BRPI0611447A2 - imunógenos para vacinas contra meningite a - Google Patents

Abstract

IMUNOGENOS PARA VACINAS CONTRA MENINGITE A. A presente invenção refere-se a um oligosacarídeo útil para vacina contra meningite-A, contendo uma primeira unidade de manose que tem um espaçador na configuração alfa em 0-1, sendo o espaçador capaz de se conjugar a uma proteína, e no qual é conectado a uma segunda unidade de manose através de uma ligação 1,6 que conecta 0-6 da primeira unidade ao 0-1 da segunda unidade, em que a ligação 1,6 compreende um fosfonato. Processos relacionados à preparação de tais compostos, compostos análo- gos, ou intermediários dos mesmos, também são descritos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "IMUNOGE-NOS PARA VACINAS CONTRA MENINGITE A".

PEDIDO DE PATENTE RELACIONADO

Este pedido de patente reivindica benefício do pedido de patenteU. S. número 60/678.289 depositado em 6 de maio de 2005, que é incorpo-rado aqui por referência em sua totalidade.

CAMPO TÉCNICO

A presente invenção refere-se a um composto útil para uma va-cina de Meningite A. Mais particularmente, o composto é um oligossacarídeoque compreende uma ligação contendo fósforo estabilizado, preferivelmenteuma ligação de fosfonato. O composto mais preferivelmente contém unida-des de manose e pode também conter um espaçador na configuração alfaem C-1 da unidade de manose. A invenção também inclui métodos de fazero oligossacarídeo e métodos melhorados de fazer compostos contendo ma·nose e intermediários.

ANTECEDENTE DA TÉCNICA

Meningite é uma infecção da meninge, o revestimento fino quecircunda o cérebro e medula espinhal. Vários tipos de bactérias podem cau-sar meningite, e N. Meníngitídís é uma das mais importantes. Outras sãoStreptococus pneumoniae e Haemophilus influenzae tipo b. Há vários sub-grupos de N. Meningitidis, que são diferenciados pela estrutura do polissaca-rídeo capsular que circunda a bactéria.

Meningite é causada por vírus e bactérias. Os dois tipos princi-pais de bactérias que causam meningite são Haemophilus influenzae eNeisseria Meningitidis. No caso de H. influenzae apenas um sorotipo, tipo b,é importante, enquanto que com N. Meningitidis doze sorogrupos foram i-dentificados, destes grupos A, B, C, e W135 são conhecidos causar epide-mias. Os vários sorotipos têm prevalência geográfica diferente, por exemplo,tipo BeC são dominantes na Europa e América do Norte e o Tipo A na Áfri-ca e América do Sul. A sorotipagem é com base na estrutura e antigenicida-de do polissacarídeo capsular (CPS) circundando as bactérias, e o CPS po-de também ser usado como uma vacina contra as bactérias. Vacinas espe-cialmente eficientes (vacinas de glicoconjugado) podem ser feitas ligando osacarídeo a uma proteína veículo. Ver Plotkin1 S. A., e Orenstein, W. A.,Vaccines, 4ê ed., Saunders1 páginas 959-987 (2004) que é incorporado aquipor referência. Estes glicoconjugados induzem uma resposta imune depen-dente de célula T com memória e efeito também em crianças pequenas, en-quanto o CPS não-conjugado em geral não fornece um efeito de memóriaem adultos ou qualquer efeito imunogênico substancial em lactentes. O de-senvolvimento de vacinas do tipo A foi considerado especialmente difícil,devido à instabilidade inerente das ligações de diéster de fosfato anoméricasque fazem parte do CPS. A unidade de repetição do tipo A é um monossaca-rídeo, 2-acetamido-2-deóxi-D-D-manopiranose ligado 1 □ 6 por meio de umaligação em ponte de fosfodiéster (Figura 1). No polissacarídeo nativo o 3-OHé acetilado a uma extensão de cerca de 80 %. A importância imunológicadesta acetilação não foi completamente investigada, mas há indicações quenão é de significação principal.

Sorogrupo A de Neisseria Meningitidis causa erupções epidêmi-cas de meningite, principalmente em partes do sul da África do Saara naassim-chamada zona de meningite. Na zona de meningite a incidência esti-mada durante o período 1970-1992 foi cerca de 800.000 casos. Vide Plotkin,S. A. e Orenstein, W. A., Vaccines, 4- ed., Saunders, páginas 959-987(2004). As erupções epidêmicas de meningite estão devastando a região,assim uma vacina eficaz é urgentemente necessária. A esperança é claro,que o desenvolvimento de uma vacina boa, em combinação com esforçossimilares aos contra varíola executada por WHO nos anos 60 e 70 poderiaigualmente eliminar a meningite causada por N. meningitides sorotipo A. Va-cinações são uma forma muito mais eficaz de custo de controlar uma doen-ça que tratamento com antibióticos e outras terapias, e o custo é especial-mente importante no mundo em desenvolvimento.

Vacinas preparadas do polissacarídeo que reveste na bactéria,seu polissacarídeo capsular, são eficazes em adultos. Exposição a este po-lissacarídeo leva os adultos a desenvolver uma resposta imunogênica queprotege contra meningite causada por N. Meningitidis. Uma limitação grandecom tais vacinas, entretanto, é que o sistema imune de crianças por volta dedois anos de idade não responde à maioria dos antígenos de polissacarídeo.Infelizmente, esta é a faixa etária de maior risco para meningite bacteriana.

Desse modo, as vacinas de polissacarídeo são inúteis em crianças jovens.

Além disso, até mesmo nas crianças mais velhas e adultos, estas vacinasinduzem apenas imunidade a curto prazo. Proteção diminui rapidamente e éem geral perseguida por volta de dois anos após vacinação.

Polissacarídeos como o CPS de N. Meningitidis são antígenosindependentes de célula T, que significa que eles podem dar uma respostaimune sem o envolvimento das células T (células timo-derivadas). Esta res-posta carece de várias propriedades importantes que caracterizam a respos-ta imune dependente de célula T, como memória imunológica, troca de clas-se de IgM para IgG1 e maturação de afinidade. Se a parte do polissacarídeofor conectada a uma proteína veículo, porém, ela desencadeia uma respostaimune celular que cria efeito de memória, e também dá proteção em crian-ças jovens. Tais polissacarídeos ligados às proteínas de veículo são fre-qüentemente referidas como glicoconjugados, e são especialmente valiososcomo vacinas.

As vacinas de glicoconjugado são assim chamadas porque suaprodução envolve a conjugação de um antígeno de polissacarídeo ou outroantígeno glicosídico a uma proteína veículo. A porção do sacarídeo em vaci-nas de glicoconjugado usualmente é um CPS bacteriano funcionalizado,mas pode também ser sintético. Estruturas de carboidrato sintético têm vá-rias vantagens potenciais sobre aquelas com base em carboidratos de fon-tes naturais. Carboidratos naturalmente derivados são misturas heterogê-neas e podem incluir quantidades pequenas de impurezas naturais e conta-minantes. Em contraste, carboidratos sintéticos podem ser produzidos comocompostos simples homogêneos de uma maneira controlada, com pouca ounenhuma variabilidade de batelada-para-batelada. Outra vantagem das es-truturas sintéticas é que elas podem ser feitas para incluir grupos funcionaispara derivatização ou modificações da porção de carboidrato que são difí-ceis ou impossíveis de executar no material nativo. A proteína veículo é umfator importante na modulação da imunogenicidade. Vários veículos foramusados para conjugação, e os melhores resultados foram alcançados usan-do versões desintoxicadas de proteínas fortemente imunogênicas como dif-teria e toxinas de tétano que foram aprovadas para o uso em seres huma-nos. Vide patente U. S. No. 4.354.170. Foi também mostrado que o sistemaimune reage mais eficazmente quando os pacientes já foram imunizadoscom a proteína veículo particular.

Uma vacina de glicoconjugado usualmente é feita conjugando aestrutura de polissacarídeo capsular nativa da bactéria com uma proteínaveículo adequada. Porém houve problemas com aquele método devido àspropriedades do polissacarídeo que encapsula N. Meningitidis. Sua ligaçãode fosfodiéster pode degradar sob as condições necessárias a ligação dopolissacarídeo às proteínas, e até mesmo após preparação, os glicoconju-gados do CPS nativo tendem a degradar durante o armazenamento.

Fosfodiésters são normalmente bastante estáveis, mas no polis-sacarídeo capsular de N. Meningitidis, o fosfodiéster é ligado ao centro ano-mérico de um resíduo de carboidrato. Desse modo um oxigênio do fosfodiés-ter é também parte de uma ligação de acetal que o torna suscetível à cliva-gem hidrolítica catalisada por eletrófilos como íons de ácido ou de metal.Clivagem desta ligação quebra o polissacarídeo em pedaços menores. Infe-lizmente, durante as manipulações requeridas para formar um glicoconjuga-do, ou até mesmo em uma formulação de vacina, o CPS de N. Meningitidis

A está sujeito a tal degradação, tornando difícil de fazer e armazenar vacinaseficazes compreendendo este CPS particular.

Um modo de tornar a ligação de fosfodiéster mais estável é eli-minar o oxigênio entre o fósforo e o oxigênio anomérico, de forma que a por-ção da ligação não seja mais suscetível à clivagem através de hidrólise ele-trofílica. O oxigênio exocíclico no centro anomérico pode ser substituído comum átomo de carbono isostérico, (CH2)1 transformando o fosfodiéster em seuanálogo de C-fosfonato. Isto deveria produzir uma versão estabilizada dopolissacarídeo antigênico. Uma investigação direcionada para este métodofoi publicada recentemente. Torres-Sanchez1 M. L, et al, Synlett (2005)7:1147-1151. Porém, os autores não avaliaram a atividade de seus compos-tos ou descreveram um oligômero de mais de duas unidades de manose.Além disso, seu método de síntese forneceu apenas o anômero beta na po-sição onde o oligossacarídeo é intencionado ligar a uma proteína, enquantoo CPS nativo de N. Meningitidis apenas contém ligações alfa. Desse modoresta uma necessidade por glicoconjugados alfa-ligados tendo ligações es-tabilizadas entre as unidades de manose e por métodos de sintetizá-los.

Outro método é estabilizar as ligações de fosfodiéster usandoefeitos indutivos de substituintes pertos para reduzir a densidade dos elé-trons nos oxigênios anoméricos; isto, também, deveria reduzir os mecanis-mos de degradação eletrofílicos antecipados. A propriedade de atração deelétrons dos substituintes pode ser mantida enquanto um oligossacarídeo éconstruído, e talvez também enquanto é conjugado com uma proteína, de-pois removida uma vez a molécula já não necessita ser exposta às condi-ções destrutivas.

A presente invenção inclui cada um destes métodos como tam-bém combinações destes. Um aspecto da invenção desse modo forneceuma síntese eficiente de um análogo de C-fosfonato de uma forma oligomé-rica da unidade de repetição do polissacarídeo capsular de N. Meningitidisdo tipo A, necessário para o desenvolvimento da vacina. Vide Bundle1 D. R.,et al, J. Biol Chem. (1974) 249:2275-2281. A invenção particularmente for-nece métodos para introduzir uma porção espaçadora através da qual osoligossacarídeos da invenção podem ser conjugados com uma proteína parafazer uma vacina de glicoconjugado, e orientar a porção espaçadora na con-figuração alfa anomérica. A Figura 2 ilustra um composto tendo a configura-ção alfa desejada neste centro e um tendo a configuração beta. Consideran-do que o CPS natural do organismo alvo é um oligômero completamentealfa-ligado de unidades de manose, é especialmente desejável fornecer amesma configuração alfa-ligada em um imunógeno sintético. Até mesmo setodas as ligações entre as unidades de manose em uma porção de oligôme-ro sintético de um glicoconjugado estivessem na configuração alfa, a confi-guração no centro através da qual o oligossacarídeo é ligado à proteína po-deria ser particularmente influente nos efeitos imunogênicos quando a por-ção de oligossacarídeo do glicoconjugado contivesse menos que cerca de10 unidades de manose.

A presente invenção desse modo fornece tais compostos e mé-todos para a preparação destes compostos. A etapa de acoplamento crucialé freqüentemente executada usando um monoéster de C-fosfonato e condi-ções de Mitsunobu. Embora possa ser não prático preparar polissacarídeosque rivalizam o CPS natural em tamanho, que não é necessário, até mesmooligossacarídeos apenas algumas unidade de manose em comprimento po-dem suscitar uma resposta imune. E oligossacarídeos sintéticos oferecem asvantagens de mecanismos de ligação seletivos e estabilidade aumentada invivo, cada uma destas deveria intensificar sua eficácia imunogênica in vivo.

Outro aspecto da invenção fornece métodos para estabilizar asunidades de manose de forma que uma ligação de fosfodiéster, a ligaçãopresente no polissacarídeo capsular nativo, possa ser usada. Ela inclui com-postos e métodos que fornecem estabilização para facilitar preparação dosconjugados de proteína dos oligossacarídeos. A estabilização é fornecidapor um grupo de atração de elétrons, uma azida, no C-2 de pelo menos umadas unidades de manose em um polissacarídeo que aumenta a estabilidadedo polissacarídeo de forma que ele pode ser conjugado com uma proteína.

Após conjugação, a estabilização é menos importante, e naquele momento aazida é tipicamente reduzida em uma amina e acilada que fornece o grupo2-acetilamino que faz parte da unidade de manose ocorrendo periodicamen-te no polissacarídeo capsular de N. Meningitidis A.

Onde apropriado, é também possível misturar os dois métodosde estabilização; desse modo um oligossacarídeo da invenção pode incluirunidades de manose contendo azida que são ligadas por um fosfodiéster nocentro anomérico adjacente em combinação com as unidades de manoseligadas ao fosfonato. Esta combinação pode fornecer estabilização adicional,dependendo da orientação do fosfonato; ou pode fornecer vantagens sintéti-cas como rendimentos aumentados e pode evitar complicações que o substi-tuinte de acetilamina pode causar.Em outros aspectos, a invenção fornece métodos para sintetizarprecursores fundamentais para estes compostos, composições farmacêuti-cas os contendo e métodos para usá-los na manufatura de um medicamen-to. Os compostos, composições e medicamentos podem ser administradosem um sujeito para induzir uma resposta imunogênica no sujeito que é tipi-camente um ser humano.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

A invenção fornece compostos imunogênicos compreendendoum polissacarídeo ou oligossacarídeo e métodos para fazer estes compos-tos, como também métodos para usá-los como vacinas para fornecer prote-ção contra infecção pela bactéria de Neisseria Meningitidis A. Os métodospermitem a preparação de oligossacarídeos compreendendo pelo menosduas unidades de manose que estão conectadas através de uma ligação1,6. Esta ligação é freqüentemente uma ligação de 1,6-alfa, e as unidadesde manose às vezes são grupos manose N-substituídos como aquelas tendo2-NHAc ou 2-N3 em uma ou mais das unidades de manose. A ligação podeter várias formas, mas freqüentemente compreende um fosfonato ou um fos-fato. Em algumas modalidades, o oligossacarídeo compreende pelo menostrês unidades de manose ligadas em seqüência, cada uma destas é tipica-mente N-substituída. Embora os compostos possam conter qualquer númerode unidades de manose, em modalidades preferidas a porção de oligossaca-rídeo da molécula tem um peso molecular abaixo de 2000. Desse modo pre-ferivelmente os compostos da invenção incluem cerca de duas a dez unida-des de manose ligadas em série, preferivelmente cerca de três a sete.

Os compostos da invenção são adaptados para ser conjugadoscom uma proteína, uma vez que as formas de glicoconjugado são imunóge-nos muito mais eficazes para propósitos de vacinação: eles suscitam respos-tas imunogênicas em lactentes, e eles suscitam respostas celulares que for-necem um efeito de memória para prolongar a eficácia da vacinação. Oscompostos desse modo compreendem uma porção espaçadora que é ligadaà primeira unidade de manose em uma cadeia de unidades de manose. Aunidade espaçadora especificamente é projetada para prover um meio paraconjugação do oligossacarídeo com uma proteína, ou prover um meio pararevestimento da unidade de sacarídeo terminal, de modo que ela fique não-reativa, por exemplo às reações de alongamento/modificação de cadeiatambém. Tipicamente, esta porção espaçadora possui um grupo amina, car-boxilato ou hidroxila para acoplar a um grupo complementar em um veículode proteína, mas outros grupos conhecidos na técnica para fornecer um mo-do para conjugar um oligossacarídeo com uma proteína estão também inclu-sos. Alternativamente, a porção espaçadora possui um grupo protetor ou derevestimento, como um grupo alquila, arila ou acila, como também outrosbem-conhecidos na técnica e/ou descritos aqui. Em compostos da invenção,esta porção espaçadora está estritamente na configuração alfa de forma queela se assemelha às ligações no CPS natural de N. Meningitidis e não inter-fere com o efeito imunogênico desejado, até mesmo em oligossacarídeoscurtos da invenção.

Os compostos da invenção freqüentemente compreendem a es-trutura mostrada na fórmula (1):

<formula>formula see original document page 9</formula>

em que cada Az representa um substituinte de aza;

cada R3 e R4 independentemente representam H ou um grupode proteção;

R6 representa H, um grupo de proteção, ou um Iigante ligado àoutra unidade de sacarídeo;

um de W e X é O, e o outro de W e X é CH2;

η é 1 ou 2;

Yn é OR quando η for 1, e quando η for 2, um Y é = O e o outro

Yé OR,em que R é H1 CrC6 alquila, ou C6-Ci2 arila, ou C6-Ci2 arilalqui-la1 ou R é M onde M é um cátion; e

Z é OR11 SR', NR12, ou halo onde cada R' é independentementeH ou um grupo alquila, acila, arila, arilalquila, heteroalquila, heteroacila, hete-roarila, ou heteroarilalquila opcionalmente substituído; ou

2 representa um Iigante ligado à outra unidade de sacarídeo ouuma porção espaçadora conjugada com uma proteína.

Freqüentemente nestes compostos, X é O e W é CH2, e Az éfreqüentemente N3, NH2 ou NHAc; e freqüentemente né 2.

Os compostos da invenção são sintetizados em parte através demétodos conhecidos na técnica, mas vários métodos novos para formar es-tas moléculas são também parte da invenção. Por exemplo, a ligação de 1,6-alfa em um composto da fórmula (1) pode ser construída com uma reaçãode Mitsunobu como descrito aqui. Também, os N-substituintes como Az co-mo uma azida podem ser inseridos por métodos fornecidos aqui, e pode de-pois ser reduzidos para fornecer uma amina ou amina substituída que fre-qüentemente está na posição 2 de uma unidade de manose, como mostradona fórmula (1). Métodos típicos para redução do azida incluem hidrogenaçãocatalítica e redução de boroidreto, tipicamente usando quantidades catalíti-cas de um sal de níquel.

A invenção também fornece um método para fazer unidades demanose fosfonato-substituídas para montar os oligossacarídeos descritosaqui. Por exemplo, um composto da fórmula (2), que está disponível de gli-cose, pode ser convertido em um precursor para um éster de fosfonato útilpara formar a ligação 1,6-alfa compreendendo fosfonato mostrada na fórmu-la (1) onde W é CH2 e X é O. O método inclui ciclizar um composto da fór-mula (2) com um eletrófilo (2)

<formula>formula see original document page 10</formula>

para formar um composto da fórmula (3)em que cada um de R2, R31 R4 e R6 é independentemente H ou um grupo deproteção;

e El representa o resíduo de eletrófilo.

O resíduo de um eletrófilo, El, é a porção do reagente eletrofílicousada para iniciar ciclização que permanece ligado ao carbono. El pode de-pois ser substituído, direta ou indiretamente, por uns grupos contendo fósfo-ro como um grupo fosfonato pelos métodos descritos aqui. Isto fornece umderivado de glicose ao invés de uma unidade de manose N-substituída, istoé, tem a estereoquímica errada em C-2; desse modo a invenção tambémfornece métodos para converter OR2 na fórmula (2) ou fórmula (3) em umgrupo de Az tendo a estereoquímica apropriada deslocando uma forma ati-vada do oxigênio de OR2 com uma azida. O método compreende uma rea-ção de Mitsunobu que tipicamente usa uma azida de fosforila como a fontede azida.

A invenção também fornece um método para preparar uma 2-azido-2-deóxi-D-manopiranose, cujo método compreende formar um triflatona posição 2 de um derivado de glucopiranose 1,3,4,6-tetra-protegido; e des-locar o triflato com um nucleófilo de azida. Em algumas modalidades, o deri-vado de glicose 1,3,4,6-tetra-protegido é uma 1,3,4,6-tetra-O-acil glucopira-nose que está facilmente disponível. Vide, por exemplo, Helferich, B. et al,Ber. Dtsch Chem. Ges. (1962) 95:2604-2611. 1,3,4,6-tetra-O-acetil glucopi-ranose às vezes é preferida.

A atividade imunogênica dos compostos e composições com-preendendo os oligossacarídeos descritos aqui é freqüentemente intensifi-cada por conjugação do oligossacarídeo com uma proteína. Desse modo emmuitas modalidades, a invenção inclui conjugar o oligossacarídeo com umaproteína através de uma porção espaçadora ligada ao carbono C-1 da pri-meira unidade de manose na cadeia. Em algumas modalidades, a proteína éuma escolhida por sua habilidade para intensificar a resposta imunogênicaem um ser humano, e os toxóides desintoxicados de difteria e tétano sãofreqüentemente usados. Desse modo os compostos da invenção freqüente-mente incluem uma porção espaçadora que pode ser Z na fórmula (1) oupode ser ligada a quaisquer dos grupos hidroxila disponíveis ou N-substituintes nas unidades de manose, e que facilita a ligação a uma proteí-na. Tipicamente, a conexão à proteína é através de Z, desse modo Z é fre-qüentemente uma porção espaçadora que é capaz de ser conjugada comuma proteína. Em muitos dos compostos da invenção, Z está em uma formaprotegida. Grupos de proteção adequados dependem da natureza exata deZ, e seleção e uso de tais grupos de proteção estão dentro da habilidadeusual na técnica. Exemplos de tais grupos de proteção e detalhes de seuuso estão disponíveis, por exemplo, em Greene, T. W. e Wuts, P. G. M., Pro-tective Groups in Organic Synthesis, 2- ed. (1991). Similarmente, a invençãofornece métodos para usar Z para conectar o oligossacarídeo com uma pro-teína para produzir uma composição imunogênica.

A invenção também fornece composições de vacina compreen-dendo um oligossacarídeo da invenção que são úteis para suscitar uma res-posta imunogênica em um mamífero. Tipicamente o mamífero é um sujeitohumano uma vez que N. Meningitidis é acreditada ser patogênica apenasem seres humanos, mas suscitar uma resposta imune em outros mamíferosé de valor, também, e pode ser usado para fornecer componentes imunescomo anticorpos. Desse modo a invenção fornece composições imunogêni-cas e métodos para usar estas para suscita uma resposta imunogênica emum mamífero.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 mostra a estrutura do polissacarídeo capsular de N.Meningitidis A.

A Figura 2 é uma ilustração dos anômeros alfa e beta no centroatravés dos quais o oligossacarídeo é conjugado com uma proteína paraintensificar sua imunogenicidade.A Figura 3 mostra a estratégia de conjunto modular para os oli-gossacarídeos sintéticos.

A Figura 4 mostra a relação entre as respostas de anticorpo es-pecíficas induzidas por glicoconjugado sintético e o conjugado de oligossa-carídeo de controle em doses de vacina diferentes.

MODOS DE REALIZAR A INVENÇÃO

Em um aspecto, a invenção fornece um oligossacarídeo com-preendendo uma primeira unidade de manose e uma segunda unidade demanose, em que a primeira unidade de manose compreende um espaçadorna configuração alfa em C-1. Este espaçador é capaz de conjugar com umaproteína, e a primeira unidade de manose é conectada à segunda unidadede manose através de uma 1,6-ligação que conecta C-6 da primeira unidadea C-1 da segunda unidade de manose. A 1,6-ligação compreende um fosfo-nato em algumas modalidades. Em algumas modalidades, a 1,6-ligação estána configuração alfa. Em algumas destas modalidades, a primeira unidadede manose é um derivado de manose substituída por 2-deóxi-2-aza, e emalgumas das modalidades a segunda unidade de manose é um derivado demanose substituída por 2-deóxi-2-aza. Certas modalidades têm dois ou três,ou mais que três destas unidades de manose substituída por 2-aza.

Em algumas das modalidades da invenção, a 1,6-ligação é daforma [C-1 da segunda unidade de manose]-CH2-P-0-[C-6 da primeira uni-dade de manose], isto é, o carbono de fosfonato é conectado a C-1 da se-gunda unidade de manose e um oxigênio de éster de fosfonato é ligado a C-6 da primeira unidade de manose. Estas unidades de manose são opcional-mente protegidas, e em muitas modalidades uma ou ambas destas duasunidades de manose compreendem um substituinte de 2-aza que é selecio-nado de NH2, NHAc, e N3. Onde estas modalidades incluírem uma terceiraunidade de manose, às vezes ela é conectada à segunda unidade de mano-se por uma ligação que compreende fósforo, e em que a ligação conecta C-6da segunda unidade de manose a C-1 da terceira unidade de manose. Estaligação freqüentemente compreende um fosfonato que é freqüentementerevestido na segunda unidade de manose através de uma ligação de ésterde fosfonato, e à terceira unidade de manose através de uma ligação de P-Cdo fosfonato.

Em outros aspectos, a invenção fornece um oligossacarídeo dafórmula (1):

<formula>formula see original document page 14</formula>

em que cada Az representa um substituinte de aza;

cada R3 e R4 independentemente representa H ou um grupo deproteção;

R6 representa H, um grupo de proteção, ou um Iigante ligado àoutra unidade de sacarídeo;

um de W e X é O, e o outro de W e X é CH2;

η é 1 ou 2;

Yn é OR quando η for 1, e quando η for 2, um Y é = O e o outro

Y é OR1

em que R é H, Ci-C6 alquila, ou C6-Ci2 arila, ou C6-Ci2 arilalqui-la, ou R é M onde M é um cátion; e

Z é OR1, SR', ou NR12 onde cada R' é independentemente H ouum grupo alquila, acila, arila, arilalquila, heteroalquila, heteroacila, heteroari-la, ou heteroarilalquila opcionalmente substituído;

ou Z representa um Iigante ligado à outra unidade de sacarídeoou uma porção espaçadora conjugada com uma proteína.

Em algumas modalidades, compostos compreendendo a fórmula(1) são conjugados com uma proteína através de uma ligação de amida ouéster. Freqüentemente nos compostos da fórmula (1), W é CH2 e X é O, eem muitas de tais modalidades, Az é NHAc e η é 2. Também, em muitasmodalidades deste aspecto, R é M e Z compreende -O-(CH2)n-NH-, em queη é 2-6. Em modalidades destes compostos com base na fórmula (1), cadaR e R4 é independentemente H ou Ac. Freqüentemente R3 é Ac1 e opcional-mente ambos R3 e R4 são H ou Ac.

Em outros aspectos, a invenção fornece métodos para fazer umoligossacarídeo, cujos métodos compreendem ligar uma primeira porçãocompreendendo pelo menos uma unidade de manose substituída por azaatravés de uma 1,6-ligação compreendendo um fosfonato a uma segundaporção compreendendo pelo menos uma unidade de manose substituída poraza. A primeira porção nestas modalidades freqüentemente compreendeuma porção espaçadora, cuja porção espaçadora é ligada a C-1 de uma u-nidade de manose na configuração alfa. Em algumas modalidades destesmétodos, uma reação de Mitsunobu é usada para ligar C-6 de uma unidadede manose da primeira porção a C-1 de uma unidade de manose da segun-da porção. Em muitas das modalidades destes métodos, a 1,6-ligação é umaligação de 1,6-alfa.

Em alguns destes aspectos, as unidades de manose substituí-das por aza ligadas compreendem a fórmula (1)

<formula>formula see original document page 15</formula>

em que cada Az representa um substituinte de aza;

cada R3 e R4 independentemente representa H ou um grupo deproteção;

R6 representa H, um grupo de proteção, ou um Iigante ligado àoutra unidade de sacarídeo;

um de W e X é O, e o outro de W e X é CH2;

η é 1 ou 2;

Yn é OR quando η for 1, e quando η for 2, um Y é = O e o outro

Y é OR,em que R é Η, CrC6 alquila, ou C6-Ci2 arila, ou C6-Ci2 arilalqui-la, ou R é M onde M é um cátion monovalente; e

Z representa uma porção capaz de ser conjugada com uma pro-teína que pode estar em forma protegida.

Em algumas modalidades do método, nos compostos que com-preendem a fórmula (1), X é CH2 e W é O. Nestas modalidades, freqüente-mente pelo menos um substituinte de aza em uma unidade de manose éuma amina ou amina substituída que é obtida por redução de um substituintede azida (N3). Em modalidades preferidas, a amina ou amina substituída es-tá na posição 2 em uma unidade de manose. Em algumas modalidades des-tes métodos, o oligossacarídeo compreende uma porção espaçadora quepode ser Z èm um composto da fórmula (1) que está no centro anomérico deuma unidade de manose. Esta unidade espaçadora pode compreender umgrupo alcóxi substituído por amina que é opcionalmente na forma protegida.

Por exemplo, pode ser da fórmula -O-(CH2)n-NH-PG, onde PG representa Hou um grupo de proteção; o grupo de proteção é freqüentemente um alcoxí-carbonila como metoxicarbonila; t-butiloxicarbonila; ou benziloxicarbonila.Desse modo NH-PG é freqüentemente um grupo carbamato.

Em algumas modalidades destes métodos, o método tambémcompreende ligar a segunda unidade de manose a um sacarídeo adicionalformando uma ligação entre o oxigênio de OR6 na fórmula (1) e o sacarídeoadicional. Este sacarídeo pode ser uma unidade de manose ou pode com-preender uma unidade de manose, e em muitas modalidades o sacarídeoadicional é ligado à segunda unidade de manose através de uma ligação de1,6-alfa. Nestas modalidades, freqüentemente R6 é H ou Ac e o centro ano-mérico de cada unidade de manose presente está na configuração alfa paraestritamente assemelhar-se ao CPS natural de N. Meningitidis.

Em outros aspectos, a invenção fornece um oligossacarídeo dafórmula (11):<formula>formula see original document page 17</formula>

em que cada Az é independentemente selecionado de NH2, NHAc, e N3;

Z representa uma porção espaçadora que é capaz de conjugarcom uma proteína, e que pode ser na forma protegida ou forma desprotegidae que pode ser conjugada com uma proteína;

cada R1 é independentemente H, C1-C6 alquila opcionalmentesubstituída, ou M onde M representa um cátion; X é O ou CH2; cada R3 e R4é independentemente selecionado do grupo que consiste em H, Ac, Bn, eoutros grupos de proteção; e R6 é H, ou um grupo de proteção, ou um fosfa-to, ou uma ligação a uma unidade de sacarídeo adicional.

Neste aspecto da invenção, algumas modalidades compreen-dem uma proteína que é conjugada com o oligossacarídeo através de umaporção espaçadora que está na configuração alfa em C-1 da primeira unida-de de manose. A proteína às vezes é uma toxina bacteriana inativada sele-cionada de toxóide de difteria, toxóide de coqueluche, LT de E. coli, ST de E.coli, exotoxina de Pseudomonas aeruginosa (rEPA), ou toxóide de tétano, oua proteína pode ser CRM197. A proteína nestas modalidades pode ser liga-da ao oligossacarídeo da fórmula (1) através de uma porção espaçadoracompreendendo uma hidroxila ou uma amina qualquer uma destas é opcio-nalmente protegida ou opcionalmente conjugada com uma proteína. Em al-gumas modalidades deste aspecto, R3 é um grupo acila e R4 é H. As moda-lidades alternadas ou preferidas da fórmula (1) também aplicam-se à fórmula (1')·

Em certos aspectos, a invenção fornece um método para sinteti-zar um oligossacarídeo das unidades de manose alfa-ligadas compreenden-do combinar uma unidade de manose compreendendo a fórmula (2), em queR6 é CrC6 acila ou H, e R11 R3, R41 Az e Z são como definidos na reivindicação 15;

<formula>formula see original document page 18</formula>

com um monômero de alongamento da fórmula (3), em que Rx representaum grupo C1-C6 acila e M representa H ou um cátion;

<formula>formula see original document page 18</formula>

sob condições de reação de Mitsunobu, para produzir um oligossacarídeocompreendendo pelo menos duas unidades de manose substituídas por 2-aza conectadas por uma ligação 1,6-alfa. Em algumas modalidades destemétodo, as condições de Mitsunobu incluem o uso de qualquer azodicarboxi-Iato de diisopropila (DIAD) ou azodicarboxilato de dietila (DEAD) e trifenilfosfina ou uma trifenil fosfina substituída como tris(p-clorofenil)fosfina. Emalgumas modalidades, DIAD e tris(p-clorofenil)fosfina são usados, e trietila-mina é usada em excesso. Em certas modalidades, as condições de reaçãode Mitsunobu são mantidas durante um período prolongado de tempo, e oproduto é um oligossacarídeo da fórmula (4),

<formula>formula see original document page 18</formula>

em que ρ é um número inteiro de 1 a 20.

Em muitas destas modalidades, cada Az representa NHAc ouN3. Em alguns destas modalidades, ρ é 1-10, e em outros, ρ é cerca de 1-5ou ρ é 2-4. Em certas destas modalidades, os métodos da invenção tambémincluem um método para conjugar o oligossacarídeo da fórmula (4) com umaproteína. Opcionalmente isto é feito através de Z que é freqüentemente umaporção espaçadora selecionada para ser capaz de conjugar com tais proteí-nas. Em algumas destas modalidades, a proteína é uma toxina bacterianainativada selecionada de toxóide de difteria, toxóide de coqueluche, LT de E.coli, ST de E. coli, exotoxina de Pseudomonas aeruginosa (rEPA), ou toxói-de de tétano. Em outras modalidades, a proteína é CRM197.

Em outros aspectos, a invenção fornece um oligossacarídeo queé preparado pelos métodos anteriores. Os compostos de oligossacarídeopreparados por estes métodos são compostos imunogênicos, e tipicamentesuscita uma resposta imunogênica em um mamífero tratado que fornece pe-lo menos imunidade parcial às infecções causadas por N. Meningitidis.

Em ainda outros aspectos, a invenção fornece um método parausar qualquer composto de oligossacarídeo da invenção para suscitar umaresposta imunogênica, tipicamente mediante administração a um mamífero.Em muitas modalidades, estes compostos são usados como um componen-te de vacina de Meningite A; os métodos desse modo freqüentemente com-preendem administrar uma quantidade eficaz do componente de vacina aum sujeito, assim fornecendo uma resposta imunogênica. A resposta imuno-gênica fornece pelo menos resistência parcial ou imunidade no sujeito à me-ningite A causada por N. Meningitidis.

A invenção também fornece composições farmacêuticas com-preendendo pelo menos um oligossacarídeo da invenção misturado compelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável para fornecer umacomposição farmacêutica que é imunogênica. Em algumas modalidades,estas composições são desse modo vacinas incluindo uma Vacina de Me-ningite A compreendendo qualquer composto da invenção. Em muitas moda-lidades, a vacina compreende pelo menos um oligossacarídeo conjugadocom uma proteína.

Em ainda outros aspectos, a invenção fornece métodos parafazer um derivado de manose útil para a preparação de um oligossacarídeoimunogênico, incluindo aqueles da invenção. Estes métodos compreendemciclizar um composto da fórmula (2) com um eletrófilo

<formula>formula see original document page 20</formula>

para formar um composto da fórmula (3),

<formula>formula see original document page 20</formula>

proteção; e

El representa um resíduo derivado de um eletrófilo.

Em certas modalidades, os métodos incluem uma etapa adicio-nal compreendendo a etapa de substituir El com um grupo fósforo. O grupofósforo é tipicamente um fosfonato. Em algumas modalidades, a invençãotambém fornece métodos para OR2 em um composto da fórmula (2) ou fór-mula (3) com uma azida. Em modalidades preferidas, a substituição de ORcompreende uma reação de Mitsunobu. Em algumas tais modalidades, umaazida de fosforila fornece a azida para a reação de Mitsunobu.

Em ainda outros aspectos, a invenção fornece um método me-lhorado para preparar uma 2-azido-2-deóxi-D-manopiranose, cujo métodocompreende:

formar um triflato na posição 2 de um derivado de glucopiranosede 1,3,4,6-tetra-O-acila; e

deslocar o triflato com um nucleófilo de azida.

Outros métodos para fazer tais compostos podem ser usados, e

o presente método melhorado fornece precauções para minimizar exposiçãoà umidade durante o processamento e isolamento do produto. Isto resultouem rendimentos grandemente melhorados sobre os métodos conhecidos,por exemplo, Popelova, et al., Carbohydrate fíes. (2005) 340:161-166. Emuma modalidade preferida, o derivado de glucopiranose de 1,3,4,6-tetra-O-acila é glucopiranose de 1,3,4,6-tetra-O-acetila, e o produto é manopiranosede 2-azido-1,3,4,6-tetra-O-acila.

Em outros aspectos, a invenção fornece uma composição imu-nogênica capaz de suscitar anticorpos protetores contra Meningitidis A com-preendendo um oligossacarídeo que tem pelo menos duas unidades de sa-carídeo que são tipicamente unidades de manose, covalentemente ligadasentre si através de uma ligação contendo fósforo estabilizada. Em muitastais modalidades, pelo menos uma unidade de sacarídeo que pode ser umaunidade de manose compreende uma porção espaçadora alfa-ligada em seucentro anomérico. A ligação contendo fósforo estabilizada pode compreen-der um fosfonato. Em certas modalidades, estes oligossacarídeos compre-endem pelo menos duas unidades de manose covalentemente ligadas entresi através de uma ligação contendo fósforo estabilizada. Em muitas das mo-dalidades, o oligossacarídeo é conjugado com uma proteína. Muitas proteí-nas como aquelas descritas acima como proteínas de veículo adequadaspodem ser usadas, mas em modalidades preferidas a proteína não é albu-mina. Em algumas modalidades, as composições imunogênicas da invençãocompreendem pelo menos 2 porções de oligossacarídeo diferentes. Em mui-tas das modalidades, a ligação contendo fósforo estabilizada entre dois sa-carídeos compreende um fosfonato. Em muitas tais modalidades, a ligaçãode fosfonato é uma 1,6-ligação, formada por uma reação de Mitsunobu, eem certas modalidades, compreende o oligossacarídeo de quaisquer dascomposições anteriores pelo menos uma unidade de manose compreenden-do uma porção espaçadora alfa-ligada em seu centro anomérico.

Em algumas das composições imunogênicas da invenção, acomposição compreende pelo menos dois oligossacarídeos diferentes quesão específicos pelo menos para dois imunotipos meningocócicos. As com-posições podem também incluir outros compostos antigênicos, e em algu-mas modalidades, as composições também compreendem um antígeno deStreptococcus Pneumoniae. Este antígeno é um polissacarídeo em algumasmodalidades, e em muitas destas modalidades o polissacarídeo é conjugadocom uma proteína.

Em algumas modalidades, as composições da invenção tambémcompreendem pelo menos um antígeno derivado de um Meningitidis dossorotipos A, B, C, W135, ou Y. Em algumas modalidades preferidas, esteantígeno é derivado de Meningitidis sorotipo C, W135, ou Y. As composiçõesda invenção freqüentemente também compreendem um adjuvante, e emalgumas das modalidades o adjuvante é alume.

Em muitas composições da invenção, o componente de oligos-sacarídeo é conjugado com uma proteína através de um reagente bifuncio-nal compreendendo um ácido dicarboxílico ou um derivado deste. Em muitasmodalidades, este ácido dicarboxílico compreende ácido adípico ou ácidosubérico ou um derivado destes. Em outras modalidades, o reagente bifun-cional compreende um esquarato.

A preparação dos compostos ligados a fosfonato dentro do es-copo da invenção pode ser realizada fazendo um monômero aceitante e ummonômero de alongamento, cada um destes é um anel de manopiranoseapropriadamente modificado, referido como uma unidade de manose. O mo-nômero de alongamento é ligado ao aceitante através de uma ligação defosfonato para fazer um dissacarídeo. O monômero de alongamento podeser adaptado para permitir sua C6 hidroxila ser desprotegida seletivamente;desse modo, se um oligossacarídeo mais longo for desejado, o monômerode alongamento no sacarídeo dimérico pode se tornar um aceitante. Ele po-de ser desprotegido sem desproteger as C3 e C4 hidroxilas, assim a C6 hi-droxila pode ser ligada ao fosfonato de outro monômero de alongamento.

Este processo pode ser iterado tantas vezes quanto necessário para forne-cer um oligossacarídeo do comprimento desejado.

A Figura 3 descreve como um monômero de aceitante e um mo-nômero de alongamento são ligados para formar um oligossacarídeo tendoduas unidades de manose (isto é, um dissacarídeo), e como este dissacarí-deo pode ser estendido também por desproteção da C6 hidroxila seguidopor ligação de outro monômero de alongamento. Opcionalmente, o monôme-ro aceitante pode ser ligado a um suporte sólido por um Iigante clivável parafacilitar a manipulação e o isolamento. Em cujo caso, o oligossacarídeo podepermanecer ligado ao suporte sólido através de repetições múltiplas do pro-cesso de alongamento, e eventualmente ser clivado para liberar um produtode oligossacarídeo relativamente puro do comprimento desejado. A porçãoespaçadora Z às vezes usa ligar o oligossacarídeo ao suporte sólido durantea síntese, e depois usado, opcionalmente com modificação, para conjugar ooligossacarídeo com uma proteína.

A invenção fornece métodos para fazer oligossacarídeos imuno-gênicos contendo duas ou mais unidades de manose modificadas, comotambém oligossacarídeo mais longo ou moléculas de polissacarídeo, e mé-todos para fazer o oligo- e/ou polissacarídeos em materiais mais imunogêni-cos conjugando-os com uma proteína. As unidades de manose são anéis depiranose tendo a estrutura básica de um anel de manose, mas tendo pelomenos algumas modificações estruturais. Em muitas modalidades, a inven-ção inclui pelo menos um substituinte onde um átomo de nitrogênio ou outroheteroátomo está ligado a um carbono de anel no lugar de um dos grupos dehidroxila de manose; como aqui usado, tais anéis substituídos são conside-rados unidades de manose contanto que o arranjo de substituintes no anelde piranose tenha a mesma estereoquímica relativa como o arranjo de este-reocentros em manose. Note que a configuração de manose não define aestereoquímica em C-1; C-I que é o centro anomérico em uma unidade demanose pode estar na configuração alfa ou beta. Desse modo uma unidadede manose pode ter um átomo de C, N1 ou S ligado no lugar de uma dashidroxilas de manose, ou pode ter duas ou mais de tais modificações. A es-trutura e numeração dos átomos de carbono para D-manose são providasaqui para referência.

<formula>formula see original document page 23</formula>

0H D-manose

Os métodos da invenção podem ser usados com unidades demanose tendo a estereoquímica absoluta de D-manose ou uma L-manose;em muitas modalidades a estereoquímica absoluta é de D-manose. Porém,um oligossacarídeo da invenção pode incluir uma ou mais unidades de ma·nose tendo a configuração de L-manose. Pode também, claro, ser ligado àsporções de sacarídeo ou porções de peptídeo adicionais, por exemplo, con-tanto que incluem pelo menos duas unidades de manose ligadas como des-crito aqui.

Os oligossacarídeos da invenção incluem pelo menos dois anéisde piranose ligados entre si; se apenas forem incluídos dois anéis, a molécu-la pode ser descrita como um dímero; com três ligados em seqüência podeser descrita como um trímero; e assim sucessivamente. Porém, o termo oli-gossacarídeo genérico como aqui usado inclui estas modalidades menorescomo também versões de polímero mais longas tendo três ou mais, cinco oumais, sete ou mais, dez ou mais, quinze ou mais, vinte ou mais, e mais de25 monômeros em seqüência. Versões tendo mais que cerca de cinco anéisde sacarídeo às vezes são referidas aqui como polissacarídeos. Em muitasmodalidades o oligossacarídeo compreende pelo menos três unidades demanose.

Independente do número de unidades de manose incluído, é àsvezes desejável ligar o oligossacarídeo às outras características molecula-res, assim as unidades de manose podem ser substituídas com vários gru-pos, e o oligossacarídeo pode ser ligado através de uma ou mais unidadesde manose, tipicamente através de uma das unidades de manose terminais,à outra porção. Em algumas modalidades, é benéfico ligar o oligossacarídeoa uma proteína, e estas formas de glicoconjugado estão especificamenteincluídas dentro da invenção. Tipicamente o glicoconjugado é formado porconjugação da proteína de interesse a um grupo funcional na porção espa-çadora ligada em C-1 da primeira manose no oligossacarídeo, e a porçãoespaçadora está na configuração alfa. Em muitas modalidades, é desejávelligar um grupo de proteção ou outra funcionalidade a um ou mais dos substi-tuintes de heteroátomo na unidade de manose. Em algumas modalidadespreferidas, os substituintes de heteroátomo são selecionados de OH, OAc1NH2, N3, NHAc, e um O, N, ou S que é conectado a um grupo de proteçãoou a uma proteína.

As unidades de manose são tipicamente conectadas por uma1,6-ligação. A 1,6-ligação significa que o carbono C-1, o centro anomérico,da segunda unidade de manose está conectado, direta ou indiretamente, aocarbono C-6 da primeira unidade de manose por uma ligação que não incluinenhum anel de sacarídeo intervenientes. Tipicamente a ligação entre duasunidades de manose incluirá pelo menos dois átomos, em geral dois ou maisátomos de não-carbono, entre os átomos de carbono de unidade de mano-se. Em muitas modalidades a ligação é da forma geral:

<formula>formula see original document page 25</formula>

onde cada um de D, E e F representa um heteroátomo selecionado de O, N,S, Si, e P, e cada um dos anéis de tetraidropirano representa o anel de umaunidade de manose. Em algumas modalidades E representa um átomo defósforo que está freqüentemente no estado de oxidação de um fosfato ou umfosfonato. Tipicamente, pelo menos um de D e F nesta fórmula é oxigênio(O), e em algumas modalidades DeF são oxigênio. Modalidades particula-res incluem aqueles em que D-E-F representa O-P(O)-O ou C-P(O)-O ou O-P(O)-C. Às vezes D-E-F é preferivelmente uma ligação compreendendo -CH2-P(O)-O-.

Em algumas modalidades, a ligação entre as unidades de ma-nose adjacentes é uma ligação 1,6-alfa (1,6-a). Para unidades de manose, aligação 1,6-alfa significa que o substituinte de não-H no C-1, que correspon-de ao carbono do centro anomérico de manose, está em uma relação este-reoquímica 'anti' relativa para o substituinte de não-H em C-2. Alternativa-mente, uma ou mais unidades de manose podem ser ligadas em um oligos-sacarídeo através de uma ligação beta. (A configuração tendo a ligação nocentro anomérico 'syn' para o substituinte de C-2 em um manose é referidacomo uma ligação beta). Porém, tipicamente os compostos são ligados jun-tos em uma relação alfa, independente da natureza da própria ligação.As estruturas a seguir ilustram a diferença entre as orientaçõesde ligação alfas e betas.

Muitas modalidades da invenção incluem uma unidade de ma-nose substituída por aza que significa que pelo menos uma das hidroxilas demanose foi substituída com um substituinte referido aqui como um substituin-te de "aza". Este é um substituinte em que pelo menos o átomo ligado dire-tamente à unidade de manose é nitrogênio. Substituintes de aza incluemNH2 e várias aminas substituídas, incluindo aminas alquiladas e dialquiladas,e aminas aciladas e diaciladas onde os grupos acila incluem heteroacilascomo benziloxicarbonila e metoxicarbonila como também tais grupos acilacomo acetila, formila e benzoíla. Outras modalidades do substituinte de azaincluem NO2 e N3. Algumas modalidades das unidades de manose substituí-da por aza da invenção têm o substituinte de aza em C-2 do anel de mano-se, e modalidades preferidas incluem compostos e métodos em que o subs-tituinte de aza em uma unidade de manose é NH2, N3, ou NHAc.

Desse modo em algumas modalidades, os compostos e méto-dos da invenção compreendem uma porção da fórmula (1):

<formula>formula see original document page 26</formula>

em que cada Az representa um substituinte de aza;

cada R3 e R4 independentemente representa H ou um grupo deproteção;

R6 representa H, um grupo de proteção, ou um Iigante ligado àoutra unidade de sacarídeo;

um de W e X é O, e o outro de W e X é CH2;η é 1 ou 2;

Yn é OR quando η for 1, e quando η for 2, um Y é = O e o outroY é OR, em que R é H, CrC6 alquila, ou C6-Ci2 arila, ou C6-Ci2 arilalquila,ou R é M onde M é um cátion; e

Z é OR', SR', NR12, ou halo onde cada R' é independentementeH ou um grupo alquila, acila, arila, arilalquila, heteroalquila, heteroacila, hete-roarila, ou heteroarilalquila opcionalmente substituído; ou

Z representa um Iigante ligado à outra unidade de sacarídeo ouuma porção espaçadora conjugada com uma proteína.

Substituintes de aza preferidos são aqueles em que um átomode nitrogênio está diretamente ligado à unidade de manose. Exemplos detais substituintes incluem N3, NH2, NH-alquila, NH-acila, NH-arila e outros.

Cada N nestes substituintes podem opcionalmente incluir um ou dois gruposselecionados de alquila, arila, e acila onde cada alquila, acila e arila é opcio-nalmente substituída.

O termo "protegido" ou um "grupo de proteção" com respeito aosgrupos hidroxila, grupos amina e grupos sulfidrila refere-se às formas destasfuncionalidades que são protegidas de reação indesejável com um grupo deproteção conhecido àqueles versados na técnica como aqueles expostos emProtective Groups in Organic Synthesis que podem ser adicionados ou re-movidos usando os procedimentos expostos nele. Exemplos de grupos hi-droxila protegidos incluem, mas não são limitados a, éteres de silila, comoTBDMS ou TBS, como aqueles obtidos por reação de um grupo hidroxilacom um reagente como, mas não limitado a, t-butildimetil-clorossilano, trime-tilclorossilano, triisopropilclorossilano, e trietilclorossilano; éteres de metilasubstituída e etílicos como, mas não limitados a éter de metoximetila, éter demetitiometila, éter de benziloximetila, éter de t-butoximetila, éter de 2-metoxietoximetila, éteres de tetraidropiranila, éter de 1-etoxietila, éter de ati-la., e éter de benzila; ésteres como, mas não limitados a, benzoíla, benzoil-formiato, formiato, acetato, tricloroacetato, e trifluoracetato. Exemplos degrupos de amina protegidos incluem, mas não são limitados, benzila ou di-benzila, amidas como, formamida, acetamida, trifluoroacetamida, e benza-mida; imidas, como ftalimida, e ditiossuccinimida; e outros. Em algumas mo-dalidades, um grupo de proteção para alcoóis é um grupo benzila ou umgrupo acetila, e um grupo de proteção típico para uma amina aqui é acetilaou um carbamato de benzila ou t-butila.

"Grupo de proteção" como aqui usado incluem aquelas porçõesreconhecidas na técnica como grupos de proteção para os heteroátomos N,

O e S, e é descrito, por exemplo, no livro de referência por Greene, T. W., eWuts, P., G. M., Grupos protetores em Síntese Orgânica, 2d ed., Wiley eFilhos (1991) que está incorporado aqui por referência. Acetila (Ac) é um talgrupo de proteção, e porque o CPS natural de N. Meningitidis é freqüente-mente acetiladas, particularmente em C-3, em algumas modalidades da in-venção, um ou mais dos grupos de proteção é Ac; e em algumas modalida-des preferidas, R3 em pelo menos uma das unidades de manose representa Ac.

Em alguns destes compostos, um de X e W é CH2, enquanto ooutro é O; por exemplo, em algumas modalidades XeW são ambos O, e emoutras, W é CH2 e X é O. Dentro de um composto dado da invenção que éoligomérico e contém três ou mais unidades de manose, modalidades dife-rentes da ligação podem estar presentes; desse modo duas unidades demanose ligadas podem ser ligadas juntas por uma ligação compreendendoum fosfonato a uma terceira unidade de manose por meio de uma ligação dediéster de fosfato sem divergir da invenção.

É freqüentemente desejável conjugar os oligossacarídeos dainvenção com outra molécula, tipicamente uma proteína. Conjugados feitospor tais métodos estão dentro do escopo da invenção. Desse modo conjuga-ção de um sacarídeo com uma proteína é freqüentemente realizada adicio-nando uma molécula bifuncional reativa à proteína depois expondo a proteí-na derivatizada ao sacarídeo, de forma que o sacarídeo se torna covalente-mente ligado através do Iigante fornecido pelo reagente bifuncional que fre-qüentemente é ligado a um dos grupos hidroxila do sacarídeo. Na síntesecontrolada dos compostos da invenção, porém, é especialmente convenienteespecificamente incluir uma porção espaçadora projetada para conjugar ooligossacarídeo com uma proteína. Uma tal porção espaçadora pode serligada a qualquer uma das unidades de manose em um oligossacarídeo;porém, tipicamente está em uma unidade de manose terminal, ou o primeiromonômero aceitante ou o último monômero de 'alongamento'. Freqüente-mente está no C-1 do monômero aceitante ou C-6 do de alongamento, e noscompostos da fórmula (1) pode ser o grupo representado por Z ou o um re-presentado por R6.

A porção espaçadora para conjugar o oligossacarídeo com umaproteína pode compreender uma porção espaçadora de multiátomos paratornar o epítopo imunogênico do oligossacarídeo mais disponível e dessemodo mais eficaz. Alternativamente, por exemplo, Z em um composto comoaqueles representados pela fórmula (1) pode ser um átomo simples como Oou N ou S, e um espaço entre o oligossacarídeo e a proteína pode ser forne-cido por um reagente bifuncional usado para ligar o oligossacarídeo e umaproteína veículo junto. Os reagentes bifuncionais adequados para uso nosglicoconjugados da invenção incluem aqueles conhecidos na técnica. Exem-plos de tais ácidos dicarboxílicos incluem como ácidos malônicos, succíni-cos, adípicos e subéricos ou versões ativadas destes, e derivados de ácidoesquárico. Estes tipos de reagentes são particularmente convenientes paraligar um composto em que a porção espaçadora compreende uma amina auma proteína.

Em algumas modalidades, a porção espaçadora é pelo menosdois ou três átomos em comprimento, entretanto ela opcionalmente pode serum átomo simples ou pode ser maior; um exemplo é um composto da fórmu-la (1), em que Z representa um grupo 2-aminoetóxi. O grupo 2-aminoetóxi ouum homólogo deste pode ser introduzido no monômero aceitante antes dosmonômeros de alongamento serem ligados, e é opcionalmente introduzidona forma protegida assim não participa nas reações subseqüentes. A porçãoespaçadora tem que incluir pelo menos um grupo funcional que é capaz deser usado para ligar o oligossacarídeo a uma proteína, e tipicamente incluium heteroátomo, Ν, O ou S, para este propósito, entretanto outros gruposcomo um dieno ou um dienófilo para ligação através de uma reação de Di-els-Alder, ou um grupo carboxilato para conjugar a proteína com o oligossa-carídeo através de um éster ou amida são também contemplados. Em mui-tas modalidades como o grupo 2-aminoetóxi debatido acima, a porção espa-çadora inclui um nitrogênio para este propósito; o nitrogênio pode ser prote-gido quando for introduzido e durante a construção do oligossacarídeo, masé capaz de ser seletivamente desprotegido após o oligossacarídeo ser cons-truído sob condições que não destroem o oligossacarídeo. A amina da por-ção espaçadora é depois facilmente aciladas ou alquiladas, por exemplo,com um reagente bifuncional, a outra extremidade desta é ligada similarmen-te a uma proteína. A ordem de tal ligação, isto é, aquele pedaço do glicocon-jugado é ligado primeiro ao reagente bifuncional, é sem importância e é de-terminado pelo julgamento do médico. Alguns exemplos típicos, mas não-limitativos dos grupos espaçadores incluem -Het-(CH2)n-A, -Het-Ph-A, -Het-(CH2)n-Ph-(CH2)n-A e formas substituídas destes, em que cada Het repre-senta um heteroátomo, usualmente O, S ou N; cada Ph representa um grupofenila, opcionalmente substituído; e cada η representa um número inteiro de1-10; A representa um grupo funcional ou um resíduo destes que é capaz deligar o espaçador à proteína, como um N, O, ou S, ou éster, uma amida, ououtro grupo contendo carboxila, um dieno, ou um dienófilo. Preferivelmente,o espaçador compreende OR', SR', ou NR12 onde cada R1 é independente-mente H ou um grupo alquila, acila, arila, arilalquila, heteroalquila, heteroaci-la1 heteroarila, ou heteroarilalquila opcionalmente substituída e pode tambémcompreender A.

M na fórmula (1) pode representar um cátion de metal álcali, se-lecionado de Li, Na, K, e Cs, ou um sal de amônio NR4+ onde cada R é inde-pendentemente H ou CrC6 alquila ou Ci-C6 heteroalquila. Alternativamente,pode representar qualquer outra espécie catiônica farmaceuticamente acei-tável como MgX ou CaX1 onde X representa halo, hidroxila, acetóxi, trifluoro-acetóxi, bissulfato, bicarbonato, ou qualquer outra espécie adequada. Emalgumas modalidades, M é um cátion divalente, e é compartilhado por duasmoléculas da fórmula (1).

Os métodos da invenção fornecem modos para sintetizar oscompostos de oligossacarídeo dentro da invenção. Os métodos incluem, porexemplo, modos para ligar duas unidades de manose juntas em uma manei-ra desejada, como formando uma ligação de 1,6-alfa entre duas unidades demanose. Onde a ligação de 1,6-alfa for um fosfato ou fosfonato como oscompostos da fórmula (1), onde X é O, a ligação pode ser criada por umareação de Mitsunobu. A reação de Mitsunobu é descrita, por exemplo, emCampbell, D. A., J. Org. Chem. (1992) 57:6331-6335, e envolve uma ativa-ção de um álcool com um reagente como um azodicarboxilato, por exemplo,DEAD ou DIAD, e uma fosfina (por exemplo, trifenil fosfina ou tris(p-clorofenil)fosfina), seguido por deslocamento do O ativado por uma espécienucleofílica. No caso dos compostos da fórmula (1) onde X é O, o nucleófilousualmente é uma espécie de P-O", tipicamente um ânion de fosfonato oufosfato. Em outros aspectos desta invenção, uma reação de Mitsunobu éempregada para apresentar um substituinte de aza a um grupo de sacarídeoem cujo caso as condições são similares exceto que o nucleófilo é uma azi-da que pode ser provida como um ânion de azida ou como uma azida detrialquilsilila ou uma azida de fosforila.

Os métodos da invenção também fornecem modos para instalare modificar N-substituintes (substituinte de aza) nas unidades de manosedos compostos como aqueles da fórmula (1). Desse modo em algumas mo-dalidades, os métodos fornecem modos para inserir um substituinte de azaem uma unidade de manose com a estereoquímica apropriada. Um tal mé-todo compreende deslocar uma C-2 hidroxila em um anel de piranose comum N-substituinte, tipicamente N3. Pode ser inserido com uma reação dedeslocamento nucleofílica, mas em algumas modalidades é inserido pormeio de uma reação do tipo Mitsunobu com a ajuda de um grupo ativadorcomo um azodicarboxilato, por exemplo, DEAD ou DIAD. O nucleófilo paraesta reação de Mitsunobu pode ser fornecido por uma azida de fosforila co-mo azida de difenil fosforila. A melhoria particular fornecida pela presenteinvenção nesta reação compreende o uso de uma azida de fosforila como afonte do substituinte de aza, e a incorporação de condições de processa-mento substancialmente livre de água para evitar decomposição do produto.Sob as condições descritas aqui, o rendimento do derivado de 2-azido deuma unidade de manose é melhorado substancialmente sobre os métodosda técnica anterior.

Em algumas modalidades preferidas, pelo menos uma das uni-dades de manose de um oligossacarídeo da invenção é um manose aza-substituída que tem uma amina ou amina acilada que está freqüentementeem C-2 da unidade de manose. Em algumas modalidades dos métodos dainvenção, o substituinte de aza é inserido como N3 que pode ser reduzidopara fornecer uma amina e a amina pode ser aciladas sob condições comoaquelas descritas no livro de Greene e Wuts acima referido dos grupos pro-tetores. Redução da azida (N3) para NH2 é facilmente realizada através demétodos típicos, como usando boroidreto de níquel que pode ser gerado insitu de hexaidrato de cloreto de níquel e boroidreto de sódio como descritoaqui.

Em algumas modalidades, a invenção fornece oligossacarídeose métodos para fazer oligossacarídeos, em que o oligossacarídeo compre-ende uma série de repetição das unidades de manose aza-substituídas; emmuitas modalidades, cada uma das unidades de manose têm um substituintede aza, tipicamente N3, NH2 ou NHAc, em C-2 de cada unidade de manose -por exemplo, nos compostos da fórmula (1), Az seria N3, NH2 ou NHAc. Op-cionalmente, a ligação entre pelo menos duas das unidades de manose éuma ligação de fosfonato que pode ser uma ligação de 1,6-alfa como às noscompostos na fórmula (1), onde W é CH2 e X é O. Tais ligações de 1,6-alfacompreendendo um fosfato ou um fosfonato, como os compostos na formula(1) onde W é CH2 ou O e X é O, podem ser formadas pela reação de Mitsu-nobu descrita acima. Preferivelmente, a Mitsunobu é feita sob condiçõesmodificadas que são descritas por Campbell, como referidas acima.

Em outro aspecto, a invenção fornece um método melhoradopara fazer certas moléculas de sacarídeo que são úteis para a síntese dosoligossacarídeos descritos acima. Desse modo a invenção fornece métodospara sintetizar certos monossacarídeos fosfonato-substituídos. Por exemplo,um composto da fórmula (2), que está disponível de glicose, pode ser con-vertido em um precursor para um éster de fosfonato útil para formar a liga-ção 1,6-alfa compreendendo fosfonato mostrada na fórmula (1) onde W éCH2 e X é O. O método inclui ciclizar um composto da fórmula (2) com umeletrófilo

<formula>formula see original document page 33</formula>

para formar um composto da fórmula (3).

<formula>formula see original document page 33</formula>

em que cada um de R j R , R e R é independentemente H ou um grupo deproteção;

e El representa o resíduo de um eletrófilo.

O eletrófilo usado para realizar a ciclização pode ser um sal demercúrio, em cujo caso após ciclização para o composto da fórmula (3), oresíduo do eletrófilo é tipicamente -HgX onde X é halo, acetóxi, ou outros. Omercúrio pode ser substituído por tratamento com iodo, dando um compostoda fórmula (3) em que El é I. O iodeto pode depois ser deslocado com umnucleófilo de fósforo; por exemplo, tratamento com fosfito de trialquila deslo-ca o iodeto diretamente e produz um fosfonato de dialquila. Outros eletrófilospodem também ser usados para realizar a ciclização; por exemplo, halocicli-zações são conhecidas, e forneceriam diretamente um haleto como El, quepoderia ser deslocado. Similarmente, métodos podem ser usados por meiodo qual a olefina pode ser epoxidada com a estereoquímica correta de formaque a abertura do epóxido pode resultar no anel de piranose, e um compostoda fórmula (3), em que El é OH. O OH pode depois ser convertido em umhaleto ou um sulfonato deslocável como um triflato, tosilato ou mesilato, e ofósforo pode ser introduzido como descrito acima com fosfito de trietila, oupode ser introduzido por substituição nucleofílica direta usando umas espé-cies P aniônicas como o ânion de sódio de fosfito de dietila.

Isto fornece um derivado de glicose da fórmula (3) ao invés umaunidade de manose N-substituída; desse modo a invenção também fornecemétodos para converter OR2 na fórmula (2) ou fórmula (3) em um substituin-te de aza que tem a orientação 'axial' desejada. Esta introdução de um subs-tituinte de nitrogênio é freqüentemente realizada reagindo um composto dafórmula (3) com um agente ativador para formar um composto em que R2 éum grupo deslocável, como um triflato, tosilato ou mesilato. Uma vez quetais deslocamentos em (2) resultaria em rearranjo alílico, esta conversão éfreqüentemente feita em um composto da fórmula (3). Embora seja possívelfazer esta reação por deslocamentos nucleofílicos usuais, em uma modali-dade da invenção, esta substituição de OR2 com um substituinte de aza éfeita usando uma reação de Mitsunobu. Em uma modalidade preferida, areação de Mitsunobu emprega uma azida de fosforila como a fonte do subs-tituinte de aza. Desse modo, a reação fornece um modo muito eficiente paraconverter um composto derivado de glicose facilmente disponível como (2)em um derivado de manose 2-deóxi-2-aza-substituída, em que o substituintede 2-aza é uma azida. A azida pode depois ser reduzida em uma amina co-mo tratamento com boroidreto de níquel; e a amina pode ser funcionalizadaou protegida como desejado. Em muitas modalidades da invenção, a aminaé imediatamente acilada com um grupo de proteção, freqüentemente comacetila (Ac), uma vez que o grupo acetila pode servir como um grupo de pro-teção e também aparece na unidade de manose do CPS de N. Meningitidis.

Em outro aspecto, a invenção fornece um método grandementemelhorado para fazer um derivado de manose de 2-aza-substituída em for-ma protegida. O método compreende deslocar o grupo 2-hidroxila de umanel de glucopiranose do contrário protegido por conversão da 2-hidroxilaem um triflato seguido por deslocamento do triflato com azida. O desloca-mento nuçleofílico inverte o centro, desse modo convertendo a glucopirano-se em uma manopiranose. Embora o próprio deslocamento tenha sido rela-tado, ele procede em rendimento isolado muito fraco usando as condiçõespadrão. Na presente invenção, foi descoberto que um rendimento alto doproduto desejado pode ser obtido usando a glucopiranose de 1,3,4,6-tetra-O-acila facilmente disponível, contanto que o processamento da reação sejasubstancialmente feito sem água. Desse modo o triflato é deslocado atravésdo ânion de azida em um solvente aprótico polar como DMF ou NMP; de-pois, ao invés de usar um processamento extrativo usual aquoso/orgânicopara remover a maioria do solvente e sais, a mistura de reação pode serconcentrada parcialmente antes de ser aplicada diretamente a uma colunade cromatografia. Usando um tal processamento não-aquoso, o produto po-de ser eluído da coluna em rendimento alto.

A descrição a seguir fornece mais detalhes sobre os métodospara fazer certos compostos da invenção.

Uma modalidade de um aceitante de monômero de partida,composto XIV mostrado abaixo, é descrita em Berkin, A., et al, Chem. Eur. J.(2002) 8:4424-4433. Como uma alternativa, a seqüência a seguir pode serusada:

<formula>formula see original document page 35</formula>

(i) TBDMSCI, pir (ii) BnBr, NaH (iii) NIS, AgOTf, HO(CH2)2NHZ (iv) 1. NaBH4,NiCI2(H2O)6 2. Ac2O (v) TBAF

<formula>formula see original document page 35</formula>

Quando o composto de dibenzila protegido que foi usado paraintroduzir o espaçador no centro anomérico, cerca de uma mistura de anô-meros 1:1 foi obtida. Se do contrário os éteres de benzila forem substituídoscom ésteres de acetato, apenas traços do anômero beta são obtidos, e umrendimento isolado de 86 % do anômero alfa desejado resultou. Desse mo-do, o método fornece um modo eficiente para produzir a configuração alfadesejada a este centro que é freqüentemente o centro ao qual um espaçadorque conecta o oligossacarídeo a uma proteína veículo está ligado. A configu-ração alfa é desejada porque ela melhorar combina o esqueleto de todo-alfado CPS natural do organismo alvo. Foi também descoberto que o anômerobeta foi menos reativo na etapa de substituição de etiltio-glicosídeo. Porém,os acetatos às vezes causam depois dificuldades na seqüência, assim emalgumas modalidades, os éteres de benzila foram utilizados para esta etapa.

O grupo azido do intermediário de manose de 2-aza completamente protegi-do foi reduzido novamente em uma amina usando NaBI-Vcat. NÍCI2.6H2O, ea amina foi acetilada com anidrido acético em 85 % de rendimento em am-bas as etapas. Por fim, o éter de silila foi removido com TBAF para obter oaceitante de bloco de construção de partida em 99 % de rendimento.

Uma síntese conveniente dos monômeros de alongamento de-sejados é mostrada nos Esquemas 1-3 abaixo que possibilita preparar mo-nômeros de alongamento tendo grupos de proteção diferentes por exemplo.

Esquema 1

<formula>formula see original document page 36</formula>

(i) MeOH/colidina (ii) BnBr/KOH, HOAc (70 %), NaOMeMeOH (Hi) Bu-Li/brometo de trifenilfosfônio de metila (iv) Hg(OAc)2, KCI.

Composto I foi obtido e usado como uma mistura de anômeros,e foi obtido em sete etapas de glicose. Foi alongado por meio de uma reaçãode Wittig com bromotrifenilfosfina de metila, por exemplo, para fornecer oalqueno em 91 % de rendimento. Outra preparação deste alqueno de D-arabinose usou um alongamento de dois carbonos que envolve adição dedivinilzinco. Ciclização de mercúrio do composto Il forneceu exclusivamenteo alfa-C-glicosídeo, entretanto o alqueno protegido com tetra-O-benzila cor-respondente rende uma mistura de anômeros. Métodos alternativos paraciclizar tais espécies, como haloeterificação e epoxidação/abertura de aneleletrofílico podem ser usados. O composto de acetato de mercúrio foi con-vertido no derivado de cloreto de mercúrio correspondente que foi isolado. Ocloreto de mercúrio foi subseqüentemente substituído com iodo em rendi-mento excelente através de tratamento com I2.

Esquema 2

<formula>formula see original document page 37</formula>

(i) I2 (ii) TBDMSCI/pir/imidazol (iii) P(OEt)3

Para evitar formação de um fosfato cíclico na próxima etapa, ogrupo hidroxila C2 foi protegido primeiro como um éter de silila. O C-fosfonato Vll foi obtido por tratamento do iodeto primário V com fosfito detrietila para dar Vl em 77 % de rendimento. O éter de silila foi subseqüente-mente clivado da hidroxila de C2 usando fIuoreto de tetrabutilamônio (TBAF)em 99 % de rendimento.

O grupo acetamido axial foi introduzido por uma reação de des-locamento com azida seguido por redução e acetilação como mostrado noEsquema 3. O deslocamento inverte o centro C-2, fornecendo a orientaçãoaxial do substituinte de acetamida de C-2 que é encontrado no polissacarí-deo capsular natural. Esta azida foi introduzida em rendimento baixo prepa-rando um triflato da hidroxila de C-2 e deslocando-o com ânion de azida.

Porém, usando condições de Mitsunobu e azida de difenilfosforila (DPPA)como a fonte de azida, um rendimento alto (86 %) do derivado de azido foiobtido IX. Para introduzir um grupo de proteção seletivamente removível em0-6, o éter de benzila primário de Vlll foi substituído com um éster de aceta-to em 84 % de rendimento usando condições de acetólise padrão; aquelaetapa poderia ser omitida em cujo caso todos os éteres de benzila poderiamser clivados imediatamente. Omitindo a acetólise encurta a síntese, mas tor-na mais difícil de usar a C-6 hidroxila para alongamento adicional ou outrafuncionalização, embora permuta da benzila para uma acetila possa tambémser feita após uma etapa de alongamento. A reação de acetólise funcionoumelhor quando uma mistura de anidrido acético e ácido acético (1/1) foi usa-da junto com ácido sulfúrico. A azida foi reduzida com boroidreto de sódio napresença de hexaidrato de cloreto de níquel, e a amina resultante foi acetila-da com anidrido acético para dar o composto X em 69 % de rendimento.

Esquema 3 ilustra a conclusão de um monômero de alongamen-to dentro da invenção que é uma unidade de manose dê 2-aza. Para a cons-trução do monômero de C-fosfonato de alongamento de uma versão modifi-cada de um método publicado foi usada. Vide Casero, F., et al, J. Org.Chem. (1996) 61:3428-3432. Após desililação do precursor Vl para render ocomposto Vll de 2-OH, deslocamento da azida usando condições de Mitsu-nobu deu a 2-azido-2-deóxi-manopiranosida Vlll (86 %). Um grupo de prote-ção ortogonal, para permitir alongamento de 6-0 depois, foi introduzido atra-vés de acetólise para fornecer o 6-O-acetato IX (84 %). Redução da azidaseguido por acetilação deu X (76 %), do qual os ésteres de etila foram remo-vidos para render o monômero de alongamento Xl com um ácido fosfônicolivre. Para muitas modalidades, é preferido acoplar um monoéster do ácidofosfônico, de forma que o produto protegido fique como um éster de fosfona-to. Estes compostos podem ser preparados em duas etapas como mostradoabaixo para conversão de Xl para XIII. Nota que a redução da azida podeser adiada até as unidades de manose adicionais terem sido instaladas seoligossacarídeos mais longo forem desejados, de forma que todas as azidaspodem ser reduzidas e as aminas resultantes acetiladas simultaneamente.Esquema 3

<formula>formula see original document page 39</formula>

Os grupos de proteção de etila no derivado de ácido fosfônicoforam substituídos com metila como mostrado acima no Esquema 3 parafacilitar a remoção após um oligossacarídeo ter sido construído. Uma vez odissacarídeo ligado foi formado, a ligação é relativamente lábil sob as condi-ções necessárias para clivar os fosfonatos de etila. Os grupos etila foramdesse modo removidos quantitativamente através de tratamento com silanode bromotrimetila (TMSBr), e o produto de ácido fosfônico foi convertido emseu fosfonato de dimetila correspondente em 84 % de rendimento usandoácido acético e trimetilortoacetato. Esta reação teve que ser monitorada cui-dadosamente uma vez que deacetilação é uma reação colateral competindodurante tempos de reação prolongados. Tratamento do fosfonato de dimetilacom trietilamina (TEA) e mercaptano de fenila forneceu o fosfonato de mo-nometila Xlll eficazmente em 82 % de rendimento.

Esquema 4 ilustra a reação de acoplamento para estabeleceruma ligação de fosfonato entre duas unidades de manose. Condições deDCC e de Mitsunobu foram relatadas acoplar um fosfonato a um álcool comoo monômero aceitante, com rendimentos na faixa de 50-70 %. Pozsgay, etal. (Vide, A. Berkin, B., Coxon e V. Pozsgay, Chem. Eur. J., 2002, 8, 4424).

Porém, quando o aceitante já continha um fosfonato, os rendimentos verte-ram nitidamente que poderia limitar a habilidade de tais condições para for-necer os trímeros desejados, tetrâmeros, e outros polissacarídeos mais lon-gos. Condições de Mitsunobu no caso presente, usando Ph3P e DIAD, deuum rendimento bom (47 %) de XV. Porém, foram percebidos rendimentossubstancialmente melhores usando uma versão modificada das condiçõesde Mitsunobu1 como descrito em Campbell, J. Org. Chem. (1992) 57:6331-6335. As condições de Campbell, usando tris(4-clorofenil)fosfina e um ex-cesso grande de trietilamina, forneceu XV em um rendimento de 88 %. Osmelhores rendimentos são obtidos nesta reação quando cuidado é tomadopara excluir outras espécies nucleofílicas que poderiam competir com o â-nion de fosfonato nucleofílico fraco.Esquema 4

<formula>formula see original document page 41</formula>

Legenda: i) (pCIPh)3P, DIAD1 Et3N1 THF; ii) KOH1 MeOH; iii) PhSH, DBU,CH3CN.

Usando as condições de Mitsunobu descritas acima o rendimen-to na formação de trímero foi encontrado ser comparável e até mais alto quena formação de dímero. O dímero de XV foi transformado em um aceitantenovo XVI) através de desacetilação. A reação de Mitsunobu modificadaentre XVI e Xlll depois forneceu o trímero XVII em um rendimento de 92 %.A identidade do produto foi provada por MS e RMN1 o último parcialmentecomplexo devido ao fosfonato de diastereômeros que resulta da quiralidadedo fósforo. Composto XVII foi desacetilado criando um aceitante novo XVIIIque pode ser ligado a outro monômero de alongamento. Após isto e remo-ção subseqüente do éster de metila de fosfonato, a quiralidade do centro defósforo foi destruída, e os dados de RMN para o composto de XIX refletirama ausência dos diastereômeros de fósforo.<formula>formula see original document page 42</formula>

Foi também descoberto que prolongando a exposição da misturado aceitante XIV e monômero de alongamento Xlll às condições de Mitsu-nobu, e na presença de algum excesso de XIII, a reação fornece monômerosmais longos. Desse modo sob as condições de reação, clivagem do grupoC-6 acetila de um monômero de alongamento incorporado ocorre in situ naalguma taxa; e isto fornece uma molécula aceitante nova. Desse modo atécerto ponto, por exemplo, conversão de XVI para XVI ocorre através de ex-posição prolongada à reação de Mitsunobu, e sob aquelas condições napresença de Xlll de excesso, forma XVII; e assim sucessivamente, para pro-duzir oligômeros mais altos. Esta reação desse modo fornece um modo parafazer oligômeros contendo unidades de manose múltiplas na forma protegidasem requerer uma desproteção nas etapas/processo de isolamento, e permi-te a síntese de oligossacarídeos imunogênicos da invenção tendo uma dis-tribuição de tamanhos. Em algumas modalidades, isto foi mostrado primari-amente fornecer tetra- e oligossacarídeos de pentamanose, com quantida-des secundárias de oligômeros mais longos. Isto desse modo fornece ummodo altamente eficiente para compostos oligoméricos mais longos sinteti-zados dentro da invenção.

A invenção também fornece uma síntese de 2-azido-2-deóxi-D-manopiranose simples e melhorada de um precursor facilmente disponível,1,3,4,6-tetra-O-acetil-glucopiranose, como ilustrado no Esquema 5. Este in-termediário é útil para a síntese de muitas das unidades de manose da pre-sente invenção.

Esquema 5

<formula>formula see original document page 43</formula>

Em uma tentativa para sintetizar um composto de manose pro-tegido por 2-azido, glucopiranose de 1,3,4,6-tetra-O-acetila foi convertida emseu 2-0-triflato usando anidrido tríflico, e o triflato foi tratado com NaN3. Deacordo com TLC e MALDI-TOF-ms, o produto de 2-azido forma em um ren-dimento alto, mas aparentemente decompõe-se substancialmente duranteum processamento aquoso típico, e o rendimento isolado foi apenas 20 %.Porém, quando a reação foi processada sem usar água, o rendimento foimelhorado nitidamente. Desse modo a maioria do DMF usado como o sol-vente para o deslocamento foi removida sob pressão reduzida, e o resíduofoi transferido para uma coluna secada contendo uma pasta de sílica pré-secada em tolueno seco. O produto foi eluído usando um gradiente de ace-tato de etila crescente em tolueno. Uma vez purificado, o produto ficou relati-vamente estável. O material de partida de glucopiranose de 1,3,4,6-tetra-O-acetila é muito fácil de sintetizar em escala grande em uma síntese de potede glicose, e o triflato de intermediário foi obtido usando condições padrõesem rendimento de 97 %. O rendimento isolado da inversão como menciona-da é fortemente dependente de quão livre de água o processamento é: ex-clusão de água usando artigos de vidro pré-secados e sílica pré-secada co-mo descrito acima é necessário para rendimento ótimo. Minimizando a ex-posição à umidade durante o processamento e durante a cromatografia emsílica-gel, rendimento reprodutível de 60 % ou mais foi obtido.

O produto de tetraacetato mostra alguma tendência para de-compor-se durante o armazenamento. Porém, uma vez convertido em seuglicosídeo de 1-etiltio de tratamento com EtSH/BF3-Et20 ficou bastante está-vel. Ele foi tratado em seguida com alcóxido para remover os grupos de ace-tato, como mostrado no Esquema 6, e a hidroxila primária foi seletivamenteprotegida com um grupo t-butildimetilsilila (TBS). As duas hidroxilas secun-dárias foram protegidas como ésteres de benzila, mas uma variedade degrupos de proteção diferentes pode ser usada aqui e em muitas outras eta-pas ao longo deste processo. O grupo -SET foi depois substituído por umIigante que pode ser usado para conjugar o oligossacarídeo final para umaproteína. Alternativamente, ele poderia ser usado pára ligar o monômeroaceitante a um suporte sólido enquanto o oligossacarídeo é montado. Nestecaso, um grupo aminoetila protegido foi introduzido à posição anomérica;porém, uma ampla variedade de grupos de ligação que são adequados paraconjugar o oligossacarídeo pode ser usada, e aqueles de habilidade na téc-nica podem selecionar facilmente e usar outros.

Esquema 6

<formula>formula see original document page 44</formula>

O dímero pode ser usado como um imunógeno sem alongamen-to adicinoal, ou oligômeros mais longos podem ser preparados e usados.Para o dímero e o trímero, o grupo acetila em C6 é removido através de hi-drólise padrão. Ésteres de metila do fosfonato foram clivados usando l,8-diaza-7-biciclo[5.4.0]undeceno (DBU) como a base junto com mercaptano defenila, para realizar uma desmetilação nucleofílica. Os éteres de benzila fo-ram depois clivados juntos com a benziloxicarbonila por meio de um padrãohidrogenação redutora, usando paládio em carvão ativado como o catalisa-dor. Para adquirir a reação para concluir, HCI aquoso foi adicionado de for-ma que a amina resultante é protonada para formar o cloridrato que reduzsua tendência de envenenar o catalisador.Os oligossacarídeos da invenção podem ser administrados a ummamífero para suscitar uma resposta imunogênica; eles podem ser usadoscomo descritos acima, tipicamente após pelo menos desproteção parcial.

Eles podem também ser em parte ou completamente acetilados para alargaro espectro da resposta imune suscitada. O CPS do organismo alvo é subs-tancialmente acetilado na C-3 hidroxila; desse modo a flexibilidade do méto-do sintético presente torna possível preparar os compostos contendo um oumais grupos acetila, e particularmente para preparar dímeros, trímeros, eoligômeros mais altos que são parcial ou completamente acetilados na C-3hidroxila, ou misturas destes.

Em vez ou além de usar ligações de fosfonato para estabilizar ofosfodiéster, como descrito acima é possível estabilizar o fosfodiéster em umgrau útil incorporando um grupo azida como o substituinte de C-2 aza duran-te as manipulações sintéticas até e opcionalmente durante a etapa de conju-gação do oligossacarídeo com uma proteína. Esta estabilização é indutiva,mas é adequada para melhorar a estabilidade de funcionamento dos inter-mediários sobre os compostos de NHAc correspondentes. Uma vez a azidaserviu seu propósito, pode ser reduzida com boroidreto de níquel e acetiladacom anidrido acético ou agentes de acilação similares como descritos aqui.

Os compostos oligoméricos da invenção podem desse modo incorporar liga-ções de fosfodiéster até certo ponto como descrito acima, e os fosfodiéste-res podem ser incorporados através de métodos típicos e aqueles descritos aqui.

Para ter a opção para adquirir ambas as moléculas alvos com ousem acetatos, a estratégia do grupo de proteção foi com base em acetatoscomo grupos de proteção permanentes. Para estabilizar a ligação anoméricade fosfodiéster, azida foi usada como um precursor para o grupo acetamidoaté onde possível na síntese, como ilustrado no Esquema 7 abaixo. As pro-priedades de extração de elétrons e a falta de efeito participativo da azidafortemente protegem a ligação. E após problemas iniciais com o uso de di-metóxi tritila como um grupo de proteção temporário para a 6-OH nós usa-mos TBDMS (éter de dimetilsilila de t-butila, às vezes referido como TBS).Os éteres de TBDMS foram clivados em rendimento bom com problemasmínimos devido à migração de acetila ou clivagem da ligação de fosfodiésterlábil. TBAF que foi de forma bem-sucedida usado para desproteção de éte-res de TBDMS na síntese de C-fosfonato anterior não pôde ser usado devi-do à migração de acetila assim bem lenta (especialmente ao ter azida empos T) mas segura se TREAT-HF fosse usado.

Esquema 7

<formula>formula see original document page 46</formula>

Para uma síntese modular eficiente, de três blocos de constru-ção de monossacarídeo foram necessários; um espaçador equipado commonômero de partida aceitante de 6-OH, um monômero de alongamento dealfa-H-fosfonato com proteção de 6-OH temporária (doador 1) e um monô-mero de alfa-H-fosfonato de terminação fosforilado na posição primária (do-ador 2). Para alcançar as moléculas-alvo com um fosfato em C-6, como e-xemplificado aqui como oligossacarídeos triméricos, um doador contendo umfosfato de dibenzila protegido foi usado porque uma tentativa de modificaçãoda pós-ligação da C-6 hidroxila usando química de amidita foi mal-sucedida.

Para simplificar a síntese todas as três unidades foram sintetiza-das do mesmo precursor, XXVIII, como mostrado acima no Esquema 7. Omaterial de partida foi sintetizado usando métodos convencionais. Para fazero aceitante, foi acoplado a um espaçador de etanolamina protegido por ben-ziloxicarbonila em 86 % de rendimento e o éter de TBDMS removidos usan-do TREAT-HF para dar para o aceitante XXIX em 97 % de rendimento.

Doador 1 foi sintetizado primeiro hidrolisando o tioglicosídeo u-sando uma glicosilação com NIS como o promotor e água como aceitante a -20s C. O alfa-anômero desejado foi obtido exclusivamente em 82 % de ren-dimento. Se a reação for realizada em temperatura ambiente, uma porcenta-gem grande de beta é formada. Este composto foi depois fosfonilado usandoPCI3ZimidazoI que dá XXX em 97 % de rendimento. Desse modo, a invençãoinclui preparar alfa-anômeros em baixas temperaturas tão inferior quantotemperatura ambiente, preferivelmente inferior que Oe C, mais preferivelmen-te inferior que -10e C, como -20e C ou menos.

Para sintetizar as unidades de manose de doador tendo o H-fosfonato, que é útil para adicionar as unidades de manose ligadas a um oli-gossacarídeo da invenção através de uma ligação de fosfodiéster, oTBDMS-éter foi clivado em 75 % de rendimento e a hidroxila foi fosforiladausando química de amidita para dar um fosfato protegido por benzila em C-6(67 %). O glicosídeo de tio de etila foi hidrolisado na mesma maneira quepara o doador 1 acoplando a água (79 %) e depois fosfonilado para dar aunidade de manose de doador de H-fosfonato XXXI em 92 % de rendimento.

O acoplamento do monômero de alongamento ao aceitante foirealizado usando química de H-fosfonato convencional com uma condensa-ção promovida por cloreto de pivaloíla como ilustrado no Esquema 8 abaixo.

O diéster de H-fosfonato foi oxidado usando iodo elementar e água para for-necer o diéster de fosfato. O dímero foi obtido em um rendimento bom(96%).

Esquema 8

<formula>formula see original document page 48</formula>

Alongamento para trissacarídeos é alcançado através de des-proteção da C-6 hidroxila com TREAT-HF e repetição da adição de um mo·nômero de alongamento; e a compatibilidade da estratégia do grupo de pro-teção aqui com aquele exemplificado nos esquemas acima para a constru-ção de ligação de fosfonato permite os dois tipos de ligações serem mistura-dos ou combinados em um oligossacarídeo dado. O exemplo aqui ilustraalongamento com as moléculas de doador XXX e XXXI, fornecendo um oli-gossacarídeo trimérico que ou tem uma C-6 hidroxila na última unidade demanose, ou um C-6 O-fosfato naquela posição.Esquema 9

<formula>formula see original document page 49</formula>

onde R ou é OH ou fosfato de dibenzila

Para obter o trissacarídeo, o TBDMS-éter no dissacarídeo foiremovido em 91 % de rendimento, novamente usando TREAT-HF. Acopla-mento subseqüente dos dois doadores usando as mesmas condições queempregadas para o acoplamento ao dissacarídeo, resultou na formação dosdois trissacarídeos em 62 % e 59 % de rendimento respectivamente. Osrendimentos obtidos durante o segundo ou acoplamentos subseqüentes fo-ram inferiores que aqueles obtidos da primeira etapa de acoplamento, comoobservado por Pozsgay, et al. (Vide, A. Berkin, B., Coxon e V. Pozsgay,Chem. Eur. J., 2002, 8, 4424). Desse modo em modalidades preferidas pelomenos algumas das ligações entre as unidades de manose adjacentes emum oligossacarídeo tipicamente compreendem um fosfonato em vez de umfosfodiéster.

As azidas em ambas formas dos oligômeros da invenção podemtambém compreender um fosfato adicional em forma protegida em R1 ou suaposição equivalente, por exemplo, o grupo R6 em dímeros e trímeros dosoligômeros de fosfonato. isto é opcionalmente introduzido porque as unida-des de manose terminais podem ser fosforiladas no CPS natural, e o grupofosforila correspondente pode ser introduzido como um éster de fosfato dedibenzila usando química convencional. Os grupos de benzila podem depoisser removidos junto com os éteres de benzila em C-3 e/ou C-4, por exemplo,ou juntos com clivagem redutora de um grupo benziloxicarbonila que podeser usado para proteger um grupo amina na porção espaçadora na posição1 da primeira unidade de manose. O fosfonato de benzila não interfere comas outras reações necessárias para produzir os oligômeros. Por exemplo, asazidas em certos compostos contendo este grupo são de forma bem sucedi-da reduzidas nas aminas usando boroidreto de sódio e uma quantidade ca-talítica de hexaidrato de cloreto de níquel, e as aminas resultantes foramacetiladas com anidrido acético que dá os derivados de aminoacila corres-pondentes. Esta reação prosseguido em 89 % de rendimento quando o gru-po terminal em uma unidade de manose em um composto ligado a fosfodiés-ter trimérico fosse OTBDMS, e em 64 % de rendimento quando aquele grupoterminal fosse um fosfato de dibenzila.

<formula>formula see original document page 50</formula>O dois trissacarídeos foram desprotegidos em uma ordem dife-rente. Para alcançar as moléculas-alvo 1 e 2 primeiro o grupo Z foi despro-tegido usando hidrogenação redutora (83 %). Para evitar problemas comdegradação da ligação de fosfodiéster durante a hidrogenação redutora, re-sina de permuta de íons básica foi adicionada à mistura com resultado bom.

O éter de TBDMS foi novamente removido usando TREAT-HF dando 1 em85 % de rendimento. O acetato foi clivado sob condições de metóxido desódio/de metanol padrões. Para molécula alvo 3 o Z foi da mesma maneiraremovido como na desproteção anterior de 1 (85 %) e para alcançar 4 osacetatos foram removidos (80 %) antes da hidrogenação redutora (64 %).

Os métodos descritos acima nos esquemas podem também serusados para fazer os compostos tendo C-fosfonato, como aqueles compos-tos da fórmula (1) ou (1') descritos aqui.USO DOS COMPOSTOS COMO ANTÍGENOS

Os oligossacarídeos preparados pelos métodos acima são imu-nogênicos e são úteis para suscitar uma resposta imune que protege contrainfecção por N. Meningitidis, como em uma vacina. Em particular, um oligos-sacarídeo que tem a estrutura mostrada na fórmula (1) acima é capaz desuscitar uma resposta imunogênica se administrado a um mamífero, e admi-nistrando composição compreendendo um oligossacarídeo da fórmula por-tanto (1) é útil para suscitar a formação de anticorpos e/ou fornecer umaresposta imunogênica e fornecer pelo menos resistência parcial ou imunida-de parcial à infecção por N. Meningitidis A. Os anticorpos e/ou resposta imu-nogênica fornece(m) proteção contra infecção por N. Meningitidis A. Com-postos compreendendo a porção na fórmula (1), especialmente aqueles emque W é CH2 ou O, X é O, e Az é NHAc1 são úteis como componentes devacina, como são os compostos da fórmula (4).

Estes compostos são especialmente úteis quando conjugadoscom uma proteína, e opcionalmente o grupo Z da fórmula (1) pode ser usadopara ligar o oligossacarídeo da fórmula (1) a uma proteína. Igualmente, emoutros compostos da fórmula, o grupo correspondente em C-1 da primeiraunidade de manose em um oligossacarídeo da invenção pode ser uma por-ção capaz de ser usada para conjugar o composto com uma proteína veículopara melhorar suas propriedades imunogênicas. Apesar da opção de ligaçãoatravés de Z1 porém, os compostos da invenção e especificamente os com-postos compreendendo a estrutura na fórmula (1) ou fórmula (4) podem serligados através de outros meios a uma proteína veículo, como através de umou mais dos grupos hidroxila ou através de um grupo acila ligado no lugar deum grupo acetila em um das acetilaminas em um das unidades de manose.Tais mecanismos de conjugação alternativos estão dentro do escopo da in-venção, contanto que o centro C-1 (anomérico) do oligossacarídeo perma-neça na configuração alfa desejada. Preferivelmente tais oligossacarídeoscompreendem pelo menos uma ligação de fosfonato entre duas unidades demanose.

Conseqüentemente, um aspecto a presente invenção é direcio-nada às vacinas contendo como um ingrediente ativo uma quantidade imu-nogenicamente eficaz de um oligossacarídeo imunogênico como descritoaqui. 0(s) oligossacarídeo(s) pode(m) ser introduzido(s) em um hospedeiro,incluindo os seres humanos, ou sozinho ou ligado a um veículo como umaproteína ou como um homopolímero ou heteropolímero de unidades de ma-nose ou de outros sacarídeos. Em algumas modalidades, eles são usadoscomo glicoconjugados, e a proteína à qual o oligossacarídeo é conjugado éselecionada por sua habilidade de intensificar a resposta imunogênica aoantígeno de oligossacarídeo: às vezes proteínas que suscitam uma respostaimune no mamífero a ser tratado são preferidas. Os glicoconjugados têm avantagem de atividade imunológica aumentada e a habilidade adicional parainduzir anticorpos e/ou CTLs que reagem com determinantes antigênicosdiferentes do vírus ou células tumorais.

As composições imunogênicas da invenção incluem pelo menosum composto da invenção, e podem opcionalmente incluir mais que um talcomposto. Desse modo às vezes é desejável misturar dois ou mais compos-tos da invenção juntos para ampliar a resposta imunogênica suscitada. Porexemplo, é freqüentemente desejável combinar um composto em que R3 é Hcom um composto em que R é Ac, uma vez que o CPS do organismo alvo éparcialmente, mas não completamente, acetilado nesta posição. Desse mo-do em algumas modalidades, as composições imunogênicas compreendempelo menos dois e opcionalmente três ou mais de tais compostos imunogê-nicos e/ou conjugados de proteína de tais compostos.

Similarmente, as proteínas de veículo podem influenciar a res-posta imunogênica e até mesmo podem afetar a natureza precisa dos anti-corpos que são o resultado de tratamento de um mamífero com um ou maiscompostos da invenção quando liberados como glicoconjugados. Portanto, ainvenção inclui composições compreendendo mais de uma proteína veículo,se ou não eles compreenderem dois ou mais oligossacarídeos.

Proteínas veículo úteis são bem-conhecidas na técnica, e inclu-em, por exemplo, tiroglobulina, albuminas como albumina de soro humano,toxóide de tétano, toxóide de difteria, poliamino ácidos como ácido po-li(lisina:glutâmico), influenza, proteína de núcleo de vírus da hepatite B, vaci-na recombinante de vírus da hepatite B e similares. Proteínas bacterianas demembrana externa como, complexo de membrana externa c (OMPC), pori-nas, proteínas Iigadoras de transferrina, pneumólise, proteína de superfíciepneumocócica A (PspA), ou proteína de adesina pneumocócica (PsaA), po-dem também ser usadas. Outras proteínas, como ovalbumina, hemocianinade lapa (KLH), albumina de soro bovino (BSA) ou derivado de proteína detuberculina purificada (PPD) podem também ser usadas como proteínas veí-culo. Proteínas veículo são preferivelmente proteínas que são não-tóxicas enão-reatogênicas e obteníveis em quantidade e pureza suficientes.

Proteínas de veículo deveriam ser tratáveis em procedimentosde conjugação padrões. Em uma modalidade preferida a toxina de difteria dapresente invenção purificada de culturas de Corynebacteria diphtheriae qui-micamente desintoxicadas usando formaldeído é usada como a proteínaveículo. Em outras modalidades, CRM197 foi usado.

Métodos para ligar um oligossacarídeo a uma proteína veículosão convencionais, e um médico versado pode criar glicoconjugados com-preendendo os compostos da invenção usando métodos convencionais. Ori-entação está também disponível em muitas publicações e, por exemplo, napatente U. S. 4.356.170; 4.619.828; 5.153.312; 5.422.427; e 5.445.817.

Em uma tal modalidade, usando 2-aminoetóxi como a porçãoespaçadora em C-1 da primeira unidade de manose e uma ligação de fosfo-diéster, e usando ácido subérico ou esquarato como o reagente bifuncionalpara conectar a porção espaçadora à proteína veículo, e usando CRM197como a proteína veículo, glicoconjugados foram preparados. De acordo comanálise espectral de massa de MALDI-TOF, estes conjugados continhamcerca de cinco moléculas de oligossacarídeo, em média, por molécula deproteína veículo. Porém, razões de oligossacarídeo:proteína veículo de cer-ca de 0,1 a cerca de um em uma razão molar são razões freqüentementedesejáveis, e molar de cerca de 1-30:1 ou cerca de 1-10:1 estão dentro doescopo da invenção independente se proteína veículo é utilizada. A razão deoligossacarídeo para proteína veículo pode também ser caracterizada comouma razão de peso entre os dois; razões de cerca de 1:1 a 1:500 são fre-qüentemente preferidas. A razão precisa depende da razão do peso molecu-lar da proteína e do oligossacarídeo; para oligossacarídeos menores, umarazão de peso de 1:5 a 1: 200 às vezes é usada.

Após conjugação do polissacarídeo capsular com a proteína veí-culo, os conjugados de polissacarídeo-proteína podem ser purificados (enri-quecidos com respeito à quantidade de conjugado de polissacarídeo-proteína) por uma variedade de técnicas. Uma meta da etapa de purificaçãoé remover o polissacarídeo não-ligado do conjugado de polissacarídeo-proteína. Um método para purificação, envolvendo uItrafiItração na presençade sulfato de amônio, é descrito na patente U. S. 6.146.902. Alternativamen-te, conjugados podem ser purificados longe da proteína e polissacarídeonão-reagidos por qualquer número de técnicas padrões incluindo, inter alia,cromatografia de exclusão de tamanho, centrifugação de gradiente de den-sidade, cromatografia de interação hidrofóbica ou fracionamento de sulfatode amônio. Vide, por exemplo, Anderson, P. W., et ai., J. Immunol. (1986)137:1181-1186. Vide também Jennings, H. J., et a!., J. Immunol. (1981)127:1011-1018.

As vacinas da invenção compreendem pelo menos um compostoimunogênico da invenção, e podem também conter um diluente fisiologica-mente tolerável (aceitável) como água, solução salina tamponada de fosfato,ou solução salina, e também tipicamente incluem um adjuvante. Patente U.S. No. 6.869.607 fornece adjuvantes não-iônicos para imunógenos conjuga-dos com proteína e debate outros adjuvantes adequados, e é incorporadapor referência por sua descrição de tais adjuvantes. Materiais como o adju-vante de Freund incompleto, fosfato de alumínio, hidróxido de alumínio oualume, sulfato de alumínio, fosfato de alumínio, e combinações destes sãomateriais bem-conhecidos na técnica como adjuvantes. Também úteis sãoBAY, DC-chol, pcpp, lipídio de monofosforila A, CpG, QS-21, toxina de cóle-ra, e peptídeo de metionila de formila, como também formulações de emul-são incluindo MF59, SAF, esqualano, Tween, polímero bloqueado plurônicoL121, e componentes como monofosforilídeo A, dimicolato de trealose, eesqueleto de parede celular. Citocinas como IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7,IL-12, interferonas, e fator de necrose tumoral (TNF) podem também ser in-cluídos. Em algumas modalidades preferidas da invenção, o alume é usadocomo o adjuvante.

Sob imunização com uma composição como descrita aqui, pormeio de injeção, aerossol, oral, rota transdérmica ou outra, o sistema imunedo hospedeiro responde à vacina produzindo quantidades grandes de CTLsespecíficos para o antígeno desejado, e o hospedeiro se torna pelo menosparcialmente imune à infecção posterior pelo patógeno de N. Meningitidis.

As vacinas e composições farmacêuticas da invenção são inten-cionadas para administração parenteral, tópica, oral ou local. Preferivelmen-te, elas são administrados parenteralmente, por exemplo, intravenosa, sub-cutânea, intradérmica, ou intramuscularmente. Desse modo, a invenção for-nece composições para administração parenteral compreendendo uma solu-ção da porção imunogênica dissolvida ou suspensa em um veículo aceitável,preferivelmente veículo primariamente aquoso. Uma variedade de veículosaquosos pode ser usada, por exemplo, água, água tamponada, 0,8 % - 0,3% solução salina de glicina, ácido hialurônico e similares. Estas composi-ções podem ser esterilizadas através de técnicas de esterilização conven-cionais, ou podem ser filtradas estéreis. As soluções aquosas resultantespodem ser empacotadas para o uso como estão, ou liofilizadas, a prepara-ção Iiofilizada sendo combinada com uma solução estéril antes da adminis-tração. As composições podem conter substâncias auxiliares farmaceutica-mente aceitáveis como requerido para aproximar às condições fisiológicas,como agentes de ajuste de pH e tamponantes, agentes de ajuste de tonici-dade, agentes umectantes e similares, por exemplo, acetato de sódio, Iacta-to de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, monolau-rato de sorbitano, oleato de trietanolamina, etc. A preparação de tais compo-sições farmacêuticas está dentro da habilidade usual na técnica, e pode serdirecionada por livros de referência padrão como Remington1S Pharmaceuti-cal Science, última ed., que é incorporado aqui por referência.

Em modalidades preferidas, uma composição de vacina com-preendendo pelo menos uma porção da fórmula (1) ou fórmula (4) em umamistura substancialmente aquosa é formulada como uma solução tampona-da estéril, solução salina livre de pirógeno ou solução contendo fosfato po-dendo incluir um conservante ou podem ser livres de conservante. Conser-vantes adequados incluem álcool benzílico, parabenos, timerosal, clorobuta-nol, e cloreto de benzalcônio, por exemplo. A solução é preferivelmente cer-ca de isotônica, e sua tonicidade pode ser ajustada com agentes como tarta-rato de sódio, cloreto de sódio, propileno glicol, e fosfato de sódio.

A concentração dos oligossacarídeos imunogênicos da invençãonas formulações farmacêuticas pode variar amplamente, isto é, de menosque cerca de 0,1 %, usualmente em ou pelo menos cerca de 0,1 % a até 20% a 50 % ou mais em peso, e será selecionada primariamente por volumesfluidos, viscosidades, etc., e de acordo com o modo particular de administra-ção selecionado. Uma forma de dose de unidade humana dos compostos ecomposição é tipicamente inclusa em uma composição farmacêutica com-preendendo uma dose de unidade humana de um veículo aceitável, preferi-velmente veículo aquoso, e é administrada em um volume de fluido que éconhecido àqueles de habilidade na técnica ser usados para administraçãode tais composições em humanos, e é ajustado de acordo com os princípioscomumente entendidos a um sujeito particular a ser tratado. Desse modo emuma modalidade, a invenção fornece uma dosagem de unidade dos compo-nentes de vacina da invenção em uma quantidade adequada de uma solu-ção aquosa, como 0,1-3 ml, preferivelmente 0,2-2 ml.

Os imunógenos da invenção podem também ser administradospor meio de Iipossomas que podem servir para concentrá-los em um tecidoparticular como tecido linfóide, ou intensificar sua atividade ou característicasde liberação. Uma variedade de métodos está disponível para preparar Ii-possomas, como descritos em, por exemplo, Szoka, et al, Ann. Rev. Bio-phys. Bioeng. (1980) 9:467, patentes U. S. Nos. 4.235.871, 4.501.728,4.837.028, e 5.019.369.

Para composições sólidas, veículos sólidos não-tóxicos conven-cionais podem ser usados que incluem, por exemplo, tipos farmacêuticos demanitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, talco, celu-lose, glicose, sucrose, carbonato de magnésio, e similares. Para administra-ção oral, uma composição não-tóxica farmaceuticamente aceitável é forma-da incorporando qualquer um dos excipientes normalmente empregados,como aqueles veículos previamente listados, e uma dosagem de unidade deum ingrediente ativo sendo um ou mais compostos da invenção, quer conju-gado com uma proteína ou não.

Para administração de aerossol, os compostos imunogênicossão preferivelmente providos em forma finamente dividida juntos com umtensoativo e propulsor. O tensoativo deve, claro que, ser não-tóxico, e prefe-rivelmente: solúvel no propulsor. Representativo de tais agentes são os éste-res ou ésteres parciais de ácidos graxos contendo de 6 a 22 átomos de car-bono, como ácidos capróico, octanóico, láurico, palmítico, esteárico, linoléi-co, linolênico, olestérico e oléico com um álcool poliídrico alifático ou seuanidrido cíclico. Ésteres misturados, como glicerídeos misturados ou naturaispodem ser empregados. O tensoativo pode constituir 0,1 %-20 % em pesoda composição, preferivelmente 0,25-5 %. O equilíbrio da composição ordi-nariamente é o propulsor. Um veículo pode também ser incluído, como dese-jado, como, por exemplo, com Iecitina para liberação intranasal.Quantidades eficazes para este uso dependerão, por exemplo,da composição de oligossacarídeo, se é conjugado com uma proteína, amaneira de administração, o peso e estado de general de saúde do pacien-te, e o julgamento do médico prescribente, mas em geral varia para a imuni-zação inicial (que é para uma administração profiláctica) de cerca de 1,0 pga cerca de 5.000 pg de peptídeo para um paciente de 70 kg, (por exemplo,1,0 pg, 1,5 pg, 2,0 pg, 2,5 pg, 3,0 pg, 3,5 pg, 4,0 pg, 4,5 pg, 5,0 pg, 7,5 pg,10 pg, 12,5 pg, 15 pg, 17,5 pg, 20 pg, 25 pg, 30 pg, 35 pg, 40 pg, 45 pg, 50pg, 75 pg, 100 pg, 250 pg, 500 pg, 750 pg, 1.000 pg, 1.500 pg, 2.000 pg,2.500 pg, 3.000 pg, 3.500 pg, 4.000 pg, 4.500 pg ou 5.000 pg). A dose atualadministrada a um sujeito é freqüentemente determinada de acordo comuma quantidade apropriada por kg do peso do corpo do sujeito, Por exem-plo, uma quantidade eficaz pode ser cerca de 0,1 a 5 pg/kg do peso do corpo.

Uma dose primária pode opcionalmente ser seguida por dosa-gens de reforço de cerca de 1,0 pg a cerca de 1,000 pg de peptídeo (porexemplo, 1,0 pg, 2,0 pg, 2,5 pg, 3,0 pg, 3,5 pg, 4,0 pg, 4,5 pg, 5,0 pg, 7,5pg, 10 pg, 12,5 pg, 15 pg, 17,5 pg, 20 pg, 25 pg, 30 pg, 35 pg, 40 pg, 45 pg,50 pg, 75 pg, 100 pg, 250 pg, 500 pg, 750 pg, 1.000 pg, 1.500 pg, 2.000 pg,2.500 pg, 3.000 pg, 3.500 pg, 4.000 pg, 4.500 pg ou 5.000 pg) de acordocom um regime de reforço durante semanas a meses dependendo da res-posta do paciente e condição medindo a atividade específica de células T nosangue do paciente.

As composições imunogênicas compreendendo um composto dainvenção são adequadas para uso em seres humanos adulto ou em crian-ças, e em algumas modalidades elas são administradas em crianças jovensque estão em risco de contrair meningite causada por N. Meningitidis. Op-cionalmente uma tal composição pode ser administrada farmaceuticamenteem combinação com outras substâncias ativas, e freqüentemente será ad-ministrada em combinação com outras vacinas como parte de um programade vacinação de infância. Composições para administração podem vantajo-samente incluir outros tipos de compostos imunogênicos como glicoconjuga-dos que suscita uma resposta imune para fornecer proteção contra outrospatógenos de meningite, também. Desse modo em algumas modalidades,as composições de vacina da invenção incluem pelo menos um antígenoderivado de outro sorotipo de Meningitidis, tipicamente de pelo menos umdos sorotipos A, B, C, W135, e Y. Modalidades preferidas freqüentementecompreendem antígenos para pelo menos um e freqüentemente dois ou to-dos sorotipos C, Y e W135 em combinação com pelo menos um e opcional-mente dois ou mais compostos compreendendo um oligossacarídeo da pre-sente invenção.

EXEMPLOS

Os exemplos a seguir ilustram certas modalidades da invenção,mas de nenhuma maneira limitam seu escopo. Outras variações das rea-ções exemplificadas e formulações serão evidentes àqueles versados natécnica, e estão também dentro do escopo da invenção. Por exemplo, alte-rando a ordem das etapas, ou modificando a estratégia do grupo de prote-ção selecionado freqüentemente representam escolhas típicas feitas pelomédico usual. A numeração dos compostos na seção a seguir não correlatacom a numeração dos compostos nos esquemas de reação fornecidos aci-ma, e é provida para conveniência do leitor.

MÉTODOS GERAIS.

TLC foi realizada em placas pré-revestidas de Merck 60 F254usando AMC (molibdato de amônio-sulfato de cério(IV)-10 % de ácido sulfú-rico 100 g:2 de g:2 L) ou 8 % de H2SO4 para visualização. Cromatografia decoluna foi executada em sílica-gel (0,040-0,063 mm, Amicon) ou de fase re-versa em gel (C 18 60 A 40-63 pm). Os espectros de RMN foram registradosem CDCI3 (Me4Si externo, δ = 0,00) ou D2O (acetona interna 13C δ = 30,89,1H = 2,22) a 25° C em um instrumento de Varian 300 MHz ou 400 MHz. So-luções orgânicas foram concentradas a 309 C sob pressão reduzida.Exemplo 1

<formula>formula see original document page 60</formula>

Legenda: i) TBAF; ii) Ph3P, DIAD, DPPA, THF; iii) HOAc1 Ac2O1 H2SO4; iv) a.NaBH4, NiCI2x6H20, b. Ac2O; v) Me3SiBr; vi) MeC(OMe)3, HOAc; vii) PhSH,Et3N.

C-(3,4,6-tri-0-benzil-a-D-glucopiranosil)metanofosfonato de dieti-la (2). TBAF (2,6 g 1,3 eq) foi adicionado a uma solução de C-(2-0-tercbutildimetilsilil-3,4,6-tri-0-benzil-a-D-glucopiranosil)metanofosfonato dedietila (1, 5,36 g, 7,7 mmols) em THF (150 ml). Após 20 min o solvente foiremovido sob pressão reduzida e o produto foi purificado através de croma-tografia de coluna em sílica-gel para dar 2 (4,44 g, 7,6 mmols, 99 %).

C-(2-azido-3,4,6-tri-0-benzil-2-deóxi-a-D-manopiranosil) metano-fosfonato de dietila (3). DIAD (2,4 ml, 12,4 mmols) foi adicionado a gotas auma solução esfriada (-5- C) de Ph3P (3,1 g, 11,7 mmols) em THF (50 ml).Após 30 min, uma solução de 2 (5,57 g, 9,5 mmols) em THF (20 ml) foi adi-cionada. Após uns 10 min adicionais, fosforazidato de difenila (DPPA; 2,4 ml,11,31 mmol) foi adicionado e a mistura de reação foi deixada atingir TA. A-pós agitar durante a noite, o solvente foi evaporado e o resíduo foi purificadoatravés de cromatografia em sílica-gel para dar 3 (5,0 g, 8,2 mmols, 86 %)como um óleo incolor. 13C-RMN (CDCI3) 138,17, 137,92, 137,38, 128,6-127,7, 78,2, 74,3, 73,9, 73,7, 73,5, 72,4, 69,5, 68,8, 62,2, 62,1, 62,0, 61,9,61,0, 60,9, 27,9 (d, J = 141 Hz), 16,5, 16,4; 31P-RMN (CDCI3) 27,9.C-(6-0-acetil-2-azido-3,4-di-0-benzil-2-deóxi-a-D-manopiranosil)metanofosfonato de dietila (4). Composto 3 (3,2 g, 5,2 mmols) foi dissolvidoem H0Ac/Ac20 (1:1, 32 ml). Dez gotas de 1 % de H2SO4 foram adicionadasem Ac2O. Após agitar durante a noite a mistura foi vertida em um funil deseparação contendo gelo e CH2CI2. A fase orgânica foi separada, filtradaatravés de um tampão de sílica e concentrada. O resíduo foi purificado atra-vés de cromatografia de coluna para dar 4 (2,48 g, 4,4 mmol, 84 %). 13C-RMN (CDCI3) 170,41, 137,41, 136,95, 128,34-127,75, 77,77, 77,60, 74,01,73,39, 72,17, 71,89, 69,26, 62,47, 61,82, 61,73, 60,50, 60,37, 27,57 (d, J =141 Hz), 20,59, 16,27, 16,19; 31P-RMN (CDCI3) 27,50; [a]D +37 (c 1,0, CH-Cl3).

C-(6-0-acetil-2-acetamido-3,4-di-0-benzil-2-deóxi-a-D-manopiranosil) metanofosfonato de dietila (5). A uma solução agitada de 4(2,50 g, 4,45 mmols) em MeOH (125 ml) uma quantidade catalítica de Ni-CI2x6H20 foi adicionada seguido por porções de NaBH4 (em total 0,34 g, 8,9mmols) a cada 10 min até que nenhum material de partida fosse observadoem TLC (sistema). Ac2O (3 ml) foi adicionado após 50 min e a mistura dereação foi diluída com tolueno, filtrada através de um tampão de sílica econcentrada. O resíduo foi purificado através de cromatografia em sílica-gelpara dar 5 (1,95 g, 3,4 mmols, 76 %). 13C-RMN (CDCI3) 170,4, 169,7, 137,3,137,0 C 128,5-127,7 permanecendo aromático, 75,3, 72,6, 72,4, 72,1, 72,0,67,1, 61,91, 61,8, 61,8, 61,3, 61,2, 48,8, 48,6, 28,5 (d, J = 142 Hz), 23,0,20,6, 16,3, 16,2, 16,1; 31P-RMN (CDCI3) 29,5.

: C-(6-0-acetil-2-acetamido-3,4-di-0-benzil-2-deóxi-a-D-manopiranosil) metanofosfonato de dimetila (7). A uma solução de 5 (0,25 g,0,43 mmol) em CH2CI2 seco (5 ml) bromotrimetilsilano (0,28 ml, 2,2 mmols, 5eq) foi adicionado em TA. Após a adição estar concluída, a mistura foi agita-da em TA por 1 h. A solução foi esfriada a Os C e Et3N (1 ml) foi adicionadoseguido por adição de água (1 ml). Após 10 min os solventes foram removi-dos sob pressão reduzida e o resíduo dessalgado por cromatografia de RP(água-água/MeOH 1:1). O produto C-(6-0-acetil-2-acetamido-3,4-di-0-benzil-2-deóxi-oc-D-manopiranosil) metanofosfonato (6) foi metilado sem puri-ficação adicional. Ao produto da reação descrito acima foram adicionadosAcOH (5,5 ml) e trimetilortoacetato (11,5 ml). A mistura foi aquecida a refluxopor 30 min e depois concentrada. O resíduo foi purificado através de croma-tografia em sílica-gel para dar 7 (0,20 g, 0,36 mmol, 84 % em duas etapas).

(A reação tem que ser monitorada cuidadosamente e parada exatamentequando a reação estiver concluída, do contrário o resultado é uma misturado produto desejado e o produto onde o 6-OAc é desprotegido.) 13C-RMN(CDCI3) 170,6, 170,0, 137,4, 137,1 permanecendo C aromático 129,9-127,4,75,3, 73,0, 72,5, 72,4, 72,0, 66,7, 61,8, 52,9, 52,8, 52,2, 52,1, 49,0, 48,7,28,0 (d, J = 142 Hz), 23,2, 20,8; 31P-RMN (CDCI3) 31,6.

C-(6-0-acetil-2-acetamido-3,4-di-0-benzil-2-deóxi-a-D-manopiranosil)metanofosfonato de metila (8). A uma solução de 7 (1,35 g,2,46 mmols) em THF (2 ml) foram adicionados tiofenol (1,0 ml, 9,83 mmols)e Et3N (2,0 ml, 14,7 mmols). Após 48 h a mistura de reação foi posta direta-mente em uma coluna em sílica-gel e primeiro eluída com tolueno e depoiscom CHCI3MeOH 9:1 contendo 1,5 % TEA para dar 8 (1,28 g, 2,01 mmols,82 %). 13C-RMN (CDCI3) 169,5, 169,1, 137,1, 137,1, permanecendo C aro-mático, 127,4-126,7, 75,0, 72,6, 72,1, 71,6, 71,2, 62,0, 51,7, 50,6, 50,5, 49,5,28,6 (d, J = 129 Hz), 22,4, 22,3, 19,9; 31P-RMN (CDCI3) 20,4; [oc]d+15 (c1,0,CHCI3).

O esquema a seguir aplica-se ao restante do Exemplo 1 e E-xemplo 2-6.<formula>formula see original document page 63</formula>

Legenda: i) (pCIPh)3P, DIAD, Et3N, THF; ii) KOH1 MeOH; iii) PhSH1 DBU1CH3CN; iv) H2,Pd/C,HCI.

6-0-[metila C-(6-0-acetil-2-acetamido-3,4-di-0-benzil-2-deóxi-a-D-manopiranosil)metanofosfonato]-2-acetamido-3,4-di-ü-benzil-2-deóxi-a-D-manopiranosídeo de 2-carboxibenzilamidoetila (10). A uma solução de 8 (50mg, 0,093 mmol), tris(4-clorofenil)fosfina (38 mg, 0,10 mmol), 2-acetamido-3,4-di-0-benzil-2-deóxi-a-D-manopiranosídeo de 2-carboxibenzilamidoetila(9, 42 mg,: 0,072 mmol), Et3N (0,050 ml, 0,36 mmol) em THF (0,5 ml), DIAD(0,021 ml, 10,4 mmols) foi adicionado. Após 45 min o solvente foi removidosob pressão reduzida e o resíduo purificado por cromatografia em sílica-gel(EtOAc seguido por CHCI3ZMeOH 9:1) seguido através de purificação adicio-nal em uma coluna de gel de LH-20 (CH2CI2/MeOH 4:1) para dar o produto(70,1 mg, 0,064 mmol, 88 %) como uma mistura diastereomérica.

Exemplo 2

6-0-[metil-C-(2-acetamido-3,4-di-0-benzil-2-deóxi-a-D-manopiranosil)metanofosfonato]-2-acetamido-3,4-di-0-benzil-2-deóxi-a-D-manopiranosídeo de 2-carboxibenzilamidoetila (11). A uma solução de 10(73 mg, 0,066 mmol) em MeOH (2 ml), KOH (7,4 mg, 0,13 mmol) de umasolução de matéria-prima de KOH dissolvida em MeOH foi adicionada. Após25 min a mistura de reação foi diluída com CH2CI2, filtrada através de umtampão de sílica e os solventes foram removidos sob pressão reduzida. Oresíduo foi purificado em uma coluna de gel de LH-20 (CH2CI2ZMeOH 4:1)para dar 11 (70 mg 0,066 mmol, 100 %).

Exemplo 3

6-0-[metil-C-(6-0-[metila C-(6-0-acetil-2-acetamido-3,4-di-0-benzil-2-deóxi-a-D-manopiranosil)metanofosfonato]-2-acetamido-3,4-di-0-benzil-2-deóxi-a-D-manopiranosil)metanofosfonato]-2-acetamido-3,4-di-0-benzil-2-deóxi-a-D-manopiranosídeo de 2-carboxibenzilamidoetila (12). Auma solução de 8 (27 mg, 0,051 mmol), tris(4-clorofenil)fosfina (19 mg, 0,052mmol), 11 (38 mg, 0,036 mmol) e Et3N (0,025 ml, 0,18 mmol) em THF (0,5ml), DIAD (0,010 ml, 0,052 mmol) foi adicionado. Após 40 min a mistura dereação foi concentrada e purificada através de cromatografia em sílica-gel(EtOAc seguido por CHCI3ZMeOH 9:1). Os produtos foram também purifica-dos em uma coluna de gel de LH-20 (CH2CI2ZMeOH 4:1) para dar 12 (52 mg,0,033 mmol, 92 %).

Exemplo 4

6-0-[metil C-(6-0-[metil C-(2-acetamido-3,4-di-0-benzil-2-deóxi-a-D-manopiranosil)fosfonato]-2-acetamido-3,4-di-0-benzil-2-fosfonato-2-deóxi-a-D-manopiranosil)fosfonato]-2-acetamido-3,4-di-0-benzil-2-deóxi-a-D-manopiranosídeo de 2-carboxibenzilamidoetila (14). A uma solução de 12(67 mg, 0,043 mmol) em MeOH (2 ml), KOH (4,7 mg, 0,085 mmol, 2 eq) deuma solução de matéria-prima de KOH dissolvida em MeOH foi adicionada.Após 25 min a mistura de reação foi diluída com DCM, filtrada através de umtampão de sílica e os solventes foram removidos sob pressão reduzida. Oresíduo foi purificado em uma coluna de gel de LH-20 (CH2CI2ZMeOH 4:1)para dar 13 (65 mg, 0,042 mmol, 100 %). A uma solução de 13 (36 mg,0,024 mmol) em acetonitrila (0,5 ml), tiofenol (0,096 ml, 0,94 mmol, 40 eq) eDBU (0,070 ml, 0,47 mmol, 20 eq) foram adicionados. Após 2,5 h o solventefoi removido sob pressão reduzida e o produto purificado por cromatografiaem sílica-gel (tolueno seguido por CHCI3ZMeOH 9:1+1,5 % TEA). Os produ-tos foram também purificados em uma coluna de gel de LH-20 (MeOH+1,5% TEA) para dar 14 (30 mg, 0,018 mmol, 75 %). 31P RMN (CDCI3): 21,2, 22,4.

Exemplo 5

6-0-[C-(2-acetamido-2-deóxi-a-D-mano manopirano-sil)metanofosfonato]-2-acetamido-2-deóxi-a-D-manopiranosídeo de 2-aminoetila (15). A uma solução de 11 (35,1 mg, 0,033 mmol) em acetonitrila(0,5 ml), tiofenol (0,066 ml, 0,64 mmol, 20 equiv.) e DBU (0,048 ml, 0,32mmol, 10 equiv.) foram adicionados. Após 2 h o solvente foi removido sobpressão reduzida e o produto purificado por cromatografia em sílica-gel (to-lueno seguido por CHCI3ZMeOH 20:1+1,5 % de TEA). Os produtos foramtambém purificados em uma coluna de gel de LH-20 (MeOH 1,5 % de TEA)para dar 6-0-[C-(2-acetamido-3,4-di-0-benzil-2-deóxi-a-D-manopiranosil)metanofosfonato]-2-acetamido-3,4-di-0-benzil-2-deóxi-a-D-manopiranosídeo de 2-(benziloxicarbonil)aminoetila (30 mg, 2,63 mmols,79%). 13C-RMN (CD3OD) 173,55, 172,57, 158,72, 139,94, 139,66, 139,64,139,39, 138,24, permanecendo C aromático 130,36-125,05, 100,26, 78,86,77,82, 76,03, 75,90, 75,18, 74,60, 74,19, 72,85, 72,27, 72,20, 71,97, 67,36,67,25, 64,57, 61,09, 54,66, 51,28, 51,16, 50,56, 41,43, 29,94 (d, J= 135 Hz),22,59, 22,43. A uma solução deste produto (10 mg) em EtOH (4 ml), HCI emágua (0,1 M, 0,25 ml) foi adicionado seguido por uma quantidade catalíticade Pd em carbono. Após agitar durante a noite sob uma atmosfera de hidro-gênio de 70,3 kgZcm2 (100 psi) a solução foi neutralizada com acetato desódio. A mistura de reação foi filtrada através de um tampão de sílica-gel defase reversa e 31P RMN mostrou conversão total do material de partida paraum produto simples que foi também purificado em uma coluna de P2-Biogelpara dar 15 (100 %) após secagem por esfriamento. RMN (D2O): 31P 23,1;13C 22,5, 22,6, 26,7, 28,5, 30,9, 39,5, 47,2, 52,8, 53,1, 53,3, 60,0, 63,6, 63,9,66,8, 67,8, 69,1, 69,6, 72,0, 72,1, 73,1, 74,5, 99,3, 174,8, 175,4.Exemplo 6

6-0-[C-(6-0-[C-(2-acetamido-2-deóxi-a-D-manopiranosil) meta-nofosfonato]-2-acetamido-2-deóxi-a-D-manopiranosil)metanofosfonato]-2-acetamido-2-deóxi-a-D-manopiranosídeo de 2-aminoetila (16). A uma solu-ção de 14 (12 mg) em EtOH (4 ml), HCI em água (0,1 M, 0,25 ml) foi adicio-nado seguido por uma quantidade cataiítica de Pd em carbono. Após agitardurante a noite sob uma atmosfera de hidrogênio de 70,3 kg/cm2 (100 psi) asolução foi neutralizada com acetato de sódio. A mistura de reação foi filtra-da através de um tampão de sílica-gel de fase reversa e 31P RMN mostrouconversão total do material de partida em um produto simples que foi tam-bém purificado em uma coluna de P2-Biogel para dar 16 (100 %). RMN(D2O): 31P 22,72, 22,75; 13C 22,5, 22,7, 23,9, 26,9, 28,7, 30,9, 39,5, 47,1,52,8, 53,2, 53,3, 60,9, 63,6, 64,0, 66,9, 67,3, 67,8, 69,2, 69,5, 69,7, 72,1,72,2, 73,2, 74,2, 74,5, 99,4, 174,8, 175,4.

Exemplo 7a

<formula>formula see original document page 66</formula>

3,4,6-tri-0-acetil-2-azido-2-deóxi-1-tio-a-D-manopiranosídeo deetila (22). A uma solução de l,3,4,6-tetra-0-acetil-2-azido-2-deóxi-D-manopiranosídeo (21) (5,04 g, 13,5 mmols) em CH2CI2 (60 ml_) foram adi-cionados EtSH (1,6 ml, 21,6 mmols) e MS (4Â). A mistura foi agitada sobargônio em TA por 30 min. BF3-eterato (4,8 ml, 38,1 mmols) dissolvido emCH2CI2 (10 ml) foi depois adicionado durante 1 h. Após 7 h a mistura foi dilu-ída com CH2CI2, lavada com NaHCOe saturado, filtrada (sílica) e concentra-da. Cromatografia (1:0->1:1 tolueno-EtOAc) deram 22 (3,46 g, 9,22 mmols,68 %); 13C RMN δ 14,8 (SCH2CH3), 20,6, 20,7, 20,8 (CH3CO), 25,6(SCH2CH3), 62,3, 62,9, 66,2, 69,0, 71,4 (C-2-6), 82,5 (C-1), 169,6, 170,0,170,7 (CH3CO).

3,4-di-0-acetil-2-azido-6-0-(terc-butildimetilsilil)-2-deóxi-1-tio-a-D-manopiranosídeo de etila (23). A uma solução de 22 (3,71 g, 9,88 mmols)em MeOH (30 ml) NaOMe (1 M) foi adicionado. A mistura foi neutralizadacom AcOH após a 1 h e concentrada. O resíduo seco foi dissolvido em piri-dina (15 ml) e cloreto de terc-butildimetilsilila (1,94 g, 12,87 mmols) foi adi-cionado. A mistura de reação foi agitada em TA durante a noite. Acetilaçãocom anidrido acético, diluição com tolueno, filtração (sílica), concentração epurificação através de cromatografia (1:0 -» 1:1 tolueno-EtOAc) deram 23(4,357 g, 9,73 mmols, 99 %); [a]D +109° (c 1,0, CHCI3); 13C RMN δ -5,33, -5,28 (CH3Si)1 14,7 (SCH2CH3), 18,4 ((CH3)3CSi), 20,7, 20,9 (CH3CO), 25,0(SCH2CH3), 25,9 ((CH3)3CSi), 62,6, 62,9, 67,0, 71,7, 71,9 (C-2-6), 81,5 (C-1),169,7, 170,1 (CH3CO); 1H RMN δ 0,05 (s, 3H), 0,05 (s, 3H), 0,90 (s, 9H),1,30 (t, 3H), 2,05 (s, 3H), 2,10 (s, 3H), 2,55-2,75 (m, 2H), 3,60-3,75 (m, 2H),4,10 (m, 1H), 4,15-4,20 (m, 1H), 5,20-5,25 (m, 1H), 5,30-5,35 (m, 1H); HRMScalc. para C18H33N3NaO6SSi [M+Na]+ 470,1757, encontrada 470,1750.

<formula>formula see original document page 67</formula>3,4-di-0-acetil-2-azido-6-0-(terc-butildimetilsilil)-2-deóxi-a-D-manopiranosídeo (26). NIS (394 mg, 1,75 mmol) e AgOTf (cat) foram adicio-nados a uma solução de 23 (653 mg, 1,46 mmol) em CH2CI2 molhado (10ml). A mistura de reação foi agitada a -20Q C por 30 min. CH2CI2 foi adicio-nado e a mistura foi lavada com Na2S2Oa (10 %), filtrada (sílica) e concen-trada. O resíduo foi purificado através de cromatografia (1:0 1:1 tolueno-EtOAc) para dar 26 (487 mg, 1,21 mmol, 82 %); 13C RMN δ -5,29, -5,22(CH3Si), 18,6 ((CHs)3CSi), 20,7, 20,9 (CH3CO), 26,0 ((CH3)3CSi), 62,1, 63,2,66,9 71,0, 71,6 (C-2-6), 92,7 (C-1), 169,8, 170,3 (CH3CO); 1H RMN δ 0,05 (s,3H), 0,06 (s, 3H), 0,89 (s, 9H), 2,03 (s, 3H), 2,08 (s, 3H), 3,65-3,70 (m, 2H),4,00-4,02 (m, 2H), 5,19-5,23 (m, 2H), 5,42-5,47 (m, 1H).

Hidrogênio-fosfonato de 3,4-di-0-acetil-2-azido-6-0-(terc-butildimetilsilil)-2-deóxi-a-D-manopirano, sal de trietilamônio (27). Uma mis-tura de imidazol (915 mg, 13,45 mmols), PCI3 (335 μΙ_, 3,84 mmols) e Et3N(2,0 ml, 14,35 mmols) em MeCN (25 ml) foi agitada a 0- C por 30 min. Umasolução do composto 26 (388 mg, 0,96 mmol) em MeCN (25 ml) foi adicio-nada durante 30 min a O9 C. A mistura de reação foi depois agitada em TApor 10 min, extinta com TEAB (0,5 M) e concentrada. O resíduo foi diluído(CHCI3), lavado com TEAB (0,5M), filtrado (algodão) e concentrado. Croma-tografia (1:0 10:1 CHCI3-MeOH+1,0 % Et3N) do resíduo deram 27 (499mg, 0,93 mmol, 97 %); [oc]D +67° (c 1,0, CHCI3); 13C RMN δ -5,43, (CH3Si),8,98, 18,3 ((CH3)3CSi), 20,6, 20,8 (CH3CO), 25,8 ((CHs)3CSi), 45,7, 62,4,62,5, 66,5, 71,1, 72,1 (C-2-6), 93,1 (C-1), 169,4, 170,0 (CH3CO); 1H RMN δ-0,06 (s, 3H), -0,05 (s, 3H), 0,79 (s, 9H), 1,94 (s, 3H), 1,99 (s, 3H), 3,59-3,63(m, 2H), 3,93-4,00 (m, 2H), 5,21-5,28 (m, 1H), 5,37-5,41 (m, 1H), 5,51-5,50(m, 1H); 31P RMN δ 0,28; HRMS calc. para Ci6H29N3O9PSi [M]" 466,1411,encontrada 466,1400.

Exemplo 7b

3,4-di-0-acetil-2-azido-6-0-(terc-butildimetilsilil)-2-deóxi-a-D-manopiranosídeo de 2-(benziloxicarbonil)aminoetila (24). Composto 23 (527g, 1,18 mmol) foi dissolvido em CH2CI2 (10 ml) contendo MS (4Á). N-(2-hidroxietil)carbamato de benzila (300 mg, 1,54 mmol) foi adicionado e a mis-tura foi agitada sob argônio a -20- C por 30 min antes de NIS (345 mg, 1,53mmol) e AgOTf (cat) foi adicionado. Após 30 min a mistura de reação foineutralizada com Et3N, diluída com CH2CI2, lavada com Na2S2O3 (10 %),filtrada (sílica) e concentrada. Cromatografia (1:0 1:1 tolueno-EtOAc) de-ram 24 (595 mg, 1,02 mmol, 86 %); [a]D +46° (c 1,0, CHCI3); 13C RMN δ-5,38, -5,34 (CH3Si), 18,4 ((CH3)3CSi), 20,6, 20,8 (CH3CO), 25,9 ((CH3)3CSi),40,7 (HOCH2CH2NH), 61,6, 62,6, 66,6, 66,9, 67,6, 71,3, 71,8 (C-2-6, Ph-CH2O, OCH2CH2N), 98,0 (C-1), 128,2, 128,3, 128,6, 136,5 (C aromático),156,4 (NHCOOCH2), 169,6, 170,1 (CH3CO); 1H RMN δ 0,03 (s, 3H), 0,04 (s,3H), 0,89 (s, 9H), 2,03 (s, 3H), 2,09 (s, 3H), 2,35 (s, 1H) 3,32 -3,40 (m, 1H),3,44-3,52 (m, 1H), 3,58-3,66 (m, 3H), 3,72-3,80 (m, 2H), 3,98-4,00 (m, 1H),5,11 (s, 2H), 5,18-5,23 (m, 1H), 5,32-5,36 (m, 1H), 7,16-7,36 (m, 5H).

3,4-di-Oacetil-2-azido-2-deóxi-a-D-manopiranosídeo de 2-(benziloxicarbonil)aminoetila (25). A uma solução do composto 24 (575 mg,0,99 mmol) em THF (5 ml), TREAT-HF (0,81 ml, 4,97 mmols) foi adicionado.A mistura foi agitada sob argônio em TA durante a noite. Concentração ecromatografia (2:1 0:1 tolueno-EtOAc) deram 25 (448 mg, 0,96 mmol, 97%); [a]D +60° (c 1,0, CHCI3); 13C RMN δ 20,7, 20,8 (CH3CO), 40,7 (HO-CH2CH2NH), 61,4, 61,6, 66,4, 67,0, 67,5, 70,9, 71,0 (C-2-6, PhCH2O, O-CH2CH2N), 98,2 (C-1), 128,3, 128,3, 128,7, 136,5 (C aromático), 156,5 (NH-COOBn), 170,1, 170,5 (CH3CO); 1H RMN δ 2,04 (s, 3H), 2,1 (s, 3H), 3,32-3,46 (m, 2H), 3,54-3,60 (m, 2H), 3,62-3,78 (m, 3H), 4,02-4,04 (m, 1H), 5,06-5,18 (m, 3H), 5,22-5,28 (m. 1H), 5,36-5,40 (m, 1H), 7,28-7,38 (m, 5H); HRMScalc. para C20H26N4NaO9 [M+Na]+ 489,1597, encontrada 489,1574.

Exemplo 7c

Sal de trietilamônio de 3,4-di-0-acetil-2-azido-2-deóxi-a-D-manopiranosídeo) de (3,4-di-0-acetil-2-azido-6-0-(terc-butildimetilsilil)-2-deóxi-a-D-manopiranosil fosfato)-(1 ->6)(2-(Benziloxicarbonil)aminoetila (28).Uma mistura de 25 (325 mg, 0,60 mmol) e 27 (217 mg, 0,47 mmol) foi dis-solvida em piridina (3 ml). Cloreto de pivaloíla (144 μΙ_, 1,18 mmol) foi adi-cionado e a mistura foi agitada sob argônio em TA por 1 h. A mistura de rea-ção foi esfriada até -40e C e uma solução de I2 (143 mg, 0,56 mmol) em piri-Clina-H2O (3 ml 49:1) foi adicionada. A oxidação foi completada a O9 C e amistura foi diluída com CHCI3, lavada com Na2S2O3 (10 %) e TEAB frio (0,5M). Filtração (algodão), concentração e cromatografia (1:0 10:1 CHCI3-MeOH+O.5 % Et3N) deram 28 (469 mg, 0,45 mmol, 96 %); [oc]D +52° (c 1,0,CHCI3); 13C RMN δ -5,48, -5,38 (CH3Si), 9,27, 18,4 ((CH3)3CSi), 20,6, 20,7,20,8, 20,8 (CH3CO), 25,9 ((CH3)3CSi), 40,7 (HOCH2CH2NH), 45,8, 61,7,62,2, 64,5, 66,3, 66,6, 66,7, 67,3, 69,8, 69,9, 71,2, 71,3, 71,8 (C-2-6, 2'-6',PhCH2O, OCH2CH2N) 94,1, 97,9 (C-1, -1'), 128,1, 128,2, 128,6, 136,8 (Caromático), 156,7 (NHCOOBn), 169,3, 169,7, 170,0, 170,1 (CH3CO); 1HRMN δ 0,00 (s, 3H), 0,02 (s, 3H), 0,88 (s, 9H), 1,98 (s, 3H), 2,00 (s, 3H), 2,06(s, 3H), 2,08 (s, 3H), 3,30-3,38 (m, 1H), 3,42-3,52 (m, 1H), 3,56-3,64 (m, 1H),3,66-3,68 (m, 2H), 3,74-3,80 (m, 1H), 3,90-4,04 (m, 5H), 4,12-4,14 (m, 1H),5,1 (s, 2H), 2,16-2,22 (m, 1H), 5,29 (m, 1H), 5,32-5,47 (m, 3H), 5,51-5,54 (m,1H), 5,63-5,68 (m, 1H), 7,28-7,38 (m, 5H); 31P RMN δ -3,61.

Exemplo 7d

Sal de 3,4-di-0-acetil-2-azido-2-deóxi-a-D-manopiranosídeo)trietilamônio de (3,4-di-0-acetil-2-azido-2-deóxi-a-D-manopiranosil fosfato)-(1 6)-(2-(benziloxicarbonil)aminoetila (29). Composto 28 (472 mg, 0,46mmol) foi dissolvido em THF (10 ml) e TREAT-HF (372 μΙ_, 2,28 mmols) foiadicionado. A mistura foi agitada em TA por 24 h seguido por concentraçãoe purificação em sílica-gel (1:0 5:1 CHCI3-MeOH+0,5 % Et3N) para dar 29(390 mg, 0,42 mmol, 91 %); [cc]D +34° (c 1,0, CHCI3); 13C RMN δ 10,6, 20,6,20,8, 20,8, (CH3CO), 40,7 (HOCH2CH2NH), 46,1, 61,5, 61,7, 62,2, 62,3,64,6, 66,6, 66,6, 66,8, 67,4, 69,9, 70,0, 70,9, 71,2, 71,9, (C-2-6, 2'-6 \ Ph-CH2O, OCH2CH2N), 94,0, 98,0 (C-1, -1'), 128,1, 128,2, 128,6, 136,6 (C aro-mático), 156,6 (NHCOOBn), 169,9, 170,3 (CH3CO); 31P RMN (5-3,51; HRMScalc. para C30H39N7O18P [M]" 816,2089, encontrada 816,2078.

Os esquemas a seguir aplicam-se aos Exemplos 8-12.<formula>formula see original document page 71</formula>

Exemplo 7

Sal de bis-trietilamônio de (3,4-di-0-acetil-2-azido-6-0-(terc-butildimetilsilil)-2-deóxi-a-D-manopiranosil fosfato)-(1 6)-(3,4-di-0-acetil-2-azido-2-deóxi-a-D-manopiranosil fosfato)-(1 6)-(2-(Benziloxicarbonil)-aminoetila 3,4-di-0-acetil-2-azido-2-deóxi-a-D-manopiranosídeo) (30). A umamistura de 27 (273 mg, 0,51 mmol) e 29 (357 mg, 0,39 mmol) em piridina (3ml) foi adicionado cloreto de pivaloíla (119 μΙ_, 0,97 mmol). Após 2 h a mistu-ra foi esfriada até -40°C e uma solução de I2 (119 mg, 0,47 mmol) em piridi-na-H20 (3 ml 49:1) foi adicionada. A mistura foi diluída com CHCb quando atemperatura alcançou -10Q C. Extração com Na2S2O3 (10 %), TEAB frio (0,5M), filtração (algodão) e cromatografia (1:0 —> 5:1 CHCI3-MeOH-I-0,5 % Et3N)deram 30 (351 mg, 0,24 mmol, 62 %); [a]D +68° (c 1,0, CHCI3); 13C RMN α-5,53, -5,42 (CH3Si), 10,1, 18,3 ((CH3)3CSi), 20,5, 20,6, 20,6, 20,8 (CH3CO),25,9 ((CHs)3CSi), 40,6 (HOCH2CH2NH), 45,9, 61,7, 62,1, 62,3, 64,2, 66,2,66,4, 66,5, 67,1, 69,7, 70,4, 71,0, 71,2, 71,4, 71,6, 77,4 (C-2-6, 2'-6\ 2"-6",PhCH2O, OCH2CH2N), 93,8, 94,0, 97,8 (C-1, -1\ -1"), 128,0, 128,2, 128,5,136,9 (C aromático), 156,8 (NHCOOBn), 169,3, 169,6, 169,7, 169,8, 169,9,170,0 (CH3CO); 1H RMN δ -0,05 (s, 3H), -0,03 (s, 3H), 0,80 (s, 9H), 1,90-2,00(m, 18H), 3,23-3,31 (m, 1H), 3,36-3,45 (m, 1H), 3,50-3,64 (m, 4H), 3,69-3,76(m, 1H), 3,79-3,97 (m, 7H), 4,02-4,15 (m, 3H), 5,00-5,06 (m, 2H), 5,12-5,21(m, 2H), 5,24-5,31 (m, 1H), 5,33-5,37 (m, 2H), 5,38-5,45 (m, 3H), 6,04-6,10(m, 1H), 7,18-7,30 (m, 5H); 31P RMN α -3,89, -3,56; HRMS calc. paraC46H66Ni0NaO27P2Si [M+Na]+ 1303,3241, encontrada 1303,3197.

Exemplo 8

Sal de bis-trietilamônio (2-acetamido-3,4-di-0-acetil-6-0-(terc-butildimetilsilil)-2-deóxi-a-D-manopiranosil fosfato)-(1 6)-(2-acetamido-3,4-di-O-acetil-2-deóxi-a-D-manopiranosil fosfato)-(1 ^ 6)-(2-(benziloxicarbonil)-aminoetil 2-acetamido-3,4-di-0-acetil-2-deóxi-a-D-manopiranosídeo) (31).Composto 30 (83 mg, 0,056 mmol) foi dissolvido em MeOH (3 ml) e Ni-CI2(H2O)6 foi adicionado (cat). Redução foi executada adicionando NaBH4em quantidades pequenas em um período de 1 h a O2 C. A mistura foi depoissubmetida a anidrido acético seguido por diluição (MeOH) e concentração. Oresíduo foi purificado em sílica-gel (1:0 5:1 CHCI3-MeOH+0,5 % Et3N) eem gel de LH-20 (MeOH+1,5 % Et3N), para dar o composto 31 (76 mg, 0,050mmol, 89 %); [a]D +63° (c 1,0, CHCI3); 13C RMN δ -5,44, -5,38 (CH3Si), 8,46,18,4 ((CH3)3CSi), 20,9, 21,0, 21,0, 21,1, 23,0, 23,0, 23,0, 23,3, 23,9 (CH3CO,CH3CONH), 26,0 ((CH3)3CSi), 40,8 (HOCH2CH2NH), 46,1, 50,1, 50,4, 50,7(C-2, -2', -2"), 59,1, 61,6, 64,5, 65,0, 65,7, 65,9, 66,7, 67,1, 70,0, 70,2, 70,3,71,3, 77,4 (C-3-6, 3'-6'f 3 "-6", PhCH2O, OCH2CH2N), 94,9, 95,1, 99,1 (C-1, -1', -1"), 128,0, 128,1, 128,6, 136,8 (C aromático), 156,6 (NHCOOBn), 169,5,169,6, 170,0, 170,5, 170,6, 170,8, 171,3 (CH3CO, CH3CONH); 31P RMN δ -3,75, -3,39; HRMS calc. para C52H79N4O30P2Si [M+H]" 1329,4024, encontra-da 1329,3984.

Exemplo 9

Sal de bis-trietilamônio 2-aminoetil-(2-acetamido-3,4-di-0-acetil-6-0-(terc-butildimetilsilil)-2-dióxi-a-D-nanopiranosil-fosfato)-(1 6)-(2-aceta-mido-3,4-di-0-acetil-2-deóxi-a-D-manopiranosil fosfato-(1 6)-(2-acetami-do-3,4-di-0-acetil-2-deóxi-a-D-manopiranosídeo) (32). A uma solução docomposto 31 (37 mg, 0,024 mmol) em MeOH (1,5 ml) foram adicionados re-sina Amberlite IR -45(OH") (40 mg) e paládio em carbono ativado. A misturafoi hidrogenolisada a 70,3 kg/cm2 (100 psi) durante a noite, diluída (MeOH),centrifugada e concentrada. Purificação em gel de fase reversa (1:0 -> 0:1H2O-MeOH) deu 32 (28 mg, 0,020 mmol, 83 %); [cc]D +60° (c 1,0, MeOH);13C RMN (D2O) δ -5,9, -5,4 (CH3Si), 8,89, 18,7 ((CH3)3CSi), 20,9, 21,0, 22,4,22,5 (CH3CO, CH3CONH), 26,0 ((CH3)3CSi), 39,7 (HOCH2CH2NH), 47,3,50,6, 51,4 (C-2, -2', -2"), 62,4, 64,4, 64,7, 64,9, 65,9, 66,2, 66,6, 70,1, 70,8,71,0, 71,2, 71,5 (C-3-6, 3'-6', 3"-6", OCH2CH2N), 95,4, 95,5, 99,1 (C-1, -1', -1"), 173,1, 173,3, 173,5, 173,6, 173,8, 174,9, 175,1, 175,2 (CH3CO,CH3CONH); 31P RMN (D2O) 6 -3,04, -2,87; HRMS calc. paraC44H72N4O28P2Si [M+H]+ 1195,3656, encontrada 1195,3567.

Exemplo 10

Sal de bis-trietilamônio 2-aminoetil (2-acetamido-3,4-di-0-acetil-2-deóxi-a-D-manopiranosil fosfato)-(1 6)-(2-acetamido-3,4-di-0-acetil-2-deóxi-a-D-manopiranosil fosfato-(1 6)-(2-acetamido-3,4-di-0-acetil-2-deóxi-a-D-manopiranosídeo) (33). Uma solução de TREAT-HF (17 μΙ_, 0,10mmol) em THF (1,5 ml) foi tratada com Et3N (17 μι., 0,12 mmol). Esta solu-ção foi adicionada ao composto 32 (28 mg, 0,020 mmol). Após 30 minutosde agitação em TA a mistura foi concentrada e purificada em gel de fase re-versa (1:0 0:1 H2O-MeOH) que deu 33 (22 mg, 0,017 mmol, 85 %); [a]D+45° (c 1,0, MeOH); 13C RMN (D2O) δ 8,87, 20,9, 20,9, 22,3, 22,4 (CH3CO,CH3CONH), 39,6 (HOCH2CH2NH), 47,3, 50,6, 51,3, 51,4 (C-2, -2', -2"), 60,2,64,3, 64,5, 64,9, 66,2, 66,4, 69,9, 70,0, 70,5, 70,5, 70,7, 70,8, 71,0, 71,6 (C-3-6, 3r-6', 3"-6", OCH2CH2N), 95,3, 95,3, 99,5 (C-I5-Y3 -1"), 173,3, 173,3,173,6, 173,7, 173,8, 175,0, 175,1, 175,3 (CH3CO, CH3CONH); 1H RMN δ(D2O) 2,03 (s, 3H), 2,08 (s,3H), 2,09 (s, 3H), 2,14 (s, 3H), 2,14 (s, 3H), 2,18(s, 3H), 2,24 (s-3H), 2,24 (s, 3H), 2,24 (s, 3H), 3,28-3,36 (m, 2H), 3,68-3,84(m, 3H), 4,00-4,18 (m, 5H), 4,27-4,33 (m, 1H), 4,57-4,64 (m, 2H), 5,22-5,30(m, 1H), 5,31-5,37 (m, 2H), 5,44-5,49 (m, 1H); 31P RMN (D2O) δ -3,02, -2,95;HRMS calc. para C38H58N4NaO28P2 [M+Na]" 1103,261, encontrada1103,2642.

Exemplo 11

Sal de bis-trietilamônio de 2-aminoetil (2-acetamido-2-deóxi-a-D-manopiranosil fosfato)-(1 6)-(2-acetamido-2-deóxi-a-D-manopiranosil fos-fato-O 6)-(2-acetamido-2-deóxi-a-D-manopiranosídeo) (34). Composto 33(22 mg, 0,017 mmol) foi dissolvido em MeOH (1 ml) e NaOMe (IM) foi adi-cionado. A mistura foi concentrada 30 min e o resíduo foi purificado em gelde fase reversa (H2O MeOH). As frações contendo o produto foram seca-das por esfriamento para dar 34 (14 mg, 0,016 mmol, 94 %); [a]D +12,4° (c0,5, MeOH); 13C RMN (D2O) δ 22,6 (CH3CONH), 40,1 (HOCH2CH2NH), 53,1,53,8, 53,9 (C-2, -2', -2"), 60,8, 65,3, 66,6, 67,0, 69,1, 69,3, 69,5, 72,2, 73,0,74,1 (C-3-6, 3'-6', 3 "-6", OCH2CH2N), 95,8, 95,8, 99,6 (C-1, -1', -1"), 175,5,175, 5, 175,6 (CH3CONH); 31P RMN (D2O) α -2,36, -2,22; HRMS calc. paraC26H47N4O22P2 [M+H]- 829,2157, encontrada 829,2064.

Exemplo 13a

<formula>formula see original document page 74</formula>

3,4-di-0-acetil-2-azido-2-deóxi-1 -tio-a-D-manopiranosídeo deetila (35). Ao composto 23 (305 mg, 0,68 mmol) dissolvido em THF (6 ml),TREAT-HF (0,55 ml, 3,38 mmol) foi adicionado. A mistura foi agitada em TAdurante a noite. Concentração e cromatografia (10:1 —► 0:1 tolueno-EtOAc)deram 35 (171 mg, 0,51 mmol, 75 %); 13C RMN δ 14,7 (SCH2CH3), 20,6,20,8 (CH3CO), 25,4 (SCH2CH3), 61,3, 63,0, 66,6, 71,1, 71,3 (C-2-6), 82,2 {Ο-Ι), 170,0, 170,6 (CH3CO); 1H RMN 6 51,26-1,30 (t, 3H), 2,05 (s, 3H), 2,08 (s,3H), 2,32 (s, 1H), 2,56-2,68 (m, 2H), 3,58-3,67 (m, 2H)5 4,09-4,14 (m, 2H),5,24-5,35 (m, 3H).

Exemplo 13b

3,4-di-0-acetil-2-azido-2-deóxi-6-0-dibenzilfosfato-1-tio-a-D-manopiranosídeo de etila (36). Ao composto 35 (171 mg, 0,51 mmol) dissol-vido em CH2CI2 (10 ml), tetrazol (125 mg, 1,78 mmol) e N-N-diisopropilfosforamidato (264 μΙ_, 0,76 mmol) foram adicionados. A misturade reação foi agitada por 30 min em TA. mCPBA (176 mg, 1,02 mmol) foiadicionado a Oe C e agitação foi continuada por 30 min. A mistura foi diluída(CH2CI2), lavada com Na2S2O3 (10 %) e NaHCO3. Filtração (Na2SO4), con-centração e cromatografia (10:1 ->2:1 tolueno-EtOAc) deram 36 (200 mg,0,34 mmol, 67 %); [a]D +92° (c 1,0, CHCI3); 13C RMN δ 14,6 (SCH2CH3),20,5, 20,6 (CH3CO), 25,3 (SCH2CH3), 62,9, 65,7, 66,1, 69,4, 69,4, 69,5, 71,4,(C-2-6, PhCH2O), 82,0 (C-1), 127,9, 128,0, 128,5, 128,5, 128,6, 128,6,128,7, 135,8, 135,9 (C aromático), 169,5, 169,9 (CH3CO); 31P RMN δ -1,36;HRMS calc. para C26H32N3NaO9PS [M+Na]+ 616,1495, encontrada616,1487.

Exemplo 13c

3,4-di-0-acetil-2-azido-2-deóxi-6-0-dibenzilfosfato-a-D-manopiranosídeo (37). Composto 36 (281 mg, 0,47 mmol) foi dissolvido emCH2CI2 molhado (10 ml) e esfriado até -20s C. NIS (137 mg, 0,61 mmol) eAgOTf (cat) foram adicionados e a mistura foi agitada por 30 min a -20- C. Amistura foi diluída (CH2CI2), lavada com Na2S2O3 (10 %), filtrada (Na2SO4) econcentrada. Cromatografia (2:1 -> 0:1 tolueno-EtOAc) deu 17 (201 mg, 0,37mmol, 79 %); 13C RMN δ 20,7, 20,7, 62,5, 66,2, 66,3, 66,4, 68,6, 68,7, 69,6,69,7, 69,8, 69,8, 71,0 (C-2-6, PhCH2O), 92,5 (C-1), 128,0, 128,1, 128,3,128,6, 128,7, 128,7, 135,6, 135,7 (C aromático), 169,8, 170,1 (CH3CO); 31PRMN δ-1,87.Exemplo 13d

3,4-di-0-acetil-2-azido-2-deóxi-6-0-dibenzilfosfato-a-D-manopiranosil-hidrogênio-fosfonato, sal de trietilamônio (38). Uma mistura deimidazol (349 mg, 5,13 mmols), PCI3 (128 μΙ_, 1,47 mmol) e Et3N (765 μΙ_,5,49 mmols) em MeCN (10 ml) foi agitada a Og C por 30 min. Uma soluçãodo composto 37 (201 mg, 0,37 mmol) em MeCN (10 ml) foi adicionada du-rante 30 min a O9 C. A mistura de reação foi depois agitada em TA por 10min, extinta com TEAB (0,5 M) e concentrada. O resíduo foi diluído (CHCI3),lavado com TEAB (0,5 M), filtrado (algodão) e concentrado. Cromatografia(1:0 -> 10:1 CHCI3-MeOH+1,0 % Et3N) do resíduo deu 38 (243 mg, 0,34mmol, 92 %); [a]D +55° (c 1,0, CHCI3); 13C RMN α 9,34, 20,6, 20,7 (CH3CO),45,9, 62,4, 62,5, 65,6, 65,7, 69,4, 69,5, 69,9, 70,0, 70,9 (C-2-6, PhCH2O),93,0 (C-1), 128,0, 128,0, 128,1, 128,5, 128,5, 128,6, 135,8 (C aromático),169,5, 169,9 (CH3CO); 31P RMN δ -1,32, 0,29; HRMS calc. paraC24H28N3Oi2P2 [M]" 612,1148, encontrada 612,1129.

O esquema a seguir aplica-se aos Exemplos 13e e 14-17.<formula>formula see original document page 77</formula>

Exemplo 13e

Sal de bis-trietilamônio de (3,4-di-0-acetil-2-azido-2-deóxi-6-0-dibenzil-fosfato)-a-D-nanopiranosil fosfato)-(1 -> 6)-(3,4-di-0-acetil-2-azido-2-deóxi-a-D-manopiranosil fosfato)-(1 6)-(3,4-di-0-acetil-2-azido-2-deóxi-α-D-manopiranosídeo) de 2-(benziloxicarbonil)aminoetila (39). Uma misturade 38 (96 mg, 0,13 mmol) e 29 (103 mg, 0,11 mmol) foi dissolvida em piridi-na (3 ml). Cloreto de pivaloíla (34 μΙ_, 0,28 mmol) foi adicionado e a misturafoi agitada sob argônio em TA por 2 h. A mistura foi esfriada até -40s C euma solução de I2 (34 mg, 0,13 mmol) em Piridina-H2O (3 ml 49:1) foi adicio-nada. A oxidação foi concluída a -105 Cea mistura foi diluída com CHCI3,lavada com Na2S2O3 (10 %) e TEAB frio (0,5 M). Filtração (algodão), con-centração e cromatografia (1:0 5:1 CHCI3-MeOH+0,5 % Et3N) deram 39(106 mg, 0,065 mmol, 59 %); [oc]D +80° (c 1,0, CHCI3); 13C RMN δ 10,2, 20,6,20,7, 20,8 (CH3CO), 40,6 (HOCH2CH2NH), 45,9, 57,9, 61,7, 62,3, 64,4, 65,5,65,7, 66,1, 66,5, 66,6, 67,2, 69,4, 69,5, 70,3, 71,0, 71,4 (C-2-6, 2·-6', 2"-6",PhCH2O, OCH2CH2N), 93,9, 94,0, 97,8 (C-1, -1',-1"), 128,0, 128,1, 128,2,128,5, 128,6, 136,0, 136,9 (C aromático), 156,8 (NHCOOBn), 169,6, 169,7,169,8, 169,9 (CH3CO); 31P RMN δ-4,13, -3,58, -1,52.

Exemplo 12

Sal de bis-trietilamônio de (2-acetamido-3,4-di-0-acetil-2-azido-2-deóxi-6-0-dibenzilfosfato-a-D-manopiranosil fosfato)-(1 6)-(2-acetamido-3,4-di-O-acetil-2-azido-2-deóxi-a-D-manopiranosil fosfato)-( 16)-(2-acetamido-3,4-di-0-acetil-2-azido-2-deóxi-a-D-manopiranosídeo) de 2-(benziloxicarbonil)aminoetila (40). Composto 39 (76 mg, 0,047 mmol) foi dis-solvido em MeOH (3 ml) e NiCI2(H2O)6 foi adicionado (cat). Redução foi exe-cutada adicionando NaBH4 em quantidades pequenas em um período de 30min a Og C. A mistura foi depois submetida a anidrido acético seguido pordiluição (MeOH) e concentração. O resíduo foi purificado em sílica-gel (1:0-> 5:1 CHCI3-MeOH+0,5 % Et3N) e em gel de LH-20 (MeOH+1,5 % Et3N),para dar o composto 40 (50 mg, 0,030 mmol, 64 %); 13C RMN (D2O) α 8,89,20,7, 20,8, 22,4 (CH3CO, CH3CONH), 40,7 (HOCH2CH2NH), 47,3, 50,7, 51,4(C-2, -2', -2"), 64,5, 65,9, 66,1, 66,5, 66,6, 67,2, 67,3, 69,7, 69,8, 70,5, 70,8,70,9, 71,1 (C-3-6, 3'-6', 3"-6", PhCH2O, OCH2CH2N), 95,2, 95,3, 98,8 (C-1, -1', -1"), 128,2, 128,9, 129,0, 129,3, 129,5, 129,7, 135,7, 135,8, 137,1 (C a-romático), 158,7 (NHCOOBn), 172,8, 172,9, 173,2, 173,3, 173,4, 173,4,174,8, 174,9, 175,0 (CH3CO, CH3CONH); 31P RMN (D2O) α -3,05, -2,75, - 1,20.Exemplo 13

Sal de tris-trietilamônio de (2-acetamido-3,4-di-0-acetil-2-azido-2-deóxi-6-0-fosfato-a-D-manopiranosil fosfato)-(1 -> 6)-(2-acetamido-3,4-di-0-acetil-2-azido-2-deóxi-a-D-manopiranosil fosfato)-(1 6)-(2-acetamido-3,4-di-0-acetil-2-azido-2-deóxi-a-D-manopiranosídeo) de 2-(benziloxicarbonil)aminoetila (41). A uma solução do composto 40 (46 mg,0,027 mmol) em MeOH (2 ml) foi adicionado resina amberlite IR -45(OH") (46mg) e paládio em carbono ativado. A mistura foi hidrogenolisada a 70,3kg/cm2 (100 psi) durante a noite, diluída (MeOH), centrifugada e concentra-da. Purificação em gel de fase reversa (l:0 —► 0:1 H2O-MeOH) deu 41 (34mg, 0,023 mmol, 85 %); [a]D +43° (c 1,0, MeOH); 13C RMN (D2O) δ 8,89,20,9, 20,9, 22,4, 22,4 (CH3CO, CH3CONH), 39,6, (HOCH2CH2NH), 47,3,50,6, 51,3, 51,4 (C-2, -2', -2"), 63,6, 64,4, 64,8, 66,1, 66,2, 66,4, 69,9, 70,0,70,6, 70,7, 71,0 (C-3-6, 3'-6\ 3"-6", OCH2CH2N), 95,3, 95,4, 99,1 (C-1, -1', -1"), 173,2, 173,3, 173,4, 173,6, 173,7, 173,7, 175,0, 175,1, 175,2 (CH3CO,CH3CONH); 31P RMN (D2O) δ -3,08, -2,95, 0,05; HRMS calc. paraC38H59N4OsiP3 [M/2+H]" 580,1188, encontrada 580,1142.

Exemplo 14

Sal de bis-sódio de (2-acetamido-2-azido-2-deóxi-6-0-dibenzilfosfato-oc-D-manopiranosil fosfato)-(1 -> 6)-(2-acetamido-2-azido-2-deóxi-a-D-manopiranosil fosfato)-(1 -> 6)-(2-acetamido-2-azido-2-deóxi-oc-D-manopiranosídeo) de 2-(benziloxicarbonil)aminoetila (42). Composto 40 (50mg, 0,030 mmol) foi dissolvido em MeOH (3 ml) e NaOMe (IM) foi adiciona-do. A mistura de reação foi agitada por 1 h em TA. Concentração e purifica-ção em gel de fase reversa (1:0 0:1 H2O-MeOH) deram 42 (30 mg, 0,024mmol, 80 %); 13C RMN (D2O) α 22,6 (CH3CONH), 40,7 (HOCH2CH2NH),53,1, 53,8, 54,0 (C-2, -2', -2"), 65,1, 66,4, 66,5, 66,8, 67,5, 68,9, 69,1, 69,6,71,0, 71,1, 71,9, 72,0, 72,3 73,1 (C-3-6, 3'-6', 3"-6", PhCH2O, OCH2CH2N),95,6, 95,8, 99,4 (C-1 ,-1',-Γ), 128,1, 128,4, 129,0, 129,0, 129,4, 129,5, 129,8,135,7, 135,8, 137,1 (C aromático), 158,8 (NHCOOBn), 175,3 (CH3CONH);31P RMN (D2O) α -2,35, -2,23, -0,96.Exemplo 15

Sal de trissódio de (2-acetamido-2-azido-2-deóxi-6-0-fosfato-a-D-manopiranosil fosfato)-(1 -> 6)-(2-acetamido-2-azido-2-deóxi-a-D-manopiranosil fosfato)-(1 6)-(2-acetamido-2-azido-2-deóxi-a-D-manopiranosídeo) de 2-aminoetila (43). Composto 42 (30 mg, 0,024 mmol)foi dissolvido em MeOH (2 ml). Resina Amberlite IR-45(OH") (30 mg) e palá-dio em carbono ativado foram adicionados. A mistura foi hidrogenolisada a70,3 kg/cm2 (100 psi) durante a noite, diluída (MeOH), centrifugada e con-centrada. Purificação em gel de fase reversa (1:0 -» 0:1 H2O-MeOH) deu 43(15 mg, 0,015 mmol, 64 %); [a]D +13,6° (c 0,5, MeOH); 13C RMN (D2O) δ22,6, 22,6, 22,6 (CH3CONH), 39,7 (HOCH2CH2NH), 49,5, 53,0, 53,7, 53,8(C-2, -2', -2"), 63,8, 64,2, 65,1, 65,2, 65,4, 66,5, 66,7, 67,0, 68,9, 69,2, 69,5,72,2, 72,3, 72,9, 73,1, 73,2, 73,4, 73,4 (C-3-6, 3'-6', 3"-6", OCH2CH2N), 95,9,99,6 (C-1, -1', -1"), 175,4, 175,5, 175,5 (CH3CONH); 31P RMN (D2O) δ -2,35,-2,30, 2,2; HRMS calc. para C26H46N4Na2O25P3 [M+2Na]" 953,1459, encon-trada 953,1440.

Exemplo 16

Para estudar a influência de C-fosfonato no lugar de fosfodiésterna imunogenicidade e estabilidade do sacarídeo de MenA, um oligossacarí-deo sintético análogo aos trímeros da unidade de repetição do polissacarí-deo do grupo A de Neisseria Meningitidis foi sintetizado e conjugado com aproteína veículo CRM197. O glicoconjugado foi analisado para verificar ascaracterísticas fisicoquímicas e imunogenicidade em camundongos. A estru-tura do conjugado está abaixo.

<formula>formula see original document page 80</formula>

Este composto foi obtido substituindo os grupos fosfodiéster queligam os monossacarídeos, com um grupo C-fosfonato na molécula de basenão-acetilada e não-fosforilada.

A) CARACTERIZAÇÃO FISICOQUÍMICA DOS GLICOCONJUGADOS DECRM-MenAsvnth

O conjugado foi caracterizado pelo teor de sacarídeo, proteínas,sacarídeo não-ligado (livre). Além disso SDS_Page e Western blot contraanticorpos de anti-MenA específicos foram executados.

CONCENTRAÇÕES DE SACARÍDEO E DE PROTEÍNA

O produto secado por congelação como reconstituído com solu-ção salina (concentração final = 0,8 mg/ml) e ensaiado por teste colorimétri-co para teor de fósforo e proteína total (ensaio de MicroBCA). O teor de fós-foro foi depois convertido no teor de sacarídeo total usando o fator de con-versão apropriado.

Porque algum precipitado foi gerado durante o armazenamentodo conjugado, um tampão de fosfato de concentrado (fosfato de Na 100 mMpH 7,5) foi adicionado para alcançar 10 mM como concentração final. Depoisa concentração foi recalculada considerando o fator de diluição. Os conjuga-dos tiveram um teor de sacarídeo total de 97,10 pg/ml e teor de proteína de215,63 pg/ml após diluição com tampão de fosfato.

B) IMUNOGENICIDADE EM CAMUNDONGOS

A imunogenicidade do conjugado com o oligossacarídeo sintéti-co foi analisada em ELISA e ensaios bactericidas. Camundongos de BALB/c(8/grupo) foram imunizados com os glicoconjugados purificados formuladoscom e sem fosfato de alume como adjuvante. O protocolo de imunização,mostrado na Tabela 1, incluiu três doses (200 ng cada) nos dias 0, 14 e 28com uma hemorragia final no dia 42. Soros de pós 1, pós 2 e pós 3 dosesforam analisados para determinar IgG total específico e a atividade funcionaldo anticorpo correspondente. MenA-CRM 2011 é o conjugado de MenA dotipo selvagem.Tabela 1: Esquema de grupos de imunização e regime de tratamento

<table>table see original document page 82</column></row><table>

ENSAIO DE ELISA

Os soros foram analisados em ensaio de ELISA para determina-ção específica de respostas de anticorpo de IgG em soros de camundongos.

Titulações de IgG totais contra antígenos de polissacarídeo A, C, W135 e Y(MenA, MenC, MenW, MenY) foram calculados através de curvas de regres-são linear e expressos como unidades/ml de ELISA (EU/ml). Titulações dossoros resultaram da comparação à curva de titulação de um soro padrão.

Placas de microtitulação foram revestidas com uma mistura depolissacarídeo capsular e albumina de soro humano metilada a uma concen-tração final de 5,0 pg/ml cada, em PBS pH 7,4. Placas foram vedadas, incu-badas durante a noite a 2°-8° C, depois lavadas e saturadas com um tampãocontendo 5 % de soro de bezerro fetal, como reagente de bloqueio, em PBSpH 7,4. Após uma incubação de hora em temperatura ambiente, as placasforam lavadas e soros de teste diluídos foram adicionados aos poços na filei-ra 1. Soros foram analisados por uma curva de titulação com uma etapa dediluição de duas vezes. Após incubação durante a noite a 2°-8° C, placasforam lavadas e um anticorpo de anti-camundongo de cabra conjugado comfosfatase alcalina foi diluído 1:2000 em tampão de saturação e adicionado àsplacas. O anticorpo secundário foi incubado durante 2 horas a 37° C e, apóslavar, as placas foram adicionadas com solução de substrato cromogênica (1mg/ml de fosfato de p-nitro fenila em 1 M de tampão de dietanolamina pH9,8, 0,5 mM de MgCI2, 0,02 % NaN3). As reações foram incubadas por 30min em temperatura ambiente e os valores de absorbância são lidos emcomprimento de onda de 405-620 nm.

Soros com valores de absorbância de primeiro ponto superioràquele do padrão foram retestados usando uma diluição inicial mais alta.

Camundongos com resposta de anticorpo negativa (valores deO.D. de primeiro ponto inferior que 0,300 em diluição 1:100) foram atribuídosa uma titulação de 2 EU/ml e classificados como "não-responsivos".

ENSAIO DE ANTICORPO BACTERICIDA DE SORO (SBAb)

Anticorpos funcionais induzidos por imunizações de vacina fo-ram analisados medindo Iise mediada por complemento in vitro de NeisseriaMeningitidis (Goldschneider, et al., 1969). Um lote comercial de complemen-to de coelho filhote foi usado como fonte de complemento (lote de PelfreezeNo. 09958).

O protocolo de ensaio foi com base no inóculo da cepa de testeem meio de cultivo de Mueller Hinton (Difco) com a adição de 0,25 % de gli-cose, a partir das colônias isoladas crescidas em chocolate de ágar. Culturabacteriana foi incubada a 37° C com 5 % de CO2 e o crescimento paradoquando as bactérias alcançaram a fase exponencial prematura (O.D.6oo0,220-0,240). A cultura foi diluída para 10"4 Unidades de Formação de Colô-nias (CFU)AnI em solução equilibrada de Gey de sal com 1 % de BSA e in-cubada durante 1 hora a 37° C com 5 % de CO2, na presença de fundos ge-rais de soros de teste inativado a calor e complemento de coelho filhote. An-tes (TO) e uma hora após (T1) a incubação, as misturas de reação forambanhadas sobre ágar de Mueller Hinton (Difco). As placas foram incubadasdurante a noite a 37s C com 5 % de CO2 e CFU/ml correspondendo a TO eT1 foram contadas.

Titulações de anticorpo bactericida de soro foram expressadascomo diluição de soro recíproca rendendo 50 % da matança das bactérias.

RESULTADOS

CARACTERIZAÇÃO FISICOQUÍMICA

Os resultados das análises fisicoquímicas indicam que o grau deglicosilação do conjugado é muito baixo. O grau baixo de conjugação é indi-cado também pelos sinais modestos obtidos em Western blot e pelas dife-renças pequenas notadas em SDS-PAGE entre os conjugados e a referên-cia de CRM. As condições de conjugação como também a purificação dosconjugados podem ser otimizadas.

RESULTADOS DE ELISA

Os resultados obtidos são relatados na Tabela 2 e Figura 4. Titu-lações de ELISA de cada animal simples foram medidas e expressas emUnidade de ELISA/ml (EU/ml). A resposta de anticorpo específica para cadaglicoconjugado foi calculada como a Titulação de Média Geométrica (GMT)do grupo de imunização correspondente.

Soros de pós dose 2 mostraram baixa titulação no conjugadosintético formulado com o adjuvante e qualquer titulação nos grupos de imu-nização tratados sem o adjuvante.

O conjugado não mostrou nenhuma titulação com e sem alume.

Como esperado, grupos de controle tratados com e sem o adju-vante mostraram respostas altas.

Tabela 2. Titulações de anticorpo de ELISA contra MenA de polissacarídeodeterminadas em soros de pós 1, pós 2 e pós 3 dose de camundonqos. Titu-lação de Média Geométrica calculada para cada grupo de imunização é relatada.

<table>table see original document page 84</column></row><table>

RESULTADOS DO ENSAIO DE SBAb

Titulações bactericidas de soro foram determinadas em fundogeral de soros preparados de cada grupo de imunização. A titulação bacteri-cida é expressa como a diluição de soro recíproca que resulta em 50 % dediminuição em CFU/ml das misturas de reação comparada à CFU/ml de con-trole medida em TO. Titulações bactericidas foram medidas contra a cepa desorogrupo A F8238. Titulações de anticorpo de SBAb são relatadas na Tabe-la 3. (MenA-CRM é o controle do tipo selvagem.)Tabela 3. Atividade bactericida em fundos gerais de soros pós 2 e pós 3 dose.

<table>table see original document page 85</column></row><table>

CONCLUSÕES

O conjugado foi preparado e analisado para propriedades fisico-químicas, imunoquímicas e imunológicas.

Ambas análises fisicoquímica e imunoquímicas indicaram grausde glicosilação dos conjugados.

Em grupos de controle, titulações foram altas na resposta às i-munizações com ou sem o adjuvante.

Em fundo geral de soros pós 3, titulações aumentaram compa-radas aos soros de dose pós 2. Em grupos tratados com o conjugado sintéti-co sem titulações de alume não foram mensuráveis em imunizações com astitulações de conjugado com adjuvante foram mensuráveis mas mais baixas.

Titulações de imunizações de controle executadas com o oligo-conjugado foram significativamente mais altas.

Os resultados dão evidência que o oligossacarídeo de MenAsintético conjugado com a proteína veículo CRM197 é imunogênico em ca-mundongos. Os conjugados têm ligações de C-fosfonato que deveriam sermuito mais estáveis que as ligações de fosfodiéster nativas. O fato que al-guma imniunogenicidade foi detectada é promissor.

Será apreciado que os exemplos anteriores são fornecidos parailustrar a invenção, não limitar seu escopo. Várias variações e combinaçõesdos elementos descritos são viáveis como alguém versado na técnica reco-nheceria, e estes estão também dentro do escopo da invenção. Por exem-pio, um amplo arranjo de grupos de proteção para grupos amina e hidroxila ébem-conhecido, e muitos destes especificamente podem ser usados no lu-gar dos citados aqui sem divergir do espírito da invenção.

Claims (71)

1. Oligossacarídeo compreendendo uma primeira unidade demanose e uma segunda unidade de manose, em que a primeira unidade demanose compreende uma porção espaçadora na configuração alfa em C-1,cujo espaçador é capaz de conjugar a uma proteína,em que a primeira unidade de manose está conectada à segun-da unidade de manose através de uma ligação 1,6 que conecta o C-6 daprimeira unidade ao C-1 da segunda unidade,e em que a ligação 1,6 compreende um fosfonato.

2. Oligossacarídeo de acordo com a reivindicação 1, em que aligação 1,6 está na configuração alfa.

3. Oligossacarídeo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, emque a primeira unidade de manose é um derivado de manose 2-deóxi-2-azasubstituído.

4. Oligossacarídeo de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 3, em que a segunda unidade de manose é um derivado de mano-se 2-deóxi-2-aza substituído.

5. Oligossacarídeo de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 4, compreendo pelo menos três unidade de manose.

6. Oligossacarídeo de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 5, em que a ligação 1,6 está na forma [C-1 da segunda unidade demanose] - CH2 -P-O- [C-6 da primeira unidade de manose].

7. Oligossacarídeo de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 6, em que cada substituinte 2-aza presente é selecionado a partirde NH2, NHAc, e N3.

8. Oligossacarídeo de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 7, em que uma terceira unidade de manose está conectada à se-gunda unidade de manose através de uma ligação que compreende fósforo,e em que a ligação conecta o C-6 da segunda unidade de manose ao C-1 daterceira unidade de manose.

9. Oligossacarídeo de acordo com a reivindicação 8, em que aligação que conecta o C-6 da segunda unidade de manose ao C-1 da tercei-ra unidade de manose compreende um fosfonato.

10. Oligossacarídeo de acordo com a reivindicação 8 ou 9, oqual apresenta a fórmula: <table>table see original document page 87</column></row><table>na qualcada Az é independentemente selecionado a partir de NH2,NHAc1 e N3;Z representa a porção espaçadora que é capaz de conjugar àuma proteína, e que pode estar na forma protegida ou desprotegida ou quepode ser conjugada a uma proteína;cada R1 é independentemente H, Ci-C6 alquila opcionalmentesubstituída ou M, e que M representa um cátion;X é O ou CH2;cada R3 e R4 é independentemente selecionado a partir do grupoconsistindo em H, Ac, Bn, e outro grupo de proteção;e R6 é H, ou um grupo de proteção, ou um fosfato, ou uma liga-ção a uma unidade sacarídica adicional.

11. Oligossacarídeo de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 1 a 10, compreendendo ainda uma proteína que é conjugada a umoligossacarídeo através da porção espaçadora que está na configuração alfaem C-1 da primeira unidade de manose.

12. Oligossacarídeo de acordo com a reivindicação 11 , em quea proteína é uma toxina bacteriana inativada selecionada a partir de toxóidediftérico, toxóide pertussis, E. coli LT, E. coli ST, exotoxina de Pseudomonasaeruginosa (rEPA), ou toxóide tetânico, ou em que a proteína é CRM 197.

13. Oligossacarídeo de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 1 a 12, em que a porção espaçadora compreende uma hidroxila ouuma amina, cada uma das quais é opcionalmente protegida ou é opcional-mente conjugada a uma proteína.

14. Oligossacarídeo de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 1 a 13, em que R3 é um grupo acila e R4 e H.

15. Oligossacarídeo de acordo com a reivindicação 1, que com-em que cada Az representa um substituínte aza;cada R3 e R4 independentemente representa H ou um grupo protetor;R6 representa H, um grupo de proteção, ou um Iigante ligado aoutra unidade sacarídica;um entre W e X é O, e o outro é W e X é CH2;η é 1 ou 2;Yn é OR1 quando η é 1, e quando η é 2, um Y é =O e o outro Y é OR,em que R é H CrC6 alquila ou C6-Ci2 arila ou C6-Ci2 arilalquila, ou R é M,em que M é um cátion; eZ é OR', SR', ou NR12, em que cad R1 é independentemente H ouum grupo alquila, acila, arila, arilalquila, heteroarila, heteroacila, heteroarilaou heteroarilalquila opcionalmente substituído; ouZ representa um Iigante ligado a outra unidade sacarídica ou afração espaçadora conjugada à proteína.

16. Oligossacarídeo de acordo com a reivindicação 15, em que aproteína é conjugada ao oligossacarídeo através de uma ligação amídica ouligação éster.

17. Oligossacarídeo de acordo com a reivindicação 15, em queW é CH2, X é O, Az é NHAc e η é 2.

18. Oligossacarídeo de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 15 a 17, em que R é M e Z compreende -O-(CH2)-NH-, em que η é-2-6.

19. Oligossacarídeo de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 15 a 18, em que cada R3 e R4 é independentemente H ou Ac.

20. Método para a preparação de um oligossacarídeo, em que ométodo compreende:ligar uma primeira fração compreendendo pelo menos uma uni-dade de manose aza substituída através de ligação 1,6, a qual compreendefosfonato a uma segunda fração que compreende pelo menos uma unidadede manose aza substituída,em que a primeira fração compreende uma fração espaçadora,cuja fração espaçadora é ligada ao C-1 de uma unidade de manose na con-figuração alfa.

21. Método de acordo com a reivindicação 20, em que a reaçãode Mitsunobu é usada para ligar o C-6 de uma unidade de manose da pri-meira fração ao C-1 de uma unidade de manose da segunda fração.

22. Método de acordo com a reivindicação 20 ou 21, em que aligação 1,6 é uma ligação 1,6-alfa.

23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 20a 22, em que a unidade de manose N-substituída ligada compreende a fórmula (1) <table>table see original document page 89</column></row><table>em que cada Az representa um substituínte aza;cada R3 e R4 independentemente, representa H ou um grupo de proteção;R6 representa H, um grupo de proteção, ou um Iigante ligado aoutra unidade sacarídica;um entre W e X é O, e o outro é W e X é CH2;η é 1 ou 2;Yn é OR1 qundo η é 1, e quando η é 2, um Y é =O e o outro Y éOR,em que pelo menos um substituinte aza em uma unidade de manose é umaamina ou amina substituída que é obtida por redução de um substituinte azi-da (N3).ou amina substituída está na posição 2 em uma unidade de manose.

24.

25.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, em que a aminaou amina substuida esta na posicao 2 em uma unidade de manose.

27. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 20a 25, em que Z ou o porção espaçadora no centro anomêrico compreendeum grupo alcóxi amino-substituído.

28. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 20a 27, compreende ainda ligar a segunda unidade de manose a um sacarídeoadicional formando uma ligação entre o oxigênio de OR6 na fórmula (1) e osacarídeo adicional.

29. Método de acordo com a reivindicação 28, em que o sacarí-deo adicional compreende pelo menos uma unidade de manose.

30. Método de acordo com a reivindicação 28 ou 29, em que osacarídeo é ligado à segunda unidade de manose através da ligação 1,6-alfa.

31. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 28a 30, em que R6 é H ou Ac e o centro anomêrico de cada unidade de mano-se presente está na configuração alfa.

32. Método para sintetizar um oligossacarídeo de unidade demanose ligadas à alfa, o referido método compreendendocombinar uma unidade de manose compreendendo fórmula (2),em que R6 é C1-C6 acila ou H, e R11 R3, R4, Az e Z são como definidos nareivindicação 15; <table>table see original document page 91</column></row><table>com um monômero de alongamento de fórmula (3), em que Rx representauma grupo C1-C6 acila e M representa H ou um cátion; <table>table see original document page 91</column></row><table>sob reação de Mitsunobu, através do qual um oligossacarídeo compreen-dendo pelo menos 2 unidades de manose 2-aza substituída ligadas por umligação 1,6-alfa é obtida.

33. Método de acordo com a reivindicação 32, em que as condi-ções de reação de Mitsunobu são mantidas por um prolongado período detempo, em que um oligossacarídeo de fórmula (4),em que ρ é um número inteiro de 1 a 20, é obtido.

34. Método de acordo com a reivindicação 32 ou 33, em que ca-da Az representa NHAc ou N3.

35. Método de acordo com a reivindicação 33 ou 34, em que ρ é 1-5.

36. Método de acordo com a reivindicação 33 ou 34, em que ρ é 2-10.

37. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 32a 36, compreendendo ainda conjugar o oligossacarídeo a uma proteína.

38. Método de acordo com a reivindicação 37, em que a proteínaé uma toxina bacteriana inativada selecionada dentre toxóide difteria, toxóidecoque luxe, E. coli LT, E. coli ST, exotoxina Pseudomonas aeruginosa (rEPA)ou toxóide tétano.

39. Método de acordo com a reivindicação 37, em que a proteínaé CRM197.

40. Oligossacarídeo preparado pelo método como definido emqualquer uma das reivindicações 32 a 36.

41. Composto imunogênico preparado pelo método como defini-do em qualquer uma das reivindicações 32 a 39.

42. Oligossacarídeo de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 1 a 16 e 40 para ser utilizado em um método, compreendendo admi-nistrar uma quantidade eficaz de um componente de uma vacina para Me-ningite A a uma pessoa, proporcionando assim uma resposta imunogênica.

43. Composição farmacêutica incluindo pelo menos um oligos-sacarídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 16 e 40, epelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.

44. Composição imunogênica compreendendo, pelo menos, umcomposto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 19 a 40 a 41.

45. Vacina para Meningite A compreendendo, pelo menos, umcomposto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 19 a 40 a 41.

46. Vacina para Meningite A de acordo com a reivindicação 45,compreendendo um oligossacarídeo conjugado a uma proteína.

47. Método de produzir um derivado de manose útil para a ela-boração de um oligossacarídeo imunogênico, o dito método compreendendo:ciclizar um composto de fórmula (2), com uma eletrófilo<table>table see original document page 93</column></row><table>no qual cada R*, Ra1 R4 e Rb é, independentemente, H ou um grupo de pro-teção;e El representa um resíduo derivado de um electrófilo.

48. Método de acordo com a reivindicação 47, que inclui ainda aetapa de substituir El com um grupo de fósforo.

49. Método de acordo com a reivindicação 47, que inclui ainda asubstituição OR2 na fórmula (2) ou fórmula (3), com uma azida.

50. Método de acordo com a reivindicação 49, no qual a etapade substituição compreende uma reação de Mitsunobu.

51. Método de acordo com a reivindicação 50, no qual a reaçãode Mitsunobu utiliza uma fosforil azida como a fonte de azida.

52. Método aperfeiçoado para preparar uma 2-azido-2-deóxi-D-manopiranose, o dito método compreendendo:formar um triflato na posição 2 de um derivado de 1,3,4,6-tetra-O-acilglucopiranose; e desalojar o triflato com um azida nucleofílica;no qual a melhoria compreende minimamente a exposição damistura reacional bruta para hidratar durante as etapas de isolamento e puri-ficação do produto.

53. Composição imunogênica capaz de obter anticorpos proteto-res contra Meningite A, a dita composição compreendendo um oligossacarí-deo tendo, pelo menos, duas unidades sacarídicas covalentemente ligadasumas às outras através de uma ligação estabilizada contendo fósforo.

54. Composição de acordo com a reivindicação 53, na qual ooligossacarídeo compreende, pelo menos, duas unidades manose covalen-temente ligadas umas às outras através de uma ligação estabilizada conten-do fósforo.

55. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 53 a 54, na qual o oligossacarídeo é conjugado a uma proteína.

56. Composição de acordo com a reivindicação 55, na qual aproteína não é albumina.

57. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 53 a 55, incluindo pelo menos 2 porções diferentes de oligossacarídeos.

58. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 53 a 57, em que a dita ligação contendo fósforo estabilizado é um fos-fonato.

59. Composição de acordo com a reivindicação 58, em que aligação de fosfonato compreende uma ligação-1,6 formada por uma reaçãode Mitsunobu.

60. Composição de acordo com a reivindicação 57, compreen-dendo pelo menos dois oligossacarídeos diferentes que são específicos parapelo menos dois imunotipos meningocócicos.

61. Composição de acordo com a reivindicação 53 a 59, com-preendendo ainda um antígeno Streptococcus Pneumoniae.

62. Composição de acordo com a reivindicação 61, em que odito antígeno Streptococcus Pneumoniae compreende um polissacarídeo.

63. Composição de acordo com a reivindicação 62, em que odito polissacarídeo é conjugado a uma proteína.

64. Composição de acordo com a reivindicação 53 a 63, com-preendendo ainda um(s) antígeno(s) derivado de pelo menos um dentre so-rotipos A, B, C1 W135 e Y de Meningitidis.

65. Composição de acordo com a reivindicação 64, em que odito antígeno é derivado do sorotipo C, W135 ou Y de Meningitidis.

66. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 53 a 65, compreendendo ainda um adjuvante.

67. Composição de acordo com a reivindicação 66, em que oadjuvante é alume.

68. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 63 a 67, em que o dito oligossacarídeo é conjugado a dita proteína a -través de um reagente bifuncional compreendendo um ácido dicarboxílico ouum derivado do mesmo.

69. Composição de acordo com a reivindicação 68, em que oácido dicarboxílico compreende ácido adípico ou ácido subérico.

70. Composição de acordo com a reivindicação 68, em que oreagente bifuncional compreende um esquarato.

71. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 53 a 70, em que pelo menos uma unidade de manose compreendeuma porção espaçadorade configuração alfa no seu centro anomérico.