d/GpL16-k0(서열번호：2, 5)의 각 FcγR에 대한 결합활성을 100으로 하였다. 평가에 사용한 샘플과 그의 서열은 GpH7-G1d/GpL16-k0(서열번호：2, 5), GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0(서열번호：3, 4, 5), GpH7-B3/GpL16-k0(서열번호：4, 5), GpH7-A5/GpL16-k0(서열번호：3, 5), GpH7-A29/GpH7-B3/GpL16-k0(서열번호：7, 4, 5), GpH7-A29/GpL16-k0(서열번호：7, 5)이다.
도 8은 L328E를 도입한 헤테로이량화 항체와 호모이량화 항체의 FcγR에 대한 결합활성의 비교를 나타내는 도면이다. GpH7-G1d/GpL16-k0(서열번호：2, 5)의 각 FcγR에 대한 결합활성을 100으로 하였다. 평가에 사용한 샘플과 그의 서열은 GpH7-G1d/GpL16-k0(서열번호：2, 5), GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0(서열번호：3, 4, 5), GpH7-B3/GpL16-k0(서열번호：4, 5), GpH7-A5/GpL16-k0(서열번호：3, 5), GpH7-A42/GpH7-B3/GpL16-k0(서열번호：8, 4, 5), GpH7-A42/GpL16-k0(서열번호：8, 5)이다.
도 9는 L328D를 도입한 헤테로이량화 항체와 호모이량화 항체의 FcγR에 대한 결합활성의 비교를 나타내는 도면이다. GpH7-G1d/GpL16-k0(서열번호：2, 5)의 각 FcγR에 대한 결합활성을 100으로 하였다. 평가에 사용한 샘플과 그의 서열은 GpH7-G1d/GpL16-k0(서열번호：2, 5), GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0(서열번호：3, 4, 5), GpH7-B3/GpL16-k0(서열번호：4, 5), GpH7-A5/GpL16-k0(서열번호：3, 5), GpH7-A43/GpH7-B3/GpL16-k0(서열번호：9, 4, 5), GpH7-A43/GpL16-k0(서열번호：9, 5)이다.
도 10은 L234E를 도입한 헤테로이량화 항체와 호모이량화 항체의 FcγR에 대한 결합활성의 비교를 나타내는 도면이다. GpH7-G1d/GpL16-k0(서열번호：2, 5)의 각 FcγR에 대한 결합활성을 100으로 하였다. 평가에 사용한 샘플과 그의 서열은 GpH7-G1d/GpL16-k0(서열번호：2, 5), GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0(서열번호：3, 4, 5), GpH7-B3/GpL16-k0(서열번호：4, 5), GpH7-A5/GpL16-k0(서열번호：3, 5), GpH7-A5/GpH7-B16/GpL16-k0(서열번호：3, 10, 5), GpH7-B16/GpL16-k0(서열번호：10, 5)이다.
도 11은 L234D를 도입한 헤테로이량화 항체와 호모이량화 항체의 FcγR에 대한 결합활성의 비교를 나타내는 도면이다. GpH7-G1d/GpL16-k0(서열번호：2, 5)의 각 FcγR에 대한 결합활성을 100으로 하였다. 평가에 사용한 샘플과 그의 서열은 GpH7-G1d/GpL16-k0(서열번호：2, 5), GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0(서열번호：3, 4, 5), GpH7-B3/GpL16-k0(서열번호：4, 5), GpH7-A5/GpL16-k0(서열번호：3, 5), GpH7-A5/GpH7-B17/GpL16-k0(서열번호：3, 11, 5), GpH7-B17/GpL16-k0(서열번호：11, 5)이다.
도 12는 Fc영역에 있어서의 P329와 FcγRIII의 상호작용을 나타내는 도면이다. H쇄, CH2, CH3의 각각에 대해서 도면을 향하여 좌측을 HA쇄, CHA2, CHA3, 우측을 HB쇄, CHB2, CHB3라 부른다. Fc영역에 있어서의 EU 넘버링 329번째의 Pro가 FcγRIII와의 주로 한쪽 CH2 도메인인 CHA2에서 상호작용하고 있는 것을 나타낸 도면이다. H쇄, CH2, CH3의 각각에 대해서 도면을 향하여 좌측을 HA쇄, CHA2, CHA3, 우측을 HB쇄, CHB2, CHB3라 부른다.
도 13은 P329R, P329K, P329D, P329E를 도입한 헤테로이량화 항체 및 호모이량화 항체의 FcγR에 대한 결합활성에 미치는 효과의 비교를 나타내는 도면이다. GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0(서열번호：3, 4, 5)의 각 FcγR에 대한 결합활성을 100으로 하였다. 평가에 사용한 샘플과 그의 서열은 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0(서열번호：3, 4, 5), GpH7-A5/GpH7-B12/GpL16-k0(서열번호：3, 12, 5), GpH7-A5/GpH7-B13/GpL16-k0(서열번호：3, 13, 5), GpH7-A5/GpH7-B14/GpL16-k0(서열번호：3, 14, 5), GpH7-A5/GpH7-B15/GpL16-k0(서열번호：3, 15, 5), GpH7-B12/GpL16-k0(서열번호：12, 5), GpH7-B13/GpL16-k0(서열번호：13, 5), GpH7-B14/GpL16-k0(서열번호：14, 5), GpH7-B15/GpL16-k0(서열번호：15, 5)이다.
도 14는 G237A가 한쪽 H쇄에 도입된 헤테로이량화 항체에 대해, P329R을 동일한 H쇄 또는 상이한 H쇄에 도입하였을 때의 각 FcγR에 대한 결합활성을 비교한 도면이다. GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0(서열번호：3, 4, 5)의 각 FcγR에 대한 결합활성을 100으로 하였다. 평가에 사용한 샘플과 그의 서열은 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0(서열번호：3, 4, 5), GpH7-A5/GpH7-B12/GpL16-k0(서열번호：3, 12, 5), GpH7-A48/GpH7-B3/GpL16-k0(서열번호：16, 4, 5), GpH7-A26/GpH7-B3/GpL16-k0(서열번호：6, 4, 5), GpH7-A26/GpH7-B12/GpL16-k0(서열번호：6, 12, 5), GpH7-A45/GpH7-B3/GpL16-k0(서열번호：17, 4, 5)이다.
도 15는 L234D가 한쪽 H쇄에 도입된 헤테로이량화 항체에 대해, P329R을 동일한 H쇄 또는 상이한 H쇄에 도입하였을 때의 각 FcγR에 대한 결합활성을 비교한 도면이다. GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0(서열번호：3, 4, 5)의 각 FcγR에 대한 결합활성을 100으로 하였다. 평가에 사용한 샘플과 그의 서열은 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0(서열번호：3, 4, 5), GpH7-A5/GpH7-B12/GpL16-k0(서열번호：3, 12, 5), GpH7-A48/GpH7-B3/GpL16-k0(서열번호：16, 4, 5), GpH7-A5/GpH7-B17/GpL16-k0(서열번호：3, 11, 5), GpH7-A48/GpH7-B17/GpL16-k0(서열번호：16, 11, 5), GpH7-A5/GpH7-B41/GpL16-k0(서열번호：3, 18, 5)이다.
도 16은 동일 개변을 도입한 헤테로이량화 항체와 호모이량화 항체의 FcγRIa에 대한 결합활성을 비교한 도면이다. 가로축에 Ho/Con, 세로축에 He/Co의 값을 나타내었다. He/Con은 변이를 도입한 GpH7-B3 variant를 한쪽 H쇄에 사용한 헤테로이량화 항체 GpH7-A5/GpH7-B3 variant/GpL16-k0의 FcγRIa에 대한 결합활성을, 변이를 도입하지 않은 GpH7-B3를 사용한 헤테로이량화 항체 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0(서열번호：3, 4, 5)의 FcγRIa에 대한 결합활성으로 나눈 값에 100을 곱한 값이다. Ho/Con은 변이를 도입한 GpH7-B3 variant를 양쪽 H쇄에 사용한 호모이량화 항체 GpH7-B3 variant/GpL16-k0의 FcγRIa에 대한 결합활성의 값을, 변이를 도입하지 않은 GpH7-B3를 사용한 호모이량화 항체 GpH7-B3/GpL16-k0(서열번호：4, 5)의 FcγRIa에 대한 결합활성의 값으로 나눈 값에 100을 곱한 값이다.
도 17은 동일 개변을 도입한 헤테로이량화 항체와 호모이량화 항체의 FcγRIIa R에 대한 결합활성을 비교한 도면이다. 가로축에 Ho/Con, 세로축에 He/Co의 값을 나타내었다. He/Con은 변이를 도입한 GpH7-B3 variant를 한쪽 H쇄에 사용한 헤테로이량화 항체 GpH7-A5/GpH7-B3 variant/GpL16-k0의 FcγRIIa R에 대한 결합활성을, 변이를 도입하지 않은 GpH7-B3를 사용한 헤테로이량화 항체 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0(서열번호：3, 4, 5)의 FcγRIIa R에 대한 결합활성으로 나눈 값이다. Ho/Con은 변이를 도입한 GpH7-B3 variant를 양쪽 H쇄에 사용한 호모이량화 항체 GpH7-B3 variant/GpL16-k0의 FcγRIIa R에 대한 결합활성의 값을, 변이를 도입하지 않은 GpH7-B3를 사용한 호모이량화 항체 GpH7-B3/GpL16-k0(서열번호：4, 5)의 FcγRIIa R에 대한 결합활성의 값으로 나눈 값에 100을 곱한 값이다.
도 18은 동일 개변을 도입한 헤테로이량화 항체와 호모이량화 항체의 FcγRIIa H에 대한 결합활성을 비교한 도면이다. 가로축에 Ho/Con, 세로축에 He/Co의 값을 나타내었다. He/Con은 변이를 도입한 GpH7-B3 variant를 한쪽 H쇄에 사용한 헤테로이량화 항체 GpH7-A5/GpH7-B3 variant/GpL16-k0의 FcγRIIa H에 대한 결합활성을, 변이를 도입하지 않은 GpH7-B3를 사용한 헤테로이량화 항체 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0(서열번호：3, 4, 5)의 FcγRIIa H에 대한 결합활성으로 나눈 값이다. Ho/Con은 변이를 도입한 GpH7-B3 variant를 양쪽 H쇄에 사용한 호모이량화 항체 GpH7-B3 variant/GpL16-k0의 FcγRIIa H에 대한 결합활성의 값을, 변이를 도입하지 않은 GpH7-B3를 사용한 호모이량화 항체 GpH7-B3/GpL16-k0(서열번호：4, 5)의 FcγRIIa H에 대한 결합활성의 값으로 나눈 값에 100을 곱한 값이다.
도 19는 동일 개변을 도입한 헤테로이량화 항체와 호모이량화 항체의 FcγRIIb에 대한 결합활성을 비교한 도면이다. 가로축에 Ho/Con, 세로축에 He/Co의 값을 나타내었다. He/Con은 변이를 도입한 GpH7-B3 variant를 한쪽 H쇄에 사용한 헤테로이량화 항체 GpH7-A5/GpH7-B3 variant/GpL16-k0의 FcγRIIb에 대한 결합활성을, 변이를 도입하지 않은 GpH7-B3를 사용한 헤테로이량화 항체 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0(서열번호：3, 4, 5)의 FcγRIIb에 대한 결합활성으로 나눈 값이다. Ho/Con은 변이를 도입한 GpH7-B3 variant를 양쪽 H쇄에 사용한 호모이량화 항체 GpH7-B3 variant/GpL16-k0의 FcγRIIb에 대한 결합활성의 값을, 변이를 도입하지 않은 GpH7-B3를 사용한 호모이량화 항체 GpH7-B3/GpL16-k0(서열번호：4, 5)의 FcγRIIb에 대한 결합활성의 값으로 나눈 값에 100을 곱한 값이다.
도 20은 동일 개변을 도입한 헤테로이량화 항체와 호모이량화 항체의 FcγRIIIa에 대한 결합활성을 비교한 도면이다. 가로축에 Ho/Con, 세로축에 He/Co의 값을 나타내었다. He/Con은 변이를 도입한 GpH7-B3 variant를 한쪽 H쇄에 사용한 헤테로이량화 항체 GpH7-A5/GpH7-B3 variant/GpL16-k0의 FcγRIIIa에 대한 결합활성을, 변이를 도입하지 않은 GpH7-B3를 사용한 헤테로이량화 항체 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0(서열번호：3, 4, 5)의 FcγRIIIa에 대한 결합활성으로 나눈 값이다. Ho/Con은 변이를 도입한 GpH7-B3 variant를 양쪽 H쇄에 사용한 호모이량화 항체 GpH7-B3 variant/GpL16-k0의 FcγRIIIa에 대한 결합활성의 값을, 변이를 도입하지 않은 GpH7-B3를 사용한 호모이량화 항체 GpH7-B3/GpL16-k0(서열번호：4, 5)의 FcγRIIIa에 대한 결합활성의 값으로 나눈 값에 100을 곱한 값이다.
도 21은 개변을 도입한 H쇄를 사용한 헤테로이량화 항체, 호모이량화 항체의 각각에 있어서의 FcγR 결합을 비교한 개념도이다. 플로팅한 점이 i의 영역에 포함된 경우, Fc영역에 도입한 개변이 He/Con > 100, Ho/Con < 100, He/Con > Ho/Con이 되는 효과를 갖는 것을 의미한다. 플로팅한 점이 ii의 영역에 포함된 경우, Fc영역에 도입한 개변이 He/Con > 100, Ho/Con > 100, He/Con > Ho/Con이 되는 효과를 갖는 것을 의미한다. 플로팅한 점이 iii의 영역에 포함된 경우, Fc영역에 도입한 개변이 He/Con > 100, Ho/Con > 100, He/Con < Ho/Con이 되는 효과를 갖는 것을 의미한다.
도 22는 3종류의 개변을 헤테로이량화 항체 중 어느 하나의 H쇄에 도입하는 경우의 조합의 수를 나타낸 도면이다. ●(검정 동그라미), ▲(검정 세모), ■(검정 네모)의 각각은 상이한 개변인 것을 의미한다.
도 23은 항체의 Fc영역에 있어서의 S239, A330, I332의 각 잔기와 FcγRIII의 상호작용을 나타내는 도면이다. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103, 4005-4010, 2006으로부터 인용.
도 24는 활성형 FcγR과 억제형 FcγR에 대한 결합활성의 비교를 나타내는 도면이다. 각 개변체의 활성형 FcγR과 억제형 FcγR에 대한 결합활성을 비교한 개념도이다. 각 개변체의 활성형 FcγR(Activating Receptor)에 대한 활성을 세로축, 억제형 FcγR(Inhibitory Receptor)에 대한 결합활성을 가로축에 취하고, 천연형 항체의 활성형 FcγR과 억제형 FcγR에 대한 결합활성을 각각 100으로 하였다. 개변체의 활성형 FcγR에 대한 결합활성이 천연형 항체보다 증강되고, 억제형 FcγR에 대한 결합활성이 저하된 항체는 a의 영역(빗금친 부분)에 플로팅된다. 개변체의 억제형 FcγR에 대한 결합활성이 천연형 항체보다 증강되고, 활성형 FcγR에 대한 결합활성이 저하된 항체는 c의 영역(사선 부분)에 플로팅된다.
도 25는 활성형 FcγR과 억제형 FcγR에 대한 결합활성의 비교를 나타내는 도면이다. 각 개변체의 활성형 FcγR과 억제형 FcγR에 대한 결합활성을 비교한 개념도이다. 활성형 FcγR(Activating Receptor)에 대한 천연형 항체의 결합활성을 세로축, 억제형 FcγR(Inhibitory Receptor)에 대한 결합활성을 가로축에 취하고, 천연형 항체의 활성형 FcγR과 억제형 FcγR에 대한 결합활성을 각각 100으로 하였다. 개변체의 활성형 FcγR에 대한 결합활성을 억제형 FcγR에 대한 결합활성으로 나눈 값이 1.2 이상인 항체는 b의 영역(빗금친 부분)에 플로팅된다. 개변체의 활성형 FcγR에 대한 결합활성을 억제형 FcγR에 대한 결합활성으로 나눈 값이 0.8 이하인 항체는 d의 영역(사선 부분)에 플로팅된다.
도 26은 헤테로이량화 항체의 FcγRIa와 FcγRIIb에 대한 결합활성의 비교를 나타내는 도면이다. 개변을 도입한 헤테로이량화 항체의 활성형 FcγR인 FcγRIa와 억제형 FcγR인 FcγRIIb에 대한 결합활성을 비교한 도면이다. 가로축에 억제형 FcγR에 대한 He/Con의 값, 세로축에 활성형 FcγR에 대한 He/Con의 값을 나타내었다. He/Con은 Fc에 변이를 도입한 헤테로이량화 항체 GpH7-A5/GpH7-B3 variant/GpL16-k0의 FcγR에 대한 결합활성을, 개변을 도입하지 않은 헤테로이량화 항체 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0(서열번호：3, 4, 5)의 FcγR에 대한 결합활성으로 나눈 값에 100을 곱한 값이다.
도 27은 헤테로이량화 항체의 FcγRIIa R과 FcγRIIb에 대한 결합활성의 비교를 나타내는 도면이다. 개변을 도입한 헤테로이량화 항체의 활성형 FcγR인 FcγRIIa R과 억제형 FcγR인 FcγRIIb에 대한 결합활성을 비교한 도면이다. 가로축에 억제형 FcγR에 대한 He/Con의 값, 세로축에 활성형 FcγR에 대한 He/Con의 값을 나타내었다. He/Con은 Fc에 변이를 도입한 헤테로이량화 항체 GpH7-A5/GpH7-B3 variant/GpL16-k0의 FcγR에 대한 결합활성을, 개변을 도입하지 않은 헤테로이량화 항체 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0(서열번호：3, 4, 5)의 FcγR에 대한 결합활성으로 나눈 값에 100을 곱한 값이다.
도 28은 헤테로이량화 항체의 FcγRIIa H와 FcγRIIb에 대한 결합활성의 비교를 나타내는 도면이다. 개변을 도입한 헤테로이량화 항체의 활성형 FcγR인 FcγRIIa H와 억제형 FcγR인 FcγRIIb에 대한 결합활성을 비교한 도면이다. 가로축에 억제형 FcγR에 대한 He/Con의 값, 세로축에 활성형 FcγR에 대한 He/Con의 값을 나타내었다. He/Con은 Fc에 변이를 도입한 헤테로이량화 항체 GpH7-A5/GpH7-B3 variant/GpL16-k0의 FcγR에 대한 결합활성을, 개변을 도입하지 않은 헤테로이량화 항체 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0(서열번호：3, 4, 5)의 FcγR에 대한 결합활성으로 나눈 값에 100을 곱한 값이다.
도 29는 헤테로이량화 항체의 FcγRIIIa와 FcγRIIb에 대한 결합활성의 비교를 나타내는 도면이다. 개변을 도입한 헤테로이량화 항체의 활성형 FcγR인 FcγRIIIa와 억제형 FcγR인 FcγRIIb에 대한 결합활성을 비교한 도면이다. 가로축에 억제형 FcγR에 대한 He/Con의 값, 세로축에 활성형 FcγR에 대한 He/Con의 값을 나타내었다. He/Con은 Fc에 변이를 도입한 헤테로이량화 항체 GpH7-A5/GpH7-B3 variant/GpL16-k0의 FcγR에 대한 결합활성을, 개변을 도입하지 않은 헤테로이량화 항체 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0(서열번호：3, 4, 5)의 FcγR에 대한 결합활성으로 나눈 값에 100을 곱한 값이다.
도 30은 L234Y, G236W, S298A와 S239D, A330L, I332E의 조합이 항체의 열안정성에 미치는 영향의 비교를 나타내는 도면이다. L234Y, G236W, S298A의 헤테로이량화 항체 및 호모이량화 항체, S239D, A330L, I332E의 헤테로이량화 항체 및 호모이량화 항체, L234Y, G236W, S298A를 한쪽 H쇄에 도입하고, S239D, A330L, I332E를 다른 한쪽 H쇄에 도입한 헤테로이량화 항체의 열가속시험(40℃ 2주간 또는 4주간) 후의 단량체 비율의 변화를 비교한 도면이다. 평가에 사용한 샘플과 그의 서열은 GpH7-G1d/GpL16-k0(서열번호：2, 5), GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0(서열번호：3, 4, 5), GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0(서열번호：31, 4, 5), GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0(서열번호：3, 41, 5), GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0(서열번호：31, 32, 5), GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0(서열번호：40, 41, 5), GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0(서열번호：31, 41, 5)이다.
도 31은 헤테로이량화 항체의 ADCC 활성의 검토결과를 나타내는 도면이다. 평가에 사용한 세포주는 SK-pca13a이고, E/T ratio=50이다. 이펙터 세포는 인간 PBMC였다. 평가에 사용한 샘플과 그의 서열은 GpH7-G1d/GpL16-k0(서열번호：2, 5), GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0(서열번호：3, 4, 5), GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0(서열번호：3, 41, 5), GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0(서열번호：31, 4, 5), GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0(서열번호：40, 41, 5), GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0(서열번호：31, 32, 5), GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0(서열번호：31, 41, 5)이다. 세로축은 항체의 세포상해활성을 나타내고, 가로축은 항체의 농도(㎍/mL)를 나타낸다.
도 32는 IgG1(서열번호：76), IgG2(서열번호：77), IgG3(서열번호：78) 및 IgG4(서열번호：79)의 Fc영역을 구성하는 아미노산 잔기와 kabat의 EU 넘버링(본 명세서에 있어서 EU INDEX라고도 불린다)의 관계를 나타내는 도면이다.
도 33은 실시예 12에 기재된 Fc 헤테로이량화 항체의 ADCC 활성의 검토결과를 나타내는 도면이다. 평가에 사용한 세포주는 SK-pca13a이고, E/T ratio=50이다. 이펙터 세포는 인간 PBMC였다. 평가에 사용한 샘플과 그의 서열은 GpH7-G1d/GpL16-k0(서열번호：2, 5), GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0(서열번호：51, 56, 5), GpH7-Kn032/GpH7-Hl032/GpL16-k0(서열번호：53, 58, 5), GpH7-Kn045/GpH7-Hl048/GpL16-k0(서열번호：54, 59, 5), GpH7-Kn056/GpH7-Hl055/GpL16-k0(서열번호：55, 60, 5), GpH7-Kn037/GpH7-Hl036/GpL16-k0(서열번호：52, 57, 5)이다. 세로축은 항체의 세포상해활성을 나타내고, 가로축은 항체의 농도(㎍/mL)를 나타낸다.
도 34는 헤테로이량화 항체 H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0의 ADCC 활성의 검토결과를 나타내는 도면이다. 평가에 사용한 세포주는 SKE18이고, E/T ratio=50이었다. 이펙터 세포는 인간 PBMC였다. 평가에 사용한 샘플과 그의 서열은 H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0(서열번호：84, 85, 106), H240-Kn032/H240-Hl032/L73-k0(서열번호：86, 87, 106), H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0(서열번호：81, 82, 106), H240-afucosyl_G1d(H240-afucosyl_G1d는 그의 아미노산 서열은 H240-G1d(서열번호：83)와 동일하고, 그의 푸코오스가 떨어진 것이다)/L73-k0(서열번호：83, 106)이다. 세로축은 항체의 세포상해활성을 나타내고, 가로축은 항체의 농도(㎍/mL)를 나타낸다.
도 35는 헤테로이량화 항체 H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0를 템플레이트로 한 점변이체의 FcgRI에 대한 결합활성을 나타내는 도면이다. 세로축의 Relative KD는 FcgRI에 대한 H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0의 KD(mol/L)를 각 개변체의 KD로 나눈 값을 나타낸다. 가로축의 숫자는 Relative KD가 작은 순서로 늘어놓았을 때의 순위를 나타낸다.
도 36은 헤테로이량화 항체 H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0를 템플레이트로 한 점변이체의 FcgRIIa R에 대한 결합활성을 나타내는 도면이다. 세로축의 Relative KD는 FcgRIIa R에 대한 H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0의 KD(mol/L)를 각 개변체의 KD로 나눈 값을 나타낸다. 가로축의 숫자는 Relative KD가 작은 순으로 늘어놓았을 때의 순위를 나타낸다.
도 37은 헤테로이량화 항체 H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0를 템플레이트로 한 점변이체의 FcgRIIa H에 대한 결합활성을 나타내는 도면이다. 세로축의 Relative KD는 FcgRIIa H에 대한 H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0의 KD(mol/L)를 각 개변체의 KD로 나눈 값을 나타낸다. 가로축의 숫자는 Relative KD가 작은 순으로 늘어놓았을 때의 순위를 나타낸다.
도 38은 헤테로이량화 항체 H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0를 템플레이트로 한 점변이체의 FcgRIIb에 대한 결합활성을 나타내는 도면이다. 세로축의 Relative KD는 FcgRIIb에 대한 H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0의 KD(mol/L)를 각 개변체의 KD로 나눈 값을 나타낸다. 가로축의 숫자는 Relative KD가 작은 순으로 늘어놓았을 때의 순위를 나타낸다.
도 39는 헤테로이량화 항체 H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0를 템플레이트로 한 점변이체의 FcgRIIIa F에 대한 결합활성을 나타내는 도면이다. 세로축의 Relative KD는 FcgRIIIa F에 대한 H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0의 KD(mol/L)를 각 개변체의 KD로 나눈 값을 나타낸다. 가로축의 숫자는 Relative KD가 작은 순으로 늘어놓았을 때의 순위를 나타낸다.
도 40은 헤테로이량화 항체 H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0를 템플레이트로 한 점변이체의 FcgRIIIa V에 대한 결합활성을 나타내는 도면이다. 세로축의 Relative KD는 FcgRIIIa V에 대한 H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0의 KD(mol/L)를 각 개변체의 KD로 나눈 값을 나타낸다. 가로축의 숫자는 Relative KD가 작은 순으로 늘어놓았을 때의 순위를 나타낸다.
도 41은 헤테로이량화 항체 H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0의 ADCC 활성의 검토결과를 나타내는 도면이다. 평가에 사용한 세포주는 MIAPaCa-2이고, E/T ratio=25였다. 이펙터 세포는 인간 PBMC였다. 평가에 사용한 샘플과 그의 서열은 H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0(서열번호：84, 85, 106), H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0(서열번호：81, 82, 106), H240-afucosyl_G1d/L73-k0(서열번호：83, 106), H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0(서열번호：90, 91, 106)이다. 세로축은 항체의 세포상해활성을 나타내고, 가로축은 항체의 농도(㎍/mL)를 나타낸다.
도 42는 헤테로이량화 항체 H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0 개량 항체의 ADCC 활성의 검토결과를 나타내는 도면이다. 평가에 사용한 세포주는 DLD-1이고, E/T ratio=50이었다. 이펙터 세포는 인간 PBMC였다. 평가에 사용한 샘플과 그의 서열은 H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0(서열번호：84, 85, 106), H240-afucosyl_G1d/L73-k0(서열번호：83, 106), H240-Kn113/H240-Hl076/L73-k0(서열번호：92, 91, 106), H240-Kn115/H240-Hl076/L73-k0(서열번호：93, 91, 106), H240-Kn125/H240-Hl076/L73-k0(서열번호：94, 91, 106)이다. 세로축은 항체의 세포상해활성을 나타내고, 가로축은 항체의 농도(㎍/mL)를 나타낸다.
도 43은 헤테로이량화 항체 H240-Kn067/H240-Hl068/L73-k0 등의 ADCC 활성의 검토결과를 나타내는 도면이다. 평가에 사용한 세포주는 DLD-1이고, E/T ratio=50이었다. 이펙터 세포는 인간 PBMC였다. 평가에 사용한 샘플과 그의 서열은 H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0(서열번호：84, 85, 106), H240-afucosyl_G1d/L73-k0(서열번호：83, 106), H240-Kn067/H240-Hl068/L73-k0(서열번호：95, 96, 106), H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0(서열번호：99, 96, 106), H240-Kn126/H240-Hl068/L73-k0(서열번호：100, 96, 106)이다. 세로축은 항체의 세포상해활성을 나타내고, 가로축은 항체의 농도(㎍/mL)를 나타낸다.
도 44는 Fc(WT)/FcgR2a R형 결정 구조(PDB ID=3RY6, J. Imunol. 2011, 187, 3208-321)의 도면이다. 동 구조의 Fc와 FcgRIIa R형의 상호작용 계면 부근에 있어서 FcgRIIa R형과 FcgRIIb에서 상이한 3 잔기 Gln127, Leu132, Phe160의 측쇄를 도시하였다. 또한 ( ) 안은 FcgRIIb 중에서의 대응하는 아미노산 잔기를 1문자 표기로 나타낸 것이다.
도 45는 X선 결정 구조 해석에 의해 결정된 Fc(Kn120/Hl068)/FcgRIIb 세포외영역 복합체의 도면이다. CH2 도메인, CH3 도메인의 각각에 대해서 도면을 향해서 좌측을 도메인 A, 우측을 도메인 B로 하였다.
도 46은 X선 결정 구조 해석에 의해 결정된 Fc(Kn120/Hl068)/FcgRIIb 세포외영역 복합체 중 FcgRIIb 세포외영역의 Lys127(FcgRIIa R형에 있어서는 Gln) 주변의 구조를 나타낸 도면이다. 또한 Fc(Kn120/Hl068)의 Tyr296에 대해서는 측쇄의 전자밀도가 관측되지 않았기 때문에, Cα원자 이외의 측쇄의 모델 구축은 행하지 않았다.
도 47은 X선 결정 구조 해석에 의해 결정된 Fc(Kn120/Hl068)/FcgRIIb 세포외영역 복합체 중 FcgRIIb 세포외영역의 Ser132(FcgRIIa R형에 있어서는 Leu) 주변의 구조를 나타낸 도면이다. 또한 Fc(Kn120/Hl068)의 D327에 대해서는 측쇄의 전자밀도가 관측되지 않았기 때문에, Cα원자 이외의 측쇄의 모델 구축은 행하지 않았다.
도 48은 X선 결정 구조 해석에 의해 결정된 Fc(Kn120/Hl068)/FcgRIIb 세포외영역 복합체 중 FcgRIIb 세포외영역의 Tyr160(FcgRIIa R형에 있어서는 Phe) 주변의 구조를 나타낸 도면이다.
도 49는 X선 결정 구조 해석에 의해 결정된 Fc(BP208)/FcgRIIb 세포외영역 복합체의 도면이다. CH2 도메인, CH3 도메인의 각각에 대해서 도면을 향해서 좌측을 도메인 A, 우측을 도메인 B로 하였다.
도 50은 X선 결정 구조 해석에 의해 결정된 Fc(BP208)/FcgRIIb 세포외영역 복합체의 구조와 Fc(WT)/FcgRIIa 세포외영역 복합체의 구조(PDB code:3RY6)를 CH2 도메인 A에 있어서 비교한 것이다. 도면 중 굵은선으로 그려진 것이 Fc(BP208)/FcgRIIb 세포외영역 복합체이고, 가는선으로 그려진 것이 Fc(WT)/FcgRIIa 세포외영역 복합체의 구조이다. 또한 Fc(WT)/FcgRIIa 세포외영역 복합체의 구조에 있어서는 CH2 도메인 A만을 그렸다.
도 51은 X선 결정 구조 해석에 의해 결정된 Fc(BP208)/FcgRIIb 세포외영역 복합체 중 Fc(BP208) CH2 도메인 B의 Ser239 주변의 구조를 나타낸 도면이다.
도 52는 X선 결정 구조 해석에 의해 결정된 Fc(BP208)/FcgRIIb 세포외영역 복합체 중 Fc(BP208) CH2 도메인 A의 Ser239 주변의 구조를 나타낸 도면이다.
도 53은 대표적인 H240-AK072/H240-BH076/L73-k0 개변 항체의 분석용 양이온 교환 크로마토그래피의 결과를 도시한 것이다. A: H240-AK072/H240-BH076/L73-k0, B: H240-FA021/H240-FB084/L73-k0
도 54는 대표적인 H240-AK072/H240-BH076/L73-k0 개변 항체인 H240- FA021/H240- FB084/L73-k0의 분취용 양이온 교환 크로마토그래피(A) 및 분취 분획의 분석용 양이온 교환 크로마토그래피(B)의 결과를 도시한 것이다.
아래의 정의는 본 명세서에 있어서 설명하는 본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해 제공된다.
본 발명은 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 헤테로이량화체에 의해 구성되어 있는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드로서, 그 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 변이가 도입되어 있는 Fc영역을 포함하고, 변이가 도입되어 있지 않은 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 Fc영역의 기능이 개변되어 있는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드를 제공한다. 또한 당해 폴리펩티드의 제조방법 및 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드의 기능을 개변하는 방법 등도 제공한다.
본 발명에 있어서 「제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 헤테로이량화체에 의해 구성되어 있는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드」란, 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드 및 다른 복수의 폴리펩티드로 구성되는 폴리펩티드 복합체여도 된다.
본 명세서에서 「제1 폴리펩티드」 및 「제2 폴리펩티드」란 항체의 Fc영역을 구성하는 폴리펩티드를 의미한다. 「제1 폴리펩티드」 및 「제2 폴리펩티드」는 서로 서열이 상이한 것을 의미하고, 바람직하게는 적어도 CH2영역의 서열이 상이한 것을 의미한다. 당해 폴리펩티드로서는, 예를 들면 천연형 IgG의 Fc영역을 구성하는 폴리펩티드여도 되고, 또한 천연형 IgG의 Fc영역을 구성하는 폴리펩티드에 개변이 가해진 폴리펩티드여도 된다.
천연형 IgG란 천연에 발견되는 IgG와 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 면역 글로불린 감마 유전자에 의해 실질적으로 코드되는 항체의 클래스에 속하는 폴리펩티드를 의미한다. 예를 들면 천연형 인간 IgG란 천연형 인간 IgG1, 천연형 인간 IgG2, 천연형 인간 IgG3, 천연형 인간 IgG4 등을 의미한다. 천연형 IgG에는 그것으로부터 자연적으로 생기는 변이체 등도 포함된다.
본 발명에 있어서의 「폴리펩티드」란 통상 10 아미노산 정도 이상의 길이를 갖는 펩티드 및 단백질을 가리킨다. 또한 통상 생물 유래의 폴리펩티드이나 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 인공적으로 설계된 서열로 이루어지는 폴리펩티드여도 된다. 또한 천연 폴리펩티드, 또는 합성 폴리펩티드, 재조합 폴리펩티드 등 중 어느 것이어도 된다. 또한 본 발명에 있어서의 단백질 분자란 당해 폴리펩티드를 포함하는 분자를 가리킨다.
본 발명의 폴리펩티드의 바람직한 예로서 항체를 들 수 있다. 더욱 바람직한 예로서, 천연형 IgG, 특히 천연형 인간 IgG를 들 수 있다. 천연형 IgG란 천연에 발견되는 IgG와 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 면역 글로불린 감마 유전자에 의해 실질적으로 코드되는 항체의 클래스에 속하는 폴리펩티드를 의미한다. 예를 들면 천연형 인간 IgG란 천연형 인간 IgG1, 천연형 인간 IgG2, 천연형 인간 IgG3, 천연형 인간 IgG4 등을 의미한다. 천연형 IgG에는 그것으로부터 자연적으로 생기는 변이체 등도 포함된다.
항체의 경쇄 불변영역에는 IgK(Kappa, κ쇄), IgL1, IgL2, IgL3, IgL6, IgL7(Lambda, λ쇄) 타입의 불변영역이 존재하고 있는데, 어느 경쇄 불변영역이어도 된다. 인간 IgK(Kappa) 불변영역과 인간 IgL7(Lambda) 불변영역으로서는, 유전자 다형에 의한 복수의 알로타입 서열이 Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242에 기재되어 있는데, 본 발명에 있어서는 그 중 어느 것이어도 된다. 또한 본 발명에 있어서 경쇄 불변영역은 아미노산의 치환, 부가, 결손, 삽입 및/또는 수식 등의 개변이 행해진 경쇄 불변영역이어도 된다. 항체의 Fc영역으로서는 예를 들면 IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM 타입의 Fc영역이 존재하고 있다. 본 발명의 항체의 Fc영역은 예를 들면 인간 IgG 항체의 Fc영역을 사용할 수 있고, 바람직하게는 인간 IgG1 항체의 Fc영역이다. 본 발명의 Fc영역으로서 예를 들면 천연형 IgG의 불변영역, 구체적으로는 천연형 인간 IgG1을 기원으로 하는 불변영역(서열번호：76), 천연형 인간 IgG2를 기원으로 하는 불변영역(서열번호：77), 천연형 인간 IgG3를 기원으로 하는 불변영역(서열번호：78), 천연형 인간 IgG4를 기원으로 하는 불변영역(서열번호：79) 유래의 Fc영역을 사용할 수 있다. 도 32에는 천연형 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4의 불변영역의 서열을 나타낸다. 천연형 IgG의 불변영역에는 그것으로부터 자연적으로 생기는 변이체 등도 포함된다. 인간 IgG1, 인간 IgG2, 인간 IgG3, 인간 IgG4 항체의 불변영역으로서는, 유전자 다형에 의한 복수의 알로타입 서열이 Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242에 기재되어 있는데, 본 발명에 있어서는 그 중 어느 것이어도 된다. 특히 인간 IgG1의 서열로서는 EU 넘버링 356-358번째의 아미노산 서열이 DEL이어도 되고 EEM이어도 된다.
또한 항체의 Fc영역과 FcγR의 상호작용의 강도는 Zn2+ 이온 농도 의존적인 것이 보고되어 있다(Immunology Letters 143(2012) 60-69). 항체는 Fc영역의 Zn2+ 이온 농도가 높을수록 Fc영역과 FcgR의 상호작용은 증강된다. 항체의 Fc영역의 CH3에 존재하는 His310, His435가 Zn2+를 킬레이트함으로써 먼 위치에 있는 Fc영역의 각 CH2 도메인이 열린다. 이것에 의해 CH2 도메인과 FcgR이 상호작용하기 쉬워져 Fc영역과 FcgR의 상호작용이 증강된다. 본 발명의 Fc영역의 비한정 일태양으로서, EU 넘버링으로 표시되는 310번 위치의 His, 435번 위치의 His, 433번 위치의 His 및/또는 434번 위치의 Asn에 Zn2+가 킬레이트된 Fc영역을 들 수 있다.
본 발명에 있어서 「Fc영역」은 항체분자 중의 힌지부 또는 그의 일부, CH2, CH3 도메인으로 이루어지는 영역을 말한다. IgG 클래스의 Fc영역은 EU 넘버링(본 명세서에서는 EU INDEX라고도 불린다)으로, 예를 들면 226번째의 시스테인으로부터 C 말단, 또는 230번째의 프롤린으로부터 C 말단까지를 의미하는데 이것에 한정되지 않는다.
Fc영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 단일클론항체 등을 펩신 등의 단백질 분해효소로 부분 소화한 후에, 프로테인 A 칼럼 또는 프로테인 G 칼럼에 흡착된 분획을 재용출함으로써 적합하게 취득될 수 있다. 이러한 단백 분해효소로서는 pH 등의 효소의 반응 조건을 적절히 설정함으로써 제한적으로 Fab나 F(ab')2를 생성시키도록 전장 항체를 소화할 수 있는 것이라면 특단의 한정은 되지 않고, 예를 들면 펩신이나 파파인 등을 예시할 수 있다.
본 명세서에 있어서 「헤테로이량화」란 아미노산 서열이 상이한 2개의 폴리펩티드로부터 하나의 폴리펩티드를 구성하는 것을 의미하고, 「헤테로이량화체」란 아미노산 서열이 상이한 2개의 폴리펩티드로 구성되는 폴리펩티드를 의미한다. 또한 「호모이량화」란 동일 아미노산 서열을 갖는 2개의 폴리펩티드로부터 하나의 폴리펩티드를 구성하는 것을 의미하고, 「호모이량화체」란 2개의 동일한 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드, 또는 헤테로이량화 형성을 효율적으로 하는 것을 목적으로 한 개변이나, 헤테로이량화체를 효율적으로 정제하는 것을 목적으로 한 개변을 제외하고 동일한 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드, 또는 Fc의 기능을 개선하는 것을 목적으로 하지 않는 개변을 제외하고 동일한 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드로 구성되는 폴리펩티드를 의미한다. 본 발명에 있어서 「헤테로이량화체」 또는 「호모이량화체」란 바람직하게는 Fc영역에 대해서 「헤테로이량화」 또는 「호모이량화」를 의미하고, 보다 바람직하게는 Fc영역 중의 CH2에 대해서 「헤테로이량화」 또는 「호모이량화」를 의미한다. 또한 「모체 폴리펩티드(parent polypeptide)」란 아미노산 변이 등의 개변을 도입하기 전의 폴리펩티드를 의미한다.
본 발명의 아미노산 변이는 단독으로 사용해도 되고 복수 조합해서 사용해도 된다.
복수 조합해서 사용하는 경우, 조합하는 수는 특별히 한정되지 않고 발명의 목적을 달성할 수 있는 범위 내에서 적당히 설정할 수 있으며, 예를 들면 2개 이상 30개 이하, 바람직하게는 2개 이상 15개 이하이다.
복수 조합하는 경우, Fc영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드의 한쪽에만 당해 아미노산 변이를 가해도 되고, 또한 2개의 폴리펩티드의 양쪽에 적당히 나눠서 가해도 된다.
또한 본 발명에 있어서는 Fc영역의 보다 높은 기능의 개변 효과를 얻기 위해, 변이를 도입하지 않는 경우 및 2개의 폴리펩티드의 양쪽 Fc영역에 변이가 도입된 경우와 비교하여, 한쪽에만 변이가 도입된 경우 쪽이 그 Fc영역의 기능이 향상되는 아미노산 변이가 하나 이상 도입되어 있는 것이 바람직하다.
개변되는 부위는 Fc영역이라면 특별히 한정되지 않고 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 범위 내에서 적당히 설정할 수 있으며, 예를 들면 힌지영역, CH2영역, CH3영역 등이다.
보다 바람직하게는 개변되는 부위는 CH2영역이다. 또한 CH2영역이란 EU 넘버링 231번째~340번째, CH3영역이란 EU 넘버링 341번째~447번째를 의미한다. 예를 들면 인간 IgG1을 기원으로 하는 불변영역의 아미노산 서열에 대해 변이를 도입하는 경우, EU 넘버링 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 있어서의 아미노산 잔기에 개변을 가할 수 있다.
보다 구체적으로는, 인간 IgG1 불변영역의 아미노산 서열에 대해 개변을 도입하는 경우, EU 넘버링 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 있어서의 아미노산 잔기에 개변을 가할 수 있다.
보다 구체적으로는 인간 IgG1 불변영역의 아미노산 서열에 대해 개변을 도입하는 경우, EU 넘버링 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 있어서의 아미노산 잔기에 개변을 가할 수 있다.
보다 구체적으로는 인간 IgG1 불변영역의 아미노산 서열에 대해 변이를 도입하는 경우, EU 넘버링 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 295, 296, 298, 300, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337로부터 선택되는 하나 이상의 위치에 있어서의 아미노산 잔기에 개변을 가할 수 있다.
본 발명에 있어서 아미노산의 개변이란, 치환, 결손, 부가, 삽입 또는 수식 중 어느 하나, 또는 그들의 조합을 의미한다. 본 발명에 있어서는 아미노산의 개변은 아미노산의 변이로 바꿔 말하는 것이 가능하고, 동일한 의미로 사용된다.
치환
아미노산 잔기를 치환하는 경우에는, 별도의 아미노산 잔기로 치환함으로써, 예를 들면 다음의 (a)~(c)와 같은 점에 대해서 개변하는 것을 목적으로 한다.
(a) 시트 구조 또는 나선 구조의 영역에 있어서의 폴리펩티드의 백본 구조；(b) 표적 부위에 있어서의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 크기.
아미노산 잔기는 일반 측쇄의 특성을 토대로 아래의 그룹으로 분류된다：
(1) 소수성：노르류신, met, ala, val, leu, ile；
(2) 중성 친수성： cys, ser, thr, asn, gln；
(3) 산성： asp, glu；
(4) 염기성： his, lys, arg；
(5) 사슬의 배향에 영향을 미치는 잔기： gly, pro； 및
(6) 방향족성： trp, tyr, phe.
이들 각 그룹 내에서의 아미노산 잔기의 치환은 보존적 치환으로 불리는 한편, 다른 그룹끼리에서의 아미노산 잔기의 치환은 비보존적 치환으로 불린다.
본 발명에 있어서의 치환은 보존적 치환이어도 되고, 비보존적 치환이어도 되며, 또한 보존적 치환과 비보존적 치환의 조합이어도 된다.
또한 본 발명의 폴리펩티드에는 본 발명을 토대로 도입된 아미노산 변이에 더하여 추가로 부가적인 개변을 포함할 수 있다. 부가적인 개변은 예를 들면 아미노산의 치환, 결손 또는 수식 중 어느 하나 또는 그들의 조합으로부터 선택할 수 있다.
예를 들면 본 발명의 폴리펩티드에는 추가로 당해 폴리펩티드의 목적으로 하는 기능에 실질적인 변화를 주지 않는 범위에서 임의로 개변을 가할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드가 항체인 경우, 중쇄나 경쇄에 개변을 가할 수 있다. 예를 들면 이와 같은 변이는 아미노산 잔기의 보존적 치환에 의해 행할 수 있다. 또한 본 발명의 폴리펩티드의 목적으로 하는 기능에 변화를 줄 수 있는 개변이라도, 당해 기능의 변화가 본 발명의 목적의 범위 내라면 그러한 개변도 행할 수 있다.
본 발명에 있어서의 아미노산 서열의 개변에는 번역 후 수식이 포함된다. 구체적인 번역 후 수식으로서 당쇄의 부가 또는 결손을 나타낼 수 있다. 예를 들면 IgG1 불변영역에 있어서 EU 넘버링의 297번째의 아미노산 잔기는 당쇄로 수식된 것일 수 있다. 수식되는 당쇄 구조는 한정되지 않는다. 일반적으로 진핵세포에서 발현되는 항체는 불변영역에 당쇄 수식을 포함한다. 따라서 아래와 같은 세포에서 발현되는 항체는 통상 어떠한 형태의 당쇄로 수식된다.
·포유동물의 항체생산세포
·항체를 코드하는 DNA를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 진핵세포
여기에 나타낸 진핵세포에는 효모나 동물세포가 포함된다. 예를 들면 CHO세포나 HEK293H세포는 항체를 코드하는 DNA를 포함하는 발현 벡터로 형질전환하기 위한 대표적인 동물세포이다. 한편 당해 위치에 당쇄 수식이 없는 것도 본 발명의 항체에 포함된다. 불변영역이 당쇄로 수식되어 있지 않은 항체는 항체를 코드하는 유전자를 대장균 등의 원핵세포에서 발현시켜서 얻을 수 있다.
본 발명에 있어서 부가적인 개변으로서는 보다 구체적으로는 예를 들면 Fc영역의 당쇄에 시알산을 부가한 것이어도 된다(MAbs. 2010 Sep-Oct;2(5):519-27.).
본 발명의 폴리펩티드가 항체인 경우, 항체 불변영역 부분에 예를 들면 FcRn에 대한 결합활성을 향상시키는 아미노산 치환(J Immunol. 2006 Jan 1;176(1):346-56, J Biol Chem. 2006 Aug 18;281(33):23514-24., Int Immunol. 2006 Dec;18(12):1759-69., Nat Biotechnol. 2010 Feb;28(2):157-9., WO/2006/019447, WO/2006/053301, WO/2009/086320), 항체의 헤테로제니티나 안정성을 향상시키기 위한 아미노산 치환((WO/2009/041613))을 가해도 된다.
본 발명의 헤테로이량화 폴리펩티드를 제작하는 데는 서로 상이한 아미노산을 갖는 폴리펩티드끼리를 회합화시키거나, 또는 목적의 헤테로이량화 폴리펩티드를 다른 호모이량화 폴리펩티드로부터 분리할 필요가 있다.
Fc영역을 갖는 상이한 아미노산을 갖는 폴리펩티드끼리의 회합화에는, 항체 H쇄의 제2 불변영역(CH2) 또는 H쇄의 제3 불변영역(CH3)의 계면에 전하적인 반발을 도입하여 목적으로 하지 않는 H쇄끼리의 회합을 억제하는 기술을 적용할 수 있다(WO2006/106905).
CH2 또는 CH3의 계면에 전하적인 반발을 도입하여 의도하지 않는 H쇄끼리의 회합을 억제시키는 기술에 있어서 H쇄의 다른 불변영역의 계면에서 접촉하는 아미노산 잔기로서는, 예를 들면 CH3영역에 있어서의 EU 넘버링 356번째의 잔기, EU 넘버링 439번째의 잔기, EU 넘버링 357번째의 잔기, EU 넘버링 370번째의 잔기, EU 넘버링 399번째의 잔기, EU 넘버링 409번째의 잔기에 상대하는 영역을 들 수 있다.
보다 구체적으로는 예를 들면 2종의 H쇄 CH3영역을 포함하는 항체에 있어서는, 제1 H쇄 CH3영역에 있어서의 아래의 (1)~(3)에 나타내는 아미노산 잔기의 조(組)로부터 선택되는 1조~3조의 아미노산 잔기가 동종의 전하를 갖는 항체로 할 수 있다；
(1) H쇄 CH3영역에 포함되는 아미노산 잔기로서, EU 넘버링 356번 위치 및 439번 위치의 아미노산 잔기,
(2) H쇄 CH3영역에 포함되는 아미노산 잔기로서, EU 넘버링 357번 위치 및 370번 위치의 아미노산 잔기,
(3) H쇄 CH3영역에 포함되는 아미노산 잔기로서, EU 넘버링 399번 위치 및 409번 위치의 아미노산 잔기.
또한 상기 제1 H쇄 CH3영역과는 상이한 제2 H쇄 CH3영역에 있어서의 상기 (1)~(3)에 나타내는 아미노산 잔기의 조로부터 선택되는 아미노산 잔기의 조로서, 상기 제1 H쇄 CH3영역에 있어서 동종의 전하를 갖는 상기 (1)~(3)에 나타내는 아미노산 잔기의 조에 대응하는 1조~3조의 아미노산 잔기가 상기 제1 H쇄 CH3영역에 있어서의 대응하는 아미노산 잔기와는 반대의 전하를 갖는 항체로 할 수 있다.
상기 (1)~(3)에 기재된 각각의 아미노산 잔기는 회합하였을 때 서로 접근해 있다. 당업자라면 목적하는 H쇄 CH3영역 또는 H쇄 불변영역에 대해서, 시판의 소프트웨어를 사용한 호모로지 모델링 등에 의해 상기 (1)~(3)에 기재된 아미노산 잔기에 대응하는 부위를 발견할 수 있어, 적당히 그 부위의 아미노산 잔기를 개변에 제공하는 것이 가능하다.
상기 항체에 있어서 「전하를 갖는 아미노산 잔기」는, 예를 들면 아래의 (X) 또는 (Y) 중 어느 하나의 군에 포함되는 아미노산 잔기로부터 선택되는 것이 바람직하다；
(X) 글루타민산(E), 아스파라긴산(D),
(Y) 리신(K), 아르기닌(R), 히스티딘(H).
상기 항체에 있어서 「동종의 전하를 갖는다」는 것은, 예를 들면 2개 이상의 아미노산 잔기 모두가 상기 (X) 또는 (Y) 중 어느 하나의 군에 포함되는 아미노산 잔기를 갖는 것을 의미한다. 「반대의 전하를 갖는다」는 것은, 예를 들면 2개 이상의 아미노산 잔기 중 하나 이상의 아미노산 잔기가 상기 (X) 또는 (Y) 중 어느 하나의 군에 포함되는 아미노산 잔기를 갖는 경우에, 나머지 아미노산 잔기가 상이한 군에 포함되는 아미노산 잔기를 갖는 것을 의미한다.
바람직한 태양에 있어서 상기 항체는 제1 H쇄 CH3영역과 제2 H쇄 CH3영역이 디설피드 결합에 의해 가교되어 있어도 된다.
본 발명에 있어서 개변에 제공하는 아미노산 잔기로서는 전술한 항체의 가변영역 또는 항체의 불변영역의 아미노산 잔기에 한정되지 않는다. 당업자라면 폴리펩티드 변이체 또는 이종 다량체에 대해서 시판의 소프트웨어를 사용한 호모로지 모델링 등에 의해 계면을 형성하는 아미노산 잔기를 발견할 수 있어, 회합을 제어하도록 그 부위의 아미노산 잔기를 개변에 제공하는 것이 가능하다.
본 발명의 Fc영역을 갖는 상이한 아미노산을 갖는 폴리펩티드끼리의 회합화에는 추가로 다른 공지기술을 사용하는 것도 가능하다. 항체의 한쪽 H쇄의 가변영역에 존재하는 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄(knob; 돌기)로 치환하고, 다른 한쪽 H쇄의 상대하는 가변영역에 존재하는 아미노산 측쇄를 보다 작은 측쇄(hole; 공극)로 치환함으로써, 돌기가 공극에 배치될 수 있도록 함으로써 효율적으로 Fc영역을 갖는 상이한 아미노산을 갖는 폴리펩티드끼리의 회합화를 일으킬 수 있다(WO1996/027011, Ridgway JB et al., Protein Engineering(1996) 9, 617-621, Merchant AM et al. Nature Biotechnology(1998) 16, 677-681).
이에 더하여, Fc영역을 갖는 상이한 아미노산을 갖는 폴리펩티드끼리의 회합화에는 추가로 다른 공지기술을 사용하는 것도 가능하다. 항체의 한쪽 H쇄의 CH3의 일부를 그 부분에 대응하는 IgA 유래의 서열로 하고, 다른 한쪽 H쇄의 CH3의 상보적인 부분에 그 부분에 대응하는 IgA 유래의 서열을 도입한 strand-exchange engineered domain CH3를 사용함으로써, 상이한 서열을 갖는 폴리펩티드의 회합화를 CH3의 상보적인 회합화에 의해 효율적으로 일으킬 수 있다(Protein Engineering Design & Selection, 23; 195-202, 2010). 이 공지기술을 사용해도 효율적으로 Fc영역을 갖는 상이한 아미노산을 갖는 폴리펩티드끼리의 회합화를 일으킬 수 있다.
이 외에도 WO2011/028952에 기재된 항체의 CH1과 CL의 회합화, VH, VL의 회합화를 이용한 헤테로이량화 항체 제작기술도 사용할 수 있다.
또한 효율적으로 헤테로이량화 폴리펩티드를 효율적으로 형성할 수 없는 경우라도, 헤테로이량화 폴리펩티드를 호모이량화 폴리펩티드와 분리, 정제함으로써도 헤테로이량화 폴리펩티드를 얻는 것이 가능하다. 서로 서열이 상이한 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드로 이루어지는 헤테로이량화 폴리펩티드를 제작할 때는, 2개의 제1 폴리펩티드만으로 이루어지는 호모이량화 폴리펩티드, 2개의 제2 폴리펩티드만으로 이루어지는 호모이량화 폴리펩티드가 불순물로서 혼입된다. 이들 2종류의 호모이량화 폴리펩티드를 효율적으로 제거하는 방법으로서 공지기술을 사용할 수 있다. 2종류의 H쇄의 가변영역에 아미노산 치환을 도입하여 등전점의 차를 부여함으로써, 2종류의 호모체와 목적의 헤테로이량화 항체를 이온 교환 크로마토그래피로 정제 가능하게 하는 방법이 보고되어 있다(WO2007114325). 헤테로이량화 항체를 정제하는 방법으로서, 지금까지 프로테인 A에 결합하는 마우스 IgG2a의 H쇄와 프로테인 A에 결합하지 않는 랫트 IgG2b의 H쇄로 이루어지는 헤테로이량화 항체를 프로테인 A를 사용하여 정제하는 방법이 보고되어 있다(WO98050431, WO95033844).
또한 IgG와 Protein A의 결합부위인 EU 넘버링 435번째 및 436번째의 아미노산 잔기를 Tyr, His 등의 Protein A로의 결합력이 상이한 아미노산으로 치환한 H쇄를 사용함으로써, 각 H쇄와 Protein A의 상호작용을 변화시켜, Protein A 칼럼을 사용함으로써 헤테로이량화 항체만을 효율적으로 정제하는 것도 가능하다.
이들의 치환, 기술을 복수, 예를 들면 2개 이상 조합해서 사용할 수 있다. 또한 이들 개변은 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드에 적당히 따로 따로 가할 수 있다. 또한 본 발명의 폴리펩티드는 상기 개변이 가해진 것을 기초로 하여 제작한 것이어도 된다.
아미노산 서열의 개변은 당분야에 있어서 공지의 각종 방법에 의해 행할 수 있다. 이들 방법으로는 다음의 것에 한정되는 것은 아니지만, 부위 특이적 변이 유도법(Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y, and Nakagawa, M.(1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271-275, Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors. Methods Enzymol. 100, 468-500, Kramer,W, Drutsa,V, Jansen,HW, Kramer,B, Pflugfelder,M, and Fritz,HJ(1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456, Kramer W, and Fritz HJ(1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154, 350-367, Kunkel,TA(1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 488-492), PCR 변이법, 카세트 변이법 등의 방법에 의해 행할 수 있다.
본 발명에 있어서 「Fc영역의 기능」이란, 예를 들면 Fc영역의 Fcγ 수용체에 대한 결합활성(결합활성의 증강 또는 결합활성의 감소), Fc영역의 Fcγ 수용체 아이소폼 간의 선택성(결합활성의 선택성의 향상), Fc영역의 물리화학적 안정성, ADCC 활성, ADCP 활성 등을 말한다. 여기서 Fc영역의 Fcγ 수용체 아이소폼 간의 선택성이란, Fcγ 수용체의 특정 아이소폼에 대해 선택적으로 결합하는 것을 의미한다. Fc영역의 물리화학적 안정성이란, 예를 들면 Fc영역의 열역학적인 안정성, 프로테아제에 대한 안정성, 화학처리에 대한 안정성, 동결융해에 대한 안정성, 보존 안정성, 산성 조건하의 안정성, 광 안정성, 진탕이나 농축에 수반되는 스트레스에 대한 안정성, 폭 넓은 용액 조건에 있어서의 용해성 유지를 의미한다. 또한 Fc영역의 기능이란, Fc영역의 Fcγ 수용체에 대한 결합활성, Fc영역의 Fcγ 수용체 아이소폼 간의 선택성, Fc영역의 물리화학적 안정성 등으로부터 2개 이상을 조합한 기능이어도 되고, 예를 들면 Fc영역의 Fcγ 수용체에 대한 결합활성과 Fc영역의 Fcγ 수용체 아이소폼 간의 선택성을 합한 기능, Fc영역의 Fcγ 수용체에 대한 결합활성과 Fc영역의 물리화학적 안정성을 합한 기능, Fc영역의 Fcγ 수용체 아이소폼 간의 선택성과 Fc영역의 물리화학적 안정성을 합한 기능, Fc영역의 Fcγ 수용체에 대한 결합활성, Fc영역의 Fcγ 수용체 아이소폼 간의 선택성 및 Fc영역의 물리화학적 안정성을 합한 기능을 의미한다.
본 발명에 있어서 「Fc영역의 기능을 개변」이란, 예를 들면 Fc영역의 기능이 Fc영역의 Fcγ 수용체에 대한 결합활성을 나타내는 경우는 Fc영역의 Fcγ 수용체에 대한 결합활성의 증강이나 감소 등을 의미한다. 선택성의 향상이란, 예를 들면 어떤 Fcγ 수용체에 대한 결합활성을 증강시키는 한편으로, 다른 Fcγ 수용체에 대한 결합활성을 유지 또는 저감시키는 것을 의미한다. 또는 선택성의 향상이란, 예를 들면 어떤 Fcγ 수용체에 대한 결합활성을 저감시키는 한편으로, 다른 Fcγ 수용체에 대한 결합활성을 유지 또는 증강시키는 것을 의미한다. 또한 예를 들면 Fc영역의 기능이 Fc영역의 Fcγ 수용체 서브타입 간의 선택성을 나타내는 경우는 Fc영역의 Fcγ 수용체 서브타입 간의 선택성의 향상이나 저하 등을 의미한다. 또한 예를 들면 Fc영역의 기능이 Fc영역의 물리화학적 안정성을 나타내는 경우는, Fc영역의 물리화학적 안정성의 향상이나 저하, 안정성 저하의 억제 등을 의미하고, 보다 구체적으로는 예를 들면 CH2영역의 Tm값의 향상이나 저하, Tm값 저하의 억제 등을 의미한다.
또한 예를 들면 Fc영역의 Fcγ 수용체에 대한 결합활성, Fc영역의 Fcγ 수용체 아이소폼 간의 선택성 및 Fc영역의 물리화학적 안정성을 합한 기능의 향상이란, 대조에 비해 반드시 Fc영역의 Fcγ 수용체에 대한 결합활성, Fc영역의 Fcγ 수용체 아이소폼 간의 선택성 및 Fc영역의 물리화학적 안정성 모두가 향상되어 있을 필요는 없고, 전체적으로 Fc영역의 기능이 향상되어 있으면 된다. 또한 반대로 예를 들면 Fc영역의 Fcγ 수용체에 대한 결합활성, Fc영역의 Fcγ 수용체 아이소폼 간의 선택성 및 Fc영역의 물리화학적 안정성을 합한 기능의 저하란, 대조에 비해 반드시 Fc영역의 Fcγ 수용체에 대한 결합활성, Fc영역의 Fcγ 수용체 아이소폼 간의 선택성 및 Fc영역의 물리화학적 안정성 모두가 저하되어 있을 필요는 없고, 전체적으로 Fc영역의 기능이 저하되어 있으면 된다.
본 발명에 있어서, Fcγ 수용체(본 명세서에서는 Fcγ 수용체, FcγR 또는 FcgR로 기재하는 경우가 있다)란 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4의 Fc영역에 결합할 수 있는 수용체를 말하고, 실질적으로 Fcγ 수용체 유전자에 코드되는 단백질 패밀리의 어떠한 멤버도 의미한다. 인간의 경우는 이 패밀리에는 아이소폼 FcγRIa, FcγRIb 및 FcγRIc를 포함하는 FcγRI(CD64)；아이소폼 FcγRIIa(알로타입 H131(H형) 및 R131(R형)을 포함한다), FcγRIIb(FcγRIIb-1 및 FcγRIIb-2를 포함한다) 및 FcγRIIc를 포함하는 FcγRII(CD32)；및 아이소폼 FcγRIIIa(알로타입 V158 및 F158을 포함한다) 및 FcγRIIIb(알로타입 FcγRIIIb-NA1 및 FcγRIIIb-NA2를 포함한다)를 포함하는 FcγRIII(CD16) 및 어떠한 미발견의 인간 FcγR류 또는 FcγR 아이소폼 또는 알로타입도 포함되는데 이들에 한정되는 것은 아니다. FcγR은 인간, 마우스, 랫트, 토끼 및 원숭이 유래의 것이 포함되는데 이들에 한정되지 않고, 어떠한 생물 유래여도 된다. 마우스 FcγR류에는 FcγRI(CD64), FcγRII(CD32), FcγRIII(CD16) 및 FcγRIII-2(CD16-2 또는 FcγRIV) 및 어떠한 미발견의 마우스 FcγR류 또는 FcγR 아이소폼 또는 알로타입도 포함되는데 이들에 한정되지 않는다. 이러한 Fcγ 수용체의 적합한 예로서는 인간 FcγRI(CD64), FcγRIIa(CD32), FcγRIIb(CD32), FcγRIIIa(CD16) 및/또는 FcγRIIIb(CD16)를 들 수 있다.
FcγR에는 ITAM(Immunoreceptor tyrosine-based activation motif)을 갖는 활성형 수용체와 ITIM(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif)을 갖는 억제형 수용체가 존재한다. FcγR은 FcγRI, FcγRIIa R, FcγRIIa H, FcγRIIIa, FcγRIIIb의 활성형 FcγR과 FcγRIIb의 억제형 FcγR로 분류된다.
FcγRI의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 NM_000566.3 및 NP_000557.1에,
FcγRIIa의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 BC020823.1 및 AAH20823.1에,
FcγRIIb의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 BC146678.1 및 AAI46679.1에,
FcγRIIIa의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 BC033678.1 및 AAH33678.1에, 및
FcγRIIIb의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 BC128562.1 및 AAI28563.1에 기재되어 있다(RefSeq 등록번호).
또한 FcγRIIa에는 FcγRIIa의 131번째의 아미노산이 히스티딘(H형) 또는 아르기닌(R형)으로 치환된 2종류의 유전자 다형이 존재한다(J. Exp. Med, 172, 19-25, 1990). 또한 FcγRIIb에는 FcγRIIb의 232번째의 아미노산이 이소류신(I형) 또는 트레오닌(T형)으로 치환된 2종류의 유전자 다형이 존재한다(Arthritis. Rheum. 46: 1242-1254(2002)). 또한 FcγRIIIa에는 FcγRIIIa의 158번째의 아미노산이 발린(V형) 또는 페닐알라닌(F형)으로 치환된 2종류의 유전자 다형이 존재한다(J. Clin. Invest. 100(5): 1059-1070(1997)). 또한 FcγRIIIb에는 NA1형, NA2형의 2종류의 유전자 다형이 존재한다(J. Clin. Invest. 85: 1287-1295(1990)).
상호작용을 관찰하는 물질의 한쪽(리간드)을 센서칩의 금박막 상에 고정하고, 센서칩의 뒤쪽에서 금박막과 유리의 경계면에서 전반사하도록 빛을 조사하면, 반사광의 일부에 반사강도가 저하된 부분(SPR 시그날)이 형성된다. 상호작용을 관찰하는 물질의 다른 쪽(애널라이트)을 센서칩의 표면에 흘려 리간드와 애널라이트가 결합하면, 고정화되어 있는 리간드 분자의 질량이 증가하고 센서칩 표면의 용매의 굴절률이 변화한다. 이 굴절률의 변화에 의해 SPR 시그날의 위치가 시프트된다(반대로 결합이 해리되면 시그날의 위치는 돌아간다). Biacore 시스템은 상기 시프트되는 양, 즉 센서칩 표면에서의 질량 변화를 세로축에 취하여, 질량의 시간 변화를 측정 데이터로서 표시한다(센서그램). 센서그램으로부터 센서칩 표면에 보족한 리간드에 대한 애널라이트의 결합량(애널라이트를 상호작용시킨 전후에서의 센서그램 상에서의 리스폰스의 변화량)이 구해진다. 다만 결합량은 리간드의 양에도 의존하기 때문에, 비교할 때는 리간드의 양을 본질적으로 동일한 양으로 한 것으로 볼 수 있는 조건하에서 비교할 필요가 있다. 또한 센서그램의 커브로부터 키네틱스：결합속도상수(ka)와 해리속도상수(kd)가, 당해 상수의 비로부터 친화성(KD)이 구해진다. BIACORE법의 경우는 저해 측정법도 적합하게 사용된다. 저해 측정법의 예는 Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2006) 103(11), 4005-4010에 있어서 기재되어 있다.
본 발명에 있어서 본 발명의 폴리펩티드 또는 Fc영역이 각종 Fcγ 수용체에 대한 결합활성이 증강되었는지 또는 결합활성이 감소되었는지 여부는, 예를 들면 본 실시예에 나타내어지는 바와 같이 표면 플라즈몬 공명(SPR) 현상을 이용한 상호작용 해석기기인 Biacore(GE Healthcare)를 사용해서 측정할 수 있다. Biacore는 Biacore T100, T200, X100, A100, 4000, 3000, 2000, 1000, C 등 어느 기종도 포함된다. 센서칩에는 CM7, CM5, CM4, CM3, C1, SA, NTA, L1, HPA，Au 칩 등의 Biacore용 센서칩 모두 사용할 수 있다. 러닝 버퍼에는 HBE-EP+에 더하여 HEPES, 인산, ACES, Tris, 구연산 등으로 pH7.4 등의 중성 부근의 pH로 조정한 버퍼를 사용할 수 있다. 측정온도는 4-37℃의 범위에서 측정 가능하다. 센서칩 상에 아민 커플링, 디설피드 커플링, 알데히드 커플링 등의 커플링 방법으로 항체를 보족하는 Protein A, Protein G, Protein L, 항인간 IgG 항체, 항인간 IgG-Fab, 항인간 L쇄 항체, 항인간 Fc 항체, 항원 단백질, 항원 펩티드 등의 항체 보족용 단백질을 고정화한다. 거기에 Fcγ 수용체I, IIa R형, IIa H형, IIb, IIIa F형, V형, IIIb 등의 각종 Fcγ 수용체를 애널라이트로서 흘리고 상호작용을 측정하여 센서그램을 취득한다. 이때의 Fcγ 수용체의 농도는 측정하는 샘플의 KD 등의 상호작용의 강도에 맞춰 수 uM 내지 수 pM의 범위에서 실시할 수 있다. 측정에 의해 그의 해리상수(KD)를 취득하여, KD의 값이 저하되었는지 또는 증가되었는지 여부로 본 발명의 폴리펩티드 또는 Fc영역이 각종 Fcγ 수용체에 대한 결합활성이 증강되었는지 또는 결합활성이 감소되었는지 여부를 판단할 수 있다. 또한 센서칩 상에 고정화한 항체 보족용 단백질로 캡쳐한 경우, 센서칩 상의 항체에 대해 각종 Fcγ 수용체를 애널라이트로서 흘린 전후에서의 센서그램 값의 변화량을 지표로 그 값이 증가된 정도로 본 발명의 폴리펩티드 또는 Fc영역이 각종 Fcγ 수용체에 대한 결합활성이 증강되었는지 또는 결합활성이 감소되었는지 여부를 판단할 수 있다. 또한 항체가 아니라 각종 Fcγ 수용체를 센서칩 상에 고정화하고, 거기에 평가하고자 하는 항체 샘플을 상호작용시키는 것도 가능하다. 상호작용의 센서그램으로부터 산출한 KD값의 저하 또는 증가, 또는 항체 샘플을 작용시키기 전후의 센서그램의 증가 정도로부터 본 발명의 폴리펩티드 또는 Fc영역이 각종 Fcγ 수용체에 대한 결합활성이 증강되었는지 또는 결합활성이 감소되었는지 여부를 판단할 수 있다.
구체적으로는 Fc영역의 Fcγ 수용체에 대한 결합활성은 ELISA나 FACS(fluorescence activated cell sorting) 외에, ALPHA 스크린(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)이나 표면 플라즈몬 공명(SPR) 현상을 이용한 BIACORE법 등에 따라 측정할 수 있다(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2006) 103(11), 4005-4010).
ALPHA 스크린은 도너와 액셉터의 2개의 비드를 사용하는 ALPHA 테크놀로지에 의해 하기의 원리를 토대로 실시된다. 도너 비드에 결합한 분자가 액셉터 비드에 결합한 분자와 생물학적으로 상호작용하여 2개의 비드가 근접한 상태일 때만 발광 시그날이 검출된다. 레이저에 의해 여기된 도너 비드 내의 감광제는 주변의 산소를 여기상태의 일중항산소로 변환한다. 일중항산소는 도너 비드 주위로 확산되어, 근접해 있는 액셉터 비드에 도달하면 비드 내의 화학발광 반응을 일으키고 최종적으로 빛이 방출된다. 도너 비드에 결합한 분자와 액셉터 비드에 결합한 분자가 상호작용하지 않을 때는 도너 비드가 생산하는 일중항산소가 액셉터 비드에 도달하지 않기 때문에 화학발광 반응은 일어나지 않는다.
예를 들면 도너 비드에 비오틴 표지된 피검 폴리펩티드가 도너 비드 상의 스트렙토아비딘에 결합되고, 액셉터 비드에는 글루타티온 S 트랜스페라아제(GST)로 태그화된 Fcγ 수용체가 결합된다. 경합하는 폴리펩티드의 비존재하에서는 피검 폴리펩티드와 Fcγ 수용체는 상호작용하여 520-620 nm의 시그날을 발생시킨다. 태그화되어 있지 않은 폴리펩티드는 피검 폴리펩티드와 Fcγ 수용체 간의 상호작용과 경합한다. 경합의 결과 나타나는 형광의 감소를 정량함으로써 상대적인 결합활성이 결정될 수 있다. 폴리펩티드를 Sulfo-NHS-비오틴 등을 사용하여 비오틴화하는 것은 공지이다. Fcγ 수용체를 GST로 태그화하는 방법으로서는, Fcγ 수용체를 코드하는 폴리뉴클레오티드와 GST를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 인프레임으로 융합한 융합 유전자를 발현 가능한 벡터에 보유한 세포 등에 있어서 발현하고, 글루타티온 칼럼을 사용하여 정제하는 방법 등이 적당히 채용될 수 있다. 얻어진 시그날은 예를 들면 GRAPHPAD PRISM(GraphPad사, San Diego) 등의 소프트웨어를 사용하여 비선형 회귀 해석을 이용하는 일부위 경합(one-site competition) 모델에 적합하게 함으로써 적합하게 해석된다.
또한 태그화는 GST에 한정되지 않고 히스티딘 태그, MBP, CBP, Flag 태그, HA 태그, V5 태그, c-myc 태그 등의 어떠한 태그여도 되고 한정되지 않는다. 또한 피검 폴리펩티드의 도너 비드로의 결합에 대해서는 비오틴-스트렙토아비딘 반응을 이용한 결합에 한정되지 않는다. 특히 피검 폴리펩티드가 항체, Fc 융합 폴리펩티드 등의 Fc를 포함하는 경우는, 도너 비드 상의 Protein A, Protein G 등의 Fc 인식 단백질을 매개로 피검 폴리펩티드를 결합시키는 방법을 생각할 수 있다.
FcγR에 대한 결합 또는 FcγR에 대한 결합활성의 감소란, 비교하는 폴리펩티드의 양을 본질적으로 동일하게 하여 어세이를 행하였을 때에 모체 폴리펩티드보다도 본질적으로 보다 약한 결합활성으로 FcγR과 결합하는 것을 말한다.
FcγR에 대한 결합 또는 FcγR에 대한 결합활성이 감소 또는 저하된 헤테로이량화 폴리펩티드란, 비교하는 폴리펩티드의 양을 본질적으로 동일하게 하여 어세이를 행하였을 때에 호모이량화 폴리펩티드보다도 본질적으로 보다 약한 결합활성으로 FcγR과 결합하는 것을 말한다.
예를 들면 상기 측정법으로 측정한 KD값에 있어서, KD값비(모체 폴리펩티드의 KD값/변이를 도입한 폴리펩티드의 KD값)는 바람직하게는 0.99 이하, 0.95 이하, 0.9 이하, 0.8 이하, 0.7 이하, 0.5 이하, 0.3 이하, 0.1 이하이다. 더욱 바람직하게는 0.08 이하, 0.05 이하, 0.02 이하, 0.01 이하, 0.001 이하이다. 또한 본 명세서에 있어서 KD값비는 KD ratio라고도 한다.
또한 상기 측정법으로 측정한 KD값에 있어서, KD값이 1 pM 이상 상승해 있는 것이 바람직하고, 10 pM, 100 pM, 1 nM 이상, 2 nM 이상, 3 nM 이상, 5 nM 이상, 10 nM 이상, 20 nM 이상, 50 nM 이상, 100 nM 이상, 1 μM 이상 상승해 있는 것이 더욱 바람직하다. 또한 상기 측정법으로 측정한 KD값에 있어서, KD값이 1 pM 이상인 것이 바람직하고, 10 pM 이상, 100 pM 이상, 1 nM 이상, 10 nM 이상, 100 nM 이상, 500 nM 이상, 1 μM 이상, 3 μM 이상, 5 μM 이상인 것이 바람직하다.
FcγR에 대한 결합 또는 FcγR에 대한 결합활성의 증강, 상승 또는 향상이란, 비교하는 폴리펩티드의 양을 본질적으로 동일하게 하여 어세이를 행하였을 때에 모체 폴리펩티드보다도 본질적으로 보다 강한 결합활성으로 FcγR과 결합하는 것을 말한다.
FcγR에 대한 결합 또는 FcγR에 대한 결합활성이 증강, 상승 또는 향상된 헤테로이량화 폴리펩티드란, 비교하는 폴리펩티드의 양을 본질적으로 동일하게 하여 어세이를 행하였을 때에 호모이량화 폴리펩티드보다도 본질적으로 보다 강한 결합활성으로 FcγR과 결합하는 것을 말한다.
예를 들면 상기 측정법으로 측정한 KD값에 있어서, KD값비(모체 폴리펩티드의 KD값/변이를 도입한 폴리펩티드의 KD값)는 바람직하게는 1.1 이상, 1.2 이상, 1.3 이상, 1.5 이상, 1．8 이상, 2 이상, 3 이상이다. 더욱 바람직하게는 5 이상, 10 이상, 100 이상, 250 이상, 1000 이상이다. 또한 본 명세서에 있어서 KD값비는 KD ratio라고도 한다.
또한 상기 측정법으로 측정한 KD값에 있어서, KD값이 1 pM 이상 저하되어 있는 것이 바람직하고, 10 pM, 100 pM, 1 nM 이상, 2 nM 이상, 3 nM 이상, 5 nM 이상, 10 nM 이상, 20 nM 이상, 50 nM 이상, 100 nM 이상, 1 μM 이상 저하되어 있는 것이 더욱 바람직하다.
또한 상기 측정법으로 측정한 KD값에 있어서, KD값이 5 μM 이하인 것이 바람직하고, 3 μM 이하, 1 μM 이하, 0.5 μM 이하, 0.1 μM 이하, 0.01 μM 이하, 1 nM 이하, 0.1 nM 이하, 0.001 nM 이하, 1 pM 이하인 것이 더욱 바람직하다.
본 발명에 있어서, 당해 폴리펩티드의 Fc영역의 기능의 개변이 Fcγ 수용체와의 결합활성의 증강인 경우, 상기 Fc영역을 구성하는 제1 폴리펩티드 및/또는 제2 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서 아미노산 변이가 도입되어 있어도 된다. 도입되는 당해 아미노산 변이의 종류나 범위는 특별히 한정되는 것은 아니다.
또한 항체의 Fc영역과 FcγR의 상호작용의 강도는 Zn2+ 이온 농도 의존적인 것이 보고되어 있다(Immunology Letters 143(2012) 60-69). 항체는 Fc영역의 Zn2+ 이온 농도가 높을수록 Fc영역과 FcgR의 상호작용은 증강된다. 항체의 Fc영역의 CH3에 존재하는 His310, His435가 Zn2+를 킬레이트함으로써 먼 위치에 있는 Fc영역의 각 CH2 도메인이 열린다. 이것에 의해 CH2 도메인과 FcgR이 상호작용하기 쉬워져 Fc영역과 FcgR의 상호작용이 증강된다. 본 발명의 항체의 비한정인 일태양으로서, EU 넘버링으로 표시되는 310번 위치의 His, 435번 위치의 His, 433번 위치의 His 및/또는 434번 위치의 Asn에 Zn2+가 킬레이트된 Fc영역을 들 수 있다.
그 Fcγ 수용체가 FcγRIa인 경우에는, 상기 Fc영역을 구성하는 제1 폴리펩티드 및/또는 제2 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, 명세서 표 2-1 및 표 2-2의 영역i에 기재된 아미노산 변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 변이가 도입되어 있어도 된다. 또한 그 Fcγ 수용체가 FcγRIa인 경우에는, 상기 Fc영역을 구성하는 제1 폴리펩티드 및/또는 제2 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, 명세서 표 2-1, 표 2-2 및 표 2-3의 영역ii에 기재된 아미노산 변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 변이가 도입되어 있어도 된다.
또한 그 Fcγ 수용체가 FcγRIIa R인 경우에는, 상기 Fc영역을 구성하는 제1 폴리펩티드 및/또는 제2 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, 명세서 표 3-1 및 표 3-2의 영역i에 기재된 아미노산 변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 변이가 도입되어 있어도 된다. 또한 그 Fcγ 수용체가 FcγRIIa R인 경우에는, 상기 Fc영역을 구성하는 제1 폴리펩티드 및/또는 제2 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, 명세서 표 3-1 및 표 3-2의 영역ii에 기재된 아미노산 변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 변이가 도입되어 있어도 된다.
또한 그 Fcγ 수용체가 FcγRIIa H인 경우에는, 상기 Fc영역을 구성하는 제1 폴리펩티드 및/또는 제2 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, 명세서 표 4의 영역i에 기재된 아미노산 변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 변이가 도입되어 있어도 된다. 또한 그 Fcγ 수용체가 FcγRIIa H인 경우에는, 상기 Fc영역을 구성하는 제1 폴리펩티드 및/또는 제2 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, 명세서 표 4의 영역ii에 기재된 아미노산 변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 변이가 도입되어 있어도 된다.
또한 그 Fcγ 수용체가 FcγRIIb인 경우에는, 상기 Fc영역을 구성하는 제1 폴리펩티드 및/또는 제2 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, 명세서 표 5의 영역i에 기재된 아미노산 변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 변이가 도입되어 있어도 된다. 또한 그 Fcγ 수용체가 FcγRIIb인 경우에는, 상기 Fc영역을 구성하는 제1 폴리펩티드 및/또는 제2 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, 명세서 표 5의 영역ii에 기재된 아미노산 변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 변이가 도입되어 있어도 된다.
또한 그 Fcγ 수용체가 FcγRIIIa인 경우에는, 상기 Fc영역을 구성하는 제1 폴리펩티드 및/또는 제2 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, 명세서 표 6의 영역i에 기재된 아미노산 변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 변이가 도입되어 있어도 된다. 또한 그 Fcγ 수용체가 FcγRIIIa인 경우에는, 상기 Fc영역을 구성하는 제1 폴리펩티드 및/또는 제2 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, 명세서 표 6의 영역ii에 기재된 아미노산 변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 변이가 도입되어 있어도 된다. 또한 그 Fcγ 수용체가 FcγRIIIa인 경우에는, 보다 구체적으로는 상기 Fc영역을 구성하는 제1 폴리펩티드 및/또는 제2 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, EU 넘버링 234번째의 아미노산 L의 Y로의 치환, EU 넘버링 235번째의 아미노산 L의 Y 또는 Q로의 치환, EU 넘버링 236번째의 아미노산 G의 W로의 치환, EU 넘버링 239번째의 아미노산 S로부터 M으로의 치환, EU 넘버링 268번째의 아미노산 H로부터 D로의 치환, EU 넘버링 270번째의 아미노산 D로부터 E로의 치환, EU 넘버링 298번째의 아미노산 S의 A로의 치환, EU 넘버링 326번째의 아미노산 K로부터 D로의 치환, EU 넘버링 327번째의 아미노산 A로부터 D로의 치환, EU 넘버링 328번째의 아미노산 L로부터 W로의 치환, EU 넘버링 330번째의 아미노산 A로부터 M 또는 K로의 치환 및 EU 넘버링 334번째의 아미노산 K로부터 E 또는 L로의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상(예를 들면 2개 또는 3개)의 아미노산 변이가 도입되어 있어도 된다. 또한 그 Fcγ 수용체가 FcγRIIIa인 경우에는, 더욱 구체적으로는 상기 Fc영역을 구성하는 제1 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드 중 어느 한쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서,
EU 넘버링 239번째의 아미노산 S의 D로의 치환, EU 넘버링 330번째의 아미노산 A의 L로의 치환 및 EU 넘버링 332번째의 아미노산 I의 E로의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상(예를 들면 2개 또는 3개)의 아미노산 변이가 도입되어 있고,
다른 한쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서,
EU 넘버링 234번째의 아미노산 L의 Y로의 치환, EU 넘버링 236번째의 아미노산 G의 W로의 치환 및 EU 넘버링 298번째의 아미노산 S의 A로의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상(예를 들면 2개 또는 3개)의 아미노산 변이가 도입되어 있어도 된다.
또한 그 Fcγ 수용체가 FcγRIIIa인 경우에는, 더욱 구체적으로는 상기 Fc영역을 구성하는 제1 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드 중 어느 한쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, EU 넘버링 234번째의 Leu, 235번째의 Leu, 236번째의 Gly, 239번째의 Ser, 268번째의 His, 270번째의 Asp, 298번째의 Ser, 327번째의 Ala, 328번째의 Leu 및 334번째의 Lys로부터 선택되는 적어도 하나 이상(예를 들면 2개 또는 3개)의 아미노산에 변이가 도입되어 있고, 다른 한쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, EU 넘버링 270번째의 Asp, 326번째의 Lys, 330번째의 Ala 및 334번째의 Lys로부터 선택되는 적어도 하나 이상(예를 들면 2개 또는 3개)의 아미노산에 변이가 도입되어 있어도 된다.
개변되는 아미노산은 적당히 선택될 수 있지만, 바람직하게는 상기 Fc영역을 구성하는 제1 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드 중 어느 한쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, EU 넘버링 234번째의 아미노산 L로부터 Y로의 치환, EU 넘버링 235번째의 아미노산 L로부터 Y 또는 Q로의 치환, EU 넘버링 236번째의 아미노산 G로부터 W로의 치환, EU 넘버링 239번째의 아미노산 S로부터 M으로의 치환, EU 넘버링 268번째의 아미노산 H로부터 D로의 치환, EU 넘버링 270번째의 아미노산 D로부터 E로의 치환, EU 넘버링 298번째의 아미노산 S로부터 A로의 치환 및 EU 넘버링 327번째의 아미노산 A로부터 D로의 치환, EU 넘버링 328번째의 아미노산 L로부터 W로의 치환 및 EU 넘버링 334번째의 아미노산 K로부터 L로의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상(예를 들면 2개 또는 3개)의 아미노산 변이가 도입되어 있고, 다른 한쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, EU 넘버링 270번째의 아미노산 D로부터 E로의 치환, EU 넘버링 326번째의 아미노산 K로부터 D로의 치환, EU 넘버링 330번째의 아미노산 A로부터 M 또는 K로의 치환, EU 넘버링 334번째의 아미노산 K로부터 E로의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상(예를 들면 2개 또는 3개)의 아미노산 변이가 도입되어 있어도 된다.
보다 바람직하게는, 상기 Fc영역을 구성하는 제1 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드 중 어느 한쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, (i)~(vi) 중 어느 하나의 변이가 도입되어 있고, 다른 한쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, (vii)~(ix) 중 어느 하나의 변이가 도입되어 있어도 된다.
(i) EU 넘버링 234번째의 아미노산 L로부터 Y로의 치환, EU 넘버링 235번째의 아미노산 L로부터 Y로의 치환, EU 넘버링 236번째의 아미노산 G로부터 W로의 치환, EU 넘버링 268번째의 아미노산 H로부터 D로의 치환 및 EU 넘버링 298번째의 아미노산 S로부터 A로의 치환
(ii) EU 넘버링 234번째의 아미노산 L로부터 Y로의 치환, EU 넘버링 235번째의 아미노산 L로부터 Y로의 치환, EU 넘버링 236번째의 아미노산 G로부터 W로의 치환, EU 넘버링 268번째의 아미노산 H로부터 D로의 치환, EU 넘버링 270번째의 아미노산 D로부터 E로의 치환 및 EU 넘버링 298번째의 아미노산 S로부터 A로의 치환
(iii) EU 넘버링 234번째의 아미노산 L로부터 Y로의 치환, EU 넘버링 235번째의 아미노산 L로부터 Q로의 치환, EU 넘버링 236번째의 아미노산 G로부터 W로의 치환, EU 넘버링 239번째의 아미노산 S로부터 M으로의 치환, EU 넘버링 268번째의 아미노산 H로부터 D로의 치환, EU 넘버링 270번째의 아미노산 D로부터 E로의 치환 및 EU 넘버링 298번째의 아미노산 S로부터 A로의 치환
(iv) EU 넘버링 234번째의 아미노산 L로부터 Y로의 치환, EU 넘버링 235번째의 아미노산 L로부터 Y로의 치환, EU 넘버링 236번째의 아미노산 G로부터 W로의 치환, EU 넘버링 268번째의 아미노산 H로부터 D로의 치환, EU 넘버링 298번째의 아미노산 S로부터 A로의 치환 및 EU 넘버링 327번째의 아미노산 A로부터 D로의 치환
(v) EU 넘버링 234번째의 아미노산 L로부터 Y로의 치환, EU 넘버링 235번째의 아미노산 L로부터 Y로의 치환, EU 넘버링 236번째의 아미노산 G로부터 W로의 치환, EU 넘버링 239번째의 아미노산 S로부터 M으로의 치환, EU 넘버링 268번째의 아미노산 H로부터 D로의 치환, EU 넘버링 298번째의 아미노산 S로부터 A로의 치환 및 EU 넘버링 327번째의 아미노산 A로부터 D로의 치환
(vi) EU 넘버링 234번째의 아미노산 L로부터 Y로의 치환, EU 넘버링 235번째의 아미노산 L로부터 Y로의 치환, EU 넘버링 236번째의 아미노산 G로부터 W로의 치환, EU 넘버링 239번째의 아미노산 S로부터 M으로의 치환, EU 넘버링 268번째의 아미노산 H로부터 D로의 치환, EU 넘버링 298번째의 아미노산 S로부터 A로의 치환, EU 넘버링 327번째의 아미노산 A로부터 D로의 치환, EU 넘버링 328번째의 아미노산 L로부터 W로의 치환 및 EU 넘버링 334번째의 아미노산 K로부터 L로의 치환
(vii) EU 넘버링 326번째의 아미노산 K로부터 D로의 치환, EU 넘버링 330번째의 아미노산 A로부터 M으로의 치환 및 EU 넘버링 334번째의 아미노산 K로부터 E로의 치환
(viii) EU 넘버링 270번째의 아미노산 D로부터 E로의 치환, EU 넘버링 326번째의 아미노산 K로부터 D로의 치환, EU 넘버링 330번째의 아미노산 A로부터 M으로의 치환 및 EU 넘버링 334번째의 아미노산 K로부터 E로의 치환
(ix) EU 넘버링 270번째의 아미노산 D로부터 E로의 치환, EU 넘버링 326번째의 아미노산 K로부터 D로의 치환, EU 넘버링 330번째의 아미노산 A로부터 K로의 치환 및 EU 넘버링 334번째의 아미노산 K로부터 E로의 치환.
또한 활성형 Fcγ 수용체로의 결합을 증강시켜 이펙터 기능의 유발이 우수한 헤테로이량화체로서는, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 헤테로이량화체에 의해 구성되어 있는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드로서, 그 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드 중 어느 한쪽이 (i) 또는 (ii)에 기재된 변이가 도입되어 있는 Fc영역을 포함하고 있어도 된다.
(i) EU 넘버링 234번째의 아미노산이 L, S, F, E, V, D, Q, I, M, T, A, G 또는 H, 235번째의 아미노산이 Y 또는 Q, 236번째의 아미노산이 W, 239번째의 아미노산이 M 또는 I, 268번째의 아미노산이 D 및 298번째의 아미노산이 A
(ii) EU 넘버링 270번째의 아미노산이 E, 326번째의 아미노산이 D, 330번째의 아미노산이 A, K, M, F, I, Y 또는 H 및 334번째의 아미노산이 E
보다 구체적으로는, 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드 중 어느 한쪽이 (iii) 또는 (iv)에 기재된 변이가 도입되고, 다른 한쪽이 (v)에 기재된 변이가 도입되어 있는 Fc영역이어도 된다.
(iii) EU 넘버링 234번째의 아미노산이 L, S, F, E, V, D, Q, I, M, T, A, G 또는 H, 235번째의 아미노산이 Y 또는 Q, 236번째의 아미노산이 W, 239번째의 아미노산이 M 또는 I, 268번째의 아미노산이 D, 298번째의 아미노산이 A 및 327번째의 아미노산이 D
(iv) EU 넘버링 234번째의 아미노산이 L, S, F, E, V, D, Q, I, M, T, A, G 또는 H, 235번째의 아미노산이 Y 또는 Q, 236번째의 아미노산이 W, 239번째의 아미노산이 M 또는 I, 268번째의 아미노산이 D, 270번째의 아미노산이 E 및 298번째의 아미노산이 A
(v) EU 넘버링 270번째의 아미노산이 E, 326번째의 아미노산이 D, 330번째의 아미노산이 A, K, M, F, I, Y 또는 H 및 334번째의 아미노산이 E
특히 Fcγ 수용체 IIIa에 대한 결합활성을 증강시키기 위해서는 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드 중 어느 한쪽이, 상기 (iii)의 EU 넘버링 234번째의 아미노산이 E, D, T 또는 L인 것이 바람직하다. 또한 Fcγ 수용체 IIIa에 대한 결합활성을 증강시키고, Fcγ 수용체 IIb에 대한 결합활성을 저하시키기 위해서는, 상기 (iv)의 EU 넘버링 234번째의 아미노산이 L, F, E 또는 D인 것이 보다 바람직하다.
Fcγ 수용체 IIa에 대한 결합활성을 증강시키기 위해서는, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드 중 어느 한쪽이 상기 (iii)의 EU 넘버링 234번째의 아미노산이 V, I, T, M 또는 L인 것이 바람직하다. 그 중에서도 I, T 또는 L인 것이 바람직하고, 이 경우 Fcγ 수용체 IIIa에 대한 결합활성도 높이는 것이 가능하다.
또한 활성형 Fcγ 수용체로의 결합을 증강시켜 이펙터 기능의 유발이 우수한 헤테로이량화체로서는,
제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드 중 어느 한쪽이 상기 (iii)의 EU 넘버링 234번째의 아미노산이 V, E, D, T, I, L 또는 F이고, 239번째의 아미노산이 M 또는 I이며, 또한 다른 한쪽이 상기 (v)의 EU 넘버링 330번째의 아미노산이 A 또는 K인 경우,
또는
제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드 중 어느 한쪽이 상기 (iv)의 EU 넘버링 234번째의 아미노산이 F, E, D, S 또는 L이고, 239번째의 아미노산이 M 또는 I이며, 다른 한쪽이 상기 (v)의 EU 넘버링 330번째의 아미노산이 A, F 또는 K인 것이 바람직하다.
보다 구체적으로는 실시예에 기재된 아미노산 변이의 도입의 조합을 들 수 있다.
결합활성의 선택성은 폴리펩티드의 Fcγ 수용체 아이소폼 각각에 대한 결합활성을 측정한 후, 그들의 비를 구함으로써 측정할 수 있다. 결합활성의 지표로서 예를 들면 FcγR에 대한 결합량, KD값을 사용할 수 있다.
본 명세서에 있어서 결합활성의 선택성이 향상되어 있다는 것은, 예를 들면 상기 측정방법을 토대로 구한 피검 폴리펩티드의 모체 폴리펩티드의 Fcγ 수용체 아이소폼으로의 결합활성의 비(피검 폴리펩티드의 모체 폴리펩티드의 제1 Fcγ 수용체 아이소폼으로의 결합활성/피검 폴리펩티드의 모체 폴리펩티드의 제2 Fcγ 수용체 아이소폼으로의 결합활성)와 비교하여 피검 폴리펩티드의 Fcγ 수용체 아이소폼으로의 결합활성의 비(피검 폴리펩티드의 제1 Fcγ 수용체 아이소폼으로의 결합활성/피검 폴리펩티드의 제2 Fcγ 수용체 아이소폼으로의 결합활성)의 비가 0.1 이상, 바람직하게는 0.2 이상, 0.5 이상, 1 이상, 2 이상, 3 이상, 5 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 15 이상, 20 이상, 30 이상, 50 이상, 70 이상, 100 이상, 150 이상, 200 이상, 500 이상, 1000 이상 향상되어 있는 것을 말한다. 또한 Fcγ 수용체 아이소폼에 대한 선택성이 저하되어 있다는 것은, 예를 들면 상기 측정방법을 토대로 구한 피검 폴리펩티드의 모체 폴리펩티드의 Fcγ 수용체 아이소폼으로의 결합활성의 비와 비교하여 피검 폴리펩티드의 Fcγ 수용체 아이소폼으로의 결합활성의 비가 0.1 이상, 바람직하게는 0.2 이상, 0.5 이상, 1 이상, 2 이상, 3 이상, 5 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 15 이상, 20 이상, 30 이상, 50 이상, 70 이상, 100 이상, 150 이상, 200 이상, 500 이상, 1000 이상 저하되는 것을 말한다.
또한 본 명세서에 있어서 선택성의 지표로서, 예를 들면 활성형 FcγR과 억제형 FcγR에 대한 결합활성의 비율을 나타내는 A/I ratio를 사용할 수 있다. 피검 폴리펩티드의 FcγRIIb에 대한 KD를 피검 폴리펩티드의 FcγRIIa H형 또는 R형의 KD로 나눈 값을 각각의 A/I ratio로 하였다. A/I ratio는 바람직하게는 1.1 이상, 1.5 이상, 2 이상, 3 이상, 5 이상이 바람직하고, 보다 바람직하게는 6 이상, 8 이상, 9 이상이다.
또한 본 명세서에 있어서 선택성의 지표로서, 예를 들면 FcγRIIb에 대한 KD를 FcγRIIIa F에 대한 KD로 나눈 값인 FcγRIIIa　F/FcγRIIb ratio를 사용할 수 있다. 피검 폴리펩티드의 FcγRIIb에 대한 KD를 피검 폴리펩티드의 FcγRIIIa에 대한 KD로 나눈 값을 각각의 FcγRIIIa　F/FcγRIIb ratio로 하였다. FcγRIIIa　F/FcγRIIb ratio는 바람직하게는 1.1 이상, 1.5 이상, 2 이상, 3 이상, 5 이상이 바람직하고, 보다 바람직하게는 10 이상, 20 이상, 30 이상, 40 이상, 50 이상, 60 이상, 70 이상, 80 이상, 90 이상, 100 이상, 110 이상, 120 이상, 130 이상, 140 이상, 150 이상, 200 이상, 210 이상, 220 이상, 230 이상, 240 이상이다.
본 발명에 있어서 당해 폴리펩티드의 Fc영역의 기능의 개변이 Fcγ 수용체와의 결합활성의 선택성 향상인 경우, 상기 Fc영역을 구성하는 제1 폴리펩티드 및/또는 제2 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서 아미노산 변이가 도입되어 있어도 된다. 도입되는 당해 아미노산 변이의 종류나 범위는 특별히 한정되는 것은 아니다.
상기 활성형 Fcγ 수용체가 FcγRIa이고, 상기 저해형 Fcγ 수용체가 FcγRIIb이며, 당해 선택성의 향상이 FcγRIIb에 비해 FcγRIa에 대한 결합활성이 선택적으로 증강된 것인 경우, 상기 Fc영역을 구성하는 제1 폴리펩티드 및/또는 제2 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, 명세서 표 19-1, 표 19-2, 표 19-3 및 표 19-4의 영역a에 기재된 아미노산 변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 변이가 도입되어 있어도 된다. 또한 당해 선택성의 향상이 FcγRIIb에 비해 FcγRIa에 대한 결합활성이 선택적으로 증강된 것인 경우, 상기 Fc영역을 구성하는 제1 폴리펩티드 및/또는 제2 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, 명세서 표 19-1, 표 19-2, 표 19-3, 표 19-4 및 표 19-5의 영역b에 기재된 아미노산 변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 변이가 도입되어 있어도 된다.
상기 활성형 Fcγ 수용체가 FcγRIa이고, 상기 저해형 Fcγ 수용체가 FcγRIIb이며, 당해 선택성의 향상이 FcγRIIb에 비해 FcγRIa에 대한 결합활성이 선택적으로 감소된 것인 경우, 상기 Fc영역을 구성하는 제1 폴리펩티드 및/또는 제2 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, 명세서 표 23-1 및 표 23-2의 영역c에 기재된 아미노산 변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 변이가 도입되어 있어도 된다. 또한 당해 선택성의 향상이 FcγRIIb에 비해 FcγRIa에 대한 결합활성이 선택적으로 감소된 것인 경우, 상기 Fc영역을 구성하는 제1 폴리펩티드 및/또는 제2 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, 명세서 표 23-1 및 표 23-2의 영역d에 기재된 아미노산 변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 변이가 도입되어 있어도 된다.
상기 활성형 Fcγ 수용체가 FcγRIIa R이고, 상기 저해형 Fcγ 수용체가 FcγRIIb이며, 당해 선택성의 향상이 FcγRIIb에 비해 FcγRIIa R에 대한 결합활성이 선택적으로 증강된 것인 경우, 상기 Fc영역을 구성하는 제1 폴리펩티드 및/또는 제2 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, 명세서 표 20-1의 영역a에 기재된 아미노산 변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 변이가 도입되어 있어도 된다. 또한 당해 선택성의 향상이 FcγRIIb에 비해 FcγRIIa R에 대한 결합활성이 선택적으로 증강된 것인 경우, 상기 Fc영역을 구성하는 제1 폴리펩티드 및/또는 제2 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, 명세서 표 20-1, 표 20-2 및 표 20-3의 영역b에 기재된 아미노산 변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 변이가 도입되어 있어도 된다.
상기 활성형 Fcγ 수용체가 FcγRIIa R이고, 상기 저해형 Fcγ 수용체가 FcγRIIb이며, 당해 선택성의 향상이 FcγRIIb에 비해 FcγRIIa R에 대한 결합활성이 선택적으로 감소된 것인 경우, 상기 Fc영역을 구성하는 제1 폴리펩티드 및/또는 제2 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, 명세서 표 24-1의 영역c에 기재된 아미노산 변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 변이가 도입되어 있어도 된다. 또한 당해 선택성의 향상이 FcγRIIb에 비해 FcγRIIa R에 대한 결합활성이 선택적으로 감소된 것인 경우, 상기 Fc영역을 구성하는 제1 폴리펩티드 및/또는 제2 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, 명세서 표 24-1 및 표 24-2의 영역d에 기재된 아미노산 변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 변이가 도입되어 있어도 된다.
상기 활성형 Fcγ 수용체가 FcγRIIa H이고, 상기 저해형 Fcγ 수용체가 FcγRIIb이며, 당해 선택성의 향상이 FcγRIIb에 비해 FcγRIIa H에 대한 결합활성이 선택적으로 증강된 것인 경우, 상기 Fc영역을 구성하는 제1 폴리펩티드 및/또는 제2 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, 명세서 표 21-1의 영역a에 기재된 아미노산 변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 변이가 도입되어 있어도 된다. 또한 당해 선택성의 향상이 FcγRIIb에 비해 FcγRIIa H에 대한 결합활성이 선택적으로 증강된 것인 경우, 상기 Fc영역을 구성하는 제1 폴리펩티드 및/또는 제2 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, 명세서 표 21-1, 표 21-2 및 표 21-3의 영역b에 기재된 아미노산 변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 변이가 도입되어 있어도 된다.
상기 활성형 Fcγ 수용체가 FcγRIIa H이고, 상기 저해형 Fcγ 수용체가 FcγRIIb이며, 당해 선택성의 향상이 FcγRIIb에 비해 FcγRIIa H에 대한 결합활성이 선택적으로 감소된 것인 경우, 상기 Fc영역을 구성하는 제1 폴리펩티드 및/또는 제2 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, 명세서 표 25-1 및 표 25-2의 영역c에 기재된 아미노산 변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 변이가 도입되어 있어도 된다. 또한 당해 선택성의 향상이 FcγRIIb에 비해 FcγRIIa H에 대한 결합활성이 선택적으로 감소된 것인 경우, 상기 Fc영역을 구성하는 제1 폴리펩티드 및/또는 제2 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, 명세서 표 25-1, 표 25-2 및 표 25-3의 영역d에 기재된 아미노산 변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 변이가 도입되어 있어도 된다.
상기 활성형 Fcγ 수용체가 FcγRIIIa이고, 상기 저해형 Fcγ 수용체가 FcγRIIb이며, 당해 선택성의 향상이 FcγRIIb에 비해 FcγRIIIa에 대한 결합활성이 선택적으로 증강된 것인 경우, 상기 Fc영역을 구성하는 제1 폴리펩티드 및/또는 제2 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, 명세서 표 22-1의 영역a에 기재된 아미노산 변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 변이가 도입되어 있어도 된다. 또한 당해 선택성의 향상이 FcγRIIb에 비해 FcγRIIIa에 대한 결합활성이 선택적으로 증강된 것인 경우, 상기 Fc영역을 구성하는 제1 폴리펩티드 및/또는 제2 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, 명세서 표 22-1, 표 22-2 및 표 22-3의 영역b에 기재된 아미노산 변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 변이가 도입되어 있어도 된다.
상기 활성형 Fcγ 수용체가 FcγRIIIa이고, 상기 저해형 Fcγ 수용체가 FcγRIIb이며, 당해 선택성의 향상이 FcγRIIb에 비해 FcγRIIIa에 대한 결합활성이 선택적으로 감소된 것인 경우, 상기 Fc영역을 구성하는 제1 폴리펩티드 및/또는 제2 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, 명세서 표 26-1 및 표 26-2의 영역c에 기재된 아미노산 변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 변이가 도입되어 있어도 된다. 또한 당해 선택성의 향상이 FcγRIIb에 비해 FcγRIIIa에 대한 결합활성이 선택적으로 감소된 것인 경우, 상기 Fc영역을 구성하는 제1 폴리펩티드 및/또는 제2 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, 명세서 표 26-1, 표 26-2, 표 26-3 및 표 26-4의 영역d에 기재된 아미노산 변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 변이가 도입되어 있어도 된다.
여기서 목적하는 Fcγ 수용체에 대한 결합활성이 선택적으로 증강된다는 것은, 아래의 어느 하나의 경우를 의미한다.
(i) 목적하는 Fcγ 수용체에 대한 결합활성이 증강되고, 목적하는 Fcγ 수용체 이외의 수용체에 대한 결합활성은 변하지 않거나 또는 감소된다,
(ii) 목적하는 Fcγ 수용체에 대한 결합활성이 증강되고, 목적하는 Fcγ 수용체 이외의 수용체에 대한 결합활성도 증강되는데, 목적하는 Fcγ 수용체 이외의 수용체에 대한 결합활성의 증강 정도가 목적하는 Fcγ 수용체에 대한 결합활성의 증강 정도보다도 낮거나, 또는
(iii) 목적하는 Fcγ 수용체에 대한 결합활성은 감소되어 있으나, 당해 결합활성의 감소 정도가 목적하는 Fcγ 수용체 이외의 Fcγ 수용체에 대한 결합활성의 감소 정도보다도 낮다.
또한 목적하는 Fcγ 수용체에 대한 결합활성이 선택적으로 감소된다는 것은, 아래의 어느 하나의 경우를 의미한다.
(i) 목적하는 Fcγ 수용체에 대한 결합활성이 감소되고, 목적하는 Fcγ 수용체 이외의 수용체에 대한 결합활성은 변하지 않거나 또는 증강된다,
(ii) 목적하는 Fcγ 수용체에 대한 결합활성이 감소되고, 목적하는 Fcγ 수용체 이외의 수용체에 대한 결합활성도 감소되는데, 목적하는 Fcγ 수용체 이외의 수용체에 대한 결합활성의 감소 정도가 목적하는 Fcγ 수용체에 대한 결합활성의 감소 정도보다도 낮거나, 또는
(iii) 목적하는 Fcγ 수용체에 대한 결합활성은 증강되어 있으나, 당해 결합활성의 증강 정도가 목적하는 Fcγ 수용체 이외의 Fcγ 수용체에 대한 결합활성의 증강 정도보다도 낮다.
본 명세서에 있어서 폴리펩티드의 물리화학적 안정성은 예를 들면 폴리펩티드의 열역학적인 안정성을 의미하고, 폴리펩티드의 열역학적인 안정성은 예를 들면 CH2영역의 Tm값 등을 지표로서 판단할 수 있다. Tm값은 CD(원이색성), DSC(시차주사형 열량계), DSF(시차주사형 형광 정량법)에 의해 측정하는 것이 가능하다.
CD는 승온에 수반되는 평균 잔기 몰 타원율(θ)의 변화를 관측함으로써 Tm값을 산출한다. 측정기기로서는 예를 들면 원이색성 분산계(일본 분광)를 들 수 있다. 적당한 일파장(예를 들면 208 nm나 222 nm)에 있어서 온도를 상승시키면서 CD 스펙트럼을 측정하면, 어느 온도에서 θ가 상승하고 그 이후의 온도에서는 일정 값이 된다. 이때 저온시의 θ와 고온시의 θ의 중점(中點)의 값을 취하는 온도를 Tm으로 한다. 측정에는 예를 들면 구연산, 트리스, 인산용액 등으로 조제된 단백질 용액을 사용하는 것이 가능하고, 수백 ug/mL의 농도로 측정에 사용할 수 있다.
DSC는 승온에 수반되는 열량변화를 관측함으로써 Tm값을 산출한다. 측정기기로서는 MicroCal VP-DSC, Micro Cal Capillary DSC(모두 DKSH 재팬)를 들 수 있다. 측정 셀에 단백질 용액 및 완충액을 봉입하고 온도를 상승시키면서 셀 간의 온도차를 측정하면, 어느 온도를 경계로 흡열반응으로 변화한다. 이때의 온도를 Tm으로 한다. 측정에는 예를 들면 구연산 완충액, TBS, PBS, 히스티딘 완충액 등으로 조제된 단백질 용액을 사용하는 것이 가능하고, 수십 ug/mL~수백 ug/mL의 농도로 측정에 사용할 수 있다.
DSF는 소수성 잔기에 특이적으로 결합하는 형광 시약(예를 들면 SYPRO Orange)을 사용하여 승온에 수반되는 소수성 잔기의 노출을 관측함으로써 Tm값을 산출한다. 단백질 용액과 형광 시약을 적당한 비율로 혼합하여 RT-PCR 장치에 의해 온도를 상승시키면서 형광 강도를 측정하면, 어느 온도에서 형광 강도의 상승이 관측된다. 이때의 온도를 Tm으로 한다. 측정기기로서는 예를 들면 Rotor-Gene Q(QIAGEN), CFX96 실시간 PCR 해석 시스템(Bio-Rad)을 들 수 있다. 측정에는 예를 들면 PBS, 히스티딘 완충액 등으로 조제된 단백질 용액을 사용하는 것이 가능하고, 수십 ug/mL~수백 ug/mL의 농도로 측정에 사용할 수 있다.
본 명세서에 있어서 폴리펩티드의 물리학적 안정성이 향상되어 있다는 것은, 예를 들면 상기 측정방법을 토대로 구한 대조 폴리펩티드의 Fc영역 중의 CH2영역의 Tm값과 비교하여 피검 폴리펩티드의 Fc영역 중의 CH2영역의 Tm값이 0.1도 이상, 바람직하게는 0.2도 이상, 0.3도 이상, 0.4도 이상, 0.5도 이상, 1도 이상, 2도 이상, 3도 이상, 4도 이상, 5도 이상, 10도 이상 향상되어 있는 것을 말한다. 또한 폴리펩티드의 물리학적 안정성이 향상되어 있다는 것은, 폴리펩티드의 물리학적 안정성의 저하가 억제되어 있는 것을 말하고, 예를 들면 상기 측정방법을 토대로 구한 대조 폴리펩티드의 Fc영역 중의 CH2영역의 Tm값에 대해 피검 폴리펩티드의 Fc영역 중의 CH2영역의 Tm값이 저하되는 것을 0.1도 이상, 바람직하게는 0.2도 이상, 0.3도 이상, 0.4도 이상, 0.5도 이상, 1도 이상, 2도 이상, 3도 이상, 4도 이상, 5도 이상, 10도 이상 억제하고 있는 것을 말한다.
또한 본 명세서에 있어서 폴리펩티드의 물리학적 안정성이 저하되어 있다는 것은, 예를 들면 상기 측정방법을 토대로 구한 대조 폴리펩티드의 Fc영역 중의 CH2영역의 Tm값과 비교하여 피검 폴리펩티드의 Fc영역 중의 CH2영역의 Tm값이 0.1도 이상, 바람직하게는 0.2도 이상, 0.3도 이상, 0.4도 이상, 0.5도 이상, 1도 이상, 2도 이상, 3도 이상, 4도 이상, 5도 이상, 10도 이상 저하되어 있는 것을 말한다.
또한 본 발명에는 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 헤테로이량화체에 의해 구성되어 있는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드로서, 그 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 변이가 도입되어 있는 Fc영역을 포함하고, 변이가 도입되어 있지 않은 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 Fc영역의 기능이 개변되어 있는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드도 포함된다.
당해 폴리펩티드에 있어서는, 상기 Fc영역의 기능의 개변이 폴리펩티드의 Fcγ 수용체와의 결합활성의 증강, 결합활성의 감소 및 결합활성의 선택성 향상으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 개변에 더하여, 추가로 물리화학적 안정성이 향상된다는 개변이어도 되고, 이들 중 어느 하나의 기능이 개변되어 있으면 본 발명의 Fc영역의 기능이 개변되어 있다고 할 수 있다.
본 발명에 있어서 「아미노산 변이가 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 양쪽 Fc영역에 도입된 경우, 그 Fc영역의 기능이 개변되지 않는다」는 것은, 동일한 아미노산 변이를 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드 양쪽에 도입한 경우에 목적하는 기능이 향상되지 않는 것을 의미하고, 예를 들면 폴리펩티드의 Fcγ 수용체와의 결합활성을 증강시키고자 하는 경우에는, 당해 결합활성이 변화되지 않거나 또는 감소되는 것을, 결합활성을 감소시키고자 하는 경우에는 당해 결합활성이 변화되지 않거나 또는 증강되는 것을, 결합활성의 선택성을 향상시키고자 하는 경우에는 당해 선택성이 향상되지 않는 것을, 폴리펩티드의 물리화학적 안정성을 향상시키고자 하는 경우에는 당해 안정성이 변화되지 않거나 또는 저하되는 것을 의미한다. 아미노산 변이가 「한쪽 Fc영역에만 도입된 경우, 그 Fc영역의 기능이 개변된다」는 것은, 아미노산 변이를 제1 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드 중 어느 한쪽에만 도입한 경우에 목적하는 기능이 향상되는 것을 의미하고, 예를 들면 폴리펩티드의 Fcγ 수용체와의 결합활성을 증강시키고자 하는 경우에는 당해 결합활성이 증강되는 것을, 결합활성을 감소시키고자 하는 경우에는 당해 결합활성이 감소되는 것을, 결합활성의 선택성을 향상시키고자 하는 경우에는 당해 선택성이 향상되는 것을, 폴리펩티드의 물리화학적 안정성을 향상시키고자 하는 경우에는 당해 안정성이 향상되는 것을 의미한다.
본 발명에는 상기 Fc영역이 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 헤테로이량화체에 의해 구성되어 있는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드가, 제1 폴리펩티드만을 포함하는 호모이량화체에 의해 구성되어 있는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드만을 포함하는 호모이량화체에 의해 구성되어 있는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드와 비교하여, 높은 Tm을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드도 포함된다. 당해 폴리펩티드는 높은 Tm을 갖는다고 하는 물리화학적 안정성이 향상된 개변과 함께 추가로 Fc영역의 기능의 개변이 가해져 있어도 된다.
추가로 부가되는 Fc영역의 기능의 개변이 FcγRIa에 대한 결합활성의 증강인 경우, 상기 Fc영역을 구성하는 제1 폴리펩티드 및/또는 제2 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, 명세서 표 31-1, 표 31-2 및 표 31-3에 기재된 아미노산 변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 변이가 도입되어 있어도 된다.
또한 추가로 부가되는 Fc영역의 기능의 개변이 FcγRIIa R에 대한 결합활성의 증강인 경우, 상기 Fc영역을 구성하는 제1 폴리펩티드 및/또는 제2 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, 명세서 표 32-1 및 표 32-2에 기재된 아미노산 변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 변이가 도입되어 있어도 된다.
또한 추가로 부가되는 Fc영역의 기능의 개변이 FcγRIIa H에 대한 결합활성의 증강인 경우, 상기 Fc영역을 구성하는 제1 폴리펩티드 및/또는 제2 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, 명세서 표 33-1 및 표 33-2에 기재된 아미노산 변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 변이가 도입되어 있어도 된다.
또한 추가로 부가되는 Fc영역의 기능의 개변이 FcγRIIb에 대한 결합활성의 증강인 경우, 상기 Fc영역을 구성하는 제1 폴리펩티드 및/또는 제2 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, 명세서 표 34-1 및 표 34-2에 기재된 아미노산 변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 변이가 도입되어 있어도 된다.
또한 추가로 부가되는 Fc영역의 기능의 개변이 FcγRIIIa에 대한 결합활성의 증강인 경우, 상기 Fc영역을 구성하는 제1 폴리펩티드 및/또는 제2 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, 명세서 표 35-1 및 표 35-2에 기재된 아미노산 변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 변이가 도입되어 있어도 된다.
본 발명에 있어서 아미노산 변이가 도입된 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 조합은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 서열번호：2~4 및 6~60에 기재된 폴리펩티드로부터 선택된 상이한 종류/또는 동일한 종류의 폴리펩티드의 조합을 예시할 수 있다. 또한 본원의 실시예에 기재된 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드의 조합(2개의 항체의 H쇄 및 하나의 항체의 L쇄의 조합)을 바람직한 예로서 들 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 항원 결합 분자여도 된다. 본 발명에 있어서 항체 결합 분자의 종류는 특별히 특정되는 것은 아니나, 바람직한 예로서는 항체, 이중 특이성 항체, 펩티드 Fc 융합 단백질 또는 스캐폴드 Fc 융합 단백질 등의 Fc 융합 분자를 예시할 수 있다.
<항체>
또한 본 발명의 폴리펩티드로서 항체를 제공한다.
본 발명에 있어서의 「항체」라는 용어는 가장 넓은 의미로 사용되고, 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 단일클론항체(전장 단일클론항체를 포함한다), 다중클론항체, 항체 변이체, 항체 단편, 다특이성 항체(예를 들면 이특이성 항체), 키메라 항체, 인간화 항체 등 어떠한 항체도 포함된다.
본 발명의 항체는 항원의 종류, 항체의 유래 등은 한정되지 않고 어떠한 항체여도 된다. 항체의 유래로서는 특별히 한정되지 않으나, 인간 항체, 마우스 항체, 랫트 항체, 토끼 항체 등을 들 수 있다.
항체를 제작하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있는데, 예를 들면 단일클론항체의 경우 하이브리도마법(Kohler and Milstein, Nature 256:495(1975)), 재조합 방법(미국특허 제4,816,567호)에 의해 제조해도 된다. 또한 파지 항체 라이브러리로부터 단리해도 된다(Clackson et al., Nature 352:624-628(1991) ; Marks et al., J.Mol.Biol. 222:581-597(1991)). 또한 단일 B세포 클론으로부터 단리해도 된다(N. Biotechnol. 28(5): 253-457(2011)).
인간화 항체는 재구성(reshaped) 인간 항체라고도 칭해진다. 구체적으로는 인간 이외의 동물, 예를 들면 마우스 항체의 CDR을 인간 항체에 이식한 인간화 항체 등이 공지이다. 인간화 항체를 얻기 위한 일반적인 유전자 재조합수법도 알려져 있다. 구체적으로는 마우스 항체의 CDR을 인간의 FR에 이식하기 위한 방법으로서, 예를 들면 Overlap Extension PCR이 공지이다.
3개의 CDR과 4개의 FR이 연결된 항체 가변영역을 코드하는 DNA와 인간 항체 불변영역을 코드하는 DNA를 인프레임으로 융합하도록 발현 벡터 중에 삽입함으로써 인간화 항체 발현용 벡터를 제작할 수 있다. 그 삽입 벡터를 숙주에 도입하여 재조합 세포를 수립한 후에 그 재조합 세포를 배양하여 그 인간화 항체를 코드하는 DNA를 발현시킴으로써, 그 인간화 항체가 그 배양세포의 배양물 중에 생산된다(유럽 특허공개 EP 239400, 국제공개 WO1996/002576 참조).
필요에 따라 재구성 인간 항체의 CDR이 적절한 항원 결합 부위를 형성하도록 FR의 아미노산 잔기를 치환하는 것도 가능하다. 예를 들면, 마우스 CDR의 인간 FR로의 이식에 사용한 PCR법을 응용하여 FR에 아미노산 서열의 변이를 도입할 수 있다.
인간 항체 유전자의 모든 레퍼토리를 갖는 형질전환 동물(국제공개 WO1993/012227, WO1992/003918, WO1994/002602, WO1994/025585, WO1996/034096, WO1996/033735 참조)을 면역동물로 하여 DNA 면역에 의해 목적하는 인간 항체가 취득될 수 있다.
또한 인간 항체 라이브러리를 사용하여 패닝에 의해 인간 항체를 취득하는 기술도 알려져 있다. 예를 들면 인간 항체의 V영역이 단일 사슬 항체(scFv)로서 파지 디스플레이법에 의해 파지의 표면에 발현된다. 항원에 결합하는 scFv를 발현하는 파지가 선택될 수 있다. 선택된 파지의 유전자를 해석함으로써, 항원에 결합하는 인간 항체의 V영역을 코드하는 DNA 서열을 결정할 수 있다. 항원에 결합하는 scFv의 DNA 서열을 결정한 후, 당해 V영역 서열을 목적하는 인간 항체 C영역의 서열과 인프레임으로 융합시킨 후에 적당한 발현 벡터에 삽입함으로써 발현 벡터가 제작될 수 있다. 당해 발현 벡터를 상기에 예로 든 바와 같은 적합한 발현 세포 중에 도입하고, 그 인간 항체를 코드하는 유전자를 발현시킴으로써 당해 인간 항체가 취득된다. 이들 방법은 이미 공지이다(국제공개 WO1992/001047, WO1992/020791, WO1993/006213, WO1993/011236, WO1993/019172, WO1995/001438, WO1995/015388 참조).
본 발명의 항체를 구성하는 가변영역은 임의의 항원을 인식하는 가변영역일 수 있다.
본 명세서에 있어서 항원은 특별히 한정되지 않고 어떠한 항원이어도 된다. 항원의 예로서는 17-IA, 4-1 BB, 4Dc, 6-keto-PGF1a, 8-iso-PGF2a, 8-oxo-dG, A1 Adenosine Receptor, A33, ACE, ACE-2, Activin, Activin A, Activin AB, Activin B, Activin C, Activin RIA, Activin RIA ALK-2, Activin RIB ALK-4, Activin RIIA, Activin RIIB, ADAM, ADAM10, ADAM12, ADAM15, ADAM17/TACE, ADAM8, ADAM9, ADAMTS, ADAMTS4, ADAMTS5, Addressins, adiponectin, ADP ribosyl cyclase-1, aFGF, AGE, ALCAM, ALK, ALK-1, ALK-7, allergen, alpha1-antichemotrypsin, alpha1-antitrypsin, alpha-synuclein, alpha-V/beta-1 antagonist, aminin, amylin, amyloid beta, amyloid immunoglobulin heavy chain variable region. amyloid immunoglobulin light chain variable region, Androgen, ANG, angiotensinogen, Angiopoietin ligand-2, anti-Id, antithrombinIII, Anthrax, APAF-1, APE, APJ, apo A1, apo serum amyloid A, Apo-SAA, APP, APRIL, AR, ARC, ART, Artemin, ASPARTIC, Atrial natriuretic factor, Atrial natriuretic peptide, atrial natriuretic peptides A, atrial natriuretic peptides B, atrial natriuretic peptides C, av/b3 integrin, Axl, B7-1, B7-2, B7-H, BACE, BACE-1, Bacillus anthracis protective antigen, Bad, BAFF, BAFF-R, Bag-1, BAK, Bax, BCA-1, BCAM, BcI, BCMA, BDNF, b-ECGF, beta-2-microglobulin, betalactamase, bFGF, BID, Bik, BIM, BLC, BL-CAM, BLK, B-lymphocyte Stimulator(BIyS), BMP, BMP-2(BMP-2a), BMP-3(Osteogenin), BMP-4(BMP-2b), BMP-5, BMP-6(Vgr-1), BMP-7(OP-1), BMP-8(BMP-8a), BMPR, BMPR-IA(ALK-3), BMPR-IB(ALK-6), BMPR-II(BRK-3), BMPs, BOK, Bombesin, Bone-derived neurotrophic factor, bovine growth hormone, BPDE, BPDE-DNA, BRK-2, BTC, B-lymphocyte cell adhesion molecule, C10, C1-inhibitor, C1q, C3, C3a, C4, C5, C5a(complement 5a), CA125, CAD-8, Cadherin-3, Calcitonin, cAMP, Carbonic anhydrase-IX, carcinoembryonic antigen(CEA), carcinoma-associated antigen, Cardiotrophin-1, Cathepsin A, Cathepsin B, Cathepsin C/DPPI, Cathepsin D, Cathepsin E, Cathepsin H, Cathepsin L, Cathepsin O, Cathepsin S, Cathepsin V, Cathepsin X/Z/P, CBL, CCI, CCK2, CCL, CCL1/I-309, CCL11/Eotaxin, CCL12/MCP-5, CCL13/MCP-4, CCL14/HCC-1, CCL15/HCC-2, CCL16/HCC-4, CCL17/TARC, CCL18/PARC, CCL19/ELC, CCL2/MCP-1, CCL20/MIP-3-alpha, CCL21/SLC, CCL22/MDC, CCL23/MPIF-1, CCL24/Eotaxin-2, CCL25/TECK, CCL26/Eotaxin-3, CCL27/CTACK, CCL28/MEC, CCL3/M1P-1-alpha, CCL3Ll/LD-78-beta, CCL4/MIP-l-beta, CCL5/RANTES, CCL6/C10, CCL7/MCP-3, CCL8/MCP-2, CCL9/10/MTP-1-gamma, CCR, CCR1, CCR10, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CD1, CD10, CD105, CD11a, CD11b, CD11c, CD123, CD13, CD137, CD138, CD14, CD140a, CD146, CD147, CD148, CD15, CD152, CD16, CD164, CD18, CD19, CD2, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD26, CD27L, CD28, CD29, CD3, CD30, CD30L, CD32, CD33(p67 proteins), CD34, CD37, CD38, CD3E, CD4, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD49a, CD49b, CD5, CD51, CD52, CD54, CD55, CD56, CD6, CD61, CD64, CD66e, CD7, CD70, CD74, CD8, CD80(B7-1), CD89, CD95, CD105, CD158a, CEA, CEACAM5, CFTR, cGMP, CGRP receptor, CINC, CKb8-1, Claudin18, CLC, Clostridium botulinum toxin, Clostridium difficile toxin, Clostridium perfringens toxin, c-Met, CMV, CMV UL, CNTF, CNTN-1, complement factor 3(C3), complement factor D, corticosteroid-binding globulin, Colony stimulating factor-1 receptor, COX, C-Ret, CRG-2, CRTH2, CT-1, CTACK, CTGF, CTLA-4, CX3CL1/Fractalkine, CX3CR1, CXCL, CXCL1/Gro-alpha, CXCL10, CXCL11/I-TAC, CXCL12/SDF-l-alpha/beta, CXCL13/BCA-1, CXCL14/BRAK, CXCL15/Lungkine. CXCL16, CXCL16, CXCL2/Gro-beta CXCL3/Gro-gamma, CXCL3, CXCL4/PF4, CXCL5/ENA-78, CXCL6/GCP-2, CXCL7/NAP-2, CXCL8/IL-8, CXCL9/Mig, CXCLlO/IP-10, CXCR, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, cystatin C, cytokeratin tumor-associated antigen, DAN, DCC, DcR3, DC-SIGN, Decay accelerating factor, Delta-like protein ligand 4, des(1-3)-IGF-1(brain IGF-1), Dhh, DHICA oxidase, Dickkopf-1, digoxin, Dipeptidyl peptidase IV, DKl, DNAM-1, Dnase, Dpp, DPPIV/CD26, Dtk, ECAD, EDA, EDA-A1, EDA-A2, EDAR, EGF, EGFR(ErbB-1), EGF like domain containing protein 7, Elastase, elastin, EMA, EMMPRIN, ENA, ENA-78, Endosialin, endothelin receptor, endotoxin, Enkephalinase, eNOS, Eot, Eotaxin, Eotaxin-2, eotaxini, EpCAM, Ephrin B2/EphB4, Epha2 tyrosine kinase receptor, epidermal growth factor receptor(EGFR), ErbB2 receptor, ErbB3 tyrosine kinase receptor, ERCC, EREG, erythropoietin(EPO), Erythropoietin receptor, E-selectin, ET-1, Exodus-2, F protein of RSV, F10, F11, F12, F13, F5, F9, Factor Ia, Factor IX, Factor Xa, Factor VII, factor VIII, Factor VIIIc, Fas, FcalphaR, FcepsilonRI, FcgammaIIb, FcgammaRI, FcgammaRIIa, FcgammaRIIIa, FcgammaRIIIb, FcRn, FEN-1, Ferritin, FGF, FGF-19, FGF-2, FGF-2 receptor, FGF-3, FGF-8, FGF-acidic, FGF-basic, FGFR, FGFR-3, Fibrin, fibroblast activation protein(FAP), fibroblast growth factor, fibroblast growth factor-10, fibronectin, FL, FLIP, Flt-3, FLT3 ligand, Folate receptor, follicle stimulating hormone(FSH), Fractalkine(CX3C), free heavy chain, free light chain, FZD1, FZD10, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, G250, Gas 6, GCP-2, GCSF, G-CSF, G-CSF receptor, GD2, GD3, GDF, GDF-1, GDF-15(MIC-1), GDF-3(Vgr-2), GDF-5(BMP-14/CDMP-1), GDF-6(BMP-13/CDMP-2), GDF-7(BMP-12/CDMP-3), GDF-8(Myostatin), GDF-9, GDNF, Gelsolin, GFAP, GF-CSF, GFR-alpha1, GFR-alpha2, GFR-alpha3, GF-β1, gH envelope glycoprotein, GITR, Glucagon, Glucagon receptor, Glucagon-like peptide 1 receptor, Glut 4, Glutamate carboxypeptidase II, glycoprotein hormone receptors, glycoprotein IIb/IIIa(GP IIb/IIIa), Glypican-3, GM-CSF, GM-CSF receptor, gp130, gp140, gp72, granulocyte-CSF(G-CSF), GRO/MGSA, Growth hormone releasing factor, GRO-β, GRO-γ, H. pylori, Hapten(NP-cap or NIP-cap), HB-EGF, HCC, HCC 1, HCMV gB envelope glycoprotein, HCMV UL, Hemopoietic growth factor(HGF), Hep B gp120, heparanase, heparin cofactor II, hepatic growth factor, Bacillus anthracis protective antigen, Hepatitis C virus E2 glycoprotein, Hepatitis E, Hepcidin, Her1, Her2/neu(ErbB-2), Her3(ErbB-3), Her4(ErbB-4), herpes simplex virus(HSV) gB glycoprotein, HGF, HGFA, High molecular weight melanoma-associated antigen(HMW-MAA), HIV envelope proteins such as GP120, HIV MIB gp 120 V3 loop, HLA, HLA-DR, HM1.24, HMFG PEM, HMGB-1, HRG, Hrk, HSP47, Hsp90, HSV gD glycoprotein, human cardiac myosin, human cytomegalovirus(HCMV), human growth hormone(hGH), human serum albumin, human tissue-type plasminogen activator(t-PA), Huntingtin, HVEM, IAP, ICAM, ICAM-1, ICAM-3, ICE, ICOS, IFN-alpha, IFN-beta, IFN-gamma, IgA, IgA receptor, IgE, IGF, IGF binding proteins, IGF-1, IGF-1 R, IGF-2, IGFBP, IGFR, IL, IL-1, IL-10, IL-10 receptors, IL-11, IL-11 receptors, IL-12, IL-12 receptors, IL-13, IL-13 receptors, IL-15, IL-15 receptors, IL-16, IL-16 receptors, IL-17, IL-17 receptors, IL-18(IGIF), IL-18 receptors, IL-1alpha, IL-1beta, IL-1 receptors, IL-2, IL-2 receptors, IL-20, IL-20 receptors, IL-21, IL-21 receptors, IL-23, IL-23 receptors, IL-2 receptors, IL-3, IL-3 receptors, IL-31, IL-31 receptors, IL-3 receptors, IL-4, IL-4 receptors IL-5, IL-5 receptors, IL-6, IL-6 receptors, IL-7, IL-7 receptors, IL-8, IL-8 receptors, IL-9, IL-9 receptors, immunoglobulin immune complex, immunoglobulins, INF-alpha, INF-alpha receptors, INF-beta, INF-beta receptors, INF-gamma, INF-gamma receptors, IFN type-I, IFN type-I receptor, influenza, inhibin, Inhibin α, Inhibin β, iNOS, insulin, Insulin A-chain, Insulin B-chain, Insulin-like growth factor 1, insulin-like growth factor 2, insulin-like growth factor binding proteins, integrin, integrin alpha2, integrin alpha3, integrin alpha4, integrin alpha4/beta1, integrin alpha-V/beta-3, integrin alpha-V/beta-6, integrin alpha4/beta7, integrin alpha5/beta1, integrin alpha5/beta3, integrin alpha5/beta6, integrin alphaσ(alphaV), integrin alphaθ, integrin beta1, integrin beta2, integrin beta3(GPIIb-IIIa), IP-10, I-TAC, JE, kalliklein, Kallikrein 11, Kallikrein 12, Kallikrein 14, Kallikrein 15, Kallikrein 2, Kallikrein 5, Kallikrein 6, Kallikrein L1, Kallikrein L2, Kallikrein L3, Kallikrein L4, kallistatin, KC, KDR, Keratinocyte Growth Factor(KGF), Keratinocyte Growth Factor-2(KGF-2), KGF, killer immunoglobulin-like receptor, kit ligand(KL), Kit tyrosine kinase, laminin 5, LAMP, LAPP(Amylin, islet-amyloid polypeptide), LAP(TGF-1), latency associated peptide, Latent TGF-1, Latent TGF-1 bp1, LBP, LDGF, LDL, LDL receptor, LECT2, Lefty, Leptin, leutinizing hormone(LH), Lewis-Y antigen, Lewis-Y related antigen, LFA-1, LFA-3, LFA-3 receptors, Lfo, LIF, LIGHT, lipoproteins, LIX, LKN, Lptn, L-Selectin, LT-a, LT-b, LTB4, LTBP-1, Lung surfactant, Luteinizing hormone, Lymphotactin, Lymphotoxin Beta Receptor, Lysosphingolipid receptor, Mac-1, macrophage-CSF(M-CSF), MAdCAM, MAG, MAP2, MARC, maspin, MCAM, MCK-2, MCP, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MCP-I(MCAF), M-CSF, MDC, MDC(67 a.a.), MDC(69 a.a.), megsin, Mer, MET tyrosine kinase receptor family, METALLOPROTEASES, Membrane glycoprotein OX2, Mesothelin, MGDF receptor, MGMT, MHC(HLA-DR), microbial protein, MIF, MIG, MIP, MIP-1α, MIP-1β, MIP-3α, MIP-3β, MIP-4, MK, MMAC1, MMP, MMP-1, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-2, MMP-24, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, monocyte attractant protein, monocyte colony inhibitory factor, mouse gonadotropin-associated peptide, MPIF, Mpo, MSK, MSP, MUC-16, MUC18, mucin(Mud), Muellerian-inhibiting substance, Mug, MuSK, Myelin associated glycoprotein, myeloid progenitor inhibitor factor-1(MPIF-I), NAIP, Nanobody, NAP, NAP-2, NCA 90, NCAD, N-Cadherin, NCAM, Neprilysin, Neural cell adhesion molecule, neroserpin, Neuronal growth factor(NGF), Neurotrophin-3, Neurotrophin-4, Neurotrophin-6, Neuropilin 1, Neurturin, NGF-beta, NGFR, NKG20, N-methionyl human growth hormone, nNOS, NO, Nogo-A, Nogo receptor, non-structural protein type 3(NS3) from the hepatitis C virus, NOS, Npn, NRG-3, NT, NT-3, NT-4, NTN, OB, OGG1, Oncostatin M, OP-2, OPG, OPN, OSM, OSM receptors, osteoinductive factors, osteopontin, OX40L, OX40R, oxidized LDL, p150, p95, PADPr, parathyroid hormone, PARC, PARP, PBR, PBSF, PCAD, P-Cadherin, PCNA, PCSK9, PDGF, PDGF receptor, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PDGF-D, PDK-1, PECAM, PEDF, PEM, PF-4, PGE, PGF, PGI2, PGJ2, PIGF, PIN, PLA2, Placenta growth factor, placental alkaline phosphatase(PLAP), placental lactogen, plasminogen activator inhibitor-1, platelet-growth factor, plgR, PLP, poly glycol chains of different size(e.g. PEG-20, PEG-30, PEG40), PP14, prekallikrein, prion protein, procalcitonin, Programmed cell death protein 1, proinsulin, prolactin, Proprotein convertase PC9, prorelaxin, prostate specific membrane antigen(PSMA), Protein A, Protein C, Protein D, Protein S, Protein Z, PS, PSA, PSCA, PsmAr, PTEN, PTHrp, Ptk, PTN, P-selectin glycoprotein ligand-1, R51, RAGE, RANK, RANKL, RANTES, relaxin, Relaxin A-chain, Relaxin B-chain, renin, respiratory syncytial virus(RSV) F, Ret, reticulon 4, Rheumatoid factors, RLI P76, RPA2, RPK-1, RSK, RSV Fgp, S100, RON-8, SCF/KL, SCGF, Sclerostin, SDF-1, SDF1α, SDF1β, SERINE, Serum Amyloid P, Serum albumin, sFRP-3, Shh, Shiga like toxin II, SIGIRR, SK-1, SLAM, SLPI, SMAC, SMDF, SMOH, SOD, SPARC, sphingosine 1-phosphate receptor 1, Staphylococcal lipoteichoic acid, Stat, STEAP, STEAP-II, stem cell factor(SCF), streptokinase, superoxide dismutase, syndecan-1, TACE, TACI, TAG-72(tumor-associated glycoprotein-72), TARC, TB, TCA-3, T-cell receptor alpha/beta, TdT, TECK, TEM1, TEM5, TEM7, TEM8, Tenascin, TERT, testicular PLAP-like alkaline phosphatase, TfR, TGF, TGF-alpha, TGF-beta, TGF-beta Pan Specific, TGF-beta RII, TGF-beta RIIb, TGF-beta RIII, TGF-beta Rl(ALK-5), TGF-beta1, TGF-beta2, TGF-beta3, TGF-beta4, TGF-beta5, TGF-I, Thrombin, thrombopoietin(TPO), Thymic stromal lymphoprotein receptor, Thymus Ck-1, thyroid stimulating hormone(TSH), thyroxine, thyroxine-binding globulin, Tie, TIMP, TIQ, Tissue Factor, tissue factor protease inhibitor, tissue factor protein, TMEFF2, Tmpo, TMPRSS2, TNF receptor I, TNF receptor II, TNF-alpha, TNF-beta, TNF-beta2, TNFc, TNF-RI, TNF-RII, TNFRSF10A(TRAIL R1 Apo-2/DR4), TNFRSF10B(TRAIL R2 DR5/KILLER/TRICK-2A/TRICK-B), TNFRSF10C(TRAIL R3 DcR1/LIT/TRID), TNFRSF10D(TRAIL R4 DcR2/TRUNDD), TNFRSF11A(RANK ODF R/TRANCE R), TNFRSF11B(OPG OCIF/TR1), TNFRSF12(TWEAK R FN14), TNFRSF12A, TNFRSF13B(TACI), TNFRSF13C(BAFF R), TNFRSF14(HVEM ATAR/HveA/LIGHT R/TR2), TNFRSF16(NGFR p75NTR), TNFRSF17(BCMA), TNFRSF18(GITR AITR), TNFRSF19(TROY TAJ/TRADE), TNFRSF19L(RELT), TNFRSF1A(TNF Rl CD120a/p55-60), TNFRSF1B(TNF RII CD120b/p75-80), TNFRSF21(DR6), TNFRSF22(DcTRAIL R2 TNFRH2), TNFRSF25(DR3 Apo-3/LARD/TR-3/TRAMP/WSL-1), TNFRSF26(TNFRH3), TNFRSF3(LTbR TNF RIII/TNFC R), TNFRSF4(OX40 ACT35/TXGP1 R), TNFRSF5(CD40 p50), TNFRSF6(Fas Apo-1/APT1/CD95), TNFRSF6B(DcR3 M68/TR6), TNFRSF7(CD27), TNFRSF8(CD30), TNFRSF9(4-1 BB CD137/ILA), TNFRST23(DcTRAIL R1 TNFRH1), TNFSF10(TRAIL Apo-2 Ligand/TL2), TNFSF11(TRANCE/RANK Ligand ODF/OPG Ligand), TNFSF12(TWEAK Apo-3 Ligand/DR3 Ligand), TNFSF13(APRIL TALL2), TNFSF13B(BAFF BLYS/TALL1/THANK/TNFSF20), TNFSF14(LIGHT HVEM Ligand/LTg), TNFSF15(TL1A/VEGI), TNFSF18(GITR Ligand AITR Ligand/TL6), TNFSF1A(TNF-a Conectin/DIF/TNFSF2), TNFSF1B(TNF-b LTa/TNFSF1), TNFSF3(LTb TNFC/p33), TNFSF4(OX40 Ligand gp34/TXGP1), TNFSF5(CD40 Ligand CD154/gp39/HIGM1/IMD3/TRAP), TNFSF6(Fas Ligand Apo-1 Ligand/APT1 Ligand), TNFSF7(CD27 Ligand CD70), TNFSF8(CD30 Ligand CD153), TNFSF9(4-1 BB Ligand CD137 Ligand), TNF-α, TNF-β, TNIL-I, toxic metabolite, TP-1, t-PA, Tpo, TRAIL, TRAIL R, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRANCE, transferrin receptor, transforming growth factors(TGF) such as TGF-alpha and TGF-beta, Transmembrane glycoprotein NMB, Transthyretin, TRF, Trk, TROP-2, Trophoblast glycoprotein, TSG, TSLP, Tumor Necrosis Factor(TNF), tumor-associated antigen CA 125, tumor-associated antigen expressing Lewis Y related carbohydrate, TWEAK, TXB2, Ung, uPAR, uPAR-1, Urokinase, VAP-1, vascular endothelial growth factor(VEGF), vaspin, VCAM, VCAM-1, VECAD, VE-Cadherin, VE-Cadherin-2, VEFGR-1(flt-1), VEFGR-2, VEGF receptor(VEGFR), VEGFR-3(flt-4), VEGI, VIM, Viral antigens, VitB12 receptor, Vitronectin receptor, VLA, VLA-1, VLA-4, VNR integrin, von Willebrand Factor(vWF), WIF-1, WNT1, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16, WNT2, WNT2B/13, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9B, XCL1, XCL2/SCM-l-beta, XCLl/Lymphotactin, XCR1, XEDAR, XIAP, XPD 등을 들 수 있다.
가변영역을 구성하는 아미노산 서열은 그 항원 결합활성이 유지되는 한, 1 또는 복수의 아미노산 잔기의 개변이 허용된다. 가변영역의 아미노산 서열을 개변하는 경우, 개변되는 부위나 개변되는 아미노산의 수는 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면 CDR 및/또는 FR에 존재하는 아미노산을 적당히 개변할 수 있다. 가변영역의 아미노산을 개변하는 경우 특별히 한정되지 않으나, 결합활성이 유지되어 있는 것이 바람직하고, 예를 들면 개변 전과 비교하여 50% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 100% 이상의 결합활성을 가지고 있는 것이 바람직하다. 또한 아미노산 개변에 의해 결합활성이 상승되어 있어도 되고, 예를 들면 결합활성이 개변 전과 비교하여 2배, 5배, 10배 등이 되어 있어도 된다. 본 발명의 항체에 있어서 아미노산 서열의 개변이란 아미노산 잔기의 치환, 부가, 결손, 삽입 및 수식 중 하나 이상일 수 있다.
예를 들면 가변영역의 N 말단의 글루타민의 피로글루타밀화에 의한 피로글루타민산으로의 수식은 당업자에게 잘 알려진 수식이다. 따라서 본 발명의 항체는 그 중쇄의 N 말단이 글루타민인 경우에는 그것이 피로글루타민산에 수식된 가변영역을 포함한다.
본 발명의 항체의 가변영역은 임의의 서열이어도 되고, 마우스 항체, 랫트 항체, 토끼 항체, 염소 항체, 낙타 항체 및 이들 비인간 항체를 인간화한 인간화 항체 및 인간 항체 등 어떠한 유래의 항체의 가변영역이어도 된다. 「인간화 항체」란 재구성(reshaped) 인간 항체로도 칭해지는 인간 이외의 포유동물 유래의 항체, 예를 들면 마우스 항체의 상보성 결정영역(CDR;complementarity determining region)을 인간 항체의 CDR로 이식한 것이다. CDR을 동정하기 위한 방법은 공지이다(Kabat et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest(1987), National Institute of Health, Bethesda, Md.; Chothia et al., Nature(1989) 342: 877). 또한 그 일반적인 유전자 재조합 수법도 공지이다(유럽 특허출원 공개번호 EP 125023호 공보, WO 96/02576호 공보 참조). 또한 이들 항체의 가변영역에 대해 항원으로의 결합, 약물동태, 안정성, 항원성을 개선하기 위해 다양한 아미노산 치환을 도입한 것이어도 된다. 본 발명의 항체의 가변영역은 항원에 대한 결합에 pH 의존성을 가짐으로써 항원에 대해 반복 결합할 수 있어도 된다(WO/2009/125825).
항체의 경쇄 불변영역에는 κ쇄와 λ쇄 타입의 불변영역이 존재하고 있는데 어느 경쇄 불변영역이어도 된다. 또한 본 발명에 있어서 경쇄 불변영역은 아미노산의 치환, 부가, 결손, 삽입 및/또는 수식 등의 개변이 행해진 경쇄 불변영역이어도 된다.
본 발명의 항체의 중쇄 불변영역으로서는, 예를 들면 인간 IgG 항체의 중쇄 불변영역을 사용할 수 있고, 바람직하게는 인간 IgG1 항체의 중쇄 불변영역이다.
본 발명의 항체를 구성하는 가변영역은 임의의 항원을 인식하는 가변영역일 수 있다. 중쇄 가변변영역을 구성하는 아미노산 서열은 그 항원 결합활성이 유지되는 한, 1 또는 복수의 아미노산 잔기의 개변이 허용된다.
또한 가변영역의 개변은 결합활성의 상승, 특이성의 개선, pI의 저하, 항원에 대한 결합에 pH 의존적인 성질의 부여, 결합 열안정성의 개선, 용해성의 개선, 화학수식에 대한 안정성, 당쇄에 유래하는 헤테로제니티의 개선, 면역원성을 저하시키는 것을 in silico 예측을 사용해서 동정하였거나 또는 in vitro의 T세포를 사용한 어세이에 의해 동정한 T세포 에피토프의 회피, 또는 조절 T세포(regulatory T cells)를 활성화하는 T세포 에피토프의 도입 등을 목적으로 실시된다(mAbs 3:243-247, 2011).
또한 본 발명의 폴리펩티드는 Fc영역과 다른 단백질, 생리 활성 펩티드 등을 결합시킨 Fc 융합 단백질 분자(펩티드 Fc 융합 단백질) 또는 콜라겐이나 폴리락트산 등의 고분자에 의해 구성되는 세포외 매트릭스 등을 결합시킨 Fc 융합 단백질 분자(스캐폴드 Fc 융합 단백질)여도 된다.
다른 단백질, 생리 활성 펩티드로서는, 예를 들면 수용체, 접착분자, 리간드, 효소를 들 수 있는데 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 Fc 융합 단백질 분자의 바람직한 예로서, 표적에 결합하는 수용체 단백질에 Fc 도메인을 융합한 단백질을 들 수 있고, 예를 들면 TNFR-Fc 융합 단백, IL1R-Fc 융합 단백, VEGFR-Fc 융합 단백, CTLA4-Fc 융합 단백 등(Nat Med. 2003 Jan;9(1):47-52, BioDrugs. 2006;20(3):151-60.)을 수 있다. 또한 본 발명의 폴리펩티드에 융합시키는 단백질은 표적 분자에 결합하는 한 어떠한 분자여도 되고, 예를 들면 scFv 분자(WO2005/037989), 단일 도메인 항체 분자(WO2004/058821, WO2003/002609), 항체 유사 분자(Current Opinion in Biotechnology 2006, 17:653-658, Current Opinion in Biotechnology 2007, 18:1-10, Current Opinion in Structural Biology 1997, 7:463-469, Protein Science 2006, 15:14-27), 예를 들면 DARPins(WO2002/020565), Affibody(WO1995/001937), Avimer(WO2004/044011, WO2005/040229), Adnectin(WO2002/032925) 등을 들 수 있다. 또한 항체 및 Fc 융합 단백질 분자는 복수 종류의 표적 분자 또는 에피토프에 결합하는 이중 특이성 항체 등의 다중 특이성 항체여도 된다.
또한 본 발명의 항체에는 항체의 수식물도 포함된다. 항체의 수식물의 예로서는, 예를 들면 폴리에틸렌글리콜(PEG)이나 세포상해성 물질 등의 각종 분자와 결합시킨 항체를 들 수 있다. 이러한 항체 수식물은 본 발명의 항체에 화학적인 수식을 행함으로써 얻을 수 있다. 항체의 수식방법은 이 분야에 있어서 이미 확립되어 있다.
또한 본 발명의 항체는 이중 특이성 항체(bispecific antibody)여도 된다. 이중 특이성 항체란 상이한 에피토프를 인식하는 가변영역을 동일 항체 분자 내에 갖는 항체를 말하는데, 당해 에피토프는 상이한 분자 중에 존재하고 있어도 되고, 동일 분자 중에 존재하고 있어도 된다.
본 발명의 폴리펩티드는 당업자에게 공지의 방법에 의해 제조할 수 있다. 예를 들면 항체는 아래의 방법으로 제작할 수 있는데 이것에 한정되는 것은 아니다.
단리된 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 적당한 숙주에 도입함으로써 항체를 제작하기 위한 숙주세포와 발현 벡터의 많은 조합이 공지이다. 이들의 발현계는 모두 본 발명의 항원 결합 분자를 단리하는데 응용될 수 있다. 진핵세포가 숙주세포로서 사용되는 경우, 동물세포, 식물세포 또는 진균세포가 적당히 사용될 수 있다. 구체적으로는 동물세포로서는 다음과 같은 세포가 예시될 수 있다.
(1) 포유류세포：CHO(Chinese hamster ovary cell line), COS(Monkey kidney cell line), 골수종(Sp2/O, NS0 등), BHK(baby hamster kidney cell line), HEK293(human embryonic kidney cell line with sheared adenovirus(Ad)5 DNA), PER.C6 cell(human embryonic retinal cell line transformed with the Adenovirus Type 5(Ad5) E1A and E1B genes), Hela, Vero 등(Current Protocols in Protein Science(May, 2001, Unit 5.9, Table 5.9.1))
(2) 양서류세포：아프리카발톱개구리 난모세포 등
(3) 곤충세포：sf9, sf21, Tn5 등
항체의 중쇄를 코드하는 DNA로서, Fc영역 중의 1 또는 복수의 아미노산 잔기가 목적의 다른 아미노산으로 치환된 중쇄를 코드하는 DNA 및 항체의 경쇄를 코드하는 DNA를 발현시킨다. Fc영역 중의 1 또는 복수의 아미노산 잔기가 목적의 다른 아미노산으로 치환된 중쇄를 코드하는 DNA는, 예를 들면 천연형의 중쇄를 코드하는 DNA의 Fc영역 부분을 취득하고, 그 Fc영역 중의 특정 아미노산을 코드하는 코돈이 목적의 다른 아미노산을 코드하도록 적당히 치환을 도입함으로써 얻을 수 있다.
또한 사전에 천연형 중쇄의 Fc영역 중의 중의 1 또는 복수의 아미노산 잔기가 목적의 다른 아미노산으로 치환된 단백질을 코드하는 DNA를 설계하고, 그 DNA를 화학적으로 합성함으로써, Fc영역 중의 1 또는 복수의 아미노산 잔기가 목적의 다른 아미노산으로 치환된 중쇄를 코드하는 DNA를 얻는 것도 가능하다. 아미노산의 치환 부위, 치환의 종류로서는 특별히 한정되는 것은 아니다. 또한 치환에 한정되지 않고 결손, 부가, 삽입 또는 수식 중 어느 하나 또는 그들의 조합이어도 된다.
또한 Fc영역 중에 있어서 1 또는 복수의 아미노산 잔기가 목적의 다른 아미노산으로 치환된 중쇄를 코드하는 DNA는 부분 DNA로 나눠 제조할 수 있다. 부분 DNA의 조합으로서는, 예를 들면 가변영역을 코드하는 DNA와 불변영역을 코드하는 DNA, 또는 Fab영역을 코드하는 DNA와 Fc영역을 코드하는 DNA 등을 들 수 있지만 이들 조합에 한정되는 것은 아니다. 경쇄를 코드하는 DNA도 또한 동일하게 부분 DNA로 나눠 제조할 수 있다.
상기 DNA를 발현시키는 방법으로서는 아래의 방법을 들 수 있다. 예를 들면 중쇄 가변영역을 코드하는 DNA를 중쇄 불변영역을 코드하는 DNA와 함께 발현 벡터에 삽입하여 중쇄 발현 벡터를 구축한다. 동일하게 경쇄 가변영역을 코드하는 DNA를 경쇄 불변영역을 코드하는 DNA와 함께 발현 벡터에 삽입하여 경쇄 발현 벡터를 구축한다. 이들 중쇄, 경쇄의 유전자를 단일 벡터에 삽입하는 것도 가능하다.
목적으로 하는 항체를 코드하는 DNA를 발현 벡터로 삽입할 때, 발현 제어영역, 예를 들면 앤헨서, 프로모터의 제어하에서 발현하도록 발현 벡터에 삽입한다. 다음으로 이 발현 벡터에 의해 숙주세포를 형질전환하여 항체를 발현시킨다. 그때에는 적당한 숙주와 발현 벡터의 조합을 사용할 수 있다.
벡터의 예로서는 M13계 벡터, pUC계 벡터, pBR322, pBluescript, pCR-Script 등을 들 수 있다. 또한 cDNA의 서브클로닝, 잘라내기를 목적으로 한 경우, 상기 벡터 외에 예를 들면 pGEM-T, pDIRECT, pT7 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 항체를 생산하는 목적에 있어서 벡터를 사용하는 경우에는 특히 발현 벡터가 유용하다. 발현 벡터로서는 예를 들면 숙주를 JM109, DH5α, HB101, XL1-Blue 등의 대장균으로 한 경우에 있어서는, 대장균에서 효율적으로 발현할 수 있는 프로모터, 예를 들면 lacZ 프로모터(Ward 등, Nature(1989) 341, 544-546；FASEB J.(1992) 6, 2422-2427, 참조로써 그 전체가 본 명세서에 포함된다), araB 프로모터(Better 등, Science(1988) 240, 1041-1043, 참조로써 그 전체가 본 명세서에 포함된다), 또는 T7 프로모터 등을 가지고 있는 것이 불가결하다. 이러한 벡터로서는 상기 벡터 외에 pGEX-5X-1(Pharmacia사 제조), 「QIAexpress system」(QIAGEN사 제조), pEGFP 또는 pET(이 경우 숙주는 T7 RNA 폴리머라아제를 발현하고 있는 BL21이 바람직하다) 등을 들 수 있다.
또한 벡터에는 폴리펩티드 분비를 위한 시그날 서열이 포함되어 있어도 된다. 폴리펩티드 분비를 위한 시그날 서열로서는, 대장균의 페리플라즘으로 생산시키는 경우, pelB 시그날 서열(Lei, S. P. et al J. Bacteriol.(1987) 169, 4397, 참조로써 그 전체가 본 명세서에 포함된다)을 사용하면 된다. 숙주세포로의 벡터의 도입은 예를 들면 리포펙틴법, 인산칼슘법, DEAE-Dextran법을 사용해서 행할 수 있다.
대장균 발현 벡터 외에 예를 들면 본 발명의 폴리펩티드를 제조하기 위한 벡터로서는, 포유동물 유래의 발현 벡터(예를 들면 pcDNA3(Invitrogen사 제조)나 pEGF-BOS(Nucleic Acids. Res.1990, 18(17),p5322, 참조로써 그 전체가 본 명세서에 포함된다), pEF, pCDM8), 곤충세포 유래의 발현 벡터(예를 들면 「Bac-to-BAC baculovirus expression system」(GIBCO BRL사 제조), pBacPAK8), 식물 유래의 발현 벡터(예를 들면 pMH1, pMH2), 동물 바이러스 유래의 발현 벡터(예를 들면 pHSV, pMV, pAdexLcw), 레트로바이러스 유래의 발현 벡터(예를 들면 pZIPneo), 효모 유래의 발현 벡터(예를 들면 「Pichia Expression Kit」(Invitrogen사 제조), pNV11, SP-Q01), 고초균 유래의 발현 벡터(예를 들면 pPL608, pKTH50)를 들 수 있다.
CHO세포, COS세포, NIH3T3세포, HEK293세포 등의 동물세포에서의 발현을 목적으로 한 경우에는, 세포 내에서 발현시키기 위해 필요한 프로모터, 예를 들면SV40 프로모터(Mulligan 등, Nature(1979) 277, 108, 참조로써 그 전체가 본 명세서에 포함된다), MMTV-LTR 프로모터, EF1α 프로모터(Mizushima 등, Nucleic Acids Res.(1990) 18, 5322, 참조로써 그 전체가 본 명세서에 포함된다), CAG 프로모터(Gene.(1991) 108, 193, 참조로써 그 전체가 본 명세서에 포함된다), CMV 프로모터 등을 가지고 있는 것이 불가결하고, 형질전환세포를 선발하기 위한 유전자(예를 들면 약제(네오마이신, G418 등)에 의해 판별할 수 있는 약제 내성 유전자)를 가지면 더욱 바람직하다. 이러한 특성을 갖는 벡터로서는, 예를 들면 pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV, pOP13 등을 들 수 있다. 또한 유전자의 카피 수를 늘릴 목적으로 EBNA1 단백질을 공발현시키는 경우도 있으나, 이 경우 복제 개시점 OriP를 갖는 벡터를 사용한다(Biotechnol Bioeng. 2001 Oct 20;75(2):197-203., Biotechnol Bioeng. 2005 Sep 20;91(6):670-7.).
또한 유전자를 안정적으로 발현시키고, 또한 세포 내에서의 유전자의 카피 수의 증폭을 목적으로 하는 경우에는, 핵산 합성경로를 결손한 CHO세포에 그것을 상보하는 DHFR 유전자를 갖는 벡터(예를 들면 pCHOI 등)를 도입하고, 메토트렉세이트(MTX)에 의해 증폭시키는 방법을 들 수 있고, 또한 유전자의 일과성 발현을 목적으로 하는 경우에는 SV40 T항원을 발현하는 유전자를 염색체 상에 갖는 COS세포를 사용하여 SV40의 복제 기점을 갖는 벡터(pcD 등)로 형질전환하는 방법을 들 수 있다. 복제 개시점으로서는 또한 폴리오마 바이러스, 아데노 바이러스, 소유두종 바이러스(BPV) 등의 유래의 것을 사용하는 것도 가능하다. 또한 숙주세포계에서 유전자 카피수 증폭을 위해 발현 벡터는 선택 마커로서 아미노글리코시드 트랜스페라아제(APH) 유전자, 티미딘 키나아제(TK) 유전자, 대장균 크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스페라아제(Ecogpt) 유전자, 디히드로엽산 환원효소(dhfr) 유전자 등을 포함할 수 있다.
항체의 회수는 예를 들면 형질전환한 세포를 배양한 후, 분자 형질전환한 세포의 세포내 또는 배양액으로부터 분리함으로써 행할 수 있다. 항체의 분리, 정제에는 원심분리, 황안분획, 염석, 한외여과, 1q, FcRn, 프로테인 A, 프로테인 G 칼럼, 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 등의 방법을 적당히 조합해서 행할 수 있다.
이중 특이성 항체의 효율적인 제작방법으로서, Knobs-into-holes 기술을 사용할 수 있다. 구체적으로는 본 발명의 헤테로이량화 폴리펩티드를 제작하는 데는 서로 상이한 아미노산을 갖는 폴리펩티드끼리를 회합화시키거나 또는 목적의 헤테로이량화 폴리펩티드를 다른 호모이량화 폴리펩티드로부터 분리할 필요가 있다.
Fc영역을 갖는 상이한 아미노산을 갖는 폴리펩티드끼리의 회합화에는 항체 H쇄의 제2 불변영역(CH2) 또는 H쇄의 제3 불변영역(CH3)의 계면에 전하적인 반발을 도입하여 목적으로 하지 않는 H쇄끼리의 회합을 억제하는 기술을 적용할 수 있다(WO2006/106905).
CH2 또는 CH3의 계면에 전하적인 반발을 도입하여 의도하지 않는 H쇄끼리의 회합을 억제시키는 기술에 있어서, H쇄의 다른 불변영역의 계면에서 접촉하는 아미노산 잔기로서는, 예를 들면 CH3영역에 있어서의 EU 넘버링 356번째의 잔기, EU 넘버링 439번째의 잔기, EU 넘버링 357번째의 잔기, EU 넘버링 370번째의 잔기, EU 넘버링 399번째의 잔기, EU 넘버링 409번째의 잔기에 상대하는 영역을 들 수 있다.
보다 구체적으로는 예를 들면 2종의 H쇄 CH3영역을 포함하는 항체에 있어서는, 제1 H쇄 CH3영역에 있어서의 아래의 (1)~(3)에 나타내는 아미노산 잔기의 조(組)로부터 선택되는 1조 내지 3조의 아미노산 잔기가 동종의 전하를 갖는 항체로 할 수 있다；
(1) H쇄 CH3영역에 포함되는 아미노산 잔기로서, EU 넘버링 356번 위치 및 439번 위치의 아미노산 잔기,
(2) H쇄 CH3영역에 포함되는 아미노산 잔기로서, EU 넘버링 357번 위치 및 370번 위치의 아미노산 잔기,
(3) H쇄 CH3영역에 포함되는 아미노산 잔기로서, EU 넘버링 399번 위치 및 409번 위치의 아미노산 잔기.
또한 상기 제1 H쇄 CH3영역과는 상이한 제2 H쇄 CH3영역에 있어서의 상기 (1)~(3)에 나타내는 아미노산 잔기의 조로부터 선택되는 아미노산 잔기의 조로서, 상기 제1 H쇄 CH3영역에 있어서 동종의 전하를 갖는 상기 (1)~(3)에 나타내는 아미노산 잔기의 조에 대응하는 1조 내지 3조의 아미노산 잔기가, 상기 제1 H쇄 CH3영역에 있어서의 대응하는 아미노산 잔기와는 반대의 전하를 갖는 항체로 할 수 있다.
상기 (1)~(3)에 기재된 각각의 아미노산 잔기는 회합하였을 때에 서로 접근해 있다. 당업자라면 목적하는 H쇄 CH3영역 또는 H쇄 불변영역에 대해서, 시판의 소프트웨어를 사용한 호모로지 모델링 등에 의해 상기 (1)~(3)에 기재된 아미노산 잔기에 대응하는 부위를 발견할 수 있어, 적당히 그 부위의 아미노산 잔기를 개변에 제공하는 것이 가능하다.
상기 항체에 있어서 「전하를 갖는 아미노산 잔기」는 예를 들면 아래의 (X) 또는 (Y) 중 어느 하나의 군에 포함되는 아미노산 잔기로부터 선택되는 것이 바람직하다；
(X) 글루타민산(E), 아스파라긴산(D),
(Y) 리신(K), 아르기닌(R), 히스티딘(H).
상기 항체에 있어서 「동종의 전하를 갖는다」는 것은, 예를 들면 2개 이상의 아미노산 잔기 모두가 상기 (X) 또는 (Y) 중 어느 하나의 군에 포함되는 아미노산 잔기를 갖는 것을 의미한다. 「반대의 전하를 갖는다」는 것은, 예를 들면 2개 이상의 아미노산 잔기 중 하나 이상의 아미노산 잔기가 상기 (X) 또는 (Y) 중 어느 하나의 군에 포함되는 아미노산 잔기를 갖는 경우에, 나머지 아미노산 잔기가 상이한 군에 포함되는 아미노산 잔기를 갖는 것을 의미한다.
바람직한 태양에 있어서 상기 항체는 제1 H쇄 CH3영역과 제2 H쇄 CH3영역이 디설피드 결합에 의해 가교되어 있어도 된다.
본 발명에 있어서 개변에 제공하는 아미노산 잔기로서는, 전술한 항체의 가변영역 또는 항체의 불변영역의 아미노산 잔기에 한정되지 않는다. 당업자라면 폴리펩티드 변이체 또는 이종 다량체에 대해서 시판의 소프트웨어를 사용한 호모로지 모델링 등에 의해 계면을 형성하는 아미노산 잔기를 발견할 수 있어, 회합을 제어하도록 그 부위의 아미노산 잔기를 개변에 제공하는 것이 가능하다.
본 발명의 Fc영역을 갖는 상이한 아미노산을 갖는 폴리펩티드끼리의 회합화에는 추가로 다른 공지기술을 사용하는 것도 가능하다. 항체의 한쪽 H쇄의 가변영역에 존재하는 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄(knob; 돌기)로 치환하고, 다른 한쪽 H쇄의 상대하는 가변영역에 존재하는 아미노산 측쇄를 보다 작은 측쇄(hole; 공극)로 치환함으로써, 돌기가 공극에 배치될 수 있도록 하여 효율적으로 Fc영역을 갖는 상이한 아미노산을 갖는 폴리펩티드끼리의 회합화를 일으킬 수 있다(WO1996/027011, Ridgway JB et al., Protein Engineering(1996) 9, 617-621, Merchant AM et al. Nature Biotechnology(1998) 16, 677-681).
이에 더하여 Fc영역을 갖는 상이한 아미노산을 갖는 폴리펩티드끼리의 회합화에는 추가로 다른 공지기술을 사용하는 것도 가능하다. 항체의 한쪽 H쇄의 CH3의 일부를 그 부분에 대응하는 IgA 유래의 서열로 하고, 다른 한쪽 H쇄의 CH3의 상보적인 부분에 그 부분에 대응하는 IgA 유래의 서열을 도입한 strand-exchange engineered domain CH3를 사용함으로써, 상이한 서열을 갖는 폴리펩티드의 회합화를 CH3의 상보적인 회합화에 의해 효율적으로 일으킬 수 있다(Protein Engineering Design & Selection, 23; 195-202, 2010). 이 공지기술을 사용해도 효율적으로 Fc영역을 갖는 상이한 아미노산을 갖는 폴리펩티드끼리의 회합화를 일으킬 수 있다.
그 밖에도 WO2011/028952에 기재된 항체의 CH1과 CL의 회합화, VH, VL의 회합화를 이용한 헤테로이량화 항체 제작기술도 사용할 수 있다.
또한 헤테로이량화 폴리펩티드를 효율적으로 형성할 수 없는 경우라도, 헤테로이량화 폴리펩티드를 호모이량화 폴리펩티드와 분리, 정제함으로써도 헤테로이량화 폴리펩티드를 얻는 것이 가능하다. 서로 서열이 상이한 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드로 이루어지는 헤테로이량화 폴리펩티드를 제작할 때는, 2개의 제1 폴리펩티드만으로 이루어지는 호모이량화 폴리펩티드, 2개의 제2 폴리펩티드만으로 이루어지는 호모이량화 폴리펩티드가 불순물로서 혼입된다. 이들 2종류의 호모이량화 폴리펩티드를 효율적으로 제거하는 방법으로서 공지기술을 사용할 수 있다. 2종류의 H쇄의 가변영역에 아미노산 치환을 도입하여 등전점의 차를 부여함으로써, 2종류의 호모체와 목적의 헤테로이량화 항체를 이온 교환 크로마토그래피로 정제 가능하게 하는 방법이 보고되어 있다(WO2007114325).
등전점의 차를 부여하기 위한 아미노산 개변은 회합하는 2개의 폴리펩티드의 등전점에 차가 생겨 있는 한 도입되는 아미노산 개변은 특별히 한정되지 않고, 면역원성의 저하 등 다른 목적의 아미노산 개변이 포함되어 있어도 된다. 개변되는 아미노산은 Fcγ 수용체로의 결합활성에 영향이 적은 위치의 아미노산인 것이 바람직하다. 또한 목적하는 Fcγ 수용체로의 결합활성을 높이는 아미노산 개변이어도 된다. 그러한 개변을 위한 아미노산의 위치로서는 구체적으로는, 예를 들면 제1 폴리펩티드 및/또는 제2 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, EU 넘버링 137번째의 Gly, 138번째의 Gly, 139번째의 Thr, 147번째의 Lys, 192번째의 Ser, 193번째의 Leu, 196번째의 Gln, 198번째의 Tyr, 199번째의 Ile, 203번째의 Asn, 214번째의 Lys, 231번째의 Ala, 233번째의 Glu, 242번째의 Leu, 263번째의 Val, 272번째의 Glu, 274번째의 Lys, 278번째의 Tyr, 288번째의 Lys, 290번째의 Lys, 316번째의 Gly, 317번째의 Lys, 320번째의 Lys, 324번째의 Lys, 335번째의 Thr, 337번째의 Ser, 338번째의 Lys, 340번째의 Lys, 341번째의 Gly, 358번째의 Leu, 360번째의 Lys, 362번째의 Gln, 364번째의 Ser, 383번째의 Ser, 384번째의 Asn, 385번째의 Gly, 386번째의 Gln, 387번째의 Pro, 390번째의 Asn, 397번째의 Val 및 422번째의 Val로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 변이가 도입되어 있는 것이 바람직하다. 또한 EU 넘버링 137번째의 Gly, 138번째의 Gly, 139번째의 Thr, 147번째의 Lys, 192번째의 Ser, 193번째의 Leu, 196번째의 Gln, 199번째의 Ile, 203번째의 Asn, 214번째의 Lys, 272번째의 Glu, 274번째의 Lys, 288번째의 Lys, 290번째의 Lys, 358번째의 Leu, 360번째의 Lys, 362번째의 Gln, 383번째의 Ser, 384번째의 Asn, 385번째의 Gly, 386번째의 Gln, 390번째의 Asn, 397번째의 Val 및 422번째의 Val로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 변이가 도입되어 있는 것이 바람직하고, 또한 EU 넘버링 137번째의 Gly, 138번째의 Gly, 147번째의 Lys, 192번째의 Ser, 193번째의 Leu, 196번째의 Gln, 199번째의 Ile, 203번째의 Asn, 214번째의 Lys, 274번째의 Lys, 288번째의 Lys, 358번째의 Leu, 384번째의 Asn 및 397번째의 Val로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 변이가 도입되어 있는 것이 보다 바람직하다.
보다 구체적으로는 제1 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드 중 어느 한쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, EU 넘버링 196번째의 Gln, 199번째의 Ile, 231번째의 Ala, 233번째의 Glu, 242번째의 Leu, 263번째의 Val, 272번째의 Glu, 316번째의 Gly, 358번째의 Leu, 364번째의 Ser, 383번째의 Ser, 387번째의 Pro 및 397번째의 Val로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 변이가 도입되어 있고, 다른 한쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, EU 넘버링 137번째의 Gly, 138번째의 Gly, 139번째의 Thr, 147번째의 Lys, 192번째의 Ser, 193번째의 Leu, 198번째의 Tyr, 199번째의 Ile, 203번째의 Asn, 214번째의 Lys, 274번째의 Lys, 278번째의 Tyr, 288번째의 Lys, 290번째의 Lys, 316번째의 Gly, 317번째의 Lys, 320번째의 Lys, 324번째의 Lys, 335번째의 Thr, 337번째의 Ser, 338번째의 Lys, 340번째의 Lys, 341번째의 Gly, 358번째의 Leu, 360번째의 Lys, 362번째의 Gln, 383번째의 Ser, 384번째의 Asn, 385번째의 Gly, 386번째의 Gln, 390번째의 Asn 및 422번째의 Val로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 변이가 도입되어 있는 것이 바람직하다. 또한 한쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, EU 넘버링 196번째의 Gln, 199번째의 Ile, 272번째의 Glu, 358번째의 Leu, 383번째의 Ser 및 397번째의 Val로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 변이가 도입되어 있고, 다른 한쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, EU 넘버링 137번째의 Gly, 138번째의 Gly, 139번째의 Thr, 147번째의 Lys, 192번째의 Ser, 193번째의 Leu, 199번째의 Ile, 203번째의 Asn, 214번째의 Lys, 274번째의 Lys, 288번째의 Lys, 290번째의 Lys, 358번째의 Leu, 360번째의 Lys, 362번째의 Gln, 383번째의 Ser, 384번째의 Asn, 385번째의 Gly, 386번째의 Gln, 390번째의 Asn 및 422번째의 Val로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 변이가 도입되어 있는 것이 바람직하다. 또한 한쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, EU 넘버링 196번째의 Gln, 199번째의 Ile, 358번째의 Leu 및 397번째의 Val로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 변이가 도입되어 있고, 다른 한쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, EU 넘버링 137번째의 Gly, 138번째의 Gly, 147번째의 Lys, 192번째의 Ser, 193번째의 Leu, 199번째의 Ile, 203번째의 Asn, 214번째의 Lys, 274번째의 Lys, 288번째의 Lys 및 384번째의 Asn으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 변이가 도입되어 있는 것이 보다 바람직하다.
아미노산의 개변은 개변 후에 회합하는 2개의 폴리펩티드의 등전점에 차가 생기도록 개변되어 있으면 특별히 한정되지 않는다.
등전점을 높게 하기 위한 바람직한 개변으로서는, 예를 들면 EU 넘버링 196번째의 아미노산의 Lys로의 치환, 231번째의 아미노산의 Lys로의 치환, 242번째의 아미노산의 Lys로의 치환, 263번째의 아미노산의 Lys로의 치환, 272번째의 아미노산의 Lys로의 치환, 316번째의 아미노산의 Lys로의 치환, 364번째의 아미노산의 Lys로의 치환, 358번째의 아미노산의 Lys로의 치환, 383번째의 아미노산의 Lys로의 치환, 387번째의 아미노산의 Lys로의 치환, 397번째의 아미노산의 Lys로의 치환을 들 수 있다. 또한 등전점을 낮게 하기 위한 바람직한 개변으로서는, 예를 들면 EU 넘버링 137번째의 아미노산의 Glu로의 치환, 138번째의 아미노산의 Glu로의 치환, 139번째의 아미노산의 Glu로의 치환, 147번째의 아미노산의 Glu로의 치환, 198번째의 아미노산의 Glu로의 치환, 203번째의 아미노산의 Asp로의 치환, 214번째의 아미노산의 Thr로의 치환, 274번째의 아미노산의 Gln으로의 치환, 278번째의 아미노산의 Glu로의 치환, 288번째의 아미노산의 Glu로의 치환, 290번째의 아미노산의 Glu로의 치환, 316번째의 아미노산의 Glu로의 치환, 317번째의 아미노산의 Glu로의 치환, 320번째의 아미노산의 Glu로의 치환, 324번째의 아미노산의 Glu로의 치환, 335번째의 아미노산의 Glu로의 치환, 337번째의 아미노산의 Asp로의 치환, 338번째의 아미노산의 Glu로의 치환, 340번째의 아미노산의 Glu로의 치환, 341번째의 아미노산의 Glu로의 치환, 358번째의 아미노산의 Glu로의 치환, 360번째의 아미노산의 Glu로의 치환, 362번째의 아미노산의 Glu로의 치환, 383번째의 아미노산의 Glu로의 치환, 384번째의 아미노산의 Glu로의 치환, 385번째의 아미노산의 Glu로의 치환, 386번째의 아미노산의 Glu로의 치환, 390번째의 아미노산의 Glu로의 치환, 422번째의 아미노산의 Glu로의 치환을 들 수 있다.
등전점에 차가 생기게 하는 목적 이외의 아미노산 개변을 조합시키는 경우, 예를 들면 면역원성을 저하시키는 경우에는 EU 넘버링 138번째의 아미노산의 Ser로의 치환, 192번째의 아미노산의 Asn으로의 치환, 193번째의 아미노산의 Phe로의 치환 및 199번째의 아미노산의 Thr로의 치환을 조합해도 된다.
여기서 면역원성이 저하되어 있다는 것은, 항체가 투여되는 개체의 적어도 과반수에 있어서 치료효과를 달성하기에 충분한 시간에 걸쳐 항체 투여의 유지된 효과를 저하시키기에 충분한 양의 항체 생산을 야기하지 않는 것을 의미한다.
인간에게 있어서의 면역원성의 레벨은 MHC 클래스 II 결합 예측 프로그램 Propred(http://www.imtech.res.in/raghava/propred)를 사용하고, 모든 대립 유전자의 1% 역치 해석을 사용하여 예측할 수 있다. 사용 가능한 다른 프로그램으로서는:
－Rankpep(http://bio.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.html)
－Epibase(Algonomics proprietary software: algonomics.com)
가 포함된다.
면역원성이 저감된 폴리펩티드는 초기 도너 분자와 비교하여 표적 집단에 있어서 고도로 발현되는 MHC 클래스 II 대립 유전자에 결합할 것으로 예측되는 펩티드를 포함하지 않거나 당해 펩티드의 수가 저감되어 있다(Flower 등(Drug Discov. Today (2004) 9(2), 82-90)).
MHC 클래스 II 결합의 기능 분석은 당해 단백질에 대응하는 중복되는 펩티드를 생성하여 T세포 활성화를 야기하는 그들의 능력을 시험하거나(T세포 증식 분석) 또는 리포터 펩티드인 기지의 MHC 클래스 II 결합 펩티드를 치환함으로써 실시할 수 있다(Hammer 등(J. Exp. Med. (1994) 180, 2353-2358)).
또한 헤테로이량화 항체를 정제하는 방법으로서, 지금까지 프로테인 A에 결합하는 마우스 IgG2a의 H쇄와 프로테인 A에 결합하지 않는 랫트 IgG2b의 H쇄로 이루어지는 헤테로이량화 항체를 프로테인 A를 사용하여 정제하는 방법이 보고되어 있다(WO98050431, WO95033844).
또한 IgG와 Protein A의 결합 부위인 EU 넘버링 435번째 및 436번째의 아미노산 잔기를 Tyr, His 등의 Protein A로의 결합력이 상이한 아미노산으로 치환한 H쇄를 사용함으로써, 각 H쇄와 Protein A의 상호작용을 변화시켜 Protein A 칼럼을 사용함으로써, 헤테로이량화 항체만을 효율적으로 정제하는 것도 가능하다. 이들의 치환, 기술을 복수, 예를 들면 2개 이상 조합해서 사용할 수 있다. 또한 이들 개변은 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드에 적당히 따로 따로 가할 수 있다. 또한 본 발명의 폴리펩티드는 상기 개변이 가해진 것을 기초로 하여 제작한 것이어도 된다.
또한 본 발명은 Fc영역을 구성하는 제1 폴리펩티드 및/또는 제2 폴리펩티드에 아미노산 변이를 도입함으로써 그 Fc영역을 헤테로이량체로 하고, 아미노산 변이의 도입에 의해 그 Fc영역이 호모이량체가 된 경우에 비해 Fc영역의 기능을 개변하는 공정을 포함하는, Fc영역을 포함하는 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공한다.
예를 들면 아래의 공정을 포함하는 제조방법을 들 수 있다；
(a) Fc영역을 포함하는 폴리펩티드에 있어서, 그 Fc영역을 구성하는 제1 폴리펩티드 및/또는 제2 폴리펩티드에 아미노산 변이를 도입하는 공정,
(b) 상기 공정(a)에서 변이가 도입된 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드로 이루어지는 헤테로이량체의 Fc영역의 기능을 측정하는 공정 및
(c) 모체 폴리펩티드 또는 아미노산 변이의 도입에 의해 그 Fc영역이 호모 이량체가 된 경우와 비교하여 Fc영역의 기능이 개변된 폴리펩티드를 선택하는 공정.
또한 본 제조방법에 있어서, 아래의 공정을 (a)의 공정 후에 행해도 된다.
(d) Fc영역을 갖는 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드로 이루어지는 헤테로이량화 폴리펩티드를 제시한 리보솜, 파지, 이스트에 디스플레이시키는 공정
바람직한 태양으로서는, Fc영역을 포함하는 폴리펩티드의 제조방법으로서,
(a) 모체 폴리펩티드 또는 아미노산 변이의 도입에 의해 그 Fc영역이 호모 이량체가 된 경우와 비교하여 Fc영역의 기능이 개변되도록 당해 폴리펩티드를 코드하는 핵산을 개변하는 공정,
(b) 숙주세포에 당해 핵산을 도입하여 폴리펩티드를 발현하도록 배양하는 공정,
(c) 숙주세포 배양물로부터 당해 폴리펩티드를 회수하는 공정을 포함하는 방법이다.
또한 당해 제조방법에 의해 제조되는 항체 및 Fc 융합 단백질 분자도 본 발명에 포함된다.
본 방법에 의해 도입되는 아미노산 변이의 종류나 범위는 특별히 한정되는 것은 아니나, 명세서에 기재된 각 Fc영역의 기능의 개변에 관여하는 아미노산 변이(보다 구체적으로는 실시예의 표에 구체적으로 개시된 아미노산 변이)를 예시할 수 있다.
또한 본 발명은 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드의 기능을 개변하는 방법으로서, 그 Fc영역을 구성하는 제1 폴리펩티드 및/또는 제2 폴리펩티드에 아미노산 변이를 도입함으로써 그 Fc영역을 헤테로이량체로 하고, 아미노산 변이의 도입에 의해 그 Fc영역이 호모이량체가 된 경우에 비해 Fc영역의 기능을 개변하는 공정을 포함하는, 폴리펩티드의 기능을 개변하는 방법을 제공한다.
예를 들면 아래의 공정을 포함하는 개변방법을 들 수 있다；
(a) Fc영역을 포함하는 폴리펩티드에 있어서, 그 Fc영역을 구성하는 제1 폴리펩티드 및/또는 제2 폴리펩티드에 아미노산 변이를 도입하는 공정,
(b) 상기 공정(a)에서 변이가 도입된 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드로 이루어지는 헤테로이량체의 Fc영역의 기능을 측정하는 공정 및
(c) 모체 폴리펩티드 또는 아미노산 변이의 도입에 의해 그 Fc영역이 호모 이량체가 된 경우와 비교하여 Fc영역의 기능이 개변된 폴리펩티드를 선택하는 공정.
또한 본 개변방법에 있어서, 아래의 공정을 (a)의 공정 후에 행해도 된다.
(d) Fc영역을 갖는 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드로 이루어지는 헤테로이량화 폴리펩티드를 제시한 리보솜, 파지, 이스트에 디스플레이시키는 공정
바람직한 태양으로서는 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드의 개변방법으로서,
(a) 모체 폴리펩티드 또는 아미노산 변이의 도입에 의해 그 Fc영역이 호모 이량체가 된 경우와 비교하여 Fc영역의 기능이 개변되도록 당해 폴리펩티드를 코드하는 핵산을 개변하는 공정,
(b) 숙주세포에 당해 핵산을 도입하여 폴리펩티드를 발현하도록 배양하는 공정,
(c) 숙주세포 배양물로부터 당해 폴리펩티드를 회수하는 공정을 포함하는 방법이다.
또한 당해 개변방법에 의해 개변되는 항체 및 Fc 융합 단백질 분자도 본 발명에 포함된다.
본 방법에 의해 도입되는 아미노산 변이의 종류나 범위는 특별히 한정되는 것은 아니나, 명세서에 기재된 각 Fc영역의 기능의 개변에 관여하는 아미노산 변이(보다 구체적으로는 실시예의 표에 구체적으로 개시된 아미노산 변이)를 예시할 수 있다.
또한 본 발명은 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 헤테로이량화체에 의해 구성되어 있는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드로서, 그 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 변이가 도입되어 있는 Fc영역을 포함하고, 변이가 도입되어 있지 않은 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 Fc영역의 기능이 개변되어 있는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드를 코드하는 핵산을 제공한다. 본 발명의 그 핵산은 DNA, RNA 등 어떠한 형태여도 된다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 벡터의 종류는 벡터가 도입되는 숙주세포에 따라 당업자가 적당히 선택할 수 있고, 예를 들면 전술한 벡터를 사용할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 벡터에 의해 형질전환된 숙주세포에 관한 것이다. 숙주세포는 당업자가 적당히 선택할 수 있고, 예를 들면 전술한 숙주세포를 사용할 수 있다.
<의약 조성물>
본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 함유하는 의약 조성물을 제공한다.
본 발명의 의약 조성물은 본 발명의 폴리펩티드인 항체 또는 Fc 융합 단백질 분자에 더하여 의약적으로 허용 가능한 담체를 도입하여 공지의 방법으로 제제화하는 것이 가능하다. 예를 들면 물 또는 그 이외의 약학적으로 허용 가능한 용액과의 무균성 용액 또는 현탁액제의 주사제의 형태로 비경구적으로 사용할 수 있다. 예를 들면 약리학상 허용되는 담체 또는 매체, 구체적으로는 멸균수나 생리식염수, 식물유, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 향미제, 부형제, 비히클, 방부제, 결합제 등과 적당히 조합하여, 일반적으로 인정된 제약실시에 요구되는 단위용량 형태로 혼화함으로써 제제화하는 것을 생각할 수 있다. 구체적으로는 경질무수규산, 젖당, 결정 셀룰로오스, 만니톨, 전분, 카르멜로스 칼슘, 카르멜로스 나트륨, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 폴리비닐아세탈디에틸아미노아세테이트, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴, 중쇄 지방산 트리글리세리드, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 60, 백당, 카르복시메틸셀룰로오스, 콘스타치, 무기염류 등을 담체로서 들 수 있다. 이들 제제에 있어서의 유효성분량은 지시된 범위의 적당한 용량이 얻어지도록 하는 것이다.
주사를 위한 무균 조성물은 주사용 증류수와 같은 비히클을 사용하여 통상의 제제실시에 따라 처방할 수 있다.
주사용 수용액으로서는 예를 들면 생리식염수, 포도당이나 기타 보조약을 포함하는 등장액, 예를 들면 D-소르비톨, D-만노오스, D-만니톨, 염화나트륨을 들 수 있고, 적당한 용해 보조제, 예를 들면 알코올, 구체적으로는 에탄올, 폴리알코올, 예를 들면 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 비이온성 계면활성제, 예를 들면 폴리소르베이트 80(TM), HCO-50과 병용해도 된다.
유성액으로서는 참기름, 대두유를 들 수 있고, 용해 보조제로서 안식향산 벤질, 벤질알코올과 병용해도 된다. 또한 완충제, 예를 들면 인산염 완충액, 초산나트륨 완충액, 무통화제, 예를 들면 염산프로카인, 안정제, 예를 들면 벤질알코올, 페놀, 산화방지제와 배합해도 된다. 조제된 주사액은 통상 적당한 앰플에 충전시킨다.
투여는 바람직하게는 비경구 투여이고, 구체적으로는 주사제형, 경비 투여제형, 경폐 투여제형, 경피 투여제형 등을 들 수 있다. 주사제형의 예로서는 예를 들면 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하 주사 등에 의해 전신 또는 국부적으로 투여할 수 있다.
또한 환자의 연령, 증상에 따라 적당히 투여방법을 선택할 수 있다. 폴리펩티드 또는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 의약 조성물의 투여량으로서는, 예를 들면 1회 체중 1 ㎏당 0.0001 ㎎~1000 ㎎의 범위에서 선택하는 것이 가능하다. 또는 예를 들면 환자당 0.001~100000 ㎎/body의 범위에서 투여량을 선택할 수 있는데, 이들 수치에 반드시 제한되는 것은 아니다. 투여량, 투여방법은 환자의 체중이나 연령, 증상 등에 따라 변동되나, 당업자라면 적당히 선택하는 것이 가능하다.
본 발명에 있어서는, 상기 본 발명의 폴리펩티드를 함유하는 의약 조성물은 암, 면역염증성 질환 등의 치료제 또는 예방제의 유효성분으로서 유용하다.
또한 본 명세서에서 사용되고 있는 아미노산의 3문자 표기와 1문자 표기의 대응은 아래와 같다.
알라닌：Ala：A
아르기닌：Arg：R
아스파라긴：Asn：N
아스파라긴산：Asp：D
시스테인：Cys：C
글루타민：Gln：Q
글루타민산：Glu：E
글리신：Gly：G
히스티딘：His：H
이소류신：Ile：I
류신：Leu：L
리신：Lys：K
메티오닌：Met：M
페닐알라닌：Phe：F
프롤린：Pro：P
세린：Ser：S
트레오닌：Thr：T
트립토판：Trp：W
티로신：Tyr：Y
발린：Val：V
또한 본 명세서에 있어서 인용된 모든 선행기술문헌은 참조로써 본 명세서에 포함된다.
실시예
아래에 본 발명을 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명하나, 본 발명은 이들 실시예에 제한되는 것은 아니다.
〔실시예 1〕헤테로이량화 항체에 의한 FcγR 인식능 향상의 콘셉트의 설명
항체는 Fc영역을 매개로 FcRn, FcγR, 보체 등 다양한 분자와 상호작용하고 있다. Fc의 리간드의 하나인 FcRn은 항체의 각 H쇄(중쇄)에 대해 각각 1분자가 결합하고 있기 때문에, 1분자의 항체에 대해 2분자의 FcRn이 결합한다(도 1). 생체내에 있어서 FcRn은 세포막 상에 발현하고 있기 때문에, 생체내에 있어서 항체는 각 H쇄의 동일한 부분을 매개로 대조적으로 2분자의 FcRn을 인식하고 있다(Nature, 372: 379-383, 1994). 또한 IgG와 동일한 면역 글로불린 패밀리에 속하는 IgA도 IgG와 FcRn의 관계와 마찬가지로 1분자의 IgA가 대칭적으로 2분자의 IgA 수용체인 FcαR을 인식하고 있다(도 2)(Nature, 423:614 - 620, 2003).
그러나 FcRn 등과 달리 FcγR은 항체 1분자에 대해 1분자밖에 결합하지 않는다(도 3)(JBC, 276: 16469-16477, 2001). IgG는 양 H쇄의 CH2 도메인을 매개로 FcγR을 인식하고 있는데, FcγR과 상호작용하고 있는 부위는 각 H쇄에 있어서 상이하다. 예를 들면 도 3의 좌측의 H쇄를 HA쇄, 우측을 HB쇄로 하면, EU 넘버링 327번째의 Ala는 HA쇄, HB쇄의 각 쇄에서 FcγR과 상호작용하고 있는데, 각 H쇄에 있어서 상호작용하는 상대측 잔기의 성질이 상이하다(도 4). HA쇄에 있어서는 FcγRIII의 EU 넘버링 87번째와 EU 넘버링 110번째의 Trp와 소수적으로 상호작용하고 있는데, HB쇄에 있어서는 EU 넘버링 131번째의 His와 상호작용하고 있다. 그 때문에 EU 넘버링 327번째의 Ala를 Trp 등의 소수성이 높은 아미노산과 치환한 경우, HA쇄에서는 FcγR과의 결합활성을 향상시키는 효과가 있더라도, HB쇄에서는 FcγR과의 결합활성을 저감시킬 가능성이 있다. 이 사실로부터 아미노산 개변에 의해 IgG의 Fc영역의 FcγR에 대한 상호작용을 최적화하기 위해서는, 각 H쇄에 있어서의 FcγR에 대한 비대칭적인 효과를 고려할 필요가 있다고 생각된다. 그럼에도 불구하고, 종래기술에서는 IgG의 Fc영역의 FcγR에 대한 상호작용을 최적화할 때에는 양 H쇄에 동일한 개변을 도입하고 있었다(WO2006/019447, WO2000/042072). 그러나 IgG의 Fc영역이 FcγR과 비대칭으로 상호작용하는 것을 고려하면, 각 H쇄에 상이한 개변을 도입한 편이 IgG와 FcγR의 상호작용을 보다 정밀하게 최적화할 수 있을 것으로 생각된다. 즉 Fc영역의 FcγR에 대한 상호작용을 최적화하기 위해 각 H쇄에 상이한 개변을 가한 항체인 헤테로이량화 항체를 사용함으로써, 종래기술에서 실시되어 온 각 H쇄에 동일한 개변을 가한 항체인 호모이량화 항체와 비교하여 FcγR과의 상호작용을 한층 최적화할 수 있을 가능성이 있다.
〔실시예 2〕헤테로이량화 항체에 의한 FcγR 인식능 향상의 콘셉트의 증명
항체의 각 H쇄에 상이한 개변을 도입한 헤테로이량화 항체를 사용함으로써, 종래기술인 호모이량화 항체와 비교하여 항체와 FcγR에 대한 결합활성을 보다 최적화할 수 있는지 검토하였다.
종래는 항체의 각 H쇄에 동일한 개변을 도입한 호모이량화 항체를 사용함으로써 FcγR에 대한 결합이 증강되는 개변을 탐색하고 있었다. 그러나 실시예 1에서 언급한 바와 같이 항체와 FcγR이 비대칭으로 상호작용하는 것으로부터, 양 H쇄에 동일한 개변을 도입한 경우 그 개변이 한쪽 H쇄에서는 FcγR에 대한 결합활성을 증강시키나, 다른 한쪽 H쇄에서는 결합을 저해하고 있을 가능성이 있다. 이러한 개변을 양 H쇄에 도입한 호모이량화 항체의 경우는 반드시 FcγR에 대한 결합활성을 증강시키지는 않으나, 한쪽 H쇄에만 개변을 도입한 헤테로이량화 항체의 경우는 FcγR에 대한 결합활성을 증강시킬 가능성이 있다.
이 가설을 검증하기 위해, FcγR에 대한 결합활성을 개변하는 것으로 생각되는 개변을 한쪽 H쇄에만 도입한 제1 폴리펩티드, 그 개변을 가하지 않은 제2 폴리펩티드로 이루어지는 헤테로이량화 항체 및 FcγR에 대한 결합활성을 개변하는 것으로 생각되는 개변을 한쪽 H쇄에만 도입한 제1 폴리펩티드로 이루어지는 호모이량화 항체의 FcγR에 대한 결합을 비교하였다. 종래의 생각에 기초하면 그 개변이 FcγR에 대한 결합활성을 증강시키는 것이라면, 반드시 호모이량화 항체 쪽이 헤테로이량화 항체보다도 우수할 것이다. 그러나 만일 항체의 Fc가 FcγR을 비대칭으로 인식하고 있는 것이라면, 개변의 종류에 따라서는 헤테로이량화 항체 쪽이 호모이량화 항체보다도 FcγR에 대해 강한 결합활성을 나타낼 것이다.
항체 H쇄 가변영역으로서는, WO2009/041062에 개시되는 혈장 중 동태가 개선된 항글리피칸 3 항체의 pH7의 CDR을 포함하는 글리피칸 3 항체의 가변영역을 사용하고, GpH7(서열번호：1)이라 부른다. 항체 H쇄 불변영역으로서 아래의 것을 사용하고, 그것을 GpH7과 조합해서 사용하였다. 또한 항체 H쇄 불변영역의 명칭을 H1으로 한 경우, 가변영역에 GpH7을 갖는 항체의 H쇄에 대응하는 서열은 GpH7-H1이라 부른다. 또한 아미노산의 개변을 나타내는 경우에는, D356K와 같이 나타낸다. 처음의 알파벳(D356K의 D에 해당)은 개변 전의 아미노산 잔기를 1문자 표기로 나타낸 경우의 알파벳을 의미하고, 그것에 계속되는 숫자(D356K의 356에 해당)는 그 개변 개소의 EU 넘버링을 의미하며, 마지막의 알파벳(D356K의 K에 해당)은 개변 후의 아미노산 잔기를 1문자 표기로 나타낸 경우의 알파벳을 의미한다. GpH7을 가변영역에 갖는 IgG1의 C 말단의 Gly 및 Lys를 제거한 GpH7-G1d(서열번호：2), GpH7-G1d에 D356K 및 H435R의 변이를 도입한 GpH7-A5(서열번호：3), GpH7-G1d에 K439E의 변이를 도입한 GpH7-B3(서열번호：4)를 참고 실시예 1의 방법에 따라 조제하였다. 각각의 H쇄에 도입한 D356K 및 K439E의 변이는 2개의 H쇄로 이루어지는 헤테로이량화 항체를 생산할 때, 각 H쇄의 헤테로체를 효율적으로 형성시키기 위해 도입하였다(WO2006/106905). H435R은 Protein A로의 결합을 방해하는 개변으로, 헤테로체와 호모체를 효율적으로 분리하기 위해 도입하였다(참고 실시예 3, 4, 5를 참조). 마찬가지로 항체의 L쇄에는 WO2009/041062에 개시되는 혈장 중 동태가 개선된 글리피칸 3 항체의 L쇄인 GpL16-k0(서열번호：5)를 사용하였다. 　
GpH7-A5, GpH7-B3를 모체 폴리펩티드로 하여 헤테로이량화 항체의 콘셉트를 증명하기 위한 변이를 도입하고 개변체를 조제하여 평가하였다. 제작한 발현 벡터는 참고 실시예 1의 방법에 따라 FreeStyle293세포(invitrogen)로의 트랜스펙션에 사용하였다. 발현한 항체는 참고 실시예 1의 방법에 따라 정제하였다. 호모이량화 항체를 발현시킬 때에는 항체 L쇄인 GpL16-k0가 삽입된 발현 벡터와 1종류의 항체 H쇄 서열이 삽입된 발현 벡터를 사용하였다. 헤테로이량화 항체를 발현시킬 때에는 항체 L쇄로서는 호모이량화 항체와 동일하게 GpL16-k0가 삽입된 발현 벡터를 사용하고, 항체 H쇄의 하나로서 D356K의 개변을 도입한 GpH7-A5에 추가로 개변을 가한 서열을 삽입한 발현 벡터를 사용하며, 항체 H쇄의 다른 하나로서 K439E의 개변을 도입한 GpH7-B3에 추가로 개변을 도입한 서열을 삽입한 발현 벡터를 사용하여, 헤테로이량화 항체가 효율적으로 발현하도록 하였다. 발현 후에 정제해서 얻어진 항체는, 예를 들면 헤테로이량화 항체의 발현에 사용한 항체 H쇄에 대응하는 발현 벡터의 하나가 GpH7-H1, 다른 하나의 항체 H쇄가 GpH7-H2, 항체 L쇄에 대응하는 발현 벡터가 GpL16-k0인 경우, GpH7-H1/GpH7-H2/GpL16-k0로 표기한다. 이때 D356K, H435R의 개변이 도입되어 있는 서열을 H1, K439E의 개변이 도입되어 있는 서열을 H2에 대응시켰다. 예를 들면 호모이량화 항체의 발현에 사용한 항체 H쇄에 대응하는 발현 벡터가 GpH7-H1, 항체 L쇄에 대응하는 발현 벡터가 GpL16-k0인 호모이량화 항체의 경우, GpH7-H1/GpL16-k0로 표기한다. 조제한 항체를 사용하여 FcγR에 대한 결합활성을 참고 실시예 2에 기재한 방법으로 측정하였다.
먼저 헤테로이량화체를 형성, 정제하기 위해 GpH7-A5에 도입된 D356K 및 H435R, GpH7-B3에 도입된 K439E의 개변이 천연형 IgG와 비교하여 FcγR에 대한 결합활성에 영향을 미치는지 여부를 평가하였다. 대조로서 항체 H쇄로서 GpH7-G1d, 항체 L쇄로서 GpL16-k0를 삽입한 플라스미드를 사용하여, 참고 실시예 1의 방법에 따라 GpH7-G1d/GpL16-k0(서열번호：2, 5)를 발현, 정제하였다. 동일하게 하여 D356K 및 H435R이 양 H쇄에 도입된 호모이량화 항체 GpH7-A5/GpL16-k0(서열번호：3, 5)를, K439E가 양 H쇄에 도입된 호모이량화 항체 GpH7-B3/GpL16-k0(서열번호：4, 5)를, D356K 및 H435R이 한쪽 H쇄에 도입되고 K439E가 다른 한쪽 H쇄에 도입된 헤테로이량화 항체 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0(서열번호：3, 4, 5)를 조제하였다. 참고 실시예 2의 방법에 따라 이들 항체와 각 FcγR에 대한 결합활성을 비교한 결과를 도 5에 정리하였다.
측정결과, GpH7-G1d/GpL16-k0와 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0를 비교하면 양자간에 각 FcγR에 대한 결합활성에 커다란 변화는 관찰되지 않았다. 또한 GpH7-A5/GpL16-k0 및 GpH7-B3/GpL16-k0는 GpH7-G1d/GpL16-k0와 비교하여 어느 FcγR에 대해서도 적어도 80% 정도의 결합활성을 유지하고 있었다. 이들 결과로부터 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0, GpH7-A5/GpL16-k0, GpH7-B3/GpL16-k0는 GpH7-G1d/GpL16-k0와 비교하여 FcγR에 대한 결합이 현저히 손상되어 있지 않아, 이들 항체의 각 H쇄에 대해 변이를 도입한 개변체의 각 FcγR에 대한 결합활성을 비교하는 것이 가능할 것으로 판단하였다.
다음으로 GpH7-A5에 G237A의 변이를 도입한 GpH7-A26(서열번호：6)을 참고 실시예 1의 방법에 따라 제작하였다. H쇄로서 GpH7-A26, GpH7-B3, L쇄로서 GpL16-k0를 사용하여, G237A가 한쪽 H쇄에만 도입된 헤테로이량화 항체 GpH7-A26/GpH7-B3/GpL16-k0(서열번호：6, 4, 5)를 참고 실시예 1의 방법에 따라 발현시켰다. 동일하게 하여 H쇄로서 GpH7-A26, L쇄로서 GpL16-k0를 사용하여, G237A가 양 H쇄에 도입된 호모이량화 항체 GpH7-A26/GpL16-k0(서열번호：6, 5)를 참고 실시예 1의 방법에 따라 발현시켰다. 이들을 참고 실시예 2의 방법에 따라 각 FcγR에 대한 결합활성을 평가하였다(도 6). 그 결과, 헤테로이량화 항체 GpH7-A26/GpH7-B3/GpL16-k0의 경우는, GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0보다도 FcγRIIa R, FcγRIIb에 대한 결합활성이 증강되었다. 그럼에도 불구하고, 동일한 개변을 양 H쇄에 가한 호모이량화 항체 GpH7-A26/GpL16-k0는 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0보다도 FcγRIIa R, FcγRIIb에 대한 결합활성이 감소되어 있었다. 이 사실로부터 G237A는 양 H쇄에 도입하면 FcγRIIa R, FcγRIIb에 대한 결합활성을 감소시킴에도 불구하고, 한쪽 H쇄에만 도입하면 FcγRIIa R, FcγRIIb에 대한 결합활성을 증강시키는 개변인 것이 명확해졌다.
다음으로 GpH7-A5에 G237L의 변이를 도입한 GpH7-A29(서열번호：7)를 참고 실시예 1의 방법에 따라 제작하였다. H쇄로서 GpH7-A29, GpH7-B3, L쇄로서 GpL16-k0를 사용하여, G237L이 한쪽 H쇄에만 도입된 헤테로이량화 항체 GpH7-A29/GpH7-B3/GpL16-k0(서열번호：7, 4, 5)를 참고 실시예 1의 방법에 따라 발현시켰다. 동일하게 하여 H쇄로서 GpH7-A29, L쇄로서 GpL16-k0를 사용하여, G237L이 양 H쇄에 도입된 호모이량화 항체 GpH7-A29/GpL16-k0(서열번호：7, 5)를 참고 실시예 1의 방법에 따라 발현시켰다. 참고 실시예 2의 방법에 따라 이들 항체와 각 FcγR에 대한 결합활성을 평가하였다(도 7). 헤테로이량화 항체 GpH7-A29/GpH7-B3/GpL16-k0의 경우는, GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0보다도 FcγRIIa R, FcγRIIb에 대한 결합활성이 증강되었다. 그럼에도 불구하고, 동일한 개변을 양 H쇄에 가한 호모이량화 항체 GpH7-A29/GpL16-k0는 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0보다도 FcγRIIa R, FcγRIIb에 대한 결합활성이 감소되어 있었다. 이 사실로부터 G237L은 양 H쇄에 도입하면 FcγRIIa R, FcγRIIb에 대한 결합활성을 감소시킴에도 불구하고, 한쪽 H쇄에만 도입하면 FcγRIIa R, FcγRIIb에 대한 결합활성을 증강시키는 효과가 있는 개변인 것이 명확해졌다.
다음으로 GpH7-A5에 L328E의 변이를 도입한 GpH7-A42(서열번호：8)를 참고 실시예 1의 방법에 따라 제작하였다. H쇄로서 GpH7-A42, GpH7-B3, L쇄로서 GpL16-k0를 사용하여, L328E가 한쪽 H쇄에만 도입된 헤테로이량화 항체 GpH7-A42/GpH7-B3/GpL16-k0(서열번호：8, 4, 5)를 참고 실시예 1의 방법에 따라 발현시켰다. 동일하게 하여 H쇄로서 GpH7-A42, L쇄로서 GpL16-k0를 사용하여, L328E가 양 H쇄에 도입된 호모이량화 항체 GpH7-A42/GpL16-k0(서열번호：8, 5)를 참고 실시예 1의 방법에 따라 발현시켰다. 이들을 참고 실시예 2의 방법에 따라 각 FcγR에 대한 결합활성을 평가하였다(도 8). 헤테로이량화 항체 GpH7-A42/GpH7-B3/GpL16-k0의 경우는, GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0보다도 FcγRIIa R, FcγRIIb에 대한 결합활성이 증강되었다. 한편으로 동일한 개변을 양 H쇄에 가한 호모이량화 항체 GpH7-A42/GpL16-k0의 경우는, FcγRIIa R에 대한 결합활성은 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0보다도 감소되어 있고, FcγRIIb에 대한 결합활성은 증강되어 있었으나, 그 증강 정도는 L328E를 한쪽 H쇄에만 도입한 GpH7-A42/GpH7-B3/GpL16-k0 쪽이 컸다. 이 사실로부터 L328E는 양 H쇄에 도입하기 보다도 한쪽 H쇄에만 도입한 쪽이 FcγRIIa R, FcγRIIb에 대한 결합활성을 증강시키는 효과가 높은 개변인 것이 명확해졌다.
다음으로 GpH7-A5에 L328D의 변이를 도입한 GpH7-A43(서열번호：9)을 참고 실시예 1의 방법에 따라 제작하였다. H쇄로서 GpH7-A43, GpH7-B3, L쇄로서 GpL16-k0를 사용하여, L328D가 한쪽 H쇄에만 도입된 헤테로이량화 항체 GpH7-A43/GpH7-B3/GpL16-k0(서열번호：9, 4, 5)를 참고 실시예 1의 방법에 따라 발현시켰다. 동일하게 하여 H쇄로서 GpH7-A43, L쇄로서 GpL16-k0를 사용하여, L328D가 양 H쇄에 도입된 호모이량화 항체 GpH7-A43/GpL16-k0(서열번호：9, 5)를 참고 실시예 1의 방법에 따라 발현시켰다. 이들을 참고 실시예 2의 방법에 따라 각 FcγR에 대한 결합활성을 평가하였다(도 9). 헤테로이량화 항체 GpH7-A43/GpH7-B3/GpL16-k0의 경우는, GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0보다도 FcγRIIa R, FcγRIIb에 대한 결합활성이 증강되었다. 한편으로 동일한 개변을 양 H쇄에 가한 호모이량화 항체 GpH7-A43/GpL16-k0의 경우는, FcγRIIa R에 대한 결합활성은 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0보다도 감소되어 있고, FcγRIIb에 대한 결합활성은 증강되어 있었으나, 그 증강 정도는 L328D를 한쪽 H쇄에만 도입한 GpH7-A43/GpH7-B3/GpL16-k0 쪽이 컸다. 이 사실로부터 L328D는 양 H쇄에 도입하기 보다도 한쪽 H쇄에만 도입한 쪽이 FcγRIIa R, FcγRIIb에 대한 결합활성을 증강시키는 효과가 있는 개변인 것이 명확해졌다.
다음으로 GpH7-B3에 L234E의 변이를 도입한 GpH7-B16(서열번호：10)을 참고 실시예 1의 방법에 따라 제작하였다. H쇄로서 GpH7-A5, GpH7-B16, L쇄로서 GpL16-k0를 사용하여, L234E가 한쪽 H쇄에만 도입된 헤테로이량화 항체 GpH7-A5/GpH7-B16/GpL16-k0(서열번호：3, 10, 5)를 참고 실시예 1의 방법에 따라 발현시켰다. 동일하게 하여 H쇄로서 GpH7-B16, L쇄로서 GpL16-k0를 사용하여, L234E가 양 H쇄에 도입된 호모이량화 항체 GpH7-B16/GpL16-k0(서열번호：10, 5)를 참고 실시예 1의 방법에 따라 발현시켰다. 이들을 참고 실시예 2의 방법에 따라 각 FcγR에 대한 결합활성을 평가하였다(도 10). 헤테로이량화 항체 GpH7-A5/GpH7-B16/GpL16-k0의 경우는, GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0보다도 FcγRIIIa F, FcγRIIb에 대한 결합활성이 증강되었다. 그럼에도 불구하고, 동일한 개변을 양 H쇄에 가한 호모이량화 항체 GpH7-B16/GpL16-k0는 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0보다도 FcγRIIIa F, FcγRIIb에 대한 결합활성이 감소되어 있었다. 이 사실로부터 L234E는 양 H쇄에 도입하면 FcγRIIIa F, FcγRIIb에 대한 결합을 감소시키나, 한쪽 H쇄에만 도입하면 FcγRIIIa F, FcγRIIb에 대한 결합활성을 증강시키는 효과가 있는 개변인 것이 명확해졌다.
다음으로 GpH7-B3에 L234D의 변이를 도입한 GpH7-B17(서열번호：11)을 참고 실시예 1의 방법에 따라 제작하였다. H쇄로서 GpH7-A5, GpH7-B17, L쇄로서 GpL16-k0를 사용하여, L234D가 한쪽 H쇄에만 도입된 헤테로이량화 항체 GpH7-A5/GpH7-B17/GpL16-k0(서열번호：3, 11, 5)를 참고 실시예 1의 방법에 따라 발현시켰다. 동일하게 하여 H쇄로서 GpH7-B17, L쇄로서 GpL16-k0를 사용하여, L234D가 양 H쇄에 도입된 호모이량화 항체 GpH7-B17/GpL16-k0(서열번호：11, 5)를 참고 실시예 1의 방법에 따라 발현시켰다. 이들을 참고 실시예 2의 방법에 따라 각 FcγR에 대한 결합활성을 평가하였다(도 11). 헤테로이량화 항체 GpH7-A5/GpH7-B17/GpL16-k0의 경우는, GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0보다도 FcγRIIa R, FcγRIIb에 대한 결합활성이 증강되었다. 그럼에도 불구하고, 동일한 개변을 양 H쇄에 가한 호모이량화 항체 GpH7-B17/GpL16-k0는 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0보다도 FcγRIIa R, FcγRIIb에 대한 결합활성이 감소되어 있었다. 이 사실로부터 L234D는 양 H쇄에 도입하면 FcγRIIa R, FcγRIIb에 대한 결합활성을 감소시키나, 한쪽 H쇄에만 도입하면 FcγRIIa R, FcγRIIb에 대한 결합활성을 증강시키는 효과가 있는 개변인 것이 명확해졌다.
이들 결과로부터 2개의 H쇄에 동일한 개변을 도입한 호모이량화 항체에서는 FcγR에 대한 결합활성이 감소되는 경우라도, 항체의 한쪽 H쇄에만 그 개변을 도입한 헤테로이량화 항체를 제작함으로써, FcγR에 대한 결합활성을 증강시키는 것이 가능한 것이 명확해졌다.
즉 이들 결과로부터, 항체의 각 H쇄에 상이한 개변을 가한 헤테로이량화 항체를 사용함으로써, 종래의 방법이었던 2개의 H쇄에 동일한 개변을 도입하는 호모이량화 항체와 비교하여 보다 우수한 항체의 Fc영역의 FcγR에 대한 결합특성을 부여하는 것이 가능한 것이 명확해졌다.
〔실시예 3〕헤테로이량화 항체에 의한 FcγR 인식방향의 확인
실시예 2에서 나타낸 바와 같이 헤테로이량화 항체를 사용함으로써, 호모이량화 항체보다도 FcγR에 대한 결합활성을 증강시킬 수 있는 것이 명확해졌다. 실시예 2의 개변을 항체의 양 H쇄에 도입한 경우에는 오히려 천연형 항체보다도 FcγR에 대한 결합활성이 감소되어 있었다. 이 결과로부터는 헤테로이량화 항체에 도입한 개변이 한쪽 H쇄에 도입되었을 때는 FcγR에 대한 결합활성을 증강시키나, 양쇄에 도입한 경우에는 FcγR이 결합한 상태로 한쪽 사슬에서는 개변 후의 잔기가 결합을 증강시키나, 다른 한쪽 사슬에서는 FcγR과의 상호작용을 저해하고 있는 것으로 생각되었다. 즉 도 3의 FcγR이 도면의 안쪽으로부터 결합하고 있는 상태를 「X방향으로부터의 결합」이라 부르고, 그와는 반대로 도면의 바깥쪽으로부터의 결합을 「Y방향으로부터의 결합」이라 부르면, 호모이량화 항체는 X방향, Y방향의 양방향으로부터의 FcγR에 대한 결합활성을 동등하게 변화시키나, 헤테로이량화 항체는 X방향, Y방향 중 어느 일방향으로부터의 결합에 치우쳐서 FcγR에 대한 결합활성을 변화시키고 있는 것으로 생각되었다.
이 가설을 실험에 의해 검증하기 위해, FcγR과의 결합을 주로 X방향, Y방향 중 어느 일방향으로부터만 저해하는 개변을 발견하여, H쇄의 어느 한쪽에 여기서 발견한 개변을 도입하고, 동일한 H쇄, 또는 상이한 다른 한쪽 H쇄에 FcγR에 대한 결합활성을 증강시키는 개변을 도입함으로써, FcγR에 대한 결합활성이 어떻게 저해되는지를 검증하였다. 이 개변과 조합시키는 방법을 검토하였다. 항체와 FcγR의 결합에 관여하고 있으나, 한쪽 H쇄에서만 결합에 관여하고 있는 개변을 입체구조 정보로부터 탐색하여 P329를 그 후보로서 발견하였다. HA쇄의 P329는 FcγRIII의 87번째와 110번째의 Trp와 소수 코어를 형성하고 있는데, HB쇄의 P329는 FcγRIII와는 직접 상호작용하고 있지 않다(Nature, 372:379 - 383, 1994)(도 12). 예를 들면 HA쇄의 P329를 전하를 갖는 잔기로 치환하면 이 소수 코어가 붕괴되어 도 12에 표시되어 있는 X방향으로부터의 결합은 저해될 것으로 생각되나, 반대인 Y방향으로부터의 결합에 관여하고 있지 않은 HB쇄의 P329는 치환되지 않고 그대로이기 때문에, Y방향으로부터의 결합에는 커다란 영향을 미치지 않을 것이 예상되었다.
GpH7-B3의 P329에 전하를 갖는 R, K, D, E의 변이를 각각 도입한 서열 GpH7-B12, GpH7-B13, GpH7-B14, GpH7-B15(서열번호：12~15)를 삽입한 발현 벡터를 참고 실시예 1에 기재한 방법으로 제작하였다. 제작한 발현 벡터는 각각 GpH7-A5, GpL16-k0와 조합시켜서 헤테로이량화 항체로서 발현하거나, 다른 H쇄와는 조합하지 않고 GpL16-k0와만 조합하여 호모이량화 항체로 하고, 참고 실시예 1의 방법에 따라 발현시켜, 정제하였다. 정제하여 얻어진 항체는 헤테로이량화 항체로서는 GpH7-A5/GpH7-B12/GpL16-k0, GpH7-A5/GpH7-B13/GpL16-k0, GpH7-A5/GpH7-B14/GpL16-k0, GpH7-A5/GpH7-B15/GpL16-k0이고, 호모이량화 항체로서는 GpH7-B12/GpL16-k0, GpH7-B13/GpL16-k0, GpH7-B14/GpL16-k0, GpH7-B15/GpL16-k0였다. 조제한 항체를 사용하여 각 FcγR에 대한 결합을 참고 실시예 2에 기재한 방법으로 측정하고, 그 결과를 도 13에 나타내었다.
P329R, P329K를 도입한 헤테로이량화 항체 GpH7-A5/GpH7-B12/GpL16-k0, GpH7-A5/GpH7-B13/GpL16-k0의 FcγR에 대한 결합활성은 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0의 각 FcγR에 대한 결합활성의 1/5~1/4 정도가 되고, 호모이량화 항체 GpH7-B12/GpL16-k0, GpH7-B13/GpL16-k0의 경우는 FcγR과의 결합이 관찰되지 않았다. 또한 P329D, P329E를 도입한 헤테로이량화 항체 GpH7-A5/GpH7-B14/GpL16-k0, GpH7-A5/GpH7-B15/GpL16-k0의 FcγR에 대한 결합활성은 FcγRIa에 대해서는 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0의 각 FcγR에 대한 결합활성의 1/5~1/4 정도가 되고, FcγRIa 이외는 1/2 이상의 결합활성을 유지하고 있었다. 호모이량화 항체 GpH7-B14/GpL16-k0, GpH7-B15/GpL16-k0의 경우는 FcγRIa에 대한 결합활성만 잔존되어 있었으나, GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0의 FcγRIa에 대한 결합활성의 1/5 이하였다. GpH7-B12, GpH7-B13에는 염기성 잔기를, GpH7-B14, GpH7-B15에는 산성 잔기를 도입하고 있는 것으로부터, P329는 Arg, Lys 등의 염기성 잔기로 치환한 쪽이 FcγR에 대한 결합활성을 보다 강력하게 저해하는 것으로 생각되었다. 금번 한쪽 H쇄에만 개변을 도입한 경우에는 FcγR에 대한 결합활성이 잔존되어 있으나, 양쇄에 동일한 개변을 도입하면 거의 결합이 관찰되지 않게 되었다고 하는 결과는, 한쪽 H쇄의 P329를 친수성 잔기로 치환하면 일방향으로부터의 결합은 저해되나, 다른 일방향으로부터의 결합은 유지된다는 가설을 지지하는 것으로 생각되었다.
다음으로 실시예 2에서 발견한 헤테로이량화함으로써 FcγR에 대한 결합활성을 증강시키는 개변 G237A, L234D가 FcγR과의 상호작용을 일방향에 치우쳐서 증강시키고 있는지를, 각 개변과 P329R의 개변을 조합한 개변체를 제작하여, 각 개변체의 각 FcγR에 대한 결합활성을 비교함으로써 검증하였다. K439E와 동일한 H쇄에 P329R의 변이가 도입되도록 GpH7-B3에 P329R의 변이를 도입한 GpH7-B12(서열번호：12), D356K, H435R과 동일한 H쇄에 P329R의 변이가 도입되도록 GpH7-A5에 P329R을 도입한 GpH7-A48(서열번호：16), GpH7-A5에 G237A와 P329R의 변이를 도입한 서열 GpH7-A45(서열번호：17), GpH7-B5에 L234D와 P329R의 변이를 도입한 GpH7-B41(서열번호：18)을 삽입한 발현 벡터를 참고 실시예 1에 기재한 방법으로 제작하였다. 참고 실시예 1의 방법에 따라 이들 발현 벡터와 항체 L쇄에 대응하는 발현 벡터인 GpL16-k0를 사용하여 G237A 또는 L234D와 P329R이 어느 한쪽 H쇄에 도입되도록 발현시켰다(표 1).
Figure pct00001
샘플 항목에는 항체의 명칭, H1, H2의 항목에는 각 항체의 H쇄 불변영역의 명칭, 변이개소의 항목에는 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0와 비교하여 상이한 변이(특히 변이가 없는 경우에는 「-」)를 표기하였다. 각 항체의 H쇄, L쇄에 대응하는 아미노산 서열의 서열번호를 병기하였다.
G237A와 P329R의 조합 평가에는, 개변을 도입하는 폴리펩티드로서 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0, P329R을 한쪽 H쇄에 도입한 개변체로서 GpH7-A5/GpH7-B12/GpL16-k0 및 GpH7-A48/GpH7-B3/GpL16-k0, P329R과 동일한 H쇄에 G237A를 도입한 개변체로서 GpH7-A45/GpH7-B3/GpL16-k0, P329R과 상이한 H쇄에 G237A를 도입한 개변체로서 GpH7-A26/GpH7-B12/GpL16-k0를 사용하여 참고 실시예 2의 방법에 따라 각 FcγR로의 결합활성을 비교하였다(도 14).
P329R을 한쪽 H쇄에 도입한 GpH7-A5/GpH7-B12/GpL16-k0와 GpH7-A48/GpH7-B3/GpL16-k0를 비교하면, FcγR에 대한 결합 패턴에 커다란 차이는 관찰되지 않았다. 이 사실로부터 P329R은 D356K, H435R이 도입된 H쇄에 도입되어도, K439E가 도입된 H쇄에 도입되어도, FcγR에 대한 결합에는 영향을 미치지 않는 것으로 생각되었다.
다음으로 G237A를 한쪽 H쇄에만 도입한 헤테로이량화 항체인 GpH7-A26/GpH7-B3/GpL16-k0는 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0보다도 FcγRIIa R, IIb에 대한 결합이 증강되어 있었다. 그러나 P329R을 한쪽 H쇄에만 도입한 GpH7-A5/GpH7-B12/GpL16-k0와 비교하여, G237A를 다른 한쪽 H쇄에 도입한 GpH7-A26/GpH7-B12/GpL16-k0의 경우는 FcγR에 대한 결합이 감소되어, G237A의 FcγRIIa R, IIb에 대한 결합 증강의 효과가 관찰되지 않았다. 그 한편으로 P329R을 한쪽 H쇄에만 도입한 GpH7-A48/GpH7-B3/GpL16-k0와 비교하여, G237A를 P329R과 동일한 H쇄에 도입한 GpH7-A45/GpH7-B3/GpL16-k0의 경우는 FcγRIIa R, IIb에 대한 결합이 증강되어 있어, G237A의 FcγRIIa R, IIb에 대한 증강 효과가 관찰되었다. 이 결과로부터 G237A는 P329R을 도입한 사슬과 상이한 사슬에 도입하면 항체와 FcγR의 결합이 강력하게 저해되었기 때문에, GpH7-A5에 도입한 G237A와 GpH7-B3에 도입한 P329R을 조합하면 항체와 FcγR의 결합을 동일한 방향에서 인식하는 것이 나타내어졌다.
L234D의 개변에 대해서도 동일한 평가를 실시하였다(도 15). L234D를 한쪽 H쇄에만 도입한 헤테로이량화 항체인 GpH7-A5/GpH7-B17/GpL16-k0는 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0보다도 FcγRIIa R, IIb에 대한 결합이 증강되어 있었다. 그러나 P329R만을 한쪽 H쇄에 도입한 GpH7-A48/GpH7-B3/GpL16-k0와 비교하여, L234D를 다른 한쪽 H쇄에 도입한 GpH7-A48/GpH7-B17/GpL16-k0의 경우는 FcγR Ia 이외의 FcγR에 대한 결합이 감소되어, L234D의 FcγRIIa R, IIb에 대한 결합 증강 효과가 관찰되지 않았다. 그 한편으로 P329R만을 한쪽 H쇄에 도입한 GpH7-A5/GpH7-B12/GpL16-k0와 비교하여, L234D를 P329R과 동일한 H쇄에 도입한 GpH7-A5/GpH7-B41/GpL16-k0의 경우는 FcγRIIa R, IIb에 대한 결합이 증강되어 있어, L234D의 FcγRIIa R, IIb에 대한 증강 효과가 관찰되었다. 이 결과로부터 L234D는 P329R을 도입한 사슬과 상이한 사슬에 도입하면 항체와 FcγR의 결합이 강력하게 저해되었기 때문에, GpH7-B3에 도입한 L234D와 GpH7-A5에 도입한 P329R을 조합하면 항체와 FcγR의 결합을 동일한 방향에서 인식하는 것이 나타내어졌다.
즉 G237A 및 L234D 모두 P329R과는 항체와 FcγR에 대한 결합활성을 증강시키는(/감소시키는) 방향이 동일하였다.
이와 같이 헤테로 개변은 FcγR에 대한 결합을 X방향, Y방향 중 어느 일방향에 치우쳐서 증강시키고 있었다. 이 결과로부터 헤테로이량화 항체는 FcγR과의 상호작용을 비대칭으로 증강시키고 있는 것이 나타내어졌다.
〔실시예 4〕헤테로이량화 항체와 호모이량화 항체의 FcγR에 대한 결합 비교
실시예 2로부터 항체의 2개의 H쇄에 상이한 개변을 가함으로써 2개의 H쇄에 동일한 개변을 가하는 것보다도 항체의 Fc영역을 매개로 한 FcγR에 대한 결합을 증강시키는 것이 가능한 것을 발견하였다. 이에 이러한 성질을 갖는 개변을 발견하기 위해 아래의 실험을 행하였다.
실시예 2에서 제작한 GpH7-B3(서열번호：4)에 있어서, FcγR과의 결합에 관여하는 것으로 생각되는 아미노산과 그 주변의 아미노산, 구체적으로는 EU 넘버링 234번째의 Leu, EU 넘버링 235번째의 Leu, EU 넘버링 236번째의 Gly, EU 넘버링 237번째의 Gly, EU 넘버링 238번째의 Pro, EU 넘버링 329번째의 Ser, EU 넘버링 265번째의 Asp, EU 넘버링 266번째의 Val, EU 넘버링 267번째의 Ser, EU 넘버링 268번째의 His, EU 넘버링 269번째의 Glu, EU 넘버링 270번째의 Asp, EU 넘버링 271번째의 Pro, EU 넘버링 295번째의 Gln, EU 넘버링 296번째의 Tyr, EU 넘버링 298번째의 Ser, EU 넘버링 300번째의 Tyr, EU 넘버링 324번째의 Ser, EU 넘버링 325번째의 Asn, EU 넘버링 326번째의 Lys, EU 넘버링 327번째의 Ala, EU 넘버링 328번째의 Leu, EU 넘버링 329번째의 Pro, EU 넘버링 330번째의 Ala, EU 넘버링 331번째의 Pro, EU 넘버링 332번째의 Ile, EU 넘버링 333번째의 Glu, EU 넘버링 334번째의 Lys, EU 넘버링 335번째의 Thr, EU 넘버링 336번째의 Ile, EU 넘버링 337번째의 Ser의 부분을 원래의 아미노산과 시스테인을 제외한 18종류의 아미노산으로 각각 치환한 GpH7-B3 variant를 제작하였다. 각 GpH7-B3 variant의 명칭은 A_B로 표현하여, A에는 개변하는 잔기의 EU 넘버링, 아미노산의 종류의 정보를 1문자 표기로 기재하고, B에는 치환 후의 아미노산의 정보를 나타내었다. 예를 들면 EU 넘버링 234번째의 Leu를 Gly로 한 B3_variant는 L234_01G로 명명된다. 또한 치환 후의 아미노산의 정보에 관해서는 1문자 표기 앞에 그 아미노산 특유의 수치를 편의상 기재하였다. 구체적으로는, Gly의 경우는 01G, Ala의 경우는 02A, Val의 경우는 03V, Phe의 경우는 04F, Pro의 경우는 05P, Met의 경우는 06M, Ile의 경우는 07I, Leu의 경우는 08L, Asp의 경우는 09D, Glu의 경우는 10E, Lys의 경우는 11K, Arg의 경우는 12R, Ser의 경우는 13S, Thr의 경우는 14T, Tyr의 경우는 15Y, His의 경우는 16H, Asn의 경우는 18N, Gln의 경우는 19Q, Trp의 경우는 20W라는 기호를 사용하였다.
2개의 H쇄에 변이를 도입한 호모이량화 항체는 아래의 순서로 조제하였다. 항체의 발현에는 H쇄로서 GpH7-B3 variant, L쇄로서 GpL16-k0(서열번호：5)를 사용하여 참고 실시예 1의 방법에 따라 항체를 조제하였다. 이와 같이 하여 조제한 양 H쇄에 변이를 도입한 호모이량화 항체를 Ho Ab라 부른다.
한쪽 H쇄에만 변이를 도입한 헤테로이량화 항체는 아래의 순서로 조제하였다. 항체의 발현에는 H쇄로서 GpH7-B3 variant, GpH7-A5(서열번호：3), L쇄로서 GpL16-k0(서열번호：5)를 사용하여 참고 실시예 1의 방법에 따라 항체를 조제하였다. 이와 같이 하여 조제한 한쪽 H쇄에만 변이를 도입한 헤테로이량화 항체를 He Ab라 부른다.
호모이량화 항체의 대조로서 H쇄에 GpH7-B3(서열번호：4), L쇄에 GpL16-k0(서열번호：5)를 사용하여 조제한 항체 GpH7-B3/GpL16-k0를 참고 실시예 1의 방법에 따라 조제하였다. 이 호모이량화 항체의 대조가 되는 항체를 HoCon Ab라 부른다. 실시예 2에서 검토한 바와 같이, HoCon Ab는 천연형 IgG1과 비교하여 각 FcγR에 대한 결합활성은 크게 변화되지 않았다.
헤테로이량화 항체의 대조로서 H쇄에 GpH7-A5(서열번호：3), GpH7-B3(서열번호：4), L쇄에 GpL16-k0(서열번호：5)를 사용하여 조제한 항체 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0를 참고 실시예 1의 방법에 따라 조제하였다. 이 헤테로이량화 항체의 대조가 되는 항체를 HeCon Ab라 부른다. HeCon Ab는 실시예 2에서 검토한 바와 같이, 천연형 IgG1과 비교하여 각 FcγR에 대한 결합은 크게 변화되지 않았다.
조제한 Ho Ab, He Ab, HeCon Ab 및 HoCon Ab를 사용하여 FcγRIa, FcγRIIa(R), FcγRIIa(H), FcγRIIb, FcγRIIIa에 대한 결합활성을 참고 실시예 2의 방법에 따라 측정하였다. 각각의 FcγR의 측정결과에 대해서 아래의 방법에 따라 도면을 제작하였다. He Ab의 각 FcγR에 대한 결합활성을 HeCon Ab의 각 FcγR에 대한 결합활성으로 나누고, 100을 곱한 값을 He/Con으로 하였다. Ho Ab의 각 FcγR에 대한 결합활성을 HoCon Ab의 각 FcγR에 대한 결합활성으로 나누고, 100을 곱한 값을 Ho/Con으로 하였다. 목적의 개변을 포함하는 GpH7-B3 variant를 사용하여 제작한 호모이량화 항체, 헤테로이량화 항체에 대해서 가로축에 Ho/Con, 세로축에 He/Con의 값을 취하였다. FcγRIa, FcγRIIa(R), FcγRIIa(H), FcγRIIb, FcγRIIIa의 각각의 FcγR에 대한 결과를 도 16, 도 17, 도 18, 도 19, 도 20에 정리하였다. 각 개변에 대해서 He/Con 및 Ho/Con의 값으로 다음과 같이 해석할 수 있다.
1. He/Con 및 Ho/Con의 값이 100인 경우：그 변이를 도입한 GpH7-B3 variant를 포함하는 헤테로이량화 항체 He Ab, 호모이량화 항체 Ho Ab의 FcγR에 대한 결합활성이 각각 헤테로이량화 항체의 대조, 호모이량화 항체의 대조의 FcγR에 대한 결합활성과 동등한 것을 나타낸다.
2. He/Con, Ho/Con의 값이 100 이하인 경우：그 변이를 도입한 GpH7-B3 variant를 포함하는 헤테로이량화 항체 He Ab, 호모이량화 항체 Ho Ab의 FcγR에 대한 결합활성이 각각 헤테로이량화 항체의 대조, 호모이량화 항체의 대조의 FcγR에 대한 결합활성보다 약한 것을 나타낸다.
3. He/Con, Ho/Con의 값이 100 이상을 나타내는 경우：그 변이를 도입한 GpH7-B3 variant를 포함하는 헤테로이량화 항체 He Ab, 호모이량화 항체 Ho Ab의 FcγR에 대한 결합활성이 각각 헤테로이량화 항체의 대조, 호모이량화 항체의 대조의 FcγR에 대한 결합활성보다 강한 것을 나타낸다.
4. He/Con의 값이 Ho/Con의 값보다 큰 경우：그 변이를 도입한 GpH7-B3 variant를 포함하는 헤테로이량화 항체 He Ab의 FcγR에 대한 결합활성이 호모이량화 항체 Ho Ab의 FcγR에 대한 결합활성보다 강한 것을 나타낸다.
5. He/Con의 값이 Ho/Con의 값보다 작은 경우：변이를 도입한 GpH7-B3 variant를 포함하는 헤테로이량화 항체 He Ab의 FcγR에 대한 결합활성이 변이를 도입한 GpH7-B3 variant를 포함하는 호모이량화 항체 Ho Ab의 FcγR에 대한 결합활성보다 약한 것을 나타낸다.
이 1~5의 해석을 토대로 도 16~도 20의 각 도면의 점을 도 21과 같이 분류할 수 있다.
그 개변이 도 21의 i의 영역에 존재한 경우는 그 개변은 2개의 H쇄에 도입된 호모이량화 항체에 있어서는 FcγR에 대한 결합을 감소시키나, 동일한 개변이 한쪽 H쇄에만 도입된 헤테로이량화 항체에 있어서는 FcγR에 대한 결합을 증강시키는 효과가 있는 것을 의미한다. 즉 그 개변은 헤테로이량화 항체에서만 FcγR에 대한 결합을 증강시키는 개변이다. i의 영역에 포함되는 개변을 각 FcγR에 대해서 표 2(표 2-1~2-3), 표 3(표 3-1 및 3-2), 표 4, 표 5, 표 6에 정리하였다.
그 개변이 도 21의 ii의 영역에 존재한 경우는 그 점에 대응하는 개변은 양 H쇄에 도입된 호모이량화 항체, 동일한 개변이 한쪽 H쇄에만 도입된 헤테로이량화 항체 중 어느 것에 있어서도 FcγR에 대한 결합을 증강시키나, 그 결합 증강 효과는 헤테로이량화 항체에 있어서가 큰 것을 의미한다. 즉 이 영역 내의 개변은 호모이량화 항체보다도 헤테로이량화 항체에 있어서가 FcγR에 대한 결합 증강 효과가 높은 개변이다. ii의 영역에 포함되는 개변을 각 FcγR에 대해서 표 2(표 2-1~2-3), 표 3(표 3-1 및 3-2), 표 4, 표 5, 표 6에 정리하였다.
또한 각 표에 있어서 FcγRIa, FcγRIIa H, FcγRIIa R, FcγRIIb, FcγRIIIa에 대한 결합활성에 관여하는 He/Con을 각각 He/Con _1a, He/Con _2aH, He/Con _2aR, He/Con _2b, He/Con_3a로 하고, FcγRIa, FcγRIIa H, FcγRIIa R, FcγRIIb, FcγRIIIa에 대한 결합활성에 관여하는 Ho/Con을 각각 Ho/Con _1a, Ho/Con _2aH, Ho/Con _2aR, Ho/Con _2b, Ho/Con_3a로 하였다.
그 개변이 도 21의 iii의 영역에 존재한 경우는 그 점에 대응하는 개변은 양 H쇄에 도입된 호모이량화 항체, 동일한 개변이 한쪽 H쇄에만 도입된 헤테로이량화 항체 중 어느 것에 있어서도 FcγR에 대한 결합을 증강시키나, 그 결합 증강 효과가 호모이량화 항체에 있어서가 큰 것을 의미한다. 즉 이 영역 내의 개변은 헤테로이량화 항체보다도 호모이량화 항체에 있어서가 FcγR에 대한 결합 증강 효과가 높은 개변이다.
또한 아래의 표에 있어서 아미노산의 개변을 나타내는 경우에는 A327_03V와 같이 나타낸다. 처음의 알파벳(A327_03V의 A에 해당)은 개변 전의 아미노산 잔기를 1문자 표기로 나타낸 경우의 알파벳을 의미한다. 그것에 계속되는 숫자(A327_03V의 327에 해당)는 그 개변 개소의 EU 넘버링을 의미한다. 마지막의 숫자＋알파벳(A327_03V의 03V에 해당)은 개변 후의 아미노산 잔기를 1문자 표기로 나타낸 경우의 알파벳(아미노산의 종류를 나타내는 숫자＋알파벳)을 의미한다. 각각 01G(Gly), 02A(Ala), 03V(Val), 04F(Phe), 05P(Pro), 06M(Met), 07I(Ile), 08L(Leu), 09D(Asp), 10E(Glu), 11K(Lys), 12R(Arg), 13S(Ser), 14T(Thr), 15Y(Tyr), 16H(His), 17C(Cys), 18N(Asn), 19Q(Gln), 20W(Trp)로 표시된다. 이상의 사실로부터, 예를 들면 「A327_03V」는 「EU 넘버링 327번째의 아미노산 A의 V로의 치환」을 의미한다.
[표 2-1]
Figure pct00002
[표 2-2]
Figure pct00003
[표 2-3]
Figure pct00004
FcγRIa에 대해서 i, ii의 영역(도 21)에 포함되는 개변을 나타낸다.
[표 3-1]
Figure pct00005
[표 3-2]
Figure pct00006
FcγRIIa R에 대해서 i, ii의 영역(도 21)에 포함되는 개변을 나타낸다.
Figure pct00007
FcγRIIa H에 대해서 i, ii의 영역(도 21)에 포함되는 개변을 나타낸다.
Figure pct00008
FcγRIIb에 대해서 i, ii의 영역(도 21)에 포함되는 개변을 나타낸다.
Figure pct00009
FcγRIIIa에 대해서 i, ii의 영역(도 21)에 포함되는 개변을 나타낸다.
본 실시예에서 발견된 개변은 실시예 2에 더하여 실시예 1에 나타낸 헤테로이량화 항체에 의한 FcγR 인식능 향상의 콘셉트를 지지하는 것으로 생각되었다. 도 21의 i의 영역에 있는 개변은 종래와 같이 2개의 H쇄 양쪽에 도입하였을 때에는 FcγR에 대한 결합활성을 감소시키는 개변으로서 생각되고, 결합을 증강시키는 개변으로서는 인식되어 오지 않았다. 그러나 2개의 H쇄 한쪽에만 도입함으로써 이러한 개변에 대해서도 FcγR에 대한 결합활성을 향상시키는 개변으로서 발견하는 것에 성공하였다.
〔실시예 5〕헤테로이량화 항체의 개변의 조합의 결정방법
실시예 3에서 나타낸 바와 같이 헤테로이량화 항체에 있어서 어떤 개변이 FcγR에 대한 결합에 미치는 효과는 개변에 따라 방향이 상이하다. 그 때문에 헤테로이량화 항체에 있어서 복수의 개변을 조합시켜서 FcγR에 대한 결합을 한층 증강 또는 감소시키고자 하는 경우에는, 각 개변의 FcγR과의 결합에 미치는 효과의 방향을 맞출 필요가 있다. 만일 2개의 개변이 항체의 FcγR에 대한 결합에 미치는 증강 효과의 방향이 상이한 상태로 각 개변을 도입한 경우 각 개변의 효과가 서로 상쇄되어, FcγR에 대한 결합 증강 개변을 조합시켰음에도 불구하고 결합 증강 효과가 관찰되지 않을 것으로 생각된다. 그러나 통상은 각 개변을 어느 쪽 H쇄에 도입해야 하는지를 사전에 구분할 방법이 없기 때문에, 적절한 조합방법을 발견하기 위해서는 목적의 개변을 동일한 H쇄 또는 상이한 H쇄에 도입한 항체를 조제하여, FcγR에 대한 결합활성을 비교해야만 한다. 예를 들면 호모이량화 항체의 경우, 3종류의 상이한 개변을 모두 도입할 때에는 양 H쇄에 각 개변을 도입한 항체를 1종류 제작하면 된다. 그러나 헤테로이량화 항체의 경우, 각 개변을 어느 한쪽 H쇄에 도입할지를 판단할 필요가 있다. 그 경우, 도 22에 나타낸 바와 같이 최대 4가지의 조합을 시도할 필요가 있다. 즉 개변의 조합의 검토를 할 때에 제작해야 하는 개변체의 수가 많아져 비효율적이다. 이에 항체와 FcγR의 결합을 일방향으부터만 저해하는 P329R을 도입을 검토하는 개변과 조합함으로써 그 개변이 항체와 FcγR의 결합에 영향을 미치는 방향을 발견하는 방법을 검토하였다.
실시예 4에서 발견된 헤테로이량화 항체에 있어서 FcγRIIIa에 대한 결합을 증강시키는 개변인 L234Y, G236W, S298A를 각각 P329R이 도입된 것과 동일한 H쇄 또는 상이한 H쇄에 도입한 경우에, FcγRIIIa에 대한 결합이 어떻게 변화되는지를 평가하였다. 먼저 H쇄로서 P329R 개변을 도입한 GpH7-B12에 L234Y, G236W, S298A를 각각 도입한 GpH7-HA5(서열번호：19), GpH7-HA6(서열번호：20), GpH7-HA11(서열번호：21), 다른 하나의 H쇄로서 GpH7-A5, L쇄로서 GpL16-k0를 사용하여 참고 실시예 1의 방법에 따라 목적의 개변체를 발현, 조제하였다. 또한 H쇄로서 L234Y, G236W, S298A를 각각 GpH7-B3에 도입한 GpH7-B3-01-15Y(서열번호：22), GpH7-B3-03-20W(서열번호：23), GpH7-B3-15-02A(서열번호：24), 다른 하나의 H쇄로서 GpH7-A5에 P329R을 도입한 GpH7-A48(서열번호：16), L쇄로서 GpL16-k0를 사용하여, 참고 실시예 1의 방법에 따라 목적의 항체를 발현, 조제하였다. 여기서 얻어진 항체를 각각 GpH7-A5/GpH7-HA5/GpL16-k0(서열번호：3, 19, 5), GpH7-A5/GpH7-HA6/GpL16-k0(서열번호：3, 20, 5), GpH7-A5/GpH7-HA11/GpL16-k0(서열번호：3, 21, 5), GpH7-A48/GpH7-B3-01-15Y/GpL16-k0(서열번호：16, 22, 5), GpH7-A48/GpH7-B3-03-20W/GpL16-k0(서열번호：16, 23, 5), GpH7-A48/GpH7-B3-15-02A/GpL16-k0(서열번호：16, 24, 5)로 하였다. 참고 실시예 2의 방법에 따라 각 개변체의 FcγRIIIa에 대한 결합활성을 비교하여 L234Y, G236W, S298A의 P329R과의 조합 효과를 표 7에 정리하였다.
Figure pct00010
샘플의 항목에는 항체의 명칭, H1, H2의 항목에는 각 항체의 H쇄 불변영역의 명칭, 변이개소의 항목에는 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0와 비교하여 상이한 변이(특히 변이가 없는 경우에는 「-」), FcγRIIIa에 대한 결합활성은 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0(서열번호：3, 4, 5)의 FcγRIIIa에 대한 결합을 100으로 하였을 때의 상대적인 결합활성을 표기하였다. 각 항체의 H쇄, L쇄에 대응하는 아미노산 서열의 서열번호를 병기하였다.
이 결과로부터 각 개변에 대해서 각 개변을 P329R과 동일한 H쇄에 도입한 경우 및 상이한 H쇄에 도입한 경우에 대해서, FcγRIIIa에 대한 결합활성을 비교하였다. L234Y의 경우, 전자에 대응하는 GpH7-A5/GpH7-HA5/GpL16-k0의 결합활성은 60, 후자에 대응하는 GpH7-A48/GpH7-B3-01-15Y/GpL16-k0의 결합활성은 11로, P329R과 상이한 H쇄에 개변이 도입된 경우 쪽이 FcγR에 대한 결합이 저해되어 있었다. G236W의 경우, 전자에 대응하는 GpH7-A5/GpH7-HA6/GpL16-k0의 결합활성은 56, 후자에 대응하는 GpH7-A48/GpH7-B3-03-20W/GpL16-k0의 결합활성은 13으로, P329R과 상이한 H쇄에 개변이 도입된 경우 쪽이 FcγR에 대한 결합이 저해되어 있었다. S298A의 경우, 전자에 대응하는 GpH7-A5/GpH7-HA11/GpL16-k0의 결합활성은 84, 후자에 대응하는 GpH7-A48/GpH7-B3-15-02A/GpL16-k0의 결합활성은 47로, P329R과 상이한 H쇄에 개변이 도입된 경우 쪽이 FcγR에 대한 결합활성이 저해되어 있었다. 어느 개변에 대해서도 후자의 P329R과 상이한 H쇄에 도입한 경우 쪽이 FcγRIIIa에 대한 결합이 저해되어 있었다. P329R을 도입한 H쇄가 도 3의 HA쇄에 대응한다고 가정하면, P329R은 X방향으로부터의 결합을 저해하는 것으로 생각된다. 결합이 현저하게 저해된 조합은 L234Y, G236W, S298A를 P329R과 상이한 H쇄에 도입하였을 때였기 때문에, 이 경우 이들 개변을 HB쇄에 도입한 것이 된다. L234Y, G236W, S298A의 어느 개변도 P329R과 상이한 H쇄에 도입하였을 때에 FcγRIIIa에 대한 결합 증강 효과가 현저하게 저해된 것으로부터, HB쇄에 도입한 경우에는 어느 개변도 P329R이 FcγRIIIa의 결합을 저해하는 X방향으로부터의 결합을 증강시키고 있었던 것으로 생각된다. 따라서 이들 개변을 동일한 H쇄에 도입함으로써 FcγRIIIa에 대한 결합을 더욱 증강시킬 수 있을 것으로 생각되었다.
L234Y, G236W, S298A 중 2개를 각각 동일한 H쇄 또는 상이한 H쇄에 도입함으로써 FcγR에 대한 결합이 증강되는지를 평가하여, 상기 가설을 검증하였다. L234Y, G236W, S298A의 각각을 GpH7-A5에 도입한 GpH7-TA1(서열번호：25), GpH7-TA2(서열번호：26), GpH7-TA3(서열번호：27)와, L234Y, G236W, S298A의 각각을 GpH7-B3에 도입한 GpH7-B3-01-15Y(서열번호：22), GpH7-B3-03-20W(서열번호：23), GpH7-B3-15-02A(서열번호：24)를 삽입한 발현 벡터를 참고 실시예 1의 방법에 따라 제작하였다. 또한 L234Y와 G236W를 GpH7-A5에 도입한 GpH7-TA4(서열번호：28), L234Y와 S298A를 GpH7-A5에 도입한 GpH7-TA5(서열번호：29), G236W와 S298A를 GpH7-A5에 도입한 GpH7-TA6(서열번호：30)를 삽입한 발현 벡터를 제작하였다. 이들을 표 8과 같이 조합하여, 각각의 조합에 대해 GpL16-k0를 L쇄로서 가하여 참고 실시예 1의 방법에 따라 목적 항체의 발현, 조제를 실시하였다. 발현한 샘플의 H쇄, 변이개소에 관한 정보, 항체의 FcγRIIIa에 대한 결합을 측정한 결과를 표 8에 정리하였다.
Figure pct00011
샘플의 항목에는 항체의 명칭, H1, H2의 항목에는 각 항체의 H쇄 불변영역의 명칭, 변이개소의 항목에는 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0와 비교하여 상이한 변이(특히 변이가 없는 경우에는 「-」), FcγRIIIa에 대한 결합활성은 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0의 FcγRIIIa에 대한 결합을 100으로 하였을 때의 상대적인 결합활성을 표기하였다. 각 항체의 H쇄, L쇄에 대응하는 아미노산 서열의 서열번호를 병기하였다.
표 8의 결과로부터 L234Y와 G236W의 조합 효과에 대해서 검증하였다. L234Y와 G236W를 상이한 H쇄에 도입한 GpH7-TA2/GpH7-B3-01-15Y/GpL16-k0는 FcγRIIIa에 대한 결합활성이 130으로, L234Y만을 도입한 GpH7-A5/GpH7-B3-01-15Y/GpL16-k0의 결합활성 131과 비교하여 증가되어 있지 않고, G236W만을 도입한 GpH7-A5/GpH7-B3-03-20W/GpL16-k0의 결합활성 140과 비교하여 감소되어 있었다. 그러나 L234Y와 G236W를 동일한 H쇄에 도입한 GpH7-TA4/GpH7-B3/GpL16-k0는 결합활성이 168로, L234Y만을 도입한 GpH7-A5/GpH7-B3-01-15Y/GpL16-k0, G236W만을 도입한 GpH7-A5/GpH7-B3-03-20W/GpL16-k0와 비교하여 결합활성이 증가되어 있었다. 이 결과로부터 L234Y와 G236W는 예측한 바와 같이, 동일한 H쇄에 도입함으로써 FcγRIIIa에 대한 결합활성을 보다 증강시키는 것이 명확해졌다.
다음으로 표 8로부터 L234Y와 S298A의 조합 효과에 대해서 검증하였다. L234Y와 S298A를 상이한 H쇄에 도입한 GpH7-TA1/GpH7-B3-15-02A/GpL16-k0는 FcγRIIIa에 대한 결합활성이 142로, L234Y만을 도입한 GpH7-A5/GpH7-B3-01-15Y/GpL16-k0의 결합활성 131과 비교하여 증가되어 있었으나, S298A만을 도입한 GpH7-A5/GpH7-B3-15-02A/GpL16-k0의 결합활성인 163보다 감소되어 있었다. 즉 GpH7-TA1/GpH7-B3-15-02A/GpL16-k0는 S298A만을 도입한 경우보다도 결합활성이 증강되어 있지 않은 것으로부터 S298A와 L234Y를 상이한 H쇄에 도입해서는, FcγRIIIa에 대한 결합활성을 보다 증강시키는 효과를 부여할 수 없었다고 할 수 있다. 그러나 L234Y와 S298A를 동일한 H쇄에 도입한 GpH7-TA5/GpH7-B3/GpL16-k0는 결합활성이 208로, L234Y만을 도입한 GpH7-A5/GpH7-B3-01-15Y/GpL16-k0, S298A만을 도입한 GpH7-A5/GpH7-B3-15-02A/GpL16-k0의 어느 것과 비교해도 FcγRIIIa로의 결합활성이 증가되어 있었다. 이 결과로부터 L234Y와 S298A는 예측한 바와 같이, 동일한 H쇄에 도입함으로써 FcγRIIIa에 대한 결합활성을 보다 증강시키는 것이 명확해졌다.
다음으로 표 8로부터 G236W와 S298A의 조합 효과에 대해서 검증하였다. G236W와 S298A를 상이한 H쇄에 도입한 GpH7-TA3/GpH7-B3-03-20W/GpL16-k0는 FcγRIIIa에 대한 결합활성이 70으로, G236W만을 도입한 GpH7-A5/GpH7-B3-03-20W/GpL16-k0의 결합활성인 140과 비교하여 감소되어 있고, S298A만을 도입한 GpH7-A5/GpH7-B3-15-02A/GpL16-k0의 결합활성인 163보다도 감소되어 있었다. 그러나 G236W와 S298A를 동일한 H쇄에 도입한 GpH7-TA6/GpH7-B3/GpL16-k0는 결합활성이 228로, G236W만을 도입한 GpH7-A5/GpH7-B3-03-20W/GpL16-k0, S298A만을 도입한 GpH7-A5/GpH7-B3-15-02A/GpL16-k0의 어느 것과 비교해도 결합활성이 증가되어 있었다. 이 결과로부터 G236W와 S298A는 예측한 바와 같이, 동일한 H쇄에 도입함으로써 FcγRIIIa에 대한 결합활성을 보다 증강시키는 것이 명확해졌다.
이들 결과로부터 처음에 예측한 바와 같이 L234Y, G236W, S298A는 각각 동일한 H쇄에 도입되었을 때만 결합이 증강되는 것이 나타내어졌다. 이는 L234Y, G236W, S298A가 동일한 사슬에 존재하는 경우에는 FcγR과의 결합을 동일한 방향으로부터 증강시키고 있는 것을 지지하는 데이터이다. 즉 각 개변과 P329R을 조합하여 FcγRIIIa에 대한 결합활성을 비교한 결과로부터 예측된 결과에 따름으로써, 2개의 개변을 적절히 조합하는 방법을 결정할 수 있는 것을 나타내고 있다. 즉 P329R과의 조합은 헤테로이량화 항체에 있어서의 개변의 조합방법을 예측하는 유용한 방법으로, 이 방법을 사용함으로써 기타 유용한 개변의 조합을 명확하게 하는 것이 가능하다.
각 개변과 P329R을 조합하여 FcγRIIIa에 대한 결합활성을 비교한 결과로부터, 2개 이상의 개변의 조합을 고려한 경우, L234Y와 G236W, G236W와 S298A, S298A와 L234Y는 동일한 H쇄에 도입한 경우, 각각 동일한 방향으로부터 FcγRIIIa와의 상호작용을 증강시키고 있는 것이 명확해졌다. 즉 이 결과로부터 L234Y, G236W, S298A는 모두 동일한 방향으로부터 FcγRIIIa에 대한 결합활성을 증강시키고 있는 것으로 생각되기 때문에, 이들 개변은 동일한 H쇄에 도입한 경우에 FcγRIIIa에 대한 결합활성이 가장 강해질 것으로 예상되었다. 이 가설을 검증하기 위해 L234Y와 G236W, L234Y와 S298A, G236W와 S298A의 각각의 개변군을 GpH7-A5에 도입한 GpH7-TA4, GpH7-TA5, GpH7-TA6과 L234Y, G236W, S298A를 각각 GpH7-B3에 도입한 GpH7-B3-01-15Y, GpH7-B3-03-20W, GpH7-B3-15-02A를 삽입한 발현 벡터를 참고 실시예 1에 따라 조제하고, L234Y, G236W, S298A의 3개의 개변이 어느 하나의 H쇄에는 도입되도록 조합하고, L쇄로서 GpL16-k0를 가하여 참고 실시예 1의 방법에 따라 목적의 항체를 발현, 정제하였다. 또한 L234Y, G236W, S298A의 3개의 개변을 GpH7-A5에 도입한 GpH7-TA7(서열번호：31)을 제작하고, GpH7-B3, GpL16-k0와 조합하여 참고 실시예 1의 방법에 따라 목적의 항체를 발현, 정제하였다. 여기서 조제한 항체의 리스트와 각각의 항체의 FcγRIIIa에 대한 결합활성을 비교한 결과를 표 9에 정리하였다.
Figure pct00012
샘플의 항목에는 항체의 명칭, H1, H2의 항목에는 각 항체의 H쇄 불변영역의 명칭, 변이개소의 항목에는 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0와 비교하여 상이한 변이(특히 변이가 없는 경우에는 「-」), FcγRIIIa에 대한 결합활성은 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0의 FcγRIIIa에 대한 결합활성을 100으로 하였을 때의 상대적인 결합활성을 표기하였다. 각 항체의 H쇄, L쇄에 대응하는 아미노산 서열의 서열번호를 병기하였다.
그 결과, 각 개변과 P329R을 조합하여 FcγRIIIa에 대한 결합활성을 비교한 결과로부터 예측한 바와 같이 L234Y, G236W, S298A가 동일한 H쇄에 도입된 GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0가 가장 FcγRIIIa에 대한 결합이 증강되어 있었다. 즉 이 결과로부터 각 개변과 P329R을 조합하여 FcγRIIIa에 대한 결합활성을 비교함으로써 2개 이상의 개변의 적절한 조합방법을 예상할 수 있는 것이 명확해졌다.
〔실시예 6〕헤테로이량화 항체에 있어서의 종래의 호모이량화 항체와 신규 헤테로이량화 항체의 비교
실시예 5의 표 7, 표 8, 표 9의 결과로부터, 단독으로 FcγRIIIa에 대한 결합활성을 증강시키는 헤테로 개변은 적절히 조합함으로써 FcγRIIIa로의 결합을 더욱 증강시키는 것이 가능한 것이 나타내어졌다. 구체적으로는 L234Y, G236W, S298A는 동일한 H쇄에 개변을 가함으로써 FcγR에 대한 결합활성이 보다 증강되는 것이 나타내어졌다.
다음으로 복수의 개변을 조합해도 대응하는 복수의 개변을 도입한 경우에 헤테로이량화 항체 쪽이 호모이량화 항체보다도 FcγR에 대한 결합이 증강되어 있다고 하는 헤테로이량화 항체의 성질이 유지되어 있는지를 확인하였다. 구체적으로는 GpH7-A5, GpH7-B3의 각각에 L234Y, G236W, S298A를 도입한 GpH7-TA7 및 GpH7-TA45(서열번호：32)를 참고 실시예 1의 방법에 따라 제작하여, 표 10에 나타내는 바와 같이 L234Y, G236W, S298A가 한쪽 H쇄에만 도입된 헤테로이량화 항체 GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0 및 GpH7-A5/GpH7-TA45/GpL16-k0, L234Y, G236W, S298A가 양 H쇄에 도입된 호모이량화 항체 GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0를 참고 실시예 1의 방법에 따라 발현, 정제하였다. 이들을 참고 실시예 2의 방법에 따라 그 FcγRIIIa에 대한 결합을 비교하였다(표 10).
Figure pct00013
샘플의 항목에는 항체의 명칭, H1, H2의 항목에는 각 항체의 H쇄 불변영역의 명칭, 변이개소의 항목에는 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0와 비교하여 상이한 변이(특히 변이가 없는 경우에는 「-」), FcγRIIIa에 대한 결합활성은 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0의 FcγRIIIa에 대한 결합활성을 100으로 하였을 때의 상대적인 결합활성을 표기하였다. 각 항체의 H쇄, L쇄에 대응하는 아미노산 서열의 서열번호를 병기하였다.
표 10의 결과로부터 L234Y, G236W, S298A가 한쪽 H쇄에만 도입된 헤테로이량화 항체 GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0 및 GpH7-A5/GpH7-TA45/GpL16-k0의 어느 것과 비교해도 L234Y, G236W, S298A가 양 H쇄에 도입된 호모이량화 항체 GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0는 FcγRIIIa에 대한 결합이 감소되어 있었다. 이 사실로부터 헤테로이량화 항체에 있어서는 FcγR에 대한 결합활성을 증강시키나, 호모이량화 항체에 있어서는 FcγR에 대한 결합활성을 감소시킨다고 하는 L234Y, G236W, S298A의 각 개변의 성질이 복수의 개변을 조합시킨 경우라도 유지되고 것이 명확해졌다.
다음으로 L234Y, G236W, S298A가 한쪽 H쇄에만 도입된 헤테로이량화 항체에 있어서, 실시예 3에서 고찰한 바와 같은 FcγRIIIa와의 결합의 방향성이 유지되고 있는지 여부를 검증하였다.
GpH7-TA7, GpH7-B3의 각각에 P329R을 도입한 GpH7-TA8(서열번호：33), GpH7-B12(서열번호：12)를 참고 실시예 1의 방법에 따라 제작하여, 표 11에 나타내는 바와 같이 L234Y, G236W, S298A와 P329R을 동일한 H쇄에 도입한 헤테로이량화 항체 GpH7-TA8/GpH7-B3/GpL16-k0, 상이한 쇄에 도입한 헤테로이량화 항체 GpH7-TA7/GpH7-B12/GpL16-k0를 참고 실시예 1의 방법에 따라 조제하였다. 이들 항체와 L234Y, G236W, S298A를 한쪽 H쇄에 도입한 헤테로이량화 항체 GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0의 FcγRIII에 대한 결합활성을 참고 실시예 2의 방법에 따라 비교하였다(표 11).
Figure pct00014
샘플의 항목에는 항체의 명칭, H1, H2의 항목에는 각 항체의 H쇄 불변영역의 명칭, 변이개소의 항목에는 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0와 비교하여 상이한 변이(특히 변이가 없는 경우에는 「-」), FcγRIIIa에 대한 결합활성은 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0의 FcγRIIIa에 대한 결합을 100으로 하였을 때의 상대적인 결합활성을 표기하였다. 각 항체의 H쇄, L쇄에 대응하는 아미노산 서열의 서열번호를 병기하였다.
표 11의 결과, L234Y, G236W, S298A의 개변군을 P329R과 동일한 H쇄에 도입한 헤테로이량화 항체 GpH7-TA8/GpH7-B3/GpL16-k0와 L234Y, G236W, S298A의 개변군을 P329R과 상이한 H쇄에 도입한 헤테로이량화 항체 GpH7-TA7/GpH7-B12/GpL16-k0 모두 GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0에 비해 FcγRIIIa에 대한 결합활성이 감소되어 있었으나, GpH7-TA7/GpH7-B12/GpL16-k0의 경우는 FcγRIIIa에 대한 결합활성이 11로 GpH7-TA8/GpH7-B3/GpL16-k0의 150에 비해 현저히 감소되어 있었다. 이 결과로부터 L234Y, G236W, S298A의 개변을 복수 H쇄에 도입해도, P329R과 상이한 H쇄에 도입한 경우에는 FcγR에 대한 결합활성이 현저히 감소된다고 하는 실시예 3에 있어서 L234Y, G236W, S298A의 각 개변의 경우에 관찰된 성질과 동일한 성질이 관찰되었다.
이들 결과로부터 FcγR에 대한 결합을 증강시키는 개변을 적절히 조합함으로써, 헤테로이량화 항체의 성질을 유지한 채로 FcγR에 대한 결합활성을 한층 증강시키는 것이 가능한 것이 명확해졌다.
〔실시예 7〕 종래기술과의 비교：FcγRIIIa 결합 증강 아미노산 개변 항체와 헤테로 개변체의 비교
지금까지도 FcγRIIIa에 대한 결합을 증강시킴으로써 ADCC 활성을 증강시키는 개변이 알려져 있다. 예를 들면 S239D, I332E, A330L의 개변은 양 항체의 H쇄에 도입한 경우에 가장 FcγRIIIa에 대한 결합을 증강시키는 개변인 것이 알려져 있다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103, 4005-4010, 2006). 항체 의존적 세포상해(ADCC)활성이 증강됨으로써 항체의 항종양활성이 증강되는 것이 나타내어져 있어, 항체의 FcγRIIIa에 대한 결합을 증강시키는 것은 항체의 의약품으로서의 유용성을 높이기 위해 유효한 수단이다. 그러나 지금까지의 실시예에서 나타내어져 있는 바와 같이, 호모이량화 항체를 사용한 FcγR에 대한 결합활성의 증강에는 한계가 있다고 생각되어, 헤테로 개변에 의해 추가적인 증강이 가능하다고 생각되었다.
실시예 1에서 기술한 바와 같이, 항체의 Fc영역과 FcγR은 비대칭적으로 상호작용하고 있다. S239D, I332E, A330L의 개변을 도입한 항체의 경우, 그 입체구조로부터 HA쇄에 있어서는 S239D, I332E, A330L의 개변된 모든 잔기가 FcγR과의 상호작용의 증강에 관여하고 있는데, HB쇄에 있어서 S239D 이외는 FcγR과 접해 있지 않아, FcγR에 대한 결합활성 증강에 기여하고 있지 않은 것으로 생각되었다(도 23). 즉 Fc영역과 FcγR의 상호작용의 비대칭성을 고려하면, 종래의 항체 개변기술로 도입한 각 개변은 FcγR과 충분히 상호작용할 수 없어 항체와 FcγR의 상호작용을 최적화하는 데는 불충분하다고 생각된다. 예를 들면 상기 S239D, I332E, A330L의 개변의 경우, HB쇄에 이들 개변 대신에 FcγRIIIa와의 상호작용을 HB쇄측으로부터 증강시키는 개변을 도입함으로써, FcγRIIIa에 대한 결합을 더욱 증강시키는 것이 가능해질 것으로 생각된다. 즉 항체의 각 H쇄에 상이한 개변을 가하는 본 발명의 헤테로이량화 항체를 제작하는 기술(이하, 본 명세서에 있어서 「헤테로이량화 항체 기술」이라 한다)을 사용함으로써, 항체의 각 H쇄에 동일한 개변을 가하는 기술(이하, 본 명세서에 있어서 「종래기술」 또는 「호모이량화 항체 기술」이라 한다)보다도 더욱 FcγR에 대한 결합을 증강시킬 수 있을 가능성이 있다.
Fc와 FcγRIIIa의 복합체의 입체구조로부터 S239D, I332E, A330L과는 반대로 S298은 FcγR과는 도 23의 HB쇄에서만 상호작용하고 있는 것으로 생각된다(JBC, 276: 16469-16477, 2001). 이 사실로부터 S298에 개변을 도입한 경우, 치환된 변이도 HB쇄측에서 FcγRIIIa와 상호작용하는 것으로 생각된다. 실시예 5에서 본 바와 같이 L234Y, G236W는 S298A와 동일한 방향으로부터 FcγR과의 상호작용을 증강시키고 있는 것으로 생각되었다. 즉 S239D, A330L, I332E를 동일한 H쇄에 도입하고, L234Y, G236W, S298A를 반대의 H쇄에 도입하면 도입한 모든 개변이 FcγR과 동시에 상호작용하는 것이 가능해져, 그 결과로서 FcγR과의 상호작용을 한층 증강시킬 수 있을 것으로 생각된다.
이 가설을 검증하기 위해 아래의 실험을 행하였다. L234Y, G236W, S298A, S239D, A330L, I332E의 개변을 각각 도입한 H쇄와, P329R을 동일한 H쇄, 또는 상이한 H쇄에 도입한 항체를 이용하여, 실시예 5의 방법에 따라 각 개변이 FcγR을 인식하는 방향을 결정하였다. 참고 실시예 1의 방법에 따라 GpH7-A5, GpH7-A5에 P329R을 도입한 GpH7-A48(서열번호：16), GpH7-B3에 S239D 및 P329R을 도입한 GpH7-HA7(서열번호：34), GpH7-B3에 A330L 및 P329R을 도입한 GpH7-HA15(서열번호：35), GpH7-B3에 I332E 및 P329R을 도입한 GpH7-HA18(서열번호：36), GpH7-B3에 L234Y 및 P329R을 도입한 GpH7-HA5(서열번호：19), GpH7-B3에 G236W 및 P329R을 도입한 GpH7-HA6(서열번호：20), GpH7-B3에 S298A 및 P329R을 도입한 GpH7-HA11(서열번호：21), GpH7-B3에 S239D를 도입한 GpH7-B3-06-09D(서열번호：37), GpH7-B3에 A330L을 도입한 GpH7-B3-20-08L(서열번호：38), GpH7-B3에 I332E를 도입한 GpH7-B3-22-10E(서열번호：39), GpH7-B3에 L234Y를 도입한 GpH7-B3-01-15Y(서열번호：22), GpH7-B3에 G236W를 도입한 GpH7-B3-03-20W(서열번호：23), GpH7-B3에 S298A를 도입한 GpH7-B3-15-02A(서열번호：24)를 삽입한 발현 벡터를 제작하였다. L234Y, G236W, S298A, S239D, A330L, I332E의 각 개변과 P329R이 동일한 H쇄 또는 상이한 H쇄에 존재하도록 각 H쇄에 대응하는 발현 벡터를 조합하고, L쇄에 대응하는 발현 벡터의 GpL16-k0와 조합하여 참고 실시예 1의 방법에 따라 목적의 항체를 발현, 조제하였다. 조제한 항체를 사용하여 FcγRIIIa에 대한 결합활성을 측정하고, P329R을 사용한 L234Y, G236W, S298A，S239D, A330L, I332E의 FcγRIIIa 인식방향을 검토한 결과를 표 12에 정리하였다.
Figure pct00015
샘플의 항목에는 항체의 명칭, H1, H2의 항목에는 각 항체의 H쇄 불변영역의 명칭, 변이개소의 항목에는 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0와 비교하여 상이한 변이(특히 변이가 없는 경우에는 「-」), FcγRIIIa에 대한 결합활성은 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0의 FcγRIIIa에 대한 결합활성을 100으로 하였을 때의 상대적인 결합활성을 표기하였다. 각 항체의 H쇄, L쇄에 대응하는 아미노산 서열의 서열번호를 병기하였다.
그 결과로부터 각 개변에 대해서 각 개변을 P329R과 동일한 H쇄에 도입한 경우 및 상이한 H쇄에 도입한 경우에서 FcγRIIIa에 대한 결합활성을 비교하였다. S239D의 경우, 전자에 대응하는 GpH7-A5/GpH7-HA7/GpL16-k0의 결합활성은 3, 후자에 대응하는 GpH7-A48/GpH7-B3-06-09D/GpL16-k0의 결합활성은 123으로, P329R과 동일한 H쇄에 개변이 도입된 경우 쪽이 FcγRIIIa에 대한 결합이 저해되어 있었다. A330L의 경우, 전자에 대응하는 GpH7-A5/GpH7-HA15/GpL16-k0의 결합활성은 32, 후자에 대응하는 GpH7-A48/GpH7-B3-20-08L/GpL16-k0의 결합활성은 60으로, P329R과 동일한 H쇄에 개변이 도입된 경우 쪽이 FcγRIIIa에 대한 결합이 저해되어 있었다. I332E의 경우, 전자에 대응하는 GpH7-A5/GpH7-HA18/GpL16-k0의 결합활성은 35, 후자에 대응하는 GpH7-A48/GpH7-B3-22-10E/GpL16-k0의 결합활성은 189로, P329R과 동일한 H쇄에 개변이 도입된 경우 쪽이 FcγRIIIa에 대한 결합이 저해되어 있었다. 어느 개변에 대해서도 전자의 P329R이 동일한 H쇄에 도입되어 있었던 경우 쪽이 FcγRIIIa에 대한 결합이 저해되어 있었다. P329R을 도입한 H쇄가 도 23의 HA쇄에 대응한다고 가정하면, P329R은 X방향으로부터의 결합을 저해하는 것으로 생각된다. 결합이 현저히 저해된 조합은 S239D, A330L, I332E를 P329R과 동일한 H쇄에 도입하였을 때였기 때문에, 이 경우 이들 개변을 HA쇄에 도입한 것이 된다. S239D, A330L, I332E 중 어느 개변도 P329R과 동일한 H쇄에 도입하였을 때 FcγRIIIa에 대한 결합 증강 효과가 현저히 저해된 것으로부터, HA쇄에 도입한 경우에는 어느 개변도 P329R이 FcγRIIIa의 결합을 저해하는 X방향으로부터의 결합을 증강시키고 있었던 것으로 생각된다. 따라서 이들 개변을 동일한 H쇄에 도입함으로써 FcγRIIIa에 대한 결합을 더욱 증강시킬 수 있을 것으로 생각된다. 실시예 5로부터 L234Y, G236W, S298A는 모두 HB쇄에 도입한 경우에 X방향으로부터의 결합을 증강시키고 있는 것으로 고찰되었다. 실시예 5, 실시예 6에서 고찰한 바와 같이, P329R과 조합함으로써 각 개변을 적절히 조합하는 방법을 발견하는 것이 가능하다. 금번의 결과로부터 도 3의 X방향으로부터의 FcγRIIIa에 대한 결합을 증강시키기 위해서는 S239D, A330L, I332E는 HA쇄, L234Y, G236W, S298A는 HB쇄에 도입할 필요가 있어, 각각의 개변군을 상이한 H쇄에 도입함으로써 X방향으로부터의 FcγRIIIa에 대한 결합을 보다 증강시키는 것이 가능할 것으로 생각되었다.
이 가설을 검증하기 위해 참고 실시예 1의 방법에 따라 S239D, A330L, I332E를 모두 GpH7-A5에 도입한 GpH7-A57(서열번호：40), GpH7-B3에 도입한 GpH7-B78(서열번호：41) 및 L234Y, G236W, S298A를 모두 GpH7-A5에 도입한 GpH7-TA7(서열번호：31), GpH7-B3에 도입한 GpH7-TA45(서열번호：32)를 삽입한 발현 벡터를 조제하였다. 이들 발현 벡터와 GpH7-A5, GpH7-B3, GpL16-k0를 사용하여 한쪽 H쇄에 L234Y, G236W, S298A를, 다른 한쪽 H쇄에 S239D, A330L, I332E를 도입한 헤테로 GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0, L234Y, G236W, S298A만을 한쪽 H쇄에 도입한 GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0, L234Y, G236W, S298A를 양쪽 H쇄에 도입한 GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0, S239D, A330L, I332E만을 한쪽 H쇄에 도입한 GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0, S239D, A330L, I332E를 양쪽 H쇄에 도입한 GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0를 참고 실시예 1의 방법에 따라 발현, 조제하였다. 조제한 항체는 참고 실시예 2의 방법에 따라 측정한 FcγRIIIa에 대한 KD를 지표로 FcγRIIIa에 대한 결합활성을 비교하여 L234Y, G236W, S298A와 S239D, A330L, I332E의 조합 효과의 검증 결과를 표 13에 정리하였다.
Figure pct00016
샘플의 항목에는 항체의 명칭, H1, H2의 항목에는 각 항체의 H쇄 불변영역의 명칭, 변이개소의 항목에는 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0와 비교하여 상이한 변이(특히 변이가 없는 경우에는 「-」)를 표기하였다. GpH7-G1d/GpL16-k0의 FcγRIIIa에 대한 KD를 각 항체의 KD로 나눈 값을 KD ratio 1로 하고, GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0의 FcγRIIIa에 대한 KD를 각 항체의 KD로 나눈 값을 KD ratio 2로 하였다. 각 항체의 H쇄, L쇄에 대응하는 아미노산 서열의 서열번호를 병기하였다.
표 13의 결과로부터 천연형 IgG1인 GpH7-G1d/GpL16-k0와 D356K, H435R 및 K439E를 각각 한쪽 H쇄에 도입한 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0를 비교하면, 그 FcγRIIIa에 대한 결합활성의 변화는 0.75배로 커다란 차이는 관찰되지 않았다. 이 사실로부터 D356K, H435R 및 K439E의 개변은 FcγRIIIa에 대한 결합활성에 대해 영향을 미치지 않는 것으로 생각되었다.
종래기술을 사용한 호모이량화 항체에 대해서 각 개변의 효과를 검증하였다. S239D, A330L, I332E를 양 H쇄에 도입한 호모이량화 항체 GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0의 경우는 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0와 비교하여 FcγRIIIa에 대한 결합활성이 약 260배 증강되어 있었으나, 반대로 L234Y, G236W, S298A를 양 H쇄에 도입한 호모이량화 항체 GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0의 경우는 0.49배로 감소되어 있었다. 이 결과로부터 호모이량화 항체에 있어서는 S239D, A330L, I332E의 개변군에만 FcγRIIIa에 대한 결합활성 증강 효과가 있는 것이 명확해졌다.
각 개변군을 한쪽 H쇄에만 도입한 헤테로이량화 항체에 대해서 각 개변군의 효과를 검증하였다. S239D, A330L, I332E를 한쪽 H쇄에 도입한 헤테로이량화 항체 GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0의 경우는 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0와 비교하여 FcγRIIIa에 대한 결합활성이 30배 증강되고, L234Y, G236W, S298A를 한쪽 H쇄에 도입한 헤테로이량화 항체 GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0의 경우는 5.1배 증강되었다. 이 결과로부터 S239D, A330L, I332E의 개변군 쪽이 FcγRIIIa에 대한 결합활성 증강 효과가 높은 것이 명확해졌다.
각 개변군의 호모이량화 항체와 헤테로이량화 항체에 있어서의 효과의 차이를 검증하였다. S239D, A330L, I332E에 대해서는 그 헤테로이량화 항체에 있어서는 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0와 비교하여 FcγRIIIa에 대한 결합활성이 30배 증강되고, 호모이량화 항체의 경우는 약 260배 증강되어 있어, 호모이량화 항체에 도입한 쪽이 FcγRIIIa에 대한 결합활성의 증강을 한층 높일 수 있는 것이 명확해졌다. 한편으로 L234Y, G236W, S298A에 대해서는 그 헤테로이량화 항체에 있어서는 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0와 비교하여 FcγRIIIa에 대한 결합활성이 5.1배 증강되었음에도 불구하고, 호모이량화 항체의 경우는 0.49배로 감소되어 있었다. 이 결과는 실시예 5에서 고찰한 것과 마찬가지로, L234Y, G236W, S298A의 개변군은 헤테로이량화 항체에 있어서만 FcγRIIIa에 대한 결합활성 증강 효과가 발견되는 것을 나타내고 있다.
호모이량화 항체에 있어서는 S239D, A330L, I332E의 개변군만이 FcγRIIIa에 대한 결합 증강 효과를 나타내고, 헤테로이량화 항체에 있어서도 S239D, A330L, I332E의 개변군 쪽이 FcγRIIIa에 대한 결합 증강이 높은 것이 나타내어져 왔다. 이들 결과로부터 S239D, A330L, I332E의 개변군과 L234Y, G236W, S298A의 개변군의 조합을 고려한 경우, 종래의 생각에 기초하여 생각할 때 헤테로이량화 항체, 호모이량화 항체 중 어느 것에 있어서도 FcγRIIIa에 대한 결합 증강이 높은 S239D, A330L, I332E의 개변군만을 양 H쇄에 도입한 호모이량화 항체 GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0가 FcγRIIIa에 대한 결합 증강 효과가 가장 높은 것으로 예측된다. 그러나 S239D, A330L, I332E를 한쪽 H쇄에 도입하고 L234Y, G236W, S298A를 다른 한쪽 H쇄에 도입한 헤테로이량화 항체 GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0는 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0와 비교하여 FcγRIIIa에 대한 결합활성이 약 350배 증강되어, S239D, A330L, I332E를 양 H쇄에 도입한 호모이량화 항체보다도 높은 결합 증강 효과를 나타내고 있었다. 이는 S239D, A330L, I332E의 개변군과 L234Y, G236W, S298A의 개변군을 상이한 H쇄에 도입함으로써 도입된 모든 개변이 HA쇄, HB쇄의 양쪽으로부터 FcγRIIIa에 대한 결합활성을 증강시켜 S239D, A330L, I332E의 개변군을 양 H쇄에 도입한 경우보다도 높은 효과를 발휘한다는 가설을 뒷받침하는 결과라고 생각되었다.
즉 헤테로이량화 항체를 사용함으로써, 종래의 호모이량화 항체를 사용하는 것보다도 Fc영역과 FcγRIIIa의 비대칭적인 상호작용을 보다 최적화할 수 있어, 보다 높은 결합활성을 갖는 Fc영역을 디자인할 수 있는 것이 나타내어졌다.
도 23으로부터 A330L, I332E는 HA쇄에서만 FcγR과 상호작용하고 있으나, S239D는 HA쇄, HB쇄의 양쪽에 있어서 FcγR과 상호작용하고 있는 것으로 생각되었다. 실제로 S239D, A330L, I332E를 한쪽 H쇄에만 도입한 헤테로이량화 항체 GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0의 경우는 FcγRIIIa에 대한 KD는 5.4E-8이나, 호모이량화 항체 GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0의 경우는 KD가 6.2E-9로, FcγRIIIa에 대한 결합활성이 8.7배 증강되어 있었다. 이 결합활성의 차는 S239D가 양 H쇄로부터 결합 증강에 관여하고 있는 것에 기인하는 것으로 생각하면, S239D를 양 H쇄에 도입함으로써 이 차가 해소될 것으로 생각되었다. 이 가설을 검증하기 위해 GpH7-A5에 S239D를 도입한 GpH7-A53(서열번호：42)을 제작하고, S239D, A330L, I332E를 도입한 GpH7-B78과 조합하여 참고 실시예 1의 방법에 따라 발현, 조제하고, 참고 실시예 2의 방법에 따라 S239D, A330L, I332E의 헤테로이량화 항체 및 호모이량화 항체와 FcγRIIIa에 대한 결합을 비교하여 S239D와 S239D, A330L, I332E의 조합 효과의 검증을 행하였다(표 14).
Figure pct00017
샘플의 항목에는 항체의 명칭, H1, H2의 항목에는 각 항체의 H쇄 불변영역의 명칭, 변이개소의 항목에는 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0와 비교하여 상이한 변이(특히 변이가 없는 경우에는 「-」)를 표기하였다. GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0의 FcγRIIIa에 대한 KD를 각 항체의 KD로 나눈 값을 KD ratio로 하였다. 각 항체의 H쇄, L쇄에 대응하는 아미노산 서열의 서열번호를 병기하였다.
표 14로부터 S239D, A330L, I332E를 한쪽 H쇄에, S239D를 다른 한쪽 H쇄에 도입한 GpH7-A53/GpH7-B78/GpL16-k0의 경우는 S239D, A330L, I332E를 한쪽 H쇄에만 도입한 GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0와 비교하여 FcγRIIIa에 대한 결합활성이 4.9배 증강되고, S239D, A330L, I332E를 양 H쇄에 도입한 GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0와 비교하여 FcγRIIIa에 대한 결합활성은 1.8배밖에 감소되어 있지 않았다. 이 결과로부터 상기 가설과 같이, S239D는 양 H쇄에 있어서 FcγRIIIa와 상호작용하여 이 개변을 도입함으로써 FcγRIIIa와의 상호작용을 한층 증강시킬 수 있는 것으로 생각되었다.
한쪽 H쇄에 L234Y, G236W, S298A를, 다른 한쪽 H쇄에 S239D, A330L, I332E를 도입한 헤테로이량화 항체 GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0에 S239D를 도입함으로써, 추가적인 FcγRIIIa에 대한 결합활성의 증강이 가능한지 검증하였다. 참고 실시예 1의 방법에 따라 GpH7-TA7에 대해 S239D를 도입한 GpH7-TA22(서열번호：43)를 삽입한 발현 벡터를 조제하고, GpH7-B3에 S239D, A330L, I332E를 도입한 GpH7-B78, GpL16-k0와 조합하여 목적의 항체를 발현, 조제하였다. 또한 한쪽 H쇄에 L234Y, G236W, S239D, S298A를, 다른 한쪽 H쇄에 S239D, A330L, I332E를 도입한 헤테로이량화 항체 GpH7-TA22/GpH7-B78/GpL16-k0를 조제하였다. 참고 실시예 2의 방법에 따라 FcγR IIIa에 대한 결합활성을 비교하여 S239D와 S239D, A330L, I332E의 조합 효과의 검증을 행하였다(표 15).
Figure pct00018
샘플의 항목에는 항체의 명칭, H1, H2의 항목에는 각 항체의 H쇄 불변영역의 명칭, 변이개소의 항목에는 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0와 비교하여 상이한 변이(특히 변이가 없는 경우에는 「-」)를 표기하였다. GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0의 FcγRIIIa에 대한 KD를 각 항체의 KD로 나눈 값을 KD ratio로 하였다. 각 항체의 H쇄, L쇄에 대응하는 아미노산 서열의 서열번호를 병기하였다.
표 15로부터 한쪽 H쇄에 L234Y, G236W, S298A를, 다른 한쪽 H쇄에 S239D, A330L, I332E를 도입한 헤테로이량화 항체 GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0에 있어서, S239D를 포함하지 않는 쪽 사슬에 S239D를 도입한 GpH7-TA22/GpH7-B78/GpL16-k0의 경우는 GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0보다도 3.2배 결합활성이 증강되어 있었다. 이 결과, S239D를 사용함으로써 FcγRIIIa에 대한 결합의 추가적인 증강이 가능한 것이 나타내어졌다.
다음으로 실시예 4에서 발견한 FcγRIIIa에 대한 결합 증강 개변의 하나인 Y296W, K334G를 추가로 가하는 것의 검토를 실시하였다.
먼저 Y296W를 어느 H쇄에 도입할지를 검토하였다. GpH7-TA7에 Y296W의 변이를 도입한 GpH7-TA52(서열번호：44)를 제작하고, GpH7-B78과 조합하여 참고 실시예 1의 방법에 따라 발현, 조제하였다. 또한 GpH7-B78에 Y296W를 도입한 GpH7-TA58(서열번호：45)을 제작하고, GpH7-TA22와 조합하여 참고 실시예 1의 방법에 따라 발현, 조제하였다. 조제한 항체에 대해서 참고 실시예 2의 방법에 따라 FcγRIIIa에 대한 결합활성을 비교하여 Y296W의 조합 효과의 검증을 행하였다(표 16).
Figure pct00019
샘플의 항목에는 항체의 명칭, H1, H2의 항목에는 각 항체의 H쇄 불변영역의 명칭, 변이개소의 항목에는 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0와 비교하여 상이한 변이(특히 변이가 없는 경우에는 「-」)를 표기하였다. GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0의 FcγRIIIa에 대한 KD를 각 항체의 KD로 나눈 값을 KD ratio로 하였다. 각 항체의 H쇄, L쇄에 대응하는 아미노산 서열의 서열번호를 병기하였다.
이 결과로부터 Y296W는 L234Y, G236W, S298A와 상이한 H쇄에 도입한 경우, 도입 전후에서 FcγRIIIa에 대한 결합활성이 1.2배밖에 증강되지 않으나, 동일한 H쇄에 도입한 경우, GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0와 비교하여 FcγRIIIa에 대한 결합활성이 1.8배 증강되었다. 이 결과로부터 Y296W는 L234Y, G236W, S298A와 동일한 H쇄에 도입함으로써 FcγRIIIa에 대한 결합 증강 효과가 있는 것으로 생각된다.
다음으로 GpH7-TA22에 Y296W를 도입한 GpH7-TA54(서열번호：46)를 제작하고, GpH7-B78과 조합하여 참고 실시예 1의 방법에 따라 발현, 조제하였다. 또한 GpH7-B78에 Y296W를 도입한 GpH7-TA58(서열번호：45)을 제작하고, GpH7-TA22와 조합하여 참고 실시예 1의 방법에 따라 발현, 조제하였다. 조제한 항체에 대해서 참고 실시예 2의 방법에 따라 FcγRIIIa에 대한 결합활성을 비교하여 Y296W의 조합 효과의 검증을 행하였다(표 17).
Figure pct00020
샘플의 항목에는 항체의 명칭, H1, H2의 항목에는 각 항체의 H쇄 불변영역의 명칭, 변이개소의 항목에는 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0와 비교하여 상이한 변이(특히 변이가 없는 경우에는 「-」)를 표기하였다. GpH7-TA22/GpH7-B78/GpL16-k0의 FcγRIIIa에 대한 KD를 각 항체의 KD로 나눈 값을 KD ratio로 하였다. 각 항체의 H쇄, L쇄에 대응하는 아미노산 서열의 서열번호를 병기하였다.
표 17의 결과로부터 Y296W는 L234Y, G236W, S298A와 상이한 H쇄에 도입한 경우, 도입 전후에서 FcγRIIIa에 대한 결합활성이 변화되지 않지만, 동일한 H쇄에 도입한 경우, GpH7-TA22/GpH7-B78/GpL16-k0와 비교하여 FcγRIIIa에 대한 결합활성이 1.3배 증강되었다. 이 결과로부터 Y296W는 L234Y, G236W, S298A와 동일한 H쇄에 도입함으로써 FcγRIIIa에 대한 결합활성 증강 효과가 있는 것으로 생각된다.
다음으로 K334G에 대해서도 동일한 검토를 행하였다. GpH7-TA7에 K334G를 도입한 GpH7-TA40(서열번호：47)을 제작하고, GpH7-B78과 조합하여 참고 실시예 1의 방법에 따라 발현, 조제하였다. 또한 GpH7-B78에 K334G를 도입한 GpH7-TA50(서열번호：48)을 제작하고, GpH7-TA7과 조합하여 참고 실시예 1의 방법에 따라 발현, 조제하였다. 조제한 항체에 대해서 참고 실시예 2의 방법에 따라 FcγRIIIa에 대한 결합을 비교하여 K334G의 조합 효과의 검증을 행하였다(표 18).
Figure pct00021
샘플의 항목에는 항체의 명칭, H1, H2의 항목에는 각 항체의 H쇄 불변영역의 명칭, 변이개소의 항목에는 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0와 비교하여 상이한 변이(특히 변이가 없는 경우에는 「-」)를 표기하였다. GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0의 FcγRIIIa에 대한 KD를 각 항체의 KD로 나눈 값을 KD ratio로 하였다. 각 항체의 H쇄, L쇄에 대응하는 아미노산 서열의 서열번호를 병기하였다.
표 18의 결과로부터 K334G는 L234Y, G236W, S298A와 동일한 H쇄에 도입한 경우, 도입 전후에서 FcγRIIIa에 대한 결합활성이 절반으로 저하되어 버리는데, 상이한 H쇄에 도입한 경우, GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0와 비교하여 FcγRIIIa에 대한 결합활성이 1.2배 증강되었다. 이 결과로부터 K334G는 L234Y, G236W, S298A와 상이한 H쇄에 도입함으로써 FcγRIIIa에 대한 결합활성 증강 효과가 있다고 생각되었다.
〔실시예 8〕활성형 FcγR 및 억제형 FcγR에 대한 선택성의 향상
FcγR은 ITAM을 갖는 활성형과 ITIM을 갖는 억제형이 존재한다. 대표적인 활성형 FcγR(Activating receptor)로서 FcγRIa, FcγRIIa, FcγRIIIa를 들 수 있고, 또한 대표적인 억제형 FcγR(Inhibitory receptor)로서 FcγRIIb를 들 수 있다. 암을 표적으로 한 항체에 있어서, ADCC 활성이나 항체 의존적 세포탐식(ADCP)활성을 작용 메커니즘에 갖는 활성형 FcγR에 대한 결합활성과 억제형 FcγR에 대한 결합활성의 비율이 중요한 역할을 하는 것으로 생각되고 있다(Nature Medicine, 6: 443-446, 2000).
암을 표적으로 한 항체는 활성형 FcγR에 대한 결합활성을 증강시키고, 억제형 FcγR에 대한 결합활성을 감소시키는 것이 바람직하다고 생각된다. 구체적으로는 도 24에 나타낸 a의 영역에 포함되는 개변과 같이 활성형 FcγR에 대해 천연형 항체보다 강하게 결합하고, 또한 억제형 FcγR에 대해 천연형 항체보다 약하게 결합하는, 즉 활성형 FcγR에 선택적으로 결합 증강하는 개변인 것이 바람직하다. 또한 도 25에 나타낸 b의 영역에 있는 개변과 같이, 활성형 FcγR과 억제형 FcγR에 대한 결합활성의 비율을 천연형 항체와 비교하여 커지는 개변인 것이 바람직하다. 이러한 개변은 억제형 FcγR과 비교하여 활성형 FcγR에 대해 선택적으로 결합활성을 증강시킨 개변이라 할 수 있다.
개변을 한쪽 H쇄에 도입한 헤테로이량화 항체 He Ab의 각각의 활성형 FcγR 및 억제형 FcγR에 대한 결합활성을 실시예 4의 방법에 준해 측정하였다. 각각의 헤테로이량화 항체의 각각의 활성형 FcγR 및 억제형 FcγR에 대한 결합활성의 비율을 평가하기 위해, 그 결과를 도 26, 도 27, 도 28, 도 29에 정리하였다. 도 26의 활성형 FcγR은 FcγRIa, 도 27의 활성형 FcγR은 FcγRIIa(R), 도 28의 활성형 FcγR은 FcγRIIa(H), 도 29의 활성형 FcγR은 FcγRIIIa이다.
도 26 중에서 도 24, 도 25의 a 및 b에 대응하는 영역에 존재하는 개변을 표 19(표 19-1~19-5)에 정리하였다. 동일하게 하여 FcγRIIa(R)(도 27), FcγRIIa(H)(도 28), FcγRIIIa(도 29)에 대해서도 a 및 b에 대응하는 영역에 존재하는 개변의 리스트를 각각 표 20(표 20-1~20-3), 표 21(표 21-1~21-3), 표 22(표 22-1~22-3)에 정리하였다.
[표 19-1]
Figure pct00022
[표 19-2]
Figure pct00023
[표 19-3]
Figure pct00024
[표 19-4]
Figure pct00025
[표 19-5]
Figure pct00026
FcγRIIb와 비교하여 FcγRIa에 대한 결합을 선택적으로 증강시키는 개변의 리스트를 나타낸다.
[표 20-1]
Figure pct00027
[표 20-2]
Figure pct00028
[표 20-3]
Figure pct00029
FcγRIIb와 비교하여 FcγRIIa(R)에 대한 결합을 선택적으로 증강시키는 개변의 리스트를 나타낸다.
[표 21-1]
Figure pct00030
[표 21-2]
Figure pct00031
[표 21-3]
Figure pct00032
FcγRIIb와 비교하여 FcγRIIa(H)에 대한 결합을 선택적으로 증강시키는 개변의 리스트를 나타낸다.
[표 22-1]
Figure pct00033
[표 22-2]
Figure pct00034
[표 22-3]
Figure pct00035
FcγRIIb와 비교하여 FcγRIIIa에 대한 결합을 선택적으로 증강시키는 개변의 리스트를 나타낸다.
한편, 유일한 억제형 FcγR인 FcγRIIb는 자기면역 질환이나 염증성 질환에 있어서 중요한 역할을 하고 있다(J.Exp.Med., 203, 2157-2164, 2006, J.immunol., 178, 3272-3280, 2007). FcγRIIb에 대한 결합활성을 증강시킨 Fc영역을 갖는 항체가 B세포가 병인으로 되어 있는 자기면역 질환의 치료에 유효할 가능성도 나타내어져 있다(Mol. Immunology 45, 3926-3933, 2008). 자기면역 질환이나 염증성 질환의 치료를 목적으로 한 항체의 경우, 활성형 FcγR을 매개로 한 ADCC 활성이나 ADCP 활성이 병태를 악화시킬 가능성이 있기 때문에, 활성형 FcγR에 대한 결합활성은 가능한 한 감소시키고, 억제형 FcγR에 대한 결합활성을 증강시키는 것이 바람직하다. 구체적으로는 도 24의 c의 영역에 존재하는 개변과 같이, 억제형 FcγR에 대한 결합활성을 천연형 항체와 비교하여 증강시키고, 활성형 FcγR에 대한 결합활성을 감소시키는 효과가 있는 것이 바람직하다. 이러한 개변은 억제형 FcγR에 선택적으로 결합 증강시키는 효과가 있다고 할 수 있다. 또한 도 25의 d의 영역에 존재하는 개변과 같이, 억제형 FcγR에 대한 결합활성과 활성형 FcγR에 대한 결합활성의 비율이 천연형 항체와 비교하여 크게 하는 효과가 있는 것이 바람직하다. 이러한 개변은 활성형 FcγR과 비교하여 억제형 FcγR에 대해 선택적으로 결합활성을 증강시킨 개변이라 할 수 있다.
이에 전술한 각 헤테로이량화 항체의 억제형 FcγR 및 활성형 FcγR에 대한 결합활성의 비율을 평가한 도 26, 도 27, 도 28, 도 29를 사용하여, 각 도면 중의 개변에 대해서 도 24, 도 25의 c 및 d에 대응하는 영역에 존재하는 개변의 리스트를 각각 표 23(표 23-1 및 23-2), 표 24(표 24-1 및 24-2), 표 25(표 25-1~25-3), 표 26(표 26-1~26-4)에 정리하였다.
[표 23-1]
Figure pct00036
[표 23-2]
Figure pct00037
FcγRIa와 비교하여 FcγRIIb에 대해 선택적으로 결합 증강시킨 개변의 리스트를 나타낸다.
[표 24-1]
Figure pct00038
[표 24-2]
Figure pct00039
FcγRIIa(R)과 비교하여 FcγRIIb에 대해 선택적으로 결합 증강시킨 개변의 리스트를 나타낸다.
[표 25-1]
Figure pct00040
[표 25-2]
Figure pct00041
[표 25-3]
Figure pct00042
FcγRIIa(H)와 비교하여 FcγRIIb에 대해 선택적으로 결합 증강시킨 개변의 리스트를 나타낸다.
[표 26-1]
Figure pct00043
[표 26-2]
Figure pct00044
[표 26-3]
Figure pct00045
[표 26-4]
Figure pct00046
FcγRIIIa와 비교하여 FcγRIIb에 대해 선택적으로 결합 증강시킨 개변의 리스트를 나타낸다.
〔실시예 9〕헤테로이량화 항체의 물리화학적 안정성의 평가
　항체를 의약품으로서 개발할 때에는 고도의 물리화학적 안정성을 갖는 것도 기대된다. 예를 들면 상기에서 언급한 S239D, A330L, I332E를 항체의 양쇄에 도입한 개변의 경우, 이 개변을 도입하면 항체의 Fc영역이 열역학적으로 불안정해지는 것이 보고되어 있고, 열안정성의 저하는 의약품으로서의 개발을 곤란하게 한다(Molecular Immunology, 45, 1872-1882, 2008). 항체의 의약품으로서의 유용성 및 개발의 용이함을 높이기 위해서는, FcγR에 대한 결합활성을 증강시키는 한편으로 물리화학적인 안정성을 유지하는 것도 중요하다. 호모이량화 항체의 경우는 개변을 양 H쇄에 도입하기 때문에, 1종류의 개변을 도입하면 항체 1분자당 2개소 개변을 도입하게 된다. 그러나, 헤테로이량화 항체의 경우는 각 H쇄에 대해 개변의 도입 여부를 선택할 수 있기 때문에, 1종류의 개변을 도입한다 하더라도 항체 1분자당 1개소 개변을 도입하는데 그치게 하는 것이 가능하다. 실시예 7에서 고찰한 바와 같이, 개변의 종류에 따라서는 FcγRIIIa에 대한 결합활성의 증강 효과에 관해서는 한쪽 H쇄에 도입하면 충분한 경우가 있다. 가령 그 개변이 항체의 물리화학적인 안정성을 감소시키는 효과를 가지고 있었던 경우에는, 한쪽 H쇄에만 그 개변을 도입함으로써 FcγRIIIa에 대한 결합활성 증강 효과를 부여하는 한편으로, 항체의 물리화학적인 불안정화를 최소한으로 억제하는 것이 가능할 것으로 생각된다.
이 가설을 검증하기 위해 S239D, A330L, I332E의 어느 잔기가 실제로 CH2영역의 불안정화에 기여하고 있는지를 검토하였다. S239D, A330L, I332E의 개변을 각각 GpH7-B3에 도입한 GpH7-B3-06-09D(서열번호：37), GpH7-B3-20-08L(서열번호：38), GpH7-B3-22-10E(서열번호：39)를 삽입한 발현 벡터를 참고 실시예 1의 방법에 따라 제작하고, L쇄로서 GpL16-k0를 사용하여 참고 실시예 1의 방법으로 목적의 항체를 발현, 조제하였다. 또한 대조로서 개변을 가하지 않은 GpH7-B3와 GpL16-k0를 사용하여 목적의 항체를 발현, 조제하였다. 각 항체의 CH2영역의 Tm을 참고 실시예 5의 방법에 따라 Thermal shift assay에 의해 비교하였다(표 27). 또한 이하에서는 특별히 언급하지 않는 한 Tm이란 CH2영역의 Tm을 가리킨다.
Figure pct00047
샘플의 항목에는 항체의 명칭, H의 항목에는 각 항체의 H쇄 불변영역의 명칭, 변이개소의 항목에는 GpH7-B3/GpL16-k0와 비교하여 상이한 변이(특히 변이가 없는 경우에는 「-」), Tm의 항목에는 각 항체의 Tm, △Tm의 항목에는 각 항체의 Tm과 GpH7-B3/GpL16-k0의 Tm의 차를 표기하였다. 각 항체의 H쇄, L쇄에 대응하는 아미노산 서열의 서열번호를 병기하였다.
S239D를 도입한 호모이량화 항체 GpH7-B3-06-09D/GpL16-k0, A330L을 도입한 호모이량화 항체 GpH7-B3-20-08L/GpL16-k0, I332E를 도입한 호모이량화 항체 GpH7-B3-22-10E/GpL16-k0와 GpH7-B3/GpL16-k0를 비교하면, 각각 Tm이 3℃, 1℃, 8℃ 감소되어 있었다. 이 결과로부터 이들 3개의 개변 중에서 I332E가 CH2의 Tm을 감소시키는 효과가 가장 높고, I332E가 S239D, A330L, I332E의 개변군을 도입한 항체에 있어서도 Tm의 감소에 가장 기여하고 있는 것으로 생각되었다.
I332E는 측쇄의 주위를 V240, V323, L328 등의 소수적인 아미노산에 둘러싸여 있다. I332E를 도입한 항체의 경우는 소수성이 높은 Ile로부터 친수성이 높은 Glu로 치환하고 있기 때문에, 주변 잔기와의 소수적인 상호작용이 소실되어 Fc영역의 불안정화에 기여하고 있는 것으로 생각되었다. 한편으로 실시예 7에서 고찰한 바와 같이, I332E는 한쪽 H쇄에서만 FcγRIIIa와 상호작용하고 있다. 그 때문에 FcγRIIIa와의 상호작용에 관여하고 있지 않은 다른 한쪽 H쇄의 I332에 대해서는 Ile 그대로 함으로써 FcγRIIIa에 대한 결합의 증강 효과를 부여하면서도 열역학적인 안정성을 유지하는 것이 가능할 것으로 생각되었다. 이에 I332E를 한쪽 H쇄에만 도입함으로써 양쇄에 도입한 경우에 비해 Tm이 상승하는지를 검증하였다. I332E를 GpH7-A5에 도입한 GpH7-A44(서열번호：49), GpH7-B3에 도입한 GpH7-B80(서열번호：50)을 삽입한 발현 벡터를 제작하고, GpH7-B3, GpH7-A5, GpL16-k0와 조합하여 I332E를 한쪽 H쇄에만 도입한 헤테로이량화 항체 GpH7-A5/GpH7-B80/GpL16-k0, GpH7-A44/GpH7-B3/GpL16-k0, I332E를 양 H쇄에 도입한 호모이량화 항체 GpH7-A44/GpH7-B80/GpL16-k0를 참고 실시예 1의 방법에 따라 각각 발현, 조제하였다. 대조로서 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0를 조제하였다. 각 항체의 FcγRIIIa에 대한 결합활성을 참고 실시예 2의 방법에 따라 평가하였다. 또한 각 항체의 CH2영역의 Tm을 참고 실시예 5의 방법에 따라 Thermal shift assay에 의해 비교하였다(표 28 및 표 29).
Figure pct00048
샘플의 항목에는 항체의 명칭, H1, H2의 항목에는 각 항체의 H쇄 불변영역의 명칭, 변이개소의 항목에는 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0와 비교하여 상이한 변이(특히 변이가 없는 경우에는 「-」)를 표기하였다. GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0의 FcγRIIIa에 대한 KD를 각 항체의 KD로 나눈 값을 KD ratio로 하였다. 각 항체의 H쇄, L쇄에 대응하는 아미노산 서열의 서열번호를 병기하였다.
Figure pct00049
I332E를 한쪽 H쇄에 치환한 항체 및 양쇄에 치환한 항체의 CH2의 Tm을 나타낸다.
샘플의 항목에는 항체의 명칭, H1, H2의 항목에는 각 항체의 H쇄 불변영역의 명칭, 변이개소의 항목에는 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0와 비교하여 상이한 변이(특히 변이가 없는 경우에는 「-」), Tm의 항목에는 각 항체의 Tm, △Tm의 항목에는 각 항체의 Tm과 GpH7-B3/GpL16-k0의 Tm의 차를 표기하였다. 각 항체의 H쇄, L쇄에 대응하는 아미노산 서열의 서열번호를 병기하였다.
표 28의 결과로부터 I332E를 한쪽 H쇄에만 도입한 헤테로이량화 항체 GpH7-A5/GpH7-B80/GpL16-k0의 경우는 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0와 비교하여 FcγRIIIa에 대한 결합활성이 약 3배 및 GpH7-A44/GpH7-B3/GpL16-k0의 경우는 약 4배 증강되어 있었다. 이 사실로부터 GpH7-A5 또는 GpH7-B3 중 어느 것에 I332E를 도입하더라도 I332E의 FcγRIIIa 결합활성 증강 효과는 크게 변하지 않을 것으로 생각되었다. 또한 I332E를 양 H쇄에 도입한 GpH7-A44/GpH7-B80/GpL16-k0의 경우는 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0와 비교하여 FcγRIIIa에 대한 결합활성이 약 7배 증강되어 있었다. 이들 결과로부터 I332E는 그 입체구조로부터 고찰한 바와 같이, 양 H쇄에 도입하지 않더라도 한쪽 H쇄에만 도입한 것만으로도 충분히 FcγRIIIa에 대한 결합활성 증강 효과를 갖는 것이 명확해졌다.
다음으로 표 29의 결과로부터 I332E를 한쪽 H쇄에만 도입한 헤테로이량화 항체 GpH7-A5/GpH7-B80/GpL16-k0와 GpH7-A44/GpH7-B3/GpL16-k0의 경우는 모두 그 모체 Fc분자(parental Fc molecule)인 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0로부터 Tm이 4℃ 감소되어 있었던 것으로부터, GpH7-A5 또는 GpH7-B3 중 어느 것에 I332E를 도입해도 I332E의 항체의 Tm에 미치는 영향은 변하지 않을 것으로 생각되었다. 한편으로 I332E를 양 H쇄에 도입한 호모이량화 항체 GpH7-A44/GpH7-B80/GpL16-k0의 경우는 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0로부터 Tm이 10℃ 감소되어 있었다. I332E를 한쪽 H쇄에만 도입한 헤테로이량화 항체는 I332E를 양 H쇄에 도입한 호모이량화 항체보다도 Tm이 6℃ 높게 유지되어 있었다. 이 결과로부터 I332E를 양 H쇄가 아니라 한쪽 H쇄에만 도입한 헤테로이량화 항체를 사용함으로써, Tm의 저하 억제가 가능한 것이 명확해졌다. 헤테로이량화 항체는 항체의 물리화학적인 안정성을 유지하기 위해서도 유용한 기술인 것을 나타내고 있다.
I332E의 개변은 FcγRIIIa에 대한 결합 증강 효과에 대해서는 우수하지만, 종래의 호모이량화 항체를 사용한 경우에는 열역학적인 안정성을 현저히 손상시켜 버려, 항체를 의약품으로서 사용하는 경우에 문제가 될 것으로 생각되었다. 그러나, 표 28 및 표 29의 결과로부터 헤테로이량화 항체를 사용함으로써, I332E의 FcγRIIIa에 대한 결합 증강 활성을 이용하면서도 항체의 물리화학적인 안정성을 유지하는 것이 가능해지는 것이 나타내어졌다. 이 결과로부터 헤테로이량화 항체는 항체의 FcγR 결합활성과 항체의 물리화학적인 안정성을 보다 정밀하고 치밀하게 조정하기에 우수한 기술이라고 생각된다.
GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0는 S239D, A330L, I332E를 한쪽 H쇄에만 갖기 때문에 S239D, A330L, I332E를 양쪽 H쇄에 갖는 GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0와 비교하여 Tm을 높게 유지하고 있을 가능성이 있다. 이에 실시예 7에 나타낸 L234Y, G236W, S298A의 개변군과 S239D, A330L, I332E의 개변군을 각각 조합한 헤테로이량화 항체, 호모이량화 항체의 Tm의 측정을 참고 실시예 5에 기재된 방법에 따라 실시하였다.
이를 검증하기 위해 한쪽 H쇄에 L234Y, G236W, S298A의 개변군을, 다른 한쪽 H쇄에 S239D, A330L, I332E의 개변군을 도입한 헤테로이량화 항체 GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0, L234Y, G236W, S298A의 개변군만을 한쪽 H쇄에 도입한 헤테로이량화 항체 GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0, 양 H쇄에 도입한 호모이량화 항체 GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0, S239D, A330L, I332E만을 한쪽 H쇄에 도입한 헤테로이량화 항체 GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0, 양 H쇄에 도입한 호모이량화 항체 GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0를 참고 실시예 1의 방법에 따라 조제하였다. 각 항체의 CH2영역의 Tm을 참고 실시예 5의 방법에 따라 Thermal shift assay에 의해 비교하고, L234Y, G236W, S298A와 S239D, A330L, I332E의 조합의 Tm에 미치는 영향을 검토하였다(표 30).
Figure pct00050
샘플의 항목에는 항체의 명칭, H1, H2의 항목에는 각 항체의 H쇄 불변영역의 명칭, 변이개소의 항목에는 GpH7-G1d/GpL16-k0와 비교하여 상이한 변이(특히 변이가 없는 경우에는 「-」), Tm의 항목에는 각 항체의 Tm, △Tm의 항목에는 각 항체의 Tm과 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0의 Tm의 차를 표기하였다. 각 항체의 H쇄, L쇄에 대응하는 아미노산 서열의 서열번호를 병기하였다.
헤테로이량화 항체 형성 효율을 높이는 개변 D356K/H435R 및 K439E를 도입한 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0를 천연형 IgG1인 GpH7-G1d/GpL16-k0와 비교하면, CH2의 Tm의 저하는 1℃였다.
종래기술인 호모이량화 항체에 대해서 각 개변군의 효과를 검증하였다. S239D, A330L, I332E를 양 H쇄에 도입한 호모이량화 항체 GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0의 경우는 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0와 비교하여 Tm이 20℃ 저하되고, L234Y, G236W, S298A의 개변군을 양 H쇄에 도입한 호모이량화 항체 GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0의 경우는 Tm의 저하가 관찰되지 않은 것으로부터, 호모이량화 항체에 있어서는 L234Y, G236W, S298A의 개변군 자체에는 Tm을 저감시키는 효과가 없는 것으로 생각되었다.
각 개변군을 한쪽 H쇄에만 도입한 헤테로이량화 항체에 대해서 각 개변군의 효과를 검증하였다. S239D, A330L, I332E를 한쪽 H쇄에 도입한 헤테로이량화 항체 GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0의 경우는 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0와 비교하여 Tm이 8℃ 저하되고, L234Y, G236W, S298A를 한쪽 H쇄에 도입한 헤테로이량화 항체 GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0의 경우는 Tm의 저하는 관찰되지 않았다. 이 결과로부터 헤테로이량화 항체에 있어서도 L234Y, G236W, S298A의 개변군 자체에는 Tm을 저감시키는 효과가 없는 것으로 생각되었다.
S239D, A330L, I332E를 양 H쇄에 도입한 GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0의 경우는 천연형 IgG1과 비교하여 Tm이 21℃ 감소되어 있었으나, 한쪽 H쇄에만 S239D, A330L, I332E의 개변을 갖는 GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0의 경우는 Tm은 60℃로, 호모이량화 항체보다도 10℃ 이상 높은 Tm을 유지하고 있었다. 실시예 7의 표 13으로부터 S239D, A330L, I332E의 호모이량화 항체 쪽이 헤테로이량화 항체보다도 약 9배 FcγRIIIa에 대한 결합이 증강되어 있었다. S239D, A330L, I332E는 양 H쇄에 도입함으로써 FcγRIIIa에 대한 결합을 크게 증강시키나, Tm도 현저히 저하시켜 버린다.
다음으로 L234Y, G236W, S298A를 양 H쇄에 도입한 GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0의 경우는 천연형 항체와 비교하여 Tm이 1℃만 감소되어 있어, 이는 L234Y, G236W, S298A에 의한 Tm의 감소가 아니라, 앞서 고찰한 바와 같이 헤테로이량화 항체를 만들기 위해 이용한 D356K/H435R 및 K439E의 영향으로 생각되었다. 이는 L234Y, G236W, S298A를 한쪽 H쇄에 도입한 GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0에서도 마찬가지로 Tm이 1℃밖에 감소되어 있지 않은 것으로부터도 나타내어진다.
마지막으로 L234Y, G236W, S298A를 한쪽 H쇄에, S239D, A330L, I332E를 다른 한쪽 H쇄에 갖는 GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0의 Tm은 천연형 항체로부터 10℃ 저하되어 있어, S239D, A330L, I332E를 한쪽 H쇄에 도입한 GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0와 거의 동일하다. 그러나 실시예 7의 표 13으로부터 GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0는 GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0보다도 FcγRIIIa에 대한 결합이 10배 이상 증강되어 있다.
즉 L234Y, G236W, S298A를 한쪽 H쇄로, S239D, A330L, I332E를 다른 한쪽 H쇄에 한 헤테로이량화 항체 GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0를 사용함으로써, S239D, A330L, I332E의 호모이량화 항체 GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0와 비교하여, FcγRIIIa에 대한 결합을 증강시킬 수 있을 뿐 아니라 Tm도 10℃ 이상 향상시키는 것이 가능한 것이 명확해졌다.
다음으로 상기 Tm을 측정한 샘플에 대해서 추가로 열역학적인 안정성을 참고 실시예 6에 기재된 열가속시험(40℃　2주간 또는 4주간)에 의해 평가하였다(도 30).
GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0와 천연형 항체 GpH7-G1d/GpH7-G1d/GpL16-k0를 비교하면, 4주간 후에 전자는 1.27%, 후자는 1.8%로 단량체 비율이 감소되어 있고, 커다란 차이는 확인되지 않았다. 즉 헤테로이량화 항체를 조제하는데 사용하고 있는 개변 D356K/H435R 및 K439E가 열가속시험에 있어서의 단량체 비율의 변화에 미치는 영향은 거의 없는 것으로 생각되었다.
S239D, A330L, I332E를 양 H쇄에 도입한 GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0의 경우는 4주간 후에는 약 16% 단량체 비율이 감소되어 있었던 것에 대해, 한쪽 H쇄에만 S239D, A330L, I332E의 개변을 갖는 GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0의 경우는 4주간 후에는 9.63% 단량체 비율이 감소되어 있었다. 즉 S239D, A330L, I332E를 한쪽 H쇄에만 도입한 헤테로이량화 항체를 사용함으로써, 보다 안정하게 단량체 비율을 유지하는 효과가 있는 것이 명확해졌다.
다음으로 L234Y, G236W, S298A를 양 H쇄에 도입한 GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0 및 한쪽 H쇄에 도입한 GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0의 경우는 4주간 후에 1.78%, 1.42% 단량체 비율이 감소될 뿐, 모두 천연형 항체와 비교하여 단량체 비율의 변화에 명확한 차이를 발견할 수 없었다. 즉 L234Y, G236W, S298A는 한쪽 H쇄에 도입하더라도, 양쇄에 도입하더라도 열가속시험에 있어서의 단량체 비율에는 영향을 미치지 않는 것으로 생각되었다.
마지막으로 L234Y, G236W, S298A를 한쪽 H쇄에, S239D, A330L, I332E를 다른 한쪽 H쇄에 갖는 GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0의 경우는 4주간 후에 2.47% 단량체 비율이 감소되어 있어, 천연형 항체의 1.86%보다도 단량체 비율이 약간 감소될 뿐이었다. 즉 L234Y, G236W, S298A를 한쪽 H쇄에, S239D, A330L, I332E를 다른 한쪽 H쇄로 한 헤테로이량화 항체 GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0를 사용함으로써, S239D, A330L, I332E의 호모이량화 항체 GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0와 비교하여, FcγRIIIa에 대한 결합을 증강시킬 수 있을 뿐 아니라, 열가속시험에 있어서도 단량체 비율을 높게 유지하는 효과를 초래하는 것이 가능한 것이 명확해졌다.
즉 헤테로이량화 항체는 통상의 호모이량화 항체와 비교하여 FcγR에 대한 결합을 증강시킬 수 있을 뿐 아니라, 안정성도 개선함으로써 항체의 의약품으로서의 가치를 호모이량화 항체보다도 더욱 높일 수 있는 기술인 것이 나타내어졌다.
〔실시예 10〕FcγR에 대한 결합이 향상되고 안정성을 저하시키지 않는 개변의 탐색
실시예 9에 기재한 바와 같이, H쇄에 개변을 도입하면 FcγR에 대한 결합활성을 증강시키나, CH2의 물리화학적인 안정성, 즉 Tm을 저하시킬 가능성이 있다. 그러나 실시예 9에서 기술한 바와 같이, 특히 항체를 의약품으로서 사용하는 경우에는 그러한 성질은 바람직하지 않다. 실시예 9에서 기술한 바와 같이, FcγR에 대한 결합활성을 증강시키는 한편으로, CH2의 불안정화를 억제하기 위해서는 한쪽 H쇄에만 개변을 도입하는 헤테로이량화 항체를 사용하는 것이 유용하다. 즉 도 21의 ii 및 iii의 영역에 해당하는 종래의 호모이량화 항체에 있어서도 FcγR에 대한 결합활성의 증강이 관찰되고 있었음에도 불구하고, 호모이량화 항체에 있어서는 Tm이 저하되어 버린 개변에 대해서는 헤테로이량화함으로써 천연형 항체와 비교하여 FcγR에 대한 결합활성은 증강되어 호모이량화 항체보다도 Tm을 향상시키는 것이 가능하다.
이러한 개변을 발견하기 위해, 도 21의 ii, iii에 있는 영역의 호모이량화 항체의 Tm을 참고 실시예 5의 방법에 따라 측정하고, Tm이 천연형 항체와 비교하여 저하된 개변의 리스트를 표 31~35에 정리하였다.
표 31(표 31-1~31-3)에 영역ii, iii에서 Tm이 68℃ 이하인 Ia의 데이터, 표 32(표 32-1 및 32-2)에 영역ii, iii에서 Tm이 68℃ 이하인 IIaR의 데이터, 표 33(표 33-1 및 33-2)에 영역ii, iii에서 Tm이 68℃ 이하인 IIaH의 데이터, 표 34(표 34-1 및 표 34-2)에 영역ii, iii에서 Tm이 68℃ 이하인 IIb의 데이터, 표 35(표 35-1 및 35-2)에 영역ii, iii에서 Tm이 68℃ 이하인 IIIa의 데이터를 나타낸다.
이들 개변을 한쪽 H쇄에만 도입한 헤테로이량화 항체를 사용함으로써 천연형 항체와 비교하여 FcγR에 대한 결합이 향상되고, 또한 안정성이 크게 저하되지 않는 항체를 제작할 수 있을 가능성이 있다.
[표 31-1]
Figure pct00051
[표 31-2]
Figure pct00052
[표 31-3]
Figure pct00053
[표 32-1]
Figure pct00054
[표 32-2]
Figure pct00055
[표 33-1]
Figure pct00056
[표 33-2]
Figure pct00057
[표 34-1]
Figure pct00058
[표 34-2]
Figure pct00059
[표 35-1]
Figure pct00060
[표 35-2]
Figure pct00061
〔실시예 11〕FcγRIIIa에 대한 인식능을 향상시킨 헤테로이량화 항체의 ADCC 활성의 측정
실시예 7에서 고찰한 바와 같이, 헤테로이량화 항체를 사용함으로써 종래의 호모이량화 항체 기술에 의해 창제된 개변체보다도 FcγRIIIa에 대한 결합활성을 증강시키는데 성공하였다. 항체는 FcγRIIIa를 매개로 NK세포를 유도하고, 표적 항원을 발현하는 세포에 대한 항체 의존적 세포상해활성을 발휘한다. 헤테로이량화 항체에 있어서 FcγRIIIa에 대한 결합활성뿐 아니라 ADCC 활성도 동일하게 증강되고 있는 것을 확인하기 위해, 실시예 7의 표 13에 기재한 FcγRIIIa에 대한 결합활성이 상승된 헤테로이량화 항체, 호모이량화 항체 및 천연형 IgG1에 대해서 참고 실시예 7의 방법에 따라 ADCC 활성을 측정하였다. 결과를 도 31에 나타낸다.
도 31의 결과로부터, 천연형 IgG1인 GpH7-G1d/GpL16-k0와, D356K, H435R 및 K439E를 각각 한쪽 H쇄에 도입한 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0를 비교하면, 그 ADCC 활성에는 커다란 차이는 관찰되지 않았다. 이 사실로부터 D356K, H435R 및 K439E의 개변은 ADCC 활성에 대해 영향을 미치지 않는 것으로 생각되었다.
다음으로 종래대로 FcγRIIIa에 대한 결합활성을 증강시키는 개변을 항체의 양 H쇄에 동일하게 도입한 호모이량화 항체에 대해서, 그 결합 증강 효과가 ADCC 활성에 있어서도 동일한 경향이 관찰되는지를 검증하였다. L234Y, G236W, S298A를 양 H쇄에 도입한 GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0와, S239D, A330L, I332E를 양 H쇄에 도입한 GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0를 비교하였다. FcγRIIIa에 대한 결합활성에 관해서는 GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0의 경우는 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0와 비교하여 현저히 결합이 증강되어 있었으나, GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0의 경우는 결합이 저하되어 있었다. ADCC 활성에 있어서도 GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0는 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0보다도 활성이 상승되어 있었으나, GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0는 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0보다도 활성이 감소되어 있었다. 이와 같이 호모이량화 항체에 대해서는 FcγRIIIa에 대한 결합활성의 강도와 ADCC 활성의 강도에 상관관계가 관찰되었다.
다음으로 항체의 한쪽 H쇄에만 FcγRIIIa에 대한 결합활성을 증강시키는 개변을 도입한 헤테로이량화 항체에 대해서, 그 결합 증강 효과가 ADCC 활성에 있어서도 동일한 경향이 관찰되는지를 검증하였다. L234Y, G236W, S298A를 한쪽 H쇄에 도입한 GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0와, S239D, A330L, I332E를 한쪽 H쇄에 도입한 GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0를 비교하였다. FcγRIIIa에 대한 결합활성에 관해서는 GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0와 GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0 모두 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0와 비교하여 증강되어 있어, ADCC 활성에 있어서도 동일한 경향이 관찰되었다. 이에 더하여, GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0 쪽이 GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0보다도 FcγRIIIa에 대한 결합활성이 증강되어 있는데, ADCC 활성에 있어서도 동일한 경향이 유지되어 있어, 호모이량화 항체와 마찬가지로 헤테로이량화 항체에 있어서도 FcγRIIIa에 대한 결합활성의 강도와 ADCC 활성의 강도에 상관관계가 있는 것이 나타내어졌다.
다음으로 L234Y, G236W, S298A 및 S239D, A330L, I332E의 각 개변군에 대해서, 각각의 헤테로이량화 항체, 호모이량화 항체에 있어서의 FcγRIIIa에 대한 결합활성과 ADCC 활성 증강 효과에 상관관계가 관찰되는지 검증하였다. 먼저 S239D, A330L, I332E의 개변군을 한쪽 H쇄에만 도입한 헤테로이량화 항체인 GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0와 양 H쇄에 도입한 호모이량화 항체인 GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0를 비교하면, FcγRIIIa에 대한 결합활성에 관해서는 헤테로이량화 항체보다도 호모이량화 항체 쪽이 결합을 증강시키는 효과는 높았지만, ADCC 활성에 관하여 차는 확인되지 않았다. 다음으로 L234Y, G236W, S298A의 개변군을 한쪽 H쇄에만 도입한 헤테로이량화 항체인 GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0와 양 H쇄에 도입한 호모이량화 항체인 GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0를 비교하면, FcγRIIIa에 대한 결합활성에 관해서는 헤테로이량화 항체 쪽이 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0보다도 결합을 증강시키고 있는 것에 대해 호모이량화 항체의 경우는 결합이 감소되어 있었다. ADCC 활성에 대해서도 동일한 경향이 관찰되었다. 이 사실로부터 L234Y, G236W, S298A의 개변군이 갖는 FcγRIIIa에 대한 결합활성을 일방향에서만 증강시킨다는 효과가 ADCC 활성에도 반영된 것으로 생각되었다. 이들 결과로부터 어떤 개변군을 한쪽 H쇄에만 도입한 헤테로이량화 항체와 양 H쇄에 도입한 호모이량화 항체의 FcγRIIIa에 대한 결합활성의 강도와 ADCC 활성의 강도에 상관관계가 있는 것으로 생각되었다.
다음으로 L234Y, G236W, S298A를 한쪽 H쇄에, S239D, A330L, I332E를 다른 한쪽 H쇄에 도입한 헤테로이량화 항체인 GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0와 S239D, A330L, I332E를 양 H쇄에 도입한 호모이량화 항체인 GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0를 비교하였다. FcγRIIIa에 대한 결합활성에 관해서는 모두 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0와 비교하여 현저히 증강되어 있고, ADCC 활성에 있어서도 동일한 경향이 관찰되었다. 이에 더하여 GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0 쪽이 GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0보다도 FcγRIIIa에 대한 결합활성이 증강되어 있고, ADCC 활성에 있어서도 GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0 쪽이 강한 ADCC 활성을 나타내고 있었다.
전술한 바와 같이 L234Y, G236W, S298A와 S239D, A330L, I332E의 각 개변군에 대해서는 각각을 한쪽 H쇄에 도입한 경우에도, 양 H쇄에 도입한 경우에도, 후자인 S239D, A330L, I332E의 개변군 쪽이 ADCC 활성을 보다 증강시키는 효과가 관찰되고 있었다. 그러나 L234Y, G236W, S298A와 S239D, A330L, I332E의 각 개변군을 상이한 H쇄에 도입함으로써, 헤테로이량화 항체 및 호모이량화 항체의 각각에 있어서 ADCC 활성 증강 효과가 높은 S239D, A330L, I332E를 양 H쇄에 가하는 것보다도 ADCC 활성 증강 효과를 나타내는 것이 명확해졌다.
즉 종래기술인 호모이량화 항체에서 관찰되어 온 바와 같은 FcγRIIIa에 대한 결합활성의 강도와 ADCC 활성의 강도의 상관관계는 헤테로이량화 항체끼리의 비교, 헤테로이량화 항체와 호모이량화 항체의 비교 모두 동일하게 관찰되는 것이 명확해졌다. 이 사실로부터 헤테로이량화 항체기술을 이용함으로써 종래기술보다도 우수한 ADCC 활성을 갖는 항체를 창제하는 것이 가능한 것이 명확해졌다.
〔실시예 12〕FcγRIIa에 있어서의 종래의 호모이량화 항체와 신규 헤테로이량화 항체의 비교
실시예 1에서 기술한 바와 같이, FcγRIIIa는 항체 의약의 약효에 있어서 중요한 역할을 하고 있는 것으로 생각되고 있다. 또한 FcγRIIIa에 더하여 IgG1 유래의 항체 의약의 약효에 있어서 FcγRIIa가 하는 역할도 주목되고 있다.
FcγRIIa에는 131번째의 아미노산이 Arg 또는 His인 R형, H형으로 각각 불리는 알로타입이 존재하여, 각각 인간 IgG2에 대한 결합활성이 상이한 것이 알려져 있다(Tissue Antigens 2003: 61: 189-202). 이 FcγRIIa의 알로타입의 차이에 의해 감염증으로 이환(罹患)되기 쉬움이 상이한 것이 알려져 있다(Tissue Antigens 2003: 61: 189-202). 이는 알로타입의 차이에 의해 FcγRIIa와 IgG2에 대한 결합활성이 상이한 결과, IgG2를 매개로 한 병원체에 대한 저항 메커니즘이 상이한 것에 기인하기 때문으로 생각된다(Infection and Immunitiy 1995: 63: 73-81). 또한 마우스 FcγRIV는 인간 FcγRIIa와 발현 세포가 대응하는 것이 알려져 있으나, 이 FcγRIV가 항CD20 항체의 마우스 모델에 있어서의 약효에 중요한 역할을 하는 것이 보고되어 있다. 이 사실로부터 인간에 있어서는 FcγRIIa가 동일한 역할을 하고 있는 것은 아닌가 추찰된다(The Journal of Experimental Medicine 2004: 199: 1659-1669, The Journal of Experimental Medicine 2006: 203: 743-753, Immunity 2005: 23: 41-51). 실제로 항체의 Fc영역의 FcγRIIa에 대한 결합활성을 IgG1보다 증강시킨 항체는 IgG1에 비해 macrophage를 매개로 한 항체 의존적 세포탐식활성(ADCP 활성)이 증강되는 것이 보고되어 있다(Molecular Cancer Therapeutics 2008: 7: 2517-2527). 또한 ADCP가 증강된 Fc영역을 갖는 항CD19 항체는 mouse xenograft model에 있어서도 IgG1보다 강한 항종양효과를 나타내고 있다(Nature Medicine 2000: 6: 443-446). 이 항체의 Fc영역은 원숭이의 FcγRIIa에 대한 결합활성도 증강시키고 있다. CD19는 B세포 표면에 발현하고 있는데, 이 항체를 원숭이에게 투여하면 IgG1의 Fc영역을 갖는 항CD19 항체와 비교하여 B세포의 소실이 증강되는 것이 보고되어 있다(Science 2005: 310: 1510-1512).
이들 보고로부터 FcγRIIIa에 대한 결합활성을 증강시키는 것에 더하여 FcγRIIa에 대한 결합활성도 증강시킴으로써 항체 의약의 약효, 특히 항종양효과의 추가적인 향상이 기대된다. 이러한 특징을 갖는 항체는 종래기술을 사용하여 과거에 제작되어 있었다(Molecular Cancer Therapeutics 2008: 7: 2517-2527). 그러나 FcγRIIa도 항체의 Fc영역과는 비대칭으로 결합하는 것으로 생각되기 때문에, 실시예 11에서 고찰한 것과 마찬가지로 헤테로이량화 항체 기술을 사용함으로써 FcγRIIa에 대한 결합활성을 한층 더 증강시키는 것이 가능할 것으로 생각된다. 이를 검증하기 위해, 실시예 4의 결과로부터 천연형 IgG와 비교하여 FcγRIIIa 및 FcgRIIa R형, H형 모두에 결합활성이 증강되는 개변을 선택하고, 그들을 조합하여 FcγRIIIa 및 FcgRIIa R형, H형 모두에 결합활성이 증강된 변이를 도입하고, FcγR에 대한 결합이 상이한 H쇄를 조합한 헤테로이량화 항체를 제작하여, 그 각 FcγR에 대한 결합활성을 평가하였다.
또한 이들 활성형 FcγR과 대조적으로 억제형 FcγR인 FcγRIIb는 면역반응을 억제하는 세포내 시그날을 유발한다. FcγRIIb를 녹아웃한 마우스에 있어서는, 항체의 항종양효과가 항진하거나(Nature Medicine 2000: 6: 443-446) 또는 항체를 매개로 한 B세포의 소실이 촉진된다(The Journal of Experimental Medicine 2006: 203: 743-753)는 보고가 되어 있는 것으로부터, FcγRIIb의 항체의 생체내에 있어서의 약효에 중요한 역할을 하고 있는 것이 나타내어져 있다. 또한 마우스 IgG 서브클래스의 항종양효과와 각 IgG 서브클래스의 활성형 FcγR과 억제형 FcγR에 대한 결합의 비율(A/I ratio) 사이에는 상관관계가 관찰되고 있다(Science 2005: 310: 1510-1512). 이들 보고로부터 A/I ratio가 항체의 면역을 매개로 한 이펙터 기능에 중요하다고 생각된다. 즉 A/I ratio가 높은 항체를 창제하면 그 이펙터 기능이 증강되어 유용할 것으로 생각된다. 그러나 활성형 FcγR인 FcγRIIa와 억제형 FcγR인 FcγRIIb는 그 세포외 도메인에 있어서 93%의 서열 상동성이 있어 서열 상동성이 매우 높기 때문에, FcγRIIa에 대한 결합활성을 증강시키면서도 FcγIIb에 대한 결합활성을 증강시키지 않고 A/I ratio를 높게 하는 것은 매우 곤란할 것으로 예상되었다. FcγRIIb와 항체의 Fc영역은 FcγRIIIa, FcγRIIa와 동일하게 비대칭으로 결합하는 것으로 생각된다. 종래기술의 경우는, 항체의 양 H쇄에 동일한 개변을 도입함으로써만 FcγR과의 상호작용을 제어할 수 있었으나, 헤테로이량화 항체 기술을 사용하면 보다 정밀하고 치밀한 제어가 가능해지고, 더 나아가서는 서열이 매우 유사한 FcγRIIa와 FcγRIIb의 A/I ratio도 향상시킬 수 있을 것으로 생각되었다. 이에 이 점에 대해서도 헤테로이량화 항체 기술이 종래기술과 비교하여 우수한지를 검증하였다.
여기에서의 검토에서는 헤테로이량화 항체를 효율적으로 형성시키기 위해 항체 H쇄 불변영역에 Knobs-into-Holes 기술을 사용하였다. Knobs-into-Holes 기술은 한쪽 H쇄의 CH3영역에 존재하는 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄(knob; 돌기)로 치환하고, 다른 한쪽 H쇄의 CH3영역에 존재하는 아미노산 측쇄를 보다 작은 측쇄(hole;공극)로 치환함으로써, 돌기가 공극 내에 배치되도록 하여 H쇄의 헤테로이량화를 촉진하고, 목적의 헤테로이량화 항체를 효율적으로 취득할 수 있는 기술이다(Nature, 372: 379-383(1994)). CH3영역에 있는 아미노산 측쇄를 보다 크게 하는 것을 목적으로 한 Y349C, T366W의 개변을 불변영역에 도입한 H쇄를 Knob쇄라 부르고, 이것에 추가로 개변을 도입한 불변영역에 대해서는 그 H쇄 불변영역의 명칭은 Kn이라는 기호로 시작하고, 그 뒤에 세자리 숫자를 붙여 Kn001과 같이 부른다. CH3영역에 있는 아미노산 측쇄를 보다 작게 하는 것을 목적으로 한 D356C, T336S, L368A, Y407V의 Hole 개변을 불변영역에 도입한 H쇄를 Hole쇄라 부르고, 이것에 추가로 개변을 도입한 것에 대해서는 그 H쇄 불변영역의 명칭은 Hl이라는 기호로 시작하고, 그 뒤에 세자리 숫자를 붙여 Hl001과 같이 부른다. 또한 항체 H쇄 불변영역의 명칭을 각각 Kn001, Hl001로 한 경우, 가변영역에 GpH7을 갖는 항체의 H쇄에 대응하는 서열은 GpH7-Kn001, GpH7-Hl001이라 부른다. 발현 후에 정제하여 얻어진 항체는, 예를 들면 헤테로이량화 항체의 발현에 사용한 항체 H쇄에 대응하는 서열이 GpH7-Kn001, 다른 하나의 항체 H쇄에 대응하는 서열이 GpH7-Hl001, 항체 L쇄에 대응하는 서열이 GpL16-k0인 경우, GpH7-Kn001/GpH7-Hl001/GpL16-k0로 표기하였다.
먼저 GpH7-G1d에 대해 Y349C, T336W의 개변을 불변영역에 도입한 GpH7-Kn033(서열번호：51), GpH7-G1d에 대해 D356C, T336S, L368A, Y407V의 개변을 불변영역에 도입한 GpH7-Hl033(서열번호：56)을 참고 실시예 1의 방법에 따라 조제하였다. 헤테로이량화 항체를 발현시킬 때에는 항체 L쇄로서는 GpL16-k0가 삽입된 발현 벡터를 사용하고, 항체 H쇄의 하나로서 Y349C, T336W의 개변을 도입한 GpH7-Kn033(서열번호：51)에 추가로 개변을 가한 서열을 삽입한 발현 벡터를 사용하며, 다른 한쪽 항체 H쇄로서 D356C, T336S, L368A, Y407V의 개변을 도입한 GpH7-Hl033(서열번호：56)에 추가로 개변을 도입한 서열을 삽입한 발현 벡터를 사용하여 헤테로이량화 항체가 효율적으로 발현하도록 하였다.
실시예 4에서 얻어진 각 개변이 항체와 각 FcγR에 대한 결합에 미치는 영향에 관한 정보를 토대로 FcγRIIIa, FcγRIIa R형, H형 모두에 대해 결합이 증강되도록 의도한 항체를 아래와 같이 제작하였다. 항체의 각 H쇄의 불변영역에 상이한 개변을 도입할 때에는 GpH7-Kn033, GpH7-Hl033을 모체 폴리펩티드로서 사용하였다. GpH7-Kn033에 L234Y, L235Y, G236A, H268D, S298A를 도입한 GpH7-Kn045(서열번호：54), L234Y, L235Y, G236A, H268D, Q295L, S298A를 도입한 GpH7-Kn056(서열번호：55), GpH7-Hl033에 G236A, S239D, A330K, I332E를 도입한 GpH7-Hl048(서열번호：59), G236A, S239D, Q295L, A330M, I332E를 도입한 GpH7-Hl055(서열번호：60)를 참고 실시예 1의 방법에 따라 제작하였다.
다음으로 아래와 같이 각 H쇄를 조합하여 참고 실시예 1에 따라 항체를 발현시켰다. H쇄로서 GpH7-Kn033, GpH7-Hl033, L쇄로서 GpL16-k0를 사용하여 G1d에 대해 Knobs-into-Holes 기술만을 적용한 GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0를 발현시켰다. H쇄로서 GpH7-Kn045, GpH7-Hl048, L쇄로서 GpL16-k0를 사용하여 헤테로이량화 항체인 GpH7-Kn045/GpH7-Hl048/GpL16-k0를 발현시켰다. H쇄로서 GpH7-Kn045, GpH7-Hl055, L쇄로서 GpL16-k0를 사용하여 헤테로이량화 항체인 GpH7-Kn045/GpH7-Hl055/GpL16-k0를 발현시켰다. H쇄로서 GpH7-Kn056, GpH7-Hl055, L쇄로서 GpL16-k0를 사용하여 헤테로이량화 항체인 GpH7-Kn056/GpH7-Hl055/GpL16-k0를 발현시켰다.
비교 대상이 되는 기존 기술을 사용한 항체(Pro. Nat. Acad. Sci., 103, 4005-4010(2006))를 참고로 하여 아래와 같이 조제하였다. FcγRIIIa, FcγRIIa R형, H형 모두에 대해 결합이 증강되는 것으로 보고되어 있는 개변 G236A/S239D/I332E를 GpH7-Kn033, GpH7-Hl033의 각각에 도입하여 GpH7-Kn037(서열번호：52), GpH7-Hl036(서열번호：57)을 제작하였다. 또한 FcγRIIIa에 대해 결합이 증강되는 것으로 보고되어 있는 개변 S239D/A330L/I332E를 GpH7-Kn033, GpH7-Hl033의 각각에 도입하여 GpH7-Kn032(서열번호：53), GpH7-Hl032(서열번호：58)를 제작하였다. 이들 H쇄를 조합하여 참고 실시예 1에 따라 항체를 발현시켰다. H쇄로서 GpH7-Kn037, GpH7-Hl036, L쇄로서 GpL16-k0를 사용하여, G1d에 대해 Knobs-into-Holes 기술만을 적용한 분자인 GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0의 양 H쇄에 G236A/S239D/I332E를 도입한 호모이량화 항체 GpH7-Kn037/GpH7-Hl036/GpL16-k0를 발현시켰다. H쇄로서 GpH7-Kn032, GpH7-Hl032, L쇄로서 GpL16-k0를 사용하여 G1d에 대해 Knobs-into-Holes 기술만을 적용한 분자인 GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0의 양 H쇄에 S239D/A330L/I332E를 도입한 호모이량화 항체 GpH7-Kn032/GpH7-Hl032/GpL16-k0를 발현시켰다.
이들 항체에 대해서 참고 실시예 2의 방법에 따라 각 FcγR에 대한 결합활성을 평가하고, 그 결과를 표 36에 정리하였다. 또한 각 항체의 KD ratio를 표 37에 FcγRIIIa에 대한 KD의 비율인 A/I ratio를 표 38에 정리하였다.
Figure pct00062
FcγRIIa, IIIa에 대한 결합 증강 헤테로이량화 항체의 각 FcγR에 대한 결합활성을 나타낸다.
샘플의 항목에는 항체의 명칭, Kn, Hl의 항목에는 각각 각 항체의 Knob쇄, Hole쇄 불변영역의 명칭, 변이개소의 항목에는 GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0와 비교하여 상이한 변이(특히 변이가 없는 경우에는 「-」)를 표기하였다.
Figure pct00063
FcγRIIa, IIIa에 대한 결합 증강 헤테로이량화 항체의 각 FcγR에 대한 결합활성을 나타낸다.
샘플의 항목에는 항체의 명칭, Kn, Hl의 항목에는 각각 각 항체의 Knob쇄, Hole쇄 불변영역의 명칭, 변이개소의 항목에는 GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0와 비교하여 상이한 변이(특히 변이가 없는 경우에는 「-」)를 표기하였다. GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0의 FcγR에 대한 KD를 각 항체의 KD로 나눈 값을 KD ratio로 하였다. 각 항체의 H쇄, L쇄에 대응하는 아미노산 서열의 서열번호를 병기하였다.
Figure pct00064
활성형 FcγR과 억제형 FcγR에 대한 결합활성의 비율을 나타낸다.
샘플의 항목에는 항체의 명칭, Kn, Hl의 항목에는 각각 각 항체의 Knob쇄, Hole쇄 불변영역의 명칭, 변이개소의 항목에는 GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0와 비교하여 상이한 변이(특히 변이가 없는 경우에는 「-」)를 표기하였다. GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0의 FcγRIIb에 대한 KD를 각 항체의 FcγRIIa H형, R형의 KD로 나눈 값을 각각의 A/I ratio로 하였다. 각 항체의 H쇄, L쇄에 대응하는 아미노산 서열의 서열번호를 병기하였다.
표 36 및 37의 결과로부터 G1d에 대해 Knobs-into-Holes 기술만을 적용한 분자인 GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0와 비교하여, G236A/S239D/I332E를 양 H쇄에 도입한 GpH7-Kn037/GpH7-Hl036/GpL16-k0는 FcγRIIa H형에 대한 결합이 22배, FcγRIIa R형에 대한 결합이 43배, FcγRIIIa F에 대한 결합이 161배로 증강되어 있었다. 또한 표 38의 결과로부터 GpH7-Kn037/GpH7-Hl036/GpL16-k0의 A/I ratio는 FcγRIIa H형에 대해 8.6, FcγRIIa R형에 대해 13으로, GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0의 6.2, 4.9와 비교하여 향상되어 있었다.
표 36 및 37의 결과로부터 G1d에 대해 Knobs-into-Holes 기술만을 적용한 분자인 GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0와 비교하여, S239D/A330L/I332E를 양 H쇄에 도입한 GpH7-Kn032/GpH7-Hl032/GpL16-k0는 FcγRIIa H형에 대한 결합이 1.2배, FcγRIIa R형에 대한 결합이 3.0배, FcγRIIIa F에 대한 결합이 381배로 증강되어 있었다. 또한 표 38의 결과로부터 GpH7-Kn032/GpH7-Hl032/GpL16-k0의 A/I ratio는 FcγRIIa H형에 대해 0.93, FcγRIIa R형에 대해 1.8로, GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0와 비교하여 저하되어 있었다.
표 36 및 37의 결과로부터 G1d에 대해 Knobs-into-Holes 기술만을 적용한 분자인 GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0와 비교하여, L234Y/L235Y/G236A/H268D/S298A를 한쪽 H쇄에, G236A/S239D/A330K/I332E를 다른 한쪽 H쇄에 도입한 GpH7-Kn045/GpH7-Hl048/GpL16-k0는 FcγRIIa H형에 대한 결합이 52배, FcγRIIa R형에 대한 결합이 154배, FcγRIIIa F에 대한 결합이 419배로 증강되어 있었다. 또한 이 결과로부터 FcγRIIa에 대한 결합활성은 H형, R형 모두에 대해서 G236A/S239D/I332E를 양 H쇄에 도입한 종래기술인 호모이량화 항체 GpH7-Kn037/GpH7-Hl036/GpL16-k0와 비교하여 증강되어 있었다. 이에 더하여 FcγRIIIa F에 대한 결합활성도 S239D/A330L/I332E를 양 H쇄에 도입한 종래기술인 호모이량화 항체 GpH7-Kn032/GpH7-Hl032/GpL16-k0와 비교하여도 약간 증강되어 있었다. 표 38의 결과로부터 GpH7-Kn045/GpH7-Hl048/GpL16-k0의 A/I ratio는 FcγRIIa H형에 대해 9.5, FcγRIIa R형에 대해 22로, GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0, GpH7-Kn037/GpH7-Hl036/GpL16-k0, GpH7-Kn032/GpH7-Hl032/GpL16-k0의 어느 것과 비교하여도 향상되어 있었다. 이 결과로부터 헤테로이량화 항체 기술을 사용함으로써, GpH7-Kn045/GpH7-Hl048/GpL16-k0는 종래기술과 비교하여 FcγRIIa, FcγRIIIa F에 대한 결합활성을 증강시키는 동시에, 보다 선택적으로 활성형 FcγR에 대해 결합하는 것이 나타내어졌다.
표 36 및 37의 결과로부터 G1d에 대해 Knobs-into-Holes 기술만을 적용한 분자인 GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0와 비교하여, L234Y/L235Y/G236A/H268D/S298A를 한쪽 H쇄에, G236A/S239D/Q295L/A330M/I332E를 다른 한쪽 H쇄에 도입한 GpH7-Kn045/GpH7-Hl055/GpL16-k0는 FcγRIIa H형에 대한 결합이 21배, FcγRIIa R형에 대한 결합이 56배, FcγRIIIa　F에 대한 결합이 985배로 증강되어 있었다. 또한 이 결과로부터 FcγRIIa에 대한 결합활성은 H형, R형 모두에 대해서 G236A/S239D/I332E를 양 H쇄에 도입한 종래기술인 호모이량화 항체 GpH7-Kn037/GpH7-Hl036/GpL16-k0와 비교하여 거의 동등하였다. FcγRIIIa　F에 대한 결합활성은 S239D/A330L/I332E를 양 H쇄에 도입한 종래기술인 호모이량화 항체 GpH7-Kn032/GpH7-Hl032/GpL16-k0와 비교하여 증강되어 있었다. 표 38의 결과로부터 GpH7-Kn045/GpH7-Hl055/GpL16-k0의 A/I ratio는 FcγRIIa H형에 대해 8.3, FcγRIIa R형에 대해 18로, GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0, GpH7-Kn032/GpH7-Hl032/GpL16-k0보다 향상되고, GpH7-Kn037/GpH7-Hl036/GpL16-k0와 비교하여 FcγRIIa H형에 대해서는 거의 동등하며, FcγRIIa R형에 대해서는 향상되어 있었다. 이 결과로부터 헤테로이량화 항체 기술을 사용함으로써, GpH7-Kn045/GpH7-Hl055/GpL16-k0는 종래기술과 비교하여 FcγRIIa에 대한 결합활성을 같은 정도로 향상시키면서 FcγRIIIa에 대한 결합활성을 보다 증강시키는 동시에, 보다 선택적으로 활성형 FcγR에 대해 결합하는 것이 나타내어졌다.
표 36 및 37의 결과로부터 G1d에 대해 Knobs-into-Holes 기술만을 적용한 분자인 GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0와 비교하여, L234Y/L235Y/G236A/H268D/Q295L/S298A를 한쪽 H쇄에, G236A/S239D/Q295L/A330M/I332E를 다른 한쪽 H쇄에 도입한 GpH7-Kn056/GpH7-Hl055/GpL16-k0는 FcγRIIa H형에 대한 결합이 20배, FcγRIIa R형에 대한 결합이 44배, FcγRIIIa F에 대한 결합이 1114배로 증강되어 있었다. 또한 이 결과로부터 FcγRIIa에 대한 결합활성은 H형, R형 모두에 대해서 G236A/S239D/I332E를 양 H쇄에 도입한 종래기술인 호모이량화 항체 GpH7-Kn037/GpH7-Hl036/GpL16-k0와 비교하여 거의 동등하였다. FcγRIIIa F에 대한 결합활성은 S239D/A330L/I332E를 양 H쇄에 도입한 종래기술인 호모이량화 항체 GpH7-Kn032/GpH7-Hl032/GpL16-k0와 비교하여 증강되어 있었다. 표 38의 결과로부터 GpH7-Kn056/GpH7-Hl055/GpL16-k0의 A/I ratio는 FcγRIIa H형에 대해 8.7, FcγRIIa R형에 대해 16으로, GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0, GpH7-Kn032/GpH7-Hl032/GpL16-k0보다 향상되고, GpH7-Kn037/GpH7-Hl036/GpL16-k0와 비교하여 FcγRIIa H형에 대해서는 거의 동등하며, FcγRIIa R형에 대해서는 향상되어 있었다. 이 결과로부터 헤테로이량화 항체 기술을 사용함으로써, GpH7-Kn056/GpH7-Hl055/GpL16-k0는 종래기술과 비교하여 FcγRIIa에 대한 결합활성을 같은 정도로 향상시키면서 FcγRIIIa에 대한 결합활성을 보다 증강시키는 동시에, 보다 선택적으로 활성형 FcγR에 대해 결합하는 것이 나타내어졌다.
〔실시예 13〕종래기술과의 비교：FcγRIIa, FcγRIIIa에 대한 결합활성이 증강된 헤테로이량화 항체의 열안정성의 평가
실시예 9에 있는 바와 같이, 종래기술에서 얻어진 호모이량화 항체는 FcγR로의 결합활성이 증강되어 있으나 물리화학적으로 불안정하기 때문에, 의약품으로서의 가치를 손상시키고 있었다. 그러나 헤테로이량화 항체 기술은 각 개변의 FcγR에 대한 결합활성의 증강 효과와 물리화학적인 면에서의 영향을 제어하기 쉬워, FcγR에 대한 결합활성을 증강시키면서도 물리화학적인 안정성을 손상시키지 않는 것이 가능한 것이 명확해졌다. 이 실시예에서는 활성형 FcγR인 FcγRIIa와 FcγRIIIa에 대한 결합활성이 증강된 항체에 대해서도 동일하게 물리화학적인 안정성, 특히 열역학적 안정성이 감소되어 있지 않은지 검증하였다. 실시예 11에서 FcγR에 대한 결합활성을 평가한 항체에 대해서, 참고 실시예 5의 방법에 따라 각 항체의 CH2영역의 Tm을 측정하고, 그 결과를 표 39에 정리하였다.
Figure pct00065
FcγRIIa, FcγRIIIa에 대한 결합활성을 증강시킨 항체의 Tm을 나타낸다.
표 39의 결과로부터 헤테로이량화 항체인 GpH7-Kn045/GpH7-Hl048/GpL16-k0, GpH7-Kn045/GpH7-Hl055/GpL16-k0, GpH7-Kn056/GpH7-Hl055/GpL16-k0 모두, 종래기술인 호모이량화 항체 GpH7-Kn037/GpH7-Hl036/GpL16-k0, GpH7-Kn032/GpH7-Hl032/GpL16-k0와 비교하여 높은 Tm을 유지하고 있었다. 실시예 11에서 기술한 바와 같이, 이들 헤테로이량화 항체는 종래의 호모이량화 항체와 비교하여, FcγR을 매개로 한 이펙터 기능을 발휘하는 데 보다 적합한 성질을 가지고 있다. 즉 이 결과로부터 헤테로이량화 항체 기술을 사용함으로써 항체의 물리화학적인 안정성을 손상시키지 않고, FcγR에 대한 결합을 정밀하고 치밀하게 제어하는 것이 가능한 것이 명확해졌다.
〔실시예 14〕활성형 FcγR인 FcγRIIIa F에 대한 선택성을 향상시킨 개변 조합 효과
실시예 8에서 기술한 바와 같이, 활성형 FcγR 및 억제형 FcγR에 대한 선택성을 향상시키는 기술은 유용하다. 여기에서는 실시예 8에서 발견한 활성형 Fcγ인 FcγRIIIa F에 대한 결합과 억제형 FcγR인 FcγRIIb에 대한 결합의 비율을 향상시키는 데, 즉 선택성의 향상에 헤테로이량화가 유효한지 검증하였다. 구체적으로는 활성형 Fcγ인 FcγRIIIa F에 대한 결합과 억제형 FcγR인 FcγRIIb에 대한 결합의 비율을 향상시키는 개변인 L234Y, G236W, S298A(표 22-1 영역 a)와 실시예 7에서 검토한 S239D, A330L, I332E와 조합하여 헤테로이량화 항체에서 호모이량화 항체와 비교하여 선택성의 향상 효과가 얻어지는지를 검증하였다.
이 검증을 위해 참고 실시예 1의 방법에 따라 S239D, A330L, I332E를 모두 GpH7-A5에 도입한 GpH7-A57(서열번호：40), GpH7-B3에 도입한 GpH7-B78(서열번호：41) 및 L234Y, G236W, S298A를 모두 GpH7-A5에 도입한 GpH7-TA7(서열번호：31), GpH7-B3에 도입한 GpH7-TA45(서열번호：32)를 삽입한 발현 벡터를 조제하였다. 이들 발현 벡터와 GpH7-A5, GpH7-B3, GpL16-k0를 사용하여 한쪽 H쇄에 L234Y, G236W, S298A를, 다른 한쪽 H쇄에 S239D, A330L, I332E를 도입한 헤테로 GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0, L234Y, G236W, S298A만을 한쪽 H쇄에 도입한 GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0, L234Y, G236W, S298A를 양쪽 H쇄에 도입한 GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0, S239D, A330L, I332E만을 한쪽 H쇄에 도입한 GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0, S239D, A330L, I332E를 양쪽 H쇄에 도입한 GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0를 참고 실시예 1의 방법에 따라 발현, 조제하였다. 조제한 항체는 참고 실시예 2의 방법에 따라 FcγRIIIa에 대한 KD 및 FcγRIIb에 대한 KD를 측정하였다. 각 항체의 FcγRIIb에 대한 KD를 FcγRIIIa에 대한 KD로 나눈 값인 FcγRIIIa/FcγRIIb ratio를 지표로 각 항체의 FcγRIIIa에 대한 결합활성의 선택성이 향상되었는지 여부를 검증하였다. 검증 결과를 표 40에 정리하였다.
Figure pct00066
샘플의 항목에는 항체의 명칭, H1, H2의 항목에는 각 항체의 H쇄 불변영역의 명칭, 변이개소의 항목에는 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0와 비교하여 상이한 변이(특히 변이가 없는 경우에는 「-」)를 표기하였다. 각 항체의 FcγRIIb에 대한 KD를 FcγRIIIa F에 대한 KD로 나눈 값을 FcγRIIIa　F/FcγRIIb ratio로 하였다. 각 항체의 H쇄, L쇄에 대응하는 아미노산 서열의 서열번호를 병기하였다.
표 40의 결과로부터 천연형 IgG1인 GpH7-G1d/GpL16-k0와, D356K, H435R 및 K439E를 각각 한쪽 H쇄에 도입한 GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0를 비교하면, FcγRIIIa/FcγRIIb ratio는 각각 2.5, 1.9로 커다란 차이는 관찰되지 않았다. 이 사실로부터 D356K, H435R 및 K439E의 개변은 FcγRIIIa에 대한 결합활성의 선택성에 대해 영향을 미치지 않는 것으로 생각되었다.
종래기술을 사용한 호모이량화 항체에 대해서 각 개변의 효과를 검증하였다. S239D, A330L, I332E를 양 H쇄에 도입한 호모이량화 항체 GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0의 경우는 FcγRIIIa/FcγRIIb ratio가 100으로, GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0와 비교하여 향상되어 있었다. 한편으로 L234Y, G236W, S298A를 양 H쇄에 도입한 호모이량화 항체 GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0의 경우는 5.3으로, 호모이량화 항체에 있어서는 S239D, A330L, I332E 조합 쪽이 FcγRIIIa에 대한 결합활성의 선택성을 향상시키는 효과가 높은 것이 명확해졌다.
다음으로 각 개변군을 한쪽 H쇄에만 도입한 헤테로이량화 항체에 대해서 각 개변군의 효과를 검증하였다. S239D, A330L, I332E를 한쪽 H쇄에 도입한 헤테로이량화 항체 GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0의 경우는 FcγRIIIa/FcγRIIb ratio가 7.9로, GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0와 비교하여 향상되어 있었다. 한편으로 L234Y, G236W, S298A를 한쪽 H쇄에 도입한 헤테로이량화 항체 GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0의 경우는 14였다. 이 결과로부터 헤테로이량화 항체에 있어서는 L234Y, G236W, S298A의 개변군 쪽이 FcγRIIIa에 대한 결합활성의 선택성을 향상시키는 효과가 높은 것이 명확해졌다.
각 개변군의 호모이량화 항체와 헤테로이량화 항체에 있어서의 효과의 차이를 검증하였다. S239D, A330L, I332E에 대해서는 그 헤테로이량화 항체에 있어서는 FcγRIIIa/FcγRIIb ratio가 7.9이고, 호모이량화 항체의 경우는 100이었다. 이 결과로부터 S239D, A330L, I332E에 대해서는 헤테로이량화하면 FcγRIIIa에 대한 결합활성의 선택성을 향상시키는 효과가 있으나, 호모이량화하면 그 효과가 더욱 증강되는 것이 명확해졌다. 반대로 L234Y, G236A, S298A에 대해서는 그 헤테로이량화 항체에 있어서는 FcγRIIIa/FcγRIIb ratio가 14이고, 호모이량화 항체의 경우는 5.3이었다. 이 결과로부터 L234Y, G236A, S298A에 대해서는 헤테로이량화하면 FcγRIIIa에 대한 결합활성의 선택성을 향상시키는 효과가 있으나, 호모이량화하면 그 효과가 감소되는 것이 명확해졌다. 이들 결과로부터 호모이량화 항체에 있어서는 S239D, A330L, I332E의 개변군 쪽이 L234Y, G236A, S298A의 개변군보다도 FcγRIIIa에 대한 결합활성의 선택성을 향상시키는 효과가 높으나, 헤테로이량화 항체에 있어서는 L234Y, G236A, S298A의 개변군 쪽이 S239D, A330L, I332E의 개변군보다도 FcγRIIIa에 대한 결합활성의 선택성을 향상시키는 효과가 높은 것이 명확해졌다.
L234Y, G236A, S298A의 개변군과 S239D, A330L, I332E의 개변군을 조합한 헤테로이량화 항체 GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0의 경우는 FcγRIIIa/FcγRIIb ratio가 244로, L234Y, G236A, S298A의 개변군을 한쪽 H쇄에만 갖는 헤테로이량화 항체 GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0, 양 H쇄에 갖는 호모이량화 항체 GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0, S239D, A330L, I332E의 개변군을 한쪽 H쇄에만 갖는 헤테로이량화 항체 GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0, 양 H쇄에 갖는 호모이량화 항체 GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0 모두와 비교하여 FcγRIIIa에 대한 결합활성의 선택성을 향상시키는 효과가 높은 것이 명확해졌다. 이 결과는 L234Y, G236A, S298A의 개변군의 헤테로이량화 항체에서의 FcγRIIIa에 대한 결합 활성의 선택성의 향상 효과와, S239D, A330L, I332E의 개변군의 헤테로이량화 항체에서의 효과를 합한 것으로 생각된다. 즉 헤테로이량화 항체의 경우는 호모이량화 항체와 비교하여 우수한 FcγRIIIa에 대한 결합 활성의 선택성의 향상 효과가 관찰되는 것이 명확해졌다.
즉 헤테로이량화 항체를 사용함으로써, 종래의 호모이량화 항체를 사용하는 것보다도 Fc영역과 FcγRIIIa의 비대칭적인 상호작용을 보다 최적화할 수 있어, 보다 높은 FcγRIIIa에 대한 결합활성의 선택성을 갖는 Fc영역을 디자인하는 것이 가능한 것이 나타내어졌다.
〔실시예 15〕FcgRIIa 결합 증강 헤테로이량화 항체의 ADCC 활성의 측정
실시예 12에서 조제한 GpH7-G1d/GpL16-k0, GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0, GpH7-Kn037/GpH7-Hl036/GpL16-k0, GpH7-Kn032/GpH7-Hl032/GpL16-k0, GpH7-Kn045/GpH7-Hl048/GpL16-k0, GpH7-Kn056/GpH7-Hl055/GpL16-k0에 대해서 참고 실시예 7의 방법에 따라 ADCC 활성을 평가하고, 그 결과를 도 33에 정리하였다.
도 33에 있어서 GpH7-G1d/GpL16-k0와 GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0의 ADCC 활성을 비교하면, 양자는 거의 동등한 활성을 가지고 있었다. 이 결과로부터 Knobs-into-Holes를 항체의 Fc영역에 도입하더라도 FcgR에 대한 결합에 더하여 ADCC 활성에 있어서도 영향이 없는 것이 명확해졌다.
실시예 12에 기재한 헤테로이량화 항체 GpH7-Kn045/GpH7-Hl048/GpL16-k0, GpH7-Kn056/GpH7-Hl055/GpL16-k0는 모두 개변 도입 전의 항체 GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0와 비교하여 보다 강한 ADCC 활성을 나타내었다. 또한 헤테로이량화 항체 GpH7-Kn045/GpH7-Hl048/GpL16-k0, GpH7-Kn056/GpH7-Hl055/GpL16-k0는 FcgRIIa R 및 FcgRIIa H에 대한 결합을 증강시켜 ADCP 활성을 증강시켰다는 보고가 있는 G236A/S239D/I332E의 개변을 양 H쇄에 갖는 호모이량화 항체 GpH7-Kn037/GpH7-Hl036/GpL16-k0 및 기존의 ADCC 활성 증강을 적용한 항체인 GpH7-Kn032/GpH7-Hl032/GpL16-k0와 같은 정도의 ADCC 활성을 나타내었다.
즉 GpH7-Kn045/GpH7-Hl048/GpL16-k0, GpH7-Kn056/GpH7-Hl055/GpL16-k0는 실시예 12에서 나타낸 바와 같이 FcgRIIa R 및 FcgRIIa H에 대한 결합이 기존 기술과 비교하여 한층 증강되어 있을 뿐 아니라 기존의 ADCC 활성 증강 기술과 비교하여 동등한 ADCC 활성 증강 효과를 가지고 있다. 즉 여기서 평가한 헤테로이량화 항체는 ADCC 활성 증강 효과에 대해서는 기존 기술과 같은 정도의 효과를 가질 뿐 아니라 FcgRIIa H 및 FcgRIIa R에 대한 결합의 증강이 있다는 점에서 기존 기술과 비교하여 우수하다고 생각된다.
〔실시예 16〕FcgRIIIa에 대한 결합을 증강시킨 헤테로이량화 항체 H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0의 창출
또한 실시예 11에서 나타낸 바와 같이 FcγRIIIa에 대한 결합활성을 증강시킨 헤테로이량화 항체는 ADCC 활성도 증강시키고 있는 것이 명확해졌다. 실시예 11에서는 GPC3에 대한 항체에 있어서 효과가 확인되었으나, 다른 항원에 있어서도 동일한 효과가 관찰되는지 확인하기 위해 항Epiregulin(EREG) 항체를 사용하여 동일한 실험을 행하였다. 여기서 EREG에 대한 항체의 H쇄 가변영역의 서열을 H240(서열번호：80), 가변영역, 불변영역을 포함하는 L쇄의 서열을 L73-k0(서열번호：106)로 한다.
실시예 4의 결과를 토대로 H쇄에 새롭게 FcgRIIIa에 대해 결합을 증강시킨 개변체를 제작하였다. 여기서는 헤테로이량화 기술로서는 실시예 12에 기재된 Knobs-into-Holes 기술을 사용하였다. 구체적으로는 H240-G1d(서열번호：83)에 대해 Y349C, T366W의 개변을 불변영역에 도입한 H240-Kn033(서열번호：84), H240-G1d에 대해 D356C, T366S, L368A, Y407V의 개변을 불변영역에 도입한 H240-Hl033(서열번호：85)을 참고 실시예 1의 방법에 따라 조제하였다. 다음으로 H240-Kn033(서열번호：84)에 L234Y, L235Y, G236W, H268D, S298A를 도입하여 H240-Kn061(서열번호：81)을 참고 실시예 1의 방법에 따라 제작하고, H240-Hl033(서열번호：85)에 K326D, A330M, K334E를 도입하여 H240-Hl071(서열번호：82)을 참고 실시예 1의 방법에 따라 제작하였다. H240-Kn061, H240-Hl071, L73-k0를 조합하여 참고 실시예 1의 방법에 따라 헤테로이량화 항체 H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0를 발현시켰다.
실시예 12와 동일하게 FcgRIIIa에 대한 결합을 증강시킨다는 보고가 있는 S239D, A330L, I332E를 도입한 개변체를 비교 대상으로서 사용하기 위해 제작하였다. 구체적으로는 참고 실시예 1의 방법에 따라 S239D, A330L, I332E를 H240-Kn033(서열번호：84), H240-Hl033(서열번호：85)의 각각에 도입한 H240-Kn032(서열번호：86), H240-Hl032(서열번호：87)를 제작하였다. H240-Kn032, H240-Hl032, L73-k0를 조합하여 참고 실시예 1의 방법에 따라 호모이량화 항체 H240-Kn032/H240-Hl032/L73-k0를 발현시켰다.
다음으로 FcgRIIIa에 대한 결합을 증강시킨다(Glycobiol. Vol.17 no.1 pp. 104-118(2006) 등)는 보고가 있는 아푸코실화 항체를 비교를 위해 제작하였다. 상동염색체 상의 양쪽 푸코오스 트랜스포터 유전자의 발현이 인위적으로 억제되어 있는 세포에서는 푸코오스 트랜스포터의 기능이 저해된다. 이 세포를 사용함으로써 푸코오스가 결손된 항체를 얻는 것이 가능하다(WO2006/067913 등). 또한 beta 1,4-N-acetylglucosaminyltransferase III와 Golgi alpha-mannosidase II가 강제 발현되는 세포에서 항체를 생산시켜도 푸코오스가 결손된 항체를 얻는 것이 가능하다(Ferrara 등, Biotechnol. Bioeng.(2006) 93(5), 851-861). 이들 동업자 공지의 수법에 의해, H240-G1d(서열번호：83) 및 L73-k0(서열번호：106)를 조합해서 발현시키고, H240-G1d/L73-k0를 아푸코실화한 항체 H240-afucosyl_G1d/L73-k0(서열번호：83, 106)를 얻었다.
또한 참고 실시예 1의 방법에 따라 대조로서 H240-Kn033(서열번호：84), H240-Hl033(서열번호：85), L73-k0(서열번호：106)를 조합하여 H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0를 발현시켰다.
이들에 대해서 참고 실시예 8의 방법에 따라 각 FcgR에 대한 결합활성을 평가하고, 그 결과를 표 41에 정리하였다.
Figure pct00067
표 41의 결과로부터 헤테로이량화 항체 H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0는 H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0와 비교하여, 특히 FcgRIIIa F, FcgRIIIa V에 대한 결합이 증강되어 있었다. 헤테로이량화 항체 H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0는 H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0에 L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298A 및 K326D/A330M/K334E를 도입한 개변체인 것으로부터, 이들 도입된 개변의 FcgR에 대한 결합이 증강되었다고 할 수 있다.
표 41의 결과로부터 헤테로이량화 항체 H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0는 기존의 ADCC 활성 증강 기술을 적용한 H240-afucosyl_G1d/L73-k0 및 H240-Kn032/H240-Hl032/L73-k0와 비교하여 FcgRIIIa F, FcgRIIIa V에 대한 결합이 증강되어 있었다. 이 결과로부터 헤테로이량화 항체는 종래의 호모이량화 항체에 의한 ADCC 활성 증강 기술 및 아푸코실화에 의한 ADCC 활성 증강 기술과 비교하여 FcgRIIIa에 대한 결합 증강 효과가 높은 것이 명확해졌다.
이에 더하여 헤테로이량화 항체의 경우는 ADCP 활성 증강에 중요하다고 생각되는 FcgRIIa에 대한 결합도 FcgRIIa H에 대해서는 양 항체보다도 증강되어 있고, FcgRIIa R에 대해서는 H240-afucosyl_G1d/L73-k0보다도 결합이 증강되어 H240-Kn032/H240-Hl032/L73-k0와 같은 정도였다.
다음으로 헤테로이량화 항체 H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0가 그 각 H쇄로 이루어지는 호모이량화 항체보다도 FcgR에 대한 결합활성을 증강시킨다는 헤테로이량화 항체의 특징을 갖는지를 확인하였다. 헤테로이량화 항체 H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0의 한쪽 H쇄인 H240-Kn061에는 L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298A가, 다른 한쪽 H쇄인 H240-Hl071에는 K326D/A330M/K334E가 도입되어 있다. 이 헤테로이량화 항체가 각 H쇄로 이루어지는 호모이량화 항체와 비교하여, 각 FcgR에 대해 보다 강한 결합활성을 갖는 것을 확인하였다. 구체적으로는 L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298A를 H240-Hl033에 도입한 H240-Hl134(서열번호：88) 및 K326D/A330M/K334E를 H240-Kn033에 도입한 H240-Kn132(서열번호：89)를 참고 실시예 1의 방법에 따라 제작하였다. 이 발현 벡터를 사용하여 참고 실시예 1의 방법에 따라 L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298A를 양 H쇄에 갖는 호모이량화 항체 H240-Kn061/H240-Hl134/L73-k0를 발현시키고, K326D/A330M/K334E를 양 H쇄에 갖는 호모이량화 항체 H240-Kn132/H240-Hl071/L73-k0를 발현시켰다. 이들 호모이량화 항체와, L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298A, K326D/A330M/K334E를 각 H쇄에 갖는 헤테로이량화 항체 H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0의 FcgRIIIaF 및 FcgRIIIa V에 대한 결합을 참고 실시예 8의 방법에 따라 측정하였다. 그 결과를 표 42에 정리하였다.
Figure pct00068
표 42의 결과로부터 L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298A를 한쪽 H쇄에 갖고, K326D/A330M/K334E를 다른 한쪽 H쇄에 갖는 헤테로이량화 항체 H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0 쪽이 L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298A를 양 H쇄에 갖는 호모이량화 항체 H240-Kn061/H240-Hl134/L73-k0 및 K326D/A330M/K334E를 양 H쇄에 갖는 호모이량화 항체 H240-Kn132/H240-Hl071/L73-k0의 어느 것보다도 FcgRIIIa F 및 FcgRIIIa V에 대한 강한 결합활성을 갖는 것이 확인되었다. 즉 H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0는 그 각 H쇄로 이루어지는 호모이량화 항체보다도 FcgR에 대한 결합활성을 증강시킨다는 헤테로이량화 항체의 특징을 갖는 것이 명확해졌다.
다음으로 참고 실시예 9의 방법에 따라 H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0, H240-Kn032/H240-Hl032/L73-k0, H240-afucosyl_G1d/L73-k0, H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0의 ADCC 활성을 비교하고, 그 결과를 도 34에 정리하였다.
도 34의 결과로부터 H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0는 H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0와 비교하여 현저히 강한 ADCC 활성을 나타내었다. 그것에 더하여 기존의 ADCC 활성 증강 기술을 적용한 H240-Kn032/H240-Hl032/L73-k0 및 H240-afucosyl_G1d/L73-k0보다도 강한 ADCC 활성을 나타내었다. 즉 ADCC 활성에 있어서도 H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0는 기존의 ADCC 활성 증강 기술보다 강한 ADCC 활성을 나타내는 것이 명확해졌다.
〔실시예 17〕헤테로이량화 항체 H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0를 템플레이트로 한 추가적인 개변체의 제작과 평가
앞선 실시예 16에 있어서 우수한 ADCC 활성을 나타내는 H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0를 발견하였다. 더욱 우수한 활성을 갖는 개변체를 발견하기 위해, H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0를 템플레이트로 하고, 참고 실시예 1의 방법에 따라 H240-Kn061 및 H240-Hl071의 각 H쇄의 EU 넘버링 231번째~242번째를 각각 Cys 및 원래의 아미노산 이외의 상이한 18종류의 아미노산으로 치환한 개변체를 합계 약 420종류 조제하고, 각 FcgR에 대한 결합을 평가하였다. 구체적으로는 참고 실시예 8에 기재된 방법에 따라 각 개변체의 FcgRI, FcgRIIa R, FcgRIIa H, FcgRIIb, FcgRIIIa F, FcgRIIIa V에 대한 KD값을 각각 산출하고, 그 KD값으로 H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0의 FcgRI, FcgRIIa R, FcgRIIa H, FcgRIIb, FcgRIIIa F, FcgRIIIa V에 대한 KD값을 나눈 값을 Relative KD로 하여, 평가의 지표로 하였다. 즉 H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0의 KD값을 1로 한 경우에, 각 개변체의 각 FcgR에 대한 KD값이 몇배 변동되었는지를 평가의 지표로 하였다. Relative KD가 클수록 그 개변체가 H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0와 비교하여 각 FcgR에 대한 결합이 보다 증강되어 있는 것을 나타내고 있다.
각 개변체의 FcgRI, FcgRIIa R, FcgRIIa H, FcgRIIb, FcgRIIIa F, FcgRIIIa V에 대한 Ralative KD를 세로축에, Relative KD가 작은 순서가 되도록 하였을 때의 순위를 가로축으로 한 도면을 각각 도 35, 도 36, 도 37, 도 38, 도 39, 도 40에 나타내었다.
이들 결과의 해석으로부터, H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0보다도 FcgRIIb로의 결합을 증강시키지 않고 FcgRIIa R, FcgRIIIa F, FcgRIIIa V 중 어느 하나 또는 몇 가지에 대한 결합을 증강시킨 개변체를 발견하였다. 그 개변을 도입한 H쇄 및 그의 개변을 표 43(FcgRIIb로의 결합을 증강시키지 않고 FcgRIIa R 및 FcgRIIIa에 대한 결합을 증강시키는 개변)에 정리하였다. FcgRIIb에 대한 Relative KD가 1 이하가 되고, FcgRIIa R, FcgRIIIa F, FcgRIIIa V 중 어느 하나 또는 몇 가지에 대한 Relative KD가 1.3 이상이 되는 개변을 선택하였다.
Figure pct00069
상기 표 43 중의 수치는 각 개변체의 각 FcgR에 대한 Relative KD를 나타낸다.
이들 개변은 억제형 FcgR인 FcgRIIb에 대한 결합을 증강시키지 않고, ADCP 활성에 중요한 역할을 하는 FcgRIIa나 ADCC 활성에 중요한 역할을 하는 FcgRIIIa에 대한 결합을 증강시키는 효과가 있다. 그 때문에 이들 개변을 도입함으로써 항체의 면역 억제적인 작용을 증강시키지 않고 ADCC 활성이나 ADCP 활성을 증강시켜, 보다 강한 항종양활성을 발휘하는 것이 기대된다.
다음으로 H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0보다도 FcgRIIIa로의 결합을 감소시키지 않고 FcgRIIa H 및 FcgRIIa R에 대한 결합을 증강시키는 개변체를 발견하였다. 그 개변을 도입한 H쇄 및 그의 개변을 표 44(FcgRIIIa로의 결합을 감소시키지 않고 FcgRIIa로의 결합을 증강시키는 개변)에 정리하였다. FcgRIIIa F 및 FcgRIIIa V에 대한 Relative KD가 0.7 이상이고, FcgRIIa H 및 FcgRIIa R에 대한 Relative KD가 1.5 이상이 되는 개변을 선택하였다.
Figure pct00070
상기 표 44 중의 수치는 각 개변체의 각 FcgR에 대한 Relative KD를 나타낸다.
이들 개변은 ADCC 활성에 중요한 역할을 하는 FcgRIIIa에 대한 결합을 감소시키지 않고, 개변에 따라서는 FcgRIIIa에 대한 결합을 증강시키며, ADCP 활성에 중요한 역할을 하는 FcgRIIa에 대한 결합을 증강시키는 개변이다. 그 때문에 이 개변을 도입함으로써 ADCC 활성 및 ADCP 활성, ADCC 활성 또는 ADCP 활성을 증강시켜서 보다 강한 항종양활성을 발휘하는 것이 기대된다.
다음으로 H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0보다도 FcgRIIIa로의 결합을 감소시키지 않고 FcgRIIb에 대한 결합을 감소시키는 개변체를 발견하였다. 그 개변을 도입한 H쇄 및 그 개변을 표 45(FcgRIIIa로의 결합을 유지한 채로 FcgRIIb로의 결합을 감소시키는 개변)에 정리하였다. FcgRIIIa F 및 FcgRIIIa V에 대한 Relative KD가 1 이상이고, FcgRIIb에 대한 Relative KD가 0.5 이하가 되는 개변을 선택하였다.
Figure pct00071
상기 표 45 중의 수치는 각 개변체의 각 FcgR에 대한 Relative KD를 나타낸다.
이들 개변은 ADCC 활성에 중요한 역할을 하는 FcgRIIIa에 대한 결합을 감소시키지 않고 억제형 FcgR인 FcgRIIb에 대한 결합을 감소시키고 있다. 그 때문에 이 개변을 도입함으로써 ADCC 활성을 저감시키지 않고 항체의 면역 억제적인 작용이 저감되어 있기 때문에 보다 강한 항종양활성을 발휘하는 것이 기대된다.
또한 헤테로이량화 항체 H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0가 각 H쇄로 이루어지는 호모이량화 항체보다도 FcgR에 대해 강하게 결합한다는 헤테로이량화 항체의 성질을 갖는 것으로부터, 이들 개변을 H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0에 도입하여 얻어지는 개변체도 동일한 헤테로이량화 항체의 성질을 갖는 것으로 생각된다.
〔실시예 18〕헤테로이량화 항체 H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0에 도입한 개변과 치환 가능한 개변
실시예 17에서 얻어진 도 35, 도 36, 도 37, 도 38, 도 39, 도 40의 결과로부터, 헤테로이량화 항체 H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0의 이들 개변 개소를 그 밖의 개변으로 치환하는 것이 가능한지를 검증하였다. 여기서 치환 가능한 개변이란, 그 개변을 도입함으로써 도입 전과 비교하여 FcgRIIIa F 및 FcgRIIIa V에 대한 결합이 0.7배 이상이고, FcgRIIb에 대한 결합이 1.3배 이하인 개변을 가리킨다.
실시예 17에서 조제한 개변체는 항체의 EU 넘버링 231번째~242번째의 아미노산에 개변을 도입하고 있다. 헤테로이량화 항체 H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0의 H240-Kn061의 H쇄에는 L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298A, H240-Hl071의 H쇄에는 K326D/A330M/K334E를 도입하고 있기 때문에, 실시예 17의 결과로부터 H240-Kn061의 H쇄에 도입된 개변 중 L234Y, L235Y, G236W가 다른 아미노산으로 치환 가능한지를 검증할 수 있다.
H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0의 한쪽 H쇄인 H240-Hl071에 도입한 개변 개소는 포함되지 않고, 다른 한쪽 H쇄인 H240-Kn061의 H쇄의 EU 넘버링 234번째, 235번째, 236번째가 포함된다. 금번 조제한 개변체 중에서, H240-Kn061의 H쇄의 EU 넘버링 234번째, 235번째, 236번째에 개변을 도입한 것으로, H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0와 비교하여, FcgRIIIa F 및 FcgRIIIa V에 대한 결합이 0.7배 이상이고, FcgRIIb에 대한 결합이 1.3배 이하인 개변체는 H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0와 동등하거나 보다 우수한 활성을 갖는 것으로 생각되기 때문에, 헤테로이량화 항체 H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0의 우수한 성질을 손상시키지 않고 치환하는 것이 가능할 것으로 생각되었다. 이러한 조건을 충족시키는 개변에 대해서, 도입한 H쇄 및 그 개변을 표 46(H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0와 동등한 활성을 유지하거나 또는 보다 우수한 성질을 부여하는 개변)에 정리하였다.
Figure pct00072
상기 표 46 중의 「개변을 도입한 H쇄」란, H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0의 H쇄 중 어느 H쇄에 치환 가능한지를 나타내고, 「개변」은 숫자가 EU 넘버링으로 표시하였을 때의 잔기 번호, 처음의 알파벳이 H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0의 그 잔기 번호에 대응하는 아미노산, 마지막의 알파벳이 치환 가능한 아미노산을 나타낸다.
이 결과로부터 H240-Kn061의 H쇄 불변영역에 도입한 개변 중 치환 가능한 부위 및 치환 가능한 아미노산은 표 47(H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0와 동등한 활성을 유지한 채로 치환 가능한 H240-Kn061의 개변부위와 치환 가능한 아미노산)과 같이 정리된다.
Figure pct00073
상기 표 47 중 「개변부위」란, H240-Kn061의 EU 넘버링으로 표시하였을 때의 잔기 번호, 「치환 가능한 아미노산」이란 그 부위를 표 중 아미노산으로 치환하더라도 H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0와 동등한 활성을 갖는, 즉 치환 가능한 아미노산을 나타낸다.
H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0에 도입한 개변 중 H240-Kn061의 H268D, S298A 및 H240-Hl071의 K326D, A330M, K334E에 대해서는 실시예 17에서는 대응하는 부위에 대해서 개변을 도입하지 않았다. 이하에서는 이들 부위에 대해서도 치환 가능한 개변의 유무를 실시예 4의 결과로부터 고찰하였다. 구체적으로는 실시예 4의 결과 중 H쇄의 한쪽에만 개변을 도입한 헤테로이량화 항체에 있어서, FcgRIIIa F에 대한 결합의 지표인 He/Con_3aF가 개변 도입 전에 비해 1.3배 이상 증강, 즉 He/Con_3aF의 값이 130 이상이고, 또한 그 부위에서 가장 강한 효과를 나타내는 3개의 개변을 선택하였다. 그 결과를 정리하면, 표 48(H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0의 개변 H268D, S298A, K326D, A330M, K334E와 치환 가능한 개변의 개변부위, 치환 가능한 아미노산 및 그 FcgRIIIa F에 대한 결합활성)과 같이 된다.
Figure pct00074
상기 표 48 중 「개변부위」란, EU 넘버링으로 표시하였을 때의 잔기 번호를 나타낸다. 「치환 가능한 아미노산」이란 실시예 4에 있어서 H쇄의 한쪽에만 개변을 도입한 헤테로이량화 항체에 있어서, FcgRIIIa F에 대한 결합의 지표인 He/Con_3aF가 개변 도입 전에 비해 1.3배 이상 증강되어 있고, 또한 그 부위에서 가장 강한 효과를 나타내는 3개의 개변을 나타낸다. 「He/Con_3aF」는 실시예 4에서 정의되는 값이다.
표 48의 결과를 개변부위별로 치환 가능한 아미노산으로 정리하면 표 49(H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0의 개변 H268D, S298A, K326D, A330M, K334E의 치환 가능한 개변부위와 치환 가능한 아미노산)와 같이 된다.
Figure pct00075
표 49로부터 H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0의 H268D는 D 대신에 E 또는 A로 치환하더라도 동등한 활성을 발휘할 것으로 생각된다. 동일하게 하여 K326D는 D 대신에 T 또는 I여도, A330M은 M 대신에 P 또는 F여도, K334D는 D 대신에 E 또는 I여도 동등한 활성을 발휘할 것으로 생각된다. 한편으로 S298A에 대해서는 개변하더라도 동등한 활성을 발휘할 것으로 생각되는 개변은 발견할 수 없었다.
또한 헤테로이량화 항체 H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0가 그 각 H쇄로 이루어지는 호모이량화 항체보다도 FcgR에 대한 결합활성을 증강시킨다는 헤테로이량화 항체의 특징을 갖는 것으로부터, 이들 개변을 H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0에 도입하여 얻어지는 개변체도 동일하게 헤테로이량화 항체의 성질을 가질 것으로 생각된다.
〔실시예 19〕헤테로이량화 항체 H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0로의 D270E의 도입과 그 평가
다음으로 H240-Kn061/H240-Hl071을 추가로 개량하기 위해 ADCC 활성을 증강시킬 것으로 생각되는 FcgRIIIa에 대한 결합을 추가 증강시키고, 면역 억제적인 시그날을 통해 항체의 항종양활성을 저감시킬 것으로 생각되는 FcgRIIb에 대한 결합을 추가로 감소시키는 것을 시도하였다. 구체적으로는 실시예 4에서 발견된 FcgRIIIa에 대한 결합을 증강시키고, 또한 FcgRIIb에 대한 결합을 감소시키는 개변인 D270E를 H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0의 양 H쇄에 도입하였다. H240-Kn061, H240-Hl071의 각각에 D270E를 도입한 서열을 각각 H240-Kn072(서열번호：90), H240-Hl076(서열번호：91)으로 하고, 실시예 1의 방법에 따라 L73-k0와 조합하여 헤테로이량화 항체 H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0를 발현, 조제하였다. 이 항체와 H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0, H240-Kn032/H240-Hl032/L73-k0, H240-afucosyl_G1d/L73-k0, H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0를 참고 실시예 8의 방법에 따라 각 FcgR에 대한 결합활성을 평가하고, 그 결과를 표 50에 정리하였다.
Figure pct00076
표 50으로부터 H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0는 H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0와 동일하게 기존의 ADCC 활성 증강 기술을 적용한 H240-Kn032/H240-Hl032/L73-k0 및 H240-afucosyl_G1d/L73-k0보다도 FcgRIIIa F 및 FcgRIIIa V에 강하게 결합하고, 또한 H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0보다도 강하게 결합하였다. FcgRIIb에 대해, H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0는 기존의 ADCC 활성 증강 기술에 의해 제작한 H240-Kn032/H240-Hl032/L73-k0 및 H240-afucosyl_G1d/L73-k0보다도 결합이 감소되고, 또한 H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0보다도 감소되어 있었다.
즉 D270E를 도입함으로써 ADCC 활성을 증강시키는 FcgRIIIa에 대한 결합이 증강되어 있는 것으로부터 보다 강한 ADCC 활성을 갖는 것이 기대되고, 면역 억제적인 시그날을 전달하는 FcgRIIb에 대한 결합이 감소되어 있는 것으로부터 항체의 면역 억제적인 작용을 저감시키는 것이 기대되기 때문에, H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0는 H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0보다도 우수한 항종양효과를 발휘할 것으로 생각된다.
다음으로 H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0의 ADCC 활성을 H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0, H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0 및 H240-afucosyl_G1d/L73-k0와 비교하였다. 그 결과를 도 41에 나타낸다.
도 41의 결과로부터 H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0는 H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0보다도 현저히 강한 ADCC 활성을 나타내었다. 또한 H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0는 기존의 ADCC 활성 증강 기술을 적용한 아푸코실화 항체 H240-afucosyl_G1d/L73-k0보다도 강한 ADCC 활성을 나타내고, H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0와는 같은 정도의 ADCC 활성을 나타내었다.
이 결과로부터 헤테로이량화 항체 H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0는 기존의 ADCC 활성 증강 기술보다도 강한 ADCC 활성을 가질 뿐 아니라, FcgRIIb에 대한 결합도 감소된 기존 기술보다도 우수한 항체이다.
또한 헤테로이량화 항체 H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0가 각 H쇄로 이루어지는 호모이량화 항체보다도 FcgR에 대해 강하게 결합한다는 헤테로이량화 항체의 성질을 갖는 것으로부터, D270E를 H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0의 양 H쇄에 도입하여 얻어진 H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0도 동일하게 헤테로이량화 항체의 성질을 가질 것으로 생각된다.
〔실시예 20〕헤테로이량화 항체 H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0의 추가적인 개량
실시예 19에 있어서 발견된 H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0의 추가적인 개량을 시도하였다. 구체적으로는 실시예 18에 있어서 발견된 H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0에 더욱 우수한 성질을 H240-Kn061에 도입함으로써 부여하는 개변 Y234E, Y235N, Y235Q, S239M을 H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0와 조합하였다.
참고 실시예 1의 방법에 따라 H240-Kn072에 Y234E, Y235N을 도입한 H240-Kn113(서열번호：92), H240-Kn072에 S239M을 도입한 H240-Kn115(서열번호：93), H240-Kn072에 Y235Q, S239M을 도입한 H240-Kn125(서열번호：94)를 제작하였다. 참고 실시예 1의 방법에 따라 한쪽 H쇄로서 H240-Hl076, L쇄로서 L73-k0를, 다른 한쪽 H쇄로서 H240-Kn113, H240-Kn115, H240-Kn125를 각각 조합하여, H240-Kn113/H240-Hl076/L73-k0, H240-Kn115/H240-Hl076/L73-k0, H240-Kn125/H240-Hl076/L73-k0를 조제하였다. 이들에 대해서, 참고 실시예 8의 방법에 따라 각 FcgR에 대한 결합을 천연형 IgG1인 H240-G1d/L73-k0, 그것에 Knobs-into-Holes를 가한 H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0, 기존의 ADCC 활성 증강 기술인 아푸코실화 항체 H240-afucosyl_G1d/L73-k0 및 ADCC 활성 증강 개변인 S239D/A330L/I332E를 양 H쇄에 도입한 호모이량화 항체 H240-Kn032/H240-Hl032/L73-k0와 함께 평가한 결과를 표 51에 정리하였다.
Figure pct00077
H240-Kn113/H240-Hl076/L73-k0는 H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0와 비교하여 억제형 FcgR인 FcgRIIb에 대한 결합은 같은 정도를 유지하며, 또한 ADCC 활성에 중요한 역할을 하는 FcgRIIIa F 및 FcgRIIIa V에 대한 결합이 증강되어 있었다. 억제형 FcgR인 FcgRIIb에 대한 결합에 대해서는 천연형 항체인 IgG1과 비교해도 결합이 같은 정도였다. FcgRIIIa에 대해서는 FcgRIIIa F 및 FcgRIIIa V에 대한 결합이 기존의 ADCC 활성 증강 기술인 아푸코실화 항체 H240-afucosyl_G1d/L73-k0 및 ADCC 활성 증강 개변인 S239D/A330L/I332E를 양 H쇄에 도입한 호모이량화 항체 H240-Kn032/H240-Hl032/L73-k0보다도 증강되어 있었다. 이 사실로부터 H240-Kn113/H240-Hl076/L73-k0는 천연형의 IgG1과 비교하여 면역 억제적인 작용이 증강되지 않고, 또한 기존의 ADCC 활성 증강 개변을 적용한 아푸코실화 항체, 호모이량화 항체 이상으로 강한 항종양효과를 가질 가능성이 있다.
H240-Kn115/H240-Hl076/L73-k0는 H240-Kn113/H240-Hl076/L73-k0와 비교하여 ADCC 활성에 중요한 역할을 하는 FcgRIIIa F 및 FcgRIIIa V에 대한 결합이 더욱 증강되어 있었다. 이뿐 아니라 ADCP 활성에 중요한 FcgRIIa R 및 FcgRIIa H에 대한 결합도 천연형 IgG1인 H240-G1d/L73-k0, 그것에 Knobs-into-Holes를 가한 H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0, 기존의 ADCC 활성 증강 기술인 아푸코실화 항체 H240-afucosyl_G1d/L73-k0 및 ADCC 활성 증강 개변인 S239D/A330L/I332E를 양 H쇄에 도입한 호모이량화 항체 H240-Kn032/H240-Hl032/L73-k0보다도 증강되어 있었다.
H240-Kn125/H240-Hl076/L73-k0는 H240-Kn113/H240-Hl076/L73-k0와 마찬가지로 억제형 FcgR인 FcgRIIb에 대한 결합이 IgG1과 같은 정도로 유지된 채로, ADCC 활성에 중요한 역할을 하는 FcgRIIIa F 및 FcgRIIIa V에 대한 결합이 H240-Kn115/H240-Hl076/L73-k0 이상으로 증강되어 있었다. 기존의 ADCC 활성 증강 기술인 아푸코실화 항체 H240-afucosyl_G1d/L73-k0 및 ADCC 활성 증강 개변인 S239D/A330L/I332E를 양 H쇄에 도입한 호모이량화 항체 H240-Kn032/H240-Hl032/L73-k0와 비교한 경우, FcgRIIa의 알로타입 중 하나인 FcgRIIa H에 대한 결합이 보다 증강되고, FcgRIIb에 대한 결합이 감소되며, FcgRIIIa에 대해서는 양 알로타입에 대한 결합이 증강되어 있는 것으로부터, H240-Kn125/H240-Hl076/L73-k0는 기존의 ADCC 활성 증강 개변을 적용한 아푸코실화 항체, 호모이량화 항체 이상으로 ADCP 활성 증강, ADCC 활성 증강이 기대되고, 이에 더하여 면역 억제적인 작용의 감소를 기대할 수 있다.
다음으로 H240-Kn113/H240-Hl076/L73-k0, H240-Kn115/H240-Hl076/L73-k0, H240-Kn125/H240-Hl076/L73-k0의 ADCC 활성을 H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0, 기존의 ADCC 활성 증강 기술인 아푸코실화 항체 H240-afucosyl_G1d/L73-k0와 비교하였다. 그 결과를 도 42에 나타낸다.
도 42로부터 어느 헤테로이량화 항체도 기존의 ADCC 활성 증강 기술인 아푸코실화 항체보다도 우수한 ADCC 활성을 나타내는 것이 명확해졌다.
각 FcgR에 대한 결합 프로파일 및 기존 기술과 비교한 ADCC 활성의 결과로부터, 금번 H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0의 H240-Kn072에 도입한 Y234E, Y235N, Y235Q, S239M은 H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0에 보다 우수한 성질을 부여하는 개변인 것이 명확해졌다.
헤테로이량화 항체 H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0가 각 H쇄로 이루어지는 호모이량화 항체보다도 FcgR에 대해 강하게 결합한다는 헤테로이량화 항체의 성질을 갖는 것으로부터, D270E를 H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0의 양 H쇄에 도입하여 얻어진 H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0도 동일하게 헤테로이량화 항체의 성질을 가지며, 거기에 추가로 개변을 도입한 H240-Kn113/H240-Hl076/L73-k0, H240-Kn115/H240-Hl076/L73-k0, H240-Kn125/H240-Hl076/L73-k0도 동일하게 헤테로이량화 항체의 성질을 갖는 것으로 생각되었다.
〔실시예 21〕FcgRIIa, FcgRIIIa에 대한 결합을 증강시킨 헤테로이량화 항체의 제작
실시예 4의 결과를 토대로 H쇄에 FcgRIIIa 및 FcgRIIa에 대해 결합을 증강시킨 개변체를 제작하였다. 구체적으로는 참고 실시예 1의 방법에 따라 H240-Kn033(서열번호：84)에 L234Y, L235Y, G236W, H268D, S298A, A327D를 도입하여 H240-Kn067(서열번호：95)을 제작하고, H240-Hl033(서열번호：85)에 D270E, K326D, A330K, K334E를 도입하여 H240-Hl068(서열번호：96)을 제작하였다. H240-Kn067, H240-Hl068, L73-k0를 조합하여 참고 실시예 1의 방법에 따라 헤테로이량화 항체 H240-Kn067/H240-Hl068/L73-k0를 발현시켰다.
먼저 이 헤테로이량화 항체 H240-Kn067/H240-Hl068/L73-k0가 그 각 H쇄로 이루어지는 호모이량화 항체보다도 FcgR에 대한 결합활성을 증강시킨다는 헤테로이량화 항체의 특징을 갖는지를 확인하였다. 헤테로이량화 항체 H240-Kn067/H240-Hl068/L73-k0의 한쪽 H쇄인 H240-Kn067에는 L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298A/A327D가, 다른 한쪽 H쇄인 H240-Hl068에는 D270E/K326D/A330K/K334E가 도입되어 있다. 이에 L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298A/A327D를 H240-Hl033에 도입한 H240-Hl136(서열번호：97) 및 D270E/K326D/A330K/K334E를 H240-Kn033에 도입한 H240-Kn133(서열번호：98)을 참고 실시예 1의 방법에 따라 제작하였다. 이 발현 벡터를 사용하여 참고 실시예 1의 방법에 따라 L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298A/A327D를 양 H쇄에 갖는 호모이량화 항체 H240-Kn067/H240-Hl136/L73-k0, D270E/K326D/A330K/K334E를 양 H쇄에 갖는 호모이량화 항체 H240-Kn113/H240-Hl068/L73-k0를 발현시켰다. 이들 호모이량화 항체와, L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298A/A327D를 한쪽 H쇄에 갖고, D270E/K326D/A330K/K334E를 다른 한쪽 H쇄에 갖는 헤테로이량화 항체 H240-Kn067/H240-Hl068/L73-k0의 FcgRIIa H, FcgRIIa R, FcgRIIIa F 및 FcgRIIIa V에 대한 결합을 참고 실시예 8의 방법에 따라 측정하였다. 그 결과를 표 52에 정리하였다.
Figure pct00078
또한 이 개변에 대해 실시예 18에 있어서 발견된 H240-Kn061에 도입함으로써 H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0에 더욱 우수한 성질을 부여하는 개변 Y235Q, S239M을 H240-Kn067/H240-Hl068/L73-k0와 조합하였다. 구체적으로는 참고 실시예 1의 방법에 따라 H240-Kn067에 S239M을 도입한 H240-Kn120(서열번호：99), H240-Kn120에 Y235Q를 도입한 H240-Kn126(서열번호：100)을 제작하였다. 참고 실시예 1의 방법에 따라 한쪽 H쇄로서 H240-Hl068, L쇄로서 L73-k0를, 다른 한쪽 H쇄로서 H240-Kn067, H240-Kn120, H240-Kn126을 각각 조합하여, H240-Kn067/H240-Hl068/L73-k0, H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0, H240-Kn126/H240-Hl068/L73-k0를 조제하였다. 이들에 대해서 참고 실시예 8의 방법에 따라 각 FcgR에 대한 결합을 평가한 결과를 표 53에 정리하였다.
Figure pct00079
이 결과로부터 H240-Kn067/H240-Hl068/L73-k0, H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0, H240-Kn126/H240-Hl068/L73-k0 모두 기존의 ADCC 활성 증강 항체인 H240-afucosyl_G1d/L73-k0 및 H240-Kn032/H240-Hl032/L73-k0와 비교하여 FcgRIIIa에 대한 결합을 동등하거나, 그 이상으로 증강시키고 있었다. 또한 어느 기존 기술과 비교해도 ADCP 활성에 중요한 역할을 하는 FcgRIIa R 및 FcgRIIa H에 대한 결합이 증강되어 있었다. 이 사실로부터 금번 제작한 H240-Kn067/H240-Hl068/L73-k0, H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0, H240-Kn126/H240-Hl068/L73-k0의 어느 헤테로이량화 항체도 기존 기술과 동등하거나 그 이상의 ADCC 활성을 가지며, 또한 그들보다도 우수한 ADCP 활성을 가질 가능성이 시사되었다.
특히 H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0는 FcgRIIa R 및 FcgRIIa H에 대한 결합을 증강시키고, ADCP 활성을 증강시켰다는 보고가 있는 G236A/S239D/I332E의 개변을 양 H쇄에 갖는 호모이량화 항체 H240-Kn037/H240-Hl036/L73-k0와 비교해도, FcgRIIa H 및 FcgRIIa R에 대한 결합이 보다 증강되어 있다. 즉 H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0는 기존의 ADCC 활성 증강 기술을 사용한 항체보다도 FcgRIIIa F 및 FcgRIIIa V에 대한 결합을 증강시키며, 또한 기존의 ADCP 활성 증강 기술을 사용한 항체보다도 FcgRIIa R 및 FcgRIIa H에 대한 결합이 증강되어 있다. 그 때문에 H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0는 기존 기술을 사용한 항체 이상으로 강한 ADCC 활성 및 ADCP 활성을 가질 가능성이 있는 우수한 항체이다.
다음으로 참고 실시예 9에 따라 각 개변체의 ADCC 활성을 기존의 ADCC 활성 증강 기술인 아푸코실화 항체 H240-afucosyl_G1d/L73-k0와 비교하였다. 그 결과를 도 43에 나타낸다.
도 43의 결과로부터 금번 제작한 어느 헤테로이량화 항체도 기존의 ADCC 활성 증강 기술인 아푸코실화 항체와 동등하거나 그 이상으로 우수한 ADCC 활성을 나타내는 것이 명확해졌다.
각 FcgR에 대한 결합 프로파일 및 기존 기술과 비교한 ADCC 활성의 결과로부터 금번 조제한 H240-Kn067/H240-Hl068/L73-k0, H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0, H240-Kn126/H240-Hl068/L73-k0 모두 기존의 ADCC 활성 증강 기술과 같은 정도나 그 이상의 ADCC 활성을 가지면서도, FcgRIIa 결합을 매개로 한 ADCP 활성도 증강시킬 가능성이 높은 헤테로이량화 항체인 것이 명확해졌다.
〔실시예 22〕헤테로이량화 항체 H240-AK072/H240-BH076/L73-k0의 각 FcgR에 대한 결합활성, ADCC 활성의 평가
지금까지 Knobs-into-Holes를 이용한 헤테로이량화 항체로서 H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0의 각 FcgR에 대한 결합, ADCC 활성을 평가해 왔다. 여기서 다른 헤테로이량화 항체 제작기술인 D356K, H435R 및 K439E를 사용한 경우에도, 상이한 2개의 H쇄로 이루어지는 헤테로이량화 항체가 그 각 H쇄로 이루어지는 호모이량화 항체보다도 FcgR에 대한 결합활성을 증강시킨다고 하는 헤테로이량화 항체의 특징이 동일하게 관찰되는지를 확인하였다.
먼저 H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0의 한쪽 H쇄인 H240-Kn072에 도입되어 있는 개변인 L234Y/L235Y/G236W/H268D/D270E/S298A를, H240-G1d(서열번호：83)의 알로타입인 H240-G1dE(서열번호：101)에 D356K, H435R을 도입한 H240-A5E(서열번호：102)에 도입하여 H240-AK072(서열번호：104)를 제작하였다. 다음으로 다른 한쪽 H쇄인 H240-Hl076에 도입되어 있는 D270E/K326D/A330M/K334E를 H240-G1dE에 K439E를 도입한 H240-B3E(서열번호：103)에 도입하여 H240-BH076(서열번호：105)을 제작하였다. 실시예 1의 방법에 따라 H240-AK072, H240-BH076, L73-k0를 조합하여 헤테로이량화 항체 H240-AK072/H240-BH076/L73-k0를 발현, 조제하였다. 동일하게 하여 H240-AK072와 L73-k0, H240-BH076과 6L73-k0를 각각 조합하여, 호모이량화 항체 H240-AK072/L73-k0, H240-BH076/L73-k0를 발현, 조제하였다. 이들 항체의 각 FcgR에 대한 결합활성을 참고 실시예 8의 방법에 따라 비교한 결과를 표 54에 정리하였다.
Figure pct00080
이 결과로부터, 헤테로이량화 항체 H240-AK072/H240-BH076/L73-k0는 그 각 H쇄로 이루어지는 호모이량화 항체 H240-AK072/L73-k0, H240-BH076/L73-k0의 어느 것보다도 강하게 FcgR에 결합한다는 헤테로이량화 항체의 특징을 갖는 것이 확인되었다.
다음으로 참고 실시예 1의 방법에 따라 H240-A5E, H240-B3E, L73-k0를 조합하여 발현하고, H240-A5E/H240-B3E/L73-k0를 조제하였다. 참고 실시예 8의 방법에 따라 H240-G1d/L73-k0, H240-A5E/H240-B3E/L73-k0, H240-afucosyl_G1d/L73-k0, 헤테로이량화 항체 H240-AK072/H240-BH076/L73-k0의 각 FcgR에 대한 결합을 평가하고, 그 결과를 표 55에 정리하였다.
Figure pct00081
그 결과, H240-AK072/H240-BH076/L73-k0의 경우는 H240-G1d/L73-k0 및 기존의 ADCC 활성 증강 기술인 아푸코실화 항체 H240-afucosyl_G1d/L73-k0와 비교하여 FcgRIIIa F, FcgRIIIa V에 대한 결합이 증강되어 있었다. 또한 H240-G1d/L73-k0와 H240-A5E/H240-B3E/L73-k0의 FcgR에 대한 결합활성은 동등한 것으로부터, H240-AK072/H240-BH076/L73-k0의 결합활성의 증강은 각 H쇄에 도입한 L234Y/L235Y/G236W/H268D/D270E/S298A 및 D270E/K326D/A330M/K334E의 개변에 유래하는 것으로 생각된다.
〔실시예 23〕Fc(Kn120/Hl068)과 FcgRIIb 세포외영역의 복합체의 X선 결정 구조 해석
실시예 21에서 제작한 H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0의 경우는, FcgRIIIa 및 FcgRIIa H형에 더하여 알로타입인 FcgRIIa R형에 대한 결합활성의 증강을 이루었는데, 억제형 수용체인 FcgRIIb에 대한 결합활성의 증강도 동시에 관찰되었다. FcgRIIb에 대한 결합 증강은 면역 억제적인 효과를 초래할 것으로 생각되기 때문에, 이 FcgRIIb와의 결합을 저감시킴으로써 본 발명의 목적인 ADCC 활성을 한층 증강시킬 수 있을 가능성이 있다.
그러나 FcgRIIa와 FcgRIIb는 세포외영역의 아미노산 서열의 93%가 일치하여 매우 높은 상동성을 가지고 있다. 또한 천연형 IgG1의 Fc(이하 Fc(WT))와 FcgRIIa R형의 세포외영역 복합체의 결정 구조(J. Imunol. 2011, 187, 3208-3217)로부터 분석하면, 양자의 상호작용 계면 부근에 있어서는, FcgRIIa R형은 FcgRIIb와 비교하여 겨우 3 아미노산(Gln127, Leu132, Phe160)에만 차이를 발견할 수 있었다(도 44). 이 때문에 FcgRIIa R형에 대한 결합활성을 유지하면서 FcgRIIb에 대한 결합활성만을 감소시키는 것은 매우 곤란할 것으로 예상되었다. 그 때문에 H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0의 Fc 부분(Fc(Kn120/Hl068))과 FcgRIIb 세포외영역의 복합체의 결정 구조 정보를 취득하여, 보다 상세하게 도입하는 아미노산 변이를 검토함으로써 FcgRIIb에 대한 결합활성을 선택적으로 저감시키는 개변을 발견할 수 있을 가능성이 보다 높아질 것으로 생각하여, Fc(Kn120/Hl068)과 FcgRIIb 세포외영역의 복합체의 X선 결정 구조 해석을 행하였다.
그 결과, Fc(Kn120/Hl068)/FcgRIIb 세포외영역 복합체에 대해서 X선 결정 구조 해석에 의해 분해능 2.78Å에서 입체구조를 결정하는 것에 성공하였다. 그 해석 결과 취득된 구조를 도 45에 나타낸다. 2개의 Fc CH2 도메인 사이에 FcgRIIb 세포외영역이 끼이듯이 결합되어 있어, 지금까지 해석된 Fc(WT)와 FcgRIIIa(Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 2011, 108, 12669-126674), FcgRIIIb(Nature, 2000, 400, 267-273; J.Biol.Chem. 2011, 276, 16469-16477), FcgRIIa의 각 세포외영역의 복합체의 입체구조가 유사한 것이 명확해졌다.
다음으로 Fc와의 결합면 가까이에 있어 FcgRIIa R형과 FcgRIIb에서 상이한 3개의 아미노산 잔기 주변의 구조를 나타낸다. 도 46에서는 Lys127(FcgRIIa R형에 있어서는 Gln) 주변의 구조를 나타내었다. 가장 가까운 FcgRIIb의 잔기는 도 46에 나타낸 Fc의 CH2 도메인 B에 있는 EU 넘버링 298번째의 Ala인데, 이 잔기는 결합의 경계면에 있어서 FcgRIIb와 직접 접해 있기 때문에, Lys127과 상호작용 가능한 커다란 잔기의 도입은 곤란할 것으로 생각되었다. 그 밖의 주위의 아미노산 잔기도 이 Lys127로부터는 거리가 멀어 직접적으로 상호작용할 수 있는 변이를 발견할 수는 없었다. 도 47에는 Ser132(FcgRIIa R형에 있어서는 Leu) 주변의 구조를 나타내었다. 역시 이 잔기도 Fc로부터의 거리가 멀어 이 Ser과 직접 상호작용이 가능해지는 변이를 발견할 수는 없었다. 마지막으로 도 48에는 Tyr160(FcgRIIa R형에 있어서는 Phe) 주변의 구조를 나타내었다. 이 Tyr은 Fc의 CH2 도메인 A에 있는 EU 넘버링 236번째의 Gly의 주쇄 카르보닐 산소와 수소 결합을 형성하고 있다. 이에 EU 넘버링 236번째의 Gly236에 변이를 도입하고 루프 구조를 변화시킴으로써, 그 결과로서 이 수소 결합을 소실시킬 수 있다면, FcgRIIb에 대한 결합활성만을 저감시킬 수 있을 가능성이 있다. 또한 EU 넘버링 236번째의 Gly의 위치에 측쇄의 커다란 변이를 도입한 경우, 그 측쇄가 FcgRIIa 및 FcgRIIb의 160번의 측쇄와 직접 상호작용하는 것이 예상되어, FcgR2a R형의 Phe160과 FcgRIIb의 Tyr160의 차이를 이용하여 FcgRIIb에 대해 선택적으로 결합활성을 저감시킬 수 있을 가능성도 생각되었다.
실험방법
［Fc(Kn0120/Hl068)의 발현 정제］
Fc(Kn0120/Hl068)의 조제는 아래와 같이 행하였다. 먼저 H240-Kn120(서열번호99) 및 H240-Hl068(서열번호96)의 EU 넘버링 220번째의 Cys를 Ser로 치환하고, EU 넘버링 236번째의 Glu로부터의 그 C 말단을 PCR에 의해 클로닝한 유전자 서열 Fc(Kn0120) 및 Fc(Hl068)을 참고예 1에 기재된 방법에 따라 발현 벡터의 제작, 발현, 정제를 행하였다. 또한 EU 넘버링 220번째의 Cys는 통상의 IgG1에 있어서는 L쇄의 Cys와 disulfide bond를 형성하고 있으나, Fc만을 조제하는 경우 L쇄를 공발현시키지 않기 때문에 불필요한 disulfide bond 형성을 회피하기 위해 Ser로 치환하였다.
［FcgRIIb 세포외영역의 발현 정제］
참고예 8의 방법에 따라 조제하였다.
［Fc(Kn120/Hl068)/FcgRIIb 세포외영역 복합체의 정제］
결정화용으로 얻어진 FcgRIIb 세포외영역 샘플 1.5 ㎎에 대해 glutathione S-transferase와의 융합 단백으로서 대장균에 의해 발현 정제한 Endo F1(Protein Science 1996, 5, 2617-2622) 0.15 ㎎을 첨가하고, 0.1M Bis-Tris pH6.5의 Buffer 조건으로 실온에서 3일간 정치함으로써, N형 당쇄를 Asn에 직접 결합한 N-acetylglucosamine을 남기고 절단하였다. 다음으로 이 당쇄 절단처리를 행한 FcgRIIb 세포외영역 샘플을 10000MWCO의 한외여과막에 의해 농축하고, 20mM HEPES pH7.5, 0.1M NaCl로 평형화한 겔 여과 칼럼크로마토그래피(Superdex200 10/300)에 의해 정제하였다. 또한 얻어진 당쇄 절단 FcgRIIb 세포외영역 분획에 Fc(Kn0120/Hl068)을 몰비로 FcgRIIb 세포외영역 쪽이 약간 과잉이 되도록 첨가하고, 10000MWCO의 한외여과막에 의해 농축 후, 25mM HEPES pH7.5, 0.1M NaCl로 평형화한 겔 여과 칼럼크로마토그래피(Superdex200 10/300)에 의해 정제하여, Fc(Kn0120/Hl068)/FcgRIIb 세포외영역 복합체의 샘플을 얻었다.
［Fc(Kn120/Hl068)/FcgRIIb 복합체 세포외영역 복합체의 결정화］
Fc(Kn120/Hl068)/FcgRIIb 세포외영역 복합체의 샘플을 10000MWCO의 한외여과막에 의해 약 10 ㎎/㎖까지 농축하고, 행잉 드롭 증기 확산법으로 Seeding법을 병용하면서 결정화를 행하였다. 결정화에는 VDXm 플레이트(Hampton Research)를 사용하고, 0.1M Bis-Tris pH6.0, 14.4% PEG3350, 0.2M Ammonium Sulfatec의 리저버용액에 대해 리저버용액：결정화 샘플＝0.85 ㎕：0.85 ㎕로 혼합하여 결정화 드롭을 제작, 추가로 동일 조건에서 얻어진 동복합체의 결정으로부터 Seeding Tool(Hampton Research)을 사용하여 종결정을 이식하는 Streak Seeding을 행하고 20℃에 정치한 바, 기둥형상의 결정을 얻는 것에 성공하였다.
［Fc(Kn120/Hl068)/FcgRIIb 세포외영역 복합체 결정으로부터의 X선 회절 데이터의 측정］
얻어진 Fc(Kn120/Hl068)/FcgRIIb 세포외영역 복합체의 단결정 하나를 0.1M Bis-Tris pH6.0, 17.5% PEG3350, 0.2M Ammonium Sulfate, Glycerol 16%(v/v)의 용액에 침지한 후, 미소한 나일론 루프 부착 핀으로 용액째 떠서, 액체질소 중에서 동결시켜 고에너지 가속기 연구기구의 방사광시설 포톤 팩토리 BL-17A로 X선 회절 데이터의 측정을 행하였다. 또한 측정 중에는 항상 -178℃의 질소기류 중에 둠으로써 동결상태를 유지하고, 빔라인이 비치된 CCD 디텍터 Quantum 315r(ADSC)에 의해, 결정을 0.5°씩 회전시키면서 토탈 360매의 X선 회절 화상을 수집하였다. 얻어진 회절 화상으로부터의 격자상수의 결정, 회절 반점의 지수부여 및 회절 데이터의 처리에는 프로그램 Xia2(J. Appl. Cryst. 2010, 43, 186-190), XDS Package(Acta Cryst. 2010, D66, 125-132) 및 Scala(Acta Cryst. 2006, D62, 72-82)를 사용하여, 최종적으로 분해능 2.78Å까지의 회절 강도 데이터를 얻었다. 본 결정은 공간군 P41212에 속하고, 격자상수 a＝152.94Å, b＝152.94Å, c＝82.24Å, α＝90°, β＝90°, γ＝90°였다.
［Fc(Kn120/Hl068)/FcgRIIb 세포외영역 복합체의 X선 결정 구조 해석］
구조 결정은 프로그램 Phaser(J. Appl. Cryst. 2007, 40, 658-674)를 사용한 분자 치환법에 의해 행하였다. 얻어진 결정 격자의 크기와 Fc(Kn120/Hl068)/FcgRIIb 세포외영역 복합체의 분자량으로부터 비대칭 단위 중 복합체의 수는 1개로 예상되었다. Fc(WT)/FcgRIIIa 세포외영역 복합체의 결정 구조인 PDB code:3SGJ의 구조 좌표로부터, A쇄 239-340번 및 B쇄 239-340번의 아미노산 잔기 부분을 별도좌표로서 취출하여, 각각을 Fc CH2 도메인의 탐색용 모델로 하였다. 마찬가지로 PDB code:3SGJ의 구조 좌표로부터, A쇄 341-444번과 B쇄 341-443번의 아미노산 잔기 부분을 하나의 좌표로서 취출하여 Fc CH3 도메인의 탐색용 모델로 하였다. 마지막으로 FcgRIIb 세포외영역의 결정 구조인 PDB code:2FCB의 구조 좌표로부터 A쇄 6-178번의 아미노산 잔기 부분을 취출하여 FcgRIIb의 탐색용 모델로 하였다. Fc CH3 도메인, FcgRIIb 세포외영역, Fc CH2 도메인의 각 탐색용 모델의 결정격자 내에서의 방향과 위치를 회전함수 및 병진함수로부터 결정하고, Fc(Kn120/Hl068)/FcgRIIb 세포외영역 복합체 결정 구조의 초기 모델을 얻었다. 얻어진 초기 모델에 대해 2개의 Fc의 CH2 도메인, 2개의 Fc의 CH3 도메인 및 FcgRIIb 세포외영역을 움직이는 강체(剛體) 정밀화를 행한 바, 이 시점에서 25-3.0Å의 회절 강도 데이터에 대해 결정학적 신뢰도 인자 R값은 41.4%, Free R값은 42.6%가 되었다. 또한 프로그램 REFMAC5(Acta Cryst. 2011, D67, 355-367)를 사용한 구조 정밀화와, 실험적으로 결정된 구조 인자 Fo와 모델로부터 계산된 구조 인자 Fc 및 모델로부터 계산된 위상을 토대로 산출한 2Fo-Fc, Fo-Fc를 계수로 하는 전자밀도 지도를 보면서 모델 수정을 프로그램 Coot(Acta Cryst. 2010, D66, 486-501)로 행하여, 이들을 반복함으로써 모델의 정밀화를 행하였다. 마지막으로 2Fo-Fc, Fo-Fc를 계수로 하는 전자밀도 지도를 토대로 수분자를 모델에 삽입하여 정밀화를 행함으로써, 최종적으로 분해능 25-2.78Å의 24274개의 회절 강도 데이터를 사용하여, 4964개의 비수소원자를 포함하는 모델에 대해 결정학적 신뢰도 인자 R값은 22.8%, Free R값은 27.7%가 되었다.
〔실시예 24〕FcgRIIaR에 대한 결합활성을 유지 또는 증강시키고, FcgRIIb에 대한 결합활성을 저감시킨 항체의 제작
실시예 21에서 발견된 개변체 H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0는 ADCP 활성에 중요한 FcgRIIaR, FcgRIIaH에 대한 결합활성이 증강되는 동시에, 억제형의 FcgRIIb에 대한 결합활성도 천연형 IgG1과 비교하여 약 50배 증강되어 있었다. 높은 ADCP 활성을 나타내기 위해서는 억제형 FcgRIIb에 대한 결합활성을 가능한 한 저감시킬 수 있는 것이 바람직하다. 이에 활성형 FcgRIIaR, FcgRIIaH로의 결합활성을 유지한 채로 FcgRIIb로의 결합활성을 저감시킬 수 있는 개변을 탐색하였다. 실시예 23에 나타낸 바와 같이, H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0의 Fc와 FcgRIIb 세포외영역의 복합체의 결정 구조 해석결과로부터 FcgRIIb의 Tyr160과 Fc(Kn120/Hl068)의 CH2 도메인 A에 존재하는 Gly236의 주쇄 카르보닐 산소와의 사이에서 수소결합이 형성되어 있는 것이 나타내어졌다. FcgRIIaR, FcgRIIaH에 있어서는 이 부위가 Phe160으로 되어 있어 전술한 상호작용은 존재하지 않을 것으로 생각되기 때문에, Gly236에 개변을 도입하여 FcgRIIb의 Tyr160과의 상호작용을 소실시킬 수 있다면, FcgRIIa R형에 대한 결합활성은 유지하면서도 FcgRIIb에 대한 결합활성을 저하시키는, 즉 FcgRIIb에 대해 선택적으로 결합활성을 저감시킬 수 있을 가능성이 있다. 구체적으로는 H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0와 FcgRIIb의 결합에 있어서 FcgRIIb의 Y160과 상호작용하고 있는 H240-Hl068에 유래하는 H쇄가 존재하는 G236을 Ser, Val, Ile, Thr로 치환함으로써 G236을 반전시키고, 루프 구조를 변화시켜, Y160과의 상호작용을 소실시킬 수 없을까 생각하였다. 또한 FcgRIIb의 Lys127과 Fc(Kn120/Hl068)의 CH2 도메인 A의 E294는 거리가 멀어도 정전 상호작용하고 있을 가능성이 있다. 따라서 E294를 양전하를 갖는 Lys, Arg로 치환함으로써 정전 반발을 일으켜, FcgRIIb와의 상호작용을 감소시킬 수 있을 가능성이 있을 것으로 생각하였다.
참고 실시예 1의 방법에 따라 H240-Kn120(서열번호 99)에 대해 각각 E294R, E294K를 도입한 H240-Kn179(서열번호 107), H240-Kn180(서열번호 108)을 H240-Hl068(서열번호 96)에 각각 G236S, G236V, G236I, G236T를 도입한 H240-Hl073(서열번호 109), H240-Hl085(서열번호 110), H240-Hl086(서열번호 111), H240-Hl089(서열번호 112)를 제작하였다. 참고 실시예 1의 방법에 따라 한쪽 H쇄로서 H240-Kn120, H240-Kn180을, L쇄로서 L73-k0를, 다른 한쪽 H쇄로서 H240-Hl073, H240-Hl085, H240-Hl086, H240-Hl089를 각각 조합하여, H240-Kn120/H240-Hl073/L73-k0, H240-Kn120/H240-Hl085/L73-k0, H240-Kn120/H240-Hl086/L73-k0, H240-Kn120/H240-Hl089/L73-k0, H240-Kn179/H240-Hl068/L73-k0, H240-Kn180/H240-Hl068/L73-k0를 조제하였다. 이들 개변체의 FcgR에 대한 결합을 참고 실시예 8의 방법에 따라 평가한 결과를 표 56에 나타낸다. 또한 표 중에 회색으로 칠한 H240-Kn120/H240-Hl073/L73-k0의 KD는 이때의 FcgRIa에 대한 kd가 본 측정에서 사용한 Biacore4000의 해리상수(kd)의 측정 가능 범위 5×10-5s-1~1s-1의 범위 측정 한계인 5×10-5s-1보다도 작은 값을 나타내고 있었기 때문에, kd를 5×10-5s-1 이하로서 산출한 KD이다.
Figure pct00082
또한 H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0의 FcgRIIaR, FcgRIIaH, FcgRIIb에 대한 각 KD를 각 개변체의 KD로 나눈 값, H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0의 FcgRIIaR, FcgRIIaH, FcgRIIb에 대한 KD를 1로 하였을 때의 상대적인 KD인 relative KD를 표 57에 나타내었다.
Figure pct00083
이들 결과로부터 본 검토에서 제작한 6종류의 개변은 모두 H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0와 비교하여, FcgRIIaR, FcgRIIaH에 대한 결합활성을 유지 또는 증강시키고, FcgRIIb에 대한 결합활성을 감소시키는 것이 나타내어졌다.
다음으로 표 57에서 검토한 개변을 조합시킴으로써 추가로 FcgRIIb에 대한 결합활성을 감소시키는 것을 시도하였다. 여기에서는 H240-Kn120으로의 E294K 또는 E294R의 도입 및 H240-Hl068로의 G236T의 도입을 병용함으로써 추가적인 FcgRIIb에 대한 결합활성의 억제를 시도하였다. 표 57에 나타낸 바와 같이, 이들 개변은 모두 FcgRIIIaF, FcgRIIIaV에 대한 결합활성을 감소시킨다. 이에 이들 개변에 더하여 FcgRIIIa에 대한 결합활성을 증강시키는 것이 보고되어 있는 I332E 및 실시예 18에서 나타낸 FcgRIIIa에 대한 결합활성을 증강시키는 개변인 Y235N을 도입하여, 추가적인 FcgRIIb에 대한 결합활성의 억제 및 FcgRIIIa에 대한 결합활성의 증강을 시도하였다.
참고 실시예 1의 방법에 따라 H240-Kn120(서열번호 99)에 대해, Y235N과 E294K를 도입한 H240-Kn192(서열번호 113), Y235N과 E294R을 도입한 H240-Kn193(서열번호 114)을, H240-Hl068(서열번호 96)에 G236T와 I332E를 도입한 H240-Hl204(서열번호 115)를 제작하였다. 참고 실시예 1의 방법에 따라 한쪽 H쇄로서 H240-Kn192, H240-Kn193을, L쇄로서 L73-k0를, 다른 한쪽 H쇄로서 H240-Hl089, H240-Hl204를 각각 조합하여, H240-Kn179/H240-Hl089/L73-k0, H240-Kn180/H240-Hl089/L73-k0, H240-Kn192/H240-Hl204/L73-k0, H240-Kn193/H240-Hl204/L73-k0를 조제하였다. 이들 개변체의 FcgR에 대한 결합활성을 참고 실시예 8의 방법에 따라 평가한 결과를 표 58에 나타낸다. 또한 표 중에 회색으로 칠한 H240-Kn120/H240-Hl073/L73-k0의 KD는, 이때의 FcgRIa에 대한 kd가 본 측정에서 사용한 Biacore4000의 해리상수(kd)의 측정 가능 범위 5×10-5s-1~1s-1의 범위 측정 한계인 5×10-5s-1보다도 작은 값을 나타내고 있었기 때문에, kd를 5×10-5s-1 이하로서 산출한 KD이다.
Figure pct00084
또한 H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0의 FcgRIIaR, FcgRIIaH, FcgRIIb에 대한 각 KD를 각 개변체의 KD로 나눈 값, H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0의 FcgRIIaR, FcgRIIaH, FcgRIIb에 대한 KD를 1로 하였을 때의 상대적인 KD인 relative KD를 표 59에 나타내었다.
Figure pct00085
H240-Kn120에 E294K 또는 E294R을 도입하고, H240-Hl068에 G236T를 도입한 H240-Kn179/H240-Hl089/L73-k0 및 H240-Kn180/H240-Hl089/L73-k0는 모두 H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0와 비교하여 FcgRIIaR, FcgRIIaH로의 결합을 증강시키면서 FcgRIIb로의 결합을 0.4배로 저감시키고 있었다. 또한 각각의 개변을 어느 한쪽 사슬에만 갖는 H240-Kn120/H240-Hl089/L73-k0, H240-Kn179/H240-Hl068/L73-k0, H240-Kn180/H240-Hl068/L73-k0와 비교하여 1.5배~2배의 FcgRIIb로의 결합 저감효과를 나타내었다.
이들 개변체에 대해 추가로 I332E 및 Y235N을 도입한 H240-Kn192/H240-Hl204/L73-k0 및 H240-Kn193/H240-Hl204/L73-k0는 모두 개변 도입 전의 H240-Kn179/H240-Hl089/L73-k0 및 H240-Kn180/H240-Hl089/L73-k0와 비교하여 FcgRIIaR, FcgRIIaH, FcgRIIb로의 결합을 유지한 채로 FcgRIIIaF로의 결합을 2배로, 또한 FcgRIIIaV로의 결합을 약 8배 향상시킬 수 있었다.
〔실시예 25〕헤테로이량화 항체 H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0의 활성형 FcgR에 대한 결합활성의 증강
실시예 24에 있어서 H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0에 대해 개변을 도입함으로써 FcgRIIaR, FcgRIIaH에 대한 결합을 유지 또는 증강시키고, 억제형 FcgRIIb에 대한 결합활성을 저감시킨 개변체를 제작하였다. 본 검토에서는 활성형의 FcgR인 FcgRIIaR, FcgRIIaH, FcgRIIIaF, FcgRIIIaV에 대한 결합활성의 증강을 시도하였다.
참고 실시예 1의 방법에 따라 H240-Kn120에 L328W를 도입한 H240-Kn138(서열번호 116), I332Q를 도입한 H240-Kn173(서열번호 117), K334Y를 도입한 H240-Kn178(서열번호 118), L328A를 도입한 H240-Kn166(서열번호 119), I332M을 도입한 H240-Kn172(서열번호 120), L328W와 K334L을 도입한 H240-Kn149(서열번호 121)를 제작하였다. 또한 다른 한쪽 H쇄로서 H240-Hl068에 L328W를 도입한 H240-Hl147(서열번호 122), L328A를 도입한 H240-Hl170(서열번호 123), I332E를 도입한 H240-Hl174(서열번호 124), I332T를 도입한 H240-Hl150(서열번호 125), A231H를 도입한 H240-Hl182(서열번호 126), I332Q를 도입한 H240-Hl177(서열번호 127)을 제작하였다. 참고 실시예 1의 방법에 따라 한쪽 H쇄로서 H240-Kn138(서열번호 116), H240-Kn173(서열번호 117), H240-Kn178(서열번호 118), H240-Kn149(서열번호 121), H240-Kn166(서열번호 119), H240-Kn172(서열번호 120)를, 또한 다른 한쪽 H쇄로서 H240-Hl170(서열번호 123), H240-Hl150(서열번호 125), H240-Hl174(서열번호 124), H240-Hl182(서열번호 126), H240-Hl147(서열번호 122), H240-Hl177(서열번호 127)을, L쇄로서 L73-k0(서열번호 106)를 사용하여 H240-Kn120/H240-Hl170/L73-k0, H240-Kn120/H240-Hl150/L73-k0, H240-Kn138/H240-Hl068/L73-k0, H240-Kn120/H240-Hl174/L73-k0, H240-Kn173/H240-Hl068/L73-k0, H240-Kn178/H240-Hl068/L73-k0, H240-Kn120/H240-Hl182/L73-k0, H240-Kn138/H240-Hl147/L73-k0, H240-Kn166/H240-Hl170/L73-k0, H240-Kn172/H240-Hl177/L73-k0, H240-Kn149/H240-Hl068/L73-k0를 조제하였다. 이들 개변체의 FcgR에 대한 결합을 참고 실시예 8의 방법에 따라 평가한 결과를 표 60에 나타낸다.
Figure pct00086
또한 H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0의 FcgRIa FcgRIIaR, FcgRIIaH, FcgRIIb, FcgRIIaF, FcgRIIIaV에 대한 각 KD를 각 개변체의 KD로 나눈 값, H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0의 FcgRIIaR, FcgRIIaH, FcgRIIb에 대한 각 KD를 1로 하였을 때의 상대적인 KD인 relative KD를 표 61에 나타내었다.
Figure pct00087
여기에 나타낸 개변체는 H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0와 비교하여 FcgRIIaR, FcgRIIaH, FcgRIIIaF, FcgRIIIaV 중 하나 이상의 FcgR에 대한 결합이 증강되어 있는 개변체이다.
H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0의 한쪽 H쇄인 H240-Hl068에 대해 L328A를 도입한 H240-Kn120/H240-Hl170/L73-k0는 H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0와 비교하여 FcgRIIaR, FcgRIIaH에 대한 결합활성이 2.3배 향상되었다.
H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0의 한쪽 H쇄인 H240-Hl068에 대해 I332T를 도입한 H240-Kn120/H240-Hl150/L73-k0는 H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0와 비교하여 FcgRIIaR에 대한 결합활성을 유지한 채로 FcgRIIaH에 대한 결합활성이 1.2배 향상되었다.
H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0의 한쪽 H쇄인 H240-Kn120에 L328W를 도입한 H240-Kn138/H240-Hl068/L73-k0는 H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0와 비교하여 FcgRIIaR에 대한 결합활성을 유지한 채로 FcgRIIaH에 대한 결합활성이 1.6배로 향상되었다.
H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0의 한쪽 H쇄인 H240-Hl068에 대해 I332E를 도입한 H240-Kn120/H240-Hl174/L73-k0는, H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0와 비교하여 FcgRIIIaF에 대한 결합활성이 4.3배, FcgRIIIaV에 대한 결합활성이 10배 향상되었다.
H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0의 한쪽 H쇄인 H240-Kn120에 대해 I332Q를 도입한 H240-Kn173/H240-Hl068/L73-k0는, H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0와 비교하여 FcgRIIIaV에 대한 결합활성을 유지한 채로 FcgRIIIaF에 대한 결합활성이 1.2배 향상되었다.
H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0의 한쪽 H쇄인 H240-Kn120에 대해 K334Y를 도입한 H240-Kn178/H240-Hl068/L73-k0는 H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0와 비교하여 FcgRIIIaF에 대한 결합활성이 1.6배로, FcgRIIIaV에 대한 결합활성이 1.9배로 향상되었다.
H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0의 한쪽 H쇄인 H240-Hl068에 대해 A231H를 도입한 H240-Kn120/H240-Hl182/L73-k0는, H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0와 비교하여 FcgRIIIaV에 대한 결합활성이 1.2배로 향상되었다.
H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0의 양쪽 H쇄에 L328W를 도입한 H240-Kn138/H240-Hl147/L73-k0는, H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0와 비교하여 FcgRIIaR에 대한 결합활성이 1.8배로 향상되었다.
H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0의 양쪽 H쇄에 L328A를 도입한 H240-Kn166/H240-Hl170/L73-k0는, H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0와 비교하여 FcgRIIaH에 대한 결합활성이 1.9배로 향상되었다.
H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0의 한쪽 H쇄인 H240-Kn120에 I332M을, 다른 한쪽 H쇄인 H240-Hl068에 대해 I332Q를 도입한 H240-Kn172/H240-Hl177/L73-k0는, H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0와 비교하여 FcgRIIIaF에 대한 결합활성을 유지한 채로 FcgRIIIaV에 대한 결합활성이 1.6배 향상되었다.
H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0의 한쪽 H쇄인 H240-Kn120에 L328W, K334L을 도입한 H240-Kn149/H240-Hl068/L73-k0는, H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0와 비교하여 FcgRIIaR, FcgRIIIaV에 대한 결합활성을 유지한 채로 FcgRIIaH에 대한 결합활성이 1.6배 향상되었다.
이상의 결과로부터 이들 개변체는 H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0와 비교하여 높은 ADCP 활성 또는 ADCC 활성을 갖는 것으로 생각되었다.
〔실시예 26〕FcgRIIb에 대한 결합활성을 증강시킨 헤테로이량화 항체의 창출
인간의 경우는 FcγR의 단백질 패밀리에는 FcγRIa(CD64A), FcγRIIa(CD32A), FcγRIIb(CD32B), FcγRIIIa(CD16A), FcγRIIIb(CD16B)의 아이소폼이 보고되어 있고, 각각의 알로타입도 보고되어 있다(Immunol Lett, 82(1-2), 57-65, 2002). FcγRIa, FcγRIIa, FcγRIIIa는 면역 활성적인 기능을 갖기 때문에 활성형 FcγR로 불리며, FcγRIIb는 면역 억제적인 기능을 가져 억제형 FcγR로 불린다(Nat Rev Immunol, 10, 328-343, 2010).
FcγRIIb는 B세포에 발현하고 있는 유일한 FcγR이다(Eur J Immunol 19, 1379-1385, 1989). FcγRIIb에 대해 항체의 Fc영역이 상호작용함으로써 B세포의 초회 면역이 억제되는 것이 보고되어 있다(J Exp Med 129, 1183-1201, 1969). 또한 B세포 상의 FcγRIIb와 B세포 수용체(B cell receptor：BCR)가 혈중 면역 복합체를 매개로 가교되면, B세포의 활성화가 억제되어, B세포의 항체 생산이 억제되는 것이 보고되어 있다(Immunol Lett 88, 157-161, 2003). 이 BCR과 FcγRIIb를 매개로 한 면역 억제적인 시그날의 전달에는 FcγRIIb의 세포 내 도메인에 포함되는 immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif(ITIM)가 필요하다(Science, 256, 1808-1812, 1992, Nature, 368, 70-73, 1994). 시그날이 들어가 ITIM이 인산화되면 SH2-containing inositol polyphosphate 5-phosphatase(SHIP)가 리쿠르트되어, 다른 활성형 FcγR의 시그날 캐스케이드의 전달을 저해하여, 염증성 면역반응을 억제한다(Science, 290, 84-89, 2000). 또한 FcgRIIb만을 회합화함으로써도 BCR 비의존적으로 IgM 생산 B세포를 아포토시스하지 않고 B세포의 증식과 BCR의 가교에 의한 칼슘 유입을 일과적으로 억제하는 것이 보고되어 있다(J Imunol, 181, 5350-5359, 2008)
또한 FcγRIIb는 수상세포, 마크로파지, 활성화된 호중구, 마스트 세포, 호염기구에서도 발현하고 있다. 이들 세포에 있어서도, FcγRIIb는 phagocytosis나 염증성 사이토카인의 방출 등의 활성형 FcγR의 기능을 저해하여, 염증성 면역반응을 억제한다(Nat Rev Immunol, 10, 328-343, 2010).
FcγRIIb의 면역 억제적인 기능의 중요성에 대해서는 지금까지 FcγRIIb 녹아웃 마우스를 사용한 연구에 의해 명확해져 왔다. FcγRIIb 녹아웃 마우스의 경우는 액성 면역이 적절히 제어되지 않고(J Immunol, 163, 618-622, 1999), 콜라겐 유도 관절염(CIA)에 대한 감수성이 증가하거나(J Exp Med, 189, 187-194, 1999), 루프스(lupus) 유사 증상을 나타내거나, 굿패스쳐(Goodpasture) 신드롬 유사 증상을 나타내는(J Exp Med, 191, 899-906, 2000) 것이 보고되어 있다.
또한 FcγRIIb의 조절 부전은 인간의 자기면역 질환과의 관련도 보고되어 있다. 예를 들면 FcγRIIb의 프로모터영역이나 세포막 관통영역에 있어서의 유전자 다형과 전신성 홍반성 루프스(SLE)의 발증 빈도의 관련(Hum, Genet, 117, 220-227, 2005, J Biol Chem, 282, 1738-1746, 2007, Arthritis Rheum, 54, 3908-3917, 2006, Nat Med, 11, 1056-1058, 2005, J Immunol, 176, 5321-5328, 2006)이나, SLE 환자의 B세포 표면에 있어서의 FcγRIIb의 발현 저하가 보고되어 있다(J Exp Med, 203, 2157-2164, 2006, J Immunol. 178, 3272-3280, 2007).
이와 같이 마우스 모델 및 임상상의 지견으로부터, FcγRIIb는 B세포와의 관여를 중심으로 자기면역 질환, 염증성 질환을 제어하는 역할을 하고 있는 것으로 생각되어, 자기면역 질환, 염증성 질환을 제어하기 위한 유망한 표적 분자이다.
시판의 항체 의약으로서 주로 사용되고 있는 IgG1은 FcγRIIb뿐 아니라 활성형 FcγR에도 강하게 결합하는 것이 알려져 있다(Blood, 113, 3716-3725, 2009). FcγRIIb에 대한 결합을 증강시켰거나 또는 활성형 FcγR과 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합활성의 선택성을 향상시킨 Fc영역을 이용함으로써, IgG1과 비교하여 면역 억제적인 성질을 가진 항체 의약의 개발 가능성을 생각할 수 있다. 예를 들면 BCR에 결합하는 가변영역과 FcγRIIb에 대한 결합을 증강시킨 Fc를 갖는 항체를 이용함으로써 B세포의 활성화를 저해할 가능성이 시사되어 있다(Mol Immunol, 45, 3926-3933, 2008). B세포 상의 FcγRIIb와 Ｂ-cell receptor에 결합한 IgE가 가교됨으로써, B세포의 플라즈마 세포로의 분화, 그 결과로서 일어나는 IgE 생산이 억제되어, 인간 PBMC를 이식한 마우스에 있어서 인간 IgG나 IgM 농도는 유지되고 있으나, 인간 IgE 농도는 감소하는 것이 보고되어 있다(Acad News, doi: 10.1016, jaci.2011.11.029). IgE뿐 아니라 B-cell receptor 복합체를 형성하는 CD79b와 FcgRIIb를 항체로 가교한 경우에는 in vitro에 있어서 B세포의 증식이 억제되어, 콜라겐 관절염 모델에 있어서 증상을 완화시킨 것이 보고되어 있다(Arthritis Rheum, 62, 1933-1943, 2010).
B세포 이외에도 IgE의 수용체인 FcεRI와 결합하는 IgE의 Fc 부분과 FcgRIIb에 대한 결합을 증강시킨 IgG의 Fc 부분을 융합시킨 분자를 사용하여, 마스트 세포 상의 FcεRI와 FcgRIIb를 가교함으로써 FcgRIIb의 인산화를 일으키고 FcεRI 의존적인 칼슘의 유입을 억제하는 것이 보고되어 있어, 이는 FcgRIIb에 대한 결합을 증강시킴으로써 FcgRIIb의 자극을 매개로 한 탈과립의 저해가 가능한 것을 시사하고 있다(Immunol let, doi: 10.1016/j.imlet.2012.01.008).
이들 사실로부터 FcγRIIb에 대한 결합활성을 향상시킨 Fc를 갖는 항체가 자기면역 질환 등의 염증성 질환의 치료제로서 유망한 것이 시사된다.
또한 FcgRIIb에 대한 결합을 증강시킨 변이체는 자기면역 질환 등의 염증성 질환의 치료제에 더하여 암 치료제로서도 유망한 것이 시사되어 있다. 지금까지 FcgRIIb는 항TNF 수용체 패밀리에 대한 아고니스트 항체의 아고니스트 활성에 있어서도 중요한 역할을 하는 것이 명확해져 있다. 구체적으로는 TNF 수용체 패밀리에 포함되는 CD40, DR4, DR5, CD30, CD137에 대한 항체의 아고니스트 활성에는 FcgRIIb와의 상호작용이 필요한 것이 시사되어 있다(Science, 333, 1030-1034, 2011, Cancer Cell 19, 101-1113, 2011, J Clin Invest 2012; doi:10.1172/JCI61226, J Immunol 171, 562-, 2003, Blood, 108, 705-, 2006, J Immunol 166, 4891, 2001). 비특허문헌(Science, 333, 1030-1034, 2011)에 있어서는 FcgRIIb에 대한 결합을 증강시킨 항체를 사용함으로써 항CD40 항체의 항종양효과가 증강되는 것이 나타내어져 있다. 이 사실로부터 FcgRIIb에 대한 결합을 증강시킨 항체는 항TNF 수용체 패밀리에 대한 항체를 비롯한 아고니스트 항체의 아고니스트 작용을 증강시키는 효과가 있을 것으로 기대된다.
지금까지 FcγRIIb에 대한 결합활성을 향상시킨 Fc를 갖는 항체에 대한 보고는 되어 있다(Mol Immunol, 45, 3926-3933, 2008). 이 문헌 중에서는 항체의 Fc영역에 S267E/L328F, G236D/S267E, S239D/S267E 등의 개변을 가함으로써 FcγRIIb에 대한 결합활성을 향상시키고 있었다. 이 문헌 중에서 S267E/L328F의 변이를 도입한 항체가 가장 강하게 FcγRIIb에 대해 결합해 있었다. 이 FcγRIIb에 대한 결합을 한층 증강시킴으로써 전술한 FcγRIIb를 매개로 한 작용을 추가로 증강시키는 것을 기대할 수 있다.
또한 S267E/L328F의 변이를 도입한 항체는 FcγRIa 및 FcγRIIa의 H형에 대한 결합은 천연형 IgG1과 같은 정도로 유지되어 있었다. 그러나 별도의 보고에 의하면, 이 개변은 FcγRIIa의 R형에 대한 결합이 FcγRIIb에 대한 결합과 같은 정도로 수백배 증강되어 있어, FcγRIIa R형과 비교한 경우, FcγRIIb에 대한 결합활성의 선택성이 향상되어 있지 않다(Eur J Immunol 23, 1098-1104, 1993).
FcγRIIb에 대한 결합이 IgG1과 비교하여 증강되어 있었다 하더라도, FcγRIIb를 발현하지 않고 FcγRIIa를 발현하고 있는 혈소판과 같은 세포(Nat Rev Immunol, 10, 328-343, 2010)에 관해서는, FcγRIIb에 대한 결합의 증강이 아니라 FcγRIIa에 대한 결합 증강의 효과만이 영향을 미치는 것으로 생각된다. 예를 들면 VEGF에 대한 항체인 bevacizumab이 투여된 환자군에서는 혈전 색전증의 리스크가 상승되는 것이 알려져 있다(J Natl Cancer Inst, 99, 1232-1239, 2007). 또한 CD40 ligand에 대한 항체의 임상 개발시험에 있어서도 마찬가지로 혈전 색전증이 관찰되어 임상시험이 중지되었다(Arthritis Rheum, 48, 719-727, 2003). 이들 중 어느 항체의 경우도, 동물 모델 등을 사용한 그 후의 연구에 의해 투여한 항체가 혈소판 상의 FcgRIIa에 대한 결합을 매개로 혈소판을 응집하여 혈전을 형성하는 것이 시사되어 있다(J Thromb Haemost, 7, 171-181, 2008, J Immunol, 185, 1577-1583, 2010). 자기면역 질환의 하나인 전신성 홍반성 루프스에 있어서는 FcγRIIa 의존적인 메커니즘에 의해 혈소판이 활성화되어, 혈소판의 활성화가 중증도와 상관관계가 있다는 보고가 있다(Sci Transl Med, vol 2, issue 47, 47-63, 2010). 이러한 혈전 색전증을 발증할 리스크가 원래 높은 환자에 대해 FcgRIIa에 대한 결합을 증강시킨 항체를 투여하는 것은, 가령 FcgRIIb에 대한 결합이 증강되어 있었다 하더라도 혈전 색전증의 발증 리스크를 한층 높이게 되어 매우 위험하다.
또한 FcgRIIa에 대한 결합을 증강시킨 항체는 마크로파지를 매개로 한 항체 의존적 탐식활성(ADCP)이 증강되는 것이 보고되어 있다(Mol Cancer Ther 7, 2517-2527, 2008). 항체의 항원이 마크로파지에 의해 탐식되는 동시에 항체 자신도 탐식되게 되는데, 그 경우 그 항체 유래의 펩티드 단편도 항원 제시되어 항원성이 높아질 것으로 생각되어, 항체에 대한 항체(항항체)의 생산 리스크를 상승시킬 것으로 생각된다. 즉 FcgRIIa에 대한 결합을 증강시키면 항체에 대한 항체의 생산 리스크를 높여 의약품으로서의 가치를 현저히 감소시켜 버린다.
즉 FcgRIIa에 대한 결합을 증강시키면 혈소판 응집을 매개로 한 혈전 형성의 리스크를 상승시켜 버리고, 또한 항원성이 높아져, 항항체 생산의 리스크를 높여 버린다는 점에서 의약품으로서의 가치를 현저히 감소시켜 버린다.
이러한 관점에서 앞선 FcgRIIb에 대한 결합을 증강시킨 Fc에 대해서 살펴보면, FcgRIIa R형에 대한 결합은 천연형 IgG1과 비교하여 현저히 증강되어 있기 때문에, FcgRIIa R형을 보유하는 환자로의 의약품으로서의 가치를 현저히 감소시키고 있다. FcγRIIa의 H형과 R형은 Caucasian이나 African-American에서 거의 같은 정도의 빈도로 관찰된다(J Clin Invest, 97, 1348-1354, 1996, Arthritis Rheum, 41, 1181-1189, 1998). 이 사실로부터 이 Fc를 자기면역 질환의 치료에 사용하는 경우에, 의약품으로서의 효과를 누리면서 안전하게 이용할 수 있는 환자의 수는 한정적이다.
또한 FcgRIIb를 결손시킨 수상세포 또는 항FcgRIIb 항체에 의해 FcgRIIb와 항체의 Fc 부분의 상호작용이 저해된 수상세포에 있어서는, 수상세포의 성숙이 자발적으로 일어나는 것이 보고되어 있다(J Clin Invest 115, 2914-2923, 2005，Proc Natl Acad Sci USA, 102, 2910-2915, 2005). 이 보고로부터 FcgRIIb는 염증 등이 발생하지 않은 정상상태(steady state)에 있어서 적극적으로 수상세포의 성숙을 억제하고 있는 것이 시사된다. 수상세포 표면에는 FcgRIIb에 더하여 FcgRIIa도 발현하고 있는 것으로부터, 설령 억제형의 FcgRIIb에 대한 결합을 증강시켰다 하더라도 활성형의 FcgRIIa 등에 대한 결합도 증강되어 있으면, 결과적으로 수상세포의 성숙을 촉진시켜 버리는 것으로 생각된다. 즉 FcgRIIb에 대한 결합활성뿐 아니라 FcgRIIa에 대한 결합활성에 대해 FcgRIIb에 대한 결합활성의 비율을 개선시키는 것이 항체에 면역 억제적인 작용을 초래하는 데 있어서는 중요한 것으로 생각된다.
이 사실로부터 FcgRIIb의 결합을 매개로 한 면역 억제적인 작용을 이용한 의약품의 창출을 고려한 경우, FcgRIIb에 대한 결합활성을 증강시킬 뿐 아니라 FcgRIIa H형, R형의 어느 유전자 다형에 대해서도 결합을 천연형 IgG1과 같은 정도로 유지하거나 그 이하로 감소시킨 Fc가 요구되고 있다.
이에 대해, 지금까지 Fc영역에 아미노산 개변을 도입함으로써 FcγRIIb에 대한 결합활성의 선택성을 상승시킨 예가 보고되어 있다(Mol Immunol, 40, 585-593, 2003). 그러나 이 문헌 중에서 보고되어 있는 FcγRIIb에 대한 선택성이 개선된 것으로 여겨지는 어느 변이체에 있어서도, 천연형 IgG1과 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합이 감소되어 있었다. 그 때문에 이들 변이체가 실제로 FcγRIIb를 매개로 한 면역 억제적인 반응을 IgG1 이상으로 일으키는 것은 곤란할 것으로 생각된다.
또한 앞서 기술한 아고니스트 항체에 있어서도 FcgRIIb는 중요한 역할을 하고 있기 때문에, 그 결합활성을 증강시킴으로써 아고니스트 활성의 증강도 기대된다. 그러나 FcgRIIa에 대한 결합도 마찬가지로 증강시켜 버리면, 목적으로 하지 않는 ADCC 활성이나 ADCP 활성 등을 발휘하여 부작용이 생길 우려가 있다. 그러한 관점에서도 FcgRIIb에 대해 선택적으로 결합활성을 증강시킬 수 있는 것이 바람직하다.
이들 결과로부터 FcγRIIb를 이용한 자기면역 질환 치료나 암의 치료를 목적으로 한 항체 의약을 창제함에 있어서는, 천연형 IgG와 비교하여 FcγRIIa의 어느 유전자 다형에 대해서도 결합활성이 유지 또는 감소되고, 또한 FcγRIIb에 대한 결합활성이 증강되어 있는 것이 중요하다. 그러나 FcγRIIb는 활성형 FcγR의 하나인 FcγRIIa와 세포외영역의 서열이 93% 일치하여 매우 구조가 유사하고, 또한 FcγRIIa에는 유전자 다형으로서 131번째의 아미노산이 His인 H type(H형)과 Arg인 R type(R형)이 존재하여, 각각에서 항체와의 상호작용이 상이하다(J Exp Med, 172, 19-25, 1990). 그 때문에 FcγRIIb에 대해 선택적으로 결합하는 Fc영역을 창제하는 데는 이들 유사한 서열을 구별하여 FcγRIIa의 각 유전자 다형에 대한 결합활성을 증강시키지 않거나 또는 감소시키는 한편으로, FcγRIIb에 대한 결합활성을 증가시킨다고 하는 FcγRIIb에 대한 결합활성을 선택적으로 향상시킨 성질을 항체의 Fc영역에 부여하는 것이 가장 곤란한 과제라고 생각되어, 지금까지 FcgRIIb에 대한 충분한 선택성을 갖는 변이체는 얻어지지 않았다. US2009/0136485에는 FcγRIIb에 대한 결합활성이 증강된 변이체도 보고되어 있으나 그 정도는 약하여, 상기와 같은 성질을 갖는 변이체의 개발이 요구되고 있었다.
본 검토에서는 헤테로이량화 항체를 사용하여 FcgRIIb 선택적으로 결합활성을 증강시킨 개변체의 제작을 검토하였다. 항체 H쇄 가변영역으로서는, WO2009/125825에 개시되어 있는 인간 인터류킨 6 수용체에 대한 항체의 가변영역인 IL6R의 가변영역 IL6R(서열번호：128)을 사용하였다. 또한 인간 IgG1의 C 말단의 Gly 및 Lys를 제거한 G1d를 갖는 IL6R-G1d(서열번호：129)를 제작하였다. 다음으로 IL6R-G1d에 대해 K439E를 도입한 IL6R-B3(서열번호：130)를 제작하였다. 또한 IL6R-B3에 대해 E233D, G237D, P238D, H268D, P271G, A330R을 도입한 IL6R-BP208(서열번호：131)을 제작하였다. 또한 IL6R-B3에 대해 S267E, L328F를 도입하여, 기존의 FcgRIIb 결합활성 증강 Fc를 갖는 IL6R-BP253(서열번호：132)을 제작하였다. 항체 L쇄로서는 tocilizumab의 L쇄인 IL6R-L(서열번호：133)을 공통으로 사용하고, 각각의 H쇄와 함께 참고 실시예 1의 방법에 따라 호모이량체 IL6R-B3/IL6R-L, IL6R-BP208/IL6R-L, IL6R-BP253/IL6R-L을 제작하였다. 참고 실시예 8에 기재된 방법에 따라 이들 개변체의 FcgR Ia, FcgR IIaR, FcgR IIaH, FcgR IIb, FcgR IIIaV에 대한 결합활성을 평가한 결과를 표 62에 나타낸다. 또한 표 62 중 회색으로 칠한 셀은 FcgR의 IgG에 대한 결합이 미약하여 속도론적인 해석으로는 바르게 해석할 수 없는 것으로 판단되었다. 이와 같이 각 개변 항체와 FcgR의 상호작용이 미약하여 상기 속도론적인 해석으로는 바르게 해석할 수 없는 것으로 판단된 경우, 그 상호작용에 대해서는 Biacore T100 Software Handbook BR1006-48 Edition AE에 기재된 아래의 1:1 결합 모델식을 이용하여 KD를 산출하였다.
1:1 binding model에서 상호작용하는 분자의 Biacore 상에서의 거동은 아래의 식 1에 의해 나타낼 수 있다.
[식 1]
Figure pct00088
Req:a plot of steady state binding levels against analyte concentration
C: concentration
RI:bulk refractive index contribution in the sample
Rmax:analyte binding capacity of the surface
이 식을 변형하면 KD는 아래의 식 2와 같이 나타낼 수 있다.
[식 2]
Figure pct00089
이 식에 Rmax, RI, C의 값을 대입함으로써 KD를 산출하는 것이 가능하다. RI, C에 대해서는 측정결과의 센서그램, 측정조건으로부터 값을 구할 수 있다. Rmax의 산출에 대해서는 아래의 방법에 따랐다. 그 측정마다 동시에 평가한 비교 대상이 되는 상호작용이 충분히 강한 항체에 대해서, 상기 1:1 Langmuir binding model에서 global fitting시켰을 때에 얻어진 Rmax의 값을 비교 대상이 되는 항체의 센서칩으로의 캡쳐량으로 나누고, 평가하고자 하는 개변 항체의 캡쳐량으로 곱하여 얻어진 값을 Rmax로 하였다.
Figure pct00090
또한 IL6R-B3/IL6R-L의 FcgRIa FcgRIIaR, FcgRIIaH, FcgRIIb에 대한 각 KD를 각 개변체의 대응하는 KD로 나눈 값, IL6R-B3/IL6R-L의 FcgRIIaR, FcgRIIaH, FcgRIIb에 대한 각 KD를 1로 하였을 때의 상대적인 KD인 relative KD를 표 63에 나타낸다.
Figure pct00091
표 63에 나타내는 바와 같이, 기존의 FcgRIIb 결합활성 증강 항체인 IL6R-BP253/IL6R-L은 개변 도입 전의 인간 IgG1형의 항체(IL6R-B3/IL6R-L)와 비교하여 FcgRIIb에 대한 결합활성을 약 350배 증강시키는 동시에, FcgRIIaR에 대한 결합활성도 약 500배 증강되어 있다. 한편 IL6R-BP208/IL6R-L은 FcgRIIb에 대한 결합활성은 약 100배로 기존의 FcgRIIb 결합활성 증강 항체에 못미치나, FcgRIIaR에 대한 결합활성은 IgG1형과 비교하여 1.3배로 같은 정도의 결합활성을 유지하고 있어, FcgRIIb로의 선택성이 우수한 항체이다.
다음으로 FcgR2b에 대한 활성 증강과 선택성의 향상을 도모하기 위해, IL6R-BP208/IL6R-L의 Fc인 Fc(BP208)과 FcgRIIb 세포외영역의 복합체의 결정 구조 정보를 취득하고, 보다 상세하게 도입하는 아미노산 변이의 검토가 필요하다고 생각하여, 아래의 실험방법에 따라 Fc(BP208)과 FcgRIIb 세포외영역의 복합체의 X선 결정 구조 해석을 행하였다.
［Fc(BP208)의 발현 정제］
Fc(BP208)의 조제는 아래와 같이 행하였다. 먼저 IL6R-BP208의 EU 넘버링 220번째의 Cys를 Ser로 치환하고, EU 넘버링 236번째의 Glu로부터 그 C 말단을 PCR에 의해 클로닝한 유전자 서열 Fc(BP208)을 참고예 1에 기재된 방법에 따라 발현 벡터의 제작, 발현, 정제를 행하였다. 또한 EU 넘버링 220번째의 Cys는 통상의 IgG1에 있어서는 L쇄의 Cys와 disulfide bond를 형성하고 있는데, Fc만을 조제하는 경우 L쇄를 공발현시키지 않기 때문에 불필요한 disulfide bond 형성을 회피하기 위해 Ser로 치환하였다.
［FcgRIIb 세포외영역의 발현 정제］
참고예 8의 방법에 따라 조제하였다.
［Fc(BP208)/FcgRIIb 세포외영역 복합체의 정제］
결정화용으로 얻어진 FcgRIIb 세포외영역 샘플 1.5 ㎎에 대해 glutathione S-transferase와의 융합 단백으로서 대장균에 의해 발현 정제한 Endo F1(Protein Science 1996, 5, 2617-2622) 0.15 ㎎을 첨가하고, 0.1M Bis-Tris pH6.5의 Buffer 조건으로 실온에서 3일간 정치함으로써, N형 당쇄를 Asn에 직접 결합한 N-acetylglucosamine을 남기고 절단하였다. 다음으로 이 당쇄 절단처리를 행한 FcgRIIb 세포외영역 샘플을 5000MWCO의 한외여과막에 의해 농축하고, 20mM HEPES pH7.5, 0.1M NaCl로 평형화한 겔 여과 칼럼크로마토그래피(Superdex200 10/300)에 의해 정제하였다. 또한 얻어진 당쇄 절단 FcgRIIb 세포외영역 분획에 Fc(BP208)을 몰비로 FcgRIIb 세포외영역 쪽이 약간 과잉이 되도록 첨가하여, 10000MWCO의 한외여과막에 의해 농축 후, 25mM HEPES pH7.5, 0.1M NaCl로 평형화한 겔 여과 칼럼크로마토그래피(Superdex200 10/300)에 의해 정제하여, Fc(BP208)/FcgRIIb 세포외영역 복합체의 샘플을 얻었다.
［Fc(BP208)/FcgRIIb 복합체 세포외영역 복합체의 결정화］
Fc(BP208)/FcgRIIb 세포외영역 복합체의 샘플을 10000MWCO의 한외여과막에 의해 약 10 ㎎/㎖까지 농축하고, 행잉 드롭 증기 확산법으로 Seeding법을 병용하면서 결정화를 행하였다. 결정화에는 VDXm 플레이트(Hampton Research)를 사용하고, 0.1M Bis-Tris pH6.5, 19% PEG3350, 0.2M Potassium Phosphate dibasic의 리저버용액에 대해 리저버용액：결정화 샘플＝0.85 ㎕：0.85 ㎕로 혼합하여 결정화 드롭을 제작, 거기에 동일한 조건에서 얻어진 동복합체의 결정을 Seed Bead(Hampton Research)를 사용하여 파쇄한 종결정 용액으로부터 만든 희석용액 0.15 ul를 첨가하고, 리저버가 든 웰에 밀폐하여 20℃에 정치한 바, 판상의 결정을 얻는 것에 성공하였다.
［Fc(BP208)/FcgRIIb 세포외영역 복합체 결정으로부터의 X선 회절 데이터의 측정］
얻어진 Fc(BP208)/FcgRIIb 세포외영역 복합체의 단결정 하나를 0.1M Bis-Tris pH6.5, 24% PEG3350, 0.2M Potassium Phosphate dibasic, Ethlene glycol 20%(v/v)의 용액에 침지한 후, 미소한 나일론 루프 부착 핀으로 용액째 떠서, 액체질소 중에서 동결시켜 Spring-8의 BL32XU로 X선 회절 데이터의 측정을 행하였다. 또한 측정 중에는 항상 -178℃의 질소기류 중에 둠으로써 동결상태를 유지하고, 빔라인이 비치된 CCD 디텍터 MX-225HE(RAYONIX)에 의해, 결정을 0.6°씩 회전시키면서 토탈 300매의 X선 회절 화상을 수집하였다. 얻어진 회절 화상으로부터의 격자상수의 결정, 회절 반점의 지수 부여 및 회절 데이터의 처리에는 프로그램 Xia2(J. Appl. Cryst. 2010, 43, 186-190), XDS Package(Acta Cryst. 2010, D66, 125-132) 및 Scala(Acta Cryst. 2006, D62, 72-82)를 사용하고, 최종적으로 분해능 2.81Å까지의 회절 강도 데이터를 얻었다. 본 결정은 공간군 C2221에 속하고, 격자상수 a＝156.69Å, b＝260.17Å, c＝56.85Å, α＝90°, β＝90°, γ＝90°였다.
［Fc(BP208)/FcgRIIb 세포외영역 복합체의 X선 결정 구조 해석］
구조 결정은 프로그램 Phaser(J. Appl. Cryst. 2007, 40, 658-674)를 사용한 분자 치환법에 의해 행하였다. 얻어진 결정 격자의 크기와 Fc(BP208)/FcgRIIb 세포외영역 복합체의 분자량으로부터 비대칭 단위 중 복합체의 수는 1개로 예상되었다. Fc(WT)/FcgRIIIa 세포외영역 복합체의 결정 구조인 PDB code:3SGJ의 구조 좌표로부터, A쇄 239-340번 및 B쇄 239-340번의 아미노산 잔기 부분을 별도 좌표로서 취출하여, 각각을 Fc의 CH2 도메인의 탐색용 모델로 하였다. 마찬가지로 PDB code:3SGJ의 구조 좌표로부터, A쇄 341-444번과 B쇄 341-443번의 아미노산 잔기 부분을 하나의 좌표로서 취출하여, Fc CH3 도메인의 탐색용 모델로 하였다. 마지막으로 FcgRIIb 세포외영역의 결정 구조인 PDB code:2FCB의 구조 좌표로부터 A쇄 6-178번의 아미노산 잔기 부분을 취출하여 Fc(BP208)의 탐색용 모델로 하였다. Fc CH3 도메인, FcgRIIb 세포외영역, Fc CH2 도메인의 각 탐색용 모델의 결정 격자 내에서의 방향과 위치를 회전함수 및 병진함수로부터 결정하고자 하였으나, CH2 도메인의 하나에 대해서는 그 위치 결정이 잘 되지 않았다. 이에 나머지 3개의 부분으로부터 계산된 위상을 토대로 계산한 전자밀도 지도에 대해 Fc(WT)/FcgRIIIa 세포외영역 복합체의 결정 구조를 참고로 하면서 마지막 CH2 도메인 A의 위치를 결정, Fc(BP208)/FcgRIIb 세포외영역 복합체 결정 구조의 초기 모델을 얻었다. 얻어진 초기 모델에 대해 2개의 Fc의 CH2 도메인, 2개의 Fc의 CH3 도메인 및 FcgRIIb 세포외영역을 움직이는 강체 정밀화를 행한 바, 이 시점에서 25-3.0Å의 회절 강도 데이터에 대해 결정학적 신뢰도 인자 R값은 42.6%, Free R값은 43.7%가 되었다. 또한 프로그램 REFMAC5(Acta Cryst. 2011, D67, 355-367)를 사용한 구조 정밀화와, 실험적으로 결정된 구조 인자 Fo와 모델로부터 계산된 구조 인자 Fc 및 모델로부터 계산된 위상을 토대로 산출한 2Fo-Fc, Fo-Fc를 계수로 하는 전자밀도 지도를 보면서 모델 수정을 프로그램 Coot(Acta Cryst. 2010, D66, 486-501)로 행하여, 이들을 반복함으로써 모델의 정밀화를 행하였다. 마지막으로 2Fo-Fc, Fo-Fc를 계수로 하는 전자밀도 지도를 토대로 수분자를 모델에 삽입하여 정밀화를 행함으로써 최종적으로 분해능 25-2.81Å의 27259개의 회절 강도 데이터를 사용하여, 4794개의 비수소원자를 포함하는 모델에 대해 결정학적 신뢰도 인자 R값은 24.4%, Free R값은 27.9%가 되었다.
구조 해석 결과, Fc(BP208)/FcgRIIb 세포외영역 복합체의 입체구조를 분해능 2.81Å에서 결정, 그 해석 결과 취득된 구조를 도 49에 나타낸다. 2개의 Fc CH2 도메인 사이에 FcgRIIb 세포외영역이 끼이듯이 결합되어 있어, 지금까지 해석된 천연형 IgG의 Fc인 Fc(WT)와 FcgRIIIa(Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 2011, 108, 12669-126674), FcgRIIIb(Nature, 2000, 400, 267-273; J.Biol.Chem. 2011, 276, 16469-16477), FcgRIIa의 각 세포외영역의 복합체의 입체구조와 유사하였다.
그러나 세부를 보면, Fc(BP208)은 G237D 및 P238D의 변이 도입의 영향에 의해 FcgRIIa와 결합한 Fc(WT)와 비교하여 CH2 도메인 A에 있어서 힌지영역으로부터 계속되는 233-239의 루프구조가 변화되어 있었다(도 50). 이 결과, Fc(BP208)의 G237 주쇄의 아미드와 FcgRIIb의 Tyr160 측쇄 사이에 강고한 수소결합의 형성이 확인되었다. 이 Tyr160은 FcgRIIa에 있어서는 Phe로, 수소결합의 형성은 불가능한 것으로부터, 이 수소결합은 FcgRIIb에 대한 결합활성의 향상 및 FcgRIIa에 대한 결합의 저감이라는 선택성의 획득에 중요한 기여를 하고 있는 것으로 생각되었다.
본 구조 해석 결과를 토대로 추가적인 활성향상을 목표로 한 개변의 가능성을 정밀조사한 바, 개변 도입 부위의 후보 중 하나로서 S239를 발견하였다. 도 51에 나타내는 바와 같이, FcgRIIb의 Lys117이 구조적으로 봐서 가장 자연스러운 형태로 신장되는 방향으로 이 CH2 도메인 B의 Ser239는 위치하고 있다. 다만 금번 해석에서는 FcgRIIb의 Lys117의 전자밀도는 관찰되고 있지 않은 것으로부터 일정 구조는 취하고 있지 않아, 현재 상태에서는 Fc(BP208)과의 상호작용으로의 이 Lys117의 관여는 한정적이라고 생각되는데, 이 CH2 도메인 B의 S239를 음전하를 갖는 D 또는 E로 개변한 경우, 양전하를 갖는 FcgRIIb의 Lys117과의 사이에 정전 상호작용을 기대할 수 있어, 그 결과로서 FcgRII로의 결합활성의 향상이 기대되었다.
한편 CH2 도메인 A에 있어서의 S239의 구조를 보면, 본 아미노산 측쇄는 G236의 주쇄와 수소결합을 형성, 힌지영역으로부터 계속해서 FcgRIIb Tyr160 측쇄와 수소결합을 형성하는 D237을 포함하는 233번째로부터 239번에 걸친 루프 구조를 안정화시키고 있는 것으로 생각되었다(도 52). 루프 구조를 결합시의 구조로 안정화시키는 것은, 결합에 수반되는 엔트로피의 저하를 억제하고, 결과로서 결합 자유 에너지의 증가, 즉 결합활성의 향상으로 이어진다. 한편 이 CH2 도메인 A의 S239를 D 또는 E로 개변한 경우, G236 주쇄와의 수소결합이 상실되어 루프 구조의 불안정화로 이어진다. 또한 바로 가까이에 존재하는 D265와 정전 반발을 초래할 가능성이 있어, 추가적인 루프 구조의 불안정화가 일어날 것으로 생각되었다. 이 불안정화된 분량의 에너지는 FcgRIIb와의 상호작용 에너지의 감소로 작용하기 때문에, 결과로서 결합활성의 저하를 초래하게 된다. 즉 S239D 또는 S239E를 양 H쇄에 도입한 호모이량화 항체의 경우는 CH2 도메인 B에 있어서의 FcgRIIb의 Lys117과의 정전 상호작용에 의한 결합활성을 증강시키는 효과가 CH2　도메인 A에 있어서의 루프 구조의 불안정화에 의한 결합활성을 감소시키는 효과에 의해 상쇄되어 결합활성의 증강으로는 이어지지 않을 가능성이 있지만, S239D 또는 S239E를 한쪽 H쇄에만 도입한 헤테로이량화 항체의 경우는 CH2 도메인 A의 S239에 의한 루프 구조의 안정화가 유지된 상태 그대로이기 때문에, CH2 도메인 B에 도입된 S239D 또는 S239E에 의해 새롭게 형성된 FcgRIIb의 Lys117과의 정전 상호작용의 분량만큼 결합활성이 증강될 가능성이 생각되었다.
이 가설을 검증하기 위해, 다음으로 IL6R-BP208/IL6R-L을 주형으로 하고 한쪽 H쇄의 Fc영역에만 S239D 또는 S239E의 개변을 도입함으로써, FcgRIIb에 대한 결합활성을 더욱 증강시킨 항체의 제작을 검토하였다. 항체 H쇄로서 IL6R-BP208에 대해 S239D를 도입한 IL6R-BP256(서열번호：134) 및 S239E를 도입한 IL6R-BP257(서열번호：135)을 제작하였다. 또한 다른 한쪽 H쇄로서 IL6R-G1d에 D356K 및 H435R의 변이를 도입한 IL6R-A5(서열번호：136)를 제작하고, 이에 대해 추가로 E233D, G237D, P238D, H268D, P271G, A330R을 도입한 IL6R-AP002(서열번호：137)를 제작하였다. 항체 L쇄로서는 tocilizumab의 L쇄인 IL6R-L(서열번호：133)을 공통으로 사용하고, 각각의 H쇄와 함께 참고 실시예 1의 방법에 따라 호모이량화 항체 IL6R-B3/IL6R-L, IL6R-BP208/IL6R-L, IL6R-BP253/IL6R-L, IL6R-BP256/IL6R-L, IL6R-BP257/IL6R-L 및 헤테로이량화 항체 IL6R-AP002/IL6R-BP256/IL6R-L, IL6R-AP002/IL6R-BP257/IL6R-L을 제작하였다. 참고 실시예 8에 기재된 방법에 따라 이들 개변체의 FcgR Ia, FcgR IIaR, FcgR IIaH, FcgR IIb에 대한 결합활성을 평가한 결과를 표 64에 나타낸다.
Figure pct00092
또한 표 64 중 회색으로 칠한 셀은 FcgR의 IgG에 대한 결합이 미약하여 속도론적인 해석으로는 바르게 해석할 수 없는 것으로 판단되었다. 이와 같이 각 개변 항체와 FcgR의 상호작용이 미약하여 상기 속도론적인 해석으로는 바르게 해석할 수 없는 것으로 판단된 경우, 그 상호작용에 대해서는 Biacore T100 Software Handbook BR1006-48 Edition AE에 기재된 아래의 1:1 결합 모델식을 이용하여 KD를 산출하였다.
1:1 binding model에서 상호작용하는 분자의 Biacore 상에서의 거동은 아래의 식 1에 의해 나타낼 수 있다.
[식 1]
Figure pct00093
Req:a plot of steady state binding levels against analyte concentration
C: concentration
RI:bulk refractive index contribution in the sample
Rmax:analyte binding capacity of the surface
이 식을 변형하면 KD는 아래의 식 2와 같이 나타낼 수 있다.
[식 2]
Figure pct00094
이 식에 Rmax, RI, C의 값을 대입함으로써 KD를 산출하는 것이 가능하다. RI, C에 대해서는 측정결과의 센서그램, 측정조건으로부터 값을 구할 수 있다. Rmax의 산출에 대해서는 아래의 방법에 따랐다. 그 측정마다 동시에 평가한 비교 대상이 되는 상호작용이 충분히 강한 항체에 대해서, 상기 1:1 Langmuir binding model에서 global fitting시켰을 때에 얻어진 Rmax의 값을 비교 대상이 되는 항체의 센서칩으로의 캡쳐량으로 나누고, 평가하고자 하는 개변 항체의 캡쳐량으로 곱하여 얻어진 값을 Rmax로 하였다.
또한 IL6R-B3/IL6R-L의 FcgRIa FcgRIIaR, FcgRIIaH, FcgRIIb에 대한 각 KD를 각 개변체의 KD로 나눈 값, IL6R-B3/IL6R-L의 FcgRIIaR, FcgRIIaH, FcgRIIb에 대한 각 KD를 1로 하였을 때의 상대적인 KD인 relative KD 및 각 개변체의 FcgRIIaR에 대한 KD를 FcgRIIb에 대한 KD로 나눈 값을 표 65에 나타낸다.
Figure pct00095
표 65에 나타내는 바와 같이, IL6R-BP208/IL6R-L의 양 H쇄에 대해 S239D 또는 S239E를 도입한 IL6R-BP256/IL6R-L, IL6R-BP257/IL6R-L의 경우는, 도입 전의 개변체 IL6R-BP208/IL6R-L과 비교하여 FcgRIIb에 대한 결합활성, FcgRIIaR에 대한 결합활성이 모두 감소되어 있었다. 한편 IL6R-BP208/IL6R-L의 한쪽 H쇄에 대해 S239D 또는 S239E를 도입한 IL6R-AP002/IL6R-BP256/IL6R-L, IL6R-AP002/IL6R-BP257/IL6R-L의 경우는 FcgRIIb로의 결합이 각각 752배, 657배로 향상되어 기존 기술보다도 높은 FcgRIIb에 대한 결합활성을 나타내었다. 또한 FcgRIIaR에 대한 결합활성도 IL6R-BP208/IL6R-L의 1.3배로부터 각각 7.7배, 8.3배로 증가되었다. 여기서 표 중의 KD(IIaR)/KD(IIb)는 각 개변체의 FcgRIIaR에 대한 KD를 FcgRIIb에 대한 KD로 나눈 값으로, 이 값이 클수록 FcgRIIb에 대한 선택성이 높은 것을 나타낸다. 기존의 FcgRIIb 결합활성 증강 항체인 IL6R-BP253/IL6R-L은 이 값이 0.3으로, IgG1형과 비교하여 선택성이 개선되지 않은 것에 대해 IL6R-BP208/IL6R-L은 26.3으로 높은 FcgRIIb 선택성을 갖는다. 금번 IL6R-BP208/IL6R-L의 한쪽 H쇄에 대해 S239D 또는 S239E를 도입한 IL6R-AP002/IL6R-BP256/IL6R-L, IL6R-AP002/IL6R-BP257/IL6R-L의 경우는 KD(IIaR)/KD(IIb)의 값이 각각 34.3 및 27.7로 IL6R-BP208/IL6R-L보다도 개선되어 있었다.
여기서 실시예 4에서 행한 IgG1형(GpH7-B3/GpL16-k0)을 주형으로 한 망라적 개변체의 평가결과에 있어서, S239D, S239E의 효과는 표 66에 나타낸 바와 같았다. 표 중의 Ho/Con_2aR 및 Ho/Con_2b는 호모이량화 항체의 대조를 100으로 하였을 때의 FcgRIIaR 및 FcgRIIb에 대한 결합활성 강도의 정도를 나타낸다. 또한 He/Con_2aR 및 He/Con_2b는 헤테로이량화 항체의 대조를 100으로 하였을 때의 FcgRIIaR 및 FcgRIIb에 대한 결합 강도의 정도를 나타낸다.
Figure pct00096
표 66으로부터는 금번 도입한 S239D 및 S239E는 천연형 IgG1에 대해 도입하였을 때에는 양쇄에 도입하는지, 편쇄에 도입하는지에 상관없이 FcgRIIaR 및 FcgRIIb에 대한 결합을 증강시키는 개변이었다. 그러나 이들 개변을 IL6R-BP208/IL6R-L의 양 H쇄에 도입하면 FcgRIIaR, FcgRIIb에 대한 결합활성이 감소되고, 한쪽 H쇄에 도입한 경우에만 FcgRIIaR, FcgRIIb에 대한 결합활성이 증강되었다. 이 결과는 IgG1형을 주형으로 하였을 때에 얻어진 개변의 효과와는 상이한 것으로, 이들 개변은 IL6R-BP208/IL6R-L에 도입하여 비로서 상기 효과를 갖는 것이 명확해졌다.
〔실시예 27〕호모이량체와 헤테로이량체의 분리 정제능 향상을 목표로 한 불변영역 아미노산 서열의 디자인
[잔기 치환 부위의 선택]
헤테로이량화 항체의 제조에 있어서 2종류의 H쇄(각각을 A쇄 및 B쇄로 함)를 공발현시킨 경우, 각 H쇄인 A쇄가 이량체화된 호모이량화 항체 및 B쇄가 이량화된 호모이량화 항체와, 상이한 2개의 H쇄인 A쇄, B쇄가 이량화된 헤테로이량화 항체가 생성된다. 목적으로 하는 헤테로이량화 항체를 효율적으로 분리 정제하는 수법으로서 각각의 가변영역에 대해서 아미노산 잔기를 치환하고, 항체의 등전점 및 이온 교환 칼럼에서의 유지능과 분리능을 제어하는 방법이 알려져 있다(WO2007/114325). 그러나 가변영역, 특히 CDR영역은 항체마다 서열이 상이한 것으로부터, 해당 기술의 범용성에는 한계가 있을 것으로 생각된다. 이에 헤테로이량화 항체 정제를 위한 보다 범용적인 항체 잔기 치환수법으로서 항체의 불변영역만의 잔기 치환에 의해, 등전점 및 이온 교환 칼럼에서의 유지능과 분리능을 제어하는 방법이 검토되었다.
일반적으로 이온 교환 칼럼에서의 분리는 분자 표면의 전하에 의존하는 것으로 생각되고 있어, 대부분의 경우, 목적 분자의 등전점을 고려한 분리조건이 검토된다. 따라서 본 실시예에 있어서도 분리하고자 하는 호모이량화 항체와 헤테로이량화 항체의 등전점에 차가 생기도록 항체 불변영역을 구성하는 아미노산 잔기를 치환함으로써 이온 교환 칼럼에서의 분리가 개선될 것으로 기대되었다.
또한 이온 교환 크로마토그래피에서의 분리는 순수한 이온 교환 모드뿐 아니라 소수성 상호작용도도 관여하는 것이 시사되어 있다(Peng Liu et al., J Chromatogr A. 2009 Oct 30;1216(44):7497-504). 이 때문에 상기 수법에 의한 분리 정제에는 이온 교환 크로마토그래피에 더하여 소수 크로마토그래피도 이용 가능하다.
등전점을 변화시키는 잔기 치환으로서는, 중성 잔기를 염기성 잔기 또는 산성 잔기로 치환하는 방법 및 염기성 잔기 또는 산성 잔기를 중성 잔기로 치환하는 방법이 있다. 보다 효과적인 대응으로서, 양전하를 갖는 잔기를 음전하를 갖는 잔기로 치환하는 방법 및 음전하를 갖는 잔기를 양전하를 갖는 잔기로 치환하는 방법이 있다.
상기 방법에 의하면, 항체 서열의 모든 부분이 등전점을 변화시킬 수 있는 잔기 치환 부위의 후보가 된다. 그러나 비천연 서열로의 랜덤 치환은 면역 원성의 리스크를 높일 위험성이 있어, 의약품으로서의 사용을 고려한 경우에 적절한 방법은 아니다.
면역 원성 리스크를 될 수 있는 한 증대시키지 않도록 하기 위해, 면역 원성에 관여하는 T-cell epitope의 수가 될 수 있는 한 적어지도록 잔기 치환을 행하는 방법을 생각할 수 있다. 하나의 수단으로서 IgG 서브클래스 서열의 이용을 들 수 있다. 인간 IgG의 서브클래스에는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4가 존재한다. WO2007/114325에서 개시되어 있는 방법을 토대로 항체 서열의 일부를 상이한 서브클래스의 서열로 치환함으로써 T-cell epitope의 증가를 억제하면서 등전점을 변화시키는 것이 가능하다.
다른 수단으로서 Epibase 등의 T-cell epitope를 예측하는 in silico 툴을 이용할 수 있다.
Epibase Light(Lonza)는 FASTER algorism(Expert Opin Biol Ther. 2007 Mar;7(3):405-18.)을 사용하여 9-mer 펩티드와 major DRB1 대립유전자(allele)의 결합능을 계산하는 in silico 툴이다. 본 툴은 MHC classII에 대한 강한 결합 및 중정도의 결합이 되는 T-cell epitope를 동정할 수 있다.
계산에는 DRB1 알로타입의 존재비가 반영되고, 이것에는 아래에 나타내는 Caucasian에 있어서의 존재비를 사용할 수 있다.
DRB1*1501(24.5%), DRB1*0301(23.7%), DRB1*0701(23.3%), DRB1*0101(15.0%), DRB1*1101(11.6%), DRB1*1302(8.2%), DRB1*1401/1454(4.9%), DRB1*0901(2.3%), DRB1*1502(0.5%), DRB1*1202(0.1%)
각 개변 항체 서열 중에 포함되는 강한 결합과 중정도의 결합의 모든 에피토프를 FASTER algorism에 의해 구한 후, 인간 검라인 서열 및 가변영역과 불변영역의 경계서열을 제외한 것이 critical epitope로서 제시된다. 본 툴의 randomized 기능을 사용함으로써, 임의 서열에 포함되는 잔기 하나씩에 대해서 각각 임의의 아미노산 잔기로 치환한 경우의 T-cell epitope 증가수가 산출된다. 이것에 의해 등전점 변화를 초래하나 T-cell epitope는 증가하지 않는 잔기 치환 부위를 선택하는 것이 가능하다.
H240-AK072(서열번호：104) 및 H240-BH076(서열번호：105)에 대해서 Epibase에 의한 해석이 실시되었다. 표 67은 H240-AK072에 대해서, 표 68은 H240-BH076에 대해서, 임의의 잔기의 치환에 의해 변화시킬 수 있는 T-cell epitope의 수가 나타내어져 있다. 이 결과를 토대로 T-cell epitope를 증가시키지 않고, 또한 등전점을 변화시키는 잔기 치환을 선택하는 것이 가능하다.
[표 67-1]
Figure pct00097
[표 67-2]
Figure pct00098
[표 67-3]
Figure pct00099
[표 67-4]
Figure pct00100
[표 67-5]
Figure pct00101
[표 67-6]
Figure pct00102
[표 68-1]
Figure pct00103
[표 68-2]
Figure pct00104
[표 68-3]
Figure pct00105
[표 68-4]
Figure pct00106
[표 68-5]
Figure pct00107
[표 68-6]
Figure pct00108
이상의 방법 및 그 조합에 의해 등전점 개변을 위한 잔기 치환 부위로서, 아래에 나타내어지는 H240-AK072 및 H240-BH076 개변체가 디자인되었다(표 69, 70).
Figure pct00109
Figure pct00110
[H240-AK072/H240-BH076/L73-k0 개변 항체 발현용 벡터의 구축]
먼저 H240-AK072/H240-BH076/L73-k0의 개변 항체의 cDNA를 제작하기 위해, H240-AK072 또는 H240-BH076을 주형으로 하여, 선택된 각 아미노산 잔기가 변이되도록 디자인된 합성 올리고 DNA가 각각 설계되었다. 다음으로 각 합성 올리고 DNA를 사용하여 참고 실시예 1의 방법에 따라 목적의 유전자를 포함하는 동물세포 발현 벡터를 제작하였다.
[H240-AK072/H240-BH076/L73-k0 개변 항체의 발현, 정제]
H240-AK072/H240-BH076/L73-k0의 개변 항체를 평가하기 위해, H240-AK072 또는 H240-BH076에 개변을 도입한 각 H쇄(H240-AK072에 개변을 도입한 H쇄를 A쇄, H240-BH076에 개변을 도입한 H쇄를 B쇄라 부른다) 및 L쇄(L73-k0, 서열번호：106)를 임의의 조합으로 공발현시킴으로써, 참고 실시예 1의 방법에 따라 A쇄 및 B쇄가 임의의 조합이 되는 개변 항체가 얻어졌다. 대표적인 A쇄 및 B쇄의 서열번호를 표 71에 나타내었다.
Figure pct00111
〔실시예 28〕H240-AK072/H240-BH076/L73-k0 개변체의 물리화학적 평가
[양이온 교환 크로마토그래피에 의한 유지시간 차의 측정]
각 항체에 대해서 하기의 조건으로 측정이 실시되었다.
Mobile phase A: 20 mM MES-NaOH, pH6.0
Mobile phase B: 20 mM MES-NaOH, 200 mM NaCl, pH6.0
Column: Bio Pro SP-F(YMC)
Flow rate: 0.5 mL/min
Gradient: 10%B(0-5 min), 10-60%B(5-55 min)
Detection: Abs. 280 nm
도 53은 대표적인 크로마토그램을 나타낸다. 용출시간이 빠른 위치에 출현하는 피크는 B쇄-B쇄의 호모이량화 항체, 주요한 피크는 A쇄-B쇄의 헤테로이량화 항체 유래이다. A쇄에는 Protein A와의 결합을 감소시키는 잔기 치환(H435R)이 도입되어 있고, 여기서 사용한 항체는 참고 실시예 1의 방법으로 조제되는 과정에서 rProtein A SepharoseTM Fast Flow(GE 헬스케어)에 의한 정제과정에서 제거되어 버리기 때문에, A쇄-A쇄 호모이량화 항체는 본 조건에서는 거의 검출되지 않는다. 헤테로이량화 항체와 호모이량화 항체의 분리를 평가하는 지표로서, 유지시간 차ΔRT(분)＝(헤테로항체 피크의 유지시간)-(B쇄 호모항체 피크의 유지시간)이 산출되었다. 표 72는 각종 개변체의 평가결과를 나타낸다. 이상으로부터 디자인한 잔기 치환의 도입 및 그 조합에 의해 헤테로항체와 호모항체의 유지시간 차가 확대되는 것이 나타내어졌다.
[겔 여과 크로마토그래프법에 의한 회합체 함유량의 평가]
ACQUITY UPLC H-Class system(Waters)을 사용한 SEC 분석에 의해, 정제 항체 중 회합체 함유량이 평가되었다. 이동상에는 300 mM의 염화나트륨을 포함하는 50 mM 인산완충액, pH7.0(이세큐)을, 분석 칼럼에는 BEH200 SEC(waters)를 사용하여 215 nm의 파장에서 측정이 행행졌다. Empower2(Waters)를 사용하여 데이터 해석을 실시하고, 단량체보다도 고분자량측에 용출된 성분을 일괄하여 회합체로서 그 함유량이 산출되었다. 표 72는 각종 개변체의 평가결과를 나타낸다. 이것으로부터 각종 개변체는 개변 전의 H240-AK072/H240-BH076/L73-k0에 비해 회합체량이 대폭 증가되어 있는 것은 없어, 회합화에 관한 안정성이 확보되어 있는 것으로 생각되었다.
[시차주사형 형광 정량법에 의한 개변 항체의 열변성 중점(Tm) 평가]
Rotor-Gene Q(QIAGEN)를 사용한 시차주사형 형광 정량법을 사용하여 항체의 열변성 중점(Tm)을 측정함으로써 열안정성이 평가되었다. 또한 본 수법은 항체의 열안정성 평가법으로서 널리 알려져 있는 시차주사형 열량계를 사용한 Tm 평가와 양호한 상관관계를 나타내는 것이 이미 보고되어 있다(Journal of Pharmaceutical Science 2010 ; 4 : 1707-1720).
5000배 농도의 SYPRO orange(Molecular Probes)를 PBS(Sigma)에 의해 희석 후 항체용액과 혼화함으로써 측정 샘플이 조제되었다. 각 샘플을 20 μL씩 측정용 튜브에 세팅하고 30℃에서 99℃까지 온도를 상승시켰다. 0.4℃ 승온시키고 약 6초 정지 후에 형광 강도가 470 nm(여기파장)/555 nm(형광파장)에 있어서 검출되었다.
데이터는 Rotor-Gene Q Series Software(QIAGEN)를 사용하여 형광 전이가 확인된 온도를 산출하여 이 값이 Tm값이 되었다. Molecular Immunology 37(2000) 697-706 등에서 보고되어 있는 바와 같이, CH2 도메인의 Tm값은 First transition 에 해당하는 Tm1으로 하였다. 한편 검토한 항체의 경우는 CH3와 Fab의 Tm값이 가까워 이들을 분리한 비교를 하는 것이 곤란할 것으로 판단하고, 본 평가에 사용하는 Tm값은 Tm1의 값을 채용하였다. 표 72는 각종 개변체의 평가결과를 나타낸다. 이것으로부터 각종 개변체는 개변 전의 H240-AK072/H240-BH076/L73-k0에 비해 Tm값이 대폭 저하되어 있는 것은 없어, 구조적인 안정성이 유지되어 있는 것으로 생각되었다.
Figure pct00112
[이온 교환 크로마토그래피 정제에 있어서의 분리의 평가]
AKTA avant25(GE healthcare)를 사용한 이온 교환 크로마토그래피 정제법에 있어서, 각 검체의 분리가 평가되었다. 이동상에는 20 mM MES 완충액, pH6.0 및 500 mM의 염화나트륨을 포함하는 20 mM MES 완충액, pH6.0을, 칼럼은 Hi Trap SP HP 1 mL(GE healthcare)를 사용하여 2액 혼합 그라디언트법에 의해 정제가 실시되었다. 정제 데이터의 취득은 280 nm의 파장으로 실시하고 Unicorn6.1(GE healthcare)을 사용하여 용출 결과가 평가되었다. 도 54는 H240-FA021/H240-BF084/L73-k0 개변체의 평가결과를 나타낸다. 이것으로부터 라지 스케일에서 사용되는 칼럼 담체를 사용한 정제에 의해, 본 검토에 있어서 신규로 발견된 잔기 치환을 도입함으로써 호모이량화 항체와 헤테로이량화 항체가 분리 정제 가능한 것이 나타내어졌다.
〔실시예 29〕H240-AK072/H240-BH076/L73-k0 개변체의 면역학적 평가
[표면 플라즈몬 산란법에 의한 FcγR에 대한 결합활성의 평가]
참고 실시예 8의 방법에 따라 목적의 항체와 FcgR의 상호작용 해석이 행해졌다.
각종 개변체의 평가결과를 표 73에 나타내었다. 이것으로부터 도 54에서 분리가 확인된 H240-FA021/H240-BF084/L73-k0 개변체의 FcγR로의 결합능은 개변 전의 H240-AK072/H240-BH076/L73-k0와 동등한 것이 나타내어졌다.
Figure pct00113
[in silico 면역원성 예측 툴 Epibase를 사용한 면역원성 리스크 평가]
임상에 있어서의 항체 의약품의 유용성과 약효는 항체 의약품 항체(ADAs)에 의해 제한된다. ADAs는 항체 의약품의 약효 및 동태에 영향을 미쳐 때로는 심각한 부작용을 초래하는 경우가 있다. 면역원성에 영향을 미치는 인자는 다수 보고되어 있는데, 특히 T cell epitope가 항원에 포함되는 것이 중요한 것으로 여겨진다. 이 T cell epitope를 예측하는 in silico 툴로서는 Epibase(Lonza), iTope/TCED(Antitope) 및 EpiMatrix(EpiVax) 등이 이용 가능하다. 이들 툴을 사용함으로써 목적으로 하는 단백질에 존재하는 T CELL EPITOPE를 포함하는 서열을 예측할 수 있는 것이 보고되어 있다(Expert Opin Biol Ther. 2007 Mar;7(3):405-18.).
Epibase Light(Lonza)는 FASTER algorism(Expert Opin Biol Ther. 2007 Mar;7(3):405-18.)을 사용하여, 9-mer 펩티드와 major DRB1 대립유전자의 결합능을 계산하는 in silico 툴이다. 본 툴은 MHC classII에 대한 강한 결합 및 중정도의 결합이 되는 T cell epitope를 동정할 수 있다.
각 개변 항체의 in silico 면역원성 스코어는 Epibase Light(Lonza) 시스템 내의 아래의 계산식(식 4)에 의해 구해진다.
[식 4]
Figure pct00114
계산에는 DRB1 알로타입의 존재비가 반영되고, 이것에는 아래에 나타내는 Caucasian에 있어서의 존재비를 사용할 수 있다.
DRB1*1501(24.5%), DRB1*0301(23.7%), DRB1*0701(23.3%), DRB1*0101(15.0%), DRB1*1101(11.6%), DRB1*1302(8.2%), DRB1*1401/1454(4.9%), DRB1*0901(2.3%), DRB1*1502(0.5%), DRB1*1202(0.1%)
각 개변 항체 서열 중에 포함되는 강한 결합과 중정도의 결합의 모든 에피토프를 FASTER algorism에 의해 구한 후, 인간 검라인 서열 및 가변영역과 불변영역의 경계서열을 제외한 것이 critical epitope로서 면역원성 스코어 계산에 사용된다. 스코어가 낮을수록 면역원성 리스크가 작은 서열로 생각된다. 표 74에 H240-AK072 및 H240-BH076, 더 나아가 그들 개변체에 대해서 계산된 리스크 스코어를 나타낸다. 이것으로부터 A쇄 및 B쇄의 임의의 조합을 선택함으로써 H240-AK072/H240-BH076/L73-k0에 비해 호모이량체와 헤테로이량체의 분리 정제능을 향상시키고, 또한 면역원성의 리스크가 크게 변화되지 않는 개변체를 제작하는 것이 가능하다.
Figure pct00115
〔실시예 30〕
실시예 20 및 실시예 21에 있어서, 활성형 FcgR로의 결합을 증강시킨 헤테로이량화 항체 H240-Kn125/H240-Hl076/L73-k0, H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0가 발견되었다. 이에 이들 헤테로이량화 항체에 사용되고 있는 개변 중 H240-Kn125와 H240-Kn120의 234번째, 239번째, 또한 H240-Hl076의 330번째를 다른 아미노산으로 치환함으로써 더욱 우수한 헤테로이량화 항체가 얻어지는지 여부를 검증하였다.
(30-1) 234번째의 아미노산의 검토
H240-Kn125 및 H240-Kn120에 포함되는 EU 넘버링 234번째의 Y를 천연형의 L 및 V, D, Q, I, M, T, A, G, H, S, F, E로 치환하고, 다른 한쪽 사슬로서 H240-Hl076 및 H240-Hl068을 갖는 헤테로이량화 개변체를 참고 실시예 1의 방법에 따라 제작하였다. 기존 기술과의 비교를 위해 아푸코실화 항체(H240-afucosyl_G1d/L73-k0) 및 양쇄에 S239D/A330L/I332E를 갖는 H240-Kn032/H240-Hl032/L73-k0를 제작하였다. 또한 WO 2012/125850에 기재되어 있는 개변체 중 FcγRIIIa에 대한 친화성이 가장 높아 가장 우수한 개변으로 생각되는 W187(S239D/A330M/K334V를 한쪽 H쇄에 갖고, L234Y/K290Y/Y296W를 다른 한쪽 H쇄에 갖는 개변체), M81(S239D/K334V를 한쪽 H쇄에 갖고, L234Y/Y296W/S298C를 다른 한쪽 H쇄에 갖는 개변체)에 대응하는 개변체를 각각 제작하였다. 구체적으로는 참고 실시예 1의 방법에 따라 H240-Kn033에 L234Y/K290Y/Y296W를 도입한 H240-Kn204, H240-Hl033에 S239D/A330M/K334V를 도입한 H240-Hl211, H240-Kn033에 L234Y/Y296W/S298C를 도입한 H240-Kn205, H240-Hl033에 S239D/K334V를 도입한 H240-Hl212를 제작하였다. 참고 실시예 1의 방법에 따라 한쪽 H쇄로서 H240-Kn204를, L쇄로서 L73-k0를, 다른 한쪽 H쇄로서 H240-Hl211, 또한 한쪽 H쇄로서 H240-Kn205를, L쇄로서 L73-k0를, 다른 한쪽 H쇄로서 H240-Hl212를 각각 조합하여 발현시켜, H240-Kn204/H240-Hl211/L73-k0, H240-Kn205/H240-Hl212/L73-k0를 조제하였다. 제작한 개변체의 FcgRIa, FcgRIIaR, FcgRIIaH, FcgRIIb, FcgRIIIaF, FcgRIIIaV로의 결합을 참고 실시예 8의 방법에 따라 측정하였다. 이들의 측정 결과를 표 75에 정리하였다.
Figure pct00116
표 75에 있어서 template에는 234번째의 아미노산을 치환하는 데 있어서 주형으로 한 사슬이 H240-Kn125 또는 H240-Kn120 중 어느 쪽인지를 나타낸다. 또한 「234번째의 아미노산」이란 H240-Kn125 또는 H240-Kn120의 EU 넘버링 234번째의 아미노산을 치환한 후의 아미노산의 종류를 나타낸다. 「fold 2aR」, 「fold 2aH」, 「fold 2b」, 「fold 3aF」, 「fold 3aV」란 각각 FcgRIIaR, FcgRIIaH, FcgRIIb, FcgRIIIaF, FcgRIIIaV에 대한 천연형 IgG1에 헤테로이량화 항체의 형성을 촉진시키기 위한 개변만을 가한 개변체인 H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0의 결합활성을 1로 하였을 때의 각 개변체의 상대적인 결합활성을 나타낸 것이다. 구체적으로는 H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0의 각 FcgR에 대한 KD를 각 개변체의 각 FcgR에 대한 KD로 나눈 값이다.
IgG1에 헤테로이량화 항체의 형성을 촉진시키기 위한 개변만을 가한 H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0와 비교하여 아푸코실화 항체(H240-afucosyl_G1d/L73-k0)는 FcgRIIIaF에 대해 4배, FcgRIIIaV에 대해 7배 결합이 증강되어 있었다. 또한 양쇄에 S239D/A330L/I332E를 갖는 H240-Kn032/H240-Hl032/L73-k0는 FcgRIIIaF에 대해 32배, FcgRIIIaV에 대해 16배 증강되어 있었다. 기존의 헤테로이량화 항체인 H240-Kn204/H240-Hl211(S239D/A330M/K334V를 한쪽 H쇄에 갖고, L234Y/K290Y/Y296W를 다른 한쪽 H쇄에 갖는 개변체)은 FcgRIIIaF에 대해 21배, FcgRIIIaV에 대해 7배 증강되어 있고, H240-Kn205/H240-Hl212(S239D/K334V를 한쪽 H쇄에 갖고, L234Y/Y296W/S298C를 다른 한쪽 H쇄에 갖는 개변체)는 FcgRIIIaF에 대해 24배, FcgRIIIaV에 대해 11배 결합이 증강되어 있었다. 한편 본 검토에 있어서 제작된 개변체는 FcgRIIIaF에 대해 69배 내지 223배, FcgRIIIaV에 대해 60배 내지 185배 증강되어 있어, 모든 개변체가 기존 기술보다도 높은 FcgRIIIa로의 결합활성을 가지고 있었다. 이 중에서 가장 FcgRIIIaF로의 결합이 높았던 것은 H240-Kn125/H240-Hl076/L73-k0의 H240-Kn125의 EU 넘버링 234번째를 천연형의 L로 치환한 H240-Kn198/H240-Hl076/L73-k0로, H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0와 비교하여 193배의 결합활성이었다. 또한 FcgRIIIaV로의 결합이 가장 높았던 것은 H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0의 H240-Kn120의 234번째를 E로 치환한 H240-Kn184/H240-Hl068/L73-k0로, H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0와 비교하여 141배의 결합활성이었다. FcgRIIIaF, FcgRIIIaV 모두 H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0와 비교하여 100배 이상의 결합활성을 갖는 개변체는 H240-Kn125/H240-Hl076/L73-k0의 H240-Kn125의 234번째를 F로 치환한 H240-Kn201/H240-Hl076/L73-k0, E로 치환한 H240-Kn202/H240-Hl076/L73-k0, D로 치환한 H240-Kn208/H240-Hl076/L73-k0, H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0의 H240-Kn120의 234번째를 E로 치환한 H240-Kn184/H240-Hl068/L73-k0, D로 치환한 H240-Kn217/H240-Hl068/L73-k0, T로 치환한 H240-Kn221/H240-Hl068/L73-k0, L로 치환한 H240-Kn199/H240-Hl068/L73-k0였다. 이들 중에서 H240-Kn125/H240-Hl076/L73-k0의 H240-Kn125의 234번째를 L로 치환한 H240-Kn198/H240-Hl076/L73-k0, F로 치환한 H240-Kn201/H240-Hl076/L73-k0, E로 치환한 H240-Kn202/H240-Hl076/L73-k0, D로 치환한 H240-Kn208/H240-Hl076/L73-k0는 모두 억제성의 FcgRIIb에 대한 결합이 H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0와 비교하여 동등 이하로 억제되어 있어, 이펙터 기능을 유발하는 데 우수한 헤테로이량화 항체이다.
또한 기존의 FcgRIIa 결합 증강 기술인 H240-Kn037/H240-Kn036/L73-k0보다도 높은 FcgRIIaR, FcgRIIaH로의 결합활성을 나타낸 개변체는 H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0의 234번째를 V로 치환한 H240-Kn216/H240-Hl068/L73-k0, I로 치환한 H240-Kn219/H240-Hl068/L73-k0, T로 치환한 H240-Kn221/H240-Hl068/L73-k0, M으로 치환한 H240-Kn220/H240-Hl068/L73-k0, L로 치환한 H240-Kn199/H240-Hl068/L73-k0였다. 이 중에서도 I로 치환한 H240-Kn219/H240-Hl068/L73-k0, T로 치환한 H240-Kn221/H240-Hl068/L73-k0, L로 치환한 H240-Kn199/H240-Hl068/L73-k0는 FcgRIIIa로의 결합활성이 높아 우수한 개변체이다.
이상의 결과로부터, 여기에서 검토된 개변체는 모두 FcgRIIIa로의 결합이 기존 기술을 윗돌 뿐 아니라 몇 개의 개변체에 대해서는 FcgRIIb에 대한 결합활성이 증강되어 있지 않거나, 또는 FcgRIIa에 대한 결합활성이 기존 기술보다 윗돌고 있어, 항체의 이펙터 기능을 유발하는 데 기존 기술보다도 우수한 헤테로이량화 항체인 것이 나타내어졌다.
(30-2) 330번째의 아미노산의 검토
다음으로 330번째의 아미노산의 검토를 행하였다. H240-Kn125/H240-Hl076/L73-k0에 있어서 H240-Hl076은 A330M 개변이 도입되어 있다. 이 330번째의 아미노산을 Ala(천연형), Phe, Pro, Ile, Tyr, His로 치환한 사슬을 참고 실시예 1의 방법에 따라 제작하고 H240-Kn125와 조합하여 발현시켰다. 항체 L쇄로서는 L73-k0를 공통으로 사용하였다. 제작한 개변체의 FcgRIa, FcgRIIaR, FcgRIIaH, FcgRIIb, FcgRIIIaF, FcgRIIIaV로의 결합을 참고 실시예 8의 방법에 따라 측정하였다. 이들의 측정 결과를 표 76에 정리하였다.
Figure pct00117
표 중 「330번째의 아미노산」이란 H240-Hl076의 330번째를 치환한 후의 아미노산의 종류를 나타낸다. 또한 「fold 2aR」, 「fold 2aH」, 「fold 2b」, 「fold 3aF」, 「fold 3aV」란 각각 FcgRIIaR, FcgRIIaH, FcgRIIb, FcgRIIIaF, FcgRIIIaV에 대한 천연형 IgG1에 헤테로이량화 항체의 형성을 촉진시키기 위한 개변만을 가한 개변체인 H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0의 결합활성을 1로 하였을 때의 각 개변체의 상대적인 결합활성을 나타낸 것이다. 구체적으로는 H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0의 각 FcgR에 대한 KD를 각 개변체의 각 FcgR에 대한 KD로 나눈 값이다.
본 검토에서 제작한 어느 개변체도 기존의 FcgRIIIa 결합 증강 기술보다도 높은 FcgRIIIa 결합활성을 가지고 있고, 검토한 것 중에서는 330번째를 Phe로 치환한 H240-Kn125/H240-Hl214/L73-k0가 FcgRIIIaF로의 결합이 가장 높고, 330번째를 Y로 치환한 H240-Kn125/H240-Hl217/L73-k0가 FcgRIIIaV로의 결합이 가장 높았다. FcgRIIb로의 결합에 관하여는 금번 검토한 개변체는 가장 낮았던 330번째를 Ile로 치환한 H240-Kn125/H240-Hl216/L73-k0에서 천연형 IgG1에 헤테로이량화 항체의 형성을 촉진시키기 위한 개변만을 가한 개변체인 H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0의 0.4배, 가장 높았던 330번째를 His로 치환한 H240-Kn125/H240-Hl218/L73-k0에서 1.1배로, 모두 H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0의 FcgRIIb에 대한 결합활성과 동등 또는 저감되어 있다는 결과였다. FcgRIIaR에 관하여는 H240-Kn125/H240-Hl076/L73-k0가 H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0의 1.8배였던 것에 대해, 금번 검토한 개변체는 가장 낮았던 330번째를 Ile로 치환한 H240-Kn125/H240-Hl216/L73-k0에서 1.0배, 가장 높았던 330번째를 His로 치환한 H240-Kn125/H240-Hl218/L73-k0에서 2.4배였다. 또한 FcgRIIaH에 관하여는 330번째를 Ile로 치환한 H240-Kn125/H240-Hl216/L73-k0가 가장 낮아 2.5배, 330번째를 His로 치환한 H240-Kn125/H240-Hl218/L73-k0가 가장 높아 4.7배였다. 이상의 결과로부터, H240-Kn125/H240-Hl076/L73-k0의 H240-Hl076에 대해 330번째를 Ala, Phe, Ile, Tyr, His로 치환한 개변체는 모두 FcgRIIIa로의 결합이 기존 기술을 윗돌고, 또한 FcgRIIb에 대한 결합활성도 증강되어 있지 않을 뿐 아니라 몇 개의 개변체에 대해서는 FcgRIIa에 대한 결합활성도 기존 기술보다 윗돌고 있어, 항체의 이펙터 기능을 유발하는 데 기존 기술보다도 우수한 헤테로이량화 항체인 것이 나타내어졌다.
(30-3) 239번째의 아미노산의 검토
H240-Kn125, H240-Kn120에는 모두 239번째의 Ser을 Met로 치환하는 개변이 도입되어 있다. 본 검토에서는 이 Met를 Ile로 치환 가능한지 검토하였다. 239번째의 Ile로의 치환은 실시예 17의 표 44에서 나타낸 바와 같이, Met보다도 FcgRIIb로의 결합을 증강시켜 버리지만 FcgRIIa 및 FcgRIIIa로의 결합에 관하여도 보다 높은 증강 효과가 있는 개변이다.
구체적으로는 H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0의 H240-Kn120과 H240-Kn125/H240-Hl076/L73-k0의 H240-Kn125의 239번째를 각각 Ile로 치환한 H240-Kn229/H240-Hl068/L73-k0 및 H240-Kn225/H240-Hl076/L73-k0를 참고 실시예 1에 기재된 방법에 따라 제작하였다. 제작한 개변체의 FcgRIa, FcgRIIaR, FcgRIIaH, FcgRIIb, FcgRIIIaF, FcgRIIIaV로의 결합을 참고 실시예 8의 방법에 따라 측정하였다. 이들의 측정 결과를 표 77에 정리하였다.
Figure pct00118
표 중 「fold 2aR」, 「fold 2aH」, 「fold 2b」, 「fold 3aF」, 「fold 3aV」란 각각 FcgRIIaR, FcgRIIaH, FcgRIIb, FcgRIIIaF, FcgRIIIaV에 대한 천연형 IgG1에 헤테로이량화 항체의 형성을 촉진시키기 위한 개변만을 가한 개변체인 H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0의 결합활성을 1로 하였을 때의 각 개변체의 상대적인 결합활성을 나타낸 것이다. 구체적으로는 H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0의 각 FcgR에 대한 KD를 각 개변체의 각 FcgR에 대한 KD로 나눈 값이다.
H240-Kn125/H240-Hl076/L73-k0의 H240-Kn125의 239번째를 Ile로 치환한 H240-Kn225/H240-Hl076/L73-k0는 FcgRIIIaF, FcgRIIIaV로의 결합이 H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0와 비교하여 각각 264배, 253배로 증강되어 있었다. 또한 FcgRIIb로의 결합도 H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0의 0.6배로 억제되어 있었다. H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0의 H240-Kn120의 239번째를 Ile로 치환한 H240-Kn229/H240-Hl068/L73-k0는 H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0와 비교하여 FcgRIIIaF, FcgRIIIaV로의 결합이 각각 138배, 62배로 향상되어 있어, 본 검토에서 제작한 2종류의 개변체는 모두 기존의 FcgRIIIa 결합 증강 기술보다 우수하였다. 또한 H240-Kn229/H240-Hl068/L73-k0는 FcgRIIaR, FcgRIIaH로의 결합이 H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0와 비교하여 각각 46배, 13배로, FcgRIIa로의 결합을 증강시키는 기존 기술 H240-Kn037/H240-Hl036/L73-k0를 윗돌고 있었다.
(30-4) 조합 개변의 검토
지금까지의 검토에서 H240-Kn125, H240-Kn120의 234번째 및 239번째의 아미노산, 또한 H240-Hl076의 330번째의 아미노산에 대해서 검토를 행해왔다. 이에 본 검토에서는 지금까지 얻어진 개변체 중에서 항체의 이펙터 기능을 증강시키는 데 높은 효과를 나타낼 것으로 생각되는 개변끼리를 조합하여, 보다 우수한 헤테로이량화 항체의 제작을 검토하였다.
구체적으로는 H240-Kn125의 234번째에는 F, E, D, S, L을, 239번째에는 I 또는 M을 도입한 항체 중쇄 유전자를 제작하였다. 또한 H240-Kn120의 234번째에는 V, E, D, T, I, L, F를, 239번째에는 M 또는 I를 도입한 항체 중쇄를 제작하였다. 다른 한쪽 항체 H쇄로서는 H240-Hl076의 330번째에 A 또는 F를 도입한 것 또는 H240-Hl068을 사용하였다. 항체 L쇄로서는 L73-k0를 공통으로 사용하였다. 제작한 개변체의 FcgRIa, FcgRIIaR, FcgRIIaH, FcgRIIb, FcgRIIIaF, FcgRIIIaV로의 결합을 참고 실시예 8의 방법에 따라 측정하였다. 이들의 측정 결과를 표 78에 정리하였다.
Figure pct00119
표 중 「Kn template」란 개변을 가할 때 H240-Kn120 또는 H240-Kn125 중 어느 쪽을 주형으로 했는지를 나타내고 있고, 「Hl template」란 H240-Hl068 또는 H240-Hl076 중 어느 쪽을 주형으로 했는지를 나타낸 것이다. 또한 「Hl template」가 회색으로 칠해진 개변체는 한쪽 H쇄로서 H240-Hl068을 사용한 것이다. 「234번째의 아미노산」 및 「239번째의 아미노산」이란 Kn쇄의 234번째, 239번째의 아미노산을 나타내고, 「330번째의 아미노산」이란 Hl쇄의 330번째의 아미노산을 치환한 후의 아미노산의 종류를 나타낸다. 「fold 2aR」, 「fold 2aH」, 「fold 2b」, 「fold 3aF」, 「fold 3aV」란 각각 FcgRIIaR, FcgRIIaH, FcgRIIb, FcgRIIIaF, FcgRIIIaV에 대한 천연형 IgG1에 헤테로이량화 항체의 형성을 촉진시키기 위한 개변만을 가한 개변체인 H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0의 결합활성을 1로 하였을 때의 각 개변체의 상대적인 결합활성을 나타낸 것이다. 구체적으로는 H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0의 각 FcgR에 대한 KD를 각 개변체의 각 FcgR에 대한 KD로 나눈 값이다.
본 검토에서 제작한 개변체의 FcgRIIIaF에 대한 결합활성은 천연형 IgG1에 헤테로이량화 항체의 형성을 촉진시키기 위한 개변만을 가한 개변체인 H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0와 비교하여 51배 내지 161배, 또한 FcgRIIIaV에 대한 결합활성은 34배 내지 107배로, 어느 개변체도 기존의 FcgRIIIa 결합 증강 기술과 비교하여 높은 결합활성을 가지고 있었다. FcgRIIIaF에 대해 가장 결합활성이 증강되어 있었던 것은 H240-Kn125의 234번째를 E로, 239번째를 I로 치환하고, H240-Hl076의 330번째를 F로 치환한 H240-Kn227/H240-Hl214/L73-k0였다. FcgRIIIaV에 대해 가장 결합활성이 증강되어 있었던 것은 H240-Kn120의 234번째를 F로 치환하고, H240-Hl076의 330번째를 A로 치환한 H240-Kn203/H240-Hl210/L73-k0였다. FcgRIIIaF, FcgRIIIaV 모두 결합활성이 증강되어 있었던 개변체로서는 H240-Kn226/H240-Hl214/L73-k0(H240-Kn125의 234번째를 F로, 239번째를 I로, H240-Hl076의 330번째를 F로 치환), H240-Kn227/H240-Hl214/L73-k0(H240-Kn125의 234번째를 E로, 239번째를 I로, H240-Hl076의 330번째를 F로 치환), H240-Kn228/H240-Hl214/L73-k0(H240-Kn125의 234번째를 D로, 239번째를 I로, H240-Hl076의 330번째를 F로 치환)를 들 수 있다. 이들 개변체는 FcgRIIb로의 결합에 관하여도 H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0와 같은 정도(1.0배 내지 1.4배)로 유지되어 있었다.
FcgRIIaR에 대한 결합활성은 천연형의 H240-Kn033/H240-Hl033/L73-k0와 비교하여 0.9배 내지 83배, 또한 FcgRIIaH에 대한 결합활성은 1.2배 내지 33배이고, 가장 결합활성이 증강되어 있었던 것은 H240-Kn120의 234번째 및 239번째를 I로 한 H240-Kn231/H240-Hl068/L73-k0였다. 기존의 FcgRIIa로의 결합 증강 개변을 도입한 H240-Kn037/H240-Kn036/L73-k0와 비교하여 FcgRIIaR, FcgRIIaH 모두 결합활성이 윗돌고 있는 개변체는 H240-Kn230/H240-Hl068/L73-k0(H240-Kn120의 234번째를 V, 239번째를 I로 치환), H240-Kn236/H240-Hl068/L73-k0(H240-Kn120의 234번째를 T, 239번째를 I로 치환), H240-Kn231/H240-Hl068/L73-k0(H240-Kn120의 234번째를 I, 239번째를 I로 치환), H240-Kn232/H240-Hl068/L73-k0(H240-Kn120의 234번째를 L, 239번째를 I로 치환), H240-Kn235/H240-Hl068/L73-k0(H240-Kn120의 234번째를 F, 239번째를 I로 치환)였다.
이상의 결과로부터, 여기서 검토된 개변체는 모두 FcgRIIIa로의 결합활성은 기존 기술을 윗돌고, 또한 몇 개의 개변체에 대해서는 FcgRIIa에 대한 결합활성도 기존 기술보다 윗돌고 있어, 항체의 이펙터 기능을 유발하는 데 기존 기술보다도 우수한 헤테로이량화 항체인 것이 나타내어졌다.
여기서 검토된 개변체의 H쇄의 서열번호를 표 79에 나타내었다.
Figure pct00120
〔참고 실시예 1〕 항체의 발현 벡터의 제작 및 항체의 발현과 정제
아미노산 치환의 도입은 QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene), PCR 또는 In fusion Advantage PCR cloning kit(TAKARA) 등을 사용하여 당업자 공지의 방법으로 행하여 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터의 염기서열은 당업자 공지의 방법으로 결정하였다. 제작한 플라스미드를 인간 태아 신장암 세포 유래 HEK293H주(Invitrogen), 또는 FreeStyle293 세포(Invitrogen사)에 일과성으로 도입하여 항체의 발현을 행하였다. 얻어진 배양상청으로부터 rProtein A SepharoseTM Fast Flow(GE 헬스케어)를 사용하여 당업자 공지의 방법으로 항체를 정제하였다. 정제 항체농도는 분광광도계를 사용하여 280 nm에서의 흡광도를 측정하고, 얻어진 값으로부터 PACE법에 의해 산출된 흡광계수를 사용하여 항체농도를 산출하였다(Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423).
〔참고 실시예 2〕FcγR의 조제와 FcγR에 대한 결합활성의 평가
FcgR의 세포외 도메인을 아래의 방법으로 조제하였다. 먼저 FcgR의 세포외 도메인의 유전자의 합성을 당업자 공지의 방법으로 실시하였다. 그때 각 FcgR의 서열은 NCBI에 등록되어 있는 정보를 토대로 제작하였다. 구체적으로는 FcgRI에 대해서는 NCBI의 accession # NM_000566.3의 서열, FcgRIIa에 대해서는 NCBI의 accession # NM_001136219.1의 서열, FcgRIIb에 대해서는 NCBI의 accession # NM_004001.3의 서열, FcgRIIIa에 대해서는 NCBI의 accession # NM_001127593.1의 서열, FcgRIIIb에 대해서는 NCBI의 accession # NM_000570.3의 서열을 토대로 제작하고, C 말단에 His 태그를 부가하였다. 또한 FcgRIIa, FcgRIIIa, FcgRIIIb에 대해서는 다형이 알려져 있으나, 다형 부위에 대해서는 FcgRIIa에 대해서는 J. Exp. Med., 1990, 172: 19-25, FcgRIIIa에 대해서는 J. Clin. Invest., 1997, 100(5): 1059-1070, FcgRIIIb에 대해서는 J. Clin. Invest., 1989, 84, 1688-1691을 참고로 하여 제작하였다.
얻어진 유전자 단편을 동물세포 발현 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 제작하였다. 제작한 발현 벡터를 인간 태아 신장암 세포 유래 FreeStyle293 세포(Invitrogen사)에 일과성으로 도입하여 목적 단백질을 발현시켰다. 또한 결정 구조 해석용으로 사용한 FcgRIIb에 대해서는 최종농도 10 ug/mL의 Kifunesine 존재하에서 목적 단백질을 발현시켜 FcgRIIb에 부가되는 당쇄가 고만노오스형이 되도록 하였다. 배양하고 얻어진 배양상청을 회수한 후, 0.22 ㎛ 필터를 통과시켜 배양상청을 얻었다. 얻어진 배양상청은 원칙으로서 다음의 4단계로 정제하였다. 제1 단계는 양이온 교환 칼럼크로마토그래피(SP Sepharose FF), 제2 단계는 His 태그에 대한 친화성 칼럼크로마토그래피(HisTrap HP), 제3 단계는 겔 여과 칼럼크로마토그래피(Superdex200), 제4 단계는 무균 여과를 실시하였다. 다만 FcgRI에 대해서는 제1 단계에 Q sepharose FF를 사용한 음이온 교환 칼럼크로마토그래피를 실시하였다. 정제한 단백질에 대해서는 분광광도계를 사용하여 280 nm에서의 흡광도를 측정하고, 얻어진 값으로부터 PACE 등의 방법으로 산출된 흡광계수를 사용하여 정제 단백질의 농도를 산출하였다(Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423).
Biacore T100(GE Healthcare)을 사용하여 목적의 항체와 FcγR의 상호작용 해석을 행하였다. 러닝 버퍼에는 HBS-EP+(GE Healthcare)를 사용하고, 측정온도는 25℃로 하였다. Series S Sencor Chip CM5(GE 헬스케어)에 아민 커플링법에 의해 항원 펩티드를 고정화한 칩, 또는 Series S Sensor Chip SA(certified)(GE 헬스케어)에 대해 사전에 비오틴화해 둔 항원 펩티드를 상호작용시켜 고정화한 칩을 사용하였다. 항원 펩티드를 고정화한 칩으로 목적의 항체를 캡쳐시키고, 러닝 버퍼로 희석한 각 FcγR을 상호작용시켰다. 10 mM glycine-HCl, pH1.5를 반응시킴으로써 칩에 캡쳐한 항체를 세정하고 칩을 재생하여 반복해서 사용하였다.
각 항체의 FcγR에 대한 결합활성은 주로 FcγR에 대한 결합활성 및 FcγR에 대한 해리상수를 지표로서 평가하였다.
FcγR에 대한 결합활성은 FcγR에 대한 상대적인 결합활성을 의미한다. FcγR에 대한 상대적인 결합활성은 각 측정시에 있어서의 대조가 되는 샘플의 결합활성을 100(%)로 하여, 다른 항체의 결합활성을 산출하였다. 여기서 말하는 결합활성에는 캡쳐시킨 항체에 FcγR을 상호작용시킨 전후에서의 센서그램의 변화량을 각 항체의 캡쳐량으로 나눈 값을 사용하였다. FcγR의 결합활성은 캡쳐한 항체의 양에 의존하기 때문이다.
각 항체의 FcγR에 대한 해리상수는 Biacore의 측정결과에 대해 속도론적 해석을 실시함으로써 산출하였다. 구체적으로는 Biacore Evaluation Software에 의해 측정하여 얻어진 센서그램을 1:1 Langmuir binding model에서 global fitting시킴으로써 결합속도상수 ka(L/mol/s), 해리속도상수 kd(1/s)를 산출하고, 그 값으로부터 해리상수 KD(mol/L)를 산출하였다.
〔참고 실시예 3〕헤테로이량화 항체 유전자 발현 벡터의 제작과 각 항체의 발현
항체 H쇄 가변영역으로서 다음의 것이 사용되었다. Q153(항인간 F.IX 항체의 H쇄 가변영역, 서열번호：61), Q407(항인간 F.IX 항체의 H쇄 가변영역, 서열번호：62), J142(항인간 F.X 항체의 H쇄 가변영역, 서열번호：63), J300(항인간 F.X 항체의 H쇄 가변영역, 서열번호：64), MRA-VH(항인간 인터류킨-6 수용체 항체의 H쇄 가변영역, 서열번호：65).
항체 L쇄로서 다음의 것이 사용되었다. L180-k(항인간 F.IX 항체/항인간 F.X 항체 공통 L쇄, 서열번호：66), L210-k(항인간 F.IX 항체/항인간 F.X 항체 공통 L쇄, 서열번호：67), MRA-k(항인간 인터류킨-6 수용체 항체의 L쇄, 서열번호：68).
항체 H쇄 불변영역으로서 다음의 것이 사용되었다. IgG4에 EU 넘버링 228번째의 Ser을 Pro로 치환하는 변이를 도입하여 C 말단의 Gly 및 Lys를 제거한 G4d(서열번호：69), G4d에 EU 넘버링 435번째의 His를 Arg로 치환하는 변이, EU 넘버링 436번째의 Tyr을 Phe로 치환하는 변이 및 EU 넘버링 445번째의 Leu를 Pro로 치환하는 변이를 도입한 z72(서열번호：70), G4d에 EU 넘버링 356번째의 Glu를 Lys로 치환하는 변이를 도입한 z7(서열번호：71), z72에 EU 넘버링 439번째의 Lys를 Glu로 치환하는 변이를 도입한 z73(서열번호：72), z7에 EU 넘버링 196번째의 Lys를 Gln으로 치환하는 변이, EU 넘버링 296번째의 Phe를 Tyr로 치환하는 변이 및 EU 넘버링 409번째의 Arg를 Lys로 치환하는 변이를 도입한 z106(서열번호：73), z73에 EU 넘버링 196번째의 Lys를 Gln으로 치환하는 변이, EU 넘버링 296번째의 Phe를 Tyr로 치환하는 변이, EU 넘버링 409번째의 Arg를 Lys로 치환하는 변이 및 EU 넘버링 436번째의 Phe를 Tyr로 치환하는 변이를 도입한 z107(서열번호：74), IgG1의 C 말단의 Gly 및 Lys를 제거한 G1d(서열번호：75). EU 넘버링 356번째의 Glu를 Lys로 치환하는 변이 및 EU 넘버링 439번째의 Lys를 Glu로 치환하는 변이는 헤테로항체를 생산할 때 각 H쇄의 헤테로분자를 효율적으로 형성시키기 때문이다((WO 2006/106905) PROCESS FOR PRODUCTION OF POLYPEPTIDE BY REGULATION OF ASSEMBLY).
Q153의 하류에 G4d 또는 z7을 연결함으로써 항인간 F.IX 항체 H쇄 유전자 Q153-G4d 또는 Q153-z7이 제작되었다. Q407의 하류에 z106을 연결함으로써 항인간 F.IX 항체 H쇄 유전자 Q407-z106이 제작되었다. J142의 하류에 G4d, z72 또는 z73을 연결함으로써 항인간 F.X 항체 H쇄 유전자 J142-G4d, J142-z72 또는 J142-z73이 제작되었다. J300의 하류에 z107을 연결함으로써 항인간 F.X 항체 H쇄 유전자 J300-z107이 제작되었다. MRA-VH의 하류에 G1d, z106 또는 z107을 연결함으로써 항인간 인터류킨-6 수용체 항체 H쇄 유전자 MRA-G1d, MRA-z106 또는 MRA-z107이 제작되었다.
각 항체 유전자(Q153-G4d, Q153-z7, Q407-z106, J142-G4d, J142-z72, J142-z73, J300-z106, MRA-G1d, MRA-z106, MRA-z107, L180-k, L210-k, MRA-k)는 동물세포 발현 벡터에 삽입되었다.
제작한 발현 벡터를 사용하여 아래의 항체를 FreeStyle293 세포(invitrogen)로의 트랜스펙션에 의해 일과성으로 발현시켰다. 아래와 같이, 트랜스펙션하는 복수의 항체 유전자를 나열한 것을 항체명으로서 표기하였다.
MRA-G1d/MRA-k
MRA-z106/MRA-z107/MRA-k
Q153-G4d/J142-G4d/L180-k
Q153-G4d/J142-z72/L180-k
Q153-z7/J142-z73/L180-k
Q407-z106/J300-z107/L210-k
〔참고 실시예 4〕헤테로이량화 항체의 프로테인 A 친화성 크로마토그래피의 용출 조건의 검토와 분리 정제
Q153-G4d/J142-G4d/L180-k 및 Q153-G4d/J142-z72/L180-k를 일과성으로 발현시켜 얻어진 FreeStyle293 세포 배양액(이하 CM으로 약칭한다)을 시료로 하여, 프로테인 A 친화성 크로마토그래피의 용출 조건을 검토하였다. D-PBS로 평형화한 rProtein A Sepharose Fast Flow 칼럼(GE Healthcare)에 ø0.22 ㎛ 필터로 여과한 CM을 부하하고, 표 80에 나타내는 세정 1, 2, 용출 1~5를 단계적으로 실시하였다. 칼럼에 부하하는 항체량이 20 ㎎/mL resine이 되도록 CM의 부하량을 조절하였다. 각 조건의 용출 분획을 분취하여 양이온 교환 크로마토그래피 분석에 의해 각 용출 분획에 포함되어 있는 성분을 동정하였다. 대조에는 각 CM을 rProtein G Sepharose Fast Flow 수지(GE Healthcare)에 부하하고, 배치로 용출함으로써 정제한 시료를 사용하였다. 프로테인 G는 항체의 Fab 부분에 결합하기 때문에 프로테인 G를 사용함으로써, 프로테인 A로의 결합활성과는 관계없이 CM 중에 존재하는 모든 항체(목적의 2종류의 H쇄가 헤테로회합화한 이중 특이성 항체(헤테로항체) 및 불순물의 1종류의 H쇄가 호모회합화한 단일 특이성의 호모항체)를 정제하는 것이 가능하다.
Figure pct00121
Q153-G4d/J142-G4d/L180-k 및 Q153-G4d/J142-z72/L180-k를 발현시킨 CM의 프로테인 A 칼럼의 각 용출 분획(용출 1~5)의 양이온 교환 크로마토그래피 분석을 행하였다. Q153-G4d/J142-G4d/L180-k는 용출 1 분획에서 용출 5 분획이 됨에 따라, 즉 용출에 사용한 용매의 pH가 내려감에 따라, 각 분획에 포함되는 항체 성분이 호모항체 J142-G4d/L180-K로부터 헤테로항체 Q153-G4d/J142-G4d/L180-k, 그리고 호모항체 Q153-G4d/L180-k의 순으로 변화되어 있는 것이 판명되었다. 용출의 순서는 프로테인 A로의 결합력의 강도에 준하고 있는 것으로 생각된다. 즉 고pH에서 용출된 호모체 J142-G4d/L180-k(FX에 대한 호모항체)보다도 저pH가 될 때까지 결합한 상태 그대로였던 호모항체 Q153-G4d/L180-k가 프로테인 A에 대한 결합력이 강하다는 것이 된다. 가변영역 J142는 프로테인 A에 결합하지 않는 서열인 것을 알 수 있다. 즉 호모체 J142-G4d/L180-k(FX에 대한 호모항체)는 프로테인 A로의 결합부위가 2개소, 헤테로항체 Q153-G4d/J142-G4d/L180-k는 3개소, 호모항체 Q153-G4d/L180-k(FIX에 대한 호모항체)는 4개소로 되어 있다. 따라서 프로테인 A로의 결합부위 수가 많을수록 프로테인 A에 강하게 결합하여 용출시키기 위해 필요한 pH가 낮아지는 것이 판명되었다.
한편 Q153-G4d/J142-z72/L180-k의 경우는, 용출 1 분획에서 용출 5 분획이 됨에 따라 각 분획에 포함되는 항체 성분이 헤테로항체 Q153-G4d/J142-z72/L180-k, 이어서 호모항체 Q153-G4d/L180-k의 순으로 변화되어 있는 것이 판명되었다. 호모항체 J142-z72/L180-k(FX에 대한 호모항체)는 각 용출 분획에 있어서 거의 검출되지 않았기 때문에, 프로테인 A에 대한 결합이 결실되어 있는 것이 나타내어졌다. J142-z72에 도입되어 있는 EU 넘버링 435번째의 His를 Arg로 치환하는 변이에 의해 프로테인 A에 결합하지 않게 될 것으로 생각된다. 호모항체 J142-z72/L180-k(FX에 대한 호모항체)는 프로테인 A로의 결합 부위가 없고, 헤테로항체 Q153-G4d/J142-z72/L180-k는 2개소, 호모항체 Q153-G4d/L180-k(FIX에 대한 호모항체)는 4개소가 된다. 호모항체 J142-z72/L180-k(FX에 대한 호모항체)는 프로테인 A에 결합하지 않고 그대로 통과하기 때문에 각 용출 분획에서 검출되지 않았다. 또한 Q153-G4d/J142-G4d/L180-k 및 Q153-G4d/J142-z72/L180-k 모두 pH3.6으로 그 이하의 pH에서 헤테로항체와 호모항체 Q153-G4d/L180-k(FIX에 대한 호모항체)를 분리할 수 있을 가능성이 나타내어졌다.
상기에서 검토한 정제 조건으로, 프로테인 A 칼럼크로마토그래피를 사용하여 헤테로이량화 항체의 정제를 실시하였다.
하기에 나타내는 항체의 CM을 시료로서 사용하였다.
·Q153-G4d/J142-G4d/L180-k
·Q153-G4d/J142-z72/L180-k
·Q153-z7/J142-z73/L180-k
·Q407-z106/J300-z107/L210-k
D-PBS로 평형화한 rProtein A Sepharose Fast Flow 칼럼(GE Healthcare)에 ø0.22 ㎛ 필터로 여과한 CM을 부하하고, 표 81에 나타내는 세정 1, 2, 용출 1, 2를 실시하였다(Q407-z106/J300-z107/L210-k는 용출 1만 실시). 용출 조건은 전술한 결과를 참고로 하였다. 부하하는 항체량이 20 ㎎/mL resine이 되도록 CM의 부하량을 조절하였다. 각 조건의 용출 분획을 분취하고, 양이온 교환 크로마토그래피 분석에 의해 각 용출 분획에 포함되어 있는 성분을 동정하였다. 대조에는 전술한 결과와 동일하게 각 CM을 rProtein G Sepharose Fast Flow 수지(GE Healthcare)에 부하하고, 배치로 용출함으로써 정제한 시료를 사용하였다.
Figure pct00122
각 용출 분획의 양이온 교환 크로마토그래피 분석 결과를 아래의 표 82~85에 나타내었다. 값은 용출 피크의 면적을 퍼센트로 표기하였다. Q153-G4d/J142-G4d/L180-k 이외의 항체의 경우는 FX에 대한 호모항체가 어느 용출 분획에도 거의 검출되지 않았다. 호모항체 J142-z72(FX에 대한 호모항체)뿐 아니라 호모항체 J142-z73 및 J300-z107(FX에 대한 호모항체)도 프로테인 A에 결합하지 않게 되어 있는 것이 판명되었다. 이는 FX에 대한 항체의 H쇄 불변영역에 도입되어 있는 EU 넘버링 435번째의 His를 Arg로 치환하는 변이에 의해 FX에 대한 호모항체에 있어서 프로테인 A에 대한 결합성이 상실되어 있기 때문이라고 생각되었다. 목적의 이중 특이성 항체인 헤테로항체는 대부분이 용출 1 분획에서 검출되고, FIX에 대한 호모항체는 용출 1 분획에도 약간 검출되었으나, 대부분이 용출 2에서 용출되어 있었다. Q153-G4d/J142-z72/L180-k와 비교하여 Q153-z7/J142-z73/L180-k 및 Q407-z106/J300-z107/L210-k에 있어서, pH3.6 용출 분획의 목적의 이중 특이성 항체인 헤테로항체의 비율이 대폭 향상되었다. EU 넘버링 435번째의 His를 Arg로 치환하는 변이에 더하여, 각 H쇄의 헤테로분자를 효율적으로 형성시키기 위한 EU 넘버링 356번째의 Glu를 Lys로 치환하는 변이 및 EU 넘버링 439번째의 Lys를 Glu로 치환하는 변이를 도입함으로써 프로테인 A 정제공정으로만 목적의 이중 특이성 항체인 헤테로항체를 98% 이상의 순도로 정제 가능한 것이 명확해졌다.
이상으로부터 호모항체와 헤테로항체의 프로테인 A 결합 부위 수의 차를 이용하여, 프로테인 A 크로마토그래피 공정만을 사용함으로써 헤테로항체를 고순도이며 효율적으로 분리 정제하는 것이 가능한 것을 발견하였다.
Figure pct00123
Figure pct00124
Figure pct00125
Figure pct00126
〔참고 실시예 5〕시차주사형 형광 정량법에 의한 개변 항체의 Tm 평가
본 검토에서는 Rotor-Gene Q(QIAGEN)를 사용한 시차주사형 형광 정량법을 사용하여 개변 항체의 Tm을 평가하였다. 또한 본 수법은 항체의 열안정성 평가법으로서 널리 알려져 있는 시차주사형 열량계를 사용한 Tm 평가와 양호한 상관관계를 나타내는 것이 이미 보고되어 있다(Journal of Pharmaceutical Science 2010 ; 4 : 1707-1720).
5000배 농도의 SYPRO orange(Molecular Probes)를 PBS(Sigma)에 의해 희석 후 항체용액과 혼화함으로써 측정 샘플을 조제하였다. 각 샘플을 20 μL씩 측정용 튜브에 세팅하고, 240℃/hr의 승온속도로 30℃에서 99℃까지 온도를 상승시켰다. 승온에 수반되는 형광변화를 470 nm(여기파장)/555 nm(형광파장)에 있어서 검출을 행하였다.
데이터는 Rotor-Gene Q Series Software(QIAGEN)를 사용하여 형광전이가 확인된 온도를 산출하고, 이 값을 Tm값으로 하였다.
〔참고 실시예 6〕헤테로 개변 항체의 가속시험
본 실시예 중의 항체에 관하여 가속시험을 실시하여 보존 안정성의 비교를 행하였다.
프로테인 A 정제 후의 각 항체를 0.2 mM 염산을 포함하는 PBS를 사용하여 1.0 ㎎/mL로 조제하고, 40℃의 항온조에 있어서 보존을 행하였다. 각 항체 모두 보존 개시시, 2주간 보존 후, 4주간 보존 후에 G3000 SWXL 칼럼을 사용한 사이즈 배제 크로마토그래피를 실시하여, 단량체 함유율을 관찰하였다.
〔참고 실시예 7〕 인간 말초혈 단핵구를 이펙터 세포로서 사용한 각 피험 항체의 ADCC 활성
항체의 편측 H쇄에만 삽입함으로써 FcγR에 대한 결합활성이 증강된 개변체에 대해서, 아래의 방법에 따라 ADCC 활성을 측정하였다.
인간 말초혈 단핵구(이하, 인간 PBMC라 지칭한다.)를 이펙터 세포로서 사용하여 각 피험 항체의 ADCC 활성을 아래와 같이 측정하였다.
(1) 인간 PBMC 용액의 조제
1000 단위/㎖의 헤파린용액(노보헤파린 주사 5천 단위，노보노르디스크)이 사전에 200 ㎕ 주입된 주사기를 사용하여, 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 소속의 건강한 정상인 자원봉사자(성인 남성)로부터 말초혈 50 ㎖를 채취하였다. PBS(-)를 사용하여 2배로 희석된 당해 말초혈을 4등분하여, 15 ㎖의 Ficoll-Paque PLUS가 사전에 주입되어 원심조작이 행해진 Leucosep 림프구 분리관(Greiner bio-one)에 첨가하였다. 당해 말초혈이 분주된 분리관이 2150 rpm의 속도로 10분간 실온에서 원심분리 조작을 한 후, 단핵구 분획층을 분취하였다. 10%FBS를 포함하는 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(SIGMA)(이하 10%FBS/D-MEM이라 칭한다.)으로 1회 당해 각 분층에 포함되는 세포를 세정한 후, 당해 세포가 10%FBS/D-MEM 중에 그 세포밀도가 5×106 세포/㎖가 되도록 현탁하였다. 당해 세포 현탁액을 인간 PBMC 용액으로서 아래의 실험에 제공하였다.
(2) 표적 세포의 조제
SK-Hep-1에 인간 글리피칸 3를 강제 발현시킨 SK-pca13a를 디쉬로부터 박리하고, 3×106 cells에 1.85MBq의 Cr-51을 첨가하였다. Cr-51을 첨가한 세포를 5% 탄산가스 인큐베이터 중에서 37℃로 1시간 인큐베이트한 후, 10%FBS/D-MEM으로 1회 세포를 세정하고, 당해 세포가 10%FBS/D-MEM 중에 그 세포밀도가 2×105 세포/㎖가 되도록 현탁하였다. 당해 세포 현탁액을 표적 세포로서 이후의 실험에 제공하였다.
(3) 크롬 유리시험(Chromium release test)(ADCC 활성)
ADCC 활성을 크롬 릴리스법에 의한 특이적 크롬 유리율로 평가하였다. 먼저 각 농도(0, 0.004, 0.04, 0.4, 4, 40 ㎍/㎖)로 조제한 항체용액을 96웰 U바닥 플레이트의 각 웰 중에 50 ㎕씩 첨가하였다. 다음으로 (2)에서 조제한 표적 세포를 50 ㎕씩 파종하고(1×104 cells/웰) 실온에서 15분간 정치하였다. 각 웰 중에 (1)에서 조제한 인간 PBMC 용액 각 100 ㎕(5×105 cells/웰)를 첨가한 당해 플레이트를 5% 탄산가스 인큐베이터 중에서 37℃로 4시간 정치한 후에 원심 조작하였다. 당해 플레이트의 각 웰 중 100 ㎕의 배양상청의 방사활성을 감마 카운터를 사용해서 측정하였다. 하기 식:
Figure pct00127
에 기초하여 특이적 크롬 유리율을 구하였다.
상기 식에 있어서, A는 각 웰 중 100 ㎕의 배양상청의 방사활성(cpm)의 평균값을 나타낸다. 또한 B는 표적 세포에 100 ㎕의 2% NP-40 수용액(Nonidet　P-40, 나칼라이테스크) 및 50 ㎕의 10% FBS/D-MEM 배지를 첨가한 웰 중 100 ㎕의 배양상청의 방사활성(cpm)의 평균값을 나타낸다. 또한 C는 표적 세포에 10% FBS/D-MEM 배지를 150 ㎕ 첨가한 웰 중 100 ㎕의 배양상청의 방사활성(cpm)의 평균값을 나타낸다. 시험은 3회 실시하고, 각 피험 항체의 ADCC 활성이 반영되는 상기 시험에 있어서의 특이적 크롬 유리율(%)의 평균값 및 표준편차를 산출하였다.
〔참고 실시예 8〕FcγR의 조제와 FcγR에 대한 결합활성의 평가
FcgR의 세포외 도메인을 아래의 방법으로 조제하였다. 먼저 FcgR의 세포외 도메인의 유전자의 합성을 당업자 공지의 방법으로 실시하였다. 그때 각 FcgR의 서열은 NCBI에 등록되어 있는 정보를 토대로 제작하였다. 구체적으로는 FcgRI에 대해서는 NCBI의 accession # NM_000566.3의 서열, FcgRIIa에 대해서는 NCBI의 accession # NM_001136219.1의 서열, FcgRIIb에 대해서는 NCBI의 accession # NM_004001.3의 서열, FcgRIIIa에 대해서는 NCBI의 accession # NM_001127593.1의 서열, FcgRIIIb에 대해서는 NCBI의 accession # NM_000570.3의 서열에 기초하여 제작하고, C 말단에 His 태그를 부가하였다. 또한 FcgRIIa, FcgRIIIa, FcgRIIIb에 대해서는 다형이 알려져 있으나, 다형부위에 대해서는 FcgRIIa에 대해서는 J. Exp. Med., 1990, 172: 19-25, FcgRIIIa에 대해서는 J. Clin. Invest., 1997, 100(5): 1059-1070, FcgRIIIb에 대해서는 J. Clin. Invest., 1989, 84, 1688-1691을 참고로 하여 제작하였다.
얻어진 유전자 단편을 동물세포 발현 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 제작하였다. 제작한 발현 벡터를 인간 태아 신장암 세포 유래 FreeStyle293세포(Invitrogen사)에 일과성으로 도입하여 목적 단백질을 발현시켰다. 또한 결정 구조 해석용으로 사용한 FcgRIIb에 대해서는 최종농도 10 ug/mL의 Kifunesine 존재하에서 목적 단백질을 발현시켜, FcgRIIb에 부가되는 당쇄가 고만노오스형이 되도록 하였다. 배양하고 얻어진 배양상청을 회수한 후, 0.22 ㎛ 필터를 통과시켜 배양상청을 얻었다. 얻어진 배양상청은 원칙으로서 다음의 4단계로 정제하였다. 제1 단계는 양이온 교환 칼럼크로마토그래피(SP Sepharose FF), 제2 단계는 His 태그에 대한 친화성 칼럼크로마토그래피(HisTrap HP), 제3 단계는 겔 여과 칼럼크로마토그래피(Superdex200), 제4 단계는 무균 여과를 실시하였다. 단 FcgRI에 대해서는 제1 단계에 Q sepharose FF를 사용한 음이온 교환 칼럼크로마토그래피를 실시하였다. 정제한 단백질에 대해서는 분광 광도계를 사용하여 280 nm에서의 흡광도를 측정하고, 얻어진 값으로부터 PACE 등의 방법으로 산출된 흡광계수를 사용하여 정제 단백질의 농도를 산출하였다(Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423).
Biacore T100, Biacore T200, Biacore A100 또는 Biacore 4000(GE Healthcare)을 사용하여 목적의 항체와 FcγR의 상호작용 해석을 행하였다. 러닝 버퍼에는 HBS-EP+(GE Healthcare)를 사용하고, 측정온도는 25℃로 하였다. 센서칩에는 Series S Sencor Chip CM5(GE 헬스케어)에 아민 커플링법에 의해 항원 펩티드를 고정화한 칩, Series S Sensor Chip SA(certified)(GE 헬스케어)에 대해 사전에 비오틴화해 둔 항원 펩티드를 상호작용시켜 고정화한 칩, Series S Sencor Chip CM5(GE 헬스케어)에 Protein L(ACTIGEN, BioVision)을 고정화한 칩 또는 Series S Sencor Chip CM5(GE 헬스케어)에 Protein A/G(Thermo Scientific)를 고정화한 칩을 사용하였다. 이들 칩으로 목적의 항체를 캡쳐시켜, 러닝 버퍼로 희석한 각 FcγR을 상호작용시켰다. 10 mM glycine-HCl, pH1.5를 반응시킴으로써 칩에 캡쳐한 항체를 세정하고 칩을 재생하여 반복해서 사용하였다.
각 항체의 FcγR에 대한 결합활성은 주로 FcγR에 대한 결합활성 및 FcγR에 대한 해리상수를 지표로 평가하였다.
FcγR에 대한 결합활성은 FcγR에 대한 상대적인 결합활성을 의미한다. FcγR에 대한 상대적인 결합활성은 각 측정시에 있어서의 대조가 되는 샘플의 결합활성을 100(%)로 하여, 다른 항체의 결합활성을 산출하였다. 여기서 말하는 결합활성에는, 캡쳐시킨 항체에 FcγR을 상호작용시킨 전후에서의 센서그램의 변화량을 각 항체의 캡쳐량으로 나눈 값을 사용하였다. FcγR의 결합활성은 캡쳐한 항체의 양에 의존하기 때문이다.
각 항체의 FcγR에 대한 해리상수는 Biacore의 측정결과에 대해 속도론적 해석을 실시함으로써 산출하였다. 구체적으로는 Biacore Evaluation Software에 의해 측정하여 얻어진 센서그램을 1:1 Langmuir binding model에서 global fitting시킴으로써 결합속도상수 ka(L/mol/s), 해리속도상수 kd(1/s)를 산출하고, 그 값으로부터 해리상수 KD(mol/L)를 산출하였다.
〔참고 실시예 9〕 인간 말초혈 단핵구를 이펙터 세포로서 사용한 각 피험 항체의 ADCC 활성
Fc 개변을 적용한 각 개변체에 대해서, 아래의 방법에 따라 ADCC 활성을 측정하였다.
인간 말초혈 단핵구(이하, 인간 PBMC라 지칭한다.)를 이펙터 세포로서 사용하여 각 피험 항체의 ADCC 활성을 아래와 같이 측정하였다.
(1) 인간 PBMC 용액의 조제
1000 단위/㎖의 헤파린용액(노보헤파린 주사 5천 단위，노보노르디스크)이 사전에 200 ㎕ 주입된 주사기를 사용하여, 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 소속의 건강한 정상인 자원봉사자(성인 남성)로부터 말초혈 50 ㎖를 채취하였다. PBS(-)를 사용하여 2배로 희석된 당해 말초혈을 4등분하여, 15 ㎖의 Ficoll-Paque PLUS가 사전에 주입되어 원심조작이 행해진 Leucosep 림프구 분리관(Greiner bio-one)에 첨가하였다. 당해 말초혈이 분주된 분리관이 2150 rpm의 속도로 10분간 실온에서 원심분리 조작을 한 후, 단핵구 분획층을 분취하였다. 10%FBS를 포함하는 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(SIGMA)(이하 10%FBS/D-MEM이라 칭한다.)으로 1회 당해 각 분층에 포함되는 세포를 세정한 후, 당해 세포가 10%FBS/D-MEM 중에 그 세포밀도가 5×106 세포/㎖ 또는 2.5×106 세포/㎖가 되도록 현탁하였다. 당해 세포 현탁액을 인간 PBMC 용액으로서 아래의 실험에 제공하였다.
(2) 표적 세포의 조제
SK-Hep-1에 인간 Epiregulin을 강제 발현시킨 SK-pca13a 또는 SKE18 또는 인간 대장암주 DLD-1 또는 인간 췌장암 세포주 MIAPaCa-2를 디쉬로부터 박리하여, 1×106 cells당 0.2 ㎎/mL의 Calcein용액 200 μL 또는 3×106 cells에 1.85 MBq의 Cr-51을 첨가하였다. Calcein용액 또는 Cr-51을 첨가한 세포를 5% 탄산가스 인큐베이터 중에서 37℃로 1-2시간 인큐베이트한 후, 10%FBS/D-MEM으로 1회 세포를 세정하고, 당해 세포가 10%FBS/D-MEM 중에 그 세포밀도가 2×105 세포/㎖가 되도록 현탁하였다. 당해 세포 현탁액을 표적 세포로서 이후의 실험에 제공하였다.
(3-1) 칼세인 또는 크롬 유리시험(ADCC 활성)
ADCC 활성을 칼세인 또는 크롬 릴리스법에 의한 특이적 칼세인 또는 크롬 유리율로 평가하였다. 먼저 각 농도(0, 0.004, 0.04, 0.4, 4, 40 ㎍/㎖)로 조제한 항체용액을 96웰 U바닥 플레이트의 각 웰 중에 50 ㎕씩 첨가하였다. 다음으로 (2)에서 조제한 표적 세포를 50 ㎕씩 파종하고(1×104 cells/웰) 실온에서 15분간 정치하였다. 각 웰 중에 (1)에서 조제한 인간 PBMC 용액 각 100 ㎕(5×105 cells/웰 또는 2.5×105 cells/웰)를 첨가한 당해 플레이트를 5% 탄산가스 인큐베이터 중에서 37℃로 4시간 정치한 후에 원심 조작하였다. 당해 플레이트의 각 웰 중 100 ㎕의 배양상청의 칼세인 형광 또는 방사활성을 흡광광도계 또는 감마 카운터를 사용해서 측정하였다. 하기 식:
Figure pct00128
에 기초하여 특이적 칼세인 또는 크롬 유리율을 구하였다.
상기 식에 있어서, A는 각 웰 중 100 ㎕의 배양상청의 칼세인 형광(여기파장 485 nm, 형광파장 535 nm) 또는 방사활성(cpm)의 평균값을 나타낸다. 또한 B는 표적 세포에 100 ㎕의 2% NP-40 수용액(Nonidet　P-40, 나칼라이테스크) 및 50 ㎕의 10% FBS/D-MEM 배지를 첨가한 웰 중 100 ㎕의 배양상청의 칼세인 형광(여기파장 485 nm, 형광파장 535 nm) 또는 방사활성(cpm)의 평균값을 나타낸다. 또한 C는 표적 세포에 10% FBS/D-MEM 배지를 150 ㎕ 첨가한 웰 중 100 ㎕의 배양상청의 칼세인 형광(여기파장 485 nm, 형광파장 535 nm) 또는 방사활성(cpm)의 평균값을 나타낸다. 시험은 3회 실시하고, 각 피험 항체의 ADCC 활성이 반영되는 상기 시험에 있어서의 특이적 칼세인 또는 크롬 유리율(%)의 평균값 및 표준편차를 산출하였다.
본 발명에 의해 항체 불변영역의 아미노산 서열을 개변함으로써 결합활성이 개변되고, 또한 물성(예를 들면 안정성, 균일성)이 개선된, 의약품으로서 적합한 폴리펩티드가 제공된다.
SEQUENCE LISTING <110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA <120> HETERODIMER POLYPEPTIDE <130> C1-A1215P <150> JP 2012-284129 <151> 2012-12-27 <160> 205 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Thr Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Glu Met His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Glu Ser Phe 50 55 60 Gln Asp Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 443 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 2 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Thr Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Glu Met His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Glu Ser Phe 50 55 60 Gln Asp Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 165 170 175 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 180 185 190 Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 195 200 205 Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 <210> 3 <211> 443 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 3 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Thr Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Glu Met His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Glu Ser Phe 50 55 60 Gln Asp Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 165 170 175 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 180 185 190 Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 195 200 205 Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Arg Lys Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 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Val Leu Gln Ser Ser 165 170 175 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 180 185 190 Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 195 200 205 Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Tyr Trp Gly Pro Ile Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Asp Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ala Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 <210> 203 <211> 444 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 203 Gln Asp Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Leu Arg Lys Gln Thr Lys Tyr Arg Glu Lys Phe 50 55 60 Glu Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Ser Gly Arg Glu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 165 170 175 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 180 185 190 Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 195 200 205 Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Glu Tyr Trp Gly Pro Ile Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Asp Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ala Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 <210> 204 <211> 444 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 204 Gln Asp Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Leu Arg Lys Gln Thr Lys Tyr Arg Glu Lys Phe 50 55 60 Glu Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Ser Gly Arg Glu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 165 170 175 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 180 185 190 Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 195 200 205 Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Asp Tyr Trp Gly Pro Ile Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Asp Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ala Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 <210> 205 <211> 444 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 205 Gln Asp Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Leu Arg Lys Gln Thr Lys Tyr Arg Glu Lys Phe 50 55 60 Glu Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Ser Gly Arg Glu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 165 170 175 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 180 185 190 Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 195 200 205 Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Tyr Trp Gly Pro Ile Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Asp Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ala Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440

Claims (21)

  1. 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 헤테로이량화체에 의해 구성되어 있는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드로서, 그 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드 중 어느 한쪽이 (i) 또는 (ii)에 기재된 변이가 도입되어 있는 Fc영역을 포함하고, 변이가 도입되어 있지 않은 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 Fc영역의 기능이 개변되어 있는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드：
    (i) EU 넘버링 234번째의 아미노산이 L, S, F, E, V, D, Q, I, M, T, A, G 또는 H, 235번째의 아미노산이 Y 또는 Q, 236번째의 아미노산이 W, 239번째의 아미노산이 M 또는 I, 268번째의 아미노산이 D 및 298번째의 아미노산이 A
    (ii) EU 넘버링 270번째의 아미노산이 E, 326번째의 아미노산이 D, 330번째의 아미노산이 A, K, M, F, I, Y 또는 H 및 334번째의 아미노산이 E.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드 중 어느 한쪽이 (i) 또는 (ii)에 기재된 변이가 도입되어 있는 Fc영역을 포함하고, 다른 한쪽이 (iii)에 기재된 변이가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드：
    (i) EU 넘버링 234번째의 아미노산이 L, S, F, E, V, D, Q, I, M, T, A, G 또는 H, 235번째의 아미노산이 Y 또는 Q, 236번째의 아미노산이 W, 239번째의 아미노산이 M 또는 I, 268번째의 아미노산이 D, 298번째의 아미노산이 A 및 327번째의 아미노산이 D
    (ii) EU 넘버링 234번째의 아미노산이 L, S, F, E, V, D, Q, I, M, T, A, G 또는 H, 235번째의 아미노산이 Y 또는 Q, 236번째의 아미노산이 W, 239번째의 아미노산이 M 또는 I, 268번째의 아미노산이 D, 270번째의 아미노산이 E 및 298번째의 아미노산이 A
    (iii) EU 넘버링 270번째의 아미노산이 E, 326번째의 아미노산이 D, 330번째의 아미노산이 A, K, M, F, I, Y 또는 H 및 334번째의 아미노산이 E.
  3. 제2항에 있어서,
    청구항 2 (i)의 EU 넘버링 234번째의 아미노산이 E, D, T 또는 L인 폴리펩티드.
  4. 제2항에 있어서,
    청구항 2 (ii)의 EU 넘버링 234번째의 아미노산이 L, F, E 또는 D인 폴리펩티드.
  5. 제2항에 있어서,
    청구항 2 (i)의 EU 넘버링 234번째의 아미노산이 V, I, T, M 또는 L인 폴리펩티드.
  6. 제2항에 있어서,
    청구항 2 (i)의 EU 넘버링 234번째의 아미노산이 V, E, D, T, I, L 또는 F 및 239번째의 아미노산이 M 또는 I이고, (iii)의 EU 넘버링 330번째의 아미노산이 A 또는 K인 폴리펩티드.
  7. 제2항에 있어서,
    청구항 2 (ii)의 EU 넘버링 234번째의 아미노산이 F, E, D, S 또는 L 및 239번째의 아미노산이 M 또는 I이고, (iii)의 EU 넘버링 330번째의 아미노산이 A, F 또는 K인 폴리펩티드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 Fc영역의 기능의 개변이 폴리펩티드의 Fcγ 수용체에 대한 결합활성의 증강, 결합활성의 약화 및 결합활성의 선택성의 향상으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 개변인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 Fcγ 수용체가 FcγRIa, FcγRIIa R, FcγRIIa H, FcγRIIb, FcγRIIIaF 및 FcγRIIIaV로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 수용체인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서,
    상기 Fc영역의 기능의 개변이 Fcγ 수용체에 대한 결합활성의 선택성의 향상인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 Fcγ 수용체에 대한 결합활성의 선택성의 향상이 활성형 Fcγ 수용체와 저해형 Fcγ 수용체 사이의 선택성인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 Fcγ 수용체에 있어서 활성형 Fcγ 수용체가 FcγRIa, FcγRIIa R, FcγRIIa H, FcγRIIIaF 및 FcγRIIIaV로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 수용체이고, 저해형 Fcγ 수용체가 FcγRIIb인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서,
    상기 활성형 Fcγ 수용체에 대한 결합활성이 상기 저해형 Fcγ 수용체에 대한 결합활성에 비해 선택적으로 증강된 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    추가로 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드의 등전점에 차를 부여하기 위한 아미노산 개변이 도입되어 있는 폴리펩티드.
  15. 제14항에 있어서,
    등전점의 차를 부여하기 위한 아미노산 개변이 제1 폴리펩티드 및/또는 제2 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, EU 넘버링 137번째의 Gly, 138번째의 Gly, 139번째의 Thr, 147번째의 Lys, 192번째의 Ser, 193번째의 Leu, 196번째의 Gln, 198번째의 Tyr, 199번째의 Ile, 203번째의 Asn, 214번째의 Lys, 231번째의 Ala, 233번째의 Glu, 242번째의 Leu, 263번째의 Val, 272번째의 Glu, 274번째의 Lys, 278번째의 Tyr, 288번째의 Lys, 290번째의 Lys, 316번째의 Gly, 317번째의 Lys, 320번째의 Lys, 324번째의 Lys, 335번째의 Thr, 337번째의 Ser, 338번째의 Lys, 340번째의 Lys, 341번째의 Gly, 358번째의 Leu, 360번째의 Lys, 362번째의 Gln, 364번째의 Ser, 383번째의 Ser, 384번째의 Asn, 385번째의 Gly, 386번째의 Gln, 387번째의 Pro, 390번째의 Asn, 397번째의 Val 및 422번째의 Val로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 부위에 있어서 하나 이상의 아미노산 변이가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  16. 제15항에 있어서,
    등전점의 차를 부여하기 위한 아미노산 개변이 제1 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드 중 어느 한쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, EU 넘버링 196번째의 Gln, 199번째의 Ile, 231번째의 Ala, 233번째의 Glu, 242번째의 Leu, 263번째의 Val, 272번째의 Glu, 316번째의 Gly, 358번째의 Leu, 364번째의 Ser, 383번째의 Ser, 387번째의 Pro 및 397번째의 Val로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산 변이가 도입되어 있고, 다른 한쪽 폴리펩티드의 아미노산 서열에 있어서, EU 넘버링 137번째의 Gly, 138번째의 Gly, 139번째의 Thr, 147번째의 Lys, 192번째의 Ser, 193번째의 Leu, 198번째의 Tyr, 199번째의 Ile, 203번째의 Asn, 214번째의 Lys, 274번째의 Lys, 278번째의 Tyr, 288번째의 Lys, 290번째의 Lys, 316번째의 Gly, 317번째의 Lys, 320번째의 Lys, 324번째의 Lys, 335번째의 Thr, 337번째의 Ser, 338번째의 Lys, 340번째의 Lys, 341번째의 Gly, 358번째의 Leu, 360번째의 Lys, 362번째의 Gln, 383번째의 Ser, 384번째의 Asn, 385번째의 Gly, 386번째의 Gln, 390번째의 Asn 및 422번째의 Val로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 변이가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드가 항원 결합 분자인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 항원 결합 분자가 항체, 이중 특이성 항체, 펩티드 Fc 융합 단백질, 또는 스캐폴드 Fc 융합 단백질 등의 Fc 융합 분자인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드 및 의학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 의약 조성물.
  20. Fc영역을 포함하는 폴리펩티드의 기능을 개변하는 방법으로서, 그 Fc영역을 구성하는 제1 폴리펩티드 및/또는 제2 폴리펩티드에 아미노산 변이를 도입함으로써 그 Fc영역을 헤테로이량체로 하고, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 아미노산 변이의 도입에 의해 그 Fc영역이 호모이량체가 된 경우에 비해 Fc영역의 기능을 개변하는 공정을 포함하는, 폴리펩티드의 기능을 개변하는 방법.
  21. Fc영역을 포함하는 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서, 그 Fc영역을 구성하는 제1 폴리펩티드 및/또는 제2 폴리펩티드에 아미노산 변이를 도입함으로써 그 Fc영역을 헤테로이량체로 하고, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 아미노산 변이의 도입에 의해 그 Fc영역이 호모이량체가 된 경우에 비해 Fc영역의 기능을 개변하는 공정을 포함하는, Fc영역을 포함하는 폴리펩티드를 제조하는 방법.
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