TWI831044B - 抗原結合分子、包含抗原結合分子的醫藥組合物以及製造及選擇抗原結合分子之方法 - Google Patents

Abstract

本案發明人等成功地製作包括對於第1抗原及和該第1抗原不同之第2抗原有結合活性但不和該第1抗原與該第2抗原同時結合之抗體可變區之彼此序列不同之多數抗原結合分子為主而成之資料庫。藉由使用本發明的資料庫，能取得對於第1抗原之結合能力增強之可變區、製造針對第1抗原及癌抗原之雙專一性抗體。再者，本案發明人等也成功地製作包括對於不同之3個抗原有結合活性但不會同時和該等抗原結合之抗體可變區的抗原結合分子。

Description

抗原結合分子、包含抗原結合分子的醫藥組合物以及製造 及選擇抗原結合分子之方法

本發明提供包括：能和不同的2個抗原(第1抗原及第2抗原)結合但是不會和兩抗原同時結合之抗體之可變區的抗原結合分子之集團(資料庫)、該資料庫之製造方法、使用該資料庫之包括共通L鏈可變區之雙專一性抗體之製造方法、及選擇含有對於第1抗原之結合增強之可變區的抗原結合分子的方法。本發明並提供包括會與不同的3個抗原(第1抗原、第2抗原及第4抗原)結合但不同時和該該3個抗原結合之抗體之可變區的抗原結合分子、含該抗原結合分子之醫藥組合物、以及此等之製造方法。

抗體在血漿中的安定性高、副作用少，故作為醫藥品受到重視(Nat.Biotechnol.(2005)23,1073-1078(非專利文獻1)及Eur J Pharm Biopharm.(2005)59(3),389-396(非專利文獻2))。抗體，不僅有和抗原結合之作用、致效劑作用、拮抗劑作用，尚可誘導ADCC(Antibody Dependent Cytotoxicity：抗體依存性障害活性)、ADCP(Antibody Dependent Cell phagocytosis：抗體依存性細胞吞噬作用)、CDC(補體依存性細胞傷害活性)此類由效應子細胞所致之細胞毒性活性(也稱為效應子機能)。尤其IgG1次型的抗體對於癌細胞顯示效應子機能，故在癌領域已有多數抗體醫藥品開發。

抗體為了表現ADCC、ADCP、CDC，抗體之Fc區，必須與NK細胞、巨噬細胞等效應子細胞中存在的抗體受體(FcγR)及各種補體成分結合。人之中，作為FcγR之蛋白質家族，已有人報告FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa、FcγRIIIb之異構體(isoform)，也有人報告各自的異型(allotype)(Immunol. Lett. (2002) 82, 57-65(非專利文獻3))。該等異構體(isoform)之中，FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIIa在細胞內分域帶有稱為ITAM(Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif)的分域，傳遞活化信號。而只有FcγRIIb在細胞內分域帶有稱為ITIM(Immunoreceptor Tyrosine-based Inhibitory Motif)的分域，傳遞抑制信號。任一FcγR已知均藉由免疫複合體等而被交聯，以傳遞信號(Nat. Rev. Immunol. (2008) 8, 34-47(非專利文獻4))。實際上，抗體在對於癌細胞發揮效應子機能時，於癌細胞膜上有多數個結合的抗體的Fc區，效應子細胞膜上的FcγR成為簇集，利用效應子細胞傳遞活化信號。其結果雖發揮殺細胞效果，但是FcγR的交聯只限於存在癌細胞附近的效應子細胞，所以免疫活化呈現只在癌細胞局部發生的情形。(Ann. Rev. Immunol. (1988). 6. 251-81(非專利文獻5))

天然型免疫球蛋白，於可變區和抗原結合，於不變區則和FcγR、FcRn、FcαR、FcεR此類受體、補體結合。於IgG之Fc區交互作用的一結合分子即FcRn，會和抗體之重鏈各結合1分子，所以據報告IgG型之抗體1分子會有2分子FcRn結合。但是FcγR和FcRn等不同，FcγR係於抗體之鉸鏈區及CH2分域交互作用，對於IgG型抗體1分子只有1分子結合(J. Bio. Chem., (20001) 276, 16469-16477)。又，FcγR與抗體之Fc區之結合，據顯示：抗體之鉸鏈區及CH2分域內的一些胺基酸殘基及CH2分域所結合之EU編號297號之Asn上附加的糖鏈係為重要(Chem. Immunol. (1997), 65, 88-110(非專利文獻6)、Eur. J. Immunol. (1993) 23, 1098-1104(非專利文獻7)、Immunol. (1995) 86, 319-324(非專利文獻8))。以此結合部位為中心，至今已有各種帶有FcγR結合特性的Fc區的變異體被研究，已獲得對於活化FcγR有更高結合活性的Fc區變異體(WO2000/042072(專利文獻1)、WO2006/019447(專利文獻2))。例如：Lazar等人，成功地藉由將人IgG1之EU編號239號之Ser、330之Ala、332之Ile各取代為Asn、Leu、Glu，而使人IgG1對於人FcγRIIIa(V158)之結合活性增加至約370倍(Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (2006) 103, 4005-4010(非專利文獻9)、WO2006/019447(專利文獻2))。此改變體比起野生型，對於FcγRIIIa與FcγIIb之結合活性之比(A/I比)成為約9倍。又，Shinkawa等人藉由使在EU編號297號之Asn附加之糖鏈之岩藻糖缺失，而成功地使對於FcγRIIIa之結合活性增加至約100倍(J. Biol. Chem. (2003) 278, 3466-3473(非專利文獻10))。利用該等方法，相對於天然型人IgG1，人IgG1之ADCC活性能大幅提高。

通常天然型IgG型之抗體，係利用其可變區(Fab)認識並結合1個抗原決定位，所以只會和1個抗原結合。而已知涉及癌、發炎的多種蛋白質，蛋白質彼此有時會交擾(crosstalk)。例如免疫病症中，已知有一些發炎性細胞介素(TNF, IL1、IL6)涉及(Nat. Biotech., (2011) 28, 502-10(非專利文獻11))。且已知癌獲得藥劑耐性的一機轉，係其他受體活化(Endocr Relat Cancer (2006) 13, 45-51(非專利文獻12))。在如此的情形，認識1個抗原決定位的通常的抗體，無法阻斷(block)多數蛋白質。

作為阻斷多數標靶的分子，已有人研究以1分子和2種以上的抗原結合的抗體(稱為雙專一性(Bispecific)抗體)。藉由將天然型IgG型抗體予以改良，能賦予對於不同的2個抗原(第1抗原與第2抗原)的結合活性(MAbs. (2012) Mar 1, 4(2))。所以，不僅是將2種以上的抗原以1個分子中和，也有藉由將帶有細胞毒性活性之細胞與癌細胞予以交聯而提高抗腫瘤活性的作用。至今，作為雙專一性(Bispecific)抗體之分子形式，已有人報告：在抗體之N末端、C末端附加抗原結合部位之分子(DVD-Ig、scFv-IgG)、抗體之2個Fab區有不同序列之分子(共通L鏈雙專一性抗體及混合融合瘤(hybrid hybridoma)、1個Fab區認識2個抗原的分子(Two-in-one IgG)、將CH3區的迴圈部位作為新抗原結合部位的分子(Fcab)(Nat. Rev. (2010), 10, 301-316(非專利文獻13)、Peds(2010), 23(4), 289-297(非專利文獻14))。任一雙專一性抗體均是以Fc區和FcγR交互作用，所以可保守抗體的效應子機能。因此雙專一性抗體對於認識的任一抗原，均會和FcγR同時結合並對於表現抗原的細胞呈現ADCC活性。

雙專一性抗體所認識之抗原若均為在癌專一性地表現的抗原，則對於任一抗原均對於癌細胞顯示細胞毒性活性，能期待比起認識1個抗原的通常抗體醫藥品有更高效率的抗癌效果。但是雙專一性抗體所認識之抗原中有任一抗原是在正常組織表現時、在免疫細胞表現的細胞時，會因和FcγR之交聯而傷害正常組織、釋出細胞介素(J. Immunol. (1999) Aug 1, 163(3), 1246-52(非專利文獻15))。其結果會誘導強副作用。

例如：已知Catumaxomab係認識在T細胞表現之蛋白質及在癌細胞表現的蛋白質(癌抗原)的雙專一性抗體。Catumaxomab以2個Fab各和癌抗原(EpCAM)與T細胞表現的CD3ε鏈結合。Catumaxomab藉由和癌抗原與CD3ε同時結合，會誘導T細胞所致之細胞毒性活性，藉由和癌抗原與FcγR同時結合，會誘導NK細胞、巨噬細胞等抗原展示細胞所致之細胞毒性活性。藉由利用2種細胞毒性活性，Catumaxomab利用腹腔內投予顯示於惡性腹水症有高治療效果，且已在歐洲獲認可。(Cancer Treat Rev. (2010) Oct 36(6), 458-67(非專利文獻16))進一步報告利用Catumaxomab投予而出現對於癌細胞有反應的抗體的例子，而解明：可誘導獲得性免疫(Future Oncol. (2012) Jan 8(1), 73-85(非專利文獻17))。由此結果，同時帶有由T細胞獲致之細胞毒性活性及介由FcγR之NK細胞、巨噬細胞等細胞獲致之作用兩者的抗體(特別稱為三官能(trifunctional)抗體)，因可期待強抗腫瘤效果及獲得性免疫誘導，故受人重視。

但是三官能(trifunctional)抗體即是於癌抗原不存在時，仍會和CD3ε與FcγR同時結合，故在癌細胞不存在的環境，表現CD3ε之T細胞與表現FcγR之細胞還是會交聯，而大量產生各種細胞介素。由於如此的癌抗原非依存性的各種細胞介素的產生誘導，目前三官能(trifunctional)抗體之投予係限於腹腔內(Cancer Treat Rev. 2010 Oct 36(6), 458-67(非專利文獻16))，由於嚴重的細胞介素風暴(cytokine storm)狀的副作用，全身投予極困難(Cancer Immunol Immunother. 2007 Sep;56(9):1397-406(非專利文獻18))。 又，習知技術之雙專一性抗體，由於第1抗原即癌抗原(EpCAM)和第2抗原即CD3ε兩者的抗原可能和FcγR同時結合，所以於分子結構無法避免由於FcγR和第2抗原之CD3ε之同時結合導致的如此的副作用。

近年來，藉由使用使對FcγR之結合活性減低的Fc區，已能提供避免副作用且同時引起T細胞所致細胞傷害活性之改良型抗體(WO2012/073985)。 但是如此的抗體，於分子結構上，也無法和癌抗原結合且和CD3ε與FcγR之2個免疫受體作用。 至今，尚未知有能避免副作用且同時以癌抗原專一性地使T細胞所致之細胞毒性活性與T細胞以外之細胞所致之細胞傷害活性兩者作用的抗體。 [先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]WO2000/042072 [專利文獻2]WO2006/019447 [非專利文獻]

[非專利文獻1] Nat. Biotechnol. (2005) 23, 1073-1078 [非專利文獻2] Eur J Pharm Biopharm. (2005) 59 (3), 389-396 [非專利文獻3] Immunol. Lett. (2002) 82, 57-65 [非專利文獻4] Nat. Rev. Immunol. (2008) 8, 34-47 [非專利文獻5] Ann. Rev. Immunol. (1988). 6. 251-81 [非專利文獻6] Chem. Immunol. (1997), 65, 88-110 [非專利文獻7] Eur. J. Immunol. (1993) 23, 1098-1104 [非專利文獻8] Immunol. (1995) 86, 319-324 [非專利文獻9] Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (2006) 103, 4005-4010 [非專利文獻10] J. Biol. Chem. (2003) 278, 3466-3473 [非專利文獻11] Nat. Biotech., (2011) 28, 502-10 [非專利文獻12] Endocr Relat Cancer (2006) 13, 45-51 [非專利文獻13] Nat. Rev. (2010), 10, 301-316 [非專利文獻14] Peds(2010), 23(4), 289-297 [非專利文獻15] J. Immunol. (1999) Aug 1, 163(3), 1246- 52 [非專利文獻16] Cancer Treat Rev. (2010) Oct 36(6), 458- 67 [非專利文獻17] Future Oncol. (2012) Jan 8(1), 73-85 [非專利文獻18] Cancer Immunol Immunother. 2007 Sep; 56(9):1397-406

(發明欲解決之課題)

本發明係有鑑於如此的狀況而生，其課題在於提供含有對於不同的2個抗原(第1抗原與第2抗原)有結合活性，但不同時和該等抗原結合之抗體可變區的抗原結合分子的集團(資料庫)、該資料庫之製造方法、使用該資料庫選擇或製造所望抗原結合分子之方法、及選擇含有對於第1抗原之結合增強之可變區的抗原結合分子的方法。又，本發明之課題在於提供含有能和不同的3個抗原（第1抗原、第2抗原及第4抗原）結合但不同時和該3個抗原結合之抗體可變區的抗原結合分子、含有該抗原結合分子之醫藥組合物、及此等之製造方法。 (解決課題之方式)

本案發明人等為了解決上述課題努力研究。其結果，本案發明人等藉由製作包含1個可變區係對於不同的2個抗原（第1抗原與第2抗原）有結合活性但對於該等抗原不同時結合之抗體之可變區，及與和該等抗原不同之抗原（第3抗原）結合之可變區之抗原結合分子，利用該抗原結合分子對於3個不同抗原的結合活性，而成功地使抗原結合分子產生的活性增強。再者，將能避免至今的多專一性抗原結合分子利用於作為醫藥品時據認為會成為副作用之原因的因和在不同的細胞上表現之抗原結合所導致的該不同的細胞間的交聯的抗原結合分子予以成功地製作。再者，成功地製作含有能和不同的2個抗原（第1抗原及第2抗原）結合，但不同時和兩抗原結合之抗體可變區之抗原結合分子資料庫之製作。此外，使用該資料庫成功地取得（選擇）對於所望之2種抗原有結合活性之抗原結合分子，並成功地取得（選擇）對於所望抗原之結合增強之可變區。再者，本案發明人等成功地製作含有能和不同的3個抗原（第1抗原、第2抗原及第4抗原）結合但不同時和該3個抗原結合之抗體可變區之抗原結合分子。

更具體而言，本發明係關於以下。 [1] 一種資料庫，係由序列彼此不同之複數的抗原結合分子為主而成， 其特徵為： 該抗原結合分子中之抗原結合域，係能和第1抗原及與該第1抗原為不同之第2抗原結合但不同時和該第1抗原與該第2抗原結合之抗體之可變區， 該第1抗原及該第2抗原中之任一抗原為CD3，另一抗原為在T細胞或其他之免疫細胞表面表現之分子。 [2] 如[1]之資料庫，其中，不同時和第1抗原與第2抗原結合之該可變區，係不同時和在各不同之細胞上表現之第1抗原與第2抗原結合之可變區。 [3] 如[1]或[2]之資料庫，其中，該可變區係被導入至少1個胺基酸之改變的可變區，且被改變之胺基酸為抗體之可變區之CDR1、CDR2、CDR3或FR3區域的胺基酸。 [4] 如[3]之資料庫，其中，被改變之胺基酸係選自抗體之H鏈可變區之Kabat編號31~35、50~65、71~74及95~102、及L鏈可變區之Kabat編號24~34、50~56及89~97中之至少1者之位置的胺基酸。 [5] 如[1]至[4]中任一項之資料庫，其中，該另一抗原係FcγR、TLR、凝集素、IgA、免疫檢查點分子、TNF超級家族分子、TNFR超級家族分子或NK受體分子。 [6] 如[1]至[5]中任一項之資料庫，其中，該抗原結合分子係抗體之可變區與病毒外殼蛋白質之至少一部分的融合多肽。 [7] 如[3]至[6]中任一項之資料庫，其中， 該至少1個胺基酸之改變係對於由序列辨識號：96記載之重鏈可變區序列及/或序列辨識號：53記載之輕鏈可變區序列所構成之模板序列導入， 該被改變之胺基酸係選自於以下任一者以上之位置的胺基酸： H鏈：31、52b、52c、53、54、56、57、61、98、99、100、100a、100b、100c、100d、100e、100f、100g（Kabat編號）； L鏈：24、25、26、27、27a、27b、27c、27e、30、31、33、34、51、52、53、54、55、56、74、77、89、90、92、93、94、96（Kabat編號）。 [8] 一種如[1]至[7]中任一項之資料庫之製造方法，包括以下的步驟(a)及(b)： (a) 將和第1抗原結合之抗體之可變區序列作為資料庫之模板序列，指定滿足以下的(i)至(iii)中之任一者以上之胺基酸改變的步驟； (i) 不使對於第1抗原之結合能力實質上帶來變化的改變； (ii) 不使ECM結合能力實質上帶來變化之改變；及 (iii) 向重鏈可變區之CDR1、CDR2、CDR3或FR3區域插入由1至25個殘基胺基酸構成之胜肽；及 (b) 設計包括編碼為該模板序列之核酸、及編碼為在該模板序列中具有該步驟(a)指定之1或多數胺基酸改變之彼此序列不同之可變區之核酸的資料庫的步驟。 [9] 如[8]之資料庫之製造方法，其中，使用序列辨識號：96記載之重鏈可變區序列及/或序列辨識號：53記載之輕鏈可變區序列作為該資料庫之模板序列而製造資料庫。 [10] 一種抗原結合分子之製造方法，該抗原結合分子包括能和為CD3之第1抗原及與該第1抗原為不同之第2抗原結合，但不同時和該第1抗原與該第2抗原結合之可變區； 包括以下的步驟(a)至(c)： (a) 使如[1]至[7]中任一項之資料庫接觸第2抗原的步驟； (b) 回收在該步驟(a)和第2抗原結合之抗原結合分子的步驟； (c) 從該步驟(b)回收之抗原結合分子之集團選擇包括不同時和第1抗原與該第2抗原結合之可變區之抗原結合分子的步驟。 [11] 如[10]之抗原結合分子之製造方法，其中，該第2抗原為FcγR、TLR、凝集素、IgA、免疫檢查點分子、TNF超級家族分子、TNFR超級家族分子或NK受體分子。 [12] 一種雙專一性抗體之製造方法，係使用以下列為特徵的資料庫： 由序列彼此不同之複數的抗原結合分子為主而成之資料庫，該抗原結合分子中之抗原結合域係由模板序列構成之抗體之可變區或該模板序列中具有至少1個胺基酸之改變之抗體之可變區，且係能和第1抗原及與該第1抗原為不同之第2抗原結合，但不同時和該第1抗原與該第2抗原結合之抗體之可變區； 包括以下的步驟(a)至(c)： (a) 選擇該資料庫之模板序列作為和第1抗原結合之可變區的步驟； (b) 選擇會和第2抗原結合但不和第1抗原結合之可變區作為和第2抗原結合之可變區的步驟，其包括以下的步驟(i)至(iv)： (i) 使該資料庫接觸第2抗原的步驟； (ii) 回收在該步驟(i)和第2抗原結合之抗原結合分子的步驟； (iii) 使在該步驟(ii)回收之抗原結合分子之集團接觸第1抗原的步驟；及 (iv) 選擇在該步驟(iii)未和第1抗原結合之抗原結合分子的步驟；及 (c) 製造包括在該步驟(a)選擇之會和第1抗原結合之可變區、及在該步驟(b)選擇之會和第2抗原結合之可變區之雙專一性抗體的步驟。 [13] 如[12]之雙專一性抗體之製造方法，其中，該第1抗原為CD3，該第2抗原為在癌組織專一性地表現之分子。 [14] 一種對於第1抗原之結合增強之可變區之選擇方法，包括以下步驟(a)至(c)： (a) 使如[1]至[7]中任一項之資料庫接觸第1抗原的步驟； (b) 回收在該步驟(a)和第1抗原結合之抗原結合分子的步驟；及 (c) 從在該步驟(b)和第1抗原結合之抗原結合分子之集團，選擇包括對於第1抗原之結合增強之可變區之抗原結合分子的步驟。 [15] 一種抗原結合分子，包括能和不同之3個抗原（第1抗原、和該第1抗原為不同之第2抗原、及和該第1抗原及該第2抗原為不同之第4抗原）結合但不同時和該3個抗原結合之抗體之可變區。 [16] 如[15]之抗原結合分子，更包括和與該3個抗原不同之第3抗原結合的可變區。 [17] 如[15]或[16]之抗原結合分子，其中，不同時和該3個抗原結合之該可變區，係不同時和在各不同之細胞上表現之第1抗原、第2抗原及第4抗原結合之可變區。 [18] 如[15]至[17]中任一項之抗原結合分子，更包括抗體之Fc區。 [19] 如[18]之抗原結合分子，其中，該Fc區對於FcγR之結合活性，比起天然型人IgG1抗體之Fc區對於FcγR之結合活性更低。 [20] 如[15]至[19]中任一項之抗原結合分子，其中，能和該3個抗原結合之該抗體之可變區係被導入了至少1個胺基酸之改變之可變區，且被改變之胺基酸係抗體之可變區之CDR1、CDR2、CDR3或FR3區域之胺基酸。 [21] 如[20]之抗原結合分子，其中，該被改變之胺基酸係選自抗體之H鏈可變區之Kabat編號31~35、50~65、71~74及95~102、及L鏈可變區之Kabat編號24~34、50~56及89~97中之至少1者之位置的胺基酸。 [22] 如[15]至[21]中任一項之抗原結合分子，其中，該第1抗原、第2抗原及第4抗原中之任一抗原係在T細胞表面專一性地表現之分子，其餘2個抗原係在T細胞或其他免疫細胞表面表現之分子。 [23] 如[22]之抗原結合分子，其中，該其餘的2個抗原係FcγR、TLR、凝集素、IgA、免疫檢查點分子、TNF超級家族分子、TNFR超級家族分子或NK受體分子。 [24] 如[16]至[23]之抗原結合分子，其中，該第3抗原係在癌組織專一性地表現之分子。 [25] 一種醫藥組合物，包括如[15]至[24]中任一項之抗原結合分子及醫學上可容許之擔體。 [26] 一種製造如[15]至[24]中任一項之抗原結合分子之方法，包括步驟(i)~(iv)： (i) 製作抗原結合分子的資料庫，該抗原結合分子係和不同之3個抗原(第1抗原、和該第1抗原為不同之第2抗原、及和該第1抗原及該第2抗原為不同之第4抗原)結合之抗體之可變區之至少1個胺基酸被改變之抗原結合分子，且包括該被改變之可變區之胺基酸之至少1者彼此不同之可變區的步驟； (ii) 從製作之資料庫之中選擇包括對於該3個抗原有結合活性但不同時和該3個抗原結合之可變區之抗原結合分子的步驟； (iii) 培養包括編碼為在步驟(ii)選擇之抗原結合分子之該可變區的核酸的寄主細胞，使包括能和該3個抗原結合但不同時和該3個抗原結合之抗體之可變區之抗原結合分子表現的步驟；及 (iv) 從該寄主細胞培養物回收抗原結合分子的步驟。 [27] 如[26]之抗原結合分子之製造方法，其中， 在步驟(ii)選擇之抗原結合分子包括之不同時和前述3個抗原結合之可變區，係不同時和在各不同之細胞上表現之該3個抗原結合的可變區。 [28] 如[26]或[27]之抗原結合分子之製造方法，其中，在步驟(iii)培養之寄主細胞更包括編碼為抗體之Fc區之核酸。 [29] 如[28]之抗原結合分子之製造方法，其中，前述Fc區對於FcγR之結合活性，比起天然型人IgG1抗體之Fc區對於FcγR之結合活性還低。 [30] 如[26]至[29]中任一項之抗原結合分子之製造方法，其中，製造之抗原結合分子為多專一性抗體。 [31] 如[26]至[30]中任一項之抗原結合分子之製造方法，其中，步驟(i)中之可變區之至少1個改變之胺基酸為取代或插入之胺基酸。 [32] 如[31]之抗原結合分子之製造方法，其中，插入之胺基酸之數目為1~25個。 [33] 如[26]至[32]中任一項之抗原結合分子之製造方法，其中，改變係抗體之可變區之CDR1、CDR2、CDR3或FR3區域之胺基酸之改變。 [34] 如[26]至[33]中任一項之抗原結合分子之製造方法，其中，改變係迴圈區域之胺基酸之改變。 [35] 如[26]至[33]中任一項之抗原結合分子之製造方法，其中，改變係選自抗體之H鏈可變區之Kabat編號31~35、50~65、71~74及95~102、及L鏈可變區之Kabat編號24~34、50~56及89~97中之至少1者之胺基酸之改變。 [36] 如[26]至[35]中任一項之抗原結合分子之製造方法，其中，前述第1抗原、第2抗原及第4抗原中之任一抗原為在T細胞表面專一性地表現之分子，其餘的2個抗原係在T細胞或其他免疫細胞表面表現之分子。 [37] 如[36]之抗原結合分子之製造方法，其中，前述第1抗原、第2抗原及第4抗原中之任一抗原為CD3，其餘的2個抗原係FcγR、TLR、IgA、凝集素、免疫檢查點分子、TNF超家族分子、TNFR超家族分子或NK受體分子。 [38] 如[26]至[37]中任一項之抗原結合分子之製造方法，其中，前述抗原結合分子更包括和與前述3個抗原不同之第3抗原結合之可變區。 [39] 如[38]之抗原結合分子之製造方法，其中，前述第3抗原係在癌組織專一性地表現之分子。 [40] 一種癌之治療方法，包括投予如[15]至[24]中任一項之抗原結合分子之步驟。 [41] 如[15]至[24]中任一項之抗原結合分子，係使用於治療癌。 [42] 一種如[15]至[24]中任一項之抗原結合分子之用途，係用於製造癌之治療劑。 [43] 一種製造癌之治療劑之處理，包括使用如[15]至[24]中任一項之抗原結合分子之步驟。 該技術領域之人士當然理解：將上述記載之1或多數態樣任意組合者，只要基於該技術領域之人士之技術常識在技術上不矛盾，則包括在本發明。

於一態樣，本發明係以序列彼此不同之複數之抗原結合分子為主而成之資料庫，其特徵為：前述抗原結合分子中之抗原結合域係能和第1抗原及與該第1抗原為不同之第2抗原結合，但不同時和該第1抗原與該第2抗原結合之抗體可變區（以下也稱為本發明之抗體可變區）。本發明之資料庫所含之抗原結合域中，較佳為前述第1抗原及前述第2抗原中之其中任一抗原為CD3，另一抗原為在T細胞或其他免疫細胞表面表的分子。

又，於另一態樣，本發明係關於包括能和不同之3個抗原（第1抗原、第2抗原及第4抗原）結合但不同時和該3個抗原之抗體可變區之抗原結合分子。在此，本發明中，「不同之3個抗原」係指第1抗原、和該第1抗原為不同之第2抗原、及和該第1抗原及該第2抗原為不同之第4抗原。

本說明書中，用語「不同之2個抗原」所含之各抗原係以「第1抗原」及「第2抗原」之用語表達，用語「不同之3個抗原」所含之各抗原係以「第1抗原」、「第2抗原」及「第4抗原」之用語表達。

再者，本發明係關於更包括和前述「不同之3個抗原」為不同之抗原即「第3抗原」結合之可變區的抗原結合分子。

本發明中「抗體之可變區」通常意指由4個框架區域(FR)及夾在其之間的3個互補性決定區域(complementarity- determining region；CDR)構成的區域，只要有和抗原之一部分或全部結合之活性即可，也包括其部分序列。尤其宜為包括抗體輕鏈可變區(VL)與抗體重鏈可變區(VH)之區域為較佳。本發明之抗體之可變區可為任意序列，也可為小鼠抗體、大鼠抗體、兔抗體、山羊抗體、駱駝抗體、及將該等非人抗體予以人化而成的人化抗體、及人抗體等任一來源的抗體之可變區。「人化抗體」，也稱為再構成(reshaped)人抗體。人以外的哺乳動物來源的抗體，例如係將小鼠抗體的互補性決定區域(CDR;complementarity determining region)移植到人抗體之CDR者。鑑別CDR的方法為公知(Kabat et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest (1987), National Institute of Health, Bethesda, Md.; Chothia et al., Nature (1989) 342: 877)。又，其一般的基因重組手法亦為公知（參照歐洲專利申請公開編號EP 125023號公報、WO 96/02576號公報）。

本發明之「抗體之可變區」，所謂「不和第1抗原與第2抗原同時結合」是指本發明之抗體之可變區在和第1抗原結合之狀態時，無法和第2抗原結合，反之該可變區在和第2抗原結合的狀態時，無法和第1抗原結合。亦即，本發明之「抗體之可變區（抗體可變區）」之「能夠和第1抗原及第2抗原結合，但不同時和該第1抗原與該第2抗原結合」或「和於第1抗原及第2抗原結合，且不同時和該第1抗原與該第2抗原結合」，係指本發明之抗體可變區在結合於第1抗原之狀態不能和第2抗原結合，在未結合於第1抗原之狀態能和第2抗原結合，反之，該可變區在結合於第2抗原之狀態不能和第1抗原結合，在未結合於第2抗原之狀態能和第1抗原結合。在此，「不和第1抗原與第2抗原同時結合」，也包括表現第1抗原表現之細胞與表現第2抗原之細胞之2個細胞不交聯，或不和分別在各自細胞表現的第1抗原與第2抗原同時結合。再者，也包括：第1抗原與第2抗原於係像可溶型蛋白質般不在細胞膜上、或兩者係存在於同一細胞上時，雖能和第1抗原與第2抗原兩者同時結合，但是在各自不同的細胞上表現時無法同時結合的情形。作為如此的抗體之可變區，只要有該機能即可，不特別限定，例如：將IgG型抗體之可變區之一部分胺基酸結合於所望抗原的方式改變而得之可變區。經改變之胺基酸，可選擇例如，和第1抗原或第2抗原結合之抗體之可變區之中，不因胺基酸改變而喪失和該抗原之結合的胺基酸。 在此，「於不同的細胞上表現」只要在各別細胞上表現即可，如此的細胞的組合，例如：T細胞和另一T細胞之類的同種細胞，也可為T細胞與NK細胞之類的異種細胞。

本發明之「抗體之可變區」「不同時和不同之3個抗原（第1抗原、第2抗原及第4抗原）結合」，係指本發明之抗體之可變區能同時結合之抗原為該不同之3個抗原（亦即3種抗原）之中，(A)任1種抗原、或(B)任2種抗原之組合。 換言之，本發明之抗體之可變區「不同時和不同之3個抗原（第1抗原、第2抗原及第4抗原）結合」，係指(A)在和該不同之3個抗原（3種抗原）中之任1種抗原結合之狀態，不能和其餘2種抗原結合，或(B)在和該不同之3個抗原（3種抗原）中之任2種抗原結合之狀態，不能和其餘1種抗原結合。上述(A)，具體而言，係指(i) 本發明之抗體之可變區在和第1抗原結合之狀態，該可變區不能和第2抗原結合也不能和第4抗原結合，(ii) 該可變區在和第2抗原結合之狀態，該可變區不能和第1抗原結合也不能和第4抗原結合，(iii) 該可變區在和第4抗原結合之狀態，該可變區不能和第1抗原結合也不能和第2抗原結合。上述(B)，具體而言，係指(i) 本發明之抗體之可變區在和第1抗原及第2抗原結合之狀態，該可變區不能和第4抗原結合，(ii) 本發明之抗體之可變區在和第1抗原及第4抗原結合之狀態，該可變區不能和第2抗原結合，(iii) 本發明之抗體之可變區在和第2抗原及第4抗原結合之狀態，該可變區不能和第1抗原結合。 本發明之抗體之可變區，宜不能同時和不同之3個抗原，亦即，不能同時和第1抗原、第2抗原及第4抗原結合，除此以外，也不同時和第1抗原及第2抗原結合、不同時和第1抗原及第4抗原結合，及/或不同時和第2抗原及第4抗原結合較佳。 最佳為本發明之抗體之可變區不同時和選自由第1抗原、第2抗原及第4抗原構成之群組中之至少2種以上之抗原結合（亦即，不同時和第1抗原與第2抗原之組合、第1抗原與第4抗原之組合、第2抗原與第4抗原之組合、第1抗原與第2抗原與第4抗原之組合結合）。 在此，「不同時和不同之3個抗原（第1抗原、第2抗原及第4抗原）結合」，也包括以下情形：選自由表現第1抗原之細胞、表現第2抗原之細胞、及表現第4抗原之細胞構成之群組中之2種以上之細胞不交聯、或不同時結合於在各自之細胞表現之由第1抗原、第2抗原及第4抗原構成之群組中之2種以上之抗原。再者，也包括以下的情形：不同之3個抗原（第1抗原、第2抗原及第4抗原）中之任1種以上之抗原不在如可溶型蛋白質之細胞膜上表現、或當不同之3個抗原中之任2種以上存在於同一細胞上時，對於此等抗原能同時結合，但當在各自不同的細胞上表現時不能同時結合。作為如此之抗體之可變區，只要有該機能即可，並不特別限定，例如，IgG型抗體之可變區之一部分胺基酸改變為結合於所望抗原之可變區。

本發明之胺基酸改變可單獨使用也可使用多種。 使用多種時，組合數不特別限定，可於能達成發明目的之範圍內適當設定，例如，2個以上30個以下，較佳為2個以上25個以下、2個以上22個以下、2個以上20個以下、2個以上15個以下、2個以上10個以下、2個以上5個以下、2個以上3個以下。 複數組合時，可只對抗體之重鏈可變區或輕鏈可變區施以該胺基酸改變，也可對於重鏈可變區與輕鏈可變區兩者適當區分施加。

改變的胺基酸殘基（改變胺基酸）只要能維持其抗原結合活性即可，可容許可變區中之1或多數胺基酸殘基改變。改變可變區之胺基酸時，不特別限定，宜維持改變前之抗體之結合活性較佳，例如：宜和改變前相較，有50%以上，較佳為80%以上，更佳為100%以上的結合活性。又，也可利用胺基酸改變而結合活性上昇，例如宜和結合活性改變前相較，成為2倍、5倍、10倍等。

作為用以胺基酸改變之理想區域，可列舉可變區中之露出於溶劑之區域及迴圈區域。其中，CDR1、CDR2、CDR3、FR3區域、及迴圈區域為較佳。具體而言，H鏈可變區之Kabat編號31~35、50~65、71~74、95~102、及L鏈可變區之Kabat編號24~34、50~56、89~97較理想，H鏈可變區之Kabat編號31、52a~61、71~74、97~101、及L鏈可變區之Kabat編號24~34、51~56、89~96更理想。又，胺基酸改變時，也可一併導入使和抗原之結合活性上昇的胺基酸。

又，本發明中「迴圈區域」，係指不涉及免疫球蛋白之β筒狀結構之維持的殘基所存在的區域。 本發明中，胺基酸之改變係指取代、缺失、附加、插入、或修飾中任一者、或此等的組合。本發明中，胺基酸之改變也可改稱胺基酸之變異，以相同含意使用。

取代胺基酸殘基時，目的為藉由取代為其他胺基酸殘基，而針對例如以下(a)~(c)的點加以改變。(a) 片結構、或、螺旋結構的區域中的多肽的骨幹結構；(b) 標的部位的電荷或疏水性、或(c) 側鏈大小。 胺基酸殘基依據一般側鏈的特性分類為以下群：(1) 疏水性：正白胺酸、met、ala、val、leu、ile；(2) 中性親水性：cys、ser、thr、asn、gln；(3) 酸性：asp、glu；(4) 鹼性：his、lys、arg；(5) 影響鏈配向之殘基：gly、pro；及(6) 芳香族性：trp、tyr、phe。

該等各群內的胺基酸殘基的取代稱為保守性取代，另一方面，他群間彼此的胺基酸殘基的取代稱為非保守性取代。 本發明中的取代可為保守性取代，也可為非保守性取代，且也可為保守性取代與非保守性取代之組合。

又，對於胺基酸殘基施加改變，也包括：從可和第1抗原或第2抗原結合之抗體之可變區當中不因胺基酸改變而喪失向該抗原之結合之胺基酸予以隨機改變者當中，選擇會和第1抗原與第2抗原結合但不能和該等抗原同時結合之可變區、或也包括預先將已知對於所望抗原有結合活性之胜肽插入到上述區域之改變。又，選擇會和第1抗原、第2抗原或第4抗原結合之抗體可變區當中，不因胺基酸改變而喪失向該抗原之結合之胺基酸予以隨機改變而得者之中能和第1抗原、第2抗原及第4抗原結合但和該等抗原不能同時結合的可變區、或預先將已知具有對於所望抗原有結合活性的胜肽插入上述區域之改變。預先已知對於所望抗原有結合活性的胜肽，例如：表1所示胜肽。

[表1]

本發明之一態樣中，提供一種抗原結合分子，包含以能和第1抗原以及和該第1抗原不同的第2抗原結合但是不和第1抗原與第2抗原同時結合的方式將重鏈可變區之胺基酸予以改變而得之抗體之可變區。本發明之另一態樣提供一種抗原結合分子，包括以能和不同的3個抗原（第1抗原、第2抗原、及第4抗原）結合但不和該3個抗原同時結合的方式改變重鏈可變區之胺基酸的抗體可變區。例如，藉由將上述胺基酸改變（取代、缺失、附加、插入、或修飾中之任一者、或此等之組合）導入到重鏈可變區，能製作可和第1抗原以及與該第1抗原不同之第2抗原結合但不和第1抗原與第2抗原同時結合的抗體之可變區，或是能和不同的3個抗原（第1抗原、第2抗原、及第4抗原）結合但不和該3個抗原同時結合之抗體可變區。導入胺基酸改變的位置宜為重鏈可變區，作為更理想的區域，可列舉可變區中露出於溶劑之區域及迴圈區域。其中，CDR1、CDR2、CDR3、FR3區域、及迴圈區域為較佳。具體而言，H鏈可變區之Kabat編號31~35、50~65、71~74、95~102較理想，H鏈可變區之Kabat編號31、52a~61、71~74、97~101更理想。又，胺基酸改變時，也可一併導入使和抗原之結合活性上昇的胺基酸。

本發明之抗體之可變區，除了上述改變，還可組合公知之改變。例如：可變區之N末端之麩醯胺酸利用焦麩胺醯基化而修飾為焦麩胺酸係該領域中通常知識者熟知的修飾。因此本發明之抗體，於其重鏈之N末端為麩醯胺酸時，包括其修飾成焦麩胺酸而成的可變區。

又，例如：對於該等抗體之可變區，為了改善向抗原之結合、藥物動態、安定性、抗原性，也可進一步導入胺基酸改變。本發明之抗體之可變區，可藉由施以對抗原有pH依存性結合性之改變，能對抗原重複結合(WO/2009/125825)。

又，例如：也可對於該等抗體之和第3抗原結合之可變區，施加能因應標的組織專一性化合物之濃度而改變對於抗原之結合活性之胺基酸改變(WO2013/180200)。

又，可變區之改變會使結合活性上升、專一性改善、pI下降，對於抗原之結合賦予pH依存的性質、結合熱安定性改善、溶解性改善、對於化學修飾之安定性、來自於糖鏈之異質性(heterogeneity)之改善、免疫原性下降的現象，可使用經電腦模擬(in silico)預測鑑定，或利用使用體外(in vitro)的T細胞的分析鑑定之T細胞抗原決定部位的規避、或活化調節性T細胞之T細胞抗原決定部位之導入等作為目的而實施(mAbs 3:243-247、2011)

本發明之抗體之可變區是否「能和第1抗原與第2抗原結合」，可使用公知之方法測定。 例如，可利用電化學發光法(ECL法)測定(BMC Research Notes 2011, 4:281)。 具體而言，例如：使由經生物素標記之待驗抗原結合分子之能和第1抗原與第2抗原結合之區域，例如，由Fab區構成之低分子化抗體、或一價性抗體（通常的抗體所擁有之2個Fab區中的1個沒有的抗體），混合經sulfo-tag(Ru錯合物)標記的第1抗原或第2抗原，添加在鏈黴抗生物素蛋白固相化板上。此時經生物素標記之待驗抗原結合分子會與板上之鏈黴抗生物素蛋白結合。藉由使Sulfo-tag發光，利用ector Imager 600、2400(MSD)等以檢測其發光信號，能確認第1抗原或第2抗原和待驗抗原結合分子之上述區域間之結合。 又，也可利用ELISA、FACS(fluorescence activated cell sorting)、ALPHAscreen(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)、利用表面電漿子共振(SPR)現象之BIACORE法等進行測定(Proc.Natl.Acad.Sci.USA (2006) 103 (11), 4005-4010)。

具體而言，例如，可使用利用表面電漿子共振(SPR)現象之交互作用解析設備Biacore(GE Healthcare)測定。Biacore包括Biacore T100、T200、X100、A100、4000、3000、2000、1000、C等任一機種。感應晶片可使用CM7、CM5、CM4、CM3、C1、SA、NTA、L1、HPA，Au晶片等任一Biacore用感應晶片。於感應晶片上利用胺偶聯、雙硫鍵偶聯、醛偶聯等偶聯方法將捕捉本發明之抗原結合分子捕捉之ProteinA、ProteinG、ProteinL、抗人IgG抗體、抗人IgG-Fab、抗人L鏈抗體、抗人Fc抗體、抗原蛋白質、抗原胜肽等捕捉用蛋白質固定化。使第1抗原或第2抗原作為分析物流入此晶片，並測定交互作用，取得感應圖。此時之第1抗原或第2抗原濃度，可配合測定樣本之KD等交互作用的強度，於數μM至數pM之範圍內實施。

又，也可不是固定抗原結合分子，而是將第1抗原或第2抗原固定在感應晶片上，並使其和欲評價之抗體樣本交互作用。從交互作用之感應圖算出之解離常數(KD)值、或使抗原結合分子樣本作用前後之感應圖之增加程度，能判斷本發明之抗原結合分子之抗體可變區是否對於第1抗原或第2抗原有結合活性。

ALPHAscreen，係使用提供者(donor)與接受者(acceptor)的2種珠粒，利用ALPHA技術依下列原理實施。和提供者珠粒已結合的分子，會與和接受者珠粒已結合的分子進行生物學交互作用，而僅於2個珠粒接近的狀態時方檢測到發光信號。因雷射而激發的提供者珠粒內的光敏劑會將周圍的氧變換為激發狀態之單線態氧。單線態氧向提供者珠粒周邊擴散，若到達接近的接受者珠粒，則引起珠粒內的化學發光反應，最終放出光。若與提供者珠粒結合之分子和與接受者珠粒結合之分子不交互作用時，提供者珠粒產生之單線態氧不會到達接受者珠粒，不引起化學發光反應。

將觀察交互作用的物質中之一者（配體）固定在感應晶片的金薄膜上，若光從感應晶片的內側照到金薄膜與玻璃之交界面而發生全反射，則會形成反射光的一部分的反射強度降低的部分（SPR信號）。若觀察交互作用之物質的另一者（分析物）流到感應晶片表面並且配體和分析物結合，則固定化配體分子的質量增加，並且感應晶片表面之溶劑之折射率變化。由於此折射率之變化，PR信號之位置偏移（反之若結合解離，則信號位置回復）。Biacore系統取上述偏移之量，亦即在感應晶片表面的質量變化為縱軸，將質量之時間變化作為測定數據顯示（感應圖）。從感應圖求出分析物對於在感應晶片表面捕捉之配體的結合量（使分析物交互作用前後在感應圖上之回應之變化量）。惟，結合量也依存於配體量，所以比較時，須在將配體量視為本質為同量的條件下進行比較。又，從感應圖的曲線可求出動力學：結合速度常數(ka)與解離速度常數(kd)，從該常數之比可求出親和性(KD)。BIACORE法也可理想地用在抑制測定法。抑制測定法例如記載於Proc.Natl.Acad. Sci.USA (2006) 103 (11), 4005-4010。

本發明之抗體之可變區是否「能結合於不同之3個抗原（第1抗原、第2抗原、及第4抗原）」，可由該技術領域中具有通常知識者依據上述公知方法，例如使用電化學發光法(ECL)法適當測定。

本發明之抗原結合分子是否「不和第1抗原與第2抗原同時結合」，可使用上述方法測定以下事項以確認：確認對於第1抗原及第2抗原有結合活性後，對於包括有該結合活性之可變區之抗原結合分子，先使第1抗原或第2抗原中任一者結合後，確認是否和其餘的一者有結合活性。 又，抗原結合分子向已固定在ELISA板或感應晶片之第1抗原或第2抗原中任一者的結合，也可藉由測定是否因將另一者添加在溶液中能抑制以確認。

具體而言，例如，使用ECL法時，準備經生物素標記之待驗抗原結合分子、經sulfo-tag(Ru錯合物)標記之第1抗原與未經標記之第2抗原。待驗抗原結合分子能和第1抗原與第2抗原結合但不和第1抗原與第2抗原同時結合的情形，於未經標記之第2抗原非存在下，將待驗抗原結合分子與第1抗原之混合物添加到鏈黴抗生物素蛋白固相化板上，使Sulfo-tag發光的話，會檢測到其發光信號，但於第2抗原存在下則發光信號減少。藉由將此發光信號之減少予以定量，可決定相對的結合活性。

又，ALPHAscreen的情形，於互相競爭的第2抗原非存在下，待驗抗原結合分子會和第1抗原交互作用並產生520-620nm的信號。未標記的第2抗原會和待驗抗原結合分子與第1抗原間之交互作用進行競爭。將競爭之結果表達出的螢光減少予以定量，可決定相對的結合活性。多肽使用Sulfo-NHS-生物素等予以生物素化係為公知。將第1抗原以GST予以加標籤的方法，可適當採用以下方法：把將編碼為第1抗原之多核苷酸與編碼為GST之多核苷酸於讀框內融合成的融合基因於保持能表現之載體的細胞等中表現，並使用谷胱甘肽管柱精製之方法等。獲得之信號例如使用GRAPHPAD PRISM(GraphPad公司、San Diego)等軟體，以利用非線形迴歸解析之一部位競爭(one-site competition)模型擬合，可理想地解析。此時，第2抗原予以標籤化、第1抗原不標籤化，也可同樣地解析。 又，也可使用利用螢光共振能量移動(FRET; Fluorescence Resonance Energy Transfer)之方法。FRET係接近的2個螢光分子之間，激發能量因電子共振而直接移動的現象。若發生FRET，提供者（處於激發狀態之螢光分子）的激發能量會向接受者（處於提供者附近的另1個螢光分子）移動，所以從提供者發射的螢光消失（正確說，是螢光壽命縮短），而代之以從接受者發射螢光。使用此現象能解析是否為雙Fab(dual-Fab)。例如，若已導入螢光提供者之第1抗原與已導入螢光接受者的第2抗原和待驗抗原結合分子同時結合，則提供者之螢光消失，且從接受者發出螢光，故出現螢光波長變化。如此的抗體可判斷不是雙Fab(dual-Fab)。另一方面，將第1抗原、第2抗原、待驗抗原結合分子混合時，若已和第1抗原結合之螢光提供者之螢光波長不變化，可判斷此待驗抗原結合分子為雙Fab(dual-Fab)。

又，例如，於提供者珠粒，有生物素標記之待驗抗原結合分子會和提供者珠粒上之鏈黴抗生物素蛋白結合，接受者珠粒則有經谷胱甘肽S轉移酶(GST)標籤化的第1抗原結合。於競爭之第2抗原非存在下，待驗抗原結合分子與第1抗原會交互作用並發出520-620nm之信號。未經標籤化的第2抗原，會和待驗抗原結合分子與第1抗原間之交互作用競爭。藉由將競爭之結果表達之螢光之減少予以定量，可決定相對的結合活性。將多肽使用Sulfo-NHS-生物素等予以生物素化係公知。作為將第1抗原以GST標籤化的方法，可適當採用以下方法：把將編碼為第1抗原之多核苷酸與編碼為GST之多核苷酸於讀框內融合成的融合基因於保持能表現之載體的細胞等中表現，並使用谷胱甘肽管柱精製之方法等。獲得之信號例如使用GRAPHPAD PRISM(GraphPad公司、San Diego)等軟體，以利用非線形迴歸解析之一部位競爭(one-site competition)模型擬合，可理想地解析。

又，加標籤不限GST，也可為如組胺酸標籤、MBP、CBP、Flag標籤、HA標籤、V5標籤、c-myc標籤等的標籤，無限定。又，針對待驗抗原結合分子向提供者珠粒之結合，不限於利用生物素-鏈黴抗生物素蛋白反應之結合。尤其待驗抗原結合分子包括Fc時，可考慮介由提供者珠粒上之Protein A、Protein G等Fc認識蛋白質使待驗抗原結合分子結合之方法。

又，針對第1抗原與第2抗原為可溶型蛋白質般未在細胞膜上表現時，或兩者存在於同一細胞上時，能和第1抗原與第2抗原兩者同時結合，但分別在不同的細胞上表現時，無法同時結合的情形，也可使用公知方法測定。 具體而言，即使在檢測對於第1抗原與第2抗原同時結合之ECL-ELISA為陽性，若分別表現第1抗原之細胞與表現第2抗原之細胞及待驗抗原結合分子混合時，此等3者不同時結合，則代表在不同的細胞上表現時無法同時結合。例如：可利用使用細胞之ECL-ELISA法測定。預先將表現第1抗原之細胞固定於板，使待驗抗原結合分子結合後，加入表現第2抗原之細胞。藉由使用只在表現第2抗原之細胞中表現的對抗其他抗原之sulfo-tag標記抗體進行檢測，於和在2個細胞上表現的2個抗原同時結合的情形，會觀測到信號，未同時結合時則未觀測到信號。 或也可利用alphascreen法測定。當經已結合提供者珠粒之表現第1抗原之細胞、與已結合接受者珠粒之表現第2抗原之細胞、與待驗抗原結合分子混合時，於和在2個細胞上表現的2個抗原同時結合的情形，會觀測到信號，未同時結合時則未觀測到信號。 或可利用使用Octet之交互作用解析法測定。首先，使附加胜肽標籤之表現第1抗原之細胞結合於認識胜肽標籤之生物感測子(biosensor)。在已放入表現第2抗原之細胞與待驗抗原結合分子的井內進行交互作用解析時，若和在2個細胞上表現的2個抗原同時結合，則待驗抗原結合分子與表現第2抗原之細胞因為和生物感測子結合而觀測到大的波長偏移，未同時結合時，只有待驗抗原結合分子和生物感測子結合，故觀測到小的波長偏移。

或也可不利用結合活性，而是利用生物活性測定。例如：當將表現第1抗原之細胞與表現第2抗原之細胞與待驗抗原結合分子進行混合培養時，當和在2個細胞上表現之2個抗原同時結合時，因介由待驗抗原結合分子而相互活化，故可檢測到各抗原的下游的磷酸化增加等活化信號的變化。或就活化之結果，誘導細胞介素產生，故藉由測定細胞介素之產生量，可判斷是否和2個細胞同時結合。

本發明之抗原結合分子是否「不同時和不同之3個抗原結合」，例如可確認對於不同之3個抗原（第1抗原、第2抗原、及第4抗原）有結合活性後，依據上述公知方法，使用例如電化學發光法(ECL)法等由該技術領域中有通常知識者適當測定。

本發明中，「Fc區」係指包括由抗體分子中之鉸鏈部或其一部分、CH2、CH3分域之片段的區域。IgG類別的Fc區，以EU編號(本說明書也稱為EU INDEX)，指例如226號之半胱胺酸至C末端、或230號之脯胺酸至C末端，但不限於此。Fc區，可藉由將IgG1、IgG2、IgG3、IgG4單株抗體等以胃蛋白酶等蛋白質分解酵素進行部分消化後，將已吸附於蛋白質A管柱或蛋白質G管柱之級分予以再溶出以理想地取得。作為該蛋白分解酵素，只要是可利用適當設定pH等酵素的反應條件，以限制性地產生Fab、F(ab') ₂的方式將全長抗體消化者即可，無特殊限定，例如：胃蛋白酶、木瓜酶等。

本發明中，「抗原結合分子」只要是包括本發明之「抗體之可變區」的分子即可，不特別限定，也包括有5個胺基酸左右以上的長度的胜肽、蛋白質。不限於生物來源的胜肽、蛋白質，例如，可為由人工設計的序列構成的多肽。又，天然多肽、或合成多肽、重組多肽等均可。

本發明之抗原結合分子之理想例，可舉包括抗體之Fc區之抗原結合分子。

本發明之「Fc區」，可使用例如：天然型IgG來源的Fc區。在此，天然型IgG，係指包括和天然發現的IgG有同一胺基酸序列，且屬於利用免疫球蛋白gamma基因實質編碼的抗體的類別的多肽。例如天然型人IgG，係指天然型人IgG1、天然型人IgG2、天然型人IgG3、天然型人IgG4等。天然型IgG也包括由其自然產生之變異體等。作為人IgG1、人IgG2、人IgG3、人IgG4抗體之不變區，因基因多型所得之多數異型序列已記載於Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242，本發明中可為其任一者。尤其人IgG1之序列，EU編號356-358號之胺基酸序列為DEL也可為EEM。

抗體之Fc區，例如存在IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM類型的Fc區。本發明之抗體之Fc區，可使用例如天然型人IgG抗體來源的Fc區。作為本發明之Fc區，可使用例如：天然型IgG之不變區，具體而言，以天然型人IgG1為起源之不變區（序列辨識號：1）、以天然型人IgG2為起源之不變區（序列辨識號：2）、以天然型人IgG3為起源之不變區（序列辨識號：3）、以天然型人IgG4為起源之不變區（序列辨識號：4）來源的Fc區。天然型IgG之不變區也包括由此自然產生的變異體等。

作為本發明之Fc區，對於其Fcγ受體之結合活性低的Fc區為較佳。在此，Fcγ受體（本說明書有時記載為Fcγ受體、FcγR或Fcγ受體），係指能和IgG1、IgG2、IgG3、IgG4之Fc區結合之受體，也意指實質上由Fcγ受體基因編碼的蛋白質家族的各種成員。人的話，此家族包括：含有FcγRIa、FcγRIb及FcγRIc之FcγRI(CD64)；FcγRIIa（包含異型H131(H型)及R131(R型)）、FcγRIIb（包含FcγRIIb-1及FcγRIIb-2）及包含FcγRIIc之FcγRII(CD32)；及含有FcγRIIIa（包含異型V158及F158）及FcγRIIIb（包含異型FcγRIIIb-NA1及FcγRIIIb-NA2）之FcγRIII(CD16)、及各種未發現的人FcγR類或FcγR或異型，但不限於此等。FcγR包括人、小鼠、大鼠、兔及猴來源者，但不限於此等，可為各種生物來源。小鼠FcγR類，包括FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)及FcγRIII-2(CD16-2)、及各種未發現的小鼠FcγR類或FcγR或異型，但不限於此等。如此的Fcγ受體的理想例，可列舉人FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)、FcγRIIb(CD32)、FcγRIIIa(CD16)及/或FcγRIIIb(CD16)。

FcγR存在帶有ITAM(Immunoreceptor tyrosine- based activation motif)之活性型受體與帶有ITIM(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif)之抑制型受體。FcγR分類為：FcγRI、FcγRIIa R、FcγRIIa H、FcγRIIIa、FcγRIIIb之活性型FcγR、及FcγRIIb之抑制型FcγR。 FcγRI之多核苷酸序列及胺基酸序列各記載於NM_000566.3及NP_000557.1，FcγRIIa之多核苷酸序列及胺基酸序列各記載於BC020823.1及AAH20823.1，FcγRIIb之多核苷酸序列及胺基酸序列各記載於BC146678.1及AAI46679.1，FcγRIIIa之多核苷酸序列及胺基酸序列各記載於BC033678.1及AAH33678.1，及FcγRIIIb之多核苷酸序列及胺基酸序列各記載於BC128562.1及AAI28563.1（RefSeq註冊編號）。又，FcγRIIa存在FcγRIIa之131號之胺基酸取代為組胺酸(H型)或精胺酸(R型)的2種基因多型(J. Exp. Med, 172, 19-25, 1990)。又，FcγRIIb存在FcγRIIb之232號之胺基酸取代為異白胺酸(I型)或蘇胺酸(T型)之2種基因多型(Arthritis. Rheum. 46: 1242-1254 (2002))。又，FcγRIIIa存在FcγRIIIa之158號之胺基酸取代為纈胺酸(V型)或苯丙胺酸(F型)之2種基因多型(J. Clin. Invest. 100(5): 1059-1070 (1997))。又，FcγRIIIb存在NA1型、NA2型之2種基因多型(J. Clin. Invest. 85: 1287-1295 (1990))。

對於Fcγ受體之結合活性是否低落，可依FACS、ELISA格式、ALPHAscreen(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)、利用表面電漿子共振(SPR)現象之BIACORE法等周知方法確認(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010)。 ALPHAscreen，係使用提供者(donor)與接受者(acceptor)的2種珠粒，利用ALPHA技術依下列原理實施。和提供者珠粒已結合的分子，會與和接受者珠粒已結合的分子進行生物學交互作用，而僅於2個珠粒接近的狀態時方檢測到發光信號。因雷射而激發的提供者珠粒內的光敏劑會將周圍的氧變換為激發狀態之單線態氧。單線態氧向提供者珠粒周邊擴散，若到達接近的接受者珠粒，則引起珠粒內的化學發光反應，最終放出光。若與提供者珠粒結合之分子和與接受者珠粒結合之分子不交互作用時，提供者珠粒產生之單線態氧不會到達接受者珠粒，不引起化學發光反應。

例如，提供者珠粒有經生物素標記之抗原結合分子結合，接受者珠粒有經谷胱甘肽S轉移酶(GST)加標籤之Fcγ受體結合。於有競爭之變異Fc區之抗原結合分子非存在下，有野生型Fc區之抗原結合分子與Fcγ受體交互作用並產生520-620nm之信號。有未加標籤的變異Fc區的抗原結合分子，會和有野生型Fc區之抗原結合分子與Fcγ受體間之交互作用競爭。藉由將表達競爭之結果之螢光之減少予以定量，可決定相對的結合親和性。將抗體等抗原結合分子使用Sulfo-NHS-生物素等予以生物素化係公知。Fcγ受體以GST予以加標籤之方法，可適當採用以下方法：把將編碼為Fcγ受體之多核苷酸與編碼為GST之多核苷酸於讀框內融合成的融合基因於保持能表現之載體的細胞等中表現，並使用谷胱甘肽管柱精製之方法等。獲得之信號例如使用GRAPHPAD PRISM(GraphPad公司、San Diego)等軟體，以利用非線形迴歸解析之一部位競爭(one-site competition)模型擬合，可理想地解析。

將觀察交互作用的物質中之一者(配體)固定在感應晶片的金薄膜上，若光從感應晶片的內側照到金薄膜與玻璃之交界面而發生全反射，則會形成反射光的一部分的反射強度降低的部分（SPR信號）。若觀察交互作用之物質的另一者（分析物）流到感應晶片表面並且配體和分析物結合，則固定化配體分子的質量增加，並且感應晶片表面之溶劑之折射率變化。由於此折射率之變化，SPR信號之位置偏移（反之若結合解離，則信號位置回復）。Biacore系統取上述偏移之量，亦即在感應晶片表面的質量變化為縱軸，將質量之時間變化作為測定數據顯示（感應圖）。又，從感應圖的曲線可求出動力學：結合速度常數(ka)與解離速度常數(kd)，從該常數之比可求出親和性(KD)。BIACORE法也可理想地用在抑制測定法。抑制測定法例如記載於Proc.Natl.Acad.Sci.USA (2006) 103 (11), 4005-4010。

本說明書中，對於Fcγ受體之結合活性低落，例如指基於上述解析方法，和包括作為對照之Fc區之抗原結合分子之結合活性進行比較，待驗抗原結合分子之結合活性為50%以下，較佳為45%以下、40%以下、35%以下、30%以下、20%以下、15%以下，尤佳為10%以下、9%以下、8%以下、7%以下、6%以下、5%以下、4%以下、3%以下、2%以下、1%以下之結合活性者。 作為對照之抗原結合分子，可適當使用有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4單株抗體之Fc區之抗原結合分子。該Fc區之結構記載於序列辨識號：1（RefSeq註冊編號AAC82527.1之N末有A附加）、序列辨識號：2（RefSeq註冊編號AAB59393.1之N末有A附加）、序列辨識號：3（RefSeq註冊編號CAA27268.1之N末有A附加）、序列辨識號：4（RefSeq註冊編號AAB59394.1之N末有A附加）。又，使用有特定抗體之Fc區之變異體的抗原結合分子作為待驗物質時，藉由使用有該特定之抗體之Fc區之抗原結合分子作為對照，可驗證該變異體擁有之變異所致對於Fcγ受體之結合活性的效果。依上述，可適當製作已驗證有對於Fcγ受體之結合活性低落的Fc區之變異體的抗原結合分子。

作為如此的變異體，例如依EU編號指定的胺基酸231A-238S之缺失(WO 2009/011941)、C226S, C229S, P238S, (C220S)(J.Rheumatol (2007) 34, 11)、C226S, C229S(Hum. Antibod.Hybridomas (1990) 1(1), 47-54)、C226S, C229S, E233P, L234V, L235A(Blood (2007) 109, 1185-1192)等變異體為公知。 亦即，具有構成特定抗體之Fc區之胺基酸中依EU編號指定之下列任一胺基酸；220位、226位、229位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、264位、265位、266位、267位、269位、270位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、325位、327位、328位、329位、330位、331位、332位有取代之Fc區之抗原結合分子為理想例。Fc區之起源抗體之不特別限定，可適當利用以IgG1、IgG2、IgG3或IgG4單株抗體為起源之Fc區，可適當利用以天然型人IgG1抗體為起源之Fc區。 例如，具施以構成IgG1抗體之Fc區之胺基酸之中依EU編號指定之下列任一取代的Fc區、或具231位至238位之胺基酸序列缺失之Fc區的抗原結合分子也可適當使用（數字代表依EU編號指定之胺基酸殘基之位置、位於數字前之單字母胺基酸記號代表取代前之胺基酸殘基、位於數字後之單字母胺基酸記號代表取代前之胺基酸殘基）； (a) L234F、L235E、P331S、 (b) C226S、C229S、P238S、 (c) C226S、C229S、 (d) C226S、C229S、E233P、L234V、L235A。

又，具有施以構成IgG2抗體之Fc區之胺基酸中之依EU編號指定之下列任一取代的Fc區的抗原結合分子也可適當使用（數字代表依EU編號指定之胺基酸殘基之位置、位於數字前之單字母胺基酸記號代表取代前之胺基酸殘基、位於數字後之單字母胺基酸記號代表取代前之胺基酸殘基）； (e) H268Q、V309L、A330S、P331S (f) V234A (g) G237A (h) V234A、G237A (i) A235E、G237A (j) V234A、A235E、G237A。

又，也可適當使用具有施以構成IgG3抗體之Fc區之胺基酸中之依EU編號指定之下列任一取代之Fc區的抗原結合分子（數字代表依EU編號指定之胺基酸殘基之位置、位於數字前之單字母胺基酸記號代表取代前之胺基酸殘基、位於數字後之單字母胺基酸記號代表取代前之胺基酸殘基）； (k) F241A (l) D265A (m) V264A。

又，也可適當使用具有施以構成IgG4抗體之Fc區之胺基酸中之依EU編號指定之下列任一取代之Fc區之抗原結合分子（數字代表依EU編號指定之胺基酸殘基之位置、位於數字前之單字母胺基酸記號代表取代前之胺基酸殘基、位於數字後之單字母胺基酸記號代表取代前之胺基酸殘基）； (n) L235A、G237A、E318A (o) L235E (p) F234A、L235A。

作為其他理想例，可列舉具有構成天然型人IgG1抗體之Fc區之胺基酸中之依EU編號指定之下列任一胺基酸；233位、234位、235位、236位、237位、327位、330位、331位取代為對應之IgG2或IgG4中之其EU編號所對應之胺基酸之Fc區的抗原結合分子。

作為其他理想例，可列舉具有構成天然型人IgG1抗體之Fc區之胺基酸中之依EU編號指定之下列任一或更多胺基酸；234位、235位、297位取代為其他胺基酸之Fc區的抗原結合分子為理想例。取代後存在之胺基酸之種類不特別限定，具234位、235位、297位中之任一或更多的胺基酸取代為丙胺酸之Fc區之抗原結合分子尤佳。

作為其他理想例，具有構成IgG1抗體之Fc區之胺基酸中之依EU編號指定之下列任一胺基酸；265位取代為其他胺基酸之Fc區之抗原結合分子為理想例。取代後存在之胺基酸之種類不特別限定，尤其具265位之胺基酸取代為丙胺酸之Fc區之抗原結合分子尤佳。

又，本發明之「抗原結合分子」之理想態樣之一，可列舉包含本發明之抗體之可變區之多專一性抗體。

多專一性抗體之締合化可應用在抗體H鏈之第2不變區(CH2)或H鏈之第3不變區(CH3)的界面導入電荷性排斥而抑制非目的之H鏈彼此的締合的技術(WO2006/106905)。 於在CH2或CH3的界面導入電荷性排斥而抑制未意欲之H鏈彼此之締合的技術，於H鏈之其他不變區界面接觸之胺基酸殘基，例如和CH3區中之EU編號356號之殘基、EU編號439號之殘基、EU編號357號之殘基、EU編號370號之殘基、EU編號399號之殘基、EU編號409號之殘基相對的區域。

更具體而言，可為：例如於包含2種H鏈CH3區之抗體，第1H鏈CH3區中之以下(1)~(3)所示之胺基酸殘基之群組選出的1組至3組胺基酸殘基有同種電荷之抗體；(1) 為H鏈CH3區所含之胺基酸殘基，且為EU編號356位及439位之胺基酸殘基、(2) 為H鏈CH3區所含之胺基酸殘基，且為EU編號357位及370位之胺基酸殘基、(3) 為H鏈CH3區所含之胺基酸殘基，且為EU編號399位及409位之胺基酸殘基。

又，可為：從和上述第1H鏈CH3區不同的第2H鏈CH3區中之前述(1)~(3)所示之胺基酸殘基之組中選出的胺基酸殘基之組且為和前述第1之H鏈CH3區中有同種電荷之前述(1)~(3)所示之胺基酸殘基之組對應的1組至3組胺基酸殘基具有和前述第1之H鏈CH3區中之對應胺基酸殘基為相反電荷之抗體。

上述(1)~(3)記載的各胺基酸殘基於締合時會彼此靠近。該領域中通常知識者可針對所望H鏈CH3區或H鏈不變區，可利用使用市售軟體的同源建模法(Homology modeling)等發現對應於上述(1)~(3)記載之胺基酸殘基之部位，可適當將該部位之胺基酸殘基供改變。

上述抗體中，「有電荷之胺基酸殘基」宜從例如以下(a)或(b)中任一群所含之胺基酸殘基中選擇較佳； (a) 麩胺酸(E)、天冬胺酸(D)、 (b) 離胺酸(K)、精胺酸(R)、組胺酸(H)。

上述抗體中，「有同種電荷」，係指例如，2個以上的胺基酸殘基任一者有上述(a)或(b)中任一群所含之胺基酸殘基。「有相反電荷」，係指例如：2個以上的胺基酸殘基中的至少1個胺基酸殘基有上述(a)或(b)任一群所含之胺基酸殘基時，其餘胺基酸殘基具有不同群所含之胺基酸殘基。

理想態樣中，上述抗體的第1H鏈CH3區與第2H鏈CH3區也可利用雙硫鍵交聯。 本發明中供改變之胺基酸殘基，不限於上述抗體之可變區或抗體不變區之胺基酸殘基。若為該領域中通常知識者，可針對多肽變異體或異種多聚體，利用使用市售軟體之同源建模法等找出形成界面之胺基酸殘基，並以控制締合之方式將該部位之胺基酸殘基供改變。

又，本發明之多專一性抗體之締合化也可使用其他公知技術。藉由將抗體之其中一H鏈之可變區存在的胺基酸側鏈取代為較大側鏈（knob; 突起），並將另一H鏈之相對之可變區存在的胺基酸側鏈取代為較小側鏈（hole; 空隙），以將突起配置於空隙，以有效率地實施有Fc區之不同胺基酸之多肽彼此的締合化(WO1996/027011、Ridgway JB et al., Protein Engineering (1996) 9, 617-621、Merchant AM et al. Nature Biotechnology (1998) 16, 677-681)。

除此以外，本發明之多專一性抗體之形成還可使用其他公知技術。藉由使用抗體的其中一H鏈之CH3之一部分設為和此部分對應的IgA來源的序列，並於另一H鏈之CH3的互補部分導入和此部分對應的IgA來源的序列而得的strand-exchange engineered domain CH3，可以有效率地利用CH3的互補性締合化生成有不同序列之多肽之締合化(Protein Engineering Design & Selection, 23; 195-202, 2010)。使用此公知技術也可有效率地形成目的之多專一性抗體。

另外，多專一性抗體的形成，也可使用利用WO2011/028952記載之抗體之CH1與CL之締合化、利用VH、VL之締合化之抗體製作技術、使用WO2008/119353、WO2011/131746記載之個別製備的單株抗體彼此而製作雙重專一性抗體之技術(Fab Arm Exchange)、WO2012/058768、WO2013/063702記載之控制抗體重鏈之CH3間之締合之技術、WO2012/023053記載之製作由2種輕鏈與1種重鏈構成之雙重專一性抗體之技術、Christoph等人(Nature Biotechnology Vol. 31, p 753-758 (2013))記載之利用各自表現由1條H鏈與1條L鏈構成之抗體之單鏈的2個細菌細胞株的製作雙重專一性抗體的技術等。又，上述締合技術以外，已知有CrossMab技術，係使形成結合於第1抗原決定位之可變區的輕鏈、及形成結合於第2抗原決定位之可變區的輕鏈，分別和結合於第1抗原決定位之可變區的重鏈、及結合於第2抗原決定位之可變區的重鏈締合之異種輕鏈之締合技術(Scaefer等人(Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A. (2011) 108, 11187-11192))，此等技術也可用於製作本發明提供之多專一性或多抗體決定簇(paratopic)的抗原結合分子。作為使用各自製備的單株抗體彼此而製作雙重專一性抗體之技術，可列舉使重鏈CH3區存在之特定胺基酸經取代而得的單株抗體置於還原狀況，以促進抗體之異化，並獲得所望雙重專一性抗體之方法。該方法之理想胺基酸取代部位，例如CH3區之EU編號392號之殘基、EU編號397號之殘基。再者，也可利用第1之H鏈CH3區之以下(1)~(3)所示之胺基酸殘基之組中選出的1組至3組胺基酸殘基有同種電荷之抗體來製作雙重專一性抗體；(1) 為H鏈CH3區所含之胺基酸殘基且係EU編號356位及439位之胺基酸殘基、(2) 為H鏈CH3區所含之胺基酸殘基且係EU編號357位及370位之胺基酸殘基、(3) 為H鏈CH3區所含之胺基酸殘基且係EU編號399位及409位之胺基酸殘基。又，也可利用和係從上述第1之H鏈CH3區為不同的第2之H鏈CH3區中的前述(1)~(3)所示之胺基酸殘基之組選出的胺基酸殘基之組且和前述第1之H鏈CH3區中有同種電荷之前述(1)~(3)所示之胺基酸殘基之組所對應之1組至3組胺基酸殘基具有和前述第1H鏈CH3區之對應胺基酸殘基有相反電荷的抗體，來製作雙重專一性抗體(WO2015/046467)。

又，即使未能有效率地形成目的多專一性抗體的情形，也可藉由從產生之抗體中將目的之多專一性抗體予以分離、精製，而獲得本發明之多專一性抗體。例如有人報告：對於2種H鏈之可變區導入胺基酸取代並賦予等電點的差異，以將2種同形體與目的之異形抗體(heteroantibody)利用離子交換層析進行精製之方法(WO2007114325)。又，作為將異形體精製之方法，至今已有將由會結合於蛋白質A之小鼠IgG2a之H鏈於不結合於蛋白質A之大鼠IgG2b之H鏈構成的異二聚化抗體使用蛋白質A進行精製的方法(WO98050431, WO95033844)。又，藉由使用為IgG與ProteinA之結合部位即EU編號435號及436號之胺基酸殘基取代成Tyr、His等和ProteinA之結合力不同的胺基酸而得的H鏈，使各H鏈與Protein A間的交互作用變化，並使用Protein A管柱，可以有效率地只將異二聚化抗體進行精製。

該等技術可使用複數個，例如組合使用2個以上。又，該等技術也可對於欲締合之2個H鏈適當地分別適用。又，本發明之抗原結合分子，可以將已施加上述改變者作為基礎，另外製作有同一胺基酸序列之抗原結合分子。

胺基酸序列之改變可依該領域中公知的各種方法實施。該等方法不限於以下方法，可利用部位專一性變異誘導法(Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y, and Nakagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271-275、Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Oligonucleotide- directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors.Methods Enzymol. 100, 468-500、Kramer,W, Drutsa,V, Jansen,HW, Kramer,B, Pflugfelder,M, and Fritz,HJ(1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456、Kramer W, and Fritz HJ(1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154, 350-367、Kunkel,TA(1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 488-492)、PCR變異法、匣盒(cassette)變異法等方法實施。

又，本發明之「抗原結合分子」在單一多肽鏈內包括形成本發明之「抗體之可變區」之重鏈及輕鏈兩者，但也可為缺少不變區的抗體片段。如此的抗體片段，例如：雙體抗體(diabody；Db)、單鏈抗體、sc(Fab')2。

Db係由2條多肽鏈構成的二聚物(Holliger P et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)、EP404，097號、W093/11161號等)，各多肽鏈係利用同鏈中L鏈可變區(VL)及H鏈可變區(VH)彼此無法結合的程度之短的例如：5個殘基左右的連結子結合。 同一多肽鏈上編碼的VL與VH，因為其之間之連結子短，故無法形成單鏈可變區片段，而利用二聚物化以形成2個抗原結合部位。

單鏈抗體，例如sc(Fv)2。sc(Fv)2係2個VL與2個VH之4個可變區利用胜肽連結子等連結子連結並構成1條鏈之單鏈抗體(J Immunol. Methods (1999) 231 (1-2), 177- 189)。此2個VH與VL可由不同單株抗體而來。例如：Journal of Immunology (1994) 152 (11), 5368-5374揭示之認識在同一抗原中存在的2種抗原決定位之雙重專一性(bispecific sc(Fv)2)亦為理想例。sc(Fv)2可依該領域中通常知識者公知之方法製作。例如，可將scFv以胜肽連結子等連結子連結以製作。

本說明書中，作為構成sc(Fv)2之抗原結合分域之構成，可舉2個VH及2個VL以單條鏈多肽之N末端側為基點，並按順序以VH、VL、VH、VL（[VH]連結子[VL]連結子[VH]連結子[VL]）排列為特徵的抗體，但2個VH與2個VL的順序不特別限於上述構成，可依任意順序排列。例如以下順序之構成。 [VL]連結子[VH]連結子[VH]連結子[VL] [VH]連結子[VL]連結子[VL]連結子[VH] [VH]連結子[VH]連結子[VL]連結子[VL] [VL]連結子[VL]連結子[VH]連結子[VH] [VL]連結子[VH]連結子[VL]連結子[VH]

針對sc(Fv)2之分子形態，於WO2006/132352也有詳細記載，若為該領域中通常知識者，可基於該等記載製作用以製造本說明書揭示之抗原結合分子的適當所望的sc(Fv)2。

本發明之抗原結合分子也可接合PEG等載體高分子、抗癌劑等有機化合物。又，也可插入糖鏈附加序列並使糖鏈獲得所望效果。

將抗體之可變區結合之連結子，可使用能利用基因工程導入的任意胜肽連結子、或合成化合物連結子(例如參照：Protein Engineering, 9 (3), 299-305, 1996)揭示的連結子等，但本發明中宜為胜肽連結子為佳。胜肽連結子之長度不特別限定，可因應目的由該領域中通常知識者適當選擇，理想長度為5個胺基酸以上（上限不特別限定，通常為30個胺基酸以下，較佳為20個胺基酸以下），尤佳為15個胺基酸。sc(Fv)2包括3個胜肽連結子時，可使用長度全部相同的胜肽連結子，也可使用不同長度的胜肽連結子。

例如，胜肽連結子的情形： Ser Gly・Ser Gly・Gly・Ser Ser・Gly・Gly Gly・Gly・Gly・Ser（序列辨識號：5） Ser・Gly・Gly・Gly（序列辨識號：6） Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（序列辨識號：7） Ser・Gly・Gly・Gly・Gly（序列辨識號：8） Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（序列辨識號：9） Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly（序列辨識號：10） Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（序列辨識號：11） Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly（序列辨識號：12） (Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（序列辨識號：7）)n (Ser・Gly・Gly・Gly・Gly（序列辨識號：8）)n [n為1以上之整數]等。惟胜肽連結子之長度、序列可因應目的由該領域中通常知識者適當選擇。

合成化學物連結子（化學交聯劑），為胜肽交聯通常使用之交聯劑，例如N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)、辛二酸二琥珀醯亞胺酯(DSS)、辛二酸二(硫琥珀醯亞胺基)酯(BS 3)、二硫雙(琥珀醯亞胺基丙酸酯)(DSP)、二硫雙(硫琥珀醯亞胺基丙酸酯)(DTSSP)、乙二醇雙(琥珀醯亞胺基琥珀酸酯)(EGS)、乙二醇雙(硫琥珀醯亞胺基琥珀酸酯)(硫-EGS)、二琥珀醯亞胺基酒石酸鹽(DST)、二硫琥珀醯亞胺基酒石酸鹽(硫-DST)、雙[2-(琥珀醯亞胺氧羰基氧)乙基]碸(BSOCOES)、雙[2-(硫琥珀醯亞胺氧羰基氧)乙基]碸(硫-BSOCOES)等，該等交聯劑在市面上可購得。 將4個抗體可變區結合時，通常須要3個連結子，但可全部使用相同連結子，也可使用不同連結子。

F(ab')2，包含2條輕鏈，以及2條重鏈，以鏈間之雙硫鍵形成於2條重鏈間之方式，包括CH1分域及CH2分域之一部分不變區。本說明書揭示之構成多肽締合體之F(ab')2，可藉由將具有所望抗原結合分域之全長單株抗體等以胃蛋白酶等蛋白質分解酵素予以部分消化後，使Fc片段吸附於蛋白質A管柱並除去以理想地取得。該蛋白質分解酵素只要是可藉由適當設定pH等酵素的反應條件而限制性地產生F(ab')2的方式將全長抗體予以消化者即可，無特殊限定，例如，胃蛋白酶、無花果酶(ficin)等。

本發明之抗原結合分子除了上述胺基酸之改變，可更包括附加的改變。附加的改變，例如可從胺基酸之取代、缺失、或修飾中任一者、或此等之組合選擇。 例如：在對於本發明之抗原結合分子不進一步使該分子之目的機能造成實質變化的範圍內任意施以改變。例如如此的變異可利用胺基酸殘基之保守性取代進行。又，對於本發明之抗原結合分子之目的機能造成變化的改變，只要是該機能之變化為本發明之目的之範圍內也可進行。

本發明中，胺基酸序列之改變也包括轉譯後修飾。具體的轉譯後修飾，可舉出糖鏈之附加或缺損。例如本發明之抗原結合分子有IgG1型不變區的情形，EU編號之297號之胺基酸殘基可為經糖鏈修飾者。修飾之糖鏈結構不限定。一般，於真核細胞表現的抗體，於不變區包括糖鏈修飾。因此如以下細胞所表現之抗體，通常會以某糖鏈修飾。 ・哺乳動物之抗體產生細胞 ・以包括編碼抗體之DNA的表現載體轉形而得的真核細胞 在此所示之真核細胞包括酵母、動物細胞。例如CHO細胞、HEK293H細胞，是為了以包括編碼抗體之DNA的表現載體轉形的代表動物細胞。另外，該位置無糖鏈修飾者也包括在本發明之抗體。不變區未經糖鏈修飾的抗體，能使編碼抗體之基因於大腸菌等原核細胞表現而得。

本發明中附加的改變，更具體而言，也可為例如Fc區之糖鏈附加唾液酸而得者(MAbs. 2010 Sep-Oct;2(5): 519-27.)。

又，本發明之抗原結合分子擁有Fc區部分時，亦可施加例如使對於FcRn之結合活性提高之胺基酸取代(J Immunol. 2006 Jan 1;176(1):346-56、J Biol Chem. 2006 Aug 18;281(33):23514-24.、Int Immunol. 2006 Dec;18(12):1759- 69.、Nat Biotechnol. 2010 Feb;28(2):157-9.、WO/2006/019447、WO/2006/053301、WO/2009/086320)、用以使抗體之異質性、安定性提高的胺基酸取代((WO/2009/041613))。

再者，本發明中，「抗體」之用語係以最廣義使用，只要顯示所望之生物學的活性即包括，包括單株抗體(含全長單株抗體)、多株抗體、抗體變異體、抗體片段、多專一性抗體（例如，雙重專一性抗體）、嵌合抗體、人化抗體等各種抗體。

本發明之抗體不限定抗原種類、抗體來源等，可為各種抗體。抗體的來源不特別限定，可列舉人抗體、小鼠抗體、大鼠抗體、兔抗體等。

製作抗體的方法為該領域中通常知識者所熟知，例如單株抗體的情形，可利用融合瘤法(Kohler and Milstein, Nature 256:495 (1975))、重組方法(美國專利第4,816,567號)製造。又，也可從噬菌體抗體庫單離 (Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) ; Marks et al., J.Mol.Biol. 222:581-597 (1991))。又，也可從單一之B細胞選殖體單離(N. Biotechnol. 28(5): 253-457 (2011))。

人化抗體也稱為再構成(reshaped)人抗體。具體而言，將人以外動物，例如將小鼠抗體之CDR移植到人抗體而得之人化抗體等為公知。用以獲得人化抗體之一般基因重組手法亦為已知。具體而言，作為將小鼠抗體之CDR移植到人之FR的方法，例如Overlap Extension PCR為公知。

藉由將編碼為3個CDR與4個FR連結而得之抗體可變區的DNA和編碼為人抗體不變區之DNA以於讀框內融合的方式插入到表現載體中，可製成人化抗體表現用載體。將該已嵌入的載體導入到寄主並建立重組細胞後，培養該重組細胞，並使編碼為該人化抗體之DNA表現，能使該培養細胞之培養物中產生該人化抗體（參照歐洲專利公開EP 239400、國際公開WO1996/002576）。

視須要，也可將FR之胺基酸殘基取代，以使再構成人抗體之CDR能形成適當的抗原結合部位。例如可應用將小鼠CDR移植到人FR時使用的PCR法，於FR導入胺基酸序列的變異。

將擁有人抗體基因的全部庫存(repertory)的基因轉殖動物（參照國際公開WO1993/012227、WO1992/003918、WO1994/002602、WO1994/025585、WO1996/034096、WO1996/033735）作為免疫動物，利用DNA免疫可獲得所望之人抗體。

再者，使用人抗體庫，利用淘選取得人抗體之技術亦為已知。例如：將人抗體之V區域以單條鏈抗體(scFv)的形式利用噬菌體展示法展示在噬菌體表面。可選擇表現和抗原結合之scFv之噬菌體。藉由將選擇的噬菌體的基因進行解析，能決定編碼為和抗原結合之人抗體之V區域的DNA序列。決定和抗原結合之scFv之DNA序列後，將該V區域序列和所望人抗體C區域之序列於讀框內融合，之後插入適當的表現載體，可製作表現載體。將該表現載體導入上述列舉的理想表現細胞中，並使編碼為該人抗體之基因表現，可取得該人抗體。該等方法已為公知（參照國際公開WO1992/001047、WO1992/020791、WO1993/006213、WO1993/011236、WO1993/019172、WO1995/001438、WO1995/015388）。

噬菌體展示法以外，作為使用人抗體庫利用淘選取得人抗體之技術，已有使用無細胞轉譯系之技術、在細胞或病毒表面展示抗原結合分子之技術、使用乳劑的技術等為已知。例如：使用無細胞轉譯系之技術可使用：藉由去除終止密碼子等而介由核糖體形成mRNA與經轉譯之蛋白質之複合體的核糖體展示法、利用嘌呤黴素(puromycin)等化合物使基因序列和經轉譯之蛋白質共價鍵結之cDNA展示法、mRNA展示法、使用對應核酸之結合蛋白質形成基因和轉譯之蛋白質之複合體之CIS展示法等。又，作為在細胞或病毒表面展示抗原結合分子之技術，可使用噬菌體展示法，除此以外可使用E. coli展示法、格蘭氏陽性菌展示法、酵母展示法、哺乳類細胞展示法、病毒展示法等。作為使用乳劑之技術，可使用使基因及轉譯關連分子內包在乳劑中的 in vitro病毒展示法等。該等方法已為公知(Nat Biotechnol. 2000 Dec;18(12):1287-92、Nucleic Acids Res. 2006;34(19):e127、Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Mar 2;101(9):2806-10、Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Jun 22;101(25):9193-8、Protein Eng Des Sel. 2008 Apr;21(4): 247-55、Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Sep 26;97(20): 10701-5、MAbs. 2010 Sep-Oct;2(5):508-18、Methods Mol Biol. 2012;911:183-98)。

構成本發明之抗體之可變區，可為任意認識抗原之可變區。

本說明書中，「抗原」不特別限定，可為任意抗原。抗原，例如：17-IA、4-1 BB、4Dc、6-酮-PGF1a、8-異-PGF2a、8-側氧基-dG、A1腺苷受體、A33、ACE、ACE-2、促進素(activin)、促進素A、促進素AB、促進素B、促進素C、促進素RIA、促進素RIA ALK-2、促進素RIB ALK-4、促進素RIIA、促進素RIIB、ADAM、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAM8、ADAM9、ADAMTS、ADAMTS4、ADAMTS5、位址素(Addressin)、脂聯素(adiponectin)、ADP核糖環化酶(ribosyl cyclase)-1、aFGF、AGE、ALCAM、ALK、ALK-1、ALK-7、過敏原(allergen)、alpha1-抗胰凝乳蛋白酶(antichemotrypsin)、alpha1-抗胰蛋白酶(antitrypsin)、alpha-突觸核蛋白(synuclein)、alpha-V/beta-1拮抗劑、aminin、amylin、類澱粉beta、類澱粉免疫球蛋白重鏈可變區、類澱粉免疫球蛋白輕鏈可變區、雄激素、ANG、血管收縮素原(angiotensinogen)、血管生成素(Angiopoietin)配體-2、抗-Id、抗凝血酶III、Anthrax、APAF-1、APE、APJ、apo A1、apo血清類澱粉A、Apo-SAA、APP、APRIL、AR、ARC、ART、Artemin、ASPARTIC、心房利鈉因子(Atrial natriuretic factor)、心房利鈉胜肽(Atrial natriuretic peptide)、心房利鈉胜肽A、心房利鈉胜肽B、心房利鈉胜肽C, av/b3整合素、Axl、B7-1、B7-2、B7-H、BACE、BACE-1、炭疽桿菌(Bacillus anthracis)保護性抗原、Bad、BAFF、BAFF-R、Bag-1、BAK、Bax、BCA-1、BCAM、BcI、BCMA、BDNF、b-ECGF、beta-2-細球蛋白、beta內醯胺酶、bFGF、BID、Bik、BIM、BLC、BL-CAM、BLK、B-淋巴球刺激子(BIyS)、BMP、BMP-2(BMP-2a)、BMP-3(Osteogenin)、BMP-4(BMP-2b)、BMP-5、BMP-6(Vgr-1)、BMP-7(OP-1)、BMP-8(BMP-8a)、BMPR、BMPR-IA(ALK-3)、BMPR-IB (ALK-6)、BMPR-II(BRK-3)、BMPs、BOK、Bombesin、骨衍生神經滋養因子、胎牛生長激素、BPDE、BPDE-DNA、BRK-2、BTC、B-淋巴球細胞黏附分子、C10、C1-抑制子、C1q、C3、C3a、C4、C5、C5a(補體5a)、CA125、CAD-8、黏鈣蛋白(Cadherin)-3、抑鈣素(Calcitonin)、cAMP、碳酸酐酶(Carbonic anhydrase)-IX、癌胚抗原(CEA)、癌關連抗原、心營養素(Cardiotrophin)-1、細胞自溶酶(Cathepsin)A、細胞自溶酶B、細胞自溶酶C/DPPI、細胞自溶酶D、細胞自溶酶E、細胞自溶酶H、細胞自溶酶L、細胞自溶酶O、細胞自溶酶S、細胞自溶酶V、細胞自溶酶X/Z/P、CBL、CCI、CCK2、CCL、CCL1/I-309、CCL11/Eotaxin、CCL12/MCP-5、CCL13/MCP-4、CCL14/HCC-1、CCL15/HCC-2、CCL16/HCC-4、CCL17/TARC、CCL18/PARC、CCL19/ELC、CCL2/MCP-1、CCL20/MIP-3- alpha、CCL21/SLC、CCL22/MDC、CCL23/MPIF-1、CCL24/ Eotaxin-2、CCL25/TECK、CCL26/Eotaxin-3、CCL27/CTACK、CCL28/MEC、CCL3/M1P-1-alpha、CCL3Ll/LD-78-beta、CCL4/MIP-l-beta、CCL5/RANTES、CCL6/C10、CCL7/MCP-3、CCL8/MCP-2、CCL9/10/MTP-1-gamma、CCR、CCR1、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CD1、CD10、CD105、CD11a、CD11b、CD11c、CD123、CD13、CD137、CD138、CD14、CD140a、CD146、CD147、CD148、CD15、CD152、CD16、CD164、CD18、CD19、CD2、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD26、CD27L、CD28、CD29、CD3、CD30、CD30L、CD32、CD33(p67蛋白)、CD34、CD37、CD38、CD3E、CD4、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD49a、CD49b、CD5、CD51、CD52、CD54、CD55、CD56、CD6、CD61、CD64、CD66e、CD7、CD70、CD74、CD8、CD80(B7-1)、CD89、CD95、CD105、CD158a、CEA、CEACAM5、CFTR、cGMP、CGRP受體、CINC、CKb8-1、密連蛋白(Claudin)18、CLC、肉毒桿菌(Clostridium botulinum)毒素、梭狀芽孢桿菌毒素(Clostridium difficile toxin)、產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)毒素、c-Met、CMV、CMV UL、CNTF、CNTN-1、補體因子3(C3)、補體因子D、皮質類固醇結合球蛋白、群落刺激因子-1受體、COX、C-Ret、CRG-2、CRTH2、CT-1、CTACK、CTGF、CTLA-4、CX3CL1/Fractalkine、CX3CR1、CXCL、CXCL1/Gro-alpha、CXCL10、CXCL11/I-TAC、CXCL12/SDF-l-alpha/beta、CXCL13/BCA-1、CXCL14/BRAK、CXCL15/Lungkine. CXCL16、CXCL16、CXCL2/Gro-beta CXCL3/Gro-gamma、CXCL3、CXCL4/PF4、CXCL5/ENA-78、CXCL6/GCP-2、CXCL7/NAP-2、CXCL8/IL-8、CXCL9/Mig、CXCLlO/IP-10、CXCR、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、cystatin C、細胞角蛋白腫瘤關聯抗原、DAN、DCC、DcR3、DC-SIGN、衰變加速因子(Decay accelerating factor)、類Delta蛋白配體4、des(1-3)-IGF-1(大腦IGF-1)、Dhh、DHICA氧化酶、Dickkopf-1、地谷新(digoxin)、二肽肽解酶IV、DKl、DNAM-1、Dnase、Dpp、DPPIV/CD26、Dtk、ECAD、EDA、EDA-A1、EDA-A2、EDAR、EGF、EGFR(ErbB-1)、含類EGF分域之蛋白質7、彈性蛋白酶(Elastase)、彈性蛋白(elastin)、EMA、EMMPRIN、ENA、ENA-78、Endosialin、內皮素受體、內毒素、腦啡肽酶(Enkephalinase)、eNOS、Eot、伊紅趨素(Eotaxin)、Eotaxin-2、eotaxini、EpCAM、Ephrin B2/EphB4、Epha2酪胺酸激酶受體、上皮生長因子受體(EGFR)、ErbB2受體、ErbB3酪胺酸激酶受體、ERCC、EREG、紅血球生成素(erythropoietin)(EPO)、紅血球生成素受體、E-選擇蛋白(selectin)、ET-1、Exodus-2、RSV的F蛋白、F10、F11、F12、F13、F5、F9、第Ia因子、第IX因子、第Xa因子、第VII因子、第VIII因子、第VIIIc因子、Fas、FcalphaR、FcepsilonRI、FcgammaIIb、FcgammaRI、FcgammaRIIa、FcgammaRIIIa、FcgammaRIIIb、FcRn、FEN-1、鐵蛋白、FGF、FGF-19、FGF-2、FGF-2受體、FGF-3、FGF-8、酸性FGF、鹼性FGF、FGFR、FGFR-3、纖維蛋白(Fibrin)、纖維母細胞活化蛋白(FAP)、纖維母細胞生長因子、纖維母細胞生長因子-10、纖網蛋白(fibronectin)、FL、FLIP、Flt-3、FLT3配體、葉酸受體、濾泡刺激激素(FSH)、Fractalkine(CX3C)、游離重鏈、游離輕鏈、FZD1、FZD10、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、G250、Gas6、GCP-2、GCSF、G-CSF、G-CSF受體、GD2、GD3、GDF、GDF-1、GDF-15(MIC-1)、GDF-3(Vgr-2)、GDF-5(BMP-14/CDMP-1)、GDF-6(BMP-13/ CDMP-2)、GDF-7(BMP-12/CDMP-3)、GDF-8(Myostatin)、GDF-9、GDNF、Gelsolin、GFAP、GF-CSF、GFR-alpha1、GFR-alpha2、GFR-alpha3、GF-β1、gH外膜糖蛋白、GITR、升糖素、升糖素受體、類升糖素胜肽1受體、Glut 4、麩胺酸羧基肽解酶(Glutamate carboxypeptidase)II、糖蛋白激素受體、糖蛋白IIb/IIIa(GP IIb/IIIa)、Glypican-3、GM-CSF、GM-CSF受體、gp130、gp140、gp72、顆粒細胞-CSF(G-CSF)、GRO/MGSA、生長激素釋放因子、GRO-β、GRO-γ、H. pylori、半抗原(NP-cap或NIP-cap)、HB-EGF、HCC、HCC 1、HCMV gB外膜糖蛋白、HCMV UL、造血生長因子(HGF)、Hep B gp120、肝素酶(heparanase)、肝素輔因子II、肝生長因子、炭疽桿菌保護性抗原、C型肝炎病毒E2糖蛋白、E型肝炎、Hepcidin、Her1、Her2/neu(ErbB-2)、Her3(ErbB-3)、Her4(ErbB-4)、單純皰疹病毒(HSV)gB糖蛋白、HGF、HGFA、高分子量黑色素瘤關連抗原(HMW-MAA)、HIV外膜蛋白，例如GP120、HIV MIB gp 120 V3 loop、HLA、HLA-DR、HM1.24、HMFG PEM、HMGB-1、HRG、Hrk、HSP47、Hsp90、HSV gD糖蛋白、人心肌凝蛋白、人細胞巨大病毒(HCMV)、人生長激素(hGH)、人血清白蛋白、人組織類型纖維蛋白溶酶原子活化子(t-PA)、Huntingtin、HVEM、IAP、ICAM、ICAM-1、ICAM-3、ICE、ICOS、IFN-alpha、IFN-beta、IFN-gamma、IgA、IgA受體、IgE、IGF、IGF結合蛋白、IGF-1、IGF-1 R、IGF-2、IGFBP、IGFR、IL、IL-1、IL-10、IL-10受體、IL-11、IL-11受體、IL-12、IL-12受體、IL-13、IL-13受體、IL-15、IL-15受體、IL-16、IL-16受體、IL-17、IL-17受體、IL-18(IGIF)、IL-18受體、IL-1alpha、IL-1beta、IL-1受體、IL-2、IL-2受體、IL-20、IL-20受體、IL-21、IL-21受體、IL-23、IL-23受體、IL-2受體、IL-3、IL-3受體、IL-31、IL-31受體、IL-3受體、IL-4、IL-4受體IL-5、IL-5受體、IL-6、IL-6受體、IL-7、IL-7受體、IL-8、IL-8受體、IL-9、IL-9受體、免疫球蛋白免疫複合體、免疫球蛋白、INF-alpha、INF-alpha受體、INF-beta、INF-beta受體、INF-gamma、INF-gamma受體、IFN第I類、IFN第I類受體、influenza、抑制素(inhibin)、抑制素α、抑制素β、iNOS、胰島素、胰島素A鏈、胰島素B鏈、類胰島素生長因子1、類胰島素生長因子2、類胰島素生長因子結合蛋白、整合素、整合素alpha2、整合素alpha3、整合素alpha4、整合素alpha4/beta1、整合素alpha-V/beta-3、整合素alpha-V/beta-6、整合素alpha4/beta7、整合素alpha5/ beta1、整合素alpha5/beta3、整合素alpha5/beta6、整合素alphaσ(alphaV)、整合素alphaθ、整合素beta1、整合素beta2、整合素beta3(GPIIb-IIIa)、IP-10、I-TAC、JE、激肽釋放酶(Kallikrein)、激肽釋放酶11、激肽釋放酶12、激肽釋放酶14、激肽釋放酶15、激肽釋放酶2、激肽釋放酶5、激肽釋放酶6、激肽釋放酶L1、激肽釋放酶L2、激肽釋放酶L3、激肽釋放酶L4、kallistatin、KC、KDR、角質細胞生長因子(KGF)、角質細胞生長因子-2(KGF-2)、KGF、類殺手免疫球蛋白受體、kit配體(KL)、Kit酪胺酸激酶、laminin 5、LAMP、LAPP(Amylin、islet-類澱粉多肽)、LAP(TGF-1)、潛伏關聯肽(latency associated peptide)、Latent TGF-1、Latent TGF-1 bp1、LBP、LDGF、LDL、LDL受體、LECT2、Lefty、Leptin、黃體化激素(LH)、Lewis-Y抗原、Lewis-Y相關抗原、LFA-1、LFA-3、LFA-3受體、Lfo、LIF、LIGHT、脂蛋白、LIX、LKN、Lptn、L-選擇素、LT-a、LT-b、LTB4、LTBP-1、肺界面活性劑、黃體化激素、Lymphotactin、淋巴毒素Beta受體、溶性鞘脂(Lysosphingolipid)受體、Mac-1、巨噬體-CSF(M-CSF)、MAdCAM、MAG、MAP2、MARC、maspin、MCAM、MCK-2、MCP、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-I(MCAF)、M-CSF、MDC、MDC(67 a.a.)、MDC(69 a.a.)、megsin、Mer、MET酪胺酸激酶受體家族、METALLOPROTEASES、膜糖蛋白OX2、Mesothelin、MGDF受體、MGMT、MHC(HLA-DR)、微生物蛋白、MIF、MIG、MIP、MIP-1α、MIP-1β、MIP-3α、MIP-3β、MIP-4、MK、MMAC1、MMP、MMP-1、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-2、MMP-24、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、單核球吸引蛋白、單核球群落抑制子y因子、小鼠性腺相關胜肽、MPIF、Mpo、MSK、MSP、MUC-16、MUC18、mucin(Mud)、Muellerian抑制物質、Mug、MuSK、髓鞘脂(Myelin)關聯糖蛋白、骨髓前身抑制因子-1(MPIF-I)、NAIP、Nanobody、NAP、NAP-2、NCA 90、NCAD、N-鈣黏蛋白、NCAM、Neprilysin、神經細胞黏附分子、neroserpin、神經生長因子(NGF)、神經滋養素-3、神經滋養素-4、神經滋養素-6、Neuropilin 1、Neurturin、NGF-beta、NGFR、NKG20、N-甲硫胺醯基人生長激素、nNOS、NO、Nogo-A、Nogo受體、來自C型肝炎病毒的非結構蛋白第3型(NS3)、NOS、Npn、NRG-3、NT、NT-3、NT-4、NTN、OB、OGG1、Oncostatin M、OP-2、OPG、OPN、OSM、OSM受體、骨誘導因子、骨橋蛋白(osteopontin)、OX40L、OX40R、氧化LDL、p150、p95、PADPr、副甲狀腺素、PARC、PARP、PBR、PBSF、PCAD、P-鈣黏蛋白、PCNA、PCSK9、PDGF、PDGF受體、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PDGF-D、PDK-1、PECAM、PEDF、PEM、PF-4、PGE、PGF、PGI2、PGJ2、PIGF、PIN、PLA2、胎盤生長因子、胎盤鹼性磷解酶(PLAP)、胎盤催乳激素、纖維蛋白溶酶原活化抑制子-1、血小板生長因子、plgR、PLP、不同大小的多二醇鏈(例如PEG-20、PEG-30、PEG40)、PP14、prekallikrein、prion protein、前降鈣素(procalcitonin)、程式化細胞死亡蛋白1、胰島素前驅體、泌乳素(prolactin)、蛋白前驅體轉換酶(Proprotein convertase)PC9、prorelaxin、前列腺專一性膜抗原(PSMA)、Protein A、Protein C、Protein D、Protein S、Protein Z、PS、PSA、PSCA、PsmAr、PTEN、PTHrp、Ptk、PTN、P-選擇素糖蛋白配體-1、R51、RAGE、RANK、RANKL、RANTES、relaxin、Relaxin A鏈、Relaxin B鏈、腎活素(rennin)、呼吸道合胞體病毒(RSV)F、Ret、reticulon 4、類風濕性因子(Rheumatoid factor)、RLI P76、RPA2、RPK-1、RSK、RSV Fgp、S100、RON-8、SCF/KL、SCGF、Sclerostin、SDF-1、SDF1α、SDF1β、SERINE、血清類澱粉P、血清白蛋白、sFRP-3、Shh、類Shiga毒素II、SIGIRR、SK-1、SLAM、SLPI、SMAC、SMDF、SMOH、SOD、SPARC、sphingosine 1-phosphate受體1、葡萄球菌磷脂壁酸(Staphylococcal lipoteichoic acid)、Stat、STEAP、STEAP-II、幹細胞因子(SCF)、streptokinase、superoxide dismutase、syndecan-1、TACE、TACI、TAG-72(腫瘤關聯糖蛋白-72)、TARC、TB、TCA-3、T-cell受體alpha/beta、TdT、TECK、TEM1、TEM5、TEM7、TEM8、Tenascin、TERT、類睪丸PLAP鹼性磷解酶、TfR、TGF、TGF-alpha、TGF-beta、TGF-beta Pan Specific、TGF-beta RII、TGF-beta RIIb、TGF-beta RIII、TGF-beta Rl(ALK-5)、TGF-beta1、TGF-beta2、TGF-beta3、TGF-beta4、TGF-beta5、TGF-I、凝血酶、thrombopoietin(TPO)、胸腺淋巴蛋白(Thymic stromal lymphoprotein)受體、Thymus Ck-1、甲狀腺刺激激素(TSH)、甲狀腺素結合球蛋白、Tie、TIMP、TIQ、組織因子、組織因子蛋白酶抑制子、組織因子蛋白、TMEFF2、Tmpo、TMPRSS2、TNF受體I、TNF受體II、TNF-alpha、TNF-beta、TNF-beta2、TNFc、TNF-RI、TNF-RII、TNFRSF10A(TRAIL R1 Apo-2/DR4)、TNFRSF10B(TRAIL R2 DR5/KILLER/TRICK- 2A/TRICK-B)、TNFRSF10C(TRAIL R3 DcR1/LIT/TRID)、TNFRSF10D(TRAIL R4 DcR2/TRUNDD)、TNFRSF11A(RANK ODF R/TRANCE R)、TNFRSF11B(OPG OCIF/TR1)、TNFRSF12 (TWEAK R FN14)、TNFRSF12A、TNFRSF13B(TACI)、TNFRSF13C(BAFF R)、TNFRSF14(HVEM ATAR/HveA/LIGHT R/TR2)、TNFRSF16(NGFR p75NTR)、TNFRSF17(BCMA)、TNFRSF18(GITR AITR)、TNFRSF19(TROY TAJ/TRADE)、TNFRSF19L(RELT)、TNFRSF1A(TNF Rl CD120a/p55-60)、TNFRSF1B(TNF RII CD120b/p75-80)、TNFRSF21(DR6)、TNFRSF22(DcTRAIL R2 TNFRH2)、TNFRSF25(DR3 Apo-3/ LARD/TR-3/TRAMP/WSL-1)、TNFRSF26(TNFRH3)、TNFRSF3 (LTbR TNF RIII/TNFC R)、TNFRSF4(OX40 ACT35/TXGP1 R)、TNFRSF5(CD40 p50)、TNFRSF6(Fas Apo-1/APT1/CD95)、TNFRSF6B(DcR3 M68/TR6)、TNFRSF7(CD27)、TNFRSF8 (CD30)、TNFRSF9(4-1 BB CD137/ILA)、TNFRST23(DcTRAIL R1 TNFRH1)、TNFSF10(TRAIL Apo-2配體/TL2)、TNFSF11 (TRANCE/RANK配體ODF/OPG配體)、TNFSF12(TWEAK Apo-3配體/DR3配體)、TNFSF13(APRIL TALL2)、TNFSF13B (BAFF BLYS/TALL1/THANK/TNFSF20)、TNFSF14(LIGHT HVEM配體/LTg)、TNFSF15(TL1A/VEGI)、TNFSF18(GITR Ligand AITR配體/TL6)、TNFSF1A(TNF-a Conectin/DIF/ TNFSF2)、TNFSF1B(TNF-b LTa/TNFSF1)、TNFSF3(LTb TNFC/p33)、TNFSF4(OX40配體gp34/TXGP1)、TNFSF5(CD40配體CD154/gp39/HIGM1/IMD3/TRAP)、TNFSF6(Fas配體Apo-1配體/APT1配體)、TNFSF7(CD27配體CD70)、TNFSF8(CD30配體CD153)、TNFSF9(4-1 BB配體CD137配體)、TNF-α、TNF-β、TNIL-I、毒性代寫物、TP-1、t-PA、Tpo、TRAIL、TRAIL R、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRANCE、運鐵蛋白受體、轉形生長因子(TGF)，比如TGF-alpha及TGF-beta、穿膜糖蛋白NMB、Transthyretin、TRF、Trk、TROP-2、營養層糖蛋白、TSG、TSLP、腫瘤壞死因子(TNF)、腫瘤關聯抗原CA 125、表現腫瘤關連抗原之Lewis Y相關碳水化合物、TWEAK、TXB2、Ung、uPAR、uPAR-1、Urokinase、VAP-1、vascular endothelial生長因子(VEGF)、vaspin、VCAM、VCAM-1、VECAD、VE-鈣黏蛋白、VE-鈣黏蛋白-2、VEFGR-1 (flt-1)、VEFGR-2、VEGF受體(VEGFR)、VEGFR-3(flt-4)、VEGI、VIM、Viral抗原、VitB12受體、Vitronectin受體、VLA、VLA-1、VLA-4、VNR整合素、von Willebrand因子(vWF)、WIF-1、WNT1、WNT10A、WNT10B、WNT11、WNT16、WNT2、WNT2B/13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9B、XCL1、XCL2/SCM-l-beta、XCLl/Lymphotactin、XCR1、XEDAR、XIAP、XPD等。

作為本發明之抗原結合分子所含之抗體的可變區之中，能和「不同的2個抗原」結合但不能和該等抗原同時結合之可變區所結合之「第1抗原」及「第2抗原」、或能和「不同之3個抗原」結合但不能同時和該等抗原結合之可變區所結合之「第1抗原」、「第2抗原」及「第4抗原」，例如會在免疫細胞表面分子（例如，T細胞表面分子、NK細胞表面分子、樹狀細胞表面分子、B細胞表面分子、NKT細胞表面分子、MDSC細胞表面分子、巨噬細胞類表面分子）、腫瘤細胞、腫瘤之血管、間質細胞等表現但於正常組織也會表現的抗原（整合素、組織因子、VEGFR、PDGFR、EGFR、IGFR、MET趨化介素受體、乙醯肝素硫酸蛋白多糖、CD44、纖網蛋白、DR5、TNFRSF等）較理想。作為能和「不同之2個抗原」結合但不能同時和該等抗原結合之可變區所結合之「第1抗原」與「第2抗原」之組合，宜為第1抗原與第2抗原中任一者為例如：T細胞上專一性地表現的分子，另一抗原為在T細胞或其他免疫細胞表面表現的分子較佳。作為其他態樣，就「第1抗原」與「第2抗原」之組合而言，宜為第1抗原與第2抗原中之任一者係例如在T細胞上專一性地表現的分子，另一抗原為在免疫細胞上表現的和先前選出的抗原不同的分子較佳。具體而言，例如：在T細胞上專一性地表現的分子可列舉CD3、T細胞受體。尤其CD3較佳。本發明之抗原結合分子所結合之CD3之部位，例如：人CD3的情形，只要是構成人CD3之γ鏈、δ鏈或ε鏈序列存在的抗原決定位即可，可結合於任一抗原決定位。尤其人CD3複合體之ε鏈之細胞外區域存在之抗原決定位為較佳。構成CD3之γ鏈、δ鏈或ε鏈之結構，其多核苷酸序列記載於序列辨識號：83(NM_000073.2)、85(NM_000732.4)及87(NM_000733.3)，其多肽序列記載於序列辨識號：84(NP_000064.1)、86(NP_000723.1)及88(NP_000724.1)(括弧內顯示RefSeq註冊編號)。作為另一抗原，可列舉Fcγ受體、TLR、凝集蛋白、IgA、免疫核對點分子、TNF超級家族分子、TNFR超級家族分子、NK受體分子。 又，作為能和「不同之3個抗原」結合但不能同時和該等抗原結合之可變區所結合之「第1抗原」、「第2抗原」及「第4抗原」之組合，宜為第1抗原、第2抗原、及第4抗原中任1者之抗原為例如：在T細胞上專一地表現之分子，其餘的2個抗原為在T細胞或其他免疫細胞表面表現之分子較佳。作為另一態樣，就「第1抗原」、「第2抗原」及「第4抗原」之組合而言，宜為第1抗原、第2抗原、及第4抗原中任1者之抗原為在例如：T細胞上專一地表現之分子，其餘2個抗原係在免疫細胞上表現之和先前選擇之抗原為不同之分子較佳。具體而言，例如就在T細胞上專一地表現之分子而言，可列舉CD3、T細胞受體。尤其CD3較佳。本發明之抗原結合分子所結合之CD3之部位，例如為人CD3情形，只要是構成人CD3之γ鏈、δ鏈或ε鏈序列存在之抗原決定位即可，可為結合在任一抗原決定位者。尤其人CD3複合體之ε鏈之細胞外域存在之抗原決定位為較佳。構成CD3之γ鏈、δ鏈或ε鏈之結構其多核苷酸序列記載於序列辨識號：83(NM_000073.2)、85 (NM_000732.4)及87(NM_000733.3)，其多肽序列記載於序列辨識號：84(NP_000064.1)、86(NP_000723.1)及88(NP_000724.1) (括弧內代表RefSeq登錄號)。又，其餘的2個抗原可列舉Fcγ受體、TLR、凝集蛋白、IgA、免疫核對點分子、TNF超級家族分子、TNFR超級家族分子、NK受體分子。 又，本發明之抗原結合分子所含之抗體之可變區中的另一可變區所結合的和先前的「第1抗原」、「第2抗原」、及「第4抗原」為不同的「第3抗原」，例如宜為腫瘤細胞專一性抗原，除了伴隨細胞之惡性化而表現的抗原以外，也包括細胞癌化時於細胞表面、蛋白質分子上出現的異常糖鏈。具體而言，例如：ALK受體(pleiotrophin受體)、pleiotrophin、KS 1/4胰臓癌抗原、卵巢癌抗原(CA125)、前列腺酸磷酸、前列腺專一性抗原(PSA)、黑色素瘤關連抗原p97、黑色素瘤抗原gp75、高分子量黑色素瘤抗原(HMW-MAA)、前列腺專一性膜抗原、癌性胚抗原(CEA)、多型上皮黏蛋白抗原、人乳脂肪球抗原、CEA、TAG-72、CO17-1A、GICA 19-9、CTA-1及LEA等結腸直腸腫瘤關連抗原、Burkitt淋巴瘤抗原-38.13、CD19、人B淋巴瘤抗原-CD20、CD33、神經節苷脂GD2、神經節苷脂GD3、神經節苷脂GM2及神經節苷脂GM3等黑色素瘤專一性抗原、腫瘤專一性移植型細胞表面抗原(TSTA)、T抗原、DNA腫瘤病毒及RNA腫瘤病毒之外膜抗原等由病毒誘導的腫瘤抗原、結腸之CEA、5T4癌胎兒營養層糖蛋白質及膀胱腫瘤癌胎兒抗原等癌胎兒抗原α-胎兒蛋白質、人肺癌抗原L6及L20等分化抗原、纖維肉瘤之抗原、人白血病T細胞抗原-Gp37、新生糖蛋白質、神經鞘脂、EGFR(上皮增殖因子受體)等乳癌抗原、NY-BR-16、NY-BR-16及HER2抗原(p185HER2)、多型上皮黏蛋白(PEM)、悪性人淋巴球抗原-APO-1、胎兒紅血球中辨識到的I抗原等分化抗原、成人紅血球中辨識到的初期內胚葉I抗原、移植前之胚、胃癌中辨識到的I(Ma)、乳腺上皮辨識到的M18、M39、骨髓細胞中辨識到的SSEA-1、VEP8、VEP9、Myl、VIM-D5、結腸直腸癌中辨識到的D156-22、TRA-1-85(血液群H)、睪丸及卵巢癌中辨識到的SCP-1、結腸癌中辨識到的C14、肺癌中辨識到的F3、胃癌中辨識到的AH6、Y半抗原、胚性癌細胞中辨識到的Ley、TL5(血液群A)、A431細胞中辨識到的EGF受體、胰臓癌中辨識到的E1系列(血液群B)、胚性癌細胞中辨識到的FC10.2、胃癌抗原、腺癌中辨識到的CO-514(血液群Lea)、腺癌中辨識到的NS-10、CO-43(血液群Leb)、A431細胞之EGF受體中辨識到的G49、結腸癌中辨識到的MH2(血液群ALeb/Ley)、結腸癌中辨識到的19.9、胃癌黏蛋白、骨髓細胞中辨識到的T5A7、黑色素瘤中辨識到的R24、胚性癌細胞中辨識到的4.2、GD3、D1.1、OFA-1、GM2、OFA-2、GD2、及M1:22:25:8及4~8細胞階段之胚中辨識到的SSEA-3及SSEA-4、皮下T細胞淋巴瘤抗原、MART-1抗原、二烯丙基Tn(STn)抗原、結腸癌抗原NY-CO-45、肺癌抗原NY-LU-12變異體A、腺癌抗原ART1、腫瘤伴隨性關連腦-睪丸癌抗原(癌神經抗原MA2、腫瘤伴隨性神經抗原)、神經癌腹部抗原2(NOVA2)、血液細胞癌抗原基因520、腫瘤關連抗原CO-029、腫瘤關連抗原MAGE-C1(癌/睪丸抗原CT7)、MAGE-B1 (MAGE-XP抗原)、MAGE-B2(DAM6)、MAGE-2、MAGE-4a、MAGE-4b及MAGE-X2、癌-睪丸抗原(NY-EOS-1)、YKL-40及上述多肽中任一片段或對於此等加以修飾而得之結構等(前述修飾磷酸基、糖鏈等)、EpCAM、EREG、CA19-9、CA15-3、唾液酸基SSEA-1(SLX)、HER2、PSMA、CEA、CLEC12A等。

本發明之抗原結合分子可依該領域中通常知識者公知之方法製造。例如：抗體可依以下方法製作，但不限於此。將編碼為單離之多肽的基因導入適當寄主以製作抗體之寄主細胞與表現載體的許多組合為公知。該等表現系均可應用在將本發明之抗原結合分子予以單離。真核細胞使用作為寄主細胞時，可以適當使用動物細胞、植物細胞、或真菌細胞。具體而言，動物細胞可列舉如下的細胞。 (1) 哺乳類細胞：CHO（中國倉鼠卵巢細胞株）、COS（猴腎細胞株）、骨髓瘤(Sp2/O、NS0等)、BHK（乳倉鼠腎細胞株）、HEK293（具有減毒腺病毒(Ad)5 DNA之人胚腎細胞株）、PER.C6細胞（以腺病毒Type 5 (Ad5) E1A與E1B基因轉染之人胚胎視網膜細胞株embryonic retinal cell line）、Hela、Vero等(Current Protocols in Protein Science (May, 2001, Unit 5.9, Table 5.9.1)) (2) 兩生類細胞：非洲爪蟾卵母細胞等 (3) 昆蟲細胞：sf9、sf21、Tn5等 又，抗體也可以利用大腸菌(mAbs 2012 Mar-Apr; 4(2): 217-225.)、酵母(WO2000023579)製作。利用大腸菌製作的抗體沒有糖鏈附加。另一方面，酵母製作的抗體有糖鏈附加。

使為編碼為抗體重鏈的DNA且為編碼為可變區中之1或多數胺基酸殘基取代為目的之其他胺基酸之重鏈的DNA、及編碼為抗體輕鏈之DNA表現。編碼為可變區中之1或多數胺基酸殘基取代為目的之其他胺基酸而得之重鏈或輕鏈的DNA，例如可藉由取得編碼為對抗某抗原之利用公知方法製作之抗體之可變區的DNA，導入適當取代，而可將編碼為該區域中之特定胺基酸之密碼子變成編碼為目的之其他胺基酸而得。

又，也可事先設計編碼為將對抗某抗原使用公知方法製作之抗體之可變區中之1或多數胺基酸殘基取代為目的之其他胺基酸而得之蛋白質的DNA，將該DNA進行化學合成，以獲得編碼為可變區中之1或多數胺基酸殘基取代為目的之其他胺基酸之重鏈的DNA。胺基酸之取代部位、取代之種類無特殊限定。胺基酸改變之理想區域，可列舉可變區中之露出於溶劑之區域及迴圈區域。其中，CDR1、CDR2、CDR3、FR3區域、及迴圈區域為較佳。具體而言，H鏈可變區之Kabat編號31~35、50~65、71~74、95~102、及L鏈可變區之Kabat編號24~34、50~56、89~97較佳，H鏈可變區之Kabat編號31、52a~61、71~74、97~101、及L鏈可變區之Kabat編號24~34、51~56、89~96更理想。 又，胺基酸改變不限於取代，也可為缺失、附加、插入、或修飾中任一者、或此等之組合。

又，編碼為可變區中之1或多數胺基酸殘基取代為目的之其他胺基酸而得之重鏈的DNA，可區分為部分DNA製造。部分DNA之組合，例如：編碼為可變區之DNA與編碼為不變區之DNA、或編碼為Fab區之DNA與編碼為Fc區之DNA等，但不限於此等組合。編碼為輕鏈之DNA也同樣可區分為部分DNA製造。

作為表現上述DNA之方法可列舉以下方法。例如：將編碼為重鏈可變區之DNA和編碼為重鏈不變區之DNA一起納入表現載體，建構重鏈表現載體。同樣，將編碼為輕鏈可變區之DNA和編碼為輕鏈不變區之DNA一起納入表現載體，並建構輕鏈表現載體。該等重鏈、輕鏈之基因也可納入到單一載體中。

當編碼為目的抗體之DNA納入到表現載體時，係在表現控制區域，例如：增強子、啟動子之控制下能表現的方式納入表現載體。然後，利用此表現載體將寄主細胞轉形，使抗體表現。此時，可以使用適當的寄主與表現載體的組合。

載體，例如M13系載體、pUC系載體、pBR322、pBluescript、pCR-Script等。又，為了將cDNA予以次選殖、切出，除了上述載體以外，可使用例如：pGEM-T、pDIRECT、pT7等。

為了生產本發明之抗體而使用載體時，尤其表現載體為有用。表現載體，例如：寄主為JM109、DH5α、HB101、XL1-Blue等大腸菌時，須帶有能於大腸菌以良好效率表現的啟動子，例如：lacZ啟動子(Ward等, Nature (1989) 341, 544-546；FASEB J. (1992) 6, 2422-2427，全體納入本說明書中作為參考)、araB啟動子(Better等, Science (1988) 240, 1041-1043、全體納入本說明書中作為參考)、或T7啟動子等。如此的載體，除了上述載體以外，可列舉pGEX-5X-1(Pharmacia公司製)、「QIAexpress system」(QIAGEN公司製)、pEGFP、或pET（於此情形，寄主宜為表現T7 RNA聚合酶之BL21為較佳）等。

又，載體也可包括用以將多肽分泌的信號序列。作為多肽分泌之信號序列，於使其在大腸菌之細胞間質產生時，可使用pelB信號序列(Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4397、全體納入本說明書中作為參考)。載體向寄主細胞之導入，可使用例如脂質體(lipofectin)、磷酸鈣法、DEAE-Dextran法實施。

大腸菌表現載體以外，作為例如製造本發明之多肽之載體，考列舉哺乳動物來源的表現載體(例如：pcDNA3(Invitrogen公司製)、pEGF-BOS(Nucleic Acids. Res. 1990, 18(17),p5322、全體納入本說明書中作為參考)、pEF、pCDM8)、昆蟲細胞來源的表現載體(例如「Bac-to-BAC baculovirus expression system」(GIBCO BRL公司製)、pBacPAK8)、植物來源的表現載體(例如pMH1、pMH2)、動物病毒來源的表現載體(例如：pHSV、pMV、pAdexLcw)、反轉錄病毒來源的表現載體(例如：pZIPneo)、酵母來源的表現載體(例如：「Pichia Expression Kit」(Invitrogen公司製)、pNV11、SP-Q01)、枯草菌來源的表現載體(例如：pPL608、pKTH50)。

為了在CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞、HEK293細胞等動物細胞表現時，須要有在細胞內表現所必要的啟動子，例如SV40啟動子(Mulligan等, Nature (1979) 277, 108、全體納入本說明書中作為參考)、MMTV-LTR啟動子、EF1α啟動子(Mizushima等, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322、全體納入本說明書中作為參考)、CAG啟動子(Gene. (1991) 108, 193、全體納入本說明書中作為參考)、CMV啟動子等，具有用以選拔轉形細胞之基因（例如，能利用藥劑(新黴素、G418等)判別的藥劑耐性基因）則更佳。帶有如此特性之載體，例如：pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13等。又，有時為了增加基因的副本數，會使EBNA1蛋白質共表現，於此情形，使用有複製開始點OriP的載體。(Biotechnol Bioeng. 2001 Oct 20;75(2):197-203.、Biotechnol Bioeng. 2005 Sep 20;91(6):670-7.)

再者，為了使基因安定表現且放大細胞內之基因副本數時，可列舉在核酸合成路徑缺損的CHO細胞導入具有和其互補之DHFR基因的載體（例如，pCHOI等），利用胺甲喋呤(MTX)使其放大的方法，又，當為了暫時表現基因時，可列舉使用染色體上帶有表現SV40 T抗原之基因的COS細胞，以帶有SV40之複製起點的載體(pcD等)轉形的方法。複製開始點也可使用多瘤病毒、腺病毒、牛乳突瘤病毒(BPV)等來源者。再者，為了以寄主細胞系將基因副本數放大，表現載體就選擇標記而言，可包括胺基糖苷轉移酶(APH)基因、胸腺嘧啶激酶(TK)基因、大腸菌黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(Ecogpt)基因、二氫葉酸還原酵素(dhfr)基因等。

抗體之回收，可藉由例如培養轉形的細胞後，從經分子轉形之細胞之細胞內或培養液分離以進行。抗體之分離、精製可適當組合離心分離、硫安分級、鹽析、超過濾、C1q、FcRn、蛋白質A、蛋白質G管柱、親和性層析、離子交換層析、凝膠過濾層析等方法以實施。

多專一性抗體之有效率的製作方法，可適用Knobs-into-holes技術(WO1996/027011、Ridgway JB et al., Protein Engineering (1996) 9, 617-621、Merchant AM et al. Nature Biotechnology (1998) 16, 677-681)、導入電荷性排斥而抑制非目的之H鏈彼此締合的技術(WO2006/106905)等前述技術。

本發明提供一種抗原結合分子之製造方法，係製造包括能和不同的2個第1抗原與第2抗原結合之抗體之可變區且和第1抗原與第2抗原不同時結合之可變區（第1可變區）、及和與該第1抗原及第2抗原為不同之第3抗原結合之可變區（第2可變區）的抗原結合分子，包含以下步驟：製作該第1可變區之胺基酸序列為多樣之抗原結合分子庫。

例如可列舉包含以下步驟之製造方法： (i) 製作抗原結合分子之庫，係和第1抗原或第2抗原結合之抗體之可變區中的至少1個胺基酸改變的抗原結合分子且含有該經改變之可變區之胺基酸的至少1個係彼此不同的可變區之抗原結合分子之庫； (ii) 從製作之庫之中，選擇含有對於第1抗原及第2抗原有結合活性、但是不和該第1抗原及第2抗原同時結合之可變區之抗原結合分子； (iii) 將包含編碼為步驟(ii)選出之抗原結合分子之該可變區的核酸與編碼為和第3抗原結合之抗原結合分子之可變區的核酸的寄主細胞進行培養，使含有會和第1抗原與第2抗原結合但是不和該第1抗原與第2抗原同時結合之抗體之可變區、及、和第3抗原結合之可變區的抗原結合分子表現；及 (iv) 從前述寄主細胞培養物回收抗原結合分子。

又，本製造方法中，步驟(ii)可為以下的選擇步驟： (v) 從製作的庫中，選擇包含對於第1抗原及第2抗原有結合活性但不會和在各自不同的細胞上表現之第1抗原與第2抗原同時結合之可變區的抗原結合分子。

上述步驟(i)使用之抗原結合分子只要是含有抗體之可變區即不特別限定，可為Fv、Fab、Fab'等抗體片段，也可為含有Fc區之抗體。

改變的胺基酸，可選擇例如和第1抗原或第2抗原結合之抗體之可變區之中不會因胺基酸改變而喪失向該抗原之結合的胺基酸。

本發明之胺基酸改變可單獨使用也可組合多數使用。 組合複數使用時，組合數不特別限定，例如：2個以上30個以下，較佳為2個以上25個以下、2個以上22個以下、2個以上20個以下、2個以上15個以下、2個以上10個以下、2個以上5個以下、2個以上3個以下。 組合複數時，可只對於抗體之重鏈可變區或輕鏈可變區施加該胺基酸改變，也可對於重鏈可變區與輕鏈可變區兩者適當選別施加。

作為胺基酸改變的理想區域，可列舉可變區中之露出於溶劑之區域及迴圈區域。其中，CDR1、CDR2、CDR3、FR3區域、及迴圈區域為較佳。具體而言，H鏈可變區之Kabat編號31~35、50~65、71~74、95~102、及L鏈可變區之Kabat編號24~34、50~56、89~97較理想，H鏈可變區之Kabat編號31、52a~61、71~74、97~101、及L鏈可變區之Kabat編號24~34、51~56、89~96更理想。

又，對於胺基酸殘基施加改變時，也包括將和第1抗原或第2抗原結合之抗體之可變區之中的上述區域之胺基酸予以隨機改變、或將預先已知對於所望抗原有結合活性的胜肽插入到上述區域。藉此，從已施加改變之抗原結合分子之中選出能和第1抗原與第2抗原結合但不能和該等抗原同時結合的可變區，可獲得本發明之抗原結合分子。作為預先已知對於所望抗原有結合活性的胜肽，例如上述表1所示之胜肽。

是否是能和第1抗原與第2抗原結合但無法和該等抗原同時結合之可變區，又，第1抗原與第2抗原中的任一者於細胞上存在且另一者單獨存在、兩者單獨存在、或兩者存在於同一細胞上時，是否是能和第1抗原與第2抗原兩者同時結合但在各自不同的細胞上表現時不能同時結合之可變區，可依上述方法同樣地確認。

此外，本發明提供一種抗原結合分子之製造方法，係製造包含能和不同的2個第1抗原與第2抗原結合之抗體之可變區且不和第1抗原與第2抗原同時結合之可變區（第1可變區）的抗原結合分子，包含製作該第1可變區之胺基酸序列為多樣的抗原結合分子庫的步驟。

作為如此的抗原結合分子之製造方法，例如：包含以下步驟： (i) 製作係和第1抗原或第2抗原結合之抗體之可變區之至少1個胺基酸經改變之抗原結合分子且含有該改變之可變區之胺基酸之至少1個彼此不同之可變區之抗原結合分子之庫； (ii) 從製作之庫之中，選出含有對於第1抗原及第2抗原有結合活性但不和該第1抗原及第2抗原同時結合之可變區的抗原結合分子； (iii) 將含有編碼為步驟(ii)選出之抗原結合分子之該可變區的核酸的寄主細胞進行培養，使含有能和第1抗原與第2抗原結合但不和該第1抗原與第2抗原同時結合之抗體之可變區的抗原結合分子表現；及 (iv)從前述寄主細胞培養物回收抗原結合分子。 又，用於上述胺基酸改變之理想區域可列舉重鏈可變區。更佳為例如可變區中之露出於溶劑之區域及迴圈區域。其中，CDR1、CDR2、CDR3、FR3區域、及迴圈區域為較佳。具體而言，H鏈可變區之Kabat編號31~35、50~65、71~74、95~102、及L鏈可變區之Kabat編號24~34、50~56、89~97較理想，H鏈可變區之Kabat編號31、52a~61、71~74、97~101、及L鏈可變區之Kabat編號24~34、51~56、89~96更理想。

又，本製造方法中，上述步驟(ii)也可為以下選擇步驟： (v) 從製作之庫之中，選擇含有對於第1抗原及第2抗原有結合活性但不和各自在不同的細胞上表現之第1抗原與第2抗原同時結合之可變區的抗原結合分子。

上述步驟(i)使用之抗原結合分子只要是含有抗體之可變區即不特別限定，可為Fv、Fab、Fab'等抗體片段，也可為含Fc區之抗體。

經改變之胺基酸，可選擇例如：和第1抗原或第2抗原結合之抗體之可變區之中，不因胺基酸改變而喪失和該抗原之結合的胺基酸。

本發明之胺基酸改變可單獨使用也可使用多種。 組合複數個使用時，組合數不特別限定，如：2個以上30個以下，較佳為2個以上25個以下、2個以上22個以下、2個以上20個以下、2個以上15個以下、2個以上10個以下、2個以上5個以下、2個以上3個以下。 組合複數個時，可只對抗體之重鏈可變區或輕鏈可變區施以該胺基酸改變，也可對於重鏈可變區與輕鏈可變區兩者適當區分施加。

又，對於胺基酸殘基施加改變時，也包括將和第1抗原或第2抗原結合之抗體之可變區之中的上述區域之胺基酸予以隨機改變、或將預先已知對於所望抗原有結合活性的胜肽插入到上述區域。藉此，從已施加改變之抗原結合分子之中選出能和第1抗原與第2抗原結合但不能和該等抗原同時結合的可變區，可獲得本發明之抗原結合分子。作為預先已知對於所望抗原有結合活性的胜肽，例如上述表1所示之胜肽。

是否是能和第1抗原與第2抗原結合但無法和該等抗原同時結合之可變區，又，第1抗原與第2抗原中的任一者於細胞上存在且另一者單獨存在、兩者單獨存在、或兩者存在於同一細胞上時，是否是能和第1抗原與第2抗原兩者同時結合但在各自不同的細胞上表現時不能同時結合之可變區，可依上述方法同樣地確認。

又，依該製造方法製造之抗原結合分子也包括在本發明。 依本方法導入的胺基酸改變的種類、範圍無特殊限定。

作為本發明之庫之一非限定態樣，可列舉選擇CD3（人CD3的情形，為構成人CD3之γ鏈、δ鏈或ε鏈）作為第1抗原，由和CD3與任意第2抗原結合之抗原結合分子構成之庫。

本發明之資料庫之一理想可列舉如下：為由序列彼此不同之多數抗原結合分子為主而成，其特徵為：前述抗原結合分子中之抗原結合域，係能和第1抗原及與該第1抗原為不同之第2抗原結合，但不同時結合於該第1抗原與該第2抗原之抗體之可變區，前述第1抗原及前述第2抗原中之任一抗原為CD3，另一抗原為在T細胞或其他免疫細胞表面表現之分子。

前述第1抗原及前述第2抗原中任一抗原為人CD3時，該抗原結合分子宜結合在構成人CD3之γ鏈、δ鏈或ε鏈較佳。再者，前述可變區宜為不同時結合在各不同之細胞上表現之第1抗原及第2抗原之可變區較佳。在此，「在不同的細胞上表現」，只要是在各別的細胞上表現即可，如此的細胞之組合，例如：T細胞與另一T細胞般為同種類細胞亦可，T細胞與NK細胞般為不同種類細胞亦可。

又，本發明提供製造抗原結合分子之方法，該抗原結合分子含有能和不同之3個抗原（第1抗原、和該第1抗原為不同之第2抗原、及和該第1抗原及該第2抗原為不同之第4抗原）結合之抗體之可變區，係不同時結合於該3個抗原之可變區（第1可變區）、及結合於和該3個抗原為不同之第3抗原之可變區（第2可變區），包括以下步驟： 製作該第1可變區之胺基酸序列為多樣的抗原結合分子資料庫。

例如可列舉包括以下步驟之製造方法： (i) 製作抗原結合分子的資料庫，該抗原結合分子為會結合於不同之3個抗原（第1抗原、和該第1抗原為不同之第2抗原、及和該第1抗原及該第2抗原為不同之第4抗原）之抗體之可變區之至少1個胺基酸經改變之抗原結合分子，包括該經改變之可變區之胺基酸之至少1個係彼此不同的可變區； (ii) 從製作之資料庫之中選擇包括對於該3個抗原有結合活性但不同時結合於該3個抗原之可變區的抗原結合分子； (iii) 培養包括編碼為在步驟(ii)選擇之抗原結合分子之該可變區之核酸、與編碼為結合於第3抗原之抗原結合分子之可變區之核酸的寄主細胞，使包括能結合於該3個抗原但不同時結合於該3個抗原之抗體之可變區、及結合於第3抗原之可變區的抗原結合分子表現；及 (iv) 從前述寄主細胞培養物回收抗原結合分子。

又，本製造方法中，步驟(ii)也可為以下的選擇步驟： (v) 從製作之資料庫之中，選擇包括對於前述3個抗原有結合活性但不同時結合於在各不同之細胞上表現之該3個抗原的可變區的抗原結合分子。

上述步驟(i)使用之抗原結合分子只要是包括抗體之可變區即可，不特別限定，可為Fv、Fab、Fab'等抗體片段，也可為包括Fc區之抗體。

改變之胺基酸，係選擇例如會結合於前述3個抗原之抗體之可變區當中，不因胺基酸改變而喪失對於該抗原之結合的胺基酸。

本發明之胺基酸改變可單獨使用也可組合多個使用。 組合複數個使用時，組合數不特別限定，例如：2個以上30個以下，較佳為2個以上25個以下、2個以上22個以下、2個以上20個以下、2個以上15個以下、2個以上10個以下、2個以上5個以下、2個以上3個以下。 組合複數個時，可只對於抗體之重鏈可變區或輕鏈可變區施加該胺基酸改變，也可對於重鏈可變區與輕鏈可變區兩者適當區分施加。

胺基酸改變之理想區域可列舉可變區中之露出在溶劑之區域及迴圈區域。其中，CDR1、CDR2、CDR3、FR3區域、及迴圈區域為較佳。具體而言，宜為H鏈可變區之Kabat編號31~35、50~65、71~74、95~102、及L鏈可變區之Kabat編號24~34、50~56、89~97，更宜為H鏈可變區之Kabat編號31、52a~61、71~74、97~101、及L鏈可變區之Kabat編號24~34、51~56、89~96。

又，對於胺基酸殘基施加改變包括：將會結合於前述3個抗原之抗體之可變區之中之上述區域之胺基酸予以隨機改變，或將預先已知對於所望抗原有結合活性之胜肽插入到上述區域。以此方式，從已施加改變之抗原結合分子之中選出能和不同之3個抗原（第1抗原、和該第1抗原為不同之第2抗原、及和該第1抗原及該第2抗原為不同之第4抗原）結合但不能同時和該等抗原結合之可變區，可藉此獲得本發明之抗原結合分子。作為預先已知對於所望抗原有結合活性之胜肽，例如上述表1所示之胜肽。

是否為能結合於前述3個抗原但不同時結合於該等抗原之可變區，進而於不同之3個抗原（第1抗原、第2抗原、第4抗原）中之任1者以上之抗原並非在細胞上而是單獨存在、或不同之3個抗原之任2者以上係存在於同一細胞上時，是否為關於此等抗原能同時結合但於各不同細胞上表現時則無法同時結合之可變區，可依上述方法同樣地確認。

又，本發明提供一種製造抗原結合分子之方法，該抗原結合分子包括能和不同之3個抗原（第1抗原、和該第1抗原為不同之第2抗原、及和該第1抗原及該第2抗原為不同之第4抗原）結合之抗體之可變區且係不同時結合於該3個抗原之可變區（第1可變區）； 包括以下步驟： 製作該第1可變區之胺基酸序列為多樣的抗原結合分子資料庫。

作為如此之抗原結合分子之製造方法例如包括以下步驟之製造方法： (i) 製作抗原結合分子的資料庫，該抗原結合分子為和不同之3個抗原（第1抗原、和該第1抗原為不同之第2抗原、及和該第1抗原及該第2抗原為不同之第4抗原）結合之抗體之可變區之至少1個胺基酸經改變之抗原結合分子，且包括該經改變之可變區之至少1個胺基酸之係彼此不同的可變區； (ii) 從製作之資料庫之中選擇包括對於該3個抗原有結合活性但不同時結合於該3個抗原之可變區的抗原結合分子； (iii) 培養包括編碼為在步驟(ii)選擇之抗原結合分子之該可變區之核酸的寄主細胞，使包括能和該3個抗原結合但不同時和該3個抗原結合之抗體之可變區的抗原結合分子表現；及 (iv) 從前述寄主細胞培養物回收抗原結合分子。 又，上述胺基酸改變之理想區域可列舉重鏈可變區。更佳為例如可變區中之露出於溶劑之區域及迴圈區域。其中，CDR1、CDR2、CDR3、FR3領域、及迴圈區域為較佳。具體而言，H鏈可變區之Kabat編號31~35、50~65、71~74、95~102、及L鏈可變區之Kabat編號24~34、50~56、89~97較理想，H鏈可變區之Kabat編號31、52a~61、71~74、97~101、及L鏈可變區之Kabat編號24~34、51~56、89~96更理想。

又，本製造方法中，上述步驟(ii)也可為以下之選擇步驟： (v) 從製作之資料庫之中選擇包括對於前述3個抗原有結合活性但不同時結合於在各不同之細胞上表現之該3個抗原之可變區之抗原結合分子。

上述步驟(i)使用之抗原結合分子只要包括抗體之可變區即可，不特別限定，可為Fv、Fab、Fab'等抗體片段，也可為包括Fc區之抗體。

改變之胺基酸，係選擇例如會結合於前述3個抗原之抗體之可變區當中，不因胺基酸改變而喪失對於該抗原之結合的胺基酸。

本發明之胺基酸改變可單獨使用也可組合多個使用。 組合複數個使用時，組合數不特別限定，例如：2個以上30個以下，較佳為2個以上25個以下、2個以上22個以下、2個以上20個以下、2個以上15個以下、2個以上10個以下、2個以上5個以下、2個以上3個以下。 組合複數個時，可只對於抗體之重鏈可變區或輕鏈可變區施加該胺基酸改變，也可對於重鏈可變區與輕鏈可變區兩者適當區分施加。

又，對於胺基酸殘基施加改變包括：將會結合於前述3個抗原之抗體之可變區之中之上述區域之胺基酸予以隨機改變，或將預先已知對於所望抗原有結合活性之胜肽插入到上述區域。以此方式，從已施加改變之抗原結合分子之中選出能和該3個抗原結合但不能同時和該等抗原結合之可變區，可藉此獲得本發明之抗原結合分子。作為預先已知對於所望抗原有結合活性之胜肽，例如上述表1所示之胜肽。

是否為能結合於前述3個抗原但不同時結合於該等抗原之可變區，進而於不同之3個抗原（第1抗原、第2抗原、第4抗原）中之任1者以上之抗原並非在細胞上而是單獨存在、或不同之3個抗原之任2者以上係存在於同一細胞上時，是否為關於此等抗原能同時結合但於各不同細胞上表現時則無法同時結合之可變區，可依上述方法同樣地確認。

依該製造方法製造之抗原結合分子也包括在本發明。 依本方法導入之胺基酸改變之種類、範圍無特殊限定。

本發明之資料庫之一非限定態樣可列舉：選擇CD3（人CD3的情形，為構成人CD3之γ鏈、δ鏈或ε鏈）作為第1抗原，由會結合於CD3與任意第2抗原及第4抗原之抗原結合分子構成的資料庫。

本發明之資料庫之一理想態樣，可列舉由序列彼此不同之多數抗原結合分子為主而成的資料庫，前述抗原結合分子中之抗原結合域為能和不同之3個抗原（第1抗原、和該第1抗原為不同之第2抗原、及和該第1抗原及該第2抗原為不同之第4抗原）結合但不同時和該3個抗原結合之抗體之可變區，前述第3個抗原中之任1者之抗原為CD3，其餘2個抗原為在T細胞或其他免疫細胞表面表現之分子。

前述3個抗原中之任1者之抗原為人CD3時，該抗原結合分子宜會結合於構成人CD3之γ鏈、δ鏈或ε鏈較佳。再者，前述可變區宜為不同時和在各不同之細胞上表現之該3個抗原結合的可變區較佳。在此，「在不同細胞上表現」只要是在各自之細胞上表現即可，如此的細胞之組合，例如：T細胞與另一T細胞般為同種類之細胞亦可，T細胞與NK細胞般為不同種類之細胞亦可。

本說明書中，「資料庫」或「資料庫」係指複數之數抗原結合分子或含抗原結合分子之多數融合多肽、或編碼為該等序列之核酸、多核苷酸。資料庫中所含之複數之數抗原結合分子或含抗原結合分子之多數融合多肽之序列，非單一序列，而是序列彼此不同之抗原結合分子或含抗原結合分子之融合多肽。

本發明之一實施形態中，可製作本發明之抗原結合分子與異種多肽的融合多肽。在某實施形態，融合多肽，可和由病毒外殼蛋白質，例如pIII、pVIII、pVII、pIX、Soc、Hoc、gpD、pVI及其變異體構成之群中選出的病毒外殼蛋白質之至少一部分融合並獲得。

在某實施形態，本發明之抗原結合分子可為ScFv、Fab片段、F(ab) ₂或F(ab') ₂，故於另一實施形態，可提供為該等抗原結合分子與異種多肽之融合多肽，且係主要由彼此序列不同的多數融合多肽而成的庫。具體而言，可提供係將該等抗原結合分子與選自於由病毒外殼蛋白質，例如pIII、pVIII、pVII、pIX、Soc、Hoc、gpD、pVI及其變異體構成之群中之病毒外殼蛋白質之至少一部分融合而得之融合多肽，且係主要由序列彼此不同的多數融合多肽而成的庫。本發明之抗原結合分子可進一步含有二聚物化分域。在某實施形態中，前述二聚物化分域可存在於抗體之重鏈或輕鏈可變區與病毒外殼蛋白質的至少一部分之間。此二聚物化分域可含有二聚物化序列之至少1個、及/或含1個或多數半胱胺酸殘基之序列。此二聚物化分域較佳為能和重鏈可變區或不變區之C末端連結。二聚物化分域，藉由是否製作為前述抗體可變區和病毒之外殼蛋白質成分的融合多肽成分（二聚物化分域之後不具UAG(amber)終止密碼子）、或是否製作為前述抗體可變區主要不含病毒外殼蛋白質成分（例如，二聚物化分域之後有UAG(amber)終止密碼子），可採取各種結構。當前述抗體可變區係主要製作為和病毒外殼蛋白質成分之融合多肽時，可由1或多數雙硫鍵及/或單一之二聚物化序列進行二價展示。。

本說明書中，序列彼此不同之多數抗原結合分子的記載中，「序列彼此不同」的用語，係指資料庫中的各個抗原結合分子的序列彼此不同。亦即，資料庫中彼此不同的序列的數目反映出庫中之序列不同的獨立選殖體的數目，有時也指稱「資料庫尺寸」。通常之噬菌體展示庫為10 ⁶至10 ¹²，可利用核糖體展示法等公知之技術將庫尺寸擴大到10 ¹⁴。但是噬菌體庫之淘選時使用之噬菌體粒子之實際數通常比起庫尺寸要大出10至10,000倍。此過剩倍數也稱為「資料庫當量數」，代表有相同胺基酸序列的各個選殖體可能有10至10,000個存在。是以本發明中「彼此序列不同」的用語，係指排除庫當量數後於資料庫中之各個抗原結合分子的序列彼此不同，更具體而言，是指彼此序列不同的抗原結合分子有10 ⁶至10 ¹⁴分子，較佳有10 ⁷至10 ¹²分子，更佳有10 ⁸至10 ¹¹，尤佳有10 ⁸至10 ¹⁰存在。

再者，本發明之主要由多數抗原結合分子而成的資料庫的記載中，「主要由…構成」之用語，反映出資料庫中序列不同的獨立選殖體之數中，抗原結合分子對於第1及/或第2抗原之結合活性（或抗原結合分子對於第1、第2、及/或第4抗原之結合活性）不同的抗原結合分子的數目。具體而言，顯示如此結合活性之抗原結合分子於庫中至少宜有10 ⁴分子存在較佳。更佳為本發明提供顯示如此結合活性之抗原結合分子至少有10 ⁵分子存在之資料庫。又更佳為本發明提供顯示如此結合活性之抗原結合分子至少有10 ⁶分子存在之資料庫。尤佳為本發明提供顯示如此結合活性之抗原結合分子至少有10 ⁷分子存在之資料庫。較佳為本發明提供顯示如此結合活性之抗原結合分子至少有10 ⁸分子存在之資料庫。於另一表達方式，也可利用以下方式表達：資料庫中之序列不同之獨立選殖體之數中，對於第1及/或第2抗原之抗原結合分子之結合活性（或抗原結合分子對於第1、第2、及/或第4抗原之結合活性）不同之抗原結合分子之比例。具體而言，本發明提供顯示如此結合活性之抗原結合分子的含量為庫中序列不同之獨立選殖體之數目之0.1%至80%，較佳為0.5%至60%，更佳為1%至40%，更佳為2%至20%，尤佳為4%至10%之資料庫。融合多肽、多核苷酸分子或載體的情形亦和上述同，可以用分子數目、在分子全體的比例表達。又，病毒的情形亦上述同，可以用病毒個體的數目、在個體全體的比例表達。

就本發明之資料庫而言，包括能和第1抗原及與該第1抗原為不同之第2抗原結合，但不同時結合於該第1抗原與該第2抗原之抗體之可變區的多數抗原結合分子（或包括能和不同之3個抗原結合，但不同時和該3個抗原結合之抗體之可變區之多數抗原結合分子）宜在資料庫中存在至少1個分子、10個分子、100個分子、1000個分子、10 ⁴個分子、10 ⁵個分子、10 ⁶個分子、10 ⁷個分子或10 ⁸個分子較佳。提供包括能結合於第1抗原及與該第1抗原為不同之第2抗原但不同時結合於該第1抗原與該第2抗原之抗體之可變區的多數抗原結合分子（或包括能和不同之3個抗原結合，但不同時和該3個抗原結合之抗體之可變區之多數抗原結合分子）之含量為資料庫中之序列不同之獨立選殖體數目之10 ^-7%%至80%，較佳為10 ^-6%至60%，更佳為10 ^-5%至40%、10 ^-4%至30%、10 ^-3%至20%、10 ^-2%至10%、10 ^-1%至1%的資料庫。

本發明中，就「由序列彼此不同之多數抗原結合分子為主而成之資料庫」之一態樣而言，係由(i)序列彼此不同之多數抗體之可變區、或含有該可變區之抗原結合分子、或(ii)編碼為該序列彼此不同之多數抗體之可變區、或含該可變區之抗原結合分子之核酸為主而成之資料庫。

在此，序列彼此不同之多數抗原結合分子，係包括對於資料庫之模板序列（例如，抗體之可變區）導入至少1個胺基酸之改變的可變區之抗原結合分子。作為為了胺基酸改變之理想區域，可列舉重鏈可變區及/或輕鏈可變區。更佳為可變區中之露出於溶劑之區域及迴圈區域。其中，CDR1、CDR2、CDR3、FR3區域、及迴圈區域為較佳。具體而言，H鏈可變區之Kabat編號31~35、50~65、71~74、95~102、及L鏈可變區之Kabat編號24~34、50~56、89~97較理想，H鏈可變區之Kabat編號31、52a~61、71~74、97~101、及L鏈可變區之Kabat編號24~34、51~56、89~96更理想。

上述抗原結合分子只要含有抗體之可變區即可，不特別限定，可以為Fv、Fab、Fab'等抗體片段，也可為包括Fc區之抗體。

改變胺基酸，可選擇例如：和第1抗原或第2抗原結合之抗體之可變區之中，不因胺基酸改變而喪失和該抗原之結合的胺基酸。或改變之胺基酸可選擇和不同之3個抗原結合之抗體之可變區之中，不因胺基酸改變而喪失和該3個抗原之結合之胺基酸。

本發明之胺基酸改變可以單獨使用也可組合多數使用。 組合複數個使用時，組合數不特別限定，例如：2個以上30個以下，較佳為2個以上25個以下、2個以上22個以下、2個以上20個以下、2個以上15個以下、2個以上10個以下、2個以上5個以下、2個以上3個以下。 組合複數個時，可只對於抗體之重鏈可變區或輕鏈可變區中之任一者施加該胺基酸改變，也可對於重鏈可變區與輕鏈可變區兩者適當區別施加。

又，對於胺基酸殘基施加改變，也包括：將會結合於第1抗原或第2抗原之抗體之可變區（或和第1、第2、或第4抗原結合之抗體之可變區）之中，上述區域之胺基酸予以隨機改變，或將預先已知對於所望抗原有結合活性之胜肽插入到上述區域。以此方式，從已施加改變之抗原結合分子之中選擇能和第1抗原與第2抗原結合但不能同時結合於該等抗原之可變區（或能和不同之3個抗原結合但不能同時和該3個抗原結合之可變區），藉此可獲得本發明之抗原結合分子。預先已知對於所望抗原有結合活性之胜肽，例如上述表1所示之胜肽。

是否為能結合於第1抗原與第2抗原但無法同時結合於該等抗原之可變區（或能結合於不同之3個抗原但無法同時結合於該3個抗原之可變區），進而第1抗原與第2抗原中的任一者於細胞上存在且另一者單獨存在、兩者單獨存在、或兩者存在於同一細胞上時，是否是能和第1抗原與第2抗原兩者同時結合但在各自不同的細胞上表現時不能同時結合之可變區（或是否為不同之3個抗原之任一者以上不是在細胞上而是單獨存在時，或不同之3個抗原中之任2者以上存在於同一細胞上時，關於此等抗原能同時結合但在各不同細胞上表現時則不能同時結合之可變區），可依上述方法同樣地確認。

本說明書中，「噬菌體展示」係變異體多肽和噬菌體，例如和纖維狀噬菌體之粒子表面的外殼蛋白質的至少一部分融合而以蛋白質展示的手法。噬菌體展示的用途，在於從隨機的蛋白質變異體的大庫快速有效率地選出和對象抗原以高親和性結合的序列。噬菌體上之胜肽及蛋白質庫之展示利用在將數百萬多肽就專一性結合特性進行篩選。多價噬菌體展示方法，利用在藉由和纖維狀噬菌體之基因III或基因VIII之融合而展示無規胜肽及小蛋白質(Wells及Lowman(Curr.Opin. Struct.Biol. (1992) 3, 355-362)及其中的引用文獻)。一價之噬菌體展示時，蛋白質或胜肽之庫融合於基因III或其一部分，噬菌體粒子以展示融合蛋白質的1個或0個副本的方式，於野生型基因III蛋白質存在下以低水平表現。結合性(avidity)效果比起多價之噬菌體較低，所以篩選係依據內在性配體親和性，使用噬粒(phagemid)載體，此載體係將DNA操作簡化(Lowman及Wells、Methods：A Companion to Methods in Enzymology (1991) 3, 205-216)。

「噬粒」係具有細菌之複製起點，例如具有ColE1及細菌噬菌體之基因間區域之副本的質體載體。噬粒可適當使用各種公知之細菌噬菌體，例如纖維狀細菌噬菌體及lambda型細菌噬菌體。質體通常也含有抗生物質耐性之選擇標記。選殖到該等載體的DNA片段可增殖作為質體。導入了該等載體的細胞當具備生產噬菌體粒子所必要的全部基因時，質體之複製樣式會變化為圓周開捲(Rolling circle)複製，生成質體DNA之1條鏈的副本和噬菌體粒子包裝體。噬粒可形成感染性或非感染性噬菌體粒子。此用語包括異種多肽以在噬菌體粒子表面展示的方式就基因融合而言和此異種多肽之基因結合而得的噬菌體外殼蛋白質基因、或含其片段的噬粒。

用語「噬菌體載體」係指含有異種基因而能複製之細菌噬菌體之2條鏈複製型。噬菌體載體具有能實施噬菌體複製及形成噬菌體粒子的噬菌體複製起點。噬菌體較佳為纖維狀細菌噬菌體，例如M13、f1、fd、Pf3噬菌體或其衍生物、或lambda型噬菌體，例如lambda、21、phi80、phi81、82、424、434、其他或其衍生物。

「寡核苷酸」係利用公知方法（例如：固相手法，例如利用EP266032記載之手法的磷酸三酯、亞磷酸鹽、或亞磷醯胺(phosphoramidite)化學、或Froeshler等(Nucl.Acids.Res. (1986) 14, 5399-5407)記載的去氧核苷酸H-膦酸鹽中間體的方法）以化學合成的短的單條鏈或2條鏈的聚去氧核苷酸。其他方法包括以下記載之聚合酶連鎖反應及其他自動引子法(auto primer method)、及固體擔體上之寡核苷酸合成。該等方法都記載於Engels等(Agnew.Chem.Int.Ed.Engl. (1989) 28, 716-734)。若基因的全部核酸序列公知，或可利用和編碼鏈互補的核酸序列的話，則可使用該等方法。或對象胺基酸序列若為公知，可使用各胺基酸殘基之公知且理想的編碼殘基而適當推測可能的核酸序列。寡核苷酸可以利用聚丙烯醯胺凝膠或分子篩管柱、或沉澱法精製。

用語「融合蛋白質」及「融合多肽」係指帶有以共價鍵彼此鍵結的2個部分的多肽，為各部分有不同特性之多肽。此特性可為例如體外( in vitro)或體內( in vivo)活性等生物學的性質。又，此特性可為單一化學或物理性質，例如和對象抗原之結合、反應觸媒等。此2個部分可利用單一胜肽鍵直接結合，或介由含1或多數胺基酸殘基的胜肽連結子結合。通常此2個部分和連結子存在於相同讀框。較佳為多肽的2個部分係由異種或不同的多肽獲得。

用語「外殼蛋白質」是指蛋白質中，至少其一部分存在於病毒粒子表面。從機能上之觀點，外殼蛋白質是在寄主細胞建構病毒的過程中和病毒粒子結合的任意蛋白質，直到病毒感染其他寄主細胞為止維持和其結合。外殼蛋白質可為主要外殼蛋白質，也可為少量的外殼蛋白質。少量外殼蛋白質，是通常病毒外殼存在的外殼蛋白質，較佳為每1病毒粒子(virion)存在至少約5個，更佳為至少約7個，再更佳為至少約10個或更多蛋白質的副本。主要外殼蛋白質，每1病毒粒子可存在數十、數百或數千個副本。主要外殼蛋白質，例如纖維狀噬菌體之p8蛋白質。

本發明之一非限定態樣，製作資料庫之方法可列舉以下6種。 1. 對於結合第1抗原之抗原結合分子插入結合於第2抗原之胜肽（或結合於第2抗原之胜肽及結合於第4抗原之胜肽）（此用語係以包括多肽及蛋白質的方式使用）之方法 2. 製作在能將抗原結合分子中之迴圈加長改變（延長）的位置出現各種胺基酸的庫，從庫以對於抗原之結合活性作為指標，取得對於任意之第2抗原（或任意之第2抗原及任意之第4抗原）有結合活性之抗原結合分子之方法 3. 從已知對第1抗原結合的抗原結合分子之中，使用利用部位專一性變異法製作的抗體鑑定維持和第1抗原之結合活性的胺基酸，從出現鑑定的胺基酸的庫之中，以對於抗原之結合活性為指標，取得對於任意之第2抗原（或任意之第2抗原及任意之第4抗原）有結合活性之抗原結合分子之方法 4. 製作3之方法中能將抗原結合分子中之迴圈加長改變（延長）的位置出現各種胺基酸的抗體庫，從庫以對於抗原之結合活性作為指標，取得對於任意之第2抗原（或任意之第2抗原及任意之第4抗原）有結合活性之抗原結合分子之方法 5. 於1.2.3.或4.之方法中，進行改變使糖鏈附加序列（例如NxS、NxT、x為P以外之胺基酸）出現，並附加糖鏈受體認識之糖鏈之方法（例如附加高甘露糖型糖鏈，高甘露糖受體會認識。高甘露糖型糖鏈已知可藉由於抗體表現時添加Kifunensine而得(MAbs. 2012 Jul-Aug;4(4):475-87)） 6. 於1.2.3.或4.之方法中，於迴圈部位、可改變為各種胺基酸之部位插入或取代Cys、Lys或非天然胺基酸，而以共價鍵附加結合第2抗原之分域(或結合於第2抗原之分域及結合於第4抗原之分域)之方法(Antibody drug conjugate為代表之方法，以共價鍵結合Cys、Lys或非天然胺基酸之方法(mAbs 6:1, 34-45; January/February 2014、WO2009/134891A2、Bioconjug Chem. 2014 Feb 19;25(2):351-61)) 又，上述例示的6種庫製作方法中，抗原結合分子中之胺基酸取代處或在抗原結合分子中插入胜肽之處，宜為抗原結合分子之Fab或可變區部分為較佳。理想的區域例如可變區中之露出於溶劑之區域及迴圈區域。其中，CDR1、CDR2、CDR3、FR3區域、及迴圈區域為較佳。具體而言，H鏈可變區之Kabat編號31~35、50~65、71~74、95~102、及L鏈可變區之Kabat編號24~34、50~56、89~97較理想，H鏈可變區之Kabat編號31、52a~61、71~74、97~101、及L鏈可變區之Kabat編號24~34、51~56、89~96更理想。

上述方法1.記載的對於結合第1抗原之抗原結合分子插入結合第2抗原之胜肽（或結合於第2抗原之胜肽及結合於第4抗原之胜肽）的方法，就一態樣而言，可列舉如Angew Chem Int Ed Engl. 2013 Aug 5;52(32):8295-8例示般插入G-CSF之方法。就其他一態樣而言，插入的胜肽可從展示胜肽的庫取得，也可利用天然存在的蛋白質的全體或其一部分。

作為本發明之一態樣，提供包括以下步驟之資料庫之製造方法。 以下(a)及(b)之步驟： (a) 將結合於第1抗原之抗體之可變區序列作為資料庫之模板序列，指定滿足以下之(i)至(iii)中之任一者以上之胺基酸改變； (i) 不使對於第1抗原之結合能力實質上帶來變化之改變； (ii) 不使ECM結合能力實質上帶來變化之改變；及 (iii) 向重鏈可變區、或輕鏈可變區之CDR1、CDR2、CDR3或FR3區域插入由1至25個殘基之胺基酸構成之胜肽；及 (b) 設計包括編碼為該模板序列之核酸、及包括編碼為該模板序列中有前述步驟(a)指定之1或多數胺基酸改變之彼此序列不同之可變區之核酸的資料庫。 依該製造方法可製造由序列彼此不同之多數抗原結合分子為主而成之資料庫，其特徵為：前述抗原結合分子中之抗原結合域係能結合於第1抗原及和該第1抗原為不同之第2抗原，但不同時結合於該第1抗原與該第2抗原之抗體之可變區，前述第1抗原及前述第2抗原中之任一抗原為CD3，另一抗原為在T細胞或其他免疫細胞表面表現之分子。又，依該製造方法，可製造由序列彼此不同之多數抗原結合分子為主之資料庫，前述抗原結合分子中之抗原結合域係能結合於不同之3個抗原（第1抗原、和該第1抗原為不同之第2抗原、及和該第1抗原與第2抗原為不同的第4抗原），但不同時結合於該3個抗原之抗體之可變區，前述3個抗原中之任一抗原為CD3，其餘2個抗原為在T細胞或其他免疫細胞表面表現之分子。

本發明中，「（資料庫之）模板序列」，係指成為用以製作資料庫之模板之序列的抗體胺基酸序列（例如：抗體之可變區序列、或CDR序列等），使用該序列指定能資料庫化之改變胺基酸（例如：由上述態樣(a)(i)、(ii)、(iii)指定），能製作抗原結合分子的資料庫。例如，第1抗原為CD3時，資料庫之模板序列可由該技術領域中有通常知識者適當選擇結合於CD3抗原之抗體之可變區序列。

為了上述步驟(a)(i)：指定不使對於CD3之結合能力實質上帶來變化之改變胺基酸（鑑定維持和第1抗原CD3（人CD3的情形，為構成人CD3之γ鏈、δ鏈或ε鏈）之結合活性的胺基酸），例如可實施據認為涉及抗原結合的部位的胺基酸改變，製作1胺基酸改變抗體並判斷。1胺基酸改變抗體之CD3結合評價可適當選擇該領域中通常知識者公知之方法，可利用例如：ELISA、FACS(fluorescence activated cell sorting)、ALPHA screen(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)、利用表面電漿子共振(SPR)現象之BIACORE法等測定。

為了上述步驟(a)(i)：指定不使對於CD3之結合能力實質上帶來變化之改變胺基酸(鑑定維持與CD3之結合活性之胺基酸)，可使用各種改變體之結合量相對於改變前之抗體之比之結果。亦即，可使用令改變前抗體之結合量為X、1胺基酸改變體之結合量為Y時之Z(結合量之比)＝Y/X之值。Z(結合量之比)為0.5以上、0.6以上、0.7以上、0.8以上、0.9以上，較佳為0.8以上時，可認為相對於改變前之抗體維持結合。可以維持該等結合之胺基酸出現的方式，製作抗體庫。

ECM(Extracellular matrix；細胞外基質)係細胞外之構成成分之一，存在於生命體內的各種部位。所以，已知和ECM強結合的抗體於血中動態變差(半減期變短) (WO2012093704A1)。是以，就抗體庫出現的胺基酸，也宜選擇ECM結合未增強的胺基酸(指定不使ECM結合能力實質上帶來變化之改變胺基酸)較佳。

上述步驟(a)(ii)：指定不使ECM結合能力實質上帶來變化之改變胺基酸(選擇ECM結合未增強之胺基酸)時，可例如依參考實施例2之方法評價ECM結合，使用各改變體之ECM結合值(ECL response；ECL反應之值)除以MRA(H鏈序列辨識號：57、L鏈序列辨識號：58)之抗體ECM結合值而得之值。該值可考慮多數改變所獲致之ECM結合增強效果，以直到5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍作為有效而採用，但較佳直到10倍作為有效而採用於庫。可依如此選擇之胺基酸出現的方法，製作抗體庫。

又，非不限於此，當向CDR3插入的胜肽為6個胺基酸時，CDR3之伸長迴圈內若含有許多側鏈帶有正電荷的胺基酸，則向ECM之結合會增強，故迴圈內宜不出現3個以上的側鏈帶有正電荷的胺基酸較佳。

本發明之資料庫，為了增加資料庫多樣性，可於上述步驟(a)(iii)：指定被插入之改變胺基酸（於可變區插入胜肽）。胜肽插入的理想區域，例如可變區中之露出於溶劑之區域及迴圈區域。其中，CDR1、CDR2、CDR3、FR3區域、及迴圈區域為較佳。具體而言，H鏈可變區之Kabat編號31~35、50~65、71~74、95~102、及L鏈可變區之Kabat編號24~34、50~56、89~97較理想，H鏈可變區之Kabat編號31、52a~61、71~74、97~101、及L鏈可變區之Kabat編號24~34、51~56、89~96更理想。更佳為H鏈可變區之Kabat編號99~100之區域。又，胺基酸改變時，也可一併導入使和抗原之結合活性上昇之胺基酸。

作為本發明之一非限定態樣，插入胜肽之長度可例如為1~3個胺基酸、4~6個胺基酸、7~9個胺基酸、10~12個胺基酸、13~15個胺基酸、15~20個胺基酸、21-25個胺基酸，但較佳為1~3個胺基酸、4~6個胺基酸、7~9個胺基酸。

用以使庫之多樣性增強之胜肽之插入處與長度之研究，可藉由製作已插入胜肽的分子並評價該分子之CD3結合以實施。評價可適當選擇該領域中通常知識者公知之方法，例如可藉由ELISA、FACS(fluorescence activated cell sorting)、ALPHA screen(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)、利用表面電漿子共振(SPR)現象之BIACORE法等測定。

作為本發明之一非限定態樣，可依以下方式設計用以取得和CD3與第2抗原（或CD3及第2抗原及第4抗原）結合之抗體之抗體庫。 步驟1：選擇保持有CD3結合能力之胺基酸（CD3結合量為未改變抗體之80%以上） 例如：可依以出現步驟1選出之胺基酸的方式，製作用以取得和CD3與第2抗原（或CD3及第2抗原及第4抗原）結合之抗體用的資料庫。

作為本發明之一非限定態樣，可依以下方式設計用以取得和CD3與第2抗原（或CD3及第2抗原及第4抗原）結合之抗體用的抗體庫。 步驟1：選擇保持有CD3結合能力之胺基酸（CD3結合量為未改變抗體之80%以上） 步驟2：將胺基酸插入H鏈CDR3之99-100（Kabat編號）之間 例如：除了步驟1，尚於步驟2在CDR3區域插入胺基酸，可製作使庫之多樣性增強之用以取得和CD3與第2抗原（或CD3及第2抗原及第4抗原）結合之抗體之資料庫。

作為本發明之一非限定態樣，可依以下方式設計用以取得和CD3與第2抗原（或CD3及第2抗原及第4抗原）結合之抗體之抗體庫。 步驟1：選擇保持有CD3結合能力之胺基酸（CD3結合量為未改變抗體之80%以上） 步驟2：選擇ECM結合比起改變前，和MRA比較為10倍以內之胺基酸 步驟3：於H鏈CDR3之99-100（Kabat編號）之間插入胺基酸 例如，除了步驟1及3，更加入步驟2，能針對在資料庫出現之胺基酸，也選擇ECM結合未增強之胺基酸，但不限於此手法。又，不經步驟2之資料庫設計，也能對於由資料庫取得之抗原結合分子測定ECM結合並進行評價。

作為本發明之一非限定態樣，當使用VH區域CE115HA000（序列辨識號：52）作為CD3(CD3ε)結合抗體之模板序列時，資料庫設計利用之改變胺基酸可列舉重鏈可變區所含之Kabat編號11位、31位、52a位、52b位、52c位、53位、54位、56位、57位、61位、72位、78位、98位、99位、100位、100a位、100b位、100c位、100d位、100e位、100f位、100g位、101位中任一者以上的胺基酸等。 使用對於VH區域CE115HA000（序列辨識號：52）施以V11L/L78I之胺基酸改變而得之模板序列（序列辨識號：94）的上述資料庫為較佳，但不限定於此。再者，使用於VH區域CE115HA000（序列辨識號：52）施以V11L/A52aD/L78I之胺基酸改變而得之模板序列（序列辨識號：95）的上述庫，或使用CDR3之序列延長之模板序列（序列辨識號：96）之上述資料庫為較佳，但不限定於此。例如序列辨識號：96記載之重鏈可變區序列作為模板序列使用時，作為資料庫設計利用之改變胺基酸，可列舉重鏈可變區所含之Kabat編號31位、52b位、52c位、53位、54位、56位、57位、61位、98位、99位、100位、100a位、100b位、100c位、100d位、100e位、100f位、100g位中之任一者以上之胺基酸等。作為其他一態樣，可使用rCE115Hchain（序列辨識號：97）作為CD3結合抗體之模板序列。

作為本發明之一非限定態樣，當使用VL區域GLS3000（序列辨識號：53）作為CD3(CD3ε)結合抗體之模板序列時，作為庫設計利用之改變胺基酸，可列舉輕鏈可變區所含之Kabat編號24位、25位、26位、27位、27a位、27b位、27c位、27e位、30位、31位、33位、34位、51位、52位、53位、54位、55位、56位、74位、77位、89位、90位、92位、93位、94位、96位中之任一者以上的胺基酸等。 作為其他一態樣，可使用rCE115Lchain（序列辨識號：98）作為CD3結合抗體之模板序列。

作為本發明之一非限定態樣，也可利用包括重鏈CDR1（序列辨識號：99）、重鏈CDR2（序列辨識號：100）及重鏈CDR3（序列辨識號：101）之重鏈可變區序列作為CD3結合抗體之模板序列。作為另一態樣，也可利用已插入胺基酸6殘基之重鏈CDR3（序列辨識號：102）。 再者，作為另一態樣，也可利用包括輕鏈CDR1（序列辨識號：103）、輕鏈CDR2（序列辨識號：104）及輕鏈CDR3（序列辨識號：105）之輕鏈可變區序列作為CD3結合抗體之模板序列。 可變區所含之框架之胺基酸序列，可適當使用例如IMGT(http://www.imgt.org/textes/IMGTrepertoire/)等網站包括之現在已知的完全人型框架區域之序列作為本發明之抗原結合分子所含之生殖細胞系列之序列，但不限於此。

本發明中，庫設計(設計)包括例如利用NNK及TRIM Library等(Gonzalez-Munoz A et al. MAbs 2012, Lee CV et al. J Mol Biol. 2004, Knappik A. et al. J Mol Biol. 2000, Tiller T et al. MAbs 2013)之公知之庫技術，設計含有特定部位之胺基酸改變為所望胺基酸之可變區之抗原結合分子之多數改變體之庫，但不特別限定於此態樣。

本發明中，所謂「1或多數胺基酸」不特別限定胺基酸的數目，可為2種以上的胺基酸、5種以上的胺基酸、10種以上的胺基酸、15種以上的胺基酸或20種胺基酸。

作為本發明之一態樣，提供對於第1抗原之結合增強之可變區之選擇方法，包括以下步驟。 以下步驟(a)乃至(c)： (a) 使本發明之資料庫和第1抗原接觸； (b) 回收在前述步驟(a)結合於第1抗原之抗原結合分子；及 (c) 選擇在前述步驟(b)結合於第1抗原之抗原結合分子之集團之中，包括對於第1抗原之結合增強之可變區之抗原結合分子。

本態樣中，第1抗原宜為CD3較佳，但無特殊限定。

上述選擇方法使用之抗原結合分子只要是含有抗體之可變區即可，並不特別限定，可為Fv、Fab、Fab'等抗體片段，也可為包括Fc區之抗體。

上述步驟(c)中，可藉由對於該技術領域中有通常知識者公知之方法，例如：ELISA、FACS(fluorescence activated cell sorting)、ALPHAscreen(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)、表面電漿子共振(SPR)現象之BIACORE法等測定對於第1抗原之結合，以選擇包括對於第1抗原之結合增強之可變區之抗原結合分子。具體而言，比較包括選擇作為上述資料庫之模板序列的可變區序列的抗原結合分子的結合活性以及在步驟(b)回收之結合於第1抗原之抗原結合分子之結合活性，當找到有比起包括模板之可變區序列之抗原結合分子的結合活性還高結合活性之抗原結合分子時，則可判斷該抗原結合分子為包括對於第1抗原之結合增強之可變區的抗原結合分子。

上述步驟(a)可使用之資料庫宜為藉由指定保持CD3結合能力80%以上之胺基酸而製造之資料庫較佳，但不限於此。

作為本發明之一態樣，提供一種抗原結合分子之製造方法，包括以下步驟。 製造包括能和為CD3之第1抗原及與該第1抗原為不同之第2抗原結合但不同時結合於該第1抗原與該第2抗原之可變區之抗原結合分子之方法，包括以下步驟(a)至(c)： (a) 使本發明之資料庫和第2抗原接觸； (b) 回收在前述步驟(a)結合於第2抗原之抗原結合分子；及 (c) 從在前述步驟(b)回收之抗原結合分子之集團，選擇包括不同時結合於第1抗原與該第2抗原之可變區之抗原結合分子。

作為本發明之另一態樣，提供一種抗原結合分子之製造方法，包括以下步驟。 一種製造包括能結合於為CD3之第1抗原、與該第1抗原為不同之第2抗原、及與該第1抗原及該第2抗原為不同之第4抗原，但不同時結合於該3個抗原之可變區之抗原結合分子之製造方法，包括以下步驟(a)乃至(f)： (a) 使本發明之資料庫和第2抗原接觸； (b) 回收在前述步驟(a)結合於第2抗原之抗原結合分子； (c) 從在前述步驟(b)回收之抗原結合分子之集團，選擇包括不同時結合於第1抗原與該第2抗原之可變區之抗原結合分子； (d) 使在前述步驟(c)回收之抗原結合分子之集團和第4抗原接觸； (e) 回收在前述步驟(d)結合於第4抗原之抗原結合分子；及 (f) 從在前述步驟(e)回收之抗原結合分子之集團，選擇包括不同時結合於該第1抗原、該第2抗原、及該第4抗原之可變區之抗原結合分子。

於該等態樣，第1抗原為CD3，第2抗原、第4抗原為在T細胞或其他免疫細胞表面表現之分子較佳。再者，第2抗原為FcγR、TLR、凝集素、IgA、免疫檢查點分子、TNF超級家族分子、TNFR超級家族分子或NK受體分子較佳。

上述抗原結合分子只要含有抗體之可變區即不特別限定，可為Fv、Fab、Fab'等抗體片段，也可為包括Fc區之抗體。

又，本製造方法中，步驟(c)也可為以下的選擇步驟： (d) 從在前述步驟(b)回收之抗原結合分子之集團選擇包括對於第1抗原及第2抗原有結合活性但不同時結合於在各不同細胞上表現之第1抗原與第2抗原之可變區的抗原結合分子。 又，本製造方法中，步驟(f)也可為以下的選擇步驟： (g) 從在前述步驟(c)回收之抗原結合分子之集團，選擇包括對於第1抗原、第2抗原、及第4抗原有結合活性但不同時結合於在各不同細胞上表現之第1抗原、第2抗原、及第4抗原之可變區的抗原結合分子。

作為本發明之一態樣，提供一種包括共通L鏈可變區之雙專一性抗體之製造方法，包括以下步驟。 一種雙專一性抗體之製造方法，係使用如下的資料庫： 由序列彼此不同之多數抗原結合分子為主而成資料庫，前述抗原結合分子中之抗原結合域為由模板序列構成之可變區或在該模板序列中有至少1個胺基酸之改變之可變區，且為能結合於第1抗原及與該第1抗原為不同之第2抗原，但不同時結合於該第1抗原與該第2抗原之抗體之可變區； 包括以下步驟(a)至(c)： (a) 選擇本發明之資料庫之模板序列作為結合於第1抗原之可變區； (b) 選擇會結合於第2抗原但不會結合於第1抗原之可變區作為結合於第2抗原之可變區之步驟，包括以下的步驟(i)至(iv)； (i) 使本發明之資料庫和所望之第2抗原接觸； (ii) 回收在前述步驟(i)結合於第2抗原之抗原結合分子； (iii) 使在前述步驟(ii)回收之抗原結合分子之集團接觸第1抗原； (iv) 選擇在前述步驟(iii)不結合於第1抗原之抗原結合分子；及 (c) 製造包括在前述步驟(a)選擇之結合於第1抗原之可變區、及在前述步驟(b)選擇之結合於第2抗原之可變區的雙專一性抗體。

本態樣中，第1抗原為CD3，第2抗原為在癌組織專一性表現之分子較佳。

藉由使用本態樣製造雙專一性抗體，能有效率地取得包括例如和第1抗原CD3結合之可變區、及和在為第2抗原之癌組織專一性表現之分子結合之可變區的雙專一性抗體的共通L鏈可變區。

上述步驟(b)使用之抗原結合分子只要含有抗體之可變區，不特別限定，可以為Fv、Fab、Fab'等抗體片段，也可為包括Fc區之抗體。

關於融合多肽之展示，可將抗原結合分子之可變區之融合多肽於細胞、病毒或噬粒粒子的表面以各種態樣展示。該等態樣包括單鏈Fv片段(scFv)、F(ab)片段及該等片段之多價形態。多價之形態較佳為ScFv、Fab或F(ab')之二聚物，此等在本說明書分別指稱為(ScFv)2、F(ab)2及F(ab')2。多價形態之展示較理想的理由之一，可認為係：利用多價形態之展示，可鑑定通常低親和性之選殖體、或具有在選擇過程中更有效率地選擇稀少的選殖體之多數抗原結合部位。

在細菌噬菌體表面使含抗體片段之融合多肽展示之方法在該發明所屬之技術區域係為公知，例如WO1992001047及本說明書中已記載。此外，於WO1992020791、WO1993006213、WO1993011236及1993019172已記載關連的方法，該領域中通常知識者可適當使用該等方法。在其他公知文獻(H.R.Hoogenboom & G.Winter (1992) J. Mol. Biol. 227, 381-388、WO1993006213及WO1993011236)，揭示對於在噬菌體表面展示之各種抗原，利用人工再配置的可變區基因庫存所進行之抗體之鑑定。

為了以scFv態樣展示建構載體時，此載體含有編碼為抗原結合分子之輕鏈可變區及重鏈可變區的核酸序列。一般而言，編碼為抗原結合分子之重鏈可變區之核酸序列融合於病毒外殼蛋白質構成成分。編碼為抗原結合分子之輕鏈可變區的核酸序列，利用編碼為胜肽連結子之核酸序列而連結於抗原結合分子之重鏈可變區。胜肽連結子一般包括約至15個胺基酸。可任意地將有用於編碼為例如精製或檢測的標記的其他序列，融合在編碼為抗原結合分子之輕鏈可變區或抗原結合分子之重鏈可變區中之任一或兩者的核酸序列的3'末端。

建構用於以F(ab)態樣展示之載體時，此載體含有編碼為抗原結合分子之可變區及抗原結合分子之不變區之核酸序列。編碼為輕鏈可變區之核酸，融合於編碼為輕鏈不變區之核酸序列。編碼為抗原結合分子之重鏈可變區之核酸序列，融合於編碼為重鏈不變CH1區域之核酸序列。一般而言編碼為重鏈可變區及不變區之核酸序列，融合於編碼為病毒外殼蛋白質的全部或一部分的核酸序列。重鏈可變區及不變區較佳為以和病毒外殼蛋白質之至少一部分的融合體的形式表現，輕鏈可變區及不變區則和重鏈病毒外殼融合蛋白質各自表現。重鏈及輕鏈彼此結合，此結合可為共價鍵也可為非共價鍵。可任意地將有用於編碼為例如精製或檢測的標記的其他序列，融合在編碼為抗原結合分子之輕鏈可變區的核酸序列的3'末端或編碼為抗原結合分子之重鏈可變區中的核酸序列的3'末端的任一者或兩者。

關於載體向寄主細胞之導入，以前述方式構建之載體，為了放大及/或表現而導入到寄主細胞。載體可以利用包括電穿孔、磷酸鈣沉澱等公知之轉形法而導入到寄主細胞。載體為如病毒之感染性粒子時，載體本身會侵入寄主細胞。利用插入有編碼為融合蛋白質之多核苷酸的可複製之表現載體進行寄主細胞之轉染及利用公知之手法進行噬菌體粒子之生產，可將融合蛋白質展示在噬菌體粒子表面。

可複製之表現載體，能使用各種方法導入到寄主細胞。於一非限定之實施態樣，載體可如WO2000106717記載，使用電穿孔法導入到細胞。將細胞於標準培養液中任意地於37℃培養約6至48小時（或直到於600nm之OD成為0.6至0.8為止），然後將培養液離心分離，以將（例如利用傾析）培養上清取出。於精製之初期階段較佳為將細胞丸粒再懸浮於緩衝液（例如1.0mM之HEPES(pH7.4)）中。然後，再度離心分離以從懸浮液取出上清。將獲得之細胞丸粒再懸浮於例如稀釋成5-20%V/V的甘油。再度離心分離以從懸浮液去除上清，以獲得細胞丸粒。依藉由將該細胞丸粒再懸浮於水或稀釋的甘油之中獲得之懸浮液之菌體濃度之測定值，將最終菌體濃度使用水或稀釋甘油調整為所望濃度。

例如，作為理想接受細胞，可列舉有電穿孔回應能力的大腸菌株SS320(Sidhu等(Methods Enzymol. (2000) 328, 333-363))。大腸菌株SS320，係將可孕性游離基因體(F'質體)或XL1-BLUE於對於移轉到MC1061細胞為充分的條件，使MC1061細胞和XL1-BLUE細胞交配而製備。對於在ATCC (10801 University Boulevard, Manassas, Virginia)寄存的大腸菌株SS320給予寄存編號98795。可於此菌株複製噬菌體的各種F'游離基因體，亦可使用在本發明。適當的游離基因體可以由在ATCC寄存的菌株取得，或也可由市售品取得(TG1, CJ236、CSH18、DHF'、ER2738、JM101、JM103、JM105、JM107、JM109、JM110、KS1000、XL1-BLUE、71-18等)。

若電穿孔使用更高DNA濃度（約10倍），轉形率會提高，向寄主細胞轉形之DNA的量增加。使用高菌體濃度也會提高效率（約10倍）。由於移轉的DNA量增加，有更大多樣性，能製作序列不同之獨立選殖體數目大的庫。轉形細胞通常可利用能否在含抗生物質之培養基增殖以選擇。

本發明提供編碼為本發明之抗原結合分子之核酸。本發明之該核酸可為DNA、RNA等各種形態。

本發明也提供含有上述本發明之核酸之載體。載體種類可因應導入有載體之寄主細胞由該領域中通常知識者適當選擇，例如可使用上述載體。

本發明也關於由上述本發明之載體轉形之寄主細胞。寄主細胞可由該領域中通常知識者適當選擇，例如可使用上述寄主細胞。

又，本發明提供一種醫藥組合物，含有本發明之抗原結合分子及醫學上可容許之擔體。本發明之醫藥組合物可除了本發明之抗原結合分子更導入醫藥上可容許之擔體，並以公知方法製劑化。例如：能以水或其他藥學上可容許之溶液的無菌性溶液、或懸浮液劑之注射劑之形態以非經口的使用。例如：藥理學上容許之擔體或介質，具體而言，可和滅菌水、生理食鹽水、植物油、乳化劑、懸浮劑、界面活性劑、安定劑、香味劑、賦形劑、運載劑、防腐劑、黏結劑等適當組合，以一般認可的製藥實務要求的單位用量形態混合以製劑化。具體而言，可列舉輕質無水矽酸、乳糖、結晶纖維素、甘露醇、澱粉、羧甲纖維素鈣、羧甲纖維素鈉、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚乙烯基縮醛二乙胺基乙酸酯、聚乙烯基吡咯烷酮、明膠、中鏈脂肪酸三酸甘油酯、聚氧乙烯硬化篦麻子油60、白糖、羧基甲基纖維素、玉米澱粉、無機鹽類等作為擔體。此等製劑的有效成分量可設為能獲得指示之範圍的適當容量。

用以注射之無菌組合物可使用如注射用蒸餾水之運載劑依通常之製劑實務配方。注射用水溶液，例如含生理食鹽水、葡萄糖、其他輔助藥之等張液，例如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化鈉，也可和適當的溶解輔助劑，例如醇，具體而言，乙醇、多元醇例如丙二醇、聚乙二醇、非離子性界面活性劑例如Polysorbate80(TM)、HCO-50併用。

油性液可列舉麻油、黃豆油，也可和作為溶解輔助劑之苯甲酸苄酯、苯甲醇併用。又，也可摻合緩衝劑，例如磷酸鹽緩衝液、乙酸鈉緩衝液、止痛劑例如：鹽酸普卡因、安定劑例如苯甲醇、苯酚、抗氧化劑。調製的注射液通常填充在適當的安瓿。投予較佳為非經口投予，具體而言，可列舉注射劑型、經鼻投予劑型、經肺投予劑型、經皮投予型等。注射劑型，例如：利用靜脈內注射、肌肉內注射、腹腔內注射、皮下注射等以全身或局部性地投予。

又，可依患者的年齡、症狀選擇適當投予方法。含有多肽或編碼為多肽之多核苷酸之醫藥組合物之投予量，例如：可於每1次體重每1kg為0.0001mg至1000mg之範圍選擇。或例如：可於每位患者在0.001至100000mg/body之範圍的投予量選擇，可不一定限於該等數值。投予量、投予方法依患者之體重、年齡、症狀等而變動，可由該領域中通常知識者適當選擇。

又，本發明提供：包含投予本發明之抗原結合分子的步驟之癌治療方法、癌治療使用的本發明之抗原結合分子、癌治療劑製造時本發明之抗原結合分子之使用、及包含使用本發明之抗原結合分子之步驟之癌治療劑製造用的處理。

本說明書使用之胺基酸的3字母表示記載與單字母表示記載的對應如下。丙胺酸：Ala：A精胺酸：Arg：R天冬醯胺酸：Asn：N天冬胺酸：Asp：D半胱胺酸：Cys：C麩醯胺酸：Gln：Q麩胺酸：Glu：E甘胺酸：Gly：G組胺酸：His：H異白胺酸：Ile：I白胺酸：Leu：L離胺酸：Lys：K甲硫胺酸：Met：M苯丙胺酸：Phe：F脯胺酸：Pro：P絲胺酸：Ser：S蘇胺酸：Thr：T色胺酸：Trp：W酪胺酸：Tyr：Y纈胺酸：Val：V

該領域中通常知識者當然可理解：將本說明書記載之1或多數態樣任意組合者，只要和基於該領域中通常知識者之技術常識於技術上不矛盾即涵蓋於本發明。

本說明書引用的全部先前技術文獻援引於本說明書作為參照。

本發明依以下實施例進一步例示，但不限定於下列實施例。 [實施例]

[實施例1] 和CD3（第1抗原）及其他抗原（第2抗原）結合且不和不同的細胞上之CD3（第1抗原）及該其他抗原（第2抗原）同時結合之改變免疫球蛋白可變(Fab)區域之概念 據認為，免疫球蛋白藉由向2分子以上的活性型FcγR同時結合、或向另一抗原與活性型FcγR同時結合而產生活化FcγR之交聯反應，則會傳達FcγR之ITAM信號，可能引起免疫細胞之活化。IgG型之抗體1分子，如上述，由於僅能和1分子FcγR結合，所以只有在抗原存在下，2分子以上的活性型FcγR交聯並引起免疫細胞活化。

又，IgG型之抗體以可變區(Fab)和抗原結合時，由於能同時以Fc區和1分子FcγR結合，所以會發生表現該抗原之細胞與FcγR表現細胞間之交聯。依表現抗原表現之細胞，有時會有抗原與FcγR之交聯較不理想的情形。具體而言，例如抗原為CD3時，藉由T細胞和FcγR表現細胞交聯，引起細胞介素釋出等免疫活化的情形(J. Immunol. (1999) Aug 1, 163(3), 1246-52)。如此的情形中，可藉由對於Fc區導入改變，而消除對於FcγR之結合活性，防止抗原與FcγR的交聯反應(Advanced Drug Delivery Reviews (2006) 58, 640- 656)。同樣地，IgG型抗體之抗原為CD40、OX40、CD27等TNFR超級家族分子、CD3與TLR2、4、8、9等TLR等的情形，亦為若介由FcγR發生交聯，則由於會發生全身性免疫活化，故和其他細胞表現之該等分子同時結合不理想。

另一方面，至今為止的多專一性抗體雖能和複數之抗原同時結合，但依抗原組合，有時不宜和多數抗原同時結合。例如，已知為黏著分子的整合素αvβ3，因為在許多癌細胞及腫瘤周邊的血管表現，所以作為標靶腫瘤的目標分子為有用(R. Haubner, PLoS Med., 2,e70(2005))，但另一方面，已知在各種正常細胞也有表現(Thromb Haemost. 1998 Nov;80(5):726- 34.)。因此，多專一性抗體若和CD3與整合素αvβ3的兩者同時結合，據認為正常細胞會因T細胞的強力細胞傷害活性而受傷害。

而作為控制如此之不宜的交聯反應的方法，有人考慮，1個可變(Fab)區域中，其一部分和第1抗原結合，且未涉及此結合之該可變(Fab)區域的其他部分和第2抗原結合之可變區(Dual Binding Fab)(第1圖)。此時如第1圖所示，當1個可變(Fab)區域中靠近的2個部分須向各自的抗原結合時，若第1抗原結合，會妨礙第2抗原之結合，同樣，若第2抗原之結合已結合的話，會妨礙第1抗原之結合。因此有如此的雙結合Fab之性質的改良抗體，無法和第1抗原及第2抗原同時結合，據認為不會引起第1抗原與第2抗原之交聯反應(第2圖)。又，當第1抗原與第2抗原係如可溶型蛋白質未在細胞膜上表現、或兩者係於同一細胞上存在時，雖能和第1抗原與第2抗原兩者同時結合，但於各自不同的細胞上表現時則無法同時結合，據認為2個細胞不交聯也是雙結合Fab(Dual Binding Fab)(第3圖)。另一方面，據認為，和又另一者之可變(Fab)區域結合之抗原(第3抗原)會和第1抗原起交聯反應(第4圖)，又，也會和第2抗原起交聯反應(第5圖)。作為該抗體之不變區，可使用和FcγR結合之Fc區，也可使用對於FcγR之結合活性減低的Fc區。 若利用如此的雙結合Fab的性質，例如使利用介由抗體而重新導向T細胞以傷害表現癌抗原之癌細胞的技術進一步帶有標靶到癌組織中之整合素的功能，能使癌專一性更提高。

亦即，藉由將可變(Fab)區域改良成雙結合Fab(Dual Binding Fab)，以賦予以下性質的話，能創制有第1圖所示之作用的抗體。 1. 對於第1抗原有結合活性 2. 對於第2抗原有結合活性 3. 對於第1抗原及第2抗原不同時結合 又，「對於第1抗原及第2抗原不同時結合」，包括：表現第1抗原之細胞與表現第2抗原之細胞的2個細胞不交聯、或和在各自的細胞表現的第1抗原與第2抗原不同時結合，及，第1抗原與第2抗原為如可溶型蛋白質般未在細胞膜上表現、或兩者於同一細胞上存在時，雖能和第1抗原與第2抗原兩者同時結合，但在各自不同的細胞上表現時，無法同時結合的情形。

同樣地，藉由將可變(Fab)區域改良成雙結合Fab，賦予以下性質的話，可創製例如有如第6圖之作用的抗體。 1. 對於T細胞上之第1抗原有結合活性 2. 對於抗原展示細胞上之第2抗原有結合活性 3. 對於第1抗原及第2抗原不同時結合

[實施例2] 抗人、食蟹猴CD3ε抗體CE115之製作 (2-1) 使用人CD3、食蟹猴CD3表現細胞免疫大鼠製作融合瘤 對於SD大鼠（雌、免疫開始時6週大、日本Charles River），將人CD3εγ或食蟹猴CD3εγ表現Ba/F3細胞以下列方式免疫。若以初次免疫時為第0日，於第0日時將佛洛依德完全佐劑(Difco)和5 × 10 ⁷個人CD3εγ表現Ba/F3細胞進行腹腔內投予。於第14日將佛洛依德不完全佐劑(Difco)和5 × 10 ⁷個食蟹猴CD3εγ表現Ba/F3細胞進行腹腔內投予，之後每隔1週的期間將5 × 10 ⁷個人或食蟹猴CD3εγ表現Ba/F3細胞交替地進行腹腔內投予4次。CD3εγ之最終投予1週後(第49日)，將人CD3εγ表現Ba/F3細胞進行靜脈內投予作為追加(boost)，於3日後，將大鼠脾臟細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0依使用PEG1500(Roche Diagnostics)之常法進行細胞融合。融合細胞，亦即融合瘤，係以含10% FBS之RPMI1640培養基（以下稱為10%FBS/RPMI1640）進行培養。

融合的次日，(1) 將融合細胞懸浮於半流動培養基(StemCells)，進行融合瘤之選擇培養，同時實施融合瘤之群落化。

於融合後第9日或10日，挑取融合瘤的群落，於裝有HAT選擇培養基(10% FBS/RPMI1640、2 vol% HAT 50x concentrate(大日本製藥)、5 vol% BM-Condimed H1(Roche Diagnostics))的96井盤，每1井接種1個群落。培養3~4日後，回收各井之培養上清，測定培養上清中之大鼠IgG濃度。針對已確認大鼠IgG的培養上清，利用已附著人CD3εγ表現Ba/F3細胞、或不表現人CD3εγ之Ba/F的細胞-ELISA，挑選產生對於人CD3εγ專一性地結合的抗體的選殖體(第7圖)。再者，實施已附著食蟹猴CD3εγ表現Ba/F3細胞之細胞-ELISA，評價對於猴CD3εγ之交叉性(第7圖)。

(2-2) 抗人、猴CD3ε嵌合抗體之製作 從融合瘤細胞使用RNeasy Mini Kits(QIAGEN)萃取總RNA，依SMART RACE cDNA Amplification Kit(BD Biosciences)合成cDNA。使用製作的cDNA，依PCR將抗體之可變區基因插入到選殖載體。各DNA片段之鹼基序列使用BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)，於DNA定序儀ABI PRISM 3700 DNA Sequencer(Applied Biosystems)，依附帶說明書記載的方法定序。CE115 H鏈可變區：（序列辨識號：13）及CE115 L鏈可變區（序列辨識號：14）之CDR、FR之決定依Kabat編號實施。

將上述大鼠抗體H鏈可變區與人抗體IgG1鏈不變區結合而得之嵌合抗體H鏈、及上述大鼠抗體L鏈可變區與人抗體Kappa鏈不變區結合而得之嵌合抗體L鏈基因，嵌入到動物細胞表現載體。使用製作之表現載體實施CE115嵌合抗體之表現及精製（參考實施例1）。

(2-3) EGFR_ERY22_CE115之製作 然後，以對抗癌抗原(EGFR)之IgG作為基本骨架，製作其中一Fab置換為對抗CD3ε之結合分域的形式的分子。此時，作為基本骨架之IgG之Fc，和上述情形同樣地，使用向FcgR(Fcγ受體)之結合性減弱的靜默型Fc。作為對於EGFR之結合分域，使用Cetuximab之可變區Cetuximab-VH（序列辨識號：15）、Cetuximab-VL（序列辨識號：16）。作為抗體H鏈不變區，使用已去除IgG1之C末端之Gly及Lys的G1d、於G1d導入D356K及H435R之變異之A5、及對於G1d導入K439E之變異的B3，且將與各自的Cetuximab-VH組合而得的Cetuximab-VH-G1d（序列辨識號：17）、Cetuximab-VH-A5（序列辨識號：18）、Cetuximab-VH-B3（序列辨識號：19）依參考實施例1之方法製備。又，抗體H鏈不變區之名稱定為H1時，可變區帶有Cetuximab-VH之抗體之H鏈所對應的序列如Cetuximab-VH-H1所示。 在此，顯示胺基酸改變的情形，如D356K。最初的字母（相當於D356K之D），意指改變前之胺基酸殘基以單字母表示記載時的字母，接續的數字（相當於D356K之356）意指其改變處之EU編號，最後的字母（相當於D356K之K）意指改變後之胺基酸殘基以單字母表示記載時的字母。

製作對於EGFR之Fab之VH分域與VL分域置換而得的EGFR_ERY22_CE115(第8圖)。亦即，使用已附加和上述方法同樣適當序列的引子的PCR法等該領域中通常知識者公知之方法，製作已插入各編碼為EGFR ERY22_Hk（序列辨識號：20）、EGFR ERY22_L（序列辨識號：21）、CE115_ERY22_Hh（序列辨識號：22）、CE115_ERY22_L（序列辨識號：23）之多核苷酸的一系列的表現載體。

將以下所示組合的表現載體導入到FreeStyle293-F細胞，將各目的分子暫時性表現。 ・目的分子：EGFR_ERY22_CE115 ・由已插入到表現載體的多核苷酸編碼的多肽：EGFR _ERY22_Hk、EGFR _ERY22_L、CE115_ERY22_Hh、CE115_ ERY22_L

(2-4) EGFR_ERY22_CE115之精製 將獲得之培養上清添加到抗FLAG M2管柱(Sigma公司)，將該管柱洗滌後，利用0.1mg/mL FLAG胜肽(Sigma公司)實施溶出。將含目的分子之級分加到HisTrap HP管柱(GE Healthcare公司)，將該管柱洗滌後，實施利用咪唑之濃度梯度所為之溶出。將含目的分子之級分以超過濾濃縮後，將該級分添加到Superdex 200管柱(GE Healthcare公司)，僅回收溶出液之單體級分，藉此獲得精製的各目的分子。

(2-5) 使用人末梢血單核球測定細胞傷害活性 (2-5-1) 人末梢血單核球(PBMC：Peripheral Blood Mononuclear Cell)溶液之製備 使用已注入1,000單位/mL之肝素溶液(Novo・heparin注5千單位，Novonordisk公司)100μL的注射器，從健康正常人自願者（成人）抽取末梢血50mL。將以PBS(-)稀釋2倍稀釋後分成4等分的末梢血，加到已預先注入15mL Ficoll-Paque PLUS並實施離心操作的Leucosep淋巴球分離管(Cat. No. 227290、Greiner bio-one公司)。該分離管離心分離(2,150rpm、10分鐘、室溫)後，分取單核球級分層。以含10%FBS之Dulbecco's Modified Eagle's Medium(SIGMA公司，以下稱為10%FBS/D-MEM)將單核球級分之細胞洗滌1次後，使用10%FBS/D-MEM調整該細胞之濃度，使細胞密度成為4×10 ⁶/mL。以此方式製備的細胞溶液以人PBMC溶液的形式用在以後的試驗。

(2-5-2) 細胞傷害活性之測定 細胞傷害活性，依使用xCELLigence即時細胞分析儀(Roche Diagnostics co.)之細胞增殖抑制率評價。標的細胞使用使SK-HEP-1細胞株強制表現人EGFR而樹立的SK-pca13a細胞株。將SK-pca13a從培養皿剝離，以成為1×10 ⁴cells/well的方式，接種100 μL/孔到E-Plate 96盤(Roche Diagnostics公司)，使用xCELLigence即時細胞分析儀開始活細胞之測定。次日從xCELLigence即時細胞分析儀取出盤，於該盤添加調整為各濃度(0.004、0.04、0.4、4nM)的各抗體50μL。於室溫使其反應15分鐘後加入於(2-5-1)調製的人PBMC溶液50μL(2×10 ⁵cells/孔)，將該盤再度安置於xCELLigence即時細胞分析儀，以開始活細胞之測定。反應係於5%二氧化碳氣體、37℃的條件下實施，從人PBMC添加72小時後之Cell Index值，依下式求出細胞增殖抑制率(%)。又，計算使用之Cell Index值，使用以即將添加抗體時之Cell Index值成為1的方式常態化後的數值。 細胞增殖抑制率(%)＝(A-B)×100/(A-1) A代表未添加抗體之井的Cell Index值的平均值(只有標的細胞及人PBMC)、B代表各井之Cell Index值的平均值。試驗進行3重複。

將由人血液調製的PBMC作為效應子細胞，實施使用CE115測定之EGFR_ERY22_CE115之細胞傷害活性，結果有極強活性(第9圖)。

[實施例3] 會和CD3及人整合素αvβ3結合但不同時結合之抗體之製作 如第1~6圖所示，雙結合Fab係於可變(Fab)區域會和CD3（第1抗原）與目的抗原（第2抗原）結合，但不和CD3（第1抗原）及目的抗原（第2抗原）同時結合之分子。當為了和第2抗原結合，於和CD3（第1抗原）結合之抗體之Fab區導入胺基酸改變時，通常係於2個H鏈或L鏈兩者導入胺基酸改變。但是若於兩者之H鏈或L鏈導入改變，抗體的2個Fab分別和2個抗原結合，因此2個Fab與CD3（第1抗原）及目的抗原（第2抗原）同時結合，可能會交聯。因此抗體之1個Fab，設為和第3抗原結合或什麼也不結合的Fab，而另一Fab設為雙結合Fab，以不發生CD3（第1抗原）及目的抗原（第2抗原）之交聯反應。

(3-1) 會和CD3及人整合素αvβ3結合但不同時結合之抗體之製作 就黏著分子而言已知之整合素αvβ3會於許多癌細胞及腫瘤的周圍血管表現，所以作為標靶腫瘤之標的分子為有用，但已知在各種正常細胞也會表現(Thromb Haemost. 1998 Nov;80(5):726-34.)。因此，若同時結合在CD3與整合素αvβ3，據認為正常細胞可能會因T細胞的強力細胞傷害活性而受傷害。而據認為，若製作不同時結合於CD3與整合素αvβ3的分子，則不會對於正常細胞造成傷害，而能將抗EGFR抗體分子標靶到表現整合素αvβ3之腫瘤細胞。亦即，探討：以單側之可變區(Fab)結合於EGFR，於另一可變區結合於第1抗原CD3，進一步結合於第2抗原整合素αvβ3，且不同時結合於CD3及整合素αvβ3之雙結合Fab分子之取得。

可說若能顯示以下特性：「係於整合素αvβ3不存在之條件，CD3與Fab區結合，於CD3不存在之條件，整合素αvβ3與Fab區結合之分子，結合於CD3之分子為不結合於整合素αvβ3之分子、或與整合素αvβ3結合之分子為不結合於CD3之分子」，則能創製有目的之雙結合Fab之特性（亦即，能結合於CD3及第2抗原且不同時結合於CD3及第2抗原）的雙結合Fab分子。

(3-2) 帶有與整合素αvβ3結合之Fab區之抗體之取得 作為取得雙結合Fab分子之方法，可考慮：利用資料庫之方法、與插入已知對於蛋白質有結合活性之胜肽的方法。作為對於整合素αvβ3有結合活性之胜肽，已知RGD(Arg-Gly-Asp)胜肽。故，依參考實施例1製作：單側之Fab作為EGFR結合分域，另一側之Fab作為CD3結合分域及整合素αvβ3結合分域之異二聚化抗體，其係結合於CD3ε之抗體CE115（重鏈可變區序列辨識號：13、輕鏈可變區序列辨識號：14）之重鏈迴圈部分已插入RGD胜肽之異二聚化抗體。亦即，製作已插入編碼為EGFR ERY22_Hk(序列辨識號：20)、EGFR ERY22_L（序列辨識號：21）及CE115_ERY22_L（序列辨識號：23）之多核苷酸以及編碼為以下任一者的多核苷酸的一系列表現載體： ・CE115_2 ERY22_Hh（序列辨識號：24、Kabat編號52b-53各取代為K及N）、 ・CE115_4 ERY22_Hh（序列辨識號：25、Kabat編號52b-54各取代為S及N）、 ・CE115_9 ERY22_Hh（序列辨識號：26、Kabat編號52a-52b之間插入RGD）、 ・CE115_10 ERY22_Hh（序列辨識號：27、Kabat編號52b-52c之間插入RGD）、 ・CE115_12 ERY22_Hh（序列辨識號：28、Kabat編號72-73之間插入RGD）、 ・CE115_17 ERY22_Hh（序列辨識號：29、Kabat編號52b-52c各取代為K及S）、 ・CE115_47 ERY22_Hh（序列辨識號：30、Kabat編號98-99之間插入RGD）、 ・CE115_48 ERY22_Hh（序列辨識號：31、Kabat編號99-100之間插入RGD）、 ・CE115_49 ERY22_Hh（序列辨識號：32、Kabat編號100-100a之間插入RGD）。 又，作為對照，依參考實施例1製作：在J. Biotech, 155, 193-202, 2011報告的抗體的CH3區插入有RGD(Arg-Gly-Asp)胜肽的抗體（EH240-Kn125 /EH240-Hl076/L73；序列辨識號33/34/35）。據認為，介由CH3區和整合素αvβ3結合的此分子，能同時結合於CD3與整合素αvβ3。

(3-3) 整合素αvβ3與抗體之結合確認 Fab區已插入RGD(Arg-Gly-Asp)胜肽的分子是否與整合素αvβ3結合可依電化學發光法(ECL法)判定。具體而言，將以含0.1%BSA及0.1g/L氯化鈣及0.1g/L氯化鎂之TBS溶液(表達為稀釋(+)溶液)稀釋而得的生物素-抗人IgG Ab(Southern biotech)、調整為5μg/mL或1μg/mL之抗體溶液、已附加sulfo-tag之整合素αvβ3(R&D Systems)，各添加25μL到Nunc-Immuno ^TmMicroWell ^TM96井圓盤(Nunc)的各井並混合後，於4℃溫育一晚，使抗體抗原複合體形成。將含0.5%BSA及0.1g/L氯化鈣及0.1g/L氯化鎂之TBS溶液(記載為阻斷(bloking)(+)溶液)各加150μL到鏈黴抗生物素蛋白盤(MSD)的各井，於4℃溫育1晚。去除阻斷溶液後，以含0.1g/L氯化鈣及0.1g/L氯化鎂之TBS溶液(記載為TBS(+)溶液)250μL洗滌3次。將抗體抗原複合體溶液各添加75μL到各井，於室溫溫育2小時，使生物素-抗人IgG Ab結合於鏈黴抗生物素蛋白盤。去除抗體抗原複合體溶液後，以TBS(+)溶液洗滌3次，將READ緩衝液(MSD)各加150μL到各井，以Sector Imager 2400(MSD)檢測sulfo-tag的發光信號。

其結果示於第11圖。為親代抗體之EGFR ERY22_Hk/ EGFR ERY22_L /CE115 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L對於整合素αvβ3完全未顯示結合活性，相對地，EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_2 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/ EGFR ERY22_L /CE115_4 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_9 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_10 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_12 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L / CE115_17 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/ EGFR ERY22_L /CE115_47 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_48 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_49 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L均觀察到與整合素αvβ3之結合。

(3-4) CD3(CD3ε)與抗體之結合確認 然後，以ECL法判定於前項製作之和整合素αvβ3於Fab區結合之抗體是否保持對CD3之結合活性。具體而言，將以含0.1%BSA之TBS溶液(記載為稀釋(-)溶液)稀釋成的生物素-抗人IgG Ab(Southern biotech)、調整為5μg/mL或1μg/mL之抗體溶液、與已附加sulfo-tag之CD3ε均二聚物蛋白質，各加25μL到Nunc-ImmunoTm MicroWellTm 96井圓盤(Nunc)的各井並混合後，於4℃溫育一晚，使抗體抗原複合體形成。將含0.5%BSA之TBS溶液(記載為阻斷(-)溶液)各加150μL到鏈黴抗生物素蛋白盤(MSD)的各井，於4℃溫育1晚。去除阻斷溶液後，以TBS溶液(-)溶液250μL洗滌3次。將抗體抗原複合體溶液各加75μL到各井，於室溫溫育2小時，使生物素-抗人IgG Ab結合於鏈黴抗生物素蛋白盤。去除抗體抗原複合體溶液後，以TBS(-)溶液洗滌3次，將READ緩衝液(MSD)各加150μL到各井，以Sector Imager 2400(MSD)檢測sulfo-tag的發光信號。

其結果示於第12圖。為親代抗體之EGFR ERY22_Hk/ EGFR ERY22_L /CE115 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L以外， EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_2 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_4 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L / CE115_9 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/ EGFR ERY22_L /CE115_10 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_12 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_17 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L / CE115_47 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/ EGFR ERY22_L /CE115_48 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_49 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L也都觀察到與CD3之結合。

(3-5) 利用ECL法確認整合素αvβ3與CD3不同時結合於Fab區 由直到前項之結果，獲得對於整合素αvβ3有結合活性且對於CD3有結合活性的分子。然後，判定是否直到前項製作的Fab區會同時結合於CD3(CD3ε)及整合素αvβ3。

Fab區已插入RGD(Arg-Gly-Asp)胜肽的分子當同時結合於整合素αvβ3與CD3時，若於抗體溶液加入整合素αvβ3及已附加生物素的CD3，會結合於兩者之抗原，所以能以ECL法檢驗。具體而言，將經稀釋(+)溶液稀釋之已附著生物素的人CD3ε均聚二聚物蛋白質、調整成10μg/mL或5μg/mL之抗體溶液、已附加sulfo-tag之整合素αvβ3(R&D Systems)，各加入25μL到Nunc-Immuno ^TmMicroWell ^Tm96井圓盤(Nunc)的各井並混合後，於4℃溫育1晚，使抗體抗原複合體形成。將阻斷(+)溶液加150μL到鏈黴抗生物素蛋白盤(MSD)各井，於4℃溫育1晚。去除阻斷溶液後，以含0.1g/L氯化鈣及0.1g/L氯化鎂之TBS(+)溶液250μL洗滌3次。將抗體抗原複合體溶液各加75μL到各井，於室溫溫育2小時，使生物素-抗人IgG Ab與鏈黴抗生物素蛋白盤結合。去除抗體抗原複合體溶液後，以TBS(+)溶液洗滌3次，將READ緩衝液(MSD)各加150μL到各井，以Sector Imager 2400(MSD)檢測sulfo-tag的發光信號。

其結果示於第13圖、第14圖。Fab區已插入RGD(Arg-Gly-Asp)胜肽之EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_2 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/ EGFR ERY22_L /CE115_12 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_17 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L，因為同時結合於整合素αvβ3與CD3，於ECL測定檢測到強信號。而，EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_9 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L與EGFR ERY22_Hk/ EGFR ERY22_L /CE115_48 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L，此信號微弱(第13圖)。又，EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_4 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/ EGFR ERY22_L /CE115_10 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_47 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_49 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L在ECL測定均幾乎未檢測到信號(第14圖)。亦即，啟示：該等抗體若與CD3結合，則不與整合素αvβ3結合。

(3-6) 利用ECL法考察整合素αvβ3與CD3不同時結合於Fab區 由以上的結果，可製備有以1個Fab分別結合於CD3(CD3ε)、整合素αvβ3且不同時結合於CD3(CD3ε)及整合素αvβ3之雙結合Fab分子特性的抗體。本實施例中，藉由對於具有結合於第1抗原CD3之可變區的抗體，將於該可變區結合於第2抗原整合素αvβ3之RGD胜肽插入Fab，而賦予對於第2抗原之結合活性，且能取得不同時結合於CD3與第2抗原之分子。以同方法，藉由將對於WO2006036834例示之蛋白質有結合活性之胜肽插入到Fab中之迴圈，可取得對於任意第2抗原有結合活性之雙結合Fab分子。此外，對於蛋白質顯示結合活性之胜肽，可使用該領域中通常知識者公知之方法製作胜肽庫，並選擇有所望活性之胜肽以取得(Pasqualini R., Nature, 1996, 380 (6572) :364-6)。再者，藉由使用將如實施例5記載之Fab中之迴圈加長改變（延長）的抗原結合分子的資料庫，據認為能製作對於任意第2抗原有結合活性之雙結合Fab分子。對抗第1抗原之可變區可以利用該領域中通常知識者公知之各種方法取得，所以使用如此的資料庫，可說能製作對於任意第1抗原與任意第2抗原有結合活性且無法同時結合於該第1抗原及該第2抗原之雙結合Fab分子。

由以上的結果，顯示EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_4 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/ EGFR ERY22_L /CE115_10 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_47 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_49 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L結合於CD3及整合素αvβ3且不同時結合於CD3與整合素αvβ3。亦即EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_4 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/ EGFR ERY22_L /CE115_10 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_47 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_49 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L是有雙結合Fab的分子，可知能製作如此的分子。

[實施例4] 結合於CD3及人toll-like受體2(TLR2)但不同時結合之抗體之製作 (4-1) 結合於CD3及人TLR2但不同時結合之抗體之製作 已知為圖案認識受體的TLR2主要表現於巨噬細胞、樹狀細胞、B細胞等免疫細胞，作為活化免疫細胞的標的分子為有用。又，TLR2已知於上皮細胞、內皮細胞等免疫細胞以外的正常細胞也表現。藉由同時結合於癌抗原與CD3，會補充腫瘤環境中表現CD3的T細胞，由T細胞傷害癌細胞，但據認為因為同時結合於癌抗原與TLR2，腫瘤環境中表現TLR2之免疫細胞也會補充並能活化。被T細胞傷害的癌細胞被納入因TLR2而補充的免疫細胞，處理抗原，並展示於HLA，藉此能活化T細胞，故能更強力地活化T細胞，且同時也可能能誘導獲得免疫。但是若同時結合於CD3與TLR2，據認為免疫細胞及正常細胞會因T細胞的強力細胞傷害活性而可能受傷害。而若能製作不同時結合於CD3與TLR2的分子，據認為能對於表現TLR2之免疫細胞及正常細胞不造成傷害，而能補充該等細胞。亦即，研究：以單側之可變區(Fab)結合於EGFR，並以另一可變區結合於第1抗原CD3，進一步結合於第2抗原TLR2且不和CD3及TLR2同時結合之雙結合Fab分子的取得。

若能顯示以下特性：「係於TLR2不存在的條件，CD3與Fab區結合，於CD3不存在的條件，TLR2與Fab區結合之分子，且結合於CD3之分子為不結合於TLR2之分子、或與TLR2結合之分子為不結合於CD3之分子」，則可說能製作有目的雙結合Fab之特性（亦即，能結合於CD3及第2抗原、且不同時結合於CD3及第2抗原）的雙結合Fab分子。

(4-2) 帶有和TLR2結合之Fab區之抗體之取得 已知RWGYHLRDRKYKGVRSHKGVPR胜肽（序列辨識號：36）係對於人TLR2有結合活性的胜肽。依參考實施例1製作：以單側Fab作為EGFR結合分域，將另一側Fab作為CD3結合分域及TLR2結合分域之異二聚化抗體，其係結合於CD3ε之抗體CE115（重鏈可變區序列辨識號：13、輕鏈可變區序列辨識號：14）之重鏈迴圈部分插入有TRL2結合胜肽的異二聚化抗體抗體。亦即，製作插入有編碼為EGFR ERY22_Hk（序列辨識號：20）、EGFR ERY22_L（序列辨識號：21）、及CE115_ERY22_L（序列辨識號：23）之多核苷酸以及編碼為以下任一者的多核苷酸的一系列表現載體： ・CE115_DU21 ERY22_Hh（序列辨識號：37、Kabat編號52b-52c之間插入TRL2結合胜肽）、 ・CE115_DU22 ERY22_Hh（序列辨識號：38、Kabat編號52b-52c之間插入TRL2結合胜肽）、 ・CE115_DU26 ERY22_Hh（序列辨識號：39、Kabat編號72-73之間插入TRL2結合胜肽）、 ・CE115_DU27 ERY22_Hh（序列辨識號：40、Kabat編號72-73之間插入TRL2結合胜肽）。 又，作為對照，依參考實施例1製作將TLR2結合胜肽附加於CH3區C末端而得的抗體（CE115_ ERY22_DU42_Hh, 序列辨識號：41）、及將TLR2結合胜肽兩端帶有Cys殘基的胜肽附加到CH3區C末端而得的抗體（CE115_ ERY22_DU43_Hh, 序列辨識號：42）。介由CH3區而和TLR2結合的此分子，據認為能同時結合於CD3與TLR2。

(4-3) TLR2與抗體之結合確認 於Fab區已插入TLR2結合胜肽的分子是否會和TLR2結合，係以電化學發光法(ECL法)判定。具體而言，將經含0.1%BSA之TBS溶液(記載為稀釋(-)溶液)稀釋的生物素-抗人IgG Ab(Southern biotech)、調整為5μg/mL或1μg/mL之抗體溶液、已附加sulfo-tag之TLR2(abnova)，各加25μL到Nunc- Immuno ^TmMicroWell ^Tm96井圓盤(Nunc)之各井並混合後，於4℃溫育1晚，使抗體抗原複合體形成。將含0.5%BSA之TBS溶液(記載為阻斷(-)溶液)各加150μL到鏈黴抗生物素蛋白盤(MSD)各井，於4℃溫育1晚。去除阻斷溶液後以TBS(-)溶液250μL洗滌3次。將抗體抗原複合體溶液各加75μL到各井，於室溫溫育2小時，使生物素-抗人IgG Ab與鏈黴抗生物素蛋白盤結合。去除抗體抗原複合體溶液後以TBS(-)溶液洗滌3次，加READ緩衝液(MSD)各150μL到各井，以Sector Imager 2400(MSD)檢測sulfo-tag的發光信號。

其結果示於第15圖。親代抗體EGFR ERY22_Hk/ EGFR ERY22_L /CE115 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L對於TLR2完全未顯示結合活性，相對地，EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L / CE115_DU21 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/ EGFR ERY22_L /CE115_DU22 ERY22_Hh/CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_DU26 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_DU27 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L均觀察到與TLR2之結合。

(4-4) CD3(CD3ε)與抗體之結合確認 然後以ECL法判定是否前項製作的會和TLR2於Fab區結合的抗體是否保持對於CD3(CD3ε)的結合活性。具體而言，將經含0.1%BSA之TBS溶液(記載為稀釋(-)溶液)稀釋的生物素-抗人IgG Ab(Southern biotech)、調整為5μg/mL或1μg/mL之抗體溶液、及已附加sulfo-tag之CD3ε均二聚物蛋白質，各加25μL到Nunc-ImmunoTm MicroWellTm 96井圓盤(Nunc)之各井，混合後於4℃溫育1晚，使抗體抗原複合體形成。將含0.5%BSA之TBS溶液(記載為阻斷(-)溶液)各加150μL到鏈黴抗生物素蛋白盤(MSD)各井，於4℃溫育1晚。去除阻斷溶液後，以TBS溶液(-)溶液250μL洗滌3次。各加抗體抗原複合體溶液75μL到各井，於室溫溫育2小時，使生物素-抗人IgG Ab與鏈黴抗生物素蛋白盤結合。去除抗體抗原複合體溶液後，以TBS(-)溶液洗滌3次，各加150μL READ緩衝液(MSD)到各井，以Sector Imager 2400(MSD)檢測sulfo-tag的發光信號。

其結果示於第16圖。除了親代抗體EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L，EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_DU21 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_DU22 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/ EGFR ERY22_L /CE115_DU26 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_DU27 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L也均觀察到和CD3之結合。

(4-5) 利用ECL法確認TLR2與CD3不同時結合於Fab區 由直到前項之結果，獲得對於TLR2有結合活性且對於CD3有結合活性的分子。然後判定是否直到前項製作的Fab區會同時結合於CD3及TLR2。

當於Fab區已插入TLR2結合胜肽的分子會同時結合於TLR2與CD3時，若於抗體溶液加入TLR2與已附加生物素的CD3，會與兩者之抗原結合，故能以ECL法檢測。具體而言，將經稀釋(-)溶液稀釋之已附加生物素的人CD3ε均二聚物蛋白質、調整為10μg/mL或5μg/mL之抗體溶液、及已附加sulfo-tag之TLR2(R&D Systems)，各加25μL到Nunc-Immuno ^TmMicroWell ^Tm96井圓盤(Nunc)之各井並混合後，於4℃溫育1晚，使抗體抗原複合體形成。各加阻斷(-)溶液150μL到鏈黴抗生物素蛋白盤(MSD)各井，於4℃溫育1晚。去除阻斷溶液後，以含0.1g/L氯化鈣及0.1g/L氯化鎂之TBS(-)溶液250μL洗滌3次。將抗體抗原複合體溶液各加75μL到各井並於室溫溫育2小時，使生物素-抗人IgG Ab與鏈黴抗生物素蛋白盤結合。去除抗體抗原複合體溶液後以TBS(-)溶液洗滌3次，各加READ緩衝液(MSD)150μL到各井，以Sector Imager 2400(MSD)檢測sulfo-tag的發光信號。

其結果示於第17圖。於CH3區已附加TLR2結合胜肽之EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_DU42 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_DU43 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L，因同時結合於TLR2與CD3，於ECL測定檢測出強信號。另一方面，EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_DU21 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_DU22 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_DU26 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L / CE115_DU27 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L均於ECL測定幾乎未檢測到信號。亦即啟示：該等抗體若與CD3結合則不與TLR2結合。

(4-6) 利用ECL法考察TLR2與CD3不同時結合於Fab區 由以上的結果，可知能製作有以1個Fab分別結合於CD3、TLR2且不同時結合於CD3及TLR2之雙結合Fab分子特性的抗體。本實施例中，藉由對於具有結合於第1抗原CD3之可變區的抗體，在該可變區將結合第2抗原TLR2之RWGYHLRDRKYKGVRSHKGVPR胜肽插入到Fab，而能取得賦予對於第2抗原之結合活性且不會同時結合於CD3與第2抗原之分子。以同方法，藉由將對於如WO2006036834例示之蛋白質有結合活性之胜肽插入到Fab中之迴圈，能取得對於任意第2抗原有結合活性的雙結合Fab分子。此外，對於蛋白質顯示結合活性之胜肽，可使用該領域中通常知識者公知之方法製作胜肽庫並選擇有所望活性之胜肽以取得(Pasqualini R., Nature, 1996, 380 (6572) :364-6))。再者，藉由使用如實施例5記載之Fab中之迴圈加長改變（延長）的抗原結合分子的資料庫，據認為可製作對於任意第2抗原有結合活性的雙結合Fab分子。對抗第1抗原之可變區可依該領域中通常知識者公知之各種方法取得，故藉由使用如此的資料庫，可說能製作對於任意第1抗原與任意第2抗原有結合活性且無法同時結合於該第1抗原及該第2抗原之雙結合Fab分子。

由以上的結果，顯示，EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_DU21 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_DU22 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_DU26 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L / CE115_DU27 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L會結合於CD3及TLR2且不同時結合於CD3與TLR2。亦即EGFR ERY22_Hk/ EGFR ERY22_L /CE115_DU21 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_DU22 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_DU26 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L、EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L / CE115_DU27 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L係有雙結合Fab，且解明可製作如此的分子。

[實施例5] 用以製作結合於CD3及第2抗原之抗體的抗體改變 (5-1)能結合於第2抗原之胜肽之插入處與長度之探討 探討以單側之可變區(Fab)結合於癌抗原，以另一可變區結合於第1抗原CD3，並且結合於第2抗原但不同時結合於CD3及第2抗原之雙結合Fab分子之取得。依參考實施例1製作：係以單側Fab作為EGFR結合分域，以另一側之Fab作為CD3結合分域之異二聚化抗體，其係結合於CD3ε之抗體CE115之重鏈迴圈部分插入有GGS胜肽之異二聚化抗體。

亦即，製作CDR2中之K52B與S52c之間插入有GGS之EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_CE31 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L：（序列辨識號：20/21/43/23）、插入有GGSGGS胜肽（序列辨識號：90）之EGFR ERY22_Hk/ EGFR ERY22_L /CE115_CE32 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L（序列辨識號：20/21/44/23）、插入有GGSGGSGGS胜肽（序列辨識號：91）之EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_CE33 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L：（序列辨識號：20/21/45/23）。同樣地，製作框架3中之迴圈狀部位D72與D73之間插入GGS之EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_CE34 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L：（序列辨識號：20/21/46/23）、插入有GGSGGS胜肽（序列辨識號：90）之EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_CE35 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L（序列辨識號：20/21/47/23）、插入有GGSGGSGGS胜肽（序列辨識號：91）之EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_CE36 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L：（序列辨識號：20/21/48/23）。又，製作在CDR3中之A99與Y100之間插入有GGS之EGFR ERY22_Hk/ EGFR ERY22_L /CE115_CE37 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L：（序列辨識號：20/21/49/23）、插入有GGSGGS胜肽之EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_CE38 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L（序列辨識號：20/21/50/23）、插入有GGSGGSGGS胜肽之EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L /CE115_CE39 ERY22_Hh/ CE115_ERY22_L：（序列辨識號：20/21/51/23）。

(5-2) 已插入GGS胜肽之CE115抗體向CD3ε之結合確認 利用BiacoreT100確認製作的各種抗體是否維持向CD3ε之結合性。於CM5晶片介由鏈黴抗生物素蛋白使生物素化CD3ε抗原決定位胜肽結合，使製作的抗體作為分析物流過，解析結合親和性。

其結果示於表2。CE35、CE36、CE37、CE38、CE39向CD3ε之結合親和性，與親代抗體CE115為同等。由此顯示：該等迴圈中能插入結合於第2抗原之胜肽。又，已插入GGSGGSGGS的CE36、CE39，結合親和性也未降低，故顯示該等處至少插入9個胺基酸為止的胜肽，不影響向CD3ε之結合性。

[表2]

亦即，顯示：藉由使用如此的胜肽插入CE115以取得對於第2抗原結合之抗體，能製作會結合於CD3與第2抗原但不同時結合之抗體。 在此，藉由將插入或取代的胜肽的胺基酸序列依部位專一性變異誘發法(Kunkel等(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1985) 82, 488-492))、Overlap extension PCR等公知方法隨機改變，並依上述方法比較各改變體之結合活性等，並改變胺基酸序列，以決定能顯示目的活性之插入、取代處、其胺基酸種類、長度，可製作資料庫。

[實施例6] 用以取得結合於CD3及第2抗原之抗體之資料庫設計 (6-1) 針對取得結合於CD3及第2抗原之抗體之抗體庫(也稱為雙Fab資料庫) 選擇CD3(CD3ε)作為第1抗原，取得結合於CD3(CD3ε)與任意第2抗原之抗體的方法可列舉以下6種方法。 1. 在結合於第1抗原之Fab分域插入結合於第2抗原之胜肽或多肽的方法（實施例3與4所示之胜肽插入以外，尚有如Angew Chem Int Ed Engl. 2013 Aug 5;52(32):8295-8例示之插入G-CSF之方法。）結合之胜肽或多肽，可從展示胜肽或多肽之資料庫取得，也可進一步利用天然存在蛋白質之全體或其一部分。 2. 製作如實施例5所示，Fab中之迴圈能加長改變(延長)之位置出現各種胺基酸的抗體庫，而以從抗體庫向抗原之結合活性為指標取得對於任意第2抗原有結合活性之Fab之方法 3. 使用從預先已知對於CD3結合的Fab分域利用部位專一性變異法製得的抗體，鑑定維持與CD3之結合活性之胺基酸，從會出現已鑑定之胺基酸的抗體庫，以抗體庫向抗原之結合活性為指標，取得對於任意第2抗原有結合活性之Fab的方法 4. 製作3之方法能進一步將Fab中之迴圈加長改變（延長）之位置有各種胺基酸出現的抗體庫，以抗體庫向抗原之結合活性為指標，取得對於任意第2抗原有結合活性之Fab的方法 5. 於1.2.3.或4.之方法中，進行改變使糖鏈附加序列(例如NxS, NxT、x為P以外之胺基酸)出現，並附加糖鏈受體認識之糖鏈之方法(例如附加高甘露糖型糖鏈，高甘露糖受體會認識。高甘露糖型糖鏈已知可藉由於抗體表現時添加Kifunensine而得(MAbs. 2012 Jul-Aug;4(4):475-87)) 6. 於1.2.3.或4.之方法中，於迴圈部位、可改變為各種胺基酸之部位插入或取代Cys、Lys或非天然胺基酸，而以共價鍵附加結合於第2抗原之分域之方法(Antibody drug conjugate為代表之方法，以共價鍵結合Cys、Lys或非天然胺基酸之方法、記載於mAbs 6:1, 34-45; January/February 2014、WO2009/ 134891A2、Bioconjug Chem. 2014 Feb 19;25(2):351-61)) 使用上述方法，可獲得與第1抗原與第2抗原結合且彼此不同時結合的雙結合Fab，且與任意第3抗原結合之分域（稱為另一可變區，記載於實施例1）可依該領域中通常知識者公知之方法，例如利用共通L鏈、Cross mab、Fab arm exchange法組合。

(6-2) 使用部位專一性變異法製作CD3(CD3ε)結合抗體之1胺基酸改變抗體 作為CD3(CD3ε)結合抗體之模板序列之VH區域選擇CE115HA000（序列辨識號：52）、VL區域選擇GLS3000（序列辨識號：53）。各對於認為涉及抗原結合的部位，參考實施例1實施胺基酸改變。又，H鏈之不變區使用pE22Hh（對於天然IgG1之CH1以後的序列施加L234A, L235A, N297A, D356C, T366S, L368A, Y407V的改變，使C末端之GK序列缺失而附加DYKDDDDK序列（序列辨識號：89）之序列，序列辨識號：54），L鏈不變區使用Kappa鏈（序列辨識號：55）。已實施改變的部位示於表3。為了實施CD3(CD3ε)結合活性評價，取得單臂抗體（天然型IgG的其中一Fab分域缺損的抗體）作為1胺基酸改變抗體。具體而言，H鏈改變的情形，使用經改變之H鏈和不變區pE22Hh連結而得者以及Kn010G3（對於天然型IgG1之216號以後的胺基酸序列施以C220S, Y349C, T366W、H435R之改變者，序列辨識號：56）與kappa鏈連結於3'側而得之GLS3000，L鏈改變的情形使用於經改變之L鏈之3'側連結有Kappa鏈之序列、與就H鏈而言於3'側有pE22Hh連結之CE115HA000與Kn010G3，以FreeStyle293細胞實施表現・精製（使用參考實施例1之方法）。

[表3]

(6-3) 1胺基酸改變抗體之CD3結合評價 於(6-2)構建及表現精製而得之1胺基酸改變體使用BiacoreT200(GE Healthcare)評價。在Sensor chip CM4(GE Healthcare)上以胺基偶聯法將CD3ε均二聚物蛋白質予以固定化適當量後，注入作為分析物的適當濃度的抗體，使其與感應晶片上之CD3ε均二聚物蛋白質交互作用。之後，注入10mmol/L Glycine-HCl(pH1.5)，將感應晶片予以再生。測定於25℃進行，運行緩衝液使用HBS-EP+(GE Healthcare)。測定結果係對於結合量與測定獲得之感應圖，使用single-cycle kinetics model (1:1binding RI=0)計算解離常數KD(M)。各參數的計算使用Biacore T200 Evaluation Software(GE Healthcare)。

(6-3-1) H鏈之改變 各種H鏈改變體之結合量相對於改變前抗體CE115HA000之比之結果示於表4。亦即，令含CE115HA000之抗體之結合量為X、H鏈1胺基酸改變體之結合量為Y時之Z(結合量之比)＝Y/X之值。此時如第18圖所示，Z未達0.8的情形，可知由感應圖得出的結合量非常少，啟示無法正確第計算解離常數K _D(M)。然後，各種H鏈改變體相對於CE115HA000之解離常數K _D(M)之比（＝CE115HA000之KD值/改變體之KD值）示於表5。 如表4所示之Z為0.8以上時，據認為對於改變前之抗體CE115HA000維持結合，故以出現該等胺基酸的方式設計的抗體庫可成為雙Fab資料庫。

[表4]

[表5]

(6-3-2) L鏈之改變 各種L鏈改變體之結合量相對於改變前抗體GLS3000之比之結果示於表6。亦即，令含GLS3000之抗體之結合量為X、L鏈1胺基酸改變體之結合量為Y時，Z(結合量之比)＝Y/X之值。此時如第18圖所示，Z未達0.8的情形，由感應圖可知結合量非常少，啟示無法正確計算解離常數K _D(M)。然後，各種L鏈改變體對於GLS3000之解離常數K _D(M)之比示於表7。 表6所示之Z為0.8以上時，考量對改變前之抗體GLS3000維持結合，故以該等胺基酸出現的方式設計的抗體庫可成為雙Fab資料庫。

[表6]

[表7]

(6-4) 1胺基酸改變抗體之ECM（Extracellular matrix；細胞外基質）結合評價 ECM（Extracellular matrix；細胞外基質）係細胞外之構成成分之一，存於生命體內的各種部位。所以，已知和ECM強結合的抗體於血中動態變差（半衰期縮短）(WO2012093704A1)。而，針對在抗體庫出現的胺基酸，宜選擇ECM結合不增強的胺基酸較佳。

各H鏈或L鏈改變體依(6-2)所示方法取得抗體。然後依參考實施例2之方法評價ECM結合。各改變體之ECM結合值(ECL response；ECL反應之值)除以同一盤內或同一實施日之MRA（H鏈序列辨識號：57、L鏈序列辨識號：58）之抗體ECM結合值而得之值示於表8(H鏈)、表9(L鏈)。如表8及9所示，在一些改變可觀察到ECM結合增強的傾向。 表8(H鏈)、表9(L鏈)所示值之中，考慮多數改變所致ECM結合增強之效果，以直到10倍為有效而採用於雙Fab資料庫。

[表8]

[表9]

(6-5) 用以增強庫多樣性之胜肽之插入處與長度的探討 實施例5中，顯示能在各處使用GGS序列而不喪失向CD3(CD3ε)之結合地插入胜肽。雙Fab資料庫中，只要迴圈能延長，據認為能成為含有更多種類的分子（也表達為多樣性大）的資料庫，可取得和多樣第2抗原結合的Fab分域。而預測由於胜肽插入會使結合活性降低，所以對於CE115HA000序列施加V11L/D72A/L78I/D101Q改變以使向CD3ε之結合活性增高並連結pE22Hh之序列，和實施例5同樣地插入GGS連結子，製作此分子並進行CD3結合的評價。GGS序列插入於Kabat編號的99-100之間。抗體分子表達為單臂抗體。具體而言，採用含GGS連結子之前述H鏈與Kn010G3（序列辨識號：56）及作為L鏈之GLS3000（序列辨識號：53）與Kappa序列（序列辨識號：55）連結成的序列，依參考實施例1實施表現精製。

(6-6) 已插入GGS胜肽之CE115抗體向CD3之結合確認 已插入GGS胜肽之改變抗體向CD3ε之結合，係使用實施例6記載的方法使用Biacore實施。其結果，可知如表10所示，可向迴圈部位插入GGS連結子。尤其可在對於抗原結合為重要的H鏈CDR3區域插入GGS連結子，3,6,9個胺基酸的任一均維持向CD3ε之結合。在本項研究使用GGS連結子進行研究，但據認為也可為不是出現GGS而是出現各種胺基酸的抗體庫。

[表10]

(6-7) 使用NNS鹼基向H鏈CDR3進行庫插入之研究 於(6-6)可使用GGS連結子插入3,6,9個胺基酸，據認為製作插入有3、6、9個胺基酸的庫，使用通常之噬菌體展示(Phage display)法所代表的抗體取得法的話，則能取得結合於第2抗原的抗體。而，於向CDR3之插入為6個胺基酸時，使用NNS鹼基（出現各種胺基酸），探討是否於插入6個胺基酸的部位出現各種胺基酸仍保持和CD3之結合。因預測結合活性降低，所以使用NNS鹼基設計引子，使比起CE115HA000有更高CD3ε結合活性之CE115HA340序列（序列辨識號：59）之CDR3中之99-100（Kabat編號）之間插入6個胺基酸。抗體分子表現作為單臂抗體。具體而言，採用含前述改變之前述H鏈與Kn010G3(序列辨識號：56)與作為L鏈之GLS3000（序列辨識號：53）與Kappa序列（序列辨識號：55）連結而得之序列，依參考實施例1實施表現精製。取得之改變抗體依(6-3)記載的方法評價結合。其結果示於表11。可知：即使於胺基酸延長的部位出現各種胺基酸，仍保持向CD3(CD3ε)之結合性。再者，依參考實施例2所示之方法評價非專一性結合是否增強的結果示於表12。其結果，若CDR3之伸長迴圈內有多數側鏈帶正電荷的胺基酸，則向ECM之結合增強，所以不希望於迴圈內出現3個以上於側鏈帶有正電荷的胺基酸。

[表11]

[表12]

(6-7) 雙Fab資料庫之設計及構建 由實施例6記載之研究，依以下方式設計用以取得結合於CD3與第2抗原之抗體的抗體庫(雙Fab資料庫)。 步驟1：選擇保持CD3(CD3ε)結合能力的胺基酸（CD3結合量為CE115HA000之80%以上） 步驟2：選擇ECM結合較改變前，比起MRA為10倍以內的胺基酸 步驟3：在H鏈CDR3之99-100（Kabat編號）之間插入6個胺基酸 又，僅步驟1也能使Fab之抗原結合部位多樣化，所以可成為鑑定結合於第2抗原之抗原結合分子之庫。又，僅步驟1與3也能使Fab之抗原結合部位多樣化，所以可成為鑑定結合於第2抗原之抗原結合分子之庫。不經步驟2之庫設計也能測定對於取得之分子的ECM結合並進行評價。

由以上，雙Fab資料庫之H鏈係對於CE115HA000之FR(框架)施加V11L/ L78I變異而得的序列，就CDR而言以表13所示多樣化，L鏈係將GLS3000之CDR以表14所示多樣化。該等抗體庫片段可以用該領域中通常知識者公知之DNA合成方法合成該庫片段。作為雙Fab資料庫(Dual Fab library)，可製作：(1) 將H鏈以表13所示多樣化，L鏈固定為原序列GLS3000或實施例6所記載之CD3ε結合增強的L鏈的庫、(2) H鏈固定為原序列(CE115HA000)或實施例6記載之CD3ε結合增強的H鏈，L鏈為如表14所示多樣化之庫、(3) H鏈如表13所示多樣化，L鏈如表14所示多樣化之庫。將H鏈係對於CE115HA000之FR（框架）施加V11L/L78I變異之序列就CDR而言依表13所示多樣化而得的庫序列委託DNA2.0的DNA合成公司，取得抗體庫片段(DNA片段)。將取得之抗體庫片段插入到經PCR法放大的噬菌體展示用噬粒。於此時，L鏈選擇GLS3000。再將構建的噬菌體展示用噬粒以電穿孔法導入到大腸菌，製作保有抗體庫片段的大腸菌。

[表13]

[表14]

[實施例7] 從雙Fab資料庫取得結合於CD3及第2抗原(IL6R)之Fab分域 (7-1) 結合於人IL6R之Fab分域之取得 從實施例6設計及構建之雙Fab資料庫鑑定對人IL6R結合之Fab分域(抗體片段)。作為抗原，使用經生物素標記之人IL6R，並實施帶有對人IL6R之結合能力的抗體片段的濃縮。 從保持著構建之噬菌體展示用噬粒的大腸菌實施噬菌體產生。於已實施噬菌體產生的大腸菌培養液添加2.5M NaCl/10%PEG，將沉澱的噬菌體的集團以TBS稀釋，而獲得噬菌體庫液。然後，於噬菌體庫液添加BSA，使終濃度成為4%BSA。淘選方法可參照一般方法，即使用固定於磁性珠粒的抗原的淘選方法(J. Immunol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9、J. Immunol. Methods. (2001) 247 (1-2), 191-203、Biotechnol. Prog. (2002) 18 (2) 212-20、Mol. Cell Proteomics (2003) 2 (2), 61-9)。磁性珠粒可使用NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或包覆了鏈黴親合素之珠粒(Dynabeads M-280 Streptavidin)。

具體而言，於製備的噬菌體庫液中加入250pmol的生物素標記抗原，使該噬菌體庫液於室溫和抗原接觸60分鐘。加入經BSA阻斷的磁性珠粒，使抗原與噬菌體之複合體和磁性珠粒於室溫進行15分鐘結合。珠粒以含TBST (0.1%Tween20之TBS, TBS為TaKaRa公司製)洗滌3次後，以1mL TBS再洗滌2次。之後，將已加入0.5mL之1mg/mL的胰蛋白酶的珠粒於室溫懸浮15分鐘後，立即使用磁座將珠粒分離，回收噬菌體溶液。將回收的噬菌體溶液加到成為對數增殖期(OD600為0.4-0.5)的10mL的大腸菌株ER2738。於37℃緩慢進行1小時上述大腸菌的攪拌培養，以使噬菌體感染大腸菌。將已感染的大腸菌接種到225mm x 225mm的盤。然後從已接種大腸菌的培養液回收噬菌體，製備噬菌體庫液。此循環稱為淘選，重複多次。又，第2次後的淘選，使用40pmol之生物素標記抗原。又，於第4次淘選，以向CD3之結合性做為指標，實施噬菌體的濃縮。具體而言，於製備的噬菌體庫液加入250pmol的生物素標記CD3ε胜肽抗原（胺基酸序列序列辨識號：60），使噬菌體庫於室溫和抗原接觸60分鐘。加入經BSA阻斷的磁性珠粒，使抗原與噬菌體之複合體和磁性珠粒於室溫結合15分鐘。珠粒以含1mL之0.1% Tween20的TBS與TBS洗滌。將已加入0.5mL之1mg/mL之胰蛋白酶的珠粒於室溫懸浮15分鐘後，立即使用磁座將珠粒分離，回收噬菌體溶液。從經胰蛋白酶處理之噬菌體溶液回收的噬菌體加到成為對數增殖期(OD600為0.4-0.7)的10mL的大腸菌株ER2738。於37℃緩慢進行1小時上述大腸菌之攪拌培養，使噬菌體感染大腸菌。將已感染的大腸菌接種在225mm x 225mm的盤。然後從已接種大腸菌的培養液回收噬菌體，以回收噬菌體庫液。 再者，為了防止對一個大腸菌有多數噬菌體感染，針對由第5次淘選回收的已感染噬菌體的大腸菌製備的噬菌體庫液，再度以稀釋100,000倍的噬菌體液感染大腸菌，獲得單一群落。

(7-2) 展示噬菌體之Fab分域與CD3或IL6R之結合(噬菌體ELISA法) 從以上述方法獲得之大腸菌之單一群落依常法(Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145)，回收含噬菌體之培養上清。將加入BSA使終濃度成為4%BSA的含噬菌體的培養上清依以下程序供ELISA。將StreptaWell 96微滴定盤(Roche)於含生物素標記抗原(生物素化CD3ε胜肽或生物素化人IL6R)之100μLPBS於4℃包覆一晚或於室溫包覆1小時。將該盤之各井以PBST洗滌以去除抗原後，將該井以250μL之4%BSA-TBS阻斷1小時以上。在已去除4%BSA-TBS之各井加有製備的培養上清的該盤於室溫靜置1小時，使展示噬菌體之抗體和各井存在的抗原結合。將各井以TBST洗滌後，添加以終濃度4%之BSA的TBS稀釋的HRP結合抗M13抗體(Amersham Pharmacia Biotech)，溫育1小時。以TBST洗滌後，以添加硫酸使已加有TMB single溶液(ZYMED)之各井中之溶液之發色反應停止，之後以450nm之吸光度測定該發色。其結果示於第19圖。#50及#62選殖體顯示對於CD3ε及人IL6R有結合性。亦即，藉由使用雙Fab資料庫，可選擇對於第2抗原(實施例7中為人IL6R)顯示結合性之選殖體。進一步增加評價數，選擇顯示結合性之選殖體，進行IgG化（選殖體帶有之VH及VL序列分別與人H鏈或L鏈不變區連結），可評價向CD3ε與第2抗原(人IL6R)之結合性。再者，是否同時與CD3ε及第2抗原(人IL6R)結合，可利用實施例3、4記載之方法、競爭法檢查。競爭法中，例如向CD3ε之結合，在比起抗體單獨時，於第2抗原存在時較減少，顯示未同時結合。

[實施例8] 從雙Fab資料庫取得結合於CD3及第2抗原(人IgA)之Fab分域 (8-1) 結合於人IgA之Fab分域之取得 IgA為體內豐富存在的抗體的，已知是在腸、黏膜面的生命體防禦相關的分子，已知會結合於FcαR(Fc alpha受體)(J. Pathol. 208: 270 -282, 2006)。 從實施例6設計及構建之雙Fab資料庫鑑定對於人IgA結合的Fab分域（抗體片段）。抗原使用經生物素標記之人IgA（記載於參考實施例3），進行帶有對人IgA之結合能力的抗體片段的濃縮。 從保持了構建的噬菌體展示用噬粒的大腸菌進行噬菌體產生。於已實施噬菌體產生之大腸菌的培養液添加2.5M NaCl/10%PEG，將沉澱的噬菌體的集團以TBS稀釋，獲得噬菌體庫液。然後於噬菌體庫液加入BSA，使終濃度成為4%BSA。淘選方法參照一般方法，即使用固定有磁性珠粒之抗原的淘選方法(J. Immunol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9、J. Immunol. Methods. (2001) 247 (1-2), 191-203、Biotechnol. Prog. (2002) 18 (2) 212-20、Mol. Cell Proteomics (2003) 2 (2), 61-9)。磁性珠粒可使用NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或包覆了鏈黴親合素之珠粒(Dynabeads M-280 Streptavidin)。 具體而言，於製備的噬菌體庫液中加入250pmol的生物素標記抗原，使該噬菌體庫液於室溫和抗原接觸60分鐘。加入經BSA阻斷的磁性珠粒，使抗原與噬菌體之複合體和磁性珠粒於室溫進行15分鐘結合。珠粒以含TBST(0.1%Tween20之TBS, TBS為TaKaRa公司製)洗滌3次後，以1mL TBS再洗滌2次。之後，將已加入0.5mL之1mg/mL的胰蛋白酶的珠粒於室溫懸浮15分鐘後，立即使用磁座將珠粒分離，回收噬菌體溶液。將回收的噬菌體溶液加到成為對數增殖期(OD600為0.4-0.5)的10mL的大腸菌株ER2738。於37℃緩慢進行1小時上述大腸菌的攪拌培養，以使噬菌體感染大腸菌。將已感染的大腸菌接種到225mm x 225mm的盤。然後從已接種大腸菌的培養液回收噬菌體，製備噬菌體庫液。此循環稱為淘選，重複4次。又，第2次後的淘選，人IgA設為40pmol。

(8-2) 噬菌體展示的Fab分域與CD3或人IgA之結合 從以上述方法獲得之大腸菌的單一群落依常法(Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145)回收含噬菌體之培養上清。將加入BSA使終濃度成為4%BSA的含噬菌體的培養上清依以下程序供ELISA。將StreptaWell 96微滴定盤(Roche)於含生物素標記抗原(生物素標記CD3ε胜肽或生物素標記人IgA,參考實施例3)之100μL PBS於4℃包覆一晚或於室溫包覆1小時。將該盤之各井以PBST洗滌以去除抗原後，將該井以250μL之0.1xTBS/150mM NaCl/0.02% Skim Milk阻斷1小時以上。在已去除0.1xTBS/150mM NaCl/0.02% Skim Milk之各井加有製備的培養上清的該盤於室溫靜置1小時，使展示噬菌體之抗體和各井存在的抗原結合。將各井以0.1xTBS/150mM NaCl/0.01% Tween20洗滌後，添加以0.1xTBS/150mM NaCl/0.01% Tween20稀釋的HRP結合抗M13抗體(Amersham Pharmacia Biotech)，溫育1小時。以TBST洗滌後，以添加硫酸使已加有TMB single溶液(ZYMED)之各井中之溶液之發色反應停止，之後以450nm之吸光度測定該發色。其結果示於第20圖。如第20圖所示，顯示存在結合於CD3及人IgA之選殖體，藉由使用雙Fab資料庫，可選擇對於第2抗原（實施例8中為人IgA）顯示結合性的選殖體。

(8-3) 具有取得之Fab分域之IgG之和CD3或人IgA之結合 對於(8-2)顯示結合於CD3與人IgA之選殖體，由具此序列之大腸菌使用對於雙Fab資料庫之H鏈專一性地結合的引子依PCR法放大VH片段。放大的VH片段依參考實施例1的方法嵌入已嵌入有pE22Hh的動物細胞表現用質體，和實施例6(6-2)同樣表現、精製為單臂抗體。選殖體名稱及H鏈序列之序列辨識號顯示於表15。亦即，採用表15所示之H鏈與Kn010G3（序列辨識號：56）與作為L鏈之GLS3000（序列辨識號：53）與Kappa序列（序列辨識號：55）連結成的序列，依參考實施例1實施表現精製。

[表15]

帶有取得之Fab區之抗體分子是否會和CD3ε、人IgA結合，以電化學發光法(ECL法)判定。具體而言，將經TBST溶液(TaKaRa公司製TBS中加有0.1% Tween20者)稀釋之生物素標記CD3ε胜肽(實施例7記載)或生物素標記人IgA(參考實施例3)、調整為2μg/mL之抗體溶液、及已附加sulfo-tag之抗人IgG抗體(Invitrogen #628400)，各添加25μL到Nunc- Immuno ^TMMicroWell ^Tm96井圓盤(Nunc)之各井並混合後，於遮光狀態於室溫溫育1小時以上，使抗體抗原複合體形成。將含0.5%BSA之TBST溶液(記載為阻斷溶液)各加150μL到鏈黴抗生物素蛋白盤(MSD)各井，於室溫溫育1小時以上。去除阻斷溶液後，以TBS(-)溶液250μL洗滌3次。各加50μL抗體抗原複合體溶液到各井，於室溫溫育1小時，使生物素化抗原-抗體-檢測用sulfo-tag抗體之複合體溶液介由生物素化抗原結合於鏈黴抗生物素蛋白盤。去除抗體抗原複合體溶液後，以TBST溶液洗滌3次，將4xREAD緩衝液(MSD)以水稀釋2倍而成的溶液各加150μL到各井，以Sector Imager 2400(MSD)檢測sulfo-tag的發光信號。

其結果示於第21圖。從於噬菌體ELISA認為結合的選殖體，將包括一部分胺基酸變異者進行IgG化，結果即使於噬菌體ELISA認為結合的序列是IgG，仍顯示會和CD3ε及人IgA結合。 由此結果顯示：從雙Fab資料庫可取得和第2抗原結合之抗體，在通常使用噬菌體庫之淘選，雖只有Fab分域，但能將成為含Fc區之IgG仍認為有結合的選殖體進行濃縮。因此雙Fab資料庫，可說是能取得保持和CD3之結合能力且有和第2抗原結合之能力的Fab分域的庫。

(8-4) 具有取得之Fab分域之IgG之和CD3(CD3ε)及人IgA之同時結合之評價 (8-3)中，雖由雙Fab資料庫獲得之選殖體成為IgG仍顯示有結合。然後，以競爭法（電化學發光法(ECL法)）判定獲得之IgG是否會與CD3(CD3ε)及人IgA同時結合。和CD3(CD3ε)及人IgA同時結合時，即使在會和IgA結合之抗體加入CD3(CD3ε)，ECL信號仍不變化，但無法同時結合時，若加入CD3(CD3ε)，應有一部分抗體與CD3(CD3ε)，而ECL信號降低。

具體而言，將經TBST溶液稀釋之生物素化人IgA 25μL、調整為1μg/mL之抗體溶液12.5μL、TBST或用以競爭之CD3ε均二聚物蛋白質(9.4pmol/μL)12.5μL、及已附加sulfo-tag之抗人IgG抗體(Invitrogen #628400)25μL，加到Nunc-Immuno ^TmMicroWell ^TM96井圓盤(Nunc)的各井並混合後，於遮光狀態於室溫溫育1小時以上，使抗體抗原複合體形成。將含0.5%BSA之TBST溶液(記載為阻斷溶液。TBST溶液係於TaKaRa公司製TBS加有0.1%Tween20者)各加150μL到鏈黴抗生物素蛋白盤(MSD)之各井，於室溫溫育1小時以上。去除阻斷溶液後以TBST溶液250μL洗滌3次。各加50μL抗體抗原複合體溶液到各井，於室溫溫育1小時，使生物素化抗原―抗體―檢測用sulfo-tag抗體之複合體溶液介由生物素化抗原結合於鏈黴抗生物素蛋白盤。去除抗體抗原複合體溶液後以TBST溶液洗滌3次，將4xREAD緩衝液(MSD)以水稀釋為2倍的溶液各加150μL到各井，以Sector Imager 2400(MSD)檢測sulfo-tag的發光信號。

其結果示於第22圖。加入用以競爭之CD3ε均二聚物蛋白質時，比起加入TBST時，認為ECL信號較低。由此結果，顯示本研究找出的結合於CD3與人IgA之分子是若結合於CD3則無法結合於人IgA之雙Fab分子。由此結果顯示：可從雙Fab資料庫取得和第2抗原有結合能力之抗體，其中，可取得若與CD3結合則無法與第2抗原結合（或若與第2抗原結合則無法與CD3結合）的無法與多種抗原同時結合之雙Fab分子。

該領域中通常知識者可明白：若於(8-2)能由使用噬菌體之結合活性評價找出結合分子，可藉由增多評價數而增加結合分子之序列的多樣性，由以上可說：雙Fab資料庫是可取得保持著對於CD3之結合能力且同時具有和第2抗原結合之能力的Fab分域的資料庫。又，本實施例使用只將H鏈多樣化的雙Fab資料庫，但通常較大資料庫尺寸（也稱為多樣性，係指資料庫中含有的多樣序列）者能更取得抗原結合分子，所以使L鏈也多樣化的雙Fab資料庫也和本實施例所示同樣地可用於雙Fab分子取得。

若依實施例8所示方式製作雙Fab分子，能使用該領域中通常知識者公知之方法，例如融合瘤法、從抗體庫選出結合抗體（或結合分域）的方法鑑定結合於第3抗原之Fab、抗原結合分域，帶有鑑定之結合於第3抗原之抗原結合分域（例如Fab）與雙Fab分子之Fab分域的抗體可依該領域中通常知識者公知之多專一性抗體之製作方法，例如將L鏈共通化而製作2條H鏈不同之抗體的方法（控制Fc區之各分域之界面之技術）、Cross Mab法、Fab Arm Exchange法取得多專一性抗體。亦即，若能鑑定雙Fab分子，能利用該領域中通常知識者公知之方法將結合於第3抗原之Fab與實施例8所示之結合於第1與第2抗原之雙Fab予以組合而取得所望之多專一性抗體。

(8-5) 針對CD3/人IgA雙Fab分子 實施例8中，顯示可獲得結合於CD3ε及人IgA且不同時結合於CD3ε與人IgA之雙Fab分子。進一步附加與第3抗原結合之抗原結合分域，也可依該領域中通常知識者公知之方法實施。 近年來，已有人揭示以結合於癌抗原之一即EGFR的方式改變而得的IgA分子會誘導表現EGFR之癌細胞的細胞死(J Immunol 2007; 179:2936-2943)。就其機轉而言，據報告係IgA之受體FcαR於多形核細胞(Polymorphonuclear cell)表現，在癌細胞誘導自體吞噬(J Immunol 2011; 187:726-732)。本實施例解明能建構結合於CD3與IgA的雙Fab分子，但若以該領域中通常知識者公知之方法(例如ELISA、ECL法)尋找介由IgA而與FcαR結合的分子，則能期待介由FcαR的抗腫瘤效果。亦即，本雙Fab，能誘導表現任意第3抗原之細胞中利用與CD3ε之結合引起的T細胞所致的細胞傷害活性、以及介由與IgA結合而引起的表現FcαR之細胞所致之細胞傷害活性兩者，能期待強細胞傷害活性。

[實施例9] 從雙Fab資料庫取得結合於CD3及第2抗原(人CD154)之Fab分域 (9-1)結合於人CD154之Fab分域之取得 從實施例6設計及構建的雙Fab資料庫鑑定對於人CD154結合之Fab分域（抗體片段）。抗原使用經生物素標記之人CD154，並進行帶有對於人CD154之結合能力之抗體片段之濃縮。 從保持著構建之噬菌體展示用噬粒的大腸菌實施噬菌體產生。將藉由於已實施噬菌體產生的大腸菌培養液添加2.5M NaCl/10%PEG而沉澱的噬菌體的集團，以TBS稀釋，而獲得噬菌體庫液。然後於噬菌體庫液添加BSA使成為終濃度4%BSA。可參照一般方法，即使用固定於磁性珠粒的抗原的淘選方法(J. Immunol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9、J. Immunol. Methods. (2001) 247 (1-2), 191-203、Biotechnol. Prog. (2002) 18 (2) 212-20、Mol. Cell Proteomics (2003) 2 (2), 61-9)。作為磁性珠粒可列舉NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或包覆了鏈黴親合素之珠粒(Dynabeads M-280 Streptavidin)。 具體而言，於製備的噬菌體庫液中加入250pmol的生物素標記抗原，使該噬菌體庫液於室溫和抗原接觸60分鐘。加入經BSA阻斷的磁性珠粒，使抗原與噬菌體之複合體和磁性珠粒於室溫進行15分鐘結合。珠粒以含TBST(0.1%Tween20之TBS, TBS為TaKaRa公司製)洗滌3次後，以1mLTBS再洗滌2次。之後，將已加入0.5mL之1mg/mL的胰蛋白酶的珠粒於室溫懸浮15分鐘後，立即使用磁座將珠粒分離，回收噬菌體溶液。將回收的噬菌體溶液加到成為對數增殖期(OD600為0.4-0.5)的10mL的大腸菌株ER2738。於37℃緩慢進行1小時上述大腸菌的攪拌培養，以使噬菌體感染大腸菌。將已感染的大腸菌接種到225mm x 225mm的盤。然後從已接種大腸菌的培養液回收噬菌體，製備噬菌體庫液。此循環稱為淘選，重複5次。又，第2次後的淘選，使用40pmol之人CD154。

(9-2) 展示噬菌體之Fab分域與CD3或人CD154之結合 從以上述方法獲得之大腸菌之單一群落依常法(Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145)回收含噬菌體之培養上清。將加入BSA使終濃度成為4%BSA的含噬菌體的培養上清依以下程序供ELISA。將StreptaWell 96微滴定盤(Roche)於含生物素標記抗原(生物素標記CD3ε胜肽、生物素標記CD154)之100μL PBS於4℃包覆一晚或於室溫包覆1小時。將該盤之各井以PBST洗滌以去除抗原後，將該井以250μL之0.1xTBS/150mM NaCl/0.02% Skim Milk阻斷1小時以上。在已去除0.1xTBS/ 150mM NaCl /0.02% Skim Milk之各井加有製備的培養上清的該盤於室溫靜置1小時，使展示噬菌體之抗體和各井存在的抗原結合。將各井以0.1xTBS/150mM NaCl/0.01% Tween20洗滌後，添加以0.1xTBS/150mM NaCl/0.01% Tween20稀釋的HRP結合抗M13抗體(Amersham Pharmacia Biotech)，溫育1小時。以TBST洗滌後，以添加硫酸使已加有TMB single溶液(ZYMED)之各井中之溶液之發色反應停止，之後以450nm之吸光度測定該發色。其結果示於第23圖。如第23圖，顯示存在結合於CD3及CD154之選殖體，可藉由使用雙Fab資料庫，選擇顯示對於第2抗原(實施例9中為人CD154)有結合性的選殖體。又，能取得對於實施例7、8、9所示不同的3個抗原為結合之Fab分域，顯示雙Fab資料庫作為用以取得和第2抗原結合之分子之庫的機能。

(9-3) 具有取得之Fab分域之IgG之CD3或人CD154之結合 對於在(9-2)顯示結合於CD3與人CD154之選殖體，從具有此序列之大腸菌使用對於雙Fab資料庫之H鏈專一性地結合的引子，利用PCR將VH片段放大。將放大的VH片段以參考實施例1的方法納入已有pE22Hh之動物細胞表現用質體，和實施例6(6-2)同樣地表現、精製為單臂抗體。取得之序列名與H鏈序列之序列辨識號記載於表16。具體而言，採用表16記載之H鏈與Kn010G3（序列辨識號：56）與作為L鏈之GLS3000（序列辨識號：53）與Kappa序列（序列辨識號：55）連結成的序列，依參考實施例1實施表現精製。

[表16]

以電化學發光法(ECL法)判定於(9-2)在噬菌體ELISA法顯示帶有結合於CD3與人CD154的Fab區的抗體分子是否結合於CD3、人CD154。具體而言，將經TBST溶液稀釋之生物素化CD3或生物素化人CD154 25μL、調整為2μg/mL之抗體溶液25μL、已附加sulfo-tag之抗人IgG抗體(Invitrogen #628400)25μL添加到Nunc-Immuno ^TmMicroWell ^Tm96井圓盤(Nunc)的各井並混合後，於遮光狀態於室溫溫育1小時以上，使抗體抗原複合體形成。將含0.5%BSA之TBST溶液(記載為阻斷溶液。TBST溶液係於TaKaRa公司製TBS加有0.1%Tween20者)各加150μL到鏈黴抗生物素蛋白盤(MSD)各井，於室溫溫育1小時以上。去除阻斷溶液後，以TBST溶液250μL洗滌3次。將抗體抗原複合體溶液各加50μL到各井，於室溫溫育1小時，將生物素化抗原―抗體―檢測用sulfo-tag抗體之複合體溶液介由生物素化抗原而結合於鏈黴抗生物素蛋白盤。去除抗體抗原複合體溶液後以TBST溶液洗滌3次，把將4xREAD緩衝液(MSD)以水稀釋成2倍的溶液各加150μL到各井，以Sector Imager 2400(MSD)檢測sulfo-tag的發光信號。

其結果示於第24圖。從噬菌體ELISA認為有結合之選殖體，將包含一部分胺基酸變異者進行IgG化，結果在噬菌體ELISA認為有結合之序列即使成為IgG也顯示與CD3ε及人CD154結合。 由此結果顯示：由雙Fab資料庫可取得和第2抗原結合的抗體，通常使用噬菌體庫之淘選只有Fab分域，但即使成為含Fc區之IgG也認為結合之選殖體之濃縮，不只在人IgA，在人CD154也可進行。因此雙Fab資料庫可說是能取得保持和CD3之結合能力且具有和第2抗原之結合能力的Fab分域的資料庫。

(9-4) 具有取得之Fab分域之IgG之和CD3ε及人CD154同時結合之評價 (9-3)中，由雙Fab資料庫獲得之選殖體即使成為IgG也顯示結合。然後，以競爭法（電化學發光法(ECL法)）判定獲得之IgG是否與CD3及人CD154同時結合。若和CD3及人CD154同時結合，則即使對於和CD154結合之抗體加入CD3，ECL信號仍不變化，但不能同時結合時，則若加入CD3，一部分抗體會與CD3結合，ECL信號應降低。

具體而言，將經TBST溶液稀釋之生物素化人CD154 25μL、調整為1μg/mL之抗體溶液12.5μL、TBST或用以競爭之CD3ε均二聚物蛋白質(9.4pmol/μL)12.5μL、及已附加sulfo-tag之抗人IgG抗體(Invitrogen #628400)25μL加到Nunc-Immuno ^TmMicroWell ^Tm96井圓盤(Nunc)的各井，混合後於遮光狀態於室溫溫育1小時以上，使抗體抗原複合體形成。將含有0.5%BSA之TBST溶液(記載為阻斷溶液。TBST溶液係於TaKaRa公司製TBS加入0.1%Tween20者)各加150μL到鏈黴抗生物素蛋白盤(MSD)各井，於室溫溫育1小時以上。去除阻斷溶液後以TBST溶液250μL洗滌3次。各加抗體抗原複合體溶液50μL到各井，於室溫溫育1小時，使生物素化抗原―抗體―檢測用sulfo-tag抗體之複合體溶液介由生物素化抗原結合於鏈黴抗生物素蛋白盤。去除抗體抗原複合體溶液後以TBST溶液洗滌3次，把將4xREAD緩衝液(MSD)以水稀釋2倍的溶液各加150μL到各井，以Sector Imager 2400(MSD)檢測sulfo-tag的發光信號。

其結果示於第25圖。加入用以競爭的CD3ε均二聚物蛋白質時，比起加入TBST，觀測到ECL信號降低。由此結果顯示：本研究找出的結合於CD3ε與人CD154之分子係若結合於CD3則無法結合於人CD154之雙Fab分子。由此結果顯示，可從雙Fab資料庫取得和第2抗原結合之抗體，其中，可取得若和CD3結合則不能和第2抗原結合（或若與第2抗原結合則無法與CD3結合）的無法和多數種抗原同時結合的雙Fab分子。

該領域中通常知識者可明白：若於(9-2)使用噬菌體之結合活性評價找到結合分子，可藉由增多評價數而增加結合分子的序列多樣性，所以，由以上可說：雙Fab資料庫是可取得保持和CD3之結合能力且同時具有與第2抗原之結合能力的Fab分域的庫。又，本實施例使用只使H鏈多樣化的雙Fab資料庫，但通常庫尺寸（也稱為多樣性，係指資料庫中含有多樣序列）較大則更能取得抗原結合分子，所以L鏈也多樣化的雙Fab資料庫也可用於和本實施例所示同樣地取得雙Fab分子。

若能如實施例9所示製作雙Fab分子，則可將結合於第3抗原之Fab、抗原結合分域使用該領域中通常知識者公知之方法，例如融合瘤法、從抗體庫選擇結合抗體、抗原結合分域之選擇方法鑑定，鑑定之結合於第3抗原之抗原結合分域(例如Fab)與帶有雙Fab分子之Fab分域之抗體，可依該領域中通常知識者公知之多專一性抗體之製作方法，例如製作L鏈共通化而2條H鏈不同的抗體的方法(控制Fc區之各分域界面之技術)、Cross Mab法、Fab Arm Exchange法，而取得多專一性抗體。亦即，若能鑑定雙Fab分子，能依該領域中通常知識者公知之方法將結合於第3抗原之Fab與結合於實施例9所示之第1與第2抗原的雙Fab組合而取得所望多專一性抗體。由以上的實施例顯示，藉由使雙Fab資料庫適應多種抗原，能取得結合於CD3ε與第2抗原之分子，進一步，於實施例8與9可知：能取得結合於第1抗原(CD3ε)及第2抗原但不同時結合於第1抗原與第2抗原之分子。如前述，鑑定結合於第3抗原之Fab能以該領域中通常知識者公知之方法進行，故可藉由使用雙Fab資料庫以獲得實施例1記載之所望抗體。

(9-5) 針對CD3/人CD154雙Fab分子 實施例9中，顯示可獲得結合於CD3ε及人CD154且不同時結合於CD3ε與人CD154之雙Fab分子。且附加和第3抗原結合之抗原結合分域，也可依該領域中通常知識者公知之方法實施。 近年來，有人揭示CD154之受體即CD40之致效劑抗體在移入癌抗原反應性之T細胞的方法會增強抗腫瘤活性(J Immunother. 2012 Apr;35(3):276-82.)。本實施例明白能建構結合於CD3與CD154之雙Fab分子，但若能選擇介由CD154而對於CD40顯示致效劑活性的抗體，則能期待介由CD40的抗腫瘤效果。亦即，本雙Fab，能期待：在表現任意第3抗原之細胞以和CD3ε之結合而獲得T細胞所致之細胞傷害活性、及介由與CD154之結合而引起的CD40之致效劑信號獲致之抗腫瘤效果之增強。

[實施例10] 關於來自抗人CD3抗體之抗體資料庫 CD3係在人T細胞上表現之蛋白質，近年已明白CD3與EpCAM之雙專一性抗體Catumaxomab藉由將癌細胞與T細胞交聯，而呈現強抗腫瘤效果。 若能建構維持了CD3結合性之抗體資料，則能以例如以下的態樣利用。 ・取得和CD3及其他抗原結合，且增加CD3所致之抗腫瘤效果之免疫球蛋白可變區(Fab)。具有以一個Fab和2個抗原結合之能力。 ・取得和CD3及其他2個抗原結合，且增強CD3所致之抗腫瘤效果之免疫球蛋白可變區(Fab)。具有以一個Fab和3個抗原結合之能力。 ・增強向CD3之結合性。 製作分別認識CD3與癌抗原之雙專一性抗體時，製作認識癌抗原之抗原結合部位。

[實施例11] 增強和CD3之結合之方法 (11-1)增強CD3結合之方法 作為利用實施例10記載之來自抗CD3抗體之抗體資料庫之方法，有人考慮獲得增大向CD3之結合之抗體之方法。一般而言，增強結合力之方法(Affinity maturation)可列舉：對於取得之抗體序列利用部位專一性變異法而改變胺基酸並測定結合力之方法，及使用噬菌體展示為主之試管內展示(In vitro display)法之方法。試管內展示係將對於取得之序列利用Error prone PCR法等而導入了變異之多種抗體序列作為資料庫，選擇結合力強之序列。 向CD3之結合，據認為使用選擇習知抗CD3抗體（例如：有上述模板序列之CD3結合抗體）之80%以上胺基酸的雙Fab資料庫，能以良好效率找到向CD3之結合強之序列。

(11-2) 對於人CD3之結合增強之Fab分域之取得 從實施例6設計及建構之雙Fab資料庫鑑別對於CD3結合之Fab分域(抗體片段)。就抗原而言，使用經生物素標記之CD3胜肽，進行對於人CD3帶有結合能力之抗體片段之濃縮。 從保持著建構之噬菌體展示用噬粒的大腸菌產生噬菌體。將藉由於實施噬菌體產生之大腸菌之培養液添加2.5M NaCl/10%PEG而沉澱之噬菌體之集團以TBS稀釋，獲得噬菌體資料庫液。然後，在噬菌體資料庫液添加BSA使終濃度成為4%BSA。淘選方法係參考一般方法，即使用固定於磁珠之抗原的淘選方法(J. Immunol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9、J. Immunol. Methods. (2001) 247 (1-2), 191-203、Biotechnol. Prog. (2002) 18 (2) 212-20、Mol. Cell Proteomics (2003) 2 (2), 61-9)。磁珠可使用包覆了NeutrAvidin之珠粒(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或包覆了鏈黴親合素之珠粒(Dynabeads M-280 Streptavidin)。 具體而言，在製備的噬菌體資料庫液中加入250pmol之生物素標記抗原，使該噬菌體資料庫液於室溫和抗原接觸60分鐘。加入經BSA阻斷的磁珠，使抗原與噬菌體之複合體於室溫和磁珠結合15分鐘。將珠粒以TBST(含有0.1%Tween20之TBS，TBS為TaKaRa公司製)洗滌3次後，以1mLTBS再洗滌2次。之後使0.5mL之已添加1mg/mL之胰蛋白酶之珠粒於室溫懸浮15分鐘後，立即使用磁座將珠粒分離，回收噬菌體溶液。將回收之噬菌體溶液添加到成為對數增殖期(OD600為0.4-0.5)之10mL之大腸菌株ER2738。於37℃緩慢地進行1小時上述大腸菌之攪拌培養，使噬菌體感染大腸菌。將已感染之大腸菌接種於225mm x 225mm之盤。然後，從已接種之大腸菌之培養液回收噬菌體，製備噬菌體資料庫液。此循環稱為淘選，總共重複7次。又，於第2回合以後之淘選，人CD3設為40、10、10、1、1、0.1pmol。又，第5回合以後，在添加人CD3時，各加入1000倍量之人CD3e同二元體。

(11-3) 具有取得之Fab分域之IgG之製備 (11-2)獲得之帶有CD3結合能力之抗體片段之集團只由Fab分域構成。而進行向IgG型(Fab及Fc之結合體)之變換。從具有帶CD3結合能力之抗體片段之大腸菌，使用專一性結合於雙Fab資料庫之H鏈之引子，以PCR將VH片段放大。將已放大的VH片段以參考實施例1之方法嵌入已嵌入了pE22Hh之動物細胞表現用質體，和實施例6(6-2)同樣地表現並精製為單臂抗體。取得之序列名與H鏈序列之序列辨識號記載於表17。具體而言，採用表17記載之H鏈與Kn010G3（序列辨識號：56）與作為L鏈之GLS3000（序列辨識號：53）與Kappa序列（序列辨識號：55）連結成的序列，依參考實施例1實施表現精製。

[表17]

(11-4) 具有取得之Fab分域之IgG之結合評價 (11-3)獲得之IgG與人CD3之結合利用BiacoreT200確認。使CM4晶片介隔鏈黴親和素和生物素化CD3結合，將製作之抗體作為分析物流過，於37℃解析結合親和性。其結果示於表18。

[表18]

如表18所示，能取得比起CE115有更強結合力之抗體。由此結果顯示：本發明之雙Fab資料庫能使用在取得對於CD3之結合能力增強之CD3結合抗體之方法。

[實施例12] 取得認識癌抗原之可變區(Fab)之方法 (12-1) 針對認識癌抗原之可變區(Fab) 作為利用實施例10之記載之來自抗CD3抗體之抗體資料庫之方法，可列舉取得針對癌抗原之結合抗體之方法。 認識癌抗原之可變區之輕鏈也可作為認識CD3之可變區之輕鏈，故從對於CD3有結合性之雙Fab資料庫取得認識癌抗原之可變區所含之輕鏈係為有效率的。

(12-2) 對於人CD154結合之Fab分域之取得 如實施例9所記載，從將人CD154作為模型癌抗原之雙Fab資料庫，鑑別對於人CD154結合之Fab分域(抗體片段)。使用經生物素標記之人CD154作為抗原，進行帶有對於人CD154之結合能力之抗體片段之濃縮。 從實施例6構建之保持著噬菌體展示用噬粒之大腸菌進行噬菌體產生。將藉由在進行噬菌體產生之大腸菌之培養液添加2.5M NaCl/10%PEG而使沉澱之噬菌體之集團以TBS稀釋，獲得噬菌體資料庫液。然後，在噬菌體資料庫液添加BSA使終濃度成為4%BSA。淘選方法參考一般方法，即使用固定於磁珠之抗原之淘選方法(J. Immunol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9、J. Immunol. Methods. (2001) 247 (1-2), 191-203、Biotechnol. Prog. (2002) 18 (2) 212-20、Mol. Cell Proteomics (2003) 2 (2), 61-9)。磁珠使用包覆了NeutrAvidin之珠粒(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或包覆了鏈黴親合素之珠粒(Dynabeads M-280 Streptavidin)。 具體而言，對於製備之噬菌體資料庫液加入250pmol之生物素標記抗原，使該噬菌體資料庫液在室溫和抗原接觸60分鐘。加入經BSA阻斷的磁珠，使抗原與噬菌體之複合體和磁珠於室溫結合15分鐘。珠粒以TBST(含有0.1%Tween20之TBS，TBS為TaKaRa公司製)洗滌3次後，以1mL之TBS再洗滌2次。之後將0.5mL之已加入1mg/mL之胰蛋白酶的珠粒於室溫懸浮15分鐘後，立即使用磁座分離珠粒，將噬菌體溶液回收。將回收的噬菌體溶液添加到成為對數增殖期(OD600為0.4-0.5)之10mL之大腸菌株ER2738。於37℃緩慢地進行1小時上述大腸菌之攪拌培養，使噬菌體感染大腸菌。將已感染的大腸菌接種在225mm x 225mm之盤。然後，從已接種的大腸菌培養液回收噬菌體，以製備噬菌體資料庫液。此循環稱為淘選，重複5次。又第2回合之後的淘選中，人CD154設為40pmol。

(12-3) 噬菌體所展示之Fab分域與CD3或人CD154之結合 從依上述方法獲得之大腸菌之單一群落，依常法(Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145)回收含噬菌體之培養上清。將添加BSA使終濃度成為4%BSA的含有噬菌體之培養上清依以下程序供ELISA。將StreptaWell 96微滴定盤(Roche)以含有生物素標記抗原(生物素標記CD3ε胜肽、生物素標記CD154)之100μL之PBS於4℃包覆一晩或於室溫包覆1小時。將該盤之各井以PBST洗滌以去除抗原後，將該井以250μL之0.1xTBS/150mM NaCl/0.02% Skim Milk阻斷1小時以上。在已去除0.1xTBS/150mM NaCl /0.02% Skim Milk之各井加入製備的培養上清，之後將該盤於室溫靜置1小時，使展示噬菌體之抗體結合於各井存在之抗原。將各井以0.1xTBS/150mM NaCl/0.01% Tween20洗滌後，添加經0.1xTBS/150mM NaCl/0.01% Tween20稀釋之HRP結合抗M13抗體(Amersham Pharmacia Biotech)，培育1小時。以TBST洗滌後，使已添加TMB single溶液(ZYMED)之各井中之溶液之發色反應利用添加硫酸停止後，以450nm之吸光度測定該發色。其結果示於第23圖。如第23圖，呈現存在結合於CD3及CD154之選殖體，可藉由使用雙Fab資料庫，選擇對於第2抗原(實施例9中為人CD154)呈結合性之選殖體。該等選殖體之中，對於CD154呈結合性但對於CD3之結合性降低之選殖體係只和CD154(癌抗原)結合之可變區(Fab)，可利用其獲得CD154結合抗體。 又，於對於CD154與CD3皆有結合性時，藉由利用實施例6探討之部位專一性變異法導入CD3結合減弱之胺基酸改變、實施例6未探討之胺基酸，可獲得CD3結合減弱且只結合於癌抗原之可變區(Fab)。 再者，可利用本實施例製造之只和癌抗原結合之可變區(Fab)、及包括和該可變區為共通之L鏈可變區序列之只和第1抗原(CD3)結合之可變區，而依該技術領域中有通常知識者公知之方法製造雙專一性抗體。

[實施例13] 認識不同之3個抗原但不同時結合於該3個抗原之可變區(Multi Fab) 直到實施例12，可製作認識CD3與IgA、或CD3與CD154此類不同之2個抗原且不同時彼此結合之可變區(Dual Fab)。再者，若改良成認識第1與第2抗原且彼此不同時結合之可變區能夠和第4抗原結合，第1、第2、第4抗原彼此不同時結合，則成為多專一性抗體Multi Fab。但是至今尚未知有能和不同之3個以上之多數抗原結合但彼此不同時結合之可變區。

(13-1) 認識3個抗原之可變區(Fab)之取得 認識3個抗原之可變區之取得，可列舉對於本說明書明白之雙專一性抗體Dual Fab，進一步進行： 1. 改變胺基酸而使和抗原結合之方法 2. 探尋已知和抗原結合、或會於該技術領域中有通常知識者公知之方法結合之胜肽，而插入抗原結合胜肽之方法 3. 使用本說明書明白之抗體資料庫，選擇結合於和DualFab為不同之抗原之可變區之方法。 又，也可使用本說明書明白之抗體資料庫，預先探尋對於不同之多數抗原會結合之分子，可於探索過程選擇會和各分子結合且不同時和不同之多數抗原結合之抗原結合分子。

(13-2) 認識CD3、人IgA及整合素αvβ3之可變區(Multi Fab)之製作 利用PCR法製作在認識實施例8取得之CD3與人IgA之Dual Fab分子IGAR6(2)B02（重鏈序列辨識號：63）之第72號（Kabat編號）與第73號（Kabat編號）之間插入了已知會和整合素αvβ3結合之胜肽的IGAR6(2)B02H1（重鏈序列辨識號：136）。將製作之DNA片段嵌入到動物細胞表現用質體，和實施例8同樣地，採用IGAR6(2)B02或IGAR6(2)B02H1作為H鏈可變區，並採用該H鏈可變區與Kn010G3（序列辨識號：56）與作為L鏈之GLS3000（序列辨識號：53）與Kappa序列（序列辨識號：55）連結成的序列，依參考實施例1進行表現精製。

(13-3) 認識CD3、人IgA及整合素αvβ3之可變區(Multi Fab)之CD3或人IgA之結合性之確認 然後以電化學發光法(ECL法)判定是否取得之帶有Fab區之試驗抗體分子會和人IgA與CD3結合且彼此同時結合。具體而言，將經TBST溶液稀釋之生物素化人IgA 12.5μL、製備成2μg/mL之試驗抗體溶液25μL、與TBST或為了競爭之CD3ε同二元體蛋白質(3.5pmol/μL)12.5μL、附加了sulfo-tag之抗人IgG抗體(Invitrogen #628400)25μL，添加在Nunc-Immuno ^TMMicroWell ^TM96井圓底盤(Nunc)之各井，混合後於4℃於遮光狀態培育一晩以上，使抗體抗原複合體形成。將含有0.5%BSA之TBST溶液(記載為阻斷溶液。TBST溶液係在TaKaRa公司製之TBS添加了0.1%Tween20者)在鏈黴親和素盤(MSD)之各井各添加150μL，於4℃培育一晩以上。去除阻斷溶液後，將抗體抗原複合體溶液在各井各添加50μL，於室溫培育1小時，使生物素化抗原-試驗抗體-檢測用sulfo-tag抗體之複合體溶液介隔生物素化抗原而結合於鏈黴親和素盤。去除抗體抗原複合體溶液後，把將4xREAD緩衝液(MSD)以水稀釋成2倍之溶液在各井各添加150μL，以Sector Imager 2400(MSD)檢測sulfo-tag之發光信號(ECL信號)。其結果示於表19。

[表19]

	ECL信號	和未添加抗原之井比較之值
樣本	hIgA	hIgA + CD3ε 同二元體蛋白質	CD3胜肽	無抗原	hIgA	hIgA + CD3ε 同二元體蛋白質	CD3胜肽	無抗原	因CD3減弱 之向hIgA之 結合量
IGA6(2)B02	20675	884	959436	1054	20	1	910	1	23.4
IGAR6(2)B02H1	5564	755	933057	663	8	1	1407	1	7.4
TBST	976	1144	1204	715	1	2	2	1	0.9

如表19，IGAR6(2)B02H1會結合於hIgA(人IgA)或CD3。在測定人IgA之結合時，若使CD3ε同二元體蛋白質共存，結合信號會減弱，顯示：和實施例6所示之IGAR6(2)B02同樣，IGAR6(2)B02H1亦為和IgA與CD3結合但彼此不同時同時結合。

(13-4) 認識CD3、人IgA及整合素αvβ3之可變區(Multi Fab)之和整合素αvβ3之結合性之確認 然後，以電化學發光法(ECL法)判定(13-2)取得之帶有Fab區域之試驗抗體分子是否和整合素αvβ3結合、是否和整合素αvβ3與CD3ε同時結合。具體而言，使整合素αvβ3(R＆D systems)溶於0.1M NaHCO ₃, pH9.6之溶液使成為1μg/mL，各加50μL於MULTI-ARRAY 96井盤(Meso Scale Diagnostics)。於沒有整合素αvβ3之井，各加50μL 0.1M NaHCO ₃, pH9.6之溶液。於4℃靜置2日。然後，將TBST溶液(在TaKaRa公司製TBS添加了0.1% Tween20者)或經TBST稀釋之CD3ε同二元體蛋白質、與製備成2μg/mL之試驗抗體溶液、與附加了sulfo-tag之抗人IgG抗體(Invitrogen #628400)，各加25μL於Nunc-Immuno ^TMMicroWell ^TM96井圓盤(Nunc)之各井並混合，之後於遮光狀態在4℃培育2日，形成試驗抗體與抗人IgG抗體之複合體。將已固定抗原之MULTI-ARRAY 96井盤(Meso Scale Diagnostics)以TBST洗滌3次。之後於各井各添加含0.5%BSA之TBST溶液(記載為阻斷溶液)150μL，於室溫培育1小時以上。去除阻斷溶液後，於各井各添加(包括CD3ε同二元體蛋白質或TBST)試驗抗體與抗人IgG抗體之複合體溶液50μL，於室溫振盪1小時，使盤上之抗原和試驗抗體-檢測用sulfo-tag抗體之複合體結合。去除抗體複合體溶液後，於各井添加150μL之4xREAD緩衝液(MSD)以水稀釋2倍而得之溶液，以Sector Imager 2400(MSD)檢測sulfo-tag之發光信號。其結果示於表20。

[表20]

	ECL信號	和未添加整合素αvβ3之井比較之值
樣本	整合素αvβ3	整合素αvβ3+CD3ε 同二元體 蛋白質	無整合素αvβ3	無整合素αvβ3+CD3ε同二元體 蛋白質	整合素 αvβ3	整合素αvβ3+CD3ε 同二元體 蛋白質	因CD3減弱之向整合素αvβ3之結合量
IGA6(2)B02	456	452	570	557	0.8	0.8	1.0
IGAR6(2)B02H1	549380	98552	1253	533	438.5	184.9	2.4
TBST	540	497	480	552	1.1	1.0	1.1

如表20，IGAR6(2)B02H1，比起無整合素αvβ3、TBST之樣本，ECL信號增加，可知已和整合素αvβ3結合。進而，若添加CD3ε同二元體則信號減弱，顯示GAR6(2)B02H1雖和整合素αvβ3結合，但若有CD3ε同二元體蛋白質共存，則和CD3ε同二元體蛋白質結合而不和整合素αvβ3結合。

(13-5) 認識CD3、人IgA及整合素αvβ3之可變區(Multi Fab)之結合特性之確認 (13-3)顯示不和IgA與CD3同時結合，(13-4)顯示不和整合素αvβ3與CD3同時結合。其次以電化學發光法(ECL法)判定是否彼此和人IgA與整合素αvβ3同時結合。具體而言，將經TBST溶液稀釋之生物素化人IgA 12.5μL、製備成1μg/mL之試驗抗體溶液25μL、及TBST或為了競爭之整合素αvβ3 (R&D systems)(250pmol/μL)12.5μL、及附加了sulfo-tag之抗人IgG抗體(Invitrogen #628400)25μL添加到Nunc-Immuno ^TMMicroWell ^TM96井圓盤(Nunc)之各井，混合後於遮光狀態於4℃培育一晩以上，形成抗體抗原複合體。將含有0.5%BSA之TBST溶液(記載為阻斷溶液。TBST溶液係於TaKaRa公司製TBS添加了0.1%Tween20者)各加150μL到鏈黴親合素盤(MSD)各井，於室溫培育1小時以上。去除阻斷溶液後，各加抗體抗原複合體溶液50μL到各井，於室溫培育1小時，使生物素化抗原-抗體-檢測用sulfo-tag抗體之複合體溶液介隔生物素化抗原和鏈黴親和素盤結合。去除抗體抗原複合體溶液後，於各井各添加4xREAD緩衝液(MSD)以水稀釋成2倍之溶液150μL，以Sector Imager 2400(MSD)檢測出sulfo-tag之發光信號(ECL信號)。其結果示於表21。

[表21]

	ECL信號	和未添加抗原之井比較之值
樣本	hIgA	hIgA + 整合素αvβ3	無抗原	hIgA	hIgA + 整合素αvβ3	無抗原	因整合素αvβ3減弱之向hIgA之結合量
IGA6(2)B02	6356	6460	408	15.6	15.9	1.0	1.0
IGAR6(2)B02H1	2796	1121	718	3.9	1.6	1.0	2.5
TBST	582	567	624	0.9	0.9	1.0	1.0

如表21，藉由整合素αvβ3共存，針對人IgA之結合信號減弱2.5倍，顯示IGAR6(2)B02H1不同時結合於人IgA與整合素αvβ3。 由以上之結果，顯示：IGAR6(2)B02H1是會和人IgA、CD3、整合素αvβ3結合，但彼此不同時結合之分子(Multi Fab)。

如本實施例所示，若能製作會和不同之3個抗原（第1抗原、第2抗原、及第4抗原）結合但不同時結合於該3個抗原之可變區(Multi Fab)，則能使用該技術領域中有通常知識者公知之方法，例如融合瘤法、從抗體資料庫挑選結合抗體、抗原結合分域之方法，來鑑別會結合於第3抗原之Fab、抗原結合分域，帶有鑑別出之會結合於第3抗原之抗原結合分域(例如Fab)與multi Fab分子之Fab分域之抗體能利用上述該技術領域中有通常知識者公知之多專一性抗體之製作方法(控制Fc區之各分域之界面技術、Cross Mab法、Fab Arm Exchange法等)製作。亦即，若能鑑別本實施例所示之和不同之3個抗原結合之Multi Fab分子，則可將該分子依該技術領域中有通常知識者公知之方法和結合於第3抗原之Fab組合，而取得所望之多專一性抗體。

[參考實施例] [參考實施例1] 抗體之表現載體之製作及抗體之表現與精製 胺基酸取代之導入係使用QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)、PCR或In fusion Advantage PCR cloning kit (TAKARA)等依該領域中通常知識者公知之方法進行，並建構表現載體。獲得之表現載體之鹼基序列依該領域中通常知識者公知之方法決定。將製作的質體暫時性導入人胎兒腎癌細胞來源HEK293H株(Invitrogen)、或FreeStyle293細胞(Invitrogen公司)並實施抗體表現。從獲得之培養上清使用rProtein A Sepharose ^TMFast Flow(GEhealthcare)，以該領域中通常知識者公知之方法精製抗體。精製抗體濃度係使用分光光度計測定於280nm之吸光度，從獲得之值使用依PACE法算出的吸光係數計算抗體濃度(Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423)。

[參考實施例2] 抗體之ECM(Extracellular matrix、細胞外基質)結合評價 抗體向ECM(Extracellular matrix)之結合評價係參考WO2012093704A1，依以下程序實施。將ECM Phenol red free(BD Matrigel #356237)以TBS稀釋為2mg/mL，於在冰上冷確的ECL測定用盤(L15XB-3、MSD high bind)的各井的正中滴加5μL。之後，以盤密封件加蓋，於4℃靜置一晚。使已固定ECM的盤回到室溫，於各井加入ECL阻斷緩衝液(PBS中加有0.5%BSA及0.05%Tween 20者)150μL，於室溫靜置2小時以上或於4℃靜置一晚。然後使用PBS-T(PBS中加有0.05%Tween 20者)將抗體樣本稀釋為9μg/mL。將2次抗體以ECLDB(PBS中加有0.1%BSA及0.01%Tween 20者)稀釋為2μg/mL，於各加ECLDB10μL在各井的圓底盤中加入抗體溶液20μL、2次抗體溶液30μL，於遮光下於室溫攪拌1小時。從已裝有ECL Bloking緩衝液的ECM盤倒出ECL阻斷緩衝液，並於此盤各加50μL前述抗體・二次抗體之混合溶液。之後於遮光下於室溫靜置1小時。將樣本倒掉後，各加READ緩衝液(MSD)150μL於各井，以Sector Imager 2400(MSD)檢測sulfo-tag的發光信號。

[參考實施例3] 人IgA之製備 作為人IgA，使用天然存在的人IgA序列中的Fc部分(人IgA-Fc)。為了於人IgA-Fc之C末端附加生物素，利用生物素連接酶將編碼為附加生物素之專一性序列(AviTag序列、序列辨識號：79)的基因片段介由連結子連結。將編碼為已連結人IgA-Fc與AviTag序列的蛋白質(序列辨識號：80)的基因片段納入動物細胞表現用載體，將構建的質體載體使用293Fectin (Invitrogen)導入到FreeStyle293細胞(Invitrogen)。此時將表現EBNA1(序列辨識號：81)之基因及表現生物素連接酶(BirA、序列辨識號：82)的基因同時導入，進一步為了將人IgA-Fc進行生物素標記而添加生物素。將依前述程序導入有基因的細胞於37℃、8% CO ₂培養6日，使目的蛋白質分泌到培養上清中。 將含有目的之人IgA-Fc之細胞培養液以0.22μm瓶頂濾器過濾，獲得培養上清。於經20mM Tris-HCl, pH7.4平衡化的HiTrap Q HP(GEhealthcare)加入以同溶液稀釋的培養上清，利用NaCl之濃度梯度使目的之人IgA-Fc溶出。然後於經50mM Tris-HCl, pH8.0平衡化之SoftLink Avidin 管柱(Promega)加入以同溶液稀釋的前述HiTrap Q HP溶出液，以5mM生物素, 150mM NaCl, 50mM Tris-HCl, pH8.0使目的之人IgA-Fc溶出。之後，利用使用Superdex200(GEhealthcare)之凝膠過濾層析，去除係目的外雜質之締合體，獲得緩衝液取代成20mM Histidine-HCl, 150mM NaCl, pH6.0的精製人IgA-Fc。

[產業利用性] 依本發明可提供一種適於作為醫藥品之多肽，能使利用抗原結合分子產生之活性增強，而且可避免據認為成為副作用原因之由於向在不同的細胞上表現之抗原之結合導致之該不同的細胞間之交聯。

無。

第1圖係和第1抗原與第2抗原結合但不同時結合之抗體之概念圖。 第2圖係由於不和2個抗原同時結合，故不引起交聯之抗體之概念圖。 第3圖係即使和2個抗原同時結合，仍不同時和2個細胞結合之抗體之概念圖。 第4圖係將癌細胞、以及表現第1受體之T細胞交聯之抗體之概念圖。 第5圖係將癌細胞、以及表現第2受體之細胞交聯之抗體之概念圖。 第6圖係將癌細胞與免疫細胞交聯，但免疫細胞彼此不交聯之抗體之概念圖。 第7圖係CE115對CD3ε之細胞ELISA之結果。 第8圖係EGFR_ERY22_CE115之分子形式圖。 第9圖係EGFR_ERY22_CE115之TDCC結果(SK-pca13a)。 第10圖係顯示人化CE115對CD3ε之結合性。 第11圖係顯示檢測RGD插入CE115對於整合素(integrin)之結合之ECL-ELISA之結果。 第12圖係顯示檢測RGD插入CE115對於CD3ε之結合之ECL-ELISA之結果。 第13圖係顯示檢測RGD插入CE115對於整合素及CD3ε之同時結合之ECL-ELSIA之結果。顯示針對同時結合之改變體之結果。 第14圖係RGD插入CE115之同時結合ECL-ELISA之結果。顯示針對未同時結合之改變體之結果。 第15圖係檢測TLR2結合胜肽插入CE115對於TLR2之結合之ECL-ELISA之結果。 第16圖係檢測TLR2結合胜肽插入CE115對於CD3ε之結合之ECL-ELISA之結果。 第17圖係檢測TLR2結合胜肽插入CE115對於TLR2及CD3之同時結合之ECL-ELISA之結果。 第18圖係結合量之比未達0.8之抗體之感應圖之例。縱軸為RU值（回應）、橫軸為時間。 第19圖係噬菌體展示之Fab分域與CD3ε、IL6R之結合。 第20圖係噬菌體展示之Fab分域與CD3ε、人IgA(hIgA)之結合。NC代表對於未固定抗原之板之結合。 第21圖係IgG化之選殖體之與CD3ε、人IgA(hIgA)之結合。 第22圖係IgG化之選殖體與人IgA之結合因CD3ε而受阻斷，該選殖體無法和人IgA(hIgA)及CD3ε同時結合之圖。 第23圖係噬菌體展示之Fab分域與CD3ε、人CD154之結合。NC代表對於未固定抗原之板之結合。 第24圖係IgG化之選殖體與CD3ε、人CD154之結合。 第25圖係IgG化之選殖體和人CD154之結合因CD3ε而受阻斷，該選殖體無法和人CD154及CD3ε同時結合之圖。

Claims (7)

1. 一種抗原結合分子，包括能和不同之3個抗原(第1抗原、和該第1抗原為不同之第2抗原、及和該第1抗原及該第2抗原為不同之第4抗原)結合但不同時和該3個抗原結合之抗體之可變區，其中能和不同之3個抗原結合之抗體可變區係對能夠結合該第1抗原的模板序列導入至少1個胺基酸之改變的可變區，其中該第1抗原係CD3，且能夠結合該第1抗原結合的模板序列包括SEQ ID NO：13、52或59的胺基酸序列，其中該改變包括賦予與該第2抗原結合的至少1個胺基酸的第一插入以及賦予與該第4抗原結合的至少1個胺基酸的第二插入，其中該第一插入以及該第二插入被導入至選自抗體重鏈可變區之Kabat編號第71~74及95~102位的不同位置，其中該改變的胺基酸係選自位在抗體重鏈可變區之Kabat編號第71~74及95~102位的至少1個位置的胺基酸，且其中該第二抗原與該第四抗原分別選自由一TNF超級家族分子、IL6R、整合素αvβ3與IgA所組成之群組。
2. 如請求項1之抗原結合分子，更包括和與該3個抗原不同之第3抗原結合的可變區。
3. 如請求項1之抗原結合分子，其中，不同時和該3個抗原結合之該可變區，係不同時和在各不同之細胞上表現之第1抗原、第2抗原及第4抗原結合之可變區。
4. 如請求項1或2之抗原結合分子，更包括抗體之Fc區。
5. 如請求項4之抗原結合分子，其中，該Fc區對於FcγR之結合活性，比起天然型人IgG1抗體之Fc區對於FcγR之結合活性更低。
6. 如請求項2之抗原結合分子，其中，該第3抗原係在癌組織專 一性地表現之分子。
7. 一種醫藥組合物，包括如請求項1至6中任一項之抗原結合分子及醫學上可容許之擔體。