CN105492021A - 脑膜炎奈瑟氏球菌组合物及其方法 - Google Patents

Abstract

在一方面，本发明涉及包括具有SEQIDNO:1所示的序列的第一多肽和具有SEQIDNO:2所示的序列的第二多肽的组合物。在一个实施方案中，组合物包括约120μg/ml的包括SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列的第一多肽、120μg/ml的包括SEQIDNO:2中所示的氨基酸序列的第二多肽、与所述第一多肽约2.8摩尔比的聚山梨酯80、与所述第二多肽约2.8摩尔比的聚山梨酯80、约0.5mg/ml铝、约10mM组氨酸、和约150mM氯化钠。在一个实施方案中，一剂量的组合物为总体积约0.5ml。在一个实施方案中，两剂量的组合物诱导人中针对不同的异源超家族A和超家族B菌株的杀菌效价。

Description

脑膜炎奈瑟氏球菌组合物及其方法

相关申请的交叉引用

本申请要求提交于2013年9月8日的美国临时专利申请序列号61/875,068、提交于2014年1月13日的美国临时专利申请序列号61/926,717和提交于2014年5月6日的美国临时专利申请序列号61/989,432的权益，所述申请以其整体通过引用并入本文。

发明领域

本发明涉及脑膜炎奈瑟氏球菌（Neisseriameningitidis）组合物及其方法。

发明背景

脑膜炎奈瑟氏球菌是可以引起脓毒症、脑膜炎和死亡的革兰氏阴性的有荚膜的细菌。脑膜炎奈瑟氏球菌基于化学上和抗原性上不同的多糖荚膜可以归类为至少12个血清群（包括血清群A、B、C、29E、H、I、K、L、W-135、X、Y和Z）。具有五种血清群(A、B、C、Y和W135)的菌株导致大部分疾病。

脑膜炎球菌性脑膜炎是破坏性疾病，其可以在尽管使用抗生素的情况下在数小时内杀死儿童和青年人。存在针对脑膜炎球菌血清群A、B、C、Y和W135和/或X的改进的免疫原性组合物的需求。

目前，针对广泛的MnB分离株的有效的交叉保护性疫苗或组合物仍未市售。例如，截至目前关于批准的针对血清群B疾病提供保护的多组分组合物的公开结果，尚未证明针对表达异源LP2086(fHBP)变体的多个菌株的直接杀菌免疫应答，至少在青少年中是这样。至多，截至目前的关于针对血清群B疾病提供保护的多组分组合物的公开结果似乎显示针对LP2086(fHBP)变体的免疫原性，所述LP2086(fHBP)变体与多组分组合物中的LP2086(fHBP)变体同源。因此，当决定针对一组不同的或异源的脑膜炎球菌菌株（例如，代表不同的地理区域）的现实疫苗覆盖时，需要针对不同MnB分离株的有效的交叉反应疫苗或组合物。

发明概述

为了实现这些和其他需求，本发明涉及脑膜炎奈瑟氏球菌组合物及其方法。

在一方面，本发明涉及组合物，其包括约120μg/ml的包括SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列的第一脂质化的多肽、120μg/ml的包括SEQIDNO:2中所示的氨基酸序列的第二脂质化多肽、与所述第一多肽约2.8摩尔比的聚山梨酯80、与所述第二多肽约2.8摩尔比的聚山梨酯80、约0.5mg/ml铝、约10mM组氨酸、和约150mM氯化钠。在一个实施方案中，第一剂量为总体积中约0.5ml。在一个实施方案中，组合物诱导针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B的杀菌免疫应答。在一个实施方案中，组合物诱导针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、29E、H、I、K、L、W-135、X、Y或Z的杀菌免疫应答。在一个实施方案中，组合物不进一步包括与SEQIDNO:1具有少于100％序列同一性的多肽。在一个实施方案中，组合物不进一步包括与SEQIDNO:2具有少于100％序列同一性的多肽。在一个实施方案中，第一多肽具有总计258个氨基酸。在一个实施方案中，第二多肽具有总计261个氨基酸。在一个实施方案中，组合物诱导这样的血清免疫球蛋白的杀菌效价，所述杀菌效价为在接受第一剂量后的人中比在接受第一剂量前的人中的血清免疫球蛋白的杀菌效价高至少2倍，其中杀菌效价中的所述增加在相同条件下在血清杀菌测定中使用人补体来测量。在一个实施方案中，第一脂质化多肽由SEQIDNO:1所示的氨基酸序列组成。在一个实施方案中，第二脂质化多肽由SEQIDNO:2所示的氨基酸序列组成。

在另一方面，本发明涉及在人中诱导针对脑膜炎奈瑟氏球菌的免疫应答的方法。所述方法包括向人施用第一剂量和第二剂量的有效量的组合物，所述组合物包括120μg/ml的包括SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列的第一脂质化的多肽、120μg/ml的包括SEQIDNO:2中所示的氨基酸序列的第二脂质化多肽、与所述第一多肽2.8摩尔比的聚山梨酯80、与所述第二多肽2.8摩尔比的聚山梨酯80、0.5mg/ml铝、10mM组氨酸、和150mM氯化钠。在一个实施方案中，组合物的剂量具有0.5ml的总体积。在一个实施方案中，人至多施用两个剂量的组合物。在一个实施方案中，人不进一步施用加强剂量的组合物。在一个实施方案中，人施用第三剂量的组合物。在一个实施方案中，第三剂量后人不进一步施用加强剂量的组合物。在一个实施方案中，人不进一步施用第四剂量的组合物。在一个实施方案中，第三剂量在第一剂量后约6个月的时期内施用给人。在一个实施方案中，第二剂量在第一剂量后至少30天施用。在一个实施方案中，方法进一步包括施用第三剂量的组合物，其中所述第三剂量在第二剂量后至少90天施用。在一个实施方案中，组合物诱导这样的血清免疫球蛋白的杀菌效价，所述杀菌效价为在接受第一剂量后的人中比在接受第一剂量前的人中的血清免疫球蛋白的杀菌效价高至少2倍，当在相同条件下在血清杀菌测定中使用人补体来测量时。在一个实施方案中，免疫应答针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族A菌株（其与表达A05的脑膜炎奈瑟氏球菌菌株异源）是杀菌的。在一个实施方案中，免疫应答针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族B菌株（其与表达B01的脑膜炎奈瑟氏球菌菌株异源）是杀菌的。在一个实施方案中，免疫应答针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族A菌株（其与脑膜炎奈瑟氏球菌菌株M98250771异源）是杀菌的。在一个实施方案中，免疫应答针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族B菌株（其与脑膜炎奈瑟氏球菌菌株CDC1127异源）是杀菌的。在一个优选的实施方案中，免疫应答针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族B菌株（其与脑膜炎奈瑟氏球菌菌株CDC1573异源）是杀菌的。在一个实施方案中，第一多肽具有总计258个氨基酸。在一个实施方案中，第二多肽具有总计261个氨基酸。在一个实施方案中，第一脂质化多肽由SEQIDNO:1所示的氨基酸序列组成。在一个实施方案中，第二脂质化多肽由SEQIDNO:2所示的氨基酸序列组成。

在一方面，本发明涉及组合物，其包括60μg的包括SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列的第一脂质化的多肽、60μg的包括SEQIDNO:2中所示的氨基酸序列的第二脂质化多肽、与所述第一多肽2.8摩尔比的聚山梨酯80、与所述第二多肽2.8摩尔比的聚山梨酯80、0.5mg/ml铝、10mM组氨酸、和150mM氯化钠，其中所述组合物具有约0.5ml的总体积。

在一个实施方案中，组合物诱导针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族A菌株（其与表达A05的脑膜炎奈瑟氏球菌菌株异源）的杀菌免疫应答。在一个实施方案中，组合物诱导针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族B菌株（其与表达B01的脑膜炎奈瑟氏球菌菌株异源）的杀菌免疫应答。在一个实施方案中，组合物诱导这样的血清免疫球蛋白的杀菌效价，所述杀菌效价为在接受第一剂量后的人中比在接受第一剂量前的人中的血清免疫球蛋白的杀菌效价高至少2倍，当在相同条件下在血清杀菌测定中使用人补体来测量时。在一个实施方案中，组合物不进一步包括与SEQIDNO:2具有少于100％序列同一性的多肽。在一个实施方案中，组合物不进一步包括与SEQIDNO:2具有少于100％序列同一性的多肽。在一个实施方案中，第一多肽具有总计258个氨基酸。在一个实施方案中，第二多肽具有总计261个氨基酸。在一个实施方案中，第一脂质化多肽由SEQIDNO:1所示的氨基酸序列组成。在一个实施方案中，第二脂质化多肽由SEQIDNO:2所示的氨基酸序列组成。

附图简述

图1－实现hSBA效价≥LLOQ的受试者比例。hSBA＝使用人补体的血清杀菌测定；LLOQ＝定量下限。

图2－用rLP2086免疫后实现hSBA效价中针对普林斯顿大学爆发菌株和个别人个体的UCSB爆发菌株的4x升高的受试者的百分比（研究B1971012－描述于实施例5、实施例6）。在临床研究B1971012中用二价rLP2086免疫的9个人受试者的血清样品在探索性hSBA中使用来自普林斯顿大学和来自UCSB的MnB爆发菌株进行评价。参见实施例9。

序列标识符

SEQIDNO:1表示重组脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B，2086变体A05多肽抗原的氨基酸序列。

SEQIDNO:2表示重组脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B，2086变体B01多肽抗原的氨基酸序列。

SEQIDNO:3表示在SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的位置1-4处的氨基酸残基。

SEQIDNO:4表示重组奈瑟氏球菌亚家族ALP2086多肽(rLP2086)(A05)多肽抗原的N末端的氨基酸序列。

SEQIDNO:5表示奈瑟氏球菌亚家族ALP2086M98250771多肽(A05)多肽抗原的N末端的氨基酸序列。

SEQIDNO:6表示脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B，2086变体B153的氨基酸序列。

SEQIDNO:7表示脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B，2086变体A04的氨基酸序列。

SEQIDNO:8表示脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B，2086变体A05的氨基酸序列。

SEQIDNO:9表示脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B，2086变体A12的氨基酸序列。

SEQIDNO:10表示脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B，2086变体A22的氨基酸序列。

SEQIDNO:11表示脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B，2086变体B02的氨基酸序列。

SEQIDNO:12表示脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B，2086变体B03的氨基酸序列。

SEQIDNO:13表示脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B，2086变体B09的氨基酸序列。

SEQIDNO:14表示脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B，2086变体B22的氨基酸序列。

SEQIDNO:15表示脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B，2086变体B24的氨基酸序列。

SEQIDNO:16表示脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B，2086变体B44的氨基酸序列。

SEQIDNO:17表示脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B，2086变体B16的氨基酸序列。

SEQIDNO:18表示脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B，2086变体A07的氨基酸序列。

SEQIDNO:19表示脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B，2086变体A19的氨基酸序列。

SEQIDNO:20表示脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B，2086变体A06的氨基酸序列。

SEQIDNO:21表示脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B，2086变体A15的氨基酸序列。

SEQIDNO:22表示脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B，2086变体A29的氨基酸序列。

SEQIDNO:23表示脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B，2086变体B15的氨基酸序列。

发明详述

本发明人令人惊奇地发现包括包含SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列的第一脂质化多肽和包含SEQIDNO:2中所示的氨基酸序列的第二脂质化多肽的组合物。组合物具有在人中可接受的安全性概况且组合物令人惊奇地在人中引发针对至少超过两种不同的脑膜炎奈瑟氏球菌菌株的广泛的交叉反应性杀菌免疫应答。

本发明人进一步发现用异源LP2086(因子H结合蛋白(fHBP))亚家族A和B疫苗的2剂量施用时间表和3剂量施用时间表令人惊奇地在人受试者中以高比例产生针对来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B的测试菌株的≥8的hSBA效价。当相比于2剂量施用时间表时，3剂量施用时间表可以提供在人中针对不同的MnB临床菌株的最广泛的保护。

本发明人还令人惊奇地发现在同时施用rLP2086组合物和针对人乳头状瘤病毒（HPV4）的四价免疫原性组合物后产生针对人乳头状瘤病毒和脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B的强力的免疫应答。例如，同时施用rLP2086组合物和HPV4组合物产生至少针对表达fHBP（其与rLP2086组合物中的那些fHBP异源）的脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B测试菌株的免疫应答。此类异源测试菌株包括表达A22fHBP、A56fHBP、B24fHBP或B44fHBP的野生型脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B菌株，其与rLP2086组合物中的fHBP各自异源。参见WO/2012/032489、WO/2013/132452、美国专利公开号US20120093852和美国专利公开号US20130243807，其描述了变体fHBP蛋白，尤其包括A22fHBP、A56fHBP、B24fHBP和B44fHBP。这些参考文献各自以其整体通过引用并入。同时施用还令人惊奇地产生至少针对HPV6型、11型、16型和/或18型的免疫应答。同时施用rLP2086组合物和HPV4组合物后针对HPV型的免疫应答当相比于在不存在rLP2086组合物的情况下由施用HPV4组合物产生的免疫应答时是不差的（noninferior）。

此外，本发明人令人惊奇地发现在同时施用rLP2086组合物和针对白喉、破伤风、百日咳和脊髓灰质炎的组合物后产生针对白喉、破伤风、百日咳和脊髓灰质炎和脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B的强力的免疫应答。例如，同时施用rLP2086组合物和REPEVAX组合物产生至少针对表达fHBP（其与rLP2086组合物中的那些fHBP异源）的脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B测试菌株的免疫应答。同时施用还令人惊奇地产生至少针对REPEVAX中9种抗原的免疫应答：白喉、破伤风、百日咳类毒素、百日咳丝状血凝素、百日咳百日咳杆菌粘附素、百日咳菌毛凝集原（fimbrialagglutinogen）2＋3型、脊髓灰质炎病毒1型、脊髓灰质炎病毒2型、脊髓灰质炎病毒3型。同时施用rLP2086组合物和REPEVAX组合物后针对REPEVAX抗原的免疫应答当相比于在不存在rLP2086组合物的情况下由施用REPEVAX组合物产生的免疫应答时是不差的（noninferior）。

此外，本发明人令人惊奇地发现rLP2086组合物诱导针对表达fHBPB153变体的ST409脑膜炎奈瑟氏球菌的杀菌免疫应答。例如，在使用人补体的血清杀菌测定（hSBA）中发现当接触人二价rLP2086组合物免疫血清时，表达fHBPB153变体的菌株易于被杀灭。

组合物和疫苗

在一方面，本发明涉及针对脑膜炎奈瑟氏球菌的组合物。组合物包括具有SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列的第一脂质化多肽和具有SEQIDNO:2中所示的氨基酸序列的第二脂质化多肽。

本发明人令人惊奇地发现诱导针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B的多个菌株的有效的广泛保护性免疫应答的单一脑膜炎奈瑟氏球菌多肽组分。因此，在一个实施方案中，组合物不包括融合蛋白。在一个实施方案中，组合物不包括嵌合蛋白。在一个实施方案中，组合物不包括杂合蛋白。在一个实施方案中，组合物不进一步包括肽片段。在另一实施方案中，组合物不进一步包括不是fHBP的奈瑟氏球菌多肽。例如，在一个实施方案中，组合物不包括PorA蛋白。在另一个实施方案中，组合物不包括NadA蛋白。在另一实施方案中，组合物不进一步包括奈瑟氏球菌肝素结合抗原（NHBA）。在另一实施方案中，组合物不进一步包括奈瑟氏球菌外膜囊泡（OMV）。在一个优选的实施方案中，除了第一多肽和第二多肽外，组合物不进一步包括抗原。

在另一方面，本发明人令人惊奇地发现衍生自至少两种脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B菌株的多肽抗原诱导针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B的多个菌株的有效的广泛保护性免疫应答。因此，在一个实施方案中，组合物不进一步包括不是衍生自脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族AM98250771菌株和/或脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族BCDC1573菌株的多肽。

在一个实施方案中，组合物不进一步包括与SEQIDNO:1具有少于100％序列同一性的多肽。在一个实施方案中，组合物不进一步包括与SEQIDNO:2具有少于100％序列同一性的多肽。在一个实施方案中，组合物不进一步包括与SEQIDNO:1和/或SEQIDNO:2的全长具有少于100％序列同一性的多肽。

在一个实施方案中，组合物进一步包括聚山梨酯80、铝、组氨酸和氯化钠。在一方面，组合物包括约60μg的包括SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列的第一脂质化的多肽、约60μg的包括SEQIDNO:2中所示的氨基酸序列的第二脂质化多肽、与每一多肽2.8摩尔比的聚山梨酯80、作为磷酸铝的0.5mg铝/ml、10mM组氨酸、和150mM氯化钠，其中所述组合物优选具有约0.5ml的总体积。

在一方面，组合物包括约120μg/ml的包括SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列的第一脂质化的多肽、约120μg/ml的包括SEQIDNO:2中所示的氨基酸序列的第二脂质化多肽、与每一多肽2.8摩尔比的聚山梨酯80、作为磷酸铝的0.5mg铝/ml、10mM组氨酸、和150mM氯化钠。

在进一步的方面，组合物包括约a）60μg的包括SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列的第一脂质化的多肽；b）60μg的包括SEQIDNO:2中所示的氨基酸序列的第二脂质化多肽；c）18μg聚山梨酯80；d）250μg铝；e）780μg组氨酸，和；f）4380μg氯化钠。

在一个示例性实施方案中，组合物包括约60μg的由SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列组成的第一脂质化的多肽、约60μg的由SEQIDNO:2中所示的氨基酸序列组成的第二脂质化多肽、与第一脂质化多肽和与第二脂质化多肽2.8摩尔比的聚山梨酯80、0.5mg/ml磷酸铝、10mM组氨酸、和150mM氯化钠，其中所述组合物具有约0.5ml的总体积。在示例性的实施方案中，组合物是无菌等渗缓冲的液体悬浮液。在示例性的实施方案中，组合物具有pH6.0。在示例性的实施方案中，第一多肽和第二多肽吸附在铝上。

在一个实施方案中，组合物具有约0.5ml的总体积。在一个实施方案中，组合物的第一剂量具有约0.5ml的总体积。“第一剂量”指在第0日施用的组合物的剂量。“第二剂量”或“第三剂量”指在第一剂量后施用的组合物的剂量，其可以是或可以不是与所述第一剂量相同的量。

在使用第一剂量给人后，组合物是免疫原性的。在一个实施方案中，第一剂量为总体积中约0.5ml。

组合物诱导这样的血清免疫球蛋白的杀菌效价，所述杀菌效价为在接受第一剂量后的人中比在接受第一剂量前的人中的血清免疫球蛋白的杀菌效价高至少1倍、优选高至少2倍，当在相同条件下在使用人补体的血清杀菌测定(hSBA)中测量时。

杀菌效价或杀菌免疫应答为针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B。在优选的实施方案中，杀菌效价或杀菌免疫应答为针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族A菌株且针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族B菌株。最优选的，杀菌效价或杀菌免疫应答至少针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族B，B01菌株。

在一个实施方案中，组合物诱导这样的血清免疫球蛋白的杀菌效价，所述杀菌效价为在接受第一剂量的组合物后的人中比在接受所述剂量前的人中的血清免疫球蛋白的杀菌效价高至少1倍、诸如例如，至少1.01倍、1.1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、或16倍，当在相同条件下在血清杀菌测定中使用人补体来测量时。

在一个实施方案中，组合物是免疫原性组合物。在一个实施方案中，组合物是用于人的免疫原性组合物。在另一个实施方案中，组合物是疫苗。“疫苗”指包括抗原的组合物，其含有诱导对于该抗原特异性的免疫应答的至少一种表位。疫苗可以通过皮下、经口、口鼻、或鼻内施用途径直接施用于受试者。优选地，肌内施用疫苗。在一个实施方案中，组合物是人疫苗。在一个实施方案中，组合物是针对脑膜炎奈瑟氏球菌的免疫原性组合物。

在一个实施方案中，组合物是液体组合物。在一个优选的实施方案中，组合物是液体悬浮液组合物。在另一个优选的实施方案中，组合物不是冻干的。

第一多肽

在一个实施方案中，组合物包括具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的第一多肽。在一个优选的实施方案中，组合物包括约60μg的包含SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的第一多肽，其中所述组合物优选具有0.5ml的总体积。在另一个实施方案中，组合物包括约120μg/ml的包含SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的第一多肽。多肽是来自脑膜炎奈瑟氏球菌菌株M98250771的经修饰的因子H结合蛋白（fHBP）。fHBP的描述公开于WO2012032489和美国专利公开US2012/0093852，其各自以其整体通过引用并入。多肽是在多肽的三个位置共价连接的三种主要脂肪酸C16:0、C16:1和C18:1的N末端脂质化的。第一多肽包括总计258个氨基酸。

第一多肽包括在所述多肽的N末端区域引入的两个修饰，当相比于来自脑膜炎奈瑟氏球菌菌株M98250771的对应野生型序列时。第二位置的甘氨酸作为引入克隆位点的结果而加入。第二修饰包括缺失四个氨基酸。因此，在一个实施方案中，第一多肽包括在N末端的C-G-S-S序列(SEQIDNO:3)。参见SEQIDNO:1，前四个氨基酸残基。

第一多肽序列和野生型奈瑟氏球菌序列之间的N末端序列差异如下。因此，在一个实施方案中，第一多肽包括SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的至少前2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13个或更多个氨基酸残基。优选地，第一多肽包括SEQIDNO:1的至少前4个、更优选至少前6个、且最优选至少前8个氨基酸残基。

在一个实施方案中，第一多肽包括SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，第一多肽具有总计258个氨基酸。在一个实施方案中，第一多肽不包括与SEQIDNO:1具有少于100％序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，第一多肽由SEQIDNO:1所示的氨基酸序列组成。在另一个实施方案中，第一多肽包括氨基酸序列KDN。参见例如，SEQIDNO:1的氨基酸残基73-75。在另一个实施方案中，第一多肽在多肽的N末端包括SEQIDNO:3所示的氨基酸序列。在另一个实施方案中，第一多肽在多肽的N末端包括SEQIDNO:4所示的氨基酸序列。

在优选的实施方案中，第一多肽使用本领域已知的标准技术在重组宿主细胞中容易地表达。在另一个优选的实施方案中，第一多肽包括SEQIDNO:1的N和/或C结构域上的杀菌表位。在一个实施方案中，第一多肽包括SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列的至少前4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个氨基酸残基。优选地，第一多肽包括SEQIDNO:1的至少前2个、更优选至少前4个、且最优选至少前8个氨基酸残基。

在一个实施方案中，第一多肽包括SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列的至少最后4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个氨基酸残基。

第二多肽

在一个实施方案中，组合物包括具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的第二多肽。在一个优选的实施方案中，组合物包括约60μg的包含SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的第二多肽，其中所述组合物优选具有0.5ml的总体积。在另一个实施方案中，组合物包括120μg/ml的包含SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的第二多肽。多肽是来自脑膜炎奈瑟氏球菌菌株CDC1573的因子H结合蛋白（fHBP）。fHBP的描述公开于WO2012032489和美国专利公开US2012/0093852，其各自以其整体通过引用并入。多肽是在多肽的三个位置共价连接的三种主要脂肪酸C16:0、C16:1和C18:1的N末端脂质化的。第二多肽包括总计261个氨基酸。在一个实施方案中，第二多肽包括在N末端的C-G-S-S序列(SEQIDNO:3)。参见SEQIDNO:2的前四个氨基酸残基。

在一个实施方案中，第二多肽包括SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，第二多肽具有总计261个氨基酸。在一个实施方案中，第二多肽由SEQIDNO:2所示的氨基酸序列组成。在另一个实施方案中，第二多肽不进一步包括与SEQIDNO:2具有少于100％序列同一性的多肽。在优选的实施方案中，第一多肽和第二多肽包括在各个多肽的N末端的C-G-S-S(SEQIDNO:3)序列。

在优选的实施方案中，第二多肽使用本领域已知的标准技术在重组宿主细胞中容易地表达。在另一个优选的实施方案中，第二多肽包括SEQIDNO:2的N和/或C结构域上的杀菌表位。在一个实施方案中，第二多肽包括SEQIDNO:2中所示的氨基酸序列的至少前4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个氨基酸残基。优选地，第二多肽包括SEQIDNO:2的至少前2个、更优选至少前4个、且最优选至少前8个氨基酸残基。

在一个实施方案中，第一多肽包括SEQIDNO:2中所示的氨基酸序列的至少最后4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个氨基酸残基。

聚山梨酯80

聚山梨酯80（PS-80）是非离子表面活性剂。使用体外基于单克隆抗体的效价测定的加速的稳定性研究证明在最终制剂中以更高摩尔比的PS-80比MnBrLP2086蛋白的亚家族B蛋白的不稳定性。用不同比例的PS-80的进一步实验证明POS-80与MnBrLP2086蛋白的保留效力的最优摩尔比为大约2.8±1.4。

组合物中PS-80的浓度取决于PS-80与多肽的摩尔比。在一个实施方案中，组合物包括PS-80与第一多肽和与第二多肽的2.8±1.4的摩尔比。在一个实施方案中，组合物包括PS-80与第一多肽和与第二多肽的2.8±1.1的摩尔比。在一个实施方案中，组合物包括至少1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2或3.3的PS-80与多肽的摩尔比。优选地，组合物包括PS-80与多肽的2.8摩尔比。

PS-80与多肽摩尔比通过从PS-80的测量浓度和测量的总多肽浓度的计算来确定，其中两个值均用摩尔表示。例如，PS-80与蛋白摩尔比通过计算在最终药物中测量的PS-80的浓度（例如，通过反向高压液相色谱（RP-HPLC））对于测量的总蛋白浓度（例如，通过离子交换高压液相色谱（IEX-HPLC））来确定，其中两个值均以摩尔表示。

RP-HPLC用于定量疫苗制剂中聚山梨酯80的浓度。去污剂的浓度通过皂化脂肪酸部分来确定；聚山梨酯80通过在40℃下碱水解转化为游离油酸。样品通过RP-HPLC使用C18柱分离且使用UV检测器在200nm波长定量。

第一和第二多肽通过阴离子交换HPLC解析。rLP2086（fHBP）亚家族A和B蛋白以不同保留时间洗脱且使用针对各个rLP2086蛋白参考材料生成的标准曲线定量。

术语“摩尔比”和包括fHBP和PS-80的免疫原性组合物的描述进一步公开于WO2012025873和美国专利公开US2013/0171194中，其各自以其整体通过引用并入。

如本文所用的术语“摩尔比”指组合物中两种不同要素的摩尔数之比。在一些实施方案中，摩尔比是去污剂摩尔与多肽摩尔之比。在一些实施方案中，摩尔比是PS-80摩尔与多肽摩尔之比。在一个实施方案中，基于蛋白和聚山梨酯80浓度，摩尔比可以使用以下公式计算：

。

在一个实施方案中，组合物包括约0.0015、0.0017、0.0019、0.0021、0.0023、0.0025、0.0027、0.0029、0.0031、0.0033、0.0035、0.0037、0.0039、0.0041、0.0043、0.0045、0.0047、0.0049、0.0051mg/mLPS-80。优选地，组合物包括约0.0035mg/mLPS-80。

在另一个实施方案中，组合物包括约10μg、11μg、12μg、13μg、14μg、15μg、16μg、17μg、18μg、19μg、20μg、21μg、22μg、23μg、24μg或25μgPS-80。在优选的实施方案中，组合物包括约18μgPS-80。

在另一个实施方案中，组合物包括范围为0.0005%-1%的PS-80。例如，PS-80浓度在组合物中可以为至少0.0005%、0.005%、0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%、0.10%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%或1.1%PS-80。在优选的实施方案中，组合物包括约0.07%PS-80。

任何最小值可以与本文描述的任何最大值组合以限定范围。

铝

组合物优选包括约0.5mg/ml磷酸铝。在一个实施方案中，组合物包括作为磷酸铝的约0.5mg铝/ml。AlPO₄以0.50mg/ml加入作为稳定剂以提供增强的可制备性和稳定性。该浓度维持亚家族A和B蛋白与铝的结合（90％结合或更好）。

生产磷酸铝的方法描述于美国专利公开US2009/0016946，其通过引用以其整体并入。

在一个实施方案中，除铝之外，组合物不进一步包括多价阳离子。在一个实施方案中，组合物不进一步包括Al(OH)₃或Al(SO₄)₃。

赋形剂

在一个实施方案中，组合物包括组氨酸。在一个实施方案中，组合物包括氯化钠。组合物优选包括约10mM组氨酸和约150mM氯化钠。在一个实施方案中，组合物包括10mM组氨酸和150mM氯化钠。

在另一个实施方案中，组合物包括约650μg、660μg、670μg、680μg、690μg、700μg、710μg、720μg、730μg、740μg、750μg、760μg、770μg、780μg、790μg、800μg、810μg、820μg、830μg、840μg或850μg组氨酸。优选地，组合物包括约780μg组氨酸。任何最小值可以与本文描述的任何最大值组合以限定范围。

在一个实施方案中，组合物包括tris、磷酸盐或琥珀酸盐缓冲液。在优选的实施方案中，组合物不包括tris缓冲液。在优选的中，组合物不包括磷酸盐缓冲液。在一个优选的实施方案中，组合物不包括琥珀酸缓冲液。在优选的实施方案中，组合物包括组氨酸缓冲液。

在优选的实施方案中，组合物的pH为6.0-7.0，最优选pH6.0。在一个实施方案中，组合物的pH为至多6.1。

杀菌活性

通过向人施用组合物诱导的免疫应答使用使用针对四种脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B（MnB）菌株的人补体的血清杀菌测定（hSBA）来测定。hSBA中使用的4种MnB菌株选自菌株库。该菌株库代表从美国和欧洲系统性收集的临床相关脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B菌株的集合。用于SBA的4种菌株中的两种来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清群BLP2086（fHBP）亚家族A，且4种菌株中的另2种来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清群BLP2086（fHBP）亚家族B。

针对所有测试菌株尤其是表达具有与第一多肽异源的序列的脂蛋白2086变体的菌株的高比例的hSBA应答表明组合物是广泛保护性疫苗且两剂量足以赋予至少针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族A菌株的高血清保护。

针对所有测试菌株尤其是表达具有与第一多肽和第二多肽两者异源的序列的脂蛋白2086变体的菌株的高比例的hSBA应答表明组合物是广泛保护性疫苗且在6个月时期内的至少3次剂量足以赋予针对表达rLP2086（FHBP）的脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族A和/或亚家族B的高血清保护。

在一个实施方案中，hSBA菌株为LP2086（fHBP）亚家族A菌株。在一个实施方案中，hSBA菌株为表达与表达A05的脑膜炎奈瑟氏球菌菌株异源的脂蛋白2086变体的LP2086（fHBP）亚家族A菌株。例如，在一个实施方案中，hSBA菌株为表达与菌株M98250771异源的脂蛋白2086变体的LP2086（fHBP）亚家族A菌株。在一个实施方案中，hSBA菌株为LP2086（fHBP）A22菌株。在另一个实施方案中，hSBA菌株为LP2086（fHBP）A56菌株。在进一步的实施方案中，hSBA菌株为LP2086(fHBP)A22和LP2086(fHBP)A56菌株。在另一个实施方案中，hSBA菌株为LP2086A04菌株。在一个实施方案中，hSBA菌株为LP2086A05菌株。在一个实施方案中，hSBA菌株为LP2086A12菌株。在一个实施方案中，hSBA菌株为LP2086A22菌株。在一个实施方案中，hSBA菌株为LP2086A12菌株。在一个实施方案中，hSBA菌株为LP2086A04菌株。在一个实施方案中，hSBA菌株为LP2086A19菌株。在一个实施方案中，hSBA菌株为LP2086A07菌株。在进一步的实施方案中，hSBA菌株包括A22、A12、A19、A05和A07或其任何组合。在一个实施方案中，hSBA菌株包括A06、A15和A29或其任何组合。

在一个实施方案中，免疫应答针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族A菌株（其与表达A05的脑膜炎奈瑟氏球菌菌株异源）是杀菌的。在一个实施方案中，免疫应答为针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群BA22菌株。在一个实施方案中，免疫应答为针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群BA56菌株。在一个实施方案中，免疫应答为针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群BA06菌株。在一个实施方案中，免疫应答为针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群BA15菌株。在一个实施方案中，免疫应答为针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群BA29菌株。在一个实施方案中，免疫应答为针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群BA62菌株。在一个实施方案中，免疫应答针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族A菌株（其与脑膜炎奈瑟氏球菌菌株M98250771异源）是杀菌的。在一个实施方案中，免疫应答为针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族A菌株是杀菌的，所述脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族A菌株表达包括具有与第一多肽至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列的因子H结合蛋白。在另一个实施方案中，免疫应答为针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族A菌株是杀菌的，所述脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族A菌株表达包括具有与由脑膜炎奈瑟氏球菌菌株M98250771表达的因子H结合蛋白至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列的因子H结合蛋白。在优选的实施方案中，免疫应答为针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族A菌株是杀菌的，所述脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族A菌株表达包括具有与由脑膜炎奈瑟氏球菌菌株M98250771表达的因子H结合蛋白至少80%、更优选至少84％同一性的氨基酸序列的因子H结合蛋白。

在另一个实施方案中，免疫应答为针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族A菌株是杀菌的，所述脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族A菌株表达包括具有与第一多肽至多81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列的因子H结合蛋白。在另一个实施方案中，免疫应答为针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族A菌株是杀菌的，所述脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族A菌株表达包括具有与由脑膜炎奈瑟氏球菌菌株M98250771表达的因子H结合蛋白至多81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列的因子H结合蛋白。在优选的实施方案中，免疫应答为针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族A菌株是杀菌的，所述脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族A菌株表达包括具有与由脑膜炎奈瑟氏球菌菌株M98250771表达的因子H结合蛋白至多85%、更优选至多99%同一性的氨基酸序列的因子H结合蛋白。任何最小值可以与本文描述的任何最大值组合以限定范围。

在一个实施方案中，hSBA菌株为LP2086（fHBP）亚家族B菌株。在一个实施方案中，hSBA菌株为表达与表达B01的脑膜炎奈瑟氏球菌菌株异源的脂蛋白2086变体的LP2086（fHBP）亚家族B菌株。例如，在一个实施方案中，hSBA菌株为表达与菌株CDC1127异源的脂蛋白2086变体的LP2086（fHBP）亚家族B菌株。在一个优选的实施方案中，hSBA菌株为表达与菌株CDC1573异源的脂蛋白2086变体的LP2086（fHBP）亚家族B菌株。

在一个实施方案中，免疫应答针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族B菌株（其与表达B01的脑膜炎奈瑟氏球菌菌株异源）是杀菌的。在一个实施方案中，免疫应答为针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群BB24菌株。在一个实施方案中，免疫应答为针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群BB44菌株。在一个实施方案中，免疫应答为针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群BB16菌株。在一个实施方案中，免疫应答为针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群BB03菌株。在一个实施方案中，免疫应答为针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群BB09菌株。在一个实施方案中，免疫应答为针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群BB15菌株。在一个实施方案中，免疫应答为针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群BB153菌株。在一个实施方案中，免疫应答针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族B菌株（其与脑膜炎奈瑟氏球菌菌株CDC1573异源）是杀菌的。在一个实施方案中，免疫应答为针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族B菌株是杀菌的，所述脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族B菌株表达包括具有与第二多肽至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列的因子H结合蛋白。在另一个实施方案中，免疫应答为针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族B菌株是杀菌的，所述脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族B菌株表达包括具有与由脑膜炎奈瑟氏球菌菌株CDC1573表达的因子H结合蛋白至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列的因子H结合蛋白。在优选的实施方案中，免疫应答为针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族B菌株是杀菌的，所述脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族B菌株表达包括具有与由脑膜炎奈瑟氏球菌菌株CDC1573表达的因子H结合蛋白至少80%同一性、更优选至少87%同一性的氨基酸序列的因子H结合蛋白。在另一优选的实施方案中，免疫应答为针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族B菌株是杀菌的，所述脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族B菌株表达包括具有与由脑膜炎奈瑟氏球菌菌株CDC1573表达的因子H结合蛋白100%同一性的氨基酸序列的因子H结合蛋白。

在另一个实施方案中，免疫应答为针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族B菌株是杀菌的，所述脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族B菌株表达包括具有与第二多肽至多81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列的因子H结合蛋白。在另一个实施方案中，免疫应答为针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族B菌株是杀菌的，所述脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族B菌株表达包括具有与由脑膜炎奈瑟氏球菌菌株CDC1573表达的因子H结合蛋白至多81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列的因子H结合蛋白。在优选的实施方案中，免疫应答为针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族B菌株是杀菌的，所述脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族B菌株表达包括具有与由脑膜炎奈瑟氏球菌菌株CDC1573表达的因子H结合蛋白至多88%同一性、更优选至少99%同一性的氨基酸序列的因子H结合蛋白。任何最小值可以与本文描述的任何最大值组合以限定范围。

在一个实施方案中，hSBA菌株为LP2086（fHBP）B24菌株。在另一个实施方案中，hSBA菌株为LP2086（fHBP）B44菌株。在进一步的实施方案中，hSBA菌株包括LP2086(fHBP)B24和LP2086(fHBP)B44菌株。在一个实施方案中，hSBA菌株包括LP2086(fHBP)A22、LP2086(fHBP)A56、LP2086(fHBP)B24和LP2086(fHBP)B44菌株。在一个实施方案中，hSBA菌株包括B15。在一个实施方案中，hSBA菌株包括B153。在另一个实施方案中，hSBA菌株为LP2086B16菌株。在一个实施方案中，hSBA菌株为LP2086B03菌株。在一个实施方案中，hSBA菌株为LP2086B09菌株。在进一步的实施方案中，hSBA菌株包括B24、B16、B44、B03和B09或其任何组合。在另一个实施方案中，hSBA菌株包括B24、B16、B44、A22、B03、B09、A12、A19、A05和A07或其任何组合。在另一个实施方案中，hSBA菌株包括A06、A07、A12、A15、A19、A29、B03、B09、B15和B16或其任何组合。

在一个实施方案中，方法诱导针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族A菌株和针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族B菌株的免疫应答。优选地，免疫应答为针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族A菌株和针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族B菌株是杀菌的。

在一个实施方案中，针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族A菌株的免疫应答比针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族B菌株的免疫应答更高。例如，在一个实施方案中，免疫原性组合物诱导比针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族B菌株更高的针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族A菌株的杀菌效价，当在相同条件下测试时。在一个实施方案中，针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族A菌株的更高的杀菌效价在针对脑膜炎奈瑟氏球菌的免疫原性组合物的第二剂量后30天内发生。在一个实施方案中，针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族A菌株的更高的杀菌效价在针对脑膜炎奈瑟氏球菌的免疫原性组合物的第三剂量不存在的情况下发生。

在另一个实施方案中，针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族B菌株的免疫应答比针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族A菌株的免疫应答更高。例如，在一个实施方案中，免疫原性组合物诱导比针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族A菌株更高的针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族B菌株的杀菌效价，当在相同条件下测试时。在一个实施方案中，针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族B菌株的更高的杀菌效价在针对脑膜炎奈瑟氏球菌的免疫原性组合物的第二剂量后30天内发生。在一个实施方案中，针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族B菌株的更高的杀菌效价在针对脑膜炎奈瑟氏球菌的免疫原性组合物的第三剂量不存在的情况下发生。

效价

在一个实施方案中，当在hSBA中相同条件下测量时，与施用一剂量的组合物前的人中的杀菌效价相比，组合物诱导在人中杀菌效价的增加。在一个实施方案中，当在hSBA中相同条件下测量时，与施用第一剂量的组合物前的人中的杀菌效价相比，将杀菌效价中的增加与施用第一剂量的组合物前的人中的杀菌效价比较。在一个实施方案中，当在hSBA中相同条件下测量时，与施用第二剂量的组合物前的人中的杀菌效价相比，在第二剂量组合物后观察到效价的增加。在另一个实施方案中，当在hSBA中相同条件下测量时，与施用第三剂量的组合物前的人中的杀菌效价相比，在第三剂量组合物后观察到杀菌效价的增加。

在一个实施方案中，组合物在使用一剂量后的人中诱导杀菌效价，其中所述杀菌效价比施用所述剂量前的人中的杀菌剂量高至少大于1倍，当在hSBA中在相同条件下测量时。例如，当与在接受一剂量前的人中的杀菌效价相比时，杀菌效价可以在接受所述剂量的组合物后的人中高至少1.01倍、1.1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、或16倍，当在hSBA中在相同条件下测量时。

在一个实施方案中，“应答者”指人，其中组合物在施用一剂量后的人中诱导杀菌效价，其中所述杀菌效价比施用所述剂量前的人中的杀菌效价高至少大于1倍。在优选的实施方案中，应答者当与施用剂量前的人中的杀菌效价相比时实现hSBA效价中至少≥4倍的升高。此类应答者可以称为具有保护性效价。

在一个实施方案中，hSBA效价为产生可测量的效果的血清样品的最高稀释度的倒数。例如，在一个实施方案中，hSBA效价为这样的测试血清的最高2倍稀释度的倒数，所述最高2倍稀释度导致相比于T30CFU值（即，在含有除测试血清外的所有测定组分的测定孔中孵育后存活的细菌数目；100％细菌存活）的MnB细菌的至少50％降低（50％细菌存活）。

在一个实施方案中，组合物诱导接受第一剂量的人中的杀菌效价，其比接受所述第一剂量前的人中的杀菌效价高至少2倍（例如，比在不存在所述第一剂量的人中的杀菌效价高），当在hSBA中在相同条件下测量时。在一个实施方案中，组合物诱导人中这样的杀菌效价，所述杀菌效价比在接受第一剂量前的人中的杀菌效价高至少4倍，当在相同条件下在使用人补体的人血清杀菌测定（hSBA）中来测量时。在一个实施方案中，组合物诱导人中这样的杀菌效价，所述杀菌效价比在接受第一剂量前的人中的杀菌效价高至少8倍，当在相同条件下在使用人补体的人血清杀菌测定（hSBA）中来测量时。

在优选的实施方案中，人血清补体来源于对于给定的SBA测试菌株具有低内在杀菌活性的人。低内在杀菌活性指例如针对给定的SBA测试菌株至少低于1：4稀释的杀菌效价。在一个实施方案中，人补体来源于针对给定的SBA测试菌株具有至少低于1：4诸如1：2稀释度的hSBA效价的人，其中所述组合物没有施用给该人。

人可以展示出在施用组合物诸如二价rLP2086组合物前低于1：4的hSBA效价，或人可以展示出施用所述组合物前≥1:4的hSBA效价。因此，在优选的实施方案和实施例中，向人施用至少一剂量的组合物导致至少大于1：4的hSBA效价，诸如，例如，≥1:8的hSBA效价、≥1:16的hSBA效价、和≥1:32的hSBA效价。本文描述的各个实施例包括评估具有≥1:8和/或≥1:16的hSBA效价的人受试者的比例，其中二价rLP2086组合物施用于人。此类大于1：4的hSBA效价的优选的评估显示在人中诱导的保护即杀菌免疫应答与组合物相关。

在一个实施方案中，人在施用第一剂量的组合物后具有等于或大于hSBA的定量下限（LLOQ）的hSBA效价。在另一个实施方案中，人在施用第二剂量的组合物后具有等于或大于hSBA的LLOQ的hSBA效价。在另一个实施方案中，人在施用第三剂量的组合物后具有等于或大于hSBA的LLOQ的hSBA效价。

额外的免疫原性组合物

本发明令人惊奇地发现针对脑膜炎奈瑟氏球菌的免疫原性组合物可以与针对人乳头瘤病毒（HPV）的免疫原性组合物施用，而不负面影响针对脑膜炎奈瑟氏球菌的杀菌应答。如实施例7和实施例8中所解释，针对脑膜炎奈瑟氏球菌测试菌株的主要hSBA应答在施用有针对脑膜炎奈瑟氏球菌的免疫原性组合物和GARDASIL的人中，和在施用有针对脑膜炎奈瑟氏球菌的免疫原性组合物和盐水的人中观察到。第三剂量的针对脑膜炎奈瑟氏球菌的免疫原性组合物后约1个月观察到hSBA应答中的额外增加。

此外，本发明人令人惊奇地发现与施用组合物前人中的免疫应答相比，施用针对脑膜炎奈瑟氏球菌的免疫原性组合物和针对HPV的免疫原性组合物后的人中产生针对脑膜炎奈瑟氏球菌和HPV两者的强力免疫应答。如实施例7和实施例8中所解释，如与施用免疫原性组合物前的人中的效价相比，针对HPV的效价在施用针对脑膜炎奈瑟氏球菌的免疫原性组合物和GARDASIL后的人中增加。针对HPV的效价中的增加为至少大于1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍或更高。

因此，在一个实施方案中，方法包括在人中诱导针对脑膜炎奈瑟氏球菌的免疫应答，其中所述方法进一步包括向人施用针对人乳头瘤病毒的免疫原性组合物。优选地，免疫应答为针对脑膜炎奈瑟氏球菌是杀菌的。在一个优选的实施方案中，方法进一步包括诱导针对HPV的免疫应答。在优选的实施方案中，方法进一步包括诱导针对人乳头瘤病毒6、11、16和18型或其任何组合的免疫应答。在一个实施方案中，针对HPV的免疫原性组合物在施用所述针对脑膜炎奈瑟氏球菌的组合物的24小时内施用于人。

在一个实施方案中，方法包括在人中诱导针对脑膜炎奈瑟氏球菌的免疫应答，其中所述方法进一步包括向人施用针对HPV的免疫原性组合物。优选地，免疫应答为针对脑膜炎奈瑟氏球菌是杀菌的。在一个优选的实施方案中，方法进一步包括诱导针对HPV的免疫应答。在优选的实施方案中，方法进一步包括诱导针对人乳头瘤病毒6、11、16和18型或其任何组合的任一项的免疫应答。在一个实施方案中，针对人乳头瘤病毒的免疫原性组合物在施用所述针对脑膜炎奈瑟氏球菌的组合物的24小时内施用于人。

在另一方面，本发明令人惊奇地发现针对脑膜炎奈瑟氏球菌的免疫原性组合物可以与针对白喉、破伤风、无细胞百日咳、和灭活的脊髓灰质炎病毒（dTaP）的免疫原性组合物一起施用，而不负面影响针对脑膜炎奈瑟氏球菌的杀菌应答。如实施例4中所解释的，在施用针对脑膜炎奈瑟氏球菌的免疫原性组合物和REPEVAX的人中观察到对于脑膜炎奈瑟氏球菌测试菌株的实质性hSBA应答。第三剂量的针对脑膜炎奈瑟氏球菌的免疫原性组合物后约1个月观察到hSBA应答中的额外增加。

此外，本发明人令人惊奇地发现与施用组合物前人中的免疫应答相比，施用针对脑膜炎奈瑟氏球菌的免疫原性组合物和针对dTaP的免疫原性组合物后的人中产生针对脑膜炎奈瑟氏球菌和dTaP两者的强力免疫应答。如实施例4中所解释，如与施用免疫原性组合物前的人中的效价相比，针对dTaP的效价在施用针对脑膜炎奈瑟氏球菌的组合物和REPEVAX后的人中增加。针对dTaP的效价中的增加为至少大于1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍或更高。

方法和施用

在一方面，本发明涉及在人中诱导针对脑膜炎奈瑟氏球菌的免疫应答的方法。在另一方面，本发明涉及接种人的方法。在一方面，方法包括向人施用至少一剂量的上文描述的组合物。在另一方面，方法包括向人施用至少第一剂量和第二剂量的上文描述的组合物。

令人惊奇地，本发明人发现两剂量时间表的组合物诱导人中针对不同的异源亚家族A和针对不同的异源亚家族B的杀菌效价。例如，两剂量时间表的上文所述组合物后，具有≥1:8的hSBA效价的人的百分比对于表达LP2086(fHBP)A22或LP2086(fHBP)A56的SBA测试菌株为90％或更高。参见实施例1。

在一个实施方案中，第二剂量在第一剂量后至少20、30、50、60、100、120、160、170或180天施用，且在第一剂量后至多250、210、200或190天施用。任何最小值可以与本文描述的任何最大值组合以限定范围。

在另一个实施方案中，第二剂量在第一剂量后约30天施用。在另一实施方案中，第二剂量在第一剂量后约60天施用，诸如例如，以0、2月免疫时间表。在另一实施方案中，第二剂量在第一剂量后约180天施用，诸如例如，以0、6月免疫时间表。在仍另一实施方案中，第二剂量在第一剂量后约120天施用，诸如例如，以2、6月免疫时间表。

在一个实施方案中，方法包括向人施用两剂量的组合物且至多两剂量。在一个实施方案中，两剂量在第一剂量后约6个月的时期内施用。在一个实施方案中，方法不包括进一步向人施用加强剂量。“加强剂量（booster）”指组合物对人的额外施用。向人施用至多两剂量的组合物可能是有利的。此类利益包括例如利于人依从完整的施用时间表且利于时间表的成本。

在一个实施方案中，第一剂量和第二剂量在第一剂量后约25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200天，且至多400、390、380、370、365、350、340、330、320、310、300、290、280、270、260、250、240、230、220、210或200天的时期内施用于人。任何最小值可以与本文描述的任何最大值组合以限定范围。

在一个实施方案中，第一剂量和第二剂量经过约30天的时期施用于人。在另一个实施方案中，第一剂量和第二剂量经过约60天的时期施用于人。在另一个实施方案中，第一剂量和第二剂量经过约180天的时期施用于人。

三个剂量

本发明人进一步令人惊奇地发现三剂量时间表的组合物比两剂量时间表在更高百分比的人中诱导针对表达异源LP2086（fHBP）亚家族B菌株的菌株的更广泛的杀菌效价。例如，两剂量时间表的上文所述组合物后，具有≥1:8的hSBA效价的人的百分比对于SBA测试菌株LP2086(fHBP)B24和LP2086(fHBP)B44为65%或更高。三剂量时间表的上文所述组合物后，具有≥1:8的hSBA效价的人的百分比对于SBA测试菌株B24和B44为86%或更高。参见实施例1。

因此，在一个实施方案中，三剂量时间表的组合物比两剂量时间表在更高百分比的人中诱导针对表达与第一和/或第二多肽异源的LP2086（fHBP）的多个菌株的杀菌效价。

在一个实施方案中，方法包括向人施用三剂量的组合物。在另一个实施方案中，方法包括向人施用至多三剂量的组合物。在一个实施方案中，三剂量在第一剂量后约6个月的时期内施用。在一个实施方案中，方法包括在第三剂量后向人施用加强剂量。在另一个实施方案中，方法不包括在第三剂量后向人施用加强剂量。在另一实施方案中，方法不进一步包括向人施用第四或加强剂量的组合物。在进一步的实施方案中，约6个月时期内至多三个剂量施用于人。

在示例性的实施方案中，第二剂量在第一剂量后约30天施用，且第三剂量在第二剂量后约150天施用，诸如例如，以0、1、6月免疫时间表。在另一示例性的实施方案中，第二剂量在第一剂量后约60天施用，且第三剂量在第二剂量后约120天施用，诸如例如，以0、2、6月免疫时间表。

在一个实施方案中，第一剂量、第二剂量、和第三剂量在约150、160、170或180天且至多240、210、200或190天的时期内施用于人。任何最小值可以与本文描述的任何最大值组合以限定范围。优选地，第一剂量、第二剂量、和第三剂量经约180天或6个月的时期施用于人。例如，第二剂量可以在第一剂量后约60天施用于人，且第三剂量可以在第二剂量后约120天施用于人。因此，施用的示例性时间表包括在约第0、2和6个月向人施用剂量。

如上所述，免疫原性组合物的多个剂量可以向人施用，且各剂量之间的天数可以改变。方法的优点包括例如对于人依从施用时间表的灵活性。

实施例

以下实施例说明本发明的实施方案。除非本文另有说明，以下实施例中提及研究中的二价重组疫苗（rLP2086），其是这样的组合物的优选的示例性实施方案，所述组合物包括每0.5mL剂量60μg的包括SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列的第一脂质化的多肽、每0.5mL剂量60μg的包括SEQIDNO:2中所示的氨基酸序列的第二脂质化多肽、与第一多肽2.8摩尔比的聚山梨酯80、与第二多肽2.8摩尔比的聚山梨酯80、0.5Al³⁺/ml组合物、10mM组氨酸、和150mM氯化钠。更具体而言，研究中的二价重组rLP2086疫苗包括约（a）60μg的包括SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列的第一脂质化的多肽；（b）60μg的包括SEQIDNO:2中所示的氨基酸序列的第二脂质化多肽；（c）18μg聚山梨酯80；（d）250μg铝；（e）780μg组氨酸，和；（f）4380μg氯化钠。各剂量为0.5mL。

实施例1：当在年龄为11－18岁的健康受试者中以2或3剂量方案施用时，研究中的脑膜炎球菌血清群B二价（MnB）rLP2086疫苗的安全性、耐受性和免疫原性

背景：在11-18岁龄的健康青少年中使用包括2或3次接种的5剂量方案（表1）来研究研究中的二价重组疫苗（rLP2086）的安全性、耐受性和免疫原性。

将疫苗配制为0.5ml剂量以包含60μg各自纯化的亚家族A和纯化的亚家族BrLP2086蛋白、2.8摩尔比的聚山梨酯80、和作为AlPO₄的0.25mg的Al³⁺、10mM的组氨酸缓冲的盐水pH6.0。

将盐水用作安慰剂，因为不存在可用作活性对照的已知被证实安全、免疫原性且有效的针对MnB的疫苗。生理盐水溶液包括0.5ml剂量中0.9％氯化钠。

方法：在该2期、随机化的、安慰剂对照的、单盲研究中的所有受试者在第0、1、2和6个月接受疫苗接种出诊。对于盲测（blinding），当未排定疫苗时，给予盐水对照。使用人补体的血清杀菌测定（hSBA）用表达LP2086(fHBP)fHBP变体A22、A56、B24和B44的4种MnB测试菌株（即，主要终点分析中的4种“主要hSBA测试菌株”）进行，其所有均与疫苗中的变体不同。评估未要求的不利事件（Unsolicitedadverseevent，AE）、要求的局部和全身性反应和退热用途。

以2侧95％置信区间（CI）在每一血液采样时间点对每一主要菌株计算集合平均hSBA效价。几何平均倍数升高以95％CI计算。

将应答者定义为具有等于或高于hSBA测定的定量下限（LLOQ）的hSBA效价的受试者。在主要终点分析中4个hSBA测试菌株的每一个的LLOQ为等于1：8的hSBA效价。对于每一主要测试菌株的检测限（LOD）为等于1：4的效价（宽泛地视为与针对脑膜炎球菌疾病的保护有关）。

结果：最后疫苗剂量后1个月，86–99%的受试者(3剂量后;P<0.001)和69–100%受试者（2剂量后）对于每一MnB测试菌株具有≥8的hSBA效价。研究剂量1后，19–27%(1.1–4.3%严重的)和23–27%(0.0–1.0%严重的)的rLP2086接受者按组分别经历发红和肿胀。注射部位疼痛是研究剂量1（7.6–13.1%严重的）后最常见的局部反应。第一研究剂量的二价rLP2086疫苗后在各组中3.3-6.5%经历发烧≥38℃相比于盐水接受者中的2.1％。局部和全身性反应在剂量1后比在随后剂量之后通常更频繁。1712位受试者中的43位（2.5％）报告51例严重AE；2例认为是相关的（1例眩晕、寒战且头疼和1例为发烧和呕吐）。未报告死亡。

结论：二价rLP2086具有可接受的安全性概况。所有5次给药方案在高比例的受试者中产生针对所有4种测试菌株的≥8的hSBA效价。相比于2剂量，3剂量后针对一些测试菌株的更高比例表明3剂量可以提供针对不同的MnB临床菌株的最宽的保护。整体的3期临床试验在用二价rLP2086疫苗进行中。

本研究的目标之一是评估免疫应答，如在组1受试者（0月、1月和6月时间表，如随机化的）和在组2受试者（0月、2月和6月时间表，如随机化的）中，用二价rLP2086第三次接种后1个月，通过用表达LP2086亚家族A和B蛋白的MnB菌株进行的hSBA所测量的。免疫原性分析的终点为对于4种主要MnB测试菌株(A22、A56、B24和B44)的每一种在第7个月（或在第三剂量的二价rLP2086后1个月）实现≥LLOQ的hSBA效价的组1和2中受试者的比例。LLOQ对于4种MnB测试菌株为1：8。

对于可评价的免疫原性人群，3剂量的二价rLP2086后实现≥1:8的hSBA效价的组1中的受试者比例为对于A22为91.7％、对于A56为99.4％、对于B24为89％且对于B44为88.5％（参见上文表1）。由于97.5％CI的下限对于所有菌株为>50%(对于菌株A22、A56、B24和B44分别为87.8%、p<0.001;97.8%、p<0.001;84.7%、p<0.001;和84.1%、p<0.001)，因此组1中的受试者达到研究目标。

对于组2，3剂量的二价rLP2086后实现≥1:8的hSBA效价的受试者比例为对于A22为95.0%、对于A56为98.9%、对于B24为88.4%且对于B44为86.1%（参见上文表1）。类似于对组1可见的，97.5％CI的下限对于所有菌株为>50%(对于菌株A22、A56、B24和B44分别为91.7%、p<0.001;96.9%、p<0.001;84.1%、p<0.001;和81.4%、p<0.001)，表明组2中的受试者也达到研究目标。

次要目标为评估免疫应答，如在组3受试者（0月和6月时间表，如随机化的）中在第二剂量的二价rLP2086后1个月，通过用表达LP2086亚家族A和B蛋白的MnB菌株进行的hSBA所测量的。该次要目标为对于4种主要MnB测试菌株的每一种在第7个月（或在第二剂量的二价rLP2086后1个月）实现≥LLOQ(1:8)的hSBA效价的组3中受试者的比例。

该次要目标也达到，因为2剂量的二价rLP2086后在组3中实现≥1:8的hSBA效价的受试者比例为对于主要MnB测试菌株为93.5%、98.4%、81.1%和77.5%，以97.5%CI的下限对于所有菌株>50%(对于菌株A22、A56、B24和B44分别为90.0%、p<0.001;96.2%、p<0.001;76.0%、p<0.001;和72.2%、p<0.001。参见上文表1）。

另一次要目标为对于组1-5中的受试者在每一血液采样时间点对于4种主要MnB测试菌株的每一种具有≥LLOQ的hSBA的受试者比例。对于4种主要hSBA测试菌株的每一种的LLOQ为1：8的效价。在研究时间时对于可评价的免疫原性群体具有≥1：8的hSBA效价的受试者的比例显示在上文表1中。

1剂量的二价rLP2086（组5[2月和6月时间表]，注射3后1个月）后具有≥1:8的hSBA效价的受试者比例对于A22为55.9％、对于A56为67.6％、对于B24为56.9％且对于B44为23.8％。

2剂量的二价rLP2086后一个月具有≥1:8的hSBA效价的受试者比例范围为对于亚家族A菌株为74.6％-100%，且对于亚家族B菌株为54.0%-81.1%。3剂量后，对于亚家族A和B菌株，比例增加且范围分别为91.7%-99.4%和86.1%-89.0%。

实施例2：使用人补体的血清杀菌测定（hSBA）

从人血清清除MnB主要通过补体介导的溶菌作用实现且完整的补体系统对于针对由MnB引起的感染的抗性是重要的。MnB的体内补体介导的溶菌作用体外通过使用人补体的血清杀菌测定（hSBA）来模拟，其为显示为对于脑膜炎球菌疾病保护的代用品的功能性血清型测定。即，使用人补体的血清杀菌测定（hSBA）中证实细菌杀伤与针对脑膜炎球菌疾病的保护相关。由疫苗引发的免疫使用针对4种MnB菌株(fHBP变体A22、A56、B24和B44)的hSBA测定。

四种主要MnB测试菌株在描述于用于测定终点的实施例的hSBA中使用。即，将这些菌株用于使用hSBA免疫原性终点估计疫苗效力。这些测试菌株代表占美国和欧洲中流行的>90%的疾病分离株的6种fHBP系统发生亚群中的4种。

变体	与匹配的fHBP亚家族疫苗组分的同一性	fHBP亚群	CC	PorA	脂低聚糖唾液酸化水平(mol%)
						A56	98.1%	N1C2	CC213	P1.22,14	55%
B44	91.6%	N4/N5	CC269	P1.19-1,10-4	23%
						A22	88.9%	N2C2	CC41/44	P1.21,16	84%
B24	86.2%	N6	CC32	P1.12-1,13-1	22%

在选择来自侵袭性疾病分离株的4种主要MnB测试菌株中，使用考虑体外LP2086表面表达的群体分布的方法。此外，hSBA测试菌株必须显示低基线hSBA阳性，因为处于脑膜炎球菌疾病的风险中的群体特征在于对于大多数菌株不存在的或低基线的杀菌活性。此外，4种主要MnB测试菌株的每一种表达与疫苗中LP2086变体不同的LP2086变体，因此允许客观评价针对人群中流行的侵袭性脑膜炎球菌疾病（IMD）的功能免疫原性和效力。

hSBA测量能够起始补体介导的杀菌活性的血清中抗脑膜炎球菌血清群B（MnB）抗体的量。简言之，测试血清在2倍步骤中连续稀释且添加到96孔测定板中。加入MnBSBA测试菌株和人血清补体，起始杀菌反应。在37℃孵育测定板30-60分钟后（取决于SBA测试菌株；称为T30），将含有在该孵育中存活的细菌的反应混合物稀释并转移至微滤板。过夜孵育后，表示为菌落形成单位（CFU）的存活细菌使用ImmunospotAnalyzer计数。原始CFU数据电子记录且转移至计算hSBA效价的数据分析应用。hSBA效价为这样的测试血清的最高2倍稀释度的倒数，所述最高2倍稀释度导致相比于T30CFU值（即，在含有除测试血清外的所有测定组分的测定孔中孵育后存活的细菌数目；100％细菌存活）的MnB细菌的至少50％降低（50％细菌存活）。效价可以报道为步骤效价，例如1：4、1：8、1：16等。血清样品在相同测定中通过两次单独的、重复测定来测试。其中重复测量值不相同的样品报道的最终效价为两次重复测量值中的低者，当达到系统适合性和样品适合性标准（例如重复效价必须在一个2倍稀释中一致）时。

在Dulbecco磷酸缓冲盐溶液中连续稀释测试血清后进行hSBA测定。将细菌（粗略2000菌落形成单位）和人血清补体（20重量％的终浓度）加入到96孔板中连续稀释的血清并在37℃下在小半径定轨摇床中以700rpm孵育30-40min（取决于hSBA测试菌株）。孵育后，将一定比例的反应混合物转移至微滤板。过夜孵育后，用ImmunospotAnalyzer(CellularTechnologyLimited;ShakerHeights、OH、USA)计数存活的细菌并用SAS（9.2版）分析hSBA效价。hSBA效价计算为与未经历测试血清的对照相比导致细菌的50％降低的内插测试血清稀释度的倒数（即，hSBA反应结束时的存活细菌）。根据方案，hSBA基于处于或高于hSBA测定的定量下限（如用在实施例1的表1中列出的菌株的测定的定量过程中建立的）的hSBA效价来完成。

人血清是用于SBA的补体来源。然而，hSBA效价可以根据所用的人补体批次而不同。因此，人补体优选经严格筛选和定量来控制以确保hSBA中的一致表现。对于hSBA，人血清补体可以从多位正常健康成年人合并或从单独供体来使用（即，不合并）。

实施例3－聚山梨酯80

对于药物制剂已优化三个参数：pH、铝浓度和聚山梨酯80（PS-80）与蛋白摩尔比。在具有0.5ml总体积的组合物剂量中，最优的与铝的蛋白结合在约6.0的pH下和约0.5mg/ml浓度的铝（作为磷酸铝(AlPO₄)（其等价于0.25mg铝/剂量））实现。PS-80与蛋白摩尔比维持在2.8±1.4以稳定制剂的体外效力。聚山梨酯80（PS-80）添加至药物以获得2.8的目标PS-80与蛋白摩尔比。因此，优选在药品配制过程中不加入PS-80。

实施例4

在健康青年人中与二价rLP2086疫苗同时施用的REPEVAX?的免疫原性和安全性的随机化的、安慰剂对照的2期研究

背景/目标：评价研究中的二价rLP2086疫苗（开发为预防青年人中的脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B（MnB））与同时施用REPEVAX^?，REPEVAX^?为该群体中同时使用的dTaP灭活脊髓灰质炎疫苗（其可描述于美国专利号7479283、WO1990/013313和EP1666057B1以及UKMarketingAuthorisationPL06745/0121）。

方法：青年人（对REPEVAX+rLP2086或REPEVAX+盐水1：1随机化）在第0、2和6个月接种。测定初始接种后30天对于9种REPEVAX抗原实现预定的抗体水平的受试者比例。接种2和3后30天测量对于4种MnB测试菌株的免疫应答（hSBA）。评价不利事件（AE）和局部/全身性反应。

REPEVAX(SanofiPasteurMSDlimited)是组合的低剂量白喉、破伤风、无细胞百日咳和灭活脊髓灰质炎病毒疫苗，其每0.5mL剂量含有吸附在磷酸铝上(1.5mg(0.33mg铝))的白喉类毒素（不低于2IU）、破伤风类毒素（不低于20IU）、百日咳抗原（百日咳类毒素（2.5微克）、丝状血凝素（5微克）、百日咳杆菌粘附素（3微克）和菌毛2型和3型（5微克））、脊髓灰质炎（灭活的）1型（40D抗原单位）、脊髓灰质炎病毒（灭活的2型（8D抗原单位）、脊髓灰质炎（灭活的）3型（32D抗原单位）。

使用多路LUMINEX测定评估针对REPEVAX（白喉类毒素、破伤风类毒素、百日咳类毒素、百日咳杆菌粘附素、菌毛2型和3型以及丝状血凝素）的白喉、破伤风、和百日咳组分的免疫应答。在病毒中和测定中测量针对脊髓灰质炎1型、2型和3型的免疫应答。将从两个组中的所有受试者获得的血清用于这些测定中。

对于评估针对二价rLP2086的免疫应答，在hSBA中用所述的4种主要MnB测试菌株分析功能性抗体。选择四种主要MnBhSBA测试菌株(A22、A56、B44和B24)，2种表达LP2086亚家族A且另2种表达LP2086亚家族B。使用这四种主要hSBA测试菌株（来自6种fHBP系统进化亚群中的4种且代表美国和欧洲流行的>90%的疾病分离株）用于测定该研究中的主要免疫原性终点。此外，A22、B24和B44变体是欧洲的流行病学相关变体，而在美国，A22和B24是在引起疾病的MnB菌株上表达的发现的最流行变体。测试用于一级和二级分析的样品前验证MnBhSBA。

来自两组中50％的随机选择的受试者的血清样品用A22和B24进行hSBA且另50％用A56和B44测试。这些测试在接种1之前、接种2之后和接种3之后对血液样品进行。

REPEVAX的免疫原性通过使用在关键的3期临床试验中在形成对于REPEVAX的许可基础的青少年中确定的每一抗原的预定标准来评估。REPEVAX共存抗原包括白喉、破伤风、百日咳类毒素、百日咳丝状血凝素、百日咳百日咳杆菌粘附素、百日咳菌毛凝集原2+3型、脊髓灰质炎病毒1型、脊髓灰质炎病毒2型、脊髓灰质炎病毒3型。例外是百日咳菌毛凝集原（FIM）2+3型，其限定在用于REPEVAX许可的测定中≥5EU/mL的效价。在该研究中，百日咳FIM2+3型的定量下限（LLOQ）为≥10.6EU/mL，其更高且因此比REPEVAX的许可标准更严格。

共存抗原的LLOQ如下：白喉类毒素为0.037IM/mL;破伤风类毒素为0.05IU/ml；百日咳类毒素为0.9EU/mL；百日咳丝状血凝素为2.9EU/mL，百日咳百日咳杆菌粘附素为3.0EU/mL；百日咳菌毛凝集原2+3型为10.6EU/mL；对于脊髓灰质炎病毒1型、脊髓灰质炎病毒2型、脊髓灰质炎病毒3型为1：8。

对于一级目标的额外描述终点为测量为在接种1后（探视2）的几何平均效价（GMT）或几何平均浓度（GMC）的针对共存疫苗抗原的抗体。

另一终点为在接种3后（探视6）对于4种主要MnB测试菌株具有≥LLOQ的hSBA效价的受试者的比例。

共存疫苗抗原接种白喉、破伤风和百日咳无细胞(dTaP)-IPV(REPEVAX)后1个月实现对于共存疫苗抗原的预定标准的受试者的比例用2侧95％精确（或Clopper-Pearson置信限）对于组1和组2进行计算。比例的差异（二价rLP2086/dTaP-IPV–dTaP-IPV，或组1－组2）还连同2侧95％精确CI对于差异进行计算。如果对于差异的2侧95％CI的下限对于dTaP-IPV疫苗中所有9种抗原大于-0.10(-10%)，则声明为非劣等（Noninferiority）。

用主要测试菌株的hSBA对于每一主要MnBhSBA测试菌株，在每一血液采样时间点实现≥LLOQ、≥1:4、≥1:8、≥1:16和≥1:128的hSBA效价的受试者的数目和比例连同精确2侧95％CI（或Clopper-Pearson置信限）对于比例进行描述性概述。

结果：在随机的749位受试者中，685位（91.5％）包括可评价的免疫原性群。REPEVAX+rLP2086或REPEVAX+盐水后的免疫应答对于所有9种REPEVAX抗原是不差的。针对二价rLP2086疫苗的免疫应答在2次剂量后是实质性的且在3次剂量后进一步增强（表2）。轻度至中度注射部位疼痛是最常见的局部反应；头疼和疲劳是最常见的全身性事件。接种后30天内报道AE的受试者比例是相似的（8.8%和11.4%，分别对于REPEVAX+rLP2086和REPEVAX+盐水）。

对于共存疫苗可评价的免疫原性群，在REPEVAX剂量后1个月实现针对共存疫苗抗原的抗体的预定水平（对于应答的阈值）的受试者比例在二价rLP2086+REPEVAX组和单独的REPEVAX组之间对于共存的疫苗抗原是相似的：白喉类毒素（各组中99.4％），破伤风类毒素（各组中100％），百日咳类毒素（分别94.7％和96.0％），百日咳丝状血凝素（各组中100％），百日咳百日咳粘附菌素（各组中100％），百日咳菌毛凝集原2+3型（分别97.6％和98.9％），脊髓灰质炎病毒1型（各组中100％），脊髓灰质炎病毒2型（各组中100％），脊髓灰质炎病毒3型（各组中100％）。

由于REPEVAX剂量后一个月二价rLP2086+REPEVAX组(组1)和单独的REPEVAX组(组2)之间应答者比例中差异的2侧95％CI的下界对于REPEVAX中的9种抗原大于-0.10(-10%)（即，比例差异上95％CI的最低下界为-4.7%（百日咳类毒素）），因此实现非劣等。因此，通过与二价rLP2086一同给予的REPEVAX诱导的免疫应答对于由单独REPEVAX诱导的免疫应答是不差的。

评估对于4种主要MnB测试菌株的每一种对于接种3后可评价的免疫原性群具有≥LLOQ的hSBA效价的受试者比例。A22的LLOQ为等于1：16的hSBA效价而对于所有其他MnB测试菌株的LLOQ为等于1：8的hSBA效价。

对于组1，在基线（接种1前）具有≥LLOQ的hSBA效价的受试者比例对于主要MnB菌株A22为14.4％，对于A56为18.2％，对于B24为12.7％，且对于B44为6.2％。对于组2，在基线（接种1前）具有≥LLOQ的hSBA效价的受试者比例对于主要MnB菌株A22为23.0%，对于A56为21.8%，对于B24为12.9%，且对于B44为6.3%。

剂量2的二价rLP2086后组1受试者中观察到实质上的hSBA应答，且接种3后1个月3个剂量后观察到额外增加。对于组1（二价rLP2086+REPEVAX），接种2后1个月时和接种3后1个月时实现≥LLOQ的hSBA效价的受试者比例对于A22为81.1%和95.6%，对于A56为97.3%和100%，对于B24为81.0%和96.8%，且对于B44为55.5%和81.5%。尽管在仅两次二价rLP2086剂量后实现实质上的hSBA应答，但2次剂量（接种2后一个月）相比于3次剂量（接种3后1个月）后具有≥LLOQ的hSBA效价的受试者比例中的增加示例3次剂量后免疫应答的增强。在对照组（组2）中，在接种2后1个月和在接种3后1个月时对于4种主要MnB测试菌株的每一种具有≥LLOQ的hSBA效价的受试者比例与每一MnB测试菌株的基线hSBA结果（接种1前）是相似的。

对于4种主要MnB测试菌株，组1中展示确定的hSBA效价的受试者比例在3次剂量后大于2次剂量后。描述了实现≥1：16的hSBA效价的受试者，由于该效价从1：4效价的4倍增加（≥1：4的效价广泛接受为与针对IMD的保护相关性）。对于组1，在接种2后1个月时具有1：16的hSBA效价的受试者比例对于A22为81.8％，对于A56为97.3%，对于B24为68.0%，且对于B44为53.4%。在接种3后1个月时，具有1：16的hSBA效价的受试者比例对于A22为95.6%，对于A56为100%，对于B24为87.3%，且对于B44为79.5%。

在对照组（组2）中，在接种2后1个月和在接种3后1个月时对于4种主要MnB测试菌株的每一种展示确定的hSBA效价的受试者比例与具有在基线（接种1前）确定的hSBA效价的受试者比例是相似的。

对于组1，3次剂量的二价rLP2086后具有1：16的hSBA效价的受试者比例证明当施用3次剂量的二价rLP2086时疫苗引发强力的免疫应答。

hSBA几何平均效价（GMT）通常，基线处GMT对于两组均低于hSBALLOQ。对于组1，在接种2后1个月的hSBAGMT对于A22为35.5，对于A56为91.1，对于B24为15.9且对于B44为14.6。在接种3后1个月的hSBAGMT对于A22为63.4，对于A56为151.5，对于B24为28.3且对于B44为36.5。

对于组1，2次剂量后对于亚家族A菌株观察的GMT以及3次剂量后对于亚家族B菌株观察的GMT表明强力的免疫应答。

评价显示A22、A56、B24和B44的hSBA效价分布的反向累积分布曲线（RCDC）。组1中来自RCDC的结果显示在二价rLP2086接种后在组1受试者中观察到实质上的免疫应答；然而，附图还显示第三剂量的二价rLP2086的益处，因为更高比例的受试者实现针对4种MnB测试菌株的更高效价。该效果对于菌株B44是最显著的。

结论：当同时给予二价rLP2086时，REPEVAX诱导不比由单独REPEVAX引发的免疫应答差的免疫应答。二价rLP2086疫苗诱导针对四种不同MnB测试菌株强力的杀菌应答，尤其是针对代表亚家族B的那些，其在3次剂量后比2次剂量后更高。同时施用通常是安全的且完全耐受的。

实施例5

健康青少年中研究中的脑膜炎球菌血清群B二价rLP2086疫苗的免疫原性

背景和目标：脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B（MnB）引起婴儿、青少年和成年人中的侵袭性疾病。保守的、表面暴露的脂蛋白LP2086（因子H结合蛋白[fHBP]）是有希望的MnB疫苗靶标。在健康青少年（11-18岁）中研究了研究中的二价、重组疫苗（rLP2086）的安全性和免疫原性。

方法：将该安慰剂对照的、单盲研究中的受试者随机分至两个3剂量时间表和三个2剂量时间表。每一120-μg剂量含有2种rLP2086抗原，每个LP2086亚家族（A和B）1种。当未排定疫苗日程时，给予盐水。使用人补体的血清杀菌测定用4种MnB测试菌株（与疫苗fHBP异源）进行。

结果：将1713位受试者（平均年龄14.4岁）随机化。3剂量疫苗后一个月，针对亚家族A和B菌株的≥8的hSBA效价分别在95-99%和86-89%的受试者中观察到；2剂量后，这些数字范围分别为91-100%和69-77%的受试者。在2剂量时间表中，0和6个月诱导最高的抗体应答（实施例5的表1）。在4种MnB异源测试菌株中，2剂量后hSBAGMT范围为6.2-125.6且3剂量后范围为25.6-155.6。轻度至中度注射位点疼痛是最常见的局部反应。剂量1后，分别在3.3-6.5％和2.1％的rLP2086和盐水接受者中经历发烧≥38℃。

结论：rLP2086是完全耐受的。所有剂量方案产生强力的杀菌应答，其在3剂量后最为显著。

实施例5的表1与上述的实施例1的表1相同。表2概述了通过研究时间对于可评价的免疫原性群的hSBAGMT及相应CI。GMT从基线（注射1前）增加且用二价rLP2086的每一随后剂量持续增加。

对于4种主要MnB菌株，3剂量的二价rLP2086后（组1和2）比2剂量后（组3、4和5）的GMT更高。GMT在两个3剂量组之间相似，且它们在三个2剂量组之间相似。

注射1前（基线），组1、2、3、4和5的hSBAGMT如下：对于A22分别为7.1、6.3、6.4、6.4和6.8；对于A56分别为6.8、6.1、6.7、6.3和6.2；对于B24分别为5.3、5.1、5.0、4.9和5.1；和对于B44分别为4.4、4.5、4.5、4.6和4.4。

对于组1（0、1和6月），在剂量2后1个月对于所有4种主要MnB菌株观察到的GMT存在实质上增加（对于A22、A56、B24和B44分别为24.4、77.3、13.8和13.1）。GMT进一步在3剂量的二价rLP2086后对于组1的受试者对于4种主要MnB测试菌株进一步增加；55.1(A22);152.96(A56);29.1(B24);和40.3(B44)。

对于组2，2和3剂量的二价rLP2086后观察到GMT的相似增加。2剂量的二价rLP2086后对于组2受试者的GMT对于A22为32.9，对于A56为94.6，对于B24为14.9且对于B44为15.5。3剂量后，GMT对于A22增加为56.3，对于A56增加为155.6，对于B24增加为25.6且对于B44增加为35.0。

对于组1和2，2次剂量后对于亚家族A菌株观察的GMT以及3次剂量后对于亚家族B菌株观察的GMT表明强力的免疫应答。

对于组3，1剂量的二价rLP2086后观察到GMT的少量增加：A22为12.0，对于A56为18.5，对于B24为9.2且对于B44为5.7。2剂量后，GMT对于A22增加为48.4，对于A56增加为125.6，对于B24增加为20.6且对于B44增加为22.5。

对于组4，1剂量的二价rLP2086后GMT对于A22为13.3；对于A56为17.7；对于B24为9.8且对于B44为5.9。2剂量的二价rLP2086后，GMT对于A22为37.1，对于A56为104.9，对于B24为17.7且对于B44为19.1。

对于组5，1剂量的二价rLP2086后GMT对于A22为16.0，对于A56为26.8，对于B24为12.6且对于B44为6.8。2剂量的二价rLP2086后，GMT对于A22增加为39.6，对于A56增加为111.8，对于B24增加为14.7且对于B44增加为17.8。

总之，对于组3、4和5，观察到的GMT表明2剂量的二价rLP2086后对于亚家族A和B菌株的免疫应答。

总之，3剂量的二价rLP2086提供基于4种主要MnB测试菌株的hSBA效价的强力的且最宽的免疫应答。与2剂量相比，接受3剂量的二价rLP2086的受试者的更高比例实现针对4种主要MnB测试菌株的≥1:8的hSBA效价。

0、1和6月剂量时间表后的结果（组1）与0、2、和6月剂量时间表后的结果（组2）相似。对于组1和2，剂量3后实现的GMT值比剂量2后GMT值更高。对于组1和2，剂量2后GMT值对于亚家族A菌株范围为24.2-94.6且对于亚家族B菌株范围为13.1-15.5。剂量3后GMT值对于亚家族A菌株范围为55.1-155.6且对于亚家族B菌株范围为25.6-40.3。对于组1和2，当与2剂量的二价rLP2086后针对4种主要MnB测试菌株实现≥1:8的hSBA效价的受试者比例相比时，3剂量的二价rLP2086后针对4种主要MnB测试菌株更高比例的受试者实现≥1:8的hSBA效价。

还评估了实现≥1:16的hSBA效价的受试者。对于组1，在2剂量的二价rLP2086后一个月实现≥1:16的hSBA效价的受试者百分比对于A22为73.5%，对于A56为96.3，对于B24为57.6，且对于B44为47.2%。3剂量的二价rLP2086后，组1中实现≥1:16的hSBA效价的受试者百分比对于A22为91.4%，对于A56为99.2%，对于B24为82.8%，且对于B44为84.8%。

对于组2，在2剂量的二价rLP2086后一个月实现≥1:16的hSBA效价的受试者比例对于A22为88.1%，对于A56为97.9%，对于B24为63.5%，且对于B44为58.6%。3剂量的二价rLP2086后，组2中实现≥1:16的hSBA效价的受试者百分比对于A22为95.0%，对于A56为98.9%，对于B24为83.6%，且对于B44为83.8%。

对于组1和2，3次剂量的二价rLP2086后实现≥1:16的hSBA效价的受试者百分比证明当疫苗引发强力的免疫应答。

对于组3，在2剂量的二价rLP2086后实现≥1:16的hSBA效价的受试者比例对于A22为93.2%，对于A56为98.4%，对于B24为73.8%，且对于B44为70.8%。

对于组4，在2剂量的二价rLP2086后一个月实现≥1:16的hSBA效价的受试者比例对于A22为90.8%，对于A56为99.2%，对于B24为67.1%，且对于B44为64.5%。

对于组5，在2剂量的二价rLP2086后实现≥1:16的hSBA效价的受试者比例对于A22为91.0%，对于A56为99.1%，对于B24为64.5%，且对于B44为66.7%。

对于组3、4和5，实现≥1:16的hSBA效价的受试者百分比证明仅2次剂量后疫苗引发针对亚家族A菌株的强力免疫应答。然而，3次剂量增加针对亚家族B菌株的应答的强度。

3次剂量的二价rLP2086后实现≥1:16的hSBA效价的受试者的百分比显示疫苗引发针对表达与疫苗组分不同的LP2086变体的MnB菌株的强力且广泛的免疫应答。

通过研究时间显示hSBA效价分布的反向累积分布曲线（RCDC）也对于每一菌株组间对于可评价的免疫原性群进行评估。RCDC显示2次剂量的二价rLP2086亚家族A菌株后的强力免疫应答。第三剂量的二价rLP2086后，应答曲线下面积对于所有4种主要MnB测试菌株增加，由此证实3剂量的二价rLP2086后免疫应答的增强。

来自主要和次要免疫原性终点分析的结果显示疫苗可以产生具有针对MnB的异源亚家族A和亚家族B变体的显著hSBA活性的抗体。尽管2或3次剂量的二价rLP2086后实现≥1:8的hSBA效价的受试者比例更高，但高比例的受试者在1次剂量的二价rLP2086后一个月实现≥1:8的hSBA效价。例如，参见组5。

对于4种主要MnB测试菌株，3剂量的二价rLP2086后（组1和2）比2剂量后（组3、4和5）的GMT更高。GMT在两个3剂量组中是相似的。GMT还在三个2剂量组中是相似的。这些数据也基于实现≥1:16的hSBA效价的受试者百分比证明3次剂量的二价rLP2086后的强力hSBA应答。

这些数据证明二价rLP2086的最终制剂产生强力免疫应答且当以2或3次剂量给予时是安全且完全耐受的。甚至1剂量的二价rLP2086也提供了高于基线的实质上的免疫应答且也是安全且完全耐受的。总之，在2或3次剂量的二价rLP2086后在安全性概况中不存在临床上有意义的差异。

实施例6

在三期、随机化的、设置对照的研究中脑膜炎球菌血清群B二价rLP2086疫苗在年龄11-18岁的健康青少年中的安全性、耐受性和免疫原性

背景：脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B（MnB）是青少年中侵袭性脑膜炎球菌疾病的主要原因。保守的、表面暴露的脂蛋白LP2086（因子H结合蛋白[fHBP]）是保护免于由MnB引起的侵袭性疾病的有希望的疫苗靶标。在三期2、随机化的、设置对照的研究中在11-18岁龄的健康青少年中检查研究中的二价、重组MnB疫苗（包括SEQIDNO:1和SEQIDNO:2、2.8摩尔比的聚山梨酯80、0.5mg/ml铝、10mM组氨酸和150mM氯化钠，本文所有实施例中称为“二价rLP2086”）的安全性、耐受性和免疫原性。

方法：研究1012检查了二价rLP2086的5种疫苗方案，而研究1010和1011评价了分别与TdaP-IPV和HPV疫苗同时给予的二价rLP2086的3剂量时间表。每一剂量的二价rLP2086含有60μg的rLP2086亚家族A变体A05和60μg的rLP2086亚家族B变体B01。为了检查二价rLP2086在三项研究中的每一项中的免疫原性，用表达异源fHBP变体A22、A56、B24和B44的4种MnB测试菌株进行使用人补体的血清杀菌测定（hSBA），选择所述测试菌株以代表fHBP变异性的相关多样性以及提供对于针对表达流行病学上流行的fHBP变体的菌株的疫苗引发的免疫应答宽度的观点。评价不利事件以及收集的局部和全身性反应。

结果：所有3个研究中82-100%的受试者在剂量3后1个月实现对于4种MnB测试菌株的每一种高于定量下限（LLOQ）的hSBA效价（表）。在这些研究中，大部分全身性事件和局部反应在严重程度上是轻度至中度的；不利事件通常不严重或不与研究疫苗有关。

结论：高于1：4的血清杀菌抗体效价保护免于侵袭性脑膜炎球菌疾病。在这些青少年2期研究中针对4种MnB测试菌株（各自对疫苗抗原是异源的）的hSBA效价≥LLOQ的证实表明二价rLP2086疫苗提供功能性抗体应答，其可以针对不同MnB疾病相关菌株是广泛有活性的。用二价rLP2086接种通常是完全耐受的。

实施例7

当同时施用人乳头瘤病毒疫苗时在11-18岁龄的健康青少年中脑膜炎球菌血清群B二价rLP2086疫苗的免疫原性

该2期、随机化的、观察者盲测的(observer-blind)、设置对照的研究在≥11至<18岁龄的健康青少年中评价具有或不具有共施用GARDASIL?的二价rLP2086的免疫原性，所述GARDASIL?为针对人乳头瘤病毒（HPV4）的四价疫苗（也描述于美国专利号5,820,870中）。GARDASIL含有HPV6型、11型、16型和18型（即HPV-6、HPV-11、HPV-16和HPV-18）L蛋白的重组抗原。终点为在每一可应用的血液采样时间点对于4种主要MnB测试菌株的每一种的hSBAGMT。

方法：受试者在第0、2和6个月时接受二价rLP2086(包括SEQIDNO:1和SEQIDNO:2、2.8摩尔比的聚山梨酯80、0.5mg/ml铝、10mM组氨酸、和150mM氯化钠)+HPV4(组1)、二价rLP2086+盐水(组2)或HPV4+盐水(组3)。通过使用人补体的血清杀菌测试（hSBA）使用4种MnB测试菌株（其各自表达与疫苗组分异源且代表fHBP多样性的宽度以及流行病学流行性的fHBP(A22、A56、B44和B24)）测试来自接种1前、和接种2和3后1个月的组1和2中的受试者的血清。评价的终点包括具有≥定量下限(LLOQ;1:16[A22]或1:8[A56、B44、B24])的hSBA效价的受试者比例和hSBA几何平均效价（GMT）。

为了证实相比于单独的GARDASIL施用GARDASIL加二价rLP2086的非劣等性，用2个hSBA（使用1种代表亚家族A变体主要测试菌株（A22）和1种代表亚家族B变体的主要测试菌株（B24））来进行免疫原性评价。然而，所有4种主要MnB测试菌株用于测定额外的二价rLP2086免疫原性/效力探索性终点。

为了评估针对二价rLP2086的免疫应答，在hSBA中用随机选自Pfizer代表性MnBSBA菌株库的脑膜炎球菌血清群B菌株分析功能性抗体，如实施例2中所述。hSBA测量人血清中的功能性抗体，其以补体依赖性方式杀死靶脑膜炎球菌菌株。

结果：814位和812位受试者分别包括对于组1和2可评价的免疫原性群。与接种1前相比，针对所有4种测试菌株具有hSBA效价≥LLOQ的受试者比例在接种2(55%–99%)和3(83%–99%;图1)后更高。实施例7的表A呈现通过对于可评价的免疫原性群的采样时间点的对于4种主要MnB菌株的每一种的hSBAGMT和相应CI。基线处GMT对于两组均低于hSBALLOQ。GMT在组1和2中范围分别为接种1后为11.1–70.6和11.9–76.3，和接种2后为25.8–117.2和28.0–128.2（下文表A）。

对于可评价的免疫原性群，对于组1和组2的接种3二价rLP2086后1个月时针对2种主要MnB菌株的hSBAGMT如下：对于A22分别为53.3和57.8，和对于B24分别为25.8和28.0。

对于组2（二价rLP2086＋盐水），在接种2后1个月的hSBAGMT对于A22为33.7，对于A56为76.3，对于B24为16.3且对于B44为11.9。在接种3后1个月的hSBAGMT对于A22为57.8，对于A56为128.2，对于B24为28.0且对于B44为31.9。

对于组1（二价rLP2086＋GARDASIL），在接种2后1个月的hSBAGMT对于A22为31.9，对于A56为70.6，对于B24为15.0且对于B44为11.1。在接种3后1个月的hSBAGMT对于A22为53.3，对于A56为117.2，对于B24为25.8且对于B44为27.2。

显示对于A22、A56、B24和B44的hSBA效价分布的反向累积分布曲线（RCDC）在可评价的免疫原性群的所有采样时间点对于组1和组2进行评价。RCDC显示大部分受试者在接种2后应答且在接种3后对于4种主要MnB测试菌株具有效价中的额外增加。对于抗原的免疫应答对于组1和2是相似的。

结论：二价rLP2086可以与HPV4施用而不影响通过hSBA血清应答或GMT评价的杀菌应答。由于hSBA效价≥1:4与针对脑膜炎球菌疾病的保护相关，因此这些数据表明在同时施用HPV疫苗环境中施用二价rLP2086后针对宽范围的MnB菌株的对于青少年保护的潜力。

实施例8

在健康青少年中与针对脑膜炎球菌血清群B的二价rLP2086疫苗共施用的人乳头瘤病毒疫苗的免疫原性

背景：该2期、随机化的研究在年龄≥11至<18岁的健康青少年中评价共施用针对人乳头瘤病毒（HPV4）的四价疫苗与二价rLP2086（针对由脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B（MnB）引起的侵袭性疾病的研究中的疫苗）。

方法：在第0、2和6个月受试者接受HPV4+二价rLP2086（组1）、二价rLP2086+盐水（组2）、或盐水+HPV4（组3）。在所有组中在基线和剂量2和3后收集血清。通过竞争性LUMINEX免疫测定(cLIAs)测定针对HPV4抗原(HPV-6、11、16和18)的免疫应答。通过使用人补体的血清杀菌测定（hSBA）用表达与疫苗异源的fHBP变体的2种MnB测试菌株（A22和B24）测量二价rLP2086免疫原性。免疫原性终点（剂量3后的所有）包括：组1和3中针对HPV抗原的几何平均效价（GMT）；组1和2中对于表达变体A22和B24的菌株的hSBAGMT；和组1和3中对于基线血清阴性受试者中的HPV抗原的血清转换率。二价rLP2086的安全性还在与HPV4或盐水共施用后评价。

针对GARDASIL(HPV6型、11型、16型、和18型L1蛋白)的免疫应答的评价使用基于荧光标记的基于微球的平台(LUMINEX)的cLIAs来进行。从用GARDASIL首次接种前（探视1）和用GARDASIL第三次接种后1个月（探视5）的组1和3中的所有受试者获得血清用在这些测定中。

组1和组3的针对4种HPV抗原的GMT的比较、及其组1与组3的相应GMT比率（GMR）和所述比率的2侧95％CI呈现在本实施例下文的表A中。非劣等性边缘的标准为1.5倍，其对应于GMR的2侧95％CI的下限的0.67的值。0.67的1.5倍标准对于除了HPV-18外的所有MnB测试菌株和HPV抗原均达到，所述HPV-18具有0.62的下界95％置信区间（CI）。在单独的分析中，≥99%的受试者在盐水＋HPV4和rLP2086＋HPV4组中血清转换为所有4种抗原。

本研究的另一目标是描述由二价rLP2086＋GARDASIL（组1）和由盐水＋GARDASIL（组3）诱导的免疫应答，如同在两组中GARDASIL的接种3剂量后（探视5）的HPV免疫原性测定中通过血清转换所测量的。

对于组1和组3中在基线处为血清阴性的受试者在最后剂量的GARDASIL后1个月，对于4种HPV抗原的每一种的血清转换率计算为对于HPV-6具有≥20mMU/ml、对于HPV-11具有≥16mMU/ml、对于HPV-16具有≥20mMU/ml和对于HPV-18具有≥24mMU/ml的抗HPV血清cLIA水平的受试者比例。

对于基线HPV血清阴性的可评价免疫原性群，在各组中用相应95％CI对于4种HPV抗原的血清转换实现预定标准的基线HPV血清阴性受试者的数目和比例、比例中的百分比差异（组1－组3）、和差异的95％CI均呈现在实施例8的表B中。

结果：对于4种HPV抗原中的3种（不是HPV-18）和两种MnB测试菌株达到（表A），在1.5倍设置预定非劣等性标准（对于GMR，95％CI的0.67下限）。组1和3的血清转换率对于所有HPV抗原为≥99%（表B）。相比于盐水，rLP2086后发生更高的局部反应原性，但用更晚的剂量不会增加；注射部位疼痛是最常见的局部反应。所有3组中的全身性事件通常在严重程度上是轻度和中度的。

对于可评价的免疫原性群，对于组1和组3的接种3时在GARDASIL剂量1个月后抗体对4种HPV抗原的GMT如下：分别为451.8和550.3(HPV-6);分别为892.9和1084.3(HPV-11);分别为3695.4和4763.4(HPV-16);和分别为744.0和1047.4(HPV-18)。接种3时GARDASIL剂量后一个月时组1与组3的GMR对于HPV-6为0.82(95%CI:0.72,0.94),对于HPV-11为0.82(95%CI:0.74,0.91),对于HPV-16为0.78(95%CI:0.68,0.88),和对于HPV-18为0.71(95%CI:0.62,0.81)。因此，组1相比于组3的抗HPVGMR的2侧95％CI的下限对于HPV-6为0.72、对于HPV-11为0.74、对于HPV-16为0.68和对于HPV-18为0.62。0.67的1.5倍标准（GMR的2侧95％CI的下限）对于除了HPV-18的所有HPV抗原均达到，所述HPV-18具有0.62的95％CI的下界。

接种3二价rLP2086剂量后一个月，二价rLP2086+GARDASIL组比二价rLP2086+盐水组的GMR对于A22为0.92(95%CI:0.85,1.00),和对于B24为0.92(95%CI:0.84,1.01)。组1与组2相比的hSBAGMR的2侧95％CI的下限对于A22为0.85和对于B24为0.84，其均大于0.67且因此达到1.5倍的非劣等性边缘。

通过分析接种3后1个月时对于2种主要MnB菌株（A22和B24）的hSBA效价4倍应答率将来自二价rLP2086+GARDASIL(组1)施用的数据与来自二价rLP2086+盐水(组2)的数据比较。对于接受二价rLP2086+GARDASIL的组1受试者和接受二价rLP2086+盐水的组2受试者测量从基线至对于2种主要MnB菌株的接种3后1个月的hSBA效价中实现≥4倍升高的受试者的比例。在组1的受试者中，85.3％展示出针对B24的hSBA效价的≥4倍升高。在组2的受试者中，86.4％展示出针对A22的hSBA效价中≥4倍升高，且84.8％展示出针对B24的hSBA效价中≥4倍升高。

接种3后1个月组1和组2之间应答者比例中的差异为对于A22为-1.1%(95%CI:-4.6,2.3),和对于B24为-1.4%(95%CI:-5.1,2.3)。4倍应答率的差异均接近1％的值，且比例差异的95％CI的下界为-4.6%A22和-5.1%B24。

相比于盐水+GARDASIL或相比于二价rLP2086+盐水的二价rLP2086+GARDASIL的非劣等性标准要求接种3后1个月对于针对HPV（对于所有4种HPV抗原(HPV-6,HPV-11,HPV-16和HPV-18)）的抗体和对于使用2种主要MnB测试菌株（A22和B24）的hSBA效价的GMR的2侧95％CI的下限大于0.67。对于两种MnB测试菌株和4种HPV抗原中的至少3种达到了该预定标准。对于HPV-18，GMR的2侧CI的下限略微低于0.67的预定阈值，为在0.62。

对于2种主要MnB测试菌株（A22和B24）的4倍升高应答在接受二价rLP2086+GARDASIL的组和接受二价rLP2086+盐水的组之间是相似的(范围83.4%-86.4%)。

组1和2中具有接种前（即接种1前）hSBA效价≥1:4的受试者比例对于菌株A22分别为15.2%和18.8%；对于菌株A56分别为10.4%和10.5%；对于B24分别为6.1%和8.4%；和对于菌株B44分别为1.7%和3.2%。此外，组2和1中具有接种前hSBA效价≥1:16的受试者比例对于菌株A22分别为13.7%和16.4%；对于菌株A56分别为9.0%和9.1%；对于B24分别为4.1%和5.4%；和对于菌株B44分别为1.2%和2.1%。

在组2（二价rLP2086＋盐水）中，在接种2后1个月时具有≥1:4的hSBA效价的受试者比例对于A22为86.3%，对于A56为98.7%，对于B24为77.1%，且对于B44为60.1%。接种3后1个月，具有≥1:4的hSBA效价的受试者比例对于A22为96.4%，对于A56为99.4%，对于B24为92.8%，且对于B44为86.5%。在组1（二价rLP2086＋GARDASIL）中，在接种2后1个月时具有≥1:4的hSBA效价的受试者比例对于A22为83.8%，对于A56为97.8%，对于B24为71.9%，且对于B44为57.7%。接种3后1个月，具有≥1:4的hSBA效价的受试者比例对于A22为94.3%，对于A56为99.1%，对于B24为91.1%，且对于B44为84.4%。

在组2（二价rLP2086＋盐水）中，在接种2后1个月时具有≥1:16的hSBA效价的受试者比例对于A22为85.8%，对于A56为98.4%，对于B24为68.8%，且对于B44为49.9%。在接种3后1个月时，具有≥1：16的hSBA效价的受试者比例对于A22为96.3%，对于A56为99.4%，对于B24为89.2%，且对于B44为82.4%。在组1（二价rLP2086＋GARDASIL）中，在接种2后1个月时具有≥1:16的hSBA效价的受试者比例对于A22为83.0%，对于A56为97.2%，对于B24为65.2%，且对于B44为46.4%。在接种3后1个月时，具有≥1：16的hSBA效价的受试者比例对于A22为94.0%，对于A56为98.9%，对于B24为86.3%，且对于B44为78.0%。

对于组1和组2两者，2或3次剂量的二价rLP2086后高比例的受试者实现≥1:16或更高的hSBA效价，而在接种前探视1时大部分受试者对于主要MnB测试菌株的任一种均不具有可测量的hSBA效价。

对于基线HPV血清阴性可评价免疫原性群，对于二价rLP2086+GARDASIL组(组1)和盐水+GARDASIL组(组3)在接种3的GARDASIL剂量后1个月时，对于HPV抗原实现HPV血清转换的预定标准的受试者比例如下：HPV-6(分别为99.4%和99.3%),HPV-11(分别为99.6%和99.5%),HPV-16(分别为99.6%和99.5%),和HPV-18(分别为99.5%和99.0%)。

GARDASIL剂量后1个月时二价rLP2086+GARDASIL组(组1)和盐水+GARDASIL组(组3)之间应答者的比例中的差异为对于HPV-6为0.1％(95%CI;-0.9,1.5),对于HPV-11为0.1%(95%CI:-0.7,1.3),对于HPV-16为0.1%(95%CI;-0.7,1.3),和对于HPV-18为0.5%(95%CI;-0.6,1.9)。

对于二价rLP2086+GARDASIL组(组1)和盐水+GARDASIL组(组3)，在所有4种HPV抗原的血清转换率差异在0.1％和0.5％内，且血清转换率组间非常相似，对于所有4种HPV抗原具有大于99％的受试者血清转换。

作为额外评价，通过分析接种3后1个月时对于2种主要MnB菌株（A22和B24）的hSBA效价4倍应答率将二价rLP2086+GARDASIL(组1)与二价rLP2086+盐水(组2)比较。从基线至接种3后1个月对于2种主要MnB菌株实现hSBA效价倍数升高≥4的受试者比例如下：在组1的受试者中，85.3%展示出针对测试菌株A22的hSBA效价中≥4倍升高，且83.4%展示出针对测试菌株B24的hSBA效价中≥4倍升高。在组2的受试者中，86.4%展示出针对测试菌株A22的hSBA效价中≥4倍升高，且84.8%展示出针对测试菌株B24的hSBA效价中≥4倍升高。

接种3后1个月组1和组2之间应答者比例中的差异为对于A22为-1.1%(95%CI:-4.6,2.3)和对于B24为-1.4%(95%CI:-5.1,2.3)。4倍应答率的差异均接近1％的值，且比例差异的95％CI的下界为-4.6%A22和-5.1%B24。

针对二价rLP2086的免疫应答本研究的另一目标是描述如通过用4种主要MnB测试菌株（2种表达LP2086亚家族A蛋白（A22和A56）且2种表达LP2086亚家族B蛋白（B24和B44））进行的hSBA测量的（在第二次探视（探视3）和用二价rLP2086第三次（探视5）接种后1个月测量的）免疫应答。

该目标的终点之一是在接种2（探视3）后1个月时和在接种3（探视5）后1个月时对于4种主要MnB测试菌株的每一种具有hSBA效价≥LLOQ的受试者的比例。评估对于4种主要MnB测试菌株的每一种对于可评价的免疫原性群具有≥LLOQ的hSBA效价的受试者比例。A22的LLOQ为等于1：16的hSBA效价而对于所有其他MnB测试菌株的LLOQ为等于1：8的hSBA效价。

对于组2（二价rLP2086＋盐水），在基线（接种1前）具有≥LLOQ的hSBA效价的受试者比例对于A22为16.4%，对于A56为9.3%，对于B24为6.9%，且对于B44为2.5%。对于组2，接种2后1个月时和接种3后1个月时实现≥LLOQ的hSBA效价的受试者比例对于A22分别为85.8%和96.3%，对于A56分别为98.5%和99.4%，对于B24分别为74.2%和92.6%，且对于B44分别为57.1%和85.7%。

对于组1（二价rLP2086＋GARDASIL），在基线（接种1前）具有≥LLOQ的hSBA效价的受试者比例对于A22为13.7%，对于A56为9.2%，对于B24为5.1%，且对于B44为1.4%。对于组1，接种2后1个月时和接种3后1个月时实现≥LLOQ的hSBA效价的受试者比例对于A22分别为83.0%和94.0%，对于A56分别为97.5%和98.9%，对于B24分别为70.6%和90.5%，且对于B44分别为54.5%和82.7%。

接种2后1个月时在组1和组2受试者中观察到针对4种主要MnB测试菌株的实质上的hSBA应答，且接种3后1个月观察到额外的增加。

评价对于4种主要MnB测试菌株的每一种实现hSBA效价倍数升高≥4的受试者比例和对于可评价免疫原性群实现复合应答的受试者比例。在基线（接种1前）对于组合的所有4种MnB菌株具有观察到的hSBA效价≥LLOQ的受试者比例在组1(0.3%)和组2(0.7%)之间是相似的。

对于组2（二价rLP2086＋盐水），从基线至接种3后1个月实现hSBA效价倍数升高≥4的受试者比例对于A22为86.4％，对于A56为95.3％，对于B24为84.8％，和对于B44为80.7％，且83.9％的受试者实现复合hSBA应答（对于组合的所有4种主要菌株hSBA≥LLOQ）。接种2后1个月时，从基线实现hSBA效价倍数升高≥4的受试者比例对于A22为74.2%，对于A56为92.6%，对于B24为63.4%，和对于B44为47.4%，且51.9%的受试者实现复合hSBA应答。

对于组1（二价rLP2086＋盐水），从基线至接种3后1个月实现hSBA效价倍数升高≥4的受试者比例对于A22为86.4％，对于A56为95.3％，对于B24为84.8％，和对于B44为80.7％，且83.9％的受试者实现复合hSBA应答（对于组合的所有4种主要菌株hSBA≥LLOQ）。接种2后1个月时，从基线实现hSBA效价倍数升高≥4的受试者比例对于A22为74.2%，对于A56为92.6%，对于B24为63.4%，和对于B44为47.4%，且51.9%的受试者实现复合hSBA应答。

额外的hSBA倍数应答。其他终点为从基线至每一接种后血液采样探视对于4种主要MnB菌株的每一种实现至少2倍和3倍hSBA效价增加的受试者的比例。注意A22的LLOQ为等于1：16的hSBA效价而对于所有其他MnB测试菌株的LLOQ为等于1：8的hSBA效价。

从基线至接种2后1个月组1和组2的对于MnB菌株实现hSBA效价中≥2倍升高的受试者比例对于A22分别为77.3%和81.1%，对于A56分别为94.4%和95.3%，对于B24分别为63.0%和66.0%，且对于B44分别为46.1%和48.6%。从基线至接种3后1个月组1和组2的对于MnB菌株实现hSBA效价倍数升高≥2的受试者比例对于A22分别为90.2%和92.8%，对于A56分别为97.2%和97.9%，对于B24分别为84.6%和87.2%，且对于B44分别为77.7%和81.7%。

从基线至接种2后1个月组1和组3的对于MnB菌株实现hSBA效价倍数升高≥3的受试者比例对于A22分别为73.1%和74.2%，对于A56分别为92.5%和92.6%，对于B24分别为61.3%和63.4%，且对于B44分别为45.7%和47.4%。从基线至接种3后1个月组1和组3的对于MnB菌株实现hSBA效价倍数升高≥3的受试者比例对于A22分别为85.3%和86.4%，对于A56分别为95.0%和95.3%，对于B24分别为83.4%和84.8%，且对于B44分别为77.0%和80.7%。

对目标下描述性终点概况说来，对于组1(二价rLP2086+GARDASIL)和组2(二价rLP2086+盐水)两者，大部分受试者实现对于所有4种主要MnB测试菌株的hSBA效价≥LLOQ，而仅非常小比例的受试者在基线（接种前探视1）时具有可测量的hSBA效价≥LLOQ。用4种MnB菌株的实质上免疫应答在接种2后1个月观察到，且对于组1和组2受试者在接种3后1个月观察到额外的增加。这一结论通过以下证实：3次剂量后具有hSBA效价≥1:16的受试者的比例，两组中2次剂量后和3次剂量后实现的观察到的GMT，和对于4种主要MnB测试菌株的RCDC。

对于组1和组2，高比例的受试者实现对于主要MnB测试菌株的每一种的hSBA效价倍数升高≥4和第三次研究接种后对于所有4种主要MnB菌株的复合hSBA应答≥LLOQ。

此外，对于组1(二价rLP2086+GARDASIL)和组2(二价rLP2086+盐水)，大多数受试者实现对于4种主要MnB菌株在所有采样时间点的hSBA效价倍数升高≥3和hSBA效价倍数升高≥2。具有达到这些标准的结果的受试者比例相比于2次接种在3次接种后更高。

这些结果支持这一论据，即当与HPV疫苗GARDASIL共施用时，针对二价rLP2086的免疫应答产生与针对二价rLP2086＋盐水的免疫应答相当的强力的免疫应答。

实施例8的表B呈现在可评价免疫原性群中对于组1(二价rLP2086+GARDASIL)和组3(盐水+GARDASIL)在接种3后1个月时对于4种HPV抗原的每一种的GMT和相应的CI。

对于组3，在基线（接种1前）和接种3后1个月时的HPVGMT对于HPV-6分别为6.0和550.3；对于HPV-11分别为4.3和1084.3；对于HPV-16分别为6.1和4763.4；和对于HPV-18分别为5.3和1047.4。对于组1（二价rLP2086+GARDASIL），在基线（接种1前）和接种3后1个月时的HPVGMT对于HPV-6分别为5.8和451.8；对于HPV-11分别为4.2和892.9；对于HPV-16分别为5.8和3695.4；和对于HPV-18分别为5.2和744.0。总体上，相比于组1，GMT对于组3在数值上更高。显示对于HPV-6,HPV-11,HPV-16和HPV-18的效价分布的反向累积分布曲线（RCDC）在可评价的免疫原性群的所有采样时间点对于组1（二价rLP2086+GARDASIL）和组3（盐水+GARDASIL）进行评价。RCDC显示对于组1和组3在接种3后受试者中的强力免疫应答。

针对GARDASIL的免疫应答的概述。相比于组1（二价rLP2086+GARDASIL），针对HPV抗原的GMT对于组3（盐水+GARDASIL）在数值上更高，且接种3后观察到的HPVGMT表明对于两组的强力的免疫应答。RCDC还支持对于组1和组3在接种3后的强力免疫应答。这也被对于4种HPV抗原具有血清阳性状态的受试者比例所支持，其在接种3后1个月对于两组均为>99%。组3（盐水+GARDASIL）中年龄更小的亚组比年龄更大的亚组具有更高的HPVGMT。当GARDASIL与二价rLP2086同时给予时维持这一差异。

免疫原性结论相比于盐水+GARDASIL或相比于二价rLP2086+盐水的二价rLP2086_GARDASIL的非劣等性标准要求接种3后1个月对于针对HPV（对于所有4种HPV抗原(HPV-6,HPV-11,HPV-16和HPV-18)）的抗体和对于使用2种主要MnB测试菌株（A22和B24）的hSBA效价的几何平均效价比率（GMR）的2侧95％CI的下限大于0.67。对于两种MnB菌株和4种HPV抗原中的3种达到了该预定阈值。对于HPV-18，GMR的2侧95％CI的下限略微低于0.67的预定阈值，为在0.62。

99％或更多的同时接受GARDASIL与二价rLP2086或盐水的组的受试者实现对于所有4种HPV抗体的血清转换。对于所有4种HPV抗原的RCDC显示大多数受试者实现在接种3后1个月高于血清转换阈值的应答。相对于基线的强力GMT对于接受GARDASIL的两组均观察到。

对于2种主要MnB测试菌株（A22和B24）的4倍升高应答在接受二价rLP2086+GARDASIL的组(分别为85.3%和83.4%)和接受二价rLP2086+盐水的组(分别为86.4%和84.8%)之间是相似的(范围83.4%-86.4%)。

针对二价rLP2086的应答的进一步描述性分析使用4种主要MnB测试菌株(A22,A56,B24和B44)进行。在接种2或3后1个月，对于接受二价rLP2086与同时的GARDASIL(二价rLP2086+GARDASIL)或与同时的盐水(二价rLP2086+盐水)的两组，高比例的受试者实现对于可评价的免疫原性群的hSBA效价倍数升高≥4和复合应答（所有4种MnB测试菌株和3期临床程序中使用的相同的免疫原性/效力终点定义）。这些应答实质上高于hSBA效价≥1:4（其已证实与保护免于包括血清群B疾病在内的脑膜炎球菌疾病相关）。这些结果还表明和支持针对二价rLP2086（无论是否与盐水或与GARDASIL同时施用）的强力免疫应答的证据。

结论：数据表明针对两种疫苗的强力免疫应答在同时施用rLP2086+HPV4后产生。预定的非劣等性标准对于6种抗原中的5中达到。尽管针对HPV-18的GMR勉强错过非劣等性标准，但高比例的应答者(≥99%)表明预期同时在施用后维持临床有效性。二价rLP2086是完全耐受且引发针对表达与疫苗中的那些异源的fHBP的测试菌株的强力免疫应答。

CI=置信区间；GMT=几何平均效价；HPV=人乳头瘤病毒；hSBA=使用人补体的血清杀菌测定；LLOQ=定量下限；NA=不可应用。

注意：LLOQ=对于HPV-6为11mMU/ml,对于HPV-11为8mMU/ml;对于HPV-16为11mMU/ml;和对于HPV-18为10mMU/ml。LLOQ=对于A22为1:16;对于A56,B24和B44为1:8。低于LLOQ的结果设定为0.5*LLOQ用于分析。

a.n=对于给定抗原或菌株具有有效且确定的测定结果的受试者数目。

b.使用在接种3后1个月具有有效且确定的测定结果的所有受试者计算几何平均效价（GMT）。

c.置信区间（CI）为基于Studentt分布对于测定结果的平均对数的置信区间的回转换（backtransformations）。

d.GMT的比率（对于HPV抗原效价为组1/组3，和对于hSBA菌株效价为组1/组2）。

e.置信区间（CI）为基于Studentt分布对于测定值对数的平均差的置信区间的回转换（对于HPV效价为组1-组3，和对于hSBA菌株效价为组1-组2）。

CI=置信区间；HPV=人乳头瘤病毒。

a.N=对于给定抗原具有基线HPV血清阴性状态的受试者数目。

b.n=对于给定抗原在接种3后1个月实现血清转换（预定标准）的受试者数目。

c.基于观察到的受试者比例的精确2侧置信区间(Clopper和Pearson)。

d.比例中的差异，表示为百分比。

e.对于比例中的差异的精确2侧置信区间（基于Chan&Zhang），表示为百分比。

实施例9：二价rLP2086疫苗效力

二价rLP2086的效力已使用hSBA应答作为效力的代用品和针对侵袭性脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B（MnB）菌株的血清杀菌抗体应答的证实来推断。

对于MnB菌株，引起侵袭性脑膜炎球菌疾病（IMD）的菌株代表用于评价中。每一MnB测试菌株表达fHBP蛋白变体(A22,A56,B24或B44)，其与疫苗组分(A05和B01)异源（不同）。

二价rLP2086的效力在美国和欧洲的4459位11-18岁龄的青少年中进行的3随机对照的II期研究中评价。还参见实施例6。总计2293位使用0、2和6月接种时间表接受至少1剂量的120μg二价rLP2086。效力通过在接种有二价rLP2086的受试者中评价hSBA免疫应答来评估。

使用5个主要疗效(co-primary)免疫原性终点推断效力。对于5个主要疗效终点中的4个，受试者中的预定比例必须在3次剂量的二价rLP2086后针对4种MnB测试菌株的每一种实现hSBA效价中的4倍升高。第五共同主要疗效终点为复合终点，其需要预定的高比例的受试者各自在3次剂量的二价rLP2086后在用主要MnB测试菌株的所有4种hSBA中均应答。免疫应答还基于第三剂量疫苗后1个月实现hSBA效价≥定量下限(LLOQ)的受试者比例来评估。LLOQ定义为可以测量的样品中抗体的最低量。

研究1（描述于实施例7和实施例8）为II期、随机化的、活性对照的（active-controlled）、观察者盲测的、多中心试验，其中2499位美国受试者（11-17岁龄）随机分配至（以2:2:1比例）3组中的一组：组1接受二价rLP2086+HPV4，组2接受二价rLP2086+盐水，和组3接受盐水+HPV4。所有接种在0、2和6月时间表上施用。

研究2（描述于实施例4）为II期、随机化的、安慰剂对照的、单盲试验，其中753位欧洲受试者（11-18岁龄）随机分配至（以1:1比例）2组：组1接受在0、2和6月时的二价rLP2086和第0月时的dTa-IPV（白喉、破伤风、无细胞百日咳-灭活的脊髓灰质炎病毒）。组2接受在0、2和6月时的盐水和第0月时的dTa-IPV。

研究3（描述于实施例5）为II期、随机化的、安慰剂对照的、单盲的、多中心试验，其中1,713位欧洲受试者（11-18岁龄）随机分配至（以3:3:3:2:1比例）5组。受试者接受在0、1、和6月时间表（组1）；在0、2和6月时间表（组2）；在0和6月时间表（组3）；在0和2月时间表（组4）；或在0和4月时间表（组5）施用的2或3次剂量的二价rLP2086。每组中施用盐水注射（1或2次剂量，取决于组）以维持盲测（theblind）。

研究1、2和3中在0、2和6月时接受3剂量系列的二价rLP2086的受试者中的结果上文描述于各实施例4-8中。4倍和复合应答率的评价为所有研究的探索性终点。4倍应答率显示对于所有4个终点的95％置信区间（CI）的下界在3个研究中是相似的且一致地达到III期终点的阈值限。实现hSBA效价≥LLOQ的受试者比例在3个研究中是相似的。

基于1或2个月分开给予疫苗的2次施用后获得的hSBA数据，在这些间隔上施用2次剂量的疫苗可以提供针对由于潜在暴露于脑膜炎球菌血清群B疾病的病例而处于增加的风险中的个体的保护。1或2个月分开递送的2次疫苗施用后观察到的应答显示一定比例的受试者表达等于或高于对于4种主要测试菌株的每一种的LLOQ值的hSBA水平（参见组1和组2的研究1的结果；参见组1的研究2的结果；参见组2的研究3的结果）。6个月时施用的第三剂量的疫苗可以实现疫苗介导的保护。

同时疫苗施用研究1（描述于实施例7和实施例8）评价在美国青少年中二价rLP2086和HPV4的同时使用。研究终点包括第三接种后1个月对于HPV4抗原（基于几何平均效价[GMT]）和对于二价rLP2086（基于使用两种MnB测试菌株[变体A22和B24]的hSBA）的免疫应答的非劣等性评价。HPV4免疫应答还通过4种HPV抗原的每一种的血清转换来评价。

研究1显示组1（二价rLP2086+HPV4）和组3（盐水+HPV4）的抗体针对HPV抗原的几何平均效价（GMT），以及组1和组3之间的其相应的GMT比率（GMR）和该比率的2侧95％CI。研究1还提供组1和组2的针对2种主要MnB测试菌株的hSBAGMT的比较以及组1和组2之间其相应的GMR和该比率的2侧95％CI。非劣等性边缘的标准为1.5倍，其对应于GMR的2侧95％CI的下限的0.67的值。0.67的1.5倍标准对于除了HPV-18外的所有MnB测试菌株和HPV抗原均达到，所述HPV-18具有0.62的下界95％置信区间（CI）。尽管针对HPV-18的应答未达到预定的非劣等性标准，但差异是微小的。在单独的分析中，≥99%的受试者在盐水＋HPV4和二价rLP2086＋HPV4组中血清转换为所有4种抗原。

实施例10：

二价rLP2086在个体中引发抗体，其提供针对表达流行的和爆发相关的fHBP变体的MnB菌株的宽覆盖

使用人补体的血清杀菌测定（hSBA）中测量的杀菌抗体已与针对脑膜炎球菌疾病的保护相关且hSBA应答已常规用作疫苗效力的代用品。fHBP多样性的全球流行病学研究揭示～80%的脑膜炎球菌疾病由表达10种流行fHBP变体之一的菌株引起。

方法：在用二价rLP2086免疫的个别人受试者中评价针对表达在美国和欧洲中10种最流行fHBP变体(B24、B16、B44、A22、B03、B09、A12、A19、A05和A07)的脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B（MnB）菌株的hSBA应答。表达这十种最流行变体的MnB菌株代表fHBP多样性的宽度，包括6种主要fHBP亚群中的5种，其分别代表MnBSBA菌株库和MnBSBA菌株库的美国子集中>98%和97%的菌株（以亚群计）。二十三种MnB测试菌株获自PfizerMnBSBA菌株库(N=1263)，其代表在2000年和2006年之间系统收集自美国和欧洲的菌株。此外，来自近期MnB疾病爆发的分离株也包括在分析内。匹配的接种前和接种后血清（剂量2后和剂量3后）随机获自参与临床研究B1971005、B1971012或B1971003的青少年和年轻成年人受试者。

为了提供支持用二价rLP2086接种提供的潜在覆盖的额外信息，用爆发菌株和来自用二价rLP2086免疫的9位受试者的血清样品进行hSBA（临床研究B1971012，描述于实施例5和实施例6）。受试者（11至<19岁龄）已接受在0、2和6个月时3次剂量的二价rLP2086。为了确保保守hSBA评价，以无偏见方式从一组不具有针对主要MnB测试菌株的基线hSBA活性的受试者中选择9位受试者。测试克隆的普林斯顿大学爆发菌株中的两株(PMB5021和PMB5025)和UCSB爆发菌株中的两株（两种基因簇PMB4478和PMB4479各一株）。

克隆的普林斯顿大学MnB爆发菌株的基因表征如下：数据表明普林斯顿大学爆发菌株是克隆的。菌株的每一株录入为CC41/44(ST409)并且表达fHBP变体B153(SEQIDNO:6)。菌株对于NHBA(2)、porA(亚型P1.5-1,2-2)和porB(3-82)具有相同的等位基因分配，所有菌株均不含nadA，并且所有菌株具有相同的脉冲场凝胶电泳(PFGE)概况(429)。

2013UniversityofCaliforniaSantaBarbara爆发菌株的基因表征如下：UCSB菌株录入为CC32(ET5;ST32)，表达fHBP变体B24，且与自从1993年已导致高度地方性的血清群B疾病的Oregon克隆相关。与菌株的Princeton爆发组不同，UCSB菌株遗传上分离为两个不同簇，其通过其PFGE概况（468或467）和porB类型(3-461或3-24)而有所区别。菌株对于NadA(1)、NHBA(5)、porA(亚型P1.7,16-20)具有相同的等位基因分配。

对于所有受试者和所有爆发菌株在基线的hSBA效价<4，表明受试者在用二价rLP2086免疫前不具有针对任何爆发菌株的保护性抗体。

结果：所有23种MnB菌株在用来自用二价rLP2086免疫的单独受试者的血清的hSBA中是易感的。代表所有10种流行性fHBP变体的菌株以及额外菌株均被hSBA杀死。基线hSBA血清保护率（实现hSBA效价≥1:4的受试者的比例）普遍低。二价rLP2086免疫前受试者中观察到的更低的血清保护率例证未接种的青少年或年轻成年人群对于MnB疾病的脆弱性。然而，在青少年和年轻成年人中用接种后血清观察到强力的血清保护率：取决于MnB菌株和测试的群体，对于这些菌株的83%观察到>70%的血清保护率。表达最流行的亚家族A和BfHBP变体B24和A22的菌株的接种后血清保护率对于表达fHBP变体B24和B153的近期爆发菌株范围为81.0%-100%和77.8%-100%。此外，针对所有爆发菌株的强力剂量2后应答（相比于基线）在这些受试者中观察到，取决于hSBA中所用的爆发菌株，范围为56-89%。相反，对于近期美国爆发的菌株，接种前血清保护率是低的或不可检测的。针对普林斯顿大学和UCSB爆发菌株的hSBA应答显示于图2。

结论：二价rLP2086引发个体中对于表达美国和欧洲流行的fHBP的不同侵袭性MnB菌株以及新近出现的变体(B153)(SEQIDNO:6)的强力的血清保护性hSBA应答。用二价rLP2086接种后显示血清保护性应答的受试者比例大大超过了在基线处血清保护的受试者的比例。数据支持二价rLP2086具有为青少年和年轻成年人提供免于侵袭性脑膜炎球菌血清群B疾病包括来自近期爆发的疾病的广泛保护的潜力。

。

序列表

<110>PfizerInc.

<120>脑膜炎奈瑟氏球菌组合物及其方法

<130>PC072048

<150>61/875068

<151>2013-09-08

<150>61/926717

<151>2014-01-13

<150>61/989432

<151>2014-05-06

<160>23

<170>PatentIn版本3.5

<210>1

<211>258

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的氨基酸序列

<400>1

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151015

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202530

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<220>

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65707580

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100105110

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165170175

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180185190

ProGluLeuAsnValAspLeuAlaValAlaTyrIleLysProAspGlu

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<213>人工序列

<220>

<223>合成的氨基酸序列

<400>4

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<210>5

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的氨基酸序列

<400>5

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151015

<210>6

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<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的氨基酸序列

<400>6

CysSerSerGlyGlyGlyGlyValAlaAlaAspIleGlyAlaGlyLeu

151015

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ProLysGlyGlySerAlaThrTyrArgGlyThrAlaPheGlySerAsp

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<400>7

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<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(组B)

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<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(组B)

<400>10

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AlaSerAlaGluLeuLysAlaAspGluLysSerHisAlaValIleLeu

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<210>11

<211>263

<212>PRT

<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(组B)

<400>11

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260

<210>12

<211>255

<212>PRT

<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(组B)

<400>12

CysSerSerGlyGlyGlyGlyValAlaAlaAspIleGlyAlaGlyLeu

151015

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115120125

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165170175

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180185190

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195200205

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210215220

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<210>13

<211>255

<212>PRT

<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(组B)

<400>13

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100105110

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130135140

ProLysGlyGlySerAlaThrTyrArgGlyThrAlaPheGlySerAsp

145150155160

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165170175

GlyHisGlyLysIleGluHisLeuLysSerProGluLeuAsnValGlu

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LeuAlaThrAlaTyrIleLysProAspGluLysArgHisAlaValIle

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<211>255

<212>PRT

<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(组B)

<400>14

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<210>15

<211>255

<212>PRT

<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(组B)

<400>15

CysSerSerGlyGlyGlyGlyValAlaAlaAspIleGlyAlaGlyLeu

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GlyAsnGlyLysIleGluHisLeuLysSerProGluLeuAsnValAsp

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195200205

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LysThrValAsnGlyIleArgHisIleGlyLeuAlaAlaLysGln

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<210>16

<211>263

<212>PRT

<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(组B)

<400>16

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115120125

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245250255

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260

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<211>255

<212>PRT

<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(组B)

<400>17

CysSerSerGlyGlyGlyGlyValAlaAlaAspIleGlyAlaGlyLeu

151015

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130135140

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GlyHisGlyLysIleGluHisLeuLysSerProGluLeuAsnValAsp

180185190

LeuAlaAlaSerAspIleLysProAspLysLysArgHisAlaValIle

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SerGlySerValLeuTyrAsnGlnAlaGluLysGlySerTyrSerLeu

210215220

GlyIlePheGlyGlyGlnAlaGlnGluValAlaGlySerAlaGluVal

225230235240

GluThrAlaAsnGlyIleArgHisIleGlyLeuAlaAlaLysGln

245250255

<210>18

<211>254

<212>PRT

<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(组B)

<400>18

CysSerSerGlyGlyGlyGlyValAlaAlaAspIleGlyAlaGlyLeu

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115120125

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130135140

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ProAsnGlyArgLeuHisTyrSerIleAspPheThrLysLysGlnGly

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TyrGlyArgIleGluHisLeuLysThrProGluGlnAsnValGluLeu

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AlaSerAlaGluLeuLysAlaAspGluLysSerHisAlaValIleLeu

195200205

GlyAspThrArgTyrGlySerGluGluLysGlyThrTyrHisLeuAla

210215220

LeuPheGlyAspArgAlaGlnGluIleAlaGlySerAlaThrValLys

225230235240

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245250

<210>19

<400>19

000

<210>20

<211>257

<212>PRT

<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(组B)

<400>20

CysSerSerGlyGlyGlyGlyValAlaAlaAspIleGlyAlaGlyLeu

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859095

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GlnArgSerPheLeuValSerGlyLeuGlyGlyGluHisThrAlaPhe

130135140

AsnGlnLeuProGlyGlyLysAlaGluTyrHisGlyLysAlaPheSer

145150155160

SerAspAspAlaGlyGlyLysLeuThrTyrThrIleAspPheAlaAla

165170175

LysGlnGlyHisGlyLysIleGluHisLeuLysThrProGluGlnAsn

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ValGluLeuAlaAlaAlaGluLeuLysAlaAspGluLysSerHisAla

195200205

ValIleLeuGlyAspThrArgTyrGlySerGluGluLysGlyThrTyr

210215220

HisLeuAlaLeuPheGlyAspArgAlaGlnGluIleAlaGlySerAla

225230235240

ThrValLysIleGlyGluLysValHisGluIleSerIleAlaGlyLys

245250255

Gln

<210>21

<211>254

<212>PRT

<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(组B)

<400>21

CysSerSerGlyGlyGlyGlyValAlaAlaAspIleGlyAlaGlyLeu

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100105110

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ProAsnGlyArgLeuHisTyrSerIleAspPheThrLysLysGlnGly

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TyrGlyArgIleGluHisLeuLysThrProGluGlnAsnValGluLeu

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GlyAspThrArgTyrGlyGlyGluGluLysGlyThrTyrHisLeuAla

210215220

LeuPheGlyAspArgAlaGlnGluIleAlaGlySerAlaThrValLys

225230235240

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245250

<210>22

<211>262

<212>PRT

<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(组B)

<400>22

CysSerSerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlyValAlaAlaAsp

151015

IleGlyThrGlyLeuAlaAspAlaLeuThrAlaProLeuAspHisLys

202530

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505560

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100105110

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225230235240

IleAlaGlySerAlaThrValLysIleGlyGluLysValHisGluIle

245250255

GlyIleAlaGlyLysGln

260

<210>23

<211>255

<212>PRT

<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(组B)

<400>23

CysSerSerGlyGlyGlyGlyValAlaAlaAspIleGlyAlaGlyLeu

151015

AlaAspAlaLeuThrAlaProLeuAspHisLysAspLysGlyLeuGln

202530

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LeuAlaAlaAlaAspIleLysProAspGluLysHisHisAlaValIle

195200205

SerGlySerValLeuTyrAsnGlnAlaGluLysGlySerTyrSerLeu

210215220

GlyIlePheGlyGlyLysAlaGlnGluValAlaGlySerAlaGluVal

225230235240

LysThrValAsnGlyIleArgHisIleGlyLeuAlaAlaLysGln

245250255

Claims (35)

1.组合物，其包含

a)包含SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的第一脂质化多肽、

b)包含SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的第二脂质化多肽。

2.根据权利要求1的组合物，其进一步包含聚山梨酯80、铝、组氨酸和氯化钠。

3.根据权利要求2的组合物，其中所述组合物包含约120μg/ml的第一多肽；约120μg/ml的第二多肽；约2.8摩尔比的聚山梨酯80；约0.5mg/ml铝；约10mM组氨酸；和约150mM氯化钠。

4.根据权利要求2的组合物，其中所述组合物包含约60μg的第一多肽；约60μg的第二多肽；约18μg的聚山梨酯80；约250μg铝；约780μg组氨酸；和约4380μg氯化钠。

5.根据权利要求1的组合物，其中所述组合物诱导血清免疫球蛋白的杀菌效价，当在相同条件下在使用人补体的血清杀菌测定中测量时，所述血清免疫球蛋白的杀菌效价为在接受第一剂量后的人中比在接受所述第一剂量前的人中的血清免疫球蛋白的杀菌效价高至少大于1倍。

6.根据权利要求1的组合物，其中所述组合物诱导血清免疫球蛋白的杀菌效价，当在相同条件下在使用人补体的血清杀菌测定中测量时，所述血清免疫球蛋白的杀菌效价为在接受第一剂量后的人中比在接受所述第一剂量前的人中的血清免疫球蛋白的杀菌效价高至少2倍。

7.根据权利要求1的组合物，其中所述组合物诱导血清免疫球蛋白的杀菌效价，当在相同条件下在使用人补体的血清杀菌测定中测量时，所述血清免疫球蛋白的杀菌效价为在接受第一剂量后的人中比在接受所述第一剂量前的人中的血清免疫球蛋白的杀菌效价高至少4倍。

8.根据权利要求1的组合物，其中所述组合物诱导血清免疫球蛋白的杀菌效价，当在相同条件下在使用人补体的血清杀菌测定中测量时，所述血清免疫球蛋白的杀菌效价为在接受第一剂量后的人中比在接受所述第一剂量前的人中的血清免疫球蛋白的杀菌效价高至少8倍。

9.根据权利要求1的组合物，其中所述组合物不进一步包含与SEQIDNO:1具有少于100％序列同一性的多肽。

10.根据权利要求1的组合物，其中所述第一多肽具有总计258个氨基酸。

11.根据权利要求1的组合物，其中所述第一多肽在多肽的N末端包括SEQIDNO:3所示的氨基酸序列。

12.根据权利要求1的组合物，其中所述组合物不进一步包含与SEQIDNO:2具有少于100％序列同一性的多肽。

13.根据权利要求1的组合物，其中所述第二多肽具有总计261个氨基酸。

14.根据权利要求1的组合物，其中所述第二多肽在多肽的N末端包括SEQIDNO:3所示的氨基酸序列。

15.根据权利要求1的组合物，其中所述组合物包含至多两种脂质化的多肽。

16.根据权利要求1的组合物，其中所述组合物不进一步包含与SEQIDNO:1具有少于100％序列同一性的多肽。

17.根据权利要求1的组合物，其中所述组合物不进一步包含与SEQIDNO:2具有少于100％序列同一性的多肽。

18.根据权利要求1的组合物，其中所述组合物不包含杂合蛋白。

19.根据权利要求1的组合物，其中所述组合物不包含嵌合蛋白。

20.根据权利要求1的组合物，其中所述组合物不包含融合蛋白。

21.根据权利要求1的组合物，其中所述组合物不是冻干的。

22.根据权利要求1的组合物，其中所述组合物是液体组合物。

23.在人中诱导针对脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)血清群B亚家族A菌株和针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族B菌株的杀菌免疫应答的方法，其包括向人施用有效量的组合物，所述组合物包含

a)包含SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的第一脂质化多肽，和

b)包含SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的第二脂质化多肽。

24.根据权利要求23的方法，其中所述组合物进一步包含聚山梨酯80、铝、组氨酸和氯化钠。

25.根据权利要求23的方法，其中针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族A菌株的免疫应答比针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族B菌株的免疫应答更高。

26.根据权利要求23的方法，其中在人中的针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族A菌株的免疫应答包含比在人中的针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B亚家族B菌株的杀菌效价更高的杀菌效价。

27.根据权利要求23的方法，其中所述组合物诱导针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群BA22、A56、B24、B44菌株中任一种、或其任何组合的杀菌免疫应答。

28.根据权利要求23的方法，其中所述组合物诱导针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群BB24、B16、B44、A22、B03、B09、A12、A19、A05、A07、B153菌株中任一种、或其任何组合的杀菌免疫应答。

29.根据权利要求23的方法，其中所述方法进一步包括向人施用针对人乳头瘤病毒的免疫原性组合物。

30.根据权利要求29的方法，其中所述针对人乳头瘤病毒的免疫原性组合物在施用所述针对脑膜炎奈瑟氏球菌的组合物的24小时内施用于人。

31.根据权利要求29的方法，其进一步包括诱导针对人乳头瘤病毒6型、11型、16型、18型中任一种、或其任何组合的免疫应答。

32.根据权利要求23的方法，其中所述方法进一步包括向人施用针对白喉、破伤风、百日咳和脊髓灰质炎的免疫原性组合物。

33.根据权利要求32的方法，其中所述针对白喉、破伤风、百日咳和脊髓灰质炎的免疫原性组合物在施用所述针对脑膜炎奈瑟氏球菌的组合物的24小时内施用于人。

34.根据权利要求32的方法，其中所述方法进一步包括在人中诱导针对白喉、破伤风、百日咳、脊髓灰质炎中的任一种、或其任何组合的免疫应答。

35.在人中诱导针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B表达B153因子H结合蛋白的菌株的杀菌免疫应答的方法，其包括向人施用有效量的组合物，所述组合物包含

a)包含SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的第一脂质化多肽，和

b)包含SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的第二脂质化多肽。