JP3095168B2 - ドメイン‐変性不変部を有する抗体 - Google Patents

ドメイン‐変性不変部を有する抗体

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JP3095168B2 JP01502277A JP50227789A JP3095168B2 JP 3095168 B2 JP3095168 B2 JP 3095168B2 JP 01502277 A JP01502277 A JP 01502277A JP 50227789 A JP50227789 A JP 50227789A JP 3095168 B2 JP3095168 B2 JP 3095168B2
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies

Description

【発明の詳細な説明】 序論 技術分野 本発明は、モノクローナル抗体及び特にドメイン−変
性不変部を有する遺伝的に変性されたモノクローナル抗
体に関する。
発明の背景 天然に存在する特異的結合分子、たとえば免疫グロブ
リン、酵素及び膜タンパク質は、過去10年にわたって商
業的用途においてひじょうに拡大して来た。モノクロー
ナル抗体の出現により、免疫グロブリンの有用性がひじ
ょうに拡大して来た。しかしながら、多くの用途におい
て、モノクローナル抗体の使用は、そのモノクローナル
抗体が生物学的環境に使用される場合、ひじょうに制限
される。たとえば、最っとも通常の生産体種であるゲッ
歯動物、たとえばマウスにおいて産生されるモノクロー
ナル抗体は、他の種に対して免疫原性である。
種間の交差免疫原性は、免疫グロブリンの不変部の機
能である。その不変部は、多くの特異的機能、たとえば
補体結合、異化速度の細胞受容体結合制御、アナフィラ
キシー、オプソニン化、胎盤及び腸トランスファー、及
び免疫調節を有し、そして免疫原性でもある。従って、
特定の抗原に対して特異的な結合領域（可変部）と共
に、特定の種からの細胞又はタンパク質に結合する不変
部を有することが所望されるであろう情況が存在する。
所望する抗原特異性のネズミモノクローナル抗体を産
生することは一般的に、比較的容易であるけれども、所
望する不変部特性を有するヒトモノクローナル抗体を産
生することはより一層難かしい。ヒトモノクローナル抗
体は、多くの用途、特にヒトの生体内診断及び治療のた
めに好ましい。マウス骨髄腫細胞又はハイブリドーマに
由来する抗原特異性を有するキメラ抗体が、モノクロー
ナル抗体固有の種制限を一部克服するためにヒト不変部
に連結された。トランスフェクトーマス（transfectoma
s）により産生される、遺伝子工学的に製造された抗体
はまた、正常な脾臓細胞への続く融合をもたらす抗体の
アイソタイプの変更、通常IgG抗体の産生を可能にし
た。
しかしながら、ネズミ可変部及びヒト不変部を有する
キメラ抗体を産生するためにトランスフェクトーマスを
用いる事に何らかの障害が存在した。たとえば、初めに
産生されたキメラ抗体は、不変部が供与体のヒト不変部
の性質のすべてを有する抗体に制限された。増強された
又は減じられた特性、たとえば補体の結合は、多くの用
途のために所望される。
従って、容易に入手できる源からの可変部の使用によ
り利用できる広い範囲の結合特異性を保持しながら、変
性された生物学的機能を有する免疫グロブリンを調製す
ることに相当の興味が存在する。
関連文献 Oi:など.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1983）80:825〜8
29;Morrisonなど.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1984）81:
6851〜6855;Ochiなど.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA（198
3）80:6351〜6355;及びOchiなど.,Nature（London）（1
983）302:340〜342は、トランスフェクトーマスにおけ
る免疫グロブリン発現を記載する。Neubergerなど.,Nat
ure（London）（1985）314:268〜270及びBouhanneな
ど.,Nature（London）（1984）312:643は、マウス可変
部及びヒト不変部を有する抗体を分泌するトランスフェ
クトーマスを記載する。Neubergerなど.,Nature（Londo
n）（1984）312:604〜608は、非免疫グロブリン配列と
共有結合する抗原結合ドメインの発現を記載する。Adva
nces in Immunology,第40巻、61〜134ページは、IgのFc
部分に存在する生物学的活性を書評する。免疫グロブリ
ン遺伝子は、多くの出版物、たとえばWatsonなど.,Mole
cular Biology of the Gene,第II巻、Benjamin/Cumming
s,Menlo Park,California,第４版、1987、チャプター2
3、及び本明細書に引用される出版物に開示され、そし
て書評されている。
発明の要約 少なくとも１つの結合部位領域及びドメイン変性不変
部を有する抗体が付与される。ドメイン変性は、不変部
のドメイン:CL,CH1,ヒンジ部,CH2,CH3又はCH4の少なく
とも１種の実質的にすべてのアミノ酸の置換、挿入又は
欠失のいづれかである。ドメイン変性された不変部を有
する抗体の機能性質は、特定の用途のために所望する生
物学的機能を増強するために選択される。抗体の不変部
ドメインは、そのＬ鎖から排除され、又は種々のアイソ
タイプ又は免疫グロブリン種のドメインにより挿入され
又は置換される。その置換又は挿入されたドメインは、
同じ動物、同じ動物の種又は異なった動物の種からの同
じ抗体又は異なった抗体からであり得る。この方法にお
いては、生物学的分子の機能的性質が所望する用途のた
めに最適化され得る。
ドメイン変性された不変部をコードするDNA構造体、
完全な不変部−ドメイン変性された抗体をコードする構
造体及びそのような抗体を発現する抗体もまた供給され
る。
図面の簡単な説明 第１図は、不変部を交換するために使用されるクロー
ニングカセットを示し； 第２図は、不変部ドメインを交換するために使用され
るクローニングカセットを示し； 第３図は、不変部ドメインを欠失又は重複するために
使用されるクローニングカセットを示し； 第４図は、カルボキシ末端ドメインを欠失するために
使用されるクローニングカセットを示し；そして 第５図は、アミノ末端ドメインを欠失するために使用
されるクローニングカセットの２種の変種を示す。
特定の態様の記載 ドメイン変形不変部を有する抗体の産生のための新規
方法及び組成物が供給される。本発明は、抗体の不変部
の１又は複数のドメインの変性に特に関与し、ここでド
メインは、不変部が由来する原抗体の結合部位又は可変
部に、又は他の抗体に結合され得る。その完全な抗体
は、宿主動物中に本来存在し又は遺伝的に変性され得る
少なくとも１種の結合部位領域を有する。抗体の結合部
位領域の変更は、本発明の部分を構成せず、但しそのよ
うな変更された結合部位を有する抗体は、それらの不変
部が本発明に記載されるようにして変性される場合、本
発明の範囲内にあるであろう。
本明細書に使用される場合、ドメイン変性不変部と
は、抗体の鎖におけるCL,CH1,ヒンジ,CH2,CH3又はCH4の
少なくとも１種のドメインのアミノ酸の実質的にすべて
が欠失され、挿入され又は交換されていることを意味す
る。交換されるとは、種々の源からのドメインが抗体に
本来存在するドメインと置換されることを意味する。変
性が置換である場合、通常、ドメインは、他のアイソタ
イプ又はアイソタイプクラスの抗体の同等のドメイン又
は同じ又は異なった抗体のＬ鎖からの同等のドメインに
より置換される。通常、ドメインの挿入は、原抗体の１
又は複数のドメインの重複である。しかしながら、他の
置換及び重複もまた行なわれ得る。
ドメイン変性不変部を有する抗体は、結合に関与する
抗体の一部をコードする遺伝子セグメント及び同じか又
は異なった宿主動物に由来するドメイン変性不変部をコ
ードする遺伝子セグメントを含む融合遺伝子から調製さ
れ得る。２種の発現カセット、すなわちＨ鎖をコードす
るカセット及びＬ鎖をコードするカセットが、完全なド
メイン変性不変部抗体を産生することにおいて一般的に
関与し、この遺伝子は発現及びプロセッシングのための
条件下で適切な真核宿主中に導入される。その遺伝子が
発現され、そしてその抗体鎖が一緒に結合する場合、そ
の組立てられた抗体が得られる。その抗体は、IgM,IgG,
IgA,IgD及びIgEクラス並びに個々のクラスの種々のサブ
クラス（たとえばヒトIgG1〜IgG4）を包含する。鎖タイ
プは、Ｌ鎖のためにκ又はλ及びＨ鎖のためにμ，γ，
α，δ及びεを含む。アイソタイプによる分類は、その
クラス及びサブクラス、Ｌ鎖タイプ及びサブタイプを言
及し、そしてまた、可変部グループ及びサブグループに
も適用され得る。マウス免疫グロブリンのためのアイソ
タイプの表示例は、IgG2a（κ）である。
結合部位又は可変部は、所望する特異性を付与するア
ミノ酸配列と共に変化するであろう。免疫グロブリンの
可変部は、便利な源、通常哺乳類（ゲッ歯動物、たとえ
ばマウス又はラット、ウサギ又は他の脊椎動物、）に由
来し、又は免疫グロブリンを産生することができる哺乳
類又は他のものに由来する。可変部は、遺伝的に変性さ
れ、又は天然に存在する。
免疫グロブリンの不変部及びIgMのためのＪ鎖（Ｈ又
はＬ免疫グロブリン鎖のＪ領域と同じでない）は、可変
部の源と同じか又は異なる脊椎動物源、特に哺乳類源、
より特別には霊長類又は家畜、たとえばウシ、ブタ、ウ
マ、イヌ、ネコ又は同様のもの、及び最っとも特別には
ヒトに由来するであろう。不変部の源は、可変部の源と
同じか又は異なった種の同じ動物か又は異なった動物の
いづれかであり得る。
既知のように、抗体鎖の不変部は、種に対して特異的
である。それぞれのクラス内に、多くのアロタイプが存
在するであろう。抗体のドメイン変性不変部部分は、通
常、抗体の意図する使用に従って選択されるであろう。
まず第１の考慮として、抗体が診断又は治療のために宿
主動物中に導入される場合、不変部又は免疫原性部分
が、宿主の免疫応答を最少にするために選択されるであ
ろう。従って、時々、不変部の源は、ヒトへの使用を意
図する場合、ヒトである。
抗体分子の可能性ある適用は、それらの抗原特異性の
みならず、またそれらのエフェクター機能により決定さ
れる。従って、２番目の考慮として、ドメイン変性抗体
は、特定の機能を行なうためのそれらの能力を最適化す
るために選択される。たとえば、抗体の半減期を増強す
ることに関係するドメインは、特定の適用に依存して、
増強された又は短くされた半減期を付与するために変性
されるであろう。本発明に教授される技法を用いて選択
的に変性される、抗体における他の機能は、組織分布、
補体を固定する能力及び抗体依存性細胞毒性に関係する
能力を包含する。
３番目の考慮として、抗体は、生体外操作を促進する
ために変性される。たとえば、抗体は、結合部位特異性
を変えないで放射性活性異性体又は薬物の分子を容易に
添加できるように変えられ得る。抗体が薬物投与システ
ムとして機能する場合、多量に分泌され得る抗体におけ
る薬物の共有結合の増強が所望されるであろう。
不変部の変性は、少なくとも１つのドメインのアミノ
酸の実質的にすべてのアミノ酸の欠失、挿入又は置換で
あり得る。ドメインのアミノ酸を言及する場合、“実質
的にすべて”とは、操作される100％のアミノ酸を包含
するだけでなく、また100％以下、たとえば80％、85
％、90％又は95％のアミノ酸も言及することができる。
イントロンにおける制限部位の使用によるドメイン中の
100％のアミノ酸の操作が最っとも一般的である。多く
の抗体機能は、第１表に例示されるようにドメインに局
在されている。Paul,Fundamental Immunology,Raven Pr
ess,New York,NY,1984を参照のこと。
これらのドメインの機能は既知であるので、特定のエ
フェクター機能は、その機能に関連するドメインを欠失
し又は挿入することによって又は所望する特性のために
ほとんど効果的に機能しない対応するドメインと異なっ
たクラス又はアイソタイプの抗体のドメインとを置換す
ることによって変性され得る。
１又は複数の欠失が、本発明のドメイン変性不変部を
調製することにおいて存在する。操作された欠失ドメイ
ンは、隣接していてもよく又は隣接していなくてもよ
い。その欠失ドメインは、不変部のカルボキシ−末端ド
メイン、１又は複数の内部ドメイン又はアミノ末端ドメ
インであり得る。特定の使用のために必要でない又は有
害な機能に関連するドメインは、排除され得る。たとえ
ば、補体結合を所望しない場合、CH2ドメインが欠失さ
れ得る。非本質的なドメインの欠失は、抗体分子の分泌
はアセンブリーを促進せしめることができる。たとえ
ば、CH1、すなわちＨ鎖結合タンパク質の結合部位の欠
失は、関連するＬ鎖を伴わないでＨ鎖の分泌を可能にす
るであろう。ドメインの欠失は、免疫グロブリンのいづ
れかの生物学的特性に影響を及ぼすために選択され得
る。
Ｈ鎖の不変部が置換により変性される場合、その置換
は、CL,CH1,ヒンジ,CH2又はCH3のドメイン、又はIgM及
びIgEの場合、CH4ドメインの少なくとも１つのドメイン
の実質的にすべてのアミノ酸を包含する。そのドメイン
は、他のアイソタイプ又はクラスの抗体からの不変部ド
メインにより置換され得る。さらに、Ｌ鎖の不変部ドメ
インはＨ鎖ドメインと置換され得、そしてＬ鎖不変部
（CL）へのＨ鎖可変部（VH）の連結も包含する。通常、
ドメインは、必ずしも必要ではないが、他のアイソタイ
プ又はクラスの抗体の対応するドメインにより置換され
るであろう。すなわち、たとえばCH1ドメインは通常、
他のCH1ドメインと交換されるであろう。
現在予測できる性質を有する抗体を産生するためにド
メインを交換する他に、現在知られていない生物学的機
能のユニークな組合せを有する分子は、生物学的活性へ
のそれぞれのドメインの貢献が洞察されるように調製さ
れ得る。たとえば、これらの性質が異なったドメインに
関連する場合、IgG2のより長い血清半減期と、単核細胞
上にFc受容体を結合するIgG3の能力とを組合すことが可
能であるべきである。補体を活性化するためのIgG4の減
じられた能力が、高い親和性でFc受容体に結合するため
のIgG1の能力と組合され得る。IgA及びIgGからのドメイ
ンを組合すことによって、分泌片と相互作用することが
でき、そしてその結果、腸におけるタンパク質の加水分
解をほとんど受けにくいIgG分子を産生することが可能
である。
不変部はまた、不変部のドメイン、すなわちCL,CH1,C
H2,CH3又はCH4の少なくとも１つのアミノ酸の実質的に
すべての挿入によりドメイン変性され得る。多くの場
合、その挿入は、複数コピーとして存在する１又は複数
のドメインを有する不変部を付与するために、すでに存
在する少なくとも１つの不変部の複製を提供する。さら
に、その挿入されたドメインは、異なったアイソタイプ
又はクラスの抗体又は他の鎖からのものである。通常、
その挿入は、それらの本来の状態でドメインを維持する
であろう。すなわち、たとえば、存在するすべてのヒン
ジドメインは、CH1及びCH2ドメイン領域間に存在するで
あろう。他方、複数の隣接するドメインが挿入される場
合、天然の状態がその挿入されたグループ内で維持され
得る。すなわち、CH1及びヒンジドメインの第二コピー
が、第一ヒンジドメインに続く。ドメイン複製はまた、
所望する機能を増強するためにも使用され得る。たとえ
ば、炭水化物はIgGのCH2ドメインに含まれ；そして炭水
化物はIgに放射性ラベルを結合するために使用されて来
た。CH2を複製することによって、より多くの炭水化物
が存在し、そしてラベリング技法に使用するために利用
できるであろう。
置換された又は挿入されたドメインは、不変部と同じ
宿主動物源から又は異なった源からであり得る。異なっ
た源は、同じか又は異なった種からであり得る。その置
換された又は挿入されたドメインはまた、天然に存在し
又は遺伝的に変性されたドメインでもあり得る。指図さ
れる遺伝的変性は、通常天然源から得られるようなドメ
インに存在するアミノ酸の置換として、薬物又は放射性
同位体の共有結合を促進するアミノ酸の付加、たとえば
ドメイン中のシステム又はリシンの付加を含む。もう１
つの予測される遺伝的変性は、炭水化物の付加又は欠失
であり、これは追加のアミノ酸を付与し、又は炭水化物
のための結合点として作用するそれらのアミノ酸を欠失
するためにアミノ酸の置換により達成されるであろう。
これまで生成された多くの典型的なドメイン変性不変
部抗体が、実験部分の第２表に列挙される。これらの列
挙の他に、0,1,2,3,4及び７個のヒンジエキソンを有す
る一連のγ３タンパク質が生成された。VHがCLに、そし
てCLがVHに連結されているタンパク質がまた生成され
た。これらのタンパク質は抗原を結合せしめ、そして分
泌される。
本発明の抗体は、転写及び翻訳調節配列を含んで成る
発現ベクターシステム及びその調節配列の制御下でドメ
イン変性不変部を産生することができる遺伝子を用い
て、一般的に微生物又は細胞系中に産生される。適切な
発現システムは良く知られており、そして本発明の一部
を構成しない。Ig遺伝子のトランスフェクションのため
に使用されるベクターは、Bio Techniques ４:214〜221
に記載される。これらのベクターは、１つの可能な供給
システムを付与し；他のベクターによる供給もまた、本
発明の範囲内である。
本発明の抗体を産生するために使用される一般的な発
現ベクターシステムは、多くの便利な性質を付与するた
めに変えられ得る。第一に、Ｈ及びＬ鎖は、別々のプラ
スミド上に存在することができる。両遺伝子は同じプラ
スミド上に存在し、そして固有のサイズ制限は存在しな
いけれども、利用できる新規の制限部位の数により、よ
り小さなプラスミドを遺伝的に操作することがより便利
である。第二に、ユニーク部位が、プラスミド間の可変
部の転移を促進するためにリンカーを用いてベクター内
に導入され得る。これは、より小さなプラスミドにおい
ては、一層容易に達成される。第三に、可変部が１つの
発現ベクター中にクローン化されれば、発現の前、同じ
大きさのプラスミドにおいて２種の変化を必要とするよ
りも、小さなプラスミドにおいて異なった不変部に関連
する部分を発現することがより簡単である。
個々の抗体ドメインをコードする遺伝子セグメント
は、典型的には、結合グループにより連結される。これ
らの結合グループは、天然のイントロンであることがで
き又は人工的な操作により変性されているイントロンで
あり得る。抗体遺伝子のイントロン／エキソンの性質
は、本発明のドメイン変性不変部の調製を促進するため
に使用され得る。抗体分子のドメイン構造は、それをコ
ードする遺伝子の構造に表わされ、そして個々のドメイ
ンは、別々のエキソンによりコードされる。個々のドメ
インを分離する介在DNA配列（イントロン）は、抗体遺
伝子を操作するための理想的部位を付与した。この介在
配列はDNAスプライシングにより除去され、そして成熟m
RNAに見出されないので、その介在配列内の変更は、成
熟タンパク質分子の構造に影響を及ぼさない。
さらに、Ｈ鎖及びＬ鎖遺伝子の両者における可変部及
び不変部エキソン間のRNAスプライス連結を用いて、本
発明を好都合にすることができる。なぜならば、これら
の連結は、たとえ種間でさえ保持されるからである。ド
メイン境界でのアミノ酸は、５′ドメインからの２個の
ヌクレオチド及び３′ドメインからの１個のヌクレオチ
ドにより常に形成される。従って、介在DNA配列内の遺
伝子セグメントを連結することによって、鎖及び種内の
及び鎖及び種間のキメラ分子を製造することが可能であ
る。
本発明のキメラ分子を製造するために使用される典型
的な一般的方法は、操作されるべくドメインを少なくと
も含むクローニングカセット（第１図を参照のこと）を
製造することである。類似する技法が、キメラ性マウス
可変部／ヒト不変部Ｈ鎖を調製するために従来技術にお
いて使用されて来た。キメラ性マウス可変部／ヒト不変
部Ｈ鎖を製造するためのベクターが構造される場合、た
とえばSal I部位が、DNAオリゴヌクレオチドリンカーを
用いて介在配列中に導入され得る。これは、ヒト不変部
遺伝子セグメントをSal I−Bam H Iフラグメントにし、
そして可変部遺伝子セグメントの次に種々の不変部の挿
入を促進する。この融合で調製される可変部がクローン
化されれば、その可変部は、新規のカセットにおいて種
々の不変部の次に配置され得る。
類似するアプローチを用いて、ドメイン変性抗体鎖
（第２図を参照のこと）を調製することに使用するため
のドメインカセットを製造することができることが決定
された。オリゴヌクレオチドリンカーを用いて、ユニー
ク制限部位を、不変部IgG H鎖遺伝子のドメインをコー
ドするエキソンを分離する１又は複数の介在配列中に導
入することができる。制限部位の例は、図面に示されて
いる。これらのリンカーが決まった場所に配置されれ
ば、エキソン及び従って免疫グロブリンのドメインを置
換挿入又は欠失することが可能である（第３図参照のこ
と）。次に、置換、挿入又は欠失により製造される新規
のベクターを用いて、所望する機能的性質を増強する変
更された構造体を有する免疫グロブリン分子を製造する
ことができる。
特定の技法が、続く例に記載される。さらに、本発明
は、制限部位がドメインをコードするエキソンを分離す
る介在配列中に及び不変部と可変部との間に導入され得
ることを示したが、種々の哺乳類源からの抗原結合ドメ
イン及び不変部ドメインを有するキメラ抗体分子の製造
に関する種々の科学出版物に記載される技法は、本明細
書に提供されるガイドを用いて不変部内のドメインの置
換、挿入及び欠失に適用され得る。多くの関連する出発
物が、上記の関連文献と称するセクションに示されてい
る。
上記方法はまた、Ig分子内の内部欠失を生ぜしめるた
めにも効果的である。わずかに異なったアプローチを用
いて、その分子のアミノ末端又はカルボキシ末端のいづ
れかで欠失を生ぜしめることができる。
カルボキシ末端欠失を行なうためには２種の方法が介
在する。第一は、特定部位の突然変異誘発によるナンセ
ンスコドンを挿入することである。このアプローチを用
いて、いづれかの残鎖で終結する鎖が作られ得る。もう
１つのアプローチとして、カセットが産生され、そして
エキソンの３′の終結を引き起こすためにエキソンの後
に配置され得る。出発物質として、たとえばマウスγ2b
のCH2b−CH3をコードする遺伝子が使用され得る。この
遺伝子は、便利な制限部位を含む。まず、ほとんどのCH
3が欠失される。次にすべての３種の読み枠における終
結コドンがCH2ドメインの５′末端で挿入される。ユニ
ークリンカーがCH2のIVS5′中に挿入され得る。次にこ
のカセットは、いづれかのエキソンの３′を配置され得
る。前記エキソンはγ2bのCH2にスプライスされ；その
得られたメッセージはこの点で終結コドンを含む。
アミノ末端欠失を行なうためには、いくつかのアプロ
ーチが可能であり、そして２種のそのようなアプローチ
が第５図に示されている。第5A図においては、そのプロ
モーター及びリーダーを有するIg遺伝子の５′領域が、
発現されるべきエキソンに連結される。前記リーダーは
そのエキソンの３′と読み枠を合わしてスプライスさ
れ、適切な出発部位を有するmRNAを産生し、そしてタン
パク質をコードせしめる。リーダー配列は、完結された
タンパク質から切断されてもよく又はされなくてもよ
い。第5B図においては、Ig転写（斜線のボックスにより
示される）のために必要なプロモーター領域及び他の領
域がエキソンに直接連結される。翻訳開始部位（AUG）
が利用できない場合、それはイン ビトロ突然変異誘発
により供給され得る。翻訳開始部位の位置は、タンパク
質生成物の大きさ及び構造を決定するであろう。
本発明はまた、ドメイン変性不変部を産生するための
DNA構造体にも向けられる。その構造体は、不変部ドメ
インをコードする配列の３′末端に、その５′末端で読
み枠を合わして結合基を通して連結される不変部ドメイ
ンのそれぞれと実質的に同じポリペプチドセグメントを
コードするDNA配列を含んで成る。その構造体は通常、
さらに、第一不変部ドメインをコードする配列の５′末
端にその３′末端で結合基を通して連結される、可変部
をコードする配列を含む。構造体がＨ鎖をコードする場
合、それは、CH1,ヒンジ,CH2,CH3及び場合によってはCH
4ドメインをコードする配列を含むであろう。同様に、
構造体は、Ｌ鎖をコードする場合、CLドメインをコード
する配列を含むであろう。構造体は、一緒にスプライス
され、そしてクローン化されるセグメントで又はいづれ
か他の生物学的技法により合成され得る。
ドメイン変性が置換である場合、交換されるべきドメ
インをコードする遺伝子セグメントの前後の結合基は通
常、ユニーク制限部位を含んで成る。次にその同じ制限
部位は、交換される予定である他の抗体のドメインをコ
ードする配列を囲む結合基に存在するであろう。複製又
は内部欠失を促進するために、その同じ第一ユニーク制
限部位は、複製されるか又は欠失されるべきドメインを
コードする配列のアミノ末端で存在するドメインをコー
ドする配列の先に存在する結合基に存在する。第二ユニ
ーク制限部位は、一本の鎖をコードする遺伝子において
複製／欠失されるべきドメインをコードする配列の先の
結合基に及び第二の同一の鎖をコードする遺伝子におい
てドメインをコードする配列の後の結合基に存在する。
この場合、交換の後、ドメインは一本の鎖をコードする
遺伝子における二種のコピー（複製された）に存在し、
そして第二の鎖をコードする遺伝子には不在（欠失され
た）である。ドメイン変性がカルボキシ末端欠失である
場合、Ｃ末端を含むであろうドメインの後の結合基は、
ナンセンスコドン又は終結コドンのいづれかを含むであ
ろう。
本発明の抗体を産生する細胞もまた供給される。その
細胞は、前に記載したドメイン変性不変部抗体Ｈ鎖の発
現のためのDNA構造体を含む。その細胞はまた、通常別
々のDNA構造体においてＬ鎖領域をコードするDNA配列も
含む。キメラ性抗体（たとえばトランスフェクトーマ
ス）を産生する細胞の産生は良く知られており、そして
関連する文献に詳細に説明されている。
完全な抗体の他に、ドメイン変性不変部を含む抗体フ
ラグメントもまた、本発明の一部である。たとえば、特
異的結合部位を形成するためにアセンブリーされた単一
のＬ鎖及び単一のＨ鎖から調製される半抗体は、一価の
結合タンパク質として使用され得る。さらに、アセンブ
リーされていないドメイン変性不変部は、特異的なポリ
クローナル又はモノクローナル抗体を生成するための抗
体として使用され得る。特定の抗体特異性の産生は、そ
れぞれ欠失又は挿入により排除又は増強され得る。交換
されたドメインを有するドメイン変性抗体の使用は、ユ
ニークな特異性の混合物を有するポリクローナル抗体を
高い収率で産生することができる。
本明細書に使用される用語“抗体”とは完全な抗体及
びそのフラグメントの両者を言及する。完全な抗体は、
天然のＹ−型形状にアセンブリーされる２種のＬ鎖及び
２種のＨ鎖を含む。抗体フラグメントは、特異的結合部
位を生成するためにアセンブリーされた単一のＨ及びＬ
鎖から形成される半抗体、及び完全な抗体又は酵素、た
とえばパパインによる切断により調製された半抗体のい
づれかのフラグメントを含む。
次の例は、例示的であって、限定するものではない。
実 験 例 １ ヒトγ３抗体は、４個のエキソンから成る拡張された
ヒンジ領域を有する。ヒトγ４は、それらの不変部にお
ける広範な配列類似性（CH2及びCH3において90％以上の
同一の残基）にもかかわらず、まったく異なった性質を
示す。IgG3遺伝子を構成し、そして発現せしめた。単離
されたタンパク質は、1,2,3又は４個（野生型）のヒン
ジエキソンを有する。続くヒンジ欠失によるＨ鎖の分子
量の変化が示された。さらにr3ヒンジを、γ４不変部に
配置し、そして逆も同様に行なった。IgG3及びIgG4から
のヒンジ領域の交換は、補体を固定し、そしてFc受容体
に結合するためのこれらの分子の能力を変えなかった。
例 ２ 薬物投与としてのそのような適用のために遺伝子工学
的に作られた抗体の有用性を最大にするためには、抗体
を変えることが有用である。抗体がアセンブリーされ、
そして分泌され、そして特異的に抗原を結合するそれら
の能力を保持すべきである制限が存在する。
産生される抗体分子の大きさについての上限が存在す
るかどうかを決定するために、CH1及びヒンジ領域が複
製されているIgG3H鎖を構成した。第二構造体におい
て、CH1,ヒンジ及びCH2を複製した。複製されたCH1及び
ヒンジを有する遺伝子がトランスフェクションのために
使用される場合、ひじょうに減じられたトランスフェク
ション頻度が見られた。残存するトランスフェクタント
を分析したが、いずれの検出可能なＨ鎖タンパク質も産
生しなかった。これらの結果は、この構造体によりコー
ドされるＨ鎖が細胞に対して毒性であることを示唆す
る。
対照的に、CH1,ヒンジ及びCH2が複製されているＨ鎖
をコードする遺伝子を、トランスフェクションの後、発
現せしめた。その鎖をマウスλＨ鎖と共にアセンブリー
し、そして分泌した。これらの研究は、産生され得る特
異的なIg分子に関して制限が存在するが、これらの制限
は本質的に大きさに無関係であることを示唆する。
例 ３ 関連する一連の研究において、アセンブリーする、分
泌されるべき及び機能するIg分子の能力に影響する種々
のドメインの欠失が行なわれた。下記ドメイン： CH2; ヒンジ＋CH2; CH1＋ヒンジ；及び CH1＋ヒンジ＋CH2 を欠失するタンパク質をコードするIgG3H鎖遺伝子を構
成し、そして骨髄腫細胞中にトランスフェクトせしめ
た。
ドメインが欠失されているキメラ性Ｈ鎖を合成した。
J558Lをキメラ性Ｈ鎖遺伝子によりトランスフェクト
し、そしてタンパク質を合成するトランスフェクタント
を単離した。トランスフェクタントを、35S−メチオニ
ンを用いて３時間、ラベル化した。細胞質性の及び分泌
されたIgを、抗−Ｈ鎖による免疫沈殿により調製した。
その免疫沈殿物を、SDS−PAGEにより分析した。
CH2を欠失する遺伝子が使用される場合、予測される
分子量のタンパク質の合成を意図することが見うけられ
た。この短くされたＨを、マウスλＨ鎖又はキメラ性Ｖ
−DNS−ヒトκＬ鎖のいづれかと共にアセンブリーし、
分泌されるH2L2分子を製造した。
ヒンジ＋CH2が欠失される場合、Ｈ鎖は、分泌されるH
L半分子に明らかにアセンブリーした。しかしながら、
これらがH2ではないことを断固として言及することは不
可能である。
CH1＋ヒンジが欠失される場合、他のＨ鎖又はＬ鎖の
いづれかとのＨ鎖のアセンブリーは、存在しなかった。
これは驚くべき事ではない。なぜならば、鎖間ジスルフ
ィド結合を形成する遊離システィンがCH1に存在するか
らである。しかしながら、鎖間ジスルフィド結合の不在
下でさえ、その短くされたＨ鎖は、分泌される。
可変部がCH3に直接結合されているＨ鎖をまた、産生
した。このＨ鎖は、キメラ性Ｌ鎖と共に同時トランスフ
ェクトされる場合、非産生骨髄腫に分泌された。それ
は、Ｌ鎖又は他のＨ鎖のいづれかと共に共有結合を形成
しなかった。
例 ４ 第２表は、産生された多くのドメイン変性不変部抗体
を例示する。
第２表に示されるベクターから調製されたタンパク質
の生成及びそれらの機能の分析を始めた。たとえば、ベ
クター1654は、そのFc受容体結合活性について分析され
たタンパク質を産生し、そしてIgG2のように、ヒト単球
細胞系のFc受容体に結合しない。
本明細書に言及されたすべての出版物及び特許出願
は、本発明が関与する当業者のレベルの表示である。す
べての出版物及び特許出願は、引用により本明細書に組
込まれる。
前述の発明は、明確に理解するために例示的及び例的
にいくらか詳細に記載されているけれども、請求の範囲
内で修飾及び変更を行なうことができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 モリソン，シェリー エル. アメリカ合衆国，ニューヨーク 10583, スカースデール，クレアモント ロード 31 (72)発明者 オイ，バーノン ティー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94025，メンロ パーク，３，ウェイバ リー 316 (56)参考文献 特開 昭60−155132（ＪＰ，Ａ) 特表 平１−502875（ＪＰ，Ａ) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，78［１］（1981）ｐ．524 −528 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ ｏｇｙ，21［６］（1984）ｐ．523−527 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ ｏｇｙ，23［３］（1986）ｐ．319−330 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (17)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】少なくとも１個の結合部位領域及びドメイ
    ン変性不変領域を有する抗体ヘビー（Ｈ）鎖であって、
    該ドメイン変性不変領域が、 ａ）CH1ドメイン、ヒンジドメイン、CH2ドメイン、CH3
    ドメイン及びCH4ドメインから成る群から選択された対
    応する未変性不変領域ドメインのアミノ酸の少なくとも
    80％の少なくとも１回の除去、但しこの除去はヒンジ、
    CH2,CH3及びCH4の各々に同時に存在することはないもの
    とする； ｂ）前記抗体Ｈ鎖のCH1、ヒンジ、CH2,CH3及びCH4から
    成る群から選択された対応する未変性不変領域ドメイン
    のアミノ酸の少なくとも80％を、CL,CH1、ヒンジ、CH2,
    CH3及びCH4から成る群から選択された異る未変性不変領
    域ドメインのアミノ酸の少なくとも80％により置換する
    ことによる、少なくとも１回の置換；並びに ｃ）CL,CH1、ヒンジ、CH2,CH3及びCH4から成る群から選
    択された対応する未変性不変領域ドメインのアミノ酸の
    少なくとも80％を、該抗体Ｈ鎖のCH1、ヒンジ、CH2,CH3
    及びCH4から成る群から選択された未変性不変領域ドメ
    インに挿入することによる、少なくとも１回の挿入； から成る群から選択された修飾により特徴付けられる、
    ことを特徴とする抗体Ｈ鎖。
  2. 【請求項２】少なくとも１個の結合部位領域及びドメイ
    ン変性不変領域を有する抗体ライト（Ｌ）鎖であって、
    該ドメイン変性不変領域が、 ａ）該抗体Ｌ鎖のCL不変領域ドメインのアミノ酸の少な
    くとも80％を、CL,CH1、ヒンジ、CH2,CH3及びCH4から成
    る群から選択された異る未変性不変領域ドメインのアミ
    ノ酸の少なくとも80％により置換することによる、少な
    くとも１回の置換；並びに ｂ）CL,CH1、ヒンジ、CH2,CH3及びCH4から成る群から選
    択された対応する未変性不変領域のアミノ酸の少なくと
    も80％を、該抗体Ｌ鎖のCL不変領域ドメインに挿入する
    ことによる、少なくとも１回の挿入； から成る群から選択された変性により特徴付けられる、
    ことを特徴とする抗体Ｌ鎖。
  3. 【請求項３】２個の抗体Ｈ鎖と２個の抗体Ｌ鎖を集合す
    ることにより形成される抗体であって、該抗体はモノク
    ローナル抗体であり、そして該２個のＨ鎖の少なくとも
    一方が請求項１に記載の抗体Ｈ鎖であることを特徴とす
    る抗体。
  4. 【請求項４】２個の抗体Ｈ鎖と２個の抗体Ｌ鎖を集合す
    ることにより形成される抗体であって、該抗体はモノク
    ローナル抗体であり、そして該２個のＬ鎖の少なくとも
    一方が請求項２に記載の抗体Ｌ鎖である、ことを特徴と
    する抗体。
  5. 【請求項５】請求項１に記載の抗体Ｈ鎖を含んで成るモ
    ノクローナル抗体。
  6. 【請求項６】請求項２に記載の抗体Ｌ鎖を含んで成るモ
    ノクローナル抗体。
  7. 【請求項７】IgM,IgG,IgA,IgD及びIgEから成る群から選
    択される、請求項３〜６のいずれか１項に記載の抗体。
  8. 【請求項８】μ，γ，α，δ及びεから成る群から選択
    される、請求項１に記載の抗体Ｈ鎖。
  9. 【請求項９】κ及びλから成る群から選択される、請求
    項２に記載の抗体Ｌ鎖。
  10. 【請求項１０】請求項１又は２に記載の抗体鎖をコード
    する単離された核酸。
  11. 【請求項１１】請求項10に記載の核酸を含んで成る、複
    製可能なベクター。
  12. 【請求項１２】プラスミドである、請求項11に記載のベ
    クター。
  13. 【請求項１３】請求項11に記載のベクターと適切な宿主
    細胞とから成る、抗体鎖の製造のための宿主ベクター
    系。
  14. 【請求項１４】抗体鎖の生産を許容するために適当な条
    件下で請求項13に記載の宿主ベクター系を用い、そして
    生産された抗体鎖を回収することを含んで成る、抗体鎖
    の製造方法。
  15. 【請求項１５】抗体の製造のための宿主ベクター系であ
    って、 （ａ）適切な宿主細胞；並びに （ｂ）少なくとも１個の結合部位領域及びドメイン変性
    不変領域を含んで成る抗体Ｈ鎖をコードする核酸を含ん
    で成る複製可能なベクター：ここで該ドメイン変性不変
    領域は、 １）CH1ドメイン、ヒンジドメイン、CH2ドメイン、CH3
    ドメイン及びCH4ドメインから成る群から選択された対
    応する未変性不変領域ドメインのアミノ酸の少なくとも
    80％の少なくとも１回の除去、但しこの除去はヒンジ、
    CH2,CH3及びCH4の各々に同時に存在することはないもの
    とする； ２）前記抗体Ｈ鎖のCH1、ヒンジ、CH2,CH3及びCH4から
    成る群から選択された対応する未変性不変領域ドメイン
    のアミノ酸の少なくとも80％を、CL,CH1、ヒンジ、CH2,
    CH3及びCH4から成る群から選択された異る未変性不変領
    域ドメインのアミノ酸の少なくとも80％により置換する
    ことによる、少なくとも１回の置換；並びに ３）CL,CH1、ヒンジ、CH2,CH3及びCH4から成る群から選
    択された対応する未変性不変領域ドメインのアミノ酸の
    少なくとも80％を、該抗体Ｈ鎖のCH1、ヒンジ、CH2,CH3
    及びCH4から成る群から選択された未変性不変領域ドメ
    インに挿入することによる、少なくとも１回の挿入； から成る群から選択された修飾により特徴付けられる；
    並びに （ｃ）少なくとも１個の結合部位領域及びドメイン変性
    不変領域を含んで成る抗体Ｌ鎖をコードする核酸を含ん
    で成る複製可能なベクター：ここで該ドメイン変性不変
    領域は、 １）該抗体Ｌ鎖のCL不変領域ドメインのアミノ酸の少な
    くとも80％を、CL,CH1、ヒンジ、CH2,CH3及びCH4から成
    る群から選択された異る未変性不変領域ドメインのアミ
    ノ酸の少なくとも80％により置換することによる、少な
    くとも１回の置換；並びに ２）CL,CH1、ヒンジ、CH2,CH3及びCH4から成る群から選
    択された未変性不変領域のアミノ酸の少なくとも80％
    を、該抗体Ｌ鎖のCL不変領域ドメインに挿入することに
    よる、少なくとも１回の挿入； から成る群から選択された変性により特徴付けられる； を含んで成る宿主ベクター系。
  16. 【請求項１６】前記ベクターがプラスミドである、請求
    項15に記載の宿主ベクター系。
  17. 【請求項１７】抗体の生産を許容するために適当な条件
    下で請求項15に記載の宿主ベクター系を使用し、そして
    生成した抗体を回収することを含んで成る抗体の製造方
    法。
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