KR20130079536A

KR20130079536A - 네이세리아 메닝기티디스 orf2086 항원의 비-지질화된 변이체

Info

Publication number: KR20130079536A
Application number: KR1020137009026A
Authority: KR
Inventors: 아날리사 사이빌 앤더슨; 수잔 케이 호이세스; 캐서린 우테 얀센; 저스틴 케이스 모란; 마크 에드워드 루펜
Original assignee: 와이어쓰 엘엘씨
Priority date: 2010-09-10
Filing date: 2011-09-08
Publication date: 2013-07-10
Also published as: ES2585328T5; TWI508739B; EP2613806B1; RU2013109167A; AU2011300409A1; MX2013001997A; SG187912A1; EP3056212A1; IL225126A; EP3549601A1; ES2585328T3; CA2809758A1; KR101584871B1; AR082952A1; CN103096920B; JP5976652B2; EP2613806B2; EP3549601B1; CN103096920A; JP2013540432A

Abstract

본 발명은 단리되고 비-피루빌화되고 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드를 포함하는 조성물 및 이와 관련된 방법에 관한 것이다. 예시적 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물은 면역원성을 나타낸다. 추가로, 본 발명은 혈청군 B 네이세리아 메닝기티디스로부터의 ORF2086 서브패밀리 B 폴리펩티드에 대한 살균 면역반응을 포유동물에서 이끌어내는 조성물 및 이와 관련된 방법에 관한 것이다.

Description

네이세리아 메닝기티디스 ORF2086 항원의 비-지질화된 변이체{NON-LIPIDATED VARIANTS OF NEISSERIA MENINGITIDIS ORF2086 ANTIGENS}

본 발명은 본원에 기재된 면역원성 조성물 중의 네이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis) ORF2086 항원의 비-지질화된 변이체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 네이세리아 메닝기티디스 ORF2086 항원의 비-지질화된 변이체의 입체구조를 보존하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 상응하는 야생형 항원과 비교될 때 비-지질화된 네이세리아 메닝기티디스 ORF2086 항원의 개선된 발현에 관한 조성물 및 방법을 추가로 포함한다.

본원은 2010년 9월 10일자로 출원된 미국 가출원 제61/381,837호(전체적으로 본원에 참고로 도입됨)를 우선권 주장한다.

rLP2086은 네이세리아 메닝기티디스 혈청형 B(MnB) 균주, 또는 보다 정확하게는 혈청군 B(MnB) 균주를 포함하는 다수의 네이세리아 메닝기티디스 균주들에 대한 교차반응성 세균 항체를 유도하는 재조합 28 kDa 지단백질이다. 유추된 아미노산 서열 상동성에 근거하여 rLP2086의 2개의 상이한 서브패밀리 A 및 B가 확인되었다. 이들 2개의 서브패밀리는 다양한 수준의 폴리소르베이트-80(PS-80)과 함께 10 mM 히스티딘(pH 6.0), 150 mM NaCl 및 0.5 mg/㎖ 알루미늄 중에 각각 20 ㎍/㎖, 60 ㎍/㎖, 120 ㎍/㎖ 및 200 ㎍/㎖를 함유하는 MnB rLP2086 백신 샘플들의 제제화에서 사용되었다. 천연 LP2086은 지단백질이다. 문헌(Fletcher et al. Infection & Immunity. vol. 72(4):2088-2100 (2004))은 아미노 말단 지질을 갖는 rLP2086이 마우스에서 동일한 단백질의 비-지질화된 버전보다 더 강한 면역원성을 나타낸다는 것을 입증하였다. 추가 임상전 연구 및 임상 연구는 이들 2개의 지질화된 단백질들의 조합물이 fHBP 패밀리 전체에 걸쳐 넓은 적용범위(coverage)를 제공할 수 있다는 것을 입증하였다. 수막구균성 수막염은 항생제의 이용가능성에도 불구하고 수시간 이내에 소아 및 청소년을 사망시킬 수 있는 파괴적인 질환이다. 적합한 혈청군 B 수막구균 면역원성 조성물에 대한 필요성이 남아있다.

수막구균 백신에 대한 이들 필요성 및 다른 필요성을 충족시키기 위해, 추가 조성물들을 평가하여 네이세리아 메닝기티디스 ORF2086 폴리펩티드의 비-지질화된 변이체의 사용에 대한 적용범위를 제공한다. 본 발명의 제1 양태는 비-지질화된 ORF2086 단백질을 포함하는 면역원성 조성물을 제공하고, 이때 상기 ORF2086 단백질은 B44, B02, B03, B22, B24, B09, A05, A04, A12 또는 A22 변이체이다. 몇몇 실시양태에서, ORF2086 단백질은 B44, B22, B09, A05, A12 또는 A22 변이체이다.

본 발명의 또 다른 양태는 비-지질화된 ORF2086 단백질 서브패밀리 B 변이체(P2086 서브패밀리 B 폴리펩티드)를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, P2086 서브패밀리 B 폴리펩티드는 B44, B02, B03, B22, B24 또는 B09 변이체이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 면역원성 조성물은 비-지질화된 ORF2086 단백질 서브패밀리 A 변이체(P2086 서브패밀리 A 폴리펩티드)를 추가로 포함한다. 몇몇 실시양태에서, P2086 서브패밀리 A 폴리펩티드는 A05, A04, A12 또는 A22 변이체이다.

몇몇 실시양태에서, 면역원성 조성물은 항원보강제를 추가로 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 항원보강제는 알루미늄 항원보강제, 사포닌, CpG 뉴클레오티드 서열 또는 이들의 임의의 조합물이다. 몇몇 실시양태에서, 알루미늄 항원보강제는 AlPO₄, Al(OH)₃, Al₂(SO₄)₃ 또는 명반이다. 몇몇 실시양태에서, 면역원성 조성물 중의 알루미늄의 농도는 0.125 ㎍/㎖ 내지 0.5 ㎍/㎖이다. 몇몇 실시양태에서, 면역원성 조성물 중의 알루미늄의 농도는 0.25 ㎍/㎖이다. 바람직한 실시양태에서, 면역원성 조성물 중의 알루미늄의 농도는 0.125 mg/㎖ 내지 0.5 mg/㎖이다. 몇몇 바람직한 실시양태에서, 면역원성 조성물 중의 알루미늄의 농도는 0.25 mg/㎖이다.

몇몇 실시양태에서, 면역원성 조성물 중의 사포닌 농도는 1 ㎍/㎖ 내지 250 ㎍/㎖이다. 몇몇 실시양태에서, 면역원성 조성물 중의 사포닌 농도는 10 ㎍/㎖ 내지 100 ㎍/㎖이다. 몇몇 실시양태에서, 면역원성 조성물 중의 사포닌 농도는 10 ㎍/㎖이다. 몇몇 실시양태에서, 면역원성 조성물 중의 사포닌 농도는 100 ㎍/㎖이다. 몇몇 실시양태에서, 사포닌은 QS-21 스티뮬론(Stimulon: 등록상표)(에이지너스(Agenus), 미국 매사추세츠주 렉싱톤 소재) 또는 이스코매트릭스(ISCOMATRIX: 등록상표)(씨에스엘 리미티드(CSL Limited), 호주 파크빌 소재)이다.

몇몇 실시양태에서, 면역원성 조성물은 다회 투여량의 상기 면역원성 조성물이 대상체에게 투여된 후 네이세리아 메닝기티디스에 대한 면역원성 반응을 일으키는 능력을 부여한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 면역원성 반응은 2회 투여량이 대상체에게 투여된 후 부여된다. 몇몇 실시양태에서, 상기 면역원성 반응은 3회 투여량이 대상체에게 투여된 후 부여된다.

본 발명의 또 다른 양태는 비-지질화된 P2086 항원의 증가된 면역원성을 부여하는 조성물을 제공하고, 이때 상기 조성물은 사포닌 및 1개 이상의 비-지질화된 P2086 항원을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 면역원성 조성물 중의 사포닌 농도는 1 ㎍/㎖ 내지 250 ㎍/㎖이다. 몇몇 실시양태에서, 면역원성 조성물 중의 사포닌 농도는 10 ㎍/㎖ 내지 100 ㎍/㎖이다. 몇몇 실시양태에서, 면역원성 조성물 중의 사포닌 농도는 10 ㎍/㎖이다. 몇몇 실시양태에서, 면역원성 조성물 중의 사포닌 농도는 100 ㎍/㎖이다. 몇몇 실시양태에서, 사포닌은 QS-21 또는 이스코매트릭스이다.

몇몇 실시양태에서, 상기 조성물은 알루미늄을 추가로 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 알루미늄은 AlPO₄, Al(OH)₃, Al₂(SO₄)₃ 또는 명반으로서 존재한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 조성물 중의 알루미늄의 농도는 0.125 ㎍/㎖ 내지 0.5 ㎍/㎖이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 조성물 중의 알루미늄의 농도는 0.25 ㎍/㎖이다. 바람직한 실시양태에서, 상기 조성물 중의 알루미늄의 농도는 0.125 mg/㎖ 내지 0.5 mg/㎖이다. 몇몇 바람직한 실시양태에서, 상기 조성물 중의 알루미늄의 농도는 0.25 mg/㎖이다.

몇몇 실시양태에서, 비-지질화된 P2086 항원은 P2086 서브패밀리 B 폴리펩티드이다. 몇몇 실시양태에서, P2086 서브패밀리 B 폴리펩티드는 B44, B02, B03, B22, B24 또는 B09 변이체이다. 몇몇 실시양태에서, 비-지질화된 P2086 항원은 P2086 서브패밀리 A 폴리펩티드이다. 몇몇 실시양태에서, P2086 서브패밀리 A 폴리펩티드는 A05, A04, A12 또는 A22 변이체이다.

몇몇 실시양태에서, 상기 조성물은 2개 이상의 비-지질화된 P2086 항원을 포함하고, 이때 상기 2개 이상의 비-지질화된 P2086 항원은 1개 이상의 비-지질화된 P2086 서브패밀리 A 폴리펩티드 및 1개 이상의 비-지질화된 P2086 서브패밀리 B 폴리펩티드이다. 몇몇 실시양태에서, 비-지질화된 P2086 서브패밀리 A 폴리펩티드는 A05 변이체이고, 비-지질화된 P2086 서브패밀리 B 폴리펩티드는 B44 변이체이다. 몇몇 실시양태에서, 비-지질화된 P2086 서브패밀리 A 폴리펩티드는 A05 변이체이고, 비-지질화된 P2086 서브패밀리 B 폴리펩티드는 B22 변이체이다. 몇몇 실시양태에서, 비-지질화된 P2086 서브패밀리 A 폴리펩티드는 A05 변이체이고, 비-지질화된 P2086 서브패밀리 B 폴리펩티드는 B09 변이체이다.

본 발명의 또 다른 양태는 네이세리아 메닝기티디스 세균에 대한 면역성을 대상체에게 부여하는 방법을 제공하고, 이때 상기 방법은 비-지질화된 P2086 서브패밀리 B 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, P2086 서브패밀리 B 폴리펩티드는 B44, B02, B03, B22, B24 또는 B09 변이체이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 면역원성 조성물은 P2086 서브패밀리 A 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 몇몇 실시양태에서, P2086 서브패밀리 A 폴리펩티드는 A05, A04, A12 또는 A22 변이체이다.

몇몇 실시양태에서, 면역원성 조성물은 항원보강제를 추가로 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 항원보강제는 알루미늄 항원보강제, 사포닌, CpG 뉴클레오티드 서열 또는 이들의 임의의 조합물이다. 몇몇 실시양태에서, 알루미늄 항원보강제는 AlPO₄, Al(OH)₃, Al₂(SO₄)₃ 또는 명반이다. 몇몇 실시양태에서, 면역원성 조성물 중의 알루미늄의 농도는 0.125 ㎍/㎖ 내지 0.5 ㎍/㎖이다. 몇몇 실시양태에서, 면역원성 조성물 중의 알루미늄의 농도는 0.25 ㎍/㎖이다. 바람직한 실시양태에서, 면역원성 조성물 중의 알루미늄의 농도는 0.125 mg/㎖ 내지 0.5 mg/㎖이다. 몇몇 실시양태에서, 면역원성 조성물 중의 알루미늄의 농도는 0.25 mg/㎖이다.

몇몇 실시양태에서, 면역원성 조성물 중의 사포닌 농도는 1 ㎍/㎖ 내지 250 ㎍/㎖이다. 몇몇 실시양태에서, 면역원성 조성물 중의 사포닌 농도는 10 ㎍/㎖ 내지 100 ㎍/㎖이다. 몇몇 실시양태에서, 면역원성 조성물 중의 사포닌 농도는 10 ㎍/㎖이다. 몇몇 실시양태에서, 면역원성 조성물 중의 사포닌 농도는 100 ㎍/㎖이다. 몇몇 실시양태에서, 사포닌은 QS-21 또는 이스코매트릭스이다.

몇몇 실시양태에서, 면역원성 조성물은 투약 스케쥴에 걸쳐 다회 투여량으로 대상체에게 투여된다. 몇몇 실시양태에서, 면역원성 조성물은 투약 스케쥴에 걸쳐 2회 투여량으로 대상체에게 투여된다. 몇몇 실시양태에서, 면역원성 조성물은 투약 스케쥴에 걸쳐 3회 투여량으로 대상체에게 투여된다.

본 발명의 또 다른 양태는 (a) ORF2086 변이체 핵산을 발현 벡터 내로 클로닝하여 ORF2086 발현 벡터를 발생시키는 단계; (b) 세균을 상기 ORF2086 발현 벡터로 형질전환시키는 단계; (c) 상기 ORF2086 발현 벡터로부터 P2086 변이체의 발현을 유도하는 단계; 및 (d) 발현된 P2086 변이체 단백질을 단리하는 단계를 포함하는, 비-지질화된 P2086 변이체를 제조하는 방법을 제공하고, 이때 상기 ORF2086 발현 벡터는 지질화 조절 서열을 포함하지 않는다. 몇몇 실시양태에서, 상기 세균은 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)이다. 몇몇 실시양태에서, 발현은 IPTG의 첨가에 의해 유도된다.

몇몇 실시양태에서, P2086 변이체의 N-말단 Cys을 코딩하는 코돈이 결실된다. 몇몇 실시양태에서, P2086 변이체의 N-말단 Cys을 코딩하는 코돈이 Ala, Gly 또는 Val 코돈을 발생시키도록 돌연변이된다. 몇몇 실시양태에서, P2086 변이체는 A05, B01 또는 B44 변이체이다. 몇몇 실시양태에서, P2086 변이체는 B09 변이체이다.

몇몇 실시양태에서, Ser 및 Gly 잔기를 부가하여 N-말단 Cys의 바로 하류(downstream)에서 Gly/Ser 줄기(stalk)가 뻗어 있도록 N-말단 꼬리가 돌연변이된다. 몇몇 실시양태에서, Gly/Ser 줄기에서 Gly 및 Ser 잔기의 총 수는 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 11 이상 또는 12 이상이다.

몇몇 실시양태에서, P2086 변이체의 N-말단 꼬리의 코돈은 점 돌연변이유발에 의해 최적화된다. 몇몇 실시양태에서, ORF2086 변이체의 N-말단 꼬리의 코돈은 ORF2086 변이체의 5번째 아미노산을 코딩하는 코돈이 서열번호 8의 뉴클레오티드 13 내지 15와 100% 동일하고 ORF2086 변이체의 13번째 아미노산을 코딩하는 코돈이 서열번호 8의 뉴클레오티드 37 내지 39와 100% 동일하도록 점 돌연변이유발에 의해 최적화된다. 몇몇 실시양태에서, 비-지질화된 ORF2086 변이체의 N-말단 꼬리는 5' 45개 핵산이 서열번호 8의 핵산 1 내지 45와 100% 동일하도록 최적화된다. 몇몇 실시양태에서, 비-지질화된 ORF2086 변이체의 N-말단 꼬리는 5' 42개 핵산이 서열번호 8의 핵산 4 내지 45와 100% 동일하도록 최적화된다. 몇몇 실시양태에서, 비-지질화된 ORF2086 변이체의 N-말단 꼬리는 5' 39개 핵산이 서열번호 8의 핵산 4 내지 42와 100% 동일하도록 최적화된다. 몇몇 실시양태에서, 비-지질화된 P2086 변이체의 N-말단 꼬리는 서열번호 18의 아미노산 1 내지 15에 비해 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 비-지질화된 P2086 변이체의 N-말단 꼬리는 서열번호 18의 아미노산 1 내지 15에 비해 2개의 아미노산 치환을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 비-지질화된 P2086 변이체의 N-말단 꼬리는 서열번호 18의 아미노산 2 내지 15에 비해 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 비-지질화된 P2086 변이체의 N-말단 꼬리는 서열번호 18의 아미노산 2 내지 15에 비해 2개의 아미노산 치환을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다.

한 실시양태에서, 본 발명은 면역원성 조성물 중의 네이세리아 메닝기티디스 ORF2086 서브패밀리 B 항원의 안정한 제제에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 네이세리아 메닝기티디스 ORF2086 항원의 입체구조를 보존하는 방법, 및 네이세리아 메닝기티디스 rLP2086 항원의 효능을 측정하는 방법에 관한 것이다.

한 양태에서, 본 발명은 단리되고 비-피루빌화되고(non-pyruvylated) 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 상기 조성물은 면역원성을 나타낸다. 또 다른 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 상응하는 야생형 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드에 비해 N-말단 Cys의 결실을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20 및 서열번호 21로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 이때 위치 1의 시스테인이 결실된다. 또 다른 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 44, 서열번호 49, 서열번호 50 및 서열번호 55로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 발현 시스템에 작동가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되고, 이때 상기 발현 시스템은 세균 세포에서 발현될 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 발현 시스템은 플라스미드 발현 시스템이다. 한 실시양태에서, 상기 세균 세포는 에스케리치아 콜라이 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 뉴클레오티드 서열은 이 뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 조절 서열에 연결되어 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 방법에 의해 수득될 수 있는 비-피루빌화되고 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 상기 방법은 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20 및 서열번호 21로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 발현하는 단계를 포함하고, 이때 위치 1의 시스테인은 결실되고, 상기 뉴클레오티드 서열은 세균 세포에서 발현될 수 있는 발현 시스템에 작동가능하게 연결되어 있다. 한 실시양태에서, 상기 세균 세포는 에스케리치아 콜라이이다.

한 양태에서, 본 발명은 서열번호 49에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드, 및 서열번호 44에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물은 면역원성을 나타낸다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물은 혈청군 B 네이세리아 메닝기티디스로부터의 ORF2086 서브패밀리 A 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물은 혈청군 B 네이세리아 메닝기티디스로부터의 ORF2086 서브패밀리 B 폴리펩티드에 대한 살균 면역반응을 포유동물에서 이끌어낸다.

한 양태에서, 본 발명은 서열번호 49에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드에 관한 것이다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 46을 포함하는 단리된 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 한 양태에서, 본 발명은 서열번호 47을 포함하는 단리된 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 한 양태에서, 본 발명은 서열번호 48을 포함하는 단리된 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 한 양태에서, 본 발명은 서열번호 50에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드에 관한 것이다. 한 양태에서, 본 발명은 서열번호 45를 포함하는 단리된 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 한 양태에서, 본 발명은 서열번호 44에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드에 관한 것이다.

한 양태에서, 본 발명은 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48 및 서열번호 45로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드에 관한 것이고, 이때 상기 플라스미드는 세균 세포에서 발현될 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 세균 세포는 에스케리치아 콜라이이다.

한 양태에서, 본 발명은 포유동물에서 ORF2086 서브패밀리 B 혈청군 B 네이세리아 메닝기티디스에 대해 특이적인 살균 항체를 이끌어내는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 서열번호 44 및 서열번호 49로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이들의 조합물을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 상기 포유동물에게 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다.

한 양태에서, 본 발명은 폴리펩티드를 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 서열번호 21에 대해 90% 초과의 동일성을 갖고 서열번호 21의 아미노산 13 내지 18, 서열번호 21의 아미노산 21 내지 34 및 서열번호 21의 아미노산 70 내지 80으로 구성된 군으로부터 선택된 1개 이상의 도메인 또는 이들의 조합물을 포함하는 서열을 포함하는 폴리펩티드를 세균 세포에서 발현하는 단계를 포함하고, 이때 상기 서열은 N-말단 시스테인을 결여한다. 상기 방법은 상기 폴리펩티드를 정제하는 단계를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 서열은 서열번호 21의 아미노산 96 내지 116, 서열번호 21의 아미노산 158 내지 170, 서열번호 21의 아미노산 172 내지 185, 서열번호 21의 아미노산 187 내지 199, 서열번호 21의 아미노산 213 내지 224, 서열번호 21의 아미노산 226 내지 237, 및 서열번호 21의 아미노산 239 내지 248로 구성된 군으로부터 선택된 1개 이상의 도메인 또는 이들의 조합물을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 세균 세포는 에스케리치아 콜라이이다.

한 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 방법을 포함하는 방법에 의해 제조된 단리된 폴리펩티드에 관한 것이다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 방법을 포함하는 방법에 의해 제조된 면역원성 조성물에 관한 것이다.

한 양태에서, 본 발명은 혈청군 B 네이세리아 메닝기티디스로부터의 ORF2086 서브패밀리 B 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이고, 이때 상기 폴리펩티드는 비-피루빌화되고 비-지질화된 B44이다. 한 실시양태에서, 상기 조성물은 혈청군 B 네이세리아 메닝기티디스로부터의 제2 ORF2086 서브패밀리 B 폴리펩티드를 추가로 포함하고, 이때 상기 제2 폴리펩티드는 비-피루빌화되고 비-지질화된 B09이다. 한 실시양태에서, 상기 조성물은 3개 이하의 ORF2086 서브패밀리 B 폴리펩티드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 조성물은 2개 이하의 ORF2086 서브패밀리 B 폴리펩티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 조성물은 ORF2086 서브패밀리 A 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 조성물은 A05 서브패밀리 A 폴리펩티드를 포함한다.

도 1은 P2086 변이체 핵산 서열을 보여준다.
도 2는 P2086 변이체 아미노산 서열을 보여준다. 각각의 변이체의 N-말단 꼬리에 있는 Gly/Ser 줄기는 밑줄로 표시되어 있다.
도 3은 ORF2086 단백질의 구조를 보여준다.
도 4는 N-말단 Cys의 제거가 에스케리치아 콜라이에서 발현의 손실을 초래한다는 것을 보여준다.
도 5는 비-지질화된 ORF2086 변이체 발현에 대한 Gly/Ser 줄기 길이의 효과를 보여준다. 단백질 변이체 표지된 B01과 관련된 서열은 서열번호 35에 기재되어 있다. 단백질 변이체 표지된 B44와 관련된 서열은 서열번호 36에 기재되어 있다. 단백질 변이체 표지된 A05와 관련된 서열은 서열번호 37에 기재되어 있다. 단백질 변이체 표지된 A22와 관련된 서열은 서열번호 38에 기재되어 있다. 단백질 변이체 표지된 B22와 관련된 서열은 서열번호 39에 기재되어 있다. 단백질 변이체 표지된 A19와 관련된 서열은 서열번호 40에 기재되어 있다.
도 6은 짧은 Gly/Ser 줄기에도 불구하고 비-지질화된 B09의 발현 수준이 높다는 것을 보여준다. 좌측 2개의 레인은 유도 전 및 유도 후 N-말단 Cys이 결실된 B09 변이체의 발현을 입증하였다. 3번째 레인 및 4번째 레인은 유도 전 및 후 N-말단 Cys 양성 B09 변이체의 발현을 입증한다. 가장 우측에 있는 레인은 분자량 표준물이다. 이미지 아래에 제시된 아미노산 서열은 서열번호 41에 기재되어 있다. 도면에서 "A22_001"로서 표시된, N-말단 Cys이 결실된 A22 변이체를 나타내는 뉴클레오티드 서열은 도면에서 서열번호 41의 아래에 제시된 서열번호 42에 기재되어 있다. "B22_001"로서 표시된, N-말단 Cys이 결실된 B22 변이체를 나타내는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 52에 기재되어 있다. "B09_004"로서 표시된, N-말단 Cys이 결실된 B09 변이체를 나타내는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 53에 기재되어 있다.
도 7은 코돈 최적화가 비-지질화된 B22 및 A22 변이체의 발현을 증가시킨다는 것을 보여준다. 좌측 패널은 IPTG 유도 전(레인 1 및 3) 및 후(레인 2 및 4) N-말단 Cys이 결실된 B22 변이체의 발현을 입증한다. 우측 패널은 IPTG 유도 전(레인 7) 및 후(레인 8) N-말단 Cys이 결실된 A22 변이체의 발현을 입증한다. 레인 5 및 6은 분자량 표준물이다.
도 8은 P2086 변이체 핵산 서열 및 아미노산 서열을 보여준다.
서열 식별번호
서열번호 1은 N-말단 Cys을 코딩하는 코돈을 포함하는, 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 2086 변이체 A04 유전자에 대한 DNA 서열을 기재한다.
서열번호 2는 N-말단 Cys을 코딩하는 코돈을 포함하는, 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 2086 변이체 A05 유전자에 대한 DNA 서열을 기재한다.
서열번호 3은 N-말단 Cys을 코딩하는 코돈을 포함하는, 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 2086 변이체 A12 유전자에 대한 DNA 서열을 기재한다.
서열번호 4는 N-말단 Cys을 코딩하는 코돈을 포함하는, 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 2086 변이체 A12-2 유전자에 대한 DNA 서열을 기재한다.
서열번호 5는 N-말단 Cys을 코딩하는 코돈을 포함하는, 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 2086 변이체 A22 유전자에 대한 DNA 서열을 기재한다.
서열번호 6은 N-말단 Cys을 코딩하는 코돈을 포함하는, 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 2086 변이체 B02 유전자에 대한 DNA 서열을 기재한다.
서열번호 7은 N-말단 Cys을 코딩하는 코돈을 포함하는, 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 2086 변이체 B03 유전자에 대한 DNA 서열을 기재한다.
서열번호 8은 N-말단 Cys을 코딩하는 코돈을 포함하는, 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 2086 변이체 B09 유전자에 대한 DNA 서열을 기재한다.
서열번호 9는 N-말단 Cys을 코딩하는 코돈을 포함하는, 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 2086 변이체 B22 유전자에 대한 DNA 서열을 기재한다.
서열번호 10은 N-말단 Cys을 코딩하는 코돈을 포함하는, 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 2086 변이체 B24 유전자에 대한 DNA 서열을 기재한다.
서열번호 11은 N-말단 Cys을 코딩하는 코돈을 포함하는, 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 2086 변이체 B44 유전자에 대한 DNA 서열을 기재한다.
서열번호 12는 아미노산 위치 1에서 N-말단 Cys을 포함하는, 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 2086 변이체 A04에 대한 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 13은 아미노산 위치 1에서 N-말단 Cys을 포함하는, 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 2086 변이체 A05에 대한 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 14는 아미노산 위치 1에서 N-말단 Cys을 포함하는, 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 2086 변이체 A12에 대한 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 15는 아미노산 위치 1에서 N-말단 Cys을 포함하는, 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 2086 변이체 A22에 대한 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 16은 아미노산 위치 1에서 N-말단 Cys을 포함하는, 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 2086 변이체 B02에 대한 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 17은 아미노산 위치 1에서 N-말단 Cys을 포함하는, 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 2086 변이체 B03에 대한 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 18은 아미노산 위치 1에서 N-말단 Cys을 포함하는, 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 2086 변이체 B09에 대한 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 19는 아미노산 위치 1에서 N-말단 Cys을 포함하는, 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 2086 변이체 B22에 대한 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 20은 아미노산 위치 1에서 N-말단 Cys을 포함하는, 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 2086 변이체 B24에 대한 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 21은 아미노산 위치 1에서 N-말단 Cys을 포함하는, 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 2086 변이체 B44에 대한 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 22는 실시예 2에 제시된 정방향(forward) 프라이머에 대한 DNA 서열을 기재한다.
서열번호 23은 실시예 2에 제시된 역방향(reverse) 프라이머에 대한 DNA 서열을 기재한다.
서열번호 24는 실시예 2의 표 1에 제시된 정방향 프라이머에 대한 DNA 서열을 기재한다.
서열번호 25는 실시예 2의 표 1에 제시된 역방향 프라이머에 대한 DNA 서열을 기재한다.
서열번호 26은 실시예 2의 표 1에 제시된 정방향 프라이머에 대한 DNA 서열을 기재한다.
서열번호 27은 실시예 2의 표 1에 제시된 역방향 프라이머에 대한 DNA 서열을 기재한다.
서열번호 28은 실시예 4에 제시된 Gly/Ser 줄기에 대한 DNA 서열을 기재한다.
서열번호 29는 예를 들면, 서열번호 28에 의해 코딩된, 실시예 4에 제시된 Gly/Ser 줄기에 대한 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 30은 실시예 4에 제시된 Gly/Ser 줄기에 대한 DNA 서열을 기재한다.
서열번호 31은 예를 들면, 서열번호 30에 의해 코딩된, 실시예 4에 제시된 Gly/Ser 줄기에 대한 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 32는 실시예 4에 제시된 Gly/Ser 줄기에 대한 DNA 서열을 기재한다.
서열번호 33은 예를 들면, 서열번호 32 및 서열번호 34에 의해 코딩된, Gly/Ser 줄기에 대한 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 34는 실시예 4에 제시된 Gly/Ser 줄기에 대한 DNA 서열을 기재한다.
서열번호 35는 도 5에 제시된, 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 2086 변이체 B01의 N-말단에 대한 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 36은 도 5에 제시된, 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 2086 변이체 B44의 N-말단에 대한 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 37은 도 5에 제시된, 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 2086 변이체 A05의 N-말단에 대한 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 38은 도 5에 제시된, 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 2086 변이체 A22의 N-말단에 대한 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 39는 도 5에 제시된, 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 2086 변이체 B22의 N-말단에 대한 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 40은 도 5에 제시된, 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 2086 변이체 A19의 N-말단에 대한 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 41은 도 6에 제시된, 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 2086 변이체의 N-말단에 대한 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 42는 도 6에 제시된, 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 2086 변이체 A22의 N-말단에 대한 DNA 서열을 기재한다.
서열번호 43은 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 2086 변이체 B44 유전자에 대한 코돈 최적화된 DNA 서열을 기재하고, 이때 N-말단 시스테인을 코딩하는 코돈이 서열번호 11에 비해 결실된다. 플라스미드 pDK087은 서열번호 43을 포함한다.
서열번호 44는 비-지질화된 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 2086 변이체 B44에 대한 아미노산 서열을 기재한다. 서열번호 44는 서열번호 21과 동일하되, 서열번호 21의 위치 1의 N-말단 시스테인이 결실된다. 서열번호 44는 예를 들면, 서열번호 43에 의해 코딩된다.
서열번호 45는 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 2086 변이체 B09 유전자에 대한 코돈 최적화된 DNA 서열을 기재하고, 이때 N-말단 시스테인을 코딩하는 코돈이 결실되고, 상기 서열은 서열번호 8에 비해 추가 Gly/Ser 영역을 코딩하는 코돈을 포함한다. 플라스미드 pEB063은 서열번호 45를 포함한다.
서열번호 46은 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 2086 변이체 B09 유전자에 대한 코돈 최적화된 DNA 서열을 기재하고, 이때 N-말단 시스테인을 코딩하는 코돈이 서열번호 8에 비해 결실된다. 플라스미드 pEB064는 서열번호 46을 포함한다.
서열번호 47은 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 2086 변이체 B09 유전자에 대한 코돈 최적화된 DNA 서열을 기재하고, 이때 N-말단 시스테인을 코딩하는 코돈이 서열번호 8에 비해 결실된다. 플라스미드 pEB065는 서열번호 47을 포함한다.
서열번호 48은 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 2086 변이체 B09 유전자에 대한 DNA 서열을 기재하고, 이때 N-말단 시스테인을 코딩하는 코돈은 서열번호 8에 비해 결실된다. 플라스미드 pLA134는 서열번호 48을 포함한다.
서열번호 49는 비-지질화된 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 2086 변이체 B09에 대한 아미노산 서열을 기재한다. 서열번호 49는 서열번호 18과 동일하되, 서열번호 18의 위치 1의 N-말단 시스테인이 결실된다. 서열번호 49는 예를 들면, 서열번호 46, 서열번호 47 및 서열번호 48로 구성된 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해 코딩된다.
서열번호 50은 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 2086 변이체 B09에 대한 아미노산 서열을 기재하고, 이때 N-말단 시스테인을 코딩하는 코돈은 결실되고, 상기 서열은 서열번호 18에 비해 추가 Gly/Ser 영역을 코딩하는 코돈을 포함한다. 서열번호 50은 예를 들면, 서열번호 45에 의해 코딩된다.
서열번호 51은 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 2086 변이체 B44 유전자에 대한 DNA 서열을 기재하고, 이때 N-말단 시스테인을 코딩하는 코돈은 서열번호 11에 비해 결실된다. 플라스미드 pLN056은 서열번호 51을 포함한다.
서열번호 52는 도 6에 제시된, 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 2086 변이체 B22의 N-말단에 대한 DNA 서열을 기재한다.
서열번호 53은 도 6에 제시된, 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 2086 변이체 B09의 N-말단에 대한 DNA 서열을 기재한다.
서열번호 54는 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 2086 변이체 A05 유전자에 대한 DNA 서열을 기재하고, 이때 N-말단 시스테인을 코딩하는 코돈은 서열번호 2에 비해 결실된다.
서열번호 55는 비-지질화된 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 2086 변이체 A05에 대한 아미노산 서열을 기재한다. 서열번호 55는 서열번호 13과 동일하되, 서열번호 13의 위치 1의 N-말단 시스테인이 결실된다. 서열번호 55는 예를 들면, 서열번호 54에 의해 코딩된다.
서열번호 56은 실시예 7에 제시된 세린-글리신 반복부(repeat) 서열의 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 57은 비-지질화된 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 2086 변이체 B01에 대한 아미노산 서열을 기재한다. 서열번호 57은 서열번호 58과 동일하되, 서열번호 58의 위치 1의 N-말단 시스테인이 결실된다.
서열번호 58은 아미노산 위치 1에서 N-말단 Cys을 포함하는, 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 2086 변이체 B01에 대한 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 59는 아미노산 위치 1에서 N-말단 Cys을 포함하는, 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 2086 변이체 B15에 대한 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 60은 아미노산 위치 1에서 N-말단 Cys을 포함하는, 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 2086 변이체 B16에 대한 아미노산 서열을 기재한다.
서열번호 61은 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 2086 변이체 B22에 대한 DNA 서열을 기재하고, 이때 서열번호 19의 아미노산 위치 1의 N-말단 Cys에 대한 코돈은 글리신에 대한 코돈으로 치환된다.
서열번호 62는 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 2086 변이체 B22에 대한 아미노산 서열을 기재하고, 이때 서열번호 19의 아미노산 위치 1의 N-말단 Cys은 글리신으로 치환된다.
서열번호 63은 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 2086 변이체 A22에 대한 DNA 서열을 기재하고, 이때 서열번호 15의 아미노산 위치 1의 N-말단 Cys에 대한 코돈은 글리신에 대한 코돈으로 치환된다.
서열번호 64는 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 2086 변이체 A22에 대한 아미노산 서열을 기재하고, 이때 서열번호 15의 아미노산 위치 1의 N-말단 Cys은 글리신으로 치환된다.

달리 정의되어 있지 않은 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어들 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 통상적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 방법 및 물질과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 이하에 기재되어 있다. 물질, 방법 및 예는 단지 예시하기 위한 것이고 한정하기 위한 것이 아니다. 본원에서 인용된 모든 공개문헌, 특허 및 다른 문헌은 전체적으로 참고로 도입된다.

본 개시내용에서 용어, 예컨대, "포함한다", "포함된", "포함하는", "함유한다", "함유하는" 등은 미국 특허법에서 이들에게 부여된 의미를 가질 수 있고, 예를 들면, 이들은 "수반한다", "수반된", "수반하는" 등을 의미할 수 있다. 이러한 용어들은 임의의 다른 성분을 배제하지 않고 특정 성분 또는 성분들의 세트의 포함을 의미한다. 용어, 예컨대, "본질적으로 구성된" 및 "본질적으로 구성된다"는 미국 특허법에서 이들에게 부여된 의미를 갖고, 예를 들면, 이들은 본 발명의 신규 또는 기본 특징을 벗어나지 않는 추가 성분 또는 단계의 포함을 허용한다(즉, 이들은 본 발명의 신규 또는 기본 특징을 벗어나는 언급되지 않은 추가 성분 또는 단계를 배제하고, 특히 종래기술, 예를 들면, 본원에서 인용되어 있거나 본원에 참고로 도입되는 문헌들에 비해 특허가능한, 예를 들면, 신규하고 자명하지 않고 발명적인 실시양태들을 정의하는 것이 이 문헌의 목적이기 때문에 종래기술, 예컨대, 본원에서 인용되어 있거나 본원에 참고로 도입되는 당업계의 문헌들의 성분 또는 단계를 배제한다. 또한, 용어 "로 구성된다" 및 "로 구성된"은 미국 특허법에서 이들에게 부여된 의미를 갖는다(즉, 이들 용어들은 폐쇄적이다). 따라서, 이들 용어들은 특정 성분 또는 성분들의 세트의 포함 및 모든 다른 성분의 배제를 의미한다.

정의

본원에서 사용된 바와 같이, 문맥이 달리 명시하지 않은 한, 단수형은 복수 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들면, "방법"의 언급은 본원에 기재되어 있고/있거나 본 개시내용 등을 읽었을 때 당업계에서 통상의 기술을 가진 자에게 자명해질 1개 이상의 방법 및/또는 단계를 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 문맥이 달리 명시하지 않은 한, 복수형은 단수 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들면, "방법들"의 언급은 본원에 기재되어 있고/있거나 본 개시내용 등을 읽었을 때 당업계에서 통상의 기술을 가진 자에게 자명해질 1개 이상의 방법 및/또는 단계를 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 값, 예컨대, 언급된 농도 범위, 시간, 분자량, 온도 또는 pH의 통계적으로 유의한 범위 이내를 의미한다. 이러한 범위는 소정의 값 또는 범위의 한 자릿수 이내, 전형적으로 20% 이내, 보다 전형적으로 10% 이내, 훨씬 더 전형적으로 5% 이내일 수 있다. 용어 "약"에 의해 포함되는 허용가능한 편차는 연구되는 특정 시스템에 의해 좌우될 것이고 당업계에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 용이하게 인식될 수 있다. 본원에서 범위가 언급될 때마다, 상기 범위 내의 모든 전체 정수도 본 발명의 실시양태로서 고려된다.

용어 "항원보강제"는 본원에 추가로 기재되고 예시된 바와 같이 항원에 대한 면역반응을 향상시키는 화합물 또는 혼합물을 의미한다. 본 발명의 백신에서 사용될 수 있는 항원보강제의 비-한정적 예에는 RIBI 항원보강제 시스템(리비 인코포레이티드(Ribi Inc.), 미국 몬타나주 해밀톤 소재), 명반, 미네랄 겔, 예컨대, 수산화알루미늄 겔, 수중유 에멀젼, 유중수 에멀젼, 예컨대, 프로인트(Freund's) 완전 및 불완전 항원보강제, 블록 공중합체(사이트알엑스(CytRx), 미국 조지아주 아틀란타 소재), QS-21(캠브리지 바이오텍 인코포레이티드(Cambridge Biotech Inc.), 미국 매사추세츠주 캠브리지 소재), SAF-M(키론(Chiron), 미국 캘리포니아주 에머리빌 소재), 암피젠(AMPHIGEN: 등록상표) 항원보강제, 사포닌, 퀼(Quil) A 또는 다른 사포닌 분획, 모노포스포릴 지질 A 및 애브리딘(Avridine) 지질-아민 항원보강제가 포함된다.

"항체"는 면역글로불린 분자 내의 가변 영역에 위치하는 1개 이상의 항원 인식 부위를 통해 표적, 예컨대, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 폴리펩티드 등에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 분자이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 문맥이 달리 표시하지 않은 한, 상기 용어는 온전한 다중클론 또는 단일클론 항체뿐만 아니라, 조작된 항체(예를 들면, 이펙터 기능, 안정성 및 다른 생물학적 활성을 변경하도록 조작된 키메라, 인간화된 및/또는 유도체화된 항체) 및 이의 단편(예컨대, Fab, Fab', F(ab')₂, Fv), 단일 쇄(ScFv) 및 도메인 항체(상어 항체 및 낙타 항체를 포함함), 및 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 다가 항체, 다중특이적 항체(예를 들면, 원하는 생물학적 활성을 나타내는 이중특이적 항체) 및 본원에 기재된 바와 같은 항체 단편, 및 항원 인식 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 입체구조도 포함하기 위한 것이다. 항체는 임의의 클래스, 예컨대, IgG, IgA 또는 IgM(또는 이들의 서브클래스)의 항체를 포함하고, 항체는 임의의 특정 클래스의 항체일 필요가 없다. 면역글로불린은 그의 중쇄의 불변 도메인의 항체 아미노산 서열에 따라 상이한 클래스들로 분류될 수 있다. 인간에서 면역글로불린의 5개의 주요 클래스들, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고 이들 중 몇몇은 서브클래스(동종형), 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 더 나누어질 수 있다. 면역글로불린의 상이한 클래스들에 상응하는 중쇄 불변 도메인들은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 지칭된다. 면역글로불린의 상이한 클래스들의 서브유닛 구조 및 3차원적 입체구조는 잘 공지되어 있다.

"항체 단편"은 온전한 항체의 부분만을 포함하고, 이때 상기 부분은 바람직하게는 상기 부분이 온전한 항체에 존재할 때 상기 부분과 통상적으로 관련되어 있는 기능들 중 1개 이상의, 바람직하게는 대부분의 또는 모든 기능을 보유한다.

용어 "항원"은 일반적으로 생물학적 분자, 통상적으로 단백질, 펩티드, 폴리사카라이드, 지질, 또는 동족(cognate) 항체가 선택적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 에피토프를 함유하는 접합체를 의미하거나; 몇몇 경우 동물 내로 주입되거나 흡수되는 조성물을 포함하는, 동물에서 항체의 생성 또는 T 세포 반응, 또는 이들 둘다를 자극할 수 있는 면역원성 물질을 의미한다. 면역반응은 전체 분자, 또는 상기 분자의 1개 이상의 다양한 부분(예를 들면, 에피토프 또는 햅텐)에 대해 발생될 수 있다. 상기 용어는 개별 분자를 의미하거나 항원성 분자의 균질한 또는 불균질한 집단을 의미하기 위해 사용될 수 있다. 항원은 항체, T 세포 수용체, 또는 특이적 체액성 및/또는 세포성 면역의 다른 구성요소에 의해 인식된다. 용어 "항원"은 모든 관련된 항원성 에피토프를 포함한다. 소정의 항원의 에피토프는 당업계에 잘 공지되어 있는 임의의 수의 에피토프 맵핑(mapping) 기법의 이용을 통해 확인될 수 있다. 예를 들면, 문헌(Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, N. J.)을 참조한다. 예를 들면, 선형 에피토프는 예를 들면, 고체 지지체 상에서 단백질 분자의 부분에 상응하는 많은 수의 펩티드들을 동시적으로 합성하고 상기 펩티드들이 상기 지지체에 여전히 부착되어 있는 동안 상기 펩티드들을 항체와 반응시킴으로써 확인될 수 있다. 이러한 기법은 당업계에 공지되어 있고 예를 들면, 미국 특허 제4,708,871호, 문헌(Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002) 및 문헌(Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23:709-715)(이들 모두 전체적으로 본원에 참고로 도입됨)에 기재되어 있다. 유사하게, 입체구조적 에피토프는 예컨대, X-선 결정학 및 2차원적 핵 자기 공명으로 아미노산의 공간적 입체구조를 결정함으로써 확인될 수 있다. 예를 들면, 상기 문헌(Epitope Mapping Protocols)을 참조한다. 나아가, 본 발명의 목적을 위해, "항원"은 천연 서열에 대한 변형, 예컨대, 결실, 부가 및 치환(일반적으로 성질 면에서 보존적 치환이지만 비-보존적 치환일 수 있음)을 포함하되, 면역학적 반응을 이끌어내는 능력을 유지하는 단백질을 의미하기 위해 사용될 수도 있다. 이들 변형은 부위 지정 돌연변이 유발, 특정 합성 절차 또는 유전적 조작 방법을 통한 의도적 변형일 수 있거나, 예컨대, 항원을 생성하는 숙주의 돌연변이를 통한 우발적 변형일 수 있다. 나아가, 항원은 미생물, 예를 들면, 세균으로부터 유도되거나, 수득되거나 단리될 수 있거나, 또는 전체 유기체일 수 있다. 유사하게, 예컨대, 핵산 면역화 적용에 있어서 항원을 발현하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드도 상기 정의에 포함된다. 합성 항원, 예를 들면, 폴리에피토프, 플랭킹(flanking) 에피토프, 및 다른 재조합 또는 합성적으로 유도된 항원도 포함된다(문헌(Bergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:2777-2781; Bergmann et al. (1996) J. Immunol. 157:3242-3249; Suhrbier, A. (1997) Immunol. and Cell Biol. 75:402-408; Gardner et al. (1998) 12^th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, Jun. 28-Jul. 3, 1998)).

용어 "보존적" 아미노산 치환은 관련된 잔기의 극성, 전하, 가용성, 소수성, 친수성 및/또는 양쪽친매성 면에서의 유사성에 근거하여 만들어질 수 있다. 예를 들면, 비-극성(소수성) 아미노산은 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 트립토판 및 메티오닌을 포함하고, 극성/중성 아미노산은 글리신, 세린, 쓰레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함하고, 양으로 하전된(염기성) 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함하고, 음으로 하전된(산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 보존적 아미노산 변화는 ORF2086 폴리펩티드의 1차 서열을 변경시키지만 분자의 기능을 변경시키지 않는다. 이들 돌연변이체들을 발생시킬 때, 아미노산의 수친매성(hydropathic) 지수가 고려될 수 있다. 상호활성 생물학적 기능을 폴리펩티드에 부여함에 있어서 아미노산 수친매성 지수의 중요성은 당업계에서 일반적으로 이해되어 있다(문헌(Kyte & Doolittle, 1982, J. Mol. Biol., 157(1):105-32)). 일부 아미노산들은 유사한 수친매성 지수 또는 점수를 갖는 다른 아미노산으로 치환될 수 있고 여전히 유사한 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드를 발생시킬 수 있다. 각각의 아미노산은 그의 소수성 및 전하 특징에 근거하여 수친매성 지수를 배정받는다. 이들 지수는 다음과 같다: 이소류신(+4.5); 발린(+4.2); 류신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스틴(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글리신(-0.4); 쓰레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 티로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).

아미노산 잔기의 상대적 수친매성 지수는 생성된 폴리펩티드의 2차 구조 및 3차 구조를 결정하고, 상기 구조는 상기 폴리펩티드와 다른 분자, 예컨대, 효소, 기질, 수용체, 항체, 항원 등의 상호작용을 한정하는 것으로 생각된다. 아미노산이 유사한 수친매성 지수를 갖는 또 다른 아미노산으로 치환될 수 있고 여전히 기능적 등가 폴리펩티드를 수득할 수 있다는 것은 당업계에 공지되어 있다. 이러한 변화에서, +/-2 이내의 수친매성 지수를 갖는 아미노산의 치환이 바람직하고, +/-1 이내의 수친매성 지수를 갖는 아미노산의 치환이 특히 바람직하고, +/-0.5 이내의 수친매성 지수를 갖는 아미노산의 치환이 훨씬 더 특히 바람직하다.

보존적 아미노산 치환 또는 삽입은 친수성에 근거하여 만들어질 수도 있다. 본원에 참고로 도입되는 미국 특허 제4,554,101호에 기재된 바와 같이, 그의 인접 아미노산의 친수성에 의해 좌우되는 폴리펩티드의 최대 국소 평균 친수성은 그의 면역원성 및 항원성, 즉 상기 폴리펩티드의 생물학적 성질과 상호관계를 갖는다. 미국 특허 제4,554,101호는 하기 친수성 값이 아미노산 잔기에 배정된다고 기술하고 있다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스파르테이트(+3.0±1); 글루타메이트(+3.0±1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글리신(0); 프롤린(-0.5±1); 쓰레오닌(-0.4); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 류신(-1.8); 이소류신(-1.8); 티로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4). 아미노산은 유사한 친수성 값을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환될 수 있고 여전히 생물학적 등가, 특히 면역학적 등가 폴리펩티드를 수득할 수 있는 것으로 이해된다. 이러한 변화에서, ±2 이내의 친수성 값을 갖는 아미노산의 치환이 바람직하고, ±1 이내의 친수성 값을 갖는 아미노산의 치환이 특히 바람직하고, ±0.5 이내의 친수성 값을 갖는 아미노산의 치환이 훨씬 더 특히 바람직하다. 다양한 상기 특징들을 고려하는 예시적 치환은 당업자에게 잘 공지되어 있고 하기 치환을 포함하나 이들로 한정되지 않는다: 아르기닌 및 라이신; 글루타메이트 및 아스파르테이트; 세린 및 쓰레오닌; 글루타민 및 아스파라긴; 및 발린, 류신 및 이소류신.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "효과적인 면역원성 양"은 척추동물 숙주에서 면역반응을 이끌어내기에 효과적인 폴리펩티드의 양 또는 폴리펩티드를 포함하는 조성물의 양을 의미한다. 예를 들면, 본 발명의 rLP2086 단백질의 효과적인 면역원성 양은 척추동물 숙주에서 면역반응을 이끌어내기에 효과적인 양이다. 구체적인 "효과적인 면역원성 투여량 또는 양"은 숙주의 연령, 체중 및 의학적 상태뿐만 아니라 투여 방법에 의해 좌우될 것이다. 적합한 투여량은 당업자에 의해 용이하게 결정된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "Gly/Ser 줄기"는 ORF2086에 의해 코딩된 단백질의 N-말단 Cys 잔기의 바로 하류에 위치하는 일련의 Gly 및 Ser 잔기를 의미한다. Gly/Ser 줄기에 5개 내지 12개의 Gly 및 Ser 잔기들이 존재할 수 있다. 따라서, Gly/Ser 줄기는 ORF2086에 의해 코딩된 단백질의 아미노산 2 내지 아미노산 7 또는 아미노산 2 내지 아미노산 13으로 구성된다. 바람직하게는, Gly/Ser 줄기는 ORF2086에 의해 코딩된 단백질의 아미노산 2 내지 아미노산 7 또는 아미노산 2 내지 아미노산 13으로 구성된다. 본 발명의 P2086 변이체의 Gly/Ser 줄기는 도 2에서 밑줄친 서열(서열번호 12 내지 서열번호 21)로 표시된다. 본원에 제시된 바와 같이, Gly/Ser 줄기의 길이는 비-지질화된 P2086 변이체의 안정성 또는 발현 수준에 영향을 미칠 수 있다. 예시적 실시양태에서, Gly/Ser 줄기의 길이로부터 영향을 받는 효과는 상응하는 야생형 변이체의 효과와 비교된다.

용어 "면역원성"은 체액성 또는 세포 매개된 면역반응, 또는 이들 둘다를 이끌어내는 항원 또는 백신의 능력을 의미한다.

본원에서 상호교환적으로 사용되는 "면역원성 양", 또는 "면역학적 유효량" 또는 "투여량"은 일반적으로 당업자에게 공지된 표준 분석에 의해 측정되었을 때 면역반응, 즉 세포성(T 세포) 또는 체액성(B 세포 또는 항체) 반응, 또는 이들 둘다를 이끌어내기에 충분한 항원 또는 면역원성 조성물의 양을 의미한다.

용어 "면역원성 조성물"은 대상체에서 면역반응을 이끌어내기 위해 사용될 수 있는, 항원, 예를 들면, 미생물 또는 이들의 성분을 함유하는 임의의 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 면역원성 조성물은 전신 경피 또는 점막 경로를 통해 상기 면역원성 조성물을 투여함으로써 네이세리아 메닝기티디스 감염에 민감한 인간을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 이들 투여는 근육내(i.m.), 복강내(i.p.), 피내(i.d.) 또는 피하 경로를 통한 주입; 패치 또는 다른 경피 전달 장치에 의한 도포; 또는 구강/소화관, 호흡관 또는 비뇨생식관에의 점막 투여를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 백신의 제조에 사용될 수 있거나 대상체를 수동적으로 보호하거나 치료하기 위해 사용될 수 있는 다중클론 또는 단일클론 항체를 이끌어내는 데에 사용될 수 있다.

특정 면역원성 조성물에 대한 성분의 최적 양은 대상체에서 적절한 면역반응을 관찰하는 단계를 포함하는 표준 연구에 의해 확인될 수 있다. 초기 백신접종 후, 대상체는 적절한 간격을 두고 1회 또는 수회 부스터(booster) 면역화를 제공받을 수 있다.

용어 "단리된"은 물질이 그의 원래의 환경(예를 들면, 상기 물질이 천연적으로 발생하는 경우 천연 환경, 또는 상기 물질이 재조합 물질이거나 하나의 환경으로부터 상이한 환경으로 옮겨진 경우 그의 숙주 유기체)로부터 회수되는 것을 의미한다. 예를 들면, "단리된" 단백질 또는 펩티드는 상기 단백질이 유래된 세포 또는 조직 공급원으로부터의 세포 물질 또는 다른 오염 단백질을 실질적으로 갖지 않거나, 화학적으로 합성되었거나 화학반응의 부분으로서 혼합물에 존재하는 경우 화학적 전구체 또는 다른 화학물질을 실질적으로 갖지 않는다. 본 발명에서, 단백질은 이 단백질이 면역원성 조성물의 제조에 유용한 형태로 제공되도록 세균 세포 또는 세포 데브리스(debris)로부터 단리될 수 있다. 용어 "단리된" 또는 "단리하는"은 예를 들면, 본원에 기재된 바와 같은 단백질의 정제 방법을 포함하는 정제 단계 또는 정제를 포함할 수 있다. 표현 "세포 물질을 실질적으로 갖지 않는"은 폴리펩티드 또는 단백질의 단리 또는 재조합 제조에 사용된 세포의 세포 성분으로부터 분리되어 있는 상기 폴리펩티드 또는 단백질의 제제를 포함한다. 따라서, 세포 물질을 실질적으로 갖지 않는 단백질 또는 펩티드는 (건조 중량을 기준으로) 약 30%, 20%, 10%, 5%, 2.5% 또는 1% 미만의 오염 단백질 또는 폴리사카라이드 또는 다른 세포 물질을 갖는 캡슐형 폴리사카라이드, 단백질 또는 펩티드의 제제를 포함한다. 폴리펩티드/단백질은 재조합적으로 제조되는 경우 바람직하게는 배양 배지도 실질적으로 함유하지 않는다(즉, 배양 배지는 단백질 제제의 부피의 약 20%, 10% 또는 5% 미만을 차지한다). 폴리펩티드 또는 단백질은 화학적 합성에 의해 제조되는 경우 바람직하게는 화학적 전구체 또는 다른 화학물질을 실질적으로 갖지 않는다(즉, 상기 폴리펩티드 또는 단백질은 단백질 또는 폴리사카라이드의 합성에 수반된 화학적 전구체 또는 다른 화학물질로부터 분리되어 있다). 따라서, 폴리펩티드 또는 단백질의 이러한 제제는 관심있는 폴리펩티드/단백질 또는 폴리사카라이드 단편 이외에 (건조 중량을 기준으로) 약 30%, 20%, 10% 또는 5% 미만의 화학적 전구체 또는 화합물을 갖는다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "N-말단 꼬리"는 ORF2086에 의해 코딩된 단백질의 N-말단 부분으로서, 상기 단백질을 세포막에 부착시키는 N-말단 부분을 의미한다. N-말단 꼬리는 도 3에서 측면도 구조의 하부에 제시되어 있다. N-말단 꼬리는 전형적으로 ORF2086에 의해 코딩된 단백질의 N-말단 16개 아미노산을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, N-말단 꼬리는 서열번호 12 내지 서열번호 21 중 어느 하나의 아미노산 1 내지 16이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "ORF2086"은 네이세리아 종 세균으로부터의 개방 판독 프레임(Open Reading Frame) 2086을 의미한다. 네이세리아 ORF2086, 이로부터 코딩된 단백질, 이 단백질의 단편, 및 이 단백질을 포함하는 면역원성 조성물은 당업계에 공지되어 있고 예를 들면, 국제특허출원 공개 제2003/063766호, 및 미국 특허출원 공개 제20060257413호 및 제20090202593호(이들 각각은 전체적으로 본원에 참고로 도입됨)에 기재되어 있다.

용어 "P2086"은 일반적으로 ORF2086에 의해 코딩된 단백질을 의미한다. "2086" 앞의 "P"는 "단백질"의 약어이다. 본 발명의 P2086 단백질은 지질화될 수 있거나 비-지질화될 수 있다. "LP2086" 및 "P2086"은 전형적으로 각각 2086 단백질의 지질화된 형태 및 비-지질화된 형태를 의미한다. 본 발명의 P2086 단백질은 재조합 단백질일 수 있다. "rLP2086" 및 "rP2086"은 전형적으로 각각 재조합 2086 단백질의 지질화된 형태 및 비-지질화된 형태를 의미한다. "2086"은 인자 H에 결합하는 그의 능력으로 인해 인자 H 결합 단백질(fHBP)로도 공지되어 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용가능한 담체"는 인간 또는 다른 척추동물 숙주에 투여되기에 적합한 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함하기 위한 것이다. 전형적으로, 약학적으로 허용가능한 담체는 인간 및 비-인간 포유동물을 포함하는 동물에서의 사용에 대해 연방정부 또는 주정부의 규제 관청 또는 다른 규제 관청에 의해 승인받았거나 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인정된 약전에 나열된 담체이다. 용어 "담체"는 약학 조성물과 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제 또는 비히클을 의미한다. 이러한 약학 담체는 석유, 동물, 식물 또는 합성 유래의 멸균 액체, 예컨대, 물 및 오일일 수 있다. 물, 식염수 용액, 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 액체 담체로서, 특히 주입 용액으로서 사용될 수 있다. 적합한 약학 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 초크, 실리카 겔, 스테아르산나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 탈지분유, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 원하는 경우, 조성물은 소량의 습윤화제, 증량제, 에멀젼화제 또는 pH 완충제도 함유할 수 있다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 지속 방출 제제 등의 형태를 취할 수 있다. 적합한 약학 담체의 예는 문헌("Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin)에 기재되어 있다. 제제는 투여 방식에 적합해야 한다. 적절한 담체는 당업자에게 자명할 것이고 주로 투여 경로에 의해 좌우될 것이다.

"보호" 면역반응은 감염으로부터 대상체를 보호하는 데에 기여하는 체액성 또는 세포 매개된 면역반응을 이끌어내는 면역원성 조성물의 능력을 의미한다. 제공된 보호는 대조군 대상체 집단, 예를 들면, 백신 또는 면역원성 조성물을 투여받지 않은 감염된 동물에 비해 통계적으로 유의한 개선이 있는 경우 절대적일 필요는 없다(즉, 감염이 완전히 예방되거나 박멸될 필요는 없다). 보호는 감염의 증상의 중증도 또는 발병의 신속도의 경감으로 한정될 수 있다. 일반적으로, "보호 면역반응"은 각각의 항원에 대한 일정한 수준의 측정가능한 기능적 항체 반응을 포함하는, 50% 이상의 대상체에서 특정 항원에 대해 특이적인 항체 수준의 증가의 유도를 포함할 것이다. 특정 상황에서, "보호 면역반응"은 각각의 항원에 대한 일정한 수준의 측정가능한 기능적 항체 반응을 포함하는, 50% 이상의 대상체에서 특정 항원에 대해 특이적인 항체 수준의 2배 증가 또는 항체 수준의 4배 증가의 유도를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 옵소닌화(opsonising) 항체는 보호 면역반응과 상관관계를 갖는다. 따라서, 보호 면역반응은 혈청 살균 활성(SBA) 분석 또는 옵소닌식균작용(opsonophagocytosis) 분석, 예를 들면, 이하에 기재된 분석에서 세균 수의 % 감소를 측정함으로써 분석될 수 있다. 이러한 분석은 당업계에도 공지되어 있다. 수막구균 백신의 경우, SBA 분석은 보호에 대한 확립된 대용 분석이다. 몇몇 실시양태에서, 면역원성 조성물의 부재 하의 세균 수에 비해 10%, 25%, 50%, 65%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 세균 수 감소가 존재한다.

용어 "단백질", "폴리펩티드" 및 "펩티드"는 아미노산 잔기로 구성된 중합체를 의미하고 최소 길이의 생성물로 한정되지 않는다. 따라서, 펩티드, 올리고펩티드, 이량체, 다량체 등이 이 정의에 포함된다. 전장 단백질 및 이의 단편 둘다가 이 정의에 포함된다. 또한, 상기 용어는 바람직하게는 단백질이 이 단백질을 투여받은 동물 내에서 면역학적 반응을 이끌어내는 능력을 유지하도록 천연 서열에 대한 변형, 예컨대, 결실, 부가 및 치환(일반적으로 성질 면에서 보존적 치환이지만 비-보존적 치환일 수 있음)을 포함한다. 발현 후 변형, 예를 들면, 글리코실화, 아세틸화, 지질화, 인산화 등도 포함된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "재조합"은 유전공학 방법에 의해 제조된임의의 단백질, 폴리펩티드 또는 관심있는 유전자를 발현하는 세포를 의미한다. 단백질 또는 폴리펩티드와 관련하여 사용된 용어 "재조합"은 재조합 폴리뉴클레오티드의 발현에 의해 제조된 폴리펩티드를 의미한다. 본 발명의 단백질은 천연 공급원으로부터 단리될 수 있거나 유전공학 방법에 의해 제조될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "재조합"은 그의 기원 또는 조작에 의해 천연 상태에서 회합되어 있는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 부분과 회합되어 있지 않은 핵산 분자도 기술한다. 숙주 세포와 관련하여 사용된 용어 "재조합"은 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 의미한다.

용어 "안정화제"는 항원에 결합하여 일정한 시간에 걸쳐 항원의 에피토프 또는 면역반응성을 유지하는 화합물을 의미한다. 안정화제는 당업계에 공지되어 있다. 안정화제의 예에는 다가 양이온, 예를 들면, 칼슘 또는 알루미늄이 포함된다.

용어 "대상체"는 포유동물, 조류, 어류, 파충류 또는 임의의 다른 동물을 의미한다. 용어 "대상체"는 인간도 포함한다. 용어 "대상체"는 애완동물도 포함한다. 애완동물의 비-한정적 예에는 개, 고양이, 돼지, 토끼, 래트, 마우스, 게르빌루스쥐, 햄스터, 기니아 피그, 흰담비, 조류, 뱀, 도마뱀, 어류, 거북이 및 개구리가 포함된다. 용어 "대상체"는 가축 동물도 포함한다. 가축 동물의 비-한정적 예에는 알파카, 들소, 낙타, 소, 사슴, 돼지, 말, 라마, 노새, 당나귀, 양, 염소, 토끼, 순록, 야크, 닭, 거위 및 칠면조가 포함된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "포유동물"은 임의의 포유동물, 예를 들면, 인간, 마우스, 토끼, 비-인간 영장류를 의미한다. 바람직한 실시양태에서, 포유동물은 인간이다.

상호교환적으로 사용되는 용어 "백신" 또는 "백신 조성물"은 대상체에서 면역반응을 유도하는 1개 이상의 면역원성 조성물을 포함하는 약학 조성물을 의미한다.

일반적인 설명

본 발명은 예를 들면, 문헌(Fletcher et al., Infection & Immunity. Vol. 72(4):2088-2100 (2004))에 기재된 바와 같이 P2086의 비-지질화된 변이체의 특정 제제 및 투약 스캐쥴이 P2086의 기존 제제보다 더 높은 살균 항체 역가를 이끌어낸다는 신규 발견으로부터 비롯된다. 대안적으로, 본 발명은 P2086의 비-지질화된 변이체의 특정 제제 및 투약 스캐쥴이 지질화된 LP2086 변이체의 상업적으로 입수가능한 제제보다 더 높은 살균 항체 역가를 이끌어낸다는 신규 발견으로부터 비롯된다. 그러나, 지질화된 LP2086의 상업적 제제가 현재 사용될 수 없다는 것을 주목한다. 지질화된 rLP2086 백신에 비해 비-지질화된 rLP2086 변이체를 함유하는 백신에 대해 더 높은 반응률(기준에 비해 SBA 역가의 4배 이상 증가에 의해 정의됨)이 관찰되었다. 비-지질화된 P2086 변이체의 제제는 유사한(>92% ID) 및 다양한(<92% ID) LP2086 서열을 갖는 균주들을 포함하는 보다 넓은 범위의 균주들에 대한 살균 항체를 이끌어내었다.

또한, 본 발명은 비-지질화된 P2086 변이체를 발현함에 있어서 종래 확인되지 않은 어려움을 확인하고 이들 어려움을 극복하는 방법 및 이로부터 유도된 신규 조성물을 제공한다. 비-지질화된 P2086 변이체를 코딩하는 플라스미드 구축물이 비-지질화된 변이체의 강한 발현을 제공하였지만, 이들 변이체는 N-말단 Cys 상에서 피루빌화되어 있었다. 피루빌화는 폴리펩티드의 제조 일관성 또는 균일성의 가능성을 방해하거나 감소시킨다. 본 발명자들은 비-지질화된 P2086 변이체 서열로부터의 N-말단 Cys의 결실이 비-지질화된 P2086 변이체의 피루빌화를 방지한다는 것을 추가로 발견하였다. N-말단 Cys에 대한 코돈의 결실을 통해 피루빌화를 극복하고자 하는 시도는 발현을 방해하였거나 불용성 변이체의 발현을 초래하였다. 대안적으로, 비-지질화된 P2086 변이체로부터의 N-말단 Cys의 제거는 일부 변이체들의 발현을 감소시켰다. 그러나, 놀랍게도, 본 발명자들은 N-말단 Cys 잔기의 결실에도 불구하고 적어도 비-피루빌화되고 비-지질화된 A05, B01, B09 및 B44 변이체가 발현될 수 있다는 것을 발견하였다. 일반적으로, 이들 폴리펩티드는 상응하는 야생형 비-지질화된 서열과 비교되었을 때 Cys 결실 이외의 추가 변형 없이 발현될 수 있었다. 예를 들면, 실시예 2 및 4를 참조한다. 나아가, 본 발명자들은 비-피루빌화되고 비-지질화된 변이체가 놀랍게도 면역원성을 나타내고 예상외로 살균 항체를 이끌어낸다는 것을 발견하였다.

따라서, 본 발명은 비-지질화된 변이체를 발현함에 있어서 이들 어려움의 가능성을 극복하거나 감소시키는 2개의 방법을 제공한다. 그러나, 추가 방법이 본 발명에 의해 고려된다. 제1 방법은 N-말단 꼬리에서 N-말단 Cys의 바로 하류에 위치하는 Gly/Ser 줄기의 길이를 변화시키는 것이었다. 제2 방법은 N-말단 꼬리 내에서의 코돈 최적화이었다. 그러나, 추가 코돈의 최적화가 본 발명에 의해 고려된다. 이들 방법은 가용성 비-지질화된 P2086 변이체의 향상된 발현을 제공한다. 예를 들면, 한 실시양태에서, 가용성 비-지질화된 P2086 변이체의 향상된 발현은 상응하는 야생형 비-지질화된 변이체의 발현과 비교된다.

단리된 폴리펩티드

본 발명자들은 놀랍게도 단리되고 비-피루빌화되고 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드를 발견하였다. 또한, 본 발명자들은 상기 폴리펩티드가 예상외로 면역원성을 나타내고 살균 면역반응을 이끌어낼 수 있다는 것을 추가로 발견하였다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "비-피루빌화된"은 피루베이트 함량을 갖지 않는 폴리펩티드를 의미한다. 피루베이트 함량을 갖는 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드는 상응하는 야생형 폴리펩티드에 비해 전형적으로 +70의 질량 이동(shift)을 나타내었다. 한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 질량 분광측정에 의해 측정되었을 때 상응하는 야생형 비-지질화된 폴리펩티드에 비해 +70의 질량 이동을 나타내지 않는다. 예를 들면, 실시예 10을 참조한다.

또 다른 실시양태에서, 단리되고 비-피루빌화되고 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드는 상응하는 야생형 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드에 비해 N-말단 시스테인 잔기의 결실을 포함한다. 용어 "N-말단 시스테인"은 폴리펩티드의 N-말단 또는 N-말단 꼬리에 위치하는 시스테인(Cys)을 의미한다. 보다 구체적으로, 본원에서 사용된 바와 같이, "N-말단 시스테인"은 LP2086 지단백질이 당업계에 공지되어 있는 바와 같이 트리팔미토일 지질 꼬리로 지질화되는 N-말단 시스테인을 의미한다. 예를 들면, 서열번호 12 내지 서열번호 21 중 어느 하나를 기준 서열로서 지칭할 때, N-말단 시스테인은 위치 1에 위치한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "야생형 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드" 또는 "야생형 비-지질화된 2086 폴리펩티드" 또는 "야생형 비-지질화된 폴리펩티드"는 천연 상태에서 발견되는 상응하는 성숙 지질화된 ORF2086 폴리펩티드의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖는 ORF2086 폴리펩티드를 의미한다. 비-지질화된 분자와 지질화된 분자 사이의 유일한 차이는 야생형 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드가 N-말단 시스테인에서 트리팔미토일 지질 꼬리로 지질화되어 있지 않다는 점이다.

당업계에 공지되어 있는 바와 같이, 비-지질화된 2086 형태는 원래의 리더 서열을 결여하는 단백질에 의해 생성되거나, 숙주 세포에서 지방산 아실화를 위한 부위를 특정하지 않은 서열의 부분으로 치환되어 있는 리더 서열에 의해 생성된다. 예를 들면, 전체적으로 본원에 참고로 도입되는 국제특허출원 공개 제2003/063766호를 참조한다.

비-지질화된 ORF2086의 예에는 전술된 야생형 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드뿐만 아니라 서열번호 12 내지 서열번호 21 중 어느 하나에 따른 아미노산 서열을 갖되 N-말단 Cys이 결실된 폴리펩티드, 및 서열번호 12 내지 서열번호 21 중 어느 하나에 따른 아미노산 서열을 갖되 N-말단 Cys이 치환된 폴리펩티드도 포함된다. 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드의 추가 예에는 서열번호 44, 서열번호 49, 서열번호 55, 서열번호 57, 서열번호 62 및 서열번호 64로부터 선택된 아미노산 서열이 포함된다.

야생형 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드의 예에는 도 2에 제시된 서열번호 12 내지 서열번호 21, 서열번호 58, 서열번호 59 및 서열번호 60 중 어느 하나에 따른 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 포함된다. 이들 예시적 야생형 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드는 N-말단 Cys을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 예를 들면, "비-지질화된" B44 폴리펩티드는 서열번호 21, 위치 1의 N-말단 Cys이 결실된 서열번호 21 및 서열번호 44로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. "야생형 비-지질화된" B44 폴리펩티드는 서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. "비-피루빌화되고 비-지질화된" B44 폴리펩티드는 위치 1의 N-말단 Cys이 결실된 서열번호 21 및 서열번호 44로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.

또 다른 예로서, 본원에서 사용된 바와 같이, "비-지질화된" B09 폴리펩티드는 서열번호 18, 위치 1의 N-말단 Cys이 결실된 서열번호 18, 서열번호 49 및 서열번호 50으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. "야생형 비-지질화된" B09 폴리펩티드는 서열번호 18의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. "비-피루빌화되고 비-지질화된" B09는 위치 1의 N-말단 Cys이 결실된 서열번호 18, 서열번호 49 및 서열번호 50으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.

추가 예로서, 본원에서 사용된 바와 같이, "비-지질화된" A05 폴리펩티드는 서열번호 13, 위치 1의 N-말단 Cys이 결실된 서열번호 13 및 서열번호 55로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. "야생형 비-지질화된" A05는 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. "비-피루빌화되고 비-지질화된" A05는 위치 1의 N-말단 Cys이 결실된 서열번호 13 및 서열번호 55로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 N-말단 Cys의 "결실"은 야생형 비-지질화된 폴리펩티드 서열에 비해 N-말단 Cys을 결실시키는 돌연변이를 포함한다. 예를 들면, N-말단 Cys의 "결실"은 기준 서열, 예를 들면, 상응하는 야생형 서열로부터 아미노산 Cys을 제거하여 상기 기준 서열에 비해 아미노산 잔기를 감소시키는 것을 의미한다.

또 다른 실시양태에서, N-말단 Cys은 Cys 잔기가 아닌 아미노산으로 치환된다. 예를 들면, 예시적 실시양태에서, 서열번호 12 내지 서열번호 21의 위치 1의 N-말단 Cys은 위치 1에서 C→G 치환을 포함한다. 예를 들면, 서열번호 19(B22 야생형)와 비교하여 서열번호 62를 참조하고 서열번호 15(A22 야생형)와 비교하여 서열번호 64를 참조한다. N-말단 Cys을 치환시키는 예시적 아미노산은 임의의 비-Cys 아미노산, 바람직하게는 극성 비-하전된 아미노산, 예컨대, 글리신을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 치환은 Cys에 대한 비-보존적 잔기에 의해 만들어진다.

본 발명자들은 놀랍게도 N-말단 Cys 잔기의 결실을 갖는 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드의 발현이 질량 분광측정에 의해 측정되었을 때 상응하는 야생형 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드에 비해 검출가능한 피루빌화를 발생시키지 않는다는 것을 발견하였다. 비-피루빌화되고 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드의 예에는 서열번호 12(A04), 서열번호 13(A05), 서열번호 14(A12), 서열번호 15(A22), 서열번호 16(B02), 서열번호 17(B03), 서열번호 18(B09), 서열번호 19(B22), 서열번호 20(B24) 및 서열번호 21(B44)로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 포함되고, 이때 위치 1의 시스테인이 결실된다. 단리되고 비-피루빌화되고 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드의 추가 예에는 서열번호 44, 서열번호 49, 서열번호 50 및 서열번호 55로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 포함된다. 바람직하게는, 비-피루빌화되고 비-지질화된 2086 폴리펩티드는 약 250개, 255개 또는 260개 이상의 연속 아미노산 내지 약 270개, 269개, 268개, 267개, 266개, 265개, 264개, 263개, 260개, 259개, 258개, 257개, 256개 또는 255개 이하의 연속 아미노산을 포함한다. 임의의 최소 값이 임의의 최대 값과 조합되어 범위를 정의할 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 폴리펩티드는 254개 또는 262개 이상의 연속 아미노산을 갖는다.

한 실시양태에서, 단리되고 비-피루빌화되고 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드는 세균 세포에서 발현될 수 있는 발현 시스템에 작동가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 예시적 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 이 뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 조절 서열에 연결되어 있다.

적합한 발현 시스템, 조절 서열 및 세균 세포는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 폴리펩티드가 세균 세포에서 발현될 수 있는 한, 임의의 플라스미드 발현 벡터, 예를 들면, PET(상표)(노보겐(Novogen), 미국 위스콘신주 매디슨 소재) 또는 PMAL(상표)(뉴잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs), 미국 매사추세츠주 비벌리 소재)이 사용될 수 있다. 바람직하게는, PET(상표) 벡터는 에스케리치아 콜라이에서 재조합 단백질의 클로닝 및 발현을 위해 사용된다. PET(상표) 시스템에서, 클로닝된 유전자는 파지 T7 프로모터의 조절 하에 발현될 수 있다. 예시적 세균 세포는 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) 및 바람직하게는 에스케리치아 콜라이를 포함한다.

한 양태에서, 본 발명은 방법에 의해 수득될 수 있는 비-피루빌화되고 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드에 관한 것이다. 상기 폴리펩티드는 바람직하게는 단리된다. 추가로, 본 발명은 방법에 의해 수득될 수 있는 비-피루빌화되고 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 바람직하게는 면역원성 조성물이다. 상기 방법은 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20 및 서열번호 21로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 발현하는 단계를 포함하고, 이때 위치 1의 시스테인이 결실된다. 상기 뉴클레오티드 서열은 세균 세포에서 발현될 수 있는 발현 시스템에 작동가능하게 연결된다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 서열번호 44, 서열번호 49, 서열번호 50 및 서열번호 55로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 발현하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열번호 43, 서열번호 51, 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 45 및 서열번호 54로 구성된 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 상기 세균 세포는 에스케리치아 콜라이이다.

한 양태에서, 본 발명은 서열번호 49에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 제1 단리된 폴리펩티드, 및 서열번호 44에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 제2 단리된 폴리펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 상기 폴리펩티드들은 면역원성을 나타낸다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 상기 조성물은 혈청군 B 네이세리아 메닝기티디스로부터의 ORF2086 서브패밀리 A 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 바람직하게는, ORF2086 서브패밀리 A 폴리펩티드는 비-피루빌화되고 비-지질화된 ORF2086 서브패밀리 A 폴리펩티드이다. 예시적 실시양태에서, ORF2086 서브패밀리 A 폴리펩티드는 A05이고, 이의 예에는 예를 들면, 위치 1의 N-말단 시스테인이 결실된 서열번호 13 및 서열번호 55가 포함된다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 단리된 폴리펩티드를 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 서열번호 21에 대해 90% 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩티드를 세균 세포에서 발현하는 단계를 포함하고, 이때 상기 서열은 서열번호 21의 아미노산 13 내지 18, 서열번호 21의 아미노산 21 내지 34, 및 서열번호 21의 아미노산 70 내지 80으로 구성된 군으로부터 선택된 1개 이상의 도메인 또는 이들의 조합물을 포함하고, 이때 상기 폴리펩티드는 N-말단 시스테인을 결여한다. 상기 방법은 상기 폴리펩티드를 정제하는 단계를 추가로 포함한다. 제조된 상기 폴리펩티드는 비-피루빌화되고 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드를 포함한다. 바람직하게는, 상기 폴리펩티드는 면역원성을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, 상기 세균 세포는 에스케리치아 콜라이이다.

서열번호 21의 아미노산 13 내지 18, 서열번호 21의 아미노산 21 내지 34, 및 서열번호 21의 아미노산 70 내지 80으로 구성된 군으로부터 선택된 1개 이상의 도메인 또는 이들의 조합물을 포함하는 폴리펩티드의 예에는 서열번호 12(A04), 서열번호 13(A05), 서열번호 14(A12), 서열번호 15(A22), 서열번호 16(B02), 서열번호 17(B03), 서열번호 18(B09), 서열번호 19(B22), 서열번호 20(B24) 및 서열번호 21(B44)이 포함된다. 바람직하게는, 이들 폴리펩티드의 위치 1의 시스테인은 결실된다. 추가 예시적 폴리펩티드는 서열번호 44, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 55, 서열번호 62 및 서열번호 64를 포함한다.

한 예시적 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드는 서열번호 21의 아미노산 96 내지 116, 서열번호 21의 아미노산 158 내지 170, 서열번호 21의 아미노산 172 내지 185, 서열번호 21의 아미노산 187 내지 199, 서열번호 21의 아미노산 213 내지 224, 서열번호 21의 아미노산 226 내지 237, 및 서열번호 21의 아미노산 239 내지 248로 구성된 군으로부터 선택된 1개 이상의 도메인 또는 이들의 조합물을 추가로 포함한다. 서열번호 21의 아미노산 13 내지 18, 서열번호 21의 아미노산 21 내지 34, 및 서열번호 21의 아미노산 70 내지 80으로 구성된 군으로부터 선택된 1개 이상의 도메인 또는 이들의 조합물을 포함하고 서열번호 21의 아미노산 96 내지 116, 서열번호 21의 아미노산 158 내지 170, 서열번호 21의 아미노산 172 내지 185, 서열번호 21의 아미노산 187 내지 199, 서열번호 21의 아미노산 213 내지 224, 서열번호 21의 아미노산 226 내지 237, 및 서열번호 21의 아미노산 239 내지 248로 구성된 군으로부터 선택된 1개 이상의 도메인 또는 이들의 조합물을 추가로 포함하는 폴리펩티드의 예에는 서열번호 16(B02), 서열번호 17(B03), 서열번호 18(B09), 서열번호 19(B22), 서열번호 20(B24) 및 서열번호 21(B44)이 포함된다. 바람직하게는, 이들 폴리펩티드의 위치 1의 시스테인은 결실된다. 추가 예시적 폴리펩티드는 서열번호 44, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 55 및 서열번호 62로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.

한 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 방법에 의해 제조된 단리된 폴리펩티드에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 상기 단리된 폴리펩티드는 비-피루빌화되고 비-지질화된 폴리펩티드이다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 방법에 의해 제조된 면역원성 조성물에 관한 것이다.

한 양태에서, 본 발명은 위치 1의 N-말단 Cys이 결실된 서열번호 18 또는 서열번호 49에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드에 관한 것이다. 서열번호 49를 코딩하는 예시적 뉴클레오티드 서열은 서열번호 46, 서열번호 47 및 서열번호 48로부터 선택된 서열을 포함한다. 바람직하게는, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열번호 46이다. 한 양태에서, 본 발명은 서열번호 46을 포함하는 단리된 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 한 양태에서, 본 발명은 서열번호 47을 포함하는 단리된 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 한 양태에서, 본 발명은 서열번호 48을 포함하는 단리된 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다.

한 양태에서, 본 발명은 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48 및 서열번호 45로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드에 관한 것이고, 이때 상기 플라스미드는 세균 세포에서 발현될 수 있다. 적합한 발현 시스템, 조절 서열 및 세균 세포는 전술된 바와 같이 당업계에 공지되어 있다. 바람직하게는, 세균 세포는 에스케리치아 콜라이이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 50에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드에 관한 것이다. 예시적 실시양태에서, 서열번호 50은 서열번호 45에 의해 코딩된다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 N-말단 Cys이 결실된 서열번호 21 또는 서열번호 44에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드에 관한 것이다. 서열번호 44를 코딩하는 예시적 뉴클레오티드 서열은 서열번호 43 및 서열번호 51로부터 선택된 서열을 포함한다. 바람직하게는, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열번호 43이다. 한 양태에서, 본 발명은 서열번호 43을 포함하는 단리된 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다.

면역원성 조성물

바람직한 실시양태에서, 단리되고 비-피루빌화되고 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드를 포함하는 본원에 기재된 조성물은 면역원성을 나타낸다. 네이세리아 메닝기티디스 ORF2086으로부터의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 단백질을 포함하는 면역원성 조성물이 당업계에 공지되어 있다. 예시적 면역원성 조성물은 전체적으로 본원에 참고로 도입되는 국제특허출원 공개 제2003/063766호, 및 미국 특허출원 공개 제20060257413호 및 제20090202593호에 기재된 면역원성 조성물을 포함한다. 본원에 기재된 이러한 면역원성 조성물은 ORF2086 단백질로서 확인된 살균 활성을 나타내는 단백질, 이의 면역원성 부분 및/또는 이들의 생물학적 등가물을 포함한다. ORF2086 단백질은 네이세리아 종의 개방 판독 프레임 2086에 의해 코딩된 단백질을 의미한다.

상기 단백질은 재조합 단백질 또는 천연 네이세리아 종으로부터 단리된 단백질일 수 있다. 예를 들면, 네이세리아 ORF2086 단백질, 및 상기 단백질의 면역원성 부분 및/또는 생물학적 등가물은 세균 균주, 예컨대, 네이세리아 메닝기티디스(혈청군 A, B, C, D, W-135, X, Y, Z 및 29E), 네이세리아 고노로이애(Neisseria gonorrhoeae) 및 네이세리아 락타미카(Neisseria lactamica)의 균주들을 포함하는 네이세리아 종의 균주로부터 단리될 수 있다.

ORF2086 단백질은 2086 서브패밀리 A 단백질 및 서브패밀리 B 단백질, 이들의 면역원성 부분 및/또는 이들의 생물학적 등가물을 포함한다. 2086 서브패밀리 A 단백질 및 2086 서브패밀리 B 단백질은 당업계에 공지되어 있다(예를 들면, 상기 인용된 문헌(Fletcher et al., 2004) 및 문헌(Murphy et al., J Infect Dis. 2009 Aug 1;200(3):379-89) 참조). 2086 서브패밀리 A 단백질과 관련된 아미노산 서열을 나타내는 것으로서 서열번호 260 내지 서열번호 278을 개시하는 국제특허출원 공개 제2003/063766호도 참조한다. 또한, 2086 서브패밀리 B 단백질과 관련된 아미노산 서열을 나타내는 것으로서 서열번호 279 내지 서열번호 299가 국제특허출원 공개 제2003/063766호에 개시되어 있다. 국제특허출원 공개 제2003/063766호는 전체적으로 본원에 참고로 도입된다. ORF2086 단백질 또는 이의 등가물 등은 지질화될 수 있거나 비-지질화될 수 있다. 바람직하게는, 네이세리아 ORF2086 단백질은 비-지질화된다. 대안적으로, 면역원성 조성물은 지질화된 ORF2086 단백질과 비-지질화된 ORF2086 단백질의 조합물일 수 있다.

한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 네이세리아 ORF2086으로부터의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 단백질에 대해 95% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 단리된 단백질을 포함한다.

한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 네이세리아 ORF2086으로부터의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 서브패밀리 A 단백질에 대해 95% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 단리된 단백질을 포함한다. 바람직하게는, 면역원성 조성물은 네이세리아 ORF2086으로부터의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 단리된 서브패밀리 A 단백질을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, ORF2086 서브패밀리 A 폴리펩티드는 A05, A04, A12 또는 A22 변이체이다. 몇몇 실시양태에서, ORF2086 서브패밀리 A 폴리펩티드는 A05, A12 또는 A22 변이체이다.

또 다른 실시양태에서, 면역원성 조성물은 네이세리아 ORF2086으로부터의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 서브패밀리 B 단백질에 대해 95% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 단리된 단백질을 포함한다. 바람직하게는, 면역원성 조성물은 네이세리아 ORF2086으로부터의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 단리된 서브패밀리 B 단백질을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, ORF2086 서브패밀리 B 단백질은 B44, B02, B03, B22, B24 또는 B09 변이체이다. 몇몇 실시양태에서, ORF2086 서브패밀리 B 단백질은 B44, B22 또는 B09 변이체이다.

바람직한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 네이세리아 ORF2086으로부터의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 서브패밀리 B 단백질에 대해 95% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 단리되고 비-피루빌화되고 비-지질화된 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들면, 몇몇 실시양태에서, ORF2086 서브패밀리 B 단백질은 서열번호 21에 제시된 아미노산 서열을 갖는 B44; 서열번호 16에 제시된 아미노산 서열을 갖는 B02; 서열번호 17에 제시된 아미노산 서열을 갖는 B03; 서열번호 19에 제시된 아미노산 서열을 갖는 B22; 서열번호 20에 제시된 아미노산 서열을 갖는 B24; N-말단 Cys이 결실된 서열번호 18에 제시된 아미노산 서열을 갖는 B09; 및 이들의 조합물로부터 선택된 서열이다.

보다 바람직하게는, 면역원성 조성물은 비-피루빌화되고 비-지질화된 B09 폴리펩티드, 비-피루빌화되고 비-지질화된 B44 폴리펩티드 또는 이들의 조합물을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 조성물은 N-말단 Cys이 결실된 서열번호 18에 제시된 아미노산 서열을 갖는 비-피루빌화되고 비-지질화된 B09 변이체, N-말단 Cys이 결실된 서열번호 21에 제시된 아미노산 서열을 갖는 비-피루빌화되고 비-지질화된 B44, 또는 이들의 조합물을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 면역원성 조성물은 서열번호 49를 갖는 비-피루빌화되고 비-지질화된 B09, 서열번호 44를 갖는 비-피루빌화되고 비-지질화된 B44, 또는 이들의 조합물을 포함한다.

한 양태에서, 본 발명은 혈청군 B 네이세리아 메닝기티디스로부터의 ORF2086 서브패밀리 B 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것으로서, 이때 상기 폴리펩티드는 비-피루빌화되고 비-지질화된 B44이다. B44는 N-말단 Cys이 결실된 서열번호 21에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호 44에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 조성물은 혈청군 B 네이세리아 메닝기티디스로부터의 제2 ORF2086 서브패밀리 B 폴리펩티드를 추가로 포함하고, 이때 상기 제2 폴리펩티드는 비-피루빌화되고 비-지질화된 B09이다. B09는 N-말단 Cys이 결실된 서열번호 18에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호 49에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 면역원성 조성물은 백신이다.

또 다른 실시양태에서, 상기 조성물은 3개 이하의 ORF2086 서브패밀리 B 폴리펩티드를 포함한다. 추가 실시양태에서, 상기 조성물은 2개 이하의 ORF2086 서브패밀리 B 폴리펩티드를 포함한다.

한 실시양태에서, 상기 조성물은 1개 이상의 ORF2086 서브패밀리 A 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 조성물은 A05 서브패밀리 A 폴리펩티드를 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 면역원성 조성물은 네이세리아 ORF2086으로부터의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 서브패밀리 A 단백질에 대해 95% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 단리된 단백질, 및 네이세리아 ORF2086으로부터의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 서브패밀리 B 단백질에 대해 95% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 단리된 단백질을 포함한다.

바람직하게는, 면역원성 조성물은 네이세리아 ORF2086으로부터의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 단리된 서브패밀리 A 단백질, 및 네이세리아 ORF2086으로부터의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 단리된 서브패밀리 B 단백질을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 면역원성 조성물은 단리되고 비-피루빌화되고 비-지질화된 서브패밀리 A ORF2086 폴리펩티드, 및 단리되고 비-피루빌화되고 비-지질화된 서브패밀리 B ORF2086 폴리펩티드를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, ORF2086 서브패밀리 A 폴리펩티드는 A05, A04, A12 또는 A22 변이체이다. 바람직한 실시양태에서, ORF2086 서브패밀리 A 폴리펩티드는 서열번호 13에 제시된 아미노산 서열을 갖는 A05; 서열번호 12에 제시된 아미노산 서열을 갖는 A04; 서열번호 14에 제시된 아미노산 서열을 갖는 A12; 또는 N-말단 Cys이 결실된 서열번호 15에 제시된 아미노산 서열을 갖는 A22 변이체; 또는 이들의 조합물이다. 몇몇 실시양태에서, ORF2086 서브패밀리 B 단백질은 B44, B02, B03, B22, B24 또는 B09 변이체이다. 바람직한 실시양태에서, ORF2086 서브패밀리 B 단백질은 서열번호 21에 제시된 아미노산 서열을 갖는 B44; 서열번호 16에 제시된 아미노산 서열을 갖는 B02; 서열번호 17에 제시된 아미노산 서열을 갖는 B03; 서열번호 19에 제시된 아미노산 서열을 갖는 B22; 서열번호 20에 제시된 아미노산 서열을 갖는 B24; N-말단 Cys이 결실된 서열번호 18에 제시된 아미노산 서열을 갖는 B09 변이체; 또는 이들의 조합물이다.

한 실시양태에서, 상기 면역원성 조성물은 서브패밀리 A 단백질 및 서브패밀리 B 단백질을 1:1 비로 포함한다.

또 다른 양태에서, 본원에 기재된 단리된 폴리펩티드 및 조성물은 혈청군 B 네이세리아 메닝기티디스로부터의 ORF2086 폴리펩티드에 대한 살균 면역반응을 포유동물에서 이끌어낸다. 상기 조성물은 포유동물에게 투여된 후 살균 항-수막구균 항체를 유도하는 능력을 갖고, 바람직한 실시양태에서 각각의 서브패밀리로 균주에 대한 살균 항체를 유도할 수 있다. 살균 반응에 대한 추가 정보는 이하에 제시된다. 예를 들면, 실시예 6, 11, 12 및 13을 참조한다. 살균 항체는 인간, 및 대용 연구로서 이용되는 임상전 연구에서 보호의 표시자이고, 임의의 신규 면역원성 조성물 후보는 이들 기능성 항체를 이끌어내야 한다.

예시적 실시양태에서, 위치 1의 N-말단 Cys이 결실된 서열번호 18 또는 서열번호 49를 갖는 단리되고 비-피루빌화되고 비-지질화된 B09 폴리펩티드 및 이의 면역원성 조성물은 혈청군 B 네이세리아 메닝기티디스 서브패밀리 A 또는 바람직하게는 서브패밀리 B로부터의 ORF2086 폴리펩티드에 대한(예를 들면, 이 폴리펩티드에 결합할 수 있는) 살균 항체를 이끌어낸다. 바람직하게는, 상기 비-피루빌화되고 비-지질화된 B09 폴리펩티드 및 이의 면역원성 조성물은 A05 변이체(서열번호 13), B44 변이체(서열번호 21), B16 변이체(서열번호 60), B24 변이체(서열번호 20), B09 변이체(서열번호 18) 또는 이들의 조합물에 대한 살균 항체를 이끌어낸다. 예시적 실시양태에서, 상기 비-피루빌화되고 비-지질화된 B09 폴리펩티드 및 이의 면역원성 조성물은 B44 변이체(서열번호 21), B16 변이체(서열번호 60), B24 변이체(서열번호 20), B09 변이체(서열번호 18) 또는 이들의 조합물에 대한 살균 항체를 이끌어낸다. 예를 들면, 실시예 11, 12 및 13을 참조한다.

또 다른 예시적 실시양태에서, 위치 1의 N-말단 Cys이 결실된 서열번호 21 또는 서열번호 44를 갖는 단리되고 비-피루빌화되고 비-지질화된 B44 폴리펩티드 및 이의 면역원성 조성물은 혈청군 B 네이세리아 메닝기티디스 서브패밀리 B로부터의 ORF2086 폴리펩티드에 대한(예를 들면, 이 폴리펩티드에 결합할 수 있는) 살균 항체를 이끌어낸다. 바람직하게는, 비-피루빌화되고 비-지질화된 B44 폴리펩티드 및 이의 면역원성 조성물은 B44 변이체(서열번호 21), B16 변이체(서열번호 60), B24 변이체(서열번호 20), B09 변이체(서열번호 18) 또는 이들의 조합물에 대한 살균 항체를 이끌어낸다. 예를 들면, 실시예 11을 참조한다. 추가로, 상기 비-피루빌화되고 비-지질화된 B44 폴리펩티드 및 이의 면역원성 조성물은 B02 변이체(서열번호 16)에 결합하는 살균 항체도 이끌어낼 수 있다. 예를 들면, 실시예 12 및 13을 참조한다. 나아가, 비-피루빌화되고 비-지질화된 B44 폴리펩티드 및 이의 면역원성 조성물은 B03 변이체(서열번호 17) 및 B15 변이체(서열번호 59)에 결합하는 살균 항체도 이끌어낼 수 있다. 예를 들면, 실시예 6을 참조한다.

추가 예시적 실시양태에서, 위치 1의 N-말단 Cys이 결실된 서열번호 19를 갖는 단리되고 비-피루빌화되고 비-지질화된 B22 폴리펩티드 및 이의 면역원성 조성물은 혈청군 B 네이세리아 메닝기티디스 서브패밀리 B로부터의 ORF2086 폴리펩티드에 대한(예를 들면, 이 폴리펩티드에 결합할 수 있는) 살균 항체를 이끌어낸다. 바람직하게는, 상기 비-피루빌화되고 비-지질화된 B22 폴리펩티드는 B44 변이체(서열번호 21), B16 변이체(서열번호 60), B24 변이체(서열번호 20), B09 변이체(서열번호 18) 또는 이들의 조합물에 대한 살균 항체를 이끌어낸다. 예를 들면, 실시예 13을 참조한다.

한 실시양태에서, N-말단 Cys이 결실된 서열번호 13 또는 서열번호 55를 갖는 단리되고 비-피루빌화되고 비-지질화된 A05 폴리펩티드 및 이의 면역원성 조성물은 혈청군 B 네이세리아 메닝기티디스 서브패밀리 A로부터의 ORF2086 폴리펩티드에 대한(예를 들면, 이 폴리펩티드에 결합할 수 있는) 살균 항체를 이끌어낸다. 바람직하게는, 상기 비-피루빌화되고 비-지질화된 A05 및 이의 면역원성 조성물은 A05 변이체(서열번호 13), A22 변이체(서열번호 15), A12 변이체(서열번호 14) 또는 이들의 조합물에 대한 살균 항체를 이끌어낸다. 예를 들면, 실시예 6 및 13을 참조한다.

한 양태에서, 본 발명은 포유동물에서 혈청군 B 네이세리아 메닝기티디스에 대해 특이적인 살균 항체를 이끌어내는 방법에 관한 것이다. 예시적 실시양태에서, 상기 방법은 ORF2086 서브패밀리 B 혈청군 B 네이세리아 메닝기티디스, ORF2086 서브패밀리 A 혈청군 B 네이세리아 메닝기티디스 또는 이들의 조합물에 대해 특이적인 살균 항체를 이끌어내는 단계를 포함한다. 상기 방법은 전술된 바와 같이 단리되고 비-피루빌화되고 비-지질화된 2086 폴리펩티드 또는 이들의 면역원성 조성물을 포유동물에게 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다.

바람직한 실시양태에서, 상기 방법은 ORF2086 서브패밀리 B 혈청군 B 네이세리아 메닝기티디스에 대해 특이적인 살균 항체를 이끌어내는 단계를 포함한다. 상기 단리된 폴리펩티드 또는 면역원성 조성물은 비-피루빌화되고 비-지질화된 B44 폴리펩티드를 포함한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 상기 조성물은 비-피루빌화되고 비-지질화된 B09 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 예시적 실시양태에서, 상기 단리된 폴리펩티드 또는 면역원성 조성물은 서열번호 49, 서열번호 44 또는 이들의 조합물을 포함한다. 또 다른 예시적 실시양태에서, 상기 단리된 폴리펩티드 또는 면역원성 조성물은 위치 1의 N-말단 Cys이 결실된 서열번호 18, 위치 1의 N-말단 Cys이 결실된 서열번호 21, 또는 이들의 조합물을 포함한다. 또 다른 예시적 실시양태에서, 상기 단리된 폴리펩티드 또는 면역원성 조성물은 위치 1의 N-말단 Cys이 결실된 서열번호 19를 포함한다.

바람직한 실시양태에서, 상기 방법은 ORF2086 서브패밀리 A 혈청군 B 네이세리아 메닝기티디스에 대해 특이적인 살균 항체를 이끌어내는 단계를 포함한다. 상기 단리된 폴리펩티드 또는 면역원성 조성물은 비-피루빌화되고 비-지질화된 A05 폴리펩티드를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 단리된 폴리펩티드 또는 면역원성 조성물은 위치 1의 N-말단 Cys이 결실된 서열번호 13을 포함한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 상기 조성물은 비-피루빌화되고 비-지질화된 B44 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 예를 들면, 실시예 6 및 13을 참조한다. 예시적 실시양태에서, 상기 단리된 폴리펩티드 또는 면역원성 조성물은 서열번호 55, 서열번호 44, 또는 이들의 조합물을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 단리된 폴리펩티드 또는 면역원성 조성물은 위치 1의 N-말단 Cys이 결실된 서열번호 13, 위치 1의 N-말단 Cys이 결실된 서열번호 21, 또는 이들의 조합물을 포함한다.

면역원성 조성물은 네이세리아 ORF2086으로부터의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 폴리뉴클레오티드 또는 등가물에 의해 코딩된 단백질을 상기 면역원성 조성물 중의 단독 활성 면역원으로서 포함할 수 있다. 대안적으로, 상기 면역원성 조성물은 다른 네이세리아 종 면역원성 폴리펩티드, 1개 이상의 다른 미생물 병원체(예를 들면, 바이러스, 프리온, 세균 또는 진균(그러나, 이들로 한정되지 않음))의 면역학적 활성 단백질 또는 캡슐형 폴리사카라이드를 포함하는 활성 면역원을 추가로 포함할 수 있다. 상기 조성물은 선택된 징후에 대해 필요한 경우 1개 이상의 원하는 단백질, 단편 또는 약학 화합물을 포함할 수 있다.

임의의 다중항원 또는 다가 면역원성 조성물이 본 발명에 의해 고려된다. 예를 들면, 상기 면역원성 조성물은 2개 이상의 ORF2086 단백질의 조합물, ORF2086 단백질과 1개 이상의 Por A 단백질의 조합물, ORF2086 단백질과 수막구균 혈청군 A, C, Y 및 W135 폴리사카라이드 및/또는 폴리사카라이드 접합체의 조합물, ORF2086 단백질과 수막구균 및 폐구균 조합물의 조합물, 또는 이들의 임의의 조합물을 원하는 투여, 예를 들면, 점막 전달에 적합한 형태로 포함할 수 있다. 당업자는 이러한 다중항원 또는 다가 면역원성 조성물을 용이하게 제제화할 수 있을 것이다.

본 발명은 병원체에 대한 유용한 임의의 조성물이 서로 조합될 수 있거나 본 발명의 조성물과 조합될 수 있는 다중면역화 요법도 고려한다. 예를 들면, 제한없이, 환자는 다중면역화 요법의 부분으로서 본 발명의 면역원성 조성물 및 인간 유두종바이러스(HPV)에 대한 면역화를 위한 또 다른 면역학적 조성물, 예컨대, HPV 백신 가다실(GARDASIL: 등록상표)을 투여받을 수 있다. 당업자는 다중면역화 요법을 개발하고 실시할 목적으로 본 발명의 면역원성 조성물과 함께 사용할 면역원성 조성물을 용이하게 선택할 수 있을 것이다.

ORF2086 폴리펩티드, 단편 및 등가물은 접합체 면역원성 조성물의 부분으로서 사용될 수 있고, 이때 1개 이상의 단백질 또는 폴리펩티드가 담체에 접합되어 여러 혈청형 또는 네이세리아 메닝기티디스의 혈청형, 특히 수막구균 혈청군, 구체적으로 혈청군 B에 대한 면역원성 및/또는 여러 질환에 대한 면역원성을 갖는 조성물을 발생시킨다. 대안적으로, ORF2086 폴리펩티드들 중 하나는 다른 면역원성 폴리펩티드에 대한 담체 단백질로서 사용될 수 있다. 이러한 면역원성 조성물의 제제는 당업자에게 잘 공지되어 있다.

본 발명의 면역원성 조성물은 바람직하게는 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 적합한 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제는 임의의 모든 통상적인 용매, 분산 매질, 충전제, 고체 담체, 수용액, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 적합한 약학적으로 허용가능한 담체는 예를 들면, 물, 식염수, 인산염 완충 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 중 1개 이상 및 이들의 조합물을 포함한다.

약학적으로 허용가능한 담체는 항체의 저장 수명 또는 효능을 향상시키는 소량의 보조 물질, 예컨대, 습윤화제 또는 에멀젼화제, 방부제 또는 완충제를 추가로 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체의 제조 및 용도는 당업계에 잘 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 물질이 활성 성분과 상용불가능한 경우를 제외하고, 본 발명의 면역원성 조성물에서 이의 사용이 고려된다.

면역원성 조성물은 비경구, 예를 들면, 피하 또는 근육내 주입에 의해 투여될 수 있을 뿐만 아니라 경구 또는 비강내로 투여될 수 있다. 근육내 면역화 방법은 문헌(Wolff et al. Biotechniques;11(4):474-85, (1991)) 및 문헌(Sedegah et al. PNAS Vol. 91, pp. 9866-9870, (1994))에 기재되어 있다. 다른 투여 방식은 경구 제제, 폐 제제, 좌약제 및 경피 도포제를 사용하나 이들로 한정되지 않는다. 예를 들면, 경구 제제는 이러한 통상적으로 사용되는 부형제, 예를 들면, 약학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산 마그네슘, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 탄산 마그네슘 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 바람직하게는, 면역원성 조성물은 근육내로 투여된다.

본 발명의 면역원성 조성물은 체액성 및/또는 세포 매개된 면역의 상향조절 또는 하향조절이 관찰되도록 면역 시스템을 교란시키거나 변경하는 물질인 1개 이상의 추가 "면역조절제"를 추가로 포함할 수 있다. 한 구체적인 실시양태에서, 면역 시스템의 체액성 및/또는 세포 매개된 암(arm)의 상향조절이 바람직하다. 일부 면역조절제의 예에는 특히, 예를 들면, 항원보강제 또는 사이토카인, 또는 미국 특허 제5,254,339호에 기재된 이스코매트릭스(씨에스엘 리미티드, 호주 파크빌 소재)가 포함된다.

본 발명의 백신에서 사용될 수 있는 항원보강제의 비-한정적 예에는 RIBI 항원보강제 시스템(리비 인코포레이티드, 미국 몬타나주 해밀톤 소재), 명반, 미네랄 겔, 예컨대, 수산화알루미늄 겔, 수중유 에멀젼, 유중수 에멀젼, 예컨대, 프로인트 완전 및 불완전 항원보강제, 블록 공중합체(사이트알엑스, 미국 조지아주 아틀란타 소재), QS-21(캠브리지 바이오텍 인코포레이티드, 미국 매사추세츠주 캠브리지 소재), SAF-M(키론, 미국 캘리포니아주 에머리빌 소재), 암피젠(등록상표) 항원보강제, 사포닌, 퀼 A 또는 다른 사포닌 분획, 모노포스포릴 지질 A, 및 애브리딘 지질-아민 항원보강제가 포함된다. 본 발명의 백신에서 유용한 수중유 에멀젼의 비-한정적 예에는 변형된 SEAM62 및 SEAM 1/2 제제가 포함된다. 변형된 SEAM62는 5%(부피/부피) 스쿠알렌(시그마(Sigma)), 1%(부피/부피) SPAN(등록상표) 85 세제(ICI 계면활성제), 0.7%(부피/부피) 폴리소르베이트(등록상표) 80 세제(ICI 계면활성제), 2.5%(부피/부피) 에탄올, 200 ㎍/㎖ 퀼 A, 100 ㎍/㎖ 콜레스테롤 및 0.5%(부피/부피) 레시틴을 함유하는 수중유 에멀젼이다. 변형된 SEAM 1/2는 5%(부피/부피) 스쿠알렌, 1%(부피/부피) SPAN(등록상표) 85 세제, 0.7%(부피/부피) 폴리소르베이트 80 세제, 2.5%(부피/부피) 에탄올, 100 ㎍/㎖ 퀼 A 및 50 ㎍/㎖ 콜레스테롤을 포함하는 수중유 에멀젼이다.

백신에 포함될 수 있는 다른 "면역조절제"는 예를 들면, 1개 이상의 인터류킨, 인터페론 또는 다른 공지된 사이토카인 또는 케모카인을 포함한다. 한 실시양태에서, 항원보강제는 사이클로덱스트린 유도체 또는 다가음이온성 중합체, 예를 들면, 각각 미국 특허 제6,165,995호 및 제6,610,310호에 기재된 유도체 또는 중합체일 수 있다. 사용될 면역조절제 및/또는 항원보강제는 백신 또는 면역원성 조성물이 투여될 대상체, 주입 경로 및 제공되는 주입 횟수에 의해 좌우될 것임이 이해될 것이다.

몇몇 실시양태에서, 항원보강제는 사포닌이다. 몇몇 실시양태에서, 사포닌 농도는 1 ㎍/㎖ 내지 250 ㎍/㎖, 5 ㎍/㎖ 내지 150 ㎍/㎖, 또는 10 ㎍/㎖ 내지 100 ㎍/㎖이다. 몇몇 실시양태에서, 사포닌 농도는 약 1 ㎍/㎖, 약 5 ㎍/㎖, 약 10 ㎍/㎖, 약 20 ㎍/㎖, 약 30 ㎍/㎖, 약 40 ㎍/㎖, 약 50 ㎍/㎖, 약 60 ㎍/㎖, 약 70 ㎍/㎖, 약 80 ㎍/㎖, 약 90 ㎍/㎖, 약 100 ㎍/㎖, 약 110 ㎍/㎖, 약 120 ㎍/㎖, 약 130 ㎍/㎖, 약 140 ㎍/㎖, 약 150 ㎍/㎖, 약 160 ㎍/㎖, 약 170 ㎍/㎖, 약 180 ㎍/㎖, 약 190 ㎍/㎖, 약 200 ㎍/㎖, 약 210 ㎍/㎖, 약 220 ㎍/㎖, 약 230 ㎍/㎖, 약 240 ㎍/㎖ 또는 약 250 ㎍/㎖이다.

일부 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 단백질은 점막 항원보강제를 포함하고 인간 숙주에서 네이세리아 메닝기티디스 감염의 치료 또는 예방을 위해 사용되는 경구 투여용 면역원성 조성물에서 사용된다. 점막 항원보강제는 콜레라 독소일 수 있으나, 바람직하게는 본 발명에 따라 사용될 수 있는 콜레라 독소 이외의 점막 항원보강제는 콜레라 홀로독소(holotoxin)의 무독성 유도체를 포함하고, 이때 A 서브유닛은 돌연변이되고 화학적으로 변형된 콜레라 독소, 또는 콜레라 독소 아미노산 서열의 변형에 의해 제조된 관련 단백질이다. 본 발명의 면역원성 조성물의 제조에 특히 유용할 수 있는 특정 콜레라 독소에 대해서는 전체적으로 본원에 참고로 도입되는 국제특허출원 공개 제00/18434호에 개시된 돌연변이체 콜레라 홀로독소 E29H를 참조한다. 이들은 본 발명의 폴리펩티드에 부가될 수 있거나 본 발명의 폴리펩티드와 접합될 수 있다. 동일한 기법이 점막 항원보강제 또는 전달 성질을 갖는 다른 분자, 예컨대, 에스케리치아 콜라이 열 불안정성 독소(LT)에 적용될 수 있다.

점막 항원보강제 또는 전달 활성을 갖는 다른 화합물, 예컨대, 담즙; 다가양이온, 예컨대, DEAE 덱스트란 및 폴리오르니틴; 세제, 예컨대, 나트륨 도데실 벤젠 설페이트; 지질 접합된 물질; 항생제, 예컨대, 스트렙토마이신; 비타민 A; 및 점막 표면의 구조적 또는 기능적 온전함(integrity)을 변경하는 다른 화합물이 사용될 수 있다. 다른 점막 활성 화합물은 미생물 구조체의 유도체, 예컨대, MDP, 아크리딘 및 시메티딘을 포함한다. 전술된 바와 같이, 스티뮬론(STIMULON: 상표) QS-21, MPL 및 IL-12도 사용될 수 있다.

본 발명의 면역원성 조성물은 ISCOMS(면역 자극 복합체), CTB를 함유하는 ISCOMS 또는 리포좀의 형태로 전달될 수 있거나, 화합물, 예컨대, 아크릴레이트 또는 폴리(DL-락타이드-코-글리코사이드) 내에 캡슐화되어 흡착에 적합한 크기의 마이크로스피어를 형성할 수 있다. 본 발명의 단백질은 유성 에멀젼 내로 도입될 수도 있다.

환자에게 투여되는 면역원성 조성물의 양(즉, 투여량)은 구체적인 항원, 항원보강제(존재하는 경우), 연령, 성별, 체중, 종, 구체적인 환자의 상태 및 투여 경로와 같은 인자를 고려하여 당업계에서 통상의 기술을 가진 자에게 공지된 표준 기법에 따라 결정될 수 있다.

예를 들면, 성인 인간 환자에 대한 투여량은 0.1 ㎍, 1 ㎍, 10 ㎍ 또는 50 ㎍ 이상의 네이세리아 ORF2086 단백질 내지 80 ㎍, 100 ㎍, 150 ㎍ 또는 200 ㎍ 이하의 네이세리리아 ORF2086 단백질을 포함할 수 있다. 임의의 최소 값과 임의의 최대 값이 조합되어 적합한 범위를 정의할 수 있다.

항원보강제

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 면역원성 조성물은 1개 이상의 항원보강제도 포함한다. 항원보강제는 면역원 또는 항원과 함께 투여되었을 때 면역반응을 향상시키는 물질이다. 인터류킨 1-α, 1-β, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12(예를 들면, 미국 특허 제5,723,127호 참조), 13, 14, 15, 16, 17 및 18(및 이의 돌연변이체 형태); 인터페론-α, 인터페론-β 및 인터페론-γ; 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)(예를 들면, 미국 특허 제5,078,996호 및 ATCC 수탁번호 39900 참조); 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF); 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF); 및 종양 괴사 인자 α 및 β를 포함하나 이들로 한정되지 않는 다수의 사이토카인 또는 림포카인이 면역 조절 활성을 갖는 것으로 밝혀져 있으므로 항원보강제로서 유용하다.

본원에 기재된 면역원성 조성물에서 유용한 다른 항원보강제는 MCP-1, MIP-1α, MIP-1β 및 RANTES를 포함하나 이들로 한정되지 않는 케모카인; 부착 분자, 예컨대, 셀렉틴(selectin), 예를 들면, L-셀렉틴, P-셀렉틴 및 E-셀렉틴; 뮤신(mucin) 유사 분자, 예를 들면, CD34, GlyCAM-1 및 MadCAM-1; 인테그린 패밀리의 구성원, 예컨대, LFA-1, VLA-1, Mac-1 및 p150.95; 면역글로불린 수퍼패밀리의 구성원, 예컨대, PECAM, ICAM, 예를 들면, ICAM-1, ICAM-2 및 ICAM-3, CD2 및 LFA-3; 보조자극 분자, 예컨대, B7-1, B7-2, CD40 및 CD40L; 혈관 성장 인자, 신경 성장 인자, 섬유모세포 성장 인자, 표피 성장 인자, PDGF, BL-1 및 혈관 내피 성장 인자를 포함하는 성장 인자; Fas, TNF 수용체, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2 및 DR6을 포함하는 수용체 분자; 및 카스파제(Caspase)(ICE)를 포함한다.

다른 예시적 항원보강제는 수산화알루미늄; 인산알루미늄; 스티뮬론(상표) QS-21(아퀼라 바이오파마슈티칼스 인코포레이티드(Aquila Biopharmaceuticals, Inc.), 미국 매사추세츠주 프래밍햄 소재); MPL(상표)(3-O-탈아실화된 모노포스포릴 지질 A; 코릭사(Corixa), 미국 몬타나주 해밀톤 소재); 529(아미노 알킬 글루코스아민 포스페이트 화합물, 코릭사, 미국 몬타나주 해밀톤 소재); IL-12(제네틱스 인스티튜트(Genetics Institute), 미국 매사추세츠주 캠브리지 소재); GM-CSF(이뮤넥스 코포레이션(Immunex Corp.), 미국 워싱톤주 시애틀 소재); N-아세틸-뮤라밀-L-쓰레오닐-D-이소글루타민(thr-MDP); N-아세틸-노르-뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타민(CGP 11637, 노르-MDP로서 지칭됨); N-아세틸뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1'-2'-디팔미토일-sn-글리세로-3-하이드록시포스-포릴옥시-에틸아민)(CGP 19835A, MTP-PE로서 지칭됨); 및 콜레라 독소를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 일부 바람직한 실시양태에서, 항원보강제는 QS-21이다.

추가 예시적 항원보강제는 콜레라 독소의 무독성 유도체(이의 A 서브유닛을 포함함), 및/또는 네이세리아 메닝기티디스 폴리펩티드와 콜레라 독소 또는 이의 B 서브유닛("CTB")의 접합체 또는 유전적으로 조작된 융합체, 프로콜레라게노이드(procholeragenoid), 진균 폴리사카라이드(쉬조필란(schizophyllan)을 포함함), 뮤라밀 다이펩티드, 뮤라밀 다이펩티드("MDP") 유도체, 포르볼(phorbol) 에스터, 에스케리치아 콜라이의 열 불안정성 독소, 블록 중합체 또는 사포닌을 포함한다.

인산알루미늄은 미국 연방정부 규제 코드[610.15(a)]에 의해 특정된 0.85 mg/투여량의 한계보다 훨씬 더 낮은 0.125 mg/투여량의 농도로 1기 임상 시험에서 항원보강제로서 사용되어 왔다. 알루미늄 함유 항원보강제는 근육내 또는 피하로 투여되었을 때 항원의 면역반응을 증강시키기 위해 인간에서 널리 사용된다. 몇몇 실시양태에서, 면역원성 조성물 중의 알루미늄의 농도는 0.125 ㎍/㎖ 내지 0.5 ㎍/㎖, 0.20 ㎍/㎖ 내지 0.40 ㎍/㎖, 또는 0.20 ㎍/㎖ 내지 0.30 ㎍/㎖이다. 몇몇 실시양태에서, 면역원성 조성물 중의 알루미늄의 농도는 약 0.125 ㎍/㎖, 약 0.15 ㎍/㎖, 약 0.175 ㎍/㎖, 약 0.20 ㎍/㎖, 약 0.225 ㎍/㎖, 약 0.25 ㎍/㎖, 약 0.275 ㎍/㎖, 약 0.30 ㎍/㎖, 약 0.325 ㎍/㎖, 약 0.35 ㎍/㎖, 약 0.375 ㎍/㎖, 약 0.40 ㎍/㎖, 약 0.425 ㎍/㎖, 약 0.45 ㎍/㎖, 약 0.475 ㎍/㎖ 또는 약 0.50 ㎍/㎖이다.

바람직한 실시양태에서, 면역원성 조성물 중의 알루미늄의 농도는 0.125 mg/㎖ 내지 0.5 mg/㎖, 0.20 mg/㎖ 내지 0.40 mg/㎖, 또는 0.20 mg/㎖ 내지 0.30 mg/㎖이다. 몇몇 실시양태에서, 면역원성 조성물 중의 알루미늄의 농도는 약 0.125 mg/㎖, 약 0.15 mg/㎖, 약 0.175 mg/㎖, 약 0.20 mg/㎖, 약 0.225 mg/㎖, 약 0.25 mg/㎖, 약 0.275 mg/㎖, 약 0.30 mg/㎖, 약 0.325 mg/㎖, 약 0.35 mg/㎖, 약 0.375 mg/㎖, 약 0.40 mg/㎖, 약 0.425 mg/㎖, 약 0.45 mg/㎖, 약 0.475 mg/㎖ 또는 약 0.50 mg/㎖이다.

면역반응을 향상시키기 위해 사용되는 적합한 항원보강제는 미국 특허 제4,912,094호에 기재된 MPL(상표)(3-O-탈아실화된 모노포스포릴 지질 A, 코릭사, 미국 몬타나주 해밀톤 소재)을 추가로 포함하나 이것으로 한정되지 않는다. 코릭사(미국 몬타나주 해밀톤 소재)로부터 입수될 수 있고 미국 특허 제6,113,918호에 기재되어 있는 합성 지질 A 유사체 또는 아미노알킬 글루코스아민 포스페이트 화합물(AGP), 또는 이들의 유도체 또는 유사체도 항원보강제로서 사용되기에 적합하다. 이러한 AGP 중 하나는 529(이전에 RC529로서 공지됨)로도 공지된 2-[(R)-3-테트라데카노일옥시테트라데카노일아미노]에틸-2-데옥시-4-O-포스포노-3-O-[(R)-3-테트라데카노일옥시테트라데카노일]-2-[(R)-3-테트라데카노일옥시테트라데카노일-아미노]-b-D-글루코피라노사이드이다. 이 529 항원보강제는 수성 형태(AF) 또는 안정한 에멀젼(SE)으로서 제제화된다.

다른 항원보강제는 뮤라밀 펩티드, 예컨대, N-아세틸-뮤라밀-L-쓰레오닐-D-이소글루타민(thr-MDP), N-아세틸-노르뮤라밀-L-알라닌-2-(1'2'-디팔미토일-sn-글리세로-3-하이드록시포스포릴-옥시)-에틸아민(MTP-PE); 수중유 에멀젼, 예컨대, MF59(미국 특허 제6,299,884호)(5% 스쿠알렌, 0.5% 폴리소르베이트 80 및 0.5% Span 85(임의적으로 다양한 양의 MTP-PE를 함유함)를 함유하고 마이크로유동화제(microfluidizer), 예컨대, 모델 110Y 마이크로유동화제(마이크로플루이딕스(Microfluidics), 미국 매사추세츠주 뉴톤 소재)의 이용을 통해 서브마이크론 입자로 제제화됨), 및 SAF(10% 스쿠알렌, 0.4% 폴리소르베이트 80, 5% 플루로닉 차단된 중합체 L121 및 thr-MDP를 함유하고 서브마이크론 에멀젼으로 마이크로유동화되거나 보다 큰 입자 크기 에멀젼을 발생시키도록 볼텍싱됨); 불완전 프로인트 항원보강제(IFA); 알루미늄 염(명반), 예컨대, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 황산산알루미늄; 암피젠; 애브리딘; L121/스쿠알렌; D-락타이드-폴리락타이드/글리코사이드; 플루로닉 폴리올; 사멸된 보르데텔라(Bordetella); 사포닌, 예컨대, 미국 특허 제5,057,540호에 기재된 스티뮬론(상표) QS-21(안티제닉스(Antigenics), 미국 매사추세츠주 프래밍햄 소재), 미국 특허 제5,254,339호에 기재된 이스코매트릭스(씨에스엘 리미티드, 호주 파크빌 소재) 및 면역자극 복합체(이스코매트릭스); 마이코박테리움 튜버큘로시스(Mycobacterium tuberculosis); 세균 리포폴리사카라이드; 합성 폴리뉴클레오티드, 예컨대, CpG 모티프를 함유하는 올리고뉴클레오티드(예를 들면, 미국 특허 제6,207,646호); 유럽특허 제1,296,713호 및 제1,326,634호에 기재된 IC-31(인터셀 아게(Intercell AG), 오스트리아 비엔나 소재); 백일해 독소(PT) 또는 이의 돌연변이체, 콜레라 독소 또는 이의 돌연변이체(예를 들면, 미국 특허 제7,285,281호, 제7,332,174호, 제7,361,355호 및 제7,384,640호); 또는 에스케리치아 콜라이 열 불안정성 독소(LT) 또는 이의 돌연변이체, 특히 LT-K63, LT-R72(예를 들면, 미국 특허 제6,149,919호, 제7,115,730호 및 제7,291,588호)를 포함한다.

비-지질화된 P2086 항원의 제조 방법

한 양태에서, 본 발명은 비-피루빌화되고 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드의 제조 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 N-말단 시스테인이 상응하는 야생형 서열에 비해 결실된 ORF2086 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 발현하는 단계를 포함하고, 이때 상기 뉴클레오티드 서열은 세균 세포에서 발현될 수 있는 발현 시스템에 작동가능하게 연결되어 있다. 상기 방법에 의해 제조된 예시적 폴리펩티드는 본원에 기재된 임의의 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들면, 바람직하게는, 상기 폴리펩티드는 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20 또는 서열번호 21에 기재된 아미노산 서열을 갖고, 이때 위치 1의 시스테인은 상응하는 야생형 서열에 비해 결실된다. 추가 예시적 폴리펩티드는 서열번호 44, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 55, 서열번호 57, 서열번호 62 및 서열번호 64로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 상기 방법은 상기 폴리펩티드를 정제하는 단계를 추가로 포함한다.

몇몇 실시양태에서, 본 발명은 ORF2086 변이체 핵산 서열을 지질화 조절 서열이 없는 에스케리치아 콜라이 발현 벡터 내로 클로닝하는 단계, 에스케리치아 콜라이 세균을 ORF2086 발현 벡터로 형질전환시키는 단계, 발현을 유도하는 단계, 및 발현된 P2086 단백질을 단리하는 단계를 포함하는, 가용성 비-지질화된 P2086 항원을 제조하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 발현은 IPTG에 의해 유도된다.

몇몇 실시양태에서, ORF2086 변이체의 N-말단 Cys에 대한 코돈은 결실된다. 이러한 코돈의 예에는 TGC가 포함된다. 몇몇 실시양태에서, ORF2086 변이체의 N-말단 Cys에 대한 코돈은 점 돌연변이유발에 의해 돌연변이되어 Ala, Gly 또는 Val 코돈을 발생시킨다. 몇몇 실시양태에서, N-말단 Cys의 바로 하류에서 Gly/Ser 줄기가 뻗어 있도록 Ser 및 Gly 코돈이 ORF2086 변이체의 N-말단 꼬리에 부가된다. 몇몇 실시양태에서, Gly/Ser 줄기 내의 Gly 및 Ser 잔기의 총 수는 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 11 이상 또는 12 이상이다. 몇몇 실시양태에서, N-말단 Cys에 대한 코돈은 결실된다. 몇몇 실시양태에서, N-말단 7개, 8개, 9개, 10개, 11개 또는 12개의 잔기가 Gly 또는 Ser이다.

몇몇 실시양태에서, 비-지질화된 ORF2086 변이체의 N-말단 꼬리의 코돈은 점 돌연변이유발에 의해 최적화된다. 몇몇 실시양태에서, 비-지질화된 ORF2086 변이체의 N-말단 꼬리는 B09 변이체의 N-말단 꼬리와 일치하도록 최적화된다. 몇몇 실시양태에서, ORF2086 변이체의 N-말단 꼬리의 코돈은 ORF2086 변이체의 5번째 아미노산을 코딩하는 코돈이 서열번호 8의 뉴클레오티드 13 내지 15와 100% 일치하고 ORF2086 변이체의 13번째 아미노산을 코딩하는 코돈이 서열번호 8의 뉴클레오티드 37 내지 39와 100% 일치하도록 점 돌연변이유발에 의해 최적화된다. 몇몇 실시양태에서, 비-지질화된 ORF2086 변이체의 N-말단 꼬리는 5' 45개 핵산이 서열번호 8의 핵산 1 내지 45와 100% 동일하도록 최적화된다. 몇몇 실시양태에서, 비-지질화된 ORF2086 변이체의 N-말단 꼬리는 5' 42개 핵산이 서열번호 8의 핵산 4 내지 45와 100% 동일하도록 최적화된다. 몇몇 실시양태에서, 비-지질화된 ORF2086 변이체의 N-말단 꼬리는 5' 39개 핵산이 서열번호 8의 핵산 4 내지 42와 100% 동일하도록 최적화된다. 몇몇 실시양태에서, 비-지질화된 P2086 변이체의 N-말단 꼬리는 서열번호 18의 아미노산 1 내지 15에 비해 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 비-지질화된 P2086 변이체의 N-말단 꼬리는 서열번호 18의 아미노산 1 내지 15에 비해 2개의 아미노산 치환을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 비-지질화된 P2086 변이체의 N-말단 꼬리는 서열번호 18의 아미노산 2 내지 15에 비해 1개 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 비-지질화된 P2086 변이체의 N-말단 꼬리는 서열번호 18의 아미노산 2 내지 15에 비해 2개의 아미노산 치환을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다.

몇몇 실시양태에서, 비-지질화된 변이체의 코돈은 증가된 발현을 위해 최적화된다. 코돈 최적화는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌(Sastalla et al., Applied and Environmental Microbiology, vol. 75(7): 2099-2110 (2009)) 및 문헌(Coleman et al., Science, vol. 320: 1784 (2008))을 참조한다. 몇몇 실시양태에서, 코돈 최적화는 특정 DNA 서열을 포함하고/하거나 배제하면서 아미노산 서열의 코돈 이용을 선택된 숙주 유기체의 코돈 빈도와 일치시키는 단계를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 코돈 최적화는 상응하는 2차 mRNA 구조를 최소화하여 번역 장애를 감소시키는 단계를 추가로 포함한다. 몇몇 실시양태에서, N-말단 꼬리는 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32 및 서열번호 34 중 어느 하나를 포함하도록 코돈 최적화된다. 몇몇 실시양태에서, Gly/Ser 줄기는 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32 및 서열번호 34 중 어느 하나를 포함하도록 코돈 최적화된다.

본 발명이 더 잘 이해될 수 있도록 하기 위해, 하기 실시예가 기재된다. 실시예는 단지 예시를 위한 것이고 본 발명의 범위를 한정하기 위한 것으로서 간주되어서는 안 된다.

면역원성 조성물 제제

일부 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 1개 이상의 항원보강제, 완충제, 냉동보호제, 염, 2가 양이온, 비-이온성 세제, 자유 라디칼 산화의 억제제, 희석제 또는 담체를 추가로 포함한다.

본 발명의 면역원성 조성물은 다수의 수막구균 단백질 항원 및 캡슐형 폴리사카라이드 단백질 접합체 이외에 1개 이상의 방부제를 추가로 포함할 수 있다. FDA는 다회 투여량(다중 투여량) 바이알 내의 생물학적 제품이 몇몇 경우만을 제외하고 방부제를 함유할 것을 요구한다. 방부제를 함유하는 백신 제품은 벤즈에토늄 클로라이드(탄저병), 2-페녹시에탄올(DTaP, HepA, 라임, 소아마비(비경구)), 페놀(폐렴, 장티푸스(비경구), 백시니아) 및 티메로살(DTaP, DT, Td, HepB, Hib, 인플루엔자, JE, 수막염, 폐렴, 광견병)을 함유하는 백신을 포함한다. 주입가능한 약물에서 사용되도록 승인받은 방부제는 예를 들면, 클로로부탄올, m-크레졸, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 2-페녹시에탄올, 벤즈에토늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤조산, 벤질 알코올, 페놀, 티메로살 및 페닐수은 니트레이트를 포함한다.

본 발명의 제제는 1개 이상의 완충제, 염, 2가 양이온, 비-이온성 세제, 냉동보호제, 예컨대, 당, 및 항산화제, 예컨대, 자유 라디칼 스캐빈저 또는 킬레이팅제, 또는 이들의 임의의 다중 조합물을 추가로 포함할 수 있다. 임의의 한 성분, 예를 들면, 킬레이터의 선택은 또 다른 성분(예를 들면, 스캐빈저)이 바람직한지를 결정할 수 있다. 투여용으로 제제화된 최종 조성물은 멸균 및/또는 발열원 무함유 조성물이어야 한다. 당업자는 다양한 인자, 예컨대, 요구되는 구체적인 저장 및 투여 조건에 따라 이들 성분들 및 다른 성분들의 어떤 조합물이 본 발명의 방부제 함유 면역원성 조성물에 포함되기에 가장 적합할지를 실험적으로 결정할 수 있다.

일부 실시양태에서, 비경구 투여에 적합한 본 발명의 제제는 트리스(트리메타민), 포스페이트, 아세테이트, 보레이트, 시트레이트, 글리신, 히스티딘 및 석시네이트로부터 선택된(그러나, 이들로 한정되지 않는) 1개 이상의 생리학적으로 허용가능한 완충제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 제제는 약 6.0 내지 약 9.0, 바람직하게는 약 6.4 내지 약 7.4의 pH 범위 내로 완충된다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물 또는 제제의 pH를 조절하는 것이 바람직할 수 있다. 본 발명의 제제의 pH는 당업계의 표준 기법의 이용을 통해 조절될 수 있다. 상기 제제의 pH는 3.0 내지 8.0으로 조절될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 제제의 pH는 3.0 내지 6.0, 4.0 내지 6.0 또는 5.0 내지 8.0의 범위 내에 있을 수 있거나 이들 범위 내의 pH로 조절될 수 있다. 다른 실시양태에서, 상기 제제의 pH는 약 3.0, 약 3.5, 약 4.0, 약 4.5, 약 5.0, 약 5.5, 약 5.8, 약 6.0, 약 6.5, 약 7.0, 약 7.5 또는 약 8.0일 수 있거나 이들 pH 값으로 조절될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 pH는 4.5 내지 7.5, 4.5 내지 6.5, 5.0 내지 5.4, 5.4 내지 5.5, 5.5 내지 5.6, 5.6 내지 5.7, 5.7 내지 5.8, 5.8 내지 5.9, 5.9 내지 6.0, 6.0 내지 6.1, 6.1 내지 6.2, 6.2 내지 6.3, 6.3 내지 6.5, 6.5 내지 7.0, 7.0 내지 7.5 또는 7.5 내지 8.0의 범위 내에 있을 수 있거나 이들 범위 내의 pH로 조절될 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 제제의 pH는 약 5.8이다.

일부 실시양태에서, 비경구 투여에 적합한 본 발명의 제제는 약 0.1 mM 내지 약 10 mM(약 5 mM 이하가 바람직함)의 범위 내의 농도로 1개 이상의 2가 양이온(MgCl₂, CaCl₂ 및 MnCl₂를 포함하나 이들로 한정되지 않음)을 포함한다.

일부 실시양태에서, 비경구 투여에 적합한 본 발명의 제제는 비경구 투여 시 대상체에게 생리학적으로 허용가능한 이온 강도로 존재하고 최종 제제에서 선택된 이온 강도 또는 오스몰농도를 생성하는 최종 농도로 포함된 1개 이상의 염(염화나트륨, 염화칼륨, 황산나트륨 및 황산칼륨을 포함하나 이들로 한정되지 않음)을 포함한다. 제제의 최종 이온 강도 또는 오스몰농도는 다수의 성분(예를 들면, 완충 화합물 및 다른 비-완충 염으로부터의 이온)에 의해 결정될 것이다. 바람직한 염인 NaCl은 약 250 mM 이하로 존재하고, 이때 염 농도는 제제의 최종 총 오스몰농도가 비경구 투여(예를 들면, 근육내 또는 피하 주입)에 적합하고 다양한 온도 범위에 걸쳐 면역원성 조성물 제제의 면역원성 성분의 장기간 안정성을 촉진하기 위해 다른 성분(예를 들면, 당)을 보충하도록 선택된다. 염 무함유 제제는 원하는 최종 오스몰농도 수준을 유지하기 위해 1개 이상의 선택된 냉동보호제의 증가된 범위를 견딜 것이다.

일부 실시양태에서, 비경구 투여에 적합한 본 발명의 제제는 다이사카라이드(예를 들면, 락토스, 말토스, 수크로스 또는 트레할로스) 및 폴리하이드록시 탄화수소(예를 들면, 둘시톨, 글리세롤, 만니톨 및 소르비톨)로부터 선택된(그러나, 이들로 한정되지 않는) 1개 이상의 냉동보호제를 포함한다.

일부 실시양태에서, 제제의 오스몰농도는 약 200 mOs/ℓ 내지 약 800 mOs/ℓ의 범위, 바람직하게는 약 250 mOs/ℓ 내지 약 500 mOs/ℓ, 또는 약 300 mOs/ℓ 내지 약 400 mOs/ℓ의 범위 내에 있다. 염 무함유 제제는 예를 들면, 약 5% 내지 약 25%의 수크로스, 바람직하게는 약 7% 내지 약 15% 또는 약 10% 내지 약 12%의 수크로스를 함유할 수 있다. 대안적으로, 염 무함유 제제는 예를 들면, 약 3% 내지 약 12%의 소르비톨, 바람직하게는 약 4% 내지 7% 또는 약 5% 내지 약 6%의 소르비톨을 함유할 수 있다. 염, 예컨대, 염화나트륨이 첨가되는 경우, 수크로스 또는 소르비톨의 효과적인 범위는 상대적으로 감소된다. 이들 및 다른 이러한 삼투질농도 및 오스몰농도 고려는 당업계의 기술 내에 있다.

일부 실시양태에서, 비경구 투여에 적합한 본 발명의 제제는 1개 이상의 자유 라디칼 산화 억제제 및/또는 킬레이팅제를 포함한다. 다양한 자유 라디칼 스캐빈저 및 킬레이터가 당업계에 공지되어 있고 본원에 기재된 제제 및 사용 방법에 적용된다. 예에는 에탄올, EDTA, EDTA/에탄올 조합물, 트리에탄올아민, 만니톨, 히스티딘, 글리세롤, 시트르산나트륨, 이노시톨 헥사포스페이트, 트리폴리포스페이트, 아스코르브산/아스코르베이트, 석신산/석시네이트, 말산/말레에이트, 데스페랄(desferal), EDDHA 및 DTPA, 및 이들 중 둘 이상의 다양한 조합물이 포함되나 이들로 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 비-환원 자유 라디칼 스캐빈저가 제제의 장기간 안정성을 효과적으로 향상시키는 농도로 첨가될 수 있다. 1개 이상의 자유 라디칼 산화 억제제/킬레이터도 다양한 조합물, 예컨대, 스캐빈저와 2가 양이온의 조합물로 첨가될 수 있다. 킬레이터의 선택은 스캐빈저의 첨가가 필요한지를 결정할 것이다.

일부 실시양태에서, 비경구 투여에 적합한 본 발명의 제제는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리소르베이트-80(트윈 80), 폴리소르베이트-60(트윈 60), 폴리소르베이트-40(트윈 40) 및 폴리소르베이트-20(트윈 20); Brij 58, Brij 35, 및 기타, 예컨대, 트리톤 X-100, 트리톤 X-114, NP40 및 Span 85를 포함하나 이들로 한정되지 않는 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르; 및 비-이온성 계면활성제의 플루로닉 계열(예를 들면, 플루로닉 121)을 포함하나 이들로 한정되지 않는 1개 이상의 비-이온성 계면활성제를 포함하고, 이때 바람직한 성분은 약 0.001% 내지 약 2%(약 0.25% 이하가 바람직함) 농도의 폴리소르베이트-80 또는 약 0.001% 내지 1%(약 0.5% 이하가 바람직함) 농도의 폴리소르베이트-40이다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 제제는 비경구 투여에 적합한 1개 이상의 추가 안정화제, 예를 들면, 1개 이상의 티올(-SH) 기를 포함하는 환원제(예를 들면, 시스테인, N-아세틸 시스테인, 환원된 글루타티온, 티오글리콜산나트륨, 티오설페이트, 모노티오글리세롤, 또는 이들의 혼합물)를 포함한다. 대안적으로 또는 임의적으로, 본 발명의 방부제 함유 면역원성 조성물 제제는 저장 용기로부터 산소를 제거하거나 (예를 들면, 앰버 유리 용기를 이용하여) 광으로부터 상기 제제를 보호함으로써 추가로 안정화될 수 있다.

본 발명의 방부제 함유 면역원성 조성물 제제는 그 자체가 면역반응을 유도하지 않는 임의의 부형제를 포함하는 1개 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함할 수 있다. 적합한 부형제는 거대분자, 예컨대, 단백질, 사카라이드, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체성 아미노산, 아미노산 공중합체, 수크로스(문헌(Paoletti et al, 2001, Vaccine, 19:2118)), 트레할로스, 락토스 및 지질 응집체(예컨대, 오일 소적 또는 리포좀)를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 이러한 담체는 당업자에게 잘 공지되어 있다. 약학적으로 허용가능한 부형제는 예를 들면, 문헌(Gennaro, 2000, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20^th edition, ISBN:0683306472)에 논의되어 있다.

본 발명의 조성물은 동결건조될 수 있거나 수성 형태, 즉 용액 또는 현탁액으로 존재할 수 있다. 액체 제제는 유리하게는 그의 포장된 형태로부터 직접적으로 투여될 수 있으므로 본 발명의 동결건조된 조성물의 경우 요구되는 수성 매질에서의 재구성을 필요로 하지 않으면서 주입되기에 이상적이다.

본 발명의 면역원성 조성물을 대상체에게 직접적으로 전달하는 것은 비경구 투여(근육내, 복강내, 피내, 피하, 정맥내, 또는 조직의 간질 공간으로의 투여)에 의해, 또는 직장, 경구, 질, 국소, 경피, 비강내, 안, 귀, 폐 또는 다른 점막 투여에 의해 달성될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 비경구 투여는 근육내 주입에 의해, 예를 들면, 대상체의 넓적다리 또는 상부 팔에 주입함으로써 달성된다. 주입은 바늘(예를 들면, 피하 바늘)을 통해 달성될 수 있으나, 대안적으로 바늘 부재 주입이 이용될 수 있다. 전형적인 근육내 투여량은 0.5 ㎖이다. 본 발명의 조성물은 다양한 형태, 예를 들면, 주입용 액체 용액 또는 현탁액으로서 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 폐 투여용, 예를 들면, 흡입기 내의 산제 또는 분무제로서 제조될 수 있다. 다른 실시양태에서, 상기 조성물은 좌약제 또는 페사리로서 제조될 수 있거나 비강, 귀 또는 안 투여용 제제, 예를 들면, 분무제, 점적제, 겔 또는 산제로서 제조될 수 있다.

특정 면역원성 조성물에 대한 성분의 최적 양은 대상체에서의 적절한 면역반응의 관찰을 포함하는 표준 연구에 의해 확인될 수 있다. 초기 백신접종 후, 대상체는 적절한 간격을 두고 1회 또는 수회 부스터 면역화를 제공받을 수 있다.

포장 및 제형

본 발명의 면역원성 조성물은 유닛 투여량 또는 다회 투여량(예를 들면, 2회 투여량, 4회 투여량 또는 그 이상의 투여량) 제형으로 포장될 수 있다. 다회 투여량 제형의 경우, 바이알이 전형적으로(그러나 반드시는 아님) 예비충전된 주사기보다 바람직하다. 적합한 다회 투여량 포맷은 투여량 당 0.1 ㎖ 내지 2 ㎖로 용기 당 2회 내지 10회 투여량을 포함하나 이것으로 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 투여량은 0.5 ㎖ 투여량이다. 예를 들면, 본원에 참고로 도입되는 국제특허출원 공개 제2007/127668호를 참조한다.

조성물은 바이알 또는 다른 적합한 저장 용기 내에 함유된 상태로 제공될 수 있거나, 바늘을 구비할 수 있거나 구비하지 않을 수 있는 예비충전된 전달 장치, 예를 들면, 단일 또는 다중 성분 주사기 내에 함유된 상태로 제공될 수 있다. 주사기는 전형적으로(그러나, 반드시는 아님) 본 발명의 방부제 함유 면역원성 조성물의 단회 투여량을 함유하지만, 다회 투여량의 예비충전된 주사기도 예상된다. 마찬가지로, 바이알은 단회 투여량을 포함할 수 있으나 대안적으로 다회 투여량을 포함할 수 있다.

효과적인 투여량 부피는 상용적으로 확립될 수 있지만, 주입용 조성물의 전형적인 투여량은 0.5 ㎖의 부피를 갖는다. 일부 실시양태에서, 상기 투여량은 인간 대상체에게 투여되도록 제제화된다. 일부 실시양태에서, 상기 투여량은 성인, 십대, 청소년, 유아 또는 영아(즉, 1세 이하) 인간 대상체에게 투여되도록 제제화되고 바람직한 실시양태에서 주입에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명의 액체 면역원성 조성물은 동결건조된 형태로 제공된 다른 면역원성 조성물을 재구성하기에 적합하다. 면역원성 조성물이 이러한 즉석 재구성에 사용되는 경우, 본 발명은 2개 이상의 바이알, 2개 이상의 충전 준비된 주사기, 또는 1개 이상의 이들 각각(이때 주사기의 내용물은 주입 전에 바이알의 내용물을 재구성하는 데에 사용되거나, 바이알의 내용물은 주입 전에 주사기의 내용물을 재구성하는 데에 사용됨)을 갖는 키트를 제공한다.

대안적으로, 본 발명의 면역원성 조성물은 당업계에 잘 공지되어 있는 다수의 동결건조 방법들 중 어느 한 방법의 이용을 통해 동결건조되고 재구성됨으로써, 예를 들면, 입자의 제조에 이용되는 정확한 방법의 변경에 의해 선택될 수 있고 조절될 수 있는 입자 특성, 예컨대, 평균 직경 크기를 갖는 건조된 규칙적인 형태(예를 들면, 구형)의 입자, 예컨대, 마이크로펠렛 또는 마이크로스피어를 형성할 수 있다. 면역원성 조성물은 임의적으로 분리되어 있는 건조된 규칙적인 형태(예를 들면, 구형)의 입자, 예컨대, 마이크로펠렛 또는 마이크로스피어와 함께 제조될 수 있거나 상기 입자에 함유될 수 있는 항원보강제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 본 발명은 임의적으로 본 발명의 1개 이상의 방부제를 추가로 포함하는 안정화된 건조된 면역원성 조성물을 포함하는 제1 성분, 및 상기 제1 성분의 재구성을 위한 멸균된 수용액을 포함하는 제2 성분을 포함하는 면역원성 조성물 키트를 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 수용액은 1개 이상의 방부제를 포함하고 임의적으로 1개 이상의 항원보강제를 포함할 수 있다(예를 들면, 국제특허출원 공개 제2009/109550호(본원에 참고로 도입됨) 참조).

또 다른 실시양태에서, 다회 투여량 포맷의 용기는 일반적인 실험 유리용기, 플라스크, 비이커, 눈금이 매겨진 실린더, 발효기, 생물반응기, 튜빙, 파이프, 가방, 병, 바이알, 바이알 밀폐기(예를 들면, 고무 마개, 덮개 상의 나사), 앰플, 주사기, 이중 또는 다중 챔버 주사기, 주사기 마개, 주사기 플런저, 고무 밀폐기, 플라스틱 밀폐기, 유리 밀폐기, 카트리지 및 일회용 펜 등으로 구성되어 있으나 이들로 한정되지 않는 1개 이상의 군으로부터 선택된다. 본 발명의 용기는 재료에 의해 한정되지 않고 재료, 예컨대, 유리, 금속(예를 들면, 강철, 스테인레스 강철, 알루미늄 등) 및 중합체(예를 들면, 열가소성 물질, 탄성체, 열가소성 탄성체)를 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 상기 포맷의 용기는 부틸 마개를 갖는 5 ㎖ 쇼트(Schott) 타입 1 유리 바이알이다. 당업자는 전술된 포맷이 결코 완전한 목록이 아니고 단지 본 발명을 위해 이용가능한 다양한 포맷들에 대한 지침을 당업자에게 제공하기 위한 것임을 인식할 것이다. 본 발명에서 사용될 것으로 고려되는 추가 포맷은 실험 장치 공급자 및 제조자, 예컨대, 유나이티드 스테이츠 플라스틱 코포레이션(United States Plastic Corp.)(미국 오하이오주 리마 소재), VWR 등으로부터의 공개된 카달로그에서 발견될 수 있다.

실시예

실시예 1: 실험 절차

혈청 살균 분석

사이노몰거스 마카크(Cynomolgus macaques)(n = 5/군)를 AlPO₄에 흡착된 rLP2086 또는 P2086(A + B) 단백질을 사용하여 근육내로 면역화시켰다. 사이노몰거스 마카크는 비-인간 영장류의 일례이다. 동물을 0주, 4주 및 24주에서 백신접종하였고, ORF2086 특이적 IgG 및 기능성 항체 역가를 0주, 4주, 6주 및 26주에서 측정하였다. rLP2086A 및 B에 대한 혈청 ORF2086 특이적 IgG 역가를 측정하였다.

상기 백신에 함유된 서열에 대한 동종성 또는 이종성을 나타내는 서열을 갖는 LP2086을 발현하는 네이세리아 메닝기티디스 균주에 대한 혈청 살균 분석(SBA)으로 기능성 항체 역가를 조사하였다.

ORF2086 백신으로 면역화된 마카크 또는 토끼에서 혈청 살균 항체를, 인간 보체와 함께 SBA를 이용하여 측정하였다. 토끼 면역 혈청 또는 마카크 면역 혈청을 열 불활성화하여 내인성 보체 활성을 제거한 후, 96-웰 마이크로타이터 플레이트에서 Ca² ⁺ 및 Mg² ⁺를 함유하는 둘베코스 PBS(D-PBS)에 1:2로 연속적으로 희석하여 네이세리아 메닝기티디스 균주에 대한 혈청 살균 활성을 시험하였다. 상기 분석에서 사용된 세균은 켈로그 보충제(Kellogg's supplement)(GCK)로 보충된 GC 배지에서 생장되었고 650 nm에서 광학 밀도에 의해 모니터링되었다. 0.50 내지 0.55의 최종 OD₆₅₀에서 세균을 분석에서 사용하기 위해 수거하고 D-PBS에 희석하고, 1000 CFU 내지 3000 CFU를 20% 인간 보체가 함유된 분석 혼합물에 첨가하였다.

검출가능한 살균 활성을 갖지 않는 인간 혈청을 외인성 보체 공급원으로서 사용하였다. 보체 공급원을 각각의 개별 시험 균주에 대한 적합성에 대해 시험하였다. 보체 공급원은 면역 혈청이 첨가되지 않은 대조군에서 생존하는 세균의 수가 75%를 초과하는 경우에만 사용되었다. 본 연구에 기재된 SBA를 수행하기 위해서는 10개의 독특한 보체 공급원이 요구되었다.

37℃ 및 5% CO₂에서 30분 동안 항온처리한 후, D-PBS를 반응 혼합물에 첨가하고 분취액을 50% GCK 배지로 충전된 마이크로필터 플레이트로 옮겼다. 상기 마이크로필터 플레이트를 여과하고 37℃ 및 5% CO₂에서 밤새 항온처리하고, 마이크로콜로니를 염색하고 정량하였다. 혈청 살균 역가는 면역 혈청을 함유하지 않는 대조군 웰의 CFU에 비해 CFU의 50% 감소를 야기하는 내삽된 혈청 희석비의 역수로서 정의되었다. SBA 역가는 37℃에서 30분 항온처리 후 세균 수의 50% 감소를 야기하는 시험 혈청의 내삽된 희석비의 역수로서 정의되었다. ORF2086 면역 혈청에 의한 사멸에 대한 민감성은 상응하는 면역 전 혈청에 비해 ORF2086 면역 혈청에 대한 SBA 역가의 4배 이상의 상승이 있는 경우 확립되었다. 출발 희석비에서 분석 균주에 대한 음성을 나타내는 혈청은 상기 분석에 대한 검출 한계 절반의 역가(즉, 4)를 배정받았다.

실시예 2: 비-지질화된 ORF2086 변이체의 클로닝 및 발현

네이세리아 메닝기티디스 균주 M98250771(A05)로부터의 잔기 27 내지 286에 상응하는 성숙 P2086 아미노산 서열은 원래 게놈 DNA의 PCR 증폭으로부터 유도되었다. TGCCATATGAGCAGCGGAAGCGGAAG(서열번호 22)의 서열을 갖는 정방향 프라이머는 5' 서열에 어닐링되었고 클로닝을 위한 NdeI 부위를 함유하였다. CGGATCCCTACTGTTTGCCGGCGATGC(서열번호 23)의 서열을 갖는 역방향 프라이머는 유전자의 3' 말단에 어닐링되었고 종결 코돈 TAG에 이어서 제한부위 BamHI을 함유하였다. 799 bp의 증폭된 단편을 중간체 벡터 PCR2.1(인비트로겐(Invitrogen), 미국 캘리포니아주 칼레스백 소재) 내에 먼저 클로닝하였다. 이 플라스미드를 NdeI 및 BamHI으로 절단하고 NdeI 및 BamHI으로 절단되어 있는 발현 벡터 pET9a(노바겐(Novagen), 미국 위스콘신주 매디슨 소재)에 라이게이션시켰다. 생성된 벡터 pLA100(서열번호 54를 포함함)은 지질화된 단백질에 존재할 N-말단 시스테인(위치 1의 N-말단 Cys이 결실된 서열번호 13 또는 서열번호 55 참조)을 갖지 않는, 균주 M98250771로부터의 성숙 서브패밀리 A05 P2086을 발현하였다. BLR(DE3) 에스케리치아 콜라이 숙주 균주[F-ompThsdSB(rB-mB-)galdcm△(srl-recA)306::Tn10(TetR)(DE3)](노바겐)를 사용하여 fHBP의 발현을 수득하였다.

동일한 클로닝 단계를 이용하여 B02, B03, B09, B22, B24, B44, A04, A12, 및 A22 N-말단 Cys 결실된 변이체를 제조하였다. Cys 코돈(예를 들면, 서열번호 1 내지 서열번호 11의 첫 번째 코돈)을 포함하는 정방향 프라이머를 사용하여 상기 방법과 동일한 방법으로 N-말단 Cys 함유 변이체도 제조하였다. 본원에서 제공된 서열에 근거하여, 당업자는 이들 변이체들 각각에 대한 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 디자인할 수 있을 것이다. 예를 들면, 하기 프라이머들을 사용하여 B44 비-지질화된 변이체를 증폭한 후 NdeI 및 BlpI을 이용하여 PET9a 내로 클로닝하였다.

[표 1]

결과

비-지질화된 플라스미드 구축물은 강하게 발현되었지만, 비-지질화된 단백질 변이체는 N-말단 Cys 잔기에서 피루빌화되었다. 예를 들면, 상기 구축물을 발현하는 방법을 기술하는 실시예 8 및 9를 참조한다. 이 피루빌화를 극복하기 위해, N-말단 Cys 코돈을 결실시켰다. 예를 들면, 실시예 10을 참조한다. 그러나, N-말단 Cys의 결실은 A22 및 B22 변이체의 발현을 방해하였다. 예를 들면, 도 4를 참조한다. 그러나, A05, B01 및 B44 변이체는 N-말단 Cys 잔기의 결실에도 불구하고 여전히 발현되었다. 예를 들면, 위치 1의 N-말단 Cys이 결실된 서열번호 13(A05), 서열번호 35(B01 N-말단), 및 위치 1의 N-말단 Cys이 결실된 서열번호 21(B44)을 참조한다. 예를 들면, 도 5를 참조한다. 또한, 비-지질화된 B09 변이체의 발현은 N-말단 Cys 잔기의 결실에 의해 영향받지 않았다. 예를 들면, 실시예 4를 참조한다.

실시예 3: 비-지질화된 변이체 발현에 대한 Gly/Ser 줄기의 영향

A05, B01 및 B44 변이체들이 N-말단 Cys의 부재 하에 발현된 이유, 및 A22 및 B22 변이체들이 발현되지 않은 이유를 확인하기 위해, 이들 변이체들의 서열들을 정렬하였다. A05, B01 및 B44 변이체들 모두가 N-말단 Cys 바로 다음에 뻗어 있는 일련의 10개 또는 11개 Gly 및 Ser 잔기(즉, Gly/Ser 줄기)를 보유한다. 그러나, A22 및 B22 변이체들은 단지 6개 Gly 및 Ser 잔기로 구성된 Gly/Ser 줄기를 가졌다. 따라서, 추가 Gly 및 Ser 잔기를 삽입하여 A22 및 B22 변이체들의 Gly/Ser 줄기를 연장시켰다.

10개 또는 11개 Gly 및 Ser 잔기를 갖는 Gly/Ser 줄기를 코딩하는 정방향 프라이머를 사용하여 실시예 2에 기재된 방법으로 긴 Gly/Ser 줄기 변이체들을 제조하였다.

N-말단 Cys이 결실되어 있고 긴 Gly/Ser 줄기(10개 또는 11개 Gly/Ser 잔기)를 갖는 A22 및 B22 변이체들은 N-말단 Cys이 결실되어 있고 짧은 Gly/Ser 줄기(6개 Gly/Ser 잔기)를 갖는 A22 및 B22 변이체들보다 증가된 발현을 보였다. 그러나, 이들 발현 수준은 A05, B01 및 B44 변이체 발현 수준에 비해 여전히 감소되어 있었다.

실시예 4: 코돈 최적화

비-지질화된 B09 변이체의 발현은 N-말단 Cys 잔기의 결실에 의해 영향을 받지 않았다(위치 1의 시스테인이 결실된 서열번호 18, 또는 서열번호 49 참조). 예를 들면, 도 6을 참조한다. B09 변이체의 서열 평가는 B09 변이체가 A22 및 B22 변이체들의 Gly/Ser 줄기와 유사한 6개 Gly 및 Ser 잔기로 구성된 Gly/Ser 줄기를 갖는다는 것을 입증하였다. 실제로, B09 및 A22 변이체들의 N-말단 꼬리는 아미노산 수준에서 동일하다. 그러나, B09 및 A22 변이체들(각각 서열번호 53 및 서열번호 42)의 N-말단 꼬리는 핵산 수준에서 2개의 핵산에 의해 구별된다: 서열번호 8의 핵산 15 및 39. 예를 들면, 도 6을 참조한다. B22 변이체의 N-말단 꼬리의 처음 14개 아미노산은 B09 및 A22 변이체들과 동일하고, B22 변이체의 N-말단 꼬리는 15번째 아미노산에서만 상이하다. B22 변이체의 핵산 1 내지 42는 A22 변이체의 핵산 1 내지 42와 동일하다. 최적으로 정렬되었을 때, B22 변이체의 핵산 1 내지 42(서열번호 52 참조)는 B09의 핵산 1 내지 42(서열번호 53 참조)와 동일하지만 핵산 15 및 39에서 상이하다. 따라서, B22 변이체는 서열번호 8의 아미노산 15 및 39에서 B09 변이체와 상이하다. 이 마지막 문장은 오타를 함유하고, B22 변이체는 서열번호 8의 핵산 15 및 39에서 B09 변이체와 상이하다고 기재되어야 한다.

상기 핵산 차이가 A22 및 B22 변이체와 비교되었을 때 B09 변이체의 발현 수준에 영향을 미쳤는지를 확인하기 위해, A22 및 B22 변이체들을 점 돌연변이로 돌연변이시켜 핵산 15 및 39를 Gly5 및 Gly13에 대한 상응하는 코돈 내로 도입하였다. 이들 침묵(silent) 핵산 돌연변이의 도입은 N-말단 Cys이 결실된 A22 및 B22 변이체의 발현을 N-말단 Cys이 결실된 B09 변이체와 유사한 수준으로 유의하게 증가시켰다. 예를 들면, 도 7을 참조한다. 따라서, B09 변이체와 일치시키기 위한 코돈 최적화는 N-말단 Cys이 결실된 비-지질화된 P2086 변이체의 발현을 증가시킬 수 있다.

비-지질화된 변이체 서열의 추가 분석은 발현을 개선하기 위한 Gly/Ser 줄기의 추가 코돈 최적화를 암시하였다. 따라서, 이러한 코돈 최적화된 서열을 포함하는 정방향 프라이머를 사용하여 실시예 2의 방법으로 추가 비-지질화된 변이체들을 구축하였다. 최적화된 Gly/Ser 줄기를 발생시키기 위해 사용된 정방향 프라이머들은 하기 서열들 중 임의의 서열을 포함한다:

실시예 5: 면역원성 조성물 제제 최적화

이스코매트릭스로 제제화된 백신은 혈청 살균 분석에서 측정되었을 때 4배 초과의 반응률을 달성하기 위해 요구되는 투약 횟수를 감소시키는 빠른 면역반응을 발생시킨다. 5마리의 레서스 마카크(rhesus macaques)로 구성된 군을 2가 비-지질화된 rP2086 백신의 상이한 제제들로 면역화시켰다. 상기 백신은 비-피루빌화되고 비-지질화된 A05 변이체(위치 1의 N-말단 Cys이 결실된 서열번호 13, 또는 서열번호 54에 의해 코딩된 서열번호 55) 및 비-피루빌화되고 비-지질화된 B44 변이체(위치 1의 N-말단 Cys이 결실된 서열번호 21, 또는 서열번호 51에 의해 코딩된 서열번호 44)를 포함하였다. 항원보강제 유닛은 다음과 같다: AlPO₄는 250 mcg이고, 이스코매트릭스는 10 mcg 내지 100 mcg이다. 표 2 내지 5에 제시된 AlPO₄에 대한 항원보강제 유닛은 밀리그램 유닛으로서 제시되어 있으므로 250 mcg와 대조적으로 0.25 (밀리그램)으로서 제시되어 있다.

면역화 스케쥴은 0주, 4주 및 24주이었고, 0주, 4주, 6주 및 26주에서 채혈하였다. 1회 투약 후 어떠한 군에서도 SBA 역가의 증가가 없었다. 2회 투약 후, SBA 역가의 증가, 및 기준에 비해 SBA 역가의 4배 이상의 증가에 의해 정의된 반응자의 수가 이스코매트릭스 항원보강제를 함유하는 제제의 경우 관찰되었다. 표 2 및 3은 fHBP 서브패밀리 A 및 B 균주 각각에 대해 관찰된 SBA GMT를 제공한다. A 및 B 서브패밀리 균주들의 경우 이스코매트릭스 제제에 대한 SBA GMT는 AlPO₄ 제제에 대해 관찰된 SBA GMT보다 각각 3배 내지 19배 및 4배 내지 24배 더 높았다. 3회 투약 후, fHBP 서브패밀리 A 및 B 균주의 경우 AlPO₄ 제제에 비해 각각 13배 내지 95배 및 2배 내지 10배 더 향상된 역가도 이스코매트릭스 제제에 대해 관찰되었다. 기준에 비해 SBA 역가의 4배 이상의 증가에 의해 정의된 반응률의 분석은 유사한 경향을 보였다(표 4 및 5).

[표 2]

[표 3]

[표 4]

[표 5]

실시예 6: 지질화된 변이체 및 비- 지질화된 변이체에 의해 부여된 면역보호

재조합적으로 발현된 비-지질화된 P2086 변이체(B44)는 SBA에 의해 측정되었을 때 다양한 fHBP 변이체(약 85% 내지 약 <92% ID) LP2086 서열을 나타내는 균주들에 대한 넓은 보호를 유도한다. 이들 반응률은 AlPO₄로 제제화된 비-지질화된 백신의 경우 수득되었다. 2가 fHBP 백신에 의해 발생된 서브패밀리 B fHBP MnB 균주에 대한 SBA 반응률을 보이는 표 6을 참조한다. 비-지질화된 백신("지질화" 컬럼에서 "-"로 표시됨)은 단백질 당 1 mcg의 비-피루빌화되고 비-지질화된 A05 변이체(위치 1의 N-말단 Cys이 결실된 서열번호 13) 및 비-피루빌화되고 비-지질화된 B44 변이체(위치 1의 N-말단 Cys이 결실된 서열번호 21)를 포함하였다.

대안적으로, 재조합적으로 발현된 비-지질화된 P2086 변이체(B44)는 SBA 역가에 의해 측정되었을 때 유사한(>92% ID) LP2086 서열 및 다양한(<92% ID) LP2086 서열을 보유하는 균주들에 대해 지질화된 변이체(B01)보다 더 높은 면역반응을 유도한다. (기준에 비해 SBA 역가의 4배 이상의 증가에 의해 정의된) 보다 높은 반응률은 지질화된 rLP2086 B01 백신에 비해 비-지질화된 rP2086 B44를 함유하는 백신의 경우 관찰되었다(표 6).

표 6에 따르면, 비-지질화된 B44는 다수의 LP2086 변이체 균주들에 대한 넓은 적용범위를 제공하기 위한(예를 들면, 이들 균주들에 대한 살균 항체를 이끌어내기 위한) 조성물에서 fHBP의 바람직한 서브패밀리 B 성분이다.

놀랍게도, 본 발명자들은 LP2086 B09 변이체 균주가 특히 이종(비-B09) ORF2086 폴리펩티드에 대해 양성 SBA 반응률을 가질 것 같지 않다는 것을 인식하였다. 특히, 본 발명자들은 표 6에 기재된 A05/B44 면역원성 조성물이 분석 균주에 대한 살균 항체를 이끌어냈다는 점에서 LP2086 B09가 예외라는 것을 발견하였다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 특히 1개 초과의 ORF2086 서브패밀리 B 폴리펩티드를 포함하는 조성물인 경우 B09 폴리펩티드를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 비-지질화된 B44를 포함하는 면역원성 조성물은 비-지질화된 B09 폴리펩티드도 포함할 수 있다.

[표 6]

실시예 7: B44 및 B09 변이체의 코돈 최적화

이전 실시예에서 달성된 발현 수준이 많은 적용에 적절할 수 있지만, 추가 최적화가 바람직할 수 있었고, 단백질의 전체 길이에 걸쳐 추가 코돈 최적화를 함유하는 에스케리치아 콜라이 발현 구축물을 제조하여 시험하였다. 비-Cys B44 단백질의 발현을 위한 이러한 개선된 서열은 서열번호 43에 기재된 핵산 서열인 것으로 발견되었다. 실시예 9에 제시된 바와 같이, 서열번호 43을 함유하는 발현 구축물은 비-최적화된 야생형 서열의 발현 구축물에 비해 향상된 발현을 보였다.

상기 최적화된 B44(서열번호 43) 구축물로부터의 코돈 변화를 B09(서열번호 48)에 적용함으로써 N-말단 Cys이 결실된 B09 단백질의 발현을 개선하였다. 최적화된 B09 서열을 발생시키기 위해, B44 최적화된 DNA 서열(서열번호 43)을 B09 대립형질(서열번호 48)의 DNA 서열과 먼저 정렬하였다. B44(서열번호 44)와 B09(서열번호 49) 사이의 아미노산이 동일한 경우 B44 최적화된 대립형질(서열번호 43)에서 관찰된 코돈 변화를 반영하도록 B09 대립형질(서열번호 48)의 전체 비-지질화된 코딩 서열을 최적화하였다. B44 최적화된 서열(서열번호 43)에서 사용된 코돈을 반영하도록 B09 대립형질과 B44 대립형질 사이의 동일한 아미노산에 상응하는 B09 대립형질의 코돈 서열을 변화시켰다. B09(서열번호 49)와 B44(서열번호 44) 사이에 상이한 아미노산에 대한 코돈 서열은 B09 DNA 서열에서 변화되지 않았다.

추가로, 비-지질화된 B44 아미노산 서열(서열번호 44)은 그의 N-말단에서 2개의 순차적인 세린-글리신 반복부 서열(S-G-G-G-G)(서열번호 56)(서열번호 44의 아미노산 2 내지 6 또한 참조)을 함유하는 반면, B09 대립형질은 N-말단에서 단지 1개의 세린-글리신 반복부를 함유한다(서열번호 49의 아미노산 2 내지 6 및 아미노산 7 내지 11 참조). 또한, B44의 N-말단에 존재하는 2개의 세린-글리신 반복부(서열번호 44의 아미노산 2 내지 6 및 아미노산 7 내지 11)는 상이한 코돈 용법을 갖고(서열번호 43의 뉴클레오티드 4 내지 18 및 뉴클레오티드 19 내지 33 참조), 최적화된 B44 세린-글리신 반복부의 상이한 조합(예를 들면, 서열번호 43의 뉴클레오티드 4 내지 18, 또는 서열번호 43의 뉴클레오티드 19 내지 33, 또는 이들의 조합물)을 B09 DNA 서열(서열번호 48, 예를 들면, 서열번호 48의 뉴클레오티드 4 내지 18)에 적용하여 재조합 단백질 발현에 대한 효과를 조사하였다.

최적화된 B09의 3개의 상이한 버전이 구축되었다: 서열번호 45는 최적화된 B44로부터의 2개의 세린-글리신 반복부(GS1 및 GS2)(서열번호 43의 핵산 4 내지 33)를 함유하고, 서열번호 46은 GS1(서열번호 43의 핵산 4 내지 18)을 함유하고, 서열번호 47은 GS2(서열번호 43의 핵산 19 내지 33)를 함유한다. 상기 코돈 최적화된 서열 모두에 대한 DNA를 당업계의 표준 화학반응을 이용하여 화학적으로 합성하였다. 생성된 DNA를 적절한 플라스미드 발현 벡터 내로 클로닝하고 실시예 8 및 9에 기재된 바와 같이 에스케리치아 콜라이 숙주 세포에서의 발현에 대해 시험하였다.

실시예 8: ORF2086, B09 변이체의 발현 방법

에스케리치아 콜라이 K-12 균주(recA, fhuA 및 araA에서 결실을 갖는 야생형 W3110(CGSC4474)의 유도체)의 세포를, 서열번호 45를 포함하는 플라스미드 pEB063, 서열번호 46을 포함하는 pEB064, 서열번호 47을 포함하는 플라스미드 pEB065, 또는 서열번호 48을 포함하는 플라스미드 pLA134로 형질전환시켰다. 상기 K-12 균주에 대한 바람직한 변형은 발효 목적에 도움이 되지만 단백질의 발현을 위해서는 요구되지 않는다.

세포를 글루코스 염 한정 배지에 접종하였다. 37℃에서 8시간 동안 항온처리한 후, 연속적인 글루코스 공급을 적용하고 항온처리를 추가 3시간 동안 계속 수행하였다. 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 배양물에 0.1 mM의 최종 농도로 첨가한 후 37℃에서 12시간 동안 항온처리하였다. 16,000xg에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 수집하고 이지-라이스(Easy-Lyse: 상표) 세포 용해 키트(리엔코 테크놀로지스(Lienco Technologies), 미국 미조리주 세인트 루이스 소재) 및 적재 완충제를 첨가하여 용해시켰다. 스캐닝 밀도측정기에 의한 정량과 함께 SDS-PAGE 겔의 코마시에 염색 및/또는 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 B09의 발현에 대해 맑은 용해물을 분석하였다. 스캐닝 밀도측정으로부터의 결과는 하기 표 7에 기재되어 있다.

[표 7]

실시예 9: ORF2086 , B44 변이체의 발현 방법

에스케리치아 콜라이 B 균주(BLR(DE3), 노바겐)의 세포를 서열번호 51을 포함하는 플라스미드 pLN056으로 형질전환시켰다. 에스케리치아 콜라이 K-12 균주(야생형 W3110의 유도체)의 세포를 서열번호 43을 포함하는 플라스미드 pDK087로 형질전환시켰다. 세포를 글루코스 염 한정 배지에 접종하였다. 37℃에서 8시간 동안 항온처리한 후, 연속적인 글루코스 공급을 적용하고 항온처리를 추가 3시간 동안 계속 수행하였다. 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 배양물에 0.1 mM의 최종 농도로 첨가한 후 37℃에서 12시간 동안 항온처리하였다. 16,000xg에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 수집하고 이지-라이스(상표) 세포 용해 키트(리엔코 테크놀로지스, 미국 미조리주 세인트 루이스 소재) 및 적재 완충제를 첨가하여 용해시켰다. 스캐닝 밀도측정기에 의한 정량과 함께 SDS-PAGE 겔의 코마시에 염색 및/또는 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 B09의 발현에 대해 상청액을 분석하였다. 스캐닝 밀도측정으로부터의 결과는 하기 표 8에 기재되어 있다.

[표 8]

실시예 10: 피루빌화

본 실시예는 예를 들면, 에스케리치아 콜라이에서 발현되었을 때 비-지질화된 ORF2086 단백질의 N-말단 Cys 잔기가 피루빌화될 수 있다는 것을 입증한다.

역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)를 이용하여 변이체 A05(서열번호 13) 및 B44(서열번호 21)의 제조 동안 이종 단백질 축적을 모니터링하였다. 이 분리를 사중극 비행시간(time-of-flight) 질량 분광측정기(QTOF-MS)와 접속시켜 생성물 관련 변이체의 형성을 모니터링하는 수단을 제공하였다.

에스케리치아 콜라이 B 및/또는 K-12 숙주 세포에서 발현한 후, 이들 발효로부터 유도된 생성물을 생성물 변형이 관찰된 시간 동안 정제 절차로 정제하였다. 질량 분광의 디콘볼루션(Deconvolution)은 상기 변이체를, A05 및 B44에 대한 각각 27640 Da 및 27572 Da의 천연 생성물에 비해 +70 Da의 질량 이동을 나타내는 것으로서 특징규명하였다.

공개문헌은 +70 Da의 질량 이동이 단백질에서 이미 관찰되었고 아미노-말단 잔기의 피루빌화에 기인한다는 것을 보여주었다.

질량 분광 발효 데이터(MS/MS)를 이용하여 피루베이트 기의 존재 및 위치를 확인하였다. 데이터는 상기 변형이 A05 및 B44에 있어서 아미노-말단 시스테인 잔기, 즉 위치 1의 아미노산 상에 존재한다는 것을 보여주었다. A05의 경우, 피루빌화된 폴리펩티드의 백분율은 A05 폴리펩티드(서열번호 13)의 총 수와 비교되었을 때 약 30%이었다. B44의 경우, 피루빌화된 폴리펩티드의 백분율은 B44 폴리펩티드(서열번호 21)의 총 수와 비교되었을 때 약 25%이었다.

아미노-말단 시스테인을 함유하지 않는 A05(위치 1의 N-말단 Cys이 결실된 서열번호 13, 또는 서열번호 55) 및 B44 변이체(위치 1의 N-말단 Cys이 결실된 서열번호 21, 또는 서열번호 44)가 정제되었을 때, 검출가능한 피루빌화(+70 Da)가 존재하지 않았다.

실시예 11: 개별적으로 사용되거나 병용된 B09 및 B44의 면역원성

레서스 마카크 원숭이의 5마리 내지 10마리 군을 투여량 당 250 mcg의 AlPO₄로 제제화된 B09 변이체(서열번호 48에 의해 코딩된 서열번호 49) 또는 B44 변이체(서열번호 43에 의해 코딩된 서열번호 44), 또는 A05, B09 및 B44 변이체(각각 서열번호 55, 서열번호 48에 의해 코딩된 서열번호 49, 및 서열번호 43에 의해 코딩된 서열번호 44)로 면역화시켰다. 0주, 4주 및 8주에, 각각 10 mcg의 비-지질화된 fHBP를 단독으로 사용하거나 표 9 및 10에 나열된 바와 같이 병용하여 근육내 경로를 통해 상기 원숭이들을 백신접종하였다. 0주 및 12주에, 서브패밀리 A 또는 서브패밀리 B fHBP 변이체를 갖는 MnB 균주에 대한 SBA에서 혈청 샘플을 분석하였다. 반응자는 역가가 4배 이상 상승된 동물로서 기록되었다. 시험된 B44 변이체는 최적화된 구축물(서열번호 43)이었고, 이전 연구에서 관찰된 넓은 반응률(상기 표)은 단독으로 사용되었거나 B09와 병용된 상기 최적화된 구축물(표 9) B44 백신의 경우 유지되었다. B09 백신 단독(표 10)은 넓은 교차반응성 면역반응도 발생시킬 수 있었다(표 10).

[표 9]

0주, 4주 및 8주에, 250 mcg의 AlPO₄를 갖는 제제 중의 각각 10 mcg의 비-지질화된 fHBP를 단독으로 사용하거나 백신 컬럼에 나열된 바와 같이 병용하여 근육내 경로를 통해 레서스 마카크(n = 10)를 면역화시켰다. 0주 및 10주에, 표에 나열된 MnB 균주에 대한 SBA에서 혈청 샘플을 분석하였다. 반응자는 역가가 4배 이상 상승된 동물로서 기록된다.

표 9는 비-피루빌화되고 비-지질화된 B44, B09 및 A05의 조합물을 포함하는 조성물이 B44만을 포함하는 조성물로부터의 교차적용범위에 비해 시험 변이체들에 대한 더 높은 교차적용범위를 보였다는 것을 보여준다. 특히 표 6 및 9를 함께 포함하는 본원에 제시된 결과에 비추어 볼 때, B44, B09 및 A05를 단독으로 또는 조합으로 포함하는 조성물이 본 발명의 바람직한 실시양태이다. 특히, B44 및 B09 둘다를 포함하는 조성물이 개시된다. 이러한 조성물은 바람직하게는 서브패밀리 A 폴리펩티드, 예컨대, 특히 A05를 추가로 포함한다.

[표 10]

0주, 4주 및 8주에, 250 mcg의 AlPO₄를 갖는 제제 중의 각각 10 mcg의 비-지질화된 fHBP를 단독으로 사용하거나 백신 컬럼에 나열된 바와 같이 병용하여 근육내 경로를 통해 레서스 마카크(n = 5)를 면역화시켰다. 0주 및 10주에, 표에 나열된 MnB 균주에 대한 SBA에서 혈청 샘플을 분석하였다. 반응자는 역가가 4배 이상 상승된 동물로서 기록된다.

실시예 12: 지질화된 변이체 및 비-지질화된 변이체 구축물에 의해 부여된 면역보호

찰스 리버(Charles River, 캐나다 소재)로부터 입수된 2.5 kg 내지 3.5 kg의 20마리의 암컷 뉴질랜드 백색 토끼를 전체 세포 ELISA로 예비스크리닝하고 fHBP 변이체 B02(서열번호 16) 및 B44(서열번호 21)를 나타내는 시험 균주들에 대한 그들의 낮은 배경 역가에 근거하여 본 연구를 위해 10마리의 동물들을 선택하였다(표 11). 0주, 4주 및 9주에, 0.5 ㎖ 투여량 당 50 ㎍의 이스코매트릭스로 제제화된 100 ㎍의 각각의 단백질을 사용하여 3마리 동물의 군을 근육내로 면역화시켰다(표 12). 군 1을 비-지질화된 B44(서열번호 44)로 백신접종하였다. AlP0₄(250 mcg)로 제제화된 지질화된 B01로 백신접종된 대조군이 포함되었다. 토끼를 0주, 4주, 9주 및 10주에 채혈하였다. 10주에 개별 혈청을 준비하고 fHBP B 서브패밀리로부터의 다수의 혈청군 B 수막구균 균주들에 대한 혈청 살균 분석으로 분석하였다.

[표 11]

[표 12]

혈청 살균 분석(SBA): 다수의 혈청군 B 수막구균 균주들에 대한 마이크로콜로니 기초 혈청 살균 분석(SBA)(표 13)을 개별 혈청 샘플에 대해 수행하였다. 공여자로부터의 인간 혈청을 분석에서 시험된 균주에 대한 보체 공급원으로서 적합하게 만들었다. 보체 매개된 항체 의존적 살균 역가를 내삽하고 상기 분석에서 수막구균 세포의 50%를 사멸시키는 시험 혈청의 희석비의 역수로서 표현하였다. 상기 분석의 검출 한계는 4의 SBA 역가이었다. 4 미만의 SBA 역가는 2의 수를 배정받았다. 예비채혈에서의 역가에 비해 10주 혈청에서의 4배 이상의 SBA 역가 상승을 계산하여 비교하였다.

SBA에서 측정된 혈청 살균 항체 활성은 수막구균 질환에 대한 보호의 면역학적 대용 활성이다. 토끼에서 살균 항체를 이끌어내는 비-지질화된 rfHBP를 사용한 면역화의 능력을 SBA로 측정하였다. SBA는 천연적으로 일어나는 보체 매개된 세균 용해를 모방함으로써 혈청 샘플에서 항체의 수준을 측정한다. 10주에 수집된 토끼 혈청 샘플을 B44 fHBP 또는 B02 fHBP를 갖는 균주에 대한 SBA로 분석하였다. 표 13에 제시된 바와 같이, 3차 면역화 후 1주(10주)에, 모든 혈청 샘플들이 시험 균주들에 대한 살균 활성을 나타내었다(표 13). 비-지질화된 B44(서열번호 44)는 뉴질랜드 토끼에서 이들 균주들에 대해 비-지질화된 B01보다 더 높은 면역원성을 나타내었다. 이스코매트릭스 항원보강제로 제제화된 비-지질화된 B44(서열번호 44)는 이들 균주들에 대해 인산알루미늄으로 제제화된 지질화된 B01에 필적할만한 역가를 제공하였다. 예비채혈된 토끼 혈청은 일반적으로 시험 균주들에 대한 기존 살균 활성을 보이지 않았다.

[표 13]

실시예 13: 뉴질랜드 백색 토끼에서 6개의 비- 지질화된 인자 H 결합 단백질의 면역원성

5마리의 토끼로 구성된 군을 표 14에 기재된 바와 같이 비-지질화된 fHBP 변이체들로 면역화시켰다. 백신을 0주, 4주 및 9주에 투여하였다. 0주 및 10주에 수집된 토끼 혈청 샘플을 동종성 fHBP 서열 및 이종성 fHBP 서열을 갖는 균주에 대한 SBA로 분석하였다. 표 14는 3차 면역화 후 반응자의 %를 보여준다. 3차 면역화 후 1주(10주)에, 모든 혈청 샘플들이 동종 균주들에 대한 살균 활성뿐만 아니라 동일한 fHBP 서브패밀리로부터의 다른 시험 균주들에 대한 살균 활성도 나타내었다. 예비채혈된 토끼 혈청은 일반적으로 시험 균주들에 대한 기존 살균 활성을 보이지 않았다.

[표 14]

본 발명은 하기 절에서 정의된 하기 실시양태들도 제공한다:

C1. P2086 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물로서, 상기 P2086이 B44, B02, B03, B22, B24, B09, A05, A04, A12 또는 A22 변이체인, 면역원성 조성물.

C2. P2086 서브패밀리 B 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물로서, 상기 P2086 서브패밀리 B 폴리펩티드가 B44, B02, B03, B22, B24 또는 B09 변이체인, 면역원성 조성물.

C3. C2에 있어서, P2086 서브패밀리 A 폴리펩티드를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.

C4. C3에 있어서, P2086 서브패밀리 A 폴리펩티드가 A05, A04, A12 또는 A22 변이체인, 면역원성 조성물.

C5. C1 내지 C4 중 어느 하나에 있어서, 항원보강제를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.

C6. C5에 있어서, 항원보강제가 a) 알루미늄 항원보강제; b) 사포닌; c) CpG 뉴클레오티드 서열; 및 d) 상기 a), b) 및 c)의 임의의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는, 면역원성 조성물.

C7. C6에 있어서, 알루미늄 항원보강제가 AlPO₄, Al(OH)₃, Al₂(SO₄)₃ 및 명반으로 구성된 군으로부터 선택되는, 면역원성 조성물.

C8. C6 또는 C7에 있어서, 알루미늄의 농도가 0.125 ㎍/㎖ 내지 0.5 ㎍/㎖인, 면역원성 조성물.

C9. C8에 있어서, 알루미늄의 농도가 0.25 ㎍/㎖인, 면역원성 조성물.

C10. C6 내지 C9 중 어느 하나에 있어서, 사포닌 농도가 1 ㎍/㎖ 내지 250 ㎍/㎖인, 면역원성 조성물.

C11. C10에 있어서, 사포닌 농도가 10 ㎍/㎖ 내지 100 ㎍/㎖인, 면역원성 조성물.

C12. C10에 있어서, 사포닌 농도가 10 ㎍/㎖인, 면역원성 조성물.

C13. C10에 있어서, 사포닌 농도가 100 ㎍/㎖인, 면역원성 조성물.

C14. C6 내지 C13 중 어느 하나에 있어서, 사포닌이 QS-21 또는 이스코매트릭스인, 면역원성 조성물.

C15. C1 내지 C14 중 어느 하나에 있어서, 다회 투여량이 대상체에게 투여된 후 네이세리아 메닝기티디스 세균에 대한 면역원성 반응을 일으키는 능력을 부여하는 면역원성 조성물.

C16. C15에 있어서, 네이세리아 메닝기티디스 세균에 대한 면역원성 반응이, 2회 투여량이 대상체에게 투여된 후 부여되는, 면역원성 조성물.

C17. C15에 있어서, 네이세리아 메닝기티디스 세균에 대한 면역원성 반응이, 3회 투여량이 대상체에게 투여된 후 부여되는, 면역원성 조성물.

C18. 비-지질화된 P2086 항원에 대한 증가된 면역원성을 부여하는 조성물로서, 사포닌 및 1개 이상의 비-지질화된 P2086 항원을 포함하는 조성물.

C19. C18에 있어서, 사포닌 농도가 1 ㎍/㎖ 내지 250 ㎍/㎖인, 면역원성 조성물.

C20. C19에 있어서, 사포닌 농도가 10 ㎍/㎖ 내지 100 ㎍/㎖인, 면역원성 조성물.

C21. C19에 있어서, 사포닌 농도가 10 ㎍/㎖인, 면역원성 조성물.

C22. C19에 있어서, 사포닌 농도가 100 ㎍/㎖인, 면역원성 조성물.

C23. C18 내지 C22 중 어느 하나에 있어서, 사포닌이 QS-21 또는 이스코매트릭스인, 면역원성 조성물.

C24. C18 내지 C23 중 어느 하나에 있어서, 알루미늄을 추가로 포함하는 면역원성 조성물.

C25. C24에 있어서, 알루미늄의 농도가 0.125 ㎍/㎖ 내지 0.5 ㎍/㎖인, 면역원성 조성물.

C26. C25에 있어서, 알루미늄의 농도가 0.25 ㎍/㎖인, 면역원성 조성물.

C27. C18 내지 C26 중 어느 하나에 있어서, 다회 투여량이 대상체에게 투여된 후 네이세리아 메닝기티디스 세균에 대한 면역원성 반응을 부여하는 면역원성 조성물.

C28. C27에 있어서, 네이세리아 메닝기티디스 세균에 대한 면역원성 반응이, 2회 투여량이 대상체에게 투여된 후 부여되는, 면역원성 조성물.

C29. C27에 있어서, 네이세리아 메닝기티디스 세균에 대한 면역원성 반응이, 3회 투여량이 대상체에게 투여된 후 부여되는, 면역원성 조성물.

C30. C18 내지 C29 중 어느 하나에 있어서, 비-지질화된 P2086 항원이 비-지질화된 P2086 서브패밀리 B 폴리펩티드인, 면역원성 조성물.

C31. C30에 있어서, 비-지질화된 P2086 서브패밀리 B 폴리펩티드가 B44, B02, B03, B22, B24 또는 B09 변이체인, 면역원성 조성물.

C32. C18 내지 C29 중 어느 하나에 있어서, 비-지질화된 P2086 항원이 비-지질화된 P2086 서브패밀리 A 폴리펩티드인, 면역원성 조성물.

C33. C32에 있어서, 비-지질화된 P2086 서브패밀리 A 폴리펩티드가 A05, A04, A12 또는 A22 변이체인, 면역원성 조성물.

C34. C18 내지 C33 중 어느 하나에 있어서, 2개 이상의 비-지질화된 P2086 항원을 포함하고, 이때 상기 2개 이상의 비-지질화된 P2086 항원이 1개 이상의 비-지질화된 P2086 서브패밀리 A 폴리펩티드 및 1개 이상의 비-지질화된 P2086 서브패밀리 B 폴리펩티드인, 면역원성 조성물.

C35. C34에 있어서, 비-지질화된 P2086 서브패밀리 A 폴리펩티드가 A05 변이체이고, 비-지질화된 P2086 서브패밀리 B 폴리펩티드가 B44 변이체인, 면역원성 조성물.

C36. C34에 있어서, 비-지질화된 P2086 서브패밀리 A 폴리펩티드가 A05 변이체이고, 비-지질화된 P2086 서브패밀리 B 폴리펩티드가 B22 변이체인, 면역원성 조성물.

C37. C34에 있어서, 비-지질화된 P2086 서브패밀리 A 폴리펩티드가 A05 변이체이고, 비-지질화된 P2086 서브패밀리 B 폴리펩티드가 B09 변이체인, 면역원성 조성물.

C38. P2086 서브패밀리 B 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 네이세리아 메닝기티디스 세균에 대한 면역성을 상기 대상체에게 부여하는 방법으로서, 상기 P2086 서브패밀리 B 폴리펩티드가 B44, B02, B03, B22, B24 또는 B09 변이체인, 방법.

C39. C38에 있어서, 면역원성 조성물이 P2086 서브패밀리 A 폴리펩티드를 추가로 포함하는, 방법.

C40. C39에 있어서, P2086 서브패밀리 A 폴리펩티드가 A05, A04, A12 또는 A22 변이체인, 방법.

C41. C38 내지 C40 중 어느 하나에 있어서, 면역원성 조성물이 항원보강제를 추가로 포함하는, 방법.

C42. C41에 있어서, 항원보강제가 a) 알루미늄 항원보강제; b) 사포닌; c) CpG 뉴클레오티드 서열; 및 d) 상기 a), b) 및 c)의 임의의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.

C43. C42에 있어서, 알루미늄 항원보강제가 AlPO₄, Al(OH)₃, Al₂(SO₄)₃ 및 명반으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.

C44. C42 또는 C43에 있어서, 알루미늄의 농도가 0.125 ㎍/㎖ 내지 0.5 ㎍/㎖인, 방법.

C45. C44에 있어서, 알루미늄의 농도가 0.25 ㎍/㎖인, 방법.

C46. C42 내지 C45 중 어느 하나에 있어서, 사포닌 농도가 1 ㎍/㎖ 내지 250 ㎍/㎖인, 방법.

C47. C46에 있어서, 사포닌 농도가 10 ㎍/㎖ 내지 100 ㎍/㎖인, 방법.

C48. C47에 있어서, 사포닌 농도가 10 ㎍/㎖인, 방법.

C49. C48에 있어서, 사포닌 농도가 100 ㎍/㎖인, 방법.

C50. C42 내지 C49 중 어느 하나에 있어서, 사포닌이 QS-21 또는 이스코매트릭스인, 방법.

C51. C38 내지 C50 중 어느 하나에 있어서, 면역원성 조성물이 투약 스케쥴에 걸쳐 다회 투여량으로 대상체에게 투여되는, 방법.

C52. C51에 있어서, 면역원성 조성물이 투약 스케쥴에 걸쳐 2회 투여량으로 대상체에게 투여되는, 방법.

C53. C51에 있어서, 면역원성 조성물이 투약 스케쥴에 걸쳐 3회 투여량으로 대상체에게 투여되는, 방법.

C54. a) ORF2086 변이체 핵산 서열을 에스케리치아 콜라이 발현 벡터 내로 클로닝하는 단계;

b) 세균을 ORF2086 발현 벡터로 형질전환시키는 단계;

c) 발현을 유도하는 단계; 및

d) 발현된 P2086 단백질을 단리하는 단계

를 포함하는, 비-지질화된 P2086 변이체 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서, 이때 상기 ORF2086 발현 벡터가 지질화 조절 서열을 포함하지 않는, 방법.

C55. C54에 있어서, ORF2086 변이체의 N-말단 Cys을 코딩하는 코돈이 결실되는, 방법.

C56. C54에 있어서, ORF2086 변이체의 N-말단 Cys을 코딩하는 코돈이 Ala, Gly 또는 Val 코돈을 발생시키도록 돌연변이되는, 방법.

C57. C55 또는 C56에 있어서, ORF2086 변이체가 A05, B01 또는 B44 변이체인, 방법.

C58. C54 내지 C57 중 어느 하나에 있어서, Ser 및 Gly 잔기를 부가하여 N-말단 Cys의 바로 하류에서 Gly/Ser 줄기가 뻗어 있도록 N-말단 꼬리가 돌연변이되는, 방법.

C59. C58에 있어서, Gly/Ser 줄기에서 Ser 및 Gly 잔기의 총 수가 7 이상인, 방법.

C60. C58에 있어서, Gly/Ser 줄기에서 Ser 및 Gly 잔기의 총 수가 8 이상인, 방법.

C61. C58에 있어서, Gly/Ser 줄기에서 Ser 및 Gly 잔기의 총 수가 9 이상인, 방법.

C62. C58에 있어서, Gly/Ser 줄기에서 Ser 및 Gly 잔기의 총 수가 10 이상인, 방법.

C63. C58에 있어서, Gly/Ser 줄기에서 Ser 및 Gly 잔기의 총 수가 11 이상인, 방법.

C64. C58에 있어서, Gly/Ser 줄기에서 Ser 및 Gly 잔기의 총 수가 12 이상인, 방법.

C65. C54 내지 C57 중 어느 하나에 있어서, ORF2086 변이체의 5번째 아미노산을 코딩하는 코돈이 서열번호 8의 뉴클레오티드 13 내지 15와 100% 동일하고, ORF2086 변이체의 13번째 아미노산을 코딩하는 코돈이 서열번호 8의 뉴클레오티드 37 내지 39와 100% 동일하도록 ORF2086 변이체의 N-말단 꼬리의 코돈이 점 돌연변이유발에 의해 최적화되는, 방법.

C66. C65에 있어서, ORF2086 변이체의 N-말단 꼬리의 코돈이 서열번호 8의 뉴클레오티드 1 내지 45와 100% 동일한, 방법.

C67. C65에 있어서, ORF2086 변이체의 N-말단 꼬리의 코돈이 서열번호 8의 뉴클레오티드 4 내지 45와 100% 동일한, 방법.

C68. C65에 있어서, ORF2086 변이체의 N-말단 꼬리의 코돈이 서열번호 8의 뉴클레오티드 4 내지 42와 100% 동일한, 방법.

C69. C65에 있어서, ORF2086 변이체에 의해 코딩된 단백질의 N-말단 꼬리가 서열번호 18의 아미노산 1 내지 15에 비해 1개 이상의 아미노산 치환을 포함하는, 방법.

C70. C65에 있어서, ORF2086 변이체에 의해 코딩된 단백질의 N-말단 꼬리가 서열번호 18의 아미노산 2 내지 15에 비해 1개 이상의 아미노산 치환을 포함하는, 방법.

C71. C65에 있어서, ORF2086 변이체에 의해 코딩된 단백질의 N-말단 꼬리가 서열번호 18의 아미노산 1 내지 15에 비해 2개의 아미노산 치환을 포함하는, 방법.

C72. C65에 있어서, ORF2086 변이체에 의해 코딩된 단백질의 N-말단 꼬리가 서열번호 18의 아미노산 2 내지 15에 비해 2개의 아미노산 치환을 포함하는, 방법.

C73. C69 내지 C72 중 어느 하나에 있어서, 아미노산 치환이 보존적 아미노산 치환인, 방법.

C74. C65 내지 C73 중 어느 하나에 있어서, ORF2086 변이체가 A22 또는 B22 변이체인, 방법.

C75. C55 내지 C74 중 어느 하나에 있어서, 발현이 IPTG의 첨가에 의해 유도되는, 방법.

C76. C55 내지 C75 중 어느 하나에 있어서, 세균이 에스케리치아 콜라이인, 방법.

<110> WYETH LLC <120> NON-LIPIDATED VARIANTS OF NEISSERIA MENINGITIDIS ORF2086 ANTIGENS <130> PC063885 <140> PCT/IB2011/053934 <141> 2011-09-08 <150> US61/381837 <151> 2010-09-10 <160> 64 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 780 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis (group B) <400> 1 tgcagcagcg gaggcggagg cggcggtgtc gccgccgaca tcggcacggg gcttgccgat 60 gcactaactg cgccgctcga ccataaagac aaaggtttga aatccctgac attggaagac 120 tccattcccc aaaacggaac actgaccctg tcggcacaag gtgcggaaaa aactttcaaa 180 gccggcgaca aagacaacag cctcaacacg ggcaaactga agaacgacaa aatcagccgc 240 ttcgacttcg tgcaaaaaat cgaagtggac ggacaaacca tcacactggc aagcggcgaa 300 tttcaaatat acaaacagga ccactccgcc gtcgttgccc tacagattga aaaaatcaac 360 aaccccgaca aaatcgacag cctgataaac caacgctcct tccttgtcag cggtttgggc 420 ggagaacata ccgccttcaa ccaactgccc ggcgacaaag ccgagtatca cggcaaagca 480 ttcagctccg acgatgccgg cggaaaactg acctatacca tagattttgc cgccaaacag 540 ggacacggca aaatcgaaca cctgaaaaca cccgagcaaa atgtcgagct tgccgccgcc 600 gaactcaaag 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cccttttcgg cgaccgcgcc caagaaatcg ccggctcggc aaccgtgaag 720 ataagggaaa aggttcacga aatcggcatc gccggcaaac agtag 765 <210> 6 <211> 792 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis (group B) <400> 6 tgcagcagcg gaggcggcgg aagcggaggc ggcggtgtcg ccgccgacat cggcgcgggg 60 cttgccgatg cactaaccgc accgctcgac cataaagaca aaggtttgaa atccctgaca 120 ttggaagact ccatttccca aaacggaaca ctgaccctgt cggcacaagg tgcggaaaga 180 actttcaaag ccggcgacaa agacaacagt ctcaacacag gcaaactgaa gaacgacaaa 240 atcagccgct tcgactttat ccgtcaaatc gaagtggacg ggcagctcat taccttggag 300 agcggagagt tccaagtgta caaacaaagc cattccgcct taaccgccct tcagaccgag 360 caagtacaag actcggagca ttccgggaag atggttgcga aacgccagtt cagaatcggc 420 gacatagtgg gcgaacatac atcttttgac aagcttccca aagacgtcat ggcgacatat 480 cgcgggacgg cgttcggttc agacgatgcc ggcggaaaac tgacctacac catagatttc 540 gccgccaagc agggacacgg caaaatcgaa catttgaaat cgcctgaact caatgttgac 600 ctggccgccg ccgatatcaa gccggatgaa aaacaccatg ccgtcatcag cggttccgtc 660 ctttacaacc aagccgagaa aggcagttac tctctaggca 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gcccaggaag ttgccggcag cgcggaagtg 720 gaaaccgcaa acggcataca ccatatcggt cttgccgcca agcaataa 768 <210> 8 <211> 768 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis (group B) <400> 8 tgcagcagcg gagggggcgg tgtcgccgcc gacatcggtg cggggcttgc cgatgcacta 60 accgcaccgc tcgaccataa agacaaaggt ttgcagtctt taacgctgga tcagtccgtc 120 aggaaaaacg agaaactgaa gctggcggca caaggtgcgg aaaaaactta tggaaacggc 180 gacagcctta atacgggcaa attgaagaac gacaaggtca gccgcttcga ctttatccgt 240 caaatcgaag tggacgggaa gctcattacc ttggagagcg gagagttcca agtgtacaaa 300 caaagccatt ccgccttaac cgcccttcag accgagcaag tacaagactc ggaggattcc 360 gggaagatgg ttgcgaaacg ccagttcaga atcggcgaca tagcgggcga acatacatct 420 tttgacaagc ttcccaaagg cggcagtgcg acatatcgcg ggacggcgtt cggttcagac 480 gatgctggcg gaaaactgac ctatactata gatttcgccg ccaagcaggg acacggcaaa 540 atcgaacatt tgaaatcgcc cgaactcaat gtcgagcttg ccaccgccta tatcaagccg 600 gatgaaaaac gccatgccgt tatcagcggt tccgtccttt acaaccaaga cgagaaaggc 660 agttactccc tcggtatctt tggcgggcaa gcccaggaag ttgccggcag cgcggaagtg 720 gaaaccgcaa acggcataca ccatatcggt cttgccgcca agcagtaa 768 <210> 9 <211> 768 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis (group B) <400> 9 tgcagcagcg gaggcggcgg tgtcgccgcc gacatcggcg cggtgcttgc cgatgcacta 60 accgcaccgc tcgaccataa agacaaaagt ttgcagtctt tgacgctgga tcagtccgtc 120 aggaaaaacg agaaactgaa gctggcggca caaggtgcgg aaaaaactta tggaaacggc 180 gacagcctca atacgggcaa attgaagaac gacaaggtca gccgcttcga ctttatccgt 240 caaatcgaag tggacgggca gctcattacc ttggagagcg gagagttcca agtgtacaaa 300 caaagccatt ccgccttaac cgcccttcag accgagcaag tacaagattc ggagcattca 360 gggaagatgg ttgcgaaacg ccagttcaga atcggcgata tagcgggtga acatacatct 420 tttgacaagc ttcccgaagg cggcagggcg acatatcgcg ggacggcatt cggttcagac 480 gatgccagtg gaaaactgac ctacaccata gatttcgccg ccaagcaggg acacggcaaa 540 atcgaacatt tgaaatcgcc agaactcaat gttgacctgg ccgcctccga tatcaagccg 600 gataaaaaac gccatgccgt catcagcggt tccgtccttt acaaccaagc cgagaaaggc 660 agttactctc taggcatctt tggcgggcaa gcccaggaag ttgccggcag cgcagaagtg 720 gaaaccgcaa acggcatacg ccatatcggt cttgccgcca agcagtaa 768 <210> 10 <211> 768 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis (group B) <400> 10 tgcagcagcg gagggggtgg tgtcgccgcc gacatcggtg cggggcttgc cgatgcacta 60 accgcaccgc tcgaccataa agacaaaggt ttgcagtctt tgacgctgga tcagtccgtc 120 aggaaaaacg agaaactgaa gctggcggca caaggtgcgg aaaaaactta tggaaacggt 180 gacagcctca atacgggcaa attgaagaac gacaaggtca gccgtttcga ctttatccgc 240 caaatcgaag tggacgggca gctcattacc ttggagagtg gagagttcca agtatacaaa 300 caaagccatt ccgccttaac cgcctttcag accgagcaaa tacaagattc ggagcattcc 360 gggaagatgg ttgcgaaacg ccagttcaga atcggcgaca tagcgggcga acatacatct 420 tttgacaagc ttcccgaagg cggcagggcg acatatcgcg ggacggcgtt cggttcagac 480 gatgccggcg gaaaactgac ctacaccata gatttcgccg ccaagcaggg aaacggcaaa 540 atcgaacatt tgaaatcgcc agaactcaat gtcgacctgg ccgccgccga tatcaagccg 600 gatggaaaac gccatgccgt catcagcggt tccgtccttt acaaccaagc cgagaaaggc 660 agttactccc tcggtatctt tggcggaaaa gcccaggaag ttgccggcag cgcggaagtg 720 aaaaccgtaa acggcatacg ccatatcggc cttgccgcca agcaataa 768 <210> 11 <211> 792 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis (group B) <400> 11 tgcagcagcg gaggcggcgg aagcggaggc ggcggtgtcg ccgccgacat cggcgcgggg 60 cttgccgatg cactaaccgc accgctcgac cataaagaca aaggtttgaa atccctgaca 120 ttggaagact ccatttccca aaacggaaca ctgaccctgt cggcacaagg tgcggaaaga 180 actttcaaag ccggcgacaa agacaacagt ctcaacacag gcaaactgaa gaacgacaaa 240 atcagccgct tcgactttat ccgtcaaatc gaagtggacg ggcagctcat taccttggag 300 agcggagagt tccaagtgta caaacaaagc cattccgcct taaccgccct tcagaccgag 360 caagtacaag actcggagca ttccgggaag atggttgcga aacgccagtt cagaatcggc 420 gacatagtgg gcgaacatac atcttttggc aagcttccca aagacgtcat ggcgacatat 480 cgcgggacgg cgttcggttc agacgatgcc ggcggaaaac tgacctacac catagatttc 540 gccgccaagc agggacacgg caaaatcgaa catttgaaat cgccagaact caatgttgac 600 ctggccgccg ccgatatcaa gccggatgaa aaacaccatg ccgtcatcag cggttccgtc 660 ctttacaacc aagccgagaa aggcagttac tctctaggca tctttggcgg gcaagcccag 720 gaagttgccg gcagcgcgga agtggaaacc gcaaacggca tacgccatat cggtcttgcc 780 gccaagcaat aa 792 <210> 12 <211> 259 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis (group B) <400> 12 Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Thr 1 5 10 15 Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly 20 25 30 Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Pro Gln Asn Gly Thr Leu 35 40 45 Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Phe Lys Ala Gly Asp Lys 50 55 60 Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Ile Ser Arg 65 70 75 80 Phe Asp Phe Val Gln Lys Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr Ile Thr Leu 85 90 95 Ala Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val 100 105 110 Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu 115 120 125 Ile Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr 130 135 140 Ala Phe Asn Gln Leu Pro Gly Asp Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala 145 150 155 160 Phe Ser Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe 165 170 175 Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu 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tcaggaaaaa tgagaaactt aagttggcgg cgcaaggcgc tgaaaaaact 180 tatggaaacg gtgacagctt aaatacaggt aaactcaaaa atgataaagt ctcgcgtttt 240 gatttcattc gtcaaatcga agtagatggc aagcttatta cattagaaag cggtgaattc 300 caagtatata aacaatccca ttcagcactt acagcattgc aaaccgaaca ggtccaagac 360 tcagaagatt ccggcaaaat ggtagctaaa cgtcaattcc gcatcggtga cattgcgggt 420 gaacatacaa gcttcgacaa attaccaaaa ggcggcagtg cgacctatcg cggtacggca 480 tttggatcag atgatgcagg cggtaaatta acttatacaa ttgactttgc agcaaaacaa 540 ggacatggca aaattgaaca tttaaaatct cccgaactta acgtagagct cgcaaccgca 600 tatattaaac cagatgaaaa acgccacgca gtcatttcag gttcagtttt atacaatcag 660 gacgaaaaag gttcgtactc tttaggtatt tttggcgggc aagctcaaga agttgcaggt 720 agcgcagaag tagaaacggc aaatggcatt caccacattg ggttagcggc gaaacaataa 780 <210> 46 <211> 765 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificial nucleotide sequence <400> 46 agctctggag gtggaggagt tgcagcagac attggagcag gattagcaga tgcactgacg 60 gcaccgttgg atcataaaga caaaggcttg cagtcgctta ccttagatca gtctgtcagg 120 aaaaatgaga aacttaagtt ggcggcgcaa ggcgctgaaa aaacttatgg aaacggtgac 180 agcttaaata caggtaaact caaaaatgat aaagtctcgc gttttgattt cattcgtcaa 240 atcgaagtag atggcaagct tattacatta gaaagcggtg aattccaagt atataaacaa 300 tcccattcag cacttacagc attgcaaacc gaacaggtcc aagactcaga agattccggc 360 aaaatggtag ctaaacgtca attccgcatc ggtgacattg cgggtgaaca tacaagcttc 420 gacaaattac caaaaggcgg cagtgcgacc tatcgcggta cggcatttgg atcagatgat 480 gcaggcggta aattaactta tacaattgac tttgcagcaa aacaaggaca tggcaaaatt 540 gaacatttaa aatctcccga acttaacgta gagctcgcaa ccgcatatat taaaccagat 600 gaaaaacgcc acgcagtcat ttcaggttca gttttataca atcaggacga aaaaggttcg 660 tactctttag gtatttttgg cgggcaagct caagaagttg caggtagcgc agaagtagaa 720 acggcaaatg gcattcacca cattgggtta gcggcgaaac aataa 765 <210> 47 <211> 765 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificial nucleotide sequence <400> 47 agcagcgggg gcggtggagt tgcagcagac attggagcag gattagcaga tgcactgacg 60 gcaccgttgg atcataaaga caaaggcttg cagtcgctta ccttagatca gtctgtcagg 120 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aaaaacgaga aactgaagct ggcggcacaa ggtgcggaaa aaacttatgg aaacggcgac 180 agccttaata cgggcaaatt gaagaacgac aaggtcagcc gcttcgactt tatccgtcaa 240 atcgaagtgg acgggaagct cattaccttg gagagcggag agttccaagt gtacaaacaa 300 agccattccg ccttaaccgc ccttcagacc gagcaagtac aagactcgga ggattccggg 360 aagatggttg cgaaacgcca gttcagaatc ggcgacatag cgggcgaaca tacatctttt 420 gacaagcttc ccaaaggcgg cagtgcgaca tatcgcggga cggcgttcgg ttcagacgat 480 gctggcggaa aactgaccta tactatagat ttcgccgcca agcagggaca cggcaaaatc 540 gaacatttga aatcgcccga actcaatgtc gagcttgcca ccgcctatat caagccggat 600 gaaaaacgcc atgccgttat cagcggttcc gtcctttaca accaagacga gaaaggcagt 660 tactccctcg gtatctttgg cgggcaagcc caggaagttg ccggcagcgc ggaagtggaa 720 accgcaaacg gcatacacca tatcggtctt gccgccaagc agtaa 765 <210> 49 <211> 254 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial amino acid sequence <400> 49 Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala 1 5 10 15 Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln Ser 20 25 30 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Asp Ser Ile Ser Gln Asn Gly Thr 35 40 45 Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Phe Lys Val Gly Asp 50 55 60 Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Ile Ser 65 70 75 80 Arg Phe Asp Phe Val Gln Lys Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr Ile Thr 85 90 95 Leu Ala Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val 100 105 110 Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser 115 120 125 Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His 130 135 140 Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Ser Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys 145 150 155 160 Ala Phe Ser Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp 165 170 175 Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro 180 185 190 Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys 195 200 205 Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys 210 215 220 Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala 225 230 235 240 Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Arg Glu Lys Val 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Ala 145 150 155 160 Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe 165 170 175 Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu 180 185 190 Leu Asn Val Asp Leu Ala Val Ala Tyr Ile Lys Pro Asp Glu Lys His 195 200 205 His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Asp Glu Lys Gly 210 215 220 Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Glu Lys Ala Gln Glu Val Ala Gly 225 230 235 240 Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile His His Ile Gly Leu Ala 245 250 255 Ala Lys Gln <210> 58 <211> 260 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis (group B) <400> 58 Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Thr Ala Asp 1 5 10 15 Ile Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys 20 25 30 Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn 35 40 45 Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn 50 55 60 Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg 65 70 75 80 Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu 85 90 95 Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr 100 105 110 Ala Leu Gln Thr Glu Gln Glu Gln Asp Pro Glu His Ser Glu Lys Met 115 120 125 Val Ala Lys Arg Arg Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr 130 135 140 Ser Phe Asp Lys Leu Pro Lys Asp Val Met Ala Thr Tyr Arg Gly Thr 145 150 155 160 Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp 165 170 175 Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro 180 185 190 Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Val Ala Tyr Ile Lys Pro Asp Glu Lys 195 200 205 His His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Asp Glu Lys 210 215 220 Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Glu Lys Ala Gln Glu Val Ala 225 230 235 240 Gly Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile His His Ile Gly Leu 245 250 255 Ala Ala Lys Gln 260 <210> 59 <211> 255 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis (group B) <400> 59 Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu 1 5 10 15 Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln 20 25 30 Ser Leu Ile Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu 35 40 45 Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn 50 55 60 Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg 65 70 75 80 Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe 85 90 95 Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu 100 105 110 Gln Val Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln 115 120 125 Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu 130 135 140 Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Ser Ser Asp 145 150 155 160 Asp Ala Gly Gly Lys Leu Ile Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln 165 170 175 Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp 180 185 190 Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro Asp Glu Lys His His Ala Val Ile 195 200 205 Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu 210 215 220 Gly Ile Phe Gly Gly Lys Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val 225 230 235 240 Lys Thr Val Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln 245 250 255 <210> 60 <211> 255 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis (group B) <400> 60 Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu 1 5 10 15 Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln 20 25 30 Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu 35 40 45 Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn 50 55 60 Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg 65 70 75 80 Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe 85 90 95 Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu 100 105 110 Gln Val Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln 115 120 125 Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu 130 135 140 Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp 145 150 155 160 Asp Ala Ser Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln 165 170 175 Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp 180 185 190 Leu Ala Ala Ser Asp Ile Lys Pro Asp Lys Lys Arg His Ala Val Ile 195 200 205 Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu 210 215 220 Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val 225 230 235 240 Glu Thr Ala Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln 245 250 255 <210> 61 <211> 768 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificial nucleic acid sequence <400> 61 ggcagcagcg gaggcggcgg tgtcgccgcc gacatcggcg cggtgcttgc cgatgcacta 60 accgcaccgc tcgaccataa agacaaaagt ttgcagtctt tgacgctgga tcagtccgtc 120 aggaaaaacg agaaactgaa gctggcggca caaggtgcgg aaaaaactta tggaaacggc 180 gacagcctca atacgggcaa attgaagaac gacaaggtca gccgcttcga ctttatccgt 240 caaatcgaag tggacgggca gctcattacc ttggagagcg gagagttcca agtgtacaaa 300 caaagccatt ccgccttaac cgcccttcag accgagcaag tacaagattc ggagcattca 360 gggaagatgg ttgcgaaacg ccagttcaga atcggcgata tagcgggtga acatacatct 420 tttgacaagc ttcccgaagg cggcagggcg acatatcgcg ggacggcatt cggttcagac 480 gatgccagtg gaaaactgac ctacaccata gatttcgccg ccaagcaggg acacggcaaa 540 atcgaacatt tgaaatcgcc agaactcaat gttgacctgg ccgcctccga tatcaagccg 600 gataaaaaac gccatgccgt catcagcggt tccgtccttt acaaccaagc cgagaaaggc 660 agttactctc taggcatctt tggcgggcaa gcccaggaag ttgccggcag cgcagaagtg 720 gaaaccgcaa acggcatacg ccatatcggt cttgccgcca agcagtaa 768 <210> 62 <211> 255 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial amino acid sequence <400> 62 Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Val Leu 1 5 10 15 Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln 20 25 30 Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu 35 40 45 Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn 50 55 60 Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg 65 70 75 80 Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe 85 90 95 Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu 100 105 110 Gln Val Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln 115 120 125 Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu 130 135 140 Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp 145 150 155 160 Asp Ala Ser Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln 165 170 175 Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp 180 185 190 Leu Ala Ala Ser Asp Ile Lys Pro Asp Lys Lys Arg His Ala Val Ile 195 200 205 Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu 210 215 220 Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val 225 230 235 240 Glu Thr Ala Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln 245 250 255 <210> 63 <211> 765 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificial nucleic acid sequence <400> 63 ggcagcagcg gaggcggcgg tgtcgccgcc gacatcggcg cggggcttgc cgatgcacta 60 accgcaccgc tcgaccataa agacaaaagt ttgcagtctt tgacgctgga tcagtccgtc 120 aggaaaaacg agaaactgaa gctggcggca caaggtgcgg aaaaaactta tggaaacggc 180 gacagcctca atacgggcaa attgaagaac gacaaggtca gccgcttcga ctttatccgt 240 caaatcgaag tggacgggca gctcattacc ttggagagcg gagagttcca aatatacaaa 300 caggaccact ccgccgtcgt tgccctacag attgaaaaaa tcaacaaccc cgacaaaatc 360 gacagcctga taaaccaacg ctccttcctt gtcagcggtt tgggtggaga acataccgcc 420 ttcaaccaac tgcccagcgg caaagccgag tatcacggca aagcattcag ctccgacgat 480 gctggcggaa aactgaccta taccatagat ttcgccgcca aacagggaca cggcaaaatc 540 gaacacttga aaacacccga gcaaaatgtc gagcttgcct ccgccgaact caaagcagat 600 gaaaaatcac acgccgtcat tttgggcgac acgcgctacg gcggcgaaga aaaaggcact 660 taccacctcg cccttttcgg cgaccgcgcc caagaaatcg ccggctcggc aaccgtgaag 720 ataagggaaa aggttcacga aatcggcatc gccggcaaac agtaa 765 <210> 64 <211> 254 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial amino acid sequence <400> 64 Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu 1 5 10 15 Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln 20 25 30 Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu 35 40 45 Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn 50 55 60 Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg 65 70 75 80 Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe 85 90 95 Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu 100 105 110 Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser 115 120 125 Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu 130 135 140 Pro Ser Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp 145 150 155 160 Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly 165 170 175 His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu 180 185 190 Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu 195 200 205 Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala 210 215 220 Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys 225 230 235 240 Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln 245 250

Claims

단리되고 비-피루빌화되고 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드를 포함하는 조성물.
제1항에 있어서,
면역원성을 나타내는 조성물.
제1항에 있어서,
폴리펩티드가 상응하는 야생형 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드에 비해 N-말단 Cys의 결실을 포함하는, 조성물.
제1항에 있어서,
폴리펩티드가 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20 및 서열번호 21로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 이때 위치 1의 시스테인이 결실되어 있는, 조성물.
제4항에 있어서,
폴리펩티드가 서열번호 44, 서열번호 49, 서열번호 50 및 서열번호 55로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.
제1항에 있어서,
폴리펩티드가 발현 시스템에 작동가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되고, 상기 발현 시스템이 세균 세포에서 발현될 수 있는, 조성물.
제6항에 있어서,
발현 시스템이 플라스미드 발현 시스템인, 조성물.
제6항에 있어서,
세균 세포가 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) 세포인, 조성물.
제6항에 있어서,
뉴클레오티드 서열이 이 뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 조절 서열에 연결되어 있는, 조성물.
제1항에 있어서,
폴리펩티드가 상응하는 야생형 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드에 비해 N-말단 Cys의 치환을 포함하는, 조성물.
서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20 및 서열번호 21로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 발현하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득되는 비-피루빌화되고 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드를 포함하는 조성물로서, 이때 위치 1의 시스테인이 결실되어 있고, 상기 뉴클레오티드 서열이 세균 세포에서 발현될 수 있는 발현 시스템에 작동가능하게 연결되어 있는, 조성물.
제11항에 있어서,
세균 세포가 에스케리치아 콜라이 세포인, 조성물.
서열번호 49에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드, 및 서열번호 44에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 포함하는 조성물.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
면역원성을 나타내는 조성물.
제13항에 있어서,
혈청군 B 네이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis)로부터의 ORF2086 서브패밀리 A 폴리펩티드를 추가로 포함하는 조성물.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
혈청군 B 네이세리아 메닝기티디스로부터의 ORF2086 서브패밀리 B 폴리펩티드에 대한 살균 면역반응을 포유동물에서 이끌어내는 조성물.
서열번호 49에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드.
서열번호 46을 포함하는 단리된 뉴클레오티드 서열.
서열번호 47을 포함하는 단리된 뉴클레오티드 서열.
서열번호 48을 포함하는 단리된 뉴클레오티드 서열.
서열번호 50에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드.
서열번호 45를 포함하는 단리된 뉴클레오티드 서열.
서열번호 44에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드.
서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48 및 서열번호 45로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드로서, 세균 세포에서 발현될 수 있는 플라스미드.
제24항에 있어서,
세균 세포가 에스케리치아 콜라이 세포인, 플라스미드.
서열번호 44 및 서열번호 49로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이들의 조합물을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 포유동물에게 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 상기 포유동물에서 ORF2086 서브패밀리 B 혈청군 B 네이세리아 메닝기티디스에 대해 특이적인 살균 항체를 이끌어내는 방법.
서열번호 21에 대해 90% 초과의 동일성을 갖고 서열번호 21의 아미노산 13 내지 18, 서열번호 21의 아미노산 21 내지 34 및 서열번호 21의 아미노산 70 내지 80으로 구성된 군으로부터 선택된 1개 이상의 도메인 또는 이들의 조합물을 포함하고 N-말단 시스테인을 결여하는 서열을 포함하는 폴리펩티드를 세균 세포에서 발현하는 단계; 및 상기 폴리펩티드를 정제하는 단계를 포함하는, 폴리펩티드를 제조하는 방법.
제27항에 있어서,
서열이 서열번호 21의 아미노산 96 내지 116, 서열번호 21의 아미노산 158 내지 170, 서열번호 21의 아미노산 172 내지 185, 서열번호 21의 아미노산 187 내지 199, 서열번호 21의 아미노산 213 내지 224, 서열번호 21의 아미노산 226 내지 237 및 서열번호 21의 아미노산 239 내지 248로 구성된 군으로부터 선택된 1개 이상의 도메인 또는 이들의 조합물을 추가로 포함하는, 방법.
제27항에 있어서,
세균 세포가 에스케리치아 콜라이 세포인, 방법.
제27항의 방법을 포함하는 방법에 의해 제조된 단리된 폴리펩티드.
제27항의 방법을 포함하는 방법에 의해 제조된 면역원성 조성물.
혈청군 B 네이세리아 메닝기티디스로부터의 ORF2086 서브패밀리 B 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물로서, 이때 상기 폴리펩티드가 비-피루빌화되고 비-지질화된 B44인, 면역원성 조성물.
제32항에 있어서,
혈청군 B 네이세리아 메닝기티디스로부터의 제2 ORF2086 서브패밀리 B 폴리펩티드를 추가로 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드가 비-피루빌화되고 비-지질화된 B09인, 면역원성 조성물.
제32항에 있어서,
3개 이하의 ORF2086 서브패밀리 B 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물.
제32항에 있어서,
2개 이하의 ORF2086 서브패밀리 B 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물.
제32항에 있어서,
ORF2086 서브패밀리 A 폴리펩티드를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
제36항에 있어서,
A05 서브패밀리 A 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물.