PT2028193E - Domínios de imunoglobulina sintéticos com propriedades de ligação modificadas em regiões da molécula diferentes das regiões de determinação de complementaridade - Google Patents

Description

ΡΕ2028193 1 DESCRIÇÃO "DOMÍNIOS DE IMUNOGLOBULINA SINTÉTICOS COM PROPRIEDADES DE LIGAÇÃO MODIFICADAS EM REGIÕES DA MOLÉCULA DIFERENTES DAS REGIÕES DE DETERMINAÇÃO DE COMPLEMENTARIDADE" A presente invenção refere-se a um domínio variável de imunoglobulina modificada. 0 campo geral é a engenharia de proteínas com o objectivo de lhes conferir propriedades de ligação específicas. Mais especificamente, as proteínas modificadas de relevância aqui referidas são imunoglobulinas (anticorpos), e ainda mais especificamente, domínios únicos ou pares ou combinações de domínios únicos de imunoglobulinas. As propriedades de ligação específicas das imunoglobulinas são características importantes, uma vez que controlam a interacção com outras moléculas, tais como antigénios, e tornar as imunoglobulinas úteis para aplicações de diagnóstico e terapêutica. A estrutura básica do anticorpo será aqui explicada utilizando como exemplo uma imunoglobulina IgGl intacta.

Duas cadeias pesadas idênticas (H) e duas cadeias leves idênticas (L) combinam-se para formar a molécula de anticorpo em forma de Y. As cadeias pesadas possuem, cada uma, quatro domínios. Os domínios variáveis amino terminais ΡΕ2028193 (VH) estão nas pontas do Y. Estes são seguidos por três domínios constantes: CHI, CH2, e o terminal carboxilo CH3, na base do tronco do Y. Um pequeno segmento, o interruptor, liga as regiões variável e constante da cadeia pesada. A charneira liga CH2 e CH3 (o fragmento Fc) à parte restante do anticorpo (os fragmentos Fab) . Um fragmento Fc e dois fragmentos Fab idênticos podem ser produzidos por clivagem proteolítica da charneira numa molécula de anticorpo intacta. As cadeias leves são construídas por dois domínios, variável (VL) e constante (CL), separados por um interruptor.

As ligações persulfureto na região de charneira ligam as duas cadeias pesadas. As cadeias leves são acopladas às cadeias pesadas através de ligações persulfureto adicionais. As unidades de hidratos de carbono ligados a Asn são ligadas a diferentes posições em domínios constantes que dependem da classe de imunoglobulina. Para IgGl duas ligações persulfureto na região de charneira, entre pares de Cys235 e Cys238, unem as duas cadeias pesadas. As cadeias leves são acopladas às cadeias pesadas por duas ligações persulfureto adicionais, entre Cys229s nos domínios CHI e Cys214s nos domínios CL. As unidades de hidratos de carbono são ligadas a Asn306 de cada CH2, criando uma protuberância pronunciada no tronco do Y.

Estas características possuem consequências funcionais profundas. As regiões variáveis das cadeias pesadas e cadeias leves (VH) e (VL) situam-se nas "pontas" 3 ΡΕ2028193 do Y, onde são posicionados para reagir com o antigénio. Esta ponta da molécula é o lado no qual o terminal N da sequência de aminoácidos está localizado. 0 tronco dos projectos do Y de modo a mediar eficientemente as funções do efector, tal como a activação de complemento e interacção com receptores Fc, ou ADCC e ADCP. Os seus dominios CH2 e CH3 protuberantes para facilitar a interacção com proteínas efectoras. 0 terminal C da sequência de aminoácidos está localizado no lado oposto da ponta, que pode ser denominado "fundo" do Y. A estrutura de um IgGl intacto é ilustrado na Figura la.

Dois tipos de cadeia leve, denominados lambda (λ) e capa (k), são encontrados nos anticorpos. Uma dada imunoglobulina possui ou cadeias K ou cadeias λ, nunca uma de cada. Não foi encontrada qualquer diferença funcional entre os anticorpos que possuem cadeias leves K ou λ. A organização estrutural dos monómeros da classe da principal classe de imunoglobulina humana é apresentada na Figura lb. As classes diferem na composição e na sequência das suas respectivas cadeias pesadas. Tanto IgM como IgE não possuem uma região de charneira, mas cada uma contém um domínio de cadeia pesada extra (CH4). Os números e as localizações das ligações persulfureto (linhas) que ligam as cadeias diferem entre os isotipos. Eles também diferem na distribuição de grupos de hidratos de carbono ligados em N, apresentado simbolicamente como círculos. 4 ΡΕ2028193

Cada domínio numa molécula de anticorpo possui uma estrutura semelhante de duas folhas beta empilhadas fortemente uma contra a outra num barril beta com compressão anti-paralela. Esta estrutura conservada é denominada a dobragem de imunoglobulina. A dobragem de imunoglobulina dos domínios constantes contém uma folha de 3 cadeias empacotada contra uma folha de 4 cadeias. A dobragem é estabilizada através de ligações de hidrogénio entre as cadeias beta de cada folha, através de ligação hidrofóbica entre resíduos de folhas opostas no interior, e através de uma ligação persulfureto entre as folhas. A folha de 3 cadeias compreende as cadeias C, F, e G, e a folha de 4 cadeias possui as cadeias A, B, E, e D. As letras A até G descrevem as posições sequenciais das cadeias beta ao longo da sequência de aminoácidos da dobragem da imunoglobulina. A dobragem dos domínios variáveis possui 9 cadeias beta dispostos em duas folhas de 4 e 5 cadeias. A folha de 5 cadeias é estruturalmente homóloga à folha de 3 cadeias dos domínios constantes, mas contém as cadeias extra C' e C''. As restantes cadeias (A, B, C, D, E, F, G) possuem a mesma topologia e estrutura semelhante aos seus homólogos nas dobragens de imunoglobulina no domínio constante. Uma ligação persulfureto liga as cadeias B e F em folhas opostas, como em domínios constantes. A dobragem da imunoglobulina é ilustrada na Figura 2 para um domínio constante e um domínio variável de uma imunoglobulina.

Os domínios variáveis de ambas as cadeias da 5 ΡΕ2028193 imunoglobulina leve e pesada contêm três ansas hipervariá-veis, ou regiões de determinação de complementaridade (CDRs) . As três CDRs de um domínio V (CDR1, CDR2, CDR3) aglutinam-se numa extremidade do barril beta. As CDRs são ansas que ligam as cadeias beta B-C, C'-C", e F-G de uma dobragem de imunoglobulina. Os resíduos nos CDRs variam desde uma molécula de imunoglobulina até à seguinte, conferindo especificidade antigénica a cada anticorpo.

Os domínios VL e VH nas pontas das moléculas de anticorpo estão empacotados de forma compacta, de modo a que as 6 CDRs (3 em cada domínio) cooperem na construção de uma superfície (ou cavidade) para a ligação específica para o antigénio. O sítio de ligação ao antigénio natural de um anticorpo é assim composto pelas ansas que se ligam às cadeias B-C, C'-C'', e F-G do domínio variável da cadeia leve e cadeias B-C, C'-C'', e F-G do domínio variável da cadeia pesada.

Utilizando a estrutura 3D de uma proteína como um auxiliar para o desenho, foram randomizados resíduos de aminoácidos localizados na superfície de muitas proteínas utilizando a estrutura de núcleo da proteína como uma estrutura de suporte. Exemplos para esta estratégia são descritos ou revisitados nas seguintes referências aqui incorporadas por referência: Nygren PA, Uhlen M., Curr Opin Struct Biol. (1997) 7:463-9; Binz HK, Amstutz P, Kohl A, Stumpp MT, Briand C, Forrer P, Grutter MG, Pluckthun A. Nat Biotechnol. (2004) 22:575-82; Vogt M, Skerra A.

Chembiochem. (2004) 5:191-9; US 6,562,617. 6 ΡΕ2028193 0 princípio básico desta técnica baseia-se na observação de que muitas proteínas possuem um núcleo estável, formado por arranjos específicos de elementos de estrutura secundária, tais como folhas beta ou hélices alfa, que são interliqadas por estruturas tais como ansas, voltas, ou espirais aleatórias. Tipicamente, estes últimos três elementos de estrutura são menos cruciais para a estrutura geral da proteína, e os resíduos de aminoácidos nestes elementos de estrutura podem ser trovados frequentemente sem destruir a dobragem geral da proteína. Um exemplo que ocorre naturalmente para este princípio de desenho são as CDRs dos anticorpos. Exemplos artificiais incluem lipocalinas, anquirinas e outras estruturas da proteína.

As ansas que não são ansas de CDR numa imunoglo-bulina nativa não possuem ligação ao antigénio ou especificidade de ligação ao epitopo, mas contribuem para a dobragem correcta da molécula de imunoglobulina inteira e/ou o seu efector ou outras funções e são por isso denominadas ansas estruturais para o objectivo desta invenção.

Na Patente dos Estados Unidos da América N° 6 294 654 é demonstrado que podem ser produzidos anticorpos alterados nos quais um antigénio peptídico pode ser incorporado numa ansa não-CDR de um anticorpo (Ab) na região CHI entre a região de charneira e a região variável, e o Ab resultante pode ser recuperado num APC de modo a que o antigénio peptídico seja apresentado na superfície do APC 7 ΡΕ2028193 no contexto de MHC II, e desse modo produzir uma resposta imunitária. Estes péptidos inseridos são epitopos e a estrutura global da molécula veiculo não é importante. Foi demonstrado que pode ser colocado um péptido ras numa ansa (não-CDR) de uma Imunoglobulina e a Imunoglobulina ainda ser secretada. Existe um "controlo de qualidade" rigoroso nas células que previne que a Imunoglobulina seja secretada a menos que esteja adequadamente dobrada, e a alteração a sequência de aminoácidos da ansa pode provocar a dobragem da proteína numa estrutura que a célula possa detectar como incorrecta, e desse modo degradá-la. Assim, para além dos exemplos apresentados foi considerado difícil modificar ainda mais as ansas estruturais sem alterar a natureza da Imunoglobulina. 0 Pedido de Patente US 2004/0101905 descreve a ligação de moléculas que compreendem um sítio de ligação ao alvo e um péptido efector Fc. O péptido efector Fc é um péptido que interage com a molécula efectora. Foi demonstrada a inserção de um péptido efector numa ansa não-CDR de um dominio CHI - de um fragmento de imunoglobulina.

Os péptidos efectores Fc são estruturas que ocorrem naturalmente em ansas não-CDR de anticorpos e é por isso expectável que não perturbem o facto de a estrutura da imunoglobulina ser enxertada em diferentes localizações diferentes equivalentes numa imunoglobulina.

Contudo, cada péptido enxertado numa ansa não-CDR 8 ΡΕ2028193 de acordo com esta descrição possui uma probabilidade elevada de ser inactivo pelo diferente ambiente estrutural que foi seleccionado. É referido, em ambos os documentos da técnica mencionados acima que é difícil inserir péptidos na ansa que possam reter a sua estrutura e função, na medida em que é crítico não perturbar a dobragem da estrutura da imunoglobulina já que esta é importante para a função e secreção. WO 01/83525 A2 revela a fusão de domínios Fc com um péptido biologicamente activo para aumentar as semi-vidas in vivo dos péptidos. Os domínios Fc são ligados aos péptidos biológicos através do terminal N ou C ou através de uma cadeia lateral de aminoácidos.

Os Pedidos de Patente US 2004/0132101 e 2005/0244403 descrevem as imunoglobulinas mutantes com afinidade de ligação alterada para um ligando efector, que são ligandos naturais para ansas estruturais de anticorpos. Neste documento, são descritas várias mutações em várias regiões ao longo da molécula de imunoglobulina inteira que influenciam a função efectora de todo o anticorpo. novas

Outros documentos da técnica anterior demonstram que a imunoglobulina do tipo estrutural foi empregue até agora com o objectivo de manipular o sítio de ligação ao antigénio existente, introduzindo desse modo 9 ΡΕ2028193 propriedades de ligação. Até agora, contudo, apenas foram construídas regiões CDR para ligação ao antigénio, por outras palavras, no caso da dobragem da imunoglobulina, apenas o sitio de ligação ao antigénio natural foi modificado de modo a alterar a sua afinidade ou especificidade de ligação. Existe um vasto conjunto de literatura que descreve diferentes formatos dessas imunoglobulinas manipuladas, frequentemente expressas na forma de fragmentos Fv de cadeia única (scFv) ou fragmentos Fab, quer dispostos na superfície de partículas fágicas ou expressas de forma solúvel em vários sistemas de expressão procarióticos ou eucarióticos. Entre os autores lideres no campo estão Greg Winter, Andreas Pluckthun e Hennie Hoogenboom. É um objectivo da presente invenção proporcionar imunoglobulinas com novos sitios de ligação ao antigénio introduzidos, e métodos para modificar e fabricar as referidas imunoglobulinas.

Por isso, a presente invenção refere-se a um método para construir uma imunoglobulina que compreende pelo menos uma modificação numa região de ansa estrutural da referida imunoglobulina e determinar a ligação da referida imunoglobulina a um epitopo de um antigénio, em que a imunoglobulina não modificada não se liga significativamente ao referido epitopo, que compreende os passos de: 10 ΡΕ2028193 proporcionar um ácido nucleico que codifica uma imunoglobulina que compreende pelo menos uma região da ansa estrutural, modificar pelo menos um residuo de nucleótido de pelo menos uma das referidas regiões de ansa estruturais, transferir o referido ácido nucleico modificado num sistema de expressão, expressar a referida imunoglobulina modificada, colocar em contacto a imunoglobulina modificada expressa com um epitopo, e determinar se a referida imunoglobulina modificada se liga a um dominio variável da imunoglobulina ou parte deste, que compreende pelo menos uma região da ansa estrutural de um domínio variável da cadeia pesada ou da cadeia leve da imunoglobulina, compreendendo a referida, pelo menos uma, região da ansa estrutural pelo menos uma modificação para proporcionar um sítio de ligação não-CDR a um epitopo de um antigénio, cuja região não modificada da ansa estrutural não se liga ao referido epitopo, em que a referida modificação compreende mutagénese numa ansa de fundo seleccionada a partir do grupo que consiste nas ansas de ligação entre as cadeias beta A-B, C-C', C' ' -D e E-F do domínio variável. A invenção refere-se ainda a uma imunoglobulina modificada, em que a região da ansa modificada está em qualquer uma de Vh ou VI. 11 ΡΕ2028193 A invenção refere-se ainda a uma imunoglobulina modificada, em que a referida região da ansa modificada está na região C terminal. A invenção refere-se ainda a uma imunoglobulina modificada, que compreende um domínio bivalente ou biespecífico. A invenção refere-se ainda a uma imunoglobulina modificada, que compreende um domínio único de imunoglobulina ou Fv de cadeia simples. A invenção refere-se ainda a uma imunoglobulina modificada, com pelos menos duas regiões de ansa estruturais modificadas. A invenção refere-se ainda a uma imunoglobulina modificada, que compreende pelo menos uma imunoglobulina modificada de acordo com a invenção, em que a referida região da ansa estrutural modificada compreende pelo menos 6 modificações de aminoácido. A invenção refere-se ainda a uma molécula que compreende pelo menos uma imunoglobulina modificada de acordo com a invenção, e pelo menos uma outra molécula de ligação, em que a referida outra molécula de ligação é seleccionada a partir do grupo de imunoglobulinas, receptores solúveis, ligandos, ácidos nucleicos e hidratos de carbono. 12 ΡΕ2028193 A invenção refere-se ainda a uma imunoglobulina, caracterizada por a referida modificação estar dentro de um domínio variável humano numa das posições de aminoácido na sequência de aminoácidos seleccionadas a partir do grupo que consiste nos aminoácidos 8 até 20, aminoácidos 44 até 50, aminoácidos 67 até 76 e aminoácidos 89 até 101, em que a numeração da posição de aminoácido dos domínios é a de IMGT. A invenção refere-se ainda a uma imunoglobulina, caracterizada por a referida modificação estar num domínio variável de murino numa das posições de aminoácido na sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste nos aminoácidos 6 até 20, aminoácidos 44 até 52, aminoácidos 67 até 7 6 e aminoácidos 92 até 101, em que a numeração da posição do aminoácido dos domínios é a de IMGT. A invenção refere-se ainda a uma imunoglobulina, que possui especificidade de ligação a um antigénio seleccionado a partir do grupo que consiste em alergénios, antigénios associados a tumor, auto antigénios, enzimas, antigénios bacterianos, antigénios fúngicos, antigénios virais e antigénios protozoários. A invenção refere-se ainda a uma imunoglobulina, que possui especificidade de ligação a FcRn. 13 ΡΕ2028193 A invenção refere-se ainda a uma imunoglobulina, que possui especificidade de ligação a uma molécula efectora. A invenção está ainda relacionada com uma imunoglobulina, que compreende uma imunoglobulina humana, humanizada, quimérica, de murino ou de camelo, ou seus homólogos. A invenção refere-se ainda a um ácido nucleico que codifica uma imunoglobulina de acordo com a invenção. A invenção refere-se ainda a uma preparação farmacêutica que contém uma imunoglobulina de acordo com a invenção.

Em particular, a presente invenção refere-se a uma imunoglobulina que se liga especificamente a um epitopo de um antigénio seleccionado a partir do grupo que consiste em alergénios, antigénios associados a tumor, auto antigénios, enzimas, antigénios bacterianos, antigénios fúngicos, antigénio protozoário e antigénios virais. Através de modificação na região da ansa estrutural a imunoglobulina pode ser construída para ser ligada ao epitopo. Numa forma de realização preferida, a imunoglobulina liga-se especificamente a pelo menos dois desses epitopos, que diferem um do outro, quer do mesmo antigénio ou de diferentes antigénios.

Por exemplo, a invenção refere-se à construção de 14 ΡΕ2028193 uma imunoglobulina que se ligue especificamente a pelo menos um primeiro epitopo e que compreende pelo menos uma modificação em pelo menos uma região da ansa estrutural da referida imunoglobulina e determinar a ligação especifica da referida pelo menos uma região da ansa a pelo menos um segundo epitopo, sendo o epitopo seleccionado a partir do grupo de antigénios como mencionado acima, em que a região não modificada da ansa estrutural (região não-CDR) não se liga especificamente ao referido, pelo menos um, segundo epitopo, que compreende os passos de: proporcionar um ácido nucleico que codifica uma imunoglobulina que se liga especificamente a pelo menos um primeiro epitopo que compreende pelo menos uma região da ansa estrutural, modificar pelo menos um resíduo de nucleótido de pelo menos uma das referidas regiões de ansa, codificadas pelo referido ácido nucleico, transferir o referido ácido nucleico modificado num sistema de expressão, expressar a referida imunoglobulina modificada, colocar em contacto a imunoglobulina modificada expressa com o referido, pelo menos um, segundo epitopo, e determinar se a referida imunoglobulina modificada se liga especificamente ao segundo epitopo. A invenção refere-se, de um modo preferido, a pelo menos uma modificação em pelo menos uma região da ansa 15 ΡΕ2028193 estrutural da referida imunoglobulina e determinar a ligação especifica da referida, pelo menos uma, região de ansa a pelo menos um antigénio seleccionado a partir do grupo que consiste em alergénios, antigénios associados a tumor, auto antigénios, enzimas, antigénios bacterianos, antigénios fúngicos, antigénios virais e antigénios protozoários, em que a imunoglobulina que contém uma região não modificada da ansa estrutural não se liga especi-ficamente ao referido, pelo menos um, antigénio. 0 termo "imunoglobulinas", como aqui utilizado (os termos imunoglobulina e anticorpo são permutáveis) podem apresentar propriedades de ligação mono- ou multi-específicas, ou multivalentes, pelo menos suas, de um modo preferido pelo menos três sitios de ligação especifica para os epitopos de e.g. antigénios, moléculas/proteinas efectoras. As imunoglobulinas de acordo com a invenção são também fragmentos funcionais aceites na técnica, tais como Fc, Fab, scFv, dimeros de cadeia simples dos domínios CH/CL, Fv, ou outros derivados ou combinações das imunoglobulinas, domínios das cadeias pesadas e leves da região variável (tal como Fd, Vlambda, Vcapa, Vh) e a região constante de um anticorpo intacto, tal como CHI, CH2, CH3, CH4, Cl e Ck, assim como mini-domínios que consistem em duas cadeias beta de um domínio de imunoglobulina ligado por uma ansa estrutural. É entendido que o termo "imunoglobulina", "imunoglobulina modificada" ou "imunoglobulina de acordo com a 16 ΡΕ2028193 invenção" inclui também um derivado de imunoglobulinas. Um derivado é qualquer combinação de uma ou mais imunoglobulinas da invenção e ou uma proteína de fusão na qual qualquer domínio ou mini-domínio da imunoglobulina da invenção pode ser fundida em qualquer posição de uma ou mais outras proteínas (tais como outras imunoglobulinas, ligandos, proteínas de estrutura, enzimas toxinas e afins). Um derivado da imunoglobulina da invenção pode também ser obtido através da ligação a outras substâncias através de várias técnicas químicas, tais como acoplamento covalente, interacção electrostática, ligação persulfureto, etc.

As outras substâncias ligadas às imunoglobulinas podem ser lípidos, hidratos de carbono, ácidos nucleicos, moléculas orgânicas e anorgânicas ou qualquer combinação destas (e.g. PEG, pró-fármacos ou fármacos). Um derivado é também uma imunoglobulina com a mesma sequência de amino-ácidos mas constituída completamente ou parcialmente de aminoácidos não naturais ou modificados quimicamente.

As moléculas construídas de acordo com a presente invenção serão úteis como proteínas isoladamente assim como proteínas de fusão ou derivados, mais tipicamente fundidas de tal como que sejam parte de estruturas de anticorpo maior ou moléculas de anticorpo completo, ou partes deste tal como fragmentos Fab, fragmentos Fc, fragmentos Fv e outros. Será possível utilizar as proteínas construídas para produzir moléculas que são monoespecíficas, biespecíficas, triespecíficas, e talvez mesmo comportar 17 ΡΕ2028193 mais especificidades ao mesmo tempo, e será possível ao mesmo tempo controlar e pré-seleccionar a valência da ligação ao mesmo tempo de acordo com os requisitos da utilização planeada dessas moléculas.

De acordo com a presente invenção, as regiões de ligação aos antigénios ou sítios de ligação ao antigénio de todos os tipos de alergénios, antigénios associados a tumor, auto antigénios, enzimas, antigénios bacterianos, antigénios fúngicos, antigénio protozoário e antigénios virais, podem ser introduzidas numa ansa estrutural de uma dada estrutura de antigénio. 0 termo "antigénio", de acordo com a presente invenção significará moléculas ou estruturas conhecidas por interagirem ou serem capazes de interagir com a região da ansa da CDR das imunoglobulinas. As regiões de ansa estruturais da técnica anterior não interagem com antigénios mas em vez disso contribuem para a estrutura global e/ou para a ligação a moléculas efectoras.

Os termos "alergénios, antigénios associados a tumor, auto antigénios, enzimas, antigénios bacterianos, antigénios fúngicos, antigénio protozoário e antigénios virais" de acordo com a presente invenção incluirão todos os alergénios e antigénios capazes de serem reconhecidos por uma estrutura de anticorpo, e fragmentos dessas moléculas (especialmente subestruturas geralmente referidas como "epitopos" (e.g. epitopos de células B) ) , desde que 18 ΡΕ2028193 sejam imunologicamente relevantes, i.e. também são reconhecíveis por anticorpos naturais ou monoclonais. 0 termo "epitopo", de acordo com a presente invenção, significará uma estrutura molecular que pode constituir completamente um parceiro de ligação específico ou ser parte de um parceiro de ligação específico para o domínio de ligação ou a imunoglobulina da presente invenção.

Quimicamente, um epitopo pode ser composto por um hidrato de carbono, um péptido, um ácido gordo, uma substância anorgânica ou seus derivados e quaisquer combinações destes. Se um epitopo é um polipéptido, irá normalmente incluir pelo menos 3 aminoácidos, de um modo preferido 8 a 50 aminoácidos, e mais preferencialmente entre cerca de 10-20 aminoácidos no péptido. Não há limite superior crítico para o comprimento do péptido, que pode compreender quase o comprimento total da sequência polipeptídica. Os epitopos podem ser epitopos lineares ou conformacionais. Um epitopo linear é compreendido por um segmento único de uma sequência primária de uma cadeia polipeptídica. Os epitopos lineares podem ser contíguos ou sobreponiveis. Os epitopos conformacionais são compreendidos por aminoácidos colocados em conjunto através da dobragem do polipéptido para formar uma estrutura terciária e os aminoácidos não estão necessariamente adjacentes um ao outro na sequência linear. 19 ΡΕ2028193

Especificamente, os epitopos são pelo menos parte das moléculas relevantes em diagnóstico, i.e. a ausência ou a presença de um epitopo numa amostra está qualitativamente ou quantitativamente correlacionada com uma doença ou com um estatuto de saúde ou com um estatuto de processo no fabrico ou com um estatuto ambiental e alimentar. Os epitopos podem também ser pelo menos parte de moléculas terapeuticamente relevantes, i.e. moléculas que podem ser direccionadas através do domínio de ligação específico que altera o cursa da doença. "Alergénios, antigénios associados a tumor, auto antigénios, enzimas, antigénios bacterianos, antigénios fúngicos, antigénio protozoário e antigénios virais" preferidos são os alergénios ou antigénios, para os quais já foi demonstrado que são, ou são capazes de ser, imunolo-gicamente ou terapeuticamente relevantes, especialmente aqueles, para os quais foi testada uma eficácia clínica.

Por outro lado, de acordo com outro aspecto da presente invenção também podem ser introduzidas outras capacidades de ligação nas regiões de ansa estruturais, e.g. capacidades de ligação para pequenas moléculas, tais como fármacos ou enzimas, sítios catalíticos de enzimas ou substratos enzimáticos ou para um estado de transição análogo a um substrato enzimático.

Preferencialmente, o novo sítio de ligação ao antigénio nas ansas estruturais é estranho para a imuno- 20 ΡΕ2028193 globulina não modificada. Deste modo, os alvos como as moléculas efectoras ou os receptores Fc são preferencialmente excluídos das moléculas de ligação e a especificidade das imunoglobulinas de acordo com a invenção.

Preferencialmente, os novos sitios de ligação ao antigénio nas ansas estruturais são introduzidos por substituição, deleção e/ou inserção da imunoglobulina codificada pelo ácido nucleico seleccionado.

De acordo com outra forma de realização preferida da presente invenção, a modificação de pelo menos um nucleótido resulta numa substituição, deleção e/ou inserção da imunoglobulina codificada pelo referido ácido nucleico. A modificação da, pelo menos uma, região de ansa pode resultar numa substituição, deleção e/ou inserção de 1 ou mais aminoácidos, preferencialmente uma mutação pontual, troca de ansas completas, mais preferida a possibilidade de pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 até 30 aminoácidos. É também preferida a mutação aleatória dirigida a um sitio. Com este método, um ou mais residuos de aminoácidos específicos da ansa são permutados ou introduzidos utilizando inserções criadas aleatoriamente nessas ansas estruturais. É alternativamente preferida a utilização de abordagens combinatórias. A, pelo menos uma, região de ansa é preferencialmente mutada ou modificada através de métodos de mutagénese 21 ΡΕ2028193 aleatória, semi-aleatória ou, em particular, através de métodos de mutagénese aleatória dirigida a um sitio. Estes métodos podem ser utilizados para produzir modificações de aminoácidos nas posições desejadas da imunoglobulina da presente invenção. Nestes casos, as posições são escolhidas aleatoriamente, ou são realizadas alterações de aminoácidos utilizando regras simplistas. Por exemplo, todos os resíduos podem ser mutados para alanina, referidos como rastreio de alanina. Esses métodos podem ser acoplados com abordagens de construção mais sofisticados que empregam métodos de selecção para rastrear niveis mais elevado de diversidade de sequência.

Um método preferido de acordo com a invenção refere-se à molécula de ácido nucleico modificada aleatoriamente que compreende pelo menos uma unidade de repetição de nucleótido possuindo a sequência 5'-NNS-3', 5'-NNN-3' ou 5'- NNK-3'. A molécula de ácido nucleico modificada aleatoriamente pode compreende as unidades de repetição acima identificadas, que codificam para todos os aminoácidos conhecidos que ocorrem naturalmente.

Como é bem conhecido na técnica, existe uma variedade de tecnologias de selecção que podem ser utilizadas para a identificação e para o isolamento de proteínas com certas características de ligação e afinidades, incluindo, por exemplo, tecnologias de apresentação, ΡΕ2028193 tais como apresentação em fagos, apresentação em ribosso-mas, apresentação em superfície de células, e semelhantes, como descrito abaixo. Métodos para a produção e o rastreio de variantes de anticorpo são bem conhecidos na técnica. Métodos gerais para a biologia molecular, expressão, purificação, e rastreio do anticorpo são descritos em Antibody Engineering, editado por Due-bel & Kontermann, Springer-Verlag, Heidelberg, 2001; e Hay-hurst & Georgiou, 2001, Curr Opin Chem Biol 5:683-689; Maynard & Georgiou, 2000, Annu Rev Biomed Eng 2:339-76.

Uma "ansa estrutural" ou "ansa não-CDR" de acordo com a presente invenção deve ser entendida do seguinte modo: as imunoglobulinas são constituídos por domínios com uma denominada dobragem de imunoglobulina. Na sua essência, as folhas beta anti-paralelas são ligadas através de ansas para formar um barril beta anti-paralelo comprimido. Na região variável, algumas das ansas dos domínios contribuem essencialmente para a especificidade do anticorpo, i.e. a ligação a um antigénio. Estas ansas são denominadas ansas de CDR. Todas as outras ansas dos domínios do anticorpo contrariamente contribuem para a estrutura da molécula e/ou a função efectora. Estas ansas são aqui definidas como ansas estruturais ou ansas não-CDR.

As moléculas de ácido nucleico que codificam as imunoglobulinas modificadas (e sempre incluídos ao longo de toda a descrição abaixo: fragmentos de imunoglobulina) podem ser clonadas em células hospedeiras, expressas e 23 ΡΕ2028193 ensaiadas para as suas especificidades de ligação. Estas práticas são realizadas utilizando processos bem conhecidos, e uma variedade de métodos que podem ter utilidade na presente invenção são descritos em Molecular Cloning--A Laboratory Manual, 3.sup.rd Ed. (Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001), e Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons). Os ácidos nucleicos que codificam imunoglobulinas modificadas da presente invenção podem ser incorporadas num vector de expressão de modo a expressar as referidas imunoglobulinas. Os vectores de expressão compreendem tipicamente uma imunoglobulina ligada operacionalmente, que é colocado numa relação funcional, com sequências de controlo ou reguladoras, marcadores de selecção, quaisquer parceiros de fusão, e/ou elementos adicionais. As imunoglobulinas modificadas da presente invenção podem ser produzidas através da cultura de uma célula hospedeira transformada com ácido nucleico, preferencialmente um vector de expressão, contendo ácido nucleico que codifica as imunoglobulinas modificadas, nas condições apropriadas para induzir ou provocar a expressão das imunoglobulinas modificadas. Os métodos de introdução de moléculas de ácido nucleico exógenas num hospedeiro são bem conhecidos na técnica, e irão variar com o hospedeiro utilizado. Obviamente, também podem ser empregues sistemas de expressão acelulares ou sem células para a expressão de imunoglobulinas modificadas.

Numa forma de realização preferida da presente - 24 - ΡΕ2028193 invenção, as imunoglobulinas modificadas são purificadas ou isoladas após expressão. As imunoglobulinas modificadas podem ser isoladas ou purificadas numa variedade de formas conhecidas dos especialistas na técnica. Métodos de purificação convencionais incluem técnicas cromatográficas, electroforéticas, imunológicas, precipitação, diálise, filtração, concentração, e de focagem cromatográfica. A purificação pode ser frequentemente permitida através de um parceiro de fusão particular. Por exemplo, os anticorpos podem ser purificados utilizando resina de glutationa se for empregue uma fusão de GST, cromatográfia de afinidade de Ni+2 se for empregue um marcador de His ou anticorpo anti-bandeira imobilizado se for utilizado um marcador de bandeira. Para guias gerais em técnicas de purificação adequada, ver Antibody Purification: Principies and Practice, 3.sup.rd Ed., Scopes, Springer- Verlag, NY, 1994. Obviamente, é também possível expressar as imunoglobulinas modificadas de acordo com a presente invenção na superfície de um hospedeiro, em particular na superfície de uma célula bacteriana, de insectos ou de leveduras ou na superfície de fagos ou vírus.

Podem ser rastreadas imunoglobulinas modificadas utilizando uma variedade de métodos, incluindo mas não limitados àqueles que utilizam ensaios in vitro, in vivo e ensaios à base de células, e tecnologias de selecção. Podem ser utilizadas tecnologias de automação e rastreio de elevada produção nos processos de rastreio. 0 rastreio pode empregar a utilização de um parceiro de fusão ou marcador, 25 ΡΕ2028193 por exemplo uma enzima, um marcador imunológico, marcador isotópico, ou marcador de pequena molécula, tal como um corante fluorescente ou colorimétrico ou uma molécula luminogénica.

Numa forma de realização preferida, as propriedades funcionais e/ou biofísicas das imunoglobulinas são rastreadas num ensaio in vitro. Numa forma de realização preferida, o anticorpo é rastreado para a funcionalidade, por exemplo a sua capacidade para catalisar uma reacção ou a sua afinidade de ligação ao alvo.

Os ensaios podem empregar uma variedade de métodos de detecção incluindo, mas não limitados a marcadores cromogénicos, fluorescentes, luminescentes, ou isotópicos.

Como é conhecido na técnica, um subconjunto de métodos de rastreio são aqueles que seleccionam membros favoráveis de uma biblioteca. Os métodos são aqui referidos como "métodos de selecção", e estes métodos têm utilidade na presente invenção para o rastreio de imunoglobulinas modificadas. Quando as bibliotecas de imunoglobulinas são rastreadas utilizando um método de selecção, apenas os membros de uma biblioteca que são favoráveis, isto é que respeitam alguns critérios de selecção, são propagados, isolados, e/ou observados. Como deve ser entendido, porque apenas são observadas as variantes mais adaptadas, esses métodos permitem o rastreio de bibliotecas que são maiores do que aquelas que podem ser rastreadas através de métodos 26 ΡΕ2028193 que ensaiam a aptidão dos membros da biblioteca individualmente. A selecção é possível através de qualquer método, técnica, ou parceiro de fusão que liqa, covalentemente ou não covalentemente, o fenótipo das imunoglobulinas com o seu genótipo, que é a função de um anticorpo com o ácido nucleico que o codifica. Por exemplo a utilização da apresentação em fagos como um método de selecção é possibilitado através da fusão de membros da biblioteca com a proteína do gene III. Deste modo, a selecção ou o isolamento de imunoglobulinas modificadas que cumprem alguns critérios, por exemplo afinidade de ligação como alvo da imunoglobulina, também selecciona para ou isola o ácido nucleico que o codifica. Uma vez isolado, o gene ou genes que codificam imunoglobulinas modificadas pode ser então amplificado. Este processo de isolamento e de amplificação, referido como biosselecção, pode ser repetido, permitindo que variantes de anticorpo na biblioteca sejam enriquecidos. A sequenciação de ácido nucleico do ácido nucleico ligado permite, em último caso, a identificação de genes. São conhecidos na técnica vários métodos de selecção que podem ser utilizados na presente invenção para o rastreio de bibliotecas de imunoglobulina. Estes incluem, mas não estão limitados à apresentação em fagos (Phage display of peptides and antibodies: a laboratory manual, Kay et al.r 1996, Academic Press, San Diego, Calif., 1996; Low-man et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10838; Smith, 1985, Science 228:1315-1317) e seus derivados, tais como 27 ΡΕ2028193 infecção de fagos selectiva (Malmborg et al., 1997, J Mol Biol 273:544-551), fago selectivamente infeccioso (Krebber et al., 1997, J Mol Biol 268:619-630), e biosselecção de infecciosidade atrasada (Benhar et al., 2000, J Mol Biol 301:893-904), apresentação em superfície de células (Witrrup, 2001, Curr Opin Biotechnol, 12:395-399) tais como apresentação em bactérias (Georgiou et al., 1997, Nat Biotechnol 15:29-34; Georgiou et al., 1993, Trends Biotechnol 11:6-10; Lee et al., 2000, Nat Biotechnol 18:645-648; Jun et al., 1998, Nat Biotechnol 16: 576-80), leveduras (Boder & Wittrup, 2000, Methods Enzymol 328:430-44; Boder & Wittrup, 1997, Nat Biotechnol 15:553-557), e células de mamíferos (Whitehorn et al., 1995, Bio/technology 13:1215-1219), assim como tecnologias de apresentação in vitro (Amstutz et al., 2001, Curr Opin Biotechnol 12:400-405), tais como apresentação de polissoma (Mattheakis et al., 1994, Proc Natl Acad Sei USA 91:9022-9026), apresentação em ribossomas (Hanes et al., 1997, Proc Natl Acad Sei USA 94:4937-4942), apresentação de mRNA (Roberts & Szostak, 1997, Proc Natl Acad Sei USA 94:12297-12302; Nemoto et al., 1997, FEBS Lett 414: 405-408), e sistema de apresentação de inactivação de ribossoma (Zhou et al., 2002, J Am Chem Soc 124, 538-543).

Outros métodos de selecção que podem ser úteis na presente invenção incluem métodos que não se baseiam em apresentação, tais como métodos in vivo incluindo, mas não limitados à expressão periplásmica e rastreio citométrico (Chen et al., 2001, Nat Biotechnol 19:537-542), o ensaio de 28 ΡΕ2028193 complementação do fragmento do anticorpo (Johnsson & Varshavsky, 1994, Proc Natl Acad Sei USA 91 :10340-10344; Pelletier et al., 1998, Proc Natl Acad Sei USA 95:12141-

12146), e o rastreio hibrido de duas leveduras (Fields & Song, 1989, Nature 340:245-246) utilizado no modo de selecção (Visintin et al., 1999, Proc Natl Acad Sei USA 96:11723-11728). Numa forma de realização alternativa, a selecção é possibilitada através de um parceiro de fusão que se liga a uma sequência especifica no vector de expressão, ligando desse modo, de forma covalente ou não covalente o parceiro de fusão e o membro da biblioteca de variantes Fc associado com o ácido nucleico que o codifica.

Por exemplo, PCT WO 00/22906 ; PCT WO 01/49058; PCT WO 02/04852; PCT WO 02/04853; PCT WO 02/08023; PCT WO 01/28702; e PCT WO 02/07466 descrevem esse parceiro de fusão e a técnica que pode ser útil na presente invenção. Numa forma de realização alternativa, a selecção in vivo pode ocorrer se a expressão do anticorpo confere alguma vantagem de crescimento, reprodução, ou sobrevivência à célula.

Um subconjunto de métodos de selecção referidos como métodos de "evolução dirigida" são aqueles que incluem o acasalamento ou a reprodução de sequências favoráveis durante a selecção, por vezes com a incorporação de novas mutações. Como será entendido pelos especialistas na técnica, os métodos de evolução dirigida podem facilitar a identificação das sequências mais favoráveis numa biblioteca, e podem aumentar a diversidade das sequências 29 ΡΕ2028193 que são rastreadas. São conhecidos na técnica uma variedade de métodos de evolução dirigida que podem ter utilidade na presente invenção para o rastreio de variantes do anticorpo, incluindo mas não limitados ao baralhar do DNA (PCT WO 00/42561 A3; PCT WO 01/70947 A3), baralhar do exão (Pat. U.S. No. 6, 365, 377; Kolkman & Stemmer, 2001, Nat Biotechnol 19:423-428), baralhar de familia (Crameri et al.r 1998, Nature 391:288-291; Pat. U.S. No. 6,376,246), RACHITT.TM. (Coco et al., 2001, Nat Biotechnol 19:354-359; PCT WO 02/06469), STEP e iniciação aleatória de recombinação in vitro (Zhao et al., 1998, Nat Biotechnol 16:258-261; Shao et al., 1998, Nucleic Acids Res 26:681-683), montagem de genes mediada por exonuclease (Pat. U.S. No. 6,352,842; Pat. U.S. No. 6,361,974), Mutagénese por Saturação do Sitio do Gene. TM. (Pat. U.S. No. 6,358,709), Remontagem de Gene. TM. (Pat. U.S. No. 6,358,709), SCRATCHY (Lutz et al., 2001, Proc Natl Acad Sei USA 98:11248-11253), Métodos de fragmentação de DNA (Kikuchi et al., Gene 23 6: 159-167), baralhar de DNA de cadeia simples (Kikuchi et al., 2000, Gene 243:133-137), e AMEsystem.TM. Tecnologia de construção de anticorpo de evolução dirigida (Applied Molecular Evolution) (Pat. U.S. N°. 5,824,514; Pat U.S. N°. 5,817,483; Pat. U.S. N°. 5,814,476; Pat U.S. N°. 5,763,192; Pat. U.S. N°. 5,723,323).

Numa forma de realização preferida, as variantes de anticorpo são rastreadas utilizando um ou mais ensaios à base de células ou in vivo. Para esses ensaios, as imunoglobulinas modificadas purificadas ou não purificadas 30 ΡΕ2028193 são adicionadas tipicamente de forma exógena, de modo que as células são expostas a imunoglobulinas individuais ou misturas de imunoglobulinas que pertencem a uma biblioteca. Estes ensaios são tipicamente, mas não sempre, baseados na função da imunoglobulina; isto é, a capacidade do anticorpo para se ligar ao seu alvo e mediar algum evento bioquímico, por exemplo função efectora, inibição da ligação ligando/receptor, apoptose, e semelhantes. Esses ensaios envolvem frequentemente a monitorização da resposta das células ao anticorpo, por exemplo sobrevivência celular, morte celular, alteração na morfologia celular, ou activação da transcrição dessa expressão celular de um gene natural ou gene repórter. Por exemplo, esses ensaios podem medir a capacidade das variantes do anticorpo para deduzir ADCC, ADCP, ou CDC. Para alguns ensaios, pode ser necessário adicionar células ou componentes adicionais, isto é, em adição às células alvo, por exemplo complemento de soro, ou células efectoras, tais como monócitos do sangue periférico (PBMCs), células NK, macrófagos, e semelhantes. Essas células adicionais podem ser derivadas de qualquer organismo, preferencialmente humanos, murganho, rato, coelho, e macaco. As imunoglobulinas podem provocar a apoptose de certas linhas celulares que expressam o alvo, ou podem mediar o ataque sobre células alvo através de células imunitárias que foram adicionadas ao ensaio. São conhecidos na técnica métodos para monitorizar a morte celular ou a viabilidade, e incluem a utilização de corantes, reagentes imunoquímicos, citoquímicos, e radioactivos. Por exemplo, os ensaios de coloração de 31 ΡΕ2028193 caspase podem permitir a medição da apoptose, e a incorporação ou libertação de substratos radioactivos ou corantes fluorescentes, tais como azul alamar podem permitir que seja monitorizado o crescimento celular ou a activação. Numa forma de realização preferida, pode ser utilizado o ensaio de citotoxicidade à base de DELFIA.RTM. EuTDA (Perkin Elmer, MA). Alternativamente, podem ser monitorizadas as células alvo mortas ou lesionadas através da medição da libertação de um ou mais componentes naturais intracelulares, por exemplo a lactato desidrogenase. A activação de transcrição também pode servir como um método para avaliar a função de ensaios à base de células. Neste caso, a resposta pode ser monitorizada através do ensaio para genes naturais ou imunoglobulinas que podem ser regulados positivamente, por exemplo a libertação de certas interleuquinas pode ser medida, ou alternativamente a leitura pode ser realizada através de uma construção repórter. Os ensaios à base de células podem também envolver a medição de alterações morfológicas de células como uma resposta à presença de imunoglobulinas modificadas. Os tipos de células para estes ensaios pode ser procarióticas ou eucarióticas, e podem ser empregues uma variedade de linhas celulares que são conhecidas na técnica. Alternativamente, os rastreios à base de células são realizados utilizando células que podem ser transformadas ou transfec-tadas com ácidos nucleicos que codificam as variantes. Isto é, as variantes de anticorpo não são adicionados exogena-mente às células. Por exemplo, numa forma de realização, 0 rastreio à base de células utiliza a apresentação em 32 ΡΕ2028193 superfície de células. Pode ser empregue um parceiro de fusão que possibilita a apresentação de imunoglobulinas modificadas na superfície das células (Witrrup, 2001, Curr Opin Biotechnol, 12:395-399).

Numa forma de realização preferida, a imunogeni-cidade das imunoglobulinas modificadas podem ser determinada experimentalmente utilizando um ou mais ensaios à base de células. Numa forma de realização preferida, os ensaios de activação de células T ex vivo são utilizados para quantificar experimentalmente a imunogenicidade. Neste método, as células que apresentam antigénios e as células T naive de adores compatíveis são expostas a um péptido ou anticorpo total de interesse uma ou mais vezes. Depois, a activação de células T pode ser detectada utilizando vários métodos, por exemplo através da monitorização da produção de citocinas ou medindo a incorporação de timidina tritiada. Na forma de realização mais preferida, a produção de interferão gama é monitorizada utilizando ensaios de Elispot (Schmittel et. al.r 2000, J. Immunol. Meth., 24: 17-24) .

As propriedades biológicas das imunoglobulinas modificadas da presente invenção podem ser caracterizadas em experiências em células, tecidos, e organismos totais. Como é conhecido na técnica, os fármacos são frequentemente testados em animais, incluindo, mas não limitados a murganhos, ratos, coelhos, cães, gatos, porcos, e macacos, de modo a medir a eficácia de um fármaco para o tratamento ΡΕ2028193 contra uma doença ou modelo de doença, ou para medir a farmacocinética de um fármaco, a sua toxicidade, e outras propriedades. Os animais podem ser referidos como modelos de doença. Aos agentes terapêuticos são frequentemente testados em murganhos, incluindo, mas não limitados a murganhos nus, murganhos SCID, murganhos de xenoenxerto, e murganhos transgénicos (incluindo activados e desacti-vados). Essa experimentação pode proporcionar dados significativos para a determinação do potencial do anticorpo a ser utilizado como um agente terapêutico. Qualquer organismo, preferencialmente mamíferos, podem ser utilizados para testes. Por exemplo, devido à sua semelhança genética em relação a humanos, os macacos podem ser modelos terapêuticos adequados, e desse modo podem ser utilizados para testar a eficácia, toxicidade, farmacoci-nética, ou outra propriedade das imunoglobulinas modificadas da presente invenção. Os testes em humanos são, em última análise, necessários para aprovação como fármacos, e desse modo, obviamente que estas experiências estão contempladas. Assim, as imunoglobulinas modificadas da presente invenção podem ser testadas em humanos para determinar a sua eficácia terapêutica, toxicidade, imunogenicidade, farmacocinética, e/ou outras propriedades clínicas.

As imunoglobulinas modificadas da presente invenção podem ter utilidade numa vasta gama de produtos de anticorpo. Numa forma de realização a variante do anticorpo da presente invenção é utilizada para terapia ou profilaxia, para utilização preparativa ou analítica, como ΡΕ2028193 um composto de diagnóstico, um composto industrial ou um reagente de investigação, preferencialmente um agente terapêutico. A variante de anticorpo pode ter utilidade numa composição de antigénio que é monoclonal ou poli-clonal. Numa forma de realização preferida, as modificadas imunoglobulinas da presente invenção são utilizadas para matar células alvo que comportam o antigénio alvo, por exemplo células cancerosas. Numa forma de realização alternativa, as imunoglobulinas modificadas da presente invenção são utilizadas para bloquear, antagonizar, ou agonizar o antigénio alvo, por exemplo através de anta-gonização de uma citocina ou receptor de citocina. Numa forma de realização alternativamente preferida, as imunoglobulinas modificadas da presente invenção são utilizadas para bloquear, antagonizar, ou agonizar o antigénio alvo e matar as células alvo que contêm o antigénio alvo. Numa forma de realização alternativa preferida, as imunoglobulinas modificadas da presente invenção são utilizadas para bloquear, antagonizar, ou agonizar factores de crescimento ou receptores do factor de crescimento e matar as células alvo que contêm ou necessitam do antigénio alvo. Numa forma de realização preferida alternativa, as imunoglobulinas modificadas da presente invenção são utilizadas para bloquear, antagonizar, ou agonizar enzimas e substrato de enzimas.

As imunoglobulinas modificadas da presente invenção podem ser utilizadas para vários objectivos terapêuticos. Numa forma de realização preferida, um 35 ΡΕ2028193 anticorpo que compreende as imunoglobulinas modificadas é administrado a um doente para tratar um distúrbio especifico. Um "doente" para os objectivos da presente invenção inclui humanos e outros animais, preferencialmente mamíferos e muito preferencialmente humanos. Por "distúrbio especifico", aqui, entende-se um distúrbio que pode ser melhorado através da administração de uma composição farmacêutica que compreende uma imunoglobulina modificada da presente invenção.

Numa forma de realização, uma imunoglobulina modificada de acordo com a presente invenção é o único agente terapeuticamente activo administrado a um doente. Alternativamente, as imunoglobulinas modificadas de acordo com a presente invenção são administradas em combinação com um ou mais agentes terapêuticos diferentes, incluindo mas não limitados a agentes citotóxicos, agentes quimiotera-pêuticos, citocinas, agentes inibidores do crescimento, agentes anti-hormonais, inibidores de quinase, agentes anti-angiogénicos, cardioprotectores, ou outros agentes terapêuticos. As imunoglobulinas modificadas podem ser administradas concomitantemente com um ou mais regimes terapêuticos diferentes. Por exemplo, uma variante de anticorpo da presente invenção pode ser administrada ao doente juntamente com quimioterapia, terapia de radiação, ou ambas quimioterapia e terapia de radiação. Numa forma de realização, as imunoglobulinas modificadas da presente invenção podem ser administradas em conjunto com um ou mais anticorpos, que podem compreender ou não uma variante de 36 ΡΕ2028193 anticorpo da presente invenção. De acordo com outra forma de realização da invenção, as imunoglobulinas modificadas da presente invenção e uma ou mais terapias anticancro diferentes são empregues para tratar células de cancro ex vivo. Está contemplado que esse tratamento ex vivo pode ser útil em transplantes de medula óssea e particularmente, em transplantes de medula óssea autóloga. Está, obviamente, contemplado que os anticorpos da invenção podem ser empregues em combinação com ainda outras técnicas terapêuticas tais como cirurgia. Várias outros agentes terapêuticos podem ser úteis para administração com as imunoglobulinas modificadas da presente invenção. Numa forma de realização, a imunoglobulina modificada é administrada com um agente anti-angiogénico, que é um composto que bloqueia, ou interfere de algum modo, com o desenvolvimento dos vasos sanguineos. 0 factor anti-angiogénico pode, por exemplo, ser uma molécula pequena ou uma proteína, por exemplo um antigénio, fusão de Fc, ou citocina, que se liga a um factor de crescimento ou receptor de factor de crescimento envolvido na promoção da angiogénese. 0 factor anti-angiogénico preferido aqui referido é um antigénio que se liga ao Factor de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF). Numa forma de realização alternativa, a imunoglobulina modificada é administrada com um agente terapêutico que induz ou aumenta uma resposta imunitária adaptativa, por exemplo um antigénio que tem como alvo CTLA-4. Numa forma de realização alternativa, a imunoglobulina modificada é 37 ΡΕ2028193 administrada com um inibidor de quinase de tirosina, que é uma molécula que inibe, até certo ponto, a actividade da quinase da tirosina de uma quinase da tirosina. Numa forma de realização alternativa, as imunoglobulinas modificadas da presente invenção são administradas com uma citocina. Por "citocina", como aqui utilizado, entende-se um termo genérico para as proteinas libertadas por uma população de células que actuam sobre outra célula como mediadores intercelulares, incluindo quimiocinas.

Estão contempladas composições farmacêuticas em que são formuladas imunoglobulinas modificadas da presente invenção e um ou mais agentes terapeuticamente activos. As formulações das variantes de anticorpo da presente invenção são preparadas para armazenamento através da mistura da referida imunoglobulina possuindo o grau desejado de pureza com veículos farmaceuticamente aceitáveis opcionais, excipientes ou estabilizadores (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed., 1980), sob a forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. As formulações a serem utilizadas para administração in vivo são preferencialmente estéreis. Isto é rapidamente realizado por filtração através de membranas de filtração estéreis ou outros métodos. As imunoglobulinas modificadas e outros agentes terapeuticamente activos aqui revelados podem também ser formulados como imunolipossomas, e/ou aprisionados em microcápsulas. A administração da composição farmacêutica que ΡΕ2028193 compreende uma imunoglobulina modificada da presente invenção, preferencialmente na forma de uma solução aquosa estéril, pode ser realizada de vários modos, incluindo, mas não limitado a, oralmente, subcutaneamente, intravenosamente, intranasalmente, intraoticamente, transdermicamente, topicamente (e.g., géis, salvas, loções, cremes, etc.), intraperitonealmente, intramuscularmente, intrapulmonar-mente (e.g., AERx™ tecnologia inalável disponível comercialmente em Aradigm, ou Inhance™ sistema de distribuição pulmonar disponível comercialmente em Inhale Therapeutics), vaginalmente, parentericamente, rectalmente, ou intraocu-larmente.

Como aqui utilizado, o termo "liga-se especifi-camente" refere-se a uma reacção de ligação que é determinante do ligando cognato de interesse numa população heterogénea de moléculas. Desse modo, nas condições designadas (e.g. condições de imunoensaio no caso de uma imunoglobulina), o anticorpo especificado liga-se ao seu "alvo" particular e não se liga numa quantidade significativa a outras moléculas presentes numa amostra. Comparável às CDRs dos anticorpos as regiões de ansa estruturais modificadas são unidade de proteína de ligação ao antigénio ou molécula e não antigénios como tal. 0 termo "sistema de expressão" refere-se a moléculas de ácido nucleico que contêm uma sequência codificante desejada e sequências de controlo em ligação operacional, de modo que os hospedeiros transformados ou 39 ΡΕ2028193 transfectados com essas sequências são capazes de produzir as proteínas codificadas. De forma a efectuar a transformação, o sistema de expressão pode estar incluído num vector; contudo, o DNA relevante pode estar então também integrado no cromossoma do hospedeiro.

De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção o sistema de expressão compreende um vector. Qualquer vector de expressão conhecido na técnica pode ser utilizado para este objectivo, quando apropriado. A imunoglobulina modificada é preferencialmente expressa num hospedeiro, preferencialmente numa bactéria, uma levedura, uma célula vegetal, numa célula animal ou numa planta ou animal.

Podem ser utilizadas uma variedade de células hospedeiras apropriadas para expressar a imunoglobulina modificada, incluindo mas não limitadas a células de mamíferos (células animais), células vegetais, bactérias (e.g. Bacillus subtilis, Escherichia coli), células de insectos, e leveduras (e.g. Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae). Por exemplo, uma variedade de linhas celulares que podem ter utilidade na presente invenção é descrita no catálogo de linhas celulares da ATCC, disponível na American Type Culture Collection. Para além disso, também podem ser utilizados plantas e animais como hospedeiros para a expressão da imunoglobulina de acordo com a presente invenção. Os vectores de expressão assim como os vectores 40 ΡΕ2028193 de transfecção ou cassetes podem ser seleccionados de acordo com o hospedeiro utilizado.

Obviamente, também podem ser utilizados sistemas de expressão de proteína acelulares ou livres de células. As plataformas de expressão de proteína por transcri-ção/tradução in vitro, que produzem quantidades suficientes de proteína oferecem muitas das vantagens de uma expressão de proteína sem células, eliminando a necessidade de passos trabalhosos a montante e a jusante (e.g. transformação, cultura ou lise da célula hospedeira) tipicamente associados a sistemas de expressão à base de células.

Um método para o fabrico de uma imunoqlobulina ou uma sua preparação farmacêutica compreende pelo menos uma modificação numa região da ansa estrutural da referida imunoglobulina e determinar a ligação da referida imunoglo-bulina a um epitopo de um antigénio, em que a imunoglobulina não modificada não se liga significativamente ao referido epitopo, compreendendo os passos de: proporcionar um ácido nucleico que codifica uma imunoglobulina que compreende pelo menos uma região de ansa, modificar pelo menos um resíduo de nucleótido de pelo menos uma das referidas regiões de ansa, transferir o referido ácido nucleico modificado num sistema de expressão, expressar a referida imunoglobulina modificada, 41 ΡΕ2028193 colocar em contacto a imunoglobulina modificada expressa com um epitopo, determinar se a referida imunoglobulina modificada se liga ao referido epitopo, e proporcionar a ligação da imunoglobulina modificada ao referido epitopo e opcionalmente recuperá-la para uma preparação farmacêutica.

Em particular, um método para fabricar uma imunoglobulina multi-especifica que se liga especificamente a pelo menos uma primeira molécula ou uma sua preparação farmacêutica que compreende pelo menos uma modificação em pelo menos uma região da ansa estrutural da referida imunoglobulina e determinar a ligação especifica da referida, pelo menos uma, região da ansa a pelo menos uma segunda molécula seleccionada a partir do grupo que consiste em alergénios, antigénios associados a tumor, auto antigénios, enzimas, antigénios bacterianos, antigénios fúngicos, antigénios protozoários e antigénios virais, em que a imunoglobulina que contém uma região não modificada da ansa estrutural não se liga especificamente à referida, pelo menos uma, segunda molécula, que compreende os passos de: proporcionar um ácido nucleico que codifica uma imunoglobulina que se liga especificamente a pelo menos uma primeira molécula que compreende pelo menos uma região da ansa estrutural, modificar pelo menos um resíduo de nucleótido de pelo 42 ΡΕ2028193 menos uma das referidas regiões da ansa codificadas pelo referido ácido nucleico, transferir o referido ácido nucleico modificado num sistema de expressão, expressar a referida imunoglobulina modificada, contactar a imunoglobulina modificada expressa com a referida, pelo menos uma, segunda molécula, e determinar se a referida imunoglobulina modificada se liga especificamente à segunda molécula e proporcionar a imunoglobulina modificada que se liga especificamente à referida, pelo menos uma, segunda molécula e opcionalmente recuperá-la para uma preparação farmacêutica. É preferida a construção de mais do que uma especificidade num membro de um par de ligação especifico (Kufer et al. (2004) Trends in Biotechnology vol. 22 páginas 238-244).

Foram realizadas numerosas tentativas para produzir anticorpos monoclonais multi-especificos, e.g. biespecificos, ou fragmentos de anticorpo. Um problema na produção de anticorpos biespecificos constituídos por duas cadeias de polipéptido diferentes (cadeia pesada e cadeia leve) é a necessidade de expressar quatro cadeias diferentes (duas cadeias pesadas e duas cadeias leves) numa célula que resulta em várias combinações de moléculas que têm que ser separadas da molécula biespecifica desejada n mistura. Devido à sua semelhança, a separação destas ΡΕ2028193 moléculas é difícil e cara. Foram empregues várias técnicas para minimizar a ocorrência desses emparelhamentos indesejáveis (Cárter (2001) Journal of Immunological Methods, vol 248, páginas 7-15).

Uma solução para o problema é a produção de uma cadeia polipeptídica com duas especificidades, como e.g. dois scFvs ligados um ou outro ou a produção de denominados diacorpos. Essas moléculas demonstraram estar muito longe da dobragem de uma molécula natural e são notoriamente difíceis de produzir (Le-Gall et al. (2004) Protein Engineering, Design & Selection vol 17 páginas 357-366).

Outro problema da construção actual de anticorpos biespecíficos é o facto de mesmo que os anticorpos parentais sejam ligados de forma bivalente ao seu respectivo parceiro de ligação (e.g. IgG) , o anticorpo biespecífico resultante é monovalente para cada um dos respectivos parceiros de ligação.

As moléculas multi-específicas preferidas da presente invenção resolvem estes problemas: A expressão de uma molécula biespecífica, como uma cadeia de polipéptido é possível (um domínio de Ig modificada com duas especificidades de ligação, ver secção de exemplos), que é mais fácil de realizar do que a expressão de duas cadeias polipeptídicas do anticorpo (Cabilly et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:3273-3277 (1984)). 44 ΡΕ2028193

Também pode ser produzida como uma molécula do tipo anticorpo (i.e. constituída por 2 cadeias polipepti-dicas) , devido ao facto de a segunda especificidade estar localizada na parte não variável da molécula não há necessidade de duas cadeias pesadas diferentes ou cadeias leves diferentes. Assim, não há possibilidade de empare-lhamento errado das duas cadeias.

Um anticorpo da presente invenção pode consistir numa cadeia pesada e uma cadeia leve, que formam em conjunto uma região variável que liga a um parceiro de ligação especifico a segunda especificidade pode ser formado por uma ansa modificada de qualquer uma das ansas estruturais da cadeia pesada ou da cadeia leve. 0 sitio de ligação pode também ser formado por mais do que uma ansa não-CDR que pode ter uma vizinhança estrutural (seja na cadeia pesada ou na cadeia leve ou em ambas as cadeias). 0 anticorpo modificado ou seu derivado pode ser um anticorpo completo ou um fragmento de anticorpo (e.g. Fab) .

Pode ligar-se de forma mono- ou multi-valente aos parceiros de ligação ou mesmo com uma valência diferente para os parceiros de ligação diferentes, dependendo da construção.

Como existem várias ansas disponíveis para a 45 ΡΕ2028193 selecção e construção de um sítio de ligação específico nas regiões não-CDR das cadeias leves e pesadas é possível construir derivados de anticorpo com ainda mais do que duas especificidades sem os problemas mencionados acima.

Os domínios de ligação específicos numa cadeia polipeptídica podem ser ligados com ou sem um péptido ligante.

Algumas classes de anticorpo podem ser encaradas como multi-específicas, em particular biespecíficas, por natureza: Elas ligam-se a um antigénio (que está tipicamente e.g. ou numa estrutura estranha ou numa estrutura associada ao cancro) com a região variável e liga-se às moléculas efectoras de Fc com a parte Fc (e.g. receptores Fc em várias células imunitárias ou proteína complementar) permitindo assim efeitos tais como ADCC, ADCP ou CDC.

As moléculas do efector Fc estão ligadas pela parte Fc de uma molécula de imunoglobulina (para IgGl consiste nos domínios CH2 e CH3) e foram descritos vários métodos para optimizar a função efectora através do melhoramento da ligação da parte Fc de uma molécula de anticorpo quer através de técnicas de glicoengenharia (US 6,602,684) ou através de engenharia de proteínas quer directamente no Fc (US 2005/0054832) ou indirectamente através de engenharia fora do Fc (US 2005/02444403). Ambas, a ligação da região Fc ao receptor Fc e/ou ligação às proteínas de complemento tais como Cql foram alteradas 46 ΡΕ2028193 através dessas técnicas. Normalmente, a afinidade de ligação e i essas moléculas efectoras de Fc é tentada ser melhorada na medida em que isso está correlacionado com funções efectoras melhoradas.

Com a presente invenção é possível conceber a ligação do anticorpo às moléculas efectoras de Fc fora da região de ligação a Fc natural. As ansas modificadas nos domínios do anticorpo diferentes das ansas envolvidas na ligação de molécula efectora Fc "natural" podem ser seleccionadas a partir de uma biblioteca ou concebidas para se ligarem a uma ou mais moléculas efectoras Fc. Um anticorpo com esses sítios de ligação à molécula efectora de Fc adicionais teria uma avidez mais forte para certas moléculas efectoras de Fc ou a célula efectora apresentando uma molécula efectora de Fc e por isso podem ter um efeito ainda mais forte do que os anticorpos sujeitos a glicoengenharia ou regiões Fc melhoradas de outra forma. Contudo, para certas formas de realização da presente invenção, as características efectoras de um dado anticorpo a serem modificadas não devem ser alteradas directamente mas permanecem não afectadas através da modificação na ansa estrutural de acordo com a presente invenção.

Os fragmentos do anticorpo possuem certas vantagens em comparação com os anticorpos totais. Os fragmentos possuem normalmente boas propriedades de biodistribuição e podem ser produzidos mais facilmente. Contudo, a maior parte das construções de fragmentos do anticorpo não têm 47 ΡΕ2028193 funções efectoras e possuem semi-vidas curtas in vivo (Holliger P, et al. Nat Biotechnol. (2005) 23:1126-36.).

Nem o domínio CHI nem os domínios Ck ou CÀ mediam as funções efectoras que é a razão pela qual os Fabs não apresentam ADCC, ADCP ou CDC. O WO 02/44215 descreve a ligação de moléculas que consiste no sítio de ligação ao antigénio de um anticorpo e um péptido que se liga a moléculas efectoras de Fc. Desse modo, pode ser construído um fragmento de anticorpo que apresenta funções efectoras. O péptido a ser incorporado na molécula de ligação numa posição que não destrói a ligação ao antigénio nem a capacidade do péptido para se ligar a uma molécula efectora de Fc.

De acordo com a presente invenção contudo, a ligação a moléculas efectoras de Fc pode ser realizada com domínios de imunoglobulina modificada que foram seleccio-nados para ligação a molécula efectora de Fc a partir de bibliotecas de sequências de ansa aleatórias numa estrutura fixada de um domínio de imunoglobulina. Por isso, é possível para seleccionar sequências de ansa específicas que não se ligariam a moléculas efectoras de Fc fora da estrutura do domínio de Ig. Os polipéptidos que resultam da presente invenção podem por isso consistir preferencialmente em mais de 100 aminoácidos.

De modo a seleccionar a função efectora potencial desses domínios de acordo com a presente invenção, as ΡΕ2028193 bibliotecas de domínios CHI, Ck ou CX mutantes podem ser seleccionados para ligação aos receptores de Fc e/ou factores de complemento, tais como Clq.

De modo a aumentar a semi-vida in vivo de uma molécula que consiste em ou que contém esse domínio (e.g. CHI, CH2, CH3, CH4, Ck ou CX) , a ligação a FcRn pode ser seleccionada com bibliotecas de domínios mutantes, e.g. domínios capa ou lambda C de acordo com a presente invenção .

Os receptores de FcRn para a selecção podem ser proporcionados quer na superfície das células que expressam naturalmente os respectivos receptores ou através da expressão e purificação da parte extracelular do respectivo receptor. Para o objective desta invenção um primeiro rastreio em FcRn pode seleccionar os domínios mutantes que podem ser ainda testados in vitro e mesmo posteriormente caracterizados em experiências de FACS através da ligação às células que expressam o receptor FcRn. Pode ser ainda caracterizado por classificação da afinidade da ligação a vários FcRn recombinantes, isoformas e alotipos e.g., com técnicas de ressonância de plasmão de superfície.

De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção, a imunoglobulina tem origem humana ou de murino.

Uma vez que a imunoglobulina modificada pode ser 49 ΡΕ2028193 empregue para vários objectivos, em particular em composições farmacêuticas, a imunoglobulina é preferencialmente de origem humana ou de murino. Obviamente, a imunoglobulina modificada pode também ser uma imunoglobulina humanizada ou quimérica.

De acordo com outra forma de realização preferida da presente invenção, a imunoglobulina humana é selec-cionada a partir do grupo que consiste em IgAl, IgA2, IgD, IgE, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 e IgM. A imunoglobulina de murino é seleccionada preferencialmente a partir do grupo que consiste em IgA, IgD, IgE, IgGl, IgG2A, IgG2B, IgG2C, IgG3 e IgM. A imunoglobulina modificada pode ser derivada de uma das classes de imunoglobulina identificada acima. A imunoglobulina compreende preferencialmente uma cadeia pesada e/ou leve da imunoglobulina ou uma parte desta. A imunoglobulina modificada pode compreender uma cadeia pesada e/ou leve, pelo menos um dominio variável. A imunoglobulina de acordo com a presente invenção compreende preferencialmente pelo menos um dominio variável da imunoglobulina ou uma parte deste incluindo um mini-dominio. 50 ΡΕ2028193

Um domínio constante é uma unidade de dobragem de imunoglobulina da parte constante de uma molécula de imunoglobulina, também referidos como um domínio da região constante (e.g. CHI, CH2, CH3, CH4, Ck, Cl).

Um domínio variável é uma unidade de dobragem de imunoglobulina da parte variável de uma imunoglobulina, também referida como um domínio da região variável (e.g. Vh, ou VI).

Uma imunoglobulina preferida de acordo com a invenção consiste num domínio variável de uma cadeia pesada ou leve, ou uma parte deste, incluindo um mini-domínio, com pelo menos um região da ansa, e é caracterizado por a referida, pelo menos uma, região da ansa compreende pelo menos uma modificação de aminoácido que forma pelo menos uma região da ansa modificada, em que a referida, pelo menos uma, região da ansa modificada se liga especifica-mente a pelo menos um epitopo de um antigénio.

De acordo com uma forma de realização preferida, o domínio constante é seleccionado a partir do grupo de CHI, CH2, CH3, CH4, Igk-C, Igl-C e combinações destes. A imunoglobulina modificada de acordo com a presente invenção pode compreender um ou mais domínios constantes (e.g. pelo menos dois, três, quatro, cinco, seis, dez domínios) . De estiver presente mais do que um 51 ΡΕ2028193 domínio na imunoglobulina modificada, estes domínios podem ser do mesmo tipo ou de tipos variáveis (e.g. CH1-CH1-CH2, CH3-CH3). Obviamente, também a ordem dos domínios únicos pode ser de qualquer tipo (e.g. CH1-CH3-CH2, CH4-CH1-CH3-CH2) .

Toda a numeração das sequências de aminoácidos das imunoglobulinas está de acordo com o esquema de numeração de IMGT (IMGT, the International ImMunoGeneTics Information systemQimgt.cines.fr; http://imgt.cines.fr; Lefranc et al., 1999, Nucleic Acids Res. 27: 209-212; Ruiz et al., 2000 Nucleic Acids Res. 28: 219-221; Lefranc et al., 2001, Nucleic Acids Res. 29: 207-209; Lefranc et al., 2003, Nucleic Acids Res. 31: 307-310; Lefranc et al., 2005, Dev Comp Immunol 29: 185-203).

As regiões de ansa estruturais do domínio variável da imunoglobulina de origem humana compreendem preferencialmente os aminoácidos 8 até 20, aminoácidos 44 até 50, aminoácidos 67 até 76 e aminoácidos 89 até 101.

De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção as regiões de ansa estruturais do domínio variável da imunoglobulina de origem murina compreende os aminoácidos 6 até 20, aminoácidos 44 até 52, aminoácidos 67 até 76 e os aminoácidos 92 até 101.

As regiões de aminoácidos acima identificados das imunoglobulinas respectivas compreendem as regiões da ansa a serem modificadas. 52 ΡΕ2028193 A imunoglobulina de acordo com a invenção é preferencialmente de origem de camelo.

Os anticorpos de camelo compreendem apenas uma cadeia pesada e possuem a mesma afinidade para o antigénio do que os anticorpos normais que consistem em cadeias leves e pesadas. Consequentemente, os anticorpos de camelo são muito mais pequenos do que, e.g., os anticorpos humanos, que permitem que penetrem nos tecidos densos para alcançar o antigénio, quando as proteínas não conseguem. Para além disso, a simplicidade comparativa, a elevada afinidade e a especificidade e o potencial para alcançar e interagir com sítios activos, os anticorpos de cadeia pesada de camelo apresentam vantagens em relação aos anticorpos comuns no design, produção e aplicação de compostos de relevância clínica. A imunoglobulina de origem de camelo compreende preferencialmente pelo menos um domínio constante selecci-onado a partir do grupo que consiste em CHI, CH2 e CH3.

De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção a ligação específica da imunoglobulina modificada à molécula é determinada através de um ensaio de ligação seleccionado a partir do grupo que consiste em ensaios imunológicos, preferencialmente ensaios de imuno-absorção ligado a enzima (ELISA), ensaios de ressonância de plasmão de superfície, espectroscopia de ressonância 53 ΡΕ2028193 magnética nuclear de diferença de transferência de saturação, espectroscopia de ressonância magnética nuclear de transferência de NOE (trNOE), ensaios competitivos, ensaios de ligação ao tecido, ensaios de ligação em célula viva e ensaios de extracto celular.

Podem ser realizados ensaios de ligação utilizando uma variedade de métodos conhecidos na técnica, incluindo mas não limitados a FRET (Transferência de Energia de Ressonância de Fluorescência) e ensaios à base de BRET (Transferência de Energia de ressonância de Bioluminescência), AlphaScreen.TM. (Ensaio Homogéneo de Proximidade Luminescente Amplificado), Ensaio de Proximidade de Cintilação, ELISA (Ensaio de Imunoabsorção Ligada a Enzima), SPR (Ressonância de Plasmão de Superfície, também conhecido como BIACORE.RTM.), calorimetria isotérmica de titulação, calorimetria de varrimento diferencial, electroforese em gel, e cromatografia incluindo filtração em gel. Estes e outros métodos podem ser vantajosos em relação a alguns parceiros ou marcadores de fusão. A imunoglobulina modificada é preferencialmente conjugada com um marcador seleccionado a partir do grupo que consiste em moléculas orgânicas, marcadores enzimá-ticos, marcadores radioactivos, marcadores coloridos, marcadores de fluorescência, marcadores cromogénicos, marcadores luminescentes, haptenos, digoxigenina, biotina, complexos metálicos, metais, ouro coloidal e suas misturas. 54 ΡΕ2028193 A imunoglobulina modificada pode ser conjugada com outras moléculas que permitem a simples detecção do referido conjugado em, por exemplo, ensaios de ligação (e.g. ELISA) e estudos de ligação. É preferido combinar molecularmente pelo menos um dominio de anticorpo modificado (= ligação ao parceiro especifico através das sequências não variáveis ou ansa estrutural) com pelo menos uma outra molécula de ligação que pode ser um anticorpo, fragmento de anticorpo, um receptor solúvel, um ligando ou outro dominio de anticorpo modificado. A molécula é seleccionada a partir do grupo que consiste em moléculas proteicas, ácidos nucleicos, e hidratos de carbono.

As regiões da ansa das imunoglobulinas modificadas podem ligar-se especificamente a qualquer tipo de moléculas de ligação, em particular a moléculas proteicas, proteínas, péptidos, polipéptidos, ácidos nucleicos, glicanos, hidratos de carbono, lípidos, moléculas orgânicas pequenas, moléculas anorgânicas. Obviamente, as imunoglobulinas modificadas podem compreender pelo menos duas regiões da ansa em que cada uma das regiões da ansa pode ligar-se especificamente a outras moléculas ou epitopos.

De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção a molécula de ligação à região da ansa 55 ΡΕ2028193 estrutural modificada é seleccionada a partir do grupo que consiste em antigénios associados a tumor, em particular EpCAM, glicoproteína-72 associada ao tumor (TAG-72), antigénio CA 125 associado ao tumor, antigénio de membrana especifico da próstata (PSMA), antigénio associado a melanoma de elevado peso molecular (HMW-MAA), hidrato de carbono relacionado com Lewis Y que expressa o antigénio relacionado com o tumor, Antigénio carcinoembrionário (CEA), CEACAM5, HMFG PEM, mucina MUC1, MUC18 e antigénio associado a tumor de citoqueratina, antigénios bacterianos, antigénios virais, alergénios, fluoresceina, lisozima, receptor 9 de tipo portagem, eritropoietina, CD2, CD3, CD3E, CD4, CD11, CDlla, CD14, CD18, CD19, CD20, CD22, CD23, CD25, CD28, CD29, CD30, CD33 (proteína p67), CD38, CD40, CD40L, CD52, CD54, CD56, CD80, CD147, GD3, IL-1, IL-1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-5, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-12, IL-15, IL-18,'IL-23, interferão alfa, interferão beta, interferão gama; TNF-alfa, TNFbeta2, TNF.alfa., TNFalfabeta, TNF-R1, TNF-RII, FasL, CD27L, CD30L, 4-1BBL, TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL, BAFF, LIGHT, VEG1, OX40L, TRAIL Receptor-1, AI Receptor da Adenosina, Receptor da Linfotoxina Beta, TACI, BAFF-R, EPO; LFA-3, ICAM-1, ICAM-3, integrina betai, integrina beta2, integrina alfa4/beta7, integrina alfa2, integrina alfa3, integrina alfa4, integrina alfa5, integrina alfaô, integrina alfav, alfaVbeta3 integrina, FGFR-3, Factor de Crescimento de Queratinócito, VLA-1, VLA-4, L-selectina, anti-Id, E-selectina, HLA, HLA-DR, CTLA-4, receptor de células T, B7-1, B7-2, VNRintegrina, TGFbetal, TGFbeta2, eotaxinal, BLyS (Estimulador do B-linfócito), 56 ΡΕ2028193 complemento C5, IgE, factor VII, CD64, CBL, NCA 90, EGFR (ErbB-1), Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB4), Factor de Tecido, VEGF, VEGFR, receptor de endotelina, VLA-4, hidratos de carbono tais como antigénios do grupo sanguineo e hidratos de carbono relacionados, Galili-Glicosilação, Gastrina, Receptores de Gastrina, hidratos de carbono associados ao tumor, Hapteno NP-cap ou NlP-cap, receptor alfa/beta de células T, E-selectina, digoxina; fosfatase alcalina da placenta (PLAP) e fosfatase alcalina de tipo PLAP testicular; receptor da transferrina, Heparanase I, miosina cardiaca humana, Glicoproteina Ilb/IIIa (GPIIb/IIIa), citomegalovirus humano (HCMV) glicoproteina do envelope de gH, HIV gpl20, HCMV, virus do sincicio respiratório RSV F, RSVF Fgp, VNRintegrina, Hep B gp12 0, CMV, gpllbllla, HIV IIIB gpl20 V3 ansa, virus do sincicio respiratório (RSV) Fgp, virus do Herpes simplex (HSV) glicoproteina gD, glicoproteina HSV gB, glicoproteina do envelope HCMV gB, toxina de Clostridium perfringens e seus fragmentos. A imunoglobulina modificada de acordo com a presente invenção pode ligar-se preferencialmente a uma das moléculas reveladas acima. Estas moléculas compreendem também alergénios. A modificação da imunoglobulina de acordo com a presente invenção é preferencialmente uma deleção, substituição ou uma inserção. 57 ΡΕ2028193

De acordo com a presente invenção pelo menos 1, preferencialmente pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 e 15, aminoácidos são eliminados, substituídos com outros aminoácidos (também com aminoácidos modificados) ou inseridos na região da ansa da imunoglobulina. Contudo, o número máximo dos aminoácidos inseridos numa região da ansa de uma imunoglobulina pode não exceder o número de 30, preferencialmente 25, mais preferencialmente 20, aminoácidos. A substituição e a inserção dos aminoácidos ocorre preferencialmente aleatoriamente através de métodos conhecidos na técnica e como revelado no presente pedido de patente. A região CH3 compreende a SEQ ID N°. 16 ou SEQ ID N°. 18, quando a EpCam se liga à referida imunoglobulina, a SEQ ID N°. 20, quando a fluoresceína se liga à referida imunoglobulina, as SEQ ID N°. 22, 24, 26, 28, 30 ou 32, quando a lisozima se liga à referida imunoglobulina, as SEQ ID N°. 34, 36, 38 ou 40, quando TLR9 se liga à referida imunoglobulina, e a SEQ ID N°. 42, quando a lisozima e/ou a eritropoietina se liga à referida imunoglobulina.

Uma imunoglobulina é caracterizada por compreender a SEQ ID N°. 44 ou a SEQ ID N°. 46, quando a lisozima e gp41 se ligam à referida imunoglobulina. A imunoglobulina modificada é preferencialmente conjugada com uma molécula marcadora ou repórter seleccio-nada a partir do grupo que consiste em moléculas orgânicas, marcadores enzimáticos, marcadores radioactivos, marcadores 58 ΡΕ2028193 corados, marcadores fluorescentes, marcadores cromogénicos, marcadores luminescentes, haptenos, digoxigenina, biotina, complexos metálicos, metais, ouro coloidal e misturas destes.

Podem ser utilizadas imunoglobulinas modificadas conjugadas com marcadores como especificado acima, por exemplo, em métodos de diagnóstico.

Outro aspecto da presente invenção refere-se à utilização de uma imunoglobulina de acordo com a presente invenção para a preparação de uma vacina para imunização activa. Por este meio, a imunoglobulina é utilizada como uma substância de fármaco antigénico para formular uma vacina ou utilizada para recuperar ou capturar estruturas antigénicas para utilização numa formulação de vacina.

Outro aspecto da presente invenção refere-se à utilização de uma imunoglobulina de acordo com a presente invenção para a preparação de uma biblioteca de proteínas de imunoglobulinas.

Ainda outro aspecto refere-se a um método para ligar e/ou detectar especificamente uma molécula que compreende os passos de: (a) contactar uma imunoglobulina modificada de acordo com a presente invenção com uma amostra de teste suspeita de conter a referida molécula, e 59 ΡΕ2028193 (b) detectar a potencial formação de um complexo de imunoglobulina/molécula específica.

Outro aspecto refere-se a um método para isolar especificamente uma molécula que compreende os passos de: (a) colocar em contacto uma imunoglobulina modificada de acordo com a presente invenção com uma amostra que contém a referida molécula, (b) separar o complexo de imunoglobulina/molécula específica formada, e (c) isolar opcionalmente a molécula a partir do referido complexo. As imunoglobulinas de acordo com a presente invenção podem ser utilizadas para isolar especificamente moléculas a partir de uma amostra. Se forem utilizadas imunoglobulinas pode ser isolada mais do que uma molécula a partir de uma amostra. É especialmente vantajoso utilizar imunoglobulinas modificadas nesses métodos porque permite, e.g., criar uma matriz que possui uma superfície homogénea com quantidades definidas de parceiros de ligação (i.e. Imunoglobulinas modificadas) aí imobilizados que permite a ligação às moléculas que vão ser isoladas. Em contraste, se forem utilizados parceiros de ligação mono-específicos não pode ser criada uma matriz homogénea porque os parceiros de ligação simples não se ligam com a mesma eficiência à matriz. 60 ΡΕ2028193

Outro aspecto refere-se a um método para direc-cionar um composto para um alvo que compreende os passos de: (a) colocar em contacto uma imunoglobulina modificada de acordo com a presente invenção capaz de se ligar especificamente ao referido composto, (b) distribuir o complexo imunoglobulina/composto ao alvo.

As imunoglobulinas modificadas de acordo com a presente invenção podem ser utilizadas para distribuir pelo menos um composto ligado às CDRs e/ou regiões da ansa modificadas a um alvo. Essas imunoglobulinas podem ser utilizadas para direccionar substâncias terapêuticas a um sitio de acção preferido no curso do tratamento de uma doença.

Outro aspecto refere-se a uma biblioteca de proteina que compreende uma imunoglobulina de acordo com a presente invenção. Métodos preferidos para construir a biblioteca podem ser encontrados acima e nos exemplos. Pode ser utilizada uma biblioteca para identificar imunoglobulinas que se ligam a uma molécula distinta.

Em particular a presente invenção refere-se à 61 ΡΕ2028193 utilização de uma biblioteca de proteínas que compreende uma imunoglobulina de acordo com a presente invenção para o design de derivados da imunoglobulina. Uma imunoglobulina existente pode ser alterada de modo a introduzir sítios de ligação ao antigénio em qualquer domínio ou mini-domínio utilizando uma biblioteca de proteínas do domínio respectivo de pelo menos 10, preferencialmente 100, mais preferencialmente 1000, mais preferencialmente 10000, mais preferencialmente 100000, mais preferencialmente mais do que 1000000 domínios variantes com pelo menos uma ansa modificada. A biblioteca é então rastreada para ligação ao antigénio específico. Após a caracterização molecular para as propriedades desejadas o domínio ou mini-domínio seleccionado é clonado na imunoglobulina original através de técnicas de engenharia genética de modo a substituir a região de tipo selvagem. Alternativamente, apenas o DNA que codifica para as ansas ou codifica para os aminoácidos mutados pode ser trocado para obter uma imunoglobulina com o sítio de ligação adicional para o antigénio específico. A escolha do sítio para a ansa estrutural mutada, específica para o antigénio está dependente da estrutura da imunoglobulina original e do objectivo do sítio de ligação adicional. Se, por exemplo, a molécula original é uma imunoglobulina completa que necessita de ser inserida num sítio de ligação ao antigénio adicional sem perturbar a função efectora, as ansas a serem modificadas seriam seleccionadas a partir dos domínios distantes de CH2 e CH3 que são os parceiros de ligação natural às moléculas 62 ΡΕ2028193 efectoras de Fc. Se a imunoglobulina original for uma Fab, é possível a modificação das ansas nos domínios constantes das cadeias leves ou das cadeias pesadas ou dos respectivos domínios variáveis. Para criar uma biblioteca podem preparar-se bibliotecas de moléculas mutantes originais que possuem mutações em uma ou mais ansas estruturais de um ou mais domínios. A selecção com moléculas completas mutadas originais pode possuir algumas vantagens na medida em que a selecção para a ligação ao antigénio com uma ansa estrutural modificada irá distribuir as modificações este-ricamente vantajosas se testadas também para as outras propriedades que a imunoglobulina mutada deve apresentar. 0 tamanho necessário (i.e. o número de proteínas variantes) de uma biblioteca de proteína de um domínio ou um mini-domínio mutado ou uma molécula de fusão de um domínio é dependente da tarefa. Em geral, uma biblioteca para criar um sítio de ligação ao antigénio de novo precisa de ser maior do que uma biblioteca utilizada para modificar posteriormente um sítio de ligação ao antigénio modificado já existente, constituído por uma ansa estrutural modificada (e.g. para aumentar a afinidade ou alterar a especificidade fina para o antigénio). A presente invenção também se refere a uma biblioteca de imunoglobulinas ou uma biblioteca de ácidos nucleicos que compreende uma pluralidade de imunoglobulinas, e.g. um domínio variável, um mini-domínio e/ou pelo menos uma região da ansa estrutural contida num mini- 63 ΡΕ2028193 domínio, ou moléculas de ácido nucleico que o codificam. A biblioteca contém membros com diferentes modificações, em que a pluralidade é definida pelas modificações em pelo menos uma região da ansa estrutural. A biblioteca de ácidos nucleicos inclui preferencialmente pelo menos 10 membros diferentes (resultando numa permuta de aminoácido) e mais preferencialmente inclui pelo menos 100, mais preferencialmente 1000 ou 10000 membros diferentes (e.g. concebidos através de estratégias de randomização ou técnicas combinatórias). Números de membros individuais ainda mais diversificados, tais como pelo menos 1000000 ou pelo menos 10000000 são também preferidos.

Um outro aspecto da invenção é a combinação de dois domínios diferentes ou mini-domínios seleccionados a partir de, pelo menos duas bibliotecas de acordo com a invenção, de modo a criar imunoglobulinas multiespecíficas. Estas imunoglobulinas específicas seleccionadas podem ser combinadas uma com a outra e com outras moléculas, semelhante a blocos de construção, para conceber o arranjo óptimo dos domínios ou mini-domínios para obter as propriedades desejadas.

Para além disso, podem ser introduzidas uma ou mais imunoglobulinas modificadas de acordo com a invenção em vários ou em todos os sítios diferentes de uma proteína possível sem destruição da estrutura da proteína. Através dessa técnica de "baralhar o domínio" são criadas novas ΡΕ2028193 bibliotecas que podem ser novamente seleccionadas para as propriedades desejadas. A biblioteca preferida contém imunoglobulinas de acordo com a invenção, seleccionada a partir do grupo que consiste em dominios de uma imunoglobulina, mini-dominios ou derivados destes.

Uma forma de realização preferida da presente invenção é uma molécula de ligação a um antigénio (molécula de ligação ao antigénio) que compreende pelo menos um dominio da imunoglobulina e uma região da ansa estrutural a ser modificada de acordo com a presente invenção para se ligar ao antigénio, em que a referida molécula de ligação não compreende dominios variáveis de um antigénio. Pode compreender outras partes utilizáveis para actividades de antigénio (e.g. tais como regiões (sequências) efectoras naturais ou modificadas; todavia, não tem a região de ligação dos anticorpos "natural", i.e. os dominios variáveis na sua posição de ocorrência natural. Estas moléculas de ligação ao antigénio de acordo com a presente invenção possuem as vantagens descritas acima para as presentes moléculas, contudo sem a actividade de ligação especifica dos anticorpos; todavia com uma actividade de ligação específica introduzida de novo na região da ansa estrutural.

Preferencialmente, estas moléculas de ligação ao antigénio de acordo com a presente invenção compreendem ΡΕ2028193 CHI, CH2, CH3, CH4, Igk-C, Igl-C e combinações destes; as referidas combinações que compreendem pelo menos dois, preferencialmente pelo menos quatro, especialmente pelo menos seis domínios constantes e pelo menos uma região da ansa estrutural modificada de acordo com a presente invenção. Preferencialmente, estas regiões de ansa estruturais são ligadas através da região da ansa estrutural modificada de acordo com a presente invenção ou das ansas estruturais que estão naturalmente presentes entre esses dois domínios constantes. Uma forma de realização destas moléculas de ligação ao antigénio consiste na região Fc de um anticorpo com pelo menos uma modificação numa ansa estrutural. Também para as moléculas de ligação ao antigénio de acordo com a presente invenção é preferido que os novos sítios de ligação ao antigénio nas ansas estruturais sejam introduzidos através de tecnologias de randomização, i.e. trocando um ou mis resíduos de aminoácidos da ansa através de técnicas de randomização ou introduzindo inserções criadas aleatoriamente nessas ansas estruturais. É alternativamente preferida a utilização de abordagens combinatórias.

De acordo com outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma imunoglobulina modificada possuindo um sítio de ligação ao antigénio estranho à imunoglobulina não modificada e incorporada em uma ou mais ansas estruturais. 0 termo "estranho" significa que o sítio de ligação ao antigénio não de forma naturalmente pela região específica da imunoglobulina, e um parceiro de ligação estranho, mas 66 ΡΕ2028193 não o parceiro de ligação natural de uma imunoglobulina, liga-se pelo sitio de ligação ao antigénio. Isto significa que um parceiro de ligação, tal como um receptor Fc ou um efector do sistema imunitário, não é considerado como estando ligado pelo sitio de ligação ao antigénio estranho à imunoglobulina não modificada.

Preferencialmente, o antigénio é seleccionado a partir do grupo que consiste em antigénio de patogénio, antigénio associado ao tumor, enzima, substrato, auto antigénio, molécula orgânica ou alergénio. os antigénios mais preferidos são seleccionados a partir do grupo que consiste em antigénios virais, antigénios bacterianos ou antigénios de patogénios de eucariotas ou fagos. Antigénios virais preferidos incluem antigénios de HAV-, HBV-, HCV-, HIV I-, HIV II-, Parvovirus-, Influenza-, HSV-, Virus da Hepatite, Flavivirus, Westnile Virus, Virus Ebola, Virus da varíola, Vírus do sarampo, Vírus Herpes, Adenovírus, Papilloma Vírus, Polioma Vírus, Parvovirus, Rhinovírus, Coxsackie vírus, Vírus da Pólio, Echovírus, Vírus da Encefalite Japonesa, Vírus da Dengue, Vírus da Encefalite da carraça, Vírus da Febre Amarela, Coronavírus, Vírus do sincício respiratório, vírus parainfluenza, Vírus La Crosse, Vírus Lassa, Vírus da Raiva, Rotavírus; antigénios bacterianos preferidos incluem antigénios de Pseudomonas-, Mycobacterium-, Staphylococcus-, Salmonella-, Meningo-coccal-, Borellia-, Listeria, Neisseria-, Clostridium-, Escherichia-, Legionella-, Bacillus-, Lactobacillus-, Streptococcus-, Enterococcus-, Corynebacterium-, Nocardia-, 67 ΡΕ2028193

Rhodococcus-, Moraxella-, Brucella, Campylobacter-, Cardio-bacterium-, Francisella-, Helicobacter-, Haemophilus-, Klebsiella-, Shigella-, Yersinia-, Vibrio-, Chlamydia-, Leptospira-, Rickettsia-, Mycobacterium-, Treponema-, Bartonella-. Antigénios eucarióticos preferidos de euca-riotas patogénicos incluem antigénios de Giardia, Toxo-plasma, Cyclospora, Cryptosporidium, Trichinella, Leveduras, Candida, Aspergillus, Cryptococcus, Blastomyces, Histoplasma, Coccidioides.

Imunoglobulinas preferidas de acordo com a presente invenção compreendem pelo menos dois sítios de ligação ao antigénio, o primeiro sítio de ligação a um primeiro epitopo, e o segundo sítio de ligação a um segundo epitopo.

De acordo com uma forma de realização preferida, a presente imunoglobulina compreende pelo menos duas regiões da ansa, a primeira região da ansa ligando a um primeiro epitopo, e a segunda região da ansa ligando a um segundo epitopo. A pelo menos primeira ou pelo menos segunda região da ansa ou ambas podem conter uma ansa estrutural. As imunoglobulinas de acordo com a presente invenção incluem os fragmentos destes conhecidos na técnica para ser funcional que contém os elementos essenciais de acordo com a presente invenção: a região da ansa estrutural modificada de acordo com a presente invenção.

Preferencialmente, a imunoglobulina de acordo com 68 ΡΕ2028193 a presente invenção é composta de pelo menos dois domínios de imunoglobulina, ou uma parte desta incluindo um mini-domínio, e cada domínio contém pelo menos um sítio de ligação ao antigénio. É também preferida uma imunoglobulina de acordo com a invenção, que compreende pelo menos um domínio da região constante e/ou pelo menos um dominio da região variável da imunoglobulina, ou uma parte deste incluindo um mini-domínio. Assim, um dominio variável, que é, por exemplo modificados na região C-terminal, ou o domínio variável ligado a uma região modificada CHI, por exemplo um mini-domínio de CHI modificado, é uma das formas de realização preferidas. A imunoglobulina preferida de acordo com a invenção compreende um domínio que possui pelo menos 50% de homologia com o domínio não modificado. O termo "homologia" indica que os polipéptidos possuem os mesmos resíduos ou resíduos conservados numa posição correspondente na sua estrutura primária, secundária ou terciária. O termo também se estende a duas ou mais sequências de nucleótidos que codificam os polipéptidos homólogos. "Domínio de imunoglobulina homólogo" significa um domínio de imunoglobulina de acordo com a invenção que possui pelo menos cerca de 50% de identidade de sequência 69 ΡΕ2028193 de aminoácidos em relação a uma sequência do domínio da imunoglobulina de sequência nativa de comprimento total ou qualquer outro fragmento de uma sequência de domínio de imunoglobulina de comprimento total, como aqui revelado. Preferencialmente, um domínio de imunoglobulina homólogo possuirá pelo menos cerca de 50% de identidade de sequência de aminoácidos, preferencialmente pelo menos cerca de 55% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 60% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 65% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 70% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 75% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 85% de identidade da sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 90% de identidade da sequência de aminoácidos, mais preferencialmente pelo menos cerca de 95% de identidade da sequência de aminoácidos em relação a uma sequência de domínio de imunoglobulina nativa, ou qualquer outro fragmento especificamente definido de uma sequência de domínio de imunoglobulina de comprimento total, como aqui revelado. "Percentagem (%) de identidade de sequência de aminoácidos" em relação às sequências do domínio da imunoglobulina aqui identificadas é definida como a percentagem de resíduos de aminoácidos numa sequência candidata que são 70 ΡΕ2028193 idênticos aos resíduos de aminoácidos na sequência do domínio de imunoglobulina específico, após o alinhamento da sequência e introdução de interrupções, se necessário, para alcançar a percentagem máxima de identidade de sequência, e não considerando quaisquer substituições conservadoras como parte da identidade da sequência. O alinhamento para objectivos de determinação da percentagem de identidade da sequência de aminoácidos pode ser realizado de vários modos que estão dentro da especialidade na técnica, por exemplo, utilizando programas informáticos disponíveis ao público, tais como o software BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Os especialistas na técnica podem determinar parâmetros apropriados para medir o alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para alcançar o alinhamento máximo ao longo do comprimento total das sequências a serem comparadas.

Os valores da % de identidade da sequência de aminoácidos podem ser obtidos como descrito abaixo utilizando o programa de computador WU-BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)). A maioria dos parâmetros de pesquisa de WU-BLAST-2 está estabelecida para serem valores por defeito. Os valores que não estão estabelecidos para valores por defeito, i.e., os parâmetros ajustáveis, são estabelecidos para os seguintes valores: overlap span=l, overlap fraction=0,125, word threshold (T)=ll, e scoring matrix=BLOSUM62. Quando se utiliza o WUBLAST-2, um valor de % de identidade de sequência de aminoácidos é determinado dividindo (a) o número de 71 ΡΕ2028193 resíduos de aminoácidos de emparelhamento idêntico entre a sequência de aminoácidos do domínio da imunoglobulina de interesse possuindo uma sequência derivada do domínio da imunoglobulina nativa e uma sequência de aminoácidos de interesse de comparação (i.e., a sequência contra a qual o domínio da imunoglobulina de interesse está a ser comparada que pode ser o domínio da imunoglobulina não modificada) como determinado por WU-BLAST-2 by (b) o número total de resíduos de aminoácidos das partes não randomizadas do domínio de interesse da imunoglobulina. Por exemplo, na afirmação "um polipéptido que compreende uma sequência de aminoácidos A que possui ou possuindo pelo menos 80% de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos B", a sequência de aminoácidos A é a sequência de aminoácidos de comparação de interesse e a sequência de aminoácidos B é a sequência de aminoácidos do domínio da imunoglobulina de interesse.

Numa forma de realização preferida, a imunoglobulina de acordo com a invenção é um anticorpo biespecífico ou um anticorpo de cadeia única biespecífico. É ainda preferido que a imunoglobulina que compreende um domínio biespecífico ou uma parte deste incluindo um mini-domínio . A imunoglobulina de acordo com a presente invenção pode ser utilizada para qualquer objectivo conhecido na técnica para as imunoglobulinas mas também permite aplicações que estão dependentes da combinação de 72 ΡΕ2028193 especificidades introduzidas pela presente invenção. Consequentemente, as imunoglobulinas de acordo com a presente invenção são preferencialmente utilizadas para utilização terapêutica e profiláctica (e.g. como uma imunoterapia activa ou passiva); para utilização preparativa e analítica e para utilização de diagnóstico.

Outro aspecto da presente invenção refere-se a um kit de parceiros de ligação que contém (a) uma imunoglobulina modificada possuindo um sitio de ligação ao antigénio estranho para a imunoglobulina incorporada numa ou mais ansas estruturais, e (b) uma molécula de ligação que contém um epitopo do referido antigénio.

Uma tal molécula de ligação deste kit de acordo com a presente invenção pode ser utilizada para identificar a especificidade de ligação da imunoglobulina modificada de acordo com a presente invenção. Utilizando uma molécula de ligação este kit de acordo com a presente invenção, a potência das imunoglobulinas modificadas de acordo com a presente invenção pode ser determinada.

Potência como aqui definido é a propriedade de ligação da molécula modificada ao seu antigénio. A ligação pode ser determinada quantitativamente e/ou qualitativamente em termos de especificidade e/ou afinidade 73 ΡΕ2028193 e/ou avidez como utilizado para efeitos de controlo de qualidade.

Para além disso, a molécula de ligação de um kit de acordo com a presente invenção pode ser utilizada para seleccionar a imunoglobulina modificada de acordo com a presente invenção a partir de uma biblioteca que consiste em pelo menos 10, preferencialmente pelo menos 100, mais preferencialmente pelo menos 1000, mais preferido pelo menos 10000, especialmente pelo menos 100000 imunoglobu-linas com modificações diferentes nas ansas estruturais.

De acordo com a presente invenção, uma das carac-terísticas chave da presente invenção é que a engenharia dos domínios imunoglobulina ocorre em regiões que não estão normalmente envolvidas na ligação ao antigénio, por outras palavras, em regiões diferentes das CDRs de um antigénio. Foi observado que a dobragem específica dos domínios da imunoglobulina permite a introdução de mutações aleatórias em regiões que são estruturalmente análogas às CDRs mas diferentes na posição na sequência. As regiões identificadas pela presente invenção são, como as CDRs, regiões da ansa que ligam as cadeias beta da dobragem da imunoglobulina .

Mais especificamente, é aqui descrito que, através da introdução de mutações aleatórias nas ansas que ligam as cadeias beta A-B e E-F de um domínio humano IgGl CH3, foram seleccionados domínios CH3 mutados que se ligam 74 ΡΕ2028193 especificamente ao péptido do receptor 9 tipo Toll (TLR-9) ou a uma lisozima de ovo de galinha, que são um péptido e uma proteina respectivamente que não são normalmente reconhecidos e ligados por dominios CH3 humanos de IgGl. As mutações introduzidas por nós incluem mutações nas quais os residuos de aminoácidos seleccionados na sequência de tipo selvagem foram substituídos por residuos escolhidos aleatoriamente, e eles também incluem inserções de residuos de aminoácidos extra nas ansas mencionadas acima.

Por analogia, os dominios de imunoglobulina de qualquer classe de imunoglobulinas e de imunoglobulinas de qualquer espécie são adequados a este tipo de engenharia. Para além disso, não apenas as ansas especificas dirigidas na presente invenção podem ser manipuladas, mas qualquer ansa que liga cadeias beta nos dominios da imunoglobulina pode ser manipulada do mesmo modo.

Podem ser utilizados dominios de imunoglobulina construídos a partir de qualquer organismo e de qualquer classe de imunoglobulina de acordo com a presente invenção quer como tal (como domínios únicos), ou como parte de uma molécula maior. Por exemplo, podem ser parte de uma imunoglobulina intacta, que consequentemente teriam a sua região de ligação ao antigénio "normal" formada pelas 6 CDRs e a nova região de ligação ao antigénio construída. Deste modo, pode ser gerada uma imunoglobulina multi-específica, e.g. biespecífica. Os domínios de imunoglobulina construídos também podem ser parte de qualquer pro- 75 ΡΕ2028193 teína de fusão. A utilização destes domínios de imuno-globulina sujeitos a engenharia situa-se no campo geral da utilização de imunoglobulinas.

Os domínios das seguintes imunoglobulinas são aqui entendidos como domínios de imunoglobulina: para IgG, IgD e IgA: VL, CL, VH, CHI, CH2, CH3 para IgM e IgE : VL, CL, VH, CHI, CH2, CH3, CH4 1. Domínios de imunoglobulina únicos randomizados num lado, i.e. em ansas que ligam cadeias beta B-C, D-E ou F-G (a "ponta", com a excepção dos dominios variáveis que estão cobertos por muitas patentes) ou cadeias beta A-B, C-D, (C-C' e C"-D no caso de domínios variáveis) ou E-F (o "fundo"). Ansas únicas ou qualquer combinação de ansas podem ser randomizadas. Os resíduos podem ser alterados, eliminados, ou podem ser inseridos residuos adicionais. 2. Domínios de imunoglobulina únicos em ambos os lados, a ponta e o fundo. 3. Qualquer proteína que contém um dos domínios randomizados únicos, tais como: a) "CH3 de cadeia simples" dímeros (scCH3) 76 ΡΕ2028193 scCH2, scCHl/CL, randomizados em um ou em ambos os lados b) Fv de cadeia simples randomizado no "fundo", i.e. no lado oposto às CDRs

c) Fragmentos Fab randomizados no "fundo", i.e. na extremidade do terminal C de CHI e do dominio CL d) Fragmentos Fc (i.e. proteínas que consistem em CH2-CH3) randomizadas em um ou em ambos os lados e) imunoglobulinas completas randomizadas no fundo de Fc f) outros domínios adequados

As principais vantagens dos domínios únicos: são muito semelhantes a todos os argumentos que são utilizados para promover as moléculas de VH de camelo ("nanocorpos", ver www.ablynx.com). Os domínios de imunoglobulina randomizados são proteínas muito pequenas (peso molecular de ca. 12-15 kDa, dependendo do número de resíduos de aminoácidos inseridos) e por isso possuirão as seguintes vantagens, em comparação com anticorpos convencionais ou fragmentos de antigénio tais como scFv e Fabs: reconhecer epitopos incomuns ou escondidos, ligando nas cavidades ou 77 ΡΕ2028193 sitios activos de alvos de proteína, facilidade de fabrico, e muitos outros. No caso de um domínio de imunoglobulina que é randomizado em ambos os lados, pode ser criada uma molécula bivalente ou biespecífica. As principais vantagens dos domínios únicos como parte das proteínas de fusão são propriedades de ligação adicional que podem ser construídas em qualquer outra proteína.

Está contemplado que qualquer sistema de expressão pode ser utilizado para produzir as proteínas. Uma analogia aos domínios únicos, como aqui descrito pode ser encontrada nos anticorpos a partir do camelo, que apenas possuem VH mas não VL. Nestas proteínas, apenas 3 CDRs (em vez de 6 como nos anticorpos "normais" são responsáveis para ligação ao antigénio).

As seguintes referências da patente são aqui incorporados por referência como se estivessem aqui na sua totalidade: US 6,294,654 Molécula de imunoglobulina modificada incorporando um antigénio numa região não-CDR da ansa US 5,844,094 Polipéptido de Ligação ao Alvo US 5,395,750 Métodos para produzir as proteínas que se ligam aos antigénios predeterminados US 2004/0071690 Reagentes polivalentes e polies-pecíficos de elevada avidez US 2004/0018508 Anticorpos substitutos e métodos 78 ΡΕ2028193 para a sua preparação e utilização US 2003/0157091 Proteínas multi-funcionais US 2003/0148372 Método para o rastreio de bibliotecas de apresentação em fagos com diferentes ligandos US 2002/0103345 Proteínas de ligação ao antigénio de tipo imunoglobulina biespecífico e método de produção US 2004/0097711 Proteínas da superfamília da imunoglobulina US 2004/0082508 Proteínas secretadas US 2004/0063924 Proteínas secretadas US 2004/0043424 Proteínas da superfamília da imunoglobulina US 5,892,019 Produção de uma imunoglobulina codificada por um único gene US 5,844,094 Polipéptido de ligação ao alvo A presente invenção é ainda ilustrada nas seguintes figuras e exemplos sem estar restringida a eles. A Figura la apresenta a estrutura de uma IgGl intacta. Os domínios são indicados com setas. A Figura lb ilustra a organização estrutural dos principais monómeros de isotipo de imunoglobulina humana. As ligações persulfureto são apresentadas como linhas, os grupos de hidrato de carbono ligados a N são apresentados como círculos. ΡΕ2028193 79 A Figura 2 apresenta a dobragem de imunoglobulina para um domínio constante (esquerda) e um domínio variável (direita) de uma imunoglobulina. As cadeias beta estão indicadas por setas. A Figura 3 apresenta um modelo molecular do domínio CH3 modificado, com a parte randomizada indicada por uma superfície acessível ao solvente. A superfície está num círculo. A Figura 4 mostra uma apresentação esquemática das PCRs utilizadas para a produção dos fragmentos utilizados para a montagem do domínio CH3 mutado. Os iniciadores da PCR são indicados por setas com a sua orientação respectiva 5'-3', e as linhas verticais indicam as posições aproximadas dos sítios de restrição introduzidos que foram utilizados para a montagem do gene mutado. Os seguintes sítios de restrição estão contidos nos iniciadores para ligações dos fragmentos de PCR: CH3LNC0: Ncol; CH3LSAC e CH3CSAC: Saci; CH3CHIN e CH3RHIN: HindIII; CH3RN0T: NotI. A Figura 5 apresenta alguns exemplos sobre como os domínios de imunoglobulina do presente pedido podem ser utilizados. As regiões randomizadas estão indicadas por um símbolo de estrela. As ΡΕ2028193 80 especificidades das regiões randomizadas numa molécula podem ser idênticas ou diferentes. A Figura 6 apresenta uma apresentação esquemática da construção do domínio CH3 biespecífico construído. Os nomes dos iniciadores são apresentados em caixas e as setas indicam a direcção na qual os iniciadores são alongados. As caixas com linhas em inclinadas indicam as posições relativas das regiões que são randomizadas nesta construção, as caixas com linhas verticais indicam as posições relativas das regiões que foram introduzidas para a criação do clone C24, e são apresentados os sítios de restrição utilizados para o processo de clonagem. A Figura 7 mostra uma apresentação esquemática da construção do domínio CH3 biespecífico construído. A sequência de nucleótidos e a sua tradução é apresentada para a construção básica do domínio CH3 biespecífico construído. As sequências vermelhas indicam regiões randomizadas de modo a criar a construção biespecífica, enquanto as caixas verdes indicam regiões nas quais a sequência foi randomizada de modo a criar o clone C24. A Figura 8 apresenta a listagem de sequências das sequências aqui reveladas. 81 ΡΕ2028193 DESCRIPÇÃO DE EXEMPLOS ESPECÍFICOS:

Exemplo 1: Construção da biblioteca de CH3 e apresentação em superfície de fagos A estrutura do cristal de um fragmento de Fc de IgGl, que é publicada na Base de Dados de Brookhaven como a entrada lOQO.pdb foi utilizada para auxiliar na construção do domínio CH3 mutado. A sequência que foi utilizada como a base para a construção da biblioteca de CH3 é apresentada na SEQ ID N°. 1. Nesta sequência, o primeiro aminoácido corresponde a Prolina 343 da cadeia A da base de dados de Brookhaven com a entrada loqo.pdb. 0 último resíduo contido em loqo.pdb é a Serina 102 da SEQ ID N°. 1. Após uma análise detalhada da estrutura de loqo.pdb e por inspecção visual dos resíduos que formam as ansas que ligam as cadeias beta, foi decidido randomizar os resíduos 17, 18 e 19, que são parte da ansa que liga a cadeia beta A-B assim como 71, 72, 73, 76, e 77, que fazem parte da ansa que liga a cadeia beta E-F da SEQ ID N°. 1. Um modelo molecular do domínio CH3 construído, com a parte randomizada indicada por uma superfície acessível ao solvente é apresentado na Figura 3. O gene construído foi produzido por uma série de reacções de PCR seguidas por ligação dos produtos de PCR resultantes. Para facilitar a ligação, alguns dos códões da sequência de ΡΕ2028193 nucleótidos que codifica para a SEQ ID N°. 1 foram modi ficados para produzir sitios de restrição sem alterar a sequência de aminoácidos (mutações silenciosas). Para inserção no vector de clonagem pHENl (Nucleic Acids Res. 1991 Ago 11; 19(15):4133-7. Multi-subunit proteins on the surface of filamentous phage: methodologies for displaying antibody (Fab) heavy and light chains. Hoogenboom HR, Griffiths AD, Johnson KS, Chiswell DJ, Hudson P, Winter G.) em grelha com o sinal de secreção pelB, os residuos de nucleótidos extra que codificam Met-Ala foram ligados na extremidade 5' da sequência para criar um sitio de restrição iVcol. Para os residuos randomizados, foi seleccionado o códão NNS (código IUPAC, em que S significa C ou G) que codifica todos os 20 aminoácidos que ocorrem naturalmente, mas evita 2 em cada 3 códões stop. A sequência modificada é apresentada como uma sequência de nucleótidos na SEQ ID N°. 2 e como uma sequência de aminoácidos na SEQ ID N°. 3. A Letra X em SEQ ID N°. 3 designa residuos de aminoácidos randomizados. As sequências dos iniciadores de PCR utilizados para a montagem do dominio CH3 mutado são apresentadas na SEQ ID N°. 4 até 9. A Figura 4 mostra uma apresentação esquemática dos fragmentos de PCR criados para montagem do gene mutado, e os iniciadores utilizados para esse fim. O cDNA da cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano 3D6 (Felgenhauer M, Kohl J, Ruker F. Nucleotide sequences of the cDNAs encoding the V-regions of H- e L-chains of a human monoclonal antibody specific to HIV- 1- 83 ΡΕ2028193 gp41. Nucleic Acids Res. 1990 Aug 25; 18 (16) :4927) foi utilizado como molde para a reacção de PCR. O 3 produtos de PCR foram digeridos com Saci e/ou HindIII, respectivamente e foram ligados em conjunto. O produto de ligação foi ainda digerido com Ncol e NotI e ligado no vector fagemídico de apresentação em superfície pHENl, gue tinha sido previa-mente digerido com IVcol e NotI. Foram controlados clones seleccionados por análise de restrição e por sequenciação de DNA e verificou-se que contêm a inserção como planeado, incluindo as sequências randomizadas inseridas de forma correcta. Para os seguintes passos da preparação de fago, foram seguidos protocolos convencionais. Em resumo, a mistura de ligação foi transformada em células de E. coli por electroporação. Subsequentemente, as partículas fágicas foram recuperadas a partir de células de E. coli TG1 com o fago auxiliar M13- K07. As partículas fágicas foram então precipitadas a partir do sobrenadante da cultura com PEG/NaCl em 2 passos, dissolvidas em água e utilizadas para selecção por biosselecçao ou, alternativamente, foram armazenadas a menos 80 °C.

Exemplo 2: Construção da biblioteca CH3+3

Esta biblioteca foi construída e clonada do mesmo modo que a biblioteca CH3. A sequência de aminoácidos da construção é apresentada na SEQ ID N°. 10, a sequência nucleotídica correspondente em SEQ ID N°. 11, e os iniciadores utilizados para construção foram SEQ ID N°. 4-7, SEQ ID N°. 9 e SEQ ID N°. 12. ΡΕ2028193

Exemplo 3: Construção da biblioteca CH3+5

Esta biblioteca foi construída e clonada do mesmo modo que a biblioteca CH3. A sequência de aminoácidos da construção é apresentada na SEQ ID N°. 13, a sequência nucleotídica correspondente na SEQ ID N°. 14, e os iniciadores utilizados para a construção foram SEQ ID N°. 4-7, SEQ ID N°. 9 e SEQ ID N° . 15.

Exemplo 4: Biosselecção da biblioteca de fagos CH3 - no péptido TLR-9

Foram realizadas 3 rondas de biosselecção de acordo com os protocolos convencionais. Resumidamente, foi aplicado o método seguinte. Foram revestidas placas de 96 poços Maxisorp (Nunc) com um péptido sintético que representa parte da sequência do Receptor 9 tipo Toll (TLR-9). Foram adicionados 200 pL da solução seguinte por poço: tampão carbonato de Na a 0,1 M, pH 9,6, com as seguintes concentrações do péptido dissolvido:

Ia ronda de biosselecção: 1 mg/mL do péptido TLR-9 2a ronda de biosselecção: 500 pg/mL de péptido TLR-9 3a ronda de biosselecção: 100 pg/mL de péptido TLR-9 A incubação foi durante 1 hora a 37 °C, seguido 85 ΡΕ2028193 por bloqueamento com 2% de leite em pó (M-PBS) com 200 pL por poço durante 1 hora à temperatura ambiente. A biblioteca de apresentação de fagos de superfície foi então deixada reagir com o péptido ligado através da adição de 100 pL de suspensão de fagos e 100 pL de leite em pó a 4% (M-PBS), seguido pela incubação durante 45 minutos com agitação e durante 90 minutos sem agitação à temperatura ambiente.

As partículas de fagos não ligadas foram removidas por lavagem como se segue. Após a Ia ronda de biosselecção: 10 x 300 pL de T-PBS, 5x 300 pL de PBS; após a 2a ronda de biosselecção: 15 x 300 pL de T-PBS, lOx 300 pL de PBS; após a 3a ronda de biosselecção: 20 x 300 pL de T-PBS, 20 x 300 pL de PBS. A eluição de partículas de fagos ligadas foi realizada adicionando 200 pL por poço de 0,1 M de glicina, pH 2,2, e incubação com agitação durante 30 minutos à temperatura ambiente. Subsequentemente, a suspensão de fagos foi neutralizada através da adição de 60 pL de Tris-Base a 2 M, seguido por infecção em células de E. coli TG1 misturando 10 mL de cultura em crescimento exponencial com 0,5 mL de fago eluído e incubação durante 30 minutos a 37 °C. Finalmente, as bactérias infectadas foram plaqueadas em meio TYE com glucose a 1% e 100 pL/mL de ampicilina, e incubada a 30 °C durante a noite. 86 ΡΕ2028193

Tabela 1: Resultados da biosselecção da biblioteca de fagos CH3 - no péptido TLR-9 (títulos fágicos)

Ronda de Concentração de TLR- Entrada Saída (fago biosselecção 9 na biosselecção (fagos/mL) /mL) Ia 1 mg/mL 6xl018 2xl010 2a 0,5 mg/mL 4x1018 2xl010 3a 0,1 mg/mL 4x1022 6xl010

Exemplo 5: Clonagem de clones seleccionados de mutantes CH3 seleccionados contra TLR-9 para a expressão solúvel 0 DNA fagemídico do fago seleccionado através de 3 rondas de biosselecção foi isolado com uma midi-prep. 0 DNA que codifica regiões CH3 mutadas foi amplificado em sistema descontínuo por PCR e clonado em Ncol-Notl no vector pNOTBAD/Myc-His, que é o vector de expressão de E. coli pBAD/Myc-His (Invitrogen) com um sítio de restrição Not I inserido para facilitar a clonagem. As construções ligadas foram transformadas nas células de E. coli LMG194 (Invitrogen) com electroporação, e cultivadas a 30 °C em meio TYE com glucose a 1% e ampicilina durante a noite. Os clones seleccionados foram inoculados num meio de 200 pL de meio 2xYT com ampicilina, cultivado durante a noite a 30 °C, e induzido através da adição de L-arabinose para uma concentração final de 0,1%. Após expressão a 16 °C durante a noite, as células foram recolhidas por centrifugação e tratadas com 100 pL de tampão borato de sódio, pH 8,0, a 87 ΡΕ2028193 4 °C durante a noite para a preparação de extractos periplásmicos. Foram utilizados 50 pL dos extractos periplásmicos em ELISA (ver abaixo).

Exemplo 6: ELISA de mutants CH3 seleccionados contra TLR-9. Os clones seleccionados foram ensaiados para a ligação especifica ao péptido TLR-9 por ELISA.

Revestimento: Placa de microtitulação (NUNC,

Maxisorp) , 100 pL por poço, 20 pg do péptido TLR-9/mL de

tampão carbonato de sódio a 0,1 M, pH 9,6, lha 37 °C

Lavagem: 3x 200 pL PBS

Bloqueamento: BSA-PBS a 1%, 1 h à Temperatura ambiente

Lavagem: 3x 200 *1 PBS

Ligação do extracto periplásmico: 50 pL de

extracto periplásmico 50 pL a 2% de BSA-PBS, à temperatura ambiente durante a noite Lavagem: 3x 200 pL PBS

Io anticorpo: anti-His4 (Qiagen), 1:1000 em 1% de BSA-PBS, 90 min à Temperatura Ambiente, 100 pL por célula

Lavagem: 3x 200 pL PBS

2o anticorpo: de cabra anti murganho*HRP (SIGMA), 1:1000 em 1% de BSA-PBS, 90 min à Temperatura Ambiente, 100 pL por célula Lavagem: 3x 200 pL de PBS

Detecção: 3 mg/mL de OPD em tampão citrato de 88 ΡΕ2028193

Na/tampão fosfato, pH 4,5, 0,4 pL de H202 a 30% Paragem: 100 mL de H2SC>4 a 3 M Leitura da Absorvência: 492/620 nm

Os clones que produziram um sinal elevado nesta primeira ELISA preliminar foram cultivados num volume de 20 mL nas mesmas condições como descrito acima. Os seus extractos periplásmicos foram isolados em 1/20 do volume da cultura, como descrito acima e testado com ELISA (como descrito acima) para confirmação.

Exemplo 7: Biosselecção da biblioteca de fagos CH3 e de CH3+5 em lisozima de ovo de galinha

Tabela 2: Resultados de ELISA de confirmação com antigénio sem antigénio clone 4 leituras A 492/62o 1 leitura A492/62o A67 0,0435 0,019 B54 0,0937 0,051 C67 0,0295 0,013 Fundo (apenas antigénio) (12 leituras paralelas): 0,0115

Foram realizadas 3 rondas de biosselecção. Foram revestidas placas de 96 poços Maxisorp (Nunc) com lisozima de ovo de galinha, adicionando 200 pL da seguinte solução por poço: PBS, com as seguintes concentrações de lisozima de ovo de galinha dissolvida: 89 ΡΕ2028193

Ia ronda de biosselecção: 2 mg/mL de HEL

2a ronda de biosselecção: 1 mg/mL de HEL

3a ronda de biosselecção: 1 mg/ml de HEL A incubação foi realizada durante 1 hora a 37 °C, seguido por bloqueamento com leite em pó a 2% (M-PBS) com 200 pL por célula durante 1 hora à temperatura ambiente. A biblioteca de fagos de apresentação em superfície foi então deixada reagir com a lisozima de ovo de galinha ligada através da adição de 100 pL de suspensão de fagos e 100 pL de leite em pó a 4% (M-PBS), seguido por incubação durante 45 minutos com agitação e durante 90 minutos sem agitação à temperatura ambiente.

As partículas de fago não ligadas foram removidas por lavagem como se segue:

Ia ronda de biosselecção: 10 x 300 pL de T-PBS, 5 x 300 pL de PBS

2a ronda de biosselecção: 15 x 300 pL de T-PBS, 10 x 300 pL de PBS

3a ronda de biosselecção: 20 x 300 pL de T-PBS, 20 x 300 pL de PBS A eluição de partículas fágicas ligadas foi realizada adicionando 200 pL por poço de glicina a 0,1 M, pH 2,2, e a incubação foi realizada com agitação durante 30 ΡΕ2028193 minutes à temperatura ambiente. Subsequentemente, a suspensão de fagos foi neutralizada através da adição de 60 pL de Tris-Base a 2 M, seguido por infecção em células de E. coli TG1 através da mistura de 10 mL de cultura em crescimento exponencial com 0,5 mL de fago eluido e incubação durante 30 minutos a 37 °C. Finalmente, as bactérias infectadas foram plaqueadas em meio TYE com glucose a 1% e ampicilina a 100 pg/mL de ampicilina, e incubadas a 30 °C durante a noite.

Tabela 3: Resultados da biosselecção da biblioteca de fagos CH3 em lisozima de ovo de galinha (Títulos dos fagos)

Ronda de Concentração de HEL Entrada Saída (fago biosselecção na biosselecção (fago/mL) /mL) Ia 2 mg/ml 4,7xl010 2a 1 mg/ml 1,29x1022 8,OxlO9 3a 1 mg/ml 5,71x1020 4,8xl010

Tabela 4: Resultados da biosselecção da biblioteca de fagos CH3 +5 em lisozima de ovo de galinha (HEL) (títulos de fagos)

Ronda de Concentração de HEL Entrada Saída (fago biosselecção na biosselecção (fago/mL) /mL) Ia 2 mg/ml 8,3x1016 2,9xl09 2a 1 mg/ml 2, lxlO19 2,6xl09 3a 1 mg/ml 5,4x1019 1,2xl010 91 ΡΕ2028193

Exemplo 8: Clonagem de clones seleccionados do exemplo 7 para expressão solúvel A clonagem dos clones seleccionados para expressão solúvel foi realizada como descrito acima para os mutantes CH3 seleccionados contra TLR-9.

Exemplo 9: Expressão solúvel de clones seleccionados do exemplo 7 A expressão solúvel dos clones seleccionados foi realizada como descrito acima para os mutantes CH3 seleccionados contra TLR-9. Os extractos periplásmicos foram testados num ELISA preliminar (protocolo ver exemplo 10)

Os clones que produziram um sinal elevado nesta primeiro ELISA preliminar foram cultivados num volume de 20 mL nas mesmas condições como descrito acima. Os seus extractos periplásmicos foram isolados em 1/20 do volume de cultura como descrito acima e testado com ELISA (como descrito no exemplo 10) para confirmação.

Exemplo 10: ELISA de mutantes CH3 seleccionados contra lisozima de ovo de galinha

Revestimento: Placa de microtitulação (NUNC, Maxi- sorp) , 100 pL por célula, 100 pg de

lisozima de ovo de galinha/mL em PBS, 1 h a 37 °C

Lavagem:

3 x 200 pL PBS ΡΕ2028193 92

Bloqueamento: BSA-PBS a 1%, 1 h à temperatura am biente

Lavagem: 3 x 200 pL de PBS

Ligação de extracto periplásmico: 50 pL do extracto peri- plásmico 50 pL de BSA-PBS a 2%, à temperatura ambiente durante a noite

Lavagem: 3 x 200 pL de PBS

Io anticorpo: anti-His4 (Qiagen), 1:1000 em BSA-PBS a 1%, 90 min à Temperatura Ambiente, 100 pL por poço

Lavagem: 3 x 200 pL de PBS

2o anticorpo: de cabra anti murganho*HRP (SIGMA), 1:1000 em 1% BSA-PBS, 90 min à TA (à Temperatura Ambiente), 100 pL por poço Lavagem: 3 x 200 pL PBS

Detecção: 3 mg/mL de OPD em citrato de Na/tampão

fosfato, pH 4,5, 0,4 pL 30% H2O2 Paragem: 100 mL de H2S04 a 3 M

Leitura de absorvência: 492/620 nm

Tabela 5: Resultados de ELISA de confirmação de mutantes CH3 seleccionados contra lisozima de ovo de galinha com antigénio sem antigénio clone 4 leituras A 492/620 1 leitura A 492/620 B12 0,396 0,012 Dl 0 0,415 0,026 D4 6 0,398 0,011 Fundo (só antigénio) (12 leituras paralelas): 0,1763 93 ΡΕ2028193

Tabela 6: Resultados de ELISA de confirmação com diluições de antigénio de mutantes CH3 seleccionados contra lisozima de ovo de galinha (pg/mL) C(pg/mL) clone 200 100 50 25 12,5 6,25 3,125 1,55 0,78 0,39 B12 0,707 0,532 0,432 0,297 0,192 0,150 0,198 0,049 0, 034 0, 015 D46 0,713 0,561 0,342 0,220 0,133 0,088 0,047 0,032 0,021 0,010 D10 0,715 0, 685 0,571 0,368 0,231 0,175 0,171 0,068 0,047 0,026 - (nc) 0,449 0,360 0,165 0,072 0,038 0,023 0,017 0,013 0,009 0,007 nc: sem extracto periplásmico adicionado

Deve ser notado que a lisozima de ovo de galinha reage com anticorpo anti-his4, por isso foi observado um fundo relativamente elevado.

Tabela 7: Resultados de confirmação de ELISA de mutantes CH3+5 seleccionados contra a lisozima de ovo de galinha com antigénio sem antigénio clone 4 leituras de A492/62o 1 leitura de A492/620 A13 0,197 0,016 A6 6 0,461 0,019 Bl 8 0,533 (5 leituras) Não efectuado B20 0,184 0,016 B68 0,535 0,019 B40 0,706 0,051 94 ΡΕ2028193 (continuação) com antigénio sem antigénio C24 0,352 0,072 D22 0, 147 0,019 C22 0,439 0,017 D37 0,360 0,026 D40 0,559 0,034 D56 0,369 0,019 Ruído de fundo (só antigénio) (12 leituras paralelas): 0,1334 Nota: lisozima de ovo de galinha reage com anticorpo anti-his4, deste modo foi observado um ruído de fundo relativamente elevado.

Inspecção visual da estrutura cristalina de um fragmento Fab (é utilizada a estrutura do Fab do anticorpo monoclonal humano 3D6; RSCB Protein Data (http://www. rcsb.org/pdb/) Entrada 1DFB.PDB (HeXM, et al. Pro Natl Acad Sei USA. 1992 Aug 1; 89 (15):7154-8) e análise com auxilio de computador(foi utilizado para este fim e.g. Protein Explorer e (http://molvis.sdsc.edu/protexpl/frntdoor.htm)) da estrutura secundária e terciária desta proteína) permite identificar os resíduos localizados em regiões da ansa que ligam as fitas beta da estrutura do domínio CL. Estes resíduos compreendem os aminoácidos 8 a 18, os aminoácidos 27 a 35, os aminoácidos 42 a 78, os aminoácidos 83 a 85, os aminoácidos 92 a 100, os aminoácidos 108 a 117 e os aminoácidos 123 a 126 (numeração de acordo com o sistema de numeração de IMGT (Lefranc MP, et al. Nucleic Acids Res. 2005 Jan 1;33 (item da Database):D593-7; Lefranc MP, et al. Dev Comp Immunol. 2005; 29 (3): 185-203)). 95 ΡΕ2028193

Mais especificamente, os resíduos 11, 12, 14-18, e 92-95 são randomizados no domínio CL humano (SEQ ID N° 48) . A randomização é conseguida por amplificação por PCR das sequências codificantes com iniciadores de PCR em que as posições dos códões relevantes são codificadas pela sequência de nucleótidos 5'-NNS-3', que potencialmente codifica todos os 20 aminoácidos embora evitando 2 de 3 códões stop. A inserção da biblioteca é amplificada pelas duas reacções de PCR separadas, e os dois fragmentos de PCR são ligados em conjunto através de um sitio de restrição HpyCH4IV que é introduzido como uma mutação silenciosa através dos iniciadores de PCR. Os iniciadores proporcionam ainda os sítios de endonuclease de restrição Ncol e NotI respectivamente, para clonagem no vector de apresentação em fagos pHEN (Hoogenboom HR, et al. Nucleic Acids Res. 1991 Aug 11;19 (15) :4133-7) . A cisterna do terminal C do domínio CL não é incluída para a apresentação em fagos, mas pode ser adicionado mais tarde quando um clone CL modificado é utilizado e.g. para a construção de um fragmento Fab.

Como um molde para a amplificação por PCR, é utilizado um plasmídeo tal como pRcCMV-3D6LC (Ruker F, et al. Ann N Y Acad Sei. 1991 Dec 27; 64 6:212-9) , que contêm como inserção a cadeia leve completa do anticorpo monoclonal humano.

Para as bibliotecas CL+3 (SEQ ID N° 50, 51) e CL+5 (SEQ ID N° 52, 53), que contêm resíduos adicionais 96 ΡΕ2028193 inseridos entre a posição 92 e 95 do dominio CL, os iniciadores CLRHPY3 e CLRHPY5 são utilizados respectiva-mente em vez do iniciador CLRHPY.

As sequências de nucleótidos e de aminoácidos do produto final dos PCRs e ligações, clonadas no sitio iVcol de pHENl, que leva à ligação de uma sequência lider pelB ao terminal N da construção são apresentadas a seguir (SEQ ID N° 48, 49):

+ 3 Μ K Y L L P T A A A G L L L L A A 1 ATGAÃATâCC TATTGCCTAC GGCÃGCCGCT G&AffGTTÃT TACfCSCGGC Hcol 3 Q P h Μ A V A h P S V F I F F F 51 CCAGCCGGCC ASRGGCCGTGG CTGCACCATÇ TGTCfTCAfC 7TCCCGCCAT + 3 s a A S V v c L L M ιοα CTNMSNBISC& GKNSNHSNNS NISSNNSGCCf CTGTTGTGTG CCTGCfGAAT +3 n F Y P R E A K V Q W K V D Μ A L 151 AACTTCTATC CÇAQAGAQQC CAAAGTACAG TGGAAGSfGG ATAACGCCCT + 3 0 s G K S Q S S V T E Q D S K D 201 CCAATCGGGT &AC TCCCAGSG AG&GTGTCAC AGÂGCAGGAC AGCAAGG&CA BlpyCH4 IV 43 s τ y s Γ, 5 S f L T L Y E 251 GChCCThCKG CCTCAGCAGC ACCCTGACST TGJJNSHSSNSS SI®iSTACGAG 4 3 K K K. V Y λ c E V '? H Q G L S S P 3 BI AAACACAAAG TCTACGCCTe CGAAGTCACC CATCAGGGCC TGAGCTCGCC ISotl + 3 V f K S F H R G E A A A 351 CSTCACAAAG AGCTTCAACA GGGGAGAGGC GOCOSCA 97 ΡΕ2028193

Lista de iniciadores para a biblioteca CL: cllnco: 5'-cttaccatgg ccgtggctgc accatctgtc ttca-tcttcc cgccatctnn snnscagnns nnsnnsnnsn nsgcctctgt tgtgtgc-3' (SEQ ID N° 56)

cllhpy: 5'-tgacaacgtc agggtgctgc tgaggc-3' (SEQ ID N° 57) clrhpy: 5'-tcagaacgtt gnnsnnsnns nnstacgaga aacacaaagt c-3' (SEQ ID N° 58) clrhpy3: 5'-tcagaacgtt gnnsnnsnns nnsnnsnnsn nstacgagaa acacaaagtc-3' (SEQ ID N° 59) clrhpy5: 5'-tcagaacgtt gnnsnnsnns nnsnnsnnsn nsnnsnnsta cgagaaacac aaagtc-3' (SEQ ID N° 60) clrnot: 5'-catcgcggcc gcctctcccc tgttgaagct c-3' (SEQ ID N° 61) Vários clones seleccionados da biblioteca (domínios CL mutados clonados no vector fagemídico pHENl) são controlados pela análise de restrição e pela sequenciação de DNA para conter a inserção como planeado, incluindo as sequências randomizadas correctamente inseridas. Para os passos seguintes da preparação de fagos, são seguidos protocolos convencionais. Resumidamente, a mistura de liga- 98 ΡΕ2028193 ção é transformada nas células E. coli TG1 por electro-poração. Subsequentemente, as partículas de fago são resgatadas a partir das células de E. coli TG1 com o fago auxiliar M13-K07. As partículas de fago são então precipitadas a partir do sobrenadante da cultura com PEG/NaCl em 2 passos, dissolvidas em água e utilizadas para selecção por biosseleção ou, alternativamente, estas podem ser armazenadas a menos 80 °C.

Exemplo 12: Biblioteca CHI A inspecção visual da estrutura cristal de um fragmento Fab (a estrutura do Fab do anticorpo monoclonal humano 3D6 é utilizado: RSCB Protein Data Bank Entry 1DFB.PDB) e análise apoiada por computador (Protein Explo-rer é utilizado para este propósito) da estrutura secundária e terciária desta proteína permite identificar os resíduos localizados em regiões da ansa que ligam as fitas beta da estrutura do domínio CHI. Estes resíduos compreendem os aminoácidos 7 a 21, os aminoácidos 25 a 39, os aminoácidos 41 a 81, os aminoácidos 83 a 85, os aminoácidos 89 a 103 e os aminoácidos 106 a 117 (numeração de acordo com o sistema de numeração do IMGT).

Mais especificamente, os resíduos 12-19 e 93-100 são randomizadas no domínio CHI humano (SEQ ID N°s 54, 55). A randomização é conseguida por amplificação por PCR das 99 ΡΕ2028193 sequências codificantes com iniciadores de PCR em que as posições dos códões relevantes são codificadas pela sequência de nucleótidos 5'-NNS-3', que potencialmente codifica todos os 20 aminoácidos enquanto evitam 2 de 3 códões stop. A inserção da biblioteca é amplificada por duas reacções de PCR separadas, e os dois fraqmentos de PCR são ligadas em conjunto através de um sitio de restrição BstEII que ocorre naturalmente no domínio CHI. Os iniciadores proporcionam ainda sítios de endonuclease de restrição Ncol e NotI respectivamente para clonagem no vector de apresentação em fagos do pHEN. A cisteína C-terminal do domínio CHI não é incluída para a apresentação em fagos, mas pode ser adicionada mais tarde quando é utilizado um clone de CHI modificado e.g. para a construção de um fragmento Fab.

Como um molde para a amplificação por PCR, é utilizado um plasmídeo tal como pRcCMV-3D6HC, que contém como uma inserção da cadeia pesada completa do anticorpo monoclonal humano.

As sequências de nucleótidos e de aminoácidos do produto final dos PCRs e ligações, clonadas no sítio Ncol de pHENl, que leva à ligação de uma sequência líder pelB ao terminal N da construção é apresentada a seguir (SEQ ID N° 54, 55) : 100 ΡΕ2028193 + 3 Η: Κ ϊ L L Ρ ΐ ΑΛΑ G L L L L Λ Α

1 ATGAAATAGC TATTGCCTAC GGCAGCCGCT GGATTGTTAT TACTCGCGGC

Ncol *3 Q Ρ Α Μ A A S T K G P S V F P I, 51 CCAGCCGGCC ATGGCCGCCT CCACCAAGGG CCCATCGGTC TTCCCCCTG6

4 3 A p $ S A L G C L

101 GACCCXCCTC CNNSNNSNNS NNSNNSNNSN MSNMSGCCCT GGGCTGCCTG

4 3 V X D Y F Ρ E Ρ V Ϊ. V S W N 5 G A

151 GTCAAGGACT ACTTCCCCGA ACCGGfGACG GfGTCGTGGA ACTCAGGCGC

+ 3 L T S G V B T F Ρ A V L Q S Ξ G

201 CCfGACCAGC GGCGTGCACA. CCTTCCCGGC TGXCCTACAG fCCTCAGGAC

BstBIÍ

Y S L

S V V T V

251 TCTACTCCCT CAGCAGCGTG GTGACOITGC CCNNSNNSÍI» SNNSNNSNNS

4 3 T Y I C n V fí H K P S N T K V D

301 NNSACCTACA TCT6CAACGT GAATCACAAG CCCAGC&ACA CCAAGGTGGA

Not I +3 Κ Κ V E Ρ K S A A A 351 CAAGAAAGTT- GAGCCCAAAT CTGCCGCCGC Ά

Lista de Iniciadores para a biblioteca de CHI CH1LNCO: 5'-acgtccatgg ccgcctccac caagggccca tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccnns nnsnnsnnsn nsnnsnnsnn sgccctgggc tgcctggtc-3' (SEQ ID N° 62)

CH1LBST: 5'-ggcacggtca ccacgctgct gag-3' (SEQ ID N° 63) ΡΕ2028193 CH1RBST: 5'-agcgtggtga ccgtgcccnn snnsnnsnns nnsnnsnnsa cctacatctg caacgtgaat c-3' (SEQ ID N° 64) CH1RN0T: 5'-catagcggcc gcagatttgg gctcaacttt cttgtc-3' (SEQ ID N° 65) Vários clones da biblioteca seleccionados (domínios CHI mutados clonados no vector fagemidico pHENl) são controlados por análise de restrição e por sequenciação de DNA para conter a inserção como planeado, incluindo as sequências randomizadas correctamente inseridas. Para os passos que se seguem de preparação de fagos, são seguidos protocolos funcionais. Resumidamente, a mistura de ligação é transformada em células E. coli TG1 por electroporação. Subsequentemente, as partículas de fago são resgatadas a partir das células E. coli TG1 com o fago auxiliar M13-K07. As partículas de fago são então precipitadas a partir do sobrenadante da cultura com PEG/NaCl em 2 passos, dissolvidas em água e utilizadas para selecção por biosselecção ou, alternativamente, estas podem ser armazenadas a menos 80 °C.

Exemplo 13: Selecção da biblioteca de fagos de CHI em lisozima de ovo de galinha (HEL) São efectuadas 3 rondas de selecção com a biblioteca de fagos de CHI (ver exemplo 12). Placas Maxisorp de 96 poços (Nunc) são revestidos com lisozima de 102 ΡΕ2028193 ovo de galinha, por adição de 200 yL da seguinte solução por poço: PBS, com as seguintes concentrações de lisozima de ovo de galinha dissolvidas:

Ia ronda de selecção: 2 mg/mL HEL 2a ronda de selecção: lmg/mL HEL 3a ronda de selecção: 1 mg/mL HEL A incubação é durante 1 hora a 37 °C, seguido por bloqueamento com 2% de leite em pó (M-PBS) com 200 yL por poço durante 1 hora à temperatura ambiente. A biblioteca de fagos com apresentação à superfície é então deixada reagir com a lisozima de ovo de galinha ligada por adição de 100 yL de suspensão de fago e 100 yL de 4% de leite em pó (M-PBS) , seguido por incubação durante 45 minutos com agitação e durante 90 minutos sem agitação à temperatura ambiente.

As partículas de fago não ligadas são removidas por lavagem como se segue:

Ia ronda de selecção: 10 x 300 yL de T-PBS, 5x 300 yL PBS

2a ronda de selecção: 15 x 300 yL de T-PBS, lOx 300 yL de PBS

3a ronda de selecção: 20 x 300 yL de T-PBS, 20 x 300 yL de PBS 103 ΡΕ2028193 A eluição de partículas de fago ligadas é efec-tuada por adição de 200 pL por poço de 0,1 M de glicina, pH 2,2, e incubação com agitação durante 30 minutos à temperatura ambiente. Subsequentemente, a suspensão de fago é neutralizada por adição de 60 pL de 2 M de Tris-Base, seguido por infecção em células E. coli TG1 por mistura de 10 mL de cultura em crescimento exponencial com 0,5 mL de fago eluído e incubação durante 30 minutos a 37 °C. Finalmente, as bactérias infectadas são plaqueadas no meio TYE com 1% de glucose e 100 pg/mL de ampicilina, e incubado a 30 °C durante a noite.

Clonagem de clones seleccionados de mutantes CHI seleccionados contra Lisozima para a expressão solúvel 0 DNA de fagemídeo dos fagos seleccionados através de 3 rondas de selecção é isolado com uma midi-prep. O DNA que codifica os domínios CHI mutados é amplificado em lote por PCR e clonado em Ncol-Notl no vector pNOTBAD/Myc-His, que é o vector de expressão de E. coli pBAD/Myc-His (Invitrogen) com um sítio de restrição Notl inserido para facilitar a clonagem. As construções ligadas são transformadas em células E. coli LMG194 (Invitrogen) por electroporação, e crescimento a 30 °C no meio TYE com 1% de glucose e ampicilina durante a noite. Os clones selecionados são inoculados em 200 pL de meio 2xYT com ampicilina, cultivados durante a noite a 30 °C, e induzidos por adição de L-arabinose para uma concentração 104 ΡΕ2028193 final de 0,1%. Após a expressão a 16 °C durante a noite, as células são recolhidas por centrifugação e tratadas com 100 pL de tampão de borato de Na, pH 8,0, a 4 °C durante a noite para a preparação de extractos periplásmicos. São utilizados em ELISA 50 pL dos extractos periplásmicos.

Os clones que produzem um sinal elevado nesta primeira ELISA, preliminar são cultivados num volume de 20 ml nas mesmas condições como descrito acima. Os seus extractos periplásmicos são isolados em 1/20 do volume de cultura como descrito acima e testado com ELISA (como descrito a seguir) para confirmação. ELISA de mutantes CHI seleccionados contra a lisozima de ovo de galinha

Revestimento: Placa de microtitulação (NUNC,

Maxisorp), 100 pL por poço, 100 pg de lisozima de ovo de galinha/mL em PBS, 1 h a 37 °C Lavagem: 3x 200 pL de PBS Bloqueamento: 1% de BSA-PBS, 1 h a TA Lavagem: 3x 200 pL de PBS

Ligação de extracto periplásmico: 50 pL de

extracto periplásmico, 50 pL de 2% de BSA-PBS, a temperatura ambiente durante a noite Ligação: 3x 200 pL de PBS

Io anticorpo: anti-His4 (Qiagen), 1:1000 em 1% de BSA-PBS, 90 min a TA, 100 pL por poço Lavagem: 3x 200 pL de PBS 105 ΡΕ2028193 2o anticorpo: anti murganho*HRP de cabra (SIGMA), 1 : 1000 em 1% de BSA-PBS, 90 min a TA, 100 yL por poço

Lavagem: 3x 200 yL de PBS

Detecção: 3 mg/mL de OPD no tampão de citrato/fosfato de Na, pH 4,5, 0,4 yL de 30% de H202

Interrupção: 100 ml de 3 M de H2SC>4

Leitura de absorvência: 492/620 nm

Os clones são interpretados como positivos quando o seu sinal de ELISA é pelo menos três vezes o do sinal de ruido de fundo.

Exemplo 14: Selecção da biblioteca de fagos de CL na lisozima de ovo de galinha (HEL) São efectuadas 3 rondas de selecção com a biblioteca de fagos de CL (ver exemplo 11) . As placas Maxisorp de 96 poços (Nunc) são revestidas com lisozima de ovo de galinha, por adição 200 yL da seguinte solução por poço: PBS, com as seguintes concentrações de lisozima de ovo de galinha dissolvida:

Ia ronda de selecção: 2 mg/mL HEL 2a ronda de selecção: lmg/mL HEL 3a ronda de selecção: 1 mg/mL HEL A incubação é durante 1 hora a 37 °C, seguido por 106 ΡΕ2028193 bloqueamento com 2% de leite em pó (M-PBS) com 200 yL por poço durante 1 hora à temperatura ambiente. A biblioteca de fagos com apresentação à superfície é então deixada reagir com a lisozima de ovo de galinha ligada através da adição de 100 yL de suspensão de fago e 100 yL de 4% de leite em pó (M-PBS) , seguido por incubação durante 45 minutos com agitação e durante 90 minutos sem agitação à temperatura ambiente.

As partículas de fago não ligado são removidas por lavagem como se segue:

Ia ronda de selecção: 10 x 300 yL de T-PBS, 5x 300 yL de PBS 2a ronda de selecção: 15 x 300 yL ( de T '-PBS, lOx 300 yL de PBS 3a ronda de selecção: 20 x 300 yL de T-PBS, 20 X 300 yL PBS A eluição de partículas de fago ligadas é efectuada por adição de 200 yL por poço de 0,1 M de glicina, pH 2,2, e incubação com agitação durante 30 minutos à temperatura ambiente. Subsequentemente, a suspensão de fago é neutralizado pela adição de 60 yL de 2 M de Tris-Base, seguido por infecção em células de E. coli TG1 por mistura de 10 mL de cultura em crescimento exponencial com 0,5 mL de fago eluido e incubação durante 30 minutos a 37 °C. Finalmente, as bactérias infectadas são 107 ΡΕ2028193 plaqueadas no meio TYE com 1% de glucose e 100 pg/mL de Ampicilina, e incubadas a 30 °C durante a noite.

Clonagem de clones seleccionados de mutantes CL seleccionados contra Lisozima para a expressão solúvel O DNA de fagemideo dos fagos seleccionados através de 3 rondas de selecção é isolado com uma midi-prep. O DNA que codifica domínios CL mutados é amplificado em lote por PCR e clonado Ncol-Notl no vector pNOTBAD/Myc-His, que é o vector de expressão de E. coll pBAD/Myc-His (Invitrogen) com um sítio de restrição NotI inserido para facilitar a clonagem. As construções ligadas são transformadas em células de E. coli LMG194 (Invitrogen) por electroporação, e cultivadas a 30 °C em meio TYE com 1% de glucose e ampicilina durante a noite. Os clones seleccionados são inoculados em 200 pL de meio 2xYT com ampicilina, cultivados durante a noite a 30 °C, e induzidos por adição de L-arabinose para uma concentração final de 0,1%. Após expressão a 16 °C durante a noite, as células são recolhidas por centrifugação e tratadas com 100 pL de tampão de borato de Na, pH 8,0, a 4 °C durante a noite para a preparação de extractos periplásmicos. São utilizados 50 pL dos extractos periplásmicos em ELISA.

Os clones que produzem um sinal elevado nesta primeira ELISA, preliminar são cultivados num volume de 20 mL nas mesmas condições como descrito acima. Os seus 108 ΡΕ2028193 extractos periplásmicos são isolados em 1/20 do volume de cultura como descrito acima e testado com ELISA (como descrito a seguir) para confirmação. ELISA de mutantes CL seleccionados contra liso-zima de ovo de galinha

Revestimento: Placa de microtitulação (NUNC,

Maxisorp) , 100 pL por poço, 100 pg de lisozima de ovo de

galinha/mL em PBS, 1 h a 37 °C

Lavagem: 3x 200 pL PBS Bloqueio: 1% BSA-PBS, 1 h a TA Lavagem: 3x 200 pL de PBS

Ligação do extracto periplásmico: 50 pL de

extracto periplásmico, 50 pL de 2% de BSA-PBS, à temperatura ambiente durante a noite Lavagem: 3x 200 pL de PBS

Io anticorpo: anti-His4 (Qiagen), 1:1000 em 1% de BSA-PBS, 90 min a TA, 100 pL por poço Lavagem: 3x 200 pL de PBS 2o anticorpo: anti murganho*HRP de cabra (SIGMA), 1 : 1000 em 1% de BSA-PBS, 90 min a TA, 100 pL por poço

Lavagem: 3x 200 pL de PBS

Detecção: 3 mg/mL de OPD em tampão Na-citra- to/fosfato, pH 4,5, 0,4 pL de 30% de H202 Interrupção: 100 mL de 3 M de H2S04 Leitura de absorvência: 492/620 nm 109 ΡΕ2028193

Os clones são interpretados como positivos quando o seu sinal de ELISA é pelo menos três vezes o do sinal de ruído de fundo.

Exemplo 15: Construção de um dominio de imunoglobulina que é randomizado em ambos os lados (domínio CH3 biespecifico manipulado)

Este exemplo descreve um dominio de imunoglobulina manipulado com duas especificidades de ligação. A concepção deste dominio de imunoglobulina manipulado compreendeu a seguinte estratégia: • um domínio CH3 manipulado, clone C24 (ver exemplo 10), derivado da biblioteca CH3+5 que se liga especificamente a lisozima foi utilizado como ponto de partida • resíduos a ser randomizados foram identificados neste domínio CH3 modificado que estão a ligar as fitas β do arranjo da imunoglobulina, e que ficam no lado oposto do domínio em comparação com os resíduos que foram mutados aquando da produção do clone C24. • foram concebidos iniciadores de PCR que permitiram a randomização destes resíduos e síntese deste 110 ΡΕ2028193 domínio de imunoglobulina manipulado num procedimento semelhante ao descrito acima para as bibliotecas CH3, a CH3+3 e a CH3+5.

Foram ligados 4 produtos de PCR que contém posições aleatórias e as inserções completas foram amplificadas por PCR. Subsequentemente, estes foram clonados em pHEN-1 através dos sítios Ncol-Notl e transformadas em células de E. coli TG-1 para construção da biblioteca com cerca de 108 colónias. Foram sequenciadas 20 colónias aleatoriamente seleccionadas e verificou-se que as posições aleatórias eram independentemente mutadas. Também não foi observada uma sequência "tipo selvagem" (C24). A biblioteca de fagos foi produzida seguindo protocolos convencionais, e foi conseguido um título de fagos de 6,32 x IO10 TU/mL.

De modo a testar biespecificidade, Eritropoietina humana recombinante (rhEPO) foi seleccionada como segundo antigénio, enquanto se esperava que a construção retivesse a sua especificidade originalmente manipulada para a lisozima de ovo de galinha. O fago reactivo com rhEPO foi selecionado em 4 rondas de selecção. De modo a conservar a população de clones C24 que após mutagénese eram ainda capazes de se ligar a lisozima de ovo de galinha, a primeira ronda de selecção em rhEPO foi seguida por uma ronda de selecção da população de fagos em lisozima de ovo de galinha (1 mg/mL em PBS) . Foram revestidos 5 poços de placa de microtitulação (Maxisorp, Nunc) com 200 yL de 111 ΡΕ2028193 rhEPO em 0,1 M de tampão de carbonato de Na, pH 9,6, em concentrações decrescentes em rondas de selecção subsequentes (ver Tabela a seguir). Após bloquear com 2% de M-PBS, o fago no agente de bloqueio foi deixado a ligar à temperatura ambiente durante 2 h. Após 20 lavagens com T-PBS e 20 com PBS, foi eluido com 0,1 M de glicina, pH 2,2, e neutralizado com 2 M de Tris. O fago eluido foi utilizado imediatamente para infectar exponencialmente TG-1 em cultura. As células infectadas foram seleccionadas em meio contendo ampicilina. As particulas de fago foram resgatadas dos sobrenadantes de cultura após superinfecção com o fago auxiliar M13-K07, concentradas com PEG e utilizadas em outra ronda de selecção. O número de fagos iniciais e finais foi determinado como unidades de transformação de E. coli após cada ronda de selecção (Tabela 8).

Tabela 8: ronda de selecção antigénio fago inicial (TU/mL) fago final (TU/mL) 1 rhEPO, 500 yg/mL 6,32 x 1010 1,9x105 2 lisozima, 1 mg/mL 6, 16xl015 4,53x1010 3 rhEPO, 100 yg/mL 6, 07xl015 6, 78xl010 4 rhEPO, 50 yg/mL 8, 92x1015 3, 0x1011 5 rhEPO, 50 yg/mL 5, 12X1015 4,28x1010

As colónias resultantes foram raspadas das

placas, cultivadas em 2xYT com ampicilina e o seu DNA 112 ΡΕ2028193 plasmídico foi isolado com uma midi-prep. As inserções foram amplificadas com uma PCR, e depois subclonadas num vector pNOTBAD e transformadas numa estirpe de E. coli E104. Foram cultivadas 4x72 colónias em 200 pL de 2xYT com ampicilina e induzidas com 0,1% de L-arabinose no dia seguinte. Após 24h de expressão a 16 °C, estas foram lisadas com 200 pL de tampão de borato de Na, pH 8,0 durante 6 h a 4 °C e o extracto periplásmico foi utilizado em ELISA.

Para ELISA, as placas Maxisorp foram revestidas com lisozima de ovo de galinha em PBS (20 pg/mL) ou rhEPO em 0,1 M de tampão de carbonato de Na, pH 9,6, respectiva-mente, durante 1 h a 37 °C. Após bloqueio com 1% de BSA- PBS, o extracto periplásmico no mesmo agente de bloqueio foi deixado a ligar durante a noite. A ligação foi revelada com um anticorpo anti-His-(4) e um anticorpo IgG anti-murganho de cabra, conjugado com HRP (para a detecção de lisozima de ovo de galinha) ou AP (para detecção de rhEP) . A reacção colorida da conversão de OPD (HRP) foi lida a 492/620 nm após ter sido parada com 1,25 M de H2SO4, e a conversão de pNPP (AP) foi lida a 405/620 nm. Foram seleccionados 14 clones com valores promissores de absorvência para a expressão a uma escala de 20 mL. Após 24 h de indução com arabinose a 16 °C, as células foram recolhidas e lisadas durante a noite em 1 mL de tampão de borato de Na a 4 °C, e um lisado foi utilizado para ELISA. A ELISA foi efectuada como acima em 4 paralelos, e os poços 113 ΡΕ2028193 sem e extracto periplásmico sem antigénio foram utilizados como controlos negativos. Os resultados (Tabela 9) foram conseguidos com clones de acordo com SEQ ID N° 42, 43.

Tabela 9: antigénio absorvência na ligação sem extracto periplásmico sem antigénio lisozima A492/620 nm 0,299 0,110 0,018 rhEPO A405/620 nm 0,258 0,095 0,090

Exemplo 16: Domínios CH3 manipulados proporcionam biespecificidade num formato tipo Fab

Na construção utilizada neste exemplo, a cadeia VL e VH de um anticorpo são fundidas num domínio CH3 manipulado. A região VL e VH do anticorpo monoclonal humano 3D6 (He XM, et al. Proc Natl Acad Sei USA. 1992 89:7154-8.; Kohl J, et al. Ann N Y Acad Sei. 1991 646:106-14.; Felgenhauer M, et al. Nucleic Acids Res. 1990 18:4927), que reconhece um epitopo em gp41 de HIV-1 foi utilizado como um parceiro de fusão para o domínio Ce3 do clone C24 que se liga especificamente a lisozima de ovo de galinha.

De modo a promover a formação do dimero VL-CH3/ VH-CH3 através de uma ligação persulfureto, os resíduos Ser-Cys foram adicionados ao terminal C da sequência C24. ΡΕ2028193

As sequências de nucleótido e de aminoácidos respectivamente, das duas cadeias, 3D6VL-C24 e 3D6VH-C24 são dadas na SEQ ID N° 47, 46 e SEQ ID N° 45, 44, respectivamente.

Foram concebidos iniciadores que permitem a amplificação de regiões codificantes, introduzindo sitios de restrição ao mesmo tempo (mutações silenciosas) que foram utilizados para ligar as regiões codificantes uma com a outra. Para a expressão dos genes, foi seleccionado o sistema de expressão de Pichia pastoris. As construções foram clonadas em vectores de expressão adequados de Pichia pastoris: 3D6VL-C24 foi clonado no pPIC9K (nome final: pPIC9K3LC) e 3D6VH-C24 (nome final: pPICZ3HC) foi clonado no pPICZalphaA. A construção pPICZ3HC foi linearizada com Bgl II, transformada em Pichia pastoris GS115 e os transformantes foram seleccionados em meio sólido contendo zeocina. Um dos transformantes foi subsequentemente utilizado como uma célula hospedeira para a construção linearizada com Sal I, pPIC9K3LC. Os duplos transformantes foram então seleccionados em meio RDB.

Os clones foram inoculados em 30 mL de meio YPG e cultivados até uma D06oo=10, e foram depois induzidos pela adição de 1% de metanol em meio BMMY. A indução foi continuada durante 36 horas a 16 °C. Os sobrenadantes foram removidos por centrifugação e foram depois concentrados 115 ΡΕ2028193 cerca de 10 vezes. A presença da proteína recombinante foi confirmada através de uma transferência de Western com um anticorpo anti-His (4), e foi estimado estar numa concentração de aproximadamente 50 - 100 yg/L de cultura inicial.

Os primeiros testes funcionais foram efectuados com sobrenadantes ΙΟχ-concentrados. Inicialmente, os poços de placas Maxisorp foram revestidos com 20 yg/mL de lisozima de ovo de galinha em PBS ou 20 yg/mL de epitopo do anticorpo 3D6 em tampão 0,1 M de tampão de carbonato de Na, pH 9,6, respectivamente, durante 1 h a 37 °C. O epitopo 3D6 epitopo foi utilizado na forma de uma proteína de fusão com GST produzida de forma recombinante. Após blogueio com 1% de BSA-PBS, os sobrenadantes concentrados foram deixados a ligar durante a noite no mesmo agente de bloqueamento. A ligação foi revelada com um anticorpo anti-His (4) e anticorpo anti-murganho de cabra, conjugada com HRP, e visualizado como uma reacção colorida resultante da conversão de OPD a 492/620 nm (Tabela 10).

Tabela 10

Sinal de Ruído de Ruído de antigénio ELISA fundo (sem fundo (sem (A492/620) antigénio) sobrenadante) lisozima 0,198 0,003 0,043 epitopo 3D6 0,061 0,001 0,007 ΡΕ2028193 116

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Riiker, Florian <120> DOMÍNIOS DE IMUNOGLOBULINA SINTÉTICA COM PROPRIEDADES DE LIGAÇÃO MANIPULADAS NAS REGIÕES DA MOLÉCULA DIFERENTES DAS REGIÕES DETERMINANTES DE COMPLEMENTARIDADE <130> R 46751 <140> PCT/EP2006/050059 <141> 2006-01-05 <150> US 60/641144 <151> 2005-01-05 <160> 65 <170> Patentln versão 3.3

<210> 1 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 ΡΓΟ Af'<· Sltí Pro Gin vai Tyr Thr 1 5 Thr Ly$ Agn Ci T n Vãl Ser teu Thr 20 Ser ASp íle Ale. vai Glu Trp 6lu 35 40 T>T Lys Thr Thr Pro pro vai leu 50 SS Tyr ser Lys Leu Thr vai Asp tys êS ?0 phe ser cys ser vai mt HÍS Glu SS tys Ssr Leu Ser teu Ser Pro Gly 100 teu pro 10 pro Ser Arg asp Gl u 15 teu Cys 25 teu vs! tys oiy Phe 30 Tyr Pro Asn Gin pro Glíi A&a Asn ser v> í y 4$ ASp ser ASP sly 00 ser Phe Phe teu Ser ArS rrp 75 Gin Gin sly ASO vai SQ teu m aj-íí Ç· Asn itB Tyr Thr Gin Ala .1· *? 95 tVS ãIa a'I a Ala <210> 2 <211> 332 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Sequência artificial <220> <221> caracteristica_misc <222> (57)..(58) <223> n é a, c, g, ou t <220> 117 ΡΕ2028193 <221> característica_misc <222> (60) . . (61) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> característica_misc <222> (63) . . (64) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> característica_misc <222> (219)..(220) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> característica_misc <222> (222)..(223) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> característica_misc <222> (225)..(226) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> característica_misc <222> (234)..(235) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> característica_misc <222> (237)..(238) <223> n é a, c, g, ou t <400> 2 ocatggcext rtSítRSCâggtagtgggasãgccgscggctc

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Rro Arg õlu Pro G"ln vai tyr Thr teu Pro pro· Ser Arg Asp Slu teu i s io lã 330 132 ΡΕ2028193 teu âl a Tyr Gin 20 Vai ser Leu Thr Cys 25 teu vai tys Gl y Phe 50 Tyr Pro Ser ãsp lie Ala Vai Gly xrp Gly Ser Asn 01 y Gin Pro Gly Aâft &sn 3S 40 4S Tyr tys Thr Thr Pro Pro vai tey ÃSp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Lee 50 55 60 Tyr ser tys L8U Thr vai Vai Ala Gly Arg Trp Thr Cys Gly Asa vai 65 70 75 80 phe ser Cys ser vai ?*et Hi $ Gly Ala Leu HlS Asn His Tyr Thr Gin 85 90 95 tys Ser teu Ser teu ser pro Gly tys 100 10 s <210> 31 <211> 315 <212> DNA <213> Artificial <22 0> <223> Sequência artificial <400> 31 eeccgagaac cacaggtgta cacectgccc ceatcccgtg acgagctcct ggcgtaccaa gtcagcctga cetgcctggt çaaâggcttc tâtcctsgcg acâtçgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caaetacaag accacgcctc ccgtgetgg* etçegaçgge tccttcttcc tct&eagcaa gcttáccgtg gtggctggca ggtggacgtg cgggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggçtctg çaçaaccaçt acacacagaa gagcctctcc ctgtctcegg gtâãâ m m 1 m 2 m 300 315 <210> 32 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Sequência artificial <400> 32

Pro Arg Gly Pro Gin Vai Tyr Thr teu Pro Pro ser Arg ASp Cslu teu 1 5 10 15 Cys vai Pro Gin Vâl Ser teu Thr Cys 25 teu vai tys Gly Phe Tyr Pró 20 30 Ser Ãsp lie Ala vai Gly Trp Gly Ser asp Gly Gin pro Gly Asn As π 35 40 45 ΡΕ2028193 133

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Pro Arg Glu Pro sln Vai Tyr Thr teu Pro pro ser Are Asp Glu teu 1 S 10 * 15

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60 120 ISO· 240 SOO SIS <210> 42 <211> 115 137 ΡΕ2028193 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Sequência artificial <400> 42

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m 120 ISO 240 300 34 S <210> 44 <211> 238 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Sequência artificial 138 ΡΕ2028193 < 4 Ο Ο > 44 G1 Μ I vai Gin Lfltí vai 5 Élu ser Gly Gly Gly 10 teu vai Gin er© Gly 15 Arg Ser teu Arei teu 20 Ser cys Ala Alâ Ser 25 Gly Pbe Thr phe ASR 30 Asp Tyr Alã HlS. 35 Trp val Arg ain Ala 40 oro Gly tys Gly teu 45 Gla Trp val Ser Gl V 50' ile Sèr Trp ASp ser 55 ser Ser Xle Gly Tyr 60 Ai a ASP Ser val tys 65 Gly Arg phe Thr ile 70 Ser Arg Asp Aso Ala 75 Lys ASP Ser Leu Tyr 80 Leu Gin J4et ASO ser m teu Arg Ala Gly ASp 90 wet Ala teu Tyr Tyr 95 cys vai tys Gly Ara 100 ASp Tyr Tyr A5P ser 105 cly Gly Tyr phe Thr 110 val Ala Phe Asp Ile 11S Trp Gly Gin Gl y Thr 120 vai Thr val Ser 12S Ser Ala ser Thr tys 150 Gly Pro Gin Vai Tyr 115 Thr Leu Pr o pro Ser 140 Arg ASp Glu teu Vai 14.5 Leu Gly Gin vai Ser 150 Pr o Thr Cys Leu Vai 155 tys Gly Pbe Tyr Pro 160 ser AS p 11« Ala Vai 165 6fu Trp Glu Ser ASn 170 Gly Gin Prõ Glu As li 175 Asn lyr tys Thr Thr 130 Pr o Pro Vai Leu ASp ιή ser ASP Gly ser Phe 190 Phg teu Tyr Gly Lys 195 teu Thr Vai Pro ΡΓΟ 200 Arg Leu tys Gly Trp 205 Pr© Arg Trp fSly írp 210 Gly ASO val Phe ser cv$ 215 Ser val «et Hf s 220 Slu Ala Leu Hf S Aso 225 H1S Tyr Thr Gin tys 230 ser Leu ser Leu ser 235 Pr© Gly Lys <210> 45 <211> 714 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Sequência artificial 139 ΡΕ2028193 <400> 45 gaagtgcagc tggtggagtc igggggagyc ttggtacage ctggcaggte cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctcjigatt eacctttaat gsttatg-cea tgcactgggt ccggcaagct 120 «.agggaagg gcctggagtg ggtètcaggt atsagttggg atagtagtãg tatagfjetat 180 gcggsctctg tgaagggecg attcaceatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240 ítgcaaatga acagtctgag agctgaggac atggccttat attactgtgt âa&aggcâtjâ 300 gattãctatg atagfcggtgg ttatttcacg gttgcttttg atatctgggg çesagggãoa seo atggtcaeeg tctcttca#c ctccaccaag ggçccacagg tgtscaccct fctcccatcc 420 cgtgacgagc tcgtcttggg gcaagtcagc ttgacctgct tggtesaaçsg cttctateec 400 agcgacatcg ccgtggagtg ggagagtaat 9ggc*gccgg ayaacsscta cmagaccacf 540 eetcccgtgc. tggactecga çggctccttc ttcctctacg gcaagtttáC. cgtgecctcg 600 cggttgaagg gctggccgag gtggggctgg gggaae§t:ct tctmgctc cgtgatgcat 660 gaggctclíjc acaatcatta eacaeag&acf agdctctccc tgtctccggg taaa 714 <210> 46 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Sequência artificial <4Ο0> 46 ASp 1 lie Olrs Mfct Thr 5 0l Í3 Ser Pro Ser Thr 10 L6U ser Alã Ser Vâl 1$ 6ly Asp Arg Vai Thr 20 Ile Thr Cys Ar§ Ai a 25 ser 61 h Ser rie Ser 30 arg Trp Leu Ala rrp 35 Tyr Gin Glfí Ly$ Pr'0 40 61 y tys Vai Pro Lys 45 Leu Le» He Tyr Ala Ser Ser Leu Glu 55 ser Gly vai Pro Ser Arg 60 Phe ser Gly Ser 65 í>1y Ser $ly Thr Glp 70 phe Thr teu Thr ile 75 Ser ser Leu õle pro 80 ASp ASp Phe Ala Thr 85 tyr Tyr cys Glrs 6ln 90 Tyr Asrt Ser Tyr ser 95 Phe 6ly Pro <fly Thr 100 Lys va1 Aáp Xle uys 1ÔS Arg Thr vai Ala Glu 110 pro filo Vai Tyr Thr 115 Leu Pro Pro Ser Arg 120 A$í> Sl« Lev VS í teu 125 61 y Gin Vai Ser pr·» 130 Thr Cys Leu Vai tys 135 Gly Phe Tyr Pro ser 140 A.Sp He a1 a Vai 140 ΡΕ2028193

Glu Trp Glu ser As» Gly eln pro Glu asa A$« Tyr Lys Thr Thr Pr® 14 S ISO 15 S 16Q pro vai leu A$» S«r Asp Gly ser phe Phe Leu Tyr Glv Lys Leu Thr 1©5 170 ‘ 175 vai pro Pro Aro teu Lys Gly Trp Pro Arg Trp Gly Trp Gly aso vai 180 185- 1§0 phe ser cvs ser vai «et hís Glu Ala teu His as» hís Tyr Thr Gin 135 200 205

Lys Ser Leu ser Leu Ser Pro Gly Lys ‘ 210 215 <210> 47 <211> 651 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Sequência artificial <400> 47

m 120 ISO 240 300 m 420 480 540 600 6SX gacatecagã tgaceeagtc tccttccacc ctgtctgcat ttgtaggaga capagtcace atcacttgcc gggtcagtca gagtattsgt aggtggttgg cetggtatea gcâgaaaeeã gggaaagtee çt&agrteet gat«t«taag gcatctagtt tagaasgtgg ggtcccatca aggttcagcg geagtggatc tgggacagaa ttenctcte* ceatcstgcag cctgcagcct gatgatlttg caacttatta ctgeeaacag tataatagtt attctttcgct ccctgggaec aaagtggata tcaaacgaac tgtggctgaa ceacaggtgt aeaecctgec cccatcccgt gatg aget.es tettggggea. agtcsgcccg acctgcctgg tcaaaggttt etateteage gacatcgecg tggagtggga gagcsatggg eagccggaga aeaactaca* gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctcetícfcte ctctacggea agcttaccgt gcccccgcgg ttgaagggct ggccgaggtg gggctçgggg aacgtcctet catgctecgt gatgcatgag gctctgeaca aecactacae aeagaag&gc ctctccctgt tttcgggtaa a. <210> 48 <211> 129 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Sequência artificial <22 0> <221> característica_misc <222> (35)..(36) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido que ocorre naturalmente <22 0> <221> caracteristica misc 141 ΡΕ2028193 <222> (38)..(42) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido que ocorre naturalmente <22 0> <221> caracteristica_misc <222> (95)..(98) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido que ocorre naturalmente <400> 48

Met Lys Τντ L8W Leu Pro Tter Ala Ala Ala Gly Leu Leu Léu Leu Ala 1 5 10 :i5 Ala Gla prs Ala rset Ala val AlS Alâ Pro ser val Phe lie Phe Pr o 20 25 30 pro Ser xaa Xaa Gin Xaa Xaa xaa xaa xaa Ala Ser val Val tys LèU 3S 40 45 Leu ASfí Asn phe Tyr Pro Arg 01 u Ala Lys val Gin Trp Lys val Asp 50 SS 00 Asn Ala Leu 6l rt ser Sly Asm ser tV! rs elu Ser Val Thr Glu 61 n Asp 65 70 75 éo Ser Lys As p ser Tlbr Tyr Ser Leu Ser ser Thr Leu Thr Leu xaa Xaa as 90 0$ XaA xaa Tyr Glu Lys nis Lys val Tyr Ala cys Glu val Thr HÍS 5ln .100 105 110 Cly Leu Ser Ser Prij Val Thr Lys Ser phe Asn Arg Gly G:lU Ala Ala 11S 120 12$

Ala <210> 49 <211> 387 <212> DNA <213> Artificial <22 0> <223> Sequência artificial <220> <221> caracteristica_misc <222> (103) .. (104) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> caracteristica_misc <222> (106) .. (107) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> caracteristica_misc <222> (112)..(113) <223> n é a, c, g, ou t 142 ΡΕ2028193 <22 0> <221> característica misc <222> (115)..(116) <223> η é a, c, g, ou t <22 0> <221> característica_misc <222> (118)..(119) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> característica_misc <222> (121) . . (122) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> característica_misc <222> (124)..(125) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> característica_misc <222> (283)..(284) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> característica_misc <222> (286)..(287) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> característica_misc <222> (289)..(290) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> característica_misc <222> (292)..(293) <223> n é a, c, g, ou t <400> 49 atgaaatacc atggccgtgg mtsíwsQcct tggaaggtgg agcaaggacaaa&cacaaag tattgcctac ctgcaccate. ctgttgtgtg ata&cgccct gtacct&cag tctacçjcctí} agcttcaaca ggggagaggc ggc&gccget ggattgttat tactcgqjgc tgtcttcatc ttcccgccat ctnasansca cetgetgast aacttctatc ec&gagagpc ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac cctcagcagc accctgacgt tgnnsrmsnn cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc ggccgca ecâgccggcc 60 grsnsrnigiwss 12 0: eaa&ptaeag 180 agagcaggae 240 mmt&cga§ 300 cgtcacaaai 360 Ϊ87 <210> 50 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Seguência artificial <22 0> <221> característica_misc <222> (35)..(36) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido que ocorre naturalmente 143 ΡΕ2028193 <22 0> <221> característica_misc <222> (38) ..(42) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido que ocorre naturalmente <22 0> <221> característica_misc <222> (95) .. (101) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido que ocorre naturalmente <400> 50 net tys Tyr teu Leu pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 1 s 10 15 Al a Gin Pro Ala wet Ala vai Ala Ala Pro ser Val Phe llé Phe Pró 20 2:5 30 Pm Sèr Xaa xaa oln xaa xaa xaa xaa. xaa Ala Ser val Val Cys Leu 35 40 45 teu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Ο Ϊ U Ala Lys Val 6ln Trp tys val ASP 50 55 60 Asr? Al λ Leu Gin Ser Ase Ser âl H 61 u Ser val Thr Csl u gin A§p 65 70 75 SO Ser Lys ASjp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Xaa Xaa 85 90 95 xaa X3S xaa Xaa xaa Tyr Glu Lys h! s LyS Vâl Tyr Ala Cys 61 u Val 100 105 no Thr HiS Gin Gly Lm Ser Ser Pro Vai Thr tys Ser Phe Asn Arg Gly 115 12:0 *25 Glu Ala Al a Ala

3JQ <210> 51 <211> 396 <212> DNA <213> Artif i( sial <22 0> <223> Sequência artif icial <22 0> <221> característi ca misc <222> (103) . .(104) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> característi ca_ misc <222> (106) . •(107) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> característi ca misc <222> (112) . . (113) 144 ΡΕ2028193 <223> η é a, c, g, ou t <22 0> <221> característica_misc <222> (115)..(116) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> característica_misc <222> (118)..(119) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> característica_misc <222> (121) . . (122) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> característica_misc <222> (124)..(125) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> característica_misc <222> (283)..(284) <223> n é a, c, g, ou t <220> <221> característica_misc <222> (286)..(287) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> característica_misc <222> (289)..(290) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> característica_misc <222> (292)..(293) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> característica_misc <222> (295)..(296) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> característica_misc <222> (298)..(299) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> característica_misc <222> (301)..(302) <223> n é a, c, g, ou t <400> 51 atg*«at#cc afegsjecgigg tgpââg-gtgg agcsaggacs

«rtstaegaga tâttgCC-tâC

CtgeaccatC ctgttgtgtg staaegceet geacctacag aacacsaagt. ggcagccgct tgtcttcatc cctgctgaat ccàiàtcgggt ectcagcagc ctacgcefcge ggattgttat ttcccgccat aacttctatc aactcccaggj accctgacgst gsaíjtçaccc tactcgcggc ctnnsnnsca ecagagaggc agagtgtcac

tgnnsfsnsnR atcãggfcct ctâgçcggcc 60 gtmsíííisrms 120 caaagtacag 180 sgagcaggac; 340 srinsarisans 800 gagctcgccc 160 145 ΡΕ2028193 396 gtcaeaaaga gcttcaaeag gggagaggcg gccgea <210> 52 <211> 134 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Sequência artificial <22 0> <221> caracteristica_misc <222> (35)..(36) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido que ocorre naturalmente <22 0> <221> caracteristica_misc <222> (38)..(42) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido que ocorre naturalmente <22 0> <221> característica_misc <222> (95)..(103) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido que ocorre naturalmente <400> 52 ^et Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala €ly teu Leu Leu Leu Ala 1 S 10 15 Alá Glo Aro Ala Met Ala Val Ala Ala Fna Ser Val Phe ile Phe pra 20 25 30 Pro ser xaa xaa gIr Xaa xaa xaa Xaa xaa Ala ser Val val Cys Leu 3S 4Ô 45 Leu Asn Asn Píie Tyr Pro Arg Glu Ala Lys val Gin Trp Lys val Asp 50 55 60 ÂSft Ala Leu Gin Ser slv Asa Ser Cila Glu Ser val Thr Glu Gin ASp 6S 20' H 80 ser Lys ASp ser Thr Tyr ser Leu Ser Ser Thr ieu Thr Leu xaa xaa 85 90 95 Xáá Xaa xaa Xaa xaa Xaa xaa Tyr 6lu tys HÍS Lys val Tyr Ala Cys 100 105 110 Glu Vai Thr Hls Glrs sly Leu Ser Ser Prs Val Thr Lys. Ser Phe Asn .115 120 1.25 Arg Gly 1 SÀ Glu Al 3 Ala Alã 1Ϊ0 <210> 53 <211> 402 <212> DNA <213> Artificial 146 ΡΕ2028193 <22 0> <223> Sequência artificial <220> <221> caracteristica_misc <222> (103)..(104) <223> η é a, c, g, ou t <22 0> <221> caracteristica_misc <222> (106)..(107) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> caracteristica_misc <222> (112)..(113) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> caracteristica_misc <222> (115)..(116) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> caracteristica_misc <222> (118)..(119) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> caracteristica_misc <222> (121)..(122) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> caracteristica_misc <222> (124)..(125) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> caracteristica_misc <222> (283)..(284) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> caracteristica_misc <222> (286)..(287) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> caracteristica_misc <222> (289)..(290) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> caracteristica_misc <222> (292)..(293) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> caracteristica_misc <222> (295)..(296) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> caracteristica_misc <222> (298)..(299) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> 147 ΡΕ2028193 <221> característica_misc <222> (301)..(302) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> característica_misc <222> (304)..(305) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> característica_misc <222> (307)..(308) <223> n é a, c, g, ou t <400> 53 atgaaatacc tattJjaetae ggcagtegct ggatt§ttat tactegcgge ccagccggcc 00 atggecgtgg etgcaeeate tgtcttcatc ttcccgeeat etrmstmsca fíífisnnsnfts 120 «snsprvsgect ctgttgtgtg ectgctgaat aacttctatc ceagagaggc caaagfâcag Ϊ8Q tggaag§tgg «taecgccct ccaatcgggt aácteccagg agagcaggac 240 ágesacigaca. gcacetacag cctcageagc accctgscgt çnnSOfiSóRS 100 eaaagtctac gcctgcgaag tcaercatca ggçcefcgaçje 300 tcgceegtca caaagagctt caacagggga ta 402 <210> 54 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Sequência artificial <22 0> <221> característica_misc <222> (38)..(45) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido que ocorre naturalmente <22 0> <221> característica_misc <222> (95)..(101) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido que ocorre naturalmente <400> 54

«et 1 Lys Tyr Leu Leu 5 Fr o Thr Ala Ala Ala 6)χ-ΙΟ teu Leu Leu Leu 15 Ala Alá Prq a! a 20 «et Ala Ala ser Thr 2S Lys ely Pro Ser val 30 pfoe pro Leu À1 a Pro 35 Ser Ser X&â. Xaa Xaa xaa 40 xaa xaa Xaa Xaa 43 Ala Leu Oly Cys Leu SO Vai Lys Asp Tyr Phe 55 Prp Oly Pro val Thr m Val Ser Trp aso ser 65 SI y Ala Leu Thr Ser 20 sly Vai Hiç Thr Phe 75 Prp Ala val Leu 6ln SO 148 ΡΕ2028193

Ser Ser <s1y Tyr Set teu âgr Ser Vai vai Th r vai P-ro xaa xaa sl 90 95 Xââ Xaa xas X&ít xaa Thr Tyr ile €vs Asa vai A S o Hl § tys Vro Ser .100 iòS 110 Asn Thr Lys vai Asp tys Lys vai filu P ÍO Lys ser Ala Ala Ala 11S 120 125 <210> 55 <211> 381 <212> DNA <213> Artificial <22 0> <223> Sequência artificial <22 0> <221> caracteristica_misc <222> (112)..(113) <223> η é a, c, g, ou t <220> <221> caracteristica_misc <222> (115)..(116) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> caracteristica_misc <222> (118)..(119) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> caracteristica_misc <222> (121)..(122) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> caracteristica_misc <222> (124)..(125) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> caracteristica_misc <222> (127)..(128) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> caracteristica_misc <222> (130)..(131) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> caracteristica_misc <222> (133) . . (134) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> caracteristica_misc <222> (283)..(284) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> caracteristica_misc <222> (286)..(287) 149 ΡΕ2028193 <223> η é a, c, g, ou t <22 0> <221> caracteristica_misc <222> (289)..(290) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> característica_misc <222> (292)..(293) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> característica_misc <222> (295)..(296) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> característica_misc <222> (298)..(299) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> característica_misc <222> (301)..(302) <223> n é a, c, g, ou t <400> 55 sígaaatacc tattgcttaç ggcagccgct ggattgttat tactcgcggc ccagecggec 60 atggccfcet ccaccaaggg ceestcggtc ttccccttgg caccctcctc trsnsnnsfms ϋϋ n:nsRr»s.iiE3:$ít íssrmsgcctt gggctgcctg gtcaaggact acttccccgâ. s.ccggtgâcg ISO gtgtcgtgga actcaggcgc: cttg-ãccãçjc ggcgtgtaea ccttcccggc tgtcctacag 240 ttctcs.gf.ac tctsctccct csgcagcgtg ftgatcgtgc CcnusnnsnR srtnsrwsstsfis 300 nnsacetaca tctgcaacgt g-aat-cacaa^ CCCàÇítldCft ccâaggtgga Caagaaagtt 360 gatjeetaaat ctgcggccgc & <210> 56 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial <22 0> <223> Seguência artificial <22 0> <221> característica_misc <222> (49)..(50) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> característica_misc <222> (52)..(53) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> característica_misc <222> (58)..(59) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> característica_misc <222> (61) .. (62) 150 ΡΕ2028193 <223> η é a, c, g, ou t <22 0> <221> caracteristica_misc <222> (64)..(65) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> característica_misc <222> (67)..(68) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> característica_misc <222> (70)..(71) <223> n é a, c, g, ou t <400> 56 cttacçstgg ecgtggetge accatctgtc ttcatxttce cgccatctnn sBftscagfms 60 «sgcfctetpt tgtgtgc 8? <210> 57 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <22 0> <223> Sequência artificial <400> 57 tgacaacgtc agggtgctgc tgaggc 26 <210> 58 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Sequência artificial <22 0> <221> característica_misc <222> (12) . . (13) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> característica_misc <222> (15)..(16) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> característica_misc <222> (18)..(19) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> característica_misc <222> (21)..(22) <223> n é a, c, g, ou t <400> 58 tcagaacgtt gnnsnnsnns nnstacgaga aacacaaagt c 41 <210> 59 <211> 50 151 ΡΕ2028193 <212> DNA <213> Artificial <22 0> <223> Sequência artificial <22 0> <221> caracteristica_misc <222> (12)..(13) <223> η é a, c, g, ou t <22 0> <221> caracteristica_misc <222> (15)..(16) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> caracteristica_misc <222> (18)..(19) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> caracteristica_misc <222> (21)..(22) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> caracteristica_misc <222> (24)..(25) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> caracteristica_misc <222> (27)..(28) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> caracteristica_misc <222> (30)..(31) <223> n é a, c, g, ou t <400> 59 tcagaacgtt gnnsnnsnns nnsnnsnnsn nstacgagaa acacaaagtc <210> 60 <211> 56 <212> DNA <213> Arti ficial <22 0> <223> Sequência artif icial <22 0> <221> caracteristica misc <222> (12) .·(13) <223> n é 3. r Cr ÇJ" f OU t <22 0> <221> caracteristica misc <222> (15) . . (16) <223> n é 3 f Cf ÇJ" f ou t <22 0> <221> caracteristica misc <222> (18) . . (19) <223> n é 3 r Cf ÇJ" f ou t 152 ΡΕ2028193 <22 0> <221> característica_misc <222> (21)..(22) <223> η é a, c, g, ou t <22 0> <221> característica_misc <222> (24)..(25) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> característica_misc <222> (27)..(28) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> característica_misc <222> (30)..(31) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> característica_misc <222> (33) . . (34) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> característica_misc <222> (36)..(37) <223> n é a, c, g, ou t <400> 60 tcagaacgtt gnnsnnsnns nnsnnsnnsn nsnnsnnsta cgagaaacac aaagtc 56 <210> 61 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <22 0> <223> Sequência artificial <400> 61 catcgcggcc gcctctcccc tgttgaagct c 31 <210> 62 <211> 99 <212> DNA <213> Arti f icia 1 <22 0> <223> Sequência artif icial <220> <221> caracterí stica misc <222> (58) . . (59 ) <223> n é a, c, 9, OU t <22 0> <221> caracterí stica misc <222> (61) . . (62 ) <223> n é a, c, 9, ou t <22 0> <221> caracterí sti< misc <222> (64) . . (65 ) <223> n é a, c, 9, ou t 153 ΡΕ2028193 <22 0> <221> característica_misc <222> (67)..(68) <223> η é a, c, g, ou t <22 0> <221> característica_misc <222> (70)..(71) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> característica_misc <222> (73)..(74) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> característica_misc <222> (76)..(77) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> característica_misc <222> (79)..(80) <223> n é a, c, g, ou t <400> 62 acgtce&tgg txgcctceae’ taagggccca tcggtctttt ccctggtacc ctccfcccnm 60 nnsmssrMisít nsRRsnnsnn sgcectgggc tgcctggtc 99 <210> 63 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <22 0> <223> Seguência artificial <400> 63 ggcacggtca ccacgctgct gag 23 <210> 64 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Seguência artificial <22 0> <221> característica_misc <222> (19)..(20) <223> n é a, c, g, ou t <220> <221> característica_misc <222> (22)..(23) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> característica_misc <222> (25)..(26) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> característica_misc <222> (28)..(29) 154 ΡΕ2028193 <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> caracteristica misc <222> (31)..(32) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> caracteristica misc <222> (34)..(35) <223> n é a, c, g, ou t <22 0> <221> caracteristica misc <222> (37) . . (38) <223> n é a, c, g, ou t <400> 64 agcgtggtga ccgtgcccsw sjimsnnsnns nnsn«s»ítsa cctacatetg eaacgtgaat e <210> 65 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <22 0> <223> Sequência artificial <400> 65 catagcggcc gcagatttgg gctcaacttt cttgtc

Lisboa, 6 de Junho de 2012

Claims (16)

1. ΡΕ2028193 1 REIVINDICAÇÕES 1. Domínio variável de imunoglobulina ou parte desta, que compreende pelo menos uma região da ansa estrutural de um domínio variável da cadeia pesada ou leve de imunoglobulina, compreendendo a referida pelo menos uma região da ansa estrutural pelo menos uma modificação para proporcionar um sítio de ligação não CDR que se liga a um epitopo de um antigénio, cuja região não modificada da ansa estrutural não se liga ao referido epitopo, em que a referida modificação compreende mutagénese numa ansa inferior seleccionada a partir do grupo consistindo em ansas que ligam fitas beta A-B, C-C', C" -D e E-F do domínio variável.
2. 2. Imunoglobulina modificada de acordo com a reivindicação 1, em que a referida região da ansa modificada está em qualquer de um domínio Vh ou VI.
3. 3. Imunoglobulina modificada de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a referida região da ansa modificada está na região C-terminal.
4. 4. Imunoglobulina modificada de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, que compreende um domínio bivalente ou biespecífico.
5. 5. Imunoglobulina modificada de acordo com 2 ΡΕ2028193 qualquer das reivindicações 1 a 4, que compreende um único domínio de imunoglobulina ou Fv de cadeia única.
6. 6. Imunoglobulina modificada de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, com pelo menos duas regiões de ansa estruturais modificadas.
7. 7. Imunoglobulina que compreende pelo menos uma imunoglobulina modificada de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6, em que a referida região modificada da ansa estrutural compreende pelo menos 6 modificações de aminoácidos.
8. 8. Molécula que compreende pelo menos uma imunoglobulina modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, e pelo menos uma outra molécula de ligação, em que a referida outra molécula de ligação é seleccionada a partir do grupo de imunoglobulinas, receptores solúveis, ligandos, ácidos nucleicos e hidratos de carbono.
9. 9. Imunoglobulina de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8, caracterizada por a referida modificação estar num domínio variável humano numa das posições de aminoácidos na sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo consistindo nos aminoácidos 8 a 20, aminoácidos 44 a 50, aminoácidos 67 a 76 e aminoácidos 89 a 101, em que a numeração da posição do aminoácido dos domínios é a da IMGT. 3 ΡΕ2028193
10. 10. Imunoglobulina de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8, caracterizada por a referida modificação estar num dominio variável de murino numa das posições de aminoácidos na sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo consistindo nos aminoácidos 6 a 20, aminoácidos 44 a 52, aminoácidos 67 a 76 e aminoácidos 92 a 101, em que a numeração da posição do aminoácido dos dominios é a de IMGT.
11. 11. Imunoglobulina de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 10, que possui especificidade de ligação a um antigénio seleccionado a partir do grupo consistindo em alergénios, antigénios associados a tumor, auto antigénios, enzimas, antigénios bacterianos, antigénios fúngicos, antigénios virais e antigénios protozoários.
12. 12. Imunoglobulina de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 11, que possui especificidade de ligação para FcRn.
13. 13. Imunoglobulina de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 12, que possui especificidade de ligação para uma molécula efectora.
14. 14. Imunoglobulina de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 13, que compreende uma imunoglobulina humana, humanizada, quimérica, murino ou camelo, ou seus homólogos. ΡΕ2028193
15. 15. Ácido nucleico que codifica uma imunoglo-bulina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14 .
16. 16. Preparação farmacêutica que contém uma imu-noglobulina de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 14 . Lisboa, 6 de Junho de 2012