MXPA99011527A

MXPA99011527A - Dispositivo para electrotransferencia optimizadade vectores de acido nucleico a tejidos in vivo

Info

Publication number: MXPA99011527A
Application number: MXPA/A/1999/011527A
Authority: MX
Inventors: Scherman Daniel; Bureau Michel; Mir Lluis; Schwartz Bertrand
Original assignee: Bureau Michel; Centre National De La Recherche Scientifique; Institut Gustave Roussy; Mir Lluis; Rhonepoulenc Rorer Sa; Scherman Daniel; Schwartz Bertrand
Priority date: 1997-06-30
Filing date: 1999-12-10
Publication date: 2000-06-01

Abstract

Esta invención estádirigida a sistemas y dispositivos que proporcionan un mejoramiento notable para la transferencia in vivo al interior de células, particularmente células musculares y células tumorales, de vectores deácido nucleico que utilizan campos eléctricos débiles, para incrementar la eficiencia de tales transferencias. Los dispositivos de la invención están diseñados paraproporcionar un gradiente de voltajeóptimo para mejorar la migración de vectores deácido nucleico al interior de células, sin dañar las células o el tejido. Tales dispositivos están caracterizados por disposicionesúnicas de electrodos y por límites de potenciaúnicos definidos por ajustes de voltaje máximo.

Description

DISPOSITIVO PARA ELECTROTRANSFERENCIA OPTIMIZADA DE VECTORES DE ÁCIDO NUCLEICO A TEJIDOS IN VIVO CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención está dirigida a una mejoría notable de la transferencia in vivo al interior de las células, particularmente células musculares, de vectores de ácido nucleico que utilizan campos eléctricos débiles, para incrementar la eficiencia de tales transferencias. La invención se relaciona específicamente con métodos, dispositivos y composiciones que alteran tal transferencia del vector de ácido nucleico para terapia de genes. Los dispositivos de la invención están diseñados para proporcionar un gradiente óptimo de voltaje para mejorar la migración de los vectores de ácido nucleico al interior de las células, sin dañar a las células o al tejido. Tales dispositivos están caracterizados por disposiciones únicas de electrodos, y por límites de energía únicos definidos por ajustes de voltaje máximo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN VECTORES Y MÉTODOS PARA EL SUMINISTRO DE GENES La transferencia de genes en una célula dada es el fundamento de la terapia de genes. Sin embargo, uno de los REF.: 32139 problemas es introducir una cantidad suficiente de ácido nucleico en las células huéspedes que se van a tratar. El gen de interés se debe expresar en las células transfectadas. Una de las soluciones adoptadas a este respecto ha sido la integración de ácido nucleico en vectores virales, particularmente retrovirus, adenovirus o virus adenoasociados . Estos sistemas aprovechan los mecanismos de penetración celular desarrollados por los virus así como su protección contra la degradación. Sin embargo, esta solución presenta problemas. Uno es el riesgo de producción de partículas virales infecciosas susceptibles a diseminación en el organismo huésped y, en el caso de vectores retrovirales, el riesgo de mutagénesis insercional. Además, la capacidad de inserción de un gen terapéutico o de vacuna en un genoma viral permanece limitado. Finalmente, con frecuencia se generan respuestas inmunes contra vectores virales, lo que vuelve la readministración del virus inefectiva debido a la depuración inmune, y también puede resultar en inflamación. Otra solución (Wolf et al., Science 247, 1465-68, 1990; Davis et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93, 7213-18, 1996; Patente de los Estados Unidos número 5,580,859 para Felgner et al . ) involucra administrar en el músculo o en la corriente sanguínea un ácido nucleico de tipo plasmídico, ya sea unido o no a compuestos diseñados para facilitar su transfección, como proteínas, liposomas, lípidos cargados o polímeros catiónicos, tales como polietilenimina, los cuales son buenos agentes de transfección in vi tro (Behr et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86, 6982-6, 1989; Felgner et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84, 7413-7, 1987; Boussif et al., Proc. Nati. Acad. Sci, USA 92, 7297-301; 1995; Patente de los Estados Unidos 5,676,954 y Patente EP 425 475) . En lo que respecta al músculo, desde la publicación original de Wolf et al., supra, que muestra la capacidad del tejido muscular para incorporar ADN inyectado en forma de plásmido libre, muchos investigadores han intentado mejorar este proceso (Manthorpe et al., 1993, Human Gene Ther. 4, 419- 431; Wolff et al., 1991, BioTechniques 11, 474-485). Algunas tendencias han surgido de estas pruebas, de manera notable: el uso de soluciones mecánicas para forzar la entrada de ADN al interior de las células, al absorber el ADN en esferas que después son impulsadas a los tejidos ("cañón de genes") (Sanders Williams et al., 1991, Proc. Nati. Acad. Sci, USA 88, 2726-2730; Fynan et al., 1993, BioTechniques 11, 474- 485) . Este proceso ha demostrado ser efectivo en estrategias de vacunación, pero hace contacto únicamente con las capas de tejidos superficiales. En el caso del músculo, se necesitaría una solución quirúrgica con el fin de tener acceso a los músculos para las partículas que no atraviesen los tejidos ' cutáneos ; la inyección de ADN, ya no en forma plasmídica, sino unido a moléculas capaces de servir como un vehículo que facilite la entrada de los complejos al interior de las células. Los lípidos catiónicos utilizados en muchos otros procesos de transfección hasta ahora han sido desalentadores en su aplicación al músculo, pues aquellos que han sido probados han demostrado inhibir la transfección (Schwartz et al., 1996, Gene Ther., 405-411). Los mismo es válido para los péptidos catiónicos y polímeros (Manthorpe et al., 1993, Human Gene Ther. 4, 419-431) . El único caso de combinación favorable parece ser la mezcla de alcohol polivinílico o polivinilpirrolidona con ADN. El incremento resultante de estas combinaciones representa únicamente un factor de menos de 10 en relación al ADN inyectado desnudo (Mumper et al . , 1996, Pharmaceutical Research 13, 701-709) ; el pretratamiento del tej ido que se va a inyectar con soluciones diseñadas para mejorar la difusión y/o estabilidad de ADN (Davis et al., 1993, Hum. Gene Ther. 4, 151-159) o para favorecer la entrada de ácidos nucleicos, por ejemplo la inducción de multiplicación celular o fenómenos de regeneración. Los tratamientos se han relacionado, en particular, con el uso de anestésicos locales o cardiotoxina, vasoconstrictores, endotoxina u otras moléculas (Manthorpe et al., 1993, Human Gene Ther. 4, 419- 431; Danko et al., 1994, Gene Ther. l, 114-121; Vitadello et al., 1994, Hum. Gene Ther. 5, 11-18). Estos protocolos de pretratamiento son difíciles de controlar. En particular, la bupivacaína debe ser utilizada en una concentración muy cercana a las dosis mortales con el fin de que sea efectiva. La preinyección de sacarosa hiperosmótica, diseñada para mejorar la difusión, no incrementa el nivel de transfección en el músculo (Davis et al., 1993) . Se han transfectado in vivo otros tejidos ya sea utilizando ADN plasmídico solo o por unión a vectores sintéticos (revisiones de Cotten y Wagner (1994) , Current Opionion in Biotechnology 4, 705; Gao and Huang (1995), Gene Therapy, 2, 710; Ledley (1995), Human Gene Therapy 6, 1129).

Los principales tejidos estudiados fueron el hígado, el epitelio respiratorio, la pared de los vasos, el sistema nervioso central y los tumores. En todos estos tejidos, los niveles de expresión transgénica demostraron ser demasiado bajos para anticipar una aplicación terapéutica (por ejemplo, en el hígado, Chao et al: (1996), Human Gene Therapy 7, 901), aunque se han presentado recientemente algunos resultados alentadores para la transferencia de ADN plasmídico en la pared vascular (Iires et al. (1996), Human Gene Therapy 7, 959 y 989) . En el cerebro, la efectividad de la transferencia es muy ligera, así como en los tumores (Schwartz et al., 1996, Gene Therapy 3, 405; Lu et al., 1994, Cáncer Gene Therapy 1, 245; Son et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91; 12669).

ELECTROPORACIÓN E IONTOFORESIS PARA SUMINISTRO DE GENES La electroporación, o el uso de campos eléctricos para permeabilizar células, se utiliza comúnmente in vitro para promover la transfección de ADN en células de cultivo. Este fenómeno depende de que se obtenga una fuerza de campo eléctrico umbral. Se ha observado la electropermeabilización en campos eléctricos de intensidad relativamente elevada, en el orden de 800 a 1200 voltios/cm para células animales. Esta técnica también se ha propuesto in vivo con el fin de mejorar la eficiencia de agentes antitumorales, como bleomicina, en tumores sólidos en los humanos (Patente de los Estados Unidos número 5,468,228, L.M. Mir) . Con pulsos de duración muy corta (100 microsegundos) , estas condiciones eléctricas (800 a 1200 volts/cm) están bien adaptadas para la transferencia intracelular de moléculas pequeñas. Estas condiciones (pulsos de 100 microsegundos) se aplican sin mejoramiento de la transferencia de ácido nucleico in vivo en el hígado, en donde los campos inferiores a 1000 volts/cm han demostrado ser totalmente inefectivos e incluso inhibidores en comparación con la inyección de ADN en ausencia de pulsos eléctricos (patente WO 97/07826 y Heller et al., FEBS Letters, 389, 225-8, 1996). Esta técnica presenta dificultades, además, para su aplicación in vivo, pues la administración de campos de tal intensidad puede provocar lesiones extensas en el tejido. Las lesiones de los tejidos objetivo no son un problema en el tratamiento de tumores en pacientes con cáncer, pero pueden representar una desventaja principal cuando se administra ácido nucleico en tejidos diferentes a los tejidos tumorales y, en particular, en el músculo estriado. Existen tres tipos básicos de sistemas utilizados para administrar pulsos eléctricos para electroporación e iontoforesis : electrodos externos, electrodos internos (que incluyen catéteres) , y electrodos externos e internos combinados .

Electrodos Externos En un tipo de dispositivo, los electrodos se colocan externamente con respecto al paciente. Véase, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos número 5,318,514 para Hofmann; 5,439,440 para Hofmann; 5,462,520 para Hofmann; 5,464,386 para Hofmann; 5,688,233 para Hofmann et al . , y 5,019,034 para Weaver et al; las descripciones de las cuales se incorporan en la presente como referencia. Con un dispositivo de electrodo externo, los electrodos están en contacto con una región de tejido de superficie de un paciente. El dispositivo se puede utilizar de manera no invasiva al aplicar los electrodos a la piel del paciente o bien de manera invasiva al aplicar los electrodos a la superficie de un órgano que ha sido expuesto quirúrgicamente . La patente '514 de Hofmann describe un dispositivo que se utiliza para implantar macromoléculas tales como genes, ADN o sustancias farmacéuticas en una región de tejido de superficie preseleccionada de un paciente. El dispositivo tiene un montaje de cabeza el cual incluye, en una primera modalidad, un conductor en serpentín colocado en un elastómero de poro abierto, ambos son transportados sobre un miembro de soporte generalmente plano. Los segmentos paralelos adyacentes del conductor de serpentín sirven como electrodos . Para administrar pulsos eléctricos al paciente, se coloca el montaje de cabeza en contacto con la región de tejido de superficie preseleccionada del paciente, se coloca al conductor en contacto con la piel . Se transfiere a la piel del paciente un medio líquido que transporta las macromoléculas, por suministro al elastómero del líquido al cual se absorbe o se humedece por el elastómero. Después se activa un conmutador para suministrar un pulso de alto voltaje desde un generador de señal a los electrodos, lo que provoca que se genere un campo eléctrico a través de los electrodos. La profundidad del campo eléctrico en la piel es proporcional a la piel entre los electrodos. El campo eléctrico inyecta el líquido dentro de la región de tej ido . En una modalidad alternativa, el montaje de cabeza incluye una pluralidad de agujas finas que se extienden generalmente perpendiculares al miembro de soporte plano. Las agujas se colocan en hileras y se conectan alternativamente a la salida del generador de señal de manera que cada aguja está adyacente a otra aguja de polaridad opuesta. Las agujas penetran las capas más exteriores de las células de la piel y facilitan la administración de pulsos eléctricos dentro del área objetivo. La patente '440 de Hofmann describe un aparato el cual incluye electrodos separados de manera ajustable para generar un campo eléctrico. Los electrodos se montan en una articulación movible de manera que los electrodos se pueden manipular por el usuario para moverse uniéndolos o separándolos como las mordazas de una abrazadera. En funcionamiento, las mordazas del electrodo se abren y el tej ido seleccionado que va a ser tratado se sujeta entre las mordazas del electrodo. Se activa un generador de señal conectado en el electrodo por un dispositivo de conmutación adecuado para generar los campos eléctricos en el tejido entre los electrodos.

Electrodos Internos Un segundo tipo de sistema de electrotransferencia utiliza electrodos implantables o insertables los cuales se colocan dentro del paciente para suministrar un campo eléctrico al área adyacente al electrodo implantado/insertado. Véanse, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos números 5,304,120 para Crandell et al.; 5,507,724 para Hofmann et al.; 5,501,662 para Hofmann; 5,702,359 para Hofmann et al.; y 5,273,525 para Hofmann; las descripciones de las cuales se incorporan en la presente como referencia. La patente de Crandell '120 describe un catéter que se inserta en el vaso sanguíneo seleccionado de un paciente. El catéter incluye una pluralidad de electrodos separados circunferencialmente los cuales se extienden axialmente y que se ponen en contacto con la pared interior del vaso sanguíneo. Después se suministra como infusión un medio líquido que contiene las macromoléculas, en los vasos sanguíneos adyacentes a los electrodos y se activan los electrodos para aplicar la señal eléctrica predeterminada para electrotransferencia. Los electrodos separados pueden ser tiras en serpentín o paralelas las cuales son activadas para crear el campo eléctrico deseado. La patente '724 de Hofmann es otro ejemplo de un dispositivo de electrotransferencia basado en catéter que tiene electrodos separados los cuales se colocan en el exterior de un catéter que se inserta dentro de un vaso sanguíneo para hacer contacto con la pared del vaso que se va a tratar. La patente '662 de Hofmann describe un par de electrodos separados montados dentro de un portador dieléctrico cilindrico. Los electrodos se colocan alrededor del centro del vaso sanguíneo una distancia predeterminada uniforme separados entre si y cerca del centro del vaso de manera que la sangre que fluye en el vaso pasa entre los electrodos . El portador dieléctrico cilindrico se implanta quirúrgicamente dentro de un vaso sanguíneo circundante. Se aplica a los electrodos una señal eléctrica predeterminada para crear campos eléctricos en la sangre que fluyen entre los electrodos. La patente '525 de Hofmann describe una jeringa de aguja doble en la cual las agujas sirven como los electrodos para llevar a cabo la electrotransferencia. Una vez que las agujas se han insertado en el área objetivo, se aplica a los electrodos una señal eléctrica para dirigir el campo eléctrico al área objetivo. La patente '359 de Hofmann describe también electrodos basados en agujas utilizados para electrotransferencia.

Electrodos combinados externos e internos Un tercer tipo de dispositivo de electrotransferencia combina las características de los sistemas antes mencionados.

Estos dispositivos utilizan por lo menos un electrodo colocado internamente y por lo menos un electrodo colocado externamente para suministrar el campo eléctrico al área de tejido que se desea. Véanse, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos números 5,286,254 para Shapland et al.; 5,499,971 para Shapland et al.; 5,498,238 para Shapland et al.; 5,282,785 para Shapland et al.; y 5,628,730 para Shapland et al.; las descripciones de las cuales se incorporan en la presente como referencia. Uno de estos dispositivos típicos se describe en la patente 0'785 de Shapland la cual describe un catéter que tiene una cámara de medicamento con una pared de suministro de medicamento (por ejemplo, una pared fabricada de un material permeable o semipermeable a través del cual puede pasar los medicamentos u otras moléculas) y un electrodo que se localiza dentro del catéter en relación opuesta a la pared de suministro de medicamento. El segundo electrodo se localiza en un sitio remoto en la piel del paciente. Un líquido que contiene las macromoléculas deseadas se suministra a la cámara de medicamento para que se coloque en el campo eléctrico generado entre los dos electrodos cuando se proporcionan con corriente. De esta manera, las macromoléculas se suministran al área objetivo. Otras características que se describen en las patentes mencionadas antes incluyen: inversión de la polaridad de los electrodos para activar el exceso de macromoléculas en una dirección opuesta a la utilizada para suministro (por ejemplo, las patentes de Shapland '238 y de Shapland '785); sistemas para sincronizar el suministro de la corriente con los electrodos con la despolarización ventricular del corazón para evitar arritmias inducidas eléctricamente o ritmos cardíacos no naturales (por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos números 5,236,4Í3 y 5,425,703 para Feiring, y la patente número 5,634,899 para Shapland); y la utilización de un transductqr piezoeléctrico ultrasónico en vez de electrodos para generar ondas de sonido como la fuerza impulsora para el suministro de macromoléculas, conocido como fonoforesis (por ejemplo, la patente de Shapland '238 y la patente de Shapland '730) .

DESCRIPCIÓN BREVE DE LA INVENCIÓN Aunque todos los estudios citados mencionan la necesidad de campos eléctricos elevados, en el orden de 1000 volts/cm para ser efectivos in vivo, de manera inesperada y notoria, la mayor parte de los solicitantes no han demostrado que la transferencia de ácido nucleico in vivo en los tejidos se incremente sustancialmente sin efectos indeseables, al someter el tejido a pulsos eléctricos de baja intensidad (menos de 600 volts/cm) , por ejemplo, de 100-200 volts/cm y de duración relativamente prolongada. Además, los solicitantes descubrieran que la amplia variabilidad de expresión transgénica portada por los plásmidos observada en la técnica anterior de la transferencia de ADN en el músculo se reduce notablemente por el proceso de acuerdo con la invención. En consecuencia, esta invención se relaciona con un proceso y dispositivo para la transferencia de ácido nucleico al interior de los tejidos in vivo, por ejemplo, de uno o más músculos estriados o tumores, en los cuales las células de tejido se ponen en contacto con el ácido nucleico que va a ser transferido por administración directa en el tejido o por administración tópica o sistémica, y transferencia la cual se asegura por aplicación a los tejidos de uno o más pulsos eléctricos de intensidad que varía entre 1 y 400 volts/cm para el músculo, y entre 1 y 600 volts/cm para tejidos tales como tumores . En consecuencia, la presente invención proporciona un sistema, tal como un aparato mejorado, para la transferencia in vivo de ácido nucleico al interior de las células de organismos, eucarióticos multicelulares, en los cuales las células de tejido se ponen en contacto con el ácido nucleico que va a ser transferido por administración directa en el tejido o por administración tópica o sistémica, y transferencia la cual se asegura por la aplicación al tejido de uno o más pulsos eléctricos suministrados por un aparato de la invención que se ajusta para proporcionar la intensidad especificada. En particular, la fuerza del campo eléctrico puede variar entre 1 y 600 volts/cm para suministro de un ácido nucleico a células tumorales, y entre 1 y 400 volts/cm para suministro de un ácido nucleico a células de músculo. El sistema (o aparato) de la invención comprende un generador de pulsos eléctricos (o un medio para generar un pulso eléctrico) , en donde el generador de pulso eléctrico produce pulsos eléctricos con tiempos de pulsos mayores de 1 milisegundo y de una intensidad que varía entre 1 y 400 o 600 volts/cm a una frecuencia de entre 0.1 y 1000 Hz; y electrodos conectados al generador de pulso eléctrico para generar un campo eléctrico en un tejido in vivo en contacto con los electrodos. En una modalidad específica, el generador de pulso eléctrico produce pulso de intensidad que varía entre 30 y 300 volts/cm (para su transferencia al músculo) y entre 400 y 600 V/cm para transferencia al interior de células tumorales y otras células pequeñas . En otra modalidad específica, el generador de pulso eléctrico produce tiempos de pulsos de más de 10 milisegundos. En otra modalidad específica adicional, el generador de pulso eléctrico produce entre 2 y 1000 pulsos. De acuerdo con la invención, el sistema o el aparato mejorado del generador de pulso eléctrico puede producir pulsos irregularmente uno en relación al otro, por lo que es variable la función que describe la intensidad del campo dependiente en 'el tiempo de un pulso, con la condición de que en ningún momento en sistema o el aparato suministre un campo eléctrico mayor (o menor) a los parámetros que se establecen antes. Por ejemplo, la integral de la función que describe la variación del campo eléctrico con respecto al tiempo puede exceder de 1 kV/mseg/cm; y en una modalidad adicional excede o es igual a 5 kV/mseg/cm. El generador de pulso eléctrico (medio generador de pulso) puede producir pulsos que se seleccionan del grupo que consiste de pulsos de onda cuadrada, ondas de decaimiento exponencial, ondas unipolares oscilantes de duración limitada, y ondas bipolares oscilantes de duración limitada. Preferiblemente, el generador de pulso eléctrico produce pulsos de onda cuadrada. Se contemplan por la invención varias configuraciones de electrodo. Por ejemplo, el electrodo puede ser un electrodo externo para colocación sobre un tejido que va a ser tratado, por ejemplo, para transferir ácidos nucleicos al interior de células de un tejido superficial de un sujeto. Alternativamente, el electrodo puede ser un electrodo interno o un electrodo de penetración de tejido, el cual es implantable en un tejido que va a ser tratado. Tal electrodo interno puede ser una aguja, y se puede configurar como un sistema inyector lo que hace posible la administración simultánea de ácidos nucleicos y del campo eléctrico. En otra modalidad, la invención proporciona un electrodo externo y uno interno.

Un electrodo externo de la invención se puede dimensionar para que haga contacto con una porción externa del cuerpo del sujeto en proximidad cercana a un músculo grande. En una modalidad específica, tal electrodo es un electrodo de placa plana,- en otra modalidad, es un electrodo de placa semicilíndrica. En otra modalidad adicional, el electrodo es un electrodo intraarterial o intravenoso, por ejemplo un aparato de catéter flexible modificado de acuerdo con la invención. El material preferido para un electrodo de la invención es acero inoxidable. El aparato mejorado de la invención se puede producir al modificar los dispositivos de la técnica anterior y particularmente el medio para generar un campo eléctrico de tales dispositivos, para generar un campo eléctrico de la invención. Por ejemplo, el medio para generar un pulso eléctrico se puede adaptar para producir pulsos que varían entre 1 y 400 ó 600 volts/cm al modificar la compuerta de voltaje para que no exceda un voltaje que corresponde a 400 ó 600 volts/cm. En una modalidad específica de tal dispositivo modificado, el voltaje se puede ajustar a un voltaje constante y el electrodo se puede ajustar a una distancia de separación constante. Alternativamente, se puede adaptar el medio para generar un pulso eléctrico para que produzca pulsos que varían entre 1 y 400 o 600 volts/cm al marcar el dispositivo para que no exceda un voltaje que corresponde a 400 ó 600 volts/cm. Por lo tanto, un objetivo de la invención es proporcionar un sistema o mejorar dispositivos existentes para suministrar un campo eléctrico que tiene un gradiente de voltaje, anchura de pulso, y el número de pulsos que se han encontrado óptimos para la transferencia de ácidos nucleicos, sin dañar el tejido. Un objetivo particular de la invención es proporcionar la electrotransferencia de ácidos nucleicos bajo condiciones más moderadas y menos dañinas que las utilizadas para electroporación (gradientes de alto voltaje que exceden a 600, y habitualmente que exceden de 1000 volts/cm) . Otro objetivo particular de la invención es proporcionar un suministro intracelular más efectivo de ácidos nucleicos que el que se puede obtener bajo los campos eléctricos de fuerza muy baja utilizados para iontoforesis . Otra ventaja adicional de la invención es proporcionar un suministro reproducible y eficiente de los ácidos nucleicos a células de músculo. Estos y otros objetivos de la invención se obtienen como se establece en lo anterior, y se describen con mayor detalle en la descripción detallada de la invención, así como en los ejemplos con los dibujos anexos.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LOS DIBUJOS Figuras la y Ib: Efectos de los pulsos eléctricos de alta intensidad de campo sobre la transfección de ADN plasmídico pXL2774 en el músculo cráneo tibial en el ratón; valores medios + SEM (media de error estándar) . Figuras 2a y 2b: Efectos de los pulsos eléctricos de intensidad de campo intermedia en la transfección de ADN plasmídico pXL2774 en el músculo cráneo tibial en el ratón; valores medios + SEM. Figuras 3a y 3b: Efectos de los pulsos eléctricos de intensidad de campo débil y de duración diferentes sobre la transfección de ADN plasmídico pXL2774 en el músculo cráneo tibial en el ratón; valores medios + SEM. Figuras 4a y 4b: Efectos de los pulsos eléctricos de intensidad de campo débil y de duración diferente en la transfección de ADN plasmídico pXL2774 en el músculo cráneo tibial en el ratón; valores medios ± SEM. FIGURA 5 : Efectividad de la electrotransferencia del ADN plasmldico pXL2774 en el músculo cráneo tibial en el ratón a intensidades de campo eléctrico bajas; valores medios ± SEM. FIGURA 6: Cinética de expresión de luciferasa en el músculo cráneo tibial de ratón. Administración del plásmido pXL2774 con (i) o sin (X) electrotransferencia; valores promedio + SEM.

FIGURA 7 : Nivel de expresión como una función de la dosis de ADN administrado con (•) y sin (D) electrotransferencia . FIGURA 8: Efectos de los diferentes tipos de electrodos sobre la eficiencia de electrotransferencia. FIGURA 9 : Cinética de la concentración sérica de la fosfatasa alcalina secretada. Administración del plásmido pXL3010 con (1) y sin ( 4 ) electrotransferencia; valores promedios + SEM. FIGURA 10: Cinética de expresión de aFGF en músculo con (barras de histograma blancas) o sin (barras de histograma negras) electrotransferencia. FIGURA 11: Mapa de los plásmidos pXL3179 y pXL3212. FIGURA 12: Mapa de los plásmidos pXL3388 y pXL3031. FIGURA 13: Mapa de los plásmidos pXL3004 y pXL3010. FIGURA 14: Mapa de los plásmidos pXL3149 y pXL3096. FIGURA 15: Mapa de los plásmidos pXL3353 y pXL3354. FIGURA 16: Mapa del plásmido pXL3348.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Como se ha indicado antes, la presente invención proporciona transferencia altamente mejorada de ácido nucleico in vivo al someter el tejido a pulsos eléctricos de baja intensidad. Por ejemplo, se ha encontrado que campos eléctricos de menos de 600 volts/cm mejoran la transferencia de ácido nucleico en tumores, y menos de 400 volts/cm, y preferiblemente 100 ó 200 volts/cm para electrodos colocados a aproximadamente 0.5 a 1 cm del músculo. Estos campos se aplican por una duración relativamente prolongada. Además, los solicitantes descubrieron que la amplia variabilidad de expresión transgenética observada en la transferencia de ADN de la técnica anterior en el músculo se reduce notablemente por el proceso de acuerdo con la invención. Finalmente, se ha descubierto que la expresión persiste durante un período de tiempo prolongado, por ejemplo más de 60 días. En un ejemplo especifico, se detectó una expresión de nivel elevada durante 63 días. Como se puede determinar fácilmente a partir de la descripción que se proporciona en la presente, los solicitantes han denominado la transferencia de ácidos nucleicos a células in vivo bajo estas condiciones como "electrotransferencia"; un término alternativo apropiado utilizado en la presente es "electrotransfección" . Ambos términos diferencian las condiciones optimizadas para transferencia de ácido nucleico de la "electroporación" (la cual utiliza campos eléctricos mayores de 800 V/cm) e iontoforesis (que utiliza campos eléctricos de poca fuerza) . En consecuencia, esta invención se relaciona con procesos, sistemas y dispositivos (o aparatos) y composiciones para la transferencia in vivo de ácido nucleico en tejidos, particularmente músculo estriado, en el cual las células de tejido se ponen en contacto con el ácido nucleico que se va a transferir por administración directa en el tejido o por administración tópica o sistémica y transferencia la cual se asegura por aplicación a los tejidos de uno o más pulsos eléctricos de intensidad que varían entre 1 y 600 volts/cm (por ejemplo para células tumorales) o entre l y 400 volts/cm para células musculares. En otras palabras, la presente invención se relaciona particularmente con sistemas (es decir, dispositivos o aparatos) para electrotransferencia. De acuerdo con una modalidad preferida, el proceso de la invención se aplica a tejidos cuyas células tienen geometrías particulares como, por ejemplo, células de tamaño grande y/o de forma alargada y/o que responden naturalmente a potenciales eléctricos y/o que tienen una morfología específica. La intensidad del campo preferiblemente varía entre 4 y 400 volts/cm para el músculo y hasta 600 volts/cm para tumores, y la duración total de aplicación excede de 1 railisegundo (mseg) y preferiblemente 10 mseg. En ejemplos específicos, la duración total es de 8 mseg o mayor. En varios de los ejemplos, la duración del pulso es de 20 mseg, y se encuentran efectivas duraciones mayores de 40 mseg. El número de pulsos utilizados, por ejemplo, es de 1 a 1,000 pulsos, preferiblemente de 2 a 100 y de manera más preferible de 4 a 20, y la frecuencia de pulso varía entre 0.1 y 1,000 hertz (Hz) ; de manera más precisa entre 0.2 y 100 Hz . En modalidades específicas, se encuentran que son efectivas frecuencias de 2, 3 y 4 Hz. Los pulsos también se pueden suministrar irregularmente y la función que describe la intensidad del campo dependiente del tiempo puede ser variable. La integral de la función que describe la variación del campo eléctrico con el tiempo es mayor de l kV.mseg/cm. De acuerdo con una modalidad preferida de la invención, la integral es mayor que o igual a 5 kV.mseg/cm. Sin embargo, se debe hacer notar, como lo puede apreciar fácilmente una persona habitualmente experta en la técnica que esta función integrada se puede obtener a los voltajes subelectroforé icos descritos antes. En un ejemplo específico, el cual representa una modalidad de la invención, el dispositivo de la invención puede suministrar una combinación de por lo menos un pulso de voltaje superior (mayor de 400 kV/cm y preferiblemente entre 500 y 800 V/cm) para una duración corta (menos de 1 mseg) seguido por uno o más pulsos más prolongados (mayores de 1 mseg) a una resistencia de campo eléctrico menor (menor de 200 V/cm) . De acuerdo con una modalidad preferida de la invención, la intensidad de campo de los pulsos varía entre 30 y 300 volts/cm.

Los pulsos eléctricos se eligen entre pulsos de onda cuadrada, los campos eléctricos generan ondas de decaimiento exponencial, ondas unipolares oscilantes de duración limitada, ondas bipolares oscilantes de duración limitada u otras formas de onda. De acuerdo con una modalidad preferida de la invención, los pulsos eléctricos son pulsos de onda cuadrada. La administración de pulsos eléctricos se puede llevar a cabo por cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo: sistema de electrodos externos colocados sobre ambos lados del tejido que se va a tratar, de manera notable, electrodos no invasivos colocados en contacto con la piel, sistema de electrodos implantados en los tejidos, electrodos/sistema inyector lo que hace posible la administración simultánea de ácidos nucleicos y del campo eléctrico. Para la administración que se lleva a cabo in vivo, algunas veces es necesario restablecer productos intermediarios asegurando continuidad eléctrica con electrodos externos no invasivos. Involucrará, por ejemplo, un electrólito en forma de gel. Los ejemplos de geles apropiados incluyen geles utilizados en los ejemplos que siguen, así como geles utilizados comúnmente en medicina para mejorar los contactos eléctricos tales como para electrocardiogramas o desfibriladores .

Los ácidos nucleicos se pueden administrar por cualquier medio apropiado, pero preferiblemente se inyectan in vivo directamente en los tejidos o se administran por cualquier otra vía, local o sistémica, lo que los vuelve disponibles en el sitio de aplicación del campo eléctrico. Los ácidos nucleicos se pueden administrar con agentes que permitan o que faciliten la transferencia, como se ha mencionado previamente.

De manera notable, los ácidos nucleicos pueden estar libres en solución o unidos a agentes sintéticos o pueden ser transportados por vectores virales. Los agentes sintéticos pueden ser lípidos o polímeros conocidos por los expertos, o incluso elementos dirigidos lo que hacen posible la fijación sobre la membrana de los tejidos objetivo. Entre estos elementos, se pueden mencionar vectores que transportan azúcares, péptidos, anticuerpos, receptores y ligandos. Es concebible, bajo estas condiciones de la invención que la administración de los ácidos nucleicos pueda preceder, ser simultánea o incluso posterior a la aplicación de los campos eléctricos, con la condición, por supuesto de que se continúe aplicando el campo eléctrico después de que se administre el ácido nucleico. Esta invención también se relaciona con un ácido nucleico y un campo eléctrico de intensidad que varía entre 1 y 600 volts/cm (preferiblemente 400 volts/cm) , como un producto de combinación para su administración in vivo simultánea, separada o alternada en el tiempo, en células de mamífero, en particular en células humanas. Preferiblemente, la intensidad del campo varía entre 4 y 400 volts/cm e incluso de manera más preferible, la intensidad de campo varía entre 30 y 300 volts/cm para su transferencia al interior del músculo. Para transferencia en tumores y células con propiedades similares de recepción de electrotransferencia, una intensidad preferida de campo eléctrico es 400-600 V/cm; de manera preferible, aproximadamente 500 (es decir 500 + 10%, preferiblemente 5%) V/cm. Como se puede apreciar fácilmente por aquellos expertos en la técnica, tal combinación define una estructura de ácido nucleico, en la cual el ácido nucleico adopta una orientación relativa respecto al campo eléctrico, así como una estructura secundaria y terciaria específicas en presencia del campo eléctrico. Además, el ADN se asociará con los componentes extracelulares que se encuentren en el tejido objetivo, el cual es diferente al ADN que experimenta electroforesis de campo bajo en un gel de agarosa o en otras condiciones de laboratorio.

Sistemas v Aparatos de Electrotransferencia Los componentes principales de cualquier sistema de electrotransferencia (es decir, el aparato o dispositivo; los términos se utilizan aquí de manera intercambiable) consiste de un generador de pulsos eléctricos que se diseña o que se modifica para proporcionar pulsos no mayores de 600 V/cm y electrodos. Un sistema o aparato de la invención para el suministro de ácido nucleico específicamente a músculo proporciona pulsos no mayores de 400 volts/cm. Naturalmente, el voltaje real dependerá de la distancia entre los electrodos. Como se conoce bien en la técnica, esta distancia afecta la resistencia específica (resistividad) a través del tejido objetivo. En consecuencia, el voltaje real que se aplique dependerá de la resistencia a la corriente y por lo tanto la potencia total, se mantiene dentro de niveles aceptables. El término "niveles aceptables" como se utiliza en la presente significa que la potencia total no resulta en daño irreversible al tejido, particularmente quemaduras al tejido. En un aspecto preferido, por lo tanto, el aparato de la invención controla la corriente aceptable al fijar el voltaje y la distancia de electrodo, o incluye un medio de retroalimentación para evitar aplicar un voltaje demasiado alto para la distancia entre los electrodos y por lo tanto demasiada corriente. El sistema de la invención puede incluir un osciloscopio u otro dispositivo medidor para monitorear el voltaje, corriente o ambos. En una modalidad, el sistema de la invención se prepara utilizando equipo disponible comercialmente. Preferiblemente, tal equipo se modifica para proporcionar las condiciones específicas de electrotransferencia definidas aquí como óptimas. En otra modalidad, se diseña un aparato nuevo y se construye para alcanzar los objetivos de la invención. Las especificaciones de diseño del generador de pulso modificado o construido incluye, pero no se limita a la incorporación de un controlador mecánico o eléctrico para mantener el gradiente de voltaje deseado, es decir, menos de 600 ó 400 V/cm, y preferiblemente menos de 200 V/cm para administración a músculo. Un control mecánico puede incluir, por ejemplo, un tope en el marcador de selección de voltaje que evite la selección de un voltaje el cual pueda proporcionar un campo eléctrico demasiado elevado. Alternativamente, el dispositivo se puede construir o modificar de manera que no se puedan seleccionar tales voltajes. El otra modalidad adicional, el dispositivo puede incluir un interruptor o fusible que se funda cuando el voltaje (por lo tanto la corriente) exceda los parámetros de la invención. En otra modalidad adicional, los controles de microprocesador pueden evitar o anular una selección de un voltaje demasiado grande. En otra modalidad adicional, un generador de pulso se modifica simplemente al aplicar una etiqueta que instruye el uso de un intervalo de voltaje particular que proporcione la fuerza de campo eléctrico de la invención. Todas estae modificaciones son habituales en la técnica y utilizan tecnología estándar eléctrica y mecánica. Como se mencionó antes, el voltaje real suministrado por un sistema de la invención para obtener la fuerza de campo eléctrico definida en la presente como óptima, dependerá, en parte, de la separación de los electrodos. Si los electrodos están separados de una manera fija, entonces el voltaje (para un tejido definido, por ejemplo músculo, hígado, corazón o un tumor) puede ser una constante definida previamente. Sin embargo, si es deseable proporcionar variación en la separación de los electrodos, entonces el voltaje puede ser ajustado para mantener un gradiente de voltaje constante. Esto se puede determinar al medir la distancia entre los electrodos, al incluir un medio de medición sobre los electrodos que proporcione un valor para su separación después del ajuste o por un medio de medición automatizado que se retroalimenta al generador de pulso para proporcionar automáticamente el voltaje correcto (véase la patente de los Estados Unidos 5,439,440 para Hofmann) . Las siguientes secciones describen más completamente generadores de pulso, electrodos y dispositivos de la técnica anterior que se pueden modificar de acuerdo con la invención.

Generadores de Pulso Los generadores de pulso (también denominados "generadores de voltaje" y "medio de generación de pulso o voltaje") son dispositivos eléctricos que producen una corriente de voltaje, duración, anchura de pulso, ciclo de trabajo (el tiempo total del pulsado y el reposo) y frecuencia de pulso, definidos. Tales dispositivos son bien conocidos en la técnica e incluyen generadores de pulso disponibles comercialmente tales como los generadores de voltaje ELECTRO CELL MANIPULATOR modelo ECM 600, T800L y T820, disponibles de BTX Instruments División of Genetronics, Inc. of San Diego, California, por ejemplo, como se describe en la patente de los Estados Unidos número 5,704,908, la cual se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. Alternativamente, el generador de pulso puede ser un Electropulsator PS 15, disponible de Jouan, Francia, como se describe en los ejemplos siguientes. En otra modalidad adicional, se puede elaborar un generador de voltaje con una o más formas de onda descritas en la patente de los Estados Unidos número 5,634,899, la cual se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. El voltaje se puede diseñar para generar pulsos de forma, intensidad y duración variables. Por ejemplo, un pulso de 200 V/cm o de 400 V/cm, 5-20 mseg, puede ser seguido por un pulso más prolongado de menor intensidad. El dispositivo puede suministrar además campos eléctricos iontoforéticos en combinación con los campos eléctricos de la invención. Un generador de pulso de la invención tendrá las siguientes especificaciones : generar gradientes de voltaje de entre 1 y 600 ó 400 V/cm; preferiblemente entre 4 y 400 V/cm, de manera más preferible entre 30 y 300 V/cm. Los gradientes de voltaje específicos contemplados para un dispositivo de la invención para electrotransferencia al músculo son de aproximadamente 100 V/cm y 200 V/cm; preferiblemente menores de 200 V/cm. Para electrotransferencia en células tumorales o células similares, se ha encontrado inesperadamente que se prefieren un campo eléctrico de 400-600 V/cm y de manera óptima de aproximadamente 500 V/cm. frecuencias de pulso de 0.1 a 1,000 hertz (Hz) ; en una modalidad específica, la frecuencia es de aproximadamente 2 Hz o mayor, hasta 10 Hz; preferiblemente mayor de 1 Hz . En una modalidad preferida, la frecuencia es de 3 ó 4 Hz . tiempo de pulso (duración) mayor de 1 milisegundo (mseg), con tiempos de trabajo variables; preferiblemente el tiempo de pulso es mayor de 15 mseg; de manera más preferible mayor de 10 mseg; y de manera más preferible mayor de 20 mseg. En un aspecto preferido, el generador de pulso de la invención produce por lo menos dos, y preferiblemente cuatro, seis u ocho pulsos. Puede producir, por ejemplo, entre 8 y 1,000 pulsos. El generador de pulso puede permitir una anulación o corte si el paciente comienza a experimentar un fenómeno adverso o si la fuerza del campo eléctrico está fuera de control. Tal anulación puede ser manual, automática o ambas.

Será evidente para aquellos habitualmente expertos en la técnica que los pulsos se pueden generar por una señal externa, tal como otro dispositivo, una computadora, etc. Por ejemplo, para el suministro de un ácido nucleico al tejido cardíaco, el generador de pulso de manera óptima se interconecta con el electrocardiograma del sujeto de manera que los pulsos se sincronicen con los latidos del corazón. El sistema preferiblemente incluye un determinador de frecuencia activo del ritmo cardíaco del sujeto, por ejemplo, con un marcapaso (véase la patente de los Estados Unidos número 5,634,899 para Shapland).

Electrodos Los electrodos de la invención proporcionan el campo eléctrico en el tejido. Un electrodo, el cátodo, está cargado negativamente; mientras el ánodo está cargado positivamente. Generalmente, de acuerdo con las invenciones, existe un flujo neto o flujo de iones desde un electrodo al otro (el flujo depende, por supuesto, de la carga neta de las especies iónicas y la polarización del electrodo) . En general, los ácidos nucleicos, los cuales presentan una fuerte carga negativa neta, se mueven hacia el ánodo. Un electrodo para uso de acuerdo con la invención debe conducir la electricidad eficientemente, y de manera preferible ser inerte, no reactivo y no tóxico bajo las condiciones utilizadas. Específicamente, un electrodo para uso interno no debe reaccionar con materiales biológicos en ningún grado apreciable, por ejemplo, se debe evitar la liberación de iones metálicos del electrodo que puedan ser dañinos o venenosos, o se debe evitar la oxidación que reduzca la eficiencia del electrodo. Un material preferido para los electrodos de la invención es acero inoxidable, el cual es no reactivo, razonablemente eficiente para conducir la electricidad y lo suficientemente barato para ser elaborado en un costo razonable. Los electrodos más ideales, particularmente para uso interno, son de oro o platino. Sin embargo, tales electrodos de metales nobles son muy costosos . El costo de estos materiales se puede reducir al revestirlos sobre otros conductores. Otros metales conductores incluyen cobre, plata o cloruro de plata, estaño, níquel, litio, aluminio y hierro, y amalgamas de los mismos. Sin embargo, ciertos materiales tales como aluminio, no deben ser utilizados internamente. Los electrodos también se pueden formar de zirconio, iridio, titanio, y ciertas formas de carbono. Algunos electrodos, tales como la plata y el cobre, tienen actividad antibacteriana, lo cual es deseable para la administración interna para suprimir la infección. Los electrodos se pueden formar en cualquier configuración apropiada para el tejido objetivo que incluyen, sin limitación, alambres rectos, alambres helicoidales (los electrodos de alambre recto o helicoidal son ideales para aplicaciones de catéter) , superficies conductoras (por ejemplo, de catéteres o catéteres de globo; véase la patente de los Estados Unidos número 5,704,908, incorporada en la presente en su totalidad) , tiras metálicas, agujas (o sondas) arreglos de agujas, electrodos de superficie o combinaciones de los mismos. Las combinaciones de electrodo contempladas incluyen: (i) un electrodo de catéter y un electrodo de aguja; (2) un electrodo de catéter y un electrodo de superficie; y (3) un electrodo de aguja y un electrodo de superficie. En una modalidad específica, se puede utilizar un electrodo de aguja con una jeringa para suministrar ADN. Tal electrodo de aguja puede tener orificios a través de su longitud de su cuerpo para permitir el suministro de la solución de ácido nucleico a través de su longitud. Para suministro de un ácido nucleico a un órgano grande, particularmente un músculo grande, se pueden utilizar dos electrodos de superficie. Los electrodos de superficie preferiblemente se utilizan en combinación con una composición electrolítica para asegurar un buen contacto y conductancia, por ejemplo, a través de la piel, como se describe antes . En una modalidad específica que tiene un electrodo interno y uno externo, el electrodo externo puede tener "cabezas" múltiples colocadas alrededor de la interna. En realidad, en general para cualquiera de las configuraciones que se establecen antes, uno de los electrodos puede tener "cabezas" múltiples. La invención contempla además arreglos de electrodos; agujas con orificios a lo largo del cuerpo, agujas con una longitud conductora definida y calibrada (para proporcionar un área conductora constante y reproducible en un tejido, sin importar la profundidad de penetración de la aguja en un tejido) con las partes superior e inferior aisladas eléctricamente; agujas con puntos aislados, para evitar los arcos eléctricos de punto a punto en un tejido; y cualquier clase de bolsa/depósito que contenga el producto alrededor de una aguja. Como se establece antes para los electrodos de aguja, los electrodos de placa pueden comprender márgenes aislados . Generalmente, los electrodos se colocan de manera que el tejido objetivo está directamente entre ellos. De esta manera, los ácidos nucleicos se someten a una fuerza de campo máxima. Sin embargo, puesto que el flujo de campo eléctrico es a todo alrededor del electrodo, es posible utilizar un campo generado periféricamente entre los electrodos así como el campo generado directamente entre los electrodos .

Dispositivos Modificados de la Técnica Anterior En una modalidad específica, un aparato en el cual los electrodos se colocan externamente con respecto al paciente (véanse, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos números 5,318,514 para Hofmann; 5,439,440 para Hofmann; 5,462,520 para Hofmann; 5,464,386 para Hofmann; 5, 688,-233 para Hofmann et al.; y 5,019,034 para Weaver et al.) se modifica de acuerdo con la presente invención, es decir, para suministrar un campo eléctrico bajo las condiciones definidas, para proporcionar un aparato mejorado de la invención. El aparato mejorado puede ser utilizado de manera no invasiva al aplicar los electrodos a la piel del paciente o de manera invasiva al aplicar los electrodos a la superficie de un órgano que ha sido expuesto quirúrgicamente . De manera similar, un sistema de electrotransferencia que utiliza electrodos implantables o insertables colocados dentro del paciente para suministrar un campo eléctrico al área adyacente a un electrodo implantado/insertado, particularmente un electrodo de catéter (véanse, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos números 5,304,120 para Crandell et al.; 5,507,724 para Hofmann et al.; 5,501,662 para Hofmann; 5,702,359 para Hofmann et al.; y 5,273,525 para Hofmann), se pueden modificar de acuerdo con la presente invención para proporcionar un aparato mejorado de la invención.

De manera natural, un dispositivo de electrotransferencia que combina las características de los sistemas mencionados antes, por ejemplo, que utiliza por lo menos un electrodo colocado internamente y por lo menos un electrodo colocado externamente para suministrar el campo eléctrico en el área de tejido deseada (véanse, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos números 5,286,254 para Shapland et al.; 5,499,971 para Shapland et al.; 5,498,238 para Shapland et al.; 5,282,785 para Shapland et al.; y 5,628,730 para Shapland et al) se pueden modificar de acuerdo con la presente invención para proporcionar un aparato mejorado de la invención.

Terapia de genes que utiliza un sistema de electrotransferencia El proceso de acuerdo con esta invención es útil para terapia de genes, esto es, terapia en la cual la expresión de un gen transferido, pero también la modulación o bloqueo de un gen, hace posible asegurar el tratamiento de una patología particular. Las células de tejido preferiblemente se tratan con el concepto de hacer posible la terapia de genes: la corrección de disfunciones de las células mismas (por ejemplo, para tratamiento de enfermedades relacionadas con deficiencias genéticas como, por ejemplo, mucoviscidosis o distrofia muscular) ,- la protección y/o regeneración de la vascularización o inervación del tejido, tales como músculos, órganos o hueso, por factores tróficos, neurotróficos, angiogénicos o por factores antiinflamatorios producidos por el transgen; la transformación de músculo en productos secretados por el órgano que llevan a un efecto terapéutico tales como el producto del gen mismo (por ejemplo, trombosis y factores de regulación de hemostasis, factores tróficos, factores de crecimiento, hormonas como insulina, eritropoyetina y leptina, etc.) o tales como metabolitos activos sintetizados en el músculo por la adición del gen terapéutico, por ejemplo, para corregir una enfermedad genética por secreción de un producto terapéutico; suministro de genes antitumorales tales como supresores tumorales (proteína de retinoblastoma, p53, p71) , genes suicidas (por ejemplo, HSV-timidina cinasa) , gentes anti-angiogénesis (por ejemplo, angiostatina, endostatina, fragmento terminal amino de urocinasa) , bloqueadores del ciclo celular, genes de apoptosis (tales como BAX) , anticuerpos intracelulares de cadena única, y genes inmunoestimuladores . una vacuna de ácido nucleico o gen inmunoestimulante . La ventaja particular del uso de la electrotransferencia en la terapia de genes para un problema sistémico por expresión en el músculo reside en numerosos factores: la estabilidad notable de la expresión del transgen, que excede a varios meses y por lo tanto hace posible la producción estable y sostenida de una proteína intramuscular o terapéutica secretada, la facilidad de acceso al tejido muscular, lo que hace posible una administración directa, rápida e inocua en un órgano no vital , el gran volumen de masa muscular, lo que hace posible sitios de administración múltiples, la capacidad secretora, ampliamente demostrada, del músculo. A estas ventajas se agrega la seguridad con la que se contribuye por un tratamiento local con el uso de campos eléctricos locales y dirigidos . Con la seguridad asociada con el uso de campos débiles, la invención se puede aplicar al músculo cardíaco para el tratamiento de enfermedades cardíacas, por ejemplo, utilizando la determinación de frecuencia cardíaca para asegurar una electrotransferencia segura (véase la patente de los Estados Unidos número 5,634,899) . También se puede aplicar al tratamiento de restenosis por la expresión de genes que inhiban la proliferación de células de músculo liso como la proteína GAX. La combinación de campos de baja intensidad y de larga duración de administración, aplicados principalmente a tejidos in vivo, mejora la transfección de ácidos nucleicos, sin provocar deterioro notable en el tejido. Estos resultados mejoran la eficiencia de las transferencias de ADN en la terapia de genes utilizando ácidos nucleicos. En consecuencia, las ventajas asociadas con la invención son la producción de un agente a dosis fisiológicas y/o terapéuticas ya sea en los tejidos o en proximidad a los mismos, o secretados sistémicamente en la corriente sanguínea o la circulación linfática. Además, la invención hace posible, por primera vez, una modulación y control finos de la cantidad efectiva de transgen expresado por la posibilidad de modular el volumen del tejido que se va a transfectar, por ejemplo, con sitios de administración múltiples, o incluso la posibilidad de modular el número, forma, superficie y disposición de los electrodos . Surge un elemento adicional de control con la posibilidad de modular la efectividad de transfección por variación de la intensidad de campo, número, duración y frecuencia de los pulsos y, por supuesto, de acuerdo con el estado de la técnica, la cantidad y volumen de administración de ácidos nucleicos. Una ventaja particular de la presente invención es la excelente curva de dosis-respuesta que se obtiene para transferencia de ADN, la cual no se obtiene por ninguno de los métodos de la técnica anterior. Por lo tanto, se puede obtener un nivel de transfección apropiado al nivel de producción intratisular o de secreción que se desea. El proceso hace posible, finalmente, seguridad adicional en relación a los métodos químicos o virales de transferencia de genes in vivo, en los cuales no se puede descartar completamente ni tampoco se puede controlar la llegada a órganos diferentes al órgano objetivo. De hecho, el proceso de acuerdo con la invención hace posible controlar la localización de los tejidos transfectados (relacionados estrictamente al volumen de tejido sometido a pulsos eléctricos locales) y por lo tanto introduce la posibilidad de suprimir la expresión transgénica por la supresión total o parcial del tejido, lo cual es posible debido a que ciertos tejidos no son críticos o se pueden regenerar, o ambas cosas, como en el caso del músculo. La gran flexibilidad de uso vuelve posible utilizar el proceso de acuerdo con la especie animal (aplicaciones en humanos y veterinarias) , la edad del sujeto y su condición fisiológica y/o patológica.

El proceso de acuerdo con la invención además hace posible, por primera vez, transfectar ácidos nucleicos de tamaño grande, en contraste con los métodos virales, los cuales se limitan con respecto al tamaño de un transgen por el tamaño del genoma viral que se puede colocar dentro de la cápside. Esta posibilidad es esencial para la transferencia de genes de tamaño muy grande, como el de distrofina o genes con intrones y/o elementos reguladores de tamaño grande, los cuales son necesarios, por ejemplo, para una producción de hormonas regulada fisiológicamente. Esta posibilidad es esencial para la transferencia de episomas de levadura artificiales o de cromosomas o minicromosomas . Otro objetivo de la invención es relacionar los puntos eléctricos de un campo de voltaje con composiciones que contienen ácidos nucleicos formulados considerando cualquier administración, lo que hace posible tener acceso al tejido por vía tópica, cutánea, oral, vaginal, parenteral, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraocular, o transdérmica, etc. Las composiciones farmacéuticas de la invención contienen un vehículo farmacéuticamente aceptable para una formulación inyectable, específicamente, para una inyección directa en el órgano deseado, o para cualguier otra administración. En particular, pueden involucrar soluciones isotónicas estériles o composiciones secas, específicamente liofilizadas, las cuales, según sea el caso, con adición de agua esterilizada o solución salina fisiológica, hacen posible la elaboración de soluciones inyectables. Las dosis de ácido nucleico utilizadas para inyección así como la cantidad de administraciones y el volumen de las inyecciones se puede adaptar a parámetros diferentes y, notablemente, al método de administración, la patología involucrada, el gen que se va a expresar o incluso la duración del tratamiento que se busque.

Tejidos Objetivo Los presentes inventores han descubierto que las condiciones óptimas para transferencia de genes de acuerdo con la invención, difieren en base en el tejido objetivo. Por ejemplo, se ha encontrado que un campo eléctrico de 200 volts/cm mejora en gran medida la transferencia de genes en las células de músculo. Bajo estas condiciones, una transferencia significativa de genes procede al interior de células tumorales también (en experimentos específicos, se observa un incremento de tres veces de transferencia de genes) , pero la transferencia de genes a células tumorales es mucho más eficiente en un campo eléctrico de 400 volts/cm (un incremento de 2 unidades logarítmicas en la eficiencia de transferencia de genes) . En experimentos adicionales, una fuerza de campo eléctrico de 500 volts/cm es óptima para transferencia de genes en células tumorales .

Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se puede elaborar un sistema o aparato mejorado para suministro de ácidos nucleicos a células de músculo (y otras células grandes) , y se puede desarrollar un sistema o un aparato mejorado que tenga parámetros de fuerza de campo eléctrico diferentes, para suministro de genes a células tumorales (y otras células pequeñas) . Para el suministro de ácidos nucleicos a células musculares, un sistema o aparato de la invención generará un gradiente de voltaje de entre 1 y 400 volts/cm, preferiblemente 4 a 400 volts/cm, de manera más preferible 30 a 300 volts/cm. En modalidades específicas, el gradiente de voltaje está entre 100 y 200 volts/cm. Se contemplan particularmente sistemas o aparatos que proporcionen un gradiente de voltaje que no exceda de 200 volts/cm. Para el suministro de ácidos nucleicos a células tumorales, un sistema o aparato de la invención generará un gradiente de voltaje de entre 1 y 600 volts/cm, preferiblemente 100 a 600 volts/cm, de manera más preferible 400 a 600 volts/cm. En modalidades específicas, el gradiente de voltaje está entre 400 y 500 volts/cm, y de manera preferible, aproximadamente 500 V/cm. Se contemplan particularmente sistemas o aparatos que proporcionan un gradiente de voltaje que no exceda de 600 volts/cm. Ácidos Nucleicos Los ácidos nucleicos pueden ser de origen sintético o biosintético, o se pueden extraer de virus o células procarióticas por células eucarióticas que se originan de organismos unicelulares (por ejemplo levaduras) u organismos multicelulares. Se pueden administrar unidas en su totalidad o en parte a componentes de organismos originales y/o sistemas de síntesis. El ácido nucleico puede ser un ácido desoxirribonucleico o un ácido ribonucleico. Puede involucrar secuencias de origen natural o artificial y, de manera especifica, ADN genómico, ADNc, ARNm, ARNt y ARNn, secuencias híbridas o secuencias sintéticas o semisintéticas de oligonucleótidos, modificados o no. Estos ácidos nucleicos se pueden obtener por cualquier método conocido por los expertos y, específicamente, por clonación, por síntesis química o incluso por métodos mixtos que incluyen modificación química o enzimática de secuencias obtenidas por clonación. Se pueden modificar químicamente. En particular, el ácido nucleico puede ser un ADN o un ARN con propiedades directas (sentido) o antisentido o catalíticas como una ribosima. "Antisentido" se refiere a un ácido nucleico que tiene una secuencia complementaria a una secuencia objetivo, por ejemplo, una secuencia de ARNm cuya expresión se busca bloquear por hibridación sobre la secuencia objetivo. "Directo" "sentido" se refiere a un ácido nucleico que tiene una secuencia homologa o idéntica a la secuencia objetivo, por ejemplo una secuencia unida a un factor de transcripción de proteína y que está involucrado en la expresión de un gen dado . De acuerdo con una modalidad preferida, el ácido nucleico contiene un gen de interés y elementos que hacen posible la expresión del gen de interés. El fragmento de ácido nucleico ventajosamente está en forma de un plásmido. Los ácidos desoxirribonucleicos pueden ser de cadena sencilla o doble, como los oligonucleótidos cortos o secuencias más grandes. Pueden presentar genes, secuencias que regulen la transcripción o la regulación, o regiones de unión a otros componentes celulares, etc. Tales genes pueden incluir genes marcadores, es decir, genes que producen un marcador detectable para estudiar la función celular, migración o función del gen,-un gen terapéutico; un antígeno protector o un gen inmunógeno; y similares. De acuerdo con la invención, "gen terapéutico" se refiere específicamente a cualquier gen que codifica para un ARN o para un producto proteínico que tenga un efecto terapéutico. El producto proteínico codificado puede ser una proteína, un péptido, etc. Este producto proteínico puede ser homólogo con la célula objetivo (es decir, un producto el cual normalmente se expresa en la célula objetivo cuando no presenta patología) . En este caso, la expresión transgenética hace posible, por ejemplo, resolver una expresión inadecuada de la célula o la expresión de una proteína inactiva o activa débilmente por razón de una modificación o también hace posible sobreexpresar la proteína. El gen terapéutico también puede codificar para un mutante de una proteína celular, que tenga una estabilidad aumentada, una estabilidad modificada, etc. El producto proteínico de igual manera puede ser heterólogo a la célula objetivo. En ese caso, una proteína expresada puede, por ejemplo, completar o introducir una actividad deficiente en la célula (tratamiento de miopatías o deficiencias enzimáticas) , o hace posible luchar contra una patología, o estimular una respuesta inmune, por ejemplo, en el tratamiento de tumores. Puede involucrar un gen suicida (timidina cinasa de herpes) para el tratamiento de cánceres o restenosis . El ácido nucleico preferiblemente incluye también secuencias que hace posible y/o que favorecen la expresión en el tejido del gen terapéutico y/o gen que codifica para el péptido antigénico. Puede involucrar secuencias las cuales son responsables naturalmente por la expresión del gen considerado cuando esas secuencias son capaces de funcionar en la célula transfectada. También involucra secuencias de origen diferente (responsables de la expresión de otras proteínas, o incluso sintéticas) . Específicamente, puede involucrar secuencias promotoras de genes eucarióticos o virales. Por ejemplo, puede involucrar secuencias promotoras que se originen del genoma de la célula que se desea transfectar. Entre los promotores eucarióticos, se pueden utilizar una secuencia inductora o represora para proporcionar una expresión específica del gen. Se pueden utilizar los promotores, ya sea fuertes o débiles, constitutivos o inducibles . Los promotores ubicuos (constitutivos) incluyen HPRT, vimentina, -aactina, tubulina, etc. Se pueden utilizar promotores específicos de tejido que incluyen (factor de alargamiento 1- , flt, flk) . Los promotores inducibles incluyen promotores que responden a hormonas (tales como receptores esteroideos, receptores de ácido retinoico, etc.,), o promotores regulados por antibióticos (tetraciclina, rapamicina, etc.,) u otras moléculas naturales o sintéticas. De igual manera, puede involucrar secuencias promotoras que se originen del genoma de un virus . A este respecto se puede mencionar, por ejemplo, promotores de los genes EIA, MLP, CMV, RSV, etc. Además, se pueden modificar estas secuencias de expresión por la adición de secuencias de activación, regulación, que permiten la expresión condicional, transitoria o temporal, la expresión específica de tejido o la expresión general, etc. Además, el ácido nucleico también puede contener particularmente por encima del gen terapéutico, una secuencia de señal que dirija el producto terapéutico sintetizado a los ductos secretores de la célula objetivo. Esta secuencia de señal puede ser una secuencia de señal natural del producto terapéutico, pero también puede involucrar cualquier otra señal funcional, o una secuencia de señal artificial. El ácido nucleico también puede contener una secuencia de señal que dirija el producto terapéutico sintetizado a un compartimiento celular particular, tal como por ejemplo la mitocondria para el tratamiento de una enfermedad genética mitocondrial .

Genes Terapéuticos y Productos de Genes Entre los productos terapéuticos de acuerdo con la invención, se pueden mencionar particularmente enzimas, proteínas sanguíneas, hormonas tales como insulina u hormona del crecimiento, linfocinas; interleucinas, interferones, factores de necrosis tumoral (TNF) , etc (patente Francesa número 92 03120) , factores del crecimiento, por ejemplo factores angiogénicos tales como VEGF o FGF. Para el tratamiento de neuropatías, se pueden suministrar con el sistema de la invención genes que codifiquen para neurotransmisores o sus precursores o enzimas que sinteticen neurotransmisores, factores tróficos, particularmente factores neurotróficos para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, daños al sistema nervioso causados por trauma o daño, o degeneración retinal. Por ejemplo, los miembros de la familia de factores neurotróficos incluyen, pero no se limitan al factor del crecimiento de nervios (NGF) , factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF) , neurotrofina-3 (NT3) , NT4/5, NT6 (que incluye las variantes alélicas y miembros de la misma familia de genes) . Otras neurotrofinas incluyen miembros de la familia del factor neurotrófico ciliar que incluyen factor neurotrófico ciliar (CNTF) , axocina, factor inhibidor de leucemia, otros factores incluye IL-6 y citocinas relacionadas,- cardiotrofina y sus genes relacionados; factor neurotrófico derivado de glia (GDNF) y genes relacionados; y miembros de la familia del factor de crecimiento similar a insulina (IGF), tales como IGF-1, IFGF-2; miembros de la familia del factor de crecimiento de fibroblastos tales como FGF1 (FGF ácido), FGF2 , FGF3 , FGF4, FGF5, FGF6, FGF7 , FGF8 , FGF9 , etc.; miembros sde la familia de factor de crecimiento tumoral tal como TGFß; HARP/pleyotrofina, factores de crecimiento óseo, factores hematopoyéticos, etc. Otros genes de interés codifican para proteína de músculo de beneficio terapéutico, tanto secretadas como no secretadas tales como distrofina o minidistrofina (patente Francesa número 91 11947) o a-1-antitripsina. Otros genes de interés codifican para factores involucrados en la coagulación: factores VII, VIII, IX; genes suicidas (timidina cinasa, citocina desaminasa) ; genes para 'hemoglobina u otros portadores de proteína.

En otra modalidad adicional, se pueden suministrar genes que corresponden a las proteínas involucradas en el metabolismo de lípidos, tales como un tipo de apolipoproteína que se elige de entre las apolipoproteínas A-I, A-II, A-IV, B, C-l, C-II, C-III D, E, F, G, H, J y apo(a), y enzimas metabólicas tales como, por ejemplo, lipoproteína lipasa, lipasa hepática, lecitina colesterol, aciltransferasa, 7- -colesterol hidroxilasa, ácido fosfatidílico fosfatasa o incluso proteínas de transferencia de lípidos como la proteína de transferencia de esteres de colesterol y la proteína de transferencia de esteres de colesterol y la proteína de transferencia de fosfolípidos, una proteína que une HDL o incluso un receptor que se elige, por ejemplo, de entre los receptores de LDL, receptores remanentes de quilomicrones y receptores eliminadores, etc. Se pueden agregar lectinas para el tratamiento de obesidad. También se puede agregar el anti-oncogen p53 y otros supresores de tumores tales como HSV-tk o incluso el limitador de proteínas GAX de proliferación celular en músculo liso (tratamiento de restenosis) . Otros genes de interés incluyen factores angiogénicos, que incluyen factores de crecimiento endotelial vascular (VEGF, VEGF-2, VEGF-3, factores de crecimiento de plaquetas) y angiostatina. Por otra parte, se puede llevar a cabo el suministro de genes que codifiquen inhibidores de angiogénesis, particularmente angiogénesis tumoral, tales como receptores solubles de factores angiogénicos, inhibidores específicos de los receptores de factor angiogénico (Tie2, receptor de urocinasa, fltl, KDR) , anticuerpos (que incluyen anticuerpos de Fv de cadena sencilla) contra factores angiogénicos (por ejemplo contra VEGF o contra FGF) , anticuerpos contra integrina, toxinas específicas para tumor de endotelio, inhibidores polipéptidos de angiogénesis (fragmentos amino terminales de urocinasa - ATF, angioestatina, endostatina, interferón-a o ß, interleucina-12, factor 4 plaquetario, TNFa, trombospondina, factor activador de plaquetas (PAI)-l, PAI2, TIMP1, fragmento de prolactina, etc. Entre las otras proteínas o péptidos que se pueden secretar por un tejido o que se pueden producir por el tejido es importante resaltar los anticuerpos, los fragmentos variables de los anticuerpos de cadena única (ScFv) o cualquier otro fragmento de anticuerpo que posea capacidades de reconocimiento para uso en inmunoterapia, por ejemplo para el tratamiento de enfermedades infecciosas, tumores y enfermedades autoinmunes tales como esclerosis insular (anticuerpos antiidiotipo) . Otras proteínas de interés son, sin limitarse, receptores solubles como, por ejemplo, receptor soluble CD4 o el receptor soluble TNF para terapia contra VIH, el receptor TNF soluble (particularmente el receptor TNFa soluble) para el tratamiento de artritis reumatoide, y el receptor soluble de acetilcolina para el tratamiento de miastenia; péptidos de sustrato o inhibidores de enzima, o incluso péptidos agonistas o antagonistas de receptor o proteínas de adhesión como, por ejemplo, para el tratamiento de asma, trombosis, restenosis, metástasis o inflamación (por ejemplo IL-4 para disminuir las respuestas de las células TH1, IL-10 e IL-13) ; y proteínas artificiales, quiméricas o truncadas. Entre las hormonas de interés esencial, se puede mencionar insulina en el caso de diabetes, hormona del crecimiento y calcitonina. Para mejorar la respuesta inmune antitumoral o antiinfecciosa, se pueden suministrar genes que codifiquen paracitocinas in unoestimuladoras que incluyen IL-2, IL-12, factores estimuladores de colonias (GM-CSF, G-CSF, M-CSF) , factores inflamatorios de macrófagos (MIP1, MIP2), factores activadores de células dendríticas (ligando flt3) , etc. Otros genes de interés se han descrito por McKusinck, V.A. , Mendelian (Inheritance in man, catalogs of autosomal dominant, autosomal recessive and X-linked phenotypes. Eighth edition, Johns Hopkins University Press (1988)) , y en Stanbury, J.B. et al (The metabolic basis of inherited disease. Fifth edition, McGraw Hill (1983)) . Los genes de interés abarcan las proteínas involucradas en el metabolismo de aminoácidos, lípidos y otros constituyentes celulares. Por lo tanto uno puede mencionar los genes relacionados con enfermedades del metabolismo de carbohidratos, como por ejemplo, fructosa-1-fosfato aldolasa, fructosa-1, 6-difosfatasa, glucosa-6-fosfatasa, a-1 , 4-glucosidasa lisosómica, amylo-1, 6-glucosidasa, amilo- (1, 4 ; 1, 6) -transglucosidasa, fosforilasa muscular, fosfofructocinasa muscular, fosforilasa-b-cinasa, galactosa-l-fosfato uridiltransferasa, todas las enzimas del complejo de deshidrogenasa pirúvica, carboxilasa pirúvica, 2-oxoglutarato glicolasa carboxilasa y deshidrogenasa D-glicérica. Uno también puede mencionar: - genes relacionados con enfermedades del metabolismo de aminoácidos como, por ejemplo, fenilalanina hidroxilasa, dihidrobiopterina sintetasa, tirosina amino transferasa, tirocinasa, histidinasa, fumarilaceto-acetasa, glutation sintetasa, g-glutamilcisteína sintetasa, ornitina-d-aminotransferasa, carbamoilfosfato sintetasa, ornitina carbamoiltransferasa, argininosuccinato sintetasa, argininosuccinato liasa, arginasa, L-lisina deshidrogenasa, L-lisina cetoglutarato reductasa, valina transminasa, leucina isoleucina transaminasa, 2-cetoácido de cadena ramificada descarboxilasa, isovaleril-CoA deshidrogenasa, acil-CoA deshidrogenasa, 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA liasa, acetoacetil-CoA 3-cetotiolasa, propionil-CoA carboxilasa, metilmalonil-CoA mutasa, ATP; cobalamina adenosiltransferasa, dihidrofolato reductasa, tetrahidrofolato de metileno reductasa, cistationina ß-sintetasa, el complejo de sarcosina deshidrogenasa, proteínas que pertenecen al sistema de separación de glicina, ß-alanina transeminasa, carnosinasa sérica y homocarnosinasa cerebral. Los genes relacionados con enfermedades de la grasa y el metabolismo de ácidos grasos como, por ejemplo, lipoproteína lipasa, apolipoproteína C-II, apolipoproteína E, otras apolipoproteínas, lecitina colesterolacetiltransferasa, receptor LDL, hidroxilasa de esterol hepático y "ácido fitánico" a-hidrolasa. - Los genes relacionados con deficiencias lisosómicas como, por ejemplo, a-L-idurodinasa lisosómica, iduronato sulfatasa lisosómica, heparano N-sulfatasa lisosómica, N-acetil-a-D-glucosaminidasa lisosómica, acetil-CoA; a-glucosamina N-acetiltransferasa lisosómica, N-acetil-a-D glucosamina 6-sulfatasa lisosómica, galactosamina 6-sulfato sulfatasa lisosómica, ß-galactosidasa lisosómica, arilsulfatasa B lisosómica, ß-glucoronidasa lisosómica, N-acetil glucosaminil fosforotransferasa, a-D-manosidasa lisosómica, a-neuramidinasa lisosómica, aspartilglucosaminidasa lisosómica, a-L-fucosidasa lisosómica, lipasa acida lisosómica, ceramidasa acida lisosómica, esfingomielinasa lisosómica, glucocerebrosidasa lisosómica y galactocerebrosidasa lisosómica, galactosilceramidasa lisosómica, arilsulfatasa A lisosómica, a-galactosidasa A, ácido ß-galactosidasa lisosómica y una cadena de hexosaminidasa A lisosómica.

Uno también puede mencionar, sin restricciones, los genes relacionados con enfermedades del metabolismo de los esteroides y los lípidos, los genes relacionados con enfermedades del metabolismo de purina y pirimidina, los genes relacionados con enfermedades de porfirina y metabolismo del grupo hemo y los genes relacionados con enfermedades de tejido conectivo, metabolismo muscular y óseo así como genes relacionados con enfermedades de la sangre y hematopoyesis, músculos (miopatía) , sistema nervioso (enfermedades neurodegenerativas) o sistema circulatorio (tratamiento de isquemia y estenosis, por ejemplo) . Los números ejemplos anteriores y aquellos que siguen ilustran el alcance potencial del área de aplicación de esta invención. Los ejemplos a continuación demuestran la expresión de cada uno de los siguientes factores.

Electrotransferencia de NT3. Entre los genes altamente deseables para ser sometidos a electrotransferencia a tejido muscular esta neutrofina 3 (NT3) . Ya se ha encontrado que NT3 suministrado intramuscularmente en un vector de adenovirus o un vector no viral incrementa la supervivencia de p n de ratón (Haase et al., Nature 3:429-436, 1997). Este es un modelo animal útil para esclerosis lateral amiotrófica (ALS), denominada comúnmente "enfermedad de Lou Gehrig's". El tratamiento de esta enfermedad incidiosa con la terapia de gen NT3 se espera que se facilite en gran medida por el suministro de NT3 por electrotransferencia, lo cual asegura una expresión adecuada y reproducible de este factor trófico.

Electrotransferencia de FGF ácido o VEGF. Otro gen altamente deseable para electrotransferencia a tejido muscular es FGF ácido (aFGF; ECGF) o factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) . Se ha encontrado que ambos son efectivos para tratar la enfermedad oclusiva arterial. El tratamiento de esta enfermedad con terapia de genes que mejorar la electrotransferencia de AFGF o VEGF se espera que incrementa adicionalmente la eficiencia del crecimiento vascular. Al aplicar el campo eléctrico de una manera sincronizada, particularmente a través de sincronización cardíaca activa, también será posible la terapia para la enfermedad oclusiva de la arteria cardíaca. Un ácido nucleico terapéutico también puede ser un gen o una secuencia antisentido, cuya expresión en la célula objetivo haga posible controlar la expresión de la transmisión de ARNm celular. Tales secuencias pueden ser transcritas, por ejemplo, en el ARN de la célula objetivo complementando el ARNm celular y de esta manera bloqueando la traducción de proteínas, de acuerdo con el método descrito en la patente Europea número 140,308. Los genes terapéuticos también incluyen secuencias qµe codifican para ribosimas, las cuales son capaces de destruir selectivamente ARN objetivos (patente Europea número 321,201) .

Genes Inmuno rénicos ? Vacunas Como se indica antes, el ácido nucleico también puede contener uno o más genes que codifiquen para un péptido inmunogénico o uno antigénico, capaces de generar una respuesta inmune en el hombre o en el animal . En esta modalidad particular, la invención por lo tanto hace posible vacunas o tratamientos inmunoterapéuticos aplicados al hombre o al animal, específicamente, contra microorganismos, virus o cánceres. De manera específica se pueden involucrar péptidos antigénicos específicos del virus de Estein-Barr, virus de VIH, virus de la hepatitis B (patente Europea número 185,573) , virus de rabia falsa, "virus de formación de sincitios", otros virus o incluso antígenos específicos de tumores como proteínas MAGE (patente Europea número 259,212), o antígenos capaces de estimular una respuesta antitumoral tal como proteína de choque calorífico bacteriana.

Vectores En el proceso de acuerdo con la invención, el ácido nucleico se puede unir a cualquier tipo de vectores o cualquier combinación de estos vectores, siendo posible mejorar la transferencia de genes, por ejemplo, sin limitación, a vectores tales como virus, agentes sintéticos o biosintéticos (por ejemplo, lípidos, polipéptidos, glicósidos o polímeros), o incluso esferas, impulsadas o no. Los ácidos nucleicos también se pueden inyectar en un tej ido el cual experimenta un tratamiento con el objetivo de mejorar la transferencia de genes, por ejemplo, un tratamiento de una naturaleza farmacológica en una aplicación local o sistémica, o un tratamiento enzimático, permeabilizante (uso de tensoactivos) , quirúrgico, mecánico, térmico o físico. Los ejemplos que siguen están diseñados para ilustrar la invención de una manera no limitante.

EJEMPLOS EJEMPLO 1: CONDICIONES DE ELECTROPORACION ESTÁNDAR La condición de electroporación estándar, por ejemplo, como se utiliza en las patentes de los Estados Unidos números 5,468,223, 5,304,120, 5,507,724, 5,273,525, 5,318,514, 5,439,440, 5,462,520, 5,464,386, 5 , 019 , 034 y 6 , 389 , 069 , y las publicaciones de patentes internacionales WO 97/07826, por ejemplo, las cuales se discuten con mayor detalle en lo anterior, se probaron y encontraron que proporcionan una eficiencia baja, e incluso inhibición de la transferencia del ácido nucleico (ADN plasmídico) en músculo estriado.

Materiales y Métodos En el ejemplo que sigue, se utilizaron los siguientes productos : ADN pXL2774 (PCT/FR patente 96/01414) es un ADN plasmídico que contiene el gen indicador de luciferasa. Los otros productos están disponibles en los proveedores en el mercado; ketamina, xilazina, solución salina fisiológica (NaCl 0.9%) . Un osciloscopio y un generador de pulso eléctrico comercial (rectangular o cuadrado) (Electropulsator PS 15, Jouan, Francia) se utilizaron) . Los electrodos utilizados son electrodos de acero inoxidable planos separados 5.3 mm. El experimento se lleva a cabo en ratones C57 Bl/6.

Los ratones, que provienen de jaulas diferentes, se distribuyen aleatoriamente antes del experimento ("aleatorización"). Los ratones fueron anestesiados con una mezcla de ketamina y xilazina. Se inyectó la solución de plásmido (30 mg/ml de una solución con 500 mg/ml de NaCl 0.9%) longitudinalmente a través de la piel dentro del músculo craneal tibial de las patas izquierda y derecha por medio de la jeringa de Hamilton' s. Los dos electrodos se recubrieron con gel conductor y la pata inyectada se colocó entre los electrodos en contacto con este último. Se aplicaron pulsos eléctricos perpendiculares al eje del músculo por medio de un generador de pulsos cuadrados un minuto después de la inyección. Un osciloscopio permitió verificar la intensidad en voltios (los valores indicados en los ejemplos representan los valores máximos) , la duración en milisegundos y la frecuencia en Hertz de los pulsos suministrados, los cuales fueron l Hz . Se suministraron ocho pulsos consecutivos. Para la evaluación de la transfección del músculo, los ratones fueron sacrificados siete días después de la administración del plásmido. Se extrajeron los músculos craneal tibial de las patas izquierda y derecha, se pesaron, se colocaron en amortiguador de lisis y se trituraron. La suspensión que se obtiene se centrifuga con el fin de obtener un sobrenadante transparente. La medición de actividad de luciferasa se llevó a cabo en 10 ml de sobrenadante por medio de un luminómetro comercial, en el cual el sustrato se agrega automáticamente a la solución. La intensidad de la reacción luminosa está dada en RLU (unidades de luminiscencia relativa) para músculo que experimenta el volumen total de suspensión. Cada condición experimental fue aprobada en 10 puntos: 5 animales inyectados bilateralmente. La comparación estadística se realizó por medio de pruebas no paramétricas.

Resultados v Discusión Dos figuras, la escala de las cuales es lineal o logarítmica, ilustra los resultados. En el primer experimento se probaron los efectos de un campo eléctrico de 800 a 1200 volts/cm, las cuales fueron las condiciones utilizadas para la electroporación de tumores, (Mir et al., Eur. J. Cáncer 27, 68, 1991; patente de los Estados Unidos 5,468,223). Se observa, de acuerdo con la figura 1, que en relación al grupo control en el cual se inyecta ADN sin un pulso eléctrico: con 8 pulsos de 1,200 volts/cm y una duración de 0.1 mseg, el valor medio de actividad de lucíferasa es mucho menor; . con pulsos de 1,200 volts/cm y 1 mseg, tres animales murieron y el valor medio de actividad de luciferasa fue mucho menor; con pulsos de 800 volts/cm y 1 mseg, el valor medio de actividad de luciferasa también se redujo significativamente. La mayor parte de los músculos que experimentaron la acción del campo eléctrico se encontraban visiblemente alterados (friables o con apariencia blancuzca) .

EJEMPLO 2 : ELECTROTRANSFERENCIA DE ÁCIDOS NUCLEICOS El experimento se llevó a cabo con ratones C57 Bl/6. Además de la intensidad del campo eléctrico de los pulsos así como su duración, las condiciones de funcionamiento fueron las del ejemplo 1. En la figura 2 se muestran los resultados. Se reprodujo el resultado del ejemplo 1, esto es, el efecto inhibitorio de una serie de 8 pulsos a 800 volts/cm con una duración de 1 mseg en la actividad de luciferasa detectada en músculo. Con un campo de 600 volts/cm, se observa la misma inhibición y la misma alteración del tejido muscular. Sin embargo, las anchuras de pulso más cortas a este voltaje es probable que eviten el daño de tejido y al mismo tiempo mejoren la transferencia de ADN. Por otra parte, de manera notable y sorprendente, la disminución de voltaje hizo posible que ya no fuera visible la alteración de los músculos y, además, a 400 y 200 volts/cm, el nivel de transfección de los músculos fue más elevada en promedio que la obtenida en músculos no sometidos a un campo. Se debe hacer notar que, en relación al grupo control (no sometido a un campo eléctrico) , la dispersión de los valores de actividad de luciferasa se reduce significativamente a 200 volts/cm (SEM = 20.59% del valor medio, en comparación con 43.32%n en ausencia del campo eléctrico (figura 2A) ) .

Una persona habitualmente experta en la técnica puede determinar fácilmente que estos datos confirman que el aparato de la técnica anterior para electrotransferencia se puede modificar de acuerdo con los descubrimientos de la presente invención para proporcionar un sistema o aparato de la invención. Aunque la modificación es sencilla, los resultados que se producen por la modificación son totalmente inesperados. Un sistema o aparato de la invención produce una mejoría inesperada tanto en la eficiencia como en la capacidad de reproducción de la transferencia de ácido nucleico, como se demuestra por los experimentos de transferencia de ADN plasmídico reportadas en este ejemplo y en los ejemplos que siguen.

EJEMPLO 3 : LA ELECTROTRANSFERENCIA MEJORA LA EXPRESIÓN TRANSGEN Este experimento se llevó a cabo con ratones C57 Bl/6. Además de la intensidad del campo eléctrico de los pulsos y su duración y el hecho de que los pulsos se suministraron 25 segundos después de la inyección de ADN, las condiciones de funcionamiento fueron las de los ejemplos anteriores. En la figura 3 se muestran los resultados. El valor medio de transgen de luciferasa expresado se incrementa notablemente con una duración de pulso de 20 mseg a 100 volts/cm, comenzando con una duración de pulso de 5 mseg a 200 volts/cm. Este experimento muestra claramente que el valor medio de actividad de luciferasa que se obtiene por electrotransfección de ADN en el músculo es una función de la duración de los pulsos eléctricos cuando se utilizan voltajes de 200 y 100 volts/cm. También se observa que la dispersión de los valores se reduce notablemente para los grupos de músculos electrotransfectados (figura 3A) . En ausencia de pulsos eléctricos (control) el SEM representa 77.43% del valor medio, mientras que el SEM relativo se reduce a 14% bajo las condiciones de campo de 200 volts/cm con tiempos de pulso de 5 mseg, 41.27% bajo condiciones de campo eléctrico de 200 volts/cm con tiempos de pulso de 20 mseg, y entre 30% y 48% para electrotransferencia a 100 volts/cm. En la mejor condición de este experimento, la expresión del transgen se incrementa en un factor de 89.7 en relación al control inyectado en ausencia de pulsos eléctricos.

EJEMPLO 4: INCREMENTO DE 200 VECES EN LA EXPRESIÓN Este experimento se lleva a cabo en ratones DBA 2 con pulsos eléctricos de 200 volts/cm de duración variable. Las otras condiciones de este experimento son las mismas que en ejemplo 3.

Este ejemplo confirma que a 200 volts/cm, se incrementa la transfección de actividad de luciferasa cuando la duración de pulso se incrementa de 5 mseg a una duración más grande (figuras 4 y 5) . Se observa una reducción de la variabilidad interindividual incidada por SEM en relación al control no sometido a electrotransferencia. El valor relativo de SEM es igual a 35% para el control y 25, 22, 16, 18 y 26% para seríes de pulsos de 1, 5, 10, 15, 20 y 24 mseg, respectivamente. Bajo las condiciones óptimas utilizadas en este experimento, se incrementa la expresión de transgen en un factor de 205 en relación al control inyectado en ausencia de pulsos eléctricos. Estos resultados confirman que la electrotransferencia bajo las condiciones descritas en estos ejemplos confirman que la electrotransferencia bajo las condiciones descritas en estos ejemplos mejora en gran medida tanto la eficacia como la capacidad de reproducción.

EJEMPLO CUANTIFICACION DE LA EFECTIVIDAD DE ELECTROTRANSFERENCI La figura 5 ejemplifica la importancia del parámetro que corresponde al producto "número de pulsos x intensidad de campo x duración de cada pulso". Este parámetro corresponde, de hecho, a la integral dependiente del tiempo de la función de la cual describe la variación del campo eléctrico.

Los datos en la figura 5 se obtienen a partir de los resultados que se obtienen en el curso de los experimentos 2, 3 y 5. Se evaluaron intensidades de campo eléctrico de 200 V/cm y 100 V/cm, o en ausencia de campos eléctricos. Los datos que muestran que la efectividad de transfección se incrementa como una función del producto de la duración total de exposición al campo eléctrico por la intensidad del campo. El mejoramiento de la trasferencia de ácido nucleico se obtiene con un valor que excede de 1 kV x mseg/cm del producto "campo eléctrico x duración total de pulsos". De acuerdo con una modalidad preferida, se obtiene una estimulación para un valor que excede o que es igual a 5 kV x mseg/cm para el producto "campo eléctrico x duración total de pulsos".

EJEMPLO 6: APLICABILIDAD AMPLIA DE ELECTROTRANSFERENCIA Se han llevado a cabo experimentos adicionales que confirman los resultados de los ejemplos 2-5, supra. En realidad, se ha observado un mejoramiento importante y reproducible en la transferencia de genes, en ratones, ratas y conejos utilizando los pulsos eléctricos de bajo voltaje. Las condiciones utilizadas se han descrito previamente como inefectivas en otros tipos de células investigadas tales como células tumorales, cutáneas o hepáticas.

Se han hecho variar los siguientes parámetros y se han estudiado en este ejemplo: Características del campo eléctrico : Voltaje/cm, número, frecuencia, duración de pulsos, que definen las mejores condiciones en el músculo de tibia de ratón como 200 V/cm, 8 pulsos de 20 ms a 1 a 2 Hz .

Forma/tipo de los electrodos : La mayor parte de los experimentos se realizaron con electrodos de placa no invasivos; la factibilidad de electrodos de agujas se demuestra en experimentos en conejo.

Cantidad de ADN (utilizando las mejores condiciones de transferencia en músculo de tibia de ratón) .

Diferentes lotes de ADN Diferentes genes indicadores : luciferasa, LacZ (ratones) , FGF (ratas) .

Diferentes especies animales : ratones, ratas, conejos , Diferentes sitios de inyección: tibia, gastrocnemius, cuadríceps en ratones; tibias en ratas, tibias, cuadríceps y tríceps en conejos.

Distancia del sitio de inyección versus sitio de pulso.

Sincronización de la inyección versus aplicación de pulsos eléctricos.

Diferentes experimentadores realizan inyecciones y aplicación de pulsos .

Los resultados observados fueron los siguientes: Un incremento significativo de la transferencia de genes sobre la inyección de ADN desnudo solo: de 5- 10 hasta 100 veces o incluso mayor en músculos de ratones, 100 a 250 veces de incremento en ratas, 100 a 50,000 veces en conejos, dependiendo del nivel del control . Una r ducción significativa de la dispersión/variabilidad entre animales, de los resultados . Los pulsos eléctricos deben ser administrados después de la inyección de ADN y en el mismo sitio. El ADN vector se puede administrar hasta 30 min antes de los pulsos sin disminución notable en la respuesta. Esto permite inyecciones múltiples de ADN en sitios cercanos seguido por un solo pulso. Los experimentos realizados en ratones con LacZ y seguidos por análisis histológico confirman que el procedimiento resulta en un incremento de aproximadamente 10 veces en las fibras de músculo que expresan el gen. Los datos en ratas con FGF también indican un incremento significativo en el número de células que expresan. Un experimento utilizando fosfatasa alcalina secretada, un gen para proteína indicadora secretada, indican también un factor de incremento logarítmico de dos para la proteína secretada dosificada en el suero. Dependencia inversa de la eficiencia de transfección respecto al tamaño . Los plásmidos más pequeños se transfieren más eficientemente; sin embargo, el dispositivo de electrotransferencia incrementa notablemente la eficiencia de transferencia de ADN sin importar el tamaño del ADN, por lo que resuelve un obstáculo importante para la transfección con YAC, cósmidos o cromosomas artificiales.

Independencia del promotor y de la proteína de procesamiento . La eficiencia de electrotransferencia no depende de manera alguna del promotor del transgen, lo cual permite otro nivel de control de la expresión del gen. Además, la presencia de secuencias secretoras u otras secuencias reguladoras/de procesamiento en el producto del gen no tiene efecto sobre la eficiencia de electrotransferencia . Estos experimentos han demostrado que la electrotransferencia no es sin algunos efectos colaterales, aunque los efectos son mínimos en comparación con las condiciones de electroporación. Se documentaron procesos de reacción inflamatoria local y regeneración a los siete días después de los pulsos. Esta inflamación es moderada y reversible. Los pulsos eléctricos inducen una contracción general en ratones. En la rata, el efecto disminuye mucho y se localiza en la extremidad posterior. En el conejo, los experimentos preliminares indican que la contracción se restringe al grupo muscular al que se dirige el pulso. No hay reacción de dolor aparente (no hay llanto) por las ratas o conejos anestesiados. Durante la recuperación de la anestesia, ninguno de los animales muestra ningún dolor aparente en las extremidades tratadas.

Estos experimentos demuestran la superioridad de los dispositivos de electrotransferencia bajo las condiciones descritas en esta solicitud, en términos de mejoramiento de la transferencia de ácido nucleico, la reducción en la variabilidad intraexperimental y la reducción o eliminación de efectos colaterales adversos. Estos resultados se presentan con mayor detalle en los ejemplos que siguen.

EJEMPLO 7: TRANSFECCION COMO UNA FUNCIÓN DE LA DURACIÓN DE PULSO Este ejemplo demuestra el efecto de incrementar la duración de pulso sobre la eficiencia de transfección bajo condiciones de electro transferencia. Las condiciones experimentales fueron las mismas que las del ejemplo 1 con ratones C57B1/6, excepto que se utilizó un generador de pulsos Gentronics/BTX T820 (BTX, una división de Genetronics, San Diego, California) . El generador de pulsos BTX permite la aplicación de pulsos cuadrados de duraciones de hasta 100 ms . Se inyecta el plásmido pXL2774 (WO 97/10343) (15 µg) . Se indica en la tabla 1 que a una fuerza de campo eléctrico constante de 200 V/cm, un incremento en la duración (T) de los pulsos mejora la eficiencia de la transfección. Estos datos establecen parámetros optimizados para un dispositivo de electrotransferencia para el suministro de ácidos nucleicos en músculo. Tal dispositivo preferiblemente proporciona un pulso de 20 mseg o mayor, con por lo menos 4, y de manera más preferible 8 pulsos.

Tabla 1: Dependencia de la eficiencia de electrotransferencia sobre la duración de pulso Valor mediano de actividad de luciferasa en millones de RLU por músculo +/- SEM, N = 10, Condiciones de electrotransferencia; 200 V/cm de fuerza de campo, frecuencia de 1 Hz. Estos datos muestran que un dispositivo para electrotransferencia bajo la fuerza de campo optimizada descrita en esta solicitud puede mejorar adicionalmente la eficiencia de transferencia de -ADN al incrementar la duración del pulso. Por ejemplo, el incrementar la duración a por lo menos 40 mseg con una serie de 8 pulsos o 50 mseg para una serie de 4 pulsos, mejora significativamente la eficiencia de transfección a 200 V/cm. Se pueden llevar a cabo optimizaciones similares del dispositivo para otras fuerzas de campo.

EJEMPLO 8: TRANSFECCIÓN COMO UNA FUNCIÓN DEL NÚMERO DE PULSOS Este ejemplo demuestra el efecto de incrementar el número de pulsos sobre la eficiencia de transfección bajo condiciones de electrotransferencia. Las condiciones experimentales fueron las mismas a las descritas en el ejemplo 1, utilizando ratones C57B1/6. La tabla 2 muestra que a 200 V/cm con una duración de pulso de 20 ms, la eficiencia de transfección mejora notablemente en comparación con el grupo control (al que no se ha aplicado un campo eléctrico) , comenzando desde un pulso único, y después continúa incrementándose cuando el número de pulsos se incrementa a 2, 4, 6, 8, 12 y 16 con un óptimo entre 8 y 16 pulsos. También se hace notar una reducción en la varianza (S.E.M.) para todos los grupos sometidos a electrotransferencia en comparación con el control (0 pulsos) .

Tabla 2 : Eficiencia de transfección versus número de pulsos Expresión de luciferasa promedio en millones de RLU por músculo, +. S.E.M.; N = 10 para cada grupo; 200 V/cm' de intensidad de campo,- frecuencia de 1Hz . Estos datos muestran que un dispositivo de electrotransferencia mejora la eficiencia de transferencia de ADN con más pulsos. Bajo la fuerza de campo probada (200 V/cm) , un dispositivo de manera óptima proporciona 4 o más, aún mejor, 8 o más pulsos. Al modificar el número de pulsos, un dispositivo de electrotransferencia puede modular la eficiencia de transferencia de ácido nucleico y de esta manera ajustar el nivel de expresión.

EJEMPLO 9: TRANSFECCIÓN COMO UNA FUNCIÓN DE LA FRECUENCIA Este experimento muestra que al incrementar la frecuencia de pulsos se incrementa la eficiencia de transfección. En uso clínico, un dispositivo de electrotransferencia que aplica los pulsos a frecuencia mayor mejora la comodidad del paciente al reducir la longitud total de tiempo que se aplica al campo eléctrico. Por lo tanto, se mejoran tanto la eficiencia como la comodidad del paciente al incrementar la frecuencia . Las condiciones experimentales fueron las mismas a las descritas en el ejemplo 1 utilizando ratones C57B1/6. Se inyecta el plásmido pXL2774 (15 µg) . La frecuencia varía de 0.1 a 4 Hz con 8 ó 4 pulsos a una resistencia de campo de 200 V/cm y una duración de 20 ms. Los resultados se muestran en la tabla 3.

Tabla 3: Eficiencia de transfección versus frecuencia (Hz) Ensayo D 4 1451 1572 + 1222 + 2474 + pulsos 228 320 126 646 Actividad de luciferasa promedio en iones de RLU por músculo + S.E.M.; N = 10 para cada grupo,- intensidad de campo eléctrico de 200 V/cm; duración de pulso, 20 mseg. Los resultados demuestran que una frecuencia mayor (mayor de 1 Hz, y preferiblemente mayor de 2 Hz) , bajo las condiciones de electrotransferencia probadas, se incrementa de manera eficiente la transfección.

EJEMPLO 10: ELECTROTRANSFECCION CON UN CAMPO ELÉCTRICO QUE VARÍA EN EL TIEMPO Y QUE DISMINUYE EXPONENCIALMENTE Este ejemplo muestra el efecto de aplicación de un campo eléctrico que disminuye exponencialmente, sobre la eficiencia de la transferencia de ácido nucleico in vivo. En este experimento se utilizaron ratones C57B1/6. El plásmido pXL3031 (Figura 12) derivado del plásmido pXL2774 al introducir luciferasa modificada de Photinus pyralis (pGL3 ; Genbank acceso número CVU47295) bajo el control del promotor temprano inmediato de citomegalovirus (CMV-IE) (acceso Genbank número HS51EE) y una señal de poliadenilación del virus SV40 (Genbank acceso número SV4CG) , se utilizaron en este experimento. Se inyectaron 10 µg de ADN.

El electropulsor comercial (Equibio electropulsater, modelo EasyjectT Plus, Kent, Reino Unido) se configura para suministrar pulsos de campo eléctrico que varían con el tiempo, disminuyendo exponencialmente. El voltaje registrado aplicado es el voltaje en el pico de la exponencial. El segundo parámetro ajustable es la capacitancia (en µF) , la cual controla la cantidad de energía suministrada. La tabla 4 muestra que, cuando se aplica un pulso de campo que disminuye exponencialmente, es posible obtener un incremento muy claro en la expresión del transgen en comparación con el caso en el que no se aplica el campo. Este resultado se obtiene a voltajes diferentes y para energías diferentes que corresponden a las constantes de tiempos diferentes del exponencial las cuales se pueden modular por la capacitancia ajustable del instrumento. Los parámetros establecidos en este ejemplo se pueden aplicar a un dispositivo de electrotransferencia.

Tabla 4: Eficiencia de transfección (actividad de luciferasa en relación al control) con un campo que varía en el tiempo, que disminuye exponencialmente Incremento en el nivel de expresión de luciferasa en relación a los niveles control, los cuales se establecen por inyección del plásmido pXL3031 sin condiciones de electrotransferencia. El valor promedio para el incremento en el nivel de expresión está representado N = 4 a 6 ratones por prueba . A modo de comparación, el incremento en la actividad de luciferasa utilizando un pulso de onda cuadrada a 200 V/cm, 8 pulsos de 20 mseg cada uno, a una frecuencia de 1 Hz, es de 44. Los datos muestran que un dispositivo de electrotransferencia que aplica un campo eléctrico que disminuye exponencialmente con el tiempo puede incrementar la expresión a una fuerza de campo eléctrico menor, con mayor capacitancia (por ejemplo 200 V/cm, capacitancia de ,3000 µFaradios) .

EJEMPLO 11: COMBINACIÓN DE UN PULSO CORTO DE ALTO VOLTAJE Y VARIOS PULSOS LARGOS DE BAJO VOLTAJE Este ejemplo muestra que el campo eléctrico suministrado puede ser una combinación de por lo menos un campo fuerte entre 500 y 800 V/cm durante un período corto, por ejemplo 50 ó 100 µs , y por lo menos un campo débil (< 100 V/cm) por un período más prolongado, por ejemplo, más de 1 ms hasta 90 ms en este experimento. Los valores de campo eléctrico débil son de 80 V/cm aplicados en 4 pulsos a 1 Hz con una duración de 9 ms cada uno. Para este experimento, se utilizaron dos electropulsadores comerciales (Jouan y Gentronix) . El suministro del voltaje eléctrico por uno y después por el otro instrumento a las placas de electrodo se produce en menos de un segundo al modificar la configuración de operación manualmente. El plásmido que codifica para luciferasa utilizado fue pXL3031 y la cantidad inyectada fueron 3 µg. Los valores para la fuerza de campo eléctrico varían, como se reporta en la tabla 5. De otra manera, las condiciones experimentales fueron las mismas a las descritas en el ejemplo 1. La tabla 5 resume los experimentos . Estos datos indican que, en comparación con el grupo control (en el que no se ha aplicado campo eléctrico) , un pulso corto de alto voltaje o 4 pulsos largos de bajo voltaje, o la aplicación de pulsos de campo eléctrico débil antes de un pulso de campo alto, proporcionan poco por mejorar la eficiencia de transfección. En contraste, en los experimentos, la combinación de un pulso corto de alto voltaje seguido por 4 pulsos de 80 V/cm de 90 ms de duración a 1 Hz incrementan muy claramente la transfección en comparación con el grupo control. A partir de estos datos, es evidente que el dispositivo de electrotransferencia preferido debe suministrar una serie de pulsos más cortos con una fuerza de campo eléctrico mayor.

Tabla 5: Combinación de pulsos de fuerza y tiempo variables Como se muestra en el ejemplo 1, antes, la aplicación de 8 pulsos de 600, 800 ó 1200 V/cm durante 1 mseg a una frecuencia de 1 Hz provoca lesiones en el músculo e inhibe la transfección. Los resultados que se obtienen en este ejemplo muestran que, bajo las condiciones especificadas, es posible utilizar un campo eléctrico de alto voltaje sin provocar lesiones. En realidad, el examen macroscópico del músculo no evidencia ninguna alteración visible. El uso de un campo de alto voltaje durante un tiempo corto, seguido por campos débiles durante períodos de tiempo más prolongados, proporciona un medio alternativo para modular la eficiencia de transferencia de ADN.

EJEMPLO 12: CINÉTICA DE EXPRESIÓN DE LUCIFERASA EN MÚSCULO El uso de un dispositivo de electrotransferencia de la aplicación permite la transfección y expresión estable de un ácido nucleico a alto nivel durante por lo menos cuatro meses . En este experimento se utilizaron ratones C67B1/6.

Los ratones fueron inyectados intramuscularmente con el plásmido pXL2774 (15 µg) . La inyección del ADN fue seguida por aplicación de un campo eléctrico bajo las siguientes condiciones: 200 V/cm; 8 pulsos de 20 mseg de duración; frecuencia de 1 Hz . Otras condiciones son como se describen en el ejemplo 1. Se determinó la actividad de luciferasa para grupos de 10 ratones sacrificados en tiempos diferentes después de la inyección del ADN. Los ratones control no fueron expuestos al campo eléctrico. Los datos en la figura 6 muestran que la expresión de luciferasa es detectable desde la tercera hora después de la inyección del plásmids y se incrementa hasta el tercer día (D3) . La expresión de luciferasa comienza a declinar desde el día 35. Para los grupos tratados por el campo eléctrico, es notorio que la transfección se incrementa de manera claramente sin importar el tiempo de medición del nivel de expresión. En el día 121 (D121) , la diferencia entre el control y los grupos tratados es incluso más pronunciada puesto que la expresión del ADN transfectado se retiene después de la electrotransferencia, mientras que la expresión en el músculo control declinó. De manera más notoria, el nivel de expresión del transgen es estable para D121. Este resultado es especialmente ventajoso desde la perspectiva del tratamiento clínico a largo plazo con genes terapéuticos .

EJEMPLO 13 : HISTOLOGÍA DEL MÚSCULO ELECTROTRANSFECTADO El análisis histológico con respecto al curso del experimento cinético verificó la ausencia de una respuesta inflamatoria crítica. Se observa una inflamación moderada, indicada por la presencia de macrófagos y linfocitos. Esta reacción inflamatoria se reduce en gran medida en el D121, mientras que el nivel de la expresión del transgen permanece estable y elevada, como se muestra en la figura 6. El análisis histológico se confirma bajo estas condiciones, excepto que se utiliza el plásmido pXL3004 (figura 13) . Este plásmido es un plásmido pCOR (pXL2774; véase WO 97/10343) que codifica para ß-galactosidasa. El plásmido pXL2774 se modifica por introducción del gen LacZ modificado con la secuencia de señal de localización nuclear (véase Mouvel et al., 1994, Virology 204:180-189) bajo el control del promotor CMV obtenido del plásmido pCDNA3 (Invitrogen, Países Bajos) , con la señal de poliadenilación SV40 (Genbank acceso número SV4CG) . Los animales se sacrifican siete días después de la administración del plásmido. El análisis histológico permite la detección de células transfectadas con ß-galactosidasa (histoquímica Xgal) y los focos inflamatorios por tinción de carmín aluminizado y la caracterización de la condición de tejido muscular por tinción con hematina-eosina.

Los ratones control no se expusieron a campo eléctrico. La diferencia entre los músculos electropermeabilizados y no-electropermeabilizados se muestran por: El número de miofibrillas que expresan ß- galactosidasa es 9 veces mayor de miofibrilla en los músculos electrotransfectados (promedio de 76, N = 6 ratones) en relación a los controles (promedio de 8.5, N = 8 ratones) . La mayor parte de estas fibras musculares están en reposo con núcleos localizados periféricamente. Las miofibrillas centronucleares, muy raras (en refrigeración) expresan ß- galactosidasa. El área de expresión de ß-galactosidasa es dos veces mayor que los músculos electropermeabilizados (4 mm) en comparación con los controles, con un gradiente de expresión el cual disminuye desde el sitio de inyección. 10 En este estudio, se hace notar que los músculos electropermeabilizados presentan un número irreversible de infiltrado (macrófagos y linfocitos) numerosas fibras musculares en regeneración con una centralización nuclear, y numerosas fibras necróticas llenas con macrófagos gagocíticos. La zona de inflamación, necrosis y regeneración corresponden a la zona alrededor de las mio ibrillas transfectadas . Esta respuesta dura hasta dos semanas y se revierte por si misma. La parte no transfectada del músculo permanece en buena condición. En los músculos no electropermeabilizados, algunas miofibrillas necróticas y otras en regeneración se localizan alrededor del sitio de inyección con algunos focos inflamatorios .

Brevemente, estos datos muestran que aunque las condiciones de electrotranferencia resultan en inflamación observable, la inflamación no es significativa, particularmente en vista de la mejoría notable de la eficiencia de transferencia de ácido nucleico. Además, los datos a partir del estudio cinético demuestran que la inflamación se revierte asi misma, incluso cuando la expresión transgénica permanece estable a un alto nivel .

EJEMPLO 14: PAPEL DEL TIEMPO DE INYECCIÓN DEL PLÁSMIDO EN RELACIÓN AL TIEMPO DE APLICACIÓN DEL CAMPO ELÉCTRICO Este ejemplo demuestra que el ácido nucleico se puede inyectar en el tejido (en este caso, músculo) por lo menos 30 minutos, incluso un período tan prolongado como una hora, antes de la aplicación del campo eléctrico. Se inyectó intramuscularmente a ratones C57B1/6 con el plásmido pXL2774 (15 ó 1.5 µg) . El ADN se inyecta hasta 120 minutos antes o 60 segundos después de que se aplica el campo eléctrico. El tiempo antes o después de la inyección se presenta en la tabla 6. Las condiciones del campo eléctrico utilizado fueron-. 200 V/cm; 8 pulsos de 20 mseg de duración; frecuencia de 1 Hz . Los ratones control recibieron una inyección de plásmido pero no expusieron al campo eléctrico.

Otras condiciones experimentales fueron las mismas que las del ejemplo 1. En la tabla 6 se presentan los datos. La inyección de ADN hasta por una hora antes de la aplicación del campo eléctrico resultan en un mejoramiento de la eficiencia de transfección aumentada, detectada por la expresión de luciferasa. Se observa la misma tendencia con la inyección de 15 µg de plásmido por músculo a la observada con inyección a una dosis 10 veces menor, es decir, 1.5 µg de ADN. No se observa un mejoramiento en la eficiencia de transfección de ADN cuando el plásmido se inyecta después de la aplicación del campo eléctrico.

Tabla 6: Eficiencia de electrotransferencia del plásmido inyectado. Antes y después de la aplicación del campo eléctrico. 6A: Inyección de ADN en ausencia de campo eléctrico (control) 6B: Inyección de ADN antes de la aplicación del campo eléctrico 6C: Inyección de ADN después de la aplicación del campo eléctrico En contraste con los resultados que se presentan aquí, en los cuales la inyección del ADN plasmídico hasta una hora antes de la aplicación del campo eléctrico proporciona un nivel elevado de expresión del plásmido, in vi tro varios autores han observado que para la electroporación, es necesario que el plásmido esté presente en el momento de la aplicación del campo eléctrico.

EJEMPLO 15: RESPUESTA A LA DOSIS CON ELECTROTRANSFERENCIA El análisis estadístico presentado en este ejemplo permite la comparación de la dosis-respuesta bajo condiciones de electrotransferencia. Este estudio confirma que el uso del dispositivo de electrotransferencia reduce en gran medida la variabilidad del nivel de expresión del plásmido. Se inyectó a ratones C57BI16 de cinco semanas de edad intramuscularmente de manera bilateral en los músculos tibio craneales con dosis que varían de 0.25 a 32 µg de ADN (plásmido pCOR-pXL3031) que presentan el transgen luciferasa para expresión citoplásmica, bajo el promotor CMVh a una tasa de 10 ratones por dosis de ADN. La dosis de ADN varía de 0.25 a 32 ug. Inmediatamente después de la inyección, una de las dos patas se expone a un campo de 250 V/cm, con cuatro pulsos de ms a una frecuencia de 1 Hz . Los animales se sacrifican 5 días después del tratamiento y se estudia la expresión del 'transgen en el extracto de tejido de cada músculo de acuerdo con el protocolo descrito en el ejemplo 1. Bajo estas condiciones de electrotransferencia, la observación macroscópica de los músculos muestra únicamente dos trazas de ligero daño térmico al tejido de 150 músculos sometidos al tratamiento . La comparación en el cambio en las varianzas como una función de la media para cada serie de ratones (n = 10) muestra claramente que la distribución de la expresión del transgen es 1ogarítmica-normal . El análisis de la gráfica de los resultados (figura 7) confirmado por los cálculos muestra que el efecto varía linealmente con el logaritmo de la dosis de ADN inyectado . Con una prueba de Cocrhan, es posible demostrar que existe homogeneidad de las varianzas para cada regresión (con y sin electrotransferencia) , un hecho el cual permite utilizar las varianzas residuales para realizar todos los cálculos. La varianza de la linearidad no es significativa para 5% de confianza bajo las condiciones de electrotransferencia. En contraste, la varianza a partir de linearidad es altamente significativa (p < 0.01), indicando una heterogeneidad significativa de la eficiencia de transfección de ADN bajo condiciones estándar (condiciones sin electrotransferencia) .

Los datos muestran que la varianza residual es cinco veces mayor en el caso en el que no hay electrotransferencia, en -comparación con aquel en el cual existe electrotransferencia.

Al considerar los valores estimados para las varianzas residuales, sería necesario utilizar 5 veces más animales para obtener la misma potencia en una prueba de comparación de eficiencia de transfección bajo condiciones sin electrotransferencia, en comparación con los sometidos a electrotransferencia. Este análisis se traduce en una ventaja clara de utilización de un dispositivo de electrotransferencia. Para demostrar una variación de 2, 5 ó 10 veces la expresión del transgen con 95% de confianza, sería necesario inyectar a 33, 8 ó 5 animales bajo condiciones de electrotransferencia, en comparación con 165, 40 ó 25 animales bajo condiciones sin electrotransferencia. En la tabla 7 que se muestra a continuación se resume este tipo de cálculo.

Tabla 7: Cálculo del número de animales para expresión de plásmido estadísticamente significativa con un dispositivo de electrotransferencia Estos datos muestran que la técnica de electrotransferencia no solo incrementa en gran medida la eficiencia de transfección, sino que reduce significativamente la variabilidad de respuestas. Este método, y los dispositivos para implementarlo, permite estudios analíticos rigurosos de transfección de tejido, asi como el suministro reproducible de genes terapéuticos dentro de la ventana de tratamiento terapéutico. Una prueba de comparación de las pendientes que se obtienen para cada regresión lineal no tiene significado. Por lo tanto es posible considerar, con un riesgo de 5%, que existe paralelismo de las dos regresiones. El cálculo de la potencia relativa muestra que para obtener el mismo efecto, se deben inyectar aproximadamente 250 veces más ADN por músculo bajo condiciones estándar en comparación con el uso de un dispositivo de electrotransferencia (243 + 85; con un intervalo de confianza de 95%) . Este resultado se puede traducir como un incremento de aproximadamente 500 veces de la expresión del transgen para la misma dosis de ADN inyectado con electrotransferencia en comparación con la inyección estándar de ADN. Este ejemplo muestra que con dos plásmidos que codifican para luciferasa, es posible establecer una correlación lineal significativa entre la dosis de plásmido inyectada y la electrotransfección. Esta correlación es mucho menos significativa sin electrotransferencia. El análisis estadístico también demuestra una reducción significativa en la varianza de los grupos electrotransfectados . Por lo tanto, es posible, con el dispositivo de electrotransferencia de la invención, modular efectiva y predeciblemente el nivel de expresión del transgen al hacer variar la cantidad de plásmido inyectada.

EJEMPLO 16: ELECTROTRANSFERENCIA CON ELECTRODOS DIFERENTES Este ejemplo compara el efecto de los dispositivos de electrotransferencia equipados con uno de dos tipos de electrodos, electrodos de placa plana y electrodos de aguja, sobre la eficiencia de transferencia de ácido nucleico. Además, se prueban los electrodos de aguja en diferentes orientaciones de implantraeion. Se inyecta el plásmido pXL2774 (150 µg) en el músculo tríceps de la rata. Se colocan los electrodos de placa como se describe en el ejemplo 1 a una distancia entre electrodos de 1.2 cm. Para los electrodos de aguja, la distancia entre electrodos es de 0.9 cm. Los electrodos de aguja se insertan una longitud igual en el tejido del músculo, ya sea paralelo o perpendicular al eje de las fibras del músculo alrededor del sitio de inyección. Sin importar el tipo de electrodos o su orientación, las condiciones de campo eléctrico fueron las siguientes: intensidad de 200 V/cm; 8 pulsos de 20 mseg; frecuencia de 2 Hz . En la figura 8 se muestran los resultados de este experimento. Los datos muestran que la electrotransfección es comparable sin importar el modo de aplicación del campo eléctrico. Se obtienen niveles similares de transfección con los electrodos de aguja y los electrodos de placa. Además, la eficiencia de electrotransferencia parece ser independiente de la orientación de los electrodos de aguja en relación a la orientación de las fibras musculares . Estos datos muestran que el dispositivo de electrotransferencia puede utilizar electrodos de placa o aguja, sin importar la orientación del electrodo en relación al tejido objetivo. Se puede preferir electrodos de aguja para administrar ácido nucleicos a músculos de tamaño para asegurar que el voltaje total sea moderado, por ejemplo 100 V con la colocación de los electrodos de aguja dentro de 0.5 cm para una fuerza de campo eléctrico de 200 v/cm. Sin embargo, los electrodos de placa, los cuales son no invasivos, se pueden preferir con músculos pequeños, por ejemplo, los dedos, tal como el suministro de una terapia de gen para artritis .

EJEMPLO 17: ELECTROTRANSFERENCIA EN DIFERENTES MÚSCULOS Y ESPECIES Este ejemplo ilustra que se puede utilizar el dispositivo de electrotransferencia para llevar a cabo la transferencia de ácido nucleico en muchos tipos diferentes de músculos en diferentes especies de animales . Se ajusta el dispositivo de electrotransferencia para proporcionar las condiciones para cada especie, como se define en la tabla 8. Los resultados también se presentan en la tabla 8.

Tabla 8. Mejoramiento de la electrotransferencia de la transfección de ácido nucleico en diversas especies y músculo.

Se indica el incremento relativo en el nivel de expresión de luciferasa utilizando un dispositivo de electrotransferencia en relación al control (sin electrotransferencia) . Se promedian los datos de 10 músculos por grupo. Se determina la actividad de luciferasa 7 días después de la administración del plásmido. También se prueba la electrotransferencia en monos {Macaca fascicularis) . El plásmido pXL3179 (figura 11) que comprende un gen que codifica para el factor 1 de crecimiento de fibroblastos (factor de crecimiento de fibroblastos ácidos) (FGFl o aFGF) se deriva del plásmido pXL2774 en el cual el péptido señal de interferón de fibroblasto humano se fusiona a ADNC para aFGF (sp-FGFl, Jouanneau et al . , 1991, PNAS, 88:2893-2897) el cual se introduce bajo el control del promotor CMV-IE humano y la señal de poliadenilación SV40. Se determina la expresión de aFGF por inmunohistoquímica. Se evalúa el número de células positivas (células que expresan aFGF) tres ,días después de la inyección intramuscular con 500 µg de plásmido pXL3179. Las condiciones del campo eléctrico fueron 200 V/cm, 8 pulsos de 20 mseg cada uno a una frecuencia de 1 Hz. Los controles no se tratan con el campo eléctrico (electrotransferencia -) . En la tabla 9 se muestran los resultados de este experimento. Los datos muestran claramente que la expresión de la proteína aFGF únicamente se puede detectar después del uso de un dispositivo de electrotransferencia para incrementar la eficiencia de transferencia de ADN en los tejidos músculos. De manera interesante, no se puede detectar expresión en ausencia de electrotransferencia bajo estas condiciones.

Tabla 9: Análisis inmunohistoquímico de expresión aFGF en músculo de mono.

Análisis inmunohistoquímico de la expresión de aFGF en diferentes músculos del mono. Los valores indican el número de 3 días positivos después de inyección intramuscular de 500 µg del plásmido pXL3179 que codifica para aFGF con (+) y sin (-) aplicación de un campo eléctrico.

EJEMPLO 18: ELECTROTRANSFERENCIA EN EL MÚSCULOS DE DIAFRAGMA DE RATA La capacidad mediante el uso de un dispositivo de electrotransferencia de la invención para proporcionar una expresión estable a largo plazo de un transgen tiene implicaciones importantes en el tratamiento de enfermedades degenerativas que afectan la función del diafragma, principalmente distrofia muscular. En estos experimentos, se vuelve accesible al diafragma por una incisión a los largo del esternón después de anestesia (mezcla de 1 mg/kg de largactil y 150 mg/kg de ketamina) . La inyección se realiza en el hemidiafragma (50 µg del plásmido pXL2774 en 50 µl de NaCl 20 mM y glucosa 5%) . Los electrodos de placa después se colocaron sobre ambos lados del plano del diafragma junto con la trayectoria de inyección a una distancia entre electrodos de 1 mm. Las condiciones de campo eléctrico utilizadas fueron las siguientes: 160 V/cm o 300 V/cm; 8 pulsos de 20 mseg de duración cada uno, frecuencia de l Hz . El campo eléctrico se aplica al músculos menos de 1 minuto después de la inyección. Posteriormente se cierra la incisión en animal . En la tabla 10 se muestran los resultados.

Tabla 10: Electrotransferencia en el músculo de diafragma de rata.

Los valores para la expresión de luciferasa son el promedio + S.E.M. (media del error estándar) de la actividad de luciferasa en iones de RLU por músculo, n = 12 para cada grupo . Este ejemplo demuestra una disminución significativa de la expresión del transgen en el diafragma después de la aplicación de 8 pulsos de 20 mseg a una fuerza de campo de 160 V/cm (p < 0.003 utilizando la prueba no paramétrica de Mann-Whitney) .

EJEMPLO 20: ELECTROTRANSFERENCIA DE UN GEN PARA FOSFATASA ALCALINA SECRETADA Este ejemplo demuestra la capacidad de transfectar y expresar un gen que codifica para una proteína secretada. Las proteínas secretadas se utilizan, por ejemplo, en un enfoque de terapias de genes sistémicas y para generar una respuesta inmune (vacuna de ADN) . El gen presentado aquí se encuentra en la circulación en una concentración elevada, y su presencia es estable. En este ejemplo, se inyecta el plásmido pXL3010 (figura 13) que codifica para fosfatasa alcalina en uno de los dos músculos tibio craneales de ratón adulto C57B1/6. El plásmido pXL3010 se deriva de ColEl en el cual se introduce el gen que codifica para la fosfatasa alcalina secretada (SeAP) a partir de pSEAP-básico (Clontech; acceso GenBank No. CVU09660) bajo el control del promotor CMV (pCDNA3 ; Invitrogen, Países Bajos) y la señal de poliadenilación de SV40. La aplicación del campo eléctrico se realiza bajo condiciones estándar, es decir, 8 pulsos cuadrados de 20 mseg de duración, frecuencia de 1 Hz y 200 V/cm aplicados 20 segundos después de la inyección del plásmido. La medición de la concentración de fosfatasa alcalina sérica en el suero sanguíneo se lleva a cabo 'en una muestra de sangre de ojo (perforación del plexo retroorbital) 7 días después utilizando un ensayo de quimioluminiscencia comercial (Phosphaligth, Tropix, Bedford, Massachusetts, Estados Unidos) . La inyección de algunos músculos sometidos o no al campo eléctrico con un plásmido no codificante (ADN de lastre) permite la verificación de la ausencia de fosfatasa alcalina sérica que no proviene de la expresión del transgen. El efecto de mejoría de la expresión del transgen por aplicación de un campo eléctrico bajo estas condiciones es evidente para las diversas cantidades de plásmidos inyectadas (tabla 11) . Es posible alcanzar concentraciones elevadas de suero de fosfatasa alcalina al incrementar la cantidad de plásmido inyectado. Esta ganancia en relación a una transfección convencional se mantiene durante un periodo prolongado después de la inyección en este experimento.

Tabla 11: Expresión de SeAP de músculo de ratón con y sin electrotransferencia .

El valor promedio de SeAP en suero + S.E.M., en ng/ml, se reporta en esta tabla. La inyección de 400 µg de plásmido (inyección de 100 µg de ADN en 54 µl bilateralmente y dos veces a intervalos de 30 minutos) proporciona una concentración sérica de 0.2 µg/ml de fosfatasa alcalina con electrotransferencia, en comparación con 0.016 µg para los controles. Además el uso de ADN de lastre, el cual hace posible trabajar con una cantidad constante de ADN sin importar la cantidad de plásmido (un total de 10 µg de ADN por ratón) mejora adicionalmente los niveles de electrotransfección para una cantidad pequeña de plásmido pXL3010 (< 1 µg) . También se siguió la expresión de la cinética de SeAP. En esta caso, la dosis de ADN fue de 15 µg que se inyectó por músculo bilateralmente (30 µg por ratón) . Los resultados se presentan en la figura 9. Uno observa que, 7 días después de la transfección, se tiene como resultado una concentración significativa y estable (por lo menos 2 meses) de concentración de SeAP de la electrotransferencia de pXL3010. Estos resultados confirman que la transferencia de ácidos nucleicos en el músculo utilizando el aparato de la invención permite la expresión de niveles elevados y estables de un transgen secretado. Por lo tanto, es posible utilizar el músculo como un órgano para la producción de una proteína secretada de interés, así como para la expresión directa de un gen terapéutico que actúa directamente sobre el músculo mismo (tal como el gen distrofina o un factor angiogénico) .

EJEMPLO 21: ELECTROTRANSFERENCIA DE UN GEN DE ERITROPOYETINA Este ejemplo demuestra que se puede transferir un gen terapéutico al músculo utilizando el aparato de la invención, y que la expresión del producto del gen produce una respuesta fisiológica detectable y significativa. En este caso, se puede detectar la expresión de eritropoyetina y la proteína expresada induce un incremento en el hematocripto del animal receptor. Se inyectó a ratones C57B1/6 en el músculo tibial craneal unilateralmente con el plásmido pXL3348 (figura 16) , que comprende el gen que codifica para eritropoyetina. El plásmido XPL3348 se deriva del plásmido pXL2774 al introducir el gen de eritropoyetina murino (NCBI : 193086) bajo el control del promotor CMV-IE humano y la señal de poliadenilación SV40. Se aplica el campo eléctrico (200 V/cm, 8 pulsos de 20 mseg de duración, frecuencia de 1 Hz) inmediatamente después de la inyección del plásmido. En la tabla 12 se presenta el resultado de este experimento .

Tabla 12: expresión y su efecto de eritropoyetina.

Valor promedio + S.E.M.; N = 4 a 5 ratones por grupo. En D24, la inyección de 1 µg de plásmido se asocia con un incremento moderado de hematocripto para ratones transfectados convencionalmente y es muy elevado para los ratones electrotransfectados . Con 10 µg de plásmido, el hematocripto se incrementa para el grupo control . Para grupos electrotransfectados, el hematocripto es claramente mayor, con menos varianza. Se observan resultados similares con una cantidad menor de ADN (1 µg) .

EJEMPLO 22: ELECTROTRANSFERENCIA DEL GEN PARA VEGF (FACTOR DE CRECIMIENTO ENDOTELIAL VASCULAR) Se inyectan ratones C57B1/6 o SCID en el músculo tibio craneal bilateralmente con 15 µg de plásmido pXL3212 (figura 11) , un plásmido pCOR hVEGF que codifica para VEGF. El plásmido pXL32l2 se deriva del plásmido pXL2774 al introducir el ADNC que codifica para VEGF (GenBank No. de acceso HUMEGFAA) bajo el control del promotor CMV-IE humano y la señal de poliadenilación SV40. La electrotransfección se lleva a cabo utilizando un electropulsor comercial (Jouan) a una velocidad de 8 pulsos de 20 mseg de duración, 200 V/cm, a una frecuencia de 2 Hz. Se toman muestras de sangre del plexo recto orbital en tubos secos. Las muestras de sangre se toman un día antes y 7 días después de la inyección del plásmido. Se realiza la cuantificación inmunoenzimática de VEGF humano utilizando el equipo Quantikine (R&D System) . Se realiza una serie suplementaria de VEGF humano en suero de ratones . En la tabla 13 se muestra el resultado de esta serie.

Tabla 13: Expresión de VEGF humano en suero de ratón.

Concentración sérica (ng/litro) de VEGF en ratones C57B1/6 y SCID. El suero de los ratones control se obtiene de ratones un día antes de la inyección del plásmido.

EJEMPLO 23: ELECTROTRANSFECCION DE UN GEN PARA EL FACTOR IX DE COAGULACIÓN Las condiciones experimentales fueron las mismas que las del ejemplo 22, excepto que se inyectan 15 µg del plásmido pCOR hFIX que codifica para el factor IX de la coagulación (pXL3388, figura 12) por músculo en ratones C57BL6 o SCID. El plásmido pXL3388 se deriva del plásmido pXL2774 al introducir el ADNC que codifica para el factor IX humano (factor Chrismas, GenBank acceso no. HUMFIXA) bajo el control del promotor CMV-IE y la señal de poliadenilación de SV40. Las condiciones de electrotransferencia fueron las siguientes: 8 pulsos de 20 mseg de duración a 200 V/cm, frecuencia de 2 Hz . Se miden los niveles de factor IX 7 días después de la inyección del plásmido. Se toman muestras de sangre del plexo retroorbital en tubos que contienen citrato trisódico y los tubos se almacenan en hielo. La siguiente tabla (tabla 14) muestra que el factor IX humano se encuentra únicamente en la sangre de ratones C57BL6 y SCID cuyos músculos tibio craneales se inyectaron con el plásmido pXL3388 y se sometieron a la aplicación de un campo eléctrico utilizando un aparato de electrotransferencia de la invención.

Tabla 14: Expresión de factor IX humano Concentración del factor IX en ratones C57B1/6 y SCID. El factor IX humano no es detectable en sangre de ratones en ausencia del uso de un aparato de electrotransferencia de la invención.

EJEMPLO 24: ELECTROTRANSFERENCIA DE UN GEN PARA EL FACTOR DE CRECIMIENTO DE FIBROBLASTOS ÁCIDO (aFGF) Las condiciones experimentales son similares a las del ejemplo 22, excepto por el hecho de que se inyectan 15 µg del plásmido que codifica para FGF, pCor CMV a FGF (pXL3096; figura 14) por músculo, en ratones C57BL6 o SCID. El plásmido pXL3096 se deriva del plásmido pXL2774 por introducción de una secuencia formadora de triple hélice (TH; Wils et al . , 1997, Gene Ther. 4:323-330) en la cual el gen codifica para una fusión entre el péptido señal de interferón de fibroblasto humano y el ADNC que codifica para FGFl (sp-FGFl; Jouanneau et al . , supra) bajo el control del promotor CMV-IE, seguido por la secuencia líder no traducida, transcrita de timidina cinasa de HSV y la secuencia de señal poliadenilación SV40. Se utilizaron las siguientes condiciones de electrotransferencia: 8 pulsos de 20 mseg de duración, 200 V/cm, frecuencia de 2 Hz . La presencia de FGF se demostró por inmunohistoquímica.

Los resultados para la transfección de ratones C57B1/6 se muestran en la figura 10, y el resultado de los ratones SCID se muestran en la tabla 15. El número de fibras que expresan FGF en secciones seleccionadas aleatoriamente es siempre claramente superior para los músculos electrotransfectados que para los músculos control, los cuales únicamente recibieron una inyección del plásmido pXL3096 sólo. La expresión de FGF después de electrotransfección alcanzó un máximo a D8. En D21 y D35, la presencia de FGF para los grupos control es virtualmente indetectable mientras que se observan una gran cantidad de fibras positivas en los grupos electrotransfectados .

Tabla 15: Expresión de aFGF en ratones SCID El número de fibras aFGF positivas, detectadas por inmunohistoquímica, en una sección de músculo, se determinaron para ratones individuales . Las secciones de músculos se obtuvieron de la parte media del músculo. La expresión de aFGF, determinada por el número de fibras positivas, revelada por inmunohistoquímica, se detecta casi exclusivamente en ratones que han recibido tratamiento con un aparato de electrotransferencia. Además, la expresión de aFGF fue detectable a una dosis más baja de ADN así como a una dosis más alta.

EJEMPLO 25: ELECTRQTRANSFERENCIA DE UN GEN PARA FACTOR NEUROTRÓFICO (NT3) Se inyectó unilateralmente a ratones de 5 semanas edad C57B1/6 y ratones XtXpmn, en el músculo tibio craneal c 12.5 µg del plásmido pXL3149 (figura 14) la cual codifica pa el factor neurotrófico NT3. Los ratones pmn son un modelo pa esclerosis lateral amiotrófica (ALS; enfermedad de Lou Gehi caracterizada por una degeneración temprana y rápida de l neuronas motoras por una esperanza de vida promedio aproximadamente 40 días. El plásmido pXL3149 se deriva d plásmido pXL2774 por introducción en el gen NT3 murino (GenBa acceso no. MMNT3) bajo el control del promotor CMV-IE huma y la señal de poliadenilación SV40. Se estudia la expresión NT3 en el sobrenadante preparado por centrifugación (12,000 g) del músculo molido en amortiguador PBS 7 días después d tratamiento del ratón, y se cuantifica por un ensayo ELI (Promega Kit) . Con los ratones C57B1/6 que recibieron inyeccion de 12.5 µg del ADN plasmídico. La mitad de los ratones sometieron a un campo eléctrico (250 V/cm con 4 pulsos de ms a una frecuencia de 1 Hz) inmediatamente después de inyección. Los intervalos de confianza al 95% respectivos calculan para un promedio de 20 músculos y son de 77 + pg/músculo cuando no hay electrotransferencia, y de 2.7 + 0. ng/músculo con electrotransferencia. No se determinó el nivel endógeno de NT3. Se encontraron datos similares para la expresión de NT3 en ratones heterocigotos XtXpmn de 4 ó 5 días de edad. Estos ratones recibieron inyecciones de 130 µg de ADN por animal después de inyección en sitios múltiples, en diferentes músculos (gastrocnemien, 25 µg; músculo tibio craneal, 12.5 µg) . Se utilizaron las siguientes condiciones de electrotransferencia: 4 pulsos de 20 ms de duración, 500 V/cm, 1 Hz. Se detectó NT3 en estos ratones 7 días después de la administración del plásmido y la aplicación del campo eléctrico. En la tabla 16 se presentan los resultados de este experimento .

Tabla 16: Expresión de NT3 en ratones XtXpmn Valores promedio de NT3 + S.E.M. (pg por músculo o pg/nl de plasma) . Bajos las condiciones experimentales probadas aquí, se detecta un nivel basal de NT3 en los músculos gastrocnemiem y tibial craneal. Bajo condiciones estándar de transferencia de ADN, la inyección del plásmido pXL3149 incrementa el nivel de la expresión de NT3. Cuando se utiliza el aparato de la invención, se observa un incremento muy grande en la cantidad de NT3 en el tejido y en plasma. Por lo tanto, para cualquier cantidad de plásmido de ADN que se administre, la utilización de un aparato de la invención para incrementar la eficiencia de transfección aumenta en gran medida en la cantidad de producto transgénico expresado, tanto en músculo como en plasma. Este incremento es especialmente importante para la expresión de NT3, para obtener una terapia de gen neurotrófico.

EJEMPLO 26: ELECTRQTRANSFERENCIA DE UN GEN DE HORMONA DEL CRECIMIENTO HUMANA Ratones C57B1/6 recibieron una inyección de plásmido pXL3353 (figura 15) o plásmido pXL3354 (figura 15) (10 µg) unilateralmente en el músculo tibial craneal . El plásmido pXL13353 se deriva del plásmido pXL2774 por introducción de un gen de hormona de crecimiento humano genómico (fragmento Xbal/Sph de hGH que se extiende desde la señal de inicio de transcripción al sitio BamHI, el cual es 224 pares de bases desde la señal de poliadenilación) bajo el control del promotor CMV-IE humano y la señal de poliadenilación SV40. Se obtiene el ADNC para hGH por transfección inversa a partir de la biblioteca de ARNM en la- ipófisis humana después de 30 ciclos de amplificación utilizando los siguientes cebadores: 5' oligo complementario: 5 ' -GGGTCTAGAGCCACCATGGCTACAGGCTCCCGGAC-3 ' Este oligonucleótido contiene una secuencia kozak Xbal 3' oligonucleótido complementario: 5 ' -GGGATGCATTTACTAGAAGCCACAGCTGCCTC-3 ' Este oligonucleótido contiene un sitio Nsil y el codón de detención.

El fragmento amplificado se clona en el plásmido pCR2.1 (TA Cloning Kit, Invitrogen) y se secuencia. Un fragmento Xbal/Nsil de 681 pares de bases que contiene el ADNC hGH se libra con el fragmento Xbal/Nsil de pSL3353 para el generar el plásmido pXL3354. Las condiciones de electrotransferencia fueron como sigue: 200 V/cm,- 8 pulsos de 20 mseg de duración,- frecuencia de l Hz . El campo eléctrico se aplica inmediatamente después de la inyección de ADN plasmídico. Se detectó la presencia de hGH 7 días después del tratamiento de los ratones en sobrenadante de músculo triturado en PBS amortiguado después de centrifugación a 12,000 x.g. La cantidad de hGH se mide por ELISA (Boehringer Manheim) . Los resultados de este experimento se presentan en la tabla 17.

Tabla 17: Expresión de la hormona de crecimiento humana Valor promedio de expresión de hGH (picogramo/músculo) + S.E.M. Estos resultados muestran que el uso del aparato de electrotransferencia de la invención permite una expresión mucho más elevada de la hormona del crecimiento humana. Este incremento en la expresión se observa ya sea que se administre ADNC de clona genómica o que codifica para hGH.

EJEMPLO 27: ELECTROTRANSFERENCIA DE TRANSGENES DE VACUNA Este ejemplo presenta- un aparato para electrotransferencia de la invención que mejora el suministro de genes para la vacunación por genes (o por ADN) . En este ejemplo, se utilizan los siguientes productos: VR-HA, un ADN plasmídico que incluye el gen de hemaglutinación del virus de gripe (cepa A/PR/8/34) . El plásmido mVRgBDT es un ADN plasmídico que incluye el gen de la glicoproteína B (gB) del citomegalovirus humano (cepa Towne) . Los otros productos están disponibles de proveedores comerciales: ketamina, xilazine y solución fisiológica de cloruro de sodio (NaCl 0.9%). El experimento se realiza en ratones Balb/c hembra de 9 semanas de edad. Los ratones que se originan en jaulas diferentes se distribuyeron aleatoriamente antes del experimento (aleatorización) . Se utilizó un osciloscopio y un generador comercial de pulsos eléctricos (rectangulares o cuadrados) (Electropulser PS 15, Jouan, Francia) . Los electrodos utilizados fueron electrodos planos de acero inoxidable separados 5 mm. Los ratones fueron anestesiados utilizando una mezcla de ketamina y xilazine. La solución de plásmido (50 µl de una solución a 20 µg/ml o 200 µg/ml en NaCl 0.9%) y se inyecta longitudinalmente a través de la piel en el músculo tibial craneal de la pata izquierda utilizando una jeringa Hamilton. Los dos electrodos se recubren con un gel conductor y la pata inyectada se coloca entre los electrodos en contacto con los mismos. Los pulsos eléctricos se aplican perpendicularmente al eje del músculo utilizando un generador de pulsos cuadrados, 20 segundos después de la inyección. Un osciloscopio permite el monitoreo del campo eléctrico: 200 V/cm, duración de 20 ms, frecuencia de 1 Hz por 8 pulsos consecutivos. Para la evaluación de la estimulación de la respuesta inmune, se sigue el siguiente protocolo de inmunización: D 0 se toma una muestra de suero preinmune D 1 primera inyección, con sin electrotransferencia D 21 se toma muestra de suero inmune D 22 inyección de refuerzo, con sin electrotransferencia D 42 se toma muestra de suero inmune D 63 se toma muestra de suero inmune Las muestras de suero sanguíneo se toman del seno retroorbital . Las cantidades de anticuerpos específicos se determinan por ELISA. Se prueba cada condición experimental en 10 puntos utilizando 10 animales inyectados unilateralmente. Los resultados de título de anticuerpo dirigidos contra hemaglutinina de gripe se presentan en la tabla 18.

Tabla 18 : Respuesta de anticuerpos de hemaglutinina contra gripe Título de anticuerpo dirigidos contra hemaglutinina de gripo, obtenido después de inyección o 1 ó 10 µg de ADN VR-HA en ausencia (-) o presencia (+) de un campo eléctrico proporcionado por un aparato de electrotransferencia. Los resultados son el promedio geométrico de 10 animales por grupo (N = 8 por el grupo inyectado con 1 µg de ADN, y expuestos a campo eléctrico, y probados a D63) + error estándar. El valor (p) se obtiene por comparación dos por dos de los grupos inyectados con ADN, después tratados o no con el campo eléctrico utilizando la prueba no paramétrica de Mann-Whitney. Estos resultados muestran que el título de anticuerpo dirigido contra la hemaglutinina de gripe se incrementa notablemente, en aproximadamente un factor de 10, en el grupo tratado con el aparato de electrotransferencia. En realidad, los ratones que recibieron únicamente 1 µg del ADN, y que fueron tratados con el aparato de electrotransferencia, tienen un título mayor contra hemaglutinina que los ratones que recibieron 10 µg de ADN, pero que no fueron tratados con el campo eléctrico. Los resultados de la respuesta de anticuerpo dirigida contra glicoproteína B de CMV se presentan en la tabla 19.

Tabla 19: Respuesta de anticuerpo contra glicoproteína B de CMV.

Título de anticuerpo dirigidos contra glicoproteína B de CMV, obtenido después de inyección de 10 µg de ADN VR-gB en ausencia (-) o presencia (+) de un campo eléctrico que se proporciona por un aparato de electrotransferencia. Los resultados son el promedio geométrico de 10 animales por grupo (N = 9) para los expuestos al campo eléctrico) + error estándar. El valor (p) se obtiene por comparación dos por dos de los grupos inyectados con ADN, y después tratados o no con el campo eléctrico utilizando la prueba no paramétrica de Mann-Whitney. Estos resultados muestran que el título contra gB se incrementa por un factor de 4 al día 42 (D42) en el grupo tratado con un campo eléctrico, en comparación con el grupo control. Además, como se observa previamente, la variación (error estándar) se reduce en gran medida para ratones tratados con el aparato de electrotransferencia en comparación con los ratones no tratados (control) .

EJEMPLO 28: APARATO DE ELECTROTRANSFERENCIA PARA TRANSFECCION DE CÉLULAS TUMORALES El siguiente ejemplo ilustra el uso de un aparato de electrotransferencia para mejorar el suministro de ácidos nucleicos en un tejido tumoral. En particular, al modificar un aparato de electrotransferencia de la invención para proporcionar voltajes superiores que se prefieren para electrotransferencia de ácidos nucleicos en músculo, se puede llevar a cabo una electrotransfección deficiente de células tumorales (y la mayor parte de otras células) in vivo . Este ejemplo demuestra los efectos de electrotransferencia sobre diferentes tumores de origen humano o implantados en ratones atímicos (inmunodeficientes) o de origen murino implantados sobre ratones C57B1/6 (inmunocompetentes) . Se han demostrado los efectos de los pulsos de campo eléctrico de baja intensidad: A) en transfección de ADN plasmídico por inyección intratumoral, y B) por la secreción de una proteína codificada por un transgen en el plasma posterior a la inyección intratumoral .

MATERIALES Y MÉTODOS Se implantaron injertos de tumor en un lado de ratones atímicos o C57B1/6 hembras que pesan 18-20 g. Se implantaron en ratones atímicos tumores de carcinoma pulmonar humano (H1299) o adenocarcinoma de colon (HT29) de 20 mm3. Se implantaron células de fibrosarcoma murino (LBP) (106 células) , o tumores de melanoma (B16) o carcinoma de pulmón (3LL) (20 mm3) en ratones C57B1/6. Los ratones se clasificaron de acuerdo con el tamaño de sus tumores y se dividieron en lotes homogéneos . Los ratones fueron anestesiados con una mezcla de ketamina y xilazine. Se inyectó ya sea el plásmido pXL3031 (luciferasa citoplásmica) o pXL3010 (fosfatasa alcalina secretada) intratumoralmente después de que los tumores alcanzaron el volumen objetivo. Se inyectó longitudinalmente la solución de plásmido (40 µl de una solución 250 µg/ml de ADN en NaCl 20 mM, glucosa 5%) en el centro del tumor por medio de una jeringa Hamilton. Las superficies laterales del tumor se recubrieron con un gel conductor y se colocó el tumor entre dos electrodos. Se aplicaron pulsos eléctricos utilizando un generador de pulsos cuadrados, 20 a 30 segundos después de la inyección. Un osciloscopio controla la intensidad de voltaje, la duración en milisegundos y la frecuencia en Hertz de los 8 pulsos suministrados a 200 a 800 V/cm, 20 mseg y 1 Hz. Se utilizaron un osciloscopio y un generador de pulso eléctrico comercial (rectangular o cuadrado) (Electro-pulsateur PS 15, Jouan, Francia) . Los electrodos son electrodos de placa de acero de acero inoxidable separados por 0.45 a 0.7 cm. Para evaluar la transfección tumoral con luciferasa, se sacrificó a los ratones (generalmente 10 ratones por grupo experimental, dependiendo de las condiciones) dos días después de la inyección del plásmido. Los tumores se removieron, pesaron y trituraron en un amortiguador de lisis. La suspensión que se obtiene se centrifuga para obtener un sobrenadante transparente. Se mide la actividad de luciferasa en 10 µl de sobrenadante utilizando un luminómetro comercial en el cual se agrega automáticamente sustrato. Los resultados se expresan en RLU totales (unidades de luz relativas) por tumor. Se midieron los niveles plasmáticos de fosfatasa alcalina secretada (SeAP) como se describe en el ejemplo 20, supra, en los días 1, 2 y 8 (DI, D2, D8) después de la inyección del ADN.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Electrotransferencia en un tumor de carcinoma pulmonar humano . En un primer experimento, se utilizaron condiciones usadas generalmente para electrotransferencia de gen intramuscular: un campo eléctrico de 200 V/cm, 8 pulsos a una frecuencia de 1 Hz, y los resultados obtenidos se ocmparan con los obtenidos a voltajes más elevados que varían de 300 a 500 volts/cm. El propósito de un segundo experimento fue determinar las condiciones óptimas de voltaje que se deben aplicar para obtener una transfección máxima, o voltajes que varían de 400 a 800 volts/cm. En la tabla 20 se muestran los resultados.

Tabla 20: Electrotransferencia en un tumor de carcinoma de tumor humano Se inyecta el plásmido pXL303l en tumores de carcinoma de pulmón humano H1299 que han alcanzado el volumen objetivo de 200-300 mm3 en ratones atímicos hembra. Se reportan valores promedio de expresión de luciferasa con el SEM. De acuerdo con la tabla 20, se puede ver que en relación al grupo control, cuando se inyecta ADN sin aplicación subsecuente de un campo eléctrico: • se incrementa la transferencia de genes de una manera que es dependiente del voltaje aplicado de 200 a 400 volts/cm hasta que alcanza una meseta que corresponde a la transfección máxima obtenida, comenzando 500 volts/cm; a voltajes más elevados (600 y 800 volts/cm) , se obtienen quemaduras cutáneas o más profundas, respectivamente; sin embargo, no disminuye la expresión del transgen, la amplificacón de la transferencia de genes por electrotransferencia es del orden de 240 a 320 veces .

Electrotransferencia en un tumor de adenocarcinoma de colon humano . En la tabla 2 se ilustran los resultados de dos experimentos. En comparación con los grupos control sin electrotransferencia, la aplicación de un campo eléctrico con una intensidad de 600 volts/cm hace posible alcanzar una tasa óptima de transfección sin importar el nivel de transfección sin electrotransferencia. La transfección se mejora por un factor de 6 a 23 veces, respectivamente, y es relativamente similar a 400 a 600 volts/cm.

Tabla 21: Electrotransferencia en el tumor de adenocarcinoma de colon humano Se inyecta el plásmido pXL3031 en tumores de adenocarcinoma de colon humano HT29 que han alcanzado el volumen objetivo de 100-200 mm3 en ratones atímicos hembra. Se reportan los valores promedio de expresión de luciferasa con el SEM. La distancia entre electrodos en este experimento es de 0.45 cm. Electrotransferencia en un tumor de fibrosarcoma murino . En la tabla 22 se ilustran los resultados de dos experimentos. En comparación con los grupos control sin electrotransferencia, la aplicación de un campo eléctrico con una intensidad de 300 a 600 volts/cm mejora la transferencia de genes en un factor de 30 a 70 veces, sin importar el voltaje aplicado.

Tabla 22: Electrotransferencia en un tumor de fibrosarcoma murino Se inyecta el plásmido pXL3031 en tumores de fibrosarcoma LPB murinos que han alcanzado un volumen objetivo de 100-200 mm3 en ratones C57B1/6 hembra. Se reportan los valores promedio de expresión de luciferasa con el SEM. Electrotransferencia de tumores de melanoma murinos . Los resultados se ilustran en la tabla 23. En comparación con el grupo control sin electrotransferencia, la aplicación de un campo eléctrico con una intensidad de 500 volts/cm mejora la transferencia de genes en un factor de 24 veces .

Tabla 23: Electrotransferencia de tumores de melanoma murinos RLU/tumor Volt/cm Promedio SEM 0 1 318 740 667 588 300 14 275 486 7 625 262 500 32 249 218 12 605 041 600 17 215 505 6 241 666 Se inyecta el plásmido pXL3031 en tumores de melanoma B16 murino que a alcanzado el volumen objetivo de 200-300 mm3 en ratones C57B1/6 hembra. Se reportan valores promedio de expresión de luciferasa con el SEM. Electrotransferencia de un tumor de carcinoma de pulmón murino . Los resultados de este experimento se reportan en la tabla 24.

Tabla 24 : Electrotransferencia de un tumor de carcinoma de pulmón murino RLU/tumor Volt/cm Promedio SEM 0 121 080 37 322 300 3 715 877 2 936 873 500 470 499 612 237 588 443 600 53 275 350 23 857 181 Se inyecta el plásmido pXL3031 en tumores de carcinoma de pulmón 3LL murino que han alcanzado el volumen objetivo de 30 mm3 después de 5 días de crecimiento en ratones C57B1/6 hembra. Se reportan los valores promedio de expresión de luciferasa con la SEM. La aplicación de un campo eléctrico con una intensidad de 500 volts/cm mejora de manera óptima la transferencia de genes en un factor de 3885 veces. Estos resultados impresionantes se relacionan con el hecho de que estos tumores son muy poco transfectables por ADN desnudo bajo condiciones sin electrotransferencia, en comparación con los otros tumores que fueron probados previamente .

Electrotransferencia de un transgen tranef ectado en un tumor de carcinoma de pulmón humano . Los resultados de este experimento se muestran en la tabla 25.

Tabla 25 : Electrotransferencia de un transgen secretado en un tumor de carcinoma de pulmón humano El plásmido pXL3010 (que expresa SeAP) se inyecta en tumores de carcinoma de pulmón humano H1299 que han alcanzado el volumen objetivo de 200-300 mm3 en ratones atímicos hembra. Se reportan valores promedio de expresión de luciferasa con el SEM. Se aplica un sólo campo eléctrico de 500 V/cm, y el nivel de SeAP en el plasma detectado en los 1, 2 y 8 días después de la inyección del plásmido.

Los resultados de este experimento demuestran un incremento transitorio y notable en el nivel de SeAP en el plasma después de la transfección de células tumorales bajo condiciones de electrotransferencia. La administración de un gen inmunoestimulador, tal como GM-CSF o IL-2, a tumores es probable que proporcione una cantidad efectiva de producción de citocina. Además, estos datos, en combinación con los datos de expresión de luciferasa reportados antes, sugieren que la administración de una citocina secretada con un gen suicida, tal como timidina cinasa de HSV, puede resultar en una respuesta antitumoral robusta. Alternativamente, los datos con SeAP sugieren que la transfección mediada por electrotransferencia con un gen contra angiogénesis, tal como el fragmento aminoterminal de urocinasa (ATF) o angiostatina (o endostastina) también pueden ser una terapia de genes tumorales efectiva. Los datos demuestran además que un aparato para electrotransferencia de genes terapéuticos en células tumorales proporciona una fuerza de campo eléctrico óptima de entre 400 y 600 volts/cm, con un óptimo probable de 500 V/cm + 10% (es decir, 450, 550 V/cm) . La presente invención no se limita en alcance por la modalidades específicas descritas en la presente. En realidad, varias modificaciones de la invención, además de las descritas en la presente, se volverán evidentes para aquellos familiarizados en la técnica a partir de la descripción precedente y de las figuras anexas . Tales modificaciones están diseñadas para caer dentro del alcance de las reivindicaciones anexas . Se debe entender además que todos los tamaños de base o los tamaños de aminoácidos, y el peso molecular o los valores de masa molecular, dados para los ácidos nucleicos o polipéptidos, son aproximados y se proporcionan con fines de descripción. Respecto a las diversas publicaciones que se mencionan en la presente, sus descripciones se incorporan como referencia en su totalidad. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el convencional para la manufactura de los objetos o productos a que la misma se refiere.

Claims

RE VINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

l. Un sistema para transferencia in vivo de ácido nucleico en células de organismos eucarióticos multicelulares, en el cual las células de tejido se ponen en contacto con el ácido nucleico que se va a transferir por administración directa en el tejido o por administración tópica o sistémica, y transferencia la cual se asegura por aplicación al tejido de uno o más pulsos eléctricos de intensidad que varía entre 1 y 600 volts/cm, caracterizado porque comprende: a) un generador de pulsos eléctricos, en donde el generador de pulsos eléctricos produce pulsos eléctricos con tiempos de pulso de más de 1 milisegundo y de intensidad que varía de entre 1 y 600 volts/cm a una frecuencia de entre 0.1 y 1000 Hz; y b) electrodos conectados al generador de pulsos eléctricos para generar un campo eléctrico en un tejido en contacto con los electrodos.
2. El sistema de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el generador de pulsos eléctricos produce pulsos de intensidad que varía entre 1 y 400 volts/cm.
3. El sistema de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el generador de pulsos eléctricos produce un pulso de intensidad que varía entre 30 y 300 volts/cm.
4. El sistema de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el generador de pulsos eléctricos produce tiempos de pulsos mayores de 10 milisegundos.
5. El sistema de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el generador de pulsos eléctricos produce entre 2 y 1000 pulsos.
6. El sistema de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el generador de pulsos eléctricos produce pulsos irregularmente uno en relación al otro, por lo que una función que describe la intensidad del campo dependiente del tiempo de un pulso es variable.
7. El sistema de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la integral de la función que describe la variación del campo eléctrico con respecto al tiempo de 1 kV -mseg/cm.
8 . El sistema de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la integral excede o es igual a 5 kV -mseg/cm.
9. El sistema de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el generador de pulsos eléctricos produce pulsos que se seleccionan del grupo que consiste de pulsos de onda cuadrada, pulsos de decaimiento exponencial, ondas unipolares oscilantes de duración limitada y ondas bipolares oscilantes de duración limitada.
10. El sistema de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el generador de pulsos eléctricos produce pulsos de onda cuadrada.
11. El sistema de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque un electrodo es un electrodo externo para colocación sobre un tejido que va a ser tratado.
12. El sistema de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque un electrodo es un electrodo interno implantado en un tejido que va a ser tratado.
13. El sistema de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque un electrodo es un electrodo externo para colocación sobre un tejido que va a ser tratado, y un electrodo es un electrodo interno implantable en el tejido que va a ser tratado.
14. El sistema de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el electrodo externo está dimensionado para hacer contacto con una porción externa del cuerpo del sujeto en proximidad cercana a un músculo grande.
15. El sistema de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el electrodo es un electrodo de placa plana .
16. El sistema de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el electrodo es un electrodo de placa se icilíndrica .
17. El sistema de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque un electrodo es un electrodo intraarterial o intravenoso .
18. El sistema de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el electrodo interno es un sistema inyector que hace posible la administración simultánea de ácidos nucleicos y del campo eléctrico.
19. El sistema de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque un electrodo es un electrodo externo para colocación sobre el tejido que se va a tratar.
20. El sistema de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el electrodo es un electrodo de acero inoxidab1e .
21. Un aparato mejorado para transferencia in vivo de ácido nucleico al interior de células de organismos eucarióticos multicelulares, en donde el aparato comprende un método para generar un pulso eléctrico conectado a los electrodos para generar un campo eléctrico en un tejido in vivo, en donde la mejora comprende adaptar el medio para generar un pulso eléctrico para producir tiempos de pulsos de más de 1 milisegundo y de intensidad que varía entre 1 y 600 volts/cm a una frecuencia entre 0.1 y 1000 Hz .
22. El aparato de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el medio para generar un pulso eléctrico genera pulsos de intensidad que varían entre 1 y 400 volts/cm.
23. El aparato de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque es un aparato de catéter flexible.
24. El aparato de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque es un aparato para implantar ácidos nucleicos dentro de tejido por un electrodo de penetración de tejido.
25. El aparato de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el electrodo de penetración de tejido es una aguja.
26. El aparato de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque es un aparato para transferir ácidos nucleicos dentro de la célula de un tejido de superficie de un sujeto.
27. El aparato de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el medio para generar un pulso eléctrico está adaptado para producir pulsos que varían entre 1 y 600 volts/cm al modificar la compuerta de voltaje para que no exceda un voltaje que corresponde a 600 volts/cm.
28. El aparato de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el voltaje se establece a un voltaje constante y los electrodos se establecen "a una distancia de separación constante.
29. El aparato de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el medio para generar un pulso eléctrico está adaptado para producir pulsos que varían entre 1 y 600 volts/cm al marcar el dispositivo que no excede un voltaje que corresponde a 600 volts/cm.
30. El aparato de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el medio para producir un impulso eléctrico produce pulsos de intensidad que varían entre 30 y 300 volts/cm.
31. El aparato de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el medio para producir un pulso eléctrico produce un pulso de intensidad que varía de entre 400 y 600 volts/cm.
32. El aparato de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el medio para producir un pulso eléctrico produce tiempos de pulso de más de 10 milisegundos.
33. El aparato de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el medio para producir un pulso eléctrico produce entre 2 y 1000 pulsos.
34. El aparato de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el medio para producir un pulso eléctrico produce pulsos irregularmente uno en relación al otro, por lo que la función que describe la intensidad del campo dependiente del tiempo de un pulso es variable.
35. El aparato de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el medio para producir un pulso eléctrico produce pulsos que se seleccionan del grupo que consiste de pulsos de onda cuadrada, ondas de decaimiento exponencial, ondas unipolares oscilantes de duración limitada y ondas bipolares oscilantes de duración limitada.
36. El aparato de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el medio para producir un pulso eléctrico produce pulsos de onda cuadrada.
37. El aparato de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el electrodo es un electrodo de acero 'inoxidable.