MXPA99011444A - Metodo mejorado de transferencia de acidos nucleicos enmusculo estraido y combinaciones que permienn el uso del procedimiento - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a la mejoría de la transferencia in vivo deácidos nucleicos oácidos nucleicos asociados a productos que permiten aumentar el rendimiento de tales transferencias, en células de músculos estriados y a la combinación de unácido nucleico y el procedimiento de transferencia de conformidad con la presente invención para su uso en terapia génica.

Description

MÉTODO MEJORADO DE TRANSFERENCIA DE ÁCIDOS NUCLEICOS EN MÚSCULO ESTRIADO Y COMBINACIONES QUE PERMITEN EL USO DEL PROCEDIMIENTO Descripción de la invención: La presente invención se refiere a un método mejorado de transferencia in vivo, en células de músculo estriado, de ácidos nucleicos o de ácidos nucleicos asociados a productos que permiten aumentar el rendimiento de tales transferencias y a la combinación" de un ácido nucleico y el procedimiento de transferencia de conformidad con la presente invención, para su utilización en terapia génica. La transferencia de genes a una célula dada es la base de la terapia génica. Sin embargo, uno de los problemas es conseguir una manera de introducir una cantidad de ácido nucleico suficiente en las células del huésped a tratar; en efecto, este ácido nucleico, en general un gen de interés, debe ser expresado en las células transfectadas. Uno de los enfoques a este respecto es la integración del ácido nucleico a vectores virales, en particular en retrovirus, adenovirus o virus asociados a los adenovirus. Estos sistemas sacan provecho de los mecanismos de penetración celular desarrollados por los virus, así como de su protección contra la degradación. No obstante, este enfoque presenta inconvenientes y en REF.: 32136 particular un riesgo de producción de partículas virales infecciosas susceptibles de diseminarse en el organismo del huésped y, en el caso de los vectores retrovirales, un riesgo de mutagénesis por inserción. Además, la capacidad de inserción de un gen terapéutico o de vacuna en un genoma viral, es de residencia limitada. En todo caso, el desarrollo de vectores virales útiles en terapia génica, impone recurrir a técnicas complejas de virus defectuosos y lineas celulares de complementación. . Otro enfoque (Wolf et al . , Science 247, 1465-8, 1990; Davis et al . , Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 93, 7213-18, 1996) consiste en administrar en el músculo o en la circulación, un ácido nucleico de naturaleza plasmídica asociado o no con compuestos destinados a favorecer su transfección, tales como proteínas, liposomas, lípidos cargados o polímeros catiónicos tales como polietilenimina, que son buenos agentes de transfección in vi tro (Behr et al . , Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 86, 6982-6, 1989; Felgner et al . , Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 84, 7413-7, 1987; Boussif et al . , Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 92, 7297-301, 1995) . Después de la publicación inicial de J. A. olff et al . , demostrando la capacidad del tejido muscular para incorporar el ADN inyectado en forma de plásmido libre ( olff et al . , Science 247, 1465-1468, 1990), numerosos autores han intentado mejorar este proceso (Manthorpe et al . , 1993, Human Gene Ther. 4, 419-431; Wolff et al., 1991, BioTechniques 11, 474-485) . Algunas tendencias se desprenden de estos ensayos, principalmente: • el uso de soluciones mecánicas para forzar la entrada del ADN en las células, adsorbiendo el ADN en microesferas que después son impulsadas sobre los tejidos ("gene gun") (Sanders Williams et al . , 1991, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 88, 2726-2730; Fyan et al . , 1993, BioTechniques 11, 474-485). Estos procedimientos han comprobado ser eficaces en estrategias de vacunación, pero no tocan más que las capas superficiales de los tejidos. En el caso del músculo, su utilización necesitaría una intervención quirúrgica para permitir acceder al músculo, ya que las partículas no atraviesan en tejido cutáneo; • la inyección de ADN, ya no en forma de plásmido libre, sino asociado a moléculas susceptibles de servir como vehículo que facilite la entrada de los complejos en las células. Los lípidos catiónicos, utilizados en muchos otros procedimientos de transfección, han comprobado hasta la fecha ser decepcionantes en cuanto a una aplicación en tejido muscular, ya que los que se han probado han - - demostrado ser inhibidores de la transfección (Schwartz et ai., 1996, Gene Ther. 3, 405-411). Es lo mismo para los péptidos y polímeros catiónicos (Manthorpe et al . , 1993, Human Gene Ther. 4, 419- 431) . El único caso de asociación favorable parece ser la mezcla de alcohol polivinílico o polivinilpirrolidona con ADN. El aumento resultante en estas asociaciones no representa más que un factor inferior a 10 con respecto a ADN inyectado desnudo (Mu per et al . , 1996, Pharmaceutical Research 13, 701-709) ; el pretratamiento del músculo a inyectar con i soluciones destinadas a mejorar la difusión y/o la estabilidad del ADN (Davis et ai., 1993, Hum. Gene Ther. 4, 151-159), o a favorecer la entrada de los ácidos nucleicos, por ejemplo la inducción de fenómenos de multiplicación o de regeneración celular. Los tratamientos se han concentrado particularmente en el uso de anestésicos locales o cardiotoxina, vasoconstrictores, endotoxina u otras moléculas (Manthorpe et al . , 1993, Human Gene Ther. 4, 419-431; Danko et al . , 1994, Gene Ther. 1, 114-121; Vitadello et al . , 1994, Hum. Gene Ther. 5, 11-18).

Estos protocolos de pretratamiento son difíciles de manejar, la bupivacaína en particular, para ser eficaz necesita ser inyectada a dosis muy cercanas a la dosis letal. La preinyección de sacarosa hiperosmótica destinada a mejorar la difusión, no aumenta el nivel de la transfección en músculo (Davis et al . , 1993) . La electroporación o utilización de campos eléctricos para permeabilizar las células, igualmente se utiliza in vi tro para favorecer la transfección de ADN en células en cultivo. Sin embargo, hasta la fecha se admite que este fenómeno responde a un efecto que depende de un umbral y que esta electropermeabilización no se podrá observar más que en campos eléctricos de intensidad relativamente elevada, del orden de 800 a 12Q0 Voltios/cm para células animales. De la misma manera, esta técnica se ha propuesto in vivo para mejorar la eficacia de agentes antitumorales, como la bleomicina, en tumores sólidos en seres humanos (Patente Norteamericana No. 5,468,228, L. M.

Mir) . Con impulsos de muy corta duración (100 microsegundos) , estas condiciones eléctricas (800 a 1200 Voltios/cm) se adaptan muy bien a la transferencia intracelular de pequeñas moléculas. Estas condiciones (impulsos de 100 microsegundos) se han aplicado sin mejoría para la transfección de ácidos nucleicos in vivo en el hígado, en donde los campos inferiores a 1000 Voltios/cm han demostrado ser totalmente ineficaces, e inhibidores con - respecto a la inyección de ADN en ausencia de impulsos eléctricos (Patente WO 97/07826 y Heller et al . , FEBS Letters, 389, 225-8, 1996) . Además, esta técnica presenta dificultades de aplicación in vivo, ya que la administración de campos de tal intensidad puede provocar lesiones tisulares más o menos extensas, que no representan un problema para el tratamiento de tejidos tumorales, pero que pueden representar un gran inconveniente para sujetos sanos o para enfermos en los que el ácido nucleico se administra en otros tejidos que no son tumorales, en particular en músculo estriado. Aunque todos los estudios citados mencionan la I necesidad de campos eléctricos elevados, del orden de 1000 Voltios/cm, para ser eficaces in vivo, de manera inesperada y remarcable, los solicitantes han demostrado que la transferencias de ácidos nucleicos en músculos in vivo se puede aumentar de manera muy importante, sin efectos indeseables, sometiendo al músculo a impulsos eléctricos de poca intensidad, por ejemplo de 100 ó de 200 Voltios/cm y de una duración relativamente prolongada. Además, los solicitantes han constatado que la gran variabilidad de expresión del transgén observada en la técnica anterior de transferencia de ADN en músculo, se reduce notablemente mediante el procedimiento de conformidad con la presente invención. Esto es por lo que la presente invención se refiere a un procedimiento de transferencia de ácidos nucleicos en uno o más músculos estriados in vivo, en donde las células de los músculos se ponen en contacto con el ácido nucleico a transferir, mediante la administración directa en el tejido o por administración tópica o sistémica y en donde la transferencia se asegura mediante la aplicación a dichos músculos de una o una pluralidad de impulsos eléctricos de una intensidad comprendida entre 1 y 800 Voltios/cm. De preferencia, la intensidad del campo están comprendida entre 4 y 400 Voltios/cm y la duración total de i la aplicación es superior a 10 milisegundos. El número de impulsos utilizados es por ejemplo de 1 a 100,000 impulsos y la frecuencia de los mismos está comprendida entre 0.1 y 1000 Hertz. De preferencia, la frecuencia de los impulsos está comprendida entre 0.2 y 100 Hertz. Los impulsos también se pueden administrar de manera irregular y la función que describe la intensidad del campo en función al tiempo, puede ser variable. Por ejemplo, el campo eléctrico aplicado puede resultar de la combinación de cuando menos un campo de una intensidad > 400 V/cm y de preferencia comprendido entre 500 y 800 Voltios/cm, de duración unitaria corta (< 1 mseg) , seguido por uno o una pluralidad de impulsos de intensidad más débil, por ejemplo < 400 Voltios/cm y de preferencia < 200 Voltios/cm y de una duración unitaria más prolongada (> 1 mseg) . La integral de la función que describe la variación del campo eléctrico con el tiempo, es superior a 1 kV x mseg/cm. De conformidad con una modalidad preferida de la presente invención, esta integral es superior o igual a 5 kV x mseg/cm. De conformidad con una modalidad preferida de la presente invención, la intensidad del campo de los impulsos está comprendida entre 30 y 300 Voltios/cm. Los impulsos eléctricos se seleccionan del grupo que consiste de impulsos con ondas cuadradas, campos eléctricos que generan ondas con disminución exponencial, ondas unipolares oscilantes de duración limitada, ondas bipolares oscilantes de duración limitada u otras formas de ondas. De conformidad con una modalidad preferida de la presente invención, los impulsos eléctribos son impulsos con ondas cuadradas. La administración de impulsos eléctricos se puede realizar por cualquier método conocido por los técnicos en la materia, por ejemplo: • sistema de electrodos externos colocados en una parte y otra del tejido a tratar, principalmente electrodos no invasivos colocados en contacto con la piel, • sistema de electrodos implantados en los tejidos, • sistema de electrodos/inyector que permite la administración simultánea de los ácidos nucleicos y del campo eléctrico. En el marco de la presente invención, los términos "transferencia de ADN" o "transferencia de ácidos nucleicos" por aplicación de uno o una pluralidad de impulsos eléctricos, así como los términos "electrotransferencia" o "electrotransfección", se deben considerar como equivalentes y que designan la transferencia de ácidos nucleicos o de ADN por aplicación o i en presencia de un campo eléctrico. La administración se realiza in vivo, siendo a veces necesario recurrir a productos intermediarios que aseguren la continuidad eléctrica con los electrodos externos no invasivos. Se trata, por ejemplo, de un electrolito en forma de gel. Los ácidos nucleicos se pueden administrar por cualquier medio apropiado, pero de preferencia se inyectan in vivo directamente en el músculo o se administran por otra vía, local o sistémica, que los vuelva disponibles en el sitio de la aplicación del campo eléctrico. Los ácidos nucleicos se pueden administrar con. agentes que permitan o faciliten la transferencia, tales como aquellos anteriormente mencionados. Principalmente, estos ácidos nucleicos pueden estar libres en solución o asociados con agentes sintéticos, o transportados por vectores virales. Los agentes sintéticos pueden ser lípidos o polímeros conocidos por los técnicos en la materia, o bien, aún pueden ser elementos de dirección al blanco que permitan la fijación sobre la membrana de los tejidos blanco. Entre estos elementos se pueden citar vectores portadores de azúcares, péptidos, anticuerpos o receptores hormonales. Así pues, en la presente invención la administración de los ácidos nucleicos puede preceder, ser simultánea o ser posterior a la aplicación de los campos eléctricos. Éste es el por qué la presente invención igualmente tiene como objetivo un ácido nucleico y un campo eléctrico de una intensidad comprendida entre 1 y 800 Voltios/cm, como producto de combinación para su administración simultánea, por separado o escalonada con respecto al tiempo, en músculo estriado in vivo . De preferencia, la intensidad del campo está comprendida entre 4 y 400 Voltios/cm y, de manera aun más preferida, la intensidad del campo está comprendida entre 30 y 300 Voltios/cm. El procedimiento de conformidad con la presente invención es útil en la terapia génica; es decir, la terapia en la cual la expresión de un gen transferido, pero igualmente la modulación o el bloqueo de un gen, permiten asegurar el tratamiento de una patología particular. De preferencia, las células musculares son tratadas con el fin de una terapia génica que permita: • la corrección de disfunciones de células musculares por parte de ellas mismas (por ejemplo, para el tratamiento de miopatías ligadas a deficiencias genéticas) , • la conservación y/o la regeneración de la vascularización o la innervación del músculo y de otros músculos u órganos por factores tróficos, neurotróficos y angiogénicos producidos por el transgén, • la transformación del músculo en un órgano secretor de productos que conducen a .un efecto terapéutico, tales como el producto del gen mismo (por ejemplo factores de regulación de trombosis y hemostasis, factores tróficos, hormonas como la insulina u otras) o tales como un metabolito activo sintetizado en el músculo gracias a la inclusión del gen terapéutico, • una aplicación como vacuna o inmunoestimulante. Otro objetivo de la presente invención es la asociación de los impulsos eléctricos de un campo a las composiciones que contienen los ácidos nucleicos formulados, con el fin de que su administración permita acceder a un músculo estriado por vía tópica, cutánea, oral, vaginal, parenteral, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutánea, infraocular, transdérmica, etc. De preferencia, las composiciones farmacéuticas de la presente invención contienen un vehículo farmacéuticamente aceptable para una formulación inyectable, principalmente para una inyección directa a nivel del órgano deseado o para cualquier otra administración. Se puede tratar en particular de soluciones estériles, isotónicas o de composiciones secas, principalmente liofilizadas, que mediante la adición según sea el caso de agua esterilizada o de suero fisiológico, permitan la constitución de soluciones inyectables. Las dosis de ácido nucleico utilizadas para la inyección, así como el número de administraciones y el volumen de las inyecciones, se pueden adaptar en función a diferentes parámetros, principalmente i en función de la vía de administración utilizada, la patología en cuestión, del gen por expresar, o aún de la duración del tratamiento requerido. Los ácidos nucleicos pueden ser de origen sintético o biosintético o extraídos de virus o de células procarióticas o de células procarióticas provenientes de organismos unicelulares (por ejemplo levaduras) o pluricelulares. Se pueden administrar en asociación con la - - totalidad o una parte de los componentes del organismo de origen y/o del sistema de síntesis. El ácido nucleico puede ser un ácido desoxirribonucleico o un ácido ribonucleico. Se puede tratar de secuencias de origen natural o artificial y principalmente de ADN genómico, ADNc, ARNm ARNt y ARNr, secuencias híbridas o secuencias sintéticas o semisintéticas de oligonucleótidos modificados o no. Estos ácidos nucleicos se pueden obtener por cualquier técnica conocida por los técnicos en la materia, principalmente por búsqueda en bancos, por síntesis química o aún por métodos mixtos, incluyendo la modificación química o enzimática de secuencias obtenidas por búsqueda en bancos. Estos ácidos se pueden modificar químicamente. En particular, el ácido nucleico puede ser ADN o ARN de sentido o antisentido, o una propiedad catalítica como un ribosoma. El término "antisentido" tal como se utiliza en la presente, se entiende como un ácido nucleico que tiene una secuencia complementaria a una secuencia blanco, por ejemplo una secuencia de ARNm buscada para bloquear la expresión por hibridación sobre la secuencia blanco. El término "sentido" tal como se utiliza en la presente, se entiende como un ácido nucleico que tiene una secuencia homologa o idéntica a una secuencia blanco, por ejemplo una secuencia que se une a un factor de transcripción proteínica y que está implicada en la expresión de un gen dado. De conformidad con una modalidad preferida, el ácido nucleico contiene un gen de interés y elementos que permitan la expresión de dicho gen de interés. Ventajosamente, el fragmento de ácido nucleico está en forma de un plásmido. Los ácidos desoxirribonucleicos pueden ser de cadena simple o de doble cadena, al igual que los oligonucleótidos o secuencias más largas. Pueden ser portadores de genes terapéuticos, de secuencias reguladoras de la transcripción o de la replicación o de regiones de unión con otros componentes celulares, etc. En el sentido de la presente invención, el término "gen terapéutico" tal como se utiliza en la presente, se entiende principalmente como cualquier gen que codifica para un ARN o para un producto proteico que tenga un efecto terapéutico. El producto proteico codificado puede ser una proteína, un péptido, etc. Este producto proteico puede ser homólogo con respecto a la célula blanco (es decir, un producto que es expresado en la célula blanco cuando ésta no presenta ninguna patología) . En este caso, la expresión del transgén permite, por ejemplo, paliar una expresión insuficiente en la célula o la expresión de una proteína inactiva o débilmente activa a causa de una modificación, o permite aún sobre expresar dicha proteína. El gen terapéutico también puede codificar para una mutante de una proteína celular, que tenga una mejor estabilidad, una actividad modificada, etc. El producto proteico igualmente puede ser heterólogo con respecto a la célula blanco. En este caso, una proteína expresada, por ejemplo, puede completar o aportar una actividad deficiente en la célula (tratamiento de miopatías o de defectos enzimáticos) o puede permitir luchar contra una patología o estimular una respuesta inmunitaria. Entre los productos terapéuticos en el sentido de la presente invención, se pueden citar particularmente los genes que codifican para - enzimas, tales como la a-1-antitripsina, proteinasa (metaloproteinasas, urocinasa, uPA, tPA, estreptocinasa) , proteasas que rompen precursores para liberar productos activos (ACE, ICE, ... ) o sus antagonistas (TIMP-1, inhibidor del activador de plasminógeno tisular PAI, TFPI, derivados sanguíneos tales como los factores implicados en la coagulación: factores VII, VIII, IX, factores del complemento, trombina, - hormonas o enzimas implicadas en la vía de síntesis de hormonas o factores implicados en el control de la síntesis o de la excreción o secreción de hormonas, tales como insulina, factores relacionados con la insulina (IGF), hormona del crecimiento, ACTH, enzimas para 1.a síntesis de hormonas sexuales, linfocinas y citocinas: interleucinas, quimiocinas (CXC y CC) , interferones, TNF, TGF, factores quimiotácticos o activadores como MIF, MAF, PAF, MCP-1, eotaxina, LIF, etc. (Patente Francesa No. 9203120), - factores de crecimiento, por ejemplo los factores IGF, EGF, FGF, KGF, NGF, PDGF, PIGF, HGF, proliferina, - factores angiogénicos tales como el VEGF o FGF, angiopoyetina 1 ó 2, endotelina, enzimas para la síntesis de neurotransmisores, - factores tróficos, en particular neurotróficos para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, traumatismos que dañan el sistema nervioso o degeneraciones de la retina, tales como los miembros de la familia de las neurotrofinas tales como la NGF, BCNF, NT3, NT4/5, NT6, sus derivados y genes emparentados - los miembros de la familia CNTF tales como la CNTF, axocina, LIF y sus derivados - la interleucina 6 y sus derivados - la cardiotrofina y sus derivados - el GDNF y sus derivados - los miembros de la familia IGF tales como la IGF-1, IFGF-2 y sus derivados - los miembros de la familia FGF tales como FGF 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y sus - - derivados, el TGFß, - factores de crecimiento óseo, - factores hematopoyéticos tales como la eritropoyetina, GM-CSF, M-CSF, LIF, etc., - proteínas de la arquitectura celular tales como la distrofina o una minidistrofina (Patente Francesa No. 9111947), genes suicidas (timidina cinasa, citocina desaminasa, enzimas del citocromo P450) , genes de la hemoglobina o de otros transportadores proteicos, - genes que corresponden a las proteínas implicadas en el metabolismo de lípidos, del tipo de la apolipoproteína que se seleccionan entre las apolipoproteínas A-I, A-II, A-IV, B, C-I, C-II, C-III, D, E, F, G, H, J y apo(a), enzimas del metabolismo como por ejemplo las lipasas, la lipoproteína lipasa, la lipasa hepática, lecitina colesterol-aciltrasnferasa, la 7-a- i colesterolhidroxilasa, la fosfatidil ácido fosfatasa, o aún proteínas de transferencia de lípidos como la proteína de transferencia de esteres de colesterol y la proteína de transferencia de fosfolípidos, una proteína de enlace de los lípidos de alta densidad (HDL) o aún un receptor que se selecciona, por ejemplo, del grupo que consiste de los receptores de lípidos de baja densidad (LDL) , receptores de quilo icrones-remanentes y receptores de desperdicios, etc.

Además, se puede agregar la leptina para el tratamiento de la obesidad, factores que regulan la presión sanguínea, tales como las enzimas implicadas en el metabolismo del NO, la angiotensina, bradicinina, vasopresina, ACE, renina, enzimas que codifican para los mecanismos de síntesis o de alargamiento de prostaglandinas, tromboxano o adenosina, receptores de la adenosina, calicreínas y calistaminas, ANP, ANF, factores diuréticos o antidiuréticos, factores implicados en la síntesis, metabolismo o alargamiento de mediadores tales como la histamina, serotonina, catecoláminas, neuropéptidos, - factores antiangiogénicos tales como el ligando de Tie-1 y de Tie-2, angiostatina, factor ATF, derivados del • plasminógeno, endotelina, tromboespondinas 1 y 2, PF-4, interferón a o ß, interleucina 12, TNFa, el receptor de la urocinasa, fltl, KDR, PAI1, PAI2, TIMP1, el fragmento prolactina, factores que protegen contra la apoptosis, tales como la familia AKT, proteínas susceptibles de inducir una muerte celular, ya sean activas por ellas mismas como las caspasas, o bien del tipo "profármacos" que necesitan una activación por parte de otros factores, o bien proteínas que activan a los profármacos para provocar una muerte celular, como la timidina cinasa del virus hepático, las desaminasas, que permiten en particular tener en cuenta terapias contra el cáncer, - proteínas implicadas en los contactos y la adhesión intercelulares: VCAM, PECAM, ELAM, ICAM, integrinas, cateninas, - proteínas de la matriz extracelular, proteínas implicadas en la migración de células, proteínas de tipo transducción de señal, como de tipo FAK, MEKK, p38 cinasa, tirocina cinasas, serina-treonina cinasas, - proteínas implicadas en la regulación del ciclo celular (p21, pl6, ciclinas, ... ) así como proteínas mutantes o derivados dominantes negativos que bloquean el ciclo celular y que, llegado el caso, pueden inducir la apoptosis, factores de transcripción: jun, fos, API, p53, ... y proteínas de la cascada de señalización de p53, proteínas estructurales de la célula, tales como los filamentos intermediarios (vimentina, desmina, queratinas) , la distrofina, proteínas implicadas en la contractibilidad y el control de la contractibilidad muscular, en particular proteínas implicadas en el metabolismo del calcio y el flujo de calcio en las células (SERCA, ...) . En el caso de proteínas que funcionan para la síntesis de ligandos y receptores, se puede tener en cuenta utilizar el ligando o el receptor (por ejemplo, FGF-R, VEGR-R, ... ) . De la misma manera, se pueden citar genes que codifican para fragmentos o mutantes de proteínas de ligandos o de receptores, principalmente las proteínas anteriormente citadas, que presentan ya sea una actividad superior a proteína original, o bien que presentan una actividad antagonista, o del tipo "dominante negativo" con respecto a la proteína inicial (por ejemplo fragmentos de receptores que inhiben la disponibilidad de proteínas circulantes, asociados o no con secuencias que inducen una secreción de estos fragmentos con respecto a un anclaje en la membrana celular, u otros sistemas de modificación del tráfico intracelular de sistemas ligando-receptor, de manera que se destruya la disponibilidad de uno de estos elementos) , o bien, que poseen una actividad propia distinta a la de la proteína total (por ejemplo, ATF) . Entre las otras proteínas o péptidos que pueden ser secretados por el músculo, es importante subrayar los i anticuerpos, fragmentos variables de anticuerpos de cadena simple (ScFv) o cualquier otro fragmento de anticuerpo que posea la capacidad de reconocimiento para su utilización en in unoterapia, por ejemplo para el tratamiento de enfermedades infecciosas, tumores, enfermedades autoinmunitarias tales como la esclerosis en placas (anticuerpos antiidiotípicos) , así como los ScFv se fijan sobre las citocinas proimflamatorias tales i como por ejemplo la IL1 y TNFa, para el tratamiento de la artritis reumatoide. Otras proteínas de interés son, de manera no limitante, receptores solubles tales como por ejemplo el receptor CD4 soluble o el receptor soluble del TNF, para la * terapia contra VIH, el receptor TNFa o el receptor soluble de IL1 para el tratamiento de la artritis reumatoide, el receptor soluble de la acetilcolina para el tratamiento de la miastenia; péptidos que son substrato o inhibidores de enzimas, o bien péptidos agonistas o antagonistas de receptores o de proteínas de adhesión, como por ejemplo para el tratamiento del asma, de la trombosis, de la restenosis, de metástasis o de inflamación; proteínas artificiales, químicas o truncadas. Entre las hormonas de interés esencial, se pueden citar la insulina en el caso de la diabetes, la hormona del crecimiento y la calcitonina. También se pueden citar proteínas capaces de inducir una inmunidad antitumoral o estimular la respuesta inmunitaria (IL2, GM-CSF, IL12, etc.). En fin, se pueden citar las citocinas que disminuyen la respuesta THI tales como las interleucinas IL10, IL4 e IL13.

Los numerosos ejemplos que preceden y los siguientes, ilustran el entendimiento potencial del campo de aplicación de la presente invención. El ácido nucleico terapéutico, igualmente, puede ser un gen una secuencia antisentido, cuya expresión en la célula blanco permite controlar la expresión de genes o la transcripción de ARNm celular. Tales secuencias, por ejemplo, pueden ser transcritas en la célula blanco en ARN complementario de ARNm celulares y bloquear de esta manera su traducción en proteínas, de conformidad con la técnica descrita en la Patente Europea No. 140308. Los genes terapéuticos comprenden igualmente secuencias que codifican para ribosomas, que son capaces de destruir selectivamente los ARN blanco (Patente Europea No. 321201) . Tal como se indicó anteriormente, el ácido i nucleico también puede comprender uno o una pluralidad de genes que codifican para un péptido antigénico, capaz de generar en seres humanos o animales una respuesta inmunitaria. En esta modalidad particular, la presente invención permite la realización ya sea de vacunas, o bien de tratamientos inmunoterapéuticos aplicados a seres humanos o animales, principalmente contra microorganismos, virus o cánceres. Se puede tratar principalmente de péptidos antigénicos específicos del virus Epstein Barr, del virus VIH, del virus de la hepatitis B (Patente Europea - - No. 185573), del virus de la pseudorrabia, el virus "formador de sincitios", de otros virus o aún de antígenos específicos de tumores como las proteínas MAGE (Patente Europea No. 259212), tales como proteínas MAGE 1, MAGE 2, ó de antígenos que pueden estimular una respuesta antitumoral tales como las proteínas bacterianas pirogénicas. De preferencia, el ácido nucleico comprende igualmente secuencias que permiten y/o que favorecen la expresión en el músculo, del gen terapéutico y/o del gen que codifica para el péptido antigénico. Se puede tratar de secuencias que son naturalmente responsables de la expresión del gen considerado cuando estas secuencias son susceptibles de funcionar en la célula transfectada. De la misma manera, se puede tratar de secuencias de origen diferente (responsables de la expresión de otras proteínas, o igualmente sintéticas) . Principalmente, se puede tratar de secuencias promotoras de genes eucarióticos o virales.

Por ejemplo, se puede tratar de secuencias promotoras provenientes del genoma de la célula que se desea transfectar. Entre los promotores eucarióticos, se puede utilizar cual promotor o secuencia derivada estimulante o represora de la transcripción de un gen, de manera específica o no, fuerte o débil. Se puede tratar en particular de promotores ubicuos (HPRT, vimentina, a-actina, tubulina, etc.), de promotores de genes terapéuticos (de tipo MDR, CFTR, etc.), de promotores específicos de tejidos (promotores del tipo de los genes de la desmina, de las miosinas, de la " creatina cinasa, de fosfoglicerato cinasa) o aún de promotores que responden a un estímulo tales como los promotores que responden a las hormonas naturales (receptor de hormonas esteroides, receptor del ácido retinoico, etc.) o un promotor regulado por antibióticos (tetraciclina, rapamicina, etc.), promotores que responden a un régimen alimentario como los promotores que responden a los fibratos, u otros promotores que responden a otras moléculas de origen natural o sintético. De la misma manera, se puede tratar de secuencias promotoras provenientes del genoma de un virus. A este respecto, se pueden citar por ejemplo los promotores de los genes EIA del adenovirus, MLP o promotores provenientes de genomas de los virus CMB, RSV, SV40, etc. Se puede tratar de promotores inducibles o reprimibles. Además, estas secuencias de expresión se pueden modificar mediante ,1a adición de secuencias de activación, de regulación, que permitan una expresión condicional, transitoria, una expresión específica de tejido o mayoritaria, etc. Además, de la misma manera, el ácido nucleico puede contener en particular una cantidad del gen terapéutico, una secuencia de señal que dirige el producto - terapéutico sintetizado en las vías de secreción de la célula blanco. Esta secuencia de señal puede ser la secuencia de señal natural de producto terapéutico, pero igualmente puede ser cualquier otra secuencia de señal funcional, o una secuencia de señal artificial. Del mismo modo, el ácido nucleico puede comprender una secuencia de señal que dirige el producto terapéutico sintetizado hacia un compartimiento particular de la célula, como por ejemplo los peroxisomas, los lisosomas y mitocondrias, para el tratamiento, por ejemplo, de enfermedades mitocondriales genéticas. Otros genes que presentan un interés se describen en McKusick, V. A. Mendelian (Inheritance in man, catalogs of autosomal dominant, autosomal recessive, and X-linked phenotypes. Octava edición. John Hopkins University Press (1988)) y en Stanbury, J. B. et al . (The metabolic basis of inherited disease, Quinta edición. McGraw-Hill (1983)). Los genes de interés recuperan las proteínas implicadas en el metabolismo de los aminoácidos, de lípidos y de otros componentes de las células. Así mismo, se pueden citar de manera no limitante los genes asociados a enfermedades del metabolismo de los carbohidratos, como por ejemplo la fructosa-1- fosfatoaldolasa, fructosa-1, 6-difosfatasa, glucosa-6- fosfatasa, a-1, 4-glucosidasa lisosomal, amilo-1,6- glucosidasa, amilo- (1, 4: 1, 6) -transglucosidasa, fosforilasa muscular, fosfofructocinasa muscular, fosforilasa-b-cinasa, galactosa-1-fosfato uridil transferasa, todas las enzimas del complejo piruvato deshidrogenasa, piruvato carboxilasa, 2-oxoglutarato gluoxilasa carboxilasa, D-glicerato deshidrogenasa. De la misma manera, se pueden citar: los genes asociados con enfermedades del metabolismo de los aminoácidos, como por ejemplo la fenilalanina hidroxilasa, dihidrobiopterina sintetasa, tirosina aminotransferasa, tirosinasa, histidinasa, fumarilacetoaceto-acetasa, glutation sintetasa, y-glutamilcisteína sintetasa, ornitina-d-aminotrasferasa, carbamoilfosfato sintetasa, ornitina carbamoiltransferasa, argininosuccinato sintetasa, argininosuccinato ligasa, arginasa, L-lisina deshidrogenasa, L-lisina cetoglutarato reductasa, valina transaminasa, leucina isoleucina transaminasa, descarboxilasa de 2-cetoácidos de cadena ramificada, isovaleril-CoA deshidrogenasa, acil-CoA deshidrogenasa, 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA ligasa, acetoacetil-CoA 3-cetotiolasa, propionil-CoA carboxilasa, metilmanonil-CoA utasa, ATP:cobalamina adenosil transferasa, dihidrofolato reductasa, metilentetrahidrofolato reductasa, cistationina ß- sintetasa, el complejo sarcosina deshidrogenasa, las proteínas que pertenecen al sistema de rompimiento de la glicina, ß-alanina transaminasa, carnosinasa sérica, homocarnosinasa cerebral. Los genes asociados con enfermedades con el metabolismo de las grasas y los ácidos grasos, como por ejemplo lipoproteína lipasa, apolipoproteína C-II, apolipoproteína E, otras apoliproteínas, lecitina colesterolaciltransferasa, receptor de LDL, esterol hidroxilasa hepática, "ácido fitánico" a-hidroxilasa. Los genes asociados con deficiencias lisosomales, como por ejemplo a-L-iduronidasa lisosomal, iduronatosulfatasa lisosomal, heparan-N-sulfatasa lisosomal, N-acetil-a-D-glucosaminidasa lisosomal, acetil-CoA:a-glucosamina N-acetiltransferasa lisosomal, N-acetil-a-D-glucosamina-6-sulfatasa lisosomal, galactosamina-6-sulfato sulfatasa lisosomal, ß-galactosidasa lisosomal, arilsulfatasa B-lisosomal, ß-glucuronidasa lisosomal, N-acetilglucosaminil-fosfotransferasa, a-D-manosidasa lisosomal, a-neuranimidasa lisosomal, aspartilglucosaminidasa lisosomal, a-L-fucosidasa lisosomal, lipasa acida lisosomal, ceramidasa acida lisosomal, esfingomielinasa lisosomal, glucocerebrosidasa lisosomal y galactocerebrosidasa lisosomal, galactosilceramidasa lisosomal, arilsulfatasa A lisosomal, a-galactosidasa A, ß-galactosidasa acida lisosomal, cadena a de la hexosaminidasa A lisosomal. De la misma manera, se pueden citar de manera no restrictiva, los genes asociados con enfermedades del metabolismo de los esteroides y los lípidos, los genes asociados con enfermedades de metabolismo de las purinas y de las pirimidinas, los genes asociados con enfermedades del metabolismo de la porfirina y el grupo hem, los genes asociados con enfermedades del metabolismo del tejido conectivo, los genes s y os así como los genes asociados con enfermedades de la sangre y de los órganos hematopoyéticos, de los músculos (miopatías) , del sistema nervioso (enfermedades neurodegenerativas) o del aparato circulatorio (tratamiento de isquemias y de estenosis, por ejemplo) y los genes implicados en enfermedades genéticas mitocondriales . En el procedimiento de conformidad con la presente invención, el ácido nucleico se puede asociar con cualguier tipo de vectores o cualquier combinación de estos vectores que permita mejorar la transferencia de los genes, por ejemplo, de manera no limitante, con vectores tales como vectores virales, agentes sintéticos o biosintéticos (por ejemplo lipidíeos, polipeptídicos, glucosídicos o poliméricos) o aún con microesferas impulsadas o no. Los ácidos nucleicos también se pueden inyectar en un músculo que está siendo sometido a .un tratamiento para mejorar la transferencia de los genes, por ejemplo un tratamiento de naturaleza farmacológica con aplicación local o sistémica, o un tratamiento enzimático, permeabilizante (utilización de agentes tensoactivos), quirúrgico, mecánico, térmico o físico. La ventaja de la utilización del músculo en la terapia génica, reside en numerosos factores: • la remarcable estabilidad de la expresión de los transgenes, superior a varios meses y que permite la producción estable y sostenida de una proteína terapéutica intramuscular o secretada, • la facilidad de acceso al tejido muscular, que permite una administración directa, rápida y no peligrosa en un órgano no vital, • el volumen importante de la masa muscular, que permite múltiples sitios de administración, • la capacidad secretora ampliamente demostrada del músculo. A estas ventajas, se le agregan la seguridad aportada por el tratamiento local ligado a la utilización de campos eléctricos locales y dirigidos al blanco. En virtud del conjunto de ventajas y la seguridad ligada a la utilización de los campos débiles, la presente invención se puede aplicar a nivel del músculo cardiaco para el tratamiento de cardiopatías, por ejemplo utilizando un desfibrilador adaptado. También se puede aplicar al tratamiento de la restenosis por medio de la expresión de genes inhibidores de la proliferación de células musculares lisas, como la proteína GAX. La combinación de campos de poca intensidad y la duración de administración prolongada aplicada principalmente a los músculos in vivo, mejora la transfección de los ácidos nucleicos sin ocasionar deterioraciones notables en los tejidos. Estos resultados mejoran en rendimiento de las transferencias de ADN en el marco de la terapia génica utilizando los ácidos nucleicos. En consecuencia, las ventajas del tejido muscular asociadas al procedimiento de conformidad con la presente invención, permiten, por primera vez, considerar producir para terapia génica un agente con dosis fisiológicas y/o terapéuticas, ya sea en las células musculares, secretado en su vecindad, o bien en la circulación sanguínea o linfática. Además, el procedimiento de conformidad con la presente invención permite, por primera vez, la modulación fina y el control de la cantidad eficaz de transgenes expresados por la posibilidad de modular el volumen del tejido muscular a transfectar, por ejemplo con sitios múltiples de administración, o incluso la posibilidad de modular el número, la forma, la superficie y la disposición de los electrodos. Un elemento de control suplementario proviene de la posibilidad de modular la eficacia de la transfección mediante la variación de la intensidad del campo, de la duración y de la frecuencia de los impulsos y evidentemente según el estado de la técnica, la cantidad y el volumen de administración de los ácidos nucleicos. De esta manera, se puede obtener un nivel de transfección apropiado a nivel de la producción o de la secreción deseados. El procedimiento permite un incremento de la seguridad con respecto a los métodos químicos o virales de transfección de genes in vivo, para los cuales alcanzar otros órganos diferentes al órgano blanco no se puede excluir totalmente. En efecto, el procedimiento de conformidad con la presente invención permite el control de la localización de los tejidos transfectados (estrictamente ligado al volumen de tejido sometido a los impulsos eléctricos locales) y aporta, de esta manera, la posibilidad de retornar a la situación inicial por la ablación total o parcial del músculo, haciéndolo posible por el carácter no vital de este tejido y por sus capacidades de regeneración. Esta gran flexibilidad de utilización permite optimizar el procedimiento de conformidad con la especie animal (aplicaciones humanas y veterinarias), la edad del sujeto, su estado fisiológico y/o patológico. El procedimiento de conformidad con la presente invención permite, además, por primera vez, transfectar ácido nucleicos de gran tamaño contrariamente a los métodos virales que están limitados por el tamaño de la cápside. Esta posibilidad es esencial para la transfección de genes de gran tamaño, como el de la distrofina o genes con intrones y/o elementos reguladores de gran tamaño, que son necesarios por ejemplo para una producción fisiológicamente regulada de hormonas. Esta posibilidad es esencial para la transfección de episomas o de cromosomas artificiales de levadura o minicromosornas . Los siguientes Ejemplos están destinados a ilustrar de manera no limitante la presente invención. En los Ejemplos, se hace referencia a las siguientes Figuras: • Figuras la y Ib: Efectos de impulsos eléctricos de intensidad de campo elevada sobre la transfección de ADN plasmídico pXL2774, en músculo tibial craneal, en ratones; valores promedio ± SEM, • Figuras 2a y 2b: Efectos de impulsos eléctricos de intensidad de campo intermedia mediante la transfección de ADN plasmídico pXL2774, en músculo tibial craneal en ratones; valores promedio ± SEM, Figuras 3a y 3b: Efectos de impulsos eléctricos de intensidad de campo débil y de diferente duración, sobre la transfección de ADN plasmídico pXL2774 en músculo tibial craneal en ratones; valores promedio ± SEM, Figuras 4a y 4b: Efectos de impulsos eléctricos de intensidad de campo débil y diferente duración, sobre la transfección de ADN plasmídico pXL2774 en músculo tibial craneal, en ratones; valores promedio ± SEM, Figura 5: Eficacia de la electrotransfección de ADN plasmídico pXL2774, en músculo tibial craneal en ratones, a intensidades de campo eléctrico débiles; valores promedio ± SEM, Figura 6: Cinética de la expresión de la luciferasa en músculo tibial craneal de ratones. Administración del plásmido pXL2774 con electrotransferencia (") y sin electrotransferencia (X) ; valores promedio ± SEM, Figura 7 : Nivel de expresión del transgén en función de la dosis de ADN administrada, con electrotransferencia (•) y sin electrotransferencia (°) . Figura 8 : Efecto de diferentes tipos de electrodos sobre la eficacia de la electrotransferencia. Figura 9: Cinética de la concentración sérica de fosfatasa alcalina secretada. Administración del plásmido pXL3010 con electrotransferencia (") y sin electrotransferencia ( ) ; valores promedio ± SEM, Figura 10: Cinética de la expresión de FGF1 en músculo con electrotransferencia (barras de histograma blancas) y sin electrotransferencia (barras de histograma negras) , Figura 11: Mapas de los plásmidos pXL3179 y pXL3212, Figura 12: Mapas de los plásmidos pXL3388 y pXL3031, Figura 13: Mapas de los plásmidos pXL3004 y pXL3010, Figura 14: Mapas de los plásmidos pXL3149 y pXL3096, Figura 15: Mapas de los plásmidos pXL3353 y pXL3354, Figura 16: Mapa del plásmido pXL3348. Ejemplo 1: experimento efectuado en las condiciones del estado de la técnica anterior, en donde los campos eléctricos muestran ser inhibidores de la trans ección . Las condiciones estándar de electroporación, tales como las utilizadas en la técnica anterior y que se discuten más adelante, fueron probadas y mostraron ser ineficaces, igualmente tener una acción inhibidora sobre la transfección de ácidos nucleicos (ADN plasmídico) en músculo estriado. Material y Métodos - Condiciones generales de operación. En este Ejemplo, se utilizaron los siguientes productos : ADN pXL2774 (Patente PCT/FR 96/01414) es un ADN plasmídico que comprende el gen productor de la luciferasa.

Los otros productos están disponibles en proveedores comerciales: Cetamina, Xilazina, Suero fisiológico (NaCl 0.9°o) . Se utilizaron un osciloscopio y un generador de impulsos eléctricos (rectangulares o cuadrados) comercial (Electropulsador PS 15, Jouan, Francia) . Los electrodos utilizados son' electrodos de placa de acero inoxidable a una distancia de 1 a 15 mm. El experimento se realizó en ratones C57 Bl/6. Los ratones provenientes de diferentes jaulas se repartieron de manera aleatoria antes ' del experimento ("aleatorización") . Los ratones fueron anestesiados con una mezcla de cetamina, xilazina. La solución del plásmido (30 µl de una solución con 500 µg/ml de NaCl 0.9%) se inyectó longitudinalmente a través de la piel en el músculo tibial craneal de las patas izquierda y derecha con la ayuda de una jeringa de Hamilton. Los dos electrodos están recubiertos con un gel conductor y la pata inyectada se colocó entre los electrodos en contacto con los mismos. Los impulsos eléctricos se aplicaron perpendicularmente al eje del músculo, con la ayuda de un generador de impulsos cuadrados, un minuto después de la inyección. Un osciloscopio permitió controlar la intensidad en voltios (los valores indicados en los Ejemplos representan los valores máximos) , la duración en milisegundos y la frecuencia en hertz de los impulsos aplicados, la cual es de 1 Hz. Se aplicaron 8 impulsos consecutivos. Para la evaluación de la transfección del músculo, los ratones fueron sacrificados 7 días después de la administración del plásmido. Los músculos tibial craneal de las patas izquierda y derecha fueron extirpados, pesados, colocados en una solución reguladora y usados. La suspensión obtenida se centrifugó con el fin de obtener un sobrenadante claro. La medición de la actividad de la luciferasa se realizó . en 10 µl del sobrenadante con la ayuda de un luminómetro comercial, en donde el substrato era agregado automáticamente a la solución. La intensidad de la reacción luminosa está dada en URL (Unidades Relativas de Luminiscencia) para un músculo conociendo el - - volumen total de la suspensión (1.10 URL son equivalentes a 30 pg de luciferasa) . Cada condición experimental se probó en 10 puntos: 5 animales fueron inyectados bilateralmente. Las comparaciones estadísticas se realizaron con la ayuda de pruebas no paramétricas . Resultados y discusión. Dos figuras, cuya escala es lineal o logarítmica, ilustran los resultados. En este primer experimento se probaron los efectos de un campo eléctrico de 800 a 1200 Voltios/cm que permite la electroporación de tumores (Mir et ai., Eur. J.

Cáncer 27, 68, 1991) . Se constata, según la Figura 1, que en relación al grupo de control, en donde el ADN fue inyectado sin impulsos eléctricos: • con 8 impulsos de 1200 Voltios/cm de una duración de 0.1 mseg, el valor promedio de la actividad de la luciferasa es muy débil, • con impulsos de 1200 Voltios/cm y de 1 mseg, 3 animales murieron, el valor promedio de la actividad de luciferasa fue muy débil, • con impulsos de 800 Voltios/cm y de 1 mseg, el valor promedio de la actividad de la luciferasa también fue significativamente reducido.

La mayor parte de los músculos que sufrieron la acción del campo eléctrico, quedaron visiblemente alterados (friables y con alpecto blanquecino) . Ejemplo 2: experimento de electrotransferencia de ácidos nucleicos a campos eléctricos moderados. Este experimento fue realizado con ratones C57 Bl/6. Aparte de la intensidad del campo eléctrico, de los impulsos y su duración, las condiciones del experimento fueron las del Ejemplo 1. Los resultados se muestran en la Figura 2. Se reproduce el resultado del Ejemplo 1; es decir, el efecto inhibidor de una serie de 8 impulsos a 800 Voltios/cm de una duración de mseg sobre la actividad de luciferasa detectada en el músculo. Con un campo de 600 Voltios/cm, se observa la misma inhibición y la misma alteración del tejido muscular. Por el contrario, de manera remarcable y sorprendente, la disminución del voltaje permite no alterar visiblemente los músculos y, además, a 400 y 200 Voltios/cm, el nivel de transfección de los músculos es superior al obtenido sobre músculos no sometidos a un campo. Debe notarse que, en relación al grupo testigo (no sometidos a un campo eléctrico) , la dispersión de los valores de la actividad de luciferasa disminuye a 200 Voltios/cm (SEM = 20.59% del valor promedio contra 43.32% en ausencia del campo eléctrico (Figura 2A) ) .

Ejemplo 3: experimento de electrotransferencia de ácidos nucleicos con impulsos de débil intensidad de campo, que demuestra una estimulación muy fuerte de la expresión del transgén. Este experimento fue realizado con ratones C57 Bl/6. Aparte de la intensidad del campo eléctrico, de los impulsos y de su duración, y del hecho de que los impulsos se aplican 25 segundos de la inyección del ADN, las condiciones del experimento fueron iguales a las de los Ejemplos precedentes. Los resultados se muestran en la Figura 3. El valor promedio de la expresión del transgén de luciferasa aumenta netamente con una duración de impulso de 20 mseg a 100 Voltios/cm y a partir de una duración del impulso de 5 mseg a 200 Voltios/cm. Este experimento demostró también claramente que el valor promedio de la actividad de luciferasa obtenido por electrotransfección del ADN en el músculo, es una función de la duración de los impulsos eléctricos, cuando se emplean voltajes de 200 y 100 Voltios/cm. También se observa que la dispersión de los valores se reduce notablemente por los grupos de músculos electrotransfectados (Figura 3A) . En ausencia de impulsos eléctricos (control), la SEM representa el 77.43% del valor promedio cuando la SEM relativa del promedio es reducida a 14% (200 Voltios/cm, 5 mseg), 41.27% (200 Voltios/cm, 20 mseg) y entre 30 y 48% para la electrotransferencia a 100 Voltios/cm de campo eléctrico. En las mejores condiciones de este experimento, se mejoró por un factor de 89.7 la expresión del transgén con respecto al control inyectado en ausencia de impulsos eléctricos. Ejemplo 4: experimento de electrotransferencia de ácidos nucleicos en músculo a 200 Voltios/cm, que demuestra un aumento de la expresión del transgén en un factor superior a 200, Este experimento se efectuó en ratones DBA 2, con impulsos eléctricos de una intensidad de campo de 200 Voltios/cm y de una duración variable, las otras condiciones de este experimento fueron las mismas del Ejemplo 3. Este Ejemplo confirma que a 200 Voltios/cm la transfección de la actividad de luciferasa aumenta a partir de una duración de impulso de 5 mseg y después continúa creciendo cuando se usan duraciones más prolongadas (Figuras 4 y 5) . Aqui se observa con la electrotransfección, una reducción de la variabilidad interindividual indicada por la SEM con respecto al control no electrotransfectado (el valor relativo de la SEM es igual a 35% para el control y de 25,.22, 16, 18, 16 y 26% para las series de impulsos de 1, 5, 10, 15, 20 y 24 mseg, respectivamente) . En las mejores condiciones de este experimento, se mejoró en un factor de 205 la expresión del transgén con respecto al control inyectado en ausencia de impulsos eléctricos. Así pues, es evidente que la variación de la duración de cada impulso aplicado, es un medio para modular la eficacia de la transfección de ácidos nucleicos y para ajustar el nivel de expresión del transgén. Ejemplo 5: eficacia de la electrotransfección de ácidos nucleicos en función del producto (número de impulsos x intensidad de campo x duración de cada impulso) . La Figura 5 ejemplifica. la importancia del parámetro correspondiente al producto (número de impulsos x intensidad del campo x duración de cada impulso) . Este parámetro corresponde de hecho a la integral en función del tiempo de la función que describe la variación del campo eléctrico. La representación en la Figura 5 de los resultados obtenidos en el transcurso de los Experimentos 2, 3 y 4 con intensidades de campo eléctrico de 200 V/cm, * 100 V/cm o en ausencia de campos eléctricos, muestra que la eficacia de la transfección aumenta en función del producto de la duración total de la exposición al campo eléctrico, por la intensidad del campo. Un efecto de estimulación se obtiene para un valor superior a 1 kV x mseg/cm del producto (campo eléctrico x duración total de los impulsos) . De conformidad con una modalidad preferida, se obtiene un estímulo para un valor superior o igual a 5 kV x mseg/cm del producto (campo eléctrico x duración total de i los impulsos) . Ejemplo 6: efecto del aumento de la duración de los impulsos eléctricos. Este Ejemplo ilustra que se puede aumentar la duración unitaria de los impulsos con respecto a los valores probados en el Ejemplo 4. Este experimento fue realizado con ratones C57 Bl/6. El plásmido utilizado es el plásmido pXL2774, la cantidad de 7ADN administrado es de 15 µg. El electropulsador utilizado para aplicar los impulsos eléctricos de una duración superior a 20 mseg, es un electropulsador comercial (Genetronics, modelo T 820, EUA, San Diego, CA) . Los impulsos eléctricos son de número y duración variable, pero de una intensidad de campo constante de 200 Voltios/cm; las otras condiciones de este experimento son como las descritas en el Ejemplo 1. Los resultados se presentan en la Tabla 1.

Tabla 1: valores promedio +/- SEM de la actividad de luciferasa en millones de URL por músculo. N = 10 para cada grupo. Condiciones de electrotransferencia: intensidad de campo 200 V/cm, 8 ó 4 impulsos (duración unitaria variable), frecuencia 1 Hz. Se constata un aumento de la expresión del transgén con el alargamiento de la duración unitaria de los impulsos (cuando menos hasta 40 mseg para una serie de 8 impulsos y cuando menos hasta 50 mseg para una serie de 4 i impulsos, de una intensidad de 200 Voltios/cm) . Este Ejemplo demuestra que la duración óptima de los impulsos depende del número de impulsos utilizados y que la duración unitaria de los impulsos puede alcanzar cuando menos 80 mseg, no siendo limitante este valor de duración. Ejemplo 7: eficacia de la electrotransferencia en función del número de impulsos eléctricos. Este Ejemplo pone en evidencia el efecto del aumento del número de impulsos eléctricos sobre la eficacia de la transferencia de ácidos nucleicos. Este experimento se realizó con ratones C57 Bl/6. El plásmido utilizado es el plásmido pXL2774, la cantidad de ADN administrada es de 15 µg. Los impulsos eléctricos son variables en número. La duración de cada impulso es de 20 mseg. La intensidad de campo es de 200 Voltios/cm. Las otras condiciones de este experimento son como las descritas en el Ejemplo 1. Los resultados se presentan en la Tabla 2.

Tabla 2: valores promedio +/- SEM de la actividad de luciferasa en millones de URL por músculo. N = 10 por grupo. Condiciones: intensidad de campo 200 V/cm, número variable de impulsos de 20 mseg, frecuencia 1 Hz. Se observa que la expresión de la luciferasa aumenta de manera muy importante desde la aplicación de un sólo impulso y que continúa aumentando en función del número de impulsos. De esta manera, parece que la variación del número de impulsos aplicados es un medio para modular la eficacia de la 'transferencia de ácidos nucleicos y para ajustar el nivel de expresión del transgén. De la misma manera, se confirma una distribución de la variabilidad de la respuesta, puesta en evidencia por la disminución del valor de la SEM con respecto al promedio para todos los grupos sometidos a la electrotransferencia. Ejemplo 8: efecto del aumento de la frecuencia de los impulsos eléctricos. Este Ejemplo demuestra que el aumento de la frecuencia de los impulsos permite de manera inesperada mejorar la eficacia de la transfección. Por otra parte y en una perspectiva clínica, el aumento de la frecuencia debe mejorar la comodidad del paciente al disminuir la duración total del tratamiento. Este experimento fue realizado con ratones C57B1/6. El plásmido utilizado es el plásmido pXL2774, la cantidad de ADN administrada es de 15 µg. La frecuencia de los impulsos eléctricos es variable (de 0.1 a 4 Hertz). La duración de cada impulso es de 20 mseg, la intensidad de campo es de 200 Voltios/cm, y las demás condiciones de este experimento son las descritas en el Ejemplo 1. Los resultados se presentan en la Tabla 3.

Tabla 3: valores promedio +/- SEM de la actividad de luciferasa en millones de URL por músculo. N = 10 para cada grupo. Condiciones: intensidad de campo 200 V/cm, 8 ó 4 impulsos de 20 mseg, frecuencia variable. Los resultados obtenidos en el experimento (A) , de la Tabla 3, demuestran que las frecuencias más elevadas > 1 Hz) son más eficaces que las frecuencias débiles que corresponden a una duración más prolongada entre dos impulsos consecutivos (10 segundos a 0.1 Hertz). La eficacia de la transfección aumenta con la frecuencia sobre el intervalo de valores probados de 0.1 a 4 Hertz por 4 impulsos y de 0.1 a 3 Hertz por 8 impulsos. I Ejemplo 9: efecto de la aplicación de un campo eléctrico variable según una disminución exponencial en función del tiempo. Este Ejemplo pone evidencia el efecto de la aplicación de un campo eléctrico variable según una disminución exponencial, sobre la eficacia de la transferencia de ácidos nucleicos. i Este experimento fue realizado con ratones C57B1/6. El plásmido utilizado es el plásmido pXL3031. El plásmido pXL3031 (Figura 12) es un vector derivado del plásmido 2774 (WO 97/10343) en el cual el gen luc+ que codifica para la luciferasa de Photinus pyralis modificada (citoplásmica) proveniente del plásmido pGL3 básico (Genbank: CVU47295) , fue introducido bajo el control del promotor proveniente de la región precoz del citomegalovirus humano (hCMV I.E., Genbank HS5IEE) y de la señal de poliadenilación de la región tardía del virus SV40 (Genbank SV4CG) . La cantidad de ADN administrada fue de 10 µg. El generador de impulsos eléctricos utilizado, permite suministrar impulsos de una intensidad de campo eléctrico variable según una disminución exponencial en función del tiempo (electropulsador Equibio, modelo easyjectT plus, Kent GB) . El voltaje impuesto es el voltaje del pico exponencial. El segundo parámetro ajustable es la capacitancia (µFaradios) que permite variar la cantidad de energía aplicada y la constante de tiempo de la exponencial. Los resultados se presentan en la Tabla 4 Tabla 4: factor de aumento de la expresión (actividad de luciferasa) obtenido mediante la aplicación de un impulso con disminución exponencial. El factor de aumento se calculó con referencia a la actividad de la luciferasa obtenida con la administración del plásmido pXL3031, sin electrotransferencia (valores promedio del factor de aumento, N = 4 a 6 por condición) . De manera comparativa, el factor de aumento de la expresión obtenido para la transferencia de pXL3031 en presencia de un campo eléctrico con impulsos de formas cuadradas (intensidad de campo de 200 V/cm, 8 impulsos de mseg, a una frecuencia de 1 Hertz) , fue de 44 en el i mismo experimento. Estos resultados demuestran que se pueden utilizar impulsos eléctricos de forma cuadrada o de una intensidad decreciente de manera exponencial, en función del tiempo. Además, en este último caso, se puede obtener un aumento importante de la expresión mediante un valor de campo débil y una capacitancia elevada (e.g. 200 V/cm, capacitancia 3000 µFaradios) o un valor de campo elevado y una capacitancia débil (e.g. 400 V/cm, capacitancia 300 µFaradios) . Ejemplo 10: efecto de la combinación de un impulso breve de voltaje elevado y una pluralidad de impulsos prolongados de voltaje débil. Este Ejemplo demuestra que el campo eléctrico aplicado puede ser una combinación de cuando menos un campo comprendido entre 500 y 800 Voltios/cm durante una corta duración, por ejemplo de 50 a 100 µseg y cuando menos un campo débil (< 100 Voltios/cm) por una duración más prolongada, por ejemplo 1 mseg y hasta 90 mseg en este experimento . Los valores del campo eléctrico débil aquí son de 80 V/cm aplicados en 4 impulsos de una duración de 90 mseg, con una frecuencia de 1 Hertz. Para experimento, se utilizaron dos electropulsadores. Los impulsos eléctricos fueron aplicados por un aparato y después el otro, el cambio se efectuaba en menos de un segundo con la ayuda de un comando manual . El plásmido utilizado es el plásmido pXL3031. La cantidad de ADN administrada es de 3 µg. Los valores de campo eléctrico se indican en la Tabla 5; las demás condiciones de este experimento fueron las mismas que las descritas, en el Ejemplo 1.

Tabla 5: valores promedio +/- SEM de la actividad de luciferasa en millones de URL por músculo. N = 10 músculos por grupo. La Tabla 5 resume los resultados obtenidos para dos series de experimentos, que demuestran que un breve impulso de voltaje elevado o que cuatro impulsos sucesivos prolongados y de débil voltaje, mejoran un poco la transfección en relación al grupo control, quienes recibieron una inyección de pXL3031 pero no fueron sometidos a un campo eléctrico. Se obtuvieron los mismos resultados cuando los impulsos de campo débil se aplicaron antes del impulso de campo elevado. Por el contrario, en la dos series de experimentos, la combinación de un breve impulso de alto voltaje seguido por cuatro impulsos sucesivos prolongados y de voltaje débil, aumenta notablemente la eficacia de la transferencia del ADN. Los resultados obtenidos en los Ejemplos 1 y 2 mostraron que 8 impulsos de 600, 800 ó 1200 voltios de una duración unitaria de 1 mseg a 1 Hertz, causaban lesiones e inhibían la transfección. Los resultados obtenidos en el Ejemplo 10 que, en condiciones particulares, es posible utilizar intensidades de campo de voltaje elevado de manera que no cause lesiones, en efecto desde un punto de vista macroscópico, los músculos nunca fueron alterados visiblemente. La utilización de campos eléctricos elevados de duración breve combinados con campos débiles de duración prolongada, pueden ser un medio suplementario para modular la eficacia de la transferencia de ADN. Ejemplo 11: electrotransferencia con plásmidos de tamaños diferentes, genes bajo el control de diferentes promotores o con sitios de direccionamiento variable de la proteina expresada por el transgén. 11.a: electrotransferencia con plásmidos de tamaños diferentes Se probaron plásmidos de tamaños diferentes (2.8, 3.8, 8.6, 20 y 52.5 Kb) que comprenden al gen que codifica para la luciferasa. La cantidad de plásmido administrada i es de 10 µg por músculo. Se aplicó un campo eléctrico de una intensidad de 200 V/cm en 8 impulsos de 20 mseg a 2 Hz, siendo las demás condiciones del experimento iguales a las descritas en el Ejemplo 1. Se observa un aumento de la expresión del transgén de aproximadamente 50 veces con los plásmidos de 2.8 y 3.8 Kb, de aproximadamente 80 veces con el plásmido 8.6 Kb y de 3 a 6 veces con los plásmidos de 20 y 52.6 Kb. Así pues, este Ejemplo demuestra la posibilidad de transferir plásmidos de tamaño importante, que tienen hasta 20 Kb y más. 11.b: control de la señal de luminiscencia en ausencia del gen que codifica para la luciferasa. Como control y para excluir la posibilidad de que las señales del luminiscencia observadas para la dosis de actividad de luciferasa, fueran debidas a radicales producidos en el tejido después del tratamiento eléctrico, se probó la actividad de la luciferasa en músculos tratados con un plásmido que no codifica para la luciferasa y sometidos a un campo eléctrico.

Tabla 6: actividad de luciferasa en músculos inyectados con diferentes plásmidos, con o sin la aplicación de un campo eléctrico. Condiciones: 200 V/cm, 8 impulsos de 20 mseg, frecuencia 1 Hz. Valores promedio +/- SEM de la actividad de la luciferasa en millones de URL or músculo. Los resultados demuestran que la actividad basal de la luciferasa en músculos inyectados con un plásmido que no codifica para la luciferasa, es despreciable. 11.c: electrotransferencia de genes bajo el control de diferentes controles. Se probó la influencia de diferentes promotores sobre el nivel de expresión de los genes transferidos, con o sin la aplicación de un campo eléctrico. La cantidad de plásmido inyectado por músculo es de 2 µg. El campo eléctrico aplicado es de 200 V/cm en 8 impulsos de 20 mseg a 1 Hz, las demás condiciones de este experimento fueron las mismas que las descritas en el Ejemplo 1. Los resultados se presentan en la Tabla 7. El plásmido probado es el plásmido pXK3031 para la construcción CMV-LUC. La construcción PGK corresponde a la substitución del promotor CMV por el promotor PGK, en el plásmido pXL3031.

Tabla 7: valores promedio +/- SEM de la actividad de luciferasa en millones de URL por músculo. Estos resultados demuestran que, cuando el ADN es transferido en presencia de un campo eléctrico, el factor de aumento de expresión del transgén es comparable a la original o a la fuerza del promotor. 11.d: electrotransferencia de genes con diferentes sitios de direccionamiento de la proteína expresada por el transgén. Este Ejemplo ilustra la transferencia de genes que codifican para proteínas que tienen diferentes localizaciones celulares. El plásmido pXL3031 codifica para una luciferasa sintetasa en el citosol y el plásmido pXL2774 codifica para una luciferasa que radica en los peroxisomas. La cantidad de plásmido inyectado por músculo es de 10 µg. El campo eléctrico aplicado es de 200 V/cm en 8 impulsos de 20 mseg a 1 Hz, las demás condiciones de este experimento fueron las mismas que las descritas en el Ejemplo 1. Los resultados se presentan en la Tabla 8.

Tabla 8: valores promedio +/- SEM de la actividad de la luciferasa en millones de URL. Estos resultados ponen en evidencia que el procedimiento de conformidad con la presente invención se aplica para la transferencia de genes que codifican para proteínas de ubicaciones celulares diferentes y principalmente para proteínas peroxisomales o proteínas citosólicas. Ejemplo 12: análisis cinético e histológico de la expresión del transgén. 12.a: cinética de expresión del transgén. Este Ejemplo demuestra que la transferencia de ácidos nucleicos en presencia de un campo eléctrico, en las condiciones de conformidad con la presente invención, permite obtener la expresión de un transgén a un nivel elevado y estable durante cuando menos 4 meses. Este experimento fue realizado en ratones C57B1/6. El plásmido utilizado es el plásmido pXL2774, la cantidad de ADN administrada es de 15 µg. La inyección de ADN es seguida o no (grupo control) por la aplicación de un campo eléctrico en las siguientes condiciones: intensidad 200 V/cm, 8 impulsos de 20 mseg, frecuencia 1 Hz. Las demás condiciones de este experimento fueron las mismas que las descritas en el Ejemplo 1. La actividad de la luciferasa se determinó en grupos de 10 ratones sacrificados a diferentes tiempos. Los resultados se presentan en la Figura 6. Para el grupo control, se observa que la expresión de la luciferasa es detectable desde la tercera hora después de la inyección del plásmido y aumenta hasta el tercer día (D3) después disminuye de manera notable después de 35 días. En contraste, para el grupo de ratones sometidos a impulsos eléctricos, la expresión del transgén se mantuvo a un nivel notablemente superior al del grupo control. Además y de manera remarcable, se observó que este nivel de expresión permaneció elevado y constante hasta más allá de los 35 días y cuando menos hasta 120 días. Este nivel de expresión elevado y durable del transgén es un resultado particularmente ventajoso en la perspectiva de los tratamientos clínicos de largo plazo con genes terapéuticos. ! 12.b: análisis histológico. Se condujo un estudio histológico en las mismas condiciones, pero administrando el plásmido pCOR CMV-lacZ (pXL3004), que codifica para la ß-galactosidasa en una ubicación nuclear. El plásmido pXL3004 (Figura 13) es un vector derivado del plásmido pXL2774 (WO 97/10343) en el que el gen lacZ adicionado de una secuencia de localización nuclear (nls) (Nouvel et al . , 1994, Virology 204: 180-189) fue introducido bajo el control del promotor CMV del plásmido pCDNA3 (Invitrogen, Países Bajos) y de la señal de poliadenilación de la región precoz del virus SV40 (Genbank SV4CG) . Los animales fueron sacrificados siete horas después de la administración del plásmido. El análisis histológico permitió detectar las células que expresaban la ß-galactosidasa y cuyo núcleo estaba situado en el plano de corte (histoquímica Xgal) . El número de fibras musculares que presentaron núcleos positivos a nivel de los cortes examinados, en promedio fue de 76 en el grupo (n=8) que había recibido el plásmido pXL3004 y después sometido a los impulsos eléctricos, contra un promedio de 8.5 en el grupo control (n=8) (animales que habían recibido el plásmido pXL3004, pero que no fueron sometidos a los impulsos eléctricos. Se observó que el número de fibras musculares que expresaba el transgén era en promedio nueve veces más elevado con respecto al grupo control. La mayor parte de estas fibras musculares estaban en reposo con los núcleos situados en la periferia. Tres raras fibras musculares centronucleadas expresaron la ß-galactosidasa. De la misma manera, se observó que a lo largo del trayecto de la inyección del plásmido, la densidad de fibras musculares positivas por unidad de superficie era más importante en el grupo tratado por electrotransferencia, con respecto al grupo control. El conjunto de estos resultados demuestra que, en relación a los músculos no sometidos al campo eléctrico, la electrotransferencia permite un aumento más neto del número de fibras musculares que expresan el transgén, así como un aumento más neto de la superficie de la zona que expresa el transgén. Del mismo modo, se observó que la aplicación del campo eléctrico no causa una reacción inflamatoria notable. Ejemplo 13: efecto del momento de inyección del ácido nucleico con respecto a la aplicación del campo eléctrico. Este Ejemplo ilustra el hecho de que el ácido nucleico puede ser administrado cuando menos 30 minutos e igualmente cuando menos una hora antes de la aplicación del campo eléctrico. Este experimento fue realizado con ratones C57B1/6. El plásmido utilizado es el plásmido pXL2774. La cantidad de ADN administrada es de 15 µg ó 1.5 µg. La inyección de ADN fue seguida o precedida por la aplicación de un campo eléctrico en las siguientes condiciones: intensidad 200 V/cm, 8 impulsos de 20 mseg, frecuencia 1 Hz. Las demás condiciones de este experimento fueron las descritas en el Ejemplo 1. Se constituyó un grupo control con animales que recibieron una inyección del plásmido pero que no fueron sometidos a los impulsos eléctricos. Los I resultados se presentan en la Tabla 9.

Tabla 9A: Inyección de ADN en ausencia de campo eléctrico.

Tabla 9B: Inyección de ADN antes de la aplicación del campo eléctrico.

Taibla 9C: Inyección de ADN después de la aplicación del campo eléctrico.

Tabla 9: valores promedio +/- SEM de la actividad de la luciferasa en millones de URL por músculo. N = 10 músculos por grupo.

La presencia del ADN en el momento de la aplicación del campo eléctrico, es una condición de eficacia de la electrotransfección. De manera remarcable, se observó que la inyección de plásmido se puede realizar cuando menos 30 minutos e igualmente 1 hora (experimentos 4 y 5) antes de la aplicación del campo eléctrico; esto sin modificación notable del nivel de expresión. Se obtuvo un resultado similar con una dosis de 15 µg del plásmido por músculo que con una dosis 10 veces más débil de 1.5 µg. Estas observaciones permiten principalmente considerar múltiples inyecciones a tiempps variables del mismo plásmido, o a tiempos variables de diferentes plásmidos, en el músculo previamente a la aplicación del campo eléctrico. Igualmente, es posible aplicar múltiples inyecciones en una zona extendida del músculo y después aplicar una serie de impulsos eléctricos en el conjunto del territorio inyectado a tratar. Ejemplo 14: estudio estadístico sobre la relación entre la dosis de ADN inyectada y el nivel de expresión. El estudio estadístico presentado en este Ejemplo, permite comparar la relación efecto/dosis de un transgén administrado en presencia o en ausencia de un campo eléctrico. De la misma manera, este estudio confirma que el procedimiento de conformidad con la presente invención reduce considerablemente la variabilidad de expresión del transgén. Ratones C57B16 de 5 semanas de edad recibieron una inyección del plásmido pXL3031 en el músculo tibial craneal y de manera bilateral. Las dosis de plásmido variaron de 0.25 a 32 µg de ADN. Cada dosis fue probada en 10 animales. Inmediatamente después de la inyección del plásmido, una de las dos patas fue sometida a un campo de 250 V/cm, con cuatro impulsos de 20 mseg y una frecuencia de 1 Hz. Los animales fueron sacrificados 5 días después del tratamiento y se investigó la expresión del transgén en el extracto tisular de cada músculo. Los resultados se presentan en la Figura 7. La comparación de la evolución de las variancias en función a las de los promedios _ para cada serie de 10 repeticiones, demuestra claramente que la distribución de la expresión del transgén es log-normal. El análisis gráfico de los resultados de la Figura 7, confirmado por los cálculos, demuestra que la expresión varía linealmente con el logaritmo de la dosis de ADN inyectada. La prueba de Cochran demostró que existe una homogeneidad de variancias para cada regresión (con y sin electrotransferencia) , lo cual permite utilizar las variancias residuales para efectuar los cálculos. Una prueba de desviación de la linearidad no es significativa a un riesgo de 5% en el caso en donde hubo electrotransferencia, por el contrario, existe una i desviación de la linearidad muy significativa (p < 0.01), la cual se traduce en una importante heterogenicidad de respuestas, en ausencia de la electrotransferencia. La variancia residual es 5 veces más pequeña en el caso de la electrotransferencia. Tomando en cuenta los valores estimados de las variancias residuales, es posible utilizar 5 veces menos animales para obtener la misma capacidad en una prueba de comparación de eficacia de transfección, según si se aplicó o no la electrotransferencia. Así pues, para evidenciar una diferencia de expresión de un factor de 2, 5 ó 10 con un intervalo de confianza P = 95%, serán necesarios, respectivamente, 33, 8 ó 5 animales si el transgén es administrado por electrotransferencia y 165, 40 ó 25 animales en ausencia de la electrotransferencia. A continuación se presenta una Tabla que resume este tipo de cálculos, en casos en donde se utiliza electrotransferencia.

Rendimiento de P = 95% P = 90% P = 85% P = 75% eficacia o de expresión 2 33 28 24 19 5 8 7 6 6 10 5 5 4 4 Así pues, la disminución de la variabilidad interindividual obtenida con la electrotransferencia, permite efectuar estudios analíticos precisos acerca de la comparación de la expresión de diferentes genes. De la misma manera, ésta permite una mejor definición de las dosis de tratamiento y debe prevenir el riesgo ligado al rebase de las dosis aceptables en el marco terapéutico. La prueba de comparación de las pendientes obtenidas para cada regresión, no es significativa. Así pues, se puede considerar al riesgo de 5%, que existe un paralelismo de las dos regresiones. El cálculo de la capacidad o potencia relativa muestra que para alcanzar un nivel de expresión comparable al obtenido en presencia de electrotransferencia, hará falta, en ausencia de la electrotransferencia, aproximadamente 250 veces más ADN inyectado por músculo (243 +/- 85; intervalo de confianza P = 95%) .

El cálculo de la potencia relativa muestra correlativamente que, para una cantidad de ADN dada, el nivel de expresión es aproximadamente 500 veces más elevado en presencia de la electrotransferencia, en comparación con el nivel de expresión obtenido en ausencia de la electrotransferencia. Ejemplo 15: comparación de diferentes tipos de electrodos . Este Ejemplo tiene como objetivo comparar el I efecto de dos tipos de electrodos, electrodos de placa y electrodos de aguja, sobre la eficacia de la transferencia de ácidos nucleicos. Así mismo, se probaron los electrodos de aguja según diferentes orientaciones de implante. El plásmido pXL2774 (150 µg) fue inyectado en el músculo tríceps en ratas. Los electrodos de placa se colocaron de la manera que se indicó en el Ejemplo 1. La distancia entre electrodos para los electrodos de placa es de 1.2 cm. Para los electrodos de aguja, la distancia entre electrodos es de 0.9 cm. Los electrodos de aguja fueron introducidos en el tejido muscular a longitudes equivalentes, ya sea de manera perpendicular, o bien paralela al eje de las fibras, en ambas partes del sitio de inyección. Cualquiera que fuera el tipo de electrodos o su orientación, las condiciones de aplicación del campo eléctrico fueron las siguientes: intensidad 200 V/cm, 8 impulsos de 20 mseg a 2 Hz. Los resultados se presentan en la Figura 8. Los resultados obtenidos demuestran que la aplicación del campo eléctrico con la ayuda de dos agujas paralelas implantadas en el músculo, produce resultados comparables a los que se obtienen con los electrodos en placa puestos en contacto con la piel que envuelve al músculo. De la misma manera, se demostró que la eficacia de la electrotransferencia es independiente de la dirección del implante de los electrodos de aguja, en relación al eje de las fibras musculares. Este Ejemplo muestra que el procedimiento de conformidad con la presente invención permite la electrotransferencia de ácidos nucleicos con la ayuda de electrodos externos o invasivos, cualquiera que sea su orientación. El uso de los electrodos de aguja es particularmente ventajoso para asegurar la transferencia de ácidos nucleicos en músculos de gran tamaño, conservando los impulsos eléctricos en un voltaje moderado (por ejemplo 100 V con una separación de 0.5 cm para aplicar un campo eléctrico de 200 V/cm. Ejemplo 16: eficacia de la elestrotransferencia sobre diferentes músculos en ratones, ratas, conejos y monos . Este Ejemplo ilustra que la electrotransferencia de ácidos nucleicos es aplicable a diferentes tipos de músculos, en diferentes especies de mamíferos (ratones, conejos, ratas y monos) . Las condiciones de aplicación del campo eléctrico se definen en la Tabla 10A con referencia a cada especie. Los resultados se presentan en la Tabla 10A.

Tabla 10A: factor de aumento de la expresión de la luciferasa obtenido con electrotransfección. Este factor se calculó con referencia a la actividad de la luciferasa obtenida mediante una inyección del plásmido pXL3031 ó pXL2774, sin electrotransferencia. Promedio en 10 músculos por grupo. La actividad de la luciferasa fue dosificada 7 días después de la administración del plásmido. De la misma manera, la electrotransferencia fue probada en monos (Macaca fascicularis) . El plásmido utilizado fue el plásmido pXL3179, que comprende el gen que codifica para el factor de crecimiento de fibroblastos 1 (FGF1 ó aFGF) . El plásmido pXL3179 (Figura 11) es un vector derivado del plásmido pXL2774 (WO 97/10343) en el cual el gen que codifica para una fusión entre el péptido de señal del interferón de fibroblastos humanos y el ADNc del FGF1 (Facto de Crecimiento de Fibroblastos 1) (sp-FGFl, Jouanneau et ai., 1991 PNAS 88: 2893-2897), fue introducido bajo el control del promotor proveniente de la región precoz del citomegalovirus humano (hCMV IE) y de la señal de poliadenilación de la región tardía del virus SV40 (Genbank SV4CG) . La presencia del FGF1 se determinó por in unohistoquímica. Los valores indican el número de cortes positivos 3 días después de la inyección intramuscular de 500 µg del plásmido pXL3179. Las condiciones de aplicación del campo eléctrico son las siguientes: intensidad del campo eléctrico 200 V/cm, 8 impulsos de 20 mseg a 1Hz. Los resultados se presentan en la siguiente Tabla.

Tabla 10B: revelación por inmunohistoquímica de la expresión del FGFl en diferentes músculos de mono (Macaca fascicularis) . Los valores indican el número de cortes positivos 3 días después de la inyección intramuscular de 500 µg del plásmido pXL3179, que codifica i para el FGFl con o sin electrotransferencia. Estos resultados demuestran que la electrotransferencia aumenta de .manera remarcable la expresión de un transgén, en diferentes tipos de músculos, en diferentes especies de mamíferos. Ejemplo 17: eficacia de la electrotransferencia en músculo del diafragma en ratas. La posibilidad de expresar de manera durable y estable los genes de interés terapéutico directamente a nivel del diafragma, es un enfoque terapéutico particularmente interesante en el marco del tratamiento de ciertas enfermedades degenerativas que afectan el funcionamiento de este músculo, tales como la miopatía de Duchenne. Las ratas se anestesian con una mezcla de largactil, cetamina (1 mg/kg de largactil, 150 mg/kg de cetamina) . En estos experimentos, el diafragma fue accesible mediante una incisión a lo largo del esternón. La inyección fue realizada en el hemidiafragma (50 µg del plásmido pXL2774 en 50 µl de NaCl 20 mM y glucosa al 5%) . Posteriormente, se colocaron los electrodos de placa a ambos lados del plano del diafragma a lo largo del trayecto de inyección (distancia entre electrodos = 1 mm) . Las condiciones de electrotransferencia fueron las siguientes: intensidad del campo 160 V/cm ó 300 V/cm, 8 impulsos de 20 mseg, frecuencia 1 Hz. El campo eléctrico fue aplicado menos de un minuto después de la inyección. Enseguida el animal fue cerrado.

Tabla 11: valores promedio +/- SEM de la actividad de la luciferasa en millones de URL por músculo. N = 12 por cada grupo. Este Ejemplo demuestra una mejoría significativa de la expresión del transgén en el diafragma, después de la aplicación de 8 impulsos de 20 mseg de una intensidad de campo de 160 V/cm (p < 0.003 con la prueba no paramétrica de Mann-Whitney) . Ejemplo 18: transferencia de un gen que codifica para la fosfatasa alcalina secretada (SeAP) y cinética de expresión de la SeAP. Este Ejemplo ilustra la capacidad del procedimiento de conformidad con la presente invención, para transformar el músculo en un órgano secretor de un polipéptido de interés terapéutico o vacunal y asegurar la presencia en la circulación sanguínea de una concentración elevada y estable del polipéptido de interés. En este Ejemplo, el procedimiento de electrotransferencia fue probado en ratones adultos con un plásmido que comprende el gen que codifica para la fosfatasa alcalina secretada placentaria humana. Ratones C57BL6 adultos recibieron, en el músculo tibial craneal y de manera unilateral, una inyección del plásmido pXL3010. El plásmido pXL3010 (Figura 13) es un vector derivado de ColEl, en el cual el gen que codifica para la fosfatasa alcalina secretada proveniente del pSEAP-básico (Clontech, Genbank: CVU09660) fue introducido bajo el control del promotor CMV proveniente del plásmido pCDNA3 (Invitrogen, Países Bajos) y de la señal de poliadenilación de la región tardía del virus SV40 (Genbank SV4CG) . Las condiciones de electrotransferencia son las siguientes: campo eléctrico 200 V/cm, 8 impulsos de 20 mseg, frecuencia 1 Hz. El campo eléctrico fue aplicado 20 segundos después de la inyección. Las tomas de sangre se realizaron 7 días más tarde a nivel del plexo retroorbital .

La concentración de fosfatasa alcalina en el suero fue medida con la ayuda de una prueba de quimioluminiscencia (Phospha-light, Tropix, Bedford, MA 01730) . La inyección, en un músculo, de un plásmido no codificante (pUC19) , seguida o no por la aplicación de un campo eléctrico, permite verificar la ausencia de señal correspondiente a la actividad de la fosfatasa alcalina endógena. Los resultados se presentan en la Tabla 12.

Tabla 12: valores promedio ± SEM de la concentración de fosfatasa alcalina (SeAP) circulante en la sangre, en ng/ml de suero. Cuando el plásmido pXL3010 fue administrado por electrotransfección, se constató un aumento de un factor de 140 a 170 en la concentración de SeAP en la sangre. La inyección de 400 µg del plásmido (inyección de 100 µg de ADN en el músculo tibial craneal, bilateralmente y dos veces a intervalos de 30 minutos, con la aplicación del campo eléctrico) permite lograr con la electrotransferencia, una concentración sérica de 2200 ng/ml de fosfatasa alcalina, contra 16 ng/ml en ausencia de la electrotransferencia. Debe notarse que el hecho de agregar un ADN no codificante (pUC19) que permite trabajar una cantidad de ADN constante (10 µg de ADN total por ratón) , permite mejorar aún el nivel de expresión de la fosfatasa alcalina para las pocas cantidades de plásmido pXL3010 inyectadas (> 1 µg) . Se realizó una cinética de expresión de la SeAP. la dosis del plásmido administrada es de 15 µg por músculo en aplicación bilateral, o sean 30 µg por ratón. Los resultados se presentan en la Figura 9. Se observa, 7 días después de la inyección, un aumento importante y durable (cuando menos durante 2 meses) de la concentración de SeAP detectada en la sangre cuando el plásmido pXL3010 fue administrado por electrotransferencia. El conjunto de estos resultados confirma que la transferencia de ácidos nucleicos en músculo con el procedimiento de conformidad con la presente invención, permite obtener un nivel de expresión elevado y durable, ya sea para proteínas localizadas en el músculo, o bien para proteínas secretadas, siendo posible de esta manera transformar el músculo en un órgano secretor del polipéptido de interés. Ejemplo 19: transferencia de un gen que codifica para eritropoyetina (EPO) . Ratones C57B1/6 adultos, recibieron, en el músculo tibial craneal y de manera unilateral, una inyección del plásmido pXL3348. El plásmido pXL3348 (Figura 16) es un vector derivado del plásmido pXL2774 en el cual el gen murino de la eritropoyetina (NCBI: 193086) fue introducido bajo el control del promotor proveniente de la región precoz del citomegalovirus humano (hCMV IE) y de la señal de poliadenilación de la región tardía del virus SV40 (Genbank SV4CG) . Las condiciones de electrotransferencia fueron las siguientes: intensidad de campo eléctrico 200 V/cm, 8 impulsos de 20 mseg, frecuencia 1 Hz. El campo eléctrico se aplicó inmediatamente después de la inyección del ADN plasmídico.

Tabla 13: valores promedio ± SEM. N = 4 a 5. Se observa, con la electrotransfección, un aumento neto de la cantidad de eritropoyetina en la sangre I en los días 7 y 24, mediante la administración de 10 µg del pXL3348. Además, el efecto fisiológico del aumento de eritropoyetina que se traduce en un aumento del hematocrito, es muy importante (85%) desde el día 7, lo mismo que se encontró para una cantidad muy pequeña del plásmido (1 µg) . Ejemplo 20: transferencia de un gen que codifica i para el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) . Ratones C57B16 o SCID adultos recibieron, en el músculo tibial craneal y de manera bilateral, una inyección de pCOR hVEGF (pXL3212, 15 µg) . El plásmido pXL3212 (Figura 11) es un vector derivado del plásmido pXL2774 (WO 97/10343) en el que el ADNc que codifica para el VEGF165 (Factor de Crecimiento Endotelial Vascular, Genbank: HUMEGFAA) fue introducido bajo el control del promotor proveniente de la región precoz del citomegalovirus humano (hCMV IE) y de la señal de poliadenilación de la región t.ardía del virus SV40 (Genbank SV4CG) . Las condiciones de electrotransferencia fueron las siguientes: intensidad de campo eléctrico 250 V/cm, 8 impulsos de 20 mseg, frecuencia 2 Hz. Las tomas de sangre se realizaron a nivel del plexo retroorbital. Las tomas se efectuaron un día antes y siete días después de la inyección del plásmido. La dosis inmunoenzimática del VEGF humano fue realizada con la ayuda del paquete Quantikine (R&D System) . La prueba fue contrastada con VEGF humano en el suero de los ratones. Los resultados se presentan en la Tabla 14.

Tabla 14: concentración sérica (ng/litro) de VEGF en ratones C57B16 y SCID. Ejemplo 21: transferencia del gen que codifica para el factor IX. Ratones C57B16 o SCID adultos recibieron, en el músculo tibial craneal y de manera bilateral, una inyección de pXL3388 (15 µg) . El plásmido pXL3388 (Figura 12) es un vector derivado del plásmido pXL2774 (WO 97/10343) en el que el ADNc que codifica para el factor IX humano (factor de Christmas) (Genbank: HUMFIXA) fue introducido bajo el control del promotor proveniente de la región precoz del citomegalovirus humano (hCMV IE, Genbank HS51EE) y de la señal de poliadenilación de la región tardía del virus SV40 (Genbank SV4CG) .

Las condiciones de electrotransferencia fueron las siguientes: intensidad de campo eléctrico 200 V/cm, 8 impulsos de 20 mseg, frecuencia 2 Hz. Las tomas de sangre se realizaron a nivel del plexo retroorbital. Las tomas se efectuaron siete días después de la inyección del plásmido. Los resultados se presentan en la Tabla 15.

Tabla 15: concentración plasmática del factor IX en ratones C57B16 y SCID. El factor IX humano no es detectable en la sangre mas que cuando el plásmido fue administrado en las condiciones del procedimiento de conformidad con la presente invención. Ejemplo 22: transferencia de un gen que codifica para el factor de crecimiento de fibroblastos 1 (FGFl) . Ratones C57BL6 o SCID adultos, recibieron, en el músculo tibial craneal y de manera bilateral, una inyección de pCOR FGFl (pXL3096, 15 µg) .

El plásmido pXL3096 (Figura 14) es un vector derivado del plásmido pXL2774 (WO 97/10343) adicionado de una secuencia capaz de formar una triple hélice (TH, Wils et ai., 1997, Gene Ther 4: 323-330) en la cual, el gen que codifica para una fusión entre el péptido de señal del interferón de fibroblastos humanos y el ADNc del FGFl (Fibroblas Growth Factorl) (sp-FGFl, Jouanneau et al . , 1991 PNAS 88: 2893-2897) fue introducido baje- el control del promotor proveniente de la región precoz del citomegalovirus humano (hCMV IE) , seguido por la secuencia líder (transcrita, no traducida) del gen TK del HSV1 y de la señal de poliadenilación de la región tardía del virus SV40 (Genbank SV4CG) . Las condiciones de electrotransferencia fueron las siguientes: intensidad del campo eléctrico 200 V/cm, 8 impulsos de 20 mseg, frecuencia 2 Hz. La presencia del FGFl fue revelada por inmunohistoquímica. Los resultados para los ratones C57BL6 se presentan en la Figura 10. Se constata que el número de fibras positivas es mucho muy superior para el grupo sometido al campo eléctrico, con respecto al grupo control (que había recibido una inyección de pXL3096 pero sin someterlos al campo eléctrico) . La presencia del FGFl para el grupo control fue casi indetectable en los días 21 y 35, en contraste con un número importante de fibras positivas que permanecían observables para los grupos tratados por electrotransferencia . Los resultados para los ratones SCID se presentan en la Tabla 16.

Tabla 16: expresión del FGF, estudio inmunohistoquímico y del número de fibras positivas bajo una secreción muscular, tomada en la parte media del músculo . La expresión del FGFl, tal como fue determinada por el número de fibras positivas reveladas por inmunohistoquímica, se detectó únicamente en los músculos sometidos al campo eléctrico. Debe notarse que la expresión del FGFl se detectó igual para una dosis pequeña del plásmido administrado (1.5 µg) .

Ejemplo 23: transferencia de un gen que codifica para el factor neurotrófico NT3. El procedimiento de conformidad i con la presente invención fue aplicado en ratones adultos (C57B16) y en ratoncillos Xt/pmn para la transferencia del gen que codifica para la neurotrofina 3 (NT3) . Los ratones pmn constituyen un modelo murino de la esclerosis amiotrófica lateral (EAL) caracterizada por una degeneración precoz y rápida de las motoneuronas y por una duración de vida promedio de 40 días aproximadamente. 23.1: transferencia del gen que codifica para la NT3 en ratones adultos. Los ratones C57B1/6 de 5 semanas de edad recibieron, en el músculo tibial craneal y de manera unilateral, una inyección del plásmido pXL3149 (12.5 µg) que comprende el gen que codifica para la neurotrofina 3 (NT-3) murina. El plásmido pXL3149 (Figura 14) es un vector derivado del plásmido pXL2774 (WO 97/10343) en el que el gen que codifica para la neurotrofina 3 (NT-3) murina (Genbank MMNT3) fue introducido bajo el control del promotor proveniente de la región precoz del citomegalovirus humano (hCMV IE) y de la señal de poliadenilación de la región tardía del virus SV40 (Genbank SV4CG) .

Las condiciones de electrotransferencia fueron las siguientes: intensidad del campo eléctrico 250 V/cm, 4 impulsos de 20 mseg, frecuencia 1 Hz. El campo eléctrico fue aplicado inmediatamente después de la inyección del ADN plasmídico. La presencia del NT3 fue investigada en el sobrenadante de músculos suspendidos en solución reguladora PBS, centrifugada a 12000 g, 7 días después del tratamiento de los ratones. La cantidad de NT3 fue -medida por una prueba de ELISA [paquete Promega] . Los valores promedio (± intervalo de confianza del 95%) en 20 músculos, fueron de 77 +/- 11 pg/músculo (ADN plasmídico administrado sin electrotransferencia) y de 2700 +/- 900 pg/músculo (ADN plasmídico administrado con electrotransferencia. De esta manera, se observó un aumento de un factor de 55 en la cantidad de NT3 producida en el músculo cuando el plásmido pXL3149 fue transferido en las condiciones del procedimiento de conformidad con la presente invención. 23.2: transferencia del gen que codifica para la NT3 en ratoncillos. Se realizó un experimento comparable en ratones Xt pmn heterocigotos de 4 a 5 días de edad, con el plásmido pXL3149. Las dosis inyectadas fueron de 130 µg por animal y las inyecciones se aplicaron en sitios múltiples en diferentes músculos del animal (gastrocnemio 25 µg, tibial craneal 12.5 µg) . Las condiciones de electrotransferencia fueron las siguientes: intensidad del campo eléctrico 500 V/cm, 4 impulsos de 20 mseg, frecuencia 1 Hz. La presencia de NT3 se investigó 7 días después de la administración del plásmido, en el plasma y en los músculos (gastrocnemio o tibial craneal) . Se preparó un testigo del nivel basal de NT3 mediante la administración de una solución de NaCl al 0.9%. La cantidad de NT3 fue determinada por una prueba de ELISA [Paquete Promega] . Los resultados se presentan en la Tabla 17.

Tabla 17: valores promedio ± SEM de la cantidad de NT3 (pg por músculo y pg por ml de plasma) . En las condiciones del experimento, se observó un nivel basal de señal de detección de NT3 en el músculo gastrocnemio y en el músculo tibial craneal. En ausencia de la electrotransferencia, el nivel de expresión del gen NT3 obtenido mediante la inyección del plásmido pXL3149, no fue superior al nivel basal de detección de NT3 en el músculo. Cuando el plásmido fue administrado con el procedimiento de conformidad con la presente invención, se constató que la cantidad de NT3 detectada en el músculo, aumentaba significativamente. Se observó igualmente que la cantidad de NT3 secretada por el músculo y detectada en el plasma, aumentaba de manera neta en estas condiciones (factor de aumento ~ x 35) . Estos resultados demuestran que para una cantidad de ADN dada, el procedimiento de conformidad con la presente invención permite aumentar de manera muy significativa la eficacia de la transferencia de ADN y también permite obtener, no solamente en el músculo sino que igualmente en el plasma, un aumento importante de la cantidad de una neurotrofina tal como la NT3. Ejemplo 24: transferencia del gen que codifica para la hormona del crecimiento humano. Ratones C57B1/6 recibieron, en el músculo tibial craneal y de manera unilateral, una inyección del plásmido PXL3353 (10 µg) o del plásmido pXL3354 (10 µg) . El plásmido pXL3353 (Figura 15) es un vector derivado del plásmido pXL2774 en el cual el gen completo de la hormona del crecimiento humano (fragmento Xbal/Sphl de la hGH que se extiende desde la señal de inicio de la transcripción, sitio BamHl, hasta 224 pb después del sitio poli A) fue introducido bajo. el control del promotor proveniente de la región precoz del citomegalovirus humano (hCMV IE) y de la señal de poliadenilación de la región tardía del virus SV40. El ADNc del gen de la hormona del crecimiento humano fue obtenido por transcripción inversa de un banco de ARNm poli(A+) de la glándula pituitaria humana, seguido por 30 ciclos de amplificación por PCR con los siguientes oligonucleótidos : Oligonucleótido complementario de la región 5' : 5' -GGGTCTAGAGCCACCATGGCTACAGGCTCCCGGAC-3' Este oligonucleótido contiene un sitio Xbal y la secuencia kozak. Oligonucleótido complementario de la región 3' : 5' -GGGATGCATTTACTAGAAGCCACAGCTGCCTC-3' Este oligonucleótido contiene un sitio Nsil y el codón de paro. I El fragmento amplificado fue introducido en el plásmido pCR2.1 (TA Cloning paquete, Invitrogen) y fue secuenciado. Un fragmento Xbal/Nsil de 681 pb que contenía el ADNc de la hormona hGH, fue ligado al fragmento Xbal/Nsil del plásmido pXL3353 para generar el plásmido pXL3354 (Figura 15) .

Las condiciones de la electrotransferencia fueron las siguientes: intensidad del campo eléctrico 200 V/cm, 8 impulsos de 20 mseg, frecuencia 1 Hz. El campo eléctrico fue aplicado inmediatamente después de la inyección del ADN plasmídico. La presencia de la hGH se investigó 7 días después del tratamiento de los ratones, en el sobrenadante de músculos molidos en solución reguladora PBS, centrifugada a 12000 g. La cantidad de hGH fue medida por una prueba de ELISA (Boehringer Mannheim) .

Tabla 18: valores promedio ± SEM de la proteína hGH (picogramos) /músculo. Estos resultados demuestran que la electrotransferencia permite obtener un aumento muy importante de la hormona del crecimiento humano. Debe notarse que esta amplificación se observó igualmente con el plásmido que contenía el gen completo con todas sus secuencias de regulación. Ejemplo 25: efecto de la electrotransferencia sobre la expresión de transgenes vacunales. Este Ejemplo pone en evidencia que el procedimiento de conformidad con la presente invención, también es aplicable para la transferencia de genes que codifican para polipéptidos de interés vacunal. El experimento fue realizado en ratones Balb/c hembras, de 9 semanas de edad. Los electrodos utilizados fueron electrodos de placa de acero inoxidable, a 5 mm de separación. El VR-HA es un ADN plasmídico que contiene el gen de la hemaglutinina del virus de la gripe (cepa A/PR/8/34) . El VR-gB es un ADN plasmídico que comprende el gen de la glucoproteína B (gB) del citomegalovirus humano (cepa Towne) . La solución del plásmido (50 µl de una solución I con 20 µg/ml ó 200 µg/ml, en NaCl al 0.9%) fue inyectada longitudinalmente a través de la piel, en el músculo tibial craneal de manera unilateral. Los . impulsos eléctricos se aplicaron 20 seg después de la administración del plásmido, perpendicularmente al eje del músculo, con la ayuda de un generador de impulsos cuadrados (intensidad del campo eléctrico 200 V/cm, 8 impulsos consecutivos de una duración de 20 mseg, frecuencia 1 Hz) . Para la evaluación de la estimulación de la respuesta inmunitaria, se siguió el siguiente protocolo de «r inmunización: DO toma de suero preinmune - DI primera inyección, con o sin electro- transferencia D2 inyección de refuerzo, con o sin electro- transferencia D42 toma de suero inmune D63 toma de suero inmune Las tomas de sangre se efectuaron a nivel del seno retroorbital. Las dosis de anticuerpos específicos fueron probadas por ELISA. Cada condición experimental fue probada en 10 animales inyectados de manera unilateral. Los resultados que concentran los títulos de anticuerpos dirigidos contra la hemaglutinina del virus de la gripe, se presentan en la Tabla 19A.

Tabla 19A: Título de anticuerpos dirigidos contra la hemaglutinina del virus de la gripe, obtenidos después de la inyección de 1 ó 10 µg de ADN (VR-HA) en ausencia o en presencia de impulsos eléctricos. Los resultados son el promedio geométrico de 10 animales (8 animales para el grupo inyectado con 1 µg de ADN en presencia de impulsos eléctricos y toma de muestras en el D63) ± desviación estándar. El valor de p fue obtenido mediante la comparación dos a dos de los grupos inyectados, en presencia y en ausencia de impulsos eléctricos, utilizando la prueba no paramétrica de Mann-Whitney. Estos resultados demuestran que los títulos de anticuerpos dirigidos contra la hemaglutinina del virus de la gripe, aumentan en un factor de 10 aproximadamente, en los grupos de animales que fueron sometidos a impulsos eléctricos. Así mismo, los ratones que recibieron 1 µg de ADN en presencia de impulsos eléctricos, presentan un título promedio de anticuerpos muy superior al de los ratones que recibieron 10 µg de ADN en ausencia de impulsos eléctricos. i Los resultados que concentran los títulos de anticuerpos dirigidos contra la glucoproteína B del citomegalovirus humano, se presentan en la Tabla 19B.

- - Tabla 19B: título de anticuerpos dirigidos contra la glucoproteína B (gB) del citomegalovirus humano, obtenido después de la inyección de 10 µg de ADN (VR-gB) en i ausencia o en presencia de impulsos eléctricos. Los resultados son el promedio geométrico de 10 animales (9 animales para el grupo inyectado en presencia de impulsos eléctricos) ± desviación estándar. El valor de p fue obtenido mediante la comparación dos a dos de los grupos inyectados en presencia y en ausencia de impulsos eléctricos, utilizando la prueba no paramétrica de Mann-Whitney. Estos resultados demuestran que los títulos de anticuerpos dirigidos contra la glucoproteína B del citomegalovirus humano, aumentan en un factor de 4 en el día D42, en el grupo de animales sometidos a impulsos eléctricos. De la misma manera, se observa que el coeficiente de variación es en promedio tres veces más bajo en los grupos de animales sometidos a impulsos eléctricos. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (90)

1. RESINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecedente, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Un procedimiento de transferencia de ácido nucleico en uno o una pluralidad de músculos estriados in vivo, caracterizado porque las células del músculo se ponen en contacto con el ácido nucleico por transferir mediante una administración directa en el tejido o mediante una administración tópica o sistémica y en donde la transferencia se asegura mediante la aplicación al músculo de uno o una pluralidad de impulsos eléctricos de una intensidad comprendida entre 1 y 800 Voltios/cm.
2. 2. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la intensidad del campo está comprendida entre 4 y 400 Voltios/cm. i
3. 3. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la intensidad del campo está comprendida entre 30 y 300 Voltios/cm.
4. 4. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la duración total de aplicación del campo eléctrico es superior a 10 milisegundos.
5. 5. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la aplicación al músculo del campo eléctrico comprende uno o una pluralidad de impulsos de frecuencia regular.
6. 6. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la aplicación al músculo del campo eléctrico comprende entre 1 y 100,000 impulsos, de una frecuencia comprendida entre 0.1 y 1000 hertz.
7. 7. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque los impulsos eléctricos se aplican de manera irregular los unos con respecto a los otros y en donde la función que describe al campo eléctrico en función del tiempo de un impulso, es variable.
8. 8. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la integral de la función que describe la variación del campo eléctrico con respecto al tiempo, es superior a 1 kV x mseg/cm.
9. 9. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque esta integral es superior o igual a 5 kV x mseg/cm.
10. 10. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque los impulsos eléctricos se seleccionan del grupo que consiste de impulsos de ondas cuadradas, campos eléctricos que generan ondas con disminución exponencial, ondas unipolares oscilantes de duración limitada, ondas bipolares oscilantes de duración limitada u otras formas de ondas.
11. 11. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque los impulsos eléctricos comprenden impulsos con ondas cuadradas .
12. 12. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque los impulsos eléctricos se aplican con electrodos colocados en distintas partes del músculo o colocados en contacto con la piel.
13. 13. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque los impulsos eléctricos se aplican con electrodos introducidos en el interior del músculo.
14. 14. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque el ácido nucleico es inyectado en el músculo.
15. 15. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque el ácido nucleico es inyectado por vía sistémica.
16. 16. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el ácido nucleico es inyectado por vía intraarterial o intravenosa.
17. 17. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque el ácido nucleico es administrado por vía tópica, cutánea, oral, vaginal, intranasal, subcutánea o infraocular.
18. 18. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado porque el ácido nucleico está presente en una composición que contiene, además, excipientes farmacéuticamente aceptables para las diferentes vías de administración.
19. 19. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la composición está adaptada para administración parenteral.
20. 20. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque el ácido nucleico es un ácido desoxirribonucleico.
21. 21. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque el ácido nucleico es un ácido ribonucleico.
22. 22. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, caracterizado porque el ácido nucleico es de origen sintético o biosintético, o es extraído de un virus o de un organismo procariótico o eucariótico unicelular o pluricelular.
23. 23. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el ácido nucleico administrado está asociado con la totalidad o una parte de los componentes del organismo de origen y/o del sistema de síntesis.
24. 24. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, caracterizado porque el ácido nucleico codifica para un ARN o una proteína de interés.
25. 25. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el ARN es un ARN catalítico o antisentido.
26. 26. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el ácido nucleico codifica para una proteína que se selecciona del grupo que consiste de enzimas, derivados sanguíneos, hormonas, linfocinas, factores de crecimiento, factores tróficos, factores angiogénicos, factores neurotróficos, factores de crecimiento óseo, factores hematopoyéticos, factores de coagulación, antígenos y proteínas implicados en el metabolismo de los aminoácidos, lípidos y otros constituyentes esenciales de la célula.
27. 27. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el ácido nucleico codifica para los factores angiogénicos VEGF y FGF, los factores neurotróficos BDNF, CNTF, NGF, IGF, FMG, FGFl, NT3, NT5, la proteína Gax, la insulina para el tratamiento de la diabetes, la hormona del crecimiento, una citocina, a-1-antitripsina, calcitonina, leptina y apolipoproteínas, enzimas para la biosíntesis de vitaminas, hormonas y neuromediadores .
28. 28. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el ácido nucleico codifica para un anticuerpo, un fragmento variable de anticuerpo de cadena simple (ScFv) o cualquier otro fragmento de anticuerpo que posea capacidad de reconocimiento de un objetivo inmunoterapéutico, o que codifica para un receptor soluble, para un péptido agonista o antagonista de un receptor o de una proteína de adhesión, para una proteína artificial, quimérica o truncada.
29. 29. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el ácido nucleico codifica para un anticuerpo antiidiotípico, un fragmento soluble del receptor CD4 o del receptor del TNFa o del receptor de la acetilcolina.
30. 30. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 26 a 29, caracterizado porque el ácido nucleico codifica para un precursor de una proteína terapéutica.
31. 31. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30, caracterizado porque el ácido nucleico está en forma de un plásmido.
32. 32. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30, caracterizado porque el ácido nucleico contiene un gen de gran tamaño y/o intrones y/o elementos reguladores de pequeño o de gran tamaño .
33. 33. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30, caracterizado porque el ácido nucleico es un ADN episomal o un cromosoma artificial de levadura o un minicromosoma.
34. 34. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33, caracterizado porque el ácido nucleico contiene secuencias que permiten y/o favorecen la expresión del transgén en el músculo.
35. 35. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34, caracterizado porque el ácido está asociado con cualquier tipo de vectores o con cualquier combinación _ de vectores que permitan mejorar la transferencia del ácido nucleico, tales como vectores de virus, agentes sintéticos, o biosintéticos o incluso microesferas propulsadas o no.
36. 36. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 35, caracterizado porque el músculo es sometido a un tratamiento con el fin de mejorar la transferencia del gen, un tratamiento de naturaleza farmacológica de aplicación local o sistémica, o un tratamiento enzimático, permeabilizante, quirúrgico, mecánico, térmico o físico.
37. 37. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 36, caracterizado porque permite la producción por parte del músculo, de un agente a dosis fisiológicas y/o terapéuticas, ya sea en las células musculares, o bien, secretado.
38. 38. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 37, caracterizado porque permite modular la cantidad del transgén expresado, modulando el volumen de tejido muscular transfectado.
39. 39. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque permite modular el volumen del tejido muscular transfectado mediante la utilización de múltiples sitios de administración.
40. 40. El procedimiento ' de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 39, caracterizado porque permite modular la cantidad del transgén expresado, modulando el número, la forma, la superficie y la disposición de los electrodos y variando la intensidad, el número, la duración, la frecuencia y la forma de los impulsos, así como la cantidad y el volumen de administración del ácido nucleico.
41. 41. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 40, caracterizado porque permite controlar la localización de los tejidos transfectados por el volumen de tejido sometido a los impulsos eléctricos locales. |
42. 42. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 41, caracterizado porque permite regresar a la situación inicial mediante la ablación de la zona de tejido transfectado.
43. 43. Un ácido nucleico y un campo eléctrico de una intensidad comprendida entre 1 y 800 Voltios/cm, como producto de combinación, para su administración separada o escalonada con respecto al tiempo, in vivo, a un músculo estriado y para terapia génica basada en la electrotransfección in vivo en el músculo estriado, después de la administración del ácido nucleico.
44. 44. El producto de combinación de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque la intensidad del campo eléctrico está comprendida entre 4 y 400 Voltios/cm.
45. 45. ,E1 producto de combinación de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque la intensidad del campo está comprendida entre 30 y 300 Voltios/cm.
46. 46. El producto de combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 43 a 45, caracterizado porque la duración total de la aplicación del campo eléctrico es superior a 10 milisegundos.
47. 47. El producto de combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 43 a 46, caracterizado porque la aplicación al músculo del campo eléctrico, comprende uno o una pluralidad de impulsos de frecuencia regular.
48. 48. El producto de combinación de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque la aplicación del campo eléctrico al músculo comprende entre 1 y 100,000 impulsos, de una frecuencia comprendida entre 0.1 y 1000 hertz.
49. 49. El producto de combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 43 a 46, caracterizado porque los impulsos eléctricos son aplicados de manera irregular unos con respecto a los otros y en donde la función que describe al campo eléctrico en función del tiempo de un impulso, es variable.
50. 50. El producto de combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 43 a 49, caracterizado porque la integral de la función que describe la variación del campo eléctrico con respecto al tiempo, es superior a 1 kV x mseg/cm.
51. 51. El producto de combinación de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque esta integral es superior o igual a 5 kV x mseg/cm.
52. 52. El producto de combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 43 a 51, caracterizado porque los impulsos eléctricos se seleccionan del grupo que consiste de impulsos de ondas cuadradas, campos eléctricos que generan ondas con disminución exponencial, ondas unipolares oscilantes de duración limitada, ondas bipolares oscilantes de duración limitada u otras formas de ondas .
53. 53. El producto de combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 43 a 52, caracterizado porque los impulsos eléctricos comprenden impulsos de ondas cuadradas.
54. 54. El producto de combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 43 a 53, caracterizado porque los impulsos eléctricos se aplican con electrodos colocados en distintas partes del músculo o colocados en contacto con la piel.
55. 55. El producto de combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 43 a 53, caracterizado porque los impulsos eléctricos se aplican con electrodos introducidos en el interior del músculo.
56. 56. El producto de combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 43 a 55, caracterizado porque el ácido nucleico es inyectado en el músculo .
57. 57. El producto de combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 43 a 55, caracterizado porque el ácido nucleico es inyectado por vía sistémica.
58. 58. El producto de combinación de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque el ácido nucleico es inyectado por vía intraarterial o intravenosa.
59. 59. El producto de combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 43 a 55, caracterizado porque el ácido nucleico es administrado por vía tópica, cutánea, oral, vaginal, intranasal, subcutánea o infraocular.
60. 60. El producto de combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 43 a 59, caracterizado porque el ácido nucleico está presente en una composición que contiene, además, excipientes farmacéuticamente aceptables para las diferentes vías de administración.
61. 61. El producto de combinación de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque la composición está adaptada para administración parenteral.
62. 62. El producto de combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 43 a 61, caracterizado porque el ácido nucleico es un ácido desoxirribonucleico .
63. 63. El producto de combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 43 a 61, caracterizado porque el ácido nucleico es un ácido ribonucleico .
64. 64. El producto de combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 43 a 63, caracterizado porque el ácido nucleico es de origen sintético o biosintético, o es extraído de un virus o de un organismo procariótico o eucariótico unicelular o pluricelular.
65. 65. El producto de combinación de conformidad con la reivindicación 64, caracterizado porque el ácido nucleico administrado está asociado con la totalidad o una parte de los componentes del organismo de origen y/o del sistema de síntesis.
66. 66. El producto de combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 43 a 65, caracterizado porque el ácido nucleico codifica para un ARN o una proteína de interés.
67. 67. El producto de combinación de conformidad con la reivindicación 66, caracterizado porque el ARN es un ARN catalítico o antisentido.
68. 68. El producto de combinación de conformidad con la reivindicación 66, caracterizado porque el ácido nucleico codifica para una proteína que se selecciona del grupo que consiste de enzimas, derivados sanguíneos, hormonas, linfocinas, citocinas, factores de crecimiento, factores tróficos, factores .angiogénicos, factores neurotróficos, factores de crecimiento ' óseo, factores hematopoyéticos, factores de coagulación, antígenos y proteínas implicados en el metabolismo de los aminoácidos, lípidos y otros constituyentes esenciales de la célula.
69. 69. El producto de combinación de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque el ácido nucleico codifica para los factores angiogénicos VEGF y FGF, los factores neurotróficos BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, FGFl, NT3, NT5, la proteína Gax, la insulina para el tratamiento de la diabetes, la hormona del crecimiento, a-1-antitripsina, calcitonina, leptina y apolipoproteínas, enzimas para la biosíntesis de vitaminas, hormonas y neuro ediadores .
70. 70. El producto de combinación de conformidad con la reivindicación 66, caracterizado porque el ácido nucleico codifica para un anticuerpo, un fragmento variable de anticuerpo de cadena simple (ScFv) o cualquier otro fragmento de anticuerpo que posea la capacidad de reconocimiento de un objetivo inmunoterapéutico, o codifica para un receptor soluble, un péptido agonista o antagonista de un receptor o de una proteína de adhesión, para una proteína artificial, quimérica o truncada.
71. 71. El producto de combinación de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque el ácido nucleico codifica para un anticuerpo antiidiotípico, un fragmento soluble del receptor CD4 o del receptor del TNFa o del receptor de la acetilcolina.
72. 72. El producto de combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 68 a 71, caracterizado porque el ácido nucleico codifica para un precursor de una proteína terapéutica.
73. 73. El producto de combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 43 a 72, caracterizado porque el ácido nucleico está en forma de un plásmido.
74. 74. El producto de combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 43 a 72, caracterizado porque el ácido nucleico contiene un gen de gran tamaño y/o intrones y/o elementos reguladores de pequeño o de gran tamaño.
75. 75. El producto de combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 43 a 72, caracterizado porque el ácido nucleico es un ADN episo al o un cromosoma artificial de levadura o bacteriano o un minicromosoma .
76. 76. El producto de combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 43 a 75, caracterizado porque el ácido nucleico contiene secuencias que permiten y/o favorecen la expresión del transgén en el músculo.
77. 77. El producto de combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 43 a 76, caracterizado porque el ácido está asociado con cualquier tipo de vectores o con cualquier combinación de vectores que permitan mejorar la transferencia del ácido nucleico, tales como vectores de virus, agentes sintéticos o biosintéticos, o incluso microesferas impulsadas o no.
78. 78. El producto de combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 43 a 77, caracterizado porque el músculo es sometido a un tratamiento con el fin de mejorar la transferencia del gen, un tratamiento de naturaleza farmacológica de aplicación local o sistémica, o un tratamiento enzimático, permeabilizante, quirúrgico, mecánico, térmico o físico.
79. 79. El producto de combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 43 a 78, caracterizado porque permite la producción por parte del músculo, de un agente a dosis fisiológicas y/o terapéuticas, ya sea en las células musculares, o bien, secretado.
80. 80. El producto de combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 43 a 78, caracterizado porque permite modular la cantidad del transgén expresado, modulando el volumen de tejido muscular transfectado . „
81. 81. El producto de combinación de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado porque permite modular el volumen del tejido muscular transfectado mediante la utilización de múltiples sitios de administración.
82. 82. El producto de combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 43 a 81, caracterizado porque permite modular la cantidad del transgén expresado, modulando el número, la forma, la superficie y la disposición de los electrodos y variando la intensidad del campo, el número, la duración, la frecuencia y la forma de los impulsos, así como la cantidad y el volumen de administración del ácido nucleico.
83. 83. El producto de combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 43 a 82, caracterizado porque permite controlar la localización de los tejidos transfectados por el volumen de tejido sometido a los impulsos eléctricos locales.
84. 84. El producto de combinación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 43 a 83, caracterizado porque permite regresar a la situación inicial mediante la ablación de la zona de tejido transfectado .
85. 85. El uso de un ácido nucleico para la fabricación de un medicamento para un tratamiento por terapia génica, poniendo en contacto células de uno o una pluralidad de músculos estriados con el ácido nucleico a transferir, in vivo, y aplicándole posteriormente a dicho músculo uno o una pluralidad de impulsos eléctricos de una intensidad comprendida entre 1 y 800 Voltios/cm.
86. 86. El uso de conformidad con la reivindicación 85, caracterizado porque la puesta en contacto se efectúa mediante una administración directa en el tejido o mediante administración tópica o sistémica.
87. 87. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 85 y 86, caracterizado porque las ondas son unipolares .
88. 88. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 85 a 87, caracterizado porque la intensidad del campo está comprendida entre 4 y 400 Voltios/cm.
89. 89. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 85 a 88, caracterizado porque la intensidad del campo está comprendida entre 30 y 300 Voltios/cm.
90. 90. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 85 a 89, caracterizado porque la duración total de la aplicación del campo eléctrico, es superior a 10 milisegundos.