JP5976652B2 - 髄膜炎菌ｏｒｆ２０８６抗原の非脂質化変異体 - Google Patents

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Description

本願は、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる、２０１０年９月１０日に出願された米国仮出願番号第６１／３８１，８３７号に対する優先権を主張する。
本発明は、本明細書において記載される免疫原性組成物における髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ＯＲＦ２０８６抗原の非脂質化変異体に関する。本発明はまた、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ＯＲＦ２０８６抗原の非脂質化変異体の立体構造を保存する方法に関する。本発明はさらに、対応する野生型抗原と比較した、非脂質化髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ＯＲＦ２０８６抗原の向上した発現に関する、組成物および方法を含む。
ｒＬＰ２０８６は、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清型Ｂ（ＭｎＢ）株、またはより正確には血清群Ｂ（ＭｎＢ）株を含む多くの髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）株に対する交差反応性の細菌抗体を含む、組換えの２８ｋＤａのリポタンパク質である。推定アミノ酸配列の相同性に基づいて、ＡおよびＢという、２つの異なるｒＬＰ２０８６サブファミリーが同定された。これらの２つのサブファミリーは、様々なレベルのポリソルベート８０（ＰＳ−８０）を有する、１０ｍＭのヒスチジン（ｐＨ６．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および０．５ｍｇ／ｍＬのアルミニウム内にそれぞれ２０、６０、１２０、および２００μｇ／ｍＬを含有する、ＭｎＢ−ｒＬＰ２０８６ワクチン試料の製剤において用いられた。天然ＬＰ２０８６は、リポタンパク質である。Ｆｌｅｔｃｈｅｒら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ＆Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．ｖｏｌ．７２（４）：２０８８〜２１００（２００４）は、アミノ末端脂質を有するｒＬＰ２０８６が、マウスにおいて、同一のタンパク質の非脂質化型よりも免疫原性であることを示した。さらなる前臨床的研究および臨床的研究は、これらの２つの脂質化タンパク質の組み合わせがｆＨＢＰファミリーの広い適用範囲を提供することを示している。髄膜炎菌性髄膜炎は、抗生物質が利用できるにも関わらず、子供および若年成人を数時間以内に死に至らしめ得る破壊的な疾患である。適切な血清群Ｂの髄膜炎菌性の免疫原性組成物に対する要求が依然として存在する。
髄膜炎菌ワクチンに対するこれらのおよび他の要求を満たすために、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ＯＲＦ２０８６ポリペプチドの非脂質化変異体を用いるための適用範囲を提供するために、さらなる組成物を評価した。本発明の第１の態様は、非脂質化ＯＲＦ２０８６タンパク質を含む免疫原性組成物を提供し、ＯＲＦ２０８６タンパク質は、Ｂ４４変異体、Ｂ０２変異体、Ｂ０３変異体、Ｂ２２変異体、Ｂ２４変異体、Ｂ０９変異体、Ａ０５変異体、Ａ０４変異体、Ａ１２変異体、またはＡ２２変異体である。一部の実施形態において、ＯＲＦ２０８６タンパク質は、Ｂ４４変異体、Ｂ２２変異体、Ｂ０９変異体、Ａ０５変異体、Ａ１２変異体、またはＡ２２変異体である。
本発明の別の態様は、非脂質化ＯＲＦ２０８６タンパク質サブファミリーＢ変異体（Ｐ２０８６サブファミリーＢポリペプチド）を含む免疫原性組成物を提供する。一部の実施形態において、Ｐ２０８６サブファミリーＢポリペプチドは、Ｂ４４変異体、Ｂ０２変異体、Ｂ０３変異体、Ｂ２２変異体、Ｂ２４変異体、またはＢ０９変異体である。一部の実施形態において、免疫原性組成物は、非脂質化ＯＲＦ２０８６タンパク質サブファミリーＡ変異体（Ｐ２０８６サブファミリーＡポリペプチド）をさらに含む。一部の実施形態において、Ｐ２０８６サブファミリーＡポリペプチドは、Ａ０５変異体、Ａ０４変異体、Ａ１２変異体、またはＡ２２変異体である。
一部の実施形態において、免疫原性組成物はさらに、アジュバントを含む。一部の実施形態において、アジュバントは、アルミニウムアジュバント、サポニン、ＣｐＧヌクレオチド配列、またはそのあらゆる組み合わせである。一部の実施形態において、アルミニウムアジュバントは、ＡｌＰＯ４、Ａｌ（ＯＨ）３、Ａｌ２（ＳＯ４）３、またはミョウバンである。一部の実施形態において、免疫原性組成物におけるアルミニウムの濃度は、０．１２５μｇ／ｍｌと０．５μｇ／ｍｌとの間である。一部の実施形態において、免疫原性組成物におけるアルミニウムの濃度は、０．２５μｇ／ｍｌである。好ましい実施形態において、免疫原性組成物におけるアルミニウムの濃度は、０．１２５ｍｇ／ｍｌと０．５ｍｇ／ｍｌとの間である。一部の好ましい実施形態において、免疫原性組成物におけるアルミニウムの濃度は、０．２５ｍｇ／ｍｌである。
一部の実施形態において、免疫原性組成物におけるサポニンの濃度は、１μｇ／ｍｌと２５０μｇ／ｍｌとの間である。一部の実施形態において、免疫原性組成物におけるサポニンの濃度は、１０μｇ／ｍｌと１００μｇ／ｍｌとの間である。一部の実施形態において、免疫原性組成物におけるサポニンの濃度は、１０μｇ／ｍｌである。一部の実施形態において、免疫原性組成物におけるサポニンの濃度は、１００μｇ／ｍｌである。一部の実施形態において、サポニンは、ＱＳ−２１ Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（登録商標）（Ａｇｅｎｕｓ、Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）またはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）（ＣＳＬ Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）である。
一部の実施形態において、免疫原性組成物は、複数回用量の免疫原性組成物を対象に投与した後に、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に対する免疫原性応答を生じさせる能力を付与する。一部の実施形態において、免疫原性応答は、２回用量を対象に投与した後に付与される。一部の実施形態において、免疫原性応答は、３回用量を対象に投与した後に付与される。
本発明の別の態様は、非脂質化Ｐ２０８６抗原の免疫原性を増大させる組成物を提供し、組成物は、サポニンおよび少なくとも１つの非脂質化Ｐ２０８６抗原を含む。一部の実施形態において、免疫原性組成物におけるサポニンの濃度は、１μｇ／ｍｌと２５０μｇ／ｍｌとの間である。一部の実施形態において、免疫原性組成物におけるサポニンの濃度は、１０μｇ／ｍｌと１００μｇ／ｍｌとの間である。一部の実施形態において、免疫原性組成物におけるサポニンの濃度は、１０μｇ／ｍｌである。一部の実施形態において、免疫原性組成物におけるサポニンの濃度は、１００μｇ／ｍｌである。一部の実施形態において、サポニンは、ＱＳ−２１またはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸである。
一部の実施形態において、組成物はさらに、アルミニウムを含む。一部の実施形態において、アルミニウムは、ＡｌＰＯ４、Ａｌ（ＯＨ）３、Ａｌ２（ＳＯ４）３、またはミョウバンとして存在する。一部の実施形態において、組成物におけるアルミニウムの濃度は、０．１２５μｇ／ｍｌと０．５μｇ／ｍｌとの間である。一部の実施形態において、組成物におけるアルミニウムの濃度は、０．２５μｇ／ｍｌである。好ましい実施形態において、組成物におけるアルミニウムの濃度は、０．１２５ｍｇ／ｍｌと０．５ｍｇ／ｍｌとの間である。一部の好ましい実施形態において、組成物におけるアルミニウムの濃度は、０．２５ｍｇ／ｍｌである。
一部の実施形態において、免疫原性組成物は、複数回用量の免疫原性組成物を対象に投与した後に、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に対する免疫原性応答を生じさせる能力を付与する。一部の実施形態において、免疫原性応答は、２回用量を対象に投与した後に付与される。一部の実施形態において、免疫原性応答は、３回用量を対象に投与した後に付与される。
一部の実施形態において、非脂質化Ｐ２０８６抗原は、Ｐ２０８６サブファミリーＢポリペプチドである。一部の実施形態において、Ｐ２０８６サブファミリーＢポリペプチドは、Ｂ４４変異体、Ｂ０２変異体、Ｂ０３変異体、Ｂ２２変異体、Ｂ２４変異体、またはＢ０９変異体である。一部の実施形態において、非脂質化Ｐ２０８６抗原は、Ｐ２０８６サブファミリーＡポリペプチドである。一部の実施形態において、Ｐ２０８６サブファミリーＡポリペプチドは、Ａ０５変異体、Ａ０４変異体、Ａ１２変異体、またはＡ２２変異体である。
一部の実施形態において、組成物は、少なくとも２つの非脂質化Ｐ２０８６抗原を含み、この２つの非脂質化Ｐ２０８６抗原は、少なくとも１つの非脂質化Ｐ２０８６サブファミリーＡポリペプチドおよび少なくとも１つの非脂質化Ｐ２０８６サブファミリーＢポリペプチドである。一部の実施形態において、非脂質化Ｐ２０８６サブファミリーＡポリペプチドはＡ０５変異体であり、非脂質化Ｐ２０８６サブファミリーＢポリペプチドはＢ４４変異体である。一部の実施形態において、非脂質化Ｐ２０８６サブファミリーＡポリペプチドはＡ０５変異体であり、非脂質化Ｐ２０８６サブファミリーＢポリペプチドはＢ２２変異体である。一部の実施形態において、非脂質化Ｐ２０８６サブファミリーＡポリペプチドはＡ０５変異体であり、非脂質化Ｐ２０８６サブファミリーＢポリペプチドはＢ０９変異体である。
本発明の別の態様は、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）細菌に対して対象に免疫を付与するための方法を提供し、この方法は、非脂質化Ｐ２０８６サブファミリーＢポリペプチドを含む免疫原性組成物を対象に投与するステップを含む。一部の実施形態において、Ｐ２０８６サブファミリーＢポリペプチドは、Ｂ４４変異体、Ｂ０２変異体、Ｂ０３変異体、Ｂ２２変異体、Ｂ２４変異体、またはＢ０９変異体である。一部の実施形態において、免疫原性組成物はさらに、Ｐ２０８６サブファミリーＡポリペプチドを含む。一部の実施形態において、Ｐ２０８６サブファミリーＡポリペプチドは、Ａ０５変異体、Ａ０４変異体、Ａ１２変異体、またはＡ２２変異体である。
一部の実施形態において、免疫原性組成物はさらに、アジュバントを含む。一部の実施形態において、アジュバントは、アルミニウムアジュバント、サポニン、ＣｐＧヌクレオチド配列、またはそのあらゆる組み合わせである。一部の実施形態において、アルミニウムアジュバントは、ＡｌＰＯ４、Ａｌ（ＯＨ）３、Ａｌ２（ＳＯ４）３、またはミョウバンである。一部の実施形態において、免疫原性組成物におけるアルミニウムの濃度は、０．１２５μｇ／ｍｌと０．５μｇ／ｍｌとの間である。一部の実施形態において、免疫原性組成物におけるアルミニウムの濃度は、０．２５μｇ／ｍｌである。好ましい実施形態において、免疫原性組成物におけるアルミニウムの濃度は、０．１２５ｍｇ／ｍｌと０．５ｍｇ／ｍｌとの間である。一部の実施形態において、免疫原性組成物におけるアルミニウムの濃度は、０．２５ｍｇ／ｍｌである。
一部の実施形態において、免疫原性組成物におけるサポニンの濃度は、１μｇ／ｍｌと２５０μｇ／ｍｌとの間である。一部の実施形態において、免疫原性組成物におけるサポニンの濃度は、１０μｇ／ｍｌと１００μｇ／ｍｌとの間である。一部の実施形態において、免疫原性組成物におけるサポニンの濃度は、１０μｇ／ｍｌである。一部の実施形態において、免疫原性組成物におけるサポニンの濃度は、１００μｇ／ｍｌである。一部の実施形態において、サポニンは、ＱＳ−２１またはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸである。
一部の実施形態において、免疫原性組成物は、投与スケジュールを通して複数回用量で対象に投与される。一部の実施形態において、免疫原性組成物は、投与スケジュールを通して２回用量で対象に投与される。一部の実施形態において、免疫原性組成物は、投与スケジュールを通して３回用量で投与される。
本発明の別の態様は、（ａ）ＯＲＦ２０８６変異体の核酸を発現ベクター内にクローニングして、ＯＲＦ２０８６発現ベクターを生成するステップ、（ｂ）細菌をＯＦＲ２０８６発現ベクターで形質転換するステップ、（ｃ）ＯＲＦ２０８６発現ベクターからのＰ２０８６変異体の発現を誘発するステップ、および（ｄ）発現したＰ２０８６変異体タンパク質を単離するステップを含む、非脂質化Ｐ２０８６変異体を産生する方法を提供し、この方法において、ＯＲＦ２０８６発現ベクターは、脂質化制御配列を含まない。一部の実施形態において、細菌は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。一部の実施形態において、発現は、ＩＰＴＧの添加によって誘発される。
一部の実施形態において、Ｐ２０８６変異体のＮ末端Ｃｙｓをコードするコドンが欠失している。一部の実施形態において、Ｐ２０８６変異体のＮ末端Ｃｙｓをコードするコドンは、Ａｌａコドン、Ｇｌｙコドン、またはＶａｌコドンを生成するように突然変異している。一部の実施形態において、Ｐ２０８６変異体は、Ａ０５変異体、Ｂ０１変異体、またはＢ４４変異体である。一部の実施形態において、Ｐ２０８６変異体は、Ｂ０９変異体である。
一部の実施形態において、Ｎ末端尾部は、Ｓｅｒ残基およびＧｌｙ残基を付加してＮ末端Ｃｙｓのすぐ下流のＧｌｙ／Ｓｅｒストークを伸長させるように突然変異している。一部の実施形態において、Ｇｌｙ／ＳｅｒストークにおけるＧｌｙ残基およびＳｅｒ残基の総数は、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、または少なくとも１２である。
一部の実施形態において、Ｐ２０８６変異体のＮ末端尾部のコドンは、点突然変異生成によって最適化されている。一部の実施形態において、ＯＲＦ２０８６変異体のＮ末端尾部のコドンは、ＯＲＦ２０８６変異体の５番目のアミノ酸をコードするコドンが配列番号８のヌクレオチド１３〜１５に１００％同一となり、ＯＲＦ２０８６変異体の１３番目のアミノ酸をコードするコドンが配列番号８のヌクレオチド３７〜３９に１００％同一となるような点突然変異生成によって最適化されている。一部の実施形態において、非脂質化ＯＲＦ２０８６変異体のＮ末端尾部は、５'の４５個の核酸が配列番号８の核酸１〜４５に１００％同一となるように最適化されている。一部の実施形態において、非脂質化ＯＲＦ２０８６変異体のＮ末端尾部は、５'の４２個の核酸が配列番号８の核酸４〜４５に１００％同一となるように最適化されている。一部の実施形態において、非脂質化ＯＲＦ２０８６変異体のＮ末端尾部は、５'の３９個の核酸が配列番号８の核酸４〜４２に１００％同一となるように最適化されている。一部の実施形態において、非脂質化Ｐ２０８６変異体のＮ末端尾部は、配列番号１８のアミノ酸１〜１５と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、非脂質化Ｐ２０８６変異体のＮ末端尾部は、配列番号１８のアミノ酸１〜１５と比較して２つのアミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、非脂質化Ｐ２０８６変異体のＮ末端尾部は、配列番号１８のアミノ酸２〜１５と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、非脂質化Ｐ２０８６変異体のＮ末端尾部は、配列番号１８のアミノ酸２〜１５と比較して２つのアミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、アミノ酸置換は、保存的なアミノ酸置換である。
１つの実施形態において、本発明は、免疫原性組成物における髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ）ＯＲＦ２０８６サブファミリーＢ抗原の安定な製剤に関する。本発明はまた、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ）ＯＲＦ２０８６抗原の立体構造を保存する方法、および髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ）ｒＬＰ２０８６抗原の有効性を決定するための方法に関する。
１つの態様において、本発明は、単離されたピルビル化されていない非脂質化ＯＲＦ２０８６ポリペプチドを含む組成物に関する。１つの実施形態において、組成物は免疫原性である。別の実施形態において、ポリペプチドは、対応する野生型の非脂質化ＯＲＦ２０８６ポリペプチドと比較して、Ｎ末端Ｃｙｓの欠失を含む。１つの実施形態において、ポリペプチドは、１位のシステインが欠失している、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、および配列番号２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号４４、配列番号４９、配列番号５０、および配列番号５５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
さらに別の実施形態において、ポリペプチドは、発現系に作動可能に連結したヌクレオチド配列によってコードされ、前記発現系は、細菌細胞において発現され得る。１つの実施形態において、発現系はプラスミド発現系である。１つの実施形態において、細菌細胞は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である。別の実施形態において、ヌクレオチド配列は、前記ヌクレオチド配列の発現を制御する調節配列に連結している。
別の態様において、本発明は、本プロセスによって得ることが可能なピルビル化されていない非脂質化ＯＲＦ２０８６ポリペプチドを含む組成物に関する。プロセスは、１位のシステインが欠失している、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、および配列番号２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現させることを含み、ヌクレオチド配列は、細菌細胞において発現され得る発現系に作動可能に連結している。１つの実施形態において、細菌細胞は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。
１つの態様において、本発明は、配列番号４９で示されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、および配列番号４４で示されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを含む組成物に関する。１つの実施形態において、本明細書において記載される組成物は、免疫原性である。別の実施形態において、本明細書において記載される組成物はさらに、血清群Ｂの髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＯＲＦ２０８６サブファミリーＡポリペプチドを含む。別の実施形態において、本明細書において記載される組成物は、血清群Ｂの髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＯＲＦ２０８６サブファミリーＢポリペプチドに対する、哺乳動物における殺菌性の免疫応答を誘発する。
１つの態様において、本発明は、配列番号４９で示されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドに関する。別の態様において、本発明は、配列番号４６を含む単離されたヌクレオチド配列に関する。１つの態様において、本発明は、配列番号４７を含む単離されたヌクレオチド配列に関する。１つの態様において、本発明は、配列番号４８を含む単離されたヌクレオチド配列に関する。１つの態様において、本発明は、配列番号５０で示されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドに関する。１つの態様において、本発明は、配列番号４５を含む単離されたヌクレオチド配列に関する。１つの態様において、本発明は、配列番号４４で示されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドに関する。
１つの態様において、本発明は、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、および配列番号４５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むプラスミドに関するものであり、プラスミドは、細菌細胞において発現され得る。１つの実施形態において、細菌細胞は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。
１つの態様において、本発明は、哺乳動物においてＯＲＦ２０８６サブファミリーＢ血清群Ｂの髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に特異的な殺菌性抗体を誘発する方法に関する。この方法は、配列番号４４および配列番号４９からなる群から選択されるアミノ酸配列、またはその組み合わせを含む、効果的な量の単離されたポリペプチドを哺乳動物に投与することを含む。
１つの態様において、本発明は、ポリペプチドを産生するための方法に関する。この方法は、配列番号２１に対する９０％を超える同一性を有する配列を含むポリペプチドを細菌細胞において発現させることを含み、前記配列は、配列番号２１のアミノ酸１３〜１８、配列番号２１のアミノ酸２１〜３４、および配列番号２１のアミノ酸７０〜８０からなる群から選択される少なくとも１つのドメイン、またはその組み合わせを含み、配列は、Ｎ末端システインを欠いている。この方法はさらに、ポリペプチドを精製することを含む。１つの実施形態において、配列は、配列番号２１のアミノ酸９６〜１１６、配列番号２１のアミノ酸１５８〜１７０、配列番号２１のアミノ酸１７２〜１８５、配列番号２１のアミノ酸１８７〜１９９、配列番号２１のアミノ酸２１３〜２２４、配列番号２１のアミノ酸２２６〜２３７、配列番号２１のアミノ酸２３９〜２４８からなる群から選択される少なくとも１つのドメイン、またはその組み合わせをさらに含む。１つの実施形態において、細菌細胞は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。
１つの態様において、本発明は、本明細書において記載される方法を含むプロセスによって産生される、単離されたポリペプチドに関する。別の態様において、本発明は、本明細書において記載される方法を含むプロセスによって産生される免疫原性組成物に関する。
１つの態様において、本発明は、血清群Ｂの髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＯＲＦ２０８６サブファミリーＢポリペプチドを含む免疫原性組成物に関するものであり、この組成物において、ポリペプチドは、ピルビル化されていない非脂質化Ｂ４４である。１つの実施形態において、組成物はさらに、血清群Ｂの髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の第２のＯＲＦ２０８６サブファミリーＢポリペプチドを含み、第２のポリペプチドは、ピルビル化されていない非脂質化Ｂ０９である。１つの実施形態において、組成物は、３つ以下のＯＲＦ２０８６サブファミリーＢポリペプチドを含む。別の実施形態において、組成物は、２つ以下のＯＲＦ２０８６サブファミリーＢポリペプチドを含む。１つの実施形態において、組成物はさらに、ＯＲＦ２０８６サブファミリーＡポリペプチドを含む。別の実施形態において、組成物は、Ａ０５サブファミリーＡポリペプチドを含む。
Ｐ２０８６変異体の核酸配列を示す図である。 Ｐ２０８６変異体のアミノ酸配列を示す図である。各変異体のＮ末端尾部におけるＧｌｙ／Ｓｅｒストークに下線が引かれている。 ＯＲＦ２０８６タンパク質の構造を示す図である。 Ｎ末端Ｃｙｓの除去の結果、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現が失われることを示す図である。 非脂質化ＯＲＦ２０８６変異体の発現に対するＧｌｙ／Ｓｅｒストークの長さの影響を示す図である。Ｂ０１と標識されたタンパク質変異体に関連する配列が、配列番号３５で示される。Ｂ４４と標識されたタンパク質変異体に関連する配列が、配列番号３６で示される。Ａ０５と標識されたタンパク質変異体に関連する配列が、配列番号３７で示される。Ａ２２と標識されたタンパク質変異体に関連する配列が、配列番号３８で示される。Ｂ２２と標識されたタンパク質変異体に関連する配列が、配列番号３９で示される。Ａ１９と標識されたタンパク質変異体に関連する配列が、配列番号４０で示される。 Ｇｌｙ／Ｓｅｒストークが短いにも関わらず高レベルの非脂質化Ｂ０９の発現を示す図である。左側の２つのレーンは、誘発の前および後の、Ｎ末端Ｃｙｓが欠失しているＢ０９変異体の発現を示す。第３および第４のレーンは、誘発の前および後の、Ｎ末端Ｃｙｓ陽性のＢ０９変異体の発現を示す。最も右側のレーンは、分子量標準である。画像の下に示されるアミノ酸配列は、配列番号４１で示される。図面において「Ａ２２＿００１」と呼ばれる、Ｎ末端Ｃｙｓが欠失しているＡ２２変異体を代表するヌクレオチド配列は、配列番号４２で示され、これは、図面において配列番号４１の下に示される。図面において「Ｂ２２＿００１」と呼ばれる、Ｎ末端Ｃｙｓが欠失しているＢ２２変異体を代表するヌクレオチド配列は、配列番号５２で示される。図面において「Ｂ０９＿００４」と呼ばれる、Ｎ末端Ｃｙｓが欠失しているＢ０９変異体を代表するヌクレオチド配列は、配列番号５３で示される。 コドンの最適化は、非脂質化Ｂ２２変異体およびＡ２２変異体の発現を増大させることを示す図である。左側のパネルは、ＩＰＴＧ誘発の前（レーン１および３）および後（レーン２および４）の、Ｎ末端Ｃｙｓが欠失しているＢ２２変異体の発現を示す。右側のパネルは、ＩＰＴＧ誘発の前（レーン７）および後（レーン８）の、Ｎ末端Ｃｙｓが欠失しているＡ２２変異体の発現を示す。レーン５および６は、分子量標準である。 Ｐ２０８６変異体の核酸配列およびアミノ酸配列を示す図である。
配列の識別子
配列番号１は、Ｎ末端Ｃｙｓをコードするコドンを含む、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、血清群Ｂ、２０８６変異体Ａ０４の遺伝子のＤＮＡ配列を示す。
配列番号２は、Ｎ末端Ｃｙｓをコードするコドンを含む、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、血清群Ｂ、２０８６変異体Ａ０５の遺伝子のＤＮＡ配列を示す。
配列番号３は、Ｎ末端Ｃｙｓをコードするコドンを含む、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、血清群Ｂ、２０８６変異体Ａ１２の遺伝子のＤＮＡ配列を示す。
配列番号４は、Ｎ末端Ｃｙｓをコードするコドンを含む、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、血清群Ｂ、２０８６変異体Ａ１２−２の遺伝子のＤＮＡ配列を示す。
配列番号５は、Ｎ末端Ｃｙｓをコードするコドンを含む、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、血清群Ｂ、２０８６変異体Ａ２２の遺伝子のＤＮＡ配列を示す。
配列番号６は、Ｎ末端Ｃｙｓをコードするコドンを含む、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、血清群Ｂ、２０８６変異体Ｂ０２の遺伝子のＤＮＡ配列を示す。
配列番号７は、Ｎ末端Ｃｙｓをコードするコドンを含む、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、血清群Ｂ、２０８６変異体Ｂ０３の遺伝子のＤＮＡ配列を示す。
配列番号８は、Ｎ末端Ｃｙｓをコードするコドンを含む、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、血清群Ｂ、２０８６変異体Ｂ０９の遺伝子のＤＮＡ配列を示す。
配列番号９は、Ｎ末端Ｃｙｓをコードするコドンを含む、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、血清群Ｂ、２０８６変異体Ｂ２２の遺伝子のＤＮＡ配列を示す。
配列番号１０は、Ｎ末端Ｃｙｓをコードするコドンを含む、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、血清群Ｂ、２０８６変異体Ｂ２４の遺伝子のＤＮＡ配列を示す。
配列番号１１は、Ｎ末端Ｃｙｓをコードするコドンを含む、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、血清群Ｂ、２０８６変異体Ｂ４４の遺伝子のＤＮＡ配列を示す。
配列番号１２は、アミノ酸位置１にＮ末端Ｃｙｓを含む、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、血清群Ｂ、２０８６変異体Ａ０４のアミノ酸配列を示す。
配列番号１３は、アミノ酸位置１にＮ末端Ｃｙｓを含む、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、血清群Ｂ、２０８６変異体Ａ０５のアミノ酸配列を示す。
配列番号１４は、アミノ酸位置１にＮ末端Ｃｙｓを含む、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、血清群Ｂ、２０８６変異体Ａ１２のアミノ酸配列を示す。
配列番号１５は、アミノ酸位置１にＮ末端Ｃｙｓを含む、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、血清群Ｂ、２０８６変異体Ａ２２のアミノ酸配列を示す。
配列番号１６は、アミノ酸位置１にＮ末端Ｃｙｓを含む、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、血清群Ｂ、２０８６変異体Ｂ０２のアミノ酸配列を示す。
配列番号１７は、アミノ酸位置１にＮ末端Ｃｙｓを含む、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、血清群Ｂ、２０８６変異体Ｂ０３のアミノ酸配列を示す。
配列番号１８は、アミノ酸位置１にＮ末端Ｃｙｓを含む、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、血清群Ｂ、２０８６変異体Ｂ０９のアミノ酸配列を示す。
配列番号１９は、アミノ酸位置１にＮ末端Ｃｙｓを含む、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、血清群Ｂ、２０８６変異体Ｂ２２のアミノ酸配列を示す。
配列番号２０は、アミノ酸位置１にＮ末端Ｃｙｓを含む、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、血清群Ｂ、２０８６変異体Ｂ２４のアミノ酸配列を示す。
配列番号２１は、アミノ酸位置１にＮ末端Ｃｙｓを含む、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、血清群Ｂ、２０８６変異体Ｂ４４のアミノ酸配列を示す。
配列番号２２は、実施例２において示される、フォワードプライマーのＤＮＡ配列を示す。
配列番号２３は、実施例２において示される、リバースプライマーのＤＮＡ配列を示す。
配列番号２４は、実施例２、表１において示される、フォワードプライマーのＤＮＡ配列を示す。
配列番号２５は、実施例２、表１において示される、リバースプライマーのＤＮＡ配列を示す。
配列番号２６は、実施例２、表１において示される、フォワードプライマーのＤＮＡ配列を示す。
配列番号２７は、実施例２、表１において示される、リバースプライマーのＤＮＡ配列を示す。
配列番号２８は、実施例４において示される、Ｇｌｙ／ＳｅｒストークのＤＮＡ配列を示す。
配列番号２９は、例えば配列番号２８によってコードされる、実施例４において示されるＧｌｙ／Ｓｅｒストークのアミノ酸配列を示す。
配列番号３０は、実施例４において示されるＧｌｙ／ＳｅｒストークのＤＮＡ配列を示す。
配列番号３１は、例えば配列番号３０によってコードされる、実施例４において示されるＧｌｙ／Ｓｅｒストークのアミノ酸配列を示す。
配列番号３２は、実施例４において示されるＧｌｙ／ＳｅｒストークのＤＮＡ配列を示す。
配列番号３３は、例えば配列番号３２および配列番号３４によってコードされる、Ｇｌｙ／Ｓｅｒストークのアミノ酸配列を示す。
配列番号３４は、実施例４において示されるＧｌｙ／ＳｅｒストークのＤＮＡ配列を示す。
配列番号３５は、図５において示される、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、血清群Ｂ、２０８６変異体Ｂ０１のＮ末端のアミノ酸配列を示す。
配列番号３６は、図５において示される、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、血清群Ｂ、２０８６変異体Ｂ４４のＮ末端のアミノ酸配列を示す。
配列番号３７は、図５において示される、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、血清群Ｂ、２０８６変異体Ａ０５のＮ末端のアミノ酸配列を示す。
配列番号３８は、図５において示される、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、血清群Ｂ、２０８６変異体Ａ２２のＮ末端のアミノ酸配列を示す。
配列番号３９は、図５において示される、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、血清群Ｂ、２０８６変異体Ｂ２２のＮ末端のアミノ酸配列を示す。
配列番号４０は、図５において示される、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、血清群Ｂ、２０８６変異体Ａ１９のＮ末端のアミノ酸配列を示す。
配列番号４１は、図６において示される、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、血清群Ｂ、２０８６変異体のＮ末端のアミノ酸配列を示す。
配列番号４２は、図６において示される、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、血清群Ｂ、２０８６変異体Ａ２２のＮ末端のＤＮＡ配列を示す。
配列番号４３は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、血清群Ｂ、２０８６変異体Ｂ４４の遺伝子の、コドンを最適化されたＤＮＡ配列を示し、この配列において、Ｎ末端システインをコードするコドンは、配列番号１１と比較して欠失している。プラスミドｐＤＫ０８７は、配列番号４３を含む。
配列番号４４は、脂質化されていない髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、血清群Ｂ、２０８６変異体Ｂ４４のアミノ酸配列を示す。配列番号４４は配列番号２１に同一であり、配列番号２１の１位のＮ末端システインが欠失している。配列番号４４は、例えば配列番号４３によってコードされる。
配列番号４５は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、血清群Ｂ、２０８６変異体Ｂ０９の遺伝子の、コドンを最適化されたＤＮＡ配列を示し、この配列において、Ｎ末端システインをコードするコドンは欠失しており、配列は、配列番号８と比較して、さらなるＧｌｙ／Ｓｅｒ領域をコードするコドンを含む。プラスミドｐＥＢ０６３は、配列番号４５を含む。
配列番号４６は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、血清群Ｂ、２０８６変異体Ｂ０９の遺伝子の、コドンを最適化されたＤＮＡ配列を示し、この配列において、Ｎ末端システインをコードするコドンは、配列番号８と比較して欠失している。プラスミドｐＥＢ０６４は、配列番号４６を含む。
配列番号４７は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、血清群Ｂ、２０８６変異体Ｂ０９の遺伝子の、コドンを最適化されたＤＮＡ配列を示し、この配列において、Ｎ末端システインをコードするコドンは、配列番号８と比較して欠失している。プラスミドｐＥＢ０６５は、配列番号４７を含む。
配列番号４８は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、血清群Ｂ、２０８６変異体Ｂ０９の遺伝子のＤＮＡ配列を示し、この配列において、Ｎ末端システインをコードするコドンは、配列番号８と比較して欠失している。プラスミドｐＬＡ１３４は、配列番号４８を含む。
配列番号４９は、脂質化されていない髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、血清群Ｂ、２０８６変異体Ｂ０９のアミノ酸配列を示す。配列番号４９は配列番号１８に同一であり、配列番号１８の１位のＮ末端システインが欠失している。配列番号４９は、例えば、配列番号４６、配列番号４７、および配列番号４８からなる群から選択されるＤＮＡ配列によってコードされる。
配列番号５０は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、血清群Ｂ、２０８６変異体Ｂ０９のアミノ酸配列を示し、この配列において、Ｎ末端システインをコードするコドンは欠失しており、配列は、配列番号１８と比較して、さらなるＧｌｙ／Ｓｅｒ領域をコードするコドンを含む。配列番号５０は、例えば配列番号４５によってコードされる。
配列番号５１は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、血清群Ｂ、２０８６変異体Ｂ４４の遺伝子のＤＮＡ配列を示し、この配列において、Ｎ末端システインをコードするコドンは、配列番号１１と比較して欠失している。プラスミドｐＬＮ０５６は、配列番号５１を含む。
配列番号５２は、図６において示される、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、血清群Ｂ、２０８６変異体Ｂ２２のＮ末端のＤＮＡ配列を示す。
配列番号５３は、図６において示される、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、血清群Ｂ、２０８６変異体Ｂ０９のＮ末端のＤＮＡ配列を示す。
配列番号５４は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、血清群Ｂ、２０８６変異体Ａ０５の遺伝子のＤＮＡ配列を示し、この配列において、Ｎ末端システインをコードするコドンは、配列番号２と比較して欠失している。
配列番号５５は、脂質化されていない髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、血清群Ｂ、２０８６変異体Ａ０５のアミノ酸配列を示す。配列番号５５は配列番号１３に同一であり、配列番号１３の１位のＮ末端システインが欠失している。配列番号５５は、例えば配列番号５４によってコードされる。
配列番号５６は、実施例７において示される、セリン−グリシン反復配列のアミノ酸配列を示す。
配列番号５７は、脂質化されていない髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、血清群Ｂ、２０８６変異体Ｂ０１のアミノ酸配列を示す。配列番号５７は配列番号５８に同一であり、配列番号５８の１位のＮ末端システインが欠失している。
配列番号５８は、アミノ酸位置１にＮ末端Ｃｙｓを含む、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、血清群Ｂ、２０８６変異体Ｂ０１のアミノ酸配列を示す。
配列番号５９は、アミノ酸位置１にＮ末端Ｃｙｓを含む、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、血清群Ｂ、２０８６変異体Ｂ１５のアミノ酸配列を示す。
配列番号６０は、アミノ酸位置１にＮ末端Ｃｙｓを含む、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、血清群Ｂ、２０８６変異体Ｂ１６のアミノ酸配列を示す。
配列番号６１は、配列番号１９のアミノ酸位置１のＮ末端Ｃｙｓのコドンがグリシンのコドンで置き換えられている、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、血清群Ｂ、２０８６変異体Ｂ２２のＤＮＡ配列を示す。
配列番号６２は、配列番号１９のアミノ酸位置１のＮ末端Ｃｙｓがグリシンで置き換えられている、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、血清群Ｂ、２０８６変異体Ｂ２２のアミノ酸配列を示す。
配列番号６３は、配列番号１５のアミノ酸位置１のＮ末端Ｃｙｓのコドンがグリシンのコドンで置き換えられている、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、血清群Ｂ、２０８６変異体Ａ２２のＤＮＡ配列を示す。
配列番号６４は、配列番号１５のアミノ酸位置１のＮ末端Ｃｙｓがグリシンで置き換えられている、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、血清群Ｂ、２０８６変異体Ａ２２のアミノ酸配列を示す。
別段の規定がない限り、本明細書において用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書において記載されるものに類似または同等の方法および材料を本発明の実施または試験において用いることができるが、適切な方法および材料が以下に記載される。材料、方法、および例は、例示的なものにすぎず、限定することを目的としたものではない。本明細書において言及される全ての刊行物、特許、および他の文献は、参照することによってその全体が組み込まれる。
本開示において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んだ（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」「含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などの用語が、米国特許法におけるそれらの意味を有し得ること、例えば、これらが、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んだ（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味し得ることに留意されたい。このような用語は、いかなる他の構成要素も排除することなく、特定の構成要素または構成要素の組を含めることを言う。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」などの用語は、米国特許法におけるそれらの意味を有し、例えば、これらは、本発明の新規なまたは基本的な特徴を損なわないさらなる構成要素またはステップを含めることを可能にし、すなわち、これらは、本発明の新規なまたは基本的な特徴を損なうさらなる言及されていない構成要素またはステップを排除し、またこれらは、特に、先行技術に対して、例えば本明細書において引用されるかまたは参照することによって本明細書に組み込まれる文献に対して特許性のある、例えば新規な、自明ではない、進歩性のある実施形態を規定することが本明細書の目的であるため、本明細書において引用されるかまたは参照することによって本明細書に組み込まれる当技術分野における文献などの先行技術の構成要素またはステップを排除する。また、用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、米国特許法におけるそれらの意味を有し、すなわち、これらの用語は限定的なものである。したがって、これらの用語は、特定の構成要素または構成要素の組を含め、かつすべての他の構成要素を排除することを言う。
定義
本明細書において用いられる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈から別のことが明らかに示されない限り、複数形の言及を含む。したがって、例えば、「方法」への言及は、１つもしくは複数の方法、ならびに／または、本明細書において記載されるタイプのおよび／もしくは本開示などを読んで当業者に明らかになるタイプのステップを含む。
本明細書において用いられる場合、複数形は、文脈から別のことが明らかに示されない限り、単数形の言及を含む。したがって、例えば、「方法」への言及は、１つもしくは複数の方法、ならびに／または、本明細書において記載されるタイプのおよび／もしくは本開示などを読んで当業者に明らかになるタイプのステップを含む。
本明細書において用いられる場合、「約」は、言及された濃度範囲、時間枠、分子量、温度、またはｐＨなどの、値の統計的に有意な範囲内にあることを意味する。このような範囲は、所与の値または範囲の１桁以内であり得、典型的には２０％以内、さらに典型的には１０％以内、さらに典型的には５％以内であり得る。用語「約」によって包含される許容可能な変型は、研究下にある特定の系に応じ、当業者によって容易に理解され得る。範囲が本願において列挙されている場合は常に、その範囲内の全ての整数もまた、本発明の実施形態として検討される。
用語「アジュバント」は、本明細書においてさらに記載および例示されるように抗原に対する免疫応答を増強させる化合物または混合物を言う。本発明のワクチンにおいて用いることができるアジュバントの非限定的な例には、ＲＩＢＩアジュバント系（Ｒｉｂｉ Ｉｎｃ．、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｍｏｎｔ．）、ミョウバン、無機物ゲル、例えば水酸化アルミニウムゲル、水中油型エマルジョン、油中水型エマルジョン、例えば、フロイント完全アジュバントおよび不完全アジュバント、ブロックコポリマー（ＣｙｔＲｘ、Ａｔｌａｎｔａ Ｇａ．）、ＱＳ−２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｍａｓｓ．）、ＳＡＦ−Ｍ（Ｃｈｉｒｏｎ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ Ｃａｌｉｆ．）、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）アジュバント、サポニン、Ｑｕｉｌ Ａ、または他のサポニン画分、モノホスホリル脂質Ａ、ならびにアブリジン脂質−アミンアジュバントが含まれる。
「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して、糖質、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的に特異的に結合し得る、免疫グロブリン分子である。本明細書において用いられる場合、文脈によって別のことが示されない限り、この用語は、無傷のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体だけではなく、操作された抗体（例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、ならびに／またはエフェクター機能、安定性、および他の生物学的活性を改変するように誘導体化された抗体）およびその断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなど）、一本鎖抗体（ＳｃＦｖ）およびサメ抗体やラクダ抗体を含むドメイン抗体）、ならびに抗体部分を含む融合タンパク質、多価抗体、多重特異的抗体（例えば、所望の生物学的活性を示す限りの二重特異的抗体）および本明細書において記載される抗体断片、ならびに抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子のあらゆる他の修飾された立体構造も包含するものである。抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＭ（またはそのサブクラス）などのあらゆるクラスの抗体を含み、また抗体は、何らかの特定のクラスのものである必要はない。抗体の重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンの５つの主要なクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在し、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えばヒトにおいてはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに分けることができる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元立体配置は周知である。
「抗体断片」は、無傷抗体の一部分のみを含み、その部分は好ましくは、無傷抗体内に存在する場合にその部分に通常は関連する機能の、少なくとも１つ、好ましくはほとんどまたは全てを保持する。
用語「抗原」は通常、同族抗体が選択的に結合し得る少なくとも１つのエピトープを含有する生体分子、通常はタンパク質、ペプチド、多糖、脂質、もしくはコンジュゲートを言うか、または場合によっては、動物内に注射もしくは吸収される組成物を含む、動物における抗体の産生もしくはＴ細胞の応答もしくはその両方を刺激し得る免疫原性物質を言う。免疫応答は、分子全体に対して、または分子の１つもしくは複数の様々な部分（例えば、エピトープまたはハプテン）に対して生じ得る。この用語は、個別の分子、または均質なもしくは異種の抗原性分子集団を言うために用いることができる。抗原は、抗体、Ｔ細胞受容体、または特異的な液性および／もしくは細胞性免疫の他のエレメントによって認識される。用語「抗原」には、全ての関連する抗原性エピトープが含まれる。所与の抗原のエピトープは、当技術分野において周知のあらゆる数のエピトープマッピング技術を用いて同定することができる。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．６６（Ｇｌｅｎｎ Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ編、１９９６）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．を参照されたい。例えば、線状エピトープは、例えば、タンパク質分子の部分に対応する多数のペプチドを固体担体上で同時に合成し、ペプチドを担体に付着させたままペプチドと抗体とを反応させることによって決定することができる。このような技術は、当技術分野において知られており、例えば、参照することによって全てその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第４，７０８，８７１号；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３９９８〜４００２；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８６）Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：７０９〜７１５において記載されている。同様に、立体構造エピトープは、例えばＸ線結晶学および２次元核磁気共鳴などによってアミノ酸の空間的立体構造を決定することによって同定することができる。例えば、上記のＥｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓを参照されたい。さらに、本発明の目的では、「抗原」はまた、免疫学的応答を誘発する能力をタンパク質が維持する限りの、天然配列に対する修飾、例えば欠失、付加、および置換（通常は保存的な性質であるが、非保存的であり得る）を含むタンパク質を言うために用いることができる。これらの修飾は、部位特異的突然変異生成を介する、もしくは特定の合成手順を介する、もしくは遺伝子操作アプローチを介する、意図的なものであり得るか、または、抗原を産生する宿主の突然変異などを介する、偶発的なものであり得る。さらに、抗原は、微生物、例えば細菌から誘導することができるか、得ることができるか、もしくは単離することができるか、または生物全体であり得る。同様に、核酸免疫化の用途におけるような、抗原を発現するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドもまた、この定義に含まれる。合成抗原、例えば、ポリエピトープ、隣接エピトープ、および他の組換え抗原または合成によって誘導された抗原もまた含まれる（Ｂｅｒｇｍａｎｎら（１９９３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：２７７７ ２７８１；Ｂｅｒｇｍａｎｎら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：３２４２ ３２４９；Ｓｕｈｒｂｉｅｒ，Ａ．（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌ．ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７５：４０２ ４０８；Ｇａｒｄｎｅｒら（１９９８）１２ｔｈ Ｗｏｒｌｄ ＡＩＤＳ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ、Ｇｅｎｅｖａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、Ｊｕｎ．２８〜Ｊｕｌ．３、１９９８を参照されたい）。
用語「保存的な」アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性の性質の類似性に基づいて行うことができる。例えば、非極性の（疎水性の）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、トリプトファン、およびメチオニンが含まれ、極性／中性のアミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれ、正に荷電した（塩基性の）アミノ酸には、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが含まれ、負に荷電した（酸性の）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。一部の実施形態において、保存的なアミノ酸の変化は、ＯＲＦ２０８６ポリペプチドの一次配列を改変するが、分子の機能は改変しない。これらの突然変異体を生成する場合、アミノ酸のハイドロパシー指標が考慮され得る。ポリペプチドへの相互作用性の生物学的機能の付与におけるハイドロパシーアミノ酸指標の重要性は、当技術分野において一般に理解されている（Ｋｙｔｅ ＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１５７（１）：１０５〜３２）。特定のアミノ酸が、類似のハイドロパシー指標またはスコアを有する他のアミノ酸に置換され得、そして依然として類似の生物学的活性を有するポリペプチドを生じさせることが知られている。各アミノ酸は、疎水性および電荷の特徴に基づいてハイドロパシー指標を付与されている。これらの指標は、イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン／シスチン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（−０．４）、スレオニン（−０．７）、セリン（−０．８）、トリプトファン（−０．９）、チロシン（−１．３）、プロリン（−１．６）、ヒスチジン（−３．２）、グルタメート（−３．５）、グルタミン（−３．５）、アスパルテート（−３．５）、アスパラギン（−３．５）、リジン（−３．９）、およびアルギニン（−４．５）である。
アミノ酸残基の相対的なハイドロパシー特徴が、生じたポリペプチドの二次構造および三次構造を決定し、これが次に、ポリペプチドと他の分子、例えば酵素、基質、受容体、抗体、抗原などとの相互作用を規定すると考えられている。アミノ酸が、類似のハイドロパシー指標を有する別のアミノ酸によって置換され得、そして依然として機能的に同等なポリペプチドを得ることが、当技術分野において知られている。このような変化において、そのハイドロパシー指標が＋／−２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、＋／−１以内である置換が特に好ましく、＋／−０．５以内である置換がさらに特に好ましい。
保存的なアミノ酸の置換または挿入はまた、親水性に基づいて行うことができる。参照することによって本明細書に組み込まれる米国特許第４，５５４，１０１号において記載されているように、その隣接するアミノ酸の親水性によって支配される、ポリペプチドの最大の局所的な平均親水性は、その免疫原性および抗原性と、すなわち、ポリペプチドの生物学的特性と相関する。米国特許第４，５５４，１０１号は、以下の親水性値がアミノ酸残基に付与されていることを挙げている：アルギニン（＋３．０）、リジン（＋３．０）、アスパルテート（＋３．０±１）、グルタメート（＋３．０±１）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、プロリン（−０．５±１）、スレオニン（−０．４）、アラニン（−０．５）、ヒスチジン（−０．５）、システイン（−１．０）、メチオニン（−１．３）、バリン（−１．５）、ロイシン（−１．８）、イソロイシン（−１．８）、チロシン（−２．３）、フェニルアラニン（−２．５）、トリプトファン（−３．４）。アミノ酸が、類似の親水性値を有する別のアミノ酸に置換され得、そして依然として生物学的に同等の、特に免疫学的に同等のポリペプチドを得ることが理解される。このような変化において、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内である置換が特に好ましく、±０．５以内である置換がさらに特に好ましい。様々な前述の特徴を考慮する典型的な置換は、当業者に周知であり、限定はしないが、アルギニンおよびリジン、グルタメートおよびアスパルテート、セリンおよびスレオニン、グルタミンおよびアスパラギン、ならびにバリン、ロイシンおよびイソロイシンを含む。
本明細書において用いられる用語「効果的な免疫原性量」は、脊椎動物宿主における免疫応答の誘発において効果的なポリペプチドまたはポリペプチド含む組成物の量を言う。例えば、本発明のｒＬＰ２０８６タンパク質の効果的な免疫原性量は、脊椎動物宿主における免疫応答の誘発において効果的な量である。特定の「効果的な免疫原性投与量または量」は、宿主の年齢、体重、および医学的状態、ならびに投与方法に応じる。適切な用量は、当業者によって容易に決定される。
本明細書において用いられる用語「Ｇｌｙ／Ｓｅｒストーク」は、ＯＲＦ２０８６によってコードされるタンパク質のＮ末端Ｃｙｓ残基のすぐ下流の一連のＧｌｙ残基およびＳｅｒ残基を言う。Ｇｌｙ／Ｓｅｒストークにおいて、５個と１２個との間のＧｌｙ残基およびＳｅｒ残基が存在し得る。したがって、Ｇｌｙ／Ｓｅｒストークは、ＯＲＦ２０８６によってコードされるタンパク質の２個から７個と１３個との間までのアミノ酸からなる。好ましくは、Ｇｌｙ／Ｓｅｒストークは、ＯＲＦ２０８６によってコードされるタンパク質の２個の、最大７個と１３個との間のアミノ酸からなる。本発明のＰ２０８６変異体のＧｌｙ／Ｓｅｒストークは、図２（配列番号１２〜２１）における下線を引かれた配列によって表される。本明細書において示されるように、Ｇｌｙ／Ｓｅｒストークの長さは、非脂質化Ｐ２０８６変異体の安定性または発現レベルに影響し得る。典型的な実施形態において、Ｇｌｙ／Ｓｅｒストークの長さに対する影響の効果を、対応する野生型変異体の効果と比較する。
用語「免疫原性の」は、抗原またはワクチンの、液性または細胞介在性またはその両方の免疫応答を誘発する能力を言う。
それぞれが本明細書において区別せずに用いられる「免疫原性量」または「免疫学的に効果的な量」または「用量」は、通常、当業者に知られている標準的なアッセイによって測定される、細胞性（Ｔ細胞）応答または液性（Ｂ細胞または抗体）応答またはその両方の免疫応答を誘発するために十分な、抗原または免疫原性組成物の量を言う。
用語「免疫原性組成物」は、抗原、例えば微生物、またはその成分を含有する、あらゆる医薬組成物に関連し、この組成物は、対象における免疫応答を誘発するために用いることができる。本発明の免疫原性組成物は、全身的な経皮経路または粘膜経路を介して免疫原性組成物を投与する手段によって、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｄｉｓ）感染にかかりやすいヒトを治療するために用いることができる。これらの投与には、筋肉内経路（ｉ．ｍ．）腹腔内経路（ｉ．Ｐ．）、皮内経路（ｉ．ｄ．）、もしくは皮下経路を介する注射、パッチもしくは他の経皮送達装置による塗布、または口道／消化管、気道、もしくは尿生殖路への経粘膜投与が含まれ得る。１つの実施形態において、免疫原性組成物は、ワクチンの製造において、または対象を受動的に防御もしくは治療するために用いることができるポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体の誘発において用いることができる。
特定の免疫原性組成物のための成分の最適な量は、対象における適切な免疫応答の観察を伴う標準的な研究によって確認することができる。初回ワクチン接種の後、対象に、適切に間隔をあけた１回または複数回の追加免疫化を行うことができる。
用語「単離された」は、材料が、その本来の環境（例えば、それが天然である場合には天然の環境、またはそれが組換え物である場合にはその宿主生物、または１つの環境から異なる環境へ移される）から取り出されることを意味する。例えば、「単離された」タンパク質またはペプチドは、細胞材料、またはタンパク質が由来する元である細胞源もしくは組織源からの他の汚染タンパク質を実質的に有さないか、あるいは、化学的に合成された場合の、または化学物質反応の一部として混合物内に別の形で存在する、化学的前駆体または他の化学物質を実質的に有さない。本発明において、タンパク質は、細菌細胞から、または細胞残屑から単離することができ、その結果、タンパク質は、免疫原性組成物の製造において有用な形態で提供される。用語「単離された」または「単離すること」は、本明細書において記載されるようなタンパク質の精製方法を例えば含む、精製することまたは精製を含み得る。表現「細胞材料を実質的に有さない」は、ポリペプチドまたはタンパク質が、それが単離されたかまたは組換えによって産生された元である細胞の細胞成分から分離されている、ポリペプチドまたはタンパク質の調製物を含む。したがって、細胞材料を実質的に有さないタンパク質またはペプチドは、約３０％、２０％、１０％、５％、２．５％、または１％（乾燥重量）未満の汚染タンパク質または多糖または他の細胞材料を有する、莢膜多糖、タンパク質、またはペプチドの調製物を含む。ポリペプチド／タンパク質が組換えによって産生される場合、これは好ましくは、培養培地を実質的に有さず、すなわち、培養培地は、タンパク質調製物の容積の約２０％、１０％、または５％未満に相当する。ポリペプチドまたはタンパク質が化学合成によって産生される場合、これは好ましくは、化学的前駆体または他の化学物質を実質的に有さず、すなわち、これは、タンパク質または多糖の合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質から分離されている。したがって、ポリペプチドまたはタンパク質のこのような調製物は、約３０％、２０％、１０％、５％（乾燥重量）未満の化学的前駆体または目的のポリペプチド／タンパク質もしくは多糖断片以外の化合物を有する。
本明細書において用いられる用語「Ｎ末端尾部」は、タンパク質を細胞膜に付着させる、ＯＲＦ２０８６によってコードされるタンパク質のＮ末端部分を言う。Ｎ末端尾部は、図３における側面図の構造の最下部に示されている。Ｎ末端尾部は、典型的には、ＯＲＦ２０８６によってコードされるタンパク質のＮ末端の１６個のアミノ酸を含む。一部の実施形態において、Ｎ末端尾部は、配列番号１２〜２１のいずれか１つの、アミノ酸１〜１６である。本明細書において用いられる用語「ＯＲＦ２０８６」は、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種の細菌に由来するオープンリーディングフレーム２０８６を言う。ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）ＯＲＦ２０８６、それからコードされるタンパク質、これらのタンパク質の断片、およびこれらのタンパク質を含む免疫原性組成物は、当技術分野において知られており、例えば、そのそれぞれが参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる、ＷＯ２００３／０６３７６６および米国特許出願公開第ＵＳ２００６０２５７４１３号および米国特許出願公開第ＵＳ２００９０２０２５９３号において記載されている。
用語「Ｐ２０８６」は通常、ＯＲＦ２０８６によってコードされるタンパク質を言う。「２０８６」の前の「Ｐ」は、「タンパク質」の略である。本発明のＰ２０８６タンパク質は、脂質化されていても脂質化されていなくてもよい。「ＬＰ２０８６」および「Ｐ２０８６」は、典型的には、それぞれ、脂質化形態および非脂質化形態の２０８６タンパク質を言う。本発明のＰ２０８６タンパク質は、組換えであり得る。「ｒＬＰ２０８６」および「ｒＰ２０８６」は、典型的には、それぞれ、脂質化形態および非脂質化形態の組換え２０８６タンパク質を言う。「２０８６」はまた、因子Ｈに結合するその能力に起因して、因子Ｈ結合タンパク質（ｆＨＢＰ）として知られている。
本明細書において用いられる用語「薬学的に許容できる担体」は、ヒト宿主または他の脊椎動物宿主への投与に適合する、あらゆるおよび全ての溶媒、分散媒質、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含むものである。典型的には、薬学的に許容できる担体は、連邦規制当局、州政府、もしくは他の規制当局によって認可されている、または、米国薬局方もしくは他の一般的に認識されている薬局方においてヒトおよび非ヒト哺乳動物を含む動物における使用について列挙されている担体である。用語「担体」は、医薬組成物がそれと共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、または媒体を言う。このような薬学的担体は、無菌の液体、例えば水および油であり得、油には、石油、動物油、植物油、または合成由来の油が含まれる。水、生理食塩水溶液、ならびに水性デキストロース溶液およびグリセロール溶液を、液体担体として、特に、注射可能な溶液に、採用することができる。適切な薬学的賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、ショ糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどが含まれる。組成物はまた、必要に応じて、少量の湿潤剤、充填剤、乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有し得る。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、持続放出製剤などの形態をとり得る。適切な薬学的担体の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」において記載されている。製剤は、投与態様に適しているべきである。適切な担体は、当業者に明らかとなり、投与経路に大きく依存する。
「保存的な」免疫応答は、対象を感染から防御する働きをする、免疫原性組成物の、液性または細胞介在性の免疫応答を誘発する能力を言う。もたらされる防御は、完全なものである必要はなく、すなわち、感染は、例えばワクチンまたは免疫原性組成物を投与されていない感染動物である対照の対象集団と比較して統計的に有意な向上があれば、完全に予防または根絶される必要はない。防御は、感染の症候の重症度または発病の速さを緩和することに限定することができる。通常、「防御性免疫応答」は、各抗原に対するある程度のレベルの測定可能な機能的抗体応答を含む、対象の少なくとも５０％における特定の抗原に特異的な抗体レベルの増大の誘発を含む。特定の状況において、「防御性免疫応答」は、各抗原に対するある程度のレベルの測定可能な機能的抗体応答を含む、対象の少なくとも５０％における特定の抗原に特異的な抗体レベルの２倍の増大または抗体レベルの４倍の増大の誘発を含み得る。特定の実施形態において、オプソニン化抗体は、防御性免疫応答と相関する。したがって、防御性免疫応答は、血清殺菌活性（ＳＢＡ）アッセイまたはオプソニン化貪食作用アッセイ、例えば以下に記載されているアッセイにおいて、細菌数の減少パーセントを測定することによってアッセイすることができる。このようなアッセイはまた、当技術分野において知られている。髄膜炎菌ワクチンでは、例えば、ＳＢＡアッセイは、防御についての確立された代替手段である。一部の実施形態において、免疫原性組成物の不存在下での細菌数と比較して、少なくとも１０％、２５％、５０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上の細菌数の減少がある。
用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」は、アミノ酸残基のポリマーを言い、最短の生成物に限定されない。したがって、ペプチド、オリゴペプチド、二量体、多量体などは、この定義に含まれる。完全長タンパク質およびその断片の両方は、この定義によって包含される。この用語はまた、好ましくはタンパク質が、タンパク質が投与される動物内で免疫学的応答を誘発する能力を維持するような、天然配列に対する修飾、例えば欠失、付加、および置換（通常は保存的な性質であるが、非保存的であり得る）を含む。また、発現後の修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、脂質化、リン酸化などが含まれる。
本明細書において用いられる用語「組換えの」は、遺伝子操作方法によって産生される、目的の遺伝子を発現するあらゆるタンパク質、ポリペプチド、または細胞を言う。タンパク質またはポリペプチドに関して用いられる用語「組換えの」は、組換えポリヌクレオチドの発現によって産生されるポリペプチドを意味する。本発明のタンパク質は、天然源から単離され得るか、または遺伝子操作方法によって産生され得る。本明細書において用いられる「組換えの」は、さらに、その由来源または操作のおかげで、それが天然で関連するポリヌクレオチドの全てまたは一部と関連していない、核酸分子を記載する。宿主細胞に関して用いられる用語「組換えの」は、組換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞を意味する。
用語「安定剤」は、抗原に結合し、一定期間にわたり抗原のエピトープまたは免疫反応性を維持する化合物を言う。安定剤は、当技術分野において知られている。安定剤の例には、多価陽イオン、例えば、カルシウムまたはアルミニウムが含まれる。
用語「対象」は、哺乳動物、鳥類、魚類、爬虫類、またはあらゆる他の動物を言う。用語「対象」はまた、ヒトを含む。用語「対象」はまた、ペットを含む。ペットの非限定的な例には、犬、猫、豚、ウサギ、ラット、マウス、スナネズミ、ハムスター、モルモット、フェレット、鳥、ヘビ、トカゲ、魚、亀、およびカエルが含まれる。用語「対象」はまた、家畜動物を含む。家畜動物の非限定的な例には、アルパカ、バイソン、ラクダ、牛、鹿、豚、馬、ラマ、ラバ、ロバ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、トナカイ、ヤク、ニワトリ、ガチョウ、および七面鳥が含まれる。
本明細書において用いられる用語「哺乳動物」は、あらゆる哺乳動物、例えば、ヒト、マウス、ウサギ、非ヒト霊長類を言う。好ましい実施形態において、哺乳動物はヒトである。
用語「ワクチン」または「ワクチン組成物」は、区別せずに用いられ、対象における免疫応答を誘発する少なくとも１つの免疫原性組成物を含む医薬組成物を言う。
概説
本発明は、Ｐ２０８６の非脂質化変異体の特定の製剤および投与スケジュールが、例えば、Ｆｌｅｔｃｈｅｒら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ＆ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｖｏｌ．７２（４）：２０８８〜２１００（２００４）において記載されているような、Ｐ２０８６のこれまでの製剤よりも高い殺菌性抗体の力価を誘発するという新規な発見に基づく。あるいは、本発明は、Ｐ２０８６の非脂質化変異体の特定の製剤および投与スケジュールが、脂質化ＬＰ２０８６変異体の市販の製剤よりも高い殺菌性抗体の力価を誘発するという新規な発見に基づく。しかし、脂質化ＬＰ２０８６の市販の製剤が現在は入手不可能であり得ることに留意されたい。より高い応答比率（ベースラインに対するＳＢＡ力価の４倍以上の増大によって規定される）が、脂質化ｒＬＰ２０８６ワクチンと比較して、非脂質化ｒＰ２０８６変異体を含有するワクチンで観察された。非脂質化Ｐ２０８６変異体の製剤は、類似の（９２％を超えるＩＤ）および多様な（９２％未満のＩＤ）ＬＰ２０８６配列の両方を有する株を含むより広範な株に対して、殺菌性抗体を誘発した。
本発明はまた、これまでに同定されていない、非脂質化Ｐ２０８６変異体を発現させる困難性を同定し、これらの困難性を克服するための方法およびそれから得られる新規な組成物を提供する。非脂質化Ｐ２０８６変異体をコードするプラスミド構築物は、非脂質化変異体の強力な発現をもたらしたが、これらの変異体は、Ｎ末端Ｃｙｓ上でピルビル化されていた。ピルビル化は、ポリペプチドの製造の一貫性または均一性の可能性を阻害するかまたは低減させる。本発明者らはさらに、非脂質化Ｐ２０８６変異体の配列からのＮ末端Ｃｙｓの欠失によって、非脂質化Ｐ２０８６変異体のピルビル化が避けられることを見出した。Ｎ末端Ｃｙｓのコドンの欠失によってピルビル化を克服しようと試みることによって、発現が無効になるか、または不溶性の変異体の発現が低減した。あるいは、非脂質化Ｐ２０８６変異体からのＮ末端Ｃｙｓの除去によって、一部の変異体における発現が減少した。しかし、驚くべきことに、本発明者らは、少なくともピルビル化されていない非脂質化Ａ０５変異体、Ｂ０１変異体、Ｂ０９変異体、およびＢ４４変異体が、Ｎ末端Ｃｙｓ残基が欠失しているにも関わらず発現され得ることを発見した。全体として、これらのポリペプチドは、対応する野生型の非脂質化配列と比較してＣｙｓ欠失以外のさらなる修飾がなくても発現され得た。例えば、実施例２および４を参照されたい。さらに、本発明者らは、ピルビル化されていない非脂質化変異体が驚くべきことに免疫原性であり、これらが殺菌性抗体を予想外に誘発することを発見した。
したがって、本発明は、非脂質化変異体の発現におけるこれらの困難性の可能性を克服するかまたは低減させるための２つの方法を提供する。しかし、さらなる方法が、本発明によって検討される。第１の方法は、Ｎ末端Ｃｙｓのすぐ下流の、Ｎ末端尾部におけるＧｌｙ／Ｓｅｒストークの長さを変化させることであった。第２の方法は、Ｎ末端尾部内でのコドンの最適化であった。しかし、さらなるコドンの最適化が、本発明によって検討される。これらの方法は、可溶性の非脂質化Ｐ２０８６変異体の発現を増強させた。例えば、１つの実施形態において、可溶性の非脂質化Ｐ２０８６変異体の増強した発現は、対応する野生型の非脂質化変異体の発現と比較したものである。
単離されたポリペプチド
本発明者らは、驚くべきことに、単離されたピルビル化されていない非脂質化ＯＲＦ２０８６ポリペプチドを発見した。本発明者らはさらに、このポリペプチドが、予想外に免疫原性であり、殺菌性の免疫応答を誘発し得ることを発見した。
本明細書において用いられる場合、用語「ピルビル化されていない」は、ピルベート含有物を有さないポリペプチドを言う。ピルベート含有物を有する非脂質化ＯＲＦ２０８６ポリペプチドは、典型的には、対応する野生型ポリペプチドと比較して＋７０の質量シフトを示した。１つの実施形態において、本発明のポリペプチドは、質量分析によって測定すると、対応する野生型の非脂質化ポリペプチドと比較して＋７０の質量シフトを示さなかった。例えば、実施例１０を参照されたい。
別の実施形態において、単離されたピルビル化されていない非脂質化ＯＲＦ２０８６ポリペプチドは、対応する野生型の非脂質化ＯＲＦ２０８６ポリペプチドと比較して、Ｎ末端システイン残基の欠失を含む。用語「Ｎ末端システイン」は、ポリペプチドのＮ末端またはＮ末端尾部のシステイン（Ｃｙｓ）を言う。さらに具体的には、本明細書において用いられる「Ｎ末端システイン」は、当技術分野において知られているように、ＬＰ２０８６リポタンパク質がトリパルミトイル脂質尾部で脂質化されている、Ｎ末端システインを言う。例えば、配列番号１２〜２１のいずれか１つを参照配列として参照する場合、Ｎ末端システインは１位に位置する。
本明細書において用いられる用語「野生型の非脂質化ＯＲＦ２０８６ポリペプチド」または「野生型の非脂質化２０８６ポリペプチド」または「野生型の非脂質化ポリペプチド」は、天然で見られる対応する成熟した脂質化ＯＲＦ２０８６ポリペプチドのアミノ酸配列に同一なアミノ酸配列を有するＯＲＦ２０８６ポリペプチドを言う。非脂質化分子と脂質化分子との間の唯一の違いは、野生型の非脂質化ＯＲＦ２０８６ポリペプチドが、Ｎ末端システインで、トリパルミトイル脂質尾部で脂質化されていないことである。
当技術分野において知られているように、非脂質化２０８６形態は、本来のリーダー配列を欠くタンパク質によって、または宿主細胞における脂肪酸アシル化のための部位を特定しない配列部分で置き換えられているリーダー配列によって、産生される。例えば、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２００３／０６３７６６を参照されたい。
非脂質化ＯＲＦ２０８６の例には、記載したばかりの野生型の非脂質化ＯＲＦ２０８６ポリペプチドだけではなく、Ｎ末端Ｃｙｓが欠失している、配列番号１２〜２１のいずれか１つに従ったアミノ酸配列を有するポリペプチド、および、Ｎ末端Ｃｙｓが置換されている、配列番号１２〜２１のいずれか１つに従ったアミノ酸配列を有するポリペプチドも含まれる。非脂質化ＯＲＦ２０８６ポリペプチドのさらなる例には、配列番号４４、配列番号４９、配列番号５５、配列番号５７、配列番号６２、および配列番号６４から選択されるアミノ酸配列が含まれる。
野生型の非脂質化ＯＲＦ２０８６ポリペプチドの例には、図２において示される配列番号１２〜２１、配列番号５８、配列番号５９、および配列番号６０のいずれか１つに従ったアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。これらの典型的な野生型の非脂質化ＯＲＦ２０８６ポリペプチドは、Ｎ末端Ｃｙｓを含む。
本明細書において用いられる場合、例えば、「非脂質化」Ｂ４４ポリペプチドは、配列番号２１、１位のＮ末端Ｃｙｓが欠失している配列番号２１、および配列番号４４から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。「野生型の非脂質化」Ｂ４４ポリペプチドは、配列番号２１のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。「ピルビル化されていない非脂質化」Ｂ４４ポリペプチドは、１位のＮ末端Ｃｙｓが欠失している配列番号２１、および配列番号４４から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
別の実施例として、本明細書において用いられる場合、「非脂質化」Ｂ０９ポリペプチドは、配列番号１８、１位のＮ末端Ｃｙｓが欠失している配列番号１８、配列番号４９、および配列番号５０から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。「野生型の非脂質化」Ｂ０９ポリペプチドは、配列番号１８のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。「ピルビル化されていない非脂質化」Ｂ０９は、１位のＮ末端Ｃｙｓが欠失している配列番号１８、配列番号４９、および配列番号５０から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
さらなる実施例として、本明細書において用いられる場合、「非脂質化」Ａ０５ポリペプチドは、配列番号１３、１位のＮ末端Ｃｙｓが欠失している配列番号１３、および配列番号５５から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。「野生型の非脂質化」Ａ０５は、配列番号１３のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。「ピルビル化されていない非脂質化」Ａ０５は、１位のＮ末端Ｃｙｓが欠失している配列番号１３、および配列番号５５から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
本明細書において用いられる、Ｎ末端Ｃｙｓの「欠失」という用語は、野生型の非脂質化ポリペプチド配列と比較してＮ末端Ｃｙｓを欠失させる突然変異を含む。例えば、Ｎ末端Ｃｙｓの「欠失」は、参照配列からの、例えば対応する野生型配列からのアミノ酸Ｃｙｓの除去を言い、これによって、参照配列と比較してアミノ酸残基が減少する。
別の実施形態において、Ｎ末端Ｃｙｓは、Ｃｙｓ残基ではないアミノ酸で置換されている。例えば、典型的な実施形態において、配列番号１２〜２１の１位のＮ末端Ｃｙｓは、１位でのＣ→Ｇ置換を含む。例えば、配列番号１９（Ｂ２２野生型）と比較した配列番号６２、および配列番号１５（Ａ２２野生型）と比較した配列番号６４を参照されたい。Ｎ末端Ｃｙｓを置き換えるための典型的なアミノ酸には、あらゆる非Ｃｙｓアミノ酸、好ましくは極性の非荷電アミノ酸、例えばグリシンが含まれる。好ましい実施形態において、置換は、Ｃｙｓに対して非保存的な残基で行われる。
本発明者らは、驚くべきことに、Ｎ末端Ｃｙｓ残基の欠失を有する非脂質化ＯＲＦ２０８６ポリペプチドの発現によって、質量分析によって測定すると、対応する野生型の非脂質化ＯＲＦ２０８６ポリペプチドと比較して、検出可能なピルビル化が生じないことを発見した。ピルビル化されていない非脂質化ＯＲＦ２０８６ポリペプチドの例には、１位のシステインが欠失している、配列番号１２（Ａ０４）、配列番号１３（Ａ０５）、配列番号１４（Ａ１２）、配列番号１５（Ａ２２）、配列番号１６（Ｂ０２）、配列番号１７（Ｂ０３）、配列番号１８（Ｂ０９）、配列番号１９（Ｂ２２）、配列番号２０（Ｂ２４）、および配列番号２１（Ｂ４４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するものが含まれる。単離されたピルビル化されていない非脂質化ＯＲＦ２０８６ポリペプチドのさらなる例には、配列番号４４、配列番号４９、配列番号５０、および配列番号５５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。好ましくは、ピルビル化されていない非脂質化２０８６ポリペプチドは、少なくとも約２５０個、２５５個、または２６０個の連続的なアミノ酸、最大約２７０個、２６９個、２６８個、２６７個、２６６個、２６５個、２６４個、２６３個、２６０個、２５９個、２５８個、２５７個、２５６個、または２５５個の連続的なアミノ酸を含む。範囲を規定するために、あらゆる最小値をあらゆる最大値と組み合わせることができる。さらに好ましくは、ポリペプチドは、少なくとも２５４個または２６２個の連続的なアミノ酸を有する。
１つの実施形態において、単離されたピルビル化されていない非脂質化ＯＲＦ２０８６ポリペプチドは、発現系に作動可能に連結したヌクレオチド配列によってコードされ、発現系は、細菌細胞において発現され得る。典型的な実施形態において、ヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の発現を制御する調節配列に連結される。
適切な発現系、調節配列、および細菌細胞は、当技術分野において知られている。例えば、ポリペプチドが細菌細胞において発現され得る限りにおいて、あらゆるプラスミド発現ベクター、例えばＰＥＴ（商標）（Ｎｏｖｏｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ．）またはＰＭＡＬ（商標）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓｓ．）を用いることができる。好ましくは、ＰＥＴ（商標）ベクターが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における組換えタンパク質のクローニングおよび発現に用いられる。ＰＥＴ（商標）系において、クローニングされた遺伝子は、ファージＴ７プロモーターの制御下で発現され得る。典型的な細菌細胞には、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）および好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が含まれる。
１つの態様において、本発明は、本プロセスによって得ることが可能なピルビル化されていない非脂質化ＯＲＦ２０８６ポリペプチドに関する。ポリペプチドは、好ましくは単離されている。本発明はさらに、本プロセスによって得ることが可能なピルビル化されていない非脂質化ＯＲＦ２０８６ポリペプチドを含む組成物に関する。組成物は、好ましくは免疫原性組成物である。プロセスは、１位のシステインが欠失している、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、および配列番号２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現させることを含む。ヌクレオチド配列は、細菌細胞において発現され得る発現系に作動可能に連結している。１つの実施形態において、プロセスは、配列番号４４、配列番号４９、配列番号５０、および配列番号５５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現させることを含む。別の実施形態において、ヌクレオチド配列は、配列番号４３、配列番号５１、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４５、配列番号５４からなる群から選択される。好ましくは、細菌細胞は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。
１つの態様において、本発明は、配列番号４９で示されるアミノ酸配列を含む第１の単離されたポリペプチド、および配列番号４４で示されるアミノ酸配列を含む第２の単離されたポリペプチドを含む組成物に関する。好ましい実施形態において、ポリペプチドは免疫原性である。別の好ましい実施形態において、組成物はさらに、血清群Ｂの髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＯＲＦ２０８６サブファミリーＡポリペプチドを含む。好ましくは、ＯＲＦ２０８６サブファミリーＡポリペプチドは、ピルビル化されていない非脂質化ＯＲＦ２０８６サブファミリーＡポリペプチドである。典型的な実施形態において、ＯＲＦ２０８６サブファミリーＡポリペプチドはＡ０５であり、この例には、例えば、１位のＮ末端システインが欠失している配列番号１３、および配列番号５５が含まれる。
別の態様において、本発明は、単離されたポリペプチドを産生するための方法に関する。本方法は、配列番号２１に対する９０％を超える同一性を有する配列を含むポリペプチドを細菌細胞において発現させることを含み、前記配列は、配列番号２１のアミノ酸１３〜１８、配列番号２１のアミノ酸２１〜３４、および配列番号２１のアミノ酸７０〜８０からなる群から選択される少なくとも１つのドメイン、またはその組み合わせを含み、ポリペプチドは、Ｎ末端システインを欠いている。本方法はさらに、ポリペプチドを精製することを含む。前記方法において産生されるポリペプチドは、ピルビル化されていない非脂質化ＯＲＦ２０８６ポリペプチドを含む。好ましくは、ポリペプチドは免疫原性である。好ましい実施形態において、細菌細胞は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。
配列番号２１のアミノ酸１３〜１８、配列番号２１のアミノ酸２１〜３４、および配列番号２１のアミノ酸７０〜８０からなる群から選択される少なくとも１つのドメイン、またはその組み合わせを含むポリペプチドの例には、配列番号１２（Ａ０４）、配列番号１３（Ａ０５）、配列番号１４（Ａ１２）、配列番号１５（Ａ２２）、配列番号１６（Ｂ０２）、配列番号１７（Ｂ０３）、配列番号１８（Ｂ０９）、配列番号１９（Ｂ２２）、配列番号２０（Ｂ２４）、および配列番号２１（Ｂ４４）が含まれる。好ましくは、これらのポリペプチドの１位のシステインは欠失している。さらなる典型的なポリペプチドには、配列番号４４、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５５、配列番号６２、および配列番号６４が含まれる。
１つの典型的な実施形態において、単離されたポリペプチド配列は、配列番号２１のアミノ酸９６〜１１６、配列番号２１のアミノ酸１５８〜１７０、配列番号２１のアミノ酸１７２〜１８５、配列番号２１のアミノ酸１８７〜１９９、配列番号２１のアミノ酸２１３〜２２４、配列番号２１のアミノ酸２２６〜２３７、配列番号２１のアミノ酸２３９〜２４８からなる群から選択される少なくとも１つのドメイン、またはその組み合わせをさらに含む。配列番号２１のアミノ酸１３〜１８、配列番号２１のアミノ酸２１〜３４、および配列番号２１のアミノ酸７０〜８０からなる群から選択される少なくとも１つのドメイン、またはその組み合わせを含み、かつ配列番号２１のアミノ酸９６〜１１６、配列番号２１のアミノ酸１５８〜１７０、配列番号２１のアミノ酸１７２〜１８５、配列番号２１のアミノ酸１８７〜１９９、配列番号２１のアミノ酸２１３〜２２４、配列番号２１のアミノ酸２２６〜２３７、配列番号２１のアミノ酸２３９〜２４８からなる群から選択される少なくとも１つのドメイン、またはその組み合わせをさらに含むポリペプチドの例には、配列番号１６（Ｂ０２）、配列番号１７（Ｂ０３）、配列番号１８（Ｂ０９）、配列番号１９（Ｂ２２）、配列番号２０（Ｂ２４）、および配列番号２１（Ｂ４４）が含まれる。好ましくは、これらのポリペプチドの１位のシステインは欠失している。さらなる典型的なポリペプチドには、配列番号４４、配列番号４９、配列番号５０、および配列番号５５、および配列番号６２から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。
１つの態様において、本発明は、本明細書において記載されるプロセスによって産生される、単離されたポリペプチドに関する。１つの実施形態において、単離されたポリペプチドは、ピルビル化されていない非脂質化ポリペプチドである。別の態様において、本発明は、本明細書において記載されるプロセスによって産生される免疫原性組成物に関する。
１つの態様において、本発明は、１位のＮ末端Ｃｙｓが欠失している配列番号１８、または配列番号４９で示されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドに関する。配列番号４９をコードする典型的なヌクレオチド配列には、配列番号４６、配列番号４７、および配列番号４８から選択される配列が含まれる。好ましくは、ヌクレオチド配列は配列番号４６である。１つの態様において、本発明は、配列番号４６を含む単離されたヌクレオチド配列に関する。１つの態様において、本発明は、配列番号４７を含む単離されたヌクレオチド配列に関する。１つの態様において、本発明は、配列番号４８を含む単離されたヌクレオチド配列に関する。
１つの態様において、本発明は、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、および配列番号４５から選択されるヌクレオチド配列を含むプラスミドに関するものであり、プラスミドは、細菌細胞において発現され得る。上記のように、適切な発現系、調節配列、および細菌細胞は、当技術分野において知られている。好ましくは、細菌細胞は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。
別の態様において、本発明は、配列番号５０で示されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドに関する。典型的な実施形態において、配列番号５０は、配列番号４５によってコードされる。
さらに別の態様において、本発明は、Ｎ末端Ｃｙｓが欠失している配列番号２１、または配列番号４４で示されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドに関する。配列番号４４をコードする典型的なヌクレオチド配列には、配列番号４３および配列番号５１から選択される配列が含まれる。好ましくは、ヌクレオチド配列は配列番号４３である。１つの態様において、本発明は、配列番号４３を含む単離されたヌクレオチド配列に関する。
免疫原性組成物
好ましい実施形態において、単離されたピルビル化されていない非脂質化ＯＲＦ２０８６ポリペプチドを含む、本明細書において記載される組成物は、免疫原性である。髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ＯＲＦ２０８６のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質を含む免疫原性組成物は、当技術分野において知られている。典型的な免疫原性組成物には、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる、ＷＯ２００３／０６３７６６および米国特許出願公開第ＵＳ２００６０２５７４１３号および米国特許出願公開第ＵＳ２００９０２０２５９３号において記載されているものが含まれる。これらの文献において記載されるこのような免疫原性組成物は、ＯＲＦ２０８６タンパク質として同定される、殺菌活性を示すタンパク質、その免疫原性部分、および／またはその生物学的同等物を含む。ＯＲＦ２０８６タンパク質とは、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種のオープンリーディングフレーム２０８６によってコードされるタンパク質を言う。
タンパク質は、天然のナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種に由来する組換えタンパク質または単離されたタンパク質であり得る。例えば、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）ＯＲＦ２０８６タンパク質は、細菌株、例えば、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（血清群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｗ−１３５、Ｘ、Ｙ、Ｚ、および２９Ｅ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、およびナイセリア・ラクタミカ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉｃａ）の株を含む、ナイセリア種（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）の細菌株、ならびに前記タンパク質の免疫原性部分および／または生物学的同等物から単離することができる。
ＯＲＦ２０８６タンパク質は、２０８６サブファミリーＡタンパク質およびサブファミリーＢタンパク質、その免疫原性部分、ならびに／またはその生物学的同等物を含む。２０８６サブファミリーＡタンパク質および２０８６サブファミリーＢタンパク質は、当技術分野において知られており、例えば、上記で引用されたＦｌｅｔｃｈｅｒら、２００４、およびＭｕｒｐｈｙら、Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．２００９ Ａｕｇ １；２００（３）：３７９〜８９を参照されたい。また、配列番号２６０から２７８を２０８６サブファミリーＡのタンパク質に関連する代表的なアミノ酸配列として開示している、ＷＯ２００３／０６３７６６を参照されたい。さらに、ＷＯ２００３／０６３７６６において、配列番号２７９から２９９が、２０８６サブファミリーＢのタンパク質に関連する代表的なアミノ酸配列として開示されている。ＷＯ２００３／０６３７６６は、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。ＯＲＦ２０８６タンパク質またはその同等物などは、脂質化されていても脂質化されていなくてもよい。好ましくは、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）ＯＲＦ２０８６タンパク質は、脂質化されていない。あるいは、免疫原性組成物は、脂質化ＯＲＦ２０８６タンパク質および非脂質化ＯＲＦ２０８６タンパク質の組み合わせであり得る。
１つの実施形態において、免疫原性組成物は、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）ＯＲＦ２０８６のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質に対する少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、単離されたタンパク質を含む。
１つの実施形態において、免疫原性組成物は、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）ＯＲＦ２０８６のヌクレオチド配列によってコードされるサブファミリーＡタンパク質に対する少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、単離されたタンパク質を含む。好ましくは、免疫原性組成物は、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）ＯＲＦ２０８６のヌクレオチド配列によってコードされる、単離されたサブファミリーＡタンパク質を含む。一部の実施形態において、ＯＲＦ２０８６サブファミリーＡポリペプチドは、Ａ０５変異体、Ａ０４変異体、Ａ１２変異体、またはＡ２２変異体である。
一部の実施形態において、ＯＲＦ２０８６サブファミリーＡポリペプチドは、Ａ０５変異体、Ａ１２変異体、またはＡ２２変異体である。
別の実施形態において、免疫原性組成物は、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）ＯＲＦ２０８６のヌクレオチド配列によってコードされるサブファミリーＢタンパク質に対する少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、単離されたタンパク質を含む。好ましくは、免疫原性組成物は、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）ＯＲＦ２０８６のヌクレオチド配列によってコードされる、単離されたサブファミリーＢタンパク質を含む。一部の実施形態において、ＯＲＦ２０８６サブファミリーＢタンパク質は、Ｂ４４変異体、Ｂ０２変異体、Ｂ０３変異体、Ｂ２２変異体、Ｂ２４変異体、またはＢ０９変異体である。一部の実施形態において、ＯＲＦ２０８６サブファミリーＢタンパク質は、Ｂ４４変異体、Ｂ２２変異体、またはＢ０９変異体である。
好ましい実施形態において、免疫原性組成物は、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）ＯＲＦ２０８６のヌクレオチド配列によってコードされるサブファミリーＢタンパク質に対する少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、単離されたピルビル化されていない非脂質化ポリペプチドを含む。例えば、一部の実施形態において、ＯＲＦ２０８６サブファミリーＢタンパク質は、Ｎ末端Ｃｙｓが欠失している、配列番号２１で示されるアミノ酸配列を有するＢ４４変異体、配列番号１６で示されるアミノ酸配列を有するＢ０２変異体、配列番号１７で示されるアミノ酸配列を有するＢ０３変異体、配列番号１９で示されるアミノ酸配列を有するＢ２２変異体、配列番号２０で示されるアミノ酸配列を有するＢ２４変異体、もしくは配列番号１８で示されるアミノ酸配列を有するＢ０９変異体から選択される配列、またはその組み合わせである。
さらに好ましくは、免疫原性組成物は、ピルビル化されていない非脂質化Ｂ０９ポリペプチド、ピルビル化されていない非脂質化Ｂ４４ポリペプチド、またはその組み合わせを含む。１つの実施形態において、組成物は、Ｎ末端Ｃｙｓが欠失している配列番号１８で示されるアミノ酸配列を有するピルビル化されていない非脂質化Ｂ０９変異体、Ｎ末端Ｃｙｓが欠失している配列番号２１で示されるアミノ酸配列を有する、ピルビル化されていない非脂質化Ｂ４４、またはその組み合わせを含む。別の実施形態において、免疫原性組成物は、配列番号４９を有するピルビル化されていない非脂質化Ｂ０９、配列番号４４を有するピルビル化されていない非脂質化Ｂ４４、またはその組み合わせを含む。
１つの態様において、本発明は、血清群Ｂの髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＯＲＦ２０８６サブファミリーＢポリペプチドを含む免疫原性組成物に関するものであり、ポリペプチドは、ピルビル化されていない非脂質化Ｂ４４である。Ｂ４４は、Ｎ末端Ｃｙｓが欠失している配列番号２１、または配列番号４４で示されるアミノ酸配列を含み得る。１つの実施形態において、組成物はさらに、血清群Ｂの髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の第２のＯＲＦ２０８６サブファミリーＢポリペプチドを含み、第２のポリペプチドは、ピルビル化されていない非脂質化Ｂ０９である。Ｂ０９は、Ｎ末端Ｃｙｓが欠失している配列番号１８、または配列番号４９で示されるアミノ酸配列を含み得る。１つの実施形態において、免疫原性組成物はワクチンである。
別の実施形態において、組成物は、３つ以下のＯＲＦ２０８６サブファミリーＢポリペプチドを含む。さらなる実施形態において、組成物は、２つ以下のＯＲＦ２０８６サブファミリーＢポリペプチドを含む。
１つの実施形態において、組成物はさらに、１つまたは複数のＯＲＦ２０８６サブファミリーＡポリペプチドを含む。好ましい実施形態において、組成物は、Ａ０５サブファミリーＡポリペプチドを含む。
さらに別の実施形態において、免疫原性組成物は、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）ＯＲＦ２０８６のヌクレオチド配列によってコードされるサブファミリーＡタンパク質に対する少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、単離されたタンパク質、およびナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）ＯＲＦ２０８６のヌクレオチド配列によってコードされるサブファミリーＢタンパク質に対する少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、単離されたタンパク質を含む。
好ましくは、免疫原性組成物は、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）ＯＲＦ２０８６のヌクレオチド配列によってコードされる、単離されたサブファミリーＡタンパク質、およびナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）ＯＲＦ２０８６のヌクレオチド配列によってコードされる、単離されたサブファミリーＢタンパク質を含む。さらに好ましくは、免疫原性組成物は、単離されたピルビル化されていない非脂質化サブファミリーＡ ＯＲＦ２０８６ポリペプチド、および単離されたピルビル化されていない非脂質化サブファミリーＢ ＯＲＦ２０８６ポリペプチドを含む。一部の実施形態において、ＯＲＦ２０８６サブファミリーＡポリペプチドは、Ａ０５変異体、Ａ０４変異体、Ａ１２変異体、またはＡ２２変異体である。好ましい実施形態において、ＯＲＦ２０８６サブファミリーＡポリペプチドは、配列番号１３で示されるアミノ酸配列を有するＡ０５、配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有するＡ０４、配列番号１４で示されるアミノ酸配列を有するＡ１２、またはＮ末端Ｃｙｓが欠失している配列番号１５で示されるアミノ酸配列を有するＡ２２変異体、またはそのあらゆる組み合わせである。一部の実施形態において、ＯＲＦ２０８６サブファミリーＢタンパク質は、Ｂ４４変異体、Ｂ０２変異体、Ｂ０３変異体、Ｂ２２変異体、Ｂ２４変異体、またはＢ０９変異体である。好ましい実施形態において、ＯＲＦ２０８６サブファミリーＢタンパク質は、配列番号２１で示されるアミノ酸配列を有するＢ４４、配列番号１６で示されるアミノ酸配列を有するＢ０２、配列番号１７で示されるアミノ酸配列を有するＢ０３、配列番号１９で示されるアミノ酸配列を有するＢ２２、配列番号２０で示されるアミノ酸配列を有するＢ２４、または末端Ｃｙｓが欠失している配列番号１８で示されるアミノ酸配列を有するＢ０９変異体、またはその組み合わせである。
１つの実施形態において、免疫原性組成物は、サブファミリーＢタンパク質に対して１：１の比率のサブファミリーＡタンパク質を含む。
別の態様において、本明細書において記載される単離されたポリペプチドおよび組成物は、血清群Ｂの髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＯＲＦ２０８６ポリペプチドに対する、哺乳動物における殺菌性の免疫応答を誘発する。組成物は、哺乳動物に投与された後に殺菌性の抗髄膜炎菌抗体を誘発する能力を有し、好ましい実施形態において、それぞれのサブファミリーを有する株に対して殺菌性である抗体を誘発し得る。殺菌性の応答についてのさらなる情報は以下で示される。例えば、実施例６、１１、１２、および１３を参照されたい。殺菌性抗体はヒトにおける防御の指標であり、前臨床研究は代替手段として役立ち、あらゆる新規な免疫原性組成物候補がこれらの機能的抗体を誘発するはずである。
典型的な実施形態において、１位のＮ末端Ｃｙｓが欠失している配列番号１８、または配列番号４９を有する、単離されたピルビル化されていない非脂質化Ｂ０９ポリペプチド、およびその免疫原性組成物は、血清群Ｂの髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のサブファミリーＡまたは好ましくはサブファミリーＢのＯＲＦ２０８６ポリペプチドに対する（例えば、それに結合し得る）殺菌性抗体を誘発する。好ましくは、ピルビル化されていない非脂質化Ｂ０９ポリペプチドおよびその免疫原性組成物は、Ａ０５変異体（配列番号１３）、Ｂ４４変異体（配列番号２１）、Ｂ１６変異体（配列番号６０）、Ｂ２４変異体（配列番号２０）、Ｂ０９変異体（配列番号１８）、またはその組み合わせに対する殺菌性抗体を誘発する。典型的な実施形態において、ピルビル化されていない非脂質化Ｂ０９ポリペプチドおよびその免疫原性組成物は、Ｂ４４変異体（配列番号２１）、Ｂ１６変異体（配列番号６０）、Ｂ２４変異体（配列番号２０）、Ｂ０９変異体（配列番号１８）、またはその組み合わせに対する殺菌性抗体を誘発する。例えば、実施例１１、実施例１２、および実施例１３を参照されたい。
別の典型的な実施形態において、１位のＮ末端Ｃｙｓが欠失している配列番号２１、または配列番号４４を有する、単離されたピルビル化されていない非脂質化Ｂ４４ポリペプチド、およびその免疫原性組成物は、血清群Ｂの髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のサブファミリーＢのＯＲＦ２０８６ポリペプチドに対する（例えば、それに結合し得る）殺菌性抗体を誘発する。好ましくは、ピルビル化されていない非脂質化Ｂ４４ポリペプチドおよびその免疫原性組成物は、Ｂ４４変異体（配列番号２１）、Ｂ１６変異体（配列番号６０）、Ｂ２４変異体（配列番号２０）、Ｂ０９変異体（配列番号１８）、またはその組み合わせに対する殺菌性抗体を誘発する。例えば、実施例１１を参照されたい。さらに、ピルビル化されていない非脂質化Ｂ４４ポリペプチドおよびその免疫原性組成物はまた、Ｂ０２変異体（配列番号１６）に結合する殺菌性抗体を誘発し得る。例えば、実施例１２および実施例１３を参照されたい。さらに、ピルビル化されていない非脂質化Ｂ４４ポリペプチドおよびその免疫原性組成物はまた、Ｂ０３変異体（配列番号１７）およびＢ１５変異体（配列番号５９）に結合する殺菌性抗体を誘発し得る。例えば、実施例６を参照されたい。
さらなる典型的な実施形態において、１位のＮ末端Ｃｙｓが欠失している配列番号１９を有する、単離されたピルビル化されていない非脂質化Ｂ２２ポリペプチド、およびその免疫原性組成物は、血清群Ｂの髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のサブファミリーＢのＯＲＦ２０８６ポリペプチドに対する（例えば、それに結合し得る）殺菌性抗体を誘発する。好ましくは、ピルビル化されていない非脂質化Ｂ２２ポリペプチドは、Ｂ４４変異体（配列番号２１）、Ｂ１６変異体（配列番号６０）、Ｂ２４変異体（配列番号２０）、Ｂ０９変異体（配列番号１８）、またはその組み合わせに対する殺菌性抗体を誘発する。例えば、実施例１３を参照されたい。
１つの実施形態において、Ｎ末端Ｃｙｓが欠失している配列番号１３、または配列番号５５を有する、単離されたピルビル化されていない非脂質化Ａ０５ポリペプチド、およびその免疫原性組成物は、血清群Ｂの髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のサブファミリーＡのＯＲＦ２０８６ポリペプチドに対する（例えば、それに結合し得る）殺菌性抗体を誘発する。好ましくは、ピルビル化されていない非脂質化Ａ０５およびその免疫原性組成物は、Ａ０５変異体（配列番号１３）、Ａ２２変異体（配列番号１５）、Ａ１２変異体（配列番号１４）、またはその組み合わせに対する殺菌性抗体を誘発する。例えば、実施例６および１３を参照されたい。
１つの態様において、本発明は、哺乳動物において血清群Ｂの髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に特異的な殺菌性抗体を誘発する方法に関する。典型的な実施形態において、本方法は、ＯＲＦ２０８６サブファミリーＢ血清群Ｂ髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ＯＲＦ２０８６サブファミリーＡ血清群Ｂ髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、またはその組み合わせに特異的な殺菌性抗体を誘発することを含む。本方法は、効果的な量の、上記のような単離されたピルビル化されていない非脂質化２０８６ポリペプチドまたはその免疫原性組成物を哺乳動物に投与することを含む。
好ましい実施形態において、本方法は、ＯＲＦ２０８６サブファミリーＢ血清群Ｂ髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に特異的な殺菌性抗体を誘発することを含む。単離されたポリペプチドまたは免疫原性組成物は、ピルビル化されていない非脂質化Ｂ４４ポリペプチドを含む。別の好ましい実施形態において、組成物はさらに、ピルビル化されていない非脂質化Ｂ０９ポリペプチドを含む。典型的な実施形態において、単離されたポリペプチドまたは免疫原性組成物は、配列番号４９、配列番号４４、またはその組み合わせを含む。別の典型的な実施形態において、単離されたポリペプチドまたは免疫原性組成物は、１位のＮ末端Ｃｙｓが欠失している配列番号１８、１位のＮ末端Ｃｙｓが欠失している配列番号２１、またはその組み合わせを含む。さらに別の典型的な実施形態において、単離されたポリペプチドまたは免疫原性組成物は、１位のＮ末端Ｃｙｓが欠失している配列番号１９を含む。
好ましい実施形態において、本方法は、ＯＲＦ２０８６サブファミリーＡ血清群Ｂの髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に特異的な殺菌性抗体を誘発することを含む。単離されたポリペプチドまたは免疫原性組成物は、ピルビル化されていない非脂質化Ａ０５ポリペプチドを含む。好ましい実施形態において、単離されたポリペプチドまたは免疫原性組成物は、１位のＮ末端Ｃｙｓが欠失している配列番号１３を含む。別の好ましい実施形態において、組成物はさらに、ピルビル化されていない非脂質化Ｂ４４ポリペプチドを含む。例えば、実施例６および１３を参照されたい。典型的な実施形態において、単離されたポリペプチドまたは免疫原性組成物は、配列番号５５、配列番号４４、またはその組み合わせを含む。好ましい実施形態において、単離されたポリペプチドまたは免疫原性組成物は、１位のＮ末端Ｃｙｓが欠失している配列番号１３、１位のＮ末端Ｃｙｓが欠失している配列番号２１、またはその組み合わせを含む。
免疫原性組成物は、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）ＯＲＦ２０８６のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質、ポリヌクレオチド、またはその同等物を、免疫原性組成物における単独の活性免疫原として含み得る。あるいは、免疫原性組成物はさらに、他のナイセリア種（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｐ．）の免疫原性ポリペプチド、または１つもしくは複数の他の微生物病原体（例えば、限定はしないが、ウイルス、プリオン、細菌、または真菌）の免疫学的に活性なタンパク質、または莢膜多糖を含む、活性免疫原を含み得る。組成物は、選択された指示に望ましい、１つまたは複数の所望のタンパク質、断片、または医薬化合物を含み得る。
あらゆる多抗原免疫原性組成物または多価免疫原性組成物が、本発明によって検討される。例えば、免疫原性組成物は、２つ以上のＯＲＦ２０８６タンパク質の組み合わせ、ＯＲＦ２０８６タンパク質と１つもしくは複数のＰｏｒＡタンパク質との組み合わせ、ＯＲＦ２０８６タンパク質と髄膜炎菌（ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ）血清群Ａ、Ｃ、Ｙ、およびＷ１３５多糖ならびに／もしくは多糖コンジュゲートとの組み合わせ、ＯＲＦ２０８６タンパク質と髄膜炎菌（ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ）および肺炎球菌（ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）の組み合わせとの組み合わせ、または所望の投与、例えば粘膜送達に適切な形態の前述のもののいずれかの組み合わせを含み得る。当業者であれば、このような多抗原免疫原性組成物または多価免疫原性組成物を容易に製剤し得よう。
本発明はまた、病原体に対して有用なあらゆる組成物を、本発明の組成物内に、または本発明の組成物と組み合わせることができる、多免疫化レジメンを検討する。例えば、限定はしないが、患者に、ヒトパピローマウイルスウイルス（ＨＰＶ）に対して免疫化するため、本発明の免疫原性組成物および別の免疫学的組成物、例えば、ＨＰＶワクチンＧＡＲＤＡＳＩＬ（登録商標）を、多免疫化レジメンの一部として投与することができる。当業者であれば、多免疫化レジメンを開発および実行する目的で本発明の免疫原性組成物と組み合わせて用いるための免疫原性組成物を、容易に選択することができよう。
ＯＲＦ２０８６ポリペプチド、断片、および同等物は、コンジュゲート免疫原性組成物の一部として用いることができ、１つまたは複数のタンパク質またはポリペプチドは、いくつかの血清型、すなわち髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の血清型、具体的には髄膜炎菌血清群、具体的には血清群Ｂに対する、および／またはいくつかの疾患に対する免疫原性特性を有する組成物を生成するために、担体にコンジュゲートさせることができる。あるいは、ＯＲＦ２０８６ポリペプチドの１つを、他の免疫原性ポリペプチドのための担体タンパク質として用いることができる。このような免疫原性組成物の製剤は、当業者に周知である。
本発明の免疫原性組成物は、好ましくは、薬学的に許容できる担体を含む。適切な薬学的に許容できる担体および／または希釈剤は、あらゆるおよび全ての従来の溶媒、分散媒質、充填剤、固体担体、水性溶液、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。適切な薬学的に許容できる担体には、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝溶液、デキストロース、グリセロール、エタノールなどの１つまたは複数、およびその組み合わせが含まれる。
薬学的に許容できる担体はさらに、抗体の保存期間または有効性を増強させる、少量の補助物質、例えば湿潤剤もしくは乳化剤、防腐剤、または緩衝液を含み得る。薬学的に許容できる担体の調製および使用は、当技術分野において周知である。あらゆる従来の培地または作用物質が活性成分と不適合である場合を除いて、本発明の免疫原性組成物におけるその使用が検討される。
免疫原性組成物は、非経口的に、例えば、皮下または筋肉内の注射によって、および経口的に、または鼻腔内に投与することができる。筋肉内免疫化のための方法は、Ｗｏｌｆｆら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ；１１（４）：４７４〜８５（１９９１）、およびＳｅｄｅｇａｈら、ＰＮＡＳ Ｖｏｌ．９１、ｐｐ．９８６６〜９８７０（１９９４）によって記載されている。他の投与態様は、例えば、限定はしないが、経口製剤、肺製剤、坐剤、および経皮塗布を採用する。経口製剤は、例えば、限定はしないが、薬学的グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの、通常採用される賦形剤を例えば採用する。好ましくは、免疫原性組成物は筋肉内に投与される。
本発明の免疫原性組成物はさらに、免疫系を混乱させるかまたは改変して液性および／または細胞介在性の免疫性の上方調節または下方調節が観察されるようにする作用物質である、１つまたは複数のさらなる「免疫調節物質」を含み得る。１つの特定の実施形態において、液性および／または細胞介在性の免疫系の上方調節が好ましい。特定の免疫調節物質の例には、例えば、アジュバントまたはサイトカイン、またはとりわけ米国特許第５，２５４，３３９号において記載されているＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（ＣＳＬ Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）が含まれる。
本発明のワクチンにおいて用いることができるアジュバントの非限定的な例には、ＲＩＢＩアジュバント系（Ｒｉｂｉ Ｉｎｃ．、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｍｏｎｔ．）、ミョウバン、無機物ゲル、例えば水酸化アルミニウムゲル、水中油型エマルジョン、油中水型エマルジョン、例えば、フロイント完全アジュバントおよび不完全アジュバント、ブロックコポリマー（ＣｙｔＲｘ、Ａｔｌａｎｔａ Ｇａ．）、ＱＳ−２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｍａｓｓ．）、ＳＡＦ−Ｍ（Ｃｈｉｒｏｎ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ Ｃａｌｉｆ．）、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）アジュバント、サポニン、Ｑｕｉｌ Ａ、または他のサポニン画分、モノホスホリル脂質Ａ、ならびにアブリジン脂質−アミンアジュバントが含まれる。本発明のワクチンにおいて有用な水中油型エマルジョンの非限定的な例には、修飾されたＳＥＡＭ６２およびＳＥＡＭ１／２製剤が含まれる。修飾されたＳＥＡＭ６２は、５％（ｖ／ｖ）のスクアレン（Ｓｉｇｍａ）、１％（ｖ／ｖ）のＳＰＡＮ（登録商標）８５洗剤（ＩＣＩ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ）、０．７％（ｖ／ｖ）のｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ（登録商標）８０洗剤（ＩＣＩ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ）、２．５％（ｖ／ｖ）のエタノール、２００μｇ／ｍｌのＱｕｉｌ Ａ、１００μｇ／ｍｌのコレステロール、および０．５％（ｖ／ｖ）のレシチンを含有する、水中油型エマルジョンである。修飾されたＳＥＡＭ１／２は、５％（ｖ／ｖ）のスクアレン、１％（ｖ／ｖ）のＳＰＡＮ（登録商標）８５洗剤、０．７％（ｖ／ｖ）のポリソルベート８０洗剤、２．５％（ｖ／ｖ）のエタノール、１００μｇ／ｍｌのＱｕｉｌ Ａ、および５０μｇ／ｍｌのコレステロールを含む、水中油型エマルジョンである。
ワクチンに含まれ得る他の「免疫調節物質」には、例えば、１つまたは複数のインターロイキン、インターフェロン、または他の既知のサイトカインもしくはケモカインが含まれる。１つの実施形態において、アジュバントは、それぞれ米国特許第６，１６５，９９５号および米国特許第６，６１０，３１０号において記載されているものなどの、シクロデキストリン誘導体またはポリアニオン系ポリマーであり得る。用いられる免疫調節物質および／またはアジュバントは、ワクチンまたは免疫原性組成物が投与される対象、注射の経路、および投与する注射の数に応じることが理解されるべきである。
一部の実施形態において、アジュバントはサポニンである。一部の実施形態において、サポニンの濃度は、１μｇ／ｍｌと２５０μｇ／ｍｌとの間、５μｇ／ｍｌと１５０μｇ／ｍｌとの間、または１０μｇ／ｍｌと１００μｇ／ｍｌとの間である。一部の実施形態において、サポニンの濃度は、約１μｇ／ｍｌ、約５μｇ／ｍｌ、約１０μｇ／ｍｌ、約２０μｇ／ｍｌ、約３０μｇ／ｍｌ、約４０μｇ／ｍｌ、約５０μｇ／ｍｌ、約６０μｇ／ｍｌ、約７０μｇ／ｍｌ、約８０μｇ／ｍｌ、約９０μｇ／ｍｌ、約１００μｇ／ｍｌ、約１１０μｇ／ｍｌ、約１２０μｇ／ｍｌ、約１３０μｇ／ｍｌ、約１４０μｇ／ｍｌ、約１５０μｇ／ｍｌ、約１６０μｇ／ｍｌ、約１７０μｇ／ｍｌ、約１８０μｇ／ｍｌ、約１９０μｇ／ｍｌ、約２００μｇ／ｍｌ、約２１０μｇ／ｍｌ、約２２０μｇ／ｍｌ、約２３０μｇ／ｍｌ、約２４０μｇ／ｍｌ、または約２５０μｇ／ｍｌである。
特定の好ましい実施形態において、本発明のタンパク質は、粘膜アジュバントを含み、そしてヒト宿主における髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）感染を治療または予防するために用いられる、経口投与のための免疫原性組成物において用いられる。粘膜アジュバントはコレラ毒素であり得るが、好ましくは、本発明に従って用いることができるコレラ毒素以外の粘膜アジュバントには、Ａサブユニットが突然変異生成されたコレラホロトキシンの無毒誘導体、化学的に修飾されたコレラ毒素、またはコレラ毒素のアミノ酸配列の修飾によって産生される関連タンパク質が含まれる。本発明の免疫原性組成物の調製において得に有用であり得る特異的なコレラ毒素については、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる国際出願公開ＷＯ００／１８４３４において開示されている、突然変異コレラホロトキシンＥ２９Ｈを参照されたい。これらは、本発明のポリペプチドに付加またはコンジュゲートすることができる。同一の技術を、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の易熱性毒素（ＬＴ）などの、粘膜アジュバントまたは送達特性を有する他の分子に適用することができる。
粘膜表面の構造的または機能的完全性を改変する、胆汁；ＤＥＡＥ−デキストランおよびポリオルニチンなどのポリカチオン；ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムなどの洗剤；脂質にコンジュゲートした材料；ストレプトマイシンなどの抗生物質；ビタミンＡ；ならびに他の化合物などの、粘膜アジュバントまたは送達活性を有する他の化合物を用いることができる。他の粘膜的に活性な化合物には、ＭＤＰなどの微生物構造の誘導体、アクリジン、およびシメチジンが含まれる。上記のようなＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）ＱＳ−２１、ＭＰＬ、およびＩＬ−１２もまた、用いることができる。
本発明の免疫原性組成物は、ＩＳＣＯＭＳ（免疫刺激複合体）、ＣＴＢを含有するＩＳＣＯＭＳ、リポソームの形態で送達され得るか、または、吸着に適したサイズのミクロスフェアを形成するために例えばアクリレートもしくはＤＬ−ラクチド−グリコシド共重合体などの化合物内にカプセル化され得る。本発明のタンパク質はまた、油性エマルジョン内に組み込むことができる。
患者に投与される免疫原性組成物の量（すなわち用量）は、特定の抗原、アジュバント（存在する場合）、特定の患者の年齢、性別、体重、種、状態、および投与経路などの因子を考慮して、当業者に知られている標準的な技術に従って決定することができる。
例えば、青年期のヒト患者のための投与量は、少なくとも０．１μｇ、１μｇ、１０μｇ、または５０μｇのナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）ＯＲＦ２０８６タンパク質、最大８０μｇ、１００μｇ、１５０μｇ、または２００μｇのナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）ＯＲＦ２０８６タンパク質を含み得る。あらゆる最小値およびあらゆる最大値を、適切な範囲を規定するために組み合わせることができる。
アジュバント
本明細書において記載される免疫原性組成物はまた、特定の実施形態において、１つまたは複数のアジュバントを含む。アジュバントは、免疫原または抗原と共に投与された場合に免疫応答を増強させる物質である。限定はしないが、インターロイキン１−α、１−β、２、４、５、６、７、８、１０、１２（例えば、米国特許第５，７２３，１２７号を参照されたい）、１３、１４、１５、１６、１７、および１８（およびその突然変異形態）、インターフェロン−α、β、およびγ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（例えば、米国特許第５，０７８，９９６号およびＡＴＣＣ受託番号３９９００を参照されたい）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ならびに腫瘍壊死因子αおよびβを含む、多くのサイトカインまたはリンホカインが、免疫調節活性を有することが示されており、したがって、アジュバントとして有用である。
本明細書において記載される免疫原性組成物と共に有用なさらに他のアジュバントには、限定はしないが、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、およびＲＡＮＴＥＳを含むケモカイン；セレクチン、例えばＬ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、およびＥ−セレクチンなどの、接着分子；ムチン様分子、例えば、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、およびＭａｄＣＡＭ−１；ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、およびｐ１５０．９５などの、インテグリンファミリーのメンバー；ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ、例えばＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、およびＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、およびＬＦＡ−３などの、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバー；Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＣＤ４０、およびＣＤ４０Ｌなどの同時刺激分子；血管増殖因子、神経成長因子、線維芽細胞増殖因子、上皮成長因子、ＰＤＧＦ、ＢＬ−１、および血管内皮増殖因子を含む増殖因子；Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、およびＤＲ６を含む受容体分子；ならびにＣａｓｐａｓｅ（ＩＣＥ）が含まれる。
他の典型的なアジュバントには、限定はしないが、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、ＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）ＱＳ−２１（Ａｑｕｉｌａ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、Ｍａｓｓ．）、ＭＰＬ（商標）（３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ、Ｃｏｒｉｘａ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｍｏｎｔ．）、５２９（アミノアルキルグルコサミンホスフェート化合物、Ｃｏｒｉｘａ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｍｏｎｔ．）、ＩＬ−１２（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ．）、ＧＭ−ＣＳＦ（Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐ．、Ｓｅａｔｔｌｅ、Ｗａｓｈ．）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ノルＭＤＰと呼ばれるＣＧＰ１１６３７）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシエチルアミン）（ＭＴＰ−ＰＥと呼ばれるＣＧＰ１９８３５Ａ）、およびコレラ毒素が含まれる。特定の好ましい実施形態において、アジュバントはＱＳ−２１である。
さらなる典型的なアジュバントには、そのＡサブユニットを含むコレラ毒素の無毒誘導体、および／あるいは、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ポリペプチドと、コレラ毒素もしくはそのＢサブユニット（「ＣＴＢ」）、プロコレラゲノイド、シゾフィランを含む真菌多糖、ムラミルジペプチド、ムラミルジペプチド（「ＭＤＰ」）誘導体、ホルボールエステル、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の易熱性毒素、ブロックポリマー、またはサポニンとの、コンジュゲートまたは遺伝子操作された融合体が含まれる。
リン酸アルミニウムは、第１相臨床試験において、米国連邦規制基準［６１０．１５（ａ）］によって特定されている０．８５ｍｇ／投与の限界よりかなり低い濃度０．１２５ｍｇ／投与まで、アジュバントとして用いられている。アルミニウム含有アジュバントは、筋肉内または皮下に投与される場合に抗原の免疫応答を強化するために、ヒトにおいて広く用いられている。一部の実施形態において、免疫原性組成物におけるアルミニウムの濃度は、０．１２５μｇ／ｍｌと０．５μｇ／ｍｌとの間、０．２０μｇ／ｍｌと０．４０μｇ／ｍｌとの間、または０．２０μｇ／ｍｌと０．３０μｇ／ｍｌとの間である。一部の実施形態において、免疫原性組成物におけるアルミニウムの濃度は、約０．１２５μｇ／ｍｌ、約０．１５μｇ／ｍｌ、約０．１７５μｇ／ｍｌ、約０．２０μｇ／ｍｌ、約０．２２５μｇ／ｍｌ、約０．２５μｇ／ｍｌ、約０．２７５μｇ／ｍｌ、約０．３０μｇ／ｍｌ、約０．３２５μｇ／ｍｌ、約０．３５μｇ／ｍｌ、約０．３７５μｇ／ｍｌ、約０．４０μｇ／ｍｌ、約０．４２５μｇ／ｍｌ、約０．４５μｇ／ｍｌ、約０．４７５μｇ／ｍｌ、または約０．５０μｇ／ｍｌである。
好ましい実施形態において、免疫原性組成物におけるアルミニウムの濃度は、０．１２５ｍｇ／ｍｌと０．５ｍｇ／ｍｌとの間、０．２０ｍｇ／ｍｌと０．４０ｍｇ／ｍｌとの間、または０．２０ｍｇ／ｍｌと０．３０ｍｇ／ｍｌとの間である。一部の実施形態において、免疫原性組成物におけるアルミニウムの濃度は、約０．１２５ｍｇ／ｍｌ、約０．１５ｍｇ／ｍｌ、約０．１７５ｍｇ／ｍｌ、約０．２０ｍｇ／ｍｌ、約０．２２５ｍｇ／ｍｌ、約０．２５ｍｇ／ｍｌ、約０．２７５ｍｇ／ｍｌ、約０．３０ｍｇ／ｍｌ、約０．３２５ｍｇ／ｍｌ、約０．３５ｍｇ／ｍｌ、約０．３７５ｍｇ／ｍｌ、約０．４０ｍｇ／ｍｌ、約０．４２５ｍｇ／ｍｌ、約０．４５ｍｇ／ｍｌ、約０．４７５ｍｇ／ｍｌ、または約０．５０ｍｇ／ｍｌである。
免疫応答を増強させるために用いられる適切なアジュバントにはさらに、限定はしないが、米国特許第４，９１２，０９４号において記載されているＭＰＬ（商標）（３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ、Ｃｏｒｉｘａ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）が含まれる。アジュバントとしての使用に同様に適切なものは、Ｃｏｒｉｘａ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）から入手可能であり、米国特許第６，１１３，９１８号において記載されている、合成脂質Ａ類似体もしくはアミノアルキルグルコサミンホスフェート化合物（ＡＧＰ）、またはその誘導体もしくは類似体である。１つのこのようなＡＧＰは、５２９としても知られている（以前はＲＣ５２９として知られていた）、２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］エチル−２−デオキシ−４−Ｏ−ホスホノ−３−Ｏ−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイル］−２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイル−アミノ］−ｂ−Ｄ−グルコピラノシドである。この５２９アジュバントは、水性形態（ＡＦ）として、または安定なエマルジョン（ＳＥ）として製剤される。
さらに他のアジュバントには、ムラミルペプチド、例えば、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルノルムラミル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）；水中油型エマルジョン、例えば、ＭＦ５９（米国特許第６，２９９，８８４号）（マイクロフルイダイザー、例えばＭｏｄｅｌ １１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）を用いてサブミクロンの粒子に製剤された、５％スクアレン、０．５％ポリソルベート８０、および０．５％Ｓｐａｎ８５を含有する（様々な量のＭＴＰ−ＰＥを含有していてもよい））、およびＳＡＦ（サブミクロンのエマルジョンにマイクロフルイダイズされているかまたはさらに大きな粒子サイズのエマルジョンを生成させるためにボルテックスされている、１０％スクアレン、０．４％ポリソルベート８０、５％のプルロニックでブロックされたポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含有する）；不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；アルミニウム塩（ミョウバン）、例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム；Ａｍｐｈｉｇｅｎ；アブリジン；Ｌ１２１／スクアレン；Ｄ−ラクチド−ポリラクチド／グリコシド；プルロニックポリオール；死滅ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）；サポニン、例えば、米国特許第５，０５７，５４０号において記載されているＳｔｉｍｕｌｏｎ（商標）ＱＳ−２１（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ.）、米国特許第５，２５４，３３９号において記載されているＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（ＣＳＬ Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）、および免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ）；結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）；細菌リポ多糖；合成ポリヌクレオチド、例えば、ＣｐＧモチーフを含有するオリゴヌクレオチド（例えば、米国特許第６，２０７，６４６号）；欧州特許第１，２９６，７１３号および欧州特許第１，３２６，６３４号において記載されているＩＣ−３１（Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌ ＡＧ、Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ）；百日咳毒素（ＰＴ）もしくはその突然変異体、コレラ毒素もしくはその突然変異体（例えば、米国特許第７，２８５，２８１号、米国特許第７，３３２，１７４号、米国特許第７，３６１，３５５号、および米国特許第７，３８４，６４０号）；または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の易熱性毒素（ＬＴ）もしくはその突然変異体、特にＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２（例えば、米国特許第６，１４９，９１９号、米国特許第７，１１５，７３０号、および米国特許第７，２９１，５８８号）が含まれる。
非脂質化Ｐ２０８６抗原を産生する方法
１つの態様において、本発明は、ピルビル化されていない非脂質化ＯＲＦ２０８６ポリペプチドを産生する方法に関する。本方法は、対応する野生型配列と比較してＮ末端システインが欠失しているＯＲＦ２０８６ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現させることを含み、このヌクレオチド配列は、細菌細胞において発現され得る発現系に作動可能に連結している。本方法によって産生される典型的なポリペプチドには、本明細書において記載されるあらゆるポリペプチドが含まれる。例えば、好ましくは、ポリペプチドは、対応する野生型配列と比較して１位のシステインが欠失している、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１で示されるアミノ酸配列を有する。さらなる典型的なポリペプチドには、配列番号４４、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５５、配列番号５７、配列番号６２、および配列番号６４から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。本方法はさらに、ポリペプチドを精製することを含む。
一部の実施形態において、本発明は、ＯＲＦ２０８６変異体の核酸配列を、脂質化制御配列を有さない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクター内にクローニングするステップ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌をＯＲＦ２０８６発現ベクターで形質転換するステップ、発現を誘発するステップ、および発現したＰ２０８６タンパク質を単離するステップを含む、可溶性の非脂質化Ｐ２０８６抗原を産生するための方法を提供する。一部の実施形態において、発現は、ＩＰＴＧを用いて誘発される。
一部の実施形態において、ＯＲＦ２０８６変異体のＮ末端Ｃｙｓのコドンは欠失している。このようなコドンの例には、ＴＧＣが含まれる。一部の実施形態において、ＯＲＦ２０８６変異体のＮ末端Ｃｙｓのコドンは、Ａｌａコドン、Ｇｌｙコドン、またはＶａｌコドンを生成するための点突然変異生成によって突然変異している。一部の実施形態において、ＳｅｒコドンおよびＧｌｙコドンがＯＲＦ２０８６変異体のＮ末端尾部に付加されて、Ｎ末端Ｃｙｓのすぐ下流のＧｌｙ／Ｓｅｒストークを伸長する。一部の実施形態において、Ｇｌｙ／Ｓｅｒストーク内のＧｌｙ残基およびＳｅｒ残基の総数は、少なくとも７、８、９、１０、１１、または１２である。一部の実施形態において、Ｎ末端Ｃｙｓのコドンは欠失している。一部の実施形態において、Ｎ末端の７、８、９、１０、１１、または１２個の残基は、ＧｌｙまたはＳｅｒである。
一部の実施形態において、非脂質化ＯＲＦ２０８６変異体のＮ末端尾部のコドンは、点突然変異生成によって最適化されている。一部の実施形態において、非脂質化ＯＲＦ２０８６変異体のＮ末端尾部は、Ｂ０９変異体のＮ末端尾部に適合するように最適化されている。一部の実施形態において、ＯＲＦ２０８６変異体のＮ末端尾部のコドンは、ＯＲＦ２０８６変異体の５番目のアミノ酸をコードするコドンが配列番号８のヌクレオチド１３〜１５に１００％同一となり、ＯＲＦ２０８６変異体の１３番目のアミノ酸をコードするコドンが配列番号８のヌクレオチド３７〜３９に１００％同一となるような点突然変異生成によって最適化されている。一部の実施形態において、非脂質化ＯＲＦ２０８６変異体のＮ末端尾部は、５’の４５個の核酸が配列番号８の核酸１〜４５に１００％同一となるように最適化されている。一部の実施形態において、非脂質化ＯＲＦ２０８６変異体のＮ末端尾部は、５’の４２個の核酸が配列番号８の核酸４〜４５に１００％同一となるように最適化されている。一部の実施形態において、非脂質化ＯＲＦ２０８６変異体のＮ末端尾部は、５'の３９個の核酸が配列番号８の核酸４〜４２に１００％同一となるように最適化されている。一部の実施形態において、非脂質化Ｐ２０８６変異体のＮ末端尾部は、配列番号１８のアミノ酸１〜１５と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、非脂質化Ｐ２０８６変異体のＮ末端尾部は、配列番号１８のアミノ酸１〜１５と比較して２つのアミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、非脂質化Ｐ２０８６変異体のＮ末端尾部は、配列番号１８のアミノ酸２〜１５と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、非脂質化Ｐ２０８６変異体のＮ末端尾部は、配列番号１８のアミノ酸２〜１５と比較して２つのアミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、アミノ酸置換は、保存的なアミノ酸置換である。
一部の実施形態において、非脂質化変異体のコドンは、発現が増大するように最適化されている。コドンの最適化は、当技術分野において知られている。例えば、Ｓａｓｔａｌｌａら、Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．７５（７）：２０９９〜２１１０（２００９）、およびＣｏｌｅｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、ｖｏｌ．３２０：１７８４（２００８）を参照されたい。一部の実施形態において、コドンの最適化は、特定のＤＮＡ配列を含めながらおよび／または排除しながら、アミノ酸配列のコドン利用を、選択された宿主生物のコドン頻度とマッチさせることを含む。一部の実施形態において、コドンの最適化はさらに、対応するｍＲＮＡ二次構造を最小化して、翻訳障害を低減させることを含む。一部の実施形態において、Ｎ末端尾部は、配列番号２８、３０、３２、および３４のいずれか１つを含むようにコドンを最適化されている。一部の実施形態において、Ｇｌｙ／Ｓｅｒストークは、配列番号２８、３０、３２、および３４のいずれか１つを含むようにコドンを最適化されている。
本発明がより良く理解され得るように、以下の実施例を示す。実施例は説明を目的としたものにすぎず、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
免疫原性組成物製剤
特定の実施形態において、本発明の免疫原性組成物はさらに、アジュバント、緩衝液、凍結保護物質、塩、二価陽イオン、非イオン性洗剤、フリーラジカル酸化の阻害剤、希釈剤、または担体の少なくとも１つを含む。
本発明の免疫原性組成物はさらに、複数の髄膜炎菌タンパク質抗原および莢膜多糖−タンパク質コンジュゲートに加えて、１つまたは複数の防腐剤を含む。ＦＤＡは、わずかな例外を除いて、複数回用量（多用量）バイアル内の生物学的生成物が防腐剤を含有することを求めている。防腐剤を含有するワクチン生成物には、塩化ベンゼトニウム（炭疽）、２−フェノキシエタノール（ＤＴａＰ、Ａ型肝炎、ライム病、ポリオ（非経口））、フェノール（肺炎、腸チフス（非経口）、ワクシニア）、およびチメロサール（ＤＴａＰ、ＤＴ、Ｔｄ、Ｂ型肝炎、Ｈｉｂ、インフルエンザ、ＪＥ、髄膜症、肺炎、狂犬病）を含有するワクチンが含まれる。注射可能な薬剤における使用に認可されている防腐剤には、例えば、クロロブタノール、ｍ−クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、２−フェノキシエタノール、塩化ベンゼトニウム、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、ベンジルアルコール、フェノール、チメロサール、および硝酸フェニル水銀が含まれる。
本発明の製剤はさらに、緩衝液、塩、二価陽イオン、非イオン性洗剤、凍結保護物質、例えば糖、および抗酸化剤、例えばフリーラジカルスカベンジャー、もしくはキレート剤の１つもしくは複数、またはそのあらゆる複数の組み合わせを含み得る。あらゆる１つの成分、例えばキレート剤の選択によって、別の成分（例えばスカベンジャー）が望ましいか否かが決定され得る。投与のために製剤された最終組成物は、無菌であり、かつ／または発熱性物質を有さない。当業者は、所要の特定の保存条件および投与条件などの様々な因子に応じて、これらのおよび他の成分のどの組み合わせが、防腐剤を含有する本発明の免疫原性組成物に含めるために最適であるかを、経験的に決定することができる。
特定の実施形態において、非経口投与に適合する本発明の製剤は、限定はしないが、Ｔｒｉｓ（トリメタミン）、ホスフェート、アセテート、ボレート、シトレート、グリシン、ヒスチジン、およびスクシネートから選択される、１つまたは複数の生理学的に許容できる緩衝液を含む。特定の実施形態において、製剤は、約６．０から約９．０、好ましくは約６．４から約７．４のｐＨ範囲内に緩衝される。
特定の実施形態において、本発明の免疫原性組成物または製剤のｐＨを調整することが望ましい場合がある。本発明の製剤のｐＨは、当技術分野における標準的な技術を用いて調整することができる。製剤のｐＨは、３．０と８．０との間に調整することができる。特定の実施形態において、製剤のｐＨは、３．０と６．０との間、４．０と６．０との間、または５．０と８．０との間であり得るか、またはそれに調整することができる。他の実施形態において、製剤のｐＨは、約３．０、約３．５、約４．０、約４．５、約５．０、約５．５、約５．８、約６．０、約６．５、約７．０、約７．５、または約８．０であり得るか、またはそれに調整することができる。特定の実施形態において、ｐＨは、４．５から７．５、または４．５から６．５、５．０から５．４、５．４から５．５、５．５から５．６、５．６から５．７、５．７から５．８、５．８から５．９、５．９から６．０、６．０から６．１、６．１から６．２、６．２から６．３、６．３から６．５、６．５から７．０、７．０から７．５、または７．５から８．０の範囲であり得るか、またはそれに調整することができる。具体的な実施形態において、製剤のｐＨは約５．８である。
特定の実施形態において、非経口投与に適合する本発明の製剤は、限定はしないが、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、およびＭｎＣｌ２を含む、１つまたは複数の二価陽イオンを、約０．１ｍＭから約１０ｍＭの範囲の濃度で含み、最大約５ｍＭが好ましい。
特定の実施形態において、非経口投与に適合する本発明の製剤は、非経口投与の際に対象に対して生理学的に許容できるイオン強度で存在し、最終製剤において、選択されたイオン強度またはモル浸透圧濃度をもたらすような最終濃度で含まれる、限定はしないが、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、および硫酸カリウムを含む、１つまたは複数の塩を含む。製剤の最終イオン強度または重量モル浸透圧濃度は、複数の成分（例えば、緩衝化合物（１つまたは複数）に由来するイオン、および他の非緩衝塩）によって決定される。好ましい塩であるＮａＣｌは、最大約２５０ｍＭの様々な濃度で存在し、塩濃度は、他の成分（例えば糖）を補って製剤の最終総モル浸透圧濃度が非経口投与（例えば、筋肉内注射または皮下注射）に適合するように、また様々な温度範囲にわたって免疫原性組成物製剤の免疫原性成分の長期の安定性を促進するように、選択される。無塩製剤は、増大した範囲の１つまたは複数の選択された凍結保護物質に対して耐性を有して、所望の最終モル浸透圧濃度レベルを維持する。
特定の実施形態において、非経口投与に適合する本発明の製剤は、限定はしないが、二糖（例えば、ラクトース、マルトース、ショ糖、またはトレハロース）およびポリヒドロキシ炭化水素（例えば、ズルシトール、グリセロール、マンニトール、およびソルビトール）から選択される、１つまたは複数の凍結保護物質を含む。
特定の実施形態において、製剤のモル浸透圧濃度は、約２００ｍＯｓ／Ｌから約８００ｍＯｓ／Ｌの範囲であり、好ましい範囲は、約２５０ｍＯｓ／Ｌから約５００ｍＯｓ／Ｌ、または約３００ｍＯｓ／Ｌ〜約４００ｍＯｓ／Ｌである。無塩製剤は、例えば、約５％から約２５％のショ糖、好ましくは約７％から約１５％、または約１０％から約１２％のショ糖を含有し得る。あるいは、無塩製剤は、例えば、約３％から約１２％のソルビトール、好ましくは約４％から７％、または約５％から約６％のソルビトールを含有し得る。塩化ナトリウムなどの塩が添加されると、ショ糖またはソルビトールの効果的な範囲は比較的減少する。これらのおよび他のこのような重量モル浸透圧濃度およびモル浸透圧濃度の考慮は、十分に当技術分野の技術の範囲内である。
特定の実施形態において、非経口投与に適合する本発明の製剤は、１つまたは複数のフリーラジカル酸化阻害剤および／またはキレート剤を含む。様々なフリーラジカルスカベンジャーおよびキレート剤が、当技術分野において知られており、本明細書において記載される製剤および使用方法に適用される。例には、限定はしないが、エタノール、ＥＤＴＡ、ＥＤＴＡ／エタノールの組み合わせ、トリエタノールアミン、マンニトール、ヒスチジン、グリセロール、クエン酸ナトリウム、イノシトールヘキサホスフェート、トリポリホスフェート、アスコルビン酸／アスコルベート、コハク酸／スクシネート、リンゴ酸／マレエート、デスフェラール、ＥＤＤＨＡおよびＤＴＰＡ、ならびに上記の２つ以上の様々な組み合わせが含まれる。特定の実施形態において、少なくとも１つの非還元性フリーラジカルスカベンジャーを、製剤の長期の安定性を効果的に増強させる濃度で添加することができる。スカベンジャーおよび二価陽イオンなどの１つまたは複数のフリーラジカル酸化阻害剤／キレート剤をまた、様々な組み合わせで添加することができる。キレート剤の選択によって、スカベンジャーの添加が必要であるか否かが決定される。
特定の実施形態において、非経口投与に適合する本発明の製剤は、限定はしないが、Ｂｒｉｊ５８、Ｂｒｉｊ３５、およびその他、例えばトリトンＸ−１００、トリトンＸ−１１４、ＮＰ４０、Ｓｐａｎ８５、およびプルロニックシリーズの非イオン性界面活性剤（例えば、プルロニック１２１）を含む、限定はしないが、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリソルベート−８０（Ｔｗｅｅｎ８０）、ポリソルベート−６０（Ｔｗｅｅｎ６０）、ポリソルベート−４０（Ｔｗｅｅｎ４０）、およびポリソルベート−２０（Ｔｗｅｅｎ２０）、ポリオキシエチレンアルキルエーテルを含む、１つまたは複数の非イオン性界面活性剤を含み、好ましい成分は、約０．００１％から約２％（最大約０．２５％が好ましい）の濃度のポリソルベート−８０、または約０．００１％から１％（最大約０．５％が好ましい）の濃度のポリソルベート−４０である。
特定の実施形態において、本発明の製剤は、非経口投与に適切な１つまたは複数のさらなる安定剤、例えば、少なくとも１つのチオール（−ＳＨ）基（例えば、システイン、Ｎ−アセチルシステイン、還元型グルタチオン、ナトリウムチオグリコレート、チオスルフェート、モノチオグリセロール、またはその混合物）を含む還元剤を含む。あるいは、または場合によって、本発明の、防腐剤を含有する免疫原性組成物製剤は、酸素を保存容器から除去すること、製剤を光から保護することによって（例えば、琥珀色ガラス容器を用いることによって）さらに安定化され得る。
本発明の、防腐剤を含有する免疫原性組成物製剤は、１つまたは複数の薬学的に許容できる担体または賦形剤を含み得、賦形剤には、それ自体は免疫応答を誘発しないあらゆる賦形剤が含まれる。適切な賦形剤には、限定はしないが、タンパク質、糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、ショ糖（Ｐａｏｌｅｔｔｉら、２００１、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９：２１１８）、トレハロース、ラクトース、および脂質凝集体（例えば、油滴またはリポソーム）などの高分子が含まれる。このような担体は、当業者に周知である。薬学的に許容できる賦形剤は、例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ、２０００、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２において論じられている。
本発明の組成物は、凍結乾燥され得るか、または水性形態、すなわち溶液もしくは懸濁液であり得る。液体製剤は、有利には、それらのパッケージされた形態から直接的に投与され得、したがって、さもなければ本発明の凍結乾燥組成物に必要な水性媒質における再構成をする必要なく、注射に理想的である。
対象への本発明の免疫原性組成物の直接的な送達は、非経口投与（筋肉内、腹腔内、皮内、皮下、静脈内、または組織の間質性空間へ）によって、または直腸投与、経口投与、膣投与、局所投与、経皮投与、鼻腔内投与、眼投与、耳投与、肺投与、もしくは他の粘膜投与によって行うことができる。好ましい実施形態において、非経口投与は、筋肉内注射によって、例えば、対象の大腿部または上腕に行われる。注射は、針（例えば皮下注射針）を介して行うことができるが、無針注射も代わりに用いることができる。典型的な筋肉内用量は、０．５ｍＬである。本発明の組成物は、例えば液体溶液または懸濁液としての注射のために、様々な形態で調製することができる。特定の実施形態において、組成物は、肺投与のために粉末またはスプレーとして、例えば吸入器において調製することができる。他の実施形態において、組成物は、坐剤もしくはペッサリーとして調製することができるか、または、鼻投与、耳投与、もしくは眼投与のために、例えばスプレー、ドロップ、ゲル、もしくは粉末として調製することができる。
特定の免疫原性組成物のための成分の最適な量は、対象における適切な免疫応答の観察を伴う標準的な研究によって確認することができる。初回ワクチン接種の後、対象に、適切に間隔をあけた１回または複数回の追加免疫化を行うことができる。
パッケージングおよび投与形態
本発明の免疫原性組成物は、単位用量形態または多用量形態（例えば、２回用量、４回用量、またはそれ以上）にパッケージすることができる。多用量形態では、バイアルが典型的であるが、充填済みシリンジよりも必ずしも好ましいというわけではない。適切な多用量フォーマットには、限定はしないが、容器当たり２から１０回用量で、用量当たり０．１から２ｍＬのものが含まれる。特定の実施形態において、用量は０．５ｍＬ用量である。例えば、参照することによって本明細書に組み込まれる、国際特許出願ＷＯ２００７／１２７６６８を参照されたい。
組成物は、バイアルもしくは他の適切な保存容器内に存在し得るか、または充填済み送達装置、例えば、針を有していてもいなくてもよい、単一成分シリンジもしくは複数成分シリンジ内に存在し得る。シリンジは、典型的には、単回用量の本発明の防腐剤を含有する免疫原性組成物を含有するが、必ずしもそうである必要はなく、多用量の充填済みシリンジもまた構想される。同様に、バイアルは、単回用量を含み得るが、代わりに複数回用量を含んでいてもよい。
効果的な投与量容積は、通常通り決定することができるが、注射のための組成物の典型的な用量は、０．５ｍＬの容積を有する。特定の実施形態において、用量は、ヒト対象への投与のために製剤される。特定の実施形態において、用量は、成人、十代、青年、幼児、または乳児（すなわち、１歳以下）のヒト対象への投与のために製剤され、好ましい実施形態においては注射によって投与することができる。
本発明の液体免疫原性組成物はまた、凍結乾燥形態の他の免疫原性組成物を再構成するために適切である。免疫原性組成物をこのような即時の再構成に用いる場合、本発明は、２つ以上のバイアル、２つ以上の充填済シリンジ、またはそれぞれの１つもしくは複数を有するキットを提供し、シリンジの内容物は注射の前にバイアルの内容物を再構成するために用いられ、または逆の場合も同様である。
あるいは、本発明の免疫原性組成物は、それらを調製するために用いられる正確な方法を変化させることによって選択および制御され得る平均直径サイズなどの粒子特徴を有するマイクロペレットまたはミクロスフェアなどの、乾燥した通常の形状の（例えば球状の）粒子を形成するための、技術分野において周知の凍結乾燥のための多数の方法の１つを例えば用いて、凍結乾燥および再構成することができる。免疫原性組成物はさらに、マイクロペレットまたはミクロスフェアなどの個別の乾燥した通常の形状の（例えば球状の）粒子と共に場合によって調製され得るかまたは前記粒子内に含有され得るアジュバントを含み得る。このような実施形態において、本発明はさらに、安定化された乾燥免疫原性組成物を含み、１つまたは複数の本発明の防腐剤をさらに包含していてもよい、第１の成分、および第１の成分を再構成するための無菌の水性溶液を含む第２の成分を含む、免疫原性組成物キットを提供する。特定の実施形態において、水性溶液は、１つまたは複数の防腐剤を含み、少なくとも１つのアジュバントを含んでいてもよい（例えば、参照することによって本明細書に組み込まれる、ＷＯ２００９／１０９５５０を参照されたい）。
さらに別の実施形態において、多用量フォーマットの容器は、限定はしないが、通常の実験用ガラス製品、フラスコ、ビーカー、メスシリンダー、発酵槽、バイオリアクター、管類、パイプ、袋、瓶、バイアル、バイアル密閉器（例えば、ゴムストッパー、ねじ式キャップ）、アンプル、シリンジ、二チャンバシリンジまたは多チャンバシリンジ、シリンジストッパー、シリンジプランジャー、ゴム密閉器、プラスチック密閉器、ガラス密閉器、カートリッジ、および使い捨てのペンなどからなる群の１つまたは複数から選択される。本発明の容器は、製造の材料によって限定されず、ガラス、金属（例えば、鋼鉄、ステンレス鋼、アルミニウムなど）、およびポリマー（例えば、熱可塑性物質、エラストマー、熱可塑性エラストマー）などの材料を含む。特定の実施形態において、このフォーマットの容器は、ブチルストッパーを有する５ｍＬのＳｃｈｏｔｔ Ｔｙｐｅ １ガラスバイアルである。当業者には、上記で説明されたフォーマットが決して包括的な列挙ではなく、単に、本発明に利用可能な様々なフォーマットに関して当業者に助言するためのものであることが理解されよう。本発明において用いるために検討されるさらなるフォーマットは、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｃｏｒｐ．（Ｌｉｍａ、ＯＨ）、ＶＷＲなどの実験機器の販売者および製造者から発行されたカタログにおいて見ることができる。
（実施例１）：実験手順
血清殺菌アッセイ
カニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ）（ｎ＝５／群）を、ＡｌＰＯ４に吸着させたｒＬＰ２０８６タンパク質またはｒＰ２０８６（Ａ＋Ｂ）タンパク質を用いて筋肉内で免疫化した。カニクイザルは、非ヒト霊長類の例である。動物に、０週目、４週目、および２４週目にワクチン接種し、ＯＲＦ２０８６特異的ＩｇＧおよび機能的抗体の力価を、０週目、４週目、６週目、および２６週目に決定した。血清のＯＲＦ２０８６特異的ＩｇＧの力価を、ｒＬＰ２０８６ＡおよびＢに対して決定した。
機能的抗体の力価を、ワクチン内に含有される配列に相同または異種の配列を有するＬＰ２０８６を発現する髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）株に対する血清殺菌アッセイ（ＳＢＡ）によって試験した。
ＯＲＦ２０８６ワクチンで免疫化されたマカクまたはウサギにおける血清殺菌抗体を、ヒト補体を用いるＳＢＡを用いて決定した。ウサギ免疫血清またはマカク免疫血清を加熱不活化して、固有の補体活性を除去し、その後、９６ウェルマイクロタイタープレート内で、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を有するダルベッコＰＢＳ（Ｄ−ＰＢＳ）内に１：２で連続希釈して、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）株に対する血清の殺菌活性について試験した。このアッセイにおいて用いられる細菌は、Ｋｅｌｌｏｇｇ補助物質を補ったＧＣ培地（ＧＣＫ）において成長させ、６５０ｎｍでの光学密度によってモニタリングした。細菌を、０．５０〜０．５５の最終ＯＤ６５０で、アッセイにおいて用いるために採取し、Ｄ−ＰＢＳ内に希釈し、１０００〜３０００ＣＦＵを、２０％ヒト補体を有するアッセイ混合物に添加した。
検出可能な殺菌活性を有さないヒト血清を、外因性の補体源として用いた。補体源を、それぞれの個別の試験株に対する適合性について試験した。補体源は、免疫血清を添加していない対照において生存している細菌の数が７５％を超える場合にのみ用いた。１０の固有の補体源が、この研究において記載されているＳＢＡを行うために必要であった。
３７℃、５％ＣＯ２での３０分間のインキュベーションの後、Ｄ−ＰＢＳを反応混合物に添加し、アリコートを、５０％ＧＣＫ培地で満たされたマイクロフィルタープレートに移した。マイクロフィルタープレートを濾過し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートし、ミクロコロニーを染色および定量した。血清の殺菌力価は、免疫血清を有さない対照ウェルにおけるＣＦＵと比較してＣＦＵが５０％低減した血清希釈の、補間された逆数として定義した。ＳＢＡの力価は、３７℃で３０分間のインキュベーションの後の細菌数における５０％の低減を引き起こす試験血清の補間された希釈の逆数として定義する。ＯＲＦ２０８６免疫血清での死滅に対する感受性は、対応する免疫前血清と比較してＯＲＦ２０８６免疫血清についてのＳＢＡ力価が４倍以上上昇する場合に定めた。開始希釈でアッセイ株に対して陰性であった血清には、アッセイでの検出限界の２分の１の力価（すなわち４）が付与された。
（実施例２）：非脂質化ＯＲＦ２０８６変異体のクローニングおよび発現
髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）株Ｍ９８２５０７７１（Ａ０５）の残基２７〜２８６に対応する成熟Ｐ２０８６アミノ酸配列は、ゲノムＤＮＡからのＰＣＲ増幅に元々由来するものであった。配列ＴＧＣＣＡＴＡＴＧＡＧＣＡＧＣＧＧＡＡＧＣＧＧＡＡＧ（配列番号２２）を有するフォワードプライマーは、５’配列にアニーリングされ、クローニングのためのＮｄｅＩ部位を含有していた。配列ＣＧＧＡＴＣＣＣＴＡＣＴＧＴＴＴＧＣＣＧＧＣＧＡＴＧＣ（配列番号２３）を有するリバースプライマーは、遺伝子の３’末端にアニーリングされ、制限部位ＢａｍＨＩの前にある終結コドンＴＡＧを含有していた。７９９ｂｐの増幅断片をまず、中間ベクターＰＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｅｓｂａｃ、ＣＡ）内にクローニングした。このプラスミドをＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで切断し、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで切断されている発現ベクターｐＥＴ９ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）内にライゲーションした。得られたベクターｐＬＡ１００（これは配列番号５４を含む）は、脂質化タンパク質内に存在するＮ末端システインを有さない株Ｍ９８２５０７７１（１位のＮ末端Ｃｙｓが欠失している配列番号１３、または配列番号５５を参照されたい）から、成熟サブファミリーＡ０５ Ｐ２０８６を発現した。ＢＬＲ（ＤＥ３）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主株［Ｆ−ｏｍｐＴ ｈｓｄＳＢ（ｒＢ−ｍＢ−）ｇａｌ ｄｃｍΔ（ｓｒｌ−ｒｅｃＡ）３０６：：Ｔｎ１０（ＴｅｔＲ）（ＤＥ３）］（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて、ｆＨＢＰの発現を得た。
同一のクローニングステップを用いて、Ｎ末端Ｃｙｓが欠失した変異体Ｂ０２、Ｂ０３、Ｂ０９、Ｂ２２、Ｂ２４、Ｂ４４、Ａ０４、Ａ１２、およびＡ２２を調製した。Ｎ末端Ｃｙｓを含有する変異体もまた、Ｃｙｓコドン（例えば、配列番号１〜１１の最初のコドン）も含むフォワードプライマーを用いて、この同一の方法によって調製した。本明細書において提供される配列に基づいて、当業者であれば、これらの変異体のそれぞれについてフォワードプライマーおよびリバースプライマーを設計し得よう。例えば、以下のプライマーを用いてＢ４４非脂質化変異体を増幅し、その後、ＮｄｅＩおよびＢｌｐＩを用いてｐＥＴ９ａ内にクローニングした。
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結果
非脂質化プラスミド構築物は強力に発現されたが、非脂質化タンパク質変異体は、Ｎ末端Ｃｙｓ残基でピルビル化されていた。例えば構築物を発現させる方法を説明する、実施例８および９を参照されたい。このピルビル化を克服するために、Ｎ末端Ｃｙｓコドンを欠失させた。例えば実施例１０を参照されたい。Ｎ末端Ｃｙｓの欠失は、しかし、Ａ２２変異体およびＢ２２変異体の発現を無効にした。例えば図４を参照されたい。Ａ０５変異体、Ｂ０１変異体、およびＢ４４変異体は、しかし、Ｎ末端Ｃｙｓ残基が欠失しているにもかかわらず、依然として発現した。例えば、１位のＮ末端Ｃｙｓが欠失している配列番号１３（Ａ０５）、配列番号３５（Ｂ０１のＮ末端）、および１位のＮ末端Ｃｙｓが欠失している配列番号２１（Ｂ４４）を参照されたい。例えば図５を参照されたい。さらに、非脂質化Ｂ０９変異体の発現は、Ｎ末端Ｃｙｓ残基の欠失によって影響されなかった。例えば実施例４を参照されたい。
（実施例３）：非脂質化変異体の発現に対するＧｌｙ／Ｓｅｒストークの影響
なぜＡ０５変異体、Ｂ０１変異体、およびＢ４４変異体がＮ末端Ｃｙｓの不存在下で発現し、Ａ２２変異体およびＢ２２変異体が発現しなかったのかを解明するために、これらの変異体の配列をアラインした。Ａ０５変異体、Ｂ０１変異体、およびＢ４４変異体は全て、Ｎ末端Ｃｙｓの直後の、伸長した一連の１０個または１１個のＧｌｙ残基およびＳｅｒ残基（すなわちＧｌｙ／Ｓｅｒストーク）を有している。Ａ２２変異体およびＢ２２変異体は、しかし、６個のＧｌｙ残基およびＳｅｒ残基からなるＧｌｙ／Ｓｅｒストークを有していたにすぎない。したがって、Ａ２２変異体およびＢ２２変異体のＧｌｙ／Ｓｅｒストークを、さらなるＧｌｙ残基およびＳｅｒ残基の挿入によって拡張した。
長いＧｌｙ／Ｓｅｒストーク変異体を、１０個または１１個のＧｌｙ残基およびＳｅｒ残基を有するＧｌｙ／Ｓｅｒストークをコードするフォワードプライマーを用いて、実施例２において記載されている方法によって調製した。
Ｎ末端Ｃｙｓが欠失した長いＧｌｙ／Ｓｅｒストーク（１０〜１１個のＧｌｙ／Ｓｅｒ残基）のＡ２２変異体およびＢ２２変異体は、Ｎ末端Ｃｙｓが欠失した短いＧｌｙ／Ｓｅｒストーク（６個のＧｌｙ／Ｓｅｒ残基）変異体Ａ２２およびＢ２２よりも増大した発現を示した。これらの発現レベルは、しかし、Ａ０５変異体、Ｂ０１変異体、およびＢ４４変異体の発現レベルと比較して依然として低減した。
（実施例４）：コドンの最適化
非脂質化Ｂ０９変異体の発現は、Ｎ末端Ｃｙｓ残基の欠失によって影響されなかった（１位のシステインが欠失している配列番号１８、または配列番号４９を参照されたい）。例えば図６を参照されたい。Ｂ０９変異体の配列の評価は、Ｂ０９変異体が、Ａ２２変異体およびＢ２２変異体のＧｌｙ／Ｓｅｒストークと同様に、６個のＧｌｙ残基およびＳｅｒ残基からなるＧｌｙ／Ｓｅｒストークを有することを示した。実際、Ｂ０９変異体およびＡ２２変異体のＮ末端尾部は、アミノ酸レベルで同一である。Ｂ０９変異体およびＡ２２変異体（それぞれ配列番号５３および４２）のＮ末端尾部は、しかし、核酸レベルで、２つの核酸、すなわち配列番号８の核酸１５および３９が異なる。例えば図６を参照されたい。Ｂ２２変異体のＮ末端尾部の最初の１４個のアミノ酸は、Ｂ０９変異体およびＡ２２変異体に同一であり、Ｂ２２変異体のＮ末端尾部は、１５番目のアミノ酸で異なるにすぎない。Ｂ２２変異体の核酸１〜４２は、Ａ２２変異体の核酸１〜４２に同一である。Ｂ２２変異体（配列番号５２を参照されたい）の核酸１〜４２は、最適にアラインした場合、Ｂ０９（配列番号５３を参照されたい）の核酸１〜４２に同一であるが、核酸１５および３９で異なる。したがって、Ｂ２２変異体は、Ｂ０９変異体と、配列番号８のアミノ酸１５および３９で異なる。この最後の文は誤植を含んでおり、Ｂ２２変異体がＢ０９変異体と配列番号８の核酸１５および３９で異なることを述べるものである。
核酸の違いが、Ａ２２変異体およびＢ２２変異体と比較してＢ０９変異体の発現レベルに影響したかを決定するために、Ａ２２変異体およびＢ２２変異体を点突然変異によって突然変異させて、核酸１５および３９をＧｌｙ５およびＧｌｙ１３の対応するコドン内に組み込んだ。これらのサイレント核酸突然変異の組み込みは、Ｎ末端Ｃｙｓが欠失した変異体Ａ２２およびＢ２２の発現を、Ｎ末端Ｃｙｓが欠失したＢ０９変異体に類似のレベルまで有意に増大させた。例えば図７を参照されたい。したがって、Ｂ０９変異体にマッチさせるためのコドンの最適化は、Ｎ末端Ｃｙｓが欠失した非脂質化Ｐ２０８６変異体の発現を増大させ得る。
非脂質化変異体の配列のさらなる分析は、発現を向上させるための、Ｇｌｙ／Ｓｅｒストークにおけるさらなるコドン最適化を示唆した。したがって、さらなる非脂質化変異体を、このようなコドンを最適化された配列を含むフォワードプライマーを用いて、実施例２の方法によって構築した。最適化されたＧｌｙ／Ｓｅｒストークを生成するために用いられるフォワードプライマーは、以下の配列のいずれかを含む：
ＡＴＧＡＧＣＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＡＡＧＣＧＧＧＧＧＣＧＧＴＧＧＡ（配列番号２８）
ＭＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号２９）
ＡＴＧＡＧＣＴＣＴＧＧＡＡＧＣＧＧＡＡＧＣＧＧＧＧＧＣＧＧＴＧＧＡ（配列番号３０）
ＭＳＳＧＳＧＳＧＧＧＧ（配列番号３１）
ＡＴＧＡＧＣＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＡ（配列番号３２）
ＭＳＳＧＧＧＧ（配列番号３３）
ＡＴＧＡＧＣＡＧＣＧＧＧＧＧＣＧＧＴＧＧＡ（配列番号３４）
ＭＳＳＧＧＧＧ（配列番号３３）
（実施例５）：免疫原性組成物製剤の最適化
ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ製剤ワクチンは、迅速な免疫応答を生じさせ、その結果、血清殺菌アッセイにおいて測定される４倍を超える応答比率を達成するために必要な投与の数が低減する。５頭のアカゲザルからなる群を、二価の非脂質化ｒＰ２０８６ワクチンの異なる製剤で免疫化した。ワクチンは、ピルビル化されていない非脂質化Ａ０５変異体（１位のＮ末端Ｃｙｓが欠失している配列番号１３、または配列番号５４によってコードされる配列番号５５）およびピルビル化されていない非脂質化Ｂ４４変異体（１位のＮ末端Ｃｙｓが欠失している配列番号２１、または配列番号５１によってコードされる配列番号４４）を含んでいた。アジュバント単位は以下の通りである：ＡｌＰＯ４は２５０ｍｃｇであり、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸは１０ｍｃｇと１００ｍｃｇとの間である。表２〜５において示されるＡｌＰＯ４のアジュバント単位はミリグラム単位で示され、したがって、２５０ｍｃｇに対して０．２５（ミリグラム）と示される。
免疫化スケジュールは、０週目、４週目、および２４週目であり、採血は０週目、４週目、６週目、および２６週目であった。いずれの群でも、１回目投与後でＳＢＡ力価は増大しなかった。２回目投与後では、ベースラインに対するＳＢＡ力価の４倍の増大によって規定される、ＳＢＡ力価およびレスポンダーの数の増大が、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸアジュバントを含有する製剤で観察された。表２および３は、それぞれｆＨＢＰサブファミリーＡおよびＢ株で観察されたＳＢＡ ＧＭＴを提供する。それぞれＡおよびＢサブファミリー株について、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ製剤のＳＢＡ ＧＭＴは、ＡＩＰＯ４製剤について観察されたものよりも３〜１９および４〜２４倍高かった。増強した力価はまた、ＡＩＰＯ４製剤と比較して、それぞれｆＨＢＰサブファミリーＡおよびＢ株について、１３〜９５および２〜１０で、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ製剤の３回目投与後に観察された。ベースラインに対するＳＢＡ力価の４倍以上の増大によって規定されるレスポンダー比率の分析は、類似の傾向を明らかにした（表４および５）。
Figure 0005976652
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（実施例６）：脂質化変異体および非脂質化変異体によって付与された免疫防御
組換えによって発現される非脂質化Ｐ２０８６変異体（Ｂ４４）は、多様なｆＨＢＰ変異体（約８５％から約９２％未満のＩＤ）のＬＰ２０８６配列を示す株に対するＳＢＡによって測定される広範な防御を誘発する。これらの応答比率を、ＡｌＰＯ４と共に製剤された非脂質化ワクチンについて得た。二価のｆＨＢＰワクチンによって生じたサブファミリーＢ ｆＨＢＰ ＭｎＢ株に対するＳＢＡ応答比率を示す表６を参照されたい。非脂質化ワクチン（「脂質化」の欄の下の「−」によって表される）は、タンパク質当たり１ｍｃｇの、ピルビル化されていない非脂質化Ａ０５変異体（１位のＮ末端Ｃｙｓが欠失している配列番号１３）およびピルビル化されていない非脂質化Ｂ４４変異体（１位のＮ末端Ｃｙｓが欠失している配列番号２１）を含んでいた。
あるいは、組換えによって発現される非脂質化Ｐ２０８６変異体（Ｂ４４）は、類似の（９２％を超えるＩＤ）および多様な（９２％未満のＩＤ）ＬＰ２０８６配列を有する株に対して、脂質化変異体（Ｂ０１）よりも、ＳＢＡ力価によって測定される優れた免疫応答を誘発する。より高い応答比率（ベースラインに対するＳＢＡ力価の４倍の増大または大きさによって規定される）が、脂質化ｒＬＰ２０８６ Ｂ０１ワクチンと比較して、非脂質化ｒＰ２０８６ Ｂ４４を含有するワクチンで観察された（表６）。
表６によると、非脂質化Ｂ４４は、複数のＬＰ２０８６変異株に対する広い適用範囲をもたらす（例えば、殺菌性抗体を誘発する）ための、組成物におけるｆＨＢＰの好ましいサブファミリーＢ成分である。
驚くべきことに、本発明者らは、ＬＰ２０８６ Ｂ０９変異株が、異種の（非Ｂ０９）ＯＲＦ２０８６ポリペプチドに関して正のＳＢＡ応答比率を有する可能性が特に低いことに気付いた。特に、本発明者らは、ＬＰ２０８６ Ｂ０９が、表６において記載されているＡ０５／Ｂ４４免疫原性組成物が殺菌性抗体を誘発した対象であるアッセイ株の例外であることを見出した。したがって、好ましい実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、特に、２つ以上のＯＲＦ２０８６サブファミリーＢポリペプチドを含む組成物の背景において、Ｂ０９ポリペプチドを含む。好ましい実施形態において、非脂質化Ｂ４４を含む免疫原性組成物はまた、非脂質化Ｂ０９ポリペプチドを含み得る。
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（実施例７）：Ｂ４４変異体およびＢ０９変異体のコドンの最適化
先の実施例において達成された発現レベルは多くの適用に適切であるが、さらなる最適化が望ましく、タンパク質の完全長にわたるさらなるコドン最適化を含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現構築物を調製および試験した。Ｃｙｓを有さないＢ４４タンパク質の発現のための１つのこのような改良された配列は、配列番号４３で示される核酸配列であることが見出された。実施例９において示されるように、配列番号４３を含有する発現構築物は、最適化されていない野生型配列の発現と比較して増強した発現を示した。
Ｎ末端Ｃｙｓが欠失したＢ０９タンパク質の発現は、上記の最適化されたＢ４４（配列番号４３）構築物からＢ０９（配列番号４８）へのコドンの変化を適用することによって向上した。最適化されたＢ０９配列を生成するために、Ｂ４４の最適化されたＤＮＡ配列（配列番号４３）をまず、Ｂ０９対立遺伝子（配列番号４８）のＤＮＡ配列にアラインした。Ｂ０９対立遺伝子（配列番号４８）の非脂質化コード配列全体を最適化して、Ｂ４４（配列番号４４）とＢ０９（配列番号４９）との間のアミノ酸が同一であるところは全て、Ｂ４４の最適化された対立遺伝子（配列番号４３）において見られるコドンの変化を反映させた。Ｂ０９対立遺伝子とＢ４４対立遺伝子との間の同一のアミノ酸に対応する、Ｂ０９対立遺伝子におけるコドン配列を、Ｂ４４の最適化された配列（配列番号４３）において用いられるコドンを反映するように変化させた。Ｂ０９（配列番号４９）とＢ４４（配列番号４４）との間で異なるアミノ酸のコドン配列は、Ｂ０９のＤＮＡ配列においては変化させなかった。
さらに、非脂質化Ｂ４４アミノ酸配列（配列番号４４）は、そのＮ末端に２つの連続的なセリン−グリシン反復配列（Ｓ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ）（配列番号５６）（配列番号４４のアミノ酸２から６もまた参照されたい）を含有し、一方、Ｂ０９対立遺伝子は、Ｎ末端にただ１つのセリン−グリシン反復を含有する（配列番号４９のアミノ酸２から６およびアミノ酸７から１１を参照されたい）。Ｂ４４のＮ末端にある２つのセリン−グリシン反復（配列番号４４のアミノ酸２から６およびアミノ酸７から１１を参照されたい）はまた、異なるコドン使用頻度を有し（配列番号４３のヌクレオチド４から１８およびヌクレオチド１９から３３を参照されたい）、最適化されたＢ４４のセリン−グリシン反復の異なる組み合わせ（例えば、配列番号４３のヌクレオチド４から１８、または配列番号４３のヌクレオチド１９から３３、またはその組み合わせ）を、組換えタンパク質発現に対する影響を試験するために、Ｂ０９のＤＮＡ配列に適用した（例えば、配列番号４８のヌクレオチド４から１８に適用された、配列番号４８）。
３つの異なる型の最適化されたＢ０９を構築した：配列番号４５は、最適化されたＢ４４の両セリン−グリシン反復（ＧＳ１およびＧＳ２）（配列番号４３の核酸４から３３）を含有し、配列番号４６は、ＧＳ１（配列番号４３の核酸４から１８）を含有し、配列番号４７は、ＧＳ２（配列番号４３の核酸１９から３３）を含有する。上記のコドンを最適化された配列の全てについてのＤＮＡは、当技術分野の化学における標準を用いて化学的に合成された。得られたＤＮＡを適切なプラスミド発現ベクター内にクローニングし、実施例８および９において記載されているように、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞における発現について試験した。
（実施例８）：ＯＲＦ２０８６、Ｂ０９変異体を発現させるための方法
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ−１２株（ｒｅｃＡ、ｆｈｕＡ、およびａｒａＡの欠失を有する野生型Ｗ３１１０（ＣＧＳＣ４４７４）の誘導体）の細胞を、配列番号４５を含むプラスミドｐＥＢ０６３、配列番号４６を含むｐＥＢ０６４、配列番号４７を含むプラスミドｐＥＢ０６５、または配列番号４８を含むプラスミドｐＬＡ１３４で形質転換した。Ｋ−１２株に対する好ましい修飾は、発酵目的に有用であるが、タンパク質の発現に必要ではない。
細胞を、グルコース−塩規定培地に接種した。３７℃で８時間インキュベートした後、線状グルコース流加物をアプライし、インキュベーションをさらに３時間続けた。イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を０．１ｍＭの最終濃度まで培養物に添加し、その後、３７℃で１２時間インキュベートした。細胞を、１６，０００×ｇで１０分間にわたる遠心分離によって回収し、Ｌｉｅｎｃｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から入手したＥａｓｙ−Ｌｙｓｅ（商標）Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｎｇ Ｋｉｔ”、およびローディングバッファーを添加することによって溶解した。澄明化した溶解物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクマシー染色および／またはウェスタンブロット分析によってＢ０９の発現について分析し、走査デンシトメーターによって定量した。走査デンシトメトリーの結果を以下の表７に示す。
Figure 0005976652
（実施例９）：ＯＲＦ２０８６、Ｂ４４変異体を発現させるための方法
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂ株（ＢＬＲ（ＤＥ３）、Ｎｏｖａｇｅｎ）の細胞を、配列番号５１を含むプラスミドｐＬＮ０５６で形質転換した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ−１２株（野生型Ｗ３１１０の誘導体）の細胞を、配列番号４３を含むプラスミドｐＤＫ０８７で形質転換した。細胞を、グルコース−塩規定培地に接種した。３７℃で８時間インキュベートした後、線状グルコース流加物をアプライし、インキュベーションをさらに３時間続けた。イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を０．１ｍＭの最終濃度まで培養物に添加し、その後、３７℃で１２時間インキュベートした。細胞を、１６，０００×ｇで１０分間にわたる遠心分離によって回収し、Ｌｉｅｎｃｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から入手したＥａｓｙ−Ｌｙｓｅ（商標）Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｎｇ Ｋｉｔ”、およびローディングバッファーを添加することによって溶解した。上清を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクマシー染色および／またはウェスタンブロット分析によってＢ０９の発現について分析し、走査デンシトメーターによって定量した。走査デンシトメトリーの結果を以下の表８に示す。
Figure 0005976652
（実施例１０）：ピルビル化
本実施例は、非脂質化ＯＲＦ２０８６タンパク質のＮ末端Ｃｙｓ残基が、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現した場合にピルビル化され得ることを示す。
変異体Ａ０５（配列番号１３）およびＢ４４（配列番号２１）の産生の間の異種タンパク質の蓄積を、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を用いてモニタリングした。この分離を、四重極飛行時間型質量分析計（ＱＴＯＦ−ＭＳ）と連動させて、生成物に関連する変異体の形成をモニタリングする手段を提供する。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂおよび／またはＫ−１２宿主細胞において発現した後、これらの発酵に由来する生成物を精製手順に供し、その間に生成物の修飾が観察された。質量スペクトルのデコンボリューションは、それぞれＡ０５およびＢ４４について、変異体を、２７６４０および２７５７２Ｄａの天然生成物と比較して＋７０Ｄａの質量シフトを示すと特徴付けした。
公開された文献は、＋７０Ｄａの質量シフトがタンパク質においてこれまでに観察されており、アミノ末端残基のピルビル化に寄与していることを示した。
ピルベート基の存在および位置を、質量スペクトルのフラグメンテーションデータ（ＭＳ／ＭＳ）を用いて確認した。データは、修飾が、Ａ０５およびＢ４４に従うと、アミノ末端のシステイン残基、すなわち１位のアミノ酸にあることを示した。Ａ０５では、ピルビル化されたポリペプチドのパーセンテージは、Ａ０５ポリペプチド（配列番号１３）の総数と比較して約３０％であった。Ｂ４４では、ピルビル化されたポリペプチドのパーセンテージは、Ｂ４４ポリペプチド（配列番号２１）の総数と比較して約２５％であった。
アミノ末端システインを含有しない、Ａ０５変異体（１位のＮ末端Ｃｙｓが欠失している配列番号１３、または配列番号５５）およびＢ４４変異体（１位のＮ末端Ｃｙｓが欠失している配列番号２１、または配列番号４４）を精製すると、検出可能なピルビル化（＋７０Ｄａ）は存在しなかった。
（実施例１１）：個別のおよび組み合わせたＢ０９およびＢ４４の免疫原性
５〜１０群のアカゲザルを、用量当たり２５０ｍｃｇのＡｌＰＯ４と共に製剤されたＢ０９変異体（配列番号４８によってコードされる配列番号４９）またはＢ４４変異体（配列番号４３によってコードされる配列番号４４）、またはＡ０５、Ｂ０９、およびＢ４４（それぞれ、配列番号５５、配列番号４８によってコードされる配列番号４９、および配列番号４３によってコードされる配列番号４４）で免疫化した。サルを、表９および１０において列挙されているような単独のまたは組み合わせた各１０ｍｃｇの非脂質化ｆＨＢＰで、０週目、４週目、および８週目に、筋肉内経路を介してワクチン接種した。０週目および１２週目の両方で、血清試料を、サブファミリーＡまたはサブファミリーＢのｆＨＢＰ変異体を用いるＭｎＢ株に対するＳＢＡにおいて分析した。レスポンダーを、力価が４倍上昇した動物として記録した。試験したＢ４４変異体は、最適化された構築物（配列番号４３）であり、これまでの研究（上記の表）において観察された広い応答比率は、最適化された構築物（表９）である単独のまたはＢ０９と組み合わされたＢ４４ワクチンについて維持された。Ｂ０９ワクチン単独（表１０）もまた、広く交差反応性の免疫応答を生じさせ得た（表１０）。
Figure 0005976652
アカゲザル（ｎ＝１０）を、２５０ｍｃｇのＡｌＰＯ４と製剤した、ワクチンの欄において列挙されているような単独のまたは組み合わされた各１０ｍｃｇの非脂質化ｆＨＢＰで、０週目、４週目、および８週目にｉ．ｍ．で免疫化した。０週目および１０週目の両方の血清試料を、表において列挙されているＭｎＢ株に対するＳＢＡにおいて分析した。レスポンダーを、力価が４倍上昇した動物として記録した。
表９は、例えば、ピルビル化されていない非脂質化Ｂ４４、Ｂ０９、およびＡ０５の組み合わせを含む組成物が、Ｂ４４のみを含む組成物からの交差適用範囲と比較して、試験変異体に対するさらに高い交差適用範囲を示したことを示す。特に表６および表９を共に含む、本願において示される結果を考慮して、単独のまたは組み合わされたＢ４４、Ｂ０９、およびＡ０５を含む組成物は、本発明の好ましい実施形態である。特に、Ｂ４４およびＢ０９の両方を含む組成物が開示される。このような組成物は、好ましくはさらに、特にＡ０５などのサブファミリーＡポリペプチドを含む。
Figure 0005976652
アカゲザル（ｎ＝５）を、２５０ｍｃｇのＡｌＰＯ４と製剤した、ワクチンの欄において列挙されているような単独のまたは組み合わされた各１０ｍｃｇの非脂質化ｆＨＢＰで、０週目、４週目、および８週目にｉ．ｍ．で免疫化した。０週目および１０週目の両方の血清試料を、表において列挙されているＭｎＢ株に対するＳＢＡにおいて分析した。レスポンダーを、力価が４倍上昇した動物として記録した。
（実施例１２）：脂質化変異体構築物および非脂質化変異体構築物によって付与された免疫防御
Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｃａｎａｄａから入手した、２．５〜３．５ｋｇの、２０頭のメスのニュージーランドホワイトウサギを、全細胞ＥＬＩＳＡによってプレスクリーニングし、１０頭の動物を、ｆＨＢＰ変異体Ｂ０２（配列番号１６）およびＢ４４（配列番号２１）を示す試験株に対するそれらの低いバックグラウンド力価に基づいて、この研究のために選択した（表１１）。３頭の動物からなる群を、０週目、４週目、および９週目に、０．５ｍｌ用量当たり５０μｇのＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸと共に製剤された１００μｇの各タンパク質でｉ．ｍ．で免疫化した（表１２）。群１を、非脂質化Ｂ４４（配列番号４４）でワクチン接種した。対照群には、ＡｌＰＯ４（２５０ｍｃｇ）と共に製剤された脂質化Ｂ０１でワクチン接種されたものが含まれた。ウサギを、０週目、４週目、９週目、および１０週目に採血した。１０週目の個別の血清を調製し、ｆＨＢＰ Ｂサブファミリーの複数の血清群Ｂの髄膜炎菌株に対する血清殺菌アッセイによって分析した。
Figure 0005976652
Figure 0005976652
血清殺菌アッセイ（ＳＢＡ）：複数の血清群Ｂの髄膜炎菌株（表１３）に対する、マイクロコロニーに基づいた血清殺菌アッセイ（ＳＢＡ）を、個別の血清試料に対して行った。ドナーのヒト血清は、アッセイにおいて試験される株のための補体源として適格であった。補体介在性の抗体依存性の殺菌力価を補間し、アッセイにおいて髄膜炎菌細胞の５０％を死滅させた試験血清の希釈の逆数として表した。アッセイの検出限界は、ＳＢＡ力価４であった。４未満のＳＢＡ力価には、数字２が付与された。採血前の力価と比較した、１０週目の血清におけるＳＢＡ力価の４倍以上の上昇を計算し、比較した。
ＳＢＡにおいて測定される血清殺菌抗体の活性は、髄膜炎菌性の疾患に対する防御の免疫学的代替手段である。非脂質化ｒｆＨＢＰでの免疫化の、ウサギにおける殺菌性抗体を誘発する能力を、ＳＢＡによって決定した。ＳＢＡは、天然に生じる補体介在性の細菌溶解を模倣することによって、血清試料における抗体のレベルを測定する。１０週目から回収されたウサギ血清試料を、Ｂ４４ ｆＨＢＰまたはＢ０２ ｆＨＢＰを有する株に対するＳＢＡによって分析した。表１３において示されるように、第３回目の免疫化（１０週目）の１週間後、全ての血清試料は、両試験株に対して殺菌活性を示した（表１３）。非脂質化Ｂ４４（配列番号４４）は、これらの株に対して、ニュージーランドウサギにおいて、非脂質化Ｂ０１よりも免疫原性であった。ｉｓｃｏｍａｔｒｉｘアジュバントと共に製剤された非脂質化Ｂ４４（配列番号４４）は、これらの株に対して、リン酸アルミニウムと共に製剤された脂質化Ｂ０１に匹敵する力価をもたらした。ウサギの採血前の血清は、全体として、試験した株に対して既存の殺菌活性を示さなかった。
Figure 0005976652
（実施例１３）：ニュージーランドホワイトウサギにおける６個の非脂質化因子Ｈ結合タンパク質の免疫原性
５頭のウサギからなる群を、表１４において記載されているように非脂質化ｆＨＢＰ変異体で免疫化した。ワクチンを、０週目、４週目、および９週目に投与した。０週目および１０週目に回収されたウサギの血清試料を、相同なおよび異種のｆＨＢＰ配列を有する株に対するＳＢＡによって分析した。表１４は、３回目の免疫化の後のレスポンダーパーセントを示す。３回目の免疫化（１０週目）の１週間後、全ての血清試料は、相同な株および同一のｆＨＢＰサブファミリーの他の試験株に対して殺菌活性を示した。ウサギの採血前の血清は、全体として、試験した株に対して既存の殺菌活性を示さなかった。
Figure 0005976652
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本発明はまた、以下の箇条書きで規定される以下の実施形態を提供する。
Ｃ１． Ｐ２０８６ポリペプチドを含む免疫原性組成物であって、Ｐ２０８６がＢ４４変異体、Ｂ０２変異体、Ｂ０３変異体、Ｂ２２変異体、Ｂ２４変異体、Ｂ０９変異体、Ａ０５変異体、Ａ０４変異体、Ａ１２変異体、またはＡ２２変異体である、免疫原性組成物。
Ｃ２． Ｐ２０８６サブファミリーＢポリペプチドを含む免疫原性組成物であって、Ｐ２０８６サブファミリーＢポリペプチドがＢ４４変異体、Ｂ０２変異体、Ｂ０３変異体、Ｂ２２変異体、Ｂ２４変異体、またはＢ０９変異体である、免疫原性組成物。
Ｃ３． Ｐ２０８６サブファミリーＡポリペプチドをさらに含む、Ｃ２に記載の免疫原性組成物。
Ｃ４． Ｐ２０８６サブファミリーＡポリペプチドがＡ０５変異体、Ａ０４変異体、Ａ１２変異体、またはＡ２２変異体である、Ｃ３に記載の免疫原性組成物。
Ｃ５． アジュバントをさらに含む、Ｃ１〜４のいずれか１つに記載の免疫原性組成物。
Ｃ６． アジュバントが、
ａ）アルミニウムアジュバント、
ｂ）サポニン、
ｃ）ＣｐＧヌクレオチド配列、ならびに
ｄ）ａ）、ｂ）、およびｃ）のあらゆる組み合わせ
からなる群から選択される、Ｃ５に記載の免疫原性組成物。
Ｃ７． アルミニウムアジュバントが、ＡｌＰＯ４、Ａｌ（ＯＨ）３、Ａｌ２（ＳＯ４）３、およびミョウバンからなる群から選択される、Ｃ６に記載の免疫原性組成物。
Ｃ８． アルミニウムの濃度が０．１２５μｇ／ｍｌと０．５μｇ／ｍｌとの間である、Ｃ６またはＣ７に記載の免疫原性組成物。
Ｃ９． アルミニウムの濃度が０．２５μｇ／ｍｌである、Ｃ８に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１０． サポニンの濃度が１μｇ／ｍｌと２５０μｇ／ｍｌとの間である、Ｃ６〜９のいずれか１つに記載の免疫原性組成物。
Ｃ１１． サポニンの濃度が１０μｇ／ｍｌと１００μｇ／ｍｌとの間である、Ｃ１０に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１２． サポニンの濃度が１０μｇ／ｍｌである、Ｃ１０に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１３． サポニンの濃度が１００μｇ／ｍｌである、Ｃ１０に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１４． サポニンがＱＳ−２１またはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸである、Ｃ６〜１３のいずれか１つに記載の免疫原性組成物。
Ｃ１５． 複数回用量を対象に投与した後に髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）細菌に対する免疫原性応答を生じさせる能力を付与する、Ｃ１〜１４のいずれか１つに記載の免疫原性組成物。
Ｃ１６． 髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）細菌に対する免疫原性応答が、２回用量を対象に投与した後に付与される、Ｃ１５に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１７． 髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）細菌に対する免疫原性応答が、３回用量を対象に投与した後に付与される、Ｃ１５に記載の免疫原性組成物。
Ｃ１８． サポニンおよび少なくとも１つの非脂質化Ｐ２０８６抗原を含む、非脂質化Ｐ２０８６抗原に対する免疫原性を増大させる組成物。
Ｃ１９． サポニンの濃度が１μｇ／ｍｌと２５０μｇ／ｍｌとの間である、Ｃ１８に記載の免疫原性組成物。
Ｃ２０． サポニンの濃度が１０μｇ／ｍｌと１００μｇ／ｍｌとの間である、Ｃ１９に記載の免疫原性組成物。
Ｃ２１． サポニンの濃度が１０μｇ／ｍｌである、Ｃ１９に記載の免疫原性組成物。
Ｃ２２． サポニンの濃度が１００μｇ／ｍｌである、Ｃ１９に記載の免疫原性組成物。
Ｃ２３． サポニンがＱＳ−２１またはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸである、Ｃ１８〜Ｃ２２のいずれか１つに記載の免疫原性組成物。
Ｃ２４． アルミニウムをさらに含む、Ｃ１８〜Ｃ２３のいずれか１つに記載の免疫原性組成物。
Ｃ２５． アルミニウムの濃度が０．１２５μｇ／ｍｌと０．５μｇ／ｍｌとの間である、Ｃ２４に記載の免疫原性組成物。
Ｃ２６． アルミニウムの濃度が０．２５μｇ／ｍｌである、Ｃ２５に記載の免疫原性組成物。
Ｃ２７． 複数回用量を対象に投与した後に髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）細菌に対する免疫原性応答を付与する、Ｃ１８〜２６のいずれか１つに記載の免疫原性組成物。
Ｃ２８． 髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）細菌に対する免疫原性応答が、２回用量を対象に投与した後に付与される、Ｃ２７に記載の免疫原性組成物。
Ｃ２９． 髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）細菌に対する免疫原性応答が、３回用量を対象に投与した後に付与される、Ｃ２７に記載の免疫原性組成物。
Ｃ３０． 非脂質化Ｐ２０８６抗原が、非脂質化Ｐ２０８６サブファミリーＢポリペプチドである、Ｃ１８〜２９のいずれか１つに記載の免疫原性組成物。
Ｃ３１． 非脂質化Ｐ２０８６サブファミリーＢポリペプチドがＢ４４変異体、Ｂ０２変異体、Ｂ０３変異体、Ｂ２２変異体、Ｂ２４変異体、またはＢ０９変異体である、Ｃ３０に記載の免疫原性組成物。
Ｃ３２． 非脂質化Ｐ２０８６抗原が、非脂質化Ｐ２０８６サブファミリーＡポリペプチドである、Ｃ１８〜２９のいずれか１つに記載の免疫原性組成物。
Ｃ３３． 非脂質化Ｐ２０８６サブファミリーＡポリペプチドがＡ０５変異体、Ａ０４変異体、Ａ１２変異体、またはＡ２２変異体である、Ｃ３２に記載の免疫原性組成物。
Ｃ３４． 組成物が少なくとも２つの非脂質化Ｐ２０８６抗原を含み、２つの非脂質化Ｐ２０８６抗原が、少なくとも１つの非脂質化Ｐ２０８６サブファミリーＡポリペプチドおよび少なくとも１つの非脂質化Ｐ２０８６サブファミリーＢポリペプチドである、Ｃ１８〜３３のいずれか１つに記載の免疫原性組成物。
Ｃ３５． 非脂質化Ｐ２０８６サブファミリーＡポリペプチドがＡ０５変異体であり、非脂質化Ｐ２０８６サブファミリーＢポリペプチドがＢ４４変異体である、Ｃ３４に記載の免疫原性組成物。
Ｃ３６． 非脂質化Ｐ２０８６サブファミリーＡポリペプチドがＡ０５変異体であり、非脂質化Ｐ２０８６サブファミリーＢポリペプチドがＢ２２変異体である、Ｃ３４に記載の免疫原性組成物。
Ｃ３７． 非脂質化Ｐ２０８６サブファミリーＡポリペプチドがＡ０５変異体であり、非脂質化Ｐ２０８６サブファミリーＢポリペプチドがＢ０９変異体である、Ｃ３４に記載の免疫原性組成物。
Ｃ３８． 対象に髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）細菌に対する免疫性を付与するための方法であって、Ｐ２０８６サブファミリーＢポリペプチドを含む免疫原性組成物を対象に投与するステップを含み、Ｐ２０８６サブファミリーＢポリペプチドがＢ４４変異体、Ｂ０２変異体、Ｂ０３変異体、Ｂ２２変異体、Ｂ２４変異体、またはＢ０９変異体である方法。
Ｃ３９． 免疫原性組成物がＰ２０８６サブファミリーＡポリペプチドをさらに含む、Ｃ３８に記載の方法。
Ｃ４０． Ｐ２０８６サブファミリーＡポリペプチドがＡ０５変異体、Ａ０４変異体、Ａ１２変異体、またはＡ２２変異体である、Ｃ３９に記載の方法。
Ｃ４１． 免疫原性組成物がアジュバントをさらに含む、Ｃ３８〜４０のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ４２． アジュバントが、
ａ）アルミニウムアジュバント、
ｂ）サポニン、
ｃ）ＣｐＧヌクレオチド配列、ならびに
ｄ）ａ）、ｂ）、およびｃ）のあらゆる組み合わせ
からなる群から選択される、Ｃ４１に記載の方法。
Ｃ４３． アルミニウムアジュバントが、ＡｌＰＯ４、Ａｌ（ＯＨ）３、Ａｌ２（ＳＯ４）３、およびミョウバンからなる群から選択される、Ｃ４２に記載の方法。
Ｃ４４． アルミニウムの濃度が０．１２５μｇ／ｍｌと０．５μｇ／ｍｌとの間である、Ｃ４２またはＣ４３に記載の方法。
Ｃ４５． アルミニウムの濃度が０．２５μｇ／ｍｌである、Ｃ４４に記載の方法。
Ｃ４６． サポニンの濃度が１μｇ／ｍｌと２５０μｇ／ｍｌとの間である、Ｃ４２〜４５のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ４７． サポニンの濃度が１０μｇ／ｍｌと１００μｇ／ｍｌとの間である、Ｃ４６に記載の方法。
Ｃ４８． サポニンの濃度が１０μｇ／ｍｌである、Ｃ４７に記載の方法。
Ｃ４９． サポニンの濃度が１００μｇ／ｍｌである、Ｃ４８に記載の方法。
Ｃ５０． サポニンがＱＳ−２１またはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸである、Ｃ４２〜４９のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ５１． 免疫原性組成物が、投与スケジュールを通して複数回用量で対象に投与される、Ｃ３８〜５０に記載の方法。
Ｃ５２． 免疫原性組成物が、投与スケジュールを通して２回用量で対象に投与される、Ｃ５１に記載の方法。
Ｃ５３． 免疫原性組成物が、投与スケジュールを通して３回用量で対象に投与される、Ｃ５１に記載の方法。
Ｃ５４． 非脂質化Ｐ２０８６変異体ポリペプチドを産生するための方法であって、
ａ）ＯＲＦ２０８６変異体の核酸配列を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクター内にクローニングするステップ、
ｂ）細菌をＯＲＦ２０８６発現ベクターで形質転換するステップ、
ｃ）発現を誘発するステップ、および
ｄ）発現したＰ２０８６タンパク質を単離するステップ
を含み、ＯＲＦ２０８６発現ベクターが脂質化制御配列を含まない方法。
Ｃ５５． ＯＲＦ２０８６変異体のＮ末端Ｃｙｓをコードするコドンが欠失している、Ｃ５４に記載の方法。
Ｃ５６． ＯＲＦ２０８６変異体のＮ末端Ｃｙｓをコードするコドンが、Ａｌａコドン、Ｇｌｙコドン、またはＶａｌコドンを生じさせるように突然変異している、Ｃ５４に記載の方法。
Ｃ５７． ＯＲＦ２０８６変異体がＡ０５変異体、Ｂ０１変異体、またはＢ４４変異体である、Ｃ５５または５６に記載の方法。
Ｃ５８． Ｎ末端尾部が、Ｓｅｒ残基およびＧｌｙ残基を付加してＮ末端Ｃｙｓのすぐ下流のＧｌｙ／Ｓｅｒストークを伸長するように突然変異されている、Ｃ５４〜５７のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ５９． Ｇｌｙ／ＳｅｒストークにおけるＧｌｙ残基およびＳｅｒ残基の総数が少なくとも７である、Ｃ５８に記載の方法。
Ｃ６０． Ｇｌｙ／ＳｅｒストークにおけるＧｌｙ残基およびＳｅｒ残基の総数が少なくとも８である、Ｃ５８に記載の方法。
Ｃ６１． Ｇｌｙ／ＳｅｒストークにおけるＧｌｙ残基およびＳｅｒ残基の総数が少なくとも９である、Ｃ５８に記載の方法。
Ｃ６２． Ｇｌｙ／ＳｅｒストークにおけるＧｌｙ残基およびＳｅｒ残基の総数が少なくとも１０である、Ｃ５８に記載の方法。
Ｃ６３． Ｇｌｙ／ＳｅｒストークにおけるＧｌｙ残基およびＳｅｒ残基の総数が少なくとも１１である、Ｃ５８に記載の方法。
Ｃ６４． Ｇｌｙ／ＳｅｒストークにおけるＧｌｙ残基およびＳｅｒ残基の総数が少なくとも１２である、Ｃ５８に記載の方法。
Ｃ６５． ＯＲＦ２０８６変異体のＮ末端尾部のコドンが、ＯＲＦ２０８６変異体の５番目のアミノ酸をコードするコドンが配列番号８のヌクレオチド１３〜１５に１００％同一となり、ＯＲＦ２０８６変異体の１３番目のアミノ酸をコードするコドンが配列番号８のヌクレオチド３７〜３９に１００％同一となるような点突然変異生成によって最適化されている、Ｃ５４〜５７のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ６６． ＯＲＦ２０８６変異体のＮ末端尾部のコドンが、配列番号８のヌクレオチド１〜４５に１００％同一である、Ｃ６５に記載の方法。
Ｃ６７． ＯＲＦ２０８６変異体のＮ末端尾部のコドンが、配列番号８のヌクレオチド４〜４５に１００％同一である、Ｃ６５に記載の方法。
Ｃ６８． ＯＲＦ２０８６変異体のＮ末端尾部のコドンが、配列番号８のヌクレオチド４〜４２に１００％同一である、Ｃ６５に記載の方法。
Ｃ６９． ＯＲＦ２０８６変異体によってコードされるタンパク質のＮ末端尾部が、配列番号１８のアミノ酸１〜１５と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、Ｃ６５に記載の方法。
Ｃ７０． ＯＲＦ２０８６変異体によってコードされるタンパク質のＮ末端尾部が、配列番号１８のアミノ酸２〜１５と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、Ｃ６５に記載の方法。
Ｃ７１． ＯＲＦ２０８６変異体によってコードされるタンパク質のＮ末端尾部が、配列番号１８のアミノ酸１〜１５と比較して２つのアミノ酸置換を含む、Ｃ６５に記載の方法。
Ｃ７２． ＯＲＦ２０８６変異体によってコードされるタンパク質のＮ末端尾部が、配列番号１８のアミノ酸２〜１５と比較して２つのアミノ酸置換を含む、Ｃ６５に記載の方法。
Ｃ７３． アミノ酸置換が、保存的なアミノ酸置換である、Ｃ６９〜７２のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ７４． ＯＲＦ２０８６変異体がＡ２２変異体またはＢ２２変異体である、Ｃ６５〜７３のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ７５． 発現がＩＰＴＧの付加によって誘発される、Ｃ５５〜７４のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ７６． 細菌が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、Ｃ５５〜７５のいずれか１つに記載の方法。

Claims (26)

  1. 単離されたピルビル化されていない非脂質化ＯＲＦ２０８６ポリペプチドを含む組成物であって、
    前記ポリペプチドが、１位のシステインが欠失している、配列番号１３、配列番号１８、配列番号２１および配列番号５８からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、
    組成物。
  2. 免疫原性である、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記ポリペプチドが、対応する野生型の非脂質化ＯＲＦ２０８６ポリペプチドと比較して、Ｎ末端Ｃｙｓの欠失を含む、請求項１に記載の組成物。
  4. 単離されたピルビル化されていない非脂質化ＯＲＦ２０８６ポリペプチドを含む組成物であって、
    前記ポリペプチドが、配列番号４４、配列番号４９、配列番号５０、および配列番号５５からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、組成物。
  5. 前記ポリペプチドが、発現系に作動可能に連結したヌクレオチド配列によってコードされ、前記発現系が、細菌細胞において発現され得る、請求項１に記載の組成物。
  6. 発現系がプラスミド発現系である、請求項５に記載の組成物。
  7. 細菌細胞が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である、請求項５に記載の組成物。
  8. ヌクレオチド配列が、前記ヌクレオチド配列の発現を制御する調節配列に連結している、請求項５に記載の組成物。
  9. 単離されたピルビル化されていない非脂質化ＯＲＦ２０８６ポリペプチドを含む組成物であって、
    前記ポリペプチドが、対応する野生型の非脂質化ＯＲＦ２０８６ポリペプチドと比較して、配列番号１３、配列番号１８、配列番号５８、配列番号２１からなる群から選択されるアミノ酸配列のＮ末端Ｃｙｓの置換を含む、組成物。
  10. １位のシステインが欠失している、配列番号１３、配列番号１８、配列番号２１、および配列番号５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、細菌細胞において発現され得る発現系に作動可能に連結しているヌクレオチド配列を発現させるステップを含むプロセスによって得ることが可能なピルビル化されていない非脂質化ＯＲＦ２０８６ポリペプチドを含む組成物。
  11. 細菌細胞が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、請求項１０に記載の組成物。
  12. 配列番号４９で示されるアミノ酸配列からなる単離されたピルビル化されていない非脂質化ＯＲＦ２０８６ポリペプチド、および配列番号４４で示されるアミノ酸配列からなる単離されたピルビル化されていない非脂質化ＯＲＦ２０８６ポリペプチドを含む組成物。
  13. 免疫原性である、請求項１〜１２のいずれかに記載の組成物。
  14. 血清群Ｂの髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＯＲＦ２０８６サブファミリーＡポリペプチドをさらに含む、請求項１２に記載の組成物。
  15. 血清群Ｂの髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＯＲＦ２０８６サブファミリーＢポリペプチドに対する、哺乳動物における殺菌性の免疫応答を誘発する、請求項１〜１２のいずれかに記載の組成物。
  16. 哺乳動物において血清群Ｂの髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＯＲＦ２０８６サブファミリーＢに特異的な殺菌性抗体を誘発するための、配列番号４４および配列番号４９からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、単離されたピルビル化されていない非脂質化ＯＲＦ２０８６ポリペプチドを含む組成物。
  17. 血清群Ｂの髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＯＲＦ２０８６サブファミリーＢポリペプチドを含む免疫原性組成物であって、前記ポリペプチドがピルビル化されていない非脂質化Ｂ４４であり、
    前記ピルビル化されていない非脂質化Ｂ４４は配列番号４４のアミノ酸配列のポリペプチドである、
    免疫原性組成物。
  18. 血清群Ｂの髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の第２のＯＲＦ２０８６サブファミリーＢポリペプチドをさらに含み、第２のポリペプチドがピルビル化されていない非脂質化Ｂ０９であり、
    前記ピルビル化されていない非脂質化Ｂ０９は配列番号４９のアミノ酸配列のポリペプチドである、
    請求項１７に記載の組成物。
  19. ３つ以下のＯＲＦ２０８６サブファミリーＢポリペプチドを含む、請求項１７に記載の組成物。
  20. ２つ以下のＯＲＦ２０８６サブファミリーＢポリペプチドを含む、請求項１７に記載の組成物。
  21. ＯＲＦ２０８６サブファミリーＡポリペプチドをさらに含む、請求項１７に記載の組成物。
  22. 配列番号５５のアミノ酸配列である、Ａ０５サブファミリーＡポリペプチドを含む、請求項２１に記載の組成物。
  23. 単離されたピルビル化されていない非脂質化ＯＲＦ２０８６ポリペプチドを含む組成物であって、
    前記ポリペプチドが１位のシステインが欠失している配列番号１３のアミノ酸配列を有する、
    組成物。
  24. 単離されたピルビル化されていない非脂質化ＯＲＦ２０８６ポリペプチドを含む組成物であって、
    前記ポリペプチドが１位のシステインが欠失している配列番号１８のアミノ酸配列を有する、
    組成物。
  25. 単離されたピルビル化されていない非脂質化ＯＲＦ２０８６ポリペプチドを含む組成物であって、
    前記ポリペプチドが１位のシステインが欠失している配列番号２１のアミノ酸配列を有する、
    組成物。
  26. 単離されたピルビル化されていない非脂質化ＯＲＦ２０８６ポリペプチドを含む組成物であって、
    前記ポリペプチドが１位のシステインが欠失している配列番号５８のアミノ酸配列を有する、
    組成物。

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