CN101954073A

CN101954073A - 一种新型的抗肿瘤细胞疫苗及其制备方法

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Publication number: CN101954073A
Application number: CN201010281957XA
Authority: CN
Inventors: 刘景晶; 胡向兵; 范豪; 叶嘉燕; 邢芸; 葛驰宇
Original assignee: ZHEJIANG YIJIU BIOPHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: ZHEJIANG YIJIU BIOPHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2010-09-10
Filing date: 2010-09-10
Publication date: 2011-01-26

Abstract

本发明涉及一种含佐剂的强免疫原性的抗肿瘤细胞疫苗及其制备方法。该疫苗包括肿瘤细胞抗原及其表位，白喉毒素DT，T辅助表位肽，以及液体佐剂。本发明的制备方法包括将实体瘤离析成单细胞，用化学偶联剂将肿瘤细胞与细菌毒素，T辅助表位肽进行化学偶联，再添加液体佐剂。获得化学偶联的H22-DT-OK432。动物实验结果表明：H22-DT-M2-OK432疫苗能有效地抑制小鼠H22肿瘤的生长。病理切片结果表明：H22-DT-M2-OK432疫苗对小鼠的主要脏器，如肝脏和肾脏无毒性。

Description

一种新型的抗肿瘤细胞疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于疫苗领域，具体涉及一种新型抗肿瘤细胞疫苗及其制备方法，以及强化蛋白免疫原性的方法。

技术背景

肿瘤细胞含有多种已知和未知的抗原，国内外研究资料表明，由于含有所有的肿瘤抗原，肿瘤细胞裂解物可能诱导多靶点的抗肿瘤免疫，有望成为理想的肿瘤疫苗。运用灭活的肿瘤细胞作为抗原，激发机体产生强大的免疫反应，较之抗原特异性的免疫，效果更好。然而单独运用肿瘤细胞裂解物免疫动物通常不能激发高效的抗肿瘤免疫。目前临床上运用灭活的肿瘤细胞与BCG混合作为疫苗接种患有转移性黑色素瘤的病人，效果不理想，而且混合BCG的细胞疫苗具有较大的不良反应，如溃疡等。其他的基因重组的细胞疫苗，如可分泌GM-CSF的细胞疫苗，临床上应用也没有取得鼓舞人心的结果。

戊二醛作为双功能偶联剂，能够简便、有效地将蛋白与小肽偶联，而又能保持蛋白或小肽天然的免疫原性。目前已经成功地用于蛋白和小肽的偶联。

白喉毒素可以作为载体，传递抗原到MHC类分子上，从而激发较强的免疫反应。国外有学者将GnRH与白喉毒素偶联，用这种偶联物能诱导机体产生抗GnRH的抗体，显示出一定的抗肿瘤作用。

T辅助表位mHSP70_407-426，来自结核杆菌，能诱导Th1的极化反应，同时也是刺激Th1极化因子的主要表位。mHSP70_407-426肽段能增强HSP70或CD40L诱导的DC成熟，主要是通过与CD40结合起作用。CD40及其配体CD40L(又称CD154)是体内免疫系统中极其重要的一对免疫共刺激分子，分别属于肿瘤坏死因子(TNF)受体和TNF超家族成员。CD40L为Ⅱ型跨膜蛋白，广泛分布于CD4+辅助T细胞(包括Th0、Th1、Th2等)及自然杀伤细胞(NK)表面。而CD40则主要分布在B细胞和抗原递呈细胞表面。CD40和CD40L之间的相互作用不仅可刺激B细胞增值和分化，促进IL-6、TNF-α等细胞因子的分泌，激发体液免疫，并且能刺激抗原递呈细胞的增殖和活性，上调MHC Ⅰ和MHC Ⅱ抗原及免疫共刺激分子B7-1、B7-2等的表达，促进记忆细胞的形成，提高抗原递呈效率，激发机体细胞免疫。

OK-432作为免疫活性剂，具有激活多种免疫效应细胞的作用，可安全、有效地提高恶性肿瘤患者的生存率，延长存活期。在日本OK-432作为抗肿瘤的辅助用药，已被广泛用于临床，且临床用药表明具有较好的效果。

为了研制一种新型的肿瘤细胞裂解物疫苗，我们将肿瘤细胞裂解物与相应的佐剂偶联，并添加相应的辅助药物，以诱发机体产生有效的免疫反应，从而为临床上肿瘤手术后的预防和治疗提供有效的辅助措施，上述疫苗可以显著提高疫苗的免疫原性，激发强烈的免疫反应，从而延长病人的生存期，改善生活质量。特别是对肿瘤负荷较轻，病灶少于3个的患者能明显改善他们的生存状况与质量。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种含佐剂的抗肿瘤的细胞疫苗，包括肿瘤细胞抗原及其表位，白喉毒素DT，T辅助表位肽，以及液体佐剂。

具体的，肿瘤细胞是实体瘤离析成的单细胞，进一步的是H22细胞，T辅助表位肽是Mhsp70407-426，液体佐剂是OK-432。

本发明的另一目的是提供生产含佐剂的抗肿瘤的细胞疫苗的方法，步骤包括将实体瘤离析成单细胞，用化学偶联剂将肿瘤细胞与细菌毒素，T辅助表位肽进行化学偶联，再添加液体佐剂。。

具体的，肿瘤细胞是实体瘤离析成的单细胞，进一步的是H22细胞，T辅助表位肽是Mhsp70407-426，液体佐剂是OK-432.

进一步的，化学偶联剂是带有两个活性醛基的戊二醛。偶联的细菌毒素是用于制作白喉疫苗的白喉毒素，其安全性是可靠的。

本发明还有一个目的是提供一种增强细胞疫苗免疫原性的方法，包括步骤：(1)将肿瘤细胞经过多次反复冻融，使其释放出多种已知与未知的抗原，增加暴露抗原的数量，抗原表位得到倍增，从而增加抗原的免疫原性；(2)引入白喉毒素，作为载体，可以有效地递送抗原到MHC类分子上；(3)T辅助表位mHSP70_407-426，来自结核杆菌，能诱导Th1的极化反应，同时也是刺激Th1极化因子的主要表位；(4)引入佐剂OK-432。

本发明还提供这种含佐剂的抗肿瘤的细胞疫苗的用途。

相比于现有技术，本发明将肿瘤细胞裂解物与相应的佐剂偶联，并添加相应的辅助药物，以诱发机体产生有效的免疫反应，从而为临床上肿瘤手术后的预防和治疗提供有效的辅助措施，上述疫苗可以显著提高疫苗的免疫原性，激发强烈的免疫反应，从而延长病人的生存期，改善生活质量。特别是对肿瘤负荷较轻，病灶少于3个的患者能明显改善他们的生存状况与质量。

另外，目前用于抗肿瘤的疫苗，其免疫原性相对较弱，一般都需加入佐剂，方能诱发机体产生强烈的免疫反应。然而常用的佐剂，如福氏不完全佐剂、福氏完全佐剂等仅能用于动物，不能用于人体。目前FDA批准能用于人体的佐剂仅有铝佐剂，但是这种佐剂常常对细胞疫苗不能起到增强免疫原性的作用。

附图说明

图1是本发明的抗肿瘤细胞疫苗的制备工艺流程图。

图2图示了小鼠皮下移植瘤的建立。

图3是本发明的本发明的抗肿瘤细胞疫苗的动物预防免疫实验结果；

其中，a：PBS；b：H22；c：DT-M2-OK432；d：H22-DT-M2-OK432。

图4显示了H&E染色结果；显示出H22-DT-M2-OK432疫苗对小鼠脏器，如肝和肾等无毒性，说明此疫苗是安全、有效的。

其中，a：PBS组肝；b：H22-DT-M2-OK432组肝；c：PBS组肾；d：H22-DT-M2-OK432组肾。

具体实施方式

在本发明的第一方面，提供了一种强化细胞疫苗免疫原性的方法，该方法的制备工艺流程见图1。

这种强化细胞疫苗免疫原性的方法的原理是：(1)将肿瘤细胞经过多次反复冻融，可以使其释放出多种已知与未知的抗原，增加暴露抗原的数量，抗原表位得到倍增，从而增加抗原的免疫原性。(2)引入白喉毒素，作为载体，可以有效地递送抗原到MHC类分子上。(3)T辅助表位mHSP70_407-426，来自结核杆菌，能诱导Th1的极化反应，同时也是刺激Th1极化因子的主要表位。(4)OK432在日本已经被广泛用于治疗多种癌症的辅助用药，作为免疫活性剂，OK432可以增强多种免疫细胞的活性，刺激淋巴细胞后，显示出LAK细胞活性，继获得淋巴细胞能够抗多种肿瘤，甚至对抗NK细胞的瘤细胞都表现出较好的活性。OK432也参与诱导产生CTL细胞。诱导一些细胞因子的表达与释放，如IFN-α，IFN-γ，TNF-α，TNF-β，IL-1，IL-2等。

在本发明的第二方面，提供了一种抗肿瘤的细胞疫苗。该疫苗采用本发明的第一方面所述的方法进行设计。在疫苗分子中，细胞裂解物含有多种已知与未知的抗原及其表位，为了叙述方便，在实施例中，本发明含H22细胞裂解物的抗原及其表位用“H22”表示；将临床上人的肿瘤细胞裂解物的抗原及其表位用“HCC”表示；白喉毒素(diphtheria toxin)是白喉杆菌被β噬菌体溶源化后，由β噬菌体tox基因编码合成的外毒素，为了叙述方便，在实施例中，本发明中将其用“DT”表示；T辅助表位mHSP70_407-426，来自结核杆菌，能诱导Th1的极化反应，同时也是刺激Th1极化因子的主要表位。研究发现：mHSP70_407-426是刺激单核细胞和树突状细胞产生TNF-α、IL-12和CCL-5的主要肽段，此处缩写为M2；OK432是由溶血性链球菌Su株经青霉素处理、冷冻干燥制成的细胞壁成分的冻干制剂；将偶联后的细胞疫苗表示为“H22-DT-M2-OK432”。

在本发明的第三方面，是提供生产抗肿瘤细胞疫苗的方法，其制造方法如下：

1.H22肿瘤皮下移植瘤的建立

为了临床应用的可行性，操作的方便与实用，在本发明中首先要获得肿瘤组织块。为此，建立小鼠皮下移植瘤模型。从液氮罐中快速取出一管冻存的肿瘤细胞，快速融化，酒精消毒后，在细胞房超净台打开冻存管盖子，迅速转入离心管，加入培养基，1000rpm/min，离心5分钟。倒去上清，加入1ml的生理盐水，计数，接种于BALB/c小鼠的腹腔。选择腹腔接种13～15d，生长良好的H22肿瘤的小鼠，无菌抽取腹水，以无菌生理盐水稀释成2.0×10⁷个/mL瘤细胞悬液，接种于健康小鼠右前肢腋部皮下，每只0.1ml。

2.H22肿瘤细胞裂解物的制备

2周后于无菌条件下处死小鼠，取肿瘤组织块，剔去结缔组织和坏死的部分，生理盐水冲洗后放于平皿中。按照每2克组织加入2mg/ml胶原酶II，0.1mg/mlDNase。4℃离心，1000rpm/min离心5min。3次后，移入冻存管中，反复冻融5次，然后5000r/min离心20min，收集上清经0.22μm微孔滤膜过滤，作为可溶性抗原，-20℃保存备用。在显微镜下观察，以仅能观察到台盼兰蓝染的单个细胞甚至观察不到完整的细胞形态为标准表示肿瘤细胞被完全裂解。

按照《中华人民共和国药典》2005年版三部提供的方法，用lowry法检测肿瘤细胞裂解物中蛋白质浓度。使用牛血清白蛋白(BSA)作为蛋白质标准品。

3.H22-DT-M2-OK432疫苗的制备

采用双功能偶联剂戊二醛进行偶联。将H22细胞裂解物，DT，M2和OK432溶解于PBS中加入偶联瓶中，向混合液中缓慢的滴加0.25％戊二醛溶液，于4℃反应4小时，然后反应液于4℃对PBS透析，可以获得化学偶联的H22-DT-M2-OK432。

在本发明的第四方面是含佐剂抗肿瘤细胞疫苗的用途，如上所述，在临床上，用本发明所述的含佐剂抗肿瘤细胞疫苗有望对肿瘤患者进行有效的辅助治疗。

现结合以下实施例更加详细的描述本发明的抗肿瘤疫苗及其制备方法和应用。提供这些实施例的目的仅在于示例性地说明本发明，不能将其理解为是对本发明的范围和实质的限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人所著《分子克隆：实验室手册》(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中的条件进行操作，或按照制造厂商所建议的条件进行。

材料：

(1)细胞株

H22小鼠肿瘤细胞购自南京凯基生物工程公司。

(2)酶和试剂：

胶原酶IV，DNase，购自Sigma公司。DT，购自上海生物制品检定所，OK432，购自广州百济抗肿瘤药房。M2，吉尔生化合成。

(3)培养基：

DMEM高糖培养基，购自上海生工。

方法

蛋白量的测定：参见Sambrook J，Fristsh E F，Maniatis T.MolecularCloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NY：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989，方法进行。

实施例1：

H22肿瘤皮下移植瘤的建立

从液氮罐中快速取出一管冻存的H22细胞，于37℃快速融化(大约1分钟)，酒精消毒后，在细胞房超净台打开冻存管盖子，迅速转入15ml的离心管，加入培养基至15ml，1000rpm/min，离心5分钟。倒去上清，加入1ml的生理盐水，计数，接种于BALB/c小鼠的腹腔。选择腹腔接种13～15d，生长良好的H22肿瘤的小鼠，无菌抽取腹水，以无菌生理盐水稀释成2.0×10⁷个/mL瘤细胞悬液，接种于健康小鼠右前肢腋部皮下，每只0.1mL。共接种3只。2周后小鼠长出较大的肿瘤，见图2。

实施例2

H22肿瘤细胞裂解物的制备

2周后于无菌条件下处死小鼠，取肿瘤组织块，剔去结缔组织和坏死的部分，生理盐水冲洗后放于平皿中。按照每2克组织加入2mg/ml胶原酶II，0.1mg/mlDNase。水平离心机4℃离心，1000rpm/min离心5min。3次后，移入冻存管中，于-80℃冻存30分钟，37℃融化5分钟，震荡1分钟。反复冻融5次，然后5000r/min离心20min，收集上清经0.22μm微孔滤膜过滤，作为可溶性抗原，-20℃保存备用。在显微镜下观察，以仅能观察到台盼兰蓝染的单个细胞甚至观察不到完整的细胞形态为标准表示肿瘤细胞被完全裂解。

实施例3

H22-DT-M2-OK432疫苗的制备

H22细胞裂解物10mg溶解于2ml的PBS中，并加入10mg的DT，5mg的M2，使之充分混匀，形成混合物。然后，向混合液中缓慢的滴加1ml的0.25％戊二醛(上海化学试剂公司产品)溶液，半小后加入2KE的OK432于4℃进行偶联反应生成H22-DT-M2-OK432。4小时后，立即加入0.25ml的1mol/L甘氨酸溶液，继续反应30min，以终止过量的戊二醛。反应液于4℃对PBS透析过夜，然后，换一次PBS液，继续透析4小时。用考马斯亮兰蛋白测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定蛋白的浓度。

实施例4：

H22-DT-M2-OK432疫苗的药效研究

选用6-7周龄BALB/c小鼠20只，实验组和对照组各6只，体重20-25克。按照免疫计划于0周每只小鼠皮下注射100μl。以后每隔2周加强免疫一次，共进行2次加强免疫。对照组注射相同量的生理盐水。于第6周接种H22肿瘤，接种量为2×107个/ml，每只100μl。第8周处死小鼠，取肿瘤，称重，拍照，计算两组间的差异。然后，立即用10％的福尔马林固定，常规方法进行组织切片，4μm厚度，苏木精和曙红染色，普通显微镜观察并拍照。从结果明显看出，经H22-DT-M2-OK432免疫后，肿瘤重明显小于对照组(图3)。表明H22-DT-M2-OK432疫苗能有效地抑制小鼠H22肿瘤的生长。病理切片结果表明：H22-DT-M2-OK432疫苗免疫组小鼠肝脏：肝细胞排列呈索状，未这明显变性坏死，肝窦无明显扩张，肝小叶结构完整，汇管区无炎细胞浸润及纤维结缔组织增生。肾脏：肾小球细胞数无明显增多，肾小管上皮细胞无明显变性、坏死，未见管型，肾间质内无明显充血、水肿及炎细胞浸润。见图4。

Claims

1.一种含佐剂的抗肿瘤的细胞疫苗，其特征在于：包括肿瘤细胞抗原及其表位，白喉毒素DT，T辅助表位肽，以及液体佐剂。

2.按照权利要求1所述的细胞疫苗，其特征在于：T辅助表位肽是Mhsp70_407-426，氨基酸序列是QPSVQIQVYQGEREIAAHNK，即谷氨酰胺-脯氨酸-丝氨酸-缬氨酸-谷氨酰胺-异亮氨酸-谷氨酰胺-缬氨酸-酪氨酸-谷氨酰胺-甘氨酸-谷氨酸-精氨酸-谷氨酸-异亮氨酸-丙氨酸-丙氨酸-组氨酸-天冬酰胺-赖氨酸。

3.按照权利要求1或2所述的细胞疫苗，其特征在于：液体佐剂是OK-432。

4.按照权利要求1-3其中任一所述的细胞疫苗，其特征在于：肿瘤细胞是实体瘤离析成的单细胞。

5.按照权利要求1-4其中任一所述的细胞疫苗，其特征在于：化学偶联剂是带有两个活性醛基的戊二醛。

6.按照权利要求1-5其中任一所述的细胞疫苗，所偶联的细菌毒素是用于制作白喉疫苗的白喉毒素。

7.按照权利要求1所述的细胞疫苗，其特征在于：既可单独使用也可与药物载体组合制成药物组合物。

8.按照权利要求1所述的细胞疫苗，其特征在于：既可单独使用也可与其他药物活性成分组合制成药物组合物。

9.一种强化细胞疫苗免疫原性的制备方法，其特征在于：包括步骤：(1)将肿瘤细胞经过多次反复冻融，使其释放出多种已知与未知的抗原，增加暴露抗原的数量，抗原表位得到倍增，从而增加抗原的免疫原性；(2)引入白喉毒素，作为载体，可以有效地递送抗原到MHC类分子上；(3)T辅助表位mHSP70_407-426，来自结核杆菌，能诱导Th1的极化反应，同时也是刺激Th1极化因子的主要表位；(4)将前述三种物质用戊二醛偶联；(5)引入佐剂OK-432。

10.如权利要求9所述的一种强化细胞疫苗免疫原性的制备方法，其特征在于：该方法适用于各种肿瘤细胞疫苗的制备。