CN103096920A - 脑膜炎奈瑟球菌orf2086抗原的非脂质化变体 - Google Patents

脑膜炎奈瑟球菌orf2086抗原的非脂质化变体 Download PDF

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Abstract

本发明涉及包括分离的非丙酮酰化非脂质化ORF2086多肽的组合物及其方法。在一例示性实施方案中，本文所述的组合物为免疫原性组合物。本发明另外关于在哺乳动物中引发针对血清群B脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)的ORF2086亚家族B多肽的杀细菌免疫应答的组合物及与其相关的方法。

Description

脑膜炎奈瑟球菌ORF2086抗原的非脂质化变体
本申请要求2010年9月10日提交的美国临时申请第61/381,837号的优先权，该临时申请据此以全文引用的方式并入本文中。
技术领域
本发明涉及如本文所述的免疫原性组合物中的脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)ORF2086抗原的非脂质化变体。本发明亦涉及保持脑膜炎奈瑟球菌ORF2086抗原的非脂质化变体的构象的方法。本发明另外包括相比于相应野生型抗原，非脂质化脑膜炎奈瑟球菌ORF2086抗原的表达改良相关的组合物及方法。
发明背景
rLP2086为一种重组28-kDa脂蛋白，其诱导针对许多脑膜炎奈瑟球菌菌株，包括脑膜炎奈瑟球菌血清型B(MnB)菌株或更准确地血清群B(MnB)菌株的交叉反应性细菌抗体。基于推断的氨基酸序列同源性，鉴别出2个不同rLP2086亚家族A及B。此2个亚家族用于配制于10mM组氨酸(pH6.0)、150mM NaCl及0.5mg/mL铝及不同含量的聚山梨醇酯80(PS-80)中各含20、60、120及200μg/mL的MnB-rLP2086疫苗样品。天然LP2086为脂蛋白。Fletcher等人Infection & Immunity,第72卷(4):2088-2100(2004)证明在小鼠中，具有氨基端脂质的rLP2086比相同蛋白的非脂质化形式更具免疫原性。其它临床前及临床研究已证明此两种脂质化蛋白的组合可提供跨越fHBP家族的广泛作用范围(coverage)。脑膜炎奈瑟球菌性脑膜炎(Meningococcal meningitis)为一种不论抗生素的可用性如何，可在数小时内杀死儿童及青少年的毁灭性疾病。仍然需要适合的血清群B脑膜炎奈瑟球菌免疫原性组合物。
发明概述
为了满足对脑膜炎奈瑟球菌疫苗的这些及其它需要，已对其他组合物进行评估以提供使用脑膜炎奈瑟球菌ORF2086多肽的非脂质化变体的作用范围。本发明的第一方面提供一种包含非脂质化ORF2086蛋白的免疫原性组合物，其中该ORF2086蛋白为B44、B02、B03、B22、B24、B09、A05、A04、A12或A22变体。在一些实施方案中，ORF2086蛋白为B44、B22、B09、A05、A12或A22变体。
本发明的另一方面提供一种包含非脂质化ORF2086蛋白亚家族B变体(P2086亚家族B多肽)的免疫原性组合物。在一些实施方案中，P2086亚家族B多肽为B44、B02、B03、B22、B24或B09变体。在一些实施方案中，免疫原性组合物另外包含非脂质化ORF2086蛋白亚家族A变体(P2086亚家族A多肽)。在一些实施方案中，P2086亚家族A多肽为A05、A04、A12或A22变体。
在一些实施方案中，免疫原性组合物另外包含佐剂。在一些实施方案中，佐剂为铝佐剂、皂苷(saponin)、CpG核苷酸序列或其任何组合。在一些实施方案中，铝佐剂为AlPO4、Al(OH)3、Al2(SO4)3或明矾。在一些实施方案中，免疫原性组合物中的铝浓度介于0.125μg/ml与0.5μg/ml之间。在一些实施方案中，免疫原性组合物中的铝浓度为0.25μg/ml。在优选实施方案中，免疫原性组合物中的铝浓度介于0.125mg/ml与0.5mg/ml之间。在一些优选实施方案中，免疫原性组合物中的铝浓度为0.25mg/ml。
在一些实施方案中，免疫原性组合物中的皂苷浓度介于1μg/ml与250μg/ml之间。在一些实施方案中，免疫原性组合物中的皂苷浓度介于10μg/ml与100μg/ml之间。在一些实施方案中，免疫原性组合物中的皂苷浓度为10μg/ml。在一些实施方案中，免疫原性组合物中的皂苷浓度为100μg/ml。在一些实施方案中，皂苷为QS-21
Figure BDA00002897206200021
(Agenus,Lexington,MA)或
Figure BDA00002897206200022
(CSL Limited,Parkville,Australia)。
在一些实施方案中，在向对象施用多剂量的免疫原性组合物之后，免疫原性组合物会赋予引起对脑膜炎奈瑟球菌的免疫原性反应的能力。在一些实施方案中，在向对象施用2个剂量之后赋予免疫原性反应。在一些实施方案中，在向对象施用3个剂量之后赋予免疫原性反应。
本发明的另一方面提供一种赋予非脂质化P2086抗原的增加的免疫原性的组合物，其中该组合物包含皂苷及至少一种非脂质化P2086抗原。在一些实施方案中，免疫原性组合物中的皂苷浓度介于1μg/ml与250μg/ml之间。在一些实施方案中，免疫原性组合物中的皂苷浓度介于10μg/ml与100μg/ml之间。在一些实施方案中，免疫原性组合物中的皂苷浓度为10μg/ml。在一些实施方案中，免疫原性组合物中的皂苷浓度为100μg/ml。在一些实施方案中，皂苷为QS-21或ISCOMATRIX。
在一些实施方案中，组合物另外包含铝。在一些实施方案中，铝是以AlPO4、Al(OH)3、Al2(SO4)3或明矾形式存在。在一些实施方案中，组合物中的铝浓度介于0.125μg/ml与0.5μg/ml之间。在一些实施方案中，组合物中的铝浓度为0.25μg/ml。在优选实施方案中，免疫原性组合物中的铝浓度介于0.125mg/ml与0.5mg/ml之间。在一些优选实施方案中，免疫原性组合物中的铝浓度为0.25mg/ml。
在一些实施方案中，在向对象施用多剂量的免疫原性组合物之后，免疫原性组合物会赋予引起对脑膜炎奈瑟球菌的免疫原性反应的能力。在一些实施方案中，在向对象施用2个剂量之后赋予免疫原性反应。在一些实施方案中，在向对象施用3个剂量之后赋予免疫原性反应。
在一些实施方案中，非脂质化P2086抗原为P2086亚家族B多肽。在一些实施方案中，P2086亚家族B多肽为B44、B02、B03、B22、B24或B09变体。在一些实施方案中，非脂质化P2086抗原为P2086亚家族A多肽。在一些实施方案中，P2086亚家族A多肽为A05、A04、A12或A22变体。
在一些实施方案中，组合物包含至少两种非脂质化P2086抗原，其中该两种非脂质化P2086抗原为至少一种非脂质化P2086亚家族A多肽及至少一种非脂质化P2086亚家族B多肽。在一些实施方案中，非脂质化P2086亚家族A多肽为A05变体且非脂质化P2086亚家族B多肽为B44变体。在一些实施方案中，非脂质化P2086亚家族A多肽为A05变体且非脂质化P2086亚家族B多肽为B22变体。在一些实施方案中，非脂质化P2086亚家族A多肽为A05变体且非脂质化P2086亚家族B多肽为B09变体。
本发明的另一方面提供一种赋予对象针对脑膜炎奈瑟球菌细菌的免疫性的方法，其中该方法包含向该对象施用包含非脂质化P2086亚家族B多肽的免疫原性组合物的步骤。在一些实施方案中，P2086亚家族B多肽为B44、B02、B03、B22、B24或B09变体。在一些实施方案中，免疫原性组合物另外包含P2086亚家族A多肽。在一些实施方案中，P2086亚家族A多肽为A05、A04、A12或A22变体。
在一些实施方案中，免疫原性组合物另外包含佐剂。在一些实施方案中，佐剂为铝佐剂、皂苷、CpG核苷酸序列或其任何组合。在一些实施方案中，铝佐剂为AlPO4、Al(OH)3、Al2(SO4)3或明矾。在一些实施方案中，免疫原性组合物中的铝浓度介于0.125μg/ml与0.5μg/ml之间。在一些实施方案中，免疫原性组合物中的铝浓度为0.25μg/ml。在优选实施方案中，免疫原性组合物中的铝浓度介于0.125mg/ml与0.5mg/ml之间。在一些实施方案中，免疫原性组合物中的铝浓度为0.25mg/ml。
在一些实施方案中，免疫原性组合物中的皂苷浓度介于1μg/ml与250μg/ml之间。在一些实施方案中，免疫原性组合物中的皂苷浓度介于10μg/ml与100μg/ml之间。在一些实施方案中，免疫原性组合物中的皂苷浓度为10μg/ml。在一些实施方案中，免疫原性组合物中的皂苷浓度为100μg/ml。在一些实施方案中，皂苷为QS-21或ISCOMATRIX。
在一些实施方案中，在给药方案中以多剂量向对象施用免疫原性组合物。在一些实施方案中，在给药方案中以2个剂量向对象施用免疫原性组合物。在一些实施方案中，在给药方案中以3个剂量向对象施用免疫原性组合物。
本发明的另一方面提供一种产生非脂质化P2086变体的方法，其包含以下步骤：(a)将ORF2086变体核酸克隆至表达载体中以产生ORF2086表达载体；(b)用该OFR2086表达载体转化细菌；(c)诱导P2086变体自该ORF2086表达载体表达；及(d)分离表达的P2086变体蛋白；其中该ORF2086表达载体不包含脂质化控制序列。在一些实施方案中，细菌为大肠杆菌(E.coli)。在一些实施方案中，通过添加IPTG来诱导表达。
在一些实施方案中，编码P2086变体的N端Cys的密码子缺失。在一些实施方案中，编码P2086变体的N端Cys的密码子经突变以产生Ala、Gly或Val密码子。在一些实施方案中，P2086变体为A05、B01或B44变体。在一些实施方案中，P2086变体为B09变体。
在一些实施方案中，N端尾部经突变以添加Ser及Gly残基来延伸紧靠N端Cys的下游的Gly/Ser茎部(stalk)。在一些实施方案中，Gly/Ser茎部中的Gly及Ser残基的总数为至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个或至少12个。
在一些实施方案中，P2086变体的N端尾部的密码子通过点诱变加以优化。在一些实施方案中，ORF2086变体的N端尾部的密码子通过点诱变加以优化以使编码ORF2086变体的第5个氨基酸的密码子与SEQ ID NO:8的核苷酸13-15100%相同且编码ORF2086变体的第13个氨基酸的密码子与SEQ ID NO:8的核苷酸37-39100%相同。在一些实施方案中，非脂质化ORF2086变体的N端尾部经优化以使5'45个核酸与SEQ ID NO:8的核酸1-45100%相同。在一些实施方案中，非脂质化ORF2086变体的N端尾部经优化以使5'42个核酸与SEQ ID NO:8的核酸4-45100%相同。在一些实施方案中，非脂质化ORF2086变体的N端尾部经优化以使5'39个核酸与SEQ ID NO:8的核酸4-42100%相同。在一些实施方案中，相比于SEQ IDNO:18的氨基酸1-15，非脂质化P2086变体的N端尾部包含至少一个氨基酸取代。在一些实施方案中，相比于SEQ ID NO:18的氨基酸1-15，非脂质化P2086变体的N端尾部包含两个氨基酸取代。在一些实施方案中，相比于SEQ ID NO:18的氨基酸2-15，非脂质化P2086变体的N端尾部包含至少一个氨基酸取代。在一些实施方案中，相比于SEQ ID NO:18的氨基酸2-15，非脂质化P2086变体的N端尾部包含两个氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代为保守性氨基酸取代。
在一实施方案中，本发明涉及呈免疫原性组合物形式的脑膜炎奈瑟球菌ORF2086亚家族B抗原的稳定制剂。本发明亦涉及保持脑膜炎奈瑟球菌ORF2086抗原的构象的方法及测定脑膜炎奈瑟球菌rLP2086抗原的效能的方法。
在一方面中，本发明涉及一种包括分离的非丙酮酰化非脂质化ORF2086多肽的组合物。在一实施方案中，组合物为免疫原性组合物。在另一实施方案中，相比于相应野生型非脂质化ORF2086多肽，该多肽包括N端Cys缺失。在一实施方案中，该多肽包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:20及SEQ ID NO:21，其中位置1处的半胱氨酸缺失。在另一实施方案中，多肽包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:44、SEQ IDNO:49、SEQ ID NO:50及SEQ ID NO:55。
在另一实施方案中，多肽由可操作地连接于表达系统的核苷酸序列编码，其中该表达系统能够在细菌细胞中表达。在一实施方案中，表达系统为质粒表达系统。在一实施方案中，细菌细胞为大肠杆菌细胞。在另一实施方案中，核苷酸序列与控制该核苷酸序列的表达的调控序列连接。
在另一方面，本发明涉及一种包括可通过如下方法获得的非丙酮酰化非脂质化ORF2086多肽的组合物。该方法包括表达编码多肽的核苷酸序列，所述多肽具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20及SEQ ID NO:21，其中在位置1处的半胱氨酸缺失，其中该核苷酸序列可操作地连接于能够在细菌细胞中表达的表达系统。在一实施方案中，细菌细胞为大肠杆菌。
在一方面，本发明涉及一种包括包含SEQ ID NO:49所述的氨基酸序列的分离的多肽及包含SEQ ID NO:44所述的氨基酸序列的分离的多肽的组合物。在一实施方案中，本文所述的组合物为免疫原性组合物。在另一实施方案中，本文所述的组合物另外包括来自血清群B脑膜炎奈瑟球菌的ORF2086亚家族A多肽。在另一实施方案中，本文所述的组合物在哺乳动物中引发针对来自血清群B脑膜炎奈瑟球菌的ORF2086亚家族B多肽的杀细菌免疫应答。
在一方面，本发明涉及一种包括SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列的分离的多肽。在另一方面中，本发明涉及一种包括SEQ ID NO:46的分离的核苷酸序列。在一方面中，本发明涉及一种包括SEQ ID NO:47的分离的核苷酸序列。在一方面中，本发明涉及一种包括SEQ ID NO:48的分离的核苷酸序列。在一方面中，本发明涉及一种包括SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列的分离的多肽。在一方面中，本发明涉及一种包括SEQ ID NO:45的分离的核苷酸序列。在一方面中，本发明涉及一种包括SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列的分离的多肽。
在一方面，本发明涉及一种包括选自由SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48及SEQ ID NO:45组成的组的核苷酸序列的质粒，其中该质粒能够在细菌细胞中表达。在一实施方案中，细菌细胞为大肠杆菌。
在一方面，本发明涉及一种在哺乳动物中引发对ORF2086亚家族B血清群B脑膜炎奈瑟球菌具有特异性的杀细菌抗体的方法。该方法包括向该哺乳动物施用有效量的分离的多肽，其包括选自由SEQ ID NO:44及SEQID NO:49或其组合组成的组的氨基酸序列。
在一方面，本发明涉及一种产生多肽的方法。该方法包括在细菌细胞中表达包括与SEQ ID NO:21的相同性大于90%的序列的多肽，该序列包括至少一个选自由以下组成的组的结构域：SEQ ID NO:21的氨基酸13-18、SEQ ID NO:21的氨基酸21-34及SEQ ID NO:21的氨基酸70-80或其组合，其中该序列缺乏N端半胱氨酸。该方法另外包括纯化多肽。在一实施方案中，序列另外包括至少一个选自由以下组成的组的结构域：SEQ ID NO:21的氨基酸96-116、SEQ ID NO:21的氨基酸158-170、SEQ ID NO:21的氨基酸172-185、SEQ ID NO:21的氨基酸187-199、SEQ ID NO:21的氨基酸213-224、SEQ ID NO:21的氨基酸226-237、SEQ ID NO:21的氨基酸239-248或其组合。在一实施方案中，细菌细胞为大肠杆菌。
在一方面，本发明涉及一种通过包括本文所述的方法的方法产生的分离的多肽。在另一方面中，本发明涉及一种通过包括本文所述的方法的方法产生的免疫原性组合物。
在一方面，本发明涉及一种包括来自血清群B脑膜炎奈瑟球菌的ORF2086亚家族B多肽的免疫原性组合物，其中该多肽为非丙酮酰化非脂质化B44。在一实施方案中，组合物另外包括来自血清群B脑膜炎奈瑟球菌的第二ORF2086亚家族B多肽，其中该第二多肽为非丙酮酰化非脂质化B09。在一实施方案中，组合物包括至多3种ORF2086亚家族B多肽。在另一实施方案中，组合物包括至多两种ORF2086亚家族B多肽。在一实施方案中，组合物还包括ORF2086亚家族A多肽。在另一实施方案中，组合物包括A05亚家族A多肽。
附图简述
图1：P2086变体核酸序列。
图2：P2086变体氨基酸序列。各变体的N端尾部中的Gly/Ser茎部加下划线。
图3：ORF2086蛋白的结构。
图4：移除N端Cys导致在大肠杆菌中的表达丧失。
图5：Gly/Ser茎部长度对非脂质化ORF2086变体表达的影响。与标记为B01的蛋白质变体相关的序列以SEQ ID NO:35示出。与标记为B44的蛋白质变体相关的序列以SEQ ID NO:36示出。与标记为A05的蛋白质变体相关的序列以SEQ ID NO:37示出。与标记为A22的蛋白质变体相关的序列以SEQ ID NO:38示出。与标记为B22的蛋白质变体相关的序列以SEQID NO:39示出。与标记为A19的蛋白质变体相关的序列以SEQ ID NO:40示出。
图6：尽管Gly/Ser茎部较短，但非脂质化B09的表达量较高。左侧2条泳道说明在诱导的前及之后N端Cys缺失B09变体的表达。第3及第4泳道说明在诱导的前及之后N端Cys阳性B09变体的表达。最右侧泳道为分子量标准。影像下方展示的氨基酸序列以SEQ ID NO:41示出。表示N端Cys缺失A22变体(在图中称为“A22_001”)的核苷酸序列以SEQ ID NO:42示出，SEQ ID NO:42在图中展示于SEQ ID NO:41下方。表示N端Cys缺失B22变体(在图中称为“B22_001”)的核苷酸序列以SEQ ID NO:52示出。表示N端Cys缺失B09变体(在图中称为“B09_004”)的核苷酸序列以SEQ ID NO:53示出。
图7：密码子优化使非脂质化B22及A22变体的表达增加。左侧版面说明在IPTG诱导的前(泳道1及3)及之后(泳道2及4)N端Cys缺失B22变体的表达。右侧版面说明在IPTG诱导的前(泳道7)及之后(泳道8)N端Cys缺失A22变体的表达。泳道5及6为分子量标准。
图8：P2086变体核酸及氨基酸序列。
序列号
SEQ ID NO:1示出脑膜炎奈瑟球菌血清群B2086变体A04基因的DNA序列，其包括编码N端Cys的密码子。
SEQ ID NO:2示出脑膜炎奈瑟球菌血清群B2086变体A05基因的DNA序列，其包括编码N端Cys的密码子。
SEQ ID NO:3示出脑膜炎奈瑟球菌血清群B2086变体A12基因的DNA序列，其包括编码N端Cys的密码子。
SEQ ID NO:4示出脑膜炎奈瑟球菌血清群B2086变体A12-2基因的DNA序列，其包括编码N端Cys的密码子。
SEQ ID NO:5示出脑膜炎奈瑟球菌血清群B2086变体A22基因的DNA序列，其包括编码N端Cys的密码子。
SEQ ID NO:6示出脑膜炎奈瑟球菌血清群B2086变体B02基因的DNA序列，其包括编码N端Cys的密码子。
SEQ ID NO:7示出脑膜炎奈瑟球菌血清群B2086变体B03基因的DNA序列，其包括编码N端Cys的密码子。
SEQ ID NO:8示出脑膜炎奈瑟球菌血清群B2086变体B09基因的DNA序列，其包括编码N端Cys的密码子。
SEQ ID NO:9示出脑膜炎奈瑟球菌血清群B2086变体B22基因的DNA序列，其包括编码N端Cys的密码子。
SEQ ID NO:10示出脑膜炎奈瑟球菌血清群B2086变体B24基因的DNA序列，其包括编码N端Cys的密码子。
SEQ ID NO:11示出脑膜炎奈瑟球菌血清群B2086变体B44基因的DNA序列，其包括编码N端Cys的密码子。
SEQ ID NO:12示出脑膜炎奈瑟球菌血清群B2086变体A04的氨基酸序列，其在氨基酸位置1处包括N端Cys。
SEQ ID NO:13示出脑膜炎奈瑟球菌血清群B2086变体A05的氨基酸序列，其在氨基酸位置1处包括N端Cys。
SEQ ID NO:14示出脑膜炎奈瑟球菌血清群B2086变体A12的氨基酸序列，其在氨基酸位置1处包括N端Cys。
SEQ ID NO:15示出脑膜炎奈瑟球菌血清群B2086变体A22的氨基酸序列，其在氨基酸位置1处包括N端Cys。
SEQ ID NO:16示出脑膜炎奈瑟球菌血清群B2086变体B02的氨基酸序列，其在氨基酸位置1处包括N端Cys。
SEQ ID NO:17示出脑膜炎奈瑟球菌血清群B2086变体B03的氨基酸序列，其在氨基酸位置1处包括N端Cys。
SEQ ID NO:18示出脑膜炎奈瑟球菌血清群B2086变体B09的氨基酸序列，其在氨基酸位置1处包括N端Cys。
SEQ ID NO:19示出脑膜炎奈瑟球菌血清群B2086变体B22的氨基酸序列，其在氨基酸位置1处包括N端Cys。
SEQ ID NO:20示出脑膜炎奈瑟球菌血清群B2086变体B24的氨基酸序列，其在氨基酸位置1处包括N端Cys。
SEQ ID NO:21示出脑膜炎奈瑟球菌血清群B2086变体B44的氨基酸序列，其在氨基酸位置1处包括N端Cys。
SEQ ID NO:22示出实施例2中所示的正向引物的DNA序列。
SEQ ID NO:23示出实施例2中所示的反向引物的DNA序列。
SEQ ID NO:24示出实施例2表1中所示的正向引物的DNA序列。
SEQ ID NO:25示出实施例2表1中所示的反向引物的DNA序列。
SEQ ID NO:26示出实施例2表1中所示的正向引物的DNA序列。
SEQ ID NO:27示出实施例2表1中所示的反向引物的DNA序列。
SEQ ID NO:28示出实施例4中所示的Gly/Ser茎部的DNA序列。
SEQ ID NO:29示出实施例4中所示的Gly/Ser茎部的氨基酸序列，其由例如SEQ ID NO:28编码。
SEQ ID NO:30示出实施例4中所示的Gly/Ser茎部的DNA序列。
SEQ ID NO:31示出实施例4中所示的Gly/Ser茎部的氨基酸序列，其由例如SEQ ID NO:30编码。
SEQ ID NO:32示出实施例4中所示的Gly/Ser茎部的DNA序列。
SEQ ID NO:33示出Gly/Ser茎部的氨基酸序列，其由例如SEQ ID NO:32及SEQ ID NO:34编码。
SEQ ID NO:34示出实施例4中所示的Gly/Ser茎部的DNA序列。
SEQ ID NO:35示出图5中所示的脑膜炎奈瑟球菌血清群B2086变体B01的N端的氨基酸序列。
SEQ ID NO:36示出图5中所示的脑膜炎奈瑟球菌血清群B2086变体B44的N端的氨基酸序列。
SEQ ID NO:37示出图5中所示的脑膜炎奈瑟球菌血清群B2086变体A05的N端的氨基酸序列。
SEQ ID NO:38示出图5中所示的脑膜炎奈瑟球菌血清群B2086变体A22的N端的氨基酸序列。
SEQ ID NO:39示出图5中所示的脑膜炎奈瑟球菌血清群B2086变体B22的N端的氨基酸序列。
SEQ ID NO:40示出图5中所示的脑膜炎奈瑟球菌血清群B2086变体A19的N端的氨基酸序列。
SEQ ID NO:41示出图6中所示的脑膜炎奈瑟球菌血清群B2086变体的N端的氨基酸序列。
SEQ ID NO:42示出图6中所示的脑膜炎奈瑟球菌血清群B2086变体A22的N端的DNA序列。SEQ ID NO:43示出脑膜炎奈瑟球菌血清群B2086变体B44基因的密码子优化DNA序列，其中相比于SEQ ID NO:11，编码N端半胱氨酸的密码子缺失。质粒pDK087包括SEQ ID NO:43。
SEQ ID NO:44示出非丙酮酰化非脂质化脑膜炎奈瑟球菌血清群B2086变体B44的氨基酸序列。SEQ ID NO:44与SEQ ID NO:21相同，其中在SEQ ID NO:21的位置1处的N端半胱氨酸缺失。SEQ ID44由例如SEQ ID NO:43编码。
SEQ ID NO:45示出脑膜炎奈瑟球菌血清群B2086变体B09基因的密码子优化DNA序列，其中相比于SEQ ID NO:8，编码N端半胱氨酸的密码子缺失，且其中该序列包括编码另一Gly/Ser区域的密码子。质粒pEB063包括SEQ ID NO:45。
SEQ ID NO:46示出脑膜炎奈瑟球菌血清群B2086变体B09基因的密码子优化DNA序列，其中相比于SEQ ID NO:8，编码N端半胱氨酸的密码子缺失。质粒pEB064包括SEQ ID NO:46。
SEQ ID NO:47示出脑膜炎奈瑟球菌血清群B2086变体B09基因的密码子优化DNA序列，其中相比于SEQ ID NO:8，编码N端半胱氨酸的密码子缺失。质粒pEB065包括SEQ ID NO:47。
SEQ ID NO:48示出脑膜炎奈瑟球菌血清群B2086变体B09基因的DNA序列，其中相比于SEQ ID NO:8，编码N端半胱氨酸的密码子缺失。质粒pLA134包括SEQ ID NO:48。
SEQ ID NO:49示出非丙酮酰化非脂质化脑膜炎奈瑟球菌血清群B2086变体B09的氨基酸序列。SEQ ID NO:49与SEQ ID NO:18相同，其中在SEQ ID NO:18的位置1处的N端半胱氨酸缺失。SEQ ID49由例如选自由SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47及SEQ ID NO:48组成的组的DNA序列编码。
SEQ ID NO:50示出脑膜炎奈瑟球菌血清群B2086变体B09的氨基酸序列，其中相比于SEQ ID NO:18，编码N端半胱氨酸的密码子缺失且其中该序列包括编码另一Gly/Ser区域的密码子。SEQ ID NO:50由例如SEQ IDNO:45编码。
SEQ ID NO:51示出脑膜炎奈瑟球菌血清群B2086变体B44基因的DNA序列，其中相比于SEQ ID NO:11，编码N端半胱氨酸的密码子缺失。质粒pLN056包括SEQ ID NO:51。
SEQ ID NO:52示出图6中所示的脑膜炎奈瑟球菌血清群B2086变体B22的N端的DNA序列。
SEQ ID NO:53示出图6中所示的脑膜炎奈瑟球菌血清群B2086变体B09的N端的DNA序列。
SEQ ID NO:54示出脑膜炎奈瑟球菌血清群B2086变体A05基因的DNA序列，其中相比于SEQ ID NO:2，编码N端半胱氨酸的密码子缺失。
SEQ ID NO:55示出非丙酮酰化非脂质化脑膜炎奈瑟球菌血清群B2086变体A05的氨基酸序列。SEQ ID NO:55与SEQ ID NO:13相同，其中在SEQ ID NO:13的位置1处的N端半胱氨酸缺失。SEQ ID NO:55由例如SEQ ID NO:54编码。
SEQ ID NO:56示出实施例7中所示的丝氨酸-甘氨酸重复序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO:57示出非丙酮酰化非脂质化脑膜炎奈瑟球菌血清群B2086变体B01的氨基酸序列。SEQ ID NO:57与SEQ ID NO:58相同，其中在SEQ ID NO:58的位置1处的N端半胱氨酸缺失。
SEQ ID NO:58示出脑膜炎奈瑟球菌血清群B2086变体B01的氨基酸序列，其在氨基酸位置1处包括N端Cys。
SEQ ID NO:59示出脑膜炎奈瑟球菌血清群B2086变体B15的氨基酸序列，其在氨基酸位置1处包括N端Cys。
SEQ ID NO:60示出脑膜炎奈瑟球菌血清群B2086变体B16的氨基酸序列，其在氨基酸位置1处包括N端Cys。
发明详述
除非另外定义，否则本文中使用的所有技术及科学术语皆具有与本领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文所述类似或相等的方法及材料可用于本发明的实施或测试中，但以下描述适合方法及材料。材料、方法及实施例仅具说明性，且不意欲具有限制性。本文中提及的所有出版物、专利及其它文献皆以全文引用的方式并入本文中。
应注意，在本发明中，诸如“包含”、“含有”及其类似表述的术语可具有美国专利法中所赋予其的含义；例如，其可意谓“包括”及其类似含义。这些术语是指包括一特定成分或一组成分而不排除任何其它成分。诸如“基本上由…组成”的术语具有美国专利法中所赋予其的含义，例如，其允许包括不会有损于本发明的新颖或基本特征的其它成分或步骤，亦即其排除会有损于本发明的新颖或基本特征的其它未叙述成分或步骤，且其排除现有技术(诸如在本文中引用或以引用的方式并入本文中的本领域中的文献)的成分或步骤，尤其当此文献的目的在于限定相比于现有技术，例如相比于本文中引用或以引用的方式并入本文中的文献的可被授予专利(例如新颖性、非显而易见性、创造性)实施方案时。此外，术语“由…组成”具有美国专利法中所赋予其的含义；亦即这些术语为封闭式术语。因此，这些术语是指包括一特定成分或一组成分且排除所有其它成分。
定义
除非上下文另外明确规定，否则如本文所用，单数形式“一”及“所述”包括复数个提及物。因此，例如提及“所述方法”包括一或多种属于本文所述类型的方法及/或步骤及/或在阅读本发明后将变得为一般技术人员显而易知的方法及/或步骤等。
如本文所用，除非上下文另外明确规定，否则复数形式包括单数个提及物。因此，例如提及“所述方法”包括一或多种属于本文所述类型的方法及/或步骤及/或在阅读本发明后将变得为一般技术人员显而易知的方法及/或步骤等。
如本文所用，“约”意谓在某一值，诸如某一指定浓度范围、时间范围、分子量、温度或pH值的有统计意义的范围内。该种范围可在某一给定值或范围的某一数量级内，通常在20%内、更通常在10%内、且甚至更通常在5%内。由术语“约”涵盖的容许偏差将视所研究的特定系统而定，且可易于为一般技术者所了解。无论何时在本申请内叙述某一范围，该范围内的每一整数皆亦涵盖为本发明的一实施方案。
术语“佐剂”是指如本文中进一步描述及例示的会增强对抗原的免疫应答的化合物或混合物。可用于本发明疫苗中的佐剂的非限制性实例包括RIBI佐剂系统(Ribi Inc.,Hamilton,Mont.)、明矾、矿物质凝胶(诸如氢氧化铝凝胶)、水包油乳液、油包水乳液(例如弗氏完全及不完全佐剂)、嵌段共聚物(CytRx,Atlanta Ga.)、QS-21(Cambridge Biotech Inc.,Cambridge Mass.)、SAF-M(Chiron,Emeryville Calif.)、
Figure BDA00002897206200141
皂苷、Quil A或其它皂苷部分、单磷酰基脂质A及阿夫立定(Avridine)脂质-胺佐剂。
“抗体”为一种免疫球蛋白分子，其能够经由位于该免疫球蛋白分子的可变区中的至少一个抗原识别位点与诸如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等目标特异性结合。如本文所用，除非上下文另外指示，否则该术语不仅意欲涵盖完整多克隆或单克隆抗体，而且意欲涵盖经工程改造的抗体(例如嵌合、人源化及/或衍生化以改变效应功能、稳定性及其它生物活性)及其片段(诸如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、单链(ScFv)及域抗体，包括鲨鱼及骆驼抗体)、及如本文所述的包含抗体部分的融合蛋白、多价抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体，只要其展现所要生物活性即可)及抗体片段、及免疫球蛋白分子的包含抗原识别位点的任何其它经修饰构型。抗体包括任何类别，诸如IgG、IgA或IgM(或其亚类)的抗体，且抗体无需为任何特定类别。视免疫球蛋白的重链的恒定结构域的抗体氨基酸序列而定，免疫球蛋白可归为不同类别。存在5种主要免疫球蛋白类别：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且这些类别中的若干类别可进一步分成亚类(同种型)，例如人类中的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。对应于不同免疫球蛋白类别的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ及μ。熟知不同类别的免疫球蛋白的亚基结构及三维构型。
“抗体片段”仅包含完整抗体的一部分，其中该部分优选保留当该部分存在于完整抗体中时通常与该部分相关的至少一种、优选大部分或所有功能。
术语“抗原”通常指代含有同源抗体(cognate antibody)可选择性结合的至少一个表位的生物分子，其通常为蛋白质、肽、多糖、脂质或缀合物；或在一些情况下，指代可在动物中刺激抗体或T细胞反应或两者的产生的免疫原性物质，包括注射至或吸收至动物中的组合物。免疫应答可针对整个分子或针对分子的一或多个不同部分(例如表位或半抗原)产生。该术语可用于指代个别分子或均质或异质抗原性分子群。抗原由抗体、T细胞受体或具有特定体液性免疫性及/或细胞免疫性的其它成分识别。术语“抗原”包括所有相关抗原性表位。可使用本领域中熟知的许多表位定位技术鉴别既定抗原的表位。参见例如Epitope Mapping Protocols in Methods in MolecularBiology,第66卷(Glenn E.Morris编,1996)Humana Press,Totowa,N.J。举例而言，线性表位可通过例如以下方法来确定：在固体支撑物上同时合成大量肽，其中这些肽对应于蛋白质分子的各部分，且使这些肽在仍然与支撑物连接的情况下与抗体反应。这些技术在本领域中为已知的且描述于例如美国专利第4,708,871号；Geysen等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:3998-4002；Geysen等人(1986)Molec.Immunol.23:709-715中，该等所有专利及文献皆以全文引用的方式并入本文中。类似地，构形表位可通过诸如通过例如x射线结晶学及2维核磁共振确定氨基酸的空间构形加以鉴别。参见例如Epitope Mapping Protocols(同上)。此外，出于本发明的目的，“抗原”亦可用于指代包括对天然序列所作的修饰，诸如缺失、添加及取代(通常基本上为保守性的，但其可为非保守性的)的蛋白质，只要蛋白质维持引发免疫应答的能力即可。这些修饰可为人为的，如经由定点诱变或经由特定合成程序，或经由遗传工程改造方法；或可为偶发性的，诸如经由产生抗原的宿主突变。此外，抗原可自微生物，例如细菌衍生、获得或分离，或可为整个生物体。类似地，此定义亦包括诸如在核酸免疫应用中表达抗原的寡核苷酸或多核苷酸。亦包括合成抗原，例如聚表位、侧接表位及其它重组或合成方式衍生的抗原(Bergmann等人(1993)Eur.J.Immunol.23:27772781；Bergmann等人(1996)J.Immunol.157:32423249；Suhrbier,A.(1997)Immunol,and Cell Biol.75:402408；Gardner等人(1998)第12届世界AIDS会议(12th World AIDS Conference),Geneva,Switzerland,1998年6月28日-7月3日)。
术语“保守性”氨基酸取代可基于所涉及残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性及/或两性性质的类似性进行。举例而言，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、色氨酸及甲硫氨酸；极性/中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺及谷氨酰胺；带正电荷(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸及组氨酸；且带负电荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸及谷氨酸。在一些实施方案中，保守性氨基酸变化会改变ORF2086多肽的一级序列，但不改变分子的功能。当产生这些突变体时，可考虑氨基酸的亲水指数。本领域中通常了解亲水氨基酸指数在赋予多肽以相互作用性生物功能方面的重要性(Kyte及Doolittle,1982,J.Mol.Biol.,157(1):105-32)。已知某些氨基酸可经取代成具有类似亲水指数或计分的其它氨基酸且仍然会产生生物活性类似的多肽。各氨基酸已基于其疏水性及电荷特征而赋予亲水指数。这些指数为：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；及精氨酸(-4.5)。
据信氨基酸残基的相对亲水特性决定所得多肽的二级及三级结构，后者又限定多肽与其它分子，诸如酶、底物、受体、抗体、抗原及其类似物的相互作用。本领域中已知某一氨基酸可经具有类似亲水指数的另一氨基酸取代且仍然获得功能相等的多肽。在这些变化中，亲水指数在+/-2内的氨基酸取代优选，亲水指数在+/-1内的氨基酸取代特别优选，且亲水指数在+/-0.5内的氨基酸取代更特别优选。
亦可基于亲水性进行保守性氨基酸取代或插入。如美国专利第4,554,101号(其据此以引用的方式并入本文中)中所述，多肽的如受其相邻氨基酸的亲水性支配的最大局部平均亲水性与该多肽的免疫原性及抗原性相关，亦即与该多肽的生物性质相关。美国专利第4,554,101号叙述以下亲水性值已赋予各氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；脯氨酸(-0.5±1)；苏氨酸(-0.4)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。应了解，某一氨基酸可经取代成具有类似亲水性值的另一氨基酸且仍然获得生物学上等价且具体而言的免疫学上等价的多肽。在这些变化中，优选亲水性值在±2内的氨基酸取代；特别优选亲水性值在±1内的氨基酸取代；且甚至更特别优选亲水性值在±0.5内的氨基酸取代。考虑各种上述特征的例示性取代为本领域技术人员所熟知且包括(不限于)：精氨酸及赖氨酸；谷氨酸及天冬氨酸；丝氨酸及苏氨酸；谷氨酰胺及天冬酰胺；及缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸。
如本文所用的术语“有效免疫原性量”是指多肽或包含多肽的组合物在脊椎动物宿主中有效引发免疫应答的量。举例而言，本发明的rLP2086蛋白的有效免疫原性量为在脊椎动物宿主中有效引发免疫应答的量。特定“有效免疫原性剂量或量”将视宿主的年龄、重量及医学病状、以及施用方法而定。本领域技术人员易于确定适合剂量。
如本文所用的术语“Gly/Ser茎部”是指紧靠由ORF2086编码的蛋白质的N端Cys残基的下游的Gly及Ser残基系列。Gly/Ser茎部中可存在5至12个Gly及Ser残基。因此，Gly/Ser茎部由ORF2086所编码的蛋白质的位置2至介于7与13之间的氨基酸组成。优选地，Gly/Ser茎部由ORF2086所编码的蛋白质的位置2且直至介于7与13之间的氨基酸组成。本发明的P2086变体的Gly/Ser茎部由图2中的加下划线序列(SEQ ID NO:12-21)表示。如本文中所示，Gly/Ser茎部的长度可影响非脂质化P2086变体的稳定性或表达量。在一例示性实施方案中，由影响Gly/Ser茎部的长度所产生的效应是与相应野生型变体进行比较。
术语“免疫原性”是指抗原或疫苗能够引发体液性免疫应答或细胞介导的免疫应答或两者。
“免疫原性量”或“免疫有效量”或“剂量”，各者在本文中可互换使用，通常是指抗原或免疫原性组合物足以引发免疫应答，细胞性(T细胞)反应或体液性(B细胞或抗体)反应或两者的量，如通过本领域技术人员已知的标准测定所量测。
术语“免疫原性组合物”涉及含有抗原(例如微生物)或其组分的任何医药组合物，该组合物可用于在对象中引发免疫应答。本发明的免疫原性组合物可用于藉助于经由全身性经皮或经粘膜途径施用所述免疫原性组合物来治疗易受脑膜炎奈瑟球菌感染的人类。这些施用可包括经由肌肉内(i.m.)、腹膜内(i.p.)、皮内(i.d.)或皮下途径注射；通过贴片或其它经皮传递装置用药；或对口腔/消化道、呼吸道或生殖泌尿道经粘膜施用。在一实施方案中，免疫原性组合物可用于制造疫苗或引发可用于被动保护或治疗对象的多克隆或单克隆抗体。
特定免疫原性组合物的组分的最佳量可通过涉及观测对象中的适当免疫应答的标准研究确定。在初始接种之后，对象可接受适当间隔的一或数次加强免疫。
术语“分离的”意谓物质自其原始环境(例如天然环境(若其为天然存在)或自其宿主生物体(若其为重组实体)，或自一种环境取至不同环境)移除。举例而言，“分离的”蛋白质或肽基本上不含来自衍生该蛋白质的细胞或组织来源的细胞物质或其它污染性蛋白质，或基本上不含在化学合成时或另外作为化学反应的一部分存在于混合物中的化学前驱体或其它化学物质。在本发明中，蛋白质可自细菌细胞或细胞碎片分离，以使其以适用于制造免疫原性组合物的形式提供。术语“分离的”或“分离”可包括纯化，包括例如如本文所述的蛋白质的纯化方法。措辞“基本上不含细胞物质”包括如下多肽或蛋白质制剂，其中该多肽或蛋白质与分离或重组产生该多肽或蛋白质的细胞的细胞组分分离。因此，基本上不含细胞物质的蛋白质或肽包括污染性蛋白质或多糖或其它细胞物质小于约30%、20%、10%、5%、2.5%或1%(以干重计)的荚膜多糖、蛋白质或肽的制剂。当重组产生多肽/蛋白质时，其亦优选基本上不含培养基，亦即培养基所占的蛋白质制剂体积小于约20%、10%或5%。当通过化学合成产生多肽或蛋白质时，其优选基本上不含化学前驱体或其它化学物质，亦即其与蛋白质或多糖的合成中所涉及的化学前驱体或其它化学物质分离。因此，这些多肽或蛋白质制剂含有小于约30%、20%、10%、5%(以干重计)的除相关多肽/蛋白质或多糖片段以外的化学前体或化合物。
如本文所用的术语“N端尾部”是指由ORF2086编码的蛋白质的N端部分，其使该蛋白质连接于细胞膜。N端尾部展示在图3中的侧视结构的底部。N端尾部通常包含由ORF2086编码的蛋白质的N端16个氨基酸。在一些实施方案中，N端尾部为SEQ ID NO:12-21任一者的氨基酸1-16。如本文所用的术语“ORF2086”是指来自奈瑟菌属(Neisseria)物种细菌的开放阅读框2086。奈瑟菌属ORF2086、由其编码的蛋白质、彼等蛋白质的片段及包含彼等蛋白质的免疫原性组合物在本领域中为已知的且例如于WO2003/063766及美国专利申请公开案第US20060257413号及第US20090202593号中描述，该等专利各据此以全文引用的方式并入本文中。
术语“P2086”通常是指由ORF2086编码的蛋白质。“2086”的前的“P”为“蛋白质”的缩写。本发明的P2086蛋白可为脂质化或非脂质化蛋白。“LP2086”及“P2086”通常分别是指2086蛋白的脂质化及非脂质化形式。本发明的P2086蛋白可为重组蛋白。“rLP2086”及“rP2086”通常分别是指重组2086蛋白的脂质化及非脂质化形式。“2086”由于其能够与因子H结合而亦称为因子H结合蛋白(fHBP)。
本文所用的术语“医药学上可接受的载体”意欲包括与施用人类或其它脊椎动物宿主兼容的任何及所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂及抗真菌剂、等张剂及吸收延迟剂及其类似物。通常，医药学上可接受的载体为联邦管理机构、州政府管理机构或其它管理机构核准或美国药典或其它公认药典中所列的供动物，包括人类以及非人类哺乳动物使用的载体。术语“载体”是指与医药组合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒剂。这些医药载体可为灭菌液体，诸如水及油，包括石油、动物、植物或合成来源的油。水、生理食盐水溶液及右旋糖水溶液及甘油溶液可用作液体载体，特别用于可注射溶液。适合医药赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。必要时，组合物亦可含有少量湿润剂、增积剂、乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可采用溶液、悬浮液、乳液、持续释放制剂及其类似形式。适合医药载体的实例描述于E.W.Martin的“Remington's Pharmaceutical Sciences”中。制剂应适合施用方式。适当载体将为本领域技术人员显而易知且大部分将视施用途径而定。
“保护性”免疫应答是指免疫原性组合物能够引发用于保护对象免遭感染的体液性或细胞介导的免疫应答。提供的保护无需为绝对保护，亦即感染无需被完全阻止或根除，若相比于对照对象群，例如未施用疫苗或免疫原性组合物的已感染动物，在统计上显著改良即可。保护可限于缓和感染症状的严重性或发作快速性。一般而言，“保护性免疫应答”包括在至少50%对象中诱导对特定抗原具有特异性的抗体含量增加，包括针对各抗原的可测量功能性抗体反应的一些程度的增加。在特定情况下，“保护性免疫应答”可包括在至少50%对象中诱导对特定抗原具有特异性的抗体含量增加2倍或4倍，包括对各抗原的可测量功能性抗体反应的一些程度的增加。在某些实施方案中，调理吞噬抗体(opsonising antibody)与保护性免疫应答相关。因此，保护性免疫应答可通过在血清杀细菌活性(SBA)测定或调理吞噬(opsonophagocytosis)测定，例如下述测定中量测细菌计数减少百分比来测定。这些测定在本领域中亦已知。对于脑膜炎奈瑟球菌疫苗，例如SBA测定为已确立的保护作用代用物。在一些实施方案中，相比于免疫原性组合物不存在下的细菌计数，细菌计数减小至少10%、25%、50%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或95%以上。
术语“蛋白质”、“多肽”及“肽”是指氨基酸残基的聚合物且不限于产物的最小长度。因此，肽、寡肽、二聚体、多聚体等包括在该定义内。全长蛋白质与其片段两者均由该定义涵盖。该等术语亦包括对天然序列所作的修饰，诸如缺失、添加及取代(通常基本上为保守性的，但其可为非保守性的)，优选使得蛋白质维持在该蛋白质所施用的动物内引发免疫应答的能力。亦包括表达后修饰，例如糖基化、乙酰化、脂质化、磷酸化等等。
如本文所用的术语“重组”是指通过遗传工程改造方法产生的任何蛋白质、多肽或表达相关基因的细胞。如关于蛋白质或多肽使用的术语“重组”意谓通过表达重组多核苷酸产生的多肽。本发明蛋白质可自天然来源分离或通过遗传工程改造方法产生。如本文所用的“重组”另外描述如下核酸分子，其通过其来源或操作而不与其在自然界中与的相缔合的全部或一部分多核苷酸相缔合。如关于宿主细胞使用的术语“重组”意谓包括重组多核苷酸的宿主细胞。
术语“稳定剂”是指与抗原结合且维持该抗原的表位或免疫应答性持续一段时间的化合物。稳定剂在本领域中为已知的。稳定剂的实例包括多价阳离子，例如钙或铝。
术语“对象”是指哺乳动物、鸟类、鱼类、爬行动物或任何其它动物。术语“对象”亦包括人类。术语“对象”亦包括家养宠物。家养宠物的非限制性实例包括：狗、猫、猪、兔、大鼠、小鼠、沙鼠(gerbil)、仓鼠、天竺鼠(guinea pig)、雪貂、鸟类、蛇、蜥蜴、鱼类、乌龟及蛙。术语“对象”亦包括家畜动物。家畜动物的非限制性实例包括：羊驼、野牛、骆驼、牛、鹿、猪、马、美洲驼(llama)、骡、驴、绵羊、山羊、兔、驯鹿、牦牛、鸡、鹅及火鸡。
如本文所用的术语“哺乳动物”是指任何哺乳动物，诸如人类、小鼠、兔、非人类灵长类动物。在一优选实施方案中，哺乳动物为人类。
可互换使用的术语“疫苗”或“疫苗组合物”是指包含至少一种在对象中诱导免疫应答的免疫原性组合物的医药组合物。
一般性描述
本发明起因于以下新颖发现：P2086的非脂质化变体的特定制剂及给药方案会引发比如例如于Fletcher等人,Infection&Immunity.第72卷(4):2088-2100(2004)中所述的P2086的先前制剂高的杀细菌抗体效价。或者，本发明起因于以下新颖发现：P2086的非脂质化变体的特定制剂及给药方案会引发比脂质化LP2086变体的市售制剂高的杀细菌抗体效价。然而，应注意，脂质化LP2086的市售制剂目前可能不可用。观测到含有非脂质化rP2086变体的疫苗相比于脂质化rLP2086疫苗具有较高反应率(如通过SBA效价相比于基线值增加4倍或4倍以上所确定)。非脂质化P2086变体的制剂引发针对较广泛菌株谱，包括具有类似(>92%相同性)与不同(<92%相同性)LP2086序列两者的菌株的杀细菌抗体。
本发明亦鉴别先前未鉴别的表达非脂质化P2086变体的困难且提供克服这些困难的方法及由此获得的新颖组合物。尽管编码非脂质化P2086变体的质粒构建体提供非脂质化变体的强劲表达，但这些变体在N端Cys上经丙酮酰化。丙酮酰化会妨碍或降低多肽的制造相同性的可能性。本发明者另外发现非脂质化P2086变体序列缺失N端Cys会避免非脂质化P2086变体的丙酮酰化。试图通过缺失N端Cys的密码子来克服丙酮酰化会消除表达或导致不溶性变体表达。或者，自非脂质化P2086变体移除N端Cys会使一些变体的表达减少。然而，意外地，本发明者发现尽管缺失N端Cys残基，但至少非丙酮酰化非脂质化A05、B01、B09及B44变体可得以表达。一般而言，这些多肽可在相比于相应野生型序列，除Cys缺失以外无其它修饰的情况下得以表达。参见例如实施例2及4。此外，本发明者发现非丙酮酰化非脂质化变体意外地具有免疫原性且其出乎意料地引发杀细菌抗体。
因此，本发明提供两种克服或降低表达非脂质化变体的这些困难的可能性的方法。然而，本发明涵盖其它方法。第一种方法为改变N端尾部中紧靠N端Cys的下游的Gly/Ser茎部的长度。第二种方法为在N端尾部内进行密码子优化。然而，本发明涵盖其它密码子的优化。这些方法使得可溶性非脂质化P2086变体的表达增强。举例而言，在一实施方案中，可溶性非脂质化P2086变体的表达增强是与相应野生型非脂质化变体的表达进行比较。
分离的多肽
本发明者意外地发现分离的非丙酮酰化非脂质化ORF2086多肽。本发明者另外发现该等多肽出乎意料地具有免疫原性且能够引发杀细菌免疫应答。
如本文所用，术语非丙酮酰化是指多肽不含丙酮酸。相比于相应野生型多肽，含有丙酮酸的非脂质化ORF2086多肽通常展现+70的质量变化。在一实施方案中，当通过质谱测量时，相比于相应野生型非脂质化多肽，本发明多肽不展现+70的质量变化。参见例如实施例10。
在另一实施方案中，相比于相应野生型非脂质化ORF2086多肽，分离的非丙酮酰化非脂质化ORF2086多肽包括N端半胱氨酸残基缺失。术语“N端半胱氨酸”是指在多肽的N端或N端尾部的半胱氨酸(Cys)。更详细地，如本文所用的“N端半胱氨酸”是指LP2086脂蛋白经脂质化成具有三软脂酰基脂质尾部所处的N端半胱氨酸，如本领域中所知。举例而言，当提及SEQ ID NO:12-21的任一者作为参考序列时，N端半胱氨酸位于位置1处。
术语“野生型非脂质化ORF2086多肽”是指氨基酸序列与在自然界中所见的相应成熟脂质化ORF2086多肽的氨基酸序列相同的ORF2086多肽。非脂质化分子与脂质化分子之间的唯一差异在于野生型非脂质化ORF2086多肽未在N端半胱氨酸处经脂质化成具有三软脂酰基脂质尾部。
如本领域中亦已知，非脂质化2086形式是由缺乏原始前导序列的蛋白质或由经不指定宿主细胞中脂肪酸酰化位点的序列的一部分置换的前导序列产生。参见例如WO2003/063766，其以全文引用的方式并入本文中。
非脂质化ORF2086的实例不仅包括刚才描述的野生型非脂质化ORF2086多肽而且包括具有对应于SEQ ID NO:12-21的任一者的氨基酸序列而其中N端Cys缺失的多肽，以及具有对应于SEQ ID NO:12-21的任一者的氨基酸序列而其中N端Cys被取代的多肽。非脂质化ORF2086多肽的其它实例包括SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:64。
野生型非脂质化ORF2086多肽的实例包括具有对应于图2中所示的SEQ ID NO:12-21、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59及SEQ ID NO:60的任一者的氨基酸序列的多肽。这些示例性野生型非脂质化ORF2086多肽包括N端Cys缺失。
如本文所用，例如，“非脂质化”B44多肽包括具有选自SEQ ID NO:21、其中位置1的N端Cys缺失的SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:44的氨基酸序列的多肽。“野生型非脂质化”B44多肽包括具有氨基酸序列SEQ ID NO:21的多肽。“非丙酮酰化非脂质化”B44多肽包括具有选自其中位置1的N端Cys缺失的SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:44的氨基酸序列的多肽。
作为另一个实例，如本文所用，“非脂质化”B09多肽包括具有选自SEQID NO:18、其中位置1的N端Cys缺失的SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50的氨基酸序列的多肽。“野生型非脂质化”B09多肽包括具有氨基酸序列SEQ ID NO:18的多肽。“非丙酮酰化非脂质化”B44多肽包括具有选自其中位置1的N端Cys缺失的SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50的氨基酸序列的多肽。
作为另一个实例，如本文所用，“非脂质化”A05多肽包括具有选自SEQ ID NO:13、其中位置1的N端Cys缺失的SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:55的氨基酸序列的多肽。“野生型非脂质化”A05多肽包括具有氨基酸序列SEQ ID NO:13的多肽。“非丙酮酰化非脂质化”A05多肽包括具有选自其中位置1的N端Cys缺失的SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:55的氨基酸序列的多肽。
如本文所用的术语N端Cys的“缺失”包括相比于野生型非脂质化多肽序列，使N端Cys缺失的突变。例如，N端Cys的“缺失”指的是从参考序列，例如从相应的野生型序列移除氨基酸Cys，由此造成与参考序列相比的氨基酸残基的减少。
在另一实施方案中，N端Cys被不为Cys残基的氨基酸取代。例如，在示例性实施方案中，在SEQ ID NO:12-21的位置1处的N端Cys在位置1包括C至G的取代。见，例如，SEQ ID NO:62与SEQ ID NO:19(B22野生型)相比；SEQ ID NO:64与SEQ ID NO:15(A22野生型)相比。置换所述N端Cys的示例性氨基酸包括任意非Cys氨基酸，优选极性不带电荷氨基酸例如甘氨酸。在优选实施方案中，用Cys的非保守残基进行所述取代。
本发明者惊奇地发现相比于相应野生型非脂质化ORF2086多肽，表达缺失N端Cys残基的非脂质化ORF2086多肽导致当由质谱分析测量时无可检测的丙酮酰化。非丙酮酰化非脂质化ORF2086多肽的实例包括具有选自由以下组成的组的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO:12(A04)、SEQ ID NO:13(A05)、SEQ ID NO:14(A12)、SEQ ID NO:15(A22)、SEQ ID NO:16(B02)、SEQ ID NO:17(B03)、SEQ ID NO:18(B09)、SEQ ID NO:19(B22)、SEQ IDNO:20(B24)及SEQ ID NO:21(B44)，其中在位置1的半胱氨酸缺失。分离的非丙酮酰化非脂质化ORF2086多肽的其它实例包括具有选自由以下组成的组的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50及SEQ ID NO:55。优选地，非丙酮酰化非脂质化2086多肽包括至少约250、255或260个连续氨基酸，且至多约270、269、268、267、266、265、264、263、260、259、258、257、256或255个连续氨基酸。任何最小值可与任何最大值组合以界定一范围。优选地，多肽具有至少254或262个连续氨基酸。
在一个实施方案中，分离的非丙酮酰化非脂质化ORF2086多肽是由可操作地连接于表达系统的核苷酸序列编码，其中该表达系统能够在细菌细胞中表达。在一例示性实施方案中，核苷酸序列与控制该核苷酸序列表达的调控序列连接。
适合的表达系统、调控序列及细菌细胞在本领域中已知。举例而言，可使用任何质粒表达载体，例如PETTM(Novogen,Madison Wis.)或PMALTM(New England Biolabs,Beverly,Mass.)，只要多肽能够在细菌细胞中表达。优选地，PETTM载体用于在大肠杆菌中克隆及表达重组蛋白。在PETTM系统中，经克隆基因可在噬菌体T7启动子控制下表达。例示性细菌细胞包括荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，优选为大肠杆菌。
在一方面中，本发明涉及一种可通过某一方法获得的非丙酮酰化非脂质化ORF2086多肽。多肽优选是分离的。本发明另外涉及包括可通过某一方法获得的非丙酮酰化非脂质化ORF2086多肽的组合物。组合物优选为免疫原性组合物。该方法包括表达编码具有选自由以下组成的组的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列：SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:20及SEQ ID NO:21，其中在位置1处的半胱氨酸缺失。核苷酸序列可操作地连接于能够在细菌细胞中表达的表达系统。在一实施方案中，该方法包括表达编码具有选自由以下组成的组的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列：SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50及SEQ ID NO:55。在另一实施方案中，核苷酸序列是选自由以下组成的组：SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ IDNO:48、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:54。优选地，细菌细胞为大肠杆菌。
在一方面中，本发明涉及一种组合物，其包括包含SEQ ID NO:49所述的氨基酸序列的第一分离的多肽及包含SEQ ID NO:44所述的氨基酸序列的第二分离的多肽。在一优选实施方案中，多肽为免疫原性多肽。在另一优选实施方案中，组合物另外包括来自血清群B脑膜炎奈瑟球菌的ORF2086亚家族A多肽。优选地，ORF2086亚家族A多肽为非丙酮酰化非脂质化ORF2086亚家族A多肽。在一例示性实施方案中，ORF2086亚家族A多肽为A05，其实例包括例如SEQ ID NO:13，其中在位置1处的N端半胱氨酸缺失；及SEQ ID NO:55。
在另一方面中，本发明涉及一种产生分离的多肽的方法。该方法包括在细菌细胞中表达包括与SEQ ID NO:21的相同性大于90%的序列的多肽，该序列包括至少一个选自由以下组成的组的结构域：SEQ ID NO:21的氨基酸13-18、SEQ ID NO:21的氨基酸21-34及SEQ ID NO:21的氨基酸70-80或其组合，其中该多肽缺乏N端半胱氨酸。该方法另外包括纯化多肽。其中产生的多肽包括非丙酮酰化非脂质化ORF2086多肽。优选地，多肽为免疫原性多肽。在一优选实施方案中，细菌细胞为大肠杆菌。
包括至少一个选自由SEQ ID NO:21的氨基酸13-18、SEQ ID NO:21的氨基酸21-34及SEQ ID NO:21的氨基酸70-80或其组合组成的组的结构域的多肽的实例包括SEQ ID NO:12(A04)、SEQ ID NO:13(A05)、SEQ IDNO:14(A12)、SEQ ID NO:15(A22)、SEQ ID NO:16(B02)、SEQ ID NO:17(B03)、SEQ ID NO:18(B09)、SEQ ID NO:19(B22)、SEQ ID NO:20(B24)及SEQ ID NO:21(B44)。优选地，其中在位置1处的半胱氨酸缺失。其它例示性多肽包括SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ IDNO:55、SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:64。
在一例示性实施方案中，分离的多肽序列另外包括至少一个选自由以下组成的组的结构域：SEQ ID NO:21的氨基酸96-116、SEQ ID NO:21的氨基酸158-170、SEQ ID NO:21的氨基酸172-185、SEQ ID NO:21的氨基酸187-199、SEQ ID NO:21的氨基酸213-224、SEQ ID NO:21的氨基酸226-237、SEQ ID NO:21的氨基酸239-248或其组合。包括至少一个选自由SEQ ID NO:21的氨基酸13-18、SEQ ID NO:21的氨基酸21-34及SEQ IDNO:21的氨基酸70-80或其组合组成的组的结构域、及另外包括至少一个选自由SEQ ID NO:21的氨基酸96-116、SEQ ID NO:21的氨基酸158-170、SEQ ID NO:21的氨基酸172-185、SEQ ID NO:21的氨基酸187-199、SEQ IDNO:21的氨基酸213-224、SEQ ID NO:21的氨基酸226-237、SEQ ID NO:21的氨基酸239-248或其组合组成的组的结构域的多肽的实例包括SEQ IDNO:16(B02)、SEQ ID NO:17(B03)、SEQ ID NO:18(B09)、SEQ ID NO:19(B22)、SEQ ID NO:20(B24)及SEQ ID NO:21(B44)，优选地，其中在位置1处的半胱氨酸缺失。其它例示性多肽包括SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50及SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:62。
在一方面中，本发明涉及一种通过本文所述的方法产生的分离的多肽。在一实施方案中，分离的多肽为非丙酮酰化非脂质化多肽。在另一方面中，本发明涉及一种通过本文所述的方法产生的免疫原性组合物。
在一方面中，本发明涉及一种包括SEQ ID NO:18(其中在位置1处的N端Cys缺失)或SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列的分离的多肽。编码SEQID NO:49的例示性核苷酸序列包括SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47及SEQID NO:48。优选地，核苷酸序列为SEQ ID NO:46。在一方面中，本发明涉及一种包括SEQ ID NO:46的分离的核苷酸序列。在一方面中，本发明涉及一种包括SEQ ID NO:47的分离的核苷酸序列。在一方面中，本发明涉及一种包括SEQ ID NO:48的分离的核苷酸序列。
在一方面中，本发明涉及一种包括选自由SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48及SEQ ID NO:45组成的组的核苷酸序列的质粒，其中该质粒能够在细菌细胞中表达。适合表达系统、调控序列及细菌细胞在本领域中为已知的，如上所述。优选地，细菌细胞为大肠杆菌。
在另一方面中，本发明涉及一种包括SEQ ID NO:50所述的氨基酸序列的分离的多肽。在一例示性实施方案中，SEQ ID NO:50由SEQ ID NO:45编码。
在另一方面中，本发明涉及一种包括SEQ ID NO:21(其中N端Cys缺失)或SEQ ID NO:44所述的氨基酸序列的分离的多肽。编码SEQ ID NO:44的例示性核苷酸序列包括SEQ ID NO:43及SEQ ID NO:51。优选地，核苷酸序列为SEQ ID NO:43。在一方面中，本发明涉及一种包括SEQ ID NO:43的分离的核苷酸序列。
免疫原性组合物
在一优选实施方案中，本文所述的包括分离的非丙酮酰化非脂质化ORF2086多肽的组合物为免疫原性组合物。包括由来自脑膜炎奈瑟球菌ORF2086的核苷酸序列编码的蛋白质的免疫原性组合物在本领域中为已知的。例示性免疫原性组合物包括WO2003/063766及美国专利申请公开案第US20060257413号及第US20090202593号中所述的组合物，该等专利以全文引用的方式并入本文中。其中描述的这些免疫原性组合物包括鉴别为ORF2086蛋白的展现杀细菌活性的蛋白质、其免疫原性部分及/或其生物等价物。ORF2086蛋白是指由奈瑟菌属物种的开放阅读框2086编码的蛋白质。
蛋白质可为来自天然奈瑟菌属物种的重组蛋白或分离的蛋白。举例而言，奈瑟菌属ORF2086蛋白以及该等蛋白的免疫原性部分及/或生物等价物可自细菌菌株，诸如奈瑟菌属物种的菌株，包括脑膜炎奈瑟球菌(血清群A、B、C、D、W-135、X、Y、Z及29E)、淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)及乳糖奈瑟球菌(Neisseria lactamica)的菌株分离。
ORF2086蛋白包括2086亚家族A蛋白及亚家族B蛋白、其免疫原性部分及/或其生物等价物。2086亚家族A蛋白及2086亚家族B蛋白在本领域中为已知的，参见例如以上引用的Fletcher等人,2004。亦参见WO2003/063766，其揭示其中SEQ ID NO:260至278表示与2086亚家族A的蛋白质相关的氨基酸序列。此外，WO2003/063766中揭示其中SEQ ID NO:279至299表示与2086亚家族B的蛋白质相关的氨基酸序列。WO2003/063766以全文引用的方式并入本文中。ORF2086蛋白或其等价物等可经脂质化或不经脂质化。优选地，奈瑟菌属ORF2086蛋白为非脂质化蛋白。或者，免疫原性组合物可为脂质化ORF2086蛋白与非脂质化ORF2086蛋白的组合。
在一实施方案中，免疫原性组合物包括与由来自奈瑟菌属ORF2086的核苷酸序列编码的蛋白质具有至少95%氨基酸序列相同性的分离的蛋白。
在一实施方案中，免疫原性组合物包括与由来自奈瑟菌属ORF2086的核苷酸序列编码的亚家族A蛋白具有至少95%氨基酸序列相同性的分离的蛋白。优选地，免疫原性组合物包括由来自奈瑟菌属ORF2086的核苷酸序列编码的分离的亚家族A蛋白。在一些实施方案中，ORF2086亚家族A多肽为A05、A04、A12或A22变体。
在一些实施方案中，ORF2086亚家族A多肽为A05、A12或A22变体。
在另一实施方案中，免疫原性组合物包括与由来自奈瑟菌属ORF2086的核苷酸序列编码的亚家族B蛋白具有至少95%氨基酸序列相同性的分离的蛋白。优选地，免疫原性组合物包括由来自奈瑟菌属ORF2086的核苷酸序列编码的分离的亚家族B蛋白。在一些实施方案中，ORF2086亚家族B蛋白为B44、B02、B03、B22、B24或B09变体。在一些实施方案中，ORF2086亚家族B蛋白为B44、B22或B09变体。
在一优选实施方案中，免疫原性组合物包括与由来自奈瑟菌属ORF2086的核苷酸序列编码的亚家族B蛋白具有至少95%氨基酸序列相同性的分离的非丙酮酰化非脂质化多肽。举例而言，在一些实施方案中，ORF2086亚家族B蛋白选自具有如SEQ ID NO:21中所示氨基酸序列的B44；具有如SEQ ID NO:16中所示氨基酸序列的B02；具有如SEQ ID NO:17中所示氨基酸序列的B03；具有如SEQ ID NO:19中所示氨基酸序列的B22；具有如SEQ ID NO:20中所示氨基酸序列的B24；或具有如SEQ ID NO:18中所示氨基酸序列的B09变体，其中N端Cys缺失；或其组合。
更佳地，免疫原性组合物包括非丙酮酰化非脂质化B09多肽、非丙酮酰化非脂质化B44多肽或其组合。在一实施方案中，组合物包括具有如SEQID NO:18中所示氨基酸序列的非丙酮酰化非脂质化B09变体，其中N端Cys缺失；具有如SEQ ID NO:21中所示氨基酸序列的非丙酮酰化非脂质化B44，其中N端Cys缺失；或其组合。在另一实施方案中，免疫原性组合物包括具有SEQ ID NO:49的非丙酮酰化非脂质化B09、具有SEQ ID NO:44的非丙酮酰化非脂质化B44或其组合。
在一方面中，本发明涉及一种包括来自血清群B脑膜炎奈瑟球菌的ORF2086亚家族B多肽的免疫原性组合物，其中该多肽为非丙酮酰化非脂质化B44。B44可包括如SEQ ID NO:21(其中N端Cys缺失)或SEQ ID NO:44中所示的氨基酸序列。在一实施方案中，组合物另外包括来自血清群B脑膜炎奈瑟球菌的第二ORF2086亚家族B多肽，其中该第二多肽为非丙酮酰化非脂质化B09。B09可包括如SEQ ID NO:18(其中N端Cys缺失)或SEQ ID NO:49中所示的氨基酸序列。在一实施方案中，免疫原性组合物为疫苗。
在另一实施方案中，组合物包括至多3种ORF2086亚家族B多肽。在另一实施方案中，组合物包括至多2种ORF2086亚家族B多肽。
在一实施方案中，组合物还包括一或多种ORF2086亚家族A多肽。在优选实施方案中，组合物包括亚家族A多肽A05。
在另一实施方案中，免疫原性组合物包括与由来自奈瑟菌属ORF2086的核苷酸序列编码的亚家族A蛋白具有至少95%氨基酸序列相同性的分离的蛋白、及与由来自奈瑟菌属ORF2086的核苷酸序列编码的亚家族B蛋白具有至少95%氨基酸序列相同性的分离的蛋白。
优选地，免疫原性组合物包括由来自奈瑟菌属ORF2086的核苷酸序列编码的分离的亚家族A蛋白及由来自奈瑟菌属ORF2086的核苷酸序列编码的分离的亚家族B蛋白。更佳地，免疫原性组合物包括分离的非丙酮酰化非脂质化亚家族A ORF2086多肽及分离的非丙酮酰化非脂质化亚家族BORF2086多肽。在一些实施方案中，ORF2086亚家族A多肽为A05、A04、A12或A22变体。在一优选实施方案中，ORF2086亚家族A多肽为具有如SEQ ID NO:13中所示氨基酸序列的A05；具有如SEQ ID NO:12中所示氨基酸序列的A04；具有如SEQ ID NO:14中所示氨基酸序列的A12；或具有如SEQ ID NO:15中所示氨基酸序列的A22变体，其中N端Cys缺失；或其任何组合。在一些实施方案中，ORF2086亚家族B蛋白为B44、B02、B03、B22、B24或B09变体。在一优选实施方案中，ORF2086亚家族B蛋白为具有如SEQ ID NO:21中所示氨基酸序列的B44；具有如SEQ ID NO:16中所示氨基酸序列的B02；具有如SEQ ID NO:17中所示氨基酸序列的B03；具有如SEQ ID NO:19中所示氨基酸序列的B22；具有如SEQ ID NO:20中所示氨基酸序列的B24；或具有如SEQ ID NO:18中所示氨基酸序列的B09变体，其中N端Cys缺失；或其组合。
在一实施方案中，免疫原性组合物包括1:1比率的亚家族A蛋白与亚家族B蛋白。
在另一方面中，本文所述的分离的多肽及组合物在哺乳动物中引发针对来自血清群B脑膜炎奈瑟球菌的ORF2086多肽的杀细菌免疫应答。组合物在向哺乳动物施用之后能够诱导杀细菌抗脑膜炎奈瑟球菌抗体，且在优选实施方案中，可诱导针对各别亚家族的菌株的杀细菌抗体。以下给出关于杀细菌反应的其它信息。参见例如实施例6、11、12及13。杀细菌抗体为人类中保护作用的指示物，且临床前研究充当代用物，且任何新颖免疫原性组合物候选物应引发这些功能性抗体。
在一例示性实施方案中，具有SEQ ID NO:18(其中在位置1处的N端Cys缺失)或SEQ ID NO:49的分离的非丙酮酰化非脂质化B09多肽及其免疫原性组合物会引发针对(例如可结合)来自血清群B脑膜炎奈瑟球菌的亚家族A或优选亚家族B ORF2086多肽的杀细菌抗体。优选地，非丙酮酰化非脂质化B09多肽及其免疫原性组合物会引发针对A05变体(SEQ ID NO:13)；B44变体(SEQ ID NO:21)；B16变体(SEQ ID NO:60)；B24变体(SEQID NO:20)；B09变体(SEQ ID NO:18)或其组合的杀细菌抗体。在一例示性实施方案中，非丙酮酰化非脂质化B09多肽及其免疫原性组合物会引发针对B44变体(SEQ ID NO:21)；B16变体(SEQ ID NO:60)；B24变体(SEQ IDNO:20)；B09变体(SEQ ID NO:18)或其组合的杀细菌抗体。参见例如实施例11、实施例12及实施例13。
在另一例示性实施方案中，具有SEQ ID NO:21(其中在位置1处的N端Cys缺失)或SEQ ID NO:44的分离的非丙酮酰化非脂质化B44多肽及其免疫原性组合物会引发针对(例如可结合)来自血清群B脑膜炎奈瑟球菌的亚家族B ORF2086多肽的杀细菌抗体。优选地，非丙酮酰化非脂质化B44多肽及其免疫原性组合物会引发针对B44变体(SEQ ID NO:21)；B16变体(SEQ ID NO:60)；B24变体(SEQ ID NO:20)；B09变体(SEQ ID NO:18)或其组合的杀细菌抗体。参见例如实施例11。另外，非丙酮酰化非脂质化B44多肽及其免疫原性组合物亦可引发与B02变体(SEQ ID NO:16)结合的杀细菌抗体。参见例如实施例12及实施例13。
此外，非丙酮酰化非脂质化B44多肽及其免疫原性组合物亦可引发与B03变体(SEQ ID NO:17)及B15变体(SEQ ID NO:59)结合的杀细菌抗体。参见例如实施例6。
在另一例示性实施方案中，具有SEQ ID NO:19(其中在位置1处的N端Cys缺失)的分离的非丙酮酰化非脂质化B22多肽及其免疫原性组合物会引发针对(例如可结合)来自血清群B脑膜炎奈瑟球菌的亚家族B ORF2086多肽的杀细菌抗体。优选地，非丙酮酰化非脂质化B22多肽会引发针对B44变体(SEQ ID NO:21)；B16变体(SEQ ID NO:60)；B24变体(SEQ ID NO:20)；B09变体(SEQ ID NO:18)或其组合的杀细菌抗体。参见例如实施例13。
在一实施方案中，具有SEQ ID NO:13(其中N端Cys缺失)或SEQ IDNO:55的分离的非丙酮酰化非脂质化A05多肽及其免疫原性组合物会引发针对(例如可结合)来自血清群B脑膜炎奈瑟球菌的亚家族A ORF2086多肽的杀细菌抗体。优选地，非丙酮酰化非脂质化A05及其免疫原性组合物会引发针对A05变体(SEQ ID NO:13)、A22变体(SEQ ID NO:15)、A12变体(SEQ ID NO:14)或其组合的杀细菌抗体。参见例如实施例6及13。
在一方面中，本发明涉及一种在哺乳动物中引发对血清群B脑膜炎奈瑟球菌具有特异性的杀细菌抗体的方法。在一例示性实施方案中，该方法包括引发对ORF2086亚家族B血清群B脑膜炎奈瑟球菌、ORF2086亚家族A血清群B脑膜炎奈瑟球菌或其组合具有特异性的杀细菌抗体。该方法包括向哺乳动物施用有效量的如上所述的分离的非丙酮酰化非脂质化2086多肽或其免疫原性组合物。
在一优选实施方案中，该方法包括引发对ORF2086亚家族B血清群B脑膜炎奈瑟球菌具有特异性的杀细菌抗体。分离的多肽或免疫原性组合物包括非丙酮酰化非脂质化B44多肽。在另一优选实施方案中，组合物另外包括非丙酮酰化非脂质化B09多肽，在一例示性实施方案中，分离的多肽或免疫原性组合物包括SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:44或其组合。在一优选实施方案中，分离的多肽或免疫原性组合物包括SEQ ID NO:18(其中在位置1处的N端Cys缺失)、SEQ ID NO:21(其中在位置1处的N端Cys缺失)或其组合。在另一优选实施方案中，分离的多肽或免疫原性组合物包括SEQ ID NO:19，其中在位置1处的N端Cys缺失。
在一优选实施方案中，该方法包括引发对ORF2086亚家族A血清群B脑膜炎奈瑟球菌具有特异性的杀细菌抗体。分离的多肽或免疫原性组合物包括非丙酮酰化非脂质化A05多肽。在一优选实施方案中，分离的多肽或免疫原性组合物包括SEQ ID NO:13，其中在位置1处的N端Cys缺失。在另一优选实施方案中，组合物另外包括非丙酮酰化非脂质化B44多肽。在一例示性实施方案中，分离的多肽或免疫原性组合物包括SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:44或其组合。在一优选实施方案中，分离的多肽或免疫原性组合物包括SEQ ID NO:13(其中在位置1处的N端Cys缺失)、SEQ ID NO:21(其中在位置1处的N端Cys缺失)或其组合。
免疫原性组合物可包括由来自奈瑟菌属ORF2086的核苷酸序列编码的蛋白质、其多核苷酸或等价物作为免疫原性组合物中的唯一活性免疫原。或者，免疫原性组合物可另外包括活性免疫原，包括其它奈瑟菌属免疫原性多肽、或一或多种其它微生物病原体(例如但不限于病毒、朊病毒、杆菌或真菌)的免疫活性蛋白、或荚膜多糖。组合物视所选适应症所需可包含一或多种所要蛋白质、片段或医药化合物。
本发明涵盖任何多抗原或多价免疫原性组合物。举例而言，免疫原性组合物可包括两种或两种以上ORF2086蛋白的组合、ORF2086蛋白与一或多种Por A蛋白的组合、ORF2086蛋白与脑膜炎奈瑟球菌血清群A、C、Y及W135多糖及/或多糖结合物的组合、ORF2086蛋白与脑膜炎奈瑟球菌及肺炎双球菌(pneumococcus)组合的组合、或任何前述物的组合，呈适于所要施用(例如经粘膜传递)的形式。本领域技术人员将能够容易地配制这些多抗原或多价免疫组合物。
本发明亦涵盖多免疫方案，其中适用于针对病原体的任何组合物皆可组合于其中或与本发明组合物组合。举例而言，但不加以限制，可向患者施用本发明的免疫原性组合物及用于使对人类乳头状瘤病毒(papillomavirusvirus)(HPV)免疫的另一免疫组合物(诸如HPV疫苗
Figure BDA00002897206200321
)作为多免疫方案的一部分。本领域技术人员将能够容易地选择与本发明的免疫原性组合物联合使用的免疫原性组合物以达成开发及实施多免疫方案的目的。
ORF2086多肽、片段及等价物可用作缀合物免疫原性组合物的一部分；其中一或多种蛋白质或多肽与载体缀合以产生具有针对若干血清型或更准确地血清群及/或针对若干疾病的免疫原性的组合物。或者，一种ORF2086多肽可用作其它免疫原性多肽的载体蛋白。这些免疫原性组合物的配制为本领域技术人员所熟知。
本发明的免疫原性组合物优选包括医药学上可接受的载体。适合医药学上可接受的载体及/或稀释剂包括任何及所有习知溶剂、分散介质、填充剂、固体载体、水溶液、包衣、抗细菌剂及抗真菌剂、等张剂及吸收延迟剂及其类似物。适合医药学上可接受的载体包括例如以下一或多者：水、生理盐水、磷酸盐缓冲生理盐水、右旋糖、甘油、乙醇等以及其组合。
医药学上可接受的载体可另外包括少量会增强抗体的存放期或效用的辅助物质，诸如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂。医药学上可接受的载体的制备及使用在本领域中为熟知的。除非任何习知介质或试剂与活性成分不兼容，否则涵盖其在本发明的免疫原性组合物中使用。
免疫原性组合物可非经肠(例如通过皮下或肌肉内注射)以及经口或经鼻内施用。肌肉内免疫的方法由Wolff等人Biotechniques:11(4):474-85,(1991)及由Sedegah等人PNAS第91卷,第9866-9870页,(1994)描述。举例而言，但不加以限制，其它施用模式采用经口制剂、经肺制剂、栓剂及经皮用药。举例而言，经口制剂包括通常采用的赋形剂，例如但不限于医药级甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。优选地，免疫原性组合物经肌肉内施用。
本发明的免疫原性组合物可另外包含一或多种其它“免疫调节剂”，其为干扰或改变免疫系统以便观测到体液性及/或细胞介导的免疫性的上调或下调的药剂。在一特定实施方案中，免疫系统的体液性及/或细胞介导的分支(arm)的上调优选。某些免疫调节剂的实例包括例如佐剂或细胞激素或ISCOMATRIX(CSL Limited,Parkville,Australia)，尤其描述于美国专利第5,254,339号中。
可用于本发明疫苗中的佐剂的非限制性实例包括RIBI佐剂系统(RibiInc.,Hamilton,Mont.)、明矾、矿物质凝胶(诸如氢氧化铝凝胶)、水包油乳液、油包水乳液(例如弗氏完全及不完全佐剂)、嵌段共聚物(CytRx,Atlanta Ga.)、QS-21(Cambridge Biotech Inc.,Cambridge Mass.)、SAF-M(Chiron,EmeryvilleCalif.)、
Figure BDA00002897206200331
皂苷、Quil A或其它皂苷部分、单磷酰基脂质A及阿夫立定脂质-胺佐剂。适用于本发明疫苗中的水包油乳液的非限制性实例包括改进SEAM62及SEAM1/2制剂。改进SEAM62为一种水包油乳液，其含有5%(v/v)角鲨烯(squalene)(Sigma)、1%(v/v)
Figure BDA00002897206200332
去污剂(ICISurfactants)、0.7%(v/v)
Figure BDA00002897206200333
去污剂(ICI Surfactants)、2.5%(v/v)乙醇、200μg/ml Quil A、100μg/ml胆固醇及0.5%(v/v)卵磷脂(lecithin)。改进SEAM1/2为一种水包油乳液，其包含5%(v/v)角鲨烯、1%(v/v)
Figure BDA00002897206200334
去污剂、0.7%(v/v)聚山梨醇酯80去污剂、2.5%(v/v)乙醇、100μg/ml Quil A及50μg/ml胆固醇。
可包括在疫苗中的其它“免疫调节剂”包括例如一或多种白介素、干扰素或其它已知细胞激素或趋化因子。在一实施方案中，佐剂可为环糊精衍生物或聚阴离子聚合物，诸如分别于美国专利第6,165,995号及第6,610,310号中描述的环糊精衍生物或聚阴离子聚合物。应了解，欲使用的免疫调节剂及/或佐剂将视疫苗或免疫原性组合物将施用的对象、注射途径及欲给与的注射次数而定。
在一些实施方案中，佐剂为皂苷。在一些实施方案中，皂苷浓度介于1μg/ml与250μg/ml之间；介于5μg/ml与150μg/ml之间；或介于10μg/ml与100μg/ml之间。在一些实施方案中，皂苷浓度为约1μg/ml；约5μg/ml；约10μg/ml；约20μg/ml；约30μg/ml；约40μg/ml；约50μg/ml；约60μg/ml；约70μg/ml；约80μg/ml；约90μg/ml；约100μg/ml；约110μg/ml；约120μg/ml；约130μg/ml；约140μg/ml；约150μg/ml；约160μg/ml；约170μg/ml；约180μg/ml；约190μg/ml；约200μg/ml；约210μg/ml；约220μg/ml；约230μg/ml；约240μg/ml；或约250μg/ml。
在某些优选实施方案中，本发明蛋白质用于供经口施用的包括经粘膜佐剂的免疫原性组合物中且用于治疗或预防人类宿主的脑膜炎奈瑟球菌感染。经粘膜佐剂可为霍乱毒素(cholera toxin)；然而，优选地，可根据本发明使用的不同于霍乱菌毒素的经粘膜佐剂包括霍乱全毒素(cholera holotoxin)的无毒衍生物，其中A亚基为经诱变且经化学修饰的霍乱毒素；或通过修饰霍乱毒素氨基酸序列所产生的相关蛋白质。对于可特别适用于制备本发明的免疫原性组合物的特定霍乱毒素，参见如公开的国际申请WO00/18434中揭示的突变霍乱全毒素E29H，该申请据此以全文引用的方式并入本文中。这些佐剂可添加至本发明多肽中或与本发明多肽结合。相同技术可应用于具有经粘膜佐剂或传递性质的其它分子，诸如大肠杆菌不耐热毒素(LT)。
可使用具有经粘膜佐剂或传递活性的其它化合物，诸如胆汁；聚阳离子，诸如DEAE-葡聚糖及聚鸟氨酸；去污剂，诸如十二烷基苯硫酸钠；脂质缀合物质；抗生素，诸如链霉素(streptomycin)；维生素A；及会改变粘膜表面的结构或功能完整性的其它化合物。其它具经粘膜活性的化合物包括微生物结构的衍生物(诸如MDP)；吖啶及西咪替丁(cimetidine)。亦可使用如上所述的STIMULONTMQS-21、MPL及IL-12。
本发明的免疫原性组合物可以ISCOMS(免疫刺激复合物)形式传递，ISCOMS含有CTB、脂质体或囊封于诸如丙烯酸酯或聚(DL-丙交酯-共-糖苷)的化合物中以形成具有适于吸收的尺寸的微球。本发明蛋白质亦可并入油性乳液中。
向患者施用的免疫原性组合物的量(亦即剂量)可根据一般技术者已知的标准技术确定，考虑诸如以下因素：特定抗原；佐剂(若存在)；特定患者的年龄、性别、重量、物种、状况；及施用途径。
举例而言，用于青少年人类患者的剂量可包括至少0.1μg、1μg、10μg或50μg奈瑟菌属ORF2086蛋白，且至多80μg、100μg、150μg或200μg奈瑟菌属ORF2086蛋白。任何最小值与任何最大值可组合以界定某一适合范围。
佐剂
在某些实施方案中，如本文所述的免疫原性组合物亦包含一或多种佐剂。佐剂为一种当与免疫原或抗原一起施用时会增强免疫应答的物质。许多细胞激素或淋巴激素已显示具有免疫调节活性，且因此适用作佐剂，包括(但不限于)白介素1-α、1-β、2、4、5、6、7、8、10、12(参见例如美国专利第5,723,127号)、13、14、15、16、17及18(及其突变形式)；干扰素-α、β及γ；颗粒球-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(参见例如美国专利第5,078,996号及ATCC寄存编号39900)；巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)；颗粒球集落刺激因子(G-CSF)；及肿瘤坏死因子α及β。
适合与本文所述的免疫原性组合物一起使用的其它佐剂包括趋化因子，包括但不限于MCP-1、MIP-1α、MIP-1β及RANTES；粘着分子，诸如选择素(selectin)，例如L-选择素、P-选择素及E-选择素；粘蛋白(mucin)样分子，例如CD34、GlyCAM-1及MadCAM-1；整合素(integrin)家族成员，诸如LFA-1、VLA-1、Mac-1及p150.95；免疫球蛋白超家族成员，诸如PECAM、ICAM(例如ICAM-1、ICAM-2及ICAM-3)、CD2及LFA-3；共刺激分子，诸如B7-1、B7-2、CD40及CD40L；生长因子，包括血管生长因子、神经生长因子、纤维母细胞生长因子、表皮生长因子、PDGF、BL-1及血管内皮生长因子；受体分子，包括Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2及DR6；及卡斯蛋白酶(Caspase)(ICE)。
其它例示性佐剂包括(但不限于)氢氧化铝；磷酸铝；STIMULONTMQS-21(Aquila Biopharmaceuticals,Inc.,Framingham,Mass.)；MPLTM(3-O-去酰化单磷酰基脂质A；Corixa,Hamilton,Mont.)、529(一种氨基烷基葡糖胺磷酸酯化合物，Corixa,Hamilton,Mont)、IL-12(Genetics Institute,Cambridge,Mass.)；GM-CSF(Immunex Corp.,Seattle,Wash.)；N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异氨酰胺(thr-MDP)；N-乙酰基-去甲基-胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺(CGP11637，称为去甲基MDP)；N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺-L-丙氨酸-2-(1'-2'-二软脂酰基-sn-甘油-3-羟基磷酰基氧基-乙胺)(CGP19835A，称为MTP-PE)；及霍乱毒素。在某些优选实施方案中，佐剂为QS-21。
其它例示性佐剂包括霍乱毒素(包括其A亚基)的无毒衍生物、及/或脑膜炎奈瑟球菌多肽与霍乱毒素或其B亚基(“CTB”)的结合物或遗传工程改造融合物、霍乱前原类毒素(procholeragenoid)、真菌多糖(包括裂裥菌素(schizophyllan))、胞壁酰二肽、胞壁酰二肽(“MDP”)衍生物、佛波醇(phorbol)酯、大肠杆菌的不耐热毒素、嵌段聚合物或皂苷。
磷酸铝已用作1期临床试验中的佐剂，浓度为每剂0.125mg，远低于美国联邦法规(US Code of Federal Regulations)[610.15(a)]所指定的每剂0.85mg的限度。含铝佐剂广泛用于人类以在肌肉内或皮下施用时增强抗原的免疫应答。在一些实施方案中，免疫原性组合物中的铝浓度介于0.125μg/ml与0.5μg/ml之间；介于0.20μg/ml与0.40μg/ml之间；或介于0.20μg/ml与0.30μg/ml之间。在一些实施方案中，免疫原性组合物中的铝浓度为约0.125μg/ml；约0.15μg/ml；约0.175μg/ml；约0.20μg/ml；约0.225μg/ml；约0.25μg/ml；约0.275μg/ml；约0.30μg/ml；约0.325μg/ml；约0.35μg/ml；约0.375μg/ml；约0.40μg/ml；约0.425μg/ml；约0.45μg/ml；约0.475μg/ml；或约0.50μg/ml。
在优选实施方案中，免疫原性组合物中的铝浓度介于0.125mg/ml与0.5mg/ml之间；介于0.20mg/ml与0.40mg/ml之间；或介于0.20mg/ml与0.30mg/ml之间。在一些实施方案中，免疫原性组合物中的铝浓度为约0.125mg/ml；约0.15mg/ml；约0.175mg/ml；约0.20mg/ml；约0.225mg/ml；约0.25mg/ml；约0.275mg/ml；约0.30mg/ml；约0.325mg/ml；约0.35mg/ml；约0.375mg/ml；约0.40mg/ml；约0.425mg/ml；约0.45mg/ml；约0.475mg/ml；或约0.50mg/ml。
适用于增强免疫应答的佐剂另外包括但不限于MPLTM(3-O-去酰化单磷酰基脂质A，Corixa,Hamilton,MT)，其描述于美国专利第4,912,094号中。可自Corixa(Hamilton,MT)获得且描述于美国专利第6,113,918号中的合成脂质A类似物或氨基烷基葡糖胺磷酸酯化合物(AGP)或其衍生物或类似物亦适用作佐剂。一种此类AGP为2-[(R)-3-十四酰基氧基十四酰基氨基]乙基2-脱氧-4-O-膦酰基-3-O-[(R)-3-十四酰基氧基十四酰基]-2-[(R)-3-十四酰基氧基十四酰基-氨基]-b-D-葡萄吡喃糖苷，其亦称为529(先前称为RC529)。此529佐剂配制成水性形式(AF)或稳定乳液(SE)。
其它佐剂包括胞壁酰肽，诸如N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏胺酰基-D-异麸酰氨酸(thr-MDP)、N-乙酰基-去甲基胞壁酰基-L-丙氨酸-2-(1'-2'二软脂酰基-sn-甘油-3-羟基磷酰基-氧基)-乙胺(MTP-PE)；水包油乳液，诸如MF59(美国专利第6,299,884号)(含有5%角鲨烯、0.5%聚山梨醇酯80及0.5%Span85(视情况含有不同量的MTP-PE)，使用微流化器(诸如110Y型微流化器(Microfluidics,Newton,MA))配制成亚微颗粒)、及SAF(含有10%角鲨烯、0.4%聚山梨醇酯80、5%普洛尼克(pluronic)嵌段聚合物L121及thr-MDP，微流化成次微乳液或涡旋以产生粒径较大的乳液)；不完全弗氏佐剂(IFA)；铝盐(明矾)，诸如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝；爱菲金(Amphigen)；阿夫立定；L121/角鲨烯；D-丙交酯-聚丙交酯/糖苷；普洛尼克多元醇；经杀死的博德特氏菌(Bordetella)；皂苷，诸如描述于美国专利第5,057,540号中的StimulonTMQS-21(Antigenics,Framingham,MA.)、描述于美国专利第5,254,339号中的ISCOMATRIX(CSL Limited,Parkville,Australia)、及免疫刺激复合物(ISCOMATRIX)；结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)；细菌脂多糖；合成多核苷酸，诸如含有CpG基元的寡核苷酸(例如美国专利第6,207,646号)；IC-31(Intercell AG,Vienna,Austria)，描述于欧洲专利第1,296,713号及第1,326,634号中；百日咳毒素(pertussis toxin)(PT)或其突变体、霍乱毒素或其突变体(例如美国专利第7,285,281号、第7,332,174号、第7,361,355号及第7,384,640号)；或大肠杆菌不耐热毒素(LT)或其突变体，具体而言LT-K63、LT-R72(例如美国专利第6,149,919号、第7,115,730号及第7,291,588号)。
产生非脂质化P2086抗原的方法
在一方面中，本发明涉及一种产生非丙酮酰化非脂质化ORF2086多肽的方法。该方法包括表达编码ORF2086多肽的核苷酸序列，其中与相应野生型序列比较，N端半胱氨酸缺失，且其中该核苷酸序列可操作地连接于能够在细菌细胞中表达的表达系统。举例而言，优选地，多肽具有SEQ IDNO:12；SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:14；SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:18；SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:20；SEQ IDNO:21所述的氨基酸序列，其中与相应野生型序列比较，在位置1处的半胱氨酸缺失。其它示例性多肽包括具有选自SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:64的氨基酸序列的多肽。该方法还包括纯化所述多肽。
在一些实施方案中，本发明提供一种产生可溶性非脂质化P2086抗原的方法，其包含以下步骤：将ORF2086变体核酸序列克隆至无脂质化控制序列的大肠杆菌表达载体中，用ORF2086表达载体转化大肠杆菌细菌，诱导表达及分离表达的P2086蛋白。在一些实施方案中，用IPTG诱导表达。
在一些实施方案中，ORF2086变体的N端Cys的密码子缺失。这些密码子的实例包括TGC。在一些实施方案中，ORF2086变体的N端Cys的密码子通过点诱变加以突变以产生Ala、Gly或Val密码子。在一些实施方案中，添加Ser及Gly密码子至ORF2086变体的N端尾部以延伸紧靠N端Cys的下游的Gly/Ser茎部。在一些实施方案中，Gly/Ser茎部内的Gly及Ser残基的总数为至少7、8、9、10、11或12。在一些实施方案中，N端Cys的密码子缺失。在一些实施方案中，N端7、8、9、10、11或12个残基为Gly或Ser。
在一些实施方案中，非脂质化ORF2086变体的N端尾部的密码子通过点诱变加以优化。在一些实施方案中，非脂质化ORF2086变体的N端尾部经优化以匹配B09变体的N端尾部。在一些实施方案中，ORF2086变体的N端尾部的密码子通过点诱变加以优化以使编码ORF2086变体的第5个氨基酸的密码子与SEQ ID NO:8的核苷酸13-15100%相同且编码ORF2086变体的第13个氨基酸的密码子与SEQ ID NO:8的核苷酸37-39100%相同。在一些实施方案中，非脂质化ORF2086变体的N端尾部经优化以使5'45个核酸与SEQ ID NO:8的核酸1-45100%相同。在一些实施方案中，非脂质化ORF2086变体的N端尾部经优化以使5'42个核酸与SEQ ID NO:8的核酸4-45100%相同。在一些实施方案中，非脂质化ORF2086变体的N端尾部经优化以使5'39个核酸与SEQ ID NO:8的核酸4-42100%相同。在一些实施方案中，相比于SEQ ID NO:18的氨基酸1-15，非脂质化P2086变体的N端尾部包含至少一个氨基酸取代。在一些实施方案中，相比于SEQ IDNO:18的氨基酸1-15，非脂质化P2086变体的N端尾部包含两个氨基酸取代。在一些实施方案中，相比于SEQ ID NO:18的氨基酸2-15，非脂质化P2086变体的N端尾部包含至少一个氨基酸取代。在一些实施方案中，相比于SEQ ID NO:18的氨基酸2-15，非脂质化P2086变体的N端尾部包含两个氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代为保守性氨基酸取代。
在一些实施方案中，非脂质化变体的密码子已出于表达增加的目的而优化。密码子优化在本领域中为已知的。参见例如Sastalla等人,Applied andEnvironmental Microbiology,第75卷(7):2099-2110(2009)及Coleman等人,Science,第320卷:1784(2008)。在一些实施方案中，密码子优化包括使氨基酸序列的密码子利用与所选宿主生物体的密码子频率匹配，同时包括及/或排除特定DNA序列。在一些实施方案中，密码子优化另外包括使相应二级mRNA结构最小以降低转译障碍。在一些实施方案中，N端尾部已经密码子优化以包含SEQ ID NO:28、30、32及34的任一者。在一些实施方案中，Gly/Ser茎部已经密码子优化以包含SEQ ID NO:28、30、32及34的任一者。
为了更佳理解本发明，阐述以下实例。实例仅出于说明的目的且不应解释为限制本发明范畴。
免疫原性组合物制剂
在某些实施方案中，本发明的免疫原性组合物另外包含佐剂、缓冲剂、低温保护剂、盐、二价阳离子、非离子去污剂、自由基氧化抑制剂、稀释剂或载体的至少一种。
除多种脑膜炎奈瑟球菌蛋白抗原及荚膜多糖-蛋白质缀合物之外，本发明的免疫原性组合物亦可另外包含一或多种防腐剂。FDA要求多次剂量小瓶中的生物产品含有防腐剂，仅有少数情况例外。含有防腐剂的疫苗产品包括含有苄索氯铵(炭疽(anthrax))、2-苯氧乙醇(DTaP、HepA、Lyme、脊髓灰质炎(Polio)(非经肠))、苯酚(肺炎(Pneumo)、伤寒(Typhoid)(非经肠)、牛痘)及硫柳汞(DTaP、DT、Td、HepB、Hib、流行性感冒、JE、脑膜炎(Mening)、肺炎、狂犬病(Rabies))的疫苗。核准用于可注射药物的防腐剂包括例如氯丁醇、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、2-苯氧乙醇、苄索氯铵、氯化苯甲烃铵、苯甲酸、苯甲醇、苯酚、硫柳汞及硝酸苯汞。
本发明制剂可另外包含以下一或多种：缓冲剂、盐、二价阳离子、非离子去污剂、低温保护剂(诸如糖)及抗氧化剂(诸如自由基清除剂或螯合剂)或其任何多重组合。任一组分(例如螯合剂)的选择可决定另一组分(例如清除剂)是否合乎需要。经配制以供施用的最终组合物应无菌及/或无热原质。本领域技术人员可凭经验确定这些及其它组分的哪些组合将最佳包括在含防腐剂的本发明免疫原性组合物中，此视多种因素而定，诸如所需的特定储存及施用条件。
在某些实施方案中，可与非经肠施用相容的本发明制剂包含一或多种生理学上可接受的缓冲剂，其选自(但不限于)Tris(氨基丁三醇)、磷酸盐、乙酸盐、硼酸盐、柠檬酸盐、甘氨酸、组氨酸及丁二酸盐。在某些实施方案中，制剂经缓冲至约6.0至约9.0、优选约6.4至约7.4的pH值范围内。
在某些实施方案中，可能需要调整本发明的免疫原性组合物或制剂的pH值。可使用本领域中的标准技术调整本发明制剂的pH值。制剂的pH值可调整至介于3.0与8.0之间。在某些实施方案中，制剂的pH值可介于或可调整至介于3.0与6.0、4.0与6.0、或5.0与8.0之间。在其它实施方案中，制剂的pH值可为或可调整为约3.0、约3.5、约4.0、约4.5、约5.0、约5.5、约5.8、约6.0、约6.5、约7.0、约7.5或约8.0。在某些实施方案中，pH值可为或可调整为以下范围：4.5至7.5、或4.5至6.5、5.0至5.4、5.4至5.5、5.5至5.6、5.6至5.7、5.7至5.8、5.8至5.9、5.9至6.0、6.0至6.1、6.1至6.2、6.2至6.3、6.3至6.5、6.5至7.0、7.0至7.5、或7.5至8.0。在一特定实施方案中，制剂的pH值为约5.8。
在某些实施方案中，可与非经肠施用相容的本发明制剂包含浓度在约0.1mM至约10mM的范围内，其中优选至多约5mM的一或多种二价阳离子，包括(但不限于)MgCl2、CaCl2及MnCl2。
在某些实施方案中，可与非经肠施用相容的本发明制剂包含一或多种盐，包括(但不限于)氯化钠、氯化钾、硫酸钠及硫酸钾，其以在非经肠施用后对对象而言为生理学上可接受的离子强度存在且以产生所选离子强度或同渗浓度的最终浓度包括在最终制剂中。制剂的最终离子强度或重量摩尔渗透浓度将由多种组分，例如来自缓冲化合物及其它非缓冲盐的离子决定。一种优选盐NaCl是以至多约250mM的范围存在，其中盐浓度经选择以补充其它组分(例如糖)以使得制剂的最终总同渗浓度可与非经肠施用(例如肌肉内或皮下注射)兼容且将促进免疫原性组合物制剂的免疫原性组分在不同温度范围的长期稳定性。无盐制剂将容许增加范围的一或多种所选低温保护剂以维持所要最终同渗浓度程度。
在某些实施方案中，可与非经肠施用相容的本发明制剂包含一或多种低温保护剂，其选自(但不限于)二糖(例如乳糖、麦芽糖、蔗糖或海藻糖)及多羟基烃(例如半乳糖醇、甘油、甘露糖醇及山梨糖醇)。
在某些实施方案中，制剂的同渗浓度在约200mOs/L至约800mOs/L的范围内，其中优选范围为约250mOs/L至约500mOs/L、或约300mOs/L至约400mOs/L。无盐制剂可含有例如约5%至约25%蔗糖、且优选约7%至约15%、或约10%至约12%蔗糖。或者，无盐制剂可含有例如约3%至约12%山梨糖醇、且优选约4%至7%、或约5%至约6%山梨糖醇。若添加诸如氯化钠的盐，则蔗糖或山梨糖醇的有效范围相对减小。这些及其它此类同渗质量摩尔浓度及同渗浓度考虑事项完全在本领域的技能内。
在某些实施方案中，可与非经肠施用相容的本发明制剂包含一或多种自由基氧化抑制剂及/或螯合剂。多种自由基清除剂及螯合剂在本领域中为已知的且适用于本文所述的制剂及使用方法。实例包括(但不限于)乙醇、EDTA、EDTA/乙醇组合、三乙醇胺、甘露糖醇、组氨酸、甘油、柠檬酸钠、六磷酸肌醇酯、三聚磷酸盐、抗坏血酸/抗坏血酸盐、丁二酸/丁二酸盐、苹果酸/顺丁烯二酸盐、甲碘酸去铁铵(desferal)、EDDHA及DTPA、及以上两者或两者以上的各种组合。在某些实施方案中，至少一种非还原性自由基清除剂可以有效增强制剂的长期稳定性的浓度添加。一或多种自由基氧化抑制剂/螯合剂亦可以各种组合，诸如清除剂与二价阳离子组合添加。螯合剂的选择将决定是否需要添加清除剂。
在某些实施方案中，可与非经肠施用相容的本发明制剂包含一或多种非离子表面活性剂，包括(但不限于)聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯、聚山梨醇酯-80(吐温80(Tween80))、聚山梨醇酯-60(吐温60)、聚山梨醇酯-40(吐温40)及聚山梨醇酯-20(吐温20)、聚氧乙烯烷基醚(包括(但不限于)Brij58、Brij35)、以及其它非离子表面活性剂，诸如曲通X-100(Triton X-100)、曲通X-114、NP40、司盘85(Span85)及普洛尼克系列的非离子表面活性剂(例如普洛尼克121)，其中优选组分为约0.001%至约2%(其中优选至多约0.25%)的浓度的聚山梨醇酯-80或约0.001%至1%(其中优选至多约0.5%)的浓度的聚山梨醇酯-40。
在某些实施方案中，本发明制剂包含适于非经肠施用的一或多种其它稳定剂，例如包含至少一个硫醇基(-SH)的还原剂(例如半胱氨酸、N-乙酰基半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、硫代乙醇酸钠、硫代硫酸盐、单硫代甘油或其混合物)。或者或视情况，本发明的含防腐剂的免疫原性组合物制剂可进一步通过自储存容器移除氧气、使制剂避光(例如通过使用琥珀色玻璃容器)来加以稳定。
本发明的含防腐剂的免疫原性组合物制剂可包含一或多种医药学上可接受的载体或赋形剂，其包括自身不会诱导免疫应答的任何赋形剂。适合赋形剂包括(但不限于)大分子(诸如蛋白质、糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物)、蔗糖(Paoletti等人,2001,Vaccine,19:2118)、海藻糖、乳糖及脂质聚集体(诸如油滴或脂质粒)。这些载体为本领域技术人员所熟知。医药学上可接受的赋形剂例如于Gennaro,2000,Remington:TheScience and Practice of Pharmacy,第20版,ISBN:0683306472中论述。
本发明组合物可冻干或呈水性形式，亦即溶液或悬浮液。液体制剂宜直接自其包装形式施用且因此对于注射而言为理想的而无需如另外为本发明的冻干组合物所需的于水性介质中重建。
可通过非经肠施用(肌肉内、腹膜内、皮内、皮下、静脉内、或向组织间隙施用)；或通过经直肠、经口、经阴道、经表面、经皮、经鼻内、经眼、经耳、经肺或其它经粘膜施用来向对象直接传递本发明的免疫原性组合物。在一优选实施方案中，非经肠施用是通过肌肉内注射，例如对对象的大腿或上臂进行肌肉内注射来达成。注射可经由针(例如皮下注射针)达成，但或者可使用无针注射。典型肌肉内剂量为0.5mL。本发明组合物可制备成各种形式，例如对于注射而言制备成液体溶液或悬浮液。在某些实施方案中，组合物可制备成供经肺施用(例如于吸入器中)的散剂或喷雾剂。在其它实施方案中，组合物可制备成栓剂或子宫托，或对于经鼻、经耳或经眼施用而言，例如制备成喷雾剂、滴剂、凝胶或散剂。
特定免疫原性组合物的组分的最佳量可通过涉及观测对象的适当免疫应答的标准研究来确定。在初始接种之后，对象可接受适当间隔的一或数次加强免疫。
包装及剂型
本发明的免疫原性组合物可以单位剂量或多剂量形式(例如2个剂量、4个剂量、或4个以上剂量)包装。对于多剂量形式，小瓶通常但并非必定优于预填充注射器。适合多剂量形式包括(但不限于)：每个容器2至10个剂量，每剂量0.1至2mL。在某些实施方案中，剂量为0.5mL剂量。参见例如国际专利申请案WO2007/127668，其以引用的方式并入本文中。
组合物可提供于小瓶或其它适合储存容器中，或可提供于预填充传递装置中，例如单一或多组分注射器，其可能连同或不连同针一起提供。注射器通常但无需必定含有单一剂量的本发明的含防腐剂的免疫原性组合物，但亦设想多次剂量预填充注射器。同样，小瓶可包括单一剂量但或者可包括多次剂量。
有效剂量体积可按常规确立，但注射用组合物的典型剂量具有0.5mL的体积。在某些实施方案中，剂量经配制以用于向人类对象施用。在某些实施方案中，剂量经配制以用于向成人、少年、青少年、婴儿或幼儿(亦即不超过1岁)人类对象施用且在优选实施方案中可通过注射施用。
本发明的液体免疫原性组合物亦适于重建以冻干形式提供的其它免疫原性组合物。当免疫原性组合物欲用于此临用时重建时，本发明提供一种具有两个或两个以上小瓶、两个或两个以上备用填充注射器、或一或多个小瓶及备用填充注射器的试剂盒，其中注射器的内含物用于在注射的前重建小瓶的内含物，或反的亦然。
或者，本发明的免疫原性组合物可冻干及重建，例如使用本领域中熟知的用于冷冻干燥的众多方法的一以形成干燥、形状规则(例如球状)的粒子，诸如微粒或微球，其具有可通过改变用于制备该等粒子的精确方法加以选择并控制的粒子特征，诸如平均直径尺寸。免疫原性组合物可另外包含可视情况与各别干燥、形状规则(例如球状)的粒子(诸如微粒或微球)一起制备或含于该等粒子中的佐剂。在这些实施方案中，本发明另外提供一种免疫原性组合物试剂盒，其包含包括稳定干燥免疫原性组合物，视情况另外包含一或多种本发明防腐剂的第一组分；及包含用于重建该第一组分的无菌水溶液的第二组分。在某些实施方案中，水溶液包含一或多种防腐剂，且可视情况包含至少一种佐剂(参见例如WO2009/109550(以引用的方式并入本文中))。
在另一实施方案中，多剂量形式的容器是选自由(但不限于)以下组成的组的一或多者：一般实验室玻璃器皿、烧瓶、烧杯、量筒、发酵器、生物反应器、配管(tubing)、导管(pipe)、袋、瓶、小瓶、小瓶扣合物(例如橡胶塞、螺旋帽盖)、安瓿、注射器、双腔室或多腔室注射器、注射器塞、注射器柱塞、橡胶扣合物、塑料扣合物、玻璃扣合物、药筒及抛弃式笔及其类似物。本发明的容器不受制造材料限制且包括各种材料，诸如玻璃、金属(例如钢、不锈钢、铝等)及聚合物(例如热塑性塑料、弹性体、热塑性弹性体)。在一特定实施方案中，该形式的容器为具有丁基塞的5mL Schott1型玻璃小瓶。本领域技术人员将了解，上述形式决不为穷举性，而仅充当对技术人员关于可用于本发明的诸多形式的导则。预期可用于本发明中的其它形式可见于实验室设备供货商及制造商，诸如United States Plastic Corp.(Lima,OH),VWR的公开目录中。
实施例
实施例1：实验程序
血清杀细菌测定
食蟹猕猴(Cynomolgus macaques)(n=5只/组)用吸附于AlPO4的rLP2086或rP2086(A+B)蛋白肌肉内免疫。在第0、4及24周对动物接种，且在第0、4、6及26周测定ORF2086特异性IgG及功能性抗体效价。针对rLP2086A及rLP2086B测定血清ORF2086特异性IgG效价。
通过血清杀细菌测定(SBA)检查功能性抗体针对表达序列与疫苗中所含序列同源或异源的LP2086的脑膜炎奈瑟球菌菌株的效价。
使用利用人类补体进行的SBA测定经ORF2086疫苗免疫的猕猴或兔中的血清杀细菌抗体。兔免疫血清或猕猴免疫血清经热灭活以移除固有补体活性，随后在96孔微量滴定板中于含Ca2+及Mg2+的杜尔贝科氏(Dulbecco's)PBS(D-PBS)中1:2连续稀释以测试针对脑膜炎奈瑟球菌菌株的血清杀细菌活性。测定中使用的细菌在补充有凯洛格氏(Kellogg's)补充剂的GC培养基(GCK)中生长且通过650nm下的光学密度监测。在0.50-0.55的最终OD650下收集细菌以用于测定中，于D-PBS中稀释，且添加1000-3000个CFU至含20%人类补体的测定混合物中。
无可检测杀细菌活性的人类血清用作外源性补体源。测试补体源针对各个别测试菌株的适合性。只有当未添加免疫血清的对照中存活的细菌数目>75%时才使用补体源。需要10个独特补体源来进行此研究中描述的SBA。
在37℃及5%CO2下孵育30分钟之后，添加D-PBS至反应混合物中且等分试样转移至填充有50%GCK培养基的微过滤板中。微过滤板经过滤，在37℃及5%CO2下孵育过夜，且染色并定量微群落。血清杀细菌效价定义为相比于无免疫血清的对照孔中的CFU，使CFU降低50%的血清稀释度的内插倒数。SBA效价定义为在37℃下孵育30分钟之后使细菌计数减少50%的测试血清的内插稀释度的倒数。若相比于相应免疫前血清，ORF2086免疫血清的SBA效价上升4倍或4倍以上，则确立对ORF2086免疫血清的杀伤作用敏感。对在起始稀释度下针对测定菌株为阴性的血清赋予为测定检测限(亦即4)的一半的效价。
实施例2：克隆及表达非脂质化ORF2086变体
对应于来自脑膜炎奈瑟球菌菌株M98250771(A05)的残基27-286的成熟P2086氨基酸序列最初由自基因组DNA进行PCR扩增而产生。正向引物，序列为TGCCATATGAG CAGCGGAAGCGGAAG(SEQ ID NO:22)，粘接至5'序列且含有NdeI克隆位点。反向引物，序列为CGGATCCCTACTGTTTGCCGGCGATGC(SEQ ID NO:23)，粘接至基因的3'端且含有终止密码子TAG，继的以限制位点BamHI。799bp扩增片段首先克隆至中间载体PCR2.1(Invitrogen,Carlesbac,CA)中。此质粒用NdeI及BamHI裂解，且连接至已用NdeI及BamHI裂解的表达载体pET9a(Novagen,Madison,WI)中。所得载体pLA100(其包括SEQ ID NO:54)表达来自菌株M98250771的无将存在于脂质化蛋白质中的N端半胱氨酸的成熟亚家族A05P2086(参见SEQID NO:13(其中在位置1处的N端Cys缺失)或SEQ ID NO:55)。使用BLR(DE3)大肠杆菌宿主菌株[F-ompT hsdSB(rB-mB-)gal dcmΔ(srl-recA)306::Tn10(TetR)(DE3)](Novagen)来获得fHBP的表达。
使用相同克隆步骤来制备B02、B03、B09、B22、B24、B44、A04、A12及A22N端Cys缺失的变体。亦通过此相同方法，使用亦包括Cys密码子(例如SEQ ID NO:1-11的第一密码子)的正向引物制备含有N端Cys的变体。基于本文提供的序列，本领域技术人员将能够设计这些变体的各自的正向引物及反向引物。举例而言，使用以下引物来扩增B44非脂质化变体，随后使用NdeI及BlpI克隆至pET9a中。
表1
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结果
非脂质化质粒构建体得以强烈表达，但非脂质化蛋白变体在N端Cys残基处经丙酮酰化。参见实施例8及9，其描述例如一种表达构建体的方法。为了克服此丙酮酰化，使N端Cys密码子缺失。参见例如实施例10。然而，缺失N端Cys使A22及B22变体的表达消除。参见例如图4。然而，尽管缺失N端Cys残基，但A05、B01及B44变体仍然得以表达。参见例如SEQID NO:13(A05)，其中在位置1处的N端Cys缺失；SEQ ID NO:35(B01N端)；及SEQ ID NO:21(B44)，其中在位置1处的N端Cys缺失。参见例如图5。此外，非脂质化B09变体的表达不受N端Cys残基缺失的影响。参见例如实施例4。
实施例3：Gly/Ser茎部对非脂质化变体表达的影响
为了确定A05、B01及B44变体在不存在N端Cys下表达而A22及B22变体却不表达的原因，将这些变体的序列进行比对。A05、B01及B44变体皆具有一系列延伸的10或11个Gly及Ser残基(亦即Gly/Ser茎部)紧随于N端Cys之后。然而，A22及B22变体仅具有由6个Gly及Ser残基组成的Gly/Ser茎部。因此，A22及B22变体的Gly/Ser茎部通过插入额外Gly及Ser残基得以扩展。
通过实施例2中描述的方法，使用编码具有10或11个Gly及Ser残基的Gly/Ser茎部的正向引物制备长Gly/Ser茎部变体。
N端Cys缺失的长Gly/Ser茎部(10-11个Gly/Ser残基)A22及B22变体显示相比于N端Cys缺失的A22及B22短Gly/Ser茎部(6个Gly/Ser残基)变体表达增加。然而，相比于A05、B01及B44变体表达量，这些表达量仍然较低。
实施例4：密码子优化
非脂质化B09变体的表达不受N端Cys残基缺失的影响(参见SEQ IDNO:18(其中在位置1处的半胱氨酸缺失)或SEQ ID NO:49)。参见例如图6。B09变体的序列评估说明B09变体具有由6个Gly及Ser残基组成的Gly/Ser茎部，与A22及B22变体的Gly/Ser茎部类似。实际上，B09及A22变体的N端尾部在氨基酸层面上相同。然而，B09及A22变体(分别为SEQ ID NO:53及42)的N端尾部在核酸层面上有以下2个核酸不同：SEQ ID NO:8的核酸15及39。参见例如图6。B22变体的N端尾部的前14个氨基酸与B09及A22变体相同，且B22变体的N端尾部仅在第15个氨基酸处不同。B22变体的核酸1-42与A22变体的核酸1-42相同。若非最佳比对时在核酸15及39处存有差异，否则B22变体(参见SEQ ID NO:52)的核酸1-42与B09(参见SEQ ID NO:53)的核酸1-42相同。因此，B22变体在SEQ ID NO:8的氨基酸15及39处不同于B09变体。上一句有打字错误且应陈述为B22变体在SEQ ID NO:8的核酸15及39处不同于B09变体。
为了确定核酸差异是否影响B09变体相比于A22及B22变体的表达量，通过点突变使A22及B22变体突变以将核酸15及39并入Gly5及Gly13的相应密码子中。并入这些沉默核酸突变使A22及B22N端Cys缺失变体的表达显著增加至与N端Cys缺失B09变体类似的程度。参见例如图7。因此，密码子优化以匹配B09变体可增加N端Cys缺失的非脂质化P2086变体的表达。
非脂质化变体序列的进一步分析表明Gly/Ser茎部中的用以改良表达的其它密码子优化。因此，通过实施例2的方法，使用包含这些密码子优化序列的正向引物构建其它非脂质化变体。用于产生优化Gly/Ser茎部的正向引物包括任何以下序列：
ATGAGCTCTGGAGGTGGAGGAAGCGGGGGCGGTGGA(SEQ ID NO:28)
  M  S   S   G   G  G   G   S   G   G  G   G(SEQ ID NO:29)
ATGAGCTCTGGAAGCGGAAGCGGGGGCGGTGCA(SEQ ID NO:30)
  M  S  S  G  S  G  S  G  G  G  G(SEQ ID NO:31)
ATGAGCTCTGGAGGTGGAGGA(SEQ ID NO:32)
  M  S  S  G  G  G  G(SEQ ID NO:33)
ATGAGCAGCGGGGGCGGTGGA(SEQ ID NO:34)
  M  S  S  G  G  G  G(SEQ ID NO:33)
实施例5：免疫原性组合物制剂优化
ISCOMATRIX配制的疫苗产生快速免疫应答，使得为达成如血清杀细菌测定中所量测的4倍以上反应率所需的剂量数降低。各组5只恒河猴(rhesus macaques)用二价非脂质化rP2086疫苗的不同制剂免疫。疫苗包括非丙酮酰化非脂质化A05变体(SEQ ID NO:13(其中在位置1处的N端Cys缺失)或由SEQ ID NO:54编码的SEQ ID NO:55)及非丙酮酰化非脂质化B44变体(SEQ ID NO:21(其中在位置1处的N端Cys缺失)或由SEQ ID NO:51编码的SEQ ID NO:44)。佐剂单位如下：AlPO4为250mcg，ISCOMATRIX介于10与100mcg之间。表2-5中所示的AlPO4的佐剂单位是以毫克单位展示且因此与250mcg形成对比，展示为0.25(毫克)。
免疫方案为0、4及24周，在0、4、6及26周采血。对于任何组，在第1剂量后，SBA效价无增加。在第2剂量后，对于含有ISCOMATRIX佐剂的制剂，观测到SBA效价及如通过SBA效价相比于基线值增加4倍所确定的反应者数目增加。表2及3分别提供所观测到的针对fHBP亚家族A及B菌株的SBA GMT。ISCOMATRIX制剂针对A及B亚家族菌株的SBAGMT分别为观测到的AlPO4制剂的SBA GMT的3-19及4-24倍。在第3剂量后亦观测到ISCOMATRIX制剂针对fHBP亚家族A及B菌株的效价增强，相比于AlPO4制剂分别为13-95及2-10倍。如通过SBA效价相比于基线值增加4倍或4倍以上所确定的反应者比率的分析揭示类似趋势(表4及5)。
Figure BDA00002897206200481
Figure BDA00002897206200491
Figure BDA00002897206200494
实施例6：由脂质化及非脂质化变体赋予的免疫保护
如通过SBA所量测，重组表达的非脂质化P2086变体(B44)会诱导针对代表不同fHBP变体(约85%至约<92%相同性)LP2086序列的菌株的广泛保护。这些反应率是对于与AlPO4一起配制的非脂质化疫苗获得。参见表6，其展示由二价fHBP疫苗产生的对亚家族B fHBP MnB菌株的SBA反应率。非脂质化疫苗(在“脂质化”栏下由“-”表示)包括非丙酮酰化非脂质化A05变体(SEQ ID NO:13(其中在位置1处的N端Cys缺失)或由SEQ ID NO:54编码的SEQ ID NO:55)及非丙酮酰化非脂质化B44变体(SEQ ID NO:21(其中在位置1处的N端Cys缺失)或由SEQ ID NO:51编码的SEQ ID NO:44)。
或者，如由SBA效价所量测，重组表达的非脂质化P2086变体(B44)诱导的针对具有类似(>92%相同性)及不同(<92%相同性)LP2086序列的菌株的免疫应答大于脂质化变体(B01)。观测到含有非脂质化rP2086B44的疫苗相比于脂质化rLP2086B01疫苗具有较高反应率(如通过SBA效价相对于基线值增加4倍或4倍以上所确定)(表6)。
根据表6，非脂质化B44为用于提供针对多种LP2086变体菌株的广泛作用范围(例如引发针对多种LP2086变体菌株的杀细菌抗体)的组合物中fHBP的优选亚家族B组分。
意外地，本发明者注意到LP2086B09变体菌株特别不可能对于异源(非B09)ORF2086多肽具有良好SBA反应率。具体而言，本发明者发现就表6中描述的A05/B44免疫原性组合物引发杀细菌抗体所针对的测定菌株而言，LP2086B09为例外。因此，在一优选实施方案中，本发明的免疫原性组合物包括B09多肽，具体而言在包括一种以上ORF2086亚家族B多肽的组合物的情形下。在一优选实施方案中，包括非脂质化B44的免疫原性组合物包括非脂质化B09多肽。
Figure BDA00002897206200511
实施例7：B44及B09变体的密码子优化
尽管先前实施例中达成的表达量对于许多应用而言已足够，但进一步优化合乎需要，因此制备并测试在蛋白质全长范围内含有其它密码子优化的大肠杆菌表达构建体。发现一种用于表达无Cys的B44蛋白的此类改良序列为SEQ ID NO:43所述的核酸序列。如实施例9中所示，相比于未经优化的野生型序列的表达，含有SEQ ID NO:43的表达构建体显示表达增强。
通过将来自以上优化B44(SEQ ID NO:43)的密码子变化应用于B09(SEQ ID NO:48)来改良N端Cys缺失的B09蛋白的表达。为了产生优化B09序列，首先将B44优化DNA序列(SEQ ID NO:43)与B09等位基因的DNA序列(SEQ ID NO:48)比对。B09等位基因的整个非脂质化编码序列(SEQ ID NO:48)经优化以反映在B44优化等位基因(SEQ ID NO:43)中所见的密码子变化，无论什么情况下B44(SEQ ID NO:44)与B09(SEQ ID NO:49)之间的氨基酸皆相同。改变B09等位基因中对应于B09等位基因与B44等位基因之间的相同氨基酸的密码子序列以反映B44优化序列(SEQ ID NO:43)中使用的密码子。未改变B09DNA序列中B09(SEQ ID NO:49)与B44(SEQ ID NO:44)之间不同的氨基酸的密码子序列。
另外，非脂质化B44氨基酸序列(SEQ ID NO:44)在其N端含有2个连续丝氨酸-甘氨酸重复序列(S-G-G-G-G)(SEQ ID NO:56)(亦参见SEQ ID NO:44的氨基酸2至6)，而B09等位基因在N端仅含有一个丝氨酸-甘氨酸重复(参见SEQ ID NO:49的氨基酸2至6及氨基酸7至11)。在B44的N端处的2个丝氨酸-甘氨酸重复(SEQ ID NO:44的氨基酸2至6及氨基酸7至11)亦使用不同密码子(参见SEQ ID NO:43的核苷酸4至18及核苷酸19至33)，且将优化B44丝氨酸-甘氨酸重复的不同组合(例如SEQ ID NO:43的核苷酸4至18、或SEQ ID NO:43的核苷酸19至33，或其组合)应用于B09DNA序列(SEQ ID NO:48，例如应用于SEQ ID NO:48的核苷酸4至18)以检查对重组蛋白表达的影响。
构建3种不同优化B09形式：SEQ ID NO:45含有来自优化B44的2个丝氨酸-甘氨酸重复(GS1及GS2)(SEQ ID NO:43的核酸4至33)，SEQ IDNO:46含有GS1(SEQ ID NO:43的核酸4至18)，且SEQ ID NO:47含有GS2(SEQ ID NO:43的核酸19至33)。所有以上密码子优化的序列的DNA皆使用化学技术中的标准加以化学合成。所得DNA克隆至适当质粒表达载体中且测试在大肠杆菌宿主细胞中的表达，如实施例8及9中所述。
实施例8：表达ORF2086B09变体的方法
大肠杆菌K-12菌株(野生型W3110(CGSC4474)的衍生物，缺失recA、fhuA及araA)的细胞用包括SEQ ID NO:45的质粒pEB063、包括SEQ ID NO:46的pEB064、包括SEQ ID NO:47的质粒pEB065、或包括SEQ ID NO:48的质粒pLA134转化。对K-12菌株进行的优选修饰有助于达成发酵目的但不为表达蛋白质所需。
将细胞接种至葡萄糖-盐确定培养基中。在37℃下孵育8小时之后，应用线性葡萄糖补料且继续再孵育3小时。添加异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至培养物中以达到最终浓度0.1mM，随后在37℃下孵育12小时。通过在16,000×g下离心10分钟收集细胞且通过添加来自LiencoTechnologies(St.Louis,MO)的Easy-LyseTM细胞溶解试剂盒''及上样缓冲液溶解。通过SDS-PAGE凝胶的库马斯(Coomassie)染色及/或蛋白印迹分析，用扫描密度计进行定量来分析澄清溶解产物中B09的表达。扫描密度测定术的结果在下表7中：
Figure BDA00002897206200521
实施例9：表达ORF2086B44变体的方法
大肠杆菌B菌株(BLR(DE3)，Novagen)的细胞用包括SEQ ID NO:51的质粒pLN056转化。大肠杆菌K-12菌株(野生型W3110的衍生物)的细胞用包括SEQ ID NO:43的质粒pDK087转化。将细胞接种至葡萄糖-盐确定培养基中。在37℃下孵育8小时之后，应用线性葡萄糖补料且继续再孵育3小时。添加异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至培养物中以达到最终浓度0.1mM，随后在37℃下孵育12小时。通过在16,000×g下离心10分钟收集细胞且通过添加来自Lienco Technologies(St.Louis,MO)的Easy-LyseTM细胞溶解试剂盒''及上样缓冲液溶解。通过SDS-PAGE凝胶的库马斯染色及/或蛋白印迹分析，用扫描密度计进行定量来分析上清液中B09的表达。扫描密度测定术的结果在下表8中：
Figure BDA00002897206200531
实施例10：丙酮酰化
本实施例说明当于例如大肠杆菌中表达时，非脂质化ORF2086蛋白的N端Cys残基可丙酮酰化。
使用反相高效液相层析(RP-HPLC)监测产生变体A05(SEQ ID NO:13)及B44(SEQ ID NO:21)期间的异源蛋白质累积。此分离与四极飞行时间质谱仪(QTOF-MS)联合以提供一种监测产物相关变体的形成的手段。
在大肠杆菌B及/或K-12宿主细胞中表达之后，由这些发酵物产生的产物经历纯化程序，在此期间观测到产物修饰。质谱解回旋表征变体相比于A05及B44的天然产物(分别为27640及27572Da)，展现+70Da的质量变化。
公开的文献指示+70Da质量变化先前已在蛋白质中观测到且已归因于氨基端残基的丙酮酰化。
使用质谱裂解数据(MS/MS)确认丙酮酸基的存在及位置。资料指示修饰位于A05及B44的氨基端半胱氨酸残基，亦即在位置1处的氨基酸上。对于A05，相比于A05多肽(SEQ ID NO:13)的总数，丙酮酰化多肽的百分比为约30%。对于B44，相比于B44多肽(SEQ ID NO:21)的总数，丙酮酰化多肽的百分比为约25%。
当纯化不含有氨基端半胱氨酸的A05(SEQ ID NO:13(其中在位置1处的N端Cys缺失)或SEQ ID NO:55)及B44变体(SEQ ID NO:21(其中在位置1处的N端Cys缺失)或SEQ ID NO:44)时，无可检测的丙酮酰化(+70Da)。
实施例11：单独及组合形式的B09及B44的免疫原性
5-10组恒河猴用与每剂量250mcg AlPO4一起配制的B09变体(由SEQID NO:48编码的SEQ ID NO:49)或B44变体(由SEQ ID NO:43编码的SEQID NO:44)、或A05、B09及B44(分别为SEQ ID NO:55、由SEQ ID NO:48编码的SEQ ID NO:49、及由SEQ ID NO:43编码的SEQ ID NO:44)免疫。在第0、4及8周经由肌肉内途径用如表9及10中所列呈单独或组合形式的10mcg各非脂质化fHBP对猴接种。第0周血清样品与第12周血清样品两者均在SBA中针对具有亚家族A或亚家族B fHBP变体的MnB菌株加以分析。效价上升4倍的动物记录为反应者。测试的B44变体为优化构建体(SEQ ID NO:43)且在先前研究中观测到的该优化构建体B44疫苗(单独或与B09组合)的广泛反应率(上表)得以维持(表9)。单独B09疫苗(表10)亦可产生广泛交叉反应性免疫应答(表10)。
表9：在恒河猴中获得的非脂质化fHBP疫苗的反应率
Figure BDA00002897206200541
恒河猴(n=10)在第0、4及8周用如疫苗栏中所列呈单独或组合形式的与250mcg AlPO4一起配制的10mcg各非脂质化fHBP肌肉内免疫。第0周血清样品与第10周血清样品两者均在SBA中针对表中所列MnB菌株加以分析。效价上升4倍的动物记录为反应者。
表9指示例如相比于仅包括B44的组合物的交叉作用率(cross-coverage)，包括非丙酮酰化非脂质化B44、B09及A05的组合的组合物显示针对测试变体的交叉作用率较高。鉴于本申请(包括具体而言的表6与表9一起)中所示的结果，包括单独或组合形式的B44、B09及A05的组合物为本发明的优选实施方案。具体而言，揭示包括B44与B09两者的组合物。此组合物优选另外包括亚家族A多肽，诸如特别是A05。
表10：在恒河猴中获得的非脂质化fHBP B09疫苗的反应率
Figure BDA00002897206200551
恒河猴(n=5)在第0、4及8周用如疫苗栏中所列呈单独或组合形式的与250mcg AlPO4一起配制的10mcg各非脂质化fHBP肌肉内免疫。第0周血清样品与第10周血清样品两者均在SBA中针对表中所列MnB菌株加以分析。效价上升4倍的动物记录为反应者。
实施例12：由脂质化及非脂质化变体构建体赋予的免疫保护
自Charles River Canada获得的20只2.5-3.5kg的雌性纽西兰(NewZealand)白兔通过全细胞ELISA预先筛检且基于其针对代表fHBP变体B02(SEQ ID NO:16)及B44(SEQ ID NO:21)的测试菌株的低背景效价选择10只动物用于此研究(表11)。各组3个动物在第0、4及9周用与每0.5ml剂量50μg ISCOMATRIX一起配制的100μg各蛋白肌肉内免疫(表12)。组1用非脂质化B44(SEQ ID NO:44)接种。包括用与AlPO4(250mcg)一起配制的脂质化B01接种的对照组。在第0、4、9及10周对兔进行采血。制备来自第10周的个别血清且通过血清杀细菌测定针对来自fHBP B亚家族的多种血清群B脑膜炎奈瑟球菌菌株加以分析。
表11：研究中使用的兔
Figure BDA00002897206200552
表12
Figure BDA00002897206200561
免疫方案：第0、4、9周；采血方案：第0、4、9、10周
血清杀细菌测定(SBA)：对个别血清样品针对多种血清群B脑膜炎奈瑟球菌菌株进行基于微群落的血清杀细菌测定(SBA)(表13)。来自供体的人类血清适用作测定中测试的菌株的补体源。补体介导的抗体依赖性杀细菌效价经内插且表示为在测定中杀死50%脑膜炎奈瑟球菌细胞的测试血清的稀释度的倒数。测定的检测限为等于4的SBA效价。对<4的SBA效价赋予数值2。计算并比较相比于采血前血清中的效价，第10周血清中的SBA效价上升≥4倍。
如SBA中量测的血清杀细菌抗体活性为对抗脑膜炎奈瑟球菌疾病的保护作用的免疫代用物。通过SBA测定用非脂质化rfHBP进行免疫在兔中引发杀细菌抗体的能力。SBA通过模拟天然发生的补体介导的细菌溶解来量测血清样品中的抗体含量。通过SBA针对具有与B44疫苗同源的fHBP的菌株、及具有与B01疫苗密切相关的fHBP(B02)的菌株来分析自第10周收集的兔血清样品。如表14中所示，在第三次免疫之后1周(第10周)，所有血清样品皆显示针对两种测试菌株的杀细菌活性。(表14)。在纽西兰兔中，似乎非脂质化B44(SEQ ID NO:44)比非脂质化B01更具免疫原性。B44与B01处于同一子组(N4/N5)中。与iscomatrix佐剂一起配制的非脂质化B44(SEQ ID NO:44)产生的效价类似于与磷酸铝一起配制的脂质化B01。兔采血前血清显示大体上无预先存在的针对测试菌株的杀细菌活性。
表13：用重组非脂质化fHBP接种的纽西兰白兔中的针对fHBP亚家族B菌株的血清杀细菌活性
Figure BDA00002897206200562
实施例13：6种非脂质化因子H结合蛋白在纽西兰白兔中的免疫原性
各组5只兔用如表15中所述的非脂质化fHBP变体免疫。在0、4及9周施用疫苗。通过SBA针对具有同源及异源fHBP序列的菌株分析自第0及10周收集的兔血清样品。表15展示第三次免疫后的反应者百分比。在第三次免疫之后1周(第10周)，所有血清样品皆显示针对同源菌株以及来自相同fHBP亚家族的其它测试菌株的杀细菌活性。兔采血前血清显示大体上无预先存在的针对测试菌株的杀细菌活性。
表14：用重组非脂质化fHBP接种的纽西兰白兔中的第3剂量后的反应者百分比
Figure BDA00002897206200571
使用的MnB fHBP蛋白
Figure BDA00002897206200572
表14中的测试变体：
Figure BDA00002897206200573
本发明亦提供如以下条款中定义的以下实施方案：
C1.一种包含P2086多肽的免疫原性组合物，其中该P2086为B44、B02、B03、B22、B24、B09、A05、A04、A12或A22变体。
C2.一种包含P2086亚家族B多肽的免疫原性组合物，其中该P2086亚家族B多肽为B44、B02、B03、B22、B24或B09变体。
C3.如C2的免疫原性组合物，其另外包含P2086亚家族A多肽。
C4.如C3的免疫原性组合物，其中该P2086亚家族A多肽为A05、A04、A12或A22变体。
C5.如C1至4中任一项的免疫原性组合物，其中该组合物另外包含佐剂。
C6.如C5的免疫原性组合物，其中该佐剂是选自由以下组成的组：
a)铝佐剂；
b)皂苷
c)CpG核苷酸序列；及
d)a)、b)及c)的任何组合。
C7.如C6的免疫原性组合物，其中该铝佐剂是选自由以下组成的组：AlPO4、Al(OH)3、Al2(SO4)3及明矾。
C8.如C6或C7的免疫原性组合物，其中该铝浓度是介于0.125μg/ml与0.5μg/ml之间。
C9.如C8的免疫原性组合物，其中该铝浓度为0.25μg/ml。
C10.如C6至9中任一项的免疫原性组合物，其中该皂苷浓度是介于1μg/ml与250μg/ml之间。
C11.如C10的免疫原性组合物，其中该皂苷浓度是介于10μg/ml与100μg/ml之间。
C12.如C10的免疫原性组合物，其中该皂苷浓度为10μg/ml。
C13.如C10的免疫原性组合物，其中该皂苷浓度为100μg/ml。
C14.如C6至13中任一项的免疫原性组合物，其中该皂苷为QS-21或ISCOMATRIX。
C15.如C1至14中任一项的免疫原性组合物，其中该组合物在向对象施用多次剂量之后赋予引起对脑膜炎奈瑟球菌细菌的免疫原性反应的能力。
C16.如C15的免疫原性组合物，其中在向该对象施用2个剂量之后赋予对该脑膜炎奈瑟球菌细菌的该免疫原性反应。
C17.如C15的免疫原性组合物，其中在向该对象施用3个剂量之后赋予对该脑膜炎奈瑟球菌细菌的该免疫原性反应。
C18.一种赋予非脂质化P2086抗原以增加的免疫原性的组合物，其中该组合物包含皂苷及至少一种非脂质化P2086抗原。
C19.如C18的免疫原性组合物，其中该皂苷浓度是介于1μg/ml与250μg/ml之间。
C20.如C19的免疫原性组合物，其中该皂苷浓度是介于10μg/ml与100μg/ml之间。
C21.如C19的免疫原性组合物，其中该皂苷浓度为10μg/ml。
C22.如C19的免疫原性组合物，其中该皂苷浓度为100μg/ml。
C23.如C18至22中任一项的免疫原性组合物，其中该皂苷为QS-21或ISCOMATRIX。
C24.如C18至23中任一项的免疫原性组合物，其另外包含铝。
C25.如C24的免疫原性组合物，其中该铝浓度是介于0.125μg/ml与0.5μg/ml之间。
C26.如C25的免疫原性组合物，其中该铝浓度为0.25μg/ml。
C27.如C18至26中任一项的免疫原性组合物，其中该组合物在向对象施用多次剂量之后赋予对脑膜炎奈瑟球菌细菌的免疫原性反应。
C28.如C27的免疫原性组合物，其中在向该对象施用2个剂量之后赋予对该脑膜炎奈瑟球菌细菌的该免疫原性反应。
C29.如C27的免疫原性组合物，其中在向该对象施用3个剂量之后赋予对该脑膜炎奈瑟球菌细菌的该免疫原性反应。
C30.如C18至29中任一项的免疫原性组合物，其中该非脂质化P2086抗原为非脂质化P2086亚家族B多肽。
C31.如C30的免疫原性组合物，其中该非脂质化P2086亚家族B多肽为B44、B02、B03、B22、B24或B09变体。
C32.如C18至29中任一项的免疫原性组合物，其中该非脂质化P2086抗原为非脂质化P2086亚家族A多肽。
C33.如C32的免疫原性组合物，其中该非脂质化P2086亚家族A多肽为A05、A04、A12或A22变体。
C34.如C18至33中任一项的免疫原性组合物，其中该组合物包含至少两种非脂质化P2086抗原，其中该两种非脂质化P2086抗原为至少一种非脂质化P2086亚家族A多肽及至少一种非脂质化P2086亚家族B多肽。
C35.如C34的免疫原性组合物，其中该非脂质化P2086亚家族A多肽为A05变体且该非脂质化P2086亚家族B多肽为B44变体。
C36.如C34的免疫原性组合物，其中该非脂质化P2086亚家族A多肽为A05变体且该非脂质化P2086亚家族B多肽为B22变体。
C37.如C34的免疫原性组合物，其中该非脂质化P2086亚家族A多肽为A05变体且该非脂质化P2086亚家族B多肽为B09变体。
C38.一种赋予对象以针对脑膜炎奈瑟球菌细菌的免疫性的方法，其中该方法包含向该对象施用包含P2086亚家族B多肽的免疫原性组合物的步骤，其中该P2086亚家族B多肽为B44、B02、B03、B22、B24或B09变体。
C39.如C38的方法，其中该免疫原性组合物另外包含P2086亚家族A多肽。
C40.如C39的方法，其中该P2086亚家族A多肽为A05、A04、A12或A22变体。
C41.如C38至40中任一项的方法，其中该免疫原性组合物另外包含佐剂。
C42.如C41的方法，其中该佐剂是选自由以下组成的组：
a)铝佐剂；
b)皂苷
c)CpG核苷酸序列；及
d)a)、b)及c)的任何组合。
C43.如C42的方法，其中该铝佐剂是选自由以下组成的组：AlPO4、Al(OH)3、Al2(SO4)3及明矾。
C44.如C42或43的方法，其中该铝浓度是介于0.125μg/ml与0.5μg/ml之间。
C45.如C44的方法，其中该铝浓度为0.25μg/ml。
C46.如C42至45中任一项的方法，其中该皂苷浓度是介于1μg/ml与250μg/ml之间。
C47.如C46的方法，其中该皂苷浓度是介于10μg/ml与100μg/ml之间。
C48.如C47的方法，其中该皂苷浓度为10μg/ml。
C49.如C48的方法，其中该皂苷浓度为100μg/ml。
C50.如C42至49中任一项的方法，其中该皂苷为QS-21或ISCOMATRIX。
C51.如C38至50的方法，其中该免疫原性组合物是在给药方案中以多剂量向该对象施用。
C52.如C51的方法，其中该免疫原性组合物是在给药方案中以2个剂量向该对象施用。
C53.如C51的方法，其中该免疫原性组合物是在给药方案中以3个剂量向该对象施用。
C54.一种产生非脂质化P2086变体多肽的方法，其包含以下步骤：
a)将ORF2086变体核酸序列克隆至大肠杆菌表达载体中；
b)用该ORF2086表达载体转化细菌；
c)诱导表达；及
d)分离表达的P2086蛋白；
其中，该ORF2086表达载体不包含脂质化控制序列。
C55.如C54的方法，其中编码该ORF2086变体的N端Cys的密码子缺失。
C56.如C54的方法，其中编码该ORF2086变体的N端Cys的密码子经突变以产生Ala、Gly或Val密码子。
C57.如C55或56的方法，其中该ORF2086变体为A05、B01或B44变体。
C58.如C54至57中任一项的方法，其中N端尾部经突变以添加Ser及Gly残基以延伸紧靠该N端Cys的下游的Gly/Ser茎部。
C59.如C58的方法，其中该Gly/Ser茎部中的Gly及Ser残基的总数为至少7个。
C60.如C58的方法，其中该Gly/Ser茎部中的Gly及Ser残基的总数为至少8个。
C61.如C58的方法，其中该Gly/Ser茎部中的Gly及Ser残基的总数为至少9个。
C62.如C58的方法，其中该Gly/Ser茎部中的Gly及Ser残基的总数为至少10个。
C63.如C58的方法，其中该Gly/Ser茎部中的Gly及Ser残基的总数为至少11个。
C64.如C58的方法，其中该Gly/Ser茎部中的Gly及Ser残基的总数为至少12个。
C65.如C54至57中任一项的方法，其中该ORF2086变体的N端尾部的密码子通过点诱变加以优化以使编码该ORF2086变体的第5个氨基酸的密码子与SEQ ID NO:8的核苷酸13-15100%相同且编码该ORF2086变体的第13个氨基酸的密码子与SEQ ID NO:8的核苷酸37-39100%相同。
C66.如C65的方法，其中该ORF2086变体的N端尾部的密码子与SEQID NO:8的核苷酸1-45100%相同。
C67.如C65的方法，其中该ORF2086变体的N端尾部的密码子与SEQID NO:8的核苷酸4-45100%相同。
C68.如C65的方法，其中该ORF2086变体的N端尾部的密码子与SEQID NO:8的核苷酸4-42100%相同。
C69.如C65的方法，其中相比于SEQ ID NO:18的氨基酸1-15，由该ORF2086变体编码的蛋白质的N端尾部包含至少一个氨基酸取代。
C70.如C65的方法，其中相比于SEQ ID NO:18的氨基酸2-15，由该ORF2086变体编码的蛋白质的N端尾部包含至少一个氨基酸取代。
C71.如C65的方法，其中相比于SEQ ID NO:18的氨基酸1-15，由该ORF2086变体编码的蛋白质的N端尾部包含两个氨基酸取代。
C72.如C65的方法，其中相比于SEQ ID NO:18的氨基酸2-15，由该ORF2086变体编码的蛋白质的N端尾部包含两个氨基酸取代。
C73.如C69至72中任一项的方法，其中所述氨基酸取代为保守性氨基酸取代。
C74.如C65至73中任一项的方法，其中该ORF2086变体为A22或B22变体。
C75.如C55至74中任一项的方法，其中通过添加IPTG来诱导表达。
C76.如C55至75中任一项的方法，其中该细菌为大肠杆菌。
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Claims (37)

1.一种组合物，其包含分离的非丙酮酰化非脂质化ORF2086多肽。
2.权利要求1的组合物，其中所述组合物为免疫原性组合物。
3.权利要求1的组合物，其中相比于相应野生型非脂质化ORF2086多肽，所述多肽包含N端Cys缺失。
4.权利要求1的组合物，其中所述多肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQID NO:20及SEQ ID NO:21，其中在位置1处的半胱氨酸缺失。
5.权利要求4的组合物，其中所述多肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50及SEQ ID NO:55。
6.权利要求1的组合物，其中所述多肽由可操作地连接于表达系统的核苷酸序列编码，其中所述表达系统能够在细菌细胞中表达。
7.权利要求6的组合物，其中所述表达系统为质粒表达系统。
8.权利要求6的组合物，其中所述细菌细胞为大肠杆菌细胞。
9.权利要求6的组合物，其中所述核苷酸序列与控制所述核苷酸序列表达的调控序列连接。
10.权利要求1的组合物，其中相比于相应野生型非脂质化ORF2086多肽，所述多肽包含N端Cys取代。
11.一种组合物，其包含可通过如下方法获得的非丙酮酰化非脂质化ORF2086多肽，所述方法包括表达核苷酸序列，所述核苷酸序列编码具有选自由以下组成的组的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20及SEQ ID NO:21，其中在位置1处的半胱氨酸缺失，其中所述核苷酸序列可操作地连接于能够在细菌细胞中表达的表达系统。
12.权利要求0的组合物，其中所述细菌细胞为大肠杆菌(E.coli)。
13.一种组合物，其包含包括SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列的分离的多肽，及包括SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列的分离的多肽。
14.权利要求1至13中任一项的组合物，其中所述组合物为免疫原性组合物。
15.权利要求13的组合物，其还包含血清群B脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)的ORF2086亚家族A多肽。
16.权利要求1至13中任一项的组合物，其中所述组合物在哺乳动物中引发针对血清群B脑膜炎奈瑟球菌的ORF2086亚家族B多肽的杀细菌免疫应答。
17.一种分离的多肽，其包含SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列。
18.一种分离的核苷酸序列，其包含SEQ ID NO:46。
19.一种分离的核苷酸序列，其包含SEQ ID NO:47。
20.一种分离的核苷酸序列，其包含SEQ ID NO:48。
21.一种分离的多肽，其包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列。
22.一种分离的核苷酸序列，其包含SEQ ID NO:45。
23.一种分离的多肽，其包含SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列。
24.一种质粒，其包含选自由SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQID NO:48及SEQ ID NO:45组成的组的核苷酸序列，其中所述质粒能够在细菌细胞中表达。
25.权利要求24的质粒，其中所述细菌细胞为大肠杆菌。
26.一种在哺乳动物中引发对血清群B脑膜炎奈瑟球菌的ORF2086亚家族B具有特异性的杀细菌抗体的方法，包括给所述哺乳动物施用有效量的分离的多肽，所述分离的多肽包含选自由SEQ ID NO:44及SEQ ID NO:49或其组合组成的组的氨基酸序列。
27.一种产生多肽的方法，其包含在细菌细胞中表达多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:21具有90%以上相同性的序列，所述序列包含至少一个选自由SEQ ID NO:21的氨基酸13-18、SEQ ID NO:21的氨基酸21-34及SEQ ID NO:21的氨基酸70-80或其组合组成的组的结构域，其中所述序列缺乏N端半胱氨酸；及纯化所述多肽。
28.权利要求27的方法，其中所述序列还包含至少一个选自由以下组成的组的结构域：SEQ ID NO:21的氨基酸96-116、SEQ ID NO:21的氨基酸158-170、SEQ ID NO:21的氨基酸172-185、SEQ ID NO:21的氨基酸187-199、SEQ ID NO:21的氨基酸213-224、SEQ ID NO:21的氨基酸226-237、SEQ ID NO:21的氨基酸239-248或其组合。
29.权利要求27的方法，其中所述细菌细胞为大肠杆菌。
30.一种分离的多肽，其由包含如权利要求27的方法的方法产生。
31.一种免疫原性组合物，其由包含如权利要求27的方法的方法产生。
32.一种免疫原性组合物，其包含血清群B脑膜炎奈瑟球菌的ORF2086亚家族B多肽，其中所述多肽为非丙酮酰化非脂质化B44。
33.权利要求32的组合物，其另外包含血清群B脑膜炎奈瑟球菌的第二ORF2086亚家族B多肽，其中所述第二多肽为非丙酮酰化非脂质化B09。
34.权利要求32的组合物，其中所述组合物包括至多3种ORF2086亚家族B多肽。
35.权利要求32的组合物，其中所述组合物包括至多两种ORF2086亚家族B多肽。
36.权利要求32的组合物，其中所述组合物还包括一或多种ORF2086亚家族A多肽。
37.权利要求36的组合物，其中所述组合物包括亚家族A多肽A05。
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