EA018897B1

EA018897B1 - Молекулы иммуноглобулина, содержащие модифицированные участки структурных петель, обладающие свойством связывания, и способ их получения

Info

Publication number: EA018897B1
Application number: EA200701443A
Authority: EA
Inventors: Гордана Возняк-Кнопп; Готфрид Химмлер; Флориан Рюкер
Original assignee: Ф-Стар Биотехнологише Форшунгс- Унд Энтвиклунгсгез.М.Б.Х.
Priority date: 2005-01-05
Filing date: 2006-01-05
Publication date: 2013-11-29
Also published as: EP1772465A1; HRP20090087T3; CN101098891B; RS50830B; CN103555733A; ATE425186T1; KR101404512B1; US10385118B2; AU2006204459A1; EP2028193A1; HRP20090326T1; US11499249B2; US20120028303A1; EP1772465B1; EA200701443A1; EP2028193B1; US11084868B2; US20110251375A1; ES2323651T3; NZ555893A

Abstract

Способ конструирования иммуноглобулина, содержащего по меньшей мере одну модификацию на участке структурной петли данного иммуноглобулина, и определения связывания данного иммуноглобулина с эпитопом антигена, причем немодифицированный иммуноглобулин практически не связывается с данным эпитопом, при этом способ включает стадии: обеспечения нуклеиновой кислоты, кодирующей иммуноглобулин, содержащий по меньшей мере один участок структурной петли; модификации по меньшей мере одного нуклеотидного остатка по меньшей мере одного из данных участков структурной петли; переноса данной модифицированной нуклеиновой кислоты в экспрессионную систему; экспрессии данного модифицированного иммуноглобулина; контактирования экспрессированного модифицированного иммуноглобулина с эпитопом и определения того, связывается ли данный модифицированный иммуноглобулин с данным эпитопом; а также сами модифицированные иммуноглобулины.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение касается способа конструирования и получения модифицированных иммуноглобулинов.

Основная область - конструирование белков с целью придания им определенных параметров связывания. В частности, подлежащими конструированию белками в настоящем изобретении являются иммуноглобулины (антитела), более конкретно - одиночные домены или пары либо комбинации одиночных доменов иммуноглобулинов. Параметры специфического связывания иммуноглобулинов являются важными характеристиками, так как они контролируют взаимодействие с другими молекулами типа антигенов и делают иммуноглобулины полезными для применения в диагностике и терапии.

Уровень техники

Основная структура антител будет раскрыта далее на примере интактного иммуноглобулина 1дС1.

Две идентичные тяжелые (Н) и две идентичные легкие (Ь) цепи объединяются с образованием Υобразной молекулы антитела. Каждая тяжелая цепь имеет четыре домена. Ν-концевые вариабельные домены находятся на верхних концах Υ. За ними следуют три константных домена: Сц1. С_н2 и С-концевой С_н3, находящийся в основании ножки Υ. Короткий отрезок - перемычка соединяет вариабельные и константные области тяжелой цепи. Шарнирная область соединяет С_н1 и С_н2 с остальной частью антитела (фрагментами РаЬ). При протеолитическом расщеплении шарнирной области интактной молекулы антитела можно получить один фрагмент Ре и два идентичных фрагмента РаЬ. Легкие цепи состоят из двух доменов - вариабельного (У_ь) и константного (С_ъ), разделенных перемычкой.

Дисульфидные связи в шарнирной области соединяют две тяжелые цепи. Легкие цепи присоединяются к тяжелым цепям дополнительными дисульфидными связями. Связанные через Ави углеводные молекулы присоединяются по различным положениям в константных доменах в зависимости от класса иммуноглобулина. У 1дС1 две дисульфидные связи в шарнирной области, между парами Сув235 и Сув238, соединяют две тяжелые цепи. Легкие цепи присоединены к тяжелым цепям дополнительными дисульфидными связями, между Сув229в в доменах С_н1 и Сув214в в доменах С1. Молекулы углеводов присоединяются к АвиЗОб каждого С_н2, образуя отчетливый выступ в ножке Υ.

Эти особенности имеют глубокие функциональные последствия. Вариабельные области тяжелых и легких цепей (У_н и У_ь) находятся на верхушках Υ, в такой позиции, где они реагируют с антигеном. Верхушка молекулы является тем местом, на котором располагается Ν-конец аминокислотной последовательности. Ножка Υ выступает таким образом, что она эффективно опосредует эффекторные функции, такие как активация комплемента и взаимодействие с Рс-рецепторами или АЭСС и АЭСР. Её домены С_н2 и С_н3 образуют выступ, способствуя взаимодействию с эффекторными белками. С-конец аминокислотной последовательности находится на противоположной от верхушки стороне, которую можно назвать ножкой Υ. Структура интактного 1дС1 представлена на фиг. 1а.

В антителах имеется два типа легких цепей, именуемых лямбда (λ) и каппа (к). Конкретный иммуноглобулин имеет либо цепи к, либо цепи λ, но никогда не имеет обеих. Функциональных различий между антителами, имеющими легкие цепи λ или к, не обнаружено.

Структурная организация мономеров основных классов иммуноглобулина человека представлена на фиг. 1Ь. Эти классы отличаются составом и последовательностью соответствующих тяжелых цепей. В 1дМ и 1дЕ отсутствует шарнирная область, но они содержат дополнительный домен тяжелой цепи (С_н4). Количество и расположение дисульфидных связей (линии), соединяющих эти цепи, различается между изотипами. Они также отличаются распределением Ν-связанных углеводных групп, символически представленных кружочками.

Каждый домен в молекуле антитела обладает сходным строением из двух β-слоев, тесно упакованных друг относительно друга в виде сжатого антипараллельного β-цилиндра. Такое консервативное строение именуется укладкой иммуноглобулина. Укладка иммуноглобулина в константных доменах содержит слой из 3 цепей, упакованный относительно слоя из 4 цепей. Укладка стабилизирована водородными связями между β-цепями каждого слоя, гидрофобными связями между остатками противоположных слоев во внутренней части и дисульфидной связью между слоями. Слой из 3 цепей включает цепи С, Р и С, а слой из 4 цепей включает цепи А, В, Е и Ό. Буквы от А до С обозначают последовательное положение β-отрезков вдоль аминокислотной последовательности укладки иммуноглобулина.

Укладка вариабельных доменов содержит 9 β-цепей, составляющих два слоя из 4 и 5 цепей. Слой из 5 цепей структурно гомологичен слою из 3 цепей константного домена, но содержит дополнительные цепи С' и С. Остальные цепи (А, В, С, Ό, Е, Р, С) имеют такую же топологию и такое же строение, как и их аналоги в укладке иммуноглобулина константных доменов. Дисульфидная связь соединяет цепи В и Р в противоположных слоях, как и у константных доменов. Укладка иммуноглобулина проиллюстрирована на фиг. 2 для константного и вариабельного домена иммуноглобулина.

Вариабельные домены легких и тяжелых цепей иммуноглобулина содержат три гипервариабельные петли, или участки, определяющие комплементарность (СЭВ). Три СЭВ У-домена (СИВ1, СИВ2, СИВЗ) собраны на одном конце β-цилиндра. Эти СЭВ представляют собой петли, соединяющие β-отрезки В-С, С'-С и Р-С в укладке иммуноглобулина. Остатки в этих СЭВ варьируют от одной молекулы иммуноглобулина к другой, что придает антигенную специфичность каждому антителу.

- 1 018897

Домены Ун и У_ъ на концах молекул антител тесно упакованы таким образом, что 6 СЭВ (по 3 на каждом домене) совместно образуют поверхность (или полость) для специфического связывания антигена. Таким образом, естественный антигенсвязывающий сайт антитела состоит из петель, соединяющих отрезки В-С, С'-С и Р-6 вариабельного домена легкой цепи и отрезки В-С, С'-С и Р-6 вариабельного домена тяжелой цепи.

Используя 3-мерную структуру белка как пособие при проектировании, аминокислотные остатки, расположенные на поверхности многих белков, подвергали рандомизации, используя коровую структуру белка в качестве каркаса. Примеры такой стратегии описаны или рассмотрены в следующих работах, включенных в настоящее изобретение путем ссылки: Иудгеп Р.А., ИЫеп М. Сигг Θρίη 81гис( ΒίοΙ. (1997), 7: 463-9; Βίηζ Н.К., ΛιηκΙιιΙζ Р., КоЬ1 А., 8!итрр М.Т., Впапй С., Роггег Р., 6гн11ег М.6., Р1иск1Ьип А. №11 Вю1есЬпо1. (2004) 22: 575-82; Уод! М., 8кетта А. СЬетЫосЬет. (2004) 5: 191-9; И8 6562617.

Основополагающий принцип этого метода основан на том наблюдении, что многие белки имеют устойчивую основу, образованную специфическим расположением таких элементов вторичной структуры, как β-структуры или α-спирали, соединяющиеся между собой такими структурами, как петли, складки или беспорядочные клубки. Как правило, эти последние три структурных элемента менее важны для полной структуры белка, и аминокислотные остатки в этих структурных элементах зачастую могут быть заменены без разрушения общей укладки белка. Естественным примером для такого принципа проектирования являются участки СИВ антител. Искусственные примеры включают липокалины, анкирины и другие белковые каркасы.

Петли, не относящиеся к петлям СИВ в нативном иммуноглобулине, не обладают специфичностью связывания антигена или эпитопа, но способствуют правильной укладке всей молекулы иммуноглобулина и/или его эффекторным или иным функциям, поэтому они именуются структурными петлями в целях настоящего изобретения.

В патенте США 6294654 показано, что можно получить измененные антитела, в которых пептидный антиген может быть встроен в петлю антитела (АЬ) вне СИВ в участок С_Н1 между шарнирной и вариабельной областью, а полученное АЬ может быть захвачено антигенпрезентирующей клеткой (АРС) с тем, что пептидный антиген будет презентирован на поверхности АРС в контексте МНС II, и при этом возникнет иммунный ответ. Встраиваемые пептиды являются эпитопами, а общая структура молекулыносителя не имеет значения. Было показано, что пептид так может быть встроен в петлю иммуноглобулина (вне СИВ) и этот иммуноглобулин все-таки будет секретироваться. В клетках есть строгий контроль качества, который предотвращает секрецию иммуноглобулина, если тот имеет неправильную укладку, а изменение аминокислотной последовательности петли может вызвать укладку иммуноглобулина в такую структуру, которую клетка будет воспринимать как неправильную и поэтому разрушит его. Так, помимо представленных примеров, дальнейшее модифицирование структурных петель без изменения самой природы иммуноглобулина посчитали затруднительным.

В патентной заявке И8 2004/0101905 описаны связывающиеся молекулы, содержащие сайт связывания мишени и эффекторный пептид Рс. Эффекторный пептид Рс представляет собой такой пептид, который взаимодействует с эффекторной молекулой. Показано встраивание эффекторного пептида в петлю вне СЭВ домена С_Н1 фрагмента иммуноглобулина.

Эффекторные пептиды Рс представляют собой структуры, которые встречаются в природе в петлях вне СЭВ антител, поэтому можно ожидать, что они не будут нарушать структуру иммуноглобулина при пересадке в другое эквивалентное место в иммуноглобулине.

Тем не менее, каждый пептид, пересаженный в петлю вне СЭВ согласно этому описанию, имеет большой шанс оказаться неактивным при другом структурном окружении, выбранном для него.

В обоих документах предшествующего уровня, приведенных выше, указывается, что трудно встроить пептиды в такую петлю, которая должна сохранять свою структуру и функцию, поскольку нужно не нарушить структуру укладки иммуноглобулина, так как это важно для функционирования и секреции.

В патентных заявках И8 2004/0132101 и 2005/0244403 описаны мутантные иммуноглобулины с измененной аффинностью связывания с эффекторным лигандом, которые являются естественными лигандами для структурных петель антител. В этом документе описан ряд мутаций в различных участках по всей молекуле иммуноглобулина, которые влияют на эффекторную функцию всего антитела.

В других документах предшествующего уровня показано, что до настоящего времени иммуноглобулиноподобный каркас использовался в целях манипулирования существующего антигенсвязывающего сайта, при этом вводились новые параметры связывания. Однако до сих пор только участки СЭВ подвергались конструированию для связывания антигена, иными словами, в случае укладки иммуноглобулина модификации подвергался только естественный антигенсвязывающий сайт для того, чтобы изменить его аффинность или специфичность связывания. Существует обширная литература, в которой описаны различные форматы таких модифицированных иммуноглобулинов, которые зачастую экспрессируют в виде одноцепочечных фрагментов Ру (ксРУ) или фрагментов РаЬ, либо в виде дисплея на поверхности фаговых частиц или в растворимом виде в различных прокариотических или эукариотических системах экспрессии. К ведущим авторам в данной области относятся 6гед \Уш1ег. Апйтеак Р1иск1Ьип и Непше НоодепЬоот.

- 2 018897

Сущность изобретения

Задачей настоящего изобретения является получение иммуноглобулинов с новыми введенными антигенсвязывающими сайтами и способов конструирования и получения таких иммуноглобулинов.

Таким образом, настоящее изобретение касается способа конструирования иммуноглобулина, содержащего по меньшей мере одну модификацию на участке структурной петли данного иммуноглобулина, и определения связывания данного иммуноглобулина с эпитопом антигена, причем немодифицированный иммуноглобулин практически не связывается с данным эпитопом, при этом способ включает стадии:

обеспечения нуклеиновой кислоты, кодирующей иммуноглобулин, содержащий по меньшей мере один участок структурной петли;

модифицирования по меньшей мере одного нуклеотидного остатка по меньшей мере одного из указанных участков структурных петель;

переноса данной модифицированной нуклеиновой кислоты в экспрессионную систему; экспрессирования данного модифицированного иммуноглобулина;

контактирования экспрессированного модифицированного иммуноглобулина с эпитопом и определения того, связывается ли данный модифицированный иммуноглобулин с данным эпитопом.

В частности, настоящее изобретение касается способа конструирования иммуноглобулина, специфически связывающегося с эпитопом антигена, выбранного из группы, состоящей из аллергенов, раковых антигенов, аутоантигенов, ферментов, бактериальных антигенов, грибковых антигенов, протозойных антигенов и вирусных антигенов. Путем модификации в участке структурной петли иммуноглобулин может быть сконструирован так, чтобы связываться с эпитопом. В предпочтительном воплощении иммуноглобулин специфически связывается по меньшей мере с двумя такими эпитопами, отличающимися друг от друга, из того же самого антигена или из разных антигенов.

Например, способ по изобретению касается конструирования иммуноглобулина, специфически связывающегося по меньшей мере с одним первым эпитопом и содержащего по меньшей мере одну модификацию по меньшей мере в одном участке структурной петли данного иммуноглобулина, и определения специфического связывания данного по меньшей мере одного участка петли по меньшей мере с одним вторым эпитопом, выбранным из вышеприведенной группы антигенов, причем немодифицированный участок структурной петли (участок вне СЭЯ) не связывается специфически с данным по меньшей мере одним вторым эпитопом, при этом способ включает стадии:

обеспечения нуклеиновой кислоты, кодирующей иммуноглобулин, специфически связывающийся по меньшей мере с одним первым эпитопом и содержащий по меньшей мере один участок структурной петли;

модификации по меньшей мере одного нуклеотидного остатка по меньшей мере одного из данных участков петель, кодируемых данной нуклеиновой кислотой;

контактирования экспрессированного модифицированного иммуноглобулина с данным по меньшей мере одним вторым эпитопом и определения того, связывается ли данный модифицированный иммуноглобулин специфически со вторым эпитопом.

Способ по изобретению предпочтительно касается по меньшей мере одной модификации по меньшей мере в одном участке структурной петли данного иммуноглобулина и определения специфического связывания данного по меньшей мере одного участка петли по меньшей мере с одним антигеном, выбранным из группы, состоящей из аллергенов, раковых антигенов, аутоантигенов, ферментов, бактериальных антигенов, грибковых антигенов, вирусных антигенов и протозойных антигенов, причем иммуноглобулин, содержащий немодифицированный участок структурной петли, не связывается специфически с данным по меньшей мере одним антигеном.

Осуществление изобретения

Термин иммуноглобулины по настоящему изобретению, которые подлежат модификации (в настоящем изобретении термины иммуноглобулин и антитело являются взаимозаменяемыми), могут проявлять характеристики моно- или мультиспецифического либо мультивалентного связывания как минимум по двум, предпочтительно по меньшей мере трем сайтам специфического связывания эпитопов, например эпитопов антигенов, эффекторных молекул/белков. Иммуноглобулинами по изобретению также являются признанные в этой области функциональные фрагменты, такие как Ес, ЕаЬ, 5сЕу. одноцепочечные димеры доменов С_н/Сь, Εν или другие производные или комбинации иммуноглобулинов, домены вариабельной (такие как Еб, У_ъ, Ук, У_н) и константной области (такие как С_н1, С_н2, С_н3, С_н4, С/ и Ск) тяжелых и легких цепей интактных антител, а также мини-домены. состоящие из двух β-отрезков домена иммуноглобулина, соединенных структурной петлей.

Подразумевается, что термины иммуноглобулин, модифицированный иммуноглобулин или

- 3 018897 иммуноглобулин в соответствии с изобретением также охватывают производные иммуноглобулинов. Производным является любая комбинация из одного или нескольких иммуноглобулинов по изобретению и/или слитый белок, у которого любой домен или мини-домен иммуноглобулина по изобретению может быть слит по любому положению с одним или несколькими другими белками (к примеру, другими иммуноглобулинами, лигандами, каркасными белками, ферментами, токсинами и др.). Производное иммуноглобулина по изобретению также может быть получено путем связывания с другими веществами при помощи различных химических методов, таких как ковалентное присоединение, электростатическое взаимодействие, образование дисульфидной связи и т.п.

Другие вещества, связывающиеся с иммуноглобулинами, могут представлять собой липиды, углеводы, нуклеиновые кислоты, органические и неорганические молекулы или любые их комбинации (например, ПЭГ, пролекарства или лекарства). Производным также является иммуноглобулин с такой же аминокислотной последовательностью, но полностью или частично состоящий из аминокислот, не встречающихся в природе или подвергшихся химической модификации.

Подвергнутые конструированию молекулы по настоящему изобретению будут полезными как в виде самостоятельных белков, так и в виде слитых белков или производных, как правило, слитых таким образом, чтобы они вошли в состав более крупных структур антител или полных молекул антител или таких фрагментов антител, как фрагменты ЕаЬ, фрагменты Ес, фрагменты Εν и другие. Подвергнутые конструирования белки можно будет использовать для получения молекул, являющихся моноспецифическими, биспецифическими, триспецифическими, может быть, даже несущих еще больше специфичностей одновременно, и в то же время можно будет контролировать и заранее выбирать валентность одновременного связывания в соответствии с потребностями планируемого применения таких молекул.

В соответствии с настоящим изобретением в структурную петлю данной структуры антитела можно вводить участки связывания с антигенами или антигенсвязывающие сайты для всевозможных аллергенов, раковых антигенов, аутоантигенов, ферментов, бактериальных антигенов, грибковых антигенов, протозойных антигенов и вирусных антигенов.

Термин антиген по настоящему изобретению должен означать молекулы или структуры, которые взаимодействуют или способны взаимодействовать с участком СЭВ-петли иммуноглобулинов. Участки структурных петель из предшествующего уровня техники не взаимодействуют с антигенами, а только вносят вклад в общую структуру и/или способствуют связыванию с эффекторными молекулами.

Термин аллергены, раковые антигены, аутоантигены, ферменты, бактериальные антигены, грибковые антигены, протозойные антигены и вирусные антигены по настоящему изобретению должен охватывать все аллергены и антигены, которые могут распознаваться структурой антитела, а также фрагменты таких молекул (в особенности такие субструктуры, которые обычно именуются эпитопами (например, эпитопы В-клеток)), если только они являются иммунологически значимыми, т.е. также распознаются природными или моноклональными антителами.

Термин эпитоп по настоящему изобретению должен означать такую молекулярную структуру, которая может полностью быть партнером специфического связывания или быть частью партнера специфического связывания для связывающего домена или иммуноглобулина настоящего изобретения.

В химическом отношении эпитоп может состоять из углевода, липида, жирной кислоты, неорганического вещества или их производных и любых комбинаций. Если эпитопом является полипептид, то он обычно включает по меньшей мере 3 аминокислоты, предпочтительно от 8 до 50 аминокислот, более предпочтительно около 10-20 аминокислот в пептиде. Не существует критического верхнего предела для длины пептида, который может охватывать почти всю длину последовательности полипептида. Эпитопы могут быть линейными или конформационными. Линейный эпитоп состоит из одного сегмента первичной последовательности полипептидной цепи. Линейные эпитопы могут быть смежными или перекрывающимися. Конформационные эпитопы состоят из аминокислот, сведенных вместе при укладке полипептида с образованием третичной структуры, а аминокислоты не обязательно находятся рядом друг с другом в линейной последовательности.

В частности, эпитопы, как минимум, входят в состав диагностически важных молекул, т.е. отсутствие или присутствие эпитопа в образце качественно или количественно коррелирует либо с болезнью, либо с состоянием здоровья или с состоянием процесса на производстве или с экологическим и продовольственным положением. Эпитопы также могут и входить в состав терапевтически важных молекул, т.е. таких молекул, которые могут быть мишенью специфического связывающегося домена, который изменит течение болезни.

Предпочтительными аллергенами, раковыми антигенами, аутоантигенами, ферментами, бактериальными антигенами, грибковыми антигенами, протозойными антигенами и вирусными антигенами являются те аллергены или антигены, которые уже оказались или могут оказаться иммунологически или терапевтически важными, особенно такие, в отношении которых проводилась проверка клинической эффективности.

С другой стороны, согласно другому аспекту настоящего изобретения в участки структурных петель могут вводиться и другие способности к связыванию, например способность к связыванию небольших молекул типа лекарств либо ферментов, каталитических сайтов ферментов или субстратов фермен

- 4 018897 тов, либо к аналогам переходного состояния субстрата фермента.

Предпочтительно новый антигенсвязывающий сайт в структурной петле является чужеродным для немодифицированного иммуноглобулина. Следовательно, такие мишени, как эффекторные молекулы или Ес-рецепторы, предпочтительно исключаются из числа связывающихся молекул и специфичности иммуноглобулинов по изобретению.

Предпочтительно новые антигенсвязывающие сайты вводятся в структурные петли путем замещения, делеции и/или вставки в иммуноглобулине, кодируемом выбранной нуклеиновой кислотой.

Согласно другому предпочтительному воплощению настоящего изобретения модификация по крайней мере одного нуклеотида приводит к замещению, делеции и/или вставке в иммуноглобулине, кодируемом данной нуклеиновой кислотой.

Модификация по меньшей мере одного участка петли может привести к замене, делеции и/или вставке 1 или нескольких аминокислот, предпочтительно точечной мутации, замене целых петель, более предпочтительно изменению по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и вплоть до 30 аминокислот.

Также предпочтителен сайт-специфический случайный мутагенез. Этим методом один или несколько специфических аминокислотных остатков петли подвергаются замене или вводятся с помощью создаваемых случайным образом вставок в такие структурные петли. В качестве альтернативы предпочтительно применяются комбинаторные подходы.

По меньшей мере один участок петли предпочтительно подвергается мутагенезу или модификации методами случайного, полуслучайного или, в особенности, сайт-специфического случайного мутагенеза. Эти методы могут применяться для получения модификаций аминокислот в желательных положениях иммуноглобулина настоящего изобретения. В таких случаях положения выбираются случайным образом либо замены аминокислот производятся по упрощенным правилам. Например, можно мутировать все остатки в аланин, что именуется сканированием по аланину. Такие методы могут сочетаться с более сложными инженерными подходами, в которых применяются методы селекции для скрининга более высокой степени разнообразия последовательности. Предпочтительно метод по изобретению относится к модифицированным случайным образом молекулам нуклеиновой кислоты, содержащим по меньшей мере одно повторяющееся звено нуклеотидов с последовательностью 5'-ΝΝ8-3', 5'-ΝΝΝ-3' или 5'-ΝΝΚ-3'.

Модифицированная случайным образом молекула нуклеиновой кислоты может содержать вышеприведенные повторяющиеся звенья, которые кодируют все известные природные аминокислоты.

Как это хорошо известно в данной области, существует целый ряд методов селекции, которые можно использовать для идентификации и выделения белков с определенными характеристиками и аффинностью связывания, включая, к примеру, методы дисплея типа фагового дисплея, рибосомного дисплея, дисплея на клеточной поверхности и т.п., как описано ниже. Методы получения и скринирования вариантов антител хорошо известны в данной области. Общие методы молекулярной биологии, экспрессии, очистки и скрининга антител описаны в ЛийЬойу Еидтссттд, сййсй Ьу ЭисЬс1 & КоШсттаии, 8рттдстУсг1ад. Нс1йс1Ьстд, 2001; и НауЬитв! & Ссотфои, 2001, Сигг Θρίη СЬет Βίοί 5: 683-689; Мауиагй & Ссогфои, 2000, Аиии Всу Вютсй Еид 2: 339-76.

Структурную петлю или петлю вне СЭВ по настоящему изобретению следует понимать следующим образом: иммуноглобулины состоят из доменов с так называемой укладкой иммуноглобулина. В сущности, антипараллельные β-слои соединяются петлями с образованием сжатого антипараллельного β-цилиндра. В вариабельной области некоторые петли доменов вносят существенный вклад в специфичность антитела, т.е. связывание с антигеном. Эти петли именуются СЭВ-петлями. Все другие петли доменов антител скорее вносят вклад в структуру молекулы и/или эффекторные функции. Эти петли определяются в настоящем изобретении как структурные петли или петли вне СЭВ.

Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующих модифицированные иммуноглобулины (что всегда включает по всему описанию и фрагменты иммуноглобулинов), можно клонировать в клетки хозяина, экспрессировать и проверить на специфичность связывания. Эти процедуры выполняются по хорошо известным методикам, и целый ряд методов, которые могут найти применение в настоящем изобретении, описан в Мо1сси1аг С1ошид: А ЬаЬога1огу Маииа1, 3гй Ей. (Машайв, Со1й 8ρπη§ НагЬог ЬаЬога1огу Ртсвв,

Уогк, 2001) и Снггси! Рго1осо1в ίη Мо1сси1аг Вю1оду (1оЬи ^11су & 8оив). Нуклеиновые кислоты, кодирующие модифицированные иммуноглобулины настоящего изобретения, могут быть встроены в экспрессионный вектор для того, чтобы экспрессировать данные иммуноглобулины. Экспрессирующий вектор обычно включает иммуноглобулин, функционально связанный, т.е. находящийся в функциональной взаимосвязи, с контрольными или регуляторными последовательностями, селекционные маркеры, какиелибо партнеры слияния и/или дополнительные элементы. Модифицированные иммуноглобулины настоящего изобретения могут быть получены путем культивирования клеток хозяина, трансформированных нуклеиновой кислотой, предпочтительно экспрессирующим вектором, содержащим нуклеиновую кислоту, кодирующую модифицированный иммуноглобулин, в соответствующих условиях, индуцирующих или вызывающих экспрессию модифицированного иммуноглобулина. Методы введения экзогенных молекул нуклеиновой кислоты в организм хозяина хорошо известны в данной области и варьируют в зависимости от хозяина. Конечно, для экспрессии модифицированных иммуноглобулинов можно ис

- 5 018897 пользовать и неклеточные или бесклеточные системы экспрессии.

В предпочтительном воплощении настоящего изобретения модифицированные иммуноглобулины после экспрессии подвергаются очистке или выделению. Модифицированные иммуноглобулины могут быть выделены или очищены рядом способов, известных специалистам в данной области. Стандартные методы очистки включают хроматографические методы, методы электрофореза, иммунологические методы, методы осаждения, диализа, фильтрации, концентрирования и хроматофокусирования. Зачастую очистке может способствовать определенный партнер по слиянию. Например, антитела можно очистить с помощью глутатионовой смолы, если используется слияние с С8Т, при помощи №1²⁺-аффинной хроматографии, если используется Нщ-метка, или иммобилизованных антител к метке Дад, если используется Дад-метка. Насчет общего руководства по подходящим методам очистки см. ЛпНЬойу РшгДсайои: Ρήηείр1с5 апб Ргасйсе, 3гб Ей., 8сорс5. §ргшдсг-Усг1ад, ΝΥ, 1994. Конечно, также можно экспрессировать модифицированные иммуноглобулины по настоящему изобретению на поверхности хозяина, в частности на поверхности бактериальных клеток или клеток насекомых или дрожжей, либо на поверхности фагов или вирусов.

Модифицированные иммуноглобулины можно подвергнуть скринингу целым рядом методов, включая методы, в которых применяются анализы ίη νίΐΓΟ, ίη νίνο и на клетках, а также технологии селекции, но не ограничиваясь этим. В процедурах скрининга может применяться автоматизация и технологии высокопроизводительного скрининга. Для скрининга могут использоваться партнеры по слиянию или метки, например, ферменты, иммунологические метки, изотопные метки или метки на основе небольших молекул типа флуоресцентных или колориметрических красителей или люминесцентных молекул.

В предпочтительном воплощении функциональные и/или биофизические свойства иммуноглобулинов подвергают скринингу методом анализа ίη νίΐτο. В предпочтительном воплощении антитела подвергают скринингу на функциональность, например на способность катализировать реакцию или на афинность связывания с мишенью.

Для анализов можно использовать целый ряд методов детектирования, включая, но не ограничиваясь этим, хромогенные, флуоресцентные, люминесцентные или изотопные метки.

Как известно в данной области, подгруппу методов скрининга составляют методы, в которых происходит селекция подходящих представителей библиотеки. Эти методы в настоящем описании именуются селекционными методами и они находят применение в настоящем изобретении для скрининга модифицированных иммуноглобулинов. При скрининге библиотек иммуноглобулинов селекционным методом подвергаются размножению, выделению и/или наблюдению только те представители библиотеки, которые подходят, т.е. соответствуют некоторым критериям селекции. Следует иметь в виду, что поскольку наблюдаются только наиболее приспособленные варианты, то такие методы позволяют скринировать более крупные библиотеки, чем те, которые можно скринировать методами, в которых пригодность представителей библиотеки определяется индивидуально. Селекция становится возможной при помощи любого способа, метода или партнера для слияния, связывающего, ковалентным или нековалентным образом, фенотип иммуноглобулина с его генотипом, т.е. функцию антитела с кодирующей его нуклеиновой кислотой. Например, применение фагового дисплея в качестве метода селекции становится возможным при слиянии представителей библиотеки с белком гена III. Таким образом, при селекции или выделении модифицированных иммуноглобулинов, соответствующих некоторым критериям, например, аффинности связывания с мишенью иммуноглобулина, также происходит селекция или выделение кодирующей его нуклеиновой кислоты. После выделения гена или генов, кодирующих модифицированные иммуноглобулины, их можно затем амплифицировать. Этот процесс выделения и амплификации, именуемый пэннингом, можно повторять, что позволяет обогащение подходящими вариантами антител в библиотеке. В конечном счете, секвенирование привязанной нуклеиновой кислоты позволяет идентифицировать гены.

В этой области известен целый ряд селекционных методов, которые могут найти применение в настоящем изобретении для скрининга библиотек иммуноглобулинов. К ним относятся, не ограничиваясь этим, фаговый дисплей (РНадс йщр1ау οί рсрйбсз аЫ айЛобюз: а 1аЬога1огу шата^ Ксу е1 а1., 1996, Асайсшис Ргсзз, 8аη Экдо, СаНТ, 1996; Го\\шап с1 а1., 1991, ВюсНсшМгу 30: 10832-10838; 8шйй, 1985, Засмсс 228: 1315-1317) и такие его разновидности, как селективное инфицирование фагом (Ма1тЬогд с1 а1., 1997, 1. Мо1 Вю1 273: 544-551), избирательная инфективность фага (КгсЬЬсг с1 а1., 1997, 1. Мо1 Вю1 268: 619630) и пэннинг на основе отсроченной инфективности (ВспНат с1 а1., 2000, 1. Мо1 Вю1 301: 893-904), дисплей на клеточной поверхности (ЭДШтир, 2001, Сшт Ορίη Вю1сс1шо1 12: 395-399), к примеру, дисплей на клетках бактерий (Ссогдюи с1 а1., 1997, №11 Вю1ссйпо1, 15: 29-34; Ссогдюи с1 а1., 1993, Тгспйз Вю1ссйпо1, 11: 6-10; Ьсс с1 а1., 2000, №а1. Вю1ссйпо1. 18: 645-648; 1ип с1 а1., 1998, №а1. Вю1ссйпо1. 16: 576-80), дрожжей (Вобсг & ЭДййир, 2000, МсШобз Еп/ушо1 328: 430-44; Вобсг & ЭДййир, 1997, №а1. Вю1ссйпо1. 15: 553-557) и млекопитающих (ЭДНйсйога с1 а1., 1995, Вю1сс1шо1оду 13: 1215-1219), а также технологии дисплея ίη νίΐΐΌ (АпъЦЦх с1 а1., 2001, Сшт Орш Вю1сс1шо1 12: 400-405), к примеру, дисплей на полисомах (Маййсак18 с1 а1., 1994, Ргос. №а11. Асаб. 8ст И8А 91: 9022-9026), дисплей на рибосомах (Намсз с1 а1., 1997, Ргос. №а11. Асаб. 8ст И8А 94: 4937-4942), дисплей на мРНК (КоЬсйз & З/оЧак 1997, Ргос. №а11. Асаб. 8ст И8А 94:

- 6 018897

12297-12302; ЫетоГо е! а1., 1997, ЕЕВ8 Ьей 414: 405-408) и система дисплея с инактивацией рибосом (/Кои е! а1., 2002, 1. Ат Сйет §ос 124: 538-543).

Другие селекционные методы, которые могут найти применение в настоящем изобретении, включают методы, которые не основаны на дисплее, к примеру, методы ίη у1уо, в том числе, но не ограничиваясь этим, экспрессирование в периплазме и цитометрический скрининг (Сйеп е! а1., 2001, №й. Вю!есйпо1. 19: 537-542), метод комплементации фрагментов антител (1ойпккоп & Уаткйаукку, 1994, Ргос. Να!ΐ. Асай. 8с1. И8А 91: 10340-10344; Ре11ейет е! а1., 1998, Ргос. №!1. Асай. δα. И8А 95: 12141-12146) и скрининг по двум гибридам на дрожжах (Е1е1йк & 8опд, 1989, №Циге 340: 245-246) в режиме селекции (Увшίίη е! а1., 1999, Ргос. №И. Асай. δα. И8А 96: 11723-11728). В альтернативном воплощении селекция становится возможной при помощи партнера по слиянию, который связывается со специфической последовательностью на экспрессирующем векторе, при этом партнер по слиянию и связанный с ним представитель библиотеки типа Ес-варианта связывается ковалентным или нековалентным образом с кодирующей их нуклеиновой кислотой. Например, в РСТ АО 00/22906, РСТ АО 01/49058, РСТ АО 02/04852, РСТ АО 02/04853, РСТ АО 02/08023, РСТ АО 01/28702 и РСТ АО 02/07466 описан такой партнер по слиянию и методика, которая может найти применение в настоящем изобретении. В альтернативном воплощении селекция может происходить ίη у1уо, если экспрессия антитела дает клетке какое-нибудь преимущество в росте, размножении или выживаемости.

Одну подгруппу селекционных методов, именуемую методами направленной эволюции, составляют методы, включающие спаривание или разведение подходящих последовательностей во время селекции, иногда с включением новых мутаций. Как это известно специалистам в данной области, методы направленной эволюции могут облегчить идентификацию наиболее подходящих последовательностей в библиотеке и могут повысить разнообразие последовательностей, подвергаемых скринингу. В данной области известен целый ряд методов направленной эволюции, которые могут найти применение в настоящем изобретении для скрининга вариантов антител, в том числе, но не ограничиваясь этим, перетасовка ДНК (РСТ АО 00/42561 А3; РСТ АО 01/70947 А3), перестановка экзонов (υδ Ра!еп! № 6365377; Ко1ктап & 81еттег, 2001, №1. Вю1есЬпо1. 19: 423-428), семейная перетасовка (Статей е! а1., 1998, №йиге 391: 288-291; И8 Ра!еп! № 6376246), КА.СН1ТТ™ (Сосо е! а1., 2001, №!. Вю!есйпо1. 19: 354-359; РСТ АО 02/06469), 8ТЕР и произвольное примирование рекомбинации ш уйто (2йао е! а1., 1998, №11. Вю!есйпо1. 16: 258-261; 8йао е! а1., 1998, №1с1ею Ас1йк Век 26: 681-683), сборка генов, опосредованная экзонуклеазой (И8 Ра!еп! № 6352842; И8 Ра!еп! № 6361974), насыщающий мутагенез сайта гена (И8 Ра!еп! № 6358709), перестройка гена (И8 Ра!еп! № 6358709), 8СКАТСНУ (ЕШх е! а1., 2001, Ргос. №1(1. Асай. δα. И8А 98: 11248-11253), методы фрагментирования ДНК (КткисЫ е! а1., Сепе 236: 159-167), перетасовка одноцепочечной ДНК (ЮкисЫ е! а1., 2000, Сепе 243: 133-137) и технология конструирования антител методом направленной эволюции АМЕкук!ет™ (прикладной молекулярной эволюции) (И8 Ра!еп! № 5824514; υδ Ра!еп! № 5817483; ϋδ Ра!еп! № 5814476; ϋδ Ра!еп! № 5763192; ϋδ Ра!еп! № 5723323).

В предпочтительном воплощении для скрининга вариантов антител используют один или несколько клеточных методов или методов ш у1уо. В таких методах очищенные или неочищенные модифицированные иммуноглобулины обычно добавляют извне таким образом, что клетки подвергаются воздействию индивидуальных иммуноглобулинов или пулов иммуноглобулинов, принадлежащих к библиотеке. Как правило, но не всегда, эти методы основываются на функции иммуноглобулина, т.е. на способности антитела связываться с мишенью и вызывать какое-нибудь биохимическое явление, к примеру, эффекторную функцию, ингибирование связывания лиганд/рецептор, апоптоз и т.п. Такие методы зачастую включают регистрацию реакции клеток на антитело, например выживаемость клеток, гибель клеток, изменение морфологии клеток или активацию транскрипции типа экспрессии клетками природного гена или гена-репортера. Например, в таких методах можно измерять способность вариантов антител вызывать АЭСС, АЭСР или СЭС. В некоторых методах может потребоваться добавление дополнительных клеток или компонентов, т.е. вдобавок к клеткам мишени, к примеру, сывороточный комплемент или такие эффекторные клетки, как моноциты периферической крови (РВМС), клетки ΝΚ, макрофаги и т.п. Такие дополнительные клетки могут происходить из любого организма, предпочтительно человека, мышей, крыс, кроликов и обезьян. Иммуноглобулины могут вызвать апоптоз определенных линий клеток, экспрессирующих мишень, либо они могут опосредовать атаку на клетки-мишени иммунных клеток, добавленных в пробу. Методы регистрации гибели клеток или жизнеспособности клеток известны в данной области, они включают применение красителей, иммунохимических, цитохимических и радиоактивных реагентов. Например, методы окрашивания на каспазу позволяют измерять апоптоз, а поглощение или выделение радиоактивных субстратов или флуоресцентных красителей типа А1атаг В1ие позволяет регистрировать рост клеток или активацию. В предпочтительном воплощении можно использовать метод определения цитотоксичности на основе ПЕЬИА™ ЕиТЭЛ (Реткш Е1тег, МА). С другой стороны, мертвые или поврежденные клетки-мишени можно регистрировать, измеряя выделение одного или нескольких естественных внутриклеточных компонентов, к примеру, лактатдегидрогеназы. Активация транскрипции также может служить методом анализа функции в клеточных методах. В этом случае реакцию можно регистрировать анализом естественных генов или иммуноглобулинов, которые могут под

- 7 018897 вергаться повышающей регуляции, например, можно измерять выделение определенных интерлейкинов, а с другой стороны, её можно регистрировать при помощи репортерной конструкции.

Клеточные методы также могут включать измерение морфологических изменений клеток как реакцию на присутствие модифицированных иммуноглобулинов. Клетки для таких методов могут быть прокариотическими или эукариотическими, а также можно использовать целый ряд клеточных линий, известных в данной области. В качестве альтернативы клеточный скрининг проводится на клетках, трансформированных или трансфецированных нуклеиновой кислотой, кодирующей эти варианты. Т.е. варианты антител не добавляются к клеткам извне. Например, в одном воплощении при клеточном скрининге применяется дисплей на клеточной поверхности. Можно использовать партнеров по слиянию, позволяющих осуществлять дисплей модифицированных иммуноглобулинов на поверхности клеток (ХУШгир. 2001, Сигг Θρίη Бю1есЬпо1. 12: 395-399).

В предпочтительном воплощении иммуногенность модифицированных иммуноглобулинов можно определять экспериментально одним или несколькими клеточными методами. В предпочтительном воплощении для экспериментального определения иммуногенности применяется анализ активации Тклеток ех νίνο. В этом методе антигенпрезентирующие клетки и наивные Т-клетки от совпадающих доноров обрабатывают представляющим интерес пептидом или целым антителом один или несколько раз. Затем можно определить активацию Т-клеток рядом методов, например, по регистрации продукции цитокинов или по измерению захвата меченного тритием тимидина. В наиболее предпочтительном воплощении регистрируют продукцию γ-интерлейкина методом Εΐίκροΐ (8сйшй1е1 е1 а1., 2000, 1. 1ттипо1 Ме111 24: 17-24).

Биологические свойства модифицированных иммуноглобулинов настоящего изобретения можно изучать в опытах на клетках, тканях и целом организме. Как это известно в данной области, лекарственные препараты часто тестируют на животных, в том числе, но не ограничиваясь этим, на мышах, крысах, кроликах, собаках, кошках, свиньях и обезьянах, чтобы измерить эффективность препарата при лечении заболевания или на модели заболевания либо измерить фармакокинетику, токсичность и другие свойства препарата. Животных можно считать моделью заболевания. Лекарственные препараты часто тестируют на мышах, в том числе, но не ограничиваясь этим, на мышах пибе, 8СГО, мышах с ксенотрансплантатами и трансгенных мышах (включая мышей нок-ин и нокаут). Такое экспериментирование может дать существенные данные для определения потенциала антитела при использовании в качестве лекарственного препарата. Для тестирования можно использовать любой организм, предпочтительно млекопитающих. Так, вследствие генетической близости к человеку обезьяны могут служить подходящей терапевтической моделью и поэтому могут использоваться для проверки эффективности, токсичности, фармакокинетики или других свойств модифицированных иммуноглобулинов настоящего изобретения. В конечном счете для одобрения препарата необходимо тестирование на человеке, поэтому, конечно, такие эксперименты предусматриваются. Таким образом, модифицированные иммуноглобулины настоящего изобретения можно тестировать на человеке, чтобы определить их терапевтическую эффективность, токсичность, иммуногенность, фармакокинетику и/или другие клинические свойства.

Модифицированные иммуноглобулины настоящего изобретения могут найти применение в широком круге продуктов на основе антител. В одном воплощении вариант антитела настоящего изобретения применяется для терапии или профилактики, для препаративного или аналитического использования, как средство диагностики, промышленное соединение или исследовательский реагент, предпочтительно лекарственное средство. Вариант антитела может найти применение в композиции такого антитела, которое является моноклональным или поликлональным. В предпочтительном воплощении модифицированные иммуноглобулины настоящего изобретения применяются для уничтожения клеток-мишеней, несущих антиген-мишень, например раковых клеток. В другом воплощении модифицированные иммуноглобулины настоящего изобретения применяются как блокаторы, антагонисты или агонисты антигенамишени, например как антагонисты цитокинов или рецепторов цитокинов. В другом предпочтительном воплощении модифицированные иммуноглобулины настоящего изобретения применяются как блокаторы, антагонисты или агонисты антигена-мишени для уничтожения клеток-мишеней, несущих антигенмишень.

В другом предпочтительном воплощении модифицированные иммуноглобулины настоящего изобретения применяются как блокаторы, антагонисты или агонисты факторов роста или рецепторов факторов роста для уничтожения клеток-мишеней, несущих или нуждающихся в антигене-мишени. В другом предпочтительном воплощении модифицированные иммуноглобулины настоящего изобретения применяются как блокаторы, антагонисты или агонисты ферментов и субстратов ферментов.

Модифицированные иммуноглобулины настоящего изобретения могут применяться для различных терапевтических целей. В предпочтительном воплощении антитело, включающее модифицированный иммуноглобулин, вводится пациенту для лечения определенного заболевания. Пациент в целях настоящего изобретения включает и человека, и других животных, предпочтительно млекопитающих и наиболее предпочтительно человека. Под определенным заболеванием подразумевается такое заболевание, которое может улучшиться при введении фармацевтической композиции, включающей модифицированный иммуноглобулин настоящего изобретения.

- 8 018897

В одном воплощении модифицированный иммуноглобулин по настоящему изобретению является единственным терапевтически активным средством, вводимым пациенту. В качестве альтернативы модифицированный иммуноглобулин по настоящему изобретению вводится в комбинации с одним или несколькими другими терапевтическими средствами, включая, но не ограничиваясь этим, цитотоксические средства, химиотерапевтические средства, цитокины, средства, ингибирующие рост, антигормональные средства, ингибиторы киназ, антиангиогеннные средства, кардиопротекторы и другие терапевтические средства. Модифицированные иммуноглобулины можно вводить в сочетании с одним или несколькими другими терапевтическими режимами. Например, вариант антитела по настоящему изобретению можно вводить пациенту вместе с химиотерапией, лучевой терапией или с химиотерапией и лучевой терапией одновременно. В одном воплощении модифицированные иммуноглобулины настоящего изобретения можно вводить в сочетании с одним или несколькими антителами, которые могут включать или не включать вариант антитела по настоящему изобретению. В соответствии с другим воплощением изобретения модифицированные иммуноглобулины настоящего изобретения и одна или несколько других противораковых терапий применяются для обработки раковых клеток ех νίνο. Предусматривается, что такая обработка ех νίνο может быть полезной при пересадке костного мозга, в особенности при аутологичной пересадке костного мозга. Конечно, предусматривается, что антитела по изобретению могут применяться и в сочетании с другими терапевтическими методами типа хирургии.

Целый ряд других терапевтических средств может найти применение для введения вместе с модифицированными иммуноглобулинами настоящего изобретения. В одном воплощении модифицированный иммуноглобулин вводится вместе с антиангиогенным средством, т.е. соединением, блокирующим или мешающим в некоторой степени развитию кровеносных сосудов. Антиангиогенный фактор может представлять собой, к примеру, небольшую молекулу или белок, например антитело, слитый Ре или цитокин, который связывается с фактором роста или рецептором фактора роста, участвующего в стимуляции ангиогенеза. Предпочтительным антиангиогенным фактором в настоящем изобретении является антитело, связывающееся с фактором роста сосудистого эндотелия (УБОР). В другом воплощении модифицированный иммуноглобулин вводится вместе с терапевтическим средством, вызывающим или усиливающим адаптивный иммунный ответ, например антителом, для которого мишенью является СТЬА-4. В следующем воплощении модифицированный иммуноглобулин вводится вместе с ингибитором тирозинкиназ, т.е. молекулой, ингибирующей в некоторой степени тирозинкиназную активность тирозинкиназ. В другом воплощении модифицированный иммуноглобулин настоящего изобретения вводится вместе с цитокином. Под цитокином в настоящем изобретении имеется в виду обобщающий термин для белков, которые выделяются одной популяцией клеток и действуют на другие клетки в качестве межклеточных посредников, включая хемокины.

Предусматриваются фармацевтические композиции, в состав которых входят модифицированные иммуноглобулины настоящего изобретения вместе с одним или несколькими терапевтически активными средствами. Композиции вариантов антител настоящего изобретения готовятся для хранения путем смешивания данного иммуноглобулина, имеющего желательную степень чистоты, с необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, наполнителями или стабилизаторами (ВепнпдЮп'х Рйагтасеийса1 8с1еисе5 1б1й ебйюп, Οδοί А, Еб., 1980) в виде лиофилизованных составов или водных растворов. Композиции, предназначенные для введения ίη νίνο, предпочтительно являются стерильными. Это легко осуществляется путем фильтрования через стерильные фильтрационные мембраны или другими методами. Модифицированные иммуноглобулины и другие терапевтически активные средства, изложенные в настоящем изобретении, также могут быть составлены в виде иммунолипосом и/или заключены в микрокапсулы.

Введение фармацевтической композиции, включающей модифицированный иммуноглобулин настоящего изобретения, предпочтительно в виде стерильного водного раствора, может осуществляться рядом способов, в том числе, но не ограничиваясь этим, перорально, подкожно, внутривенно, интраназально, интраотикально, трансдермально, местно (например, гели, мази, лосьоны, кремы и т.п.), внутрибрюшинно, внутримышечно, внутрилегочно (например, ингаляционная технология АЕВх™, коммерчески доступная от Агабщт, или система легочного введения 1пйапсе™, коммерчески доступная от 1пйа1е Тйегареибск), вагинально, парентерально, ректально или интраокулярно.

В настоящем изобретении термин специфически связывается относится к реакции связывания, которая ограничивается соответствующим узнаваемым лигандом в гетерогенной популяции молекул. Таким образом, в заданных условиях (например, условиях иммуноанализа в случае иммуноглобулина) определенное антитело связывается со своей конкретной мишенью и не связывается в заметной степени с другими молекулами в образце. Как и участки СЭВ антител, модифицированные участки структурных петель являются антиген- или молекулосвязывающими частями молекулы белка, а вовсе не антигенами.

Термин система экспрессии относится к молекулам нуклеиновой кислоты, содержащим требуемую кодирующую последовательность и функционально связанные контрольные последовательности, так что реципиент, трансформированный или трансфецированный этими последовательностями, спосо

- 9 018897 бен вырабатывать кодируемые белки. Для того чтобы осуществить трансформацию, система экспрессии может быть включена в вектор; однако соответствующая ДНК также может быть встроена в хромосомы хозяина.

Согласно предпочтительному воплощению настоящего изобретения система экспрессии включает вектор. Для этой цели можно использовать любой известный в этой области экспрессионный вектор, который подойдет.

Модифицированный иммуноглобулин предпочтительно подвергается экспрессии в организме реципиента, предпочтительно в бактериальных, дрожжевых, растительных клетках, в животных клетках либо в растениях или животных.

Для экспрессии модифицированных иммуноглобулинов можно использовать широкий круг подходящих клеток хозяина, включая, но не ограничиваясь этим, клетки млекопитающих (животные клетки), растительные клетки, бактерии (например, ВасШик киЬ1Шк, ЕксйепсШа сой), клетки насекомых и дрожжей (например, Рю1па райопк, Зассйатошусек сетеу151ае). Так, целый ряд клеточных линий, которые могут найти применение в настоящем изобретении, описан в каталоге клеточных линий АТСС, доступном от Американской коллекции типовых культур. Кроме того, в качестве хозяина можно также использовать растения и животных для экспрессии иммуноглобулинов по настоящему изобретению. Вектора или кассеты для экспрессии и для трансфекции можно выбирать в соответствии с используемым организмом хозяина.

Конечно, также можно использовать и неклеточные или бесклеточные системы экспрессии белка. Системы экспрессии с транскрипцией/трансляцией белка ίη νίΐτο, вырабатывающие достаточное количество белка, обладают многими преимуществами бесклеточной экспрессии белка, устраняя необходимость в трудоемких предшествующих и последующих стадиях (например, трансформации, культивирования или лизиса клеток хозяина), обычно связанных с клеточными системами экспрессии.

Другой аспект настоящего изобретения касается способа получения иммуноглобулина или его фармацевтического препарата, содержащего по меньшей мере одну модификацию на участке структурной петли данного иммуноглобулина, и определения связывания данного иммуноглобулина с эпитопом антигена, причем немодифицированный иммуноглобулин практически не связывается с данным эпитопом, при этом способ включает стадии:

обеспечения нуклеиновой кислоты, кодирующей иммуноглобулин, содержащий по меньшей мере один участок петли;

модификации по меньшей мере одного нуклеотидного остатка по меньшей мере одного из данных участков петель;

переноса данной модифицированной нуклеиновой кислоты в экспрессионную систему; экспрессии данного модифицированного иммуноглобулина;

контактирования экспрессированного модифицированного иммуноглобулина с эпитопом; определения того, связывается ли данный модифицированный иммуноглобулин с данным эпитопом;

получения модифицированного иммуноглобулина, связывающегося с данным эпитопом, и необязательно доведения его до фармацевтического препарата.

В частности, настоящее изобретение касается способа получения мультиспецифического иммуноглобулина или его фармацевтического препарата, специфически связывающегося по меньшей мере с одной первой молекулой и содержащего по меньшей мере одну модификацию по меньшей мере в одном участке структурной петли данного иммуноглобулина, и определения специфического связывания данного по меньшей мере одного участка петли по меньшей мере с одной второй молекулой, выбранной из группы, состоящей из аллергенов, раковых антигенов, аутоантигенов, ферментов, бактериальных антигенов, грибковых антигенов, протозойных антигенов и вирусных антигенов, причем иммуноглобулин, содержащий немодифицированный участок структурной петли, не связывается специфически с данной по меньшей мере одной второй молекулой, при этом способ включает стадии:

обеспечения нуклеиновой кислоты, кодирующей иммуноглобулин, специфически связывающийся по меньшей мере с одной первой молекулой и содержащий по меньшей мере один участок структурной петли;

переноса данной модифицированной нуклеиновой кислоты в экспрессионную систему;

экспрессии данного модифицированного иммуноглобулина;

контактирования экспрессированного модифицированного иммуноглобулина с данной по меньшей мере одной второй молекулой;

определения того, связывается ли данный модифицированный иммуноглобулин специфически со второй молекулой, и получения модифицированного иммуноглобулина, специфически связывающегося с данной по меньшей мере одной второй молекулой, и необязательно доведения его до фармацевтического препарата.

Предпочтительным является встраивание более чем одной специфичности в одного из членов спе

- 10 018897 цифически связывающейся пары (КиГсг е! а1. (2004), Тгепбз ίη Вю1се11по1оду. νοί. 22, р. 238-244).

Предпринимались многочисленные попытки получения мультиспецифических, например, биспецифических моноклональных антител или фрагментов антител. Одна из проблем при получении биспецифических антител, состоящих из двух разных полипептидных цепей (тяжелой и легкой цепи), заключается в необходимости экспрессировать четыре различные цепи (две тяжелые и две легкие цепи) в одной клетки, что приводит к большому числу разнообразных комбинаций молекул, которые приходится отделять от требуемой биспецифической молекулы в смеси. Вследствие их схожести разделение этих молекул является затруднительным и дорогостоящим. Применялось несколько разных методик, чтобы свести к минимуму встречаемость таких нежелательных пар (Сайет (2001), 1оитпа1 оГ 1ттипо1ощса1 МеШобз, νο1. 248, р. 7-15).

Одним из решений проблемы является получение одной полипептидной цепи с двумя специфичностями типа двух зсΡν, соединенных друг с другом, или получение так называемых диател. Такие молекулы, как оказалось, весьма далеки от укладки природной молекулы, и их чрезвычайно трудно получить (Ье Са11 е! а1. (2004), Рто1еш Епдтееппд, Эезщп & 8е1ес1юп, νο1 17, р. 357-366).

Другой проблемой при текущей разработке биспецифических антител является то, что даже если исходные антитела двухвалентны по связыванию со своим партнером связывания (например, 1дС), то образующееся биспецифическое антитело одновалентно по каждому из соответствующих партнеров связывания.

Предпочтительные мультиспецифические молекулы настоящего изобретения решают эти проблемы.

Становится возможной экспрессия биспецифической молекулы в виде одной полипептидной цепи (модифицированный домен 1д с двумя специфичностями связывания, см. раздел Примеры), что легче осуществить, чем экспрессирование двух полипептидных цепей антител (СаЬШу е! а1. Ргос. N311. Асаб. 8с1. И8А 81: 3273-3277 (1984)).

Она также может быть получена в виде антителоподобной молекулы (т.е. состоящей из 2 полипептидных цепей) благодаря тому, что вторая специфичность располагается в невариабельной части молекулы, поэтому нет необходимости в двух различных тяжелых цепях или различных легких цепях. Таким образом, отпадает возможность неправильного спаривания двух цепей.

Антитело настоящего изобретения может состоять из тяжелой цепи и легкой цепи, которые вместе образуют вариабельную область, связывающуюся со специфическим партнером связывания, а вторая специфичность может быть образована модифицированной петлей любой из структурных петель тяжелой цепи или же легкой цепи. Сайт связывания также может быть образован более чем одной петлей вне СЭВ, которая по структуре может оказаться по соседству (на тяжелой цепи или на легкой цепи либо на обеих цепях).

Модифицированное антитело или производное может представлять собой полное антитело или фрагмент антитела (например, ЕаЬ, С_н1-С_н2, С_н2-С_н3).

Оно может связываться как одно- или многовалентное антитело с партнерами связывания или даже с различной валентностью для разных партнеров связывания, в зависимости от конструкции.

Поскольку имеется несколько разных петель, доступных для селекции и разработки специфического сайта связывания в участках вне СЭВ тяжелых и легких цепей, то можно разработать производные антител даже с более чем двумя специфичностями без указанных выше проблем.

Домены специфического связывания в пределах одной полипептидной цепи могут соединяться пептидным линкером или без него.

Некоторые классы антител можно рассматривать как мультиспецифические, в частности биспецифические от природы: они связываются с антигеном (который, как правило, является чужеродной структурой или связан с раком) по вариабельной области и с Ес-эффекторными молекулами по Ес-части (например, Ес-рецепторами на различных иммунных клетках или белке комплемента), поэтому становятся возможными такие эффекты, как АЭСС, АЭСР или СЭС.

Ес-эффекторные молекулы связываются Ес-частью молекулы иммуноглобулина (у 1дС1 она состоит из доменов С_н2 и С_н3), и описано несколько методов оптимизации эффекторной функции путем усовершенствования связывания Ес-части молекулы антител либо методами гликоконструирования (И8 6602684), либо белковой конструирования как непосредственно на Ес (И8 2005/0054832), так и косвенным образом через конструирование вне области Ес (И8 2005/02444403). Такими методами изменяется связывание Ес-области с Ес-рецептором и/или связывание с белками комплемента типа Сс.|1. Обычно стремятся улучшить аффинность связывания с такими Ес-эффекторными молекулами, так как это коррелирует с улучшением эффекторных функций.

С помощью настоящего изобретения можно разрабатывать антитела, связывающиеся с Есэффекторными молекулами за пределами естественной области Ес-связывания. Модифицированные петли в доменах антител, отличные от петель, участвующих в естественном связывании Ес-эффекторных молекул, могут быть выбраны из библиотеки или разработаны таким образом, чтобы они связывали одну или несколько Ес-эффекторных молекул. Антитело с такими дополнительными сайтами связывания Есэффекторных молекул будут обладать более сильной авидностью к определенной Ес-эффекторной моле

- 11 018897 куле или к эффекторным клеткам, обладающим Ес-эффекторными молекулами, и поэтому могут оказывать более сильный эффект, чем подвергшиеся гликоконструирования антитела или усовершенствованные Ес-области. Однако в некоторых воплощениях настоящего изобретения эффекторные характеристики данного антитела, подлежащего модификации, не должны непосредственно изменяться, а должны остаться не затронутыми модификацией в структурной петле согласно настоящему изобретению.

Фрагменты антител имеют определенные преимущества перед целыми антителами. Фрагменты обычно обладают хорошими параметрами биораспределения, и они легче получаются. Однако большинство конструкций фрагментов антител не обладает эффекторными функциями и имеет короткое время полужизни ίη νίνο (НоШдет Р. е! а1. Ναΐ Бю1есЬпо1. (2005), 23:1126-36).

Ни домены С_Н1, ни домены Ск или Ολ не опосредуют эффекторные функции, по этой причине ЕаЬфрагменты не проявляют ЛЭСС. АЭСР или СЭС. В АО 02/44215 описаны связывающиеся молекулы. состоящие из антигенсвязывающего сайта антитела и пептидсвязывающих Ес-эффекторных молекул. Таким путем можно сконструировать фрагмент антитела, проявляющий эффекторные функции. Пептид встраивают в связывающуюся молекулу в таком положении, которое не разрушает ни связывание антигена, ни способность пептида к связыванию с Ес-эффекторной молекулой.

Однако согласно настоящему изобретению связывание с Ес-эффекторными молекулами может осуществляться с помощью модифицированных доменов иммуноглобулина, прошедших селекцию на связывание Ес-эффекторных молекул, из библиотек случайных последовательностей петель в пределах фиксированного каркаса домена иммуноглобулина. Таким образом, можно проводить селекцию на определенные последовательности петель, которые не будут связываться с Ес-эффекторными молекулами за пределами каркаса домена 1д. Поэтому полипептиды, получаемые по настоящему изобретению, могут предпочтительно состоять из более чем 100 аминокислот.

Для того чтобы провести селекцию на потенциальную эффекторную функцию таких доменов согласно настоящему изобретению, можно подвергнуть селекции библиотеки мутантных доменов С_Н1, Ск или Ολ на связывание с Ес-рецепторами и/или такими факторами комплемента, как С1с.|.

Для того чтобы повысить время полужизни ίη νίνο молекулы, состоящей из или содержащей такой домен (например, С_Н1, С_Н2, С_Н3, С_Н4, Ск, Ολ), можно провести селекцию на связывание с ЕсКп с помощью библиотек мутантных доменов, например доменов С_Н1, С_Н2, С_Н3, С_Н4, Ск, Ολ согласно настоящему изобретению.

Рецепторы ЕсКп для селекции можно получить либо на поверхности клеток, экспрессирующих естественным образом соответствующие рецепторы, либо путем экспрессии и очистки внеклеточной части соответствующего рецептора. В целях настоящего изобретения при первом скрининге на ЕсКп можно проводить селекцию по мутантным доменам, которые можно далее тестировать ίη νίΐτο, а затем охарактеризовать в опытах ЕЛС8 по связыванию с клетками, экспрессирующими рецепторы ЕсКп. Их можно дополнительно охарактеризовать по степени аффинности связывания с различными рекомбинантными ЕсКп, изоформами и аллотипами ЕсКп, например методом поверхностного плазмонного резонанса.

Согласно предпочтительному воплощению настоящего изобретения иммуноглобулин происходит из человека или мыши.

Поскольку модифицированный иммуноглобулин может использоваться для разнообразных целей, в частности, в фармацевтических композициях, то иммуноглобулин предпочтительно происходит из человека или мыши. Конечно, модифицированный иммуноглобулин также может представлять собой гуманизованный или химерный иммуноглобулин.

Оогласно другому предпочтительному воплощению настоящего изобретения иммуноглобулин человека выбирают из группы, состоящей из 1дА1, 1дА2, 1дИ, 1дЕ, 1дО1, 1дО2, 1дО3, 1дО4 и 1дМ.

Мышиный иммуноглобулин предпочтительно выбирают из группы, состоящей из 1дА, 1дЭ, 1дЕ, 1дО1, 1дО2А, 1дО2В, 1дО2С, 1дО3 и 1дМ.

Модифицированный иммуноглобулин может происходить из одного из вышеприведенных классов иммуноглобулина.

Иммуноглобулин предпочтительно включает тяжелую и/или легкую цепь иммуноглобулина или её часть.

Модифицированный иммуноглобулин может включать тяжелую и/или легкую цепь, по меньшей мере один вариабельный и/или константный домен.

Иммуноглобулин по настоящему изобретению предпочтительно включает по меньшей мере один константный и/или по меньшей мере один вариабельный домен иммуноглобулина или его часть, в том числе мини-домен.

Константный домен представляет собой звено укладки иммуноглобулина в константной части молекулы иммуноглобулина и также именуется доменом константной области (например, С_Н1, С_Н2, С_Н3, СН4, Ск, Ολ).

Вариабельный домен представляет собой звено укладки иммуноглобулина в вариабельной части молекулы иммуноглобулина и также именуется доменом вариабельной области (например, У_Н, Ук, νλ, V).

- 12 018897

Предпочтительный иммуноглобулин по изобретению состоит из константного домена, выбранного из группы, состоящей из С_н1, С_н2, С_н3, С_н4, Ск, СЛ или его части, в том числе мини-домена, по меньшей мере с одним участком петли, и отличается тем, что данный по меньшей мере один участок петли содержит по меньшей мере одну аминокислотную модификацию, образующую по меньшей мере один модифицированный участок петли, причем данный по меньшей мере один модифицированный участок петли специфически связывается по меньшей мере с одним эпитопом антигена.

Другой предпочтительный иммуноглобулин по изобретению состоит из вариабельного домена тяжелой или легкой цепи или его части, в том числе мини-домена, по меньшей мере с одним участком петли, и отличается тем, что данный по меньшей мере один участок петли содержит по меньшей мере одну аминокислотную модификацию, образующую по меньшей мере один модифицированный участок петли, причем данный по меньшей мере один модифицированный участок петли специфически связывается по меньшей мере с одним эпитопом антигена.

Согласно предпочтительному воплощению константный домен выбирают из группы С_н1, С_н2, С_н3, С_н4, Ск, Сл и их комбинаций.

Модифицированный иммуноглобулин по настоящему изобретению может содержать один или несколько константных доменов (например, по меньшей мере два, три, четыре, пять, шесть, десять доменов). Если в модифицированном иммуноглобулине содержится более одного домена, эти домены могут быть одного и того же типа или различных типов (например, С_н1-С_н2-С_н3, С_н3-С_н3). Конечно, и порядок расположения доменов может быть любым (например, С_н1-С_н3-С_н2, С_н4-С_н1-С_н3-С_н2).

Нумерация всех аминокислотных последовательностей иммуноглобулинов соответствует системе нумерации 1МСТ (Международная система информации по иммуногенетике на сайте ипдЬстек.Гг; 1Шр://ипд1.стек.Гг; ЬеГтаис е! а1., 1999, Ынс1е1с Аабк Кек. 27: 209-212; Βιιίζ е! а1., 2000, Ынс1е1с Ас1бк Кек. 28: 219-221; ЬеГтаис е! а1., 2001, ЫисШс Аабк Кек. 29: 207-209; ЬеГтаис е! а1., 2003, ЫисШс Лабк Кек. 31: 307-310; ЬеГтаис е! а1., 2005, Ьеу Сотр 1ттипо1. 29: 185-203).

Согласно другому предпочтительному воплощению настоящего изобретения модифицированные участки петель в Сн1, Сн2, Сн3 и Сн4 включают аминокислоты 7-21, аминокислоты 25-39, аминокислоты

41- 81, аминокислоты 83-85, аминокислоты 89-103 и аминокислоты 106-117.

Участки петель в Ск и СЛ иммуноглобулина человека предпочтительно включают аминокислоты 818, аминокислоты 27-35, аминокислоты 42-78, аминокислоты 83-85, аминокислоты 92-100, аминокислоты 108-117 и аминокислоты 123-126.

Участки петель в Ск и СЛ иммуноглобулина мыши предпочтительно включают аминокислоты 8-20, аминокислоты 26-36, аминокислоты 43-79, аминокислоты 83-85, аминокислоты 90-101, аминокислоты 108-116 и аминокислоты 122-125.

Участки структурных петель вариабельного домена иммуноглобулина человека предпочтительно включают аминокислоты 8-20, аминокислоты 44-50, аминокислоты 67-76 и аминокислоты 89-101.

Согласно предпочтительному воплощению настоящего изобретения участки структурных петель вариабельного домена иммуноглобулина мыши включают аминокислоты 6-20, аминокислоты 44-52, аминокислоты 67-76 и аминокислоты 92-101.

Вышеприведенные аминокислотные отрезки соответствующих иммуноглобулинов составляют подлежащие модификации участки петель.

Иммуноглобулин по изобретению предпочтительно происходит из верблюда.

Верблюжьи антитела содержат только одну тяжелую цепь и имеют такое же сродство к антигену, как и нормальные антитела, состоящие из легких и тяжелых цепей. Вследствие этого верблюжьи антитела намного меньше, чем, например, антитела человека, что позволяет им проникать в плотные ткани и достигать антигена там, где более крупные белки не могут. Более того, сравнительная простота, высокое сродство и специфичность, а также возможность достижения и взаимодействия с активными сайтами, дают состоящим из тяжелой цепи верблюжьим антителам преимущества перед обычными антителами при разработке, получении и применении клинически ценных соединений.

Иммуноглобулин из верблюда предпочтительно содержит по меньшей мере один константный домен, выбранный из группы, состоящей из С_н1, С_н2 и С_н3.

Согласно предпочтительному воплощению настоящего изобретения участки петель в Сн1, Сн2 и С_н3 верблюжьего иммуноглобулина включают аминокислоты 8-20, аминокислоты 24-39, аминокислоты

42- 78, аминокислоты 82-85, аминокислоты 91-103 и аминокислоты 108-117.

Согласно предпочтительному воплощению настоящего изобретения специфическое связывание модифицированного иммуноглобулина с молекулой определяют методом связывания, выбранным из группы, состоящей из иммунологических методов, предпочтительно методов ферментного иммуносорбентного анализа (ЕЫ8А), поверхностного плазмонного резонанса, разностной спектроскопии ядерного магнитного резонанса с насыщающим переносом, спектроскопии ядерного магнитного резонанса с переносом ΝΟΕ (!τΝΟΕ), конкурентными методами, методами тканевого связывания, методами связывания с живыми клетками и методами клеточных экстрактов.

Анализ связывания может проводиться рядом методов, известных в этой области, включая, но не

- 13 018897 ограничиваясь этим, методы на основе РЕЕТ (флуоресценции с резонансным переносом энергии) и ВЕЕТ (биолюминесценции с резонансньм переносом энергии), Л1рйа8сгееи™ (гомогенного анализа близости по усилению люминесценции), анализа близости по сцинтилляции, ЕЬ18Л (ферментного иммуносорбентного анализа), 8РЕ (поверхностного плазмонного резонанса, также известного как В1асоге®), изотермической титрационной калориметрии, дифференциальной сканирующей калориметрии, гельэлектрофореза и хроматографии, включая гель-фильтрацию. В этих и других методах могут использоваться партнеры по слиянию или метки.

Модифицированный иммуноглобулин предпочтительно конъюгируют с меткой, выбранной из группы, состоящей из органических молекул, ферментных меток, радиоактивных меток, окрашенных меток, флуоресцентных меток, хромогенных меток, люминесцентных меток, гаптенов, дигоксигенина, биотина, комплексных соединений металлов, металлов, коллоидного золота и их смесей.

Модифицированный иммуноглобулин может быть конъюгирован с другими молекулами, которые позволяют простое детектирование данного конъюгата, к примеру, в методах анализа связывания (например, ЕЫ8Л) и в опытах по связыванию.

Следующий аспект настоящего изобретения касается иммуноглобулина, состоящего из константного домена, выбранного из группы, состоящей из С_н1, С_н2, С_н3, С_н4, Ск, СХ, или его части, в том числе мини-домена, или их комбинаций, по меньшей мере с одним участком петли, и отличающегося тем, что данный по меньшей мере один участок петли содержит по меньшей мере одну аминокислотную модификацию, образующую по меньшей мере один модифицированный участок петли, причем данный по меньшей мере один модифицированный участок петли специфически связывается по меньшей мере с одним эпитопом антигена.

Предпочтительно по меньшей мере один модифицированный домен антитела (= связывающийся со специфическим партнером через невариабельные последовательности или структурную петлю) молекулярно соединяют по меньшей мере с одной другой связывающейся молекулой, которая может представлять собой антитело, фрагмент антитела, растворимый рецептор, лиганд или другой модифицированный домен антитела.

Молекулу выбирают из группы, состоящей из белковых молекул, нуклеиновых кислот и углеводов.

Участки петель модифицированных иммуноглобулинов могут специфически связываться со связывающимися молекулами любого типа, в частности с белковыми молекулами, белками, пептидами, полипептидами, нуклеиновыми кислотами, гликанами, углеводами, липидами, небольшими органическими молекулами, неорганическими молекулами. Конечно, модифицированные иммуноглобулины могут содержать по меньшей мере два участка петель, при этом каждый из участков петель может специфически связываться с другими молекулами или эпитопами.

Согласно предпочтительному воплощению настоящего изобретения с модифицированным участком структурной петли связывается молекула, выбранная из группы, состоящей из раковых антигенов, в частности ЕрСАМ, ракового гликопротеина-72 (ТАС-72), ракового антигена СА 125, специфического мембранного антигена простаты (Р8МА), высокомолекулярного антигена, связанного с меланомой (ИМА-МАА), ракового антигена, экспрессирующего Υ-сцепленный углевод Льюиса, раковоэмбрионального антигена (СЕА), СЕАСАМ5, ИМЕС РЕМ, МИС1 муцина, МИС18 и ракового антигена цитокератина, бактериальных антигенов, вирусных антигенов, аллергенов, флуоресцеина, лизоцима, 1о11подобного рецептора 9, эритропоэтина, СИ2, СИ3, СО3Е, СЭ4, СИ11, СИ11а, СЭ14, СЭ18, СЭ19, СЭ20, СО22, СО23, СО25, СИ28, СИ29, СИ30, СИ33 (белка р67), СИ38, СИ40, СП40Ь, СИ52, СИ54, СИ56, СЭ80, СО147, 6Ό3, 1Ь-1, 1Ь-1Е, 1Ь-2, 1Ь-2Е, 1Ь-4, 1Ь-5, 1Ь-6, 1Ь-6Е, 1Ь-8, 1Ь-12, 1Ь-15, 1Ь-18, 1Ь-23, αинтерферона, β-интерферона, γ-интерферона, ΤΝΡ-α, ΤΝΡ-β2, ΤΝΡ-α, ΤΝΡ-αβ, ΤΝΡ-Ε1, ΤΝΡ-ΕΙΙ, РакЬ, СП27Ь, СП30Ь, 4-1ВВЬ, ТЕА1Ь, ЕАМКЬ, ТАЕАК. АРЕЩ ВАΡΡ, ЬЮИТ, УЕ61, ОХ40Ь, рецептора-1 ТЕА1Ь, А1-рецептора аденозина, рецептора β-лимфотоксина, ТАС1, ВАΡΡ-Е, ЕРО, ЕЕА-3, 1САМ-1, 1САМ-3, β1-интегрина, β2-интегрина, α4/β7-интегрина, α2-интегрина, α3-интегрина, α4-интегрина, α5интегрина, αό-интегрина, αν-интегрина, αV/β3-интегрина, ΡΟΡΕ-3, фактора роста кератинбцитов, УЬА-

1, ^А-4, Ь-селектина, анти-Ιά, Е-селектина, нЬА, нЬА-ΌΕ, СТЬА-4, Т-клеточных рецепторов, В7-1, В7-

2, νΝΕ-интегрина, Τ0Ρ-β1, Τ0Ρ-β2, эотаксина-1, ВЬу8 (стимулятора В-лимфоцитов), комплемента С5, 1дЕ, фактора VII, СИ64, СВЬ, ХСА 90, ЕС,ЕЕ (ЕгЬВ-1), нег2/иеи (ЕгЬВ-2), нег3 (ЕгЬВ-3), нег4 (ЕгЬВ4), тканевого фактора, νΈΟΡ, νΈΟΡ-Ε, рецептора эндотелина, УТАМ, таких углеводов, как антигены групп крови и родственные углеводы, Са1Ш-гликозилирования, гастрина, рецепторов гастрина, раковых углеводов, гаптена №-сар или ЫГР-сар, Т-клеточного рецептора α/β, Е-селектина, дигоксина, плацентарной щелочной фосфатазы (РЬАР) и РЬАР-подобной щелочной фосфатазы яичек, рецептора трансферрина, гепараназы I, сердечного миозина человека, гликопротеида 11Ь/111а (СРПЬ/Ша), гликопротеида дИ оболочки цитомегаловируса человека (нСММ), др120 ВИЧ, ΗСМV, гликопротеида Ρ респираторного синцитиального вируса (Εδν), Ρдр ΕδνΡ, νΝΕ-интегрина, др120 вируса нер В, СМ^ дрПЬШа, петли ν3 др120 ВИЧ ШВ, Ρдр респираторного синцитиального вируса (Εδν), гликопротеида дИ вируса негрек 81шр1ех (Ήδν), гликопротеида дВ Εδν, гликопротеида дВ оболочки ΗСМV, токсина С1о81пйшт регГппдепк и их фрагментов.

- 14 018897

Модифицированный иммуноглобулин по настоящему изобретению может предпочтительно связываться с одной из молекул, приведенных выше. Эти молекулы также охватывают аллергены.

Согласно следующему предпочтительному воплощению настоящего изобретения подвергаются модификации аминокислотные остатки С_н3 в положениях 15-17, 29-34, 85.4-85.3, 92-94, 97-98 и/или 108110.

Модификация иммуноглобулина по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой делецию, замену или вставку.

Согласно настоящему изобретению по меньшей мере 1, предпочтительно по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и 15 аминокислот подвергаются делеции, замене на другие аминокислоты (в том числе модифицированные аминокислоты) или вставке в участок петли иммуноглобулина. Однако максимальное число аминокислот, вставленных в участок петли иммуноглобулина, не может превышать 30, предпочтительно 25, более предпочтительно 20 аминокислот. Замена и вставка аминокислот предпочтительно осуществляется случайным образом известными в этой области методами и так, как изложено в настоящем патенте.

Иммуноглобулин по изобретению согласно конкретному воплощению отличается тем, что участок С_н3 включает 8ЕО ΙΌ Νο. 16 или 8ЕО ΙΌ Νο. 18, если с данным иммуноглобулином связывается ЕрСат, 8ЕО ΙΌ Νο. 20, если с данным иммуноглобулином связывается флуоресцеин, 8ЕО ΙΌ Νο. 22, 24, 26, 28, 30 или 32, если с данным иммуноглобулином связывается лизоцим, 8ЕО ΙΌ Νο. 34, 36, 38 или 40, если с данным иммуноглобулином связывается ТЬК.9, и 8ЕО ΙΌ Νο. 42, если с данным иммуноглобулином связывается лизоцим и/или эритропоэтин.

Согласно особому воплощению изобретения иммуноглобулин отличается тем, что он включает 8ЕО ΙΌ Νο. 44 или 8ЕО ΙΌ Νο. 46, если с данным иммуноглобулином связывается лизоцим и др41.

Модифицированный иммуноглобулин предпочтительно конъюгируют с меткой или репортерной молекулой, выбранной из группы, состоящей из органических молекул, ферментных меток, радиоактивных меток, окрашенных меток, флуоресцентных меток, хромогенных меток, люминесцентных меток, гаптенов, дигоксигенина, биотина, комплексных соединений металлов, металлов, коллоидного золота и их смесей.

Модифицированные иммуноглобулины, конъюгированные с метками, как указано выше, могут применяться, к примеру, в диагностических методах.

Следующий аспект настоящего изобретения касается применения иммуноглобулина по настоящему изобретению или получаемого способом согласно настоящему изобретению для получения вакцины для активной иммунизации. При этом иммуноглобулин используется либо как антигенное лекарственное вещество для составления вакцины, либо для вылавливания или захвата антигенных структур для применения в составе вакцины.

Следующий аспект настоящего изобретения касается применения иммуноглобулина по настоящему изобретению или получаемого способом согласно настоящему изобретению для получения белковой библиотеки иммуноглобулинов.

Следующий аспект настоящего изобретения касается способа специфического связывания и/или детектирования молекул, включающего стадии:

(a) контактирования модифицированного иммуноглобулина по настоящему изобретению или модифицированного иммуноглобулина, получаемого способом по настоящему изобретению, с тестируемым образцом, предположительно содержащим данную молекулу;

(b) детектирования возможного образования специфического комплекса иммуноглобулин/молекула.

Следующий аспект настоящего изобретения касается способа специфического выделения молекул, включающего стадии:

(a) контактирования модифицированного иммуноглобулина по настоящему изобретению или модифицированного иммуноглобулина, получаемого способом по настоящему изобретению, с образцом, содержащим данную молекулу;

(b) отделения образовавшегося специфического комплекса иммуноглобулин/молекула и (c) необязательно выделения молекулы из данного комплекса.

Иммуноглобулины по настоящему изобретению могут применяться для специфического выделения молекул из образца. При использовании мультиспецифических иммуноглобулинов из образца можно выделить более одного вида молекул. Особенно предпочтительно применение модифицированных иммуноглобулинов в таких методах, так как это позволяет, например, создать матрикс, имеющий однородную поверхность с определенным количеством иммобилизованных на ней партнеров связывания (т.е. модифицированных иммуноглобулинов), способных связываться с выделяемыми молекулами. В отличие от этого при использовании моноспецифических партнеров связывания невозможно создать однородный матрикс, так как одинарные партнеры связывания не связываются с матриксом с такой же эффективностью.

Следующий аспект настоящего изобретения касается способа доставки соединения к мишени, включающего стадии:

- 15 018897 (a) контактирования модифицированного иммуноглобулина по настоящему изобретению или модифицированного иммуноглобулина, получаемого способом по настоящему изобретению, способного специфически связываться с данным соединением;

(b) доставки комплекса иммуноглобулин/соединение к мишени.

Модифицированные иммуноглобулины по настоящему изобретению могут применяться для доставки по меньшей мере одного соединения, связанного с участками СОЯ или модифицированными участками петель, к мишени. Такие иммуноглобулины могут применяться для доставки лекарственных веществ к предпочтительному месту действия в ходе лечения заболевания.

Следующий аспект настоящего изобретения касается белковой библиотеки, содержащей иммуноглобулины по настоящему изобретению или получаемые способом по настоящему изобретению.

Предпочтительные методы конструирования такой библиотеки можно найти выше и в примерах. Библиотека по настоящему изобретению может применяться для идентификации иммуноглобулинов, связывающихся с определенной молекулой.

В частности, настоящее изобретение касается применения белковой библиотеки, содержащей иммуноглобулины по настоящему изобретению или получаемые способом по настоящему изобретению, для разработки производных иммуноглобулина. Существующий иммуноглобулин можно изменить введением антигенсвязывающих сайтов в любой домен или мини-домен с помощью белковой библиотеки соответствующего домена из по меньшей мере 10, предпочтительно 100, более предпочтительно 1000, еще более предпочтительно 10000, еще более предпочтительно 100000, наиболее предпочтительно более чем 1000000 вариантов домена по меньшей мере с одной модифицированной петлей. Затем библиотека подвергается скринингу на связывание со специфическим антигеном. После молекулярной характеристики насчет желательных свойств отобранный домен или мини-домен клонируют в исходный иммуноглобулин методами генетической конструирования с тем, чтобы он заменил участок дикого типа. С другой стороны, можно заменить только ДНК, кодирующую петли или кодирующую мутантные аминокислоты, получая иммуноглобулин с дополнительным сайтом связывания для определенного антигена.

Выбор места для мутированной, специфической к антигену структурной петли зависит от структуры исходного иммуноглобулина и от назначения дополнительного сайта связывания. Если, к примеру, исходная молекула представляет собой полный иммуноглобулин, в который нужно вставить дополнительный антигенсвязывающий сайт, не нарушая эффекторную функцию, то подлежащие модификации петли отбирают из доменов, удаленных от С_н2 и С_н3, которые являются естественными партнерами связывания для Ес-эффекторных молекул. Если же исходный иммуноглобулин представляет собой ЕаЬ, то возможна модификация петель в константных доменах легких или тяжелых цепей либо соответствующих вариабельных доменов. Для создания библиотеки можно получить библиотеки из мутантных исходных молекул, имеющих мутации в одной или нескольких структурных петлях одного или нескольких доменов. Селекция полных мутированных исходных молекул может иметь некоторые преимущества, так как селекция на связывание антигена с модифицированной структурной петлей будет давать стерически выгодные модификации, если их тестировать также и на другие свойства, которые должен проявлять мутированный иммуноглобулин.

Требования к размеру белковой библиотеки (т.е. количеству вариантов белка) мутированного домена или мини-домена либо слитой молекулы домена зависит от задачи. В общем, для создания антигенсвязывающего сайта бе ηονο библиотека должна быть большей, чем библиотека, используемая для дополнительной модификации уже существующего встроенного антигенсвязывающего сайта, образованного из модифицированной структурной петли (например, для повышения сродства или изменения тонкой специфичности к антигену).

Настоящее изобретение также касается библиотеки иммуноглобулинов или библиотеки нуклеиновых кислот, содержащей несколько иммуноглобулинов, например, константный или вариабельный домен, мини-домен и/или по меньшей мере один участок структурной петли, содержащийся в минидомене, либо молекулы нуклеиновых кислот, их кодирующих. Библиотека содержит представителей с различными модификациями, причем множество определяется модификациями по меньшей мере в одном участке структурной петли. Библиотека нуклеиновых кислот предпочтительно включает по меньшей мере 10 различных представителей (происходящих из замены одной аминокислоты), более предпочтительно включает по меньшей мере 100, более предпочтительно 1000 или 10000 различных представителей (например, сконструированных методами рандомизации или комбинаторными методами). Также предпочтительно еще большее разнообразие количества индивидуальных представителей, например, по меньшей мере 1000000 или по меньшей мере 10000000.

Следующий аспект изобретения составляет комбинирование двух разных доменов или минидоменов, выбранных по меньшей мере из двух библиотек согласно изобретению для создания мультиспецифических иммуноглобулинов. Эти выбранные специфические иммуноглобулины можно комбинировать друг с другом и с другими молекулами, по блочному принципу, чтобы разработать оптимальное расположение доменов или мини-доменов и получить желательные свойства.

Кроме того, можно ввести один или несколько модифицированных иммуноглобулинов в различные или во все возможные сайты белка, не нарушая структуру белка. Таким методом перетасовки доменов

- 16 018897 создаются новые библиотеки, которые можно опять подвергнуть селекции на желательные свойства.

Предпочтительно библиотека содержит иммуноглобулины по изобретению, выбранные из группы, состоящей из доменов иммуноглобулина, мини-доменов или их производных.

Предпочтительное воплощение изобретения составляют молекулы, связывающие антиген (антигенсвязывающие молекулы), содержащие по меньшей мере один домен иммуноглобулина и участок структурной петли, подвергшийся модификации согласно настоящему изобретению для связывания с антигеном, причем данные связывающие молекулы не содержат вариабельных доменов антител. Они могут содержать другие части, используемые для активности антител (например, природные или модифицированные эффекторные участки (последовательности)), однако они не содержат природного связывающего участка антител, т.е. вариабельных доменов в их естественном положении. Эти антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению обладают преимуществами, описанными выше для данных молекул, хотя и без специфической связывающей активности антител, но с новой специфической связывающей активностью, введенной в участок структурной петли.

Предпочтительно эти антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению содержат С_н1, С||2. Сц3. С||4. Ск, Сл и их комбинации, причем данные комбинации включают по меньшей мере два, предпочтительно по меньшей мере четыре, в особенности по меньшей мере шесть константных доменов и по меньшей мере один участок структурной петли, модифицированный согласно настоящему изобретению. Предпочтительно эти участки структурных петель соединяются либо через участок структурной петли, модифицированный по настоящему изобретению, либо через структурные петли, находящиеся естественным образом между двумя такими константными доменами. Одно воплощение этих антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению состоит из Ес-участка антитела по меньшей мере с одной модификацией в структурной петле согласно настоящему изобретению. В отношении антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению также предпочтительно, чтобы новые антигенсвязывающие сайты вводились в структурные петли по принципу рандомизации, т.е. путем замены одного или нескольких аминокислотных остатков петли слепыми методами или путем введения созданных случайным образом вставок в такие структурные петли. В качестве альтернативы предпочтительно применение комбинаторных подходов.

Согласно следующему аспекту настоящее изобретение касается модифицированного иммуноглобулина, содержащего антигенсвязывающий сайт, чужеродный по отношению к немодифицированному иммуноглобулину и встроенный в одну или несколько структурных петель. Термин чужеродный означает то, что антигенсвязывающий сайт не образован естественным путем в специфической области иммуноглобулина, и связывается с ним не естественный партнер связывания иммуноглобулина, а чужеродный партнер связывания. Это значит, что такой связывающийся партнер, как Ес-рецептор или эффектор иммунной системы, не может связываться антигенсвязывающим сайтом, чужеродным по отношению к немодифицированному иммуноглобулину.

Предпочтительно антиген выбирают из группы, состоящей из антигенов патогенных микроорганизмов, раковых антигенов, ферментов, субстратов, аутоантигенов, органических молекул или аллергенов. Более предпочтительно антиген выбирают из группы, состоящей из вирусных антигенов, бактериальных антигенов или антигенов из патогенов эукариот или фагов. К предпочтительным вирусным антигенам относятся антигены НАУ, НВУ, НСУ, Ηΐν I, Ηΐν II, парвовируса, вируса гриппа, Н8У, вирусов гепатита, флавивирусов, вируса Западного Нила, вируса Эбола, поксвирусов, вируса оспы, вируса кори, герпесвирусов, аденовирусов, вируса папилломы, вируса полиомы, парвовирусов, риновирусов, вируса Коксаки, вируса полиомиелита, эховирусов, вируса японского энцефалита, вируса Денге, вируса клещевого энцефалита, вируса желтой лихорадки, коронавирусов, респираторного синцитиального вируса, вируса парагриппа, вируса Ла Кросс, вируса Ласса, вируса бешенства, ротавирусов; к предпочтительньм бактериальным антигенам относятся антигены Ркеиботоиак, МусоЬас1егшт, 81арйу1ососсик, 8а1тоие11а, Мешидососсик, ВогеШа, Ык1епа, №ккепа, С1ок1пбшт, ЕксйепсЫа, Ьедюие11а, ВасШик, ЬасгоЬасШик, 81гер1ососсик, Ейегососсик, СогуиеЬас1егшт, ЫосагФа, ВНобососсик, Могахе11а, Вгисе11а, Сатру1оЬас1ег, СагбюЬас1егшт, Егаис1ке11а, Не1юоЬас1ег, НаеторЫ1ик, К1еЬк1е11а, 8Ыде11а, Уегыша, МЬпо, СН1атуб1а, Ьер1окр1га, К1ске(1к1а, МусоЬас1епит, Тгеропета, ВайоиеНа. К предпочтительным антигенам патогенных эукариот относятся антигены из О1агб1а, Тохор1акта, Сус1окрога, Сгур!окропбшт, Тпс1ппе11а, дрожжей, Саиб1ба, АкрегдШик, Сгур!ососсик, В1акЮтусек, Н1к1ор1акта, Сосс1бю1бек.

Предпочтительно иммуноглобулины по настоящему изобретению содержат по меньшей мере два антигенсвязывающих сайта, при этом первый сайт связывается с первым эпитопом, а второй сайт связывается со вторым эпитопом.

Согласно предпочтительному воплощению иммуноглобулин настоящего изобретения содержит по меньшей мере два участка петель, при этом первый участок петли связывается с первым эпитопом, а второй участок петли связывается со вторым эпитопом. По меньшей мере либо первый, либо второй участок петли, либо оба могут содержать структурную петлю. Иммуноглобулины по настоящему изобретению охватывают и их фрагменты, о которых в данной области известно, что они являются функциональными, и которые содержат основные элементы по настоящему изобретению: участок структурной петли, модифицированный согласно настоящему изобретению.

- 17 018897

Предпочтительно иммуноглобулин по настоящему изобретению состоит по меньшей мере из двух доменов иммуноглобулина или их частей, включая мини-домены, и каждый домен содержит по меньшей мере один антигенсвязывающий сайт.

Также предпочтительно иммуноглобулин по изобретению содержит по меньшей мере один домен константной области и/или по меньшей мере один домен вариабельной области иммуноглобулина либо их части, включая мини-домены. Таким образом, одним из предпочтительных воплощений является вариабельный домен, который, к примеру, модифицирован по С-концевому участку, либо вариабельный домен, соединенный с модифицированным участком С_н1, к примеру, модифицированным мини-доменом Сн1. Предпочтительный иммуноглобулин по изобретению содержит домен, который по меньшей мере на 50% гомологичен немодифицированному домену.

Термин гомология означает, что полипептиды имеют одинаковые или консервативные остатки в соответствующих положениях их первичной, вторичной или третичной структуры. Этот термин также распространяется на две или больше нуклеотидные последовательности, кодирующие гомологичные полипептиды.

Г омологичный домен иммуноглобулина означает такой домен иммуноглобулина по изобретению, у которого аминокислотная последовательность по меньшей мере на 50% идентична по отношению к полной нативной последовательности домена иммуноглобулина или любого другого фрагмента полной последовательности домена иммуноглобулина. Предпочтительно у гомологичного домена иммуноглобулина аминокислотная последовательность по меньшей мере на 50% идентична, предпочтительно по меньшей мере на 55% идентична, более предпочтительно по меньшей мере на б0% идентична, более предпочтительно по меньшей мере на б5% идентична, более предпочтительно по меньшей мере на 70% идентична, более предпочтительно по меньшей мере на 75% идентична, более предпочтительно по меньшей мере на 80% идентична, более предпочтительно по меньшей мере на 85% идентична, более предпочтительно по меньшей мере на 90% идентична, более предпочтительно по меньшей мере на 95% идентична последовательности нативного домена иммуноглобулина или любого другого специфически определенного фрагмента полноразмерной последовательности домена иммуноглобулина, раскрытой в настоящем изобретении.

Степень (%) идентичности аминокислотной последовательности в отношении последовательностей доменов иммуноглобулина, приведенных в настоящем изобретении, определяется как процентное содержание таких аминокислотных остатков в рассматриваемой последовательности, которые идентичны аминокислотным остаткам в последовательности определенного домена иммуноглобулина после совмещения последовательностей и введения пробелов, если нужно, для достижения максимального процента идентичности последовательностей, при этом не рассматривая консервативные замены как часть идентичности последовательностей. Совмещение в целях определения степени идентичности аминокислотной последовательности может осуществляться различными способами, которые доступны специалистам в этой области, например, с помощью таких общедоступных компьютерных программ, как ВЬА8Т, ВЬА8Т-2, ΛυΟΝ или Медайдп (^NА§ТΛВ). Специалисты в состоянии определить надлежащие параметры для измерения степени совпадения, включая алгоритмы, необходимые для достижения максимального совпадения по всей длине сравниваемых последовательностей.

Значения % идентичности аминокислотной последовательности можно получить, как описано ниже, с помощью компьютерной программы ^и-ВЬА8Т-2 (АЙ5сйи1 е! а1., Ме11юЙ8 ίη Епхуто1оду 2бб: 4б0480 (199б)). Большинство значений параметров поиска в ^и-ВЬА8Т-2 устанавливают по умолчанию. Те параметры, которые не устанавливаются по умолчанию, т.е. настраиваемые параметры, устанавливают на следующие значения: оуег1ар врап=1, оуег1ар £гасйоп=0,125, \уогй 111ге51ю1й (Т)=11 и всоппд тайгх =ВЬО8ИМб2. При использовании ^и-ВЬА8Т-2 значение % идентичности аминокислотной последовательности определяется делением (а) числа идентичных аминокислотных остатков, совпадающих между аминокислотной последовательностью рассматриваемого домена иммуноглобулина, у которого последовательность происходит из нативного домена иммуноглобулина, и используемой для сравнения аминокислотной последовательностью (т.е. той последовательностью, с которой сравнивают рассматриваемый домен иммуноглобулина, и которой может служить немодифицированный домен иммуноглобулина), определенного программой ^и-ВЬА8Т-2, на (б) общее число аминокислотных остатков, не подвергавшихся рандомизации частей рассматриваемого домена иммуноглобулина. Например, в выражении полипептид, имеющий аминокислотную последовательность А, которая по меньшей мере на 80% идентична аминокислотной последовательности В аминокислотная последовательность А является рассматриваемой сравниваемой аминокислотной последовательностью, а аминокислотная последовательность В является аминокислотной последовательностью рассматриваемого домена иммуноглобулина.

В предпочтительном воплощении иммуноглобулин по изобретению представляет собой биспецифическое антитело или биспецифическое одноцепочечное антитело. Также предпочтительно иммуноглобулин включает биспецифический домен или его часть, в том числе мини-домен.

Иммуноглобулин по настоящему изобретению может применяться для любых целей, известных в этой области для иммуноглобулинов, но делает возможными и такие применения, которые зависят от комбинации специфичностей, введенных по настоящему изобретению. Соответственно, иммуноглобули

- 18 018897 ны по настоящему изобретению предпочтительно используются для терапевтического и профилактического применения (например, в качестве активной или пассивной иммунотерапии), для препаративного и аналитического применения и для диагностического применения.

Следующий аспект настоящего изобретения касается набора партнеров связывания, содержащего:

(a) модифицированный иммуноглобулин, содержащий антигенсвязывающий сайт, чужеродный для этого иммуноглобулина, встроенный в одну или несколько структурных петель, и (b) связывающуюся молекулу, содержащую эпитоп данного антигена.

Такая связывающаяся молекула из этого набора по настоящему изобретению может применяться для идентификации специфичности связывания модифицированного иммуноглобулина согласно настоящему изобретению. С помощью связывающейся молекулы из этого набора по настоящему изобретению можно определять активность (силу действия) модифицированных иммуноглобулинов по настоящему изобретению.

Активность в настоящем изобретении определяется как свойство связывания модифицированной молекулы со своим антигеном. Связывание может определяться количественно и/или качественно в смысле специфичности и/или авидности, как это делается в целях контроля качества.

Кроме того, связывающаяся молекула из набора по настоящему изобретению может применяться для селекции модифицированного иммуноглобулина по настоящему изобретению из библиотеки, состоящей по меньшей мере из 10, предпочтительно по меньшей мере 100, более предпочтительно по меньшей мере 1000, более предпочтительно по меньшей мере 10000, в особенности по меньшей мере 100000 иммуноглобулинов с различными модификациями в структурных петлях.

В соответствии с настоящим изобретением одна из ключевых особенностей настоящего изобретения состоит в том, что конструирование доменов иммуноглобулина происходит в тех участках, которые в норме не участвуют в связывании антигена, иными словами, в участках антитела, отличных от участков СЭВ. Было отмечено, что специфическая укладка доменов иммуноглобулина позволяет вводить случайные мутации в такие участки, которые по структуре аналогичны участкам СЭВ, но отличаются положением в последовательности. Участки, идентифицированные в настоящем изобретении, как и участки СЭВ, представляют собой участки петель, соединяющих β-отрезки в укладке иммуноглобулина.

В частности, в настоящем изобретении описано, что при введении случайных мутаций в петли, соединяющие β-отрезки А-В и Е-Р домена С_Н3 1д61 человека, были отобраны мутированные домены С_Н3, которые специфически связываются либо с пептидом-9 То11-подобного рецептора (ТЬВ-9), либо с яичным лизоцимом курицы, причем данный пептид и данный белок, соответственно, в норме не распознаются и не связываются доменами С_Н3 1д61 человека. Введенные нами мутации включают такие мутации, при которых отдельные аминокислотные остатки в последовательности дикого типа были заменены выбранными случайным образом остатками, а также они включают вставку дополнительных аминокислотных остатков в петли, указанные выше.

По аналогии, домены иммуноглобулинов из любого класса иммуноглобулинов и полученных из любых видов могут быть подвергнуты конструированию этого типа. Кроме того, таким же образом можно видоизменять не только конкретные петли, затрагиваемые в настоящем изобретении, но и любые петли, соединяющие β-цепи в доменах иммуноглобулина.

Подвергшиеся конструированию домены иммуноглобулина из любого организма и из любого класса иммуноглобулинов могут применяться по настоящему изобретению либо как таковые (в виде одиночных доменов), либо в составе более крупных молекул.

Например, они могут входить в состав интактного иммуноглобулина, у которого, соответственно, будет свой нормальный антигенсвязывающий участок, образованный 6 участками СЭВ, и новый, встроенный антигенсвязывающий участок. Аналогичным образом можно создать мультиспецифический, например, биспецифический иммуноглобулин. Подвергшиеся конструированию домены иммуноглобулина также могут входить в состав любого слитого белка. Применение таких подвергшихся конструированию доменов иммуноглобулина входит в общую область применения иммуноглобулинов.

Под доменами иммуноглобулина подразумеваются домены следующих иммуноглобулинов:

для 1_ёО, и 1§А: У_ь С_ь У_н, С_Н1, С_н2, С_н3 для 1§М и 1_ёЕ: У_ь С_ь V», С_н1, С_н2, С_н3, С_н4.

1. Одиночные домены иммуноглобулина, подвергнутые рандомизации с одной стороны, т.е. либо в петлях, соединяющих β-цепи В-С, Ώ-Е или Р-6 (верхушка за исключением тех вариабельных доменов, которые защищены многими патентами), либо β-отрезки А-В, С-Ώ (С-С и С-0 в случае вариабельных доменов) или Е-Р (основание). Рандомизации могут подвергаться одиночные петли или любые комбинации петель. Остатки могут подвергаться замене, делеции или вставке добавочных остатков.

2. Одиночные домены иммуноглобулина, подвергнутые рандомизации с обеих сторон, на верхушке и основании.

3. Любые белки, содержащие один из подвергнутых рандомизации одиночных доменов, как то:

а) одноцепочечные димеры С_Н3 (зсС_Н3), зсС_Н2, 8сС_Н1/С_ь подвергнутые рандомизации с одной или с обеих сторон;

- 19 018897

b) одноцепочечные Ρν, подвергнутые рандомизации по основанию, т.е. со стороны, противоположной участкам СЭР;

c) фрагменты РаЬ, подвергнутые рандомизации по основанию, т.е. на С-конце домена С_Н1 и домена С_ь;

б) фрагменты Рс (т.е. белки, состоящие из С_Н2-С_Н3), подвергнутые рандомизации с одной или с обеих сторон,

е) полные иммуноглобулины, подвергнутые рандомизации по основанию Рс,

ί) другие подходящие домены.

Главные преимущества одиночных доменов: очень похожи на все те доводы, которые использовались для внедрения верблюжьих У_Н-молекул (нанотел, см. те^ет.аЫупх.сот). Рандомизированные домены иммуноглобулина являются очень небольшими белками (молекулярный вес около 12-15 кДа в зависимости от количества встроенных аминокислотных остатков), поэтому они должны обладать следующими преимуществами перед обычными антителами или фрагментами антител типа ксРу и РаЬ: распознавание редко встречающихся или скрытых эпитопов, связывание в полости или активном сайте белка мишени, легкость получения и многие другие. В случае домена иммуноглобулина, подвергнутого рандомизации с обеих сторон, можно создать двухвалентную или биспецифическую молекулу. Основным преимуществом одиночных доменов в составе слитых белков является то, что можно встроить дополнительные параметры связывания в любой другой белок.

Предусматривается, что для получения этих белков можно использовать любые системы экспрессии. Аналогию описанным в настоящем изобретении одиночным доменам можно обнаружить в антителах верблюда, у которых есть только У_Н, но нет У_ь. В этих белках за связывание антигена отвечают только 3 участка СОЯ (вместо 6 у нормальных антител).

Следующие патентные ссылки включены в настоящее изобретение путем отсылки во всей полноте.

И8 6294654. Моббзеб 1ттипод1оЬи1т то1еси1е тсотрогабпд ап апбдеп ίη а поп-СЭР 1оор гедюп.

И8 5844094. Тагде( Ьтбтд ро1урер!1бе.

И8 5395750. МеШобк Гог ргобистд ргоШпк \г1ис11 Ьтб (о ргебе1егттеб апбдепк.

И8 2004/0071690. Н1дб а\зббу ро1ууа1еп1 апб ро1укресбзс геадейк.

И8 2004/0018508. 8нггодйе апбЬоб1ек апб тебюбк оГ ргерагабоп апб ике (НегеоГ

И8 2003/0157091. МиШ-Гипс1юпа1 рго1етк.

И8 2003/0148372. Ме(Ноб (о ксгееп рНаде б1кр1ау ИЬгапек \\6Н б1ГГегеп1 Ндапбк.

И8 2002/0103345. Вйресбю 1ттипод1оЬи1т-11ке апбдеп Ьтбтд рго1етк апб те(Ноб оГ ргобийюп.

И8 2004/0097711. 1ттипод1оЬи1т кирегГатбу рго1етк.

И8 2004/0082508. 8есге1еб ргоШпк

И8 2004/0063924. 8есге1еб рго1етк.

И8 2004/0043424. 1ттипод1оЬи1т кирегГатбу ргоЮпк.

И8 5892019. Ргобийюп оГ а ктд1е-депе-епсобеб 1ттипод1оЬи1т.

И8 5844094. Тагде! Ьтбтд ро1урер!1бе.

Далее настоящее изобретение иллюстрируется нижеследующими фигурами и примерами, но не ограничивается ими.

Краткое описание фигур

На фиг. 1а представлена структура интактного 1дС1. Домены показаны стрелками.

На фиг. 1Ь представлена структурная организация мономеров основных изотипов иммуноглобулина человека. Дисульфидные связи представлены линиями, Ν-связанные группы углеводов показаны кружочками.

На фиг. 2 представлена укладка иммуноглобулина для константного (слева) и вариабельного (справа) домена иммуноглобулина. β-Отрезки указаны стрелками.

На фиг. 3 представлена молекулярная модель подвергнутого конструированию домена СН1 согласно настоящему изобретению, при этом рандомизованная часть представлена доступной растворителю поверхностью. Эта поверхность обведена кружком.

На фиг. 4 представлена схема реакций ПЦР для получения фрагментов, использовавшихся для сборки мутированного домена С_Н3. Праймеры для ПЦР указаны стрелками при соответствующей ориентации 5'-3', а вертикальные линии обозначают приблизительное положение введенных сайтов рестрикции, использовавшихся для сборки мутированного гена. В праймерах для лигирования ПЦР-фрагментов содержатся следующие рестрикционные сайты: ΓΉ3ΓΝίΌ: №о1; СН3Ь8ЛС и СН3С8ЛС: 8ас1; СН3СНШи СН3РНГ№ НтбШ; С ΓΉΝΟΤ: №б.

На фиг. 5 представлены некоторые примеры того, как могут использоваться домены иммуноглобулина по настоящему изобретению. Рандомизованные участки обозначены звездочками. Специфичности рандомизованных участков могут быть как идентичными, так и различными.

На фиг. 6 представлена схема конструирования биспецифического искусственного домена СН3. Названия праймеров приведены в рамках, а стрелками указано направление, в котором происходит наращивание праймера. Косой штриховкой обозначено относительное положение участков, подвергавшихся рандомизации в данной конструкции, а прямой штриховкой обозначено относительное положение участ

- 20 018897 ков, введенных для получения клона С24, и приведены рестрикционные сайты, использовавшиеся при клонировании.

На фиг. 7 представлена схема конструирования биспецифического искусственного домена С_н3. Приведена нуклеотидная последовательность и её трансляция в основной конструкции биспецифического искусственного домена С_н3. Красным цветом выделены участки, подвергавшиеся рандомизации для создания биспецифической конструкции, а зеленым цветом выделены участки, в которых проводилась рандомизация последовательности для создания клона С24.

На фиг. 8 представлен перечень последовательностей, раскрытых в настоящем изобретении.

Примеры

Пример 1. Конструирование библиотеки Сн3 и дисплей на поверхности фага.

При конструировании мутированного домена С_н3 использовали кристаллическую структуру Есфрагмента 1д61, которая опубликована в базе данных ВгоокНауеп как объект 1ос.|о.рбЬ.

Последовательность, лежащая в основе конструкции библиотеки С_н3, приведена в 8Е0 ГО Ыо. 1. В этой последовательности первая аминокислота соответствует пролину 343 цепи А объекта 1ос.|о.рбЬ базы данных ВгоокНауеп. Последним остатком, содержащимся в 1ос.|о.рбЬ, является серин 102 из 8ЕО ГО Ыо. 1. После детального анализа структуры 1ос.|о.рбЬ и визуального осмотра остатков, образующих петли, соединяющие β-отрезки, было решено подвергнуть рандомизации остатки 17, 18 и 19, которые входят в состав петли, соединяющей β-цепи А-В, а также остатки 71, 72, 73, 76 и 77, которые входят в состав петли, соединяющей β-цепи Ε-Е в 8ЕО ГО Ыо. 1. Молекулярная модель подвергаемого конструированию домена С_н3, на которой рандомизованная часть представлена как доступная растворителю поверхность, приведена на фиг. 3. Подвергаемый конструированию ген получали при помощи ряда реакций ПЦР с последующим лигированием продуктов ПЦР. Чтобы облегчить лигирование, некоторые кодоны в нуклеотидной последовательности, кодирующей 8ЕО ГО Ыо. 1, подвергали модификации так, чтобы получить рестрикционные сайты без изменения аминокислотной последовательности (молчащие мутации). Для встраивания в клонирующий вектор рнЕЫ1 (Ыис1ею Лабз Вез. 1991 Аид 11, 19(15): 4133-7. Ми1йзиЬипй ргсЛетз оп (Не зигГасе оГ ГбатеШонз ркаде: те11юбо1од1ез Гог б1зр1аутд апйЬобу (ЕаЬ) Неауу апб ПдЫ сНатз. ноодепЬоот нВ, СпГГбНз АО, 1ойпзоп К8, С1из\уе11 Ώ1, нибзоп Р, \Ут1ег 6.) в одной рамке с сигналом секреции ре1В на 5'-конец последовательности вставляли дополнительные нуклеотиды, кодирующие Ме1-А1а, получая сайт рестрикции Ысо1. Для рандомизации остатков выбрали кодон NN8 (код ГОРАС, где 8 означает С или С), который кодирует все 20 встречающихся в природе аминокислот, но обходит 2 из 3 стоп-кодонов. Подвергаемая конструированию последовательность приведена в виде нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО Ыо. 2 и в виде аминокислотной последовательности 8ЕО ГО Ыо. 3. Буквой X в 8ЕО ГО Ыо. 3 обозначены подвергаемые рандомизации аминокислотные остатки. Последовательности праймеров для ПЦР при сборке мутированного домена С_н3 приведены в 8ЕО ГО Ыо. 4-9. На фиг. 4 схематически представлены ПЦР-фрагменты, созданные для сборки мутированного гена, и использовавшиеся для этого праймеры.

В качестве матрицы для реакций ПЦР использовали кДНК тяжелой цепи моноклонального антитела 3Ώ6 человека (Ее1депЬаиет М., КоН1 ί., Викег Е. Ыис1еойбе зециепсез оГ Фе сОЫАз епсобшд Ле Vтедюпз оГ н- апб Ь-скатз оГ а китап топос1опа1 апйЬобу зресШс (о др41. Ыис1ею Аабз Вез. 1990

Аид 25, 18(16): 4927). Все 3 продукта ПЦР расщепляли с помощью 8ас1 и/или ШпбШ, соответственно, и лигировали друг с другом. Продукт лигирования далее расщепляли с помощью Ысо1 и ЫоЙ и лигировали в фагомидный вектор для поверхностного дисплея рИЕЫ1, предварительно расщепленный Ысо1 и ЫоЙ. Несколько отобранных клонов проверяли рестрикционным анализом и секвенированием ДНК и убедились, что они содержат намеченную вставку, включая встроенные правильным образом рандомизованные последовательности. На последующих стадиях получения фага следовали стандартным методикам. Вкратце, смесью для лигирования трансформировали клетки Е. сой ТС1 методом электропорации. После этого из клеток Е. сой ТС1 выделяли частицы фага с помощью фага-хелпера М13-К07. Затем частицы фага осаждали из супернатантов культур с помощью ПЭГ/ЫаС1 в 2 стадии, растворяли в воде и использовали для селекции методом пэннинга или, в качестве альтернативы, хранили при -80°С.

Пример 2. Конструирование библиотеки С_н3+3.

Эту библиотеку конструировали и клонировали таким же образом, как и библиотеку С_н3. Аминокислотная последовательность конструкции приведена в 8ЕО ГО Ыо. 10, соответствующая нуклеотидная последовательность - в 8ЕО ГО Ыо. 11, и при конструировании использовали праймеры 8ЕО ГО Ыо. 4-7, 8ЕО ГО Ыо. 9 и 8ЕО ГО Ыо. 12.

Пример 3. Конструирование библиотеки С_н3+5.

Эту библиотеку конструировали и клонировали таким же образом, как и библиотеку С_н3. Аминокислотная последовательность конструкции приведена в 8ЕО ГО Ыо. 13, соответствующая нуклеотидная последовательность - в 8ЕО ГО Ыо. 14, и при конструировании использовали праймеры 8ЕО ГО Ыо. 4-7, 8ЕО ГО Ыо. 9 и 8ЕО ГО Ыо. 15.

- 21 018897

Пример 4. Пэннинг фаговой библиотеки С_н3 на пептиде ТЬК-9.

Проводили 3 цикла пэннинга по стандартным методикам. Вкратце, применяли следующий метод. 9б-луночные планшеты Μπχίδοτρ (Хипс) сенсибилизировали синтетическим пептидом, составляющим часть последовательности Τοίί-подобного рецептора-9 (ТЬК-9). В лунки вносили по 200 мкл следующего раствора: 0,1 М Ха-карбонатный буфер, рН 9,б, при следующих концентрациях растворенного пептида:

1- й цикл пэннинга: 1 мг/мл пептида ТЬК-9

2- й цикл пэннинга: 500 мкг/мл пептида ТЬК-9

3- й цикл пэннинга: 100 мкг/мл пептида ТЬК-9

Инкубировали в течение 1 ч при 37°С, а затем блокировали 2% сухим молоком (М-РВ8) по 200 мкл на лунку в течение 1 ч при комнатной температуре.

После этого библиотеку дисплея на поверхности фага оставляли реагировать с фиксированным пептидом добавлением 100 мкл суспензии фага и 100 мкл 4% сухого молока (М-РВ8), а затем инкубировали в течение 45 мин со встряхиванием и 90 мин без встряхивания при комнатной температуре.

Несвязавшиеся частицы фага отмывали следующим образом. После 1-го цикла пэннинга: 10x300 мкл Т-РВ8, 5x300 мкл РВ8; после 2-го цикла пэннинга: 15x300 мкл Т-РВ8, 10x300 мкл РВ8; после 3-го цикла пэннинга: 20x300 мкл Т-РВ8, 20x300 мкл РВ8.

Элюирование связавшихся частиц фага осуществляли добавлением в лунки по 200 мкл 0,1 М глицина, рН 2,2 и инкубировали со встряхиванием в течение 30 мин при комнатной температуре. После этого суспензию фага нейтрализировали добавлением б0 мкл 2 М трис-основания, а затем инфицировали клетки Е. εοίί ТО1 смешиванием 10 мл культуры в экспоненциальной фазе роста с 0,5 мл элюированного фага и инкубировали 30 мин при 37°С. Наконец, инфицированные бактерии высевали на чашки со средой ΤΥΕ с 1% глюкозы и 100 мкг/мл ампициллина и инкубировали при 30°С в течение ночи.

Таблица 1 Результаты пэннинга фаговой библиотеки С_н3 на пептиде ТЬК-9 (титры фага)

Цикл пэннинга	Концентрация ТЬК-9 при пэннинге	На входе (частиц фага/мл)	На выходе (частиц фага/мл)
1-й	1 мг/мл	6х10¹⁸	2х1О¹⁰
2-й	0,5 мг/мл	4х10¹⁸	2*1О¹⁰
3-й	0,1 мг/мл	6х10²²	6χ10^ιυ

Пример 5. Клонирование отобранных клонов мутантов С_н3 при селекции по ТЬК-9 для растворимой экспрессии.

Выделяли фагомидную ДНК методом Μίάί-ргер из фага, прошедшего 3 цикла селекции пэннингом. ДНК, кодирующую мутированные участки С_н3, целиком амплифицировали методом ПЦР и клонировали по ΝοοΙ-ΝοίΙ в вектор рХОТВАИ/Мус-Шз, представляющий собой вектор рВАИ/Мус-Нтз (Ιηνίΐτο^η) для экспрессии в Е. οοίϊ со вставленным сайтом рестрикции ΝοΐΙ, облегчающим клонирование. Лигированными конструкциями трансформировали клетки Е. οοίϊ ЬМО194 (Ιηνίΐτο^η) методом электропорации и культивировали при 30°С на среде ТΥЕ с 1% глюкозы и ампициллином в течение ночи. Отобранные клоны инокулировали в 200 мкл среды 2xΥТ с ампициллином, культивировали в течение ночи при 30°С и индуцировали добавлением Ь-арабинозы до конечной концентрации 0,1%. После экспрессирования при 1б°С в течение ночи клетки собирали центрифугированием и обрабатывали 100 мкл Ха-боратного буфера, рН 8,0, при 4°С в течение ночи для получения периплазматических экстрактов. По 50 мкл периплазматических экстрактов использовали в методе ЕЫ8А (см. ниже).

- 22 018897

Пример 6. ЕЕ18А мутантов С_Н3, отобранных по ТЬВ-9.

Отобранные клоны анализировали на специфическое связывание с пептидом ТЬВ-9 методом ЕЫ8А.

Сенсибилизация: микропланшет Мах1зогр (Νιιηο), 100 мкл на лунку, 20 мкг пептида ΊΈΒ.-9 на 1 мл Иа-карбонатного буфера, рН 9,6, 1 ч при 37°С

Отмывка: 3 *200 мкл РВ 8

Блокировка: 1% В8А-РВ8, 1 ч при комнатной температуре

Отмывка: 3 *200 мкл РВ8

Связывание с периплазматическим экстрактом: 50 мкл периплазматического экстракта, 50 мкл 2% В8А-РВ8, при комнатной температуре в течение ночи

Отмывка: 3x200 мкл РВ8

1- е антитело: анти-Ηί з₄ (СИа§еп), 1:1000 в 1% В8А-РВ8, 90 мин при комн, темп.,

100 мкл на лунку

Отмывка: 3x200 мкл РВ8

2- е антитело: козье против мыши*НКР (81§та), 1:1000 в 1 % В8 А-РВ8, 90 мин при комн, темп., 100 мкл на лунку

Отмывка: 3x200 мкл РВ8

Детектирование: 3 мг/мл ΟΡΏ в Иа-цитрат/фосфатном буфере, рН 4,5, 0,4 мкл 30% Н₂О₂

Остановка: 100 мл 3 М Н₂8О₄

Измерение поглощения: 492/620 нм

Клоны, дававшие сильный сигнал при этом первом, предварительном анализе методом ЕЫ8А, культивировали в объеме 20 мл в тех же условиях, что описаны выше. Из них выделяли периплазматические экстракты в 1/20 объеме культуры, как описано выше, и тестировали методом Е1Л8А (как описано выше) для подтверждения.

Таблица 2

Результаты проверки методом ЕЬ18А

Клон	с антигеном	без антигена
А492/620 4 измерения	А492/620 1 измерение
А67	0,0435	0,019
В54	0,0937	0,051
С67	0,0295	0,013

Фон (только антиген) (12 параллельных измерений): 0,0115.

Пример 7. Пэннинг фаговой библиотеки С_Н3 и С_Н3+5 на лизоциме куриного яйца.

Проводили 3 цикла пэннинга. 96-луночные планшеты Махщогр (Νιιικ) сенсибилизировали лизоцимом куриного яйца (НЕЕ) внесением 200 мкл на лунку следующего раствора: РВ8, при следующих концентрациях растворенного яичного лизоцима:

1- й цикл пэннинга: 2 мг/мл НЕЬ

2- й цикл пэннинга: 1 мг/мл НЕЬ

3- й цикл пэннинга: 1 мг/мл НЕЬ

После этого библиотеку дисплея на поверхности фага оставляли реагировать с фиксированным яичным лизоцимом добавлением 100 мкл суспензии фага и 100 мкл 4% сухого молока (М-РВ8), а затем инкубировали в течение 45 мин со встряхиванием и 90 мин без встряхивания при комнатной температуре.

Несвязавшиеся частицы фага отмывали следующим образом:

1- й цикл пэннинга: 10^χ300 мкл Т-РВ8, 5^х300мклРВ8

2- й цикл пэннинга: 15x300 мкл Т-РВ8, 10x300 мкл РВ8

3- й цикл пэннинга: 20x300 мкл Т-РВ8, 20^х300 мкл РВ8.

Элюирование связавшихся частиц фага осуществляли добавлением в лунки по 200 мкл 0,1 М гли- 23 018897 цина, рН 2,2, и инкубировали со встряхиванием в течение 30 мин при комнатной температуре. После этого суспензию фага нейтрализировали добавлением 60 мкл 2 М трис-основания, а затем инфицировали клетки Е. ^1ΐ ТО1 смешиванием 10 мл культуры в экспоненциальной фазе роста с 0,5 мл элюированного фага и инкубировали 30 мин при 37°С. Наконец, инфицированные бактерии высевали на чашки со средой ΤΥΕ с 1% глюкозы и 100 мкг/мл ампициллина и инкубировали при 30°С в течение ночи.

Т аблица 3

Результаты пэннинга фаговой библиотеки С_н3 на лизоциме куриного яйца (НЕЬ) (титры фага)

Цикл пэннинга	Концентрация НЕЬ при пэннинге
1-й	2 мг/мл
2-й	1 мг/мл
3-й	1 мг/мл

На входе (частиц фага/мл)	На выходе (частиц фага/мл)
	4,7х1О¹⁰
1,29x10²²	8,0x10⁹
5,71 хЮ²⁰	4,8х10^1и

Таблица 4

Результаты пэннинга фаговой библиотеки С_н3+5 на лизоциме куриного яйца (НЕЬ) (титры фага)

Цикл пэннинга	Концентрация НЕЬ при пэннинге	На входе (частиц фага/мл)	На выходе (частиц фага/мл)
1-й	2 мг/мл	8,Зх10¹⁶	2,9х10⁹
2-й	1 мг/мл	2,1х10¹⁹	2,6х10⁹
3-й	1 мг/мл	5,4х10¹⁹	1,2χ10^ιυ

Пример 8. Клонирование отобранных клонов из примера 7 для растворимой экспрессии.

Клонирование отобранных клонов для растворимой экспрессии осуществляли, как описано выше для мутантов С_н3, проходивших селекцию по ТИК-9.

Пример 9. Растворимая экспрессия отобранных клонов из примера 7.

Растворимую экспрессию отобранных клонов осуществляли, как описано выше для мутантов С_н3, проходивших селекцию по ТИК-9. Периплазматические экстракты предварительно тестировали методом ЕИ13А (см. методику в примере 10).

Клоны, дававшие сильный сигнал при этом первом предварительном анализе методом ЕИ13А, культивировали в объеме 20 мл в тех же условиях, что описаны выше. Из них выделяли периплазматические экстракты в 1/20 объеме культуры, как описано выше, и тестировали методом ЕИ13А (как описано в примере 10) для подтверждения.

Пример 10. Анализ методом ЕИ13А мутантов С_н3, отобранных против лизоцима куриного яйца. Сенсибилизация: микропланшет Мах1зогр (Липе), 100 мкл на лунку, 20 мкг яичного лизоцима на 1 мл ΡΒδ, 1 ч при 37°С

Отмывка: 3x200 мкл РВЗ

1- е антитело: анти-Н184 ((^адеп), 1:1000 в 1% В8А-РВ8, 90 мин при комн, темп.,

100 мкл на лунку

Отмывка: 3x200 мкл РВЗ

2- е антитело: козье против мыши*НКР (Зщгпа), 1:1000 в 1% В8А-РВ8, 90 мин при комн, темп., 100 мкл на лунку

Отмывка: 3x200 мкл РВЗ

Детектирование: 3 мг/мл ΟΡϋ в Яа-цитрат/фосфатном буфере, рН 4,5, 0,4 мкл 30% Н₂О₂

Остановка: 100 мл 3 М Н₂ЗО4

Измерение поглощения: 492/620 нм

- 24 018897

Таблица 5

Результаты проверки методом ЕБ18А мутантов С_Н3, отобранных против лизоцима куриного яйца

Клон	с антигеном	без антигена
А492/620 4 измерения	А₄92/620 1 измерение
В12	0,396	0,012
то	0,415	0,026
Э46	0,398	0,011

Фон (только антиген) (12 параллельных измерений): 0,1763.

Таблица 6 Результаты проверки методом ЕБ18А мутантов С_Н3, отобранных против лизоцима куриного яйца, при различных разведениях антигена

—: периплазматический экстракт не добавляли.

Отмечено, что лизоцим куриного яйца реагирует с антителом анти-Н1з₄, поэтому наблюдается относительно высокий уровень фона.

Таблица 7

куриного яйца

Фон (только антиген) (12 параллельных измерений): 0,1334.

Примечание: лизоцим куриного яйца реагирует с антителом анти-Н1з₄, поэтому наблюдается относительно высокий уровень фона.

Пример 11. Библиотека С_ь.

Визуальное изучение кристаллической структуры БаЬ-фрагмента (использовали структуру ЕаЬ моноклонального антитела 3Ώ6 человека: объект 1бГЬ.рбЬ Банка данных по белкам К8СВ (Ы!р://ААА.гзсЬ.огд/рбЬ/) (Не ХМ е! а1. Ргос. Ыа!1. Асаб. 8сг И8А, 1992 Аид 1, 89(15): 7154-8) и компьютерный анализ (например, для этой цели используется Рго!ет Ехр1огег (й!!р://шок1з.збзс.еби/рго!ехр1/1т!боог.й!ш)) вторичной и третичной структуры этого белка позволяет идентифицировать остатки, локализованные в участках петель, соединяющих β-цепи каркаса домена С_ь. Эти остатки охватывают аминокислоты 8-18, аминокислоты 27-35, аминокислоты 42-78, аминокислоты 83-85, аминокислоты 92-100, аминокислоты 108-117 и аминокислоты 123-126 (нумерация по системе нумерации 1МОТ (БеГгапс М.Р. е! а1. ЫисЫс Ас1бз Кез. 2005 1ап 1, 33 (Эа!аЬазе 1ззие): Ώ593-7; БеГгапс МР е! а1. ΙΧν Сошр 1шшипо1. 2005, 29(3): 185-203)).

В частности, подвергали рандомизации остатки 11, 12, 14-18 и 92-95 в пределах домена С_ь человека (8Е^ ГО Ыо. 48). Рандомизацию осуществляли посредством ПЦР-амплификации кодирующих последовательностей с помощью праймеров для ПЦР, у которых положения соответствующих кодонов кодируются последовательностью нуклеотидов 5'-ΝΝ8-3', которая потенциально кодирует все 20 аминокислот, но обходит 2 из 3 стоп-кодонов. Библиотечную вставку амплифицировали посредством двух отдельных реакций ПЦР и два ПЦР-фрагмента лигировали друг с другом через рестрикционный сайт НруСН41У, который вводили в виде молчащей мутации с помощью ПЦР-праймеров. Эти праймеры также обеспечивают сайты рестрикционных эндонуклеаз Ысо1 и Ыо!1, соответственно, для клонирования в вектор фагового дисплея рНЕЫ (НоодепЬоош НК е! а1. ЫисЫс Ас1бз Кез. 1991 Аид 11, 19(15): 4133-7). Для фагового дисплея не включали О-концевой цистеин домена С_ь, но его можно вставить позже, при использовании модифицированного клона С_ь, например, для конструирования БаЬ-фрагмента.

В качестве матрицы для ПЦР-амплификации использовали плазмиду типа рКсСМУ-3Э6БС (Кикег Б. е! а1. Апп ΝΥ Асаб. 8сг 1991 Эес 27, 646: 212-9), которая содержит в виде вставки полную легкую цепь

- 25 018897 моноклонального антитела 3Ό6 человека.

Для библиотек С_ь+3 (8Ер ΙΌ Νο. 50, 51) и С_ь+5 (8Ер ΙΌ Νο. 52, 53), которые содержат дополнительные остатки, вставленные между положениями 92 и 95 домена С_ь использовали праймеры С_ьКнРУ3 и СьКнРУ5 соответственно вместо праймера С_ьКнРУ.

Нуклеотидная и аминокислотная последовательность конечного продукта реакций ПЦР и лигирования, клонированного в ρΐ ΙΕΝ1 по сайту Ν^Ι, что ведет к присоединению лидерной последовательности ре1В на Ν-конец конструкции, представлены ниже (8Ер ГО Νο. 48, 49):

+з

ΑΑΑ

АТСАААТАСС ТАТТСССТАС

СССАСССССТ

ССАТТСТТАТ

ТАСТСССССС

Ысо!

О Р А МАУ

ССАСССССССАТСССССТСС

СТССАССАТС

ТСТСТТСАТС

ТТССССССАТ

101 <2 εΤΝΝ3ΝΝ3ΟΑ

6ΝΝ3ΝΝ3ΝΝ3

ΝΝ3ΝΝ3300Τ

СТСТТСТСТС

ССТССТСААТ

Ρ К. Е А

ЭД К V

151

ААСТТСТАТС

ССАСАСАССС

САААСТАСАС

ТССААССТСС

АТААСССССТ

N30

201

ССААТССССТ

ААСТСССАСС

АСАСТСТСАС

АСАССАССАС

АССААССАСА

НруСН41У

251

ССАССТАСАС

ССТСАССАСС

АСССТСАССТ

Τ3ΝΝ3ΝΝ3ΝΝ

ЗЫЫЗТАССАС

НОС

301

АААСАСАААС

ТСТАССССТС

ССААСТСАСС

САТСАССССС

ТСАССТСССС

ΝοΕΙ

351

ССТСАСАААС

АССТТСААСА ссссасассс сссссса

Перечень праймеров для библиотеки С_к

СЕЕНРУ:

СЕКИРУ:

СЬКНРУЗ:

СЬКНРУБ:

СБЕШОТ:

СЬЬЭДСО:

Несколько отобранных библиотечных клонов (мутированные домены Сц, клонированные в фагомидный вектор ρΐ ΙΕΝ1) проверяли рестрикционным анализом и секвенированием ДНК и убедились, что они содержат намеченную вставку, включая встроенные правильным образом рандомизованные после

- 26 018897 довательности. На последующих стадиях получения фага следовали стандартным методикам. Вкратце, смесью для лигирования трансформировали клетки Е. соЕ ТО1 методом электропорации. После этого из клеток Е. соЕ ТО1 выделяли частицы фага с помощью фага-хелпера М13-К07. Затем частицы фага осаждали из супернатантов культур с помощью 1 Е)Г/№С1 в 2 стадии, растворяли в воде и использовали для селекции методом пэннинга или, в качестве альтернативы, хранили при -80°С.

Пример 12. Библиотека С_н1.

Визуальное изучение кристаллической структуры ЕаЬ-фрагмента (использовали структуру ЕаЬ моноклонального антитела 3Ό6 человека: объект 1бГЬ.рбЬ Банка данных по белкам В8СВ) и компьютерный анализ (для этой цели использовали Рго1ет Ехр1огег) вторичной и третичной структуры этого белка позволяет идентифицировать остатки, локализованные в участках петель, соединяющих β-цепи каркаса домена С_н1. Эти остатки охватывают аминокислоты 7-21, аминокислоты 25-39, аминокислоты 41-81, аминокислоты 83-85, аминокислоты 89-103 и аминокислоты 106-117 (нумерация по системе нумерации 1МОТ).

В частности, подвергали рандомизации остатки 12-19 и 93-100 в пределах домена С_н1 человека (8Ε^ ΙΌ №. 54, 55). Рандомизацию осуществляли посредством ПЦР-амплификации кодирующих последовательностей с помощью праймеров для ПЦР, у которых положения соответствующих кодонов кодируются последовательностью нуклеотидов 5'-ΝΝ8-3', которая потенциально кодирует все 20 аминокислот, но обходит 2 из 3 стоп-кодонов. Библиотечную вставку амплифицировали посредством двух отдельных реакций ПЦР и два ПЦР-фрагмента лигировали друг с другом через рестрикционный сайт ΒδΐΕΙΙ, который встречается естественным образом в домене С_н1. Эти праймеры также обеспечивают сайты рестрикционных эндонуклеаз ΝγόΙ и №11, соответственно, для клонирования в вектор фагового дисплея ρί ΙΕΝ. Для фагового дисплея не включали С-концевой цистеин домена С_н1, но его можно вставить позже, при использовании модифицированного клона С_н1, например, для конструирования ЕаЬ-фрагмента.

В качестве матрицы для ПЦР-амплификации использовали плазмиду типа рВсСМУ-3Э6нС, которая содержит в виде вставки полную тяжелую цепь моноклонального антитела 3Ό6 человека.

Нуклеотидная и аминокислотная последовательность конечного продукта реакций ПЦР и лигирования, клонированного в ρΗΕN 1 по сайту №о1, что ведет к присоединению лидерной последовательности ре1В на Ν-конец конструкции, представлены ниже (8Ε^ ΙΌ №. 54, 55):

ААА

СЬЬ

АТСАААТАСС ТАТТСССТАС

СССАСССССТ

ССАТТСТТАТ

ТАСТСССССС

ΩΡΑ

101

ΝοοΙ

МАА

ЕРЬ

ССАССССССС АТСССССССТ

САСССТССТС

ΟΝΝ3ΝΝ3ΝΝ3

ССАССААСС6

ΝΝ3ΝΝ3ΝΝ3Ν

СССАТСССТС

ЫЗШЗССССТ

ТТСССССТС6

ССССТСССТС +3

РУТ

151

СТСААССАСТ

АСТТСССССА

АССССТСАСС

СТСТССТССА

АСТСАССССС +3

СУН

ΤΕΡΑ

V Ь <2

201

ССТСАССАСС

ССССТССАСА

ССТТССССЗС

ТСТССТАСАС

ТССТСАССАС

ВзГЕП

251

ТСТАСТСССТ

САССАСССТС СТСАСССТСС

ΟΟΝΝ3ΝΝ3ΝΝ

3ΝΝ3ΝΝ3ΝΝ3

301

ЫНЗАССТАСА

ТСТССААССТ

СААТСАСААС

СССАССААСА

ССААССТССА

ΝοΙΙ

351

СААСАААЗТТ

САССССАААТ стасаасссс

- 27 018897

Перечень праймеров для библиотеки С_н1:

СНГЪЫСО: 5 '-асдЬсса-Ьдд ссдссГссас саадддссса

ЬсддЬсШзсс ссскддсасс сЬссЬссЬЬз

ППЗППЗППЗП пзппзппзпп здссскдддс

СНГЬВЗТ:

5'-ддсасддЕса ссасдскдсЬ дад-3 (ЗЕО ΙΌ Νο.

СН1К.В8Т:

' -адсд-ЬддЬда ссдЬдссспп зппзппзппз ппзппзппза

ΟΗΙΚΝΟΤ:

(ЗЕ<2 Ю Νο.

64) дсадаШ:Гдд дсксаасЬ-Ы:

Несколько отобранных библиотечных клонов (мутированные домены С_н1, клонированные в фагомидный вектор р1 ΙΕΝ1) проверяли рестрикционным анализом и секвенированием ДНК и убедились, что они содержат намеченную вставку, включая встроенные правильным образом рандомизованные последовательности. На последующих стадиях получения фага следовали стандартным методикам. Вкратце, смесью для лигирования трансформировали клетки Е. со11 ТО1 методом электропорации. После этого из клеток Е. со11 ТО1 выделяли частицы фага с помощью фага-хелпера Μ13-ΚΟ7. Затем частицы фага осаждали из супернатантов культур с помощью ПЭГ/№С1 в 2 стадии, растворяли в воде и использовали для селекции методом пэннинга или, в качестве альтернативы, хранили при -80°С.

Пример 13. Пэннинг фаговой библиотеки С_н1 на яичном лизоциме курицы (нЕЬ).

Проводили 3 цикла пэннинга с фаговой библиотекой С_н1 (см. пример 12). 96-луночные планшеты Мах1когр (Νιιπο) сенсибилизировали лизоцимом куриного яйца внесением 200 мкл на лунку следующего раствора: РВ8, при следующих концентрациях растворенного яичного лизоцима:

1- й цикл пэннинга: 2 мг/мл НЕЬ

2- й цикл пэннинга: 1 мг/мл НЕЬ

3- й цикл пэннинга: 1 мг/мл НЕЬ

1- й цикл пэннинга: 10x300 мкл Т-РВ8, 5x300 мкл РВ8

2- й цикл пэннинга: 15x300 мкл Т-РВ8, 10x300 мкл РВ8

3- й цикл пэннинга: 20x300 мкл Т-РВ8, 20x300 мкл РВ8.

Элюирование связавшихся частиц фага осуществляли добавлением в лунки по 200 мкл 0,1 М глицина, рН 2,2, и инкубировали со встряхиванием в течение 30 мин при комнатной температуре. После этого суспензию фага нейтрализировали добавлением 60 мкл 2 М трис-основания, а затем инфицировали клетки Е. со11 ТО1 смешиванием 10 мл культуры в экспоненциальной фазе роста с 0,5 мл элюированного фага и инкубировали 30 мин при 37°С. Наконец, инфицированные бактерии высевали на чашки со средой ΤΥΕ с 1% глюкозы и 100 мкг/мл ампициллина и инкубировали при 30°С в течение ночи.

Клонирование отдельных клонов мутантов Сн1, отобранных против лизоцима, для растворимой экспрессии.

Выделяли фагомидную ДНК методом Μίάί-ргер из фага, прошедшего 3 цикла селекции пэннингом. ДНК, кодирующую мутированные домены С_н1, целиком амплифицировали методом ПЦР и клонировали по ^о1-№11 в вектор рNΟТВΑ^/Μус-Η^8, представляющий собой вектор рВЛ1)/Мус-1118 (1пуйго§еп) для экспрессии в Е. со11 со вставленным сайтом рестрикции ^И, облегчающим клонирование. Лигированными конструкциями трансформировали клетки Е. со11 ЬМО194 (1пу11го§еп) методом электропорации и культивировали при 30°С на среде ΤΥΕ с 1% глюкозы и ампициллином в течение ночи. Отобранные клоны инокулировали в 200 мкл среды 2χΥΤ с ампициллином, культивировали в течение ночи при 30°С и индуцировали добавлением Ь-арабинозы до конечной концентрации 0,1%. После экспрессирования при 16°С в течение ночи клетки собирали центрифугированием и обрабатывали 100 мкл №-боратного буфера, рН 8,0, при 4°С в течение ночи для получения периплазматических экстрактов. По 50 мкл периплазматических экстрактов использовали в методе ЕЬ18Л.

Клоны, дававшие сильный сигнал при этом первом предварительном анализе методом ЕЬ18Л, куль

- 28 018897 тивировали в объеме 20 мл в тех же условиях, что описаны выше. Из них выделяли периплазматические экстракты в 1/20 объеме культуры, как описано выше, и тестировали методом ЕЬ^А (как описано ниже) для подтверждения.

Анализ методом ЕЬ^А мутантов С_Н1, отобранных против лизоцима куриного яйца Сенсибилизация: микропланшет Мах1зогр (Липе), 100 мкл на лунку, 100 мкг лизоцима куриного яйца на 1 мл РВЗ, 1 ч при 37°С

Отмывка: 3x200 мкл РВ 8

Блокировка: 1% В8А-РВ8, 1 ч при комн. темп.

Отмывка: 3x200 мкл РВ8

Отмывка: З^х200мклРВ8

1- е антитело: анти-Н184 ((Да§еп), 1:1000 в 1% В8А-РВ8, 90 мин при комн, темп.,

100 мкл на лунку

Отмывка: 3x200 мкл РВ8

2- е антитело: козье против мыши*НКР (81§та), 1:1000 в 1% В8А-РВ8, 90 мин при комн, темп., 100 мкл на лунку

Отмывка: 3x200 мкл РВ8

Детектирование: 3 мг/мл ΟΡϋ в Ыа-цитрат/фосфатном буфере, рН 4,5, 0,4 мкл 30%

Н₂О₂

Остановка: 100 мл 3 М Н₂8О4

Измерение поглощения: 492/620 нм

Клоны считались положительными, если их сигнал ЕЬ^А по меньшей мере в три раза превышал фоновый сигнал.

Пример 14. Пэннинг фаговой библиотеки С_ь на лизоциме куриного яйца (НЕИ).

Проводили 3 цикла пэннинга с фаговой библиотекой С| (см. пример 11). 96-луночные планшеты Мах18огр (Νικία) сенсибилизировали яичным лизоцимом курицы внесением 200 мкл на лунку следующего раствора: РВδ, при следующих концентрациях растворенного яичного лизоцима:

1- й цикл пэннинга: 2 мг/мл НЕЬ

2- й цикл пэннинга: 1 мг/мл НЕЕ

3- й цикл пэннинга: 1 мг/мл НЕЬ

Инкубировали в течение 1 ч при 37°С, а затем блокировали 2% сухим молоком (М-РВδ) по 200 мкл на лунку в течение 1 ч при комнатной температуре.

После этого библиотеку дисплея на поверхности фага оставляли реагировать с фиксированным яичным лизоцимом добавлением 100 мкл суспензии фага и 100 мкл 4% сухого молока (М-РВδ), а затем инкубировали в течение 45 мин со встряхиванием и 90 мин без встряхивания при комнатной температуре.

1- й цикл пэннинга: 10x300 мкл Т-РВ8, 5x300 мкл РВЗ

2- й цикл пэннинга: 15x300 мкл Т-РВ8, 10x300 мкл РВ8

3- й цикл пэннинга: 20^χ300 мкл Т-РВ8, 20x300 мкл РВЗ.

Элюирование связавшихся частиц фага осуществляли добавлением в лунки по 200 мкл 0,1 М глицина, рН 2,2, и инкубировали со встряхиванием в течение 30 мин при комнатной температуре. После этого суспензию фага нейтрализировали добавлением 60 мкл 2 М трис-основания, а затем инфицировали клетки Е. со11 ТС1 смешиванием 10 мл культуры в экспоненциальной фазе роста с 0,5 мл элюированного фага и инкубировали 30 мин при 37°С. Наконец, инфицированные бактерии высевали на чашки со средой ТУЕ с 1% глюкозы и 100 мкг/мл ампициллина и инкубировали при 30°С в течение ночи.

Клонирование отдельных клонов мутантов С_ь, отобранных против лизоцима, для растворимой экспрессии.

Выделяли фагомидную ДНК методом М1й1-ргер из фага, прошедшего 3 цикла селекции пэннингом. ДНК, кодирующую мутированные домены С_ь, целиком амплифицировали методом ПЦР и клонировали по №о1-Ж!1 в вектор рNОТВΛ^/Мус-Н^8, представляющий собой вектор рВАЭ/Мус-НЦ (1пу1!годеп) для экспрессии в Е. соН со вставленным сайтом рестрикции Νσ!ΐ, облегчающим клонирование. Лигированными конструкциями трансформировали клетки Е. соН ЕМС194 (1пу1!годеп) методом электропорации и

- 29 018897 культивировали при 30°С на среде ΤΥΕ с 1% глюкозы и ампициллином в течение ночи. Отобранные клоны инокулировали в 200 мкл среды 2χΥΤ с ампициллином, культивировали в течение ночи при 30°С и индуцировали добавлением Ь-арабинозы до конечной концентрации 0,1%. После экспрессирования при 16°С в течение ночи клетки собирали центрифугированием и обрабатывали 100 мкл №а-боратного буфера, рН 8,0, при 4°С в течение ночи для получения периплазматических экстрактов. По 50 мкл периплазматических экстрактов использовали в методе ЕЫ8А.

Клоны, дававшие сильный сигнал при этом первом предварительном анализе методом ЕЫ8А, культивировали в объеме 20 мл в тех же условиях, что описаны выше. Из них выделяли периплазматические экстракты в 1/20 объеме культуры, как описано выше, и тестировали методом ЕЫ8А (как описано ниже) для подтверждения.

Анализ методом ЕЫ8А мутантов С_ь отобранных против лизоцима куриного яйца.

Сенсибилизация: микропланшет Мах1зогр (Νιιηο), 100 мкл на лунку, 100 мкг лизоцима куриного яйца на 1 мл РВ8, 1 ч при 37°С

Отмывка: 3*200 мкл РВ8

Блокировка: 1% В8А-РВ8, 1 ч при комн. темп.

Отмывка: 3*200 мкл РВ8

1- е антитело: анти-Н18₄ ((Дадеи), 1:1000 в 1% В8А-РВ8, 90 мин при комн, темп.,

100 мкл на лунку

Отмывка: 3*200 мкл РВ8

Отмывка: 3*200мклРВ8

Детектирование: 3 мг/мл ΟΡϋ в Иа-цитрат/фосфатном буфере, рН 4,5, 0,4 мкл 30%

Н₂О₂

Остановка: 100 мл 3 М Н₂8О₄

Измерение поглощения: 492/620 нм

Клоны считались положительными, если их сигнал ЕЫ8А по меньшей мере в три раза превышал фоновый сигнал.

Пример 15. Конструирование домена иммуноглобулина, рандомизованного с обеих сторон (биспецифичный сконструированный домен С_Н3).

В этом примере описан сконструированный домен иммуноглобулина с двумя специфичностями связывания.

Конструирование этого сконструированного домена иммуноглобулина включает следующую стратегию:

в качестве исходного пункта использовали сконструированный домен С_Н3, клон С24 (см. пример 10), полученный из библиотеки С_Н3+5, который связывается специфически с лизоцимом;

в этом модифицированном домене С_Н3 идентифицировали подлежащие рандомизации остатки, соединяющие β-отрезки в укладке иммуноглобулина и находящиеся на противоположной стороне домена по сравнению с остатками, подвергавшимися мутагенезу при создании клона С24;

разработали праймеры для ПЦР, которые позволили рандомизировать эти остатки и синтезировать этот искусственный домен иммуноглобулина по методике, аналогичной той, что описана выше для библиотек С_Н3, С_Н3+3 и С_Н3+5.

Лигировали 4 продукта ПЦР, содержащие рандомизованные положения, и полноразмерные вставки амплифицировали методом ПЦР. После этого их клонировали в рНЕ№-1 по сайтам №со1-№о11 и трансформировали ими клетки Е. со11 ТО-1 для конструирования библиотеки примерно из 10 колоний. Просеквенировали 20 выбранных случайным образом колоний и оказалось, что рандомизованные положения мутировали независимо друг от друга. Не наблюдалось и последовательности дикого типа (С24). Фаговую библиотеку создавали по стандартным методикам и получили титр фага в 6,32χ10¹⁰ Ти/мл.

Для проверки биспецифичности в качестве второго антигена выбрали рекомбинантный эритропоэтин человека (гЕЕРО), при этом предполагается, что конструкция сохранит первоначально встроенную специфичность к яичному лизоциму курицы. Селекцию реагирующего на гНЕРО фага проводили за 4 цикла пэннинга. Для того чтобы сохранить популяцию тех клонов С24, которые после мутагенеза все

- 30 018897 еще должны связывать яичный лизоцим курицы, после первого цикла селекции на гЬЕРО проводили цикл пэннинга популяции фага на яичном лизоциме (1 мг/мл в РВВ). 200 мкл гЬЕРО фиксировали на 5 лунках микропланшета Мах1вогр (Νιιιιο) в 0,1 М №-карбонатном буфере, рН 9,б, в порядке снижения концентраций при последующих циклах пэннинга (см. таблицу ниже). После блокирования с помощью 2% М-РВВ фаг в блокирующей среде оставляли для связывания при комнатной температуре на 2 ч. После 20 отмывок Т-РВВ и 20 с помощью РВВ его элюировали 0,1 М глицином, рН 2,2, и нейтрализировали 2 М трисом. Элюированный фаг сразу же использовали для инфицирования клеток ТО-1 в экспоненциальной фазе роста. Инфицированные клетки подвергали селекции на среде, содержащей ампициллин. Частицы фага выделяли из супернатантов культур после суперинфицирования фагом-хелпером М13-К07, концентрировали с помощью ПЭГ и использовали в следующем цикле пэннинга. Содержание фага на входе и выходе определяли в виде трансформирующих единиц (ТИ) Е. со11 после каждого цикла пэннинга (табл. 8).

Таблица 8

Цикл пэннинга	Антиген	Фаг на входе (Ти/мл)	Фаг на выходе (ТО/мл)
1-й	гЬЕРО, 500 мкг/мл	6,32χ10^ιυ	1,9x10⁵
2-й	лизоцим, 1 мг/мл	6,16х10^1Ь	4,53χ10^ιυ
3-й	гЬЕРО, 100 мкг/мл	6,07χ10¹⁵	6,78χ10^ιυ
4-й	гЬЕРО, 50 мкг/мл	8,42x1ο¹⁵	3,0x10^й
5-й	гЬЕРО, 50 мкг/мл	5,12х10¹⁵	4,28х1О¹⁰

Образовавшиеся колонии соскребали из чашек, культивировали в среде 2χΥΪ с ампициллином и выделяли из них плазмидную ДНК методом Μΐάΐ-ргер. Вставки амплифицировали методом ПЦР, а затем субклонировали в вектор рNОТВΛ^ и трансформировали ими штамм Е. со11 Е104. 4x72 колонии культивировали в 200 мкл среды 2χΥΣ с ампициллином и на следующий день индуцировали 0,1% Еарабинозой. После экспрессирования в течение 24 ч при 1б°С клетки лизировали в 200 мкл №-борагного буфера, рН 8,0, в течение б ч при 4°С, и периплазматические экстракты использовали в методе ЕЫВА.

Для метода ЕЫВА планшеты Мах1вогр сенсибилизировали лизоцимом куриного яйца в РВВ (20 мкг/мл) или гЬЕРО в 0,1 М №-карбонатном буфере, рН 9,б, соответственно, в течение 1 ч при 37°С. После блокирования 1% ВВА-РВВ периплазматический экстракт оставляли в той же блокировочной среде для связывания в течение ночи. Связывание детектировали с помощью антитела анти-Швд и козьего антитела против 1дО мыши, конъюгированного с нВР (для выявления яичного лизоцима) или с АР (для выявления гЬЕРО). Цветную реакцию превращения ОРС) (нВР) измеряли при 492/б20 нм после остановки с помощью 1,25 М н₂ВО₄, а превращение рЫРР (АР) измеряли при 405/б20 нм. Было отобрано 14 клонов с перспективными значениями поглощения для экспрессии в объеме 20 мл. После индуцирования арабинозой в течение 24 ч при 1б°С клетки собирали и лизировали в течение ночи в 1 мл №-боратного буфера при 4°С, а лизат использовали для метода ЕЫВА. ЕЫВА проводили как и выше в 4 повторах, а в качестве отрицательного контроля использовали лунки без периплазматического экстракта и без антигена. Приведенные результаты (табл. 9) были получены с клоном, соответствующим ВЕО ΙΌ Νο. 42, 43.

Таблица 9

Пример 1б. Сконструированные домены С_н3 обеспечивают биспецифичность в формате РаЬ.

В конструкции, использовавшейся в этом примере, обе цепи антитела, Уь и У_н, сливали со сконструированным доменом С_н3.

Области Уь и У_н моноклонального антитела 3Бб человека (Не Х.М. е! а1. Ргос. №11. Асаб. Всё ИВА, 1992, 89: 7154-8; КоЬ1 I. е! а1. Апп ΝΥ Асаб. Всё 1991, б4б: 10б-14; Ре1депЬаиег М. е! а1. №с1ею Ас1бз Вез. 1990, 18: 4927), распознающего эпитоп на др41 у ВИЧ-1, использовали в качестве партнера по слиянию для несущего сконструированный домен Сн3 клона С24, который специфически связывается с лизоцимом куриного яйца.

Для того чтобы облегчить образование димера У_ь-С_н3/У_н-С_н3 через дисульфидную связь, на Сконец последовательности С24 добавили остатки Вег-Суз.

Нуклеотидные и аминокислотные последовательности соответственно двух цепей, 3Р)б-У|-С24 и 3Бб-У_н-С24, приведены в ВЕР ΙΌ Νο. 47, 4б и ВЕР ΙΌ Νο. 45, 44 соответственно.

Были составлены праймеры, позволяющие амплифицировать кодирующие области и в то же время ввести рестрикционные сайты, использовавшиеся для лигирования кодирующих областей между собой. Для экспрессирования генов использовали систему экспрессии в Р1сЬ1а раз!опз. Конструкции клонировали в подходящие вектора для экспрессии в Р1сЬ1а раз!опз: 3Бб-Уь-С24 клонировали в рР1С9К (конечное название: рР1С9К3ЬС), а 3Бб-У_н-С24 (конечное название: рР1С23нС) клонировали в рР1С2а1рЬаА. Конструкцию рР1С23нС линеаризировали с помощью Вд111, вводили в клетки ОВ115 Р1сЬ1а раз!ог1з путем трансформации и проводили селекцию трансформантов на твердой среде, содержащей зеоцин. После

- 31 018897 этого использовали одного из трансформантов в качестве клеток хозяина для линеаризованной с помощью 8а11 конструкции рР1С9К3ЬС. Затем проводили селекцию двойных трансформантов на среде КОВ.

Клоны инокулировали в 30 мл среды ΥΡΟ и культивировали до достижения ΟΌ₆₀₀ = 10, а затем индуцировали добавлением 1% метанола в среду ВΜΜΥ. Индуцирование продолжали в течение 3б ч при 1б°С. Супернатанты выделяли центрифугированием, а затем концентрировали примерно в 10 раз. Наличие рекомбинантного белка проверяли методом Вестерн-гибридизации с помощью антитела анти-Н1з₄, и концентрация его составила приблизительно 50-100 мкг/л исходной культуры.

Первые функциональные тесты выполняли на концентрированном в 10 раз супернатанте. Сначало лунки планшетов Μаx^8ο^ρ сенсибилизировали лизоцимом куриного яйца в РВ8 (20 мкг/мл) или эпитопом антитела 3Ό6 (20 мкг/мл) в 0,1 М Ха-карбогатном буфере, рН 9,б, соответственно, в течение 1 ч при 37°С. Эпитоп 3Ό6 использовали в виде рекомбинантного белка, слитого с О8Т. После блокирования 1% В8А-РВ8 концентрированные супернатанты оставляли в той же блокировочной среде для связывания в течение ночи. Связывание детектировали с помощью антитела анти-Н1з₄ и козьего антитела против мыши, конъюгированного с НКР, и визуализировали по цветной реакции, установившейся при превращении ОРО, при 492/б20 нм (табл. 10).

Таблица 10

Антиген	Сигнал ЕЫ8А (А492/620)	Фон (без антигена)	Фон (без супернатанта)
Лизоцим	0,198	0,003	0,043
Эпитоп ЗЭ6	0,061	0,001	0,007

- 32 018897

Список последовательностей <110> Рюкер, Флориан < 12 0 > СИНТЕТИЧЕСКИЕ ДОМЕНЫ ИММУНОГЛОБУЛИНА, СОДЕРЖАЩИЕ МОДИФИЦИРОВАННЫЕ УЧАСТКИ СТРУКТУРНЫХ ПЕТЕЛЬ, ОБЛАДАЮЩИЕ СВОЙСТВОМ СВЯЗЫВАНИЯ, СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ <130> К 46751 <140> РСТ/ЕР2006/050059 <141> 2006-01-05 <150> из 60/641144 <151> 2005-01-05 <160> 65 <170> РаЬепЫп уегзхоп 3.3 <210> 1 <211> 108 <212> ПРТ <213> Ното зарлепз <400> 1

Рго 1

Агд

С1и

Рго С1п 5

Уа1

Туг

ТЬг

Ьеи

Рго 10

Рго

Зег Агд Азр

О1и Ьеи 15

ТЬг

Ьуз

Азп

σΐη

Уа1

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

С1у

РЬе

Туг

Рго

20

25

30

Зег

Азр

Не

А1а

Уа1

С1и

Тгр

С1и

Зег

Азп

С1у

<31п

Рго

С1и

Азп

35

40

45

Туг

Ьуз

ТЬг

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

Зег

Азр

О1у

Зег

РЬе

Ьеи

- 33 018897

Туг Зег Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр (31η <31п С1у Азп Уа1

70 75 80

РЬе Зег Суз Зег Уа1 Меб Нтз С1и А1а Ьеи Нхз Азп Нхз Туг ТЬг О1п

Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго О1у Ьуз А1а А1а А1а

100

105 <210> 2 <211> 332 <212> ДНК <213> Искусственный <220>

<223> Искусственная последовательность <220>

<221> Область биологического интереса; новая или редкая характеристика <222> (57) . . (58) <223> п это а, с, д, или б <220>

<221> Область биологического интереса; новая или редкая характеристика <222> (60)..(61) <223> п это а, с, д, или б <220>

<221> Область биологического интереса; новая или редкая характеристика <222> (63)..(64) <223> п это а, с, д, или б <220>

- 34 018897

<221> <222> <223>	Область (219),. η Ϊ5 а,	биологического (220) с, д, или 1:	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<220>
<221>	Область	биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(222) . .	(223)
<223>	η Ϊ3 а,	с, д, или Е
<220>
<221>	Область	биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(225) . .	(226)
<223>	η это а	, с, д, или б
<220>
<221>	Область	биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(234) . .	(235)
<223>	η это а	, с, д, или б
<220>
<221>	Область	биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(237) . .	(238)
<223>	η это а	, с, д, или б
<400>	2

ссаЕддсссс	ссдадаасса	саддбдбаса	сссЕдссссс	аСсссдддаЕ	дадсЕсппзп	60
пзппзсаддб	садссбдасс	Едссбддбса	ааддсббсЕа	бсссадсдас	аЕсдссдбдд	120
адбдддадад	саабдддсад	ссддадааса	асбасаадас	сасдссбссс	дбдсбддасб	180
ссдасддсЕс	сббсЕЕссбс	басадсаадс	ЕЕассдЕдпп	зппзппзадд	Еддппзппзд	240
ддаасдЕсбб	сбсабдсбсс	дбдаЕдсабд	аддсбсбдса	саассасбас	асасадаада	300
дссбсбсссб	дбсбссдддб	ааадсддссд	са			332
<210> 3 <211> 110

- 35 018897 <212> ПРТ <213> Искусственный <220>

<223> Искусственная последовательность <220>

<221> Область биологического интереса; новая или редкая характеристика <222> (19) . . (21) <223> Хаа может быть любая природная аминокислота <220>

<221> Область биологического интереса; новая или редкая характеристика <222> (73)..(75) <223> Хаа может быть любая природная аминокислота <220>

<221> Область биологического интереса; новая или редкая характеристика <222> (78)..(79) <223> Хаа может быть любая природная аминокислота <400> 3

Мер 1

А1а

Рго

Агд

С1и 5

Рго

<31п

Уа1

Туг

Ткг 10

Ьеи

Рго

Зег Агд Азр 15

О1и

Ьеи

Хаа

С1п

Уа1

Зег

Ьеи

Ткг

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

С1у

Рке

20

25

30

Туг

Рго

Зег

Азр

Не

А1а

Уа1

С1и

Тгр

С1и

Зег

Азп

С1у

С1п

Рго

С1и

35

40

45

Азп

Туг

Ьуз

Ткг

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

Зег

Азр

О1у

Зег

Рке

55 60

- 36 018897

РЬе 65

Ьеи

Туг

Зег

Ьуз

Ьеи 70

ТЬг

Уа1

Хаа

Хаа Хаа Агд 75

Тгр

Хаа

СПу 80

Азп

Уа1

РЬе

Зег

Суз

Зег

Уа1

МеЪ

Н13

С1и

А1а

Ьеи

Н13

Азп

Ηίβ

Туг

85

90

95

ТЬг

О1п

Ьуз

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

С1у

Ьуз

А1а

100 105110 <210>4 <211>33 <212> ДНК <213> Искусственный <220>

<223> Искусственная последовательность <400>4 сЬЬдссаЬдд ссссссдада ассасаддЬд Ьас33 <210>5 <211>30 <212> ДНК <213> Искусственный <220>

<223> Искусственная последовательность <400> 5 адЬсдадсЬс дйсасдддаЬ дддддсаддд 30

<210>	6
<211>	41
<212>	ДНК
<213>	Искусственный

- 37 018897 <220>

<223>

Искусственная последовательность

<220>

<221>	Область биологического интереса; новая или редкая характеристика
<222>	(11) . · (12)
<223>	η это а, с, д, или б

<220>

<221>	Область биологического интереса; новая или редкая характеристика
<222>	(14) . . (15)
<223>	η это а, с, д, или Р

<220>

<221>	Область биологического интереса; новая или редкая характеристика
<222>	(17) . . (18)
<223>	η это а, с, д, или Р
<400>	6

дРасдадсРс ппзппзппзс аадРсадссР дассРдссРд д 41

<210>	7
<211>	32
<212>	днк
<213>	Искусственный

<220>

<223>	Искусственная последовательность
<400>	7

РдссаадсРР дсРдРададд аадааддадс сд 32

<210>	8
<211>	59
<212>	ДНК
<213>	Искусственный

- 38 018897 <220>

<223> Искусственная последовательность <220>

<221> <222> <223>	Область биологического (17) . . (18) η это а, с, д, или Б	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<220>
<221>	Область биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(20)..(21)
<223>	η это а, с, д, или б
<220>
<221>	Область биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(23) . . (24)
<223>	η это а, с, д, или б
<220>
<221>	Область биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(32) . . (33)
<223>	η это а, с, д, или б
<220>
<221>	Область биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика

<222> (35)..(36) <223> η это а, с, д, или Ъ <400> 8

Ъдссаадсбб ассдбдппзп пзппзаддбд дппзппзддд аасдбсббсб сабдсбссд 59

<210>	9
<211>	33
<212>	ДНК
<213>	Искусственный
<220>

- 39 018897 <223> Искусственная последовательность <400>9 адббдсддсс дсбббасссд дадасаддда дад33 <210> 10 <211>113 <212> ПРТ <213> Искусственный <220>

<223> Искусственная последовательность <220>

<221> Область биологического интереса; новая или редкая характеристика <222> (19)..(21) <223> Хаа может быть любая природная аминокислота <220>

<221> Область биологического интереса; новая или редкая характеристика <222> (73) . . (78) <223> Хаа может быть любая природная аминокислота <220>

<221> Область биологического интереса; новая или редкая характеристика <222> (81)..(82)

<223> .

Хаа может

¹ быть любая

природная аминокислота

<400>

10

Меб А1а

Рго

Агд

<31и

Рго

С1п

Уа1

Туг

ТЬг

Ьеи

Рго

Зег

Агд

Азр

1

5

10

15

С1и Ьеи

Хаа

Θΐη

Уа1

Зег

Ьеи

ΤΪ1Γ

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

О1у

РЬе

20

25

30

- 40 018897

Туг

Рго

Зег 35

Азр

Не А1а Уа1

<31и 40

Тгр

С1и

Зег Азп

61у 45

О1п

Рго

(31и

Азп

Туг

Ьуз

ТЬг

Рго

Уа1

Ьей

Азр

Зег

Азр

О1у

Зег

РЬе

50

55

60

РЬе

Ьей

Туг

Зег

Ьуз

Ъеи

ТЬг

Уа1

Хаа

Агд

Тгр

65

70

75

80

Хаа

61у

Азп

Уа1

РЬе

Зег

Суз

Зег

Уа1

Мер

Н1з

С1и

А1а

Ьей

Н13

85

90

95

Азп

Н13

Туг

ТЬг

(31п

Ьуз

Зег

Ьей

Зег

Ьей

Зег

Рго

С1у

Ьуз

А1а

100 105 110

А1а <210> 11 <211> 341 <212> ДНК <213> Искусственный <220>

<223> Искусственная последовательность <220>

<221> Область биологического интереса; новая или редкая характеристика <222> (57) . . (58) <223> η это а, с, д, или Р <220>

<221> Область биологического интереса; новая или редкая характеристика

- 41 018897 <222> (60)..(61) <223> η это а, с, д, или б <220>

<221> <222> <223>	Область (63) . . (ι η это а	биологического 54) , с, д, или б	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<220>
<221>	Область	биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(219) . .	(220)
<223>	η это а	, с, д, или б
<220>
<221>	Область	биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(222) . .	(223)
<223>	η это а	, с, д, или б
<220>
<221>	Область	биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(225) . .	(226)
<223>	η это а	, с, д, или б
<220>
<221>	Область	биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(228) . .	(229)
<223>	η это а	, с, д, или б
<220>
<221>	Область	биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(231) . .	(232)
<223>	η это а	, с, д, или б
<220>
<221>	Область	биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(234) . .	(235)
<223>	η это а	, с, д, или б
<220>
<221>	Область	биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика

- 42 018897 <222> (243) . . (244) <223> η это а, с, д, или б <220>

<221> Область биологического интереса; новая или редкая характеристика <222> (246)..(247) <223 > η это а, с, д, или б <400>11 ссабддсссс ссдадаасса саддбдбаса сссбдссссс абсссдбдас дадсбсппзп60 пзппзсаадб садссбдасс бдссбддбса ааддсббсба бсссадсдас абсдссдбдд120 адбдддадад саабдддсад ссддадааса асбасаадас сасдссбссс дбдсбддасб180 ссдасддсбс сббсббссбс басадсаадс ССассдбдпп зппзппзппз ппзппзаддб240 ддппзппздд даасдбсббс бсабдсбссд Сдабдсабда ддсбсбдсас аассасбаса300 сасадаадад ссбсбсссбд бсбссдддба аадсддссдс а341 <210> 12 <211> 68 <212> ДНК <213> Искусственный <220>

<223> Искусственная последовательность <220>

<221> Область биологического интереса; новая или редкая характеристика <222> (17) . . (18) <223> η это а, с, д, или б <220>

<221> Область биологического интереса; новая или редкая характеристика <222> (20)..(21) <223> η это а, с, д, или б

- 43 018897 <220>

<221> <222> <223>	Область биологического (23)..(24) η это а, с, д, или Р	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<220>
<221>	Область биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(26) . . (27)
<223>	η это а, с, д, или Р
<220>
<221>	Область биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(29)..(30)
<223>	η это а, с, д, или Р
<220>
<221>	Область биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(32) . . (33)
<223>	п это а, с, д, или Р
<220>
<221>	Область биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(41)..(42)
<223>	η это а, с, д, или Р
<220>
<221>	Область биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика

<222> (44)..(45) <223> η это а, с, д, или Р <400>12

РдссаадсРР ассдрдппзп. пзппзппзпп зппзаддРдд ппзппзддда асдРсРРсРс60 аРдсРссд68

<210>	13
<211>	115
<212>	ПРТ

- 44 018897 <213 > Искусственный <220>

<223> Искусственная последовательность <220>

<221> Область биологического интереса; новая или редкая характеристика <222> (73)..(80) <223> Хаа может быть любая природная аминокислота <220>

<221> Область биологического интереса; новая или редкая характеристика <222> (83) . . (84) <223> Хаа может быть любая природная аминокислота <400> 13

Меб 1

А1а

Рго Агд

С1и 5

Рго

<31п Уа1

Туг

ТИг 10

Ьеи

Рго

Зег

Агд 15

Азр

61и

Ьеи

Хаа

О1п

Уа1

Зег

Ьеи

ТИг

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

О1у

РИе

20

25

30

Туг

Рго

Зег

Азр

Не

А1а

Уа1

61и

Тгр

61и

Зег

Азп

С1у

С1п

Рго

С1и

35

40

45

Азп

Туг

Ьуз

ТИг

ТЬг

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

Зег

Азр

61у

Зег

РЬе

50

55

60

РИе

Ьеи

Туг

Зег

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Уа1

Хаа

- 45 018897

65

70

75

80

Агд

Тгр

Хаа

(31у

Азп

Уа1

Рке

Зег

Суз

Зег

Уа1

Мек

Н13

С1и

А1а

85

90

95

Ьеи

ΗΪ3

Азп

Нхз

Туг

Ткг

С1п

Ьуз

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

С1у

Ьуз

100

105

110

А1а А1а А1а

115

<210>	14
<211>	347
<212>	ДНК
<213>	Искусственный

<220>

<223>

Искусственная последовательность

<220>

<221> <222> <223>	Область биологического (57)..(58) п это а, с, д, или б	интереса;	новая или редкая	характеристика
<220>
<221>	Область биологического	интереса;	новая или редкая	характеристика
<222>	(60)..(61)
<223>	п это а, с, д, или б

<220>

<221> Область биологического интереса; новая или редкая характеристика <222> (63) . . (64) <223> η это а, с, д, или Ъ <220>

- 46 018897

<221> <222> <223>	Область (219).. η это а	биологического (220) , с, д, или б	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<220>
<221>	Область	биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(222) . .	(223)
<223>	η это а	, с, д, или б
<220>
<221>	Область	биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(225) . .	(226)
<223>	η это а	, с, д, или б
<220>
<221>	Область	биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(228) . .	(229)
<223>	η это а	, с, д, или б
<220>
<221>	Область	биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(231) . .	(232)
<223>	η это а	, с, д, или б
<220>
<221>	Область	биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(234) . .	(235)
<223>	η это а	, с, д, или б
<220>
<221>	Область	биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(237) . .	(238)
<223>	η это а	, с, д, или б
<220>
<221>	Область	биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика

<222> (240)..(241) <223> η это а, с, д, или б <220>

- 47 018897 <221> Область биологического интереса; новая или редкая характеристика <222> (249) . . (250) <223> η это а, с, д, или б <220>

<221> Область биологического интереса; новая или редкая характеристика <222> (252) . . (253) <223> η это а, с, д, или С

<400> 14
ссаСддсссс	ссдадаасса	саддРдРаса	сссРдссссс	аРсссдСдас	дадсРсппзп	60
пзппзсаадр	садссбдасс	йдссРддйса	ааддсйРсРа	Рсссадсдас	аРсдссдбдд	120
ад^дддадад	саардддсад	ссддадааса	асРасаадас	сасдссЬссс	дРдсбддасР	180
ссдасддсРс	сЬбсРРссРс	Расадсаадс	ЪЪассдйдпп	зппзппзппз	ппзппзппзп	240
пзаддрддпп	зппздддаас	дРсРРсйсаР	дсРссдРдаР	дсабдаддсР	срдсасаасс	300
асРасасаса	даададссРс	ЬсссйдРсйс	сдддйааадс	ддссдса		347

<210> 15 <211> 74 <212> ДНК <213 > Искусственный <220>

<223> Искусственная последовательность <220>

<221> Область биологического интереса; новая или редкая характеристика <222> (17)..(18) <223> η это а, с, д, или б <220>

<221> Область биологического интереса; новая или редкая характеристика <222> (20) . . (21)

- 48 018897 <223> η это а, с, д, или б <220>

<221> <222> <223>	Область биологического (23)..(24) η это а, с, д, или б	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<220>
<221>	Область биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(26) . . (27)
<223>	η это а, с, д, или б
<220>
<221>	Область биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(29) . . (30)
<223>	п это а, с, д, или б
<220>
<221>	Область биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(32)..(33)
<223>	п это а, с, д, или б
<220>
<221>	Область биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(35) . . (36)
<223>	η это а, с, д, или б
<220>
<221>	Область биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(38) . . (39)
<223>	η это а, с, д, или б
<220>
<221>	Область биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(47)..(48)
<223>	η это а, с, д, или б
<220>
<221>	Область биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика

<222> (50)..(51)

- 49 018897 <223> η это а, с, д, или ϋ <400> 15

ЕдссаадсЕЕ ассдЬдппзп пзппзппзпп зппзппзппз аддЬддппзп пздддаасдЕ 60 сЬРсЕсакдс Ьссд

<210>	16
<211>	110
<212>	ПРТ
<213>	Искусственный

<220>

<223> Искусственная последовательность <400> 16

Рго Агд 1

С1и

Рго <31п 57а1 5

Туг

ТЬг Ьеи

Рго 10

Рго

Зег

Агд

Азр

С1и Ьеи 15

(31у

Тгр

Рго

О1п

Уа1

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

С1у

РЬе

Туг

Рго

20

25

30

Зег

Азр

Не

А1а

Уа1

С1и

Тгр

<Э1и

Зег

Азп

<Э1у

<31п

Рго

С1и

Азп

35

40

45

Туг

Ьуз

ТЬг

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

Зег

Азр

(31у

Зег

РЬе

Ьеи

50

55

60

Туг

Зег

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Уа1

Рго

Ьуз

Агд

Тгр

Суз

Уа1

Зег

Уа1

Агд

Тгр

65

70

75

80

Рго

С1у

Азп

Уа1

РЬе

Зег

Суз

Зег

Уа1

МеЬ

ΗΪ3

О1и

А1а

Ьеи

Н13

90 95

- 50 018897

Азп

100

105

110

<210>	17
<211>	330
<212>	ДНК
<213>	Искусственный

<220>

<223>

Искусственная последовательность

<400> 17

ссссдадаас	сасаддбдба	сасссбдссс	ссабсссдбд	асдадсбсдд	сбддссдсаа	60
дбсадссбаа	ссбдссбддб	саааддсббс	бабсссадсд	асабсдссдб	ддадбдддад	120
адсаабдддс	адссддадаа	саасбасаад	ассасдссбс	ссдбдсбдда	сбссдасддс	180
бссббсббсс	бсбасадсаа	дсббассдбд	сссаадсддб	ддбдсдбдад	сдбсаддбдд	240
сссссдддда	асдбсббсбс	абдсбссдбд	абдсабдадд	сбсбдсасаа	ссасбасаса	300

садаададсс бсбсссбдбс бссдддбааа 330 <210> 18 <211> 110 <212> ПРТ <213> Искусственный <220>

<223> Искусственная последовательность <400> 18

Рго Агд С1и Рго (31п Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд Азр С1и Ьеи

10 15

- 51 018897

Зег Уа1

Зег

С1п Уа1 20

Зег

Рго

ТЬг

Суз 25

Ьей

Уа1

Ьуз

61у

РЬе 30

Туг

Рго

Зег

Азр

Не

А1а

Уа1

61и

Тгр

<31и

Зег

Азп

(31у

С31П

Рго

С1и

Азп

35

40

45

Туг

Ьуз

ТЬг

Рго

Уа1

Ьей

Азр

Зег

Азр

С1у

Зег

РЬе

Ьей

50

55

60

Туг

Зег

Ьуз

Ьей

ТЬг

Уа1

Не

Рго

РЬе

Суз

Агд

Мер

Зег

Рго

Агд

Тгр

65

70

75

80

Тгр

Не

С1у

Азп

Уа1

РЬе

Зег

Суз

Зег

Уа1

Мер

Н13

61и

А1а

Ьей

ΗΪ3

85

90

95

Азп

Н13

Туг

ТЬг

<31п

Ьуз

Зег

Ьей

Зег

Ьей

Зег

Рго

(31у

Ьуз

100 105 НО <210> 19 <211> 330 <212> ДНК <213> Искусственный <220>

<223> Искусственная последовательность <400> 19

ссссдадаас	сасаддрдра	сасссРдссс	ссаРсссдРд	асдадсРсРс	ддрдрсдсаа	60
дРсадсссда	ссРдссРддР	саааддсРРс	РаРсссадсд	асаРсдсадР	ддадРдддад	120
адсааРдддс	адссддадаа	саасРасаад	ассасдссРс	ссдРдсРдда	сРссдасддс	180

- 52 018897

РссРРсРРсс РсРасадсаа дсРРассдРд аРссссРРсР дсаддаРдад ссссаддрдд 240

РддаРсддда асдРсРРсРс аРдсРссдРд аРдсаРдадд сРсРдсасаа ссасРасаса 300 садаададсс РсРсссРдРс РссдддРааа 330 <210> 20 <211> 105 <212> ПРТ <213> Искусственный <220>

<223> Искусственная последовательность <400> 20

Рго Агд С1и 1

Рго

Θΐη 5

Уа1

Туг

ТЬг Ьеи

Рго 10

Рго

Зег

Агд

Азр

С1и 15

Ьеи

С1и

А1а

Ьеи

61п

Уа1

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

<31у

РЬе

Туг

Рго

20

25

30

Зег

Азр

Не

А1а

Уа1

С1и

Тгр

С1и

Зег

Азп

С1у

СЯп

Рго

С1и

Азп

35

40

45

Туг

Ьуз

ТЬг

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

Зег

Азр

<31у

Зег

РЬе

Ьеи

50

55

60

Туг

Зег

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Уа1

Агд

Азп

Агд

Тгр

Зег

Тгр

С1у

Азп

Уа1

65

70

75

80

РЬе

Зег

Суз

Зег

Уа1

МеР

ΗΪ3

С1и

А1а

Ьеи

Ηίβ

Азп

Н13

Туг

ТЬг

С1п

90 95

- 53 018897

Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго <31у Ьуз

100 105 <210> 21 <211> 315 <212> ДНК <213> Искусственный <220>

<223> Искусственная последовательность <400> 21

ссбсдадаас	сасаддЬдба	сасссбдссс	ссабсссдЬд	асдадсЪсда	ддсдсбдсаа	60
дЬсадссбда	ссбдссЬддб	саааддсЬЬс	ЬаЬсссадсд	асаЪсдссдб	ддадбдддад	120
адсааЬдддс	адссддадаа	саасЬасаад	ассасдссЬс	ссдЬдсЬдда	сЬссдасддс	180
ЬссЬЬсЬЬсс	ЬсЬасадсаа	дсЪЬассдЪд	сддсдсааса	ддЬддЬссЬд	ддддаасдЬс	240
ЬЬсЬсаЬдсЬ	ссдЪдаЬдса	ЬдаддсЬсЬд	сасаассасб	асасасадаа	дадссЬсЬсс	300

сЬдбсЬссдд дбааа 315 <210> 22 <211> 108 <212> ПРТ <213> Искусственный <220>

<223> Искусственная последовательность <400> 22

Рго Агд (31и Рго (31п Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд Азр С1и Ьеи

10 15

- 54 018897

С1п <31у

Зег

Θΐη 20

Уа1

Зег

Ьеи ТЬг

Суз 25

Ьеи

Уа1

Ьуз

(31у

РЬе 30

Туг

Рго

Зег

Азр

Не

А1а

Уа1

О1и

Тгр

О1и

Зег

Азп

<31у

<31п

Рго

61и

Азп

35

40

45

Туг

Ьуз

ТЬг

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

Зег

Азр

С1у

Зег

РЬе

Ьеи

50

55

60

Туг

Зег

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Уа1

Ьуз

Зег

Агд

А1а

ТЬг

Агд

Тгр

Уа1

65

70

75

80

61у

Азп

Уа1

РЬе

Зег

Суз

Зег

Уа1

Мей

Н13

<31и

А1а

Ьеи

Н13

Азп

Н13

85

90

95

Туг

ТЬг

С1п

Ьуз

Азп

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

61у

Ьуз

100105 <210>23 <211>324 <212> ДНК <213> Искусственный <220>

<223> Искусственная последовательность <400> 23

ссссдадаас	сасаддйдйа	сасссйдссс	ссайсссдйд	асдадсйсса	ддддадссаа	60
дйсадссйда	ссйдссйддй	саааддсййс	йайсссадсд	асайсдссдй	ддадйдддад	120
адсаайдддс	адссддадаа	саасйасаад	ассасдссйс	ссдйдсйдда	сйссдасддс	180

- 55 018897

ЬссЬЬсЬЬсс ЬсЪасадсаа дсЕЬассдЬд аадЬсдсдсд ссасссддад дйдддЬддЬд 240 дддаасдЬсЬ ЬЪЬсЬЬдсЬс сдбдаЬдсаЬ даддсЬсЬдс асаассасЬа сасасадаад 300 аассЬсйссс ЬдЬсЬссддд Ьааа

324

<210>	24
<211>	107
<212>	ПРТ
<213>	Искусственный

<220>

<223> Искусственная последовательность <400> 24

Рго Агд 1

01и

Рго С1п Уа1 5

Туг

ТЬг Ьеи

Рго 10

Рго

Зег

Агд

Азр

61и 15

Ьеи

А1а

Не

61у

С1п

Уа1

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

С1у

РЬе

Туг

Рго

20

25

30

Зег

Азр

11е

А1а

Уа1

С1и

Тгр

С1и

Зег

Азп

61у

Θΐη

Рго

С1и

Азп

35

40

45

Туг

Ьуз

ТЬг

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

Зег

Азр

С1у

Зег

РЬе

Ьеи

50

55

60

Туг

Зег

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Уа1

Агд

Зег

ТЬг

Агд

Азр

Азп

Агд

Тгр

Ьеи

Уа1

65

70

75

80

<31у

Азп

Уа1

РЬе

Зег

Суз

Зег

Уа1

МеС

Н13

С1и

А1а

Ьеи

Н13

Азп

Н13

90 95

- 56 018897

Туг Ткг С1п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у

100105 <210>25 <211>324 <212> ДНК <213 > Искусственный <220>

<223> Искусственная последовательность <400> 25

ссссдадаас	сасаддкдка	сассскдссс	ссаксссдкд	асдадсксдс	даксддссаа	60
дксадсскда	сскдсскддк	саааддсккс	каксссадсд	асаксдссдк.	ддадкдддад	120
адсаакдддс	адссддадаа	сааскасаад	ассасдсскс	ссдкдскдда	скссдасддс	180
кссккскксс	Ьскасадсаа	дсккассдкд	сдсксдасда	дддасаасад	дкддскддкд	240
дддаасдкск	ксксакдскс	сдкдакдсак	даддскскдс	асаассаска	сасасадаад	300

адсскскссс Сдкскссддд кааа 324 <210> 26 <211> 110 <212> ПРТ <213> Искусственный <220>

<223> Искусственная последовательность <400> 26

Рго Агд <31и Рго (31п Уа1 Туг Ткг Ьеи Рго Рго Зег Агд Азр С1и Ьеи

10 15

- 57 018897

Зег

(31у

А1а

О1п 20

Уа1

Зег Ьеи ТЬг

Суз 25

Ьеи

Уа1

Ьуз

С1у

РЬе 30

Туг

Рго

Зег

Азр

Не

А1а

Уа1

С1и

Тгр

61и

Зег

Азп

<31у

С1п

Рго

С1и

Азп

35

40

45

Туг

Ьуз

ТЬг

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

Зег

Азр

О1у

Зег

РЬе

Ьеи

50

55

60

Туг

Зег

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Уа1

Тгр

РЬе

Агд

(31п

С1и

С1у

Меи

Агд

Тгр

65

70

75

80

РЬе

А1а

С1у

Азп

Уа1

РЬе

Зег

Суз

Зег

Уа1

МеЕ

ΗΪ3

С1и

А1а

Ьеи

Н15

85

90

95

Азп

Н13

Туг

ТЬг

61п

Ьуз

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

С1у

Ьуз

100 105 НО <210> 27 <211> 330 <212> ДНК <213> Искусственный <220>

<223> Искусственная последовательность <400> 27

ссссдадаас	сасаддидиа	сасссидссс	ссаисссдид	асдадсисад	сддддсдсаа	60
дисадссида	ссидссидди	саааддсиис	иаисссадсд	асаисдссди	ддад^дддад	120
адсааидддс	адссддадаа	саасиасаад	ассасдссис	ссдидсидда	сиссдасддс	180

- 58 018897 бссббсббсс бсбасадсаа дсббассдбд бддббсаддс аддадддсдд сабдаддбдд 240 ббсдсдддда асдбсббсбс абдсбссдбд абдсабдадд сбсбдсасаа ссасбасаса 300 садаададсс бсбсссбдбс бссдддбааа 330 <210> 28 <211> 110 <212> ПРТ <213> Искусственный <220>

<223> Искусственная последовательность <400> 28

Рго Агд 1

С1и

Рго С1п Уа1 5

Туг

ТЬг Ьеи

Рго 10

Рго

Зег

Агд

Азр

С1и 15

Ьеи

Уа1

Ьеи

С1у

Θΐη

Уа1

Зег

Рго

ТЬг

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

С1у

РЬе

Туг

Рго

20

25

30

Зег

Азр

Не

А1а

Уа1

<31и

Тгр

С1и

Зег

Азп

С1у

Θΐη

Рго

<31и

Азп

35

40

45

Туг

Ьуз

ТЬг

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

Зег

Азр

(31у

Зег

РЬе

Ьеи

50

55

60

Туг

С1у

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Уа1

Рго

Агд

Ьеи

Ьуз

С1у

Тгр

Рго

Агд

Тгр

65

70

75

80

О1у

Тгр

О1у

Азп

Уа1

РЬе

Зег

Суз

Зег

Уа1

Меб

Н13

С1и

А1а

Ьеи

Н13

90 95

- 59 018897

Азп Н13 Туг ТЬг е1п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго 01у Ьуз

100 105110 <210>29 <211>330 <212> ДНК <213> Искусственный <220>

<223> Искусственная последовательность <400>29

ссссдадаас	сасаддЬдЬа	сасссЬдссс	ссаЬсссдЬд	асдадсЬсдЬ	сЪЬддддсаа	60
дЬсадсссда	ссЕдссЬддЬ.	саааддсЬЬс	ЬаЬсссадсд	асаЪсдссдЕ	ддадЕдддад	120
адсааЬдддс	адссддадаа	саасЬасаад	ассасдссЬс	ссдЕдсЬдда	сЬссдасддс	180
ЬссЕЬсЕЬсс	ЬсЕасддсаа	дсЬЬассдЬд	сссссдсддЕ	ЬдаадддсЬд	дссдаддЬдд	240
ддсЬддддда	асдЪсЬЬсЬс	аЬдсЕссдЬд	аЬдсаЬдадд	сЬсЬдсасаа	ссасЕасаса	300

садаададсс ЕсЬсссЬдЪс ЬссдддЬааа330 <210>30 <211>105 <212> ПРТ <213> Искусственный <220>

<223> Искусственная последовательность <400> 30

Рго Агд <31и Рго (31п Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд Азр С1и Ьеи

10 15

- 60 018897

Ьеи

А1а

Туг С1п 20

Уа1

Зег Ьеи

ТЬг

Суз 25

Ьеи

Уа1

Ьуз

61у

РЬе 30

Туг

Рго

Зег

Азр

Не

А1а

Уа1

О1и

Тгр

С1и

Зег

Азп

61у

αΐη

Рго

<31и

Азп

35

40

45

Туг

Ьуз

ТЬг

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

Зег

Азр

С1у

Зег

РЬе

Ьеи

50

55

60

Туг

Зег

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Уа1

А1а

С1у

Агд

Тгр

ТЬг

Суз

<31у

Азп

Уа1

65

70

75

80

РЬе

Зег

Суз

Зег

Уа1

Меб

Ηίβ

С1и

А1а

Ьеи

Н13

Азп

Н13

Туг

ТЬг

<Э1п

85

90

95

Ьуз

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

С1у

Ьуз

100 105 <210> 31 <211> 315 <212> ДНК <213> Искусственный <220>

<223> Искусственная последовательность <400> 31

ссссдадаас	сасаддбдЬа	сасссЬдссс	ссаЬсссдбд	асдадсЪссб	ддсдЬассаа	60
дбсадссбда	ссЬдссбддЬ	саааддсббс	Ьабсссадсд	асаЬсдссдб	ддадбдддад	120
адсаабдддс	адссддадаа	саасбасаад	ассасдссбс	ссдЬдсСдда	сбссдасддс	180

- 61 018897 бссббсббсс бсбасадсаа дсббассдбд дбддссддса ддкддасдбд сдддаасдбс 240 ббсбсабдсб ссдбдабдса бдаддсбсбд сасаассасб асасасадаа дадссбсбсс 300 сбдбсбссдд дбааа

315

<210>	32
<211>	110
<212>	ПРТ
<213>	Искусственный

<220>

<223> Искусственная последовательность <400> 32

Рго Агд <31и 1

Рго

<31п 5

Уа1

Туг

ТИг Ьеи

Рго 10

Рго

Зег

Агд

Азр

б1и Ьеи 15

Суз

Уа1

Рго

О1п

Уа1

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

С1у

РИе

Туг

Рго

20

25

30

Зег

Азр

Не

А1а

Уа1

С1и

Тгр

О1и

Зег

Азп

О1у

С1п

Рго

61и

Азп

35

40

45

Туг

Ьуз

Тйг

ТИг

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

Зег

Азр

<31у

Зег

РИе

РИ.е

Ьеи

50

55

60

Туг

Зег

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Уа1

Ьеи

Ьуз

Уа1

<31п

А1а

Агд

Тгр

65

70

75

80

<31и

Уа1

С1у

Азп

Уа1

РЬе

Зег

Суз

Зег

Уа1

Меб

ΗΪ3

С1и

А1а

Ьеи

Н13

90 95

- б2 018897

Азп Ηίβ Туг ТЬг <31п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у Ьуз

100 105110 <210>33 <211>330 <212> ДНК <213> Искусственный <220>

<223> Искусственная последовательность <400>33

ссссдадаас	сасаддбдба	сасссбдссс	ссабсссдбд	асдадсбсбд	сдбсссдсаа	60
дбсадссбда	ссбдссбддб	саааддсббс	бабсссадсд	асабсдссдб	ддадбдддад	120
адсаабдддс	адссддадаа	саасбасаад	ассасдссбс	ссдбдсбдда	сбссдасддс	180
бссббсббсс	бсбасадсаа	дсббассдбд	дбдсбсаадд	бсдбдсаддс	дсдсаддбдд	240
даддбдддда	асдбсббсбс	абдсбссдбд	абдсабдадд	сбсбдсасаа	ссасбасаса	300

садаададсс бсбсссбдбс бссдддбааа330 <210>34 <211>105 <212> ПРТ <213> Искусственный <220>

<223> Искусственная последовательность <400> 34

Рго Агд (31и Рго С1п Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд Азр <31и Ьеи

10 15

- 63 018897

СЬу

Не

А1а

СЬп 20

УаЬ

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз 25

Ьеи

УаЬ

Ьуз

СЬу

РЬе 30

Туг

Рго

Зег

Азр

11е

АЬа

УаЬ

СЬи

Тгр

СЬи

Зег

Азп

СЬу

СЬп

Рго

СЬи

Азп

35

40

45

Туг

Ьуз

ТЬг

Рго

УаЬ

Ьеи

Азр

Зег

Азр

СЬу

Зег

РЬе

Ьеи

50

55

60

Туг

Зег

Ьуз

Ьеи

ТЬг

УаЬ

Ьеи

СЬу

Агд

Тгр

ТЬг

Ьеи

СЬу

Азп

УаЬ

65

70

75

80

РНе

Зег

Суз

Зег

УаЬ

Мер

Ηίβ

СЬи

АЬа

Ьеи

ΗΪ3

Азп

Ηίβ

Туг

ТЬг

СЬп

85

90

95

Ьуз

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

СЬу

Ьуз

100 105 <210> 35 <211> 315 <212> ДНК <213> Искусственный <220>

<223> Искусственная последовательность <400> 35

ссссдадаас	сасаддрдба	сасссЬдссс	ссаЬсссддд	асдадсбсдд	саЬсдсдсаа	60
дЪсадссЬда	ссЬдссЬддй	саааддсЬРс	РаРсссадсд	асаРсдссдб	ддадрдддад	120
адсаасдддс	адссддадаа	саасРасаад	ассасдссбс	ссдСдсЬдда	сЬссдасддс	180

- 64 018897

ЕсЕЬЬскЛсс Ъскасадсаа дсЬЬассдкд ЬЬдддссдса ддкддасссЬ ддддаасдкс 240

ЪЪсБсакдсС ссдЬдакдса Ьдаддскскд сасаассаск асасасадаа дадссЪсксс 300 скдксЬссдд дкааа315 <210>36 <211>105 <212> ПРТ <213> Искусственный <220>

<223> Искусственная последовательность <400> 36

Рго Агд 1

61и

Рго Θΐη Уа1 5

Туг

ТЬг Ьеи

Рго 10

Рго

Зег

Агд

Азр

61и 15

Ьеи

61у

Не

А1а

С1п

Уа1

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

(31у

РЬе

Туг

Рго

20

25

30

Зег

Азр

11е

А1а

Уа1

С1и

Тгр

С1и

Зег

Азп

61у

Θΐη

Рго

С1и

Азп

35

40

45

Туг

Ьуз

ТЬг

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

Зег

Азр

<31у

Зег

РЬе

Ьеи

50

55

60

Туг

Зег

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Уа1

Ьеи

С1у

Агд

Тгр

ТЬг

Ьеи

(31у

Азп

Уа1

65

70

75

80

РЬе

Зег

Суз

Зег

Уа1

Мек.

Н13

61и

А1а

Ьеи

ΗΪ3

Азп

Ηίβ

Туг

ТЬг

О1п

90 95

- б5 018897

Ьуз Зег Ьей Зег Ьей Зег Рго <31у Ьуз

100105 <210>37 <211>315 <212> ДНК <213> Искусственный <220>

<223> Искусственная последовательность <400>37

ссссдадаас	сасаддРдРа	сасссРдссс	ссаРсссдРд	асдадсРсдд	саРсдсдсаа	60
дРсадсРРда	ссРдссРддР	саааддсРРР	РаРсссадсд	асаРсдссдР	ддадРдддад	120
адсаасдддс	адссддадаа	саасРасаад	ассасдссРс	ссдРдсРдда	сРссдасддс	180
РссРРсРРсс	РсРасадсаа	дсРРассдРд	РРдддссдса	ддрддассср	ддддаасдРс	240
РРсРсаРдсР	ссдРдаРдса	РдаддсРсРд	сасаассаср	асасасадаа	дадссРсРсс	300

сРдРсРссдд дРааа315 <210>38 <211>105 <212> ПРТ <213> Искусственный <220>

<223> Искусственная последовательность <400> 38

Рго Агд С1и Рго Θΐη Уа1 Туг ТЬг Ьей Рго Рго Зег Агд Азр С1и Ьей

10 15

- 66 018897

Ьеи

Рго

Суз

О1п 20

Уа1

Зег

Ьеи ТЬг

Суз 25

Ьеи

Уа1

Ьуз

С1у

РЬе 30

Туг

Рго

Зег

Азр

11е

А1а

Уа1

(31и

Тгр

<31и

Зег

Азп

С1у

О1п

Рго

С1и

Азп

35

40

45

Туг

Ьуз

ТЬг

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

Зег

Азр

61у

Зег

РЬе

Ьеи

50

55

60

Туг

Зег

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Уа1

РЬе

Суз

Рго

Агд

Тгр

Ьеи

С1у

<31у

Азп

Уа1

65

70

75

80

РЬе

Зег

Суз

Зег

Уа1

МеЬ

Н13

61и

А1а

Ьеи

Н13

Азп

ΗΪ3

Туг

ТЬг

С1п

85

90

95

Ьуз

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

<31у

Ьуз

100

105

<210> 39 <211> 315 <212> ДНК <213> Искусственный <220>

<223> Искусственная последовательность

<400> 39
ссссдадаас	сасаддЬдба	сасссбдссс	ссаЪсссдЪд	асдадсбсЬЪ	дсссбдссаа	60
дЬсадссбда	сседссЬддЬ	саааддсЬЬс	ЪаЬсссадсд	асаЬсдссдЬ	ддадЬдддад	120
адсааЬдддс	адссддадаа	саасЬасаад	ассасдссбс	ссдбдсЬдда	сЬссдасддс	180

- 67 018897

ЬсЪЬЬсЬЬсс ЬсЕасадсаа дсЬЬассдЬд ЬЬскдсссса ддЬддсЬддд ддддаасдЬс 240

ЬЬсЬсаЪдсЕ ссдкдаЪдса ЬдаддсЕсЬд сасаассасЬ асасасадаа дадссксЬсс 300 сЬдксЬссдд дкааа

315

<210>	40
<211>	105
<212>	ПРТ
<213>	Искусственный

<220>

<223> Искусственная последовательность <400> 40

Рго 1

Агд

С1и

Рго С1п Уа1 5

Туг

ТЬг Ьеи

Рго 10

Рго

Зег

Агд Азр

С1и Ьеи 15

ТЬг

Ьуз

Азп

С1п

Уа1

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

С1у

РЬе

Туг

Рго

20

25

30

Зег

Азр

11е

А1а

Уа1

<31и

Тгр

С1и

Зег

Азп

С1у

С1п

Рго

С1и

Азп

35

40

45

Туг

Ьуз

ТЬг

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

Зег

Азр

С1у

Зег

РЬе

Ьеи

50

55

60

Туг

Зег

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Уа1

Рго

Суз

Мер

Агд

Тгр

61у

С1у

Азп

Уа1

65

70

75

80

РЬе

Зег

Суз

Зег

Уа1

МеЬ

Н13

(31и

А1а

Ьеи

Н13

Азп

ΗΪ8

Туг

ТЬг

σΐη

90 95

- 68 018897

Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго <31у Ьуз

100105 <210>41 <211>315 <212> ДНК <213> Искусственный <220>

<223> Искусственная последовательность <400>41

ссссдадаас	сасаддбдба	сасссбдссс	ссабсссддд	абдадсбдас	саадаассад	60
дбсадссбда	ссбдссбддб	саааддсббс	бабсссадсд	асабсдссдб	ддадбдддад	120
адсаабдддс	адссддадаа	саасбасаад	ассасдссбс	ссдбдсбдда	сбссдасддс	180
бссббсббсс	бсбасадсаа	дсббассдбд	сссбдсабда	ддбддбдддд	сдддаасдбс	240
ббсбсабдсб	ссдбдабдса	бдаддсбсбд	сасаассасб	асасасадаа	дадссбсбсс	300

сбдбсбссдд дбааа315 <210>42 <211>115 <212> ПРТ <213> Искусственный <220>

<223> Искусственная последовательность <400> 42

Агд Агд 31и Рго (31п Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд Азр С1и Ьеи

10 15

- 69 018897

Уа1

Ьеи

(31у

<31п 20

Уа1

Зег

Ьеи

А1а

Суз 25

Ьеи

Уа1

Ьуз

61у

Рке Уа1 30

Уа1

Агд

Ьеи

Не

А1а

Уа1

О1и

Тгр

С1и

Зег

Азп

С1у

(31п

Рго

С1и

Азп

35

40

45

Туг

Ьуз

Ткг

ТНг

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

Зег

Азр

С1у

Агд

С1п

Ьеи

А1а

50

55

60

Азр

Зег

Рке

РНе

Ьеи

Туг

Зег

Ьуз

Ьеи

Ткг

Уа1

Рго

Агд

Ьеи

Ьуз

65

70

75

80

С1у

Тгр

Рго

Агд

Тгр

О1у

Тгр

С1у

Азп

Уа1

Рке

Зег

Суз

Зег

Уа1

Мек

85

90

95

Рке

Ьеи

А1а

Ьеи

Н13

Азп

Нхз

Туг

Ткг

61п

Ьуз

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

100 105 НО

Рго С1у Ьуз

115 <210> 43 <211> 345 <212> ДНК <213> Искусственный <220>

<223> Искусственная последовательность <400> 43 сддсдадаас сасаддкдка сассскдссс ссаксссдкд асдадсксдк сккддддсаа 60

- 70 018897

дРсадссРдд	ссРдссРсдР	даааддсРРс	дрддрссддр	РдаРсдссдР	ддадрдддад	120
адсааРдддс	адссддадаа	саасРасаад	ассасдссРс	ссдРРсРада	сРссдасддс	180
сддсадРРдд	сддасРссРР	сРРссРсРас	адсаадсРРа	ссдрдссссс	дсддррдаад	240
ддсРддссда	ддрддддсрд	ддддаасдРс	РРсРсаРдса	дРдРдаРдРР	ссРддсдсРд	300
сасаассасР	асасасадаа	дадссРсРсс	сРдРсРссдд	дРааа		345

<210> 44 <211> 238 <212> ΠΡΤ <213> Искусственный <220>

<223> Искусственная последовательность <400> 44

С1и Уа1 1

С1п

Ьеи

Уа1 5

С1и

Зег

<31у

С1у

СПу 10

Ьеи 17а1

О1п

Рго С1у 15

Агд

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

Зег

С1у

РЬе

Т11Г

РЬе

Азп

Азр

Туг

20

25

30

А1а

Мер

Н13

Тгр

Уа1

Агд

Θΐη

А1а

Рго

61у

Ьуз

61у

Ьеи

(31и

Тгр

Уа1

35

40

45

Зег

<31у

11е

Зег

Тгр

Азр

Зег

11е

С1у

Туг

А1а

Азр

Зег

Уа1

50

55

60

Ьуз

(Э1у

Агд

РЬе

ТЬг

11е

Зег

Агд

Азр

Азп

А1а

Ьуз

Азп

Зег

Ьеи

Туг

65

70

75

80

- 71 018897

Ьеи 01η Мей

Азп

Зег Ьеи Агд 85

А1а

С1и Азр 90

Мей А1а Ьеи

Туг

Туг 95

Суз

Уа1

Ьуз

О1у

Агд

Азр

Туг

Азр

Зег

С1у

Туг

РЬе

ТЬг

Уа1

А1а

100

105

110

РЬе

Азр

11е

Тгр

61у

С1п

С1у

ТЬг

Мей

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

А1а

Зег

115

120

125

ТЬг

Ьуз

(31у

Рго

<31п

ν31

Туг

ТЬг

Ьеи

Рго

Зег

Агд

Азр

О1и

Ьеи

130

135

140

Уа1

Ьеи

С1у

С1п

Уа1

Зег

Рго

ТЬг

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

(31у

РЬе

Туг

Рго

145

150

155

160

Зег

Азр

11е

А1а

Уа1

С1и

Тгр

С1и

Зег

Азп

С1у

С1п

Рго

С1и

Азп

165

170

175

Туг

Ьуз

ТЬг

Рго

Уа1

Ьеи

Азр

Зег

Азр

е1у

Зег

РЬе

Ьеи

180

185

190

Туг

О1у

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Уа1

Рго

Агд

Ьеи

Ьуз

С1у

Тгр

Рго

Агд

Тгр

195

200

205

С1у

Тгр

С1у

Азп

Уа1

РЬе

Зег

Суз

Зег

Уа1

Мей

Нтз

О1и

А1а

Ьеи

Н13

210

215

220

Азп

Н13

Туг

ТЬг

σΐη

Ьуз

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

С1у

Ьуз

225 230 235

- 72 018897

<210>	45
<211>	714
<212>	ДНК
<213>	Искусственный

<220>

<223>

Искусственная последовательность

<400> 45

даадСдсадс	СддСддадСс	Сдддддаддс	ССддСасадс	сСддсаддСс	ссСдадасСс	60
СссСдСдсад	ссСсСддаСС	сассСССааС	даССаСдсса	СдсасСдддС	ссддсаадсС	120
осадддаадд	дссСддадСд	ддСсСсаддС	аСаадССддд	аСадСадСад	СаСаддсСаС	180
дсддасСсСд	Сдаадддссд	аССсассаСс	Сссададаса	асдссаадаа	сСсссСдСаС	240
сСдсаааСда	асадСсСдад	адсСдаддас	аСддссССаС	аССасСдСдС	ааааддсада	300
даССасСаСд	аСадСддСдд	ССаСССсасд	дССдсССССд	аСаСсСдддд	ссаадддаса	360
аСддСсассд	СсСсССсаде	сСссассаад	ддсссасадд	СдСасасссС	дсссссаСсс	420
сдСдасдадс	СсдСсССддд	дсаадСсадс	ссдассСдсс	СддСсааадд	сССсСаСссс	480
адсдасаСсд	ссдСддадСд	ддададсааС	дддсадссдд	адаасаасСа	саадассасд	540
ссСсссдСдс	СддасСссда	сддсСссССс	ССссСсСасд	дсаадсССас	сдСдсссссд	600
сддССдаадд	дсСддссдад	дСддддсСдд	дддаасдСсС	СсСсаСдсСс	сдСдаСдсаС	660
даддсСсСдс	асаассасСа	сасасадаад	адссСсСссс	СдСсСссддд	Сааа	714

<210>	46
<211>	217
<212>	ПРТ
<213>	Искусственный

- 73 018897 <220>

<223> Искусственная последовательность <400> 46

Азр 1

11е С1п

МеС

ТЬг 5

Θΐη Зег

Рго

Зег

ТЬг 10

Ьеи

Зег

А1а

Зег

Уа1 15

С1у

Азр

Агд

Уа1

ТЬг

11е

ТЬг

Суз

Агд

А1а

Зег

О1п

Зег

11е

Зег

Агд

Тгр

20

25

30

Ьеи

А1а

Тгр

Туг

С1П

Θΐη

Ьуз

Рго

С1у

Ьуз

Уа1

Рго

Ьуз

Ьеи

Пе

35

40

45

Туг

Ьуз

А1а

Зег

Ьеи

С1и

Зег

С1у

Уа1

Рго

Зег

Агд

РЬе

Зег

О1у

50

55

60

Зег

<31у

Зег

О1у

ТЬг

С1и

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

Ьеи

О1п

Рго

65

70

75

80

Азр

РЬе

А1а

ТЬг

Туг

Суз

С1п

Οίη

Туг

Азп

Зег

Туг

Зег

РЬе

85

90

95

С1у

Рго

С1у

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азр

11е

Ьуз

Агд

ТЬг

Уа1

А1а

О1и

Рго

О1п

100

105

110

Уа1

Туг

ТЬг

Ьеи

Рго

Зег

Агд

Азр

О1и

Ьеи

Уа1

Ьеи

О1у

С1п

Уа1

115

120

125

Зег

Рго

ТЬг

Суз

Ьеи

Уа1

Ьуз

<31у

РЬе

Туг

Рго

Зег

Азр

11е

А1а

Уа1

130 135 140

- 74 018897

СЬи 145

Тгр

СЬи

Зег

Азп

СЬу СЬп 150

Рго СЬи Азп Азп 155

Туг

Ьуз

ТЬг

Рго 160

Рго

УаЬ

Ьеи

Азр

Зег

Азр

СЬу

Зег

РЬе

Ьеи

Туг

СЬу

Ьуз

Ьеи

ТЬг

165

170

175

УаЬ

Рго

Агд

Ьеи

Ьуз

СЬу

Тгр

Рго

Агд

Тгр

СЬу

Тгр

СЬу

Азп

УаЬ

180

185

190

РЬе

Зег

Суз

Зег

УаЬ

МеЬ

Н1з

СЬи

АЬа

Ьеи

НЬз

Азп

Н13

Туг

ТЬг

СЬп

195

200

205

Ьуз

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

СЬу

Ьуз

210 215 <210> 47 <211> 651 <212> ДНК <213> Искусственный <220>

<223> Искусственная последовательность <400> 47

дасаЬссада	Ьдасссадбс	ЬссЬРссасс	сбдЪсЬдсаР	сбдРаддада	сададЬсасс	60
абсасЬЬдсс	дддссадРса	дадРаРЬадб	аддЬддЬЬдд	ссйддбаРса	дсадааасса	120
дддааадЬсс	сЬаадсЬссй	даЬсЬаЬаад	дсайсРадСР	Ьадааадбдд	ддРсссаЬса	180
аддРРсадсд	дсадрддабс	Рдддасадаа	РРсасЬсЬса	ссабсадсад	ссбдсадссР	240
даЬдаЬЬРРд	саасЬЬаБЬа	сбдссаасад	ЬаЬааЬадЬЪ	абЬсЬЬЬсдд	сссРдддасс	300

- 75 018897

ааадбддаба	бсааасдаас	бдбддсбдаа	ссасаддбдб	асасссбдсс	сссабсссдб	360
дасдадсбсд	бсббддддса	адбсадсссд	ассбдссбдд	бсаааддсбб	сбабсссадс	420
дасабсдссд	Ъддадбддда	дадсаабддд	садссддада	асаасбасаа	дассасдссб	480
сссдбдсбдд	асбссдасдд	сбссббсббс	сбсбасддса	адсббассдр	дсссссдсдд	540
Ъбдаадддсб	ддссдаддбд	дддсбддддд	аасдбсббсб	сабдсбссдб	дабдсабдад	600
дсбсбдсаса	ассасбасас	асадаададс	сЪсбсссЪдР	сбссдддбаа	а	651

<210> 48 <211> 129 <212> ΠΡΤ <213> Искусственный <220>

<223> Искусственная последовательность <220>

<221> Область биологического интереса; новая или редкая характеристика <222> (35) . . (36) <223> Хаа может быть любая природная аминокислота <220>

<221> Область биологического интереса; новая или редкая характеристика <222> (38) . . (42) <223> Хаа может быть любая природная аминокислота <220>

<221> Область биологического интереса; новая или редкая характеристика <222> (95) . . (98) <223> Хаа может быть любая природная аминокислота <400> 48

- 76 018897

Ме£ 1

Ьуз

Туг

Ьеи Ьеи 5

Рго ТЬг

А1а

А1а А1а 10

С1у Ьеи

Ьеи

Ьеи 15

А1а

С1п

Рго

А1а

Меи

А1а

Уа1

А1а

Рго

Зег

Уа1

РЬе

11е

РЬе

Рго

20

25

30

Рго

Зег

Хаа

С1п

Хаа

А1а

Зег

Уа1

Суз

Ьеи

35

40

45

Ьеи

Азп

РЬе

Туг

Рго

Агд

<31и

А1а

Ьуз

Уа1

С1п

Тгр

Ьуз

Уа1

Азр

50

55

60

Азп

А1а

Ьеи

О1п

Зег

61у

Азп

Зег

О1п

С1и

Зег

Уа1

ТЬг

С1и

С1п

Азр

65

70

75

80

Зег

Ьуз

Азр

Зег

ТЬг

Туг

Зег

Ьеи

Зег

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Ьеи

Хаа

85

90

95

Хаа

Туг

51и

Ьуз

Нтз

Ьуз

Уа1

Туг

А1а

Суз

С1и

Уа1

ТЬг

ΗΪ3

С1п

100

105

110

<31у

Ьеи

Зег

Рго

Уа1

ТЬг

Ьуз

Зег

РЬе

Азп

Агд

61у

С1и

А1а

115 120 125

А1а <210> 49 <211> 387 <212> ДНК <213 > Искусственный <220>

<223> Искусственная последовательность <220>

<221> <222> <223>	Область (103) . . η это а	биологического (104) , с, д, или С	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<220>
<221>	Область	биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(106) . ,	(107)
<223>	η это а	, с, д, или б
<220>
<221>	Область	биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(112) . .	(ИЗ)
<223>	η это а	, с, д, или С
<220>
<221>	Область	биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(115) . .	(116)
<223>	η это а	, с, д, или б
<220>
<221>	Область	биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(118) . .	(119)
<223>	η это а	, с, д, или б
<220>
<221>	Область	биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(121)..	(122)
<223>	η это а	, с, д, или б
<220>
<221>	Область	биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(124) . .	(125)
<223>	η это а	, с, д, или б

- 78 018897 <220>

<221> <222> <223>	Область (283) . . η это а	биологического (284) , с, д, или б	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<220>
<221>	Область	биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(286) . .	(287)
<223>	η это а	, с, д, или б
<220>
<221>	Область	биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(289) . .	(290)
<223>	η это а	, с, д, или б
<220>
<221>	Область	биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика

<222> (292)..(293) <223> η это а, с, д, или б

<400> 49
абдааабасс	баббдссбас	ддсадссдсб	ддаббдббаб	басбсдсддс	ссадссддсс	60
абддссдбдд	сбдсассабс	бдбсббсабс	ббсссдссаб	сбппзппзса	дппзппзппз	120
ппзппздссб	сбдббдбдбд	ссбдсбдааб	аасббсбабс	ссадададдс	сааадбасад	180
бддааддбдд	абаасдсссб	ссаабсдддб	аасбсссадд	ададбдбсас	ададсаддас	240
адсааддаса	дсассбасад	ссбсадсадс	асссбдасдб	бдппзппзпп	зппзбасдад	300
ааасасааад	бсбасдссбд	сдаадбсасс	сабсадддсс	бдадсбсдсс	сдбсасааад	360
адсббсааса	ддддададдс	ддссдса				387

<210>	50
<211>	132
<212>	ПРТ
<213>	Искусственный

- 79 018897 <220>

<223> Искусственная последовательность <220>

<221> Область биологического интереса; новая или редкая характеристика <222> (35)..(36) <223> Хаа может быть любая природная аминокислота <220>

<221> Область биологического интереса; новая или редкая характеристика <222> (38)..(42) <223> Хаа может быть любая природная аминокислота <220>

<221> Область биологического интереса; новая или редкая характеристика <222> (95)..(101) <223> Хаа может быть любая природная аминокислота <400> 50

Мер 1

Ьуз

Туг

Ьей

Ьей 5

Рго

ТЬг

А1а

А1а 10

О1у Ьей

Ьей

Ьей 15

А1а

αΐη

Рго

А1а

Мер

А1а

Уа1

А1а

Рго

Зег

Уа1

РЬе

11е

РЬе

Рго

20

25

30

Рго

Зег

Хаа

<31п

Хаа

А1а

Зег

Уа1

Суз

Ьей

35

40

45

Ьей

Азп

РЬе

Туг

Рго

Агд

(31и

А1а

Ьуз

Уа1

С1п

Тгр

Ьуз

Уа1

Азр

50

55

60

Азп

А1а

Ьей

СЯп

Зег

<31у

Азп

Зег

С1П

61ц

Зег

Уа1

ТЬг

С1и

61п

Азр

70 75 80

- 80 018897

Зег Ьуз Азр

Зег

ТЬг Туг 85

Зег

Ьеи

Зег

Зег ТЬг 90

Ьеи

ТЬг

Ьеи Хаа 95

Хаа

Туг

О1и

Ьуз

Н13

Ьуз

Уа1

Туг

А1а

Суз

С1и

Уа1

100

105

110

ТЬг

Н13

С1п

С1у

Ьеи

Зег

Рго

Уа1

ТЬг

Ьуз

Зег

РЬе

Азп

Агд

С1у

115

120

125

С1и А1а А1а А1а

130 <210> 51 <211> 396 <212> ДНК <213> Искусственный <220>

<223> Искусственная последовательность <220>

<221> <222> <223>	Область (103) . . п это а	биологического (104) , с, д, или б	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<220>
<221>	Область	биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(106)..	(107)
<223>	п это а	, с, д, или б
<220>
<221>	Область	биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(112) . .	(113)

- 81 018897 <223> п это а, с, д, или к <220>

<221> <222> <223>	Область (115) . . η это а	биологического (116) , с, д, или б	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<220>
<221>	Область	биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(118) . .	(119)
<223>	η это а	, с, д, или б
<220>
<221>	Область	биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(121) . .	(122)
<223>	η это а	, с, д, или б
<220>
<221>	Область	биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(124) . .	(125)
<223>	η это а	, с, д, или б
<220>
<221>	Область	биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(283) . .	(284)
<223>	η это а	, с, д, или б
<220>
<221>	Область	биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(286) . .	(287)
<223>	η это а	, с, д, или б
<220>
<221>	Область	биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(289)..	(290)
<223>	η это а	, с, д, или б
<220>
<221>	Область	биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(292)..	(293)

- 82 018897

<223>	η это а	, с, д, или б
<220>
<221>	Область	биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(295) . .	(296)
<223>	η это а	, с, д, или б
<220>
<221>	Область	биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(298)..	(299)
<223>	η это а	, с, д, или б
<220>
<221>	Область	биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(301) . .	(302)
<223>	η это а	, с, д, или б
<400>	51

абдааабасс баббдссбас ддсадссдсб ддаббдббаб басбсдсддс ссадссддсс 60 абддссдбдд сбдсассабс бдбсббсабс ббсссдссаб сбппзппзса дппзппзппз 120 ппзппздссб сбдббдбдбд ссбдсбдааб аасббсбабс ссадададдс сааадбасад 180 бддааддбдд абаасдсссб ссаабсдддб аасбсссадд ададбдбсас ададсаддас 240 адсааддаса дсассбасад ссбсадсадс асссбдасдб бдппзппзпп зппзппзппз 300 ппзбасдада аасасааадб сбасдссбдс даадбсассс абсадддссб дадсбсдссс 360 дбсасааада дсббсаасад дддададдсд дссдса 396

<210>	52
<211>	134
<212>	ПРТ
<213>	Искусственный

<220>

<223>

Искусственная последовательность

- 83 018897 <220>

<221> Область биологического интереса; новая или редкая характеристика <222> (35)..(36) <223 > Хаа может быть любая природная аминокислота <220>

<221> Область биологического интереса; новая или редкая характеристика <222> (95) . . (103) <223> Хаа может быть любая природная аминокислота <400> 52

МеЬ 1

Ьуз

Туг

Ьеи

Ьеи 5

Рго

Ткг

А1а

А1а 10

С1у Ьеи Ьеи

Ьеи

Ьеи 15

А1а

61п

Рго

А1а

Меб

А1а

Уа1

А1а

Рго

Зег

Уа1

Рке

11е

Рке

Рго

20

25

30

Рго

Зег

Хаа

С1п

Хаа

А1а

Зег

Уа1

Суз

Ьеи

35

40

45

Ьеи

Азп

РНе

Туг

Рго

Агд

С1и

А1а

Ьуз

Уа1

С1п

Тгр

Ьуз

Уа1

Азр

50

55

60

Азп

А1а

Ьеи

С1п

Зег

С1у

Азп

Зег

<31п

61и

Зег

Уа1

Ткг

С1и

С1п

Азр

65

70

75

80

Зег

Ьуз

Азр

Зег

ТНг

Туг

Зег

Ьеи

Зег

Ткг

Ьеи

Ткг

Ьеи

Хаа

- 84 018897

85

90

95

Хаа

Туг

С1и

Ьуз

Н13

Ьуз

Уа1

Туг

А1а

Суз

100

105

но

(31и

Уа1

ТЬг

Н13

σΐη

О1у

Ьеи

Зег

Рго

Уа1

ТЬг

Ьуз

Зег

РЬе

Азп

115

120

125

Агд

<31у

С1и

А1а

130 <210> 53 <211> 402 <212> ДНК <213> Искусственный <220>

<223> Искусственная последовательность <220>

<221> <222> <223>	Область (103) . . п это а	биологического (104) , с, д, или б	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<220>
<221>	Область	биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(106) . .	(107)
<223>	п это а	, с, д, или б
<220>
<221>	Область	биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика

<222> (112) . . (113) <223> п это а, с, д, или б <220>

- 85 018897

<221> <222> <223>	Область (115) . . η это а	биологического (116) , с, д, или б	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<220>
<221>	Область	биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(118) . .	(119)
<223>	η это а	, с, д, или б
<220>
<221>	Область	биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(121) . .	(122)
<223>	η это а	, с, д, или б
<220>
<221>	Область	биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(124) . .	(125)
<223>	η это а	, с, д, или Ъ
<220>
<221>	Область	биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(283) . .	(284)
<223>	η это а	, с, д, или б.
<220>
<221>	Область	биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(286)..	(287)
<223>	η это а	, с, д, или б
<220>
<221>	Область	биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(289)..	(290)
<223>	η это а	, с, д, или б
<220>
<221>	Область	биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика

<222> (292) . . (293) <223> η это а, с, д, или б <220>

- 86 018897 <221> Область биологического интереса; новая или редкая характеристика <222> (295) . . (296) <223> п это а, с, д, или С <220>

<221> Область биологического интереса; новая или редкая характеристика <222> (298) . . (299) <223> η это а, с, д, или С <220>

<221> Область биологического интереса; новая или редкая характеристика <222> (301)..(302) <223> η это а, с, д, или С <220>

<221> Область биологического интереса; новая или редкая характеристика <222> (304)..(305) <223> η это а, с, д, или С <220>

<221> Область биологического интереса; новая или редкая характеристика <222> (307) . . (308) <223> η это а, с, д, или С <400>

абдааабасс СаССдссСас ддсадссдсС ддаССдССаб Сасбсдсддс ссадссддсс абддссдСдд сбдсассаСс СдСсССсабс ССсссдссаС сбппзппзса дппзппзппз

120 ппзппздссб сСдССдбдСд ссСдсСдааб аасССсбаСс ссадададдс сааадСасад

180

СддааддСдд аСаасдсссб ссаабсдддС аасСсссадд ададбдбсас ададсаддас

240 адсааддаса дсассбасад ссбсадсадс асссбдасдЪ Сдппзппзпп зппзппзппз

300 ппзппзппзб асдадаааса сааадбсбас дссСдсдаад СсасссаСса дддссбдадс

360

Ссдсссдбса сааададсСС саасадддда даддсддссд са

402

- 87 018897 <210> 54 <211> 127 <212> ΠΡΤ <213> Искусственный <220>

<223> Искусственная последовательность <220>

<221> Область биологического интереса; новая или редкая характеристика <222> (38) . . (45) <223> Хаа может быть любая природная аминокислота <220>

<221> Область биологического интереса; новая или редкая характеристика <222> (95)..(101) <223> Хаа может быть любая природная аминокислота <400> 54

Меб 1

Ьуз Туг

Ьеи Ьеи 5

Рго ТЬг

АЬа АЬа АЬа 10

СЬу Ьеи Ьеи

Ьеи

Ьеи АЬа 15

А1а

О1п

Рго

АЬа

Меб

АЬа

Зег

ТЬг

Ьуз

СЬу

Рго

Зег

УаЬ

РЬе

Рго

20

25

30

Ьеи

АЬа

Рго

Зег

Хаа

АЬа

Ьеи

СЬу

35

40

45

Суз

Ьеи

УаЬ

Ьуз

Азр

Туг

РЬе

Рго

СЬи

Рго

УаЬ

ТИг

УаЬ

Зег

Тгр

Азп

50

55

60

Зег

СЬу

АЬа

Ьеи

ТЬг

Зег

СЬу

УаЬ

ΗΪ8

ТЬг

РИе

Рго

АЬа

УаЬ

Ьеи

СЬп

65

70

75

80

- 88 018897

Зег

Зег <31у

Ьеи Туг 85

Зег

Ьеи

Зег

Уа1 90

Уа1

ТЬг

Уа1

Рго

Хаа 95

Хаа

ТЬг

Туг

11е

Суз

Азп

Уа1

Азп

Н13

Ьуз

Рго

Зег

100

105

но

Азп

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азр

Ьуз

Уа1

<31и

Рго

Ьуз

Зег

А1а

115

120

125

<210>	55
<211>	381
<212>	ДНК
<213>	Искусственный

<220>

<223>

Искусственная последовательность

<220>

<221>	Область	биологического	интереса;	новая или редкая	характеристика
<222>	(112) . .	(113)
<223>	п это а	, с, д, или Р
<220>
<221>	Область	биологического	интереса;	новая или редкая	характеристика
<222>	(115) . .	(116)
<223>	п это а	, с, д, или Р

<220>

<221> Область биологического интереса; новая или редкая характеристика <222> (118)..(119) <223> η это а, с, д, или б <220>

<221> Область биологического интереса; новая или редкая характеристика <222> (121) . . (122)

- 89 018897 <223> η это а, с, д, или б <220>

<221> <222> <223>	Область (124) . . η это а	биологического (125) , с, д, или б	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<220>
<221>	Область	биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(127)..	(128)
<223>	η это а	, с, д, или б
<220>
<221>	Область	биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(130)..	(131)
<223>	η это а	, с, д, или б
<220>
<221>	Область	биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(133)..	(134)
<223>	η это а	, с, д, или б
<220>
<221>	Область	биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(283) . .	(284)
<223>	η это а	, с, д, или б
<220>
<221>	Область	биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(286)..	(287)
<223>	η это а	, с, д, или б
<220>
<221>	Область	биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(289) . .	(290)
<223>	η это а	, с, д, или б
<220>
<221>	Область	биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(292)..	(293)

- 90 018897

<223>	η это а	, с, д, или б
<220>
<221>	Область	биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(295) . .	(296)
<223>	η это а	, с, д, или б
<220>
<221>	Область	биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(298) . .	(299)
<223>	η это а	, с, д, или б
<220>
<221>	Область	биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(301)..	(302)
<223>	η это а	, с, д, или б
<400>	55

айдааабасс ЬаЬйдссйас ддсадссдсб ддабйдййаб йасйсдсддс ссадссддсс 60 абддссдссб ссассааддд сссайсддйс йбсссссбдд сасссбссбс сппзппзппз 120 ппзппзппзп пзппздсссб дддсбдссбд дйсааддасй асббссссда ассддбдасд 180 дбдйсдбдда асйсаддсдс ссбдассадс ддсдбдсаса ссббсссддс йдйссйасад 240 йссйсаддас бсйасбсссб садсадсдйд дйдассдйдс ссппзппзпп зппзппзппз 300 ппзассбаса йсбдсаасдй даайсасаад сссадсааса ссааддйдда саадааадйб 360 дадсссаааб сбдсддссдс а 381

<210>	56
<211>	87
<212>	днк
<213>	Искусственный

<220>

<223>

Искусственная последовательность

- 91 018897 <220>

<221> <222> <223>	Область биологического (49) . . (50) η это а, с, д, или С	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<220>
<221>	Область биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(52)..(53)
<223>	η это а, с, д, или С
<220>
<221>	Область биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(58)..(59)
<223>	η это а, с, д, или ύ
<220>
<221>	Область биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(61)..(62)
<223>	η это а, с, д, или Ъ
<220>
<221>	Область биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(64)..(65)
<223>	η это а, с, д, или С
<220>
<221>	Область биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(67) .. (68)
<223>	η это а, с, д, или С
<220>
<221>	Область биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика

<222> (70)..(71) <223> η это а, с, д, или ΐ:

<400> 56 сЬйассаЪдд ссдйддсйдс ассаЪсЪдЬс Сйсайсбйсс сдссабсЬпп зппзсадппз 60

- 92 018897 ппзппзппзп пздссбсбдб бдбдбдс 87 <210> 57 <211> 26 <212> ДНК <213> Искусственный <220>

<223> Искусственная последовательность <400>57 бдасаасдбс адддбдсбдс бдаддс26 <210>58 <211>41 <212> ДНК <213> Искусственный <220>

<223> Искусственная последовательность <220>

<221> Область биологического интереса; новая или редкая характеристика <222> (12) . . (13) <223> η это а, с, д, или б <220>

<221> Область биологического интереса; новая или редкая характеристика <222> (15) . . (16) <223> η это а, с, д, или б <220>

<221> Область биологического интереса; новая или редкая характеристика <222> (18)..(19) <223 > η это а, с, д, или б <220>

- 93 018897 <221> Область биологического интереса; новая или редкая характеристика <222> (21) . . (22) <223> η это а, с, д, или Р <400> 58

РсадаасдРР дппзппзппз ппзРасдада аасасааадР с

<210>	59
<211>	50
<212>	ДНК
<213>	Искусственный

<220>

<223>

Искусственная последовательность

<220>

<221> Область биологического интереса; новая или редкая характеристика <222> (12) . . (13) <223> η это а, с, д, или О <220>

<221> Область биологического интереса; новая или редкая характеристика <222> (15)..(16) <223> η это а, с, д, или Р <220>

<221> Область биологического интереса; новая или редкая характеристика <222> (18)..(19) <223> η это а, с, д, или Р <220>

<221> Область биологического интереса; новая или редкая характеристика <222> (21) . . (22) <223> η это а, с, д, или Р <220>

<221> Область биологического интереса; новая или редкая характеристика <222> (24)..(25)

- 94 018897 <223> η это а, с, д, или б <220>

<221> Область биологического интереса; новая или редкая характеристика <222> (27) . . (28) <223> η это а, с, д, или б <220>

<221> Область биологического интереса; новая или редкая характеристика <222> (30)..(31) <223> η это а, с, д, или ϋ <400>59 бсадаасдби дппзппзппз ппзппзппзп пзбасдадаа асасааадбс50 <210> 60 <211>56 <212> ДНК <213> Искусственный <220>

<223> Искусственная последовательность <220>

<221> Область биологического интереса; новая или редкая характеристика <222> (12) . . (13) <223> п это а, с, д, или б <220>

<221> Область биологического интереса; новая или редкая характеристика <222> (15)..(16) <223> п это а, с, д, или б <220>

<221> Область биологического интереса; новая или редкая характеристика <222> (18)..(19) <223> η это а, с, д, или б

- 95 018897 <220>

<221> <222> <223>	Область биологического (21) . . (22) η это а, с, д, или б	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<220>
<221>	Область биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(24) . . (25)
<223>	η это а, с, д, или б
<220>
<221>	Область биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(27) . . (28)
<223>	η это а, с, д, или б
<220>
<221>	Область биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(30)..(31)
<223>	η это а, с, д, или б
<220>
<221>	Область биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(33)..(34)
<223>	п это а, с, д, или б
<220>
<221>	Область биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика

<222> (36)..(37) <223> η это а, с, д, или С <400> 60 бсадаасдбб дппзппзппз ппзппзппзп пзппзппзба сдадааасас ааадбс 56

<210>	61
<211>	31
<212>	ДНК
<213>	Искусственный
<220>

- 9б 018897 <223> Искусственная последовательность <400> 61 сабсдсддсс дссбсбсссс бдббдаадсб с

<210>	62
<211>	99
<212>	ДНК
<213>	Искусственный

<220>

<223>

Искусственная последовательность

<220>

<221> <222> <223>	Область биологического (58)..(59) η это а, с, д, или б	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<220>
<221>	Область биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(61)..(62)
<223>	η это а, с, д, или Ь
<220>
<221>	Область биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(64)..(65)
<223>	η это а, с, д, или С
<220>
<221>	Область биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(67)..(68)
<223>	η это а, с, д, или Ъ

<220>

<221> Область биологического интереса; новая или редкая характеристика <222> (70)..(71) <223> η это а, с, д, или б

- 97 018897 <220>

<221>	Область биологического интереса; новая или редкая характеристика
<222>	(73)..(74)
<223>	п это а, с, д, или Ь

<220>

<221>	Область биологического интереса; новая или редкая характеристика
<222>	(76)..(77)
<223>	η это а, с, д, или б

<220>

<221>	Область биологического интереса; новая или редкая характеристика
<222>	(79) . . (80)
<223>	η это а, с, д, или б
<400>	62

асдбссабдд ссдссбссас саадддссса бсддбсббсс сссбддсасс сбссбссппз 60 ппзппзппзп пзппзппзпп здсссбдддс бдссбддбс 99

<210>	63
<211>	23
<212>	ДНК
<213>	Искусственный

<220>

<223>	Искусственная последовательность
<400>	63

ддсасддбса ссасдсбдсб дад 23

<210>	64
<211>	61
<212>	ДНК
<213>	Искусственный

<220>

<223>

Искусственная последовательность

- 98 018897 <220>

<221> <222> <223>	Область биологического (19) . . (20) η это а, с, д, или б	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<220>
<221>	Область биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(22)..(23)
<223>	η это а, с, д, или б
<220>
<221>	Область биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(25)..(26)
<223>	η это а, с, д, или б
<220>
<221>	Область биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(28)..(29)
<223>	η это а, с, д, или б
<220>
<221>	Область биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(31)..(32)
<223>	η это а, с, д, или б
<220>
<221>	Область биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика
<222>	(34) . . (35)
<223>	η это а, с, д, или б
<220>
<221>	Область биологического	интереса;	новая	или	редкая	характеристика

ДНК

Искусственный <222> (37)..(38) <223> η это а, с, д, или б <400> 64 адсдбддбда ссдбдссспп зппзппзппз ппзппзппза ссбасабсбд саасдбдааб 60 с

<210>

<211>

<212>

<213>

<220>

<223>

<400>

сабадсддсс дсадабббдд дсбсаасббб сббдбс 36

Искусственная последовательность

Claims

1. Способ конструирования иммуноглобулина, содержащего по меньшей мере один модифицированный участок структурной петли для обеспечения отличного от СИВ (гипервариабельный участок) сайта связывания и определения связывания указанного иммуноглобулина с эпитопом антигенной молекулы, причем немодифицированный участок структурной петли не связывается существенно с указанным эпитопом, причем способ включает стадии:

(a) получения нуклеиновой кислоты, кодирующей иммуноглобулин, содержащий по меньшей мере один участок структурной петли;

(b) модификации по меньшей мере одного нуклеотидного остатка указанной нуклеиновой кислоты, кодирующей участок структурной петли, путем мутагенеза, причем указанная модификация осуществляется методом мутагенеза, выбранным из группы, состоящей из случайной, полуслучайной или сайтспецифической рандомизации, сканирующего мутагенеза или комбинаторных подходов, причем указанная модификация соответственно обеспечивает:

ί) получение иммуноглобулина, содержащего любой из участков структурных петель С_н1, С_н2, С_н3 и С_н4, где по меньшей мере в одном из положений аминокислот в аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из аминокислот 7-21, аминокислот 25-39, аминокислот 41-81, аминокислот 83-85, аминокислот 89-103 и аминокислот 106-117, произошла модификация; или ίί) получение иммуноглобулина, содержащего любой из участков структурных петель легкой цепи 1д-каппа или 1д-лямбда, где по меньшей мере в одном из положений аминокислот в аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из аминокислот 8-18, аминокислот 27-35, аминокислот 42-78, аминокислот 83-85, аминокислот 92-100, аминокислот 108-117 и аминокислот 123-126, произошла модификация; или

ш) получение иммуноглобулина, содержащего любой из участков структурных петель вариабельного домена, где по меньшей мере в одном из положений аминокислот в аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из аминокислот 8-20, аминокислот 44-50, аминокислот 6776, аминокислот 89-101, произошла модификация; где нумерация приведена в соответствии с 1МСТ;

(c) переноса указанной модифицированной нуклеиновой кислоты в экспрессионную систему;

(б) экспрессии указанного модифицированного иммуноглобулина;

(е) контактирования экспрессированного модифицированного иммуноглобулина с эпитопом и (Г) определения того, связывается ли указанный модифицированный иммуноглобулин с указанным эпитопом.

2. Способ по п.1, в котором указанная модификация обеспечивает модификацию более чем одной структурной петли для обеспечения сайта, связывающегося с указанным эпитопом.

3. Способ по п.1 или 2, в котором указанная модификация исключает встраивание биологически активного пептида длиной от 2 до 40 аминокислот в Ес-домен.

4. Способ по любому из пп.1-3, в котором указанная антигенная молекула представляет собой молекулу, выбранную из группы, состоящей из аллергенов, раковых антигенов, аутоантигенов, ферментов, бактериальных антигенов, грибковых антигенов, вирусных антигенов и протозойных антигенов.

5. Способ по любому из пп.1-4, характеризующийся тем, что указанный иммуноглобулин специфически связывается по меньшей мере с двумя различными эпитопами.

6. Способ по любому из пп.1-5, характеризующийся тем, что указанный иммуноглобулин является мультиспецифическим, специфически связывающимся по меньшей мере с одной первой антигенной молекулой и по меньшей мере с одной второй антигенной молекулой посредством по меньшей мере одной модификации по меньшей мере в одном участке структурной петли указанного иммуноглобулина, причем вторая молекула выбрана из группы, состоящей из аллергенов, раковых антигенов, аутоантигенов, ферментов, бактериальных антигенов, грибковых антигенов, вирусных антигенов и протозойных антигенов.

7. Способ по любому из пп.1-6, характеризующийся тем, что указанная антигенная молекула выбрана из группы, состоящей из раковых антигенов, в частности ЕрСАМ, ракового гликопротеина-72 (ТА6-72), ракового антигена СА 125, простата-специфического мембранного антигена (Р8МА), высокомолекулярного антигена, связанного с меланомой (ИМ^-МАА), ракового антигена, экспедирующего Υсцепленный углевод Льюиса, раково-эмбрионального антигена (СЕА), СЕАСАМ5, нМЕС РЕМ, МИС1 муцина, МИС18 и ракового антигена цитокератина, бактериальных антигенов, вирусных антигенов, аллергенов, флуоресцеина, лизоцима, !о11-подобного рецептора 9, эритропоэтина, СИ2, СИ3, СИ3Е, СИ4, СИ11, СИ11а, СИ14, СИ18, СИ19, СИ20, СИ22, СИ23, СИ25, СИ28, СИ29, СИ30, СИ33 (белка р67), СИ38, СИ40, СИ40Ь, СИ52, СИ54, СИ56, СИ80, СИ147, 6Ό3, 1Ь-1, 1Б-1В, 1Ь-2, 1Б-2В, 1Ь-4, 1Ь-5, 1Ь-6, 1Ь6В, 1Ь-8, 1Б-12, 1Б-15, 1Б-18, 1Б-23, α-интерферона, β-интерферона, γ-интерферона, ТИЕ-а, ТИЕ-в2, ТИЕαβ, ТИЕ-В1, ТИЕ-ВП, ЕазЬ, СИ27Ь, СИ30Ь, 4-1ВВБ, ТВА1Б, ВАИКЬ, Т№ЕАК, АРВ1Б, ВАРЕ, ЫСЫТ, УЕ61, ОХ40Б, рецептора-1 ТВА1Б, А1-рецептора аденозина, рецептора β-лимфотоксина, ТАС1, ВАГЕ-В, ЕРО, ЬЕА-3, 1САМ-1, 1САМ-3, β1-интегрина, β2-интегрина, α4/β7-интегрина, а2-интегрина, а3

- 100 018897 интегрина, а4-интегрина, а5-интегрина, а6-интегрина, аУ-интегрина, аУ/в3-интегрина, ЕСЕВ-3, фактора роста кератиноцитов, УБА-1, УБА-4, Б-селектина, анти-1б, Е-селектина, НБА, НБА-ЭВ,, СТБА-4, Тклеточных рецепторов, В7-1, В7-2, УНВ-интегрина, ТСЕ-βΕ ТСЕ-32, эотаксина-1, ВБу8 (стимулятора Влимфоцитов), комплемента С5, 1дЕ, фактора VII, СБ64, СВБ, ЫСА 90, ЕСЕВ (ЕгЬВ-1), Нег2/иеи (ЕгЬВ-2), Нег3 (ЕгЬВ-3), Нег4 (ЕгЬВ-4), тканевого фактора, УЕСЕ, УЕСЕ-В, рецептора эндотелина, УБА-4, таких углеводов, как антигены групп крови и родственные углеводы, СаШЕгликозилирования, гастрина, рецепторов гастрина, раковых углеводов, гаптена ΝΡ-сар или ΝΊΡ-сар, Т-клеточного рецептора α/β, Еселектина, дигоксина, плацентарной щелочной фосфатазы (РБАР) и РБАР-подобной щелочной фосфатазы яичек, рецептора трансферрина, гепараназы I, сердечного миозина человека, гликопротеида ПЬ/Ша (СРПЬ/Ша), гликопротеида дН оболочки цитомегаловируса человека (НСМУ), др120 ВИЧ, НСМУ, гликопротеида Е респираторного синцитиального вируса (В5У), Едр В8УЕ, УНВ-интегрина, др120 вируса Нер В, СМУ, дрПЬШа, петли У3 др120 ВИЧ ШВ, Едр респираторного синцитиального вируса (В8У), гликопротеида др вируса Негрек К1тр1ех (Н8У), гликопротеида дВ Н8У, гликопротеида дВ оболочки НСМУ, токсина С1ок1пбшт ретйтпдеик и их фрагментов.

8. Способ по п.7, в котором указанный модифицированный иммуноглобулин обладает специфичностью связывания с неонатальным Ес-рецептором (ЕсВп).

9. Способ по п.7, в котором указанный модифицированный иммуноглобулин обладает специфичностью связывания с эффекторной молекулой.

10. Способ по любому из пп.1-9, характеризующийся тем, что иммуноглобулин включает тяжелую и/или легкую цепь иммуноглобулина или её часть.

11. Способ по любому из пп.1-10, характеризующийся тем, что иммуноглобулин включает по меньшей мере один константный домен и/или по меньшей мере один вариабельный домен иммуноглобулина.

12. Способ по любому из пп.1-11, характеризующийся тем, что иммуноглобулин содержит по меньшей мере один одиночный домен или его часть, включая мини-домен, состоящий из двух бета-цепей домена иммуноглобулина, соединенных структурной петлей, одиночный вариабельный домен иммуноглобулина или одноцепочечный Еу.

13. Способ по любому из пп.1-12, характеризующийся тем, что иммуноглобулин выбран из группы, состоящей из ЕаЬ-фрагмента, Ес-фрагмента, одиночного домена иммуноглобулина, одноцепочечного димера С_Н3 (ксС_Н3), ксС_Н2, ксС_Н1/С_ь и полноразмерного иммуноглобулина.

14. Способ по любому из пп.1-13, характеризующийся тем, что иммуноглобулин содержит константный домен, выбранный из группы С_Н1, С_Н2, С_Н3, С_Н4, С_ъ и их комбинаций, включая ЕаЬ-фрагмент, Ес-фрагмент или полноразмерный иммуноглобулин.

15. Способ по любому из пп.1-14, характеризующийся тем, что иммуноглобулин содержит легкую цепь Ц-каппа или ^-лямбда.

16. Способ по любому из пп.1-15, характеризующийся тем, что иммуноглобулин является человеческим, гуманизированным, химерным, мышиным или верблюжьим иммуноглобулином или его гомологом.

17. Способ по любому из пп.15, 16, характеризующийся тем, что иммуноглобулин выбран из группы, состоящей из ЦА, ^А1, ЦА2, !дО- IдЕ, ^С1, ЦС2, ЦС2А, ЦС2В, [дС2С, ЦС3, ЦС4 и ЦМ.

18. Способ по любому из пп.1-17, характеризующийся тем, что указанная модификация приводит к замене, и/или делеции, и/или вставке нуклеотида.

19. Способ по любому из пп.1-18, характеризующийся тем, что указанная модифицированная нуклеотидная последовательность содержит по меньшей мере одно повторяющееся нуклеотидное звено с последовательностью 5-ΝΝ8-3', 5'-ΝΝΝ-3' или 5'-ΝΝΚ-3'.

20. Способ по любому из пп.1-19, характеризующийся тем, что модифицированный иммуноглобулин экспрессируют в хозяине, выбранном из группы, состоящей из бактериального хозяина, дрожжевой клетки, растительной клетки, животной клетки, растения и животного.

21. Способ по любому из пп.1-20, характеризующийся тем, что специфическое связывание модифицированного иммуноглобулина с эпитопом антигенной молекулы определяют методом определения связывания, выбранным из группы, состоящей из иммунологических методов, предпочтительно методов ферментного иммуносорбентного анализа (ЕЫ8А), поверхностного плазмонного резонанса, разностной спектроскопии ядерного магнитного резонанса с насыщающим переносом, спектроскопии ядерного магнитного резонанса с переносом NΟЕ (ΙγΝΟΞ), конкурентными методами, методами тканевого связывания, методами связывания с живыми клетками и методами клеточных экстрактов.

22. Способ по любому из пп.1-21, характеризующийся тем, что модифицированный иммуноглобулин конъюгируют с меткой, выбранной из группы, состоящей из органических молекул, ферментных меток, радиоактивных меток, окрашенных меток, флуоресцентных меток, хромогенных меток, люминесцентных меток, гаптенов, дигоксигенина, биотина, комплексных соединений металлов, металлов, коллоидного золота и их смесей.

23. Способ изготовления фармацевтического препарата, содержащего иммуноглобулин, посредст

- 101 018897 вом конструирования модифицированного иммуноглобулина способом по любому из пп.1-22 и введения указанного модифицированного иммуноглобулина в фармацевтический препарат.

24. Способ получения библиотеки модифицированных иммуноглобулинов, модифицированных способом по любому из пп.1-22, включающий стадии получения нуклеиновой кислоты, кодирующей иммуноглобулин, содержащий по меньшей мере один участок структурной петли;

модификации по меньшей мере одного нуклеотидного остатка в участке нуклеиновой кислоты, кодирующем по меньшей мере один из указанных участков структурных петель методом мутагенеза;

переноса указанной модифицированной нуклеиновой кислоты в экспрессионную систему;

экспрессии модифицированного иммуноглобулина с получением библиотеки модифицированных иммуноглобулинов и определения в указанной библиотеке ряда иммуноглобулинов, которые связываются с указанным эпитопом.

25. Способ получения библиотеки нуклеиновых кислот, кодирующих иммуноглобулины, модифицированные способом по любому из пп.1-22, включающий стадии получения нуклеиновой кислоты, кодирующей иммуноглобулин, содержащий по меньшей мере один участок структурной петли;

модифицикации по меньшей мере одного нуклеотидного остатка в участке нуклеиновой кислоты, кодирующем по меньшей мере один из указанных участков структурных петель с получением библиотеки нуклеиновых кислот, кодирующих модифицированные иммуноглобулины.

26. Способ по п.24 или 25, в котором указанная модификация обеспечивает модификацию более чем одной структурной петли для обеспечения нового сайта связывания для указанного эпитопа.

27. Способ по любому из пп.24-2б, в котором указанная модификация приводит к мутациям по меньшей мере в б аминокислотных положениях по меньшей мере в одном участке структурной петли.

28. Библиотека, получаемая способом по любому из пп.24-27.

29. Библиотека по п.28, включающая по меньшей мере 10 модифицированных иммуноглобулинов, имеющих одинаковую или разную специфичность.

30. Библиотека по п.28 или 29, включающая по меньшей мере 10 различных модифицированных иммуноглобулинов, имеющих одинаковую специфичность и связывающихся с одним и тем же эпитопом.

31. Библиотека по любому из пп.28-30, в которой указанный иммуноглобулин содержит по меньшей мере один одиночный домен или его часть, включая мини-домен, состоящий из двух бета-цепей домена иммуноглобулина, соединенных структурной петлей, одиночный вариабельный домен или одноцепочечный Ρν.

32. Библиотека по любому из пп.28-31, отличающаяся тем, что модифицированный участок структурной петли происходит из константного домена иммуноглобулина, выбранного из группы, состоящей из С_н1, С_н2, С_н3, С_н4, Сь, где модификация затрагивает по меньшей мере одно положение аминокислот в аминокислотной последовательности, выбранных из группы, состоящей из аминокислот 7-21, аминокислот 25-39, аминокислот 41-81, аминокислот 83-85, аминокислот 89-103 и аминокислот 10б-117, где нумерация приведена в соответствии с 1МСТ.

33. Библиотека по любому из пп.28-32, отличающаяся тем, что иммуноглобулин содержит константный домен иммуноглобулина, выбранный из группы, состоящей из С_н1, С_н2, С_н3, С_н4, С_ъ и их комбинаций, включая ГаЬ-фрагмент, Рс-фрагмент или полноразмерный иммуноглобулин.

34. Библиотека по любому из пп.28-33, отличающаяся тем, что модифицированный участок структурной петли происходит из легкой цепи 1д-каппа или 1д-лямбда, где модификация затрагивает по меньшей мере одно из положений аминокислот в аминокислотной последовательности, выбранных из группы, состоящей из аминокислот 8-18, аминокислот 27-35, аминокислот 42-78, аминокислот 83-85, аминокислот 92-100, аминокислот 108-117 и аминокислот 123-12б.

35. Библиотека по любому из пп.28-34, в которой иммуноглобулин содержит вариабельный домен с модифицированным участком структурной петли, где модификация затрагивает по меньшей мере одно из положений аминокислот в аминокислотной последовательности, выбранных из группы, состоящей из аминокислот 8-20, аминокислот 44-50, аминокислот б7-7б, аминокислот 89-101, где нумерация приведена в соответствии с 1МСТ.

36. Библиотека по любому из пп.28-35, которая представляет собой библиотеку иммуноглобулинов.

37. Библиотека по любому из пп.28-3б, которая представлена на поверхности хозяина.

38. Библиотека по п.37, в которой указанный хозяин выбран из группы, состоящей из клеток млекопитающих, бактерий, насекомых или дрожжей.

39. Библиотека по любому из пп.28-38, которая представлена фагами, фагмидами или вирусами.

40. Библиотека по любому из пп.28-39, которая представляет собой библиотеку нуклеиновых кислот, кодирующих модифицированные иммуноглобулины.

41. Библиотека по любому из пп.28-40, которая представлена технологией дисплея ίη νίΐτο.

42. Способ специфического связывания и/или детектирования антигенной молекулы, включающий стадии:

- 102 018897 (a) контактирования библиотеки модифицированных иммуноглобулинов по любому из пп.28-41 с тестируемым образцом, содержащим указанную молекулу; и (b) детектирования образованного специфического комплекса модифицированный иммуноглобулин/молекула.

43. Способ специфического выделения модифицированного иммуноглобулина, связывающегося с антигенной молекулой, включающий стадии:

(a) контактирования библиотеки модифицированных иммуноглобулинов по любому из пп.28-41 с образцом, содержащим указанную молекулу;

(b) отделения образовавшегося специфического комплекса модифицированный иммуноглобулин/молекула и (c) выделения модифицированного иммуноглобулина из указанного комплекса.

44. Константный домен иммуноглобулина, полученного способом по любому из пп.1-22, или его часть, содержащий по меньшей мере один участок структурной петли любого из Сц1 домена, С_н2 домена, С.'| |3 домена, С_н4 домена или Сь домена, причем указанный по меньшей мере один участок структурной петли содержит по меньшей мере одну модификацию, обеспечивающую связывание указанного по меньшей мере одного модифицированного участка петли с эпитопом антигена, где константный домен немодифицированного иммуноглобулина не связывается с указанным эпитопом, причем указанная модификация исключает из своего числа встраивание фармакологически активного пептида длиной от 2 до 40 аминокислот в Ес домен.

45. Модифицированный иммуноглобулин, содержащий константный домен иммуноглобулина или его часть по п.44, в котором указанный модифицированный участок петли находится в любом из доменов легкой цепи 1д-лямбда или 1д-каппа, ЕаЬ-фрагмента или Ес-фрагмента.

46. Модифицированный иммуноглобулин, содержащий константный домен иммуноглобулина или его часть по любому из пп.44, 45, который происходит из 1дС.

47. Модифицированный иммуноглобулин, содержащий константный домен иммуноглобулина или его часть по любому из пп.44-46 по меньшей мере с двумя модифицированными участками структурных петель.

48. Иммуноглобулин, включающий по меньшей мере один модифицированный иммуноглобулин, содержащий константный домен иммуноглобулина или его часть по любому из пп.44-47, в котором указанный модифицированный участок структурной петли включает по меньшей мере 6 аминокислотных модификаций.

49. Нуклеиновая кислота, кодирующая иммуноглобулин, содержащий константный домен иммуноглобулина или его часть по любому из пп.44-48.

50. Вариабельный домен иммуноглобулина или его часть, который может быть получен способом по любому из пп.1-22, включающий по меньшей мере один участок структурной петли вариабельного домена тяжелой или легкой цепи иммуноглобулина, причем указанный по меньшей мере один участок структурной петли включает по меньшей мере одну модификацию для обеспечения отличного от СОЯ сайта связывания, связывающегося с эпитопом антигена, где немодифицированный участок структурной петли не связывается с указанным эпитопом, где указанная модификация является:

модификацией иммуноглобулина, содержащего любой из участков структурных петель С_н1, С_н2, С_н3 и С_н4, по меньшей мере в одном из положений аминокислот в аминокислотной последовательности, выбранных из группы, состоящей из аминокислот 7-21, аминокислот 25-39, аминокислот 41-81, аминокислот 83-85, аминокислот 89-103 и аминокислот 106-117, или модификацией иммуноглобулина, содержащего любой из участков структурных петель 1д-каппа или 1д-лямбда, по меньшей мере в одном из положений аминокислот в аминокислотной последовательности, выбранных из группы, состоящей из аминокислот 8-18, аминокислот 27-35, аминокислот 42-78, аминокислот 83-85, аминокислот 92-100, аминокислот 108-117 и аминокислот 123-126, или модификацией иммуноглобулина, содержащего любой из участков структурных петель вариабельного домена, по меньшей мере в одном из положений аминокислот в аминокислотной последовательности, выбранных из группы, состоящей из аминокислот 8-20, аминокислот 44-50, аминокислот 67-76, аминокислот 89-101, где нумерация приведена в соответствии с 1МСТ.

51. Модифицированный иммуноглобулин, содержащий вариабельный домен иммуноглобулина или его часть по п.50, в котором указанный модифицированный участок петли находится в любом из У_н, Ук, У_ь или У_а доменов.

52. Модифицированный иммуноглобулин, содержащий вариабельный домен иммуноглобулина или его часть по п.50 или 51, в котором указанный модифицированный участок петли находится в Сконцевой области.

53. Модифицированный иммуноглобулин, содержащий вариабельный домен иммуноглобулина или его часть по любому из пп.50-52, в котором указанная модификация включает мутагенез нижней петли, выбранной из группы, состоящей из петель, соединяющих бета-цепи А-В, С-С', С-0 и Е-Е вариабельного домена.

54. Модифицированный иммуноглобулин, содержащий вариабельный домен иммуноглобулина или

- 103 018897 его часть по любому из пп.50-53, который включает бивалентный или биспецифичный домен.

55. Модифицированный иммуноглобулин, содержащий вариабельный домен иммуноглобулина или его часть по любому из пп.50-54, который включает одиночный домен иммуноглобулина или одноцепочечный Еу.

56. Модифицированный иммуноглобулин, содержащий вариабельный домен иммуноглобулина или его часть по любому из пп.50-55, по меньшей мере с двумя модифицированными участками структурных петель.

57. Иммуноглобулин, включающий по меньшей мере один модифицированный иммуноглобулин, содержащий вариабельный домен иммуноглобулина или его часть по любому из пп.50-56, в котором указанный модифицированный участок структурной петли включает по меньшей мере 6 аминокислотных модификаций.

58. Нуклеиновая кислота, кодирующая иммуноглобулин, содержащий вариабельный домен иммуноглобулина или его часть по любому из пп.50-57.

59. Иммуноглобулин, содержащий константный домен иммуноглобулина или его часть по любому из пп.44-48 и/или вариабельный домен иммуноглобулина или его часть по любому из пп.50-57, который обладает специфичностью связывания в отношении ЕсВп или эффекторной молекулы.

60. Фармацевтический препарат, содержащий иммуноглобулин, содержащий константный домен иммуноглобулина или его часть по любому из пп.44-48 и/или вариабельный домен иммуноглобулина или его часть по любому из пп.50-57.