EA022898B1

EA022898B1 - Стабильные полипептиды, вариабельные домены антитела и антагонисты против tnfr1

Info

Publication number: EA022898B1
Application number: EA201290172A
Authority: EA
Inventors: Инуша Де Сильва; Армин Сепп; Адриан Алларт Стооп
Original assignee: Глаксо Груп Лимитед
Priority date: 2009-10-27
Filing date: 2010-10-25
Publication date: 2016-03-31
Also published as: IL218860A0; CR20120197A; NZ599114A; US20150210767A1; ES2552177T3; CN102686239B; AU2010311640B2; EP2493504A1; PE20121564A1; SG10201500274TA; DOP2012000113A; KR20120101417A; CN102686239A; MX2012005024A; WO2011051217A1; CO6612254A2; BR112012010114A2; CA2777312A1; CL2012001055A1; TW201125877A

Abstract

Изобретение относится к стабильным при хранении единичным вариабельным доменам антитела (dAbs), антагонистам и полиспецифическим лигандам против TNFR1, а также к способам и их применениям. Полипептиды, единичные вариабельные домены антитела (dAbs), антагонисты и полиспецифические лиганды против TNFR1 полезны для лечения и/или предупреждения воспалительного заболевания, такого как артрит или COPD (хроническое обструктивное заболевание легких), а также для легочного введения, перорального введения, доставки в легкое и доставки в ЖК (желудочно-кишечный) тракт пациента.

Description

Настоящее изобретение относится к полипептидам, единичным вариабельным доменам иммуноглобулина (антитела) против фактора некроза опухоли 1 (ΤΝΡΚ1, р55, С.Н12()а. Р60, член 1А суперсемейства рецепторов ΤΝΡ, ΤΝΡΚ8Ε1Α) и антагонистам, содержащим их. Изобретение также относится к способам, применению, препаратам, композициям и устройствам, содержащим или в которых используют такие лиганды против ΤΝΡΚ.1.

Предшествующий уровень техники

ΤΝΡΚ1

ΤΝΡΚ.1 представляет собой трансмембранный рецептор, содержащий внеклеточную область, которая связывает лиганд, и внутриклеточный домен, который лишен присущей ему активности в отношении передачи сигнала, но может связываться с молекулами, передающими сигнал. Комплекс ΤΝΡΚ.1 со связанным ΤΝΡ содержит три цепи ΤΝΡΚ.1 и три цепи ΤΝΡ (Ваппег е( а1., Се11, 73(3): 431-445 (1993)). Лиганд ΤΝΡ присутствует в виде тримера, который связан тремя цепями ΤΝΡΚ.1 (там же). Три цепи ΤΝΡΚ.1 плотно кластеризованы вместе в рецептор-лигандном комплексе, и эта кластеризация является необходимым условием для ΤΝΡΚΤ-опосредованной передачи сигнала. Фактически, поливалентные агенты, которые связывают ΤΝΡΚ.1, такие как антитела против ΤΝΡΚ.1, могут индуцировать ΤΝΡΚ.1 кластеризацию и передачу сигнала в отсутствие ΤΝΡ и обычно используются в качестве агонистов ΤΝΡΚ.1 (см., например, Ве1ка е( а1., ЕМВО, 14(6): 1156-1165 (1995); МапФк-№уак е( а1., I. 1ттипо1, 167: 1920-1928 (2001)). Соответственно, поливалентные агенты, которые связывают ΤΝΡΚ.1, как правило, не являются эффективными антагонистами ΤΝΡΚ.1, даже если они блокируют связывание ΤΝΡα с ΤΝΡΚ.1.

5>ЕС ГО номера в этом параграфе относятся к нумерации, используемой в νΟ 2006038027. Внеклеточная область ΤΝΡΚ.1 содержит аминоконцевой сегмент из тринадцати аминокислот (аминокислоты 113 из 5>ЕС ГО ΝΟ: 603 (человек); аминокислоты 1-13 из δΕΟ ГО ΝΟ: 604 (мышь)), домен 1 (аминокислоты 14-53 из δΕΟ ГО ΝΟ: 603 (человек); аминокислоты 14-53 из δΕΟ ГО ΝΟ: 604 (мышь)), домен 2 (аминокислоты 54-97 из δΕΟ ГО ΝΟ: 603 (человек); аминокислоты 54-97 из δΕΟ ГО ΝΟ: 604 (мышь)), домен 3 (аминокислоты 98-138 из δΕΟ ГО ΝΟ: 603 (человек); аминокислоты 98-138 из δΕΟ ГО ΝΟ: 604 (мышь)) и домен 4 (аминокислоты 139-167 из δΕΟ ГО ΝΟ: 603 (человек); аминокислоты 139-167 из δΕΟ ГО ΝΟ: 604 (мышь)), за которыми следует проксимальная к мембране область (аминокислоты 168-182 из δΕΟ ГО ΝΟ: 603_(человек); аминокислоты 168-183 из δΕΟ ГО νΟ: 604 (мышь)) (см. Ваппег е( а1., Се11 73(3) 431-445 (1993) и Рое18сНег е( а1., Се11 61(2) 351-359 (1990)). Домены 2 и 3 образуют контакт со связанным лигандом (ΤΝΡβ, ΤΝΡα) (Ваппег е( а1., Се11, 73(3) 431-445 (1993)). Внеклеточная область ΤΝΡΚ.1 также содержит участок, называемый прелиганд-связывающим доменом сборки или РЬАЭ (от англ. рте-Ндапй Ыпбшд а88етЫу йоташ) доменом (аминокислоты 1-53 из δΕΟ ГО ΝΟ: 603_(человек); аминокислоты 1-53 из δΕΟ ГО ΝΟ: 604 (мышь)) (ЛНе ОоуегптеШ: οί (Не υδΑ, νΟ 01/58953; Иепд е( а1., №Циге МеЙ1С1пе, йот 10.1038/пт 1304 (2005)).

ΤΝΡΚ.1 слущивается с поверхности клеток ш У1уо в результате процесса, который включает протеолиз ΤΝΡΚ.1 в домене 4 или в проксимальной к мембране области (аминокислоты 168-182 из δΕΟ ГО ΝΟ: 603; аминокислоты 168-183 из δΕΟ ГО ΝΟ: 604) с получением растворимой формы ΤΝΡΚ.1. Растворимый ΤΝΡΚ.1 сохраняет способность связывать ΤΝΡα и таким образом действует в качестве эндогенного ингибитора активности ΤΝΡα.

В νΟ 2006038027, νΟ 2008149144 и νΟ 2008149148 описаны единичные вариабельные домены иммуноглобулина против ΤΝΡΚ.1 и антагонисты, содержащие их. В этих документах также описано применение таких доменов и антагонистов для лечения и/или предупреждения состояний, опосредованных ΤΝΡα. Желательно предложить единичные вариабельные домены иммуноглобулина против человеческого ΤΝΡΚ.1 с улучшенной стабильностью при хранении, антагонисты, лиганды и продукты, содержащие их. Цель этого состоит в обеспечении улучшенных диагностических реагентов для обнаружения человеческого ΤΝΡΚ.1 в образцах, а также или альтернативно, в обеспечении улучшенных терапевтических средств для лечения и/или профилактики ΤNΡΚ.1-опосредованных состояний и заболеваний у людей или других млекопитающих. Особенно желательно предложить единичные вариабельные домены иммуноглобулина против ΤΝΡΚ.1, содержащие их антагонисты, лиганды и продукты, которые являются мощными нейтрализаторами ΤΝΡΚ.1, особенно человеческого ΤΝΡΚ.1.

Различные аспекты настоящего изобретения удовлетворяют этим желательным характеристикам. Краткое изложение сущности изобретения

В одном аспекте в изобретении предложен единичный вариабельный домен иммуноглобулина против рецептора ΤΝΡα 1 типа (ΤΝΡΚ.1; р55), содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95, 96, 97, 98 или 99% идентична (или на 100% идентична) аминокислотной последовательности ΌΟΜ1Η-574-188, ΌΟΜ1Η-574-189, ΌΟΜ1Η-574-190, ΌΟΜ1Η-574-191, ΌΟΜ1Η-574-192, ΌΟΜ1Η-574-195, ΌΟΜ1Η-574-196, ΌΟΜ1Η-574-201, ΌΟΜ1Η-574-202, ΌΟΜ1Η-574-203, ΌΟΜ1Η-574-204, ΌΟΜ1Η-574-205, ΌΟΜ1Η-574-206, ΌΟΜ1Η-574-207, ΌΟΜ1Η-574-208, ΌΟΜ1Η-574-209, ΌΟΜ1Η-574-211, ΌΟΜ1Η-574-212, ΌΟΜ1Η-574-213 или ΌΟΜ1Η-574-214, где единичный вариабельный домен имеет ΟΌ₃₂₀менее 1,0, менее 0,9, менее 0,8, менее 0,7, менее 0,6, менее 0,5 или менее 0,4 после инкубации в РВЗ при 40°С в течение 40 ч. В одном воплощении единичный вариабельный домен имеет ΟΌ₃₂₀ менее 1,0, менее

- 1 022898

0,9, менее 0,8, менее 0,7, менее 0,6, менее 0,5, или менее 0,4, как определено следующим тестом:

a) 100 мкл 1 мг/мл единичного вариабельного домена в РВ8 (забуференный фосфатами физиологический раствор) распределяют в планшете для ПЦР;

b) планшет инкубируют в течение 40 ч при 40°С; и

c) аликвоту 50 мкл извлекают и измеряют ΟΌ₃₂₀, например, в устройстве для считывания микропланшетов (например, от Мо1еси1аг ОсЦссЦ

В одном аспекте в изобретении предложен единичный вариабельный домен иммуноглобулина против рецептора ΤΝΡα 1 типа (ΤΝΡΚ1; р55), содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95, 96, 97, 98 или 99% идентична (или на 100% идентична) аминокислотной последовательности ΌΟΜ1Η-574-188, ΌΟΜ1Η-574-189, ΌΟΜ1Η-574-190, ΌΟΜ1Η-574-191, ΌΟΜ1Η-574-192, ΌΟΜ1Η-574-193, ΌΟΜ1Η-574-194, ΌΟΜ1Η-574-195, ΌΟΜ1Η-574-196, ΌΟΜ1Η-574-201, ΌΟΜ1Η-574-202, ΌΟΜ1Η-574-203, ΌΟΜ1Η-574-204, ΌΟΜ1Η-574-205, ΌΟΜ1Η-574-206, ΌΟΜ1Η-574-207, ΌΟΜ1Η-574-208, ΌΟΜ1Η-574-209, ΌΟΜ1Η-574-211, ΌΟΜ1Η-574-212, Ό0Μ1Η-574-213 или ΌΟΜ1Η-574-214.

В одном аспекте в изобретении предложен единичный вариабельный домен иммуноглобулина против рецептора ΤΝΡα 1 типа (ΤΝΡΚ1; р55), содержащий аминокислотную последовательность, которая идентична аминокислотной последовательности, выбранной из ΌΟΜ1Η-574-188, ΌΟΜ1Η-574-189. ΌΟΜ1Η-574-190, ΌΟΜ1Η-574-191, ΌΟΜ1Η-574-192, ΌΟΜ1Η-574-193, ΌΟΜ1Η-574-194, ΌΟΜ1Η-574-195, ΌΟΜ1Η-574-196, ΌΟΜ1Η-574-201, ΌΟΜ1Η-574-202, ΌΟΜ1Η-574-203, ΌΟΜ1Η-574-204, ΌΟΜ1Η-574-205, ΌΟΜ1Η-574-206, ΌΟΜ1Η-574-207, ΌΟΜ1Η-574-208, ΌΟΜ1Η-574-209, ΌΟΜ1Η-574-211, ΌΟΜ1Η-574-212, ΌΟΜ1Η-574-213 и ΌΟΜ1Η-574-214, или имеет 1 или 2 аминокислотных изменения по сравнению с указанной аминокислотной последовательностью.

В одном аспекте в изобретении предложена нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, которая кодирует единичный вариабельный домен иммуноглобулина против рецептора ΤΝΡα 1 типа (ΤΝΡΚ1; р55), где вариабельный домен содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95, 96, 97, 98 или 99% идентична (или на 100% идентична) аминокислотной последовательности ΌΟΜ1Η-574-188, ΌΟΜ1Η-574-189, ΌΟΜ1Η-574-190, ΌΟΜ1Η-574-191, ΌΟΜ1Η-574192, ΌΟΜ1Η-574-193, ΌΟΜ1Η-574-194, ΌΟΜ1Η-574-195, ΌΟΜ1Η-574-196, ΌΟΜ1Η-574-201, ΌΟΜ1Η-574202, ΌΟΜ1Η-574-203, ΌΟΜ1Η-574-204, ΌΟΜ1Η-574-205, ΌΟΜ1Η-574-206, ΌΟΜ1Η-574-207, ΌΟΜ1Η-574208, ΌΟΜ1Η-574-209, ΌΟΜ1Η-574-211, ΌΟΜ1Η-574-212, ΌΟΜ1Η-574-213 или ΌΟΜ1Η-574-214.

В одном аспекте в изобретении предложена нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, которая кодирует единичный вариабельный домен иммуноглобулина против рецептора ΤΝΡα 1 типа (ΤΝΡΚ1; р55), где нуклеотидная последовательность по меньшей мере на 70, 75 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична (или на 100% идентична) нуклеотидной последовательности ΌΟΜ1Η-574-188, ΌΟΜ1Η-574-189, ΌΟΜ1Η-574-190, ΌΟΜ1Η-574-191, ΌΟΜ1Η-574-192, ΌΟΜ1Η-574-193, ΌΟΜ1Η-574-194, ΌΟΜ1Η-574-195, ΌΟΜ1Η-574-196, ΌΟΜ1Η-574-201, ΌΟΜ1Η-574-202, ΌΟΜ1Η-574-203, ΌΟΜ1Η-574-204, ΌΟΜ1Η-574-205, ΌΟΜ1Η-574-206, ΌΟΜ1Η-574-207, ΌΟΜ1Η-574-208, ΌΟΜ1Η-574-209, ΌΟΜ1Η-574-211, ΌΟΜ1Η-574-212, ΌΟΜ1Η-574-213 или ΌΟΜ1Η-574-214.

В одном аспекте изобретение относится к полиспецифическому лиганду, содержащему единичный вариабельный домен иммуноглобулина по настоящему изобретению и возможно по меньшей мере один единичный вариабельный домена иммуноглобулина, который специфически связывает сывороточный альбумин (8А). В одном воплощении полиспецифический лиганд представляет собой или содержит аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотной последовательности любой конструкции, называемой ΌΜ8, описанной в данной заявке, например любой из ΌΜ85535, 5541, 5542 и 5544. В одном воплощении полиспецифический лиганд представляет собой или содержит аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью любой ΌΜ8, раскрытой в данной заявке, например, любой из нуклеотидных последовательностей ΌΜ85535, 5541, 5542 и 5544. В одном воплощении в изобретении предложена нуклеиновая кислота, кодирующая полиспецифический лиганд, содержащий единичный вариабельный домен иммуноглобулина против ΤΝΡΚ1 и единичный вариабельный домен против 8А, где указанная нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность любой ΌΜ8, описанной в данной заявке, например любой из нуклеотидных последовательностей ΌΜ85535, 5541, 5542 и 5544. Предложен вектор, содержащий такую нуклеиновую кислоту, а также клетка-хозяин, содержащая такой вектор.

В одном аспекте в изобретении предложен полиспецифический лиганд, содержащий: (1) единичный вариабельный домен иммуноглобулина против рецептора ΤΝΡα 1 типа (ΤΝΡΚ1; р55), который содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95, 96, 97, 98 или 99% идентична (или на 100% идентична) аминокислотной последовательности ΌΟΜ11ι-574-188, ΌΟΜ1Η-574-189, ΌΟΜ1Η574-190, ΌΟΜ1Η-574-191, ΌΟΜ1Η-574-192, ΌΟΜ1Η-574-193, ΌΟΜ1Η-574-194, ΌΟΜ1Η-574-195, ΌΟΜ1Η574-196, ΌΟΜ1Η-574-201, ΌΟΜ1Η-574-202, ΌΟΜ1Η-574-203, ΌΟΜ1Η-574-204, ΌΟΜ1Η-574-205, ΌΟΜ1Η574-206, ΌΟΜ1Η-574-207, ΌΟΜ1Η-574-208, ΌΟΜ1Η-574-209, ΌΟΜ1Η-574-211, ΌΟΜ1Η-574-212, ΌΟΜ1Η574-213 или ΌΟΜ1Η-574-214, (2) по меньшей мере один единичный вариабельный домен иммуноглобулина против сывороточного альбумина (8А), который специфически связывает 8А, где единичный ва- 2 022898 риабельный домен иммуноглобулина против (8Ά) содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности ΟΟΜ7Η-11-3, и (3) возможно где между единичным вариабельным доменом против ΤΝΡΚ1 и единичным вариабельным доменом против §А имеется линкер.

В одном воплощении линкер содержит аминокислотную последовательность ΑδΤ, возможно ΑδΤδΟΡδ. Альтернативно, линкер представляет собой Αδ(Ο₄δ)_η, где η равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8, например Αδ(Ο₄δ)₃.

В одном аспекте в изобретении предложен антагонист ΤΝΡΚ1, содержащий единичный вариабельный домен, полипептид или полиспецифический лиганд из любого предшествующего аспекта изобретения.

В одном аспекте в изобретении предложен антагонист рецептора ΤΝΡα 1 типа (ΤΝΡΚ1; р55) по изобретению для пероральной доставки, доставки в ЖК (желудочно-кишечный) тракт пациента, легочной доставки, доставки в легкое пациента или системной доставки.

В одном аспекте в изобретении предложен антагонист ΤΝΡΚ1 по изобретению для лечения и/или профилактики воспалительного состояния.

В одном аспекте в изобретении предложено применение антагониста ΤΝΡΚ1 по изобретению в изготовлении лекарственного средства для лечения и/или профилактики воспалительного состояния.

В другом аспекте изобретения предложен полиспецифический лиганд, содержащий или состоящий из ΌΜΞ5535, ΌΜΞ5541, ΌΜΞ5542 или ΌΜΞ5544. В одном аспекте изобретения предложена нуклеиновая кислота, кодирующая один из полиспецифических лигандов. В другом аспекте изобретения предложена нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична нуклеотидной последовательности ΌΜΞ5535, ΌΜΞ5541, ΌΜΞ5542 или ΌΜΞ5544. Кроме того, в изобретении предложены вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, а также клетка-хозяин, возможно нечеловеческая эмбриональная клетка, содержащая вектор.

Краткое описание графических материалов

Фиг. 1. Выравнивание аминокислотной последовательности для бАЬк, выбранных по стабильности и очищенных для характеристики. Последовательности выравнивают против ΟΟΜ1Η-574-156 - бАЬ, типичного для используемых в качестве исходного бАЬ для селекции в отношении стабильности. в конкретном положении указывает на такую же аминокислоту, как обнаружено в ΟΟΜ1Η-574-156 в этом положении. СЭР указаны подчеркиванием и жирным шрифтом (первая подчеркнутая последовательность представляет собой СОЕР вторая подчеркнутая последовательность представляет собой СЭР2. и третья подчеркнутая последовательность представляет собой СОК3).

Подробное описание изобретения

В пределах данного описания изобретение было описано со ссылкой на воплощения таким образом, который позволяет представить ясное и точное описание. Предполагается и следует понимать, что воплощения могут быть различным образом скомбинированы или разделены без отклонения от объема изобретения.

Если не определено иначе, все используемые в данном изобретении технические и научные термины имеют такое же значение, которое обычно понятно специалисту в данной области (например, в культивировании клеток, молекулярной генетике, химии нуклеиновых кислот, способах гибридизации и биохимии). Стандартные методы используют для молекулярных, генетических и биохимических способов (см. в основном БатЬгоок е1 а1., ΜοΙοοηΙηγ С1ошпд: А ЬаЬогаФгу Μαπυαΐ, 26 еб. (1989) Со16 Бргшд НагЬог ЬаЬогаФгу Рге88, Со16 8ргшд НагЬог, Ν.Υ. апб Ан5нЬе1 е1 а1., 5>1юг1 РгоЮсоЕ ίη Μо1еси1а^ Вю1о§у (1999) 4'¹' Еб, 1ойп \Уйеу & 8оп8, 1пс., которые включены в данное описание посредством ссылки) и химических способов.

Единичные вариабельные домены иммуноглобулина (6АЬ), описанные в данной заявке, содержат участки, определяющие комплементарность (СОК1, СОК2 и СОК3). Локализации СОК и каркасных участков (РК) и система нумерации была определена КаЬа1 и др. (КаЬа1 Е.А. е1 а1., Бесщепсех оГ Ргсйенъ оГ 1тпшпо1ощса1 1п1еге81, ΡίΓιΗ Ебйюп, υ.δ. Оерайтей оГ НеаЙИ апб Нитап Бегущее υ.δ. СоуегптеШ Ρήηΐίη§ ОГйсе (1991)). Аминокислотные последовательности СОК (СОК1, СОК2, СОК3) У_Н и У_ь (У_К) бАЬк, описанные в данной заявке, будут очевидны специалисту в данной области на основании хорошо известной системы нумерации аминокислот по КаЬа1 и определения СОК. Согласно системе нумерации по КаЬа1 СОК-Н3 тяжелой цепи имеет варьирующиеся длины, вставки нумеруются между остатком Н100 и Н101 буквами вплоть до К (т.е. Н100, Н100А... Н100К, Н101). СОК§ можно альтернативно определить с использованием системы Сйобна (Сйобна е1 а1., (1989) Конформации иммуноглобулиновых гипервариабельных участков; №йиге 342, р. 877-883), согласно ΑЬΜ или согласно контактному способу являются следующими. См. 1Шр://\у\у\у.ЬютГог8.ик/аЬ5/ для подходящих методов определения СОК§.

После нумерации каждого остатка можно затем применить следующие определения СОК (- означает такие же номера остатков, как показано для КаЬа1).

КаЬа1 - наиболее часто используемый метод, основанный на вариабельности последовательности (с использованием нумерации по КаЬа1):

СОК Н1: 31-35/35А/35В

- 3 022898

ΟΌΚ Η2: 50-65

ΟΌΚ Η3: 95-102

ΟΌΚ Ь1: 24-34

ΟΌΚ Ь2: 50-56

ΟΌΚ Ь3: 89-97

Сйо1Ыа - основан на локализации структурных петлевых участков (с использованием нумерации по СНоОиа):

СПК Η1: 26-32

СПК Η2: 52-56

СПК Η3: 95-102

СПК Ь1: 24-34

СПК Ь2: 50-56

СПК Ь3: 89-97

АЬМ - представляет собой компромисс между КаЬа1 и СИоИна (с использованием нумерации по КаЬа1):

СОР Н1: 26-35/35А/35В (с использованием нумерации по СКо1К|а):

26-35

СОР Н2: 50-58 СОР НЗ: 95-102 СОР И :24-34 СОР Ь2: 50-56 СОР 13: 89-97 Контактный - основан на кристаллических структурах и предсказании контактных остатков с антигеном (с использованием нумерации (с использованием нумерации по КаЬар: по СИоМа):

СОР Н1: 30-35/35А/35В 30-35

СОР Н2: 47-58 СОР НЗ: 93-101 СОР И: 30-36 СОР 12: 46-55 СОР !_3: 89-96 Как использовано в данной заявке, термин антагонист рецептора фактора некроза опухоли 1 типа (ΤΝΡΚ.1) или антагонист ΤΝΡΚ.1 или тому подобное относится к агенту (например, молекуле, соединению), который связывается с ΤΝΡΚ.1 и может ингибировать (т.е. одну или более чем одну) функцию ΤΝΡΚ.1. Например, антагонист ΤΝΡΚ.1 может ингибировать связывание ΤΝΡα с ΤΝΡΚ.1 и/или ингибировать передачу сигнала, опосредованную через ΤΝΡΚ.1. Соответственно, ΤΝΡΚΤ-опосредованные процессы и клеточные ответы (например, ΤΝΡα-индуцированная гибель клеток в стандартном анализе цитотоксичности в отношении Ь929) можно ингибировать с помощью антагониста ΤΝΡΚ.1.

Как использовано в данной заявке, пептид относится к аминокислотам в количестве от примерно двух до примерно 50, которые соединены друг с другом посредством пептидных связей.

Как использовано в данной заявке, полипептид относится по меньшей мере примерно к 50 аминокислотам, которые соединены друг с другом посредством пептидных связей. Полипептиды, как правило, содержат третичную структуру и свернуты в функциональные домены.

Как использовано в данной заявке, пептид или полипептид (например, доменное антитело (бЛЬ)), который устойчив к протеазному расщеплению, по существу, не расщепляется протеазой при инкубации с указанной протеазой в условиях, подходящих для протеазной активности. Полипептид (например, бЛЬ), по существу, не расщепляется, когда не более чем примерно 25%, не более чем примерно 20%, не более чем примерно 15%, не более чем примерно 14%, не более чем примерно 13%, не более чем примерно 12%, не более чем примерно 11%, не более чем примерно 10%, не более чем примерно 9%, не более чем примерно 8%, не более чем примерно 7%, не более чем примерно 6%, не более чем примерно 5%, не более чем примерно 4%, не более чем примерно 3%, не более чем примерно 2%, не более чем примерно 1% или, по существу, ни один из белков не расщепляется протеазой после инкубации с указанной протеазой в течение примерно 1 ч при температуре, подходящей для протеазной активности, например при 37° или 50°С. Деградацию белка можно оценить с использованием любого подходящего метода, например, с помощью ПААГ-ДСН (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) или с помощью функционального анализа (например, связывания лиганда), как описано в данной заявке.

Как использовано в данной заявке, дисплейная система относится к системе, в которой коллекция

- 4 022898 полипептидов или пептидов доступна для селекции, основанной на желаемой характеристике, такой как физическая, химическая или функциональная характеристика. Дисплейная система может представлять собой подходящий репертуар полипептидов или пептидов (например, в растворе, иммобилизованных на подходящей подложке). Дисплейная система также может представлять собой систему, в которой используется клеточная система экспрессии (например, экспрессия библиотеки нуклеиновых кислот, например, в трансформированных, инфицированных, трансфицированных или трансдуцированных клетках и экспонирование кодируемых полипептидов на поверхности клеток) или бесклеточная система экспрессии (например, компартментализация и дисплей с использованием эмульсии). Типичные дисплейные системы связывают кодирующую функцию нуклеиновой кислоты и физические, химические и/или функциональные характеристики полипептида или пептида, кодируемого указанной нуклеиновой кислотой. При применении такой дисплейной системы полипептиды или пептиды, которые имеют желаемую физическую, химическую и/или функциональную характеристику, могут быть селектированы, и нуклеиновую кислоту, кодирующую выбранный полипептид или пептид, можно легко изолировать или извлечь. В данной области известны различные дисплейные системы, которые связывают кодирующую функцию нуклеиновой кислоты и физические, химические и/или функциональные характеристики полипептида или пептида, например, бактериофаговый дисплей (фаговый дисплей, например фагмидный дисплей), рибосомный дисплей, компартментализация и дисплей с использованием эмульсии, дрожжевой дисплей, пуромициновый дисплей, бактериальный дисплей, дисплей на плазмиде, ковалентный дисплей и тому подобное (см., например, ЕР 0436597 (Όνα.\). патент США № 6172197 (МсСайебу е! а1.), патент США № 6489103 (ОгййЦйб е! а1.)).

Как использовано в данной заявке, репертуар относится к коллекции полипептидов или пептидов, которые характеризуются разнообразием аминокислотных последовательностей. Индивидуальные члены репертуара могут иметь общие признаки, такие как общие структурные признаки (например, общая коровая структура) и/или общие функциональные признаки (например, способность связываться с общим лигандом (например, типичным лигандом или целевым лигандом, ΤΝΕΚ1)).

Как использовано в данной заявке, функциональный описывает полипептид или пептид, который имеет биологическую активность, такую как специфическую связывающую активность. Например, термин функциональный полипептид включает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывает целевой антиген через антигенсвязывающий сайт.

Как использовано в данной заявке, типичный лиганд относится к лиганду, который связывается со значительной частью (например, по существу, всеми) функциональных членов заданного репертуара. Типичный лиганд (например, общий типичный лиганд) может связываться со многими членами заданного репертуара, даже если члены не обладают специфичностью связывания с общим целевым лигандом. В целом, присутствие на полипептиде сайта, связывающего функциональный типичный лиганд (как показано по способности связывать типичный лиганд), означает, что полипептид правильно свернут и является функциональным. Подходящие примеры типичных лигандов включают суперантигены, антитела, которые связываются с эпитопом, экспрессирующимся на значительной части функциональных членов репертуара, и тому подобное.

Суперантиген представляет собой термин из уровня техники, который относится к типичным лигандам, которые взаимодействуют с членами суперсемейства иммуноглобулинов в сайте, который отличается от целевых лиганд-связывающих сайтов этих белков. Стафилококковые энтеротоксины представляют собой примеры суперантигенов, которые взаимодействуют с Т-клеточными рецепторами. Суперантигены, которые связываются с антителами, включают белок С, который связывается с константной областью 1дС (В_)огек апб КгоиуаП, 1. 1ттипо1., 133: 969 (1984)); белок А, который связывается с константной областью 1дС и У_н-доменами (Рогкдгеп апб ^осцщО 1. 1ттипо1., 97: 822 (1966)); и белок Ь, который связывается с У[-доменами (В_)огек, 1. 1ттипо1., 140: 1194(1988)).

Как использовано в данной заявке, целевой лиганд относится к лиганду, который специфически или селективно связывается с полипептидом или пептидом. Например, когда полипептид представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, целевой лиганд может быть любым желаемым антигеном или эпитопом. Связывание с целевым антигеном зависит от того, является ли полипептид или пептид функциональным.

Используемое в данной заявке антитело относится к 1дС, 1дМ, 1дА, Ι§Ό или 1дЕ или фрагменту (такому как РаЬ, Р(аЬ')₂, Εν, дисульфидсвязанный Εν, 8сРу, полиспецифическое антитело в закрытой конформации, дисульфидсвязанный δсΕν, диатело), независимо от того, происходит ли оно из любого вида, естественно продуцирующего антитело, или создано посредством технологии рекомбинантных ДНК; или выделено из сыворотки, В-клеток, гибридом, трансфертом, дрожжей или бактерий.

Как использовано в данной заявке, формат антитела, форматированный или сходные термины относятся к любой подходящей полипептидной структуре, в которой один или более вариабельных доменов антитела могут быть встроены таким образом, чтобы придать специфичность связывания с антигеном на структуре. В данной области техники известны различные подходящие форматы антител, такие как химерные антитела, гуманизированные антитела, человеческие антитела, одноцепочечные антитела, биспецифические антитела, тяжелые цепи антител, легкие цепи антител, гомодимеры и гетеродимеры

- 5 022898 тяжелых цепей и/или легких цепей антител, антиген-связывающие фрагменты любого из вышеизложенного (например, Ρν-фрагмент (например, одноцепочечный Ρν (8сРу), дисульфидсвязанный Ρν), РаЬфрагмент, РаЬ'-фрагмент, Р(аЬ')₂-фрагмент), единичный вариабельный домен антитела (например, йАЬ, ν_ΗΗ, ν_ΗΗ, и модифицированные варианты любого из вышеизложенных (например, модифицированные посредством ковалентного присоединения полиэтиленгликоля или другого подходящего полимера, или гуманизированный ν_ΗΗ).

Фраза единичный вариабельный домен иммуноглобулина относится к вариабельному домену антитела (ν_Η, ν_ΗΗ, νθ, который специфически связывает антиген или эпитоп независимо от других Vобластей или доменов. Единичный вариабельный домен иммуноглобулина может присутствовать в формате (например, гомо- и гетеро-мультимера) с другими вариабельными областями или вариабельными доменами, где другие области или домены не требуются для связывания с антигеном посредством единичного вариабельного домена иммуноглобулина (т.е. где единичный вариабельный домен иммуноглобулина связывает антиген независимо от дополнительных вариабельных доменов). Доменное антитело или йАЬ представляет собой единичный вариабельный домен иммуноглобулина в качестве термина, используемого в данной заявке. Единичный иммуноглобулиновый вариабельный домен представляет собой то же, что и единичный вариабельный домен иммуноглобулина в качестве термина, используемого в данной заявке. Единичный вариабельный домен антитела или антительный единичный вариабельный домен представляет собой то же, что и единичный вариабельный домен иммуноглобулина в качестве термина, используемого в данной заявке. В одном воплощении единичный вариабельный домен иммуноглобулина представляет собой человеческий вариабельный домен антитела, но также включает единичные вариабельные домены антитела из другого вида, такие как йАЬз грызунов (например, как описано в \νϋ 00/29004, содержание которой включено в данную заявку посредством ссылки во всей своей полноте), акулы-няньки и ν_ΗΗ верблюдовых. ν_ΗΗ верблюдовых представляют собой полипептиды единичного вариабельного домена иммуноглобулина, которые происходят из вида, включающего верблюда, ламу, альпака, дромедара и гуанако, которые продуцируют антитела, состоящие из тяжелых цепей, естественно лишенные легких цепей. ν_ΗΗ могут быть гуманизированными.

Домен представляет собой свернутую белковую структуру, которая имеет третичную структуру, не зависящую от остального белка. Как правило, домены отвечают за отдельные функциональные свойства белков и во многих случаях могут быть добавлены, удалены или перенесены на другие белки без потери функции остальной части белка и/или домена. Единичный вариабельный домен антитела представляет собой свернутый полипептидный домен, содержащий последовательности, характерные для вариабельных доменов антитела. Поэтому он включает вариабельные домены полного антитела и модифицированные вариабельные домены, например, в которых один или более петель были заменены последовательностями, которые не характерны для вариабельных доменов антитела, или вариабельные домены антитела, которые были укорочены или содержат Ν- или С-концевые удлинения, а также свернутые фрагменты вариабельных доменов, которые сохраняют, по меньшей мере, связывающую активность и специфичность полноразмерного домена.

Термин библиотека относится к смеси гетерогенных полипептидов или нуклеиновых кислот. Библиотека состоит из членов, каждый из которых имеет единичную полипептидную или нуклеиновокислотную последовательность. В этом смысле библиотека является синонимом репертуара. Различия в последовательности между членами библиотеки ответственны за разнообразие, присутствующее в библиотеке. Библиотека может принимать форму простой смеси полипептидов или нуклеиновых кислот или может быть в форме организмов или клеток, например, бактерий, вирусов, животных или растительных клеток и тому подобного, трансформированных библиотекой нуклеиновых кислот. В одном воплощении каждый отдельный организм или клетка содержит только один или ограниченное число членов библиотеки. В одном воплощении нуклеиновые кислоты включены в экспрессирующие векторы для того, чтобы обеспечить экспрессию полипептидов, кодируемых нуклеиновыми кислотами. Поэтому в одном аспекте библиотека может принимать форму популяции организмов-хозяев, где каждый организм содержит одну или более копий экспрессирующего вектора, содержащего один член библиотеки в форме нуклеиновой кислоты, способной экспрессироваться с получением соответствующего полипептидного члена. Таким образом, популяция организмов-хозяев имеет потенциал для кодирования большого репертуара разнообразных полипептидов.

Универсальный каркас представляет собой единичную каркасную последовательность антитела, соответствующую областям антитела, консервативным по последовательности, как определено КаЬа! (8сс.]испсс5 о£ РгсЛсиъ о£ 1тшиио1одюа1 1и1сгс51, И8 ОсраПтсШ о£ ^аИй апй Интаи §сг\асс5), или соответствующую репертуару или структуре иммуноглобулина зародышевой линии человека, как определено С1ю11йа и Ьезк, (1987) I. Мо1. Βίο1. 196: 910-917. В библиотеках и репертуарах можно использовать единичный каркас или набор таких каркасов, которые, как было обнаружено, обеспечивают получение практически любой связывающей специфичности посредством изменения только гипервариабельных участков.

Используемый в данной заявке термин доза относится к количеству лиганда, вводимого субъекту полностью в одно время (однократная доза) или в двух или более введениях в течение определенного

- 6 022898 промежутка времени. Например, доза может относиться к количеству лиганда (например, лиганда, содержащего единичный вариабельный домен иммуноглобулина, который связывается с целевым антигеном), вводимому субъекту в течение одних суток (24 ч) (суточная доза), двух суток, одной недели, двух недель, трех недель или одного или более месяцев (например, посредством единичного введения или посредством двух или более введений). Интервал между дозами может представлять собой любое желаемое количество времени.

Как использовано в данной заявке, гидродинамический размер относится к кажущемуся размеру молекулы (например, белковой молекулы, лиганда) на основании диффузии молекулы через водный раствор. Диффузия или движение белка через раствор могут осуществляться для получения кажущегося размера белка, где размер задается радиусом Стокса или гидродинамическим радиусом белковой частицы. Гидродинамический размер белка зависит как от массы, так и от формы (конформации), так что два белка, имеющие одинаковую молекулярную массу, могут иметь разные гидродинамические размеры на основании общей конформации белка.

Как указано в настоящей заявке, термин конкурирует означает, что связывание первой мишени с ее штатным целевым связывающим доменом ингибируется в присутствии второго связывающего домена, который является специфическим для когнатной мишени. Например, связывание может ингибироваться стерически, например, посредством физического блокирования связывающего домена или путем изменения структуры или окружения связывающего домена таким образом, чтобы его аффинность или авидность к мишени уменьшалась. См. \УО 2006038027 для деталей того, как выполнять конкурентные ЕЬ1§Л и конкурентные ЫаСоге эксперименты для определения конкуренции между первым и вторым связывающими доменами.

Расчеты гомологии или идентичности или сходства между двумя последовательностями (данные термины используются взаимозаменяемо в данной заявке) осуществляются следующим образом. Последовательности выравнивают для оптимального сравнения (например, бреши можно вводить в одну или обе первую или вторую аминокислотную или нуклеиновокислотную последовательность для оптимального выравнивания, и негомологичные последовательности можно не учитывать для целей сравнения). В воплощении длина эталонной последовательности, выровненной для целей сравнения, составляет по меньшей мере 30%, или по меньшей мере 40%, или по меньшей мере 50%, или по меньшей мере 60%, или по меньшей мере 70, 80, 90, 100% от длины эталонной последовательности. Аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих аминокислотных положениях или нуклеотидных положениях затем сравнивают. Если положение в первой последовательности занято тем же аминокислотным остатком или нуклеотидом, что и соответствующее положение во второй последовательности, то молекулы являются идентичными по этому положению (используемая в данной заявке гомология аминокислот или нуклеиновых кислот эквивалентна идентичности аминокислот или нуклеиновых кислот). Процент идентичности между двумя последовательностями зависит от числа идентичных положений, разделенных последовательностями, с учетом числа брешей и длины каждой бреши, которые необходимо вводить для оптимального выравнивания этих двух последовательностей. Выравнивания и гомологию, сходство или идентичность аминокислотных и нуклеотидных последовательностей, как определено в данной заявке, можно получить или определить с использованием алгоритма ВЬА§Т 2 Зедиеиеек, используя параметры по умолчанию (ТаНкоуа Т.А. е! а1., РЕМ§ М1егоЪю1 Ьей, 174: 187-188 (1999)).

В одном воплощении любого аспекта изобретения единичный вариабельный, антагонист, лиганд или полипептид против ΤΝΕΚ1 нейтрализует ΤΝΕΚ1 (например, человеческий ΤΝΕΚ1) с ΝΌ50 (средняя нейтрализующая доза) (или примерно) 5, 4, 3, 2 или 1 нМ или менее в стандартном анализе МКС5, как определено путем ингибирования ΤΝΕ-альфа-индуцированной секреции 1Ь-8.

В одном воплощении любого аспекта изобретения единичный вариабельный, антагонист, лиганд или полипептид против ΤΝΕΚ1 нейтрализует ΤΝΕΚ1 (например, мышиный ΤΝΕΚ1) с ΝΏ50 150, 100, 50, 40, 30 или 20 нМ или менее; или от (примерно) 150 до 10 нМ; или от (примерно) 150 до 20 нМ; или от (примерно) 110 до 10 нМ; или от (примерно) 110 до 20 нМ в стандартном анализе Ь929, как определено путем ингибирования ΤΝΕ-альфа-индуцированной цитотоксичности.

В одном воплощении любого аспекта изобретения единичный вариабельный, антагонист, лиганд или полипептид против ΤΝΕΚ1 нейтрализует ΤΝΕΚ1 (например, ΤΝΕΚ1 яванского макака) с ΝΏ50 5, 4, 3, 2 или 1 нМ или менее; или от (примерно) 5 до (примерно) 1 нМ в стандартном анализе ΚΙ яванского макака, как определено путем ингибирования ΤΝΕ-альфа-индуцированной секреции 1Ь-8.

В одном воплощении любого аспекта изобретения единичный вариабельный домен содержит концевой, возможно С-концевой остаток цистеина. Например, остаток цистеина можно использовать для присоединения ПЭГ к вариабельному домену, например, с использованием малеимидной связи (см., например, \УО 04081026). В воплощении любого аспекта изобретения единичный вариабельный домен связан с полиалкиленгликолевой группировкой, возможно полиэтиленгликолевой группировкой. См., например, \УО 04081026 для подходящих ПЭГ группировок и методов и тестов конъюгации. Эти описания включены в данную заявку с целью обеспечения описания, например, конкретных полиэтиленгликолей, подлежащих включению в формулу изобретения ниже.

В одном аспекте изобретение относится к полипептиду, содержащему единичный вариабельный

- 7 022898 домен иммуноглобулина по настоящему изобретению и эффекторную группу или константный домен антитела, возможно Ре-область антитела, где возможно Ν-конец Рс связан (возможно непосредственно связан) с С-концом вариабельного домена. Любую эффекторную группу, как описано в νθ 04058820, можно использовать в этом аспекте настоящего изобретения, и описание эффекторных групп в νθ 04058820 и способы их связывания с вариабельными доменами, описанными в этой публикации, непосредственно включены в данное описание посредством ссылки для обеспечения описания, которое можно использовать, например, в пунктах формулы изобретения данной заявки.

В одном аспекте изобретение относится к полиспецифическому лиганду, содержащему единичный вариабельный домен иммуноглобулина по настоящему изобретению и возможно по меньшей мере один единичный вариабельный домен иммуноглобулина, который специфически связывается с сывороточным альбумином (8Ά). В одном воплощении полиспецифический лиганд связывает ΤΝΕΚ1 (например, человеческий ΤΝΕΚ1) с ΚΌ (константа диссоциации), которая по меньшей мере в два раза ниже, чем ΚΌ мономера ΤΝΕΚ1. Дополнительно или альтернативно, в одном воплощении полиспецифический лиганд имеет период полувыведения, который по меньшей мере в 5, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 раз больше, чем для мономера. Дополнительно или альтернативно, в одном воплощении полиспецифический лиганд имеет конечный период полувыведения по меньшей мере 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 суток у человека (например, как определено эмпирически у людей-добровольцев или как рассчитано с использованием стандартных способов, знакомых специалисту, путем экстраполяции периода полувыведения лиганда в животной системе, например у мыши, собаки и/или примата, не являющегося человеком (например, яванский макак, бабуин, макак-резус)), например, когда домен против §А перекрестно реагирует с человеческим §А и §А животного.

В одном воплощении полиспецифических лигандов по изобретению лиганд представляет собой антагонист ΤΝΕΚ1 (например, человеческого ΤΝΕΚ1), возможно ΤNРΚ1-опосредованной передачи сигнала.

В одном воплощении в настоящем изобретении предложены вариабельный домен, полиспецифический лиганд или антагонист в соответствии с изобретением, который имеет период полувыведения ΐβ в диапазоне от (или примерно) 2,5 ч или более. В одном воплощении нижний предел диапазона составляет (или составляет примерно) 3, 4, 5, 6, 7, 10, 11 или 12 ч. Дополнительно или альтернативно, период полувыведения ΐβ составляет (или составляет примерно) вплоть до и включая 21 или 25 суток. В одном воплощении верхний предел диапазона составляет (или составляет примерно) 12, 24 ч, 2, 3, 5, 10, 15, 19, 20, 21 или 22 суток. Например, вариабельный домен или антагонист в соответствии с изобретением имеет период полувыведения ίβ в диапазоне от 12 до 60 ч (или от примерно 12 до примерно 60 ч). В другом воплощении он будет находиться в диапазоне от 12 до 48 ч (или от примерно 12 до примерно 48 ч). Еще в другом воплощении он будет находиться в диапазоне от 12 до 26 ч (или от примерно 12 до примерно 26 ч).

В качестве альтернативы использованию двухкомпартментного моделирования, специалист обычно знаком с использованием некомпартментного моделирования, которое можно использовать для определения конечных периодов полувыведения (в этой связи термин конечный период полувыведения, используемый в данной заявке, означает конечный период полувыведения, определенный с использованием некомпартментного моделирования). Пакет аналитических программ \νίηΝοη1ίη. например версию 5.1 (доступную от РЬаг81§Ы Согр., Моийат УЮм СА94040, США), можно использовать, например, для моделирования кривой таким образом. В этом случае в одном воплощении единичный вариабельный домен, полиспецифический лиганд или антагонист имеет конечный период полувыведения по меньшей мере (или по меньшей мере примерно) 8, 10, 12, 15, 28, 20 ч, 1, 2, 3, 7, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 суток. В одном воплощении верхний предел данного диапазона составляет (или составляет примерно) 24, 48, 60, или 72, или 120 ч. Например, конечный период полувыведения составляет (или составляет примерно) от 8 до 60 ч, или от 8 до 48 ч, или от 12 до 120 ч, например, у человека.

Дополнительно или альтернативно к вышеупомянутым критериям, вариабельный домен или антагонист в соответствии с изобретением имеет значение АИС (площадь под кривой) в диапазоне от (или примерно) 1 мг-мин/мл или более. В одном воплощении нижний предел диапазона составляет (или составляет примерно) 5, 10, 15, 20, 30, 100, 200 или 300 мг-мин/мл. Дополнительно или альтернативно, вариабельный домен, полиспецифический лиганд или антагонист в соответствии с изобретением имеет АиС в диапазоне (или примерно) вплоть до 600 мг-мин/мл. В одном воплощении верхний предел диапазона составляет (или составляет примерно) 500, 400, 300, 200, 150, 100, 75 или 50 мг-мин/мл. Преимущественно вариабельный домен или антагонист будет иметь АИС в (или примерно в) диапазоне, выбранном из группы, состоящей из следующих значений: от 15 до 150 мг-мин/мл, от 15 до 100 мг-мин/мл, от 15 до 75 мг-мин/мл и от 15 до 50 мг-мин/мл.

Один или более из ΐ-альфа, ΐ-бета и конечных периодов полувыведения, а также значения АИС, приведенные в данной заявке, можно получить у человека и/или животного (например, мыши или примата, не являющегося человеком, например бабуина, резуса, яванского макака) путем предложения одного или более единичных вариабельных доменов против ΤΝΕΚ1 (или других связывающих группировок, определенных в данной заявке), связанных либо с ПЭГ, либо с единичным вариабельным доменом (или

- 8 022898 связывающей группировкой), который специфически связан с сывороточным альбумином, например мышиным и/или человеческим сывороточным альбумином (ЗА). Размер ПЭГ может составлять (или может составлять примерно) по меньшей мере 20 кДа, например 30, 40, 50, 60, 70 или 80 кДа. В одном воплощении ПЭГ представляет собой 40 кДа, например, 2 х 20 кДа ПЭГ. В одном воплощении для получения (-альфа, ί-бета и конечных периодов полувыведения или АИС, упомянутых в данной заявке, предложен антагонист, содержащий единичный вариабельный домен иммуноглобулина против ΤΝΡΚ1, связанный с единичным вариабельным доменом иммуноглобулина против ЗА. В одном воплощении ПЭГ представляет собой 40 кДа, например, 2 х 20 кДа ПЭГ. Например, антагонист содержит только один такой вариабельный домен против ΤΝΡΚ1, например один такой домен, связанный только с одним вариабельным доменом против ЗА. В одном воплощении для получения (-альфа, (-бета и конечных периодов полувыведения или АИС, упомянутых в данной заявке, предложен антагонист, содержащий единичный вариабельный домен иммуноглобулина против ΤΝΡΚ.1, связанный с ПЭГ, например 40-80 кДа ПЭГ, например 40 кДа ПЭГ. Например, антагонист содержит только один такой вариабельный домен против ΤΝΡΚ1, например один такой домен, связанный с 40 кДа ПЭГ.

В одном воплощении полиспецифического лиганда по изобретению лиганд содержит единичный вариабельный домен против ЗА (например, НЗА), который содержит аминокислотную последовательность, которая идентична или по меньшей мере на 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична последовательности ΌΟΜ7Ρ-11, ΌΟΜ7Ρ-11-3, ΌΟΜ7Ρ-11-12, ΌΟΜ7Ρ-11-15, ΌΟΜ7Ρ-14, ΌΟΜ7Ρ14-10, ΌΟΜ7Ρ-14-18 или ^ΟΜ7т-16 (см. АО 04003019, АО 2008096158 и находящиеся на совместном рассмотрении патентные заявки υЗЗN 61/163987 и 61/163990, поданные 27 марта 2009 г., описания которых включены в данную заявку, включая конкретно последовательности бАЬ против сывороточного альбумина). Альтернативно или дополнительно, в воплощении полиспецифический лиганд содержит линкер, предложенный между единичным вариабельным доменом против ΤΝΡΚ1 и единичным вариабельным доменом против ЗА и содержащий аминокислотную последовательность АЗК возможно АЗΤЗΟΡЗ. Альтернативно, линкер представляет собой АЗ(О₄З)_П, где η равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8, например АЗ(О₄З)₃. Например, лиганд содержит (с Ν- к С-концу) ^ОΜ1Ь-574-16-АЗΤ-^ОΜ7Ь-11; или ΌΟΜ1Ρ574-72-АЗΤЗΟΡЗ-^ΟΜ7т-16; или ^ΟΜ1Ь-574-72-АЗΤЗΟΡЗ-^ΟΜ7Ь-11-12.

В одном аспекте в изобретении предложен полиспецифический лиганд, содержащий (1) единичный вариабельный домен иммуноглобулина против рецептора ΤΝΡα 1 типа (ΤΝΡΚ1; р55), который содержит аминокислотную последовательность, которая идентична или по меньшей мере на 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности ΌΟΜ1Ρ-574-188, ΌΟΜ1Ρ-574-189, ΌΟΜ1Ρ574-190, ΌΟΜ1Ρ-574-191, ΌΟΜ1Ρ-574-192, ΌΟΜ1Ρ-574-193, ΌΟΜ1Ρ-574-194, ΌΟΜ1Ρ-574-195, ΌΟΜ1Ρ574-196, ΌΟΜ1Ρ-574-201, ΌΟΜ1Ρ-574-202, ΌΟΜ1Ρ-574-203, ΌΟΜ1Ρ-574-204, ΌΟΜ1Ρ-574-205, ΌΟΜ1Ρ574-206, ΌΟΜ1Ρ-574-207, ΌΟΜ1Ρ-574-208, ΌΟΜ1Ρ-574-209, ΌΟΜ1Ρ-574-211, ΌΟΜ1Ρ-574-212, ΌΟΜ1Ρ574-213 или ΌΟΜ1Ρ-574-214, (2) по меньшей мере один единичный вариабельный домен иммуноглобулина против сывороточного альбумина (ЗА), который специфически связывается с ЗА, где единичный вариабельный домен иммуноглобулин против (ЗА) содержит аминокислотную последовательность, которая идентична или по меньшей мере на 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична последовательности ΌΟΜ7Ρ-11-3, и (3) возможно где между единичным вариабельным доменом против ΤΝΡΚ1 и единичным вариабельным доменом против ЗА имеется линкер, содержащий аминокислотную последовательность АЗК возможно АЗΤЗΟΡЗ. Альтернативно, линкер представляет собой АЗ(О₄З)_П, где η равно 1,2,3, 4, 5, 6, 7 или 8, например АЗ(О₄З)₃. Например, лиганд содержит ΌΟΜ1Ρ-574-156 и ΌΟΜ7Ρ11-3, возможно связанные с помощью АЗΤ или АЗΤЗΟΡЗ. Альтернативно, линкер представляет собой АЗ(О₄З)_п, где η равно 1,2,3, 4, 5, 6, 7 или 8, например АЗ(О₄З)₃. В этом примере или аспекте лиганд возможно адаптирован для введения пациенту внутрисосудисто, подкожно, внутримышечно, внутрибрюшинно или посредством ингаляции. В одном примере лиганд предложен в виде сухой порошковой или лиофилизированной композиции (которую возможно смешивают с разбавителем перед введением).

В одном аспекте в изобретении предложен полиспецифический лиганд, содержащий (1) единичный вариабельный домен иммуноглобулина против рецептора ΤΝΡα 1 типа (ΤΝΡΚ1; р55), который содержит аминокислотную последовательность, которая идентична или по меньшей мере на 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности ΌΟΜ1Ρ-574-188, ΌΟΜ1Ρ-574-189, ΌΟΜ1Ρ574-190, ΌΟΜ1Ρ-574-191, ΌΟΜ1Ρ-574-192, ΌΟΜ1Ρ-574-193, ΌΟΜ1Ρ-574-194, ΌΟΜ1Ρ-574-195, ΌΟΜ1Ρ574-196, ΌΟΜ1Ρ-574-201, ΌΟΜ1Ρ-574-202, ΌΟΜ1Ρ-574-203, ΌΟΜ1Ρ-574-204, ΌΟΜ1Ρ-574-205, ΌΟΜ1Ρ574-206, ΌΟΜ1Ρ-574-207, ΌΟΜ1Ρ-574-208, ΌΟΜ1Ρ-574-209, ΌΟΜ1Ρ-574-211, ΌΟΜ1Ρ-574-212, ΌΟΜ1Ρ574-213 или ΌΟΜ1Ρ-574-214, (2) по меньшей мере один единичный вариабельный домен иммуноглобулина против сывороточного альбумина (ЗА), который специфически связывается с ЗА, где единичный вариабельный домен иммуноглобулина против (ЗА) содержит аминокислотную последовательность, которая идентична или по меньшей мере на 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична последовательности ΌΟΜ7Ρ-14-10, и (3) возможно где между единичным вариабельным доменом против ΤΝΡΚ1 и единичным вариабельным доменом против ЗА имеется линкер, содержащий аминокислотную последовательность АЗП возможно АЗΤЗΟΡЗ. Альтернативно, линкер представляет собой АЗ(О₄З)_П, где

- 9 022898 η равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8, например Л8(О₄8)₃. В этом примере или аспекте лиганд возможно адаптирован для введения пациенту внутрисосудисто, подкожно, внутримышечно, внутрибрюшинно или посредством ингаляции. В одном примере лиганд предложен в виде сухой порошковой или лиофилизированной композиции (которую возможно смешивают с разбавителем перед введением).

В изобретении предложен антагонист ΤΝΕΚ1, содержащий единичный вариабельный домен, полипептид или полиспецифический лиганд из любого аспекта или воплощения изобретения. Например, антагонист или вариабельный домен по изобретению является моновалентным для связывания ΤΝΕΚ1. Например, антагонист или вариабельный домен по изобретению является моновалентным или, по существу, моновалентным, как определено с помощью стандартного §ЕС-МЛЬЬ§ (эксклюзионная хроматография/многоугловое лазерное светорассеяние). На существенную моновалентность указывает не более чем 5, 4, 3, 2 или 1% вариабельного домена или антагониста, присутствующего не в моновалентной форме, как определено с помощью стандартного 8ЕС-МЛЕЬ§.

В одном воплощении антагонист по изобретению содержит первый и второй единичные вариабельные домены иммуноглобулина против ΤΝΕΚ1, где каждый вариабельный домен соответствует любому аспекту или воплощению изобретения. Первый и второй единичные вариабельные домены иммуноглобулина в одном примере идентичны. В другом примере они различаются.

В одном примере аминокислотная последовательность антагониста или каждого единичного вариабельного домена против ΤΝΕΚ1 в антагонисте по изобретению идентична аминокислотной последовательности ΌΟΜ1Ε-574-188, ΌΟΜ1Ε-574-189, ΌΟΜ1Ε-574-190, ΌΟΜ1Ε-574-191, ΌΟΜ1Ε-574-192, ΌΟΜ1Ε-574-193, ΌΘΜ1Ε-574-194, ΌΘΜ1Ε-574-195, ΌΘΜ1Ε-574-196, ΌΘΜ1Ε-574-201, ΌΘΜ1Ε-574-202, ΌΘΜ1Ε-574-203, ΌΘΜ1Ε-574-204, ΌΘΜ1Ε-574-205, ΌΘΜ1Ε-574-206, ΌΘΜ1Ε-574-207, ΌΘΜ1Ε-574-208, ΌΘΜ1Ε-574-209, ΌΘΜ1Ε-574-211, ΌΘΜ1Ε-574-212, ΌΘΜ1Ε-574-213 или ΌΘΜ1Ε-574-214.

В одном аспекте в изобретении предложен антагонист рецептора ΤΝΕα 1 типа (ΤΝΕΚ1; р55), содержащий вариабельный домен против ΤΝΕΚ1 согласно любому аспекту изобретения, для пероральной доставки, доставки в ЖК (желудочно-кишечный) тракт пациента, легочной доставки, доставки в легкое пациента или системной доставки. В другом аспекте в изобретении предложено применение антагониста ΤΝΕΚ1 из любого аспекта изобретения в изготовлении лекарственного средства для пероральной доставки. В другом аспекте в изобретении предложено применение антагониста ΤΝΕΚ1 из любого аспекта изобретения в изготовлении лекарственного средства для доставки в ЖК тракт пациента. В одном примере антагонист или вариабельный домен устойчив к трипсину, эластазе и/или панкреатину (см. \УО 2008149143).

В одном аспекте в изобретении предложено применение антагониста ΤΝΕΚ1 из любого аспекта изобретения в изготовлении лекарственного средства для легочной доставки. В другом аспекте в изобретении предложено применение антагониста ΤΝΕΚ1 из любого аспекта изобретения в изготовлении лекарственного средства для доставки в легкое пациента. В одном примере антагонист или вариабельный домен устойчив к лейкозиму.

В одном аспекте в изобретении предложен способ пероральной доставки или доставки лекарственного средства в ЖК тракт пациента или в легкое или в легочную ткань пациента, где способ включает введение пациенту фармацевтически эффективного количества антагониста ΤΝΕΚ1 по изобретению.

В одном аспекте в изобретении предложен антагонист рецептора ΤΝΕα 1 типа (ΤΝΕΚ1; р55) для связывания с ΤΝΕΚ1 человека, мыши или яванского макака, имеющий последовательность СЭВ1. которая идентична или по меньшей мере на 50, 60, 70, 80, 90, 95 или 98% идентична последовательности С1Ж1 из ΌΟΜ1Ε-574-188, ΌΟΜ1Ε-574-189, ΌΟΜ1Ε-574-190, ΌΟΜ1Ε-574-191, ΌΟΜ1Ε-574-192, Ι)Ο\111ι574-193, ΌΟΜ1Ε-574-194, ΌΟΜ1Ε-574-195, ΌΟΜ1Ε-574-196, ΌΟΜ1Ε-574-201, ΌΟΜ1Ε-574-202, Ι)Ο\111ι574-203, ΌΟΜ1Ε-574-204, ΌΟΜ1Ε-574-205, ΌΟΜ1Ε-574-206, ΌΟΜ1Ε-574-207, ΌΟΜ1Ε-574-208, ΌΟΜ1Ε574-209, ΌΟΜ1Ε-574-211, ΌΟΜ1Ε-574-212, ΌΟΜ1Ε-574-213 или ΌΟΜ1Ε-574-214. Возможно, антагонист также имеет последовательность ί'ΌΒ2, которая идентична или по меньшей мере на 50, 60, 70, 80, 90, 95 или 98% идентична последовательности С'НВ2 из выбранной последовательности. Возможно, дополнительно или альтернативно, антагонист также имеет последовательность СОК3, которая идентична или по меньшей мере на 50, 60, 70, 80, 90, 95 или 98% идентична последовательности С'НВ3 из выбранной последовательности.

В одном аспекте в изобретении предложен антагонист рецептора ΤΝΕα 1 типа (ΤΝΕΚ1; р55) для связывания с ΤΝΕΚ1 человека, мыши или яванского макака, имеющий последовательность СОК2, которая идентична или по меньшей мере на 50, 60, 70, 80, 90, 95 или 98% идентична последовательности С1)Н2 из ΌΟΜ1Ε-574-188, ΌΟΜ1Ε-574-189, ΌΟΜ1Ε-574-190, ΌΟΜ1Ε-574-191, ΌΟΜ1Ε-574-192, Ι)Ο\111ι574-193, ΌΟΜ1Ε-574-194, ΌΟΜ1Ε-574-195, ΌΟΜ1Ε-574-196, ΌΟΜ1Ε-574-201, ΌΟΜ1Ε-574-202, Ι)Ο\111ι574-203, ΌΟΜ1Ε-574-204, ΌΟΜ1Ε-574-205, ΌΟΜ1Ε-574-206, ΌΟΜ1Ε-574-207, ΌΟΜ1Ε-574-208, ΌΟΜ1Ε574-209, ΌΟΜ1Ε-574-211, ΌΟΜ1Ε-574-212, ΌΟΜ1Ε-574-213 или ΌΟΜ1Ε-574-214. Возможно, антагонист также имеет последовательность СОК3, которая идентична или по меньшей мере на 50, 60, 70, 80, 90, 95 или 98% идентична последовательности С'НВ3 из выбранной последовательности.

В одном аспекте в изобретении предложен антагонист рецептора ΤΝΕα 1 типа (ΤΝΕΚ1; р55) для

- 10 022898 связывания с ΤΝΡΚ1 человека, мыши или яванского макака, имеющий последовательность СЭК3. которая идентична или по меньшей мере на 50, 60, 70, 80, 90, 95 или 98% идентична последовательности С.ПК3 из ΌΘΜ1Η-574-188, ΌΘΜ1Η-574-189, ΌΘΜ1Η-574-190, ΌΘΜ1Η-574-191, ΌΘΜ1Η-574-192, ΌΘΜΙΗ574-193, ΌΘΜ1Η-574-194, ΌΘΜ1Η-574-195, ΌΘΜ1Η-574-196, ΌΘΜ1Η-574-201, ΌΘΜ1Η-574-202, ΌΘΜ1Η574-203, ΌΘΜ1Η-574-204, ΌΘΜ1Η-574-205, ΌΘΜ1Η-574-206, ΌΘΜ1Η-574-207, ΌΘΜ1Η-574-208, ΌΘΜ1Η574-209, ΌΘΜ1Η-574-211, ΌΘΜ1Η-574-212, ΌΘΜ1Η-574-213 или ΌΘΜ1Η-574-214.

В одном аспекте в изобретении предложен антагонист рецептора ΤΝΡα 1 типа (ΤΝΡΚ1; р55) для связывания с ΤΝΡΚ1 человека, мыши или яванского макака, содержащий единичный вариабельный домен иммуноглобулина, содержащий последовательность СЭРЕ СЭК2 и/или СОКЗ единичного вариабельного домена, выбранного из ΌΘΜ1Η-574-188, ΌΘΜ1Η-574-189, ΌΘΜ1Η-574-190, ΌΘΜ1Η-574-191, ΌΘΜ1Η-574-192, ΌΘΜ1Η-574-193, ΌΘΜ1Η-574-194, ΌΘΜ1Η-574-195, ΌΘΜ1Η-574-196, ΌΘΜ1Η-574-201, ΌΘΜ1 й-574-202, ΌΘΜ1Η-574-203, ΌΘΜ1Η-574-204, ΌΘΜ1Η-574-205, ΌΘΜ1Η-574-206, ΌΘΜ1Η-574-207, ΌΘΜ1Η-574-208, ΌΘΜ1Η-574-209, ΌΘΜ1Η-574-211, ΌΘΜ1Η-574-212, ΌΘΜ1Η-574-213 или ΌΘΜ1Η-574214.

В изобретении предложен антагонист ΤΝΡΚ1 из любого аспекта для лечения и/или профилактики воспалительного состояния. В изобретении предложено применение антагониста ΤΝΡΚ1 из любого аспекта в изготовлении лекарственного средства для лечения и/или профилактики воспалительного состояния. В одном воплощении антагониста или применения состояние выбрано из группы, состоящей из артрита, рассеянного склероза, воспалительного заболевания кишечника и хронического обструктивного заболевания легких. В одном примере артрит представляет собой ревматоидный артрит или ювенильный ревматоидный артрит. В одном примере воспалительное заболевание кишечника выбрано из группы, состоящей из болезни Крона и неспецифического язвенного колита. В одном примере хроническое обструктивное заболевание легких выбрано из группы, состоящей из хронического бронхита, хронического обструктивного бронхита и эмфиземы. В одном примере пневмония является бактериальной пневмонией. В одном примере бактериальная пневмония является стафилококковой пневмонией.

В изобретении предложен антагонист ΤΝΡΚ1 из любого аспекта для лечения и/или профилактики респираторного заболевания. В изобретении предложено применение антагониста ΤΝΡΚ1 из любого аспекта в изготовлении лекарственного средства для лечения и/или профилактики респираторного заболевания. В одном примере респираторное заболевание выбрано из группы, состоящей из воспаления легких, хронического обструктивного заболевания легких, астмы, пневмонии, гиперчувствительного пневмонита, легочного инфильтрата с эозинофилией, заболевания легких, вызванного факторами окружающей среды, пневмонии, бронхоэктаза, муковисцидоза, интерстициального заболевания легких, первичной легочной гипертензии, легочной тромбоэмболии, расстройств плевры, расстройств средостения, расстройств диафрагмы, гиповентиляции, гипервентиляции, апноэ во сне, острого респираторного дистресссиндрома, мезотелиомы, саркомы, отторжения трансплантата, реакции трансплантат против хозяина, рака легких, аллергического ринита, аллергии, асбестоза, аспергиллемы, аспергиллеза, бронхоэктаза, хронического бронхита, эмфиземы, эозинофильной пневмонии, идиопатического фиброза легких, инвазивного пневмококкового заболевания, гриппа, нетуберкулезных микобактерий, плеврального выпота, пневмокониоза, пневмоцистоза, пневмонии, актиномикоза легких, легочного альвеолярного протеиноза, легочной формы сибирской язвы, отека легких, легочной эмболии, легочного воспаления, легочного гистиоцитоза X, легочной гипертензии, легочного нокардиоза, туберкулеза легких, легочной веноокклюзионной болезни, ревматоидного заболевания легких, саркоидоза и гранулематоза Вегенера.

Полипептиды, йАЬк и антагонисты

Полипептид, лиганд, ЙЛЬ, лиганд или антагонист может экспрессироваться в Е сой или в видах Ρίαίιία (например, Ρ. ρακίοτίκ). В одном воплощении лиганд или мономер ЙЛЬ секретируется в количестве по меньшей мере примерно 0,5 мг/л при экспрессии в Е. сой или в видах РюЫа (например, Р. ракЮпк). Хотя лиганды и мономеры ЙЛЬ, описанные в данной заявке, могут секретироваться при экспрессии в Е. сой или в видах РюЫа (например, Р. ракЮпк), их можно продуцировать с использованием подходящего способа, такого как синтетические химические способы или способы биологического производства, в которых не используют Е. сой или виды РюЫа.

В некоторых воплощениях полипептид, лиганд, ЙЛЬ, лиганд или антагонист не содержит вариабельный домен иммуноглобулина верблюдовых (Сатейй) или одну или более каркасных аминокислот, которые являются уникальными для вариабельных доменов иммуноглобулина, кодируемых сегментами гена антитела зародышевой линии верблюдовых, например, в положении 108, 37, 44, 45 и/или 47. В одном воплощении вариабельный домен против ΤΝΡΚ1 по изобретению содержит остаток С в положении 44 согласно КаЬа1 и возможно содержит одну или более аминокислот, специфичных для верблюдовых, в других положениях, например, в положении 37 или 103.

Антагонисты ΤΝΡΚ1 согласно изобретению могут быть моновалентными или поливалентными. В некоторых воплощениях антагонист является моновалентным и содержит один связывающий сайт, который взаимодействует с ΤΝΡΚ1, где связывающий сайт представлен полипептидом или ЙАЬ по изобретению. Моновалентные антагонисты связывают один ΤΝΡΚ1 и не могут индуцировать сшивание или кластеризацию ΤΝΡΚ1 на поверхности клеток, что может приводить к активации рецептора и сигнальной

- 11 022898 трансдукции. Моновалентные антагонисты согласно изобретению могут связывать домен 1, домен 2, домен 3 или домен 4 ΤΝΡΚ1. В воплощении моновалентный антагонист связывает домен 4 ΤΝΡΚ1. В других воплощениях моновалентный антагонист связывает эпитоп, который охватывает более чем один домен ΤΝΡΚ1. Таким образом, в одном воплощении моновалентный антагонист может связывать оба домена 1 и 2, домены 1 и 3, домены 1 и 4, домены 2 и 3, домены 2 и 4, домены 3 и 4, домены 1, 2 и 3, домены 1, 2 и 4,д или домены 1, 3 и 4 ΤΝΡΚ1.

В других воплощениях антагонист ΤΝΡΚ1 является поливалентным. Поливалентные антагонисты ΤΝΡΚ1 могут содержать две или более копий конкретного связывающего сайта для ΤΝΡΚ1 или содержать два или более различных связывающих сайтов, которые связывают ΤΝΡΚ1, где по меньшей мере один из связывающих сайтов представлен полипептидом или бЛЬ по изобретению. Например, как описано в данной заявке, антагонист ΤΝΡΚ1 может быть димером, тримером или мультимером, содержащим две или более копий конкретного полипептида или бЛЬ по изобретению, которые связывают ΤΝΡΚ1 или два или более различных полипептидов или 6ЛЬ§ по изобретению, которые связывают ΤΝΡΚ1. В одном воплощении поливалентный антагонист ΤΝΡΚ1, по существу, не оказывает агонистического влияния на ΤΝΡΚ1 (действует в качестве агониста ΤΝΡΚ1) в стандартном клеточном анализе (т.е. когда присутствует в концентрации 1 нМ, 10 нМ, 100 нМ, 1 мкМ, 10 мкМ, 100 мкМ, 1000 и 5000 мкМ, приводит к не более чем примерно 5% ΤΝΡΚΤ-опосредованной активности, индуцируемой с помощью ΤΝΡα (100 пг/мл) в анализе).

В некоторых воплощениях поливалентный антагонист ΤΝΡΚ1 содержит два или более связывающих сайтов для желаемого эпитопа или домена ΤΝΡΚ1. Например, поливалентный антагонист ΤΝΡΚ1 может включать два или более связывающих сайтов, которые связываются с тем же эпитопом в домене 1 ΤΝΡΚ1 или связывается с тем же эпитопом в домене 4 ΤΝΡΚ1.

В других воплощениях поливалентный антагонист ΤΝΡΚ1 содержит два или более связывающих сайтов, представленных полипептидами или 6ЛЬ§ по изобретению, которые связываются с различными эпитопами или доменами ΤΝΡΚ.1. Например, поливалентные антагонисты ΤΝΡΚ1 могут содержать связывающие сайты для доменов 1 и 2, доменов 1 и 3, доменов 1 и 4, доменов 2 и 3, доменов 2 и 4, доменов 3 и 4, доменов 1, 2 и 3, доменов 1, 2 и 4 или доменов 1, 3 и 4 ΤΝΡΚ1. В одном воплощении такие поливалентные антагонисты не обладают агонистической активностью в отношении ΤΝΡΚ1, когда присутствуют в концентрации примерно 1 нМ, или примерно 10 нМ, или примерно 100 нМ, или примерно 1 мкМ, или примерно 10 мкМ в стандартном анализе цитотоксичности Ь929 или в стандартном анализе НеЬа 1Ь8, как описано в \УО 2006038027.

Другие антагонисты ΤΝΡΚ1 не ингибируют связывание ΤΝΡα с ΤΝΡΚ1. Такие лиганды (и антагонисты) могут быть полезны в качестве диагностических агентов, поскольку они могут быть использованы для связывания или обнаружения, количественного определения или измерения ΤΝΡΚ1 в образце и не будут конкурировать с ΤΝΡ в образце за связывание с ΤΝΡΚ1. Таким образом, можно осуществить точное определение наличия и количества ΤΝΡΚ1 в образце.

В других воплощениях полипептид, лиганд, бЛЬ или антагонист связывает ΤΝΡΚ1 и антагонизирует активность ΤΝΡΚ1 в стандартном клеточном анализе с ΝΏ₅₀ не более 100 нМ и при концентрации не более 10 мкМ бЛЬ антагонизирует активность ΤΝΡΚ1 не более чем на 5% в анализе.

В конкретных воплощениях полипептид, лиганд, бЛЬ или антагонист, по существу, не оказывает агонистического влияния на ΤΝΡΚ1 (действует в качестве агониста ΤΝΡΚ1) в стандартном клеточном анализе (т.е. когда присутствует в концентрации 1 нМ, 10 нМ, 100 нМ, 1 мкМ, 10 мкМ, 100 мкМ, 1000 или 5000 мкМ, приводит не более чем к примерно 5% Р^РКЛ-опосредованной активности, индуцированной ΤΝΡα (100 пг/мл) в анализе).

В некоторых воплощениях полипептид, лиганд, бЛЬ или антагонист по изобретению является эффективным в моделях хронических воспалительных заболеваний при введении эффективного количества. Как правило, эффективное количество составляет от примерно 1 до примерно 10 мг/кг (например, примерно 1 мг/кг, примерно 2 мг/кг, примерно 3 мг/кг, примерно 4 мг/кг, примерно 5 мг/кг, примерно 6 мг/кг, примерно 7 мг/кг, примерно 8 мг/кг, примерно 9 или примерно 10 мг/кг). Модели хронического воспалительного заболевания (см. модели, описанные в \УО 2006038027) признаются специалистами в данной области для прогнозирования терапевтической эффективности у людей.

В конкретных воплощениях полипептид, лиганд, бЛЬ или антагонист является эффективным в стандартной мышиной модели коллаген-индуцированного артрита (см. \УО 2006038027 для подробной информации о модели). Например, введение эффективного количества полипептида, лиганда, бЛЬ или антагониста может уменьшать средний артритный индекс при суммировании четырех конечностей в стандартной мышиной модели коллаген-индуцированного артрита, например, на от примерно 1 до примерно 16, от примерно 3 до примерно 16, от примерно 6 до примерно 16, от примерно 9 до примерно 16 или от примерно 12 до примерно 16 по сравнению с подходящим контролем. В другом примере введение эффективного количества полипептида, лиганда, бЛЬ или антагониста может замедлять появление симптомов артрита в стандартной мышиной модели коллаген-индуцированного артрита, например, на примерно 1 сутки, примерно 2 суток, примерно 3 суток, примерно 4 суток, примерно 5 суток, примерно 6

- 12 022898 суток, примерно 7 суток, примерно 10 суток, примерно 14 суток, примерно 21 сутки или примерно 28 суток по сравнению с подходящим контролем. В другом примере введение эффективного количества полипептида, лиганда, бАЬ или антагониста может приводить к среднему артритному индексу при суммировании четырех конечностей в стандартной мышиной модели коллаген-индуцированного артрита от 0 до примерно 3, от примерно 3 до примерно 5, от примерно 5 до примерно 7, от примерно 7 до примерно 15, от примерно 9 до примерно 15, от примерно 10 до примерно 15, от примерно 12 до примерно 15 или от примерно 14 до примерно 15.

В других воплощениях полипептид, лиганд, бАЬ или антагонист является эффективным в модели артрита у мышей ΔΆΚΕ (см. АО 2006038027 для подробной информации о модели). Например, введение эффективного количества полипептида, лиганда, бАЬ или антагониста может уменьшать средний артритный индекс в модели артрита у мышей ΔΑΚΕ, например, на от примерно 0,1 до примерно 2,5, от примерно 0,5 до примерно 2,5, от примерно 1 до примерно 2,5, от примерно 1,5 до примерно 2,5 или от примерно 2 до примерно 2,5 по сравнению с подходящим контролем. В другом примере введение эффективного количества полипептида, лиганда, бАЬ или антагониста может замедлять появление симптомов артрита в модели артрита у мышей ΔΑΚΕ, например, на примерно 1 сутки, примерно 2 суток, примерно 3 суток, примерно 4 суток, примерно 5 суток, примерно 6 суток, примерно 7 суток, примерно 10 суток, примерно 14 суток, примерно 21 сутки или примерно 28 суток по сравнению с подходящим контролем. В другом примере введение эффективного количества полипептида, лиганда, бАЬ или антагониста может приводить к среднему артритному индексу в модели артрита у мышей ΔΑΚΕ от 0 до примерно 0,5, примерно 0,5 до примерно 1, от примерно 1 до примерно 1,5, от примерно 1,5 до примерно 2 или от примерно 2 до примерно 2,5.

В других воплощениях полипептид, лиганд, бАЬ или антагонист является эффективным в модели воспалительного заболевания кишечника (ΙΒΌ) у мышей ΔΑΚΕ (см. АО 2006038027 для подробной информации о модели). Например, введение эффективного количества полипептида, лиганда, бАЬ или антагониста может уменьшать средний индекс острого и/или хронического воспаления в модели ΙΒΌ у мышей ΔΑΚΕ, например, на от примерно 0,1 до примерно 2,5, от примерно 0,5 до примерно 2,5, от примерно 1 до примерно 2,5, от примерно 1,5 до примерно 2,5 или от примерно 2 до примерно 2,5 по сравнению с подходящим контролем. В другом примере введение эффективного количества полипептида, лиганда, бАЬ или антагониста может замедлять появление симптомов ΙΒΌ в модели ΙΒΌ у мышей ΔΑΚΕ, например, на примерно 1 сутки, примерно 2 суток, примерно 3 суток, примерно 4 суток, примерно 5 суток, примерно 6 суток, примерно 7 суток, примерно 10 суток, примерно 14 суток, примерно 21 сутки или примерно 28 суток по сравнению с подходящим контролем. В другом примере введение эффективного количества полипептида, лиганда, бАЬ или антагониста может приводить к среднему индексу острого и/или хронического воспаления в модели ΙΒΌ у мышей ΔΑΚΕ от 0 до примерно 0,5, от примерно 0,5 до примерно 1, от примерно 1 до примерно 1,5, от примерно 1,5 до примерно 2 или от примерно 2 до примерно 2,5.

В других воплощениях полипептид, лиганд, бАЬ или антагонист является эффективным в мышиной модели ΙΒΌ, индуцированного декстрансульфатом натрия (Όδδ) (см. АО 2006038027 для подробной информации о модели). Например, введение эффективного количества полипептида, лиганда, бАЬ или антагониста может уменьшать индекс средней тяжести в мышиной Όδδ модели ΙΒΌ, например, от примерно 0,1 до примерно 2,5, от примерно 0,5 до примерно 2,5, от примерно 1 до примерно 2,5, от примерно 1,5 до примерно 2,5 или от примерно 2 до примерно 2,5 по сравнению с подходящим контролем. В другом примере введение эффективного количества полипептида, лиганда, бАЬ или антагониста может замедлять появление симптомов ΙΒΌ в мышиной Όδδ модели ΙΒΌ, например, на примерно 1 сутки, примерно 2 суток, примерно 3 суток, примерно 4 суток, примерно 5 суток, примерно 6 суток, примерно 7 суток, примерно 10 суток, примерно 14 суток, примерно 21 сутки или примерно 28 суток по сравнению с подходящим контролем. В другом примере введение эффективного количества полипептида, лиганда, бАЬ или антагониста может приводить к среднему индексу тяжести в мышиной Όδδ модели ΙΒΌ от 0 до примерно 0,5, от примерно 0,5 до примерно 1, от примерно 1 до примерно 1,5, от примерно 1,5 до примерно 2 или от примерно 2 до примерно 2,5.

В конкретных воплощениях полипептид, лиганд, бАЬ или антагонист является эффективным в мышиной модели хронического обструктивного заболевания легких (ХОЗЛ), вызванного табачным дымом (см. АО 2006038027 и АО 2007049017 для подробной информации о модели). Например, введение эффективного количества лиганда может уменьшать или замедлять появление симптомов ХОЗЛ по сравнению с подходящим контролем.

Имеются животные модельные системы, которые можно использовать для скрининга эффективности антагонистов ΤΝΕΚ1 (например, лигандов, антител или их связывающих белков) в защите против или лечении заболевания. Способы тестирования системной красной волчанки (δΗΕ) у восприимчивых мышей известны в данной области (Кш§й! е1 а1. (1978) 1. Εχρ. Меб, 147: 1653; КетеШеп е1 а1. (1978) Νο\ν Εη§. 1. Меб., 299: 515). Астенический бульбарный паралич (МО, шуакШеша §гау18) тестируют на самках мышей §1Ъ/1 посредством индукции заболевания растворимым белком АсЬК (рецептор ацетилхолина) из

- 13 022898 других видов (Ьшб51гот е! а1. (1988) Αάν. 1ттипо1., 42: 233). Артрит индуцируют у восприимчивого штамма мышей посредством инъекции коллагена II типа (8!иаг! е! а1. (1984) Апп. Κβν. 1ттипо1., 42: 233). Была описана модель, где адъювантный артрит индуцируют у восприимчивых крыс посредством инъекции микобактериального белка теплового шока (Уап Ебеп е! а1. (1988) Иа!иге, 331: 171). Тиреоидит индуцируют у мышей посредством введения тиреоглобулина, как описано (Магоп е! а1. (1980) I. Ехр. Меб., 152: 1115). Инсулинозависимый сахарный диабет (ГОИМ) возникает естественным путем или может быть индуцирован в некоторых линиях мышей, таких как описанные в Каиака^а е! а1. (1984) О1аЬе1о1од1а. 27: 113. ЕАЕ (экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит) у мышей и крыс служит моделью М8 (рассеянный склероз) у человека. В этой модели демиелинизирующее заболевание индуцируют путем введения основного миелинового белка (см. Ра!егкоп (1986) Тех!Ьоок о£ 1ттипора1йо1о§у, М15сйег е! а1., ебк., Сгипе апб 8!га!!оп, Иете Уогк, рр. 179-213; МсРагНп е! а1. (1973) 8с1епсе, 179: 478: и 8а!ой е! а1. (1987) I. 1ттипо1, 138: 179).

Как правило, лиганды (например, антагонисты) будут использоваться в очищенной форме вместе с фармакологически приемлемыми носителями. В общем, эти носители включают водные или спиртовые/водные растворы, эмульсии или суспензии, в том числе солевые и/или буферные среды. Парентеральные носители включают раствор хлорида натрия, раствор Рингера с декстрозой, декстрозу и хлорид натрия и раствор Рингера с лактатом. Подходящие физиологически приемлемые адъюванты, если необходимо сохранить полипептидный комплекс в суспензии, можно выбрать из загустителей, таких как карбоксиметилцеллюлоза, поливинилпирролидон, желатин и альгинаты.

Внутривенные носители включают жидкости и питательные наполнители и электролиты на основе, например, декстрозы Рингера. Также могут присутствовать консерванты и другие добавки, такие как противомикробные агенты, антиоксиданты, хелатирующие агенты и инертные газы (Маск (1982) Кеттд!оп'к Рйагтасеибса1 8с1епсек, 161Й Ебйюп). Можно использовать различные подходящие препараты, включая препараты с пролонгированным высвобождением.

Лиганды (например, антагонисты) по настоящему изобретению можно использовать в виде отдельно вводимых композиций или в сочетании с другими агентами. Они могут включать различные иммунотерапевтические лекарственные средства, такие как циклоспорин, метотрексат, адриамицин или цисплатин и иммунотоксины. Фармацевтические композиции могут включать коктейли различных цитотоксических или других агентов в сочетании с лигандами по настоящему изобретению или даже комбинации лигандов в соответствии с настоящим изобретением, имеющих различные специфичности, такие как лиганды, выбранные с использованием различных целевых антигенов или эпитопов, независимо от того, объединяются ли они перед введением или нет.

Путь введения фармацевтических композиций в соответствии с изобретением может представлять собой любой из обычно известных специалистам в данной области. Для терапии, включая без ограничения иммунотерапию, выбранные лиганды по изобретению можно вводить пациенту в соответствии со стандартными методами.

Введение можно осуществлять любым подходящим способом, включая парентеральное, внутривенное, внутримышечное, внутрибрюшинное, подкожное, трансдермальное введение, посредством легочного пути или также, соответственно, посредством прямой инфузии с использованием катетера. Дозировка и частота введения будут зависеть от возраста, пола и состояния пациента, одновременного введения других лекарственных средств, противопоказаний и других параметров, которые должны быть приняты во внимание врачом. Введение может быть локальным (например, локальная доставка в легкое посредством легочного введения, например, интраназального введения) или системным, как указано.

Лиганды по изобретению могут быть лиофилизированы для хранения и восстановлены в подходящем носителе перед применением. Этот метод, как было показано, является эффективным с обычными иммуноглобулинами, и можно использовать известные в данной области методы лиофилизации и восстановления. Специалисту в данной области понятно, что лиофилизация и восстановление могут приводить к различной степени потери активности антител (например, что касается обычных иммуноглобулинов, то антитела 1дМ в большей степени теряют активность, чем антитела 1дС) и что используемые уровни можно увеличивать для компенсации.

Композиции, содержащие лиганды (например, антагонисты) по настоящему изобретению или их коктейль, можно вводить для профилактического и/или терапевтического лечения. При некоторых терапевтических применениях количество, достаточное для достижения по меньшей мере частичного ингибирования, подавления, модулирования, уничтожения или какого-либо другого измеряемого параметра популяции выбранных клеток определяют как терапевтически эффективную дозу. Количества, необходимые для достижения этой дозировки, будут зависеть от тяжести заболевания и общего состояния собственной иммунной системы пациента, но обычно варьируются от 0,005 до 10,0 мг лиганда, например бАЬ или антагониста, на килограмм массы тела при дозах от 0,05 до 2,0 мг/кг/доза, являющихся наиболее часто используемыми. Что касается профилактических применений, то композиции, содержащие лиганды по настоящему изобретению или коктейли из них, также можно вводить в аналогичных или чуть более низких дозировках для предупреждения, ингибирования или замедления наступления заболевания (например, для поддержания ремиссии или состояния покоя или для предупреждения острой фазы). Ква- 14 022898 лифицированный врач сможет определить подходящий интервал между дозами для лечения, подавления или предупреждения заболевания. Когда лиганд ΤΝΡΚ1 (например, антагонист) вводят для лечения, подавления или предупреждения хронического воспалительного заболевания, тогда его можно вводить вплоть до четырех раз в сутки, два раза в неделю, один раз в неделю, один раз каждые две недели, один раз в месяц или один раз каждые два месяца, в дозе, например, от примерно 10 мкг/кг до примерно 80 мг/кг, от примерно 100 мкг/кг до примерно 80 мг/кг, от примерно 1 до примерно 80 мг/кг, от примерно 1 до примерно 70 мг/кг, от примерно 1 до примерно 60 мг/кг, от примерно 1 до примерно 50 мг/кг, от примерно 1 до примерно 40 мг/кг, от примерно 1 до примерно 30 мг/кг, от примерно 1 до примерно 20 мг/кг, от примерно 1 до примерно 10 мг/кг, от примерно 10 мкг/кг до примерно 10 мг/кг, от примерно 10 мкг/кг до примерно 5 мг/кг, от примерно 10 мкг/кг до примерно 2,5 мг/кг, примерно 1 мг/кг, примерно 2 мг/кг, примерно 3 мг/кг, примерно 4 мг/кг, примерно 5 мг/кг, примерно 6 мг/кг, примерно 7 мг/кг, примерно 8 мг/кг, примерно 9 мг/кг или примерно 10 мг/кг. В конкретных воплощениях лиганд ΤΝΡΚ1 (например, антагонист) вводят для лечения, подавления или предупреждения хронического воспалительного заболевания один раз каждые две недели или раз в месяц в дозе от примерно 10 мкг/кг до примерно 10 мг/кг (например, примерно 10 мкг/кг, примерно 100 мкг/кг, примерно 1 мг/кг, примерно 2 мг/кг, примерно 3 мг/кг, примерно 4 мг/кг, примерно 5 мг/кг, примерно 6 мг/кг, примерно 7 мг/кг, примерно 8 мг/кг, примерно 9 или примерно 10 мг/кг.)

Лечение или терапия, выполняемые с использованием композиций, описанных в данной заявке, считаются эффективными, если один или более симптомов уменьшаются (например, по меньшей мере на 10% или по меньшей мере на один пункт в клинической шкале оценки) по сравнению с такими симптомами, присутствующими до лечения, или по сравнению с такими симптомами у индивидуума (в человеческой или животной модели), не подвергнутого лечению такой композицией, или другим подходящим контролем. Очевидно, что симптомы будут меняться в зависимости от целевого заболевания или расстройства, но могут быть измерены обычным квалифицированным врачом или специалистом. Такие симптомы можно измерить, например, посредством мониторинга уровня одного или более биохимических показателей заболевания или расстройства (например, уровней фермента или метаболита, коррелирующих с заболеванием, влияющих на число клеток и т.д.), посредством мониторинга физических проявлений (например воспаления, размера опухоли и т.д.) или с помощью принятой шкалы клинической оценки, например расширенной шкалы инвалидизации (для рассеянного склероза), опросника Ирвина относительно воспалительного заболевания кишечника (32 пункта оценивают качество жизни относительно функции кишечника, системных симптомов, социальных функций и эмоционального статуса показатель колеблется от 32 до 224, более высокие показатели указывают на лучшее качество жизни), шкалы оценки качества жизни при ревматоидном артрите или другой принятой шкалы клинической оценки, известной в данной области. Устойчивое (например, одни сутки или больше, или дольше) снижение симптомов заболевания или расстройства по меньшей мере на 10% или на один или более пунктов по заданной клинической шкале является показателем эффективного лечения. Аналогично, профилактика, осуществляемая с использованием композиции, как описано в данной заявке, является эффективной, если появление или тяжесть одного или более симптомов замедляется, уменьшается или отменяется относительно таких симптомов у подобного индивидуума (человеческая или животная модель), не подвергнутого воздействию композиции.

Композицию, содержащую лиганд (например, антагонист) или их коктейль, в соответствии с настоящим изобретением можно использовать в профилактических или терапевтических применениях для обеспечения изменения, инактивации, уничтожения или удаления выбранной целевой популяции клеток у млекопитающего. Кроме того, выбранные репертуары полипептидов, описанных в данной заявке, можно использовать экстракорпорально или ίη νίίτο, выборочно уничтожая, истощая или иным образом эффективно удаляя целевую клеточную популяцию из гетерогенной совокупности клеток. Кровь млекопитающего можно объединять экстракорпорально с лигандами, посредством чего нежелательные клетки уничтожаются или иным образом удаляются из крови для возвращения млекопитающему в соответствии со стандартными методами.

Композицию, содержащую лиганд (например, антагонист), в соответствии с настоящим изобретением можно использовать в профилактических или терапевтических применениях для обеспечения изменения, инактивации, уничтожения или удаления выбранной целевой популяции клеток у млекопитающего.

Лиганды (например, анти-ΤΝΡΚΤ антагонисты, 4АЬ мономеры) можно вводить или готовить в виде препаратов вместе с одним или более дополнительными терапевтическими или активными агентами. Когда лиганд (например, 4АЬ) вводят с дополнительным терапевтическим агентом, тогда лиганд можно вводить до, одновременно или после введения дополнительного агента. Как правило, лиганд и дополнительный агент вводят способом, который обеспечивает перекрывание терапевтического эффекта.

В одном воплощении в изобретении предложен способ лечения, подавления или предупреждения хронического воспалительного заболевания, включающий введение млекопитающему, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективной дозы или количества полипептида, лиганда, 4АЬ или антагониста ΤΝΡΚ1 в соответствии с изобретением.

- 15 022898

В одном воплощении в изобретении предложен способ лечения, подавления или предупреждения артрита (например, ревматоидного артрита, ювенильного ревматоидного артрита, анкилозирующего спондилита, псориатического артрита), включающий введение млекопитающему, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективной дозы или количества полипептида, лиганда, ЙАЪ или антагониста ΤΝΕΚ1 в соответствии с изобретением.

В другом воплощении в изобретении предложен способ лечения, подавления или предупреждения псориаза, включающий введение млекопитающему, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективной дозы или количества полипептида, лиганда, ЙАЪ или антагониста ΤΝΕΚ1 в соответствии с изобретением.

В другом воплощении в изобретении предложен способ лечения, подавления или предупреждения воспалительного заболевания кишечника (например, болезни Крона, неспецифического язвенного колита), включающий введение млекопитающему, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективной дозы или количества полипептида, лиганда, ЙАЪ или антагониста ΤΝΕΚ1 в соответствии с изобретением.

В другом воплощении в изобретении предложен способ лечения, подавления или предупреждения хронического обструктивного заболевания легких (например, хронического бронхита, хронического обструктивного бронхита, эмфиземы), включающий введение млекопитающему, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективной дозы или количества полипептида, лиганда, ЙАЪ или антагониста ΤΝΕΚ1 в соответствии с изобретением.

В другом воплощении в изобретении предложен способ лечения, подавления или предупреждения пневмонии (например, бактериальной пневмонии, такой как стафилококковая пневмония), включающий введение млекопитающему, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективной дозы или количества полипептида, лиганда, ЙАЪ или антагониста ΤΝΕΚ1 в соответствии с изобретением.

В изобретении предложен способ лечения, подавления или предупреждения других легочных заболеваний, в дополнение к хроническому обструктивному заболеванию легких и пневмонии. Другие легочные заболевания, которые можно лечить, подавлять или предупреждать в соответствии с изобретением, включают, например, муковисцидоз и астму (например, стероид-устойчивую астму). Таким образом, в другом воплощении в изобретении предложен способ лечения, подавления или предупреждения легочного заболевания (например, муковисцидоза, астмы), включающий введение млекопитающему, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективной дозы или количества полипептида, лиганда, ЙАЪ или антагониста ΤΝΕΚ1 в соответствии с изобретением.

В конкретных воплощениях антагонист ΤΝΕΚ1 вводят посредством легочной доставки, например, посредством ингаляции (например, внутрибронхиальной, интраназальной или пероральной ингаляции, интраназальных капель) или посредством системной доставки (например, парентеральной, внутривенной, внутримышечной, внутрибрюшинной, подкожной).

В другом воплощении в изобретении предложен способ лечения, подавления или предупреждения септического шока, включающий введение млекопитающему, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективной дозы или количества полипептида, лиганда, ЙАЪ или антагониста ΤΝΕΚ1 в соответствии с изобретением.

В другом аспекте изобретения предложена композиция, содержащая полипептид, лиганд, ЙАЪ или антагонист ΤΝΕΚ1 в соответствии с изобретением и фармацевтически приемлемый носитель, растворитель или эксципиент.

Кроме того, в настоящем изобретении предложен способ лечения заболевания с использованием полипептида, лиганда, ЙАЪ или антагониста ΤΝΕΚ1 или композиции в соответствии с настоящим изобретением. В воплощении заболевание представляет способ рак или воспалительное заболевание, например ревматоидный артрит, астму или болезнь Крона.

В другом аспекте изобретения предложена композиция, содержащая полипептид, единичный вариабельный домен, лиганд или антагонист, согласно изобретению и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель.

В конкретных воплощениях полипептид, лиганд, единичный вариабельный домен, антагонист или композицию вводят посредством легочной доставки, например, посредством ингаляции (например, внутрибронхиальной, интраназальной или пероральной ингаляции, интраназальных капель) или посредством системной доставки (например, парентеральной, внутривенной, внутримышечной, внутрибрюшинной, подкожной).

В одном аспекте изобретения предложено устройство для легочной доставки, содержащее полипептид, единичный вариабельный домен, лиганд, композицию или антагонист в соответствии с изобретением. Устройство может представлять собой ингалятор или устройство для интраназального введения.

В других воплощениях любой из лигандов, описанных в данной заявке (например, антагонист или единичный вариабельный домен), дополнительно содержит группировку, увеличивающую период полувыведения, такую как полиалкиленгликолевая группировка, сывороточный альбумин или его фрагмент, рецептор трансферрина или его трансферрин-связывающий участок или группировка, содержащая связывающий сайт для полипептида, который увеличивает период полувыведения ίη νίνο. В некоторых воплощениях группировка, увеличивающая период полувыведения, представляет собой группировку, содержащую связывающий сайт для полипептида, который увеличивает период полувыведения ίη νίνο,

- 16 022898 выбранного из группы, состоящей из антитела, домена 8рА, домена рецептора ЬОЬ класса А, домена ЕСР и авимера.

В других воплощениях группировка, увеличивающая период полувыведения, представляет собой полиэтиленгликолевую группировку. В одном воплощении антагонист содержит (возможно состоит из) единичный вариабельный домен по изобретению, связанный с полиэтиленгликолевой группировкой (возможно, где группировка имеет размер от примерно 20 до примерно 50 кДа, возможно примерно 40 кДа линейного или разветвленного ПЭГ). Ссылка сделана на \У0 04081026 для более подробной информации о ПЭГ илировании бАЬк и связывающих группировок. В одном воплощении антагонист состоит из мономера бАЬ, связанного с ПЭГ, где мономер бАЬ представляет собой единичный вариабельный домен в соответствии с изобретением. Этот антагонист может быть предложен для лечения воспалительного заболевания, состояния легких (например, астмы, гриппа или ХОЗЛ) или рака и возможно подходит для внутривенного введения.

В других воплощениях группировка, увеличивающая период полувыведения, представляет собой антитело или фрагмент антитела (например, единичный вариабельный домен иммуноглобулина), содержащий связывающий сайт для сывороточного альбумина или неонатального Рс-рецептора.

Изобретение также относится к композиции (например, фармацевтической композиции), содержащей лиганд по изобретению (например, антагонист или единичный вариабельный домен) и физиологически приемлемый носитель. В некоторых воплощениях композиция содержит носитель для внутривенного, внутримышечного, внутрибрюшинного, внутриартериального, интратекального, внутрисуставного, подкожного введения, легочного, интраназального, вагинального или ректального введения.

Изобретение также относится к устройству для доставки лекарственного средства, содержащему композицию (например, фармацевтическую композицию) по изобретению. В некоторых воплощениях устройство для доставки лекарственного средства содержит множество терапевтически эффективных доз лиганда. В других воплощениях устройство для доставки лекарственного средства выбрано из группы, состоящей из устройства для парентеральной доставки, устройства для внутривенной доставки, устройства для внутримышечной доставки, устройства для внутрибрюшинной доставки, устройства для трансдермальной доставки, устройства для легочной доставки, устройства для внутриартериальной доставки, устройства для интратекальной доставки, устройства для внутрисуставной доставки, устройства для подкожной доставки, устройства для интраназальной доставки, устройства для вагинальной доставки, устройства для ректальной доставки, шприца, устройства для трансдермальной доставки, капсулы, таблетки, небулайзера, ингалятора, атомайзера, генератора аэрозоля, генератора тумана, сухого порошкового ингалятора, дозирующего ингалятора, дозирующего распылителя, дозирующего генератора тумана, дозирующего атомайзера и катетера.

Лиганд (например, единичный вариабельный домен, антагонист или полиспецифический лиганд) по изобретению может быть отформатирован, как описано в данной заявке. Например, лиганд по изобретению можно отформатировать с целью изменения периода полувыведения из сыворотки ш νί\Ό. При желании, лиганд может дополнительно содержать токсин или токсиновую группировку, как описано в данной заявке. В некоторых воплощениях лиганд содержит поверхностно-активный токсин, такой как генератор свободных радикалов (например, селен-содержащий токсин) или радионуклид. В других воплощениях токсин или токсиновая группировка представляет собой полипептидный домен (например, бАЬ), имеющий связывающий сайт со специфичностью связывания в отношении внутриклеточной мишени. В конкретных воплощениях лиганд представляет собой 1дС-подобный формат, который обладает специфичностью связывания в отношении ΤΝΕΚ1 (например, человеческого ΤΝΕΚ1).

В одном аспекте в изобретении предложен слитый белок, содержащий единичный вариабельный домен по изобретению. Вариабельный домен может быть слит, например, с пептидом или полипептидом или белком. В одном воплощении вариабельный домен слит с антителом или фрагментом антитела, например, моноклональным антителом. Как правило, слияния можно достичь путем экспрессии слитого продукта с последовательности единичной нуклеиновой кислоты или путем экспрессии полипептида, содержащего единичный вариабельный домен, и последующего объединения этого полипептида в больший белок или формат антитела с использованием методов, которые являются общепринятыми.

В одном воплощении единичный вариабельный домен иммуноглобулина, антагонист или слитый белок содержит константный домен антитела. В одном воплощении единичный вариабельный домен иммуноглобулина, антагонист или слитый белок содержит Рс антитела, возможно, где Ν-конец Рс связан (возможно, непосредственно связан) с С-концом вариабельного домена. В одном воплощении единичный вариабельный домен иммуноглобулина, антагонист или слитый белок содержит группировку, увеличивающую период полувыведения. Группировка, увеличивающая период полувыведения, может представлять собой полиэтиленгликолевую группировку, сывороточный альбумин или его фрагмент, рецептор трансферрина или его трансферрин-связывающий участок, или антитело или фрагмент антитела, содержащие связывающий сайт для полипептида, который увеличивает период полувыведения ш νί\Ό. Группировка, увеличивающая период полувыведения, может представлять собой антитело или фрагмент антитела, содержащие связывающий сайт для сывороточного альбумина или неонатального Рс-рецептора. Группировка, увеличивающая период полувыведения, может представлять собой бАЬ, антитело или

- 17 022898 фрагмент антитела. В одном воплощении предложен единичный вариабельный домен иммуноглобулина, или антагонист, или слитый белок, такой что вариабельный домен (или вариабельный домен, представленный антагонистом или слитым белком) дополнительно содержит полиалкиленгликолевую группировку.

Полиалкиленгликолевая группировка может представлять собой полиэтиленгликолевую группировку. Дополнительное обсуждение представлено ниже.

Сделана ссылка на νθ 2006038027, в которой описаны единичные вариабельные домены иммуноглобулина против ΤΝΡΚ1. Описание этого документа включено в данную заявку во всей своей полноте, в частности, для обеспечения применений, форматов, способов отбора, способов получения, способов приготовления фармацевтических препаратов и анализов единичных вариабельных доменов, лигандов, антагонистов против ΤΝΡΚ1 и тому подобного таким образом, чтобы эти описания можно было применить специально и точно в контексте настоящего изобретения, в том числе для обеспечения точного описания для введения в формулу изобретения настоящего описания.

Анти-ΤNРΚ1 по изобретению представляет собой единичный вариабельный домен иммуноглобулина, который возможно представляет собой человеческий вариабельный домен или вариабельный домен, который содержит или происходит из человеческих каркасных областей (например, каркасные области ΌΡ47 или ΌΡΚ9). В некоторых воплощениях вариабельный домен основан на универсальной каркасной области, как описано в данной заявке.

В некоторых воплощениях полипептидный домен (например, единичный вариабельный домен иммуноглобулина), который имеет связывающий сайт со специфичностью связывания в отношении ΤΝΡΚ1, устойчив к агрегации, обратимо разворачивается (см. νθ 04101790, идеи которой включены в данную заявку посредством ссылки).

Молекулы нуклеиновой кислоты, векторы и клетки-хозяева

В изобретении также предложены выделенные и/или рекомбинантные молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие лиганды (единичные вариабельные домены, слитые белки, полипептиды, лиганды с двойной специфичностью и полиспецифические лиганды), как описано в данной заявке.

В одном аспекте в изобретении предложена выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий единичный вариабельный домен иммуноглобулина согласно изобретению. В одном воплощении нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность ИОМ1Ь-574-188, ΌΟΜ1Η-574-189, ΌΟΜ1Η-574-190, ϋΟΜ1Ε-574-191, ΌΟΜ1Η-574-192, ΌΟΜ1Η-574-193, ИОМ1Ь-574-194, ΌΟΜ1Η-574-195, ΌΟΜ1Η-574-196, ϋΟΜ1Ε-574-201, ΌΟΜ1Η-574-202, ΌΟΜ1Η-574-203, ΌΟΜ1Η-574-204, ΌΟΜ1Η-574-205, ΌΟΜ1Η-574-206, ΌΟΜ1Η-574-207, ΌΟΜ1Η-574-208, ΌΟΜ1Η-574-209, ΌΟΜ1Η-574-211, ΌΟΜ1Η-574-212, ΌΟΜ1Η-574-213 или ΌΟΜ1Η-574-214. В одном аспекте в изобретении предложена выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота, где указанная нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентична нуклеотидной последовательности ΌΟΜ1Η-574-188, ΌΟΜ1Η-574-189, ΌΟΜ1Η-574-190, ΌΟΜ1Ε-574-191, ΌΟΜ1Η-574-192, ΌΟΜ1Η-574-193, ΌΟΜ1Η-574-194, ΌΟΜ1Η-574-195, ΌΟΜ1Η-574-196, ΌΟΜ1Ε-574-201, ΌΟΜ1Η-574-202, ΌΟΜ1Η-574-203, ΌΟΜ1Η-574-204, ΌΟΜ1Η-574-205, ΌΟΜ1Η-574-206, ΌΟΜ1Η-574-207, ΌΟΜ1Η-574-208, ΌΟΜ1Η-574-209, ϋΟΜ1Ε-574-211, ΌΟΜ1Η-574-212, ΌΟΜ1Η-574-213 или ΩΟΜ11ι-574-214, и где указанная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, содержащий единичный вариабельный домен иммуноглобулина, который специфически связывается с ΤΝΡΚ1. В одном аспекте в изобретении предложена выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота, где указанная нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентична нуклеотидной последовательности ΌΟΜ1Η-574-188, ΌΟΜ1Η-574-189, ΌΟΜ1Η-574-190, ϋΟΜ1Ε-574-191, ΌΟΜ1Η-574-192, ΌΟΜ1Η-574-193, ΌΟΜ1Η-574-194, ΌΟΜ1Η-574-195, ΌΟΜ1Η-574-196, ϋΟΜ1Ε-574-201, ΌΟΜ1Η-574-202, ΌΟΜ1Η-574-203, ΌΟΜ1Η-574-204, ΌΟΜ1Η-574-205, ΌΟΜ1Η-574-206, ΌΟΜ1Η-574-207, ΌΟΜ1Η-574-208, ΌΟΜ1Η-574-209, ΌΟΜ1Ε-574-211, ΌΟΜ1Η-574-212, ΩΟΜ11ι-574-213 или ΩΟΜ1Η-574-214, и где указанная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, содержащий единичный вариабельный домен иммуноглобулина, который специфически связывается с ΤΝΡΚ1. В одном аспекте в изобретении предложена выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота, где указанная нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентична нуклеотидной последовательности ΌΟΜ1Η-574-188, ΌΟΜ1Η-574-189, ΌΟΜ1Η-574-190, ϋΟΜ1Ε-574-191, ΌΟΜ1Η-574-192, ΌΟΜ1Η-574-193, ΌΟΜ1Η-574-194, ΌΟΜ1Η-574-195, ΌΟΜ1Η-574-196, ϋΟΜ1Ε-574-201, ΌΟΜ1Η-574-202, ΌΟΜ1Η-574-203, ΌΟΜ1Η-574-204, ΌΟΜ1Η-574-205, ΌΟΜ1Η-574-206, ΌΟΜ1Η-574-207, ΌΟΜ1Η-574-208, ΌΟΜ1Η-574-209, ϋΟΜ1Ε-574-211, ΩΟΜ1Η-574-212, ΩΟΜ1Η-574-213 или ΩΟΜ1Η-574-214, и где указанная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, содержащий единичный вариабельный домен иммуноглобулина, который специфически связывается с ΤΝΡΚ1. В одном аспекте в изобретении предложена выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота, где указанная нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентична нуклеотидной последовательности ΌΟΜ1Η-574-188, ΌΟΜ1Η-574-189, ΌΟΜ1Η-574-190, ϋΟΜ1Ε-574-191, ΌΟΜ1Η-574-192, ΌΟΜ1Η-574-193, ΌΟΜ1Η-574-194, ΌΟΜ1Η-574-195, ΌΟΜ1Η-574-196, ϋΟΜ1Ε-574-201, ΌΟΜ1Η-574-202, ΌΟΜ1Η-574-203,

- 18 022898

ΌΘΜ1Η-574-204, ΟΘΜ1Η-574-205, ΟΘΜ1Η-574-206, ΟΘΜ1Η-574-207, ΟΘΜ1Η-574-208, ΟΘΜ1Η-574-209, ΟΘΜ1Η-574-211, ΌΘΜ1Η-574-212, ΌΘΜ1Η-574-213 или ΌΘΜ1Η-574-214, и где указанная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, содержащий единичный вариабельный домен иммуноглобулина, который специфически связывается с ΤΝΡΚ1.

В одном аспекте в изобретении предложен вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по изобретению. В одном аспекте в изобретении предложена клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по изобретению или вектор. Предложен способ получения полипептида, содержащего единичный вариабельный домен иммуноглобулина, включающий поддержание клетки-хозяина в условиях, подходящих для экспрессии нуклеиновой кислоты или вектора, посредством чего продуцируется полипептид, содержащий единичный вариабельный домен иммуноглобулина. Возможно, способ дополнительно включает стадию выделения полипептида и возможно получение варианта, например мутантного варианта, имеющего улучшенную аффинность (КО); ΝΟ₅₀ для нейтрализации ΤΝΡΚ1 в стандартном анализе ΜΚΟ5, Ь929 или К1 яванского макака, чем у выделенного полипептида.

Нуклеиновые кислоты, называемые в данной заявке выделенными, представляют собой нуклеиновые кислоты, которые были отделены от нуклеиновых кислот геномной ДНК или клеточной РНК из источника их происхождения (например, поскольку она существует в клетках или в смеси нуклеиновых кислот, такой как библиотека) и включают нуклеиновые кислоты, полученные способами, описанными в данной заявке, или другими подходящими способами, включая практически чистые нуклеиновые кислоты, нуклеиновые кислоты, полученные с помощью химического синтеза, с помощью комбинаций биологических и химических методов, и рекомбинантные нуклеиновые кислоты, которые выделяют (см., например, Оаидйейу, В.Ь. е! а1., №с1ею Аайк Ке8., 19(9): 2471-2476 (1991); ЬеМк, А.Р. и 1.8. Сго\уе, Оепе, 101: 297-302(1991)).

Нуклеиновые кислоты, называемые в данной заявке рекомбинантными, представляют собой нуклеиновые кислоты, которые были получены с помощью методологии рекомбинантных ДНК, в том числе и нуклеиновые кислоты, которые образуются с помощью процедур, которые основаны на методе искусственной рекомбинации, такой как полимеразная цепная реакция (ПЦР) и/или клонирование в вектор с использованием рестрикционных ферментов.

В некоторых воплощениях выделенная и/или рекомбинантная нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую лиганд, как описано в данной заявке, где указанный лиганд содержит аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно меньшей мере примерно

85%, по меньшей мере примерно 90%, по меньшей мере примерно 91%, по

92%, по меньшей мере примерно 93%, по меньшей мере примерно 94%, по меньшей мере примерно 95%, по меньшей мере примерно 96%, по меньшей мере примерно 97%, по меньшей мере примерно 98% или по меньшей мере примерно 99%-ную идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью ЙАЬ, которое связывается с ΤΝΡΚ1, описанным в данной заявке, например, ΟΘΜ1Η-574-188, ΟΘΜ1Η-574-189, ΟΘΜ1Η-574-190, ΟΘΜ1Η-574-191, ΟΘΜ1Η-574-192, ΟΘΜ1Η-574-193, ΟΘΜ1Η-574-194, ΟΘΜ1Η-574-195, ΟΘΜ1Η-574-196, ΟΘΜ1Η-574-201, ΟΘΜ1Η-574-202, ΟΘΜ1Η-574-203, ΟΘΜ1Η-574-204, ΟΘΜ1Η-574-205, ΟΘΜ1Η-574-206, ΟΘΜ1Η-574-207, ΟΘΜ1Η-574-208, ΟΘΜ1Η-574-209, ΟΘΜ1Η-574-211, ΟΘΜ1Η-574-212, ΟΘΜ1Η-574-213 или ΟΘΜ1Η-574214. Идентичность нуклеотидной последовательности можно определить по всей длине нуклеотидной последовательности, которая кодирует выбранное ЙАЬ против ΤΝΡΚ1.

В изобретении также предложен вектор, содержащий молекулу рекомбинантной нуклеиновой кислоты по изобретению. В некоторых воплощениях вектор представляет собой экспрессирующий вектор, содержащий один или более элементов, контролирующих экспрессию, или последовательности, которые функциональным образом связаны с рекомбинантной нуклеиновой кислотой по изобретению. В изобретении также предложена рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая молекулу рекомбинантной нуклеиновой кислоты или вектор по изобретению. Подходящие векторы (например, плазмиды, фагмиды), элементы, контролирующие экспрессию, клетки-хозяева и способы получения рекомбинантных клетокхозяев по изобретению хорошо известны в данной области, и примеры более подробно описаны в данной заявке.

Подходящие экспрессирующие векторы могут содержать ряд компонентов, например, точку начала репликации, селектируемый маркерный ген, один или более элементов, контролирующих экспрессию, таких как элемент контроля транскрипции (например, промотор, энхансер, терминатор) и/или один или более сигналов трансляции, сигнальную последовательность или лидерную последовательность и тому подобное. Элементы, контролирующие экспрессию, и сигнальная последовательность, если они присутствуют, могут быть представлены вектором или другим источником. Например, транскрипционные и/или трансляционные регуляторные последовательности клонированной нуклеиновой кислоты, кодирующей цепь антитела, можно использовать для прямой экспрессии.

Промотор может быть предложен для экспрессии в желаемой клетке-хозяине. Промоторы могут быть конститутивными или индуцибельными. Например, промотор может быть функциональным образом связан с нуклеиновой кислотой, кодирующей антитело, цепь антитела или его участок, так что он управляет транскрипцией нуклеиновой кислоты. Имеются различные подходящие промоторы для прока- 19 022898 риотических (например, промоторы 1ас, 1ас. Т3, Т7 для Е. сой) и эукариотических (например, ранний или поздний промотор обезьяньего вируса 40, промотор из длинных концевых повторов вируса саркомы Рауса, промотор цитомегаловируса, поздний промотор аденовируса) хозяев.

Кроме того, экспрессирующие векторы обычно содержат селектируемый маркер для селекции клеток-хозяев, несущих вектор, и, в случае реплицируемого экспрессирующего вектора, точку начала репликации. Гены, кодирующие продукты, которые придают устойчивость к антибиотикам или лекарственным средствам, представляют собой обычные селектируемые маркеры и могут быть использованы в прокариотических (например, ген лактамазы (устойчивость к ампициллину), ген ΤοΙ устойчивости к тетрациклину) и эукариотических клетках (например, неомицин (0418 или генетицин), др1 (микофеноловая кислота), ампициллин или гены устойчивости к гигромицину). Маркерные гены дигидрофолатредуктазы позволяют осуществлять селекцию с помощью метотрексата в различных хозяевах. Гены, кодирующие генный продукт ауксотрофных маркеров хозяина (например, ЬЕи2, ИКА3, ΗΙ§3), часто используют в качестве селектируемых маркеров в дрожжах. Также рассматривается применение вирусных (например, бакуловирусных) или фаговых векторов и векторов, которые способны интегрироваться в геном клеткихозяина, таких как ретровирусные векторы. Подходящие экспрессирующие векторы для экспрессии в клетках млекопитающих и прокариотических клетках (Е. сой), клетках насекомых (клетки Эгохорййа 8сйтебег §2, δΓ9) и дрожжах (Р. теШапойса, Р. ра81оп8, 8. сеге\л81ае) хорошо известны в данной области.

Подходящие клетки-хозяева могут представлять собой прокариотические клетки, включая бактериальные клетки, такие как Б. сой, В. 8иЬбЙ8 и/или другие подходящие бактерии; эукариотические клетки, такие как грибковые или дрожжевые клетки (например, РюЫараЧогК АзрегдШиз 8р., §ассйаготусе8 сегеу181ае, ЗсЫ/озассйаготусез ротЬе, Ыеигозрога сгазза) или другие низшие эукариотические клетки, и клетки высших эукариот, такие как клетки насекомых (например, клетки Ого8орйба §сйтебег §2, клетки §Г9 насекомых (УО 94/26087 (О'Соппог)), млекопитающих (например, клетки СО8, такие как СО§-1 (номер доступа в АТСС СКЬ-1650) и СО§-7 (номер доступа в АТСС СКЬ-1651), СНО (например, номер доступа в АТСС СКЬ-9096), СНО Ό044 (Иг1аиЬ, 0. апб Сйа81п, ЬА., Ргос. Ыаб. Асас. 8ск и§А, 77(7): 4216-4220 (1980))), 293 (номер доступа в АТСС СКЬ-1573), 11е1.а (номер доступа в АТСС ССЬ-2), СУ1 (номер доступа в АТСС ССЬ-70), УОР (Пабеу, Ь. е! а1., 1. Убо1, 54: 739-749 (1985), 3Т3, 293Т (Реаг, У. §., е! а1., Ргос. Наб. Асаб. §ск И.8.А., 90: 8392-8396 (1993)), клетки ЖО, §Р2/0, клетки ΗιιΤ 78 и тому подобное, или растений (например, табака) (см., например, Аи8иЬе1, Ρ.Μ. е! а1., еб8. Сиггей РгоЮсой ш Мо1еси1аг Вю1оду, Огеепе РиЬЙ8й1пд Л88ос1а1е8 апб 1ойп Убеу & §оп8 1пс. (1993)). В некоторых воплощениях клетка-хозяин представляет собой выделенную клетку-хозяина и не является частью многоклеточного организма (например, растения или животного). В некоторых воплощениях клетка-хозяин не является человеческой клеткой-хозяином.

В изобретении также предложен способ получения лиганда (например, лиганда с двойной специфичностью, полиспецифического лиганда) по изобретению, включающий поддержание рекомбинантной клетки-хозяина, содержащей рекомбинантную нуклеиновую кислоту по изобретению, в условиях, подходящих для экспрессии рекомбинантной нуклеиновой кислоты, посредством чего экспрессируется рекомбинантная нуклеиновая кислота и продуцируется лиганд. В некоторых воплощениях способ дополнительно включает выделение лиганда.

Ссылка делается на УО 2006038027 для деталей описания, которое применимо к воплощениям настоящего изобретения. Например, релевантное описание относится к получению лигандов на основе единичного вариабельного домена иммуноглобулина, библиотечным векторным системам, конструированию библиотек, комбинированию единичных вариабельных доменов, характеристике лигандов, структуре лигандов, скелетам, белковым каркасам, диверсификации канонической последовательности, анализам и терапевтическим и диагностическим композициям и применениям, а также определениям функциональным образом связанный, наивный, предупреждение, подавление, лечение и терапевтически эффективная доза.

Форматы

Увеличенный период полувыведения полезен в применениях ш νί\Ό иммуноглобулинов, особенно антител, и в еще большей степени фрагментов антител малого размера. Такие фрагменты (Ρν8, дисульфидсвязанные Ρν8, РаЬ8, 8сΡν8, бАЬ8) подвергаются быстрому выведению из организма; таким образом, хотя они способны быстро достигать большинства частей тела, и быстро производятся и просты в обращении, их применения ш νί\Ό ограничивались лишь коротким временем их существования ш νί\Ό. Одно воплощение изобретения решает эту проблему путем обеспечения увеличенного периода полувыведения лигандов ш νί\Ό и, следовательно, более продолжительного времени пребывания в организме функциональной активности лиганда. Методы фармакокинетического анализа и определение периода полувыведения лиганда знакомы специалистам в данной области. Детали можно найти в Кеппебг А. е! а1. Сйешюа1 §1аЬШ1у оГ РйагтасеибсаК А ΗапбЬоок Гог Рйагтас1818 и в Ре!ег8 е! а1., РйагтасоктеЮ апа1у818: А Ргасбса1 Арргоасй (1996). Ссылка также делается на Рйагтасокшебс8, М 01Ьа1б1 & Ό Реггоп, опубликованную Магсе1 Эеккег, 2^пб Κ£ν. ех ебШоп (1982), в которой описаны фармакокинетические параметры, такие как периоды полувыведения ΐ-альфа и 1-бета и площадь под кривой (АИС). Определения периода полувыведения и АИС представлены выше.

- 20 022898

В одном воплощении в настоящем изобретении предложены лиганд (например, полипептид, вариабельный домен, антагонист, полиспецифический лиганд) или композиция, содержащая лиганд в соответствии с изобретением, имеющие период полувыведения ΐα в диапазоне от 15 мин или более. В одном воплощении нижний предел диапазона составляет 30, 45 мин, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 11 или 12 ч. Дополнительно или альтернативно, лиганд или композиция в соответствии с изобретением имеют период полувыведения Ια в диапазоне вплоть до и включая 12 ч. В одном воплощении верхний предел диапазона составляет 11, 10, 9, 8, 7, 6 или 5 ч. Пример подходящего диапазона составляет от 1 до 6 ч, от 2 до 5 ч или от 3 до 4 ч.

В одном воплощении в настоящем изобретении предложен лиганд (например, полипептид, вариабельный домен, антагонист, полиспецифический лиганд) или композиция, содержащая лиганд в соответствии с изобретением, имеющие период полувыведения ΐβ в диапазоне от примерно 2,5 ч или более. В одном воплощении нижний предел диапазона составляет примерно 3 ч, примерно 4 ч, примерно 5 ч, примерно 6 ч, примерно 7 ч, примерно 10 ч, примерно 11 ч или примерно 12 ч. Дополнительно или альтернативно, лиганд или композиция в соответствии с изобретением имеют период полувыведения ΐβ вплоть до и включая 21 сутки. В одном воплощении верхний предел диапазона составляет примерно 12 ч, примерно 24 ч, примерно 2 суток, примерно 3 суток, примерно 5 суток, примерно 10 суток, примерно 15 суток или примерно 20 суток. В одном воплощении лиганд или композиция в соответствии с изобретением будут иметь период полувыведения ΐβ в диапазоне от примерно 12 до примерно 60 ч. В другом воплощении он будет находиться в диапазоне от примерно 12 до примерно 48 ч. В другом воплощении он будет находиться в диапазоне от примерно 12 до примерно 26 ч.

Дополнительно или альтернативно к вышеприведенным критериям, в настоящем изобретении предложен лиганд или композиция, содержащая лиганд в соответствии с изобретением, имеющие значение ЛИС (площадь под кривой) в диапазоне от примерно 1 мг-мин/мл или более. В одном воплощении нижний предел диапазона составляет примерно 5, примерно 10, примерно 15, примерно 20, примерно 30, примерно 100, примерно 200 или примерно 300 мг-мин/мл. Дополнительно или альтернативно, лиганд или композиция в соответствии с изобретением имеют АИС в диапазоне вплоть до примерно 600 мг-мин/мл. В одном воплощении верхний предел диапазона составляет примерно 500, примерно 400, примерно 300, примерно 200, примерно 150, примерно 100, примерно 75 или примерно 50 мг-мин/мл. В одном воплощении лиганд в соответствии с изобретением имеет АИС в диапазоне, выбранном из группы, состоящей из следующих диапазонов: от примерно 15 до примерно 150 мг-мин/мл, от примерно 15 до примерно 100 мг-мин/мл, от примерно 15 до примерно 75 мг-мин/мл и от примерно 15 до примерно 50 мг- мин/мл.

Полипептиды и 6АЬ§ по изобретению и антагонисты, содержащие их, можно отформатировать для получения большего гидродинамического размера, например, посредством присоединения ПЭГ группы, сывороточного альбумина, трансферрина, рецептора трансферрина или, по меньшей мере, его трансферрин-связывающего участка, Рс-области антитела или путем конъюгирования с доменом антитела. Например, полипептиды 6АЬ§ и антагонисты, отформатированные в виде большего антиген-связывающего фрагмента антитела или в виде антитела (например, в формате РаЬ, РаЬ', Р(аЬ)₂, Р(аЬ')₂, 1дС. 8сРу).

Гидродинамический размер лигандов (например, бАЬ мономеров и мультимеров) по изобретению можно определить с использованием способов, которые хорошо известны в данной области. Например, гель-фильтрационную хроматографию можно использовать для определения гидродинамического размера лиганда. Подходящие гель-фильтрационные матрицы для определения гидродинамических размеров лигандов, такие как сшитые агарозные матрицы, хорошо известны и легко доступны.

Размер формата лиганд (например, размер ПЭГ группировки, присоединенной к бАЬ мономеру) может варьироваться в зависимости от желаемого применения. Например, если предполагается, что лиганд должен покинуть кровообращение и проникнуть в периферические ткани, то желательно поддерживать небольшой гидродинамический размер лиганда для облегчения просачивания из кровотока. Альтернативно, если желательно, чтобы лиганд оставался в системном кровообращении в течение более длительного периода времени, то размер лиганда может быть увеличен, например, посредством форматирования в виде 1д-подобного белка.

Увеличение периода полувыведения посредством нацеливания на антиген или эпитоп, который увеличивает период полувыведения ίη νίνο

Гидродинамический размер лиганда и его период полувыведения из сыворотки можно также увеличить посредством конъюгации или ассоциации ΤNΡК1-связывающего полипептида, бАЬ или антагониста по изобретению со связывающим доменом (например, антителом или фрагментом антитела), который связывает антиген или эпитоп, который увеличивает период полувыведения ίη νίνο, как описано в данной заявке. Например, ΤNΡК1-связывающий агент (например, полипептид) может быть конъюгирован или связан с антителом или фрагментом антитела против сывороточного альбумина или против неонатального Рс-рецептора, например, бАЬ, РаЬ, РаЬ' или 8сΡν против §А или против неонатального Рсрецептора, или с аффителом против §А или аффителом против неонатального Рс-рецептора, или авимером против §А, или анти-§А-связывающим доменом, который содержит каркас, выбранный, но не огра- 21 022898 ничивающийся этим, из группы, состоящей из СТЬА-4, липокалина, 8рА, аффитела, авимера, СгоЕ1 и фибронектина (см. νΟ 2008096158 для описания этих связывающих доменов, которые вместе с их последовательностями включены в данную заявку посредством ссылки и составляют часть настоящего описания). Конъюгирование относится к композиции, содержащей полипептид, йАЬ или антагонист по изобретению, которые связаны (ковалентно или нековалентно) со связывающим доменом, который связывает сывороточный альбумин.

Подходящие полипептиды, которые увеличивают период полувыведения ίη νίνο, включают, например, белки слияния лиганда, специфичного к рецептору трансферрина, и нейрофармацевтического агента (см. патент США № 5977307, идеи которого включены в данную заявку посредством ссылки), рецептор эндотелиальных клеток капилляров головного мозга, трансферрин, рецептор трансферрина (например, растворимый рецептор трансферрина), инсулин, рецептор инсулиноподобного фактора роста 1 (ЮР 1), рецептор инсулиноподобного фактора роста 2 (ЮР 2), рецептор инсулина, фактор X свертывания крови, α1-антитрипсин и ΗΝΡ 1α (гепатоцитарный ядерный фактор 1α). Подходящие полипептиды, которые увеличивают период полувыведения из сыворотки, также включают гликопротеин альфа-1 (орозомукоид; ААС), антихимотрипсин альфа-1 (АСТ), микроглобулин альфа-1 (белок НС; ΑΙΜ), антитромбин III (ΑΤ III), аполипопротеин А-1 (Аро А-1), аполипопротеин В (Аро В), церулоплазмин (Ср), компонент С3 комплемента (С3), компонент С4 комплемента (С4), ингибитор С1 эстеразы (С1 INΗ), С-реактивный белок (СКР), ферритин (РЕК), гемопексин (НРХ), липопротеин(а) (Ьр(а)), манноза-связывающий белок (МВР), миоглобин (Муо), преальбумин (транстиретин; РАЬ), ретинол-связывающий белок (КВР) и ревматоидный фактор (КР).

Подходящие белки из внеклеточного матрикса включают, например, коллагены, ламинины, интегрины и фибронектин. Коллагены являются основными белками внеклеточного матрикса. В настоящее время известно примерно 15 типов молекул коллагена, обнаруженных в различных частях тела, например коллаген I типа (составляет 90% коллагена тела), обнаруженный в костях, коже, сухожилиях, связках, роговице, внутренних органах, или коллаген II типа, обнаруженный в хряще, межпозвоночном хряще, хорде и стекловидном теле глаза.

Подходящие белки из крови включают, например, белки плазмы крови (например, фибрин, α-2 макроглобулин, сывороточный альбумин, фибриноген (например, фибриноген А, фибриноген В), сывороточный амилоидный белок А, гаптоглобин, профилин, убиквитин, утероглобулин и β-2микроглобулин), ферменты и ингибиторы ферментов (например, плазминоген, лизоцим, цистатин С, альфа-1-антитрипсин и панкреатический ингибитор трипсина), белки иммунной системы, такие как иммуноглобулиновые белки (например, ЦА, ЦО, ЦЕ, ЦО, ^Μ, легкие цепи иммуноглобулинов (каппа/лямбда)), транспортные белки (например, ретинол-связывающий белок, α-1 микроглобулин), дефензины (например, бета-дефензин 1, дефензин 1 нейтрофилов, дефензин 2 нейтрофилов и дефензин 3 нейтрофилов) и тому подобное.

Подходящие белки, обнаруженные в гематоэнцефалическом барьере или в нервной ткани, включают, например, рецептор меланокортина, миелин, аскорбатный транспортер и тому подобное.

Подходящие полипептиды, которые увеличивают период полувыведения из сыворотки ίη νίνο, также включают белки, локализованные в почках (например, полицистин, коллаген IV типа, органический анионный транспортер XI, антиген Хейманна), белки, локализованные в печени (например, алкогольдегидрогеназу, О250), белки, локализованные в легких (например, секреторный компонент, который связывает ЦА), белки, локализованные в сердце (например, Н8Р 27, который ассоциирован с дилатационной кардиомиопатией), белки, локализованные в коже (например, кератин), специфические белки костей, такие как морфогенетические белки (ΒΜΓδ), которые являются подгруппой суперсемейства белков трансформирующего фактора роста, которые демонстрируют остеогенную активность (например, ВМР2, ВМР-4, ВМР-5, ВМР-6, ВМР-7, ВМР-8), опухолеспецифические белки (например, антиген трофобласта, рецептор герцептина, рецептор эстрогена, катепсины (например, катепсин В, которые можно обнаружить в печени и селезенке)).

Подходящие специфические для заболевания белки включают, например, антигены, экспрессирующиеся только на активированных Т-клетках, включая ЬАО-3 (ген активации лимфоцитов), остеопротегериновый лиганд (ЮРОЕ; см. №йиге 402, 304-309 (1999)), ΟΧ40 (член семейства рецепторов ΤΝΡ, экспрессирующийся на активированных Т-клетках и, в частности, активирующийся в клетках, продуцирующих Т-лимфотропный вирус человека I типа (ΗΤΕν-β; см. Iттиηο1. 165 (1): 263-70 (2000)). Подходящие специфические для заболевания белки также включают, например, металлопротеазы (ассоциированные с артритом/видами рака), включая СО6512 дрозофилы, человеческий параплегин, человеческий ΡΐδΗ, человеческий АРО3Е2, мышиный й§Н; и ангиогенные факторы роста, включая кислотный фактор роста фибробластов (РОР-1), основный фактор роста фибробластов (РОР-2), фактор роста эндотелия сосудов/фактор проницаемости сосудов (νΕΟΕ/νΤΕ), трансформирующий фактор роста-α (ΤΟΡα), фактор некроза опухоли-альфа (ΤΝΡα), ангиогенин, интерлейкин-3 ОШ), интерлейкин-8 ОШ), тромбоцитарный фактор роста эндотелия (РО-ЕСОГ), плацентарный фактор роста (Р1ОГ), тйкше тромбоцитарный фактор роста-ВВ (РООГ) и фракталкин.

- 22 022898

Подходящие полипептиды, которые увеличивают период полувыведения из сыворотки ίη νίνο, также включают стрессовые белки, такие как белки теплового шока (ΗδΡδ). ΗδΡδ обычно обнаруживаются внутри клеток. Когда они обнаруживаются вне клеток, то это является показателем того, что клетка умерла, и ее содержимое вылилось. Эта ^запрограммированная клеточная гибель (некроз) происходит в результате травмы, заболевания или повреждения, внеклеточные ΗδΡδ запускают ответ со стороны иммунной системы. Связывание с внеклеточным ΗδΡ может приводить к локализации композиций по изобретению в участке заболевания.

Подходящие белки, участвующие в Рс-транспорте, включают, например, рецептор Брамбелла (БгатЬеП) (также известный как РсКБ). Этот Рс-рецептор имеет две функции, которые обе являются потенциально полезными для доставки. Функции представляют (1) транспорт Ι§0 от матери к ребенку через плаценту, (2) защиту Ι§0 от деградации, таким образом пролонгирование периода полувыведения из сыворотки. Считается, что рецептор повторно использует Ι§0 из эндосом (см. ИоШдег е1 а1., ΝηΙ ΒίοίοΛηο1 15(7): 632-6 (1997)).

бАЬк, которые связывают сывороточный альбумин

В изобретении в одном воплощении предложен лиганд, полипептид или антагонист (например, лиганд с двойной специфичностью, содержащий бАЬ против ΤΝΡΚ1 (первое бАЬ)), который связывается с ΤΝΡΚ1, и второе бАЬ, которое связывает сывороточный альбумин ОА), где второе бАЬ связывает δΑ с КО, как определено методом поверхностного плазмонного резонанса, от примерно 1 нМ до примерно 1, примерно 2, примерно 3, примерно 4, примерно 5, примерно 10, примерно 20, примерно 30, примерно 40, примерно 50, примерно 60, примерно 70, примерно 100, примерно 200, примерно 300, примерно 400 или примерно 500 мкМ (т.е. от х 10^-9 до 5 х 10^-4 М) или от примерно 100 нМ до примерно 10 мкМ, или от примерно 1 до примерно 5 мкМ, или от примерно 3 до примерно 70 нМ, или от примерно 10 нМ до примерно 1, примерно 2, примерно 3, примерно 4 или примерно 5 мкМ. Например, от примерно 30 до примерно 70 нМ, как определено методом поверхностного плазмонного резонанса. В одном воплощении первое бАЬ (или мономер бАЬ) связывает δΑ (например, Ηδ.4| с КО, как определено методом поверхностного плазмонного резонанса, примерно 1, примерно 50, примерно 70, примерно 100, примерно 150, примерно 200, примерно 300 нМ или примерно 1, примерно 2 или примерно 3 мкМ. В одном воплощении для лиганда с двойной специфичностью, содержащего первое бАЬ против δΑ и второе бАЬ к ΤΝΡΚ1, аффинность (например, КО и/или К_ой как измерено методом поверхностного плазмонного резонанса, например, с использованием ΒίΗί'.'οΐΌ) второго бАЬ к его мишени составляет от примерно 1 до примерно 100000 раз (например, от примерно 100 до примерно 100000, или от примерно 1000 до примерно 100000, или от примерно 10000 до примерно 100000 раз) аффинности первого бАЬ для δΑ. В одном воплощении сывороточный альбумин представляет собой человеческий сывороточный альбумин (ЖА). Например, первое бАЬ связывает δΑ с аффинностью примерно 10 мкМ, в то время как второе бАЬ связывает свою мишень с аффинностью примерно 100 пМ. В одном воплощении сывороточный альбумин представляет собой человеческий сывороточный альбумин (ЖА). В одном воплощении первое бАЬ связывает δΑ (например, ЖА) с КО примерно 50, например, примерно 70, примерно 100, примерно 150 или примерно 200 нМ. Подробности о лигандах с двойной специфичностью можно найти в АО 03002609, АО 04003019, АО 2008096158 и АО 04058821.

В одном воплощении лиганды по изобретению могут включать бАЬ, которое связывает сывороточный альбумин ^А) с КО, как определено методом поверхностного плазмонного резонанса, от примерно 1 нМ до примерно 1, примерно 2, примерно 3, примерно 4, примерно 5, примерно 10, примерно 20, примерно 30, примерно 40, примерно 50, примерно 60, примерно 70, примерно 100, примерно 200, примерно 300, примерно 400 или примерно 500 мкМ (т.е. от примерно х 10^-9 до примерно 5 х 10^-4 М) или от примерно 100 нМ до примерно 10 мкМ, или от примерно 1 до примерно 5 мкМ, или от примерно 3 до примерно 70 нМ, или от примерно 10 нМ до примерно 1, примерно 2, примерно 3, примерно 4 или примерно 5 мкМ. Например, от примерно 30 до примерно 70 нМ, как определено методом поверхностного плазмонного резонанса. В одном воплощении первое бАЬ (или мономер бАЬ) связывает δΑ (например, ЖА) с КО, как определено методом поверхностного плазмонного резонанса, примерно 1, примерно 50, примерно 70, примерно 100, примерно 150, примерно 200, примерно 300 нМ или примерно 1, примерно 2 или примерно 3 мкМ. В одном воплощении первое и второе бАЬк связаны с помощью линкера, например линкера из 1-4 аминокислот или из 1-3 аминокислот или более чем 3 аминокислот или более чем 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 или 20 аминокислот. В одном воплощении более длинный линкер (более 3 аминокислот) используют для увеличения эффективности (КО одного или обоих бАЬк в антагонисте).

В конкретных воплощениях лигандов и антагонистов бАЬ связывает человеческий сывороточный альбумин и конкурирует за связывание с альбумином с бАЬ, выбранным из группы, состоящей из БОМ7Ь-11, ООМ7Ы1-3, ООМ7Б-11-12, ООМ7Б-11-15, ООМ7Б-14, ООМ7Б-14-10, ООМ7Б-14-18 и ООМ7т-16.

В некоторых воплощениях лигандов и антагонистов бАЬ связывает человеческий сывороточный альбумин и конкурирует за связывание с альбумином с бАЬ, выбранным из группы, состоящей из МδΑ16, МδΑ-26 (см. АО 04003019 относительно описания этих последовательностей и их нуклеиновокис- 23 022898 лотных аналогов, которые включены в данную заявку посредством ссылки и являются частью раскрытия сущности изобретения в настоящем тексте),

ООМ7Н-23 (ЗЕО ГО N0: 490), ООМ7И-24 (ЗЕО ГО N0: 491), ООМ7К-25 (ЗЕО ГО N0: 492), ООМ7Р-26 (ЗЕО ГО N0: 493), ООМ7И-21 (ЗЕО ГО N0: 494), ООМ7И-27 (ЗЕО ГО N0: 495), ϋ0Μ7Μ (ЗЕО ГО N0: 496), ООМ7Г-13 (ЗЕО ГО N0: 497), ϋΟΜ7Γ-14 (ЗЕО ГО N0: 498), ООМ7Г-15 (ЗЕО ГО N0: 499), ООМ7Г-16 (ЗЕО ГО N0: 500), ООМ7Г-17 (ЗЕО ГО N0: 501), ООМ7Г-18 (ЗЕО ГО N0: 502), ООМ7Г-19 (ЗЕО ГО N0: 503), ООМ7Г-20 (ЗЕО ГО N0: 504), ООМ7г-21 (ЗЕО ГО N0: 505),

ООМ7Г-22 (ЗЕО ГО N0: 506), ООМ7Г-23 (ЗЕО ГО N0: 507), ООМ7Г-24 (ЗЕО ГО N0: 508), ООМ7Г-25 (ЗЕО ГО N0: 509), ООМ7Г-26 (ЗЕО ГО N0: 510), ООМ7Г-27 (ЗЕО ГО N0: 511), ООМ7Г-28 (ЗЕО ГО N0: 512), ООМ7Г-29 (ЗЕО ГО N0: 513),

ООМ7Г-30 (ЗЕО ГО N0: 514), 00М7Г-31 (ЗЕО ГО N0: 515), ООМ7Г-32 (ЗЕО ГО N0: 516), ООМ7Г-33 (ЗЕО ГО N0: 517) (см. νΟ 2007080392 относительно описания этих последовательностей и их нуклеиновокислотных аналогов, которые включены в данную заявку посредством ссылки и являются частью раскрытия сущности изобретения в настоящем тексте; δΕΟ ГО ΝΟ в этом параграфе представляют собой последовательности, представленные в νΟ 2007080392),

РАЬ8 (С1АЫ0), с!АЬ 10, РАР36, РАЬ7г2С (ООМ7г20), РАЬ7г21 (00М7г21),

РАЬ7г22 (ООМ7Г22), с1АЬ7г23 (ООМ7Г23), РАЬ7г24 (ООМ7Г24), ЙАЬ7г25 (ООМ7Г25), РАЬ7г26 (00М7г26), РАЬ7г27 (ООМ7г27), РАЬ7г28 (ϋΟΜ7Γ28),

8АЬ7г29 ГООМ7г29) с1АЬ7г29 (ООМ7г29), с)АЬ7г31 (ООМ7г31), 8АЬ7г32 (ООМ7Г32), с1АЬ7гЗЗ (ООМ7гЗЗ), 4АЬ7гЗЗ (ООМ7ГЗЗ), РАР7Р22 (ϋΟΜ7ίι22),

РАР7Р23 (ΟΟΜ7ΙΊ23), РАР7И24 (ООМ7П24), РАР7И25 (ϋΟΜ7ή25), РАР7И26 (ООМ7Г26), РАР7Н27 ЮОМ7Г27), РАЬ7Р30 (ООМ7ИЗО), с!АЬ7Г31 (ООМ7П31),

ЙАЬ2 (РАЬз 4,7,41), РАЬ4, ЙАЬ7, ЙАЫ1, РАМ 2 (йАЬ7пИ2), РАМЗ (бАЬ 15),

6АМ5, РАМ 6 (6АР21, бАЬ7т16), 6АМ7, РАМ 8 РАМЭ РАЬ21, РАЬ22, РАЬ23,

РАР24, 6АЬ25 ( РАЬ26, РАЬ7т26), РАЬ27, РАЬЗО (РАЬ35), РАР31, бАЬЗЗ, РАР34, (1АЬ35, РАЬЗЗ (РАР54) 6АЬ41, РАЬ46 (<ДАЬ& 47, 52 и 56), 6АР47, РАР52 6АР53,

РАР54, 6АР55, 6АР56, РАЬ7т12, бАЬ7т16, бАЬ7т26, РАЬ7г1 (ϋΟΜ 7г1), РАЬ7гЗ ГООМ7ГЗ), РАЬ7г4 (ООМ7Г4), РАЬ7г5 (ООМ7г5), РАЬ7г7 (ООМ7г7), РАЬ7г8 (ϋΟΜ7Γ8), РАЬ7г13 (ООМ7г13), РАЬ7г14 (ООМ7г14), с1АЬ7г15 (ООМ7И5), РАЬ7г16 (ООМ7г16), РАЬ7г17 (ООМ7г17), РАЬ7г18 (ООМ7г18), РАЬ7г19 (ООМ7г19),

ΡΑΡ7Μ ГО0М7М), РАР7И2 (ϋΟΜ7Κ2), 6АР7Р6 (ООМ786), РАЬ7Ь7 (ООМ7И7),

РАЬ7Р8 (ООМ7И8), 6АР7И9 (ООМ7И9), 6АЬ7И1О (ϋΟΜ7ΜΟ), РАЬ7М1 (00М7И11),

РАР7М2 (00М7М2), РАЬ7Ь13 (ООМ7МЗ), РАР7М4 (ООМ7М4), РАЬ7р1 (ϋΟΜ7ρ1) и бАЬ7р2 (ϋΟΜ7ρ2) (см. νΟ 2008096158 относительно описания этих последовательностей и их нуклеиновокислотных аналогов, которые включены в данную заявку посредством ссылки и являются частью раскрытия сущности изобретения в настоящем тексте). Альтернативные названия приведены в скобках после йАЫ, например, йАЫ8 имеет альтернативное название, которое представляет собой ЙАЫ10, т.е. йАЫ8 (ЙАЫ10).

В некоторых воплощениях йАЫ связывает человеческий сывороточный альбумин и содержит аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере примерно 80%, или по меньшей мере примерно 85%, или по меньшей мере примерно 90%, или по меньшей мере примерно 95%, или по меньшей мере примерно 96%, или по меньшей мере примерно 97%, или по меньшей мере примерно 98%, или по меньшей мере примерно 99%-ную идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью йАЫ, выбранной из группы, состоящей из ΌΟΜ7Η-11, ΌΟΜ7Η-11-3, ΌΟΜ7Η-11-12, ΌΟΜ7Η-11-15, ΌΟΜ7Η-14, ΌΟΜ7Η-14-10, ΌΟΜ7Η-14-18 и ^ΟΜ7т-16.

В некоторых воплощениях йАЫ связывает человеческий сывороточный альбумин и содержит аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере примерно 80%, или по меньшей мере примерно 85%, или по меньшей мере примерно 90%, или по меньшей мере примерно 95%, или по меньшей мере примерно 96%, или по меньшей мере примерно 97%, или по меньшей мере примерно 98%, или по меньшей мере примерно 99%-ную идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью йАЫ, выбранной из группы, состоящей из

МЗА-16, МЗА-26, ϋΟΜ7ηι-16 (ЗЕО ГО N0: 473), ООМ7Ш-12 (ЗЕО ГО N0: 474), ϋΟΜ7πι-26 (ЗЕО ГО N0: 475), ООМ7г-1 (ЗЕО ГО N0: 476), 00М7Г-3 (ЗЕО ГО N0: 477),

00М7М (ЗЕО ГО N0: 478), ООМ7Г-5 (ЗЕО ГО N0: 479), ООМ7Г-7 (ЗЕО ГО N0:

480), ООМ7Г-8 (ЗЕО ГО N0: 481), ООМ7Р-2 (ЗЕО ГО N0: 482), ООМ7Н-3 (ЗЕО ГО N0: 483), ООМ7Р-4 (ЗЕО ГО N0: 484), ООМ7Н-6 (ЗЕО ГО N0: 485), 00М7Р-1 (ЗЕО ГО N0: 486), ООМ7Р-7 (ЗЕО ГО N0: 487), ООМ7Р-22 (ЗЕО ГО N0: 489),

ООМ7Р-23 (ЗЕО ГО N0: 490), ООМ7Р-24 (ЗЕО ГО N0: 491), ООМ7И-25 (ЗЕО ГО N0: 492), ООМ7Н-26 (ЗЕО ГО N0: 493), ϋΟΜ7ή-21 (ЗЕО ГО N0: 494), (ЗОМ7И-27 (ЗЕО ГО N0: 495), ООМ7Р-8 (ЗЕО ГО N0: 496), ООМ7Г-13 (ЗЕО ГО N0: 497),

- 24 022898 ϋΟΜ7Γ-14 (ЗЕО ГО N0: 498), ϋΟΜ7Μ5 (ЗЕО ГО N0: 499), ΟΟΜ7Μ6 (3Ε0 Ю N0: 500), ϋΟΜ7Γ-17 (ЗЕО ГО N0: 501), ЭОМ7Г-18 (ЗЕО ГО ΝΟ: 502), ϋΟΜ7Μ9 (ЗЕО ГО ΝΟ: 503), ООМ7Г-20 (ЗЕО ГО ΝΟ: 504), 00М7г-21 (ЗЕО ГО ΝΟ: 505), ϋΟΜ7Γ-22 (ЗЕО ГО ΝΟ: 506), ϋΟΜ7Γ-23 (3Ε0 ГО ΝΟ: 507), ООМ7г-24 (5ΕΟ ГО ΝΟ: 508), ϋΟΜ7Γ-25 (3ΕΟ ΙΟ ΝΟ: 509), ООМ7г-26 (ЗЕО ГО ΝΟ: 510), ООМ7Г-27 (3ΕΟ ΙΟ ΝΟ: 511), ϋΟΜ7Γ-28 (ЗЕО ГО ΝΟ: 512), ΟΟΜ7Γ-29 (5Ε0 ГО ΝΟ: 513), ϋΟΜ7Γ-30 (ЗЕО ГО ΝΟ: 514), ϋΟΜ7Γ-31 (3Ε0 Ιϋ ΝΟ: 515), ϋ0Μ7Γ-32 (ЗЕО ГО ΝΟ: 516), ООМ7Г-33 (ЗЕО Ю ΝΟ: 517) (ЗЕЦ ΙΌ ΝΟ в этом параграфе представляют собой последовательности, упомянутые в ΑΟ 2007080392), йАЬв, с!АЬ 10, ЙАЬЗб, 6АЬ7г20, ЙАЬ7г21, 0АЬ7г22, 6А57Г23, с1АЬ7г24, йАЬ7г25, йАЬ7г26, 8АЬ7г27, с!АЬ7г28, 8АЬ7г29, 8АЬ7гЗО, 6АЬ7г31, 8АЬ7г32,

8АЬ7гЗЗ, 8АЬ7Л21, 6АЬ7Н22, 0АЬ7623, АЬ7Н24, АЬ7И25. АЬ7Ь26, 6АЬ7Л27,

6АЬ7Л30, 6АЬ7И31 6АЬ2, 5АЬ4, 6АЬ7, 8АЫ1, 8АЫ2, 8АЫЗ, с1АЫ5, 6АЫ6,

6АЫ7, РАМ 8, РАМ 9, РАЬ21, РАЬ22, РАЬ23, РАЬ24, 5АЬ25, РАЬ26, ЙАЬ27, ЙАЬЗО,

РАЬ31, РАЬЗЗ, 6АЬ34, РАЬ35, РАЬ38, с1АЬ41, РАЬ46, РАЬ47, РАЬ52, 8АЬ53, с!АЬ54,

6А055 РАЬ56, РАЬ7т12, РАЬ7т16, с!АЬ7т26, РАЬ7г1, 6АЬ7гЗ, 8АЬ7г4, с1АЬ7г5,

РАЬ7г7, 8АЬ7г8, с!АЬ7г13, РАЬ7г14, с1АЬ7г15, 6АЬ7г16, РАЬ7г17, 8АЬ7г18, с1АЬ7г19,

0АЬ7М, РАЬ7Н2, РАЬ7И6, РАЬ7М7, РАЬ7Л8, 0АЬ7Ь9, РАЬ7М0, 8АЬ7М1, 6АЬ7М2, с!АЬ7М13, РАЬ7М4, 0АЬ7р1 и РАЬ7р2.

Например, бАЬ. которое связывает человеческий сывороточный альбумин, может содержать аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере примерно 90%, или по меньшей мере примерно 95%, или по меньшей мере примерно 96%, или по меньшей мере примерно 97%, или по меньшей мере примерно 98%, или по меньшей мере примерно 99%-ную идентичность аминокислотной последовательности с ΩΟΜ711-11-3 или ΩΟΜ7Η-14-10.

Например, бАЬ, которое связывает человеческий сывороточный альбумин, может содержать аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере примерно 90%, или по меньшей мере примерно 95%, или по меньшей мере примерно 96%, или по меньшей мере примерно 97%, или по меньшей мере примерно 98%, или по меньшей мере примерно 99%-ную идентичность аминокислотной последовательности с

ООМ7И-2 (ЗЕО ГО N0:482), ООМ7Н-3 (ЗЕО ГО N0:483), ООМ7Н-4 (ЗЕО ГО N0:484), ООМ7И-6 (ЗЕО ГО N0:485), ООМ7И-1 (ЗЕО ГО N0:486), ООМ7К-7 (ЗЕО ГО N0:487), ООМ7П-8 (ЗЕО ГО N0:496), ϋΟΜ7Μ3 (ЗЕО ГО N0:497), ООМ7Г-14 (ЗЕО ГО N0:498), ООМ7П-22 (ЗЕО ГО N0:489), ϋΟΜ7ή-23 (ЗЕО ГО N0:490),

ООМ7Л-24 (ЗЕО ГО N0:491), ООМ711-25 (ЗЕО ГО N0:492), ООМ7И-26 (ЗЕО ГО N0:493), ООМ7И-21 (ЗЕО ГО N0:494) или ООМ7И-27 (ЗЕО ГО N0:495) (ЗЕЦ ΙΌ ΝΟ в этом параграфе представляют собой последовательности, упомянутые в ΑΟ 2007080392), или

РАЬ8, РАЬ 10, РАЬЗб, РАЬ7К21, РАЬ7Ь22, РАЬ7Ь23, АЬ7И24, АЬ7И25,

АЬ7Ь26, РАЬ7Ь27, РАЬ7П30, РАЬ7Ь31, ЙАЬ2, РАЬ4, РАЬ7, РАМ1, РАМ 2, РАМЗ,

РАМ5, РАМ6, РАМ 7, РАМ8, РАМЭ, РАЬ21, РАЬ22, РАЬ23, РАЬ24, РАЬ25, РАЬ26,

РАЬ27, РАЬЗО, РАЬ31, РАЬЗЗ, РАЬ34, РАЬ35, РАЬ38, РАЬ41, РАЬ46, РАЬ47, РАЬ52,

РАЬ53, РАЬ54, РАЬ55, <±АЬ56, РАЬ7Ь1, РАЬ7Ь2, РАЬ7Ь6, РАЬ7Ь7, РАЬ7Ь8, РАЬ7Ь9,

РАЬ7Ь10, РАЬ7Ь11, РАЬ7Ь12, РАЬ7Ь13 или ΡΑΡ7Μ4.

В некоторых воплощениях бАЬ связывает человеческий сывороточный альбумин и содержит аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере примерно 80%, или по меньшей мере примерно 85%, или по меньшей мере примерно 90%, или по меньшей мере примерно 95%, или по меньшей мере примерно 96%, или по меньшей мере примерно 97%, или по меньшей мере примерно 98%, или по меньшей мере примерно 99%-ную идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью бАЬ, выбранной из группы, состоящей из

ООМ7Р-2 (ЗЕО ГО N0:482), ООМ7И-6 (ЗЕО ГО N0:485), ООМ7Г-1 (ЗЕО ГО N0:486), ООМ7П-7 (ЗЕО Ю N0:487), ООМ7М-8 (ЗЕО ГО N0:496), ООМ7И-22 (ЗЕО ГО N0:489), ϋΟΜ7Ιι-23 (ЗЕО ГО N0:490), ООМ7Р-24 (ЗЕО ГО N0:491),

ООМ7И-25 (ЗЕО ГО N0:492), ООМ7И-26 (ЗЕО ГО N0:493), ϋΟΜ7ίι-21 (ЗЕО ГО N0:494), ООМ7К-27 (ЗЕО ГО N0:495) (ЗЕЦ ГО ΝΟ в этом параграфе представляют собой последовательности, упомянутые в ΑΟ 2007080392),

РАЬ7Ь21, РАЬ7Ь22, РАЬ7Ь23, АЬ7И24, АЬ7И25, АЬ7Ь26, РАЬ7Ь27, с1АЬ7Ь30,

РАЬ7Ь31, РАЬ2, РАЬ4, РАЬ7, РАЬ38, РАЬ41, с1АЬ7И1, РАЬ7Ь2, с1АЬ71т6, РАЬ7Ь7,

РАЬ7Ь8, РАЬ7Ь9, РАЬ7Ь10, РАЬ7011, ЙАЬ7М2, РАЬ7Ь13 и <1АЬ7М4.

В более конкретных воплощениях бАЬ представляет собой ν_κ бАЬ, которое связывает человеческий сывороточный альбумин и имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из

- 25 022898

ООМ7Н-2 (ЗЕО Ю N0:482), ϋΟΜ7Μ-6 (ЗЕО Ю N0:485), 00М7И-1 (ЗЕО Ю N0:486), ООМ7П-7 (ЗЕО ГО N0:487), ООМ7П-8 (ЗЕО ГО N0:496) (δΕΟ ГО N0 в этом параграфе представляют собой последовательности, упомянутые в \УО 2007080392), <ЗАЬ2, с!АЬ4, <ЗАЬ7, 0АЬ38, с1АЬ41, <1АЬ54, с)АЬ7Н1,0АЬ732, с1АЬ7Н6, 0АЬ7п7, с!АЬ7Н8, с!АЬ71п9, 0АЬ7Н10, (1АЬ7М1, с1АЬ7М2, с(АЬ7М 3 и с!АЬ7М 4.

В более конкретных воплощениях бАЬ представляет собой У_Н бАЬ, которое связывает человеческий сывороточный альбумин и имеет аминокислотную последовательность, выбранную из бАЬ7130 и бАЬ7131.

В более конкретных воплощениях бАЬ представляет собой бАЬ7111 или бАЬ7114. В одном примере бАЬ представляет собой Ό0Μ7Η-11-3. В другом примере бАЬ представляет собой Ό0Μ7Η-14-10.

В других воплощениях бАЬ, лиганд или антагонист связывает человеческий сывороточный альбумин и содержит один, два или три СГОК из любых вышеприведенных аминокислотных последовательностей, например один, два или три СОК из Ό0Μ7Η-11-3, Ό0Μ7Η-14-10, бАЬ7Н11 или бАЬ7114.

Подходящие У_НН верблюдовых, которые связывают сывороточный альбумин, включают описанные в \У0 2004/041862 (АЬ1упх Ν.ν.) и в \У0 2007080392 (эти У_НН последовательности и их нуклеиновокислотные аналоги включены в данную заявку посредством ссылки и являются частью раскрытия сущности изобретения в настоящем тексте), такие как последовательность А (δΕΟ ГО N0: 518), последовательность В (δΕΟ ГО N0: 519), последовательность С (δΕΟ ГО N0: 520), последовательность Ό (δΕΟ ГО N0: 521), последовательность Е (δΕΟ ГО N0: 522), последовательность Ρ (δΕΟ ГО N0: 523), последовательность С (δΕΟ ГО N0: 524), последовательность Н (δΕΟ ГО N0: 525), последовательность I (δΕΟ ГО N0: 526), последовательность ί (δΕΟ ГО N0: 527), последовательность К (δΕΟ ГО N0: 528), последовательность Ь (δΕΟ ГО N0: 529), последовательность М (δΕΟ ГО N0: 530), последовательность N (δΕΟ ГО N0: 531), последовательность О (δΕΟ ГО N0: 532), последовательность Р (δΕΟ ГО N0: 533), последовательность О (δΕΟ ГО N0: 534), где эти номера последовательностей соответствуют указанным в \У0 2007080392 или \У0 2004/041862 (АЬ1упх КУ.). В некоторых воплощениях У_НН верблюдовых связывает человеческий сывороточный альбумин и содержит аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере примерно 80%, или по меньшей мере примерно 85%, или по меньшей мере примерно 90%, или по меньшей мере примерно 95%, или по меньшей мере примерно 96%, или по меньшей мере примерно 97%, или по меньшей мере примерно 98%, или по меньшей мере примерно 99%-ную идентичность аминокислотной последовательности с АЬВ1, описанной в \У0 2007080392 или любой из δΕΟ ГО N0: 518-534, где эти номера последовательностей соответствуют указанным в \У0 2007080392 или \У0 2004/041862.

В некоторых воплощениях лиганд или антагонист содержит бАЬ против сывороточного альбумина, которое конкурирует с любым бАЬ против сывороточного альбумина, описанным в данной заявке, за связывание с сывороточным альбумином (например, человеческим сывороточным альбумином).

В альтернативном воплощении антагонист или лиганд содержит связывающую группировку, специфичную в отношении δΑ (например, человеческого δΑ), где указанная группировка содержит неиммуноглобулиновые последовательности, как описано в \У0 2008096158, описание этих связывающих группировок, способы их получения и селекции (например, из различных библиотек) и их последовательности включены в данную заявку посредством ссылки в качестве части раскрытия сущности изобретения в настоящем тексте).

Конъюгирование с группировкой, увеличивающей период полувыведения (например, альбумином)

В одном воплощении (одну или более) группировку, увеличивающую период полувыведения (например, альбумин, трансферрин и их фрагменты и аналоги), подвергают конъюгированию или ассоциации с ΤNΡК1-связывающим полипептидом, бАЬ или антагонистом по изобретению. Примеры подходящих альбумина, фрагментов альбумина или вариантов альбумина для применения в ΤNΡК1связывающем формате описаны в \У0 2005077042, это описание включено в данную заявку посредством ссылки и является частью раскрытия сущности изобретения в настоящем тексте. В частности, следующие альбумин, фрагменты альбумина или варианты альбумина можно использовать в настоящем изобретении:

δΕΟ ГО N0: 1 (как описано в \У0 2005077042, эта последовательность прямо включена в настоящее описание посредством ссылки);

фрагмент или вариант альбумина, содержащий или состоящий из аминокислот 1-387 из δΕΟ ГО N0: 1 в \С02005077042;

альбумин, или его фрагмент, или вариант, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (а) аминокислот 54-61 из δΕΟ ГО N0: 1 в \У0 2005077042; (б) аминокислот 76-89 из δΕΟ ГО N0: 1 в \У0 2005077042; (в) аминокислот 92-100 из δΕΟ ГО N0: 1 в \У0 2005077042; (г) аминокислот 170-176 из δΕΟ ГО N0: 1 в \У0 2005077042; (д) аминокислот 247-252 из δΕΟ ГО N0: 1 в \С0 2005077042; (е) аминокислот 266-277 из δΕΟ ГО N0: 1 в \С0 2005077042; (ж) аминокислот 280-288 из δΕΟ ГО N0: 1 в \С0 2005077042; (з) аминокислот 362-368 из δΕΟ ГО N0: 1 в \С0 2005077042; (и) аминокислот 439-447 из δΕΟ ГО N0: 1 в \У0 2005077042; (к) аминокислот 462-475 из

- 26 022898 δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 1 в №Θ 2005077042; (л) аминокислот 478-486 из δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 1 в №Θ 2005077042; и (м) аминокислот 560-566 из δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 1 в №Ο 2005077042.

Другие примеры подходящих альбумина, фрагментов и аналогов для применения в ΤΝΡΡ1связывающем формате описаны в №Ο 03076567, описание которой включено в данную заявку посредством ссылки и является частью раскрытия сущности изобретения в настоящем тексте. В частности, следующие альбумин, фрагменты или варианты можно использовать в настоящем изобретении:

человеческий сывороточный альбумин, как описано в №Ο 03076567, например, на фиг. 3 (информация об этой последовательности прямо включена в настоящее описание посредством ссылки);

человеческий сывороточный альбумин (НА), состоящий из одной негликозилированной полипептидной цепи из 585 аминокислот с молекулярной массой согласно формуле 66500 (см. Μе1οиη е1 а1., ΡΕΒδ Ьейегк 55: 136 (1975); Вейгеик е1 а1., Рей. Ргос. 34: 591 (1975); Ьа^и е1 а1., ШсЫс Аайк КекеагсЬ 9: 6102-6114 (1981); Μίη^ΐύ е1 а1., 1. Вю1. СЬет. 261: 6141 (1986));

полиморфный вариант, или аналог, или фрагмент альбумина, как описано в №ейкатр, е1 а1., Αηη. Нит. Сепе1. 37: 219 (1973);

фрагмент или вариант альбумина, как описано в ЕР 322094, например, НА(1-373), НА(1-388), НА(1389), НА(1-369) и НА(1-419) и фрагменты между 1-369 и 1-419;

фрагмент или вариант альбумина, как описано в ЕР 399666, например, НА(1-177) и НА(1-200) и фрагменты между НА(1-Х), где X имеет любой номер от 178 до 199.

Когда (одну или более) группировку, увеличивающую период полувыведения (например, альбумин, трансферрин и их фрагменты и аналоги), используют для форматирования ΤNРК1-связывающих полипептидов, йАЬк и антагонистов по изобретению, ее можно конъюгировать с использованием любого подходящего способа, например, посредством прямого слияния с ΤNРК1-связывающей группировкой (например, йАЬ против ΤΝΡΚ1), например, с использованием единичной нуклеотидной конструкции, которая кодирует слитый белок, где слитый белок кодируется в виде одной полипептидной цепи с группировкой, увеличивающей период полувыведения, локализованной на Ν- или С-конце относительно ΤNΡК1-связывающей группировки. Альтернативно, конъюгирование может быть достигнуто с использованием пептидного линкера между группировками, например, пептидного линкера, описанного в №Ο 03076567 или \νΟ 2004003019 (эти описания линкера включены в настоящее описание посредством ссылки для обеспечения примеров применения в настоящем изобретении). Как правило, полипептид, который увеличивает период полувыведения из сыворотки ίη угуо, представляет собой полипептид, который встречается в природе ίη νί\Ό и который устойчив к деградации или удалению с помощью эндогенных механизмов, которые удаляют нежелательный материал из организма (например, человека). Например, полипептид, который увеличивает период полувыведения из сыворотки ίη угуо, можно выбрать из белков внеклеточного матрикса, белков, обнаруженных в крови, белков, обнаруженных в гематоэнцефалическом барьере или в нервной ткани, белков, локализованных в почках, печени, легких, сердце, коже или костях, стрессовых белков, специфических для заболевания белков или белков, вовлеченных в Рс-транспорт.

В воплощениях изобретения, описанных в данном описании, вместо применения единичного вариабельного домена против ΤΝΡΚ1 (йАЬ) в антагонисте или лиганде по изобретению, предполагают, что специалист может использовать полипептид или домен, который содержит одну, или более, или все 3 СЭКк из йАЬ по изобретению, которое связывает ΤΝΡΚ1 (например, СЭКк, перенесенные на подходящий белковый каркас или скелет, например аффитело, δρΑ каркас, домен рецептора ЬНЬ класса А или домен ΕΟΡ). Описание, в целом, следует истолковывать соответственно для обеспечения описания антагонистов с использованием таких доменов вместо йАЬ. В связи с этим см. №Ο 2008096158 для подробного описания того, как получить различные библиотеки на основании белковых каркасов, селекции и характеристики доменов из таких библиотек, описание которых включено посредством ссылки.

Поэтому в одном воплощении антагонист по изобретению содержит единичный вариабельный домен иммуноглобулина или доменное антитело (йАЬ), которые обладают специфичностью связывания в отношении ΤΝΡΡ1 или определяющих комплементарность участков такого йАЬ в подходящем формате. Антагонист может представлять собой полипептид, который состоит из такого йАЬ или состоит, по существу, из такого йАЬ. Антагонист может представлять собой полипептид, который содержит йАЬ (или СЭКк из йАЬ) в подходящем формате, таком как формат антитела (например, 1дС-подобный формат, ксРу РаЬ, РаЬ', Р(аЬ')₂) или лиганд с двойной специфичностью, который содержит йАЬ, которое связывает ΤΝΡΗ1, и второе йАЬ, которое связывает другой целевой белок, антиген или эпитоп (например, сывороточный альбумин).

Полипептиды, йАЬк и антагонисты в соответствии с изобретением можно отформатировать в виде множества подходящих форматов антител, которые известны в данной области, таких как 1дС-подобные форматы, химерные антитела, гуманизированные антитела, человеческие антитела, одноцепочечные антитела, биспецифические антитела, тяжелые цепи антител, легкие цепи антител, гомодимеры и гетеродимеры тяжелых цепей и/или легких цепей антител, антиген-связывающие фрагменты любого из вышеизложенного (например, Ρν-фрагмент (например, одноцепочечный Ρν (ксРу), дисульфидсвязанный Ρν), РаЬ-фрагмент, РаЬ'-фрагмент, Р(аЬ')₂-фрагмент), единичный вариабельный домен (например, У_Н, У_ъ), йАЬ

- 27 022898 и модифицированные варианты любого из вышеизложенного (например, модифицированные посредством ковалентного присоединения полиалкиленгликоля (например, полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, полибутиленгликоля) или другого подходящего полимера).

В некоторых воплощениях в изобретении предложен лиганд (например, антагонист против ΤΝΕΚ1), который находится в 1дО-подобном формате. Такие форматы имеют стандартную четырехцепочечную структуру молекулы 1дО (2 тяжелые цепи и две легкие цепи), в которой одна или более вариабельных областей (У_н и/или У_ь) заменены ЙЛЬ по изобретению. В одном воплощении каждая из вариабельных областей (2 У_н-области и 2 У_ъ-области) заменена ЙЛЬ или единичным вариабельным доменом, по меньшей мере один из которых представляет собой анти-ΤΝΕΚΤ ЙЛЬ в соответствии с изобретением. ЙЛЬ(§) или единичный(е) вариабельный(е) домен(ы), которые включены в 1дО-подобный формат, могут иметь одинаковую специфичность или разные специфичности. В некоторых воплощениях 1дО-подобный формат представляет собой тетравалент и может иметь одну (только анти-ΤΝΕΚΤ), две (например, антиΤΝΕΚ1 и анти-8Л), три или четыре специфичности. Например, 1дО-подобный формат может быть моноспецифическим и содержит 4 йЛЬк, которые имеют одинаковую специфичность; биспецифическим и содержит 3 йЛЬк, которые имеют одинаковую специфичность, и другое ЙЛЬ, которое имеет другую специфичность; биспецифическим и содержит два йЛЬк, которые имеют одинаковую специфичность, и два йЛЬк, которые имеют общую, но разную специфичность; триспецифическим и содержит первое и второе йЛЬк, которые имеют одинаковую специфичность, третье ЙЛЬ с другой специфичностью и четвертое ЙЛЬ со специфичностью, отличной от первого, второго и третьего ЙЛЬ§; или тетраспецифическим и содержит четыре йЛЬк, каждое из которых имеет разную специфичность. Могут быть получены антигенсвязывающие фрагменты 1дО-подобных форматов (например, РаЬ, Р(аЬ')₂, РаЬ', Ρν, 8ϋΡν). В одном воплощении 1дО-подобные форматы или антиген-связывающие фрагменты могут быть моновалентными в отношении ΤΝΕΚ1. Если желательна активация комплемента и/или функция антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ЛОСС), то лиганд может представлять собой 1дО1-подобный формат. При необходимости, 1дО-подобный формат может содержать мутантную константную область (вариант константной области тяжелой цепи 1дО) для минимизации связывания с Рс-рецепторами и/или способности фиксировать комплемент (см., например, νίη^τ е! а1., ОВ 2209757 В; Μοττίδοη е! а1., νΟ 89/07142; Μοτдап е! а1., νΟ 94/29351, ОесетЬег 22, 1994).

Лиганды по изобретению (например, полипептиды, ЙЛЬ8 и антагонисты) могут быть отформатированы в виде слитого белка, который содержит первый единичный вариабельный домен иммуноглобулина, который подвергают слиянию непосредственно со вторым единичным вариабельным доменом иммуноглобулина. При желании, такой формат может дополнительно содержать группировку, увеличивающую период полувыведения. Например, лиганд может содержать первый единичный вариабельный домен иммуноглобулина, который слит непосредственно со вторым единичным вариабельным доменом иммуноглобулина, который слит непосредственно с единичным вариабельным доменом иммуноглобулина, который связывает сывороточный альбумин.

Как правило, ориентация полипептидных доменов, которые имеют связывающий сайт со специфичностью связывания в отношении мишени, независимо от того, содержит ли лиганд линкер, являются вопросом выбора конструкции. Однако некоторые ориентации, с линкерами или без них, могут обеспечивать лучшие характеристики связывания, чем другие ориентации. Все ориентации (например, ЙЛЬ1линкер-йЛЬ2; йЛЬ2-линкер-йЛЬ1), охватываемые изобретением, представляющие собой лиганды, которые содержат ориентацию, обеспечивающую желательные характеристики связывания, можно легко идентифицировать посредством скрининга.

Полипептиды и ЙЛЬ8 в соответствии с изобретением, включая ЙЛЬ мономеры, димеры и тримеры, могут быть связаны с Рс-областью антитела, содержащей один или оба С_н2 и С_н3 домена и возможно шарнирную область. Например, векторы, кодирующие лиганды, связанные в виде единичной нуклеотидной последовательности с Рс-областью, можно использовать для получения таких полипептидов.

Кроме того, в изобретении предложены димеры, тримеры и полимеры вышеупомянутых ЙЛЬ мономеров.

Примеры

Биофизические свойства фрагментов антител играют ключевую роль в определении того, можно ли фрагмент антитела разрабатывать в качестве терапевтического агента или нет. Одним из этих биофизических свойств является устойчивость (стабильность) фрагмента антитела к осаждению при хранении. Ускоренное тестирование стабильности представляет собой метод, используемый для оценки стабильности более быстрыми темпами путем инкубации белка при повышенных температурах в течение длительных периодов времени и последующего определения уровня осаждения. Поэтому авторы изобретения охарактеризовали семь йЛЬх против ΤΝΓΚ1 по их ускоренному тестированию стабильности. В связи с очень разными свойствами (особенно, разными Т.пл.) отдельных исследуемых ЙЛЬ8, все ускоренные исследования стабильности этих ЙЛЬ8 осуществляли при 40°С.

Протокол, используемый для ускоренного тестирования стабильности, следующий: все белки подвергали замене буфера на РВ8 и доводили до концентрации 1 мг/мл. Четыре аликвоты (соответствующие 4 временным точкам; 0, 2, 23 и 47 ч) по 250 мкл готовили в 0,5-мл эппендорфах. Первые образцы (вре- 28 022898 менная точка 47 ч) помещали в сушильный шкаф при температуре 40°С; через 24 ч вторые 250 мкл аликвоты (временная точка 23 ч) помещали в сушильный шкаф; еще через 20 ч третьи 250 мкл аликвоты (временная точка 2 ч) помещали в сушильный шкаф; 0 ч аликвоты хранили при температуре 4°С в течение этого исследования. Все аликвоты хранили при температуре 4°С до тех пор, пока их не помещения в сушильный шкаф при 40°С. В общей сложности через 47 ч все аликвоты удаляли из сушильного шкафа и центрифугировали при 16100 х д в течение 10 мин. А280 каждого образца измеряли, используя УФустройство для считывания 96-луночного планшета, чтобы контролировать количество белка, который остался еще в растворе. Эти данные использовали для вычисления концентрации белка для каждого белка в каждой временной точке и их, в свою очередь, наносили на график относительно времени для контроля потери белка с течением времени.

Пример 1. Тестирование 4АЬ§ против ΤΝΡΚ1 в отношении ускоренной стабильности

Для 4АЬ§ против ΝΡΚ1 оценивали шесть родственных 4АЬ§ против ΤΝΡΚ1, т.е. ЭОМ1Н-574-72.

ЭОМ1Ь-574-109, ЭОМ1Ь-574-133, ЭОМ1Ь-574-138, ЭОМ1Ь-574-156 и ЭОМ1Ь-574-180, а также неродственное 4АЬ против ΤΝΡΚ1 ЭОМ1Н-131-206. Генетические конструкции всех этих 4АЬ§, клонированные с помощью δπ11/Νο1Ι в рЭОМ13 (экспрессирующий вектор, происходящий из рВК322), подвергали трансформации в Е. οοΐί НВ2151, с последующей экспрессией белка в супернатанте. 4АЬ§ очищали из супернатанта посредством одностадийной очистки на Рго1еш-А §1геаш1ше (ОЕ НеаНЪсаге кат. № 17-1281-03) с последующей элюцией с помощью 100 мМ глицина рН 2,0 и нейтрализацией 200 мМ трис рН 8. После концентрирования 4АЬ§ подвергали замене буфера на ΡΒδ посредством диализа и тестировали в отношении ускоренной стабильности при 1 мг/мл. Результаты ускоренной стабильности представлены в табл. 1, в которой приведено количество 4АЬ в растворе в каждой временной точке в виде процента количества 4АЬ, присутствующего при 1=0 ч.

Клон	% в растворе
	0,0 ч	2,3 ч	23,0 ч	47,0 ч
ϋΟΜ1 К-574-72	100%	91%	18%	9%
ϋΟΜ1 К-574-109	100%	86%	18%	8%
ϋΟΜ1 К-574-133	100%	101%	91%	80%
ϋΟΜ1 К-574-138	100%	100%	39%	18%
ϋΟΜ1 К-574-156	100%	84%	17%	9%
ϋΟΜ1 К-574-180	100%	73%	12%	8%
ϋΟΜΙΚ-131-206	100%	102%	101%	100%

Таблица 1. Ускоренная стабильность 4АЬ§ против ΤΝΡΚ1 при инкубации при 1 мг/мл в ΡΒδ при 40°С. Значения представляют количество 4АЬ в растворе в каждой временной точке в виде процента количества 4АЬ, присутствующего при 1=0 ч.

Анти-ЮТК! 4АЬ§ линии ЭОМ1Ь-574, за исключением ЭОМ1Ь-574-133, имеют тенденцию осаждаться в течение первых 47 ч, что приводит к существенному снижению количество белка в растворе в этой временной точке. Напротив, анти-ΤNΡК1 4АЬ ЭОМ1Н-131-206 не остается в растворе в течение этого периода времени. Поэтому стабилизация 4АЬ, делающая его более устойчивым к осаждению в исследовании ускоренной стабильности, является полезной.

Пример 2. Селекции и скрининг анти-ΤNΡК1 4АЬ линии ЭОМ1Н-574 в отношении улучшенных биофизических свойств

Для идентификации новых 4АЬ§ с улучшенной устойчивостью к осаждению после инкубации при повышенных температурах конструировали склонные к ошибкам ПЦР-библиотеки на основании пяти анти-ΤΝΡΚ йАЬк: ЭОМ1Ь-574-156, ЭОМ1Ь-574-109, ЭОМ1Ь-574-138, ЭОМ1Ь-574-162 и ЭОМ1Ь-574180. Склонные к ошибкам библиотеки получали с использованием этих клонов в векторе рЭОМ13 в качестве матрицы и затем подвергали двум раундам склонных к ошибкам ПЦР, используя ОепеМогрЬ II ^1га1адепе, кат. № 200550). В первом раунде 50 нг вектора амплифицировали в течение 30 циклов в объеме 50 мкл с использованием олигонуклеотидов Αδ9 и Αδ339 и следующего профиля амплификации: 2 мин 95°С и затем 30 циклов: 15 с 95°С, 30 с 50°С, 1 мин 72°С и в конце 10 мин 72°С.

Во втором раунде 0,4 мкл первого продукта склонной к ошибкам ПЦР реакции использовали в качестве матрицы во втором раунде мутагенеза с ОепеМогрЬ II ^1га1едепе) в объеме 200 мкл с использованием гнездовых праймеров Αδ639 и Αδ65 и профиля амплификации: 2 мин 95°С и затем 35 циклов: 15 с 95°С, 30 с 50°С, 1 мин 72°С и в конце 10 мин 72°С.

ПЦР-продукты очищали на 2% Е-гелях с использованием набора 01адеп Ое1 Ех1гас1юп и разрезали с помощью рестриктаз δа11 и Νο11 (ΝΕΒ). Продукты реакции переваривания пропускали через 2% Е-гель и ДНК-вставки, кодирующие 4АЬ, очищали из Е-гелей с использованием набора 01адеп Ое1 Ех1гас1юп. Очищенные вставки лигировали в вектор рЭОМ33 для фагового дисплея с использованием набора ДНКлигазы Т4 (ΝΕΒ):

мкл 30 нМ 0,7 мкг/мкл δа11/Nο11-разрезанного вектора рЭОМ33 мкл 300 нМ вставки

400 мкл Н₂О мкл 10 х буфер

- 29 022898 мкл 400 ед./мкл ДНК-лигазы Т4

Реакции проводили при 16°С в течение 18 ч. Продукты реакции экстрагировали с помощью фенолхлороформа, осаждали этанолом и растворяли в 50 мкл Н₂О, добавляли к 400 мкл электрокомпетентных клеток ТВ1 Е. сой и подвергали электропорации с использованием Ню-Каб Сепе Ри1зег II в объеме 100 мкл перед высеванием на чашки с тетрациклин-2хТУ агарозой. В среднем, примерно 2,4х10⁸ отдельных трансформантов получали для каждой из пяти библиотек. В среднем, регистрировали примерно три аминокислотных мутации на ген.

Перед исходной селекцией в отношении улучшенных биофизических свойств пять склонных к ошибкам фаговых библиотек подвергали предварительной селекции на растворимом человеческом ΤΝΕΚ.1 (К&к) 8уз1етз), который был биотинилирован с использованием Е/,-1,тк 8ιι1Γ<.>-ΝΙ ЖкС-НкЯт (Рюгсе Рго1ет Кезеагск Ргобис!з, КоскГогб П1то18, кат. № 21327) для обогащения функционального фага ТЖКЛ-связывающими свойствами. Предварительную селекцию проводили с использованием следующего протокола:

1. Блокировали 1 мл покрытых стрептавидином шариков М280 ЖпаЬеабз (Iиν^ΐ^одеи) с 2% Магсе1 в РБ8 в течение 1 ч при комнатной температуре.

2. Блокировали примерно 10¹¹ трансформирующих единиц (Ти) фага для каждой из библиотек в 0,5 мл РБ8 с 2% Мап'е1 в течение 1 ч при комнатной температуре.

3. Добавляли 0,53 мкл 47 мкМ биотинилированного человеческого растворимого ΤΝΕΚ1 к 0,5 мл заблокированного фага. Инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре.

4. Добавляли 200 мкл блокированных ОупаЬеабз к раствору фага. Инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре.

5. Промывали пять раз РБ8Т (РБ8 с 0,1% Ттеееп 20).

6. Элюировали связанный фаг с помощью 500 мкл 0,1 М глицина рН 2.

7. Нейтрализовали элюированный фаг с помощью 100 мкл 1 М трис, рН 8.

Примерно 2% вводимого Ти фага извлекали в конце предварительного раунда селекции для каждой библиотеки. После предварительной селекции библиотеки для основных клонов ООМ1Й-574-109, ООМ1Й-574-138, ООМ1И-574-162 и ООМ1И-574-180 собирали с образованием библиотеки А. Библиотеку В для ООМ1И-574-156 хранили отдельно.

На этой стадии четыре стратегии фаг-дисплейной селекции применяли для обогащения вариантов к)ОМ1Н-574 с улучшенными биофизическими свойствами из этих склонных к ошибкам ПЦР-библиотек:

1) Кинетическая стабильность при повышенных температурах (65°С).

2) Обратимость тепловой денатурации (80°С).

3) Устойчивость к перевариванию протеазами.

4) Обратимость денатурации, индуцированной низким рН.

Раунд 1 селекции фаг-дисплейной библиотеки

В первом раунде фаг-дисплейной селекции библиотеки А и В разбавляли до 5 х 10¹¹ Ти/мл в РБ8 и аликвоты по 100 мкл затем подвергали тепловой, протеазной предварительной обработке или предварительной обработке низким рН. Для тепловых селекций (образцы с 1 по 4, табл. 2) использовали температуры от 50 до 80°С и периоды инкубации составляли 2 ч или 10 мин, как указано в табл. 2. Селекцию трипсином (Рготеда, У511) (образцы с 5 по 7) осуществляли при инкубации с трипсином в концентрации от 10 до 100 мкг/мл в течение 2 ч при 37°С в РБ8 и контрольные инкубации осуществляли при комнатной температуре в течение 2 ч в РБ8 (образцы 8 и 9). После инкубации 50 мкл 2х полного набора ингибиторов протеаз (КосИе 04 693 116 001) добавляли к каждому из образцов 5-9. Для кислотных селекций образцов 10-13 фаг разбавляли в 10 раз из фагового концентрата в 420 мкл буфера 11Ж’ (5 мМ НЕРЕ8, 5 мМ №С1, 100 мМ цитрат, рН 3,2). В конце инкубации (продолжительность кислотной инкубации для каждого образца указана в табл. 2) образцы нейтрализовали 80 мкл трис-буфера.

После инкубации в этих стрессовых условиях фаговые библиотеки подвергали селекции в отношении функционально активных бАЬз путем инкубации с биотинилированным человеческим растворимым ТЖ'Кк как описано выше на стадии предварительной селекции. Единственным изменением к используемому протоколу была стадия десятикратной промывки, выполняемая с использованием Ктдйзйет. Для всех селекций с обеими библиотеками А и В количество извлеченного фага было определено и показано в табл. 2. Впоследствии фаг амплифицировали для следующего раунда селекции.

Таблица 2. Раунд 1 селекции в отношении улучшенных свойств. Указаны используемые условия селекции и Ти фага, извлеченного для каждой из двух библиотек после селекции. Выход для всех селекции составил 5х10¹⁰ Ти фага.

	Условия селекции	Библиотека А	Библиотека В
1	Инкубация при 50®С в течение двух часов	4x10'	1x10“
2	Инкубация при 55°С в течение двух часов	3x10'	7x10'
3	Инкубация при 60®С в течение двух часов	Έϊο⁷	ВЖ⁷
4	Инкубация при 80°С в течение 10 минут	ЖП7	1x10'
5	Трипсин 10 мкг/мл 37°С в течение 2 часов в РВ8	1x10’	1x10°

- 30 022898

6	Трипсин 30 мкг/мл 37°С в течение 2 часов в РВЗ	3x10*	3x10“
7	Трипсин 100 мкг/мл 37°С в течение 2 часов в РВЗ	Τχϊό⁰	ΪΧΪΟ®
8	Комнатная температура в течение 2 часов в РВЗ	1x10^й	ϊχΐο⁵
9	Комнатная температура в течение 2 часов в РВ5	1x10^й	1x10
10	рН при 37°С в течение 30 минут	4x10'	1x10'
11	рН 3,2 при 37’С в течение 1 часа	ΙχϊΟ⁷	8x10’
12	рН 3,2 при 37°С в течение 2 часов	5x10“	1x10
13	рН 3,2 на льду в течение 1 мин	1x10^й	7x10'

Основываясь на уровнях извлечения, выходы продуктов после селекции 3, 4, 5 и 12 для обеих библиотек (и селекции 6 из библиотеки А) были приняты во внимание во втором раунде селекции. Полученные фаги амплифицировали посредством раунда заражения Е. соП и затем очистки и концентрирования до 2 χ 10¹⁴ Τυ/мл.

Раунд 2 селекции фаг-дисплейной библиотеки

Продукты первого раунда селекции из библиотек А и В разбавляли до 5 χ 10¹¹ Τυ/мл в РВ§ и аликвоты по 100 мкл для каждой использовали для второго раунда селекции. Хотя использовали тот же протокол, условия селекции модифицировали, как суммировано в табл. 3.

Таблица 3. Исходный уровень, условия и выход продукта селекции в раунде 2. Исходный уровень относится к стандартным условиям селекции, используемым в раунде 1. Для библиотеки А продукты селекции для условий 5 и 6 в раунде 1 собирали и используемый пул обозначали Условия селекции включали отрицательные контроли для определения фонового связывания в отсутствие лиганда. Исходный уровень для всех селекций составлял 5 χ 10¹⁰ Τυ фага.

	Исходный уровень из Раунда 1 селекции	Условия селекции	Выход продукта в Ти из библиотеки А	Выход продукта в Ти из библиотеки В

1	3	Инкубация при 65°С в течение двух часов	3x10^е	1x10^е
2	3	Комнатная температура, выход продукта с лигандом	1,5x10’	3,5x10’
3	3	Комнатная температура, выход продукта без лиганда	0	0
4	4	Инкубация при 80°С в течение 10 минут	1,5x10’	3,5x10’
5	4	Комнатная температура, выход продукта с лигандом	1,5x10’	2,5x10’
6	4	Комнатная температура, выход продукта без лиганда	0	0
7	5	Трипсин 10 мкг/мл 37^вС в течение 2 часов в РВЗ	* 3x10	3x10
3	5	Трипсин 30 мкг/мл 37’С в течение 2 часов в РВЗ	* 1,5x10	2x10
9	5	Трипсин 100 мкг/мл 37°С, 2 часов в РВЗ	* 1,5x10	2x10“
10	5	Комнатная температура, выход продукта с лигандом	•4x10’	5x10’
11	5	Комнатная температура, выход продукта без лиганда	‘0	0
12	12	рНЗ,2 при 37°С в течение 4 часов	1,5x10	1x10’
13	12	рНЗ,2 при 37°С в течение ночи	1x10'	5x10
14	12	Комнатная температура, выход продукта с лигандом	5x10’	2,5x10’
15	12	Комнатная температура, выход продукта без лиганда	5x10⁴	0

Полученные фаговые продукты очищали и концентрировали до 1 χ 10¹³ Τυ/мл. Продукты селекции 1, 4, 9 и 12 для обеих библиотек использовали для следующего раунда селекции. Полученные фаговые продукты амплифицировали посредством раунда заражения Е. соП и затем очищали и концентрировали до 2 χ 10¹⁴ Τυ/мл.

Раунд 3 селекции фаг-дисплейной библиотеки

Продукты второго раунда селекции библиотеки А и В разбавляли до 5 χ 10¹¹ Τυ/мл в РВ§ и 100 мкл аликвоты каждого использовали для третьего раунда селекции. Хотя использовали тот же протокол, условия селекции модифицировали, как суммировано в табл. 4.

- 31 022898

Таблица 4. Исходный уровень, условия и выход продукта селекции в раунде 3. Исходный уровень относится к стандартным условиям селекции, используемым в раунде 2. Условия селекции включали отрицательные контроли для определения фонового связывания в отсутствие лиганда. Исходный уровень для всех селекций составлял 5χ10¹⁰ Ти фага. Выходы продукта регистрировали в объеме 0,5 мл и результаты выражали в Ти/мл.

	Исходный уровень из Раунда 2 селекции	Условия селекции	Выход продукта в Ти из библиотеки А	Выход продукта в Ти из библиотеки В
1	1	Инкубация при 60°С в течение в часов	0	100
2	1	Инкубация при 80°С в течение 18 часов	30	100
3	1	Комнатная температура, выход продукта с лигандом	1x10”	5x10”
4	1	Комнатная температура, выход продукта без лиганда	0	0
5	4	Инкубация при 80°С в течение 20 минут	8	20
6	4	Комнатная температура, выход продукта с лигандом	1x10’“	3x10”
7	4	Комнатная температура, выход продукта без лиганда	0	4x10
8	9	Трипсин 100 мкг/мл 37’С в течение 6 часов в РВ5	1x10	3x10
9	9	Трипсин 100 мкг/мл 37°С в течение 18 часов в ΡΒδ	2x10'	3x10
10	9	Комнатная температура, выход продукта с лигандом	5x10”	3x10”
11	9	Комнатная температура, выход продукта без лиганда	0	1000
12	12	рН 3,2 при 37°С в течение б часов	3x10”	3x10
13	12	рН 3,2 при 37°С в течение 18 часов	5000	3x10
14	12	Комнатная температура, выход продукта с лигандом	1Х10¹¹	5x10”
15	12	Комнатная температура, выход продукта без лиганда	2x10	1,0x10

Полученные фаговые продукты из раунда 2 и раунда 3 амплифицировали и затем очищали и концентрировали до 1 χ 10¹³ Ти/мл. Бактериальные культуры (100 мл) заражали фагом из продуктов селекции, выращивали и использовали для извлечения двухцепочечно фаговой ДНК с использованием колонок для очистки О1адеп Μί6ί ΌΝΛ (О1адеп).

бАЬ вставки из раунда 2, продуктов селекции 1 и 4 из библиотек А и В, а также раунда 3 селекции 2, 5, 9, 12, 13 библиотеки А и селекции 1, 2, 5, 8, 9, 12 и 13 библиотеки В подвергали ПЦР-амплификации из соответствующих аликвот препаратов фага с использованием Тац-полимеразы и праймеров СЕ2 и СЕ3. Продукты амплификации очищали с помощью геля и разрезали рестриктазами §а11 и №11 перед клонированием в вектор ρΌΘΜ13 для секвенирования и экспрессии.

Анализ результатов селекции

Анализ пулов последовательностей ДНК вариантов ΌΘΜ1Η-574, выбранных после раунда 3 из библиотеки В с использованием вышеупомянутых фаговых селекций, выявил, что различные давления селекции преимущественно были обогащены различными наборами мутаций, как показано в табл. 5. Определенные наблюдаемые мутации также присутствуют в бАЬк, используемых в качестве исходной точки для селекции, т.е. 30У и 62А присутствуют в ΌΘΜ1Η-574-180, 30У присутствует в ΌΘΜ1Η-574-109 и 100А присутствует в ΌΘΜ1Η-574-138.

Таблица 5. Обобщение, указывающее положения и изменения, наиболее часто встречающиеся для каждого условия селекции. Количество ''+'' указывает на относительную частоту этого аминокислотного остатка. Нумерация в соответствии с КаЬа!.

зсю

65°С ++

80°С Трипсин рН

305 ЗОУ ++ ++ ++ +++

Пример 3. Характеристика выбранных бАЬк

Используя информацию из анализа последовательности ДНК, выбрали субпопуляцию анти-ТЫРК! бАЬк, суммировали в табл. 6, которая объединила различные мутации, как показано на фиг. 1. Для дальнейшей характеристики эти бАЬк экспрессировали в Е. соН, очищали от супернатанта с использованием

- 32 022898 периодического связывания с Рго1ет-А МгеатЬие и меняли буфер на РВ8. Для облегчения процесса скрининга ускоренное тестирование стабильности слегка модифицировали по сравнению с ранее описанным способом.

Для тестирования ускоренной стабильности реакции выполняли в планшете для ПЦР, инкубируемом в термоциклере в течение желаемого периода времени:

Й) 100 мкл 1 мг/мл ЙАЬ в РВ8 вносят в лунки планшета для ПЦР. е) Белок инкубируют в течение 40 ч либо при 40°С, либо при 50°С.

ί) Извлекают аликвоту 50 мкл и измеряют ΟΌ₃₂₀ в устройстве для считывания микропланшетов (ΜοΚο-υΠηΓ Эеую-ек) и возвращают в реакционный сосуд после измерения. Более высокие значения указывают на образование агрегатов. Используют определение ΟΌ₃₂₀, поскольку это лучше всего подходит для определения осаждения и агрегации, в то время как ΟΌ₂₈₀ лучше всего использовать для определения концентрации белка в растворе.

Результаты этого анализа приведены в табл. 6. Этот анализ демонстрирует многочисленные ЙАЬз со значительным увеличением ускоренной стабильности по сравнению с ΌΟΜ1Η-574-156 при измерении при 40°С. В то время как исходный клон ΌΟΜ1Η-574-156 дает поглощение 1,08 при 320 нМ после 40 ч при 40°С, показывая, что значительное количество белка выпало в осадок, многие новые ЙАЬз имеют низкие показатели при считывании (менее 0,5), показывая, что большая часть белка остается в растворе.

Наиболее выраженное увеличение ускоренной стабильности при 40°С в течение 40 ч наблюдалось для ΌΟΜ1Η-574-188, ΌΟΜ1Η-574-191, ΌΟΜ1Η-574-192, ΌΟΜ1Η-574-196, ΌΟΜ1Η-574-201, ΌΟΜ1Η-574204, ΌΟΜ1Η-574-205, ΌΟΜ1Η-574-206 и ΌΟΜ1Η-574-208.

Таблица 6. Новые ЙАЬз, протестированные в отношении ускоренной стабильности. Для каждого ЙАЬ указывается, из какой библиотеки оно происходит, а также приведены условия селекции, используемые для идентификации этого ЙАЬ. Очищенные ЙАЬз (1 мг/мл) тестировали в отношении ускоренной стабильности посредством инкубации при 40 или 50°С в течение 40 ч в планшете для ПЦР. После инкубации определяли ΟΌ₃₂₀ для каждого ЙАЬ, устанавливая уровень осаждения в каждой лунке. Чем меньше значение, тем более стабильно ЙАЬ.

Клон	Библиотека	Селективное давление	ООзго, 40 часов 40°С	ООзго, 48 часов 50®С
РВЗ			0,15	0,15
ООМ1 М-574-156		Родительский клон	1,08	2
ϋΟΜ1 М-574-188	В	65°С	0,37
ООМ1 М-574-189	В	80’С	0,7
ООМ1 М-574-190	В	трипсин	0,94	2
ϋΟΜ1 М-574-191	в	рН 3,2, 6М	0,37	1,6
ϋΟΜ1 М-574-192	в	рН 3,2, 18 ч	0,4	2
ООМ1 М-574-193	в	65°С, 18 ч	2,0
ООМ1 М-574-194	в	65°С, 18 ч	1,3
ООМ1 М-574-195	в	65°С	0,87
ϋΟΜ1 М-574-196	в	рН 3,2	0,35
ϋΟΜ1 М-574-201	А	80°С	0,31	1,9
ϋΟΜ1 М-574-202	А	80°С	0,57
ϋΟΜ1 М-574-203	А	80°С	0,52	2,25
ϋΟΜΙή-574-204	А	трипсин	0,25
ϋΟΜ1 М-574-205	А	рН 3,2, 6 ч	0,24	1,6
ϋΟΜ1 М-574-206	А	рН 3,2,6 ч	0,28	2,1
ϋΟΜ1 М-574-208	А	80°С	0,38	1,65

ϋΟΜ1 М-574-209	А	трипсин	1,98
ООМ1М-574-211	А	рН 3,2, 18 ч	2
ООМ1М-574-212	А	рН 3,2,6 ч	2,1
ООМ1М-574-213	А	рН 3,2, 18 ч	1,5
ϋΟΜ1 М-574-214	А	рК 3,2, 18 ч	0,4

ΌΟΜ1Η-574-207 тестировали в трис-глициновом буфере, и оно было более стабильным, чем ΌΟΜ1Η-574-156.

Пример 4. Стабильные ЙАЬз против ΤΝΡΚ1 являются функционально активными

Для подтверждения увеличения ускоренной стабильности четыре новых ЙАЬз также характеризовали в соответствии с более расширенным протоколом, описанным в примере 1. В этом протоколе ЙАЬз инкубировали вплоть до 48 ч при 40°С, центрифугировали, и оставшееся ЙАЬ в растворе определяли количественно с использованием ΟΌ₂₈₀. Тестировали следующие ЙАЬз: ΌΟΜ1Η-574-188, ΌΟΜ1Η-574-196, ΌΟΜ1Η-574-208 и ΌΟΜ1Η-574-214, и результаты представлены в табл. 7. Очевидно, что эти ЙАЬз значительно более стабильны по сравнению с исходным ЙАЬ ΌΟΜ1Η-574-156 (исторические данные), поскольку не наблюдается потери белка в течение первых 48 ч при 40°С. Чтобы убедиться, что увеличение стабильности происходит не за счет функциональной анти-ΤNΡΚ1 активности ЙАЬ, определяли аффинность связывания ЙАЬз с ΤΝΡΚ1 с помощью В1Асоге, используя биотинилированный ΤΝΡΚ.1, захваченный на чипе В1Асоге 8А. Хотя аффинность к человеческому ΤΝΡΚ1 этих новых ЙАЬз немного ниже, чем

- 33 022898 описанная ранее для ΌΟΜ1Η-574-156 бАЬ (150 пМ), она остается в пределах 4 раз относительно родительского бАЬ. Поэтому эти 6АЬ§ имеют увеличение ускоренной стабильности без существенного влияния на аффинность бАЬ к ΤΝΕΚ1.

адь	% в растворе	В1Асоге
	0,0 ч	2ч	24 ч	48 ч	ка (нМ)
ϋΟΜ1Κ-574-188	100	98	102	101	0,35
ϋΟΜΙΚ-574-196	100	102	98	100	0,47
0ОМ1Н-574-208	100	98	103	100	0,27
ϋΟΜ1 К-574-214	100	99	100	99	0,58

Таблица 7. Ускоренная стабильность и аффинность в отношении человеческого ΤΝΕΚ1 для новых 6АЬ§ против ΤΝΕΚ1. Очищенное бАЬ инкубировали при 1 мг/мл в РВ8 при 40°С в течение указанных промежутков времени. После этого времени процент остаточного белка в растворе оценивали путем определения ΟΌ₂₈₀. Аффинность к 8ΤΝΕΚ1 определяли с помощью В1Асоге с использованием покрытия 8ΤΝΕΚ1 и инъекции бАЬ, как описано.

Пример 5. Конструирование генетических слияний стабильных анти-ΤNΡК1 6АЬ§ с А1ЬибАЬ8

Чтобы увеличить период полувыведения 6АЬ§ против ΤΝΕΚ1 из сыворотки, их подвергали слиянию с альбумин-связывающим бАЬ ΌΟΜ7Η-11-3. Четыре выбранных стабильных 6АЬ§ против ΤΝΕΚ1 представляли собой ΌΟΜ1Ε-574-188, ΌΟΜ1Ε-574-196, ΌΟΜ1Ε-574-208 и ΌΟΜ1Ε-574-214, и для слияния с ΌΟΜ7Η-11-3 использовали линкерную последовательность А1а-8е^-Τй^. Конструирование этих слитых молекул осуществляли в две стадии. Во-первых, 6АЬ§ против ΤΝΕΚ1 амплифицировали посредством ПЦР с использованием праймеров А89 и ОА154, очищенный реакционный продукт затем переваривали с помощью 8а11/№е1, очищали в геле и лигировали в За11/МЬе1-переваренный вектор ρΌΟΜ13, содержащий линкер и ΌΟΜ7Η-11-3. После лигирования ДНК подвергали трансформации в клетки ХЬ10-Оо1б (8Ча1адепе) и выбирали колонии для анализа последовательности. После подтверждения последовательности этой конструкции выполняли вторую стадию конструирования посредством амплификации антиΤNΡК1/антиальбуминовой кассеты с использованием олигонуклеотидов 1АЬ102 и А865. Продукты реакции переваривали рестриктазами Νώ;1/Νο11 и прогоняли через агарозный гель и очищали посредством экстракции из геля. Очищенный фрагмент ДНК, содержащий слитый продукт, затем клонировали в Ше1/№11-разрезанный вектор рЕТ30а (Μе^ск). Клонирование в этом векторе осуществляли для обеспечения экспрессии этого белка с использованием ΙΡΤΟ-индукции в ферментере и будет приводить к процессированию бАЬ без добавления каких-либо аминокислотных остатков. Это отличает его от вектора ρΌΟΜ13, который добавляет ^γ-Τ1ιγ на Ν-конце всех 6АЬ§, экспрессирующихся в этом векторе. Следующие слияния анти-ΤNΡК1 6Λό/ΌΟΜ71ι-11-3 конструировали в рЕТ30а:

Название клона	с!АЬ против ΤΝΡΚ1	Линкер	РАЬ против альбумина
ОМ35535	ЦОМ1И-574-196	А1а-Зег-ТИг	ЦОМ7И-11-3
ЦМ35541	ЦОМ1П-574-208	А1а-Зег-ТПг	ЦОМ7И-11-3
ЦМ35542	ЦОМ1Р-574-214	А1а-5ег-ТРг	ЦОМ7И-11-3
ЦМ35544	ЦОМ1И-574-188	А1а-Зег-ТРг	ЦОМ7И-11-3

Для экспрессии эти конструкции подвергали трансформации в штамм Е. сой ВЬ21 (ΌΕ3) с ρΕСΟ1рд1, как описано в Аоп еΐ а1. 2008. Все четыре конструкции затем экспрессировали в ферментере, выращивая при 23°С после индукции, и экспрессию индуцировали с помощью 0,01 мМ ΙΡΤΟ. Все ферментации проводили до высокой плотности клеток в минимальной среде в 5-л масштабе.

Периплазматический экстракт готовили следующим образом. Замороженную клеточную пасту размораживали и смешивали с 0,5 М ОиНс1, 200 мМ трис, рН 8, 10 мМ ΕΌ^ при 37°С в течение ночи с последующим центрифугированием в течение 1 ч при 4500д и отбрасыванием осадка. Очистку от периплазмы осуществляли посредством периодического связывания с РгОет-А с последующей элюцией 100 мМ глицином, рН 2, и нейтрализацией с помощью 200 мМ трис, рН 8. Элюированный белок подвергали замене буфера на РВ8 и концентрировали перед функциональной характеристикой.

Пример 6. Характеристика слияний анти-ΤNΡК1/антиальбумин

Очищенный белок для ΌΜ85535, ΌΜ85541, ΌΜ85542 и ΌΜ85544 затем характеризовали в серии тестов для демонстрации, что эти молекулы являются и стабильными, и обладают хорошей анти-ЮТК! активностью.

Характеристика ускоренной стабильности

Для оценки биофизических свойств молекул слитые белки тестировали в отношении ускоренной стабильности. Поскольку молекулы, как ожидается, значительно более стабильны, тестирование ускоренной стабильности проводили при 1 мг/мл в РВ8 в течение 28 суток при температуре 40°С, вместо 2-х суток. Результаты приведены в табл. 8. Из результатов можно сделать вывод, что все конструкции очень стабильны без потери белка, как определено по ΟΌ₂₈₀ после 28 суток. Незначительное увеличение белка наблюдается скорее всего из-за ошибки в этом методе обнаружения и не является значимым.

Таблица 8. Обобщение результатов по ускоренной стабильности и функциональной характеристике

- 34 022898 генетических слияний анти-ΤNΡΚ1/антиальбумин. Ускоренную стабильность определяли количественно в виде процента слитого белка в растворе после 28 суток при 40°С, как определено по ОЭ₂₈₀. ΒΙΑ^κ™ аффинности (КО) определяли посредством инъекции по меньшей мере шести различных концентраций анти-ΤNΡΚ1/Α1ЬибΑЬ™ (А1ЬибАЬ представляет собой бАЬ против сывороточного альбумина). Эту процедуру осуществляли в двух независимых экспериментах и значения этих экспериментов усредняли, получая указанное стандартное отклонение (δϋ). Эффективность слияний анти-ΤNΡΚ1/Α1ЬибаЬ определяли в анализе клеток ΗυνΕΟ. Средние значения ЕС50 рассчитывали в общей сложности из 7 экспериментов для слияний анти-ΤNΡΚ1/Α1ЬибаЬ. δ.Ε = стандартная ошибка среднего.

Название клона	% в растворе после 28 суток при 40’С	№ (рМ) ± 5Ц	Среднее ЕС50 (нМ) ±ЗЕ
ОМ35535	104	277 ± 62	5,79 ± 0,69
ОМ35541	106	163 ±74	3,58 ± 0,45
ЭМ35542	103	202 ± 30	6,23 ±1,05
ОМ55544	108	180 ± 24	4,83 ± 0,94

Функциональная характеристика белка анти-ΤNΡΚ1/антиальбумин

Для того чтобы гарантировать, что функциональная активность молекулы против ΤΝΡΚ1 не нарушена, четыре генетических слияния анти-ΤNРΚ1/антиальбумин тестировали в функциональных анализах для определения как их аффинности к ΤΝΡΚ1, так и их эффективности при ингибировании ΤΝΡαиндуцированной передачи сигнала.

ΤΝΡΚ1 аффинность - ΒΙΑ^κ

Аффинность слияний анти-ΤNΡΚ1/Α1ЬибΑЬ в отношении человеческого ΤΝΡΚ1 определяли с помощью ΒΙΑ^κ. Кратко, молекулы против ΤΝΡΚ1 вводили на стрептавидиновый чип ΒΙΑ^κ, на котором был иммобилизован биотинилированный человеческий ΤΝΡΚ1. Ассоциацию и диссоциацию определяли при различных концентрациях вводимого анти-ΤNΡΚ1. Результаты этой характеристики представлены в табл. 8 и показывают, что молекулы представляют собой связывающие агенты с высокой аффинностью к человеческому ΤΝΡΚ1 (КО менее 280 пМ). Аффинность к человеческому ΤΝΡΚ1, как определено с помощью ΒΙΑ^κ слияния анти-ΤNРΚ1/Α1ЬибΑЬ, немного выше, чем определено для одного анти-ΤNРΚ1 бАЬ, используемого в каждой из комбинированных конструкций.

Эффективность в анализе клеток ΗυνΈΟ

Второй функциональный анализ для определения анти-ΤNРΚ1 активности бАЬк представляет собой анализ ΗυνΈΟ. Кратко, в этом анализе ΗυνΈΟ предварительно инкубируют в течение 1 ч с бАЬ с последующей стимуляцией 1 нг/мл ΤΝΡα. Эта стимуляция приводит к увеличению экспрессии УСАМ на клетке, которую можно определить. Уровень ингибирования ΤΝΡα-индуцированной экспрессии УСАМ, обеспечиваемой с помощью бАЬ, определяют посредством построения кривой зависимости концентрации бАЬ от экспрессии УСАМ.

Результаты представлены в табл. 8 и демонстрируют, что слияния анти-ΤNΡΚ1/Α1ЬибΑЬ имеют однозначную нМ эффективность в анализе ΗυνΈΟ

В заключение, выполняя фаг-дисплейные селекции мутантных библиотек в жестких условиях селекции, авторы изобретения смогли идентифицировать новые бАЬк против ΤΝΡΚ1. Эти бАЬк объединяют высокую аффинность к ΤΝΡΚ1, определенную с помощью ΒΙΑ^κ, с увеличенной ускоренной стабильностью. При этом связывающие свойства сохраняются, когда эти бАЬк подвергают слиянию с другим белком или пептидом, как подтверждено примером с ООМ7И-11-3 А1ЬибАЬ, и стабильность дополнительно увеличивается. Эти бАЬк демонстрируют значительное улучшение и новые свойства бАЬк должны улучшить возможность разработки этих бАЬк в качестве терапевтических агентов.

Протокол ΒΙΑ^Κ

Аффинность связывания с рекомбинантным человеческим ΤΝΡΚ1 оценивали с помощью ΒΙΑ^κ™ анализа. Анализ проводили с использованием стрептавидин-покрытых ^А) чипов (ΒΙΑ^κ, кат. № ΒΚ1000-32). Чип δΑ покрывали биотинилированным ΗΤΝΡΚ1 при низкой плотности. Исследуемые молекулы впрыскивали на эту поверхность в семи концентрациях, т.е. 32, 16 (дважды), 8, 4, 2, 1 и 0,5 нМ, в случайном порядке, используя скорость потока 50 мкл/мин. Между отдельными впрыскиваниями поверхность регенерировали до исходного уровня с помощью 10 мМ глицина рН 2,0. Данные корректировали с учетом артефактов прибора с использованием двойного эталона. Эксперименты осуществляли на приборе ΒΙΑ^κ™ 3000 и данные анализировали с использованием программного обеспечения ΒIΑеνа1иаΐ^οη, версия 4.1, 1<_οη и Κ_ο[γ были одновременно установлены с использованием модели связывания по Ленгмюру 1:1. Для целей аппроксимации использовали диапазон концентраций 1-32 нМ для мономеров, в то время как 0,5-16 нМ использовали для слитых молекул А1ЬибАЬ. Данные связывания хорошо соответствовали модели 1: 1 для всех протестированных молекул. Все значения К_с рассчитывали из соотношений Έ_οη и к^. Исследование ΒΙΑ^κ™ проводили при 25°С.

Протокол анализа клеток ΗυУΕС

Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (ΗυνΈΟ) отвечают на ΤΝΡ-α лечение повышением экспрессии Усам-1. бАЬк против ΤΝΡΚ1 ингибируют действие ΤΝΡ-α, поэтому в присутствии бАЬк

- 35 022898 против ΤΝΡΚ1 можно видеть снижение экспрессии VСΑΜ-1 в клетках ΗυVΕС. Для оценки этого ингибирования, кратко, нормальные собранные клетки ΗυVΕС (Рготосе11 # С-12203) высевают в покрытые желатином лунки 96-луночных микротитрационных планшетов (ννΚ # 734-0403) (4 х 10⁴ клеток/лунка) в среде для роста эндотелиальных клеток (Рготосе11 # С-22110). Клетки оставляют прикрепляться в течение ночи (37°С/5%СΟ2) перед добавлением к клеткам диапазона доз йАЬ или только среды, и планшеты оставляют при 37°С/5%СО2 на 1 ч. Фиксированную концентрацию ΤΝΡ-α (1 нг/мл, РергоРесЬ # 300-01 А) затем добавляют к клеткам, которые инкубируют в течение еще 23 ч (37^оС/5%СΟ2). Для отрицательного контроля клетки инкубируют только со средой, а для положительного контроля клетки инкубируют только с ΤΝΡ-α.

После инкубации супернатант культуры клеток удаляют и клетки промывают три раза ледяным РВ8. Клетки лизируют путем добавления 75 мкл/лунка ледяного трис-глицеринового лизирующего буфера (40 мМ трис, 274 мМ №С1, 2% тритон-Х-100, 20% глицерин, 50 мМ ΝαΡ, 1 мМ Να₃νΟ₄, 1х таблетка ингибиторов протеаз на 10 мл (КосЬе # 11-836-170-001)) и инкубировали в течение 15 мин на льду. Клеточные лизаты затем переносят на VСΑΜ-1 сэндвич''-ЕЫ8А.

Для VСΑΜ-1 сэндвич''-ЕЫ8А иммунопланшеты Ρ96 Μаx^8ο^р (Жтс # 439454) покрывают в течение ночи тАЬ против VСΑΜ-1 (К&Э 8У81ет8 # ΜΑΒ809, 2 мкг/мл), 100 мкл/лунка в РВ8 при 4°С. На следующие сутки планшеты промывают и блокируют 1% БСА (бычий сывороточный альбумин)/РВ8 (200 мкл/лунка) в течение 1 ч перед добавлением лизатов клеток ΗυVΕС (50 мкл/лунка). Планшеты инкубируют с лизатами в течение 2 ч и снова промывают перед добавлением биотинилированного поликлонального АЬ против VСΑΜ-1 (К&Э 8У81ет8 # ΒΑΡ809) 0,4 мкг/мл в 0,1% БСА/РВ8, 0,05% Τтеееη-20, 100 мкл/лунка, и инкубацией в течение еще 1 ч. Планшеты промывают еще раз перед добавлением стрептавидин-НКР (разбавленный согласно инструкциями производителя в 0,1% БСА/РВ8, 0,05% Τ\γее11). 100 мкл/лунка. Связанный стрептавидин-НКР визуализируют путем добавления пероксидазного субстрата 8игеЬ1ие ΤΜΒ-1 (КРЬ-# 52-00-00) и реакцию останавливают добавлением 1 М НС1. Поглощение немедленно считывают в устройстве для считывания планшетов 8ресί^аΜаx Μ5^ί! (Μο1еси1а^ Ое\асе8) при 450 нМ.

Нескорректированные значения ΟΌ направляют в Μ^с^ο8οΓι Ехсе1, и фоновые значения ΟΌ (клетки, инкубируемые только со средой) вычитают из всех экспериментальных точек. Для расчета ингибирования ΤΝΡ-α-индуцированной повышающей регуляции VСΑΜ-1 клетками процент ингибирования максимальной экспрессии VСΑΜ-1 (как показано с помощью положительного контроля) при каждой концентрации йАЬ вычисляют с использованием следующей формулы:

% ингибирования максимальной повышающей регуляции VСΑΜ-1 = 100 - (значение ΟΌ при конкретном разведении йАЬ/значение ΟΌ для положительного контроля) х 100.

Затем значения концентраций йАЬ наносят на график относительно процента ингибирования в ОгарЬРай Рп8т, и кривые эффекта концентрации и значения эффективности (ЕС₅₀) определяют с использованием сигмоидальной кривой доза-ответ с переменным наклоном.

Концентрация ΤΝΡ-α, используемая для стимуляции клеток, составляет приблизительно 70% (ЕС70) максимального ответа клеток на ΤΝΡ-α.

Ссылки

Αοη ЛС, Οβίπηί ВЗ, Тау1ог АН, Ьи О, О1иЬоуес1е Р, Оа11у Л, Козз1ег Μϋ,

Кетдап ЛЭ, Ьемз Т5, \Л/узоск1 ЬА, Ра1е1 Р5. Зирргеззтд роз11гапз1а1юпа1 д1исопоу1а1юп οί Ье1его1одоиз ρΓοΙθίηβ Ьу те1аЬоНс впдюееппд οί ЕзсЬепсЬ|а соН.

ΑρρΙ Εηνίκιη ΜίΟΌύίοί. 2008 РеЬ;74(4):950-8. ЕриЬ 2007 Эве 14.

Перечень последовательностей

Все нуклеотидные последовательности записаны с 5' по 3' и все аминокислотные последовательности записаны от Ν- до С-конца.

ΌΟΜ1Η-131-206 раскрыт в νΟ 2008149148 (аминокислотная последовательность которого и нуклеотидная последовательность которого, как указано в данной заявке РСТ, специально включены в данную заявку посредством ссылки, как если бы они были прямо описаны в данной заявке и для применения в настоящем изобретении, и предполагается, что любая часть такого описания изобретения может быть включена в один или более пунктов формулы изобретения).

Используемые олигонуклеотиды

А89: САООАААСАОСТАТОАССАТО А8339: ТТСАООСТОСОСААСТОТТО А8639: СОССААОСТТОСАТОСАААТТС А865: ТТОТААААСОАСООССАОТО СЕ2: СТТАААСАОСТТОАТАССС СЕЗ: САСАОСССТСАТАОТТАО

ОА154: ТТСТТТТОСТАССССТСОАОАСООТОАССАССОТТС 1АЫ02:

ООААТТССАТАТОАААТАССТОСТОССОАССОСТОСТОСТООТСТОСТОСТССТСО

СТОСССАССССОСОАТООССОАООТСЗСАОСТОТТООАОТСТООООО

- 36 022898

Нуклеотидные последовательности >ООМ1Ь-574-188

ОАССТССЛССТОТТСаАСТСТООСССАСОСТТООТАСАСССТССООООТС

ССТОССТСТСТССТСТССАСССТССССАТТСАССТТТСАТААОТАТТСААТССССТ

ОООТСССССАООСТССАОООААОООТСТАОАОТОООТСТСАСАОАТТТСООАТАС

ТССТОАТСОТАСАТАСТАСОСАСАСТССОТОААОООСССОТТСАССАТСТСССОС

ОАСААТТССААОААСАСОСТОТАТСТССАААТОААСАОССТССОТСЗСТОАООАС

АССОСОСТАТАТТАСТСТСССАТАТАТАСТСССССТТОООТСССТТТТСАОТАСТС

СССТСАСССААСССТОСТСАСССТСТССАСС >ϋΟΜ1Η-574-189

ОАООТОСАОСТОТТООАОТСТОСЮООАОССТТеСТАСАОССТССССССТС

ССТОСОТСТСТССТОТОСАОССТССООАТТСАССТТТТТСААОТАТТСОАТООООТ (К5СТССОССАООСТССАООСААОСОТСТАСАОТОООТСТСАСАОАТТТССОАТАС

ТОСТОАТСОТАСАТАСТАСОСАСАСТССОТОААСООСССОТТСАССАТСТСССОС

САСААТТССААСААСАСОСТОТАТСТОСАААТСААСАОССТСССТбСТСАССАС

АССОСООТТТАТТАСТОТОССОТАТАТАСТОООСОТТООСАСССТТТТОАОТАСТО

ОООТСАОООААСССТООТСАССОТСТСОАОС >ϋΟΜ1Η-574-190

САООТССАССТОТТООАСТСТСССССАСССТТСОТАСАеССТССССССТС

ССТССОТСТСТССТОТОСАОССТССООАТТСАССТТТТТСААСТАТТСОАТООООТ (ЮАТССОССАОССТССАООТААОООТСТАОАОТСЮОТСТСАСАОАТТТССХЗАТАС

ТСХ^ТОАТСОТАСАТАСТАСССАСАСТСССТСААСССССССТТСАССАТСТССССС

ОАСААТТССААОААСАСОСТОТАТСТССАААТСААСАСССТСССТОСССАССАС

АССОСОСТАТАТТАСТОТССООТАТАТАСОООТСОСТОООСОССТТТТОАОТАСТ

ОООСТСАООСААСССТСОГСАССОТСТСОАОС >ΏΟΜ1Η-574-191

ОАСОТОСЛОСТОТТСОАОТСТОООООАООСТТООТАСАОССТООООООТС

ССТОСОТСТСТССТСТОСАОССТССОСАТТСАСАТТТТССААОТАТТССАТСОООТ

СССТССОССАСССТССАОССААОСОТСТАОАОТОССТСТСАСАСАТТТСССАТАС

ТОСТОАТСОТАСАТАСТАСССАСАСТСССТОААОССССООТТСАССАТСТССССС

ОАСААТТССААОААСАСОСТОТАТСТССАААТОААСАОССТССОТОСТСАСОАС

АССССООТАТАТТАСТОТСССАТАТАТАСТОСОСОТТСООТСССТТТТСАСТАСТС

ОООТСАССОААСССТССТСАССОТСТССАСС >ООМ1Ь-574-192

САСОТССАССТСТТООАСТСТСОООСАСССТТСОТАСАСССГОСССССТС

ССТСССТСТСТССТСТССАОССТССООАТТСАССТТТТССААСТАТТССАТООСЮТ

ООСТССОССАСССТССАСеСААОССТСТАОАОТОООТСТСАСАСАТТТСССАТАС

ТОСТОАТСОТАСАТАСТАСССАСАСТССОТОААОООССООТТСАССАТСТСССОС

ОАСААТТССААОААСАСОСТСТАТСТССАААТОААСАОССТССОТОСТОАООАС

АССССООТАТАТТАСТСТСССАТАТАТАСТССССОТТОССТОССТТТТОАСААСТ

ООССТСАОООААСССТССТСАСССТСТСОАСС >ϋΟΜ1Η-574-193

ОАССТССАССТОТТООАСТСТООООСАСССТТОСТАСАОССТССОСООТС

ССТСССТСТСТССТОТССАОССТССООАТТСАССТТТСАТААСТАТТССАТСОСОТ

ОООТССОССАООСТССАСООААСССТССАСАСТСООТСТСАСАСАТТТСОСАТА

СТОСТОАТСОТАСАТАСТАСОСАСАСТССОТСААОООССССТТСАССААСТСССО

СОАСААТТССААОААСАСОСТСТАТСТОСАААТСААСАСССТССОТССТСАСОАС

АССССООТАТАТТАСТОТОССАТАТАТАСТОСОСОТТОООАОССТТТТОАОТАСТ

ООООТСАООСААСССТСОТСАССОТСТСОАОС >ϋΟΜ1Η-574-194

ОАССТССАОСТОТТССАОТСТС(ЗСССАООСТТСОТАСАСССТССООООТС

ССТССОТСТСТССТОТОСАСССТССООАТТСАССТТТОТТААОТАТТСОАТОООСТ

ОССТССОССАОССТССАОООААСООТСТАОАОТОООТСТСАСАОАТТТСООАТАС

ТОСТОАТСОТАСАТАСТАСССАСАСОССОТОААОССССОСТТСАССАТСТСССОС

ОАСААТТССААСААСАСОСТОТАТСТОСАААТОААСАОССТСССТССТОАОСАС

АССССССТАТАТТАСТСТОССАТАТАТАСТОСССОТТОССТСССАТТТСАСТАСТ

ООООТСАСОСААСССТССТСАСССТСТСОАОС >ООМ1Ь-574-195

САООТОСАОСТОТТООАОТСТСККЗОСАООСТТОСТАСАОССТООСОСОТС

ССТОСОТСТСТССТОТОСАОССТССООАТТСАССТТТТТСААОТАТТСОАТООООТ

ОООТСССССАООСТССТОООААОООТСТАОАСТСООТСТСАСАОАТТТСООАТАС

ТОСТОАТССТАСАТАСТАСССАСАСТССОТСААСООСССОТТСАССАТСТССССС

САСААТТССААОААСАСОСТСТАТСТССАААТОААСАСССТСССТССТСАССАС

АССОСССТАТАТТАСТСТОСОАТАТАТАСТССОСССТОООАСССТТТТОАОТАСТ

ССССАСАСССААСССТССТСАСССТСТСОАСС >ϋΟΜ1Η-574-196

ОАССТССАССТОТТООАСТСТООССОАООСТТСОТАСАСССТСССССОТС

ССТОСОТСТСТССТСТССАСССТСССОАТТСАССТТТТССААОТАТТСОАТСССОТ

ОООТСССССАООСТССАОССААООСТСТАОАОТСОСТСТСАСАОАТТТСООАТАС

ТССТСАТСОТАСАТАСТАСССАСАСТСССТСААСССССССТТСАССАТСТССССС

ОАСААТТССААОААСАСОСТОТАТСТССАААТОААСАОССТОСОТОСТОАООАС

АССОСООТАТАТТАСТОТОССАТАТАТАСТООССОТТСООАОССТТТТОАОТАСТ

- 37 022898

ОСССТСАСССААСССТСЮТСАССОТСТСОАСС >ϋΟΜ1Η-574-201

ОАССТССАССТСТТССАСТСТСЮССОАСОСТТССТАСАСССТСКЮОООТС

ССТОСОТСТСТССТСТОСАОССТССООАТТСАССТТТОАТААОААТТСОАТООООТ

ОООТССОССАООСТССАОССААООСТСТАОАСТССОТСТСАСАОАТАТСООАТА

САССТОАТССТАСАТАСТАСОСАСАСТСАСТСААОССССОСТТСАССАТСТСССО

ССАСААТТССААОААСАСОСТОТАТСТОСАААТСААСАСССТСССТССТСАССАС

АССССОСТАТАТТАСТСТОССАТАТАТАСТОООСОТТОООТОССТТТТОАСТАСТС

ОССТСАОСОААСССТООТСАССОТСТССАОС >ΏΟΜ1Η-574-202

ОАООТОСАОСТСТТССАСТСТССееОАСССТТООТАСАОССТСООООСТС

ССТОССТСТСТССТОТССАОССТССООАТТСАССТТТТТСААОТАТТСОАТОСООТ

ОСОТСССССАООСТССАОООААОСОТСТАОАОТОООТАТСАСАОАТАТСООАТА

СТОСТОАТСОТАСАТАСТАСССАСАСТСССТОААССОССООТТСАССАТСТСССО

СОАСААТТССААСААСАСССТСТАТСТССАААТСААСАСССТСССТССССАССА

САССССООТАТАТТАСТОТОСООТАТАТАСОООТСООТСООСОССТТТТОАОТАС

ТССОСТСАОООААСССТООТСАССОТСТСОАОС >ϋΟΜ1Η-574-203

ОАООТССАОСТОТТООАСТСТОСССОАОССТТООТАСАОССТОООООСТС

ССТОСОТСТСТССТСТОСАСССТСССОАТТСАССТТТТТСААОТАТТСОАТООООТ

СССТСССССАОССТССАОСОААОООТСТАСАОТООСТСТСАСАОАТТТСССАТАС

ТОСТОАТСОТАСАТАСТАСОСАСАСТССОЮААОООССООТТСАССАТСТСССОС

ОАССАТТССААОААСАСОСТОТАТСТОСАААТОААСАОССТССОСОССОАООАС

АССССОСТАТАТТАСТОСОСОАТАГАТАССООТССОТСССССССГ'ГТТОЛОТАСТ

ООООТСАОООААСССТОСТСАССОТСТССАСС >ϋΟΜ1Η-574-204

САООТССАОСТОТТООАОТСТООСООАСОСТТСОТАСАОССТОСЮОСОТС

ССТОССТСТСТССТОТССАСССТССССАТТСАССТТТТТСААОТАТТССАТООССТ

ООСТССОССАСССТССАСССААООСТСТАОАСТОООТСТСАСАОАТТТСССАТАС

ТОСТОАТСОТАСАТАСТАСОСАСАСТСССТОААСОССССОТТСАССАТСТССССС

ОАСААТТССААСААСАСССТСТАТСТССАААТОААСАОССТСССТСТССАССАС

АССССССТАТАТТАСТСТСССАТАТАТАСОССТСАСТСОССОССТТАТОАОТАСТ

ССССТСАСССААСССТСОТСАССОТТСОАОСО >ϋΟΜ1Η-574-205

САССГССАССТС'ГТССАОТСТОООССАООСТТССТАСАСССТССССССТС

ССТОСОТСТСТССТОТОСАОССТССООАТТСАССТТТОАТААОТАТТСОАТОССОТ

ССОТССОССАСССТССАССОААССАТСТАСАСТСССТСТСАСАСАТТТССОАТАС

ТОСТОАССОТАСАТАСТАСОСАСАСТССОТСААОООСССОТТСАССАТСТСССОС

САСААТТССААСААСАСОСТСТАТСТеСАААТСААСАСТСТСССТССТСАССАСА

ССОСООТАТАТТАСТСТОССАТАТАТАСТСООСОТТООСТСЗССТТТТОАОААСТО

ОООТСАСООААСССТСОТСАСССТСТСОАОС >ϋΟΜ1ή-574-206

ОАССТССАОТТОТТСОАТТСТССССОАОССГЮСгТАСЛОССТСОООСтСТС

СССТСССССАСССТССАСССААСССТСТАОАСТОСОТСТСАСАСАТТТССОАТАС

ТОСТ&АТСОТАСАТАСТАСТСАСССТССОТОААСЮОССООТТСАССАТСТСССОС

ОАСААТТССССОААСАСОСТОААТСТССАААТОАССССССТССОТОСТОАОСАСА

СССССЗОТАТАТТАСТСТОСОАТАТАТАСТОООСОГГОСОАОССТТТТОАОТАСТО

СССТСАСОСААСССТССТСАСССТСТССАОС >ЬОМ1Ь-574-207

САСОТССАОСТОТТСОАСТСТССОССАСССАТ<ЗСТАСАСССООООСССТС

ССТОСОТСТСТССТСТССАТССТСССОАТТСАССТТТТССААОТАТТСОАТССССТ

ОООТССОССАСССТССАОССАААССТСТАСАСТСССТСТСАСАОАТТТСССАТАС

ТССТОАТСТТАСАТАСТАСССАСАСТСССТСААОССССССТТСАССАТСТССССС

САСААТТССААОААСАСОСТСТАТСТОСАААТСААСАОССТСССТССССАССАС

АССССССААТАТТАСТСТСССАТАТАТАСССеТСССТеОСССССТТТТСАСТАСТ

ООООТСАООСААСССТООТСаССОТСТСОАОС >ϋΘΜ11ι-574-208

САССТССЛСтСТСТТССАСтТСТСССССАСССГТССТАСАСССТСССССОТС

ССТОСОТСТСТССТОТССАОССТССССАТТСАССТТТСАТААСТАТТСОАТООООТ

- 38 022898

ОООТСССССАООСТССАСЮСААОСОТСТАОАСТССОТСТСАСАОАТТТСООАТАС

ТОСТОАТСОТАСАТАСТАСОСАСАСОСОСТОААСОССССЮТТСАССАТСТСССОС

САСААТТССААСААСАСССТСТАТСТОСАААТОААСАОССТОССТССТСАССАС

АССССОСТАТАТТАСТОТОСОАТАТАТАСТСООССТТСССТОССТТТТОАОТАСТС

СССТСАСССААСССТССТСАССОТСТССАСС >ООМ1Ь-574-209

ОАССТССАССТСТТОСАОТСТСОСССАСССТТСОТАСАСССТССООООТС

ССТОССТСТСТССТОТССАеССТССООАТТСАССТТТТТСААСТАТТСОАТСОООТ

СССТССОССАООСТССАОООААСССТСТАСАСТСССТСТСАСАОАТТТСССАТАС

ТОСТОАТСОТАСАТАСТАСОСАСАСТСССТСААСаСССООТТСАССАТСТССССС

САСААТТССААОААСАСОСТОТАТСТССАААТСААСАОССТОСОТСТССАСОАС

АССССССТАТАТТАСТСТСССАТАТАТАССССТСАСТСССССССТТАТОАСТАСТ

ОСССТСАСССААСССТООТСАСССТСТСОАСС >ООМ1Ь-574-2П

САССТССАССТСТТССАСТСТСССССАСССТТССТАСАСССТССССССТС

ССТСССТСТСТССТСТССАСССТССООАТТСАССТТТССТААСТАТТССАТССООТ

СССТСССССАСОСТССАОССААССОТСТАСАОТСССТСТСАСАОАТТТССОАТАС

ТОСТОАТССТАСАТАСТАСССАСАСССССТСААССОСССОТТСАССАТСТСССОС

ОАСААТТССААОААСАСОСТОТАТСТОСАААТОААСАСССТСССТОСТОАСОАС

АССССССТАТАТТАСТОТОСОАТАТАТАСТОСОССТТООСТОССТТТТСАСТАСТС

СССТСАСССААСССТОСТСАСССТСТСОАОС >ООМ1Ь-574-212

ОАООТОСАОСТОТТСЮАСТСТОООООАСССТТССТАСАОССТООСОООТС

ССТСССТСТСТССТСТОСАОССТССССАТТСАССТТТТССААСТАТТССАТСССОТ

СООТСССССАСССТССАОССААСССТСТАОАОТОСОТСТСАСАОАТТТСССАТАС

ТОСТОАТСОТАСАТАСТАСССАСАСТССОТСААСОССССОТТСАССАТСТССССС

САСААТТССААОААСАСАСТСТАССТССАААТСААСАОССТОСОТОСТОАССАС

АССССССТАТАТТАСТОТОСОАТАТАТАСТОООССТТССОТОССТТТТОАОТАСТО

ССОТСАОООААСССТССТСАССОТСТССАСС >ООМ1Ь-574-213

САСОТССАССТСТТООАСТСТСССССАСеСТТСОТАСАСССТСССССОТС

ССТСССТСТСТССТСТССАСССТССООАТТСАССТТТСАТААОТАТТСОАТССССТ

СССТСССССАСССТССАСССААСССТСТАСАСТСССТСТСАСАСАТТТСССАТАС

ТОСТОАТССТАСАТАСТАСССАСАСТССОТАААСОСССССТТСАССАТСАССССС

САСААТТССААСААСАСОСТСТАТСТССАААТСААСАСССТСССТССТСАОСАС

АССССССТАТАТТАСТОТОСОАТАТАТАСТОСССОТТОООАСССТТТТОАОТАСТ

ОСССТСАСССААСССТССТСАССеТСТССАСС >ϋΟΜ1Η-574-214

САСОТССАОСТСТТСОАСТСТСОСОСАООСТТОСТАСАССССОООСООТС

ССТСССТСТСТССТСТОСАОССТССССАТТСАССТТТТССААОТАТТССАТОСОСТ

ОООТССОССАООСТССАОСОААОООТСТАОАОТОООТСТСАСАОАТТТСООАТАС

ТССТОАТСОТАСАТАСТАСОСАСАСТССОТОААОООССООТТСАССАТСТСССОС

САСААТТССААОААСАСССТСТАТСТОСАААТСААСАСССТОССТССССАССАС

АССССССТАТАТТАСТОТОСОАТАТАСАСТОООСОТТСССТОССТТТТСАСТАСТ

ОСООТСАОООААСССТООТСАССОТСТСОАОС >ϋΜ55535

ОАССТССАОСТСТТООАСТСТСОСССАОССТТССТАСАСССТСЮСОООТС

ССТССОТСТСТССТОТОСАОССТССООАТТСАССТТТТССААОТАТТССАТСССОТ

ОССТСССССАСССТССАОООААССОТСТАОАОТОСОТСТСАСАОАТТТСССАТАС

ТССТОАТСОТАСАТАСТАСССАСАСТСССТСААСОСССООТТСАССАТСТСССОС

ОАСААТТССААОААСАСССТСТАТСТССАААТСААСАСССТСССТССТСАОСАС

АССССООТАТАТТАСТСТСССАТАТАТАСТССССОТТСССАОССТТТТСАСТАСТ

СОООТСАОССААСССТССТСАСССТСТССАОСОСТАОСАССОАСАТССАСАТСА

СССАСТСТССАТССТСССТОТСТССАТСТОТАССАСАСССТСТСАССАТСАСТТОС

СОООСААОТСОТССОАТТОООАСОАСОТТААОТТСОТАССАССАОАААССАООО

АААОССССТААССТССТСАТССТТТССААТТСССОТТТОСАААСТССССТСССАТ

САСОТТТСАСТСССАОТООАТСТСООАСАСАТТТСАСТСТСАССАТСАОСАОТСТ

ССААССТСААСАТТТТСгСТАССТАСТАСТОТССССАСОСТОООАСОСАТССТАСС

АССТТСООССААСССАССААССТССАААТСАААСОС >ϋΜ55541

САООТОСАССТСТТССАСТСТССОООАООСТТССТАСАСССТООСОООТС

- 39 022898

ССТОСОТСТСТССТОТСЗСАОССТССООАТТСАССТТТОАТААОТАТТСОАТООООТ

СООТСССССАСССТССАСХЗОААОСОТСТАОАСТССОТСТСАСАСАТТТСССАТАС

ТОСТОАТСОТАСАТАСТАСССАСАСССССТОААОССССОСТТСАССАТСТССССС

САСААТТССААСЛАСАСССТСТАТСТССАААТСААСАСССТСССТССТСАССАС

АССОСОСТАТАТТАСТСТОСОАТАТАТАСТОСОСОТТОООТОССТТТТСАОТАСТО

СССТСАСССААСССТССТСАСССТСТССАССОСТАССАСССАСАТССАОАТОАСС

САСТСТССАТССТСССТСТСТОСАТСТОТАСОАОАСССТСТСАССАТСАСТТОССС

ООСААСТСОТССОАТТООСАСОАСОГТААОТТСОТАССАОСАОАААССАО(ЗОАА

АОССССТААССТССТСАТССТОТООААТТСССОТТТОСАААОТОСООТСССАТСА

ССТТТСАСТСОСАОТССАТСТООСАСАОАТТТСАСТСТСАССАТСАОСАСТСТОС

ААССТСААСАТТТТССТАСОТАСТАСТОТССССАООСТССОАСССАТССТАСОАС

СТТСООСС ААСОСАСС ААССТСС А А АТС АААССО >ЭМ55542

САСЮТОСАОСТСгТТООАОТСТООСгООАООСТТООТЛСАОСССООООООТС

ССТОСОТСТСТССТОТОСАОССТССООАТТСАССТТТТССААОТАТТСОАТОСООТ

СООТСССССАООСТССАОООААОООТСТАОАОТОООТСТСАСАОАТТТСООАТАС

ТОСТОАТСОТАСАТАСТАСССАОАСТССОТСААСООСССОТТСАССАТСТСССОС

ОАСААТТССААОААСАСОСТОТАТСТОСАААТОААСАОССТССОТСССОАССАС

АССОСООТАТАТТАСТОТОСОАТАТАСАСТОООСОТТОООТОССТТТТОАОТАСТ

ООООТСАОООААСССТООТСАССОТСТСОАОСОСТАОСАССОАСАТССАОАТОА

СССАОТСТССАТССТСССТОТСТССАТСТОТАООАОАССОТОТСАССАТСАСТТОС

СОСОСААОТСОТСССАТТОССАСОАСОТТААСТТООТАССАОСАОАААССАОСО

АААОССССТААОСТССТОАТССТТТООААТТСССОТТТОСАААОТСОООТСССАТ

САСОТТТСАОТООСАОТСОАТСТООСАСАОАТТТСАСТСТСАССАТСАОСАОТСТ

ОСААССТОААСАТТТТОСТАСОТАСТАСТОТОСОСАООСТОООАСССАТССТАСО

АСОТТСООССААОООАССААООТООАААТСАААСОО >ЭМ55544

ОАООТОСАОСТОТТООАОТСТССОСОАСОСТТССТАСАСССТООСОООТС

ССТОСОТСТСТССТОТОСАОССТССООАТТСАССТТТОАТААОТАТТСААТООООТ

ОООТССОССАООСТССАОООААССОТСТАСАОТООСТСТСАСАСАТТТССОАТАС

ТССТСАТССТАСАТАСТАСОСАСАСТССОТСААОООССОСТТСАССАТСТССССС

ОАСААТТССААОААСАСОСТОТАТСТ(ЗСАААТОААСАОССТСССТОСТОАООАС

АССОСООТАТАТТАСТОТОСОАТАТАТАСТОООСОТТОООТОССТТТТОАОТАСТО

ОООТСАОООААСССТООТСАССОТСТСОАОСОСТАОСАССОАСАТССАОАТОАСС

САОТСТССАТССТСССТОТСТОСАТСТОТАООАОАССОТОТСАССАТСАСТТОССО

ООСААОТСОТССОАТТОООАСОАСОТТААОТТООТАССАОСАОАААССАОООАА

АСССССТААССТССТОАТССТТТООААТТСССОТТТОСАААОТССОСТСССАТСАС

ОТТТСАОТООСАОТООАТСТОСОАСАОАТТТСАСТСТСАССАТСАОСАОТСТОСА

АССТОААОАТТТТОСТАСОТАСТАСТОТОСОСАОССТОООАСОСАТССТАСОАСО

ТТСООССААОООАССААООТООАААТСАААСОО >ЭОМ1Ь-574-72

ОАООТОСАОСТОТТООАОТСТОООООАООСТТООТАСАОССТООООООТС

ССТОСОТСТСТССТОТОСАОССТССООАТТСАССТТТОТТААОТАТТСОАТООООТ

ОООТССОССАООСТССАОООААОООТСТАОАОТОООТСТСАСАОАТТТСОААТАС

ТОСТОАТСОТАСАТАСТАСОСАСАСТССОТОААОООССООТТСАССАТСТСССОС

САСААТТССААОААСАСОСТОТАТСТОСАААТСААСАСССТОСОТОСТОАОСАС

ОООТСАОООААСССТООТСАССОТСТСОАОС >ϋΟΜ1Η-574-109

ССТОССТСТСТССТОТОСАОССТССОСАТТСАССТТТОТТААОТАТТСОАТООООТ

ОООТССОССАООСТССАССОААОООТСТАОАСТСООТСТСАСАОАТТТСООАТАС

ТОСТОАТСОТАСАТАСТАСССАСАСТССОТОААСОССССОТТСАССАТСТСССОС

ОАСААТТССААОААСАСОСТОТАТСТОСАААТОААСАОССТОССТОСТОАООАС

АССОССОТАТАТТАСТОТОСОАТАТАТАСТОООССТТОООТОССТТТТОАОТАСТО

ОООТСАООСААСССТООТСАССОТСТСОАОС >ООМ1Ь-574-133

ССТССОТСТСТССТОТССАОССТССООАТТСАССТТТСТТААСТАТТСОАТОСОСТ

ССОТССОССАООСТССАОООААСООТСТАОАОТОООТСТСАСАОАТТТСООАТАС

ТОСТОАТСОТАСАТАСТАСОАТСАСТССОТОААОООССООТТСАССАТСТСССОС

ОАСААТТССААОААСАСОСТОТАТСТОСАААТОААСАОССТОСОТОССОАООАС

АССОСООТАТАТТАСТОТССОАТАТАТАСОООТСОТТОООАОССТТТТОТСТАСТО

- 40 022898

СССТСАСООААСССТООТСАССОТСТСОАСС >ϋΟΜ1Η-574-138

ОАООТОСАОСТОТТООАСТСТССОССАСССТТСОТАСАОССТСС5СООСТС

ССТОСОТСТСТССТОТОСАОССТССООАТТСАССТТТТТСААСТАТТСОАТООООТ

ОООТССОССАООСТССАОООААОООТСТАОАОТОООТСТСАСАСАТТТСООАТАС

ТОСТСАТСОТАСАТАСТАСОСАСАСТСССТСААСССССООТТСАССАТСТССССС

АСССССОТАТАТТАСТОТОСОАТАТАТАСОООТСОСТООССОССТТТТСАСТАСТ

ССССТСАОССААСССТССТСАСССТСТССАСС >ϋΟΜ1Η-574-156

ССТОСОТСТСТССТОТОСАОССТССССАТТСАССТТТТТСААСТАТТССАТСССОТ

СООТСССССАООСТССАОООААОООТСТАОАСТОССТСТСАСАСАТТТСССАТАС

САСААТТССААСААСАСССТОТАТСТССАААТСААСАСССТСССТССТСАССАС

ОООТСАОООААСССТООТСАССОТСТСОАОС >ЭОМ1Н-574-180

ОАООТОСАОСТОТТООАОТСТООСКЮАООСТТООТАСАОССТООООООТС

ССТОССТСТСТССТОТОСАСССТССССАТТСАССТТТОТТААОТАТТССАТССССТ

СССТСССССАСССТССАОССААСССТСТАСАОТСССТСТСАСАОАТТТССОАТАС

ТОСТСАТССТАСАТАСТАСОСАСАСОСООТОААООСССООТТСАССАТСТССССС

ОАСААТТССААОААСАСОСТСТАТСТОСАААТОААСАОССТОСОТОСТОАООАС

АССОССОТАТАТТАСТСТССОАТАТАТАСТОООСОТТОООТОССТТТТОАОТАСТО

ОООТСАОООААСССТСОТСАССОТСТСОАОС >ϋΟΜ1Η-574-162

ОАООТОСАОСТОТТООАОТСТООООСАООСТТООТАСАОССТООООООТС

ОООТССОССАООСТССАОООААОООТСТАОАОТОООТСТСАСАОАТТТСООАТАС

ТОСТОАТСОТАСАТАСТАСТСАСАСТСССТОААОССССССТТСАССАТСТСССОС

ОАСААТТССААОААСАСОСТОТАТСТОСАААТОААСАОССТОСОТОСТОАООАС

АССОССОТАТАТТАСТОТОСОАТАТАТАСТОООСОТТОООТСССТТТТСАОТАСТО

ОООТСАОООААСССТООТСАССОТСТСОАОС

ООМ7И-11-3

ОАСАТССАОА ТОАСССАОТС ТССАТССТСС СТСТСТОСАТ СТОТАООАСА ССОТОТСАСС АТСАСТТССС ОСССААОТСО ТССОАТТОСО АСОАССТТАА ОТТ ООТАССА ОСАОАААССА ОООАААОССС СТААОСТССТ ОАТССТТТОО ААТТСС СОТТ ТОСАААОТОС ООТСССАТСА ССТТТСАОТО ОСАОТООАТС ТОООАСАОА Т ТТСАСТСТСА ССАТСАССАС ТСТССААССТ СААОАТТТТС СТАССТАСТА СТО ТОСОСАС ССТОООАСОС АТССТАСОАС ОТТСООССАА ОООАССААОО ТООАА АТСАА АСОО

Аминокислотные последовательности >ϋΟΜ11ι-574-188

ЕУрЬЬЕ8СОСЬУ0РСО8ЬКЬ5САА5ОРТРВКУЗМО^УЕ«ЗАРОКСЬЕ\¥УЗ<318

0ΤΑΓΚΤΥΥΑΗδνΚ0ΚΓΤΙδΚΒΝδΚΝΤΕΥΕ(}ΜΝδΕΚΑΕΟΤΑνΥΥ€ΑΙΥΤΟΚ\ννΡΡΕΥ

ХУОрОТБУТУЗЗ >РОМ1Ь-574-189

ЕУСЗЬЬЕЗОООЬУрРООЗЕКЬЗСААЗОРТРРКУЗМО^УКрАРОКОЬЕАУУЗрЬ ϋΤΑϋΚ.ΤΥΥΑΗδνΚ0ΚΠΊ8ΚΒΝδΚΝΤΈΥΕ()ΜΝ3ΕΚΑΕϋΤΑνΥΥεΑνΥΤΟΚ.\νΕΡΡΕΥ χνοςοτΕντνδδ >ϋΟΜ1Η-574-190

ΕνρΕΕΕδΟΟΟΕν^ΡΟΟδΕΚΕδεΑΑδΟΡΊΤΡΚΥδΜΟννΊΚί^ΑΡΟΚΟΕΕλΥνδβΙδϋ

ΤΑΟΚ,ΤΥΥΑΗδνκΟΚΡΤΙδΚΟΝδΚΝΤΕΥΕΡΜΝδΕΚΑΕΟΤΑνΥΥΟΑνΥΤΟΚ-ΑνΑΡΡΕΥ ν/ΟβΟΤΕντνδδ >ϋΟΜΐΗ-574-191

ΕνρΕΕΕ5000Εν(5Ρ005ΕΚΕ5€ΑΑ50ΡΤΡ5ΚΥ5ΜΟ\ννκς»ΑΡΟΚΟΕΕ\νν5ς>Ι5 ϋΤΑϋΚΤΥΥΑΗδνΚΟΚΡΤΙδΚΡΝδΚΝΤΕΥΕφΜΝδΕΚΑΕΟΤΑνΥΥεΑΙΥΤΟΚνννΡΡΕΥ ΧνΟβΟΤί νΤΥδ8

- 41 022898 >ϋΟΜ1Η-574-192

ЕУ9ЬЬЕ8(ХЮЬУрРООЗии.ЗСААЗОР1Г5К¥8МО\¥УК(}АРОКОЬЕ\¥У891$

ΟΤΑΒΚΤΥΥΑΗ8νΚΟΚΡΉ8ΚΟΝ8ΚΝΤΕΥΕ^ΜΝ3ΕΚΑΕΟΤΑνΎΥ€ΑΙΥΤ(ϊΚΛννΡΡΕΝ \¥С(5ОТЬУТУ85 >ϋΟΜ11ι-574-193

ЕУрЪЬЕЗОСОЬУ<5РООЗЫ<ЬЗСААЗОРТРОК¥ЗМС\¥УКрАРОКОРЕ\УУ3918

ΟΤΑϋΚΤΥΥΑΗ5νΚΟΚΡΤΝ8ΚΟΝ5ΚΝΤΕ^,ιΤ9ΜΝ3ΡΚΑΕΌΤΑνΥΥε.ΑΙΥΤΟΚ.\νΕΡΡΕΥ

ЖКЗОТЬУТУЗЗ >ϋΟΜ1Η-574-194

ЕУОЬЬЕ8СЮОЬУ9РООЗЬКЬЗСААЗОРТРУКУ5МОЛ¥УК9АРОКОЬЕ\¥У5р13

ΟΤΑΓ>Κ.ΤΥΥΑΗΑνΚ<5ΚΡΊΊ5ΚΟΝ8ΚΝΤΕΥΕ<3ΜΝ5ΕΚΑΕΟΤΑνΥΎεΑΙΥΤΟΚ5¥νΡΡΕΥ

ЖКМЗТЬУТУЗЗ >ϋΟΜ1Η-574-195

ЕУрЬЬЕЗООСЬУрРООЗЬКЕЗСААЗОРТРРКУЗМОХУУКОАРОКОЬЕХУУЗСЯЗ

ΟΤΑϋΡΤΥΥΑΗ8νΚϋΚΡΤΙ5Κ.ΟΝδΚΝΤΕΥΕρΜΝ5Ι.ΡΑΕΟΤΑνΥΥ€.ΑΙΥΤΟΡ.\νΕΡΡΕΥ

ЖХХЗТЬУТУЗЗ >ϋΟΜ1Η-574-196

ЕУ9ЬЬЕ8ОООЕУ9РСС5ЬКЕ5САА8СРТРЗКУ8МО^УК9АРСКСЬЕ\¥УЗр18

ΟΤΑϋΚΤΥΥΑΗ3νΚΟΚΡΤΙ8ΚΟΝ5ΚΝΤΕΥΕ9ΜΝ3ΕΚΑΕΟΤΑνΥΥ€ΑΙΥΤΟΚ\νΕΡΡΕΥ №СС>СТЬУТУ53 >ϋΟΜ11ι-574-201

ЕУ0ЬЕЕЗССОЬУ9РООЗЬКЬЗСАА8ОРТРОКК5МО^УК<ЗАРОКСЬЕ\¥У3018

ΟΤΑΟΚΤΥΥΑΗ8ΕΚΟΚΡΊΊ3ΐωΝ3ΚΝΤΕΥΕ9ΜΝ8ΕΚΑΕΟΤΑνΥΥ€ΑΙΥΤΟΚ.\ννΡΡΕΥ

ХУСК^СТЕУТУЗЗ >ИОМ1Ь-574-202

ЕУ(£ЕЕЕЗСССЕУ<ЗРОО8ЕКЕ5САА5(ЗРТРРКУ5МС\¥УК(ЗАРОКСЕЕ\УУ5<318

ΟΤΑϋΚΤΥΥΑΗ5νΚΟΚΡΤΙ3ΚΟΝ5ΚΝΤΕΥΕΟΜΝ8ΕΚΑΕΟΤΑνΥΥΟΑ\ΎΤΘΚΛνΑΡΡΕΥ \¥С<5ОТЕУТУ55 >ϋΟΜ1Η-574-203

ЕУРЕЕЕЗОООЕУ0РОО5ЕКЕЗСААЗСРТРРКУЗМО\УУК9АРСКОЕЕ\УУ8р18 ϋΤΑϋΚΤΥΥΑΗ5νΚΟΚΡπ5ΐα>Ώ5ΚΝΤΕΥΕ9ΜΝ3ΕΚΑΕΟΤΑνΥΥ€ΑΙΥΤΟΚΑνΑΡΡΕΥ

УОЗОТЕУТУЗЗ >ϋΘΜΐΗ-574-204

ΕνρΕΕΕ3ΟΟ0ΕνςΡ0Ο3ΕΚΕ8€ΑΑ30ΡΤΡΡΚΥ5ΜΟ\ννΡ.ζ)ΑΡ0ΚΟΕΕλνν3ρΐ5 ϋΤΑϋΚΤΥΥΑΗ8νΚΟΚΡΤΙ3ΚΟΝ5ΚΝΤΕΥΕ9ΜΝ3ΕΚνΕΟΤΑνΥΥεΑΙΥΤθρ\νΑΡΥΕΥ

ΧνΟΟΟΤΕντνΚΑ >ϋΟΜΐΗ-574-205

ЕУрЕЕЕ5СССЕУОРО<г8ЕКЕ8САА5СРТРОКУЗМС\УУК<)АРСКОЕЕ5УУ8<318

ΟΤΑϋΚΤΥΥΑΗ3νΚΟΚΡΤΙ3ΚϋΝ3ΚΝΤΕΥΕΡΜΝ3ΕΚΑΕυΤΑνΥΥεΑΙΥΤΟΚ\ννΡΡΕΝ

ЖЗНСТЕУТУЗЗ >ООМ1Ъ-574-206

Εν0ΕΕΟ50α0Ενς>Ρ0Ό8ΕΡΕ5ΕΑΑ5ΟΡΤΡΡΚΥ3Μ0\ννΚ9ΑΡΟΚΟΕΕ\νν5ρΐ5

ΟΤΑΟΚΤΥΥ3Ρ8νΚΟΚΡΤΙ3ΚϋΝ30ΝΤΕΝΕΡΜΤΡΕΚΑΕϋΤΑνΥΥ€ΑΙΥΤΟΚ\νΕΡΡΕΥΑν

ООСТЪУТУЗЗ >ΟΟΜ1Η-574-207

ЕУрЕЕЕЗСССМУрРОСЗЕКЕЗСАЗЗОРТРЗКУЗМОАУУКрАРОКСЕЕХУУЗСДЗ ϋΤΑΟΕΤΥΥΑΗ5νΚΟΚΡΤΙ5ΚΟΝ5ΚΝΤΕΥΕ(}ΜΝ5ΕΚΑΕϋΤΑΕΥΥ€ΑΙΥΤΟΚ\νΑΡΡΕΥ \УС(5СТЕУТУ55 >ϋΟΜ1Η-574-208

ЕУрЕЕЕЗСООЕУрРСОЗЕКЕ8САА5ОРТРОКУЗМО\УУКрАРОКОЕЕ\УУЗр18 ϋΤΑΟΚΤΥΥΑΗΑνΚΟΚΡΊΊ5ΚΟΝ5ΚΝΤΕΥΕ(3ΜΝ5ΕΚΑΕΟΤΑνΥΥ€ΑΙΥΤΟΚ\ννΡΓΕΥ \УС<ЗСТЕУТУ35 >ϋΟΜ1Η-574-209

Εν<3ΕΕΕ3ΟΟ0Εν<5Ρ0Ο5ΕΚΕ5εΑΑ50ΡΤΡΡΚΥ8ΜΟ\ννΚ<3ΑΡ0Κ0ΕΕ\νν89Ι8

ΟΤΑΟΚΤΥΥΑΗ8νΚΟΚΡΤΙ3ΚΟΝ5ΚΝΤΕΥΕΡΜΝ3ΕΚνΕΟΤΑνΥΥ€ΑΙΥΤΟρ\νΑΡΥΕΥ \УС<)ОТЕУТУ83

- 42 022898 >ЭОМ1Ь-574-211

ЕУ0ЬЬЕЗОООЬУ0РОО8ЬКЬ8САА8ОРТРАК¥8МС\УУК9АРОКОЬЕ\¥У8018

ΟΤΑΟΚ.ΤΥΥΑΗΑνΚΟΚΡπδΚΟΝ8ΚΝΤΕΥΕ9ΜΝ8ΕΚΑΕΟΤΑνΥΥ€ΑΙΥΤΟΚ\ννΡΡΕΥ

ХУСбОТБУТУЗЗ >ЭОМ1Ь-574-212

Εν<3ΕΕΕ3ΟΟθΕν<3ΡΟθ3ΕΚΕ5εΑΑ3ΟΡΤΡ3ΚΥ3Μθ\ννΚ9ΑΡΟΚθΕΕ\νν3()Ι3

ΟΤΑϋΚ.ΤΥΥΑΗ5νΚΟΚΡΤΙ5ΚϋΝ3ΚΝΤΕΥΕ9ΜΝ3ΕΚΑΕΟΤΑνΥΥ€ΑΙΥΤΟΚ\ννΡΡΕΥ \νθ<3ΟΤΕντν58 >ΏΟΜ1Η-574-213

ЕУрЕЕЕ500ОЕУрР0О5ЕКЕ5САА50РТРОК¥5МО\УУК<}АРОКСЕЕ\УУ5р15

ΟΤΑΟΚΤΥΥΑΗ3νΚΟΚΡΠΤΚΟΝ3ΚΝΤΕΥΕΡΜΝ3ΕΚΑΕϋΤΑλΑΥΥθΑΓΥΤΟΚ\νΕΡΡΕΥ

ЖХ>ОТЕУТУ55 >ϋΟΜ1Η-574-214

ЕУрЕЕЕЗОООЕУрРООЗЕКЕЗСААЗОРТРЗКУЗМОХУУКрАРОКОЕЕЧУУЗрГЗ

ΟΤΑϋΚΤΥΥΑΟ5νΚΟΚΡΤΙ3ΚϋΝ3ΚΝΤΕΥΕ9ΜΝ5ΕΚΑΕΟΤΑνΥΥ€ΑΙΥΤΟΚλννΡΡΕΥ

ХУОСЮТЬУТУЗЗ >ϋΜ35535

ЕУрЕЬЕЗ(ЮОЕУрРСС5и<Ь5САА5ОРТР5КУ5МО\УУК<)АРСКСЕЕУ¥У5<}15 ϋΤΑϋΚΤΥΥΑΗ3νΚΟΚΡπ3ΚϋΝ3ΚΝΤΕΥΕ9ΜΝ8ΕΚΑΕΟΤΑνΥΥΕΑΙΥΤΟΚΑνΕΡΡΕΥ \ν<^ΟΤΕντν55Α5ΤΏΙ9ΜΤ95Ρ55Ε5Α5νθΟΚνΤΙΤ<:ΚΑ5ΚΡΙΟΤΤΕ5\νΥς>(3ΚΡΟΚΑΡ

КЫЛ1А\ТЧ8КЬРЗОУР5КР8С5СЗСТОРТЬТ158Ь<2РЕВРАТ¥УСА<ЗАСТНРТТРОРСТК

УЕКК >ΌΜ55541

Е\'9ЕЕЕЗОООЕУрРС05ЕКЕ8САА80РТРОК¥5МС\У\'К9.АРОКСЕЕ'ЛУ8р18

ΟΤΑϋΚΤΥΥΑΗΑνΚΟΚΡΤΙδΚΟΝδΚΝΤΕΥΕΟΜΝδΕΚΑΕϋΤΑνΥΥεΑΙΥΤΟΚΧννΡΡΕΥ \ν<ΧΣΟΤΕνΊΎ55Α5ΤΏΙ9ΜΤ<35Ρ55Ε5Α5νθΟΚνΊΊΊΌΚΑ5ΚΡΙΟΤΤΕ3\ΥΥ<50ΚΡΟΚΑΡ

КЕЕЕЛУЖадЗОУРЗИРЗОЗОЗСТПРТЕПЗЗЕрРЕПРАТУУСАрАСТРФТТРОрСгТК

УЕПСК >ϋΜ35542

ЕУрЕЕЕ5000ЕУ9Р005ЕКЕ5САА50ГТР5КУ5МО\У\ТЮАРОКОЕЕУт<515 ϋΤΑΏΚΤΥΥΑΟ3νΚΟΚΡΤΙ3Κ0Ν3ΚΝΤΕΥΕ0ΜΝ3ΕΚΑΕϋΤΑνΥΥ€ΑΓΥΤΟΚ\ννΡΡΕΥ \¥(ЮОТЬУТУ55А5ТОЮМТ(ЗЗР38Ь5А8УООКУТГГСКА5КРгаТТЬ31УУ<ЮКРОКАР

КЕЬ1Ь\\Т45КЕ93&УР5КР5О8О86ТОРТЬТ188Ь0РЕОРАТУУСА<ЗАОТНРТТР6<ЗОТК

УЕПСК >ϋΜ85544

ЕУ0ЕЬЕ5ОООЕУ(ЗРООЗЬКЕ5САА5ОРТРПКУ5МО\УУК(ЗАРОКОЬЕ\УУ5С>18

ΟΤΑΕ>ΚΊΎΥΑΗ5νΚΟΚΡΤΙ5ΐυ^5ΚΝΤΕΥΕΟΜΝ5ΕΚΑΕΟΤΑνΥΥ€ΑΙΥΤΟΚΑ¥νΡΡΕΥ

ХУСЮСТЬУТУЗЗАЗТОЮМТрЗРЗЗЬЗАЗУСПКУПТСКАЗКРЮТТЬЗУУУррКРСКАР

КЬЫЬРЖЗКЕОЗеУРЗКРЗСЗСЗСТОРТЬПЗЗЬОРЕОРАТУУСАОАОТНРТТРСООТК

УЕПСК >ϋΟΜ1Κ-574-72

ЕУрЬЬЕЗОСХгЬУрРбОЗЕКЬЗСААЗОРТРУКУЗМОАУУКрАРОКОЕЕХУУЗСНЗ

ΝΤΑΟΚΤΥΥΑΗ8νΚΟΚΡΤΙ3ΚυΝ8ΚΝΤΕΥΕΟΜΝ8ΕΚΑΕΟΤΑνΥΥ€ΑΙΥΤΟΚΐννΡΡΕΥ \¥0<30ТЬУТУ35 >ϋΟΜ11ΐ-574-]09

ЕУРЕЕЕ8СЮОЕУ<)РОО8ЕКЬ5САА5СгРТРУКУ8МО\¥УК(ЗАРОКОЕЕ\¥У8()13

ΟΤΑΟΚΤΥΥΑΗ5νΚΟΚΡΤΙ5ΚΒΝ8ΚΝΤΕΥΕ<3ΜΝ5ΕΚΑΕΕ>ΤΑνΥΥεΑΙΥΤΟΚΑ¥νΡΡΕΥ

ХУОСЗОТЬУТУЗЗ >ϋΟΜ1Ε-574-133

Εν9ΕΕΕ5ΌΟΟΕνςΡ<Χί8ΕΚΕ5€ΑΑ3ΟΡΎΡνΚΥ3ΜΟ\ννΚ9ΑΡΟΚΟΕΕ\νν8(}Ι5 υΤΑϋΚΤΥΥϋΗ5νΚΟΚΡΠ5ΚΟΝ5ΚΝΤΕΥΙ,<3ΜΝ5ΕΚΑΕΟΤΑνΥΥ€ΑΙΥΤΟΚ\νΕΡΡνΥ \\'ОрОТЕУРУ88 >ϋΟΜ11ι-574-138

Εν9ΕΕΕ50Ο0Εν<}Ρ0<35ΕΚΕ5ΕΑΑ50ΡΤΓΓΚΥ5Μ0\ννΚ<2ΑΡ0Κ0ΕΕ\Υν59Ι5 ϋΤΑΟΚΤΥΥΑΗ3νΚΟΚΡΤΙ8ΚϋΝ5ΚΝΤΕΥΕ(3ΜΝ5ΕΚΑΕΟΤΑνΥΥΕΑΙΥΤΟΚ\νΑΡΡΈΥ

УУОООТЬУТУЗЗ

- 43 022898 >ϋΟΜ1Ιι-574-156

ЕУрШЗСССЬУрРССЗЬКЬаСААКОРТРРКУКМС^УКОАРОКСЬЕУт/да

ΟΤΑϋΚΤΥΥΑΗ8νΚΟΚΡΉ8ΚΟΝ8ΚΝπ.ΥΕ0ΜΝ8ΕΚΑΕΟΤΑνΥΥεΑΙΥΤΟΚ\ννΡΡΕΥ «СРОТЬУТУЗЗ >ϋΟΜ1Η-574-180

ЕУОЬЬЕЗСЮСЬУрРООЗЬ^БСААЗСРТРУКУЗМОУЛ-'КРАРСКСЬЕт'З/ЦЗ

ΟΤΑΟΚΤΥΥΑΗΑνΚΟΚΡΤΙδΚΟΝδΚΝΤΕΥΕΟΜΝδΕΚΑΕΟΤΑνΥΥΟΑΙΥΤΟΚΧννΡΡΕΥ

МХ)ОТЬУТУЗЗ >ϋΟΜ1Η-574-162

ЕУрЕЕЕ5СОСЕУ0РССЗЫ<ЬЗСАА8СРТРРКУ5МС'Л'УК9АРОКСЬЕ\УУ5015 ϋΤΑυΚΤΥΥ3Η3νΚΟΚΡΤΙ3Κυΐ\3Κ.\ΤΕΥΙ_<3ΜΝ3ΕΚΑΕΟΤΑνΥΥ(:ΑΙΥΤΟΚΥ,'νΡΓΕΥ

ХУСрОТЬУТУЗЗ

ООМ7Ы1-3

0Ι0ΜΪ08Ρ33Ε3Α3νί;θΚνΤΙΤ€ΚΑ5ΚΡΤΟΤπ.8\νΥΡ0ΚΡΟΚΑΡΚΕΕΙΕΨΝ5ΚΕ

0δΟ\Τ5ΡΓ3Ο8<;8«ΤΟΡΤΕΤΙ55ΕρΡΕηΡΑΤΥΥ€Α0ΛΟΤΗΡΤΤΡα<5αΤΚνΕΙΚΚ

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Единичный вариабельный домен иммуноглобулина против рецептора ΨΝΡα (фактор некроза опухоли α) 1 типа (ТМРК!; р55), содержащий аминокислотную последовательность с 8ЕЦ ГО NО: 59.
2. Полиспецифический лиганд, содержащий единичный вариабельный домен иммуноглобулина по

п.1.
3. Полиспецифический лиганд, содержащий единичный вариабельный домен иммуноглобулина по п.1 и по меньшей мере один единичный вариабельный домен иммуноглобулина, который специфически связывает сывороточный альбумин (8А).
4. Полиспецифический лиганд по п.2 или 3, где лиганд содержит: (1) единичный вариабельный домен иммуноглобулина против рецептора ΊΝΕα 1 типа (ТЖК1; р55) по п.1, (2) по меньшей мере один единичный вариабельный домен иммуноглобулина против сывороточного альбумина (8А), который специфически связывает 8А, где единичный вариабельный домен иммуноглобулина против (8А) содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична (или на 100% идентична) последовательности с 8ЕЦ ГО NО: 76, и (3) возможно где между единичным вариабельным доменом против ТЫРК! и единичным вариабельным доменом против 8А имеется линкер.
5. Лиганд по п.4, где линкер содержит аминокислотную последовательность А8Т (возможно А8Т8СР8) или где линкер представляет собой А8(С₄8)_п, где п равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8, например А8(С48)э.
6. Полиспецифический лиганд, содержащий аминокислотную последовательность с 8ЕЦ ГО NО: 66.
7. Полиспецифический лиганд, состоящий из аминокислотной последовательности с 8ЕЦ ГО NО:

66.
8. Антагонист рецептора ΨΝΕα 1 типа (ТЖК1; р55), содержащий единичный вариабельный домен или полиспецифический лиганд по любому из пп.1-7.
9. Применение антагониста рецептора ΊΝΕα 1 типа (ТЖК1; р55), содержащего единичный вариабельный домен или полиспецифический лиганд по любому из пп.1-8, в терапии.
10. Применение по п.9, где антагонист доставляют перорально, доставляют в ЖК (желудочнокишечный) тракт пациента, доставляют пульмонально, доставляют в легкое пациента или доставляют системно.
11. Применение по п.9 или 10 для лечения и/или профилактики воспалительного состояния.
12. Применение по п.9 или 10 для лечения артрита, ревматоидного артрита или ювенильного ревматоидного артрита.
13. Нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична (или на 100% идентична) нуклеотидной последовательности с 8ЕЦ ГО NО: 32.
14. Нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, которая кодирует единичный вариабельный домен иммуноглобулина против рецептора ΨΝΕα 1 типа (ТЖК1; р55) по п.1.
15. Нуклеиновая кислота по п.14, содержащая нуклеотидную последовательность, которая кодирует единичный вариабельный домен иммуноглобулина против рецептора ΕΝΕα 1 типа (ТЫРК!; р55) по п.1, где нуклеотидная последовательность по меньшей мере на 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична (или на

- 44 022898

100% идентична) нуклеотидной последовательности с δΕΟ ГО NО: 25.
16. Нуклеиновая кислота по п.14 или 15, содержащая нуклеотидную последовательность, которая кодирует единичный вариабельный домен иммуноглобулина против рецептора ΤΝΡα 1 типа (ΤΝΡΚ1; р55) по п.1, где нуклеотидная последовательность представляет собой нуклеотидную последовательность с δΕΟ ГО ΝΘ: 25.
17. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по пп.13-15 или 16.
18. Клетка-хозяин (возможно нечеловеческая эмбриональная клетка), содержащая вектор по п.17.
19. Фармацевтическая композиция, содержащая: (а) антагонист рецептора ΤΝΡα 1 типа (ΤΝΡΚ1; р55), как определено в любом из пп.1-8, и (б) один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов.