JP2003531149A - 抗体由来の免疫応答の増強 - Google Patents

抗体由来の免疫応答の増強

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＦｃγＲＩＩＢによりもたらされる活性を調節することにより抗腫瘍抗体の機能を増強することに関する。特に、ＦｃγＲＩＩＢによるＳＨＩＰ活性化を断つことは、ヒトにおいてインビボで治療抗体により引き出される細胞傷害を増強する。本発明はさらに、減少した親和性でＦｃγＲＩＩＢへの抗体の結合をもたらす変異体Ｆｃ領域を有する抗体、例えば抗腫瘍抗体を提供する。様々なトランスジェニックマウスモデルは、抑制ＦｃγＲＩＩＢ分子がインビボにおける細胞傷害の強力な調節因子であることを示す。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 関連出願へのクロスリファレンス 本願は、２０００年４月１３日に出願された米国仮特許出願第６０／１９８，
５５０号及び２０００年５月１５日に出願された第６０／２０４，２５４号に対
する優先権を請求し、それらの各々は引用することにより本明細書に組み込まれ
る。 連邦政府的に支援される研究に関する申し立て 本発明への研究誘導（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌｅａｄｉｎｇ）は、国立衛生研究
所助成Ｎｏ．ＣＡ８０７５７により部分的に支援された。従って、米国政府は、
本発明におけるある種の権利を有することができる。 発明の分野 本発明は、ＦｃγＲ活性を調節することにより抗腫瘍抗体の機能を増強するこ
とに関する。 発明の背景 免疫系の細胞と抗体及び抗体−抗原複合体との相互作用は、抗体依存性細胞傷
害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、食作用、炎症性メディエー
ター放出、抗原の除去、並びに抗体半減期を包含する様々な応答をもたらす（Ｄ
ａёｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９７；１５：２０３−
２３４；Ｗａｒｄ ａｎｄ Ｇｈｅｔｉｅ，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．，１９９５；２：７７−９４；Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，
Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９１；９：４５７−４９２に概説さ
れる、これらの各々は引用することにより本明細書に組み込まれる）。
【０００２】 抗体定常ドメインは、抗体を抗原に結合させることに直接関与していないが、
様々なエフェクター機能を示す。抗体もしくは免疫グロブリンは、それらの重鎖
の定常領域のアミノ酸配列により、異なるクラスに特定することができる。５つ
の主要なクラスの免疫グロブリン：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ
があり、そしてこれらのいくつかはさらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば
、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４；ＩｇＡ１及びＩｇＡ２に分類す
ることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常領域は、そ
れぞれ、α、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。様々なヒト免疫グロブリンクラスの
うち、ヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ３は、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４より効果的にＡＤＣ
Ｃをもたらす。
【０００３】 抗体のパパイン消化は、各々が単一の抗原結合部位を有するＦａｂフラグメン
トと呼ばれる２本の同一の抗原結合フラグメント、及び容易に結晶化できること
をその名前が表す残りの「Ｆｃ」フラグメントを生成する。Ｆｃ領域は、抗体の
エフェクター機能にとって重要である。ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の結晶構造は決定
されている（Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０：２３
６１−２３７０（１９８１）、これは引用することにより本明細書に組み込まれ
る）。ヒトＩｇＧ分子において、Ｆｃ領域はＣｙｓ、２２６のＮ末端のパパイン
切断により生成される。
【０００４】 抗体Ｆｃ領域によりもたらされるエフェクター機能は、２つの種類に分類する
ことができる：（１）抗原への抗体の結合後に働くエフェクター機能；これらの
機能は、補体カスケードもしくはＦｃ受容体（ＦｃＲ）保有細胞の関与を伴う；
及び（２）抗原結合に関係なく働くエフェクター機能；これらの機能は、循環に
おける存続及びトランスサイトーシスにより細胞障壁を越えて運ばれる能力を与
える（Ｗａｒｄ ａｎｄ Ｇｈｅｔｉｅ，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｉｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｙ，１９９５，２：７７−９４、これは引用することにより本明細書に
組み込まれる）。
【０００５】 要求される抗原への抗体の結合は、外来抗原のその内因性標的（例えば受容体
もしくはリガンド）への結合を妨げるかもしれない中和作用を有するが、外来抗
原を取り除くこと及び／もしくは破壊することには効率のよいエフェクター機能
もまた必要とされる。
【０００６】 いくつかの抗体エフェクター機能は、抗体のＦｃ領域に結合するＦｃ受容体（
ＦｃＲｓ）によりもたらされる。ＦｃＲｓは、免疫グロブリンアイソタイプに対
するそれらの特異性により特定され：ＩｇＧ抗体のＦｃ受容体はＦｃγＲ、Ｉｇ
ＥのものはＦｃεＲ、ＩｇＡのものはＦｃαＲ、などと呼ばれる。免疫グロブリ
ンＧの表面受容体は２つの異なるクラス、それらが架橋すると細胞を活性化する
もの（「活性化ＦｃＲｓ」）及び共連動すると活性化を抑制するもの（「抑制Ｆ
ｃＲｓ（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ＦｃＲｓ）」）において存在する。ＩｇＧの活
性化ＦｃＲｓは、細胞活性化をもたらすために免疫チロシン活性化モチーフ（Ｉ
ｍｍｕｎｅ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｍｏｔｉｆ）（ＩＴＡ
Ｍ）の存在を必要とする。受容体もしくはそれらの関連サブユニットの細胞質末
端に存在するこの１９アミノ酸配列は、チロシンキナーゼのｓｒｃ及びｓｙｋフ
ァミリーと順次相互作用する。免疫複合体により活性化ＦｃγＲが架橋すると、
ＩＴＡＭ配列はこれらのチロシンキナーゼの活性化を誘発し、それらが今度はＰ
Ｉ３Ｋ、ＰＬＣγ及びＴｅｃキナーゼのような様々な細胞性メディエーターを活
性化する。これらの活性化工程の最終的な結果は、持続性カルシウム応答を引き
起こすために小胞体貯蔵からの細胞内カルシウム放出及び電気容量共役カルシウ
ムチャンネルの開口を増すことである。これらのカルシウムフラックスは、顆粒
含有物のエキソサイトーシス、食作用及びＡＤＣＣ応答の刺激、並びに特定の核
転写因子の活性化のためにきわめて重要である。これらの活性化応答を阻むのは
抑制ＦｃγＲである。抑制シグナリングは、免疫チロシン抑制モチーフ（Ｉｍｍ
ｕｎｅ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｍｏｔｉｆ）（ＩＴＩＭ）
と呼ばれる１３アミノ酸の細胞質配列に依存している。抑制ＦｃγＲにＩＴＡＭ
含有受容体が共連結すると、ＩＴＩＭにおける重要なチロシン残基がリン酸化さ
れるようになり、ＳＨＩＰと呼ばれる特定のＳＨ２含有イノシトールポリリン酸
５ホスファターゼの漸増を引き起こす。ＳＨＩＰは、膜イノシトール脂質ＰＩＰ
３の加水分解を触媒し、それによりＰＬＣγ及びＴｅｃキナーゼの活性化を妨げ
、そして電気容量共役チャンネルを通したカルシウムの流入によりもたらされる
持続性カルシウムフラックスを妨げる。
【０００７】 ＦｃγＲの３つのサブクラス：ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ
３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）が同定されている。各ＦｃγＲサブクラ
スは２もしくは３個の遺伝子によりコードされ、そして選択的ＲＮＡスプライシ
ングは複数の転写産物をもたらすので、ＦｃγＲアイソフォームにおける広範な
多様性が存在する。ＦｃγＲＩサブクラス（ＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲＩＢ及びＦ
ｃγＲＩＣ）をコードする３個の遺伝子は第１染色体の長腕の領域１ｑ２１．１
に密集し；ＦｃγＲＩＩアイソフォーム（ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ及び
ＦｃγＲＩＩＣ）をコードする遺伝子及びＦｃγＲＩＩＩ（ＦｃγＲＩＩＩＡ及
びＦｃγＲＩＩＩＢ）をコードする２個の遺伝子は全て領域１ｑ２２に密集する
。
【０００８】 マウスは２種の活性化ＦｃγＲｓ、リガンド結合αサブユニット及びＩＴＡＭ
含有γサブユニットを有するオリゴマー表面受容体のＦｃＲＩ及びＦｃＲＩＩＩ
を発現する。抑制受容体は、リガンド結合α鎖の細胞質末端に存在するＩＴＩＭ
配列を有する一本鎖受容体のＦｃγ ＲＩＩＢである。ＦｃＲＩＩＢ及びＦｃＲ
ＩＩＩは、１ｘ１０6の親和性定数でモノマーＩｇＧに結合し；従って、生理的
条件下でそれらはモノマーＩｇＧに結合しないが、低い親和性及び高いアビディ
ティーでマルチマーＩｇＧ免疫複合体と相互作用する。ＦｃＲＩＩＩは、細胞傷
害性抗体もしくは病原性免疫複合体により引き起こされる炎症性疾患をもたらす
ことにとって生理学的に重要な活性化ＦｃＲである。ＦｃＲＩＩＩは、マウスに
おいてＮＫ細胞、マクロファージ、マスト細胞及び好中球上に発現される。それ
は、Ｂ細胞、Ｔ細胞もしくは循環する単球上に存在しない。ＦｃＲＩＩＢは、Ｂ
細胞、マクロファージ、マスト細胞、好中球上に存在する。それは、Ｔ細胞もし
くはＮＫ細胞上に存在しない。ＦｃＲＩＩ及びＩＩＩは、それらの細胞外のリガ
ンド結合ドメインにおいて９０％より大きい配列同一性を有する。
【０００９】 ヒトにおける状況はいっそう複雑である。ＩｇＧには２種の低親和性活性化Ｆ
ｃＲｓ、ＦｃγＲＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＩＡがある。ＦｃγＲＩＩＡは、その
細胞質末端に位置するＩＴＡＭ配列を有する、ＩｇＧの一本鎖低親和性受容体で
ある。それは、マクロファージ、マスト細胞、単球、好中球及びいくつかのＢ細
胞上に発現される。Ｂ細胞、マクロファージ、マスト細胞、好中球、単球上に発
現されるが、ＮＫ細胞もしくはT細胞上には発現されない、細胞質ドメインにＩ
ＴＩＭ配列を有するヒト抑制ＦｃＲＩＩＢ分子とそれはその細胞外ドメインにお
いて９０％相同である。ＦｃＲＩＩＩＡは、リガンド結合αサブユニット及びＩ
ＴＡＭ含有γもしくはζサブユニットからなるオリゴマー活性化受容体である。
それは、ＮＫ細胞、マクロファージ及びマスト細胞上に発現される。それは、好
中球、Ｂ細胞もしくはＴ細胞上に発現されない。さらに、ＦｃＲＩＩＩＢと呼ば
れるその細胞外ドメインにおける９５％より大きい配列同一性を有する受容体が
、ＧＰＩアンカー型タンパク質としてヒト好中球上に存在する。それは免疫複合
体に結合することはできるが、ＦｃＲＩＩＡのようなＩＴＡＭ含有受容体との会
合なしに細胞を活性化することはできない。ＦｃＲＩＩ及びＦｃＲＩＩＩは、そ
れらのリガンド結合細胞外ドメインにおいて約７０％同一である。
【００１０】 従って、ヒトにおいて、ＩｇＧ細胞傷害性抗体は４種の異なる低親和性受容体
と相互作用し、それらのうち２種は細胞性応答を活性化することができ（ＦｃＲ
ＩＩＡ及びＦｃＲＩＩＩＡ）、それらのうち１種は抑制性であり（ＦｃＲＩＩＢ
）、そしてそれらのうち１種はＩｇＧ複合体に結合するが、細胞性応答を引き起
こさない（ＦｃＲＩＩＩＢ）。マクロファージはＦｃＲＩＩＡ、ＦｃＲＩＩＢ及
びＦｃＲＩＩＩＡを発現し、好中球はＦｃＲＩＩＡ、ＦｃＲＩＩＢ及びＦｃＲＩ
ＩＩＢを発現し、一方、ＮＫ細胞はＦｃＲＩＩＩＡのみを発現する。従って、治
療抗腫瘍抗体の効能は、異なる細胞タイプ上に特異的に発現される、活性化、抑
制及び不活性低親和性ＦｃＲｓとの特定の相互作用により決まる。
【００１１】 治療抗腫瘍抗体が開発されている明確に定義された腫瘍モデルは既知である。
例えば、ＨＥ Ｒ２／ｎｅｕ増殖因子受容体に対して向けられる抗体は、インビ
トロ及びインビボで乳癌細胞の増殖を妨げる。同様に、Ｂ細胞上のＣＤ２０抗原
に向けられる抗体は、非ホジキンリンパ腫の増殖を抑える（Ｔａｊｉ，Ｈ．ｅｔ
ａｌ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１９９８，８９：７４８、こ
れは引用することにより本明細書に組み込まれる）。これらの抗体は、インビト
ロで腫瘍細胞増殖を妨げるそれらの能力に基づいて開発され、そしてＥＧＦ受容
体（Ｍａｓｕｌ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１９８６，
４６：５５９２、これは引用することにより本明細書に組み込まれる）、ＩＬ−
２Ｒ（Ｗａｌｄｍａｎｎ，Ｔ．Ａ．，Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１９９４，５ Ｓ
ｕｐｐ．１：１３−７、これは引用することにより本明細書に組み込まれる）及
び他のもの（Ｔｕｔｔ，Ａ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９
８，１６１：３１７６、これは引用することにより本明細書に組み込まれる）に
特異性を有するものを含むクラスを代表する。細胞性癌原遺伝子ｐ１８５ＨＥＲ
−２／ｎｅｕに特異的なヒト化抗体のＨｅｒｃｅｐｔｉｎR（Ｐｅｇｒａｍ，Ｍ
．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１９９８，１６：２６５９；
Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ，１９９２，８９：４２８５−４２８９、これらの各々は引用することによ
り本明細書に組み込まれる）及びＢ細胞マーカーＣＤ２０に特異的なキメラ抗体
のＲｉｔｕｘａｎR（Ｌｅｇｅｔ，Ｇ．Ａ．及びＣｚｕｃｚｍａｎ，Ｍ．Ｓ．，
Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１９９８，１０：５４８−５１、これは引
用することにより本明細書に組み込まれる。）は、それぞれ、ＨＥＲ−２陽性乳
癌及びＢ細胞リンパ腫の処置に対して承認されている。多数のインビトロ研究に
より、ＨｅｒｃｅｐｔｉｎR及びそのマウス親分子４Ｄ５の抗腫瘍活性を招く重
要な機構は受容体−リガンド遮断のためであることが示され（Ｋｏｐｒｅｓｋｉ
，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１９９６，１６：４３
３−６；Ｌｅｗｉｓ，Ｇ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．
Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，１９９３，３７：２５５−６３、これらの各々は引用
することにより本明細書に組み込まれる）、一方、他のインビトロ研究は、抗体
依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）のような活性が重要であり得ることを示唆している
（Ｃａｒｔｅｒ，１９９２，上記；Ｌｅｗｉｓ，Ｇ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，１９９３，３７：２５５−
６３、これは引用することにより本明細書に組み込まれる）。ＲｉｔｕｘａｎR
及びそのマウス親２Ｂ８でのインビトロ研究は、直接的前アポトーシス（ｐｒｏ
−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）活性がこの抗体と関連し得ることを示唆している（Ｓｈ
ａｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１９９８，９１：１６４４−５２、これ
は引用することにより本明細書に組み込まれる）。
【００１２】 このように、抗腫瘍抗体のインビボでそれらの効果をもたらす能力に関して、
長い半減期、シグナリング経路の遮断、アポトーシスの活性化及びエフェクター
細胞由来の細胞傷害を包含する多数の機構が提示されている。腫瘍を効果的に処
置する抗腫瘍抗体の能力を増強する機構の解明は非常に望ましい。 発明の要約 本発明は、抗体由来の細胞傷害を調整することにおいてＦｃ繃ＲＩＩＢが果た
す重要な役割を認識することにより抗体由来の免疫応答を調節するための先行技
術の成果より優れた重要な改善を示す。従って、本発明は、ヒトにおいてインビ
ボで治療抗体により引き出される細胞傷害を増強する方法を都合よく提供する。
本発明の方法は、Ｆｃガンマ受容体ＩＩＢ（Ｆｃ繃ＲＩＩＢ）によるＳＨＩＰの
活性化を断つことを含んでなる。好ましくは、抗体のＦｃ部分をＦｃγＲＩＩＢ
に対するその親和性を下げるように改変することにより抗体結合を阻害する。本
発明は、抗腫瘍抗体の活性、従って効果を増強するために特に有用である。
【００１３】 本発明はまた、変異体Ｆｃ領域を有する抗体も提供し、この抗体は、減少した
親和性でＦｃγＲＩＩＢに結合する。好ましくは、抗体は、野生型抗体と少なく
とも同じ親和性で活性化Ｆｃ受容体に結合する。上記で触れたように、これらの
特性は抗腫瘍抗体に特に有用である。
【００１４】 本発明のこれら及び他の態様は、図面、詳細な記述及び実施例への参照により
さらによく理解される。 発明の詳細な記述 本発明は、ヒトにおける治療抗体、特定の抗腫瘍、抗ウイルス及び抗微生物（
細菌及び単細胞寄生虫）抗体のエフェクター機能を増強する有益な方法を提供す
る。ヒトにおいてインビボで治療抗体により引き出される細胞傷害を増強するこ
とは、Ｆｃガンマ受容体ＩＩＢ（ＦｃγＲＩＩＢもしくはＦｃＲＩＩＢ）による
ＳＨＩＰの活性化を断つことを含んでなる。特に、ＦｃＲＩＩＡ及びＦｃＲＩＩ
ＩＡへの結合を保持するかもしくは増強しながら抑制Ｆｃ受容体ＦｃＲＩＩＢへ
の治療抗体結合を断つことにより、またはＦｃＲＩＩＢがＳＨＩＰを活性化する
のを妨げることにより、本発明は抗体効能を有意に向上する。
【００１５】 本発明は、一つには、腫瘍標的に対するインビボ細胞傷害性応答を抑制受容体
が調整するという認識に基づく。様々な同系及び異種移植モデルを使用する実験
は、抑制ＦｃγＲＩＩＢ分子がインビボにおける細胞傷害の強力な調節因子であ
り、エフェクター細胞上のＦｃγＲＩＩＩの活性を調整することを示した。治療
抗体の抗腫瘍活性を説明するために多数の機構が提示されているが、今回、エフ
ェクター細胞上のＦｃγＲｓの連動が抗腫瘍抗体のインビボ活性の重要な成分で
あることが示される。
【００１６】 マウスモノクローナル抗体並びにヒト化した臨床的に有効な治療法Ｈｅｒｃｅ
ｐｔｉｎR及びＲｉｔｕｘａｎRは、骨髄性細胞上の活性化及び抑制抗体受容体の
両方と連動し、従って、それらの細胞傷害能力を調整する。ＦｃγＲＩＩＢを欠
損するマウスは非常に増強された抗体由来の細胞傷害を示し；逆に、活性化Ｆｃ
受容体を欠損するマウス並びにそれらの受容体へのＦｃ結合を断つように工学設
計した抗体は、インビボにおける腫瘍増殖を阻止することができない。これらの
結果は、ＦｃＲに依存する機構が細胞傷害性抗腫瘍抗体の作用に有意に寄与する
ことを示し、そしてヒト治療のために最適な抗腫瘍抗体は活性化ＦｃＲｓに優先
的にそして抑制パートナーＦｃγＲＩＩＢに最低限に結合することを示唆する。
【００１７】 これらのデータは、妥当な治療モデル（トランスジェニックマウスにおける腫
瘍細胞）に対する抗体由来の細胞傷害の直接効果を測定することによりインビボ
における効果を示すので、より初期の研究が行っているより大いに抑制ＦｃＲＩ
ＩＢ機能の重要性を立証する。インビボでの結果は、生理的条件下での活性化及
び抑制クラスの両方、すなわち、ＦｃＲＩ、ＦｃＲＩＩＢ及びＦｃＲＩＩＩの複
数の受容体相互作用の効果を表す。従って、これらの結果は、ＦｃＲＩＩＩの連
動によりもたらされるインビトロ抗体活性を測定するＡＤＣＣデータと対照をな
す。実際、インビボデータは、ＦｃＲＩＩＢが抗体由来の細胞傷害に主に寄与し
そしてＦｃＲＩＩＢを断つことが細胞傷害を非常に向上するという発見にとって
きわめて重要であった。 定義 本明細書及び請求項の全体にわたって、免疫グロブリン重鎖における残基のナ
ンバリングは、引用することにより本明細書に明白に組み込まれるＫａｂａｔ
ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａ
ｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈ
ｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）におけるようなＥＵインデッ
クスのものである。「ＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックス」は、ヒトＩ
ｇＧ１ ＥＵ抗体の残基ナンバリングをさす。
【００１８】 「親ポリペプチド」は、本明細書において開示する１つもしくはそれ以上のＦ
ｃ領域改変がなくそして本明細書において開示するようなポリペプチド変異体と
比較してエフェクター機能が異なるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドであ
る。親ポリペプチドは、天然配列Ｆｃ領域または以前から存在するアミノ酸配列
改変（付加、欠失及び／もしくは置換のような）を有するＦｃ領域を含んでなる
ことができる。
【００１９】 「Ｆｃ」領域という用語は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するため
に用いる。「Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域もしくは変異体Ｆｃ領域であるこ
とができる。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は様々であるかもしれないが
、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、位置Ｃｙｓ２２６のアミノ酸残基からもし
くはＰｒｏ２３０からそのカルボキシル末端までの範囲に特定される。
【００２０】 ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」（「Ｃγ２」ドメインとも呼ばれ
る）は、通常、約アミノ酸２３１から約アミノ酸３４０までに及ぶ。ＣＨ２ドメ
インは、それが別のドメインと密接に対になっていない点において独特である。
むしろ、２本のＮ結合した分枝状炭水化物鎖が、完全な天然のＩｇＧ分子の２個
のＣＨ２ドメイン間に介在している。炭水化物は、ドメイン−ドメイン対合の代
わりをするものを提供しそしてＣＨ２ドメインを安定させるのに役立つことがで
きると推測されている（Ｂｕｒｔｏｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９８５，
２２：１６１−２０６、これは引用することにより本明細書に組み込まれる）。
【００２１】 「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域におけるＣＨ２ドメインのＣ末端の残基の範
囲を含んでなる（すなわち、ＩｇＧの約アミノ酸残基３４１から約アミノ酸残基
４４７まで）。
【００２２】 「ヒンジ領域」は、一般に、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６からＰｒｏ２３０ま
でに及ぶと定義される（Ｂｕｒｔｏｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９８５，
上記）。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、重鎖間Ｓ−Ｓ結合を形成する
最初及び最後のシステイン残基を同じ位置に並べることによりＩｇＧ１配列と整
列させることができる。
【００２３】 Ｆｃ領域の「下流（ｌｏｗｅｒ）ヒンジ領域」は、一般に、ヒンジ領域のすぐ
Ｃ末端の残基の範囲、すなわち、Ｆｃ領域の残基２３３〜２３９と定義される。
本発明より前に、ＦｃγＲ結合は、一般に、ＩｇＧ Ｆｃ領域の下流ヒンジ領域
におけるアミノ酸残基に起因すると考えられた。
【００２４】 「結合ドメイン」という用語は、別の分子に結合するポリペプチドの領域をさ
す。ＦｃＲの場合、結合ドメインは、Ｆｃ領域に結合することを招くそのポリペ
プチド鎖（例えばそのα鎖）の一部を含んでなることができる。一つの有用な結
合ドメインは、ＦｃＲ鎖の細胞外ドメインである。
【００２５】 「機能性Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の「エフェクター機能」を保有する
。典型的な「エフェクター機能」には、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞傷害；Ｆｃ
受容体結合；抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；食作用：細胞表面受容体（例え
ばＢ細胞受容体；ＢＣＲ）のダウンレギュレーションなどが包含される。そのよ
うなエフェクター機能は、一般に、Ｆｃ領域が結合ドメイン（例えば抗体可変ド
メイン）と組み合わさることを必要とし、そして例えば本明細書において開示す
るような様々なアッセイを用いて評価することができる。
【００２６】 「天然配列Ｆｃ領域」は、天然に存在するＦｃ領域のアミノ酸配列と同一であ
るアミノ酸配列を含んでなる。「変異体Ｆｃ領域」は、本明細書において定義す
るような少なくとも一つの「アミノ酸改変」によって天然配列Ｆｃ領域のものと
異なるアミノ酸配列を含んでなる。好ましくは、変異体Ｆｃ領域は、天然配列Ｆ
ｃ領域もしくは親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して少なくとも１個のアミノ酸
置換、例えば天然配列Ｆｃ領域もしくは親ポリペプチドのＦｃ領域における約１
〜約１０個のアミノ酸置換、そして好ましくは約１〜約５個のアミノ酸置換を有
する。本明細書における変異体Ｆｃ領域は、好ましくは、天然配列Ｆｃ領域及び
／もしくは親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％の相同性、そして最
も好ましくはそれと少なくとも約９０％の相同性、より好ましくはそれと少なく
とも約９５％の相同性を有する。
【００２７】 「Ｆｃ領域含有ポリペプチド」という用語は、Ｆｃ領域を含んでなる抗体もし
くは免疫付着因子（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎｓ）（以下の定義を参照）のよ
うなポリペプチドをさす。
【００２８】 「Ｆｃ受容体」もしくは「ＦｃＲ」という用語は、抗体のＦｃ領域に結合する
受容体を表すために用いる。好ましいＦｃＲは、天然配列ヒトＦｃＲである。さ
らに、好ましいＦｃＲはＩｇＧ抗体に結合するもの（ガンマ受容体）であり、そ
してＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含み、
これらの受容体の対立遺伝子変異体及び選択的スプライシング形態を包含する。
ＦｃγＲＩＩ受容体にはＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃγＲＩＩ
Ｂ（「抑制受容体」）が包含され、これらは主にその細胞質ドメインが異なる同
様のアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメイ
ンに免疫受容体チロシンに基づく活性化モチーフ（ＦＡＭ）を含有する。抑制受
容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンに基づく抑制
モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する（Ｄａёｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．，１９９７，１５：２０３−２３４における総説を参照；ＦｃＲｓは、
Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，
１９９１，９：４５７−９２；Ｃａｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔ
ｈｏｄｓ，１９９４，４：２５−３４；及びｄｅ Ｈａａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ
．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，１９９５，１２６：３３０−４１に概説される
、これらの各々は引用することにより本明細書に組み込まれる）。
【００２９】 「抗体依存性細胞傷害」及び「ＡＤＣＣ」は、ＦｃＲｓを発現する非特異的細
胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びマクロファージのよ
うな単球性細胞）が標的細胞上の結合抗体を認識しそして続いて標的細胞の溶解
を引き起こすインビトロ細胞性反応をさす。原則として、活性化ＦｃγＲを有す
る任意のエフェクター細胞を、ＡＤＣＣをもたらすように誘発することができる
。ＡＤＣＣをもたらす主要な細胞、ＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現し、
一方、単球は、それらの活性化状態、配置もしくは分化により、ＦｃγＲＩ、Ｆ
ｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現することができる。造血細胞上のＦｃＲ発
現は、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．，１９９１，９：４５７−９２に要約されており、これらの各々は、引用す
ることにより本明細書に組み込まれる。
【００３０】 「ヒトエフェクター細胞」は、１種もしくはそれ以上のＦｃＲを発現しそして
エフェクター機能を果たす白血球である。好ましくは、細胞は少なくともＦｃγ
ＲＩＩＩを発現し、そしてＡＤＣＣエフェクター機能を果たす。ＡＤＣＣをもた
らすヒト白血球の例には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（Ｎ
Ｋ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞及び好中球が包含され；ＰＢＭＣ及びＮＫ細
胞が好ましい。エフェクター細胞はその天然起源から、例えば本明細書において
記述するように血液もしくはＰＢＭＣから単離することができる。 抗体 「抗体」という用語は、最も広い意味において使用し、そして特にモノクロー
ナル抗体（全長モノクローナル抗体を包含する）、ポリクローナル抗体、多重特
異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び所望の生物学的活性を示す限り抗体フ
ラグメントを包含する。
【００３１】 「抗体フラグメント」は、本発明の目的のために定義する場合、一般に完全な
抗体の抗原結合もしくは可変領域またはＦｃＲ結合能力を保持する抗体のＦｃ領
域を包含する、完全な抗体の一部を含んでなる。抗体フラグメントの例には、線
状抗体；一本鎖抗体分子；及び抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体
が包含される。抗体フラグメントは、好ましくは、ＩｇＧ重鎖のヒンジ及び場合
によりＣＨ１領域の少なくとも一部を保持する。より好ましくは、抗体フラグメ
ントは、ＩｇＧ重鎖の全定常領域を保持し、そしてＩｇＧ軽鎖を含む。
【００３２】 「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書において用いる場合、実質的
に均質な抗体の集団から得られる抗体をさし、すなわち、集団を含んでなる個々
の抗体は、わずかな量で存在し得る可能な天然に存在する突然変異を除いて同一
である。モノクローナル抗体は、単一の抗原性部位に対して向けられ、非常に特
異的である。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対して向けられる異なる抗
体を典型的に含む通常の（ポリクローナル）抗体調製物と異なり、各モノクロー
ナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して向けられる。「モノクローナル」と
いう修飾語は、抗体の実質的に均質な集団から得られるような抗体の特性を示し
、そして任意の特定の方法による抗体の生産を必要とすると解釈されるべきでは
ない。例えば、本発明に従って使用するモノクローナル抗体は、引用することに
より本明細書に組み込まれるＫｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔ
ｕｒｅ，１９７５，２５６：４９５−４９７により最初に記述されたハイブリド
ーマ法により製造することができ、もしくは組換えＤＮＡ法（例えば米国特許第
３０ ４，８１６，５６７号を参照、これは引用することにより本明細書に組み
込まれる）により製造することができる。「モノクローナル抗体」はまた、例え
ば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９１，３５２：６２
４−６２８及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９１
，２２２：５８１−５９７に記述されている技術を用いてファージ抗体ライブラ
リーから単離することができ、これらの各々は引用することにより本明細書に組
み込まれる。
【００３３】 本明細書におけるモノクローナル抗体には、特に、重鎖及び／もしくは軽鎖の
一部は特定の種から得られるかまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属
する抗体における対応する配列と同一であるかまたは相同であり、一方、鎖（１
本もしくは複数）の残りの部分は別の種から得られるかまたは別の抗体クラスも
しくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一であるかもしくは相
同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、並びに所望の生物学的活性を示す
限りそのような抗体のフラグメントが包含される（米国特許第４，８１６，５６
７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，１９８４，８１：６８５１−６８５５；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ
ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８４，３１２：６０４−６０８；Ｔａｋｅｄａ
ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８５，３１４：４５２−４５４；国際特許出
願第ＰＣＴ／ＧＢ８５／００３９２を参照、これらの各々は引用することにより
本明細書に組み込まれる）。
【００３４】 非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンから
得られる最低限の配列を含有するキメラ抗体である。大体、ヒト化抗体は、レシ
ピエントの超可変領域からの残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有するマ
ウス、ラット、ウサギもしくは非ヒト霊長類のような非ヒト種（ドナー抗体）の
超可変領域からの残基で置換されるヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）で
ある。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖ骨格領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ
ｒｅｇｉｏｎ）（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基で置換される。さらに、
ヒト化抗体は、レシピエント抗体もしくはドナー抗体に存在しない残基を含んで
なることができる。これらの改変は、抗体性能をさらに改良するためになされる
。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１個、そして典型的には２個の可変ドメイ
ンの実質的に全てを含んでなり、ここで、超可変ループの全てもしくは実質的に
全ては非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、そしてＦＲ残基の全てもしくは実
質的に全てはヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体はまた場合によ
り、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グ
ロブリンのものを含んでなる。さらなる詳細は、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎ
ａｔｕｒｅ，１９８６，３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ
ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８８，３３２：３２３−３２９；Ｐｒｅｓｔａ，Ｃ
ｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，１９９２，２：５９３−５９６；米
国特許第５，２２５，５３９号を参照、これらの各々は引用することにより本明
細書に組み込まれる。 拮抗阻害剤による阻害 本発明は、ＦｃＲＩＩＢを活性化せずにそれに特異的に結合し、従って腫瘍特
異的抗体による結合を妨げる拮抗阻害剤の有効量を投与することを意図する。例
えば、ＦｃＲＩＩＢへのモノマー分子の結合は、活性化に必要とされる受容体の
架橋を妨げる。
【００３５】 抗ＦｃＲＩＩＢ抗体（好ましくは、細胞傷害性応答の発生を妨げるためのＦｖ
抗体）及び免疫グロブリンのＦｃＲＩＩＢ結合配列に対応するペプチドを包含す
るがこれらに決して限定されるものではない様々な拮抗阻害剤を本発明の実践に
用いることができる。
【００３６】 ＦｃＲＩＩＢ結合部位の低分子量拮抗阻害剤は、抑制Ｆｃ受容体への細胞傷害
性抗体の結合を妨げることにおいて有効である。抑制受容体の活性化を妨げるた
めの他の標的には、主要なシグナリング分子、ＳＨＩＰが包含される。ＳＨＩＰ
、イノシトールポリリン酸５−ホスファターゼは、ＦｃＲＩＩＢの生物学的活性
にとって必須である（Ｏｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９６，３８３
：２６３；Ｏｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１９９７，９０：２９３；Ｂｏｌ
ｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１９９８，８：５０９、これらの
各々は引用することにより本明細書に組み込まれる）。ＳＨＩＰのイノシトール
ホスファターゼ活性の拮抗阻害剤はＦｃＲＩＩＢの抑制活性を妨げ、そしてそれ
によりＩｇＧ抗体の有効な細胞傷害活性を増強する。拮抗阻害剤には、抗体並び
に低分子量アンタゴニストを包含することができる。 改変されたＦｃＲＩＩＢ結合部位を有する抗体 好ましい態様として、抗体のＦｃ部分をＦｃγＲＩＩＢに対するその親和性を
下げるように改変すること、従って抗体変異体を作製することにより抗体結合を
阻害する。多数の参考文献が、ＦｃＲｓに対する結合親和性を調整するためにＦ
ｃ部分を改変する技術を記述している（ＰＣＴ公開第ＷＯ ９９／５８５７２号
、第ＷＯ ９９／５１６４２号、第ＷＯ ９８／２３２８９号、第ＷＯ ８９／０
７１４２号、第ＷＯ ８８／０７０８９号；米国特許第５，８３４，５９７号及
び第５，６２４，８２１号を参照、これらの各々は引用することにより本明細書
に組み込まれる）。
【００３７】 「改変された」ＦｃＲ結合親和性を有する抗体変異体は、親ポリペプチドもし
くは天然配列Ｆｃ領域を含んでなるポリペプチドと比較して減少したＦｃγＲＩ
ＩＢ結合活性及び増強された細胞傷害性を有するものである。
【００３８】 親抗体より「効果的にヒトエフェクター細胞の存在下で抗体由来の細胞傷害を
もたらす」抗体変異体は、抗体の好ましい変異体の量が、例えば本明細書におい
て開示する一つもしくはそれ以上のインビボアッセイにおいて、親より細胞傷害
をもたらすことにおいて約１．５倍〜約１００倍、例えば約２倍〜約５０倍有効
である場合に、インビトロもしくはインビボで細胞傷害をもたらすことにおいて
実質的にいっそう有効であるものである。
【００３９】 「アミノ酸改変」は、前もって決定したアミノ酸配列のアミノ酸配列における
改変をさす。典型的な改変には、アミノ酸置換、挿入及び／もしくは欠失が包含
される。本明細書における好ましいアミノ酸改変は置換である。
【００４０】 例えばＦｃ領域の、特定の位置「でのアミノ酸改変」は、特定残基の置換もし
くは欠失、または特定残基の近くの少なくとも１個のアミノ酸残基の挿入をさす
。特定残基の「近くの」挿入は、その１〜２残基以内の挿入を意味する。挿入は
、特定残基のＮ末端もしくはＣ末端であることができる。
【００４１】 「アミノ酸置換」は、別の異なる「置換」アミノ酸残基での前もって決定した
アミノ酸配列における少なくとも１個の存在するアミノ酸残基の置換をさす。１
個もしくは複数の置換残基は、「天然に存在するアミノ酸残基」である（すなわ
ち、遺伝暗号によりコードされる）ことができ、そしてアラニン（Ａｌａ）；ア
ルギニン（Ａｒｇ）；アスパラギン（Ａｓｎ）；アスパラギン酸（Ａｓｐ）；シ
ステイン（Ｃｙｓ）；グルタミン（Ｇｌｎ）；グルタミン酸（Ｇｌｕ）；グリシ
ン（Ｇｌｙ）；ヒスチジン（Ｈｉｓ）；イソロイシン（Ｉｌｅ）；ロイシン（Ｌ
ｅｕ）；リシン（Ｌｙｓ）；メチオニン（Ｍｅｔ）；フェニルアラニン（Ｐｈｅ
）；プロリン（Ｐｒｏ）；セリン（Ｓｅｒ）；トレオニン（Ｔｈｒ）；トリプト
ファン（Ｔｒｐ）；チロシン（Ｔｙｒ）；及びバリン（Ｖａｌ）よりなる群から
選択することができる。１個もしくはそれ以上の天然に存在しないアミノ酸残基
での置換もまた、本明細書におけるアミノ酸置換の定義により包含される。「天
然に存在しないアミノ酸残基」は、ポリペプチド鎖において隣接するアミノ酸残
基（１個もしくは複数）と共有結合的に結合することができる、上記の天然に存
在するアミノ酸残基以外の残基をさす。天然に存在しないアミノ酸残基の例には
、ノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリン及び引用することにより
本明細書に組み込まれるＥｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．
，１９９１，２０２：３０１−３３６に記述されているもののような他のアミノ
酸残基類似体が包含される。そのような天然に存在しないアミノ酸残基を作製す
るためには、引用することにより本明細書に組み込まれるＮｏｒｅｎ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９，２４４：１８２及びＥｌｌｍａｎ ｅｔ ａ
ｌ．，上記の方法を用いることができる。簡潔に言えば、これらの方法は、天然
に存在しないアミノ酸残基でサプレッサーｔＲＮＡを化学的に活性化すること、
続いてインビトロ転写及びＲＮＡの翻訳を伴う。
【００４２】 「アミノ酸挿入」は、前もって決定したアミノ酸配列への少なくとも１個のア
ミノ酸の導入をさす。通常、挿入は１もしくは２個のアミノ酸残基の挿入からな
るが、本願は、さらに大きい「ペプチド挿入」、例えば約３〜約５個もしくはさ
らに約１０個までのアミノ酸残基の挿入を意図する。挿入される残基（１個もし
くは複数）は、上記に開示するような天然に存在するかもしくは天然に存在しな
いものであることができる。
【００４３】 「アミノ酸欠失」は、前もって決定したアミノ酸配列からの少なくとも１個の
アミノ酸残基の除去をさす。
【００４４】 特定の態様として、本発明の改変された抗体変異体は、ＦｃＲＩＩＢに対する
減少した親和性を有するが、刺激ＦｃＲｓ、ＦｃＲＩ及びＦｃＲＩＩＩに対する
変化していないかもしくはさらに増強された親和性を有する。
【００４５】 一般に、これらの改変されたＦｃドメインの作製は、酵母もしくは哺乳動物細
胞のような適合する宿主における突然変異させたダイマーＩｇＧ Ｆｃドメイン
のライブラリーの発現、及び固相もしくは溶液結合のいずれかによる特定のＦｃ
受容体でのこれらの表面発現させたＦｃドメインのスクリーニングを伴う。Ｆｃ
ＲＩＩＢへの減少した結合を有する改変されたＦｃドメインは、この方法におい
て同定される。 ＦｃγＲＩＩＢもしくはＳＨＩＰの発現を阻害すること 上記に説明するように、腫瘍特異的（もしくは任意の）抗体由来の細胞傷害を
増強する一つの方法は、抑制Ｆｃ受容体、ＦｃγＲＩＩＢもしくはこの受容体に
よるシグナル伝達をもたらす分子、ＳＨＩＰのいずれかの発現を阻害することを
含む。アンチセンス及び細胞内抗体を包含する、標的タンパク質の発現を阻害す
る多数の技術がある。これらの標的をコードする核酸及びタンパク質自体は周知
である（Ｂｒｏｏｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９８９，１７
０：１３６９；Ｄａｍｅｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
１９９６，９３：１６８９；Ｋａｖａｎａｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．
Ｂｉｏｌ．１９９６，６：４３８、これらの各々は引用することにより本明細書
に組み込まれる）。
【００４６】 「アンチセンス核酸」は、ＲＮＡもしくはＤＮＡ分子における相補的塩基と細
胞質条件下でハイブリダイズすると、後者の役割を阻害する一本鎖核酸分子であ
る。ＲＮＡがメッセンジャーＲＮＡ転写産物である場合、アンチセンス核酸は逆
転写産物（ｃｏｕｎｔｅｒｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）もしくはｍＲＮＡを妨げる相
補的核酸である。現在用いる場合、「アンチセンス」には、広く、ＲＮＡ−ＲＮ
Ａ相互作用、ＲＮＡ−ＤＮＡ相互作用、リボザイム及びＲＮアーゼＨによりもた
らされる阻害が包含される。アンチセンス核酸分子は、細胞における発現のため
に組換え遺伝子によりコードすることができ（例えば、米国特許第５，８１４，
５００号；米国特許第５，８１１，２３４号、これらの各々は引用することによ
り本明細書に組み込まれる）、あるいはまたそれらを合成的に製造することがで
きる（例えば、米国特許第５，７８０，６０７号、これは引用することにより本
明細書に組み込まれる）。遺伝子発現を抑制するためのアンチセンス核酸の使用
の多数の例がある（米国特許第５，７７３，２３１号及び第５，５７６，２０８
号；Ｈａｎｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ，２０００，３１：７
７０−７８０；Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｎａｌ
Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２０００，２７８：Ｆ６２８−Ｆ６３４；Ｐｒａｔｉ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，２０００，６８：２３９
−２４４；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２０
００，６：１０２４−３０；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．，２０００，６：７７３−８１；Ｍａｃｋ ａｎｄ Ｒｏｂｉｔｚｋ
ｉ，Ｐｒｏｇ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，２０００，６０：６０２−２８を参照、
これらの各々は引用することにより本明細書に組み込まれる）。
【００４７】 本発明のために予見される合成オリゴヌクレオチドの特定の非限定的な例には
、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、ホスホン酸メチル、短鎖アルキル
、あるいはシクロアルキル糖間結合または短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式糖間
結合を含有するオリゴヌクレオチドが包含される。最も好ましいのは、ＣＨ2−
ＮＨ−Ｏ−ＣＨ2、ＣＨ2−Ｎ（ＣＨ3）−Ｏ−ＣＨ2、ＣＨ2−Ｏ−Ｎ（ＣＨ3）−
ＣＨ2、ＣＨ2−Ｎ（ＣＨ3）−Ｎ（ＣＨ3）−ＣＨ2及びＯ−Ｎ（ＣＨ3）−ＣＨ2
−ＣＨ2主鎖（ここで、ホスホジエステルはＯ−ＰＯ2−Ｏ−ＣＨ2である）を有
するものである。引用することにより本明細書に組み込まれる米国特許第５，６
７７，４３７号は、複素環式芳香族化合物オリゴヌクレオシド結合を記述してい
る。窒素リンカーもしくは窒素を含有する基もまた、オリゴヌクレオチド模倣物
を製造するために用いることができる（米国特許第５，７９２，８４４号及び第
５，７８３，６８２号、これらの各々は引用することにより本明細書に組み込ま
れる）。引用することにより本明細書に組み込まれる米国特許第５，６３７，６
８４号は、ホスホルアミデート及びホスホロチオアミデートオリゴマー化合物を
記述している。モルホリノ主鎖構造を有するオリゴヌクレオチドもまた予見され
る（米国特許第５，０３４，５０６号、これは引用することにより本明細書に組
み込まれる）。別の態様として、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）主鎖のように、オリ
ゴヌクレオチドのホスホジエステル主鎖をポリアミド主鎖で置換することができ
、塩基は、ポリアミド主鎖のアザ窒素原子に直接もしくは間接的に結合される（
Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１４９７，１９９１
、これは引用することにより本明細書に組み込まれる）。他の合成オリゴヌクレ
オチドは、２’位で以下のものの一つを含んでなる置換された糖成分を含有する
ことができる：ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ3、Ｆ、ＯＣＮ、Ｏ（ＣＨ2）nＮＨ2もしくは
Ｏ（ＣＨ2）nＣＨ3、ここで、ｎは１〜約１０である；Ｃ1〜Ｃ10低級アルキル、
置換された低級アルキル、アルカリール（ａｌｋａｒｙｌ）もしくはアラルキル
；Ｃｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ3；ＯＣＦ3；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルキル；Ｏ−
、Ｓ−もしくはＮ−アルケニル；ＳＯＣＨ3；ＳＯ2ＣＨ3；ＯＮＯ2；ＮＯ2；Ｎ3 ；ＮＨ2；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリール；アミノアルキル
アミノ；ポリアルキルアミノ；置換されたシリル；フルオレセイン成分；ＲＮＡ
切断基；レポーター基；インターカレーター（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ）；オ
リゴヌクレオチドの薬物動態学的性質を向上する基；またはオリゴヌクレオチド
の薬力学的性質を向上する基、及び同様の性質を有する他の置換基。オリゴヌク
レオチドはまた、ペントフラノシル基の代わりにシクロブチルもしくは他のカー
ボサイクリック（ｃａｒｂｏｃｙｃｌｉｃｓ）のような糖模倣物を有することも
できる。イノシンのような、アデノシン、シチジン、グアノシン、チミジン及び
ウリジン以外のヌクレオシドを有するヌクレオチド単位をオリゴヌクレオチド分
子に用いることができる。
【００４８】 細胞内抗体もまた、タンパク質発現もしくは機能を阻害することにおいて有効
である。細胞内抗体は、典型的には一本鎖Ｆｖ構築物である（Ｂｉｒｄ，Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ，１９８８，２４２：４２３−４２６；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８８，８５：５８７９−
５８８３；Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８９，３３４：５４４
−５４６；米国特許第５，４７６，７８６号，第５，１３２，４０５号及び第４
，９４６，７７８号；Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２
７５−１２８１，１９８９、これらの各々は引用することにより本明細書に組み
込まれる）。多数の研究が、細胞内タンパク質機能を阻害することにおけるそれ
らの効果について報告している（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎ
ｅ Ｔｈｅｒ．，１９９８，５：６３５−４４；Ｍａｒａｓｃｏ ｅｔ ａｌ．
，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１９９８，９：１６２７−４２；Ｃｏｃｈｅ
ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１９９８，５８：１１７０−６；
Ｃｕｒｉｅｌ，Ａｄｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９７，４０：５１−８４、
これらの各々は引用することにより本明細書に組み込まれる）。 シグナル伝達を阻害すること 別の態様として、ＳＨＩＰ活性化をイノシトールホスファターゼ阻害剤により
阻害する。ＳＨＩＰのイノシトールポリリン酸５−ホスファターゼ活性は、Ｆｃ
ＲＩＩＢの抑制シグナルを伝達するために必要且つ十分である（Ｏｎｏ ｅｔ
ａｌ．，１９９７，上記；Ｂｏｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９８，上記）。
それは、細胞傷害性抗体がマクロファージ、マスト細胞、好中球もしくは単球上
の表面ＦｃＲｓと連動するとインビボで起こるように、ＦｃＲＩＩＡもしくはＦ
ｃＲＩＩＩＡのようなＩＴＡＭ含有受容体に架橋することによりＦｃＲＩＩＢが
リン酸化されるとそれと独特に会合する。ＳＨＩＰのホスファターゼ活性の突然
変異はＦｃＲＩＩＢを不活性化し、抑制シグナリングを妨げ、そしてそれにより
活性化ＦｃＲｓの細胞傷害性抗体連動のインビボ効果を増強するように働く。多
数のクラスのイノシトールホスファターゼが存在することが知られているが、Ｓ
ＨＩＰの５−ホスファターゼ活性は独特であり、ＳＨＩＰ特異的阻害剤の作製を
可能にする。ＳＨＩＰは、造血細胞において広く発現され、そして様々な増殖因
子受容体からのシグナリングに結びつけられているが、それらの活性へのホスフ
ァターゼ活性の寄与はまだ立証されていない。任意の事象において、ＳＨＩＰホ
スファターゼ活性もしくはリン酸化されたＦｃＲＩＩＢ ＩＴＩＭモチーフへの
漸増の阻害剤は、エフェクター（ｅｆｆｅｃｔｅｄ）細胞における抑制シグナリ
ングを妨げる。 組換え技術 本発明に従って、当該技術分野の技術の範囲内の通常の分子生物学、微生物学
及び組換えＤＮＡ技術を用いることができる。そのような技術は、文献において
十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（本明細書では「Ｓａｍｂｒｏｏｋ
ｅｔ ａｌ．，１９８９」）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃ
ａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ及びＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ
ｅｄ．１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（
Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ ｅｄ．１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉ
ｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ
．１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ
（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．１９８４）；Ａ
ｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．１
９８６）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（Ｉ
ＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ
Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｆ．Ｍ
．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃ
ｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ
＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）を参照、これらの各々は引用することによ
り本明細書に組み込まれる。 分子生物学−定義 「宿主細胞」という用語は、細胞による物質の生産、例えば、遺伝子、ＤＮＡ
もしくはＲＮＡ配列、タンパク質または酵素の細胞による発現のために、任意の
方法で選択するか、改変するか、形質転換するか、増やすか、または使用もしく
は操作する任意の生物体の任意の細胞を意味する。宿主細胞はさらに、下記のよ
うに、スクリーニングもしくは他のアッセイに用いることができる。
【００４９】 タンパク質及び酵素は、遺伝暗号に従って、ＤＮＡ及びＲＮＡ中の指令を用い
て宿主細胞において作られる。一般に、特定のタンパク質もしくは酵素の指令を
有するＤＮＡ配列は、ＲＮＡの対応する配列に「転写」される。そのＲＮＡ配列
は、今度はタンパク質もしくは酵素を形成するアミノ酸の配列に「翻訳」される
。「アミノ酸配列」は、２個もしくはそれ以上のアミノ酸の任意の鎖である。各
アミノ酸は、ヌクレオチドの１個もしくはそれ以上のトリプレットによりＤＮＡ
もしくはＲＮＡにおいて表される。各トリプレットは、アミノ酸に対応するコド
ンを形成する。例えば、アミノ酸リシン（Ｌｙｓ）は、ヌクレオチドトリプレッ
トもしくはコドンＡＡＡによりまたはコドンＡＡＧによりコードすることができ
る。（遺伝暗号は、大部分のアミノ酸が１個より多くの対応するコドンを有する
ことを意味する縮重とも呼ばれるいくらかの重複性を有する）。ＤＮＡ及びＲＮ
Ａ配列におけるヌクレオチドはタンパク質生産のために３個のグループで読まれ
るので、正しいトリプレットが読まれるように、正しいアミノ酸で配列を読み始
めることが重要である。ヌクレオチド配列をコドンのグループに分ける方法を「
リーディングフレーム」と呼ぶ。
【００５０】 「コーディング配列」またはＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質もしくは酵素
のような発現産物を「コードする」配列は、発現されると、そのＲＮＡ、ポリペ
プチド、タンパク質もしくは酵素の生産をもたらすヌクレオチド配列であり、す
なわち、ヌクレオチド配列は、そのポリペプチド、タンパク質もしくは酵素のア
ミノ酸配列をコードする。タンパク質のコーディング配列は、開始コドン（通常
はＡＴＧ）及び終止コドンを含むことができる。
【００５１】 「構造遺伝子」とも呼ばれる「遺伝子」という用語は、１個もしくはそれ以上
のタンパク質もしくは酵素の全部もしくは一部を含んでなるアミノ酸の特定の配
列をコードするかもしくはそれに対応するＤＮＡ配列を意味し、そして例えば遺
伝子が発現される条件を決定する、プロモーター配列のような調節ＤＮＡ配列を
含んでも含まなくてもよい。構造遺伝子ではないいくつかの遺伝子は、ＤＮＡか
らＲＮＡに転写され得るが、アミノ酸配列に翻訳されない。他の遺伝子は、構造
遺伝子の調節因子もしくはＤＮＡ転写の調節因子の機能を果たすことができる。
【００５２】 「プロモーター配列」は、細胞においてＲＮＡポリメラーゼに結合すること及
び下流（３’方向）のコーディング配列の転写を開始することができるＤＮＡ調
節領域である。本発明を定義する目的では、プロモーター配列は、その３’末端
で転写開始部位と接しそしてバックグラウンドより上の検出可能なレベルで転写
を開始するために必要な最低限の数の塩基もしくは要素を含むように上流（５’
方向）に広がる。プロモーター配列内には、転写開始部位（例えば、ヌクレアー
ゼＳ１でのマッピングにより都合よく特定される）、並びにＲＮＡポリメラーゼ
の結合を招くタンパク質結合ドメイン（共通配列）が存在する。
【００５３】 コーディング配列は、細胞における転写及び翻訳制御配列の「制御下であるか
」もしくは「それらと操作可能に結合され」、ＲＮＡポリメラーゼがコーディン
グ配列をｍＲＮＡに転写すると、それは次にトランス−ＲＮＡスプライシングさ
れ（それがイントロンを含有する場合）、そしてコーディング配列によりコード
されるタンパク質に翻訳される。
【００５４】 「発現する」及び「発現」という用語は、遺伝子もしくはＤＮＡ配列における
情報を明白になるようにさせることもしくは引き起こすこと、例えば対応する遺
伝子もしくはＤＮＡ配列の転写及び翻訳に関与する細胞機能を活性化することに
よりタンパク質を生産することを意味する。ＤＮＡ配列は、タンパク質のような
「発現産物」を生成せしめるように細胞においてもしくは細胞により発現される
。発現産物自体、例えば生成するタンパク質もまた、細胞により「発現される」
ということができる。発現産物は、細胞内、細胞外もしくは分泌されると特性化
することができる。「細胞内」という用語は、細胞内部にあるものを意味する。
「細胞外」という用語は、細胞外部にあるものを意味する。物質は、細胞外部に
有意な量で出てくる場合、細胞上もしくは内部のどこかから、細胞により「分泌
される」。
【００５５】 「トランスフェクション」という用語は、細胞への外来核酸の導入を意味する
。「形質転換」という用語は、宿主細胞が、所望の物質、典型的には導入遺伝子
もしくは配列によりコードされるタンパク質もしくは酵素を生産するために導入
遺伝子もしくは配列を発現するような、宿主細胞への「外来」（すなわち、外部
もしくは細胞外）遺伝子、ＤＮＡもしくはＲＮＡ配列の導入を意味する。導入遺
伝子もしくは配列はまた、「クローン化」もしくは「外来」遺伝子もしくは配列
と呼ぶこともでき、開始、終止、プロモーター、シグナル、分泌のような調節も
しくは制御配列、または細胞の遺伝子機構により用いられる他の配列を含むこと
ができる。遺伝子もしくは配列は、非機能性配列もしくは既知の機能がない配列
を含むことができる。導入ＤＮＡもしくはＲＮＡを受け取りそして発現する宿主
細胞は、「形質転換」されており、そして「形質転換体」もしくは「クローン」
である。宿主細胞に導入するＤＮＡもしくはＲＮＡは、宿主細胞と同じ属もしく
は種の細胞、または異なる属もしくは種の細胞を包含する任意の起源から得るこ
とができる。
【００５６】 「ベクター」、「クローニングベクター」及び「発現ベクター」という用語は
、宿主を形質転換しそして導入配列の発現（例えば転写及び翻訳）を促進するよ
うに、ＤＮＡもしくはＲＮＡ配列（例えば外来遺伝子）を宿主細胞に導入するこ
とができる媒体を意味する。ベクターには、プラスミド、ファージ、ウイルスな
どが包含され；それらを以下にさらに非常に詳細に説明する。
【００５７】 ベクターは、典型的に、伝達可能な因子のＤＮＡを含んでなり、その中に外来
ＤＮＡを挿入する。ＤＮＡのあるセグメントをＤＮＡの別のセグメントに挿入す
る一般的な方法は、制限部位と呼ばれる特定の部位（ヌクレオチドの特定のグル
ープ）でＤＮＡを切断する制限酵素と呼ばれる酵素の使用を伴う。「カセット」
は、特定の制限部位でベクターに挿入することができる発現産物をコードするＤ
ＮＡコーディング配列もしくはＤＮＡのセグメントをさす。カセット制限部位は
、正しいリーディングフレームにおけるカセットの挿入を保証するように設計さ
れる。一般に、外来ＤＮＡは、ベクターＤＮＡの１個もしくはそれ以上の制限部
位で挿入され、そして次に伝達可能なベクターＤＮＡと一緒に宿主細胞にベクタ
ーにより運ばれる。発現ベクターのような、挿入もしくは付加ＤＮＡを有するＤ
ＮＡのセグメントもしくは配列はまた、「ＤＮＡ構築物」と呼ぶこともできる。
ベクターの一般的な型は「プラスミド」であり、それは一般に付加的（外来）Ｄ
ＮＡを容易に受け入れることができそして適当な宿主細胞に容易に導入すること
ができる、通常は細菌起源の、二本鎖ＤＮＡの自己充足的分子である。プラスミ
ドベクターは、大抵、コーディングＤＮＡ及びプロモーターＤＮＡを含有し、そ
して外来ＤＮＡを挿入するために適当な１個もしくはそれ以上の制限部位を有す
る。コーディングＤＮＡは、特定のタンパク質もしくは酵素の特定のアミノ酸配
列をコードするＤＮＡ配列である。プロモーターＤＮＡは、コーディングＤＮＡ
の発現を開始し、調節し、そうでなければもたらすかもしくは制御するＤＮＡ配
列である。プロモーターＤＮＡ及びコーディングＤＮＡは、同じ遺伝子からもし
くは異なる遺伝子からであることができ、そして同じもしくは異なる生物体から
であることができる。プラスミド及び真菌ベクターを包含する多数のベクターが
、様々な真核及び原核宿主における複製及び／もしくは発現のために記述されて
いる。非限定的な例には、本明細書において開示もしくは引用するか、そうでな
ければ当業者に既知である方法を用いる、ｐＫＫプラスミド（ＣＬＯＮＴＥＣＫ
，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）、ｐＵＣプラスミド、ｐＥＴプラスミド（Ｎｏｖ
ａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ｐＲＳＥＴもしくはｐＲＥＰプ
ラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、またはｐＭＡ
Ｌプラスミド（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍ
Ａ）、及び多数の適切な宿主細胞が包含される。組換えクローニングベクターは
、大抵、クローニングもしくは発現のための１個もしくはそれ以上の複製系、宿
主における選択のための１個もしくはそれ以上のマーカー、例えば抗生物質耐性
、及び１個もしくはそれ以上の発現カセットを含む。
【００５８】 特にインビトロ及びインビボにおける細胞アッセイのために、好ましいベクタ
ーは、レンチウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、
アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスのようなウイルス
ベクター、及び望ましい細胞親和性を有する他の組換えウイルスである。従って
、機能性もしくは突然変異体タンパク質もしくはそのポリペプチドドメインフラ
グメントをコードする遺伝子は、ウイルスベクターを用いてもしくはＤＮＡの直
接導入によりインビボ、エクスビボもしくはインビトロで導入することができる
。標的組織における発現は、ウイルスベクターもしくは受容体リガンドで、また
は組織特異的プロモーターを用いることにより、またはその両方のような、特定
の細胞にトランスジェニックベクターをターゲッティングすることによりもたら
すことができる。選択的遺伝子送達は、引用することにより本明細書に組み込ま
れる、１９９５年１０月に公開された国際特許公開ＷＯ ９５／２８４９４に記
述されている。
【００５９】 インビボもしくはエクスビボターゲッティング及び治療方法に一般的に用いら
れるウイルスベクターは、ＤＮＡに基づくベクター及びレトロウイルスベクター
である。ウイルスベクターを構築しそして使用する方法は、当該技術分野におい
て既知である（例えば、Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｒｏｓｍａｎ，ＢｉｏＴｅｃｈ
ｎｉｑｕｅｓ，１９９２，７：９８０−９９０を参照、これは引用することによ
り本明細書に組み込まれる）。好ましくは、ウイルスベクターは複製欠損性であ
り、すなわち、それらは標的細胞において自律的に複製することができない。好
ましくは、複製欠損性ウイルスは最小ウイルスであり、すなわち、それはウイル
ス粒子を生産するためにゲノムを包膜化するのに必要なそのゲノムの配列のみを
保持する。
【００６０】 ＤＮＡウイルスベクターには、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、パピローマ
ウイルス、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、アデノウイルス、アデノ随
伴ウイルス（ＡＡＶ）などのような、しかしこれらに限定されるものではない弱
毒もしくは欠損ＤＮＡウイルスが包含される。ウイルス遺伝子を完全にもしくは
ほとんど完全に欠く欠損ウイルスが好ましい。欠損ウイルスは、細胞への導入後
に感染力がない。欠損ウイルスベクターの使用により、ベクターが他の細胞に感
染することができるという懸念なしに、特定の限局領域における細胞に投与する
ことができる。従って、特定の組織を特異的に標的とすることができる。特定の
ベクターの例には、欠損ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ１）ベクター（Ｋａｐｌｉ
ｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１９９１，２：
３２０−３３０、これは引用することにより本明細書に組み込まれる）、糖タン
パク質Ｌ遺伝子を欠く欠損ヘルペスウイルスベクター（特許公開ＲＤ ３７１０
０５ Ａ、これは引用することにより本明細書に組み込まれる）、もしくは他の
欠損ヘルペスウイルスベクター（１９９４年９月２９日に公開された国際特許公
開第ＷＯ ９４／２１８０７号；１９９４年４月２日に公開された国際特許公開
第ＷＯ ９２／０５２６３号、これらの各々は引用することにより本明細書に組
み込まれる）；引用することにより本明細書に組み込まれるＳｔｒａｔｆｏｒｄ
−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１
９９２，９０：６２６−６３０（引用することにより本明細書に組み込まれるＬ
ａ Ｓａｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９３，２５９：９８８−
９９０もまた参照）により記述されているベクターのような弱毒アデノウイルス
ベクター；及び欠損アデノ随伴ウイルスベクター（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９８７，６１：３０９６−３１０１；Ｓａｍｕｌｓ
ｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９８９，６３：３８２２−３８２８
；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．ＢＩｏｌ．，１９８
８，８：３９８８−３９９６、これらの各々は引用することにより本明細書に組
み込まれる）が包含されるが、これらに限定されるものではない。
【００６１】 Ａｖｉｇｅｎ，Ｉｎｃ．（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ；ＡＡＶベクター）、Ｃｅｌ
ｌ Ｇｅｎｅｓｙｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ；レトロウイルス、アデノ
ウイルス、ＡＡＶベクター及びレンチウイルスベクター）、ＣＬＯＮＴＥＣＨ（
Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ；レトロウイルス及びバキュロウイルスベクター）、
Ｇｅｎｏｖｏ，Ｉｎｃ．（Ｓｈａｒｏｎ Ｈｉｌｌ，ＰＡ；アデノウイルス及び
ＡＡＶベクター）、Ｇｅｎｖｅｃ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ；アデノウ
イルスベクター）、ＩｎｔｒｏＧｅｎｅ（Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄ
ｓ；アデノウイルスベクター）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（レト
ロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶ及びヘルペルウイルスベクター）、Ｎｏｒ
ｇｅｎ（Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ；アデノウイルベクター）、Ｏｘｆｏｒ
ｄ ＢｉｏＭｅｄｉｃａ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ；レン
チウイルスベクター）及びＴｒａｎｓｇｅｎｅ（Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ，Ｆｒａ
ｎｃｅ；アデノウイルス、ワクシニア、レトロウイルス及びレンチウイルスベク
ター）を包含するが、これらに決して限定されるものではない様々な会社がウイ
ルスベクターを商業的に製造する。
【００６２】 非ウイルスベクターは、リポフェクションによるか、裸のＤＮＡとして、もし
くは他のトランスフェクション促進因子（ペプチド、ポリマーなど）で導入する
ことができる。マーカーをコードする遺伝子のトランスフェクション用のリポソ
ームを製造するために合成カチオン脂質を用いることができる（Ｆｅｌｇｎｅｒ
，ｅｔ ａｌ，，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９
８７，８４：７４１３−７４１７；Ｆｅｌｇｎｅｒ ａｎｄ Ｒｉｎｇｏｌｄ，
Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９，３３７：３８７−３８８；Ｍａｃｋｅｙ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８８，８５
：８０２７−８０３１；Ｕｌｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９３
，２５９：１７４５−１７４８、これらの各々は引用することにより本明細書に
組み込まれる）。核酸の導入のために有用な脂質化合物及び組成物は、国際特許
公開ＷＯ ９５／１８８６３及びＷＯ ９６／１７８２３、並びに米国特許第５，
４５９，１２７号に記述されており、これらの各々は引用することにより本明細
書に組み込まれる。脂質は、ターゲッティングの目的のために他の分子に化学的
に連結することができる（Ｍａｃｋｅｙ ｅｔ ａｌ．，上記を参照）。標的に
向けられるペプチド、例えばホルモンもしくは神経伝達物質、及び抗体のような
タンパク質、または非ペプチド分子をリポソームに化学的に連結することができ
るはずである。カチオンオリゴペプチド（例えば、引用することにより本明細書
に組み込まれる国際特許公開ＷＯ ９５／２１９３１）、ＤＮＡ結合タンパク質
から得られるペプチド（例えば、引用することにより本明細書に組み込まれる国
際特許公開ＷＯ ９６／２５５０８）、もしくはカチオンポリマー（例えば、引
用することにより本明細書に組み込まれる国際特許公開ＷＯ ９５／２１９３１
）のような他の分子もまた、インビボにおける核酸のトランスフェクションを促
進するために有用である。裸のＤＮＡプラスミドとしてインビボでベクターを導
入することもまた可能である。遺伝子治療のための裸のＤＮＡベクターは、当該
技術分野において既知である方法、例えば、電気穿孔、微量注入、細胞融合、Ｄ
ＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、遺伝子銃の使用、もしくはＤＮＡ
ベクター輸送体の使用により所望の宿主細胞に導入することができる（例えば、
Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９２，２６７：９６３−
９６７；Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８８，２６３：
１４６２１−１４６２４；Ｈａｒｔｍｕｔ ｅｔ ａｌ．，１９９０年３月１５
日に出願されたカナダ特許出願第２，０１２，３１１号；Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９１，８８
：２７２６−２７３０を参照、これらの各々は引用することにより本明細書に組
み込まれる）。受容体によりもたらされるＤＮＡ送達方法もまた用いることがで
きる（Ｃｕｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１９９２
，３：１４７−１５４；Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９
８７，２６２：４４２９−４４３２、これらの各々は引用することにより本明細
書に組み込まれる）。米国特許第５，５８０，８５９号及び第５，５８９，４６
６号（これらの各々は引用することにより本明細書に組み込まれる）は、トラン
スフェクション促進因子なしの、哺乳動物における外来ＤＮＡ配列の送達を開示
する。最近、電気導入（ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｒ）と呼ばれる比較的低
電圧で高効率のインビボＤＮＡ導入技術が記述されている（Ｍｉｒ ｅｔ ａｌ
．，Ｃ．Ｐ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９８，３２１：８９３；ＷＯ ９９／０
１１５７；ＷＯ ９９／０１１５８；ＷＯ ９９／０１１７５、これらの各々は引
用することにより本明細書に組み込まれる）。
【００６３】 「発現系」という用語は、例えばベクターにより運ばれそして宿主細胞に導入
される外来ＤＮＡによりコードされるタンパク質の発現のために適当な条件下の
宿主細胞及び適合するベクターを意味する。一般的な発現系には、エシェリキア
・コリ宿主細胞及びプラスミドベクター、昆虫宿主細胞及びバキュロウイルスベ
クター、並びに哺乳動物宿主細胞及びベクターが包含される。特定の態様として
、目的のタンパク質はＣＯＳ−１もしくはＣ2Ｃ12細胞において発現される。他
の適当な細胞には、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、２９３T（ヒト腎臓細胞）、マ
ウス一次（ｐｒｉｍａｒｙ）筋芽細胞及びＮＩＨ３Ｔ３細胞が包含される。
【００６４】 「異種起源の」という用語は、天然に存在しない要素の組み合わせをさす。例
えば、異種起源のＤＮＡは、細胞もしくは細胞の染色体位置に生来位置しないＤ
ＮＡをさす。好ましくは、異種起源のＤＮＡには、細胞にとって外来の遺伝子が
包含される。異種起源の発現調節要素は、生来それが操作可能に結合されるもの
と異なる遺伝子と操作可能に結合されるような要素である。本発明に関連して、
目的のタンパク質をコードする遺伝子は、それがクローニングもしくは発現のた
めに挿入されるベクターＤＮＡと異種起源であり、そしてそれが発現されるその
ようなベクターを含有する宿主細胞、例えばＣＨＯ細胞と異種起源である。
【００６５】 核酸分子は、核酸分子の一本鎖形態が温度及び溶液イオン強度の適切な条件下
で別の核酸分子にアニーリングすることができる場合（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ
ａｌ．，上記を参照）、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡもしくはＲＮＡのような別の
核酸分子に「ハイブリダイゼーション可能」である。温度及びイオン強度の条件
は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。相同な核酸
の予備スクリーニングには、５５℃のＴm（融解温度）に相当する低ストリンジ
ェンシーハイブリダイゼーション条件を用いることができる、例えば、５ｘ Ｓ
ＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、０．２５％ミルク及びホルムアミドなし；もしくは３
０％ホルムアミド、５ｘ ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ。中程度のストリンジェンシ
ーハイブリダイゼーション条件は、さらに高いＴmに相当する、例えば、５ｘも
しくは６ｘ ＳＣＣで、４０％ホルムアミド。高ストリンジェンシーハイブリダ
イゼーション条件は、最も高いＴmに相当する、例えば、５０％ホルムアミド、
５ｘもしくは６ｘ ＳＣＣ。ＳＣＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５M クエ
ン酸Ｎａである。ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーションのストリ
ンジェンシーにより、塩基間のミスマッチが可能であるが、２つの核酸が相補的
配列を含有することを必要とする。核酸 をハイブリダイゼーションさせる適切
なストリンジェンシーは、核酸の長さ及び相補性の程度、当該技術分野において
周知である変数により決まる。２つのヌクレオチド配列間の類似性もしくは相同
性の程度が大きいほど、それらの配列を有する核酸のハイブリッドのＴm値は大
きい。核酸ハイブリダイゼーションの相対的安定性（より高いＴmに相当する）
は以下の順に減少する：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長
さが１００ヌクレオチドより大きいハイブリッドには、Ｔmを計算する式が得ら
れている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，上記、９．５０−９．５１を参照
）。さらに短い核酸、すなわち、オリゴヌクレオチドでのハイブリダイゼーショ
ンでは、ミスマッチの位置がいっそう重要になり、そしてオリゴヌクレオチドの
長さがその特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，上記、１１．
７−１１．８を参照）。ハイブリダイゼーション可能な核酸の最低限の長さは少
なくとも約１０ヌクレオチド；好ましくは少なくとも約１５ヌクレオチドであり
；そしてより好ましくは、長さは少なくとも約２０ヌクレオチドである。
【００６６】 特定の態様として、「標準的なハイブリダイゼーション条件」という用語は５
５℃のＴmをさし、そして上記のような条件を利用する。好ましい態様として、
Ｔmは６０℃であり；より好ましい態様として、Ｔmは６５℃である。特定の態様
として、「高ストリンジェンシー」は、６８℃で０．２X ＳＳＣにおける、４２
℃で５０％ホルムアミド、４Ｘ ＳＳＣにおける、もしくはこれら２つの条件の
いずれかの下で認められるものと同等のハイブリダイゼーションのレベルをもた
らす条件下でのハイブリダイゼーション及び／もしくは洗浄条件をさす。
【００６７】 本明細書において用いる場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、目的の
遺伝子、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡもしくは他の核酸をコードするゲノムＤＮＡ分子、
ｃＤＮＡ分子もしくはｍＲＮＡ分子にハイブリダイゼーション可能な、一般に少
なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、そしてより好ましくは少なくとも２
０ヌクレオチドの、好ましくは１００ヌクレオチド以下の核酸をさす。オリゴヌ
クレオチドは、例えば32Ｐ−ヌクレオチドもしくはビオチンのような標識が共有
結合的に結合されているヌクレオチドで標識することができる。一つの態様とし
て、標識したオリゴヌクレオチドは、核酸の存在を検出するためにプローブとし
て用いることができる。別の態様として、オリゴヌクレオチド（それらの一方も
しくは両方を標識することができる）は、遺伝子の全長もしくはフラグメントを
クローニングするか、またはタンパク質をコードする核酸の存在を検出するいず
れかのために、ＰＣＲプライマーとして用いることができる。さらなる態様とし
て、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡと三重らせんを形成することができ
る。一般に、オリゴヌクレオチドは、好ましくは核酸合成機上で、合成的に製造
される。従って、オリゴヌクレオチドは、チオエステル結合などのような、天然
に存在しないホスホエステル類似体結合を用いて製造することができる。 ＦｃＲＩＩＢによるＳＨＩＰ活性化の治療的調整 本発明は、腫瘍、ウイルス及び微生物の抗体に基づく処置（受動免疫療法）を
増強する方法、すなわち、免疫応答の増強が治療利益をもたらす条件を提供する
。
【００６８】 「治療的に有効な」もしくは「治療的」という語句は、患者の活性、機能及び
応答における臨床的に有意な欠損を少なくとも約１５パーセント、好ましくは少
なくとも５０パーセント、より好ましくは少なくとも９０パーセント減らす、そ
して最も好ましくは取り除くことを意味するために本明細書において用いる。あ
るいはまた、治療的に有効な量は、患者における臨床的に有意な症状の改善をも
たらすために十分である。本発明によれば、治療効果は、治療抗体がＦｃＲＩＩ
Ｂ阻害のない状態より大きい効果を達成する場合にＦｃＲＩＩＢ活性を阻害する
ことにより得られる。そのような効果には、癌を改善すること（腫瘍サイズを減
らすこと、転移を除くこと、再発までの時間を増やすこと、もしくは生存率を上
げることによる）；感染を取り除くこと；急性感染を抑えること；もしくは寄生
虫を除くことが包含される。
【００６９】 治療抗体、及びＦｃＲＩＩＢの阻害剤（集合的に「治療因子」）は、製薬学的
に許容しうる製剤において患者に提供することができる。「製薬学的に許容しう
る」という語句は、ヒトに投与する場合に生理学的に許容できそして典型的には
アレルギー反応もしくは同様の不都合な反応を引き起こさない分子存在及び組成
物をさす。好ましくは、本明細書において用いる場合、「製薬学的に許容しうる
」という用語は、動物における、そしてさらに特にヒトにおける使用のために連
邦もしくは州政府の管理機関により承認されるかまたは米国薬局方もしくは他の
一般に認められる薬局方に記載されることを意味する。「担体」という用語は、
化合物を一緒に投与する希釈剤、添加剤、賦形剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）もしく
は賦形剤（ｖｅｈｉｃｌｅ）をさす。そのような製薬学的担体は、落花生油、大
豆油、鉱油、ゴマ油などのような、石油、動物、植物もしくは合成起源のものを
包含する、水及び油のような滅菌した液体であることができる。特に注入可能な
溶液には、好ましくは、水もしくは水溶液食塩水溶液並びにデキストロース及び
グリセロール水溶液を担体として用いる。適当な製薬学的担体は、Ｅ．Ｗ．Ｍａ
ｒｔｉｎにより「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓ
ｃｉｅｎｃｅｓ」に記述されており、これは引用することにより本明細書に組み
込まれる。
【００７０】 本発明によれば、治療因子は、非経口的、経粘膜的、例えば経口的、鼻から吸
って、もしくは直腸に、または経皮的に導入する本発明の製薬学的組成物におい
て一緒にもしくは別個に調合することができる。好ましくは、投与は非経口的、
例えば静脈注射により、そしてまた小動脈内、筋肉内、皮内、皮下、腹腔内、心
室内及び頭蓋内投与も包含するがこれらに限定されるものではない。
【００７１】 別の態様として、治療因子は小胞において、特にリポソームにおいて一緒にも
しくは別個に送達することができる（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９０
，２４９：１５２７−１５３３；Ｔｒｅａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｐｏｓｏｍｅ
ｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａ
ｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ中，Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｆ
ｉｄｌｅｒ（ｅｄｓ．），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３５３−３６５
（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，同書中，ｐｐ．３１７−３２
７を参照；一般に同書中を参照、これらの各々は引用することにより本明細書に
組み込まれる）。その全身副作用を減らすために、これは因子を導入する好まし
い方法であることができる。
【００７２】 さらに別の態様として、治療因子は、制御放出系において一緒にもしくは別個
に送達することができる。例えば、ポリペプチドは、連続ポンプで静脈内注入を
用いて、ポリ乳酸／グルタミン酸（ＰＬＧＡ）のようなポリマーマトリックス、
皮下に移植するコレステロール及びエストロゲン化合物の混合物を含有するペレ
ット剤（ＳｉｌａｓｔｉｃＲTM；Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｍｉｄｌａｎｄ，Ｍ
Ｉ；米国特許第５，５５４，６０１号を参照、これは引用することにより本明細
書に組み込まれる）、移植可能な浸透ポンプ、経皮パッチ、リポソーム、もしく
は他の投与形態において投与することができる。一つの態様として、ポンプを用
いることができる（Ｌａｎｇｅｒ，上記；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒ
ｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．，１９８７，１４：２０１；Ｂｕｃｈｗａｌｄ
ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｒｇｅｒｙ，１９８０，８８：５０７；Ｓａｕｄｅｋ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，１９８９，３２１：５７４を参照、
これらの各々は引用することにより本明細書に組み込まれる）。別の態様として
、ポリマー材料を用いることができる（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏ
ｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ
Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ：Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒ
ｉｄａ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂ
ｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒ
ｍａｎｃｅ，Ｓｍｏｌｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｌ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ：Ｎｅ
ｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）；Ｒａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｐｅｐｐａｓ，Ｊ．，Ｍａ
ｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ，１９８３，２３
：６１；Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２８：１９０
；Ｄｕｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，１９８９，２５：３
５１；Ｈｏｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．，１９８９，７
１：１０５を参照、これらの各々は引用することにより本明細書に組み込まれる
）。さらに別の態様として、制御放出系を治療標的、例えば腫瘍もしくは感染の
部位の近くに配置することができ、従って、全身投与量のほんの一部分のみを必
要とする（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
ｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，上記，ｖｏｌ．２，ｐｐ．
１１５−１３８（１９８４）中を参照、これは引用することにより本明細書に組
み込まれる）。他の制御放出系は、引用することにより本明細書に組み込まれる
Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９０，２４９：１５２７−１５３３）によ
る総説に説明されている。
【００７３】 抗体及びＦｃＲＩＩＢ阻害因子の投与が、腫瘍治療または感染性微生物もしく
は寄生虫の処置のような、増強された免疫活性から利益を得る疾病もしくは疾患
の有効な治療処方計画を提供する患者は、好ましくはヒトであるが、臨床試験も
しくはスクリーニングもしくは活性実験に関連する実験動物を包含する任意の動
物であることができる。従って、当業者が容易に認識することができるように、
本発明の方法及び組成物は、特に哺乳動物、並びにネコもしくはイヌ患者のよう
な飼いならされた動物、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ及びブタ患者のようなしかし
これらに限定されるものではない農場動物、野生動物（野生の状態におけるかも
しくは動物園における）、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ
、ネコなどのような研究動物、ニワトリ、シチメンチョウ、鳴禽などのような鳥
類の種を包含するがこれらに決して限定されるものではない任意の動物への投与
に、すなわち、獣医学用途に特に適している。特定の態様として、動物は、ヒト
ＦｃＲ鎖を発現するトランスジェニックマウスである。 抗腫瘍治療 本発明は、腫瘍、特に充実性腫瘍の処置に関する。本発明により処置すること
ができる充実性腫瘍の例には、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原
性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、骨膜
腫、内皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌
、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭
状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆
管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、
肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、神経膠星状細胞腫、髄芽細胞腫
、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神
経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞種及び網膜芽細胞種のような、しかしこれ
らに限定されるものではない肉腫及び癌腫が包含される。血液学的悪性疾患には
、白血病、リンパ腫及び多発性骨髄腫が包含される。以下のものは、本発明の組
成物及び方法で処置可能な癌の非限定的な好ましい例である：４期黒色腫を包含
する黒色腫；進行した卵巣癌を包含する卵巣癌；急性骨髄性白血病を包含するが
これに限定されるものではない白血病；肝臓に転移した結腸癌を包含する結腸癌
；直腸癌、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、腎臓癌及び前立腺癌。
【００７４】 抗腫瘍抗体は、腫瘍細胞自体に対して、もしくは特定の腫瘍細胞抗原に対して
作製することができる。同じ腫瘍抗原が異なるヒト黒色腫腫瘍により発現される
実質的な証拠があり、トランスフォーメーションに関連する事象が、関係のある
組織及び／もしくは細胞起源の腫瘍における同じ腫瘍抗原の頻発する発現を起こ
し得ることを示唆する（Ｓａｈａｓｒａｂｕｄｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．，１９９３，１５１：６３０２−６３１０；Ｓｈａｍａｍｉａｎ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，１９９
４，３９：７３−８３；Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９４，２
６４：７１６；Ｐｅｏｐｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９
３，１５１：５４８１−５４９１；Ｊｅｒｏｍｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．，１９９１，５１：２９０８−２９１６；Ｍｏｒｉｏｋｅ ｅｔ ａｌ
．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９４，１５３：５６５０−５６５８、これらの
各々は引用することにより本明細書に組み込まれる）。そのような抗原の例には
、ＭＡＲＴ１／ＭｅｌａｎＡ、ｇｐ−１００及びチロシナーゼ（黒色腫）；ＭＡ
ＧＥ−１及びＭＡＧＥ−３（膀胱癌、頭部及び頸部癌、非小細胞癌）；ＨＰＶ
Ｅ６及びＥ７タンパク質（子宮頸癌）；ＨＥＲ２／ｎｅｕ／ｃ−ｅｒｂＢ−２（
乳癌）；ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ムチン（ＭＵＣ−１）（乳房、膵臓、結腸、前立
腺）；前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）（前立腺）；ＣＤ２０（Ｂ細胞リンパ腫）；
並びにＣＥＡ（結腸、乳房、ＧＩ）が包含されるが、これらに限定されるもので
はない。 抗真菌、抗ウイルス、抗細菌及び抗寄生虫治療 ＦｃＲＩＩＢの阻害のために増強された細胞傷害活性を有する抗ウイルス、抗
細菌及び抗寄生虫抗体は、これらの微生物による感染を処置するかもしくは取り
除くために用いることができる。そのようなウイルス感染には、ヒト免疫不全ウ
イルス（ＨＩＶ）；A型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、
Ｄ型肝炎ウイルス及び他の肝炎ウイルス；サイトメガロウイルス；単純ヘルペス
ウイルス；ヒトパピローマウイルス；エプスタイン・バーウイルス；並びに他の
ウイルス感染が包含されるが、これらに決して限定されるものではない。抗ウイ
ルス抗体は当該技術分野において周知であり、そして上記のようなＦｃＲＩＩＢ
阻害（ＳＨＩＰ阻害を包含する）因子との使用のための試薬の容易に入手可能な
供給源を与え、もしくは減少したＦｃＲＩＩＢ結合親和性を有するように上記の
ように改変することができる。
【００７５】 本発明に従って処置することができる感染性細菌の例には、ストレプトコッカ
ス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、スタヒロコッカス・アウレウ
ス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、エンテロコッカス・ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌ
ｉｓ）、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｉ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌ
ａ）、マイコパクテリウム・レプエ（Ｍ．Ｌｅｐｒａｅ）、マイコバクテリウム
・ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ナイセリア・ゴノロエ
エ（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）などが包含されるが、これらに決して限定さ
れるものではない。実際、本発明は、例えばストレプトコッカス・ニューモニエ
について記述されているように（米国特許第５，９８１，２２９号、これは引用
することにより本明細書に組み込まれる）、細菌外被もしくは細胞壁に位置する
、細菌の輸送される（表面）タンパク質に対して作製される抗体の活性を増強す
る方法を提供する。
【００７６】 本発明はまた、クリプトコッカス・ネオホルマンス（Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎ
ｓ）及びカンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）（Ｙｕａｎ ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９９８，１８７：６４１、これは引用するこ
とにより本明細書に組み込まれる）のような病原性真菌に対して作製される細胞
傷害性抗体の活性を増強することも提供する。
【００７７】 本発明に従って処置することができる寄生虫の例には、トリパノソーマ、プラ
スモジウム（マラリア微生物）、シストソーム（ｓｈｉｓｔｏｓｏｍｅｓ）など
が包含されるが、これらに限定されるものではない。本発明の重要な利点は、寄
生虫が異なるステージに変化するかもしくは新しい抗原性外被を発生することが
できる前に、寄生虫感染を初期に取り除く増強された抗体由来の細胞傷害の能力
にある。 製薬学的キット 本発明の別の態様は、ＦｃγＲＩＩＢによるＳＨＩＰ活性化を断つことにより
治療抗体の細胞傷害を増強することに向けられる製薬学的キットに関する。一つ
の態様として、本発明のこの態様によるキットは、改変されたＦｃドメインを有
する抗体のような、ＦｃγＲＩＩＢに対する減少した親和性を有する治療抗体を
含んでなる。別の態様として、キットは、治療抗体及びＦｃγＲＩＩＢ結合の拮
抗阻害剤を含んでなる。本発明のさらなる態様として、キットは、治療抗体、並
びにアンチセンス核酸分子及び細胞内抗体を包含するがこれらに限定されるもの
ではない、ＦｃγＲＩＩＢもしくはＳＨＩＰの発現の阻害剤を含んでなる。キッ
トはまた、場合により、成分抗体及び阻害剤の使用説明書、コントロール、並び
にデータを表す写真もしくは図面も含む。
【００７８】 本発明は、例示のためにそして限定としてではなく提供する以下の実施例を参
照することによりさらによく理解することができる。
【００７９】 実施例 実施例１：抑制Ｆｃ受容体は、腫瘍標的に対するインビボ細胞傷害を調整する
材料及び方法黒色腫転移モデル ． マウスに０日に１ｘ１０6のＢ１６黒色腫細胞を静脈内に
、そして０、２、４、７、９及び１１日にＰＢＳもしくは２０μｇの精製された
ＴＡ９９のいずれかをｉ．ｐ．注入した。２００μｇの用量のｍＡｂ ＴＡ９９
は、野生型マウスでは腫瘍転移の９０％より大きい減少を引き起こしたが、Ｆｃ
Ｒγ-/-マウスではそうではなかった。しかしながら、この下げた２０μｇ用量
のＴＡ９９では、限られた防御のみがＷＴマウスにおける腫瘍転移に対してもた
らされた。マウスを１４日に殺し、そして表面肺転移を解剖顕微鏡下で計数した
。腫瘍異種移植モデル ． 乳癌異種移植実験には、０．１ｍｌのマトリゲル（ｍａ
ｔｒｉｇｅｌ）（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｂｅｄｆｏ
ｒｄ，ＭＡ）と混合した０．１ｍｌのＰＢＳにおいて５ｘ１０6のＢＴ４７４Ｍ
１細胞（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ
で得られたＢＴ４７４サブクローン）を１日に皮下注入した。２−４ヶ月齢のＢ
ＡＬＢ／ｃヌードマウス、γ-/- ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスもしくはＲＩＩ-/-
ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに腫瘍細胞注入の２４時間前に１７β−エストラジオ
ール６０日放出ペレット剤（０．７５ｍｇ／ペレット剤）（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖ
ｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｓａｒａｓｏｔａ，ＦＬ）を皮
下注入した。治療抗体（バイアルに入れた臨床材料から得られる、Ｇｅｎｅｎｔ
ｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）は、４μ
ｇ／ｍｇの負荷投与量で１日に開始して静脈内注入し、ＢＡＬＢ／ｃヌード及び
γ-/- ＢＡＬＢ／ｃヌードには２μｇ／ｍｇを毎週注入した。図３に示す実験に
は１０倍低い投与量を用いた。Ｂ細胞リンパ腫異種移植実験には、２−４ヶ月齢
のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスもしくはγ-/- ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに５ｘ１
０6のＲａｊｉ Ｂリンパ腫細胞の皮下注入の前に３．０ｃＧｙを照射した。Ｒｉ
ｔｕｘａｎRはＩＤＥＣ Ｐｈａｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から入手し
、そして１０μｇ／ｇｍの投与量で毎週与えた。腫瘍測定を毎週実施した。Ｄ２６５Ａ突然変異体抗体の工学設計及び結合アッセイ ． ＱｕｉｋＣｈａｎｇ
ｅ突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用
いて部位特異的突然変異誘発を実施した。突然変異体抗体をｐＲＫ発現ベクター
においてＡ２９３細胞で一過性発現させ、そしてならし上清を採取し、プロテイ
ンＧアフィニティーカラムクロマトグラフィーにより精製した。組換えＦｃγＲ
ｓに結合する様々な突然変異体の能力をインビトロ結合アッセイを用いて評価し
た。マイクロタイタープレートに組換えＦｃγＲＩＩＩ ＧＳＴ融合タンパク質
をＰＢＳ中１００ｎｇ／ウェルの濃度で被覆した。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２
０を補足したＰＢＳ（洗浄バッファー）でプレートを洗浄し、次に０．５％ Ｂ
ＳＡ、５０ｍＭ ＴＢＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０、２ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ
８．０（ＥＬＩＳＡバッファー）で室温で１時間ブロックした。マウス４Ｄ５並
びにＤ２６５ＡのＩｇＧ１ Ｆｃフラグメントを抗ヒトＩｇＥ（ｍＡｂ Ｅ２７）
のＦａｂ上に移植し、そして組換え抗体を上記のように製造した。ＥＬＩＳＡバ
ッファー中１：１のモル比で野生型もしくは突然変異体Ｆｃドメインを有する抗
ヒトＥ２７にヒトＩｇＥを加えると、均質なヘキサマー複合体の形成がもたらさ
れた。複合体をプレートに加え、洗浄バッファーにおいて５回洗浄し、そしてヤ
ギＦ（ａｂ’）2抗マウスＩｇＧの添加、続いて発色試験法の発色により検出し
た。増殖阻害アッセイ ． ＢＴ４７４Ｍ１細胞を１ｘ１０4で平板培養し、そして２
４時間接着させた。抗体を示す濃度で４８時間加え、続いて［Ｈ3］チミジンで
１４時間パルス標識した。細胞を採取し、フィルターマット上に集め、そしてＷ
ａｌｌａｃ Ｍｉｃｒｏｂｅｔａシンチレーションカウンターにおいて計数した
。ＢＴ４７４Ｍ１細胞を４Ｄ５もしくはＤ２６５Ａ抗体とインキュベーションし
、そしてＦＩＴＣを結合したヤギ抗マウスＩｇＧで染色した。蛍光強度をＦＡＣ
Ｓｃａｎフローサイトメーター上で測定した。インビトロＡＤＣＣアッセイ ． 接着性ＮＫエフェクター細胞は、ナイロンウー
ル非接着性脾臓細胞のＩＬ−２刺激した（２５０Ｕ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．
Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）１４日培養物から得た。抗体（１０μｇ／ｍｌ）の存在下も
しくは非存在下で９６ウェルプレートにおいて５ｘ１０4のクロム標識したＨＥ
Ｒ２過剰発現ＳＫ−ＢＲ３乳癌（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）標的細胞
で４時間のＡＤＣＣ反応を実施した。パーセンテージ（％）細胞傷害は、上清に
おける計数−自然遊離（エフェクターなしの）／取り込まれた総計数−自然遊離
として表した。データは、３回の反復試験ウェルの平均として表す。 結果 同系Ｂ１６黒色腫モデルにおける肺転移に対する受動及び能動防御は、ＮＫ細
胞のようなエフェクター細胞上の活性化ＦｃＲｓ（２）の存在を必要とすること
が最近示されている。抑制ＦｃγＲＩＩＢは、黒色腫分化抗原ｇｐ７５（ＴＲＰ
−１）に特異的な防御ＩｇＧ２ａ抗体のｍＡｂ ＴＡ９９ ２のインビボ抗腫瘍活
性を決定することにおける因子であるどうかを決定するために、Ｃ５７Ｂ１／６
マウスをＦｃγＲＩＩＢ欠損系統と交配し、そして次に同系系統を樹立するため
に戻し交配した。ＲＩＩＢ欠損バックグラウンドにおけるＢ１６黒色腫細胞の転
移は野生型と同一であり（転移性黒色腫腫瘍細胞で肺がほとんど全部黒くなる）
、抑制受容体が腫瘍増殖もしくは広がりに関与しないことを示した。それに反し
て、ＲＩＩＢ欠損動物に防御ＩｇＧ２ａ抗体を与えると、ＦｃγＲＩＩＢに関し
て野生型のマウスと比較した場合に、この抗体の活性の大きい増強が認められた
。切除した肺における腫瘍小節の定量により、野生型の処置マウスは腫瘍負荷を
３倍減らし（１００＋／−１０に比較して３００＋／−３０）、一方、ＲＩＩＢ
−／−動物の抗体処置は１００倍の減少をもたらす（３に比較して３００）こと
が示された。以前に示したように、活性化γサブユニットの欠失は、この抗体の
インビボ防御効果を除く。
【００８０】 ＡＤＣＣに関与する主要な細胞タイプのＮＫ細胞は、活性化ＦｃγＲ、ＲＩＩ
Ｉを発現するが、抑制相対物、ＲＩＩＢを発現しない。従って、ＲＩＩＢ欠損マ
ウスにおいて認められる増強は、ＮＫ細胞過剰反応性に起因すると考えることは
できない。むしろ、単球及びマクロファージは、ＲＩＩＩ及びＲＩＩＢの両方を
発現し、従って、インビボにおけるこの抗体依存性防御に関与する主要なエフェ
クター細胞として結び付けられる。従って、野生型動物における防御ＩｇＧ２ａ
抗体に起因すると考えられる活性は、ＮＫ細胞、単球及びマクロファージが寄与
する反対である活性化及び抑制経路の集約である。４Ｄ５、ＨｅｒｃｅｐｔｉｎR及びＲｉｔｕｘａｎRの抗腫瘍活性は、ＦｃγＲ活 性化受容体を必要とした ＨｅｒｃｅｐｔｉｎR及びＲｉｔｕｘａｎRのインビボ活性へのＦｃドメイン及
びエフェクター細胞ＦｃγＲｓ間の相互作用の寄与を決定するために、抗腫瘍応
答におけるＦｃγＲＩＩ及びＲＩＩＩの役割を検討するのに適当なモデルを生じ
るように正常位無胸腺ヌードマウス腫瘍モデルを改変した。活性化ＦｃγＲｓ、
Ｉ及びＩＩＩを欠く共通γ鎖欠損マウス（ＦｃＲγ-/-）（Ｔａｋａｉ Ｔ．ｅ
ｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１９９４，７６：５１９−２９、これは引用することに
より本明細書に組み込まれる）もしくはＦｃγＲＩＩＢ欠損マウス（Ｔａｋａｉ
，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９６，３７９：３４６−９、これは引
用することにより本明細書に組み込まれる）を各々無胸腺ヌードマウスと交配し
て異種移植ヒト腫瘍モデルにおける使用のためのＦｃＲγ-/-／ｎｕ／ｎｕ及び
ＦｃγＲＩＩＢ-/-／ｎｕ／ｎｕマウスを作製した。ｐ１８５／ＨＥＲ−２／ｎ
ｅｕを過剰発現するヒト乳癌ＢＴ４７４Ｍ１の増殖を妨げることにおける抗ｐ１
８５ＨＥＲ−２／ｎｅｕ抗体ＨｅｒｃｅｐｔｉｎR（ヒト化ＩｇＧ１）（Ｃａｒ
ｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，上記）及びそのマウス親抗体４Ｄ５（マウス
ＩｇＧＩ）の抗腫瘍活性をＦｃＲγ-/-及び+/+無胸腺ヌードマウスにおいて検討
した（図１Ａ−１Ｄ）。体積として測定する腫瘍増殖は、５ｘ１０6のＢＴ４７
４Ｍ１細胞を皮下注入したホモ接合体γ-/-及び+/+ ｎｕ／ｎｕマウスにおいて
同一であった。γ+/+マウスにおいて、単一の４μｇ／ｇｍの静脈内投与量、続
いて毎週２μｇ／ｇｍのｉ．ｖ．注入は、腫瘍増殖のほぼ完全な阻害をもたらし
（４Ｄ５及びＨｅｒｃｅｐｔｉｎR処置マウスにおける９０及び９６％の腫瘍の
大きさの減少）、１７匹のマウスのうち４匹のみが明白な腫瘍を発生した。しか
しながら、ＨｅｒｃｅｐｔｉｎR及び４Ｄ５のこの防御効果は、γ-/-マウスでは
減少した。抗体処置したγ-/-マウスにおける腫瘍の大きさは、それぞれ、２９
及び４４％減少し、そして１５匹のマウスのうち１４匹が明白な腫瘍を発生した
。
【００８１】 同様の結果が、キメラモノクローナルＩｇＧ１ 抗ＣＤ２０抗体Ｒｉｔｕｘａ
ｎRがインビボにおいてＢ細胞リンパ腫増殖を阻害する機構に対してγ-/- ｎｕ
／ｎｕ異種移植モデルにおいて得られた。ヒトＢ細胞リンパ腫細胞系Ｒａｊｉの
腫瘍増殖は、γ-/-及び+/+ ｎｕ／ｎｕマウスにおいて区別できない（図１Ｅ及
び１Ｆ）。しかしながら、γ-/-マウスにおいて見られるＲｉｔｕｘａｎR（１０
μｇ／ｇｍ）の毎週のｉ．ｖ．投与量の防御効果は、γ-/- ｎｕ／ｎｕマウスに
おいて減少する。野生型無胸腺マウスのＲｉｔｕｘａｎR処置は、９９％より大
きい腫瘍の大きさの減少をもたらし、そしていかなる野生型マウスも明白な腫瘍
を発生しなかった。それに反して、γ-/-マウスでは、ＲｉｔｕｘａｎRによりほ
とんど防御が与えられず；７匹のマウスのうち６匹が明白な腫瘍を発生し、そし
て腫瘍の大きさの減少は平均して２３％だけであった。４Ｄ５及びＨｅｒｃｅｐｔｉｎRの抗乳癌活性は、ＦｃγＲＩＩＢ欠損マウスに
おいて増強される それに反して、ＦｃγＲＩＩＢ-/-マウスは、このヌードマウスモデルにおけ
るＢＴ４７４増殖を妨げることにおいてさらに効果的であった（図２）。抗体の
サブ治療用量（ｓｕｂ−ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｄｏｓｅ）（０．４μｇ／ｇ
ｍの負荷、毎週０．２μｇ／ｇｍ）でＲＩＩＢ欠損マウスにおける腫瘍増殖は妨
げられ、このモデルにおける抑制ＲＩＩＢ経路の関与を同様に示す。ヌードマウ
スは、高いＮＫ細胞数を示すことが既知であり、これらのマウスにおける抗体防
御は、ヒト疾患におけるような同系の系において見られる防御を表さないという
推測を導く。ＲＩＩＢ欠損がヌードマウスにおける防御を増強するという結果は
、防御応答における単球及びマクロファージのようなＮＫ細胞以外のエフェクタ
ー細胞の関与を示し、そしてさらにＦｃＲに依存する経路は、ＮＫ細胞に偏った
系に限定されず、同系黒色腫系におけるように、他の同系の系においてもまた関
係があると思われることを示す。Ｄ２６５Ａ突然変異体抗体のインビトロ及びインビボ特性 防御応答におけるＦｃ−ＦｃγＲ相互作用の関与をさらに示すために、マウス
ＩｇＧ１抗ＨＥＲ２抗体４Ｄ５の改変を、そのコグネイト抗原ｐ１８５ ＨＥＲ
−２／ｎｅｕに対するその親和性を保持しながら細胞のＦｃγＲ受容体と連動す
る抗体の能力を破壊するように工学設計した。ＦｃγＲに対するマウスＩｇＧ１
Ｆｃドメイン結合のアラニン走査突然変異誘発マッピングに基づき、マウスＩ
ｇＧ１重鎖のＣH２ドメインにおける残基２６５での単一アミノ酸置換が、受容
体被覆プレートアッセイにおいてＦｃγＲＩＩ及びＩＩＩの両方へのＩｇＧ１含
有免疫複合体の結合を減らすことが判明した（図３Ａ）。この残基は、ＦｃＲｓ
の表面と直接相互作用すると考えられるＩｇＧ分子のＦｃ部分内の部位に位置す
る。２６５（ａｓｐ→ａｌａ）突然変異を４Ｄ５ ＩｇＧ１重鎖遺伝子に配置し
、そして４Ｄ５κ鎖と一緒にＡ２９３細胞に野生型４Ｄ５ ＩｇＧ１重鎖と同時
にトランスフェクションして４Ｄ５及び突然変異体（Ｄ２６５Ａ）抗体を製造し
た。突然変異は抗体−抗原相互作用を壊すと考えられないので、予測どおり、ト
ランスフェクションした細胞上清から精製される４Ｄ５及びＤ２６５Ａ抗体は両
方とも、同等のアビディティーで細胞のｐ１８５ＨＥＲ−２／ｎｅｕに結合し、
そして組織培養したＢＴ４７４Ｍ１発現乳癌細胞に加えると匹敵するインビトロ
増殖阻害活性を有した（図３Ｂ）。しかしながら、Ｄ２６５Ａはインビボ半減期
、抗原性ターゲッティング及び機能性ｐ１８５ＨＥＲ−２／ｎｅｕ受容体遮断の
野生型特性を保持するが、エフェクター細胞上のＦｃγＲＩＩＩに対するその減
少した親和性のために突然変異体のインビトロＡＤＣＣ能力は失われた（図３Ｃ
）。インビボにおいて、Ｄ２６５Ａの抗腫瘍活性は、乳癌ＢＴ４７４Ｍ１異種移
植モデルにおいて試験すると、４Ｄ５と比較した場合に減少した抗腫瘍活性を示
した（図３Ｄ）。４Ｄ５で処置した５匹のマウスのうち２匹においてのみに対し
て、Ｄ２６５Ａで処置した全ての野生型無胸腺マウスにおいて明白な腫瘍が発生
した。Ｄ２６５Ａ処置は、４Ｄ５で見られる８５％の減少と比較した場合に腫瘍
体積を３０％減らした。Ｄ２６５Ａの減少した抗腫瘍応答は、インビトロで腫瘍
増殖を阻害するその能力にもかかわらずＦｃＲを保有するエフェクター細胞を活
性化するその損なわれた能力と相関関係があり、ＦｃＲ連動がインビボにおける
抗腫瘍活性の重要な寄与成分であるという結論を裏付ける。 説明 本明細書に示すデータは、ＦｃγＲ結合がインビボ活性に有意に寄与すること
を示唆する。このＦｃγＲ依存性は、本明細書に示す３つの関係のない腫瘍及び
標的抗原の同系及び異種移植モデルの両方に認められているので単一の抗体より
多くに当てはまるようである。ＦｃγＲ連動は活性化及び抑制受容体の両方を含
み、従って、防御応答のエフェクター細胞成分に単球及びマクロファージを結び
つける。この解釈を支持する証拠は、インビトロでＡＤＣＣをもたらすＨｅｒｃ
ｅｐｔｉｎRの能力及び抗ＣＤ２０抗体のインビボ活性のいくらかを阻害する抗
ＦｃＲ抗体の能力において認められる（Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．
，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，１９９６，１９：９３−１０１、これは引用す
ることにより本明細書に組み込まれる）。本明細書に示す研究は、Ｆｃ−Ｆｃγ
Ｒ相互作用の重要な役割を示すが、ｐ１８５ＨＥＲ２／ｎｅｕ及びＣＤ２０の抗
体連動により増殖及びアポトーシス調節経路を誘発することはそれに加えて、抗
腫瘍抗体の総合的なインビボ効能に寄与する可能性がある。この解釈の証拠は、
抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体で処置したＦｃＲ-/-マウスで見られる部分的防御にお
いて認めることができ（図１）、ここで、ＢＴ４７４Ｍ１乳癌細胞に対するこれ
らの抗体の抗腫瘍活性は減少するが、除去されない。抗体により腫瘍細胞へのシ
グナリングを阻止することもまた、免疫エフェクター細胞が誘発するアポトーシ
スもしくは溶解細胞死をいっそう受けやすいように腫瘍細胞をすることにより免
疫エフェクター応答と相乗作用的に働く可能性がある（Ｂａｓｅｌｇａ，Ｊ．ｅ
ｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１９９８，５８：２８２５−３１、これ
は引用することにより本明細書に組み込まれる）。これらの研究は、インビボに
おける抑制経路の基本的重要性を強調し、そして抗腫瘍抗体に対する個々の応答
がこれらの抑制経路の発現に依存し得ることを示唆する。
【００８２】 実施例２：ＦｃＲＩＩＢへの減少した結合を有する変異体ＩｇＧ１ Ｆｃドメ
インの作製 Ｆｃドメイン突然変異誘発の基本的原則は、例えば、分子をグリコシル化しそ
してそれを結合研究のために表面上に展示する細胞系における、ヒトＩｇＧ１の
ダイマーＦｃドメインの発現を必要とする。適合する発現系には、酵母もしくは
哺乳動物細胞のような真核細胞が包含される。
【００８３】 本実施例では、酵母細胞を宿主系として用いる。分子当たり平均して２−４ア
ミノ酸の変異を引き起こすように以前に記述されている方法（Ｓａｖｉｒａｎｔ
ａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．，１９９８，１１：１４３−１５２；Ｌ
ｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，１９９２，１：１１）に従って
ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２−ＣＨ３ドメインの配列のライブラリーを作製するために
誤りを起こしやすいＰＣＲを用いた。用いるプライマーは、ヒンジ領域（アミノ
酸２１８−２２９）及び発現ベクターｐＣＴ３０２における３’組込み部位に隣
接するベクター配列にわたった。１０7より多い組換え体のライブラリーが得ら
れた。発現は、表面発現される酵母タンパク質ＡＧ１とのジスルフィド相互作用
により酵母細胞壁に固定される酵母親Ａｇａ２ｐとのＦｃ融合タンパク質を作製
するために記述されているように（Ｂｏｄｅｒ ａｎｄ Ｗｉｔｔｒｕｐ，Ｎａ
ｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９７，１５：５５３−５５７、これは引用す
ることにより本明細書に組み込まれる）酵母ＡＧ１：ＡＧ２表面展示系において
実施した。ＰＣＲ突然変異させたＩｇＧ１ ＦｃフラグメントをＡｇａ２ｐ−リ
ンカー−融合ベクターｐＣＴ３０２にクローン化し、そして酵母株ＥＢＹ１００
に形質転換した。形質転換体をＳＤ＋ＣＡＡプレート上で選択した。Ａｇａ２ｐ
Ｆｃ融合物の発現の誘導は、ガラクトース含有培地における誘導により実施し
た。
【００８４】 突然変異体ライブラリーのスクリーニングは、パンニングもしくはフローサイ
トメトリーにより実施した。例えば、フローサイトメトリースクリーニングは、
標識していない１０倍モル過剰のＦｃＲＩＩＢ／ＩｇＥ抗ＩｇＥ複合体の存在下
で１：１のモル比のＦｃＲＩＩＡ／ＩｇＥ Ｆｃ融合物及び抗ＩｇＥ ｍＡｂ Ｅ
２５（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９５，３４：１０４７４
、これは引用することにより本明細書に組み込まれる）を用いて、ヘキサマー複
合体として発現されるＦＩＴＣ標識した組換えＦｃＲＩＩＢにより実施した。変
化していないかもしくは増強されたＲＩＩＡ結合で減少したＲＩＩＢ結合をもた
らす突然変異を決定するために、ＦＩＴＣ陽性の酵母細胞を複数回のフローサイ
トメトリーソーティングにより濃縮し、そして得られる酵母細胞を平板培養し、
ｐ ＣＴ３０２融合プラスミドを単離し、そして塩基配列を決定した。ＲＩＩＡ
、ＲＩＩＩＡ及びＲＩＩＢとＩｇＧ１ Ｆｃとの異なる相互作用の部位は、結合
差を完全に最適化するためにそれらの領域の選択的ＰＣＲ突然変異誘発及び酵母
表面展示スクリーニングを繰り返すことによりさらに特定した。増強されたＲＩ
ＩＢ結合、ＲＩＩＩＡ結合もしくはＲＩＩＩＢ結合を有するポリペプチド変異体
を同定するために同様の実験を実施した。
【００８５】 あるいはまた、スクリーニングは、組換えＲＩＩＡ、ＲＩＩＢ、ＲＩＩＩＡも
しくはＲＩＩＩＢを固定したプレート上での突然変異させたｐＣＴ３０２融合ラ
イブラリーのパンニングによっても実施した。複数回のＲＩＩＡ上でのパンニン
グを実施し、そして次にＲＩＩＢ結合を保持するあらゆる突然変異体を除くため
に陽性の結合するものをＲＩＩＢプレート上でパンニングし、このようにして保
持されるかもしくは増強されるＲＩＩＡ結合及び減少するかもしくは除かれるＲ
ＩＩＢ結合を有するＦｃ突然変異体を同定した。
【００８６】 表面展示のために哺乳動物発現ベクターをそのような細胞上で用い、そして突
然変異させたＦｃライブラリーを同様に作製して同様の実験を実施することがで
きる。
【００８７】 実施例３：ＦｃＲＩＩＢに対する特異性を有するモノクローナル抗体の単離 マウスモノクローナル抗体は、上記のように、マウスを組換えヒトＲＩＩＢタ
ンパク質で免疫しそしてハイブリドーマを得るために脾臓細胞を融合させること
により得られる。得られるハイブリドーマを、ＲＩＩＡもしくはＲＩＩＩＡもし
くはＲＩＩＩＢに結合しないがＲＩＩＢに選択的に結合することに関してスクリ
ーニングする。次に所望の特性を有する抗体をクローン化し、そしてｍＲＮＡを
単離し、重鎖及び軽鎖のｃＤＮＡに転化する。次に一本鎖Ｆｖを上記のように構
築し、そしてファージ展示には遺伝子ＩＩＩ融合タンパク質もしくは酵母展示に
はＡｇａ２ｐ融合物として発現させる。ＲＩＩＡより大きいＲＩＩＢに対する特
異性に関するパンニングによる一本鎖Ｆｖ結合及びスクリーニングのために無作
為に突然変異させたライブラリーを構築する。得られるファージもしくは酵母細
胞は、それぞれ、融合ファージゲノムもしくはプラスミドを単離し、ＤＮＡの塩
基配列を決定し、そして次に組換え抗体として発現させることにより特性化する
。
【００８８】 本発明は、本明細書において記述する特定の態様により範囲が限定されるもの
ではない。実際、本明細書において記述するものに加えて本発明の様々な改変が
、先の記述及び添付の図面から当業者に明白になる。そのような改変は、添付の
請求項の範囲内に入ると考えられる。様々な特許、特許出願及び公開が本明細書
において引用され、これらの開示はそれらの全部が引用することにより本明細書
に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、１Ｅ及び１Ｆは、４Ｄ５、ＨｅｒｃｅｐｔｉｎR
及びＲｉｔｕｘａｎRの抗腫瘍活性がＦｃγＲ活性化受容体を必要とすることを
示す。ヌードマウス（グループ当たり６−１０匹）に５ｘ１０6 ＢＴ４７４Ｍ１
細胞を皮下注入し、続いてｍＡｂ ４Ｄ５（図１Ａ及び図１Ｂ）もしくはＨｅｒ
ｃｅｐｔｉｎR（図１Ｃ及び１Ｄ）もしくはＲｉｔｕｘａｎR（図１Ｅ及び１Ｆ）
を毎週注入した。ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおいて認められる抗体依存性腫瘍
防御（図１Ａ、１Ｃ及び１Ｅ）は、ＦｃγＲγ-/-ヌードマウスでは欠如してい
る（図１Ｂ、１Ｄ及び１Ｆ）。全ての実験は、同様の結果で３回繰り返された。
【図２】 図２Ａ及び２Ｂは、４Ｄ５及びＨｅｒｃｅｐｔｉｎRの抗乳癌活性がＦｃγＲ
ＩＩＢ欠損マウスにおいて増強されることを示す。ヌードマウス（グループ当た
り８匹）に図１におけるようにＢＴ４７４Ｍ１細胞を注入し、そして０．４μｇ
／ｇｍの負荷投与量及び毎週０．２μｇ／ｇｍの野生型マウスのサブ治療用量で
処置した。完全な阻害がＲＩＩＢ欠損マウスにおいて認められ、そして部分的阻
害がＲＩＩＢヘテロ接合体マウスにおいて認められる。
【図３】 図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ及び３Ｄは、Ｄ２６５Ａ突然変異体抗体のインビトロ及び
インビボ特性を示す。図３Ａ−ＦｃγＲＩＩＩ結合。野生型及び突然変異体Ｆｃ
フラグメントの両方を抗ヒトＩｇＥ Ｆａｂフラグメント上に移植した。固相結
合アッセイをヒトＩｇＥ／抗ヒトＩｇＥヘキサマー複合体及び組換えＦｃγＲＩ
ＩＩ被覆プレートで実施した。図３Ｂ−ＢＴ４７４Ｍ１細胞の増殖阻害。ＢＴ４
７４Ｍ１細胞のＦＡＣＳ分析（差し込み図）は、細胞表面ｐ１８５ＨＥＲ２／ｎ
ｅｕに対する４Ｄ５（実線）及びＤ２６５Ａ（点線）の同等なアビディティーを
示す。ＢＴ４７４Ｍ１細胞の3Ｈ−チミジンの取り込みを４Ｄ５もしくはＤ２６
５Ａ抗体のいずれかの存在下で測定した。図３Ｃ−クロム標識した腫瘍標的のＮ
Ｋ細胞ＡＤＣＣ。クロム標識したＳＫＢＲ−３細胞をＮＫエフェクター細胞と様
々な比率でインキュベーションし、そして標識の遊離を定量した。図３Ｄ−乳癌
細胞のインビボ増殖：無胸腺ＢＡＬＢ／ｃ ｎｕ／ｎｕ動物にＢＴ４７４Ｍ１異
種移植片を移植し、そして４Ｄ５、Ｄ２６５ＡもしくはＰＢＳでの処置に応答す
るそれらの増殖を図１において記述するように測定した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 31/04 Ａ６１Ｐ 31/04 31/12 31/12 33/00 33/00 35/00 35/00 35/02 35/02 35/04 35/04 37/04 37/04 43/00 １０５ 43/00 １０５ １１１ １１１ // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ， ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA61 CA04 CA05 CA09 CA10 CA11 DA03 DA12 EA04 GA11 GA18 GA19 HA01 HA14 4C084 AA13 AA17 NA14 ZB091 ZB212 ZB261 ZB322 ZB331 ZB351 ZB371 ZC201 ZC422 4C085 AA13 AA14 BB01 CC03 CC22 DD62 EE01 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 CA40 DA50 DA75 EA28 FA71

Claims (21)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 Ｆｃガンマ受容体ＩＩＢ（ＦｃγＲＩＩＢ）によるＳＨＩＰ
    の活性化を断つことを含んでなる、患者においてインビボで治療抗体により引き
    出される細胞傷害を増強する方法。
  2. 【請求項２】 ＦｃγＲＩＩＢによるＳＨＩＰ活性化が、ＦｃγＲＩＩＢへ
    の抗体結合に起因する、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 拮抗阻害剤により抗体結合を阻害する、請求項２に記載の方
    法。
  4. 【請求項４】 抗体のＦｃ部分をＦｃγＲＩＩＢに対するその親和性を下げ
    るように改変することにより抗体結合を阻害する、請求項２に記載の方法。
  5. 【請求項５】 ＦｃγＲＩＩＢの発現を妨げることによりＦｃγＲＩＩＢに
    よるＳＨＩＰ活性化を断つ、請求項１に記載の方法。
  6. 【請求項６】 γＩＩＢ鎖ｍＲＮＡに特異的なアンチセンス核酸でＦｃγＲ
    ＩＩＢ発現を断つ、請求項５に記載の方法。
  7. 【請求項７】 γＩＩＢ鎖に特異的な細胞内抗体でＦｃγＲＩＩＢ発現を断
    つ、請求項５に記載の方法。
  8. 【請求項８】 イノシトールホスファターゼ阻害剤によりＳＨＩＰ活性化を
    阻害する、請求項１に記載の方法。
  9. 【請求項９】 ＳＨＩＰ発現を妨げることによりＳＨＩＰ活性化を阻害する
    、請求項１に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 抗体が抗腫瘍抗体である、請求項１に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 抗体が腫瘍細胞増殖受容体に特異的である、請求項１０に
    記載の方法。
  12. 【請求項１２】 抗体がＨＥＲ２／ｎｅｕ増殖因子受容体に特異的である、
    請求項１１に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 抗体がＣＤ２０ Ｂ細胞抗原に特異的である、請求項１１
    に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 抗体がヒト活性化Ｆｃ受容体に結合する、請求項１に記載
    の方法。
  15. 【請求項１５】 患者がヒトＦｃ受容体を発現する、請求項１４に記載の方
    法。
  16. 【請求項１６】 減少した親和性でＦｃγＲＩＩＢに結合する、変異体Ｆｃ
    領域を有する抗体。
  17. 【請求項１７】 野生型抗体と少なくとも同じ親和性で活性化Ｆｃ受容体に
    結合する、請求項１６の抗体。
  18. 【請求項１８】 抗腫瘍抗体である、請求項１６の抗体。
  19. 【請求項１９】 腫瘍細胞増殖受容体に特異的である、請求項１８の抗体。
  20. 【請求項２０】 ＨＥＲ２／ｎｅｕ増殖因子受容体に特異的である、請求項
    １９の抗体。
  21. 【請求項２１】 ＣＤ２０ Ｂ細胞抗原に特異的である、請求項１９の抗体
    。
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