CZ475499A3 - Použití nukleové kyseliny pro výrobu léčiva pro genovou terapii, které se vnáší do buněk vícebuněčných eukaryotických organismů - Google Patents

Použití nukleové kyseliny pro výrobu léčiva pro genovou terapii, které se vnáší do buněk vícebuněčných eukaryotických organismů Download PDF

Info

Publication number
CZ475499A3
CZ475499A3 CZ19994754A CZ475499A CZ475499A3 CZ 475499 A3 CZ475499 A3 CZ 475499A3 CZ 19994754 A CZ19994754 A CZ 19994754A CZ 475499 A CZ475499 A CZ 475499A CZ 475499 A3 CZ475499 A3 CZ 475499A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
nucleic acid
tissue
pulses
use according
composite product
Prior art date
Application number
CZ19994754A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ299638B6 (cs
Inventor
Michel Bureau
Lluis Mir
Daniel Scherman
Original Assignee
Rhone-Poulenc Rorer S. A.
Institut Gustave Roussy
Centre National De La Recherche Scientifique
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from FR9708232A external-priority patent/FR2765241B1/fr
Application filed by Rhone-Poulenc Rorer S. A., Institut Gustave Roussy, Centre National De La Recherche Scientifique filed Critical Rhone-Poulenc Rorer S. A.
Publication of CZ475499A3 publication Critical patent/CZ475499A3/cs
Publication of CZ299638B6 publication Critical patent/CZ299638B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
    • A61N1/00—Electrotherapy; Circuits therefor
    • A61N1/02—Details
    • A61N1/04—Electrodes
    • A61N1/0404—Electrodes for external use
    • A61N1/0408—Use-related aspects
    • A61N1/0412—Specially adapted for transcutaneous electroporation, e.g. including drug reservoirs
    • A61N1/0416—Anode and cathode
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
    • A61N1/00—Electrotherapy; Circuits therefor
    • A61N1/18—Applying electric currents by contact electrodes
    • A61N1/32—Applying electric currents by contact electrodes alternating or intermittent currents
    • A61N1/325—Applying electric currents by contact electrodes alternating or intermittent currents for iontophoresis, i.e. transfer of media in ionic state by an electromotoric force into the body
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Description

Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká mimořádného zlepšení přenosu nukleových kyselin in vivo do buněk vícebuněčných eukaryotických organismů, a také se týká nukleových kyselin sdružených s produkty, které umožňují zvýšit výtěžek takového přenosu pomocí slabého elektrického pole s intenzitou 1 až 600 V/cm, a dále se týká kombinace nukleové kyseliny a způsobu přenosu podle vynálezu pro použití v genové terapii.
Dosavadní stav techniky
Přenos genů do dané buňky je základním kamenem genové terapie. Avšak jedním z problémů je, jak vnést dostatečné množství nukleové kyseliny do buněk hostitele (příjemce), který má být léčen.. A tato nukleová kyselina, obecně požadovaný gen, pak ještě musí být exprimována v transfekovaných buňkách. Jeden z přístupů používaných k tomuto účelu spočívá v tom, že se nukleová kyselina integruje do virového vektoru, zejména retroviru, adenoviru nebo adeno-asociovaného viru. Tyto systémy využívají k proniknutí do buňky výhod mechanismů, které vyvinuly viry, a také užívají jejich ochranných mechanismů proti degradaci. Avšak tento přístup má řadu nevýhod, zejména riziko produkce infekčních virových částic schopných rozšíření v hostitelském organismu, a ještě navíc v případě retrovirových vektorů
4 4 4 · 4 * · · · • 44 · 4 4 · 4 · · · • 4 9 4 4 9 4 4 44 4
4444944 4 4 · 4 ·· ·
4 44 4 ·' 4 4 4
4 44 494 44 99 riziko inzerční mutageneze. Kromě toho inzerční kapacita virových genomů pro terapeutické nebo vakcinační geny je značně omezena.
V každém případě vývoj virových vektorů vhodných pro použití v genové terapii vyžaduje velmi složité metody pro přípravu defektních virů a komplementačních buněčných linií.
* Jiný přístup (Wolf et al., Science 247, 1465-68, 1990;
Davis et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93, 7213-18, 1996) z spočívá v tom, ze se podávají nukleové kyseliny plazmidového typu do svalu nebo krevního oběhu, ať již nenavázaných nebo navázaných na sloučeniny určené k tomu, aby usnadnily transfekci, jako jsou např. proteiny, liposomy, nabité lipidy nebo kationtové polymery jako je polyetylénimin, který je
dobrým transfekčním činidlem in ví tro (Behr et al., Proč.
Nati. Acad. Sci. USA 86, 6982-6, 1989; Felgner et al. , Proč.
Nati. Acad. Sci. USA 84, 7413-7, 1987 ; Boussif et al., Proč.
Nati. Acad. Sci. USA 92, 7297-301, 1995)
Pokud jde o svaly, od doby původní publikace Wolf fa et al. ukazující schopnost svalové tkáně inkorporovat DNA injikovanou ve formě volného plazmidu (Wolf et al. , Science 247, 1465-1468, 1990), se mnozí autoři snažili zlepšit tento proces (Manthorpe et al., 1993, Human Gene Ther. 4, 419-431;
Wolff et al., 1991, BioTechniques 11, 474-485). Na základě těchto pokusů se objevily jisté trendy, jako např.:
• použití mechanických prostředků k nucenému vstupu DNA do buněk tak, že se DNA adsorbuje na částice (perličky) a ty se pak vstřelí do tkáně (gene gun) (Sanders Williams et al. , 1991, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88, 2726-2730; Fynan et al. , 1993, BioTechniques 11, 474-485). Tento způsob se ukázal účinným v očkovacích strategiích, ale zasahuje pouze povrchové vrstvy tkání. V případě svalu by jejich použití nutně znamenalo, chirurgický zákrok, aby se neboť částice neprocházejí • · · · · • · * · · · • · · · · · • ······· « • · · · ·
It · ·* · zajistil přístup ke svalu, tkáněmi kůže, injekce DNA, již ne však ve formě volného plazmidu, ale ve spojení s molekulou schopnou sloužit jako nosič usnadňující vstup komplexu do buněk. Kationtové lipidy, používané v mnohých jiných způsobech transfekce, se ukázaly být, zklamáním, neboť ty, které byly dosud testované, dokonce inhibovaly,transfekci (Schwartz et al., 1996, Gene Ther., 405-411). Totéž platí pro kationtové peptidy a polymery (Manthorpe et al., 1993, Human Gene Jediným případem vhodné kombinace se póly(vinylalkoholu) . nebo polyvinylVýsledný faktor zlepšení přenosu DNA je však nižší- než 10 při srovnání
Ther. 4, 419-431).
zdála být směs pyrolidonu s DNA. u těchto kombinací s injekcí nahé DNA (Mumper et al. Research 13, 701-709)
1996, Pharmaceutical • předběžné ošetření tkáně, do které se má injikovat DNA, roztokem, který má zvýšit difúzi a stabilitu DNA (Davis et al., Hum. Gene Ther. 4, 151-159) nebo podpořit vstup nukleových kyselin, např. indukovat buněčné dělení nebo regeneraci. Ošetření se týkalo především použití lokálního anestetika nebo kardiotoxinu, vazokonstriktorů, endotoxinů nebo jiných molekul (Manthorpe et al. , 1993, Human Gene Ther. 4, 419-431; Danko et al. , 1994, Gene Ther. 1, 114121; Vitadello et al., 1994, Hum. Gene Ther. 5, 11-18). Tyto postupy předběžného ošetření se však obtížně provádějí. Tak konkrétně např. přípravek Bupivacaine, aby byl účinný, se musí užít v dávce velmi blízké letální dávce. Injekce hyperosmotické sacharózy před aplikací DNA, zamýšlená ke zlepšení difúze, nezvyšuje úroveň transfekce ve svalu (Davis et al., 1993).
• · * • · · · • « · 4 4
4444444 «4 4 « 4 4 4 4
44 4 44 4
4 4 4 4 4
4 4 4 ·4·
4 >444
444 44 44
Jiné tkáně byly transfekovány in vivo buďto pomocí samotné plazmidové DNA nebo DNA spojené se syntetickými vektory (přehled viz Cotten and Wagner, 1994, C.urrent Opinion in Biotechnology 4, 705; Gao and Huang (1995), Gene Therapy,
2, 710; Ledley (1995), Human Gene Therapy 6, 1129). Hlavní tkáně, které se zkoumaly, byla játra, respirační epitel, cévní stěny, centrální nervový systém a nádory. Ve všech těchto tkáních však byla exprese transgenu nízká, takže se nepředpokládala terapeutická aplikace (v játrech např. . viz Chao et al., 1996, Human Gene Therapy 7, 901), ačkoliv povzbudivé výsledky, byly získány při přenosu plazmidové DNA do cévní stěny (Iires et al. , 1996, Human Gene Therapy 7, 959 a 989). V mozku je účinnost přenosu velmi nízká, stejně jako
je tomu v nádorech (Schwartz et al. 1996, Gene' Therapy 3,
405; Lu et al. , 1994, Cancer Gene Therapy 1, 245; Son et al.,
Proč. Nati. Acad. Sci . USA 91, 12669).
Elektroporace nebo elektrického pole k permeabilizaci
buněk se obecně využívají in vitro k podpoře transfekce DNA do buněk v kulturách. Ale dosud se mělo za to, že tento jev závisí na dosažení prahové intenzity elektrického pole, a že elektropermeabilizace lze dosáhnout pouze při relativně vysoké intenzitě elektrického pole intenzity 800 až 1200 V/cm v případě živočišných buněk. Tyto způsoby byly také navrženy pro použití in vivo ke zvýšení účinnosti protinádorových přípravků jako je např. bleomycin u solidních nádorů člověka (patent US 5,468,228, L.M. Mir)). S pulzy velmi krátkého trvání (100 mikrosekund) jsou tyto elektrické podmínky (800 až 1200 V/cm) velmi vhodné k intracelulárnímu přenosu malých molekul. Tyto podmínky (pulsy v délce 100 mikrosekund) byly aplikovány, aniž by se však zlepšila účinnost přenosu nukleové kyseliny do jater, přičemž pole s intenzitou nižší než 1000 V/cm se ukázalo být zcela neúčinné, a dokonce * φ φ φ
Φ Φ Φ 1 « Φ Φ 4 • Φ · · 4
ΦΦΦ 4
Φ Φ · Φ • · · φ φ · · φφφφφ φ φ • φ * inhibující ve srovnání s injekcí DNA v nepřitomnosti elektrického pole (patentová přihláška WO 97/07826, Heller et al., FEBS Letters, 389, 225-8, 1996).
Při aplikaci této techniky se vyskytují mnohé problémy, především při aplikaci in vivo, neboť aplikace elektrického pole takové intenzity může způsobovat léze menšího či většího rozsahu. Léze v cílové tkání nejsou problémem při léčení nádorů u pacientů s rakovinou, ale představují hlavní nevýhodu u zdravého subjektu nebo i nemocných, subjektů, pokud se DNA podává do tkáně jiné než nádorové.
Podstata vynálezu
Zatímco všechny výše citované práce zdůrazňovaly nutnost užít elektrického pole s vysokým napětím řádu 1000.V/cm, aby byly způsoby účinné in vivo, původce předkládaného Vynálezu zcela neočekávaně ukázal, že přenos nukleových kyselin in vivo do tkání je podstatně zlepšen, a to bez nežádoucích vedlejších účinků, když se tkáň vystaví elektrickým pulzům nízké intenzity, např. 100 až 200 V/cm, a relativně dlouhého trvání. Kromě toho původce zjistil, že velká variabilita exprese transgenů nesených plazmidy, ke které dochází při přenosu DNA způsoby dle dosavadního stavu techniky, byla snížena při použití způsobu podle vynálezu.
Tudíž předkládaný vynález se týká způsobů přenosu nukleových kyselin in vivo, kdy se buňky nebo tkáně přivedou do kontaktu s nukleovou kyselinou, která má být přenesena, přímým podáním do tkáně nebo topickým či systémovým podáním, a kdy je přenos způsoben -aplikací jednoho nebo několika elektrických pulzů s intenzitou 1 až 600 V/cm na tkáň.
4 4 4 · · ·
4 4 4
4 4 4 4 • · · · »4 4 4 4 4 4 a * ·
4 4
Podle výhodného provedení vynálezu je způsob podle vynálezu vhodný pro tkáně, geometrii, jako jsou např, prodlouženého tvaru a/nebo jejichž buňky mají specifickou buňky velkých rozměrů a/nebo buňky přirozeně reagující na elektrický akční potenciál a/nebo buňky mající specifickou morfologii.
Výhodně je intenzita elektrického pole 200 až 400 V/cm a celková doba aplikace je delší než 10 milisekund (ms). Počet použitých pulzú je např. 1 až 100 000 a frekvence pulzů je 0,1 až 1000 Hz. Výhodně je frekvence pulzů 0,2 až 100 Hz. Pulzy se mohou také aplikovat nepravidelným způsobem, přičemž funkce popisující intenzitu pole v závislosti na 'čase je proměnlivá. Tak např. aplikované elektrické pole může být výsledkem kombinace jednoho pole s intenzitou >400 V/cm a výhodně 500 až 800 V/cm, s krátkým trváním jednotky (<lms) , následovaného jedním nebo .několika pulzy nízké intenzity, např. <400 V/cm, výhodně <200- V/cm a s dlouhý trváním jednotky (>1 ms) . Integrál funkce popisující závislost intenzity elektrického pole na čase je větší než 1 kV x ms/cm. Ve výhodném provedení je integrál větší nebo roven 5 kV x ms/cm.
Ve výhodném provedení vynálezu je intenzita elektrického pole pulzů přibližně 500 V/cm (tj. s rozmezím ± 10 % a výhodně ± 5%) .
Pulzy jsou vybrány ze skupiny obsahující pulzy tvaru obdélníkových kmitů, exponenciálně tlumených kmitů, oscilujících unipolárních kmitů omezeného trvání, oscilujících bipolárních kmitů omezeného trvání a další formy kmitů. Ve výhodném provedení vynálezu jde o pulzy obdélníkových kmitů.
'99 ·
9 9 9 9 · 9 « 9 9 9 9 9 9 9 · 9 ·
9999 99 9 9999 • 999999* 9 9 99 99 9
9 ·,9'9 9999 «9 9 9 9 «99 9 9 9 9
Aplikaci elektrických pulzů lze provést jakýmkoliv způsobem odborníkovi známým, např. tak, že se užije:
• systém externích elektrod umístěných na obou stranách tkáně, která má být ošetřena, zejména systém neinvazivních elektrod umístěných v kontaktu s kůží, • systém elektrod implantovaných do tkání, • systém elektrody/injektor, který umožňuje simultánní podání nukleových kyselin a aplikaci električkého pole.
V textu této přihlášky vynálezu jsou termíny přenos
DNA (nebo nukleových kyselin) aplikací jednoho nebo několika elektrických pulzů a termíny elektropřenos . nebo alternativně elektrotransfekce ekvivalentní a označují přenos nukleové kyseliny neb DNA pomocí aplikace nebo v přítomnosti elektrického pole.
Pro aplikaci in vivo je někdy nezbytné užít prostředek, který zajistí elektrickou vodivost v případě neinvazivních externích elektrod. Takovým prostředkem je např. elektrolyt ve formě gelu.
Nukleové kyseliny se podávají jakýmkoliv vhodným způsobem, ale výhodně se injikují in vivo přímo do tkáně, nebo se podávají jiným způsobem, lokálním nebo systémovým, a výhodně pomocí katétru, čímž se stávají dostupnými v místě aplikace elektrického pole. Nukleové kyseliny se mohou podávat společně s činidly, která umožňují nebo usnadňují přenos, jak bylo již zmíněno. Nukleové kyseliny mohou být zejména volné v roztoku, nebo navázané na syntetická činidla nebo nesené virovými vektory. Syntetická činidle mohou být lipidy nebo polymery, známé odborníkům, nebo to dokonce mohou být zaměřovači prvky, které umožňují zachycení na membráně cílové tkáně. K těmto prvkům patří např. vektory nesoucí cukry, peptidy, protilátky nebo receptory hormonů.
0 0 0 0 0 * · 0 0 0 0 0 0 0-00 0 · 0 0 «••0 · · 0 0 0 0 0 • ·00·0·> 0 · 0 0 00 0 00 0 0' 0 0 0000
Je zřejmé, že v podmínkách podle vynálezu podávání nukleové kyseliny předchází, . provádí se současně, nebo následuje aplikaci elektrického pole.
Tudíž se předkládaný vynález také týká nukleových kyselin a elektrického pole s intenzitou 1 až 600 V/cm jakožto sdruženého (kombinovaného) produktu pro jejich současnou, samostatnou nebo střídavou aplikaci in vivo do savčích buněk, a zejména do lidských buněk. Výhodně je intenzita pole 200 až 600 V/cm a ještě výhodněji je přibližně 500 V/cm.
Výhodně se vynález užívá v genové terapii, což je terapie, kdy exprese vneseného genu, ale také modulace nebo zablokování ' cílového genu, umožňuje léčit konkrétní patologický stav.
Výhodně se buňky nebo tkáně podrobují genové terapii, která umožňuje:
• buďto korekci dysfunkcí samotných . buněk (například pro léčení nemocí spojených s genetickými vadami jako je např. cystická fibróza), • nebo ochranu a/nebo regeneraci vaskulariz-ace nebo inervace svalu nebo jiných svalových tkání nebo orgánů pomocí trofických, neurotrofických nebo angiogenních faktorů, které jsou produkovány transgenem, , • nebo transformaci tkáně na orgán secernující produkty vedoucí k léčebnému účinku, jako je např. produkt genu samotného (například regulační faktory trombózy a hemostázy, trofické faktory, hormony)., nebo jako je aktivní metabolit syntetizovaný ve tkáni díky vnesenému terapeutickému genu, • aplikaci vhodnou pro vakcinaci nebo imunostimulaci.
• ·
4 4 4
4 4
4 4
Dalším předmětem vynálezu je kombinace elektrických pulsů určitého napětí s přípravky kyseliny formulovanými s. ohledem obsahujícími nukleové na kteroukoliv cestu aplikace, která umožní dosáhnout tkáně, ať už jde o aplikací topickou, perkutánní, perorální, vaginální, parenterální, intranazální, intravenózní, intramuskulární, subkutánní, intraokulární, transdermální ; apod. Farmaceutické přípravky podle vynálezu výhodně obsahují farmaceuticky přijatelný nosič pro injikovatelný přípravek, zejména pro přímou injekci do požadovaného orgánu nebo pro jakékoliv jiné podávání. Může obsahovat zejména sterilní izotonické roztoky nebo suché přípravky, zejména lyofilizované, které po přidání například sterilní vody nebo fyziologického roztoku, v závislosti na případu, vytvoří přípravky roztoků pro nukleových podávání a parametrů biosyntetického prokaryotických z jednobuněčných injekce. Dávky kyselin použité pro injekci, jakož i počet objem injekcí, mohou být upraveny podle různých a obzvláště dle způsobu podávání, příslušné patologie, exprimovaného genu nebo trvání požadované léčby.
Nukleové kyseliny mohou být syntetického nebo původu, nebo extrahované z virů nebo nebo eukaryotických buněk pocházejících organismů (např. ' kvasinek) nebo mnohobuněčných organismů. Mohou být podávány spojené úplně nebo částečně se složkami původních organismů a/nebo systému syntézy.
Nukleová kyselina může být deoxyribonukleová kyselina' nebo ribonukleová kyselina. Může zahrnovat sekvence přirozeného původu nebo umělé sekvence a zejména genomovou mRNA, tRNA a rRNA, hybridní sekvence nebo či semisyntetické sekvence oligonukleotidů, modifikované či nikoliv. Tyto nukleové kyseliny mohou být získány jakoukoliv metodou odborníkovi známou, zvláště
DNA, cDNA, syntetické • · φφφ φ φφφφ cíleným prohledáváním genových knihoven, chemickou syntézou nebo dokonce smíšenými metodami, včetně chemické nebo, enzymové modifikace sekvencí získaných screeningem knihoven. Mohou být modifikovány chemicky.
Konkrétně může být nukleová kyselina DNA nebo RNA typu sense nebo antisense nebo RNA s katalytickou vlastností ribozymu. „Antisense RNA je nukleová kyselina, která má sekvenci komplementární k cílové sekvenci, např. mRNA sekvenci, a která hybridizaci blokuje expresi cílové sekvence. „Sense označuje nukleovou kyselinu,· která je sekvenčně homologická nebo která je totožná s cílovou sekvencí jako je např. sekvence spojená s proteinovým transkripčním faktorem a zapojená do exprese daného genu. Podle jednoho výhodného provedení obsahuje nukleová kyselina požadovaný gen a prvky umožňující expresi uvedeného genu. Výhodně je fragment nukleové kyseliny ve formě plazmidu.
Deoxyribonukleová kyselina může být jedno- nebo dvouvláknová, může jít o krátké oligonukleotidy nebo delší sekvence. Může nést terapeutické geny, sekvence regulující transkripci nebo replikaci, nebo oblasti' pro vazbu s dalšími buněčnými složkami apod. Termín terapeutický gen 'nebo též„léčebný gen se v popisu vynálezu týká zejména každého genu kódujícího RNA nebo proteinový produkt mající léčebný účinek. Kódovaný' produkt může být protein, peptid apod. Tento proteinový produkt může být s cílovou buňkou homologní (produkt, který je normálně exprimován v cílové buňce, když nevykazuje žádnou patologii). V tomto případě transgenní exprese například, umožňuje překonat nepřiměřenou expresi v buňce nebo expresi proteinu, který je z,důvodu modifikace inaktivní nebo málo aktivní, protein exprimovat nadměrně.
nebo také umožňuje uvedený Terapeutický gen může také kódovat mutantu buněčného proteinu, která má zvýšenou
ft · ft ft ftft • ftftft • · · · ft ft • ftft ftft ft
ftftft ftft ftft stabilitu, modifikovanou aktivitu apod. Proteinový produkt může být také s pilovou buňkou heterologní. V tomto případě muže exprimovaný protein například doplnit nebo vnést do buňky chybějící aktivitu (léčení enzymových deficitů), nebo umožní zasáhnout proti patologickému stavu, či stimulovat imunitní reakci, například .při léčení nádorů. Může také obsahovat tzv. sebevražedný gen (thymidinkinázu viru herpes) pro léčbu rakovin nebo restenózy.
Z léčebných produktů vhodných k použití podle vynálezu se mohou konkrétně uvést geny, které kódují:
enzymy jako je např. a-1-antitrypsin, proteinázy (metaloproteinázy, urokináza, uPA, tPA, streptorkináza), proteázy štěpící prekurzory, čímž se uvolní aktivní produkty (ACE, ICE, ... ) nebo jejich antagonisté (TIMP-1, inhibitor tkáňového aktivátoru plasminogenu PAI, TFPI), krevní deriváty jako faktory zapojené ' do koagulace: faktory VII, VIII, IX, faktory komplementu, trombin, hormony nebo enzymy účastnící se v biosyntéze hormonů nebo faktory podílející se na řízení syntézy nebo exkrece hormonů,'' jako je inzulín, faktory příbuzné inzulínu (IGF), růstový hormon, ACTH, enzymy· pro syntézu pohlavníchj hormonů, lymfokiny a cytokiny: interleukiny, chemokiny (CXC a CC) , interferony, TNF, TGF, chemotaktické faktory nebo aktivátory jako jsou MIF, MAF, PAF, MCP-1, eotaxin, LIF apod. (franzouzský patent 92 03120), růstové faktory, např. IGF, EGF,' FGF, KGF, NGF, PDGF, PIGF, HGF, proliferin, angiogenní faktory jako jsou VEGF nebo FGF, angiopoetin 1 nebo 2, endotelin, enzymy syntézy neurotransmiterů (nervových přenašečů) • ·
9 99 »99 · <
I 9 9 9 9 1
I 9999999 · 9
9 9 trofické faktory, zejména neurotrofické faktory pro léčeni neurodegenerativních nemocí, poškození nervového systému způsobené úrazem nebo poraněním, nebo degradace retiny, např. členy rodiny neurotrofinů jako NGF, BDNF, NT3, NT4/5, NT6, jejich deriváty a příbuzné geny, členy rodiny CNTF, axokin, LIF a jeho deriváty, IL-6 a jeho deriváty, kardiotrofin a jeho deriváty, GDNF a jeho deriváty, členy rodiny IGF, jako jsou IGF-1, IGF-2 a jejich deriváty, členy rodiny FGF, jako jsou FGF1, FGF2, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9 a jejich deriváty, TGFP, růstové faktory kostí, hematopoetické faktory jako erytropoetin, GM-CSF, M-CSF, LIF apod., dystrofin nebo
11947) nebo cytosindeamináza, buněčné stavební proteiny jako je minidystrofin (francouzský patent č. sebevražedné geny (thymidinkináza, enzymy obsahující cytochrom P450), geny hemoglobinu nebo jiných proteinových nosičů, geny odpovídající proteinům zapojeným do metabolismu lipidu, například apolipoproteinového typu vybrané z apolipoproteinů A-I, A-II, A-IV, B, C-l, C-II, C-III, D, E, F, G, H, J a apo(a), a metabolických enzymů, jako jsou například lipoproteinová lipáza, jaterní lipáza, lečitincholesterol-acyltransferáza, 7-alfacholesterolhydroxyláza, kyselá fosfatidylfosfatáza, nebo alternativně lipidové transferové proteiny, jako je transferový protein esterů cholesterolu, a transferový protein fosfolipidů, protein vázající HDL nebo dokonce vybraný receptor, například z receptorů LDL, chylomikronových zbytkových receptorů a scavenger receptorů apod., dále také leptin pro léčbu obezity, « ·
9
9 9
9 9 9 • 9 9999 9
9 9
9 9
9 9 9
9 9 9
9 9 9 9
9 9 9
9 9 9 faktory regulující krevní tlak' jako např. enzymy účastnicí se metabolismu NO, angiotensin, bradykinin, vasopresin, ACE, . renin, enzymy ' kódující mechanismy syntézy a uvolňování prostaglandinů, tromboxan, adenosin, adenosinové receptory, kallikreiny a kallistatiny, ANP, ANF, diuretický a antidiuretický faktor, faktory podílekící se na syntéze, metabolismu nebo uvolňování mediátorů jako histamin, serotonin, katecholaminy, neuropeptidy, antiangiogenní faktory jako je např. ligand pro Tie-1 a Tie-2, angiostatin, faktor ATF, deriváty plasminogenu, endotelin, trombospondin 1 a 2, PF-4, interferon-α a -β, interleukin-12, TNFa, urokinázový receptor, fltl, KDR, PAI1, PAI2, TIMP1, fragment prolaktinu, faktory ochraňující proti apoptóze ' jako jsou faktor rodiny AKT, proteiny schopné indukovat buněčnou smrt, které jsou buďto sami aktivní jako kaspázy, nebo které jsou typu předléků, tj. vyžadují aktivaci jiným faktorem, jako např. proteiny, .které aktivují předléky na činidla způsobující buněčnou smrt,· např. thymidinkináza viru herpes a deaminázy, se kterými se počítá zvláště v protinádorové terapii, proteiny podílející se na kontaktu mezi buňkami a adhezi: VCAM, PECAM, ELÁM, ICAM, integriny, kateniny, proteiny extracelulární matrix, proteiny podílející se na migraci buněk, proteiny podílející se na signální transdukci jako např. FAK, MEKK, p38 kináza, tyrosinkinázy, serinthreoninkinázy, proteiny podílející se na regulaci buněčného cyklu (p21, pl6, cykliny apod.) a také dominantně-negativní mutanta • fcfc fcfcfcfc fcfcfcfc • fcfcfc fc fc fc fc fcfc « • · fcfcfcfc fcfc · fc fcfc fcfc fc • fcfc fcfcfc fcfcfcfc fcfc · fcfc fcfcfc fcfc fcfc nebo odvozené protein, které blokují, buněčný cyklus a které mohou, kde je to vhodné, indukovat apoptózu, transkripční faktory: jun, fos, API, p53 apod. a proteiny v signální kaskádě p53, buněčné strukturní proteiny, jako jsou intermediátní filamenta (vimentin, desmin, keratiny), dystrofin, proteiny podílející se na kontrakci svalu a regulující kontraktibilutu svalu, zejména proteiny účastnící se metabolismu kalcia a toku kalcia v buňkách (SERCA apod.)
V případě proteinů, které fungují prostřednictvím systému ligand a receptor lze předvídat použití ligand nebo receptorů (např. FGF-R, VEGF-R apod.). Lze také uvést geny kódující fragmenty ligandů nebo receptorů, zvláště proteinů zmíněných výše, které vykazují aktivitu, která je buďto vyšší, než aktivita proteinu plné délky, nebo jde o antagonistickou aktivitu anebo dokonce dominantně-negativní typ vzhledem k původnímu proteinu (např. receptorové fragmenty inhibující dostupnost proteinů v oběhu, ať už asociované nebo ne se sekvencemi indukujícími sekreci těchto fragmentů ve vztahu ukotvení na buněčné membráně, a nebo jiné systémy pro modifikaci intracelulárního transportu v těchto systémech ligand-receptor, kterou by se změnila dostupnost jednoho z prvků) nebo dokonce mají vlastní aktivitu odlišnou od aktivity původního úplnéhoproteinu (např. ATF).
Mezi dalšími proteiny nebo peptidy, které mohou být secernovány svalem, je důležité zdůraznit protilátky, variabilní fragmenty jednořetězcových protilátek (ScFv) nebo jakékoliv protilátkové fragmenty, které mají dostatečné rozpoznávací schopnosti pro použití v imunoterapii, např. pro léčbu infekčních nemocí, nádorů a autcimunitních chorob, jako je roztroušená skleróza (anti-idiotypové protilátky), a také
0 0
0 0 0
0000 · 0
0 0
ScFv', který je navázán na protizánětlivé cytokiny jako jsou např. IL1 a TNFa pro léčení revmatoidní artritidy. Další vhodně proteiny jsou, aniž by výčet byl omezující, rozpustné receptory jako' například rozpustný receptor CD4 .nebo rozpustný receptor TNF pro léčení infekce HIV, rozpustný receptor TNFa nebo rozpustný receptor IL1 pro léčení revmatoidní artritidy, rozpustný receptor acetylcholinu pro léčbu myastenie, substrátové peptidy nebo enzymové inhibitory, nebo ' peptidy, které jsou agonisty nebo antagonisty receptorů nebo nebo adhezivních proteinů, jako například pro léčení astmatu, trombózy, restenózy, metastáz nebo zánětů, a umělé, chimérické nebo zkrácené proteiny. Z hormonů základního významu se může uvést inzulín v případě diabetů, růstový hormon a kalcitonin. Je třeba také uvést proteiny schopné indukovat protinádorovou imunitu nebo stimulovat imunitní odpověď . (IL2, GM-CSF, IL-12 apod.) Nakonec lze zmínit cytokiny, které redukují THi odpověď, jako jsou např. IL10, IL4 a IL13,.
Četné příklady, které byly uvedeny i ty, které budou ještě následovat, ilustrují potenciální rozsah aplikací předkládaného vynálezu.
Terapeutické nukleové kyseliny mohou být antisense sekvence nebo geny, jejichž exprese v cílové buňce umožní kontrolovat expresi genů nebo transkripci buněčných mRNA. Takové sekvence mohou být např. transkribovány v cílové buňce do RNA komplementární k buněčné mRNA a tak blokovat její translaci do proteinu, což je způsob popsaný v evropském patentu č. 140 308. Terapeutické geny také mohou obsahovat sekvence kódujíc ribozymy, které -jsou schopné selektivně ničit cílové RNA (evropský patent č. 321 201).
Jak bylo'již uvedeno výše, nukleové kyseliny mohou také obsahovat jeden nebo několik genů kódujících antigenní * · ·· · ·· • · · · · · • « · · · · * *·····« · «· * · · * · · · · • * * ·· ··· ·· ·· peptidy schopné vyvolat imunitní odpověď u člověka nebo zvířete. V takovém konkrétním provedení umožňuje vynález buďto produkci vakcín nebo imunoterapii člověka nebo zvířete, účinkující zejména proti mikroorganismům, virům a rakovinným onemocněním. Zejména sem patří antigenní peptidy specifické pro virus Epstein-Barrové, virus HIV, virus hepatitidy B (evropský patent č. 185 573), virus pseudorabies, „virus tvořící syncytia, další viry nebo dokonce specifické nádorové antigeny, jako jsou proteiny MÁGE (evropský patent č. 259 212), a sice MAGEl a MAGE2, nebo antigeny schopné stimulovat reakci proti nádorům, jako jsou bakteriální proteiny tepelného šoku.
Výhodně nukleová kyselina obsahuje také sekvence umožňující a/nebo napomáhající expresi léčebného genu a/nebo genu kódujícího antigenní peptid ve svalu. Může zahrnovat sekvence, které jsou přirozeně odpovědné . za expresi uvažovaného genu, když jsou tyto sekvence schopné fungovat v transfekované buňce. Může také zahrnovat sekvence různého původu (zodpovědné za expresi jiných proteinů nebo dokonce syntetické sekvence). Může zahrnovat zejména promotorové sekvence eukaryotických nebo virových genů. Například to mohou být promotorové sekvence pocházející z genomu buňky, kterou je žádoucí transfekovat. Z eukaryotických promotorů se mohou použít jakékoliv promotory nebo z nich odvozené sekvence, které stimulují nebo potlačují transkripci genu specifickým nebo nespecifickým a slabým nebo silným způsobem. Jedná se zvláště o obecné, konstitutivní promotory promotory (gen pro HPRT, vimentin, α-aktin, tubulin atd.), promotory terapeutických genů (typu MDR nebo CTFR apod.), tkáňově specifické promotory (včetně promotorů genů desminu, myosinů, kreatinkinázy, fosfoglycerátkinázy) nebo alternativně promotory odpovídající na podnět jako jsou promotory • · ·
9*9 9 •99*9 · 9 ·· ··
9 9 I
9 9 I
9 9 9 1
9 9 I
9 9 9 odpovídající na přirozené hormony (jako jsou receptory steroidních hotmonů, receptory kyseliny retinové), a nebo promotory regulované antibiotiky (tetracyklin, rapamycin apod.), promotory reagující na stravovací režim jako jsou promotory odpovídající na fibráty, nebo promotory odpovídající na další přirozené či syntetické molekuly. Mohou to také být promotorové sekvence pocházející z genomu viru. V této souvislosti se mohou, například uvést promotory adenovirových genů EIA nebo MLP, nebo promotory odvozené z genomú virů CMV, RSV, SV 40 apod. Dále mohou být tyto expresní sekvence modifikovány přidáním sekvencí pro aktivaci, regulaci, umožňujících podmíněnou, přechodnou nebo dočasnou expresi, expresi nebo tkáňově specifickou převládající expresi apod.
Kromě toho může nukleová kyselina také obsahovat, zejména v poloze nad léčebným genem (upstream), signální sekvenci zaměřující syntetizovaný léčebný produkt do sekreční dráhy cílové buňky. Tato signální sekvence může být přirozená signální sekvence léčebného produktu, ale může také obsahovat jakýkoliv jiný funkční signál, nebo umělou signální sekvenci.
kyselina může také obsahovat signální sekvenci léčebný produkt do konkrétního jako jsou například peroxisomy, lysosomy anebo mitochondrie např. pro léčení mitochondriální genetické nemoci.
Další vhodné geny popsal McKusick, V.A., (Mendelian Inheritance in Man, Catalogs of autosomal dominant, autosomal recessive, and X-linked phenotypes, 8. vydání, Johns Hopkins University Press, 1988) a Stanbury, J. B. et al. (The metabolic basis of inherited disease, 5. vydání, McGraw-Hill, 1983) . Požadované geny pokrývají proteiny zapojené do metabolismu aminokyselin, lipidů a dalších buněčných složek.
Nukleová směřuj ící buněčného syntetizovaný kompartmentu, • · · · φ φ • ······· · • · · · · • Φ φ ·· • φ φ · • · φ · • φ φ φ φφ φφ
Lze také uvést geny spojené s chorobami metabolismu sacharidů (aniž by tím však byl vynález omezen) jako je např. fruktózo-l-fosfátaldoláza, fruktózo-1, 6-difosfatáza, glukózo-6-fosfatáza, lysozomální α-l,4-glukosidáza, amylo1,6-glukosidáza,. amylo-(1,4:1,6)-transglukosidáza, svalová fosforyláza, svalová fosfo-fruktokináza, fosforyléza-βkináza, galaktózo-l-fosfáturidyl-transferáza, všechny enzymy komplexu pyruvátdehydrogenázy, pyruvátkarboxyláza, 2-oxoglutarát/glyoxylátkarboxyláza, a D-glycerátdehydrogenáza.
Lze uvést i další vhodné geny:
- Geny spojené s nemocemi aminokyselinového metabolismu, jako například fenylalaninhydroxyláza, dihydrobiopterinsyntetáza, tyrosinaminotransferáza, tyrosináza, histidináza, fumarylacetoacetáza, glutathionsyntetáza, syntetáza, syntetáza, syntetáza, genáza, γ-glutamylcysteinkarbamoylfosfátargininosukcinátornithin-d-aminotransferáza, ornithinkarbamoyltransferáza, arginosukcinátlyáza, argináza, L-lysindehydroL-lysinketoglutarát-reduktáza, valintransamináza, leucin/isoleucintrans-amináza, dekarboxyláza 2-ketokyselin s rozvětveným řetězcem; isovaleryl-CoAdehydrogenáza, acylCoA-dehydrogenáza, 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoAlyáza, acetoacetyl-CoA-3-ketothioláza, propionyl-CoA-karboxyláza, metylmalonyl-CoA-mutáza, dihydrofolátreduktáza, cystathionin-β-syntetáza, do (ATP:kobalamin)adenosyltransferáza, metylentetrahydrofolátreduktáza, komplex sarkosindehydrogenázy, systému štěpícího sérová karnosináza, a glycin, cerebrální proteiny patřící β-alanintransamináza, homokarnosináza,
- geny se vztahem k nemocem metabolismu tuků a mastných kyselin, jako například lipoproteinová lipáza, apolipoprotein
C-ΞΙ, apolipoprotein E, další apolipoproteiny, lecitin • · · · · φ • φφφφφφφ φ • · φ φ φ φφ φ φφ φ φ · φ · φ φ φ φ φφ φφ cholesterolacetyltransferáza, LDL receptor, jaterní sterolhydroxyláza a α-hydroxyláza kyseliny fytanové, geny se vztahem k lysozomálním deficitům, jako například lysozomální a-L-iduronidáza, lysozomální iduronátlysozomální acetyl-CoA:aN-acetyl-a-Dsulfatáza, lysozomální heparan-N-sulfatáza, N-acetyl-a-D-glukózoaminidáza, lysozomální glukozamin-N-acetyltransferáza, lysozomální glukozamin-6-sulfatáza, lysozomální galaktózo-amin-6-su.lf átsulfatáza, lysozomální β-galaktosidáza, lysozomální arylsulfatáza B, lysozomální β-glukuronidáza·, N-acetylglukózoaminylfosfotransferáza, lysozomální a-D-manosidáza, lysozomální ' α-neuraminidáza, lysozomální glukozaminidáza, lysozomální a-L-fukosidáza, kyselá lipáza, lysozomální kyselá ceramidáza, aspartyllysozomální lysozomální sfingomyelináza, lysozomální glukocerebrosidáza a lysozomální galaktocerebrosidáza, lysozomální gal akt o syl ceramidáza,.
lysozomální arylsulfatáza A, α-galaktosidáza A, lysozomální lysozomální kyselá β-galaktosidáza, a řetězec hexosaminidázy A.
Mohou se také uvést (aniž by to vynález omezovalo) geny se vztahem metabolismu, lipidového purinového k onemocněním steroidního a geny se vztahem k onemocněním a pyrimidinového metabolismu, geny se vztahem k onemocněním metabolismu porfyrinů a hernu, a geny se vztahem k onemocněním pojivové tkáně, metabolismu svalů a kostí, - a také geny se vztahem k onemocněním krve a hematopoetických orgánů, svalů (myopatie), nervového systému (neurodegenerativní choroby) nebo oběhového systému (například léčení ischémií a stenózy) a geny podílející se na genetických nemocech mitochondrií.
Ve způsobu podle vynálezu může být nukleová kyselina spojena s jakýmkoliv typem vektorů nebo s jakoukoliv kombinací těchto vektoru, která umožní zlepšit genový přenos, • Φ
Φ např. (aniž by výčet byl omezující) s vektory jako jsou viry, syntetické nebo biosyntetické přípravky (např. činidla jako lipid, polypeptid, glykosid nebo polymer), či dokonce navázání na částice (perličky) ' nebo propulzní částice. Nukleové kyseliny mohou být také injikovány do tkáně, která podstoupila ošetření ke zlepšení genového přenosu, např. ošetření farmakologické povahy v aplikaci lokální nebo systémové, nebo ošetření enzymem, permeabilizující (použití surfaktantú), chirurgické, mechanické, tepelné nebo fyzikální ošetření.
Výhodnost použití elektropřenosu v genové terapii spočívá mj . v bezpečnosti, pramenící z toho, že se provádí jen lokální ošetřeni ve spojení s lokální a cílenou aplikací elektrického pole.
Vzhledem ke všem uvedeným výhodám a také bezpečnosti, která doprovází použití slabých polí, může být tento vynález aplikován i na srdeční sval pro léčbu srdečních chorob, např. použitím vhodného defibrilátoru. Může být také použit pro léčbu restenózy pomocí exprese genů inhibujících proliferaci buněk hladkého svalstva, jako je protein GAX.
Kombinace polí nízké intenzity a dlouhotrvajícího podávání, aplikované na tkáně in vivo, zlepšují transfekci nukleových kyselin, aniž by způsobily významné poškození tkání. Tyto výsledky zvyšují účinnost přenosu DNA v genové terapii používající nukleové kyseliny.
Jak vyplývá z výše uvedeného, způsob podle vynálezu poprvé umožňuje, a sice prostřednictvím genové terapie, že k vytvoření přípravku, ve fyziologických a/nebo léčebných dávkách dojde přímo ve tkáni nebo je přípravek secernován do jejího blízkého okolí nebo je secernován do krevního či lymfatického oběhu. Kromě toho vynález poprvé umožňuje jemnou modulaci a kontrolu účinného množství exprimovaného transgenu ·· · ··
4 4 4 4
4 4 4 4 4 ·4444 44 4
4 4 4 4
4 ··
44 44
4 4 4 4 4 • 4 4 4 4
4 4 4 4 4
4 4 4 4 • 44 44 44 pomocí možnosti regulovat objem transfekované tkáně, například počtem míst podávání nebo dokonce možností regulovat počet, tvar, povrch a uspořádání elektrod. Další kontrolní prvek vychází z možnosti regulovat . účinnost transfekce změnou intenzity pole, počtu, trvání a frekvenci pulsů a samozřejmě také, v souladu se stavem techniky, množstvím a objemem podávaných nukleových kyselin. Lze tak dosáhnout vhodné úrovně transfekce a požadované úrovně produkce v tkáních nebo požadovaná sekrece. Způsob podle vynálezu zaručuje mimořádnou bezpečnost ve srovnání s chemickými nebo virovými metodami genového přenosu in vivo, při kterých nemůže být zcela vyloučeno a kontrolováno zasažení orgánů jiných než je cílový orgán. Skutečně způsob podle vynálezu umožňuje kontrolu lokalizace transfekované tkáně (naprosto jasně spojené s objemem tkáně podrobené lokálním elektrickým pulsům), a proto poskytuje i možnost návratu k výchozímu stavu tím, že se úplně nebo částečně odstraní tkáň, pokud je to možné, v případě tkání, které nejsou vitálně důležité a nebo které mají velkou regenerační kapacitu jako např. játra nebo svaly. Velká flexibilita použití umožňuje optimalizovat způsob podle druhu zvířete (použití v humánní nebo veterinární medicíně), věku pacienta a jeho fyziologického a/nebo patologického stavu.
Způsob podle vynálezu dále poprvé umožňuje transfekovat nukleové kyseliny značné velikosti, na rozdíl metod užívajících viry, ve kterých je velikost transgenu limitována velikostí kapsidy. Tato možnost je nezbytná pro přenos značně velikých genů jako je dystrofin nebo obecně geny s introny a/nebo značně rozsáhlými regulačními prvky, které jsou nezbytné například pro fyziologicky regulovanou tvorbu hormonů. Dále je tato možnost nezbytná .pro přenos episomú nebo umělých kvasinkových chromozomů či minichromozomů.
«00 · 0 ·· 0 0 0 · • 000 ·· * 0 0 0 0 » 0 0··· ·· · 000 00 0
000 000 0000
0 00 000 ·0 00
Příklady uvedené v další části slouží k ilustraci vynálezu, aniž by vynález jakkoliv omezovaly. V příkladech jsou odkazy na následující obrázky.
Popis obrázků • Obr. 1: Účinek elektrických pulzů pole s vysokou intenzitou na transfekci DNA plazmidu pX.L2774 do horního holenního svalu myši, uvedena průměrná hodnota ± střední chyba průměru (SEM).
• Obr. 2: Účinek elektrických pulzů pole se střední intenzitou na transfekci DNA plazmidu pXL277.4 do horního holenního svalu myši, uvedena průměrná hodnota ± SEM.
• Obr. 3 : Účinek elektrických pulzů pole se slabou
intenzitou na transfekci DNA ; plazmidu pXL'2774 do horního
holenního svalu myši, uvedena průměrná hodnota ± SEM.
• Obr. 4 : Účinek elektrických pulzů pole se slabou
intenzitou s různou délkou trvání pulzu na transfekci DNA plazmidu pXL2774 do horního holenního svalu myši, uvedena průměrná hodnota ± SEM. ‘ • Obr. 5: Účinnost elektropřenosu DNA plazmidu pXL2774 do horního holenního svalu myši při slabé intenzitě pole, uvedena průměrná hodnota ± SEM.
• Obr. 6: Mapy plasmidů pXL3031 a pXL3010.
φφφ ·· ♦ ·· ·· φφφ φ φ φ · ·«·· φ··· · · * φφφ· φ ΦΦΦΦΦΦΦ φ φ φφ φφ φ
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Experimenty prováděné v souladu s dosavadním stavem techniky, kdy se prokázalo, že elektrické pole inhibuje transfekci
Standardní podmínky elektroporace, které se užívají podle dosavadního stavu techniky, byly vyzkoušeny, ale prokázalo se, že jsou neúčinné nebo dokonce inhibují přenos nukleových kyselin (plazmidové DNA) -do příčně pruhovaného svalu.
Materiály a metody, obecné experimentální podmínky
V tomto příkladu byly užity následující produkty:
DNA pXL2774 (patentová přihláška PCT/FR 96/01414) je plazmidová DNA obsahující gen luciferázy jako ' reportérovy gen. Ostatní použité produkty jsou běžně komerčně dostupné: ketamin, xylazin, fyziologický roztok (NaCl 0,9 %).
Byl použit běžný komerční osciloskop a generátor elektrických pulzů (obdélníkových nebo čtvercových kmitů) (Electropulsator PS 15, Jouan, Francie). Eletrody byly ploché elektrody z nerezové oceli vzdálené od sebe 5,3 mm.
Experimenty se prováděly na myších C57 Bl/6. Myši pocházející z různých klecí byly před pokusech náhodně promíchány (randomizace).
Myši byl anestetizovány směsí ketaminu a xylazinu. Roztok plazmidů (30 μΐ roztoku s 500 pg/ml v 0,9% NaCl) byl ihjikován skrz kůži podélně do horního, lýtkového svalu- pravé i levé končetiny pomocí stříkačky Hamilton. Elektrody byly potřeny vodivým gelem a injikovaná končetina byla pak umístěna mezí elektrody, tak aby s nimi byla v kontaktu.
e · • ·
Elektrické pulzy byly aplikovány kolmo na osu svalu pomocí generátoru obdélníkových pulzů jednu minutu po injekci. Pomocí osciloskopu se sledovalo napětí ve Voltech, V (hodnoty uváděné v příkladech představují maximální hodnoty), trvání pulzu' v milisekundách, ms, a frekvence v hertzech, Hz, přičemž frekvence byla 1 Hz. Bylo aplikováno 8 po sobě jdoucích pulzů.
Pro vyhodnocení transfekce svalu byly myši utraceny sedm dní po podání plazmidu. Horní lýtkový sval obou končetin byl vyjmut, zvážen, umístěn do lyzovacího .pufru a rozmělněn. Suspenze byla centrifugována a byl tak získán čistý supernatant. Měření aktivity luciferázy se provádělo v 10 μΐ supernatantu pomocí komerčního luminometru, ve kterém se automaticky přidával k roztoku substrát. Intenzita luminiscence je uvedena v relativních jednotkách (RLU) pro sval při známém celkovém objemu suspenze. Každý pokus byl opakován v 10 - bodech, t j . 5 zvířat bylo injikováno oboustranně. Statistické vyhodnocení bylo provedeno pomocí neparametrických testů.
Výsledky a diskuse
Výsledky jsou ilustrovány dvěma obrázky, kde je -užito buďto lineární nebo logaritmické měřítko.
V tomto prvním pokusu se testovaly účinky elektrického
pole 800 až 1200 V/cm, což jsou podmínky umožňující
elektroporaci nádorů (Mir et al., Eur. J. Cancer 27, 68,
1991) ) . Bylo pozorováno (viz obr . 1), na rozdíl od kontrolní
skupiny, kde byla injikována DNA bez eletrických. pulzů, že • s osmi pulzy 1200 V/cm a délkou 0,1 ms byla průměrná hodnota aktivity luciferázy mnohem nižší, • · · • · · · • · • s pulzy 1200 V/cm a délkou 1 ms tři zvířata uhynula a navíc průměrná aktivita luciferázy byla mnohem nižší, • s pulzy 800 V/cm a délkou 1 ms byla průměrná hodnota luciferázové aktivity také významně snížena.
Většina svalů, které byly vystaveny působení elektrického pole, byla viditelně změněna (svaly byly drobivé a bělavého vzhledu).
Příklad 2
Experiment s přenosem nukleových kyselin, pomocí elektrického pole střední intenzity
Tento pokus byl proveden na myších C57 Bl/6. Až na intenzitu elektrického pole a jeho trvání byly podmínky provádění pokusu prakticky shodné s příkladem 1.
Výsledky jsou uvedeny na obr. 2. Opakoval se v podstatě výsledek příkladu 1, tj. inhibující účinek 8 pulzů intenzity 800 V/cm a délky 1 ms na aktivitu luciferázy detekované ve svalu. Užitím pole intenzity 600 V/cm byla zjištěna stejná inhibice a stejné změny svalové tkáně. Ale na druhé straně velmi překvapivě snižování napětí vedlo k tomu, že svalovátkáň nebyla již poškozována a při 400 a 200 V/cm byla míra transfekce svalů v průměru vyšší než u svalů bez aplikace elektrického pole. Je třeba poznamenat, že ve vztahu ke kontrolní skupině (která nebyla vystavena působení elektrického pole) rozptyl hodnot luciferázové aktivity je významně snížen při 200 V/cm (střední chyba průměru, SEM, je 20,59 'ť průměrů ve srovnání s hodnotou 43,321 v nepřítomnosti elektrického pole, viz obr. 2A).
«·· ·· 4 ·· ·· ' • · · · · · · · · · · ···· ·♦ · ···· • · ···· ·· · · · · · · · ·· · · · 9 9 9 9 9 . 99 9 9» 99 9 9ι9 9 9
Příklad 3
Experiment s přenosem nukleové kyseliny pomocí pulzů pole nízké intenzity, který ukazuje velmi vysokou stimulaci exprese transgenu
Tento pokus byl proveden na myších C57 Bl/6. Až na intenzitu elektrického pole a jeho trvání, a skutečnost, že pulzy byly aplikovány 25 vteřin po injekci DNA, byly podmínky shodné s předchozími příklady.
Výsledky jsou uvedeny na obr. 3. Průměrné hodnoty exprese transgenu luciferázy byly výrazně zvýšeny při trvání pulzu 20 ms při 100 V/cm a počínaje pulzy dlouhými 5 ms při 200 V/cm.
Pokus také jasně ukázal, že průměrná hodnota luciferázové aktivity získaná po eletrotransfekci DNA do svalu je . funkcí trvání elektrických pulzů, pokud se užije napětí 200 a 100 V/cm. Bylo také pozorováno, že rozptyl hodnot luciferázové aktivity byl významně snížen u skupiny, kde byla aplikována elektrotransfekce (obr. 3A).
V nepřítomnosti elektrického pole (kontrola) byla relativní střední chyba průměru 77,43 % průměrné hodnoty, zatímco se snížila na 14% (200 V/cm, 5 ms) a na 41,27 % (200 V/cm, ms), nebo na 30 až 48% při elektropřenosu v poli 100 V/cm.
V nej lepších podmínkách tohoto pokusu byl faktor zvýšení exprese transgenu 89,7 vzhledem ke kontrole injikované bez aplikace elektrických pulzů.
• φ • φ » (ί · · φ • φ φ » φ • ····· φ · • · · φ • Φ φ • Φ Φ ·*· · Φ
Příklad 4
Experiment s elektropřenosem nukleové kyseliny do svalu při 200 V/cm, který ukazuje zvýšení exprese transgenů více než 200x
Tento experiment byl proveden na myších DBA 2 s elektrickými pulzy 200 V/cm s různou délkou. Ostatní podmínky byly shodné jako v příkladu 3.
Pokus potvrdil, že při 200 V/cm se transfgkce luciferázy zvyšuje, když se zvyšuje trvání pulzu nad 5 ms (obr. 4 a 5) . Bylo zde opět pozorováno snížení vnitroskupinové variability detekované hodnotou střední chyby průměru, u skupiny s elektrotransfekcí ve srovnání s kontrolou (relativní hodnoty střední chyby průměru byly 35 % pro kontrolu a. 25, 22, 16, 18 a 26 % pro série pulzů s dobou 1, 5, 10, 15, 20 a 24 ms, v uvedeném pořadí). V optimálních podmínkách v tomto experimentu byla zvýšena exprese transgenů 205 x vzhledem ke kontrole injikované bez elektrických pulzů.
Příklad 5
Účinnost elektropřenosu nukleových kyselin je funkcí součinu počet pulzů x intenzita pole x doba trvání každého pulzu
Obr. 5 slouží za příklad důležitosti parametru odpovídajícího součinu počet pulzů x intenzita pole x trvání každého pulzu. Tento parametr ve skutečnosti odpovídá integrálu funkce, která popisuje změny intenzity elektrického pole v závislosti na čase.
• fc ·
• fcfc fcfc • · e « · · • · · · · « · · · · fc • fc · · · ··· fcfc ··
Data uvedená na obr. 5 byla získána v průběhu pokusů . . v příkladech 2, 3 a 4 s intenzitami elektrického' pole 200 V/cm a 100 V/cm anebo bez elektrického pole. Údaje ukazují, že účinnost transfekce roste jako funkce součinu celkové doby expozice elektrickému poli a intenzity pole. Stimulujícího účinku' bylo dosaženo při parametru počet pulzů x intenzita pole x trvání každého pulzu přesahujícím hodnotu 1 kV x ms/cm. Podle výhodného provedení vynálezu stimulace je dosaženo pro hodnoty součinu elektrické pole x celková doba trvání pulzů shodné nebo vyšší než 5 kV x ms/cm.
V následujících příkladech byl elektropřenos nukleových kyselin způsobem podle vynálezu testován na různých nádorech, buďto lidského původu, které byly implantovány na nahé (imunodeficientní) myši, nebo myšího původu, které byly implantovány, na myši. C57B1/6 (imunokompetentní) . >
Příklad 6
Elektropřenos nukleové kyseliny do lidského plicního nádoru H1299
Experiment byl proveden na samicích nahých myší s hmotností 18 až 20 g. Štěpy nádoru H1299 byly implantovány jednostranně v objemu 20 mm3, myši pak byly rozděleny podle velikosti nádoru do. homogenních skupin. Myši byly anestetizovány směsí ketaminu a xylazinu. Roztok plazmidu (40 μΐ roztoku s 250 pg/ml DNA ve 20mM NaCl a 5% glukóze) byl injikován do středu nádoru pomocí stříkačky Hamilton. Laterální povrchy nádoru byly potřeny vodivým- gelem a nádor byl umístěn mezi dvě elektrody. Elelktrody byly destičkové elektrody z nerezavějící oceli vzdálené navzájem 0,45 až ♦ · • · • · · • · · • · · ♦ • · · · · * «· *
0,7 mm. Elektrické pulzy byly aplikovány komerčního generátoru obdélníkových pulzů PS15, Jouan, Francie) a osciloskopu.
V pokuse byl užit plazmid pXL3031 (obr.
a mereny pomoci (Electropulsator který obsahuje gen kódující luciferázu (cytoplazmatickou). Plazmid pXL3031 je WO 97/10343), modifikovanou vektor odvozený z plazmidu pXL2774 (viz do kterého byl vložen gen luc+ kódující (cytoplazmatickou) luciferázu z Photinus pyralis získanou z pGL3basic (GenBank: CVU47295) pod kontrolu promotoru získaného z časného úseku cytomegaloviru (hCMV IE, GenBank HS51EE) s polyadenylační signálem z pozdního úseku viru SV40 (GenBank SV4CG).
Elektrické pulzy byly aplikovány a měřeny pomocí komerčního generátoru obdélníkových pulzů 20 až 30 sekund po injekci. Pomocí osciloskopu se sledovaly parametry elektrické pole: 200 až 800 V/cm, délka pulzu 20 ms, frekvence 1 Hz.
Pro vyhodnocení transfekce nádoru luciferázou byly myši (10 myší v jedné pokusné skupině) utraceny 2 dny po injekci plazmidu. Nádory byly vyjmuty, zváženy a· rozdrceny v lyzovacím pufru. Suspenze byla centrifugována a byl tak získán čistý supernatant. Měření aktivity luciferázy se provádělo v 10 μΐ supernatantu pomocí komerčního luminometru, ve kterém se automaticky přidával substrát. Výsledky jsou uvedeny v celkových relativních jednotkách (RLU) na nádor.
RLU/nádor
pokus 1 pokus 2
V/cm průměr SEM průměr SEM
0 32,8 ±6,8 44,7 ± 10,2
200 129,7 ± 39,1
300 585,0 ± 134,8
400 5266,6 ± 1473,8 8488,2 ± 3881,7
500 14201,6 ± 6162,6
600 7401,0 ± 5323,1
800 11884,1 ± 4048,3
• * • · · · · • « 9 9 · · • « ···· O · · • · · 9 9
9 9 9
Tabulka 1: Účinek elektrických pulzů pole s různou intenzitou na transfekci plazmidu pXL3031 do plicního karcinomu H1299 (nemalobuněčný plicní karcinom), uvedeny jsou průměrné hodnoty exprese luciferázy v RLU se střední chybou průměru (SEM) na jeden nádor. Podmínky: intenzita elektrického.......pole uvedena-ve V/cm jak je uvedeno v tabulce, aplikováno 8 pulzů délky 20 ms při frekvenci -1- Hz.
Jak ukazují data v tab. 1, bylo pozorováno, že ve srovnání s\kontrolní skupinou, kde byla DNA injikována bez následné aplikace elektrického ' pole, přenos genu je zlepšen způsobem, který je závislý na použitém napětí od 200 do 400 V/cm! dokud nebylo dosaženo stálé hodnoty odpovídající maximální transfekci, které bylo dosaženo počínaje 500 V/cm. Při vyšších napětích (600 a 800 V/cm) .došlo k popáleninám kůže nebo i k hlubším popáleninám, avšak by však došlo ke snížení exprese transgenu.
Zesílení přenosu genu do plicního nádoru H1299 prostřednictvím elektropřenosu bylo řádově 240x až 320x.
Příklad 7 '
Elektropřenos nukleové kyseliny do lidského nádoru tlustého střeva HT29
Experiment byl proveden na samicích nahých myší s hmotností 18 až 20 g. Štěpy nádoru HT29 byly implantovány jednostranně v objemu 20 mm3. Nádory dosáhly očekávané cílové velikosti 100 až 200 mm3. Myši pak byly rozděleny podle velikosti nádoru do homogenních skupin, kromě vzdálenosti mezi elektrodami (0,45 cm) byly podmínky aplikace stejné jako • 0
0 • · » <
* » • 0 0 0 «·
0 0 ·
0 0 0 0 »00
0
0 0 * » 0 * • 0 0 0 »0 v příkladu 6. Výsledky dvou nezávislých sérií experimentů jsou uvedeny v tah. 2.
RLU/nádor
pokus 1 pokus 2
V/cm průměr SEM průměr SEM
0 4 043 062 1 827 237 634 999 338 311
400 16 037 136 5 420 572
500 14 096 640 7 629 212 5 537 359 - 3 571 433
600 24 223 872 9 217 062 14 607 850 6 392 841
Tabulka 2: Účinek elektrických pulzů pole různé intenzity na transfekci plazmidu pXL3031 do lidského nádoru HT29 (adenokarcinomu tlustého střeva), uvedeny jsou průměrné hodnoty exprese luciferázy v RLU se střední chybou průměru (SEM). Podmínky: intenzita elektrického pole uvedena ve V/cm jak je uvedeno v tabulce, aplikováno 8 pulzů délky 20 ms při frekvenci 1 Hz.
Ve srovnání s kontrolními skupinami bez elektropřenosu se ukazuje, že aplikace elektrického pole s intenzitou 600 V/cm umožňuje dosáhnout optimální míry transfekce bez ohledu na základní míru transfekce prováděnou bez elektropřenosu. Faktor zesílení transfekce byl 6x až 23x a byl v podstatě podobný při intenzitě pole 400 a 600 V/cm.
Příklad 8
Elektropřenos nukleové kyseliny do myšího fibrosarkomu
Experiment byl proveden na myších C57B1/6 s hmotností 18 až 20 g. Myším' byly implantovány jednostranně' LPB buňky,, a sice 1 χ 106 ve 100 μΐ MEM média bez séra. Nádory dosáhly očekávané cílové velikosti 100 až 200 mink Myši pak byly rozděleny podle velikosti nádoru do homogenních skupin.
• 4
4· 4
4 4
4 4 «44 » · · • 4 4 · 4 4 • 4444444 4 • 4 4 4 4
4 444
Podmínky experimentu byly stejné jako v příkladu 6.
Výsledky dvou. nezávislých, sérií experimentů jsou uvedeny v tab. 3.
RLU/nádor
pokus 1 pokus 2
V/cm průměr SEM průměr SEM
0 0, 6 ±0,3 0,4 ±0,1
300 26, 3 ±14,8 11, 6 ±4,6
400 42, 5 ±31,2 10, 4 ±3,5
500 - 17,0 ±12,8 6,0 ±1,8
600 11,0 ± 7,1 -
Tabulka 3: Účinek elektrických pulzů pole různé intenzity na transfekci plazmidu pXL3031 do myšího fibrosarkomu, jsou uvedeny průměrné hodnoty exprese luciferázy v RLU ± střední chyba průměru (SEM). Podmínky: intenzita elektrického pole uvedena ve.V/cm jak je uvedeno v tabulce, aplikováno 8 pulzů délky 20 ms při frekvenci 1 Hz.
Ve srovnání s kontrolními skupinami bez elektropřenosu se ukazuje, že aplikace elektrického pole s intenzitou 300 až 600 V/cm umožňuje zesílení transfekce 30x až 70x bez ohledu na použité napětí.
Příklad 9
Elektropřenos nukleové kyseliny do myšího melanomu
Experiment byl proveden na myších C57B1/6 s hmotností 18 až 20 g. Myším bylyimplantovány jednostranně štěpy nádorů
B16 o objemu 20 mm3. Nádory se vyvíjely a dosáhly cílové velikosti '200 až 300 mm3. Myši pak byly rozděleny podle velikosti nádoru do homogenních skupin.
♦ · 0 0 0 • 0 0000 »00 00 0 • · · 0. «0 « «0 0
0 0 0 0 0 0
000 00 00
Ostatní v příkladu 6.
Výsledky podmínky experimentu jsou uvedeny v tab. 4.
byly stejné jako
Experiment 1
V/cm průměr SEM
0 1,3 ±0,7
300 14,3 ±7,6
500 32,2 ± 12,6
600 17,2 ± 6, 2
Tabulka 4: Účinek pulzů elektrického pole s různou intenzitou na transfekci DNA plazmidu pXL3031 byl injikován do myšího melanomu B16, jsou uvedeny průměrné hodnoty exprese luciferázy v RLU se střední chybou průměru (SEM) na jeden nádor. Podmínky: intenzita elektrického pole uvedena ve V/cm jak je uvedeno v tabulce, aplikováno 8 pulzů délky 20 ms při frekvenci 1 Hz.
Ve srovnání s kontrolními skupinami bez elektropřenosu se ukázalo, že aplikace elektrického pole s intenzitou 500 V/cm umožňuje zesílení transfekce až 24x.
Příklad 10
Elektropřenos nukleové kyseliny do myšího nádoru 3LL
Experiment byl proveden na myších C57B1/6 s hmotností 18 až 20 g. Myším byly implantovány jednostranně štěpy nádorů 3LL o objemu 20 mm3. Velikost transfekovaných nádorů pět dnů po implantaci byla 30 mm3. Podmínky experimentu byly shodné s příkladem 6. Výsledky jsou uvedeny v tab. 5.
4 4
4 4 • · 4 • · · 4
4 · 9 ·
4 4444 4 4
4 4 4
4 4
V/cm průměr SEM
0 0, 1 ± 0, 04
300 3,7 ±2,9
500 470, 5 ± 237,6
600 53,3 ± 23, 9
Tabulka 5: Účinek elektrických pulzů pole s různou intenzitou na transfekci plazmidu pXL3031 do myšího plicního karcinomu 3LL, uvedeny jsou průměrné hodnoty exprese luciferázy v RLU ± střední chyba průměru , (SEM) na jeden nádor. Podmínky: intenzita elektrického pole uvedena ve V/cm jak je uvedeno v tabulce, aplikováno 8 pulzů délky 20 ms při frekvenci 1 Hz.
Aplikace elektrického pole s intenzitou 500 V/cm umožnila zvýšit expresi transgenu 3885 x.
Tyto pozoruhodné výsledky byly způsobeny zejména tím, že tyto nádory jsou velmi obtížně transfekovatelné samotnou DNA pokud je DNA jednoduše injikována bez elektropřenosu.
Příklad 11
Elektropřenos nukleové kyseliny do lidského plicního nádoru H1299, účinek na sekreci lidské secernovatelné alkalické fosfatázy do plazmy
V tomto příkladu byla použita DNA plazmidu pXL3010 (obr. 6), který obsahuje gen kódující lidskou secernovanou alkalickou fosfatázu.
Plazmid pXL3010 je vektor odvozený z z ColEl, do kterého byl vložen gen kódující secernovanou alkalickou fosfatázu z pSEAP-basic (Clontech, Genbank: CVU09660) pod kontrolu promotoru CMV získaného z plazmidu pCDNA3, (Invitrogen, Holandsko) a po.lyadenylační signál pozdního úseku viru SV40 (GenBank SV4CG).
9 99 9 ·· 99 • · · 9 9 99 · 9 9 9
9999 99 9 999«
9 9999 99 9 9 99 999
9 99 9 9999
9 99 999 99 99
Experiment byl proveden na nahých myších s hmotností 18 až 20 g. Myším byly implantovány jednostranně štěpy nádorů H1299 o objemu 20 mm'1. Nádory se vyvíjely a dosáhly velikosti 200 až 300 mm3. Myši pak byly rozděleny podle velikosti nádorů do homogenních skupin.
Nádory byly transfekovány za podmínek aplikace jako v příkladu 6, až na to, že bylo užito jediné napětí, a sice 500 V/cm, pulzy délky 20 ms a frekvence 1Hz.
Měření koncentrace sérové alkalické fosfatázy v krevním séru bylo prováděno pomocí komerčně dostupného testu Phosphalight (Tropix, Bedford, Massachusetts, USA) a sice 1, 2 a 8 dnů '(Dl, D2, D8) po transfekci buďto pomocí elektropřenosu nebo bez. Výsledky jsou uvedeny v tab. 6.
plazmatická hladina alkalické fosfatázy
čas vyhodnocení 0 V/cm (průměr ± SEM) 500 V/cm (průměr ±'SEM)
Dl 1,42 ± 0,07 8, 90 ± 1,74
D2 1,40 ± 0,01 9, 04 ± 1,55
D8 • 1,31 ± 0, 01 1,67 ± 0,12
Tabulka 6: Účinek elektrických pulzů na sekreci exogenního proteinu: sekrece lidské alkalické fosfatázy po injekci plazmidu pXL3010 do lidského plicního karcinomu H1299, uvedeny jsou průměrné hodnoty alkalické fosfatázy (ng/1) se střední . chybou průměru (SEM). Podmínky: intenzita elektrického pole ve V/cm dle tabulky, 8 pulzů délky 20 ms·, frekvence 1 Hz.
Všechny výsledky uvedené v příkladech 6 až 11 ukazují, že elektropřenos nukleových kyselin v podmínkách podle vynálezu umožňuje výrazně zvýšit hladinu exprese transgenu v různých typech nádorů. Kromě toho, v případě transgenu kódujícího secernovaný protein, aplikace plazmidu do nádoru pomocí elektropřenosu umožnila výrazně zvýšit koncentraci secernovaného proteinu.
• · • · • · · · • · ·· • ·· • · · · • ♦ · · ·····* · • · · • · · · • * · · • · · · • · · t ·. · · · · • · · · • · · · ·
36
Příklad 12
Vliv prodloužení doby elektrického pulzu
Tento příklad ilustruje skutečnost, že je možné
prodloužit trvání jednotky 'pulzu ještě nad hodnoty, které
byly zkoušeny v příkladu 4.
Pokus byl proveden s myšmi C57B1/6, použit byl plazmid pXL2774, množství podané DNA bylo 15 μμ. Byl užit generátor elektrických pulzú, poskytující délku pulzú větší než 20 ms (Centronics, model T 820, Centronics, San Diego, CA) . Byl užit proměnlivý počet pulzů a doba pulzu, ale při konstantní intenzitě pole 200 V/cm, ostatní podmínky byly shodné jako v příkladu 1. Výsledky jsou uvedeny v tab. 7.
Trvání pulzu (ms) 0 1 5 10 20 30 40 50 60 80
Experiment A 8 pulsů 11 ±5' 39 ±6 211 ±26 288 ±46 1158 ±238 1487 ±421 2386 ±278
Experiment B 4 pulsy 11 ±5 26,8 ±6 123 ±17 246 ±32 575 ±88 704 ±130 34 4 0 ±1077
Experiment C 4 pulsy 15 ±8 2885 ±644 2626 ±441 1258 ±309
Tabulka 7: Průměrná hodnota aktivity· luciferázy v milionech relativních jednotek (RLU) na sval ± střední chyba průměru (SEM), v každé skupině N=10. Podmínky elektropřenosu: intenzita pole 200 V/cm, 8 nebo 4 pulzy (proměnlivé trvání jednotky), frekvence 1 Hz.
Byla pozorována zvýšená exprese transgenu při prodloužení trvání jednotky pulzů (na alespoň 40 ms při aplikaci série 8 pulzů nebo na alespoň 50 ms při aplikaci série 4 pulzů při intenzitě pole 200 V/cm). Tento přiklaď ukazuje, že , optimální doba trvání pulzu závisí na počtu ·· · 99
9 9 9 9
9 9 9 9 9
99999 9 9 9
9 9 9 9
9 99
9 9 9
9 9 ·
9 9 9
9 9 9
99 aplikovaných pulzů a že trvání jednotky pulzů může dosáhnout až, 80 ms,. přičemž tato hodnota není limitující.
Příklad 13
Účinnost elektropřenosu v závislosti na počtu elektrických pulzů
Tento příklad demonstruje vliv rostoucího počtu pulzů na účinnost elektropřenosu nukleových kyselin.
V pokusu byly použity myši C57B1/6, použit byl plazmid pXL2774, množství podané DNA bylo 15 gg. .Proměnlivý byl počet pulzů, doba pulzu byla 20 ms, intenzita pole 200 V/cm. Ostatní podmínky pokusu byly stejné jako v příkladu 1. Výsledky jsou uvedeny v tab. 8.
Počet pulzů 0 1 2 4 6 8 12 16
celkem RLU 70 ± 56 147 + 26 281 ± 46 439 ± 50 678 ± 129 819' + 73 929 i 169 890 ± 137
Tabulka 8: Průměrná hodnota exprese luciferázy v milionech relativních jednotek (RLU) na sval ± střední chyba průměru (SEM), v každé skupině N=10. Podmínky elektropřenosu: intenzita pole 200 V/cm, proměnlivý počet pulzů délky 20 ms, frekvence 1 Hz.
Bylo pozorováno, že exprese luciferázy se podstatně zvyšovala počínaje aplikací jediného pulzu a pak se dále zvyšovala se zvyšujícím se počtem pulzů. Ukázalo se tedy, že variací počtu pulzů se může modulovat účinnost přenosu nukleové kyseliny a tím regulovat hladina exprese transgenu.
Bylo také potvrzeno snížení variability odpovědi demonstrované snížením hodnoty střední chyby průměru
• · · · · • · · ♦ · * • ♦···· · · • · · · · relativně k hodnotě průměru pro všechny skupiny, u kterých byl aplikován elektropřenos.
Příklad 14
Účinek zvyšování frekvence elektrických pulzů
Tento příklad ukazuje, že rostoucí frekvence pulzů překvapivě umožňuje zvýšit účinnost transfekce. Navíc, z hlediska klinického použití, pulzy s vyšší frekvencí zvyšují komfort pacienta tím, že se snižuje celkový čas aplikace.
V tomto pokusu byly použity myši C 57B1/6. Použitý plazmid byl pXL2774, množství podané DNA bylo 15 gg. Frekvence se v pokusu měnila (od 0,1 do 4 Hz) .. Doba pulzu byla 20 ms, intenzita pole 200 V/cm. Ostatní experimentální podmínky byly stejné jako v příkladu 1. Výsledky tohoto pokusu jsou uvedeny v tab. 9.
Frekvence (Hertz) 0 0, 1 0,2 ' 0, 5 1 2 3· 4
ExperimentA 8 pulsů 5 ±2 54 ±13 95 ±16 405 ±60 996 ±156 1528 ±257
Experiment B 4 pulsy 114 ±14 163 ±24 175 ±26 337 ±53 587 ±90
Experiment C 8 pulsů 21 ±14 1294 ±189 2141 ±387 3634 ±868 2819 ±493
Experiment D 4 pulsy 1451 ±228 1572 ±320 1222 ±126 2474 ±646
Tabulka 9: Průměrná hodnota aktivity luciferázy v milionech relativních jednotek (RLU) na sval ± střední chyba průměru (SEM), N=10 v každé skupině. Podmínky elektropřenosu:
intenzita pole 200 V/cm, 8 nebo 4 pulzy, délka pulzu 20 ms, proměnlivá frekvence.
39 • 9 9 9· * 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9999999 9 9 · * 9 9 99 9 99 9 99 99 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 99 99
Výsledky získané v pokusu A' ukázaly, že vyšší
frekvence (větší nebo rovna 1 Hz) jsou účinnější než nízké
frekvence, které odpovídají delší době mezi následujícími
pulzy (10 s při 0,1 Hz). Transfekční ·účinnost se zvyšovala s frekvencí v testovaném rozmezí od 0,1 do 4 Hz při 4 pulzech a od 0,1 do 3 Hz při aplikaci 8 pulzů.
Příklad 15
Vliv aplikace elektrického pole exponenciálně se zmenšujícího v závislosti na čase
Tento příklad ukazuje účinek aplikace exponenciálně se snižujícího elektrického pole na účinnost přenosu nukleových kyselin.
V tomto pokusu byly užity myši C57B1/6.
V pokuse byl užit plazmid pXL3031 (obr. 12), což je vektor odvozený z plazmidu pXL2774, do kterého byl vložen gen luc+ kódující modifikovanou (cytoplazmatickou) luciferázu z Photinus pyralis získanou z pGL3basic (GenBank: CVU47295) pod kontrolu promotoru získaného z časného úseku cytomegaloviru (hCMV IE, GenBank HS51EE) s polyadenylační signálem z pozdního úseku viru SV40 (GenBank SV4CG). Bylo podáno 10 pg DNA.
Byl použit zdroj elektrických pulzů, který umožňoval aplikovat pulzy elektrického pole s intenzitou měnící se podle exponenciálně klesající funkce v závislosti na čase (Equibio elektropulzátor, model Easyject Plus, Kent, UK). Uvedená velikost aplikovaného napětí odpovídá hodnotě napětí v maximu exponenciály. Druhým nastavitelným parametrem byla kapacitance (v gF) , která umožňovala kontrolovat celkové ·· ·
4 44
• »4 « 4 4 4
4 94 44 • 44 • 4 4
4 • 4 • 4
4 množství dodané energie exponenciální časovou konstantu. Výsledky jsou uvedeny v tab. 10.
Kapacit 150μΓ Kapacit 300μΗ Kapacit 450μΕ Kapacit 600μΗ Kapacit 1200μΗ Kapacit 2400μΗ Kapacit 3000μΓ
40 V/cm 1,23 11'
100 V/cm 16, 5 2, 8 6, 5 23, 9
150 V/cm 1,8 3, 5 .6,1
200 V/cm 5, 1 15,8 18, 8 121,5 189, 7
300 V/cm 32, 1 90, 5 4 8,7 760, 4 56, 2
400 V/cm 795
600 V/cm 62
8 0 0 \t / cm 3, 1 1,1
Tabulka 10: Faktor zvýšení exprese (aktivity luciferázy)po aplikaci exponenciálně se snižujících pulzů. faktor zvýšení je vypočten vzhledem ke kontrole, která byla získána injekcí plazmidu pXL3031 bez elektropřenosu (uvedeny jsou průměrné hodnoty faktoru zvýšení, v každém testu bylo N = 4 až N = 6.
Pro srovnání uvádíme, že faktor zvýšení exprese pro přenos pXL3031 při aplikaci obdélníkových pulzů (intenzita pole 200 V/cm, 8 pulzů délky 20 ms, s frekvencí 1 Hz) byl v témže pokusu 44.
Tyto výsledky ukazují, že je možné užít obdélníkové elektrické pulzy exponenciálně se snižujícího elektrického pole. Kromě toho v takovém případě bylo dosaženo podstatného zvýšení exprese při nízké intenzitě pole s vyšší kapacitancí (např. 200 V/cm a kapacitance 3000 μΕ) nebo při vysoké intenzitě pole s nižší kapacitancí . (např. 400 V/cm a kapacitance 300 μΗ).
• · . · »
• ·<
• · • · • · • · ·· ·· ·<
• c · • · · • · · • · · · ·· «»
Příklad 16
Účinek kombinace krátkého pulzu vysokého napětí a několika dlouhých pulzů nízkého napětí
Tento příklad ukazuje, že aplikované elektrické pole může být kombinací alespoň jednoho pulzu silného pole 500 až 800 V/cm' s krátkou dobou trvání, např. 50 nebo 100 με, a alespoň jednoho pulzu slabého pole (méně než 100 V/cm) s delší dobou trvání, např. delší než 1 ms až do 90 ms, jak bylo užito v tomto experimentu.
Slabé elektrické pole v tomto experimentu mělo intenzitu 80 V/cm a bylo aplikováno ve 4 pulzech a dobou jednoho pulzu 90 ms a s .frekvencí 1 Hz. Byla použita dvě komerční Elektrické pak druhýma elektropulzní zařízení aplikovány jedním a pulzy byly nejdříve zařízením,' změna se vteřina pomocí ruční kratší než uskutečnila v době kontroly.
Plazmid použitý v tomto pokusu .byl pXL3031. Podané množství DNA bylo 3 pg. Byly použity hodnoty intenzity elektrického pole, jak jsou uvedeny v tab. 5, ostatní experimentální podmínky byly shodné s příkladem 1.
Vlastnosti elektrického pole Pokus 1 (3 μα pXL3031) Pokus 2 (3 pg pXL3031)
Kontroly (bez elektrického pole) 320 ± 126 75 ± 27
Al : 500 V/cm , 1 x 0.1 ms - 169 ± 63
A3 : 800 V/cm , 1 x 0.1 ms 416 ± 143 272 ± 84
B : 80 V/cm , 4 x 90 ms, 1 Hz 1282 ± 203 362,21' ± 85, 17
Podmínky: Al, pak B - 1479 ± 276
Podmínky: A3, pak B 3991 ± 418· 1426 ± 209
Podmínky: B, pak A3 - 347 ± 66
Tabulka 5: Střední hodnoty luciferázové aktivity ± střední chyba průměru (SEM) v milionech RLU na sval. V každé skupině N = 10.
• · · 4 · · ·· · · • · · 4 4 4 4 4 4 4 4 • · · · 4 4 « 4444 • · 4444 44 * 4 44 ·4 · •4 4 44 4 · 4 4 4 ·· 4 ·'.» 444 44 «·
Tabulka 5, shrnující výsledky získané ve dvou sériích experimentů, ukazuje, že aplikace krátkého vysokonapěťového pulzu, nebo 4 dlouhých nízkonapěťových po sobě následujících pulzú, jen málo zvyšuje · transfekční účinnost ve srovnání s· kontrolní skupinou, která dostala injekci plazmidu pXL3031 ale nebyla vystavena působení elektrického pole. Totéž platí, když se aplikují slabé pulzy před pulzem vysokého' napětí.
Na druhou stranu, . v obou sériích pokusů kombinace krátkého vysokonapěťového pulzu následovaného čtyřmi po sobě jdoucími pulzy nízkého napětí zřetelně vedla ke zvýšení účinnosti transfekce DNA.
Jak bylo ukázáno v příkladu 1 a 2, aplikace 8 pulzů při intenzitě 600, 800 nebo 1200 V/cm po dobu 1 ms s frekvencí
Hz způsobovala svalové léze a inhibovala
Výsledky získané v příkladu 16 ukázaly, že za podmínek je možné použít vysokonapěťové pole, způsobilo léze. A skutečně podle makroskopické vyšetření svaly nebyly nikdy viditelně poškozeny. Užití vysokonapěťové pole s krátkou dobou trvání' v kombinaci se slabým polem delšího trvání poskytuje další prostředek ' pro modulaci účinnosti přenosu DNA.
transfekci.
'popsaných aniž by
Příklad 17
Vliv okamžiku, kdy je injikován plazmid, vzhledem k aplikaci elektrického pole
Tento příklad ilustruje skutečnost, že nukleové kyseliny mohou být podávány přinejmenším 30 minut, a dokonce přinejmenším 1 hodinu před aplikací elektrického pole.
V pokusu byly užity myši C57B1/6. Použitý plazmid byl pXL2774 a·množství podané DNA bylo 15 pg nebo 1,5 pg. Podání DNA předcházela nebo následovala aplikace elektrického pole: intenzita 200 V/cm, 8 pulzů délky 20 ms,· frekvence 1 Hz. Ostatní experimentální podmínky byly stejné jako v příkladu 1. Kontrolní myši obdržely injekci plazmidů, ale nebyly vystaveny elektrickým pulzům. Získané výsledky jsou uvedeny v tab. 12.
Tabulka 12 A: Injekce DNA bez aplikace elektrického pole
Exp 1 PXL2774 (15 pg) Exp 2 pXL2774 (15 pg) Exp 3 pXL2774 (1,5 pg) Exp 4 PXL2774 (15 pg) Exp 5 pXL2774 (1,5 pg)
kontrola 7 + 4 8 + 6 0.410.2 22 + 15 111
Tabulka 12 B: Injekce DNA před aplikací elektrického pole
čas Exp 1 Exp 2 Exp 3 Exp 4 Exp 5
-120 minut 2 0 + 5 2 + 1
-60 minut 106+22 10 +3
-30 minut· 303 ± 36 237 + 61 7 13 184 ± 22 15 ± 4
-5 minut 410 + 7
-60 s . 253 ± 51
-20 s 492 1 122 201 ± 43 9+3 123 + 23 12 + 2
Tabulka 12 C: Injekce DNA po aplikaci elektrického pole
čas Exp 1 Exp 2 Exp 3 Exp 4 Exp 5
+ 10 s 7 + 7
+ 20 s 11 + 6. 0,4 ± 0,1
+ 60 s 8+7 17 ± 15
Tabulka 12: Průměrné hodnoty ± SEM luciferázové aktivity v milionech RLU na sval. V každé skupině N = 10 svalů.
« · • · * ···· «·· ···» · · · ·♦· • ·····«· · · ¢4 ·· .· · ·
Přítomnost DNA v okamžiku aplikace elektrického pole je podmínkou účinné elektrotrnasfekce. Překvapivě' bylo pozorováno, že injekce plazmidové DNA může být aplikována nejméně 30 minut a dokonce až jednu hodinu (pokusy 4 a 5) před aplikací elektrického pole, aniž by tú výrazně ovlivnilo hladinu exprese. Podobné výsledky byly získány s dávkami 15 pg plazmidu na sval a také s 10 x nižšími dávkami 1,5 pg.
.Tyto výsledky umožňují představit si aplikaci několika injekcí stejného plazmidu, nebo různých plazmidů, do svalu v různých okamžicích před aplikací elektrického 'pole. Je také možné aplikovat několik injekcí do rozsáhlé oblasti svalu a pak aplikovat sérii elektrických pulzů na celou injikovanou oblast.
^říklad 18
Přenos genu ' kódujícího erytropoetin (EPO)
Dospělým myším C57B1/6 byl injikován oboustranně do horního holenního svalu plazmid pXL3348 obsahující gen kódující erytropoetin. Plazmid pXL3348 je .vektor odvozený z plazmidu pXL2774, do kterého byl vložen my-ší. genu pro erytropoetin (NCBI: 193086) pod kontrolu promotoru časného úseku lidského cytomegaloviru (hCMV-IE) a polyadenylačního signálu pozdního úseku viru aplikováno elektrické pole
SV40 (Genbank SV4CG). Bylo následujících vlastností:
intenzita 200 V/cm, .8 pulzů délky 20 ms, frekvence 1 Hz.
Elektrické pole bylo aplikováno bezprostředně po injekci plazmidu.
• · · ·
l
fc fcfc fcfc • · · fcfc · • fcfcfcfc • fc ♦ • fcfcfcfc • fc · »-' · ·«
sérová hladina erytropoetinu (mlU/ml) 7. den (D7) sérová hladina erytropoetinu (mlU/ml)
24. den (D24)
plazmid elektropřenos elektropřenos + elektropřenos elektropřenos +
pXL3348 (1 Ml) 0 3.0 ± 1.6 0 '1.12 ±0.8
pXL3348 (10 μ5) 0,9 ± 0,9 61.8 ±15.8 0 74.1 ± 28·. 9
pUC19 (i pg) 0 0
hematokrit % hematokrit % odběr vzorků 24. den (D24)
odběr vzorků 7 . den (D7)
plazmid elektropřenos elektropřenos + elektropřenos elektropřenos +
pXL3348 (1 PO) 38.5 ± 0.5 35.0 ± 3.6 50.8 ±2.3 81 ± 0.5
pXL3348 (10 μg) ' 32.0 ± 3.2 26.0 ± 4.1 69.0 ± 5.1 83.0 ± 1.0
pUC19 (i pg) 30.8 ± 2.3 43.2 ± 0.9
Tabulka 13: Průměrné hodnoty ± SEM, N=4 až 5 ve skupině.
Bylo pozorováno významné zvýšení obsahu erytropoetinu v krvi 7. a 24. den (D7 a D24) po podání 10 mg pXL3348 elektropřenosem. Kromě toho, fyziologický účinek zvýšení erytropoetinu, který vedl ke zvýšení hematokritu, byl velmi vysoký (85 %), a počínaje 7. dnem byl takový dokonce i pro velmi malá množství plazmidu (1 μρ).
• 9 9
9 9 * 9 · « · · · · « · · · · · · • ······· *
9 9 9 « ·· 9 99 9
Příklad 19
Účinek elektropřenosu na expresi vakcinačních transgenu
Tento příklad ukazuje, že způsob podle předkládaného vynálezu je využitelný pro přenos genů kódujících požadované vakcinační peptidy.
Experiment byl proveden na 9 týdnů starých samicích myší Balb/c. Použité elektrody byly ploché elektrody z nerezavějící oceli vzdálené od sebe 5 mm. VR-HA je plazmidová DNA obsahující gen pro hemaglutinin z chřipkového viru (kmen A/PR/8/34). VR-gB je plazmidová DNA obsahující gen pro glykoprotein B (gB) lidského cytomegaloviru (kmen Towne).
Roztok plazmidu (50 μΐ roztoku 20 μg/ml' nebo 200 gg/ml v 0,9% NaCl) byl injikován podélně skrz kůži do horního lýtkového svalu, levé končetiny. Elektrické pulzy byly aplikovány kolmo na osu svalu pomocí generátoru obdélníkových pulzů 20 sekund po injekci (intenzita elektrického , pole 200 V/cm, 8 po sobě jdoucích pulzů dílky 20 ms, frekvence 1 Hz) .
Pro hodnocení stimulace imunitní odpovědi byl použit následující imunizační protokol:
DO byl odebrán vzorek pre-imunního séra
Dl první injekce, s elektropřenosem nebo bez
D2 odebrán vzorek imunního séra
D2 zesilující injekce, s elektropřenosem nebo bez
D42 odebrán vzorek imunního séra
D63 odebrán vzorek imunního séra
Vzorky krevního séra byly odebírány z retroorbitálního sinusu. Množství specifických protilátek bylo stanoveno pomocí ELISA testu. Každé experimentální podmínky byly testovány na 10 zvířatech injikovaných jednostranně.
• · 0 • » 0 0« • 0
« 4 • « 0 0 0 0 « e •
• • • · • · 0 0 4 • 0
• • • 00 0 • · 0 0
• 9 • • * 0 • • 0 0
• 0 9 « 0 • · 0 « · • ·
, Výsledky uvádějící titry protilátek proti chřipkovému hemaglutíninu jsou uvedeny v tab. 14 A.
elektro přenos DO D21 D42 D63
VR-HA (i μς) <50 132 ± 739 1201 ± 4380 . 1314 ± 2481
VR-HA (i μο) + <50 1121 ± 1237 10441 ± 7819 8121 ± 5619
(P) (0.0135)· (0.0022) (0.0033)
VR-HA. (10 μο) <50 781 ± 666 5113 ± 16015 4673 ± 8238
VR-HA (1 ομςτ) + <50 4153 ± 2344 74761 + 89228 41765 ± 52361
(P) (0.0002)' (0.0005) (0.0007)
Tabulka 14-a: Titr protilátek proti chřipkovému hemaglutíninu po injekci 1 nebo 10 ng DNA (VR-HA),. buďto bez (-). a nebo s ( + ) aplikací elektrického pole. Tyto výsledky představují geometrický průměr ze skupin po 10 zvířatech (N=8 pro skupinu injikovanou 1 μg, exponovanou elektrickému poli a testovanou v D63) ± směrodatná odchylka. Hodnota p byla získána srovnáním vždy dvou skupin injikovaných DNA buďto s aplikací elektrického pole nebo bez něho pomocí statistického neparametrického Mann-Whitneyova testu.
Tyto výsledky ukazují, že titr protilátek proti chřipkovému hemaglutíninu výrazně vzrostl, a to asi 10 x, ve skupině, kde byly aplikovány elektrické pulzy. Takže myši, které obdržely 1 pg DNA při současné, aplikaci elektrických pulzů měly mírně vyšší průměrný titr protilátek proti hemaglutíninu než myši, které obdržely 10 μg DNA, ale nebyly podrobeny působení elektrického pole.
Výsledky ukazující protilátkovou reakci namířenou proti
CMV glykoproteinu B jsou uvedeny v tab. 14 B.
·· * • 4 * · * • · · · · 9
9499999 4 • 9 9 4 · · ♦ '49
99 9 9
9 «9 «
9 9 9 9 • * 9 9 9 O
9 9 9 9 ··· »9 49
elektro přenos DO D21 D42 D63
VR-gB (lOjug) - <50 73 ± 138 755 ± 1766 809 ± 1363
VR-gB (lO^tg) + <50 200 ± 119 3057·± 1747 2112 ± 1330
(P) (0.0558) (0.0108) (0.0479)
Tabulka 14-b: Titr protilátek proti CMV glykoproteinu B po injekci 10 gg DNA (VR-gB).buďto bez (-) a nebo s ( + ) 'aplikací elektrických pulzů. Tyto výsledky představují geometrický průměr ze skupin po 10 zvířatech (N=9 pro skupiny exponované elektrickému poli) ± směrodatná odchylka. Hodnota p byla získána srovnáním vždy dvou skupin ,injikovaných DNA buďto s aplikací elektrického pole nebo bez, pomocí statistického neparametrického Mann-Whitneyova testu.
Tyto výsledky ukazují, žé titr anti-gB protilátek vzrostl 4 x do 42. dne (D42) ve skupině podrobené působení elektrických pulzů. Bylo také pozorováno, že koeficient rozptylu byl 3x menší u skupiny myší po aplikaci elektrických pulzů.

Claims (9)

PATENTOVÉ NÁROKY
1/10
9 · ♦ *
9 ·
9 ·
9 ·
9 9
9« 9 ·♦ ·· « «99 9 99 *
9 9 9 »999
99 »99 99 9
1. Použití nukleové kyseliny k výrobě léčiva pro genovou terapii k vnesení do buněk vícebuněčných eukaryotických organizmů in vivo tím, že buňky tkáně jsou přivedeny do kontaktu s nukleovou kyselinou, která má být do nich vnesena, přímým podáním do tkáně nebo topickým či systémovým podáním, a že přenos je proveden tím, že se na tkáň působí jedním nebo několika elektrickými pulzy s intenzitou 1 až 600 V/cm.
2. Použití podle nároku 1, kdy buňky mají zvláštní uspořádání (jsou to velké buňky a/nebo mají podlouhlý tvar a/nebo přirozeně reagují na elektrický akční potenciál a/nebo mají specifickou morfologii).
3. Použití podle nároku 1, kdy intenzita elektrického pole je 200 až 600 V/cm.
4 9 4 4 · 4 • 4 4 4 · · • 4 • · ·
444« 4 9
44 4·
88. Použití podle nároku 86 nebo 87, kdy elektrické pulzy jsou unipolární.
89. Použití podle kteréhokoliv z nároků 86 až 88, kdy intenzita elektrického pole je 4 až 400 V/cm.
4 9
99 4 44 « 4 4 4 9
9 9 4 4 4 9 • 4 9449 9 4 9
4 · objem tkáně, která je transfekována, tím, že se užije více míst k podávání.
83. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 44 až
82 vyznačující se tím, že umožňuje modulovat množství exprimovaného transgenu tím, že se moduluje počet, tvar, povrch a uspořádání elektrod, a tím, že se mění intenzita, počet, trvání, frekvence a tvar pulzů, a také tím, že se mění množství a objem podávané nukleové kyseliny.
84. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 44 až
83 vyznačující se tím, že umožňuje kontrolovat lokalizaci transfekované tkáně prostřednictvím objemu tkáně vystavené lokálním elektrickým pulzům.
85. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 44 až
84 vyznačující se tím, že umožňuje návrat do počátečního stavu tím, že se odstraní oblast transfekované tkáně.
86. Použití nukleové kyseliny pro výrobu léku pro genovou terapii, který se vnáší do buněk nebo tkání vícebuněčných eukaryotických organismů, přičemž buňky nebo tkáně jsou stimulovány elektrickým proudem s intenzitou pole 1 až 800 V/cm.
87. Použití podle nároku 86, kdy kontakt se provádí přímým podáním do buněk nebo tkání nebo topickým nebo systémovým podáním.
4 4 4 4 4 • 4 peptid, který nebo adhezního nebo zkrácený imunoterapie, nebo kóduje rozpustný receptor, je agonistou nebo antagonistou receptorů proteinu, nebo kóduje umělý, chimérický protein.
72. Sdružený produkt podle nároku 71 vyznačující se tím, že nukleová kyselina kóduje antiidiotypovou protilátku, rozpustný fragment receptorů CD4 nebo receptorů TNFa nebo acetylcholinového receptorů.
73. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 69 až 72 vyznačující se tím, že nukleová kyselina kóduje prekurzor terapeutického proteinu.
74. Sdružený produkt podle 73 vyznačující se je ve formě plazmidu.
kteréhokoliv z nároků 44 až tím, že nukleová kyselina
75. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 44 až 73 vyznačující se tím, že nukleová kyselina obsahuje gen velkého rozsahu a/nebo introny a/nebo regulační prvky malého nebo velkého rozsahu.
76. Sdružený produkt podle 73 vyznačující se t episomální DNA nebo umělý miniohromosom.
77. Sdružený produkt podle 76 vyznačuj ící kteréhokoliv z nároků 44 až i m, že nukleová kyselina je kvasinkový chromosom nebo kteréhokoliv z nároků 44 až tím, že nukleová kyselina ·· · ·· · ·· ·· ♦ ·· · · ♦ φ»»· • · · * · · · · · ♦ · « • · ···· · · · ···· · · 9 9 · ··· · · · · · · · • · · · · « · · · · obsahuje sekvence, které umožňují a/nebo podporují expresi transgenů ve svalu.
78. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 44 až 77 vyznačující se tím, že nukleová kyselina je spojena s jakýmkoliv typem vektoru nebo s jakoukoliv kombinací vektorů pro zlepšení přenosu nukleové kyseliny, jako jsou viry, syntetická nebo biosyntetická činidla nebo propulzní či jiné částice (perličky).
79. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 44 až
78 vyznačující se tím, že sval se podrobí ošetření, jehož cílem je zlepšit přenos genu, kteréžto ošetření je farmakologické povahy lokální nebo systémovou cestou nebo se jedná o ošetřeni enzymatické, permeabilizující, chirurgické, mechanické, tepelné nebo fyzikální povahy.
80. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 44 až
79 vyznačující se tím, že umožňuje to, aby tkáň produkovala činidlo ve fyziologické a/nebo terapeutické dávce, přičemž činidlo buďto zůstává v buňkách tkáně nebo je vylučováno.
81. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 44 až 79 vyznačující se tím, že umožňuje modulovat množství exprimovaného transgenů tím, že se moduluje objem tkáně, která je transfekována.
82. Sdružený vyznačuj ící produkt podle m, že nároku 81 umožňuje modulovat « · · • · 4 · • ···· · · • ♦ ·
4 4 ·
4 · ·
4444 4 4 • 4
4 4
4 4 4 4 9 9 4 4 · · · · • ······· ······· ·· · jsou vybrány ze skupiny obsahující pulzy typu obdélníkových kmitů, exponenciálně tlumených kmitů, oscilujících unipolárních kmitů omezeného trvání, oscilujících bipolárních kmitů omezeného trvání a dalších tvarů kmitů.
54. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 44 až
53 vyznačující se tím, že elektrické pulzy obsahují pulzy obdélníkových kmitů.
55. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 44 až
54 vyznačující se tím, že elektrické pulzy se aplikují externě.
56. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 44 až 54 vyznačující se tím, že elektrické pulzy se aplikují uvnitř tkáně.
57. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 44 až 56 vyznačující se tím, že nukleová kyselina se injikuje do tkáně.
58. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 44 až 56 vyznačující se tím, že nukleová kyselina se injikuje systémovým způsobem.
59. Sdružený produkt podle nároku 58 vyznačující se tím, že nukleová kyselina se injikuje intraarteriálním nebo intravenózním způsobem.
60. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 44 až 56 vyznačující se tím, že nukleová kyselina se podává způsobem topickým, kutánním, perorálním, vaginálním, intranasálním, subkutánním nebo intraokulárním.
61. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 44 až 60 vyznačující se tím, že nukleová kyselina je obsažena v přípravku, který navíc obsahuje farmaceuticky přijatelné excipienty pro různé způsoby podávání.
62. Sdružený produkt podle nároku 61 vyznačující se tím, že přípravek je vhodný pro parenterální podávání.
63. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 44 až 62 vyznačující se tím, že nukleová kyselina je deoxyribonukleová kyselina.
64. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 44 až 62 vyznačující se tím, že nukleová kyselina je ribonukleová kyselina.
65. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 44 až 64 vyznačující se tím, že nukleová kyselina je syntetického nebo biosyntetického původu, nebo je izolována z viru, z jednobuněčného nebo vícebuněčného eukaryotického organismu nebo z prokaryotického organismu.
66. Sdružený produkt podle nároku 65 vyznačující se tím, že podávaná nukleová kyselina je spojena s některými nebo všemi složkami organismu, ze kterého pochází, a/nebo systému, který byl užit pro její syntézu.
·* • · φ φφφ • φ φ φφφ φ φφφ φ φφφ φ φφφφφφφ φφφφφ • ♦ φ · φ φφφ φ φ φ φ «φ φ φφ φ φφ * ·
67. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 44 až 66 vyznačující se tím, že nukleová kyselina kóduje požadovanou RNA nebo požadovaný protein.
68. Sdružený produkt podle nároku 67 vyznačuj ící se tím, že RNA je katalytická RNA nebo antisense RNA. 69. Sdružený produkt podle nároku 67
vyznačující se tím, že nukleová kyselina kóduje protein vybraný ze skupiny obsahující enzymy, krevní deriváty, hormony, lymfokiny, růstové faktory, trofické faktory, angiogenní faktory, neurotrofické faktory, růstové faktory kostí, hematopoetické faktory, koagulační faktory, antigeny a proteiny účastnící se metabolismu aminokyselin, lipidů a dalších esenciálních složek buňky.
70. Sdružený produkt podle nároku 69 vyznačující se tím, že nukleová kyselina kóduje angiogenní faktory VEGF a FGF, neurotrofické faktory BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, FGF1, NT3, NT5, protein GAX, inzulín k léčení diabetů, růstový hormon, cytokin, a-1antitripsin, kalcitonin, leptin a apolipoproteiny, enzymy biosyntézy vitamínů, hormony a neuromediátory.
71. Sdružený produkt podle nároku 67 vyznačující se tím, že nukleová kyselina kóduje protilátku, variabilní fragment jednořetězcové protilátky (ScFv) nebo jakýkoliv protilátkový fragment, který má vhodnou rozpoznávací schopnost pro účely • 4
4 9 4 4 4 4 4 4 4 ·
4 4 4 « ♦ 4 4 *
4 4« 4
4 4 · 4
4 4«· · · * 4 4444 4 4 4 • 4 4 4 4 4
44 4 44 · • 4 44 « ·· 4
4 4 4 4 4
4. Použití podle nároku 1, kdy intenzita elektrického pole je 500 V/cm.
5. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, kdy celková doba aplikace elektrického pole je delší než 10 ms.
6. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, kdy aplikace elektrického pole na tkáň obsahuje jeden nebo několik pulzů s pravidelnou frekvencí.
9 · • 444
7. Použití podle nároku 6, kdy aplikace elektrického pole na tkáň obsahuje 1 až 100 000 pulzů s frekvencí 0,1 až 1000 Hz.
8. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, kdy elektrické pulzy jsou aplikovány vzájemně nepravidelným způsobem, a že funkce popisující závislost intenzity elektrického pole na čase pro jeden pulz je proměnlivá.
9. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8, kdy integrál funkce popisující proměnlivost elektrického pole v čase má hodnotu větší než 1 kV x ms/cm.
10. Použití podle nároku 9, kdy integrál je větší než 5 kV x ms/cm.
11. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10, kdy elektrické pulzy jsou vybrány ze skupiny obsahující pulzy typu obdélníkových kmitů, exponenciálně tlumených kmitů, oscilujících unipolárních kmitů omezeného trvání, oscilujících bipolárních kmitů omezeného trvání a dalších forem kmitů.
12. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 11, kdy elektrické pulzy obsahují pulzy obdélníkových kmitů.
13. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12, kdy elektrické pulzy se aplikují elektrodami, které jsou umístěny z obou stran tkáně, na kterou se působí, nebo jsou umístěny v kontaktu s kůží.
·· · ·»· · • · · · · · • · · > · · · · • · ···· · · · ···» · • · · · · · ·· · ** · ·· ·► • · · <
* · · · • ♦ » · • · · ♦ ·· ··
14. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12, kdy elektrické pulzy se aplikují elektrodami, které jsou vloženy do vnitřku tkáně, na kterou se působí.
15. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 14, kdy nukleová kyselina se injikuje do tkáně. 16. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 14, kdy nukleová kyselina se injikuje systémovým způsobem. 17. Použití podle nároku 16, kdy nukleová kyselina se
injikuje intraarteriálním nebo intravenozním způsobem.
18. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 14, kdy nukleová kyselina se podává způsobem topickým, kutánním, perorálním, vaginálním , intranasálním , subkutánním nebo intraokulárním. 19. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 18, kdy
nukleová kyselina je obsažena v přípravku, který navíc obsahuje farmaceuticky přijatelné excipienty pro různé způsoby podávání.
20. Použití podle nároku 19, kdy přípravek je vhodný pro parenterální podávání.
21. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 20, kdy nukleová kyselina je deoxyribonukleová kyselina.
22. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 20, kdy nukleová kyselina je ribonukleová kyselina.
• · · · · · ·
23. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 22, kdy nukleová kyselina je syntetického nebo biosyntetického původu, nebo je izolována z viru, z jednobuněčného nebo vícebuněčného eukaryotického organismu nebo prokaryotického organismu.
24. Použití podle nároku 23, kdy podávaná nukleová kyselina je spojena s některými nebo všemi složkami organismu, ze kterého pochází, a/nebo systému, který byl užit pro její syntézu.
25. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 24, kdy nukleová kyselina kóduje požadovanou RNA nebo požadovaný protein.
26. Použití podle nároku 25, kdy RNA je katalytická RNA nebo antisense RNA.
27. Použití podle nároku 25, kdy nukleová kyselina kóduje protein vybraný ze skupiny obsahující enzymy, krevní deriváty, hormony, lymfokiny, růstové faktory, trofické faktory, angiogenní faktory, neurotrofické faktory, růstové faktory kostí, hematopoetické faktory, koagulační faktory, antigeny a proteiny zúčastněné v metabolismu aminokyselin, lipidů a dalších esenciálních složek buňky.
28. Použití podle nároku 27, kdy nukleová kyselina kóduje angiogenní faktory VEGF a FGF, neurotrofické faktory BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, FGF1, NT3, NT5, protein GAX, inzulín k léčení diabetů, růstový hormon, cytokin, a-1• · · ··· ···· • ··· · ··· · ·· · • ······· ······· · · · antitripsin, kalcitonin, leptin a apolipoproteiny, enzymy biosyntézy vitamínů, hormony a neuromediátory.
29. Použití podle nároku 25, kdy nukleová kyselina kóduje protilátku, variabilní fragment jednořetězcové protilátky (ScFv) nebo jakýkoliv jiný protilátkový fragment, který má vhodnou rozpoznávací schopnost pro účely imunoterapie, nebo kóduje rozpustný receptor, peptid, který je agonistou nebo antagonistou receptoru nebo adhezního proteinu, nebo kóduje umělý, chimérický nebo zkrácený protein.
30. Použití podle nároku 29, kóduje antiidiotypovou protilátku, receptoru CD4 nebo receptoru TNFa receptoru.
kdy nukleová kyselina rozpustný fragment nebo acetylcholinového
31. Použití podle kteréhokoliv z nároků 27 až 30, kdy nukleová kyselina kóduje prekurzor terapeutického proteinu.
32. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 31, kdy nukleová kyselina je ve formě plazmidu.
33. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 31, kdy nukleová kyselina obsahuje gen velkého rozsahu a/nebo introny a/nebo regulační prvky malého nebo velkého rozsahu.
34. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 31, kdy nukleová kyselina je episomální DNA nebo umělý kvasinkový chromosom nebo minichromosom.
• · • · • · • · • · · • · · · ·
35. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 34, kdy nukleová kyselina obsahuje sekvence, které umožňují a/nebo podporují expresi transgenu ve tkáni.
36. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 35, kdy nukleová kyselina je spojena s jakýmkoliv typem vektoru nebo s jakoukoliv kombinací vektorů pro zlepšení přenosu nukleové kyseliny, jako jsou viry, syntetická nebo biosyntetická činidla nebo propulzní či jiné částice (perličky).
37. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 36, kdy tkáň se podrobí ošetření, jehož cílem je zlepšit přenos genu, kteréžto ošetření je farmakologické povahy lokální nebo systémovou cestou nebo se jedná o ošetření enzymatické, permeabilizující, chirurgické, mechanické, tepelné nebo fyzikální povahy.
38. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 36, které umožňuje to, aby tkáň produkovala činidlo ve fyziologické a/nebo terapeutické dávce, přičemž činidlo buďto zůstává v buňkách nebo je vylučováno.
39. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 38, které umožňuje modulovat množství exprimovaného transgenu tím, že se moduluje objem tkáně, která je transfekována.
40. Použití podle nároku 39, které umožňuje modulovat objem tkáně, která je transf ekována, tím, že se užije více míst k podávání.
41. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 40, které umožňuje modulovat množství exprimovaného transgenu tím, že se moduluje počet, tvar, povrch a uspořádání elektrod, a tím, že se mění intenzita pole, počet, trvání, frekvence a tvar pulzů, a také tím, že se mění množství a objem podávané nukleové kyseliny.
42. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 41, které umožňuje kontrolovat lokalizaci transfekované tkáně prostřednictvím objemu tkáně vystavené lokálním elektrickým pulzům.
43. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 42, které umožňuje návrat do počátečního stavu tím, že se odstraní oblast transfekované tkáně.
44. Nukleová kyselina a elektrické pole s intenzitou 1 až 600 V/cm, jako sdružený produkt, vyznačuj ící se tím, že je určen pro jejich samostatnou nebo časově oddělenou aplikaci do/na tkáně in vivo, a pro genovou terapii
založenou nukleové na in kyseliny. vivo elektrotransf ekci tkání po podání 45. Sdružený produkt podle nároku 44 vyzná č u j í i o i se tím, že intenzita elektrického pole je 200 až 600 V/cm. 46. Sdružený produkt podle nároku 44
vyznačující se tím, že intenzita elektrického pole je 500 V/cm.
47. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 44 až
46 vyznačující se tím, že celková doba aplikace elektrického pole je delší než 10 ms.
48. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 44 až
47 vyznačující se tím, že aplikace elektrického pole na tkáň obsahuje jeden nebo několik pulzů s pravidelnou frekvencí.
49. Sdružený produkt podle nároku 48 vyznačující se tím, že aplikace elektrického pole na tkáň obsahuje 1 až 100 000 pulzů s frekvencí 0,1 až 1000 Hz.
50. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 44 až 47 vyznačující se tím, že elektrické pulzy jsou aplikovány navzájem nepravidelným způsobem, a že funkce popisující závislost intenzity elektrického pole na čase pro jeden pulz je proměnlivá.
51. Sdružený produkt podle kteréhokoliv z nároků 44 až 50 vyznačující se tím, že integrál funkce popisující proměnlivost elektrického pole v čase má hodnotu větší než 1 kV x ms/cm.
51. Sdružený produkt podle nároku 51 vyznačující se tím, že integrál je větší než 5 kV x ms/cm.
53. Sdružený produkt vyznačuj ící podle kteréhokoliv z nároků 44 až tím, že elektrické pulzy
.//77,:
« 44 4 44 44
9 9 9 9 9 9 9 «9 999 '99 99
Účinek elektrických pulzů s vysokou intenzitou pole na transfekci plazmidové DNA pXL2774 do horního holenního svalu myši, uvedena průměrná hodnota ± střední chyba průměru (SEM).
CZ0475499A 1997-06-30 1998-06-30 Lécivo pro genovou terapii, které se vnáší do nádoru za aplikace slabého elektrického pole, a kombinovaný produkt pro genovou terapii CZ299638B6 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9708232A FR2765241B1 (fr) 1997-06-30 1997-06-30 Amelioration du transfert d'acide nucleique dans les cellules d'organismes eucaryotes pluricellulaires et combinaison permettant la mise en oeuvre du procede
US6748797P 1997-12-01 1997-12-01

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ475499A3 true CZ475499A3 (cs) 2000-07-12
CZ299638B6 CZ299638B6 (cs) 2008-10-01

Family

ID=26233647

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ0475499A CZ299638B6 (cs) 1997-06-30 1998-06-30 Lécivo pro genovou terapii, které se vnáší do nádoru za aplikace slabého elektrického pole, a kombinovaný produkt pro genovou terapii

Country Status (16)

Country Link
US (1) US6528315B2 (cs)
EP (1) EP0991425B1 (cs)
JP (1) JP4664450B2 (cs)
KR (1) KR20010020570A (cs)
CN (1) CN1261808A (cs)
AT (1) ATE290403T1 (cs)
AU (1) AU8444698A (cs)
BR (1) BR9810372A (cs)
CA (1) CA2294802A1 (cs)
CZ (1) CZ299638B6 (cs)
DE (1) DE69829287T2 (cs)
HU (1) HUP0004728A3 (cs)
IL (1) IL133708A0 (cs)
NO (1) NO327499B1 (cs)
PL (1) PL337584A1 (cs)
WO (1) WO1999001157A1 (cs)

Families Citing this family (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6884430B1 (en) 1997-02-10 2005-04-26 Aventis Pharma S.A. Formulation of stabilized cationic transfection agent(s) /nucleic acid particles
WO1998043702A2 (en) * 1997-04-03 1998-10-08 Iacob Mathiesen Method for introducing pharmaceutical drugs and nucleic acids into skeletal muscle
US6261281B1 (en) 1997-04-03 2001-07-17 Electrofect As Method for genetic immunization and introduction of molecules into skeletal muscle and immune cells
AU2868200A (en) * 1999-02-08 2000-08-25 Chiron Corporation Electrically-mediated enhancement of dna vaccine immunity and efficacy in vivo
CA2377565A1 (en) * 1999-06-25 2001-01-04 Genetronics, Inc. High efficiency transfection based on low electric field strength, long pulse length
CA2398995C (en) * 2000-02-04 2014-09-23 Children's Hospital Research Foundation Lipid hydrolysis therapy for atherosclerosis and related diseases
US7223395B2 (en) 2000-03-13 2007-05-29 Cornell Research Foundation, Inc. Blocking leukocyte emigration and inflammation by interfering with CD99/HEC2
AU5345901A (en) 2000-04-13 2001-10-30 Univ Rockefeller Enhancement of antibody-mediated immune responses
US6928318B2 (en) 2000-05-22 2005-08-09 Merck & Co., Inc. System and method for assessing the performance of a pharmaceutical agent delivery system
US6821274B2 (en) 2001-03-07 2004-11-23 Gendel Ltd. Ultrasound therapy for selective cell ablation
EP1353723A2 (en) 2000-11-17 2003-10-22 Gendel Limited Ablation of cells using combined electric field and ultrasound therapy
DE60144198D1 (de) 2000-12-28 2011-04-21 Wyeth Llc Rekombinantes schutzprotein aus streptococcus pneumoniae
CN1610556A (zh) 2001-03-02 2005-04-27 洛克菲勒大学 保留天然变应原的免疫原性并具减弱的变应原性的重组杂合变应原构建体
US20040023910A1 (en) * 2001-09-28 2004-02-05 Zhiming Zhang Use of cyr61 in the treatment and diagnosis of human uterine leiomyomas
MX339524B (es) 2001-10-11 2016-05-30 Wyeth Corp Composiciones inmunogenicas novedosas para la prevencion y tratamiento de enfermedad meningococica.
WO2003047684A2 (en) * 2001-12-04 2003-06-12 University Of Southern California Method for intracellular modifications within living cells using pulsed electric fields
US7472563B2 (en) 2002-01-17 2009-01-06 Alfa Laval Corporate Ab Submerged evaporator with integrated heat exchanger
FR2836831B1 (fr) * 2002-03-07 2004-06-25 Centre Nat Rech Scient Combinaison chimiotherapie et antisens de la dna demethylase
US20050154434A1 (en) 2002-03-07 2005-07-14 Adam Simon Clinical syringe with electrical stimulation aspects
US20030198625A1 (en) * 2002-04-19 2003-10-23 Genteric, Inc. Electroporation-mediated transfection of the salivary gland
DE60324417D1 (de) 2002-05-23 2008-12-11 Gendel Ltd Ablationsvorrichtung
NZ554740A (en) 2002-05-24 2009-01-31 Schering Corp Neutralizing human anti-IGFR antibody
EP1578974A4 (en) * 2002-12-31 2006-02-08 Univ Johns Hopkins METHOD AND KIT FOR SUBSTITUTING INJURY
US20050059999A1 (en) * 2003-09-15 2005-03-17 Mongeon Luc R. Delivering genetic material to a stimulation site
EP1763321A4 (en) 2004-04-16 2010-02-17 Critical Care Innovations Inc SYSTEMS AND METHOD FOR ENHANCING ABLATION OF IMAGE-GUIDED FABRIC
US8101169B2 (en) * 2005-02-23 2012-01-24 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Ocular gene therapy using avalanche-mediated transfection
US7923251B2 (en) * 2005-02-23 2011-04-12 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method and apparatus for avalanche-mediated transfer of agents into cells
WO2007005898A2 (en) 2005-07-05 2007-01-11 Cornell Research Foundation, Inc. Blocking leukocyte emigration and inflammation by interfering with cd99l2
WO2007030375A2 (en) * 2005-09-08 2007-03-15 Children's Hospital Medical Center Lysosomal acid lipase therapy for nafld and related diseases
PL1991303T3 (pl) 2006-03-03 2021-10-11 Oncosec Medical Incorporated Sposób i urządzenie do leczenia mikroskopowych nowotworów pozostałych w tkankach po resekcji chirurgicznej
WO2008060813A2 (en) 2006-10-19 2008-05-22 Merck & Co., Inc. High affinity antibody antagonists of interleukin-13 receptor alpha 1
US8613925B2 (en) 2006-10-19 2013-12-24 Csl Limited Anti-IL-13Rα1 antibodies and their uses thereof
AR064642A1 (es) 2006-12-22 2009-04-15 Wyeth Corp Polinucleotido vector que lo comprende celula recombinante que comprende el vector polipeptido , anticuerpo , composicion que comprende el polinucleotido , vector , celula recombinante polipeptido o anticuerpo , uso de la composicion y metodo para preparar la composicion misma y preparar una composi
KR20100100868A (ko) * 2007-11-14 2010-09-15 브이지엑스 파마수티컬즈, 엘엘씨 전기천공에 의해 전달되는 ｄｎａ 백신에 의해 유도되는 항체의 생산 방법
US8093043B2 (en) 2008-06-04 2012-01-10 New York University β-TrCP1, β-TrCP2 and RSK1 or RSK2 inhibitors and methods for sensitizing target cells to apoptosis
WO2010053986A1 (en) 2008-11-05 2010-05-14 Wyeth Multicomponent immunogenic composition for the prevention of beta-hemolytic streptococcal (bhs) disease
WO2012025873A2 (en) 2010-08-23 2012-03-01 Wyeth Llc STABLE FORMULATIONS OF NEISSERIA MENINGITIDIS rLP2086 ANTIGENS
JP5976652B2 (ja) 2010-09-10 2016-08-24 ワイス・エルエルシー 髄膜炎菌ｏｒｆ２０８６抗原の非脂質化変異体
US9078878B2 (en) 2010-12-01 2015-07-14 Alderbio Holdings Llc Anti-NGF antibodies that selectively inhibit the association of NGF with TrkA, without affecting the association of NGF with p75
US9884909B2 (en) 2010-12-01 2018-02-06 Alderbio Holdings Llc Anti-NGF compositions and use thereof
US9539324B2 (en) 2010-12-01 2017-01-10 Alderbio Holdings, Llc Methods of preventing inflammation and treating pain using anti-NGF compositions
WO2012075340A2 (en) 2010-12-01 2012-06-07 Alderbio Holdings Llc Anti-ngf compositions and use thereof
US9067988B2 (en) 2010-12-01 2015-06-30 Alderbio Holdings Llc Methods of preventing or treating pain using anti-NGF antibodies
US11214610B2 (en) 2010-12-01 2022-01-04 H. Lundbeck A/S High-purity production of multi-subunit proteins such as antibodies in transformed microbes such as Pichia pastoris
US9592398B2 (en) 2011-05-12 2017-03-14 Medtronic, Inc. Leadless implantable medical device with osmotic pump
EP3485906A1 (en) 2012-03-09 2019-05-22 Pfizer Inc Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
SA115360586B1 (ar) 2012-03-09 2017-04-12 فايزر انك تركيبات لعلاج الالتهاب السحائي البكتيري وطرق لتحضيرها
WO2014107739A1 (en) 2013-01-07 2014-07-10 Eleven Biotherapeutics, Inc. Antibodies against pcsk9
CA2903716C (en) 2013-03-08 2019-04-09 Pfizer Inc. Immunogenic fusion polypeptides
KR20180099912A (ko) 2013-09-08 2018-09-05 화이자 인코포레이티드 나이세리아 메닌지티디스 조성물 및 그의 방법
US10888611B2 (en) 2015-02-19 2021-01-12 Pfizer Inc. Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
WO2017151409A1 (en) 2016-02-29 2017-09-08 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Chemotherapeutic methods
SG10202111092UA (en) 2017-01-31 2021-11-29 Pfizer Neisseria meningitidis compositions and methods thereof

Family Cites Families (68)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4301794A (en) 1978-10-18 1981-11-24 Robert Tapper Method for iontophoretic treatment
US4411657A (en) 1980-05-19 1983-10-25 Anibal Galindo Hypodermic needle
JPS5810066A (ja) 1981-07-10 1983-01-20 株式会社アドバンス イオントフオレ−ゼ用プラスタ−構造体
US4441972A (en) 1983-04-08 1984-04-10 D.E.P. Systems, Inc. Apparatus for electrofusion of biological particles
US4476004A (en) 1983-04-08 1984-10-09 D.E.P. Systems, Inc. Apparatus for electrofusion of biological particles
US4639244A (en) 1983-05-03 1987-01-27 Nabil I. Rizk Implantable electrophoretic pump for ionic drugs and associated methods
DE3317415A1 (de) 1983-05-13 1984-11-15 Kernforschungsanlage Jülich GmbH, 5170 Jülich Kammer zur behandlung von zellen im elektrischen feld
US4557723A (en) 1983-08-18 1985-12-10 Drug Delivery Systems Inc. Applicator for the non-invasive transcutaneous delivery of medicament
US4622031A (en) 1983-08-18 1986-11-11 Drug Delivery Systems Inc. Indicator for electrophoretic transcutaneous drug delivery device
US4578168A (en) 1984-07-27 1986-03-25 Biotronics Apparatus for fusing live cells with electric fields
US4663292A (en) 1984-12-21 1987-05-05 Wong Daniel T High-voltage biological macromolecule transfer and cell fusion system
US4702732A (en) 1984-12-24 1987-10-27 Trustees Of Boston University Electrodes, electrode assemblies, methods, and systems for tissue stimulation and transdermal delivery of pharmacologically active ligands
AT385894B (de) 1985-10-04 1988-05-25 Basem Dr Nashef Schlauchfoermige sonde
US5049488A (en) 1985-11-08 1991-09-17 Genentech, Inc. Method and nucleic acid for the preparation of lecithin:cholesterol acyltransferase
US4695547A (en) 1986-04-02 1987-09-22 Jeffrey L. Hilliard Probe for electrofusion, electroporation, or like procedure
US4786277A (en) 1986-11-21 1988-11-22 Trustees Of Boston University Electrodes, electrode assemblies, methods, and systems for tissue stimulation
US5371003A (en) 1987-05-05 1994-12-06 Sandoz Ltd. Electrotransformation process
US5128257A (en) 1987-08-31 1992-07-07 Baer Bradford W Electroporation apparatus and process
US4970154A (en) 1987-10-09 1990-11-13 Baylor College Of Medicine Method for inserting foreign genes into cells using pulsed radiofrequency
US5389069A (en) 1988-01-21 1995-02-14 Massachusetts Institute Of Technology Method and apparatus for in vivo electroporation of remote cells and tissue
ATE131081T1 (de) 1988-01-21 1995-12-15 Massachusetts Inst Technology Molekültransport durch gewebe mit der verwendung von elektroporation.
US5547467A (en) 1988-01-21 1996-08-20 Massachusettes Institute Of Technology Method for rapid temporal control of molecular transport across tissue
US5749847A (en) 1988-01-21 1998-05-12 Massachusetts Institute Of Technology Delivery of nucleotides into organisms by electroporation
US5119832A (en) 1989-07-11 1992-06-09 Ravi Xavier Epidural catheter with nerve stimulators
US5124259A (en) 1989-08-23 1992-06-23 Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. Method for electroporation
US5236413B1 (en) 1990-05-07 1996-06-18 Andrew J Feiring Method and apparatus for inducing the permeation of medication into internal tissue
US5081990A (en) 1990-05-11 1992-01-21 New York University Catheter for spinal epidural injection of drugs and measurement of evoked potentials
ATE123658T1 (de) 1990-06-15 1995-06-15 Cortrak Medical Inc Vorrichtung zur abgabe von medikamenten.
US5499971A (en) 1990-06-15 1996-03-19 Cortrak Medical, Inc. Method for iontophoretically delivering drug adjacent to a heart
US5501662A (en) 1992-05-22 1996-03-26 Genetronics, Inc. Implantable electroporation method and apparatus for drug and gene delivery
US5814603A (en) 1992-06-12 1998-09-29 Affymax Technologies N.V. Compounds with PTH activity
US5607691A (en) 1992-06-12 1997-03-04 Affymax Technologies N.V. Compositions and methods for enhanced drug delivery
JPH063783A (ja) 1992-06-19 1994-01-14 Fuji Photo Film Co Ltd ハロゲン化銀カラー写真感光材料
US5304120A (en) 1992-07-01 1994-04-19 Btx Inc. Electroporation method and apparatus for insertion of drugs and genes into endothelial cells
JP3099049B2 (ja) * 1992-07-29 2000-10-16 農林水産省果樹試験場長 電気的細胞融合及び電気的核酸導入のための大量処理用電極
US5273525A (en) 1992-08-13 1993-12-28 Btx Inc. Injection and electroporation apparatus for drug and gene delivery
US5464386A (en) 1992-08-17 1995-11-07 Genetronics, Inc. Transdermal drug delivery by electroincorporation of vesicles
US5688233A (en) 1992-08-17 1997-11-18 Genetronics, Inc. Electronincorporation enhanced transdermal delivery of molecules
US5462520A (en) 1992-08-17 1995-10-31 Genetronics, Inc. Transsurface drug delivery by electrofusion of microbubbles to the tissue surface
US5318514A (en) 1992-08-17 1994-06-07 Btx, Inc. Applicator for the electroporation of drugs and genes into surface cells
JP3351572B2 (ja) 1992-10-05 2002-11-25 井上 聰一 イオンクロマトグラフィーによる分析体の分離・分析方法、イオンクロマトグラフィー用両荷電具備固定相及び多機能液体クロマトグラフィーによる分析体の分離・分析方法
US5468223A (en) 1992-11-30 1995-11-21 C.N.R.S. Paris Electrochemotherapy
FR2703253B1 (fr) 1993-03-30 1995-06-23 Centre Nat Rech Scient Applicateur d'impulsions electriques pour traitement de tissus biologiques.
US5993434A (en) 1993-04-01 1999-11-30 Genetronics, Inc. Method of treatment using electroporation mediated delivery of drugs and genes
US5439440A (en) 1993-04-01 1995-08-08 Genetronics, Inc. Electroporation system with voltage control feedback for clinical applications
US5702359A (en) 1995-06-06 1997-12-30 Genetronics, Inc. Needle electrodes for mediated delivery of drugs and genes
GB9317380D0 (en) * 1993-08-20 1993-10-06 Therexsys Ltd Transfection process
US5849719A (en) 1993-08-26 1998-12-15 The Regents Of The University Of California Method for treating allergic lung disease
US5804566A (en) 1993-08-26 1998-09-08 The Regents Of The University Of California Methods and devices for immunizing a host through administration of naked polynucleotides with encode allergenic peptides
US5679647A (en) 1993-08-26 1997-10-21 The Regents Of The University Of California Methods and devices for immunizing a host against tumor-associated antigens through administration of naked polynucleotides which encode tumor-associated antigenic peptides
DE4341424A1 (de) 1993-12-04 1995-06-08 Bosch Gmbh Robert Kraftstoffeinspritzpumpe
IL108775A (en) 1994-02-25 2003-09-17 Univ Ramot Method for efficient incorporation of molecules into cells
EP0765397A1 (en) * 1994-06-17 1997-04-02 Nederlandse Organisatie Voor Toegepast-Natuurwetenschappelijk Onderzoek Tno Method for introduction of genetic material into microorganisms and transformants obtained therewith
EP0766579A1 (en) 1994-06-24 1997-04-09 Cygnus, Inc. Pulsatile delivery systems of biologically active agents using electro voltage pulsing for controlling membrane permeability
IT235163Y1 (it) 1994-10-10 2000-03-31 Ideal Standard Spa Gruppo di tenuta per elementi maschio di stampi per la colatura di apparecchiature igienico-sanitarie
US5641680A (en) * 1994-11-14 1997-06-24 Zhao; Xi Gene transfer apparatus and method for using the same
US5810762A (en) 1995-04-10 1998-09-22 Genetronics, Inc. Electroporation system with voltage control feedback for clinical applications
AU5659696A (en) * 1995-05-18 1996-11-29 Takara Shuzo Co., Ltd. Nucleic acid molecule for treating b cell malignant tumor, p rocess for producing the same and utilization of the same
WO1997007826A1 (en) * 1995-08-29 1997-03-06 Cbr Laboratories, Inc. In vivo electroporation of cells
US5944710A (en) 1996-06-24 1999-08-31 Genetronics, Inc. Electroporation-mediated intravascular delivery
US5944726A (en) 1996-08-23 1999-08-31 Scimed Life Systems, Inc. Stent delivery system having stent securement means
US5960974A (en) 1996-10-03 1999-10-05 Advance Engineered Products Ltd. Intermodal bulk container
JPH10234366A (ja) 1997-02-26 1998-09-08 Hisamitsu Pharmaceut Co Inc エレクトロポレーション用電極及びその製法、それを用いた製剤
WO1998043702A2 (en) 1997-04-03 1998-10-08 Iacob Mathiesen Method for introducing pharmaceutical drugs and nucleic acids into skeletal muscle
HUP0004589A3 (en) * 1997-06-30 2003-08-28 Centre Nat Rech Scient Improved method for transferring nucleic acid into the striped muscle and combination therefor
US6055453A (en) 1997-08-01 2000-04-25 Genetronics, Inc. Apparatus for addressing needle array electrodes for electroporation therapy
WO1999036563A1 (en) 1998-01-14 1999-07-22 Emed Corporation Electrically mediated cellular expression
EP2428250A1 (en) 1998-07-13 2012-03-14 Genetronics, Inc. Skin and muscle-targeted gene therapy by pulsed electrical field

Also Published As

Publication number Publication date
DE69829287T2 (de) 2006-04-13
KR20010020570A (ko) 2001-03-15
NO996541D0 (no) 1999-12-29
CZ299638B6 (cs) 2008-10-01
DE69829287D1 (de) 2005-04-14
EP0991425A1 (fr) 2000-04-12
JP4664450B2 (ja) 2011-04-06
US6528315B2 (en) 2003-03-04
EP0991425B1 (fr) 2005-03-09
PL337584A1 (en) 2000-08-28
CN1261808A (zh) 2000-08-02
HUP0004728A3 (en) 2003-08-28
NO996541L (no) 2000-02-17
ATE290403T1 (de) 2005-03-15
BR9810372A (pt) 2000-09-05
AU8444698A (en) 1999-01-25
NO327499B1 (no) 2009-07-20
IL133708A0 (en) 2001-04-30
CA2294802A1 (fr) 1999-01-14
HUP0004728A1 (hu) 2001-04-28
JP2002507984A (ja) 2002-03-12
WO1999001157A1 (fr) 1999-01-14
US20020012914A1 (en) 2002-01-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ475499A3 (cs) Použití nukleové kyseliny pro výrobu léčiva pro genovou terapii, které se vnáší do buněk vícebuněčných eukaryotických organismů
US6939862B2 (en) Method for transferring nucleic acid into striated muscles
KR100377889B1 (ko) 핵산을함유하는조성물,제조및용도
CA2295029A1 (en) Device for optimized electrotransfer of nucleic acid vectors to tissues in vivo
Dean Nonviral gene transfer to skeletal, smooth, and cardiac muscle in living animals
Wang et al. Combination of electroporation and DNA/dendrimer complexes enhances gene transfer into murine cardiac transplants
MXPA99011444A (es) Metodo mejorado de transferencia de acidos nucleicos enmusculo estraido y combinaciones que permienn el uso del procedimiento
AU4576202A (en) Improvement in the transfer of nucleic acid into the cells of pluricellular eukaryotic organisms and combination allowing the method to be carried out
FR2765241A1 (fr) Amelioration du transfert d&#39;acide nucleique dans les cellules d&#39;organismes eucaryotes pluricellulaires et combinaison permettant la mise en oeuvre du procede
AU4439102A (en) Improved method for transferring nucleic acid into the striped muscle and combination therefor
FR2765242A1 (fr) Amelioration du transfert d&#39;acide nucleique dans le muscle strie et combinaison permettant la mise en oeuvre du procede
US20050004055A1 (en) Increasing electro-gene transfer of nucleic acid molecules into host tissue
CZ475699A3 (cs) Systém a zařízení pro in vivo přenos nukleových kyselin do tkání
Bathula et al. Gene therapy with plasmid DNA
MXPA99011527A (en) Device for optimized electrotransfer of nucleic acid vectors to tissues in vivo

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MK4A Patent expired

Effective date: 20180630