CN101466733A - 包含免疫球蛋白铰链区和Fc效应子功能改变了的Fc区的结合蛋白 - Google Patents

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CN101466733A CNA2007800222151A CN200780022215A CN101466733A CN 101466733 A CN101466733 A CN 101466733A CN A2007800222151 A CNA2007800222151 A CN A2007800222151A CN 200780022215 A CN200780022215 A CN 200780022215A CN 101466733 A CN101466733 A CN 101466733A
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Abstract

本发明提供包含一个或多个免疫球蛋白Fc区铰链、CH2和/或CH3结构域的结合蛋白，其中所述一个或多个铰链和/或恒定区CH2和/或CH3结构域被修饰，以改变结合蛋白对关联受体(例如Fc受体)的结合亲和力和/或特异性，和/或赋予该铰链和/或恒定区一种或多种新的结合特异性，这些新的结合特异性是相应的未修饰结合蛋白所不具有的(例如对与未修饰结合蛋白所特异性结合的关联受体类别不同的关联受体类别的亲和力)。根据本发明的结合蛋白包括例如经修饰的抗体、抗体片段、重组结合蛋白和分子工程改造的结合结构域－免疫球蛋白融合蛋白，包括小模块免疫药物产品(SMIPTM产品)在内。

Description

包含免疫球蛋白铰链区和Fc效应子功能改变了的Fc区的结合蛋白
相关申请的交叉引用
本申请要求2006年4月14日提交的美国临时申请系列号60/744,899的权利，60/744,899的更早提交日的权利按35U.S.C.§119(e)在此提出并通过引用进一步结合到本文中。
发明背景
技术领域
本发明主要涉及免疫学、蛋白质化学和分子生物学领域。更具体的说，本文提供包含一个或多个免疫球蛋白铰链、CH2和/或CH3结构域的结合蛋白，其中该一个或多个免疫球蛋白铰链、CH2和/或CH3结构域被修饰，以改变结合蛋白对关联(cognate)受体(例如Fc受体)的结合亲和力和/或特异性，和/或赋予该铰链区和/或恒定区一种或多种新的结合特异性，这些新的结合特异性是相应的未修饰结合蛋白所不具有的(例如对与未修饰结合蛋白所特异性结合的关联受体不同的Fc受体的亲和力)。根据本发明的结合蛋白包括例如经修饰的抗体、抗体片段、重组结合蛋白和分子工程改造的(molecularly engineered)结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白，包括小模块免疫药物产品(small modularimmunopharmaceutical products，SMIPTM产品)在内。
相关领域的描述
免疫球蛋白是由两条相同的轻链多肽和两条相同的重链多肽通过链间二硫键连接成大分子复合物而构成的多聚蛋白质(H2L2)。链间二硫键将同一多肽链的不同区域连接起来，导致环的形成，环连同相邻的氨基酸一起构成免疫球蛋白结构域。
在氨基末端部分，每个轻链和每个重链都具有单个可变区，在该区的氨基酸组成上，不同的抗体显示出极大的不同。轻链可变区VL与重链可变区VH发生缔合，形成免疫球蛋白的抗原结合位点Fv。轻链具有单个恒定区结构域(CH1)，而重链具有几个恒定区结构域。IgG类、IgA类和IgD类具有三个重链恒定区结构域，分别称为CH1、CH2和CH3；而IgM类和IgE类具有四个重链恒定区结构域，分别称为CH1、CH2、CH3和CH4。在Harlow et al.，Eds.，“Antibodies：ALaboratory Manual，”Chapter 14(Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，1988)中和在Lo，Ed.，“Antibody Engineering：Methodsand Protocols，”Part 1(Humana Press，Totowa，New Jersey，2004)中，对免疫球蛋白结构和功能进行了综述。
免疫球蛋白的重链可分成三个功能区域：Fd区、铰链区和Fc区(可结晶片段)。Fd区包含VH结构域和CH1结构域，它与轻链组合在一起形成Fab，即抗原结合片段。Fc片段负责免疫球蛋白效应子功能，这种功能包括例如补体固定和与效应细胞关联Fc受体的结合。铰链区存在于IgG类、IgA类和IgD类免疫球蛋白，能起到柔性间隔区的作用，让Fab部分在与Fc区相对的空间中自由移动。与恒定区形成对比的是，铰链结构域结构多样，不同的免疫球蛋白类别和亚类在铰链的序列和长度上各不相同。
根据晶体学研究，免疫球蛋白铰链区按结构和功能还可进一步细分成以下三个区域：上铰链、核心和下铰链。Shin et al.，ImmunologicalReviews 130：87(1992)。上铰链包括从CH1的羧基末端到铰链中限制运动的第一个残基的那些氨基酸，该第一个残基通常是在两条重链之间形成链间二硫键的第一个半胱氨酸残基。上铰链区的长度关系到抗体的区段柔性(segmental flexibility)。核心铰链区含有重链间二硫键。下铰链区连接CH2结构域的氨基末端且包括CH2结构域中的残基。同上文献。
人IgG1的核心铰链区含有序列Cys-Pro-Pro-Cys，该序列当通过二硫键形成而发生二聚化时，会导致产生据认为起到支点(pivot)作用的环状八肽，从而赋予柔性。免疫球蛋白铰链区多肽序列的结构和柔性所允许的构象变化，会影响抗体Fc部分的效应子功能。
与Fc区有关的三种主要类别的效应子功能包括：(1)经典的补体级联的激活，(2)与效应细胞的相互作用和(3)免疫球蛋白的区室化。不同的人IgG亚类在固定补体或者激活和扩大补体级联的步骤的相对效能上不尽相同(参见例如Kirschfink，Immunol.Rev.180：177(2001)；Chakraborti et al.，Cell Signal 12：607(2000)；Kohl et al.，Mol.Immunol.36：893(1999)；Marsh et al.，Curr.Opin.Nephrol.Hypertens.8：557(1999)和Speth et al.，Wien Klin.Wochenschr.111：378(1999))。补体依赖性细胞毒性(CDC)据认为是清除特定的靶细胞如肿瘤细胞的重要机制。一般来说，IgG1和IgG3能最有效地固定补体，IgG2不够有效，而IgG4不能激活补体。补体激活是通过级联中第一个组分C1的亚单位Clq与抗原-抗体复合物的结合引发的。
尽管Clq的结合位点位于抗体的CH2结构域中，但铰链区会影响抗体激活级联的能力。例如，缺乏铰链区的重组免疫球蛋白不能够激活补体。Shin et al.，(1992)，出处同上。没有铰链区所赋予的柔性，结合抗原的抗体Fab部分可能不能够采取为允许Clq结合CH2所需的构象(参见同上文献)。铰链长度和区段柔性与补体激活的关系有限。因此，具有改变了的、如同IgG4铰链区一样刚硬的铰链区的人IgG3分子，在激活补体级联方面保持有效。
铰链区还可含有一个或多个糖基化位点，这些位点包括多种结构类型不同的碳水化合物连接位点。例如，IgA1在铰链区的17氨基酸区段当中含有五个糖基化位点，从而赋予铰链区多肽对肠蛋白酶的超常抗性，这被认为是分泌性免疫球蛋白的有利性质。
铰链区的不存在或者功能性铰链区的缺乏，也会影响某些人免疫球蛋白结合免疫效应细胞上的Fc受体的能力。免疫球蛋白与Fc受体的结合能促进抗体依赖性细胞介导细胞毒性(ADCC)，ADCC据推测是清除肿瘤细胞的重要机制。人IgG Fc受体(FcR)家族分成三类：FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)，前一类能够以高亲和力结合IgG，后两类是低亲和力受体。人IgA Fc受体是FcαR(CD89)。实验证据表明，CH2结构域的铰链近侧区域(hinge proximal region)中的残基，对于免疫球蛋白与各自Fc受体的每一个之间的相互作用的特异性是重要的。这一点得到以下观察结果的支持：缺乏铰链区的IgG1骨髓瘤蛋白和重组IgG3嵌合抗体不能够结合FcγRI，很可能是因为与CH2结构域的可接近性降低所致。Shin et al.，Intern.Rev.Immunol.10：177，178-79(1993)。Ingmar et al.，“人IgG Fc受体，”Intern.Rev.Immunol.16：29-55(1997)及Ravetch和Bolland，“IgG Fc受体，”Annu.Rev.Immunol.19：275-90(2001)中对Fcγ-受体作了全面的综述。另参见Getahun et al.，J.Immunol.172：5269-5276(2004)。
FcγRI(CD64)在巨噬细胞和树突细胞上表达，在吞噬作用、呼吸爆发、细胞因子刺激和树突细胞内吞转运中起作用。FcγRI的表达由GM-CSF和γ-干扰素(γ-IFN)上调和由白细胞介素-4(IL-4)下调。当所有的激活性受体被剔除(knock out)时，小鼠免于发生免疫复合物介导的炎症。同样，当FCγRI被剔除时，小鼠受到一定的保护。
已鉴定出三种形式的FcγRII(CD32)，即FcγRIIa、FcγRIIb和FcγRIIc。FcγRIIa在多形核白细胞(PMN)、巨噬细胞、树状细胞和肥大细胞上表达。FcγRIIa在吞噬作用、呼吸爆发和细胞因子刺激中起作用。FcγRIIa的表达受GM-CSF和γ-IFN上调和被IL-4降低。当所有的激活性受体被剔除时，小鼠免于发生免疫复合物介导的炎症。FcγRIIa以高亲和力结合c-反应性蛋白(CRP)多晶型体H131，以低亲和力结合CRP多晶型体R131。多晶型现象在一般人群中的分布大约为50:50 R131，伴有对感染和狼疮肾炎的易感性增加。FcγIIb在B细胞、PMN、巨噬细胞和肥大细胞上表达。FcγIIb能抑制基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)所介导的应答；因此，这是一种抑制性受体。FcγRIIc的表达受静脉免疫球蛋白(IVIG)和IL-4上调和被γ-IFN降低。当滤泡树突细胞(FDC)剔除了CD32时，FcγRIIb剔除的小鼠显示出抗体应答和对自身免疫疾病的易感性增加，B细胞回忆应答(recallresponse)减少。FcγRIIc在NK细胞上表达，但对它的功能和表达调节知之甚少。
已鉴定出两种形式的FcγRIII(CD16)，即FcγRIIIa和FcγRIIIb。FcγRIIIa在自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、肥大细胞和血小板上表达。这个受体参与吞噬作用、呼吸爆发、细胞因子刺激、血小板聚集和脱粒以及NK介导的ADCC。FcγRIII的表达受C5a、TGFβ和γ-IFN上调，受IL-4下调。当所有的激活性受体被剔除时，小鼠免于发生免疫复合物介导的炎症。FcγRIIIa是多晶型体，其中F176最为常见，V-176较少见。F-176以较小的亲合力(avidity)结合IgG，与红斑狼疮有关。FcγRIIIb是PMN上表达的GPI连接受体。FcγRIIIb的遗传缺陷是存在的，但没有或普遍认可的表型。FcγIIIb NA1/NA2多晶型现象在同种免疫(isoimmune)嗜中性白细胞减少症中是重要的。
单克隆抗体技术和遗传工程方法已导致人类疾病诊断和治疗用的免疫球蛋白分子得到快速开发。蛋白质工程已被用来改进抗体对其关联抗原的亲和力，减少与所给予的重组多肽的免疫原性有关的问题和改变抗体效应子功能。免疫球蛋白结构域的结构适于进行重组工程改造，因为抗原结合结构域和赋予效应子功能的结构域可在免疫球蛋白各类别(例如IgG、IgA和IgE)和各亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4等)之间交换。
另外，已构建出更小的免疫球蛋白分子来克服与完全免疫球蛋白疗法有关的问题。例如，单链免疫球蛋白可变区片段多肽(scFv)包含通过短接头肽与免疫球蛋白轻链可变结构域连接的免疫球蛋白重链可变结构域。Huston et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：5879-83(1988)。由于scFv分子的尺寸小，它们显示出非常快速的从血浆和组织的清除，且与完整的免疫球蛋白相比能够更有效地渗入到组织中。参见，例如Jain，Cancer Res.50：814s-819s(1990)。抗肿瘤scFv与相应的嵌合抗体相比，显示出向肿瘤的渗入更快速，遍布肿瘤团(tumormass)的分布更均匀。Yokota et al.，Cancer Res.52：3402-08(1992)。将scFv与另一分子如毒素进行融合，是利用scFv的特异性抗原结合活性和小尺寸来将毒素递送到靶组织中。Chaudary et al.，Nature 339：394(1989)和Batra et al.，Mol.Cell.Biol.11：2200(1991)。
尽管scFv分子给血清疗法带来优点，这一治疗方法还存在几个缺点。虽然scFv的快速清除可降低在正常细胞中的毒性作用，但这种快速清除可能会阻碍最小有效剂量(minimum effective dose)向靶组织的递送。要制备出足够量的scFv来给予患者，这是一项挑战性工作，因为scFv表达和分离上的困难会对收率造成不利影响。在表达过程中，scFv分子缺乏稳定性，往往会因为不同分子的可变区的配对而发生聚集。此外，scFv分子在哺乳动物表达系统中的生产水平低下，这限制了有效制备治疗用scFv分子的潜在可能。Davis et al.，J.Biol.Chem.265：10410-18(1990)和Traunecker et al.，EMBO J.10：3655-59(1991)。已探索了改进生产的策略，包括向可变区加入糖基化位点。参见例如美国专利5,888,773和Jost et al.，J.Biol.Chem.269：26267-73(1994)。
使用scFV进行治疗的另一个缺点是缺乏效应子功能。缺乏细胞溶解功能、ADCC和补体依赖性细胞毒性(CDC)(这些通常与免疫球蛋白恒定区有关)的scFv，可能不能有效地治疗疾病。尽管scFv技术的发展几乎在二十年前就开始了，但目前还没有scFv产品被批准用于治疗。因此，将毒素与scFv缀合或融合已成为提供强效的抗原特异性分子的另选策略，但是用这种缀合物或嵌合体进行投药往往受到起源于这种制品的毒素部分的过量和/或非特异性毒性的限制。毒性作用可包括肝脏酶的超生理范围的升高和血管渗漏综合征以及其他不需要的作用。另外，免疫毒素本身在给予宿主后具有高度免疫原性，宿主所产生的抗免疫毒素抗体限制了它对个体反复进行医疗性治疗的潜在有用性。
免疫球蛋白恒定区相关效应子功能在疾病治疗中的好处促进了融合蛋白的开发，在所述融合蛋白当中存在免疫球蛋白恒定区多肽序列，而抗体可变区被非免疫球蛋白序列代替。例如，将CD4这种被HIV识别的T细胞表面蛋白与免疫球蛋白Fc效应结构域进行重组融合。参见Sensel et al.，Chem.Immunol.65：129-158(1997)。这种分子的生物活性部分上取决于所选择的恒定区的类别或亚类。例如，IL-2-IgG1融合蛋白能实现携带IL-2受体的细胞的补体介导裂解。参见同上文献。使用免疫球蛋白恒定区来构建这些和其他的融合蛋白，也可赋予改进的药代动力学特性。
对于这样的改进的免疫球蛋白衍生结合蛋白，本领域还存在着未得到满足的需求，在所述结合蛋白当中，铰链结构域和/或Fc结构域被修饰，以改变一种或多种效应子功能，如改变Fc受体结合亲和力和/或特异性(和相关的ADCC)、结合蛋白体内半寿期和/或补体固定。
发明概述
本发明通过提供诸如以下的结合蛋白来解决这些和其他相关的需求，这种结合蛋白包含一个或多个免疫球蛋白恒定区铰链、CH2和/或CH3结构域，其中该一个或多个铰链结构域和/或恒定区CH2结构域和/或CH3结构域被修饰，以改变一种或多种的结合蛋白Fc效应子功能。本文示例性举出的是这样的结合蛋白，其中免疫球蛋白铰链和/或Fc区被修饰，以实现对关联受体(例如Fc受体)的结合亲和力和/或特异性的改变，和/或赋予该Fc区一种或多种新的结合特异性，这些新的结合特异性是相应的未修饰结合蛋白所不具有的(例如对一种或多种与未修饰结合蛋白所特异性结合的关联受体不同的Fc受体的亲和力)。
根据本发明的结合蛋白包括例如经修饰的抗体、抗体片段、重组结合蛋白和分子工程改造的结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白，包括小模块免疫药物产品(SMIPTM产品)在内，在这些结合蛋白当中，免疫球蛋白铰链、CH2和/或CH3结构域中的一个或多个氨基酸序列被改变。在某些实施方案中，本文所公开的修饰结合蛋白在负责受体结合亲和力和/或特异性的铰链、CH2和/或CH3结构域中包含一个或多个氨基酸序列的变化。
在一个方面，本发明提供结合蛋白，特别是包含一个或多个免疫球蛋白重链铰链、CH2和/或CH3结构域的结合蛋白，其中该结合蛋白被修饰，使得它能以改变了的(即增加了的或降低了的)结合亲和力和/或特异性结合一种或多种免疫球蛋白特异性Fc受体。
本文示例性举出的是包含一个或多个IgG免疫球蛋白重链铰链、CH2和/或CH3结构域的结合蛋白，其中该结合蛋白被修饰，使得它能以改变了的(即增加了的或降低了的)结合亲和力和/或特异性结合一种或多种以下IgG免疫球蛋白特异性Fc受体：FcγRI(CD64)；FcγRII(CD32)，包括FcγRIIa、FcγRIIb和FcγRIIc在内；和/或FcγRIII(CD16)，包括FcγRIIIa和FcγRIIIb在内。这一类型的结合蛋白包括例如这样的结合蛋白，其中负责Fcγ-受体结合的区域、结构域、转角和/或环结构中的一级氨基酸序列有一个或多个氨基酸插入和/或缺失。这种变化包括但不限于在这样的氨基酸片段(amino acids)中间和/或近邻插入和/或缺失一个或多个氨基酸，该氨基酸片段(amino acids)当结合关联Fc受体时，会与一个或多个免疫球蛋白特异性Fc受体当中的氨基酸发生直接接触，所述免疫球蛋白特异性Fc受体包括FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和/或FcγRIII(CD16)。
本发明这些方面的具体实施方案包括这样的结合蛋白，其包含一个或多个IgG CH2结构域，其中该CH2结构域是IgG1和/或IgG3CH2结构域。一些这类实施方案提供了这样的结合蛋白，其在IgG1和/或IgG3CH2结构域的铰链近侧环结构L-L-G-G-P当中包含一个或多个氨基酸缺失和/或氨基酸插入。本文具体示例性举出的是这样的结合蛋白，其在以下铰链近侧环结构当中“*”所示的位置处包含单个氨基酸的单一插入。因此，本文提供包含经修饰的铰链近侧环结构L-L-*-G-G-P、L-L-G-*-G-P和L-L-G-G-*-P的结合蛋白。本文还提供这样的结合蛋白，其在铰链近侧环结构L-L-*-G-G-P、L-L-G-*-G-P和L-L-G-G-*-P当中“*”所示的位置处包含两个或多个氨基酸的单一插入。因此，在这些实施方案当中，“*”表示插入至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。通常，适用于产生具有这种经修饰的铰链近侧环结构的结合蛋白的氨基酸选自Ala、Gly、Ile、Leu和Val。
其他这类实施方案提供这样的结合蛋白，其包含一个或多个IgGCH2结构域，其中该CH2结构域是IgG1、IgG2和/或IgG3CH2结构域。一些这类实施方案提供了这样的结合蛋白，其在IgG1、IgG2和/或IgG3 CH2结构域的BC环结构D-V-S-H-E当中包含一个或多个氨基酸缺失和/或氨基酸插入。本文具体示例性举出的是这样的结合蛋白，其在以下BC环结构当中“*”所示的位置处包含单个氨基酸的单一插入。因此，本文提供包含经修饰的BC环结构D-V-*-S-H-E和D-V-S-*-H-E的结合蛋白。本文还提供这样的结合蛋白，其在BC环结构D-V-*-S-H-E和D-V-S-*-H-E当中“*”所示的位置处包含两个或多个氨基酸的单一插入。因此，在这些实施方案当中，“*”表示插入至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。通常，适用于产生具有这种经修饰的BC环结构的结合蛋白的氨基酸选自Ala、Gly、Ile、Leu和Val。
另外其他这类实施方案提供这样的结合蛋白，其包含一个或多个IgG CH2结构域，其中该CH2结构域是IgG1和/或IgG3CH2结构域。一些这类实施方案提供了这样的结合蛋白，其在CH2结构域的FG环结构A-L-P-A-P-I当中包含一个或多个氨基酸缺失和/或氨基酸插入。本文具体示例性举出的是这样的结合蛋白，其在以下FG环结构当中“*”所示的位置处包含单个氨基酸的单一插入。因此，本文提供包含经修饰的FG环结构A-L-*-P-A-P-I、A-L-P-*-A-P-I和A-L-P-A-*-P-I的结合蛋白。本文还提供这样的结合蛋白，其在FG环结构A-L-*-P-A-P-I、A-L-P-*-A-P-I和A-L-P-A-*-P-I当中“*”所示的位置处包含两个或多个氨基酸的单一插入。因此，在这些实施方案当中，“*”表示插入至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。通常，适用于产生具有这种经修饰的FG环结构的结合蛋白的氨基酸选自Ala、Gly、Ile、Leu和Val。
在另一个方面，本发明提供结合蛋白，特别是包含一个或多个重链铰链、CH2和/或CH3结构域的结合蛋白，其中该结合蛋白在该一个或多个重链铰链、CH2和/或CH3结构域当中包含一个或多个修饰，其中该修饰包括插入一个或多个N-连接糖基化序列和/或一个或多个O-连接糖基化序列，该糖基化序列足以实现在插入位置处的N-连接和/或O-连接糖基化，从而改变(即提高或降低)结合蛋白与一个或多个免疫球蛋白特异性Fc受体的结合亲和力和/或特异性。这类结合蛋白包括例如在一级氨基酸序列中这样的位置处包含变化的结合蛋白，该位置处在负责未修饰结合蛋白的糖基化的区域、结构域和/或环结构的近侧和/或远侧。
本文示例性举出的是这样的结合蛋白，其包含一个或多个IgG重链铰链、CH2和/或CH3结构域，其中该结合蛋白在该一个或多个IgG重链铰链、CH2和/或CH3结构域当中包含一个或多个修饰，其中该修饰包括插入一个或多个N-连接糖基化序列和/或一个或多个O-连接糖基化序列，该糖基化序列足以实现在插入位置处的N-连接和/或O-连接糖基化，从而改变(即提高或降低)结合蛋白与一种或多种以下IgG免疫球蛋白特异性受体的结合亲和力和/或特异性：FcγRI(CD64)；FcγRII(CD32)，包括FcγRIIa、FcγRIIb和FcγRIIc在内；和/或FcγRIII(CD16)，包括FcγRIIIa和FcγRIIIb在内，所述改变是相比于包含一个或多个未修饰的IgG重链铰链、CH2和/或CH3结构域的相应结合蛋白而言。
本发明这些方面的具体实施方案包括这样的结合蛋白，其包含一个或多个IgG铰链结构域、一个或多个IgG CH2结构域和/或一个或多个IgG CH3结构域，其中该铰链、CH2和/或CH3结构域是IgG1铰链、CH2和/或CH3结构域，IgG2铰链、CH2和/或CH3结构域，IgG3铰链、CH2和/或CH3结构域和/或IgG4铰链、CH2和/或CH3结构域。一些这类实施方案提供了包含这样的插入的结合蛋白，该插入是在相应的天然IgG免疫球蛋白铰链、CH2和/或CH3结构域中的N-连接和/或O-连接糖基化位点的近侧(proximal)和/或远侧(distal)，插入一个或多个N-连接糖基化序列N-X-(S/T)(其中X为任何氨基酸)和/或一个或多个O-连接糖基化序列X-P-X-X(其中至少一个X为T)、T-X-X-X(其中至少一个X为T)、X-X-T-X(其中至少一个X为R或K)和/或S-X-X-X(其中至少一个X为S))。在这些实施方案的某些方面当中，结合蛋白显示出改变了的(即提高了的或降低了的)FcγR结合亲和力和/或特异性。
本文示例性举出的是这样的实施方案，其中结合蛋白包含一个或多个IgG铰链结构域、一个或多个IgG CH2结构域和/或一个或多个IgG CH3结构域，且其中结合蛋白还包含一个或多个N-连接糖基化序列N-X-(S/T)(其中X为任何氨基酸)的插入。例如，本发明提供包含这样的插入的结合蛋白，该插入是在接近一个或多个IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4 CH2结构域的DE环当中的天然N-S-T序列处，插入一个或多个N-X-(S/T)序列。在这些实施方案的某些方面当中，结合蛋白显示出改变了的(即提高了的或降低了的)FcγR结合亲和力和/或特异性。
在具体的这类实施方案当中，一个或多个IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4 CH2结构域的DE环当中的N-连接糖基化序列包含氨基酸序列N-S-T，并被插入到距天然N-S-T序列的氨基末端和/或羧基末端0-100个氨基酸的近邻(adjacent)或当中，使得天然氨基酸序列X-N-S-T-Z被修饰成(AAa)-N-S-T-(AAb)-N-S-T-(AAc)，其中AAa、AAb和AAc每一个独立地从1-100个氨基酸指定。在具体的这类实施方案当中，一个或多个IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4CH2结构域的DE环当中的N-连接糖基化序列包含氨基酸序列N-S-T，并被插入到天然N-S-T序列的近邻，使得天然氨基酸序列X-N-S-T-Z被修饰成X-N-S-T-Z-N-S-T-Z，其中X和Z独立选自Tyr(Y)和Phe(F)。
在另选的这类实施方案当中，插入在一个或多个IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4 CH3结构域的BC环当中的N-连接糖基化序列包含氨基酸序列N-S-T，并被插入到天然N-S-T序列的远侧，使得天然氨基酸序列Y-P-S-D-I-A被修饰成Y-P-N-S-T-D-I-A和Y-N-S-T-P-S-D-I-A。
在还进一步的方面，本发明提供结合蛋白，特别是包含第一免疫球蛋白类别(即IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)的一个或多个重链铰链、CH2和/或CH3结构域的结合蛋白，其中该结合蛋白在第一免疫球蛋白类别的一个或多个重链铰链、CH2和/或CH3结构域的一级氨基酸序列中被修饰(即氨基酸替代(replacement)和/或氨基酸插入)，以产生能够结合与第一免疫球蛋白类别不同的第二免疫球蛋白类别的一个或多个关联Fc受体的结合蛋白。这种变化包括例如用第二免疫球蛋白结构域的一个或多个环或其氨基酸和/或肽部分来替代和/或重塑(remodeling)第一免疫球蛋白结构域的一个或多个环或其氨基酸和/或肽部分，其中第二免疫球蛋白结构域包含一个或多个这样的氨基酸，这些氨基酸能形成第二免疫球蛋白特异性Fc受体的结合序列的至少一部分。根据本发明这些方面的结合蛋白除了能够特异性结合FcγRI、FcγRII和/或FcγRIII外，还能够特异性结合FcαR。
本文示例性举出的是包含一个或多个IgG重链铰链、CH2和/或CH3结构域的结合蛋白，其中该结合蛋白被修饰成能结合一个或多个非IgG免疫球蛋白特异性Fc受体，包括但不限于IgA免疫球蛋白特异性受体FcαR(CD89)。这类结合蛋白包括例如这样的结合蛋白，其在一个或多个IgG重链铰链、CH2和/或CH3结构域的一级氨基酸序列中包含变化(即氨基酸替代和/或氨基酸插入)，以产生能够结合非IgG免疫球蛋白特异性Fc受体如结合Fcα受体的氨基酸序列。
在某些这类实施方案当中提供的是包含一个或多个IgG重链铰链、CH2和/或CH3结构域的结合蛋白，其中该结合蛋白被修饰成能结合IgA免疫球蛋白特异性受体FcαR(CD89)。这类示例性结合蛋白在IgG CH3 FG环当中包含一个或多个氨基酸置换(substitution)和/或在IgG CH3 CD环当中包含一个或多个氨基酸置换。例如，一种这类示例性结合蛋白包含这样的替代，该替代是用包含氨基酸序列C-M-V-G-H-E-A-L-P-L-A-F-T-Q的IgA CH3 FG环或其相应部分替代包含氨基酸序列C-S-V-M-H-E-A-L-H-N-H-Y-T-Q的IgG CH3 FG环或其相应部分。
另一种示例性结合蛋白包含这样的替代，该替代是用包含氨基酸序列Q-E-L-P-R-E的IgA CH3 CD环或其部分替代包含氨基酸序列Q-P-E-N的IgG CH3 CD环或其部分。又一种这类示例性结合蛋白包含这样的替代，该替代是用包含氨基酸序列C-M-V-G-H-E-A-L-P-L-A-F-T-Q的IgA CH3 FG环或其相应部分替代包含氨基酸序列C-S-V-M-H-E-A-L-H-N-H-Y-T-Q的IgG CH3 FG环或其部分，和用包含氨基酸序列Q-E-L-P-R-E的IgA CH3 CD环或其部分替代包含氨基酸序列Q-P-E-N的IgG CH3 CD环或其部分。
任何上述结合蛋白实施方案可进一步包含这样的置换，该置换是用氨基酸Leu置换IgG重链CH3氨基酸Met(在序列K-D-T-L-M-I-S-R-T当中CH3氨基酸位置28)，使得该结合蛋白进一步包含氨基酸序列K-D-T-L-L-I-S-R-T。或者或另外，任何上述结合蛋白实施方案可进一步包含这样的置换，该置换是用氨基酸Arg置换IgG重链CH3氨基酸Glu(在序列D-I-A-V-E-W-E-S-N当中CH3氨基酸位置157)，使得该结合蛋白进一步包含氨基酸序列D-I-A-V-R-W-E-S-N。
本发明的这些和其他方面在参阅以下详细说明和附图后将变得显而易见。本文无论在上文或下文中引用到的所有出版物、专利和专利申请，都通过引用整体结合到本文中。
附图和序列标识符的简述
图1显示IgG结构域与IgA CH2结构域的比对。
图2显示野生型IgG CH2-CH3区域与这个区域的三个示例性修饰的比对，所述修饰适合于产生根据本发明的结合蛋白。
图3显示IgA1、IgA2、IgM、IgG2、IgG2、IgG2、IgG2和IgE的CH2和CH2区域与相应的免疫球蛋白环的比对。(见Herr et al.，Nature 423：614-620(2003))。
SEQ ID NO：1是人IgA1铰链区的氨基酸序列(VPSTPPTPSPSTPPTPSPS)。
SEQ ID NO：2是人IgA1 CH2区的氨基酸序列(CCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGVTFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAEPWNHGKTFTCTAAYPESKTPLTATLSKS)。
SEQ ID NO：3是人IgA1 CH3区的氨基酸序列(GNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY)。
SEQ ID NO：4是人IgA2铰链区的氨基酸序列(VPPPPP)。
SEQ ID NO：5是人IgA2CH2区的氨基酸序列(CCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTANITKS)。
SEQ ID NO：6是人IgA2 CH3区的氨基酸序列(GNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY)。
SEQ ID NO：7是人IgD铰链区的氨基酸序列(ESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTP)。
SEQ ID NO：8是人IgD CH2区的氨基酸序列(ECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREP)。
SEQ ID NO：9是人IgD CH3区的氨基酸序列(AAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPRSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDHGPMK)。
SEQ ID NO：10是人IgE CH2区的氨基酸序列(VCSRDFTPPTVKILQSSCDGGGHFPPTIQLLCLVSGYTPGTINITWLEDGQVMDVDLSTASTTQEGELASTQSELTLSQKHWLSDRTYTCQVTYQGHTFEDSTKKCA)。
SEQ ID NO：11是人IgE CH3区的氨基酸序列(DSNPRGVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITCLVVDLAPSKGTVNLTWSRASGKPVNHSTRKEEKQRNGTLTVTSTLPVGTRDWIEGETYQCRVTHPHLPRALMRSTTKTS)。
SEQ ID NO：12是人IgE CH4区的氨基酸序列(GPRAAPEVYAFATPEWPGSRDKRTLACLIQNFMPEDISVQWLHNEVQLPDARHSTTQPRKTKGSGFFVFSRLEVTRAEWEQKDEFICRAVHEAASPSQTVQRAVSVNPGK)。
SEQ ID NO：13是人IgG1铰链区的氨基酸序列(EPKSCDKTHTCPPCP)。
SEQ ID NO：14是人IgG1 CH2区的氨基酸序列(APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK)。
SEQ ID NO：15是人IgG1 CH3区的氨基酸序列(GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK)。
SEQ ID NO：16是人IgG2铰链区的氨基酸序列(ERKCCVECPPCP)。
SEQ ID NO：17是人IgG2 CH2区的氨基酸序列(APPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTK)。
SEQ ID NO：18是人IgG2 CH3区的氨基酸序列(GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK)。
SEQ ID NO：19是人IgG3铰链区的氨基酸序列(ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCP)。
SEQ ID NO：20是人IgG3 CH2区的氨基酸序列(APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTK)。
SEQ ID NO：21是人IgG3 CH3区的氨基酸序列(GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK)。
SEQ ID NO：22是人IgG4铰链区的氨基酸序列(ESKYGPPCPSCP)。
SEQ ID NO：23是人IgG4 CH2区的氨基酸序列(APEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAK)。
SEQ ID NO：24是人IgG4 CH3区的氨基酸序列(GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK)。
SEQ ID NO：25是人IgM CH2区的氨基酸序列(VIAELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLGQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVP)。
SEQ ID NO：26是人IgM CH3区的氨基酸序列(DQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPK)。
SEQ ID NO：27是人IgM CH4区的氨基酸序列(GVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCVVAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVMSDTAGTCY)。
SEQ ID NO：28是本文称为Bci-I Forward的寡核苷酸引物的核苷酸序列(ttc ttc tga tca gga gcc caa at)。
SEQ ID NO：29是本文称为Sac-II Reverse的寡核苷酸引物的核苷酸序列(GCT CCT CCC GCG GCT TTG TCT TGG)。
SEQ ID NO：30是本文称为Lib1A_F1的寡核苷酸引物的核苷酸序列(ttc ttc tga tca gga gcc caa atc ttc tga caa aac tca cac atc tcc acc gtg cccag)。
SEQ ID NO：31是本文称为Lib1A_F2的寡核苷酸引物的核苷酸序列(ggg acc gtc agt ctt cct ctt ccc ccc aaa acc caa gga cac cct cat gat ctc ccgga)。
SEQ ID NO：32是本文称为Lib1A_F3的寡核苷酸引物的核苷酸序列(tgt ggt gga cgt gag cca cga aga ccc tga ggt caa gtt caa ctg gta cgt ggacgg cg)。
SEQ ID NO：33是本文称为Lib1A_R1的寡核苷酸引物的核苷酸序列(AGA GGA AGA CTG ACG GTC CAC CNW NCA AGA GTTCAG GTG CTG GGC ACG GTG GAG ATG TGT)。
SEQ ID NO：34是本文称为Lib1A_R2的寡核苷酸引物的核苷酸序列(CGT GGC TCA CGT CCA CCA CCA CGC ATG TGA CCT CAGGGG TCC GGG AGA TCA TGA GGG TGT)。
SEQ ID NO：35是本文称为Lib1A_R3的寡核苷酸引物的核苷酸序列(GCT CCT CCC GCG GCT TTG TCT TGG CAT TAT GCA CCTCCA CGC CGT CCA CGT ACC AGT TGA)。
SEQ ID NO：36是本文称为Lib1B_F2的寡核苷酸引物的核苷酸序列(wgg acc gtc agt ctt cct ctt ccc ccc aaa acc caa gga cac cct cat gat ctcccg ga)。
SEQ ID NO：37是本文称为Lib1B_R1的寡核苷酸引物的核苷酸序列(AGA GGA AGA CTG ACG GTC CNW NAC CCA AGA GTTCAG GTG CTG GGC ACG GTG GAG ATG TGT)。
SEQ ID NO：38是本文称为Lib1C_F2的寡核苷酸引物的核苷酸序列(gnw ncc gtc agt ctt cct ctt ccc ccc aaa acc caa gga cac cct cat gat ctcccg ga)。
SEQ ID NO：39是本文称为Lib1C_R1的寡核苷酸引物的核苷酸序列(AGA GGA AGA CTG ACG GNW NTC CAC CCA AGA GTTCAG GTG CTG GGC ACG GTG GAG ATG TGT)。
SEQ ID NO：40是本文称为Lib2A_F2的寡核苷酸引物的核苷酸序列(gcc gtc agt ctt cct ctt ccc ccc aaa acc caa gga cac cct cat gat ctc ccg gaccc)。
SEQ ID NO：41是本文称为Lib2A_F3的寡核苷酸引物的核苷酸序列(tgt gga cgt gnw nag cca cga aga ccc tga ggt caa gtt caa ctg gta cgt ggacgg cg)。
SEQ ID NO：42是本文称为Lib2A_R1的寡核苷酸引物的核苷酸序列(GGA AGA GGA AGA CTG ACG GTC CAC CCA AGA GTTCAG GTG CTG GGC ACG GTG GAG ATG TGT)。
SEQ ID NO：43是本文称为Lib2A_R2的寡核苷酸引物的核苷酸序列(CGT GGC TNW NCA CGT CCA CCA CCA CGC ATG TGA CCTCAG GGG TCC GGG AGA TCA TGA GG)。
SEQ ID NO：44是本文称为Lib2B_F3的寡核苷酸引物的核苷酸序列(tgt gga cgt gag cnw nca cga aga ccc tga ggt caa gtt caa ctg gta cgt ggacgg cg)。
SEQ ID NO：45是本文称为Lib2B_R2的寡核苷酸引物的核苷酸序列(CGT GNW NGC TCA CGT CCA CCA CCA CGC ATG TGA CCTCAG GGG TCC GGG AGA TCA TGA GGG)。
SEQ ID NO：46是本文称为lib3A-F的寡核苷酸引物的核苷酸序列(gtc tcc aac aaa gcc nwn ctc cca gcc ccc atc)。
SEQ ID NO：47是本文称为lib3A-R的寡核苷酸引物的核苷酸序列(GAT GGG GGC TGG GAG NWN GGC TTT GTT GGA GAC)。
SEQ ID NO：48是本文称为Lib3B-F的寡核苷酸引物的核苷酸序列(ccc aac aaa gcc ctc nwn cca gcc ccc atc gag)。
SEQ ID NO：49是本文称为Lib3B-R的寡核苷酸引物的核苷酸序列(CTC GAT GGG GGC TGG NWN GAG GGC TTT GTT GGA G)。
SEQ ID NO：50是本文称为Lib3C-F的寡核苷酸引物的核苷酸序列(cac aaa gcc ctc cca nwn gcc ccc atc gag aaa ac)。
SEQ ID NO：51是本文称为Lib3C-R的寡核苷酸引物的核苷酸序列(GTT TTC TCG ATG GGG GCN WNT GGG AGG GCT TTG TTG)。
SEQ ID NO：52是本文称为F1_ver1的寡核苷酸引物的核苷酸序列(cag aac cac agg tgt aca ccc tgc ccc cat ccc ggg atg agc tga cca aga accagg)。
SEQ ID NO：53是本文称为F2_ver1的寡核苷酸引物的核苷酸序列(agc ttc tat cca agc gac atc gcc gtg cgt tgg gag agc aat ggg cag gag ctgccg)。
SEQ ID NO：54是本文称为F3_ver1的寡核苷酸引物的核苷酸序列(ccc cgt gct gga ctc cga cgg ctc ctt ctt cct cta cag caa gct cac cgt ggacaa)。
SEQ ID NO：55是本文称为F4-_ver1的寡核苷酸引物的核苷酸序列(gct tct cct gca tgg tga tgc atg agg ctc tgc cac tcg cct tca cgc aga agagcc)。
SEQ ID NO：56是本文称为R1_ver1的寡核苷酸引物的核苷酸序列(tgc ttg gat aga agc ctt tga cca ggc agg tca ggc tga cct ggt tct tgg tcagct)。
SEQ ID NO：57是本文称为R2_ver1的寡核苷酸引物的核苷酸序列(cga gtc cag cac ggg agg cgt ggt ctt gta gtt gtt ctc cgg cag ctc ctg cccatt)。
SEQ ID NO：58是本文称为R3_ver1的寡核苷酸引物的核苷酸序列(ccc atg cag gag aag acg ttc ccc tgc tgc cac ctg ctc ttg tcc acg gtg agcttg)。
SEQ ID NO：59是本文称为R4_ver1的寡核苷酸引物的核苷酸序列(cgc tat aat cta gat cat tta ccc gga gac agg gag agg ctc ttc tgc gtg aag g)。
SEQ ID NO：60是本文称为short-F的寡核苷酸引物的核苷酸序列(cag aac cac agg tgt aca ccc tgc cc)。
SEQ ID NO：61是本文称为short-R的寡核苷酸引物的核苷酸序列(cct ata atc tag atc att tac c)。
SEQ ID NO：62是本文称为F4_ver2的寡核苷酸引物的核苷酸序列(gtc ttc tcc tgc atg gtg ggc cac gag gcc ctg ccg ctg gcc ttc aca cag aagacc a)。
SEQ ID NO：63是本文称为R4_ver2的寡核苷酸引物的核苷酸序列(cgc tat aat cta gat cat tta ccc gcc aag cgg tcg atg gtc ttc tgt gtg aag g)。
SEQ ID NO：64是本文称为F2_ver3的寡核苷酸引物的核苷酸序列(agg ctt cta tcc aag cga cat cgc cgt tcg ctg gct gca ggg gtc aca gga gctgcc c)。
SEQ ID NO：65是本文称为R2_ver3的寡核苷酸引物的核苷酸序列(cga gtc cag cac ggg agg cgt ggt ctt gta ctt ctc gcg ggg cag ctc ctg tgaccc)。
发明详述
如上所述，本发明提供包含一个或多个免疫球蛋白恒定区铰链、CH2和/或CH3结构域的结合蛋白，其中该一个或多个铰链区和/或恒定区CH2结构域和/或CH3结构域被修饰，以改变该结合蛋白的一个或多个Fc效应子功能。本文示例性举出的是这样的结合蛋白，其中免疫球蛋白铰链Fc区被修饰，以实现对关联受体(例如Fc受体)的结合亲和力和/或特异性的改变，和/或赋予该Fc区一种或多种新的结合特异性，这些新的结合特异性是相应的未修饰结合蛋白所不具有的(例如对一种或多种与未修饰结合蛋白所特异性结合的关联受体不同的Fc受体的亲和力)。
具体的说，本文公开的经修饰结合蛋白包括以下：
(1)包含这样的插入的结合蛋白，该插入是在免疫球蛋白铰链、CH2和/或CH3结构域当中插入一个或多个氨基酸，其中该免疫球蛋白显示出改变了的(即提高了的或降低了的)对一种或多种以下受体的结合亲和力和/或特异性：FcγRI(CD64)；FcγRII(CD32)，包括FcγRIIa、FcγRIIb和FcγRIIc在内；和/或FcγRIII(CD16)，包括FcγRIIIa和FcγRIIIb在内；
(2)包含这样的插入的结合蛋白，该插入是在相应的天然免疫球蛋白Fc区中的N-连接和/或O-连接糖基化位点的近侧和/或远侧，插入一个或多个N-连接和/或O-连接糖基化序列(例如一个或多个N-连接N-X-(S/T)糖基化序列和/或一个或多个O-连接X-P-X-X(其中至少一个X为T)、T-X-X-X(其中至少一个X为T)、X-X-T-X(其中至少一个X为R或K)和S-X-X-X(其中至少一个X为S))，其中该结合蛋白显示出改变了的(即提高了的或降低了的)FcγR结合亲和力和/或特异性；和
(3)包含这样的插入和/或替代的结合蛋白，该插入和/或替代是在IgG免疫球蛋白CH2区和/或CH3区当中插入和/或替代一个或多个氨基酸，其中该氨基酸插入和/或替代包含一个或多个对应于IgA免疫球蛋白CH2区和/或CH3区的氨基酸，其中IgA免疫球蛋白CH2区和/或CH3区的该一个或多个氨基酸参与IgA免疫球蛋白与其关联Fcα受体的特异性结合，且其中该经修饰的结合蛋白能够特异性结合FcαR。
本发明这些实施方案的每一个在下文中都有更详细的描述。
本发明的实施要采用到落入技术人员技能范围内的免疫学、分子生物学和蛋白质化学常规方法，除非另有指明。许多这些方法出于说明的目的在下文中进行描述。这些技术在文献中有充分的阐述。参见例如Sambrook，et al.，“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”(2ndEdition，1989)；“DNA Cloning：A Practical Approach，vol.I & II”(D.Glover，ed.)；“Oligonucleotide Synthesis”(N.Gait，ed.，1984)；“NucleicAcid Hybridization”(B.Hames和S.Higgins，eds.，1985)；Perbal，“APractical Guide to Molecular Cloning”(1984)；Ausubel et al.，“CurrentProtocols in Molecular Biology”(New York，John Wiley and Sons，1987)；Bonifacino et al.，“Current Protocols in Cell Biology”(New York，John Wiley & Sons，1999)；Coligan et al.，“Current Protocols inImmunology”(New York，John Wiley & Sons，1999)；Harlow和LaneAntibodies：a Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory(1988)；以及Lo，Ed.，“Antibody Engineering：Methods and Protocols，”Part 1(Humana Press，Totowa，New Jersey，2004)。产生两类突变的技术是本领域公知的。例如，特异性突变可使用如Sambrook et al.，“Protocols inMolecular Biology，”(出处同上)中所述的位点特异性诱变来引入。特定区域中的随机突变可使用例如Gulick和Fahl，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92：8140-8144(1995)中所述的强制进化来引入。
定义
本文所用的术语“结合蛋白”是指包含一个或多个免疫球蛋白重链铰链、CH2和/或CH3结构域的蛋白质。“结合蛋白”包括且最优选是免疫球蛋白如抗体或其生物或功能等同物，包括它们的部分、片段、前体形式、衍生物、变体和遗传工程改造形式，包括用化学物质和/或放射性同位素等进行标记。“结合蛋白”包括但不限于“免疫球蛋白”、“抗体”、“单克隆抗体”、“嵌合抗体”、“人源化抗体”和“小模块免疫药物产品(即SMIPTM产品)，其中免疫球蛋白铰链、CH2和/或CH3结构域中的一个或多个氨基酸序列被改变。在某些实施方案当中，本文所公开的经修饰结合蛋白在负责受体结合亲和力和/或特异性的铰链、CH2和/或CH3结构域中包含一个或多个氨基酸序列的改变。
术语“免疫球蛋白”和“抗体”广义地包括所有类别和亚类的抗体，包括IgM、IgD、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgA1和IgA2在内。术语“抗体”包括本文所用的“单克隆抗体”，是指从基本上均匀的抗体的群体获得的抗体，所述基本上均匀的抗体即是指，构成该群体的各单个抗体除了基本上不会影响抗体结合特异性、亲和力和/或活性的自然突变之外是相同的。“单克隆抗体“包括但不限于非人单克隆抗体、嵌合单克隆抗体、人源化单克隆抗体和完全人单克隆抗体以及它们的生物或抗原结合片段和/或部分。
本文所用的术语“嵌合抗体”是指包含这样的重链和轻链的单克隆抗体分子，在重链和轻链中非人抗体可变结构域与人恒定结构域发生可操作地融合(operably fused)。嵌合抗体与亲本的完全非人单克隆抗体相比显示出减低的免疫原性。
本文所用的术语“人源化抗体”是指这样的单克隆抗体，其包含一个或多个非人互补决定区(CDR)、人可变结构域构架区(FR)和人重链恒定结构域(如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4重链恒定结构域)和人轻链恒定结构域(如IgLambda和IgKappa轻链恒定结构域)。本文所用的术语“人源化抗体”意指包括这样的人单克隆抗体(受方抗体(recipientantibody))，其中受方的互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(如小鼠、大鼠或兔等的供方抗体(donor antibody))的具有所需特异性、亲和力和容量(capacity)的CDR的残基所替代。在一些情况中，人抗体的可变结构域构架残基被相应的非人残基所替代。人源化抗体还可包含既不存在于受方抗体也不存在于所输入的CDR序列或构架序列的残基。使非人抗体人源化的方法是本领域公知的。通常，人源化抗体具有一个或多个从非人来源引入到其中的氨基酸残基。人源化可以这样来实现：将CDRs嫁接到人支撑性(supporting)FR中，然后与适当的人抗体恒定结构域融合。参见Jones et al.，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature 332：323-327(1988)；和Verhoeyen et al.，Science 239：1534-1536(1988)。
本文所用的术语“完全人抗体”是指除了包含人构架和恒定区外还包含人可变区的免疫球蛋白。这种抗体可用多种本领域公知的技术来产生。例如，噬菌体展示方法已有描述，按该方法，人抗体片段的重组文库被展示在噬菌体上。参见McCafferty et al.，Nature 348：552-554(1990)；Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.227：381(1991)；和Markset al.，J.Mol.Biol.222：581(1991)。
或者，“完全人抗体”还可在这样的转基因动物中制备，该转基因动物包含人免疫球蛋白抗体库(immunoglobulin repertoire)和用以实现基因重排和免疫球蛋白装配的机制(machinery)。使用杂交瘤技术，可生产和选择出具有所需特异性的抗原特异性完全人抗体。一种示例性的转基因动物系统是Green et al.，Nature基因tics 7：13-21(1994)所描述的
Figure A200780022215D0030145442QIETU
品系。该品系经遗传工程法引入了这样的酵母人工染色体(YACs)，它含有人重链基因座和kappa轻链基因座的分别245kb和190kb的种系构形片段(germline configurationfragment)，这些片段含有核心可变区序列和恒定区序列。含有人Ig的YACs在抗体的重排和表达方面与小鼠系统是相容的，能够置换不活化的小鼠Ig基因。更近一段时间，Mendez等人描述了将大约80％的人抗体库(antibody repertoire)作为人重链基因座和kappa轻链基因座的兆碱基种系构形YAC片段来引入。Nature基因tics 15：146-156(1997)。适合于产生根据本发明的完全人抗体的转基因动物系统，还在以下专利和文章中有描述：美国专利6,150,584；5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016以及Jakobavits，Adv DrugDeliv Rev.31：33-42(1998)；Marks et al.，Bio/Technology 10：779-783(1992)；Lonberg et al.，Nature 368：856-859(1994)；Morrison，Nature368：812-13(1994)；Fishwild et al.，Nature Biotechnology 14：845-51(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology 14：826(1996)；和Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.13：65-93(1995)。
其他人在另选的产生完全人抗体的方法中采用了“小基因座(miniloci)”，籍此通过并入Ig基因座的各个基因片段来模拟外源Ig基因座。因此，将一个或多个VH基因、一个或多个DH基因、一个或多个JH基因、mu恒定区和第二恒定区(通常是gamma恒定区)形成为构建物以供插入到动物中。这个方法在以下专利和文章中有描述：Surani等人的美国专利5,545,807(Medical Research Council)及Lonberg和Kay的美国专利5,545,806和5,625,825(GenPharm International，Inc.)以及Taylor et al.，International Immunology 6：579-591(1994)；Chen etal.，International Immunology 5：647-656(1993)；Tuaillon et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：3720-3724(1993)；Tuaillon et al.，J.Immunol.154：6453-6465(1995)；Choi et al.Nature Genetics 4：117-123(1993)；Lonberg et al.，Nature 368：856-859(1994)；和Taylor et al.，NucleicAcids Res.20：6287-6295(1992)。
人抗体能避免某些与具有小鼠或大鼠可变区和/或恒定区的抗体有关的问题。这种小鼠或大鼠衍生的序列的存在会导致抗体被快速清除，或者会导致患者产生对该抗体的免疫反应。因此，完全人抗体的使用在慢性和复发性人类疾病的治疗方面可提供极大的优点，所述人类疾病例如炎症，自身免疫性和癌症，需要反复给予抗体来治疗。
本文所用的术语“小模块免疫药物产品”(SMIPTM产品)是指具有比单克隆抗体和重组抗体增强的药物特性的高度模块化化合物类别。SMIP产品包含这样的单一多肽链，其包括基于例如抗体可变结构域的靶标特异性结合结构域和与之组合的可变FC区，该可变FC区使得可以特异性募集所需类别的效应细胞(例如巨噬细胞和自然杀伤(NK)细胞)和/或募集补体介导的杀灭作用。取决于所选的靶标和铰链区，SMIP产品能通过细胞表面受体进行信号转导或阻断信号转导。本文所用的称为“小模块免疫药物产品”或“SMIPTM产品”的基因工程化融合蛋白，是如共同拥有的美国专利公开说明书2003/133939、2003/0118592和2005/0136049及共同拥有的国际专利公开说明书WO02/056910、WO2005/037989和WO2005/017148中所描述，每个这些专利公开说明书通过引用结合到本文中。
根据本发明的结合蛋白被修饰以改变它们的效应子功能，使得它们能以提高了的或降低了的亲和力和/或特异性结合(a)一种或多种关联Fc受体和/或(b)一种或多种非关联Fc受体。结合蛋白如果以可检测的水平(在例如ELISA测定当中)与靶关联受体发生反应，但在类似的条件下与无关的多肽不发生可检测的反应，则它就能够“特异性结合”关联或非关联受体。在这个情形中所用的“特异性结合”通常是指抗体Fc区与抗体Fc区的特异性受体之间出现的那类非共价相互作用。
“特异性结合”相互作用的强度或亲和力可用相互作用的解离常数(Kd)来表示，其中Kd越小代表亲和力越大。结合特性可用本领域公知的方法进行定量。一种这样的方法需要测量靶标特异性结合蛋白/Fc受体复合物形成(即缔合)和解离的速度，其中这些速度取决于复合物各方的浓度、相互作用的亲和力，和取决于对缔合和解离这两个方向的速度有同等影响的几何参数。因此，通过对浓度及缔合和解离的实际速度进行计算，可确定“缔合速度常数”(Kon)和“解离速度常数”(Koff)。Koff/Kon比使得可以消除所有与亲和力不相关的参数，因此等于解离常数Kd。主要参见Davies et al.，Annual Rev.Biochem.59：439-473(1990)。本文所谓的“特异性结合”是指结合蛋白以至少10-6-10-9M、更通常至少10-7-10-9M的解离常数结合靶标Fc受体、蛋白质和/或其他分子。
在本说明书和所附权利要求书中用到的单数形式的名词包含复数指代含义，除非上下文清楚表明并非如此。
免疫球蛋白恒定区结构
本发明的结合蛋白包含来自一个或多个选自IgM、IgD、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgA1和IgA2的免疫球蛋白的一个或多个铰链、CH2和/或CH3结构域的可操作组合(in operable combination)。示例性的结合蛋白包含选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的IgG免疫球蛋白的一个或多个铰链、CH2和/或CH3结构域。如本文所详细公开，本发明的结合蛋白是由原本天然的免疫球蛋白铰链、CH2和/或CH3结构域插入、缺失和/或替代一个或多个氨基酸而在氨基酸序列上发生改变得来的。
免疫球蛋白铰链、CH2结构域和CH3结构域的氨基酸序列在下表1中给出，该表由International ImMunoGeneTics Information System(国际免疫遗传学信息系统，IMGT)所提供的序列改编而成，这些序列可公开获自例如http://imgt.cines.fr/，在本文中以SEQ ID NO 1-27给出。
表1
人免疫球蛋白的一级氨基酸序列
Fc区铰链和CH结构域
 
免疫球蛋白类别   重链结构域   SEQIDNO   氨基酸序列
IgA1 铰链 1 (V)PSTPPTPSPSTPPTPSPS
CH2 2 CCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGVTFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAEPWNHGKTFTCTAAYPESKTPLTATLSKS                   
CH3 3 (G)NTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAGKPTHVN VSVVMAEVDGTCY                           
IgA2 铰链 4 (V)PPPPP
CH2 5 CCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTANITKS                   
CH3 6 (G)NTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAGKPTHVN VSVVMAEVDGTCY                           
IgD 铰链 7 (E)SPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNT(G)RGGEEKKKEKEKEEQEERETKTP                  
CH2 8 (E)CPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREP          
CH3 9 (A)AQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPRSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVS(Y)VTDHGPMK                                       
IgE CH2 10 (V)CSRDFTPPTVKILQSSCDGGGHFPPTIQLLCLVSGYTPGTINITWLEDGQVMDVDLSTASTTQEGELASTQSELTLSQKHWLSDRTYTCQVTYQGHTFEDSTKKCA           
CH3 11 (D)SNPRGVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITCLVVDLAPSKGTVNLTWSRASGKPVNHSTRKEEKQRNGTLTVTSTLPVGTRDWIEGETYQCRVTHPHLPRALMRSTTKTS          
CH4 12 (G)PRAAPEVYAFATPEWPGSRDKRTLACLIQNFMPEDISVQWLHNEVQLPDARHSTTQPRKTKGSGFFVFSRLEVTRAEWEQKDEFICRAVHEAASPSQTVQRAVSVNPGK        
IgG1 铰链 13 (E)PKSCDKTHTCPPCP
CH2 14 (A)PELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK        
CH3 15 (G)QPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK           
IgG2 铰链 16 (E)RKCCVECPPCP
CH2 17 (A)PPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTK         
CH3 18 (G)QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK           
IgG3 铰链 19 (E)LKTPLGDTTHTCPRCP(E)PKSCDTPPPCPRCP(E)PKSCDTPPPCPRCP(E)PKSCDTPPPCPRCP          
CH2 20 (A)PELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH
 
EDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTK        
CH3 21 (G)QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK           
IgG4 铰链 22 (E)SKYGPPCPSCP
CH2 23 (A)PEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAK        
CH3 24 (G)QPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK           
IgM CH2 25 (V)IAELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLGQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVP      
CH3 26 (D)QDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPK            
CH4 27 (G)VALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCVVAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYN VSLVMSDTAGTCY                           
免疫球蛋白铰链区多肽天然出现在IgG、IgA和IgD类免疫球蛋白中。IgG1、IgG2、IgG3和IgG4之间的主要结构差异是铰链区的长度。在免疫球蛋白重链中，野生型免疫球蛋白铰链区多肽位于CH1区和CH2区之间，含有负责形成链内二硫键的半胱氨酸残基。
本领域公知，尽管各免疫球蛋白氨基酸序列存在着极大的总体差异，但免疫球蛋白一级结构却显示高度的序列保守性，特别是免疫球蛋白多肽链的一些部分，尤其是在半胱氨酸残基的出现方面，这些半胱氨酸残基凭借它们的巯基基团，提供与其他可利用的巯基基团形成二硫键的潜力。因此，在本发明的情形中，野生型免疫球蛋白铰链区多肽包括那些以一个或多个高度保守半胱氨酸残基为特色的多肽。野生型人IgG1铰链区多肽序列包含三个非相邻半胱氨酸残基，沿着铰链区序列从多肽N末端到C末端，分别称为野生型铰链区的第一半胱氨酸、野生型铰链区的第二半胱氨酸和野生型铰链区的第三半胱氨酸。
免疫球蛋白IgA、IgD和IgG的Fc区包含单一CH2结构域和单一CH3结构域，而IgE和IgM的Fc区包含单一CH2结构域、单一CH3结构域和单一CH4结构域。虽然四个亚类的IgG Fc区(即IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)之间的同一性百分数超过95％，但这些区域具有显著不同的FcγR结合特异性(参见下表2)。
表2
各IgG免疫球蛋白亚类之间的相对人Fcγ受体识别特异性
 
IgG1 IgG2 IgG3 IgG4
FcγRI +++ - +++ ++
FcγRII + - + -
FcγRIII + - + -
在某些实施方案当中，本发明的结合蛋白能够进行抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性和/或补体固定。本发明提供了这方面的出乎意料的优点，即尽管本文所述的结合蛋白对一种或多种关联和/或非关联受体结合亲和力和/或特异性有任何的改变，但它们仍保持介导ADCC和/或CDC和/或补体固定的能力。对编码抗体恒定区结构域的序列的操作，在Morrison和Oi的美国专利6,218,149中提到。
改变IgG基(IgG-based)免疫球蛋白Fcγ-受体结合亲和力和/或特异性的 氨基酸插入突变
在一个方面，本发明提供结合蛋白，特别是包含一个或多个免疫球蛋白重链铰链、CH2和/或CH3结构域的结合蛋白，其中该结合蛋白被修饰，使得它能以改变了的(即增加了的或降低了的)结合亲和力和/或特异性结合一种或多种免疫球蛋白特异性Fc受体。本文所提供的结合蛋白还包括其中恒定区中的一个或多个氨基酸序列插入了一个或多个氨基酸残基的那些结合蛋白。在一个方面，一个或多个氨基酸残基被插入到以下序列中：一个或多个直接接触受体的氨基酸序列、一个或多个处在直接接触受体的氨基酸序列的近邻的氨基酸序列、一个或多个处在直接接触受体的氨基酸序列的远侧的氨基酸序列，或者这些序列的各种组合。所插入的氨基酸残基可在免疫球蛋白三维结构中引入局部或全面的构象变化，这个变化会改变对关联受体的结合亲和力和/或特异性。
在某些实施方案当中，所插入的氨基酸残基包含这样的氨基酸序列，它与发生结合时直接接触关联受体的结合蛋白的铰链、CH2和/或CH3结构域中现有的氨基酸序列相同。在一个这种实施方案中，将一个或多个直接接触受体的氨基酸序列相对于“野生型”受体结合氨基酸序列的位置成串联放置(positioned in tandem)。在这个情形中所用的“野生型”是指将要引入变化的结合蛋白的氨基酸序列或者编码该结合蛋白的多核苷酸的核苷酸序列。
在另一个方面，结合蛋白包括一个或多个插入的与野生型受体结合序列相同的受体结合序列，该插入的受体结合序列是在这样的位点引入结合蛋白的恒定区，该位点处于野生型受体结合序列的远侧且在同一条链上，和/或该位点在结合蛋白中的野生型受体结合序列所不处在的链上，或者这两种位点。不管氨基酸插入的确切性质(precise nature)和序列如何，如Sambrook et al.，“Protocols in Molecular Biology，”(出处同上)所述，这类修饰是本领域公知和常规实施的。
本文示例性举出的是结合蛋白，特别是包含一个或多个IgG重链铰链、CH2和/或CH3结构域的结合蛋白，其中该结合蛋白被修饰，使得它能以改变了的(即增加了的或降低了的)结合亲和力和/或特异性结合一种或多种免疫球蛋白特异性Fc受体，所述受体包括但不限于IgG免疫球蛋白特异性Fc受体FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和/或FcγRIII(CD16)中的一种或多种。这种类型的结合蛋白包括例如这样的结合蛋白，其中有一个或多个氨基酸插入在结合蛋白的一级氨基酸序列当中，在铰链、CH2和/或CH3结构域当中，在负责Fcγ-受体结合的序列中。这种变化包括但不限于在这样的氨基酸片段中间和/或近邻插入一个或多个氨基酸，该氨基酸片段通过直接接触而促使结合蛋白与一个或多个免疫球蛋白特异性Fc受体发生缔合，所述免疫球蛋白特异性Fc受体包括FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和/或FcγRIII(CD16)。
本发明这些方面的具体实施方案包括包含一个或多个IgG CH2结构域的结合蛋白，其中该CH2结构域是IgG1和/或IgG3 CH2结构域。一些这类实施方案提供了这样的结合蛋白，其在IgG1和/或IgG3 CH2结构域的铰链近侧环结构L-L-G-G-P当中包含一个或多个氨基酸缺失和/或氨基酸插入。本文具体示例性举出的是这样的结合蛋白，其在以下铰链近侧环结构当中“*”所示的位置处包含单个氨基酸的单一插入。因此，本文提供包含经修饰的铰链近侧环结构L-L-*-G-G-P、L-L-G-*-G-P和L-L-G-G-*-P的结合蛋白。本文还提供这样的结合蛋白，其在铰链近侧环结构L-L-*-G-G-P、L-L-G-*-G-P和L-L-G-G-*-P当中“*”所示的位置处包含两个或多个氨基酸的单一插入。因此，在这些实施方案当中，“*”表示插入至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。通常，适用于产生具有这种经修饰的铰链近侧环结构的结合蛋白的氨基酸选自Ala、Gly、Ile、Leu和Val。
其他这类实施方案提供这样的结合蛋白，其包含一个或多个IgGCH2结构域，其中该CH2结构域是IgG1、IgG2和/或IgG3 CH2结构域。一些这类实施方案提供了这样的结合蛋白，其在IgG1、IgG2和/或IgG3 CH2结构域的BC环结构D-V-S-H-E当中包含一个或多个氨基酸缺失和/或氨基酸插入。本文具体示例性举出的是这样的结合蛋白，其在以下BC环结构当中“*”所示的位置处包含单个氨基酸的单一插入。因此，本文提供包含经修饰的BC环结构D-V-*-S-H-E和D-V-S-*-H-E的结合蛋白。本文还提供这样的结合蛋白，其在BC环结构D-V-*-S-H-E和D-V-S-*-H-E当中“*”所示的位置处包含两个或多个氨基酸的单一插入。因此，在这些实施方案当中，“*”表示插入至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。通常，适用于产生具有这种经修饰的BC环结构的结合蛋白的氨基酸选自Ala、Gly、Ile、Leu和Val。
另外其他这类实施方案提供这样的结合蛋白，其包含一个或多个IgG CH2结构域，其中该CH2结构域是IgG1和/或IgG3 CH2结构域。一些这类实施方案提供了这样的结合蛋白，其在CH2结构域的FG环结构A-L-P-A-P-I当中包含一个或多个氨基酸缺失和/或氨基酸插入。本文具体示例性举出的是这样的结合蛋白，其在以下FG环结构当中“*”所示的位置处包含单个氨基酸的单一插入。因此，本文提供包含经修饰的FG环结构A-L-*-P-A-P-I、A-L-P-*-A-P-I和A-L-P-A-*-P-I的结合蛋白。本文还提供这样的结合蛋白，其在FG环结构A-L-*-P-A-P-I、A-L-P-*-A-P-I和A-L-P-A-*-P-I当中“*”所示的位置处包含两个或多个氨基酸的单一插入。因此，在这些实施方案当中，“*”表示插入至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。通常，适用于产生具有这种经修饰的FG环结构的结合蛋白的氨基酸选自Ala、Gly、Ile、Leu和Val。
第一插入受体结合序列和第二插入受体结合序列之间的间距，第二插入受体结合序列和第三插入受体结合序列之间的间距，和依此类推的两序列之间的间距，按间插氨基酸残基的数目来说，可从零(0)个间插氨基酸残基至约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个或更多个氨基酸残基。第一插入受体结合序列和第二插入受体结合序列之间的及第二插入受体结合序列和第三插入受体结合序列之间的间插氨基酸残基(如果存在的话)的准确数目，要以提高受体结合亲和力的方式来变动。在包含超过两个受体结合位点的修饰结合蛋白中，各受体结合序列之间的间插氨基酸残基的数目可相同或者可不同。间隔区中的间插氨基酸残基可进行具体选择，或者可通过测定结合亲和力来随机选择。
在一个示例性的实施方案当中，结合蛋白功能性例如G-SMIPTM产品功能性，可按上文所述方式通过对经修饰的G-SMIPTM产品的结合作出变化来改变，以提高或降低FcγRI(CD64)结合、FcγRII(CD32)结合和/或FcγRIIIa(CD16)结合。在这些示例性实施方案的某些方面当中，这种对免疫球蛋白功能性的变化能有效地分别提高或降低相应的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。在某些这种实施方案当中，结合蛋白是这样的G-SMIP产品，其功能性是如上所述通过在Fcγ环当中插入和/或缺失氨基酸序列来作出改变。在相关的实施方案当中，结合蛋白是这样的G-SMIP产品，其功能性是通过对环与FcγR和/或Clq的接触作出变化来改变。例如，可进行氨基酸的插入和/或缺失，以便改变对FcγR的结合面(binding face)，或者以便通过降低Clq结合来降低CDC。
要将氨基酸残基插入到结合蛋白的氨基酸序列中，这可例如通过在编码免疫球蛋白氨基酸序列的多核苷酸当中的一个或多个插入突变来作出，或者通过如本文所述在特定区域中的随机突变来作出。
FcγRI结合、FcγRII结合、FcγRIII结合和FcαRIII结合，可通过用本领域公知的和下文进一步详述的方法分别测量与CD64、CD32、CD16和CD89的结合来进行评估。
能改变IgG基免疫球蛋白Fcγ-受体结合亲和力和/或特异性的、包含糖 基化序列的突变
根据某些实施方案，本文所述的本发明结合蛋白可按需包含供进行糖基化的另外位点，所述糖基化例如是诸如单糖或寡糖的碳水化合物部分的共价连接。为多肽糖基化提供底物的氨基酸序列的掺入，是在相关技术领域的技能范围内，包括例如使用遗传工程或蛋白质工程方法，来获得含有例如供进行N-(天冬酰胺)连接糖基化的经典Asn-X-Ser/Thr位点的多肽序列，或者含有作为O-连接糖基化的合适底物的Ser残基或Thr残基的序列，或者适于进行C-甘露糖基化、糖基磷脂酰肌醇化(glypiation)/糖基磷脂酰肌醇修饰作用或磷酸加糖作用(phosphoglycation)的序列，其中所有都可按本领域确立的标准来鉴定(例如Spiro，Glybiology 12：43R(2002))。
免疫球蛋白CH2DE环的N-连接糖基化据认为能改变CH2构象和提供与FcγR的直接糖接触。免疫球蛋白糖形(glycoform)当中的修饰，可通过插入一个或多个包含N-连接糖基化位点的氨基酸序列来实现，所述氨基酸序列例如氨基酸序列YNSTY。这种新的糖形可具有改变了的FCγR结合特性。在这类实施方案的另外一个方面当中，可在CH2DE环当中插入第二N-连接糖基化位点。例如，可将野生型序列YNSTY转变成YNSTYNSTY。这种免疫球蛋白修饰会极大地影响FcγR结合，并因此影响抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
已证实N-连接糖基化特别是在氨基酸位置Asn297处的N-连接糖基化，对于IgG类免疫球蛋白与其关联Fcγ受体的结合来说是必要的。因此，已证实Asn297突变成Ala297会废除FcγRI的识别。类似地还证实，在位置Asn297处如不存在N-连接寡糖，FcγRI、FcγRII、FcγRIII(以及补体Clq)的识别和/或激活会被废除，而A蛋白和类风湿因子结合则不受影响。N-连接和O-连接糖基化序列是本领域公知的，例如描述于Gooley et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.178：1194-1201(1991)和Pisano et al.，Glycobiology 3：429-435(1993)中。
在某些方面当中，本发明提供这样的修饰，其包括在一个或多个包含一个或多个O-连接和/或N-连接糖基化位点的铰链区和/或恒定区免疫球蛋白环插入一个或多个氨基酸和/或缺失一个或多个氨基酸。
因此，本发明提供结合蛋白，特别是包含一个或多个重链铰链、CH2和/或CH3结构域的结合蛋白，其中该结合蛋白在一个或多个重链铰链、CH2和/或CH3结构域当中包含一个或多个修饰，其中该修饰包含插入一个或多个N-连接糖基化序列和/或一个或多个O-连接糖基化序列，该糖基化序列足以实现在插入位置处的N-连接和/或O-连接糖基化，从而改变(即提高或降低)结合蛋白与一个或多个免疫球蛋白特异性Fc受体或其他靶蛋白质的结合亲和力和/或特异性。这种类型的结合蛋白包括例如在一级氨基酸序列中这样的位置处包含变化的结合蛋白，该位置处在负责未修饰结合蛋白的糖基化的区域、结构域和/或环结构的近侧和/或远侧。
本文示例性举出的是这样的结合蛋白，其包含一个或多个IgG重链铰链、CH2和/或CH3结构域，其中该结合蛋白在该一个或多个IgG重链铰链、CH2和/或CH3结构域当中包含一个或多个修饰，其中该修饰包含插入一个或多个N-连接糖基化序列和/或一个或多个O-连接糖基化序列，该糖基化序列足以实现在插入位置处的N-连接和/或O-连接糖基化，从而改变(即提高或降低)结合蛋白与一种或多种以下IgG免疫球蛋白特异性受体的结合亲和力和/或特异性：FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和/或FcγRIII(CD16)，所述改变是相比于包含一个或多个未修饰的IgG重链铰链、CH2和/或CH3结构域的相应结合蛋白而言。
本发明这些方面的具体实施方案包括这样的结合蛋白，其包含一个或多个IgG铰链结构域、一个或多个IgG CH2结构域和/或一个或多个IgG CH3结构域，其中该铰链、CH2和/或CH3结构域是IgG1铰链、CH2和/或CH3结构域，IgG2铰链、CH2和/或CH3结构域，IgG3铰链、CH2和/或CH3结构域和/或IgG4铰链、CH2和/或CH3结构域。一些这类实施方案提供了包含这样的插入的结合蛋白，该插入是在相应的天然IgG免疫球蛋白IgG1铰链、CH2和/或CH3结构域中的N-连接和/或O-连接糖基化位点的近侧和/或远侧，插入一个或多个N-连接糖基化序列N-X-(S/T)(其中X为任何氨基酸)和/或一个或多个O-连接糖基化序列X-P-X-X(其中至少一个X为T)、T-X-X-X(其中至少一个X为T)、X-X-T-X(其中至少一个X为R或K)和/或S-X-X-X(其中至少一个X为S))。在这些实施方案的某些方面当中，结合蛋白显示出改变了的(即提高了的或降低了的)FcγR结合亲和力和/或特异性。
本文示例性举出的是这样的实施方案，其中结合蛋白包含一个或多个IgG铰链结构域、一个或多个IgG CH2结构域和/或一个或多个IgG CH3结构域，且其中结合蛋白还包含一个或多个N-连接糖基化序列N-X-(S/T)(其中X为任何氨基酸)的插入。例如，本发明提供包含这样的插入的结合蛋白，该插入是在接近一个或多个IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4 CH2结构域的DE环当中的天然N-S-T序列处，插入一个或多个N-X-(S/T)序列。在这些实施方案的某些方面当中，结合蛋白显示出改变了的(即提高了的或降低了的)FcγR结合亲和力和/或特异性。
在具体的这类实施方案当中，一个或多个IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4 CH2结构域的DE环当中的N-连接糖基化序列包含氨基酸序列N-S-T，并被插入到距天然N-S-T序列的氨基末端和/或羧基末端0-100个氨基酸的近邻或当中，使得天然氨基酸序列X-N-S-T-Z被修饰成(AAa)-N-S-T-(AAb)-N-S-T-(AAc)，其中AAa、AAb和AAc每一个独立地从1-100个氨基酸指定。
在具体的这类实施方案当中，一个或多个IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4 CH2结构域的DE环当中的N-连接糖基化序列包含氨基酸序列N-S-T，并被插入到天然N-S-T序列的近邻，使得天然氨基酸序列X-N-S-T-Z被修饰成X-N-S-T-Z-N-S-T-Z，其中X和Z独立选自Tyr(Y)和Phe(F)。
在另选的这类实施方案当中，插入在一个或多个IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4 CH3结构域的BC环当中的N-连接糖基化序列包含氨基酸序列N-S-T，并被插入到天然N-S-T序列的远侧，使得天然氨基酸序列Y-P-S-D-I-A被修饰成Y-P-N-S-T-D-I-A和Y-N-S-T-P-S-D-I-A。
在另一个方面，本发明提供结合蛋白，特别是包含一个或多个IgG重链铰链、CH2和/或CH3结构域的结合蛋白，其中该结合蛋白在该一个或多个IgG重链铰链、CH2和/或CH3结构域当中包含一个或多个修饰，其中该修饰包含插入一个或多个N-连接糖基化序列和/或一个或多个O-连接糖基化序列，该糖基化序列足以实现在插入位置处的N-连接和/或O-连接糖基化，从而改变(即提高或降低)结合蛋白与一种或多种免疫球蛋白特异性Fc受体的结合亲和力和/或特异性，所述免疫球蛋白特异性Fc受体包括IgG免疫球蛋白特异性受体FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和/或FcγRIII(CD16)，所述改变是相比于包含一个或多个未修饰的IgG重链铰链、CH2和/或CH3结构域的相应结合蛋白而言。这种类型的结合蛋白包括例如在一级氨基酸序列中这样的位置处包含变化的结合蛋白，该位置处在负责未修饰结合蛋白的糖基化的区域、结构域和/或环结构的近侧和/或远侧。
这种变化包括例如在这样的氨基酸片段中间和/或近邻，插入三个或更多个包含供进行N-连接糖基化的YNS序列的氨基酸，该氨基酸片段当在结合时与包括FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和/或FcγRIII(CD16)在内的一个或多个免疫球蛋白特异性Fc受体发生接触。
当前描述的实施方案的一个这种方面提供这样的修饰，该修饰是在被称为G-SMIPTM产品的IgG类免疫球蛋白的CH2结构域的DE环当中，这类免疫球蛋白含有一个或多个氨基酸序列YNSTY，该序列是供进行N-连接糖基化和FcγR接触的位点。
同时具有关联受体和非关联受体结合特异性的结合蛋白
在还进一步的方面，本发明提供这样的结合蛋白，其中新的功能性是通过用第二免疫球蛋白类别的一个或多个第二免疫球蛋白环替代第一免疫球蛋白类别的一个或多个免疫球蛋白环来实现的，其中该第二免疫球蛋白环给经修饰的结合蛋白赋予新的结合特异性，这种新的结合特异性是相应的未修饰结合蛋白中不存在的。
根据本发明这些方面的结合蛋白包含第一免疫球蛋白类别(即IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)的一个或多个重链铰链、CH2和/或CH3结构域，其中该结合蛋白在第一免疫球蛋白类别的一个或多个重链铰链、CH2和/或CH3结构域的一级氨基酸序列中被修饰(即氨基酸替代和/或氨基酸插入)，以产生能够结合与第一免疫球蛋白类别不同的第二免疫球蛋白类别的一个或多个关联Fc受体的结合蛋白。这种变化包括例如用第二免疫球蛋白结构域的一个或多个环或其氨基酸和/或肽部分来替代和/或重塑第一免疫球蛋白结构域的一个或多个环或其氨基酸和/或肽部分，其中第二免疫球蛋白结构域包含一个或多个这样的氨基酸，这些氨基酸能形成第二免疫球蛋白特异性Fc受体的结合序列的至少一部分。根据本发明这些方面的结合蛋白除了能够特异性结合FcγRI、FcγRII和/或FcγRIII外，还能够特异性结合FcαR。
本文示例性举出的是包含一个或多个IgG重链铰链、CH2和/或CH3结构域的结合蛋白，其中该结合蛋白被修饰成能结合一个或多个非IgG免疫球蛋白特异性Fc受体，包括但不限于IgA免疫球蛋白特异性受体FcαR(CD89)。这类结合蛋白包括例如这样的结合蛋白，其在一个或多个IgG重链铰链、CH2和/或CH3结构域的一级氨基酸序列中包含变化(即氨基酸替代和/或氨基酸插入)，以产生能够结合非IgG免疫球蛋白特异性Fc受体如结合Fcα受体的氨基酸序列。
在某些这类实施方案当中提供的是包含一个或多个IgG重链铰链、CH2和/或CH3结构域的结合蛋白，其中该结合蛋白被修饰成能结合IgA免疫球蛋白特异性受体FcαR(CD89)。这类示例性结合蛋白在IgG CH3 FG环当中包含一个或多个氨基酸置换和/或在IgG CH3CD环当中包含一个或多个氨基酸置换。
例如，一种这类示例性结合蛋白包含这样的替代，该替代是用包含氨基酸序列C-M-V-G-H-E-A-L-P-L-A-F-T-Q的IgA CH3 FG环或其相应部分替代包含氨基酸序列C-S-V-M-H-E-A-L-H-N-H-Y-T-Q的IgG CH3 FG环或其相应部分。
另一种示例性结合蛋白包含这样的替代，该替代是用包含氨基酸序列Q-E-L-P-R-E的IgA CH3 CD环或其部分替代包含氨基酸序列Q-P-E-N的IgG CH3 CD环或其部分。
又一种这类示例性结合蛋白包含这样的替代，该替代是用包含氨基酸序列C-M-V-G-H-E-A-L-P-L-A-F-T-Q的IgA CH3 FG环或其相应部分替代包含氨基酸序列C-S-V-M-H-E-A-L-H-N-H-Y-T-Q的IgGCH3FG环或其部分，和用包含氨基酸序列Q-E-L-P-R-E的IgA CH3CD环或其部分替代包含氨基酸序列Q-P-E-N的IgG CH3 CD环或其部分。
任何上述结合蛋白实施方案可进一步包含这样的置换，该置换是用氨基酸Leu置换IgG重链CH3氨基酸Met(在序列K-D-T-L-M28-I-S-R-T当中CH3氨基酸位置28)，使得该结合蛋白进一步包含氨基酸序列K-D-T-L-L28-I-S-R-T。或者或另外，任何上述结合蛋白实施方案可进一步包含这样的置换，该置换是用氨基酸Arg置换IgG重链CH3氨基酸Glu(在序列D-I-A-V-E157-W-E-S-N当中CH3氨基酸位置157)，使得该结合蛋白进一步包含氨基酸序列D-I-A-V-R157-W-E-S-N。
本文在某些实施方案中示例性举出包含非FcγR的结合接触的环，该环被插入到包含一个或多个IgG重链铰链、CH2和/或CH3结构域的IgG基结合蛋白，其中该结合蛋白被修饰成能结合一个或多个非IgG免疫球蛋白特异性Fc受体，包括但不限于IgA免疫球蛋白特异性Fc受体FcαR(CD89)。这类结合蛋白包括例如这样的结合蛋白，其在一个或多个IgG重链铰链、CH2和/或CH3结构域的一级氨基酸序列中包含一个或多个变化(即氨基酸替代和/或氨基酸插入)，以产生能够结合非IgG免疫球蛋白特异性Fc受体如结合Fcα受体的氨基酸序列。这种变化包括例如用一个或多个非IgG免疫球蛋白环和/或其肽部分替代和/或重塑一个或多个IgG免疫球蛋白环，其中该非IgG免疫球蛋白环包含非IgG免疫球蛋白特异性Fc受体的结合序列。
在某些实施方案当中，结合蛋白是G-SMIP产品，其中G-SMIP产品功能性被改变，使得G-SMIP产品能结合一个或多个FcαR如CD89。IgG的CH3结构域上的几个环如上所述被进行基因工程改造(engineered)，以提供新的和/或经修饰的分子相互作用。例如，可将IgG铰链氨基酸、CH2氨基酸和/或CH3氨基酸用能参与IgA和FcαR之间的结合的IgA铰链残基、CH2残基和/或CH3残基进行替代。例如和如上对结合蛋白一般所述，可将IgG CH3 FG环用IgA CH3 FG环加上其他能接触FcαR的氨基酸进行替代。或者或另外，可将IgG CH3 CD环用IgA CH3 CD环加上其他能接触FcαR的氨基酸进行替代。示例性的G-SMIP产品包含来自称为2H7-018014的人源化抗体的氨基末端。包含例如能赋予FcαR结合活性的氨基酸的G-SMIPTM产品，保持着未修饰G基SMIPTM产品的好处，例如体内半寿期长、容易通过A蛋白进行纯化和/或IgG效应子功能。
还另外的实施方案提供结合蛋白对非抗体受体结合的特异性方面的修饰，所述非抗体受体结合例如是对T细胞表面蛋白、B细胞表面蛋白、髓样细胞表面蛋白质和非免疫细胞蛋白的结合。
产生、表达和鉴定效应子功能改变了的结合蛋白的功能性的方法
一旦设计出本文所提供的结合蛋白，可将编码该结合蛋白的多核苷酸包括DNA，通过例如Sinha et al.，Nucleic Acids Res.，12：4539-4557(1984)中所述的寡核苷酸合成进行完全或部分合成；并例如Innis，Ed.“PCR Protocols”(Academic Press，1990)及Better et al.，J Biol.Chem.267：16712-16118(1992)中所述通过PCR进行装配。对这种未经修饰的和经修饰的结合蛋白进行测序、克隆和表达的方法是本领域公知的，例如可参考Ausubel et al.，Eds.“Current Protocols in MolecularBiology”(John Wiley & Sons，New York，1989)及Robinson et al.，Hum.Antibod.Hybridomas 2：84-93(1991)中所描述的程序。本发明的结合蛋白可在真核细胞系(例如CHO细胞系)中进行表达，通过A蛋白层析进行纯化和通过功能试验进行鉴定。
可在本领域公知的任何常规哺乳动物表达系统中如下来实现表达：分离编码目的结合蛋白的DNA片段并克隆到哺乳动物表达载体如pD18中。得自阳性克隆的DNA可用QIAGEN质粒制备试剂盒(QIAGEN，Valencia，CA)进行扩增。重组质粒DNA可通过用合适的限制性内切核酸酶消化在非必需区域中进行线性化，通过苯酚提取进行纯化，并重悬在组织培养基(例如Excell302；目录号14312-79P，JRHBiosciences，Lenexa，KS)中。适用于转染的细胞是例如CHO DG44细胞，通常处于对数生长期。收获细胞供进行每个转染反应，并将线性化的DNA加入到细胞中进行转染或电穿孔。例如，本发明结合蛋白的稳定生产可如下实现：用含有在CMV启动子控制下的编码结合蛋白的cDNA的可选择可扩增质粒如pD18，对CHO细胞进行电穿孔。(所有的细胞系均获自美国模式培养物保藏所；Manassas，VA)。包含结合蛋白cDNA的表达盒可亚克隆在合适的启动子(如CMV启动子)的下游。
让被转染的细胞在非选择性培养基中过夜恢复，然后以例如从125个细胞/孔到2000个细胞/孔的不同系列稀释度选择性接种在96孔平底板(Costar)中，该板含有供进行细胞克隆的合适培养基如Excell302完全培养基，该培养基含有选择剂(例如在DHFR抗性的情况中含有100nM甲氨喋呤)。对来自原孔(master well)的培养上清液的系列稀释液进行筛选，找出与表达相应结合蛋白配体的细胞的结合。
通常从表达结合蛋白的CHO细胞收集上清液，滤过0.2μm滤器(Nalgene，Rochester，NY)，并通过A蛋白-琼脂糖(IPA300交联琼脂糖)柱(Repligen，Needham，MA)。用PBS洗涤该柱，用0.1M柠檬酸盐缓冲液(pH 3)洗脱结合的蛋白质。收集各流分，将洗脱的蛋白质用1MTris(pH 8.0)中和，然后透析到PBS中。纯化的结合蛋白的浓度可通过280nm处的吸收进行测定。
可例如在Harlow et al.，Eds.“Antibodies：A Laboratory Manual”Chapter 14(Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，1988)和Munson et al.，Anal.Biochem.107：220-239(1980)中所述，对结合蛋白进行所需的活性方面的测试，例如与靶受体如FcγRI、FcγRII、FcγRIII和/或FcαR的结合活性或者特异性抗原结合活性，以及通过本领域公知的方法，对结合蛋白进行抗体依赖性细胞介导细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)方面的测试。ADCC测定和CDC测定、二级体外抗体应答、使用确立的标志抗原系统对各种外周血或淋巴单核细胞亚群的流式免疫细胞荧光术分析、免疫组织化学测定和其他相关的测定，都是例如参考Rose et al.Eds.“Manual of Clinical LaboratoryImmunology”(American Society of Microbiology，Washington，DC，1997)在本文中提供。
结合蛋白介导ADCC的能力可用任何合适的靶细胞系和PBMC作为效应细胞来测量。例如，在CD20特异性结合蛋白的具体情况中，合适的细胞系包括B细胞系Ramos和Bjab。效应细胞与靶细胞比通常如下变动：100:1、50:1、25:1和10:1，其中每孔的靶细胞数保持恒定，而改变PBMC的数量。将靶细胞标记以51Cr(例如Na2 51CrO4)，以5 x 104个细胞/孔的细胞密度等分到96孔板的每个孔。将纯化的结合蛋白以10μg/ml的浓度加到PBMC的各个稀释液中。自发释放是通过不加PBMC或结合蛋白来测量，最大释放是通过向适当的孔中加入去污剂(1％ NP-40)来测量。温育进行反应，将细胞上清液收获到γ闪烁计数器(例如Lumaplate；Packard Instruments)。总裂解和自发裂解是通过将靶细胞分别在0.2％ SDS或完全培养基中进行温育来测定。按以下公式计算裂解百分数：
裂解百分数用LU(裂解单位)表示，它是用Pross et al.，J.Clin.Immunol.1：51-63(1981)所述的指数拟合方程来测定的。一个裂解单位定义为为获得20％靶细胞裂解所需的效应细胞的数量。
补体依赖性细胞毒性(CDC)测定还可用51Cr标记的靶细胞在PMBC存在下进行(如上对ADCC所述)。经标记的细胞通常以2000个细胞/孔接种在含有递增浓度的结合蛋白的96孔板中，然后与兔补体(Pei-Freez，Rogers，AK)以1:100的最终稀释度在37℃下温育1小时。将来自正常供体的人血清加到含有靶细胞的各孔中，在37℃下温育。可将热灭活的血清用作对照，以保证补体特异性裂解的测量。特异性靶细胞裂解如上文对ADCC所述进行测定。结合蛋白介导的CDC是通过减去只归因于补体的靶细胞裂解的百分数来测定。
FcR结合可通过评估对可溶性FcIg(例如CD64Ig、CD32Ig、CD16Ig和CD89Ig)的结合和/或在表达各个Fc受体的细胞(即CD64+、CD32+、CD16+和CD89+细胞)的结合来测定和定量。FcR接合(engagement)和激活可例如通过由白细胞(例如U937细胞)产生过氧化物来测量。
效应子功能改变了的结合蛋白的设想用途
本发明的结合蛋白会在众多治疗应用中具有效用。
如上文所述和如下文所示例性举出，在某些实施方案当中，本发明提供在免疫球蛋白铰链区、CH2区和/或CH3区当中包含一个或多个氨基酸插入的结合蛋白，其中该免疫球蛋白显示出改变了的(即提高了的或降低了的)对FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和/或FcγRIII(CD16)中的一个或多个的结合亲和力和/或特异性。
这类结合蛋白的设想用途包括例如在如下患者中对细胞群体进行定向耗尽(targetted depletion)：(a)具有低/次功能性自然杀伤(NK)细胞群体的患者和/或(b)能受益于经修饰的结合蛋白的改进效应强度(potency)的患者。这种结合蛋白的另选的设想用途包括治疗细菌性、寄生虫性和/或病毒性感染，其中与FcγRI、FcγRII和/或FcγRIII中的一种或多种的结合的提高或下降会增加病原体中和或清除。这种FcγR结合活性的改变，对于其中传染可通过抗体FcγR相互作用来促进的传染病的治疗也会有用，所述疾病包括但不限于诸如HIV-1的疾病。
在另选的实施方案当中提供的是包含这样的插入的结合蛋白，该插入是在相应的天然免疫球蛋白Fc区中的N-连接和/或O-连接糖基化位点的近侧和/或远侧，插入一个或多个N-连接和/或O-连接糖基化序列(例如一个或多个N-连接N-X-(S/T)糖基化序列和/或一个或多个O-连接X-P-X-X(其中至少一个X为T)、T-X-X-X(其中至少一个X为T)、X-X-T-X(其中至少一个X为R或K)和S-X-X-X(其中至少一个X为S))，其中该结合蛋白显示出改变了的(即提高了的或降低了的)FcγR结合亲和力和/或特异性，如改变了的对Clq、FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和/或FcγRIII(CD16)的结合亲和力和/或特异性。
在某些方面当中，这类结合蛋白的设想用途是基于结合蛋白的半寿期的保持和交联潜在性的相应减少。例如，本发明设想到，这种经修饰的结合蛋白会可用于对Clq、FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和/或FcγRIII(CD16)中的一种或多种进行优先靶向，且交联作用介导的胞内信号转导如CD3和/或CD28信号转导减低。这类结合蛋白的另选的设想用途，包括以较低的细胞损耗潜在性保持半寿期，和当交联作用驱动所需的信号但不需要靶细胞耗损时保持交联作用以供使用。例如(Ex.)EPO-R的激动剂SMIP。
本发明的又一个实施方案提供包含这样的插入和/或替代的结合蛋白，该插入和/或替代是在IgG免疫球蛋白CH2区和/或CH3区当中插入和/或替代一个或多个氨基酸，其中该氨基酸插入和/或替代包含一个或多个对应于IgA免疫球蛋白CH2区和/或CH3区的氨基酸，其中IgA免疫球蛋白CH2区和/或CH3区的该一个或多个氨基酸参与IgA免疫球蛋白与其关联Fcα受体的特异性结合，且其中该经修饰的结合蛋白能够特异性结合FcαR。
这类结合蛋白的设想用途包括耗损被靶向细胞，其中例如包含一个或多个IgG CH2区和/或CH3区和一个或多个IgA CH2区和/或CH3区的组合的结合蛋白能够结合CD16、CD32和/或CD64中的一个或多个以及结合CD89。这种结合蛋白会使得可以除了使用自然杀伤细胞(NK)/单核细胞效应子外，还可使用多形核细胞(PMN)效应子，来实现靶细胞的消除。本文所述的结合蛋白的结合特异性的这种改变，会因此导致在广大的患者群体中有改进的效应强度(potency)和更大的功效(efficacy)。
如上文对在免疫球蛋白铰链区、CH2区和/或CH3区当中包含一个或多个插入的氨基酸的结合蛋白所述，具有对一个或多个IgG CH2区和/或CH3区和一个或多个IgA CH2区和/或CH3区的组合的结合特异性的结合蛋白，将可用于治疗细菌性、寄生虫性或病毒性感染，其中在FcγR结合和/或在FcαR结合上的改进可导致病原体中和和/或清除活性的增加。在FcγR结合和/或在FcαR结合上的改变，还可用于治疗其中传染可通过抗体FcR相互作用来促进的传染病，所述疾病例如与HIV-1感染有关的疾病。
以下实施例是以示例性方式而非限制性方式提供。
实施例
实施例1
对IgG免疫球蛋白铰链结构域和/或CH2结构域当中的环的修饰 能赋予改进的FcR结合亲和力
IgG类抗体的成员能特异性结合CD16(FcRγIII)。构建了示例性IgG抗体的环结构域当中的突变变化，以改变IgG对其关联Fc受体CD16的结合亲和力。特异性靶向的是CH2 IgG结构域的四个在两个界面接触CD16分子的环。基于Sondermann P.et al.，Nature406(6793)：267-73(2000)所描述的晶体结构，第一个界面涉及CD16与CH2的α链的铰链区环和FG环的相互作用。第二个界面涉及CD16分子与CH2的β链的铰链区环、BC环、DE环(即碳水化合物环)和FG环的相互作用。这些接触位点的示意图见图1。
应用插入诱变来在以下三个非碳水化合物环当中的两个界面产生变化：(1)铰链区环、(2)BC环和(3)FG环。这种插入突变的文库适用于选择具有所需的对一个或多个FcRγ受体的结合亲和力的个体突变体。图2中的指向下方的箭头表示供掺入氨基酸插入以获得根据本发明这个方面的插入突变体的代表性位置。
插入突变体的文库是通过将多核苷酸序列插入在三个铰链区的每一个当中的NWN序列编码区当中来构建。文库1A、1B和1C在铰链区环制作，文库2A和2B在BC环制作，文库3A、3B和3C在FG环制作。共含有96个成员的文库是通过将12个独特序列插入在8个不同位置的每一个来构建。具有长的或体积大的侧链的氨基酸：苯丙氨酸(F)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)、酪氨酸(Y)、组氨酸(H)、谷氨酰胺(Q)、天冬酰胺(N)、赖氨酸(K)、天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)。
文库1A、1B、1C、2A和2B的每一个的cDNA序列，是用重叠PCR延伸方法采用6个寡核苷酸引物(序列在表3中提供)来构建。用于产生文库1A的寡核苷酸是Lib1A_F1、Lib1A_F2、Lib1A_F3、Lib1A_R1、Lib1A_R2和Lib1A_R3。用于产生文库1B的寡核苷酸，除了寡核苷酸Lib1B_F2替代Lib1A_F2和Lib1B_R1替代Lib1A_R1外，所有的寡核苷酸都相同。用于产生文库Lib1C的寡核苷酸，同样除了寡核苷酸Lib1C_F2替代Lib1A_F2和Lib1C_R1替代Lib1A_R1外，所有的寡核苷酸都相同。用于产生文库2A的寡核苷酸是Lib1A_F1、Lib2A_F2、Lib2A_F3、Lib2A_R1、Lib2A_R2和Lib1A_R3。用于产生文库2B的寡核苷酸，所用的寡核苷酸与文库2A所用的相同，例外的是oligo Lib2B_F3替代Lib2A_F3和寡核苷酸Lib2B_R2替代oligo Lib2A_R2。
对于每个文库，将6个浓度20nM的长寡核苷酸引物与浓度1μM的两个短末端寡核苷酸引物(包含Bci-I的限制位点(正向引物)和Sac-II的限制位点(反向引物))进行混合。用Invitrogen supermix聚合酶(Carlsbad，CA)，采用以下条件进行PCR反应：(a)初始94℃解链1分钟，(b)94℃ 1分钟，50℃ 2分钟，72℃ 3分钟，30个循环。
表3
用以产生抗体文库1A、1B、1C、2A和2B的寡核苷酸引物
 
寡核苷酸名称     SEQIDNO： 序列
Bci-I正向  28 ttcttctgatcaggagcccaaat
Sac-II反向   29 GCTCCTCCCGCGGCTTTGTCTTGG
Lib1A_F1 30 ttcttctgatcaggagcccaaatcttctgacaaaactcacacatctccaccgtgcccag
Lib1A_F2 31 gggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccgga
Lib1A_F3 32 tgtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcg
Lib1A_R1 33 AGAGGAAGACTGACGGTCCACCNWNCAAGAGTTCAGGTGCTGGGCACGGTGGAGATGTGT
Lib1A_R2 34 CGTGGCTCACGTCCACCACCACGCATGTGACCTCAGGGGTCCGGGAGATCATGAGGGTGT
Lib1A_R3 35 GCTCCTCCCGCGGCTTTGTCTTGGCATTATGCACCTCCACGCCGTCCACGTACCAGTTGA
Lib1B_F2 36 wggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccgga
Lib1B_R1 37 AGAGGAAGACTGACGGTCCNWNACCCAAGAGTTCAGGTGCTGGGCACGGTGGAGATGTGT
Lib1C_F2 38 gnwnccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccgga
Lib1C_R1 39 AGAGGAAGACTGACGGNWNTCCACCCAAGAGTTCAGGTGCTGGGCACGGTGGAGATGTGT
Lib2A_F2 40 gccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggaccc
Lib2A_F3 41 tgtggacgtgnwnagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcg
Lib2A_R1 42 GGAAGAGGAAGACTGACGGTCCACCCAAGAGTTCAGGTGCTGGGCACGGTGGAGATGTGT
Lib2A_R2 43 CGTGGCTNWNCACGTCCACCACCACGCATGTGACCTCAGGGGTCCGGGAGATCATGAGG
Lib2B_F3 44 tgtggacgtgagcnwncacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcg
Lib2B_R2 45 CGTGNWNGCTCACGTCCACCACCACGCATGTGACCTCAGGGGTCCGGGAGATCATGAGGG
将扩增的片段连接到Invitrogen的TOPO载体中，并转化到TOP10细菌细胞中。汇集超过200个菌落，通过对15个菌落进行序列分析来确定每个文库的复杂度(complexity)。然后将各片段用Bci-I和Sac-II消化，并连接到Bci-I/Sac-II消化的pD18表达载体中，该载体编码抗CD20小模块免疫药物产品(SMIPTM产品)，且经基因工程法除去了额外的Sac-II限制位点，及经基因工程法引入了终止密码子和独特的限制位点(Not-I)，该Not-I限制位点能使得含有野生型CH2结构域的背景载体可以线性化。
文库3A、3B和3C的基因用Stratagene(La Jolla，CA)的Quikchange方法来构建。设计了33个碱基对的正义和反义寡核苷酸引物，以促进编码氨基酸序列NWN(即天冬酰胺-色氨酸-天冬酰胺)的核苷酸序列的掺入。这些寡核苷酸引物的序列在表4中给出。文库3A的寡核苷酸是Lib3A-F和Lib3A-R。文库3B的寡核苷酸是Lib3B-F和Lib3B-R。文库3C的寡核苷酸是Lib3C-F和Lib3C-R。
表4
用以产生抗体文库3A、3B和3C的寡核苷酸引物
 
寡核苷酸名称 SEQIDNO： 序列
lib3A-F 46 gtctccaacaaagccnwnctcccagcccccatc
lib3A-R 47 GATGGGGGCTGGGAGNWNGGCTTTGTTGGAGAC
Lib3B-F 48 cccaacaaagccctcnwnccagcccccatcgag
Lib3B-R 49 CTCGATGGGGGCTGGNWNGAGGGCTTTGTTGGAG
Lib3C-F 50 cacaaagccctcccanwngcccccatcgagaaaac
Lib3C-R 51 GTTTTCTCGATGGGGGCNWNTGGGAGGGCTTTGTTG
对于每个文库，100μL PCR反应中含有20ng的模版DNA(即编码CD37特异性小模块免疫药物产品(SMIPTM产品)的pD18表达载体、各125ng的正向和反向寡核苷酸引物、500nM的dNTP和2.5单位的Stratagene Ultra Pfu DNA。采用以下条件进行PCR反应：(a)初始95℃解链1分钟，(b)95℃ 1分钟，60℃ 1分钟，68℃ 6.5分钟，18个循环。每个PCR反应后，将野生型载体通过与限制性内切核酸酶Dpn-I温育2小时进行消化。然后将DNA混合物转化到TOP10细菌细胞中。每个文库汇集超过200个菌落，通过对15个菌落进行序列分析来确定每个文库的复杂度。将各文库用Sac-II和Bsr-G1限制性内切核酸酶进行消化并连接到pD18中，该pD18具有抗Cd37前末端(anti-CD 37front end)、额外的Sac-II位点、终止密码子和独特的Not1限制位点，该Not-I限制位点能使含有野生型CH2序列的背景载体线性化。图3。
在96孔板或24孔板中将每个文库的成员克隆在COS细胞中进行表达。各克隆与CD16的结合可这样进行测试：采用具有人(HuIg)或鼠(MuIg)免疫球蛋白尾(tail)的生物素酰化CD16，通过标准的ELISA方法筛选各个候选蛋白质，按该方法，各板包被着A蛋白，加入含有各个候选蛋白质的各上清液，然后加入CD16 HuIg-生物素和链霉亲和素-HRP。然后可选择出与相应的野生型SMIPTM产品相比具有更高的对CD16的特异性结合亲和力的分子，以供在ADCC测定中作进一步的鉴定和供与A蛋白进行相互作用。
实施例2
对IgG免疫球蛋白CH3结构域当中的环的修饰能赋予独特的结合 特异性
本实施例公开IgG CH3区当中的示例性修饰，该修饰能提供新的非天然的识别表面，并因此提供新的非天然的结合特异性。
对IgG的CH3结构域当中的几个环进行基因工程改造以提供IgA特异性结合相互作用(在本文中称为IgG/A成环作用(looper))。以下三种IgG/A成环作用(looper)构建物的表达在Cos细胞中进行：(a)IgGCH3结构域当中的IgG氨基酸被来自IgA CH3结构域的氨基酸以及CD环当中的两个另外的氨基酸所替代，该野生型IgA免疫球蛋白中的氨基酸直接接触Fcα-受体(即CD89)；(b)IgG CH3 FG环结构域当中的IgG氨基酸被来自IgA CH3 FG环结构域以及其他接触Fcα-受体的氨基酸所替代；和(c)IgG CH3 CD环结构域当中的IgG氨基酸被来自CH3 CD环结构域的氨基酸以及其他接触Fcα-受体的氨基酸所替代。在所有情况中，每个所得的突变IgG SMIPTM产品的前末端是人源化2H7-018014。
FcRα受体结合位点的结合特异性和/或亲和力是通过改变CH3的CD环和FG环处的氨基酸残基来修饰。图1显示IgG和IgA的CH2结构域和CH3结构域的序列比对。当骨架叠合时由均方根(RMS)偏差为
Figure A200780022215D0056152649QIETU
表明，IgG和IgA的三级结构极为相似。
该三种基因用重叠PCR延伸方法进行构建。对于每种基因形式，将一组4个浓度20nM的长寡核苷酸与两个浓度1uM的短末端寡核苷酸(短F和短R)进行混合。用Invitrogen supermix聚合酶采用以下条件进行PCR反应：(1)初始94℃解链1分钟和(2)94℃1分钟，50℃2分钟和72℃3分钟，30个循环。将扩增的片段用Bsr-G1和Xba-I消化并插入到pD18载体中，该载体携有人源化抗CD20 SMIPTM产品(018014)，经Bsr-G1和Xba-I消化以除去野生型CH3结构域。各寡核苷酸的序列在表5中给出。
表5
用以修饰IgG免疫球蛋白CH3结构域当中的环的寡核苷酸引物
 
寡核苷酸名称     SEQIDNO： 序列
F1_ver1 52 cagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccagg
F2_ver1 53 agcttctatccaagcgacatcgccgtgcgttgggagagcaatgggcaggagctgccg
F3_ver1 54 ccccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaa
F4-_ver1 55 gcttctcctgcatggtgatgcatgaggctctgccactcgccttcacgcagaagagcc
R1_ver1 56 tgcttggatagaagcctttgaccaggcaggtcaggctgacctggttcttggtcagct
R2_ver1 57 cgagtccagcacgggaggcgtggtcttgtagttgttctccggcagctcctgcccatt
R3_ver1 58 cccatgcaggagaagacgttcccctgctgccacctgctcttgtccacggtgagcttg
R4_ver1 59 cgctataatctagatcatttacccggagacagggagaggctcttctgcgtgaagg
短-F 60 cagaaccacaggtgtacaccctgccc
短-R 61 cctataatctagatcatttacc
F4_ver2 62 gtcttctcctgcatggtgggccacgaggccctgccgctggccttcacacagaagacca
R4_ver2 63 cgctataatctagatcatttacccgccaagcggtcgatggtcttctgtgtgaagg
F2_ver3 64 aggcttctatccaagcgacatcgccgttcgctggctgcaggggtcacaggagctgccc
R2_ver3 65 cgagtccagcacgggaggcgtggtcttgtacttctcgcggggcagctcctgtgaccc
通过PCR诱变，将靠近CH2区的起始处的MI氨基酸替代成LL。这两个氨基酸是IgA同种型的免疫球蛋白与其关联Fc受体CD89(FcαR)之间的另外的接触点。参见图2。对三个经修饰的IgG基SMIPTM产品的每一个的序列进行了确证，相应的pD18载体转染到COS细胞中进行基因表达。通过将Wil2S染色和流式细胞术分析，检查上清液的与CD20的结合活性。CD20染色与2H7SMIP CH3突变用于与IgA受体的结合(CD20staining with 2H7 SMIP CH3 mutated for binding toIgA receptor)。
首先将上清液与Wil2S细胞在冰上温育30分钟。将细胞洗涤两次，加入PE缀合的抗人IgG的1:100稀释液。再次洗涤细胞，用流式细胞术测定每个样品的MF。与标准曲线比较得知，三个经修饰的免疫球蛋白的每一个都以大约2-4μg/mL的水平表达。
为测试这些分子与IgA受体的结合，将Wil2S细胞与上清液温育30分钟，用1％ BSA/PBS洗涤两次，加入5μg/ml的CD89(IgA受体)人Ig于PBS中的溶液，再温育30分钟。再次洗涤细胞，加入50μL1:100稀释的PE缀合A蛋白于1％ BSA/PBS中的溶液，温育30分钟。将样品用1％ BSA/PBS洗涤，重悬在100ml的洗涤缓冲液中。然后通过流式细胞术对样品读数。
三个经修饰的免疫球蛋白的每一个都以大约2-4μg/ml的水平表达，用A蛋白亲和层析进行纯化，并采用CD89 HuIg和PE标记的A蛋白通过常规的流式细胞术方法，对它们与Wil2S细胞和与CD89的特异性结合进行鉴定。
序列表
<110>TRUBION PHARMACEUTICALS INC.
<120>BINDING PROTEINS COMPRISING IMMUNOGLOBULIN HINGE
     AND FC REGIONS HAVING ALTERED FC EFFECTOR FUNCTIONS
<130>20632/2203607-WO0
<140>
<141>
<150>60/744,899
<151>2006-04-14
<160>106
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>19
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>1
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<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
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Figure A200780022215D00741
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<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
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Figure A200780022215D00751
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成引物
<400>28
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成引物
<400>29
Figure A200780022215D00753
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成引物
<400>30
Figure A200780022215D00754
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<211>59
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成引物
<400>31
Figure A200780022215D00761
<210>32
<211>59
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成引物
<400>32
Figure A200780022215D00762
<210>33
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成引物
<220>
<221>修饰碱基
<222>(23)..(23)
<223>a，c，g，t，未知或其它
<220>
<221>修饰碱基
<222>(25)..(25)
<223>a，c，g，t，未知或其它
<400>33
Figure A200780022215D00763
<210>34
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成引物
<400>34
Figure A200780022215D00771
<210>35
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成引物
<400>35
Figure A200780022215D00772
<210>36
<211>59
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成引物
<400>36
<210>37
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成引物
<220>
<221>修饰碱基
<222>(20)..(20)
<223>a，c，g，t，未知或其它
<220>
<221>修饰碱基
<222>(22)..(22)
<223>a，c，g，t，未知或其它
<400>37
Figure A200780022215D00781
<210>38
<211>59
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成引物
<220>
<221>修饰碱基
<222>(2)..(2)
<223>a，c，g，t，未知或其它
<220>
<221>修饰碱基
<222>(4)..(4)
<223>a，c，g，t，未知或其它
<400>38
Figure A200780022215D00782
<210>39
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成引物
<220>
<221>修饰碱基
<222>(17)..(17)
<223>a，c，g，t，未知或其它
<220>
<221>修饰碱基
<222>(19)..(19)
<223>a，c，g，t，未知或其它
<400>39
Figure A200780022215D00783
<210>40
<211>59
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成引物
<400>40
Figure A200780022215D00791
<210>41
<211>59
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成引物
<220>
<221>修饰碱基
<222>(11)..(11)
<223>a，c，g，t，未知或其它
<220>
<221>修饰碱基
<222>(13)..(13)
<223>a，c，g，t，未知或其它
<400>41
Figure A200780022215D00792
<210>42
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成引物
<400>42
Figure A200780022215D00793
<210>43
<211>59
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成引物
<220>
<221>修饰碱基
<222>(8)..(8)
<223>a，c，g，t，未知或其它
<220>
<221>修饰碱基
<222>(10)..(10)
<223>a，c，g，t，未知或其它
<400>43
Figure A200780022215D00801
<210>44
<211>59
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成引物
<220>
<221>修饰碱基
<222>(14)..(14)
<223>a，c，g，t，未知或其它
<220>
<221>修饰碱基
<222>(16)..(16)
<223>a，c，g，t，未知或其它
<400>44
Figure A200780022215D00802
<210>45
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成引物
<220>
<221>修饰碱基
<222>(5)..(5)
<223>a，c，g，t，未知或其它
<220>
<221>修饰碱基
<222>(7)..(7)
<223>a，c，g，t，未知或其它
<400>45
Figure A200780022215D00811
<210>46
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成引物
<220>
<221>修饰碱基
<222>(16)..(16)
<223>a，c，g，t，未知或其它
<220>
<221>修饰碱基
<222>(18)..(18)
<223>a，c，g，t，未知或其它
<400>46
Figure A200780022215D00812
<210>47
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成引物
<220>
<221>修饰碱基
<222>(16)..(16)
<223>a，c，g，t，未知或其它
<220>
<221>修饰碱基
<222>(18)..(18)
<223>a，c，g，t，未知或其它
<400>47
Figure A200780022215D00821
<210>48
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成引物
<220>
<221>修饰碱基
<222>(16)..(16)
<223>a，c，g，t，未知或其它
<220>
<221>修饰碱基
<222>(18)..(18)
<223>a，c，g，t，未知或其它
<400>48
Figure A200780022215D00822
<210>49
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成引物
<220>
<221>修饰碱基
<222>(16)..(16)
<223>a，c，g，t，未知或其它
<220>
<221>修饰碱基
<222>(18)..(18)
<223>a，c，g，t，未知或其它
<400>49
<210>50
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成引物
<220>
<221>修饰碱基
<222>(16)..(16)
<223>a，c，g，t，未知或其它
<220>
<221>修饰碱基
<222>(18)..(18)
<223>a，c，g，t，未知或其它
<400>50
Figure A200780022215D00831
<210>51
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成引物
<220>
<221>修饰碱基
<222>(18)..(18)
<223>a，c，g，t，未知或其它
<220>
<221>修饰碱基
<222>(20)..(20)
<223>a，c，g，t，未知或其它
<400>51
Figure A200780022215D00832
<210>52
<211>57
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成引物
<400>52
Figure A200780022215D00841
<210>53
<211>57
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成引物
<400>53
Figure A200780022215D00842
<210>54
<211>57
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成引物
<400>54
Figure A200780022215D00843
<210>55
<211>57
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成引物
<400>55
Figure A200780022215D00844
<210>56
<211>57
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成引物
<400>56
Figure A200780022215D00851
<210>57
<211>57
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成引物
<400>57
Figure A200780022215D00852
<210>58
<211>57
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成引物
<400>58
<210>59
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成引物
<400>59
Figure A200780022215D00854
<210>60
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成引物
<400>60
Figure A200780022215D00861
<210>61
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成引物
<400>61
Figure A200780022215D00862
<210>62
<211>58
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成引物
<400>62
Figure A200780022215D00863
<210>63
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成引物
<400>63
<210>64
<211>58
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成引物
<400>64
Figure A200780022215D00865
<210>65
<211>57
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成引物
<400>65
Figure A200780022215D00871
<210>66
<211>223
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>66
Figure A200780022215D00872
Figure A200780022215D00881
<210>67
<211>214
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>67
Figure A200780022215D00882
Figure A200780022215D00891
<210>68
<211>216
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>68
Figure A200780022215D00901
<210>69
<211>218
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>69
Figure A200780022215D00921
<210>70
<211>218
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>70
Figure A200780022215D00922
Figure A200780022215D00931
<210>71
<211>218
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>71
Figure A200780022215D00932
Figure A200780022215D00941
<210>72
<211>218
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>72
Figure A200780022215D00942
Figure A200780022215D00951
<210>73
<211>209
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>73
Figure A200780022215D00952
Figure A200780022215D00961
<210>74
<211>209
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>74
Figure A200780022215D00971
Figure A200780022215D00981
<210>75
<211>212
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>75
Figure A200780022215D00982
<210>76
<211>208
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>76
Figure A200780022215D00992
<210>77
<211>208
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>77
Figure A200780022215D01002
Figure A200780022215D01011
<210>78
<211>208
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>78
Figure A200780022215D01012
Figure A200780022215D01021
<210>79
<211>208
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>MOD_RES
<222>(80)..(80)
<223>可变氨基酸
<220>
<221>MOD_RES
<222>(90)..(90)
<223>可变氨基酸
<220>
<221>MOD_RES
<222>(103)..(103)
<223>可变氨基酸
<220>
<221>MOD_RES
<222>(105)..(105)
<223>可变氨基酸
<220>
<221>MOD_RES
<222>(181)..(181)
<223>可变氨基酸
<400>79
Figure A200780022215D01031
Figure A200780022215D01041
<210>80
<211>210
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>80
Figure A200780022215D01042
Figure A200780022215D01051
<210>81
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<400>81
Figure A200780022215D01052
<210>82
<211>25
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(3)..(22)
<223>区域可涵盖2—20个可变氨基酸
<400>82
Figure A200780022215D01061
<210>83
<211>25
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(4)..(23)
<223>区域可涵盖2—20个可变氨基酸
<400>83
Figure A200780022215D01062
<210>84
<211>25
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(5)..(24)
<223>区域可涵盖2—20个可变氨基酸
<400>84
Figure A200780022215D01071
<210>85
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<400>85
Figure A200780022215D01072
<210>86
<211>25
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(3)..(22)
<223>区域可涵盖2—20个可变氨基酸
<400>86
Figure A200780022215D01073
<210>87
<211>25
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(4)..(23)
<223>区域可涵盖2—20个可变氨基酸
<400>87
Figure A200780022215D01081
<210>88
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<400>88
<210>89
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(3)..(22)
<223>区域可涵盖2—20个可变氨基酸
<400>89
Figure A200780022215D01091
<210>90
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(4)..(23)
<223>区域可涵盖2—20个可变氨基酸
<400>90
<210>91
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(5)..(24)
<223>区域可涵盖2—20个可变氨基酸
<400>91
Figure A200780022215D01093
Figure A200780022215D01101
<210>92
<211>306
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)..(100)
<223>区域可涵盖1-100个可变氨基酸
<220>
<221>MOD_RES
<222>(104)..(203)
<223>区域可涵盖1-100个可变氨基酸
<220>
<221>MOD_RES
<222>(207)..(306)
<223>区域可涵盖1-100个可变氨基酸
<400>92
Figure A200780022215D01102
Figure A200780022215D01111
Figure A200780022215D01121
<210>93
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)..(1)
<223>Tyr或Phe
<220>
<221>MOD_RES
<222>(5)..(5)
<223>Tyr或Phe
<220>
<221>MOD_RES
<222>(9)..(9)
<223>Tyr或Phe
<400>93
Figure A200780022215D01122
<210>94
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<400>94
Figure A200780022215D01123
<210>95
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<400>95
Figure A200780022215D01131
<210>96
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<400>96
Figure A200780022215D01132
<210>97
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<400>97
<210>98
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<400>98
Figure A200780022215D01134
<210>99
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<400>99
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Claims (31)

1.一种包含一个或多个免疫球蛋白恒定区铰链、CH2和/或CH3结构域的结合蛋白，其中所述一个或多个铰链和/或恒定区CH2和/或CH3结构域包含一个或多个氨基酸的插入和/或缺失，其中所述结合蛋白显示出改变了的对一种或多种关联Fc受体的结合亲和力。
2.权利要求1的结合蛋白，其中所述结合蛋白选自抗体、抗体片段和小模块免疫药物产品(SMIPTM产品)。
3.权利要求1的结合蛋白，所述结合蛋白包含一个或多个经修饰的IgG免疫球蛋白重链铰链、CH2和/或CH3结构域，其中所述一个或多个IgG免疫球蛋白重链铰链、CH2和/或CH3结构域是通过插入一个或多个氨基酸和/或缺失一个或多个氨基酸来修饰，其中所述经修饰的结合蛋白以较高的亲和力结合选自FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)的Fc受体，所述较高亲和力是相比于包含未修饰的IgG免疫球蛋白重链铰链、CH2和/或CH3结构域的相应结合蛋白而言。
4.权利要求3的结合蛋白，其中所述经修饰的IgG结构域是经修饰的IgG1CH2结构域、经修饰的IgG2CH2结构域、经修饰的IgG3CH2结构域和/或经修饰的IgG4CH2结构域。
5.权利要求4的结合蛋白，其中所述经修饰的IgG结构域是经修饰的IgG1CH2结构域和/或经修饰的IgG3CH2结构域，且其中所述经修饰的IgG1CH2结构域和/或经修饰的IgG3CH2结构域在IgG1和/或IgG3CH2结构域的铰链近侧环结构L-L-G-G-P当中包含一个或多个氨基酸缺失和/或氨基酸插入。
6.权利要求5的结合蛋白，其中所述结合蛋白在铰链近侧环结构L-L-G-G-P当中包含一个或多个氨基酸的一个或多个插入。
7.权利要求6的结合蛋白，其中所述铰链近侧环结构在位置“*”处包含一个或多个氨基酸的插入，使得该铰链近侧环结构包含选自L-L-*-G-G-P、L-L-G-*-G-P和L-L-G-G-*-P的序列，其中“*”表示插入至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。
8.权利要求7的结合蛋白，其中所述“*”包含一个或多个选自Ala、Gly、Ile、Leu和Val的氨基酸。
9.权利要求4的结合蛋白，其中所述经修饰的IgG结构域是经修饰的IgG1CH2结构域、经修饰的IgG2CH2结构域和/或经修饰的IgG3CH2结构域，且其中所述经修饰的IgG1CH2结构域、经修饰的IgG2CH2结构域和/或经修饰的IgG3CH2结构域在IgG1、IgG2和/或IgG3CH2结构域的BC环结构D-V-S-H-E当中包含一个或多个氨基酸缺失和/或氨基酸插入。
10.权利要求9的结合蛋白，其中所述结合蛋白在BC环结构D-V-S-H-E当中包含一个或多个氨基酸的一个或多个插入。
11.权利要求10的结合蛋白，其中所述BC环结构在位置“*”处包含一个或多个氨基酸的插入，使得该BC环结构包含选自D-V-*-S-H-E和D-V-S-*-H-E的序列，其中“*”表示插入至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。
12.权利要求11的结合蛋白，其中所述“*”包含一个或多个选自Ala、Gly、Ile、Leu和Val的氨基酸。
13.权利要求4的结合蛋白，其中所述经修饰的IgG结构域是经修饰的IgG1CH2结构域和/或经修饰的IgG3CH2结构域，且其中所述经修饰的IgG1CH2结构域和/或经修饰的IgG3结构域在IgG1和/或IgG3CH2结构域的FG环结构A-L-P-A-P-I当中包含一个或多个氨基酸缺失和/或氨基酸插入。
14.权利要求13的结合蛋白，其中所述结合蛋白在FG环结构A-L-P-A-P-I当中包含一个或多个氨基酸的一个或多个插入。
15.权利要求14的结合蛋白，其中所述FG环结构在位置“*”处包含一个或多个氨基酸的插入，使得所述BC环结构包含选自A-L-*-P-A-P-I、A-L-P-*-A-P-I和A-L-P-A-*-P-I的序列，其中“*”表示插入至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。
16.权利要求15的结合蛋白，其中所述“*”包含一个或多个选自Ala、Gly、Ile、Leu和Val的氨基酸。
17.权利要求1的结合蛋白，所述结合蛋白包含一个或多个经修饰的IgG重链铰链、CH2和/或CH3结构域，其中所述一个或多个重链铰链、CH2和/或CH3结构域是通过在天然糖基化序列的近侧和/或远侧的一个或多个位置处插入一个或多个N-连接糖基化序列来修饰，该糖基化序列足以实现在插入位置处的N-连接糖基化，其中所述经修饰的结合蛋白能以较高的亲和力结合选自FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)的Fc受体，所述较高亲和力是相比于包含未修饰的IgG免疫球蛋白重链铰链、CH2和/或CH3结构域的相应结合蛋白而言。
18.权利要求17的结合蛋白，其中所述铰链、CH2和/或CH3结构域是包含一个或多个N-连接糖基化序列N-X-(S/T)的插入的IgG1铰链、CH2和/或CH3结构域，IgG2铰链、CH2和/或CH3结构域，IgG3铰链、CH2和/或CH3结构域，和/或IgG4铰链、CH2和/或CH3结构域，其中X是处在相应的天然IgG免疫球蛋白铰链、CH2和/或CH3结构域中的N-连接糖基化位点的近侧和/或远侧的任何氨基酸。
19.权利要求18的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含IgG CH2结构域，其中所述CH2结构域包含一个或多个N-X-(S/T)序列的插入，该插入在所述IgG CH2结构域的DE环当中的距天然N-S-T序列的氨基末端和/或羧基末端0-100个氨基酸的近邻或当中。
20.权利要求19的结合蛋白，其中所述IgG CH2结构域包含氨基酸序列N-S-T，这个序列被插入到距天然N-S-T序列的氨基末端和/或羧基末端0-100个氨基酸的近邻或当中，使得天然氨基酸序列X-N-S-T-Z被修饰成(AAa)-N-S-T-(AAb)-N-S-T-(AAc)，其中AAa、AAb和AAc每一个独立地从1-100个氨基酸指定。
21.权利要求20的结合蛋白，其中所述IgG CH2结构域被修饰，使得氨基酸序列N-S-T被插入到距天然N-S-T序列一个氨基酸以内，使得天然氨基酸序列X-N-S-T-Z被修饰成X-N-S-T-Z-N-S-T-Z，其中X和Z独立选自Tyr(Y)和Phe(F)。
22.权利要求18的结合蛋白，其中所述N-连接糖基化序列被插入在所述CH2结构域当中的天然N-连接糖基化位点的远侧的一个或多个IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4CH3结构域的BC环当中，使得天然氨基酸序列Y-P-S-D-I-A被修饰成Y-P-N-S-T-D-I-A或被修饰成Y-N-S-T-P-S-D-I-A。
23.权利要求3的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含选自IgA、IgD、IgE、IgG和IgM的第一免疫球蛋白类别的一个或多个重链铰链、CH2和/或CH3结构域，其中该结合蛋白通过在所述第一免疫球蛋白类别的一个或多个重链铰链、CH2和/或CH3结构域的一级氨基酸序列中进行氨基酸替代和/或氨基酸插入而被修饰，以产生能够结合第二免疫球蛋白类别的一个或多个Fc受体的结合蛋白，其中所述第二免疫球蛋白类别与所述第一免疫球蛋白类别不同。
24.权利要求23的结合蛋白，其中所述第一免疫球蛋白类别是IgG，且其中所述第二免疫球蛋白类别是IgA。
25.权利要求24的结合蛋白，其中所述结合蛋白能够特异性结合(a)选自FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)的Fc受体，和(b)FcαR(CD89)。
26.权利要求25的结合蛋白，其中所述结合蛋白在IgG CH3 FG环当中包含一个或多个氨基酸置换和/或在IgG CH3 CD环当中包含一个或多个氨基酸置换。
27.权利要求26的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含这样的替代，该替代是用包含氨基酸序列C-M-V-G-H-E-A-L-P-L-A-F-T-Q的IgA CH3 FG环或其相应部分替代包含氨基酸序列C-S-V-M-H-E-A-L-H-N-H-Y-T-Q的IgG CH3FG环或其部分。
28.权利要求27的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含这样的替代，该替代是用包含氨基酸序列Q-E-L-P-R-E的IgA CH3 CD环或其部分替代包含氨基酸序列Q-P-E-N的IgG CH3 CD环或其部分。
29.权利要求28的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含这样的替代，该替代是用包含氨基酸序列C-M-V-G-H-E-A-L-P-L-A-F-T-Q的IgA CH3 FG环或其相应部分替代包含氨基酸序列C-S-V-M-H-E-A-L-H-N-H-Y-T-Q的IgG CH3 FG环或其部分，和用包含氨基酸序列Q-E-L-P-R-E的IgA CH3 CD环或其部分替代包含氨基酸序列Q-P-E-N的IgG CH3 CD环或其部分。
30.权利要求27-29中任一项的结合蛋白，所述结合蛋白进一步包含这样的置换，该置换是用氨基酸Leu置换序列K-D-T-L-M-I-S-R-T当中CH3氨基酸位置28处的IgG重链CH3氨基酸Met，使得所述结合蛋白进一步包含氨基酸序列K-D-T-L-L-I-S-R-T。
31.权利要求27-29中任一项的结合蛋白，所述结合蛋白进一步包含这样的置换，该置换是用氨基酸Arg置换序列D-I-A-V-E-W-E-S-N当中CH3氨基酸位置157处的IgG重链CH3氨基酸Glu，使得所述结合蛋白进一步包含氨基酸序列D-I-A-V-R-W-E-S-N。
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