CZ299638B6

CZ299638B6 - Lécivo pro genovou terapii, které se vnáší do nádoru za aplikace slabého elektrického pole, a kombinovaný produkt pro genovou terapii

Info

Publication number: CZ299638B6
Application number: CZ0475499A
Authority: CZ
Inventors: Bureau@Michel; Mir@Lluis; Scherman@Daniel
Original assignee: Rhone-Poulenc Rorer S. A.; Institut Gustave Roussy; Centre National De La Recherche Scientifique
Priority date: 1997-06-30
Filing date: 1998-06-30
Publication date: 2008-10-01
Also published as: NO996541L; HUP0004728A1; CA2294802A1; CN1261808A; US20020012914A1; DE69829287D1; AU8444698A; NO327499B1; DE69829287T2; HUP0004728A3; KR20010020570A; JP4664450B2; JP2002507984A; ATE290403T1; US6528315B2; PL337584A1; NO996541D0; WO1999001157A1; BR9810372A; IL133708A0

Abstract

Predkládané rešení se týká mimorádného zlepšení prenosu nukleových kyselin nádoru in vivo, a dále se vynález týká nukleových kyselin sdružených s produkty, které umožnují zvýšit výtežek takového prenosu užitím slabého elektrického pole s intenzitou 1 až 600 V/cm. Dále je predmetem rešení kombinovaný produkt nukleové kyseliny a elektrického pole s intenzitou 1 až 600 V/cm pro použití pri genové terapii pro podání nukleové kyseliny do nádoru založené na in vivo elektrotransfekci, pricemž nukleovákyselina a elektrické pole se aplikují samostatnenebo casove oddelene do nádoru nebo na nádor in vivo.

Description

(57) Anotace:

Předkládané řešení se týká mimořádného zlepšení přenosu nukleových kyselin nádorů in vivo, a dále se vynález týká nukleových kyselin sdružených s produkty, které umožňují zvýšit výtěžek takového přenosu užitím slabého elektrického pole s intenzitou 1 až 600 V/cm. Dále je předmětem řešení kombinovaný produkt nukleové kyseliny a elektrického pole s intenzitou 1 až 600 V/cm pro použití při genové terapii pro podání nukleové kyseliny do nádoru založené na in vivo elektrotransfekci, přičemž nukleová kyselina a elektrické pole se aplikují samostatně nebo časově odděleně do nádoru nebo na nádor in vivo.

Léčivo pro genovou terapii, které se vnáší do nádorů za aplikace slabého elektrického pole, a kombinovaný produkt pro genovou terapii

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká mimořádného zlepšení přenosu nukleových kyselin ín vivo do buněk vícébuněčných eukaryotických organismů, a také se týká nukleových kyselin sdružených s produkty, které umožňují zvýšit výtěžek takového přenosu pomocí slabého elektrického pole s intenzitou 1 až 600 V/cm, a dále se týká kombinace nukleové kyseliny a způsobu přenosu podle vynálezu pro použití v genové terapii.

Dosavadní stav techniky ¹⁵

Přenos genů do dané buňky je základním kamenem genové terapie. Avšak jedním z problémů je, jak vnést dostatečné množství 'nukleové kyseliny do buněk hostitele (příjemce), který má být léčen. A tato nukleová kyselina, obecně požadovaný gen, pak ještě musí být exprimována v transfekovaných buňkách. Jeden z přístupů používaných k tomuto účelu spočívá v tom, že se nukleová kyselina integruje do virového vektoru, zejména retroviru, adenoviru nebo adeno-asociovaného viru. Tyto systémy využívají k proniknutí do buňky výhod mechanismů, které vyvinuly viry, a také užívají jejich ochranných mechanismů proti degradaci. Avšak tento přístup má řadu nevýhod, zejména riziko produkce infekčních virových částic schopných rozšíření v hostitelském organismu, a ještě navíc v případě retrovirových vektorů riziko inzerent mutageneze,

Kromě toho inzerční kapacita virových genomů pro terapeutické nebo vakcinační geny je Značně omezena.

V každém případě vývoj virových vektorů vhodných pro použití v genové terapii vyžaduje velmi složité metody pro přípravu defektních virů a komplementaěních buněčných linií.

· _.

Jiný^řistup(WólfěfaI“Sčienče 2T7, 1465-68, 1990; Davis et af, Proč. Nati. Acad. Sci. USA^_93, 7213-18, 1996) spočívá v tom, že se podávají nukleové kyseliny plazmidového typu do svalu nebo krevního oběhu, ať již nenavázaných nebo navázaných na sloučeniny určené k tomu, aby usnadnily transfekci, jako jsou např. proteiny, liposomy, nabité lipidy nebo kationtové polymery jako je polyetylénimin, který je dobrým transfekčním činidlem in vitro (Behr et af, Proč. Natí. Acad. Sci. USA 86, 6982-6, 1989; Felgner et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84, 7413-7, 1987; Boussif et al., Proč, Nati. Acad. Sci. USA 92, 7297-301, 1995).

Pokud jde o svaly, od doby původní publikace Wolffa et al. ukazující schopnost svalové tkáně inkorporovat DNA indikovanou ve formě volného plazmidu (Wolf et al., Science 247, 14651468,. 1990), se mnozí autoři snažili zlepšit tento proces (Manthorpe et al., 1993, Human Gene Ther. 4, 419-431; Wolfi et al., 1991, BioTechniques 11, 474-485). Na základě těchto pokusů se objevily jisté trendy, jako např.:

• použití mechanických prostředků k nucenému vstupu DNA do buněk tak, že se DNA adsorbu45 je na částice (perličky) a ty se pak „vstřelí“ do tkáně („gene gun“) (Sanders Williams et al., 1991, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88,2726-2730; Fynan et al., 1993, BioTechniques 11,474485). Tento způsob se ukázal účinným v očkovacích strategiích, ale zasahuje pouze povrchové vrstvy tkání. V případě svalu by jejich použití nutně znamenalo chirurgický zákrok, aby se zajistil přístup ke svalu, neboť částice neprocházejí tkáněmi.kůže, · injekce DNA, již ne však ve formě volného plazmidu, ale ve spojení s molekulou schopnou sloužit jako nosič usnadňující vstup komplexu do buněk. Kationtové lipidy, používané v mnohých jiných způsobech transfekce, se ukázaly být zklamáním, neboť ty, které byly dosud testované, dokonce inhibovaly transfekci (Schwartz et al., 1996, Gene Ther., 405-411). Totéž platí pro kationtové peptidy a polymery (Manthorpe et al., 1993, Human Gene Ther. 4, 419-1CZ 299638 B6

431). Jediným případem vhodné kombinace se zdála být směs poly(vinylalkoholu) nebo polyvinylpyrolidonu s DNA. Výsledný faktor zlepšení přenosu DNA u těchto kombinací je však nižší než 10 při srovnání s injekcí „nahé“ DNA (Mumper et al., 1996, Pharmaceutical Research 13, 701-709) · předběžné ošetření tkáně, do které se má injikovat DNA, roztokem, který má zvýšit difúzi a stabilitu DNA (Davis et al., Hum. Gene Ther. 4, 151-159) nebo podpořit vstup nukleových kyselin, např. indukovat buněčné dělení nebo regeneraci. Ošetření se týkalo především použití lokálního anestetika nebo kardiotoxinu, vazokonstriktorů, endotoxinů nebo jiných molekul (Manthorpe et al., 1993, Human Gene Ther. 4, 419-431; Danko et al., 1994, Gene Ther. Ί, ίο 114-121; Vitadello et al., 1994, Hum. Gene Ther. 5, 11-18). Tyto postupy předběžného ošetření se však obtížně provádějí. Tak konkrétně např. přípravek Bupivacaine, aby byl účinný, se musí užít v dávce velmi blízké letální dávce. Injekce hyperosmotické sacharózy před aplikací DNA, zamýšlená ke zlepšení difúze, nezvyšuje úroveň transfekce ve svalu (Davis et al.,

1993).

Jiné tkáně byly transfekovány in vivo buďto pomocí samotné plazmidové DNA nebo DNA spojené se syntetickými vektory (přehled viz. Cotten and Wagner, 1994, Current Opinion in Biotechnology 4, 705; Gao and Huang (1995), Gene Therapy, 2, 710; Ledley (1995), Human Gene Therapy 6, 1129). Hlavní tkáně, které se zkoumaly, byla játra, respiraění epitel, cévní stěny, cent20 rální nervový systém a nádory. Ve všech těchto tkáních však byla exprese transgenu nízká, takže se nepředpokládala terapeutická aplikace (v játrech např. viz Chao et al., 1996, Human Gene Therapy 7, 901), ačkoliv povzbudivé výsledky byly získány při přenosu plazmidové DNA do cévní stěny (Iires et al., 1996, Human Gene Therapy 7, 959 a 989). V mozku je účinnost přenosu velmi nízká, stejně jako je tomu v nádorech (Schwartz et al. 1996, Gene Therapy 3, 405; LU et al., 1994, Cancer Gene Therapy 1, 245; Son et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91,12669).

Elektroporace nebo elektrického pole k permeabilizaci buněk se obecně využívají in vitro k podpoře transfekce DNA do buněk v kulturách. Ale dosud se mělo za to, že tento jev závisí na dosažení prahové intenzity elektrického pole, a že elektropermeabilizace lze dosáhnout pouze při

30___relativně vysoké intenzitě_elektrického-pole-intenzitv-800-až-l-200-V/cm-v-případě-živočišných buněk. Tyto způsoby byly také navrženy pro použití in vivo ke zvýšení účinnosti protinádorových přípravků jako je např. bleomycin u solidních nádorů člověka (patent US 5 468 228, L.M. Mír)). S pulzy velmi krátkého trvání (100 mikrosekund) jsou tyto elektrické podmínky (800 až 1200 V/cm) velmi vhodné k intracelulámímu přenosu malých molekul. Tyto podmínky (pulzy v délce 100 mikrosekund) byly aplikovány, aniž by se však zlepšila účinnost přenosu nukleové kyseliny do jater, přičemž pole s intenzitou nižší než 1000 V/cm se ukázalo být zcela neúčinné, a dokonce inhibující ve srovnání s injekci DNA v nepřítomnosti elektrického pole (patentová přihláška WO 97/07826, Helíer et al., FEBS Letters, 389,225-8, 1996).

Při aplikaci této techniky se vyskytují mnohé problémy, především při aplikaci in vivo, neboť aplikace elektrického pole takové intenzity může způsobovat léze menšího ci většího rozsahu. Léze v cílové tkáni nejsou problémem při léčení nádorů u pacientů s rakovinou, ale představují hlavní nevýhodu u zdravého subjektu nebo i nemocných subjektů, pokud se DNA podává do tkáně jiné než nádorové.

⁴⁵

Podstata vynálezu

Zatímco všechny výše citované práce zdůrazňovaly nutnost užít elektrického pole s vysokým napětím řádu 1000 V/m, aby byly způsoby účinné in vivo, původce předkládaného vynálezu zcela neočekávaně ukázal, že přenos nukleových kyselin in vivo do tkání je podstatně zlepšen, a to bez nežádoucích vedlejších účinků, když se tkáň vystaví elektrickým pulzům nízké intenzity, např. 100 až 200 V/cm, a relativně dlouhého trvání. Kromě toho původce zjistil, že velká variabilita exprese transgenů nesených plazmidy, ke které dochází při přenosu DNA způsoby dle dosavad55 ního stavu techniky, byla snížena při použití způsobu podle vynálezu.

-2CZ 299638 B6

Tudíž předkládaný vynález se týká způsobů přenosu nukleových kyselin in vivo, kdy se buňky nebo tkáně přivedou do kontaktu s nukleovou kyselinou, která má být přenesena, přímým podáním do tkáně nebo topickým či systémovým podáním, a kdy je přenos způsoben aplikací jednoho nebo několika elektrických pulzů s intenzitou 1 až 600 V/cm na tkáň.

Podle výhodného provedení vynálezu je způsob podle vynálezu vhodný pro tkáně, jejichž buňky mají specifickou geometrii, jako jsou např. buňky velkých rozměrů a/nebo prodlouženého tvaru a/nebo buňky přirozeně reagující na elektrický akční potenciál a/nebo buňky mající specifickou ío morfologii.

Výhodně je intenzita elektrického pole 200 až 400 V/cm a celková doba aplikace je delší než 10 milisekund (ms). Počet použitých pulzů je např, 1 až 100 000 a frekvence pulzů je 0,1 až 1000 Hz. Výhodně je frekvence pulzů 0,2 až 100 Hz, Pulzy se mohou také aplikovat nepravili dělným způsobem, přičemž funkce popisující intenzitu pole v závislosti na čase je proměnlivá.

Tak např. aplikované elektrické pole může být výsledkem kombinace jednoho pole s intenzitou >400 V/cm a výhodně 500 až 800 V/cm, s krátkým trváním jednotky (<1 ms), následovaného jedním nebo několika pulzy nízké intenzity, např, <400 V/cm, výhodně <200 V/cm a s dlouhý trváním jednotky (>1 ms). Integrál funkce popisující závislost intenzity elektrického pole na čase je větší než 1 kV x ms/cm. Ve výhodném provedení je integrál větší nebo roven 5 kV x ms/cm.

Ve výhodném provedení vynálezu je intenzita elektrického pole pulzů přibližně 500 V/cm (tj. s rozmezím ± 10 % a výhodně ± 5%),

Pulzy jsou vybrány ze skupiny obsahující pulzy tvaru obdélníkových kmitů, exponenciálně tlumených kmitů, oscilujících unipolámích kmitů omezeného trvání, oscilujících bipolámích kmitů omezeného trvání a další formy kmitů. Ve výhodném provedení vynálezu jde o pulzy obdélníkových kmitů.

Aplikaci elektrických pulzů lze provést jakýmkoliv způsobem odborníkovi známvm._nar)ř-taL-že šé Užije:

• systém externích elektrod umístěných na obou stranách tkáně, která má být ošetřena, zejména systém neinvazivních elektrod umístěných v kontaktu s kůží, • systém elektrod implantovaných do tkání, · systém elektrody/injektor, který umožňuje simultánní podání nukleových kyselin a aplikaci elektrického pole.

V textu této přihlášky vynálezu jsou termíny „přenos DNA (nebo nukleových kyselin) aplikaci jednoho nebo několika elektrických pulzů“ a termíny „elektropřenos“ nebo alternativně „elektro40 transfekce“ ekvivalentní a označují přenos nukleové kyseliny neb DNA pomocí aplikace nebo v přítomnosti elektrického pole.

Pro aplikaci in vivo je někdy nezbytné užít prostředek, který zajistí elektrickou vodivost v případě neinvazivních externích elektrod. Takovým prostředkem je např. elektrolyt ve formě gelu.

Nukleové kyseliny se podávají jakýmkoliv vhodným způsobem, ale výhodně se injikují in vivo přímo do tkáně, nebo se podávají jiným způsobem, lokálním nebo systémovým, a výhodně pomocí katétru, čímž se stávají dostupnými v místě aplikace elektrického pole. Nukleové kyseliny se mohou podávat společně s činidly, která umožňují nebo usnadňují přenos, jak bylo již zmí50 něno. Nukleové kyseliny mohou být zejména volné v roztoku, nebo navázané na syntetická činidla nebo nesené virovými vektory. Syntetická činidla mohou být lipidy nebo polymery, známé odborníkům, nebo to dokonce mohou být zaměřovači prvky, které umožňují zachycení na membráně cílové tkáně. K těmto prvkům patří např. vektory nesoucí cukry, peptidy, protilátky nebo receptory hormonů.

-3CZ 299638 B6

Je zřejmé, že v podmínkách podle vynálezu podávání nukleové kyseliny předchází, provádí se současně nebo následuje aplikaci elektrického pole.

Tudíž se předkládaný vynález také týká nukleových kyselin a elektrického pole s intenzitou 1 až 600 V/cm jakožto sdruženého (kombinovaného) produktu pro jejich současnou, samostatnou nebo střídavou aplikaci in vivo do savčích buněk, a zejména do lidských buněk. Výhodně je intenzita pole 200 až 600 V/cm a ještě výhodněji je přibližně 500 V/cm.

Výhodně se vynález užívá v genové terapii, což je terapie, kdy exprese vneseného genu, ale také modulace nebo zablokování cílového genu, umožňuje léčit konkrétní patologický stav.

Výhodně se buňky nebo tkáně podrobují genové terapii, která umožňuje:

• buďto korekci dysfunkcí samotných buněk (například pro léčení, nemocí spojených s genetic15 kými vadami jako je např. cystická fíbróza), • nebo ochranu a/nebo regeneraci vaskularizace nebo inervace svalu nebo jiných svalových tkání nebo orgánů pomocí trofíckých, neurotrofických nebo angiogenních faktorů, které jsou produkovány transgenem, • nebo transformaci tkáně na orgán secemující produkty vedoucí k léčebnému účinku, jako je 20 např. produkt genu samotného (například regulační faktory trombózy a hemostázy, trofické faktory, hormony), nebo jako je aktivní metabolit syntetizovaný ve tkáni díky vnesenému terapeutickému genu, • aplikaci vhodnou pro vakcinaci nebo imunostimulaci.

Dalším předmětem vynálezu je kombinace elektrických pulzů určitého napětí s přípravky obsahujícími nukleové kyseliny formulovanými s ohledem na kteroukoliv cestu aplikace, která umožní dosáhnout tkáně, ať už jde o aplikací topickou, perkutánní, perorální, vaginální, parenterální, intranazální, intravenózní, intramuskulámí, subkutánní, intraokulámí, transdermální apod. Farmaceutické přípravky podle vynálezu výhodně Obsahuj í-farmaceuticky-přijatelnv-nosič-pro-in i i30 kovatelný přípravek, zejména pro přímou injekci do požadovaného orgánu nebo pro jakékoliv jiné podávání. Může obsahovat zejména sterilní izotonické roztoky nebo suché přípravky, zejména lyofilizované, které po přidání například sterilní vody nebo fyziologického roztoku, v závislosti na případu, vytvoří přípravky roztoků pro injekce. Dávky nukleových kyselin použité pro injekci, jakož i počet podávání a objem injekcí, mohou být upraveny podle různých parametrů a obzvláště dle způsobu podávání, příslušné patologie, exprimovaného genu nebo trvání požadované léčby.

Nukleové kyseliny mohou být syntetického nebo biosyntetického původu, nebo extrahované z virů nebo prokaryotických nebo eukaryotických buněk pocházejících z jednobuněčných organis40 mů (např. kvasinek) nebo mnohobuněčných organismů. Mohou být podávány spojené úplně nebo částečně se složkami původních organismů a/nebo systému syntézy.

Nukleová kyselina může být deoxyribonukleová kyselina nebo ribonukleová kyselina. Může zahrnovat sekvence přirozeného původu nebo umělé sekvence a zejména genomovou DNA, cDNA, mRNA, tRNA a rRNA, hybridní sekvence nebo syntetické ěi semisyntetické sekvence oligonukleotidů, modifikované či nikoliv. Tyto nukleové kyseliny mohou být získány jakoukoliv metodou odborníkovi známou, zvláště cíleným prohledáváním genových knihoven, chemickou syntézou nebo dokonce smíšenými metodami, včetně chemické nebo enzymové modifikace sekvenci získaných sereeningem knihoven. Mohou být modifikovány chemicky.

Konkrétně může být nukleová kyselina DNA nebo RNA typu „senze“ nebo „antísepse“ nebo RNA s katalytickou vlastností ribozymu. „Antisenze RNA“ je nukleová kyselina, která má sekvenci komplementární k cílové sekvenci, např. mRNA sekvenci, a která hybridizaci blokuje expresi cílové sekvence. „Senze“ označuje nukleovou kyselinu, která je sekvenčně homologická

-4CZ 299638 B6 nebo která je totožná s cílovou sekvencí jako je např. sekvence spojená s proteinovým transkripčním faktorem a zapojená do exprese daného genu. Podle jednoho výhodného provedení obsahuje nukleová kyselina požadovaný gen a prvky umožňující expresi uvedeného genu. Výhodně je fragment nukleové kyseliny ve formě plazmidu.

Deoxyribonukleová kyselina může být jedno- nebo dvouvláknová, může jít o krátké oligonukleotidy nebo delší sekvence. Může nést terapeutické geny, sekvence regulující transkripci nebo replikací, nebo oblasti pro vazbu s dalšími buněčnými složkami apod. Termín „terapeutický gen“ nebo též „léčebný gen“ se v popisu vynálezu týká zejména každého genu kódujícího RNA nebo proteinový produkt mající léčebný účinek. Kódovaný produkt může být protein, peptid apod. Tento proteinový produkt může být s cílovou buňkou homologní (produkt, který je normálně exprimován v cílové buňce, když nevykazuje žádnou patologii). V tomto případě transgenní exprese například umožňuje překonat nepřiměřenou expresi v buňce nebo expresi proteinu, který je z důvodu modifikace inaktivní nebo málo aktivní, nebo také umožňuje uvedený protein expri15 movat nadměrně. Terapeutický gen muže také kódovat mutantu buněčného proteinu, která má zvýšenou stabilitu, modifikovanou aktivitu apod. Proteinový produkt muže být také s cílovou buňkou heterologní. V tomto případě může exprimovaný protein například doplnit nebo vnést do buňky chybějící aktivitu (léčení enzymových deficitů), nebo umožní zasáhnout proti patologickému stavu, či stimulovat imunitní reakci, například při léčení nádorů. Může také obsahovat tzv.

sebevražedný gen (thymidinkinázu viru herpes) pro léčbu rakovin nebo restenózy.

Z léčebných produktů vhodných k použití podle vynálezu se mohou konkrétně uvést geny, které kódují:

- enzymy jako je např. α-1-antitrypsin, proteinázy (metaloproteinázy, urokináza, uPA, tPA, ...

streptorkináza), proteázy štěpící prekurzory, čímž se uvolní aktivní produkty (ACE, ICE, ...) nebo jejich antagonisté (TIMP-1, inhibitor tkáňového aktivátoru plazminogenu PAI, TFPI),

- krevní deriváty jako faktory zapojené do koagulace: faktory Vil, VIII, IX, faktory komplementu, trombin,

- hormony nebo enzymy účastnící se v biosyntéze hormonů nebo faktory podílející se na řízení syntéz>'nebo'exkrece hormonu, jáko‘jě‘ihžulíň.faktóry 'příbuznčiiizuiínu (IGF), růstový hormon, ACTH, enzymy pro syntézu pohlavních hormonů,

- lymfokiny a cytokiny: ínterleukiny, chemokiny (CXC a CC), interferony, TNF, TGF, chemotaktické faktory nebo aktivátory jako jsou MIF, MAF, PAF, MCP-1, eotaxin, UF apod. (francouzský patent 92 03120),

- růstové faktory, např. IGF, EGF, FGF, KGF, NGF, PDGF, PIGF, HGF, proliferin, _x - angiogenní faktory jako jsou VEGF nebo FGF, angiopoetin 1 nebo 2, endotelin,

- enzymy syntézy neurotransmiterů (nervových přenašečů)

- trofické faktory, zejména neurotrofické faktory pro léčení neurodegenerativních nemocí, poškození nervového systému způsobené úrazem nebo poraněním, nebo degradace retiny, např.

členy rodiny neurotrofinů jako NGF, BDNF, NT3, NT4/5, NT6, jejich deriváty a příbuzné geny, členy rodiny CNTF, axokin, LIF a jeho deriváty, IL—6 a jeho deriváty, kardiotrofin a jeho deriváty, GDNF a jeho deriváty, členy rodiny IGF, jako jsou IGF-1, IGF-2 a jejich deriváty, členy rodiny FGF, jako jsou FGF1, FGF2, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9 a jejich deriváty, TGFB,

- růstové faktory kostí,

- hematopoetické faktory jako erytropoetin, GM-CSF, M-CSF, LIF apod.,

- buněčné stavební proteiny jako je dystrofin nebo minidystrofin (francouzský patent 9111947) nebo sebevražedné geny (thymidinkináza, cytosindeamináza, enzymy obsahující cytochrom P450), geny hemoglobinu nebo jiných proteinových nosičů,

- geny odpovídající proteinům zapojeným do metabolismu lipidu, například apo li poprote i nového typu vybrané z apolipoproteinů A-I, Α-ΙΓ, A-IV, B, C-1, C—II, C-I-II, D, E, F, G, H, J a apo(a), a metabolických enzymů, jako jsou například lipoproteinová lipáza, jatemí lipáza,

-5CZ 299638 B6 lecitinchoiesterol-acyltransferáza, 7-alfacholesterolhydroxyláza, kyselá fosfatidylfosfatáza, nebo alternativně lipidové transferové proteiny, jako je transferový protein esterů cholesterolu, a transferový protein fosfolipidp, protein vázající HDL nebo dokonce vybraný receptor, například z receptorň LDL, chylomikronových zbytkových receptorů a „scavenger“ receptorů apod., dále také leptin pro léčbu obezity,

- faktory regulující krevní tlak jako např. enzymy účastnící se metabolismu NO, angiotensin, bradykinin, vasopresin, ACE, renin, enzymy kódující mechanismy syntézy a uvolňování prostaglandinů, tromboxan, adenosin, adenosinové receptory, kallikreiny a kallistatiny, ANP, ANF, diuretický a antidiuretický faktor, faktory podílející se na syntéze, metabolismu nebo uvolňování mediátorů jako histamin, serotonin, katecholaminy, neuropeptidy,

- antiangiogenní faktory jako je např. ligand pro Tie—1 a Tie-2, angiostatin, faktor ATF, deriváty plazminogenu, endotelin, trombospondin 1 a 2, PF-4, interferon-α a -β, interleukin-12, TNFa, uroktnázový receptor, fltl, KDR, PAI1, PAI2, TIMPl, fragment prolaktínu,

- faktory ochraňující proti apoptóze jako jsou faktor rodiny AKT,

- proteiny schopné indukovat buněčnou smrt, které jsou buďto sami aktivní jako kaspázy, nebo které jsou typu „předléku“, tj. vyžadují aktivaci jiným faktorem, jako např. proteiny, které aktivují předléky na činidla způsobující buněčnou smrt, např. thymidinkináza viru herpes a deaminázy, se kterými se počítá zvláště v protinádorové terapii,

- proteiny podílející se na kontaktu mezi buňkami a adhezi; VCAM, PECAM, ELÁM, ICAM, integriny, kateniny,

- proteiny extracelulámí matrix,

- proteiny podílející se na migraci buněk,

- proteiny podílející se na signální transdukci jako např, FAK, MEKK, p38 kináza, tyrosinkinázy, serinthreoninkinázy,

- proteiny podílející se na regulaci buněčného cyklu (p21, pl6, cykliny apod.) a také dominantně-negativní mutanta nebo odvozené protein, které blokují buněčný cyklus a které mohou, kde je to vhodné, indukovat apoptózu,

-^-transkripční-faktorvv-j un-fos-APl—p5 3-apod-a- proteiny- vs ignál n rkaskádě p 53;

- buněčné strukturní proteiny, jako jsou intermediální filamenta (vimentin, desmin, keratiny), dystrofin, proteiny podílející se na kontrakci svalu a regulující kontraktibilutu svalu, zejména proteiny účastnící se metabolismu kalcia a toku kalcia v buňkách (SERCA apod.)

V případě proteinů, které fungují prostřednictvím systému ligand a receptor lze předvídat použití ligand nebo receptorů (např. FGF-R, VEGF-R apod.). Lze také uvést geny kódující fragmenty .ligandů nebo receptorů, zvláště proteinů zmíněných výše, které vykazují aktivitu, která·je buďto vyšší, než aktivita proteinu plné délky, nebo jde o antagonistickou aktivitu anebo dokonce „dominantně-negatívní“ typ vzhledem k původnímu proteinu (např. receptorové fragmenty inhibující dostupnost proteinů v oběhu, ať už asociované nebo ne se sekvencemi indukujícími sekreci těchto fragmentů ve vztahu ukotvení na buněčné membráně, a nebo jiné systémy pro modifikaci intracelulámího transportu v těchto systémech Iigand-receptor, kterou by se změnila dostupnost jednoho z prvků) nebo dokonce mají vlastní aktivitu odlišnou od aktivity původního úplného proteinu (např. ATF).

Mezi dalšími proteiny nebo peptidy, které mohou být secernovány svalem, je důležité zdůraznit protilátky, variabilní fragmenty jednořetězcových protilátek (ScFv) nebo jakékoliv protilátkové fragmenty, které mají dostatečné rozpoznávací schopnosti pro použití v imunoterapii, např. pro léčbu infekčních nemocí, nádorů a autoimunitních chorob, jako je roztroušená skleróza (antiidiotypové protilátky), a také ScFv', který je navázán na protizánětlivé cytokiny jako jsou např. IL1 a TNFa pro léčení revmatoidní artritidy. Další vhodné proteiny jsou, aniž by výčet byl ome50 zující, rozpustné receptory jako například rozpustný receptor CD4 nebo rozpustný receptor TNF pro léčení infekce HIV, rozpustný receptor TNFa nebo rozpustný receptor IL1 pro léčení revmatoidní artritidy, rozpustný receptor acetylcholinu pro léčbu myastenie, substrátové peptidy

-6CZ 299638 Bó nebo enzymové inhibitory, nebo peptidy, které jsou agonisty nebo antagonisty receptorů nebo adhezivních proteinů, jako například pro léčení astmatu, trombózy, restenózy, metastáz nebo zánětů, a umělé, chimérické nebo zkrácené proteiny. Z hormonů základního významu se může uvést inzulín v případě diabetů, růstový hormon a kalcitonin. Je třeba také uvést proteiny schopné indukovat protinádorovou imunitu nebo stimulovat imunitní odpověď (ÍL2, GM-CSF, 1L-12 apod.) Nakonec lze zmínit cytokiny, které redukují Tm odpověď, jako jsou např. IL10, IL4 a IL13,.

Četné příklady, které byly uvedeny i ty, které budou ještě následovat, ilustrují potenciální rozsah aplikací předkládaného vynálezu.

Terapeutické nukleové kyseliny mohou být antisenze sekvence nebo geny, jejichž exprese v cílové buňce umožní kontrolovat expresi genů nebo transkripci buněčných mRNA. Takové sekvence mohou být např. transkribovány v cílové buňce do RNA komplementární k buněčné mŘNA a tak blokovat její translaci do proteinu, což je způsob popsaný v evropském patentu 140 308. Terapeutické geny také mohou obsahovat sekvence kódujíc ribozymy, které jsou schopné selektivně ničit cílové RNA (evropský patent 321 201).

Jak bylo již uvedeno výše, nukleové kyseliny mohou také obsahovat jeden nebo několik genů kódujících antigenní peptidy schopné vyvolat imunitní odpověď u člověka nebo zvířete. V takovém konkrétním provedení umožňuje vynález buďto produkci vakcín nebo imunoterapii člověka nebo zvířete, účinkující zejména proti mikroorganismům, virům a rakovinným onemocněním. Zejména sem patří antigenní peptidy specifické pro virus Épstein-Barrové, virus HIV, virus hepatitidy B (evropský patent 185 573), virus pseudorabies, „virus tvořící syncytia“, další viry nebo dokonce specifické nádorové antigeny, jako jsou proteiny MÁGE (evropský patent 259 212), a sice MAGE1 a MAGE2, nebo antigeny schopné stimulovat reakci proti nádorům, jako jsou bakteriální proteiny tepelného šoku.

Výhodně nukleová kyselina obsahuje také sekvence umožňující a/nebo napomáhající expresi

30_léčebného genu a/nebo genu kódujícího antigenní peptid ve svalu.._Může.zahrnovat-sekv.ence,které jsou přirozeně odpovědné za expresi uvažovaného genu, když jsou tyto sekvence schopné fungovat v transfekované buňce, Může také zahrnovat sekvence různého původu (zodpovědné za expresi jiných proteinů nebo dokonce syntetické sekvence). Může zahrnovat zejména promotorové sekvence eukaryotických nebo virových genů. Například to mohou být promotorové sekvence pocházející' z genomu buňky, kterou je žádoucí transfekovat. Z eukaryotických promotorů se mohou použít jakékoliv promotory nebo z nich odvozené sekvence, které stimulují nebo potlačují transkripci genu specifickým nebo nespecifickým a slabým nebo silným způsobem. Jedná se zvláště o obecné, konstitutivní promotóřý (gen pro HPRT, vimentin, α-aktin, tubulin átdj, promotory terapeutických genů (typu MDR nebo CTFR apod.), tkáňově specifické promotory (včetně promotorů genů desminu, myosinů, kreatinkinázy, fosfoglycerátkinázy) nebo alternativně promotory odpovídající na podnět jako jsou promotory odpovídající na přirozené hormony (jako jsou receptory steroidních hormonů, receptoiy kyseliny retinové), a nebo promotory regulované antibiotiky (tetracyklin, rapamycin apod.), promotory reagující na stravovací režim jako jsou promotory odpovídající na fibráty, nebo promotory odpovídající na další přirozené či syntetické molekuly. Mohou to také být promotorové sekvence pocházející z genomu viru. V této souvislosti se mohou například uvést promotory adenovirových genů EIA nebo MLP, nebo promotory odvozené z genomu virů CMV, RSV, SV 40 apod. Dále mohou být tyto expresní sekvence modifikovány přidáním sekvencí pro aktivaci, regulaci, umožňujících podmíněnou, přechodnou nebo dočasnou expresi, tkáňově specifickou expresi nebo převládající expresi apod.

Kromě toho může nukleová kyselina také obsahovat, zejména v poloze nad léčebným genem („upstream“), signální sekvenci zaměřující syntetizovaný léčebný produkt do sekreční dráhy cílové buňky. Tato signální sekvence může být přirozená signální sekvence léčebného produktu, ale může také obsahovat jakýkoliv jiný funkční signál, nebo umělou signální sekvenci. Nukleová kyselina může také obsahovat signální sekvenci směřující syntetizovaný léčebný produkt do kon-7CZ 299638 B6 krétního buněčného kompartmentu, jako jsou například peroxisomy, lysosomy anebo mitochondrie např. pro léčení mitochondriální genetické nemoci.

Další vhodné geny popsal McKusick, V.A., (Mendelian inheritance in Man, Catalogs of autoso5 mal dominant, autosomal recessive, and X-Iinked phenotypes, 8. vydání, Johns Hopkins University Press, 1988) a Stanbury, J. B. et al. (The metabolic basis of inherited disease, 5. vydání, McGraw-Hill, 1983). Požadované geny pokrývají proteiny zapojené do metabolismu aminokyselin, lipidů a dalších buněčných složek.

ío Lze také uvést geny spojené s chorobami metabolismu sacharidů (aniž by tím však byl vynález omezen) jako je např. fruktózo-l-fosfátaldoláza, fruktózo-l,6-difosfatáza, glukózo-ó-fosfatáza, lysozomální a-l,4-glukosidáza, amy!o-l,6-glukosidáza, amylo-(l,4:l,6>”t^ransgl^ukosidáza, svalová fosfoiyláza, svalová fosfo-fruktokináza, fosforyláza-B-kináza, galaktózo-l-fosfáturidyltransferáza, všechny enzymy komplexu pyruvátdehydrogenázy, pyruvátkarboxyláza, 2-oxogluta15 rát/glyoxylátkarboxyláza, a D-glycerátdehydrogenáza.

Lze uvést i další vhodné geny:

- Geny spojené s nemocemi aminokyselinového metabolismu, jako například fenylalaninhydroxyláza, dihydrobiopterinsyntetáza, tyrosinaminotransferáza, tyrosináza, histidináza, fumaryl20 acetoacetáza, glutathionsyntetáza, γ-glutamylcysteinsyntetáza, ornithin-d-amínotransferáza, karbamoylfosfátsyntetáza, omithinkarbamoyltransferáza, argininosukcinátsyntetáza, arginosukcinátlyáza, argináza, L-lysindehydrogenáza, L-lysinketoglutarát-reduktáza, valíntransamínáza, leucin/isoleucintrans-amináza, dekarboxyláza 2-ketokyselin s rozvětveným řetězcem; isovaleryl-CoAdehydrogenáza, acyl-CoA-dehydrogenáza, 3-hydroxy-3-methylgluta25 ryl-CoAlyáza, acetoacetyl-CoA-3-ketothioláza, propionyl-CoA-karboxyláza, metylmalonyl-CoA-mutáza, (ATP:kobalamin)adenosyltransferáza, dihydrofolátreduktáza, metylentetrahydrofolátreduktáza, cystathionin-B-syntetáza, komplex sarkosindehydrogenázy, proteiny patřící do systému štěpícího glycin, μ-alanintransamináza, sérová kámoši náza, a cerebrální homokamosináza,

30----^geny~se-vztahemA~nemOcemmetaboIisnnrtul<ů^_an^:nášťňýčh~kyšěliň7jáko^_ňápříklád~íipo⁷ proteinová lipáza, apolipoprotein C~II, apolipoprotein E, další apolipoproteiny, lecitin cholesterolacetyltransferáza, LDL receptor, jatemí sterolhydroxyláza a α-hydroxyláza kyseliny fytanové,

- geny se vztahem k lysozomálním deficitům, jako například lysozomální a-L-iduronídáza, lysozomální iduronátsulfatáza, lysozomální heparan-N-suífatáza, lysozomální N-acetyl-aD-glukózoaminidáza, lysozomální acetyl-CoA :a-glukozám in-N~acetyltransferáza, lysozomální N-acetyl-a-D-glukozamin-6-sulfatáza, lysozomální galaktózo-amin-6-sulfátsulfatáza, lysozomální β-galaktosidáza, lysozomální arylsulfatáza B, lysozomální B-glukuronidáza, N-acetylglukózoaminylfosfotransferáza, lysozomální α-D-manosidáza, lysozomální <x40 neuraminidáza, lysozomální aspartylglukozaminídáza, lysozomální α-L-fukosidáza, lysozomální kyselá lipáza, lysozomální kyselá ceramidáza, lysozomální sftngomyelináza, lysozomální glukocerebrosidáza a lysozomální galaktocerebrosidáza, lysozomální galaktosylceramídáza, lysozomální arylsulfatáza A, α-galaktosidáza A, lysozomální kyselá B-galaktosidáza, a řetězec a lysozomální hexosaminidázy A.

Mohou se také uvést (aniž by to vynález omezovalo) geny se vztahem k onemocněním steroidního a lipidového metabolismu, geny se vztahem k onemocněním purinového a pyrimidinového metabolismu, geny se vztahem k onemocněním metabolismu porfyrinů a hernu, a geny se vztahem k onemocněním pojivové tkáně, metabolismu svalů a kostí, a také geny se vztahem k one50 mocněním krve a hematopoetických orgánů, svalů (myopatie), nervového systému (neurodegeneratívní choroby) nebo oběhového systému (například léčení ischémií a stenózy) a geny podílející se na genetických nemocech mitochondrií.

-8CZ 299638 Bó

Ve způsobu podle vynálezu může být nukleová kyselina spojena s jakýmkoliv typem vektorů nebo s jakoukoliv kombinací těchto vektorů, která umožní zlepšit genový přenos, např. (aniž by výčet byl omezující) s vektory jako jsou viry, syntetické nebo biosyntetické přípravky (např, činidla jako lipid, polypeptid, glykosid nebo polymer), či dokonce navázání na částice (perličky) nebo propulzní částice. Nukleové kyseliny mohou být také injikovány do tkáně, která podstoupila ošetření ke zlepšení genového přenosu, např, ošetření farmako logické povahy v aplikaci lokální nebo systémové, nebo ošetření enzymem, permeabilizující (použití surfaktantů), chirurgické, mechanické, tepelné nebo fyzikální ošetření.

Výhodnost použití elektropřenosu v genové terapii spočívá mj. v bezpečnosti, pramenící z toho, že se provádí jen lokální ošetření ve spojení s lokální a cílenou aplikací elektrického pole.

Vzhledem ke všem uvedeným výhodám a také bezpečnosti, která doprovází použití slabých polí, může být tento vynález aplikován i na srdeční sval pro léčbu srdečních chorob, např. použitím vhodného defibrilátoru. Může být také použit pro léčbu restenózy pomocí exprese genů inhíbujících prolíferaci buněk hladkého svalstva, jako je protein GAX.

Kombinace polí nízké intenzity a dlouhotrvajícího podávání, aplikované na tkáně in vivo, zlepšují transfekci nukleových kyselin, aniž by způsobily významné poškození tkání. Tyto výsledky zvy20 sují účinnost přenosu DNA v genové terapii používající nukleové kyseliny.

Jak vyplývá z výše uvedeného, způsob podle vynálezu poprvé umožňuje, a sice prostřednictvím genové terapie, že k vytvoření přípravku ve fyziologických a/nebo léčebných dávkách dojde přímo ve tkáni nebo je přípravek secernován do jejího blízkého okolí nebo je secernován do ₍ krevního či iymfatického oběhu. Kromě toho vynález poprvé umožňuje jemnou modulaci a kontrolu účinného množství exprimovaného transgenu pomocí možnosti regulovat objem transfekované tkáně, například počtem míst podávání nebo dokonce možností regulovat počet, tvar, povrch a uspořádání elektrod. Další kontrolní prvek vychází z možnosti regulovat účinnost transfekce změnou intenzity pole, poctu, trvání a frekvenci pulzů a samozřejmě také, v souladu se _30 stavem techniky, množstvím a objemem podávaných nukleových kysel in.__Lze_tak_.dosáhnout.

vhodné úrovně transfekce a požadované úrovně produkce v tkáních nebo požadovaná sekrece. Způsob podle vynálezu zaručuje mimořádnou bezpečnost ve srovnání s chemickými nebo virovými metodami genového přenosu in vivo, při kterých nemůže být zcela vyloučeno a kontrolováno zasazení orgánů jiných než je cílový orgán. Skutečně způsob podle vynálezu umožňuje kont35 rolu lokalizace transfekované tkáně (naprosto jasně spojené s objemem tkáně podrobené lokálním elektrickými putzům), a proto poskytuje i možnost návratu k výchozímu stavu tím, že se úplně nebo částečně odstraní tkáň, pokud je to možné, v případě tkání, které nejsou vitálně důležité a nebo které mají velkou regenerační kapacitu jako úápř. játra nebo svaly. Velká flexibilita použití umožňuje optimalizovat způsob podle druhu zvířete (použití v humánní nebo veterinární medicí40 ně), věku pacienta ajeho fyziologického a/nebo patologického stavu.

Způsob podle vynálezu dále poprvé umožňuje transfekovat nukleové kyseliny značné velikosti, na rozdíl metod užívajících viry, ve kterých je velikost transgenu limitována velikosti kapsidy. Tato možnost je nezbytná pro přenos značně velikých genů jako je dystrofin nebo obecně geny s introny a/nebo značně rozsáhlými regulačními prvky, které jsou nezbytné například pro fyziologicky regulovanou tvorbu hormonů. Dále je tato možnost nezbytná pro přenos episomů nebo umělých kvasinkových chromozomů ěi minichromozomů.

Příklady uvedené v další části slouží k ilustraci vynálezu, aniž by vynález jakkoliv omezovaly. V 50 příkladech jsou odkazy na následuj ící obrázky.

-9CZ 299638 B6

Přehled obrázků na výkresech · Obr. 1: Účinek elektrických pulzů pole s vysokou intenzitou na transfekci DNA plazmidu pXL2774 do horního holenního svalu myši, uvedena průměrná hodnota ± střední chyba prů5 měru (SEM).

• Obr. 2: Účinek elektrických pulzů pole se střední intenzitou na transfekci DNA plazmidu pXL2774 do horního holenního svalu myši, uvedena průměrná hodnota ± SEM.

io · Obr. 3: Účinek elektrických pulzů pole se slabou intenzitou na transfekci DNA plazmidu pXL2774 do horního holenního svalu myši, uvedena průměrná hodnota ± SEM.

• Obr. 4: Účinek elektrických pulzů pole se slabou intenzitou s různou délkou trvání pulzů na transfekci DNA plazmidu pXL2774 do horního holenního svalu myši, uvedena průměrná hodnota ± SEM.

• Obr. 5: Účinnost elektropřenosu DNA plazmidu pXL2774 do horního holenního svalu myší při slabé intenzitě pole, uvedena průměrná hodnota ± SEM.

· Obr. 6: Mapy plazmidů pXL3031 a DXL3010.

Příklady provedeni vynálezu

Příklad 1

Experimenty prováděné v souladu s dosavadním stavem techniky, kdy se prokázalo, že elektrické pole inhibuje transfekci.

30----------—

Standardní podmínky elektroporace, které se užívají podle dosavadního stavu techniky, byly vyzkoušeny, ale prokázalo se, že jsou neúčinné nebo dokonce inhibují přenos nukleových kyselin (plazmídové DNA) do příčně pruhovaného svalu.

Materiály a metody, obecné experimentální podmínky

V tomto příkladu byly užity následující produkty: .....

DNA pXL2774 (patentová přihláška PCT/FR 96/01414) je plazmidová DNA obsahující gen luci40 ferázy jako reportérovy gen. Ostatní použité produkty jsou běžně komerčně dostupné: ketamin, xylazin, fyziologický roztok (NaCl 0,9 %).

Byl použit běžný komerční osciloskop a generátor elektrických pulzů (obdélníkových nebo čtvercových kmitů) (Electropulzátor PS 15, .louan, Francie). Elektrody byly ploché elektrody z nerezové oceli vzdálené od sebe 5,3 mm.

Experimenty se prováděly na myších C57 Bl/6. Myši pocházející z různých klecí byly před pokusy náhodně promíchány (randomizace).

Myši byl anestetizovány směsí ketaminu a xylazinu. Roztok plazmidu (30 μΐ roztoku s 500 pg/ml v 0,9% NaCl) byl injikován skrz kůži podélně do horního lýtkového svalu pravé i levé končetiny pomocí stříkačky Hamilton. Elektrody byly pepřeny vodivým gelem a injikovaná končetina byla pak umístěna mezi elektrody, tak aby s nimi byla v kontaktu.

-10CZ 299638 B6

Elektrické pulzy byly aplikovány kolmo na osu svatu pomocí generátoru obdélníkových pulzů jednu minutu po injekci. Pomocí osciloskopu se sledovalo napětí ve voltech, V (hodnoty uváděné v příkladech představují maximální hodnoty), trvání pulzu v milisekundách, ms, a frekvence v hertzech, Hz, přičemž frekvence byla 1 Hz, Bylo aplikováno 8 po sobě jdoucích pulzů.

Pro vyhodnocení transfekee svalu byly myši utraceny sedm dní po podání plazmidu. Horní lýtkový sval obou končetin byl vyjmut, zvážen, umístěn do lyzovacího pufru a rozmělněn. Suspenze byla centrifugována a byl tak získán čistý supematant. Měření aktivity luciferázy se provádělo v 10 μϊ supematantu pomocí komerčního luminometru, ve kterém se automaticky přidával k roztoku substrát. Intenzita luminiscence je uvedena v relativních jednotkách (RLU) pro sval při známém celkovém objemu suspenze. Každý pokus byl opakován v 10 bodech, tj. 5 zvířat bylo injikováno oboustranně. Statistické vyhodnocení bylo provedeno pomocí neparametrických testů. Výsledky a diskuze '

Výsledky jsou ilustrovány dvěma obrázky, kde je užito buďto lineární, nebo logaritmické měřítko.

V tomto prvním pokusu se testovaly účinky elektrického pole 800 až 1200 V/cm, což jsou pod20 minky umožňující elektroporaci nádorů (Mir et al., Eur. J. Cancer 27, 68, 1991).

Bylo pozorováno (viz obr. 1), na rozdíl od kontrolní skupiny, kde byla injikována DNA bez elektrických pulzů, že • s osmi pulzy 1200 V/cm a délkou 0,1 ms byla průměrná hodnota aktivity luciferázy mnohem nižší, • s pulzy 1200 V/cm a délkou 1 ms tři zvířata uhynula a navíc průměrná aktivita luciferázy byla mnohem nižší, • s pulzy 800 V/cm a délkou 1 ms byla průměrná hodnota luciferázové aktivity také významně snížena.__· _

Většina svalů, které byly vystaveny působení elektrického pole, byla viditelně změněna (svaly byly drobivé a bolavého vzhledu).

Příklad 2

Experiment s přenosem nukleových kyselin pomocí'elektrického pole střední intenzity

Tento pokus byl proveden na myších C57 Bl/6. Až na intenzitu elektrického pole a jeho trvání byly podmínky provádění pokusu prakticky shodné s příkladem 1.

Výsledky jsou uvedeny na obr. 2. Opakoval se v podstatě výsledek příkladu l, tj. inhibující účinek 8 pulzů intenzity 800 V/cm a délky 1 ms na aktivitu luciferázy detekované ve svalu. Užitím pole intenzity 600 V/cm byla zjištěna stejná inhibice a stejné změny svalové tkáně. Ale na druhé straně velmi překvapivě snižování napětí vedlo k tomu, že svalová tkáň nebyla již poškozována a při 400 a 200 V/cm byla míra transfekee svalů v průměru vyšší než u svalů bez aplikace elektrického pole. Je třeba poznamenat, že ve vztahu ke kontrolní skupině (která nebyla vystavena působení elektrického pole) rozptyl hodnot luciferázové aktivity je významně snížen při 200 V/cm (střední chyba průměru, SEM, je 20,59 % průměru ve srovnání s hodnotou 43,32 % v nepřítom50 nosti elektrického pole, viz obr. 2A).

Příklad 3

Experiment s přenosem nukíeové kyseliny pomocí pulzů pole nízké intenzity, který ukazuje velmi vysokou stimulaci exprese transgenu

Tento pokus byl proveden na myších C57 Bl/6. Až na intenzitu elektrického pole a jeho trvání, a skutečnost, že pulzy byly aplikovány 25 vteřin po injekci DNA, byly podmínky shodné s předchozími příklady.

Výsledky jsou uvedeny na obr. 3. Průměrné hodnoty exprese transgenu luciferázy byly výrazně zvýšeny při trvání pulzů 20 ms při 100 V/cm a počínaje pulzy dlouhými 5 ms při 200 V/cm.

Pokus také jasně ukázal, že průměrná hodnota lucíferázové aktivity získaná po eletrotransfekci DNA do svalu je funkcí trvání elektrických pulzů, pokud se užije napětí 200 a 100 V/cm. Bylo také pozorováno, že rozptyl hodnot lucíferázové aktivity byl významně snížen u skupiny, kde byla aplikována elektrotransfekce (obr. 3A). V nepřítomnosti elektrického pole (kontrola) byla relativní střední chyba průměru 77,43 % průměrné hodnoty, zatímco se snížila na 14% (200 V/cm, 5 ms) a na 41,27 % (200 V/cm, 20 ms), nebo na 30 až 48% při elektropřenosu v poli 100 V/cm.

V nej lepších podmínkách tohoto pokusu byl faktor zvýšení exprese transgenu 89,7 vzhledem ke kontrole injikované bez aplikace elektrických pulzů.

Příklad 4

Experiment s elektroprenosem nukíeové kyseliny do svalu při 200 V/cm, který ukazuje zvýšení exprese transgenu více než 200x.

Tento experiment byl proveden na myších DBA 2 s elektrickými pu1zy_200JV/cm.s_různouidéL koufOstatní podmínky byly shodné jako v příkladu 3.

Pokus potvrdil, že při 200 V/cm se transfekce luciferázy zvyšuje, když se zvyšuje trvání pulzů nad 5 ms (obr. 4 a 5). Bylo zde opět pozorováno snížení vnitroskupinové variability detekované hodnotou střední chyby průměru, u skupiny s elektrotransfekci ve srovnání s kontrolou (relativní hodnoty střední chyby průměru byly 35 % pro kontrolu a 25, 22, 16, 18 a 26 % pro série pulzů s dobou 1,5, 10, 15, 20 a 24 ms, v uvedeném pořadí). V optimálních podmínkách v tomto experimentu byla zvýšena exprese transgenu 205 X vzhledem ke kontrole mjikovaňé bez elektrických pulzů.

Příklad 5

Účinnost elektropřenosu nukleovych kyselin je funkcí součinu „počet pulzů x intenzita pole x doba trvání každého pulzu“

Obr. 5 slouží za příklad důležitosti parametru odpovídajícího součinu „počet pulzů x intenzita pole x trvání každého pulzu“. Tento parametr ve skutečnosti odpovídá integrálu funkce, která popisuje změny intenzity elektrického pole v závislosti na čase.

Data uvedená na obr. 5 byla získána v průběhu pokusů v příkladech 2, 3 a 4 s intenzitami elektrického pole 200 V/cm a 100 V/cm anebo bez elektrického pole. Údaje ukazují, že účinnost transfekce roste jako funkce součinu celkové doby expozice elektrickému poli a intenzity pole. Stimulujícího účinku bylo dosaženo při parametru „počet pulzů x intenzita pole x trvání každého pulzu“ přesahujícím hodnotu 1 kV x ms/cm. Podle výhodného provedení vynálezu stimulace je

-12CZ 299638 B6 dosaženo pro hodnoty součinu „elektrické pole x celková doba trvání pulzů“ shodné nebo vyšší než 5 kV x ms/cm.

V následujících příkladech byl elektropřenos nukleových kyselin způsobem podle vynálezu tes5 tován na různých nádorech, buďto lidského původu, které byly implantovány na „nahé” (imunodeficientní) myši, nebo myšího původu, které byly implantovány na myši C57B1/6 (imunokompetentní).

ío Příklad 6

Elektropřenos nukleové kyseliny do lidského plicního nádoru H1299

Experiment byl proveden na samicích „nahých myší s hmotností 18 až 20 g. Štěpy nádoru

H1299 byly implantovány jednostranně v objemu 20 mm³. Myši pak byly rozděleny podle velikosti nádoru do homogenních skupin. Myši byly anestetizovány směsí ketaminu a xylazinu. Roztok plazmidu (40 μΐ roztoku s 250 pg/ml DNA ve 20mMi NaCl a 5% glukóze) byl ihjikován do středu nádoru pomocí stříkačky Hamilton. Laterální povrchy nádoru byly potřeny vodivým gelem a nádor byl umístěn mezi dvě elektrody, Elektrody byly destičkové elektrody z nerezavějí20 cí oceli vzdálené navzájem 0,45 až 0,7 mm. Elektrické pulzy byly aplikovány a měřeny pomocí komerčního generátoru obdélníkových pulzů (Electropuízator PS 15, Jouan, Francie) a osciloskopu.

V pokuse byl užit plazmid pXL3031 (obr. 6), který obsahuje gen kódující luciferázu (cytoplaz25 matickou). Plazmid pXL3031 je vektor odvozený z plazmidu pXL2774 (viz WO 97/10 343), do kterého byl vložen gen luc+ kódující modifikovanou (cytopfazmatickou) luciferázu z Photinus pyralis získanou z pGL3basic (GenBank: CVU47295) pod kontrolu promotoru získaného z časného úseku cytomegalovíru (hCMV IE, GenBank HS51EE) s polyadenylačním signálem z pozdního úseku víru SV40 (GenBank SV4CG),

30_____Elektrické pulzy byly aplikovány a měřeny pomocí komerčního generátoru obdélníkových pulzů 20 až 30 sekund po injekci. Pomocí osciloskopu se sledovaly parametry elektrické pole: 200 až 800 V/cm, délka pulzů 20 ms, frekvence 1 Hz.

Pro vyhodnocení transfekce nádoru luciferázou byly myši (10 myši v jedné pokusné skupině) utraceny 2 dny po injekci plazmidu. Nádory byly vyjmuty, zváženy a rozdrceny v lyzovacím pufru. Suspenze byla centrifugována a byl tak získán čistý supematant. Měření aktivity luciferázy se provádělo v 10 μΐ supemataritu pomocí komerčního luminometru, ve kterém se automaticky přidával substrát. Výsledky jsou uvedeny v celkových relativních jednotkách (RLU) na nádor.

Tabulka 1

RLU/nádor
	pokus 1	pokus 2
V/cm	průměr	SEM	průměr	SEM
0	32,8	± 6,8	44,7	± 10,2
200	129,7	± 39,1
300	585,0	± 134,8
400	5266,6	+ 1473/8	' 8488, 2	± 3881., 7
⁵⁰⁰			14201,6	± 6162,6,
600-			7401,0	± 5323,.1
.soo			11884,1	± 4048,3

Tabulka 1; Účinek elektrických pulzů pole s různou intenzitou na transfekci plazmidu pXL3031 do plicního karcinomu H1299 (nemalobuněčný plicní karcinom), uvedeny jsou průměrné hod- ji noty exprese luciferázy v RLU se střední chybou průměru (SEM) na jeden nádor. Podmínky: f intenzita elektrického pole uvedena ve V/cm jak je uvedeno v tabulce, aplikováno 8 pulzů délky ms při frekvenci 1 Hz. j

Jak ukazují data v tab. I, bylo pozorováno, že ve srovnání s kontrolní skupinou, kde byla DNA injíkována bez následné aplikace elektrického pole, přenos genu je zlepšen způsobem, který je io závislý na použitém napětí od 200 do 400 V/cm dokud nebylo dosaženo stálé hodnoty odpovídající maximální transfekci, které bylo, dosaženo počínaje 500 V/cm. Při vyšších napětích (600 a 800 V/cm) došlo k popáleninám kůže nebo i k hlubším popáleninám, avšak by však došlo ke sníženi exprese transgenu.

Zesílení přenosu genu do plicního nádoru H1299 prostřednictvím elektropřenosu bylo řádově 240x až320x.

Příklad 7

Elektropřenos nukleové kyseliny do lidského nádoru tlustého střeva HT29

Experiment byl proveden na samicích „nahých“ myší s hmotnosti 18 až 20 g. Štěpy nádoru HT29 byly implantovány jednostranně v objemu 20 mm³. Nádory dosáhly očekávané cílové velikosti

1 00 až 200 mm³. Myši pak byly rozděleny podle velikosti nádoru do homogenních skupin, kromě vzdálenosti mezi elektrodami (0,45 cm) byly podmínky aplikace stejné jako v příkladu 6. Výsledky dvou nezávislých sérií experimentů jsou uvedeny v tab. 2.

Tabulka 2 ______

RLU/nádor
	pokus 1	pokus 2
V/cm	průměr	- ^SEM ,	průměr	SEM
0	4 043 062	1 827 237	634 999	338 311
400	'16 037 136	5 420,572
500	. 1.4. 096 64.0..	7 -629 212	5 537 359	- -3 57l· 433
600-	24 223 872	9 217 062	14 607 ,850	6 392 841

Tabulka 2: Účinek elektrických pulzů pole různé intenzity na transfekci plazmidu pXL3031 do 35 lidského nádoru HT29 (adenokarcinomu tlustého střeva), uvedeny jsou průměrné hodnoty exprese luciferázy v RLU se střední chybou průměru (SEM,). Podmínky: intenzita elektrického pole uvedena ve V/cm jak je uvedeno v tabulce, aplikováno 8 pulzů délky 20 ms při frekvenci 1 Hz.

Ve srovnání s kontrolními skupinami bez elektropřenosu se ukazuje, že aplikace elektrického 40 pole s intenzitou 600 V/cm umožňuje dosáhnout optimální míry transfekce bez ohledu na základní míru transfekce prováděnou bez elektropřenosu. Faktor zesílení transfekce byl 6x až 23x a byl v podstatě podobný při intenzitě pole 400 a 600 V/cm.

Příklad 8

Elektropřenos nukleové kyseliny do myšího fibrosarkomu

- 14CZ 299638 B6

Experiment byl proveden na myších C57B1/6 s hmotností 18 až 20 g. Myším byly implantovány jednostranně LPB buňky, a sice 1 x 10⁶ ve 100 μΐ MEM média bez séra. Nádory dosáhly očekávané cílové velikosti 100 až 200 mm³. Myši pak byly rozděleny podle velikosti nádoru do homogenních skupin.

Podmínky experimentu byly stejné jako v příkladu 6.

Výsledky dvou nezávislých sérií experimentů jsou uvedeny v tab. 3.

Tabulka 3

RLU/nádor
	pokus 1	·, pokus 2
V/cm	průměr	' SEM	průměr	SEM .
0	0, 6	+' 0,:3 .	0, 4	+ 0,1
300	26, 3	±.14_ř 8·	' 11, 6	± 4,6
4 00	42,5	+ 31,2	10, 4	± 3,5
500	17,0	+' 12, 3	6, 0	± 1., S
600			11,0	± 7,1 ·

Tabulka 3: Účinek elektrických pulzů pole různé intenzity na transfekci plazmidu pXL303'l do myšího fibrosarkomu, jsou uvedeny průměrné hodnoty exprese luciferázy v RLU ± střední chyba průměru (SEM). Podmínky: intenzita elektrického pole uvedena ve V/cm jak je uvedeno v tabulce, aplikováno 8 pulzů délky 20 ms při frekvenci 1 Hz.

Ve srovnání s kontrolními skupinami bez elektropřenosu se ukazuje, že aplikace elektrického pole s intenzitou 300 až 600 V/cm umožňuje zesílení transfekce 30x až 70x bez ohledu na pou20-----ž ité-napět ή-----:Příklad 9

Elektropřenos nukleové kyseliny do myšího melanomu

Experiment byl proveden na myších C57B1/6 s hmotností 18 až 20. g. Myším byly implantovány.., jednostranně štěpy nádorů B16 o objemu 20 mm³. Nádory se vyvíjely a dosáhly cílové velikosti 200 až 300 mm³. Myši pak bylý rozděleny podle velikosti nádoru dó homogenních skupin.

Ostatní podmínky experimentu byly stejné jako v příkladu 6.

Výsledky jsou uvedeny v tab. 4.

Tabulka 4

Experiment 1
V/cm	průměr	SEM
0	- 1,3	± 0,7
300	14, 3	+ 7,6 .
500	32,2	+ 12, 6
600	17,2	± 6,2

Tabulka 4: Účinek pulzů elektrického pole s různou intenzitou na transfekci DNA ptazmidu pXL3031 byl injikován do myšího melanomu B16, jsou uvedeny průměrné hodnoty exprese luciferázy v RLU se střední chybou průměru (SEM) najeden nádor. Podmínky: intenzita elektrické5 ho pole uvedena ve V/cm jak je uvedeno v tabulce, aplikováno 8 pulzů délky 20 ms při frekvenci 1 Hz.

Ve srovnání s kontrolními skupinami bez elektropřenosu se ukázalo, že aplikace elektrického pole s intenzitou 500 V/cm umožňuje zesílení transfekce až 24x.

Příklad 10

Elektropřenos nukleové kyseliny do myšího.nádoru 3LL

Experiment byl proveden na myších C57B1/6 s hmotností 18 až 20 g. Myším byly implantovány jednostranně štěpy nádorů 3LL o objemu 20 mm³. Velikost transfekovaných nádorů pět dnů po implantaci byla 30 mm³. Podmínky experimentu byly shodné s příkladem 6. Výsledky jsou uvedeny v tab. 5.

Tabulka 5

V/cm	průměr	SEM
0		.. ± 0/ 04
3Ό0	' 3/7	± 2,9
500	470,5	± 237,6
600	53/ 3	± 23/9

Tabulka 5: Účinek elektrických pulzů pole s různou intenzitou na transfekci plazmidu pXL3031 do myšího plicního karcinomu 3LL, uvedeny jsou průměrné hodnoty exprese luciferázy v RLU ± střední chyba průměru (SEM) najeden nádor. Podmínky: intenzita elektrického pole uvedena ve V/cm jak je uvedeno v tabulce, aplikováno 8 pulzů délky 20 ms při frekvenci 1 Hz.

Aplikace elektrického pole s intenzitou 500 V/cm umožnila zvýšit expresi transgenu 3885 x.

Tyto pozoruhodné výsledky byly způsobeny zejména tím, že tyto nádory jsou velmi obtížně transfekovatelné samotnou DNA pokud je DNA jednoduše injikována bez elektropřenosu.

Příklad 11

Elektropřenos nukleové kyseliny do lidského plicního nádoru H1299, účinek na sekreci lidské secemoyatelné alkalické fosfatázy do plazmy

V tomto příkladu byla použita DNA plazmidu pXL3010 (obr. 6), který obsahuje gen kódující lidskou secemovanou alkalickou fosfatázu.

Plazmid pXL30l0 je vektor odvozený z ColEl, do kterého byl vložen gen kódující secemovanou alkalickou fosfatázu z pSEAP-basic (Clontech, Genbank: CVU09660) pod kontrolu promotoru CMV získaného z plazmidu pCDNA3, (Invitrogen, Holandsko) ápolyadenylační signál pozdního úseku viru SV40 (GenBank SV4CG). *

- 16CZ 299638 B6

Experiment byl proveden na „nahých“ myších s hmotností 18 až 20 g. Myším byly implantovány jednostranně štěpy nádorů H1299 o objemu 20 mm³. Nádory se vyvíjely a dosáhly velikosti 200 až 300 mm³. Myši pak byly rozděleny podle velikosti nádorů do homogenních skupin.

Nádory byly transfekovány za podmínek aplikace jako v příkladu 6, až na to, že bylo užito jediné napětí, a sice 500 V/cm, pulzy délky 20 ms a frekvence 1 Hz.

Měření koncentrace sérové alkalické fosfatázy v krevním séru bylo prováděno pomocí komerčně dostupného testu Phosphalight (Tropix, Bedford, Massachusetts, USA) a sice 1, 2 a 8 dnů (Dl,

D2, D8) po transfekci buďto pomocí elektropřenosu nebo bez. Výsledky jsou uvedeny v tab. 6.

Tabulka 6

	. plazmatická hladina alkalické' fosfatázy
čas vyhodnocení	0 'V/čin ' {průměr ± SEM)	500 V/cm {průměr ± SEM)
DX	1,42 ± 0,07	_:8,90 ± 1,74
D2	1,40.+ 0,01	·, 9,04 ± 1,55
D8	1,31 ± 0/01	1,67 + 0,12

Tabulka 6: Účinek elektrických pulzů na sekreci exogenního proteinu: sekrece lidské alkalické fosfatázy po injekci plazmidu pXL3010 do lidského plicního karcinomu HÍ299, uvedeny jsou průměrné hodnoty alkalické fosfatázy (ng/1) se střední chybou průměru (SEM). Podmínky: inten20 žita elektrického pole ve V/cm dle tabulky, 8 pulzů délky 20 ms, frekvence 1 Hz.

Všechny výsledky uvedené v příkladech 6 až 11 ukazují, že elektropřenos nukleových kyselin v podmínkách podle vynálezu umožňuje výrazně zvýšit hladinu exprese transgenu v různých typech nádorů. Kromě toho, v případě transgenu kódujícího secemovaný protein, aplikace plaz25 miduHdo nádoru pomocí~ělěktropřenosu umožnila výrazné zvyšiFkoncentrát i secerno vanéhď proteinu.

Příklad 12

Vliv prodloužení doby elektrického pulzu

Tento příklad ilustruje skutečnost, že je možné prodloužit trvání jednotky pulzu ještě nad hodnoty, které byly zkoušeny v příkladu 4.

Pokus byl proveden s myšmi C57B1/6, použit byl plazmid pXL2774, množství podané DNA bylo 15 pg. Byl užit generátor elektrických pulzů, poskytující délku pulzu větší než 20 ms (Centronics, model T 820, Centronics, San Diego, CA). Byl užit proměnlivý počet pulzů a doba pulzu, ale při konstantní intenzitě pole 200 V/cm, ostatní podmínky byly shodné jako v příkladu 1. Výsledky jsou uvedeny v tab, 7.

I . 17 .

Tabulka 7

Trvání pulzu (ms)	0	1	5	10	20	30	40	50	60	80
Experiment A S pulsů.	11 ±5	39 ±6	211 ±26	288 ±46	1158 ±238	1487 ±421	2386 ±278
Experiment S 4 pulsy	11 + 5	26, 8. ±6	123 ±17	246 ±32	575 ±88	704 ' ±130		3440 ±1077
Experiment C 4 pulsy	15 ±8		1				2885 ±64 4		2626 ±4 41	1258 ±309

Tabulka 7: Průměrná hodnota aktivity luciferázy v milionech relativních jednotek (RLU) na sval ± střední chyba průměru (SEM), v každé skupině N=10. Podmínky elektropřenosu: intenzita pole 200 V/cm, 8 nebo 4 pulzy (proměnlivé trvání jednotky), frekvence 1 Hz,

Byla pozorována zvýšená exprese transgenu při prodloužení trvání jednotky pulzu (na alespoň ío 40 ms při aplikaci série 8 pulzů nebo na alespoň 50 ms při aplikaci série 4 pulzů při intenzitě pole

200 V/cm). Tento příklad ukazuje, že optimální doba trvání pulzu závisí na počtu aplikovaných pulzů a že trvání jednotky pulzu může dosáhnout až 80 ms, přičemž tato hodnota není limitující.

Příklad 13

Účinnost elektropřenosu v závislosti na počtu elektrických pulzů

Tento příklad demonstruje vliv rostoucího počtu pulzů na účinnost elektropřenosu nukleových kyselin.

VpokušiTby lý^oužilymyšTCS 7B176, použitbylplažmi“dpXL277'4, množštvípocláňe’DNA^- bylo 15 pg. Proměnlivý byl počet pulzů, doba pulzu byla 20 ms, intenzita pole 200 V/cm. Ostatní podmínky pokusu byly stejné jako v příkladu 1.

'

Výsledky jsou uvedeny v tab. 8.

Tabulka 8

Počet pulzů	0	1	2 _;	^:4	6 ,	8	'12	16
celkem RLU	70 ± 56	147 ±,26.	281 ± 46' .	439 :± 5Ό	673 ± 129	815 ± 73 '	929 .± 169	890 ± 137

Tabulka 8: Průměrná hodnota exprese luciferázy v milionech relativních jednotek (RLU) na sval ± střední chyba průměru (SEM), v každé skupině N=l0. Podmínky elektropřenosu: intenzita pole

200 V/cm, proměnlivý počet pulzů délky 20 ms, frekvence 1 Hz.

Bylo pozorováno, že exprese luciferázy se podstatně zvyšovala počínaje aplikací jediného pulzu a pak se dále zvyšovala se zvyšujícím se počtem pulzů. Ukázalo se tedy, že variací počtu pulzů se může modulovat účinnost přenosu nukleové kyseliny a tím regulovat hladina exprese transgenu.

. i a _

Bylo také potvrzeno snížení variability odpovědi demonstrované snížením hodnoty střední chyby průměru relativně k hodnotě průměru pro všechny skupiny, u kterých byl aplikován elektropřenos.

Příklad 14

Účinek zvyšování frekvence elektrických pulzů io Tento příklad ukazuje, že rostoucí frekvence pulzů překvapivě umožňuje zvýšit účinnost transfekce. Navíc, z hlediska klinického použití, pulzy s vyšší frekvencí zvyšují komfort pacienta tím, že se snižuje celkový čas aplikace.

V tomto pokusu byly použity myši C 57B1/6. Použitý plazmid byl pXL2774, množství podané

DNA bylo 15 pg. Frekvence se v pokusu měnila (od 0,1 do 4 Hz). Doba pulzu byla 20 ms, intenzita pole 200 V/cm. Ostatní experimentální podmínky byly stejné jako v příkladu 1. Výsledky tohoto pokusu jsou uvedeny v tab. 9.

Tabulka 9

Frekvence (Hertz)	0	0,1	0,2	0,5	1.	2	3'	4
ExperimentA 8 pulsů	5 ±2	±1.3	95 ±16	405 ±60	996 + 156	1528 + 257·
Experiment B 4 pulsy		114 ±14	163 +24	175 ±26	337 ±53	587 + 90
Experiment C 8 pulsů	21 .±14				1294 + 189.	2141 ±38,7	3634 + 868	2819 ±493
Experiment ,D •4 pulsy					1451 ±228	1572 + 320	1222 :±126	2474 ±646

Tabulka 9: Průměrná hodnota aktivity luciferázy v milionech relativních jednotek (RLU) na svat 25 ± střední chyba průměru (SEM), N= 10 v každé skupině. Podmínky elektropřenosu: intenzita pole

200 V/cm, 8 nebo 4 pulzy, délka pulzu 20 ms, proměnlivá frekvence.

Výsledky získané v pokusu „A“ ukázaly, že vyšší frekvence (větší nebo rovna 1 Hz) jsou účinnější než nízké frekvence, které odpovídají delší době mezi následujícími pulzy (10 s při 0,1 Hz).

Transfekční účinnost se zvyšovala s frekvenci v testovaném rozmezí od 0,1 do 4 Hz při 4 pulzech a od 0,1 do 3 Hz při aplikaci 8 pulzů.

Příklad 15 ³⁵

Vliv aplikace elektrického pole exponenciálně se zmenšujícího v závislosti na čase

Tento příklad ukazuje účinek aplikace exponenciálně se snižujícího elektrického pole na účinnost přenosu nukleových kyselin.

V tomto pokusu byly užity myši C57B1/6.

V pokuse byl užit plazmid pXL303l (obr. 12), což je vektor odvozený z plazmidu pXL2774, do kterého byl vložen gen luc+ kódující modifikovanou (cytoplazmatickou) luciferázu z Photinus pyralis získanou z pGL3basic (GenBank: CVU47295) pod kontrolu promotoru získaného z čas-19CZ 299638 B6 ného úseku cytomegaloviru (hCMV IE, GenBank HS51EE) s polyadeny lační signálem z pozdního úseku viru SV40 (GenBank SV4CG). Bylo podáno 10 pg DNA.

Byl použit zdroj elektrických pulzů, který umožňoval aplikovat pulzy elektrického pole s inten5 žitou měnící se podle exponenciálně klesající funkce v závislosti na čase (Equibio elektropulzátor, model Easyject Plus, Kent, UK). Uvedená velikost aplikovaného napětí odpovídá hodnotě napětí v maximu exponenciály. Druhým nastavitelným parametrem byla kapacitance (v pF), která umožňovala kontrolovat celkové množství dodané energie exponenciální časovou konstantu, ío Výsledky jsou uvedeny v tab, 10,

Tabutka 10

	Kapacit l'50pF	Kapacit. 300μΡ	Kapacit 450pF	.'Kapacit 600pF	Kapacit. 1200μΓ	Kapacit 2400μΕ	Kapacit 3Ó00UF
40 V/cm						1,23 .	11
100 V/cm				16,5	2,8	6,5	23,9
150 V/cm				1,8	3,5	6/1 ..
200 v/cm		5,1 '		15, 8	18, 8	121,5	189, 7
300 V/cm	32., 1;	90, 5	4 8,7	760, 4	56,2
400 V/cm;		795
600 V/cm	62
800 V/cm	3,1	1,1-

Tabulka 10: Faktor zvýšení exprese (aktivity luciferázy)po aplikaci exponenciálně se snižujících pulzů. Faktor zvýšení je vypočten vzhledem ke kontrole, která byla získána injekcí plazmidu pXL3O3l bez elektropřenosu (uvedeny jsou průměrné hodnoty faktoru zvýšení, v každém testu by loN = 4 až N = 6,

Pro srovnání uvádíme, že'faktor zvýšení exprese pro přenos pXL3031 při aplikaci obdélníkových pulzů (intenzita pole 200 V/cm, 8 pulzů délky 20 ms, s frekvencí 1 Hz) byl v témže pokusu 44.

Tyto výsledky ukazují, zeje možné užít obdélníkové elektrické pulzy exponenciálně se snižujícího elektrického pole. Kromě toho v takovém případě bylo dosaženo podstatného zvýšení exprese při nízké intenzitě pole s vyšší kapacitancí (např. 200 V/cm a kapacitance 3000 pF) nebo při⁷vysoké intenzitě pole s nižší kapacitancí (např. 400 V/cm a kapacitance 300 pF).

Příklad 16

Účinek kombinace krátkého pulzu vysokého napětí a několika dlouhých pulzů nízkého napětí

Tento příklad ukazuje, že aplikované elektrické pole může být kombinací alespoň jednoho pulzu silného pole 500 až 800 V/cm s krátkou dobou trvání, např. 50 nebo 100 ps, a alespoň jednoho pulzu slabého pole (méně než 100 V/cm) s delší dobou trvání, např. delší než 1 ms až do 90 ms, jak bylo užito v tomto experimentu.

Slabé elektrické pole v tomto experimentu mělo intenzitu 80 V/cm a bylo aplikováno ve 4 pulzech a dobou jednoho pulzu 90 ms a s frekvenci 1 Hz. Byla použita dvě komerční elektropulzní zařízení. Elektrické pulzy byly nejdříve aplikovány jedním a pak druhým zařízením, změna se uskutečnila v době kratší než 1 vteřina pomocí ruční kontroly.

-7ΩCZ 299638 Bó

Plazmid použitý v tomto pokusu byl pXL3031. Podané množství DNA bylo 3 pg. Byly použity hodnoty intenzity elektrického pole, jak jsou uvedeny v tab. 5, ostatní experimentální podmínky byly shodné s příkladem 1.

Tabulka 11

Vlastnosti elektrického póle .	Pokus 1 (3 pg pXL3031)	Pokus 2 (3 pg pXL303l)
Kontroly (b.ez elektrického pole}	320 ± 126 '	75 ± 27
AI. 500 V/cm , 1 x 0.1 ms	-	169 ± 63
A3 : 800 V/cm ,.1 x 0.1 ms	416 ± 143	272 ± ' 84: '
B 80 V/cm , 4 x 90 ms, .1 Hz.	1282, +' 203	362,21 ± 85,17
Podmínky: AI,· pak B	-	1479. + 276
Podmínky:, A3, pak B	3991 ± 418.	1426 ± 209
Podmínky': B, pák A3		347 ± 66.

ío Tabulka 11: Střední hodnoty luciferázové aktivity ± střední chyba průměru (SEM) v milionech RLU na sval, V každé skupině N - 10.

Tabulka 11, shrnující výsledky získané ve dvou sériích experimentů, ukazuje, že aplikace krátkého vysokonapěťového pulzu, nebo 4 dlouhých nízkonapěťových po sobě následujících pulzů, jen málo zvyšuje transfekční účinnost ve srovnání s kontrolní skupinou, která dostala injekci plazmidu pXL3031 ale nebyla vystavena působení elektrického pole. Totéž platí, když se aplikují slabé pulzy před pulzem vysokého napětí.

Na druhou stranu, v obou sériích pokusů kombinace krátkého vysokonapěťového pulzu následo20 váného čtyřmi po sobě jdoucími pulzy nízkého napětí zřetelně vedla ke zvýšení účinnosti transfekčě‘DNA‘‘

Jak bylo ukázáno v příkladu 1 a 2, aplikace 8 pulzů při intenzitě 600, 800 nebo 1200 V/cm po dobu 1 ms s frekvenci 1 Hz způsobovala svalové léze a inhibovala transfekci. Výsledky získané v příkladu 16 ukázaly, že za popsaných podmínek je možné použít vysokonapěťové pole, aniž by způsobilo léze. A skutečně podle makroskopické vyšetření svaly nebyly nikdy viditelně poškozeny. Užití vysokonapěťové pole s krátkou dobou trvání v kombinaci se slabým polem delšího trvání poskytuje další prostředek pro modulaci účinnosti přenosu DNA, ³⁰

Příklad 17

Vliv okamžiku, kdy je injikován plazmid, vzhledem k aplikaci elektrického pole

Tento příklad ilustruje skutečnost, že nukleové kyseliny mohou být podávány přinejmenším 30 minut, a dokonce přinejmenším 1 hodinu před aplikací elektrického pole.

V pokusu byly užity myši C57B1/6. Použitý plazmid byl pXL2774 a množství podané DNA bylo 15 pg nebo 1,5 pg. Podání DNA předcházela nebo následovala aplikace elektrického pole: inten40 žita 200 V/cm, 8 pulzů délky 20 ms, frekvence 1 Hz. Ostatní experimentální podmínky byly stejné jako v příkladu 1. Kontrolní myši obdržely injekci plazmidu, ale nebyly vystaveny elektrickým pulzům. Získané výsledky jsou uvedeny v tab. 12.

-21 CZ 299638 Bó

Tabulka 12 A: Injekce DNA bez aplikace elektrického pole

	Exp 1 PXL2774 ' (15 pg)	Exp 2 pXL2774- , (15 pg)	Exp 3 pXL27?4 (1,5 pg) .	Exp 4 PXL2774 (15 pg)	Exp 5 pXL2774 (1,5 pg)
kontrola	7 + 4 j	3+6-	0.4 ±0.2 \|	L, 22±15	1 + 1.

Tabulka 12 B: Injekce DNA před aplikací elektrického pole

čas	Exp 1	Exp. 2	Exp 3	Exp 4	Exp 5
-120 minut				20+5	2+1
-60 minut				106+22	10 +3
--30 minut	303 + 36	237 ± 61'	7 ± 3	184 ± 22	15 ± 4
-5 minut	410 ± 7
-60 s	253 ±51
-20 Ξ	492 + 122	.201 + 43	9+3	123 ± 23	12 ± 2

Tabulka 12 C: Injekce DNA po aplikaci elektrického pole

čas .	Exp 1.	Exp 2	\| Exp 3	Exp 4	Exp 5
+ 10 s				7 + 7
+20 s	11 + 6	Oj 4 ± Oji.
+ 60 s	8 + 7 ' ,			17 ± 15

Tabulka 12: Průměrné hodnoty ± SEM luciferázové aktivity v milionech RLU na sval. V každé skupině N = 10 svalů.

Přítomnost DNA v okamžiku aplikace elektrického poleje podmínkou účinné elektrotmasfekce,

Překvapivě bylo pozorováno, že injekce plazmidové DNA může být aplikována nejméně 30 minut a d'okončéaž jednu hodinu (pokusy 4 a 5) před aplikací elektrického pole, aniž by to výrazně ovlivnilo hladinu exprese. Podobné výsledky byly získány s dávkami 15 pg ptazmidu na sval a také s 10 x nižšími dávkami 1,5 pg.

Tyto výsledky umožňují představit si aplikaci několika injekcí stejného plazmidu, nebo různých plazmidů, do svalu v různých okamžicích před aplikací elektrického pole. Je také možné aplikovat několik injekcí do rozsáhlé oblasti svalu a pak aplikovat sérii elektrických pulzů na celou injikovanou oblast.

Příklad 18

Přenos genu kódujícího erytropoetin (EPO)

Dospělým myším Č57B1/6 byl injikován oboustranně do horního holenního svalu plazmíd pXL3348 obsahující gen kódující erytropoetin. Plazmid pXL3348 je vektor odvozený z plazmidu pXL2774, do kterého byl vložen myší genu pro erytropoetin (NCBI: 193086) pod kontrolu promotoru časného úseku lidského cytomegaloviru (hCMV-IE) a polyadenylačního signálu pozdní_ 72 .

ho úseku viru SV40 (Genbank SV4CG). Bylo aplikováno elektrické pole následujících vlastností: intenzita 200 V/cm, 8 pulzů délky 20 ms, frekvence 1 Hz. Elektrické pole bylo aplikováno bezprostředně po injekci plazmídu.

Tabulka 13

	. sérová hladina erytropoetinu (mlU/ml)	sérová hladina erytropoetinu {mlU/ml) 24. den (Ď24)
7, der	i CD7) '
plazmid	elektropřenos	elektropřenos_ +	elektropřenos	elektropřenos +
pXL3348 (i gg)	0	: 3.0+1.6	0	1.12 + 0.8
pXL3348 (10 pg)	0,9 ± 0,9	61.8 ± 15.,8	o.	74.1 ± 28.9
pUC19 ’ (i pg)		0		0

	hematokrit % odběr vzorků 7. den (D7)	hematokrit % odběr vzorků 24, den (D24)
plazmid	elektropřenos	elektropřenos Ť	elektropřenos	elektropřenos Γ
pXL334S íl pg)	38.5 + 0.5	.35.0 ± 3.6 .	50.S ± 2;3	81 ± 0.5
pXL3348 (10 pg)	32.0 + 3,2	26.0 ± 4.1	69.0 ± 5.1	33.0 ± 1.0
' pUC19		30-8.. ±2.3		_4.3...2_±_Ú..-9-
(i gg)

Tabulka 13; Průměrné hodnoty ± SEM, N=4 až 5 ve skupině.

Bylo pozorováno významné zvýšení obsahu erytropoetinu v krvi 7. a 24. den (D7 a D24) po podání 10 mg pXL3348 elektropřenosem. Kromě toho, fyziologický účinek-zvýšení erytropoeti15 nu, který vedl ke zvýšení hematokritu, byl velmi vysoký (85 %), a počínaje 7. dnem byl takový dokonce i pro velmi malá množství plazmídu (1 pg).

Příklad 19 ²⁰

Účinek elektropřenosu na expresi vakcinačních transgenu

Tento příklad ukazuje, že způsob podle předkládaného vynálezu je využitelný pro přenos genů kódujících požadované vakcinačni peptidy.

Experiment byl proveden na 9 týdnů starých samicích myší Balb/c. Použité elektrody byly ploché elektrody z nerezavějící oceli vzdálené od sebe 5 mm. VR-HA je plazmidová DNA obsahující gen pro hemaglutinin z chřipkového viru (kmen A/PR/8/34). VR-gB je plazmidová DNA obsahující gen pro glykoprotein B (gB) lidského cytomegaloviru (kmen Towne).

-23CZ 299638 B6

Roztok plazmidu (50 μΐ roztoku 20 gg/ml nebo 200 pg/ml v 0,9% NaCI) byl injikován podélně skrz kůží do horního lýtkového svalu levé končetiny. Elektrické pulzy byly aplikovány kolmo na osu svalu pomocí generátoru obdélníkových pulzů 20 sekund po injekci (intenzita elektrického pole 200 V/cm, 8 po sobě jdoucích pulzů dílky 20 ins, frekvence 1 Hz).

Pro hodnocení stimulace imunitní odpovědi byl použit následující imunizační protokol:

DO byl odebrán vzorek pre-imunního séra Dl první injekce, s elektropřenosem nebo bez ]

D2 odebrán vzorek imunního séra io D2 zesilující injekce, s elektropřenosem nebo bez D42 odebrán vzorek imunního séra D63 odebrán vzorek imunního séra

Vzorky krevního séra byly odebírány z retroorbitálního sinusu. Množství specifických protilátek bylo stanoveno pomocí EL1SA testu. Každé experimentální podmínky byly testovány na 10 zvířatech injikovaných jednostranně.

Výsledky uvádějící titry protilátek proti chřipkovému hemaglutininu jsou uvedeny v tab. 14 A.

Tabulka 14A

	elektro přenos	,D0	D21	D42	D63
VR-HA . .d μ?.).	—	<50	132 + 739	1201 + 4380	1314 + 2481
VR-HA (i μς)	+	<50	1121 ± 1237	10441 ± 7819	8121 ± 5619
íp)'			(0.0135)	(0.0022)	. (0.0033)
VR-HA (10 pg)		<50	731' + 6 6.6	5.113 ± 1.6015	4673 + 8238
VR-HA (10μσ)	+	<50	4153+ 2344	74761 + 89228	41765 + 52361
íp}			(010002).	(0.000.5). '	(0.0007). .. .

Tabulka 14A: Titr protilátek proti chřipkovému hemaglutininu po injekci 1 nebo 10 pg DNA (VR-HA), buďto bez (-) a nebo s (+) aplikací elektrického pole. Tyto výsledky představují geometrický průměr ze skupin po 10 zvířatech (N=8 pro skupinu injikovanou 1 pg, exponovanou elektrickému poli a testovanou v D63) ± směrodatná odchylka. Hodnota p byla získána srovnáním vždy dvou skupin injikovaných DNA buďto s aplikaci elektrického pole, nebo bez něho pomocí statistického neparametrického Mann-Whitneyova testu.

Tyto výsledky ukazují, že titr protilátek proti chřipkovému hemaglutininu výrazně vzrostl, a to asi 10 x, ve skupině, kde byly aplikovány elektrické pulzy. Takže myši, které obdržely 1 pg DNA při současné aplikaci elektrických pulzů měly mírně vyšší průměrný titr protilátek proti hema35 glutininu než myši, které obdržely 10 pg DNA, ale nebyly podrobeny působení elektrického pole.

Výsledky ukazující protilátkovou reakci namířenou proti CMV glykoproteinu B jsou uvedeny v tab. 14 B.

-24CZ 299638 B6

Tabulka 14B

	elektro přenos	DO	D21	D42	. D63
VE.-flB (ΙΟμς)	-	<50	73 ‘± 138'	755 ± 1766	809 ± 1363
VR-gB Ιΐΰμς}	+	<50	200 ± 119	3057 ± 1747	•2112 ± 1330.
(ΡΪ			(0,0558)	(0.0108)	(0.0479)

Tabulka 14B: Titr protilátek proti CMV glykoproteinu B po injekci 10 pg DNA (VR-gB) buďto bez (-) a nebo s (+) aplikací elektrických pulzů. Tyto výsledky představují geometrický průměr ze skupin po 10 zvířatech (N=9 pro skupiny exponované elektrickému poli) ± směrodatná odchylka. Hodnota p byla získána srovnáním vždy dvou skupin ínjikovaných DNA buďto s aplikací elektrického pole nebo bez, pomocí statistického neparametrického Mann-Whitneyova io testu.

Tyto výsledky ukazují, že titr anti-gB protilátek vzrostí 4 x do 42. dne (D42) ve skupině podrobené působení elektrických pulzů. Bylo také pozorováno, že koeficient rozptylu byl 3x menší u skupiny myší po aplikaci elektrických pulzů.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

20 .

1. Použití nukleové kyseliny pro výrobu léčiva pro genovou terapii k vnesení do nádorů in vivo tak, že buňky nebo tkáně jsou přivedeny do kontaktu s nukleovou kyselinou, která má být do nich vnesena, přímým podáním do tkáně nebo topickým či systémovým podáním, a že se na buňky

25 nebo tkáně působí jedním nebo několika.elektrickými-pulzy-S4ntenzitou-l-až-6QQ-V-/cnfc
2. Použití podle nároku 1, kdy buňky mají zvláštní uspořádání; jsou to velké buňky a/nebo mají podlouhlý tvar a/nebo přirozeně reagují na elektrický akční potenciál a/nebo mají specifickou morfologii.
3. Použití podle nároku I, kdy intenzita elektrického pole je 200 až 600 V/cm.

'
4. Použití podle nároku I, kdy intenzita elektrického pole je 500 V/cm.

35 5. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, kdy celková doba aplikace elektrického poleje delší než 10 ms.

6. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, kdy aplikace elektrického pole na tkáň obsahuje jeden nebo několik pulzů s pravidelnou frekvencí.

7. Použití podle nároku 6, kdy aplikace elektrického pole na tkáň obsahuje 1 až 100 000 pulzů s frekvencí 0,1 až 1000 Hz.

8. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, kdy elektrické pulzy jsou aplikovány vzájemně 45 nepravidelným způsobem, a funkce popisující závislost intenzity elektrického pole na čase pro jeden pulz je proměnlivá.

9. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8, kdy integrál funkce popisující proměnlivost elektrického pole v čase má hodnotu větší než 1 kV x ms/cm.

-25CZ 299638 B6

10. Použití podle nároku 9, kdy integrál je větší než 5 kV x ms/cm.

11. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10, kdy elektrické pulzy jsou vybrány ze skupiny J obsahující pulzy typu obdélníkových kmitů, exponenciálně tlumených kmitů, oscilujících unipo- i
5 lamích kmitů omezeného trvání, oscilujících bipolámích kmitů omezeného trvání a dalších forem j kmitů. I

12. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 11, kdy i elektrické pulzy obsahují pulzy obdélníkových kmitů.

13. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12, kdy elektrické pulzy se aplikují elektrodami, které jsou umístěny z obou stran tkáně, na kterou se působí, nebo jsou umístěny v kontaktu s kůží.

15 14. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12, kdy elektrické pulzy se aplikují elektrodami, které jsou vloženy do vnitřku tkáně, na kterou se působí.

15. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 14, kdy nukleová kyselina se i nj i kuje do tkáně.

20 16. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 14, kdy nukleová kyselina se injikuje systémovým způsobem.

, 17. Použití podle nároku 16, kdy nukleová kyselina se injikuje intraarteriálním nebo intravenózním způsobem.

18. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 14, kdy nukleová kyselina se podává způsobem topickým, kutánním, perorálním, vaginálním, intranasálním, subkutánním nebo intraokulámím.

19. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 18, kdy nukleová kyselina je obsažena v přípravku,

30 který navíc obsahuje farmaceuticky přijatelné excipienty-pro.různé-způsoby-podávání.^-20. Použití podle nároku 19, kdy přípravek je vhodný pro parenterální podávání.

21. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 20, kdy nukleová kyselina je deoxyribonukleová

35 kyselina.

22. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 20, kdy nukleová kyselina je ribonukleová kyselina.

40 23. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 22, kdy nukleová kyselina je syntetického nebo biosyntetického původu, neboje izolována z viru, z jednobuněčného nebo vícebuněčného eukaryotického organismu nebo prokaryotického organismu.

24. Použití podle nároků 23, kdy podávaná nukleová kyselina je spojena s některými nebo všemi

45 složkami organismu, ze kterého pochází, a/nebo systému, který byl užít pro její syntézu,

25. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 24, kdy nukleová kyselina kóduje požadovanou RNA nebo požadovaný protein.

50 26. Použití podle nároku 25, kdy RNA je katalytická RNA nebo antisenze RNA.

27. Použití podle nároku 25, kdy nukleová kyselina kóduje protein vybraný ze skupiny obsahující enzymy, krevní deriváty, hormony, lymfokiny, růstové faktory, trofícké faktory, angiogenní faktory, neurotrofické faktory, růstové faktory kostí, hematopoetické faktory, koagulační faktory,

-96CZ 299638 B6 antigeny a proteiny zúčastněné v metabolismu aminokyselin, lipidů a dalších esenciálních složek buňky.

28. Použití podle nároku 27, kdy nukleová kyselina kóduje angiogenní faktory VEGF a FGF, 5 neurotrofické faktory BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, FGF 1, NT3, NT5, protein GAX, inzulín k léčení diabetů, růstový hormon, cytokin, α-1-antitripsin, kalcitonin, íeptin a apolipoproteiny, enzymy biosyntézy vitaminů, hormony a neuromediátory.

29. Použití podle nároku 25, kdy nukleová kyselina kóduje protilátku, variabilní fragment jednoio řetězcové protilátky (ScFv) nebo jakýkoliv jiný protilátkový fragment, který má vhodnou rozpoznávací schopnost pro účely imunoterapie, nebo kóduje rozpustný receptor, peptid, který je agonistou nebo antagonistou receptorů nebo adhezního proteinu, nebo kóduje umělý, chimérický nebo zkrácený protein.

15 30. Použití podle nároku 29, kdy nukleová kyselina kóduje antiidiotypovou protilátku, rozpustný fragment receptorů CD4 nebo receptorů TNFa nebo acetylcholinového receptorů.

31. Použití podle kteréhokoliv z nároků 27 až 30, kdy nukleová kyselina kóduje prekurzor terapeutického proteinu.

32; Použití podlé kteréhokoliv z nároků l až 31, kdy nukleová kyselina je ve formě plazmidu.

33, Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 31, kdy nukleová kyselina obsahuje gen velkého rozsahu a/nebo introny a/nebo regulační prvky malého nebo velkého rozsahu.

34. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 31, kdy nukleová kyselina je episomální DNA nebo umělý kvasinkový chromosom nebo minichromosom.

35.. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 34, kdy nukleová kyselina obsahuje sekvence, které 30 umožňují a/nebo podporují expresi transgenu ve tkáni___{;_}_

36. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 35, kdy nukleová kyselina je spojena s jakýmkoliv typem vektoru .nebo s jakoukoliv kombinací vektorů pro zlepšení přenosu nukleové kyseliny, jako jsou viry, syntetická nebo biosyntetická činidla nebo propulzní či jiné částice (perličky).

37. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 36, kdy tkáň se podrobí ošetření, jehož cílem je zlepšit přenos genu, přičemž toto ošetření je farmakologické povahy lokální nebo systémovou cestou nebo se jedná o ošetření enzymatické, permeabilizující, chirurgické, mechanické, tepelné nebo fyzikální povahy.

38. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 36, které umožňuje to, aby tkáň produkovala činidlo ve fyziologické a/nebo terapeutické dávce, přičemž činidlo buďto zůstává v buňkách nebo je vylučováno.

45 39. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 38, které umožňuje modulovat množství exprimovaného transgenu tím, že se moduluje objem tkáně, která je transfekována.

40. Použití podle nároku 39, které umožňuje modulovat objem tkáně, která je transfekována, tím, že se užije více míst k podávání.

41. Použití podle kteréhokoliv z nároků I až 40, které umožňuje modulovat množství exprimovaného transgenu tím, že se moduluje počet, tvar, povrch a uspořádání elektrod, a tím, že se mění intenzita pole, počet, trvání, frekvence a tvar pulzů, a také tím, že se mění množství a objem podávané nukleové kyseliny.

-77.

42. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 41, které umožňuje kontrolovat lokalizaci transfekované tkáně prostřednictvím objemu tkáně vystavené lokálním elektrickým pulzům,

43. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 42, které umožňuje návrat do počátečního stavu 5 tím, že se odstraní oblast transfekované tkáně.

44. Kombinovaný produkt nukleové kyseliny a elektrického pole s intenzitou 1 až 600 V/cm pro použití při genové terapii pro podání nukleové kyseliny do nádoru založené na in vivo elektrotransfekci, přičemž nukleová kyselina a elektrické pole se aplikují in vivo do nádoru nebo na ío nádor samostatně nebo časově odděleně .

45. Kombinovaný produkt podle nároku 44, vyznačující se tím, že intenzita elektrického poleje 200 až 600 V/cm.

15 46. Kombinovaný produkt podle nároku 44, v y z n a č u j í c í se tí m , že intenzita elektrického poleje 500 V/cm.

47. Kombinovaný produkt podle kteréhokoliv z nároků 44 až46, vy značn j íc í se tím, že celková doba aplikace elektrického poleje delší než 10 ms,

48. Kombinovaný produkt podle kteréhokoliv z nároků 44 až 47, v y z n a Č u j í c í se tím, že aplikace elektrického pole na tkáň obsahuje jeden nebo několik pulzů s pravidelnou frekvencí.

A

49. Kombinovaný produkt podle nároku48, v y z n a č u j í c í se t í m , že aplikace elektric25 kého pole na tkáň obsahuje 1 až 100 000 pulzů s frekvencí 0,1 až 1000 Hz.

50. Kombinovaný produkt podle kteréhokoliv z nároků 44až47,vyznačující se tím, že elektrické pulzy jsou aplikovány navzájem nepravidelným způsobem, a že funkce popisující závislost intenzity elektrického pole na čase projeden pulzje proměnlivá.

51. Kombinovaný produkt podle kteréhokoliv z nároků 44 až50, vy zn aču j ící se tím, že integrál funkce popisující proměnlivost elektrického pole v čase má hodnotu větší· než 1 kV x ms/cm.

35 52. Kombinovaný produkt podle nároku 51, vyznač uj ící se tí m , že integrál je větší než 5 kV x ms/cm.

53. Kombinovaný produkt podle kteréhokoliv z nároků 44 až 52, v y z n a č u j í c í s e tím, že elektrické pulzy jsou vybrány ze skupiny obsahující pulzy typu obdélníkových kmitů, expo40 nenciálně tlumených kmitů, oscilujících unipolámích kmitů omezeného trvání, oscilujících bipolárních kmitů omezeného trvání a dalších tvarů kmitů.

54. Kombinovaný produkt podle kteréhokoliv z nároků 44 až 53, v y z n a č u j í c í se tím, že elektrické pulzy obsahují pulzy obdélníkových kmitů.

55. Kombinovaný produkt podle kteréhokoliv z nároků 44 až 54, vy značu j í cí se tím, že elektrické pulzy se aplikují externě.

56. Kombinovaný produkt podle kteréhokoliv z nároků 44 až 54, vy zn ačuj ící se tím, 50 že elektrické pulzy se aplikují uvnitř tkáně.

57. Kombinovaný produkt podle kteréhokoliv z nároků 44 až 56, v y z n a č u j í c í se tím, že nukleová kyselina se injikuje do tkáně.

-28CZ 299638 B6

58. Kombinovaný produkt podle kteréhokoliv z nároků 44 až 56, v y z n a č u j í c í se tím, ;

že nukleová kyselina se injikuje systémovým způsobem. J

59. Kombinovaný produkt podle nároku 5 8, vyznač uj íc í se tí m, že nukleová kyselina 1

5 se injikuje intraarteriálním nebo intravenózním způsobem, 1

60. Kombinovaný produkt podle kteréhokoliv z nároků 44 až 56, v y z n a č u j í c í se tím, 3 že nukleová kyselina se podává způsobem topickým, kutánním, perorálním, vaginálním, intranasálním, subkutánním nebo intraokulámím.

61. Kombinovaný produkt podle kteréhokoliv z nároků 44 až60, vyznač u j í cí se tím, že nukleová kyselina je obsažena v přípravku, který navíc obsahuje farmaceuticky přijatelné excipienty pro různé způsoby podávání.

15 62. Kombinovaný produkt podle nároku 61,vyznačující se tím, že přípravek je vhodný pro parenteráíní podávání.

63. Kombinovaný produkt podle kteréhokoliv z nároků 44 až62, vy značu j í cí se tím, že nukleová kyselina je deoxyribonukleová kyselina.

64. Kombinovaný produkt podle kteréhokoliv z nároků 44 až 62, v y z n a č u j í c í se tím, že nukleová kyselina je ribonukleová kyselina.

65. Kombinovaný produkt podle kteréhokoliv z nároků 44 až 64, v y z n a č u j í c í se tím,

25 že nukleová kyselina je syntetického nebo biosyntetického původu, nebo je izolována z viru, z jednobuněčného nebo vícebuněčného eukaryotického organismu nebo z prokaryotického organismu.

66. Kombinovaný produkt podle nároku 65, v y z ή a č u j í c í se t í m , že podávaná nukleo30 vá kyselina je spojena s některými_nebo_všemi_složkamLorganism u,-ze_kterého-pochází,-a/nebosystému, který byl užit pro její syntézu.

67. Kombinovaný produkt podle kteréhokoliv z nároků 44 až 66, v y z n a č u j í c í se tím, že nukleová kyselina kóduje požadovanou RNA nebo požadovaný protein,

68. Kombinovaný produkt podle nároku 67, vyznačující se tím, že RNA je katalytická RNA nebo antisenze RNA.

69. Kombinovaný produkt podle nároku 67, vyznačující se tím, že nukleová kyselina

40 kóduje protein vybraný ze skupiny obsahující enzymy, krevní deriváty, hormony, lymfokiny, růstové faktory, trofické faktory, angiogenní faktory, neurotrofické faktory, růstové faktory kostí, hematopoetické faktory, koagulační faktory,, antigeny a proteiny účastnící se metabolismu aminokyselin, lipidů a dalších esenciálních složek buňky.

45 70. Kombinovaný produkt podle nároku 69, v y z n a č u j í c í se tí m, že nukleová kyselina kóduje angiogenní faktory VEGF a FGF, neurotrofické faktory BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF,

FGF1, NT3, NT5, protein GAX, inzulín k léčení diabetů, růstový hormon, cytokin, α-1-antitripsin, kalcitonin, leptin a apolipoproteiny, enzymy biosyntézy vitamínů, hormony a neuromediátory.

⁵⁰

71. Kombinovaný produkt podle nároku 67, v y z n a č u j í c í se t í m, že nukleová kyselina kóduje protilátku, variabilní fragment jednořetězcové protilátky (ScFv) nebo jakýkoliv protilátkový fragment, který má vhodnou rozpoznávací schopnost pro účely imunoterapíe, nebo kóduje rozpustný receptor, peptid, kteiý je agonistou nebo antagonistou receptorů nebo adhez55 ního proteinu, nebo kóduje umělý, chimérický nebo zkrácený protein.

72. Kombinovaný produkt podle nároku 71, vyznačující se tí m , že nukleová kyselina kóduje antiidiotypovou protilátku, rozpustný fragment receptoru CD4 nebo receptoru TNFa nebo acetylcholinového receptoru.

73. Kombinovaný produkt podle kteréhokoliv z nároků 69 až 72, v y z n a č u j í c í se tím, že nukleová kyselina kóduje prekurzor terapeutického proteinu.

74. Kombinovaný produkt podle kteréhokoliv z nároků 44 až 73,vyznačující se tím, ío že nukleová kyselina je ve formě plazmidu.

75. Kombinovaný produkt podle kteréhokoliv z nároků 44 až 73, v y z n a č u j í c í se tím, že nukleová kyselina obsahuje gen velkého rozsahu a/nebo introny a/nebo regulační prvky malého nebo velkého rozsahu.

¹⁵

76. Kombinovaný produkt podle kteréhokoliv z nároků 44 až 73,vyznačující se tím, že nukleová kyselina je episomální DNA nebo umělý kvasinkový chromosom nebo minichromosom,

20 77. Kombinovaný produkt podle kteréhokoliv z nároků 44až 76, vy znaČ u j ící se tím, že nukleová kyselina obsahuje sekvence, které umožňují a/nebo podporují expresi transgenu ve svalu.

78. Kombinovaný produkt podle kteréhokoliv z nároků 44 až 77, v y z n a č u j í c í setím, 25 že nukleová kyselina je spojena s jakýmkoliv typem vektoru nebo s jakoukoliv kombinací vektorů pro zlepšení přenosu nukleové kyseliny, jako jsou viry, syntetická nebo biosyntetieká činidla nebo propulzní či jiné částice (perličky).

79. Kombinovaný produkt podle kteréhokoliv z nároků 44 až 78, v y z n a č u j í c í se tím, _ 30 že sval se podrobí ošetření, jehož cílem ie zlepšit přenos, genu.-přičemžloto-ošetření-i e-farmakologické povahy lokální nebo systémovou cestou nebo se jedná o ošetření enzymatické, permeabilizující, chirurgické, mechanické, tepelné nebo fyzikální povahy.

80. Kombinovaný produkt podle kteréhokoliv z nároků 44 až 79, v y z n a č u j í c í se tím, 35 že umožňuje to, aby tkáň produkovala činidlo ve fyziologické a/nebo terapeutické dávce, přičemž činidlo buďto zůstává v buňkách tkáně neboje vylučováno.

81. Kombinovaný produkt podle kteréhokoliv z nároků 44áž 79, vy zn ač u j ící se tím, že umožňuje modulovat množství exprimovaného transgenu tím, že se moduluje objem tkáně,

40 která je transfekována.

82. Kombinovaný produkt podle nároku 81,vyznačující se tím, že umožňuje modulovat objem tkáně, která je transfekována, tím, že se užije více míst k podávání.

45 83. Kombinovaný produkt podle kteréhokoliv z nároků 44 až 82, v y z n a č u j í c í se tím, že umožňuje modulovat množství exprimovaného transgenu tím, že se moduluje počet, tvar, povrch a uspořádání elektrod, a tím, že se mění intenzita, počet, trvání, frekvence a tvar pulzů, a také tím, že se mění množství a objem, podávané nukleové kyseliny.

50 84. Kombinovaný produkt podle kteréhokoliv z nároků 44 až 83,vyznačující se tím, že umožňuje kontrolovat lokalizaci transfekované tkáně prostřednictvím objemu tkáně vystavené lokálním elektrickým pulzům.

85. Kombinovaný produkt podle kteréhokoliv z nároků 44 až 84, v y z n a č u j í c í se tím,

55 že umožňuje návrat do počátečního stavu tím, že se odstraní oblast transfekované tkáně.

-30CZ 299638 B6

86. Použití nukleové kyseliny pro výrobu léčiva pro genovou terapii, přičemž toto léčivo se vnáší do nádorů, přičemž buňky nebo tkáně jsou stimulovány elektrickým proudem s intenzitou pole 1 až 600 V/cm.

87. Použití podle nároku 86, kdy kontakt se provádí přímým podáním do buněk nebo tkání nebo topickým nebo systémovým podáním,

88. Použití podle nároku 86 nebo 87, kdy elektrické pulzy jsou unipolámí.

89. Použití podle kteréhokoliv z nároků 86 až 88, kdy intenzita elektrického pole je 4 až