CN102203276A - 基于补体因子h对脑膜炎奈瑟球菌血清杀菌活性的鉴定 - Google Patents

Abstract

本发明提供了采用介导与奈瑟球菌H因子结合蛋白(fhBp)结合的具有人氨基酸序列的H因子多肽来检测杀菌性抗奈瑟球菌抗体的鉴定方法，还提供了奈瑟球菌感染的非人动物模型。

Description

基于补体因子H对脑膜炎奈瑟球菌血清杀菌活性的鉴定

关于联邦资助研究的声明

本研究受国家过敏反应和传染病研究院(National Institute of Allergyand Infectious Diseases)的公共卫生服务部(Public Health Service)的资助RO1 AI46464和RO1 AI054544的支持。在儿童医院奥克兰研究中心(Children’s Hospital Oakland Research Institute)的研究依靠国立卫生研究院国家研究资源中心(National Center for Research Resources，NIH)的研究设备改进计划(Research Facilities Improvement Program)资助号CO6RR-16226资助的设备进行。联邦政府享有本发明的某些权利。

技术领域

本发明涉及对脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)抗体杀菌活性的鉴定。

背景技术

脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)是常见于健康青少年咽喉的一种共生生物(Maiden，M.C.等(2008)J Infect Dis.；Mueller，J.E.等(2007)Emerg Infect Dis 13：847-854；Trotter，C.L.等(2006)Epidemiol Infect134：556-566；Bogaert，D.等(2005)Clin Infect Dis 40：899-902；Verdu，M.E.等(2001)Epidemiol Infect 127：245-259；Ala′Aldeen，D.A.等(2000)J ClinMicrobiol 38：2311-2316)。在很少的情况下，该生物体侵入血流，并引起脑膜炎或迅速致死的脓毒症。

据目前已知，确定该生物体为人病原体。脑膜炎球菌疾病的可靠动物模型难以开发(Lewis，T.等(1943)J Clin Invest 22：375-385；Ashton，F.E.等(1989)Microb Pathog 6：455-458；Zarantonelli，M.L.等(2007)Infect Immun75：5609-5614)。在人体中具有高致病性的很多脑膜炎奈瑟球菌包囊菌株易于从常用的实验动物如兔(Lewis，T.等(1943)J Clin Invest 22：375-385)、小鼠(Zarantonelli，M.L.等(2007)Infect Immun 75：5609-5614；Oftung，F.等(1999)FEMS Immunol Med Microbiol 26：75-82；Holbein，B.E.等(1979)Infect Immun 24：545-551)或大鼠(易变不定，参见下文)的血流中清除。此外，据报道，脑膜炎球菌菌株在年幼大鼠中引起菌血症的能力不同(参见例如，Welsch，J.A.等(2004)J Immunol 172：5606-5615，Hou，V.C.等(2005)J Infect Dis 192：580-590；Toropainen，M.等(2005)Vaccine23：4821-4833；Toropainen，M.等(2005)Infect Immun 73：4694-4703；Toropainen，M.等(2001)Microb Pathog 30：139-148；Toropainen，M.等(2006)Infect Immun 74：2803-2808)。

脑膜炎奈瑟球菌与人的补体因子H(fH)结合(Schneider，M.C.等(2006)J Immunol 176：7566-7575；Madico，G.等(2006)JImmunol 177：501-510)，补体因子H是下调补体激活作用的分子。与fH的结合增强该生物体对补体介导的杀菌作用的抗性，可能是使脑膜炎奈瑟球菌避开先天宿主防御的重要机制。淋病奈瑟球菌(N.gonorrhoeae)与fH的结合限于人fH，这可部分解释天然淋球菌感染的种特异性限制(Ngampasutadol，J.等(2008)JImmunol 180：3426-3435)。血清fH对人的脑膜炎球菌疾病易感性的重要性得到了强调，近来的流行病学观察到，在cfH基因的启动子区中推定的NF-κB-应答元件内的单核苷酸多态性(C-496T)与较高的血清fH水平(C/C纯合基因型)和增大的患脑膜炎球菌疾病风险(Haralambous，E.等(2006)Scand J Infect Dis 38：764-771)相关。

相当多的数据显示，血清补体介导的杀菌抗体具有针对脑膜炎球菌疾病的保护作用(Goldschneider，I.等(1969)J Exp Med 129：1307-1326；，I.等(1969)J Exp Med 129：1327-1348；Borrow，R.等(2005)Vaccine 23：2222-2227；Balmer，P.等(2004)Expert Rev Vaccines 3：77-87；Andrews，N等(2003)ClinDiagn Lab Immunol 10：780-786；Borrow，R.等(2001)Infect Immun69：1568-1573)。在用人补体测定时，估计最小保护血清效价在1∶4到1∶8之间。评价杀菌抗体效价已成为评价人对象是否具有针对奈瑟球菌的保护性免疫应答的黄金标准。

然而，人补体难以获得(很大程度上由于大多数人血清具有对脑膜炎奈瑟球菌的自然获得抗体，使它们不适合作为人补体的来源)。必须对大量健康捐赠者进行筛选，其中显示缺乏抗体的血清可提供合适的补体用于鉴定。因此，用于血清群A和C杀菌鉴定的若干标准化方案采用幼兔血清代替人血清作为补体来源(Maslanka，S.E.等(1997)Clin Diagn LabImmunol 4：156-167；Jodar，L.等(2000)Biologicals 28：193-197)。采用兔血清作为补体来源的鉴定已广泛用于推断疫苗有效性并作为新脑膜炎球菌疫苗颁发许可的根据。虽然由于较易进行标准化而选择兔补体用于这些方案，但多年来已知与用人补体测定的效价相比，兔补体会增大血清杀菌效价(Zollinger，W.D.等(1983)Infect Immun 40：257-264；Santos，G.F.等(2001)Clin Diagn Lab Immunol 8：616-623)。虽然用兔补体测定的血清杀菌效价与引入大量人群的脑膜炎球菌疫苗接种的有效性相关联(Borrow，R.等(2005)Vaccine 23：2222-2227；Balmer，P.等(2004)Expert Rev Vaccines 3：77-87；N等(2003)Clin Diagn Lab Immunol 10：780-786)，但如果用人补体进行测试，很多这些血清均缺乏杀菌活性。

因此，用兔补体观察到的相关性可能无法精确或完全反映疫苗诱导抗体赋予的保护作用的实际机制。例如，在存在人补体且抗体浓度或质量不足以引发杀菌活性但足以支持调理吞噬作用时，用兔补体测定的阳性效价可以是清除脑膜炎奈瑟球菌替代机制的代替物(Welsch，J.A.等(2007)ClinVaccine Immunol 14：1596-1602；Plested，J.S.等(2008)Clin Vaccine Immunol15：799-804)。

发明概述

本发明提供了采用介导与奈瑟球菌H因子结合蛋白(fhBp)结合的具有人氨基酸序列的H因子多肽来检测杀菌性抗奈瑟球菌抗体的鉴定方法，还提供了奈瑟球菌感染的非人动物模型。

因此，本发明提供检测样品中杀菌性抗奈瑟球菌抗体的方法，所述方法包括：将疑似包含杀菌性抗奈瑟球菌抗体的样品、包含人短同源重复序列6(SCR 6)的氨基酸序列的fH多肽、非人补体来源和奈瑟球菌在反应混合物中混合，通过评价奈瑟球菌的生存力来检测样品中存在或缺乏杀菌性抗奈瑟球菌抗体，其中所述样品存在下的奈瑟球菌生存力减小表示所述样品包含杀菌性抗奈瑟球菌抗体。在相关实施方式中，所述fH多肽是人fH多肽。在其它实施方式中，所述fH多肽是包含非人动物内源fH多肽氨基酸序列的嵌合fH多肽，所述嵌合fH多肽经修饰包含人SCR6的氨基酸序列。所述非人补体可以是例如兔补体、大鼠补体或小鼠补体。在其它相关实施方式中，所述奈瑟球菌是脑膜炎奈瑟球菌，其可来自任何荚膜群，例如群A、B、C、X、Y或W-135。在感兴趣的实施方式中，所述样品是人血清。

本发明还提供反应混合物，其包含疑似包含杀菌性抗奈瑟球菌抗体的样品、包含人保守序列重复序列6(SCR 6)的氨基酸序列的分离的H因子(fH)多肽(即不是可天然存在于待测样品中的fH)、非人补体和奈瑟球菌。在相关实施方式中，所述fH多肽是人fH多肽。在其它实施方式中，所述fH多肽是包含非人动物内源fH多肽氨基酸序列的嵌合fH多肽，所述嵌合fH多肽经修饰包含人SCR6的氨基酸序列。所述非人补体可以是例如兔补体、大鼠补体或小鼠补体。在其它相关实施方式中，所述奈瑟球菌是脑膜炎奈瑟球菌，其可来自任何荚膜群，例如群A、B、C、X、Y或W-135。在感兴趣的实施方式中，所述样品是人血清。

本发明还提供包含一个或多个小瓶的试剂盒，所述小瓶包含：包含人短同源重复序列6(SCR 6)的氨基酸序列的分离的H因子(fH)多肽和非人补体。所述试剂盒还包含奈瑟球菌的培养物作为检测杀菌抗体的靶。在相关实施方式中，所述fH多肽是人fH多肽，且/或可以是包含非人动物内源fH多肽氨基酸序列的嵌合fH多肽，所述嵌合fH多肽经修饰包含人SCR6的氨基酸序列。所述试剂盒的非人补体可以是例如兔补体、大鼠补体或小鼠补体。

本发明还提供非人动物，其编码含人短同源重复序列6(SCR 6)的氨基酸序列的H因子(fH)多肽的基因组整合核酸，其中所述转基因操作性连接于启动子以提供所述核酸在非人动物中的表达，所述核酸在非人动物中的表达提供结合奈瑟球菌的fH多肽的产生。在相关实施方式中，所述fH多肽是人fH多肽，且/或可以是包含非人动物内源fH多肽氨基酸序列的嵌合fH多肽，所述嵌合fH多肽经修饰包含人SCR6的氨基酸序列。所述非人动物可以是例如大鼠或小鼠。在一些实施方式中，用奈瑟球菌例如脑膜炎奈瑟球菌感染所述非人动物。这样的非人动物模型可用于筛选对奈瑟球菌具有活性的候选试剂的方法，其中这样的方法通常包括：在用奈瑟球菌进行感染之前、期间或之后将候选试剂给予所述非人动物，检测存在或缺乏杀菌性抗奈瑟球菌抗体的产生。

本发明还提供奈瑟球菌感染的非人动物模型，其包含：包含人短同源重复序列6(SCR 6)的氨基酸序列的H因子(fH)多肽的非人动物宿主，其中所述fH多肽存在于非人动物宿主的血流中；用奈瑟球菌进行细菌感染，其中所述fH多肽存在于非人动物的血清中。所述fH多肽可由整合到非人动物基因组中的核酸编码(因此表达到血流中)，且/或可通过对非人动物宿主的血流从外源给药而提供。所述fH多肽可以是人fH多肽或包含非人动物内源fH多肽氨基酸序列的嵌合fH多肽，所述嵌合fH多肽经修饰包含人SCR6的氨基酸序列。所述非人动物宿主可以是例如大鼠或小鼠。所述奈瑟球菌可以是感兴趣的脑膜炎奈瑟球菌菌株。

本发明还提供使用本文所述奈瑟球菌感染的非人动物模型的方法，以筛选候选试剂用于促进抗奈瑟球菌活性，所述方法包括：将候选试剂给予用奈瑟球菌感染的非人动物，检测候选试剂对所述非人动物中奈瑟球菌的生存力存在或缺乏作用。

通过阅读本发明，普通技术人员不难理解其它的方面和实施方式。

附图简要说明

图1的A-C显示fH与脑膜炎奈瑟球菌结合的种特异性。(图1A)通过Western印迹测定的灵长动物fH与脑膜炎奈瑟球菌菌株H44/76的结合。抗人fH抗体识别来自黑猩猩、狒狒和猕猴血清的fH的能力显示于标记为“仅血清”的泳道中，其包含来自所述各种灵长动物的以1∶100稀释的热失活血清。标记为“血清+细菌”的泳道包含用所述各种灵长动物血清培育的H44/76，具有H44/76而无血清(“无”)的泳道仅包含细菌。(图1B)和(图1C)通过流式细胞术测定的加入大鼠(图1B)或兔(图1C)血清对生物素化人fH与脑膜炎奈瑟球菌细胞结合的作用。虚线表示不加生物素化人fH时的细菌细胞。实黑线表示不加血清时生物素化人fH的结合情况。实灰线表示存在40％热失活人血清时生物素化人fH的结合情况。填充的浅灰色区域表示存在40％热失活大鼠或兔血清时生物素化人fH的结合情况。在三个独立的实验中均观察到大鼠和兔血清而非人血清存在时生物素化人fH的结合的类似抑制作用。

图2显示在年幼大鼠血清中加入人fH对脑膜炎奈瑟球菌存活率的作用。将细菌(约10,000CFU/ml)悬浮在不同浓度的年幼大鼠血清中。将各血清分为两等份，向其中加入50μg/ml或0μg/ml人fH。将血清和细菌在37℃培育1小时。虚线表示不加fH时血清中细菌存活率百分数；实线表示包含人fH时血清中的存活率百分数。数据是来自每个菌株9-20个血清样品的结果的平均值±95％置信区间。

图3A和3B显示大鼠C3与脑膜炎奈瑟球菌的结合情况和人fH对大鼠C3结合的调控作用。(图3A)大鼠C3与用年幼大鼠补体培育而不加人fH(Hu fH，实线)或包含25μg/mi人fH(灰色阴影直方图)的菌株H44/76和NZ98/254的结合情况。(图3B)人fH对大鼠C3结合的浓度依赖性抑制作用。仅用10％年幼大鼠血清或用加入浓度范围为50-6.25μg/ml的人fH的10％大鼠血清培育细菌。通过流式细胞术采用抗大鼠C3-FITC测定C3在细菌上的沉积。在类似条件下测定大鼠C3与作为替代途径激活物的酵母聚糖的结合作为对照。X轴表示log₁₀度量的荧光，Y轴是事件数量。(图3C)人fH与细菌的结合调控兔替代途径激活作用。人fH(hfH)对兔C3结合脑膜炎球菌的剂量应答性抑制作用。用包含剂量范围为0-64μg/ml的hfH的经Mg/EGTA处理的幼兔补体培育菌株A2594(左图)，通过流式细胞术测定与细菌结合的兔C3。将作为替代途径激活物的酵母聚糖用作对照(右图)，以确保对兔C3结合的抑制作用不是非特异性补体抑制作用的结果。对照直方图(不加血清)用虚线表示。

图4显示在用群B菌株H44/76对年幼大鼠进行IP刺激之后人fH联合给药对菌血症的作用。除给予动物0μg fH的动物数量是10以外，各组均每组由15只大鼠组成。在细菌刺激后8小时获得的血液培养物中测定菌血症。用50μg人fH处理的大鼠的几何平均CFU/ml高于用50μg人C1酯酶抑制剂处理的对照(P＜0.005)。给予每只大鼠50、10、2或0μg人fH的四组的各自的几何平均值具有显著性(ANOVA测定P＜0.02)。

图5显示加入人fH(25μg/ml)对用幼兔补体测定的血清群C血清杀菌效价的作用。在对用群C脑膜炎球菌偶联疫苗免疫的11名成人或用四价脑膜炎球菌多糖疫苗免疫的19名4岁儿童进行免疫之后获得所述血清。

图6显示fH结合对脑膜炎奈瑟球菌的对补体介导杀死作用的抗性的作用。

图7显示人、黑猩猩、猕猴、大鼠和小鼠的fH的短同源重复序列6(SCR6)的氨基酸序列。虚线表示的残基与人fH氨基酸序列中的相应残基相同。

图8显示维斯达(Wistar)大鼠幼崽(F0代)中人fH表达的Western印迹。用抗人fH抗体探测所述印迹，加样的人血清作为阳性对照。

在描述本发明和本发明的具体示例性实施方式之前，应理解，本发明不限于所述的具体实施方式，因为它们当然可能发生变化。还应理解，本文所用术语的目的仅是描述具体实施方式，不用来构成限制，因为本发明的范围仅受所附权利要求书的限制。

应理解，提供数值范围时，除非上下文中另有明确说明，该范围上下限之间、以下限单位的十分之一为间隔的各间插数值，以及所述范围的任何其它所述或间插数值均包括在本发明内。这些较小范围的上下限可独立地包括在所述较小范围中，也包括在本发明内，除非所述范围中存在任何明确排除的限值。所述范围包括一个或两个限值时，排除这一个或两个所包括限值的范围也包括在本发明中。

除非另有说明，本文所用的所有科技术语与本发明所属领域普通技术人员所理解的通常含义相同。虽然也可采用与本文所述的任何类似或等同的方法和材料实施或测试本发明，但以下描述的是优选的方法和材料。本文提及的所有出版物均通过引用纳入本文，以公开和描述与所引用出版物相关的方法和/或材料。这样的出版物可列出与本发明明确或隐含的定义冲突的术语定义，该情况下以本发明的定义为准。

必须注意到，本文和所附权利要求书所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”、“该”包括复数对象，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提及“一个多肽”包括多个这样的多肽，提及“所述细菌”包括一个或多个细菌，等等。

提供本文讨论的出版物仅因为其公开早于本申请的申请日。本文中所有内容均不应解释为承认本发明由于在先发明而不早于这样的出版物。此外，所提供的出版日期可能与实际公开日期不同，可能需要单独确认。

示例性实施方式的详述

本发明提供了采用介导与奈瑟球菌H因子结合蛋白(fhBp)结合的具有人氨基酸序列的H因子多肽来检测杀菌性抗奈瑟球菌抗体的鉴定方法，还提供了奈瑟球菌感染的非人动物模型。

定义

“补体”指提供功能性补体级联系统的血清蛋白质的集合，所述补体级联系统是促进细菌死亡的生化级联系统。同样地，本文所用的“补体”指可介导与经典途径、替代途径或二者相关的功能性补体级联系统的血清蛋白质的集合，还可包括可介导甘露糖结合凝集素途径的血清蛋白质。

“非人补体”指来自非人来源通常为哺乳动物来源的补体，其包括但不一定限于啮齿动物补体(例如，大鼠补体、小鼠补体、兔补体)和非人灵长动物补体(例如，黑猩猩补体、猴补体)等。

本文所用的“杀菌性抗体”指促进补体介导细菌杀死作用的抗体。

“H因子结合蛋白”(fHBP)在文献中也称为GNA1870、GNA 1870、ORF2086、LP2086(脂蛋白2086)，“741”指呈现在细菌表面的奈瑟球菌例如脑膜炎奈瑟球菌的多肽。根据氨基酸序列可变性和免疫交叉反应性(Masignani等J Exp Med 2003；197：789-99)，脑膜炎奈瑟球菌菌株已被细分为三个fHBP变体群(在一些报道(Masignani等2003，见上)中称为变体1(v.1)、变体2(v.2)和变体3(v.3)，在其它报道(参见例如，Fletcher等2004 Infect Immun 2088-2100)中称为家族A和B)。为清楚起见，本发明采用术语v.1、v.2和v.3。因为变体2(v.2)fHBP蛋白(来自菌株8047)和变体3(v.3)fHBP蛋白(来自菌株M1239)的长度与MC58的长度分别具有-1和+7氨基酸残基的差异，用来指代v.2和v.3fHBP蛋白质残基的编号与基于这些蛋白质实际氨基酸序列的编号不同。

“分离的”指感兴趣的化合物(例如fH多肽)如果天然存在，其所在的环境与其可天然产生的环境不同。“分离的”用来包括充分富集感兴趣的化合物和/或其中感兴趣的化合物部分或充分纯化的样品内的化合物。所述化合物不是天然存在时，“分离的”表示所述化合物已与由合成或重组手段对其进行制备的环境隔离。

“富集”表示对样品进行非自然操作(例如通过实验者或临床医生)，使感兴趣的化合物以大于(例如，至少大3倍、至少大4倍、至少大8倍、至少大64倍或更大)起始样品如生物样品(例如所述化合物天然产生或在给药后存在于其中的样品)或制备所述化合物的样品(例如在细菌多肽、抗体、嵌合多肽等中的情况)中所述化合物的浓度存在。

“基本纯”表示实体(例如多肽)的量大于组合物的总含量(例如组合物的总蛋白质)的约50％，通常大于总蛋白质含量的约60％。更通常地说，“基本纯”指组合物总量(例如总蛋白质)的至少75％、至少75％、至少85％、至少90％或更多是感兴趣的实体的组合物。优选所述蛋白质的量大于组合物中总蛋白质的约90％，更优选大于组合物中总蛋白质的约95％。

术语“异源”指由来自不同来源的结构定义的两种组分。例如，在上下文中存在嵌合多肽而使用“异源”时，所述嵌合多肽包含可来自不同多肽的操作性连接的氨基酸序列(例如，来自第一来源(例如人)fH多肽的第一组分和来自第二来源(例如兔)fH多肽的第二组分)。类似地，上下文中存在编码嵌合多肽的多核苷酸时的“异源”包括可来自不同基因的操作性连接的核酸序列。其它示例性“异源”核酸包括表达构建体，其中包含编码序列的核酸操作性连接于来自不同于编码序列来源的遗传来源的调节元件(例如启动子)(例如，以提供在感兴趣的宿主细胞中表达，所述宿主细胞可来自相对于启动子、编码序列或二者不同的遗传来源)。例如，据称，操作性连接于编码fH多肽或其结构域的多核苷酸的T7启动子是异源核酸。上下文中存在重组细胞时的“异源”可指存在与其存在的宿主细胞遗传来源不同的核酸(或基因产物，如多肽)。

本文在上下文中存在嵌合fH多肽时所用的“异源”表示所述嵌合fH多肽包含操作性连接的至少两个不同来源的不同fH多肽的结构元件的邻接氨基酸序列。例如，“异源fH多肽”包括具有兔fH多肽氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列侧接具有人CSR6序列的CSR6结构域。

上下文存在氨基酸序列或多核苷酸序列(例如，“衍生自”人fH多肽的氨基酸序列)时的“衍生自”用来表示所述多肽或核酸的序列基于参考多肽或核酸(例如，天然产生的人fH多肽或编码核酸)的序列，而不用来对所述蛋白质或核酸制备的来源或方法构成限制。上下文中存在细菌菌株时的“衍生自”用来表示通过体内或体外培养亲本菌株获得的菌株和/或通过修饰亲本菌株获得的重组细胞。

术语“保护性免疫”指给予哺乳动物的疫苗或免疫方案诱导防止、延迟由脑膜炎奈瑟球菌引起的疾病的发展、降低所述疾病的严重程度或减少或一并消除所述疾病症状的免疫应答。保护性免疫可伴随杀菌性抗体的产生。应注意，针对脑膜炎奈瑟球菌的杀菌性抗体的产生在所述领域中被接受为预示疫苗在人中具有保护作用(Goldschneider等，1969，J.Exp.Med.129：1307；Borrow等2001 Infect Immun.69：1568)。

术语“转基因”在本文中用来描述已被或即将被人工插入到非人动物基因组特别是活的非人哺乳动物(例如啮齿动物，如大鼠、小鼠)细胞中的遗传材料。

术语“转基因动物”指具有整合到所述动物一个或多个细胞基因组中的转基因元件的非人动物。因此，本文所用的“转基因动物”包括所有或几乎所有细胞包含遗传修饰的动物(例如，完全转基因动物、具有可遗传转基因的特定转基因动物)，以及动物中细胞亚组经修饰包含基因组整合转基因的嵌合转基因动物。

靶基因“敲除”指导致靶基因功能降低的基因序列的改变。特别感兴趣的“敲除”是指靶基因的表达不可检测或不显著的敲除。例如，受体基因的敲除指所述受体功能显著降低，使结合其正常配体的受体活性不可检测或处于不显著水平。功能降低可由遗传改变引起的全长基因产物的产生减少或相对于天然基因产物具有功能缺陷的改变的基因产物产生而造成。本发明的“敲除”转基因学可以是杂合或纯合敲除靶基因的转基因动物。“敲除”还包括条件性敲除，其中靶基因的改变可由例如使动物接触促进靶基因改变的物质而发生。

基因“敲入”指向基因组加入编码感兴趣的基因产物的核酸，其可伴随相应内源基因的敲除。可将这样的“敲入”基因重组到基因组中，使其受调控的方式与内源基因的方式相当。所述转基因可以是内源基因的修饰形式(例如在嵌合fH多肽中的情况)。“敲入”转基因学可具有杂合或纯合的遗传改变。“敲入”还包括条件性敲入。

概述

本发明提供方法和组合物，其利用了关于人H因子(fH)可介导脑膜炎奈瑟球菌对非人补体(例如，兔补体、大鼠补体)的补体介导杀死作用的抗性的观察。该观察可用来提供可评价采用人fH和非人补体来源的抗脑膜炎奈瑟球菌抗体的补体介导杀死作用的鉴定，以降低假阳性结果(即鉴定显示样品包含杀菌性抗脑膜炎奈瑟球菌抗体而其实际并不包含，或显示其包含的杀菌性抗脑膜炎奈瑟球菌水平高于其实际水平的结果)的发生率和/或程度。向这样的鉴定中加入人fH可更精确地模拟人体内的情况，即fH与脑膜炎奈瑟球菌结合并抑制补体介导的细菌杀死作用，由此可能破坏人血清中可能存在的抗脑膜炎奈瑟球菌抗体的杀菌活性。本发明的鉴定提供的额外优点在于，采用非人补体(例如大鼠或兔补体)进行这样的鉴定，由此避免了采用人补体的需求。人补体来源价格昂贵，至少部分是由于这样的鉴定需要人补体不含抗脑膜炎奈瑟球菌抗体，其可能增大假阳性结果的发生率。因此，利用关于分离的人fH可与非人补体因子协同发挥作用的发现，以提供对人免疫更为相关的反映和相比采用非人补体的常规鉴定方法价格更为低廉的鉴定。

本发明还利用了关于人fH可在非人补体存在时发挥作用的发现，以提供脑膜炎奈瑟球菌感染的非人动物模型。由于非人fH不与脑膜炎奈瑟球菌结合，因此非人fH不提供对补体介导杀死作用的抗性，消除了脑膜炎奈瑟球菌对非人动物的感染，由此破坏对提供感染的非人动物模型的尝试。本发明的非人动物模型提供具有结合脑膜炎奈瑟球菌的fH的非人动物。所述“结合脑膜炎奈瑟球菌的fH”指包含介导与脑膜炎奈瑟球菌结合的人fH的氨基酸序列即人短同源重复序列6(SCR 6)的氨基酸序列，对其更详细的描述见下文。因此，所述结合脑膜炎奈瑟球菌的fH可以是人fH，可通过以下方式提供：在例如被动保护的体内小鼠或年幼大鼠模型中给予奈瑟球菌(例如脑膜炎奈瑟球菌)接种物(例如，采用胃肠外(如静脉内、腹膜内)或鼻内刺激)之前、同时或之后给予人fH(例如胃肠外给药，如静脉内、腹膜内、皮下)；表达非人动物中存在的人fH编码转基因；“人源化”非人动物fH编码基因的SCR 6氨基酸序列；和/或表达来自非人动物中存在的转基因的这样的“人源化”fH。

对示例性实施方式更详细的描述见下文。

H因子(FHBP)多肽

“H因子多肽”、“H因子”、“补体因子H”、“H因子蛋白”、“fH”、“fH蛋白”和“fH多肽”在本文中可互换使用以指代调节补体途径的多肽，其在包含人fH多肽的短同源重复结构域6(SCR6)时通过奈瑟球菌蛋白H因子结合蛋白(fHbp)与奈瑟球菌结合。在人中，H因子是补体激活作用调节子(RCA)基因簇的成员，编码具有20个短同源重复序列(SCR)结构域的蛋白质。在体内，fH分泌到血流中，在调节补体激活中发挥作用，在清除细菌感染中具有特定作用。

“包含人短同源重复序列6(SCR6)氨基酸序列的H因子(fH)多肽”指包含fH多肽氨基酸序列的多肽，其包含或经修饰包含具有人fH多肽的人SCR6氨基酸序列的短同源重复结构域6(SCR6)。因此，“包含人SCR6氨基酸序列的fH多肽”包括完整的人fH多肽及其片段，以及包含操作性连接于非人fH氨基酸序列的人SCR6氨基酸序列的嵌合多肽，条件为所述多肽具有与奈瑟球菌(例如脑膜炎奈瑟球菌)H因子结合蛋白结合的活性。

术语“短同源重复结构域6”在本文中也称为“短同源重复序列6”和“SCR6”，三者可互换使用，指在人H因子中将H因子的结合能力赋予奈瑟球菌fHbp的H因子多肽结构域。“人SCR6”指具有SEQ ID NO：1氨基酸序列的多肽(以及编码这样的多肽的核酸，从使用时的上下文不难理解)。图7显示黑猩猩(SEQ ID NO：2)、猕猴(SEQ ID NO：3)、大鼠(SEQ IDNO：4)和小鼠(SEQ ID NO：5)SCR6的氨基酸序列。

可从任何合适的来源获得适合用于本文所述方法的fH多肽。例如，所述fH多肽是人fH多肽时，可通过从天然产生所述多肽或经遗传修饰产生所述多肽的来源(例如重组来源)分离获得所述人fH多肽。

已知各种哺乳动物来源的编码fH多肽的核酸，以及编码的fH多肽的核酸序列和氨基酸序列。对人fH多肽及其编码核酸的描述见例如GenBank登录号NM_000186，对可变剪接多肽变体的描述见GenBank登录号NM_001014975。其它示例性哺乳动物fH多肽(核酸和多肽序列)为本领域已知，包括但不限于小鼠(GenBank登录号NM_009888)、大鼠、灵长动物(例如，黑猩猩、猴(例如猕猴))和绵羊(GenBank登录号EU888587)。

可通过本领域可利用和已知的任何合适的方法改造包含人CSR6氨基酸序列的嵌合fH多肽。例如，可采用本领域众所周知的重组方法用编码人SCR6的核酸片段代替编码非人哺乳动物fH多肽的核酸编码序列。或者或此外，可通过定点突变修饰编码序列来产生这样的嵌合fH多肽，以编码人SCR6的氨基酸残基。其它可利用的技术包括对fH编码DNA进行核酸扩增，将扩增的序列或消化的片段克隆到含启动子和polyA尾的载体中以形成fH编码构建体。在适合的情况下可通过合成技术产生包括嵌合fH多肽在内的fH多肽。

可采用本领域众所周知的标准蛋白质表达方法在体外或体内将核酸构建体表达为蛋白质，以产生包含人SCR6的嵌合多肽。也可将这样的改造核酸构建体引入到非人动物的基因组中，以便表达为转基因基因产物。

fH多肽的生产方法可包括任何合适的构建体和任何合适的宿主细胞，其可以是原核或真核细胞，通常为哺乳动物、细菌或酵母宿主细胞。将遗传材料引入到宿主细胞中的方法包括例如，转化、电穿孔、接合、磷酸钙法等。可选择转移的方法以使引入的fH多肽编码核酸稳定表达。可以可遗传的游离元件(例如质粒)的形式提供这样的核酸，或可对其进行基因组整合。

转移感兴趣核酸的合适载体的组成可不同。整合载体可以是条件性复制或自杀质粒、噬菌体等。所述构建体可包括各种元件，包括例如，启动子、选择性遗传标记(例如，具有抗生素抗性的基因(例如，卡那霉素、红霉素、氯霉素或庆大霉素))、复制起点(以促进在宿主细胞例如细菌宿主细胞中的复制)等。对载体的选择取决于各种因素，如需要增殖的细胞类型和增殖的目的。某些载体可用于扩增和制备大量所需DNA序列。其它载体适合用于在培养物的细胞中进行表达。还有其它载体适合用于在整个动物的细胞中进行转移和表达。对合适载体的选择是本领域众所周知的技术。很多这样的载体可市售购得。

在一个实施方式中，所述载体是表达载体，其基于包含选择性药物抗性标记和提供在不同宿主细胞(例如在大肠杆菌(E.coli)和脑膜炎奈瑟球菌二者)中自主复制的元件的游离质粒。这样的“穿梭载体”的一个例子是质粒pFP10(Pagotto等Gene 2000244：13-19)。

可通过例如将感兴趣的多核苷酸插入到构建体主链中，通过采用DNA连接酶连接到载体中切割的限制性酶位点来制备构建体。或者，可通过同源重组或位点特异性重组插入所需核苷酸序列。通常通过将同源区域与载体在所需核苷酸序列的侧翼连接来完成同源重组，而通过采用促进位点特异性重组的序列(例如，cre-lox、att位点等)来完成位点特异性重组。可通过例如连接寡核苷酸或采用同时包含同源区域和所需核苷酸序列一部分的引物进行聚合酶链反应来加入包含这样序列的核酸。

载体可在宿主细胞中保持处于染色体外，或可整合到宿主细胞基因组中。本领域技术人员众所周知的大量出版物详细描述了载体，所述出版物包括例如，《分子生物学简明实验方案》(Short Protocols in MolecularBiology)，(1999)F.Ausubel等编，韦利&森斯出版公司(Wiley&Sons)。载体可表达编码嵌合fHBP的核酸，可扩增所述对象核酸，或二者兼有。

可采用的示例性载体包括但不限于衍生自重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA的载体。例如，可采用质粒载体如pBR322、pUC 19/18、pUC118、119和M13mp系列载体。pET21也是可采用的表达载体。噬菌体载体可包括λgt10、λgt11、λgt18-23、λZAP/R和EMBL系列噬菌体载体。可利用的其它载体包括但不限于，pJB8、pCV 103、pCV 107、pCV 108、pTM、pMCS、pNNL、pHSG274、COS202、COS203、pWE15、pWE16和卡隆粒9系列载体。

就表达感兴趣的fH多肽而言，可采用表达盒。因此，本发明提供包含对象核酸的重组表达载体。所述表达载体提供转录和翻译调节序列，并可提供诱导型或组成型表达，其中在转录起始区以及转录和翻译终止区的转录控制下操作性连接编码区。这些控制区可以是天然产生的fH多肽先天具有的，或可衍生自外源。通常，所述转录和翻译调节序列可包括但不限于，启动子序列、核糖体结合序列、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列以及增强子或激活物序列。启动子可以是组成型或诱导型，并可以是强组成型启动子(例如T7等)。

表达载体通常具有位于启动子序列附近的方便的限制性位点，以便插入编码感兴趣蛋白质的核酸序列。可存在在表达宿主中可操作的选择性标记以促进对包含所述载体的细胞进行选择。此外，所述表达构建体可包含其它元件。例如，所述表达载体可具有一个或多个复制系统，由此使其能保持于用于表达的生物例如哺乳动物或昆虫细胞中和用于克隆和扩增的原核宿主中。此外，所述表达构建体可包含选择性标记基因以允许对转化的宿主细胞进行选择。选择基因在本领域中众所周知，随采用的宿主细胞而变化。

应注意，重组fH多肽可包含其它元件，如可检测标记，例如，放射性标记、荧光标记、生物素标记和免疫可检测标记(例如，HA标签、多组氨酸标签)等。可提供这样的其它元件以促进通过各种方法(例如亲和捕获等)进行分离(例如，生物素标签、免疫可检测标签)。

可根据本领域已知的方法完成对感兴趣多肽的分离和纯化。例如，可通过免疫亲和纯化从经遗传修饰表达fH多肽的细胞的裂解物分离fH多肽，其通常包括：使所述样品接触抗fH多肽抗体，洗涤以去除非特异性结合的材料，洗脱特异性结合的fH多肽。可通过透析和其它通常用于蛋白质纯化的方法来进一步纯化分离的fH多肽。可提供纯化的fH多肽，使所述多肽存在于基本不含其它表达多肽的组合物中，例如，所述组合物少于90％、通常少于60％、更通常少于50％的部分由其它表达多肽组成。

杀菌性抗脑膜炎奈瑟球菌抗体的检测鉴定

如上所述，本发明提供检测样品中杀菌性抗奈瑟球菌抗体的方法和组合物。采用包含人短同源重复序列6(SCR6)氨基酸序列的分离的H因子多肽和非人补体来提供评价抗脑膜炎奈瑟球菌抗体的补体介导杀死作用的鉴定。这样的鉴定可降低假阳性结果(即鉴定显示样品包含杀菌性抗脑膜炎奈瑟球菌抗体而其实际并不包含，或显示样品包含的杀菌性抗脑膜炎奈瑟球菌水平高于其实际水平的结果)的发生率和/或程度。向这样的鉴定中加入包含人SCR6的分离的H因子多肽相比传统鉴定可更精确地模拟人体内的情况，因为人fH的SCR6结构域与脑膜炎奈瑟球菌结合并抑制补体介导的细菌杀死作用，由此可能破坏可能存在于人血清中的抗脑膜炎奈瑟球菌抗体的杀菌活性。本发明的鉴定提供的额外优点在于，采用非人补体(例如大鼠或兔补体)进行这样的鉴定，由此避免了采用人补体的需求。因此，利用关于人fH可与非人补体因子协同发挥作用的发现，以提供相比采用人补体的常规鉴定方法更精确、价格更低廉的鉴定。

所述方法通常包括：将疑似包含杀菌性抗奈瑟球菌抗体的样品、包含人短同源重复序列6(SCR 6)的氨基酸序列的分离的H因子多肽、非人补体和奈瑟球菌在反应混合物中混合，评价奈瑟球菌的生存力，其中所述样品存在下的奈瑟球菌生存力减小表示所述样品包含杀菌性抗奈瑟球菌抗体。

人fH或包含人短同源重复序列(SCR 6)氨基酸序列的分离的H因子多肽也可用于采用非人补体评价抗奈瑟球菌抗体的调理吞噬(opsonophagocytic)活性。调理吞噬作用鉴定通常包括：将疑似包含调理吞噬性抗奈瑟球菌抗体的样品、作为吞噬作用效应细胞的外周血单核白细胞或在组织培养物中生长的单核细胞细胞系、包含人短同源重复序列6(SCR6)的氨基酸序列的分离的H因子多肽、非免疫非人补体和奈瑟球菌在反应混合物中混合，评价奈瑟球菌的生存力，其中所述样品存在下的奈瑟球菌生存力减小表示所述样品包含调理吞噬性抗奈瑟球菌抗体。对测试样品(即对调理吞噬性抗奈瑟球菌抗体的存在接受评价的样品)进行热失活以去除任何内部补体活性。对测定调理吞噬活性的鉴定及其在评价抗奈瑟球菌抗体中的应用的描述见Plested J.S.和Granoff D.M.，Clin Vaccine Immunol2008，15(5)：799-804和GranoffDM，Vaccine，2009(“补体介导的杀菌和调理活性对脑膜炎疾病保护作用的相对重要性(Relative importance ofcomplement-mediated bactericidal and opsonic activity for protection againstmeningococcal disease)”Doi：10.1016/j.vaccine.2009.04.066)。

样品

可鉴定疑似包含杀菌性抗奈瑟球菌抗体的任何样品，例如从对象(例如，血液或血液成分(例如血清)、粘膜分泌物、组织等)、从细胞培养物(例如从抗体分泌细胞(例如杂交瘤)的上清液)获得的生物样品。所述血清样品可用缓冲液例如杜贝克(Dulbecco)缓冲液稀释，并可作为系列稀释物进行测试以促进对抗体效价的评价。通常，所述样品可能包含补体(例如在血清样品中的情况)时，例如通过加热(例如在56℃进行约30分钟)处理所述样品以使内源补体失活。样品在使用前可以是新鲜的或冷冻的。评价样品以确定疫苗引发杀菌性抗奈瑟球菌抗体的有效性时，可在免疫对象之前和之后获得所述样品。

非人补体

用于所述鉴定的非人补体可来自任何合适的来源，通常为哺乳动物来源。补体的示例性来源包括兔类动物(例如兔)、啮齿动物(大鼠、小鼠、豚鼠、仓鼠等)、有蹄类动物(例如，牛、绵羊、山羊、猪)和非人灵长动物(猴、猿、黑猩猩)，可以是年幼动物(例如，幼兔、年幼大鼠等)。非人补体可市售购得，或可根据本领域已知方法很容易地从血清获得。所述非人补体通常不包含或经处理而不包含可检测的杀菌活性。这可通过例如采用来自年幼动物的血清或处理来自年老动物的非人血清以在用于鉴定之前消除抗体(例如采用抗IgG亲和柱)来完成。作为对照的样品在鉴定中非人补体的量可不同，或可提供与各测试样品(例如作为标准)中几乎相同的量。例如，所述反应混合物可在血清中包含约10％-25％(体积/体积)非人补体。

可向反应混合物中加入不同量的非人补体，以提供具有不同已知量的非人补体的反应样品。可平行鉴定这样的样品以促进对杀菌性抗体效价的检测。

奈瑟球菌

任何合适的奈瑟球菌，特别是表达表面fHbp的奈瑟球菌均可用作本文所述鉴定中检测杀菌性抗体的靶细菌。这样的奈瑟球菌包括脑膜炎奈瑟球菌和淋病奈瑟球菌。可根据待鉴定的杀菌性抗体的特异性选择所述靶细菌。例如，所述鉴定用来提供对杀菌性抗脑膜炎奈瑟球菌抗体的检测时，所述靶细菌可以是任何合适的脑膜炎奈瑟球菌，例如，群A、B、C、X、Y或W-135，或感兴趣的任何其它荚膜群的脑膜炎奈瑟球菌、表达特定感兴趣的抗原的脑膜炎奈瑟球菌菌株(例如，v.1、v.2或v.3fHbp，包括fHbp亚变体，PorA型等)。所述鉴定可与经遗传修饰而表达感兴趣的抗原的奈瑟球菌联用。例如，可选择所述靶细菌以促进对用疫苗免疫之后杀菌性抗奈瑟球菌抗体的产生进行分析。

在用于鉴定之前，可通过本领域已知方法，例如在肉汤(例如穆勒-辛顿(Mueller-Hinton)肉汤)中或在琼脂平板(例如巧克力琼脂平板)上培养所述靶细菌。如果在琼脂平板上培养，从所述琼脂平板上去除所述细菌并将其重悬浮。如果在液体肉汤中培养，可离心所述细菌并将其重悬浮。通常提供所需细胞数量的细菌，并可提供细胞数量不同的样品作为对照。例如，可以约10⁵-10⁸集落生成单位(CFU)/ml，通常为约5x 10⁷CFU/ml的细胞密度重悬浮细菌。可选择重悬浮溶液以可与检测鉴定相容使用，所述溶液例如缓冲液，通常为补充有MgCl₂和CaCl₂的HBSS(汉克斯碱性盐溶液(Hanks Basic Salt Solution))或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。

在用于鉴定之前，可洗涤所述细菌一次或多次以去除配培养肉汤的组分。例如，可用缓冲液(例如包含牛血清白蛋白)和/或用热失活血清(例如消除IgG，例如以使包含的IgG不可检测)洗涤所述细菌。洗涤通常包括：将所述细菌重悬浮在溶液中，通过离心沉淀所述细菌细胞，例如用反应混合物缓冲液重悬浮所述细菌以便用于鉴定。

fH多肽

本文所述的具有人SCR6氨基酸序列的任何合适的fH多肽均可用于所述鉴定。特别感兴趣的是采用完整的人fH多肽和其保持与fHbp结合和调节补体级联系统的活性的片段。包括SCR6在内的H因子若干结构域的晶体结构已被破解，可为产生感兴趣的片段提供指导。可向反应混合物中加入任何合适量例如约5-6μg/ml、10μg/ml、12μg/ml、20μg/ml、25μg/ml、50μg/ml或更多的fH多肽。采用的量根据反应混合物是否包含钙螯合剂而变化(例如，以检测独立于补体活性经典途径的替代途径)。

反应混合物

通过将鉴定试剂(包含含人SCR6氨基酸序列的分离的H因子多肽和非人补体)、奈瑟球菌和测试样品以任何合适的顺序混合来制备所述鉴定的反应混合物。可通过将这些组分在任何合适的容器，如试管、平板孔或毛细管中混合来产生所述反应混合物。通常用缓冲液，特别是生理相容性缓冲液例如PBS或本文示例的其它合适的缓冲液悬浮所述反应混合物。所述反应混合物的反应体积可不同，通常为数微升到数毫升(例如，100μl、500μl、1ml等)。可提供在反应混合物中具有不同稀释度例如1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16、1∶18、1∶20、1∶22、1∶24或更大以及类似稀释度的样品，，其中感兴趣的是1∶4和更大的稀释度。

在适合补体介导的杀菌性抗体活性的条件下培育所述反应混合物。例如，可将所述反应混合物在合适的温度(例如环境温度或生理学相关温度(例如约37℃))下培育一段时间，所述时间足以产生补体介导的杀菌性抗体活性(例如，约15分钟-90分钟、约30分钟-90分钟等)。除测试样品以外，可提供对照样品。这样的对照样品可包括阴性对照样品(例如与测试样品条件平行但不加生物样品、不加fH、不加非人补体或加入杀菌活性不可检测的抗体的样品)和/或阳性对照样品(例如与测试样品条件平行但加入对靶细菌具有已知杀菌活性的抗体的样品)。

检测

用测试样品培育之后，通过评价反应混合物中奈瑟球菌的生存力来检测存在或缺乏杀菌性抗奈瑟球菌抗体。这可通过例如以下步骤完成：将所述反应混合物接种在合适的培养基(例如琼脂平板)上，评价集落生成单位，在肉汤中培养所述反应混合物，通过细胞密度、FACS(参见例如，Mountzouros等“在群B脑膜炎奈瑟球菌的基于荧光的血清杀菌鉴定中检测补体介导的抗体依赖性杀菌活性(Detection of Complement MediatedAntibody-Dependent Bactericidal Activity in a Fluorescence-Based SerumBactericidal Assay for Group B Neisseria meningitidis)”(2000)J.Clin.Microbiol.38：2878-2884)等评价细菌的生长情况(例如通过分光光度吸收)。将杀菌效价定义为观察到活奈瑟球菌减少(例如每毫升CFU降低)时的血清稀释度，通常为与在零时间(或60分钟之后或在阴性对照血清中培育)的对照相比引起生存力下降50％或90％(例如每毫升CFU降低50％)的稀释度。结果也可描述为与零时间的存活率相比的50％存活率。

本领域普通技术人员应理解，需要使对照反应混合物与实验反应混合物的实验平行进行。例如，可将包含已知杀菌性抗体效价(从低到高)的样品作为阳性对照进行鉴定。此外，应进行不加样品的反应混合物以及不加非人补体的反应混合物的实验。也可平行进行包含非人fH多肽代替包含人SCR6氨基酸序列的H因子多肽的反应混合物的实验，以确认包含人SCR6氨基酸序列的H因子(fH)多肽会减弱补体介导的对奈瑟球菌的毒性。

试剂盒

本发明还提供用于本文所述鉴定的试剂盒。这样的试剂盒可包含例如，具有人CSR6氨基酸序列的fH多肽(例如人fH多肽)、非人补体并任选包含靶奈瑟球菌。可用独立的小瓶提供所述试剂，或至少可用单个小瓶提供fH多肽和非人补体。所述试剂盒可任选包含用于上述对照鉴定的试剂。

除上述组分以外，所述试剂盒还可包括使用试剂盒组分实施本文所述鉴定的说明书。所述说明书通常记录在合适的记录媒介上。例如，所述说明书可印刷在基材如纸或塑料等上。同样地，所述说明书在试剂盒中可作为包装插入物存在、处于试剂盒或其组分的容器标签(即与包装或分装相关)中等。可在存在于合适的计算机可读存储介质例如CD-ROM、磁盘等上的电子存储数据文件上提供所述说明书。在一些实施方式中，试剂盒中不存在实际的说明书，但提供从远程来源例如经互联网获得说明书的手段。该实施方式的一个例子是包括网络地址的试剂盒，可从所述网络地址浏览说明书且/或可从所述网络地址下载说明书。就说明书而言，获得说明书的手段记录在合适的基材上。

除说明书以外，所述试剂盒还包含一个或多个对照试剂混合物，例如，具有已知的针对奈瑟球菌的补体介导杀菌活性的抗体(杀菌活性为阳性或杀菌活性不可检测)等。

非人动物模型

如上所述，本发明还利用了关于人fH可在非人补体存在时发挥作用的发现，以提供脑膜炎奈瑟球菌感染的非人动物模型。由于非人fH不与脑膜炎奈瑟球菌发生可检测或显著的结合，因此非人fH不提供对补体介导杀死作用的抗性，消除了脑膜炎奈瑟球菌对非人动物的感染，由此破坏对提供感染的非人动物模型的尝试。

本发明的非人动物模型提供具有结合脑膜炎奈瑟球菌的fH的非人动物。所述“结合脑膜炎奈瑟球菌的fH”指包含介导与脑膜炎奈瑟球菌结合的人fH的氨基酸序列即人短同源重复结构域6(SCR 6)的氨基酸序列，对其更为详细的描述见下文。因此，所述结合脑膜炎奈瑟球菌的fH可以是人fH，可通过给予fH(例如静脉内给药)，从非人动物中存在的人fH编码核酸序列进行表达，或表达经“人源化”包含代替内源SCR6结构域或除内源SCR6结构域以外的编码人SCR6结构域的序列的非人fH编码核酸来提供。可采用以上讨论的任何合适的技术获得人fH编码核酸以及嵌合fH多肽编码核酸用于在非人动物中表达。

转基因动物

产生经修饰表达fH多肽的转基因动物的方法在本领域中众所周知。示例性方法包括在以下出版物、专利和文献中描述的方法：《转基因动物的产生和应用》(Transgenic Animal Generation and Use)L.M.Houdebine，哈伍德学术出版社(Harwood Academic Press)1997；《转基因技术：原理和方法》(Transgenesis Techniques：Principles and Protocols)D.Murphy和D.A.Carter编(1993年6月)胡马纳出版社(Humana Press)；《转基因动物技术：实验手册》(Transgenic Animal Technology：A LaboratoryHandbook)C.A.Pinkert编(1994年1月)学术出版社(Academic Press)《转基因动物》(Transgenic Animals)F.Grosveld和G Kollias编(1992年7月)学术出版社(Academic Press)和《胚胎干细胞：将计划的改变引入动物种系》(Embryonal Stem Cells：Introducing Planned Changes into theAnimal Germline)M.L.Hooper(1993年1月)戈登和布里奇科学出版社(Gordon&Breach Science Pub)；美国专利第6,344,596号、美国专利第6,271,436号、美国专利第6,218,596号和美国专利第6,204,431号；Maga和Murray(1995)Bio/Technol.13：1452-1457；Ebert等(1991)Bio/Technol.9：835-838；Velander等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：12003-12007；Wright等(1991)Bio/Technol。

也可通过核转移或克隆方法采用胚胎或成体细胞系产生转基因动物，如例如Campbell等(1996)Nature 380：64-66和Wilmut等(1997)Nature385：810-813中所述。可采用胞质注射DNA，如美国专利第5,523,222号所述。可通过引入包含硬脂酰辅酶A去饱和酶编码序列的构建体获得对象转基因动物。

转基因动物还包括体细胞转基因动物，例如体细胞(而非生殖系细胞)中包含转基因的转基因动物。例如，用硬脂酰辅酶A去饱和酶转基因转化动物的乳腺细胞，转基因在所述动物的乳腺细胞中表达。本领域中描述了体细胞转化的方法。参见例如Furth等(1995)Mol.Biotechnol.4：121-127。

可采用本发明的方法和系统对基因组易于修饰的任何非人动物进行遗传修饰以产生转基因动物。所述非人动物可以是脊椎动物或无脊椎动物，可以是哺乳动物或非哺乳动物(例如鸟类(例如鸡))。示例性非人哺乳动物对象包括但不一定限于非人灵长动物(猴、猿、黑猩猩)、啮齿动物(大鼠、小鼠、豚鼠、仓鼠等)、兔类动物(例如兔)和有蹄类动物(例如，牛、绵羊、山羊、猪)。术语“有蹄类动物”用来表示猪、牛、绵羊和山羊的任何种或亚种。

可采用本领域众所周知的克隆方法对经“人源化”包含用于在非人动物中表达的编码人SCR6结构域的序列的非人fH编码核酸序列进行改造。例如，改造小鼠fH编码核酸序列，使其包含编码人SCR6结构域而非小鼠SCR6的序列，可采用限制性消化酶将编码小鼠SCR6多肽的核酸序列从小鼠fH的CDS(注释于Genbank登陆号NM_009888)中去除，并采用连接酶用编码人SCR6多肽的核酸序列代替。

为在非人动物中表达而改造的核酸序列可设有操作性连接以调节其表达的序列如启动予序列。本文所述实施方式的核酸序列可经改造而包含本领域已知各种启动子中的任何一种以调节所述核酸序列的表达。例如，可改造所述核酸序列使核酸序列表达受fH启动子、组织特异性或细胞特异性启动子、由信号传导途径例如雌激素受体激活作用或药物例如四环素调节的启动子的调节。

可将人fH编码核酸序列或经人源化包含编码人SCR6结构域的序列的嵌合fH编码核酸序列引入非人动物的基因组中，使其在非人动物宿主中从与编码内源fH多肽的基因分离的基因组进行表达。这样的一个例子是转基因小鼠模型，其中向发育的囊胚提供编码感兴趣序列的改造DNA，并允许其随机插入到囊胚细胞的DNA中。这样的另一个例子是通过感染例如腺病毒或慢病毒感染提供DNA的动物，可在胚胎发育、出生后发育过程中或成体中进行。

或者，可将改造的核酸序列引入基因组中，使其由基因组从特定的基因座例如以所需方式调节的基因座编码，目的是限制转基因的表达或用转基因代替内源基因，如“敲入”转基因动物的情况。可通过将编码感兴趣序列的改造核酸序列引入胚胎干(ES)细胞来产生这样的敲入转基因动物，然后对其进行筛选以鉴定改造DNA已代替基因组内源序列的细胞。然后向所述ES细胞注射囊胚细胞或与囊胚细胞混合，以有利于发育的动物。通常，对引入以产生这样的动物的核酸进行改造，使所述核酸序列受其所代替基因的启动子的调节。本领域众所周知，在这样的情况中，不需要改造的核酸序列包含完整的非人fH，其中换入引入编码人SCR6的序列以代替非人SCR6；而可采用直接侧接SCR6的非人fH结构域。

通过给予fH多肽产生的非人动物模型

本发明还提供用作奈瑟球菌感染模型的非人动物，其中将fH多肽(例如，人fH多肽或具有人SCR6氨基酸序列的其它fH多肽)从外源引入非人动物的血流中。例如，可通过输注将所述fH多肽引入血流中以使血流中的fH多肽水平模拟人中发现的水平。

使用方法

非人动物模型可用于以下示例的各种背景中。通常，所述非人动物模型可用来测试候选疫苗引发杀菌性抗奈瑟球菌抗体(例如抗脑膜炎奈瑟球菌抗体)的功效。在给予候选试剂之前或之后感染非人动物模型时，所述模型可用于评价候选试剂(例如，候选抗生素、候选疫苗试剂)降低非人动物中细菌接种量的能力。

通常，用感兴趣的奈瑟球菌(例如，脑膜炎奈瑟球菌菌株、淋病奈瑟球菌菌株)接种非人动物模型。从培养物(例如从肉汤培养物)中取出细菌时，通常在如上所述给药之前洗涤所述细菌。接种物的密度可不同，例如，约10²-10⁹CFU/ml、约10⁴-10⁷CFU/ml、约10⁵-10⁶CFU/ml等。

筛选鉴定

可通过向本文所述的非人动物模型给药来筛选各种候选试剂中的任何一种。例如，所述动物模型可用来鉴定例如抑制或防止奈瑟球菌(例如脑膜炎奈瑟球菌)感染、复制或其引起疾病症状的候选试剂。

“候选试剂”用来包括合成、天然产生或重组产生的分子(例如，小分子、药物、多肽、抗体(包括抗原结合抗体片段，例如以提供被动免疫)或其它免疫治疗试剂，真核或原核细胞中存在的内源因子(例如，多肽、植物提取物等)等)。

本文所述的非人动物模型可用来评价用奈瑟球菌抗原免疫的人或非人动物中产生的抗奈瑟球菌抗体提供的被动免疫。本文所述的非人动物模型也可用于测试针对表达低水平fHbp的奈瑟球菌菌株的被动保护作用。例如，某些奈瑟球菌菌株如群C菌株4343可侵入年幼大鼠的血液并在其中复制(Welsch JA和GranoffDM，Infect Immun.，2004，72(10)：5903-9)。这些菌株还可在非免疫人血清中存活，与其结合的fH不可检测(Welsch JA等J.Infect.Dis.，2008，197(7)：1053-61)。这样的菌株倾向于表达低水平的fHbp。然而，低fHbp表达子菌株的fHbp对所述菌株在人血液和人血清中的存活率具有重要作用(Seib KL，Infect.Immun.2009，77(1)：292-299)。因此，所述非人动物模型可用于评价甚至针对fH低表达子的被动免疫。

候选试剂包括多种类型的分子和大量化学类别，例如，多肽、核酸、有机分子(例如分子量大于50且小于约2500道尔顿的小有机化合物)。可从各种来源包括合成或天然化合物文库获得候选试剂。

筛选候选抗奈瑟球菌试剂

可鉴定候选试剂以评价例如所述候选试剂降低细菌接种量、促进抗奈瑟球菌抗体产生等方面的能力。通常，将所述候选试剂给予动物模型，评价候选试剂相对于对照(例如，相对于未感染动物、相对于用抗菌作用已知的试剂处理的感染动物等)的作用。例如，可将所述候选试剂给予脑膜炎奈瑟球菌感染的动物模型，将受处理动物的细菌效价与处理之前和/或对照、未处理动物的细菌效价进行比较。通常，可检测到用候选试剂处理之后感染动物细菌效价显著降低，这指示所述试剂的抗菌活性。

可以任何所需的和/或适合递送所述试剂的方式给予所述候选试剂，以实现所需结果。例如，可通过注射(例如，静脉内、肌内、皮下或直接注射到需要达到所需效果的组织中)、口服或任何其它所需手段给予所述候选试剂。体内筛选通常包括接受不同量和浓度的候选试剂(从无试剂到用量达到可成功递送到动物的上限量的试剂)的大量动物，并可包括以不同制剂和途径递送所述试剂。所述试剂可单独给药或与两种或更多种试剂联合给药，特别是在试剂联合给药可产生协同作用时。

可通过各种方式评价所述候选试剂的活性。例如，用奈瑟球菌感染宿主动物时，可通过检测血清样品存在病原体(例如细菌效价)或与病原体存在相关的标记物(例如病原体特异性蛋白质或编码核酸等)来评价所述试剂的作用。检测和评价细菌感染的存在和/或严重程度的定性和定量方法在本领域中众所周知。在一个实施方式中，可通过检测血清样品和/或组织切片存在细菌来评价针对奈瑟球菌感染的试剂活性。

如之前所述，所述候选试剂可以是来自用奈瑟球菌抗原免疫的人或非人动物的测试血清，可鉴定所述测试血清赋予针对奈瑟球菌被动免疫的能力。可将所述测试血清给予所述非人动物模型。可将阴性对照血清如来自非免疫动物的血清或从免疫前动物获得的血清给予非人动物模型作为阴性对照。可通过如上所述的各种方式评价所述测试血清赋予的被动免疫。对评价针对奈瑟球菌的被动免疫的方法的描述见例如，Welsch JA等(J.Infect.Dis.，2003，188(11)：1730-40)，Vu DM等(J.Infect.Dis.，2006，193(6)：821-8)。

疫苗开发

本文所述动物模型还可用来对候选疫苗防止或改善奈瑟球菌感染的能力进行筛选。通常，“疫苗”是在给予之后促进宿主获得针对靶病原体的免疫应答的试剂。引发的体液、细胞或体液/细胞免疫应答可促进对疫苗针对的病原体感染的抑制作用。特别感兴趣的是引发抑制奈瑟球菌，例如脑膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌感染和/或复制的保护性免疫应答的预防疫苗。同样感兴趣的还有提供针对例如杀菌性抗奈瑟球菌抗体产生引起的刺激的保护作用的治疗疫苗。

可通过例如在用奈瑟球菌接种之前给予候选试剂来完成对候选疫苗的筛选。可通过快速灌注方式(例如，腹膜内或肌内注射)，并可在之后任选地进行一次或多次加强免疫来给予所述候选试剂。可通过检测抗体应答例如采用常规鉴定或本文所述鉴定来评价对免疫应答的诱导作用。可用奈瑟球菌刺激免疫动物，然后观察所述免疫动物和所需非免疫对照动物(如果有)的感染发展，评价感染的严重程度(例如通过评价存在的奈瑟球菌效价)。将使感染显著降低和/或杀菌性抗奈瑟球菌抗体显著增加的疫苗候选物鉴定为活疫苗。

实施例

提供以下实施例以进一步说明本发明的优点和特征，并不用来限制本发明的范围。尽管它们是可能采用的典型实施例，但可代替采用本领域技术人员已知的其它方案、方法或技术。

材料和方法

细菌菌株

将脑膜炎奈瑟球菌群C菌株4243用于采用幼兔补体测定免疫人(接种疫苗者)血清的杀菌活性。之前已对该菌株的特征进行了鉴定(Harris，S.L.等(2003)Infect Immun 71：275-286；D.M.等(2005)Vaccine 23：4307-4314；Welsch，J.A.等(2004)Infect Immun 72：5903-5909；Granoff，D.M.等(2005)Pediatr Infect Dis J 24：132-136)。所述测试菌株包括三个脑膜炎奈瑟球菌群B菌株H44/76、Cu385和NZ98/254，所述三个菌株已用于制备显示对人有效的外膜囊泡(OMV)疫苗(Sierra，G.V.等(1991)NIPHAnn 14：195-207和208-110；Bjune，G.等(1991)Lancet 338：1093-1096；Kelly，C.等(2007)Am J Epidemiol 166：817-823)。各菌株还广泛用于测定接种疫苗的人中的脑膜炎球菌血清杀菌性抗体应答(Tappero，J.W.等(1999)Jama281：1520-1527；Perkins，B.A.等(1998)J Infect Dis 177：683-691；M.等(1999)Vaccine 17：2377-2383；Wong，S.等(2007)Pediatr Infect Dis J26：345-350；Wedege，E.等(2007)Clin Vaccine Immunol 14：830-838；Sandbu，S.等(2007)Clin Vaccine Immunol 14：1062-1069；Oster，P.等(2007)Vaccine25：3075-3079；Thornton，V.等(2006)Vaccine 24：1395-1400)。测试年幼大鼠血清中所述三个群B菌株的存活率。此外，选择三个菌株之一的H44/76来检测给予人fH后年幼大鼠血流中的生物存活率。在之前的研究中，该菌株用于年幼大鼠菌血症模型中以测定OMV疫苗引发抗体的被动保护活性(Toropainen，M.等(1999)Vaccine 17：2677-2689；Toropainen，M.等(2005)Vaccine 23：4821-4833；Toropainen，M.等(2005)Infect Immun 73：4694-4703；Toropainen，M.等(2001)Microb Pathog 30：139-148)。

菌株4243的血清型(PorB)、血清亚型(PorA)和序列型(ST)分别是2a、P1.5，2和ST-11。菌株H44/76的相应类别是15、P1.7，16和ST-32，菌株Cu385的相应类别是4，7P1.19，15和ST-33，菌株NZ98/254的相应类别是4、P1.4和ST-42。菌株H44/76和Cu385是变体1群中H因子结合蛋白(fHbp)的高表达子，具有与菌株MC58相同的fHbp氨基酸序列(Masignani，V.等(2003)J Exp Med 197：789-799)。菌株4243和NZ98/254表达较低量的变体1群中的亚变体fHbp(与菌株MC58的fHbp的氨基酸相同性具有＜12％的差异)(Welsch，J.A.等(2004)J Immunol172：5606-5615；Welsch，J.A.等(2008)J Infect Dis 197：1053-1061)。

血清样品

可从之前的研究获得在对用四价脑膜炎球菌多糖免疫的4-5岁儿童接种疫苗之前和一个月之后立即获得的冷冻血清，或来自用群C脑膜炎球菌寡糖-CRM₁₉₇偶联疫苗免疫的成人的血清(King，W.J.等(1996)J Pediatr128：196-202；Vu，D.M.等(2006)Clin Vaccine Immunol 13：605-610)。在本研究中，根据各体积血清的可用性选择来自69名儿童和11名成人的方便血清样品进行鉴定。

灵长动物fH与脑膜炎奈瑟球菌的结合

从市场供应商(纽约希克威尔的生物改造公司(Bioreclamation，Hicksville，NY))获得黑猩猩、猕猴和狒狒的补体。从10名健康的成人志愿者获得人血清(fH结合的阳性对照)并进行合并。将该鉴定所用的所有血清在56℃加热30分钟以防止补体激活和C3b与细菌结合，从而可作为fH结合的另外配体。如之前采用也与灵长动物fH结合的多克隆抗人fH的淋病奈瑟球菌的情况所述，通过Western印迹测定黑猩猩、猕猴和狒狒的fH与菌株H44/76的结合。在用各血清分别培育所述细菌之后，洗涤、溶解所述细菌，并通过SDS-PAGE进行分析。通过Western印迹检测fH。

大鼠和兔血清对人H因子与脑膜炎奈瑟球菌结合的抑制作用

因为仅有多克隆抗人fH可作为测定fH与细菌直接结合的手段，所述试剂不与来自非灵长动物如大鼠或兔的fH交叉反应，因此非灵长动物fH与脑膜炎奈瑟球菌的结合不可直接测定。而是通过流式细胞术测定大鼠或兔血清抑制人fH与脑膜炎奈瑟球菌结合的能力。简单而言，将大鼠或兔血清和对照人血清在56℃加热30分钟以防止C3b与细菌结合。血清热失活不影响补体抑制功能或fH的结合性质(Jarva，H.等(2002)J Immunol168：1886-1894；Ram，S.等(1998)J Exp Med 188：671-680)。

在生长6-8小时后从巧克力琼脂平板收获脑膜炎奈瑟球菌菌株H44/76，将其悬浮在包含1mM CaCl₂和1mM MgCl₂(HBSS²⁺)的汉克斯碱性盐溶液(HBSS)中，达到约5x 10⁷CFU/ml。用40μl热失活的人、大鼠或兔血清将所述细菌悬浮液以100μl反应体积在37℃培育10分钟，之后加入5μg生物素化的人H因子(根据制造商的说明书，采用NHS-LC-生物素(皮尔斯公司(Pierce))以20∶1的生物素∶fH摩尔比进行生物素化反应)。将所述反应混合物(最终体积110μl)再培育15分钟，之后通过流式细胞术采用抗生物素蛋白(Extravidin)-FITC(西格玛公司(Sigma))在1∶100稀释度下检测结合的生物素化人fH。

异源C3在脑膜炎奈瑟球菌上的沉积和人fH的抑制作用

测定大鼠C3在用年幼大鼠血清培育(终浓度10％(体积/体积(v/v)))的菌株H44/76和NZ98/254上的沉积。通过流式细胞术(24)采用偶联FITC的抗大鼠C3测定结合细菌的大鼠C3。采用流式细胞术，通过增大加入年幼大鼠血清的人fH浓度(范围为0-50μg/ml)来评价人fH限制大鼠C3在菌株H44/76上沉积的能力，之后用5×10⁷细菌培育血清(终浓度20％)和fH的混合物。在一些实施方式中，向所述大鼠血清中加入EGTA和MgCl₂(二者终浓度均达到10mM)以阻断补体的经典和凝集素途径并选择性地允许替代途径激活。采用酵母聚糖作为补体替代途径完整性的对照，其为补体替代途径的有效激活物(Fearon，D.T.等(1977)Proc NatlAcadSci U SA74：1683-1687)。将酵母聚糖(西格玛公司)悬浮在PBS中，使浓度达到10mg/ml。将10μl该悬浮液加入如上所述的包含人fH的年幼大鼠血清中，最终反应体积为50μl。

年幼大鼠血清中脑膜炎奈瑟球菌的存活率

根据所述菌株，在9-20只年幼大鼠的血清中测试脑膜炎奈瑟球菌的存活率。通过对6窝幼崽进行心脏穿刺获得所述血清，将其储存在-70℃以维持内源补体。使用于鉴定的细菌在补充有0.25％葡萄糖(重量/体积(wt/vol))和0.02mM胞苷-5’-一磷-N-乙酰神经氨酸(密苏里州圣路易斯的西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich Co.，St.Louis，MO))的穆勒-辛顿肉汤(新泽西州富兰克林拉克斯的BD公司(BD，Franklin Lakes，NJ))中生长约2小时(A_620nm达到约0.6)到对数期。如上所述在别处洗涤所述细菌(52)并将其重悬浮于包含0.9mM Ca²⁺(CaCl₂x2H₂O)和0.5mM Mg²⁺(MgCl₂x6H₂O)的杜贝克磷酸盐缓冲盐水(DPBS，弗吉尼亚州赫恩顿的密迪亚泰克公司(Mediatech，Herndon，VA))和1％(wt/vol)牛血清白蛋白(BSA科恩组分V(Cohn Fraction V)，德克萨斯州科尔威尔的艾奇泰克生物公司(Equitech-Bio，Inc.，Kerrville，TX))(DPBS/Ca²⁺/Mg²⁺-1％BSA)中。最终的40μl反应混合物包含约400CFU细菌，20％、40％或60％血清和0-50μg/ml纯化的人fH(德克萨斯州泰勒的补体技术公司(ComplementTechnologies，Inc.，Tyler，TX))。通过将培育60分钟之后存在的各CFU/ml与阴性对照反应中在零时间的CFU/ml分别进行比较来确定各反应混合物中细菌的存活率百分数。阴性对照包含细菌和来自非免疫成人的不具有针对任何测试菌株的内源杀菌活性的20％或40％血清，其通常在37℃培育60分钟之后可产生大于150％的存活率。

补体介导的血清杀菌活性

对对数期经洗涤的生物测定群C杀菌效价，所述生长的生物已经过洗涤，如上所述被重悬浮于DPBS/Ca²⁺/Mg²⁺-1％BSA中，以便进行年幼大鼠血清中脑膜炎奈瑟球菌的存活率实验。补体来源是20％合并的幼兔血清代替非免疫人血清。所述兔血清合并物(阿肯色州罗杰斯的佩尔-弗里兹公司(Pel-Freeze，Rogers，Arkansas))未显示出可检测的杀菌活性(与零时间的CFU/ml相比，在1小时培育过程中，20％或40％血清中测试菌株CFU/ml的增长大于150％).

年幼大鼠中的菌血症

获得怀孕的远系繁殖维斯达大鼠(密歇根州波蒂奇的查尔斯河公司(Charles River，Portage，MI))，在出生后4-6天，将幼崽随机重新分配给养母以防止实验不同处理中的母性偏向。采用CHORI IACUC(儿童医院奥克兰研究中心，研究动物管理和使用委员会)批准的方案进行动物实验。如上所述使细菌生长并进行洗涤用于血清杀菌鉴定，将其重悬浮于包含10％合并热失活年幼大鼠血清的DPBS/Ca²⁺/Mg²⁺中，所述年幼大鼠血清已通过1mL HiTrap蛋白G HP柱(新泽西州皮斯卡塔韦的通用医疗公司(GEHealthcare，Piscataway，NJ))以去除IgG。通过ELISA检测不到消耗的血清中的IgG(大于99％的IgG被去除)，在热失活之前的血清中不存在可检测的杀菌活性。

将所述细菌悬浮液分为五等份，置于试管中。向其中三等份加入纯化的人fH(补体技术公司)以达到20μg/ml、100μg/ml或500μg/ml的浓度(以在100μl中递送2μg、10μg或50μg/只大鼠用于刺激)。向第四等份中加入(500μg/ml)纯化的人C1酯酶抑制剂(补体技术公司)作为阴性对照。仅含细菌的第五等份作为另外的阴性对照(0μg fH或C 1酯酶抑制剂)。在零时间，用100μl含经洗涤的对数期脑膜炎奈瑟球菌(约7X 103CFU/只大鼠)连同剂量为0、2、10或50μg的人fH或50μg的C 1酯酶抑制剂对幼崽进行IP刺激。细菌刺激后8小时，通过心脏穿刺获得血液标本，将1μL、10μL和100μL的血液份涂布到巧克力琼脂(堪萨斯州来尼克谢的瑞美尔公司(Remel，Lenexa，Kansas))平板上。在37℃的5％CO₂中过夜培育平板之后确定血液的CFU/mL。

统计学分析

求幂计算60分钟时CFU/ml的各几何平均数。在进行log₁₀转化时，对低于细菌检测下限的样品的赋值为下限的一半(即5CFU/ml)。通过单向ANOVA确定分别给予50μg、10μg、2μg或0μg fH/只大鼠的四组CFU/ml几何平均数各差异的显著性。通过T检验确定从用50μg人fH相对于50μg人C1酯酶抑制剂处理的动物获得的CFU/ml几何平均数的差异显著性。

fH转基因盒的产生

采用含cfH的质粒(pBluescript-cfH；Ngampasutadol J.等J.Immunol.180：3426-35，2008)作为模板扩增人H因子基因(cfH)。将扩增的PCR产物克隆到载体pCAGGS(pCAGGS包含鸡的β-肌动蛋白启动子：Niwa，H.，K.等Gene 108：193-9，1991)的EcoRI限制位点中。用SalI和PstI消化所得的载体pCAGGS-cfH，对包含启动子和cfH基因的约6kb的转基因盒进行凝胶纯化。将纯化的盒用于维斯达大鼠胚胎的微注射。

实施例1：灵长动物fH与脑膜炎奈瑟球菌结合的种特异性

多克隆抗人fH识别来自人以及非人灵长动物的热失活血清中的fH(图1A，标记为(“仅血清”)的泳道)，因此可用来测试灵长动物fH与细菌的结合。fH与灵长动物热失活血清中的菌株H44/76的结合显示于标记为“血清+细菌”的泳道。热处理不影响fH的结合性质(Jarva，H.等(2002)JImmunol 168：1886-1894；Ram，S.等(1998)J Exp Med 188：671-680)。用人血清培育的细菌(阳性对照)显示最多的fH结合，而黑猩猩血清中fH的结合处于低水平，狒狒和猕猴血清中检测不到结合。

实施例2：大鼠或兔fH不与人fH形成结合脑膜炎奈瑟球菌的竞争

采用间接流式细胞鉴定来确定热失活大鼠或兔fH(在其各自的热失活血清中)是否与生物素化的人fH形成结合活脑膜炎奈瑟球菌上相同配体的竞争。加入40％热失活的大鼠或兔血清(最高测试浓度)不会抑制生物素化的人fH与脑膜炎奈瑟球菌结合，而加入作为阳性对照的40％热失活的人血清会抑制生物素化的人fH的结合(图1B和1C)。这些数据表示大鼠和兔fH在脑膜炎奈瑟球菌上结合的配体与人fH的不同。虽然不能排除大鼠和兔fH在脑膜炎球菌上的结合位点不同于人fH的结合位点的可能性，但人fH、猕猴fH和大鼠fH(来自NCBI数据库)的氨基酸序列比对显示，与人和大鼠fH之间约64％的氨基酸序列相同性相比，人和猕猴fH具有约88％的氨基酸序列相同性。因为猕猴fH不与脑膜炎球菌结合(图1A)，大鼠或兔血清对人fH缺乏抑制作用与这些物种的fH也不与脑膜炎球菌结合相一致。

实施例3：加入年幼大鼠血清的人fH对脑膜炎奈瑟球菌存活率的作用

在37℃下对混合物中的脑膜炎奈瑟球菌三个菌株培育1小时时，测定向年幼大鼠血清加入人fH对其存活率的作用(图2)。在浓度为20％、40％和60％的浓度下测试各血清。不加fH时，与各自的零时间存活率相比，NZ98/254和Cu385两个菌株(分别为图2的上图和中图)的存活率在培育期间升高超过150％。相比之下，第三个菌株H44/76的存活率在所有三个血清浓度(图2下图)中均降低40％-60％。在向反应加入浓度为50μg/ml的人fH时，菌株H44/76相应的存活率升高＞150％(例如，相比不加人fH时的26％存活率，包含人fH的60％血清中的存活率为152％，P＜0.001)。两个已对血清具有抗性的菌株中的一种(菌株NZ98/254)的存活率不受加入人fH的影响，而第二个血清抗性菌株Cu385的存活率在40％和60％血清中进一步升高(fH，P＜0.001)。

虽然菌株H44/76在不加人fH的年幼大鼠血清中显示很差的存活率，但该菌株在于来自缺乏自然获得杀菌性抗体的成人的人血清中培育时可存活(在20％、40％或60％血清中在37℃培育1小时的存活率＞130％，数据未显示)，这一观察强调了生理学相关水平的人fH的存在对血清中菌株H44/76存活率的重要性。这些结果与我们之前的研究类似，之前的研究显示用来自健康成人的缺乏脑膜炎球菌杀菌性或调理性抗体的抗凝人全血或血浆培育的菌株H44/76的存活和生长情况(Welsch，J.A.等(2008)J InfectDis 197：1053-1061)。

实施例4：大鼠C3与脑膜炎球菌的结合和人fH对其的调节作用

为研究各菌株中年幼大鼠血清杀死作用抗性差异的基础，对大鼠C3与菌株H44/76(对年幼大鼠血清的杀死作用敏感)和NZ98/254(对杀死作用具有抗性)的结合进行测定。在年幼大鼠血清中培育时，菌株NZ98/254和H44/76结合类似量的大鼠C3(图3A，实线显示的直方图)。因此，C3沉积(如总C3结合量所确定)时或其之前的调节作用无法解释NZ98/254对年幼大鼠血清杀菌活性的抗性和H44/76对其的易感性。向大鼠补体中加入25μg/ml人fH导致大鼠C3与两个菌株的结合均降低(图3A，阴影灰色直方图)。确定大鼠C3通过人fH对菌株H44/76的调节效率以评价敏感性降低与大鼠血清的杀死作用可能的相关性。加入人fH以剂量反应形式降低了大鼠C3与H44/76的结合(图3B)；在向大鼠血清加入25和50μg/ml的人fH时，可见几乎完全的抑制作用，而大鼠血清中人fH浓度为6.25μg/ml时可见部分抑制作用。排它性地采用补体替代途径的实验(向补充有人H因子的大鼠血清加入Mg-EGTA以阻断补体的经典途径)显示在缺乏经典途径时C3调节效率增强(C3结合降低)。图3C显示人fH与细菌的结合也以剂量依赖方式调节兔的替代途径激活作用。

为确保对大鼠C3与菌株H44/76结合的抑制作用并非由对补体激活的非特异性抑制作用产生，采用作为补体替代途径有效激活物的酵母聚糖(Fearon，D.T.等(1977)Proc NatlAcadSci USA 74：1683-1687)进行平行实验。替代途径特异性补体激活作用和大鼠C3与酵母聚糖的结合在补充有浓度增加的人fH(在较高浓度的fH下可见一些抑制作用，实验为显示)的大鼠血清中以不受抑制的方式发生。

实施例5：人fH对年幼大鼠中脑膜炎球菌菌血症的作用

为确定人fH是否增强了体内脑膜炎奈瑟球菌球菌的存活率，将剂量为2、10或50μg的人fH联合给予每只大鼠用约7X 10³对数期CFU的菌株H44/76刺激的年幼大鼠(N＝15/组)。作为阴性对照，给予一组大鼠不含人fH(0μg)的细菌刺激，给予第二组含50μg/只大鼠的人C1酯酶抑制剂。刺激8小时后获得血液培养物。从给予与感染接种物混合的、量减少(50、10、2或0μg)的fH的动物血液中分离的细菌数量(CFU/ml)降低(图4，由ANOVA得到P＜0.02)。从给予人fH最高测试剂量50μg的动物血液分离的几何平均CFU/ml显著高于给予50μg人C1酯酶抑制剂的对照分离的CFU/ml(1050vs.43，P＜0.005，T检验)。

实施例6：人fH对幼兔补体引发的免疫人血清杀菌效价的作用

采用兔补体测定来自用脑膜炎球菌多糖疫苗免疫的69名4-5岁儿童的免疫前和免疫一个月后的血清中群C杀菌效价。19名儿童的效价在免疫前血清中＜1∶16(测试最低稀释度)，在免疫后血清中为1∶64或更高。

用单独的兔补体、用加入25μg/ml人fH的兔补体或作为对照的25μg/ml人补体C1酯酶抑制剂重新鉴定19例阳性免疫后血清的效价。对来自用群C脑膜炎球菌偶联疫苗免疫的11名成人的免疫后血清进行类似的鉴定。结果总结在图5中。在向反应加入人fH时，成人的血清杀菌几何平均效价(GMT)下降超过8倍(P＜0.001)，儿童的血清杀菌几何平均效价下降60倍(P＜0.001)。在加入人C1酯酶抑制剂时，各GMT与不含抑制剂测定的各效价不具有显著差异(P＞0.5)。

实施例7：表达人fH的F0转基因大鼠的产生

向大鼠胚胎注射纯化的人fH转基因盒(参见“材料和方法”)。将经微注射的大鼠胚胎植入到假孕的雌性维斯达大鼠中。通过Western印迹采用亲和分离的多克隆山羊抗人fH对F0代的一窝大鼠筛选人fH在血清中的表达(Granoff，D.M.，J.A.Welsch和S.Ram.2009.Infect Immun 77：764-9；Ngampasutadol J.等，J.Immunol.180：3426-35，2008)。将0.5μl来自16只F0大鼠幼崽的血清加样到泳道中。将0.06μl人血清用作阳性对照。16只动物(F0代)中的两只在其血清中表达人fH(图8)。

实施例8：表达人fH的转基因大鼠的产生

使表达fH的F0转基因大鼠与野生型维斯达大鼠交配，并对来自该交配的幼崽(F1代)筛选如实施例7所述血清中的fH表达。通过PCR确定这些幼崽中存在cfH基因。将来自表达人fH的F1代的大鼠鉴定为将人cfH整合到生殖系细胞中，用来进一步繁殖育种以产生表达人fH的纯合转基因大鼠。

讨论

以上内容表明：(a)fH与脑膜炎奈瑟球菌的结合对人fH而言是特异性的，(b)向年幼大鼠血清加入人fH增加了细菌对补体介导杀菌活性的抗性并降低了大鼠C3沉积，(c)在用群B脑膜炎奈瑟球菌进行腹膜内刺激时将人fH给予年幼大鼠使生物的存活率升高超过1log₁₀。此外，在向测试反应混合物加入人H因子时，采用幼兔补体在免疫儿童和成人血清中测定的群C杀菌效价下降了8-60倍。

近30年前首次报道了补体在宿主对脑膜炎奈瑟球菌防御中的重要作用(Nicholson，A.等(1979)Science 205：298-299)。Zollinger和Mandrell在25年前报道，用兔补体测定的血清杀菌效价远高于用人补体测定的各效价(Zollinger，W.D.等(1983)InfectImmun 40：257-264)，这一观察被随后的研究证实(Santos，G.F.等(2001)Clin Diagn Lab Immunol 8：616-623)。以上数据(图5)显示，加入人fH降低了采用兔补体在来自免疫儿童或成人的血清中测定的杀菌效价。因此，脑膜炎球菌选择性与人fH结合的能力可能是用非人补体源测定的杀菌效价较高的一个原因。应注意，在我们的研究中，在测试人血清的高稀释度(≥1∶64)下，预期人fH是有限的。然而，在人血清的较低稀释度下，预期人fH的浓度足以下调兔C3，其可有利于用兔补体偶然观察到的前区(即在人测试血清的低稀释度下缺乏杀菌活性，但在兔C3激活作用不再受人fH的下调时在高稀释度下存在杀菌活性)。

Claims (36)

1.一种检测样品中杀菌性抗奈瑟球菌抗体的方法，所述方法包括：

将以下组分在反应混合物中混合：

疑似包含杀菌性抗奈瑟球菌抗体的样品；

包含人短同源重复序列6(SCR 6)的氨基酸序列的H因子(fH)多肽，

非人补体来源，和

奈瑟球菌；

通过评价奈瑟球菌的生存力来检测样品中存在或缺乏杀菌性抗奈瑟球菌抗体，

其中所述样品存在下的奈瑟球菌生存力减小表示所述样品包含杀菌性抗奈瑟球菌抗体。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述fH多肽是人fH多肽。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述fH多肽是包含非人动物内源fH多肽氨基酸序列的嵌合fH多肽，所述嵌合fH多肽经修饰包含人SCR6的氨基酸序列。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述非人补体是兔补体。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述非人补体是大鼠补体或小鼠补体。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述奈瑟球菌是脑膜炎奈瑟球菌。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述脑膜炎奈瑟球菌是群A、B、C、X、Y或W-135脑膜炎奈瑟球菌。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品包含人血清。

9.一种反应混合物，其包含：

疑似包含杀菌性抗奈瑟球菌抗体的样品；

包含人短同源重复序列6(SCR 6)的氨基酸序列的分离的H因子(fH)多肽，

非人补体，和

奈瑟球菌。

10.如权利要求9所述的反应混合物，其特征在于，所述fH多肽是人fH多肽。

11.如权利要求9所述的反应混合物，其特征在于，所述fH多肽是包含非人动物内源fH多肽氨基酸序列的嵌合fH多肽，所述嵌合fH多肽经修饰包含人SCR6的氨基酸序列。

12.如权利要求9所述的反应混合物，其特征在于，所述非人补体是兔补体。

13.如权利要求9所述的反应混合物，其特征在于，所述非人补体是大鼠补体或小鼠补体。

14.如权利要求9所述的反应混合物，其特征在于，所述奈瑟球菌是脑膜炎奈瑟球菌。

15.如权利要求13所述的反应混合物，其特征在于，所述脑膜炎奈瑟球菌是群A、B、C、X、Y或W-135脑膜炎奈瑟球菌。

16.一种包括一个或多个小瓶的试剂盒，所述小瓶包含：

包含人短同源重复序列6(SCR 6)的氨基酸序列的分离的H因子(fH)多肽；和

非人补体。

17.如权利要求16所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含奈瑟球菌的培养物作为检测杀菌性抗体的靶。

18.如权利要求16所述的试剂盒，其特征在于，所述fH多肽是人fH多肽。

19.如权利要求16所述的试剂盒，其特征在于，所述fH多肽是包含非人动物内源fH多肽氨基酸序列的嵌合fH多肽，所述嵌合fH多肽经修饰包含人SCR6的氨基酸序列。

20.如权利要求16所述的试剂盒，其特征在于，所述非人补体是兔补体。

21.一种非人动物，其包含：

编码含人短同源重复序列6(SCR 6)的氨基酸序列的H因子(fH)多肽的基因组整合核酸，其中所述转基因操作性连接于启动子以提供所述核酸在非人动物中的表达；

其中所述核酸在非人动物中的表达提供结合奈瑟球菌的fH多肽的产生。

22.如权利要求21所述的非人动物，其特征在于，所述fH多肽是人fH多肽。

23.如权利要求21所述的非人动物，其特征在于，所述fH多肽是包含非人动物内源fH多肽氨基酸序列的嵌合fH多肽，所述嵌合fH多肽经修饰包含人SCR6的氨基酸序列。

24.如权利要求21所述的非人动物，其特征在于，所述非人动物是大鼠或小鼠。

25.如权利要求21所述的非人动物，其特征在于，用奈瑟球菌感染所述非人动物。

26.如权利要求25所述的非人动物，其特征在于，所述奈瑟球菌是脑膜炎奈瑟球菌。

27.一种筛选候选奈瑟球菌疫苗的方法，所述方法包括：

将候选试剂给予如权利要求21所述的非人动物；

检测存在或缺乏杀菌性抗奈瑟球菌抗体的产生。

28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将奈瑟球菌给予所述非人动物。

29.一种奈瑟球菌感染的非人动物模型，其包含：

包含人短同源重复序列6(SCR 6)的氨基酸序列的H因子(fH)多肽的非人动物宿主，其中所述fH多肽存在于所述非人动物宿主的血流中；和

用奈瑟球菌进行细菌感染；

其中所述fH多肽存在于非人动物的血清中。

30.如权利要求29所述的非人动物模型，其特征在于，所述fH多肽由整合到非人动物基因组中的核酸编码。

31.如权利要求29所述的非人动物模型，其特征在于，对非人动物宿主的血流从外源给予所述fH多肽。

32.如权利要求29所述的非人动物模型，其特征在于，所述fH多肽是人fH多肽。

33.如权利要求29所述的非人动物模型，其特征在于，所述fH多肽是包含非人动物内源fH多肽氨基酸序列的嵌合fH多肽，所述嵌合fH多肽经修饰包含人SCR6的氨基酸序列。

34.如权利要求29所述的非人动物宿主，其特征在于，所述非人动物是大鼠或小鼠。

35.如权利要求29所述的非人动物宿主，其特征在于，所述奈瑟球菌是脑膜炎奈瑟球菌。

36.一种筛选促进抗奈瑟球菌活性的候选试剂的方法，所述方法包括：

将候选试剂给予如权利要求25所述的非人动物或如权利要求29所述的非人动物模型；

检测候选试剂对非人动物中奈瑟球菌的生存力存在或缺乏作用。

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