JPH02503056A - ドメイン‐変性不変部を有する抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、モノクローナル抗体及び特にドメイン−変性不変部を有する遺伝的に 変性されたモノクローナル抗体に関する。

発明の背景 天然に存在する特異的結合分子、たとえば免疫グロブリン、酵素及び膜タンパク 質は、過去１０年にわたって商業的用途においてひじょうに拡大して来た。モノ クローナル抗体の出現により、免疫グロブリンの有用性がひじょうに拡大して来 た。

しかしながら、多くの用途において、モノクローナル抗体の使用は、そのモノク ローナル抗体が生物学的環境に使用される場合、ひじように制限される。たとえ ば、最っとも通常の生産体積であるゲラ歯動物、たとえばマウスにおいて産生さ れるモノクローナル抗体は、他の種に対して免疫原性である。

種間の交差免疫原性は、免疫グロブリンの不変部の機能である。その不変部は、 多くの特異的機能、たとえば補体結合、異化速度の細胞受容体結合制御、アナフ ィラキシ−、オブソニン化、胎盤及び腸トランスファー、及び免疫調節を有し、 そして免疫原性でもある。従って、特定の抗原に対して特異的な結合領域（可変 部）と共に、特定の種からの細胞又はタンパク質に結合する不変部を有すること が所望されるであろう情況が存在する。

所望する抗原特異性のネズミモノクローナル抗体を産生ずることは一般的に、比 較的容易であるけれども、所望する不変部枠性を有するヒトモノクローナル抗体 を産生ずることはより一層難かしい。ヒトモノクローナル抗体は、多くの用途、 特にｈトの生体内診断及び治療のために好ましい。マウス骨髄腫細胞又はハイブ リドーマに由来する抗原特異性を有するキメラ抗体が、モノクローナル抗体固有 の種制限を一部克服するためにヒト不変部に連結された。トランスフェクト−マ ス（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｍａｓ）により産生される、遺伝子工学的に製造され た抗体はまた、正常な膵臓細胞への続く融合をもたらす抗体のアイソタイプの変 更、通常１ｇＧ抗体の産生を可能にした。

しかしながら、ネズ弯可変部及びヒト不変部を有するキメラ抗体を産生ずるため にトランスフェクト−マスを用いる事に何らかの障害が存在した。たとえば、初 めに産生されたキメラ抗体は、不変部が供与体のヒト不変部の性質のすべてを有 する抗体に制限された。増強された又は減じられた特性、たとえば補体の結合は 、多くの用途のために所望される。

従って、容易に入手できる源からの可変部の使用により利用できる広い範囲の結 合特異性を保持しながら、変性された生物学的機能を有する免疫グロブリンを調 製することに相当の興味が存在する。

トランスフェクト−マスにおける免疫グロブリン発現を記載ス可変部及びヒト不 変部を有する抗体を分泌するトランスフ物学的活性を書評する。免疫グロブリン 遺伝子は、多、くの出版物、たとえばＷａｔｓｏｎなど、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ 　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｇｅｎｅ。

第■巻、Ｂｅｎｊａｍｉｎ／　ＣｕＣｕｍｍ１ｎ、　Ｍｅｎｌｏ　Ｐａｒｋ、　 Ｃａｌ　１ｆｏｒｎｉａ、第４版、１９８７、チャプター２３、及び本明細書に 引用される出版物に開示され、そして書評されている。

発明の要約 少なくとも１つの結合部位領域及びドメイン変性不変部を有する抗体が付与され る。ドメイン変性は、不変部のドメイン：　ＣＬ、　Ｃ，１、ヒンジ部、・Ｃ１ ０，Ｃ□３又はＣ，４の少なくとも１種の実質的にすべてのアミノ酸の置換、挿 入又は欠失のいづれかである。ドメイン変性された不変部を有する抗体の機能性 質は、特定の用途のために所望する生物学的機能を増強するために選択される。

抗体の不変部ドメインは、そのＩＪＪから排除され、又は種々のアイソタイプ又 は免疫グロブリン種のドメインにより挿入され又は置換される。その置換又は挿 入されたドメインは、同じ動物、同じ動物の種又は異なった動物の種からの同じ 抗体又は異なった抗体からであり得る。この方法においては、生物学的分子の機 能的性質が所望する用途のために最適化され得る。

ドメイン変性された不変部をコードするＤＮＡ構造体、完全な不変部−ドメイン 変性された抗体をコードする構造体及びそのような抗体を発現する抗体もまた供 給される。

図面の簡単な説明 第１図は、不変部を交換するために使用されるクローニングカセットを示し； 第２図は、不変部ドメインを交換するために使用されるクローニングカセットを 示し； 第３図は、不変部ドメインを欠失又は重複するために使用されるクローニングカ セットを示し； 第４図は、カルボキシ末端ドメインを欠失するために使用されるクローニングカ セットを示し：そして第５図は、アミノ末端ドメインを欠失するために使用され るクローニングカセットの２種の変種を示す。

特定の態様の記載 ドメイン変形不変部を有する抗体の産生のための新規方法及び組成物が供給され る。本発明は、抗体の不変部の１又は複数のドメインの変性に特に関与し、ここ でドメインは、不変部が由来する原抗体の結合部位又は可変部に、又は他の抗体 に結合され得る。その完全な抗体は、宿主動物中に本来存在し又は遺伝的に変性 され得る少なくとも１種の結合部位領域を有する。抗体の結合部位領域の変更は 、本発明の部分を構成せず、但しそのような変更された結合部位を有する抗体は 、それらの不変部が本発明に記載されるようにして変性される場合、本発明の範 囲内にあるであろう。

本明細書に使用される場合、ドメイン変性不変部とは、抗体の鎖におけるＣＬ、 　Ｃ，１、ヒンジ、Ｃ，２、Ｃ，３又はＣ，４の少なくとも１種のドメインのア ミノ酸の実質的にすべてが欠失され、挿入され又は交換されていることを意味す る。交換されるとは、種々の源からのドメインが抗体に本来存在するドメインと 置換されることを意味する。変性が置換である場合、通常、ドメインは、他のア イソタイプ又はアイソタイプクラスの抗体の同等のドメイン又は同じ又は異なっ た抗体のし鎮からの同等のドメインにより置換される。通常、ドメインの挿入は 、原抗体の１又は複数のドメインの重複である。

しかしながら、他の置換及び重複もまた行なわれ得る。

ドメイン変性不変部を有する抗体は、結合に関与する抗体の一部をコードする遺 伝子セグメント及び同じか又は異なった宿主動物に由来するドメイン変性不変部 をコードする遺伝子セグメントを含む融合遺伝子から調製され得る。２種の発現 カセット、すなわちＨ鎮をコードするカセット及びＬ鎖をコードするカセットが 、完全なドメイン変性不変部抗体を産生ずることにおいて一般的に関与し、この 遺伝子は発現及びプロセッシングのための条件下で適切な真核宿主中に導入され る。その遺伝子が発現され、そしてその抗体鎖が一緒に結合する場合、その組立 てられた抗体が得られる。その抗体は、ＩｇＭ、　ＩｇＧ、　ＩｇＡ、　Ｉｇ口 及びＩｇＢクラス並びに個々のクラスの種々のサブクラス（たとえばヒ）ＩｇＧ １〜ＩｇＧ４）を包含する。鎖タイプは、Ｌ鎮のためにに又はλ及びＨ鎖のため にμ、Ｔ。

α、δ及びεを含む。アイソタイプによる分類は、そのクラス及びサブクラス、 Ｌ鎖タイプ及びサブタイプを言及し、そしてまた、可変部グループ及びサブグル ープにも適用され得る。マウス免疫グロブリンのためのアイソタイプの表示例は 、ＩｇＧ２□（に）である。

結合部位又は可変部は、所望する特異性を付与するアミノ酸配列と共に変化する であろう。免疫グロブリンの可変部は、便利な鑞、通常哺乳類（ゲラ歯動物、た とえばマウス又はラット、ウサギ又は他の呑椎動物、）に由来し、又は免疫グロ ブリンを産生ずることができる哺乳類又は他のものに由来する。可変部は、遺伝 的に変性され、又は天然に存在する。

免疫グロブリンの不変部及びＩｇＭのためのＪ鎖（Ｈ又はＬ免疫グロブリン鎮の Ｊ領域と同じでない）は、可変部の源と同じか又は異なるを推動物源、特に哺乳 類源、より特別には霊長類又は家畜、たとえばウシ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ又 は同様のもの、及び最っとも特別にはヒトに由来するであろう。不変部の源は、 可変部の源と同じか又は異なった種の同じ動物か又は異なった動物のいづれかで あり得る。

既知のように、抗体鎮の不変部は、種に対して特異的である。それぞれのクラス 内に、多くのアロタイプが存在するであろう。抗体のドメイン変性不変部部分は 、通常、抗体の意図する使用に従って選択されるであろう。まず第１の考慮とし て、抗体が診断又は治療のために宿主動物中に導入される場合、不変部又は免疫 原性部分が、宿主の免疫応答を最少にするために選択されるであろう。従って、 時々、不変部の源は、ヒトへの使用を意図する場合、ヒトである。

抗体分子の可能性ある適用は、それらの抗原特異性のみならず、またそれらのエ フェクター機能により決定される。従って、２番目の考慮として、ドメイン変性 抗体は、特定の機能を行なうためのそれらの能力を最適化するために選択される 。たとえば、抗体の半減期を増強することに関係するドメインは、特定の適用に 依存して、増強された又は短くされた半減期を付与するために変性されるであろ う。本発明に教授される技法を用いて選択的に変性される、抗体における他の機 能は、組織分布、補体を固定する能力及び抗体依存性細胞毒性に関係する能力を 包含する。

３番目の考慮として、抗体は、生体外操作を促進するために変性される。たとえ ば、抗体は、結合部位特異性を変えないで放射性活性異性体又は薬物の分子を容 易に添加できるように変えられ得る。抗体が薬物投与システムとして機能する場 合、多量に分泌され得る抗体における薬物の共有結合の増強が所望されるであろ う。

実質的にすべてのアミノ酸の欠失、挿入又は置換であり得る。

ドメインの°アミノ酸を言及する場合、“実質的にすべて”とは、操作される１ ００％のアミノ酸を包含するだけでなく、また１００％以下、たとえば８０％、 ８５％、９０％又は９５％のアミノ酸も言及することができる。イントロンにお ける制限部位のＲａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ＮＹ、　１９ ８４を参照のこと。

第１表 ドメイン　　　　　　　　　　　　　　　機　　　能Ｖ、＋ＶＬ　　　　　　　 　抗原結合。Ｈ及びＬ鎖の非共有アセンブリー。

Ｃ）＋　１　＋　ＣＬ　　　　　　　　Ｈ及びＩＪＪの非共有アセンブリー抗原 結合機能とエフェクター機能 との間の“スペーサー”。Ｈ及び Ｌ鎖の共有アセンブリー。

Ｃ，３マクロファージ及び単球上のＰｃ　−受容体との相互作用。Ｈ鎖の非共 有アセンブリー。

Ｃｏ２＋ＣＨ３スタフィロコー力ス　アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ ｓ　ａｕｒｅｕｓ）からのプロティンＡとの相互作用。下記 細胞上のＰｃ−受容体との相互作用＝ （ａ）胎盤今胞体栄養細胞 （ｂ）好中球 （ｃ）細胞毒性に一細胞 （ｄ）腸上皮細胞（一定の種の新生 児） これらのドメインの機能は既知であるので、特定のエフェクター機能は、その機 能に関連するドメインを欠失し又は挿入することによって又は所望する特性のた めにほとんど効果的に機能しない対応するドメインと異なったクラス又はアイソ タイプの抗体のドメインとを置換することによって変性され得る。

１又は複数の欠失が、本発明のドメイン変性不変部を調製することにおいて存在 する。操作された欠失ドメインは、隣接していてもよく又は隣接していなくても よい。その欠失ドメインは、不変部のカルボキシ−末端ドメイン、１又は複数の 内部ドメイン又はアミノ末端ドメインであり得る。特定の使用のために必要でな い又は有害な機能に関連するドメインは、排除され得る。たとえば、補体結合を 所望しない場合、ＣＨ２ドメインが欠失され得る。非本質的なドメインの欠失は 、抗体分子の分泌又はアセンブリーを促進せしめることができる。たとえば、Ｃ □１、すなわちＨ１ｌ結合タンパク質の結合部位の欠失は、関連するし鎮を伴わ ないでＨ鎖の分泌を可能にするであろう。ドメインの欠失は、免疫グロブリンの いづれかの生物学的特性に影響を及ぼすために選択され得る。

Ｈ鎮の不変部が置換により変性される場合、その置換は、ＣＬ、　Ｃ，１、ヒン ジ、Ｃ，２又はＣ，３のドメイン、又はＩｇＭ及びＩｇＢの場合、Ｃ，４ドメイ ンの少なくとも１つのドメインの実質的にすべてのアミノ酸を包含する。そのド メインは、他のアイソタイプ又はクラスの抗体からの不変部ドメインにより置換 され得る。さらに、Ｌ鎖の不変部ドメインはＨ鎮ドメインと置換され得、そして Ｌ鎖不変部（ＣＬ）へのＨ鎖可変部（Ｖ□）の連結も包含する。通常、ドメイン は、必ずしも必要ではないが、他のアイソタイプ又はクラスの抗体の対応するド メインにより置換されるであろう。すなわち、たとえばＣ□１ドメインは通常、 他のＣＨ１ドメインと交換されるであろう。

現在予測できる性質を有する抗体を産生ずるためにドメインを交換する他に、現 在知られていない生物学的機能のユニークな組合せを有する分子は、生物学的活 性へのそれぞれのドメインの貢献が洞察されるように調製され得る。たとえば、 これらの性質が異なったドメインに関連する場合、ＩｇＧｚのより長い血清半減 期と、単核細胞上にＦｃ受容体を結合するＩｇＧｓの能力とを組合すことが可能 であるべきである。補体を活性化するための１ｇＧ４の減じられた能力が、高い 親和性でＰｃ受容体に結合するためのＩｇＧ　＋の能力と組合され得る。ＩｇＡ 及びＩｇＧからのドメインを組合すことによって、分泌片と相互作用することが でき、そしてその結果、腸におけるタンパク質の加水分解をほとんど受けにくい １ｇ６分子を産生ずることが可能である。

不変部はまた、不変部のドメイン、すなわちＣＬ、　Ｃ，１。

Ｃ，２、Ｃ，３又はＣ，４の少なくとも１つのアミノ酸の実質的にすべての挿入 によりドメイン変性され得る。多くの場合、その挿入は、複数コピーとして存在 する１又は複数のドメインを有する不変部を付与するために、すでに存在する少 なくとも１つの不変部の複製を提供する。さらに、その挿入されたドメインは、 異なったアイソタイプ又はクラスの抗体又は他の鎖からのものである。通常、そ の挿入は、それらの本来の状態でドメインを維持するであろう。すなわち、たと えば、存在するすべてのヒンジドメインは、Ｃ□１及びＣＨ２ドメイン領域間に 存在するであろう。他方、複数の隣接するドメインが挿入される場合、天然の状 態がその挿入されたグループ内で維持され得る。ずなわち、ＣＨ１及びヒンジド メインの第二コピーが、第一ヒンジドメインに続く。ドメイン複製はまた、所望 する機能を増強するためにも使用され得る。たとえば、炭水化物はＩｇＧのＣＨ ２ドメインに含まれ；そして炭水化物はＩｇに放射性ラベルを結合するために使 用されて来た。

Ｃ□２を複製することによって、より多くの炭水化物が存在し、そしてラベリン グ技法に使用するために利用できるであろう。

置換された又は挿入されたドメインは、不変部と同じ宿主動物源から又は異なっ た源からであり得る。異なった源は、同じか又は異なった種からであり得る。そ の置換された又は挿入されたドメインはまた、天然に存在し又は遺伝的に変性さ れたドメインでもあり得る。指図される遺伝的変性は、通常天然源から得られる ようなドメインに存在するアミノ酸の置換として、薬物又は放射性同位体の共有 結合を促進するアミノ酸の付加、たとえばドメイン中のシステム又はリシンの付 加を含む。もう１つの予測される遺伝的変性は、炭水化物を欠失するためにアミ ノ酸の置換により達成されるであろう。

これまで生成された多くの典型的なドメイン変性不変部抗体が、実験部分の第２ 表に列挙される。これらの列挙の他に、０．１．２，３．４及び７個のヒンジエ キソンを有する一連のγ３タンパク質が生成された。ＶＨがＯＬに、そしてＣ５ がＶＨに連結されているタンパク質がまた生成された。これらのタンパク質は抗 原を結合せしめ、そして分泌される。

本発明の抗体は、転写及び翻訳調節配列を含んで成る発現ベクターシステム及び その調節配列の制御下でドメイン変性不変部を産生ずることができる遺伝子を用 いて、一般的に微生物又は細胞系中に産生される。適切な発現システムは良く知 られており、そして本発明の一部を構成しない。１ｇ遺伝子のトランスフェクシ ョンのために使用されるベクターは、Ｂｉｏ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　４　：２ １４〜２２１に記載される。これらのベクターは、１つの可能な供給システムを 付与し；他のベクターによる供給もまた、本発明の範囲内である。

本発明の抗体を産生ずるために使用される一般的な発現ベクターシステムは、多 くの便利な性質を付与するために変えられ得る。第一に、Ｈ及びＬ鎖は、別々の プラスミド上に存在することができる。両遺伝子は同じプラスミド上に存在し、 そして固有のサイズ制限は存在しないけれども、利用できる新規の制限部位の数 により、より小さなプラスミドを遺伝的に操作することがより便利である。第二 に、ユニーク部位が、プラスミド間の可変部の転移を促進するためにリンカ−を 用いてベクター内に導入され得る。これは、より小さなプラスミドにおいては、 一層容易に達成される。第三に、可変部が１つの発現ベクター中にクローン化さ れれば、発現の前、同じ大きさのプラスミドにおいて２種の変化を必要とするよ りも、小さなプラスミドにおいて異なった不変部に関連する部分を発現すること がより簡単である。

個々の抗体ドメインをコードする遺伝子セグメントは、典型的には、結合グルー プにより連結される。これらの結合グループは、天然のイントロンであることが でき又は人工的な操作により変性されているイントロンであり得る。抗体遺伝子 のイントロン／エキランの性質は、本発明のドメイン変性不変部の調製を促進す るために使用され得る。抗体分子のドメイン構造は、それをコードする遺伝子の 構造に表わされ、そして個々のドメインは、別々のエキソンによりコードされる 。個々のドメインを分離する介在ＤＮＡ配列（イントロン）は、抗体遺伝子を操 作するための理想的部位を付与した。この介在配列はＤＮＡ、Ｉ−プライシング により除去され、そして成熟ｍＲＮＡに見出されないので、その介在配列内の変 更は、成熟タンパク質分子の構造に影響を及ぼさない。

さらに、Ｈ鎮及びｌ遺伝子の両者における可変部及び不変部エキソン間のＲＮＡ スプライス連結を用いて、本発明を好都合にすることができる。なぜならば、こ れらの連結は、たとえ種間でさえ保持されるからである。ドメイン境界でのアミ ノ酸は、５′　ドメインからの２個のヌクレオチド及び３′ドメインからの１個 のヌクレオチドにより常に形成される。

従って、介在ＤＮＡ配列内の遺伝子セグメントを連結することによって、釦及び 部内の及び鎮及び種間のキメラ分子を製造することが可能である。

本発明のキメラ分子を製造するために使用される典型的な一般的方法は、操作さ れるべくドメインを少なくとも含むクローニングカセット（第１図を参照のこと ）を製造することである。類似する技法が、キメラ性マウス可変部／ヒト不変部 Ｈ鎮を調製するために従来技術において使用されて来た。

キメラ性マウス可変部／ヒト不変部Ｈ鎮を製造するためのベクターが構造される 場合、たとえばＳａβ１部位が、ＤＮＡオリゴヌクレオチドリンカーを用いて介 在配列中に導入され得る。これは、ヒト不変部遺伝子セグメントをＳａｌ　Ｉ　 −Ｂａｍ　Ｈｌフラグメントにし、そして可変部遺伝子セグメントの次に種々の 不変部の挿入を促進する。この融合で調製される可変部がクローン化されれば、 その可変部は、新規のカセットにおいて種々の不変部の次に配置され得る。

類似するアプローチを用いて、ドメイン変性抗体鎖（第２図を参照のこと）を調 製することに使用するためのドメインカセットを製造することができることが決 定された。オリゴヌクレオチドリンカーを用いて、ユニーク制限部位を、不変部 １ｇＧ　Ｈ鎮遺伝子のドメインをコードするエキソンを分離する１又は複数の介 在配列中に導入することができる。制限部位の例は、図面に示されている。これ らのリンカ−が決まった場所に配置されれば、エキソン及び従って免疫グロブリ ンのドメインを置換挿入又は欠失することが可能である（第３図参照のこと）。

次に、置換、挿入又は欠失により製造される新規のベクターを用いて、所望する 機能的性質を増強する変更された構造体を有する免疫グロブリン分子を製造する ことができる。

特定の技法が、続く例に記載される。さらに、本発明は、制限部位がドメインを コードするエキソンを分離する介在配列中に及び不変部と可変部との間に導入さ れ得ることを示したが、種々の補乳類源からの抗原結合ドメイン及び不変部ドメ インを有するキメラ抗体分子の製造に関する種々の科学出版物に記載される技法 は、本明細書に提供されるガイドを用いて不変部内のドメインの置換、挿入及び 欠失に適用され得る。多くの関連する出版物が、上記の関連文献と称するセクシ ョンに示されている。

上記方法はまた、Ｉｇ分子内の内部欠失を生ぜしめるためにも効果的である。わ ずかに異なったアプローチを用いて、その分子のアミノ末端又はカルボキシ末端 のいづれかで欠失を生ぜしめることができる。

カルボキシ末端欠失を行なうためには２種の方法が介在する。第一は、特定部位 の突然変異誘発によるナンセンスコドンを挿入することである。このアプローチ を用いて、いづれかの残鋼で終結する鎖が作られ得る。もう１つのアプローチと して、カセットが産生され、そしてエキソンの３′の終結を引き起こすためにエ キソンの後に配置され得る。出発物質として、たとえばマウスγ２ｂのＣ□２ｂ 　　ＣＨ３をコードする遺伝子が使用され得る。この遺伝子は、便利な制限部位 を含む。

まず、はとんどのＣ，３が欠失される。次にすべての３種の読み枠における終結 コドンがＣ）１２ドメインの５′末端で挿入される。ユニークリンカ−がＣ□２ のＩＶＳ５’中に挿入され得る。次にこのカセットは、いづれかのエキソンの３ ′を配置され得る。前記エキソンはγ２ｂのＣ，２にスプライスされ：その得ら れたメツセージはこの点で終結コドンを含む。

アミノ末端欠失を行なうためには、いくつかのアプローチが可能であり、そして ２種のそのようなアプローチが第５図に示されている。第５Ａ図においては、そ のプロモーター及びリーダーを有する１ｇ遺伝子の５′領域が、発現されるべき エキソンに連結される。前記リーダーはそのエキソンの３′と読み枠を合わして スプライスされ、適切な出発部位を有するｍＲＮＡを産生じ、そしてタンパク質 をコードせしめる。リーダー配列は、完結されたタンパク質から切断されてもよ く又はされなくてもよい。第５Ｂ図においては、１ｇ転写（斜線のボックスによ り示される）のために必要なプロモーター領域及び他の領域がエキソンに直接連 結される。翻訳開始部位（ＡＵＧ）が利用できない場合、それはイン　ビトロ突 然変異誘発により供給され得る。翻訳開始部位の位置は、タンパク質生成物の大 きさ及び構造を決定するであろう。

本発明はまた、ドメイン変性不変部を産生ずるためのＤＮＡ構造体にも向けられ る。その構造体は、不変部ドメインをコードする配列の３′末端に、その５′末 端で読み枠を合わして結合基を通して連結される不変部ドメインのそれぞれと実 質的に同じポリペプチドセグメントをコードするＤＮＡ配列を含んで成る。その 構造体は通常、さらに、第−不変部ドメインをコードする配列の５′末端にその ３′末端で結合基を通して連結される、可変部をコードする配列を含む。構造体 がＨｌＪをコードする場合、それは、Ｃｏｔ：ヒンジ、　Ｃ，２゜ＣＨ３及び場 合によってはＣ，４ドメインをコードする配列を含むであろう。同様に、構造体 は、Ｌ鎖をコードする場合、ＣＬ　ドメインをコードする配列を含むであろう。

構造体は、−緒にスプライスされ、そしてクローン化されるセグメントで又はい づれか他の生物学的技法により合成され得る。

ドメイン変性が置換である場合、交換されるべきドメインをコードする遺伝子セ グメントの前後の結合基は通常、ユニーク制限部位を含んで成る。次にその同じ 制限部位は、交換される予定である他の抗体のドメインをコードする配列を囲む 結合基に存在するであろう。複製又は内部欠失を促進するために、その同じ第一 ユニーク制限部位は、複製されるか又は欠失されるべきドメインをコードする配 列のアミノ末端で存在するドメインをコードする配列の先に存在する結合基に存 在する。第二ユニーク制限部位は、一本の鎖をコードする配列の先の結合基に及 び第二の同一の鎖をコードする遺伝子においてド°メインをコードする配列の後 の結合基に存在する。

この場合、交換の後、ドメインは一本の鎖をコードする遺伝子における二種のコ ピー（複製された）に存在し、そして第二の釦をコードする遺伝子には不在（欠 失された）である。

ドメイン変性がカルボキシ末端欠失である場合、Ｃ末端を含むであろうドメイン の後の結合基は、ヂンセンスコドン又は終結コドンのいづれかを含むであろう。

本発明の抗体を産生ずる細胞もまた供給される。その細胞は、前に記載したドメ イン変性不変部抗体Ｈ鎖の発現のためのＤＮＡ構造体を含む。その細胞はまた、 通常別々のＤＮＡ構造体においてＬ鎖領域をコードするＤＮＡ配列も含む。キメ ラ性抗体（たとえばトランスフェクト−マス）を産生ずる細胞の産生は良く知ら れており、そして関連する文献に詳細に説明されている。

完全な抗体の他に、ドメイン変性不変部を含む抗体フラグメントもまた、本発明 の一部である。たとえば、特異的結合部位を形成するためにアセンブリーされた 単一のＬ釦及び単一のＨ鎖から調製される半抗体は、−価の結合タンパク質とし て使用され得る。さらに、アセンブリーされていないドメイン変性不変部は、特 異的なポリクローナル又はモノクローナル抗体を生成するための抗体として使用 され得る。特定の抗体特異性の産生は、それぞれ欠失又は挿入により排除又は増 強され得る。交換されたドメインを有するドメイン変性抗体の使用は、ユニーク な特異性の混合物を有するポリクローナル抗体を高い収率で産生ずることができ る。

本明細書に使用される用語“抗体”とは完全な抗体及びそのフラグメントの両者 を言及する。完全な抗体は、天然のＹ−型形状にアセンブリーされる２種のＬｔ 、Ｅｌ及び２種のＨ鎖を含む。抗体フラグメントは、特異的結合部位を生成する ためにアセンブリーされた単一のＨ及びｌから形成される半抗体、及び完全な抗 体又は酵素、たとえばパパインによる切断により調製された半抗体のいづれかの フラグメントを含む。

次の例は、例示的であって、限定するものではない。

ヒトＴ３抗体は、４個のエキソンから成る拡張されたヒンジ領域を有する。ヒト Ｔ４は、それらの不変部における広範な配列類似性（Ｃ）＋２及びＣ，４３にお いて９０％以上の同一の残基）にもかかわらず、まったく異なった性質を示す。

１ｇＧ３遺伝子を構成し、そして発現せしめた。単離されたタンパク質は、１， ２．３又は４個（野生型）のヒンジエキソンを有する。続くヒンジ欠失によるＨ 鎖の分子量の変化が示された。

さらにＴ３ヒンジを、Ｔ、不変部に配置し、そして逆も同様に行なった。ＩｇＧ ｓ及びＩｇＧ＜からのヒンジ領域の交換は、補体を固定し、モしてＦｃ受容体に 結合するためのこれらの分子の能力を変えなかった。

例２ 薬物投与としてのそのような適用のために遺伝子工学的に作られた抗体の有用性 を最大にするためには、抗体を変えることが有用である。抗体がアセンブリーさ れ、そして分泌され、そして特異的に抗原を結合するそれらの能力を保持すべき である制限が存在する。

産生される抗体分子の大きさについての上限が存在するかどうかを決定するため に、Ｃ□１及びヒンジ領域が複製されているＩｇＧ３Ｈ鎖を構成した。第二構造 体において、Ｃ，１，ヒンジ及びＣ，２を複製した。複製されたＣ□１及びヒン ジを有する遺伝子がトランスフェクションのために使用される場合、ひじょうに 減じられたトランスフェクション頻度が見られた。

残存するトランスフエクタントを分析したが、いずれの検出可能なＨ鎖タンパク 質も産生じなかった。これらの結果は、この構造体によりコードされるＨ釦が細 胞に対して毒性であることを示唆する。

対照的に、Ｃ，＋１−ヒンジ及びＣ，２が複製されているＨ鎮をコードする遺伝 子を、トランスフェクションの後、発現せしめた。その鎖をマウスλＨ鎖と共に アセンブリーし、そして分泌した。これらの研究は、産生され得る特異的なＩ［ 分子に関して制限が存在するが、これらの制限は本質的に大きさに無関係である ことを示唆する。

例３ 関連する一連の研究において、アセンブリーする、分泌されるべき及び機能する １ｇ分子の能力に影響する種々のドメインの欠失が行なわれた。下記ドメイン： Ｃｏ　ｌ＋上ヒンジ及び Ｃ，１＋ヒンジ＋Ｃ，２ を欠失するタンパク質をコードするＩｇＧ、Ｈ鎮遺伝子を構成し、そして骨髄腫 細胞中にトランスフェクトせしめた。

ドメインが欠失されているキメラ性ＨｔＪを合成した。Ｊ５５８Ｌをキメラ性Ｈ 鎖遺伝子によりトランスフェクトし、そしてタンパク質を合成するトランスフエ クタントを単離した。トランスフェクシントを、３ＳＳ−メチオニンを用いて３ 時間、ラベル化した。細胞質性の及び分泌されたＩｇを、抗−Ｈ鎖による免疫沈 殿により調製した。その免疫沈殿物を、５Ｏ３−ＰＡＧＥにより分析した。

Ｃ，２を欠失する遺伝子が使用される場合、予測される分子量のタンパク質の合 成を意図することが見うけられた。この短くされたＨを、マウスλＨ鎖又はキメ ラ性Ｖ−ＤＮＳ−ヒトにＬ鎖のいづれかと共にアセンブリーし、分泌される８２ １２分子を製造した。

ヒンジ＋Ｃ，２が欠失される場合、ＨｌＪｌは、分泌されるＨＬ半分子に明らか にアセンブリーした。しかしながら、これらがＨ２ではないことを断固として言 及することは不可能である。

Ｃｌ４１＋ヒンジが欠失される場合、他のＨ鎮又はＬ鎖のいづれかとのＨ鎮のア センブリーは、存在しなかった。これは驚くべき事ではない。なぜならば、鋼量 ジスルフィド結合を形成する遊離システィンがＣ１１１に存在するからである。

しかしながら、鎮間ジスルフィド結合の不在下でさえ、その短くされたＨ鎮は、 分泌される。

可変部がＣ，３に直接結合されているＨ鎖をまた、産生じた。このＨｔＪは、キ メラ性り鎖と共に同時トランスフェクトされる場合、非産生骨髄腫に分泌された 。それは、Ｌ鎖又は他のＨ鎮のいづれかと共に共有結合を形成しなかった。

例４ 第２表は、産生された多くのドメイン変性不変部抗体を例産生されたドメイン交 換タンパク質 １６５８　　　　γ２　　　　γ３　　　　　γ３　　　　　γ３１６４７　　 　　γ３　　　　γ２　　　　　γ２　　　　　γ２１６５４　　　　ｒ３　　 　　　γ、　　　　　γ２　　　　　γ２１６５６　　　　γ２　　　　γ２　 　　　　γ２　　　　　γ３第２表に示されるベクターから調製されたタンパク 質の生成及びそれらの機能の分析を始めた。たとえば、ベクター１６５４は、そ のＦｃ受容体結合活性について分析されたタンパク質を産生じ、そしてＩｇＧｚ のように、ヒト単球細胞系のＦｃ受容体に結合しない。

本明細書に言及されたすべての出版物及び特許出願は、本発明が関与する当業者 のレベルの表示である。すべての出版物及び特許出願は、引用により本明細書に 組込まれる。

前述の発明は、明確に理解するために例示的及び測的にい及び変更を行なうこと ができる。

ＦＩＧ、　１ ＦＩＧ、　２ ＦＩＧ、３ ＦＩＧ、４ →＝］）口）０−　　ＦＩＧ、５Ｂ 国際調査報告 ｒ＋ｗｌｉｏ＋ｗｌ　ＡＢｐ＆ｇ１ｍ＋　１１ｏ■テ、、、Ｓ８９，００２９゜ ＡＬＩ＝ａｃｈｍｅｎセｔｏ　ＰＣＴ　Ｔｅ１ｅｐｈｏｎｅ　Ｍｅ＋ｎｏｒｎｄ ｕｍＤｅセａｉｌｅｄ　　Ｒｅａｓｏｎｓ　　ｆｏｒ　　Ｆｌｏｌｄｉｎ　　　 ＬＩＩＣに　ｏｆ　　Ｌｌｎｉセ　　ｏｆ　　Ｉｎｖｅｎヒ１ｏ■ Ｔｈｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｃｈａｉｎ　Ｏｆ　Ｇｒｏｕｐ　Ｉ　ｃｏｕｌｄｂ ｅ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｂｙａ　ｍｅｔｈｏｄ　ｄｉｆｆ＠ｒｅｎヒｔｈａｎ　 ｔｈａｔ　ｏｆ　Ｇｒｏｕｐ　ＩＸ、５ｕｃｈ　ａｓ　ｃｈｅｍｉ−ｃａｌ　５ ｙｎｔｈｅｓｉｓ。

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. １．少なくとも１つの結合部位領域及びドメイン変性不変部を有する抗体鎖。
2. ２．前記結合部位領域及び前記ドメイン変性不変部が同じ哺乳類源からである請 求の範囲第１項記載の抗体鎖。
3. ３．前記結合部位領域が第一哺乳類源からであり、そして前記ドメイン変性不変 部が第二哺乳類源からである請求の範囲第１項記載の抗体鎖。
4. ４．前記第一哺乳類源が第二哺乳類源と同じ種のものである請求の範囲第３項記 載の抗体鎖。
5. ５．前記第一哺乳類源が前記第二哺乳類源とは異なる種のものである請求の範囲 第３項記載の抗体鎖。
6. ６．前記ドメイン変性不変部が、ＣＨ１，ヒンジ，ＣＨ２，ＣＨ３又はＣＨ４の 少なくとも１種のドメインの実質的にすべてのアミノ酸の欠失を含み、そして前 記ドメイン変性不変部の残存するアミノ酸が、哺乳類抗体の不変部の少なくとも １種のドメインのアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を有する請求の範囲 第１項記載の抗体鎖。
7. ７．前記欠失が少なくとも２種のドメインの実質的にすべてのアミノ酸を含んで 成る請求の範囲第６項記載の抗体鎖。
8. ８．前記ドメインが隣接しない請求の範囲第７項記載の抗体鎖。
9. ９．前記ドメイン変性不変部が、哺乳類抗体の不変部のアミノ酸配列と実質的に 同じアミノ酸配列を有し、但しＣＬ，ＣＨ１，ヒンジ，ＣＨ２，ＣＨ３又はＣＨ ４の少なくとも１種のドメインの実質的にすべてのアミノ酸が、異なった哺乳類 抗体鎖からの少なくとも１種のドメインの実質的にすべてのアミノ酸により置換 されている請求の範囲第１項記載の抗体鎖。
10. １０．前記ドメイン変性不変部が、他のアイソタイプ又はクラスの抗体の対応す るドメインの置換である請求の範囲第９項記載の抗体鎖。
11. １１．前記置換されたドメインが、前記不変部と同じ宿主動物源からである請求 の範囲第９項記載の抗体鎖。
12. １２．前記置換されたドメインの源が、前記不変部の源以外の異なった種からで ある請求の範囲第９項記載の抗体鎖。
13. １３．前記ドメイン変性不変部が、哺乳類抗体の不変部のアミノ酸配列と同じア ミノ酸配列を有し、そしてＣＬ，ＣＨ１，ヒンジ，ＣＨ２，ＣＨ３及びＣＨ４の 少なくとも１種のドメインの実質的にすべてのアミノ酸の挿入をさらに含んで成 る請求の範囲第１項記載の抗体鎖。
14. １４．前記挿入が少なくとも２種のドメインのものである請求の範囲第１３項記 載の抗体鎖。
15. １５．前記挿入が、前記不変部の少なくとも１種のドメイン複製である請求の範 囲第１３項記載の抗体鎖。
16. １６．請求項１記載の抗体をコードするＤＮＡ配列を含んで成るＤＮＡ構造体。
17. １７．抗体Ｈ鎖のドメイン変性不変部を産生するためのＤＮＡ構造体であって： （ａ）抗体Ｈ鎖のＣＨ１領域と実質的に同じポリペプチドをコードする第一ＤＮ Ａ配列； （ｂ）前記第一ＤＮＡ配列の３′末端に、その５′末端で読み枠を合わして、結 合基を通して連結される第二ＤＮＡ配列（該第二配列は、抗体Ｈ鎖のヒンジ領域 と実質的に同じポリペプチドをコードする）； （ｃ）前記第二ＤＮＡ配列の３′末端、にその５′末端で読み枠を合わして、結 合基を通して連結される第三ＤＮＡ配列（該第三配列は、抗体Ｈ鎖のＣＨ２領域 と実質的に同じポリペプチドをコードする）；及び （ｄ）前記第三ＤＮＡ配列の３′末端に、その５′末端で読み枠を合わして、結 合基を通して連結される第四ＤＮＡ配列（該第四配列は、抗体Ｈ鎖のＣＨ３領域 と実質的に同じポリペプチドをコードする）を含んで成り、ここで少なくとも１ つの前記結合基が前記構造体に対してユニークな制限部位を含むＤＮＡ構造体。
18. １８．前記結合基のうち２種がユニークな制限部位を含んで成る請求の範囲第１ ７項記載のＤＮＡ構造体。
19. １９．抗体Ｈ鎖のＣＨ４領域と実質的に同じポリペプチドをコードする前記第四 ＤＮＡ配列の３′末端に、その５′末端で結合基を通して連結される第五ＤＮＡ 配列をさらに含んで成る請求の範囲第１７項記載のＤＮＡ構造体。
20. ２０．前の配列に、抗体Ｈ鎖のＣ末端ドメインをコードする配列を連結する前記 結合基が終結コドン又はナンセンスコドを含んで成る請求の範囲第１７項記載の ＤＮＡ構造体。
21. ２１．抗体Ｈ鎖のドメイン変性不変部を発現するためのＤＮＡ構造体であって： （ａ）抗体Ｈ鎖の可変部と実質的に同じポリペプチドをコードする第一ＤＮＡ配 列； （ｂ）前記第一ＤＮＡ配列の３′末端に、その５′末端で読み枠を合わして、結 合基を通して連結される第二ＤＮＡ配列（該第二配列は、抗体Ｈ鎖のＣＨ１領域 と実質的に同じポリペプチドをコードする）； （ｃ）前記第二ＤＮＡ配列の３′末端に、その５′末端で読み枠を合わして、結 合基を通して連結される第三ＤＮＡ配列（該第三配列は、抗体Ｈ鎖のヒンジ領域 と実質的に同じポリペプチドをコードする）； （ｄ）前記第三ＤＮＡ配列の３′末端に、その５′末端で読み枠を合わして、結 合基を通して連結される第四ＤＮＡ配列（該第四配列は、抗体Ｈ鎖のＣＨ２領域 と実質的に同じポリペプチドをコードする）；及び （ｅ）前記第四ＤＮＡ配列の３′末端に、その５′末端で読み枠を合わして、結 合基を通して連結される第五ＤＮＡ配列（該第五配列は、抗体Ｈ鎖のＣＨ３領域 と実質的に同じポリペプチドをコードする）を含んで成り；ここで前記構造体が ドメイン変性抗体鎖をコードするＤＮＡ構造体。
22. ２２．抗体Ｌ鎖のドメイン変性不変部の発現のためのＤＮＡ構造体であって： （ａ）抗体Ｌ鎖の可変部と実質的に同じポリペプチドをコードする第一ＤＮＡ配 列；及び （ｂ）前記第一ＤＮＡ配列の３′末端に、その５′末端で読み枠を合わして結合 基を通して連結される第二ＤＮＡ配列（該第二配列は、抗体Ｈ鎖のＣＨ１領域と 実質的に同じポリペプチドをコードする）を含んで成るＤＮＡ構造体。
23. ２３．抗体Ｈ鎖のドメイン変性不変部の発現のために請求の範囲第２１項記載の ＤＮＡ構造体を含む細胞。
24. ２４．抗体Ｌ鎖をコードするＤＮＡ配列をさらに含んで成る請求の範囲第２３項 記載の細胞。
25. ２５．ドメイン変性不変部抗体を産生するための方法であって： （ａ）栄養培地中で請求の範囲第２３項記載の細胞を増殖せしめ、これによって 前記ＤＮＡ構造体が発現され、そして前記Ｈ及びＬ鎖が抗体を形成するために細 胞内で一緒に結合され；そして （ｂ）前記抗体を単離することを含んで成る方法。