RS50752B - Domeni sintetskih imunoglobulina sa svojstvima vezivanja, konstruisani u regionima molekula, koji se razlikuju od regiona, koji određuju komplementarnost - Google Patents

Abstract

Konstantni domen imunoglobulina ljudskog porekla ili njegov deo, koji obuhvata najmanje jedan region petlje bilo kog od CH1 domena, CH2 domena, CH3 domena, CH4 domena ili CL domena, navedeni najmanje jedan strukturni region petlje koji obuhvata najmanje jednu modifikaciju koja omogućava vezivanje navedenog najmanje jednog modifikovanog regiona petlje za epitop antigena, gde se nemodifikovani konstantni domen imunoglobulina ne vezuje za navedeni epitop, gde navedena modifikacija isključuje ugrađivanje farmakološki aktivnog peptida od 2 do 40 amino kiselina u Fc domen.Prijava sadrži još 10 patentnih zahteva.

Description

DOMENI SINTETSKIH

IMUNOGLOBULINA SA SVOJSTVIMA

VEZIVANJA, KONSTRUISANIU

REGIONIMA MOLEKULA, KOJI SE

RAZLIKUJU OD REGIONA, KOJI

ODREĐUJU KOMPLEMENTARNOST

Ovaj pronalazak se odnosi na postupak konstruisanja i proizvodnje modifikovanog imunoglobulina.

Opšta oblast jeste konstruisanje proteina sa ciljem da ih opskrbi specifičnim vezujućim karakteristikama. Određenije, konstruisani proteini od značaja ovde su imunoglobulini (antitela), a još specifičnije, pojedinačni domeni ili parovi ili kombinacije pojedinačnih domena imunoglobulina. Specifična vezujuća svojstva imunoglobulina su važne karakteristike, budući da one kontrolišu interakciju sa drugim molekulima, kao što su antigeni i povratni imunoglobulini, koji su korisni za dijagnostičke i terapeutske primene.

Osnovna struktura antitela će ovde biti objašnjena korišćenjem, kao primera, intaktnog lgG1 imunoglobulina.

Dva identična teška (H) i dva identična laka (l_) lanca sjedinjuju se kako bi obrazovali molekul antitela Y-oblika. Svaki od teških lanaca ima četiri domena. Amino terminalni varijabilni domeni (VH) su na krakovima Y-a. Oni su praćeni sa tri konstantna domena: CH1, CH2 i karboksi terminalni CH3, na bazi stabla Y-a. Kratki raspon, skretnica, povezuje varijabilne i konstantne regione teškog lanca. Zglob povezuje CH2 i CH3 (Fc fragment) za ostatak antitela (Fab fragmenti). Jedan Fc i dva identična Fab fragmenta mogu biti proizvedena proteolitičkim otcepljivanjem zgloba u intaktnom molekulu antitela. Laki lanci su konstruisani od dva domena, varijabilnog (VL) i konstantnog (CL), koji su razdvojeni skretnicom.

Disulfidne veze u regionu zgloba povezuju dva teška lanca. Laki lanci su kuplovani na teške lance dodatnim disulfidnim vezama. Asn-spojeni ugljenohidratni delovi su pričvršćeni za različite položaje u konstantnim domenima, u zavisnosti od klase imunoglobulina. U lgG1, dve disulfidne veze u zglobnom regionu, između Cys235 i Cys238 parova, spajaju dva teška lanca. Laki lanci su kuplovani na teške lance pomoću dve dodatne disulfidne veze, između Cys229 u CH1 domenima i Cys214 u CL domenima. Ugljenohidratni delovi su pričvršćeni za Asn306 svakog CH2, proizvodeći izrazito ispupčenje u stablu Y-a.

Ove karakteristike imaju temeljne funkcionalne posledice. Varijabilni regioni i teških (VH) i lakih lanaca (VL) leže na "krakovima" Y-a, gde su oni pozicionirani kako bi reagovali sa antigenom. Ovaj krak molekula jeste strana, na kojoj je lociran N-kraj aminokiselinske sekvence. Stablo Y-a projektuje se na neki način, kako bi efikasno posredovalo u efektorskim funkcijama, kao što je aktivacija komplementa i interakcija sa Fc receptorima, ili ADCC i ADCP. Njegovi CH2 i CH3 domeni ispupčeni su kako bi olakšali interakciju sa efektorskim proteinima. C-kraj aminokiselinske sekvence lociran je na suprotnoj strani kraka, koji se može nazvati "temeljem" Y-a. Struktura intaktnog lgG1 ilustrativno je prikazana na Slici 1a.

U antitelima su utvrđena dva tipa lakih lanaca, označenih sa lambda (A) i kapa (k). Dati imunoglobulin ima iliklance ili A lance, nikad po jedan od svakog. Nisu utvrđene funkcionalne razlike između antitela, koja imaju A iliklake lance.

Strukturna organizacija monomera glavne klase humanih imunoglobulina prikazana je na Slici 1b. Klase se razlikuju u sastavu i sekvenci njihovih pojedinih teških lanaca. Oba, i IgM i IgE gube zglobni region, ali svaki sadrži ekstra domen teškog lanca (CH4). Brojnost i lokacije disulfidnih veza (linija), koje vezuju lance, razlikuju se između izotipova. Oni se, takođe, razlikuju po raspodeli N-spojenih grupa ugljenih hidrata, koji su simbolički prikazani kao krugovi.

Svaki domen u molekulu antitela ima sličnu strukturu u vidu dve beta ploče, koje su čvrsto upakovane jedna prema drugoj, u kompreosovanom neparalelnom beta stubu. Konzervisana struktura je nazvana imunoglobulinskim prevojem. Imunoglobulinski prevoj konstantnih domena sadrži 3-struku ploču upakovanu prema 4-strukoj ploči. Prevoj je stabilizovan vodoničnim vezama između beta strukova svake ploče, hidrofobnim vezivanjem između ostataka suprotnih ploča u unutrašnjosti i disulfidnom vezom između ploča. 3-struka ploča sadrži strukove C, F i G, a 4-struka ploča ima strukove A, B, E i D. Slova A do G označavaju položaje u sekvenci beta strukova, uzduž aminokiselinske sekvence imunoglobulinskog prevoja.

Prevoj varijabilnih domena ima 9 beta strukova, koji su raspoređeni u dve ploče od 4 i 5 strukova. 5-struka ploča je strukturno homologna sa 3-strukom pločom konstantnih domena, ali sadrži ekstra strukove C i C". Preostali strukovi (A, B, C, D, E, F, G) imaju istovetnu topologiju i sličnu strukturu kao i njihove kopije u konstantnom domenu imunoglobulinskih prevoja. Disulfidna veza spaja strukove B i F u suprotnim pločama, kao u konstantnim domenima. Imunoglobulinski prevoj je ilustrativno prikazan na Slici 2 za konstantni i varijabilni domen imunoglobulina.

Varijabilni domeni i lakih i teških imunoglobulinskih lanaca sadrže tri hipervarijabilne petlje ili regione, koji određuju komplementarnost (CDRi). Tri CDR-a V domena (CDR1, CDR2, CDR3) nakupljaju se na jednom kraju beta stuba. CDR-i su petlje, koje povezuju beta strukove B-C, C'-C" i F-G imunoglobulinskog prevoja. Ostaci u CDR-ima variraju od jednog imunoglobulinskog molekula do drugog, pružajući antigensku specifičnost svakom antitelu.

VL i VH domeni na krakovima molekula antitela blisko su upakovani tako da 6 CDR-a (3 na svakom domenu) zajednički sudeluju u konstruisanju površine (ili šupljine) za antigen-specifično vezivanje. Prirodni antigen vezujući položaj antitela, tako je sastavljen od petlji, koje povezuju strukove B-C, C'-C" i F-G varijabilnog domena lakog lanca i strukove B-C, C'-C" i F-G varijabilnog domena teškog lanca.

Koristeći 3D strukturu proteina kao pomoć u dizajniranju, aminokiselinski ostaci koji su locirani na površini mnogih proteina, bili su nasumično raspoređeni, koristeći strukturu jezgra proteina kao osnovu građe. Primeri ove strategije opisani su ili izloženi u sledećim referencama, koje su ovde uključene kao reference: Nvgren PA, Uhlen M., Curr Opin Struct Biol. (1997) 7:463-9; Binz HK, Amstutz P, Kohl A, Strumpp MT, Briand C, Forrer P, Grutter MG, Pluckthun A. Nat Biotechnol. (2004) 22:575-82; Vogt M, Skerra A. Chembiochem. (2004) 5:191-9; US 6,562,617.

Osnovni princip ove tehnike zasnovan je na zapažanju da mnogi proteini imaju stabilno jezgro, koje je obrazovano specifičnim razvrstavanjem sekundarnih strukturnih elemenata, kao što su beta ploče ili alfa heliksi, koji su međusobno povezani strukturama, kao što su: petlje, zavoji ili nasumične spirale. Uobičajeno, ova poslednja tri strukturna elementa su manje značajna za celokupnu strukturu proteina, a aminokiselinski ostaci u ovim strukturnim elementima mogu biti zamenjeni, često bez razaranja opšteg prevoja proteina. Primer ovog principa dizajniranja, koji postoji u prirodi, jesu CDR-i antitela. Veštački primeri obuhvataju: lipokaline, ankirine i druge proteinske građevine.

Petlje, koje nisu CDR-petlje u nativnom imunoglobulinu, ne poseduju antigen vezujuću ili epitop vezujuću specifičnost, ali doprinose korektnom savijanju celokupnog imunoglobulinskog molekula i/ili njegovog efektora ili drugim funkcijama, i zbog toga su nazvane, za potrebe ovog pronalaska, strukturnim petljama.

U United States Patentu 6,294,654, prikazano je kako mogu biti proizvedena izmenjena antitela, u kojima peptidni antigen može biti uključen u ne-CDR petlju antitela (Ab) u CH1 regionu, između zglobnog regiona i varijabilnog regiona, a nastalo Ab može biti preuzeto u APC, tako da je peptidni antigen prisutan na površini APC, u sklopu MHC II, i time proizvesti imuni odgovor. Ovi umetnuti peptidi su epitopi, a ukupna struktura molekula nosača nije od važnosti. Demonstrirano je kako ras peptid može biti postavljen na (ne-CDR) petlju Imunoglobulina, a Imunoglobulin još može biti sekretovan. Postoji stroga "kontrola kvaliteta" u ćelijama, koje sprečavaju da Imunoglobulin bude sekretovan, dok nije pravilno savijen, a izmena aminokiselinske sekvence petlje mogla bi prouzrokovati savijanje proteina u strukturu, koju bi ćelije detektovale kao nekorektnu, i zbog toga je razgradile. Zato, pored toga što su primeri pokazali, smatra se da je komplikovano da se dalje modifikuju strukturne petlje, bez izmene prirode Imunoglobulina.

US Pat prijava 2004/0101905 opisuje vezujuće molekule, koji sadrže ciljni vezujući položaj i Fc efektorski peptid. Fc efektorski peptid je peptid, koji stupa u međudejstvo sa efektorskim molekulom. Bilo je prikazano umetanje efektorskog peptida u ne-CDR petlju CH1-domena imunoglobulinskog fragmenta.

Fc efektorski peptidi su strukture, koje postoje u prirodi u ne-CDR petljama antitela, pa se, iz tih razloga, očekuje da se ne narušava struktura imunoglobulina ukoliko se kaleme na različite ekvivalentne lokacije u imunoglobulinu.

Uprkos tome što svaki protein, nakalemljen na ne-CDR petlju, u skladu sa ovim izlaganjem, ima veliku šansu da bude inaktiviran pomoću različitog strukturnog okruženja, on je bio odabran.

U oba prethodna stručna dokumenta, koja su gore pomenuta, utvrđeno je da je komplikovano da se peptidi umeću u petlju, koja bi zadržala svoju strukturu i funkciju, budući da je presudno da se ne naruši savijena imunglobulinska struktura, jer je to značajno za funkciju i sekreciju.

US Patentne prijave 2004/0132101 i 2005/0244403 opisuju mutant imunoglobuline sa izmenjenim afinitetom vezivanja za efektorske ligande, koji su prirodni ligandi za strukturne petlje anitela. U ovim dokumentima, opisane su brojne mutacije u raznim regionima, uzduž celokupnog imunoglobulinskog molekula, koje utiču na efektorsku funkciju celog antitela.

WO 01/83525 se odnosi na proteine, koji sadrže Fc domene, spojene sa biološki aktivnim peptidima, na koji način su navedeni peptidi spojeni sa Fc domenima na njihovom N- ili C-kraju.

US 2002/0106370 prikazuje himerne polipeptide, koji sadrže vezujući deo, koji pokazuje specifični afinitet vezivanja za površinu ciljnih eukariotskih ćelija i za efektorski deo.

WO 02/32925 prikazuje proteine, koji su sposobni za funkciju sličnu antitelu. Da bi se ovo postiglo, takođe se strukture petlje uvode u navedene proteine, koji po strukturi i položaju, odgovaraju CDR petljama.

WO 2006/036834 izlaže molekule i postupke, kojima se biološki aktivni peptidi ugrađuju u region petlje Fc domena. Biološki aktivan peptid sa željenom biološkom aktivnošću je, najpre odabran, a zatim uveden u Fc domene, ili povezivanjem peptida sa proteinom ili umetanjem pojedine nukleinske kiseline u nukleinsku kiselinu, koja kodira Fc domen.

Ostala prethodna stručna dokumenta pokazuju da je, dosad, građevina, slična imunoglobulinu, bila korišćena, za potrebe manipulisanja postojećim antigen vezujućim položajem, uvodeći, time nove karakteristike vezivanja. Dosad su, međutim, bili izgrađeni samo CDR regioni za vezivanje antigena, drugim recima, u slučaju imunoglobulinskog savijanja, bio je modifikovan samo prirodni antigen vezujući položaj, kako bi se izmenio njegov afinitet ili specifičnost vezivanja. Postoji velika većina literature, koja opisuje različite formate takvih manipulisanih imunoglobulina, često izraženih u formi jedno-lančanih Fv fragmenata (scFv) ili Fab fragmenata, ili izloženih na površini čestica faga ili rastvorljivo ekspresovanih u raznim ekspresionim sistemima prokariota ili eukariota. Među vodećim autorima u ovoj oblasti su: Greg Winter, Andreas Pluckthun i Hennie Hoogenboom.

Cilj ovog pronalaska jeste da se obezbede imunoglobulini sa uvedenim novim antigen vezujućim položajima, i postupci za izgradnju i proizvodnju navedenih imunoglobulina.

Iz tih razloga, ovaj pronalazak se odnosi na konstantni domen imunoglobulina ili na njegovu prethodnicu, kao što je definisano u patentnim zahtevima 1 do 7 i na molekule nukleinske kiseline, koje kodiraju navedeni imunoglobulin, kao što je definisano u patentnom zahtevu 7.

Postupak konstruisanja imunoglobulina, koji uključuje najmanje jednu modifikaciju u strukturnom regionu petlje navedenog imunoglobulina i utvrđivanje vezivanja navedenog imunoglobulina za epitop antigena, pri čemu se nemodifikovani imunoglobulin ne vezuje značajno za navedeni epitop, obuhvata korake: - obezbeđivanja nukleinske kiseline, koja kodira imunoglobulin, koji sadrži najmanje jedan strukturni region petlje, - modifikovanja najmanje jednog nukleotidnog ostatka iz najmanje jednog od navedenih strukturnih regiona petlje, - prevođenja navedene modifikovane nukleinske kiseline u ekspresioni sistem,

- ekspresovanja navedenog modifikovanog imunoglobulina,

- dovođenja u kontakt ekspresovanog modifikovanog imunoglobulina sa epitopom, i - određivanja da li se navedeni modifikovani imunoglobulin veže za navedeni epitop.

Posebno, navedeni postupak konstruisanja uključuje imunoglobulin, koji se specifično vezuje za epitop antigena, odabranog iz grupe, koju sačinjavaju: alergeni, antigeni povezani sa tumorima, sopstveni antigeni, enzimi, bakterijski antigeni, gljivični antigeni, antigeni protozoa i virusni antigeni. Kroz modifikovanje u strukturnom regionu petlje, može biti izgrađen imunoglobulin, vezan za epitop. U poželjnom ostvarenju, imunoglobulin se specifično vezuje za najmanje dva takva epitopa, koji se razlikuju jedan od drugog, ili od istog antigena ili od različitih antigena.

Na primer, postupak se odnosi na konstruisanje imunoglobulina, koji se specifično vezuje za najmanje jedan prvi epitop i koji uključuje, najmanje jednu, modifikaciju u, najmanje jednom, strukturnom regionu petlje navedenog imunoglobulina, i na određivanje specifičnog vezivanja navedenog, najmanje jednog, regiona petlje za, najmanje jedan, drugi epitop, epitop, koji je odabran iz grupe antigena, kao što su gore pomenuti, pri čemu se nemodifikovani strukturni region petlje (ne-CDR region) ne vezuje specifično za navedeni, najmanje jedan, drugi epitop, a koji obuhvata korake: - obezbeđivanja nukleinske kiseline, koja kodira imunoglobulin, koji se specifično vezuje za, najmanje jedan, prvi epitop, koji sadrži, najmanje jedan, strukturni region petlje, - modifikovanja, najmanje jednog, nukleotidnog ostatka, najmanje jednog od navedenih regiona petlje, koje kodira navedena nukleinska kiselina, - prevođenja navedene modifikovane nukleinske kiseline u ekspresioni sistem,

- ekspresovanja navedenog modifikovanog imunoglobulina,

- dovođenja u kontakt ekspresovanog modifikovanog imunoglobulina sa navedenim, najmanje jednim, drugim epitopom, i - utvrđivanja da li se navedeni modifikovani imunoglobulin specifično vezuje za drugi epitop.

Postupak se, poželjno, odnosi na, najmanje jednu, modifikaciju u, najmanje jednom, strukturnom regionu petlje navedenog imunoglobulina i na određivanje specifičnog vezivanja navedenog, najmanje jednog, regiona petlje za, najmanje jedan, antigen, odabran iz grupe, koju sačinjavaju: alergeni, antigeni povezani sa tumorima, sopstveni antigeni, enzimi, bakterijski antigeni, gljivični antigeni, virusni antigeni i protozoalni antigeni, pri čemu se imunoglobulin, koji sadrži nemodifikovani strukturni region petlje ne vezuje specifično za navedeni, najmanje jedan, antigen.

Izraz "imunoglobulini", koji se modifikuju u skladu sa ovim pronalaskom (kao što su ovde korišćeni, izrazi imunoglobulin i antitelo su međusobno zamenjivi), mogu pokazivati mono- ili multi-specifične, ili multivalentne karakteristike vezivanja, najmanje dva, poželjno, najmanje tri specifična položaja vezivanja za epitope npr., antigena, efektorskih molekula/proteina. Imunoglobulini, u skladu sa pronalaskom, takođe su funkcionalni fragmenti, prihvaćeni u struci, kao što su: Fc, Fab, scFv, pojedinačni lančani dimeri CH/CL domena, Fv ili drugi derivati ili kombinacije imunoglobulina, domeni varijabilnog regiona teških i lakih lanaca (kao što su Fd, VI, Vk, Vh) i konstantnog regiona intaktnog antitela, kao što su CH1, CH2, CH3, CH4, Cl i Ck, kao i mini-domeni, sastavljeni od dva beta struka imunoglobulinskog domena, koji su povezani strukturnom petljom.

Podrazumeva se da izraz "imunoglobulin", "modifikovani imunoglobulin" ili "imunoglobulin u skladu sa pronalaskom" uključuje, isto tako, derivat imunoglobulina. Derivat je bilo koja kombinacija jednog ili više imunoglobulina pronalaska i ili fuzionog proteina, u kojima bilo koji domen ili minidomen imunoglobulina pronalaska, može biti spojen na bilo kojoj poziciji jednog ili više drugih proteina (kao što su drugi imunoglobulini, ligandi, gradivni proteini, enzimi toksina i slično). Derivat imunoglobulina pronalaska može se, isto tako, dobiti vezivanjem na druge supstance raznim hemijskim tehnikama, kao što je kovalentno kuplovanje, elektrostatska interakcija, disulfidno vezivanje, itd.

Druge supstance, vezane na imunoglobuline, mogu biti: lipidi, ugljeni hidrati, nukleinske kiseline, organski i neorganski molekuli ili bilo koja njihova kombinacija (npr., PEG, prolekovi ili lekovi). Derivat je, takođe, imunoglobulin sa istom aminokiselinskom sekvencom, ali proizveden, kompletno ili parcijalno, iz ne-prirodnih ili hemijski modifikovanih aminokiselina.

Molekuli, konstruisani u skladu sa ovim pronalaskom, biće korisni kao samo- stojeći proteini, kao i fuzioni proteini ili derivati, najčešće spojeni na takav način da budu deo veće strukture antitela ili kompletnih molekula antitela ili njihovih delova, kao što su Fab fragmenti, Fc fragmenti, Fv fragmenti i drugi. Biće moguće da se konstruisani proteini koriste za proizvodnju molekula, koji su monospecifični, bispecifični, trispecifični i možda čak nose više specifičnosti u isto vreme, a biće moguće, u isto vreme, da se kontroliše i, u isto vreme, prethodno izabere valenca vezivanja, u skladu sa zahtevima planirane upotrebe takvih molekula.

U skladu sa ovim pronalaskom, vezujući regioni za antigene ili antigen vezujući položaji svih vrsta alergena, antigena povezanih sa tumorima, sopstvenih antigena, enzima, bakterijskih antigena, gljivičnih antigena, protozoalnih antigena i virusnih antigena, mogu se uvesti u strukturnu petlju date strukture antitela.

Izraz "antigen", u skladu sa ovim pronalaskom, označavao bi molekule ili strukture, za koje se zna da stupaju u interakciju ili su u stanju da stupe u interakciju sa regionom CDR-petlje imunoglobulina. Strukturni regioni petlji iz prethodnih stručnih dokumenata ne stupaju u interakciju sa antigenima, već pre doprinose ukupnoj strukuri i/ili vezivanju efektorskih molekula.

Izraz "alergeni, antigeni povezani sa tumorima, sopstveni antigeni, enzimi, bakterijski antigeni, gljivični antigeni, protozoalni antigeni i virusni antigeni", u skladu sa ovim pronalaskom, uključivao bi sve alergene i antigene, koje su strukture antitela u stanju da prepoznaju i fragmente takvih molekula (posebno substrukture, koje su uopšteno označene kao "epitopi" (npr., epitopi B-ćelija)), sve dok su imunološki relevenatni, t.j., takođe prepoznatljivi od strane prirodnih ili monoklonalnih antitela.

Izraz "epitop", u skladu sa ovim pronalaskom, označavao bi molekularnu strukturu, koja može kompletno sačiniti specifičnog vezujućeg partnera, ili biti deo specifičnog vezujućeg partnera za vezujući domen ili imunoglobulin ovog pronalaska.

Hemijski, epitop može biti sastavljen od ugljenog hidrata, peptida, masne kiseline, neorganske supstance ili njihovih derivata i bilo koje njihove kombinacije. Ako je epitop polipeptid, uglavnom će uključiti najmanje 3 aminokiseline, poželjno 8 do 50 aminokiselina, a još poželjnije između oko 10-20 aminokiselina u peptidu. Nema kritične gornje granice za dužinu peptida, koji može sadržavati gotovo punu dužinu polipeptidne sekvence. Epitopi mogu biti ili linearni ili konformacioni epitopi. Linearni epitop je sastavljen od pojedinačnog segmenta primarne sekvence polipeptidnog lanca. Linearni epitopi mogu biti dodirni ili preklapajući. Konformacioni epitopi su sastavljeni od aminokiselina dovedenih u vezu, savijanjem polipeptida, da bi se obrazovala tercijarna struktura, a nije neophodno da aminokiseline budu blizu jedna drugoj u linearnoj sekvenci.

Specifično, epitopi su barem deo dijagnostički relevantnih molekula, t.j., odsustvo ili prisustvo epitopa u uzorku kvalitativno ili kvantitativno korelira sa bolešću ili stanjem zdravlja ili sa stanjem procesa proizvodnje ili sa stanjem okruženja ili ishrane. Epitopi mogu, takođe, biti barem deo terapeutski relevantnih molekula, t.j., molekula, koji mogu biti ciljano gađani od strane specifičnog vezujućeg domena, koji menja tok bolesti.

Poželjno, "alergeni, antigeni povezani sa tumorima, sopstveni antigeni, enzimi, bakterijski antigeni, gljivični antigeni, protozoalni antigeni i virusni antigeni" su oni alergeni ili antigeni, za koji je već bilo dokazano da su bili ili su u stanju da budu imunološki ili terapeutski relevantni, posebno oni, kojima je klinička efikasnost bila ispitana.

S druge strane, u skladu sa drugim aspektom ovog pronalaska, u strukturne regione petlje mogu biti, takođe, uvedeni drugi kapaciteti vezivanja, npr., kapaciteti vezivanja za male molekule, kao što su tekovi ili enzimi, katalitički položaji enzima ili enzimskih supstrata ili za analoge tranzicionog stanja enzimskog supstrata.

Poželjno, novi antigen vezujući položaj u strukturnim petljama, stran je nemodifikovanom imunoglobulinu. Zbog toga su, metama slični, efektorski molekuli ili

Fc-receptori, poželjno, isključeni iz vezujućih molekula i specifičnosti imunoglobulina, u skladu sa pronalaskom.

Poželjno, novi antigen vezujući položaji u strukturnim petljama uvedeni su pomoću supstitucije, delecije i/ili umetanja imunoglobulina, koga kodira odabrana nukleinska kiselina.

U skladu sa drugim, poželjnim, ostvarenjem ovog pronalaska, modifikacija najmanje jednog nukleotida dovodi do supstitucije, delecije i/ili umetanja imunoglobulina, koga kodira navedena nukleinska kiselina.

Modifikacija najmanje jednog regiona petlje može dovesti do supstitucije, delecije i/ili umetanja 1 ili više aminokiselina, poželjno tačkaste mutacije, izmene celih petlji, poželjnije izmene najmanje 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 sve do 30 aminokiselina.

Takođe je poželjna nasumična mutacija, usmerena ka položaju. Ovim postupkom, jedan ili više specifičnih aminokiselinskih ostataka petlje, izmenjen je ili uveden, korišćenjem nasumično proizvedenih umetaka, u takve strukturne petlje. Alternativno, poželjna je upotreba kombinatornih pristupa.

Najmanje jedan region petlje, poželjno je mutiran ili modifikovan nasumičnim, polu-nasumičnim postupcima ili, posebno, postupcima nasumične mutageneze, usmerenim prema položaju. Ovi postupci mogu biti korišćeni za izradu aminokiselinskih modifikacija na željenim položajima imunoglobulina ovog pronalaska. U ovim slučajevima, položaji su birani nasumično, ili su aminokiselinske izmene izvedene korišćenjem jednostavnih pravila. Primera radi, svi ostaci mogu biti mutirani u alanin, što je označeno kao alaninsko skeniranje. Takvi postupci mogu biti vezani sa sofisticiranijim inženjerijskim pristupima, koji koriste selektivne postupke za zaštitu visokih nivoa različitosti sekvenci. Poželjni postupak, u skladu sa pronalaskom, odnosi se na nasumično modifikovani molekul nukleinske kiseline, koji sadrži najmanje jednu nukleotidnu jedinicu, koja se ponavlja, a ima sekvencu 5'-NNS-3', 5'-NNN-3' ili 5'-NNK-3\

Nasumično modifikovani molekul nukleinske kiseline može sadržavati gore identifikovane jedinice, koje se ponavljaju, koje kodiraju sve poznate aminokiseline, koje postoje u prirodi.

Kao što je, u struci, dobro poznato, postoje raznovrsne selektivne tehnologije, koje mogu biti korišćene za identifikovanje i izolovanje proteina sa određenim karakteristikama i afinitetima vezivanja, uključujući, primera radi, tehnologije izlaganja, kao što je izlaganje faga, izlaganje nbosoma, izlaganje ćelijske površine i slično, kao što je opisano ispod. Postupci za proizvodnju i skriniranje varijanti antitela, dobro su poznati u struci. Opšti postupci molekularne biologije antitela, ekspresije, prečišćavanja i skriniranja, opisani su u Antibodv Engineering, koje su izdali Duebel & Kontermann, Springer-Verlag, Heidelberg, 2001; i Havhurst & Georgiou, 2001, Curr Opin Chem Biol 5:683-689; Mavnard & Georgiou, 2000, Annu Rev Biomed Eng 2:339-76.

"Strukturnu petlju" ili "ne-CDR-petlju", u skladu sa ovim pronalaskom, treba shvatiti na sledeći način: imunoglobulini su izrađeni od domena sa takozvanim imunoglobulinskim prevojem. U suštini, ne-paralelne beta ploče povezane su petljama, da bi se obrazovao kompresovani neparalelni beta stub. U varijabilnom regionu, neki od petlji domena suštinski doprinosi specifičnosti antitela, t.j. vezivanju za antigen. Ove petlje su nazvane CDR-petlje. Sve druge petlje domena antitela pre doprinose strukturi molekula i/ili funkciji efektora. Ove petlje su ovde definisane kao strukturne petlje ili ne-CDR petlje.

Molekuli nukleinske kiseline, koji kodiraju modifikovane imunoglobuline (i tokom celokupnog opisa patenta, u nastavku, uvek uključene imunoglobulinske fragmente) mogu biti klonirani u ćelije domaćina, ekspresovani i ispitani na njihove specifičnosti vezivanja. Ovi postupci su izvedeni korišćenjem dobro poznatih procedura i brojnih postupaka, koji mogu naći primenu u ovom pronalasku, a opisani su u Molecular Cloning - A Laboratorv Manual 3. sup. rd Ed. (Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratorv Press, New York, 2001) i Current Protocols in Molecular Biologv (John Wiley & Sons). Nukleinske kiseline, koje kodiraju modifikovane imunoglobuline ovog pronalaska, mogu biti ugrađene u ekspresioni vektor, da bi se ekspresovali navedeni imunoglobulini. Ekspresioni vektori obično sadrže operativno vezan imunoglobulin, koji je postavljen u funkcionalnu vezu, sa kontrolnim ili regulatornim sekvencama, selektivnim markerima, bilo kojim fuzionim partnerima i/ili dodatnim elementima. Modifikovani imunoglobulini ovog pronalaska mogu se proizvesti kultivisanjem ćelija domaćina, transformisanih nukleinskom kiselinom, poželjno ekspresionim vektorom, koji sadrži nukleinsku kiselinu, koja kodira modifikovane imunoglobuline, pod odgovarajućim uslovima, da bi se indukovala ili prouzrokovala ekspresija modifikovanih imunoglobulina. Postupci uvođenja egzogenih molekula nukleinske kiseline u domaćina, dobro su poznati u struci, i variraće u zavisnosti od domaćina, koji je korišćen. Naravno, isto tako mogu biti upotrebljeni acelularni ekspresioni sistemi ili ekspresioni sistemi bez ćelija, za ekspresiju modifikovanih imunoglobulina.

U poželjnom ostvarenju ovog pronalaska, modifikovani imunoglobulini su prečišćeni ili izolovani nakon ekspresije. Modifikovani imunoglobulini mogu biti izolovani ili prečišćeni različitim načinima, poznatim stručnim licima u ovoj oblasti. Standardni postupci prečišćavanja uključuju hromatografske tehnike, elektroforetske, imunološke, precipitacione, dijalizne, filtracione tehnike, tehnike koncentrisanja i hromatofokusiranja. Prečišćavanje često može biti omogućeno pomoću pojedinog fuzionog partnera. Na primer, antitela mogu biti prečišćena korišćenjem glutation smole, ako se koristi GST fuzija, Ni<+2>afinitetne hromatografije, ako je korišćen His-Tag ili ako je korišćen fleg-tag, korišćenjem imobilisanih anti-fleg antitela. Za opšte preporuke u pogodnim tehnikama prečišćavanja vidi Antibody Purification: Principles and Practice, 3.sup.rd Ed., Scopes, Springer-Verlag, NY, 1994. Naravno, takođe je moguće da se ekspresuju modifikovani imunoglobulini, u skladu sa ovim pronalaskom, na površini domaćinske ćelije, posebno na površini ćelije bakterije, insekta ili kvasca ili na površini faga ili virusa.

Modifikovani imunoglobulini mogu biti skrinirani korišćenjem raznolikih postupaka, koji uključuju, ali se ne njima ne ograničavaju, tehnologije, koje koriste in vitro testove, in vivo testove, testove na bazi ćelija i selektivne tehnologije. U skrining procedurama mogu se koristiti automatizacija i skrining tehnologije visokog protoka. Skrining može uključiti upotrebu fuzionog partnera ili obeleživača, na primer, enzima, imuno obeleživača, izotopskog obeleživača ili malih molekula obeleživača, kao što su fluorescentna ili kolorimetrijska boja ili luminogeni molekul.

U poželjnom ostvarenju, funkcionalne i/ili biofizičke karakteristike imunoglobulina skrinirane su in vitro testom. U poželjnom ostvarenju, ispitana je funkcionalnost antitela, na primer, njihova sposobnost da katalizuju reakciju ili njihov afinitet vezivanja za svoju metu.

Testovi mogu uključiti razne postupke detekcije, koji uključuju, ali bez ograničenja, hromogene, fluorescentne, luminsicentne ili izotopske obeleživače.

Kao što je u struci poznato, podgrupa skrining testova su oni testovi, kojima se biraju pogodni članovi biblioteke. Postupci su ovde označeni kao "selektivni postupci", a ovi postupci nalaze upotrebu u ovom pronalasku za skriniranje modifikovanih imunoglobulina. Kada su biblioteke imunoglobulina skrinirane korišćenjem selektivnog postupka, samo oni članovi biblioteke, koji su pogodni, to jest koji zadovoljavaju neke selektivne kriterijume, umnoženi su, izolovani i/ili opservirani. Kao što će biti procenjeno, budući da se opservira samo najveći broj pogodnih varijanti, takvi postupci omogućuju skriniranje biblioteka, koje su veće od onih, koje se mogu skrinirati postupcima, koji pojedinačno ispituju pogodnost članova biblioteke. Selekcija je omogućena bilo kojim postupkom, tehnikom, ili fuzionim partnerom, koji povezuje, kovalentno ili nekovalentno, fenotip imunoglobulina sa njihovim genotipom, što je funkcija antitela sa nukleinskom kiselinom, koja ga kodira. Na primer, upotreba izloženog faga, kao selektivnog postupka, omogućena je fuzijom članova biblioteke za gen III. protein. Na ovaj način, selekcija ili izolovanje modifikovanih imunoglobulina, koji zadovoljavaju neke kriterijume, primera radi, afinitet vezivanja za imunoglobulinsku metu, takođe, omogućuje selekciju ili izoiovanje nukleinske kiseline, koja ih kodira. Čim su izolovani, gen ili geni, koji kodiraju modifikovane imunoglobuline, mogu biti amplifikovani. Ovaj postupak izolovanja i amplifikacije, označen kao paning, može se ponoviti, omogućujući da se uvećaju varijante pogodnog antitela u biblioteci. Sekvencioniranje nukleinskih kiselina vezane nukleinske kiseline konačno omogućuje identifikaciju gena.

U struci su poznati razni selektivni postupci, koji, u ovom pronalasku, mogu naći primenu u skriniranju biblioteka imunoglobulina. Oni uključuju, ali bez ograničenja: izloženost faga (Phage displav of peptides and antibodies: a laboratorv manual, Kay et al., 1996, Academic Press, San Diego, Calif., 1996; Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10838; Smith, 1985, Science 228:1315-1317) i njegovih derivata, kao što je stvaranje selektivne fagne infekcije (Malmborg et al., 1997, J Mol Biol 273:544-551), stvaranje selektivno infektivnih faga (Krebber et al., 1997, J Mol Biol 268:619-630) i stvaranje odložene infektivnosti (Benhar et al., 2000, J Mol Biol 301:893-904), izloženost ćelijske površine (VVitrrup, 2001, Curr Opin Biotechnol, 12:395-399), kao što je izlaganje na bakterijskim ćelijama (Georgiou et al., 1997, Nat Biotechnol 15:29-34; Georgiou et al., 1993, Trendis Biotecnol 11:6-10; Lee et al., 2000, Nat Biotechnol 18:645-648; Jun et al., 1998, Nat Biotechnol 16: 576-80), kvascima (Boder & Vvlttrup, 2000, Methods Enzymol 328:430-44; Boder & Vvltrup, 1997, Nat Biotechnol 15:553-557), i ćelijama sisara (VVhitehorn et al., 1995, Bio/technology 13:1215-1219), kao i in vitro tehnologije izlaganja (Amstutz et al., 2001, Curr Opin Biotechnol 12:400-405), kao što je izloženost polizoma (Mattheakis et al., 1994, Proc Natl Acad Sci USA 91:9022-9026), izloženost ribozoma (Hanes et al., 1997, Proc Natl Acad Sci USA 94:4937-4942), izloženost mRNK (Roberts & Szostak, 1997, Proc Natl Acad Sci USA 94:12297-12302; Nemoto et al., 1997, FEBS Lett 414:405-408) i sistem izlaganja inaktivacije ribozoma (Zhou et al., 2002, J Am Chem Soc 124, 538-543).

Drugi selektivni postupci, koji mogu naći primenu u ovom pronalasku, uključuju postupke, koji se ne oslanjaju na izloženost, kao što su in vivo postupci, koji uključuju, ali se njima ne ograničavaju, periplazmatsku ekspresiju i citometrijski skrining (Chen et al., 2001, Nat Biotechnol 19:537-542), test komplementarnosti fragmenta antitela (Johnsson & Varshavsky, 1994, Proc Natl Acad Sci USA 91:10340-10344; Pelletier et al., 1998, Proc Natl Acad Sci USA 95:12141-12146) i dvo hibridno skriniranje kvasca (Fields & Song, 1989, Nature 340:245-246), korišćeno u selektivnom modu (Visintin et al., 1999, Proc Natl Acad Sci USA 96:11723-11728). U alternativnom ostvarenju, selekcija je omogućena upotrebom fuzionog partnera, koji se veže na specifičnu sekvencu ekspresionog vektora, povezujući, tako, kovalentno ili nekovalentno, fuzionog partnera i povezanu Fc varijantu člana biblioteke sa nukleinskom kiselinom, koja ih kodira. Primera radi, PCT WO 00/22906; PCT WO 01/49058; PCT WO 02/04852; PCT WO 02/04853; PCT WO 02/08023; PCT WO 01/28702 i PCT WO 02/07466, opisuju takvog partnera fuzije i tehnike, koje mogu naći primenu u ovom pronalasku. U alternativnom ostvarenju, može se desiti i in vivo selekcija, ukoliko ekspresija antitela pruža ćeliji neke prednosti u odnosu na rast, reprodukciju ili preživljavanje.

Podgrupa selektivnih postupaka, koji su označeni kao postupci "usmerene evolucije" su oni koji uključuju ispletanje i stvaranje pogodnih sekvenci, tokom selekcije; ponekad sa uključivanjem novih mutacija. Kao što stručna lica ovoj oblasti mogu proceniti, postupci usmerene evolucije mogu olakšati identifikaciju najpogodnije sekvence u biblioteci, i mogu povećati raznolikost sekvenci, koje se skriniraju. U struci su poznati razni postupci usmerene evolucije, koji, u ovom pronalasku, mogu naći primenu u skriniranju varijanti antitela, uključujući, ali bez ograničavanja njima: mešanje DNK (PCT WO 00/42561 A3; PCT WO 01/70947 A3), mešanje egzona (U.S. Pat. No. 6,365,377; Kolkman & Stemmer, 2001, Nat Biotechnol 19:423-428), mešanje familija (Crameri et al., 1998, Nature 391:288-291; U.S. Pat. No. 6,376,246), RACHITT.TM. (Coco et al., 2001, Nat Biotecnol 19:354-359; PCT WO 02/06469), STEP i nasumični prajming in vitro rekombinovanja (Zhao et al., 1998, Nat Biotechnol 16:258-261; Shao et al., 1998, Nucleic Acids Res 26:681-683), slaganje gena posredovano egzonukleazom (U.S. Pat. No. 6,352,842; U.S. Pat. No. 6,361,974), Gene Site Saturation Mutagenesis. TM. (U.S. Pat. No. 6,358,709), Gene Reassembly.TM. (U.S. Pat. No. 6,358,709), SCRATCHY (Lutz et al., 2001, Proc Natl Acad Sci USA 98:11248-11253), postupke fragmentacije DNK (Kikuchi et al., Gene 236: 159-167), mešanje jednostruke DNK (Kikuchi et al., 2000, Gene 243:133-137) i AMEsystem.TM. usmerenu evolucionu inženjering tehnologiju antitela (Applied Molecular Evolution). (U.S. Pat. No. 5,824,514; U,S. Pat. No. 5,817,483; U.S. Pat. No. 5,814,476; U.S. Pat. No. 5,763,192; U.S. Pat. No. 5,723,323).

Varijante antitela mogu biti skrinirane korišćenjem jednog ili više testova na bazi ćelija ili in vivo testova. Za takve testove, uobičajeno se prečišćeni ili neprečišćeni modifikovani imunoglobulini dodaju egzogeno, tako da su ćelije izložene pojedinačnim imunoglobulinima ili pulovima imunoglobulina, koji pripadaju biblioteci. Ovi testovi su obično, ali ne uvek, bazirani na funkciji imunoglobulina; to jest, na sposobnosti antitela da se vežu na svoju metu i posreduju u nekim biohenrtijskim događajima, na primer, efektorskoj funkciji, inhibiciji vezivanja liganda/receptora, apoptozi, i slično. Takvi testovi često uključuju praćenje odgovora ćelija na antitelo, kao što su, primera radi, ćelijsko preživljavanje, ćelijska smrt, promena u ćelijskoj morfologiji, ili transkripciona aktivacija, kao što je ćelijska ekspresija prirodnog gena ili reporter gena. Na primer, takvi testovi mogu meriti sposobnost varijanti antitela da pobude ADCC, ADCP ili CDC. U nekim testovima može postojati potreba da se dodaju dodatne ćelije ili komponente, to jest, pored ciljnih ćelija, na primer, serumski komplement, ili efektor ćelije, kao što su monociti periferne krvi (PBMCi), NK ćelije, makrofagi i slično. Takve dodatne ćelije mogu biti iz bilo kog organizma, poželjno organizma čoveka, miša, pacova, zeca i majmuna. Imunoglobulini mogu izazvati apoptozu određenih ćelijskih nizova, koji ekspresuju ciljnu ćeliju, ili oni mogu posredovati u napadu na ciljne ćelije pomoću imunih ćelija, koje su bile dodate testu. Postupci za praćenje ćelijske smrti ili održivosti, poznati su u struci, a uključuju: upotrebu boja, imunohemijskih, citohemijskih i radioaktivnih reagenasa. Na primer, testovi caspase bojenja mogu omogućiti merenje apoptoze, a prihvatanje ili oslobađanje radioaktivnih supstrata ili fluorescentnih boja, kao što je alamar blu, mogu omogućiti praćenje rasta ili aktivacije ćelije. U poželjnom ostvarenju, može se koristiti DELFIA.RTM. test citotoksičnosti na bazi EuTDA (Perkin Elmer, MA). Alternativno, mrtve ili oštećene ciljne ćelije mogu se pratiti merenjem oslobađanja jedne ili više prirodnih intracelularnih komponenti, na primer, laktat dehidrogenaze. Transkripciona aktivacija može, takođe, poslužiti kao postupak za ispitivanje funkcije u testovima na bazi ćelija. U ovom slučaju, odgovor se može pratiti ispitivanjem prirodnih gena ili imunoglobulina, koji mogu biti ushodno regulisani, primera radi, može se meriti oslobađanje određenih interleukina, ili se alternativno iščitavanje može izvesti preko konstrukcije reportera. Testovi na bazi ćelija mogu, isto tako, uključiti merenje morfoloških promena u ćelijama, kao odgovor na prisustvo modifikovanih imunoglobulina. Ćelijski tip, za takve testove, može biti prokariotski ili eukariotski, a mogu se koristiti razni ćelijski nizovi, koji su poznati u ovoj oblasti. Alternativno, testovi na bazi ćelija izvedeni su korišćenjem ćelija, koje su bile transformisane ili transfektovane sa nukleinskim kiselinama, koje kodiraju varijante. To jest, varijante antitela nisu egzogeno dodate ćelijama. Primera radi, u jednom ostvarenju, skriniranje na ćelijskoj osnovi koristi otkrivanje ćelijske površine. Može se koristiti fuzioni saučesnik, koji omogućuje otkrivanje modifikovanih imunoglobulina na površini ćelija (VVitrrup, 2001, Curr Opin Biotechnol, 12:395-399).

U poželjnom ostvarenju, imunogenost modifikovanih imunoglobulina može se eksperimentalno odrediti, korišćenjem jednog ili više testova na ćelijskoj bazi. U poželjnom ostvarenju, korišćeni su testovi ex vivo aktivacije T-ćelije, za eksperimentalno kvantitativno određivanje imunogenosti. U ovom postupku, ćelije, koje predstavljaju antigen i prirodne T ćelije iz podudarnog donora, zaustavljene su peptidom ili celim antitelom od značaja, jednom ili više puta. Zatim, može biti merena aktivacija T ćelija, korišćenjem brojnih postupaka, na primer, praćenjem proizvodnje citokina ili merenjem prihvata timidina sa tricijumom. U najpoželjnijem ostvarenju, merena je proizvodnja gama interferona, korišćenjem Elispot testa (Schmittel et al., 2000, J. Immunol. Meth., 24:17-24).

Biološka svojstva modifikovanih imunoglobulina ovog pronalaska mogu biti opisana eksperimentima na ćelijama, tkivu i ćelom organizmu. Kao što je u struci poznato, lekovi se često testiraju na životinjama, uključujući, ali bez ograničenja, miševe, pacove, zečeve, pse, mačke, svinje i majmune, kako bi se odredila efikasnost leka u lečenju bolesti ili model bolesti, ili utvrdila farmakokinetika, toksičnost ili druga svojstva leka. Životinje se mogu označiti kao modeli bolesti. Terapeutici se često testiraju na miševima, uključujući, ali bez ograničavanja na njih, gole miševe, SCID miševe, ksenograft miševe i transgenske miševe (uključujući ukucavanja i izbijanja). Takvi eksperimenti mogu pružiti značajne podatke za određivanje potencijala antitela, koji se koristi kao terapeutik. Za ispitivanje se može koristiti bilo koji organizam, poželjno sisara. Primera radi, zbog njihove genetske sličnosti sa ljudima, pogodni terapeutski modeli mogu biti majmuni i zato mogu biti korišćeni za ispitivanje efikasnosti, toksičnosti, farmakokinetike ili drugih osobina modifikovanih imunoglobulina ovog pronalaska. Testovi na ljudima su krajnji zahtev za odobravanje lekova, tako da se ovi eksperimenti, naravno, razmatraju. Iz tih razloga, modifikovani imunoglobulini ovog pronalaska mogu biti testirani na ljudima, da bi se odredila njihova terapeutska efikasnost, toksičnost, imunogenost, farmakokinetika i/ili druge kliničke karakteristike.

Modifikovani imunoglobulini ovog pronalaska mogu naći upotrebu u širokom rasponu produkata antitela. U jednom ostvarenju, varijanta antitela ovog pronalaska koristi se za terapiju ili profilaksu, za preparativnu ili analitičku upotrebu, u vidu dijagnostičkog jedinjenja, industrijskog jedinjenja ili istraživačkog reagensa, poželjno terapeutika. Varijanta antitela može naći primenu u smeši antitela, koja su monoklonalna ili poliklonalna. U poželjnom ostvarenju, modifikovani imunoglobulini ovog pronalaska, korišćeni su za uništavanje ciljnih ćelija, koje nose ciljni antigen, na primer, kancerske ćelije. U alternativnom ostvarenju, modifikovani imunoglobulini ovog pronalaska su korišćeni kao blokatori, antagonisti ili agonisti ciljnog antigena, primera radi, stvaranjem antagonizma sa citokinom ili receptorom citokina. U alternativnom poželjnom ostvarenju, modifikovani imunoglobulini ovog pronalaska, korišćeni su kao blokatori, antagonisti ili agonisti ciljnog antigena i za uništavanje ciljnih ćelija, koje nose ciljni antigen. U alternativnom poželjnom ostvarenju, modifikovani imunoglobulini ovog pronalaska su korišćeni kao blokatori, antagonisti ili agonisti faktora rasta ili receptora faktora rasta i za uništavanje ciljnih ćelija, koje nose ili trebaju ciljni antigen. U alternativnom poželjnom ostvarenju, modifikovani imunoglobulini ovog pronalaska su korišćeni kao blokatori, antagonisti ili agonisti enzima i enzimskih supstrata.

Modifikovani imunoglobulini ovog pronalaska mogu biti korišćeni za razne terapeutske svrhe. U poželjnom ostvarenju, antitelo, koje sadrži modifikovane imunoglobuline daje se pacijentu za lečenje specifičnog poremećaja. "Pacijent", za potrebe ovog pronalaska, uključuje i ljude i životinje, poželjno sisare, a najpoželjnije ljude. Pod "specifičnim poremećajem", ovde se podrazumeva poremećaj, koji može biti ublažen primenom farmaceutske smeše, koja sadrži modifikovani imunoglobulin ovog pronalaska.

U jednom ostvarenju, modifikovani imunoglobulin, u skladu sa ovim pronalaskom, jeste jedini terapeutski aktivan agens, koji se primenjuje pacijentu. Alternativno, modifikovani imuoglobulin u skladu sa ovim pronalaskom, primenjuje se u kombinaciji sa jednim ili više drugih terapeutskih agenasa, koji uključuju, ali bez ograničavanja na njih, citotoksične agense, hemioterapeutske agense, citokine, agense, koji inhibiraju rast, anti-hormonalne agense, inhibitore kinaze, anti-angiogene agense, kardioprotektivne agense ili druge terapeutske agense. Modifikovani imunoglobulini mogu biti primenjeni istovremeno sa jednim ili više drugih terapeutskih režima. Primera radi, varijanta antitela ovog pronalaska može biti primenjena pacijentu zajedno sa hemioterapijom, radijacionom terapijom ili i hemioterapijom i radijacionom terapijom. U jednom ostvarenju, modifikovani imunoglobulini ovog pronalaska mogu biti primenjeni zajedno sa jednim ili više antitela, koja mogu, ali ne moraju sadržavati varijantu antitela ovog pronalaska. U skladu sa drugim ostvarenjem pronalaska, modifikovani imunoglobulini ovog pronalaska i jedna ili više drugih antikancerskih terapija primenjuje se za lečenje ćelija raka ex vivo. Smatra se da takav ex vivo tretman može biti koristan kod transplantacija koštane srži a, posebno, autologne transplantacije koštane srži. Smatra se, naravno, da antitela pronalaska, mogu biti korišćena u kombinaciji sa još nekim drugim terapeutskim tehnikama, kao što je hirurgija.

Razni drugi terapeutski agensi mogu naći upotrebu u primeni sa modifikovanim imunoglobulinima ovog pronalaska. U jednom ostvarenju, modifikovani imunoglobulini se primenjuju sa anti-angiogenim agensom, koji predstavlja jedinjenje, koje blokira ili interferira do nekog stepena, razvijanje krvnih sudova. Anti-angiogeni faktor može, primera radi, biti mali molekul ili protein, na primer, antitelo, Fc fuzija ili citokin, koji se veže sa faktorom rasta ili receptorom faktora rasta, koji su uključeni u podupiranje angiogeneze. Poželjni anti-angiogeni faktor, ovde je antitelo koje se veže na vaskularni endotelni faktor rasta (VEGF). U alternativnom ostvarenju, modifikovani imunoglobulin se daje sa terapeutskim agensom, koji indukuje ili pojačava adaptivni imuni odgovor, na primer, antitelo, koje cilja CTLA-4. U alternativnom ostvarenju, modifikovani imunoglobulin se primenjuje sa inhibitorom tirozin kinaze, koji je molekul, koji inhibira, do nekih granica, aktivnost tirozin kinaze. U alternativnom ostvarenju, modifikovani imunoglobulini ovog pronalaska primenjuju se sa citokinom. Pod "citokinom", kao što je ovde korišćen, misli se na generički naziv za proteine, koji se oslobađaju u jednoj ćelijskoj populaciji, i koji deluju na drugu ćeliju, kao intercelulami medijatori, uključujući hemokine.

Razmatrane su farmaceutske smeše, u kojima su formulisani modifikovani imunoglobulini ovog pronalaska i jedan ili više terapeutski aktivnih agenasa. Formulacije varijanti antitela ovog pronalaska, pripremljene su za čuvanje, mešanjem navedenog imunoglobulina, koji ima željeni stepen čistoće, sa opcionim farmaceutski prihvatljivim nosačima, ekscipijentima ili stabilizatorima (Remington's Pharmaceutical Sciences 16<th>edition, Osol, A. Ed., 1980), u formi liofilizovanih formulacija ili vodenih rastvora. Formulacije koje se upotrebljavaju primenom in vivo, poželjno su sterilne. Ovo se jednostavno postiže filtracijom kroz sterilne filtracione membrane ili drugim postupcima. Modifikovani imunoglobulini i drugi terapeutski aktivni agensi, koji su ovde izloženi, takođe mogu biti formulisani u vidu imunolipozoma i/ili sadržani u mikrokapsulama.

Primena farmaceutske smeše, koja sadrži modifikovani imunoglobulin ovog pronalaska, poželjno u formi sterilnog vodenog rastvora, može biti izvedena na razne načine, uključujući, ali bez ograničenja, oralni, subkutani, intravenski, intranazalni, intraotički, transdermalni, površinski način (npr., gelovi, melemi, losioni, kremovi, itd.), ili intraperitonealno, intramuskularno, intrapulmonalno (npr., AERx™ inhalatorna tehnologija, komercijalno raspoloživa posredstvom Aradigma, ili Inhance™ sistem za pulmonalno oslobađanje, koji je komercijalno dostupan posredstvom Inhale Therapeutics), vaginalno, parenteralno, rektalno ili intraokularno.

Kao što je ovde korišćen, izraz "specifično vezivanje" odnosi se na reakciju vezivanja, koja određuje srodni ligand od značaja, u heterogenoj populaciji molekula. Tako, pod određenim uslovima (npr., uslovi imunotesta, u slučaju imunoglobulina), specifikovano antitelo se veže na svoju pojedinu "metu", a ne vezuje se, u značajnoj količini, za druge molekule, koji su prisutni u uzorku. U poređenju sa CDR-ima antitela, modifikovani strukturni regioni petlje su proteinski delovi, koji vezuju antigen ili molekul, i kao takvi, nisu antigeni.

Izraz "ekspresioni sistem" odnosi se na molekule nukleinske kiseline, koji sadrže željenu kodirajuću sekvencu i kontrolne sekvence u operativnoj vezi, tako da su domaćini, koji su transformisani ili transfektovani sa ovim sekvencama, u stanju da proizvode kodirane proteine. Da bi se delovalo na transformaciju, ekspresioni sistem može biti uključen u vektor; međutim, relevantna DNK može, zatim, takođe, biti integrisana u hromozom domaćina.

Ekspresioni sistem može sadržavati vektor. Bilo koji ekspresioni vektor, poznat u struci, može, kao pogodan, biti korišćen za ovu svrhu.

Modifikovani imunoglobulin je, poželjno, ekspresovan u domaćinu, poželjno bakterijskoj, kvaščevoj, biljnoj ćeliji, u životinjskoj ćeliji ili u biljci ili životinji.

Široki varijetet pogodnih domaćinskih ćelija može se koristiti za ekspresovanje modifikovanog imunoglobulina, uključujući, ali bez ograničenja na njih, ćelije sisara (životinjske ćelije), biljne ćelije, bakterije (npr., Bacillus subtilis, Escherichia coli), ćelije insekata i kvasce (npr., Pichia pastoris, Saccharomvces cerevisiae). Na primer, razni ćelijski nizovi, koji mogu naći upotrebu u ovom pronalasku, opisani su katalogu ATCC ćelijskog niza, raspoloživom posredstvom American Type Culture Collection. Dalje, takođe se mogu koristiti biljke i životinje, kao domaćini za ekspresovanje imunoglobulina u skladu sa ovim pronalaskom. Ekspresioni, kao i transfekcioni vektori ili kasete mogu se odabrati prema korišćenom domaćinu.

Mogu se, naravno, koristiti acelularni proteinski ekspresioni sistemi ili proteinski ekspresioni sistemi bez ćelija. Proteinske ekspresione platforme in vitro transkripcije/translacije, koje proizvode dovoljne količine proteina, pružaju mnoge prednosti proteinske ekspresije, bez ćelija, eliminišući potrebu za napornim ushodnim i nishodnim koracima (npr., transformacija, kultivisanje ili liziranje ćelije domaćina), koji su obično povezani sa ekspresionim sistemima, na bazi ćelija.

Imunoglobulin ili njegov farmaceutski preparat, koji sadrži najmanje jednu modifikaciju u strukturnom regionu petlje navedenog imunoglobulina i koji određuje vezivanje navedenog imunoglobulina za epitop antigena, pri čemu se nemodifikovani imunoglobulin ne vezuje, značajno, za navedeni epitop, može biti proizveden na sledeći način: - obezbeđivanjem nukleinske kiseline, koja kodira imunoglobulin, koji sadrži najmanje jedan region petlje, - modifikovanjem najmanje jednog nukleotidnog ostatka najmanje jednog od navedenih regiona petlje, - prevođenjem navedene modifikovane nukleinske kiseline u ekspresioni sistem,

- ekspresovanjem navedenog modifikovanog imunoglobulina,

- dovođenjem u kontakt ekspresovanog modifikovanog imunoglobulina sa epitopom, - određivanjem da li se navedeni modifikovani imunoglobulin veže za navedeni epitop, i - obezbeđivanjem vezivanja modifikovanog imunoglobulina za navedeni epitop i opciono njegovom završnom ugradnjom u farmaceutski preparat.

Preciznije, multispecifični imunoglobulin, koji se specifično vezuje za, najmanje jedan, prvi molekul, ili njegov farmaceutski preparat, koji sadrži, najmanje jednu, modifikaciju u, najmanje jednom, strukturnom regionu petlje navedenog imunoglobulina i koji određuje specifično vezivanje navedenog, najmanje jednog, regiona petlje sa, najmanje jednim, drugim molekulom, koji je odabran iz grupe, koju sačinjavaju: alergeni, antigeni, povezani sa tumorom, sopstveni antigeni, enzimi, bakterijski antigeni, gljivični antigeni, antigeni protozoa i virusni antigeni, pri čemu se imunoglobulin, koji sadrži nemodifikovani strukturni region petlje, ne vezuje, specifično, za navedeni, najmanje jedan, drugi molekul, može biti proizveden na sledeći način: - obezbeđivanjem nukleinske kiseline, koja kodira imunoglobulin, koji se specifično vezuje za, najmanje jedan, prvi molekul, koji sadrži, najmanje jedan, strukturni region petlje, - modifikovanjem, najmanje jednog, nukleotidnog ostatka, najmanje jednog od navedenih regiona petlje, koje kodira navedena nukleinska kiselina, - prevođenjem navedene, modifikovane nukleinske kiseline u ekspresioni sistem,

- ekspresovanjem navedenog modifikovanog imunoglobulina,

- dovođenjem u kontakt ekspresovanog, modifikovanog imunoglobulina sa navedenim, najmanje jednim, drugim molekulom, i - utvrđivanjem, da li se navedeni, modifikovani imunoglobulin specifično vezuje za drugi molekul, i - obezbeđivanjem da se modifikovani imunoglobulin specifično vezuje za navedeni, najmanje jedan, drugi molekul i opciono, njegovom završnom ugradnjom u farmaceutski preparat.

Poželjno je konstruisanje više od jedne specifičnosti u člana specifičnog vezujućeg para (Kufer et al. (2004) Trends in Biotechnologv vol. 22 strane 238-244).

Izvedeni su brojni poduhvati da se proizvedu multi-specifična, npr., bispecifična, monoklonska antitela ili fragmenti antitela. Jedan problem u proizvodnji bispecifičnih antitela, izrađenih od dva različita polipeptidna lanca (teški i laki lanac) jeste potreba da se ekspresuju četiri različita lanca (dva teška i dva laka lanca), u jednoj ćeliji, što dovodi do brojnih, različitih kombinacija molekula, koji treba da se razdvoje od željenog bispecifičnog molekula u mešavini. Zbog njihove sličnosti, razdvajanje ovih molekula je komplikovano i skupo. Bile su korišćene brojne tehnike za minimiziranje pojave takvih neželjenih sparivanja (Čarter (2001) Journal of Immunological Methods, vol 248, strane 7-15).

Jedno rešenje problema jeste proizvodnja jednog polipeptidnog lanca sa dve specifičnosti, kao npr., dva scFv-a, vezana jedan na drugi, ili proizvodnja takozvanih diantitela. Pokazalo se da su takvi molekuli daleko od prevoja prirodnog molekula, a opšte poznato je da su komplikovani za proizvodnju (LeGall et al. (2004) Protein Engineering, Design & Selection vol 17 strane 357-366).

Drugi problem tekućeg dizajna bispecifičnih antitela jeste činjenica da, čak ukoliko se matična antitela dvovalentno vezuju za pojedinog njihovog vezujućeg partnera (npr., IgG), nastalo bispecifično antitelo je monovalentno za svakog od pojedinih partnera u vezivanju.

Poželjni multi-specifični molekuli ovog pronalaska rešavaju ove probleme: Moguća je ekspresija bispecifičnog molekula, kao jednog polipeptidnog lanca (modifikovani Ig domen sa dve specifičnosti vezivanja, vidi u delu primera), koja je jednostavnija za izvođenje, nego ekspresija dva polipeptidna lanca antitela (Cabilly et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3273-3277 (1984)).

Takođe je moguća proizvodnja u vidu molekula sličnog antitelu (t.j. koji je izrađen od 2 polipeptidna lanca), a zbog činjenice da je druga specifičnost locirana na ne-varijabilnom delu molekula, ne postoji potreba za dva različita teška lanca ili različita laka lanca. Zbog toga, nije moguće pogrešno sparivanje dva lanca.

Antitelo ovog pronalaska može biti sastavljeno od teškog lanca i lakog lanca, koji zajedno obrazuju varijabilni region, vezujući se za specifičnog partnera vezivanja, druga specifičnost može se obrazovati modifikovanom petljom bilo koje od strukturnih petlji ili teškog ili lakog lanca. Položaj vezivanja može se, takođe, obrazovati pomoću više od jedne ne-CDR petlje, koje mogu biti strukturno bliske (ili na teškom lancu ili na lakom lancu ili na oba lanca).

Modifikovano antitelo ili derivat može biti kompletno antitelo ili fragment antitela (npr., Fab, CH1-CH2, CH2-CH3).

Ono se može vezivati mono- ili multi-valentno za partnere u vezivanju ili čak sa različitom valencijom za različite vezujuće partnere, u zavisnosti od dizajna.

Kako postoji veliki broj različitih petlji, koje su raspoložive za selekciju i dizajniranje specifičnog položaja vezivanja u ne-CDR regionima teških i lakih lanaca, moguće je da se dizajniraju derivati antitela sa čak više od dve specifičnosti, bez gore pomenutih problema.

Specifični vezujući domeni, unutar jednog polipeptidnog lanca, mogu se povezivati sa ili bez peptidnog vezivača.

Neke klase antitela mogu biti označene kao multi-specifične, posebno bispecifične, po prirodi: One se vezuju za antigen (koji je obično npr. ili strana struktura ili struktura povezana sa kancerom), sa varijabilnim regionom, i vezuju se za Fc-efektor molekula, Fc delom (npr. Fc receptori na raznim imunim ćelijama ili proteinu komplementa), omogućujući tako efekte kao što su: ADCC, ADCP ili CDC.

Fc-efektorski molekuli su vezani pomoću Fc-dela molekula imunoglobulina (kod lgG1 on je sastavljen od domena CH2 i CH3), a opisani su brojni postupci za optimiziranje efektorske funkcije, poboljšanjem vezivanja Fc-dela molekula antitela tehnikama glikoinženjeringa (US 6,602,684) ili proteinskim inženjeringom direktno na Fc (US 2005/0054832) ili indirektno inženjeringom izvan Fc (US 2005/02444403). I vezivanje Fc regiona na Fc receptor i/ili vezivanje na proteine komplementa, kao što je Cq1 bilo je izmenjeno takvim tehnikama. Uglavnom se traži da se afinitet vezivanja za takve Fc-efektorske molekule poboljša, budući da ono korelira sa poboljšanim efektorskim funkcijama.

Ovim pronalaskom je moguće dizajnirati antitelo, koje se vezuje za Fc-efektorske molekule, van prirodnog Fc vezujućeg regiona. Modifikovane petlje u domenima antitela, koji nisu petlje, a koji su uključeni u "prirodno" vezivanje Fc-efektorskog molekula, mogu biti odabrane iz biblioteke ili dizajnirane tako da se vezuju za jedan ili više Fc-efektorskih molekula. Antitelo sa takvim, dodatnim, vezujućim položajima za Fc-efektorski molekul, imalo bi jaču sklonost za određeni Fc-efektorski molekul ili efektorsku ćeliju, sa izloženim Fc-efektorskim molekulom, i, iz tih razloga, može imati čak snažniji efekat, nego glikoinženjeringom poboljšana antitela ili na drugi način poboljšani Fc regioni. Međutim, u određenim ostvarenjima ovog pronalaska, efektorske karakteristike datog antitela, koje se modifikuje, ne bi direktno bile promenjene, već bi ostale nedirnute modifikacijom u strukturnoj petlji, u skladu sa ovim pronalaskom.

Fragmenti antitela imaju određene prednosti, u poređenju sa celim antitelima. Fragmenti uglavnom imaju dobre karakteristike bioraspoloživosti i mogu biti lakše proizvedeni. Međutim, najveći broj dizajniranih fragmenata antitela gube efektorske funkcije i imaju kraći in vivo poluživot (Holliger P, et al. Nat Biotechnol.

(2005) 23:1126-36).

Nijedan od CH1, Ckili CA domena ne posreduje u efektorskim funkcijama, što je razlog zbog koga Fab-i ne pokazuju ADCC, ADCP ili CDC. WO 02/44215 opisuje vezujuće molekule, koji se sastoje od antigen vezujućeg položaja na antitelu i Fc-efektorskih molekula, koji vezuju peptid. Na takav način, može biti konstruisan fragment antitela, koji pokazuje efektorske funkcije. Peptid je bio ugrađen u vezujući molekul na poziciji, koja niti narušava vezivanje antigena, niti sposobnost peptida da se vezuje na Fc-efektorski molekul.

U skladu sa ovim pronalaskom, međutim, vezivanje za Fc-efektorske molekule, može se izvesti sa modifikovanim imunoglobulinskim domenima, koji su bili odabrani za vezivanje Fc-efektorskog molekula, iz biblioteka nasumičnih sekvenci petlje, unutar fiksne građe imunoglobulinskog domena. Prema tome, moguće je da se izaberu specifične sekvence petlji, koje se ne bi vezivale za Fc-efektorske molekule, van građevine Ig-domena. Polipeptidi, proistekli iz ovog pronalaska, mogu, zbog toga, poželjno biti sastavljeni od više od 100 aminokiselina.

Da bi se odabrala potencijalna efektorska funkcija takvih domena, u skladu sa ovim pronalaskom, iz biblioteka mutant CH1, Ckili CA domena, mogu se odabrati oni za vezivanje sa Fc-receptorima i/ili faktorima komplementa, kao što je C1q.

Kako bi se povećao in vivo poluživot molekula, koji je sastavljen od ili koji sadrži takav domen (npr. CH1, CH2, CH3, CH4, Ckili CA), koji se vezuje na FcRn, domen se može odabrati iz biblioteka mutant npr. CH1-, CH2-, CH3-, CH4-, Ck- ili CA- domena, u skladu sa ovim pronalaskom.

FcRn-receptori za odabiranje mogu biti obezbeđeni ili na površini ćelija, koje prirodno ekspresuju respektivne receptore ili mogu biti dobijeni ekspresijom i prečišćavanjem ekstracelularnog dela odgovarajućeg receptora. Za potrebe ovog pronalaska, prvim skriniranjem na FcRn, mogu se odabrati mutant domeni, koji se dalje, mogu ispitati in vitro, i čak dalje karakterisati u FACS eksperimentima, vezivanjem za ćelije, koje ekspresuju FcRn receptor. Mogu se dalje opisati razvrstavanjem afiniteta vezivanja za razne rekombinantne FcRn, izoforme i alotipove, npr., rezonatnim tehnikama površinskog plazmona.

Imunoglobulin ovog pronalaska je humanog porekla.

Budući da modifikovani imunoglobulin može biti korišćen za razne svrhe; posebno u farmaceutskim smešama, imunoglobulin je poželjno humanog porekla. Naravno, modifikovani imunoglobulin može, takođe, biti himerni imunoglobulin.

U skladu sa drugim, poželjnim, ostvarenjem ovog pronalaska, humani imunoglobulin je dobijen iz IgG, posebno iz lgG1, lgG2, lgG3 ili lgG4.

Modifikovani imunoglobulin može biti dobijen iz jedne od, gore identifikovanih, klasa imunoglobulina.

Imunoglobulin, poželjno, sadrži teški i/ili laki lanac imunoglobulina ili njihov deo.

Modifikovani imunoglobulin može sadržavati teški i/ili laki lanac, najmanje jedan varijabilni i/ili konstantni domen.

Imunoglobulin, u skladu sa ovim pronalaskom, sadrži najmanje jedan konstantni domen imunoglobulina ili njihov deo, uključujući minidomen.

Konstantni domen je jedinica imunoglobulinskog prevoja konstantnog dela molekula imunoglobulina, koji je takođe označen kao domen konstantnog regiona (npr., CH1, CH2, CH3, CH4, Ck, Cl).

Poželjni imunoglobulin, u skladu sa ovim pronalaskom, sastavljen je od konstantnog domena, koji je odabran iz grupe, koju sačinjavaju: CH1, CH2, CH3, CH4, Igk-C, Igl-C, ili njihov deo, uključujući minidomen, sa, najmanje jednim, regionom petlje, a opisan je time što navedeni, najmanje jedan, region petlje sadrži, najmanje jednu, aminokiselinsku modifikaciju, koja obrazuje, najmanje jedan, modifikovani region petlje, pri čemu se navedeni, najmanje jedan, modifikovani region petlje specifično vezuje za, najmanje jedan, epitop antigena.

Konstantni domen je odabran iz grupe, sastavljene od CH1, CH2, CH3 ili CH4 domena, CL domena, Ckdomena, CA, Fab fragmenta ili Fc fragmenta i njihovih kombinacija.

Modifikovani imunoglobulin, u skladu sa ovim pronalaskom, može sadržavati jedan ili više konstantnih domena (npr., najmanje dva, tri, četiri, pet, šest, deset domena). Ukoliko je u modifikovanom imunoglobulinu prisutno više od jednog domena, ovi domeni mogu biti istog tipa ili različitih tipova (npr., CH1-CH1-CH2, CH3-CH3). Naravno da, isto tako, i redosled pojedinačnih domena može biti bilo kog tipa (npr., CH1-CH3-CH2, CH4-CH1-CH3-CH2).

Sve brojčane oznake aminokiselinskih sekvenci imunoglobulina su u skladu sa IMGT šemom brojčanog označavanja (IMGT, the International ImMunoGeneTics information system@imgt.cines.fr; http://imgt.cines.fr; Lefranc et al., 1999, Nucleic Acids Res. 27:209-212; Ruiz et al., 2000 Nucleic Acids Res. 28:219-221; Lefranc et al., 2001, Nucleic Acids Res. 29:207-209; Lefranc et al., 2003, Nucleic Acids Res. 31:307-310; Lefranc et al., 2005, Dev Comp Immunol 29:185-203).

Prema drugom, poželjnom, ostvarenju ovog pronalaska, modifikovani regioni petlje CHT, CH2, CH3 i CH4, sadrže aminokiseline 7 do 21, aminokiseline 25 do 39, aminokiseline 41 do 81, aminokiseline 83 do 85, aminokiseline 89 do 103 i aminokiseline 106 dol 17.

Regioni petlje Igk-C i Igl-C humanog porekla sadrže, poželjno, aminokiseline 8 do 18, aminokiseline 27 do 35, aminokiseline 42 do 78, aminokiseline 83 do 85, aminokiseline 92 do 100, aminokiseline 108 do 117 i aminokiseline 123 do 126.

Strukturni regioni petlje varijabilnog domena imunoglobulina humanog porekla, poželjno, sadrže aminokiseline 8 do 20, aminokiseline 44 do 50, aminokiseline 67 do 76 i aminokiseline 89 do 101.

Gore identifikovani regioni aminokiselina pojedinih imunoglobulina sadrže regione petlje, koji se modifikuju.

Specifično vezivanje modifikovanog imunoglobulina za molekul, određeno je pomoću testa vezivanja, odabranog iz grupe, koju čine: imunološki testovi, poželjno enzim vezani imunosorbent testovi (ELISA), rezonantni testovi površinskog plazmona, nuklearno magnetno rezonantna spektroskopija razlike u transferu saturacije, nuklearno magnetno rezonantna spektroskopija transfera NOE (trNOE), kompetitivni testovi, testovi tkivnog vezivanja, testovi vezivanja žive ćelije i testovi ćelijskog ekstrakta.

Testovi vezivanja mogu biti izvedeni korišćenjem raznih, u struci poznatih, postupaka, koji uključuju, ali se njima ne ograničavaju: FRET (Fluorescence Resonance Energv Transfer) i testove na bazi BRET-a (Bioluminescence Resonance Energy Transfer), AlphaScreen.TM. (Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay), Scintillation Proximity Assay, ELISA-u (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), SPR (Surface Plasmon Resonance, takođe poznat kao BIACORE.RTM.), izotermalnu titracionu kalorimetriju, diferencijalnu skaning kalorimetriju, gel elektroforezu i hromatografiju, uključujući gel filtraciju. Ovi i drugi postupci mogu preuzeti prednost nekih fuzionih partnera ili obeleživača.

Modifikovani imunoglobulin je, poželjno, konjugovan sa obeleživačem, odabranim iz grupe, koju čine: organski molekuli, enzimski obeleživači, radioaktivni obeleživači, obojeni obeleživači, fluorescentni obeleživači, hromogeni obeleživači, luminiscentni obeleživači, hapteni, digoksigenin, biotin, metalni kompleksi, metali, koloidno zlato i njihove mešavine.

Modifikovani imunoglobulin može biti konjugovan sa drugim molekulima, koji omogućuju jednostavnu detekciju navedenog konjugata, primera radi, testovima vezivanja (npr. ELISA) i studijama vezivanja.

U skladu sa, posebno poželjnim, ostvarenjem ovog pronalaska, imunoglobulin se sastoji od konstantnog domena, koji je odabran iz grupe, koju sačinjavaju: CH1, CH2, CH3, CH4, Igk-C, Igl-C, ili njihov deo, uključujući minidomen, ili njihove kombinacije, sa, najmanje jednim, regionom petlje, opisanim time što navedeni, najmanje jedan, region petlje sadrži, najmanje jednu, aminokiselinsku modifikaciju, koja obrazuje, najmanje jedan, modifikovani region petlje, pri čemu se navedeni, najmanje jedan, modifikovani region petlje specifično vezuje za najmanje jedan epitop antigena.

Poželjno je molekularno kombinovanje, najmanje jednog, modifikovanog domena antitela (=koji se vezuje za specifičnog partnera preko ne-varijabilnih sekvenci ili strukturne petlje) sa, najmanje jednim, drugim vezujućim molekulom, koji može biti: antitelo, fragment antitela, rastvorljivi receptor, ligand ili drugi modifikovani domen antitela.

Molekul je odabran iz grupe, koju sačinjavaju: proteinasti molekuli, nukleinske kiseline i ugljeni hidrati.

Regioni petlje modifikovanih imunoglobulina mogu se specifično vezivati za bilo koju vrstu vezujućih molekula, posebno za proteinaste molekule, proteine, peptide, polipeptide, nukleinske kiseline, glikane, ugljene hidrate, lipide, male organske molekule, neorganske molekule. Naravno, modifikovani imunoglobulini mogu sadržavati najmanje dva regiona petlje, pri čemu se svaki od regiona petlje može specifično vezati za druge molekule ili epitope.

U skladu sa poželjnim ostvarenjem ovog pronalaska, molekul, koji se vezuje za modifikovani strukturni region petlje, odabran je iz grupe, koju sačinjavaju: antigeni, povezani sa tumorom, posebno EpCAM, glikoprotein-72 povezan sa tumorom (TAG-72), antigen CA 125, povezan sa tumorom, membranski antigen specifičan za prostatu (PSMA), antigen velike molekularne težine, povezan sa melanomom (HMVV-MAA), antigen povezan sa tumorom, koji ekspresuje ugljeni hidrat srodan Levvisu Y, karcinoembrionalni antigen (CEA), CEACAM5, HMFG PEM, mucin MUC1, MUC18 i citokeratin antigen, povezan sa tumorom, bakterijski antigeni, virusni antigeni, alergeni, fluorescein, lizozom, toll-like receptor 9, eritropoetin, CD2, CD3, CD3E, CD4, CD11, CD11a, CD14, CD18, CD19, CD20, CD22, CD23, CD25, CD28, CD29, CD30, CD33 (p67 protein), CD38, CD40, CD40L, CD52, CD54, CD56, CD80, CD147, GD3, IL-1, IL-1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-5, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-12, IL-15, IL-18, IL-23, interferon alfa, interferon beta, interferon gama; TNF-alfa, TNFbeta2, TNF.alfa., TNFalfabeta, TNF-R1, TNF-RII, FasL, CD27L, CD30L, 4-1BBL, TRAIL, RANKL, TVVEAK, APRIL, BAFF, LIGHT, VEG1, OX40L, TRAIL receptor-1, A1 adenozin receptor, limfotoksin beta receptor, TACI, BAFF-R, EPO; LFA-3, ICAM-1, ICAM-3, integrin betal, integrin beta2, integrin alfa4/beta7, integrin alfa2, integrin alfa3, integrin alfa4, integrin alfa5, integrin alfa6, integrin alfav, alfaVbeta3 integrin, FGFR-3, keratinocitni faktor rasta, VLA-1, VLA-4, L-selektin, anti-ld, E-selektin, HLA, HLA-DR, CTLA-4, receptor T ćelije, B7-1, B7-2, VNRintegrin, TGFbetal, TGFbeta2, eotaksinl, BLys (B-limfocitni stimulator), komplement C5, IgE, faktor VII, CD64, CBL, NCA 90, EGFR (ErbB-1), Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB4), tkivni faktor, VEGF, VEG-FR, endotelni receptor, VLA-4, ugljeni hidrati, kao što su antigeni krvnih grupa i srodni ugljeni hidrati, Galili-glikozilacija, gastrin, receptori gastrina, ugljeni hidrati povezani sa tumorom, hapten NP-kap ili NIP-kap, T ćelijski receptor alfa/beta, E-selektin, digoksin, placentna alkalna fosfataza (PLAP) i testikularna alkalna fosfataza slična PLAP-u, transferinski receptor, heparanaza I, humani srčani miozin, glikoprotein llb/llla (GPIIb/llla), gH glikoprotein omotača humanog citomegalovirusa (HCMV), HIV gp 120, HCMV, respiratorni sincicijalni virus RSV F, RSVF Fgp, VNRintegrin, Hep B gp120, CMV, gpllbllla, HIV IIIB gp120 V3 petlja, respiratorni sincicijalni virus (RSV) Fgp, gD glikoprotein virusa herpes simpleksa (HSV), HSV gB glikoprotein, gB glikoprotein omotača HCMV, toksin Clostridium perfringensa i njihovi fragmenti.

Modifikovani imunoglobulin, u skladu sa ovim pronalaskom, poželjno se može vezati za jedan od, gore izloženih, molekula. Ovi molekuli, takođe, obuhvataju alergene.

Prema drugom, poželjnom, ostvarenju ovog pronalaska, modifikovani su aminokiselinski ostaci na pozicijama 15 do 17, 29 do 34, 85.4 do 85.3, 92 do 94, 97 do 98 i/ili 108 do 110 CH3.

Modifikacija imunoglobulina, u skladu sa ovim pronalaskom, poželjno je delecija, supstitucija ili umetanje.

U skladu sa ovim pronalaskom, na najmanje 1, poželjno barem 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 i 15 aminokiselina, izvedena je delecija, supstitucija drugim aminokiselinama (takođe sa modifikovanim aminokiselinama) ili umetanje u region petlje imunoglobulina. Međutim, maksimalan broj aminokiselina, koje su umetnute u region petlje imunoglobulina može da ne prelazi broj 30, poželjno 25, još poželjnije 20 aminokiselina. Supstitucija i umetanje aminokiselina, poželjno, se odvijaju nasumično, postupcima, koji su poznati u struci, a izloženi su u ovoj patentnoj prijavi.

Imunoglobulin, u skladu sa pronalaskom, je, prema specifičnom ostvarenju, opisan time što CH3 region sadrži SEQ ID No. 16 ili SEQ ID No. 18, kada se EpCam vezuje za navedeni imunoglobulin, SEQ ID No. 20, kada se, za navedeni imunoglobulin, vezuje fluorescein, SEQ ID No. 22, 24, 26, 28, 30 ili 32, kada se lizozom vezuje za navedeni imunoglobulin, SEQ ID No. 34, 36, 38 ili 40, kada se TLR9 vezuje za navedeni imunoglobulin i SEQ ID No. 42, kada se lizozom i/ili eritropoetin vezuju za navedeni imunoglobulin.

U skladu sa specifičnim ostvarenjem pronalaska, imunoglobulin je opisan time što sadrži SEQ ID No. 44 ili SEQ ID No. 46, kada se lizozom i gp41 vezuju za navedeni imunoglobulin.

Modifikovani imunoglobulin je, poželjno, konjugovan sa obeleživačem ili reporter molekulom, odabranim iz grupe, koju čine: organski molekuli, enzimski obeleživači, radioaktivni obeleživači, obojeni obeleživači, fluorescentni obeleživači, hromogeni obeleživači, luminiscentni obeleživači, hapteni, digoksigenin, biotin, metalni kompleksi, metali, koloidno zlato i njihove mešavine.

Modifikovani imunoglobulini, koji su konjugovani sa obeleživačima, kao što je prethodno naznačeno, mogu se koristiti, primera radi, u dijagnostičkim postupcima.

Drugi aspekt ovog pronalaska odnosi se na upotrebu imunoglobulina, u skladu sa ovim pronalaskom, ili imunoglobulina, koji se može dobiti postupkom, u skladu sa ovim pronalaskom, za izradu vakcine za aktivnu imunizaciju. Na taj način se imunoglobulin koristi kao supstanca antigenog leka, za formulisanje vakcine ili se koristi za traženje ili prihvatanje antigenih struktura, za korišćenje u formulisanju vakcine.

Drugi aspekt ovog pronalaska odnosi se na upotrebu imunoglobulina, u skladu sa ovim pronalaskom, ili imunoglobulina, koji se može dobiti postupkom, u skladu sa ovim pronalaskom, za izradu proteinske biblioteke imunoglobulina.

Imunoglobulin ovog pronalaska može se koristiti u postupku specifičnog vezivanja i/ili detektovanja molekula, koji uključuje korake: (a) dovođenja u kontakt modifikovanog imunoglobulina, u skladu sa ovim pronalaskom, ili modifikovanog imunoglobulina, koji se može dobiti postupkom, u skladu sa ovim pronalaskom, sa test uzorkom, za koji se pretpostavlja da sadrži navedeni molekul, i (b) detektovanja potencijalne formacije specifičnog kompleksa imunoglobulin/molekul.

Imunoglobulin ovog pronalaska može se koristiti u postupku specifičnog izolovanja molekula, koji uključuje korake: (a) dovođenja u kontakt modifikovanog imunoglobulina, u skladu sa ovim pronalaskom, ili modifikovanog imunoglobulina, koji se može dobiti postupkom, u skladu sa ovim pronalaskom, sa uzorkom, koji sadrži navedeni molekul, (b) separacije specifičnog kompleksa imunoglobulin/molekul, koji se obrazuje, i (c) opciono izolovanja molekula iz navedenog kompleksa.

Imunoglobulini, u skladu sa ovim pronalaskom, mogu se koristiti za specifično izolovanje molekula iz uzorka. Ukoliko se koriste multi-specifični imunoglobulini, iz uzorka se može izolovati više od jednog molekula. Posebno je pogodno korišćenje modifikovanih imunoglobulina, u takvim postupcima, budući da ono omogućava, npr., proizvodnju matriksa, koji ima homogenu površinu sa definisanom količinom vezujućih partnera (t.j. modifikovanih imunoglobulina), koji su imobilisani na njima, i koji su u stanju da se vezuju sa molekulima, koji se izdvajaju. Kao suprotnost tome, ukoliko se koriste mono-specifični vezujući partneri, ne može se proizvesti homogeni matriks, budući da se pojedinačni vezujući partneri ne vezuju istom efikasnošću za matriks.

Imunoglobulin ovog pronalaska može se koristiti u postupku ciljnog delovanja na jedinjenje, koje predstavlja metu, a koji uključuje korake: (a) dovođenja u kontakt modifikovanog imunoglobulina, u skladu sa ovim pronalaskom ili modifikovanog imunoglobulina, koji se može dobiti postupkom, u skladu sa ovim pronalaskom, koji je u stanju da se specifično vezuje za navedeno jedinjenje, (b) oslobađanja kompleksa imunoglobulin/jedinjenje prema meti.

Modifikovani imunoglobulini, u skladu sa ovim pronalaskom, mogu biti korišćeni za oslobađanje najmanje jednog jedinjenja, vezanog za CDR-e i/ili modifikovane regione petlje u metu. Takvi imunoglobulini mogu se koristiti za ciljano dovođenje terapeutskih supstanci u poželjni položaj delovanja, u toku tretmana bolesti.

Imunoglobulin, u skladu sa ovim pronalaskom ili imunoglobulin, koji se može dobiti postupkom, u skladu sa ovim pronalaskom, može biti deo proteinske biblioteke.

Poželjni postupci za konstruisanje navedene biblioteke mogu se naći gore i u primerima. Biblioteka, u skladu sa ovim pronalaskom, može se koristiti za identifikaciju imunoglobulina, koji se vezuju za određeni molekul.

Proteinska biblioteka, koja sadrži imunoglobulin, u skladu sa ovim pronalaskom ili imunoglobulin, koji se može dobiti postupkom, u skladu sa ovim pronalaskom, može se upotrebiti za dizajniranje imunoglobulinskih derivata.

Postojeći imunoglobulin može biti izmenjen, da bi se uveli antigen vezujući položaji u bilo koji domen ili minidomen, korišćenjem proteinske biblioteke pojedinog domena od najmanje 10, poželjno 100, poželjnije 1 000, još poželjnije 10 000, još poželjnije 100 000, a najpoželjnije više od 1 000 000 varijanti domena sa, najmanje jednom, modifikovanom petljom. Zatim je biblioteka ispitana na vezivanje specifičnog antigena. Nakon molekularnog opisa željenih karakteristika, odabrani domen ili minidomen je kloniran u originalni imunoglobulin, tehnikama genetskog inženjeringa, tako da on zamenjuje region divljeg tipa. Alternativno, može biti izmenjeno samo DNK kodiranje petlji ili kodiranje mutiranih aminokiselina, kako bi se dobio imunoglobulin sa dodatnim vezujućim položajem za specifični antigen.

Izbor položaja za mutiranu, antigen-specifičnu strukturnu petlju, zavisi od strukture originalnog imunoglobulina i svrhe dodatnog vezujućeg položaja. Ukoliko je, primera radi, originalni molekul kompletan imunoglobulin, koji treba da ima umetnut dodatni antigen vezujući položaj, bez remećenja efektorske funkcije, petlje koje se modifikuju, bile bi odabrane od domena, koji su udaljeni od CH2 i CH3, koji su prirodni vezujući partneri za Fc-efektorske molekule. Ako je originalni imunoglobulin Fab, moguća je modifikacija petlji u konstantnim domenima lakih lanaca ili teških lanaca ili u pojedinim varijabilnim domenima. Da bi se proizvela biblioteka, mogu se pripremiti biblioteke mutanata originalnih molekula, koji imaju mutacije u jednoj ili u više strukturnih petlji jednog ili više domena. Selekcija sa kompletnim mutiranim originalnim molekulima može imati neke prednosti, budući da će selekcija za vezivanje antigena sa modifikovanom strukturnom petljom, osloboditi sterno pogodne modifikacije, ukoliko bi ih moglo pokazati i ispitivanje drugih karakteristika mutiranog imunoglobulina.

Zahtevi za veličinom (t.j. brojem varijanti proteina) proteinske biblioteke mutiranog domena ili minidomena ili fuzionog molekula domena, zavise od zadatka. Uopšteno, potrebno je da biblioteka za de novo proizvođenje antigen vezujućeg položaja, bude veća od biblioteke, koja se koristi za dalju modifikaciju, već postojećeg, izgrađenog antigen vezujućeg položaja, izrađenog od modifikovane strukturne petlje (npr. za pojačavanje afiniteta ili menjanje fine specifičnosti za antigen).

Imunoglobulinska biblioteka ili biblioteka nukleinske kiseline sadrži mnoštvo imunoglobulina, npr., konstantni domen, minidomen i/ili najmanje jedan strukturni region petlje, sadržan u minidomenu ili molekulu nukleinske kiseline, koji kodiraju isti. Biblioteka sadrži članove sa različitim modifikacijama, pri čemu je raznolikost definisana modifikacijama u, najmanje jednom, strukturnom regionu petlje. Biblioteka nukleinskih kiselina poželjno uključuje najmanje 10 različitih članova (koji dovode do jedne aminokiselinske zamene), a još poželjnije uključuje najmanje 100, još poželjnije 1 000 ili 10 000 različitih članova (npr., dizajniranih strategijama nasumičnog izbora ili tehnikama kombinovanja). Takođe je poželjan još raznovrsniji broj pojedinačnih članova, kao na primer najmanje 1 000 000 ili najmanje 10 000 000.

Dva različita domena ili minidomena, odabrana iz najmanje dve biblioteke, u skladu sa pronalaskom, mogu biti korišćena u kombinaciji, da bi se proizveli multispecifični imunoglobulini. Ovi odabrani, specifični, imunoglobulini mogu se kombinovati jedan sa drugim i sa drugim molekulima, slično gradivnim blokovima, da bi se dizajnirao optimalni raspored domena ili minidomena, kako bi se dobile željene karakteristike.

Dalje, jedan ili više modifikovanih imunoglobulina, u skladu sa pronalaskom, mogu biti uvedeni na raznim ili na svim različitim položajima proteina, moguće bez razaranja strukture proteina. Takvom tehnikom "mešanja domena" kreirane su nove biblioteke, u kojima se mogu ponovo birati željene karakteristike.

Biblioteka može sadržavati imunoglobuline, u skladu sa pronalaskom, odabrane iz grupe, sastavljene od domena imunoglobulina, minidomena ili njihovih derivata.

Poželjno ostvarenje ovog pronalaska jeste vezujući molekul za antigen (antigen vezujući molekul), koji sadrži, najmanje jedan, imunoglobulinski domen i strukturni region petlje, koji se modifikuje u skladu sa ovim pronalaskom, da bi se vezao sa antigenom, pri čemu navedeni vezujući molekul ne sadrži varijabilne domene antitela. On može sadržavati druge delove, koji se mogu koristiti za aktivnosti antitela (npr. kao što su prirodni ili modifikovani efektorski regioni (sekvence); međutim, on gubi "prirodni" vezujući region antitela, t.j. varijabilne domene u njihovom, u prirodi postojećem, položaju. Ovi antigen vezujući molekuli, u skladu sa ovim pronalaskom, imaju, gore opisane, prednosti za ove molekule, još bez aktivnosti specifičnog vezivanja antitela: međutim, sa novo uvedenom aktivnošću specifičnog vezivanja u strukturnom regionu petlje.

Poželjno, ovi antigen vezujući molekuli, u skladu sa ovim pronalaskom, sadrže CH1, CH2, CH3, CH4, Igk-C, Igl-C i njihove kombinacije; navedene kombinacije, koje sadrže najmanje dve, poželjno najmanje četiri, posebno najmanje šest konstantnih domena i, najmanje jedan, strukturni region petlje, koji je modifikovan u skladu sa ovim pronalaskom. Poželjno, ovi strukturni regioni petlji su ili povezani preko strukturnog regiona petlje, modifikovanog u skladu sa ovim pronalaskom, ili su strukturne petlje bile prirodne prisutne između takva dva konstantna domena. Ostvarenje ovih antigen vezujućih molekula, u skladu sa ovim pronalaskom, sastavljeno je od Fc regiona antitela sa, najmanje jednom, modifikacijom u strukturnoj petlji, u skladu sa ovim pronalaskom. Za antigen vezujuće molekule, u skladu sa ovim pronalaskom, takođe je poželjno da se novi antigen vezujući položaji u strukturnim petljama uvode tehnologijama nasumičnog izbora, t.j. izmenom jednog ili više aminokiselinskih ostataka petlje nasumičnim tehnikama ili uvođenjem, slučajno proizvedenih, umetaka u takve strukturne petlje. Alternativno, poželjno je korišćenje kombinatornih pristupa.

Modifikovani imunoglobulin može posedovati antigen vezujući položaj, koji je stran nemodifikovanom imunoglobulinu, a ugrađen je u jednu ili više strukturnih petlji. Izraz "stran" znači da antigen vezujući položaj nije prirodno obrazovan pomoću specifičnog regiona imunoglobulina, a strani vezujući partner, ali ne i prirodni vezujući partner imunoglobulina, vezan je za antigen vezujući položaj. Ovo znači da se ne smatra da se vezujući partner, kao što je Fc-receptor ili efektor imunog sistema, vezuje pomoću antigen vezujućeg položaja, koji je stran nemodifikovanom imunoglobulinu.

Poželjno, antigen je odabran iz grupe, koju sačinjavaju: patogeni antigen, antigen povezan sa tumorom, enzim, supstrat, sopstveni antigen, organski molekul ili alergen. Poželjniji antigeni su odabrani iz grupe, koju sačinjavaju: virusni antigeni, bakterijski antigeni ili antigeni iz patogena eukariota ili faga. Poželjni virusni antigeni uključuju: HAV-, HBV-, HCV-, HIV I-, HIV II-, Parvovirus-, virus Influenze-, HSV-, viruse hepatitisa, Flaviviruse, VVestnile virus, Ebola virus, virus boginja, virus malih boginja, virus ospica, herpes virus, adenovirus, papiloma virus, polioma virus, Parvovirus, rinovirus, Coxasackie virus, Polio virus, Echovirus, virus japanskog encefalitisa, virus denge, virus tick borne encefalitisa, virus žute groznice, Coronavirus, respiratorni sincicijalni virus, virus parainfluence, La Crosse virus, Lassa virus, virus besnila, antigene Rotavirusa; poželjni bakterijski antigeni uključuju: Pseudomonas-, Mvcobacterium-, Staphvlococcus-, Salmonella-, Meningococcus-, Borellia-, Listeria, Neisseria-, Clostridium-, Escherichia-, Legionella-, Bacillus-, Lactobacillus-. Streptococcus-, Enterococcus-, Corvnebacterium-. Nocardia-, Rhodococcus-, Moraxella-, Brucella, Camphvlobacter-, Cardiobacterium-, Franciseila-, Helicobacter-, Haemophilus-, Klebsiella-, Shigella-, Yersinia-, Vibrio-, Chlamvdia-, Leptospira-, Rickettsia-, Mvcobacterium-, Treponema-, Bartonella-antigene. Poželjni eukariotski antigeni patogenih eukariota uključuju antigene Giardie, Toxoplasme, Cvclospore, Crvptosporidiuma, Trichinelle, kvasaca, Candide, Aspergillusa, Crvptococcusa, Blastomvcesa, Histoplasme, Coccidoidesa.

Poželjni imunoglobulini, u skladu sa ovim pronalaskom, sadrže, najmanje dva, antigen vezujuća položaja, prvi položaj vezivanja za prvi epitop i drugi položaj vezivanja za drugi epitop.

U skladu sa poželjnim ostvarenjem, ovaj imunoglobulin sadrži najmanje dva regiona petlje, prvi region petlje, koji se vezuje za prvi epitop i drugi region petlje, koji se vezuje za drugi epitop. Barem prvi ili barem drugi region petlje, ili oba, mogu sadržavati strukturnu petlju. Imunoglobulini, prema ovom pronalasku, uključuju njihove fragmente, za koje se u struci zna da su funkcionalni, a koji sadrže bitne elemente u skladu sa ovim pronalaskom: strukturni region petlje, modifikovan u skladu sa ovim pronalaskom.

Poželjno, imunoglobulin u skladu sa ovim pronalaskom, sastavljen je od, najmanje dva, imunoglobulinska domena ili od njihovog dela, uključujući minidomen, a svaki domen sadrži, najmanje jedan, antigen vezujući položaj.

Imunoglobulin, u skladu sa pronalaskom, može sadržavati, najmanje jedan, domen konstantnog regiona ili njegov deo, uključujući minidomen. Tako, varijabilni domen, koji je, primera radi, modifikovan u C-terminalnom regionu, ili varijabilni domen, vezan na modifikovani CH1 region, na primer modifikovani CH1 minidomen, jeste jedno od poželjnih ostvarenja.

Poželjni imunoglobulin, u skladu sa pronalaskom, sadrži domen, koji ima najmanje 50% homolognosti sa nemodifikovanim domenom.

Izraz "homologija" znači da polipeptidi imaju iste ili očuvane ostatke na odgovarajućoj poziciji u njihovoj primarnoj, sekundarnoj ili tercijarnoj strukturi. Izraz se, takođe, proširuje na dve ili više nukleotidnih sekvenci, koje kodiraju homologne polipeptide.

"Homologni imunoglobulinski domen" označava imunoglobulinski domen, u skladu sa pronalaskom, koji ima najmanje oko 50% identičnosti aminokiselinske sekvence, s obzirom na punu dužinu nativne sekvence sekvence imunoglobulinskog domena ili bilo kog drugog fragmenta sekvence pune dužine imunoglobulinskog domena, kao što je ovde izloženo. Poželjno, homologni imunoglobulinski domen imaće najmanje oko 50% identičnosti aminokiselinske sekvence, poželjno najmanje oko 55% identičnosti aminokiselinske sekvence, još poželjnije najmanje oko 60% identičnosti aminokiselinske sekvence, još poželjnije najmanje oko 65% identičnosti aminokiselinske sekvence, još poželjnije najmanje oko 70% identičnosti aminokiselinske sekvence, još poželjnije najmanje oko 75% identičnosti aminokiselinske sekvence, još poželjnije najmanje oko 80% identičnosti aminokiselinske sekvence, još poželjnije najmanje oko 85% identičnosti aminokiselinske sekvence, još poželjnije najmanje oko 90% identičnosti aminokiselinske sekvence, još poželjnije najmanje oko 95% identičnosti aminokiselinske sekvence sa nativnom sekvencom imunoglobulinskog domena ili bilo kojim drugim specifično definisanim fragmentom sekvence imunoglobulinskog domena pune dužine, kao što je gore definisano.

"Procenat (%) identičnosti aminokiselinske sekvence" u odnosu na, ovde identifikovane, sekvence imunoglobulinskog domena, definisan je kao procenat aminokiselinskih ostataka u kandidat sekvenci, koji je identičan sa aminokiselinskim

ostacima u specifičnoj sekvenci imunoglobulinskog domena, nakon razvrstavanja sekvence i uvođenja šupljina, ukoliko je to potrebno, da bi se postigao maksimalni procenat identičnosti sekvence, i ne smatrajući bilo koje konzervativne supstitucije delom identiteta sekvence. Razvrstavanje za potrebe određivanja procenta identičnosti aminokiselinske sekvence, može se izvesti na razne načine, koji su uključeni u okvire upućenosti u ovu oblast struke, primera radi, korišćenjem javno dostupnog kompjuterskog softvera, kao što je BLAST, BLAST-2, ALIGN ili Megalign (DNASTAR) softver. Upućeni u ovu oblast mogu odrediti pogodne parametre za merenje razvrstavanja, koji uključuju bilo koje algoritme, potrebne za postizavanje maksimalnog razvrstavanja, tokom pune dužine sekvenci, koje se upoređuju.

Vrednosti za % identičnosti aminokiselinske sekvence mogu se dobiti, kao što je gore opisano, korišćenjem VVU-BLAST-2 kompjuterskog programa (Altschul et al., Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)). Najveći broj parametara istraživanja VVU-BLAST-2 dat je u vidu vrednosti nepodudaranja. Oni koji nisu dati kao vrednosti nepodudaranja, t.j. parametri, koji se mogu podesiti, dati su sa sledećim vrednostima. razmak preklapanja=1, frakcija preklapanja=0.125, prag reči (T)=11, i matriks beleženja=BLOSUM62. Kada se koristi VVU-BLAST-2, vrednost % identičnosti aminokiselinske sekvence utvrđena je deljenjem (a) broja identičnih aminokiselinskih ostataka, koji se slažu, između aminokiselinske sekvence imunoglobulinskog domena od značaja, koji ima sekvencu, dobijenu iz nativnog imunoglobulinskog domena i aminokiselinske sekvence od značaja, koja se poredi (t.j., sekvence sa kojom se upoređuje imunoglobulinski domen od značaja, koji može biti nemodifikovani imunoglobulinski domen), kao što je utvrđeno pomoću VVU-BLAST-2, sa (b) ukupnim brojem aminokiselinskih ostataka ne-randomizovanih delova imunoglobulinskog domena od značaja. Na primer, u tvrdnji "polipeptid, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu A, koja ima ili poseduje najmanje 80% identičnosti aminokiselinske sekvence sa aminokiselinskom sekvencom B", aminokiselinska sekvenca A jeste poređenje aminokiselinske sekvence od značaja, a aminokiselinska sekvenca Bje aminokiselinska sekvenca imunoglobulinskog domena od značaja.

Imunoglobulin, u skladu sa ovim pronalaskom, može biti korišćen za bilo koje, u struci poznate, namene imunoglobulina, ali isto tako omogućava primene koje zavise od kombinacija specifičnosti, predstavljenih ovim pronalaskom. Sledstveno tome; imunoglobulini, u skladu sa ovim pronalascima, poželjno se koriste za terapeutsku i profilikatičku upotrebu (npr. kao aktivna ili pasivna imunoterapija); za preparativno i analitičko korišćenje i za dijagnostičku upotrebu.

Imunoglobulin ovog pronalaska može biti korišćen u kompletu vezujućih partnera, koji sadrži: (a) modifikovani imunoglobulin, koji ima antigen vezujući položaj, stran imunoglobulinu, koji je uključen u jednu ili više strukturnih petlji, i

(b) vezujući molekul, koji sadrži epitop navedenog antigena.

Takav vezujući molekul ovog kompleta, u skladu sa ovim pronalaskom, može se koristiti za identifikovanje specifičnosti vezivanja modifikovanog imunoglobulina, u skladu sa ovim pronalaskom. Korišćenjem vezujućeg molekula ovog kompleta u skladu sa tekućim pronalaskom, može se utvrditi jačina modifikvanih imunoglobulina, u skladu sa ovim pronalaskom.

Jačina, kao što je ovde definisana jeste svojstvo vezivanja modifikovanog molekula za svoj antigen. Vezivanje se može odrediti kvantitativno i/ili kvalitativno pomoću utvrđivanja specifičnosti i/ili afiniteta i/ili privlačnosti, kao što se koristi u svrhe kontrole kvaliteta.

Dalje, vezujući molekul kompleta, u skladu sa ovim pronalaskom, može se koristiti za biranje modifikovanog imunoglobulina, u skladu sa ovim pronalaskom, iz biblioteke, koja je sastavljena od najmanje 10, poželjno najmanje 100, poželjnije najmanje 1 000, još poželjnije najmanje 10 000, a posebno najmanje 100 000 imunoglobulina sa različitim modifikacijama u strukturnim petljama.

Prema ovom pronalasku, jedna od ključnih karakteristika ovog pronalaska jeste da se izgradnja imunoglubulinskih domena dešava u regionima, koji nisu normalno uključeni u vezivanje antigena, drugim rečima, u regionima, koji nisu CDR-i antitela. Zapaženo je da specifični prevoj imunoglobulinskih domena omogućuje uvođenje nasumičnih mutacija u regione, koji su strukturno analogni CDR-ima, ali se razlikuju po položaju u sekvenci. Regioni, koji su identifikovani ovim pronalaskom, su, slično CDR-ima, regioni petlje, koji povezuju beta strukove imunoglobulinskog prevoja.

Još određenije, ovde je opisano da su, uvođenjem nasumičnih mutacija u petlje, koje povezuju beta strukove A-B i E-F CH3 domena humanog lgG1, odabrani mutirani CH3 domeni, koji se specifično vezuju za Toli like receptor 9-peptida (TLR-9) ili za lizozom kokošijeg jajeta, koji je peptid, odnosno protein, koga CH3 domeni humanog lgG1 normalno ne prepoznaju i ne vezuju. Mutacije, koje smo uveli, uključuju mutacije, u kojima su odabrani aminokiselinski ostaci u sekvenci divljeg tipa, zamenjeni nasumično odabranim ostacima, a oni takođe, uključuju umetanja ekstra aminokiselinskih ostataka u gore pomenute, petlje.

Po analogiji, imunoglobulinski domeni iz bilo koje klase imunoglobulina i iz imunoglobulina bilo koje vrste, podložni su ovom tipu inženjeringa. Dalje, ne samo da se može manipulisati specifičnim petljama, ciljanim u ovom pronalasku, već se, na isti način, može manipulisati bilo kojom petljom, koja povezuje beta strukove u imunoglobulinskim domenima.

Konstruisani imunoglobulinski domeni iz bilo kog organizma i iz bilo koje klase imunoglobulina mogu se koristiti, u skladu sa ovim pronalaskom, ili kao takvi (kao pojedinačni domeni) ili kao deo većeg molekula. Primera radi, oni mogu biti deo intaktnog imunoglobulina, koji bi sledstveno tome, imao svoj "normalni" antigen vezujući region, obrazovan pomoću 6 CDR-a i novi, inženjeringom izgrađeni, antigen vezujući region. Slično ovome, može se proizvesti multi-specifični, npr. bispecifični, imunoglobulin. Konstruisani imunoglobulinski domeni mogu, takođe, biti deo bilo kog fuzionog proteina. Upotreba ovih konstruisanih imunoglobulinskih domena je u opštoj oblasti upotrebe imunoglobulina.

Ovde se, kao imunoglobulinski domeni, podrazumevaju domeni sledećih imunoglobulina:

za IgG, IgD i IgA: VL, CL, VH, CH1, CH2, CH3

za IgM i IgE: VL, CL, VH, CH1, CH2, CH3, CH4

1. Pojedinačni imunoglobulinski domeni, nasumično birani na jednom kraku, t.j. u petljama, koje povezuju beta-strukove B-C, D-E ili F-G ("vršak", sa izuzetkom varijabilnih domena, koji su pokriveni brojnim patentima) ili beta-strukove A-B, C-D, (C-C i C"-D, u slučaju varijabilnih domena) ili E-F ("osnova"). Pojedinačne petlje ili bilo koja kombinacija petlji, mogu biti nasumično odabrane. Ostaci mogu biti izmenjeni ili izbrisani ili mogu biti umetnuti dodatni ostaci. 2. Pojedinačni imunoglobulinski domeni, nasumično odabrani na oba kraka, na vrhu i na osnovi. 3. bilo koji protein, koji sadrži jedan od pojedinačnih, nasumičnih domena, kao što su: a) "jedno-lančani CH3" dimeri (scCH3), scCH2, scCH1/CL, nasumično odabrani na jednom ili na oba kraka b) jedno-lančani Fv, nasumično odabran na "osnovi", t.j. na strani, koja je suprotna CDR-ima c) Fab fragmenti, nasumično odabrani na "osnovi", t.j. na C-terminalnom kraju CH1 i CL domena d) Fc fragmenti (t.j. proteini sastavljeni od CH2-CH3), nasumično odabrani na jednom ili na oba kraka

e) kompletni imunoglobulini, nasumično odabrani na osnovi Fc

f) drugi pogodni domeni.

Primarne prednosti pojedinačnih domena su: vrlo su slični svim

argumentima koji se koriste za promovisanje kamiljih VH molekula ("nanotela", vidi

www.ablynx.com). Nasumično birani imunoglobulinski domeni su veoma mali proteini (molekularna težina ca. 12-15 kDa, u zavisnosti od broja umetnutih aminokiselinskih ostataka), i, zbog toga, će imati sledeće prednosti, u poređenju sa konvencionalnim antitelima ili fragmentima antitela, kao što su scFv i Fab-i: prepoznavanje neuobičajenih ili skrivenih epitopa, vezivanje u šupljine ili aktivne položaje proteinskih meta, jednostavnost proizvodnje i mnoge druge prednosti. U slučaju imunoglobulinskog domena, koji je nasumično odabran na oba kraka, može biti proizveden dvovalentni ili bispecifični molekul. Glavne prednosti pojedinačnih domena kao dela fuzionih proteina jesu u tome što se, na bilo kom drugom proteinu, mogu izgraditi dodatne vezujuće karakteristike.

Smatra se da, za izradu proteina, može biti korišćen bilo koji ekspresioni sistem. Analozi pojedinačnim domenima, kao što su ovde opisani, mogu se pronaći u antitelima kamile, koja imaju samo VH, a ne i VL. U ovim proteinima su samo 3 CDR-a (umesto 6 kao u "normalnim" antitelima) odgovorna za vezivanje antigena.

Sledeće patentne reference su ovde uključene kao reference, kao što su u svojoj celosti navedene u prilogu: US 6,294,654 Modifikovani imunoglobulinski molekul, koji uključuje antigen u ne-CDR regionu petlje

US 5,844,094 Ciljani vezujući polipeptid

US 5,395,750 Postupci za proizvodnju proteina, koji se vezuju za predodređene antigene

US 2004/0071690 Polivalentni i polispecifični reagensi visoke privlačne moći

US 2004/0018508 Surogat antitela i postupci za njihovu izradu i korišćenje

US 2003/0157091 Multi-funkcionalni proteini

US 2003/0148372 Postupci skriniranja biblioteka izloženih faga, sa različitim ligandima

US 2002/0103345 Bispecifični imunoglobulinu slični antigen vezujući proteini i postupci proizvodnje

US 2004/0097711 Proteini superfamilije imunoglobulina

US 2004/0082508 Sekretovani proteini

US 2004/0063924 Sekretovani proteini

US 2004/0043424 Proteini superfamilije imunoglobulina

US 5,892,019 Proizvodnja pojedinačnim-genom-kodiranog imunoglobulina

US 5,844,094 Ciljni vezujući polipeptid

Ovaj pronalazak je, dalje, ilustrovan, sledećim slikama i primerima, bez ograničavanja na njih.

Slika 1a prikazuje strukturu intaktnog lgG1. Domeni su označeni strelicama.

Slika 1b ilustruje strukturnu organizaciju monomera glavnog izotipa humanog imunoglobulina. Disulfidne veze su prikazane kao linije, N-vezane grupe ugljenih hidrata su prikazane u vidu krugova.

Slika 2 prikazuje imunoglobulinski prevoj za konstantni (levo) i varijabilni (desno) domen imunoglobulina. Beta strukovi su označeni strelicama.

Slika 3 prikazuje molekularni model CH3 domena, izgrađenog u skladu sa ovim pronalaskom, sa nasumično odabranim delom, označenim površinom sa pristupom rastvaraču. Površina je zaokružena.

Slika 4 prikazuje šematsku prezentaciju PCR-a, korišćenih za proizvodnju fragmenata, koji su upotrebljeni za sklapanje mutiranog CH3 domena. PCR prajmeri su označeni strelicama, koje se odnose na njihovu 5-3' orijentaciju, a vertikalne linije označavaju približne pozicije uvedenih restrikcionih položaja, koji su bili korišćeni za slaganje mutiranog gena. Sledeći restrikcioni položaji su sadržani na prajmerima za povezivanje PCR fragmenata: CH3LNCO: Ncol; CH3LSAC i CH3CSAC: Sad; CH3CHIN i CH3RHIN: Hindlll; CH3RNOT: Noti.

Slika 5 prikazuje neke primere kako bi se mogli koristiti imunoglobulinski domeni tekuće prijave. Nasumični regioni su naznačeni simbolom zvezdice. Specifičnosti nasumičnih regiona u jednom molekulu mogu biti identične ili različite.

Slika 6 prikazuje šematsku prezentaciju dizajna izgrađenog, bispecifičnog CH3 domena. Nazivi prajmera su dati u kvadratima, a strelice označavaju smer u kome su prajmeri produženi. Kvadrati sa kosim linijama označavaju odgovarajuće položaje regiona, koji su nasumično odabrani u ovoj konstrukciji, kvadrati sa vertikalnim linijama označavaju odgovarajuće položaje regiona, koji su bili uvedeni za proizvođenje klona C24, a dati su i restrikcioni položaji, koji su korišćeni za postupak kloniranja.

Slika 7 prikazuje šematsko predstavljanje dizajna izgrađenog, bispecifičnog CH3 domena. Nukleotidna sekvenca i njen prevod prikazani su na bazičnom dizajnu izgrađenog, bispecifičnog CH3 domena. Crvene sekvence označavaju nasumične regione, kako bi se proizvela bispecifična konstrukcija, dok zeleni kvadrati označavaju regione u kojima je sekvenca nasumično odabrana, da bi se proizveo klon C24.

Slika 8 prikazuje listing sekvenci ovde izloženih sekvenci.

OPIS SPECIFIČNIH PRIMERA:

Primer 1: Konstrukcija CH3 biblioteke i izlaganje površine faga

Kristalna struktura Fc fragmenta lgG1, koja je publikovana u Brookhaven bazi podataka sa ulazom 10QO.pdb, korišćena je, kao pomoć, u dizajniranju mutiranog CH3 domena.

Sekvenca, koja je korišćena kao osnova za konstruisanje CH3 biblioteke, data je u SEQ ID No. 1. U ovoj sekvenci, prva aminokiselina odgovara Prolinu 343 lanca A Brookhaven baze podataka sa ulazom 1oqo.pdb. Poslednji ostatak, sadržan u 1oqo.pdb, je Serin 102 SEQ ID No.1. Nakon detaljne analize strukture 1oqo.pdb i vizuelnim pregledavanjem ostataka, koji obrazuju petlje, koje povezaju beta strukove, odlučeno je da se nasumično odaberu ostaci 17, 18 i 19, koji su deo petlje, koja povezuje beta struk A-B, kao i 71, 72, 73, 76 i 77, koji su deo petlje, koja povezuje beta struk E-F SEQ ID No. 1. Molekularni model izgrađenog CH3 domena, sa nasumično odabranim delom, označenim površinom sa pristupom rastvaraču, prikazan je na Slici 3. Izgrađeni gen je proizveden serijama PCR reakcija, koje su praćene povezivanjem nastalih PCR proizvoda. Da bi se olakšalo povezivanje, neki od kodona nukleotidne sekvence, koji kodiraju SEQ ID No.1, bili su modifikovani, kako bi se proizveli restrikcioni položaji, bez menjanja aminokiselinskih sekvenci (tihe mutacije). Za umetanje u klonirajući vektor pHEN1 (Nucleic Acids Res. 1991 Aug 11; 19(15):4133-7. Multi-subunit proteins on the surface of filamentous phage: methodologies for displaving antibodv (Fab) heavy and light chains. Hoogenboom HR, Griffiths AD, Johnson KS, Chiswell DJ, Hudson P, Vvinter G.) u okviru sa pelB sekrecionim signalom, ekstra nukleotidni ostaci, koji kodiraju Met-Ala su pričvršćeni na 5' kraj sekvence, kako bi se kreirao Ncol restrikcioni položaj. Za nasumične ostatke, izabran je kodon NNS (IUPAC kod, gde S znači C ili G), koji kodira svih 20 aminokiselina, koje postoje u prirodi, a izbegava 2 od 3 stop kodona. Izgrađena sekvenca je data kao nukleotidna sekvenca u SEQ ID No. 2, i kao aminokiselinska sekvenca u SEQ ID No. 3. Slovo X u SEQ ID No. 3 označava nasumične aminokiselinske ostatke. Sekvence PCR prajmera, koje su korišćene za slaganje mutiranog CH3 domena, date su u SEQ ID No.4 do 9. Slika 4 prikazuje šematsku prezentaciju PCR fragmenata, proizvedenih za slaganje mutiranog gena, i, za te potrebe, korišćene prajmere.

cDNK teškog lanca humanog monoklonalnog antitela 3D6 (Felgenhauer M, Kohl J, Ruker F. Nucleotide sequences of the cD-NAs, encoding the V-regions of H- i L-chains of a human monoclonal antibody specific to HIV-1-gp41. Nucleic Acids Res. 1990 Aug 25;18(16):4927) je korišćena kao kalup za PCR reakcije. 3 PCR proizvoda su svarena sa Sad, odnosno sa i/ili Hindlll, i povezana zajedno. Proizvod povezivanja je dalje, svaren sa Ncol i Noti i povezan u fagemid vektoru pHEN1 sa izloženom površinom, koji je prethodno bio svaren sa Ncol i Noti. Broj odabranih

klonova je kontrolisan pomoću restrikcione analize i sekvencioniranja DNK, i utvrđeno je da sadrže umetak, kao što je planirano, uključujući korektno umetnute nasumične sekvence. Za sledeće korake pripreme faga, praćeni su standardni protokoli. Ukratko, smeša za povezivanje je transformisana u ćelije E. coli TG1, pomoću elektroporacije. Nakon toga, čestice faga su oslobođene iz ćelija E. coli TG1 sa pomagač fagom M13-K07. Čestice faga su, zatim, precipitirane iz supernatanta kulture sa PEG/NaCI u 2 koraka, rastvorene su u vodi i korišćene za selekciju putem dobijanja ili su, alternativno, čuvane na minus 80°C.

Primer 2.Konstruisanje CH3+3 biblioteke

Ova biblioteka je konstruisana i klonirana na isti način kao CH3 biblioteka. Aminokiselinska sekvenca je data u SEQ ID No. 10, odgovarajuća nukleotidna sekvenca u SEQ ID No. 11, a prajmeri, korišćeni za konstruisanje su bili u SEQ ID No. 4-7, SEQ ID No. 9 i SEQ ID No. 12.

Primer 3:Konstruisanje CH3+5 biblioteke

Ova biblioteka je konstruisana i klonirana na isti način kao CH3 biblioteka. Aminokiselinska sekvenca je data u SEQ ID No. 13, odgovarajuća nukleotidna sekvenca u SEQ ID No. 14, a prajmeri, korišćeni za konstruisanje su bili u SEQ ID No. 4-7, SEQ ID No. 9 i SEQ ID No. 15.

Primer 4:Dobijanje biblioteke CH3 - faga na TLR-9 peptidu

U skladu sa standardnim protokolima izvedena su 3 kruga dobijanja. Ukratko, primenjen je sledeći postupak. Maxisorp ploče sa 96 jamica (Nunc) su obložene sintetskim peptidom, koji predstavlja deo sekvence Toll-like Receptora 9 (TLR-9). U svaku jamicu je dodato 200 ul sledećeg rastvora: 0.1 M pufer Na karbonata, pH 9.6, sa sledećim koncentracijama rastvorenog peptida:

1. krug dobijanja: 1 mg/ml TLR-9 peptida

2. krug dobijanja: 500 ug/ml TLR-9 peptida

3. krug dobijanja: 100 ug/ml TLR-9 peptida

Inkubacija je trajala 1 sat na 37°C, nakon čega je sledilo blokiranje sa 2% suvim mlekom (M-PBS) sa 200 ul po jamici, tokom 1 sata, na sobnoj temperaturi.

Zatim je ostavljeno da biblioteka površinski izloženih faga reaguje sa vezanim peptidom, dodavanjem 100 ul suspenzije faga i 100 ul 4% suvog mleka (M-PBS), posle čega je sledila inkubacija tokom 45 minuta, uz mućkanje, i tokom 90 minuta, bez mućkanje, na sobnoj temperaturi.

Nevezane čestice faga su otklonjene ispiranjem na sledeći način. Posle prvog kruga dobijanja: 10 x 300 ul T-PBS, 5x 300 ul PBS; nakon drugog kruga dobijanja: 15 x 300 ul T-PBS, 10x 300 ul PBS; posle trećeg kruga dobijanja: 20 x 300Ml T-PBS, 20x 300 ul PBS.

Eluacija čestica vezanih faga izvedena je dodavanjem 200 ul, po jamici, 0.1 M glicina, pH 2.2, i inkubacijom, uz mućkanje, tokom 30 minuta, na sobnoj temperaturi. Nakon toga, suspenzija faga je neutralisana dodavanjem 60 ul 2 M Tris-baze, posle čega je sledila infekcija u ćelije E. coli TG1, mešanjem 10 ml eksponencijalno rastuće kulture sa 0.5 ml eluiranih faga i inkubacijom tokom 30 minuta, na 37°C. Konačno, inficirane bakterije su postavljene na TYE medijum sa 1% glukoze i 100 ug/ml ampicilina, i inkubirane su na 30°C, tokom noći.

Primer5: Kloniranje odabranih klonova CH3 mutanata, odabranih prema TLR-9, za rastvorljivu ekspresiju

Fagemid DNK iz faga, koji je odabran kroz 3 kruga dobijanja, izolovan je pomoću midi-prepa. DNK, koja kodira mutirane CH3-regione, bila je serijski amplifikovana PCR-om i klonirana Ncol-Notl u vektor pNOTBAD/Myc-His, koji je E. coli ekspresioni vektor pBAD/Myc-His (Invitrogen) sa umetnutim Noti restrikcionim položajem, za olakšavanje kloniranja. Povezane konstrukcije su transformisane u ćelije E. coli LMG194 (Invitrogen) elektroporacijom, i uzgajane su na 30°C, na TYE medijumu sa 1% glukozom i ampicilinom, tokom noći. Odabrani klonovi su inokulisani u 200 ul 2xYT medijuma sa ampicilinom, rasli su tokom noći na 30°C, i indukovani su dodavanjem L-arabinoze do krajnje koncentracije od 0.1%. Nakon ekspresije na 16°C, preko noći, ćelije su prikupljene centrifugiranjem i obrađene sa 100 ul pufera Na-borata, pH 8.0, na 4°C tokom noći, kako bi se proizveli periplazmatski ekstrakti. 50 ul periplazmatskih ekstrakata upotrebljeno je za ELISA test (vidi ispod).

Primer6: ELISA test CH3 mutanata, odabranih prema TLR-9

Ispitano je specifično vezivanje odabranih klonova za TLR-9 peptid pomoću ELISA testa.

Omotač: Mikrotitarska ploča (NUNC, Maxisorp), 100 ul po reakcionoj čašici, 20 ug TLR-9 peptida/ml 0.1 M pufera Na karbonata, pH 9.6, 1 h na 37°C

Ispiranje: 3x 200 ul PBS

Blokiranje: 1% BSA-PBS, 1 h na RT

Ispiranje: 3 x200 ul PBS

Vezivanje periplazmatskog ekstrakta: 50 ul periplazmatskog ekstrakta 50 ul 2% BSA-PBS, na sobnoj temperaturi, preko noći

Ispiranje: 3x 200 ul PBS

1. antitelo: anti-His4 (Oiagen), 1:1000 u 1% BSA-PBS, 90 min na RT, 100 ul po jamici

Ispiranje: 3x 200 ul PBS

2. antitelo: kozji anti mišji<*>HRP (SIGMA), 1:1000 u 1% BSA-PBS, 90 min na RT, 100 ul po jamici

Ispiranje: 3x 200 ul PBS

Detekcija: 3 mg/ml OPD u Na citrat/fosfatni pufer, pH 4.5, 0.4 ul 30% H202

Stopiranje: 100 ml 3M H2S04

čitanje apsorbancije: 492/620 nm

Klonovi, koji su davali visoki signal u prvom, preliminarnom ELISA testu, kultivisani su u 20-ml zapremini, pod istim uslovima, kao što su gore opisani. Njihovi periplazmatski ekstrakti su izolovani u 1/20 zapremini kulture, kao što je prethodno opisano, i ispitani su ELISA testom (kao što je prethodno opisano) za potvrdu.

Primer 7: Dobijanje biblioteke CH3 i CH3+5 - faga na lizozimu kokošjeg jajeta

Izvedene su 3 kruga dobijanja. Maxisorp ploče sa 96 jamica (Nunc) su obložene lizozimom kokošjeg jajeta, dodavanjem 200 ul sledećeg rastvora, po reakcionoj čašici: PBS, sa sledećim koncentracijama rastvorenog lizozima kokošjeg jajeta:

1. krug dobijanja: 2 mg/ml HEL

2. krug dobijanja: 1 mg/ml HEL

3. krug dobijanja: 1 mg/ml HEL

Inkubacija je trajala 1 sat, na 37°C, posle čega je sledilo blokiranje sa 2% suvim mlekom (M-PBS) sa 200 ul po jamici, tokom 1 sata, na sobnoj temperaturi.

Zatim je ostavljeno da biblioteka površinski izloženih faga reaguje sa vezanim lizozimom kokošjeg jajeta, dodavanjem 100 ul suspenzije faga i 100 ul 4% suvog mleka (M-PBS), nakon čega je sledila inkubacija, tokom 45 minuta, uz mućkanje, i tokom 90 minuta, bez mućkanje, na sobnoj temperaturi.

Nevezane čestice faga su otklonjene ispiranjem na sledeći način:

Prva krug dobijanja. 10 x 300 ul T-PBS, 5x 300 ul PBS

Drugi krug dobijanja: 15 x 300 ul T-PBS, 10x 300 ul PBS

Treći krug dobijanja: 20 x 300 ul T-PBS, 20 x 300 ul PBS

Eluacija vezanih čestica faga izvedena je dodavanjem 200 ul, po jamici, 0.1 M glicina, pH 2.2, i inkubacijom, uz mućkanje, tokom 30 minuta, na sobnoj temperaturi. Posle toga, suspenzija faga je neutralisana dodavanjem 60 ul 2 M Tris-baze, nakon čega je sledila infekcija u ćelije E. coli TG1, mešanjem 10 ml eksponencijalno rastuće kulture sa 0.5 ml eluiranih faga i inkubacijom tokom 30 minuta, na 37°C. Konačno, inficirane bakterije su postavljene na TYE medijum sa 1 % glukozom i 100 ug/ml ampicilina, i inkubirane su, na 30°C, tokom noći.

Primer8: Kloniranje odabranih klonova primera 7 za rastvorljivu ekspresiju

Kloniranje odabranih klonova za rastvorljivu ekspresiju izvedeno je, kao što je opisano prethodno za CH3 mutante, odabrane prema TLR-9.

Primer9: Rastvorljiva ekspresija odabranih klonova primera 7

Rastvorljiva ekspresija odabranih klonova izvedena je, kao što je opisano prethodno za CH3 mutante, odabrane prema TLR-9. Periplazmatski ekstrakti su ispitani preliminarnim ELISA testom (za protokol vidi primer 10).

Klonovi, koji su davali visoki signal u prvom, preliminarnom ELISA testu, kultivisani su u 20-ml zapremini pod istim uslovima, kao što su gore opisani. Njihovi periplazmatski ekstrakti su izolovani u 1/20 zapremini kulture, kao što je prethodno opisano, i ispitani su ELISA testom (kao što je opisano u primeru 10) za potvrdu.

Primer10: ELISA test CH3 mutanata, odabranih prema lizozimu kokošjeg jajeta

Omotač: Mikrotitarska ploča (NUNC, Maxisorp), 100 ul po jamici, 100 ug lizozima kokošjeg jajeta/ml u PBS, 1 h na 37°C

Ispiranje: 3x 200 ul PBS

Blokiranje: 1 % BSA-PBS, 1 h na RT

Ispiranje: 3 x200 ul PBS

Vezivanje periplazmatskog ekstrakta: 50 ul periplazmatskog ekstrakta 50 ul 2% BSA-PBS, na sobnoj temperaturi, preko noći

Ispiranje: 3x 200 ul PBS

1. antitelo: anti-His4 (Oiagen), 1.1000 u 1% BSA-PBS, 90 min na RT, 100 ul po jamici

Ispiranje: 3x 200 ul PBS

2. antitelo: kozji anti mišji<*>HRP (SIGMA), 1:1000 u 1% BSA-PBS, 90 min na RT (sobna temperatura), 100 ul po jamici

Ispiranje: 3x 200 ul PBS

Detekcija: 3 mg/ml OPD u Na citrat/fosfatni pufer, pH 4.5, 0.4 ul 30% H202

Stopiranje: 100 ml 3M H2S04

Čitanje apsorbancije: 492/620 nm

Uočeno je da lizozim kokošjeg jajeta reaguje sa anti-his4antitelom, zbog čega je zapažen relativno visoki background.

Primer 11:CL biblioteka

Vizuelni pregled kristalne strukture Fab fragmenta (korišćena je struktura Fab humanog monoklonalnog antitela 3D6: banka podataka RSCB Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb/) sa ulazom 1DFB.PDB (He XM, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1992 Aug 1;89(15):7154-8) i analiza uz pomoć kompjutera (npr., za ove potrebe je korišćen Protein Explorer (http://molvis.sdsc.edu/protexpl/frntdoor.htm)) sekundarne i tercijarne strukturu ovog proteina) omogućavaju identifikaciju ostataka, iociranih u regionima petlje, koji povezuju beta-strukove građe CL-domena. Ovi ostaci sadrže aminokiseline 8 do 18, aminokiseline 27 do 35, aminokiseline 42 do 78, aminokiseline 83 do 85, aminokiseline 92 do 100, aminokiseline 108 do 117 i aminokiseline 123 do 126 (brojčano označavanje u skladu sa IMGT brojčanim sistemom (Lefranc MP, et al. Nucleic Acids Res. 2005 Jan 1;33 (izdanje baze podataka): D593-7; Lefranc MP, et al. Dev Comp Immunol. 2005;29(3): 185-203)).

Još određenije, ostaci 11, 12, 14-18 i 92-95 su nasumično odabrani u okviru humanog CL domena (SEQ ID No. 48). Nasumično biranje je izvršeno PCR amplifikacijom kodirajućih sekvenci sa PCR prajmerima, u kojima su položaji relevantnih kodona kodirani nukleotidnom sekvencom 5'-NNS-3\ koja potencijalno kodira svih 20 aminokiselina, uz izbegavanje 2 od 3 stop kodona. Umetak iz biblioteke je amplifikovan pomoću dve zasebne PCR reakcije, a dva PCR fragmenta su povezana zajedno preko restrikcionog položaja HpyCH4IV, koji je uveden kao tiha mutacija, pomoću PCR prajmera. Prajmeri dalje, obezbeđuju restrikcione endonukleazne položaje Ncol, odnosno Noti, za kloniranje u vektor otkrivenog faga pHEN (Hoogenboom HR, et al. Nucleic Acids Res. 1991 Aug 11 ;19(15):4133-7). C-terminalni cistein CL domena nije uključen u izlaganje faga, ali može biti dodat kasnije, kada se koristi modifikovani CL klon, npr. za konstruisanje Fab fragmenta.

Kao kalup za PCR amplifikaciju, korišćen je plazmid, kao što je pRcCMV-3D6LC (Ruker F, et al. Ann N Y Acad Sci. 1991 Dec 27;642:212-9), koji sadrži, kao umetak, kompletan laki lanac humanog monoklonalnog antitela.

Za biblioteke CL+3 (SEQ ID No. 50, 51) i CL+5 (SEQ ID No. 52, 53), koje sadrže dodatne ostatke, umetnute između pozicije 92 i 95 CL domena, korišćeni su prajmeri CLRHPY3, odnosno CLRHPY5, umesto prajmera CLRHPY.

Nukleotidna i aminokiselinska sekvenca konačnog proizvoda PCR-a i povezivanja, koji je kloniran u Ncol položaj pHEN1, koji dovodi do pričvršćivanja lider sekvence pelB za N-kraj konstrukcije, prikazana je ispod (SEQ ID No. 48, 49):

Brojni odabrani klonovi biblioteke (mutirani CL domeni, klonirani u fagemid vektor pHEN1) kontrolisani su pomoću restrikcione analize i sekvencioniranja DNK, da li sadrže umetak, kao što je planirano, uključujući korektno umetnute nasumične sekvence. Za sledeće korake pripreme faga, praćeni su standardni protokoli. Ukratko, smeša za povezivanje je transformisana u ćelijeE. coliTG1, pomoću elektroporacije. Posle toga, čestice faga su oslobođene iz ćelijaE. coliTG1 sa pomagač fagom M13-K07. Čestice faga su, zatim, precipitirane iz supernatanta kulture sa PEG/NaCI u 2 koraka, rastvorene su u vodi i korišćene za selekciju putem dobijanja (paninga) ili su, alternativno, čuvane na minus 80°C.

Primer12: CH1 biblioteka

Vizuelni pregled kristalne strukture Fab fragmenta (korišćena je struktura Fab humanog monoklonalnog antitela 3D6: banka podataka RSCB Protein Data Bank, ulaz 1DFB.PDB) i kompjuterski potpomognuta analiza (za ove potrebe je korišćen Protein Explorer) sekundarne i tercijarne strukture ovog proteina, omogućavaju identifikaciju ostataka, lociranih u regionima petlje, koji povezuju beta-strukove građe CH1-domena. Ovi ostaci sadrže aminokiseline 7 do 21, aminokiseline 25 do 39, aminokiseline 41 do 81, aminokiseline 83 do 85, aminokiseline 89 do 103 i aminokiseline 106 do 117 (brojčano označavanje u skladu sa IMGT brojčanim sistemom).

Još određenije, ostaci 12-19 i 93-100 su nasumično odabrani u okviru humanog CH1 domena (SEQ ID No. 54, 55). Nasumično biranje je izvršeno PCR amplifikacijom kodirajućih sekvenci sa PCR prajmerima, u kojima su položaji relevantnih kodona kodirani nukleotidnom sekvencom 5'-NNS-3', koja potencijalno kodira svih 20 aminokiselina, uz izbegavanje 2 od 3 stop kodona. Umetak iz biblioteke je amplifikovan pomoću dve odvojene PCR reakcije, a dva PCR fragmenta su povezana zajedno preko restrikcionog položaja BstEII, koji prirodno postoji u CH1 domenu. Prajmeri, dalje, obezbeđuju restrikcione endonukleazne položaje Ncol, odnosno Noti, za kloniranje u vektor otkrivenog faga pHEN. C-terminalni cistein CH1 domena nije uključen u izlaganje faga, ali može biti dodat kasnije, kada se koristi modifikovani CH1 klon, npr. za konstruisanje Fab fragmenta.

Kao kalup za PCR amplifikaciju, korišćen je plazmid, kao što je pRcCMV-3D6HC, koji sadrži, kao umetak, kompletan teški lanac humanog monoklonalnog antitela.

Nukleotidna i aminokiselinska sekvenca konačnog proizvoda PCR-a i povezivanja, koji je kloniran u Ncol položaj pHEN1, koji dovodi do pričvršćivanja lider sekvence pelB za N-kraj konstrukcije, prikazana je ispod (SEQ ID No. 54, 55):

Brojni odabrani klonovi biblioteke (mutirani CH1 domeni, klonirani u fagemid vektor pHEN1) kontrolisani su pomoću restrikcione analize i sekvencioniranja DNK, da li sadrže umetak, kao što je planirano, uključujući korektno umetnute nasumične sekvence. Za sledeće korake pripreme faga, praćeni su standardni protokoli. Ukratko, smeša za povezivanje je transformisana u ćelijeE. coliTG1, pomoću elektroporacije. Posle toga, čestice faga su oslobođene iz ćelijaE. coliTG1 sa pomagač fagom M13-K07. Čestice faga su, zatim, precipitirane iz supernatanta kulture sa PEG/NaCI u 2 koraka, rastvorene su u vodi i korišćene za selekciju putem paninga ili su, alternativno, čuvane na minus 80°C.

Primer 13: Dobijanje biblioteke CH1 - faga na lizozimu kokošjeg jajeta (HEL)

Izvedena su 3 kruga dobijanja sa bibliotekom CH1 - faga (vidi primer 12). Maxisorp ploče sa 96 jamica (Nunc) su obložene lizozimom kokošjeg jajeta, dodavanjem 200 ul, po jamici, sledećeg rastvora: PBS, sa sledećim koncentracijama rastvorenog lizozima kokošjeg jajeta:

1. krug dobijanja: 2 mg/ml HEL

2. krug dobijanja: 1 mg/ml HEL

3. krug dobijanja: 1 mg/ml HEL

Inkubacija je trajala 1 sat na 37°C, nakon čega je sledilo blokiranje sa 2% suvim mlekom (M-PBS) sa 200 ul, po jamici, tokom 1 sata na sobnoj temperaturi.

Zatim je biblioteka površinski izloženih faga ostavljena da reaguje sa vezanim lizozimom kokošjeg jajeta, dodavanjem 100 ul suspenzije faga i 100 ul 4% suvog mleka (M-PBS), posle čega je sledila inkubacija tokom 45 minuta, uz mućkanje i tokom 90 minuta, bez mućkanje, na sobnoj temperaturi.

Nevezane čestice faga su otklonjene ispiranjem na sledeći način:

Prvi krug dobijanja: 10 x 300 ul T-PBS, 5x 300 ul PBS

Drugi krug dobijanja: 15 x 300 ul T-PBS, 10x 300 ul PBS

Treći krug dobijanja: 20 x 300 ul T-PBS, 20 x 300 ul PBS

Eluacija vezanih čestica faga izvedena je dodavanjem 200 ul, po reakcionoj čašici, 0.1 M glicina, pH 2.2, i inkubacijom, uz mućkanje, tokom 30 minuta, na sobnoj temperaturi. Nakon toga, suspenzija faga je neutralisana dodavanjem 60 ul 2 M Tris-baze, posle čega je sledila infekcija u ćelijeE.co//TG1, mešanjem 10 ml eksponencijalno rastuće kulture sa 0.5 ml eluiranih faga i inkubacijom tokom 30 minuta, na 37°C. Konačno, inficirane bakterije su postavljene na TYE medijum sa 1% glukoze i 100 ug/ml ampicilina, i inkubirane su na 30°C, tokom noći.

Kloniranje odabranih klonova CH1 mutanata, odabranih prema lizozimu,

za rastvorljivu ekspresiju

Fagemid DNK iz faga, koja je odabrana kroz 3 kruga dobijanja, izolovan je pomoću midi-prepa. DNK, koja kodira mutirane CH1-domene, je serijski amplifikovana PCR-om i Ncol-Notl klonirana u vektor pNOTBAD/Myc-His, koji je £.coliekspresioni vektor pBAD/Myc-His (Invitrogen), sa umetnutim Noti restrikcionim položajem, za olakšavanje kloniranja. Povezane konstrukcije su transformisane u ćelijeE. coliLMG194 (Invitrogen) elektroporacijom, i uzgajane su na 30°C, na TYE medijumu sa 1% glukozom i ampicilinom, tokom noći. Odabrani klonovi su inokulisani u 200 ul 2xYT medijuma sa ampicilinom, rasli su tokom noći, na 30°C, i indukovani su dodavanjem L-arabinoze do završne koncentracije od 0.1%. Nakon ekspresije na 16°C, preko noći, ćelije su prikupljene centrifugiranjem i obrađene sa 100 ul pufera Na-borata, pH 8.0, na 4°C tokom noći, kako bi se proizveli periplazmatski ekstrakti. 50 ul periplazmatskih ekstrakata upotrebljeno je za ELISA test.

Klonovi, koji su davali visoki signal u prvom, preliminarnom ELISA testu, kultivisani su u 20-ml zapremini, pod istim uslovima, kao što gore opisani. Njihovi periplazmatski ekstrakti su izolovani u 1/20 zapremini kulture, kao što je.prethodno opisano, i ispitani su ELISA testom (kao što je dole opisano) za potvrdu.

ELISA test CH1 mutanata, odabranih prema lizozimu kokošjeg jajeta

Omotač: Mikrotitarska ploča (NUNC, Maxisorp), 100 ul po jamici, 100 ug lizozima kokošjeg jajeta/ml u PBS, 1 h na 37°C

Ispiranje: 3x 200 ul PBS

Blokiranje: 1% BSA-PBS, 1 h na RT

Ispiranje: 3 x200 ul PBS

Vezivanje periplazmatskog ekstrakta: 50 ul periplazmatskog ekstrakta 50 ul 2% BSA-PBS, na sobnoj temperaturi, preko noći

Ispiranje: 3x 200 ul PBS

1. antitelo: anti-His4(Qiagen), 1:1000 u 1% BSA-PBS, 90 min na RT, 100 ul po jamici

Ispiranje: 3x 200 ul PBS

2. antitelo: kozji anti mišji<*>HRP (SIGMA), 1:1000 u 1% BSA-PBS, 90 min na RT, 100 ul po jamici

Ispiranje: 3x 200 ul PBS

Detekcija: 3 mg/ml OPD u Na citrat/fosfatni pufer, pH 4.5, 0.4 ul 30% H202

Stopiranje: 100 ml 3M H2S04

Čitanje apsorbancije: 492/620 nm

Klonovi su interpretirani kao pozitivni kada je njihov ELISA signal najmanje trostruko veći od signala backgrounda.

Primer 14:Dobijanje biblioteka CL - faga na lizozimu kokošjeg jajeta (HEL)

Izvedena su 3 kruga dobijanja sa bibliotekom CL - faga (vidi primer 11). Maxisorp ploče sa 96 jamica (Nunc) su obložene lizozimom kokošjeg jajeta, dodavanjem 200 ul sledećeg rastvora, po reakcionoj čašici: PBS, sa siedećim koncentracijama rastvorenog lizozima kokošjeg jajeta:

1. krug dobijanja: 2 mg/ml HEL

2. krug dobijanja: 1 mg/ml HEL

3. krug dobijanja: 1 mg/ml HEL

Inkubacija je trajala 1 sat na 37°C, posle čega je sledilo blokiranje sa 2% suvim mlekom (M-PBS) sa 200 ul, po jamici, tokom 1 sata na sobnoj temperaturi.

Zatim je biblioteka površinski izloženih faga ostavljena da reaguje sa vezanim lizozimom kokošjeg jajeta, dodavanjem 100 ul suspenzije faga i 100 ul 4% suvog mleka (M-PBS), nakon čega je sledila inkubacija, tokom 45 minuta, uz mućkanje, i tokom 90 minuta, bez mućkanje, na sobnoj temperaturi.

Nevezane čestice faga su otklonjene ispiranjem na sledeći način:

Prvi krug dobijanja: 10 x 300 ul T-PBS, 5x 300 ul PBS

Drugi krug dobijanja: 15 x 300 ul T-PBS, 10x 300 ul PBS

Treći krug dobijanja: 20 x 300 ul T-PBS, 20 x 300 ul PBS

Eluacija vezanih čestica faga izvedena je dodavanjem 200 ul, po jamici, 0.1 M glicina, pH 2.2, i inkubacijom, uz mućkanje, tokom 30 minuta, na sobnoj temperaturi. Posle toga, suspenzija faga je neutralisana dodavanjem 60 ul 2 M Tris-baze, nakon čega je sledila infekcija u ćelijeE. coliTG1, mešanjem 10 ml eksponencijalno rastuće kulture sa 0.5 ml eluiranih faga i inkubacijom tokom 30 minuta, na 37°C. Konačno, inficirane bakterije su stavljene na TYE medijum sa 1% glukoze i 100 ug/ml ampicilina, i inkubirane su na 30°C, tokom noći.

Kloniranje odabranih klonova CL mutanata, odabranih prema lizozimu, za

rastvorljivu ekspresiju

Fagemid DNK iz faga, koji je odabran kroz 3 kruga dobijanja, izolovan je pomoću midi-prepa. DNK, koja kodira mutirane CL-domene, je serijski amplifikovana PCR-om i Ncol-Notl klonirana u vektor pNOTBAD/Myc-His, koji jeE. coliekspresioni vektor pBAD/Myc-His (Invitrogen), sa umetnutim Noti restrikcionim položajem, za olakšavanje kloniranja. Povezane konstrukcije su transformisane u ćelijeE. coliLMG194 (Invitrogen) elektroporacijom, i uzgajane su na 30°C, na TYE medijumu sa 1% glukozom i ampicilinom, tokom noći. Odabrani klonovi su inokulisani u 200 ul 2xYT medijuma sa ampicilinom, rasli su tokom noći na 30°C, i indukovani su dodavanjem L-arabinoze do završne koncentracije od 0.1%. Nakon ekspresije na 16°C, preko noći, ćelije su prikupljene centrifugiranjem i obrađene sa 100 ul pufera Na-borata, pH 8.0, na 4°C tokom noći, kako bi se proizveli periplazmatski ekstrakti.

50 ul periplazmatskih ekstrakata upotrebljeno je za ELISA test.

Klonovi, koji su davali visoki signal u prvom, preliminarnom ELISA testu, kultivisani su u 20-ml zapremini, pod istim uslovima, kao što gore opisani. Njihovi periplazmatski ekstrakti su izolovani u 1/20 zapremini kulture, kao što je prethodno opisano, i ispitani su ELISA testom (kao što je dole opisano) za potvrdu.

ELISA test CL mutanata, odabranih prema lizozimu kokošjeg jajeta

Omotač: Mikrotitarska ploča (NUNC, Maxisorp), 100 ul po jamici, 100 ug lizozima kokošjeg jajeta/ml u PBS, 1 h na 37°C

Ispiranje: 3x 200 ul PBS

Blokiranje: 1% BSA-PBS, 1 h na RT

Ispiranje: 3 x200 ul PBS

Vezivanje periplazmatskog ekstrakta: 50 ul periplazmatskog ekstrakta 50 ul 2% BSA-PBS, na sobnoj temperaturi, preko noći

Ispiranje: 3x 200 ul PBS

1. antitelo: anti-His4(Oiagen), 1:1000 u 1% BSA-PBS, 90 min na RT, 100 ul po jamici

Ispiranje: 3x 200 ul PBS

2. antitelo: kozji anti mišji<*>HRP (SIGMA), 1:1000 u 1% BSA-PBS, 90 min na RT, 100 ul po jamici

Ispiranje: 3x 200 ul PBS

Detekcija: 3 mg/ml OPD u Na citrat/fosfatni pufer, pH 4.5, 0.4 ul 30% H202

Stopiranje: 100 ml 3M H2S04

Čitanje apsorbancije: 492/620 nm

Klonovi su interpretirani kao pozitivni kada je njihov ELISA signal najmanje trostruko veći od signala backgrounda.

Primer15: Konstruisanje imunoglobulinskog domena, koji je randomizovan na oba kraka (bispecifično konstruisan CH3 domen)

Ovaj primer opisuje konstruisani domen imunoglobulina, sa dve specifičnosti vezivanja.

Dizajniranje ovog konstruisanog imunoglobulinskog domena uključivalo je sledeću strategiju: • konstruisani CH3 domen, klon C24 (vidi primer 10), dobijen iz CH3+5 biblioteke, koji se specifično vezuje za lizozim, upotrebljen je kao polazna tačka • u ovom modifikovanom CH3 domenu, bili su identifikovani ostaci, koji se randomizuju, a koji povezuju B-strukove imunoglobulinskog prevoja, i koji leže na suprotnoj strani domena, u poređenju sa ostacima, koji su mutirani, kada se proizvodi klon C24. • dizajnirani su PCR prajmeri, koji omogućavaju randomizovanje ovih ostatka i sintezu ovog izgrađenog imunoglobulinskog domena u postupku, koji je sličan onom, koji je prethodno opisan za bibliteke CH3, CH3+3 i CH3+5. 4 PCR proizvoda, koji sadrže randomizovane položaje, vezani su i punoj dužini umetnuti, amplifikovani su PCR-om. Zatim su klonirani u pHEN-1 preko Ncol-Notl položaja i transformisani u E. coli TG-1 ćelije da bi se konstruisala biblioteka od oko 10<8>kolonija. 20 nasumično odabranih kolonija je sekventovano i nađeno je da su nasumični položaji nezavisno mutirani. Takođe, nije primećena sekvenca "divljeg tipa" (C24). Biblioteka faga je stvorena prema standardnim protokolima i postignut je titarfaga od 6.32 x 10<10>TU/ml.

Sa ciljem ispitivanja bispecifičnosti, izabran je rekombinantni humani eritropoetin (rhEPO) kao drugi antigen, dok je očekivano da konstrukcija zadrži svoju originalno konstruisanu specifičnost za lizozim kokošijeg jajeta. rhEPO-reaktivni fag je izabran u kruga dobijanja. Da bi se sačuvala populacija C24 klonova, koji posle mutageneze i dalje vezuju lizozim kokošijeg jajeta, prvi krug odabiranja rhEPO sledi krug dobijanja populacije faga na lizozim kokošijeg jajeta (1 mg/ml u PBS). 200 \ x\ rhEPO je obmotano na 5 jamica mikrotitarske ploče (Maxisorp, Nunc) u 0.1 M Na-karbonatnog pufera, pH 9.6, u opadajućim koncentracijama u uzastopnim krugovima dobijanja (vidi Tabelu u nastavku). Posle blokiranja sa 2% M-PBS, fagu u blokirajućem sredstvu je omogućeno da se veže na sobnoj temperaturi u toku 2 h. Nakon 20 ispiranja sa T-PBS i 20 sa PBS, eluirano je sa 0.1 M glicinom, pH 2.2 i neutralisano sa 2 M Trisom. Eluirani fag je odmah upotrebljen za infekciju eksponencijalno rastućeg TG-1. Infektovane ćelije su odabrane na medijumu sa ampicilinom. Čestice faga su uklonjene iz supernatanta kulture u toku superinfekcije sa fagom pomagačem M13-K07, ukoncentrisane sa PEG-om i upotrebljene u drugom krugu dobijanja. Unos i dobitak brojeva faga je određen kao transformišuće jediniceE. coli nakonsvakog kruga dobijanja (Tabela 8).

Dobijene kolonije su sastrugane sa ploča, držane u kulturi u 2xYT sa ampicilinom i njihov plazmid DNK je izolovan sa midi-prep. Umetci su amplifikovani PCR-om, a zatim, subklonirani u vektor pNOTBAD i transformisani uE. colivrstu E104. 4x72 kolonije su držane u kulturi u 200 ul 2xYT sa ampicilinom i indukovane sa 0.1%L-arabinozom sledećeg dana. Nakon 24 h ekspresije na 16°C, lizirane su sa 200 uJ Na-boratnog pufera, pH 8.0 u toku 6 h na 4°C i za ELISA-u je upotrebljen periplazmatski ekstrakt.

Za ELISA-u, Maxisorp ploče su obložene sa lizozomom kokošijeg jajeta u PBS-u (20 ug/ml) ili sa rhEPO u 0.1 M Na-karbonatnom puferu, pH 9.6, tokom 1 h na 37°C. Nakon blokiranja sa 1% BSA-PBS, omogućeno je periplazmatskim ekstraktima u istom blokirajućem sredstvu da se vežu preko noći. Vezivanje je dokazano sa anti-His-(4) antitelom i kozijim mišijim IgG antitelom, konjugovanim sa HRP (za detekciju lizozima kokošijeg jajeta) ili AP (za detekciju rhEPO). Boja reakcije od OPD konverzije (HRP) je pročitana na 492/620 nm nakon zaustavljanja sa 1.25 M H2S04i pNPP konverzija (AP) je pročitana na 405/620 nm. Za ekspresiju na 20-ml-skali je odabrano je 14 kolonija sa obećavajućim vrednostima apsorbanci. Nakon 24 h indukcije arabinozom na 16°C, ćelije su sakupljene i preko noći lizirane u 1 ml Na-boratnog pufera na 4°C, a lizat je upotrebljen za ELISA-u. ELISA je izvedena kao i prethodno, u 4 paralele, a jamice bez periplazmatskog ekstrakta i bez antigena su upotrebljene kao negativna kontrola. Rezultati (Tabela 9) su dobijeni sa klonom u skladu sa SEQ ID No. 42, 43.

Primer 16: Konstruisani Ch3 domeni obezbeđuju bispecifičnost u Fab-sličnom formatu

U konstrukciji, koja je upotrebljena u ovom primeru, i VLi VHlanac antitela su spojeni u konstruisani CH3 domen.

VH i VL region humanog monoklonskog antitela 3D6 (He XM, et al. Proc Natl Acad Sci USA, 1992 89:7154-8; Kohl J, et al. Ann N Y Acad Sci. 1991 646:106-14; Felgenhauer M, et al. Nucleic Acids Res. 1990 18:4927), koje prepoznaje epitop na gp41 HIV-1 je upotrebljen kao fuzioni partner za konstruisanje CH3 domena klona C24 koji se specifično vezuje za lizozim kokošijeg jajeta.

U cilju unapređivanja formacije VL-CH3 / VH-CH3 dimera putem disulfidne veze, na C-kraj C24 sekvence se dodaju ostaci Ser-Cys.

Nukleotidne, odnosno amino kiselinske sekvence dva lanca, 3D6VL-C24 i 3D6VH-C24 su date u SEQ ID No. 47, 46 odnosno SEQ ID No. 45, 44.

Prajmeri su dizajnirani tako da omoguće amplifikaciju kodirajućih regiona, uvođenjem restrikcionih položaja u isto vreme (tihe mutacije), koji su iskorišćeni da drže zajedno kodirajuće regione. Za ekspresiju gena, izabran je Pichia pastoris ekspresioni sistem. Konstrukcije su klonirane u pogodne ekspresione vektore Pichia pastoris: 3D6VL-C24 je kloniran u pPIC9K (konačno ime: pPIC9K3LC) i 3D6VH-C24 je kloniran u pPICZalfaA (konačno ime: pPICZ3HC). Konstrukcija pPICZ3HC je linearizovana saBglU,transformisana u Pichia pastoris GS115 i izdvojeni su transformanti na čvrstom medijumu sa zeocinom. Jedan od transformanata je zatim upotrebljen kao ćelija domaćin zaSaiI- linearizovanu konstrukciju pPIC9K3LC. Zatim su izabrani dvostruki transformanti na RDB-medijumu.

Klonovi su inokulirani u 30 ml YPG medijuma i rasli su do OD6oo=10, a zatim su indukovani dodavanjem 1% metanola u BMMY medijumu. Indukcija je nastavljena tokom 36 sati na 16°C. Supernatanti su uklonjeni centrifugiranjem i onda su ukoncentrisani oko 10 puta. Prisustvo rekombinantnog proteina je potvrđeno VVestern blotom sa anti-His (4) antitelom, a određena je koncentracija od otprilike 50-100 ug/l početne kulture.

Prvi funkcionalni testovi su izvedeni sa 10x-ukoncentrisanim supernatantima. Prvo, jamice Maxisorp ploča su obložene sa 20 ug/ml lizozima kokošijeg jajeta u PBS-u ili sa 20 ug/ml epitopa antitela 3D6 u 0.1 M Na-karbonatnom puferu, pH 9.6, tokom 1 h, na 37°C. 3D6 epitop je korišćen u obliku rekombinantno proizvedenog GST-fuzionog proteina. Posle blokiranja sa 1% BSA-PBS, ukoncentrisani supematanti su ostavljeni da se izvrši vezivanje preko noći u istom blokirajućem sredstvu. Blokiranje je dobijeno sa anti-His (4) antitelom i kozijim anti-mišijim antitelom, koje je konjugovano sa HRP i, vizualizovano je kao boja reakcije koja nastaje od OPD konverzije na 492/620 nm (Tabela 10).

Claims (11)

1. Konstantni domen imunoglobulina ljudskog porekla ili njegov deo, koji obuhvata najmanje jedan region petlje bilo kog od CH1 domena, CH2 domena, CH3 domena, CH4 domena ili CL domena, navedeni najmanje jedan strukturni region petlje koji obuhvata najmanje jednu modifikaciju koja omogućava vezivanje navedenog najmanje jednog modifikovanog regiona petlje za epitop antigena, gde se nemodifikovani konstantni domen imunoglobulina ne vezuje za navedeni epitop, gde navedena modifikacija isključuje ugrađivanje farmakološki aktivnog peptida od 2 do 40 amino kiselina u Fc domen.

2. Modifikovani imunoglobulin, kao u patentnom zahtevu 1, gde je navedeni modifikovani region petlje bilo koji od CKili CX domena.

3. Modifikovani imunoglobulin, kao u patentnom zahtevu 1 ili 2, gde je navedeni modifikovani region petlje bilo koji od Fab fragmenta.

4. Modifikovani imunoglobulin, kao u patentnom zahtevu 1, gde je navedeni modifikovani region petlje bilo koji od Fc fragmenta.

5. Modifikovani imunoglobulin, kao u bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, koji potiče od IgG.

6. Modifikovani imunoglobulin, kao u bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, sa najmanje dva regiona petlje kojima je modifikovana struktura.

7. Imunoglobulin koji obuhvata najmanje jedan modifikovani imunoglobulin, kao u bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, gde navedeni region petlje koji je modifikovan obuhvata najmanje 6 amino kiselinskih modifikacija.

8. Molekul koji obuhvata najmanje jedan modifikovani imunoglobulin, kao u bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7 i, najmanje jedan drugi vezujući molekul, gde je navedeni drugi vezujući molekul odabran iz grupe modifikovanih imunoglobulina, kao u bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, rastvorljivih receptora, liganada, nukleinskih kiselina i ugljenohidrata.

9. Molekul, kao u bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8, naznačen timeštoma koji modifikovani region petlje: CH1, CH2, CH3 ili CH4, uključuje modifikaciju jednog amino kiselinskog položaja u okviru amino kiselinske sekvence odabrane iz grupe, koja se sastoji od amino kiselina 7 do 21, amino kiselina 25 do 39, amino kiselina 41 do 81, amino kiselina 83 do 85, amino kiselina 89 do 103 ili amino kiselina 106 do 117, gde je numerisanje amino kiselinskog položaja domena prema IMGT.

10. Molekul, kao u bilo kom od patentnih zahteva1 do 8, naznačen timešto ma koji od regiona petlje CKili CA. uključuje modifikaciju jednog amino kiselinskog položaja u okviru amino kiselinske sekvence odabrane iz grupe, koja se sastoji od amino kiselina 8 do 18, amino kiselina 27 do 35, amino kiselina 42 do 78, amino kiselina 83 do 85, amino kiselina 92 do 100, amino kiselina 108 do 117 ili amino kiselina 123 do 126, gde je numerisanje amino kiselinskog položaja domena prema IMGT.

11. Nukleinska kiselina koja kodira imunoglobulin, kao u bilo kom od patentnih zahteva 1 do 10.