CN101627111A - 用于生产具有增强的效应子功能的抗体恒定区的宿主细胞系 - Google Patents

Abstract

选择有能力诱导改善的细胞效应子功能(例如Fc介导的效应子功能)的宿主细胞系，用于抗体、抗体片段或抗体衍生的融合蛋白的生物药品生产。所述宿主细胞得自大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0，并适合于在化学成分确定的培养基中生长。

Description

用于生产具有增强的效应子功能的抗体恒定区的宿主细胞系

发明领域

本发明涉及可用于重组DNA技术并用于在细胞培养物中生产蛋白的细胞、细胞系和细胞培养物。更具体地说，本发明涉及能够在化学成分确定的培养基中生长、提供增强的抗体效应子功能的克隆骨髓瘤细胞系。

发明背景

抗体经常被称为与体液免疫机制和细胞免疫机制有关的衔接分子：体液应答主要归因于能够高亲和性结合靶抗原的成熟的分泌性循环抗体，所述高亲和性由可变区的固有特异性赋予。细胞应答归因于通过抗体-抗原(ab-ag)复合物的结合和由于ab-ag复合物结合效应细胞导致的细胞介质释放引起的下游后发事件导致的细胞活化的结果。这些细胞应答包括中和靶、调理和敏化(如果抗原展示在细胞表面)，肥大细胞敏化以及补体活化。对于作为细胞表面抗原的细胞靶，这些效应子功能导致通常所谓的抗体导向的细胞毒性(ADCC)和补体介导的细胞毒性(CDC)。

正是所谓的抗体的可变区和高变区负责特异性抗原识别，是所谓的异二聚体重链部分的恒定区Fc部分与存在于多种通常高活动性细胞上的这些Fc受体相互作用，能够刺激这些细胞，以影响某些功能，包括抗体摄入和细胞毒性机制或ADCC、CDC，并还影响抗体与多种受体的结合，包括与C1q蛋白的结合。这些受体被称为Fc受体。

在抗体同种型(例如IgA、IgE、IgD、IgG和IgM)中，IgG是最丰富的，IgG1亚类表现出最显著程度和系列的效应子功能。IgG1型抗体是癌症免疫治疗中最常用的抗体。在结构上，IgG铰链区和CH2结构域在抗体效应子功能中起主要作用。存在于Fc区(由铰链、CH2和CH3结构域的二聚体形成)中的N-联寡糖影响效应子功能(图1)。所有天然抗体的Fc部分都在重链中的保守位置进一步被糖链修饰。在IgG同种型中，N-联糖基化位点位于Asn297，其处于每个CH2结构域中。因为恒定区随同种型变化，所以每种同种型都具有一系列不同的N-联糖结构，该结构可变地影响蛋白组装、分泌或功能活性(Wright，A.和Morrison，S.L.，Trends Biotech.15：26-32(1997))。所连接的N-联糖的结构变化相当大，取决于加工程度，并可包含高甘露糖、多分支以及双触角的复合寡糖和唾液酸(N-乙酰基神经氨酸或NANA)、岩藻糖、半乳糖和GlcNAc(N-乙酰基葡糖胺)残基作为末端糖，如图2所示。业已知晓宿主细胞和抗体的寡糖含量对效应子功能的影响(Lifely，M.R.等，1995 Glycobiology 5：813-822；Jefferis，R.等，1998 Immunol Rev.163：59-76；Wright，A.和Morrison，S.L.，出处同上；Presta L.2003.CurrOpin Struct Biol.13(4)：519-25)。而且，关于抗体中的糖链，已报道在抗体的N-糖苷-联糖链中的还原性末端的近端N-乙酰基葡糖胺处加入或修饰岩藻糖，显著改变抗体的ADCC活性(WO00/61739)。

另外，使用稳定工程化的宿主细胞进行重组治疗性蛋白生产在传统上要求使用补加化学成分不确定的动物源组分(例如血清或器官提取物)的培养基。除批间差异性问题之外，在使用这些组分时，将产品与这些杂质纯化开来的需要以及传播人病原体的可能性提升。由于牛海绵状脑病(BSE)的发现，这种敏感性在近些年已变得更严重，牛海绵状脑病是一种牛神经退化性疾病，也称为疯牛病，与一般被认为是侵袭人类的疾病的病原体的克雅氏病(vCJD)无法区分(Bruce等，Nature 389：498-501，1997)。因此，许多管理机构强烈推荐在细胞培养基中不连续地或有限地使用动物源物质。因此，现在可得到用于哺乳动物细胞生长和维持的化学成分确定的(“CD”)培养基，其是无血清的(SF)和/或无动物源蛋白的(APF)。CD培养基的缺点在于，大部分生产细胞系不适应在其中生长或生长缓慢和生产差。因此，用于生产糖基化优化的治疗蛋白的理想生产细胞系在CD培养基中生长的同时还能够以大规模的工业化能力生产重组蛋白。

因此，在治疗性重组蛋白的工业化生产中，需要能够影响在无血清和/或无蛋白培养基中生长的所表达和加工蛋白的优化糖型(carbohydrate pattern)的细胞系，该细胞系改善蛋白功效，避免例如通过酶法进行收获后加工的需要，以获得优化糖基化模式(参见例如美国专利第6,399,336号)。

发明概述

本发明涉及能够在化学成分确定的、无动物蛋白的培养基中生长并生产最佳糖基化免疫球蛋白源治疗蛋白的细胞、细胞系和细胞培养物。在优选的实施方案中，所述细胞系为适于在CD培养基中生长的YB2/0大鼠骨髓瘤衍生细胞系。

在优选实施方案中，本发明的细胞、细胞系和细胞培养物以约10mg/L培养基至约10,000mg/L培养基生产重组蛋白。在另一个实施方案中，本发明的细胞、细胞系和细胞培养物以约0.1pg/细胞/天至约100ng/细胞/天的水平生产重组蛋白。

本发明还提供由本发明的培养的宿主细胞生产至少一种蛋白如抗体或含Fc的蛋白的方法。在优选实施方案中，表达至少一种所需蛋白的本发明细胞在化学成分确定的培养基中培养，使所述蛋白与化学成分确定的培养基或细胞自身分离开来。

本发明的另一个实施方案包括由本发明的细胞系生产的抗体或含Fc的治疗蛋白。本发明的抗体或含Fc的治疗蛋白可包括或者可来源于任何哺乳动物，例如但不限于人、小鼠、兔、大鼠、啮齿动物、灵长类动物或其任何组合，并包括分离的人抗体、灵长类动物抗体、啮齿动物抗体、哺乳动物抗体、嵌合抗体、人源化抗体和/或CDR嫁接抗体、免疫球蛋白、裂解产物及其其它特定部分和变体。

在本发明的一个方面，所述抗体为抗整联蛋白抗体、抗组织因子抗体或其它能够结合展示在受试者细胞表面的抗原的抗体，由此期望降低或阻止所述细胞在体内的生长，该活性通过在本发明细胞系中生产抗体而赋予或得到增强。

附图简述

图1图示了典型的IgG亚类哺乳动物抗体、结构域和糖基化点。

图2A-2E显示了与天然或哺乳动物细胞源的重组抗体相关的显性双触角寡糖结构：缩写的糖结构Fuc＝岩藻糖；Gal＝半乳糖；Glc＝葡萄糖；GlcNAc＝N-乙酰基葡糖胺；Man＝甘露糖；和NANA*＝鉴别的唾液酸(N-乙酰神经氨酸)。

图3A和3B显示了在无血清培养基和含血清培养基中培养的APF-YB2/0(C1083B)细胞系经过多代的生长和变异性的对比。C1083B在DMEM+5％FBS和补加6mM谷氨酰胺的CD-Hyb培养基中培养。细胞使用2-3×10⁵个细胞/ml的接种密度每周传代3次：(A)生长曲线和(B)变异性。

图4显示了来自C1083B的4种APF-YB2/0细胞系的相对生长特性。通过两种方法分离适应CD-Hyb的克隆，即断血清(C1083B-1和C1083B-12)和直接选择(C1083-H18和C1083-H21)。细胞在补加6mM谷胺酰胺的CD-Hyb中培养。细胞使用2-3×10⁵个细胞/ml的接种密度每周传代3次。

图5图示了5天后LCA凝集素对C1083B的毒性。

图6A和6B显示了：(A)大鼠fut8 mRNA(Genbank(NM_001002289)的核苷酸序列，并标记了探针和引物对以及fut8mRNA在C1083B变体中的表达的位置(引物(标以下划线)和探针(标以斜体)使用‘Primer Express’软件(Applied Biosystems)设计)，和(B)来源于C1083B的8种凝集素抗性细胞系的QPCR分析。每个细胞系都在DMEM+5％FBS中培养，在指数期收获1×10⁷个细胞。各个克隆中的fut8 mRNA水平通过QPCRP分析。

图7A和7B图示了(A)存活细胞密度和(B)来源于C1083B的岩藻糖减少型(fucose-depleted)克隆的变异性。所述细胞系在补加6mM谷胺酰胺的CD-Hyb培养基中培养。

图8A和8B图示了用于细胞系产生的CNTO 860表达载体：(A)p2401为重链表达载体，和(B)p2402为轻链表达载体。

图9A和9B图示了随时间变化的C1261A稳定性，C1261A为表达抗组织因子抗体CNTO 860的、由C1083B工程化的细胞系。以双份将第11代细胞接种(以2×10⁵个/ml)在摇瓶培养物中的CD-Hyb培养基(Gibco)中。在没有和有1×Lipid(Gibco)的情况下监测生长和抗体效价。

图10A和10B为(A)条带图，显示了由小鼠骨髓瘤细胞系C463和大鼠YB2/0宿主细胞系C1083B中产生的CNTO 859和CNTO 860激发的剂量依赖性抗体特异性细胞裂解。(B)条带图，显示了与C1083B和fut8减少型(fut8 depleted)YB2/0细胞系C1083C(A4-3)相比在CNTO 860和C463之间的ADCC差异。

图11A-C显示了由多种细胞系产生的CNTO860的MALDI-TOF-MS分析描绘的记录；(A)在适应APF的大鼠骨髓瘤YB2/0宿主细胞系C463A中，(B)C1083B，和(C)fut8减少型YB2/0宿主细胞系C1083C。

图12A-C显示了由多种细胞系产生的CNTO148的MALDI-TOF-MS分析描绘的记录；(A)在适应APF的大鼠骨髓瘤YB2/0宿主细胞系C463A中，(B)C1083B，和(C)fut8减少型YB2/0宿主细胞系C1083C。

图13图示了几批在不同宿主细胞中表达的抗TNFαMab CNTO148的浓度依赖性和相对ADCC活性(通过靶细胞特异性裂解检测)。

图14显示了由YB2/0宿主细胞系C1083A产生的2C11抗CD3Mab的MALDI-TOF-MS分析描绘的记录。

图15图示了以脾细胞上的脾细胞标记检测的T细胞活化，所述脾细胞由已用如所示的多种抗体制备物给药的小鼠收获。

发明详述

缩写

Ab＝多克隆或单克隆抗体；APF＝无动物蛋白；CD＝化学成分确定的；CDR＝互补决定区；Ig＝免疫球蛋白；IgG＝免疫球蛋白G；Mab＝单克隆抗体；TF＝组织因子。对于糖残基：Fuc＝岩藻糖基；Gal＝半乳糖基；Glc＝葡糖基；GlcNAc＝N-乙酰葡糖胺基；Man＝甘露糖基；和NANA＝唾液酸基(N-乙酰神经氨酸基，但也可包括5-N-乙酰神经氨酸(NeuAc)或5-N-乙醇酰基神经氨酸(NeuGc，NGNA)作为“唾液酸”)；Mab＝单克隆抗体；MALDI-TOF-MS＝基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱。

定义

术语“ADCC活性”代表抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，指非敏化效应细胞所具有的抗体介导的靶细胞破坏作用的现象。靶细胞的特性可变，但其必须结合具有Fc结构域或能够活化Fc受体的Fc结构域部分的表面免疫球蛋白G。效应细胞是具有Fc受体的“杀伤”细胞。其可为例如缺乏常规B细胞或T细胞标记的淋巴细胞，或者可为单核细胞、巨噬细胞或多核白细胞，这取决于靶细胞的特性。该反应不依赖于补体。如果本发明的抗体或其它含Fc蛋白表现出的ADCC介导的细胞杀伤的能力优于由可选宿主细胞产生的抗体或基本相似序列的蛋白和Fc结构域的能力，则其ADCC活性被“增强”。ADCC活性可在标准体内或体外细胞杀伤测定中确定，例如本文论述的测定。优选地，具有增强的ADCC活性的本发明抗体以比可选宿主细胞产生的参比抗体低的剂量和/或短的时间达到相同的效果(防止或抑制肿瘤细胞生长)。优选地，根据例如在所选标准铬释放ADCC测定中的平行对比，本发明范围内的抗体和参比抗体的效力之间的差异为至少约1.5倍，更优选地为至少约2倍，再更优选地为至少约3倍，最优选地为至少约5倍。

“抗体”意在包括完整抗体分子、抗体片段或包含等同于免疫球蛋白Fc区的区域的融合蛋白。

“抗体片段”包含全长抗体的一部分，一般来说，包含其抗原结合结构域或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)₂和Fv片段；双抗体(diabody)；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。这些抗体片段可融合至相同或不同物种的抗体的Fc结构域区，或者融合至抗体的修饰型Fc结构域或CH₂结构域(图1显示了这些抗体的基本结构)。

本文使用的术语“克隆的”、“克隆衍生的”或“克隆细胞系”指一群增殖的遗传学上等同的细胞，所述细胞来自衍生于单个祖细胞的特定细胞系。对于YB2/0来源的宿主细胞，亲代细胞系是描述于美国专利第4,472,500号的大鼠骨髓瘤细胞系，其以ATCC CRL 1662保藏。

本文使用的抗体或抗体类似物的“效应子功能”是破坏并由机体去除病原体或异常细胞例如肿瘤细胞的过程。先天性和获得性免疫应答使用大部分相同的效应子机制来消除病原体，包括ADCC、CA(补体活化)、C1q结合和调理。

本文使用的术语“Fc”、“含Fc蛋白”或“含Fc的分子”指至少具有免疫球蛋白CH2结构域的二聚蛋白或异二聚蛋白。CH2结构域可构成该蛋白/分子(例如抗体)的至少一部分二聚体区。

岩藻糖基转移酶或“fut8”或“fudase”指被称为fut8的基因和具有α-1，6-岩藻糖基转移酶活性的基因产物。

“含Fc的治疗蛋白”用于指具有抗原结合域、Fc区或包含至少免疫球蛋白CH2结构域的二聚蛋白或异二聚蛋白，所述含Fc或CH2的抗体部分包含能够被糖基化的天冬酰胺残基。

本文使用的术语“宿主细胞”涵盖任何种类的细胞系统，所述系统可被工程化，以产生目标蛋白、蛋白片段或肽，包括抗体和抗体片段。宿主细胞包括但不限于培养细胞，例如来源于啮齿动物(大鼠、小鼠、豚鼠或仓鼠)的哺乳动物培养细胞，例如CHO、BHK、NSO、SP2/0、YB2/0；或人组织细胞或杂交瘤细胞、酵母细胞和昆虫细胞，而且包括包含在转基因动物或培养组织中的细胞。

本文使用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”或“Mab”指基本单一分子组成的抗体分子制备物。单克隆抗体组合物表现出单一结合特异性和对特定表位的亲和性。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原位点。而且，与通常包含针对不同决定簇(表位)的常规(多克隆)抗体制备物相反，每种单克隆抗体都针对抗原上的单个决定簇。修饰语“单克隆”表示由基本同源的抗体群获得的抗体的特征，不能被解释为要求通过任何特定方法生产抗体。例如，按照本发明使用的单克隆抗体可通过首先由Kohler等，Nature 256：495(1975)描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组DNA法制备(参见例如美国专利第4,816,567号)。“单克隆抗体”还可以使用例如描述于Clarkson等，Nature 352：624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)的技术分离自噬菌体抗体文库。

具体地说，本文的单克隆抗体包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中一部分重链和/或轻链与来源于特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，而链的其余部分与来源于另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体以及这些抗体的片段中的对应序列相同或同源，只要它们表现出所需的生物活性(美国专利第4,816,567号和Morrison等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 81：6851-6855(1984))。

“人源化”形式的非人(例如鼠)抗体为具有许多替换的来源于非人免疫球蛋白的序列部分的嵌合抗体。人源化抗体很大程度上为其中受体的超变区(其也被称为互补决定区或CDR)残基被具有所需特异性、亲和性和能力的非人物种(例如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物)的超变区残基(供体抗体)置换的人免疫球蛋白(受体抗体)。在某些情况下，人免疫球蛋白的构架区(FR)残基被对应的非人残基置换。而且，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中不存在的残基。实施这些修饰，以进一步改进抗体性能。一般而言，人源化抗体将大致包含全部的至少一个和典型地两个可变结构域，其中全部或基本全部的超变区都对应于非人免疫球蛋白的超变区，全部或基本全部的FR都是人免疫球蛋白序列的FR。任选地，人源化抗体还包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，典型地为人IgG免疫球蛋白的恒定区。关于进一步的细节，参见Jones等，Nature 321：522-525(1986)；Reichmann等，Nature 332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。

本文使用的术语“人抗体”指其具有的氨基酸序列具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和/或恒定区的抗体。如果人抗体由使用人免疫球蛋白序列的系统获得，例如通过免疫携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠或通过筛选人免疫球蛋白基因文库，并且其中选定的人抗体就氨基酸序列而言与由种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列有至少90％相同，更优选有至少95％相同，再更优选有至少96％、97％、98％或99％相同，则该抗体“来源于”特定种系序列。本发明的人抗体可包含不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸序列(例如通过体外随机诱变或位点特异性诱变或体内体细胞突变导入的突变)，在超变序列或互补决定区(CDR)序列是抗体特异性的独特决定簇和不是用于在种系中编码的情况下，这些区域应被排除在序列鉴定分析之外。

本文使用的术语“重组抗体”包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有抗体，例如(a)分离自对人免疫球蛋白基因而言为转基因的或转染色体的动物(例如小鼠)或由其制备的杂交瘤(下文进一步描述)的抗体，(b)分离自经转化以表达抗体的宿主细胞(例如转染瘤(transfectoma))的抗体，(c)分离自重组、联合人抗体文库的抗体，和(d)通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接为其它DNA序列的任何其它方法制备、表达、产生或分离的抗体。重组人抗体具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。但是，在某些实施方案中，可对这些重组的人抗体进行体外诱变(或在使用对人Ig序列为转基因的动物时进行体内体细胞诱变)，由此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列为这样的序列：尽管其来源于人种系VH和VL序列并与这些序列相关，但其可能在体内并非天然存在于人抗体种系库中。

本文使用的“分离的抗体”用于指基本没有具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体(例如特异性结合组织因子的分离抗体基本没有特异性结合非组织因子的抗原的抗体)。但是，特异性结合人组织因子的表位、同种型或变体的分离抗体可与例如来自其它物种的其它相关抗原(例如组织因子物种同系物)具有交叉反应性。而且，分离的抗体可基本没有其它细胞物质和/或化学物质。在本发明的一个实施方案中，具有不同特异性的“分离的”单克隆抗体的组合合并在充分确定的组合物中。

术语“双特异性分子”用于包括具有两种不同结合特异性的任何物质，例如蛋白、肽或者蛋白或肽复合物。例如，所述分子可结合(a)细胞表面抗原和(b)效应细胞表面的Fc受体或与上述(a)和(b)互作。术语“多特异性分子”或“异特异性分子”用于包括具有不止两种不同结合特异性的任何物质，例如蛋白、肽或者蛋白或肽复合物。例如，所述分子可结合或互作于(a)细胞表面抗原，(b)效应细胞表面的Fc受体，和(c)至少一种其它组分，或与上述(a)、(b)和(c)互作。因此，本发明包括但不限于针对靶蛋白(可为细胞表面受体或此受体的配体)或其它靶(例如效应细胞上的Fc受体)的双特异性、三特异性、四特异性和其它多特异性分子。

本文使用的术语“异种抗体”指两种或多种抗体、抗体结合片段(例如Fab)、其衍生物或连接在一起的抗原结合区，其中的至少两种具有不同的特异性。这些不同的特异性包括对效应细胞上的Fc受体的结合特异性，以及对靶细胞如肿瘤细胞上的抗原或表位的结合特异性。

最佳糖基化的免疫球蛋白衍生的治疗性蛋白包括重组蛋白，该重组蛋白含有人或人源的CH2区，该区具有N联糖基化位点，该位点由赋予所述治疗性蛋白改变的(相对增强或减弱的)能力的聚糖占据，以激发统称为效应子功能的体内细胞免疫机制。

为了生产生物药品，需要能够有效并可重复地表达重组多肽的生产细胞系。所述细胞系是稳定的和可制库的(bankable)。所述细胞系能够以高密度生长，即为高于500,000(5×10⁵)个细胞/ml培养物的浓度，优选高于1,000,000(1×10⁶)个/ml培养物或更高的浓度。多种宿主细胞系可用于该目的。随着对细胞机器如何影响生物治疗产品的最终量和组成的复杂性的理解，对产品的生产和组成赋予需要的品质的宿主细胞系的选择变得更显而易见。

美国专利第4,472,500号讲授了可用作杂交瘤融合配偶体并具有优良的稳定性和生产能力的大鼠骨髓瘤细胞系。后一种细胞系已经以不同的名称命名为Y0、YB2 Ag0、YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20细胞或YB2/0(ATCC CRL 1662)，在下文将被称为YB2/0。Lifely等(1995Glycobiology 5：813-822)对比了结合于CAMPATH-1H的糖链的组成，CAMPATH-1H是嫁接CDR的人IgG1抗体，由CHO细胞系、NS0细胞或大鼠骨髓瘤Y0(YB2/0)细胞产生。另外，评价了ADCC活性。有报道指Y0细胞产生的CAMPATH-1H显示出最高的ADCC活性，且在N-联寡糖中的等分位置具有最高的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)含量(图2A-E)。这是因为将等分GlcNAc加入多种类型的N-联寡糖中的糖基转移酶GlcNAc-转移酶III(GnT III)在CHO细胞中一般不存在(Stanley和Campell，1984，J.Biol.Chem.261：13370-13378)。其它增加治疗性抗体如C2B8、利妥昔单抗的ADCC能力的努力集中于具有优化水平GnT酶的工程化宿主细胞系(Umana等，US6602684)。后一发明人进一步发现，GnT III高水平过表达导致生长抑制，且对过表达截然不同的糖基转移酶GnT V的细胞有毒。因此，降低的细胞存活率和生产能力可能为修饰糖蛋白的糖基转移酶过表达的一般特征。

关于多种细胞宿主产生的Mab的寡糖组成的第二个观察结果是CHO和NSO产生的Mab具有显著岩藻糖基化的寡糖(图2C-D，结构16-30)，而YB2/0产生的Mab具有包含更多非岩藻糖基化结构的更复杂的模式(图2A、B和E；结构1-15和31-36)。

根据此观察结果，业已表明，负责使N-联寡糖结构岩藻糖基化的酶α-1，6-岩藻糖基转移酶(为fut8的基因产物，也被称为“fudase”)在YB2/0细胞中比在CHO或NSO细胞系中低。因此，可在具有相似效应的宿主细胞系中操作fut8基因(Shinkawa等，2003 J.Biol.Chem.，278：3466-3473；EP1176195A1)。此外，双触角寡糖的半乳糖苷化、等分GlcNac的存在和岩藻糖基化的相对影响表明，依据体外和体内检测，非岩藻糖基化Mab表现出比其它N-联双触角寡糖结构修饰更大的增强ADCC的能力(Shields等，2002.J Biol Chem.277：26733-40；Ninwa等，2004.Cancer Res.64：2127-2133)。

目标驱动的细胞系开发

生产细胞系的开发通常包括将抗体基因转染入宿主细胞系(例如小鼠骨髓瘤Sp2/0、适应CD的Sp2/0(C463)和NS/0)中，并分离表达高水平所需抗体的转染瘤。在其中治疗性抗体用于中和生物靶分子的某些情况下，例如cA2抗体，抗体通过结合和随后清除循环TNF-α起作用。在其它情况下，抗体通过靶向过表达特定抗原如组织因子的癌细胞起作用。当抗体与组织因子的结合中和组织因子活性时，癌细胞通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和识别结合Fc而被活化的补体依赖性细胞毒性(CDC)途径杀死。ADCC是对抗体靶向细胞的裂解性攻击，在淋巴细胞受体FcγR与抗体的恒定区(Fc)结合时被触发。

本发明的组合物

本发明涉及具有在CD培养基中连续生长之能力的克隆骨髓瘤细胞系。在一个实施方案中，克隆骨髓瘤细胞系是通过经6次传代使培养物逐渐断绝补加FBS的CD-Hyb(CD-Hybridoma，Gibco)培养基而由YB2/0细胞库克隆的自发突变体。在该实施方案中，克隆骨髓瘤细胞系被命名为C1083B。C1083B的表征揭示，该细胞系具有众多与亲代YB2/0细胞不相关的独特生长特征。例如，C1083B可在没有血清的情况下被冷冻和融解，而血清是YB2/0亲代细胞系必需的冷冻保护剂。另外，与亲代细胞系不同，C1083B可在CD培养基中生长至高细胞密度。进一步的表征表明，在CD培养基中生长的C1083B表现出的生长参数，包括活细胞密度和倍增时间，类似于或优于细胞维持在补加血清的生长培养基中时观察到的那些参数。C1083A的第二个亚克隆称为C1083E，其是通过将C1083A细胞培养物直接扩增入仅补加6mM谷胺酰胺的CD-Hyb培养基中达3周而选择出的。

在另一个实施方案中，克隆骨髓瘤细胞系通过用补加凝集素的CD培养基选择而衍生于C1083B细胞库。在此情况下使用的凝集素是兵豆(Lens culinaris)凝集素(LCA)；但是，两种岩藻糖特异性凝集素中的任一种都可用于选择。在该实施方案中，克隆骨髓瘤细胞被称为C1083C和C1083D。C1083C和C1083D生长的表征证实，它们CD-Hyb中与C1083B相当。

因此，C1083B细胞和衍生物能够在体外无限维持、生长和增殖。C1083B细胞增殖，可传代培养(即重复地传代入新培养容器中)，并长时间(over time)冷冻保存(例如和冷冻保护剂如10％二甲基亚砜或甘油一起储存在液氮的气相中)。C1083B细胞可作为细胞系维持在长期培养物中。

本发明的细胞一般在任何容器、烧瓶、组织培养皿或提供能够换气的适宜无菌环境的细胞培养用装置中生长。典型地，本发明使用的起始(foundative)培养物是这样的培养物：其中细胞由现有的亲代C1083B细胞原种中取出，放置在培养容器中的含血清和无血清培养基的混合物中，随后传代至无血清状态，如本文所详述。

在优选实施方案中，本发明的细胞、细胞系和细胞培养物可产生来源于啮齿动物或灵长类动物的免疫球蛋白或其片段。更具体地说，免疫球蛋白或其片段可来源于小鼠或人。或者，免疫球蛋白或其片段可为嵌合的或工程化的。实际上，本发明进一步设想了产生人源化的、CDR嫁接的、噬菌体展示的、转基因小鼠生产的、优化的、诱变的、随机化的或重组的免疫球蛋白或其片段的细胞、细胞系和细胞培养物。

抗体类别或同种型(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)由重链恒定区基因编码的恒定区赋予。在人IgG类别中，有4个亚类或亚型：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，其按照它们在血清中的天然丰度的顺序由最高向最低命名。IgA抗体被发现有两个亚类：IgA1和IgA2。本文使用的“同种型转换”还指IgG亚类或亚型之间的改变。

本发明的细胞、细胞系和细胞培养物可产生免疫球蛋白或其片段，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、slgA、IgD、IgE及其任何结构或功能类似物。在具体的实施方案中，在本发明的细胞、细胞系和细胞培养物中表达的免疫球蛋白为CNTO860(融合至人huIgG1来源的恒定结构域的cCLB8可变区)。

本发明还提供表达能够在CH2结构域中糖基化的免疫球蛋白或其片段的细胞、细胞系和细胞培养物，所述免疫球蛋白或其片段结合抗原、细胞因子、整联蛋白、抗体、生长因子、细胞周期蛋白、激素、神经递质、受体或其融合蛋白、血液蛋白、其任何片段和前述任一种的任意结构或功能类似物。在优选实施方案中，免疫球蛋白、其片段或衍生物结合靶细胞表面的抗原。在特别优选的实施方案中，靶细胞为肿瘤细胞、肿瘤血管系统的细胞或免疫细胞。在具体的实施方案中，免疫球蛋白、其片段或衍生物结合组织因子。本发明的抗组织因子抗体的实例为由称为C1261的细胞系产生的CNTO860。

在又一个实施方案中，本发明的细胞、细胞系和细胞培养物可以可检测地表达含生长因子或激素的融合蛋白。本发明设想的生长因子的实例包括但不限于人生长因子、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、人绒膜促性腺激素、促红细胞生成素、血小板生成素、骨形态发生蛋白、转化生长因子、胰岛素样生长因子或胰高血糖素样肽，以及其任何结构或功能类似物。

本发明的分离的抗体包括那些具有有ADCC活性的抗体同种型的抗体，尤其是人IgG1(例如IgG1κ和IgG1λ)，次优选IgG2和IgG3，或在作为它们的其它物种对应物的Fc结构域中的特定残基处含改变的残基的杂种同种型。所述抗体可为全长抗体(例如IgG1)，或者可包括仅抗原结合部分和Fc部分或能够激发效应子功能的结构域，所述效应子功能包括ADCC、补体激活和C1q结合。

而且，由本发明的细胞、细胞系和细胞培养物产生的免疫球蛋白片段可包括但不限于含Fc或其它CH2结构域的结构及其任何结构或功能类似物。在一个实施方案中，免疫球蛋白片段为二聚受体结构域融合多肽。在具体的实施方案中，二聚受体结构域融合多肽为依那西普。依那西普是重组的可溶性TNFα受体分子，该分子皮下给药，结合患者血清中的TNFα，使其无生物活性。依那西普是二聚融合蛋白，由连接至人IgG1之Fc部分的人75kD(p75)肿瘤坏死因子受体(TNFR)的胞外配体结合部分组成。依那西普的Fc组分包含CH2结构域、CH3结构域和铰链区，但不包含IgG1的CH1结构域。

能够使用本发明的细胞系制造的其它产品包括目前通过其它类型的动物细胞系生产并具有能够被糖基化的CH2的治疗性或预防性蛋白。特别优选那些治疗性的、糖基化的、包含CH2结构域的蛋白，其结合细胞表面的靶抗原，期望所述细胞类型无能力或由机体清除。许多这样的治疗性抗体被工程化，以包含人IgG1(尤其是IgG1κ)重链，其含人CH1、CH2和CH3结构域。这样的治疗性蛋白包括但不限于：

英夫利昔单抗现在以

售卖。英夫利昔单抗是嵌合型IgG1κ单克隆抗体，具有约149,100道尔顿的分子量。其由人恒定区和鼠可变区组成。英夫利昔单抗以10¹⁰M^-1的结合常数特异性地结合人肿瘤坏死因子α(TNF(α))。英夫利昔单抗通过以高亲和性结合可溶和跨膜形式的TNF(α)中和TNF(α)的生物活性，并抑制TNF(α)与其受体的结合。表达由英夫利昔单抗结合的跨膜TNF(α)的细胞可在体外或在体内被裂解。英夫利昔单抗适用于类风湿性关节炎、克罗恩病和强直性脊柱炎的治疗。英夫利昔单抗以3-5mg/kg的剂量作为静脉内输注给予，接着根据要治疗的疾病在其后的2、6和/或8周并以每8周的间隔给予另外的相似剂量。

达克珠单抗(以

售卖)是通过重组DNA技术产生的免疫抑制性人源化IgG1单克隆抗体，其特异性结合在活化淋巴细胞表面表达的人高亲和性白介素-2(IL-2)受体的α亚基(p55α、CD25或Tac亚基)。达克珠单抗是嫁接互补决定区(CDR)的小鼠-人嵌合抗体。人序列来源于人IgG1的恒定结构域和Eu骨髓瘤抗体的可变构架区。鼠序列来源于鼠抗-Tac抗体的CDR。达克珠单抗适用于在接受肾移植的患者中预防急性器官排斥，一般用作包含环孢菌素和皮质类固醇的免疫抑制方案的一部分。

巴利昔单抗(以

售卖)是通过重组DNA技术产生的嵌合(鼠/人)单克隆抗体，起免疫抑制剂的作用，特异性结合和阻断活化T-淋巴细胞表面的白介素-2受体(α)-链(IL-2R(α)，也称为CD25抗原)。基于氨基酸序列，所述蛋白的理论分子量为144kDa。其是由既有小鼠骨髓瘤细胞系发酵而获得的糖蛋白，所述小鼠骨髓瘤细胞系经遗传工程，以表达含人重链和轻链恒定区基因(IgG1)以及编码选择性结合IL-2R(α)的RFT5抗体的小鼠重链和轻链可变区基因的质粒。巴利昔单抗在用作包含环孢菌素和皮质类固醇的免疫抑制方案的一部分时，适用于在接受肾移植的患者中预防急性器官排斥。

阿达木单抗(以

售卖)是对人肿瘤坏死因子(TNF)特异性的重组人IgG1单克隆抗体。阿达木单抗使用噬菌体展示技术产生，产生具有人源重链和轻链可变区以及人IgG1κ恒定区的抗体。

适用于在具有中度至严重活动性类风湿性关节炎的成人患者中减轻病征和症状以及抑制结构损伤的进展，其中所述患者对一种或多种DMARD的反应已不足够。可单独使用，或与MTX或其它DMARD组合使用。

利妥昔单抗(以

售卖)是经遗传工程的嵌合鼠/人单克隆抗体，针对存在于正常和恶性B淋巴细胞表面的CD20抗原。该抗体为包含鼠轻链和重链可变区序列以及人恒定区序列的IgG1κ免疫球蛋白。利妥昔单抗对CD20抗原具有约8.0nM的结合亲和性。利妥昔单抗适用于治疗具有复发性的或难治疗的、低级的或滤泡性的、CD20阳性B细胞非霍奇金淋巴瘤的患者。

以375mg/m²以每周一次IV输注给予4或8剂。

曲妥珠单抗(以

售卖)是重组DNA来源的人源化单克隆抗体，其在基于细胞的测定中以高亲和性(K_d＝5nM)选择性结合人表皮生长因子受体2蛋白HER2的胞外结构域。该抗体为包含人构架区和结合HER2的鼠抗体(4D5)的互补决定区的IgG1κ。HERCEPTIN作为单一药物疗法适用于治疗具有转移性乳癌的患者，所述患者的肿瘤过表达HER2蛋白，并且所述患者已接受一种或多种用于他们的转移性疾病的化疗方案。

与紫杉醇组合适用于治疗具有转移性乳癌患者，所述患者的肿瘤过表达HER2蛋白，并且所述患者未曾接受用于他们的转移性疾病的化疗。推荐剂量为以90分钟输注给予的4mg/kg曲妥珠单抗的初始负荷剂量和每周一次2mg/kg曲妥珠单抗的维持剂量，如果初始负荷剂量良好耐受的话，则维持剂量可以30分钟输注给予。

阿仑单抗(以售卖)是重组DNA来源的人源化单克隆抗体(Campath-1H)，其针对21-28kD的细胞表面糖蛋白CD52。阿仑单抗结合CD52，CD52是存在于基本所有的B和T淋巴细胞、大部分单核细胞、巨噬细胞和NK细胞、粒细胞亚群以及雄性/男性生殖系统组织表面的非调节性抗原。Campath-1H抗体是具有人可变构架区和恒定区以及鼠(大鼠)单克隆抗体(Campath-1G)的互补决定区的IgG1κ。Campath适用于在已用烷基化剂治疗并且氟阿糖腺苷治疗失败的患者中治疗B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)。Campath的有效性的测定基于总反应率。Campath开始时以3mg以每日一次的2小时IV输注给予；一旦耐受就应将每日剂量逐步升高至10mg，并持续，直至耐受。一旦耐受了该剂量水平，则可启动30mg Campath的维持剂量，并每周给予3次，一直到12周。在大部分患者中，逐步升高至30mg可在3-7天内完成。

奥马佐单抗(Omalizumab)(以

售卖)是选择性结合人免疫球蛋白E(IgE)的重组人源化IgG1(κ)单克隆抗体。奥马佐单抗抑制IgE与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的高亲和性IgE受体(Fc(ε)RI)的结合。具有Fc(ε)RI的细胞上的表面结合IgE的减少限制了变态反应介质的释放程度。用奥马佐单抗治疗还降低了特应性患者中嗜碱性粒细胞上的Fc(ε)RI受体数量。奥马佐单抗适用于患有中度至重度持续性哮喘的成人和青少年(12岁及以上)，所述患者对常年性气源性过敏原具有阳性皮试或体外反应性，其症状用吸入的皮质类固醇不足以控制。奥马佐单抗以150-375mg的剂量每2周或4周SC给予。

依法珠单抗(Efalizumab)是结合人CD11a的免疫抑制性重组人源化IgG1κ同种型单克隆抗体。依法珠单抗结合CD11a并降低CD11a的细胞表面表达，CD11a是白细胞功能抗原-1(LFA-1)的(α)亚基，在所有白细胞上表达。依法珠单抗抑制LFA-1与胞间粘附分子-1(ICAM-1)的结合，由此抑制白细胞与其它细胞类型的粘附。LFA-1和ICAM-1之间的相互作用有助于多种过程的启动和维持，包括T淋巴细胞活化、T淋巴细粘附于胞内皮细胞以及T淋巴细胞向炎症部位包括银屑病皮肤的迁移。淋巴细胞活化和向皮肤迁移在慢性斑块状银屑病的病理生理学中起作用。在银屑病皮肤中，内皮和角质细胞上的ICAM-1细胞表面表达被上调。CD11a还在B淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、天然杀伤细胞和其它白细胞的表面表达。因此，依法珠单抗存在影响非T淋巴细胞的细胞的活化、粘附、迁移和数量的潜力。推荐的

剂量为单次0.7mg/kg SC条件化剂量，后接每周一次的1mg/kg的SC剂量(最大单次剂量不超过总共200mg)。

在另一个实施方案中，本发明的细胞系被稳定转染，要不然被工程化，以表达非免疫球蛋白来源的多肽。

在又一个实施方案中，本发明的细胞、细胞系和细胞培养物可以可检测地表达重组血液蛋白或其它结缔组织蛋白。这样的重组蛋白包括但不限于促红细胞生成素、血小板生成素、组织纤溶酶原激活物、纤维蛋白原、血红蛋白、转铁蛋白、白蛋白、蛋白c、胶原蛋白及其任何结构或功能类似物。在具体的实施方案中，本发明的细胞、细胞系和细胞培养物表达组织纤溶酶原激活物。

编码本发明的抗体和蛋白的核酸可以本领域众所周知的几种方式获得。一方面，抗体常规上由通过用本发明的肽免疫小鼠制备的杂交瘤获得。因此，抗体可使用本领域众所周知的任何杂交瘤技术获得。参见例如Ausubel等编辑，Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley & Sons，Inc.，NY，NY(1987-2001)；Sambrook等，MolecularCloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，NY(1989)；Harlow和Lane，Antibody，a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY(1989)；Colligan等编辑，Current Protocols in Immunology，John Wiley &Sons，Inc.，NY(1994-2001)；Colligan等，Current Protocols in ProteinScience，John Wiley & Sons，NY，NY，(1997-2001)，所述文献每个均整体在此引入作为参考。

在另一种得到抗体的靶向结合部分(典型地为抗体的可变重链和/或可变轻链结构域)的常规方法中，由在例如噬菌体文库中建立的这些结合域的文库选择这些部分。可通过插入随机寡核苷酸文库或含目标序列的多核苷酸文库(例如得自免疫动物或人的B细胞)建立噬菌体文库(Smith，G.P.1985.Science 228：1315-1317)。抗体噬菌体文库在一个噬菌体中包含重链(H)和轻链(L)可变区对，这允许表达单链Fv片段或Fab片段(Hoogenboom等，2000，Immunol.Today 21(8)371-8)。可操作噬菌粒文库的多样性，以增加和/或改变文库的单克隆抗体的免疫特异性，从而生产和随后鉴别另外的所需人单克隆抗体。例如，可将重链(H)和轻链(L)免疫球蛋白分子编码基因随机混合(改组)，以在组装的免疫球蛋白分子中产生新的HL对。另外，H和L链编码基因中的任一个或两个都可在免疫球蛋白多肽可变区的互补决定区(CDR)中被诱变，随后根据所需亲和性和中和能力进行筛选。抗体文库还可通过选择一个或多个人构架序列并导入来源于人抗体库的CDR表达盒的集合或通过设计的改变来合成产生(Kretzschmar和von Ruden 2000，Current Opinion in Biotechnology，13：598-602)。多样性的位置并不限于CDR，而是还可包括可变区的构架节段，或者可包括非抗体可变区，例如肽。

可包含非抗体可变区的靶向结合组分的其它文库为核糖体展示、酵母展示和细菌展示。核糖体展示是将mRNA翻译为它们的关连蛋白同时保持所述蛋白连接至RNA的方法。核酸编码序列通过RT-PCR回收(Mattheakis，L.C.等，1994.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，9022)。酵母展示基于膜结合的α-凝集素酵母粘附受体aga1和aga2的融合蛋白的构建，aga1和aga2是交配型系统的一部分(Broder等，1997.NatureBiotechnology，15：553-7)。细菌展示基于靶与输出的细菌蛋白的融合，所述细菌蛋白与细胞膜或细胞壁结合(Chen和Georgiou，2002.Biotechnol Bioeng，79：496-503)。

与杂交瘤技术相比，噬菌体和其它抗体展示方法提供了在体外针对抗原靶进行操作选择的机会，而不受宿主与抗原可能相互影响的限制。

生产方法

本发明的YB2/0细胞系一旦被确立为稳定转染的，就可将其冷冻保存并回收，以开始生产过程。典型地，细胞系以1×10⁷个细胞/瓶在补加10％DMSO的CD-Hybridoma培养基中建库。在生产过程开始时，融化一瓶细胞，将内容物转移至含10ml CD-Hybridoma培养基的烧瓶，将烧瓶于37℃/5％CO₂培养。随后，在较大容器中扩增培养物，再将其转移至所需容量的灌流生物反应器中(Deo等，1996.Biotechol.Prog.12：57-64)。

例如，可操作本发明的克隆骨髓瘤细胞系，以约0.01mg/L培养基至约10,000mg/L培养基的水平生产重组蛋白。在另一个实施方案中，可操作本发明的克隆骨髓瘤细胞系，以约0.1pg/细胞/天至约100ng/细胞/天的水平生产重组蛋白。

用于本发明以支持本发明的C1083B-E细胞扩增和维持的培养基或生长培养基包括无血清培养基(SFM)、无蛋白培养基(PF)、无动物源组分的(ADCF)培养基以及化学成分确定的(CD)的制剂。本发明使用的CD培养基包含没有动物来源的任何组分的生长培养基，所述组分包括血清、血清蛋白、水解物或未知组成的化合物。CD培养基的所有组分都具有已知化学结构，导致消除了先前论述的批间差异。

本发明使用的CD培养基可包括但不限于Invitrogen Corp.，Carlsbad，Calif.生产的CD培养基CD-Hybridoma(目录号11279)。CDHybridoma培养基是化学成分确定的、无蛋白的培养基，其已对各种杂交瘤和骨髓瘤生长以及在静止或搅拌的悬浮系统中生产单克隆抗体进行了优化。CD Hybridoma培养基不包含动物、植物或合成来源的蛋白。在制剂中也不存在未确定的裂解物或水解物。配制无L-谷胺酰胺的CD Hybridoma培养基，用于增加稳定性。谷胺酰胺可作为每1,000ml培养基40ml的200mM L-谷胺酰胺或40ml GlutaMAX^TM-I补加物(也得自Invitrogen)在使用前加入。Hybridoma培养基主配方已提交至FDA。CD Hybridoma培养基并未对脂质依赖性或类固醇依赖性培养物如NSO来源的细胞系进行优化。

对于生长模式，CD-Hybridoma培养基补加1g/L NaHCO₃和L-谷胺酰胺至6mM终浓度。本发明还设想了化学成分限定的培养基的应用，包括“CDM培养基”，其描述于题为“Chemically Defined MediumFor Cultured Mammalian Cells”的PCT公布号WO 02/066603，该文献特地引入作为参考。

评价效应子功能的方法

尚不清楚抗体糖基化在治疗性含Fc蛋白的清除方面以及由此在其药代动力学方面的作用：与新生Fc受体(FcRn)的结合被认为导致IgG由循环被清除，该结合似乎不因抗体的Fc部分上缺乏N-联寡糖而受到干扰。

将IgG抗体介导的免疫应答与细胞效应子功能相关联的IgG Fc受体(FcR)包括Fc-γ受体：FcRI(CD64)、FcRII(CD32)和FcRIII(CD16)。全部3种都被发现展示在单核细胞上。但是，多种靶细胞上的这些受体的加工似乎有差别地并响应于其它因素发生。因此，检测含糖基化修饰型Fc的生物治疗剂对Fc-γ受体的亲和性是一种预测效应子功能增强的适宜检测。

业已报道在其Fc聚糖中具有低水平岩藻糖的人IgG1抗体对人CD16 FcR具有较高的亲和力，并在使用人PBMC效应细胞的测定中具有急剧增强的体外活性(Shinkawa等，J Biol Chem 278(5)：3466-3473，2003；Shields等，J Biol Chem 277(30)：26733-26740，2002；Umana等，Nat Biotech 17：176-180，1999)。但是，在报道了这些抗体对小鼠CD16和CD32 FcR的亲和性没有高岩藻糖抗体的亲和性高(Shields等，2002)之后，就几乎没有动力在小鼠中研究低岩藻糖抗体。不过，当比较针对CC趋化因子受体4的高岩藻糖和低岩藻糖形式的嵌合人IgG1抗体的抗肿瘤活性时，没有观察到它们的体外ADCC活性方面有差异(使用小鼠效应细胞)，κ但是，低岩藻糖抗体显示出更有效的体内效力。没有提供人效应细胞，小鼠保留了内源性NK细胞(Niwa等，Cancer Res64：2127-2133，2004)。

由于人NK细胞上的CD16受体已表现出对IgG1抗体的岩藻糖水平的敏感性增强，所以这些数据提示，在小鼠中运行的机制与已在人效应细胞中研究的机制截然不同。一种可能性是最近发现的小鼠CD16-2受体(Mechetina等，Immunogen 54：463-468，2002)。小鼠CD16-2的胞外结构域与人CD16A的序列同一性(65％)显著高于了解更多的小鼠CD16受体的同一性，提示其对所结合的IgG的岩藻糖水平可能比小鼠CD16更敏感。有报道指在小鼠巨噬细胞样J774细胞中的表达与Niwa等(2004)所描述的表达CD16-2的小鼠巨噬细胞可能造成低岩藻糖抗体的抗肿瘤活性更大的可能性相一致。因此，使用含人IgG1类Fc的蛋白进行的对Fc受体与鼠效应细胞结合的研究并不是预示性的。

另一种评价效应子功能的方法是以定量方式使用体外ADCC测定。因此，可设计体外测定，以通过正确选择靶和效应细胞系并通过细胞不能继续分裂或释放内容物如⁵¹铬释放评价细胞“杀伤作用”，来检测结合抗体引起展示其关连配体的细胞被破坏的能力。靶细胞可为正常表达本发明的抗体、抗体片段或融合蛋白的目标配体的细胞系，或者可经工程化，以在其表面表达并保留靶蛋白。这样工程化细胞系的实例是K2细胞，K2细胞为在其表面稳定表达重组人TNF的Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞系，其中所述重组人TNF因导入了缺失氨基酸1-12的成熟细胞因子而以跨膜形式保留(Perez等，Cell 63：251-258，1990)。该细胞系可用于评价具有Fc结构域或Fc结构域活性的抗TNF抗体、抗体片段或工程化抗TNFα靶向融合蛋白的ADCC活性的改变。

用于体外ADCC活性测定的效应细胞可为人或其它哺乳动物来源的PBMC(外周血单核细胞)。PBMC效应细胞可通过适宜的方法由供体收集血液后新鲜分离。可使用的其它单核细胞和巨噬细胞为来源于渗出液如腹膜渗出液的那些细胞。

尽管已概括地描述了本发明，但本发明的实施方案将在以下实施例中进一步公开。

实施例1：APF-YB2/0细胞系的适应和克隆

在补加5％FBS的DMEM(DMEM+5％FBS)中培养的大鼠杂交瘤细胞系YB2/0(C1083A)通过两种不同方法在APF培养基CD-Hyb，CD-Hybridoma(Gibco)中适应生长：

方法1.通过在补加6mM谷胺酰胺的CD-Hyb培养基中1∶1重复传代，使细胞缓慢断绝含FBS的培养基。在6次传代后，细胞能够在APF培养基中生长。该细胞系称为C1083B(表I)。C1083B在CD-Hyb和DMEM+5％FBS中的生长特征相当(图3)。使用DMEM+5％FBS通过有限稀释法由C1083B分离单个克隆。转移24个克隆用于放大，选择该试验的8个克隆用于进一步研究。这8个克隆的选择标准包括平均倍增时间(MDT)、在摇瓶培养物中达到高细胞密度的能力以及经过多次传代的稳定性。

表1

细胞系	来源于	标记
			C1083A	YB2/0	ATCC CRL-1662
C1083B	C1083A	适应于无血清培养基CD-Hyb
			C1083C	C1083B	表达1/6的fut8 mRNA
C1083D	C1083B	表达1/2的fut8 mRNA
			C1083E	C1083B	C1083B的亚克隆
C1261A	C1083B	分泌CNTO 860的转染细胞

方法2.将200、500、1000或5000个C1083A细胞铺板在96孔板的每孔中(每类5块板)补加含6mM谷胺酰胺的CD-Hyb培养基中。在3周培养后，只有具有5000个细胞/孔的板才在约10孔/板中有集落。将24个克隆转移至24孔板用于扩增。基于平均倍增时间、在摇瓶培养物中达到高细胞密度的能力以及经过多次传代的稳定性拣选4个克隆用于进一步研究。

对比12个克隆(8个通过方法1产生，4个通过方法2产生)在CD-Hyb培养基中的生长特征，即平均倍增时间、在摇瓶培养物中达到高细胞密度的能力和经过多次传代的稳定性。由该试验选择4个克隆(C1083B-1、C1083B-12、C1083-H18和C1083-H21)用于进一步的研究。全部4个克隆都具有相当的生长特征。它们的MDT约为22小时，它们能够在摇瓶培养物中达到高细胞密度(＞2×10⁶个/ml)(图4)。然后测试4种细胞系中的3种(C1083B-1、C1083B-12和C1083-H21)，以使用AMAXA电穿孔仪和先前对骨髓瘤细胞系转染优化的设置来确定它们的转染效率。由该研究选择细胞系C1083B-12作为具有所需特征的APF-YB2/0细胞系，其将用作C1083B之外的替代的转染宿主细胞系。其被命名为C1083E。

实施例2：分离抗岩藻糖特异性凝集素的YB2/0克隆

凝集素可用于选择表达特定类型寡糖的细胞系(Ripka和Stanley，1986.Somatic Cell Mol Gen 12：51-62)。在可得到的两种岩藻糖特异性凝集素中，选择扁豆凝集素(LCA)使用C1083B来产生杀伤曲线(为条带图形式)(图5)。在存在多种浓度的LCA凝集素的情况下将C1083B细胞(在DMEM+5％FBS中培养)以5000个细胞/孔铺板在96孔板中。在5天后，通过阿尔玛蓝(Alamar Blue)测定(Vybrant细胞代谢测定试剂盒，Molecular Probes，Inc.)确定变异性。

在50μg/ml LCA存在下通过在96孔板中以5个细胞/孔铺板，选择表达降低水平的fut8 mRNA(SEQ ID NO：1)的C1083B的稀有天然变体。在3周后，(从铺板的2×10⁴个细胞中)鉴别出17株抗性克隆。这些克隆被扩增并在CD-Hyb培养基中传代数次。基于茁壮生长、在摇瓶培养物中达到高细胞密度的能力和培养物经过多次传代的稳定性选择了17个克隆中的8个。从这些克隆分离总RNA。定量PCR试验使用两组大鼠特异性fut8 Taqman探针(标以下划线)和引物(标以斜体)(SEQ ID NO：2-7，图6A)。

这些分析表明，1个克隆(A4)具有1/6的fut8 mRNA，而其它2个克隆(A8和A9)具有约1/2的fut8 mRNA(图6B)。克隆A4称为C1083C，而克隆A9称为C1083D。图7A和B的数据表明，基于每体积培养基的存活细胞(图7A)和总细胞存活率(图7B)，C1083C和C1083D在CD-Hyb中的生长特征与亲代细胞系C1083B的特征相当。

实施例3：用抗组织因子抗体DNA转染C1083B细胞

选择抗人组织因子抗体CNTO 860，因为在小鼠中的人异种移植物癌症模型中测试的其减少或阻止肿瘤生长的效力取决于ADCC活性。进一步描述于WO/04110363、编码CNTO 860重链和轻链的表达载体p2401和p2402(如在图8中所示)和美国专利申请序号11/010,797)与pSV2DHFR(Promega)一起共转染，通过ELISA分析抗选择标记MHX(霉酚酸、次黄嘌呤和黄嘌呤)的克隆的抗体表达。选择一个高表达细胞系C1261A用于进一步的研究。其在摇瓶培养物的CD-Hyb培养基中产生45-50mg/L，表明了经过多次传代的表达稳定性(图9)。在没有和有1x Lipid(Gibco)的情况下监测生长和抗体效价。

实施例4：测定来源于C1083B的抗组织因子抗体的ADCC活性

使用一系列体外⁵¹Cr-释放细胞毒性测定，表明以下几种抗组织因子的ADCC活性增强：CNTO859，其包含人IgG4 Fc(描述于EP833911B1)；CNTO860，其与CNTO859具有相同抗原结合区，但已克隆到人IgG1构架中，因此产生具有SEQ ID NO：8重链序列和SEQ ID NO：9轻链序列的人源化抗体(如在2004年12月13日中请的美国专利序号11/010797中描述)；以及由于在YB2/0CD-Hyb适应性细胞系中产生CNTO860抗体而产生的糖基化变体或fut8减少型变体。

表达组织因子的人结肠癌细胞HCT 116用作靶细胞。将细胞保持在补加10％热失活FBS和1％LNN(M5A-10)的McCoy 5A培养基中。在测定当天，用胰蛋白酶处理细胞，收获，并在37℃以10×10⁶个细胞/200μCi Na₂ ⁵¹CrO₄(PerkinElmer Life Science，Boston，MA)在1mLM5A-10中标记2小时。标记的细胞用无钙或镁的50mL PBS(PBS^--)洗涤2次，并重悬浮至4×10⁵个细胞/mL M5A-10。

由健康供体分离PBMC。将静脉血收集到肝素化注射器中，并用等体积的PBS^--稀释至50mL圆锥管中(20mL∶20mL)。该血液溶液铺在13mL Ficoll-Paque(Amersham，Uppsala，Sweden)上，于室温(RT)以2200rpm离心30分钟。吸出上部血浆层，收集含PBMC的交界面(血沉棕黄层)。用PBS^--洗涤效应细胞3次，然后以5×10⁶个细胞/mL重悬浮在M5A-10中。所有试验都使用25∶1的效应子对靶比率。

在第一个试验中，使用得自两名不同供体的PBMC表征抗组织因子的单克隆抗体(即CNTO 859、CNTO 860和CNTO 860YB2/0)的ADCC活性(图10A)。在4小时后测定特异性裂解，每个条棒都代表两个供体的一式三份的平均值。自发释放和最大释放的对照样品分别用存在2μg/mL抗体但无效应细胞的单独培养基处理用或0.5％TritonX-100处理。各个样品的特异性裂解的百分率基于经自发释放cpm修正的Triton X-100释放的cpm(最大释放)计算。

与小鼠骨髓瘤宿主细胞系C463产生的IgG1亚类CNTO 860相比，IgG4亚类CNTO 859具有最低ADCC活性。相比之下，在比较它们的EC₅₀和最大裂解值时，来源于YB2/0宿主细胞系C1083B的CNTO 860的效力是来源于C463的CNTO 860的约20-60倍(图10A)。与99％岩藻糖基化的、来源于C463的CNTO 860相比，YB2/0来源的CNTO 860为40％岩藻糖基化。

在第二个试验中，对比来源于3种细胞系(即C463、适应于无动物蛋白的YB2/0细胞系C1083B和fut8减少型YB2/0细胞系C1083C)的CNTO 860的相对ADCC效力。在4小时后测定特异性裂解，条棒代表单个供体的一式三份的平均值。

来源于C1083B细胞系的CNTO 860的效力是来源于小鼠骨髓瘤细胞系C463的CNTO 860的约10倍(图10B)。

在来源于亲代YB2/0衍生细胞系C1083B和fut8减少型克隆A4-2即C1083C的CNTO 860之间未观察到ADCC活性差异。这些结果表明，因进一步降低岩藻糖水平而引起的ADCC活性进一步增加是使用体外测定方法不可检测的。

实施例5：抗体糖基化的分析

对在C463和多种转染宿主细胞系中产生的CNTO 860进行MALDI-TOF-MS分析。

按照已公开的方法，对在C463A(图11A)、适应APF的大鼠骨髓瘤YB2/0宿主细胞系C1083B(图11B)和fut8减少型YB2/0宿主细胞系C1083C(图11C)中产生的CNTO 860进行MALDI-TOF-MS分析。(Papac等，1996；Papac等，1998；Raju等，2000)。

通过不同方法在结构上分析测试抗体。为进行完整IgG抗体的MALDI-TOF-MS分析，将IgG样品溶解在10mM Tris-HCl缓冲液pH7.0中，并调节至约1mg/mL缓冲液的浓度。将约2μl IgG溶液与2μl基质溶液(通过将10mg芥子酸(sinnapinic acid)溶解在含0.1％三氟乙酸的1.0ml 50％乙腈水溶液中制备基质溶液)混合，将2ml该溶液加载至靶上，使其风干。使用Applied BioSystems(Foster City，CA)的Voyager DE设备获得MALDI-TOF-MS。

为进行所释放的Fc聚糖的MALDI-TOF-MS分析，用PNGase F的10mM Tris-HCl缓冲液(50μl)pH 7.0溶液于37℃消化IgG样品(约50μg)达4小时。通过用50％乙酸(约5μl)酸化反应混合物而终止消化，然后如前所述(Papac等，1996；Papac等，1998；Raju等，2000)通过阳离子交换树脂柱。如它处所述(Papac等，1996；Papac等，1998；Raju等，2000)使用Applied BioSystems(Foster City，CA)的Voyager DE设备，通过MALDI-TOF-MS以阳离子和阴离子模式分析这些包含酸性和中性寡糖的混合物的样品。

对由在不同YB2/0细胞中产生的抗体样品释放的聚糖的MALDI-TOF-MS分析示于图11A-C，寡糖的结构示于图2A-E。寡糖基于核心岩藻糖、等分GlcNAc的存在情况、末端糖(例如唾液酸、半乳糖等)的有无按顺序编号。MALDI-TOF-MS数据提示，在YB2/0细胞中产生的抗体样品包含增加量的非岩藻糖化寡糖(图2A-B，结构1-15)。非岩藻糖基化寡糖的量对于某些抗体样品在50％-95％之间变化。另外，还在YB2/0来源的抗体样品中观察到含等分GlcNAc的非岩藻糖基化寡糖的增加。此外，由于存在非岩藻糖基化和含等分GlcNAc的寡糖，来源于YB2/0细胞的抗体样品包含增加的均一性和/或更均一的结构。相反，在其它细胞类型中产生的抗体样品趋向于包含更异质结构的寡糖(图2A-E，结构1-36)，表明了YB2/0细胞产生由于存在更确定和均一的寡糖结构而活性增强的治疗性抗体样品的价值。此外，相比于在其它细胞系如HEK或NS/0中产生的抗体样品，在YB2/0细胞中产生的抗体样品趋向于包含较低百分率的高甘露糖含量的结构(图2E，结构31-36)。

实施例6：抗TNF_αMAB的C1083B/C表达

对几种骨髓瘤宿主细胞系(Sp2/0、NS0和YB2/0)中的CNTO 860表达水平的检验揭示了，与在这些细胞系中产生的其它抗体相比抗体生产水平相对较低。因此，选择替代抗体用于在本发明的YB2/0来源的宿主细胞系中表达。用编码称为CNTO 148(戈利木单抗(Golimumab))的人抗TNFαMab的重链(其可变区为SEQ ID NO：10)和轻链(其可变区为SEQ ID NO：11)编码质粒(分别为质粒p1783和p1776)，按照已描述的方法(Knight等，Mol Immunol 30：1443-1453，1993；WO 02/012502)通过电穿孔转染C1083B YB2/0细胞和C1083CYB2/0细胞。按照已描述的方法(Knight等，1993)通过对人IgG的ELISA测定转染的YB2/0源细胞的霉酚酸抗性集落的培养物上清液中的CNTO 148存在情况。转染体(#14 C1083B转染体和#1 C1083C转染体)在IMDM、5％FBS、1％谷胺酰胺、1X MHX选择(0.5μg/ml霉酚酸、2.5μg/ml次黄嘌呤、50μg/ml黄嘌呤)中放大至1升体积，使培养物过度生长，直至细胞存活率小于20％。标准A蛋白层析用于纯化CNTO 148的两个样品。纯化由C1083B转染细胞产生1.3mg CNTO148和由C1083C转染细胞产生3.2mg CNTO 148。

对C1083B-148-14和另一个克隆C1083B-148-33进行Halo亚克隆。由克隆33的第一轮Halo拣选21个晕轮(halo)，其中的1个亚克隆C1083B-148-33-19在摇瓶中表达约89μg/mL。在扩增和第二轮Halo时，亚克隆C1083B-148-33-19-42在摇瓶中表现出约105μg/mL的效价。该克隆正在适应APF培养基。

YB2/0源CNTO 148的生物分析表征

PNGase F释放的寡糖的MALDI-TOF-MS分析(图12A-C)表明，YB2/0源宿主细胞C1083B和C1083B的超过80％的寡糖不是岩藻糖基化的。出乎意料的是，发现C1083C源CNTO 148的岩藻糖含量不低于C1083B源CNTO 148的岩藻糖含量(图12B和C)。也包含增加量的等分GlcNAc但没有岩藻糖的这些抗体样品的寡糖似乎比在NS/0宿主细胞中产生的抗体的寡糖更均一(图12A)。

采用YB2/0源CNTO 148的体外ADCC测定

称为K2或C480A细胞的靶细胞为在其表面稳定表达重组人TNF的Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞系，所述重组人TNF由于导入了缺失氨基酸1-12的成熟细胞因子而保持为跨膜形式(Perez等，1990，出处同上)。将K2细胞培养在含热失活FBS、2mM L-谷胺酰胺、1mM丙酮酸钠、0.1mM非必需氨基酸和1X MHX选择的Iscove培养基中。K2细胞每2-3天以1∶5传代一次。

在测定当天，离心K2细胞，并用PBS洗涤1次。用培养基将细胞调节至约1×10⁶个细胞/ml，将15μl BATDA荧光标记试剂(在DelfiaEuTDA细胞毒性试剂盒中，Perkin-Elmer Life Sciences)加入5ml细胞中(Blomberg等，J Immunl Methods 193：199-206，1996)。将细胞于37℃温育30分钟，然后以1000rpm、5分钟用PBS洗涤2次。临与PBMC效应细胞混合之前，离心靶细胞，并以2×10⁵个细胞/ml重悬浮在含1％BSA的Iscove培养基中。

在将血液收集入肝素化Vacutainer中后由健康供体分离PBMC效应细胞，并用PBS稀释2倍。将30m1稀释的血液覆盖在50ml锥形管中的15ml Ficoll-Paque(Amersham，Uppsala，Sweden)上部，并于室温以1500rpm离心30分钟。收集含PBMC的交界面(血沉棕黄层)，并用PBS洗涤2次，以1200rpm于室温离心10分钟。将细胞重悬浮在含5％热失活FBS、2mM L-谷胺酰胺、1mM丙酮酸钠和0.1mM非必需氨基酸的Iscove培养基中。于37℃、5％CO₂中通过在已于4℃过夜包被OKT3(10μg/ml的PBS溶液，Ortho Pharmaceutical)并用PBS淋洗的100mm组织培养皿中温育而活化PBMC约4小时。收集PBMC，用含1％BSA的Iscove培养基洗涤1次，计数并重悬浮至约1×10⁷个细胞/ml。

在Iscove，1％BSA培养基中连续稀释CNTO 148测试样品。将50μl靶细胞(约10,000个)和100μl抗体加入圆底96孔板中。将50μl效应细胞(约500,000个细胞)加入混合物中，于室温以1000rpm离心板5分钟。效应细胞对靶细胞的比率(E∶T)为50∶1。为检测背景荧光，将孔与效应细胞和靶细胞在无抗体的培养基中的混合物温育。为确定最大荧光，加入10μl裂解溶液(得自Delfia EuTDA细胞毒性试剂盒)至背景孔。对于ADCC测定，细胞于37℃、5％CO₂中温育大约2小时。将20μl上清液转移至96孔平底板。加入200μl铕溶液(Delfia EuTDA细胞毒性试剂盒)，于室温将平板放置在板振荡器上达10分钟。在时间分辨荧光仪EnVision设备(Perkin-Elmer Life Sciences)中检测荧光。按照下式计算各个样品中的特异性裂解的百分率：特异性裂解％＝([试验释放-自发释放]÷[最大释放-自发释放])×100。

ADCC测定的结果表明，C1083B来源的CNTO 148的效力是参比物质小鼠骨髓瘤细胞的CNTO 148的约70倍(图13)。C1083C来源的CNTO 148显示出和C1083B来源的CNTO 148基本相同的效力，这与表明它们具有非常相似的岩藻糖水平的生物分析数据相一致。由于岩藻糖水平的出乎意料的相似性，所以这些抗体批次并没有提供手段来测试：极低水平的岩藻糖(10-20％)是否可解释为与具有中等水平的岩藻糖(40-50％)相比并不进一步增强ADCC活性，如已用CNTO 860在体外(和用2C11在体内)观察到的。不过，这些结果提供了在C1083B或C1083C中表达的抗体的另一个实例，其相对于在替代宿主细胞中表达的相同抗体显示出显著增强的ADCC活性。

实施例7：在HEK 293E细胞、C1083A细胞和C1083C细胞中表达的抗CD3抗体的体内激动剂活性

基于先前表明抗CD3单克隆抗体对T细胞的活化依赖于抗体结合Fcγ受体(FcγR)的能力的报告，使用简单模型系统测试小鼠是否应对在其Fc聚糖中具有不同岩藻糖水平的人IgG1抗体显示出不同程度的Fc依赖性应答。重组仓鼠抗小鼠CD3ε-链抗体145-2C11(2C11)用于这些研究。编码单链Fv形式的2C11的质粒由Jeffrey Bluestone博士(University of California，San Francisco)惠赠。在该质粒中的重链和轻链可变区(V)编码序列预先已经过PCR扩增，首先将扩增的DNA片段克隆入基因组重链和轻链V区载体中，然后分别克隆入小鼠IgG2a和κ链的基因组恒定区表达载体中。

为制备2C11的人IgG1变体，由其中一个预先制备的质粒p2213扩增编码重链可变区的DNA，并将其克隆入含人G1恒定区编码序列的两种不同表达载体中。这导致产生其中抗体基因的转录由CMV启动子驱动的表达质粒p2648和其中转录由小鼠免疫球蛋白启动子驱动的表达质粒p2694。2C11轻链可变区由质粒p2208扩增，并克隆入含人κ恒定区、由CMV启动子或免疫球蛋白启动子驱动的表达载体。这导致产生其中抗体基因的转录由CMV启动子驱动的表达质粒p2623和其中转录由免疫球蛋白启动子驱动的表达质粒p2669。含CMV启动子的质粒在HEK 293E细胞中瞬时表达。约3.5×10⁸个细胞在10层cell stack(10 tier cell stack)(Corning)中的生长培养基(含10％FBS的DMEM)中于37℃、5％CO₂中过夜培养。通过将1.4ml脂质转染胺试剂2000与质粒p2648或p2622和p2623各300μg在40ml Optimem(Invitrogen，Inc.)中混合制备转染混合物，将该混合物加入细胞囊，并于37℃过夜温育。第二天，具有转染混合物的培养基用1L 293SFMII(Invitrogen，Inc.)+4mM丁酸钠置换，将细胞于37℃温育4天。收获含表达的抗体的上清液，通过离心和0.8μm过滤澄清。所表达的抗体通过标准蛋白A亲和层析纯化。

将含免疫球蛋白启动子的质粒经稳定转染导入到C1083A和C1083C YB2/0细胞中。用质粒p2694和p2669各10μg通过电穿孔转染约2×10⁷个YB2/0细胞，并铺板在含补加10％FBS、NEAA、L-谷胺酰胺和丙酮酸钠的αMEM的生长培养基的96孔细胞培养皿中。用霉酚酸选择质粒稳定整合的细胞。通过抗人IgG ELISA筛选分泌抗体的霉酚酸抗性克隆。在含5％FBS的培养物中放大高表达的稳定克隆。所表达的抗体通过标准A蛋白亲和层析纯化。

如在以上实施例5和6中所述，对已在C1083A YB2/0细胞中表达制备的2C11 huG1抗体进行MALDO-TOF-MS(图14)。该分析表明，所述细胞系尽管在血清存在下培养，但持续产生糖基化产物抗体，其中优势种类是非岩藻糖基化的(图2中的结构2)。将2C11制备物酶促去糖基化，以便制备没有FcγR结合能力的对照抗体。通过用1000单位的PNGase F于37℃处理抗体24小时进行去糖基化(约10mg抗体在1.0mL缓冲液中的溶液)。加入另一等份的酶，再继续温育24小时。使用HiTrap蛋白A柱纯化去糖基化的IgG样品，并配制到磷酸缓冲盐水pH 7.0中。获得的糖形(glycoform)称为2C11 Gno，其通过MALDI-TOF-MS显示已被完全去糖基化(未显示)。

通过以分光光度法检测OD₂₈₀以及将SDS-聚丙烯酰胺凝胶染色，测定每个抗体样品的浓度。对所有测试抗体都进行LAL测定，以测定污染的内毒素水平。如上所述进行的MALDI-TOF-MS和HPLC分析表明，在HEK 293E来源的抗体(2C11 huG1、HEK)、C1083A来源的抗体(2C11 huG1、C1083A)和C1083C来源的抗体(2C11 huG1、C1083C)中的Fc聚糖分别为约95％、40％和15％岩藻糖基化。对新鲜分离的小鼠脾细胞上的CD3的定量结合分析揭示，对这3种不同抗体制备物的抗原亲和性没有可检测的差异(未显示数据)。

为评价如何彼此比较3种抗体的体内T细胞活化特性，给予正常的雌性Balb/c小鼠(Charles River Laboratories)单次腹膜内注射的变化量的测试抗体。在测试抗体注射后约24小时，所有小鼠都通过CO₂窒息安乐死，经心脏穿刺收集末端血样，收集脾脏，并放置入含冷的收获培养基(RPMI 1640，5％热失活胎牛血清、1％L-谷胺酰胺)的管中。通过将脾脏轻柔按压通过100μm尼龙筛网并用RPMI-1640培养基洗涤1次制备脾细胞的单细胞悬浮液。然后按照生产商的说明(Pharmingen)用NH₄Cl低渗裂解溶液使单细胞悬浮液缺失无核的红细胞。洗涤脾细胞2次，并重悬浮在PBS、0.5％BSA和0.2％叠氮化钠中。使用CD4PE⁺/CD25APC⁺/CD8和7-AAD存活率染料来免疫染色脾细胞，并通过流式细胞仪分析。所有染色都在抗CD16/CD32mAb2.4G2存在下进行，以封闭Fc受体结合介导的染色。

结果揭示，与高岩藻糖变体相比，在中等岩藻糖变体给药的小鼠中的T细胞活化更大，高岩藻糖变体需要用约4倍的抗体给药，以实现相同程度的T细胞活化(图15)。但是，低岩藻糖变体并不比中等岩藻糖变体更有活性，提示完全没有岩藻糖并不是在小鼠中实现低岩藻糖变体的最大增强的Fc功能所必需的。已知其中一种人低亲和性FcγRFcγRIIIA对Fc岩藻糖水平敏感，这些发现提示，小鼠可能比先前所认为的更紧密地模拟人细胞的Fc依赖性应答。

本文提及的所有出版物和专利都在此引入作为参考，用于描述和公开例如在出版物中描述的、可连同当前描述的发明一起使用的结构和方法。提供以上和整个本案中述及的出版物只是因为它们公开在本申请的申请日之前。即使存在在先发明，但本发明的内容仍然在这些公开内容之前。

序列表

<110>Centocor，Inc.

<120>用于生产具有增强的效应子功能的抗体恒定区的宿主细胞系

<130>CEN5110PCT

<150>60/712858

<151>2005-08-31

<150>60/713055

<151>2005-08-31

<160>11

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1263

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>1

atgcgggcat ggactggttc ctggcgttgg attatgctca ttctttttgc ctgggggacc  60

ttgttgtttt atataggtgg tcatttggtt cgagataatg accaccctga tcactctagc  120

agagaactct ccaagattct tgcaaagctt gaacgcttaa aacaacaaaa tgaagacttg  180

aggcgaatgg ctgagtctct acgaatacca gaaggcccca ttgaccaggg gacggctacg  240

ggaagagtcc gtgttttaga agaacagctt gttaaggcca aagaacagat tgaaaattac  300

aagaaacaag ccagaaatgg tctggggaag gatcatgaaa tcttaaggag gaggattgaa  360

aatggagcta aagagctctg gttttttcta caaagtgaac tgaagaaatt aaagcattta  420

gaaggaaatg aactccaaag acatgcagat gaaattcttt tggatttagg acaccatgaa  480

aggtctatca tgacggatct atactacctc agtcaaacag atggagcagg ggattggcgt  540

gaaaaagagg ccaaagatct gacagagctg gtccagcgga gaataactta tctccagaat  600

cccaaggact gcagcaaagc caggaagctg gtgtgtaaca tcaataaggg ctgtggctat  660

ggttgccaac tccatcacgt ggtctactgt ttcatgattg cttatggcac ccagcgaaca  720

ctcatcttgg aatctcagaa ttggcgctat gctactggtg gatgggagac tgtgtttaga  780

cctgtaagtg agacatgcac agacagatct ggcctctcca ctggacactg gtcaggtgaa  840

gtgaatgaca aaaatattca agtggtggag ctccccattg tagacagcct ccatcctcgg  900

cctccttact taccactggc tgttccagaa gaccttgcag atcgactcgt aagagtccat  960

ggtgatcctg cagtgtggtg ggtgtcccag ttcgtcaaat atttgattcg tccacaacct  1020

tggctagaaa aggaaataga agaagccacc aagaagcttg gcttcaaaca tccagtcatt  1080

ggagtccatg tcagacgcac agacaaagtg ggaacagagg cagccttcca tcccatcgaa  1140

gagtacatgg tacatgttga agaacatttt cagcttctcg cacgcagaat gcaagtggat  1200

aaaaaaagag tatatctggc taccgatgac cctgctttgt taaaggaggc aaagacaaag  1260

taa                                                                1263

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>Rattus norvegicus

<400>2

atggcaccca gcgaacac

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>Rattus norvegicus

<400>3

ctactggtgg atgggagact gtg              23

<210>4

<211>23

<212>DNA

<213>Rattus norvegicus

<400>4

cttggcttca aacatccagt cat              23

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>Rattus norvegicus

<400>5

gaacagaggc agccttccatc                 21

<210>6

<211>30

<212>DNA

<213>Rattus norvegicus

<400>6

tcatcttgga atctcagaat tggcgctatg       30

<210>7

<211>26

<212>DNA

<213>Rattus norvegicus

<400>7

tggagtccat gtcagacgca cagaca            26

<210>8

<211>447

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>基于人源化单克隆抗体重链

<400>8

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr

            20                 25                 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

        35                 40                 45

Gly Leu Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Pro Lys Phe

    50                 55                 60

Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe

65                 70                 75                 80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                 90                 95

Ala Arg Asp Asn Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro

            100                 105                 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

        115                 120                 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

    130                 135                 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145                 150                 155                 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

                165                 170                 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

            180                 185                 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn Hig Lys Pro Ser Asn

        195                 200                 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

    210                 215                 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

225                 230                 235                 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

                245                 250                 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

            260                 265                 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

        275                 280                 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

    290                 295                 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305                 310                 315                 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

                325                 330                 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

            340                 345                 350

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

        355                 360                 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

    370                 375                 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385                 390                 395                 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

                405                 410                 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

            420                 425                 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

             435                 440                 445

<210>9

<211>214

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>基于鼠轻链CDR的人源化单克隆抗体重链

<400>9

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Arg Lys Tyr

            20                  25                  30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly Glu Ser Pro Tyr

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Arg Thr Val Ala Ala

            100                 105                 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

        115                 120                 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

    130                 135                 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145                 150                 155                 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

                165                 170                 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

            180                 185                 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

        195                 200                 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210>10

<211>126

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>10

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Ser Tyr

            20                  25                  30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Ala Phe Met Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Lys Tyr Ala Asp Ser Val

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

 65                  70                  75

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Arg Asp Arg GlyIle Ala Ala Gly Gly Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Gly

            100                 105                 110

Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

        115                 120                 125

<210>11

<211>108

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>11

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1               5                   10                  15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Tyr Ser Tyr

            20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro

                85                  90                  95

Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

            100                 105

Claims (22)

1.得自大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCC 1662)的、用于生产抗体的分离的细胞系，所述细胞系生产糖基化多肽，所述糖基化多肽的特征在于，与使用YB2/0(ATCC 1662)生产的多肽相比，具有显著降低的岩藻糖含量。

2.权利要求1的细胞系，其中所述细胞系通过使大鼠杂交瘤细胞系YB2/0(C1083A)适应于在无动物蛋白的培养基CD-Hybridoma(CD-Hyb)中生长而由细胞系YB2/0(C1083A)开发，并命名为C1083B。

3.权利要求1的细胞系，其中所述细胞系为基于高转染效率、短平均倍增时间和在CD-Hyb中达到高细胞密度的能力中的至少一项而选择的C1083B的亚克隆，其中所述细胞系被命名为C1083E。

4.权利要求1的细胞系，其中fut8 mRNA水平低于野生型YB2/0细胞系的水平。

5.权利要求1的细胞系，其中根据对凝集素的抗性选择所述细胞系。

6.权利要求2的细胞系，其中所述细胞系的糖基化肽与野生型骨髓瘤细胞系和CHO细胞系生产的肽相比，具有显著减少的岩藻糖含量。

7.由权利要求1-6中任一项的转染宿主细胞系生产的抗体，其中所述分子的特征在于主要具有非岩藻糖基化N-联寡糖基团。

8.权利要求7的抗体，其中所述抗体与在野生型YB2/0细胞系中生产的抗组织因子抗体相比，具有增加的ADCC活性。

9.生物药物组合物，其包含与药学上可接受的载体组合的权利要求7的抗体。

10.生产抗体的方法，所述方法包括：

将编码所述抗体的多核苷酸序列转染入权利要求1的细胞系中；和

以可检测的或可回收的量表达所述抗体。

11.权利要求10的生产抗体的方法，其中由所述多核苷酸序列编码的抗体为人抗体。

12.权利要求10的生产抗体的方法，其中由所述多核苷酸序列编码的抗体为人源化抗体。

13.权利要求11或12的生产抗体的方法，其中由所述多核苷酸序列编码的抗体结合可连接至细胞表面的人多肽区域。

14.通过权利要求10的方法生产的抗体，其中由所述多核苷酸序列编码的回收抗体的特征在于主要具有非岩藻糖基化的N-联寡糖基团。

15.通过权利要求10的方法生产的抗体，其包含SEQ ID NO：9的轻链氨基酸序列和SEQ ID NO：8的重链氨基酸序列。

16.通过权利要求10的方法生产的抗体，其包含SEQ ID NO：11的轻链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO：10的重链可变区氨基酸序列。

17.治疗疾病或病症的方法，所述方法包括给受试者、细胞或组织施用权利要求14-16中任一项的抗体，或使受试者、细胞或组织接触权利要求14-16中任一项的抗体。

18.权利要求17的方法，其中所述疾病或病症为肿瘤疾病或免疫介导的疾病，在所述疾病中，期望破坏展示出所述抗体能够结合的多肽的细胞。

19.权利要求18的方法，其中所述抗体能够结合的多肽为人组织因子或人TNFα。

20.权利要求18的方法，其中所述疾病或病症的特征在于异常的血管发生，所述异常的血管发生选自类风湿性关节炎、黄斑变性、银屑病和糖尿病性视网膜病。

21.权利要求19的方法，其中所述疾病或病症的特征在于由所述细胞释放所述多肽。

22.本文公开的任何发明。

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