CN104096224A - 一种增强流行性嗜血杆菌b型多糖蛋白结合物免疫原性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种增强流行性嗜血杆菌b型多糖蛋白结合物免疫原性的方法,通过在CRM197A中加入万能表位肽P30,并采用基因重组大肠杆菌来生产含有该万能表位肽的白喉毒素变异体CRM197的A链的蛋白载体(简称P30CRM197A);然后将流行性嗜血杆菌b型多糖通过共价键连接至P30CRM197A蛋白载体上形成流行性嗜血杆菌b型多糖-P30CRM197A结合物;采用这种方法获得的流行性嗜血杆菌b型-P30CRM197A结合物与不含有万能表位肽的对应蛋白载体CRM197A获得的流行性嗜血杆菌b型多糖-CRM197A结合物相比较,其免疫原性比对照提高了3-5倍。
Description
技术领域
本发明涉及一种增强流行性嗜血杆菌b型多糖蛋白结合物免疫原性的方法。
背景技术
当多糖以共价键连接至蛋白载体上时,能将半抗原的多糖转变成全抗原,使得多糖的免疫原性得到增强。以此方法合成的多糖蛋白结合疫苗已被广泛地应用于小儿,成功地预防了包括肺炎球菌,流行性脑膜炎球菌以及流行性嗜血杆菌b型等细菌的感染。
用于合成多糖蛋白结合物的蛋白载体有多种,如破伤风类毒素、白喉类毒素、白喉毒素变异体CRM197,以及基因重组技术生产的流行性嗜血杆菌表面蛋白D等;但是,由于不同蛋白的免疫特性,以不同蛋白载体合成的多糖蛋白结合物的免疫原性有差异,动物体免疫后,对于由不同蛋白载体与同一种多糖合成形成的多糖蛋白结合物,所显现的多糖免疫原性也不同。由此可见,采用不同技术生产的蛋白载体,合成出来的多糖蛋白结合物的免疫原性有差异。
进入动物机体内后,抗原经抗原处理细胞(Antigen Process Cell,APC)处理后产生表位肽(Epitope)[1],在和主要组织相容性复合物(MajorHistocompatibility Complex,MHC)分子结合后,进而呈现在APC细胞表面,能够被T淋巴细胞识别,这是免疫学通过实验已经得出的结论。现在知道,一个已知表位肽的免疫原性取决于三个因素:
第一、适当表位肽的产生;
第二,和表位肽结合的主要组织相容性复合物分子的呈现;
第三,识别表位肽与主要组织相容性复合物形成的结合物的T细胞的呈现。
其中,任何一个环节的缺少都将导致免疫应答缺失。
用小鼠进行的试验表明,缺乏适当的表位肽与主要组织相容性复合物形成的结合物分子是最常导致动物体免疫响应缺失的原因。主要组织相容性复合物具有高度的多形态性,已知的表位肽仅通过一个或者几个等位基因(Alleles)就可结合至主要组织相容性复合物,而不是全部表位肽片段。另外,有实验结果显示,由于抗原处理不适当,或者T细胞耐受性空缺,也会导致免疫响应的缺失。
有实验表明,破伤风毒素的表位肽FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(称为P30),可和大量不同的主要组织相容性复合物Class II结合,显示其能够被T细胞识别,具有万能免疫原性的特性,被称之万能表位肽。
万能免疫原性表位肽具有和多个人类主要组织相容性抗原复合物Class II分子的同型和异型体结合。这种万能表位肽和人类主要组织相容性抗原复合物Class II分子随机的结合可用于开发合成疫苗,因为其能够激活人群中的大部分个体的获得性免疫系统的应答。
研究表明,P30表位肽由破伤风毒素的947-967氨基酸序列组成(FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE)。在含有该表位肽的蛋白进入机体后,蛋白将被摄入至APC细胞内,被消化降解。但是,这些表位肽将保存完整,在和主要组织相容性复合物结合后,被呈现在APC细胞表面,并被T细胞识别,这表明万能表位肽以相同的方式和多种DR分子作用。
MHC分子是加工后抗原的杂性受体,其功能是在胸腺中的免疫耐受诱导和周边免疫响应外来抗原的过程中,来呈现其抗原中的表位肽。因此,MHC分子必须在呈现大量的表位肽(容许更好的抗原识别,但更多的消耗T细胞储备),和少许表位肽(大量的T细胞储备,但是少许有效地呈现外来抗原)中达到平衡。也就是说,如果抗原中含有在APC细胞处理后能够保存完整性、并具有代表性的少量表位肽,在和MHC结合后,就能够刺激一定量的T细胞,来建立免疫记忆效应,而这一过程不会消耗过量的T细胞,以避免消耗大量的T细胞,造成免疫耐受。含有这种表位肽的抗原具有更强的免疫原性,这也就解释了为什么破伤风类毒素具有很强的免疫原性的原因。
现发现的大部分T细胞的刺激表位肽对于不同MHC Class II单体(haplotype)作用有限,不同动物保存和呈现不同的抗原多肽区域(epitopes)来刺激其T细胞。这种T细胞刺激活性的基因限制阻碍了以合成方法来开发疫苗,而这种方法对于基因上不同的人群的应用,应该是非常有效的方法。那些被发现具有刺激多重小鼠个体和/或与大多数人体MHC Class II分子相关联的T细胞刺激表位肽,提供了一个设计万能活化T细胞的有效途径。在普通的蛋白抗原中加入万能表位肽(也称为万能T细胞抗原簇)P30,能够被大多数动物的MHC Class II分子识别。这种T细胞抗原簇能够用于直接诱导T细胞,或提供帮助B细胞生产针对于弱免疫原的抗体,增强机体获得性免疫应答的效应。
致病性细菌通常能够表达高分子量,包裹在细菌表面的是荚膜多糖,简称多糖。对于成人来说,荚膜多糖是具有很好的免疫原性抗原,可用于制备疫苗;但是,对于小儿,即2岁以下的婴幼儿,荚膜多糖被认为是非依赖于T细胞抗原。实验显示,当用作为抗原时,荚膜多糖可诱导野株或者T细胞缺失小鼠生产多糖特异性IgM抗体的响应;但是,并不诱导IgM抗体向IgG抗体的转化。人体实验也显示,作为疫苗,多糖可以诱导成人生产保护性抗体,但无法诱导婴幼儿的免疫应答;也就是说,在小儿重复免疫荚膜多糖抗原后,无第二次抗体增强响应,也无法诱导持续的T细胞记忆。
现代免疫学实验证实,多糖蛋白结合疫苗和纯多糖疫苗比较的优势在于,前者能够诱导免疫响应。当非依赖T细胞的荚膜多糖共价键地连接至载体蛋白而形成的多糖蛋白结合物,在免疫了哺乳动物后,可诱导T细胞来帮助B细胞产生针对于结合物中的多糖部分的IgG抗体。因此,多糖蛋白结合物诱导多糖特异性抗体IgM转化为IgG,记忆B细胞的分化,以及长期存在的T细胞记忆。
流行性嗜血杆菌是一种微小的革兰氏阴性球菌,目前共有六个在抗原性和生化特性上不同的荚膜多糖菌株被发现,分别是a、b、c、d、e、和f;其中b型(Haemophilus influenzae type b,Hib)在临床上和免疫学上最重要,是引起儿童患侵袭性细菌疾病,包括脑膜炎、菌血症、会厌炎、肺炎、化脓性关节炎、心包炎和蜂窝炎的主要菌株中,占全部分离出来菌株的95%。研究表明细菌的致病性主要由菌体表面的几个结构成分所决定,其中,最具有致病性的是荚膜多糖。
据免疫前的记录,在每年5岁以下患有严重疾病儿童的中,已确证有300多万例与Hib有关,并导致全球大约40万人死亡。在美国,Hib感染是引起儿童细菌性脑膜炎的首要原因,资料显示,每年至少有20,000个侵袭性细菌疾病病例;据估计,每200个儿童中,有1个儿童会在他的5岁以下年纪时患1次由于Hib感染导致的疾病。在流行的高峰年,发病率可和和脊髓灰质炎发病率相同,如美国在1951年-1955年间,有10,000到21,000个病例被报告,其中死亡为1,000到31,00,超过了脑膜炎球菌和肺炎球菌发病率的几倍。
当前临床医生在治疗Hib感染患者时所面临的可能难题之一就是耐药性的出现,氨苄青霉素一直是主要用于治疗Hib感染的抗菌素,到上世纪70年代中期,第一例Hib耐药菌株出现后,开始广泛地扩散,根据世界地区的不同,被分离到的耐药菌株占5%-50%。特别令人担忧的是氯霉素抗药株和氨苄青霉素-氯霉素抗药株的出现,现有报道,在西班牙临床上分离到耐药菌株中50%的有耐氨苄青霉素-氯霉素。由此可见,Hib对抗生素耐药性的增加突显了预防的重要性,进行流行性嗜血杆菌b型疫苗的开发是对全世界儿童的健康成长具有极大的意义。
流行性嗜血杆菌b型多糖结合疫苗在预防严重的传染病中,发挥了巨大的作用。不过,不同品种的Hib多糖结合疫苗的免疫原性变异性较大,其原因除了是由于采用了不同合成方法的结果外,不同蛋白载体的使用,也是导致其免疫原性差异的主要原因。在某些高危人群中,比如小儿、老年人或免疫功能低下人,低免疫原性的Hib多糖结合疫苗的免疫效果不佳,保护性受到限制。因此,开发出免疫原性更强的流行性嗜血杆菌b型多糖结合疫苗,仍然是该领域努力的方向。
将衍生后的荚膜多糖共价键连接到一种蛋白载体上的技术,是上世纪80年代开发的制备Hib-蛋白结合疫苗的顶峰。在应用于2岁以下的儿童中,该疫苗能够将在刺激机体免疫系统应答的非依赖T-细胞荚膜多糖抗原,转变成依赖性T-细胞多糖-蛋白结合物。这种Hib-蛋白结合物的安全性和有效性已经在临床试验中得到了印证,甚至在和其它疫苗联用时也得到了证明。
目前临床上使用的Hib多糖蛋白结合疫苗的生产是采用纯化的Hib荚膜多糖和蛋白载体进行共价键的结合来制备,常用的蛋白载体部分种类包括破伤风类毒素、白喉类毒素、白喉毒素突变体CRM197。试验证明,采用这些蛋白载体合成的Hib荚膜多糖蛋白结合物的主要原因是,这些蛋白是在人体上长期使用的疫苗或者类似物,安全、无毒;并且,合成后的结合物免疫原性好。
本发明是将Hib荚膜多糖与基因重组技术表达的,带有P30万能表位肽的白喉毒素变异体P30CRM197A以共价键的形式连接而形成的Hib-P30CRM197A结合物。该方法合成的疫苗不同于传统多糖蛋白结合疫苗在于,通过加入P30万能表位肽来增强Hib-P30CRM197A结合物的免疫原性。
发明内容
本发明的目的是提供一种增强流行性嗜血杆菌b型多糖蛋白结合物免疫原性的方法,先在白喉毒素变异体CRM197的A链(简称CRM197A)中加入万能表位肽FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(简称P30),通过基因重组工程菌来生产含有P30的CRM197A蛋白载体(简称P30CRM197A);然后将流行性嗜血杆菌b型多糖通过共价键形式连接到P30CRM197A蛋白载体上形成流行性嗜血杆菌b型多糖-P30CRM197A结合物。所获得的Hib-P30CRM197A结合物与不带万能表位肽P30的蛋白载体合成的Hib-CRM197A结合物比较,该结合物的Hib多糖抗体滴度提高了3-5倍。
本发明采取的技术方案如下:
步骤一:在白喉毒素变异体CRM197的A链(简称CRM197A)中加入万能表位肽FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(简称P30),通过基因重组工程菌来生产含有P30的CRM197A蛋白载体(简称P30CRM197A);
步骤二:将流行性嗜血杆菌b型多糖通过共价键形式连接到P30CRM197A蛋白载体上形成流行性嗜血杆菌b型多糖-P30CRM197A结合物。
进一步,在所述含有P30CRM197A的蛋白载体中含有X个P30,1≤X≤3。
进一步,在P30CRM197A蛋白载体中,P30连结在CRM197A蛋白的N-末端或C-末端,或者同时连接在N-末端和C-末端。
进一步,在P30CRM197A蛋白载体中,所述P30与CRM197A蛋白之间是通过GSGSG氨基酸序列进行连接。
进一步,所述基因重组工程菌是通过基因重组方法构建的大肠杆菌。
进一步,所述流行性嗜血杆菌b型多糖是通过培养流行性嗜血杆菌b型菌获得的荚膜多糖。
具体实施方式
下面举例说明本发明的具体实施方法,但不局限于以下实例。
本发明的实施方法是用基因重组的方法,在大肠杆菌工程菌表达系统中,对CRM197A蛋白载体和带有万能表位肽P30的CRM197A蛋白载体进行表达并纯化;然后,将流行性嗜血杆菌b型荚膜多糖(简称Hib)共价键地连接至P30CRM197A,制备出Hib-P30CRM197A结合物;配制成疫苗后,免疫小白鼠,采血获得免疫血清;用ELISA方法检测小白鼠血清中的多糖特异性抗体滴度,以评估多糖蛋白结合物的免疫原性。
步骤一:蛋白载体和流行性嗜血杆菌b型荚膜多糖的制备
为说明本发明的有效性,制备了两种载体蛋白,即含有P30的蛋白载体P30CRM197A和不含P30的蛋白载体CRM197A。其中,CRM197A蛋白载体是用于合成对照用流行性嗜血杆菌b型多糖-CRM197A结合物样品。
一、CRM197A蛋白载体和P30CRM197A蛋白载体氨基酸序列的设计
1、CRM197A蛋白载体氨基酸序列的设计
白喉毒素是由带有白喉毒素基因的β噬菌体在白喉杆菌内表达,在细菌胞浆中存在形式为多肽,由560个氨基酸组成,分子量为62,000道尔顿。其氨基酸序列如下:
MSRKLFASILIGALLGIGAPPSAHAGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKP GYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSG KAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRF GDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMY EYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFFEIKS
当分泌至细菌体外前,多肽N-末端的25个引导氨基酸序列被切除掉,变成了由535个氨基酸组成、分子量为58kD的单链多肽而分泌至细菌体外,其氨基酸序列如下:
GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDD DWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDN AETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINN WEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFFEIKS
分泌至细菌体外的白喉毒素被酶切为A链和B链,其间由一个二硫键连接而形成一个蛋白分子这两个多肽链具有不同的功能,A链为白喉毒素蛋白分子的N-末端片段,分子量为21kD,由193个氨基酸组成,是白喉毒素的毒性功能部分。它是通过在真核生物细胞浆内,将二磷酸三腺苷核糖(ADP-Ribosyl)的异柠檬酸脱氢酶(NAD+)部分转移至延伸因子2(Elongation Factor-2,EF-2)上,从而抑制细胞中的蛋白质合成,进而抑制细胞生长,造成细胞伤亡。B链为白喉毒素蛋白分子的C-末端片段,分子量大约为37kD,由342个氨基酸组成。B链的功能是识别敏感细胞表面的特异性受体,将白喉毒素吸附在敏感细胞上,帮助A链进入细胞内。
白喉毒素的A链具有良好的水溶性,其氨基酸序列如下:
GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDD
DWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDN
AETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINN
WEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRR
研究发现[3],由于β噬菌体上的毒素基因tox的突变,对于噬菌体的复制没有影响,但是,合成出来的毒素的毒性可能消失,或大大地降低,而形成白喉毒素突变体(Cross Reacting Material,CRM),但是白喉毒素突变体的血清学免疫原性仍然和毒素相关联。比如,白喉毒素突变体CRM197,无白喉毒素的毒性,从氨基酸序列分析来看是由于A链中的第52位氨基酸,由甘氨酸(Gly)突变成谷氨酸(Glu),其氨基酸序列如下:
GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDD
DWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDN
AETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINN
WEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRR
试验研究表明,与其它现在市场上用于肺炎球菌结合疫苗合成的蛋白载体比较,白喉毒素变异体CRM197蛋白A链多肽具备以下一些优势,如其免疫原性和白喉毒素及白喉内毒素相关联,分子量小,水溶性高,易于生产和进行大分子合成反应。长期的白喉类毒素疫苗的临床使用,已经证明其安全性和有效性。
2、含有P30万能表位肽的P30CRM197A蛋白载体氨基酸序列的设计
将万能表位肽P30连接至CRM197A蛋白载体上,构建出一种新的用于合成多糖蛋白质结合物的蛋白载体。所用的万能表位肽P30可连接至CRM197A蛋白载体的N-末端或C-末端;也可将两个不同的万能表位肽分别连接至CRM197A蛋白载体的N-末端或C-末端;另一种方式是将两个万能表位肽自身连接,然后再连接至CRM197A蛋白载体N-末端或者C-末端;还有一种方式是将一个万能表位肽连接至C-末端或者N-末端,两个自身连接万能表位肽连接至另一端。
2-1、含有万能表位肽P30的P30CRM197A蛋白载体氨基酸序列的设计
2-1-1、P30-N-末端CRM197A蛋白载体(称为P30-CRM197A)氨基酸序列的设计
通过将P30氨基酸序列FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE加入至CRM197A蛋白载体的N-末端,形成一个新的蛋白,其氨基酸序列如下:
FNNFTVSFWLRVPKVSASHLEGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRR
在P30氨基酸序列和CRM197A蛋白载体的N-末端间插入了GSGSG片段来进行连接,以此方法构建的蛋白称为P30-CRM197A蛋白载体。
2-1-2、CRM197AC-末端-P30蛋白载体(称为CRM197A-P30)氨基酸序列的设计
通过将P30氨基酸序列FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE加入至CRM197A蛋白载体的C-末端,形成另一种新的蛋白,其氨基酸序列如下:
MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE
在P30氨基酸序列和CRM197A蛋白载体的C‐末端间插入了GSGSG片段来进行连接,以此方法构建的蛋白称为CRM197A‐P30蛋白载体。
2-1-3、P30-N-末端CRM197AC-末端-P30蛋白载体(称为P30-CRM197A-P30)氨基酸序列的设计
通过将两个P30氨基酸序列FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE分别加入至CRM197A蛋白载体的N-末端和C-末端,形成一种新的蛋白,其氨基酸序列如下:
FNNFTVSFWLRVPKVSASHLEGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE
在P30氨基酸序列和CRM197A蛋白载体的N‐末端和C‐末端之间插入了GSGSG片段来进行连接,以此方法构建的蛋白称为P30‐CRM197A‐P30蛋白载体。
2-1-4、P30-P30-N-末端CRM197A蛋白载体(称为P30-P30-CRM197A)氨基酸序列的设计
通过将两个P30氨基酸序列FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE自身连接,然后再加入至CRM197A蛋白载体的N-末端,形成一种新的蛋白,其氨基酸序列如下:
FNNFTVSFWLRVPKVSASHLEGSGSGFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRR
在两个自身连接的P30氨基酸序列之间,以及和CRM197A蛋白载体的N‐末端间插入了GSGSG片段来进行连接,以此方法构建的蛋白称为P30‐P30‐CRM197A蛋白载体。
2-1-5、CRM197AC-末端-P30-P30蛋白载体(称为CRM197A-P30-P30)氨基酸序列的设计
通过将两个P30氨基酸序列FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE自身连接,然后再加入至CRM197A蛋白载体的C-末端,形成一种新的蛋白,其氨基酸序列如下:
GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEGSGSGFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE
在两个自身连接的P30氨基酸序列之间,以及和CRM197A蛋白载体的C‐末端间插入了GSGSG片段来进行连接,以此方法构建的蛋白称为CRM197A‐P30‐P30蛋白载体。
2‐1‐6、P30‐P30‐N‐末端CRM197AC‐末端‐P30蛋白载体(称为P30‐P30‐CRM197A‐P30)氨基酸序列的设计
通过将两个P30氨基酸序列FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE自身连接,然后再加入至CRM197A蛋白载体的N-末端;另外,将一个P30加入至CRM197A蛋白载体的C-末端,形成另一种新的蛋白,其氨基酸序列如下:
FNNFTVSFWLRVPKVSASHLEGSGSGFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE
在两个自身连接的P30氨基酸序列之间,以及和CRM197A蛋白载体的C‐末端间插入了GSGSG片段来进行连接,以此方法构建的蛋白称为P30‐P30CRM197AP30蛋白载体。
2‐1‐7、P30‐N‐末端CRM197AC‐末端‐P30‐P30蛋白载体(称为P30‐CRM197A‐P30‐P30)氨基酸序列的设计
通过将一个P30氨基酸序列FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE连接至CRM197A蛋白载体的N-末端;另外,将两个P30进行自身连接,然后再加入至CRM197A蛋白载体的C-末端,形成另一种新的蛋白,其氨基酸序列如下:
FNNFTVSFWLRVPKVSASHLEGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEGSGSGFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE
在两个自身连接的P30氨基酸序列之间,以及和CRM197A蛋白载体的C-末端间插入了GSGSG片段来进行连接,以此方法构建的蛋白称为P30-CRM197A-P30-P30蛋白载体。
二、CRM197A蛋白载体和含有万能表位肽的P30CRM197A蛋白载体表达质粒的构建
1、CRM197A蛋白载体表达质粒的构建
从GenBank获取CRM197蛋白完整氨基酸序列PRF:224021,确定CRM197蛋白的A链片段,CRM197的氨基酸1-193为CRM197的A链片段。以此为依据,对该片段的氨基酸的核酸序列进行优化,以便在大肠杆菌表达系统中高效表达。采用自制的表达质粒,用NdeI酶识别质粒位点CATATG,BamHI酶识别位点GGATCC。经过CRM197A的基因序列进行分析,在序列内,无NdeI及BamHI酶切位点。CRM197A蛋白基因合成序列如下:
CATATG
GGTGCGGACGACGTTGTGGACTCCTCAAAATCGTTTGTCATGGAAAACTTCAGCTCTTAT
CATGGCACCAAACCGGGTTACGTGGACTCCATTCAGAAGGGCATCCAAAAACCGAAGTCA
GGCACCCAGGGTAACTACGATGACGATTGGAAGGAATTCTACAGCACGGACAATAAGTAT
GATGCGGCCGGCTACTCTGTTGACAACGAAAATCCGCTGAGTGGTAAAGCAGGCGGTGTG
GTTAAGGTCACCTATCCGGGTCTGACGAAAGTTCTGGCGCTGAAGGTCGATAACGCCGAA
ACCATTAAAAAGGAACTGGGCCTGTCTCTGACCGAACCGCTGATGGAACAAGTGGGTACG
GAAGAATTTATCAAACGTTTCGGCGATGGTGCATCGCGTGTCGTGCTGAGCCTGCCGTTT
GCTGAAGGCAGTTCCTCAGTGGAATACATTAACAATTGGGAACAAGCAAAAGCTCTGTCA
GTTGAACTGGAAATCAATTTCGAAACGCGTGGCAAACGCGGTCAAGATGCTATGTATGAA
TATATGGCTCAGGCGTGTGCGGGCAATCGCGTCCGTCGCTAAGGATCC
向空白质粒和合成的CRM197A蛋白基因的PCR产物中,分别加入Nde I酶和Bam HI酶进行双酶切反应;纯化后,在连接体系中加入T4连接酶进行连接,完成后纯化表达质粒,并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。用BL21(DE3)感受态细胞,将表达质粒转化至细胞内,筛选克隆。获得阳性表达工程菌后,建立种子库,包括主种子和工作种子。储存于-20℃以下冰箱中。
2、含有万能表位肽的P30CRM197A蛋白载体表达质粒的构建
2-1、P30-CRM197A蛋白载体表达质粒的构建
采用自制的空白表达质粒,用NdeI酶识别质粒位点CATATG,Bam HI酶识别位点GGATCC。经过P30CRM197A蛋白载体基因序列进行分析,在序列内,无NdeI及BamHI酶切位点。P30-CRM197A基因合成全序列如下:
CATATG
TTCAATAATTTTACGGTGTCGTTTTGGCTGCGTGTCCCGAAAGTCTCTGCGAGTCATCTG
GAAGGTTCTGGTAGCGGTGGTGCGGATGACGTGGTTGATAGCTCTAAATCTTTCGTTATG
GAAAACTTCAGTTCCTATCATGGCACCAAACCGGGTTACGTCGATTCGATTCAGAAAGGC
ATCCAAAAACCGAAAAGCGGCACCCAGGGTAACTACGATGACGATTGGAAAGAATTCTAC
TCAACGGACAACAAATACGATGCGGCCGGCTACTCCGTGGACAACGAAAATCCGCTGAGC
GGTAAAGCGGGCGGTGTCGTGAAAGTTACCTATCCGGGTCTGACGAAAGTGCTGGCTCTG
AAAGTTGATAATGCGGAAACCATCAAAAAAGAACTGGGCCTGTCCCTGACCGAACCGCTG
ATGGAACAAGTGGGTACGGAAGAATTTATCAAACGTTTCGGCGACGGTGCCTCTCGCGTT
GTCCTGAGTCTGCCGTTTGCAGAAGGCTCATCGAGCGTCGAATACATTAACAATTGGGAA
CAAGCAAAAGCTCTGAGCGTGGAACTGGAAATCAACTTCGAAACGCGTGGCAAACGCGGT
CAGGATGCGATGTATGAATACATGGCGCAAGCCTGCGCAGGTAATCGTGTTCGTCGC
GGATCC
向空白质粒和合成的P30-CRM197A蛋白基因的PCR产物中,分别加入NdeI酶和Bam HI酶进行双酶切反应;纯化后,在连接体系中加入T4连接酶进行连接,完成后纯化表达质粒,并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。用BL21(DE3)感受态细胞,将表达质粒转化至细胞内,筛选克隆,并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。获得阳性表达工程菌后,建立种子库,包括主种子和工作种子。储存于-20℃以下冰箱中。
2-2、CRM197AP30、P30CRM197AP30、P30P30CRM197A、CRM197AP30P30、P30P30CRM197AP30、以及P30CRM197AP30P30蛋白表达质粒的构建:
方法和上节“2-1、P30CRM197A蛋白表达质粒的构建”相同。
三、含有万能表位肽P30CRM197A蛋白载体和CRM197A蛋白载体的制备
本发明的实验结果表明,CRM197A蛋白载体和含有万能表位肽的CRM197A蛋白载体的特性相似,因此,这些蛋白载体的纯化方法相似,以下以含有万能表位肽的CRM197A蛋白载体为例说明方法。
1、表达含有万能表位肽P30CRM197A蛋白载体工程菌的制备
用分子生物学标准方法将各个表达蛋白载体的质粒转入至感受态细胞内,并进行表达检定。筛选出蛋白表达量高,并且通过用抗血清检定合格的克隆,建立主种子库和工作种子库。
2、含有万能表位肽P30CRM197A蛋白载体表达工程菌的发酵
从大肠杆菌工程菌工作种子库低温冰箱中,取出一支含有万能表位肽P30CRM197A蛋白载体的工作种子管,在室温下解冻;将种子管中的菌液无菌转移至50毫升的培养基中,在37℃,摇速为180rpm的摇床中培养至OD600=1.0左右;将菌液无菌接种至1升培养基中,在37℃,摇速为180rpm的摇床中培养至OD600=1.0左右;接种种子液至50升发酵罐中的20升培养基中,在37℃下,240rpm条件下进行发酵;当OD600至7-8时,加入IPTG诱导重组蛋白在细菌中合成;发酵至14小时后,停止发酵,离心,收集菌体待用。
3、含有万能表位肽的P30CRM197A蛋白载体的纯化
由于构建含有不同万能表位肽的蛋白载体都是以CRM197A为主体,实验表明,尽管加入了万能表位肽,但对蛋白纯化的参数影响不大,只需要在纯化CRM197A蛋白载体的工艺参数上进行一些修饰,就可建立起其他含有万能表位肽的CRM197A蛋白载体的纯化方法。
称重50g湿菌体于2升离心杯中,加入300ml1xPBS pH7.0的缓冲液混悬菌体,在磁力搅拌器上搅拌混匀30min;在4℃下,4000rpm,离心20min,弃上清,收集菌体;重复该步骤两次;加入300ml1xPBS pH7.0至菌体离心管,在均质机上进行破碎;在4℃下,10000rpm,离心20min,收集沉淀,弃上清液;加入300ml1xPBS pH7.0缓冲液,在磁力搅拌器上搅拌30min;在4℃下,4000rpm,离心20min,弃上清液,收集包涵体;加入900ml变性缓冲液至洗涤后的包涵体,在25℃下,10000rpm离心30min,收集上清液,弃沉淀;将离心上清液转移至6-8KD透析袋中,封闭透析袋,置透析袋于10升复性缓冲液1中,室温下,在磁力搅拌器上搅拌透析过夜;次日将透析袋转入10升复性缓冲液2中,室温搅拌透析8-10小时;将透析袋转入10升复性缓冲液3中,室温搅拌透析过夜;次日将透析袋转入10升复性缓冲液4中,室温搅拌透析8-10小时;将透析袋转入10升复性缓冲液5中,室温搅拌透析过夜;次日将透析袋转入2升储备缓冲液中,室温搅拌透析8-10小时;更换储备缓冲液二次,室温透析过夜;取1ml透析液,室温12000rpm离心10min,收集上清,测蛋白质浓度;将蛋白溶液上样至预先平衡的DEAE胶柱,用等梯度洗脱,并收集目的蛋白峰;然后上样至Phenyl疏水柱进一步纯化,收集洗脱峰;最后上样SP胶柱,收集洗脱峰;将收集获得的纯化目的蛋白转至透析袋中,在0.15M的氯化钠中透析,完成后转移至4℃下储存待用。
四、流行性嗜血杆菌b型菌荚膜多糖的制备
1、种子库的建立
取出流行性嗜血杆菌b型菌株作为原始种子株,加入0.5ml的培养基将菌种混匀,取0.25ml菌液于5%兔血培养液中。接种后的5%兔血培养液管置于36℃±1℃的培养摇床上,摇速120rpm,培养12-20小时。待OD600至1.0时,用接种环将5%羊血培养液接种至培养基平皿上,置于36℃±1℃的培养箱内培养12-20小时。用接种环将琼脂平皿上的1至数个菌落接种于10ml的培养液中,置于36℃±1℃,在培养摇床上培养12小时,摇速150-200rpm。培养液中细菌OD600长到1.0,取出5ml细菌培养液接种到200ml的新鲜培养液中,置于36℃±1℃的培养摇床上培养12小时左右,摇速150-200rpm。OD600至1.0时,将细菌培养液以1ml分装于200个小试管中,离心(4000rpm,10min),去除上清培养液,然后加入0.5ml的新鲜培养液和0.5ml的无菌脱脂牛奶,混匀,在乙醇干冰上快速冷冻。真空冻干,编号,作为主种子批保存于4℃冰箱内。取出主种子批建立,按照主种子建立方法,将细菌培养液接种到另一个200ml的新鲜培养液中,置于36℃±1℃的培养摇床上培养12小时左右,摇速150-200rpm。待OD600至1.0时,将细菌培养液以1ml分装于200个小试管中,离心(4000rpm,10min),去除上清培养液,然后加入0.6ml的新鲜AHC培养液和0.4ml的40%甘油溶液,混匀。速冻于干冰上,作为工作种子保存于-70℃低温冰箱中。
2、细菌发酵
将流行性嗜血杆菌b型工作种子接种到平皿培养基上,在36.5℃培养箱过夜。取一个Hib菌斑,接种到5毫升的新鲜基本培养液中,在36.5℃和300rpm细菌培养摇床培养。当接种的培养液达到了指数生长中期,OD为0.6-1.0,将接种的培养液转接到250毫升培养瓶中,其中有45毫升的新鲜基本培养液,在36.5℃和300rpm细菌培养摇床培养。当接种的培养液达到了指数生长中期,OD为0.6-1.0,将接种的培养液转接到4升培养瓶中,其中有1升的新鲜基本培养液,在36.5℃和300rpm细菌培养摇床培养。当接种的培养液达到了指数生长中期(约16-18小时),OD为0.6-1.0,将接种的培养液转接到发酵罐中,其中有20升的新鲜基本培养液。当Hib细菌达到指数生长中期时,加入新鲜基本培养液和补充培养液,最终培养液中的糖浓度为23g/l,所加入的新鲜补充培养液的总体积为25升。培养14.5小时停止发酵。
3、多糖纯化
将Hib培养液离心沉淀的Hib菌体,悬浮在2升的蒸馏水中,用磁力搅拌器混匀。加入200ml的12%Deoxycholate sodium溶液入细菌悬浮液中,搅拌混匀30分钟,然后转入到10℃±3℃冷柜中搅拌8–24小时,保证菌体完全裂解、多糖释放出来。用50%的醋酸调节细菌裂解液的pH值到6.4–6.8,温度为20℃±5℃,停止搅拌,静置12–24小时。以10,000rpm离心1小时,收集上清液,丢弃沉淀物,用0.05M的磷酸盐pH7.0透析多糖上清液。加入等体积的0.2%HB溶液,用磁力搅拌器混匀30分钟,然后,转入到4℃冷柜中静置过夜。以10,000rpm离心30min,收集沉淀,丢弃上清液,加入100ml的0.5M氯化钠溶液溶解沉淀;加入680ml无水乙醇,混匀,然后,转入到4℃冷柜中静置过夜。以10,000rpm离心30min,收集上清液,丢弃沉淀,加入5.2升无水乙醇,混匀,然后,转入到4℃冷柜中静置过夜。以10,000rpm离心30min,收集沉淀,丢弃上清液,加入500ml的蒸馏水溶解沉淀,透析。冻干。
步骤二:Hib-P30CRM197A结合物的制备及免疫原性的评估
多糖蛋白结合物的合成包括含有万能表位肽P30的Hib-P30CRM197A结合物和不含万能表位肽P30的Hib-CRM197A结合物的合成,两种结合物的合成方法相同。含有P30万能表位肽的Hib-P30CRM197A结合物包括:
Hib-P30-CRM197A、Hib-CRM197A-P30、Hib-P30-CRM197A-P30、Hib-P30-P30-CRM197A、Hib-CRM197A-P30-P30、Hib-P30-P30-CRM197A-P30和Hib-P30-CRM197A-P30-P30。
1、多糖蛋白结合物的合成
称取5mg纯化Hib荚膜多糖于反应瓶中,量取0.5ml的1mol/L NaCl加入反应瓶中,磁力搅拌使多糖完全溶解,记录多糖溶液的初始pH。分别量取适量的CDAP溶液,加入反应瓶中,室温下搅拌反应1.5min,30s时测定溶液的pH。1.5min后,用0.2mol/L NaOH调节溶液的pH至9.5,室温下搅拌反应3min(用0.2mol/L NaOH维持pH在9.5)。3min后立即向反应瓶中加入5mg的P30CRM197A蛋白,在室温下(25℃)搅拌反应1h。量取37.5μl2mol/L赖氨酸加入反应瓶中,用0.1M的HCl调节溶液pH至9.0,室温下搅拌反应30min,将反应瓶转移到4℃下反应过夜。将反应混合物转移至透析袋(MWCO6-8000)中,在4℃下,用0.85%NaCl溶液透析3次,6L/次。透析结束后将反应混合液10000rpm,离心10min后取上清液,采用Sepharose CL-4B凝胶柱纯化透析后的多糖结合物,并收集结合物峰,取样送检。
2、免疫用Hib-P30CRM197A结合疫苗的制备
分别将Hib-CRM197A和Hib-P30CRM197A结合物纯化液进行稀释,至多糖浓度约为25μg/ml,用0.22μm膜除菌过滤,加入无菌磷酸铝胶,最终铝离子浓度为125mg/ml;用缓冲液定容至最终体积;灌装,0.5ml/瓶。
3、结合疫苗免疫及采血
取5-6周的KM57系小鼠240只,每支小鼠免疫注射制备的7种Hib-P30CRM197A结合疫苗,注射容量为0.1ml/支小鼠/次。每种结合疫苗设定为三组,即免疫注射一针、二针和三针。
采集小鼠血液至离心管,在室温下静置2小时,在10000rpm条件下离心10分钟,用移液枪小心吸取离心上清血清,储存于4℃冰箱中,待检。
4、ELISA法检测小鼠血清中Hib多糖抗体IgG滴度及结合物免疫原性的评估
配制Hib荚膜多糖储备液1mg/ml(1×PBS溶液中),存储于冰箱中。用包被缓冲液稀释至4μg/ml,加100μl包被溶液到每一个孔中来包被ELISA板,在室温下孵育过夜。用洗板缓冲液洗4次,加入100μl封闭缓冲液,在室温下孵育2小时,用洗板缓冲液洗4次,可在4℃下保存一周。
将小鼠注射结合疫苗及对照样品获得的待测血清,以1:10稀释成工作样品血清,稀释适当倍数,加入到ELISA板第一排孔内,总体积200μl,从第一排开始向下进行二倍系列稀释,在室温下孵育2小时。用洗板缓冲液洗4次,加入100μl碱性磷酸酶标记羊抗鼠抗体(1:2000稀释),在室温下孵育4小时。用洗板缓冲液洗4次,加入100μl磷酸-4-硝基苯酯二钠盐底物溶液,在405nm读盘。
下表为小鼠结合物免疫血清中多糖IgG抗体滴度结果表:
结果显示,P30CRM197A蛋白载体合成的Hib-P30CRM197A结合物的免疫原性要强于用CRM197A蛋白载体合成的Hib-CRM197A结合物。
Hib-P30-CRM197A的免疫血清和Hib-CRM197A的免疫血清比较,在注射三针后,免疫血清中Hib荚膜多糖的特异性IgG抗体滴度提高了3-4倍;并且,注射三针后,免疫血清中Hib荚膜多糖的特异性IgG抗体滴度,高于注射一针的4倍以上,符合WHO对于结合疫苗滴度提高的标准。
5、杀菌试验及结合物免疫原性的评估
杀菌试验是评价Hib荚膜多糖结合物杀菌效力的方法,其方法是根据杀菌50%的流行性嗜血杆菌b型的数量来对血清中的中和性抗体滴度进行评估,结果如下表:
样品ID | Hib-P30-CRM197A | Hib-CRM197A |
1 | 16384 | 2048 |
3 | 8192 | 1024 |
4 | 8192 | 1024 |
5 | 8192 | 2048 |
6 | 8192 | 2048 |
7 | 16384 | 1024 |
8 | 16384 | 1024 |
9 | 4096 | 2048 |
10 | 8192 | 2048 |
试验结果可见,免疫三针Hib-P30-CRM197A结合物后的小鼠血清和免疫三针Hib-CRM197A结合物的小鼠血清比较,其半数杀菌的抗体滴度有明显提高。
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Claims (6)
1.一种增强流行性嗜血杆菌b型多糖蛋白结合物免疫原性的方法,其特征在于:
步骤一:在白喉毒素变异体CRM197的A链(简称CRM197A)中加入万能表位肽FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(简称P30),通过基因重组工程菌来生产含有P30的CRM197A蛋白载体(简称P30CRM197A);
步骤二:将流行性嗜血杆菌b型多糖通过共价键形式连接到P30CRM197A蛋白载体上形成流行性嗜血杆菌b型多糖-P30CRM197A结合物。
2.根据权利要求1所述的增强流行性嗜血杆菌b型多糖蛋白结合物免疫原性的方法,其特征在于:在所述含有P30CRM197A的蛋白载体中含有X个P30,1≤X≤3。
3.根据权利要求1所述的增强流行性嗜血杆菌b型多糖蛋白结合物免疫原性的方法,其特征在于:在P30CRM197A蛋白载体中,P30连结在CRM197A蛋白的N-末端或C-末端,或者同时连接在N-末端和C-末端。
4.根据权利要求1、2或3所述的增强流行性嗜血杆菌b型多糖蛋白结合物免疫原性的方法,其特征在于:在P30CRM197A蛋白载体中,所述P30与CRM197A蛋白之间是通过GSGSG氨基酸序列进行连接。
5.根据权利要求1所述的增强流行性嗜血杆菌b型多糖蛋白结合物免疫原性的方法,其特征在于:所述基因重组工程菌是通过基因重组方法构建的大肠杆菌。
6.根据权利要求1所述的增强流行性嗜血杆菌b型多糖蛋白结合物免疫原性的方法,其特征在于:所述流行性嗜血杆菌b型多糖是通过培养流行性嗜血杆菌b型菌获得的荚膜多糖。
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C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |