TW201938194A

TW201938194A - 包含結合cd3及cd137的改變的抗體可變區之抗原結合分子

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Publication number: TW201938194A
Application number: TW107143406A
Authority: TW
Inventors: 清水駿; 文何菽; 廣庭奈緒香; 櫻井実香; 宮崎太郎; 井川智之
Original assignee: 日商中外製藥股份有限公司
Priority date: 2017-12-05
Filing date: 2018-12-04
Publication date: 2019-10-01
Also published as: JP7357616B2; EP3720963A1; JP2021508441A; US20200377595A1; WO2019111871A1; JP2023138966A; US11952422B2; EP3720963A4

Abstract

提供可結合至CD3及CD137但不同時結合至CD3及CD137的抗原結合域及其使用方法。亦提供更有效率地獲得結合二種或更多種抗原的抗原結合域的方法。

Description

包含結合CD3及CD137的改變的抗體可變區之抗原結合分子

本發明關於結合至CD3及CD137 (4-1BB)的抗原結合分子及其使用方法。

由於在血漿中具有高的安定性且產生很少的不良反應，抗體已受到作為藥物之注目(Nat. Biotechnol. (2005) 23, 1073-1078(非專利文獻1)及Eur J Pharm Biopharm. (2005) 59(3), 389-396(非專利文獻2))。抗體不僅具有抗原結合功效及促效劑或拮抗劑功效，也誘發由效應子細胞媒介的細胞毒性活性(亦稱為效應子功能)，例如ADCC (antibody dependent cytotoxicity，抗體依賴性細胞毒性)、ADCP (antibody dependent cell phagocytosis，抗體依賴性細胞吞噬作用)、或CDC (complement dependent cytotoxicity，補體依賴性細胞毒性)。特別地，IgG1亞型的抗體顯現對癌細胞的效應子功能。因此，於癌領域中已開發了大量的抗體藥物。

為了發揮抗體的ADCC、ADCP或CDC，其Fc區必須結合至存在於效應子細胞(如NK細胞或巨噬細胞)的抗體受體(FcγR)及各種補體組成。人類中， FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa及FcγRIIIb同型異構物(isoform)已報導為FcγR的蛋白質家族，且也已報導其各自的同種異型體(allotype)(Immunol. Lett. (2002) 82, 57-65(非專利文獻3))。該等同型異構物中，FcγRIa、FcγRIIa及FcγRIIIa於其細胞內域中，具有稱為ITAM (immunoreceptor tyrosine-based activation motif，免疫受體酪胺酸活化基序)的域，其轉導活化信號。相對於此，僅有FcγRIIb，於其細胞內域中，具有稱為ITIM (immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，免疫受體酪胺酸抑制基序)的域，其轉導抑制信號。該等FcγR的同型異構物皆已知藉由免疫複合物或其類似物經由交聯以轉導信號(Nat. Rev. Immunol. (2008) 8, 34-47(非專利文獻4))。事實上，當抗體發揮效應子功能對抗癌細胞時，效應子細胞膜上的FcγR分子藉由結合至癌細胞的複數個抗體的Fc區而簇集，藉此經由效應子細胞轉導活化信號。因此，發揮殺細胞功效。此態樣中，FcγR的交聯侷限於接近癌細胞的效應子細胞，顯示免疫的活化係局部化(localize)於癌細胞(Ann. Rev. Immunol. (1988). 6. 251-81(非專利文獻5))。

天然發生的免疫球蛋白經由其可變區結合至抗原且經由其恆定區結合至如FcγR、FcRn、FcαR及FcεR的受體及補體。各分子的FcRn (與IgG Fc區交互作用的結合分子)於一對一連結(one-to-one connection)中結合至抗體的各重鏈。因此，二分子的FcRn據報導結合一個IgG型抗體分子。與FcRn等不同，FcγR與抗體鉸鏈區及CH2域交互作用，且僅有一分子的FcγR結合至一個IgG型抗體分子(J. Biol. Chem. (20001) 276, 16469-16477)。對於FcγR及抗體的Fc區之間的結合，已發現抗體的鉸鏈區及CH2域中的一些胺基酸殘基及CH2域之經加成至Asn297 (EU編號)的糖鏈是重要的(Chem. Immunol. (1997), 65, 88-110(非專利文獻6)，Eur. J. Immunol. (1993) 23, 1098-1104(非專利文獻7)，及Immunol. (1995) 86, 319-324(非專利文獻8))。具有多種FcγR結合性質的Fc區變體先前已藉由著眼於此結合位點被研究，以產生針對活化FcγR具有較高的結合活性的Fc區變體(WO2000/042072(專利文獻1)及WO2006/019447(專利文獻2))。例如，Lazar等人已藉由以Asn、Leu及Glu分別取代人類IgG的Ser239、Ala330及Ile332 (EU編號)，成功地增加人類IgG針對人類FcγRIIIa (V158)的結合活性達約370倍(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2006) 103, 4005-4010(非專利文獻9)及WO2006/019447(專利文獻2))。就FcγRIIIa對FcγIIb的比例(A/I比例)而言，此改變的形式具有野生型約9倍的活性。或者，Shinkawa等人已藉由刪除經加成至Asn297 (EU編號)的糖鏈的海藻糖(fucose)，成功地增加針對FcγRIIIa的結合活性達約100倍(J. Biol. Chem. (2003) 278, 3466-3473(非專利文獻10))。相較於天然發生的人類IgG1，此等方法可劇烈地改良人類IgG1的ADCC活性。

天然發生的IgG型抗體典型地經由其可變區(Fab)辨識及結合至一個抗原決定基，因此可結合至僅一個抗原。同時，許多類型的蛋白質已知參與癌或發炎，且該等蛋白質可彼此交叉作用(crosstalk)。例如，一些發炎細胞介素(TNF、IL1及IL6)已知參與免疫疾病(Nat. Biotech., (2011) 28, 502-10(非專利文獻11))。再者，已知其他受體的活化已知為癌獲得抗藥性的一個基礎機制(Endor Relat Vancer (2006) 13, 45-51(非專利文獻12))。該情況中，其辨識一個抗原決定基的一般抗體，不能抑制複數個蛋白質。

藉由一個分子結合二種或更多種類型抗原的抗體(該等抗體亦稱為雙特異性抗體)已作為抑制複數個靶的分子而被研究。針對二種不同抗原(第一抗原及第二抗原)的結合活性可藉由天然發生的IgG型抗體的修飾而賦予(mAbs. (2012) Mar 1, 4(2))。因此，該抗體不僅具有藉由一個分子中和該二種或更多種類型的抗原的功效，亦具有經由對癌細胞具有細胞毒性的細胞的交聯增強抗腫瘤活性的功效。具有加成至抗體的N或C終端的抗原結合位點的分子(DVD-Ig、TCB及scFv-IgG)、具有抗體的二種Fab區的不同序列的分子(共同L-鏈雙特異性抗體及雜合融合瘤)、一種Fab區辨識二種抗原的分子(二合一(two-in-one) IgG及DutaMab)及具有CH3域環作為另一種抗原結合位點(Fcab)的分子先前已經報導為雙特異性抗體分子形式(Nat. Rev. (2010), 10, 301-316(非專利文獻13)及Peds (2010), 23(4), 289-297(非專利文獻14))。由於任何該等雙特異性抗體於其Fc區與FcγR交互作用，於其中保留抗體效應子功能。

假使由雙特異性抗體辨識的所有抗原為特異性表現於癌的抗原，結合至任何該等抗原的雙特異性抗體顯現針對癌細胞的細胞毒性活性，因此可期望相較於辨識一種抗原的傳統抗體藥物具有更有效率的抗癌功效。然而，在藉由雙特異性抗體所辨識的任一種抗原係表現於正常組織或為表現於免疫細胞的細胞的情況中，由於與FcγR交聯，而發生對該正常組織的損傷或細胞介素的釋放(J. Immunol. (1999) Aug 1, 163(3), 1246-52(非專利文獻15))。因此，誘發嚴重的不良反應。

例如，卡妥索單抗(Catumaxomab)已知為辨識表現於T細胞的蛋白質及表現於癌細胞的蛋白質(癌抗原)的雙特異性抗體。卡妥索單抗分別於二種Fab結合癌抗原(EpCAM)及表現於T細胞的CH3ε鏈。卡妥索單抗經由同時結合至癌抗原及該CH3ε誘發T細胞媒介的細胞毒性活性，且經由同時結合至癌抗原及FcγR誘發NK細胞或抗原呈現細胞(例如，巨噬細胞)媒介的細胞毒性活性。藉由該二種細胞毒性活性的使用，卡妥索單抗藉由腹腔內投藥對惡性腹水顯現高的治療功效，因而已於歐洲核准(Cancer Treat Rev. (2010) Oct 36(6), 458-67(非專利文獻16))。此外，卡妥索單抗的投藥據報導於某些案例中產生癌細胞反應性抗體，展現出後天性免疫係經誘導(Future Oncol. (2012) Jan 8 (1), 73-85(非專利文獻17))。由此等結果，因為可期望強的抗腫瘤功效及後天性免疫的誘導，具有T-細胞媒介的細胞毒性活性及經由 FcγR藉由如NK細胞或巨噬細胞的細胞所引起的功效的這種抗體(該等抗體特別指稱三功能抗體)已受到注目。

然而，即使癌抗原不存在，該三功能抗體仍同時結合至CD3ε及FcγR，因此甚至於無癌細胞環境，交聯CD3ε表現T細胞至FcγR表現細胞，以大量地製造各種細胞介素。各種細胞介素的製造之這種癌抗原非依賴性誘導使目前的三功能抗體的投藥侷限於腹腔途徑(Cancer Treat Rev. 2010 Oct 36(6), 458-67(非專利文獻16))。因嚴重的類細胞介素風暴的不良反應，該三功能抗體非常難以全身性投藥(Cancer Immunol Immunother. 2007 Sep; 56(9): 1397-406 (非專利文獻18))。
傳統技術的雙特異性抗體能結合至雙抗原，亦即第一抗原癌抗原(EpCAM)及第二抗原CD3ε，同時結合至FcγR，因此考慮到其分子結構，不能規避藉由同時結合至FcγR及第二抗原CD3ε所引起的這種不良反應。
近年來，已藉由使用針對FcγR具有減低的結合活性的Fc區，而提供引起T細胞所媒介的細胞毒性活性且規避不良反應的修飾抗體(WO2012/073985)。
然而，考慮到其分子結構，甚至是這種抗體也未能於結合至癌抗原時作用於二種免疫受體，亦即CD3ε及FcγR。
以癌抗原特異性方式發揮T細胞所媒介的細胞毒性活性及T細胞以外的細胞所媒介的細胞毒性活性二者且規避不良反應的抗體目前尚屬未知。

T細胞於腫瘤免疫中扮演重要角色，且已知藉由二種信號活化: 1) T細胞受體(T cell receptor，TCR)對主要組織相容性複合物(major histocompatibility complex，MHC)第I型分子所呈現的抗原性肽的結合及TCR的活化；以及2) T細胞表面的共刺激分子對於抗原呈現細胞的配體的結合及共刺激分子的活化。再者，屬於腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)超級家族以及TNF受體超級家族的分子的活化，如於T細胞表面的CD137(4-1BB)，，已被描述為對於T細胞活化為重要的(Vinay, 2011, Cellular & Molecular Immunology, 8, 281-284 (非專利文獻19))。

CD137促效劑抗體已顯現出顯示抗腫瘤功效，且此已實驗性地顯示出主要因為CD8陽性T細胞及NK細胞的活化(Houot, 2009, Blood, 114, 3431-8(非專利文獻20))。亦了解經工程化以具有嵌合抗原受體分子的T細胞(CAR-T細胞) 可增強藥效持續性，前述嵌合抗原受體分子由作為細胞外域的腫瘤抗原結合域以及作為細胞內域的CD3及CD137信號轉導域所組成(Porter, N ENGL J MED, 2011, 365; 725-733(非專利文獻21))。然而，該等CD137促效劑抗體之起因於其等非特異性肝毒性的副作用於臨床上及非臨床上已成為問題，而醫藥劑的開發未有進展(Dubrot, Cancer Immunol. Immunother., 201028, 512-22 (非專利文獻22))。副作用的主因建議為涉及抗體經由抗體恆定域之對Fcγ受體的結合(Schabowsky, Vaccine, 2009, 28, 512-22 (非專利文獻23))。再者，已報導為了使靶定屬於TNF受體超級家族的受體之促效劑抗體發揮活體內促效劑活性，藉由Fcγ受體表現細胞(FcγRII表現細胞)的抗體交聯為必要的(Li, Proc Natl Acad Sci USA. 2013, 110(48), 19501-6 (非專利文獻24))。WO2015/156268(專利文獻3)描述了，具有含有CD137促效活性的結合域以及對腫瘤特異性抗原的結合域的雙特異性抗體可發揮CD137促效活性且僅於表現該腫瘤特異性抗原的細胞存在下活化免疫細胞，藉此可避免CD137促效抗體的肝毒性不良事件而保留抗體的抗腫瘤活性。WO2015/156268進一步描述抗腫瘤活性可進一步增強，且可藉由與具有含有CD3促效活性的結合域及對腫瘤特異性抗原的結合域的另一雙特異性抗體組合來使用此雙特異性抗體而避免該等不良事件。亦已經報導具有對CD137、CD3及腫瘤特異性抗原(EGFR)的三個結合域的三特異性抗體(WO2014/116846(專利文獻4))。然而，發揮藉由T細胞媒介的細胞毒性活性以及T細胞和其他免疫細胞經由CD137以癌抗原特異性方式的活化活性二者，同時規避不良反應的抗體目前尚屬未知。

使用庫以獲得對任何抗原的結合域的技術已為習知(Clackson et al., Nature 352: 624-628(1991)(非專利文獻25)；Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991)(非專利文獻26))。舉例而言，噬菌體展示、核糖體展示、mRNA展示、CIS展示、大腸桿菌展示、細胞展示、以及酵母菌展示已知為使用庫獲得結合域的技術(Nat Biotechnol. 1996 Mar; 14(3): 309-14 (非專利文獻27)；Nat Biotechnol. 2000 Dec; 18(12): 1287-92 (非專利文獻28)；Nucleic Acids Res. 2006; 34(19): e127 (非專利文獻29); Proc Natl Acad Sci USA. 2004 Mar 2; 101 (9): 2806-10 (非專利文獻30)；Proc Natl Acad Sci USA. 2004 June 22; 101 (25): 9193-8 (非專利文獻31)；Protein Eng Des Sel. 2008 Apr; 21(4): 247-55 (非專利文獻32)；Proc Natl Acad Sci USA. 2000 Sep 26; 97 (20): 10701-5 (非專利文獻33)；MAbs. 2010 Sep-Oct; 2(5): 508-18 (非專利文獻34)；及 Methods Mol Biol. 2012; 911: 183-98 (非專利文獻35))。

結合至二種不同抗原的結合域已以庫方法獲得(Bostrom et al., Science 323:1610-4 (2009)(非專利文獻36))。有一些報導之獲得結合至二種不同抗原的該等域的技術，如在不同淘選回合交替地使用不同抗原的方法，以及自藉由對第一抗原的結合域的隨機化所製得的庫先獲得對第一抗原的第一結合域，然後獲得對第二抗原的結合域的方法。然而，這些策略在回收第一抗原結合域之後需要基因擴增步驟，以擴增所回收的多核苷酸。

已報導其中依序施加二次對一抗原之選擇壓力而無擴增核酸的中間步驟的噬菌體展示庫方法，被稱為雙重回合選擇(Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226: 889-96 (1992)(非專利文獻37))。然而，沒有已知更有效率地藉由施加依序二次或更多次對二種或更多種不同抗原之選擇壓力，來收集對二種或更多種不同抗原的結合域的方法。
文獻列單
專利文獻

專利文獻1：WO2000/042072
專利文獻2：WO2006/019447
專利文獻3：WO2015/156268
專利文獻4：WO2014/116846
非專利文獻

非專利文獻1：Nat. Biotechnol. (2005) 23, 1073-1078
非專利文獻2：Eur J Pharm Biopharm. (2005) 59(3), 389-396
非專利文獻3：Immunol. Lett. (2002) 82, 57-65
非專利文獻4：Nat. Rev. Immunol. (2008) 8, 34-47
非專利文獻5：Ann. Rev. Immunol. (1988). 6. 251-81
非專利文獻6：Chem. Immunol. (1997), 65, 88-110
非專利文獻7：Eur. J. Immunol. (1993) 23, 1098-1104
非專利文獻8：Immunol. (1995) 86, 319-324
非專利文獻9：Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2006)103, 4005-4010
非專利文獻10：J. Biol. Chem. (2003) 278, 3466-3473
非專利文獻11：Nat. Biotech., (2011) 28, 502-10
非專利文獻12：Endocr Relat Cancer (2006) 13, 45-51
非專利文獻13：Nat. Rev. (2010), 10, 301-316
非專利文獻14：Peds (2010), 23(4), 289-297
非專利文獻15：J. Immunol. (1999) Aug 1, 163(3), 1246-52
非專利文獻16：Cancer Treat Rev. (2010) Oct 36(6), 458-67
非專利文獻17：Future Oncol. (2012) Jan 8(1), 73-85
非專利文獻18：Cancer Immunol Immunother. 2007 Sep; 56(9): 1397-406
非專利文獻19：Vinary, 2011, Cellular & Molecular Immunology, 8, 281-284
非專利文獻20：Houot, 2009, Blood, 114, 3431-8
非專利文獻21：Porter, N ENGL J MED, 2011, 365; 725-733
非專利文獻22：Dubrot, Cancer Immunol. Immunother., 2010, 28, 512-22
非專利文獻23：Schabowsky, Vaccine, 2009, 28, 512-22
非專利文獻24：Li, Proc Natl Acad Sci USA. 2013, 110(48), 19501-6
非專利文獻25：Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991)
非專利文獻26：Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991)
非專利文獻27：Nat Biotechnol. 1996 Mar; 14(3): 309-14
非專利文獻28：Nat Biotechnol. 2000 Dec; 18(12): 1287-92
非專利文獻29：Nucleic Acids Res. 2006; 34(9): e127
非專利文獻30：Proc Natl Acad Sci USA. 2004 Mar 2; 101(9): 2806-10
非專利文獻31：Proc Natl Acad Sci USA 2004 Jun 22; 101(25): 9193-8
非專利文獻32：Protein Eng Des Sel. 2008 Apr; 21(4): 247-55
非專利文獻33：Proc Natl Acad Sci USA. 2000 Sep 26; 97(20): 10701-5
非專利文獻34：MAbs. 2010 Sep-Oct; 2(5): 508-18
非專利文獻35：Methods Mol Biol. 2012; 911: 183-98
非專利文獻36：Bpstrom et al., Science 323: 1610-4 (2009)
非專利文獻37：Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226: 889-96 (1992)

[技術問題]

已報導包含腫瘤特異性抗原(EGFR)結合域、CD137結合域及CD3結合域的三特異性抗體(WO2014116846)。然而，由於具有這種分子格式的抗體可同時結合至三種不同抗原，本發明者們推測該等三特異性抗體可能藉由同時結合至CD3及CD137而造成CD3ε表現T細胞及CD137表現細胞(例如，T細胞、B細胞、NK細胞、DC等)之間的交聯。
再者，已報導因為抗體與其等交聯，所以針對CD8及CD3ε的雙特異性抗體在CD8陽性T細胞中誘發彼此的細胞毒性(Wong, Clin. Immunol. Immunopathol. 1991, 58(2), 236-250)。因此，本發明者們推測針對表現於T細胞的分子及CD3ε的雙特異性抗體也會在T細胞中誘發彼此的細胞毒性，因為其等將交聯表現該分子及CD3ε的細胞。

有一些之前報導過之取得結合至二種不同抗原的抗原域的技術以，如在不同淘選回合交替地使用不同抗原的方法，以及自藉由對第一抗原的結合域的隨機化所製得的庫先獲得對第一抗原的第一結合域，然後獲得對第二抗原的結合域的方法。然而，該等策略需要回收對第一抗原的結合域後，擴增所回收之編碼對第一抗原的結合域的核苷酸的步驟，以及進一步地回收亦可結合至第二抗原且擴增其核酸。本發明者們認為作為此步驟的結果，各淘選回合步驟最後將濃縮結合域，前述結合域相較於其他抗原，對於使用於其中的不同抗原之一者顯示較強的結合，且相較於對不同抗原各者顯示結合的結合域，更特異性地，因此將預防所期望分子免於有效率地回收。

應了解的是，於一些方法中，如可使用FACS(fluorescence activated cell sorting，螢光活化細胞篩選)用以選擇的細胞展示、酵母菌展示或細菌展示，可能同時施加對二或更多種不同抗原之二或更多種選擇壓力。然而，本發明者們認為在無法使用FACS之如噬菌體展示、核糖體展示、mRNA展示或CIS展示的方法中，難以同時施加對二或更多種不同抗原之二或更多種選擇壓力。
[問題的解決手段]

本發明提供結合至CD3及CD137的抗原結合域以及其使用方法。本發明亦提供更有效率地結合至二或更多種抗原的抗原結合域的獲得方法。

一些實施例中，本發明的抗原結合分子係包含能結合至CD3及CD137 (4-1BB)但不同時結合至CD3及CD137的抗體可變區，以及結合至不同於CD3及CD137的第三抗原的可變區的抗原結合分子。
一些實施例中，本發明的抗原結合分子係包含能結合至T細胞受體及CD137 (4-1BB)但不同時結合至T細胞受體及CD137的抗體可變區；以及結合至不同於T細胞受體及CD137的第三抗原的可變區的抗原結合分子。
一些實施例中，本發明的抗原-結合分子係包含能結合至CD3及CD137但不同時結合至CD3及CD137的抗體可變區，以及結合至特異性地表現於癌組織中的分子的可變區的抗原結合分子。

一些實施例中，本發明的抗原結合域係能結合至CD3及CD137但不同時結合至CD3及CD137的可變區。一些實施例中，本發明的抗體可變區係能結合至CD3及CD137但不同時結合至CD3及CD137的可變區。

一些實施例中，本發明亦提供不同時結合至CD3及CD137的抗原結合域，其為不同時結合至各表現於不同細胞的CD3及CD137的可變區。

一些實施例中，本發明的抗原結合分子包含抗體Fc區。另一些實施例中，本發明的抗原結合分子包含相較於天然發生的人類IgG1抗體的Fc區，針對FcγR具有減弱的結合活性的抗體Fc區。

一些實施例中，本發明的抗原結合分子具有選自下述(1)至(4)所組成的群組的至少一特徵：
(1) 可變區結合至包含序列編號: 91的胺基酸序列的CD3ε (epsilon)的細胞外域，
(2) 抗原結合分子具有針對CD137的促效活性，
(3) 抗原結合分子誘發T細胞針對表現第三抗原的分子的細胞的的CD3活化，但不誘發針對表現CD137的細胞的T細胞的活化，以及
(4) 抗原結合分子於表現第三抗原的分子的細胞不存在下，不誘發自PBMC的細胞介素釋放。

一些實施例中，本發明的抗原結合分子具有選自下述(1)至(2)所組成的群組的至少一特徵：
(1) 抗原結合分子不與CD137配體競爭對CD137的結合，以及
(2) 抗原結合分子誘發T細胞針對表現第三抗原的分子的細胞的細胞毒性，但不誘發針對表現CD137的細胞的T細胞的細胞毒性。

一些實施例中，本發明的抗原結合分子與選自下述所組成的群組的抗體競爭對CD137的結合：
(a) 包含具有序列編號: 30的胺基酸序列的VH序列以及具有序列編號: 51的胺基酸序列的VL序列的抗體，
(b) 包含具有序列編號: 46的胺基酸序列的VH序列以及具有序列編號: 53的胺基酸序列的VL序列的抗體，
(c) 包含具有序列編號: 40的胺基酸序列的VH序列以及具有序列編號: 56的胺基酸序列的VL序列的抗體，
(d) 包含具有序列編號: 30的胺基酸序列的VH序列以及具有序列編號: 58的胺基酸序列的VL序列的抗體，以及
(e) 包含具有序列編號: 40的胺基酸序列的VH序列以及具有序列編號: 61的胺基酸序列的VL序列的抗體。

一些實施例中，本發明的抗原結合分子包含由於序列編號: 92所述的重鏈可變域序列和/或序列編號: 93所述的輕鏈可變域序列所組成的模板序列中導入一或多個胺基酸的改變所造成的胺基酸序列，其中該一或多個胺基酸包含選自下述位置的至少一胺基酸：
H鏈：31、52b、52c、53、54、56、57、61、98、99、100、100a、100b、100c、100d、100e、100f及100g (Kabat編號)；以及
L鏈：24、25、26、27、27a、27b、27c、27e、30、31、33、34、51、52、53、54、55、56、74、77、89、90、92、93、94及96(Kabat編號)，
其中，經改變的重鏈可變域序列的HVR-H3包含選自下述的至少一胺基酸：
Ala、Pro、Ser、Arg、His或Thr於胺基酸位置98；
Ala、Ser、Thr、Gln、His或Leu於胺基酸位置99；
Tyr、Ala、Ser、Pro或Phe於胺基酸位置100；
Tyr、Val、Ser、Leu或Gly於胺基酸位置100a；
Asp、Ser、Thr、Leu、Gly或Tyr於胺基酸位置100b；
Val、Leu、Phe、Gly、His或Ala於胺基酸位置100c；
Leu、Phe、Ile或Tyr於胺基酸位置100d；
Gly、Pro、Tyr、Gln、Ser或Phe於胺基酸位置100e；
Tyr、Ala、Gly、Ser或Lys於胺基酸位置100f；
Gly、Tyr、Phe或Val於胺基酸位置100g (Kabat編號)。

一些實施例中，本發明的抗原結合分子包含(a) 與序列編號41、30、46或40的胺基酸序列具有至少95%序列同一性的VH序列；(b) 與序列編號: 51、52、53、54、55、56或57的胺基酸序列具有至少95%序列同一性的VL序列；或 (c) (a)的VH序列及(b)的VL序列。

一些實施例中，本發明的抗原結合分子係單株抗體。某些實施例中，本發明的抗原結合分子係人類抗體、人源化抗體或嵌合抗體。另一些實施例中，本發明的抗原結合分子係全長IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體。

本發明亦提供編號本發明的抗原結合分子的單離的核酸。本發明亦提供包含本發明的核酸的宿主細胞的。本發明亦提供製造抗體的方法，包含培養本發明的宿主細胞以製造該抗體。

本發明亦提供包含本發明的抗原結合分子以及醫藥上可接受的載劑的醫藥調配物。

本發明的抗原結合分子可使用作為藥物。本發明的抗原結合分子可用於治療各種類型的癌症的用途。
本發明的抗原結合分子可使用於製造藥物。一些實施例中，該藥物用於治療各種類型癌症。本發明亦提供治療具有各種類型癌症的個體的方法。一些實施例中，此方法包含對該個體投藥有效量之本發明的抗原結合分子。

本發明者們已成功地製備一種抗原結合分子，其包含：具有針對二個不同抗原(CD3及CD137)但不同時結合至該二抗原的結合活性的抗原可變區，以及結合至不同於該等抗原的抗原(第三抗原)的可變區，且已發現其造成藉由經由使用其針對該三種不同抗原的結合活性的抗原結合分子所誘發之增強活性。此外，本發明者們已成功地製備能規避不同細胞之間由傳統多特異性抗原結合分子對表現於不同細胞的抗原的結合所造成的交聯的抗原結合分子，認為當多特異性抗原結合分子使用作為藥物時，其有責於不良反應。

本發明者們已成功地開發出更有效地結合至二或更多不同抗原的抗原結合域的獲得方法。
一些實施例中，本發明之結合至至少兩種或更多種感興趣的不同抗原的抗原結合域的篩選方法包含：
(a) 提供包含複數個抗原結合域的庫，
(b) 將步驟(a)提供的庫與感興趣的第一抗原接觸且收集結合至該第一抗原的抗原結合域，
(c) 將步驟(b)所收集的抗原結合域與感興趣的第二抗原接觸且收集結合至該第二抗原的抗原結合域，以及
(d) 擴增編碼步驟(c)所收集的抗原結合域的基因且鑑定候選抗原結合域，
其中該方法不包含在步驟(b)及步驟(c)之間，擴增編碼步驟(b)所收集的抗原-結合域的核酸。

一些實施例中，本發明的抗原結合域為Fab、scFv、Fab’2、VHH、VH或VL。
一些實施例中，本發明的抗原結合域係融合多肽，其藉由融合抗原結合域與支架以交聯抗原結合域與編碼該抗原結合域的核酸而形成。

一些實施例中，本發明的支架為噬菌體。一些實施例中，本發明的支架為核糖體、RepA蛋白質或DNA嘌呤黴素連接子。

一些實施例中，使用為酸性溶液、鹼性溶液、DTT或IdeS的沖提溶液，於上述步驟(b)及(c)中進行沖提。
一些實施例中，本發明上述步驟(b)及(c)中使用的沖提溶液為EDTA或IdeS。

一些實施例中，本發明之結合至至少二種或更多種感興趣之不同抗原的抗原結合域的篩選方法，包含：
(a) 提供包含複數個抗原結合域的庫，
(b) 將步驟(a)提供的庫與感興趣的第一抗原接觸且收集結合至該第一抗原的抗原結合域，
(b)’ 轉譯編碼步驟(b)中所收集的抗原結合域的核酸，
(c) 將步驟(b)所收集的抗原結合域與感興趣的第二抗原接觸且收集結合至該第二抗原的抗原結合域，以及
(d) 擴增編碼步驟(c)所收集的抗原結合域的基因且鑑定候選抗原結合域，
其中該方法不包含在步驟(b)及步驟(c)之間，擴增編碼步驟(b)所收集的抗原-結合域的核酸。

一些實施例中，本發明之結合至至少二或更多種感興趣之不同抗原的抗原結合域的製造方法，包含：
(a) 提供包含複數個抗原結合域的庫，
(b) 將步驟(a)提供的庫與感興趣的第一抗原接觸且收集結合至該第一抗原的抗原結合域，
(c) 將步驟(b)所收集的抗原結合域與感興趣的第二抗原接觸且收集結合至該第二抗原的抗原結合域，以及
(d) 擴增編碼步驟(c)所收集的抗原結合域的基因且鑑定候選的抗原結合域，
(e) 將編碼步驟(d)中所選擇之候選抗原結合域的多核苷酸與編碼包含Fc區多肽的多核苷酸連接，
(f) 培養經導入載體的細胞，該載體中上述步驟(d)所獲得的多核苷酸係經可操作地連結，以及
(g) 自上述步驟(f)所培養的細胞的培養溶液收集抗原結合分子，
其中該方法不包含在步驟(b)及步驟(c)之間，擴增編碼步驟(b)所收集的抗原結合域的核酸。

一些實施例中，本發明之步驟(a)中所提供的庫為設計庫。

一些實施例中，本發明的抗原結合分子係藉由上述方法所製備的抗體。

更具體地，本發明關於下述者：
[1] 一種抗原結合分子，包含：
能結合至CD3及CD137，但不同時結合至CD3及CD137的抗體可變區；以及結合至不同於CD3及CD137的第三抗原的可變區。
[2] 如[1]之抗原結合分子，其中該第三抗原為特異性地表現於癌組織的分子。
[3] 如[1]或[2]之抗原結合分子，其中該不同時結合CD3及CD137的可變區為不同時結合至各自表現於不同細胞的CD3及CD137。
[4] 如[1]至[3]中任一項之抗原結合分子，更包含抗體Fc區。
[5] 如[4]之抗原結合分子，其中該Fc區為相較於天然發生的人類IgG1抗體的Fc區，針對FcγR具有減低的結合活性的Fc區。
[6] 如[1]至[5]中任一項之抗原結合分子，其中，該抗原結合分子具有選自下述(1)至(4)所組成的群組的至少一特徵：
(1) 該可變區結合至包含序列編號: 91的胺基酸序列的CD3ε (epsilon)的細胞外域，
(2) 該抗原結合分子具有針對CD137的促效活性，
(3) 該抗原結合分子誘發T細胞針對表現第三抗原的分子的細胞的CD3活化，但不誘發針對表現CD137的細胞的T細胞的CD3活化，以及
(4) 該抗原結合分子在表現第三抗原的分子的細胞不存在下，不誘發自PBMC的細胞介素釋放。
[7] 如[1]至[6]中任一項之抗原-結合分子，其與選自下述所成群組之抗體競爭對CD137的結合：
(a) 包含具有序列編號: 30的胺基酸序列的VH序列以及具有序列編號: 51的胺基酸序列的VL序列的抗體，
(b) 包含具有序列編號: 46的胺基酸序列的VH序列以及具有序列編號: 53的胺基酸序列的VL序列的抗體，
(c) 包含具有序列編號: 40的胺基酸序列的VH序列以及具有序列編號: 56的胺基酸序列的VL序列的抗體，
(d) 包含具有序列編號: 30的胺基酸序列的VH序列以及具有序列編號: 58的胺基酸序列的VL序列的抗體，以及
(e) 包含具有序列編號: 40的胺基酸序列的VH序列以及具有序列編號: 61的胺基酸序列的VL序列的抗體。
[8] 如[1]至[7]中任一項之抗原結合分子，包含於序列編號: 92所述的重鏈可變域序列和/或序列編號: 93所述的輕鏈可變域序列所組成的模板序列中導入一或多個胺基酸的改變所造成的胺基酸序列，其中該一或多個胺基酸包含選自下述位置的至少一胺基酸：
H鏈：31、52b、53、54、56、57、61、98、99、100、100a、100b、100c、100d、100e、100f及100g (Kabat編號)；以及
L鏈：24、25、26、27、27a、27b、27c、27e、30、31、33、34、51、52、53、54、55、56、74、77、89、90、92、93、94及96 (Kabat編號)，
其中該經改變的重鏈域序列的HVR-H3包含選自下述之至少一胺基酸：
Ala、Pro、Ser、Arg、His或Thr於胺基酸位置98；
Ala、Ser、Thr、Gln、His或Leu於胺基酸位置99；
Tyr、Ala、Ser、Pro或Phe於胺基酸位置100；
Tyr、Val、Ser、Leu或Gly於胺基酸位置100a；
Asp、Ser、Thr、Leu、Gly或Tyr於胺基酸位置100b；
Val、Leu、Phe、Gly、His或Ala於胺基酸位置100c；
Leu、Phe、Ile或Tyr於胺基酸位置100d；
Gly、Pro、Tyr、Gln、Ser或Phe於胺基酸位置100e；
Tyr、Ala、Gly、Ser或Lys於胺基酸位置100f；
Gly、Tyr、Phe或Val於胺基酸位置100g (Kabat編號)。
[9] 如[1]至[8]中任一項之抗原結合分子，包含(a) 與序列編號41、30、46或40的胺基酸序列具有至少95%序列同一性的VH序列；(b) 與序列編號: 51、52、53、54、55、56或57的胺基酸序列具有至少95%序列同一性的VL序列；或 (c) (a)的VH序列及(b)的VL序列。
[10] 一種醫藥組成物，包含[1]至[9]中任一項之抗原結合分子以及醫藥上可接受的載劑。
[11] 一種結合至少二或更多種感興趣的不同抗原的抗原結合域的篩選方法，包含：
(a) 提供包含複數個抗原-結合域的庫，
(b) 將步驟(a)提供的庫與感興趣的第一抗原接觸且收集結合至該第一抗原的抗原結合域，
(c) 將步驟(b)所收集的抗原-結合域與感興趣的第二抗原接觸且收集結合至該第二抗原的抗原結合域，以及
(d) 擴增編碼步驟(c)所收集的抗原結合域的基因且鑑定候選抗原結合域，
其中該方法不包含在步驟(b)及步驟(c)之間，擴增編碼步驟(b)所收集的抗原結合域的核酸。
[12] 如[11]的方法，其中該抗原結合域係融合多肽，其藉由融合抗原結合域與支架以交聯抗原結合域與編碼該抗原結合域的核酸而形成。
[13] 如[12]的方法，其中該支架為噬菌體。
[14] 如[12]的方法，更包含於步驟(b)及(c)之間，包含轉譯編碼步驟(b)所收集的抗原結合域的核酸的步驟。
[15] 如[12]或[14]的方法，其中該支架為核糖體、RepA蛋白質或DNA嘌呤黴素連接子。

一態樣中，本發明的抗原結合分子為包含可結合至CD3及CD137 (4-1BB)但不同時結合至CD3及CD137的抗體可變區，以及結合至不同於CD3及CD137的第三抗原的可變區的抗原結合分子。
一態樣中，本發明抗原結合分子為包含可結合至T細胞受體及CD137 (4-1BB)但不同時結合至T細胞受體及CD137的抗體可變區，以及結合至不同於T細胞受體及CD137的第三抗原的可變區的抗原結合分子。
一態樣中，本發明的抗原結合分子為包含可結合至CD3及CD137但不同時結合至CD3及CD137的抗體可變區，以及結合至特異性地表現於癌組織的分子的可變區。

一態樣中，本發明的抗原結合域為可結合至CD3及CD137但不同時結合至CD3及CD137的可變區。一態樣中，本發明的抗體可變區為可結合至CD3及CD137但不同時結合至CD3及CD137的可變區。

一些實施例中，本發明的抗原結合分子可藉由其對CD3的促效活性來活化T細胞，且其可誘發針對靶細胞之T細胞的細胞毒性，且藉由其對CD137及CD3的共刺激促效活性來強化T細胞活化、生存以及分化為記憶T細胞。同時，因為其不同時結合至CD3及CD137，本發明的抗原結合分子可避免由CD137及CD3的交聯所引起的不良事件。

一些實施例中，本發明的抗原結合分子亦可藉由對CD137的促效活性，來活化表現CD137的免疫細胞並強化對靶細胞的免疫回應。

本發明中，「抗體可變區」通常意指包含由四個框架區(framework region，FR)以及被其側接(flank)的三個互補決定區(complementarity-determining region，CDR)所構成的域的區，且亦包括其部分序列，只要該部分序列具有結合至部分抗原或全抗原的活性。特別地，較佳的是包含抗體輕鏈可變域(VL)及抗體重鏈可變域(VH)的區。本發明的抗體可變區可具有任意序列且可為衍生自任何抗體的可變區，如小鼠抗體、大鼠抗體、兔抗體、山羊抗體、駱駝抗體以及藉由該等非人類抗體的人源化所獲得的人源化抗體，以及人類抗體。「人源化抗體」，也稱為重塑(reshaped)人類抗體，係藉由將例如小鼠抗體之非人類哺乳動物-衍生的抗體的互補決定區(complementarity-determining region，CDR)接枝至人類抗體CDR所獲得。鑑定CDR的方法為所屬技術領域習知的(Kabat et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest (1987), National Institute of Health, Bethesda, Md; and Chothia et al., Nature (1989) 342: 877)。前述的一般基因重組方案亦已為所屬技術領域習知(參照歐洲專利公開案 EP 125023及WO 96/02576)。

本發明的「不同時結合至CD3及CD137(4-1BB)」的「抗體可變區」意指本發明的抗體可變區無法在與CD3結合的狀態中結合CD137，反之該可變區無法在與CD137結合的狀態中結合CD3。此全文中，用語「不同時結合至CD3及CD137」亦包括將表現CD3的細胞交聯至表現CD137的細胞，或不同時結合至各表現於不同細胞的CD3及CD137。此用語更包括當CD3及CD137不表現於細胞膜，和可溶性蛋白質一樣，或二者皆位於相同細胞時，可變區可同時結合至CD3及CD137二者，但無法同時結合至CD3及CD137各表現於不同細胞的情況。這種抗體可變區不特別限制，只要該抗體可變區具有該等功能。其範例可包括藉由改變其部分胺基酸以結合至所期望抗原之衍生自IgG-型抗體可變區的可變區。欲改變的胺基酸係選自於結合至CD3或CD137的抗體可變區中，例如其改變不取消對抗原的結合的胺基酸。
此全文中，用語「表現於不同細胞」僅意指抗原表現於分開的細胞。這種細胞的組合可為，例如相同類型的細胞，如T細胞與另一T細胞，或可為不同類型的細胞，如T細胞與NK細胞。

本發明中，可單獨使用一個胺基酸改變，或可組合使用複數個胺基酸改變。
於組合使用複數個胺基酸改變的情況中，欲組合的改變數不特別限定且可適宜地設定於可實現本發明目的的範圍內。欲組合的改變數為，例如2或更多以及30或更少，較佳為2或更多以及25或更少、2或更多以及22或更少、2或更多以及20或更少、2或更多以及15或更少、2或更多以及10或更少、2或更多以及5或更少、或2或更多以及3或更少。
欲組合的複數個胺基酸改變可僅加成於抗體重鏈可變域或輕鏈可變域或可合適地分布於重鏈可變域及輕鏈可變域二者。

可變區中一或多個胺基酸殘基可接受作為欲改變的胺基酸殘基，只要抗原結合活性受到維持。在改變可變區中的胺基酸的情況中，所得的可變區較佳地維持對應的未經改變抗體的結合活性，且較佳地具有，例如改變前的結合活性的50%或更高、更佳地80%或更高，再更佳地100%或更高，但根據本發明的可變區不限定於此。可藉由胺基酸改變增加結合活性，且可為改變前的結合活性的例如2倍、5倍或10倍。

對於胺基酸改變較佳的區的範例包括可變區中的溶劑暴露區及環。其中，較佳為CDR1、CDR2、CDR3、FR3及環。具體地，較佳為H鏈可變域中的Kabat編號位置31至35、50至65、71至74及95至102以及L鏈可變域中的Kabat編號位置24至34、50至56及89至97。更佳為H鏈可變域中的Kabat編號位置31、52a至61、71至74及97至101以及L鏈可變域中Kabat編號位置24至34、51至56及89至96。再者，於胺基酸改變的同時可進一步導入增加抗原結合活性的胺基酸。

本文所使用的詞語「高度可變區(hypervariable region)」或「HVR」意指其係於序列中為高度可變(「互補性決定區(complementarity determining region)」或「CDR」)及/或形成結構性定義環(「高度可變環」)及/或含有抗原接觸殘基(「抗原接觸物(antigen contact)」)的抗體可變域的區。一般而言，抗體包含6個HVR：3個於VH (H1、H2、H3)以及3個於VL (L1、L2、L3)。
本文中例示性HVR包括：
(a) 發生於胺基酸殘基26至32 (L1)、50至52 (L2)、91至96 (L3)、26至32 (H1)、53至55 (H2)及96至101 (H3)的高度可變環(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987))；
(b) 發生於胺基酸殘基24至34 (L1)、50至56 (L2)、89至97 (L3)、31至35b (H1)、50至65 (H2)及95至102 (H3)的CDR(Kabat et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest, 5^th Ed. Public Health Service, National of Health, Bethesda, MD (1991))；
(c) 發生於胺基酸殘基27c至36 (L1)、46至55 (L2)、89至96 (L3)、30至35b (H1)、47至58 (H2)及93至101 (H3)的抗原接觸物(MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996))；
(d) (a)、(b)及/或(c)的組合，包括HVR胺基酸殘基46至56 (L2)、47至56 (L2)、48至56 (L2)、49至56 (L2)、26至35 (H1)、26至35b (H1)、49至65 (H2)、93至102 (H3)及94至102 (H3)。
除非特別指明，本文中，可變域中的HVR殘基及其他殘基(例如，FR殘基)，係根據Kabat et al.編號，如前文。

本發明中，「環」意指含有不涉及維持免疫球蛋白β桶形結構的殘基的區。
本發明中，胺基酸改變意指取代、刪除、加成、插入或修飾、或其組合。本發明中，胺基酸改變可與胺基酸突變交換使用且以其相同意義使用。

胺基酸殘基的取代係藉由以另一胺基酸殘基置換來改變，例如下述(a)至(c)：(a) 具有平板結構或螺旋結構的區的多肽骨架結構；(b) 靶位點的電荷或疏水性；以及(c) 側鏈的尺寸。
根據通常的側鏈性質，將胺基酸殘基分類為下述群組：(1) 疏水性殘基：正白胺酸(norleucine)、Met、Ala、Val、Leu及Ile；(2) 中性親水性殘基：Cys、Ser、Thr、Asn及Gln；(3) 酸性殘基：Asp及Glu；(4) 鹼性殘基：His、Lys及Arg；(5) 影響鏈方向的殘基：Gly及Pro；以及(6) 芳族殘基：Trp、Tyr及Phe。

各該群組內胺基酸殘基的取代係稱為保守性取代，而一群組的胺基酸殘基藉由另一群組的胺基酸殘基的取代係稱為非保守性取代。
根據本發明的取代可為保守性取代或可為非保守性取代。或者，可組合保守性取代及非保守性取代。

胺基酸殘基的改變亦包括：自藉由其改變不取消對抗原的結合的胺基酸的隨機改變所獲得者，於結合至CD3或CD137的抗體可變區中，選擇可結合至CD3及CD137但無法同時結合至該等抗原的可變區；以及將先前已知具有針對所期望抗原的結合活性的肽插入至上述區。

本發明的抗體可變區中，上述改變可與所屬技術領域習知的改變組合。例如，可變區的N-終端麩醯胺(glutamine)藉由焦麩醯胺化(pyroglutamylation)為焦麩胺酸的修飾係所述技術領域中具有通常知識者習知的修飾。因此，本發明之於其重鏈的N終端具有麩醯胺的抗體可含有具有此N-終端麩醯胺被修飾為焦麩胺酸的可變區。

這種抗體可變區可進一步具有改良，例如抗原結合、藥物動力學、安定性或抗原性的胺基酸改變。可改變本發明的抗體可變區，以具有針對抗原的pH依賴性結合活性，藉此可重複地結合至抗原(WO2009/125825)。

再者，根據靶組織-特異性化合物濃度來改變抗原-結合活性的胺基酸改變可加成至例如這種結合至第三抗原的抗體可變區(WO2013/180200)。

可變區可進一步被改變，以例如增強結合活性、改良特異性、減低pI、賦予pH依賴性抗原結合性質、改良結合的熱安定性、改良可溶性、改良針對化學修飾的安定性、改良衍生自糖鏈的異質性、避免藉由使用用以減低免疫原性之電腦(in silico )預測或活體外(in vitro )基於T細胞的測定所鑑定的T細胞抗原決定基、或導入T細胞抗原決定基用以活化調節T細胞(regulatory T cell)(mAbs 3: 243-247, 2011)。

本發明的抗體可變區是否「可結合至CD3及CD137」，可藉由所屬技術領域習知的方法來決定。
此可藉由，例如電化學發光方法(electrochemiluminescence method，ECL 方法)來決定(BMC Research Notes 2011, 4: 281)。
具體地，例如，由可結合至CD3及CD137的區，例如欲測試的生物素標記抗原結合分子或其單價抗體(缺乏由一般抗體所帶有的二個Fab區之一者的抗體)的Fab區所構成的低分子抗體與以硫標籤(釕複合物)標記的CD3或CD137混合，且該混合物添加至鏈黴素-固定化盤。此操作中，欲測試的生物素標記抗原結合分子結合至盤中的鏈黴素。由硫標籤發展出光，且可使用Sector Imager 600或2400(MSD K.K.)等偵測發光(luminescence)信號，以藉此確認前述欲測試的抗原-結合分子的區對CD3或CD137的結合。
替代地，可藉由ELISA、FACS (fluorescence activated cell sorting，螢光活化細胞分類)、ALPHAScreen (amplified luminescent proximity homogeneous assay screen，放大發光近似均質測定篩選)、基於表面電漿共振(surface plasmon resonance，SPR)現象的BIACORE方法等(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006)103 (11), 4005-4010)來進行此測定。

具體地，可使用例如基於表面電漿共振(SPR)現象的交互分析儀Biacore (GE Health Japan Corp.)來進行此測定。Biacore分析儀包括任何型號如Biacore T100、T200、X100、A100、4000、3000、2000、1000或C。用於Biacore的任何感測晶片，如CM7、CM5、CM4、CM3、C1、SA、NTA、L1、HPA或Au晶片皆可使用作為感測晶片。用於捕捉本發明的抗原結合分子的蛋白質，如蛋白質A、蛋白質G、蛋白質L、抗人類IgG抗體、抗人類IgG-Fab、抗人類L鏈抗體、抗人類Fc抗體、抗原性蛋白質或抗原性肽，係藉由如胺偶合、雙硫偶合或醛偶合之偶合方法固定化至感測晶片。CD3或CD137係注射於其上作為分析物，以及測定該交互作用以獲得感測圖。此操作中，CD3或CD137的濃度可根據測定樣品的交互作用強度(例如，KD)於數μM至數pM的範圍內選擇。

或者，CD3或CD137可取代抗原結合分子而固定化至感測晶片，欲評估的抗體樣品反過來允許與其交互作用。本發明的抗原結合分子的抗體可變區是否具有針對CD3或CD137的結合活性，可基於由該交互作用的感測圖所計算的解離常數(KD)或基於抗原結合分子樣品作用後相較於作用前的層級之感測圖中增加的程度而予以證實。

藉由使用二種珠粒(捐贈者及接受者)的ALPHA技術基於下述準則來實施ALPHAScreen方法：僅當經由與捐贈者珠粒結合的分子以及與接受者珠粒結合的分子之間的交互作用，而使該二珠粒位於接近時，偵測到發光信號。捐贈者珠粒中的雷射-激發感光劑將環境氧轉換為具激發態的單態氧(singlet oxygen)。單態氧圍繞捐贈者珠粒擴散且觸及位於接近的接受者珠粒，以藉此於珠粒中引起化學發光，其最終發射光。在與捐贈者珠粒結合的分子以及與接受者珠粒結合的分子之間的交互作用不存在時，由捐贈者珠粒所產生的單態氧不觸及接受者珠粒。因此，無化學發光反應發生。

在欲觀察其之間交互作用的物質之一者(配體)係固定化至感測晶片的薄金膜。由背部以光照射感測晶片，使得該薄金膜及玻璃之間的界面發生全反射。因此，反射強度(SPR信號)下降的位點形成於反射光的一部分。在欲觀察其之間交互作用的物質之另一者(分析物)係注射至該感測晶片的表面。一旦分析物結合至配體，經固定化之配體分子的質量增加，改變感測晶片表面上的溶劑的折射率。此折射率的變化偏移SPR的位置(相對於此，已結合的分子的解離使信號回至原始位置)。Biacore系統於偏移量的軸作圖，亦即感測晶片表面的質量變化，且展示時間依賴性的質量變化作為測定數據(感測圖)。經捕捉於感測晶片表面之已結合至配體的分析物的量(於分析物的交互作用之前與之後之間感測圖的回應變化量)可由感測圖決定。然而，由於結合量亦取決於配體量，比較必須於所使用的配體量為實質相同的條件下進行。可由感測圖曲線決定動力學，亦即締合速率常數(ka)與解離速率常數(kd)，而可由該等常數之間的比例決定親和性(KD)。抑制測定也較佳地使用於BIACORE方法。抑制測定的範例描述於Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103(11), 4005-4010。

可藉由下述來證實本發明之抗原結合分子是否「不同時結合至CD3及CD137」：證實抗原-結合分子具有針對CD3及CD137二者的結合活性；然後使CD3或CD137預先結合至包含具有此結合活性的可變區的抗原結合分子；以及然後藉由上述方法決定其存在或不存在針對另一者的結合活性。或者，此亦可藉由決定抗原結合分子對固定化至ELISA盤或感測晶片的CD3或CD137的結合，是否藉由另一者添加至溶液受到抑制而證實。一些實施例中，本發明之抗原結合分子對CD3或CD137的結合係藉由抗原結合分子對另一者的結合而受到抑制至少50%、較佳60%或更多、更佳70%或更多、更佳80%或更多、再佳90%或更多、或甚至更佳95%或更多。

一態樣中，當一抗原(例如，CD3)被固定化，抗原結合分子對CD3的結合的抑制可於另一抗原(例如，CD137)的存在下，藉由所屬技術領域習知的方法(亦即，ELISA、BIACORE等)予以決定。另一態樣中，當CD137被固定化，抗原結合分子對CD137的結合的抑制亦可於CD3的存在下予以決定。當進行上述二態樣之任一者時，本發明的抗原結合分子係決定為不同時結合至CD3及CD137，若結合受到抑制至少50%、較佳60%或更多、更佳70%或更多、更佳80%或更多、再佳90%或更多、或甚至更佳95%或更多。
一些實施例中，注射作為分析物的抗原濃度高於經固定之另一抗原濃度至少1倍、2倍、5倍、10倍、30倍、50倍或100倍。
較佳方式中，注射作為分析物的抗原濃度為高於欲固定之另一抗原濃度100倍且結合受到抑制至少80%。
一實施例中，計算抗原結合分子的CD3(分析物)結合活性與抗原結合分子的CD137(經固定化)結合活性的KD值的比例(KD(CD3)/KD(CD137)，且為KD值的比例(KD(CD3)/KD(CD137)的10倍、50倍、100倍或200倍之高於CD137(經固定化)濃度的CD3(分析物)濃度可使用於上述競爭測量。(例如，當KD值的比例為0.1時，可選擇高於1倍、10倍或20倍的濃度。再者，當KD值比例為10時，可選擇高於100倍、500倍、1000倍或2000倍的濃度。)

一態樣中，當一抗原(例如，CD3)被固定化，抗原結合分子對CD3的結合信號的衰減可於另一抗原(例如，CD137)的存在下，藉由所屬技術領域習知的方法(亦即，ELISA、ECL等)來決定。另一態樣中，當CD137被固定化，抗原結合分子對CD137的結合信號的衰減亦可於CD3的存在下來決定。當進行上述二態樣之任一者時，本發明的抗原結合分子係決定為不同時結合至CD3及CD137，若結合信號衰減至少50%、較佳60%或更多、更佳70%或更多、更佳80%或更多、再佳90%或更多、或甚至更佳95%或更多(參照實施例5-5、7-5、8-9、9-4)。
一些實施例中，注射作為分析物的抗原濃度高於經固定之另一抗原濃度至少1倍、2倍、5倍、10倍、30倍、50倍或100倍。
較佳方式中，注射作為分析物的抗原濃度為高於欲固定之另一抗原濃度100-倍且結合受到抑制至少80%。
一實施例中，計算抗原-結合分子的CD3(分析物)結合活性與抗原結合分子的CD137(經固定化)結合活性的KD值的比例(KD(CD3)/KD(CD137)，且為KD值的比例(KD(CD3)/KD(CD137)的10倍、50倍、100倍或200倍之高於CD137(經固定化)濃度的CD3(分析物)濃度可使用於上述競爭測量。(例如，當KD值的比例為0.1時，可選擇高於1倍、10倍或20倍的濃度。再者，當KD值比例為10時，可選擇高於100倍、500倍、1000倍或2000倍的濃度。)

具體地，例如在使用ECL方法的情況中，製備欲測試的生物素標記抗原結合分子、以硫-標籤(釕複合物)標記的CD3以及未標記的CD137。當欲測試的抗原-結合分子可結合至CD3及CD137，但不同時結合至CD3及CD137時，藉由添加欲測試的抗原結合分子及經標記的CD3的混合物至鏈黴素固定化盤，接著顯光而於未標記CD137的不存在下偵測該硫-標籤的發光信號。相對地，於未標記CD137的存在下，該發光信號降低。可將此發光信號的降低定量以決定相對結合活性。可使用經標記的CD137及未標記的CD3類似地進行此分析。

於ALPHAScreen的情況下，於競爭CD137不存在下，欲測試的抗原結合分子與CD3交互作用以產生520至620nm的信號。未標籤的CD137與CD3競爭與欲測試的抗原-結合分子的交互作用。可將競爭結果所引起的螢光減低定量，以藉此決定相對結合活性。使用硫-NHS-生物素等的多肽生物素化已知於所屬技術領域。可藉由合適地採用的方法以GST來標籤CD3，例如涉及：使框架中編碼CD3的多肽與編碼GST的多肽融合；以及使所得融合基因藉由帶有能表現其之載體的細胞等予以表現，接著使用穀胱甘肽(glutathione)管柱純化。較佳地使用，例如適用於基於非線性迴歸分析之一位點競爭模型的軟體GRAPHPAD PRISM (GraphPad Software, Inc., San Diego)，來分析所得信號。可使用標籤的CD137及未標籤的CD3類似地進行此分析。
替代地，可使用用螢光共振能量轉移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)的方法。FRET為激發能量藉由電子共振於位於接近的兩個螢光分子之間直接地轉移的現象。當FRET發生時，捐贈者(具有激發態的螢光分子)的激發能量轉移至接受者(位於靠近捐贈者的另一螢光分子)，使得由捐贈者發射的螢光消失(精確而言，螢光的壽命縮短)，且相反地，由接受者發射螢光。藉由使用此現象，可分析是否同時結合至CD3及CD137。例如，當帶有螢光捐贈者的CD3及帶有螢光接受者的CD137同時結合至欲測試的抗原結合分子時，捐贈者的螢光消失而由接受者發射螢光。因此，觀察到螢光波長的變化。這種抗體被證實同時結合至CD3及CD137。另一方面，若CD3、CD137及欲測試的抗原-結合分子的混合物不改變與CD3結合的螢光捐贈者的螢光波長，可認為此欲測試的抗原結合分子為可結合至CD3及CD137，但不同時結合至CD3及CD137的抗原結合域。

例如，允許欲測試的生物素標記抗原結合分子結合至捐贈者珠粒的鏈黴素，而以穀胱甘肽 S 轉移酶(glutathione S transferase，GST)標籤的CD3係允許結合至接受者珠粒。於競爭第二抗原的不存在下，欲測試的抗原結合分子與CD3交互作用以產生520至620nm的信號。未標籤的第二抗原與CD3競爭與欲測試的抗原結合分子的交互作用。可將競爭結果所引起的螢光減低定量，以藉此決定相對結合活性。使用硫-NHS-生物素等的多肽生物素化已知於所屬技術領域。可藉由適當採用的方法以GST來標籤CD3，例如，涉及：使框架中編碼CD3的多核苷酸與編碼GST的多核苷酸融合；以及使所得融合基因藉由帶有能表現其之載體的細胞等予以表現，接著使用穀胱甘肽管柱純化。較佳地使用，例如適用於基於非線性迴歸分析之一位點競爭模型的軟體GRAPHPAD PRISM (GraphPad Software, Inc., San Diego)，來分析所得信號。

加標籤不限定於GST標籤且可以任何標籤進行，例如但不限於組胺酸標籤、MBP、CBP、Flag標籤、HA標籤、V5標籤或c-myc標籤。欲測試的抗原結合分子對捐贈者珠粒的結合不限於使用生物素-鏈黴素反應的結合。特別地，當欲測試的抗原結合分子包含Fc時，可能的方法涉及允許欲測試的抗原結合分子經由Fc辨識蛋白質，如捐贈者珠粒的蛋白質A或蛋白質G，而結合。

再者，當CD3及CD137不表現於細胞膜，而是作為可溶性蛋白質，或二者同時在相同細胞，可變區可同時結合至CD3及CD137但不可同時結合至各自表現於不同細胞的CD3及CD137的情況，亦可藉由所屬技術領域習知的方法測定。
具體地，已證實對於偵測同時結合至CD3及CD137的ECL-ELISA為陽性的欲測試的抗原-結合分子亦與表現CD3的細胞及表現CD137的細胞混合。除非抗原-結合分子及該等細胞同時彼此結合，否則欲測試的抗原-結合分子可顯示為不可同時結合至表現於不同細胞的CD3及CD137。可藉由例如基於細胞的ECL-ELISA進行此測試。表現CD3的細胞預先固定化至盤。在欲測試的抗原結合分子對其結合之後，對盤添加表現CD137的細胞。僅表現於表現CD137的細胞的不同抗原是使用針對此抗原的硫-標籤標記的抗體來偵測。當抗原結合分子同時結合至個別地表現於二種細胞的二種抗原時，觀察到信號。當抗原結合分子不同時結合至該等抗原時未觀察到信號。
或者，可藉由ALPHAScreen方法來進行此測試。欲測試的抗原結合分子與表現已結合至捐贈者珠粒的CD3的細胞以及表現已結合至接受者珠粒的CD137的細胞混合。當抗原結合分子同時結合至個別地表現於二種細胞的二種抗原時，觀察到信號。當抗原結合分子不同時結合至該等抗原時未觀察到信號。
或者，可藉由八隅體交互作用(Octet interaction)方法來進行此測試。首先，表現以肽標籤加以標籤的CD3的細胞係允許結合至辨識該肽標籤的生物感應器。表現CD137的細胞和欲測試的抗原結合分子置於孔中且分析交互作用。當抗原結合分子同時結合至個別表現於兩個細胞的兩種抗體時，觀察到由欲測試的抗原結合分子和表現CD137的細胞對生物感應器的結合所引起的大波長偏移。當抗原結合分子不同時結合至該等抗原時，觀察到僅由欲測試的抗原結合分子對生物感應器的結合所引起的小波長偏移。

不是基於結合活性的該等方法，可進行基於生物活性的測試。例如，表現CD3的細胞以及表現CD137的細胞與欲測試的抗原結合分子混合，並培養。當欲測試的抗原結合分子同時結合至兩種抗原時，個別地表現於兩個細胞的兩種抗原經由欲測試的抗原結合分子互相活化。因此，可偵測到活化信號的變化，如抗原的個別下游磷酸化程度的增加。或者，因為活化而誘發細胞介素產生。因此，可測量所產生的細胞介素的量以藉此證實是否同時結合至兩個細胞。或者，因為活化而誘發針對表現CD137的細胞的細胞毒性。或者，因為活化而藉由於CD137或CD3的信號轉導途徑的下游受到活化的啟動子，來誘發報導子基因的表現。因此，可測量所產生的細胞毒性或報導子蛋白質的量，以藉此證實是否同時結合至兩個細胞。

本發明中，「Fc區」意指包含由抗體分子中的鉸鏈或其部分以及CH2及CH3域所組成的片段的區。IgG類(IgG class)的Fc區意指，但不限於例如從半胱胺酸226(EU編號(本文中亦稱為EU指標))至C終端或脯胺酸230(EU編號)至C終端的區。較佳地可藉由以蛋白質分解酵素如胃蛋白酶部分分解，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4單株抗體，接著將吸附於蛋白質A管柱或蛋白質G管柱的分液的再沖提，以獲得Fc區。這種蛋白質分解酵素不特別限定，只要於該酵素之適當設定的反應條件下(例如，pH)，該酵素能分解全抗體以限制性地形成Fab或F(ab’)₂ 。其範例可包括胃蛋白酶及木瓜酵素。

一些實施例中，「抗原結合分子」不特別限定，只要該分子包含本發明的「抗體可變區」。抗原結合分子可更包含具有長度約5或更多個胺基酸的肽或蛋白質。該肽或蛋白質不特別限定為衍生自有機體的肽或蛋白質，且可為例如由人工設計的序列所組成的多肽。再者，可使用天然多肽、合成多肽、重組多肽等。

一些實施例中，本發明的「抗原結合分子」不特別限定於包含「抗體可變區」的分子。某些實施例中，不是包含可變區的抗體且可結合至二種不同抗原的抗原結合分子，例如親和體(Affibody)等，可藉由所屬技術領域中具有通常知識者習知的方法獲得(PLoS One. 2011; 6(10): e25791；PLoS One. 2012; 7(8): e42288；J Mol Biol. 2011 Aug 5; 411 (1): 201-19；Proc Natl Acad Sci USA. 2011 Aug 23; 108(34): 14067-72)。

本發明的抗原結合分子的較佳範例可包括包含抗體Fc區的抗原結合分子。

衍生自例如天然發生的IgG的Fc區可使用作為本發明的「Fc區」。本文中，天然發生的IgG意指多肽，其含有與自然中發現的IgG的胺基酸相同的胺基酸序列且屬於實質上由免疫球蛋白γ基因所編碼的抗體類型。天然發生的人類IgG意指例如天然發生的人類IgG1、天然發生的人類IgG2、天然發生的人類IgG3或天然發生的人類IgG4。天然發生的IgG也包括自自發性地其衍生的變體等。於Sequences of proteins of immunological interest, NIH出版號No. 91-3242中，基於基因多型性的複數個同種異型體序列被描述為人類IgG1、人類IgG2、人類IgG3及人類IgG4抗體的恆定區，其任一者皆可使用於本發明。特別地，人類IgG1的序列可具有DEL或EEM作為EU編號位置356至358的胺基酸序列。

發現抗體Fc區為例如IgA1、IgA2、IgD1、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgM類型的Fc區。例如，衍生自天然發生的人類IgG抗體的Fc區可使用作為本發明的抗體Fc區。例如，衍生自天然發生的IgG的恆定區的Fc區，具體地，源自天然發生的人類IgG1的恆定區(SEQ ID N: YY004)、源自天然發生的人類IgG2的恆定區(SEQ ID N: YY005)、源自天然發生的人類IgG3的恆定區(SEQ ID N: YY006)或源自天然發生的人類IgG4的恆定區(SEQ ID N: YY007)，可使用作為本發明的Fc區。天然發生的IgG的恆定區也包括自發性自其衍生的變體等。

本發明的Fc區特別較佳為針對Fcγ受體具有減低的結合活性的Fc區。本文中，Fcγ受體(本文中也指稱FcγR)意指可結合至IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc區的受體，且意味實質上由Fcγ受體基因編碼的蛋白質家族的任何成員。人類中，此家族包括但不限於：包括同型異構物FcγRIa、FcγRIb及FcγRIc的FcγRI (CD64)；包括同型異構物FcγRIIa(包括同種異型體H131 (H型)及R131 (R型)、FcγRIIb (包括FcγRIIb-1及FcγRIIb-2)及FcγRIIc的FcγRII (CD32)；以及包括同型異構物FcγRIIIa (包括同種異型體V158及F158)及FcγRIIIb(包括同種異型體FcγRIIIb-NA1及FcγRIII-NA2)的FcγRIII (CD16)；以及任何尚未發現的人類FcγR或FcγR同型異構物或同種異型體。FcγR包括衍生自人類、小鼠、大鼠、兔子和猴子的那些。FcγR不限制為該等分子且可衍生自任何有機體。小鼠FcγR包括但不限於，FcγRI (CD64)、FcγRII (CD32)、FcγRIII (CD16)及FcγRIII-2 (CD16-2)、以及任何尚未發現的小鼠FcγR或FcγR同型異構物或同種異型體。這種FcγR受體的較佳範例包括人類FcγRI (CD64)、FcγRIIa (CD32)、FcγRIIb (CD32)、FcγRIIIa (CD16)及/或FcγRIIIb (CD16)。

發現FcγR為具有ITAM (immunoreceptor tyrosine-based activation motif，免疫受體酪胺酸系活化模組)的活化性受體以及具有ITIM (immnoreceptor tyrosine-based inhibition motif，免疫受體酪胺酸系抑制模組)的抑制性受體的形式。FcγR分類為活化性FcγR (FcγRI、FcγRIIa R、FcγRIIa H、FcγRIIIa及FcγRIIIb)以及抑制性FcγR (FcγRIIb)。
FcγRI的多核苷酸序列及胺基酸序列分別描述於NM_000566.3及NP_000557.1；FcγRIIa的多核苷酸序列及胺基酸序列分別揭示於BC020823.1及AAH20823.1；FcγRIIb的多核苷酸序列及胺基酸序列分別揭示於BC146678.1及AAI46679.1；FcγRIIIa的多核苷酸序列及胺基酸序列分別揭示於BC033678.1及AAH33678.1；FcγRIIIb的多核苷酸序列及胺基酸序列分別揭示於BC128562.1及AAI28563.1 (RefSeq登錄號)。FcγRIIa具有兩類型的基因多型性，其由組胺酸(H型)或精胺酸(R型)取代FcγRIIa的第131個胺基酸(J. Exp. Med, 172, 19-25, 1990)。FcγRIIb具有兩類型的基因多型性，其由異白胺酸(I型)或蘇胺酸(T型)取代FcγRIIb的第232個胺基酸(Arthritis. Reheum. 46: 1242-1254 (2002))。FcγRIIIa具有兩類型的基因多型性，其由纈胺酸(V型)或苯丙胺酸(F型)取代FcγRIIIa的第158個胺基酸(J. Clin. Invest. 100(5): 1059-1071 (1997)。FcγRIIIb具有兩類型的基因多型性(NA1型及NA2型)(J. Clin. Invest. 85: 1287-1295 (1990))。

針對Fcγ受體的減低結合活性可藉由習知方法如FACS、ELISA格式、ALPHAScreen (amplified luminescent proximity homogeneous assay screen，放大發光近似均質測定篩選)、或基於表面電漿共振(SPR)現象的BIACORE方法予以證實(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006)103(11), 4005-4010)。
藉由使用二種珠粒(捐贈者及接受者)的ALPHA技術基於下述準則來實施ALPHAScreen：僅當經由與捐贈者珠粒結合的分子以及與接受者珠粒結合的分子之間的交互作用，而使該二珠粒位於接近時，偵測到發光信號。捐贈者珠粒中的雷射-激發感光劑將環境氧轉換為具激發態的單態氧(singlet oxygen)。單態氧圍繞捐贈者珠粒擴散且觸及位於接近的接受者珠粒，以藉此於珠粒中引起化學發光，其最終發射光。在與捐贈者珠粒結合的分子以及與接受者珠粒結合的分子之間的交互作用不存在時，由捐贈者珠粒所產生的單態氧不觸及接受者珠粒。因此，無化學發光反應發生。

例如，允許生物素標記抗原結合分子結合至捐贈者珠粒，而以穀胱甘肽 S 轉移酶(GST)標籤的Fcγ受體係允許結合至接受者珠粒。於具有突變Fc區的競爭性抗原結合分子的不存在下，具有野生型Fc區的抗原結合分子與Fcγ受體交互作用，以產生520至620nm的信號。加標籤的具有突變Fc區的抗原結合分子和具有野生型Fc區的抗原結合分子競爭與Fcγ受體的交互作用。可將競爭結果所引起的螢光減低定量，以藉此決定相對結合活性。使用硫-NHS-生物素等的抗原結合分子生物素化係已知於所屬技術領域。可藉由適當採用的方法以GST來標籤Fcγ受體，例如，涉及：使框架中編碼Fcγ受體的多核苷酸與編碼GST的多核苷酸融合；以及使所得融合基因藉由帶有能表現其之載體的細胞等予以表現，接著使用穀胱甘肽管柱純化。較佳地使用，例如，適用於基於非線性迴歸分析之一位點競爭模型的軟體GRAPHPAD PRISM(GraphPad Software, Inc., San Diego)來分析所得信號。

本說明書中，針對Fcγ受體的減低結合活性意指基於上述分析方法，相較於包含Fc區的對照抗原結合分子的結合活性，欲測試的抗原結合分子展現例如50%或更低、較佳45%或更低、40%或更低、35%或更低、30%或更低、20%或更低、或15%或更低、特佳為10%或更低、9%或更低、8%或更低、7%或更低、6%或更低、5%或更低、4%或更低、3%或更低、2%或更低、或1%或更低的結合活性。
具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4單株抗體Fc區的抗原結合分子可適當地使用作為對照抗原結合分子。Fc區結構係描述於序列編號: 94 (RefSeq登錄No. AAC82527.1具有A加成至N終端)、序列編號: 95 (RefSeq登錄No. AAB59393.1具有A加成至N終端)、序列編號: 96 (RefSeq登錄No. CAA27268.1具有A加成至N終端)、或序列編號: 97 (RefSeq登錄No. AAB59394.1具有A加成至N終端)。於使用具有某同型抗體的Fc區的變體的抗原結合分子作為測試物質的情況中，使用具有此某同型抗體的Fc區的抗原結合分子作為對照，以測試變體中的突變對於針對Fcγ受體的結合活性的效果。因此，證實針對Fcγ受體具有減低的結合活性之具有Fc區變體的抗原結合分子係適當地被製備。

例如，231A-238S刪除(WO 2009/011941)，C226S、C229S、P238S、(C220S)(J. Rheumatol (2007) 34, 11)，C226S、C229S (Hum. Antibod. Hybridomas (1990) 1(1), 47-54)，C226S、C229S、E233P、L234V、或L235A (Blood (2007) 109, 1185-1192)(該等胺基酸係根據EU編號界定)變體為所屬技術領域習知作為這種變體。
其較佳範例包括具有衍生自藉由下述組成胺基酸任一者取代的某同型抗體的Fc區的抗原結合分子：根據EU編號界定於位置220、226、229、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、264、265、266、267、269、270、295、296、297、298、299、300、325、327、328、329、330、331及332的胺基酸。Fc區源自的同型抗體不特別限制，且可適當地使用源自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4單株抗體的Fc區。較佳地使用源自天然發生的人類IgG1抗體的Fc區。
例如，亦可適當地使用Fc區的抗原結合分子，其中前述Fc區係藉由組成胺基酸之下述取代群組之任一者的IgG1抗體Fc區所衍生(數字表示根據EU編號界定的胺基酸殘基的位置；位於數字前的一字母胺基酸碼表示取代前的胺基酸殘基；以及位於數字後的一字母胺基酸碼表示取代前的胺基酸殘基)：
(a) L234F、L235E及P331S，
(b) C226S、C229S及P238S，
(c) C226S及C229S，以及
(d) C226S、C229S、E233P、L234V及L235A
或藉由從根據EU編號界定的位置231至238的胺基酸序列刪除所衍生。

亦可適當地使用Fc區的抗原結合分子，其中前述Fc區係藉由組成胺基酸之下述取代群組之任一者的IgG2抗體Fc區所衍生(數字表示根據EU編號界定的胺基酸殘基的位置；位於數字前的一字母胺基酸碼表示取代前的胺基酸殘基；以及位於數字後的一字母胺基酸碼表示取代前的胺基酸殘基)：
(e) H268Q、V309L、A330S及P331S，
(f) V234A，
(g) G237A，
(h) V234A及G237A，
(i) A235E及G237A以及
(j) V234A、A235E及G237A
根據EU編號界定。

亦可適當地使用具有Fc區的抗原-結合分子，其中前述Fc區係藉由組成胺基酸之下述取代群組之任一者的IgG3抗體Fc區所衍生(數字表示根據EU編號界定的胺基酸殘基的位置；位於數字前的一字母胺基酸碼表示取代前的胺基酸殘基；以及位於數字後的一字母胺基酸碼表示取代前的胺基酸殘基)：
(k) F241A，
(l) D265A，以及
(m) V264A
根據EU編號界定。

亦可適當地使用具有Fc區的抗原結合分子，其中前述Fc區係藉由組成胺基酸之下述取代群組之任一者的IgG4抗體Fc區所衍生(數字表示根據EU編號界定的胺基酸殘基的位置；位於數字前的一字母胺基酸碼表示取代前的胺基酸殘基；以及位於數字後的一字母胺基酸碼表示取代前的胺基酸殘基)：
(n) L235A、G237A及E318A，
(o) L235E，以及
(p) F234A及L235A
根據EU編號界定。

其之其他較佳範例包括具有Fc區的抗原結合分子，其中前述Fc區係藉由組成胺基酸之下述取代群組之任一者的IgG1抗體Fc區所衍生：根據EU編號界定於位置233、234、235、236、237、327、330及331的胺基酸，藉由於相對的IgG2或IgG4的Fc區中對應的EU編號位置的胺基酸所衍生。

其之其他較佳範例包括具有Fc區的抗原結合分子，其中前述Fc區係藉由組成胺基酸之下述取代群組之任一者的IgG1抗體Fc區所衍生：根據EU編號界定於位置234、235及297的胺基酸，藉由不同的胺基酸。取代後呈現的胺基酸類型並不特別限制。特別較佳為具有於位置234、235及297的一或多個胺基酸由丙胺酸取代的Fc區的抗原結合分子。

其之其他較佳範例包括具有Fc區的抗原結合分子，其中前述Fc區係藉由根據EU編號界定的位置265的組成胺基酸取代的IgG1抗體的Fc區所衍生，藉由不同的胺基酸。取代後呈現的胺基酸類型並不特別限制。特別較佳為具有於位置265的胺基酸由丙胺酸取代的Fc區的抗原-結合分子。

本發明的「抗原結合分子」的一較佳形式可為，例如包含本發明的抗體可變區的多特異性抗體。

藉由將電荷排斥導入至抗體H鏈的第二恆定域(CH2)或第三恆定域(CH3)之間的界面以壓抑H鏈之間的不期望締合的技術(WO2006/106905)可應用於多特異性抗體的締合。
在藉由將電荷排斥導入至CH2或CH3界面以壓抑H鏈之間的不期望締合的技術中，於H鏈恆定域之間的界面彼此接觸的胺基酸殘基的範例可包括於一CH3域中EU編號位置356的殘基、EU編號位置439的殘基、於EU編號位置357的殘基、於EU編號位置370的殘基、於EU編號位置399的殘基及於EU編號位置409的殘基，以及於另一CH3域的夥伴殘基(partner residue)。

更具體地，例如，包含兩個H鏈CH3域的抗體可製備為抗體，其中選自第一H鏈CH3域的下述胺基酸殘基對(1)至(3)的一至三對胺基酸殘基帶有相同電荷：(1)於H鏈CH3域的EU編號位置356及439所含有的胺基酸殘基；(2)於H鏈CH3域的EU編號位置357及370所含有的胺基酸殘基；(3)於H鏈CH3域的EU編號位置399及409所含有的胺基酸殘基。

抗體可進一步製備為抗體，其中一至三對胺基酸殘基係選自在不同於第一H鏈CH3域的第二H鏈CH3域中的胺基酸殘基對(1)至(3)的，以對應於第一H鏈CH3域中帶有相同電荷的胺基酸對(1)至(3)且帶有與其對應於第一H鏈CH3域的胺基酸殘基相反電荷。

對(1)至(3)中所述的各胺基酸殘基係位於靠近締合H鏈中的夥伴。所屬技術領域中具有通常知識者可使用市售軟體藉由同源模型等找到對應於對(1)至(3)各者中所述的胺基酸殘基的位置如所期望的H鏈CH3域或H鏈恆定域，且可適當地改變該等位置的胺基酸殘基。

上述抗體中，「帶電荷的胺基酸殘基」之各者較佳選自，例如，下述群組(a)及(b)之任一者所包括的胺基酸殘基：
(a) 麩胺酸(glutamic acid，E)及天冬胺酸(aspartic acid，D)；以及
(b) 離胺酸(lysine，K)、精胺酸(arginine，R)及組胺酸(histidine，H)。

上述抗體中，用語「帶相同電荷」意味，例如，所有的二或更多個胺基酸殘基為群組(a)及(b)之任一者所包括的胺基酸殘基。用語「帶相反電荷」意味，例如，該二或更多個胺基酸殘基中的至少一個胺基酸殘基可為群組(a)及(b)之任一者所包括的胺基酸殘基，而其餘胺基酸殘基為其他群組所包括的胺基酸殘基。

較佳實施例中，抗體可具有經由雙硫鍵結交聯的第一H鏈CH3域及第二H鏈CH3域。
根據本發明之欲改變的胺基酸殘基不限制為上述抗體可變區或抗體恆定區中的胺基酸殘基。所屬技術領域中具有通常知識者可使用市售軟體藉由同源模型等找到如多肽變體或雜多倍體之組成界面的胺基酸殘基，且可於該等位置改變胺基酸殘基以調節締合。

對本發明的多特異性抗體的締合也可藉由所屬技術領域習知的替代技術進行。存在於一抗體H鏈的可變域的胺基酸側鏈係被較大的側鏈(紐)取代，且其存在於其他H鏈可變域中的夥伴胺基酸側鏈係被較小的側鏈(扣)取代。鈕可置於扣中以有效率地締合胺基酸序列不同的Fc域的多肽(WO1996/027011；Ridway JB et al., Protein Engineering (1996) 9, 617-621；以及Merchant AM et al., Nature Biotechnology (1998) 16, 677-681)。

除了此技術外，所屬技術領域習知的另一替代技術可使用於形成本發明的多特異性抗體。將一抗體H鏈的CH3的一部分轉換為其相應的IgA-衍生序列，且將其他H鏈的CH3中之其互補部分係轉為其相應的IgA-衍生序列。所得之經股-交換工程化域CH3的使用，可經由互補性CH3締合在序列不同的多肽之間引起有效率的締合(Protein Engineering Design & Selection, 23; 195-202, 2010)。藉由使用所屬技術領域習知的此技術，亦可有效率的形成感興趣的多特異性抗體。

或者，可藉由，例如使用如WO2011/028952所述的抗體CH1-CL締合及VH-VL締合的抗體製備技術、使用如WO2008/119353及WO2011/131746所述的分開製備的單株抗體(Fab臂交換)製備雙特異性抗體的技術、如WO2012/058768及WO2013/063702所述的控制抗體重鏈CH3域之間的締合的技術，如WO2012/023053所述的製備藉由兩類型的輕鏈及一類型的重鏈所構成的雙特異性抗體的技術、或如Christoph等人(Nature Biotechnology Vol. 31, p. 753-758 (2013))所述的使用兩個各自表現由一個H鏈及一個L鏈所組成的抗體半分子的細菌細胞株來製備雙特異性抗體的技術，來形成多特異性抗體。除該等締合技術外，CrossMab技術，一種將形成結合至第一抗原決定基的可變區的輕鏈以及形成結合至第二抗原決定基的可變區的輕鏈，分別締合至形成結合至第一抗原決定基的可變區的重鏈以及形成結合至第二抗原決定基的可變區的重鏈的習知雜輕鏈締合技術(Scaefer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2011)108, 11187-11192)，亦可用於製備本發明所提供的多特異性或多互補位(multiparatopic)的抗原結合分子。使用分開製備的單株抗體來製備雙特異性抗體的技術範例可包括涉及藉由將於重鏈CH3域的特別胺基酸取代的單株抗體放置於還原條件下，而促進抗體異源二倍體化，以獲得所期望的雙特異性抗體的方法。對於此方法的較佳胺基酸取代位點範例可包括於CH3域中EU編號位置392的殘基及EU編號位置397的殘基。再者，亦可藉由使用其中於第一H鏈CH3域中選自下述胺基酸殘基對(1)至(3)的一至三對胺基酸殘基帶有相同電荷的抗體，來製備雙特異性抗體：(1)於H鏈CH3域所含有的EU編號位置356及439的胺基酸殘基；(2)於H鏈CH3域所含有的EU編號位置357及370的胺基酸殘基；以及(3)於H鏈CH3域所含有的EU編號位置399及409的胺基酸殘基。亦可藉由使用其中一至三對胺基酸殘基係不同於第一H鏈CH3域之第二H鏈CH3域中選自胺基酸殘基對(1)至(3)，以對應於第一H鏈CH3域中帶有相同電荷的胺基酸殘基對(1)至(3)，且帶有與其對應於第一H鏈CH3域的胺基酸殘基相反電荷的抗體，來製備雙特異性抗體。

即使感興趣的多特異性抗體不能有效率地形成，本發明的多特異性抗體可自所製造的抗體當中，藉由分離及純化感興趣的多特異性抗體而獲得。例如，之前報導的方法涉及將胺基酸取代導入至兩種類型的H鏈的可變域，以對其賦予不同的等電點，使得感興趣的兩種類型的同源二倍體及異源二倍化抗體可藉由離子交換層析，來分開純化(WO2007114325)。使用蛋白質A純化由可結合至蛋白質A的小鼠IgG2a H鏈及不可結合至蛋白質A的大鼠IgG2b H鏈所組成的異源二倍體化抗體的方法已報導作為純化異源二倍體的方法(WO98050431及WO95033844)。或者，構成IgG的蛋白質A結合位點的EU編號位置435及436的胺基酸殘基可被胺基酸取代，例如Tyr及His，其提供不同的蛋白質A結合強度，且所得的H鏈係用於改變各H鏈與蛋白質A的交互作用。因此，只有異源二倍化抗體可藉由使用蛋白質A管柱有效率地純化。

可組合使用複數個，例如二或更多種該等技術。再者，該等技術可適當地分開應用於欲締合的兩個H鏈。基於，但分開地自因此改變的型，本發明的抗原結合分子可製備為具有與其相同的胺基酸序列的抗原結合分子。

可藉由所屬技術領域習知的各種方法進行胺基酸序列的改變。可進行的該等方法的範例可包括但不限於，例如位點導向突變(Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y, and Nakagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide- directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271-275; Zoller, MJ, and Smith, M (1983) Oligonucleotide-dirested mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors. Methods Enxymo. 100, 468-500; Kramer, W, Drutsa, V, Jansen, HW, Kramer, B, Pflugfelder, M, and Fritz, HJ (1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456; Kramer W, and Fritz HJ (1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Method. Enzymol. 154, 350-367; 及 Kunkel, TA (1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci USA. 82, 488-492)、PCR突變、及匣突變(cassette mutagenesis)的方法。

本發明的「抗原結合分子」可為包含於單一多肽鏈構成本發明「抗體可變區」的重鏈及輕鏈二者，但缺乏恆定區的抗體片段。這種抗體片段可為，例如，雙鏈抗體(diabody，Db)、單鏈抗體或sc(Fab’)2。

Db係藉由兩個多肽鏈構成的二倍體(例如，Holliger P et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993); EP404,097及WO93/11161)。該等多肽鏈可經由短至例如約5個殘基的連接子連接，使得於相同多肽鏈的L鏈可變域(VL)及H鏈可變域(VH)不能彼此配對。
由於此短連接子，編碼於相同多肽鏈的VL及VH不能形成單鏈Fv，且相反地，係於分別與另一多肽鏈VH及VL二倍體化，以形成兩個抗原結合位點。

單鏈抗體的範例包括sc(Fv)2。該sc(Fv)2為具有一條藉由四個可變域構成的鏈的單鏈抗體，亦即兩個VL及兩個VH經由例如肽連接子的連接子連接(J Immunol. Methods (1999) 231(1-2), 177-189)。這兩個VH及VL可衍生自不同的單株抗體。其較佳範例包括雙特異性sc(Fv)2，其辨識存在於相同抗原的兩種類型的抗原決定基，如Journal of Immunology (1994) 152 (11), 5368-5374所述。該sc(Fv)2可藉由所屬技術領域中具有通常知識者通常習知的方法製備。例如，該sc(Fv)2可藉由經由例如肽連接子的連接子連結兩個scFv而製備。

本文所述之構成該sc(Fv)2的抗原結合域的配置(configuration)的範例包括其中兩個VH及兩個VL係對齊為VH、VL、VH及VL係經對準(亦即[VH]-連接子-[VL]-連接子-[VH]-連接子-[VL])，以此順序自單鏈多肽的N-終端起始的抗體。兩個VH及兩個VL的順序不特別限制為上述配置且可為任何排列順序。其範例亦可包括下述排例：
[VL]-連接子-[VH]-連接子-[VH]-連接子-[VL]，
[VH]-連接子-[VL]-連接子-[VL]-連接子-[VH]，
[VH]-連接子-[VH]-連接子-[VL]-連接子-[VL]，
[VL]-連接子-[VL]-連接子-[VH]-連接子-[VH]，以及
[VL]-連接子-[VH]-連接子-[VL]-連接子-[VH]。

該sc(Fv)的分子形式也詳細地描述於WO2006/132352。基於該文獻的描述，所屬技術領域中具有通常知識者可適當地製備所期望的sc(Fv)2，以製備本發明所揭示的抗原結合分子。

本發明的抗原-結合分子可與載劑聚合物如PEG或有機化合物如抗癌劑接合(conjugate)。再者，較佳地可藉由糖基化序列的插入，將糖鏈加成至本發明的抗原結合分子，以產生所期望效果。

例如，可藉由基因工程導入的任意肽連接子，或合成化合物連接子(例如，連接子揭示於Protein Engineering, 9(3), 299-305, 1996)可作為連接抗體可變域的連接子。本發明中，較佳為肽連接子。肽連接子的長度不特別限制且可根據目的由所屬技術領域中具有通常知識者適當地選擇。長度較佳為5或更多個胺基酸(上限不特別限制，且通常為30或更少個胺基酸，較佳為20或更少個胺基酸)，特佳為15個胺基酸。當sc(Fv)2含有三個肽連接子時，所使用的所有該等肽連接子可具有相同長度或可具有不同長度。

肽連接子的範例可包括
Ser、
Gly-Ser、
Gly-Gly-Ser、
Ser-Gly-Gly、
Gly-Gly-Gly-Ser (序列編號: 162)、
Ser-Gly-Gly-Gly (序列編號: 163)、
Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (序列編號: 164)、
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly (序列編號: 165)、
Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (序列編號: 166)、
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly (序列編號: 167)、
Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (序列編號: 168)、
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly (序列編號: 169)、
(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (序列編號: 164))n、以及
(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly (序列編號: 165))n，
其中，n為1或更大的整數。
然而，肽連接子的長度或序列可由所屬技術領域中具有通常知識者根據目的而合適地選擇。

合成化合物連接子(化學交聯劑)為通常用於肽的交聯之交聯劑，例如N-羥基琥珀醯亞胺(N-hydroxysuccinimide，NHS)、辛二酸二琥珀醯亞胺酯(disuccinimidyl suberate，DSS)、辛二酸雙(硫琥珀醯亞胺酯)(bis(sulfosuccinimidyl) suberate，BS3)、二硫代雙(丙酸琥珀醯亞胺酯)(dithiobis(succinimidyl propionate)，DSP)、二硫代雙(丙酸硫代琥珀醯亞胺酯)(dithiobis(sulfosuccinimidyl propionate)，DTSSP)、乙二醇雙(琥珀酸琥珀醯亞胺酯)(ethylene glycol bis(succinimidyl succinate)，EGS)、乙二醇雙(琥珀酸硫代琥珀醯亞胺酯)(ethylene glycol bis(sulfosuccinimidyl succinate)，sulfo-EGS)、酒石酸二琥珀醯亞胺酯(disuccinimidyl tartrate，DST)、酒石酸二硫代琥珀醯亞胺酯(sulfo-DST)、雙[2-(琥珀醯亞胺氧基羰基氧基)乙基]碸(bis[2-(succinimidoxycarbonyloxy)ethyl]sulfonate，BSOCOES)、或雙[2-(硫代琥珀醯亞胺氧基羰基氧基)乙基]碸(bis[2- (sulfosuccinimidoxycarbonyloxy)ethyl]sulfonate，sulfo-BSOCOES)。該等交聯劑為市售可得。
通常需要三個連接子連接四個抗體可變域。所用的所有該等連接子可為相同連接子或可為不同連接子。

F(ab’)2包含含有恆定區(CH1域及CH2域的一部分)的兩個輕鏈及兩個重鏈，使得於這兩個重鏈之間形成鏈間雙硫鍵。較佳地可藉由以蛋白質分解酵素如胃蛋白酶部分分解例如具有所期望的抗原-結合域的全單株抗體，接著移除吸附於蛋白質A管柱的Fc片段，來獲得構成本說明書所揭示的多肽締合物的F(ab’)2。這種蛋白質分解酵素不特別限制，只要該酵素於該酵素適當設定的反應條件(例如，pH)下可分解全抗體，以限制性地形成F(ab’)₂ 。其範例可包括胃蛋白酶及無花果蛋白酶(ficin)。

除了上述胺基酸改變外，本發明的抗原結合分子可更含有額外改變。額外改變可選自，例如胺基酸取代、刪除、及修飾、及其組合。
例如，本發明的抗原結合分子可進一步被任意改變，而實質上不改變該分子所冀求的功能。可藉由例如胺基酸殘基的保守性取代來進行這種突變。或者，甚至可實施改變本發明的抗原結合分子所冀求的功能的改變，只要被這種改變所改變的功能係在本發明的目標內。

根據本發明的胺基酸序列的改變也包括轉譯後修飾。具體地，轉譯後修飾可意指糖鏈的加成或刪除。例如，具有IgG1-型恆定區之本發明的抗原結合分子可於EU編號位置297具有經糖鏈修飾的胺基酸殘基。使用於修飾的糖鏈結構不特別限制。一般而言，藉由真核細胞表現的抗體於其恆定區涉及糖鏈修飾。因此，藉由下述細胞表現的抗體通常以某個糖鏈修飾：哺乳動物抗體產生細胞；及以包含抗體-編碼DNA的表現載體轉形的真核細胞。
本文中，真核細胞包括酵母菌及動物細胞。例如，CHO細胞或HEK293H細胞為用於以包含抗體-編碼DNA的表現載體轉形的典型動物細胞。另一方面，本發明的抗體也包括於該位置缺乏糖鏈修飾的抗體。具有未經糖鏈修飾的恆定區的抗體可藉由在如大腸桿菌(E. coli )之原核細胞中表現編碼該等抗體的基因而獲得。

根據本發明之額外改變更具體地可為例如，於Fc區對糖鏈的唾液酸(sialic acid)加成(mAbs. 2010 Sep-Oct; 2(5): 519-27)。

當本發明的抗原結合分子具有Fc區，例如，可對其加成改良針對FcRn的結合活性胺基酸取代(J Immunol. 2006 Jan1; 176(1): 346-56; J Biol Chem. 2006 Aug 18; 281(33): 23514-24; Int Immunol. 2006 Dec; 18(12): 1759-69; Nat Biotechnol. 2000 Feb; 28(2):157-9; WO2006/053301; 及WO2009/086320))或改良抗體異質性(heterogeneity)或安定性的胺基酸取代((WO2009/041613))。

本發明中，用語「抗體」係以最廣意義使用，且也包括任何抗體，例如單株抗體(包括全單株抗體)、多株抗體、抗體變體、抗體片段、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、嵌合抗體以及人源化抗體，只要該抗體展現所期望的生物活性。

本發明的抗體不被其抗原的類型、其來源等所限制，且可為任何抗體。抗體的來源的範例可包括但不特別限制於，人類抗體、小鼠抗體、大鼠抗體及兔子抗體。

可藉由所屬技術領域中具有通常知識者習知的方法來製備抗體。例如，可藉由融合瘤方法(Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975))或重組方法(美國專利號4,816,567)來製備單株抗體。或者，可自噬菌體展示的抗體庫單離出單株抗體(Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); 及 Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991))。再者，可自單一B細胞純株單離出單株抗體(N. Biotechnol. 28(5): 253-457 2011))。

人源化抗體也稱為重塑(reshaped)人類抗體。具體地，例如，由經非人類動物(例如，小鼠)抗體CDR接枝的抗體所組成的人源化抗體習知於所屬技術領域。用於獲得人源化抗體的一般基因重組方案亦為習知。具體地，例如，重疊延伸PCR (overlap extension PCR)為所屬技術領域習知為用於將小鼠抗體CDR接枝至人類FR的方法。

編碼各包含三個CDR及四個FR連接的抗體可變域的DNA以及編碼人類抗體恆定域的DNA可插入至表現載體，使得可變域DNA係與恆定域DNA於框架內融合以製備用於人源化抗體表現的載體。具有插入物的該等載體轉移至宿主以建立重組細胞。然後，培養該重組細胞用於表現編碼人源化抗體的DNA，以產生人源化抗體至培養的細胞的培養物(參照歐洲專利公開號EP239400及國際專利公開號WO1996/002576)。

必要時，FR胺基酸殘基可被取代，使得重塑人類抗體的CDR形成適當的抗原結合位點。例如，可藉由應用用於小鼠CDR接枝至人類FR的PCR方法，來突變FR的胺基酸殘基。

可使用具有人類抗體基因所有品系(repertoires)的基因轉殖動物作為免疫動物，藉由DNA免疫來獲得所期望的人類抗體(參照國際專利公開號WO1993/012227、WO1992/0039185、WO1994/002602、WO1994/025585、WO1996/034096、及WO1996/033735)。

此外，使用人類抗體庫藉由淘選獲得人類抗體的技術亦為習知。例如，藉由噬菌體展示方法，於噬菌體表面將人類抗體V區表現為單鏈抗體(scFv)。可選擇表現抗原結合scFv的噬菌體。可分析所選擇的噬菌體的基因，以決定編碼抗原結合人類抗體的V區的DNA序列。決定抗原結合scFv的DNA序列後，V區序列可與所期望的人類抗體C區的序列於框架內融合，然後插入至適當的表現載體以製備表現載體。表現載體轉移至上述所列之較佳表現細胞，用於表現編碼人類抗體的基因以獲得人類抗體。該等方法己為所述技術領域所知(參照國際專利公開號WO1992/001047、WO1992/020791、WO1993/006213、WO1993/011236、WO1993/019172、WO1995/001438、及WO1995/015388)。

除了噬菌體展示技術外，例如，使用無細胞轉譯系統的技術、於細胞或病毒表面展示抗原結合分子的技術、以及使用乳化的技術已知為使用人類抗體庫藉由淘選獲得人類抗體的技術。例如，涉及藉由移除終止碼等經由核糖體而形成mRNA及轉譯蛋白質的複合物的核糖體展示方法、涉及使用如嘌呤黴素的化合物共價結合轉譯蛋白質至基因序列的cDNA或mRNA展示方法、或涉及使用核酸結合蛋白質形成基因及轉譯蛋白質的複合物的CIS展示方法，可用作為使用無細胞轉譯系統的技術。噬菌體展示方法以及大腸桿菌展示方法、格蘭氏陽性菌展示方法、酵母菌展示方法、哺乳動物細胞展示方法、病毒展示方法等可用作為於細胞或病毒表面展示抗原結合分子的技術。例如，使用內含於乳化物的基因及轉譯相關分子的活體外病毒展示方法可用作為使用乳化的技術。該等方法已為所屬技術領域所知(Nat Biotechnol. 2000 Dec; 18(12): 1287-92; Nucleic Acids Res. 2006; 34(19): e27; Proc Natl Acad Sci USA. 2004 Mar 2; 101(9): 2806-10; Proc Natl Acad Sci USA. 2004 Jun 22; 101 (25): 9193-8; Protein Eng Des Sel. 2008 Apr; 21(4): 247-55; Pron Natl Acad Sci USA. 2000 Sep 26; 97(20): 10701-5; MAbs. 2010 Sep-Oct; 2 (5): 508-18; 及Methods Mol Biol. 2012; 911: 183-98)。

本發明之結合至第三抗原的可變區可為辨識任意抗原的可變區。本發明之結合至第三抗原的可變區可為辨識特異性地表現於癌組織的分子的可變區。

本說明書中，「第三抗原」不特別限制且可為任何抗原。抗原的範例包括17-IA、4Dc、6-酮基-PGFIa、8-異-PGF2a、8-側氧基-dG、A1腺苷受體、A33、ACE、ACE-2、活化素、活化素 A、活化素AB、活化素B、活化素C、活化素RIA、活化素RIA ALK-2、活化素RIB ALK-4、活化素 RIIA、活化素 RIIB、ADAM、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAM8、ADAM9、ADAMTS、ADAMTS4、ADAMTS5、位址素(Addressin)、脂聯素(adiponectin)、ADP核糖基環化酶-1、aFGF、AGE、ALCAM、ALK、ALK-1、ALK-7、過敏原、α1-抗胰凝乳蛋白酶(alpha 1-antichemotrypsin)、α1-抗胰蛋白酶、α-突觸核蛋白、α-V/β-1拮抗劑、阿米寧(aminin)、澱粉素(amylin)、類澱粉蛋白β、類澱粉蛋白免疫球蛋白重鏈可變區、類澱粉蛋白免疫球蛋白輕鏈可變區、雄性素、ANG、血管收縮素原、血管生成素配體-2、抗-Id、抗凝血酶III、炭疽病、APAF-1、APE、APJ、apo A1、apo 血清類澱粉蛋白A、Apo-SAA、APP、APRIL、AR、ARC、ART、青蒿琥酯(Artemin)、ASPARTIC、心房利尿肽因子(Atrial natriuretic factor)、心房利尿肽、心房利尿肽A及心房利尿肽B、心房利尿肽C、av/b3整合素、Axl、B7-1、B7-2、B7-H、BACE、BACE-1、炭疽桿菌保護抗原(Bacillus anthracis protective antigen)、Bad、BAFF、BAFF-R、Bag-1、BAK、Bax、BCA-1、BCAM、Bcl、BCAM、BDNF、b-ECGF、β-2-微球蛋白、β內醯胺酶、bFGF、BID、Bik、BIM、BLC、BL-CAM、BLK、B-淋巴球刺激物(B-lymphocyte Stimulator，BIyS)、BMP、BMP-2 (BMP-2a)、BMP-3 (成骨素)、BMP-4 (BMP-2b)、BMP-5、BMP-6 (Vgr-1)、BMP-7 (OP-1)、BMP-8 (BMP-8a)、BMPR、BMPR-IA (ALK-3)、BMPR-IB (ALK-6)、BMPRII (BRK-3)、BMPs、BOK、鈴蟾素(Bombesin)、骨衍生的嗜中性因子、牛生長激素(bovine growth hormone)、BPDE、BPDE-DNA、BRK-2、BTC、B-淋巴球細胞黏附分子、C10、C1-抑制劑、C1q、C3、C3a、C4、C5、C5a (補體5a)、CA125、CAD-8、鈣黏蛋白-3、降鈣素、cAMP、碳酸酐酶-IX、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、癌相關抗原、心肌營養素-1、組織蛋白酶A、組織蛋白酶B、組織蛋白酶C/DPPI、組織蛋白酶D、組織蛋白酶E、組織蛋白酶H、組織蛋白酶L、組織蛋白酶O、組織蛋白酶S、組織蛋白酶V、組織蛋白酶X/Z/P、CBL、CCI、CCK2、CCL、CCL1/I-309、CCL11/伊紅趨素(Eotaxin)、CCL12/MCP-5、CCL13/MCP-4、CCL14/HCC-1、CCL15/HCC-2、CCL16/HCC-4、CCL17/TARC、CCL18/PARC、CCL19/ELC、CCL2/MCP-1、CCL20/MIP-3-α、CCL21/SLC、CCL22/MDC、CCL23/MPIF-1、CCL24/Eotaxin-2、CCL25/TECK、CCL26/Eotaxin-3、CCL27/CTACK、CCL28/MEC、CCL3/M1P-1-α、CCL31/LD-78-β、CCL4/MIP-1-β、CCL5/RANTES、CCL6/C10、CCL7/MCP-3、CCL8/MCP-2、CCL9/10/MTP-1-γ、CCR、CCR1、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CD1、CD10、CD105、CD11a、CD11b、CD11c、CD123、CD13、CD137、CD138、CD14、CD140a、CD146、CD147、CD148、CD15、CD152、CD16、CD164、CD18、CD19、CD2、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD26、CD27L、CD28、CD29、CD3、CD30、CD30L、CD32、CD33 (p67蛋白質)、CD34、CD37、CD38、CD3E、CD4、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD49a、CD49b、CD5、CD51、CD52、CD54、CD55、CD56、CD6、CD61、CD64、CD66e、CD7、CD70、CD74、CD8、CD80 (B7-1)、CD89、CD95、CD105、CD158a、CEA、CEACAM5、CFTR、cGMP、CGRP受體、CINC、CKb8-1、閉合蛋白18、CLC、肉毒桿菌毒素(Clostridium botulinum toxin)、艱難梭狀芽孢桿菌毒素(Clostridium difficile toxin)、產氣莢膜梭菌毒素(Clostridium perfringens toxin)、c-Met、CMV、CMV UL、CNTF、CNTN-1、補體因子3(C3)、補體因子D、皮質類固醇-結合球蛋白、群落刺激因子-1受體、COX、C-Ret、CRG-2、CRTH2、CT-1、CTACK、CTGF、CTLA-4、CX3CL1/曲動蛋白(Fractalkine)、CX3CR1、CXCL、CXCL1/Gro-α、CXCL10、CXCL11/I-TAC、CXCL12/SDF-1-α/β、CXCL13/BCA-1、CXCL14/BRAK、CXCL15/Lungkine. CXCL16、CXCL16、CXCL2/Gro-βCXCL3/Gro-γ、CXCL3、CXCL4/PF4、CXCL5/ENA-78、CXCL6/GCP-2、CXCL7/NAP-2、CXCL8/IL-8、CXCL9/Mig、CXCL1O/IP-10、CXCR、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、胱抑素C、細胞角蛋白腫瘤相關抗原(cytokeratin turmor-associated antigen)、DAN、DCC、DcR3、DC-SIGN、衰變加速因子、類δ蛋白質配體4、去(1-3)-IGF-1(腦IGF-1)、Dhh、DHICA氧化酶、Dickkopf-1、地高辛、二肽基肽酶IV、DK1、DNAM-1、去氧核醣核酸酶、Dpp、DPPIV/CD26、Dtk、ECAD、EDA、EDA-A1、EDA-A2、EDAR、EGF、EGFR(ErbB-1)、含有類EGF域的蛋白質7、彈性蛋白酶、彈性蛋白、EMA、EMMPRIN、ENA、ENA-78、內皮唾液酸蛋白、內皮素受體、內毒素、腦啡肽(Enkephalinase)、eNOS、Eot、Eotaxin、Eotaxin-2、eotaxini、EpCAM、Ephrin B2/EphB4、Epha2酪胺酸激酶受體、表皮生長因子受體(EGFR)、ErbB2受體、ErbB3酪胺酸激酶受體、ERCC、EREG、紅血球生成素(EPO)、紅血球生成素受體、E-選擇素、ET-1、Exodus-2、RSV的F蛋白質、F10、F11、F12、F13、F5、F9、因子Ia、因子IX、因子Xa、因子VII、因子VIII、因子VIIIc、Fas、FcαR、FcεRI、FcγIIb、FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa、FcγRIIIb、FcRn、FEN-1、鐵蛋白、FGF、FGF-19、FGF-2、FGF-2受體、FGF-3、FGF-8、FGF-酸性、FGF-鹼性、纖維蛋白、纖維母細胞活化蛋白(FAP)、纖維母細胞生長因子、纖維母細胞生長因子-10、纖網蛋白、FL、FLIP、Flt-3、FLT3配體、葉酸受體、濾泡刺激激素 (FSH)、曲動蛋白(CX3C)、游離重鏈、游離輕鏈、FZD1、FZD10、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、G250、Gas 6、GCP-2、GCSF、G-CSF、G-CSF受體、GD2、GD3、GDF、GDF-1、GDF-15 (MIC-1)、GDF-3 (Vgr-2)、GDF-5 (BMP-14/CDMP-1)、GDF-6 (BMP-13/CDMP-2)、GDF-7 (BMP-12/CDMP-3)、GDF-8 (肌肉生長抑制素)、GDF-9、GDNF、凝溶膠蛋白、GFAP、GF-CSF、GFR-α1、GFR-α2、GFR-α3、GF-β1、gH外膜糖蛋白、GITR、升糖素、升糖素受體、類升糖素肽1受體、Glut4、夫胺酸羧基肽酶II、糖蛋白激素受體、糖蛋白IIb/IIIa(GP IIb/IIIa)、磷脂醯肌醇聚糖-3、GM-CSF、GM-CSF受體、gp130、gp140、gp72、顆粒球-CSF (G-CSF)、GRO/MGSA、生長激素釋放因子、GRO-β、GRO-γ、幽門螺旋桿菌、半抗原(NP-cap或NIP-cap)、HB-EGF、HCC、HCC 1、HCMV gB外膜糖蛋白、HCMV UL、造血生長因子(Hemopoietic growth factor，HGF)、Hep B gp120、肝素酶、肝素共因子II、肝生長因子、炭疽菌保護抗原、肝炎C病毒E2糖蛋白、肝炎E、鐵調素、Her1、Her2/neu (ErbB-2)、Her3 (ErbB-3)、Her4 (ErbB-4)、單純疱疹病毒(HSV)gB糖蛋白、HGF、HGFA、高分子量黑色素瘤相關抗原(High molecular weight melanoma-associated antigen，HMW-MAA)、HIV外膜蛋白如GP120、HIV MIB gp 120 V3環、HLA、HLA-DR、HM1.24、HMFG PEM、HMGB-1、HRG、Hrk、HSP47、Hsp90、HSV gD糖蛋白、人類心肌凝蛋白、人類細胞巨大病毒(human cytomegalovirus，HCMV)、人類生長激素(hGH)、人類血清白蛋白、人類組織型血纖維溶原酶活化子(t-PA)、亨丁頓氏蛋白、HVEM、IAP、ICAM、ICAM-1、ICAM-3、ICE、ICOS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IgA、IgA受體、IgE、IGF、IGF結合蛋白、IGF-1、IGF-1 R、IGF-2、IGFBP、IGFR、IL、IL-1、IL-10、IL-10受體、IL-11、IL-11受體、IL-12、IL-12受體、IL-13、IL-13受體、IL-15、IL-15受體、IL-16、IL-16受體、IL-17、IL-17受體、IL-18 (IGIF)、IL-18受體、IL-1α、IL-1β、IL-1受體、IL-2、IL-2受體、IL-20、IL-20受體、IL-21、IL-21受體、IL-23、IL-23受體、IL-2受體、IL-3、IL-3受體、IL-31、IL-31受體、IL-3受體、IL-4、IL-4受體、IL-5、IL-5受體、IL-6、IL-6受體、IL-7、IL-7受體、IL-8、IL-8受體、IL-9、IL-9受體、免疫球蛋白免疫複合物、免疫球蛋白、INF-α、INF-α受體、INF-β、INF-β受體、INF-γ、INF-γ受體、IFN型-I、IFN型-1受體、流感病毒、抑制素、抑制素α、抑制素β、iNOS、胰島素、胰島素A-鏈、胰島素B-鏈、類胰島素生長因子1、類胰島素生長因子2、類胰島素生長因子結合蛋白、整合素、整合素α2、整合素α3、整合素α4、整合素α4/β1、整合素α-V/β-3、整合素α-V/β-6、整合素α4/β7、整合素α5/β1、整合素α5/β3、整合素α5/β6、整合素ασ(αV)、整合素αθ、整合素β1、整合素β2、整合素β3 (GPIIb-IIIa)、IP-10、I-TAC、JE、激肽釋放素(kalliklein)、激肽釋放素11、激肽釋放素12、激肽釋放素14、激肽釋放素15、激肽釋放素2、激肽釋放素5、激肽釋放素6、激肽釋放素L1、激肽釋放素L2、激肽釋放素L3、激肽釋放素L4、激肽釋放酶結合蛋白(kallistatin)、KC、KDR、角質形成細胞生長因子(KGF)、角質形成細胞生長因子-2 (KGF-2)、KGF、類殺手免疫球蛋白受體、Kit配體(KL)、Kit酪胺酸激酶、層黏蛋白5、LAMP、LAPP(澱粉素，胰島類澱粉蛋白多肽)、LAP (TGF-1)、潛在相關肽、潛在性TGF-1、潛在性TGF-1 bp1、LBP、LDGF、LDL、LDL受體、LECT2、左素、瘦素、促黃體素(leutinizing hormone，LH)、路易士-Y抗原、路易士-Y相關抗原、LFA-1、LFA-3、LFA-3受體、Lfo、LIF、LIGHT、脂蛋白、LIX、LKN、Lptn、L-選擇素、LT-a、LT-b、LTB4、LTBP-1、肺界面活性劑、促黃體素、淋巴細胞趨化素(lymphotactin)、淋巴毒素β受體、溶血神經鞘脂受體、Mac-1、巨噬細胞-CSF (M-CSF)、MAdCAM、MAG、MAP2、MARC、乳腺絲胺酸蛋白酶抑制劑(maspin)、MCAM、MCK-2、MCP、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-1 (MCAF)、M-CSF、MDC、MDC (67個胺基酸)、MDC (69個胺基酸)、絲胺酸蛋白酶抑制抗體(megsin)、Mer、MET酪胺酸激酶受體家族、金屬蛋白酶、膜糖蛋白OX2、間皮素、MGDF受體、MGMT、MHC (HLA-DR)、微生物蛋白、MIF、MIG、MIP、MIP-1α、MIP-1β、MIP-3α、MIP-3β、MIP-4、MK、MMAC1、MMP、MMP-1、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-2、MMP-24、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、單核球吸引劑蛋白、單核球聚落抑制因子、小鼠促性腺激素相關蛋白、MPIF、Mpo、MSK、MSP、MUC-16、MUC18、黏液素(Mud)、穆勒氏抑制物質、Mug、MuSK、髓磷質相關糖蛋白、骨髓前驅細胞抑制劑因子-1(myeloid progenitor inhibitor factor-1，MPIF-1)、NAIP、奈米體、NAP、NAP-2、NCA 90、NCAD、N-鈣黏蛋白、NCAM、腦啡肽酶、神經細胞黏附分子、神經絲胺酸(neroserpin)、神經元生長因子(neuronal growth factor，NGF)、神經營養分子-3、神經營養分子-4、神經營養分子-6、神經氈1、神經秩蛋白、NGF-β、NGFR、NKG20、N-甲硫胺醯基人類生長激素、nNOS、NO、Nogo-A、Nogo受體、來自肝炎C病毒的非結構性蛋白3型(NS3)、NOS、Npn、NRG-3、NT、NT-3、NT-4、NTN、OB、OGG1、抑瘤素M、OP-2、OPG、OPN、OSM、OSM受體、骨誘導因子、骨橋蛋白、OX40L、OX40R、氧化LDL、p150、p95、PADPr、副甲狀腺激素、PARC、PARP、PBR、PBSF、PCAD、P-鈣黏蛋白、PCNA、PCSK9、PDGF、PDGF受體、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PDGF-D、PDK-1、PECAM、PEDF、PEM、PF-4、PGE、PGF、PGI2、PGJ2、PIGF、PIN、PLA2、胎盤生長激素、胎盤鹼性磷酸酶(placental alkaline phosphatase，PLAP)、胎盤催乳激素、血纖維蛋白溶酶原活化子抑制劑-1、血小板生長因子、plgR、PLP、不同尺寸的多元醇鏈(例如PEG-20、PEG-30、PEG-40)、PP14、前激肽釋放肽、普里昂蛋白、前降鈣素、計畫性細胞死亡蛋白1、前胰島素、促乳素、前蛋白轉化酶PC9、前鬆弛素、前列腺特異性膜抗原(prostate specific membrane antigen，PSMA)、蛋白質A、蛋白質C、蛋白質D、蛋白質S、蛋白質Z、PS、PSA、PSCA、PsmAr、PTEN、PTHrp、Ptk、PIN、P-選擇素糖蛋白配體-1、R51、RAGE、RANK、RANKL、RANTES、鬆弛素、鬆弛素A-鏈、鬆弛素B-鏈、腎素、呼吸道融合瘤病毒(respiratory syncytial virus，RSV)F、Ret、內質網蛋白4、風濕性因子、RLI P76、RPA2、RPK-1、RSK、RSV Fgp、S100、RON-8、SCF/KL、SCGF、抑硬素、SDF-1、SDF1α、SDF1β、SERINE、血清類澱粉蛋白P、血清白蛋白、sFRP-3、Shh、類志賀毒素II、SIGIRR、SK-1、SLAM、SLPI、SMAC、SMDF、SMOH、SOD、SPARC、神經胺醇1-磷酸酯受體、金黃色葡萄球菌脂磷壁酸、Stat、STEAP、STEAP-II、幹細胞因子(stem cell factor，SCF)、鏈球菌激酶、超氧化歧酶(superoxide dismutase)、配體蛋白聚醣1、TACE、TACI、TAG-72(腫瘤相關糖蛋白-72)、TARC、TB、TCA-3、T-細胞受體α/β、TdT、TECK、TEM1、TEM5、TEM7、TEM8、生腱蛋白、TERT、類睪丸PLAP鹼性磷酸酶、TfR、TGF、TGF-α、TGF-β、TGF-β泛特異性、TGF-βRII、TGF-βRIIb、TGF-βRIII、TGF-βRI (ALK-5)、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、TGF-β5、TGF-I、凝血酶、血小板生成素(thrombopoietin，TPO)、胸腺基質淋巴蛋白質受體(thymic stromal lymphoprotein receptor)、胸腺Ck-1、甲狀腺刺激激素(thyroid stimulating hormone，TSH)、甲狀腺素、甲狀腺素-結合蛋白、Tie、TIMP、TIQ、組織因子、組織因子蛋白酶抑制劑、組織因子蛋白、TMEFF2、Tmpo、TMPRSS2、TNF受體I、TNF受體II、TNF-α、TNF-β、TNF-β2、TNFc、TNF-RI、TNF-RII、TNFRSF10A (TRAIL R1 Apo-2/DR4)、TNFRSF10B (TRAIL R2 DR5/KILLER/TRICK-2A/TRICK-B)、TNFRSF10C (TRAIL R3 DcR1/LIT/TRID)、TNFRSF10D (TRAIL R4 DcR2/TRUNDD)、TNFRSF11A (RANK ODFR/TRANCE R)、TNFRSF11B (OPG OCIF/TR1)、TNFRSF12 (TWEAK R FN14)、TNFRSF12A、TNFRSF13B (TACI)、TNFRSF13C (BAFF R)、TNFRSF14 (HVEM ATAR/HveA/LIGHT R/TR2)、TNFRSF16 (NGFR p75NTR)、TNFRSF17 (BCMA)、TNFRSF18 (GITR AITR)、TNFRSF19 (TROY TAJ/TRADE)、TNFRSF19L (RELT)、TNFRSF1A (TNF R1 CD20a/p55-60)、TNFRSF1B (TNF RII CD120b/p75-80)、TNFRSF21 (DR6)、TNFRSF22 (DcTRAIL R2 TNFRH2)、TNFRSF25 (DR3 Apo-3/LARD/TR-3/TRAMP/WSL-1)、THFRSF26 (TNFRH3)、TNFRSF3 (LTbR TNF RIII/TNFC R)、TNFRSF4 (OX40 ACT35/TXGP1 R)、TNFRSF5 (CD40 p50)、TNFRSF6 (Fas Apo-1/APT1/CD95)、TNFRSF6B (DcR3 M68/TR6)、TNFRSF7 (CD27)、TNFRSF8 (CD30)、TNFRSF9 (4-1 BB CD137/ILA)、TNFRST23 (DcTRAIL R1 TNFRH1)、TNFSF10 (TRAIL Apo-2配體/TL2)、TNFSF11 (TRANCERANK配體ODF/OPG配體)、TNFSF12 (TWEAK Apo-3配體/DR3配體)、TNFSF13 (APRIL TALL2)、TNFSF13B (BAFF BLYS/TALL1/THANK/TNFSF20)、TNFSF14 (LIGHT HVEM配體/LTg)、TNFSF15 (TL1A/VEG1)、TNFSF18 (GITR配體AITR配體/TL6)、TNFSF1A (TNF-a Conectin/DIF/TNFSF2)、TNFSF1B (TNF-b LTa/TNFSF1)、TNFSF3 (LTb TNFC/p33)、TNFSF4 (OX40配體p34TXGP1)、TNFSF5 (CD40配體CD154/gp39/HIGM1/IMD3/TRAP)、TNFSF6 (Fas配體Apo-1配體/APT1配體)、TNFSF7 (CD27配體CD70)、TNFSF8 (CD30配體CD153)、TNFSF9 (4-1 BB配體CD137配體)、TNF-α、TNF-β、TNIL-1、毒性代謝物、TP-1、t-PA、Tpo、TRAIL、TRAIL R、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRANCE、轉鐵蛋白受體、轉形生長因子(transforming growth factor，TGF)如TGF-α及TGF-β、穿膜糖蛋白NMB、轉甲狀腺素蛋白、TRF、Trk、TROP-2、滋胚層糖蛋白、TSG、TSLP、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、腫瘤相關抗原CA125、表現腫瘤相關抗原的路易士Y相關碳水化合物、TWEAK、TXB2、Ung、uPAR、uPAR-1、尿激酶、VAP-1、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、內臟脂肪特異性絲胺酸蛋白酶抑制劑(vaspin)、VCAM、VCAM-1、VECAD、VE-鈣聯素、VE-鈣聯素-2、VEFGR-1 (flt-1)、VEFGR-2、VEGF受體(VEGF receptor，VEGFR)、VEGFR-3 (flt-4)、VEGI、VIM、病毒抗原、VitB12受體、玻璃粘連蛋白受體(Vitronectin receptor)、VLA、VLA-1、VLA-4、VNR整合素、溫韋伯氏因子(von Willebrand Factor，vWF)、WIF-1、WNT1、WNT10A、WNT10B、WNT11、WNT16、WNT2、WNT2B/13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9B、XCL1、XCL2/SCM-1-β、XCL1/淋巴細胞趨化因子、XCR1、XEDAR、XIAP及XPD。

特異性地表現T細胞的具體範例包括CD3及T細胞受體。特別地，較佳為CD3。例如於人類CD3的情況中，CD3中本發明的抗原結合分子所結合的位點可為呈現於構成人類CD3的γ鏈、δ鏈、或ε鏈中的任何抗原決定基。特別地，較佳為呈現於人類CD3複合物中ε鏈的細胞外區的抗原決定基。構成CD3的γ鏈、δ鏈、或ε鏈結構的多核苷酸序列係顯示於序列編號: 170 (NM_000073.2)、172 (NM_000732.4)及174 (NM_000733.3)，且其多肽序列係顯示於序列編號: 171 (NP_000064.1)、173 (NP_000723.1)及175 (NP_000724.1)(RefSeq登錄編號係顯示於括弧內)。

本發明的抗原-結合分子所包括的抗原的兩個可變區之一者，結合至不同於上述「CD3」及「CD137」的「第三抗原」。一些實施例中，該第三抗原係衍生自人類、小鼠、大鼠、猴、兔或犬。一些實施例中，該第三抗原為特異性地表現於衍生自人類、小鼠、大鼠、猴、兔或犬的細胞或器官的分子。該第三抗原較佳地為不全身性表現於細胞或器官的分子。該第三抗原較佳地為，例如，腫瘤細胞特異性抗原且亦包括與細胞的惡性改變以及於細胞的惡性轉形期間於細胞表面或蛋白質分子出現的異常糖鏈一起表現的抗原。其具體範例包括ALK受體(多效生長因子受體)、多效生長因子、KS 1/4胰臟癌抗原、卵巢癌抗原(CA125)、前列腺酸性磷酸、前列腺特異性抗原(prostate-specific antigen，PSA)、黑色素瘤相關抗原p97、黑色素瘤抗原gp75、高分子量黑色素瘤抗原(high-molecular-weight melanoma antigen，HMW-MAA)、前列腺特異性膜抗原、癌胚胎抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、多型性上皮黏蛋白抗原、人類乳脂球抗原、直腸腫瘤相關抗原(例如，CEA、TAG-72、CO17-1A、GICA、CTA-1及LEA)、伯奇氏淋巴瘤抗原38.13、CD19、人類B淋巴瘤抗原CD20、CD33、黑色素瘤特異性抗原(例如，神經節苷酯GD2、神經節苷酯GD3、神經節苷酯GM2及神經節苷酯GM3)、腫瘤特異性移植抗原(tumor-specific transplantation antigen，TSTA)、T抗原、病毒誘發腫瘤抗原(例如，DNA腫瘤病毒及RNA腫瘤病毒的外膜抗原)、大腸CEA、癌胚抗原α-胎兒蛋白(例如，癌胚滋胚層糖蛋白5T4及癌胚膀胱腫瘤抗原)、分化抗原(例如，人類肺癌抗原L6及L20)、纖維肉瘤抗原、人類T細胞白血病相關抗原Gp37、新生兒糖蛋白、鞘磷脂、乳癌抗原(例如，EGFR(epithelial growth factor receptor，表皮生長因子受體))、NY-BR-16、NY-BR-16及HER2抗原(p185HER2)、多型性表皮黏蛋白(polymorphic epithelial mucin，PEM)、惡性人類淋巴球抗原APO-1、分化抗原例如於胎兒紅血球中發現的I抗原、於成人紅血球中發現的原內胚層I抗原、於移植前的胚胎中或於胃癌中發現的I(Ma)、於乳腺上皮細胞中發現的M18、M39、於骨髓細胞中發現的SSEA-1、VEP8、VEP9、Myl、VIM-D5、於大腸直腸癌中發現的D156-22、TRA-1-85(血液群H)、於睪丸及子宮癌中發現的SCP-1、於大腸癌中發現的C14、於肺癌中發現的F3、於胃癌中發現的AH6、Y半抗原、於胚胎癌細胞中發現的Ley、TL5 (血液群A)、於A4312細胞中發現的EGF受體、於胰臟癌中發現E1系列(血液群B)、於胚胎癌細胞中發現的FC10.2、胃癌抗原、於腺癌中發現的CO-514 (血液群Lea)、於腺癌中發現的NS-10、CO-43 (血液群Leb)、於A431細胞EGF受體中發現的G49、於大腸癌中發現的MH2(血液群ALeb/Ley)、於大腸癌中發現的19.9、胃癌黏蛋白、於骨髓細胞中發現的T5A7、於黑色素瘤中發現的R24、於胚胎癌細胞中發現的4.2、GD3、D1.1、OFA-1、GM2、OFA-2、GD2及M1:22:25:8、於4-細胞至8-細胞胚胎中發現的SSEA-3及SSEA-4、皮膚T細胞淋巴瘤相關抗原、MART-1抗原、唾液酸Tn (sialyl Tn，STn)抗原、大腸癌抗原NY-CO-45、肺癌抗原NY-LU-12變體A、腺癌抗原ART1、副腫瘤性相關腦-睪丸癌抗原(致癌神經元抗原MA2及副腫瘤性神經元抗原)、神經致癌性腹抗原2 (neurooncological ventral antigen 2，NOVA2)、血球細胞癌抗原基因520、腫瘤相關抗原CO-029、腫瘤相關抗原MAGE-C1 (癌/睪丸抗原CT7)、MAGE-B1 (MAGE-XP抗原)、MAGE-B2 (DAM6)、MAGE-2、MAGE-4a、MAGE-4b、MAGE-X2、癌-睪丸抗原(NY-EOS-1)、YKL-40、及該等多肽的任何片段，以及其經修飾結構物(前述之經修飾的磷酸基、糖鏈等)、EpCAM、EREG、CA19-9、CA15-3、唾液酸SSEA-1 (SLX)、HER2、PSMA、CEA及CLEC12A。

本文中用語「CD137」，亦稱為4-1BB，為腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)受體家族的成員。屬於TNF超級家族或TNF受體超級家族的因子的範例，包括CD137、CD137L、CD40、CD40L、OX40、OX40L、CD27、CD70、HVEM、LIGHT、RANK、RANKL、CD30、CD153、GITR及GITRL。

一態樣中，本發明的抗原結合分子具有選自下述(1)至(4)所組成的群組之至少一特徵：
(1) 可變區結合至包含序列編號: 91的胺基酸序列的CD3ε (epsilon)的細胞外域，
(2) 抗原結合分子具有針對CD137的促效活性，
(3) 抗原結合分子誘發T細胞針對表現第三抗原的分子的細胞的CD3活化，但不誘發針對表現CD137的細胞的T細胞的活化，以及
(4) 抗原結合分子於表現第三抗原的分子的細胞不存下不誘發自PBMC的細胞介素釋放。

一態樣中，本發明的抗原-結合分子具有選自下述(1)至(4)所成群組之至少一特徵：
(1) 可變區結合至包含序列編號: 91的胺基酸序列的CD3ε (epsilon)的細胞外域，
(2) 抗原結合分子具有針對CD137的促效活性，
(3) 抗原結合分子誘發T細胞針對表現第三抗原的分子的細胞的細胞毒性，但不誘發針對表現CD137的細胞的T細胞的活化，以及
(4) 抗原結合分子於表現第三抗原的分子的細胞不存下不誘發自PBMC的細胞介素釋放。
一些實施例中，本發明的抗原結合分子具有選自下述(1)至(2)所組成的群組之至少一特徵：
(1) 抗原結合分子不與CD137配體競爭對CD137的結合，以及
(2) 抗原結合分子誘發T細胞針對表現第三抗原的分子的細胞的細胞毒性，但不誘發針對表現CD137的細胞的T細胞的細胞毒性。

一態樣中，本發明的「CD137促效劑抗體」或「具有針對CD137的促效活性的抗原結合分子」意指當添加至表現CD137的細胞、組織或活體時，活化表現CD137的細胞至少約5%、具體地至少約10%或更具體地至少約15%的細胞的抗體或抗原結合分子，其中0%活化為表現CD137之非活化細胞的背景程度(例如，IL-6分泌等)。各種具體範例中，使用作為本發明的醫藥組成物的CD137促效劑抗體可活化細胞活性至少約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%、750%或1000%。
一態樣中，本發明的「CD137促效劑抗體」或「具有針對CD137的促效活性的抗原結合分子」也意指當添加至表現CD137的細胞、組織或活體時，活化表現CD137的細胞至少約5%、具體地至少約10%或更具體地至少約15%的細胞的抗體或抗原-結合分子，其中100%活化為於生理條件下，由等莫耳量的結合夥伴達成的活化程度。各種具體範例中，使用作為本發明的醫藥組成物的CD137促效劑抗體可活化細胞活性至少約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%、750%或1000%。某些實施例中，使用於本文之「結合夥伴」為已知結合至CD137且誘發表現CD137的細胞的活化的分子。另一些實施例中，結合夥伴的範例包括揭示於WO2005/035584A1的Urelumab (CAS註冊No. 934823-49-1)及其變體、揭示於WO012/032433A1的Utomilumab(CAS註冊No. 1417318-27-4)及其變體以及各種已知的CD137促效劑抗體。某些實施例中，結合夥伴的範例包括CD137配體。另一些實施例中，藉由抗CD137促效劑抗體之表現CD137的細胞的活化可使用ELISA決定以特徵化IL6分泌(參照，例如本文中實施例10-2)。用作為結合夥伴的抗CD137抗體以及用於測定的抗體濃度可參照實施例10-2，其中100%活化為由抗體達成的活化的程度。另一些實施例中，可以30ug/mL，將包含序列編號: 69的重鏈胺基酸序列以及序列編號: 71的輕鏈胺基酸序列的抗體用於測定作為結合夥伴(參照，例如本文中實施例10-2)。

作為非限制性實施例，本發明提供包含Fc區的「CD137促效劑抗體」，其中Fc區對於抑制性Fcγ受體具有增強的結合活性。

作為非限制性實施例，CD137促效劑活性可使用B細胞證實，該B細胞已知於其表面表現CD137。作為非限制性實施例，HDLM-2 B細胞株可用作為B細胞。由於IL-6的表現因為CD137的活化而受到誘發，故CD137促效劑活性可藉由所產生的人類介白素-6 (Interleukin-6，IL-6)的量予以評估。此評估中，藉由使用來自非活性B細胞的IL-6的量作為0%背景程度而評估IL-6表現的增加量，來決定所評估的分子具有多少%的CD137促效劑活性是有可能的。

一些實施例中，本發明的抗原結合分子誘發T細胞針對表現第三抗原的分子的細胞的CD3活化，但不誘發T細胞針對表現CD137的細胞的CD3活化。可藉由例如於抗原結合分子的存在下，共培養T細胞與表現第三抗原的細胞，且測定T細胞的CD3活化，來決定抗原結合分子是否誘發T細胞針對表現第三抗原的細胞的CD3活化，。T細胞活化可藉由，例如使用回應於CD3傳信而表現報導子基因(例如，螢光素酶)的重組T細胞，且偵測報導子基因的表現或報導子基因產物的活性作為T細胞的活化指標而予以測定。當回應於CD3傳信而表現報導子基因的重組T細胞，於抗原-結合分子的存在下與表現第三抗原的細胞共培養時，以依賴於抗原結合分子的劑量的方式偵測到報導子基因的表現或報導子基因產物的活性，指示抗原結合分子誘發T細胞針對表現第三抗原的細胞的活化。類似地，抗原結合分子是否不誘發T細胞針對表現CD137的細胞的CD3活化可藉由，例如於抗原結合分子的存在下共培養T細胞與表現CD137的細胞，且如上所述地測定T細胞的CD3活化而予以決定。當回應於CD3傳信而表現報導子基因的重組T細胞，於抗原結合分子的存在下與表現CD137的細胞共培養時，若報導子基因的表現或報導子基因產物的活性不存在或低於偵測界限或低於陰性對照，決定抗原結合分子不誘發T細胞針對表現CD137的細胞的活化。一態樣中，當表現回應於CD3傳信的報導子基因的重組T細胞於抗原結合分子存在下與表現CD137的細胞共培養時，若報導子基因的表現或該報導子基因產物的活性至多為約50%、30%、20%、10%、5%或1%，其中由同時結合至CD3及CD137的抗原結合分子所達成的活化程度為100%活化，，則決定該抗原結合分子不誘發T細胞針對表現CD137的細胞的活化。一態樣中，當於表現回應於CD3傳信而表現報導子基因的重組T細胞，於抗原結合分子的存在下與表現CD137的細胞共培養時，若報導子基因的表現或該報導子基因產物的活性至多為約50%、30%、20%、10%、5%或1%，其中由針對表現第三抗原的分子的細胞的相同抗原結合分子所達成的活化程度為100%活化，則決定該抗原結合分子不誘發針對表現CD137的細胞的T細胞活化。

一些實施例中，於表現第三抗原的分子的細胞不存在下，本發明的抗原結合分子不誘發自PBMC的細胞介素釋放。可藉由例如將PBMC與抗原結合分子於表現第三抗原的細胞不存在下培養，且使用所屬技術領域習知的方法測定自PBMC釋放至培養上清的細胞介素如IL-2、IFNγ及TFNα，來決定抗原結合分子於表現第三抗原的分子的細胞不存在下是否不誘發細胞介素的釋放。，。若於表現第三抗原的細胞不存在下，偵測到無顯著程度的細胞介素或於已經與抗原結合分子培養之PBMC的培養上清中發生無顯著誘發細胞介素表現，決定抗原結合分子於表現第三抗原的細胞不存在下，不誘發自PBMC的細胞介素釋放。一態樣中，「無顯著程度的細胞介素」也意指細胞介素濃度的程度為約至多50%、30%、20%、10%、5%或1%，其中由同時結合至CD3及CD137的抗原結合分子所達成的細胞介素濃度為100%活化。一態樣中，「無顯著誘發的細胞介素」也意指細胞介素濃度的程度為約至多50%、30%、20%、10%、5%或1%，其中100%活化為表現第三抗原的分子的細胞存在下所達成的細胞介素濃度。一態樣中，「無顯著誘發的細胞介素表現」也意指細胞介素濃度的程度增加為添加抗原結合分子前之各細胞介素濃度的至多5倍、2倍或1倍。

一些實施例中，本發明的抗原結合分子與選自由下述所組成的群組的抗體競爭對CD137的結合：
(a) 包含具有序列編號: 30的胺基酸序列的VH序列及具有序列編號: 51的胺基酸序列的VL序列的抗體，
(b) 包含具有序列編號: 46的胺基酸序列的VH序列及具有序列編號: 53的胺基酸序列的VL序列的抗體，
(c) 包含具有序列編號: 40的胺基酸序列的VH序列及具有序列編號: 56的胺基酸序列的VL序列的抗體，
(d) 包含具有序列編號: 30的胺基酸序列的VH序列及具有序列編號: 58的胺基酸序列的VL序列的抗體，以及
(e) 包含具有序列編號: 40的胺基酸序列的VH序列及具有序列編號: 61的胺基酸序列的VL序列的抗體。

一些實施例中，本發明的抗原結合分子與選自由下述所組成的群組的抗體結合至相同的抗原決定基：
[1] 包含序列編號: 98的胺基酸序列作為重鏈可變區以及序列編號: 99的胺基酸序列作為輕鏈可變區的抗體；
[2] 包含序列編號: 100的胺基酸序列作為重鏈可變區以及序列編號: 101的胺基酸序列作為輕鏈可變區的抗體；
[3] 包含序列編號: 102的胺基酸序列作為重鏈可變區以及序列編號: 103的胺基酸序列作為輕鏈可變區的抗體；
[4] 包含序列編號: 104的胺基酸序列作為重鏈可變區以及序列編號: 105的胺基酸序列作為輕鏈可變區的抗體；
[5] 包含序列編號: 106的胺基酸序列作為重鏈可變區以及序列編號: 107的胺基酸序列作為輕鏈可變區的抗體；
[6] 包含序列編號: 108的胺基酸序列作為重鏈可變區以及序列編號: 109的胺基酸序列作為輕鏈可變區的抗體；
[7] [1]至[6]中任一抗體中，包含序列編號: 110的胺基酸序列作為重鏈恆定區以及序列編號: 111的胺基酸序列或序列編號: 112的胺基酸序列作為輕鏈恆定區的抗體；以及
[8] 具有相等於[1]至[7]中任一抗體的活性的抗體；以及
[9] 結合至與[1]至[7]中任一抗體所結合的抗原決定基相同的抗原決定基的抗體。

[8]的抗體中，「相等活性」意指CD137促效劑活性為[1]至[7]中任一抗體的結合活性的70%或更多，較佳為80%或更多，以及更佳為90%或更多。

測試抗體是否與某抗體共有共同抗原決定基可根據兩個抗體之間對於相同抗原決定基的競爭而予以評估。可藉由交叉封阻測試等來偵測抗體之間的競爭。例如，競爭性ELISA測試為較佳的交叉封阻測試。具體地，於交叉封阻測試中，用於被覆微量滴定盤的孔的CD137蛋白質係於候選競爭抗體的存在或不存在下預培養，然後對其添加本發明的抗CD137抗體。於孔中結合至CD137蛋白質之本發明的抗CD137抗體的量，係不直接相關於競爭結合至相同抗原決定基的候選競爭抗體(測試抗體)的結合活性。亦即，測試抗體對於相同的抗原決定基的親和性越大，結合至CD137蛋白質被覆孔的本發明之抗CD137抗體的量越低，且結合至CD-137蛋白質被覆孔的測試抗體的量越高。

可輕易地藉由事先標記的抗體，來決定結合至孔的抗體量。例如，可使用卵白素/過氧化酶接合物(avidin/peroxidase conjugate)及合適的受質來測定生物素標記的抗體。特別地，使用例如過氧化酶的酵素標記物的交叉封阻測試被稱為「競爭性ELISA測試」。可以能偵測或測量的其他標記物質，來標記抗體。具體地，放射標記、螢光標記等為習知。

再者，當測試抗體具有衍生自與本發明的抗CD137抗體的物種不同的物種的恆定區時，可藉由使用辨識該抗體的恆定區的經標記抗體，來測量結合至孔的抗體的量。或者，若抗體衍生自相同物種但屬於不同類別，可使用分辨各類別的抗體，來測定結合至孔的抗體量。

相較於候選競爭抗體不存在下所進行的對照試驗中所獲得的結合活性，若候選抗體可封阻抗CD137抗體的結合至少20%，較佳至少20%至50%，以及甚至更佳至少50%，候選競爭抗體為與本發明的抗C137抗體為實質上結合至相同的抗原決定基的抗體或競爭結合至相同的抗原決定基的抗體。

另一實施例中，可使用例如習知於所屬技術領域的BIAcore分析或流體細胞術之標準結合測試，由所屬技術領域中具有通常知識者適當地測定測試抗體與另一抗體競爭性或交叉競爭性(cross competitively)結合的能力。

測定抗原決定基的空間構形的方法包括，例如，X射線結晶法及二維核磁共振(參照，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, G. E. Morris (ed.), Vol. 66 (1996))。

亦可基於測試抗體及CD137配體對於相同的抗原決定基之間的競爭，來評估測試抗體是否與CD137配體共有共同抗原決定基。可藉由如上述的交叉封阻測試等，來偵測抗體及CD137配體之間的競爭。另一實施例中，可使用如習知於所屬技術領域的BIAcore分析或流體細胞術之標準的結合測試，由所屬技術領域中具有通常知識者適當地測定測試抗體與CD137配體競爭性或交叉競爭性結合的能力。

一些實施例中，本發明的抗原結合分子的較佳範例包括結合至與選自由下述所成的群組的抗體所結合的人類CD137抗原決定基相同的抗原決定基的抗原結合分子：
於人類CD137蛋白質中辨識包含SPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRT RKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGC序列(序列編號: 81)的區的抗體，
辨識包含DCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGC序列(序列編號: 76)的區的抗體，
辨識包含LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQ CKGVFRTRKECSSTSNAEC序列(序列編號: 79)的區的抗體，以及
辨識包含LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQIC序列(序列編號: 74)的區的抗體。

取決於靶定的癌抗原，所屬技術領域中具有通常知識者可適當地選擇結合至癌抗原的重鏈可變區序列及輕鏈可變區序列，以用於欲包括於癌特異性抗原結合域的重鏈可變區及輕鏈可變區。當由抗原結合域結合的抗原決定基係含有於複數個不同抗原中時，含有抗原結合域的抗原結合分子可結合至具有該抗原決定基的多種抗原。

「抗原決定基」意指抗原中的抗原性決定子，且指稱對於本文所揭示的抗原結合分子中的各種結合域所結合的抗原位點。因此，例如，可根據其結構來界定抗原決定基。或者，可根據辨識該抗原決定基的抗原結合分子的抗原結合活性，來界定抗原決定基。當抗原係肽或多肽時，可藉由形成該抗原決定基的胺基酸殘基，來將抗原決定基具體化。或者，當抗原決定基係糖鏈時，可藉由其特異性糖鏈結構，來具體化抗原決定基。

線性抗原決定基為含有其一級胺基酸序列被辨識的抗原決定基的抗原決定基。這種線性抗原決定基於其特異性序列中典型地含有至少3個且最常見至少5個，例如約8至10或6至20個胺基酸。

相對於線性抗原決定基，「構形抗原決定基」係其中含有該抗原決定基的一級胺基酸序列不是經辨識的抗原決定基的唯一決定子的抗原決定基(例如，構形抗原決定基的一級胺基酸序列不一定為被抗原決定基-界定抗體所辨識)。相較於線性抗原決定基，構形抗原決定基可含有較大數目的胺基酸。構形抗原決定基-辨識抗體辨識肽或蛋白質的三維結構。例如，當蛋白質分子摺疊且形成三維結構，形成構形抗原決定基的胺基酸及/或多肽主鏈變成對準(aligned)，且使該抗原決定基成為可由抗體辨識。決定構形抗原決定基的方法包括，例如，X射線結晶法、二維核磁共振光譜法、位點特異自旋標記(site-specific spin labeling)及電子順磁共振光譜(electron paramagnetic resonance spectroscopy)，但不限於此，參照，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology (1996), Vol. 66, Morris (ed)。

癌特異性抗原中抗原決定基被抗原結合分子結合的評估方法範例顯示於下文。根據下文範例，靶抗原中抗原決定基被另一結合域結合的評估方法亦可適當地進行。

例如，包含用於癌特異性抗原的抗原結合域的測試抗原結合分子是否辨識抗原分子中的線性抗原決定基，例如可如下文所述予以證實。例如，包含形成癌特異性抗原的細胞外域的胺基酸序列的線性肽係經合成用於上述目的。肽可為化學性合成，或藉由使用編碼對應於細胞外域的胺基酸序列的癌特異性抗原的cDNA中的域的基因工程技術所獲得。然後，含有用於癌特異性抗原的抗原結合域的測試抗原結合分子，係評估其對於包含構成細胞外域的胺基酸序列的線性抗原決定基的結合活性。例如，固定化的線性肽可使用作為抗原，以藉由ELISA評價對於肽的抗原結合分子的結合活性。或者，對於線性肽的結合活性可基於線性肽抑制抗原結合分子對癌特異性抗原表現細胞的結合的程度予以評估。對於線性肽的抗原結合分子的結合活性可由該等測試展現。

含有對於抗原的抗原結合域的上述測試抗原結合分子是否辨識構形抗原決定基，可如下文所述予以證實。例如，包含用於癌特異性抗原的抗原結合域的抗原結合分子，在接觸時強力地結合至癌特異性抗原表現細胞，但不實質上結合至包含形成該癌特異性抗原的細胞外域的胺基酸序列之固定化的線性肽。本文中，「不實質上結合」意指相較於對抗原表現細胞的結合活性，使用抗原表現細胞作為抗原ELISA 或螢光活化細胞分選(fluorescence activated cell sorting，FACS)的結合活性為80%或更少，通常為50%或更少，較佳為30%或更少以及特別較佳為15%或更少。

ELISA格式中，包含對於抗原表現細胞的抗原結合域的測試抗原結合分子的結合活性，可藉由比較以酵素反應所產生的信號程度予以定量地評估。具體地，測試抗原結合分子係添加至抗原表現細胞被固定化至其上的ELISA盤。然後，使用辨識測試抗原結合分子的經酵素標記的抗體偵測結合至該細胞的測試抗原結合分子。或者，當使用FACS時，製備系列稀釋的測試抗原-結合分子，且可決定對於抗原表現細胞的抗體結合力價，以比較測試抗原結合分子對於抗原表現細胞的結合活性。

可使用流式細胞術，來偵測測試抗原結合分子對在懸浮於緩衝液等之細胞的表面上表現的抗原的的結合。習知的流式細胞術包括，例如，下述裝置：
FACSCanto™ II
FACSAria™
FACSArray™
FACSVantage™ SE
FACSClibur™ (所有皆為BD Biosciences的商品名稱)
EPICS ALTRA HyPreSort
Cytomics FC 500
EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC
Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC (所有皆為Beckman Coulter的商品名稱)

評估包含抗原結合域的上述測試抗原結合分子對於抗原的結合活性的合適方法包括，例如，下述方法。首先，抗原表現細胞與測試抗原結合分子反應，然後使用FACSCalibur (BD)以經標記FITC的二級染色。使用CELL QUEST軟體(BD)藉由分析獲得的螢光強度，亦即幾何平均值，反應經結合至細胞的抗體定量。亦即，可藉由測量該幾何平均值來測定測試抗原結合分子的結合活性，其係藉由經結合的測試抗原結合分子的定量所表示。

包含本發明之抗原結合域的抗原結合分子是否與另一抗原結合分子共有共同的抗原決定基，可基於兩個分子之間對相同決定基的競爭予以評估。抗原結合分子之間的競爭可藉由交叉封阻測試等予以偵測。例如，競爭性ELISA為較佳的交叉封阻測試。

具體地，於交叉封阻測試中，被覆微量滴定盤的孔的抗原係於候選競爭抗原結合分子的存在或不存在下預培養，然後對其添加測試抗原結合分子。結合至孔中的抗原之測試抗原結合分子的定量，係非直接地相關於競爭對相同抗原決定基之結合的候選競爭抗原結合分子的結合活性。亦即，競爭抗原結合分子對於相同抗決定基的親和性越大，測試抗原結合分子對於抗原被覆孔的結合活性越低。

可輕易地藉由預先標記抗原結合分子，來測量經由抗原結合至孔的測試抗原結合分子的定量。例如，可使用卵白素/過氧化酶接合物和適當的受質，來測量經生物素標記的抗原結合分子。特別地，使用例如過氧化酶的酵素標記的交叉封阻測試係稱為「競爭性ELISA測試」。亦可用能偵測或測量的其他標記物質，來標記抗原結合分子。具體地，放射標記、螢光標記等為習知。
相較於在競爭抗原結合分子不存在下所進行的對照試驗中的結合活性，當候選競爭抗原結合分子可封阻包含抗原結合域的測試抗原結合分子的結合活性至少20%、較佳至少20至50%、及更佳至少50%時，決定該測試抗原結合分子實質上結合至由競爭抗原結合分子所結合的相同抗原決定基，或競爭對相同抗原決定基的結合。

當由包含本發明的抗原結合域的抗原結合分子所結合的抗原決定基的結構已經鑑定時，可藉由比較兩個抗原結合分子對於藉由導入胺基酸突變至形成抗原決定基的肽所製備的肽的結合活性，來測試及對照抗原結合分子是否共有共同的抗原決定基。

作為測量這種結合活性的方法，例如，測試及對照抗原結合分子對於經導入突變之線性肽的結合活性，可藉由於上述ELISA格式中的比較而測量。除了ELISA方法之外，對於結合至管柱的突變肽的結合活性可藉由使測試及對照抗原結合分子經過管柱，然後定量沖提於沖提物中的抗原結合分子。吸收突變肽至管柱的方法，例如以GST融合肽的形式為習知。

或者，當經鑑定的抗原決定基為構形抗原決定基時，測試及對照抗原結合分子是否共有共同的抗原決定基，可藉由下述方法予以評估。首先，製備表現由抗原結合分子所靶定之抗原的細胞以及表現具有經導入突變的抗原決定基的細胞。對藉由懸浮該等細胞於例如PBS之適當的緩衝液中所製備的細胞懸浮物添加測試及對照抗原結合分子。然後，以緩衝液適當地清洗細胞懸浮物，且對其添加可辨識測試及對照抗原結合分子之經FITC標記的抗體。使用FACSCalibur(BD)，來決定以經標記之抗體染色的細胞的螢光強度及數目。使用適當的緩衝液來稀釋測試及對照抗原結合分子，且以所期望的濃度使用。例如，其等可於10μ/ml至10ng/ml範圍內的濃度使用。使用CELL QUEST軟體(BD)分析所決定的螢光強度，亦即幾何平均值，反應接合至細胞的經標記之抗體的定量。亦即，可藉由測量該幾何平均值，來測定測試及對照抗原結合分子的結合活性，其由所結合之經標記之抗體的定量所表示。

一些具體實施例中，本發明的抗原結合分子包含由於序列編號: 92所述的重鏈可變域序列和/或序列編號: 93所述的輕鏈可變域序列所組成的模板序列中導入一或多個胺基酸的改變所造成的胺基酸序列，其中該一或多個胺基酸包含選自下述位置的至少一胺基酸：
H鏈：31、52b、52c、53、54、56、57、61、98、99、100、100a、100b、100c、100d、100e、100f、及100g (Kabat編號)；及
L鏈：24、25、26、27、27a、27b、27c、27e、30、31、33、34、51、52、53、54、55、56、74、77、89、90、92、93、94、及96 (Kabat編號)，
其中經改變的重鏈可變域序列的HVR-H3包含選自下述的至少一胺基酸：
Ala、Pro、Ser、Arg、His或Thr於胺基酸位置98；
Ala、Ser、Thr、Gln、His或Leu於胺基酸位置99；
Tyr、Ala、Ser、Pro或Phe於胺基酸位置100；
Tyr、Val、Ser、Leu或Gly於胺基酸位置100a；
Asp、Ser、Thr、Leu、Gly或Tyr於胺基酸位置100b；
Val、Leu、Phe、Gly、His或Ala於胺基酸位置100c；
Leu、Phe、Ile或Tyr於胺基酸位置100d；
Gly、Pro、Tyr、Gln、Ser或Phe於胺基酸位置100e；
Tyr、Ala、Gly、Ser或Lys於胺基酸位置100f；
Gly、Tyr、Phe或Val於胺基酸位置100g (Kabat編號)。

本發明的抗原結合分子可藉由所屬技術領域中具有通常知識者習知的方法製造。例如，抗體可藉由下文所述的方法製備，但製備本發明的抗體的方法不限於此。宿主細胞及表現載體的許多組合於所屬技術領域中已知用於藉由將編碼多肽之經單離基因轉移至適當宿主之抗體製備。所有該等表現系統可應用於單離本發明的抗原結合分子。於使用真核細胞作為宿主細胞的情況中，可適當地使用動物細胞、植物細胞或真菌細胞。具體地，動物細胞的範例可包括下述細胞：
(1) 哺乳動物細胞如CHO (中國倉鼠卵巢細胞株(Chinese hamster ovary cell line))、COS (猴腎細胞株)、骨髓瘤細胞(Sp2/O、NS0等)、BHK(幼年倉鼠腎細胞株(baby hamster kidney cell line))、HEK293 (帶有經剪切的腺病毒(adenovirus，Ad) 5 DNA的人類胚胎腎細胞株)、PER.C6細胞(經腺病毒5型(adenovirus type 5，Ad5)E1A及E1B基因轉形的人類胚胎腎細胞株)、Hela及Vero (Current Protocols in Protein Science (May, 2001, Unit 5.9, Table 5.9.1))；
(2) 兩棲類細胞如蟾蜍卵細胞；及
(3) 昆蟲細胞如sf9、sf21、及Tn5。
抗體也可使用大腸桿菌(E. coli )(mAbs 2012 Mar-Apr; 4(2): 217-225)或酵母菌(WO2000023579)製備。使用大腸桿菌製備的抗體為非糖基化。另一方面，使用酵母菌製備的抗體為經糖基化。

表現抗體的編碼可變域中具有由感興趣的不同胺基酸所取代之一或多個胺基酸殘基的重鏈之編碼抗體重鏈的DNA，以及編碼輕鏈的DNA。例如可藉由獲得編碼由所屬技術領域習知的方法所製備之針對某抗原的抗體可變域的DNA，且適當地導入取代使得域中編碼特定胺基酸的密碼子編碼感興趣的不同胺基酸，來獲得編碼於可變域中具有由感興趣的不同胺基酸所取代之一或多個胺基酸殘基的重鏈或輕鏈的DNA。

或者，可事先設計編碼其中藉由所屬技術領域習知的方法針對某抗原所製備的抗體可變域中的一或多個胺基酸殘基由感興趣的不同胺基酸所取代的蛋白質的DNA，且可化學性合成以獲得編碼於可變域中具有由感興趣的不同胺基酸所取代的一或多個胺基酸殘基的重鏈的DNA。胺基酸取代位點及取代的類型並不特別限制。用於胺基酸改變的較佳區的範例包括可變區中的溶劑暴露區及環。其等之中，較佳為CDR1、CDR2、CDR3、FR3及環。具體地，較佳為H鏈可變域中Kabat編號位置31至35、50至65、71至74及95至102，以及L鏈可變域中Kabat編號位置24至34、50至56及89至97。更佳為H鏈可變域中Kabat編號位置31、52a至61、71至74及97至101，以及L鏈可變域中Kabat編號位置24至34、51至56及89至96。
胺基酸改變不限制於取代且可為刪除、加成、插入或修改、或其組合。

編碼具有於可變域中由感興趣的不同胺基酸所取代的一或多個胺基酸殘基的重鏈的DNA，亦可製備為分開的部分DNA。部分DNA的組合的範例包括，但不限於：編碼可變域的DNA及編碼恆定域的DNA；以及編碼Fab域的DNA及編碼Fc域的DNA。同樣地，編碼輕鏈的DNA亦可製備為分開的部分DNA。

該等DNA可藉由下述方法表現：例如，編碼重鏈可變域的DNA，與編碼重鏈恆定域的DNA一起整合至表現載體以構築重鏈表現載體。同樣地，編碼輕鏈可變域的DNA，與編碼輕鏈恆定域的DNA一起整合至表現載體以構築輕鏈表現載體。該等重鏈及輕鏈基因可整合至單一載體。

編碼感興趣的抗體的DNA整合至表現載體，以於表現控制區例如增強子及啟動子的控制下表現。其次，以所得的表現載體將宿主細胞轉形且允許表現抗體。此情況中，可組合使用適當的宿主細胞及表現載體。

載體的範例包括M13系列載體、pUC系列載體、pBR322、pBluescript及pCR-Script。除了該等載體之外，例如，亦可使用pGEM-T、pDIRECT或pT7於cDNA次選殖及切割的目的。

特別地，表現載體有用於將載體使用於製造本發明的抗體的目的。例如，當宿主為大腸桿菌如JM109、DH5α、HB101、或XL1-Blue時，表現載體不可缺地具有於大腸桿菌中允許有效率表現的啟動子，例如，lacZ啟動子(Ward et al., Nature(1989) 341, 544-546；及FASEB J. (1992) 6, 2422-2427，其全文以參考方式併入本文)、araB啟動子(Better et al., Science (1988) 240, 1041-1043，其全文以參考方式併入本文)、或T7啟動子。這種載體的範例包括上述載體以及pGEX-5X-1(由Pharmacia製造)、「QIAexpress system」(由Qiagene N. V.製造)、pEGFP、以及pET (此情況中，宿主較佳為表現T7 RNA聚合酶的BL21)。

載體可含有用於多肽分泌的信號序列。在大腸桿菌的周質(periplasm)中製造的情況，可使用pelB信號序列(Lei, S. P. et al., J. Bacteriol. (1987) 169, 4397，其全文以參考方式併入本文)作為用於多肽分泌的信號序列。可藉由使用，例如，脂染法、磷酸鈣法、或DEAE-葡聚糖法，將載體轉移至宿主細胞。

除了用於大腸桿菌的表現載體之外，用於製造本發明的多肽的載體範例包括哺乳動物衍生的表現載體(例如，pcDNA3 (由Invitrogen公司製造)、pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res. 1990, 18(17), p. 5322，其全文以參考方式併入本文)、pEF及pCDM8)、昆蟲細胞衍生的表現載體(例如，「Bac-to-BAC桿狀病毒表現系統」(由GIBCOL BRL製造)及pBacPAK8)、植物衍生的表現載體(例如，pMH1及pMH2)、動物病毒衍生的表現載體(例如，pHSV、pMV、及pAdexLew)、反轉錄病毒衍生的表現載體(例如，pZIPneo)、酵母菌衍生的表現載體(例如，「Pichia Expression Kit」(由Invitrogen公司製造)、pNV11、及SP-Q01)、以及枯草桿菌(Bacillus subtilis )衍生的表現載體(例如，pPL608及pKTH50)。

為了於動物細胞例如CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞、或HEK293細胞中表現的目的，載體不可缺地具有細胞內表現所需要的啟動子，例如，SV40啟動子(Mulligan et al., Nature (1979) 277, 108，其全文以參考方式併入本文)、MMTV-LTR啟動子、EF1α啟動子(Mizushima et al., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322，其全文以參考方式併入本文)、CAG啟動子(Gene. (1991) 108, 193，其全文以參考方式併入本文)、或CMV啟動子，且更佳地，具有用於篩選經轉形的細胞的基因(例如，藉由藥物(新黴素、G418等)可作用為記號的藥物抗性基因)。具有這種性質的載體的範例包括pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、及pOP13。此外，EBNA1蛋白質可與其共表現用於增加基因套數數目的目的。此情況中，使用具有複製原點OriP的載體(Biotechnol Bioeng. 2001 Oct 20; 75 (20: 197-203；及Biotechnol Bioeng. 2005 Sep 20; 1 (6): 670-7)。

意圖安定地表現基因及增加細胞內基因套數的數目的例示性方法涉及以具有作為其互補的DHFR基因的載體(例如，pCHOI)，將核酸合成途徑有缺陷的CHO細胞轉形以及於基因擴增中使用甲胺蝶呤(methotrexate，MTX)。意圖瞬時地表現基因的例示性方法涉及使用於其染色體具有SV40 T抗原基因的COS細胞，以用具有SV40的複製原點的載體(pcD等)將細胞轉形。亦可使用衍生自多瘤病毒、腺病毒、牛乳突病毒(bovine papillomavirus，BPV)等的複製原點。為了於宿主細胞系統中增加基因套數的數目，表現載體可含有選擇記號如胺基糖苷磷酸轉移酶(aminoglycoside phosphotransferase，APH)基因、胸苷激酶(thymidine kinase，TK)基因、大腸桿菌黃嘌呤鳥糞嘌呤磷酸核糖轉移酶(E. coli xanthine guanine phosphoribosyltransferase，Ecogpt)基因、或二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase，dhfr)基因。

可藉由例如，培養經轉形的細胞，然後自分子-轉形細胞中或自其培養溶液分離抗體，來回收抗體。可適當地組合使用例如離心、硫酸銨區分、鹽析、超過濾、C1q、FcRn、蛋白質A及蛋白質G管柱、親和性管柱、離子交換層析、及凝膠過濾層析的方法，來分離及純化抗體。

上述技術，例如鈕-至-洞(knobs-into-holes)技術((WO1996/027011；Ridway JB et al., Protein Engineering (1996) 9, 617-621；以及Merchant AM et al., Nature Biotechnology (1998) 16, 677-681)或藉由導入電荷排斥而壓抑H鏈之間的不意圖的締合的技術(WO2006/106905)，可應用於有效率地製備多特異性抗體的方法。

本發明更提供用於製造本發明的抗原結合分子的方法，且更具體地提供製造抗原結合分子的方法，前述抗原結合分子包含：能結合至兩種不同抗原(第一抗原及第二抗原)的抗體可變區，但不同時結合至CD3及CD137(此可變區亦指稱為第一可變區)；以及結合至不同於CD3及CD137的第三抗原的可變區(此可變區亦指稱為第二可變區)，該方法包含製備含有該第一可變區的多樣胺基酸序列的抗原結合分子庫的步驟。

其範例可包括包含下述步驟的製造方法：
(i) 製備於其等之各自結合至CD3或CD137的抗體可變區中具有至少一個胺基酸改變的抗原結合分子庫，其中該經改變的可變區彼此至少一個胺基酸；
(ii) 由所製備的庫，選擇包含具有針對CD3及CD137的結合活性，但不同時結合至CD3及CD137的可變區的抗原結合分子；
(iii) 培養包含編碼步驟(ii)中所選擇的抗原結合分子的可變區的核酸、以及編碼結合至第三抗原的抗原結合分子的可變區的核酸之宿主細胞，以表現包含能結合至CD3及CD137，但不同時結合至CD3及CD137的抗體可變區以及結合至第三抗原的可變區的抗原結合分子；以及
(iv) 由宿主細胞培養物回收抗原結合分子。

此製造方法中，步驟(ii)可為下述選擇步驟：
(v) 從所製備的庫，選擇包含具有針對CD3及CD137的結合活性，但不同時結合至個別表現於不同細胞的CD3及CD137的可變區的抗原結合分子。

步驟(i)中所使用的抗原結合分子不特別限制，只要該等分子各自包含抗體可變區。抗原結合分子可為抗體片段如Fv、Fab、或Fab’，或可為含有Fc區的抗體。

欲改變的胺基酸係選擇自，例如其改變不取消於結合至CD3或CD137的抗體可變區中，對抗原的結合的胺基酸。

本發明中，可單獨使用一個胺基酸改變，或可組合使用複數個胺基酸改變。
在組合使用複數個胺基酸改變的情況中，欲組合的改變的數目不特別限制，且例如為2或更多及30或更少，較佳為2或更多及25或更少、2或更多及22或更少、2或更多及20或更少、2或更多及15或更少、2或更多及10或更少、2或更多及5或更少、或2或更多及3或更少。
欲組合的複數的胺基酸改變可僅添加至抗體重鏈可變域或輕鏈可變域或可適當地分布於重鏈可變域及輕鏈可變域二者。

對於胺基酸改變的較佳區的範例包括可變區中的溶劑暴露區及環。其等之中，較佳為CDR1、CDR2、CDR3、FR3及環。具體地，較佳為H鏈可變域中Kabat編號位置31至35、50至65、71至74及95至102，以及L鏈可變域中Kabat編號位置24至34、50至56及89至97。更佳為H鏈可變域中Kabat編號位置31、52a至61、71至74及97至101，以及L鏈可變域中Kabat編號位置24至34、51至56及89至96。

胺基酸殘基的改變也包括：結合至CD3或CD137的抗體可變域中的上述區中的胺基酸的隨機改變；以及先前已知具有針對CD3或CD137的結合活性的肽對上述區的插入。可從因此而改變的抗原結合分子中，選擇能結合至CD3及CD137，但不能同時結合至該等抗原的可變區，來獲得本發明的抗原結合分子。

可根據上述方法，來證實可變區是否能結合至CD3及CD137，但不同時結合至該等抗原，以及進一步地，當CD3及CD137之任一者存在於細胞而另一抗原單獨存在、該等抗原二者各自單獨存在、或該等抗原二者存在於相同細胞，該可變區是否能同時結合至CD3及CD137二者，但無法同時結合至各自表現於不同細胞的該等抗原。

本發明人們已成功地開發出更有效率地結合至二或更多不同抗原的抗原結合域的方法。
一些實施例中，本發明之結合至至少二或更多種感興趣的不同抗原的抗原結合域的篩選方法包含：
(a) 提供包含複數個抗原結合域的庫，
(b) 將步驟(a)提供的庫與感興趣的第一抗原接觸以及收集結合至該第一抗原的抗原結合域，
(c) 將步驟(b)所收集的抗原結合域與感興趣的第二抗原接觸以及收集結合至該第二抗原的抗原結合域，以及
(d) 擴增編碼步驟(c)所收集的抗原結合域的基因以及鑑定候選抗原結合域，
其中，該方法不包含於步驟(b)及步驟(c)之間，擴增編碼步驟(b)所收集的抗原結合域的核酸。
上述方法中，將抗原結合域與抗原接觸的步驟數不特別限制。一些實施例中，當感興趣的抗原數為二或更多時，本發明的篩選方法可包含三或更多個接觸步驟。另一些實施例中，本發明的篩選方法可包含二或更多個將抗原結合域與一或更多個感興趣的抗原各者接觸的步驟。此情況中，抗原結合域可以任意順序與各抗原接觸。例如，抗原結合域可依序地與各抗原接觸二次或更多次，或先與一抗原接觸一或多次，然後在與相同抗原再次接觸之前與其他抗原接觸。甚至當本發明的篩選方法包含三或更多個抗原結合域與抗原接觸的步驟時，該方法不包含於任何二連續的接觸步驟之間，擴增編碼所收集的抗原結合域的核酸。

一些實施例中，本發明的抗原結合域為Fab、scFv、Fab’2、VHH、VH、或VL。
一些實施例中，本發明的抗原結合域為藉由融合抗原結合域與支架以交聯抗原結合域與編碼該抗原結合域的核酸而形成。

一些實施例中，使用為酸性溶液、鹼性溶液、DTT或IdeS的沖提溶液，於上述步驟(b)及(c)中進行沖提。
某些實施例中，使用於本發明的上述步驟(b)及(c)的沖提溶液為EDTA或IdeS。

一些實施例中，本發明之結合至至少二或更多種感興趣的不同抗原的抗原結合域的篩選方法包含：
(a) 提供包含複數個抗原-結合域的庫，
(b) 將步驟(a)提供的庫與感興趣的第一抗原接觸以及收集結合至該第一抗原的抗原結合域，
(b)’ 轉譯編碼步驟(b)所收集的抗原結合域的核酸，
(c) 將步驟(b)所收集的抗原結合域與感興趣的第二抗原接觸以及收集結合至該第二抗原的抗原結合域，以及
(d) 擴增編碼步驟(c)所收集的抗原結合域的基因以及鑑定候選抗原結合域，
其中，該方法不包含於步驟(b)及步驟(c)之間，擴增編碼步驟(b)所收集的抗原-結合域的核酸。

某些實施例中，本發明之結合至至少二或更多種感興趣的不同抗原的抗原-結合域的製造方法包含：
(a) 提供包含複數個抗原結合域的庫，
(b) 將步驟(a)提供的庫與感興趣的第一抗原接觸以及收集結合至該第一抗原的抗原結合域，
(c) 將步驟(b)所收集的抗原-結合域與感興趣的第二抗原接觸以及收集結合至該第二抗原的抗原結合域，以及
(d) 擴增編碼步驟(c)所收集的抗原結合域的基因以及鑑定候選抗原結合域，
(e) 將編碼步驟(d)所選擇的候選抗原結合域的多核苷酸與編碼包含Fc區的多肽的多核苷酸連接，
(f) 培養經導入載體的細胞，該載體中上述步驟(d)所獲得的多核苷酸係經可操作地連結，以及
(g) 自上述步驟(f)所培養的細胞的培養溶液收集抗原結合分子，
其中，該方法不包含於步驟(b)及步驟(c)之間，擴增編碼步驟(b)所收集的抗原結合域的核酸。

些實施例中，本發明的抗原結合分子係藉由上述方法所製備的抗體。

一態樣中，本發明的篩選方法使獲得更有效率地結合至至少二或更多種感興趣的不同抗原的抗原結合域成為可能。

本說明書中，「庫」指稱複數個抗原結合分子或複數個包含抗原結合分子、或編碼該等序列的核酸或多核苷酸的融合多肽。庫中所包括的複數個抗原結合分子或複數個包含抗原結合分子的融合多肽，為不具有單一序列、彼此序列的抗原結合分子，或包含抗原結合分子的融合多肽。某些實施例中，本發明的庫為設計庫。另一些實施例中，設計庫為WO2016/076345中所揭示的設計庫。

本發明的一實施例中，可製備本發明的抗原結合分子的融合多肽與異源性多肽。一實施例中，融合多肽可包含與選自由下述所組成的群組的病毒外殼蛋白質的至少一部分融合的本發明的抗原結合分子，例如病毒外殼蛋白質pIII、pVIII、pVII、pIX、Soc、Hoc、gpD、及pVI，及其變體。

一實施例中，本發明的抗原結合分子可為ScFv、Fab片段、F(ab)₂ 、或F(ab’)₂ 。另一實施例中，本發明提供主要由彼此序列不同的複數個融合多肽所組成的庫，該融合多肽各自包含任何該等抗原結合分子及異源性多肽。具體地，本發明提供主要由彼此序列不同的複數個融合多肽所組成的庫，該融合多肽包含與選自由下述所組成的群組的病毒外殼蛋白質的至少一部分融合的任何該等抗原結合分子，例如病毒外膜蛋白質pIII、pVIII、pVII、pIX、Soc、Hoc、gpD、及pVI，及其變體。本發明的抗原結合分子可更包含二倍體化域。一實施例中，二倍體化域可位於抗體重鏈或輕鏈可變域及該病毒外殼蛋白質的至少一部分之間。此二倍體化域可包含至少一個二倍體化序列及/或包含一或多個半胱胺酸殘基的序列。此二倍體化域可較佳地連接至重鏈可變域或恆定域的C終端。二倍體化域可假設多種結構，取決於抗體可變域是否製備為具有病毒外膜蛋白質成分的融合多肽成分(在二倍體化域之後的琥珀終止密碼子不存在)或取決於是否優位地(predominantly)製備抗體可變域而不包含病毒外殼蛋白質成分(例如，在二倍體化域之後的琥珀終止密碼子存在)。當抗體可變域優位地製備為具有病毒外殼蛋白質的融合多肽時，藉由一或多個雙硫鍵及/或單一的二倍體化序列來產生二價展示。

本文所述的彼此序列不同的複數個抗原結合分子中的用語「彼此序列不同」意指庫中的個別抗原結合分子具有相異的序列。具體地，庫中相異的序列的數目反應庫中獨立純株相異的序列的數目，且亦可指稱為「庫尺寸」。通常噬菌體展示庫的庫尺寸為10⁶ 至10¹² ，且可藉由所屬技術領域習知技術的應用，例如核糖體展示方法，可擴充至10¹⁴ 。然而，使用用於噬菌體庫的淘選選擇的噬菌體顆粒的真實數目，通常為10至10,000倍較大於庫尺寸。此過多的倍數，也稱為「庫之均等物的數目」，表示10至10,000個個別純株可具有相同的胺基酸序列。因此，本發明所述的用語「彼此序列不同」意指，排除庫之均等物的數目的庫中的個別抗原結合分子具有相異的序列，且更具體地意指庫具有10⁶ 至10¹⁴ ，較佳10⁷ 至10¹² ，更佳10⁸ 至10¹¹ ，特別佳10⁸ 至10¹⁰ 個彼此序列不同的抗原結合分子。

如本文所述之「噬菌體展示」指稱其變體多肽係展示為具有於例如絲狀噬菌體之噬菌體的顆粒表面的外殼蛋白質的至少一部分的融合蛋白質的方案。噬菌體展示為有用的，因為隨機化的蛋白質變體的大庫可快速地且有效率地篩選以高親和性結合至靶抗原的序列。於噬菌體的肽及蛋白質庫的展示已使用於對數百萬個多肽篩選具有特異性結合性質者。經由與絲狀噬菌體基因III或基因VIII融合，多價噬菌體展示方法已使用於展示小隨機肽及小蛋白質(Wells and Lowman, Curr. Opin. Struct. Biol. (1992) 3, 335-362；以及該文中所引用的參考文獻)。單價噬菌體展示涉及使蛋白質或肽庫融合至基因III或其部分，以及於野生型基因III蛋白質的存在下以低程度表現融合蛋白質，使得各噬菌體顆粒展示一套或無融合蛋白質。單價噬菌體具有比多價噬菌體更低的親留性(avidity)功效，因此使用噬粒(phagemid)載體基於內源性配體親和性來篩選，其簡化DNA操作(Lowman and Wells, Methods: A Companion to Methods in Enzymology (1991) 3, 205-216)。

「噬粒」指稱具有細菌複製原點的質體載體，例如ColE1，以及一套噬菌體的基因間之區。可適當地使用衍生自所屬技術領域習知的任何噬菌體，例如，絲狀噬菌體或λ狀噬菌體(lambdoid phage)的噬粒，。通常，質體亦含有對於抗生素耐性的選擇性記號。選殖至該等載體中的DNA片段可生長為質體。當帶有該等質體的細胞擁有對於噬菌體顆粒的製造為必要的所有基因時，質體的複製模式偏移至滾環式複製(rolling circle replication)，以形成多套的一質體DNA股及包裝體噬菌體顆粒。噬粒可形成感染性或非感染性噬菌體顆粒。此用語包括包含藉由基因融合與異源性多肽基因結合的噬菌體外殼蛋白質基因或其片段的噬粒，使得該異源性多肽展示於該噬菌體顆粒的表面。

用語「噬菌體載體」意指包含異源性基因且能複製的雙股複製性噬菌體。噬菌體載體具有允許噬菌體複製及噬菌體顆粒形成的噬菌體複製原點。噬菌體較佳為絲狀噬菌體，例如M13、f1、fd、或Pf3噬菌體或其衍生物，或λ狀噬菌體，例如λ、21、phi80、phi81、82、424、434、或任何其他噬菌體或其衍生物。

用語「外殼蛋白質」指稱蛋白質，其至少一部分係呈現在病毒顆粒的表面。就功能性立場，外殼蛋白質係於宿主細胞中病毒構築的過程中結合至病毒顆粒，且直到病毒感染其他宿主細胞為止保持與其結合的任意蛋白質。外殼蛋白質可為主要外殼蛋白質或可為次要外殼蛋白質。次要外殼蛋白質通常為以較佳至少接近5，更佳至少接近7，再佳至少接近10或更多蛋白質套數每病毒體，存在於病毒殼體的外殼蛋白質。主要外殼蛋白質可以數十、數百、或數千套數每病毒體存在。主要外殼蛋白質的範例包括絲狀噬菌體p8蛋白質。

本文所述之「核糖體展示」指稱藉由其變體多肽展示於核糖體的方案(Nat. Methods 2007 Mar; 4(3): 269-79, Nat. Biotechnol. 2000 Dec; 18(12): 1287-92, Methods Mol. Biol. 2004; 248: 177-89)。較佳地，核糖體展示方法需要編碼變體多肽的核酸具有像大腸桿菌secM之適當的核糖體失速序列(ribosome stalling sequence)(J. Mol. Biol. 2007 Sep 14; 372(2): 513-24)或不具有終止密碼子。較佳地，編碼變體多肽的核酸也具有間隔子序列。如本文所使用地，用語「間隔子序列」意指一系列核酸，其編碼融合至變體多肽的肽，以使變體多肽在轉譯後通過核糖體隧道且允許變體多肽表現其功能。任何活體外轉譯系統可使用於核糖體展示，例如，大腸桿菌S30系統、PURE系統、兔網狀紅血球裂解物系統(rabbit reticulocyte lysate system)或無穀類生殖細胞轉譯系統。

用語「寡核苷酸」指稱短的單股或雙股多去氧核苷酸，其藉由所屬技術領域習知的方法化學合成(例如，使用固相方案如EP266032所述之方案的磷酸三酯、亞磷酸、或亞磷醯胺化學；或Froeshler et al., Nucl. Acids. Res. (1986) 14, 5399-5407所述之經由去氧核苷酸H-磷酸酯中間體的方法)。用於寡核苷酸合成的其他方法包括下文所述的聚合酶鏈鎖反應及其他自動引子方法以及於固體支持物的寡核苷酸合成。所有該等方法描述於Engels et al., Agnew. Chem. Int. Ed. Engl. (1989)28, 716-734。若基因的全核酸序列為已知或若可取得互補於編碼股的核酸序列，則使用該等方法。或者，若靶胺基酸序列為已知，可使用編碼各胺基酸殘基的已知及較佳的殘，來適當地預測可能的核酸序列。可使用聚丙烯醯胺凝膠(polyacrylamide gel)或分子大小分級管柱(molecular sizing column)或藉由沉澱，來純化寡核苷酸。

用語「核酸的擴增」指稱增加核酸莫耳數的試驗過程。作為非限制實施例，核酸包括單股RNA (single-stranded RNA，ssRNA)、雙股DNA (double-stranded DNA，dsDNA)或單股DNA (single-stranded DNA，ssDNA)。作為非限制實施例，PCR (polymerase chain reaction，聚合酶鏈鎖反應)通用地(generically)使用作為擴增核酸的方法，但可使用任何可擴增核酸的方法。或者，當核酸載體導入至該等宿主細胞時，核酸可於宿主細胞中擴增。作為非限制實施例，電穿孔、熱休克、具有載體的噬菌體或病毒感染、或化學藥劑可使用於將核酸導入至細胞。或者，DNA轉錄或mRNA反轉錄後將其轉錄亦可擴增核酸。作為非限制實施例，噬粒載體導入至大腸桿菌中通用地使用於擴增編碼結合域的核酸，但PCR亦能使用於噬菌體展示技術。核糖體展示、cDNA展示、mRNA展示及CIS展示中，通用地使用PCR方法或轉錄以擴增核酸。

用語「融合蛋白質」及「融合多肽」指稱具有彼此連接的兩個節段(segment)的多肽。多肽中的該等節段的特性不同。例如，此特性可為如活體外或活體內活性的生物性質。或者，特性可為單一化學或物理性質，例如，結合至靶抗原或反應的催化。可直接經由單一肽鍵或經由含有一或多個胺基酸殘基的肽連接子連接該等二節段。通常，該等二節段及連接子係位於相同的讀框。較佳地，自異源性或不同的多肽獲得多肽的兩個節段。

「藉由融合抗原結合域與支架所形成的融合蛋白質」中的用語「支架」指稱交聯抗原結合域與編碼抗原結合域的核酸的分子。作為非限制實施例，噬菌體展示中的噬菌體外殼蛋白質、核糖體展示中的核糖體、mRNA或cDNA展示中的嘌呤黴素、CIS展示中的RepA蛋白質、病毒展示中的病毒外殼蛋白質、哺乳動物細胞展示中的哺乳動物細胞膜錨定蛋白質、酵母菌展示中的酵母菌細胞膜錨定蛋白質、細菌展示或大腸桿菌展示中的細菌細胞膜錨定蛋白質等，可使用作為各展示方法中的支架。

本發明中，用語「一或多個胺基酸」不限定於特定數目的胺基酸且可為2或更多類型的胺基酸、5或更多類型的胺基酸、10或更多類型的胺基酸、15或更多類型的胺基酸、或20或更多類型的胺基酸。

至於融合多肽展示，抗原結合分子的可變區的融合多肽可以各種形式展示於細胞、病毒、核糖體、DNA、RNA或噬菌體顆粒的表面。該等形式包括單鏈Fv片段(single chain Fv fragment，scFv)、F(ab)片段、及該等片段的多價形式。多價形式較佳為ScFv、Fab、及F(ab’)二倍體，本文中其分別被稱為(ScFv)2、F(ab)2、及F(ab’)2。多價形式的展示為較佳，可能部分因為經展示的多價形式通常允許低親和性純株的鑑定及/或於選擇過程中具有允許稀有純株的有效率選擇的複數個抗原結合位點。

於噬菌體表面展示包含抗體片段的融合多肽的方法為所屬技術領域習知且描述於，例如WO1992001047及本案說明書。其他相關方法揭示於WO1992020791、WO1993006213、WO1993011236及1993019172。所屬技術領域中具有通常知識者可適當地使用該等方法。其他公開文獻(H.R. Hoorenboom & G. Winter (1992) J. Mol. Biol. 227, 381-388、WO1993006213及WO1993011236)揭示使用針對各種展示於噬菌體表面的抗原的人工重排可變區基因組(repertoire)來鑑定抗體。

在構築用於以scFv形式展示的載體的情況中，此載體包含編碼抗原結合分子的輕鏈可變域及重鏈可變域的核酸序列。一般而言，編碼抗原結合分子的重鏈可變域的核酸序列，係與編碼病毒外殼蛋白質組分(constituent)的核酸序列融合。編碼抗原結合分子的輕鏈可變域的核酸序列，係經由編碼肽連接子的核酸序列，連接至抗原結合分子的重鏈可變域核酸。肽連接子通常含有接近5至15個胺基酸。視需要地，編碼例如有用於純化或偵測的標籤的額外序列，可與編碼抗原結合分子的輕鏈可變域的核酸序列的3’端或編碼抗原結合分子的重鏈可變域的核酸序列的3’端、或二者融合。

在構築用於以F(ab)形式展示的載體的情況中，此載體包含編碼抗原結合分子的可變域及抗原結合分子的恆定域的核酸序列。編碼輕鏈可變域的核酸序列係與編碼輕鏈恆定域的核酸序列融合。編碼抗原結合分子的重鏈可變域的核酸序列係與編碼重鏈恆定CH1域的核酸序列融合。一般而言，編碼重鏈可變域及恆定域的核酸序列，係與編碼病毒外殼蛋白質整體或一部分的核酸序列融合。重鏈可變域及恆定域較佳係表現為具有病毒外殼蛋白質的至少一部分的融合產物，而輕鏈可變域及恆定域係由重鏈病毒外殼融合蛋白質分開地表現。重鏈及輕鏈可經由共價鍵或非共價鍵彼此締合。視需要地，編碼例如有用於純化或偵測的標籤的額外序列，可與編碼抗原結合分子的輕鏈恆定域的核酸序列的3’端或編碼抗原結合分子的重鏈恆定域的核酸序列的3’端、或二者融合。

至於載體轉移至宿主細胞，如上所述構築的載體係轉移至宿主細胞用以擴增及/或表現。可藉由所屬技術領域習知的轉形方法包括電穿孔、磷酸鈣沉澱等，將載體轉移至宿主細胞。當載體為感染性顆粒例如病毒時，載體本身侵入宿主細胞。藉由用具有編碼該融合蛋白質的多肽插入物之可複製的表現載體轉染宿主細胞，且藉由所屬技術領域習知的方案製造噬菌體顆粒，以於噬菌體顆粒的表面展示融合蛋白質。

可藉由使用各種方法，將可複製的表現載體轉移至宿主細胞。非限制實施例中，可藉由WO2000106717所述的電穿孔，將載體轉移至宿主細胞。細胞於標準培養基中於37℃培養，視需要地接近約6至48小時(或直到於600nm的OD達到0.6至0.8)。其次，離心培養基，且移除培養上清(例如，藉由傾析(decantation))。於純化的起始階段，細胞沉澱物較佳地重新懸浮於緩衝溶液(例如，1.0mM HEPES (pH 7.4))。其次，再次離心懸浮液以移除上清。所得細胞沉澱物重新懸浮於稀釋至例如5至20% V/V的甘油。再次離心懸浮液用以移除上清以獲得細胞沉澱物。細胞沉澱物重新懸浮於水或經稀釋甘油。基於所測得之所得懸浮物的細胞密度，使用水或經稀釋甘油調整最終細胞密度至所期望的密度。

較佳的接受細胞的範例包括能回應於電穿孔的大腸桿菌菌株SS320 (Siduh et al., Methods Enzymol. (2000) 328, 333-363)。已藉由於足以用於將繁殖附加體(F’質體)或XL1-BLUE轉移進入MC1061細胞的條件下，偶合MC1061細胞與XL1-BLUE而製備大腸桿菌菌株SS320。大腸桿菌菌株SS320以寄存編號No. 98795已寄存於ATCC (10801 University Boulevard, Manassas, Virginia)。於此菌株中允許噬菌體複製的任何F’附加體可使用於本發明。可自寄存於ATCC的菌株獲得或可以市售產品獲得(TG1、CJ236、CSH18、DHF’、ER2738、JM101、JM103、JM105、JM107、JM109、JM110、KS1000、XL1-BLUE、71-18等)適當的附加體。

電穿孔中使用較高DNA濃度(接近10倍)改良轉形頻率及增加轉形宿主細胞的DNA的量。使用高細胞密度也改良效率(接近10倍)。增加轉移的DNA的量可產生具有較大多樣性及更多序列不同的獨立純株的庫。通常基於含有抗生素的培養基中的生長存在或不存在，來選擇經轉形的細胞。

本發明更提供編碼本發明的抗原結合分子的核酸。本發明的核酸可為任何形式，例如DNA或RNA。

本發明更提供包含本發明的核酸的載體。根據接受載體的宿主細胞，可適當地由所屬技術領域中具有通常知識者選擇載體的類型。例如，可使用上述任何載體。

本發明更關於以本發明的載體轉形的宿主細胞。可由本發明所屬技術領域中具有通常知識者適當地選擇宿主細胞。例如，可使用上述任何宿主細胞。

本發明也提供包含本發明的抗原結合分子及醫藥上可接受的載劑的醫藥組成物。可藉由用醫藥上可接受的載劑補充本發明的抗原結合分子，根據所屬技術領域習知的方法，來調配本發明的醫藥組成物。例如，可以有水或其他醫藥上可接受的溶液之無菌溶液或懸浮液的腸胃外注射的形式使用醫藥組成物。例如，醫藥組成物可調配為與抗原結合分子混合於一般接受的醫藥實施所需的單位劑形，與醫學上可接受的載劑或媒劑(media)適當的組合，具體地為無菌水、生理鹽水、植物油、乳化劑、懸浮劑、界面活性劑、安定劑、調味劑、賦形劑、媒介劑、防腐劑、結合劑等。載劑的具體範例可包括輕無水矽酸、乳糖、結晶纖維素、甘露醇、澱粉、羧甲基纖維素鈣(carmellose calcium)、羧甲基纖維素鈉(carmellose sodium)、羥丙基纖維素(hydroxypropylcellulose)、羥丙基甲基纖維素(hydroxypropylmethylcellulose)、聚乙烯基縮醛二乙基胺基乙酸酯(polyvinyl acetal diethylaminoacetate)、聚乙烯吡咯啶酮(polyvinylpyrrolidone)、明膠、中鏈脂肪酸三甘油酯、聚氧乙烯輕化蓖麻油60 (polyoxyethylene hydrogenated castor oil 60)、多醣、羧甲基纖維素(carboxymethylcellulose)、玉米澱粉及無機鹽類。決定這種製劑中活性成分的量，使得可達成調劑範圍內的適當劑量。

可使用媒介劑例如可注射蒸餾水，根據傳統醫藥實施來調配用於注射的無菌組成物。用於注射之水溶液的範例包括生理鹽水、含有葡萄糖及其他佐劑之等張溶液，佐劑例如為D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇及氯化鈉。該等溶液可與適當的助溶劑組合使用，例如，醇(具體地，乙醇)或多元醇(例如，丙二醇(propylene glycol)及乙二醇(polyethylene glycol))或非離子性界面活性劑，例如，聚山梨醇酯 80(TM)或HCO-50。

油性溶液的範例包括芝麻油及大豆油。該等溶液可與作為助溶劑的苯甲酸苯甲酯(benzyl benzoate)或苯甲醇(benzyl alcohol)組合使用。溶液可進一步與緩衝劑(例如，磷酸鹽緩衝溶液及乙酸鈉緩衝溶液)、舒緩劑(例如，鹽酸普卡因(procaine hydrochloride))、安定劑(例如，苯甲醇及酚)及抗氧化劑混合。由此所製備的注射溶液通常裝填至適當的安瓿(ampule)。本發明之醫藥組成物較佳為腸胃外地投藥。其劑型的具體範例包括注射、鼻內投藥劑、經肺投藥劑、及經皮投藥劑。注射的範例包括靜脈內注射、肌肉內注射、腹腔內注射、及皮下注射，透過這些，醫藥組成物可全身性或局部性投藥。

投藥方法可根據患者的年齡及症狀而合適地選擇。含有多肽或編碼多肽的多核苷酸的醫藥組成物的劑量可於，例如，每次劑量為0.0001至1000 mg/kg體重的範圍內選擇。或者，劑量可於，例如，患者的0.001至100000 mg/患者體重的範圍內選擇，然而劑量不一定限制為該等數值。雖然劑量及投藥方法根據患者的體重、年齡、症狀等而變化，所屬技術領域中具有通常知識者可合適地選擇劑量及方法。

本發明也提供包含投藥本發明的抗原結合分子的步驟之治療癌症的方法、用於治療癌症之本發明的抗原結合分子、本發明的抗原結合分子用於癌症的治療劑的製造的用途、以及包含使用本發明之抗原-結合分子的步驟之製造用於癌症的治療劑的製程。

使用於本文中之胺基酸的三字母代號及對應的一字母代號係定義如下述：丙胺酸(alanine): Ala及A、精胺酸(arginine): Arg及R、天冬醯胺(asparagine): Asn及N、天冬胺酸(aspartic acid): Asp及D、半胱胺酸(cysteine): Cys及C、麩醯胺(glutamine): Gln及Q、麩胺酸(glutamic acid): Glu及E、甘胺酸(glycine): Gly及G、組胺酸(histidine): His及H、異白胺酸(isoleucine): Ile及I、白胺酸(leucine): Leu及L、離胺酸(lysine): Lys及K、甲硫胺酸(methionine): Met及M、苯丙胺酸(phenylalanine): Phe及F、脯胺酸(proline): Pro及P、絲胺酸(serine): Ser及S、蘇胺酸(threonine): Thr及T、色胺酸(tryptophan): Trp及W、酪胺酸(tyrosine): Tyr及Y、以及纈胺酸(valine): Val及V。

所屬技術領域中具有通常知識者應了解本文所述之態樣的一個或二或更多個態樣的組合，也包括於本發明，除非基於本發明所屬技術領域中具有通常知識者的共同技術知識，產生技術矛盾。

所有本文引用文獻的全文皆以參考方式併入本文。

本發明參考下述實施例進一步說明。然而，本發明不為下述實施例所限制。

[實施例]
[實施例1] 結合CD3及CD137，但不同時結合CD3及CD137的經改變免疫球蛋白可變(Fab)區的概念
T細胞在腫瘤免疫中扮演要角，且已知藉由下述二信號活化: 1) T細胞受體(T cell receptor，TCR)結合至藉由主要組織相容複合物(major histocompatibility complex，MHC)類型I分子呈現的抗原性肽且活化TCR；及2)位於T細胞表面上的共刺激子結合至位於抗原呈現細胞上的配體且活化該刺激子。再者，屬於腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)超級家族及TNF受體超級家族的分子的活化，如位於T細胞表面上的CD137(4-1BB)，已被敘述為對於T細胞活化為重要的(Vinay, 2011, Cellular & Molecular Immunology, 8, 281-284)。

CD137促效劑抗體已展現顯示抗-腫瘤功效，且此已實驗性地顯示主要起因於CD8-陽性細胞及NK細胞的活化(Houot, 2009, Blood, 114, 3431-8)。也了解經工程化以具有由腫瘤抗原-結合域作為細胞外域及CD3與CD137信號傳導域作為細胞內域所組成的嵌合抗原受體分子的T細胞(chimeric antigen receptor molecules，CAR-T細胞)可增強藥效的持續性(Porter, N ENGL J MED, 2011, 365; 725-733)。然而，起因於其非特異性肝毒性的這種CD137促效劑抗體的副作用已為臨床上及非臨床上的問題，且醫藥劑的開發目前未有進展(Dubrot, Cancer Immunol. Immunother., 2010, 28, 512-22)。該副作用的主要成因已建議為涉及抗體經由抗體恆定區結合至Fcγ (Schabowsky, Vaccine, 2009, 28, 512-22)。再者，已報導為了使靶定屬於TNF受體超級家族的受體的促效劑抗體，發揮活體內促效劑活性，藉由Fcγ受體-表現細胞(FcγRII-表現細胞)之抗體交聯為必要的(Li, Proc Natl Acad Sci USA. 2013, 110(48), 19501-6)。WO2015/156268描述僅於表現腫瘤特異性抗原的細胞存在下，具有CD137促效活性的結合域以及針對腫瘤特異性抗原的結合域的雙特異性抗體可發揮CD137促效活性活化免疫細胞，藉此可避免CD137促效抗體的肝毒性不良事件而仍保留該抗體的抗腫瘤活性。WO2015/156268進一步描述藉由使用此雙特異性抗體與具有CD3促效活性的結合域以及針對種瘤特異性抗原的結合域的另一雙特異性抗體組合，可進一步增強該抗腫瘤活性且可避免該等不良事件。已報導具有針對CD137、CD3及腫瘤特異性抗原(EGFR)的三個結合域的三特異性抗體(WO2014/116846)。然而，期望此分子即使於腫瘤特異性抗原表現細胞的不存在下，將交聯CD3ε-表現T細胞及CD137表現細胞(T細胞、B細胞、NK細胞、DC等)，因其將同時結合至CD3ε及CD137(圖2)。事實上，已報導針對CD3及CD8的雙特異性抗體交聯CD8陽性T細胞且於該等細胞誘發細胞毒性(Wong, Clin. Immunol. Immunopathol. 1991, 58(2), 236-250)。因此亦期望CD3及表現於T細胞上的抗原的交聯將誘發T細胞的交聯且引起T細胞去殺死彼此。

卡妥索單抗(catumaxomab)已知為辨識表現於T細胞上的蛋白質及表現於癌細胞上的蛋白質(癌抗原)的雙特異性抗體，且其於二個Fab分別結合至癌抗原(EpCAM)及表現於T細胞上的CD3ε鏈，已知即使於癌抗原不存在下其同時結合至CD3ε及FcγR，因而即使在無癌細胞的環境中將CD3ε-表現T細胞交聯至Fcγ-表現細胞，以大量產生各種細胞介素。該癌抗原-獨立的各種細胞介素產生的誘發，使目前三功能抗體的投藥侷限於腹腔內途徑(Cancer Treat Rev. 2010 36(6), 458-67(非專利文獻16))。因此，由於嚴重的類細胞介素風暴的不良反應，所以該三功能抗體非常難以全身性投藥(Cancer Immunol Immunother. 2007 Sep; 56(9): 1397-406)(非專利文獻18))。

同時，傳統的多特異性抗體同時結合至複數個抗原。取決於抗原的組合，同時結合至複數個抗原可能為不佳。發揮由T細胞媒介的細胞毒性活性及以癌抗原-特異性方法，經由CD137的T細胞及其他免疫細胞的活化活性二者的抗體仍未知。

因此，調控不佳的交聯反應的可能方法為雙結合Fab，其為經由其一部分結合至CD3及經由不參予此結合至第一抗原的不同部分結合至CD137的一種可變(Fab)區(圖1)。若一個可變(Fab)區中的二個定位接近部分，對於結合至其各自抗原為必需的，如圖1所示，對CD3的結合抑制對CD137的結合而對CD137的結合也抑制對CD3的結合。因此，具有這種雙結合Fab的性質的經修飾抗體不能同時結合至CD3及CD137，且因而推測不會引起CD3及CD137之間的交聯反應(圖2)。再者，當CD3及CD137不表現於細胞膜上，作為可溶性蛋白質，或二者皆在相同細胞時，認為雙結合Fab能同時結合至CD3及CD137，但不同時結合至分別表現於不同細胞之這些抗原也不交聯這兩個細胞(圖3)。另一方面，結合至另一可變(Fab)區的抗原(第三抗原)可與T細胞上的CD3及CD137進行交聯反應(圖4)或可與CD137陽性免疫細胞上的CD137進行交聯反應(圖5)。對於此抗體，結合至FcγR的Fc區可使用作為恆定區，或具有減低針對FcγR之結合活性的Fc區可使用作為恆定區。
藉由使用這種雙CD3/CD137結合Fab的性質，例如，可進一步對藉由T細胞的抗體媒介的重新導向來損傷表現癌抗原之癌細胞的技術提供T細胞、NK細胞及/或免疫細胞活化的功能，且藉此達到較高的抗癌潛力。

簡明地，若可變(Fab)區可經修飾為雙結合Fab以賦予下述性質，則可開發如圖1所示之具有該功效的抗體：
1. 具有針對CD3的結合活性；
2. 具有針對C137的結合活性；以及
3. 不同時結合至CD3及CD137。
片語「不同時結合至CD3及CD137」也包括不將表現CD3的細胞交聯至表現CD137的細胞，或不同時結合至各自表現於不同細胞上的CD3及CD137。此片語進一步地包括當CD3及CD137不表現於細胞膜上，作為可溶性蛋白質，或二者皆位於相同細胞上，該可變區能同時結合至CD3及CD137二者，但不同時結合至各自表現於不同細胞上的CD3及CD137的情況。

類似地，若可變(Fab)區可經修飾為雙結合Fab以賦予下述性質，則可開發具有，例如，如圖3、圖4及圖5所示之功效的抗體：
1. 具有針對位於T細胞上之CD3的結合活性；
2. 具有針對位於CD137表現細胞上之CD137的結合活性；以及
3. 不同時結合至CD3及CD137。

[實施例2]構築用於核糖體展示的雙scFv庫
於參考例3中合成的抗體庫片段係使用於構築用於核糖體展示的雙scFv庫。該雙庫係製備為其中H鏈係多樣化為如表38中(參考例4中)所示而L鏈係固定於原始序列GLS3000(序列編號: 1)。
核糖體展示雙抗體庫的設計係示於圖6中。使用一部分的噬菌體λgpD基因及大腸桿菌secM基因作為間隔子基因以有效率地於核糖體上展示scFv庫(序列編號: 2)。藉由PCR，GLS3000的VL片段與間隔子基因及Gly/Ser富集連接子基因組裝(序列編號: 3)。然後經合成的抗體VH庫片段係藉由PCR擴增，於3’-終端融合至該VL-間隔子基因且於5’-終端融合至具有5’未轉譯區(untranslated region，UTR)( 序列編號: 4)的T7啟動子。

[實施例3] 由雙scFv庫獲得結合至CD3ε及人類CD137的scFv域
(3-1) 獲得結合至人類CD137的scFv域
結合至人類CD137的scFv域係自實施例2中所設計及構築的雙scFv庫鑑定。經融合至人類IgG1 Fc片段的生物素標記的人類CD137融合(稱為人類CD137-Fc，序列編號: 16)作為抗原。
於實施例2中構築的scFv核糖體展示庫係使用於活體外轉錄(T7 RiboMAX^TM Express Large scale RNA production system, P1320, Promega)以製備mRNA scFv庫。合成的mRNA藉由RNAeasy mini套組純化(Cat. No. 74104, QIAGEN)。所獲得的mRNA庫係藉由PUREfrex 1.0(PF001-025, Genefroniter)於具有DnaK GroE Mix及DS補充劑(PF003-0.5、PF004-0.5、PF005-0.5，Genefroniter)無細胞活體外轉譯系統轉譯。在那之後，添加WBTH緩衝液(50mM Tris-Acetate, 150mM NaCl, 70mM Mg-Acetate, 0.1%Tween20, 2.5 mg/mL Heparin)以中止轉譯，也添加封阻緩衝液(一包裝的SuperBlock Dry Blend Blocking Buffer in TBS (Cat No. 37545, Pierce)於200mM milliQ)。淘選方法係參照一般淘選方法以磁性珠粒實施(Nat Methods. 2007 Mar; 4(3); 269-79; Methods Mol Biol. 2012; 805: 261-86)。所使用的磁性珠粒為Neutr生物素(NeutrAvidin)被覆珠粒(Sera-Mag Speed Beads NeutrAvidin-corted或FG NeutrAvidin beads)或鏈黴素(Streptavidin)被覆珠粒(Dynabeads M-280 Streptavidin或Dynabeads MyOne Strptavidin T1 beads)。

具體地，250pmol的生物素標記抗原及2nmol的游離人類IgG Fc域(該等「游離」意指「無生物素標記」)添加至所製備的核糖體展示庫溶液且藉此與庫溶液於攝氏4度接觸60分鐘。加入SuperBlock-Blocked 磁性珠粒後，抗原-scFv複合物於攝氏4度附接至磁性珠粒15分鐘。珠粒以WBT緩衝液(50mM Tris-Acetate, 150mM NaCl, 50mM Mg-Acetate, 0.1%Tween)清洗三次。加入沖提緩衝液(50mM Tris-Acetate, 150mM NaCl, 50mM EDTA and 50μg/mL S.cerevisiae RNA (SIGMA))，珠粒於攝氏50度懸浮15分鐘，在那之後立即使用磁性底座分開該珠粒以回收mRNA溶液。使用序列編號: 147的引子及SuperScript III Reverse Transcriptase (Thermo Fisher Scientific)，藉由反轉錄將經純化的mRNA庫轉為cDNA且之後以序列編號: 148的引子及KOD-FX聚合酶(TOYOBO)藉由PCR擴增。以序列編號: 149及150的引子，藉由PCR將T7啟動子基因添加至經擴增的DNA庫。此循環，稱為淘選，係重複數次。淘選的第二回合及後續回合中，使用150至50 pmol的生物素標記人類CD137-Fc，且使用沖提緩衝液(命名為EDTA沖提運轉期)或FabRICATOR(IdeS，對於IgG鉸鏈區的蛋白酶，GENOVIS)(命名為IdeS沖提運轉期)以回收mRNA。該過程中，添加10單位/μL Fabricator 5μL與95μLWBT緩衝液且珠粒於攝氏37度懸浮10分鐘，在那之後立即使用磁性底座分開該珠粒以回收mRNA溶液。然後添加100μL沖提緩衝液至回收的mRNA且於攝氏50度培育10分鐘。

(3-2)scFv域對CD3ε或CD137的結合(scFv ELISA)
為了藉由ELISA評估scFv域的結合，以序列編號: 148及151的引子藉由PCR於第5及6回合添加FLAG-標籤至回收的DNA庫。所獲得的scFv-FLAG DNA片段接合至TOPO TA 選殖套組雙啟動子(Invitrogen)載體中，且將DH5α大腸桿菌轉形。分析來自大腸桿菌的各單一菌落的VH序列。然後選取5至7個純株(clone)，該純株具有於第5回合及第6回合中來自EDTA及IdeA沖提運轉期二者彼此不同的VH序列。各scFv-FLAG基因係以序列編號: 148及151的引子由菌落擴增。添加PUREfrex1.0ss至各經擴增的scFv基因且於攝氏37度培養2小時。添加2%脫脂乳緩衝液後，藉由下述過程將含有scFv的溶液進行ELISA: StreptaWell 96微滴定盤(F. Hoffmann-La Roche Ltd.)以生物素化CD3ε肽(序列編號: 6)或生物素化人類CD137-Fc於室溫被覆30分鐘。盤的各孔以TBST(TBS含有0.1%Tween20；TBS可得自Takara Bio Inc.)清洗以移除未結合的抗原。然後，該孔以250μL的2%脫脂乳-TBS封阻1小時或更久。移除2%脫脂乳-TBS後，所製備的scFv溶液添加至各孔，且該盤於室溫靜置1小時使得scFv結合至於各孔中含有的抗原。各孔以TBST清洗，然後對各孔添加MONOCLONAL ANTI-FLAG® M2, ANTIBODY(SIGMA，以TBS稀釋1000倍)。培育盤1小時。各孔以TBST清洗，然後對各孔添加山羊抗-小鼠IgG、IgA、IgM(H+L)、HRP接合物(Invitrogen，以TBS稀釋2000倍)。培育盤1小時。以TBST清洗後，對孔添加TMB單一溶液(ZYMED Laboratories, Inc.)。各孔中溶液的發色反應係藉由添加硫酸予以終止。然後基於450nm的吸收度測定顯色。結果示於圖7。多數的scFv結合至CD3ε或CD137，但來自IdeS沖提運轉期的二個scFv，圖7中經塗黑，顯示結合至人類CD137及CD3ε二者。換言之，藉由使用雙scFv庫成功地選擇出針對第二抗原(人類CD137)顯現結合活性的純株。

(3-3) IgG結合至CD3ε或CD137的分析
11個純株(dBBDu_001至011)係經選擇進一步評估。該等純株轉為IgG(各純株的VH及VL序列分別連接至人類H鏈及L鏈恆定域)，且評估其等針對CD3ε及CD137的結合活性。各純株的VH片段係使用特異性地結合至庫中的H鏈的引子藉由PCR來擴增。經擴增的VH片段係組裝至人類IgG1的CH1基因且整合至動物表現質體中。所製備的質體係藉由參考例1的方法於動物細胞中表現。GLS3000係使用作為輕鏈且其表現質體係如參考例4-2中所示來製備。

各分子的抗原結合係藉由電化學發光方法(electrochemiluminescence method，ECL方法)測試。具體地，以含有0.1% Tween 20的TBS溶液，稱為TBST，稀釋至18 pmol/mL的生物素化CD3ε肽或生物素化人類CD137，且調整至 2μg/mL的各抗體溶液，以及調整至18 pmol/mL的SULFO-TAG標記(MESO SCALE DIAGNOSTICS，釕(II)-三-聯吡啶，N-羥基琥珀醯亞胺)抗-人類IgG抗體(Invitrogen #628400)，各以25μL/孔添加至Nunc-Immuno(TM) MicroWell(TM) 96孔圓底盤(Nunc)，且混合，然後將盤於培育室溫1小時以形成抗體-抗原複合物。以150μL/孔添加含有0.5%BSA的TBST溶液至鏈黴素盤(MSD K.K., L15SA-1)，且盤於4℃培育隔夜。移除封阻溶液後，各孔以250μL TBST溶液清洗三次。以75μL/孔對其添加抗體-抗原複合物溶液，且盤於室溫培育1小時使生物素-抗人類IgG Ab結合至鏈黴素盤。移除抗體-抗原複合物溶液後，各孔以TBST溶液清洗三次，且以150μL/孔對其添加讀取緩衝液(MSD K.K.)，接著使用Sector Imager 2400 (MSD K.K.)偵測sulfo-tag的發光信號。

該等11個純株中，純株011(序列編號: 5)顯示明顯的結合至CD3ε及人類CD137二者，及某些其他純株也顯示結合CD3ε及人類CD137二者(圖8)，所以此結果證明結合至二個不同抗原的該等雙抗體可以此設計之雙scFv庫獲得。

[實施例4] 由雙scFv庫以雙重回合選擇獲得結合至CD3ε及人類CD137的scFv域
(4-1) 改良獲得結合至人類CD137的scFv域的效率的淘選方案
結合至CD3ε及CD137的scFv域係成功地於實施例3中獲得，但獲取效率不甚高。改良效率的可考慮方案之一為替代性淘選，其中不同抗原將使用於不同淘選回合中。藉由此方法，可於不同回合中，但不同時地將針對CD3ε及CD137二者的選擇壓力置於雙scFv庫。為解決此缺陷，發明人使用雙重回合選擇，其經報導於1回合對抗原進行二次淘選(1回合意指於噬菌體展示中，從自大腸桿菌中之噬菌體回收到對大腸桿菌之噬菌體感染以及於核糖體展示中，從活體外轉錄到PCR擴增)(J Mol Biol. 1992 Aug 5; 226(3): 889-96)。於各淘選回合中僅他們使用一類型的抗原，但發明人認為藉由其中於各淘選過程中使用二種不同抗原的雙重回合選擇，將能夠更有效率地回收二種不同抗原特異性的抗體。

(4-2) 以雙重回合選擇獲得結合至人類CD137的scFv域
淘選條件係示於表1。運轉期1及2係替代性淘選條件且運轉期3為其中雙重回合選擇於回合3、5及7進行的雙重回合選擇條件。使用生物素標記CD3ε肽抗原(胺基酸序列: 序列編號: 6)及經融合至人類IgG Fc片段(命名為人類CD137-Fc)的生物素標記人類CD137作為抗原。表1中，CD3意指以生物素標記CD3肽的淘選，CD137意指以生物素標記人類CD137-Fc的淘選，以及Duble意指雙重回合選擇。

[表1]

構築於實施例2中的scFv核糖體展示庫使用於活體外轉錄(T7 RiboMAX^TM Express Large scale RNA Production system, P1320, Progema)以製備mRNA scFv庫。合成的mRNA藉由RNeasy mini kit(Cat. No. 74104, QIAGEN)純化。所得mRNA庫藉由PUREfrex1.0(PF001-0.25, Genefroniter)無細胞活體外轉譯系統以DnaK GroE Mix及DS補充劑(PF003-0.5, PF004-0.5, PF005-0.5, Genefroniter)轉譯。在那之後，添加WBTH緩衝液(50 mM Tris-Acetate, 150mM NaCl, 70 mM Mg-Acetate, 0.1% Tween, 2.5 mg/mL Heparin)以中止轉譯，也添加封阻緩衝液(一包裝的SuperBlock Dry Blend Blocking Buffer in TBS (Cat No. 37545, Pierce)於200mM milliQ)。淘選方法係參照一般淘選方法以磁性珠粒實施(Nat Methods. 2007 Mar; 4(3); 269-79; Methods Mol Biol. 2012; 805: 261-86)。所使用的磁性珠粒為Neutr生物素被覆珠粒(Sera-Mag Speed Beads Neutr Avidin-corted或FG Neutr Avidin beads)或鏈黴素被覆珠粒(Dynabeads M-280 Streptavidin或Dynabeads MyOne Strptavidin T1 beads)。

具體地，250 pmol的生物素標記抗原及2 nmol的游離人類IgG Fc域(當生物素標記抗原為人類CD137-Fc時)添加至所製備的核糖體展示庫溶液且藉此與庫溶液於攝氏4度接觸60分鐘。添加SuperBlock-封阻磁性珠粒後，抗原-scFv複合物係於攝氏4度附接至磁性珠粒15分鐘。珠粒以WBT緩衝液(50 mM Tris-Acetate, 150 mM NaCl, 50mM Mg-Acetate, 0.1% Tween)清洗二次或三次。添加沖提緩衝液((50mM Tris-Acetate, 150mM NaCl, 50mM EDTA and 50μg/mL S.cerevisiae RNA (SIGMA))後，珠粒於攝氏50度懸浮15分鐘，在那之後立即使用磁性底座分開該珠粒以回收mRNA溶液。回收的mRNA使用High Pure RNA Isolation kit(Roche)純化。使用序列編號: 147的引子及SuperScript III Reverse Transcriptase(Thermo Fisher Scientific)，藉由反轉錄將經純化的mRNA庫轉成cDNA，然後以序列編號: 148的引子及KOD-FX聚合酶(TOYOBO)藉由PCR來擴增。以序列編號: 149及150的引子藉由PCR，將T7啟動子基因添加至經擴增的DNA庫。此循環重複數次。於淘選的第二回合及後續回合中，使用150至50 pmol的生物素標記人類CD137-Fc或250 pmol的生物素標記CD3ε肽。

運轉期3的回合3、5及7中，進行雙重回合選擇。具體地，250 pmol的生物素標記CD3ε肽添加至所製備的核糖體展示庫溶液且藉此與庫溶液於攝氏4度接觸60分鐘。添加SuperBlock-封阻磁性珠粒後，抗原-scFv複合物於攝氏4度附接至磁性珠粒15分鐘。珠粒以WBT緩衝液(50 mM Tris-Acetate, 150 mM NaCl, 50mM Mg-Acetate, 0.1% Tween)清洗六至十次(取決於淘選回合)。添加沖提緩衝液後，珠粒於攝氏50度懸浮15分鐘，在那之後立即使用磁性底座分開該珠粒，以回收mRNA溶液。回收的mRNA使用High Pure RNA Isolation kit(Roche)純化。經純化的mRNA後續地再次藉由PUREfrex1.0(Genefroniter)來轉譯。250 pmol或100 pmol的生物素標記CD137-Fc及 2 nmol的游離人類IgG Fc域添加至所製備的核糖體展示庫溶液，且藉此與庫溶液於攝氏4度接觸60分鐘。添加SuperBlock-封阻磁性珠粒後，抗原-scFv複合物係於攝氏4度附接至磁性珠粒15分鐘。珠粒以WBT緩衝液清洗三次至十次(取決於淘選回合)。添加沖提緩衝液後，珠粒於攝氏50度懸浮15分鐘，在那之後立即使用磁性底座分開該珠粒，以回收mRNA溶液。回收的mRNA使用High Pure RNA Isolation kit(Roche)純化。使用序列編號: 147的引子及SuperScript III Reverse Transcriptase(Thermo Fisher Scientific)，藉由反轉錄將經純化的mRNA庫轉成cDNA，然後以序列編號: 148的引子及KOD-FX聚合酶(TOYOBO)藉由PCR來擴增。以SEQ ID NO: 149及150的引子藉由PCR，將T7啟動子基因係添加至經擴增的DNA庫。

(XX-2) scFv域對CD3ε或CD137的結合(scFv ELISA)
為了藉由ELISA評估scFv域的結合，於回合6及7以序列編號: 149及151的引子藉由PCR對回收的DNA庫添加FLAG-tag。所得scFv-FLAG DNA片段係接合至 TOPO TA 選殖套組雙啟動子(Invitrogen)且轉形至DH5α大腸桿菌。分析來自大腸桿菌各單一菌落的VH序列。然後選取來自回合6及回合7中各淘選運轉期彼此具有不同VH序列的某些純株。以序列編號: 149及151的引子由各菌落擴增各scFv-FLAG基因。PUREfrex1.0ss添加至各經擴增的scFv基因且於攝氏37度培育2小時。添加2%脫脂乳緩衝液後，含有scFv的溶液藉由下述過程進行ELISA: StreptaWell 96微滴定盤(F. Hoffmann-La Roche Ltd)係以生物素化CD3ε肽或生物素化人類CD137-Fc於室溫被覆30分鐘。盤的各孔以TBST(含有0.1%Tween20的TBS；TBS可得自Takara Bio Inc.)清洗以移除未結合的抗原。然後，該孔以250μL的2%脫脂乳-TBS封阻1小時或更久。移除2%脫脂乳-TBS後，所製備的scFv溶液添加至各孔，且該盤於室溫靜置1小時使得scFv結合至於各孔中含有的抗原。各孔以TBST清洗，然後對各孔添加MONOCLONAL ANTI-FLAG® M2, ANTIBODY (SIGMA，以TBS稀釋1000倍)。培育盤1小時。各孔以TBST清洗，然後對各孔添加山羊抗小鼠IgG、IgA、IgM(H+L)、HRP接合物(Invitrogen，以TBS稀釋2000倍)。培育盤1小時。以TBST清洗後，對孔添加TMB單一溶液(ZYMED Laboratories, Inc.)。各孔中溶液的發色反應係藉由添加硫酸予以終止。然後基於450nm的吸收度測定顯色。結果示於圖9中。運轉期1及2的所有scFv結合至CD3ε或CD137。另一方面，運轉期3中的許多scFV顯示結合至人類CD137及CD3ε二者。換言之，藉由其中於各淘選回合中使用二種不同抗原的雙重回合選擇，成功地改良獲得顯現針對CD3ε及第二抗原(人類CD137)之結合活性的純株的效率。

(4-3) 以雙重回合選擇獲得更多結合至人類CD137的scFv域的額外淘選
為了製造更多結合至人類CD137及CD3ε的scFv域，於運轉期2及3進行額外回合的淘選。於回合8，傳統選擇及雙重回合選擇皆使用於運轉期3回合7輸出庫，且於運轉期3回合7輸出庫僅進行雙重回合選擇。各淘選過程係相同於實施例4-2。

(4-4) 以雙重回合選擇及IdeS沖提獲得結合至人類CD137的scFv域
淘選條件示於表2。運轉期4及5為替代性淘選條件及運轉期6為雙重回合選擇條件，其中雙重回合選擇係於回合3、5及7進行。使用生物素標記CD3ε肽抗原(胺基酸序列: 序列編號: 6)及經融合至人類IgG Fc片段(命名為人類CD137-Fc)的生物素標記人類CD137作為抗原。表2中，CD3意指以生物素標記CD3肽的淘選，CD137意指以生物素標記人類CD137-Fc的淘選，以及Double意指雙重回合選擇。

[表2]

構築於實施例2的scFv核糖體展示庫使用於活體外轉錄(T7 RiboMAX^TM Express Large scale RNA Production system, P1320, Progema)以製備mRNA scFv庫。合成的mRNA藉由RNeasy mini kit(Cat. No. 74104, QIAGEN)純化。所得mRNA庫藉由PUREfrex1.0(PF001-0.25, Genefroniter)無細胞活體外轉譯系統以DnaK GroE Mix及DS補充劑(PF003-0.5, PF004-0.5, PF005-0.5, Genefroniter)轉譯。在那之後，添加WBTH緩衝液(50 mM Tris-Acetate, 150mM NaCl, 70 mM Mg-Acetate, 0.1% Tween, 2.5 mg/mL Heparin)以中止轉譯，也添加封阻緩衝液(一包裝的SuperBlock Dry Blend Blocking Buffer in TBS (Cat No. 37545, Pierce)於200mM milliQ)。淘選方法係參照一般淘選方法以磁性珠粒實施(Nat Methods. 2007 Mar; 4(3); 269-79; Methods Mol Biol. 2012; 805: 261-86)。所使用的磁性珠粒為Neutr生物素被覆珠粒(Sera-Mag Speed Beads Neutr Avidin-corted或FG Neutr Avidin beads)或鏈黴素被覆珠粒(Dynabeads M-280 Streptavidin或Dynabeads MyOne Strptavidin T1 beads)。

具體地，250 pmol的生物素標記抗原及2 nmol的游離人類IgG Fc域(當生物素標記抗原為人類CD137-Fc時)添加至所製備的核糖體展示庫溶液且藉此與庫溶液於攝氏4度接觸60分鐘。添加SuperBlock-封阻磁性珠粒後，抗原-scFv複合物係於攝氏4度附接至磁性珠粒15分鐘。珠粒以WBT緩衝液清洗二次或三次。添加沖提緩衝液後，珠粒於攝氏50度懸浮15分鐘，那之後立即使用磁性底座分開該珠粒，以回收mRNA溶液。回收的mRNA使用High Pure RNA Isolation kit(Roche)純化。使用序列編號: 147的引子及SuperScript III Reverse Transcriptase(Thermo Fisher Scientific)，藉由反轉錄將經純化的mRNA庫轉成cDNA，然後以序列編號: 148的引子及KOD-FX聚合酶(TOYOBO)藉由PCR來擴增。以SEQ ID NO: 149及150的引子藉由PCR，將T7啟動子基因添加至經擴增的DNA庫。此循環重複數次。於淘選的第二回合及後續回合中，使用150至50 pmol的生物素標記人類CD137-Fc或250 pmol的生物素標記CD3ε肽。當於第二及後續回合中抗原為生物素標記人類CD137-Fc時，使用FabRICATOR(IdeS，對於IgG鉸鏈區的蛋白酶，GENOVIS)以回收mRNA。在那過程中，添加10單位/μL Fabricator 5μL與95μL WBT緩衝液且珠粒於攝氏37度懸浮10分鐘，在那之後立即使用磁性底座分開該珠粒以回收mRNA溶液。然後添加100μL沖提緩衝液至回收的mRNA且於攝氏50度培育10分鐘。當抗原為生物素標記CD3ε肽時，僅沖提緩衝液使用地與回合1相同。

於運轉期6的回合3、5及7，進行雙重回合選擇。具體地，250 pmol的生物素標記CD3ε肽添加至所製備的核糖體展示庫溶液且藉此與庫溶液於攝氏4度接觸60分鐘。添加SuperBlock-封阻磁性珠粒後，抗原-scFv複合物係於攝氏4度附接至磁性珠粒15分鐘。珠粒以WBT緩衝液清洗六至十次(取決於淘選回合)。添加沖提緩衝液後，珠粒於攝氏50度懸浮15分鐘，在那之後立即使用磁性底座分開該珠粒，以回收mRNA溶液。對回收的mRNA添加核糖體(GeneFroniter)且使用High Pure RNA Isolation kit(Roche)純化mRNA。經純化的mRNA後續地再次藉由PUREfrex1.0(GeneFroniter)來轉譯。250 pmol或100 pmol的生物素標記CD137-Fc及 2 nmol的游離人類IgG Fc域，添加至所製備的核糖體展示庫溶液，且藉此與庫溶液於攝氏4度接觸60分鐘。添加SuperBlock-封阻磁性珠粒後，抗原-scFv複合物係於攝氏4度附接至磁性珠粒15分鐘。珠粒以WBT緩衝液清洗三次至十次(取決於淘選回合)。添加10單位/μL Fabricator 5μL與95μL WBT緩衝液，珠粒於攝氏37度懸浮10分鐘，在那之後立即使用磁性底座分開該珠粒，以回收mRNA溶液。然後添加100μL 沖提緩衝液至回收的mRNA，且於攝氏50度培育10分鐘。回收的mRNA使用High Pure RNA Isolation kit(Roche)純化。使用序列編號: 147的引子及SuperScript III Reverse Transcriptase(Thermo Fisher Scientific)藉由反轉錄，將經純化的mRNA庫轉成cDNA，然後以序列編號: 148的引子及KOD-FX聚合酶(TOYOBO)藉由PCR來擴增。以SEQ ID NO: 149及150的引子藉由PCR，將T7啟動子基因添加至經擴增的DNA庫。

(4-5) 以雙重回合選擇及IdeS沖提獲得更多結合至人類CD137的scFv域的額外淘選
為了製造更多結合至人類CD137及CD3ε的scFv域，於運轉期4、5及6如同實施例4-3進行額外回合的淘選。於運轉期5及運轉期6回合7輸出庫使用傳統選擇及雙重回合選擇二者，且於運轉期4回合6輸出庫進行雙重回合選擇。各淘選過程係相同於實施例4-4。

(4-6) scFv域對CD3ε或CD137的結合(scFv ELISA)
為了藉由ELISA評估scFv域的結合，以序列編號: 149及151的引子藉由PCR對實施例4-3、4-4及4-5的回合6至8中的回收DNA庫添加FLAG-tag。所得scFv-FLAG DNA片段係接合至 TOPO TA 選殖套組雙啟動子(Invitrogen)且轉形至DH5α大腸桿菌。分析來自大腸桿菌各單一菌落的VH序列。然後發明人選取各淘選運轉期彼此具有不同VH序列的某些純株。以序列編號: 149及151的引子由各菌落擴增各scFv-FLAG基因。PUREfrex1.0ss添加至各經擴增的scFv基因且於攝氏37度培育2小時。添加2%脫脂乳緩衝液後，含有scFv的溶液藉由下述過程進行ELISA: StreptaWell 96微滴定盤(F. Hoffmann-La Roche Ltd)係以生物素化CD3ε肽或生物素化人類CD137-人類IgG1 Fc融合於室溫被覆30分鐘。盤的各孔以TBST(含有0.1%Tween 20的TBS；TBS可得自Takara Bio Inc.)清洗以移除未結合的抗原。然後，該孔以250μL的2%脫脂乳-TBS封阻1小時或更久。移除2%脫脂乳-TBS後，所製備的scFv溶液添加至各孔，且該盤於室溫靜置1小時使得scFv結合至於各孔中含有的抗原。各孔以TBST清洗，然後對各孔添加MONOCLONAL ANTI-FLAG® M2, ANTIBODY(SIGMA，以TBS稀釋1000倍)。培育盤1小時。各孔以TBST清洗，然後對各孔添加山羊抗-小鼠IgG、IgA、IgM(H+L)、HRP接合物(Invitrogen，以TBS稀釋2000倍)。培育盤1小時。以TBST清洗後，對孔添加TMB單一溶液(ZYMED Laboratories, Inc.)。各孔中溶液的發色反應係藉由添加硫酸予以終止。然後基於450nm的吸收度測定顯色。
結果示於圖10。許多scFv於各淘選運轉期中顯示結合至人類CD137及CD3ε。

(4-7) 轉化抗體格式為IgG1及製備各IgG1分子
選擇11個匯池(示於表3)以進一步評估。匯池中包括的scFv係轉化成IgG(各純株的VH及VL序列係分別連接至人類H鏈及L鏈恆定域)，且評估其針對CD3ε及CD138的結合活性。各匯池的VH片段係使用特異性結合至庫中的H鏈的引子(序列編號: 152及153)藉由PCR來擴增。經擴增的VH片段係整合至已具有人類IgG1 CH1-Fc區的動物表現質體。所製備的質體藉由參考例1的方法用以於動物細胞表現。使用GLS3000(序列編號: 1)作為輕鏈且其表現質體係以參考例4-2的所示方式製備。

[表3]

(4-8) 所獲得抗體對於其CD3ε及人類CD137結合活性的評量
所製備的抗體進行ELISA以評估其對於CD3ε及人類CD137的結合能力。
首先，經鏈黴素被覆微孔盤(384孔，Greiner)以20μL的含有生物素標記CD3ε肽或生物素標記人類CD137-Fc的TBS於室溫被覆1或多小時。藉由以TBST清洗盤的各孔以移除未結合至盤的生物素標記抗原後，孔以20μL的封阻緩衝液(2%脫脂乳/TBS)封阻一或多小時。由各孔移除封阻緩衝液。將以1%脫脂乳/TBS稀釋二次之含有IgG的哺乳動物細胞上清液各10μL添加至孔，且使盤於室溫靜置一小時以使各IgG結合至各孔中的生物素標記抗原。之後，以TBST清洗各孔。以TBS稀釋的山羊抗人類kappa輕鏈鹼性磷酸酶接合物(BETHYL, A80-115AP)添加至各孔。盤培育1小時。以TBST清洗後，各孔中經添加Blue Phos Microwell Phosphatase Substrate System (KPL)的溶液的發色反應，係藉由添加Blue Phos Stop Solution (KPL)終止。然後，藉由於615 nm的吸收度來測量顏色發展。測量結果示於圖11。

即使在IgG1格式中，許多純株顯示對CD3ε及人類CD137的結合。然後分析來自大腸桿菌各單一菌落的VH序列。於結合至CD3ε及CD137的該等抗體中，含有總計19個不同的HCDR3序列，且其中存在許多HCDR1或2序列變體。

此建議，結合至二種不同抗原CD3ε及人類CD137的抗體係由使用如參考例4所述的CD3結合抗體作為模板所構築的合理設計的庫所獲得，以及雙重回合選擇可大幅改良獲得該等抗體的效率。傳統替代性淘選中，選擇壓力於各淘選回合中改變，所以理想純株的濃縮變成越來越慢或可能發生理想純株的遺失。以二種不同抗原藉由使用雙重回合選擇，發明人可於各淘選回合中均一化選擇壓力而使得理想純株易於平順地且更直接地收集。

[實施例5] 由具有設計的輕鏈庫的雙scFv庫之結合至CD3ε及人類CD137的抗體域的親和性成熟
(5-1) 構築具有所獲得重鏈的輕鏈庫
於實施例4中獲得許多結合至CD3ε及人類CD137的抗體，但其對於人類CD137的親和性仍弱，所以進行親和性成熟以改良其親和性。
為了達成此，於參考例4中所述之設計的輕鏈庫係與結合至CD3ε及人類CD137二者的一候選抗體的重鏈組合。發明人選擇抗體，命名為dBBDu_115(序列編號: 7)，作為用於親和性成熟的候選抗體，因為於實施例4所述的該等19個抗體中其較佳結合至CD3ε及人類CD137二者。
發明人構築二種不同抗體格式庫，VL-GS-連接子-VH scFv格式及Fab格式。核糖體展示雙抗體庫的設計係示於圖12。如同實施例2，使用一部分的噬菌體λgpD基因及大腸桿菌secM基因作為間隔子基因以有效率地於核糖體展示scFv或Fab庫。

參考例4所述之合成抗體VL庫片段係藉由PCR擴增，於3’終端與Gly/Ser富集連接子-dBBU_VH間隔子基因(序列編號: 8)融合以及於5’終端與具有5’未轉譯區的T7啟動子(序列編號: 4)融合，以創造VL-VH scFv格式庫。
參考例4所述之合成抗體VL庫片段係藉由PCR擴增，於3’終端與CL-間隔子基因(序列編號: 9)融合以及於5’終端與具有5’未轉譯區的T7啟動子(序列編號: 4)融合，以創造Fab格式庫。dBBDu_115的VH基因片段也藉由PCR擴增，於3’終端與CH1基因(序列編號: 0)融合以及於5’終端與具有5’未轉譯區的T7啟動子(序列編號: 4)融合，以創造Fab格式的Hch片段。

(5-2) 獲得結合至CD3ε及人類CD137二者的抗體域
淘選條件示於表4。此表4中，double意指雙重回合選擇及CD137Fc意指針對生物素標記人類CD137-Fc的傳統淘選。生物素標記CD3ε肽抗原(胺基酸序列: 序列編號: 6)及融合至人類IgG1 Fc片段的生物素標記人類CD137(命名為人類CD137-Fc)使用作為抗原。

[表4]

於實施例5-1構築的scFv核糖體展示庫、Fab輕鏈核糖體展示庫及Fab重鏈係使用於活體外轉錄(T7 RiboMAX^TM Express Large scale RNA production system, P1320, Promega)以製備mRNA庫及重鏈RNA。合成的mRNA係藉由RNeasy mini套組純化(Cat. No. 74104, QIAGEN)。所獲得的mRNA庫及Fab重鏈係藉由PUREfrex 1.0(PF001-025, Genefroniter)於具有DnaK GroE Mix及DS補充劑(PF003-0.5、PF004-0.5、PF005-0.5，Genefroniter)無細胞活體外轉譯系統來轉譯。在那之後，添加WBTH緩衝液以中止轉譯，也添加封阻緩衝液(2x, c-block-e, Beacle)。所使用的磁性珠粒為Neutr生物素被覆珠粒(Sera-Mag Speed Beads NeutrAvidin-corted或FG NeutrAvidin beads)或鏈黴素被覆珠粒(Dynabeads M-280 Streptavidin或Dynabeads MyOne Strptavidin T1 beads)。

具體地，60 pmol的生物素標記人類CD137-Fc於攝氏4度添加至磁性珠粒持續60分鐘，然後於攝氏4度持續60分鐘添加c-block-e(Beacle)以封阻珠粒。此經抗原被覆的磁性珠粒及2 nmol的游離人類IgG Fc域添加至所製備的核糖體展示庫溶液，藉此與庫溶液於攝氏4度接觸75分鐘。珠粒與WBT緩衝液培育2分鐘(運轉期10)或10分鐘(運轉期2、6及9)，然後丟棄WBT緩衝液。此清理過程以WBT緩衝液重複10次。加入沖提緩衝液後，珠粒於攝氏50度懸浮15分鐘，在那之後立即使用磁性底座分開該珠粒，以回收mRNA溶液。回收的RNA使用High Pure RNA Isolation kit(Roche)純化。使用序列編號: 147的引子及SuperScript III Reverse Transcriptase (Thermo Fisher Scientific)藉由反轉錄，將經純化的mRNA庫轉為cDNA，且之後以序列編號: 148的引子及KOD-FX聚合酶(TOYOBO)藉由PCR來擴增。以序列編號: 149及150的引子藉由PCR，將T7啟動子基因係添加至經擴增的DNA庫。此循環，稱為淘選，係重複數次。

淘選的第二回合及後續回合中，生物素標記人類CD137-Fc的量係如表5所示變化，以及清洗數也如表6所示變化。當運轉期6、9及10中的第二及後續回合中的抗原為生物素標記人類CD137-Fc時，使用FabRICATOR(IdeS，對於IgG鉸鏈區的蛋白酶，GENOVIS)以回收mRNA。該過程中，添加10單位/μL Fabricator 5μL與95μLWBT緩衝液，且珠粒於攝氏37度懸浮10分鐘，在那之後立即使用磁性底座分開該珠粒，以回收mRNA溶液。然後添加100μL沖提緩衝液至回收的mRNA且於攝氏50度培育10分鐘。

[表5] 生物素標記人類CD137-Fc的量(pmol)

[表6] 清洗數

某些運轉期中進行雙重回合選擇。具體地，150 pmol的生物素標記CD3ε肽於攝氏4度添加至磁性珠粒持續60分鐘，然後於攝氏4度持續60分鐘添加c-block-e(Beacle)以封阻珠粒。此經抗原被覆的磁性珠粒添加至所製備的核糖體展示庫溶液，藉此與庫溶液於攝氏4度接觸60分鐘。珠粒以WBT緩衝液清洗十次。添加沖提緩衝液後，珠粒於攝氏50度懸浮15分鐘，在那之後立即使用磁性底座分開該珠粒，以回收mRNA溶液。回收的mRNA使用High Pure RNA Isolation kit(Roche)純化。經純化的mRNA後續再次藉由PUREfrex1.0(Genefroniter)轉譯。生物素標記CD137-Fc於攝氏4度添加至該磁性珠粒持續60分鐘，然後於攝氏4度持續60分鐘添加c-block-e(Beacle)以封阻珠粒。此經抗原被覆的磁性珠粒及2nmol 游離人類IgG Fc域添加至所製備的核糖體展示庫溶液，且藉此與庫溶液於攝氏4度接觸60分鐘。珠粒與WBT緩衝液培育10分鐘，然後丟棄WBT緩衝液。此清係過程以WBT緩衝液重複10次。運轉期6、9及10中，添加10單位/μL Fabricator 5μL與95μLWBT緩衝液且珠粒於攝氏37度懸浮10分鐘，在那之後立即使用磁性底座分開該珠粒，以回收mRNA溶液。然後添加100μL沖提緩衝液至回收的mRNA且於攝氏50度培育10分鐘。回收的mRNA使用High Pure RNA Isolation kit(Roche)純化。使用序列編號: 147的引子及SuperScript III Reverse Transcriptase(Thermo Fisher Scientific)藉由反轉錄，將經純化的mRNA庫轉成cDNA，然後以序列編號: 148的引子及KOD-FX聚合酶(TOYOBO)藉由PCR來擴增。以序列編號: 149及150的引子藉由PCR，將T7啟動子基因添加至經擴增的DNA庫。

轉化抗體格式為IgG1且製備各IgG1分子
來自實施例5-2中記載的親和性成熟淘選的scFv或Fab域庫的輕鏈基因係轉化為IgG，且評估其針對CD3ε及CD137的結合活性。運轉期5、6及9匯池的VL-CL片段係使用庫中特異性結合至L鏈的引子(序列編號: 154及155)藉由PCR來擴增。經擴增的VL-CL片段整合至動物表現質體且轉形DH5α大腸桿菌菌株。所獲得的質體也使用於構築來自運轉期10的輕鏈表現載體。以限制酵素SfiI及kpnI從所獲得的表現載體去除VL區基因。運轉期10匯池的VL片段係使用庫中特異性結合VL區的引子(序列編號: 154及156)藉由PCR來擴增。所製備的VL片段係導入至經分解的表現質體。選取菌落數係示於表7。所製備的質體係藉由參考例1的方法使用於動物細胞中表現。於實施例4構築的dBBDu_115重鏈也使用於表現全長IgG。

[表7]

(5-4) 所獲得抗體對於其CD3ε及人類CD137結合活性的評量
所製備的抗體進行ELISA以評估其對於CD3ε及人類CD137的結合能力。
首先，經鏈黴素被覆微孔盤(384孔，Greiner)以20μL的含有生物素標記CD3ε肽、生物素標記人類CD137-Fc及生物素標記人類IgG1 Fc區的TBS於室溫被覆1或多小時。藉由以TBST清洗盤的各孔以移除未結合至盤的生物素標記抗原後，孔以20μL的封阻緩衝液(2%脫脂乳/TBS)封阻一或多小時。由各孔移除封阻緩衝液。將以2%脫脂乳/TBS稀釋二次之含有IgG的哺乳動物細胞上清液各10μL添加至孔，且使盤於室溫靜置一小時以使各IgG結合至各孔中的生物素標記抗原。之後，以TBST清洗各孔。以TBS稀釋的山羊抗人類kappa輕鏈鹼性磷酸酶接合物(BETHYL, A80-115AP)添加至各孔。盤培育1小時。以TBST清洗後，各孔中經添加Blue Phos Microwell Phosphatase Substrate System (KPL)的溶液的發色反應，係藉由添加Blue Phos Stop Solution (KPL)終止。然後，藉由於615 nm的吸收度來測量顏色發展。測量結果示於圖13。

(5-5) 具有所獲得的Fab域同時對CD3ε及人類CD137的結合的評估
選擇5種抗體(示於表8)進一步評估。根據實施例5-3及參考例1表現及純化該等抗體係。經純化的抗體進行ELISA以評估其對於CD3ε及人類CD137同時結合能力。

[表8]

首先，MyOne-T1鏈黴素珠粒係與0.625 pmol的生物素標記人類CD137-Fc或生物素標記人類Fc混合，且於室溫培育10分鐘，然後添加2%脫脂乳/TBS以封阻磁性珠粒。經混合的溶液係分注至96孔盤(Corning, 3792黑色圓底PS盤)之各孔且於室溫培育60分鐘或更長。在那之後，藉由TBS清洗磁性珠粒一次。100ng經純化的IgG與62.5、6.25或0.625 pmol的游離人類CD3ε或62.5 pmol的游離人類Fc(此實施例中，「游離」意指「無生物素標記」)或TBS混合，然後添加至各孔中的磁性珠粒，使盤於室溫靜置一小時，使各IgG結合各孔中的生物素標記抗原。在那之後，以TBST清洗各孔。以TBS稀釋的山羊抗人類kappa輕鏈鹼性磷酸酶接合物(BETHYL, A80-115AP)添加至各孔。盤培育1小時。以TBST清洗後，對各孔添加APS-5(Lumigen)。2分鐘後偵測各孔的螢光。測量結果示於圖14及表9。

[表9]

於所有測試抗體中皆觀察到藉由游離CD3ε肽之對人類CD134-Fc結合的抑制但未藉由游離Fc域觀察到。此結果意指該等獲得的抗體於CD3ε肽的存在下不能結合至人類CD137-Fc，換言之，該等抗體不能同時結合至人類CD137及CD3ε肽。所以其證實以設計的庫及核糖體展示雙重回合選擇，成功地獲得可結合至二種不同抗原CD137及CD3ε肽，但不同時結合的Fab域。

[實施例6] 由雙Fab噬菌體展示庫獲得結合至CD3ε肽及人類CD137的Fab域
(6-1) 構築具有GLS3000輕鏈的重鏈噬菌體展示庫
參考例4合成的抗體庫片段使用於構築用於噬菌體展示的雙Fab庫。雙庫係製備為庫其中H鏈係如參考例4所示多樣化而L鏈係固定至原始序列GLS3000(序列編號: 1)。藉由添加V11L/L78I突變至FR(框架)且進一步多樣化CDR如表38所示(於參考例4)而衍生自CE115HA000 的H鏈庫序列係託付於DNA合成公司DNA2.0, Inc.，以獲得抗體庫片段(DNA片段)。所獲得抗體庫片段係插入至藉由PCR擴增之用於噬菌體展示的噬菌體質粒。選擇GLS3000作為L鏈。所構築的用於噬菌體展示的噬菌體質粒藉由電穿孔轉移至大腸桿菌，以製備帶有抗體庫片段的大腸桿菌。

藉由感染編碼FkpA伴侶蛋白基因的助手噬菌體M13KO7TC/FkpA，然後於0.002%阿拉伯糖(arabinose)的存在下於攝氏25度(此噬菌體庫命名為DA庫)或於0.02%阿拉伯糖的存在下於攝氏20度(此噬菌體庫命名為DX庫)培育隔夜，由帶有所構築的噬菌體質粒的大腸桿菌，來製造展示Fab域的噬菌體庫。M13KO7TC為助手噬菌體，其於助手噬菌體具有於pIII蛋白質的N2域及CT域之間的胰蛋白酶裂解序列的插入物(參照National Publication of International Patent Application No. 2002-514413)。插入物基因至M13KO7TC基因的導入已揭示於其他地方(參照National Publication of International Patent Application No. WO2015016554)。

(6-2) 以雙重回合選擇獲得結合至CD3ε及人類CD137的Fab域
結合至CD3ε及人類CD137的Fab域係由實施例6-1所構築的雙Fab庫鑑定出。生物素標記CD3ε肽抗原(胺基酸序列: 序列編號: 6)、經由雙硫鍵連接子生物素標記的CD3ε肽抗原(圖15，稱為C3NP1-27；胺基酸序列: 序列編號: 145，由Genscript合成)、融合至人類IgG1 Fc片段的生物素標記人類CD137(命名為人類CD137-Fc)及融合至人類IgG1 Fc片段的SS-生物素化人類CD137(命名為ss-人類CD137-Fc)使用作為抗原。藉由對融合至人類IgG1 Fc片段的人類CD137使用EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotinylation Kit(PIERCE, Cat. No. 21445)，來製備ss-人類CD137-Fc。生物素化係根據指導手冊進行。

噬菌體係由帶有用於噬菌體展示之所構築的噬菌體質粒的大腸桿菌製造。將2.5M NaCl/10%PEG添加至已製造噬菌體的大腸桿菌的培養溶液，及因此沉澱的噬菌體匯池以TBS稀釋以獲得噬菌體庫溶液。接著，BSA(最終濃度：4%)添加至噬菌體庫溶液。淘選方法係參考一般淘選方法，使用固定於磁性珠粒的抗原進行(J. Immunol. Methods. (2008) 332(1-2), 2-9; J. Immunol. Methods (2001) 247 (1-2), 191-203; Biotechnol. Prog (2002) 18(2) 212-20; 及Mol. Cell Proteomics (2003) 2(2), 61-9)。使用的磁性珠粒為NeutrAvidin被覆珠粒(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或鏈黴素被覆珠粒(Dynabeads M-280 Streptavidin)。為了去除結合至磁性珠粒本身或人類IgG1 Fc區的抗體展示噬菌體，對於磁性珠粒及生物素標記人類Fc進行減去。

具體地，噬菌體溶液與250 pmol的人類CD137-Fc及4 nmol的游離人類IgG1 Fc域混合且於室溫培育60分鐘。磁性珠粒以具有游離鏈黴素(Roche)的2%脫脂乳/TBS於室溫封阻60分鐘或更久且以TBS清洗三次，然後與培育的噬菌體溶液混合。於室溫培育15分鐘後，珠粒以TBST(含有0.1% Tween20的TBS；TBS可由Takara Bio Inc.取得)清洗三次後，進一步以1mL的TBS清洗二次。添加5μL的100 mg/mL胰蛋白酶及495μL的TBS且於室溫培育15分鐘，在那之後立即使用磁性底座分開該珠粒，以回收噬菌體溶液。透過於37℃溫和旋轉培養該菌株1小時，以藉由噬菌體感染大腸桿菌。經感染的大腸桿菌接種至225mm × 225mm盤。接著，由經接種的大腸桿菌的培養溶液回收噬菌體，以製備噬菌體庫溶液。
此淘選回合1過程中，結合至人類CD137的抗體展示噬菌體係經濃縮。淘選的第二回合中，250pmol的ss-人類CD137-Fc使用作為生物素標記抗原，且以TBSTR進行清洗三次，然後以TBS進行二次。沖提於室溫以25mM DTT進行15分鐘，然後藉由胰蛋白酶分解。
淘選的第三回合及第六回合中，使用62.5 pmol的C3NP1-27作為生物素標記抗原且以TBST進行清洗三次，然後以TBS進行二次。沖提於室溫以25mM DTT進行15分鐘，然後藉由胰蛋白酶分解。
淘選的第四、五及七回合中，使用62.5pmol的ss-人類CD137-Fc作為生物素標記抗原且以TBST進行清洗三次，然後以TBS進行二次。沖提於室溫以25mM DTT進行15分鐘，然後藉由胰蛋白酶分解。

(6-3) 藉由噬菌體所展示之Fab域對CD3ε或人類CD137的結合
含有噬菌體的培養上清係根據一般方法(Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145)自藉由上述方法所獲得之大腸桿菌的各96個單一菌落回收。含有噬菌體的培養上清係藉由下述過程進行ELISA：鏈黴素被覆微孔盤(384孔，greiner，Cat#781990)以10μL之含有生物素標記抗原(生物素標記CD3ε肽或生物素標記人類CD137-Fc)的TBS於4℃被覆隔夜或於室溫被覆1小時。盤的各孔以TBST清洗以移除未結合的抗原。然後，孔以80μL的TBS/2%脫脂乳封阻1小時或更久。移除TBS/2%脫脂乳後，所製備的培養上清添加至各孔，且盤於室溫靜置1小時使得噬菌體展示的抗體結合至各孔中含有的抗原。各孔以TBST清洗，然後對各孔添加HRP/抗M13(GE Healthcare 27-9421-010)。盤培育1小時。以TBST清洗後，對孔添加TMB單一溶液(ZYMED Laboratories, Inc.)。各孔中的發色反應藉由添加硫酸終止。然後，呈色係以450nm的吸收為基準測定。結果示於圖16。
如圖16所示，所有純株顯示對人類CD3ε的結合但不顯示對人類CD137的結合，即便經由進行5次對人類CD137的淘選過程。此可能取決於此具有鏈黴素被覆微孔盤之噬菌體ELISA的低敏感度，所以也進行具有鏈黴素被覆珠粒的噬菌體ELISA。

(6-4) 藉由噬菌體展示的Fab域對人類CD137的結合(噬菌體珠粒ELISA)
首先，鏈黴素被覆磁性珠粒MyOne-T1珠粒以包括0.5x block Ace、0.02% Tween及0.05% ProClin 300的封阻緩衝液清洗三次後，於室溫以此封阻緩衝液封阻60分鐘或更久。以TBST清洗一次後，對磁性珠粒添加0.625pmol的ss-人類CD137-Fc且於室溫培育10分鐘或更久後，將磁性珠粒施用至96孔盤(Corning, 3792黑圓底PS盤)的各孔。12.5μL的Fab展示噬菌體溶液各者與 12.5的TBS添加至孔，且使盤於室溫靜置30分鐘使得各Fab結合至各孔中的生物素標記抗原。之後各孔以TBST清洗。對各孔添加以包括0.5x block Ace、0.02% Tween及0.05% ProClin 300的封阻緩衝液稀釋的抗-M13(p8)Fab-HRP。盤培育10分鐘。以TBST清洗3次後，對各孔添加LumiPhos-HRP(Lumigen)。2分鐘後偵測各孔的螢光。結果示於圖17。

一些純株顯示對人類CD137之明顯結合。此結果顯示結合至人類CD3ε及CD137二者的Fab域也由具有噬菌體展示淘選方案的此設計之庫獲得。然而相較於CD3ε肽，對人類CD137的結合仍為弱。人類CD137結合純株各者的VH片段係使用特異性地結合至噬粒載體(序列編號: 157及158)的引子藉由PCR擴增且分析該DNA序列。結果顯示所有結合純株具有相同的VH序列，其意指只有一個Fab純株結合至人類CD137及CD3ε二者。為了改良此點，於下個試驗也應用雙重回合選擇至噬菌體展示方案。

[實施例7] 以雙重回合選擇方法由雙Fab噬菌體展示庫獲得結合至CD3ε及人類CD137的Fab域
(7-1) 構築具有GLS3000輕鏈的重鏈噬菌體展示庫
展示Fab域的噬菌體展示庫係自含有所構築的噬粒，藉由感染編碼FkpA伴侶蛋白(序列編號: 17)的助手噬菌體M13KO7TC/FkpA的大腸桿菌後，於0.002%阿拉伯糖的存在下於攝氏25度(此噬菌體庫命名為DA庫)或於0.02%阿拉伯糖的存在下於攝氏20度(此噬菌體庫命名為DX庫)隔夜培育所製造。M13KO7TC為助手噬菌體，其於助手噬菌體的pIII蛋白質的N2域及CT域之間具有胰蛋白酶裂解序列的插入(參照日本專利申請公開號2002-514413)。插入基因至M13KO7TC基因的導入已揭示於他處(參照WO2015/046554)。

(7-2) 以雙重回合選擇獲得結合至CD3ε及人類CD137的Fab域
結合至CD3ε及人類CD137的Fab域係從實施例7-1構築的Fab庫鑑定。生物素標記CD3ε肽抗原(胺基酸序列: 序列編號: 6)、經由雙硫鍵連接子之經生物素標記的CD3ε肽抗原 (C3NP1-27: 序列編號: 145)及經融合至人類IgG1 Fc片段的生物素標記人類CD137(命名為人類CD137-Fc)使用作為抗原。

為了製造更多結合至人類CD137及CD3ε的Fab域，也於淘選回合2及後續的回合中應用雙重回合選擇於噬菌體展示淘選。
噬菌體係由帶有用於噬菌體展示的構築的噬粒的大腸桿菌製造。對已製造噬菌體的大腸桿菌的培養溶液添加2.5M NaCl/10% PEG，因此所沉澱的噬菌體匯池以TBS稀釋以獲得噬菌體庫溶液。其次，對噬菌體展示溶液添加BSA(最終濃度：4%)。淘選方法係參照使用抗原經固定化於磁性珠粒的一般淘選方法進行(J. Immunol. Methods. (2008) 332(1-2), 2-9; J. Immunol. Methods (2001) 247 (1-2), 191-203; Biotechnol. Prog. (2002) 18(2) 212-20; 及 Mol. Cell Proteomics (2003) 2(2), 61-9)。使用的磁性珠粒為NeutrAvidin被覆珠粒(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或鏈黴素被覆珠粒(Dynabeads M-280 Streptavidin)。為了去除結合至磁性珠粒本身或人類IgG1 Fx區的抗體展示噬菌體，進行刪減磁性珠粒及生物素標記人類Fc。

具體地，於淘選回合1，磁性珠粒於室溫藉由2%脫脂乳/TBS封阻60分鐘或更久且以TBS清洗三次。DA庫或DX庫的噬菌體溶液添加至經封阻的磁性珠粒且於室溫培育60分鐘或更久後，回收上清。500 pmol的生物素標記人類IgG1 Fc添加至新的磁性珠粒且於室溫培育15分鐘後，添加2%脫脂乳/TBS。於室溫封阻60分鐘或更久之後，磁性珠粒以TBS清洗三次。回收的噬菌體溶液添加至經封阻的磁性珠粒且於室溫培育60分鐘或更久後，回收上清。500 pmol的生物素標記人類CD137-Fc添加至新的磁性珠粒，且於室溫培育15分鐘後添加2%脫脂乳/TBS。於室溫封阻60分鐘或更久之後，磁性珠粒以TBS清洗三次。回收的噬菌體溶液添加至經封阻的磁性珠粒且也添加8 nmol的游離人類IgG1 Fc域後，於室溫培育60分鐘。珠粒以TBST(含有0.1% Tween 20的TBS；TBS可自Takara Bio Inc.取得)清洗二次後，進一步以1 mLTBS清洗一次。添加0.5 mL的1 mg/mL胰蛋白酶後，珠粒於室溫懸浮15分鐘，在那之後，立即使用磁性底座分開該珠粒，以回收噬菌體溶液。回收的噬菌體溶液添加至於生長對數期(OD 600: 0.4-0.5)的大腸桿菌菌株ER2738。經由於37℃溫和旋轉培養該菌株1小時藉由噬菌體感染大腸桿菌菌株。經感染的大腸桿菌接種至225mm × 225mm盤。其次，由經接種的大腸桿菌的培養溶液回收噬菌體以製備噬菌體庫溶液。

此淘選回合1過程中，結合至人類CD137的抗體展示噬菌體係經濃縮，所以自淘選過程的次回合進行雙重回合選擇以回收結合至CD3ε及人類CD137二者的抗體展示噬菌體。

具體地，於淘選回合2，磁性珠粒係藉由2%脫脂乳/TBS於室溫封阻60分鐘或更久，且以TBS清洗三次。噬菌體溶液添加至經封阻的磁性珠粒且於室溫培育60分鐘或更久後，回收上清。500 pmol生物素標記人類IgG1 Fc添加至新的磁性珠粒，且於室溫培育15分鐘後添加2%脫脂乳/TBS。於室溫封阻60分鐘或更久後，磁性珠粒以TBS清洗三次。回收的噬菌體溶液添加至經封阻的磁性珠粒且於室溫培育60分鐘或更久後，回收上清。500 pmol的生物素標記人類CD137-Fc添加至新的磁性珠粒且於室溫培育15分鐘後，添加2%脫脂乳/TBS。於室溫封阻60分鐘或更久之後，磁性珠粒以TBS清洗三次。回收的噬菌體溶液添加至經封阻的磁性珠粒後，於室溫培育60分鐘。珠粒以TBST(含有0.1% Tween的TBS；TBS可自Takara Bio Inc.取得)清洗三次後進一步以1 mL TBS清洗兩次。使用FabRICATOR(IdeS，IgG鉸鏈區的蛋白酶，GENOVIS)(命名為IdeS沖提運轉期)以回收抗體展示噬菌體。該過程中，添加10單位/μL的Fabricator 20μL與80μL的TBS緩衝液且珠粒於攝氏37度懸浮30分鐘，在那之後立即使用磁性底座分開該珠粒，以回收噬菌體溶液。

此淘選過程第1循環中，結合至人類CD1378的抗體展示噬菌體係經濃縮，然後進行至第2循環淘選過程以在噬菌體感染及擴增前，回收也結合至CD3ε的抗體展示噬菌體。500 pmol生物素標記CD3ε添加至新的磁性珠粒且於室溫培育15分鐘後添加2%脫脂乳/TBS。於室溫封阻60分鐘或更久後，磁性珠粒以TBS清洗三次。回收的噬菌體溶液、50μL的TBS及250μL的8% BSA封阻緩衝液添加至經封阻的磁性珠粒後，於攝氏37度培育30分鐘、於室溫培育60分鐘、於攝氏4度培育隔夜後，於室溫培育60分鐘以將抗體展示噬菌體自人類CD137轉移至CD3ε。珠粒以TBST(含有0.1% Tween 20的TBS；TBS可由Takara Bio Inc.取得)清洗三次後，進一步以1mL的TBS清洗二次。補充0.5mL的1mg/mL胰蛋白酶的珠粒於室溫懸浮15分鐘，在那之後立即使用磁性底座分開該珠粒，以回收噬菌體溶液。自經胰蛋白酶處理的噬菌體溶液回收的噬菌體添加至於對數生長期(OD600: 0.4-0.7)的大腸桿菌菌株ER2738。經由於37℃溫和旋轉培養該菌株1小時藉由噬菌體感染大腸桿菌菌株。經感染的大腸桿菌接種至225mm × 225mm盤。其次，由經接種的大腸桿菌的培養溶液回收噬菌體以回收噬菌體庫溶液。

淘選的第三及第四回合中，以TBST增加清洗數達五次後以TBS清洗二次。雙重回合選擇的第2循環中，使用C3NP1-27抗原取代生物素標記CD3ε肽抗原，以及沖提係藉由DTT溶液進行以切斷CD3ε肽及生物素之間的雙硫鍵。明確地，以TBS清洗二次後，添加500μL的25mM DTT溶液且珠粒於室溫懸浮15分鐘，在那之後立即使用磁性底座分開該珠粒，以回收噬菌體溶液。添加0.5mL的1mg/mL胰蛋白酶至回收的噬菌體溶液且於室溫培育15分鐘。

(7-3) 具有所獲得之Fab域的IgG結合至人類CD137及食蟹猴CD137
於回合3及回合4由各DA及DX庫的各淘選輸出匯池選取96個純株且分析其等的VH基因序列。獲得29個VH序列且全部皆轉為IgG格式。各純株的VH序列係使用特異性地結合至噬粒載體(序列編號: 157及158)的引子藉由PCR擴增。經擴增的VH序列係整合至已具有人類IgG1 CH1-Fc區的動物表現質體。所製備的質體藉由參考例1的方法使用於動物細胞中表現。GLS3000使用作為輕鏈且其表現質體係如參考例4-2所示方式製備)。

所製備的抗體進行ELISA以評估其對於人類CD137(序列編號: 146)及食蟹猴(亦稱為cyno)CD137(序列編號: 18)的結合能力。圖18顯示人類與食蟹猴CD137之間的胺基酸序列差異。其等之中有8的不同殘基。

首先，20μg的鏈黴素被覆磁性珠粒MyOne-T1珠粒以包括0.5x block Ace、0.02% Tween及0.05% ProClin 300的封阻緩衝液清洗三次後，於室溫以封阻緩衝液封阻60分鐘或更久。以TBST清洗一次後，磁性珠粒施用至白圓底PS盤(Corning, 3605)之各孔且對磁性珠粒添加0.625pmol的生物素標記人類CD137-Fc、生物素標記cyno CD137-Fc或生物素標記人類Fc，且於室溫培育15分鐘或更久。以TBST清洗一次後，50 ng/μL經純化的IgG 之各者25μL添加至孔，且使盤於室溫靜置一小時以使各IgG結合至各孔中的生物素標記抗原。之後，以TBST清洗各孔。經以TBS稀釋的山羊抗-人類kappa輕鏈鹼性磷酸酶接合物(BETHYL, A80-115AP)添加至各孔。盤培育1小時。以TBST清洗後，各樣品轉移至96孔盤(Corning, 3792黑圓底PS盤)且對各孔添加APS-5(Lumigen)。2分鐘後偵測各孔的螢光。測量結果示於表10及圖19。其中，純株DXDU01_3#094、DXDU01_3#072、DADU01_3#018、DADU01_3#002、DXDU01_3#019及DXDU01_3#051顯示結合至人類及cyno CD1037二者。另一方面，DADU01_3#001顯示對人類CD137最強的結合，並未顯示對cynoCD137的結合。

[表10]

(7-4) 具有所獲得之Fab域的IgG對人類CD3ε的結合
各抗體也進行ELISA以評估其對CD3ε的結合能力。
首先，MyOne-T1鏈黴素珠粒與0.625 pmol生物素標記CD3ε混合且於室溫培育10分鐘後，添加包括0.5x block Ace、0.2% Tween及0.05% ProClin 300/TBS的封阻緩衝液，以封阻磁性珠粒。混合溶液分注至96孔盤(Corning, 3792黑圓底PS盤)之各孔且於室溫培育60分鐘或更久。磁性珠粒以TBS清洗一次後，100ng經純化的IgG添加至各孔中的磁性珠粒，且使盤於室溫靜置一小時使各IgG結合至各孔中的生物素標記抗原。之後，以TBST清洗各孔。以TBS稀釋的山羊抗-人類kappa輕鏈鹼性磷酸酶接合物(BETHYL, A80-115AP)添加至各孔。盤培育1小時。以TBST清洗後，對各孔添加APS-5(Lumigen)。2分鐘後偵測各孔的螢光。測量結果示於表11及圖20。所有純株顯示對CD3ε肽的明顯結合。該等數據證明結合至CD3ε、人類CD137及cyno CD137二者的Fab域可有效率地藉由設計的雙Fab抗體噬菌體展示庫，以相較於實施例6進行的傳統噬菌體淘選過程具有較高點擊率的雙回合選擇過程所獲得。

[表11]

(7-5) 具有所獲得之Fab域的IgG對CD3ε及人類CD137同時結合的評估
選擇六種抗體(DXDU01_3#094(#094)、DADU01_03#018(#018)、DADU01_3#002 (#002)、DXDU01_3#019(#019)、DXDU01_3#051(#051)及DADU01_3#001(#001))進一步評估。描述於WO2005/035584A1的抗-人類CD137抗體(序列編號: 19用於重鏈及序列編號: 20用於輕鏈)使用作為對照抗體。經純化的抗體進行ELISA以評估其等對於CD3ε及人類CD137同時的結合能力。
首先，MyOne-T1鏈黴素珠粒與0.625 pmol生物素標記人類CD137-Fc或生物素標記人類Fc混合，且於室溫培育10分鐘後，添加2%脫脂乳/TBS以封阻磁性珠粒。混合溶液分注至96孔盤(Corning, 3792黑圓底PS盤)之各孔且於室溫培育60分鐘或更久。之後，磁性珠粒以TBS清洗一次，100ng經純化的IgG與62.5、6.25或0.625 pmol 的游離CD3ε肽或62.5 pmol的游離人類Fc或TBS混合後，添加至各孔中的磁性珠粒，且使盤於室溫靜置一小時使各IgG結合至各孔中的生物素標記抗原。之後，以TBST清洗各孔。以TBS稀釋的山羊抗-人類kappa輕鏈鹼性磷酸酶接合物(BETHYL, A80-115AP)添加至各孔。盤培育1小時。以TBST清洗後，對各孔添加APS-5(Lumigen)。2分鐘後偵測各孔的螢光。測量結果示於圖21及表12。

[表12]

於所有測試抗體中觀察到藉由游離CD3ε肽抑制結合至人類CD137-Fc但未見於對照抗-CD137抗體，以及藉由游離Fc域未見抑制。此結果顯示該等所獲得的抗體在CD3ε肽的存在下不能結合至人類CD137-Fc，換言之，該等抗體不同時結合至人類CD137及CD3ε。因此其證實可結合至二種不同抗原CD137及CD3ε，但不同時結合的Fab域成功地以設計的庫及噬菌體雙重回合選擇獲得。

[實施例8] 以雙重回合替代選擇或四重回合選擇自雙Fab庫獲得結合至CD3ε、人類CD137及食蟹猴CD137的Fab域
(8-1) 改良獲得結合至食蟹猴CD137的Fab域的效率的淘選方案
結合至CD3ε、人類CD137及食蟹猴CD137的Fab域係成功地於實施例7獲得，但結合至食蟹猴CD137為較弱於結合至人類CD137。一個改良此之可考慮方案為以雙重回合選擇的替代淘選，其中於不同淘選回合使用不同抗原。藉由此方法，對CD3ε、人類CD137及食蟹猴CD137二者的選擇壓力可以較佳的抗原組合置於各回合中的雙Fab庫，CD3ε與人類CD137、CD3ε與食蟹猴CD137或人類CD137與食蟹猴CD137。另一改良方案為三重或四重回合選擇，其中發明人可於一次淘選回合中使用所有必要的抗原。

實施例7的雙重回合選擇過程中，使用隔夜培育以使抗體展示噬菌體自第1抗原轉移至第2抗原。此方法運行良好，但當隊第1抗原的親和性較強於第2抗原時，轉移可能幾乎不會發生(例如當此雙庫中第1抗原為CD3ε時)。為了處理此狀況，也進行以鹼性溶液的結合噬菌體沖提。運轉名稱及各淘選過程的條件係描述於表13。

結合至CD3ε、人類CD137及食蟹猴CD134的Fab域係從實施例6-1構築的雙Fab庫鑑定。生物素標記CD3ε肽抗原(胺基酸序列: 序列編號: 6)、經由雙硫鍵連接子經生物素標記的CD3ε肽抗原(稱為C3NP1-27；胺基酸序列: 序列編號: 145)、融合至人類IgG1 Fc片段的生物素標記人類CD3ε及融合至人類IgG1 Fc片段的生物素標記人類CD3δ的異源二倍體(命名為CD3ed-Fc，胺基酸序列: SEQ ID: 21, 22)、融合至人類IgG1 Fc片段的生物素標記人類CD137(命名為人類CD137-Fc)、融合至人類IgG1 Fc片段的生物素標記食蟹猴CD137(命名為cyno CD137-Fc)及生物素標記食蟹猴CD137(命名為cyno CD137-Fc)使用作為抗原。

[表13]

(8-2) 以雙重回合選擇及替代淘選獲得結合至CD3ε、人類CD137及食蟹猴CD137的Fab域
以雙重回合選擇和替代淘選進行命名為運轉期DU05的淘選條件以獲得結合至CD3ε、人類CD137及食蟹猴CD137的Fab域，如表13所示。
人類CD137-Fc係使用於偶數回合及食蟹猴CD137-Fc係使用於奇數回合。雙重回合選擇的詳細淘選條件係如實施例7所示。於DU05運轉其中，係自淘選的第2回合進行雙重回合選擇。

(8-3) 以鹼性沖提雙重回合選擇及替代淘選獲得結合至CD3ε、人類CD137及食蟹猴CD137的Fab域
以示於實施例7的不同抗原的前述雙重回合中，由於IdeS或DTT裂解抗原與生物素之間的連接子區，抗體展示噬菌體係經沖提為與其第1抗原複合，所以第1抗原也帶入雙重回合選擇的第2循環且與第2抗原競爭。為了壓制此帶入的第1抗原，也進行以鹼性緩衝液沖提，其誘發結合抗體自抗原的解離，且於傳統噬菌體淘選中為非常普遍的方法(命名為運轉期DS01)。
淘選回合1的詳細淘選過程係與實施例7所示者相同。回合1中，進行以生物素標記CD137-Fc的傳統淘選。
淘選回合1中，結合至人類CD137的Fab展示噬菌體係累積所以自淘選回合2進行鹼沖提雙重回合選擇以獲得結合至CD3ε、人類CD137及食蟹猴CD137的Fab域。

具體地，於淘選回合2，磁性珠粒以2%脫脂乳/TBS於室溫封阻60分鐘或更久且以TBS清洗三次。噬菌體溶液添加至經封阻的磁性珠粒且於室溫培育60分鐘或更久，回收上清。500 pmol的生物素標記人類IgG1 Fc添加至新的磁性珠粒且於室溫培育15分鐘後，添加2%脫脂乳/TBS。於室溫封阻60分鐘或更久後，磁性珠粒以TBS清洗三次。回收的噬菌體溶液添加至經封阻的磁性珠粒且於室溫培育60分鐘或更久後，回收上清。500 pmol的生物素標記CD3ε肽添加至新的磁性珠粒且於室溫培育15分鐘後，添加2%脫脂乳/TBS。於室溫封阻60分鐘或更久後，磁性珠粒以TBS清洗三次。回收的噬菌體溶液添加至經封阻的磁性珠粒且於室溫培育60分鐘。珠粒以TBST(含0.1% Tween 20的TBS；TBS可由Takara Bio Inc.取得)清洗三次後，進一步以1mL的TBS清洗二次。使用0.1M三乙基胺(TEA, Wako 202-02646)回收抗體展示噬菌體。該過程中，添加 500μL的0.1M TEA且珠粒於室溫懸浮10分鐘，在那之後立即使用磁性底座分開該珠粒，以回收噬菌體溶液。添加100μL的1M Tris-HCl (pH 7.5)以中和噬菌體溶液15分鐘。

淘選過程的第1循環中，結合至CD3ε的抗體展示噬菌體係經濃縮後移至第2循環淘選過程，以於噬菌體感染及擴增之前回收也結合至CD137的抗體展示噬菌體。500 pmol的生物素標記人類CD137-Fc添加至新的磁性珠粒且於室溫培育15分鐘後，添加2%脫脂乳/TBS。於室溫封阻60分鐘或更久後，磁性珠粒以TBS清洗三次。回收的噬菌體溶液、50μL的TBS及8% BSA封阻緩衝液係添加至經封阻的磁性珠粒後，於室溫培育60分鐘。珠粒以TBST(含0.1% Tween 20的TBS；TBS可由Takara Bio Inc.取得)清洗三次後，進一步以1mL的TBS清洗二次。補充0.5 mL的1mg/mL胰蛋白酶的珠粒於室溫懸浮15分鐘，在那之後立即使用磁性底座分開該珠粒，以回收噬菌體溶液。自胰蛋白酶處理的噬菌體溶液回收的噬菌體添加至對數生長期(OD600: 0.4-0.7)的大腸桿菌菌株ER2738。經由於37℃溫和旋轉培養該菌株1小時藉由噬菌體感染大腸桿菌。經感染的大腸桿菌接種至225mm × 225mm盤。其次，自經接種的大腸桿菌的培養溶液回收噬菌體，以回收噬菌體庫溶液。

淘選第四及第6回合中的雙重回合選擇中的第2循環，使用生物素標記食蟹猴CD137-Fc取代生物素標記人類CD137-Fc。於淘選回合4至回合6，250 pmol的生物素標記人類或食蟹猴CD137-Fc係使用於雙重回合選擇的第2循環。

(8-4) 以四重回合選擇獲得結合至CD3ε、人類CD137及食蟹猴CD137的Fab域
前述雙重回合選擇中，僅有二種不同抗原可使用於淘選一回合。為了打破此限制，也進行四重回合選擇(命名為運轉期MP09及MP11，示於表13)。
MP09及MP11二者的淘選回合1及MP09的淘選回合2，進行雙重回合選擇。

具體地，磁性珠粒藉由2%脫脂乳/TBS於室溫封阻60分鐘或更久且以TBS清洗三次。噬菌體溶液添加至經封阻的磁性珠粒且於室溫培育60分鐘或更久後，回收上清。500 pmol的生物素標記人類IgG1 Fc添加至新的磁性珠粒且於室溫培育15分鐘後，添加2%脫脂乳/TBS。於室溫封阻60分鐘或更久後，磁性珠粒以TBS清洗三次。回收的噬菌體溶液添加至經封阻的磁性珠粒且於室溫培育60分鐘或更久後，回收上清。268 pmol的生物素標記食蟹猴CD137-Fc添加至新的磁性珠粒且於室溫培育15分鐘後，添加2%脫脂乳/TBS。於室溫封阻60分鐘或更久後，磁性珠粒以TBS清洗三次。回收的噬菌體溶液添加至經封阻的磁性珠粒後，於室溫培育60分鐘或更久。珠粒以TBST(含0.1% Tween 20的TBS；TBS可由Takara Bio Inc.取得)清洗三次後，進一步以1mL的TBS清洗二次。使用FabRICATOR(IdeS, IgG鉸鏈區的蛋白酶, GENOVIS)(命名為IdeS沖提運轉期)回收抗體展示噬菌體。該過程中，添加10單位/μL Fabricator 20μL與80μLTBS，且珠粒於攝氏37度懸浮30分鐘，在那之後立即使用磁性底座分開該珠粒，以回收噬菌體溶液。

此淘選過程的第1循環中，結合至食蟹猴CD137的抗體展示噬菌體係經濃縮後移至第2循環淘選過程，以於噬菌體感染及擴增之前回收也結合至CD3ε的抗體展示噬菌體。為了自噬菌體溶液移除IdeS蛋白酶，添加40μL的助手噬菌體M13KO7 (1.2E+13pfu)及200μL的10% PEG-2.5M NaCl，且因此沉澱之噬菌體匯池係以TBS稀釋以獲得噬菌體庫溶液。500 pmol的生物素標記CD3ed-Fc添加至新的磁性珠粒且於室溫培育15分鐘後，添加2%脫脂乳/TBS。於室溫封阻60分鐘或更久後，磁性珠粒以TBS清洗三次。回收的噬菌體溶液及500μL的8% BSA封阻緩衝液添加至經封阻的磁性珠粒後，於室溫培育60分鐘。珠粒以TBST(含0.1% Tween 20的TBS；TBS可由Takara Bio Inc.取得)清洗三次後，進一步以1mL的TBS清洗二次。添加10單位/μL Fabricator 20μL與80μLTBS且珠粒於攝氏37度懸浮30分鐘，在那之後立即使用磁性底座分開該珠粒，以回收噬菌體溶液。添加5μL的100 mg/mL胰蛋白酶及395μL的TBS且於室溫培育15分鐘。自經胰蛋白酶處理的噬菌體溶液回收的噬菌體添加至於對數生長期(OD600: 0.4-0.7)的大腸桿菌菌株ER2738。經由於37℃溫和旋轉培養該菌株1小時藉由噬菌體感染大腸桿菌。經感染的大腸桿菌接種至225mm × 225mm盤。其次，自經接種的大腸桿菌的培養溶液回收噬菌體以回收噬菌體庫溶液。

於MP09的淘選運轉期的第二回合中，生物素標記人類CD137-Fc使用作為第1循環淘選抗原及具有藉由胰蛋白酶沖提的生物素標記食蟹猴CD137使用作為第2循環淘選抗原，如表13所示。

MP09運轉期的淘選回合3及回合4，以及MP11運轉期的淘選回合2及回合3中進行四重淘選。

MP09的淘選回合3及MP11運轉期的淘選回合2中，磁性珠粒係藉由2%脫脂乳/TBS於室溫封阻60分鐘或更久且以TBS清洗三次。噬菌體溶液添加至經封阻的磁性珠粒且於室溫培育60分鐘或更久後，回收上清。500 pmol的生物素標記人類IgG1 Fc添加至新的磁性珠粒且於室溫培育15分鐘後，添加2%脫脂乳/TBS。於室溫封阻60分鐘或更久後，磁性珠粒以TBS清洗三次。回收的噬菌體溶液添加至經封阻的磁性珠粒且於室溫培育60分鐘或更久後，回收上清。250 pmol的生物素標記人類CD137-Fc添加至新的磁性珠粒且於室溫培育15分鐘後，添加2%脫脂乳/TBS。於室溫封阻60分鐘或更久後，磁性珠粒以TBS清洗三次。回收的噬菌體溶液添加至經封阻的磁性珠粒後，於室溫培育60分鐘。珠粒以TBST(含0.1% Tween 20的TBS；TBS可由Takara Bio Inc.取得)清洗三次後，進一步以1mL的TBS清洗二次。使用FabRICATOR(IdeS, IgG鉸鏈區的蛋白酶, GENOVIS)(命名為IdeS沖提運轉期)回收抗體展示噬菌體。該過程中，添加10單位/μL Fabricator 20μL與80μLTBS，且珠粒於攝氏37度懸浮30分鐘，在那之後立即使用磁性底座分開該珠粒，以回收噬菌體溶液。
為了自噬菌體溶液移除IdeS蛋白酶，添加40μL的助手噬菌體M13KO7 (1.2E+13pfu)及200μL的10% PEG-2.5M NaCl，且因此沉澱之噬菌體匯池係以TBS稀釋以獲得噬菌體庫溶液。250 pmol的生物素標記CD3ed-Fc添加至新的磁性珠粒且於室溫培育15分鐘後，添加2%脫脂乳/TBS。於室溫封阻60分鐘或更久後，磁性珠粒以TBS清洗三次。回收的噬菌體溶液及500μL的8% BSA封阻緩衝液添加至經封阻的磁性珠粒後，於室溫培育60分鐘。珠粒以TBST(含0.1% Tween 20的TBS；TBS可由Takara Bio Inc.取得)清洗三次後，進一步以1mL的TBS清洗二次。添加10單位/μL Fabricator 20μL與80μLTBS且珠粒於攝氏37度懸浮30分鐘，在那之後立即使用磁性底座分開該珠粒，以回收噬菌體溶液。
四重回合選擇的第3循環中，添加40μL的助手噬菌體M13KO7 (1.2E+13pfu)及200μL的10% PEG-2.5M NaCl，且因此沉澱之噬菌體匯池係以TBS稀釋以獲得噬菌體庫溶液。250 pmol的生物素標記食蟹猴CD137-Fc添加至新的磁性珠粒且於室溫培育15分鐘後，添加2%脫脂乳/TBS。於室溫封阻60分鐘或更久後，磁性珠粒以TBS清洗三次。回收的噬菌體溶液及500μL的8% BSA封阻緩衝液添加至經封阻的磁性珠粒後，於室溫培育60分鐘。珠粒以TBST(含0.1% Tween 20的TBS；TBS可由Takara Bio Inc.取得)清洗三次後，進一步以1mL的TBS清洗二次。添加10單位/μL Fabricator 20μL與80μLTBS且珠粒於攝氏37度懸浮30分鐘，在那之後立即使用磁性底座分開該珠粒，以回收噬菌體溶液。

四重回合選擇的第4循環中，添加40μL的助手噬菌體M13KO7 (1.2E+13pfu)及200μL的10% PEG-2.5M NaCl，且因此沉澱之噬菌體匯池係以TBS稀釋以獲得噬菌體庫溶液。500 pmol的生物素標記CD3ed-Fc添加至新的磁性珠粒且於室溫培育15分鐘後，添加2%脫脂乳/TBS。於室溫封阻60分鐘或更久後，磁性珠粒以TBS清洗三次。回收的噬菌體溶液及500μL的8% BSA封阻緩衝液添加至經封阻的磁性珠粒後，於室溫培育60分鐘。珠粒以TBST(含0.1% Tween 20的TBS；TBS可由Takara Bio Inc.取得)清洗三次後，進一步以1mL的TBS清洗二次。添加10單位/μL Fabricator 20μL與80μLTBS且珠粒於攝氏37度懸浮30分鐘，在那之後立即使用磁性底座分開該珠粒，以回收噬菌體溶液。添加5μL的100 mg/mL胰蛋白酶及395μL的TBS且於室溫培育15分鐘。由經胰蛋白酶處理的噬菌體溶液回收的噬菌體添加至於對數生長期(OD600: 0.4-0.7)的大腸桿菌菌株ER2738。經由於37℃溫和旋轉培養該菌株1小時藉由噬菌體感染大腸桿菌。經感染的大腸桿菌接種至225mm × 225mm盤。其次，由經接種的大腸桿菌的培養溶液回收噬菌體以回收噬菌體庫溶液。

MP09的淘選回合4及MP11運轉期的淘選回合3中，生物素標記人類CD137-Fc使用作為第1循環抗原及生物素標記食蟹猴CD137-Fc使用作為第3循環抗原。

(8-5) 藉由噬菌體展示之Fab域對人類及食蟹猴CD137的結合(噬菌體ELIASA)
Fab展示噬菌體溶液係經由實施例8-2、8-3及8-4的淘選過程製備。首先，20μg的鏈黴素被覆磁性珠粒MyOne-T1珠粒以包括0.4% block Ace、1%BSA、0.02% Tween及0.05% ProClin 300的封阻緩衝液清洗三次後，於室溫以此封阻緩衝液封阻60分鐘或更久。以TBST清洗一次後，磁性珠粒施用至96孔盤(Corning, 3792黑圓底PS盤)的各孔且對磁性珠粒添加0.625pmol的生物素標記人類CD137-Fc、生物素標記食蟹猴CD137-Fc或生物素標記CD3ε肽，且於室溫培育15分鐘或更久。以TBST清洗一次後，250nL的Fab展示噬菌體溶液之各者與24.75μL的TBS添加至孔，且使盤於室溫靜置一小時使各Fab結合至各孔中的生物素標記抗原。之後各孔以TBST清洗。對各孔添加以TBS稀釋的抗-M13(p8)Fab-HRP。盤培育10分鐘。以TBST清洗後，對各孔添加LumiPhos-HRP(Lumigen)。2分鐘後偵測各孔的螢光。結果示於圖22。

於各淘選輸出噬菌體溶液中，觀察到對各抗原的結合，人類CD137、食蟹猴CD137及CD3ε。此結果顯示以鹼沖提的雙重回合選擇如前述以IdeS方法的雙重回合選擇同樣運作良好，以及具有替代淘選的雙重回合選擇也運作良好而獲得結合至三種不同抗原的Fab域。儘管該等方法收集結合至三種不同抗原的Fab域，但對食蟹猴CD137的結合相較於對人類CD137的結合為弱。另一方面，MP09及MP11運轉期中，於相同回合點觀察到對CD3ε、人類CD137及食蟹猴CD137的結合，且其等對食蟹猴CD137的結合係較高於其他運轉期。此結果展現四重回合選擇可更有效率地濃縮結合至三種不同抗原的Fab域。

(8-6) 具有所獲得之Fab域的IgG的製備
由各淘選輸出匯池選取96個純株且分析其等之VH基因序列。選擇32個純株因為其等之VH序列於所有經分析的匯池中出現多過二次。其等之VH基因藉由PCR擴增且轉為IgG格式。各純株的VH序列使用特異性地結合至庫中的H鏈的引子(序列編號: 157及158)藉由PCR擴增。經擴增的VH片段整合至已具有人類IgG1 CH1-Fc區的動物表現質體。所製備的質體藉由參考例1的方法使用於動物細胞中表現。該等樣品稱為經轉為IgG的純株。GLS3000使用作為輕鏈。

各淘選輸出匯池的VH基因也轉為IgG格式。噬粒載體庫由各淘選輸出匯池DU05、DS01及MP11的大腸桿菌製備，且以NheI及SalI限制酵素分解以直接抽出VH基因。所抽出的VH片段整合至已具有人類IgG1 CH1-Fc區的動物表現質體。所製備的質體導入至大腸桿菌且由各淘選輸出匯池選取192或288個菌落以及分析其等之VH序列。MP09及11運轉期中，儘可能選取具有不同VH序列的純株。由各大腸桿菌菌落所製備的質體藉由參考例1的方法使用於動物細胞中表現。該等樣品稱為經轉為IgG的團塊(bulk)。GLS3000使用作為輕鏈。

(8-7) 評價所獲得的抗體針對其CD3ε、人類CD137及食蟹猴CD137的結合活性
所製備之經轉為IgG抗體的團塊係進行ELISA以評估其對於CD3ε、人類CD137及食蟹猴CD137的結合能力。

首先，經鏈黴素被覆微孔盤(384孔，Greiner)以20μL的含有生物素標記CD3ε肽、生物素標記人類CD137-Fc或生物素標記食蟹猴CD137的TBS於室溫被覆1或多個小時。藉由以TBST清洗盤的各孔以移除未結合至盤的生物素標記抗原後，孔以20μL的封阻緩衝液(2%脫脂乳/TBS)封阻一或多個小時。自各孔移除封阻緩衝液。以2%脫脂乳/TBS稀釋二倍之含有IgG的哺乳動物細胞上清各者20μL添加至孔，且使盤於室溫靜置一小時以使各IgG結合至各孔中的生物素標記抗原。之後，以TBST清洗各孔。以TBS稀釋的山羊抗-人類kappa輕鏈鹼性磷酸酶接合物(BETHYL, A80-115AP)添加至各孔。盤培育1小時。以TBST清洗後，各孔中的溶液之經添加Blue Phos Microwell Phosphatase Substrate System (KPL)的發色反應，係藉由添加Blue Phos Stop Solution (KPL)終止。然後，藉由測量於615 nm的吸收度測量顏色發展。測量結果示於圖23。

顯示結合至CD3ε、人類CD137及食蟹猴CD137二者的許多IgG純株係自各淘選過程獲得，所以其證實具有替代淘選的雙重回合選擇、以鹼沖提的雙重選擇及四重回合選擇二者皆如預期的運作良好。尤其是，相較於其他二個淘選條件，來自結合至人類CD137的四重回合選擇的所有純株之多數顯示相等程度之對食蟹猴CD137的結合。該等淘選條件中，可能獲得較少顯示結合至CD3ε及人類CD137二者的純株，其主因在於彼此具有相同VH序列而於此運轉期中盡可能地有目的地不被選取。選擇顯示對各蛋白質顯示較佳結合且彼此具有不同V序列的54個純株且進一步評估。

(8-8) 評價經純化IgG抗體針對其CD3ε、人類CD137及食蟹猴CD137的結合活性
評估經純化的IgG抗體的結合能力。使用實施例8-5中的32個經轉為IgG的純株以及實施例8-6中所選擇之經轉為IgG的54個團塊。

首先，20μg的鏈黴素被覆磁性珠粒MyOne-T1珠粒以包括0.4% block Ace、1% BSA、0.02% Tween及0.05% ProClin 300的封阻緩衝液清洗三次後，於室溫以此封阻緩衝液封阻60分鐘或更久。以TBST清洗一次後，磁性珠粒施用至白圓底PS盤(Corning, 3605)之各孔且對磁性珠粒添加0.625pmol的生物素標記CD3ε、2.5 pmol的人類CD137-Fc、2.5 pmol的生物素標記食蟹猴CD137-Fc或0.625pmol的生物素標記人類Fc，且於室溫培育15分鐘或更久。以TBST清洗一次後，50 ng/μL經純化的IgG 之各者25μL添加至孔，且使盤於室溫靜置一小時以使各IgG結合至各孔中的生物素標記抗原。之後各孔以TBST清洗。以TBS稀釋的山羊抗-人類kappa輕鏈鹼性磷酸酶接合物(BETHYL, A80-115AP)添加至各孔。盤培育1小時。以TBST清洗後，各樣品轉移至96孔盤(Corning, 3792黑圓底PS盤)且對各孔添加APS-5 (Lumigen)。2分鐘後偵測各孔的螢光。測量結果示於圖24。許多純株顯示相同程度對人類及食蟹猴CD137二者的結合，且亦顯示對CD3ε的結合。

(8-9) 評估具有所獲得Fab域IgG對CD3ε及人類CD137的同時結合
選擇實施例8-7中顯示對CD3ε、人類CD137及食蟹猴CD137明顯結合的37個抗體進一步評估。也評估實施例7-3中所獲得的7個抗體(該7個純株如同表14重新命名)。經純化的抗體進行ELISA以評估其等同時對CD3ε及人類CD137的結合能力。實施例7-5中所述之命名為B的抗-人類CD137抗體使用作為對照抗體。

[表14]

首先，20μg的鏈黴素被覆磁性珠粒MyOne-T1珠粒以包括0.4% block Ace、1%BSA、0.02% Tween及0.05% ProClin 300的封阻緩衝液清洗三次後，於室溫以此封阻緩衝液封阻60分鐘或更久。以TBST清洗一次後，磁性珠粒施用至黑圓底PS盤(Corning, 3792)之各孔。添加1.25 pmol的生物素標記人類CD137-Fc且於室溫培育10分鐘。之後，磁性珠粒以TBS清洗一次。1250 ng的經純化的IgG與125、12.5或1.25 pmol的游離CD3ε肽或TBS混合後，添加至各孔中的磁性珠粒，且使盤於室溫靜置一小時以使各IgG結合至各孔中的生物素標記抗原。之後各孔以TBST清洗。以TBS稀釋的山羊抗-人類kappa輕鏈鹼性磷酸酶接合物(BETHYL, A80-115AP)添加至各孔。盤培育10分鐘。以TBST清洗後，對各孔添加APS-5 (Lumigen)。2分鐘後偵測各孔的螢光。測量結果示於圖25及表15。

[表15]

除了對照抗-CD137抗體B以外，所有經測試的純株之對人類CD137的結合都受到過量的游離CD3ε所抑制，其展現所獲得之具有雙Fab庫的抗體不同時結合至CD3ε及人類CD137。

(8-10) 具有所獲得之Fab域的IgG的人類CD137抗原決定基對CD3ε及人類CD137的評估
選擇實施例8-8中的21個抗體進一步評估(表17)。經純化的抗體進行ELISA以評估其人類CD137的結合抗原決定基。
為了分析抗原決定基，片段化人類CD137以及域藉由稱為CRD參考物的Cys-Cys所形成的結構分割抗體的Fc區的融合蛋白(表16)係描述於WO2015/156268。片段化人類CD137-Fc融合蛋白包括示於表16的胺基酸序列，由編碼全長人類CD137-Fc融合蛋白的多核苷酸(序列編號: 16)藉由PCR得到個別基因片段，藉由所屬技術領域習知的方法併入質體載體用以於動物細胞表現。片段化人類CD137-Fc融合蛋白藉由如WO2015/156268揭示的方法純化成抗體。

[表16]

首先，20μg的鏈黴素被覆磁性珠粒MyOne-T1珠粒以包括0.4% block Ace、1% BSA、0.02% Tween及0.05% ProClin 300的封阻緩衝液清洗三次後，於室溫以封阻緩衝液封阻60分鐘或更久。以TBST清洗一次後，磁性珠粒施用至黑圓底PS盤(Corning, 3792)之各孔。添加1.25 pmol的生物素標記人類CD137-Fc、人類CD137域1-Fc、人類CD137域1/2-Fc、人類CD137域2/3-Fc、人類CD137域2/3/4-Fc、人類CD137域3/4-Fc及人類Fc且於室溫培育10分鐘。之後，磁性珠粒以TBS清洗一次。1250 ng的經純化的IgG添加至各孔中的磁性珠粒，且使盤於室溫靜置一小時以使各IgG結合至各孔中的生物素標記抗原。之後各孔以TBST清洗。以TBS稀釋的山羊抗-人類kappa輕鏈鹼性磷酸酶接合物(BETHYL, A80-115AP)添加至各孔。盤培育10分鐘。以TBST清洗後，對各孔添加APS-5 (Lumigen)。2分鐘後偵測各孔的螢光。測量結果示於圖26。

各純株辨識人類CD137的不同抗原決定基域。抗體辨識僅有域1/2(例如，dBBDu183、dBBDu205)、域1/2及域2/3二者(例如，dBBDu193、dBBDu202、dBBDu222)、域2/3、2/3/4及3/4二者(例如，dBBDu139、dBBDu217)、廣的人類CD137域(dBBDu174)且其不結合至各分開的人類CD137域(例如，dBBDu126)。此結果展現出以此經設計的庫及雙重回合選擇過程可獲得針對多個人類CD137抗原決定基的許多雙結合抗體。

dBBDu126的具體抗原決定基區無法由此ELISA所決定，但是可猜測其將辨識其中人類及食蟹猴具有不同殘基的位置，因為dBBDu126不能如實施例7-3所述地與食蟹猴CD137交叉反應。如圖18所示，人類於食蟹猴之間有8個不同位置，且藉由對食蟹猴CD137/人類CD137/融合分子的結合測試及結合複合物的晶體結構分析，75E(人類中75G)係經鑑定為干擾dBBDu126結合至食蟹猴CD137的狀況。晶體結構也解明dBBDu126主要辨識人類CD137的CDR3區。

[表17]

[實施例9] 以設計的輕鏈庫自雙Fab庫之結合至CD3ε及人類CD137的抗體域的親和性成熟
(9-1) 具有所獲得之重鏈的輕鏈庫的構築
實施例8中獲得結合至CD3ε及人類CD137二者的許多抗體，但其對於人類CD137的親和性仍弱，因此進行改良其等親和性的親和性成熟。

13個VH序列，dBBDu_179、183、196、197、199、204、205、167、186、189、191、193及222選擇用於親和性成熟。其等之中，dBBDu_179、183、196、197、199、204及205具有相同的CDR3序列及不同的CDR1或2序列，因此該等7個噬粒係經混合以製造輕鏈Fab庫。dBBDu_191、193及222三個噬粒也經混合以製造輕鏈Fab庫，然而其等具有不同的CDR3序列。輕鏈庫的清單示於表18。

[表18]

描述於參考例4之經合成的抗體VL庫片段，係以序列編號: 159及160的引子藉由PCR方法擴增。經擴增的VL片段藉由SfiI及KpnI限制酵素分解且導入至已具有各13個VH片段的噬粒載體。用於噬菌體展示之所構築的噬粒係藉由電穿孔轉移至大腸桿菌，以製備帶有抗體庫片段的大腸桿菌。

展示Fab域的噬菌體庫係自帶有所構築的噬粒藉由感染編碼FkpA伴侶蛋白基因的助手噬菌體M13KO7TC/FkpA後，於0.002%阿拉伯糖的存在下於攝氏25度隔夜培育而製造。M13KO7TC為助手噬菌體，其於助手噬菌體的pIII蛋白質的N2域及CT域之間具有胰蛋白酶裂解序列的插入(參照日本專利申請公開號2002-514413)。插入基因至M13KO7TC基因的導入已揭示於他處(參照WO2015/046554)。

(9-2) 以雙重回合選擇獲得結合至CD3ε及人類CD137的Fab域
結合至CD3ε、人類CD137及食蟹猴CD137的Fab域係鑑定自實施例9-1所構築的雙Fab庫。經由雙硫鍵連接子經生物素標記的CD3ε肽抗原(C3NP1-27)、融合至人類IgG1 Fc片段的生物素標記人類CD137(命名為人類CD137-Fc)及融合至人類IgG1 Fc片段的生物素標記食蟹猴CD137(命名為食蟹猴CD137-Fc)使用作為抗原。

噬菌體由帶有用於噬菌體展示所構築的噬粒的大腸桿菌製造。對已製造噬菌體的大腸桿菌的培養溶液添加2.5M NaCl/10% PEG，因此所沉澱的噬菌體匯池以TBS稀釋以獲得噬菌體展示庫溶液。其次，對噬菌體展示溶液添加BSA(最終濃度：4%)。淘選方法係參照使用抗原經固定化於磁性珠粒的一般淘選方法進行(J. Immunol. Methods. (2008) 332(1-2), 2-9; J. Immunol. Methods (2001) 247 (1-2), 191-203; Biotechnol. Prog. (2002) 18(2) 212-20; 及 Mol. Cell Proteomics (2003) 2(2), 61-9)。使用的磁性珠粒為NeutrAvidin被覆珠粒(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)或鏈黴素被覆珠粒(Dynabeads M-280 Streptavidin)。

具體地，噬菌體溶液與100 pmol的人類CD137-Fc及4 nmol的游離人類IgG1 Fc域混和且於室溫培育60分鐘。磁性珠粒以具有游離鏈黴素(Roche)的2%脫脂乳/TBS於室溫封阻60分鐘或更久，且以TBS清洗三次後，與培育的噬菌體溶液混合。於室溫培育15分鐘後，珠粒以TBST(含有0.1% Tween 20 的TBS；TBS可由Takara Bio Inc.取得)清洗三次10分鐘後，進一步以1mL的TBS清洗二次10分鐘。使用FabRICATOR (IdeS，對於IgG鉸鏈區的蛋白酶，GENOVIS)(命名為IdeS沖提運轉期)以回收抗體展示噬菌體。該過程中，添加10單位/μL Fabricator 20μL與80μLWBT緩衝液且珠粒於攝氏37度懸浮10分鐘，在那之後立即使用磁性底座分開該珠粒，以回收噬菌體溶液。添加5μL的100 mg/mL胰蛋白酶及400μL的TBS且於室溫培育15分鐘。回收的噬菌體溶液添加至於對數生長期(OD600: 0.4-0.5)的大腸桿菌菌株ER2738。經由於37℃溫和旋轉培養該菌株1小時藉由噬菌體感染大腸桿菌。經感染的大腸桿菌接種至225mm × 225mm盤。其次，由經接種的大腸桿菌的培養溶液回收噬菌體以製備噬菌體庫溶液。

此淘選回合1過程中，結合至人類CD137的抗體展示噬菌體係經濃縮。淘選的第2回合中，160 pmol的C3NP1-27使用作為生物素標記抗原且以TBST進行七次清洗2分鐘後，以TBS清洗三次2分鐘。沖提以25 mM DTT於室溫進行15分鐘後，藉由胰蛋白酶分解。

淘選的第3回合中，16或80 pmol的生物素標記食蟹猴CD137-Fc使用作為抗原且以TBST進行七次清洗10分鐘後，以TBS清洗三次10分鐘。沖提以IdeS與回合1同樣方式進行。

淘選的第4回合中，16或80 pmol的生物素標記人類CD137-Fc使用作為抗原且以TBST進行七次清洗10分鐘後，以TBS清洗三次10分鐘。沖提以IdeS與回合1同樣方式進行。

(9-3) 具有所獲得之Fab域的IgG對人類CD137及食蟹猴CD137的結合
各淘選輸出匯池的Fab基因係轉為IgG格式。所製備的哺乳動物表現質體導入大腸桿菌且自各淘選輸出匯池選取96個菌落，以及分析其等之VH及VL序列。分別地，庫2中的VH序列之多數已濃縮至dBBDu_183以及庫6中的VH序列之多數已濃縮至dBBDu_193。由各大腸桿菌菌落所製備的質體藉由參考例1的方法使用於動物細胞中表現。

所製備的IgG抗體進行ELISA以評估其對於CD3ε、人類CD137及食蟹猴CD137的結合能力。

首先，經鏈黴素被覆微孔盤(384孔，Greiner)以20μL的含有生物素標記CD3ε肽、生物素標記人類CD137-Fc或生物素標記食蟹猴CD137的TBS於室溫被覆1或多個小時。藉由以TBST清洗盤的各孔以移除未結合至盤的生物素標記抗原後，孔以20μL的封阻緩衝液(2%脫脂乳/TBS)封阻一或多個小時。自各孔移除封阻緩衝液。經以1%脫脂乳/TBS稀釋二倍之含有IgG的哺乳動物細胞上清10ng/μL各者20μL添加至孔，且使盤於室溫靜置一小時以使各IgG結合至各孔中的生物素標記抗原。之後，以TBST清洗各孔。以TBS稀釋的山羊抗-人類kappa輕鏈鹼性磷酸酶接合物(BETHYL, A80-115AP)添加至各孔。盤培育1小時。以TBST清洗後，各孔中的溶液經添加Blue Phos Microwell Phosphatase Substrate System (KPL)的發色反應，係藉由添加Blue Phos Stop Solution (KPL)終止。然後，藉由測量於615 nm的吸收度測量顏色發展。測量結果示於圖27。

自各淘選過程獲得顯示結合至CD3ε、人類CD134及食蟹猴CD137二者的許多IgG純株。選擇顯示較佳結合的96個純株且進一步評估。

(9-4) 具有所獲得之Fab域的IgG對CD3ε及人類CD137同時結合的評估
選擇實施例9-3中顯示對CD3ε、人類CD137及食蟹猴CD137二者明顯結合的96個抗體進一步評估。經純化的抗體進行ELISA以評估其等對於CD3ε及人類CD137同時結合能力。

首先，20μg的鏈黴素被覆磁性珠粒MyOne-T1珠粒以包括0.5x block Ace、0.02% Tween及0.05% ProClin 300的封阻緩衝液清洗三次後，於室溫以此封阻緩衝液封阻60分鐘或更久。以TBST清洗一次後，磁性珠粒施用至黑圓底PS盤(Corning, 3792)之各孔。添加0.625pmol的生物素標記人類CD137-Fc且於室溫培育10分鐘。之後以TBS清洗磁性珠粒一次。250 ng經純化的IgG 與62.5、6.25及0.625 pmol的游離CD3ε或62.5 pmol的游離人類IgG1 Fc域混合後，添加至各孔中的磁性珠粒，且使盤於室溫靜置一小時以使各IgG結合至各孔中的生物素標記抗原。之後各孔以TBST清洗。以TBS稀釋的山羊抗-人類kappa輕鏈鹼性磷酸酶接合物(BETHYL, A80-115AP)添加至各孔。盤培育10分鐘。以TBST清洗後，對各孔添加APS-5 (Lumigen)。2分鐘後偵測各孔的螢光。測量結果示於圖28及表19。多數經測試的純株對人類CD137的結合藉由過量的游離CD3ε肽受到抑制，其展現所獲得之具有雙Fab庫的抗體不同時結合至CD3ε及人類CD137。

[表19]

(9-5) 具有所獲得之Fab域的IgG對CD3ε、人類CD137及食蟹猴CD137的親和性評估
實施例9-4所獲得之各IgG對人類CD3ed、人類CD137及食蟹猴CD137的結合係使用Biacore T200確認。根據實施例9-4的結果選擇16個抗體。感測晶片CM3 (GE Healthcare)藉由胺偶合與合適量的當然蛋白質A (sure protein A)(GE Healthcare)固定化。所選擇的抗體藉由晶片捕捉而允許對作為抗原之人類CD3ed、人類CD137及食蟹猴CD137的交互作用。所使用的運行緩衝液為20 mmol/l ACE、150 mmol/l NaCl、0.05% (w/v) Tween 20，pH 7.4。所有測量於25℃施行。抗原使用運行緩衝液稀釋。

關於人類CD137，所選擇的抗體於抗原濃度4000、1000、250、62.5及15.6 nM評價其結合。稀釋的抗原溶液及作為空白之運行緩衝液，以流速30μL/min 裝載180秒而允許各濃度的抗原與捕捉於感測晶片的抗體交互作用。然後，運行緩衝液以流速30μL/min運行300秒且觀察抗原自抗體的解離。其次，為了再生感測晶片，10 mmol/L甘胺酸-HCl，pH 1.5，以流速30μL/min 裝載10秒且50 mmol/L NaOH以流速30μL/min 裝載10秒。

關於食蟹猴CD137，所選擇的抗體於抗原濃度4000、1000及250nM評價其結合。稀釋的抗原溶液及作為空白之運行緩衝液，以流速30μL/min 裝載180秒而允許各濃度的抗原與捕捉於感測晶片的抗體交互作用。然後，運行緩衝液以流速30μL/min運行300秒且觀察抗原自抗體的解離。其次，為了再生感測晶片，10 mmol/L甘胺酸-HCl，pH1.5，以流速30μL/min 裝載10秒且50 mmol/L NaOH以流速30μL/min 裝載10秒。

關於人類CD3ed，所選擇的抗體於抗原濃度1000、250及62.5 nM評價其結合。稀釋的抗原溶液及作為空白之運行緩衝液，以流速30μL/min 裝載120秒而允許各濃度的抗原與捕捉於感測晶片的抗體交互作用。然後，運行緩衝液以流速30μL/min運行且觀察抗原自抗體的解離。其次，為了再生感測晶片，10 mmol/L甘胺酸-HCl，pH1.5，以流速30μL/min 裝載30秒且50 mmol/L NaOH以流速30μL/min 裝載30秒。

如締合速率常數ka (1/Ms)及解離速率常數kd (1/s)之動力學參數，係基於由測量所獲得的感應圖譜計算。解離常數KD (M)係由該等常數計算。各參數係使用Biacore T200評估軟體(GE Healthcare)計算。結果示於表20。

[表20]

[實施例10] 製備抗-人類GPC3/雙Fab三特異性抗體及評估其人類CD137促效活性
(10-1) 製備抗-人類GPC3/抗-人類CD137雙特異性抗體及抗-人類GPC3/雙-Fab三特異性抗體
帶有人類IgG1恆定區的抗-人類GPC3/抗-人類CD137雙特異性抗體及抗-人類GPC3/雙-Fab三特異性抗體係由下述過程製造。描述於WO2005/035584 A1之編碼抗-人類CD137抗體(序列編號: 19為H鏈，及序列編號: 20為L鏈)的基因 (簡寫為B)使用作為對照抗體。抗體的抗-人類GPC3側共有重鏈可變區H0000 (序列編號: 66)及輕鏈可變區GL4 (序列編號: 67)。描述於實施例9及表20的16個雙-Fab使用作為候選雙-Ig抗體。對於該等分子，使用由Schaefer等人所報導的CrossMab技術(Schaefer, Proc. Natl. Acad. Sci., 2011, 108, 11187-11192)調控H和L鏈之間的締合且有效率地獲得雙特異性抗體。更具體地，該等抗體係藉由交換針對人類GPC3的Fab的VH及VL域而製造。對於異源性締合的促進，鈕-進入-孔(Knobs-into-Holes)技術使用於抗體H鏈的恆定區。鈕-進入-孔技術為一種藉由經由H鏈的異源二倍體化的促進，而能製備感興趣的異源二倍體抗體的技術，該H鏈的二倍體化係藉由以較大側鏈(鈕)取代存在於H鏈之一者的CH3區的胺基酸側鏈以及以較小的側鏈(孔)取代存在於H鏈之一者的CH3區的胺基酸，使得鈕將被置入孔(Burmeister, Nature, 1994, 372, 379-383)。以下，已被導入鈕修飾的恆定區將被指稱為Kn，以及孔修飾已被導入的恆定區將被指稱為Hl。再者，使用描述於WO2011/108714的修飾以減低Fcγ結合。具體地，位置234、235及297 (EU編號)的胺基酸取代為Ala的修飾被導入。位置446的Gly及位置447的Lyc (EU編號)自抗體H鏈的C終端被移除。組胺酸標籤添加至Kn Fc區的C終端，且FLAG標籤添加至Hl Fc區的C終端。藉由導入上述修飾所製備的抗-人類GPC3 H鏈為GC33(2)H-G1dKnHS (序列編號: 68)。所製備的抗-人類CD137 H鏈為BVH-G1dHIFS (SEQ ID NO：69)。抗體L鏈GC33(2)L-k0 (序列編號: 70)及BVL-k0 (序列編號: 71)通常分別使用於抗-人類GPC3側及抗-CD137側。雙抗體的H鏈和L鏈也示於表20。分別地，各雙抗體純株的VH融合至G1dH1FS (序列編號: 83) CH區，且各雙抗體純株的VL融合至k0 (序列編號: 84) CL區，相同於BVH-G1H1FS及BVL-k0。具有示於表22的組合的抗體係經表現以獲得感興趣的雙特異性抗體。具有公認不相干者的抗體使用作為對照(簡寫為Ctrl)。該等抗體係藉由瞬時表現於FreeStyle293細胞(Invitrogen)予以表現且根據「參考例1」純化。

(10-2) 評價抗-人類GPC3/雙Fab三特異性抗體的活體外GPC3-依賴性CD137促效功效
人類CD137的促效活性係使用ELISA套組(R&D systems, DY206)基於細胞介素產生而予以評估。為了避免抗-人類GPC3/雙-Fab抗體的CD3ε結合域的功效，使用不表現CD3ε也不表現GPC3，但組成性地(constitutively)表現CD137的B細胞株HDLM-2。HDLM-2以8×10⁵ 細胞/mL的密度，懸浮於含有20% FBS的RPMI-1640培養基。表現GPC3的小鼠癌細胞株CT26-GPC3 (參考例5)以4×10⁵ 細胞/mL的密度懸浮於相同培養基。混合相同體積的各細胞懸浮液，經混合的細胞懸浮液以體積200 ul/孔接種至96-孔盤。抗-GPC3/Ctrl抗體、抗GPC-3/抗CD-137抗體及8個實施例10-1所製備的抗-GPC3/雙-Fab抗體各者以30μg/ml、6μg/ml、1.5μg/ml、0.24μg/ml添加。細胞於37℃及5% CO₂ 的條件培養3日。收集細胞上清，以及於該上清所含有的人類IL-6的濃度係以Human IL-6 DuoSet ELISA(R&D systems, DY206)以估算HDLM-2活化。ELISA係由套組製造商(R&D systems)所提供的指示實施。

其結果(圖29及表21)，8個抗-GPC3/雙Fab抗體中的七個顯示取決於抗體濃度之HDLM-2以及抗-GPC3/抗-CD137的IL-6製造的活化。表21中，相較於Ctrl的促效活性意指在Ctrl的存在下，hIL-6的分泌超過背景的增加程度。基於該結果，認為該等雙-Fab抗體對人類CD137具有促效活性。

[表21]

[實施例11]評價抗-人類GPC3/雙-Fab三特異性抗體的人類CD3ε促效活性
(11-1) 製備抗-人類GPC3/抗-人類CD3ε雙特異性抗體及抗-人類GPC3/雙Fab三特異性抗體
帶有人類IgG1恆定區的抗-人類GPC3/Ctrl雙特異性抗體及抗-人類GPC3/雙Fab三特異性抗體係製備於實施例10-1，及抗-人類GPC3/抗-人類CD3ε雙特異性抗體也以相同構築方式製備。參考例2中所製造的CE115 VH(序列編號: 72)及CE115 VL(序列編號: 73)使用於抗-人類CD3ε抗體重鏈及輕鏈。抗體具有的組合示於表22。該等抗體藉由瞬時表現於FreeStyle293細胞(Invitrogen)予以表現且根據「參考例1」純化。

[表22]

(11-2) 評價抗-人類GPC3/雙-Fab三特異性抗體的活體外GPC3-依賴性CD3促效活性
針對人類CD3的促效活性藉由使用GloResponseTM NFAT-luc2 Jurkat細胞株(Promega, CS#176401)作為效應子細胞予以評估。Jurkat細胞為衍生自人類急性T細胞白血病的人類T淋巴細胞的不死化細胞株，且於其本身表現人類CD3。NFAT luc2_jurkat細胞中，螢光素的表現係藉由來自CD3活化的信號而誘發。於細胞膜表現人類GPC3的SK-pca60細胞株(參考例5)使用作為靶細胞。

5.00E+03 SK-pca69細胞(靶細胞)及3.00E+04 NFAT-luc2 Jurkat細胞(效應子細胞)二者添加於白底96孔分析盤(Costar, 3917)之各孔後，具有濃度0.1、1或10 mg/mL各抗體10μL添加於各孔且於5% CO2的存在下於攝氏37度培育24小時。所表現的螢光素以Bio-Glo螢光素酶測試系統(Promega, G7940)根據隨附的指示偵測。2104 EnVIsion使用於偵測。結果示於圖30。

多數的雙Fab純株顯示明顯的CD3ε促效活性，且其中一些顯示與CD115抗-人類CD3ε抗體同等程度的活性。此展現對雙Fab域的添加CD137結合活性不會誘發CD3ε促效活性的損失，且雙Fab域顯示不僅結合至二種不同抗原，人類CD3ε及CD137，也顯示僅藉由一種域之人類CD3ε及CD137二者的促效活性。

具有重鏈dBBDu_186的一些雙-Fab域相較於其他者顯示較弱的CD3ε促效活性。該等抗體於實施例9-5的biacore分析也顯示對人類CD3ε較弱的親和性。此展現來自此雙Fab庫的雙-Fab的CD3ε促效活性僅依賴於其對人類CD3ε的親和性，此意指CD3ε促效活性保留於此庫設計中。

[實施例12] 評價PBMC T細胞細胞介素釋放測試中雙-Fab抗體的人類CD3ε/人類CD137協同性活性
(12-1) 抗體製備
描述於WO2005/035584A1的抗-CD137抗體(簡寫為B)、描述於實施例10-1的Ctrl抗體及描述於實施例12的抗-CD3ε CE115抗體使用作為單一抗原特異性對照。選擇雙-Fab，描述於表20的H183L072(重鏈：序列編號: 30，輕鏈：序列編號: 51)用於進一步評估且藉由瞬時表現於FreeStyle293細胞(Invitrogen)予以表現且根據「參考例1」純化。

(12-2) PBMC T細胞測試
為了研究雙-Fab抗體對於CD3ε及CD137活化的協同功效，使用流式細胞珠粒陣列(CBA)人類Th1/T2細胞介素套組II(BD Biosciences #551809)評估總細胞介素釋放。關於CD137活化，由自冷凍購得(STEMCELL)的冷凍人類周邊血液單核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)單離的T細胞評估IL-2(介白素-2)、IFNγ(干擾素γ)及TNFα(腫瘤壞死因子-α)。

(12-2-1) 製備冷凍人類PBMC及單離T細胞
含有PBMC的冷凍管置於37℃水浴以融解細胞。然後細胞分注於含有9mL培養基(使用於培養靶細胞的培養基)之15mL falcon 管。然後細胞懸浮液以1,200rpm於室溫進行離心5分鐘。溫和吸取上清且添加新鮮溫熱培養基用以再懸浮且使用作為人類PBMC溶液。使用Dynabeads Untouched Human T細胞套組(Invitrogen #11344D)依照製造商指示單離T細胞。

(12-2-2) 細胞介素釋放測試
實施例12-1所製備的30μg/mL及10μg/mL的抗體被覆於maxisorp 96-孔盤(Thermofisher #442404)隔夜。對含有抗體的各孔添加1.00E+05 T細胞且於37℃培育72小時。盤以1,200rpm離心5分鐘且收集上清。根據製造商指示進行CBA且結果示於圖31。

僅有雙-Fab，H183L072抗體顯示藉由T細胞的IL-2分泌。抗CD-137 (B)或抗-CD3ε抗體(CE115)單獨皆未造成自T細胞的IL-2誘發。此外，抗-CD137抗體單獨也未造成任何細胞介素的偵測。相較於抗-CD3ε抗體，雙-Fab抗體造成增加的TNFα程度及IFNγ的類似分泌。該等結果建議雙-Fab抗體可引出CD3ε及CD137二者對於T細胞功能活化的協同活化。

[實施例13] 評價抗-GPC3/雙-Fab三特異性抗體的細胞毒性
(13-1) 抗-GPC3/雙-Fab及抗-GPC3/CD137雙特異性抗體製備
根據描述於(Proc Natl Acad Sci USA. 2013 Mar 26;110(13): 5145-5450)的方法，使用Fab-臂交換(FAE)將描述於實施例11的抗-GPC3或Ctrl抗體以及雙-Fab(H183L072)或抗-CD137抗體用以產生四種抗體，抗-GPC3/雙-Fab、抗-GPC3/CD137、Ctrl/H183L072及Ctrl/CD137抗體。所有四種抗體的分子格式係與傳統IgG相同格式。抗-GPC3/H183L072為能結合GPC3、CD3及CD137的三特異性抗體，抗-GPC3/CD137為能結合GPC3及CD137的雙特異性抗體，以及Ctrl/H183L072與Ctrl/CD137係使用作為對照。產生的所有四種抗體由對Fcγ受體具有減弱的親和性(L235R、G236R及S239K)及去糖基化(N297A)的靜默Fc所組成。

(13-2) T細胞依賴性細胞的細胞毒性(T-cell dependent cellular cytotoxicity，TDCC)測試
細胞毒性活性係如參考例(2-5-2)所述地使用xCELLigence Real-Time Cell Analyzer (Roche Diagnostics)藉由細胞生長抑制性的比率評價。1.00E+04 SK-pca60或SK-pca13a，二者皆為表現GPC3的轉染細胞株，使用作為靶(簡寫為T)細胞(分別為參考例5及2)，且與如實施例(12-2-1)所述地製備的5.00E+04冷凍人類PBMC效應子(簡寫為E)細胞共培育。其意指5-倍量的效應子細胞添加於腫瘤細胞，本文描述為ET 5。抗-GPC3/H183L072抗體及GPC3/CD137抗體以0.4、5及10nM添加，而Ctrl/H183L072抗體及Ctrl/CD137抗體以10nM添加於各孔。類似參考例2-5-2所述地進行細胞毒性活性的測量。反應以5%二氧化碳氣體於37℃的條件實施。添加PBMC 72小時後，使用描述於參考例2-5-2的方程式測定細胞生長抑制(Cell Growth Inhibition，CGI)比率(%)且作圖於如圖32所示的圖。於實施例11-2中於Jurkat細胞顯示CD3活化的抗-GPC3/H183L072雙-Fab抗體，而不是不顯示CD3活化的對照/H183L072雙-Fab抗體，及抗-GPC3/CD137抗體於二種靶細胞株中於所有濃度造成GPC3-表現細胞的強力的細胞毒性活性，建議雙-Fab三特異性抗體可造成細胞毒性活性。

[實施例14] 評價抗-GPC3/CD3/人類CD137三特異性抗體及抗-GPC3/雙-Fab抗體的脫靶細胞毒性
(14-1) 製備抗-GPC3/CD/人類CD137三特異性抗體
為了研究靶非依賴性細胞毒性及細胞介素釋放，藉由利用CrossMab及FAE技術(圖33)產生三特異性抗體。如上所述以CrossMab產生四價類-IgG分子，其臂各具有二種域而造成一分子中四種結合域的抗體A(mAb A)係。二價IgG，抗體B(mAb B)係與傳統IgG為相同格式。mAb A及mAb B二者的Fc區為對於Fcγ受體具有減弱親和性(L235R、G236R、S239K)及去糖基化(N297A)的FcγR靜默，且可應用於FAE。構築六種三特異性抗體。六種三特異性抗體中的各Fv區的靶抗原係示於表23。mAb A、mAb B及mAb AB的結合域各者的命名原則示於圖34。產生六種三特異性抗體各者的mAb A及mAb B的配對、mAb AB及其等序列編號分別示於表xx19及表xx20。描述於WO2005/035584A1的抗體CD3D(2)_i121(簡寫為AN121)使用作為抗-CD3ε抗體。所有六種三特異性抗體藉由上述方法予以表現及純化。

[表23]
抗體各臂的靶

[表24]

[表25]

(14-2) 評估GPC3/CD3/人類CD137三特異性抗體的結合
三特異性抗體對於人類CD3及CD137的結合親和性係使用Biacore T200儀器(GE Healthcare)於37℃評價。使用胺偶合套組(GE Healthcare)將抗-人類Fc抗體(GE Healthcare)固定化至CM4感測晶片的流體槽。抗體經捕捉至抗-Fc感測器表面後，於流體槽注射重組人類CD3或CD137。所有抗體及分析物係於含有20mM ACES、150 mM NaCl、0.05% Tween 20、0.005%NaN3的ACES pH7.4中製備。各循環以3M MgCl2再生感測器表面。結合親和性使用Biacore T200評估軟體，版本2.0(GE Healthcare)，藉由處理及擬合數據至1:1結合模型而決定。
三特異性抗體對於重組人類CD3及CD137的結合親和性示於表26。

[表26]

(14-3) 評估GPC3/CD137xCD3三特異性抗體及抗-GPC3/雙-Fab對人類CD137及CD3的同時結合
進行Biacore串聯(in tandem)封阻測試以特徵化三特異性抗體或雙-Fab抗體對於CD3及CD137二者的同時結合。測定係於Biacore T200儀器(GE Healthcare)於含有20mM ACES、150 mM NaCl、0.05% Tween 20、0.005%NaN3的ACES pH7.4於25℃進行。使用胺偶合套組(GE Healthcare)將抗-人類Fc抗體(GE Healthcare)固定化至CM4感測晶片的流體槽後。抗體經捕捉至抗-Fc感測器表面後，於流體槽注射8μM CD3接著於8μM CD3的存在下同樣注射8μM CD137。對於第二次注射的結合回應的增加表示結合至不同的互補位(paratope)因此為同時結合交互作用；相反地對於第二次注射沒有結合回應的增強或減低表示結合至相同或重疊或相鄰的互補位，因此為非同時結合交互作用。

此測定的結果示於圖35，其中GPC3/CD137xCD3三特異性抗體但不是抗-GPC/雙-Fab抗體顯示對於CD3及CD137的同時結合特徵。

(14-4) 評估GPC3/CD137xCD3三特異性抗體及抗-GPC3/雙-Fab抗體對表現人類CD137之CHO細胞或Jurkat細胞的結合
圖36顯示藉由FACS分析，三特異性抗體及雙-Fab抗體對於親代CHO細胞於參考例5產生的hCD137轉染體的結合或對表現於Jurkat細胞的hCD3(參考例11-2)的結合。簡明地，三特異性抗體及雙-Fab抗體與各細胞株於室溫培育2小時且以FACS緩衝液(2% FBS、於PBS中2mM EDTA)清洗。然後添加山羊F(ab')2抗-人類IgG、小鼠ads-PE(Southern Biotech, Cat. 2043-09)，且於4℃培育30分鐘並以FACS緩衝液清洗。於FACS Verse (Becton Dickinson)進行數據取得，接著使用FlowJo軟體(Tree Star)分析。

圖36顯示相對於對照抗體(灰填實)，50nM的抗-GPC3/H183L072 (黑線)抗體於hCD137轉染體特異性地結合hCD137(圖36a)，但觀察不到結合CHO親代細胞(圖36b)。類似地，相對於Ctrl/CtrlxCD3三特異性對照抗體(淺灰，填實) ，2nM的抗-GPC3/CD137xCD3(深灰填實)及抗-GPC3/CD137xCtrl(黑線)三特異性抗體顯示於轉染體對hCD137的特異性結合(圖36c)。於CHO親代細胞未觀察到非特異性結合(圖36d)。

相對於其個別的對照(淺灰填實)，50nM的圖36e中的抗-GPC3/H183L072(黑線)抗體及圖36f中的GPC3/CD137xCD3(深灰填實)或GPC3/CD137xCtrl(黑線)三特異性抗體二者顯示對表現於Jurkat細胞的CD3的結合。

(14-5) 評價GPC3/CD137xCD3三特異性抗體及抗-GPC3/雙-Fab三特異性抗體之對於人類GPC3表現細胞於T細胞的CD3活化
為了研究三特異性抗體及抗-GPC3/雙-Fab抗體兩種格式是否都能以靶依賴性方式活化效應子，如實施例11-2所述地進行NFAT-luc2 Jurkat螢光素酶測試。5.00E+03 SK-pcs60細胞(參考例5)使用作為靶細胞且與2.50E+0.4 NFAT-luc2 Jurkat細胞於0.1、1及10nM的三特異性抗體或雙-Fab抗體的存在下共培育24小時。24小時後，根據製造商指示利用Bio-Glo螢光素酶測試系統(Pormega, G7940)偵測螢光素酶活性。發光(單位)係使用GloMax® Explorer System (Promega #GM3500)偵測且捕捉的數值使用Graphpad Prism 7作圖。如示於圖37，只有包含抗-GPC3及抗-CD3結合二者的三特異性抗體如GPC3/CD137xCD3、GPC3/CtrlxCD3或抗-GPC3/H183L072，於靶細胞存在下造成Jurkat細胞的劑量依賴性活化。值得注意的，抗-GPC3/H183L072抗體可引出如同GPC3/CD137xCD3或GPC3/CtrlxCD3抗體之Jurkat活化的類似程度，儘管實施例(14-4)中藉由FACS分析之於Jurkat細胞的抗-GPC3/H183L072的結合為較弱。綜上，三特異性抗體及抗GPC3/雙-Fab抗體二者可造成效應子細胞的靶依賴性活化。

(14-6) GPC3/CD137xCD3三特異性抗體及抗-GPC3/雙-Fab三特異性抗體之對於人類CD137表現細胞於T細胞的CD3活化
為了研究三特異性抗體格式及抗-GPC3/雙-Fab抗體兩者是否皆可造成hCD137表現細胞對表現hCD3的效應子細胞的交聯，如實施例(14-5)所述地，5.00E+03 hCD137表現CHO與2.50E+0.4 NFAT-luc2 Jurkat細胞於0.1、1及10nM的三特異性抗體的存在下共培育24小時。當與親代CHO細胞共培育時，藉由所有三特異性抗體，圖38皆沒有顯示Jurkat細胞的非特異性活化。然而，觀察到GPC3/CD137xCD3及Ctrl/CD137xCD3三特異性抗體二者可於hCD137表現CHO細胞存在下活化Jurkat細胞。當與hCD137表現CHO細胞共培育時，抗-GPC3/H183L072抗體不造成Jurkat細胞的活化。10nM的抗-GPC3/H183L072顯示約0.96%之1nM的GPC3/CD137xCD3三特異性抗體的發光，且10nM的抗-GPC3/H183L072抗體顯示約1.93%之1nM 的GPC3/CD137xCD3三特異性抗體以的發光。當其與針對實施例14-5中所評估的GPC3陽性細胞的CD3活化比較時，使用10nM或1nM的抗-GPC3/H183L072抗體時，針對CD137陽性細胞偵測到約1.36%或1.89%發光，雖然相較於針對GPC3陽性細胞，10及1nM 的GPC3/CD137xCD3三特異性抗體針對CD137陽性細胞，分別顯示約127.77%及107.22%發光。
總結而言，此建議三特異性格式抗-GPC3/CD137xCD3，其同時結合至CD3及CD137，可針對hCD137表現細胞造成Jurkat細胞活化而獨立於靶或腫瘤抗原結合，導致脫靶細胞毒性，不同於不同時結合至CD3及CD137的抗-GPC3/雙-Fab格式者。顯示於實施例13、14-5及14-6的該等結果證實，只有不同時結合至CD3及C137的抗體可特異性地殺死靶抗原表現細胞。

(14-7) 評價Ctrl/CD137xCD3三特異性抗體及Ctrl/雙-Fab抗體之自PBMC的脫靶細胞介素釋放
也使用人類PBMC溶液評價三特異性抗體格式及雙-Fab抗體對於脫靶毒性的比較。簡明地，如實施例(12-2-1)所述地製備的2.00E+05 PBMC與80、16及3.2nM的三特異性抗體或雙-Fab抗體於靶細胞不存在下培育48小時。如實施例(12-2-2)所述地使用細胞介素釋放測試測量上清中的IL-2、IFNγ及TNFα。如圖39所示，Ctrl/CD137xCD3三特異性抗體可造成IL-2、IFNγ及TNFα自PBMC釋放，而Ctrl/雙-Fab抗體則不然。80nM的Ctrl/雙-Fab抗體顯示約50%的80nM Ctrl/CD137xCD3的IL-2濃度，且當使用16nM抗體時觀察到低於10% IL-2濃度。至於IFNγ及TNFα，Ctrl/雙-Fab抗體於各抗體濃度顯示低於10%的Ctrl/CD137xCD3三特異性抗體的IL-2濃度。
該等結果建議，於靶細胞不存在下，Ctrl/CD137xCD3三特異性格式造成PBMC的非特異性活化。最終地，數據顯示雙-Fab格式可賦予靶特異性效應子細胞活化而無脫靶毒性。

[參考例]
[參考例1] 抗體表現載體的製備及抗體的表現和純化
藉由所屬技術領域中具有通常知識者習知的方法，使用QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene Corp.),、PCR或In fusion Advantage PCR cloning kit (Takara Bio Inc.)等，來進行胺基酸取代或IgG轉化以構築表現載體。所得的表現載體藉由所屬技術領域中具有通常知識者習知的方法定序。所製備的質體瞬時轉移至人類胚胎腎癌細胞衍生的HEK293H株(Invitrogen Corp.)或FreeStyle 293細胞(Invitrogen Corp.)以表現抗體。藉由所屬技術領域中具有通常知識者習知的方法，使用rProtein A Sepharose (TM) Fast Flow(GE Healthcare Japan Corp.)自所獲得的培養上清純化各抗體。至於經純化的抗體的濃度，使用分光度計測量280nm的吸收，且抗體濃度藉由使用由PACE (Protein Science 1995; 4: 2411-2423)所獲得的值計算的吸光係數(extinction coefficient)來計算。

[參考例2] 抗-人類及抗-食蟹猴CD3ε抗體CD115的製備
(2-1) 使用以表現人類CD3的細胞及表現食蟹猴CD3的細胞予以免疫的大鼠的融合瘤的製備
各SD大鼠(雌性，於起始免疫為6週齡，Charles River Laboratories Japan, Inc.)以表現人類CD3εγ或食蟹猴CD3εγ的Ba/F3細胞予以免疫，如下所述：於第0日(首次免疫日期定義為第0日)，5×10⁷ 個表現人類CD3εγ的Ba/F3細胞與弗氏完全佐劑(Difco Laboratories, Inc.)一起腹腔內投藥至大鼠。於第14日，5×10⁷ 個表現食蟹猴CD3εγ的Ba/F3細胞與弗氏不完全佐劑(Difco Laboratories, Inc.)一起腹腔內投藥至大鼠。然後以交替方式，每隔週總計四次腹腔內投藥5×10⁷ 個表現人類CD3εγ的Ba/F3細胞與表現食蟹猴CD3εγ的Ba/F3細胞。最終投藥CD3εγ後一週(第49日)，對其靜脈內投藥表現人類CD3εγ的Ba/F3細胞作為追加。其三日後，大鼠的脾臟細胞使用PEG1500(Roche Diagonostics K.K)根據常規方法與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0融合。融合細胞，亦即融合瘤，培育於含有10% FBS的RPMI1640培養基(後文中，指稱為10% FBS/RPMI1640)。

融合後的那日，(1) 融合細胞係懸浮於半流體培養基(Stemcell Technologies, Inc.)。融合瘤選擇性培養也純株化(colonize)。

融合後九或十日，選取融合瘤純株且以1菌落/孔接種於含有HAT選擇培養基(10% FBS/RPMI1640，2 vol% HAT 50x 濃縮物(Sumiotmo Dainippon Pharma Co., Ltd.)及5 vol% BM-Condimed HI (Roche Diagonostics K.K)的96-孔盤。3或4日培育後，回收各孔中的培養上清，且測量培養上清中的大鼠IgG濃度。確認含有大鼠IgG的培養上清係使用表現人類CD3εγ的黏附Ba/F3細胞或不表現人類CD3εγ的黏附Ba/3細胞藉由細胞-ELISA，來篩選製造特異性結合至人類CD3εγ的抗體的純株(圖40)。純株也使用表現食蟹猴CD3εγ的黏附Ba/F3細胞藉由細胞-ELISA，來評估與猴CD3εγ的交叉反應性(圖40)。

(2-2) 製備抗-人類及抗-食蟹猴CD3ε嵌合抗體
自各融合瘤細胞使用RNeasy Mini Kits (Qiagen N.V.)抽出總RNA，且使用SMART RACE cDNA Amplification Kit (BD Biosciences)合成cDNA。所製備的 cDNA使用於PCR以將抗體可變區基因插入至選殖載體。各DNA片段的核苷酸序列係使用BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Inc.)及DNA定序儀ABI PRISM 3700 DNA Sequencer (Applied Biosystem, Inc.)根據其所包含的指示手冊中所述的方法來決定。CE115 H鏈可變域(序列編號: 113)及CE115 L鏈可變域(序列編號: 114)的CDR及FR係根據Kabat編號決定。

編碼含有連接至人類抗體IgG1鏈恆定域的大鼠抗體H鏈可變域的嵌合抗體H鏈的基因，以及編碼含有連接至人類抗體κ鏈恆定域的大鼠抗體L鏈可變域的嵌合抗體L鏈的基因整合至用於動物細胞的表現載體。所製備的表現載體係用於CE115嵌合抗體的表現及純化(參考例1)。

(2-3) 製備EGFR_ERY22_CE115
其次，針對癌抗原(EGFR)的IgG係使用作為骨架以製備具有一個Fab以CD3ε-結合域取代之形式的分子。此操作中，使用針對FcgR(Fcγ受體)具有減弱活性的靜默Fc，如上所述情況，作為骨架IgG的Fc。構成西妥昔單抗(cetuximab)的可變區的西妥昔單抗-VH(序列編號: 115)及西妥昔單抗-VL(序列編號: 116)係使用作為EGFR-結合域。藉由刪除C-終端的Gly及Lys由IgG1衍生的G1d，藉由導入D356K和H435R突變由G1d衍生的A5、及藉由導入K493E突變由G1d衍生的B3，使用作為抗體H鏈恆定區，且根據參考例1的方法各與西妥昔單抗-VH組合以製備西妥昔單抗-VH-G1d (序列編號: 117)、西妥昔單抗-VH-A5 (序列編號: 118)及西妥昔單抗-VH-B3 (序列編號: 119)。當抗體H鏈恆定域係指定為H1，對應至具有西妥昔單抗-VH作為可變域的抗體H鏈的序列係由西妥昔單抗-VH-H1表示。
此全文中，胺基酸的改變係由，例如，D356K表示。第1個字元(其對應於D356K中的D)意指表示改變前的胺基酸殘基的一字元編碼的字元。接於該字元之後的數字(其對應於D356K中的356)意指此經改變殘基的EU編號位置。最後的字元(其對應於D356K中的K)意指表示改變後的胺基酸殘基的一字元編碼的字元。

EGFR_ERY22_CE115 (圖41)藉由針對EGFR的Fab的VH域及VL域之間的交換而製備。具體地，藉由所屬技術領域中具有通常知識者一般習知的方法，如PCR，使用具有如前述方法相同方式添加之合適序列的引子，製備具有編碼EGFR ERY22_Hk (序列編號: 120)、EGFR ERY22_L (序列編號: 121)、CE115_ERY22_Hh (序列編號: 122)、或CE115_ERY22_L (序列編號: 123)的各多核苷酸插入物的一系列表現載體。

表現載體以下述組合轉移至FreeStyle 293-F細胞，其中各感興趣分子係瞬時表現：
感興趣的分子：EGFR_ERY22_CE115
由表現載體中插入的多核苷酸所編碼的多肽：EGFR ERY22_Hk、EGFR ERY22_L、CE115_ERY22_Hh及CE115_ERY22_L

(2-4) EGFR_ERY22_CE115的純化
所獲得之培養上清添加至抗FLAG M2管柱(Sigma-Aldrich Corp.)，且清洗該管柱，接著以0.1 mg/mL FLAG肽(Sigma-Aldrich Corp.)沖提。含有感興趣的分液添加至HisTrap HP管柱(GE Healthcare Japan Corp.)，且清洗該管柱，接著以咪唑的濃度梯度沖提。含有感興趣分子的分液藉由超過濾濃縮。然後，此分液添加至Superdex 200管柱(GE Healthcare Japan Corp.)。自沖提物僅回收單體分液以獲得經純化的感興趣分子各者。

(2-5) 使用人類周邊血液單核細胞測量細胞毒性活性
(2-5-1) 人類周邊血液單核細胞(PBMC)溶液的製備
50mL的周邊血液使用預先填充有100μL的1,000單位/mL的肝素溶液的注射管(Novo-Heparin 5,000單位注射用，Novo Nordisk A/S)自各健康志願者(成人)收集。周邊血液以PBS(-)稀釋2-倍後分為四個等分，然後將其添加至預先填充15 mL的Ficoll-Paque PLUS且事先經離心的 Leucosep淋巴球分離管(Cat. No. 227290, Greiner Bio-One GmbH)。分離管離心後(2,150rpm，10分鐘，室溫)，分離出單核細胞分液層。單核細胞分液中的細胞以含有10% FBS的Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (Sigma-Aldrich Corp；後文中稱為10% FBS/D-MEM)清洗一次。然後，細胞以10% FBS/D-MEM調整為細胞密度4×10⁶ 細胞/mL。由此所製備的細胞溶液於後續測試中使用作為人類PBMC溶液。

(2-5-2) 測量細胞毒性活性
細胞毒性活性係使用xCELLigence實時細胞分析儀(Roche Diagnostics)基於細胞生長抑制率而評估。所使用的靶細胞為藉由強迫SK-HEP-1細胞株表現EGFR所建立的SK-pca13a細胞株。SK-pca13a自盤解離且以100 μL/孔(1×10⁴ 細胞/孔)接種至E-Plate 96孔盤(Roche Dianostics)，使用xCELLigence實時細胞分析儀以開始活細胞測試。於次日，從xCELLigence實時細胞分析儀將盤取出，且50μL之經調整至各濃度(0.004、0.04、0.4及4nM)的各抗體添加至盤。於室溫反應15分鐘後，對其添加於前述段落(2-5-1)所製備的人類PBMC溶液50μL (2×10⁵ 細胞/孔)。此盤重新裝載至xCELLigence實時細胞分析儀以開始活細胞測試。反應於5% CO₂ 及37℃的條件實施。添加人類PBMC72小時後，根據下文給定的表現由細胞指標值決定細胞生長抑制率(%)。此計算中，在添加定義為1的抗體之前立即對細胞指標值進行校正後的數值使用作為細胞指標值。
細胞生長抑制率(%) = (A-B) × 100/(A-1)，其中
A表示無補充抗體(僅有靶細胞及人類PBMC)的孔的平均細胞指標值，且B表示補充有各抗體的孔的平均細胞指標值。測試進行三重複。

含有CE115的EGFR_ERY22_CE115的細胞毒性活性係以自人類血液所製備的PBMC作為效應子細胞來測量。因此，確認非常強的活性(圖42)。

[參考例3] 用於製備結合至CD3及第二抗原的抗體的抗體改變
(3-1) 能結合至第二抗原的肽的插入位點及長度的研究
進行研究以獲得能經由一可變區(Fab)結合至癌抗原及經由其他可變區結合至第一抗原CD3及第二抗原，但不能同時結合至CD3及第二抗原的雙結合Fab分子。根據參考例1，GGS肽插入至該CD3ε-結合抗體CE115的重鏈環以製備於一個Fab具有EGFR-結合域以及於其他Fab具有CD3-結合域的各異源二倍體化抗體。

具體地，製備在CDR2的K52B及S52c之間具有GGS插入的EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_CE31 ERY22_Hh/CE115_ERY22_L (序列編號: 120/121/124/123)、於此位置具有GGSGGS肽(序列編號: 126)插入的EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_CE32 ERY22_Hh/CE115_ERY22_L (序列編號: 120/121/125/123)以及於此位置具有GGSGGSGGS肽(序列編號: 128)插入的EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_CE33 ERY22_Hh/CE115_ERY22_L(序列編號: 120/121/127/123)。類似地，製備於FR3的D72及D73 (環)之間具有GGS插入的EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_CE34 ERY22_Hh/CE115_ERY22_L (序列編號: 120/121/129/123)，於此位置具有GGSGGS肽(序列編號: 126)插入的EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_CE35 ERY22_Hh/CE115_ERY22_L (序列編號: 120/121/130/123)及於此位置具有GGSGGSGGS肽 (序列編號: 128)插入的EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_CE36 ERY22_Hh/CE115_ERY22_L (序列編號: 120/121/131/123)。此外，製備於CDR3的A99及Y100之間具有GGS插入的EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_CE37 ERY22_Hh/CE115_ERY22_L (序列編號: 120/121/132/123)、於此位置具有GGSGGS肽插入的EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_CE38 ERY22_Hh/CE115_ERY22_L(序列編號: 120/121/133/123)以及於此位置具有GGSGGSGGS肽插入的EGFR ERY22_Hk/EGFR ERY22_L/CE115_CE39 ERY22_Hh/CE115_ERY22_L(序列編號: 120/121/134/123)。

(3-2) 確認GGS-肽插入的CE115抗體對CD3ε的結合
所製備的抗體各者針對CD3ε的結合活性係使用Biacore T100確認。生物素化CD3ε抗原決定基肽經由鏈黴素固定化至CM5晶片，且對其注射所製備的抗體作為分析物並分析其結合親和性。

結果示於表27。CE35、CE36、CE37、CE38及CE39對於CD3ε的結合親和性係相等於親代抗體CE115。此表示結合至第二抗原的肽可插入其等之環。於GGSGGSGGS-插入的CE36或CE39中不減低結合親和性。此表示對該等位點知多達至少9個胺基酸的肽的插入不影響針對CD3ε的結合活性。

[表27]

該等結果顯示能結合CD3及第二抗原，但不同時結合至該等抗原的抗體可藉由使用這種經插入肽的CE115，以獲得結合至第二抗原的抗體來製備。
此全文中，可根據所屬技術領域中具有通常知識者習知的方法，如定點突變(Kunkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1985)82, 488-492)或重疊延長PCR (overlap extension PCR)，藉由隨機改變用於插入或取代的肽的胺基酸序列，且根據前述方法比較各經改變的形式的結合活性等，來決定允許感興趣的活性發揮的插入或取代位點，甚至在胺基酸序列及此位點的胺基酸類型及長度的改變後，來製備庫。

[參考例4] 設計用於獲得結合至CD3及第二抗原的抗體的庫
(4-1) 用於獲得結合至CD3及第二抗原的抗體庫(亦稱為雙Fab庫)
於選擇CD3 (CD3ε)作為第一抗原的情況中，用於獲得結合至CD3 (CD3ε)及任意第二抗原的抗體的方法包括下述6種方法：
1. 涉及將結合至第二抗原的肽或多肽插入至結合至第一抗原的Fab域的方法(此方法包括示於WO2016076345A1的實施例3或4的肽插入以及說明於Angew Chem Int Ed Engl. 2013 Aug 5; 52(32): 8295-8的G-CSF插入方法)，其中結合肽或多肽可自肽或多肽-展示庫獲得，或可使用天然存在的蛋白質的全體或一部份；
2.涉及製備抗體庫而使得各種胺基酸呈現位置允許如WO201607635A1的實施例5所示之Fab環的較長長度(延長)的改變，且藉由使用針對該抗原的結合活性作為指標而自抗體庫獲得具有針對任意的第二抗原的結合活性的Fab的方法；
3.涉及藉由使用由之前已知結合至CD3的Fab域藉由定點突變所製備的抗體，來鑑定維持結合活性的胺基酸，且自抗體庫獲得具有針對任意第二抗原的結合活性的Fab，其中該經鑑定的胺基酸藉由使用針對該抗原的結合活性作為指標而呈現的方法；
4.進一步涉及製備抗體庫使得各種胺基酸呈現位置允許Fab環的較長長度(延長)的改變，且藉由使用針對該抗原的結合活性作為指標而自抗體庫獲得具有針對任意的第二抗原的結合活性的Fab的方法3；
5.進一步涉及改變抗體使得糖基化序列(例如，NxS及NxT其中x為P以外的胺基酸)呈現添加至其可由糖鏈受體辨識的糖鏈(例如，對其添加高-甘露糖-型糖鏈且藉此可為高-甘露糖受體所辨識；已知高-甘露糖-型糖鏈可藉由於抗體表現時添加幾夫鹼(kifunensine)而獲得(mAbs. 2012 Jul-Aug; 4(4): 475-87))的方法1、2、3或4；以及
6.進一步涉及對其添加經由共價鍵各結合至第二抗原的域(由TLR促效劑所典型化的多肽、糖鏈及核酸)，藉由插入Cys、Lys或非天然胺基酸至環或發現可改變為各種胺基酸的位點或以Cys、Lys或非天然胺基酸取代該等位點 (此方法係藉由藥物接合物典型化的方法且為用於經由共價鍵結合至Cys、Lys或非天然胺基酸的方法(揭示於mAbs 6: 1, 34-45; January/February 2014; WO2009/134891 A2;及Bioconjug Chem. 2014 Feb 19; 25(2): 351-61)) 的方法1、2、3或4。
結合至第一抗原及第二抗原，但不同時結合至該等抗原的雙結合Fab係藉由使用該等方法知任何者而獲得，且可藉由所屬技術領域中具有通常知識者習知的方法，例如，常見L鏈、CrossMab、或Fab臂交換，與結合至任意的第三抗原的域(稱為其他可變域，揭示於實施例1)組合。

(4-2) 使用定點突變製備CD3(CD3ε)-結合抗體的單胺基酸改變抗體(one-amino acid alteration antibody)。
VH域CE115HA000 (序列編號: 135)及VL域GLS3000 (序列編號: 136)選擇作為用於CD3 (CD3ε)-結合抗體的模板序列。根據參考例1，各域於推定參與抗原結合的位點接受胺基酸改變。而且，pE22Hh(衍生自天然IgG1 CH1的序列和藉由L234A、L235A、N297A、D356C、T366S、L368A及Y407V的改變、C-終端GK序列的刪除、以及DYKDDDDK序列(序列編號: 161)的加成的後續序列；序列編號: 137)使用作為H鏈恆定域，且κ鏈(序列編號: 138)使用作為L鏈恆定域。改變位點示於表28。對於CD3 (CD3ε)-結合活性評估，獲得作為單臂抗體的單胺基酸改變抗體各者(缺乏一個Fab域的天然發生的IgG抗體)。具體地，於H鏈改變的情況，連接至恆定域pE22Hh的經改變H鏈和Kn010G3(具有C220S、Y349C、T336W及H435R改變之由位置216至C終端的天然發生的IgG1胺基酸序列；序列編號: 139)使用作為H鏈，以及於3’側連接至κ鏈的GLS3000使用作為L鏈。於L鏈改變的情況，於3’側連接至κ鏈的經改變L鏈使用作為L鏈，且於3’側連接至pE22Hh的CE115HA000和Kn010G3使用作為H鏈。該等序列於FreeStyle 293細胞中表現及純化(其應用參考例1的方法)。

[表28]

(4-3) 評估單胺基酸改變抗體對CD3的結合
於段落(參考例4-2)中構築、表現且純化的一胺基酸改變形式各者，使用Biacore T200(GE Healthcare Japan Corp.)評估。合適量的CD3ε同源二倍體蛋白質藉由胺偶合方法固定化至感測晶片 CM4 (GE Healthcare Japan Corp.)。然後，具有合適濃度的抗體係注射至其作為分析物且允許於感測晶片上與CD3ε同源二倍體蛋白質交互作用。然後，感測晶片係藉由注射10 mmol/L甘胺酸-HCl (pH 1.5)再生。測試於25℃進行，以及HBS-EP+ (GE Healthcare Japan Corp.)使用作為運行緩衝液。由測試結果，使用用於測試中所獲得的已結合量及傳感圖的單一循環動力學模型(1:1結合RI+0)來計算該解離常數K_D (M)。使用Biacore T200評估軟體(GE Healthcare Japan Corp.)計算各參數。

(4-3-1)H鏈的改變
表29顯示經結合之各H鏈改變形式的量和經結合之對應的未改變抗體CE115HA000的量的比例結果。具體地，當包含經結合的CE115HA000的抗體的量定義為X，且經結合的H鏈單胺基酸改變形式的量定義為Y，使用Z(經結合的量的比例)=Y/X值。如圖43所示，於傳感圖中對於小於0.8的Z觀察到非常小量的結合，建議解離常數K_D (M)無法正確地計算。表30顯示各H鏈改變形式對CE115HA000的解離常數K_D (M)的比例(=CE115HA000的KD值/改變形式的KD值)。
當示於表29的Z為0.8或更大時，認為改變形式相對於對應的未改變抗體CE115HA000係維持結合。因此，設計抗體庫使得該等胺基酸呈現可作為雙Fab庫。

[表29]

[表30]

(4-3-2)L鏈改變
表31顯示經結合之各L鏈改變形式的量與經結合之對應的未改變抗體GLS3000的量的比例結果。具體地，當含有經結合的GLS3000的抗體的量定義為X以及經結合的L鏈單胺基酸改變形式的量定義為Y，使用Z(經結合的量的比例)=Y/X的值。如示於圖43，於傳感圖中對於小於0.8的Z觀察到非常小量的結合，建議解離常數K_D (M)無法正確地計算。表32顯示各H鏈改變形式對GLS3000的解離常數K_D (M)的比例。
當示於表31的Z為0.8或更大時，認為改變形式相對於對應的未改變抗體GLS3000係維持結合。因此，設計抗體庫使得該等胺基酸呈現可作為雙Fab庫。

[表31]

[表32]

(4-4) 評估單胺基酸改變抗體對ECM (extracellular matrix，細胞外基質)的結合
ECM (細胞外基質)係細胞外組份且位在活體內各種位點。因此，強力地結合至ECM的抗體已知於血液中具有較差的動力學(較短的半衰期)(WO2012093704 A1)。因此，不增強ECM結合的胺基酸係較佳選擇作為呈現於抗體庫中的胺基酸。

藉由描述於段落(參考例4-2)的方法獲得為H鏈或L鏈改變形式的各抗體。其次，其ECM結合係根據參考例6的方法評估。改變形式各者的ECM結合值(ECL反應)係除以由相同盤中或相同執行日所獲得的抗體MRA (H鏈：序列編號: 140，L鏈：序列編號: 141)的ECM結合值，且所得值係示於表33 (H鏈)及表34 (L鏈)。如示於表33及34，確認一些改變具有增強ECM結合的傾向。
示於表33 (H鏈)及表34 (L鏈)的值中，考慮藉由複數的改變之增強ECM結合的功效，有效值多至10倍係適用至雙Fab庫。

[表33]

[表34]

(4-5) 研究用於增強庫的多樣性之肽的插入位點及長度
參考例3顯示可使用GGS序列，來將肽插入至各位點而不取消結合至CD3(CD3ε)。若環延長對於雙Fab庫係可能的，所得庫可包括更多類型的分子(或具有較大的多樣性)且允許獲得結合至多樣第二抗原的Fab域。因此，考慮到由肽插入所引起的假定結合活性的減低，V11L/D72A/L78I/D101Q改變以增強針對CD3ε的結合活性係加成至CE115HA000序列，其進一步連接至pE22Hh。藉由插入GGS連接子至此序列來製備分子，如參考例3，且評估其CD3結合。GGS序列係插入至Kabat編號位置99及100之間。以單臂抗體表現抗體分子。具體地，上述含有GGS連接子的H鏈及Kn010G3 (序列編號: 139)使用作為H鏈，且連接至κ鏈(序列編號: 138)的GLS3000 (序列編號: 136)使用作為L鏈。該等序列根據參考例1表現及純化。

(4-6) 確認經插入GGS肽的CD115抗體對CD3的結合
經插入GGS肽的改變抗體對CD3ε的結合係使用Biacore藉由揭示於參考例3的方法予以確認。如示於表35，結果展現GGS連接子可插入至環。特別地，GGS連接子能插入至H鏈CDR3區，其對於抗原結合為重要的，且維持對CD3ε的結合，如任何3-、6-或9-胺基酸插入之一者的結果。雖然此研究係使用GGS連接子進行，抗體庫中除GGS以外的各種胺基酸呈現是可接受的。

[表35]

(4-7)研究使用NNS核苷酸序列對於庫之H鏈CDR3的插入
段落(參考例4-6)顯示可使用GGS連接子插入3、6或9個胺基酸，且推知可藉由使用由噬菌體展示方法典型化的通常抗體獲得方法製備具有3-、6-或9-胺基酸插入的庫，以獲得結合至第二抗原的抗體。因此，進行研究是否6-胺基酸插入至CDR3可維持對CD3的結合，即使各種胺基酸使用NNS核苷酸序列(其允許每種類型的胺基酸呈現)呈現於6-胺基酸插入。考慮到假定結合活性減低，使用NNS序列設計引子使得6個胺基酸插入至具有比CE115HA000還高的CD3ε-結合活性的CE115HA340序列(序列編號: 144)的CDR3的位置99及100之間(Kabat編號)。以單臂抗體表現抗體分子。具體地，上述的改變H鏈及Kn010G3 (SEQ NO ID: 139)使用作為H鏈，且連接至κ鏈(序列編號: 138)的GLS3000 (序列編號: 136)採用作為L鏈。該等序列根據參考例1表現及純化。所獲得的改變抗體藉由描述於段落(參考例4-6)的方法評估其結合。結果示於表36。結果展現維持針對CD3 (CD3ε)的結合活性，即使各種胺基酸呈現於以胺基酸延長的位點。表37顯示藉由描述於參考例6的方法進一步評估於非特異性結合的增強的存在或不存在。因此，若CDR3的延長環係富含具有正電荷側鏈的胺基酸，則對ECM的結合係增強的。因此，期望於環中應不呈現三個或更多個具有正電荷側鏈的胺基酸。

[表36]

[表37]

(4-7) 雙Fab庫的設計與構築
基於描述於參考例4的研究，用於獲得結合至CD3及第二抗原的抗體的抗體庫(雙Fab庫)係如下述設計：
步驟1：選擇維持結合至CD3 (CD3ε)的能力的胺基酸(以確保CD115HA000結合至CD3的量的80%或更多)；
步驟2：選擇ECM結合相較於改變前保持於MRA的10倍以內者的胺基酸；及
步驟3：插入6個胺基酸至H鏈CDR3中位置99及100(Kabat編號)之間。
可僅藉由施行步驟1而將Fab的抗原-結合位點多樣化而。因此，所得之庫可使用於鑑定結合至第二抗原的抗原結合分子。可僅藉由施行步驟1及3而將Fab的抗原-結合位點多樣化。因此，所得之庫可使用於鑑定結合至第二抗原的抗原結合分子。甚至無步驟2的庫設計允許對所獲得之分子測試及評估ECM結合。

因此，對於雙Fab庫，藉由對FR(framework，框架)加成V11L/L78I突變且如表38所示地進一步將CDR多樣化而衍生自CE115HA000的序列使用作為H鏈，且如表39所示地藉由將CDR多樣化而衍生自GLS3000的序列使用作為L鏈。該等抗體庫片段可藉由所屬技術領域中具有通常知識者所習知的一般DNA合成方法來合成。雙Fab庫可製備為(1)H鏈如表38所示地被多樣化而L鏈係固定為原始序列GLS3000或具有如參考例4所述之增強的對CD3ε結合的L鏈的庫；(2)H鏈固定為原始序列(CE115HA000)或具有如參考例4所述之具有增強的CD3ε結合的H鏈而L鏈如表39所示地被多樣化的庫，以及(3)H鏈如表38所示地被多樣化而L鏈如表39所示地被多樣化的庫。藉由對FR(框架)加成V11L/L78I突變且如表38所示地進一步將CDR多樣化而衍生自CE115HA000的序列係委託DNA合成公司DNA2.0公司，以獲得抗體庫片段(DNA片段)。所獲得的抗體庫片段插入至用於藉由PCR擴增之噬菌體展示的噬粒。選擇GLS3000作為L鏈。所構築之用於噬菌體展示的噬粒藉由電穿孔法轉移至大腸桿菌，以製備帶有抗體展示片段的大腸桿菌。
基於表39，發明人設計如表40所示之用於GLS300的新多樣化庫。L鏈庫序列衍生自GLS3000且如表40(DNA庫)所示地被多樣化。DNA庫係藉由DNA合成公司構築。然後，將含有各種GLS3000衍生序列的L鏈庫以及含有各種CE115HA000衍生序列的H鏈庫插入噬粒，以構築噬菌體展示庫。

[表38]

[表39]

[表40]

[參考例5] 實驗細胞株
人類GPC3基因係藉由所述技術領域具有通常知識者習知的方法整合至小鼠直腸癌細胞株CT-26 (ATCC No.: CRL-2638)，以獲得高表現CT26-GPC3細胞株。使用QIFI kit(Dako)藉由製造商的建議方法測量人類GPC3 (2.3×10⁵ /細胞)的表現程度。為了維持人類GPC3基因，藉由對CT26-GPC3以200μg/mL添加Geneticin(GIBCO)，將該等重組細胞株培養於ATCC-建議的培養基。培養後，使用2.5 g/L胰蛋白酶-1mM EDTA(nacalai tesque)將該等細胞脫離後，使用於各實驗。
人類CD137基因係藉由所屬技術領域中具有通常知識者習知的方法整合至中國倉鼠卵巢細胞株CHO-DG44的染色體，以獲得高表現CHO-hCD137細胞株。使用PE抗-人類CD137(4-1BB)抗體(BioLegend, Cat. No. 309803)藉由製造商建議方法，藉由FACS分析來測量人類CD137的表現程度。

[參考例6] 評估抗體對ECM(細胞外基質)的結合
各抗體對ECM(細胞外基質)的結合係參照WO2012093704 A1藉由下述步驟評估：ECM 酚紅游離(BD Matrigel#356237)以TBS稀釋至2 mg/mL且以 5μL/孔滴加至冰上冷卻之用於ECL測試的盤(L15XB-3, MSD K.K., high bind)的各孔的中心。之後，盤以盤封加蓋且於4℃靜置隔夜。經ECM固定化的盤回至室溫。以150 μL/孔對其添加ECL封阻緩衝液(補充有0.5% BSA及0.05% Tween 20的PBS)，且盤於室溫靜置2小時或更久，或於4℃隔夜。其次，各抗體樣品以PBS-T(補充有0.05% Tween 20的PBS)稀釋至9 μg/mL。二次抗體以ECLDB(補充有0.1% BSA及0.01% Tween 20的PBS)稀釋至2 μg/mL。20 μL的抗體溶液及30μL的二次抗體溶液添加至含有以10 μL/孔分注的ECLDB的圓底盤的各孔，且於室溫攪拌1小時同時遮蔽光。藉由倒置含有ECL緩衝液的ECM盤以移除ECL封阻緩衝液。對此盤，以50 μL/孔添加上述抗體及二次抗體的混合溶液。之後，盤於室溫靜置1小時同時遮蔽光。藉由將盤倒置以移除樣品後，以150 μL/孔對其添加READ緩衝液(MSD K.K.)，接著藉由使用Sector Imager 2400 (MSD K.K.)的硫-標籤的發光信號偵測。
[產業可利用性]

本發明提供可結合至CD3及CD137但不同時結合至CD3及CD137的抗原結合域以及其使用方法。包含根據本發明之抗原結合域的抗體結合分子可使用作為藥物，特別地，用於治療各種類型的癌。

無。

圖1為結合至CD3及CD137，但不同時結合至該等抗原的抗體的概念模式圖。

圖2為因為抗體不同時結合至CD3及CD137而不引起交聯的抗體的概念模式圖。相對於此，對CD3、CD137及第三抗原的三功能性抗體引起T細胞與CD137陽性細胞的交聯。

圖3為結合至CD3及CD137，但不同時連接兩個細胞的抗體的概念模式圖。

圖4為將第三抗原陽性細胞交聯至表現CD3及CD137的T細胞的抗體的概念模式圖。

圖5為將第三抗原陽性細胞交聯至表現CD137的細胞的抗體的概念模式圖。

圖6為雙scFv VH核糖體展示庫的設計及構築流程的示意圖。

圖7為顯示以對CD3及CD137的核糖體展示所獲得的純株的ELISA的結果圖組。Y軸意指對CD137-Fc的特異性且X軸意指各純株對CD3的特異性。黑著色純株經鑑定為顯示對CD137及CD3二者的結合的陽性scFv。

圖8為顯示以對CD3及CD137的核糖體展示所獲得的IgG的ECL分析的結果圖。Y軸意指對CD137、CD3以及盤本身二者的回應。

圖9為以對CD3及CD137的核糖體展示所獲得的純株的ELISA的結果圖組。Y軸意指各純株對CD137-Fc的特異性且X軸意指各純株對CD3的特異性。運轉期(Campaign) 3意指具有雙重回合選擇的核糖體展示庫淘選。

圖10為顯示以對CD3及CD137的核糖體展示所獲得的純株的ELISA的結果圖。Y軸意指各純株對CD137-Fc的特異性且X軸意指各純株對CD3的特異性。

圖11為顯示以對CD3及CD137的核糖體展示所獲得的IgG的ELISA的結果圖。Y軸意指各純株對CD137-Fc的特異性且X軸意指各純株對CD3的特異性。

圖12為雙scFv VL核糖體展示庫及雙Fab VL核糖體展示庫的設計的示意圖。

圖13為顯示以對CD3及CD137的核糖體展示親和性成熟所獲得的IgG的ELISA的結果圖。Y軸意指各純株對CD137-Fc的特異性且X軸意指各純株對CD3的特異性。

圖14為顯示以對CD3及CD137的核糖體展示親和性成熟所獲得的IgG的競爭性ELISA的結果圖。Y軸意指ELISA對生物素-人類CD137-Fc或生物素-人類Fc的回應。過量的人類CD3或人類Fc使用作為競爭者。

圖15顯示C3NP1-27的設計，CD3ε肽抗原經由雙硫鍵連接子經生物素標記。

圖16為顯示以對CD3及CD137的噬菌體(phage)展示所獲得的純株的噬菌體ELISA的結果圖。Y軸意指各純株對CD137-Fc的特異性且X軸意指各純株對CD3的特異性。

圖17為顯示以對CD3及CD137的噬菌體(phage)展示所獲得的純株的噬菌體ELISA的結果圖。Y軸意指於珠粒ELISA中對CD137-Fc的特異性且X軸意指於盤ELISA中對CD3的特異性，如同各純株的第16圖。

圖18顯示人類CD137胺基酸序列與食蟹猴CD137胺基酸序列的比較數據。

圖19為顯示以對CD3及CD137的噬菌體展示所獲得的IgG的ELISA結果圖。Y軸意指各純株對食蟹猴CD137-Fc的特異性且X軸意指各純株對人類CD137的特異性。

圖20為顯示以對CD3及CD137的噬菌體展示所獲得的IgG的ELISA結果圖。Y軸意指對CD3e的特異性。

圖21為顯示以對CD3及CD137的噬菌體展示所獲得的IgG的競爭性ELISA的結果圖。Y軸意指ELISA對生物素-人類CD137-Fc或生物素-人類Fc的回應。過量的人類CD3或人類Fc使用作為競爭者。

圖22為顯示對CD3及CD137的噬菌體展示淘選輸出匯池的噬菌體ELISA的結果圖組。Y軸意指對人類CD137(圖22A)、食蟹猴CD137(圖22B)及CD3(圖22C)的特異性。X軸意指淘選輸出匯池。首次(primary)為噬菌體展噬淘選前的匯池，且R1至R6分別意指噬菌體展示淘選回合1至回合6之後的淘選輸出匯池。

圖23為顯示以對CD3及CD137的噬菌體展示所獲得的IgG的ELISA結果圖組。Y軸意指各純株對人類CD137-Fc的特異性以及X軸意指各純株對人類CD137或CD3的特異性。

圖24為顯示以對CD3及CD137的噬菌體展示所獲得的IgG的ELISA結果圖組。Y軸意指各純株對人類CD137-Fc的特異性以及X軸意指各純株對人類CD137或CD3的特異性。

圖25為顯示以對CD3及CD137的噬菌體展示所獲得的IgG的競爭性ELISA結果圖。Y軸意指ELISA對生物素-人類CD137-Fc或生物素-人類Fc的回應。過量的人類CD3或人類Fc使用作為競爭者。

圖26為顯示以對CD3及CD137的噬菌體展示所獲得的IgG的ELISA結果圖，以鑑定各純株的抗原決定基域。Y軸意指ELISA對人類CD137各域的回應。

圖27為顯示以對CD3及CD137的噬菌體展示親和性成熟所獲得的IgG的ELISA結果圖組。Y軸意指對各純株對人類CD137-Fc的特異性且X軸意指對各純株對人類CD137或CD3的特異性。

圖28為顯示以對CD3及CD137的噬菌體展示所獲得的IgG的競爭性ELISA結果圖組。Y軸意指ELISA對生物素-人類CD137-Fc或生物素-人類Fc的回應。過量的人類CD3使用作為競爭者。

圖29B表示顯示藉由自經活化的B細胞所分泌的IL-6的產生程度，來評估各種抗人類GPC3/雙Fab抗體的CD137所媒介的促效活性的結果圖。Ctrl是指陰性對照人類IgG1抗體。圖29A顯示經由抗人類GPC3/雙Fab抗體之自經活化的B細胞的IL-6分泌機制。

圖30B表示顯示藉由於經活化的Jurkat T細胞中表現的螢光素酶的產生程度，來評估各種抗人類GPC3/雙Fab抗體的CD3所媒介的促效活性的結果圖。Ctrl是指陰性對照人類IgG1抗體。圖30A顯示經由抗人類GPC3/雙Fab抗體之於經活化的Jurkat T細胞中的螢光素酶表現機制。

圖31為顯示於各固定化抗體的存在下，評估自人類PBMC衍生的T細胞的細胞介素(IL-2、IFN-γ及TNF-α)釋放的結果圖組。Y軸意指所分泌的各細胞介素的濃度且X軸意指固定化抗體的濃度。對照抗CD137抗體(B)、對照抗CD3抗體(CE-115)、陰性對照抗體(Ctrl)及雙抗體之一者(L183L072)用於測定。

圖32為顯示評估以各雙特異性抗體之針對GPC3陽性靶細胞(SK-pca60及SK-pca13a)的T-細胞依賴性細胞的細胞毒性(T-cell dependent cellular cytotoxicity，TDCC)的結果圖組。Y軸意指細胞生長抑制(Cell Growth Inhibition，CGI)的比例且X軸意指各雙特異性抗體的濃度。抗GPC3/雙二特異性抗體(dual bi-specific antibody)(GC33/H183L072)、陰性對照/雙二特異性抗體(Ctrl/H183L072)、抗GPC3/抗CD137雙特異性抗體(GC33/B)以及陰性對照/抗CD137雙特異性抗體(Ctrl/B)用於此測定。5倍量的效應子(E)細胞係添加於腫瘤(T)細胞(ET5)。

圖33顯示三特異性抗體(mAb AB)的設計及構築流程。

圖34顯示所製備的三特異性抗體的命名原則。

圖35為顯示GPC3/CD137xCD3三特異性抗體及抗-GPC3/雙-Fab抗體的同時結合的Biacore分析的結果圖組。Y軸意指對各抗原的結合回應。一開始，人類CD3 (hCD3)用作為分析物，然後hCD3(顯示為虛線)或人類CD137 (hCD137)以及hCD3的混合物(顯示為實線)亦用作為分析物。

圖36為顯示各抗體對CD137陽性CHO細胞或Jurkat細胞的FACS分析結果的傳感圖組。圖35(a)及圖35(c)為結合至人類CD137陽性CHO細胞的結果，且圖35(b)及圖35(d)為結合至親代CHO細胞的結果。於圖35(a)及圖35(b)中，實線顯示抗GPC-3/雙抗體(GC33/H183L072)且填實顯示對照抗體(Ctrl)的結果。圖35(c)及圖35(d)中，實線、深灰填實以及淺灰填實分別顯示GPC3/CD137xCtrl三特異性抗體、GPC3/CD137xCD3三特異性抗體以及Ctrl/CtrlxCD3三特異性抗體的結果。圖35(e)及圖35(f)為結合至Jurkat CD3陽性細胞的結果。圖35(e)中，實線及填實分別顯示抗GPC3/雙抗體(GC33/H183L072)及對照抗體(Ctrl)的結果。圖35(f)中，實線、深灰填實以及淺灰填實分別顯示GPC3/CtrlxCD3三特異性抗體、GPC3/CD137xCD3三特異性抗體以及Ctrl/CD137xCtrl三特異性抗體的結果。

圖37表示顯示藉由於經活化的Jurkat T細胞中表現的螢光素酶的產生程度，來評估各種抗體對GPC3陽性靶細胞SK-pca60之CD3所媒介的促效活性的結果。六種三-特異性抗體、抗GPC3/雙Fab抗體(GPC3/H183L072)及對照/雙Fab抗體(Ctrl/H183L072)用於此測定。X軸意指各抗體所使用的濃度。

圖38表示顯示藉由於經活化的Jurkat T細胞中表現的螢光素酶的產生程度，來評估各種抗體對人類CD137陽性CHO細胞及親代CHO細胞之CD3所媒介的促效活性的結果。六種三-特異性抗體、抗GPC3/雙Fab抗體(GPC3/H183L072)及對照/雙Fab抗體(Ctrl/H183L072)用於此測定。X軸意指各抗體所使用的濃度。

圖39為顯示於各可溶性抗體的存在下，評估自人類PBMC的細胞介素(IL-2、IFN-γ及TFN-α)釋放的結果圖組。Y軸意指所分泌的各細胞介素的濃度且X軸意指所使用的抗體濃度。Ctrl/CD137xCD3三特異性抗體以及對照/雙Fab抗體(Ctrl/H183L072)用於此測定。

圖40為顯示CE115對CD3e的細胞ELISA結果圖。

圖41為顯示EGFR_ERY22_CE115的分子形式圖。

圖42為顯示EGFR_ERY22_CE115的TDCC (SK-pca13a)的結果圖。

圖43為具有低於0.8的結合量的比例的例示性傳感圖。縱軸說明RU值(回應)。橫軸說明時間。

Claims

一種抗原結合分子，包含：可結合至CD3及CD137，但不同時結合至CD3及CD137的抗體可變區；以及結合至不同於CD3及CD137的第三抗原的可變區。
如申請專利範圍第1項的抗原結合分子，其中該第三抗原為特異性地表現於癌組織的分子。
如申請專利範圍第1或2項的抗原結合分子，其中該不同時結合至CD3及CD137的可變區為不同時結合至各自表現於不同細胞的CD3及CD137的可變區。
如申請專利範圍第1至3項中任一項的抗原結合分子，更包含抗體Fc區。
如申請專利範圍第4項的抗原結合分子，其中該Fc區為相較於天然發生的人類IgG1抗體的Fc區，針對FcγR具有減低的結合活性的Fc區。
如申請專利範圍第1至5項中任一項的抗原-結合分子，其中該抗原結合分子具有選自下述(1)至(4)所組成的群組的至少一特徵： (1) 該可變區結合至包含序列編號: 91的胺基酸序列的CD3ε的胞外域， (2) 該抗原結合分子具有針對CD137的促效活性， (3) 該抗原結合分子誘發T細胞針對表現第三抗原的分子的細胞的CD3活化，但不誘發針對表現CD137的細胞的T細胞的CD3活化，以及 (4) 該抗原-結合分子於表現第三抗原的分子的細胞不存在下，不誘發自PBMC的細胞介素釋放。
如申請專利範圍第1至6項中任一項的抗原結合分子，其與選自下述所成群組的抗體競爭對CD137的結合： (a) 一抗體，包含具有序列編號: 30的胺基酸序列的VH序列及具有序列編號: 51的胺基酸序列的VL序列， (b) 一抗體，包含具有序列編號: 46的胺基酸序列的VH序列及具有序列編號: 53的胺基酸序列的VL序列， (c) 一抗體，包含具有序列編號: 40的胺基酸序列的VH序列及具有序列編號: 56的胺基酸序列的VL序列， (d) 一抗體，包含具有序列編號: 30的胺基酸序列的VH序列及具有序列編號: 58的胺基酸序列的VL序列，以及 (e) 一抗體，包含具有序列編號: 40的胺基酸序列的VH序列及具有序列編號: 61的胺基酸序列的VL序列。
如申請專利範圍第1至7項中任一項的抗原結合分子，包含由於序列編號: 92所述的重鏈可變域序列和/或序列編號: 93所述的輕鏈可變域序列所組成的模板序列中導入一或多個胺基酸的改變所造成的胺基酸序列，其中該一或多個胺基酸包含選自下述位置的至少一胺基酸： H鏈：31、52b、52c、53、54、56、57、61、98、99、100、100a、100b、100c、100d、100e、100f及100g (Kabat編號)；以及 L鏈：24、25、26、27、27a、27b、27c、27e、30、31、33、34、51、52、53、54、55、56、74、77、89、90、92、93、94及96 (Kabat編號)，其中，經改變的重鏈可變域序列的HVR-H3包含選自下述的至少一胺基酸： Ala、Pro、Ser、Arg、His或Thr於胺基酸位置98； Ala、Ser、Thr、Gln、His或Leu於胺基酸位置99； Tyr、Ala、Ser、Pro或Phe於胺基酸位置100； Tyr、Val、Ser、Leu或Gly於胺基酸位置100a； Asp、Ser、Thr、Leu、Gly或Tyr於胺基酸位置100b； Val、Leu、Phe、Gly、His或Ala於胺基酸位置100c； Leu、Phe、Ile或Tyr於胺基酸位置100d； Gly、Pro、Tyr、Gln、Ser或Phe於胺基酸位置100e； Tyr、Ala、Gly、Ser或Lys於胺基酸位置100f； Gly、Tyr、Phe或Val於胺基酸位置100g (Kabat編號)。
如申請專利範圍第1至8項中任一項的抗原結合分子，包含(a)與序列編號41、30、46或40的胺基酸序列具有至少95%序列同一性的VH序列；(b) 與序列編號: 51、52、53、54、55、56或57的胺基酸序列具有至少95%序列同一性的VL序列；或 (c) (a)的VH序列及(b)的VL序列。
一種醫藥組成物，包含如申請專利範圍第1至9項中任一項的抗原結合分子及醫藥上可接受的載劑。
一種結合至至少兩種或更多種感興趣的不同抗原的抗原結合域的篩選方法，包含： (a) 提供包含複數個抗原結合域的庫， (b) 將步驟(a)提供的庫與感興趣的第一抗原接觸且收集結合至該第一抗原的抗原結合域， (c) 將步驟(b)所收集的該抗原結合域與感興趣的第二抗原接觸且收集結合至該第二抗原的抗原結合域，以及 (d) 擴增編碼步驟(c)所收集的抗原結合域的基因且鑑定候選抗原結合域，其中該方法不包含在步驟(b)及步驟(c)之間，擴增編碼步驟(b)所收集的抗原結合域的核酸。
如申請專利範圍第11項的方法，其中該抗原結合域係融合多肽，其藉由融合抗原結合域與支架以交聯該抗原結合域與編碼該抗原-結合域的該核酸而形成。
如申請專利範圍第12項的方法，其中該支架為噬菌體。
如申請專利範圍第12項的方法，更包含於步驟(b)及(c)之間，包含轉譯編碼步驟(b)所收集的抗原結合域的核酸的步驟。
如申請專利範圍第12或14項的方法，其中該支架為核糖體、RepA蛋白質或DNA嘌呤黴素連接子。