EA017417B1 - КОНСТРУКТ ОДНОДОМЕННОГО АНТИТЕЛА, КОТОРЫЙ СВЯЗЫВАЕТСЯ С ЧЕЛОВЕЧЕСКИМ TNF-α, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ - Google Patents

КОНСТРУКТ ОДНОДОМЕННОГО АНТИТЕЛА, КОТОРЫЙ СВЯЗЫВАЕТСЯ С ЧЕЛОВЕЧЕСКИМ TNF-α, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ Download PDF

Info

Publication number
EA017417B1
EA017417B1 EA200870208A EA200870208A EA017417B1 EA 017417 B1 EA017417 B1 EA 017417B1 EA 200870208 A EA200870208 A EA 200870208A EA 200870208 A EA200870208 A EA 200870208A EA 017417 B1 EA017417 B1 EA 017417B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
zeg
tht
domain antibody
bie
sequence
Prior art date
Application number
EA200870208A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200870208A1 (ru
Inventor
Энтони Джерард Дойл
Бенджамин П. Вулвен
Ян М. Томлинсон
Дженнифер А. Ли
Филип Энтони Дженнингз
Original Assignee
Сефалон Астралия Пти Лтд.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from AU2006900456A external-priority patent/AU2006900456A0/en
Application filed by Сефалон Астралия Пти Лтд. filed Critical Сефалон Астралия Пти Лтд.
Publication of EA200870208A1 publication Critical patent/EA200870208A1/ru
Publication of EA017417B1 publication Critical patent/EA017417B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/08—Bronchodilators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/06—Antigout agents, e.g. antihyperuricemic or uricosuric agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/02—Antidotes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G01N2333/525—Tumor necrosis factor [TNF]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/16—Ophthalmology
    • G01N2800/164—Retinal disorders, e.g. retinopathy

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение предоставляет конструкт однодоменного антитела, который связывается с человеческим TNF-α, причем конструкт включает: (а) однодоменное антитело (dAb), которое связывается с человеческим TNF-α; (b) модифицированную последовательность шарнирной области; (с) последовательность константной области тяжелой цепи человека или примата, имеющую усеченный домен C1 не более чем из 20 остатков, где указанная модифицированная последовательность шарнирной области содержит или делецию, или одну аминокислотную замену по меньшей мере одного цистеинового остатка, который обычно способствует образованию дисульфидной связи между тяжелой и легкой цепями антитела.

Description

Область, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к конструкту однодоменного антитела, полезному для лечения людей. Более конкретно, настоящее изобретение относится к конструкту однодоменного антитела, который связывается с человеческим ΤΝΡ-α, и к его применению при лечении расстройств, характеризующихся активностью ΤΝΡ-α.
Предпосылки изобретения
Фактор некроза опухоли альфа (ΤΝΡ-α) представляет собой цитокин, который вовлечен в опосредование шока и патофизиологии разнообразных заболеваний человека и расстройств, включающих сепсис, инфекции, аутоиммунные заболевания, например ревматоидный артрит, болезнь Крона, язвенный колит и другие кишечные заболевания, псориаз, токсический шок, отторжение трансплантата и болезнь трансплантат против хозяина. ΤΝΡ-α продуцируется, главным образом, активированными макрофагами и Т-лимфоцитами, но также нейтрофилами, эндотелиальными клетками, кератиноцитами и фибробластами во время острых воспалительных реакций.
ΤΝΡ-α, ввиду его роли при воспалении, стал важной мишенью для ингибирования при усилиях по снижению симптомов воспалительных заболеваний. Преследуются различные подходы к ингибированию ΤΝΡ-α для клинического лечения заболеваний, включая, в частности, применение растворимых рецепторов ΤΝΡ-α и ΤΝΡ-α-специфичных антител.
Однодоменные антитела.
Однодоменные антитела (бАЬ) представляют собой самые маленькие функционирующие связывающие единицы антител и соответствуют вариабельным областям или тяжелой (Ун), или легкой (Уъ) цепей антител. Однодоменные антитела имеют молекулярную массу приблизительно 13 кДа или менее одной десятой размера полного антитела.
В отличие от обычных антител однодоменные антитела хорошо экспрессируются в системах бактерий, дрожжей и млекопитающих. Их малый размер дает возможность получения более высоких молярных количеств на грамм продукта, обеспечивая, таким образом, значительное увеличение активности на миллиграммовую дозу. Кроме того, бАЬ можно использовать в качестве строительных блоков для создания терапевтических продуктов, таких как бЛЬ-содержащие молекулы множественного нацеливания, в которых два или более бАЬ связываются с двумя или более определенными молекулярными мишенями, или бАЬ могут быть включены в структуры, предназначенные для легочного или перорального введения.
Заявители в настоящее время разработали новый конструкт однодоменного антитела, содержащий вариабельный домен иммуноглобулина, соединенный с константной областью, включающей усеченный домен СН1. Считают, что включение константной области поможет продлить период полужизни ίη νίνο бАЬ, который обычно имеет короткую продолжительность.
Иммуноглобулин приматов Нового Света.
Эволюционно отдаленные приматы, такие как приматы Нового Света, по существу, подобны человеку в отношении наличия антител, аналогичных человеческим антителам, так что хозяин не генерирует иммунный ответ против антитела, когда такие антитела, полученные от приматов, вводят человеку. Приматы Нового Света (подотряд Р1а(уггН1П1) включают по меньшей мере 53 вида, обычно разделенные на два семейства, СаШИпабас и С’сЫбас. СаШИпабас состоят из игрунок и тамаринов. С’сЫбас включают беличьих обезьян, прыгунов, паукообразных обезьян, шерстистых обезьян, капуцинов, ночных или совиных обезьян и ревунов.
Предыдущие исследования характеризовали экспрессированный репертуар тяжелой цепи иммуноглобулина игрунки Са11ййпх )асс1и.15 (νοη Вибшдсп ΙΙ.-С. с! а1., С’11агас1сп/аОоп οί 111с схргс88сб 1шшипод1оЬи1ш ЮНУ гсрсПойс ίη 111с Ναν \УогЮ тагтохс! С’а11Ц11пх )ассНи8. 1ттиподспс1тс8; 53:557-563 (2001))). Были идентифицированы шесть подгрупп ЮНУ, которые проявили высокую степень аналогии последовательности с их человеческими копиями ЮНУ. Каркасные области были более сохранными по сравнению с областями, определяющими комплементарность (СЭЯ), при наибольшей степени вариабельности, локализованной в СЭК.3. Степень аналогии между С'.)асс1ш8 и последовательностями ЮНУ человека была меньше, чем между обезьянами Старого Света и людьми.
Сущность изобретения
В первом аспекте настоящее изобретение предоставляет конструкт однодоменного антитела, который связывается с человеческим ΤΝΡ-α, причем конструкт включает:
(a) однодоменное антитело (бАЬ), которое связывается с человеческим ΤΝΡ-α;
(b) модифицированную последовательность шарнирной области;
(c) последовательность константной области тяжелой цепи человека или примата, имеющую усеченный домен СН1 не более чем из 20 остатков, более предпочтительно не более чем из 10 остатков, еще более предпочтительно не более чем из 5 остатков и даже более предпочтительно из одного остатка;
где указанная модифицированная последовательность шарнирной области содержит или делецию, или одну аминокислотную замену цистеинового остатка, который обычно способствует образованию дисульфидной связи между тяжелой и легкой цепями антитела.
Во втором аспекте настоящее изобретение предоставляет последовательность нуклеиновой кисло
- 1 017417 ты, кодирующую конструкт однодоменного антитела по первому аспекту изобретения.
В третьем аспекте настоящее изобретение предоставляет выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, включающую последовательность, кодирующую конструкт однодоменного антитела, который связывает человеческий ΤΝΡ-α, где молекула нуклеиновой кислоты включает последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 60%, предпочтительно по меньшей мере на 80% идентичную, более предпочтительно по меньшей мере на 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичную последовательности, представленной в 8ЕО ΙΌ Νο: 50 или 8ЕО ΙΌ Νο: 51, и наиболее предпочтительно последовательность, представленную в 8ЕО ΙΌ Νο: 50 или 8ЕО ΙΌ Νο: 51.
В четвертом аспекте настоящее изобретение предоставляет выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, включающую последовательность, кодирующую конструкт однодоменного антитела, который связывает человеческий ΤΝΡ-α, где молекула нуклеиновой кислоты включает последовательность нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в условиях высокой строгости с нуклеотидной последовательностью, представленной в 8ЕО ΙΌ Νο: 50 или 8ЕО ΙΌ Νο: 51.
В пятом аспекте изобретение предоставляет фармацевтическую композицию, содержащую эффективное количество конструкта однодоменного антитела в соответствии с первым аспектом вместе с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем.
В шестом аспекте настоящее изобретение предусматривает применение конструкта однодоменного антитела в соответствии с пятым аспектом изобретения при диагностике для выявления человеческого ΤΝΡ-α.
В седьмом аспекте изобретение предоставляет способ лечения расстройства, характеризующегося активностью человеческого ΤΝΡ-α у индивидуума-человека, включающий введение индивидууму фармацевтической композиции в соответствии со вторым аспектом изобретения.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 показана аминокислотная (8ЕО ΙΌ Νο: 5) и нуклеотидная последовательность (8ЕО ΙΌ Νο: 6) акцепторного бЛЬ.
На фиг. 2 показана структура предпочтительного варианта осуществления конструкта однодоменного антитела в соответствии с настоящим изобретением в виде (А) мономера и (В) димера.
На фиг. 3 показаны нуклеотидная и аминокислотная последовательности сегментов гена V одиннадцати (11) игрунок и шести (6) совиных обезьян.
На фиг. 4 показана аминокислотная (8ЕО ΙΌ Νο: 5) и нуклеотидная последовательности акцепторного бАЬ (обеих нитей; 8ЕО ΙΌ Νο: 6 и 68). На чертеже показаны рестрикционные сайты переваривания для Κρη Ι и 8аи ΌΙ, которые осуществляют удаление области, включающей ί.ΌΡ2. Удаленные остатки ί.ΌΡ2 указаны подчеркиванием.
На фиг. 5 показана способность соединения 170 (8ЕО ΙΌ Νο: 11) нейтрализовать опосредованную ΤΝΡ-α цитотоксичность при анализе жизнеспособности мышиных клеток Ь929.
На фиг. 6 показано, что соединение 170 (8ЕО ΙΌ Νο: 11) предотвращает взаимодействие ΤΝΡ-α с рецепторами р55 или р75 человеческого ΤΝΡ.
На фиг. 7 показано окрашивание соединением 170 (8ЕО ΙΌ Νο:11) клеток Ν8Θ 27Ό4, экспрессирующих трансмембранный ΤΝΡ-α (сплошная черная линия), проявляющих более высокую интенсивность флуоресценции, чем нерелевантный, подобранный по изотипу специфичности контроль (серая закраска).
На фиг. 8 показано, что соединение 170 (8ЕО ΙΌ Νο: 11), продуцируемое в бактериальной экспрессионной системе, сохраняет связывание с ΤΝΡ-α в ЕЫ8А.
На фиг. 9 показана эффективность соединения 170 (8ЕО ΙΌ Νο: 11) на мышиной модели ΤΝΡопосредованного артрита относительно человеческого Ι§Ο1, регулирующего специфичность.
Через еженедельные интервалы у мышей проводили балльную оценку (балльная оценка артрита), А, и их взвешивали, В.
На фиг. 10 показано влияние на экспрессию белка соединения 112 (8ЕО ΙΌ Νο: 59) и соединения 170 (5ЕС) ΙΌ Νο: 11).
На фиг. 11 показан невосстанавливающий анализ 8Ό8 РАСЕ соединения 170 (8ЕО ΙΌ Νο: 11), очищенного белком А, из 4x10 л ферментаций лидерной клеточной линии; полоса 1 = контроль между анализами; полоса 2 = маркеры молекулярной массы; полоса 3 = контроль; полоса 4 = соединение 170 (8ЕО ΙΌ Νο: 11), очищенное белком А, в 10 л ферментационной ΙΌ (цикл 1); полоса 5 = соединение 170, очищенное белком А, в 10 л ферментационной ΙΌ (цикл 2); полоса 6 = соединение 170, очищенное белком А, в 10 л ферментационной ΙΌ (цикл 3); полоса 7 = соединение 170, очищенное белком А, в 10 л ферментационной ΙΌ (цикл 4).
На фиг. 12 показан восстанавливающий анализ 8Ό8 РАСЕ соединения 170 (8ЕО ΙΌ Νο: 11), очищенного белком А, из 4x10 л ферментаций лидерной клеточной линии; полоса 1 = контроль между анализами; полоса 2 = маркеры молекулярной массы; полоса 3 = контроль; полоса 4 = соединение 170 (8ЕО ΙΌ Νο: 11), очищенное белком А, в 10 л ферментационной ΙΌ (цикл 1); полоса 5 = соединение 170, очищенное белком А, в 10 л ферментационной ΙΌ (цикл 2); полоса 6 = соединение 170, очищенное белком А,
- 2 017417 в 10 л ферментационной ГО (цикл 3); полоса 7 = соединение 170, очищенное белком А, в 10 л ферментационной ГО (цикл 4).
Подробное описание изобретения
Заявители создали конструкт однодоменного антитела, который связывается с человеческим ΤΝΕ-α и который, как указано, проявляет низкую иммуногенность при введении людям. Конструкт однодоменного антитела включает часть, соответствующую вариабельному домену тяжелой или легкой цепи иммуноглобулина (т.е. однодоменное антитело (ЙАЬ)), шарнирную область и часть, соответствующую константной области тяжелой цепи антитела, но где константная область имеет усеченный домен СН1.
Указывается, что включение константной области увеличивает период полужизни ЙАЬ ίη νίνο, а также обеспечивает эффекторные функции, которые, как считают, являются компонентом противовоспалительного механизма антител против ΤΝΕ.
В первом аспекте настоящее изобретение предоставляет конструкт однодоменного антитела, который связывается с человеческим ΤΝΒ-α, причем конструкт включает:
(a) однодоменное антитело (ЙАЬ), которое связывается с человеческим ΤΝΒ-α, (b) модифицированную последовательность шарнирной области;
(c) последовательность константной области тяжелой цепи человека или примата, имеющую усеченный домен СН1 не более чем из 20 остатков, более предпочтительно не более чем из 10 остатков, еще более предпочтительно не более чем из 5 остатков и даже более предпочтительно из одного остатка;
где указанная модифицированная последовательность шарнирной области содержит или делецию, или одну аминокислотную замену цистеинового остатка, который обычно способствует образованию дисульфидной связи между тяжелой и легкой цепями антитела.
В предпочтительном варианте осуществления последовательность домена СН1 и шарнирная область представляют собой ΧΕΡΚδΖΌΚΤΙΙΤΟΡΡΟΡΑ, где X обозначает валин, лейцин или изолейцин, а Ζ отсутствует или обозначает аминокислоту, отличную от цистеина. Предпочтительно, чтобы X был валином, а Ζ был серином.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения ЙАЬ содержит вариабельный домен тяжелой или легкой цепи иммуноглобулина, где указанный вариабельный домен включает по меньшей мере одну область, определяющую комплементарность (СЭР), имеющую последовательность, полученную от примата Нового Света, где СОВ выбрана из группы, состоящей из ΑΑΤΚ^^8 (8ΕΟ ГО Νο: 1), ЕА8§ЬР§ (8ΕΟ ГО Νο: 2), НА8КЕО8 (8ΕΟ ГО Νο: 3) и ^δΝΕΕΤ (8Ер ГО Νο: 4).
В другом предпочтительном варианте осуществления СОК представляет собой СЭК2.
В предпочтительном варианте осуществления ЙАЬ имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
П^МТд8РЗЗЬ5А$УаоКУ'ПТСКА5рЗЮЗ’ШГ^УООКРаКАРК1ХП,5А5КЬЕТСг νΡδΚΡδϋδαδοτοΓΓΓΤ^δΕΟΡΕΟΡΑΤΥΥοςςννννκρρτραοατκνΕίκκ (Соединение 145; ЗЕО Ю Νο:7) ϋΙ9ΜΤ05Ρ58υ8Α8ν<1ΟΚ.νΊΤΓΟΕΑ8(2Απ>3ΥίΗννγς0ΚΡσΚΑΡΚ1ΕΙΥ5Α8ΝΕΓϊΤ аУР5КГ503С89ТОКГкТ788ЪОРЕОРАТУУСООУУТУКРРТРаООТКУЕ1КЯ (Соединение 123; ЗЕр Ю Νο;8)
О^МТрЗРЗЗЪЗАйУрОКУЗ'П'СЙАЗрЗтЗУЪШ^УррКРСКАРКЪЕГУЗАЗМЬЕТа УРЗКРЗРЗСЗСТПЕГЬТКЖЛ.РНПЕАТУУСррУУТУЙРЕТЕ'СрОТКУЕЖК (Соединение 100;ЗЕрЮ№>:9)
И0МТХ25Р581£А5УООКУТ1ТС1^50АГО5УЬ№УУ00КРОКАРКШУ8А8КЕЕТ θνΡ3ΚΡ3Ο3Ο5σΤΟΕη,Τί35ΕΕΡΕϋΡΛΤΥΥσ0Ρνν\νΚΡΓΠΌ0σΤΚνΕΙΚΚ (Соединение 196; 5ЕР Ю Νο: 10)
ΟΙ0ΜΤ03Ρ381ΛΑ5νσθΕνΤΓΤ€ΚΑ5<18η>5ΥΙ.Η\νΥ2ρΚΡσΚΡΡΐαΐΓΥ8Α8ΝΕΕΤ0 УР8ВРЗОЗС13ОТОГГЕТ188ЕрРЕПЕАТУУСРрУУ^КРРТРа0ОТКУЕ1К1г (Соединение 134; ЗЕр ΙΕ> Νο:52) ΟΐΡΜΤΡ5Ρ33Ι^Α3νθϋΕ.νΤΠ,€ΒΑ3()51ϋ5ΥΕΗ4ΓΥ<}ρΚΡ6ΚΛΡΚΙΧΙΥ8Α$ΝΕΕΤΟ УРЗЙГЗОВ.С.ЗСТРРТЬ'ПБЗЕрРЕОРА'П^СррУУУ/РРЕТРСОаТКУЕТКК (Соединение 137,5 Εζ П> Νο:53)
ΟΐΡΜΤΡ3Ρ83Ε5Α3νσθΚντΠ’€ιί1Λ308ΤΟ3ΥΕΠΥ/ΥρρΚΡαΚΛΡΚΕΕΓΥ3Α3ΝΙ.ΕΤα УРЗКЕ8О8аЗСГГОГГЪТ133ЕУРШРЛТУУСррУУУ/КРГТГО<ЗаТКУЕ1КК (Соединение 121,; ЗЕО ΙΟ Νο:54);
и последовательность, по меньшей мере на 95%, более предпочтительно по меньшей мере на 96, 97, 98 или 99% идентичную одной из этих последовательностей.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления константная область включает домены СН2 и СН3, которые вместе имеют следующую последовательность:
- 3 017417
ΡΕΙΧαΟΡδνΗΛΦΡΚΡΚΟΤΙ.ΜΙδΚΤΡΕνΊΧ^νΎϋνΒΙΙΕΟΡΕνΚΙΉλ^ΎνΟΟνΕνΗΝ' ΑΚΤΚΡΚΕΕςΥΝ8ΊΎΒ.νν8νΕΤνΕΗ0Ο\νΕΝαΚΕΥΚ€Κν8ΝΚΑΕΡΑΡ1ΕΚ.ΤΙ5ΚΑΚΟ (^ΡΚΕΡΟ'/ΥΤΕΡΡΒΚϋΕΕτΚΝΟΥδΕΤΟΕνκαΡΥΤίΟΐΑνΕ^ΕδΝΟςΡΕΝΝΥΚΤΤΡΡν ЬОЗОиЗГГЬУЗКЬТУОКЗКУ^ОСН УР8СЗ ΥΜΗΕΑΙΗΝΗΥΤΟ КЗ Ι 95Б5РСК;
(8Е<Э ГО N0:63) или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60%, предпочтительно по меньшей мере на 80% идентична, более предпочтительно по меньшей мере на 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична ей.
В другом предпочтительном варианте осуществления конструкт однодоменного антитела включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60%, предпочтительно по меньшей мере на 80% идентична, более предпочтительно по меньшей мере на 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична последовательности, представленной в 8Е0 ΙΌ Νο: 11, а наиболее предпочтительно последовательность, представленную в 8Е0 ΙΌ Νο: 11.
Используемый в настоящем документе термин связывается с предназначен для указания связывания антигена вариабельной областью иммуноглобулина с константой диссоциации (Кб), составляющей 1 мкМ или ниже, по данным измерения анализом поверхностного плазмонного резонанса с использованием, например, устройства поверхностного плазмонного резонанса В1Асоге™ и программного обеспечения кинетической оценки В1Асоге™ (например, версии 2.1). Константа сродства или диссоциации (Кб) для взаимодействия в виде специфического связывания составляет предпочтительно примерно 500 нМ или ниже, более предпочтительно примерно 300 нМ или ниже и предпочтительно по меньшей мере от 300 нМ до 50 пкМ, от 200 нМ до 50 пкМ и более предпочтительно по меньшей мере от 100 нМ до 50 пкМ, от 75 нМ до 50 пкМ, от 10 нМ до 50 пкМ. Используемый в настоящем документе термин бАЬ относится к полипептиду одного вариабельного домена антитела (Ун или Уъ), который специфически связывает антиген.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения конструкт однодоменного антитела образует гомо- или гетеродимер с другим конструктом однодоменного антитела в соответствии с настоящим изобретением. Димеризация может увеличить прочность связывания антигена, где сила связывания зависит от суммы величин сродства связывания множественных сайтов связывания. Для содействия образованию димера шарнирная область конструкта однодоменного антитела включает по меньшей мере один, а предпочтительно два цистеиновых остатка.
В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения конструкт однодоменного антитела образует гомодимер с идентичным конструктом однодоменного антитела.
Соответственно в другом аспекте настоящее изобретение предоставляет димерный конструкт однодоменного антитела, который связывается с человеческим ΤΝΕ-α, где димер состоит из двух конструктов однодоменного антитела в соответствии с настоящим изобретением.
Предпочтительно, чтобы димерный конструкт однодоменного антитела представлял собой гомодимер и особенно предпочтительно, чтобы конструкты однодоменного антитела, составляющие гомодимер, включали аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60%, предпочтительно по меньшей мере на 80% идентична, более предпочтительно по меньшей мере на 90, 95, 96, 97, 98% или 99% идентична последовательности, представленной в 8ЕО ΙΌ Νο: 11, и наиболее предпочтительно последовательность, представленную в 8ЕО ΙΌ Νο: 11.
Во втором аспекте настоящее изобретение предоставляет последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую конструкт однодоменного антитела по первому аспекту изобретения.
В третьем аспекте настоящее изобретение предоставляет выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, включающую последовательность, кодирующую конструкт однодоменного антитела, который связывает человеческий ΤΝΕ-α, где молекула нуклеиновой кислоты включает последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 60%, предпочтительно по меньшей мере на 80% идентичную, более предпочтительно по меньшей мере на 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичную последовательности, представленной в 8ЕО ΙΌ Νο: 50 или 8ЕО ΙΌ Νο: 51, и наиболее предпочтительно последовательность, представленную в 8ЕО ΙΌ Νο: 50 или 8ЕО ΙΌ Νο: 51.
В четвертом аспекте настоящее изобретение предоставляет выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, включающую последовательность, кодирующую конструкт однодоменного антитела, который связывает человеческий ΤΝΕ-α, где молекула нуклеиновой кислоты включает последовательность нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в условиях высокой строгости с нуклеотидной последовательностью, представленной в 8ЕО ΙΌ Νο: 50 или 8ЕО ΙΌ Νο: 51.
При определении того, входят ли две полипептидные последовательности в пределы процентной доли идентичности или нет, специалистам в данной области известно, что необходимо провести параллельное сравнение или множественное выравнивание последовательностей. При таких сравнениях или выравниваниях возникнут различия в расположении неидентичных остатков, в зависимости от алгоритма, используемого для выполнения выравнивания. В настоящем контексте ссылку на идентичность в процентах или сходство между двумя или более аминокислотными последовательностями следует
- 4 017417 воспринимать как указание на количество соответственно идентичных и аналогичных остатков между указанными последовательностями, как определено с использованием любого стандартного алгоритма, известного специалистам в данной области. Например, значения идентичности или сходства аминокислотных последовательностей можно рассчитать, используя программу САР, и/или выровнять с использованием программы Р1ЬЕиР СотрШег Сепейск Сгоир, 1пс., ийуеткйу Кекеатсй Рагк, Майкоп, Ущсопкт, ИпИей 81а1ек о£ Атепса (Эеуегеаих е1 а1., 1984). В программе САР используется алгоритм №ей1етап апй Уипксй (1970) для максимизации количества идентичных/сходных остатков и для минимизации количества и длины гэпов последовательностей при выравнивании. Альтернативно или дополнительно, при сравнении более чем двух аминокислотных последовательностей используется программа С1ик!а1 V из Тйотркоп е1 а1. (1994).
При определении того, входят ли две нуклеотидные последовательности в пределы процентной доли идентичности или нет, специалистам в данной области известно, что необходимо провести параллельное сравнение или множественное выравнивание последовательностей. При таких сравнениях или выравниваниях возникнут различия в расположении неидентичных остатков, в зависимости от алгоритма, используемого для выполнения выравнивания. В настоящем контексте ссылку на идентичность в процентах между двумя или более нуклеотидными последовательностями следует воспринимать как указание на количество идентичных остатков между указанными последовательностями, как определено с использованием любого стандартного алгоритма, известного специалистам в данной области. Например, нуклеотидные последовательности можно выровнять и их идентичность можно рассчитать, используя программу ВЕ8ТЕ1Т или другую соответствующую программу Сотри1ет Сепейск Сгоир, 1пс., ИшуегкИу Кекеатсй Рагк, Майкоп, УЦсопкт, Ипйей 81а1ек о£ Атепса (Эеуегеаих е1 а1., Ыиск Аайк Кек., 12:387-395, 1984).
Высокая строгость предпочтительно включает гибридизацию в условиях 65°С и 0,1х88С (1х88С=0,15 М ЫаС1, 0,015 М цитрат Ыа3 рН 7,0).
В одном варианте осуществления изобретение далее основано на способе амплификации генов вариабельной области иммуноглобулина приматов Нового Света, например путем полимеразной цепной реакции (ПЦР) из нуклеиновой кислоты, экстрагированной из лимфоцитов приматов Нового Света с использованием праймеров, специфичных для семейств генов вариабельной области тяжелой и легкой цепи. Например, данные относительно границ вариабельных доменов генов тяжелой и легкой цепи (соответственно УН и Уь) можно использовать для конструирования праймеров ПЦР, которые амплифицируют вариабельный домен из кодирующей тяжелую или легкую цепь клонированной последовательности, кодирующей антитело, которое, как известно, связывает данный антиген. Затем амплифицированная вариабельная область вставляется или отдельно, или в виде слияния с другой полипептидной последовательностью последовательности константной области человека или примата по изобретению, в подходящий вектор экспрессии для получения конструкта однодоменного антитела по изобретению. Подходящие векторы экспрессии известны специалистам в данной области.
Репертуар доменов УН, Уъ и константной области может представлять собой природный репертуар последовательностей иммуноглобулина или синтетический репертуар. Природный репертуар представляет собой репертуар, полученный, например, из экспрессирующих иммуноглобулин клеток, собранных из культуры клеток от одного или нескольких приматов. Такие репертуары могут быть наивными, т.е. полученными из только что родившихся клеток, экспрессирующих иммуноглобулин, или реаранжированными, т.е. полученными, например, из В-клеток взрослых приматов. При желании, клоны, идентифицированные из природного репертуара или любого репертуара, которые связывают антиген-мишень, затем подвергаются мутагенезу и дальнейшему скринингу для получения и выбора вариантов с улучшенными характеристиками связывания.
Синтетические репертуары одиночных вариабельных доменов иммуноглобулина получают искусственным введением разнообразия в клонированный вариабельный домен.
Можно провести скрининг репертуара доменов УН и Уъ для выявления желаемой специфичности связывания и функционального поведения, например методом фагового дисплея. Методы конструирования бактериофаг-дисплейных библиотек и библиотек экспрессии фага лямбда хорошо известны в данной области. Технология фагового дисплея широко описана в данной области и примеры способов и соединений для создания и скрининга таких библиотек и их продуктов аффинного созревания можно найти, например, в документах Ватйак е1 а1. (1991), РЫА8 88:7978-7982; С1агккоп е1 а1. (1991), Ыа1иге 352:624628; 1)о\\ег е1 а1. РСТ 91/17271, Ра1еп1 Νθ. 5427908, и.8. Ра1еп1 Νθ. 5580717 и ЕР 527839; Еисйк е1 а1. (1991), В1о/Тес11ио1од\ 9:1370-1372; Саттай е1 а1. (1991), В^о/Тесйио1о§у 9:1373-1377; Саттай е1 а1. РСТ УО 92/09690; Сгат е1 а1. (1992), ₽ΝΆ8 89:3576-3580; Спйййк е1 а1. (1993), ЕМВО 1 12:725-734; СпййЬз е1 а1. и.8. Ра1еп1 Νο. 5885793 апй ЕР 589877; Наикт.к е1 а1. (1992), 1. Мо1 Вю1 226:889-896; Нау е1 а1. (1992), Нит Апййой НуЬпйотак 3:81-85; НоодепЬоот е1 а1. (1991), кис Ас1й Кек 19:4133-4137; Нике е1 а1. (1989), 8с1епсе 246:1275-1281; Кпарр1к е1 а1. (2000), 1. Мо1 Βΐο1 296:57-86; Кпарр1к е1 а1. РСТ УО 97/08320; Ьайпег е1 а1. И.8. Ра1еп1 Νο. 5223409, Νο. 5403484, Νο. 5571698, Νο. 5837500 апй ЕР 436597; МсСаНейу е1 а1. (1990), кайте 348:552-554; МсСайейу е1 а1. РСТ УО 92/01047, и.8. Ра1ей Νο. 5969108
- 5 017417 апа ЕР 589877; 8а1Ге1а е! а1. РСТ νθ 97/29131, и.8. Ра!еп! Аррйсайоп Νο. 20050004354; апа №ш1ег е! а1. РСТ νθ 92/20791 апа ЕР 368684.
Рекомбинантные библиотеки, экспрессирующие репертуар доменов νΗ и Уь, могут быть экспрессированы на поверхности микроорганизмов, например дрожжей или бактерий (см. публикации РСТ νθ 99/36569 и 98/49286).
Конструкт однодоменного антитела по изобретению можно получить рекомбинантным методом, включая получение из эукариотических систем экспрессии, включающих, например, клетки дрожжей, высших растений, насекомых и млекопитающих, а также грибы и кодированные вирусами системы экспрессии, как описано в настоящем документе или как известно в данной области.
Конструкты однодоменного антитела по настоящему изобретению можно получить, используя 8антитело, кодирующее нуклеиновую кислоту, для обеспечения клеток трансгенных растений и культивированных растений (например, без ограничения, табака и кукурузы), которые продуцируют такие конструкты в частях растений или в клетках, культивированных из них. В качестве неограничивающего примера, листья трансгенного табака, экспрессирующие рекомбинантные белки, успешно использовали для обеспечения больших количеств рекомбинантных белков, например, с использованием индуцируемого промотора (см., например, Сгатег е! а1., Сигг. Тор. М1стоЬю1. 1ттипо1. 240:95-118, 1999 и приведенные в нем ссылки). Также на уровнях промышленной продукции использовали трансгенную кукурузу для экспрессии белков млекопитающих с биологической активностью, эквивалентной белкам, продуцированным в других рекомбинантных системах или очищенным из природных источников (см., например, Нооа е! а1., Аау. Ехр. Меа. Вю1. 464:127-147, 1999 и приведенные в нем ссылки). Антитела также получали в больших количествах из семян трансгенных растений, включая фрагменты антител, такие как одноцепочечные антитела (бсЕу), включая семена табака и клубни картофеля (см., например, Сопгаа е! а1., Р1ап! Мо1. Вю1. 38:101-109, 1998 и приведенные в нем ссылки). Таким образом, конструкты однодоменного антитела по настоящему изобретению можно также получить, используя трансгенные растения, в соответствии с известными методами (см. также, например, Ексйет е! а1., Вю!есйио1. Арр1. Вюсйет. 30:99-108 Ос!оЬег, 1999; Ма & Нет., Тгепа§ Вю!есЬпо1. 13:522-7, 1995; Ма е! а1., Р1ап! РЬ.у8ю1. 109:341-6, 1995; VЫ!е1ат е! а1., Вюсйет. 8ос. Тгапз. 22:940-944, 1994; и приведенные в них ссылки; каждая из приведенных выше ссылок полностью включена в настоящий документ путем ссылки).
Конструкты однодоменного антитела по настоящему изобретению включают естественно очищенные продукты, продукты методов химического синтеза и продукты, полученные рекомбинантными методами от эукариотического хозяина, включая, например, клетки дрожжей, высших растений, насекомых и млекопитающих. В зависимости от хозяина, используемого в методе рекомбинантной продукции, конструкты антитела по настоящему изобретению могут быть гликозилированными или могут быть негликозилированными, причем предпочтительны гликозилированные продукты. Такие методы описаны во многих стандартных лабораторных руководствах 8атЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬота!огу Мапиа1, 2па Еайюп, Со1а 8рппд НагЬог, Ν.Υ. 1989, 8ес!юп§ 17.37-17.42; АизиЬе1 е! а1., еа§. Сштеп! Рто!осо1з ш Мо1еси1аг Вю1оду 1987-1093, Сйар!ет8 10, 12, 13, 16, 18 апа 20, СоШдап е! а1., Сштеп! Рто!осок ш Рто!еш 8аепсе, ДоПп \УПеу & 8опз, ΝΥ, Ν.Υ. 1997-2001, Рто!еш 8аепсе, Сйар!ет8 12-14, все полностью включенные в настоящий документ путем ссылки.
В одной системе экспрессии библиотека рекомбинантного пептида/белка проявляется на рибосомах (например, см. КоЬетк, Κ.ν. апа 8/ойак, IV. 1997, Ргос. №!1. Асаа. 8а. И8А, 94:12297-123202 и публикацию РСТ №. νθ 98/31700). Таким образом, другой пример включает создание и транскрипцию ш У1!то библиотеки ДНК (например, из антител или производных, предпочтительно полученных из иммунизированных клеток, но без такого ограничения), трансляцию библиотеки так, чтобы белок и иммунизированные мРНК оставались на рибосомах, отбор по сродству (например, связыванием с К8Р), выделение мРНК, обратную трансляцию и последующую амплификацию (например, с помощью полимеразной цепной реакции или родственной технологии). При необходимости, можно соединять дополнительные циклы отбора и амплификации для созревания сродства посредством введения соматической мутации в этой системе или другими способами созревания сродства, как известно в данной области.
Другим примером является применение технологии компартментализации эмульсии для генерирования однодоменных антител по изобретению. При компартментализации эмульсии способы ш νίΙΐΌ и оптической сортировки комбинируют с совместной компартментализацией транслированного белка и его кодирующей нуклеотиды последовательности в водной фазе внутри капельки масла в эмульсии (см. публикации РСТ № νθ 99/026711 и νθ 00/40712).
Последовательности СЭК. можно получить из нескольких источников, например, баз данных, таких как базы данных белков и нуклеотидов Национального центра биотехнологической информации те^ет.псЬ1.п1т.п1й.доу, база данных КаЬа! последовательностей белков, представляющих иммунологический интерес, \у\у\у.каЬа1аа1аЬа5е.сот или база данных 1МОТ \у\у\у.шщ1.апе5.Гг. Альтернативно, области СОК можно прогнозировать по репертуару доменов νΗ и V,. (см., например, КаЬа! Е.А. апа νυ Т.Т. А!!етрк !о 1оса!е сотр1етеп!атйу ае!еттшшд геЧаиек ш !йе уапаЫе розйюпз оГ 1ίβ1ιΙ апа йеауу скате. Апп. ΝΥ Асаа. 8а. 190:382-393 (1971)). Последовательность СОК может представлять собой геномную ДНК или кДНК.
- 6 017417
Существует ряд путей, которыми заместительная СЭЯ может быть трансплантирована в последовательность вариабельной области, и такие способы должны быть знакомы специалистам в данной области. Предпочтительный способ по настоящему изобретению включает замену СЭЯ2 в вариабельной области (или ЙАЬ) посредством направленного мутагенеза с использованием праймера. Этот способ состоит из отжига синтетического олигонуклеотида, кодирующего желательную мутацию (мутации), с областью-мишенью, где он служит в качестве праймера для инициации синтеза ДНК ίη νίίτο, удлинения олигонуклеотида ДНК-полимеразой для генерирования двухнитевой ДНК, которая несет желательную мутацию, и лигирования и клонирования последовательности в соответствующий вектор экспрессии.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения последовательность СЭЯ приматов Нового Света трансплантируется в последовательность вариабельной области, которая имеет низкую иммуногенность у людей.
При ссылке на термин низкая иммуногенность подразумевается, что конструкт однодоменного антитела или его антигенсвязывающая часть не вызывает у человека силу реакции антитела, достаточную для снижения эффективности продолжительного введения конструкта однодоменного антитела в течение времени, достаточного для достижения терапевтической эффективности.
Предпочтительно последовательность вариабельной области, в которую трансплантируется СЭЯ примата Нового Света, представляет собой акцепторную последовательность ЙЛЬ (обозначенную соединением 128) на фиг. 1. Акцепторная последовательность ЙАЬ состоит из аминокислотной последовательности, представленной в 8ЕО ГО Νο: 5:
ΒΤ9Μ.ΤΏ5Ρ85Ε8Αδν6ϋΚνΤΙΤ0κΑ808ΙΟ8ΥΕΗ!νν00ΚΡθΚΑΡΚΕΕ1Υ8ΑδΕ1Χ38Ο νΡδΒΗδαδΟδστοΓτι.τίδδΕςΡΕΟΓΑΤΥΥαςίίννν,τΐΡΠ'ΓΟΟοτκνΕίκκ (8Е<2 Ю Νο:5).
Эта последовательность кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в 8ЕО ГО Νο: 6:
ОАС АТС САС АТС лее САС ТСТ ССА ТСС ТСТ СТС ТСТ ССА ТСТ СТА ССА
СЛС ССТ СТС АСС АТС АСТ тсс ССС ССА АСТ САС АСС АТТ САТ АСТ ТАТ
ТТЛ САТ тсс ТАС САС САС АЛА ССА ССО ААА ССС ССТ ААС СТС СТС АТС
ТАТ АУТ ССА ТСС ОАО ТТС САА. АСТ ссс СТС ССА ТСА СОТ ТТС АСТ ССС
АСТ ®ЭА ТСТ ССС АСА САТ ТТС АСТ СТС АСС АТС АСС АСТ СТС САА ССТ
САА САТ ТТТ ССТ АСС ТАС ТАС ТСТ САА САС СТТ СТС ТСС ССТ ССТ ТТТ
АСС ТТС ссс СЛА ССС АСС ААС сто САА АТС ААА ССС
(5ЕО Ю Νο:ό)
В одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения последовательность СЭЯ примата Нового Света игрунки 8Α8ΝΕΕΤ (8ЕО ΙΌ Νο: 4) трансплантируется в вариабельную область акцепторной последовательности ЙАЬ с тем, чтобы заместить последовательность СЭЯ2 (8А8ЕБО8; 8ЕО ГО Νο: 55) акцепторной последовательности ЙАЬ для продуцирования следующего ЙАЬ (обозначенного соединением 145):
соединение 145
Ы<2МТ<Э5Р88 Ь5А8 νβΟΒνΤΙΤΟβΑδςδΙΟδ УООКРСКЛРКЕЫ Υ8 АЙЫЬЕТС νΡ8ΚΗ8θδΟ8βΤϋΓΤΕΤΙ$5^ΡΕΟΡΑΤΥΥΟ00ννννΕΡΡΠΓϋ0.σΓΚνΕΙΚΚ (2ЕС ГО Νο:7.)
Таким образом, в одном предпочтительном варианте осуществления ЙАЬ конструкта однодоменного антитела, которое связывается с человеческим ΤΝΕ-α, включает аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕО ГО Νο: 7.
В объем настоящего изобретения входит то, что последовательность вариабельной области (ЙАЬ) конструкта однодоменного антитела может далее подвергаться аффинному созреванию для улучшения его антигенсвязывающих характеристик. Это может вызвать необходимость модификации определенных аминокислотных остатков в пределах СЭЯ1, СЭЯ3 или каркаса конструкта однодоменного антитела.
Например, 8ЕО ГО Νο: 7 подвергали аффинному созреванию, как изложено в разделе Материалы и методы, и испытывали на ΤΝΕ-α-связывание. В еще одном предпочтительном варианте осуществления вариабельная область (ЙАЬ) конструкта однодоменного антитела, который связывается с человеческим ΤΝΕ-α, включает аминокислотную последовательность 8ЕО ГО Νο: 8 или 8ЕО ГО Νο: 9. Они были обозначены соответственно как соединение 123 и соединение 100, и их последовательности показаны ниже.
Соединение 123
ΟίςΜΥΏδΡδδΕδΑδνσοΚνΤΠΓΚΑδφΑΙΟδΥΙΗν^ΟΚΡσΛζΛΡΜΧΓΥδΑδΝΕΕΤ СУР5КРЗО805аТ£>Е1ЪТ188Ь(2Р£ОЕАТУ¥С£2С¥У\УКН=ТГС0О'ПСУЕ(КК. (5Е<? Ю Νο:8)
- 7 017417
Соединение 100
Ώ19ΜΤ<25Ρ38Ε3Α8νσΕΚνΤ1ΤεΚΑ5<2δ[Ε3ΥΕ}!\νΎςθΚΡαΚΑΡΚΕΕΠ'8Α5ΝΈΕΤΟ νΡ3ΚΡ3Ο5ϋ3σΐΌΡΤΕΤΙ58Ε1ΡΕϋΡΑΤΥΥϋα0νν\νΐΐΡΡΤΠσςΰΤΚνρ.ΐΚΒ.
(5Е0 ΕΟ Νο:9)
В особенно предпочтительном варианте осуществления вариабельная область (ЙАЬ) конструкта однодоменного антитела, который связывается с человеческим ΤΝΡ-α, включает аминокислотную последовательность 8ЕО ГО Νο: 10. Она была обозначена как соединение 196, и последовательность представлена ниже.
Соединение 196 □Ι0ΜΤ03Ρ55Ε3Α3νοηκντπαΚΑ8αΛ©8ΥΕΗΧνΥ00ΚΡσΚΑΡΚΙ1ΙΥ$Α3ΝΙ.ΕΤ С¥Р88ЕЗС308СТОРТЕТ133ЕЕРЕОГАТ¥ГСОЦУУ%ГКРЕГЕОООТКУЕ1КК (ЗЕ2ГОМо:10)
Специалисту в данной области должно быть понятно, что последовательность константной области конструкта однодоменного антитела можно получить из последовательностей человека или примата. Последовательность примата может быть от примата Нового Света или от примата Старого Света. Подходящие приматы Старого Света включают шимпанзе или другую человекообразную обезьяну, например гориллу или орангутанга, которые благодаря их тесной филогенетической близости к людям разделяют высокую степень гомологии с последовательностью константной области человека. Предпочтительно константная область получена из последовательности человеческого антитела. Примеры таких последовательностей можно найти в базе данных белков и нуклеотидов Национального центра биотехнологической информации \ν\ν\ν.ηοΝ.η1ιη.ηί1ι.§ον и в базе данных КаЬа! последовательностей белков, представляющих иммунологический интерес, те^ет.каЬа!йа!аЬа8е.сош, или в базе данных ΙΜΟΤ \\Л\ЛУ.ШЩ1.СШС5.Гг.
При проектировании конструкта однодоменного антитела по настоящему изобретению заявители производили усечение домена СН1 константной (Рс) области. Минимальное количество остатков домена СН1 сохраняли для обеспечения гибкости в конструкте однодоменного антитела вокруг шарнирной области.
Предпочтительно сохраняются по меньшей мере 20 С-терминальных аминокислотных остатков домена С'цЕ более предпочтительно по меньшей мере 10 аминокислот, еще более предпочтительно по меньшей мере 5 аминокислот, даже более предпочтительно один аминокислотный остаток.
Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления конструкт однодоменного антитела имеет формат, включающий остаток йАЬ-С-концевого домена Сн1-шарнирная область-домен Сн2-домен СН3, как схематически проиллюстрировано на фиг. 2.
В особенно предпочтительном варианте осуществления конструкт однодоменного антитела имеет аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕО ГО Νο: 11. Она обозначена как соединение 170.
Соединение 170
Е>1(2МТ93РЗЯ1-8Л8 ν<3 ОКУТГГСКА8<ЭАЦ>5 ΥΕΗΛνΥΟς КРСКАРК ΙΧΤΥδΑδΝίΕΤ ОУРЗКГЗаЗСЗСТОРТЕПЗЗЬЕРЕОРАТУУСССУУ^КРГТРаОаткУЕЖКУЕРКЗ ЗОКТНТСРРСРАРЕ1ХаСР5УРЕГРРКРКОТЕМ15КТРЕУ'1'СУУУОУ5<1ЕОРЕУКРМ \νΥνϋανΕνΗΝΑΚΤΚΡΚΕΕαΥΝ8ΤΥΚ.νν8νΕΤνΕΗ001ΛΤΝ<3ΚΕΥΚΟΚν5ΝΚΑΕΡ ΑΡ1ΕΚΤΙ3ΚΑΚ<50ΡΕΕΡανΥΤΕΡΡ5Κ.ΟΕΕΤΚΝαν3ΕΤΟΕνκαΕΥΡ3ϋΙΑνΕννΕ5Να 0ΡΕΝΝΥΚ.ΤΠ’ΡνΕΟ8ΟΟ8ΕΕΕΥ5ΚΕΤνϋΚ3Κνν000ΝνΕ5Ε8νΜΗΕΑΕΗΝΗΥΤρΚ ЗЬЗЕЗРОК (5ΕΟ Ю Νο:11)
Шарнирная область природного иммуноглобулина содержит цистеиновую (С) боковую цепь, которая содействует образованию дисульфидной связи между доменом СН1 тяжелой цепи и константным доменом легкой цепи. Благодаря тому что конструкт включает только один вариабельный домен и, таким образом, оставляет потенциально реактивный неспаренный цистеиновый остаток, цистеиновый остаток был замещен аминокислотным остатком, который предотвращает образование дисульфидной связи. Потенциальные последствия наличия неспаренного цистеина могут включать пониженную экспрессию белка за счет агрегации и ошибочной укладки конструкта.
Следует понимать, что любая последовательность шарнирной области, полученная из любого класса антител, была бы целесообразна для использования в настоящем изобретении. Однако предпочтительно, чтобы шарнирная область была получена из подкласса антител 1дС1. Предпочтительно шарнирная область основана на природной последовательности шарнирной области 1дС1 и включает последовательР РКЯ5 ПКТНТСРРС РА ность — хиг-гг^г.-. (§Εζ) ГО Νο: 12). В этой последовательности Суз, который обычно встречается в положении 5, заменен подчеркнутым, выделенным жирным шрифтом остатком 8ет.
Предпочтительно С-концевой аминокислотный остаток домена Сн1 получен из 1дС1. Более предпочтительно остаток СН1 представляет собой остаток валина (V) или консервативное аминокислотное замещение, такое как лейцин (Ь) или изолейцин (I). Этот остаток расположен непосредственно прокси
- 8 017417 мально к шарнирной области и содействует увеличению гибкости конструкта вокруг шарнирной области.
Последовательности доменов СН2 и СН3 предпочтительно получены из базы данных δΜδδρτοΐ под номером доступа РО1857:
ΡΡΧΙΧ;0Ρ3νΡίΗ’ΡΚΡΚϋΊ1,ΜΙ5ΚΤΡΕντσνννυν8ΗΕ0ΡΕνΚΙτΝ!νΥνϋ0νΕνΐΙΝ ΑΚΤΚΡΚΕΕΟΥΝϊΤΥΚννΚλΤ-ΤνΕΗΟϋλνΕΝΟΚΕΥ^ΚνδΝΚΑΕΡΑΡΙΕΚΤΙ'ΐΚΛΚΟ ςρΚΕΡανγ·πυΡΡ3ΙΦΕυΓΚ№ν5ΕΤ€ΕνκαΕΥΡ8ΡΙΑνΕΛνΕ8ΝαθΡΕΝΜΥΚΤΤΡΡν υ>8ηθ8ΡΡΕΥ5ΚΕΤνϋΚ81<^0€ιΝνΓ8α3νΜ*ΐΕΑΕΗΙ<ΗΥΤ0Κ8Ε818ΡαΚ (8Ε0 ГО Νο:63).
Конструкт однодоменного антитела может быть дериватизирован или связан с другой функциональной молекулой. Например, конструкт однодоменного антитела может быть функционально связан химической связью, генетическим слиянием, нековалентной ассоциацией или иным образом с одной или несколькими другими молекулярными объектами, такими как другое антитело, детектируемый агент, цитотоксический агент, фармацевтическое средство и/или белок или пептид, который может опосредовать ассоциацию антитела или антитело-связывающую часть с другой молекулой (такой как сердцевинная область стрептавидина или полигистидиновая метка).
Полезные детектируемые агенты, которыми может быть дериватизирован конструкт однодоменного антитела, включают флуоресцентные соединения. Иллюстративные флуоресцентные детектируемые агенты включают флуоресцеин, изотиоцианат флуоресцеина, родамин, хлорид 5-диметиламин-1нафталинсульфонила, фикоэритрин и т.п. Конструкт однодоменного антитела также может быть дериватизирован детектируемыми ферментами, такими как щелочная фосфатаза, пероксидаза хрена, глюкозоксидаза и тому подобное. Когда конструкт однодоменного антитела дериватизирован детектируемым ферментом, его выявляют добавлением дополнительных реагентов, которые фермент использует для продукции детектируемого продукта реакции. Конструкт однодоменного антитела также может быть дериватизирован биотином и выявлен посредством косвенного метода измерения содержания авидина или связывания стрептавидина.
Конструкт однодоменного антитела в соответствии с изобретением может быть связан с одной или несколькими молекулами, которые обеспечивают увеличенный период полужизни и устойчивость к разрушению без потери активности (например, сродства связывания) ίη νίνο. Эти молекулы могут быть связаны с конструктом однодоменного антитела посредством линкера так, что они не мешают/стерически не препятствуют сайту связывания антигена. Эти молекулы аддукта включают, например, 4АЬ, направленные на эндогенную молекулу, как описано в заявке на патент США 20050271663. Обычно такие молекулы аддукта представляют собой полипептиды или фрагменты полипептидов, которые встречаются в природе ίη νίνο и которые препятствуют разрушению или удалению за счет эндогенных механизмов. Молекулы, которые увеличивают период полужизни, могут быть выбраны из следующих:
(a) белки из внеклеточной матрицы, например коллаген, ламинин, интегрин и фибронектин;
(b) белки, обнаруживаемые в крови, например фибрин, макроглобулин а-2, сывороточный альбумин, фибриноген А, фибриноген В, сывороточный амилоидный белок А, гептаглобин, белок, убиквитин, утероглобулин, макроглобулин β-2, плазминоген, лизоцим, цистатин С, альфа-1-антитрипсин и ингибитор панкреатического кипсина;
(c) иммунные сывороточные белки, например 1дЕ, 1дО, 1дМ;
(4) транспортные белки, например белок, связывающий ретинол, α-1-микроглобулин;
(е) дефенсины, например бета-дефенсин 1, нейтрофильные дефенсины 1, 2 и 3;
(Г) белки, обнаруживаемые в гематоэнцефалическом барьере или в нервных тканях, например рецептор меланокортина, миелин, транспортер аскорбата;
(д) слитые белки из лиганда, специфичного для рецептора трансферрина, и нейрофармацевтического агента (см. И85977307); рецептор эндотелиальных клеток капилляров головного мозга, трансферрин, рецептор трансферрина, инсулин, рецептор инсулиноподобного фактора роста-1 (ЮР-1), рецептор инсулиноподобного фактора роста-2 (ЮР-2), рецептор инсулина;
(11) белки, локализованные в почках, например, полицистин, коллаген IV типа, транспортер органических анионов К1, антиген Неутапп;
(ί) белки, локализованные в печени, например алкогольдегидрогеназа, 0250;
(ί) фактор X свертывания крови;
(k) α-1-антитрипсин;
(l) ΗΝΕ-1α;
(т) белки, локализованные в легких, например секреторный компонент (связывает 1дА);
(п) белки, локализованные в сердце, например Н8Р 27;
(о) белки, локализованные в коже, например кератин;
(р) костно-специфические белки, такие как костные морфогенные белки (ВМР), например, ВМР-2, -4, -5, -6, -7 (также именуемые как остеогенный белок (ОР-1) и -8 (ОР-2);
(с.|) опухолеспецифические белки, например человеческий трофобластный антиген, рецептор гер- 9 017417 цептина, рецептор эстрогена, катепсины, например катепсин В (обнаруживаемый в печени и селезенке);
(г) белки, специфичные для заболевания, например антигены, экспрессированные только на активированных Т-клетках, включающие ЬАС-3 (ген активации лимфоцитов); лиганд остеопротегерина (ОРСЬ), см. Копд Υ.Υ. ей а1., Майиге (1999) 402, 304-309; 0X40 (член семейства рецепторов ΤΝΒ, экспрессированных на активированных Т-клетках, и единственная совместно стимулирующая Т-клеточная молекула, которая, как известно, подвергается специфической стимулирующей регуляции в клетках, продуцирующих вирус человеческого Т-клеточного лейкоза I типа (НТЬУ-1) - см. Ранкой В ей а1. 1. 1ттипо1. (2000) Йи1 1; 165 (1):263-70; металлопротеазы, связанные с артритом/раковыми заболеваниями, включая СС6512 Эго5орЫ1а. человеческий параплегин, человеческий ЕйзН, человеческий АЕС3Ь2, мышиный ййзН, ангиогенный фактор роста, включая кислотный фактор роста фибробласта (ЕСЕ-1), основный фактор роста фибробласта (ЕСЕ-2), сосудистый эндотелиальный фактор роста/фактор сосудистой проницаемости (УЕСЕ/УРЕ), трансформирующий фактор роста-α (ТСЕ-а), фактор некроза опухоли-альфа (ΤΝΕ-α), ангиогенин, интерлейкин-3 (1Ь-3), интерлейкин-8 (1Ь-8), эндотелиальный фактор роста, полученный из тромбоцитов (РЭ-ЕССЕ), плацентарный фактор роста (Р1СЕ), полученный из тромбоцитов фактор ростаВВ (РОСЕ), фракталкин;
(§) стрессовые белки (белки теплового шока) и (й) белки, участвующие в транспорте Ес.
Настоящее изобретение также распространяется на пэгилированный конструкт однодоменного антитела, который обеспечивает увеличенный период полужизни и устойчивость к разрушению без потери активности (например, сродства связывания) относительно полипептидов не пэгилированного антитела.
Конструкт однодоменного антитела можно соединить с молекулами полимера (предпочтительно РЕС (ПЭГ)), используя известные в данной области способы, применяемые для достижения свойств увеличенного периода полужизни и устойчивости к разрушению. Полимерные фрагменты, которые могут быть использованы в изобретении, могут быть синтетическими или природными и включают, но не ограничиваются ими, неразветвленные или разветвленные полиалкиленовые, полиалкениленовые или полиоксиалкиленовые полимеры, или разветвленный или неразветвленный полисахарид, такой как гомоили гетерополисахарид. Предпочтительные примеры синтетических полимеров, которые могут быть использованы в изобретении, включают разветвленный или неразветвленный поли(этиленгликоль) (ПЭГ), поли(пропиленгликоль) или поли(виниловый спирт) и их производные или замещенные формы. Особенно предпочтительные замещенные полимеры для соединения с конструктом однодоменного антитела включают замещенный ПЭГ, включая метокси(полиэтиленгликоль). Природные полимерные фрагменты, которые можно использовать в дополнение или вместо ПЭГ, включают лактозу, амилозу, декстран или гликоген, а также их производные, которые известны специалистам в данной области.
Полимерные (ПЭГ) молекулы, которые могут быть использованы в изобретении, можно прикреплять к конструкту однодоменного антитела, используя способы, которые хорошо известны в данной области. Первая стадия прикрепления ПЭГ или других полимерных фрагментов к конструкту однодоменного антитела по изобретению представляет собой замещение гидроксильных концевых групп полимера ПЭГ функциональными группами, содержащими электрофил. В частности, полимеры ПЭГ прикреплены или к цистеиновым остаткам, или к лизиновым остаткам в мономерах или мультимерах конструкта однодоменного антитела. Цистеиновые и лизиновые остатки могут быть природными или могут быть включены методами генной инженерии в молекулу конструкта однодоменного антитела.
Пэгилирование конструкта однодоменного антитела по изобретению можно осуществить любым путем (см., например, 1<ох1о\\'5к|-А & Наггйз-Й.М. (2001), Йоигпа1 о! Сопйго11е6 Ве1еазе 72:217). ПЭГ может быть прикреплен к конструкту однодоменного антитела или непосредственно, или промежуточным линкером. Безлинкерные системы для прикрепления полиэтиленгликоля к белкам описаны в публикациях Эе1да6о ей а1. (1992), Спй. Веу. Тйега. Эгид Сатег 8уз. 9:249-304; Егапсйз ей а1. (1998), 1пйегп. й. Нетайо1. 68:1-18; И8 4002531; И8 5349052; \УО 95/06058; \УО 98/32466, описания каждого из которых включены в настоящий документ путем ссылки.
В одной из систем для прикрепления полиэтиленгликоля непосредственно к аминокислотным остаткам белков без промежуточного линкера используется трезилированный МПЭГ, который продуцируется путем модификации монометоксиполиэтиленгликоля (МПЭГ) с использованием трезилхлорида. После взаимодействия аминокислотных остатков с трезилированным МПЭГ, полиэтиленгликоль непосредственно прикрепляется к аминогруппам. Таким образом, изобретение включает конъюгаты белокполиэтиленгликоль, продуцируемые взаимодействием белков по изобретению с молекулой полиэтиленгликоля, имеющей 2,2,2-трифторэтансульфонильную группу.
Полиэтиленгликоль может также быть прикреплен к белкам с использованием ряда различных промежуточных линкеров. Например, в патенте США № 5612460 раскрыты уретановые линкеры для соединения полиэтиленгликоля с белками. Конъюгаты белок-полиэтиленгликоль, где полиэтиленгликоль прикреплен к белку линкером, можно также получить взаимодействием белков с такими соединениями, как МПЭГ-сукцинимидилсукцинат, МПЭГ, активированный 1,1'-карбонилдиимидазолом, МПЭГ2,4,5-трихлорфенилкарбонат, МПЭГ-п-нитрофенолкарбонат и различные производные МПЭГ-сукцината. Ряд дополнительных производных полиэтиленгликоля и химизм реакций для прикрепления полиэти- 10 017417 ленгликоля к белкам раскрыты в документе νθ 98/32466, полное описание которого включено в настоящий документ путем ссылки.
В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения конструкт однодоменного антитела непосредственно связан с полиэтиленгликолем через лизиновый остаток. В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения конструкт однодоменного антитела непосредственно связан с ПЭГ через цистеиновый остаток. Неспаренный цистеиновый остаток может предварительно существовать в последовательности, может быть добавлен включением цистеинового остатка, например, в С-конец конструкта однодоменного антитела. Альтернативно, прикреплению ПЭГ к конструкту однодоменного антитела можно содействовать посредством связанного дисульфидной связью цистеина, такого как цистеин, описанный в документе И8 20060210526.
Другие дериватизированные формы полимерных молекул включают, например, производные, которые имеют дополнительные фрагменты или реактивные группы, присутствующие в них, для обеспечения возможности взаимодействия с аминокислотными остатками описанного в настоящем документе конструкта однодоменного антитела. Такие производные включают активные сложные эфиры Νгидроксисукцинимида (ΝΗ8), полимеры сукцинимидилпропионата и сульфгидрил-селективные реактивные агенты, такие как малеимид, винилсульфон и тиол. Полимеры ПЭГ могут представлять собой линейные молекулы или могут быть разветвленными, где множественные фрагменты ПЭГ присутствуют в одном полимере.
Реактивная группа (например, МАБ, ΝΗ8, 8РА, У8 или тиол) может быть прикреплена непосредственно к полимеру ПЭГ через линкерную молекулу.
Размер полимеров, используемых в изобретении, может находиться в диапазоне от 500 Да до 60 кДа, например от 1000 Да до 60 кДа, от 10 до 60 кДа, от 20 до 60 кДа, от 30 до 60 кДа, от 40 до 60 кДа и до 50-60 кДа. Полимеры, используемые в изобретении, в частности ПЭГ, могут представлять собой полимеры с прямой цепью или могут иметь разветвленную конформацию.
В еще одном варианте осуществления конструкт однодоменного антитела в соответствии с первым аспектом может быть мультимеризован, как, например, гетеро- или гомодимеры, гетеро- или гомотримеры, гетеро- или гомотетрамеры или гетеро- или гомомультимеры более высокого порядка. Мультимеризация может увеличить прочность связывания антигена, причем прочность связывания зависит от суммы величин сродства связывания множественных сайтов связывания.
В пятом аспекте изобретение предоставляет фармацевтическую композицию, содержащую эффективное количество конструкта однодоменного антитела в соответствии с первым аспектом, вместе с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем.
Фармацевтически приемлемый носитель включает любой и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, изотонические и задерживающие всасывание агенты и подобные соединения, которые являются физиологически приемлемыми. Примеры фармацевтически приемлемых носителей включают один или несколько носителей из воды, солевого раствора, забуференного фосфатом солевого раствора, декстрозы, глицерина, этанола и тому подобное, а также их комбинаций. Во многих случаях будет предпочтительно включать в композицию изотонические агенты, например сахара, полиспирты, такие как маннит, сорбит, или хлорид натрия. Также в композицию включают фармацевтически приемлемые вещества, такие как небольшие количества вспомогательных веществ, таких как смачивающие или эмульгирующие агенты, консерванты или буферы.
Композиция может быть представлена в разнообразных формах, включая жидкие, полужидкие и твердые лекарственные формы, такие как жидкие растворы (например, растворы для ингаляции, инъекций и вливаний), дисперсии или суспензии, таблетки, пилюли, порошки, липосомы и суппозитории. Предпочтительно композиция представлена в форме инъецируемого раствора для иммунизации. Введение может быть внутривенным, внутриартериальным, подкожным, внутрибрюшинным или внутримышечным.
Терапевтические композиции обычно должны быть стерильными и устойчивыми в условиях изготовления и хранения. Композиции можно составлять в виде раствора, микроэмульсии, дисперсии, липосомы или другой упорядоченной структуры, подходящей для высокой концентрации лекарственного средства. Соответствующую текучесть раствора можно поддерживать, например, использованием покрытия, такого как лецитин и/или поверхностно-активные вещества. Стерильные инъецируемые растворы можно получить включением активного соединения (т.е. конструкта однодоменного антитела) в требуемом количестве в соответствующий растворитель с одним или комбинацией перечисленных выше ингредиентов, с последующей фильтрационной стерилизацией.
Композицию можно также составить в виде стерильного порошка для получения стерильных инъецируемых растворов.
В определенных вариантах осуществления активное соединение можно получить с носителем, который защитит соединение против быстрого высвобождения, например, лекарственная форма с контролируемым высвобождением, включающая имплантаты, трансдермальные системы и микроинкапсулированные системы доставки. Можно использовать совместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота.
- 11 017417
Композиция может также быть составлена для перорального введения. В этом варианте осуществления конструкт однодоменного антитела может быть заключен в желатиновую капсулу из твердой или мягкой оболочки, спрессован в таблетки или включен непосредственно в рацион индивидуума.
Лекарственные формы, которые обеспечивают возможность легочного, ректального, трансдермального, подоболочечного и внутриглазного введения, должны быть знакомы специалистам в данной области.
В композицию могут также быть включены дополнительные активные соединения. Конструкт однодоменного антитела может быть совместно включен в лекарственную форму и/или совместно введен с одним или несколькими дополнительными терапевтическими средствами, например растворимым рецептором ΤΝΡ-α или химическим агентом, который ингибирует продукцию человеческого ΤΝΡ-α, или антителами, которые связывают другие мишени, такие как цитокины или молекулы клеточной поверхности. Альтернативно, его можно совместно вводить с растворимым иммунохимическим реагентом, таким как белок А, С, С или Ь.
Эффективное количество может включать терапевтически эффективное количество или профилактически эффективное количество конструкта однодоменного антитела по изобретению. Терапевтически эффективное количество относится к количеству, эффективному в дозировках и в течение периода времени, необходимых для достижения желаемого терапевтического результата. Профилактически эффективное количество относится к количеству, эффективному в дозировках и в течение периода времени, необходимых для достижения желаемого профилактического результата. Ввиду того что профилактическую дозу вводят индивидууму перед заболеванием или на более ранней стадии заболевания, то профилактически эффективное количество может быть меньше, чем терапевтически эффективное количество.
В шестом аспекте настоящее изобретение предусматривает использование конструкта однодоменного антитела в соответствии с первым аспектом изобретения в диагностическом применении для выявления человеческого ΤΝΡ-α.
Например, конструкт однодоменного антитела против человеческого ΤΝΡ-α в соответствии с изобретением можно использовать для выявления человеческого ΤΝΡ-α, например, в биологическом образце, таком как сыворотка или плазма, с использованием обычного иммунного анализа, такого как ферментный иммуносорбентный анализ (ЕЫ8А), радиоиммуноанализ (КТА) или иммуногистохимия ткани. Конструкт однодоменного антитела против человеческого ΤΝΡ-α в соответствии с изобретением можно анализировать в биологических жидкостях конкурентным иммуноанализом, используя стандарты рекомбинантного человеческого ΤΝΡ-α, меченные детектируемым веществом, и немеченое антитело против человеческого ΤΝΡ-α.
Конструкт однодоменного антитела против человеческого ΤΝΡ-а в соответствии с изобретением можно также использовать для выявления ΤΝΡ-α у видов, отличных от людей, таких как нечеловекообразные приматы, включая зеленых мартышек, шимпанзе, игрунок, макак резус и другие виды, такие как собака, крыса, мышь, кролик, кошка, свинья, корова.
Конструкт однодоменного антитела против человеческого ΤΝΡ-а в соответствии с изобретением можно также использовать при выращивании клеточных культур, где желательно ингибировать активность ΤΝΡ-α.
В седьмом аспекте изобретение предоставляет способ лечения расстройства, характеризующегося активностью человеческого ΤΝΡ-α у человека, включающий введение индивидууму фармацевтической композиции в соответствии со вторым аспектом изобретения.
Расстройство, характеризующееся активностью человеческого ΤΝΡ-α, включает заболевания и другие расстройства, при которых было продемонстрировано, что у субъекта, страдающего расстройством, присутствие ΤΝΡ-α или является ответственным, или подозревается, что ответственно за патофизиологию расстройства, или представляет собой фактор, который вносит вклад в усугубление расстройства. Предпочтительно расстройство, характеризующееся активностью человеческого ΤΝΡ-α, выбрано из группы, состоящей из воспаления, воспалительных заболеваний, сепсиса, включая септический шок, эндотоксический шок, грамотрицательный сепсис и синдром токсического шока; аутоиммунного заболевания, включая ревматоидный артрит, ювенильный артрит, ревматоидный спондилит, анкилозирующий спондилит, синдром Шегрена, остеоартрит и подагрический артрит, аллергию, рассеянный склероз, аутоиммунный диабет, аутоиммунный увеит, псориаз, псевдопузырчатку и нефротический синдром; воспалительных состояний глаз, включая дегенерацию желтого пятна, увеит, болезнь Бехчета; инфекционного заболевания, включая лихорадку и миалгии вследствие инфекции и кахексию, вызванную инфекцией; болезнь трансплантат против хозяина; роста или метастазирования опухоли, злокачественных гематологических заболеваний; легочных расстройств, включая астму, респираторный дистресс-синдром взрослых, шоковое легкое, хроническое легочное воспалительное заболевание, легочный саркоидоз, пневмосклероз и силикоз; воспалительных кишечных расстройств, включая болезнь Крона и язвенный колит; сердечных расстройств, застойной сердечной недостаточности; сосудистых расстройств, включая болезнь Вегенера, гигантоклеточный артериит; воспалительных костных расстройств, расстройств центральной нервной системы, таких как болезнь Альцгеймера; расстройств периферической нервной сис- 12 017417 темы, таких как ишиас, гепатит, расстройства свертывания, ожоги, реперфузионное повреждение, эндометриоз, образование келоидов и образование рубцовой ткани.
В особенно предпочтительном варианте осуществления расстройство, характеризующееся активностью человеческого ΤΝΕ-α, представляет собой возрастную дегенерацию желтого пятна. ΤΝΕ-α участвует в стимуляции продукции УЕСЕ и стимуляции неоваскуляризации глаза (О1-Н с( а1., 1999, ΙηνοδΙίβαΙίνο Ор11111а1то1оду & У18иа1 8с1епсе 40:1891-98), и поэтому ингибиторы активности ΤΝΡ-α, такие как описанный в настоящем документе конструкт однодоменного антитела, можно было бы использовать для лечения связанных с ангиогенезом расстройств, включая возрастную дегенерацию желтого пятна.
По всему описанию слово содержать или такие его варианты, как содержит или содержащий, следует понимать как включение указанного элемента, целого числа или стадии, или группы элементов, целых чисел или стадий, но не исключение любого другого элемента, целого числа или стадии, или группы элементов, целых чисел или стадий.
Все публикации, указанные в настоящем описании, включены в настоящий документ в виде ссылки. Любое обсуждение документов, актов, материалов, устройств, изделий или им подобных, которые были включены в настоящее описание, предназначено исключительно с целью предоставления контекста для настоящего изобретения. Его не следует воспринимать как допущение того, что какой-либо или все эти предметы образуют часть основы предшествующего уровня техники или являлись общеизвестными в области, относящейся к настоящему изобретению, существовавшей в Австралии или в других странах до даты приоритета каждого пункта формулы настоящей заявки.
Для более ясного понимания сущности настоящего изобретения его предпочтительные формы будут описаны со ссылкой на следующие неограничивающие примеры.
Пример 1.
Материалы и методы.
Выделение генов Уъ приматов Нового Света.
Геномную ДНК игрунки (род Са111йпх, вид неизвестен) и совиной обезьяны (Ао1и§ 1г1У1гда1и5) получали из Европейской Коллекции Клеточных Культур (ЕСАСС), каталожные номера соответственно 85011419 и 90110510. ДНК игрунок получали из линии клеток В95-8, тогда как ДНК совиных обезьян получали из линии клеток ОМК 637-69.
Дегенеративные праймеры на основе человеческих лидерных последовательностей Ук и рекомбинантных сигнальных последовательностей (К.88) получали от \Уа11ег апй Тотйпкоп, АпНЬойу Епдшеетшд: А Ргас11са1 АрргоасН (1996). Праймеры, используемые для амплификации ДНК линии зародышевых клеток Ук, были следующие:
праймер УК1ВЬ
ААТСКСАС.ОТКССЛСАТС (51^ ГО Νο:13) праймер УК1ВЬ35а
ОТГУКОСТККСТААСАСТ (8Е0ГО Νο:Ι4) праймер УК1ВЬ35Ь
АТС.МСТТС'ПУАСАСТОТС (ЗЕЦ ГО Но: 15)
ПЦР (30 циклов) выполняли, используя полимеразу Тад, или с парой праймеров УК1ВЕ%УК1ВЬ35а или УК1ВЕ%УК1ВЬ35Ь. Имелось перекрытие между клонированными последовательностями и двумя использованными наборами праймеров.
Геномные продукты ПЦР клонировали в набор клонирования ЕщЦгодеп ТОРО ТА (каталожный № К4500-01) и секвенировали праймерами М13 Еоптагй и рИС Кеуегае. Последовательность подтверждали в направлении вперед и назад. Для дополнительного подтверждения того, что ключевые последовательности не были подвергнуты ошибкам ПЦР, ПЦР и процесс клонирования повторяли дважды для последовательностей игрунки. Нуклеотид (8ЕО ΙΌ №: 16-26 и 8ЕО ΙΌ №: 38-43) и аминокислота (8ЕО ΙΌ №: 27-37 и 8ЕО ΙΌ №: 44-49) представлены на фиг. 3. Последовательности игрунки 1, 2 и 3 были подтверждены. Последовательности 4, 5, 6, 7 и 8 наблюдались только при начальной ПЦР. Последовательности 9, 10 и 11 наблюдались только при повторной (второй) ПЦР и клонировании.
Синтез олигонуклеотидов и клонирование их в акцепторную последовательность.
Четыре последовательности СОК, а именно ААТКЕС8 (8ЕО ΙΌ №: 1) из последовательности 1 совиной обезьяны (8ЕО ΙΌ №: 44), ЕА88ЬР8 (8ЕО ΙΌ №: 2) из последовательности 2 совиной обезьяны (8ЕО ΙΌ №: 45), ЕАЗКБОЗ (8ЕО ΙΌ №: 3) из последовательности 1 игрунки (8ЕО ΙΌ №: 27) и 8А8ΝΕ-ЕТ (8ЕО ΙΌ №: 4) из последовательности 2 игрунки (8ЕО ΙΌ №: 28) были выбраны из аминокислотных последовательностей, показанных на фиг. 3. Было обнаружено, что последовательность 5 совиной обезьяны УА88ЬР8 (8ЕО ΙΌ №: 56) идентична последовательности кДНК ΟΙ6176295 Ао1и§ папсутаас (ночной обезьяны Ма), все другие последовательности не имели аналогов.
Последовательность вариабельной области акцептора (однодоменного антитела против ΤΝΕ) в векторе экспрессии (вектор, являющийся собственностью Оотапйк) расщепляли (25 мкг) последовательно Крп! и ΞηηΌΙ. которые вырезают большинство ЕК2, а также СЭК2, как указано на карте рестрикционного расщепления, фиг. 4. Затем вектор очищали гелем для удаления вырезанной последовательности ЕК2 и
- 13 017417
ί.ΌΒ2 дикого типа.
Отжиг олиго выполняли инкубацией олиго-пар (500 пмоль, на основании последовательностей, показанных на фиг. 3), при 95°С в течение 5 мин и затем при 65°С в течение 5 мин с последующим предоставлением возможности медленного достижения комнатной температуры на горячем блоке. Затем перекрытия заполняли во время реакции Кленова в присутствии 6ΝΤΡ. Молекулярного клонирования синтетической двухцепочечной ДНК (полученной отжигом олиго и концевым заполнением) в последовательность вариабельной области акцептора достигали, используя стандартные способы.
Созревание сродства.
6АЬ с трансплантированной ΟΌΚ игрунки, соединение 145 (8Еф ΙΌ Νο: 7), подвергали созреванию сродства конструированием 14 отдельных библиотек, каждая из которых являлась диверсификацией последовательности 8ЕЦ ΙΌ Νο: 7 в одном аминокислотном остатке. Выбранные остатки показаны подчеркнутыми ниже.
РЮМТО8Р88Ь5А8УОРКУТ1ТСКА8О81Р8¥ЬН\УУО0КРСКАРКЕИ¥8А8МЕЕТСтУР 8КГ8О8О8ОТРРТЕТ188Е0РЕРГАТУУС00УУ\УКРГТРОООТКУЕ1КК
Отбор был основан на остатках в СЭК.1 и СЭКЗ. которые, как известно, диверсифицированы в репертуаре зрелого человеческого 1д, и каркасных остатках, которые, по наблюдениям, продуцируют функциональные белки после мутагенеза в родственных 6АЬ. Для каждого из отобранных остатков пары комплементарных прямых и обратных праймеров ПЦР были сконструированы с дегенерацией ΝΚΚ, и каждую из двух начальных реакций ПЦР выполняли с одним мутагенным праймером и фланкирующим праймером. После очистки два продукта ПЦР подвергали отжигу и затем амплифицировали, используя только фланкирующие праймеры (сплайсинг перекрывающим распространением ПЦР; Ьотетаи Н.Ь. & С1аск8ои Τ. (ебк), Рйаде 01кр1ау: А ртасйеа1 арргоасй, Οχίοτά ЬшуегкОу Ргекк, Οχίοτά, υΚ). Производили первоначальный скрининг клонов с помощью ЕЬ18А, используя твердофазный ΤΝΕ, и проводили секвенирование положительных клонов. Белок бАЬ очищали из лучших клонов и оценивали на активность при анализах связывания рецепторами и анализах цитотоксичности Ь929. Было обнаружено, что соединения 100 (8ЕЦ ΙΌ Νο: 9) и 123 (8ЕЦ ΙΌ Νο: 8) обеспечивают улучшенную нейтрализацию ΤΝΕ относительно материнского бАЬ, соединения 145 (8ЕЦ ΙΌ Νο: 7).
Комбинация усиливающих сродство замещений соединений 100 и 123 давала бАЬ против ΤΝΕ с дополнительно повышенной активностью в анализе цитотоксичности Ь929 (соединение 196; 8ЕЦ ΙΌ Νο: 10).
Клеточная культура.
Клетки СНОК18У (Εοηζη Βίοίο^ίοκ, υΚ), суспензионный вариант СНОК1, поддерживали на логарифмической фазе роста в среде СО СНО с добавлением 6 мМ Ь-глутамина Дпуйгодеп каталожные № 10743-029 и 25030-081). Культуры инкубировали при 36,5°С, 10% СО2 и встряхивании при 140 об/мин. За 24 ч до трансфекции оценивали количество клеток и жизнеспособность методом исключения трипанового синего (81дта, каталожный № Т8154) на гемоцитометре, 8х106 жизнеспособных клеток осаждали центрифугированием при 200хд в течение 5 мин и ресуспендировали в 8 мл среды СМ25 (Εοηζη Βίοίοβίοκ, НК) с добавлением 10% инактивированной нагреванием диализированной фетальной телячьей сыворотки Дпуйгодеп каталожный № 26400-044) и 6 мМ Ь-глутамина. Клетки высевали из расчета 500 мкл на лунку в 24-луночный планшет и инкубировали при 36,5°С, 10% СО2.
За 3 ч до трансфекции среду пополняли свежим аликвотным количеством 500 мкл среды с добавлением 10% инактивированной нагреванием диализированной фетальной телячьей сыворотки и 6 мМ Ьглутамина.
Векторы экспрессии.
Генные последовательности соединения 112 (8ЕЦ ΙΌ Νο: 50) и соединения 170 (8ЕЦ ΙΌ Νο: 51) оптимизировали для экспрессии клеток млекопитающих и синтезировали.
- 14 017417
Соединение 112
САСАТССАСАТСАСССАСАеССССАОСАВССТЕАССасСТСТСтССЕССАТАЙАСтейСС АТСАССТЕСАСАСССАбССАССССАТСОАСАССТАССТЕСАСТЕЕТАТСАОСЛЕААЕССТ еЕСАДОЕССССТААЗСТЕСТЕАТСТАСАОСаССАЕСААТСТЕОаеАССЕСЗСЕТЕССТАЕС АЕАТТСА0€<ЖА6СеОСТССОЕСАССЕАСТТСАСССГГСАССАТСАЕСАасСТЕСТЕССТ ЕАЕСАТТТсеССАССТАСТАСТЕССА<ЮАООТе<ЭТеТОЕАЕАССТТТСДССТТСССССАС бЕСАССААЕЕТСЕАЕАТСААССЕСОТЕОАОСССААеАЕСТСССАТДАйАСССАСАССТСС ССССССТССССТОСССССОАОСТаСТ&ЗВСОЗАСССАОССТСТТСС'ГйТТСССССССААС ССТААЕЕАСАСССТЕАТОАТСЫКАЕААСССССОАЕеТЕАССТЕССТЕЕТЕЕТЕЕАТЕТЯ лсксАСоассдигсстеадетсАмтсААС^^ ЗССЛАСАССААеСССАСССАСОАССАОТАСААСАОСАССТАССС-еСТССТСТСССИЗСТа АСССТОСТССАССАСаАТТСССТОААССОСААО<ЭАС:ТАСААОТССААеетСТССААСАА(3 ССССТЕССТСССССТАТССАЕААА/кССАТСАССААЕЕССААОаСССАЕСССАОАОАОССС САЕЕТОТАСАСССТЕСССССТАЕСАаАЕАтеАЕСТЕАССААеААССАЕЕТЕТСССТСАСС ТСССТССТЕААЕЗаСТТСТАССССЛЕСЕАСАТСССССТСЮАЕТБЕОАЕАаСААССаССАЗ сссоаоаасаастасааеассагхссссстетестесасаессатес-сассттсттссте ТАСАОСААОСТвАСССТОЭАСЛАСАССАОАТСаСАОСАС(ЭССААССТ0ТТСАОСТ<ЭСА0С ЕТеАТОСАСЕАЕаСССТОСАСААТСАСТАСЛСССАОААЕАВССтаАСССТЕТССССТОЕС ААС (ЗЕЦ ГО Ыо:50)
Соединение 170
САСАТССАСАтеАСССАОАОССССАОСАОССтаАОСОССТСТСТССаСОАТАОАНТОАСС АТСАССТССАСАЕССАЕССАСОССАТСОАСЛССТАСС'гаСАСТЕЕТАТСАССДЕААаССТ (ЗССДА<заССССТААССТ6СТ(5АТСТАСА<ЗС(ЭССАЙСААТСТООАСАССаеСС?ГСССТАС5С АЙАТГСАСССаСАСССаСТССОЗСАССЯАСТТСАСССТОАССАТСАССАСССтССТСССТ <ЗА®ЗАТТТССССАССТАСТАСТ(ЗССАеСА<ЗСТеСТ0ТООАаАССТТТСАССТТСеСССАС ЕеСАССААСЙТСЕАЕАТСААЕСЕЕЕТС-ЕАЕСССААбАЕСАЕСОАТЛАСАСССАСАССТЙС ССССССТЕСССТбССССсеАЕСТЕСТСЕЕСЕЕАСССАОСеТВТТССТОТТСССССССААЕ ССТААйСАСАССС'ГСАтеАТСАЕаАаААССССССАйОТеАССТСССТСКГГОЗТСаАТСТС АСССАССАССАСССТСА.аСТСААОТТСААСТССТАССТдеАССОСОтееАОСТСадСААТ СССААЕАССАА<КССАСССАОЕАЕСАЕТА£ААСВДСАСС|1АССООЕТОЕТЕ'ГСССТЕСТС! АССетЙСТОСАССАЕСАТТСССТСЛАССНСА71ЕСАСТАСАпЕТОСАА&ЗТЕТС’СААСААа еСССТСССТОССССТАТС<ЗАСААААССАТСАеСАА®ЭССААвазССАССССАОАОАаССС САеатеТАСАСССТтааЗСССГласАСАСАТЗАхЭСТОАССААОААССАСЗСТСТСССТеАСС ТОССТООТЕААВ(ЗаСТТСТАССССА5С<ЗАСАТаЗСС<ЗТа<ЭА©ТОССАЙАбСААСС<ЗССАС ССССАЕААСЖАСТАСААЕАССАСССССССТОТОС'ГСбАСАССОАТбвСАаСТТСТТССТС ТАСАССААОСТеАССаТСЕАСААОАССАСАТЕССАССАСаССАЛСеТОТТСАОСТеСАйС ЕТЕАТаСАСеАЕССССТОСАСААТСАСТАСАСССАЕААСАЕССТЕАеССТСТССССТЕеС ΛΑΟ (5Ε<21Ε>Νο:51)
Каждую последовательность фланкировали на 5'-конце сайтом Ηίπά III, последовательностью Козака (СССАСС: 8Е0 ΙΌ Νο: 57) и каппа-лидерной последовательностью человеческого ΙβΟ (аминокислотная последовательность Μ5>νΡΤ0νΕΟΕΕΕΕ\νΕΤΟΑΒί.’: 8Е0 ΙΌ Νο:58). К каждой последовательности на З'-конце добавляли два стоп-кодона и сайт ЕсоКЕ После синтеза гены вводили клонированными в вектор рСК8спр1 (81га!едепе) и высвобождали расщеплением Ηίηά ΙΙΙ/ЕсоК I в соответствующем рестрикционном ферментном буфере (Коске Бхадпозйсз, каталожные № соответственно 10656313001, 10703737001 и 11417967001). Вектор экспрессии 68 рЕЕ12.4 (Бопха Вю1од1ез, ИК) аналогичным образом переваривали и дефосфорилировали, используя щелочную фосфатазу кишечника теленка (Коске Б1адпозксз, каталожный № 10713023001). Каждый ген лигировали в полученный каркас рЕЕ12.4 с использованием системы лигирования ДНК ЫдаЕаз! Кар1б от Рготеда (каталожный № М8221). Продукты лигирования затем трансформировали в химически компетентные клетки Опе 8ко1 Тор 10 (Шуйгодеп, каталожный № С4040-03) и положительные колонии идентифицировали по стандартными методикам. Большие количества полученных векторов (рЕЕ12.4-РNО621 и рЕЕ12.4-РNО521-8114С) получали с помощью набора культур М1б1ргер, выращенных в течение ночи, с использованием колонок М1б1ргер 0!АП11ег (РОден, каталожный № 12243). Векторы получали для трансфекции осаждением 20 мкг в 100% этаноле с 1/10 объема 3М ацетата натрия (рН 5,2) (81дта, каталожные № соответственно Е7023 и 82889). После промывания в 70% этаноле векторы ресуспендировали в 40 мкл Т.Е. рН 8,0 (81дта, каталожный № Т9285) при рабочей концентрации 0,5 мкг/мл.
Трансфекция.
Для каждой трансфекции 2 мкл липофектамина 2000 добавляли к 50 мкл среды Орйтет I (Зпуйгодеп, каталожные № 11668-027 и 31985-062) в лунке 96-луночного планшета. Во вторую лунку добавляли 1,6 мкл вектора экспрессии (0,8 мкг) к 50 мкл среды Орйтет I. После 5-минутной инкубации при комнатной температуре содержимое двух лунок смешивали вместе и оставляли для дальнейшей 20минутной инкубации. После этой второй инкубации всю трансфекционную смесь добавляли в лунку в 24-луночном планшете, содержащем клетки ΟΗΟΚ18ν. Клетки инкубировали в течение по меньшей ме
- 15 017417 ре 72 ч и собирали супернатанты.
Супернатанты центрифугировали при 4000хд в течение 5 мин для осаждения клеточных фрагментов и хранили при -20°С до тех пор, когда экспрессию соединения 112 (8ЕО ΙΌ Νο: 59) и соединения 170 (8ЕО ΙΌ Νο: 11) анализировали с помощью ЕБ18А ΤΝΡ.
Соединение 112 £>I^ΜΤ^8Ρ^81^Α8VС^ΚVΤ^ΓСΚΑЗ^ΑΠ58Υ^Η^VΥ^^ΚΡСΚΑΡΚШΥЗΑ8N^ΕΤ αVΡ5Κ^;8СЗα5ΟТОΡΓ^ΤI88^^ΡΕ^ΡΛΊΎΥС^^VVV/ΚΡΡΤΡ^^ΰΓΚVΕIΚΕVΕΡΚЗ СОКТНТСРРСРАРЕШааР5УШ:Т‘РКРКОТГМ15КТРЕУ'ГСУУУОУ8НЕОРЕУКЕМ \νγνθθνΕνΗΝΑΚ.ΤΚΡΚΕΕΟΥΝ8ΤΥΚνν8νΕΤνΕΗΟΏ5ΫΕΝΟΚΕΥΚακν3ΝΚΑΕΡ ΑΡΙΕΚΤΙ8ΚΑΚΟΟΡΒΕΡθνΥΤυ>Ρ3ΒΙ)ΕΕΤΚΝρν3ΕΤΤ:ΕνκσΓΥΡ5ΒΙΑνΗν/Ε8ΝΟ 9ΡΕΝΝΥΚΤΤΡΡνΕΟ5ΟΟ3ΡΡ£ΥδΚΕΤνθΚ8Κν/(^0ΟΝνΕ8α8νΜΗΕΑΕΗΝΗΥΤ0Κ ЗЕЗЬЗРСК (5Е<Э ГО Νο:59)
ΕΙ.Ι8Λ ΤΝΓ
Титровальные микропланшеты (например, 8агз1ей1 82.9923-148) покрывали раствором 1 мкг/мл человеческого рекомбинантного ΝΗΡ-α (Рерго1есЬ каталожный № 300-01А) в карбонатном/бикарбонатном буфере покрытия при рН 9,6, из расчета 100 мкл/лунку. После инкубации в течение ночи при 4°С планшеты промывали 3 раза РВ8 (0,01 М, рН 7,2) с 0,05% Агееп 20 и 3 раза РВ8. Добавляли 200 мкл блокирующего буфера (РВ8 с 1% В8А {бычий сывороточный альбумин, 81дта каталожный № А-9647}) на лунку и инкубировали при 25°С в течение 1 ч. Планшеты промывали, как указано выше, и добавляли 100-мкл объемы образца или стандартов соединения 170, разбавленных в разбавителе антитела (РВ8 с 1% В8А и 0,05% Агеев 20) на лунку. После инкубации в течение 1 ч при 25°С планшеты промывали, как указано выше, и добавляли 100-мкл объемы вторичного антитела (конъюгированных с пероксидазой козьих античеловеческих иммуноглобулинов, 2утей, каталожный № 81-7120) при разведении 1:1000 в разбавителе антитела на лунку. Планшеты промывали и добавляли 100-мкл объемы субстрата АВΤ8 диаммониевой соли (2,2'-азино-бис(3-этилбензтиазолин-6-сульфоновой кислоты), 81дта, каталожный номер А-1888, 0,5 мг/мл в цитратном буфере при рН 4,4 с 0,03% Η2Ο2) на лунку. Субстрат выдерживали в течение 30 мин при комнатной температуре и поглощение считывали при 405 нм (эталон 620 нм). Концентрации образцов определяли относительно стандартной кривой и выражали относительно средней концентрации экспрессированного соединения 112.
Результаты.
Включение усеченного СН1.
Включение усеченного СН1 в конструкт однодоменного антитела приводит к соединению между вариабельным доменом и шарниром с более высокой гомологией с обычным соединением СН1 1дС1шарниром (91,7%), чем соединение, не имеющее усеченного СН1 (83,3%; рассчитанное с использованием А11дп X Уес1ог ΝΤΙ Диуйгодеи), с наказанием в виде открытия гэпа 1). Вероятно, что увеличенная гомология транслируется в увеличенное напоминание пептидных последовательностей обычного иммуноглобулина, к которым люди-пациенты должны быть иммунологически устойчивыми, посредством этого снижая иммуногенный потенциал.
Последовательности.
Соединение вариабельной области соединения ΤI<VЕII<КVЕРI<8 170-усеченного СН1-шарнира: Соединение СН1 1д61-шарнира (доступ ААС00909 ТКУБККУЕРК8 в NСВI):
Соединение вариабельной области соединения 'ГКУЕ1КК.ЕРК8 170-шарнира (усеченный СН1 отсутствует):
Последовательность СН1 выделена жирным шрифтом, как указано.
Домен СН1 (8ЕО ΙΌ Νο: 60) получен из базы данных белков NСВI (1Шр://\г\г\г.псЫ.п1в1.ш11.с.|ог) ААС00909:
£ΤΚαΡ2νΡΉζ ЛРЯЙКаФеСО 'РЛЛЦОСЬУКР ГРРЕРУГУЖ ЫЭСАЬТЗПУН 'РКРАУИВЗС глгвг.5зууту резеьстотг гаиуинкряг ткурккуерк йсрктптсрр срлрвыдср
121 аУГЪГРВКРК 0ТЦМ15ЯТРЕ УГСУУТОУЯН ΕΟΡρ,νκΡΝΗΎ УВСУЕУНЫАК ΤΚΡΚΕΕΟΥΜ5
161 ТХИУУЗУЬТУ ЬНООДЬКСКВ УКСКУЭНКМ, ΡΆΡΙΕΚΤΙ6Κ АКО0РЯЯР0У ΪΤΙιΡΡεΕΕΕΜ
241 ΦΚΝανϋΙ,ΤΟΙ, νΚΟΕΥΡεΟΙΑ УЕИЕЗКСОРЕ тггкттрруг, ОЙООаггЬУЗ КиТУГЖЗКИО
301 исИУГбСВУМ ИЕАЬНННУТО КЗЬЗЬНРОК
Соединение Сн1-шарнира показано подчеркиванием.
Нейтрализация цитотоксичности, вызванной ΤΝΡ-α.
Способность конструкта однодоменного антитела, соединения 170 (8ЕО ΙΌ Νο: 11), нейтрализовать цитотоксичность, опосредованную ΤΝΡ-α, оценивали с использованием анализа жизнеспособности мы
- 16 017417 шиных клеток Ь929. Серийные разведения соединения 170 в среде ЯРМ1 с 10% фетальной бычьей сывороткой (ΚΡΜΙ-ΡΒ8) получали в объемах по 50 мкл в 96-луночных планшетах с плоским дном. В каждую из этих лунок добавляли 50 мкл рекомбинантного человеческого ΤΝΡ-α (З1га11ипапп Вю1сс. НатЬигд, Осгтапу) в концентрации 360 пг/мл, с последующим добавлением 2,5х104 клеток Ь929 в 50 мкл и 25 мкл актиномицина Ό в концентрации 40 мкг/мл, все полученные в среде ΚΡΜΙ-ΡΒ8. Контроли включали лунки без ΤΝΡ (для определения 100% жизнеспособности), без клеток (0% жизнеспособность) и стандартную кривую ΤΝΡ-α в диапазоне от 2 до 4200 пг/мл. Культуральные планшеты инкубировали в атмосфере 5% СО2 при 37°С в течение 20 ч, затем в течение еще 3 ч после добавления 25 мкл 3-(4,5-диметилтиазол2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2Н-тетразолия (Мтауфеназинэтосульфат (РЕЗ) (Рготсда СсПтасг 96 АО1|с||1|?, Опс, Майкоп ИЗА). Поглощение при 492 нм определяли в сравнении с эталонной длиной волны 630 нм и кривые выживаемости строили с использованием средних величин, рассчитанных по тестируемым лункам в трех повторениях. На способность соединения 170 нейтрализовать ΤΝΡ-α указывает увеличение жизнеспособности клеток увеличивающимися концентрациями соединения 170 (фиг. 6).
Нейтрализация связывания ΤΝΡ-α с человеческими рецепторами р55 и р75 ΤΝΡ.
Способность конструкта однодоменного антитела, соединения 170 (ЗЕЦ ΙΌ Νο: 11), ингибировать связывание ΤΝΡ-α с человеческими рецепторами р55 и р75 ΤΝΡ оценивали анализами связывания с рецепторами. Человеческие рецепторы р55 (ЯпО куйсту каталожный № 372-Κ.Ι) или р75 (ЯпЭ куэсту каталожный № 762-Я2) наносили в виде покрытия на планшеты МахкогЬ (Мшс) в концентрации 0,1 мкг/мл в карбонатном буфере покрытия при рН 9,2 инкубацией в течение ночи при 4°С. Серийные полулогарифмические разведения соединения 170 в диапазоне от 100 мкг/мл до 3,15 нг/мл (и пустой контроль без соединения 170) получали в разбавителе антитела (РВЗ рН 7,2, 0,05% Τνссη-20. 1% ВЗЛ) и смешивали с равным объемом 60 нг/мл человеческого ΤΝΡ-α в разбавителе антитела. Также получали контроль, не содержащий ΡΝ0621 и не содержащий ΤΝΡ-α, для измерения фонового связывания. Всем смесям давали возможность инкубироваться точно в течение 1 ч при комнатной температуре при осторожном перемешивании. В процессе этой инкубации покрытые планшеты промывали 3 раза РВЗ, 0,05% Τ\\Όαι-20 и затем 3 раза РВЗ. Затем планшеты блокировали 200 мкл/лунку РВЗ, 1% ВЗЛ в течение 45 мин при комнатной температуре. После промывания планшета в лунки в трех повторениях добавляли 100 мкл смеси соединения 170/ΤΝΡ-α для каждой испытуемой концентрации соединения 170, наряду с добавлением контролей. Затем планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. После промывания планшетов в каждый планшет добавляли биотинилированное антитело против человеческого ΤΝΡ-α (ЯпЭ Зуйсту каталожный № ВЛΡ210) в концентрации 0,6 мкг/мл в разбавителе антитела и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После промывания добавляли конъюгат стрептавидин-НЯР (2утсй, каталожный № 43-4323) в соотношении 1:2000 в разбавителе антитела и инкубировали при комнатной температуре в течение 45 мин. Визуализацию выполняли с использованием субстрата ТМВ (^йгодсп, каталожный № 00-2023), прекращая с помощью 1 М НС1 через 4 мин. Затем измеряли поглощение при 450 нм с использованием эталона 620 нм. Анализ выполняли, рассчитывая среднее поглощение трех повторений. Среднюю величину неспецифического связывания (без ΤΝΡ-α) вычитали из каждой величины поглощения.
Результаты представлены на фиг. 7 и показывают, что соединение 170 предотвращает взаимодействие ΤΝΡ-α с человеческими рецепторами р55 и р75 ΤΝΡ.
Связывание связанного с клеткой ΤΝΡ-α.
Анализ связывания со связанным с клеткой (трансмембранного) ΤΝΡ-α выполняли, используя линию клеток Ν8Ο, 27Ό4, стабильно трансфицированную геном, кодирующим человеческий белок ΤΝΡ-α, не имеющий сайта расщепления ТАСЕ, так что ΤΝΡ-α остается связанным с клеточной мембраной, поскольку он не может быть расщеплен. Была описана аналогичная клеточная линия на основе другой мышиной миеломы (ЗР2/0) (Зса11оп с! а1. (1995), СуЮкшс 7, 251-259).
Анализ проточной цитометрией выполняли на 5х105 жизнеспособных клетках 27Ό4 на образец, осуществляя все стадии при 4°С или на льду. Клеточные осадки ресуспендировали с тестируемым соединением (соединение 170; ЗЕЦ ΙΌ Νο: 11) или с нерелевантным, подобранным по изотипу специфичности контролем (З1дта, каталожный № 15154) при концентрации 100 мкг/мл в РВЗ, содержащем 2% кВЗ, и инкубировали на льду в течение 1 ч. Выполняли 2 цикла промывания клеток, каждый включающий центрифугирование в течение 10 мин при 1000хд и ресуспендирование клеточного осадка в РВЗ/2% кВЗ. После другой стадии центрифугирования клеточный осадок ресуспендировали в 100 мкл вторичного конъюгата антитела (конъюгат ΡΙΤί.' против человеческого кс, З1дта, каталожный № Ρ9512) и инкубировали в течение 30 мин. Затем образцы дважды промывали, как описано выше, и клеточные осадки ресуспендировали в 500 мкл РВЗ/2%ΡВЗ с 5 мкг/мл йодида пропидия (З1дта, каталожный № Р4864). Флуоресцентное окрашивание клеток анализировали на проточном цитометре Сои11сг Сс11 ЬаЬ ОнагИа и данные обрабатывали с использованием ХУшМОЕ
Результаты представлены на фиг. 8 и показывают, что окрашивание соединением 170 клеток ЖО
- 17 017417
27Ό4, экспрессирующих трансмембранный ΤΝΡ-α (сплошная черная линия), проявляют более высокую интенсивность флуоресценции, чем нерелевантный, подобранный по изотипу специфичности контроль (серая штриховка).
Создание клеточных линий с высокой экспрессией соединения 170.
Устойчивые линии клеток СНОК18У. экспрессирующих соединение 170 (8ЕО ΙΌ Νο: 11), создавали с использованием вектора экспрессии, описанного в разделе Материалы и методы. Кратко, 1х 107 клеток в логарифмической фазе роста подвергали электропорации в лишенной глутамина безбелковой среде СЭСНО в присутствии 40 мкг линеаризованной плазмидной ДНК. Через 24 ч после трансфекции прикладывали селективное давление 50 мкМ метионинсульфоксимина (81дта) и устойчивым клеткам давали возможность образовывать колонии в 96-луночных планшетах. Когда слияние приближалось, одиночные колонии трансфицировали в 24-луночные планшеты Т25 и затем в колбы Т75. После достижения слияния в колбах Т75 клеточные линии прогрессировали в культуры в колбах Е125 Эрленмейера и адаптировали для роста суспензии через 6 субкультур. После адаптации к росту суспензии линии клеток криоконсервировали в замороженной смеси 92,5% среды СЭСНО:7,5% ДМСО.
Пока линии клеток распространяли по лункам и колбам различного размера, параллельно выполняли ряд оценок производительности для продвижения клеточных линий на следующую стадию. Так, на стадиях 24-луночных планшетов и колб Е125 Эрленмейера выполняли оценку производительности. В каждом случае клеткам обеспечивали возможность роста в течение 14 дней и супернатанты оценивали методом ЕМ8А ΤΝΡ, описанным в примере 1, для определения уровней соединения 170. Линии клеток ранжировали по производительности и 10 линий с самой высокой производительностью отбирали для оценки производительности подаваемой партии в анализаторе Εοηζα Βίοίο^ίοδ. Величины производительности составляли от 700 мг/л до 3371 мг/л. Ведущую клеточную линию с производительностью 2724 мг/л отбирали для оценки в 10-литровых ферментерах лабораторного масштаба.
Четыре отдельных 10-литровых ферментера лабораторного масштаба работали в течение 15 дней с ведущей клеточной линией и фирменным способом подаваемой родовой партии на основе безбелковой среды СЭСНО. Итоговая средняя производительность 4 ферментаций составила 4851 мг/л, причем самая высокая производительность составила 4925 мг/л (самый высокий отмеченный уровень производительности, о котором ранее сообщалось Εοηζα Βίοίοβίοδ для не клональной клеточной линии при 15-дневной ферментаций, составляет 3560 мг/л). Используемые 10-литровые ферментеры лабораторного масштаба были предназначены для имитации условий ферментаций, обнаруживаемых в ферментерах большего масштаба до 2000 л, следовательно, ожидается, что ведущая клеточная линия подходит для изготовления в промышленном масштабе. Действительно, аналогичные уровни экспрессии наблюдались в 200литровом ферментере.
Продукт, собранный из 4x10 л ферментаций ведущей клеточной линии, экспрессирующей соединение 170 (8ЕО ΙΌ Νο: 11), очищали методом аффинной хроматографии с белком А и анализировали с помощью 8Ό8 РАСЕ в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях. Как показано на фиг. 11, соединение 170 экспрессируется в виде мономера приблизительно 90 кДа. Этот мономер составлен из 2 субъединиц приблизительно 40 кДа, которые видны на фиг. 12, когда 8Ό8 РАСЕ проводят в восстанавливающих условиях. Поскольку 8Ό8 РАСЕ не подходит для точного определения размера белков, выполняли дополнительный анализ мономера соединения 170. Размер мономера соединения 170, определенный путем Е8ЕМ8 (электрораспылительной ионизационной масс-спектрометрии), составил 78,739 кДа. Это согласуется с прогнозируемой молекулярной массой 2 субъединиц (2x38,058=76,116 кДа), каждая из которых также несет биантеннальную сердцевинную структуру фукозилированного гликанового сахара.
Длительный период полужизни в сыворотке у нечеловекообразных приматов.
Соединение 170 (8ЕО ΙΌ Νο: 11) вводили подкожно зеленым мартышкам в дозах 0,5, 5 и 50 мг/кг, и образцы крови брали через 0,5, 1, 2, 6 и 24 ч, затем через 1 день, 2, 4, 7, 10 и 14 дней. Анализ этих образцов для количественного определения уровней соединения 170 выполняли, используя способ анти-ΤΝΡЕЫ8А, описанный в примере 1. Период полужизни определяли анализом уровней соединения 170 в этих образцах. При 0,5 мг/кг был рассчитан период полужизни 110,5±13,9 ч. При 5 и 50 мг/кг был рассчитан период полужизни 110,9±10,4 и 103,5±11,5 ч.
Когда соединение 170 вводили внутривенным путем в дозе 50 мг/кг, образцы крови брали через 10, 30 и 60 мин, 4 и 24 ч, 2, 4, 7, 10 и 14 дней. Анализ этих образцов для количественного определения уровней соединения 170 выполняли, используя способ анти-ΤNΡ-Е^I8А, описанный в примере 1. Период полужизни определяли анализом уровней соединения 170 в этих образцах. После внутривенного введения 50 мг/кг был рассчитан период полужизни 109,6±10,7 ч.
Благоприятный профиль безопасности.
Соединение 170 (8ЕО ΙΌ Νο: 11), полученное в соответствии со стандартами СМР, оценивали в исследованиях безопасности и токсикологии у животных.
- 18 017417
Безопасность одной дозы.
У различных обезьян, которым вводили соединение 170 разовыми дозами 0,5, 5 и 50 мг/кг подкожным или внутривенным путем введения, не проявлялись эффекты, связанные с их лечением соединением 170. В этих экспериментах проводили микроскопическое исследование ряда органов и не наблюдали никаких эффектов.
Безопасность повышающейся дозы и повторной дозы.
Зеленым мартышкам в течение 7 дней, начиная с дозы 0,5 мг/кг, вводимой или подкожно, или внутривенно, вводили повышающиеся дозы до 50 мг/кг. У животных проводили оценку широкого диапазона физиологических и поведенческих параметров, включая гематологию, биохимические показатели, массу тела и органов и макроскопический осмотр органов после вскрытия. В ходе этих исследований не было отмечено неблагоприятных реакций на лечение соединением 170. После окончания фазы исследования с повышающейся дозой тем животным, которые подкожно получали повышающиеся дозы, вводили дополнительные 4 дозы по 50 мг/кг в течение еще одного 4-недельного периода. Вновь, по широкому диапазону параметров, не наблюдали эффектов, связанных с лечением соединением 170.
Безопасность для сердечно-сосудистой системы.
Безопасность соединения 170 в дозе 50 мг/кг для сердечно-сосудистой системы оценивали у зеленых мартышек с установленными радиотелеметрическими мониторами. Эти мониторы осуществляли прямую регистрацию серии параметров функции дыхания и сердечно-сосудистой системы у бодрствующих обезьян. После введения соединения 170 не было отмечено неблагоприятных клинических явлений, связанных с лечением.
Бактериальная экспрессия.
Соединение 170 (8ЕЦ ΙΌ Νο: 11) в предыдущих примерах получали в системах экспрессии млекопитающих. Функциональное соединение 170 также получали, используя бактериальную систему экспрессии.
Проводили обратную трансляцию аминокислотной последовательности для соединения 170 минус сигнальная последовательность и ее оптимизацию с помощью СспсОр1пшхсг|Л1 для экспрессии Ε.οοίί и вновь синтезировали в СепеЛП СшЬН. Синтезированный ген субклонировали в ρΒΛΌ д111/меченный Нщ вектор экспрессии (1пуйгодеп) через рестрикционные сайты Ναοί и ΗίηάΙΙΙ (Воске), генерирующие вектор, готовый для бактериальной экспрессии. Клетки ТОР10 (1пуйтодеп) трансформировали вектором способом теплового шока и генерировали запасы глицерина одиночных колоний. Условиями индукции были 0,002% арабиноза (81дша; конечная концентрация) и период индукции 4 ч. Образцы белка соединения 170 генерировали, используя способ осмотического шока, как подробно описано в руководстве по системе бактериальной экспрессии ρΒΛΌ (1пуйтодеп). Анализ ВСА (Йетсе) использовали для определения общей концентрации белка в образцах. Бактериально экспрессированное соединение 170 анализировали для выявления связывания с ΤΝΕ-α в ЕБ18Л. как описано в примере 1.
На фиг. 9 показано, что соединение 170, полученное в бактериальной системе, сохраняло связывание с ΤΝΕ-α в анализе ЕБ18Л.
Последовательность ДНК для бактериальной экспрессии соединения 170 представлена ниже:
АТЕаС0АССАСС<ЗАТАТТСАСАТаАССС-А.<ЗАСССССАССАСССТСАССССйАСССТСС<5Т САТССТОТеАССАТТАССТССССТаССДСССАСССОАТТСАТАССТАТСТаСАТТОСТАТ САОСАОАААСССОССАААССеССОАААСТССТОАТТТАТАССССОАаСААССТСКЗАААСС аСССТОСОТАОССвТТТТА0СО0САОСССТАаСС<ЗСАСССАТТТТАСССТЗАССАТТА<5С АссстестессосААаАттттесбАСОтАТТАттсссдесАаотоатстоасстсссттт АССТТТОеССАСООСАССАААвтаеАААТТАААСОСаТОСААСССААААдСАСССАТААА АсссАСАсстссссссссзтстсссососссаААстостсоотассссаАОсатстттсто ТттССаССаАААССЙАААСАТАСССТОА.ТЙАТТА^ССОТАСССССЙААО'ГОЛССГСССТС ет<ЗСТ(ЗОАТСТОАаССАТСААаАТССССАА<ЗТОАААТТСААСТ(ЗСТАТ<5ТОС5АТеасаТВ ОААаТССАТААСОСОААААССАААСССССТОААСААСАСТАТААСАССАССТАТССТОТС СТаАаСОТаСТОАСССТССТССАТСАеСАТТОаСТОААСаССАААаААТАСАААТССААА ОТОТСТААСАААаСОСТССССССССССАТТ(ЗААААААССАТСАОСАААаС<5АААа«ССАО ССвСбТЗААССССАСЗОТСТАТАСССТОСССЗССЗАаСССТСАТОААСТОАССАААААССАО СТСА<ЖЗСТСАССТСССТ<ЗатСАЛАО<ЗСТТТТАТССОАеСОАТАТТССа<ЗТОС!ААТЗ№АА АССААСОСССАвССООААААСААСТАТААДАССАСССССССССТаСТСОАТАОССАТееС АОСТТТ'ГТССТСТАТАвСАААСТСАСССТССАТААААОСССТТСЮСАОСАООССААСОТС тттасст«зсаосст0ат(зсатсзаа<зссстссатаассаттатасссасаааассстс!АОС СТСАСССССаСТАААОСОССОССС (5Ε<2ΙΙ>Νο;61)
Аминокислотная последовательность, кодируемая 8ЕЦ ΙΌ Νο: 61, представлена ниже:
- 19 017417
МЛЗТПГСМТОЗРЗЗЬЗАЗУЕИКУТГТСКАЗОАЮЗТ’ЬНИТОаКРСКАРКЬЫУЗАЗИЬЕТ <^рдррЭ03050ТЕРТЬТ138ЬЕРЮРАТ¥УСООУ™КРЕТРСОСТКУВ1КНУЕРК55ПК ТНТСРРСРАРЕЬЬССРЗУРЪРРРКРКРТЫНЗКТРЕУТСУУУОУЗНЕПРЕУКРМИУУГМЭУ ΕνΗΠΆΚΤΚΡΚΕΕΟ'ΪΝδΤΥΗννδνΕΤνΏΗΟΟΗΙΝαΚΕΥΚακνδΝΚΑΙ,ΡΑΡΙΕΚΤΙΞΚΑΚΟΟ ΡΚΕΡ0νΤίΤΕΡ₽3ΚϋΕΙΛ?ΚΝΰν5ΙΛ?σΕνκαΓνΡ3ΟΙΑνΕ™Ε3Νθ0ΡΕΝΝΥΚΤΤΡΡνΡΡ3ϋ(3 ЗРРЪ¥5КЕТТОК8НМКХ51^6СЗУМНЕАЬИ№УТОКЗЪ5ЬеРакАААТОНННННН (3ΕΟΪΟΝΟ;62)
Эффективность ΐπ уйуо соединения 170 на мышиной модели артрита, опосредованного человеческим Т№.
Линия трансгенных мышей, экспрессирующая человеческий Т№, Тд197, проявляет разрегулированную экспрессию ЮТ, и у нее развивается хронический воспалительный полиартрит (Кейег, й. ей а1. (1991) Тгапкдешс писе ехргекктд Нитап йитог песгокйк йасйог: а ргебйсйуе депеййс то6е1 о! аПНпЕк. ЕМВО Йоигпа1 10:4025-31). Введение соединения 170 (8ЕО ГО №: 11) предотвратило развитие артрита и связанную с ним потерю массы тела у этих мышей (фиг. 10А и В). Группы из 8 гетерозиготных мышей Тд197 (каждая содержащая 4 самца и 4 самки) лечили дважды в неделю внутрибрюшинными инъекциями соединения 170 и нерелевантным контролем специфичности человеческим 1дС1 {паливизумаб (Зупадйк®), Ме61ттипе/АЬЬойй} в РВ8, оба в дозе 10 мг/кг. Лечение начинали, когда возраст мышей достигал 3 недель. Через недельные интервалы мышей взвешивали и проводили балльную оценку (балльную оценку артрита) на основании макроскопической морфологии голеностопного сустава (отек, деформация и степень движения).
Замещение Сук в положении 114 в соединении 112 приводит к увеличенной экспрессии белка.
Соединение 112 (8ЕЦ ГО №: 59) представляет собой модификацию соединения 170 (8ЕЦ ГО №: 11), которое содержит цистеиновый остаток в положении 114 вместо серинового остатка, который присутствует в этом положении в соединении 170. Влияние на экспрессию белка замещения цистеина 114 на серин оценивали сравнением с соединением 170. Множественные культуры клеток-хозяев, трансфицированных генными конструктами для соединения 112 и 170, анализировали с помощью ЕЬ18А для выявления экспрессии белка твердофазным Т№, как изложено в разделе Материалы и методы. Результаты представлены на фиг. 11.
Специалистам в данной области будет понятно, что в изобретение, представленное в определенных вариантах осуществления, можно внести многочисленные изменения и/или модификации без отхода от сущности или объема широко описанного изобретения. Следовательно, представленные варианты осуществления следует рассматривать во всех отношениях как иллюстративные, а не ограничивающие.
- 20 017417
Список последовательностей
<110> РОУЬЕ, АпЬЬопу О. ИООЬУЕИ, Беп)агг.1п Р. ТОМЬЬИЗОЫ, 1ап М. ЬЕЕ, ЛеппЬТег А. 1ΕΝΝΙΝ63, РЫИр А.
<120> КОНСТРУКТ ОДНОДОМЕННОГО АНТИТЕЛА
<130> 529282002500
<140> <141> ИЗ 11/670,261 2007-02-01
<150> <151> из 60/817,507 2006-06-28
<160> 68
<17 0> ЕазЬЗЕО £ог Итпйоыз УегзЬоп 4.0
<210> <211> <212> <213> 1 7 Белок АоЬиз ЬгЬутгдаЬиз
<400> 1
Л1а А1а ТНг Ьуз Ьеи С1п Зег
1 5
<210> <211> <212> <213> 2 7 Белок АоЬиз ЫЬуЬгдаЬиз
<400> 2
С1и А1а Зег Зег Ьеи С1п Зег
1 5
<210> <211> <212> <213> 3 7 Белок СаШЬЬгЬх, вид неизвестен
<400> 3
С1и А1а Зег Ьуз Ьеи С1п Зег
1 5
<210> <211> <212> <213> 4 7 Белок СаШлЬгЬх, вид неизвестен
<400> 4
Зег А1а Зег Азп Ьеи С1и ТЬг
1 5
<210> 5
- 21 017417 <211> 108 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтезированный конструкт <400> 5
Азр Не С1п МеЬ ТЬг <Э1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у
1 5 10 15
Азр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Зег Θΐη Зег 11е Азр Зех Туг
20 25 30
Ьеи ΗΪ3 Тгр Туг <31п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не
35 40 45
туг Зег А1а Зег С1и Ьеи С1п Зег (31у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег <31у
50 55 60
Зег С1у Зег <31у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи <Э1п Рхо
65 70 75 80
<31и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз <31п С1п Уа1 Уа1 Тгр Агд Рго РЬе
85 90 95
ТЬг РЬе С1у С1п С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и 11е Ьуз Агд
100 105 <210> 6 <211> 324 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтезированный конструкт <400> 6 дасаЪссада ьдасссадПс СссаСссЬсЪ сЪдЪаЪдсаЪ сЪдЪаддада ссдЪдЪсасс60 аЪсасЪЪдсс дддсаадЪса дадсаЬЪдаЪ адЪЬа^ЬЪас аЪЬддЬасса дсадааасса120 дддааадссс сЪаадсСссВ да£с£а£адЪ дсаЪссдадЪ идсааадЪдд дд^сссаиса180 сдЪЪЪсадЪд дсадЪдда^с ЪдддасадаЪ ЪСсасЬсЪса сса^садсад ЬсЬдсаассЬ240 даадаЬВЪЬд сЪасдСасСа сЪдСсаасад дЬЬдЪдЬддс дЪссЪССЪас дЪЪсддссаа300 дддассаадд ЬддаааЪсаа асдд324 <210> 7 <211> 108 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
с223> Синтезированный конструкт <400> 7
Азр Не <31п МеЬ ТЬг <31п Зег Рго Зег Зех Ьеи Зех А1а Зег Уа1 С1у
1 5 10 15
Азр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п Зег 11е Азр Зег Туг
20 25 30
Ьеи ΗΪ3 Тгр Тух С1п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не
35 40 45
Туг Зег А1а Зех Азп ьеи 61и ТЬг <31у νβΐ Рго Зег Ахд РЬе Зег 01у
50 55 60
Зег С1у Зег <31у ТЬх Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи С1п Рго
65 70 75 80
01и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг суз 01п С1п Уа1 Уа1 Тхр Агд Рхо РЬе
85 90 95
ТЬг РЬе С1у <31п С1у ТЬг Ьуз Уа1 61и Не
100 105
Ьуз
Агд <210>
<211>
<212>
<213>
108
Белок
Искусственная последовательность <220>
<223>
Синтезированный конструкт <400>
Азр 1 11е С1п Мес ТЬг 5 С1п Зег Рго Зег Зег 10 Ьеи Зег А1а Зег Уа1 15 <31у
Азр Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п А1а Не Азр Зег Туг
20 25 30
Ьеи ΗΪ3 Тгр Туг С1п <31п Ьуз Рго <31у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи 11е
35 40 45
Туг Зег А1а 8ег Азп Ьеи 61и ТЬг 61у ν&ι РГО Зег Агд РЬе Зег <31у
50 55 60
Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не зег Зег ьеи О1п Рго
65 70 75 80
О1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п С1п Уа1 Уа1 Тгр Агд Рго РЬе
85 90 95
тЬг РЬе О1у (31η. <31у ТЬг Ьуз νθΐ С1и 11е Ьуз Агд
100 105
<210> <211>
<212>
<213>
108
Белок
Искусственная последовательность <220>
<223>
Синтезированный конструкт <400>
Азр 1 Не С1п Меб ТЬг 5 <Э1п Зег Рго Зег Зег Ьеи 10 Зег А1а Бег Уа1 15 С1у
Азр Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п Зег Не Азр Зег Туг
20 25 30
Ьеи ΗΪ3 Тгр Туг С1п б1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго ьуз ьеи Ьеи Не
35 40 45
Туг Зег А1а Зег Азп Ьеи С1и ТЬг В1у Уа1 Рго зег Агд РЬе Зег С1у
50 55 60
Зег Й1у Зег 01у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи Ьеи Рго
65 70 75 80
<31и АЗр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз <31п С1П Уа1 Уа1 Тгр Агд Рго РЬе
85 90 95
ТЬг РЬе С31у О1п 61у ТЬг Ьуз Уа1 <31и Не Ьуз Агд
100 105
<210>
<211>
<212>
<213>
108
Белок
Искусственная последовательность <220>
<223>
Синтезированный конструкт <400>
Азр 11е <31п Мер ТЬг <31п Зег Рго Зег Зег
Ьеи
Зег
А1а
Зег
Уа1
С1у
- 23 017417
1 5 10 15
Азр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п А1а 11е Азр Зег Туг
20 25 30
ьеи ΗΪ8 Тгр Туг <31п 61п Ьуз РГО 31у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи 11е
35 40 45
Туг Зег А1а Зег Азп Ьеи О1и ТЬг С1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у
50 55 60
Бег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи Ьеи Рго
65 70 75 80
С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз (31п С1п Уа1 ν&1 Тгр Агд Рго РЬе
85 90 95
ТЬг РЬе 31у 61П 31у ТЬг ьуз Уа1 С1и 11е Ьуз Агд
100 105 <210> 11 <211> 341 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтезированный конструкт <400> 11
Авр 11е 61п Мер ТЬг О1п Зег РГО Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у
1 5 10 15
Азр Агд Уа1 ТЬг Т1е ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п А1а 11е Азр Зег Туг
20 25 30
Ьеи Ηίδ Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго 61у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи 11е
35 40 45
Туг Зег А1а Зег Азп Ьеи С1и ТЬг С1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у
50 55 60
Зег С51у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи Ьеи Рго
65 70 75 80
С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п С1п Ца1 Уа1 Тгр Агд Рго РЬе
85 90 95
ТЬг РЬе 61у С1п 61у ТЬг ьуз Уа1 С1и 11е Ьуз Агд Уа1 С1и Рго Ьуз
100 105 110
Зег Зег Азр Ьуз ТЬг Н1а ТЬг Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго О1и Ьеи
115 120 125
Ьеи О1у С1у Рго Зег ца1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг
130 135 140
Ьеи мео 11е Зег Агд тЬг Рго С1и Уа1 ТЬг Суз Уа1 Уа1 Уа1 Аар Уа1
145 150 155 160
Зег ΗΪΞ С1и Азр Рго С1и Уа1 Ьуз РЬе Азп Тгр Туг Уа1 Азр С1у Уа1
165 170 175
<Э1и Уа1 Н1з Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуа Рго Агд С1и С1и <31п Туг Азп зег
180 185 190
ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 Зег νβΐ Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи Н1з С1п Азр Тгр Ьеи
195 200 205
АЗП Й1у Ьуз <31и Туг ьуз Суз Ьуз Ца1 Зег Азп Ьуз А1а Ьеи Рго А1а
210 215 220
Рго 11е 61и Ьуз ТЬг 11е Зег Ьуз А1а Ьуз С1у е1п Рго Агд С1и Рго
225 230 235 240
61п Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд Азр С1и Ьеи ТЬг Ьуз АЗП С1п
245 250 255
Уа1 Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз С1у РЬе Туг Рго Зег Азр 11е А1а
260 265 270
Уа1 С1и Тгр С1и Зег Азп (31у С1п Рго 61и Азп Азп Туг Ьуа ТЬг ТЬг
275 280 285
Рго Рго Ца1 Ьеи Аар Зег Азр □1у Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи
290 295 300
ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр <31п <31п С1у Азп Уа1 РЬе Зег Суя Зег
- 24 017417
305 310 315 320
Уа1 Меб Н1з <31и А1а Ьеи Н13 Азп НЬз Туг ТЬг <Э1п Ьуз Зег Ьеи Зег
325 330 335
Ьеи Зег Рго <31у Ьуз
340
<210> 12 <211> 16 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<22 3> Синтезированный конструкт <220>
<221> ВАРИАНТ <222> 5 <223> В этой последовательности, Суз, который обычно встречается в положении 5, замещен на остаток Зег.
<400> 12
С1и Рго Ьуз Зег Зег Авр Ьуз ТЬг Н1з ТЬг Суз Рго Рго Суз Рго А1а 15 10 15 <210> 13 <211> 18 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтезированный конструкт <400> 13 ааЪсксаддб кссадабд 18 <210> 14 <211> 18 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220ь <223> Синтезированный конструкт <400ь 14 дрругддс.кк дкаасасЬ 18 <210> 15 <211> 18 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<22 3> Синтезированный конструкт <400> 15 аСдтсббдЬи асасбдбд 18 <210> 16 <211> 267 <212> ДНК
- 25 017417 <213> М1г.Ьг:х, вид неизвестен <400= 16 дасаВссада СдасссадВс ВссаВсВВсс сВдасСдсаС сВдВаддадд сааадВсасс60 аСсасВСдсс дддсдадВса ддасаВВаас аадкддВВад ссВддкаВса дсадааасса120 дддасадВсс сВаадссссВ даВсбаВдад дсаВссаааВ ВдсааадВдд ддВсссаВса180 аддВВсадсд дсадВддаВс ВдддасаВаВ ВВВасВсВса ссаВсадсад ссВдсадссВ240 даадаВдсВд саасВВаВВа сВдВсад267 <210= 17 <211= 267 <212> ДНК <213> Са111ВЕг1х, вид неизвестен <400= 17 дасаВссада ВдаВссадВс ВссаВссВсс сВдВсВдсаВ сВдВаддада сададВсасс60 аьсасвьдсв дддсаадВса дддВаВЬадс сасВддВВад ссВддВаВса дсадааасса120 дддааадссс сВаадсВссВ даВсВаВадВ дсаВсаааВВ Вадааасадд ддВсссаВса180 аддввсадвд даадеддаВс саддасадаВ ВВВасВсВса ссаВсадсад ссВдсадссВ240 даадаВаВВд саасаВаВВа сВдВсаа267 <210= 13 <211= 267 <212> ДНК <213> СаШвНггх, вид неизвестен <400= 18 дасаВссада Вдасссадас ВссаВссВсс сВдВсВдсаВ сВдВаддада сададВсасс60 аВсасВВдсс дддсаадВса дддВаВВадс адсВддВВад ссВддВаВса дсадааасса120 дддааадссс сВаадсВссВ даВсВаВддд дсаВсаааВВ Вддааасадд ддВсссаВса180 адаввсадсд даадвддавс вдддасадав ВВВасВсВса ссаВсадсад ВсВдсадссВ240 даадаВаВВд саасаВаВВа сВдВсаа267 <210= 19 <211= 267 <212> ДНК <213> Са111ВНг1х, вид неизвестен <400= 19 дасаВссада ВдаВссадВс ВссаВссВсс сВдВсВдсаВ сВдВаддада сададВсасс60 аВсасВВдсВ дддсаадВса дддВаВВадс сасВддВВад ссВддВаВса дсадааасса120 дддааадссс сВаадсВссВ даВсВаВадВ дсаВсаааВВ Ваддаасадд ддВсссаВса180 аддВВсадВд даадВддаВс саддасадаВ ВВВасВсВса ссаВсадсад ссВдсадссВ240 даадаВаВВд саасаВаВВа сВдВсаа267 <210= 20 <211= 267 <212> ДНК <213= СаИНЬпх, вид неизвестен <400= 20 дасаВссада ВдасссадВс вссавсввсс сВдасВдсаВ сВдВаддадд сааадВсасс60 аВсасВВдсс дддсдВдВса ддасаВВаас аадВддВВад ссВддВаВса дсадааасса120 дддасадВсс сВаадссссВ даВсВаВдад дсаВссаааВ ВдсааадВдд ддВсссаВса180
аддВВсадсд дсадВддаВс ВдддасаВаВ ВВВасВсВса ссаВсадсад ссВдсадссВ 240
даадаВдсВд саасВВаВВа сВдВсад 267
<210> 21 <211> 267
<212> ДНК <213> СаШЪкггх, вид неизвестен
- 26 017417 <400> 21 дасаЕссада аЕсасЕЕдсс дддаааасЕс сддЕЕсадсд даадаЕдЕЕд
ЕдасссадЕс дддсдадЕса сЕаддсЕссЕ дсадЕддаЕс сааЕЕЕаЕЕа
ЕссаЕссЕсс дддсаЕЕадЕ даЕсЕаЕдсЕ Ьдддасадас сЕдЕсаа сЕдЕсЕдсаЕ ааЕЕаЕЕЕад дсаЕссадЕЕ ЕасасЕсЕса сЕдЕаддада ссЕддЕаЕса ЕасааасЕдд ссаЕсадсад сададЕЕасс дсадааасса даЕЕсссЕсЕ ссЕдсадЕсЕ
120
100
240
267 <210>
<211>
<212>
<213>
267
ДНК
Са1ИЕЬг1х, вид неизвестен <400> дасаЕссада аЕсасЕЕдсс дддасадЕсс аддсЕсадсд даадаЕдсЕд
ЕдасссадЕс дддсдадЕса сЕаадссссЕ дсадЕддаЕс саасЕЕаЕЕа
ЕссаЕсЕЕсс ддасаЕЕаас даЕсЕаЕдад ЕдддасаЕаЕ сЕдЕсад сЕдасЕдсаЕ аадЕддЕЕад дсаЕссаааЕ ЕЕсасЕсЕса сЕдЕаддадд ссЕддЕаЕса ЕдсааадЕдд ссаЕсадсад сааадЕсасс дсадааасса ддЕсссаЕса ссЕдсадссЕ
120
180
240
267 <210=· <211>
<212>
<213>
267
ДНК
СаИЫпхх, вид неизвестен <400=· дасаЕссада аЕсасЕЕдсс дддасадЕсс аддЕЕсадсд даадаЕдсЕд
ЕдасссадЕс дддсдадЕса сЕаадссссЕ дсадЕддаЕс саасЕЕаЕЕа
ЕссаЕсЕЕсс ддасаЕЕаас даЕсЕаЕдад ЕдддасаЕаЕ сЕдЕсад сЕдасЕдсаЕ аадЕддЕсад дсаЕссаааЕ ЕЕЕасЕсЕса сЕдЕаддадд ссЕддЕаЕса ЕдсааадЕдд ссаЕсадсад сааадЕсасс дсадааасса ддЕсссаЕса ссЕдсадссЕ
120
180
240
267 <210>
<211>
<212>
<213>
267
ДНК
СаШЕЬгтх, вид неизвестен <400> дасаЕссада дЕсасЕЕдсс дддасадЕсс аддЕЕсадсд даадаЕдсЕд
ЕдасссадЕс дддсдадЕса сЕаадссссЕ дсадЕддаЕс саасЕЕаЕЕа
ЕссаЕсЕЕсс ддасаЕЕаас даЕсЕаЕдад ЕдддасаЕаЕ сЕдЕсад сЕдасЕдсаЕ аадЕддЕЕад дсаЕссаааЕ ЕЕЕасЕсЕса сЕдЕаддадд ссЕддЕаЕса ЕдсааадЕдд ссаЕсадсад сааадЕсасс дсадааасса ддЕсссаЕса ссЕдсадссЕ
120
180
240
267 <210>
<211>
<212>
<213>
267
ДНК
Са111ЕЬг1х, вид неизвестен <400> дасаЕссада аЕсасЕЕдсс дддасадЕсс аддЕЕсадсд даадаЕдсЕд
ЕдасссадЕс дддсдадЕса ЕЕаадссссЕ дсадЕддаЕс саасЕЕаЕЕа
ЕссаЕсЕЕсс ддасаЕЕаас даЕсЕаЕдад ЕдддасаЕаЕ сЕдЕсад сЕдасЕдсаЕ аадЕддЕЕад дсаЕссаааЕ ЕЕЕасЕсЕса сЕдЕаддадд ссЕддЕаЕса ЕдсааадЕдд ссаЕсадсад сааадЕсасс дсадааасса ддЕсссаЕса ссЕдсадссЕ
120
180
240
267 <210 = <211=· <212>
<213>
267 днк
СаШЕЬгтх, вид неизвестен <400> дасаЕссада аЕсасЕЕдсс дддасадЕсс
ЕдасссадЕс дддсдадЕса сЕаадссссЕ
ЕссаЕсЕЕсс ддасаЕЕаас даЕсЕаЕдад сЕдасЕдсаЕ аадЕддЕЕад дсаЕссаааЕ сЕдЕаддадд ссЕддЕаЕса ЕдсааадЕдд сааадЕсасс дсадааасса ддЕсссаЕЕа
120
160
- 27 017417 аддССсадсд дсадСддаСс СдддасаЬаС даадаСдсСд саасССаССа сСдСсад
СССасСсСса ссаСсадсад ссСдсадссС 240
267 <210> 27 <211> 09 <212> Белок <213> СаНЬСЬгЬх, вид неизвестен <400> 27
Азр 1 Не СЬп МеС ТЬг 5 СЬп Зег Рго Зег Зег Ьеи 10 ТЬг АЬа Зег УаЬ 15 СЬу
СЬу Ьуз УаЬ ТЬг ЬЬе ТЬг Сув Агд АЬа Зег СЬп Азр ЬЬе Авп Ьув Тгр
20 25 30
Ьеи АЬа Тгр Туг СЬп СЬп Ьуз Рго СЬу ТЬг УаЬ Рго Ьуз Рго Ьеи 1Ье
35 40 45
Туг СЬи АЬа Зег Ьув Ьеи СЬп Зег СЬу УаЬ Рго Зег Агд РЬе Зег СЬу
50 55 60
Зег- СЬу Зег О1у ТЬг Туг РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 1Ье Зег Зег Ьеи СЬп Рго
65 70 75 80
СЬи Авр А1а АЬа ТЬг Туг Туг Сув СЬп
85
<210> 28 <211> 89 <212> Белок <213> СаЬЬЬсЬгЬх, вид неизвестен
<400> 28
Азр 1Ье СЬп МеЬ 1Ье СЬп Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег АЬа Зег УаЬ СЬу
1 5 10 Ь5
Азр Агд УаЬ ТЬх- 1Ье ТЬг Сув Тгр АЬа Зег СЬп СЬу 1Ье Зег НЬз Тгр
20 25 30
Ьеи АЬа Тгр Туг СЬп СЬп Ьув Рго СЬу ьуз АЬа Рго ьуз Ьеи Ьеи 1Ье
35 40 45
Туг Зег АЬа Зег Азп Ьеи СЬи ТЬг СЬу УаЬ Рго Зег Агд РЬе Зег СЬу
50 55 60
Зег СЬу Зег Агд ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг ЬЬе Зег Зег Ьеи СЬп Рго
65 70 75 80
СЬи Азр 1Ье АЬа ТЬг Туг Туг Суз СЬп
85
-:210> 29 <211> 89 <212> Белок <213э СаШЬЬгтх, вид неизвестен
<400> 29
Авр 1Ье СЬп МеС ТЬг СЬп ТЬг Рго Зег Зег Ьеи Зег АЬа Зег УаЬ СЬу
1 5 10 15
Азр Агд УаЬ ТЬг ЬЬе ТЬг Суз Агд АЬа Зег СЬп СЬу 1Ье Зег Зег Тгр
20 25 30
Ьеи АЬа Тгр Туг СЬп СЬп Ьуз Рго СЬу Ьуз АЬа Рго Ьуз Ьеи Ьеи 1Ье
35 40 45
Туг СЬу АЬа Зег Азп Ьеи СЬи ТЬг СЬу УаЬ Рго Зег Агд РЬе Зег СЬу
50 55 60
Зег СЬу Зег СЬу ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 1Ье Зег Зег Ьеи СЬп Рго
65 70 75 80
СЬи Азр 1Ье АЬа ТЬг 85 Туг туг Сув СЬп
<210> 30
- 28 017417 <211> 89 <212> Белок <213=· Са111ЪЬг1х, вид неизвестен <400> 30
Азр 1 Не 61п Мер Не 5 01п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег 7а1 01у
10 15
Азр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Тгр А1а Зег <31п С1у Не Бег Нхэ Тгр
20 25 30
Ьеи А1а Тгр Туг С1п 61п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго Ьуз ьеи Ьеи Не
35 40 45
Туг Зег А1а Зег Азп Ьеи <31у ТЬг С1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег □1у
50 55 60
Зег С1у Зег Агд ТЬг Аар РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Бег ьеи 61п рго
65 70 75 80
<31и Аар 11е А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п
85
<210> 31 <211> 89 <212> Белок <213> Са1ИЫ1Г1Х, вид неизвестен
<400=. 31
Авр Не <31п Мер ТЬг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи ТЬг А1а Зег V*! <31у
1 5 10 15
61у Ьуз Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Суз С1п Азр Не Азп Ьуз Тгр
20 25 30
Ьеи А1а Тгр Туг Θΐη С1п Ьуз Рго <31у ТЬг Уа1 Рго Ьуз Рго Ьеи Не
35 40 45
Туг С1и А1а Зег Ьуз Ьеи С1п Зег С1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у
50 55 60
Зег 61у Зег С1у ТЬг Туг РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи <31п Рго
65 70 75 80
С1и Азр А1а А1а ТЬг Туг Туг Суз <31п
85
<210> 32 <211> 89 <212> Белок <213=· СаШЛпх, вид неизвестен
<400> 32
Азр Не С1п МеЬ ТЬг С1п Зег Рго зег Бег Ьеи Бег А1а Бег Уа1 □1у
1 5 10 15
Азр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Бег 01п 01у Не Зег Азп Туг
20 25 30
Ьеи А1а Тгр Туг Θΐη еш ьуз Рго 01у ьуз ТЬг Рго Агд Ьеи Ьеи Не
35 40 45
Туг А 1а А1а Зег Зег Ьеи <31п ТЬг 01у Не Рго Зег Агд РЬе Зег С1у
50 55 60
Зег <Э1у Зег <Э1у ТЬг Азр Туг ТЬг Ьеи ТЬг Г1е Зег Зег Ьеи 01п Зег
65 70 75 80
С1и Азр Уа1 А1а Не 85 Туг Туг Суз С1п
<210> 33 <211> 89 <212> Белок <213> Са111ЪЬг1х, вид неизвестен
- 29 017417 <400 = 33
Азр 1 Не С1п Мее ТЬг 61п Зег 5 Рго Зег Зег Ьеи 10 ТЬГ А1а Зег Уа1 15 <31у
С1у Ьуз Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Зег 61П АЗр Не АЗП Ьув Тгр
20 25 30
Ьеи А1а Тгр Туг <Э1п 61п Ьуз Рго 01у ТЬг Уа1 Рго Ьуз Рго Ьеи Не
35 40 45
Туг 61и А1а Зег Ьув Ьеи <31п Зег 61у Уа1 Рго Зег Агд Ьеи Зег 61у
50 55 60
Зег 61у Зее <31у ТЬг Туг РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи 61п Рго
65 70 75 80
С1и АЗР А1а А1а ТЬг туг Туг Суз С1п
<210 = 34 <211 = 89 <212 = Белок <213 = Са111ЪЬг1х, вид неизвестен <400 = 34
Авр 11е 61п МеЬ ТЬг е1п Зег Рго Зег Зег Ьеи ТЬг А1а Зег Уа1 <31у
1 5 10 15
С1у Ьув Уа1 ТЬг 11е ТЬг Сув Агд А1а Зег С1п Азр 11е Авп Ьув Тгр
20 25 30
Зег А1а Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у ТЬг Уа1 Рго Ьуз Рго Ьеи Не
35 40 45
Туг С1и А1а Зег Ьуз Ьеи С1п Зег С1у Уа1 Рго Бег Агд РЬе Зег <31у
50 55 60
Зег <Э1у Зег С1у ТЬг Туг РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи 61п' Рго
65 70 75 80
С1и Авр А1а А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п
<210 = 35 <211> 89 <212 = Белок <213 = СаНЬЬЬгЬх, вид неизвестен <400= 35
Авр 1 11е 61п Мее ТЬг 5 61п Зег Рго Зег Зег 10 Ьеи ТЬг А1а Зег Уа1 15 61у
С1у Ьуз Уа1 ТЬг ν»1 ТЬг Суз Агд А1а Зег 61П Азр Не Азп Ьуз Тгр
20 25 30
Ьеи А1а Тгр Туг 61п 61п Ьуз Рго 61у ТЬг Уа1 Рго Ьуз Рго Ьеи Не
35 40 45
Туг (31и А1а Зег Ьуз Ьеи 61п Бег 61у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег 61у
50 55 60
Зег С1у зег 61у ТЬг Туг РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи 61п Рго
65 70 75 80
61и Азр А1а А1а ТЬг Туг Туг Суз 61п
<210= 36 <211= 89 <212> Белок <213= СаШЬЬгЬх, вид неизвестен <400= 36
Азр 1 Не 61η мее ТЬг 5 С1п Зег Рго Зег Зег 10 Ьеи ТЬг А1а Зег Уа1 15 61у
61у Ьув Уа1 ТЬг Не ТЬг Сув Агд А1а Зег 61п Авр Не Авп Ьуз Тгр
- 30 017417
20 25 30
Ьеи А1а Тгр Туг С1п С1п Буг Рго 61у ТЬг Уа1 Ьеи Ьуз Рго Ьеи Не
35 40 45
Туг С1и А1а Зег Ьуз Ьеи С1п Зег С1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у
50 55 60
Зег С1у Зег С1у ТЬг Туг ₽Ье ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи С1п Рго
65 70 75 80
<31и Азр А1а А1а ТЬг Туг Туг Суз Е1п
85
Азр 1 Не С1п Μβΐ. ТЬг 01п Зег 5 Рго Зег Зег 10 Ьеи ТЬг А1а Зег ν&1 <Э1у 15
С1у Ьуз Уа1 ТЬг Не ТЬг Суе Агд А1а Зег С1п Азр Не Азп Ьуз Тгр
20 25 30
Ьеи А1а Тгр Туг □ 1п <31п Ьуз Рго Е1у ТЬг Уа1 Рго Ьуз Рго ьеи Не
35 40 45
Туг С1и А1а Зег Ьуз Ьеи С1п Зег С1у Уа1 Рго Ьеи Агд Рке Зег С1у
50 55 60
Зег С1у Зег С1у ТЬг Туг РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи С1п Рго
65 70 75 80
01и АЗр А1а А1а ТЬг 85 Туг Туг суз <31П
- 31 017417 сддССсадСд дсадСддаЪс Сдддасадас даСдаССССд ссасССаССа сСдЪсаа
СасасСсСса ссаъсадсад
СсСдсадссЪ
240
267 <210>
<211>
<212>
<213>
267
ДНК
АоСиз СгхухгдаСиз <400> дасаСссада аСсассидсс дддааадссс аддССсадСд даадаСаЪсд
Сдасссадас дддсаадЪса сЪаадсЪссС даадСддаСс саасаСаССа
СссаЪссСсс дддСаССадс даСссаСаад Сдддасадас сСдСсаа сСдссСдсаС адсСддпъад дсаЬсаааЪЬ СССасСсСса сСдСаддада сссддСаСса Ъддааасадд ссассадсад сааадСсасс дсадааасса ддСсссаЪса ссСдсадссС
120
180
240
267 <210>
<211>
<212>
<213>
267
ДНК
АоСиз Сг±у±гдаСиз <400> дасаСссада аСсасЬЬдсс дддааадссс аддССсадсд даадаСЬЪСд
СдасссадСс дддсаадСса сСаадссссС дсадСддаСс саасЪСаСЪа ессасссссс дддсаССадс даСсСаТХаС СддддсадаЬ сЪдЪсаа сСдасСдсаС ааСааСЬСад дсаСссадСЪ ЪасасСсСса сСдСаддада ссЬддЪаЬса Сдсааадсдд ссассадсад сааадСсасс дсадааасса ддСсссаСса ссЬдсадссС
120
180
240
267 <210> <211> <212> <213>
267
ДНК
АоЪиз СггуТгдаСиз <400> дасаассада аСсасССдсс дддасадСсс аддССсадСд даадаСЬСЪд
СдаЪссадСс дадссадСса сСаадссЪсС дсСдСддаСс саасЪСаССа
ЪссаСсССсс дадСаССадс даСсСаСдас СдддасадаС сЪдСсаа сСдассдсаС адсСддССад дсаЪссаааб СССасСсСса сСдСаддада ссСддСаСса ЬдсСаадСдд ссаЪсадсад сададСсасс дсадааасса ддСсссаЪса ссСдсадссС
120
180
240
267 <210>
<211>
<212>
<213>
Белок
АоСиз
СггуТгдаСиз <400>
АЗр 1 Не С1п МеЬ ТЬг 5 С1п Зег Рго Зег РЬе 10 Ьеи Зег А1а Зег А1а 61у 15
Азр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз <31п Уа1 Зег О1п сиу Не 5ег Зег О1и
20 25 30
Ьеи Ьеи Тгр Туг С1п □1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго МеЬ Ьеи Ьеи 11е
35 40 45
Туг А1а А1а ТЬг Ьуз Ьеи <31а Зег <31у Не Рго Зег Агд РЬе Зег С1у
50 55 60
ΜΪΒ С1у Зег <31у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи <31п Рго
65 70 75 30
Азр Авр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз βΐη
<210> 45 <211> 89 <212> Белок <213> АоСив Сгдуа-ГдаСиз
- 32 017417 <400> 45
А ер Не 61п МеЬ ТЬг <31ь Зег А1а
1 5
Аар Агд Уа1 ТЬг 20 11е ТЬг Суз С1п
ьеи А1а Тгр 35 Туг σΐη 01П ьуз Рго 40
Туг С1и 50 Д1а Зег Зег Ьеи С1п 55 Зег
Зег 65 С1у зег 01у Агд Азр 70 РЬе ТЬг
С1и Аар РЬе Уа1 ТЬг 85 Туг Туг Сув
РЬе Зег 10 Ьеи 5ег А1а Зег Уа1 15 <31у
А1а Зег С1п 01у Не ТЬг Зег Азр
25 30
С1у Азп А1а Зег Ьуз Ьеи Ьеи 11е
45
С1и Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег <Э1у
60
Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи С1п Рго
75 80
С1п
<210> 46 <211> 89 <212> Белок <213 > АоЬиз ЬгхухгдаЬив
<400> 46
Азр Не С1п МеЬ ТЬг 01п ТЬг Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 (31у
1 5 10 15
Азр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Сув Агд А1а Зег С1п Азр Не Туг Авп Туг
20 25 30
Ьеи А1а Тгр Туг (31п 01п Ьув Рго 61у Ьув ТЬг Рго Агд Ьеи Ьеи Не
35 40 45
Туг А1а А1а Зег Зег Ьеи 01п ТЬг 01у 11е Рго Зег Агд РЬе Зег С1у
50 55 50
Зег <31у Зег 01у ТЬг Авр туг ТЬг ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи О1п Рго
65 70 75 80
Авр Авр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Сув О1п
85
<210> 47 <211> 89 <212> Белок <213 > АоЬиз Ьг1У1гдаЬив <400> 47
Авр 1 Не 01п МеЬ ТЬг 5 01п ТЬг Рго Зег Зег 10 Ьеи Рго А1а Зег Уа1 15 31у
Авр Ьуз Уа1 ТЬг Не ТЬг Сув Агд А1а Зег 01п 01у Не Зег Зег Тгр
20 25 30
Ьеи А1а Тгр Туг 01п 01п Ьув Рго 01у Ьув А1а Рго Ьув Ьеи Ьеи 11е
35 40 45
ΗΪ3 Ьув А1а Зег Авп Ьеи 01и ТЬг 01у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у
50 55 50
Зег 01у Зег 01у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи С1п Рго
55 70 75 80
О1и Авр Не А1а ТЬг 85 Туг Туг Суз О1п
<210> 48 <211> 89 <212> Белок <213> АоЬиВ ЬгЗ^хгдаЬиз <400> 48
Азр Не 01п МеЬ ТЬг 01п Зег РГО Зег Зег Ьеи ТЬг А1а Зег Уа1 С1у
1 5 10 15
Азр Ьуз Уа! ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п 61у Не Зег Азп Авп
- 33 017417
20 25 30
Ьеи А1а Тгр Туг <31п О1п Ьуз Рго 01у Ьуз А1а Рго Ьуз Рго ьеи Не
35 40 45
Туг Туг А1а Бег Зег ьеи 61п Зег 01у Уа1 Рго Бег Агд РЬе Зег 01у
50 55 60
Бег С1у Бег 01у А1а Авр Туг ТЬг Ьеи ТЬг ТЬг Зег Зег ьеи б!п Рго
65 70 75 80
61и Авр РНе А1а ТЬг Туг Туг Суз 01п
85
<210> 49
<211> 89
<212> Белок
<213> АоЬиз Ьгь'/хгдаСиз
<400> 49
Авр Авп С1п МеЬ Не С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи ТЬг А1а Бег Уа1 О1у
1 5 10 15
Азр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п Зег Не Бег Зег Тгр
20 25 30
Ьеи А1а Тгр Туг 01п 01п Ьуз Рго 01у ТЬг Уа1 Рго Ьуз Рго Ьеи 11е
35 40 45
Туг Авр А1а Зег Ьуз Ьеи Ьеи Зег С1 у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег 01у
50 55 60
Суз <31у Зег О1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи 01п Рго
65 70 75 80
01и Авр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Сув (31п <210> 50 <211> 1023 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтезированный конструкт <400> 50 дасаЬссада Вдасссадад ссссадсадс сГдадсдссС сСдВдддсда Вададбдасс 60 аЬсассЬдса дадссадсса ддссаЬсдас адсЬассЬдс асЕдд^аеса дсадаадссъ 120 ддсааддссс сЬаадсЬдсЬ даЬсЁасадс дссадсааЬс Ьддадассдд сдЬдссЬадс 180 адаЬЬсадсд дсадсддсЬс сддсассдас ИсасссЬда ссаСсадсад ссЬдсЬдссЬ 240 даддаСВСсд ссассСасСа сСдссадсад дбддЬдЬдда дассЬЕЬсас сССсддссад 300 ддсассаадд ЬддадаЬсаа дсдддЪддад сссаададсь дсдаЬаадас ссасассЬдс 360 ссссссЬдсс сСдсссссда дсВдсбдддс ддасссадсд ЬдСЬссЕдЬЬ сссссссаад 420 ссбааддаса сссЬдаЬдаС садсадаасс сссдаддСда сседсдьддь ддьддаьдед 480 адссасдадд асссЬдаддЬ даадПсаас еддЬасдЬдд асддсдЬдда ддЬдсасааС 540 дссаадасса адсссаддда ддадсадЬас аасадсассЬ ассдддСддС дСссдбдсбд 600 ассдЬдсВдс ассаддаЬЪд дсЬдаасддс ааддадЪаса адЬдсааддЬ дЬссаасаад 660 дсссВдссСд ссссСарсда даааассаЬс адсааддсса адддссадсс садададссс 720 саддЬдЬаса сссЬдссссс ЬадсададаЬ дадсЬдасса адаассаддЬ дЪссседасс 780 ЪдссСддСда адддсСЬсба ссссадсдас аЬсдссдСдд адЪдддадад саасддссад 840 сссдадааса асЬасаадас сасссссссЬ дЬдсЬддаса дсдаВддсад сЬЬсЬЬссЁд 900 Ьасадсаадс ЬдассдЬдда саададсада Сддсадсадд дсаасдЬдСЬ садсЬдсадс 960 дВдаСдсасд аддсссСдса сааЬсасЬас асссадаада дссСдадссС дВссссСддс 1020 аад 1023 е210э 51 <211> 1023 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 34 017417 <220>
<223> Синтезированный конструкт <400> 51 дасаЪссада Ъдасссадад ссссадсадс сЪдадсдсс^ сЪдЪдддсда ЪададЪдасс 60 аЪсассЪдса дадссадсса ддссаСсдас адссасс^дс аскддСаЬса дсадаадссЪ 120 ддсааддссс сЪаадсСдс! да^сЕасадс дссадсааЬс Еддадаседд сдЕдссЬадс 180 адаЕЕсадсд дсадсддсЪс сддсассдас ЫзсасссСда ссаЕсадсад ссЕдсЕдссЕ 240 даддаЕЕЕсд ссассЕасЕа сЕдссадсад дЕддЕдЕдда дассЕЕЕсас сЕЕсддссад 300 ддсассаадд ЕддадаЕсаа дсдддЕддад сссаададса дсдаЕаадас ссасассЕдс 360 ссссссЕдсс сЕдсссссда дсЕдсЕдддс ддасссадсд ЕдЕЕссЕдЕЕ сссссссаад 420 осЕааддаса сссЕдаЕдаЕ садсадаасс сссдаддЕда ссЕдсдЕддЕ ддЕддаЕдЕд 480 адссасдадд асссЕдаддЕ даадЕЕсаас ЕддЕасдЕдд асддсдЕдда ддЕдсасааЕ 540 дссаадасса адсссаддда ддадсадЕас аасадсассЕ ассдддЕддЬ дЕссдЕдсЕд 600 ассдЕдсЕдс ассаддаСЕд дсЕдаасддс ааддадЕаса адЕдсааддЕ дЕссаасаад 660 дсссЕдссЕд ссссЕаЕсда даааассаЕс адсааддсса адддссадсс садададссс 720 саддЕдЕаса сссЕдссссс ЕадсададаЕ дадсЕдасса адаассаддЕ дЕсссЕдасс 780 ЕдссЕддЕда адддсЕЕсЕа ссссадсдас аЕсдссдЕдд адЕдддадад саасддссад В40 сссдадааса асЕасаадас сасссссссЕ дЕдсЕддаса дсдаЕддсад сЕЕсЕЕссЕд 900 Еасадсаадс ЕдассдЕдда саададсада Еддсадсадд дсаасдЕдЕЕ садсЕдсадс 960 дЕдаЕдсасд аддсссЕдса сааЕсасЕас аоссадаада дссЕдадссЕ дЕссссЕддс 1020 аад 1023 <210> 52 <211> 108 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтезированный конструкт <400> 52
Азр 1 Не (31п МеЕ ТЫ 5 <31п Зег Рго Зег Зег Ьеи 10 Зег А1а Зег ν»1 15 61у
Азр Агд νβΐ ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п Зег Не Азр Зег Туг
20 25 30
Ьеи ΗΪ8 Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз Рго Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не
35 40 45
Туг Зег А1а Зег Азп Ьеи С1и ТЫ С1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у
50 55 60
Зег <31у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТНг Не Зег Зег Ьеи О1п Рго
65 70 75 80
<Э1и Азр РЬе А1а ТЫ Туг Туг Суз С1п С1п νβΐ Уа1 Тгр Агд Рго РЬе
85 90 95
ТЫ РЬе <Э1у αΐη 61у ТЬг Ьув ν31 βία Не Ьуз Агд
100 105
<210> 53 <211> 108 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтезированный конструкт <400> 53
Азр Не С1п МеЬ ТЬг С1п Зег Рго
1 5
Азр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Агд
20
Ьеи Н1з Тгр Туг <Э1п σΐη Ьуз Рго
35 40
Туг Зег А1а Зег Азп Ьеи <31и ТЫ
Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 01у
10 15
А1а 25 Зег <31п Зег 11е Азр 30 Зег Туг
<31у Ьуз А1а Рго ьуз 45 Ьеи Ьеи Не
(31у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег (31у
- 35 017417
50 55 60
Агд СЬу Зег СЬу ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг ЬЬе Зег Зег Ьеи СЬп Рго
65 70 75 80
01и Авр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз СЬп СЬп УаЬ УаЬ Тгр Агд Рго РЬе
85 90 95
ТЬг РЬе СЬу СЬп СЬу ТЬг Ьуз УаЬ СЬи ЬЬе Ьуз Агд
100 105 <210> 54 <211> 108 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтезированный конструкт <400> 54
Азр Ь ЬЬе СЬп МеЬ ТЬг 5 СЬп Зег Рго Зег Зег ЬО Ьеи Зег АЬа Зег УаЬ Ь5 СЬу
Азр Агд УаЬ ТЬг ЬЬе ТЬг Суз Агд АЬа Зег СЬп Зег ЬЬе Азр Зег Туг
20 25 30
Ьеи НЬз Тгр Туг СЬп СЬп Ьуз Рго СЬу Ьуз АЬа Рго Ьуз Ьеи Ьеи ЬЬе
35 40 45
Туг Зег АЬ а Зег Авп Ьеи СЬи ТЬг СЬу УаЬ Рго Зег Агд РЬе Зег СЬу
50 55 60
Зег С1у Зег СЬу ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи УаЬ Рго
65 70 75 80
СЬи Азр РЬе АЬа ТЬг Туг Туг Суз СЬп СЬп УаЬ УаЬ Тгр Агд Рго РЬе
35 90 95
ТЬг РЬе СЬу СЬп СЬу ТЬг Ьуз УаЬ СЬи ЬЬе Ьуз Агд
100 105 <210> 55 <211> 7 <2Ь2> Белок <2ЬЗ> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтезированный конструкт <400> 55
Зег АЬа Зег СЬи Ьеи СЬп Зег
5 <2Ь0> 56 <211> 7 <212> Белок <213> АоЬиз Сг1У1гдаСиз <400> 56
Туг АЬа Зег Зег Ьеи СЬп Зег
5 <210> 57 <211> 6 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
- 36 017417 <22 3> Синтезированный конструкт <400> 57 <31у Сув Сув А1а Сув Сув
5
<210> 58
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтезированный конструкт
<400> 53
МеВ Зег 7а1 Рго ТЬг <31п Уа1 Ьеи С1у Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Тгр Ьеи ТЬг
1 5 10 15
Аар А1а Агд Суз
<210> 59 с211> 341 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтезированный конструкт <400> 59
Аар 1 Не <31п МеЕ ТЬг 5 С1п Зег Рго Зег Зег 10 Ьеи Зег А1а Зег Уа1 15 61у
Азр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Зег 61п А1а Не Азр Зег Туг
20 25 30
Ьеи ΗΪ3 Тгр Туг С1п □1п Ьуз Рго <Э1у Ьуз А1а Рго Ьув Ьеи ьеи Не
35 40 45
Туг Зег А1а Зег Азп Ьеи О1и ТЬг <Э1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у
50 55 60
Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи Ьеи Рго
65 70 75 80
С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз 61п 61п Уа1 Уа1 Тгр Агд Рго РЬе
85 90 95
ТЬг РЬе 01у Θΐη (31у ТЬг Ьуз Уа1 С1и Не Ьуз Агд Уа1 Й1и Рго Ьуз
100 105 110
Зег Суз Аар Ьуе ТЬг ΗΪ3 ТЬг Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго С1и Ьеи
115 120 125
Ьеи С1у <31у Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг
130 135 140
Ьеи МеВ Не Зег Агд ТЬг Рго 61и Уа1 ТЬг Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1
145 150 155 160
Зег ΗΪ3 <31и Азр Рго <31и Уа1 Ьуз РЬе АЗП Тгр Туг Уа1 Азр <31у Уа1
165 170 175
<31и Уа1 ΗΪ3 Азп А1а Ьуа ТЬг Ьуз Рго Агд С1и 61и <31п Туг АЗП Зег
180 185 190
ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 Зег ν»1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи Н13 (31п Азр Тгр Ьеи
195 200 205
Азп С1у Ьуз 61и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз А1а Ьеи Рго А1а
210 215 220
Рго Не <31и Ьуз ТЬг Не Зег Ьуз А1а Ьуз О1у 01п Рго Агд С1и Рго
225 230 235 240
<31п Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд Азр <31и Ьеи ТЬг Ьуз Азп 01п
245 250 255
Уа1 Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз С1у РЬе Туг Рго Зег Азр Не А1а
- 37 017417
260 265 270
νβΐ 01и Тгр С1и Зег Азп <31у 01п Рго 61и Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг
275 280 285
Рго Рго ν»1 Ьеи Азр Зег Азр □1у Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи
290 295 300
ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр С1п С1п С1у Азп Уа1 РЬе Зег Суз Зег
305 310 315 320
Уа1 Меь Нхз (31и А1а Ьеи Нхз Азп Нхз Туг ТЬг <31п Ьуз Зег Ьеи Зег
325 330 335
ьеи Зег Рго С1у Ьуз
340
<210> 60 <211> 329 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтезированный конструкт <400> 60
Зег 1 ТЬг Ьуз С1у Рго 5 Зег Уа1 РЬе Рго Ьеи 10 А1а Рхо Зех Зег Ьуз 15 Зег
ТЬг Зег С1у 01у ТЬг А1а А1а Ьеи 01у Суз Ьеи Уа1 Ьуз Азр Тух РЬе
20 25 30
Рго <31и Рго Уа1 ТЬг Уа1 Зег Тгр Азп Зег С1у А1а Ьеи ТЬг Зег 01у
35 40 45
Уа1 Нхз ТЬг РЬе Рго А1а Уа1 Ьеи αΐη Зег Зег С1у Ьеи Туг Зег Ьеи
50 55 60
Зег Зег Уа1 Уа1 ТЬг Уа1 Рго Зег Зег Зег Ьеи С1у ТЫ О1п ТЬг туг
65 70 75 80
Не Суэ Азп Ча1 Азп НхЗ Ьуз Рхо Зег Азп ТЬг Ьуз Уа1 Азр Ьуз Агд
85 90 95
Уа1 О1и Рго Ьуз Зег Суз Азр ьуз ТЫ Нхз ТЬг Суз Рго Рго Суз Рго
100 105 110
А1а Рго 61и Ьеи Ьеи <31у С1у Рго Зег νΑ1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз
115 120 125
Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи Меб Не зех Агд ТЬг Рго С1и Уа1 ТЬг Суз Уа1
130 135 140
Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег Нхз С1и Азр Рго <31и Уа1 Ьуз РЬе Азп Тгр Туг
145 150 155 160
Уа1 Азр С1у Уа1 С1и Уа1 НХЗ Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд С1и О1и
165 170 175
с1п Туг Азп Зег ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи Нхз
180 185 190
С1п АЗр Тгр Ьеи Азп <31у Ьуз <51и Туг Ьуз Суе Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз
195 200 205
А1а Ьеи Рго А1а Рхо Не С1и Ьуз ТЫ Не Зег Ьуз А1а ьуз С1у С1п
210 215 220
Рго Агд С1и Рго О1п Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд С1и С1и Меи
225 230 235 240
ТЫ Ьуз Азп С1п Уа1 Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз 61у РЬе Туг Рго
245 250 255
Зег Азр Не А1а Уа1 <31и Тгр С1и Зег Азп С1у С1п Рго С1и Азп Азп
260 265 270
Туг Ъуз ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Зег Азр С1у Зег РЬе РЬе Ьеи
275 280 285
Туг Зег Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр С1п С1л <31у Азп Уа1
290 295 300
РЬе Зег Суз Зег Уа1 Меи Нхз О1и А1а Ьеи Нхз АЗП Нхз Туг ТЬг С1П
305 310 315 320
Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи зег Рго С1у ьуз
325
- 38 017417 <210> 61 <211> 1044 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтезированный конструкт <400> 61 аЪддсдадса ссдаЪаЬЬса даЬдасссад адсссдадса даЪсдЪдЪда ссаЬЬассЪд ссдЪдсдадс саддсдаььд садсадааас сдддсааадс дссдааасДд сЬдаЬЬДаЬа ддсдЪдссда дссдЬЬЬЪад сддсадсддЬ адсддсассд адссЬдсЬдс сддаадаЬЬЬ ЬдсдассЬаЬ Ьа^Идссадс ассЬЪЬддсс адддсассаа адсддаааСЬ ааасдедЪдд асссасасдЬ дсссдссдЬд Ьссддсдссд даасЬдсЬдд СЬДссдссда аассдааада Ъассс^даСд аЬЪадссдЪа дЬддЪддаЬд ЬдадссаЬда адаьссддаа дЬдаааЫзса даадьдсаъа асдсдаааас сааассдсдс даадаасадЬ дЪдадсдСдс ЪдассдЪдсЪ дсаЬсаддаЬ СддсЪдаасд дЬдЬсЬааса аадсдсйдсс ддсдссдаСе даааааасса ссдсдЪдаас сдсаддИдЪа ЪасссЬдссд ссдадссдСд дрдадссРда ссЕдссЬддЬ даааддсЬЫ: ЬаЬссдадсд адсаасддсс адссддаааа саасЁаЬааа ассассссдс адсЪЪЬЪЬсс ЪдЬаСадсаа асъдассдъд даЪаааадсс ЬЬСадсСдса дсдСдаДдса ЬдаадсдсЬд саЁаассаСЬ сЪдадсссдд дСааадсддс ддсд дссЪдадсдс аЬадсЬа-ЬсЬ дсдсдадсаа аЬЪЫзасссЬ аддьддъдьд аассдаааад дЬддсссдад ссссддаад! асЬддЬаЬдЪ аЪаасадсас дсааадааЪа Ссадсааадс аЬдаас^дас аСаЬЬдсддС сддЕдсЕдда дЕЕддсадса аЕасссадаа дадсдЬдддЪ дсаЫзддЬае ссЬддааасс дассаЫзадс дсдЬссдЪЬЬ садсдаЬааа сдЬдСЬЬсЬд дассЬдсдЬд ддаЕддсдЬд оЬаЪсдЬдЬд саааЬдсааа даааддссад сааааассад ддаардддаа ЬадсдаЬддс дддсаасдЬд аадссЬдадс
120
180
240
300
360
420
480
Б40
600
660
720
780
840
900
960
1020
1044 <210> 62 <211> 356 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтезированный конструкт <400> 62
МеС А1а Зег ТЬг Азр 11е С1п МеЕ ТЬг С1п 10 Зег Рго Зег Зег Ьеи 15 Зег
1 5
А1а Зег Уа1 С1у Аар Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п А1а
20 25 30
Не Азр Зег Туг Ьеи Η1Ξ Тгр Туг С1п 61Π Ьуз Рго □1у Ьуз А1а Рго
35 40 45
Ьуз Ьеи Ьеи Не Туг Зег А1а Зег Азп Ьеи С1и ТЫ С1у Уа1 Рго Зег
50 55 60
Агд РЬе Зег <31у Зег С1у Зег С1у ТЬг Авр РЬе ты Ьеи ТЬг 11е Зег
65 70 75 80
8ег Ьеи Ьеи Рго О1и Авр РЬе А1а ТЬг Туг туг Суз С1п С1п Уа1 Уа1
85 90 95
Тгр Агд Рго РЬе ТЫ РЬе С1у С1п С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и 11е Ьуз Агд
100 105 110
Уа1 О1и Рго Ьуз Зег Зег Аор Ьуэ ТЬг Н1й ТЬг Суз Рго РГО Суз Рго
115 120 125
А1а Рго С1и Ьеи Ьеи 31у С1у Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз
130 135 140
Рго Ьуэ Азр ТЫ Ьеи МеД 11е Зег Агд ТЬг Рго С1и Уа1 ТЬг Суз Уа1
145 150 155 160
Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег ΗΪ3 <Э1и Авр Рго С1и Уа1 Ьув РЬе Азп Тгр Туг
165 170 175
Уа1 Азр С1у Уа1 С1и Уа! Ηίθ Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуэ Рго Агд С1и С1и
180 185 190
<31п Туг Азп Зег ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи Ηίβ
- 39 017417
195 200 205
С1П Азр Тгр Ьеи Азп 61у Ьуз О1и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Бег Азп Ьуз
210 215 220
А1а Ьеи Рго А1а Рго Не 61и Ьуз ТЬг Не Зег Ьуз А1а Ьуз 61у С1п
225 230 235 240
Рго Агд О1и Рго О1п Уа1 Туг ТЬг ьеи Рго Рго Зег Агд Азр С1и Ьеи
245 250 255
ТЬг Ьуз АЗП С1п Уа1 Бег ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз С31у РЬе Туг Рго
260 265 270
Зег Азр Не А1а Уа1 С1и Тгр С1и Зег Азп (31у Е1п Рго С1и Азп Азп
275 280 285
Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Зег Азр С1у Зег РЬе РЬе Ьеи
290 295 300
Туг Зег Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр <31п С1п С1у Азп Уа1
305 310 315 320
РЬе Зег Суз Зег Уа1 меб Нхз С1и А1а Ьеи НХЗ Азп Нхз Туг ТЬг С1п
325 330 335
Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у Ьуз А1а А1а А1а Уа1 Азр Н1з ΗΪ3
340 345 350
ΗΪ3 Нхз Нхз Нхз
355 <210? 63 <211? 216 <212> Белок <213> последовательность доменов СН2/СНЗ из Бнхззрго! ΙΝΞΕΚΤ <400? 63
Рго <Э1и Ьеи Ьеи С1у <Э1у Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи 10 РЬе Рго Рго Ьуз 15 Рго
1 5
Ьуз Авр ТЬг Ьеи МеЬ Не Зег Агд ТЬг Рго О1и Уа1 ТЬг Суз Уа1 Уа1
20 25 30
Уа1 Азр Уа1 Зег Н1з <Э1и Авр Рго Й1и Уа1 Ьуз РЬе Азп Тгр Туг Уа1
35 40 45
Азр <31у Уа1 61и Уа1 Нхз АЗП А1а ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд С1и С1и 61п
50 55 60
Туг АЗП Зег ТЬг Туг Агд Уа1 νβΐ Зег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи Нхз 61п
65 70 75 80
Азр тгр Ьеи Азп О1у Ьуз <31и туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Бег Азп Ьуз А1а
85 90 95
ьеи Рго А1а Рхо Не С1и Ьуз ТЬг Не зег Ьуз А1а Ьуз С1у 61П РГО
100 105 110
Агд 61и РГО С1п Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд Азр <31и Ьеи ТНг
115 120 125
ьуз Азп <31п Уа1 Бег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз <Яу РЬе Туг Рго Зег
130 135 140
Азр Не А1а Уа1 <31и Тгр (31и Бег Азп <31у <31п Рго С1и Азп Азп Туг
145 150 155 160
Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1 ьеи Азр Бег Азр <31у Зег РЬе РЬе Ьеи Туг
165 170 175
Зег Ьуз ьеи ТЬг Уа1 Азр ьуз Зег Агд Тгр 01п С1п С1у Азп Уа1- РЬе
180 185 190
Зег Суз Зег Уа1 МеЬ Нхз С1и А1а Ьеи Н1з АЗП Нхз Туг ТЬг О1п Ьуз
195 200 205
Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у Ьуз
210 215
<210? 64 <211? 17 <212? Белок <213> Искусственная последовательность
- 40 017417 <220>
<223> Синтезированный конструкт <220>
<221> ВАРИАНТ <222> 1 <223> Хаа = X обозначает валин, лейцин или иэолейцин. Предпочитается, чтобы X был валином.
<220>
<221> ВАРИАНТ <222> 6 <223> Хаа = X отсутствует или обозначает аминокислоту, отличную от цистеина. Предпочитается, чтобы X был серином.
А1а
Рго <210> <211> 12> 13>
<220>
<223>
Искусственная последовательность
Синтезированный конструкт
<210> <211>
12>
<213>
Белок
Ното
Зег <210> 67 <211> 11 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтезированный конструкт <400> 67
ТЬг Ьуз Уа1 С1и Не Ьуз Агд С1и Рго Ьуз Зег 15 10 <210> 68 <211> 324 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтезированный конструкт <400> 68 сбдЬаддЬсЪ асЬдддЬсад аддЬаддада дасадасдра дасаВссЬсЬ ддсасадЬдд 60
ЬадЬдаасдд сссдЬЬсадЬ сЬсдЬаасЬа ЬсааЬаааЬд ЬаассаРддС одСсЬЫддЬ 120 сссЬЬЬсддд даЬЬсдадда сбадаЬаСса сдЬаддсЬса асдЪЬЬсасс ссадддрадр 180 дсааадЬсас сдЬсассЬад асссЬдЬсЬа аадСдададЬ ддрадЬсдЬс адасдЬЬдда 240 сЬЬсЬаааас даЬдсаЬдаЬ дасадЬЬдЬс саасасассд саддаааабд саадссддЬЬ 300 сссбддЬЬсс ассСЬЬадЬЬ Ьдсс 324

Claims (15)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Конструкт однодоменного антитела, который связывается с человеческим ΤΝΡ-α, причем конструкт включает:
    (a) однодоменное антитело (бАЬ), которое связывается с человеческим ΤΝΡ-α;
    (b) модифицированную последовательность шарнирной области;
    (c) последовательность константной области тяжелой цепи человека или примата, имеющую усеченный домен СН1 не более чем из 20 остатков, где указанная модифицированная последовательность шарнирной области содержит или делецию, или одну аминокислотную замену по меньшей мере одного цистеинового остатка, который обычно способствует образованию дисульфидной связи между тяжелой и легкой цепями антитела.
  2. 2. Конструкт однодоменного антитела по п.1, где последовательность домена СН1 и шарнирная область представляют собой XЕРКЗΖ^КΤНΤСРРСРΛ (ЗЕО ΙΌ Νο: 64), где X обозначает валин, лейцин или изолейцин, а Ζ отсутствует или обозначает аминокислоту, отличную от цистеина.
  3. 3. Конструкт однодоменного антитела по п.1 или 2, где бЛЬ включает вариабельный домен тяжелой или легкой цепи иммуноглобулина, включающий по меньшей мере одну область, определяющую комплементарность (СОЯ), имеющую последовательность, полученную у примата Нового Света, выбранную из группы, состоящей из ЛЛ'ГКЬрЗ (ЗЕО ΙΌ Νο: 1), ЕЛЗЗЬЦЗ (ЗЕО ΙΌ Νο: 2), ЕЛЗКЬЦЗ (ЗЕО ΙΌ Νο: 3) и ЗЛЗN^ЕΤ (ЗЕО ΙΌ Νο: 4).
  4. 4. Конструкт однодоменного антитела по любому из пп.1-3, где бЛЬ имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
    О10МТ23РЗЗЬЗАЗУСОЕУТ1ТСЕАЗСЗГОЗУЪНИУ0аКР6КАРКЬЫУЗА8НЬЕТО νΡΒΒΕΞΟδαΗΕΤΌΡΤΕΤΙΞΗΏΏΡΕΟΡΑΤΥΥαΟΟννΗΗΡΡΤϊΌβαΤΚνΕΙΚΚ (ЗЕО
    ГО N0:7};
    ОЮМТОЗРЗЗЬЗАЗУСОЕУПТСЕАЗСАГОЗУЬННУООКРаКАРКЬЫУЗАЗНЬЕТ СУР8ЕРЗСЗазеТОРТЬТ138Ь0РЕОРАТУУС00УУИЕРРТРе2<ЗТКУЕ1КЕ (ЗЕО ГО N0:8);
    ОЮМТОЗРЗЗЬЗАЗУСОКУПТСЕАЗОЗТОЗУЪНИУООКРСКАРКЬЬХУЗАЗНЬЕТб
    УР8ЕРЗаЗ&3<ЗТОРТЬТ133ЬЬРЕОРАТУУС0фУУИЕРРТРО0ОТКУЕ1КЕ (ЗЕф
    ГО N0:9) ;
    П10МТ08РЗЗЬЗАЗУСЕВУТ1ТСЕАЗСА1БЗУЬНИУ00КРаКАРКЬЫУ8АЗНЬЕТ
    СУ₽ЗКР5ОЗОЗС;ТОРТЕТ133ЬЬРЕОГАТ¥УС0С’^/ИНРРТГС0СТК7Е1КЕ (ЗЕО
    10 N0:10);
    ОИЭМТЙЗРЗЗЬЗАЗУСОЕУТТТСЕАЗСЗТОЗУЬНИУСОКРаКРРКЪЫУЗАЗНЬЕТе
    УР8ЕРЗСЗаЗОТОРТЬТ133ЬОРЕОРАТУУСООУУИКРРТРООеТКУЕ1КЕ (ЗЕО
    ГО N0:52};
    ШбМТОЗРЗЗЬЗАЗУООЕУПТСЕАЗСЗЮЗУЬНИУОСКРСКАРКЬЫУЗАЗНЬЕте
    УРЗЕРЗ<ЗЕаЗ<ЗТОРТЬТ133Ь0РЕОРАТУУС00УУИЕРРТРОССТКУЕ1КЕ (ЗЕО
    ГО N0:53);
    010МТОЗРЗЗЬЗАЗУСОЕУТ1ТСЕАЗОЗГОЗУЬНИУООКРСКАРКЬЫУЗАЗНЬЕТО УРЗЕРЗОЗ<ЗЗОТОРТЬТ133ЬУРЕОРАТУУС00УУИЕРРТГС0СТКУЕ1КЕ (ЗЕО ГО N0:54);
    и последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную одной из этих последовательностей.
  5. 5. Конструкт однодоменного антитела по любому из пп.1-4, где шарнирная область включает последовательность ЕРИЗЗОКРНТСРРСРЛ (ЗЕО ΙΌ Νο: 12).
  6. 6. Конструкт однодоменного антитела по любому из пп.1-5, где константная область включает домены СН2 и СН3, по меньшей мере на 60% идентичные последовательности ЗЕО ΙΌ Νο: 63.
  7. 7. Конструкт однодоменного антитела по любому из пп.1-6, где константная область включает домены СН2 и СН3, идентичные последовательности ЗЕО ΙΌ Νο: 63.
  8. 8. Конструкт однодоменного антитела по любому из пп.1-7, имеющий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 60% идентичную последовательности ЗЕО ΙΌ Νο: 11.
  9. 9. Конструкт однодоменного антитела по п.8, имеющий аминокислотную последовательность ЗЕО ΙΌ Νο: 11.
  10. 10. Димерный конструкт однодоменного антитела, который связывается с человеческим ΤΝΡ-α, где димер состоит из двух конструктов однодоменного антитела по любому из пп.1-9.
  11. 11. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая конструкт однодоменного антитела по любому из пп.1-9.
    - 42 017417
  12. 12. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по п.11, которая идентична последовательности 8ЕО ΙΌ Νο: 50 или 8Е0 ΙΌ Νο: 51.
  13. 13. Фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество конструкта однодоменного антитела по любому из пп.1-9 или димерного конструкта однодоменного антитела по п.10 вместе с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем.
  14. 14. Способ лечения расстройства, характеризующегося активностью человеческого ΤΝΕ-α у индивидуума-человека, включающий введение индивидууму эффективного количества фармацевтической композиции по п.13, где расстройство, характеризующееся активностью человеческого ΤΝΕ-α, выбрано из группы, состоящей из воспаления, воспалительных заболеваний, сепсиса, включая септический шок, эндотоксический шок, грамотрицательный сепсис и синдром токсического шока; аутоиммунного заболевания, включая ревматоидный артрит, ювенильный артрит, ревматоидный спондилит, анкилозирующий спондилит, синдром Шегрена, остеоартрит и подагрический артрит, аллергию, рассеянный склероз, аутоиммунный диабет, аутоиммунный увеит, псориаз, псевдопузырчатку и нефротический синдром; воспалительных состояний глаз, включая дегенерацию желтого пятна, увеит, болезнь Бехчета; инфекционного заболевания, включая лихорадку и миалгии вследствие инфекции и кахексию, вызванную инфекцией; болезни трансплантат против хозяина; роста или метастазирования опухоли, злокачественных гематологических заболеваний; легочных расстройств, включая астму, респираторный дистресс-синдром взрослых, шоковое легкое, хроническое легочное воспалительное заболевание, легочный саркоидоз, пневмосклероз и силикоз; воспалительных кишечных расстройств, включая болезнь Крона и язвенный колит; сердечных расстройств, застойной сердечной недостаточности; сосудистых расстройств, включая болезнь Вегенера, гигантоклеточный артериит; воспалительных костных расстройств, расстройств центральной нервной системы, таких как болезнь Альцгеймера; расстройств периферической нервной системы, таких как ишиас, гепатит, расстройства свертывания, ожоги, реперфузионное повреждение, эндометриоз, образование келоидов и образование рубцовой ткани.
  15. 15. Способ по п.14, где расстройство, характеризующееся активностью человеческого ΤΝΕ-α, представляет собой глазное расстройство, связанное с ангиогенезом.
    1 САС АТС САС АТС АСС САС ТСТ ССА ТСС ТСТ СТС ТСТ ССА ТСТ СТА 45 1 Аар 11е С1п МеЬ ТЬг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 15 46 СОА САС ССТ СТС АСС АТС АСТ ТСС ССС ССА АСТ САС АСС АТТ САТ 90 16 С1у Аар Агд νδΐ ТЬг 11е ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п Зег Не Аар 30 91 АСТ ТАТ ТТА САТ тсс ТАС САС САС ААА ССА ССС ААА ССС сст ААС 135 31 8ег Туг Ьеи Тгр Туг С1п С1п Ьуэ Рго С1у Ьуз А1а Рго Ьуз 45 136 СТС СТС АТС ТАТ АСТ ССА ТСС САС ТТС САА АСТ ССС СТС ССА ТСА 180 46 Ьеи Ьеи Не Туг Зег А1а Зег С1и Ьеи С1п Зег С1у νβΐ Рго Зег 60 181 СОТ ттс АСТ ССС АСТ ССА ТСТ СОО АСА САТ ТТС АСТ СТС АСС АТС 225 61 Агд РЬе Зег С1у Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е 75 226 АСС АСТ СТС САА ССТ САА САТ ТТТ ССТ АСС ТАС ТАС ТСТ САА САС 270 76 Зег Зег Ьеи С1п Рго С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суе С1п С1п 90 271 СТТ стс ТСС ССТ ССТ ТТТ АСС ТТС ССС САА ССС АСС ААС СТС САА 315 91 Уа1 Уа1 Тгр Агд Рго РЬе ТЬг РЬе 61у <Э1п С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и 105
EA200870208A 2006-02-01 2007-02-01 КОНСТРУКТ ОДНОДОМЕННОГО АНТИТЕЛА, КОТОРЫЙ СВЯЗЫВАЕТСЯ С ЧЕЛОВЕЧЕСКИМ TNF-α, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ EA017417B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2006900456A AU2006900456A0 (en) 2006-02-01 Domain antibody construct
US81750706P 2006-06-28 2006-06-28
PCT/AU2007/000085 WO2007087673A1 (en) 2006-02-01 2007-02-01 Domain antibody construct

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200870208A1 EA200870208A1 (ru) 2009-02-27
EA017417B1 true EA017417B1 (ru) 2012-12-28

Family

ID=45220168

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200870208A EA017417B1 (ru) 2006-02-01 2007-02-01 КОНСТРУКТ ОДНОДОМЕННОГО АНТИТЕЛА, КОТОРЫЙ СВЯЗЫВАЕТСЯ С ЧЕЛОВЕЧЕСКИМ TNF-α, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ

Country Status (12)

Country Link
US (2) US7846439B2 (ru)
EP (1) EP1987064A4 (ru)
JP (2) JP5259423B2 (ru)
KR (1) KR20090039666A (ru)
CN (2) CN103232540A (ru)
AU (1) AU2007211829C9 (ru)
BR (1) BRPI0707425A2 (ru)
CA (1) CA2640661A1 (ru)
EA (1) EA017417B1 (ru)
MX (1) MX2008009792A (ru)
NZ (1) NZ569988A (ru)
WO (1) WO2007087673A1 (ru)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20080068004A (ko) * 2005-08-15 2008-07-22 아라나 테라퓨틱스 리미티드 뉴 월드 영장류 구조형성영역을 가진 조작 항체
EP1969010A4 (en) * 2005-12-20 2009-07-22 Peptech Ltd ANTIBODY TO ANOTHER ANTI-INFLAMMATORY DOMAIN
EA017417B1 (ru) * 2006-02-01 2012-12-28 Сефалон Астралия Пти Лтд. КОНСТРУКТ ОДНОДОМЕННОГО АНТИТЕЛА, КОТОРЫЙ СВЯЗЫВАЕТСЯ С ЧЕЛОВЕЧЕСКИМ TNF-α, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
US20080139790A1 (en) * 2006-12-08 2008-06-12 Jennings Philip A Chimeric antibodies
WO2008092209A1 (en) * 2007-02-01 2008-08-07 Arana Therapeutics Limited Protein construct with improved properties
EP2036980A1 (de) * 2007-09-14 2009-03-18 Gruber, Jens Herabregulation der Genexpression mittels Nukleinsäure-beladener virusähnlicher Partikel
US9181327B2 (en) 2008-01-07 2015-11-10 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anti-HIV domain antibodies and method of making and using same
CN102171247A (zh) * 2008-07-02 2011-08-31 特鲁比昂药品公司 TNF-α拮抗剂多靶点结合蛋白
JP2011530297A (ja) * 2008-08-14 2011-12-22 セファロン・オーストラリア・ピーティーワイ・リミテッド バリアントドメイン抗体
CA2744055A1 (en) * 2008-11-26 2010-06-03 Glaxo Group Limited Polypeptides, antibody variable domains & antagonists
US8133979B2 (en) * 2008-12-16 2012-03-13 Hoffmann-La Roche Inc. Antibodies against human angiopoietin 2
EP2210902A1 (en) * 2009-01-14 2010-07-28 TcL Pharma Recombinant monovalent antibodies
IT1394281B1 (it) * 2009-01-19 2012-06-06 Zardi Processo per la produzione di proteine di fusione polivalenti e polispecifiche utilizzando come struttura portante l'uteroglobina e prodotti cosi' ottenuti.
US20120135005A1 (en) * 2009-04-16 2012-05-31 Harding Fiona A ANTI-TNF-a ANTIBODIES AND THEIR USES
AU2012310328A1 (en) * 2011-09-23 2014-04-10 Technophage, Investigação E Desenvolvimento Em Biotecnologia, S.A. Anti-Tumor Necrosis Factor-alpha agents and uses thereof
CN104045715B (zh) * 2013-03-15 2018-05-01 兰州大学 二聚体化融合蛋白的制备及应用
CN108136012B (zh) 2015-08-07 2022-10-04 伊麦吉纳博公司 靶向分子的抗原结合构建体
US11266745B2 (en) 2017-02-08 2022-03-08 Imaginab, Inc. Extension sequences for diabodies

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1989001974A1 (en) * 1987-09-04 1989-03-09 Celltech Limited Recombinant antibody
WO1989007142A1 (en) * 1988-02-05 1989-08-10 Morrison Sherie L Domain-modified constant region antibodies
US5892019A (en) * 1987-07-15 1999-04-06 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of a single-gene-encoded immunoglobulin
WO2002077029A2 (en) * 2000-11-07 2002-10-03 City Of Hope Cd19-specific redirected immune cells
US20030215427A1 (en) * 2001-04-11 2003-11-20 Michael Jensen CE7-specific redirected immune cells
US20030232971A1 (en) * 1989-08-07 2003-12-18 Rathjen Deborah Ann Tumour necrosis factor binding ligands

Family Cites Families (74)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4002531A (en) * 1976-01-22 1977-01-11 Pierce Chemical Company Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby
US4816567A (en) * 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5225539A (en) * 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
DE3785186T2 (de) 1986-09-02 1993-07-15 Enzon Lab Inc Bindungsmolekuele mit einzelpolypeptidkette.
US5223409A (en) * 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
EP0768377A1 (en) 1988-09-02 1997-04-16 Protein Engineering Corporation Generation and selection of recombinant varied binding proteins
US5349052A (en) * 1988-10-20 1994-09-20 Royal Free Hospital School Of Medicine Process for fractionating polyethylene glycol (PEG)-protein adducts and an adduct for PEG and granulocyte-macrophage colony stimulating factor
DE68913658T3 (de) 1988-11-11 2005-07-21 Stratagene, La Jolla Klonierung von Immunglobulin Sequenzen aus den variablen Domänen
US5530101A (en) * 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5324844A (en) * 1989-04-19 1994-06-28 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
EP0486526B2 (en) * 1989-08-07 2001-03-07 Peptech Limited Tumour necrosis factor binding ligands
US5977307A (en) * 1989-09-07 1999-11-02 Alkermes, Inc. Transferrin receptor specific ligand-neuropharmaceutical agent fusion proteins
US5427908A (en) * 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9015198D0 (en) * 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
AU665190B2 (en) 1990-07-10 1995-12-21 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
CA2090126C (en) * 1990-08-02 2002-10-22 John W. Schrader Methods for the production of proteins with a desired function
ES2113940T3 (es) 1990-12-03 1998-05-16 Genentech Inc Metodo de enriquecimiento para variantes de proteinas con propiedades de union alteradas.
GB9109645D0 (en) 1991-05-03 1991-06-26 Celltech Ltd Recombinant antibodies
US5994510A (en) 1990-12-21 1999-11-30 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibodies specific for TNFα
DK0605442T3 (da) 1991-07-25 2003-08-04 Idec Pharma Corp Rekombinante antistoffer til human terapi
ATE463573T1 (de) * 1991-12-02 2010-04-15 Medimmune Ltd Herstellung von autoantikörpern auf phagenoberflächen ausgehend von antikörpersegmentbibliotheken
GB9317618D0 (en) 1993-08-24 1993-10-06 Royal Free Hosp School Med Polymer modifications
EP0859841B1 (en) 1995-08-18 2002-06-19 MorphoSys AG Protein/(poly)peptide libraries
US6090382A (en) * 1996-02-09 2000-07-18 Basf Aktiengesellschaft Human antibodies that bind human TNFα
CA2243459C (en) 1996-02-09 2002-09-17 Basf Aktiengesellschaft Human antibodies that bind human tnf.alpha.
CA2249195A1 (en) 1996-03-18 1997-09-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobin-like domains with increased half lives
US6300065B1 (en) 1996-05-31 2001-10-09 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Yeast cell surface display of proteins and uses thereof
JP3692542B2 (ja) 1997-01-21 2005-09-07 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレーション Ｒｎａ−蛋白質の融合体を用いた蛋白質の選抜
JP2001508783A (ja) 1997-01-29 2001-07-03 ポリマスク・ファーマシューティカルズ・パブリック・リミテッド・カンパニー Ｐｅｇ化法
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
AU7171098A (en) 1997-05-01 1998-11-24 Board Of Regents, The University Of Texas System Directed evolution of enzymes and antibodies
IES80929B2 (en) 1997-11-26 1999-06-30 Donal Richard Mcgoey Filter with form-retaining stabilizing means
EP1105427A2 (en) * 1998-08-17 2001-06-13 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
GB9900298D0 (en) 1999-01-07 1999-02-24 Medical Res Council Optical sorting method
KR101077001B1 (ko) 1999-01-15 2011-10-26 제넨테크, 인크. 효과기 기능이 변화된 폴리펩티드 변이체
US7235643B2 (en) * 2000-11-07 2007-06-26 Morphotek, Inc. Antibodies and methods for generating genetically altered antibodies with high affinity
GB0029407D0 (en) 2000-12-01 2001-01-17 Affitech As Product
US7754208B2 (en) * 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US20050271663A1 (en) * 2001-06-28 2005-12-08 Domantis Limited Compositions and methods for treating inflammatory disorders
WO2004058821A2 (en) 2002-12-27 2004-07-15 Domantis Limited Dual specific single domain antibodies specific for a ligand and for the receptor of the ligand
US20060073141A1 (en) * 2001-06-28 2006-04-06 Domantis Limited Compositions and methods for treating inflammatory disorders
MXPA05000511A (es) * 2001-07-12 2005-09-30 Jefferson Foote Anticuepros super humanizados.
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
DK1527100T3 (da) 2002-03-29 2009-09-07 Schering Corp Humane monoklonale antistoffer mod interleukin-5 og fremgangsm der og sammens tninger omfattende samme
US7696320B2 (en) * 2004-08-24 2010-04-13 Domantis Limited Ligands that have binding specificity for VEGF and/or EGFR and methods of use therefor
US20080241166A1 (en) * 2002-06-28 2008-10-02 Domantis Limited Ligands that bind a receptor
ATE328906T1 (de) 2002-06-28 2006-06-15 Domantis Ltd Dual-specifische liganden mit erhöhter halbwertszeit
EP1558645B1 (en) * 2002-11-08 2011-07-27 Ablynx N.V. Stabilized single domain antibodies in pharmaceutical composition adapted for inhalation
US20060034845A1 (en) 2002-11-08 2006-02-16 Karen Silence Single domain antibodies directed against tumor necrosis factor alpha and uses therefor
GB0230201D0 (en) 2002-12-27 2003-02-05 Domantis Ltd Retargeting
GB0230203D0 (en) 2002-12-27 2003-02-05 Domantis Ltd Fc fusion
SI1606318T1 (sl) 2003-03-26 2009-12-31 Apogenix Gmbh Izboljšani Fc fuzijski proteini
ES2609102T3 (es) 2003-06-27 2017-04-18 Bioren, LLC Mutagénesis por revisión
AU2004220325B2 (en) 2003-06-30 2011-05-12 Domantis Limited Polypeptides
GB0316294D0 (en) * 2003-07-11 2003-08-13 Polytherics Ltd Conjugated biological molecules and their preparation
RS53476B (en) * 2003-07-18 2014-12-31 Amgen Fremont Inc. Hepatocyte Growth Factor Binders
EP1692174A2 (en) 2003-11-07 2006-08-23 Amgen Inc. Monkey immunoglobulin sequences
US20050226863A1 (en) 2003-11-20 2005-10-13 Massachusetts Institute Of Technology Single-domain antibodies and uses thereof
BRPI0417107A (pt) 2003-12-19 2007-02-06 Genentech Inc fragmento de anticorpo, métodos de preparação do fragmento de anticorpo, ácido nucléico isolado, composições, célula hospedeira e métodos de fabricação e de geração de fragmento de anticorpo
EP1732946B1 (en) 2004-03-08 2011-07-27 ZymoGenetics, Inc. Dimeric fusion proteins and materials and methods for producing them
US6979473B2 (en) 2004-03-15 2005-12-27 Boston Scientific Scimed, Inc. Method for fine bore orifice spray coating of medical devices and pre-filming atomization
EP1769003A1 (en) 2004-07-06 2007-04-04 Bioren, Inc. HIGH AFFINITY ANTI-TNF-alpha ANTIBODIES AND METHOD
CN101171263A (zh) 2005-03-04 2008-04-30 比奥根艾迪克Ma公司 通过合理修饰互补决定区残基使免疫球蛋白可变区人源化的方法
EP1874816A4 (en) 2005-04-26 2010-08-25 Medimmune Inc MODULATION OF THE ANTIBODY EFFECTOR FUNCTION BY "HINGE" DOMENGINE ENGINEERING
EP1888649A2 (en) 2005-05-09 2008-02-20 GlycArt Biotechnology AG Antigen binding molecules having modified fc regions and altered binding to fc receptors
KR20080068004A (ko) * 2005-08-15 2008-07-22 아라나 테라퓨틱스 리미티드 뉴 월드 영장류 구조형성영역을 가진 조작 항체
ZA200802246B (en) 2005-08-15 2009-09-30 Arana Therapeutics Ltd Engineered antibodies with new world primate framework regions
EP1969010A4 (en) * 2005-12-20 2009-07-22 Peptech Ltd ANTIBODY TO ANOTHER ANTI-INFLAMMATORY DOMAIN
EA017417B1 (ru) 2006-02-01 2012-12-28 Сефалон Астралия Пти Лтд. КОНСТРУКТ ОДНОДОМЕННОГО АНТИТЕЛА, КОТОРЫЙ СВЯЗЫВАЕТСЯ С ЧЕЛОВЕЧЕСКИМ TNF-α, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
AU2007212147A1 (en) 2006-02-03 2007-08-16 Medimmune, Llc Protein formulations
CN101466733A (zh) 2006-04-14 2009-06-24 特鲁比昂药品公司 包含免疫球蛋白铰链区和Fc效应子功能改变了的Fc区的结合蛋白
US20080139790A1 (en) 2006-12-08 2008-06-12 Jennings Philip A Chimeric antibodies
WO2008131242A1 (en) 2007-04-18 2008-10-30 Zymogenetics, Inc. Single chain fc, methods of making and methods of treatment
US20090148905A1 (en) 2007-11-30 2009-06-11 Claire Ashman Antigen-binding constructs

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5892019A (en) * 1987-07-15 1999-04-06 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of a single-gene-encoded immunoglobulin
WO1989001974A1 (en) * 1987-09-04 1989-03-09 Celltech Limited Recombinant antibody
WO1989007142A1 (en) * 1988-02-05 1989-08-10 Morrison Sherie L Domain-modified constant region antibodies
US20030232971A1 (en) * 1989-08-07 2003-12-18 Rathjen Deborah Ann Tumour necrosis factor binding ligands
WO2002077029A2 (en) * 2000-11-07 2002-10-03 City Of Hope Cd19-specific redirected immune cells
US20030215427A1 (en) * 2001-04-11 2003-11-20 Michael Jensen CE7-specific redirected immune cells

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GenBank accession AAB37424 & Qi and Xiang (1995), "A genetically engineered single-gene-encoded anti-TAG72 chimeric antibody secreted from myeloma cells" Hum. Antibodies Hybridomas 6(4): 161-166 *
Muñoz E. et al. (1998), "The C1 domain of IgG is not essential for C3 covalent binding: importance of the other constant domains as targets for C3" International Immunology 10(2): 97-106, Fig. 1 and 2 *

Also Published As

Publication number Publication date
CA2640661A1 (en) 2007-08-09
US7846439B2 (en) 2010-12-07
WO2007087673A1 (en) 2007-08-09
JP2013059338A (ja) 2013-04-04
AU2007211829C1 (en) 2013-05-23
AU2007211829C8 (en) 2013-06-27
US20070202105A1 (en) 2007-08-30
JP5259423B2 (ja) 2013-08-07
JP2009525031A (ja) 2009-07-09
CN103232540A (zh) 2013-08-07
EP1987064A1 (en) 2008-11-05
CN101400703A (zh) 2009-04-01
BRPI0707425A2 (pt) 2011-05-03
EA200870208A1 (ru) 2009-02-27
EP1987064A4 (en) 2010-04-07
KR20090039666A (ko) 2009-04-22
AU2007211829A1 (en) 2007-08-09
CN101400703B (zh) 2013-05-08
NZ569988A (en) 2011-09-30
MX2008009792A (es) 2008-09-01
AU2007211829B2 (en) 2012-11-08
AU2007211829C9 (en) 2013-07-11
US20110044979A1 (en) 2011-02-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA017417B1 (ru) КОНСТРУКТ ОДНОДОМЕННОГО АНТИТЕЛА, КОТОРЫЙ СВЯЗЫВАЕТСЯ С ЧЕЛОВЕЧЕСКИМ TNF-α, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
JP6749235B2 (ja) Ｇｌｐ−１ｒに特異的に結合する抗体およびそのｇｌｐ−１との融合タンパク質
JP2009525031A5 (ru)
US11472864B2 (en) Polynucleotides encoding APOA1-PON1 fusion polypeptides
US11780916B2 (en) GIPR antibody and GLP-1 fusion protein thereof, and pharmaceutical composition and application thereof
WO2021052349A1 (zh) Gipr抗体及其与glp-1的融合蛋白质，以及其药物组合物和应用
EA022898B1 (ru) Стабильные полипептиды, вариабельные домены антитела и антагонисты против tnfr1
CN110357959B (zh) Gcgr抗体及其与glp-1的融合蛋白质，以及其药物组合物和应用
WO2019238093A1 (zh) APJ抗体及其与Elabela的融合蛋白质，以及其药物组合物和应用
JP2024514253A (ja) ヒトエンドセリン受容体に特異的に結合できる抗体及び糖尿病性腎症及び慢性腎疾患の治療におけるその応用
NZ738963B2 (en) Apoa-1 fusion polypeptides and related compositions and methods

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): BY RU