CN101636174B - 抗肿瘤疫苗制备方法 - Google Patents
抗肿瘤疫苗制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101636174B CN101636174B CN2007800520447A CN200780052044A CN101636174B CN 101636174 B CN101636174 B CN 101636174B CN 2007800520447 A CN2007800520447 A CN 2007800520447A CN 200780052044 A CN200780052044 A CN 200780052044A CN 101636174 B CN101636174 B CN 101636174B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- tumor
- cell
- antigen
- tumor cell
- vaccine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 77
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 67
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 131
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 131
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 131
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims abstract description 77
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 27
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims abstract description 26
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 claims abstract description 25
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims abstract description 20
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 claims abstract description 17
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims abstract 2
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 62
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 23
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 11
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 11
- 230000030833 cell death Effects 0.000 claims description 10
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 claims description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 72
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 28
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 abstract description 24
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 12
- 230000009471 action Effects 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 23
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 22
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 22
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 19
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 12
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 10
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 9
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 8
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 6
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 6
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 238000010183 spectrum analysis Methods 0.000 description 6
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000011398 antitumor immunotherapy Methods 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 4
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 4
- 150000002500 ions Chemical group 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 238000012958 reprocessing Methods 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- SJQBHPJLLIJASD-UHFFFAOYSA-N 3,3',4',5-tetrachlorosalicylanilide Chemical compound OC1=C(Cl)C=C(Cl)C=C1C(=O)NC1=CC=C(Cl)C(Cl)=C1 SJQBHPJLLIJASD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 3
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000000118 anti-neoplastic effect Effects 0.000 description 3
- 230000005975 antitumor immune response Effects 0.000 description 3
- 238000009566 cancer vaccine Methods 0.000 description 3
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 3
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 3
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 3
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010002198 Anaphylactic reaction Diseases 0.000 description 2
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 2
- MKYLOMHWHWEFCT-AJNGGQMLSA-N chembl1221863 Chemical compound C1C2=CC=3OCOC=3C=C2[C@H]2C3=C[C@H](OC)[C@@H](O)C[C@@H]3N1C2 MKYLOMHWHWEFCT-AJNGGQMLSA-N 0.000 description 2
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 2
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 2
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 2
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- HTPGOQRGCUSPGR-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid silane Chemical compound [SiH4].OP(O)(O)=O HTPGOQRGCUSPGR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 2
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 238000000575 proteomic method Methods 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 102220240796 rs553605556 Human genes 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 229940021747 therapeutic vaccine Drugs 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N (2S,5R,10R,13R)-16-{[(2R,3S,4R,5R)-3-{[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy}-5-(ethylamino)-6-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy}-5-(4-aminobutyl)-10-carbamoyl-2,13-dimethyl-4,7,12,15-tetraoxo-3,6,11,14-tetraazaheptadecan-1-oic acid Chemical compound NCCCC[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@@H](C)NC(=O)C(C)O[C@@H]1[C@@H](NCC)C(O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N 0.000 description 1
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WFIYPADYPQQLNN-UHFFFAOYSA-N 2-[2-(4-bromopyrazol-1-yl)ethyl]isoindole-1,3-dione Chemical compound C1=C(Br)C=NN1CCN1C(=O)C2=CC=CC=C2C1=O WFIYPADYPQQLNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RCQRKPUXJAGEEC-ZLUOBGJFSA-N Ala-Cys-Cys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O RCQRKPUXJAGEEC-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- YNSCBOUZTAGIGO-ZLUOBGJFSA-N Asn-Asn-Cys Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)C(=O)N YNSCBOUZTAGIGO-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108010067225 Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 1
- 102000016289 Cell Adhesion Molecules Human genes 0.000 description 1
- 102000003858 Chymases Human genes 0.000 description 1
- 108090000227 Chymases Proteins 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- ZXGDAZLSOSYSBA-IHRRRGAJSA-N Cys-Val-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O ZXGDAZLSOSYSBA-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 206010015150 Erythema Diseases 0.000 description 1
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 1
- 102000002068 Glycopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- KBHYLOIVRVBBEB-JBDRJPRFSA-N Ile-Cys-Cys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N KBHYLOIVRVBBEB-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 206010022061 Injection site erythema Diseases 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 102000000853 LDL receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001831 LDL receptors Proteins 0.000 description 1
- NFHJQETXTSDZSI-DCAQKATOSA-N Leu-Cys-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O NFHJQETXTSDZSI-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- DUKURNFHYQXCJG-UHFFFAOYSA-N Lewis A pentasaccharide Natural products OC1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)C(NC(C)=O)C(OC2C(C(OC3C(OC(O)C(O)C3O)CO)OC(CO)C2O)O)OC1CO DUKURNFHYQXCJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- MKYLOMHWHWEFCT-UHFFFAOYSA-N Manthidine Natural products C1C2=CC=3OCOC=3C=C2C2C3=CC(OC)C(O)CC3N1C2 MKYLOMHWHWEFCT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010027406 Mesothelioma Diseases 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical class CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- SUHOOTKUPISOBE-UHFFFAOYSA-N O-phosphoethanolamine Chemical compound NCCOP(O)(O)=O SUHOOTKUPISOBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 description 1
- 208000015634 Rectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N Silane Chemical compound [SiH4] BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002070 Transferrins Human genes 0.000 description 1
- 108010015865 Transferrins Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 230000036783 anaphylactic response Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000014102 antigen processing and presentation of exogenous peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 1
- 230000027645 antigenic variation Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000190 bacillus calmette–guérin vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000035 biogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- MPCQNSCUKOECNW-UHFFFAOYSA-N butan-1-ol;ethanol Chemical compound CCO.CCCCO MPCQNSCUKOECNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004956 cell adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 201000010989 colorectal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 108010004073 cysteinylcysteine Proteins 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N dodecahydrosqualene Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 1
- 231100000321 erythema Toxicity 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 150000002402 hexoses Chemical class 0.000 description 1
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 230000005865 ionizing radiation Effects 0.000 description 1
- BWHLPLXXIDYSNW-UHFFFAOYSA-N ketorolac tromethamine Chemical compound OCC(N)(CO)CO.OC(=O)C1CCN2C1=CC=C2C(=O)C1=CC=CC=C1 BWHLPLXXIDYSNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004880 lymph fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 229940031346 monovalent vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000002969 morbid Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 208000025113 myeloid leukemia Diseases 0.000 description 1
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- 238000011017 operating method Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 229940023041 peptide vaccine Drugs 0.000 description 1
- 108010018625 phenylalanylarginine Proteins 0.000 description 1
- 210000004910 pleural fluid Anatomy 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 201000010174 renal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000027272 reproductive process Effects 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 description 1
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000001419 two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- -1 urine Substances 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明属于生物技术领域，尤其涉及抗肿瘤疫苗的制备。本发明所述制备抗肿瘤疫苗的方法，包括培养肿瘤细胞和分离表面肿瘤抗原。将预先从生长培养基上洗脱的肿瘤细胞进行培养，用蛋白酶对肿瘤细胞进行不使细胞死亡的处理，收集释放的表面抗原。在一段时间间隔后，用蛋白酶重复处理培养的活体肿瘤细胞，该时间间隔足以使得细胞表面肿瘤抗原得到恢复。积聚表面肿瘤抗原，直至达到足够的疫苗剂量，控制表面肿瘤抗原的组成。蛋白酶可以采用胰蛋白酶。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及抗肿瘤疫苗的制备。
背景技术
对于肿瘤疾病的治疗，由于手术、化学疗法和放射线疗法在实施中受到限制，迫切需要治疗肿瘤患者的新方法的开发。特别是，人们相信，由于免疫治疗的原则是增强人体自身的、防御性的抗肿瘤免疫能力，因而免疫疗法的发展前景良好。
免疫治疗的有效方法之一是疫苗接种。疫苗接种的效果好坏，取决于由肿瘤抗原引起的免疫应答强度，这些肿瘤抗原可存在于疫苗的组分中，也可存在于疫苗制备的不同阶段(例如，基于抗个体抗体，树突状细胞等而制备的疫苗)。因此，肿瘤抗原的分离是开发抗肿瘤疫苗的必要先决条件。
现已知有很多不同制备抗肿瘤疫苗的方法。
一些疫苗是利用肿瘤细胞(TC)的特异性抗原制备——即肽类、热休克蛋白、多糖和其他物质。特别公知的方法是通过合成的方法制备肿瘤肽类抗原。由9个氨基酸合成的肽类疫苗，在髓细胞性白血病患者的临床试验中效果良好(Williams R.，″Harnessing the Immune System：The Promiseand Potential of Cancer Vaccines″，Oncolog.，2005，v.50，№4)。其他的肽类治疗效果不一。例如，gp100蛋白组成的肽类在初期效果良好，但不能引起足够的免疫应答来对抗患者的肿瘤发展(Yu Z.，Restifo N.P.，″CancerVaccines：Progress Reveals New Complexities″，J.Clin.Invest.，2002，v.110，289-294)。
使用肿瘤糖类物质作为激活免疫反应抗原的方法是众所周知的。但是，类似的抗原疗效仅表现在对单一的肿瘤细胞时以及早期的转移阶段。(Franco A.，″CTL-Based cancer Preventive/Therapeutic Vaccines forCarcinomas：Role of Tumour-Associated Carbohydrate Antigens″，Scand.J.Immunol.，2005，v.61，391-397)。
应注意的是，基于确定抗原的疫苗具有其本质缺点。肿瘤细胞不仅具有多种抗原，而且其突变率较高且在机体中具有不断地细胞选择作用机制，这导致新抗原和经过修饰的已有的肿瘤抗原的出现。由此使用自体疫苗(基于病人自身肿瘤细胞的疫苗)的优点更为突出，这些自体疫苗覆盖引起免疫反应的整个抗原谱，包括个体的和疾病状态下的特异性抗原，这些抗原具有特定的病人在肿瘤发展过程中的所有特征。
使用外来体(exosome)制备肿瘤抗原的方法是公知的。外来体是直径不足几纳米的囊泡，可由多种细胞分泌，包括肿瘤细胞(如，论文WolfersJ.et al.，″Tumor-derived exosomes are a source of shared tumor rejectionantigens for CTL cross-priming″，Nat.Med.，2001，v.7，297-303)、T-淋巴细胞和B-淋巴细胞(Raposo G.et al.，″B lymphocytes secrete antigenpresentingvesicles″，J.Exp.Med.，1996，v.183，1161-1172)，以及树突状细胞(ZitvogelL.et al.，″Eradication of established murine tumors using a novel cell-freevaccine：dendritic cell-derived exosomes″，Nature Med.，1998，v.4，594-600)。
这种方法的缺点是具有表面蛋白的外来体浓缩水平低，而这些表面蛋白是实质上免疫治疗中的抗原。众所周知，外来体主要包含胞浆蛋白和内涵体间隔担保(见论文Thery C.et al.，“Exosomes：composition，biogenesisand function”Reviews Immunology，2002，v.2，569-579)。该方法的第二个公知缺点是，收集外来体所需时间较长，这使得生长培养基中必须有肿瘤细胞，并且必须从生长培养基成分中纯化抗原。
另一种公知的制备抗肿瘤疫苗的方法，是向机体引入编码抗原的DNA，而不是引入抗原本身。抗原递呈细胞吸取DNA，形成肿瘤抗原，并且主要与组织相容性复合体(hystocompatibility complex)结合表达于细胞表面，以激活细胞毒性T淋巴细胞。由此，采用基于病毒载体的疫苗，在动物模型上得到较好的效果(见论文Yu Z.，Restifo N.P.，″Cancer Vaccines：Progress Reveals New Complexities″，J.Clin.Invest，2002，v.110，289-294)。
这种方法的缺点是病毒载体自身会引发免疫系统的反应，这会导致人体内的抗肿瘤疫苗缺乏明显的疗效。
另一种制备抗肿瘤疫苗的公知方法是，事先用整个肿瘤细胞作为抗原，从病人自身的肿瘤细胞或者其他病人的肿瘤细胞制备自体疫苗或同种异体疫苗。细胞预先用电离辐射灭活。这种疫苗的优势在于不需要鉴别和分离具体的抗原。由此与作为佐剂的卡介苗疫苗混合后的细胞，可用于治疗结肠直肠癌、黑色素瘤以及肾癌(见Armstrong A.C.，Eaton D.，Ewing J.C.，″Cellular Immunotherapy for Cancer″，Brit.Med.J.，2001，v.3323，1289-1293)。
这种方法的缺点是肿瘤细胞必须灭活，以及由于吞噬作用和抗原呈递细胞的作用而导致的位于整个肿瘤细胞表面的抗原的低适应性。
美国专利US 6039941(分类号C12N 15/09，A61K 31/00，公开于于2000年3月21日)公开了利用基因工程的方法处理编码具有免疫活性的表面蛋白的基因，以从肿瘤细胞中制得高致免疫性抗肿瘤疫苗的方法。
这种方法的缺点是，第一，必须对肿瘤细胞灭活；第二，肿瘤细胞表面抗原很难适合吞噬作用和抗原呈递细胞的作用。
国际申请WO 02053176(分类号A61K 39/00；C12N 5/06；A61K 39/00；C12N 5/06，公开于2002年7月11日)公开了一种基于培养肿瘤细胞的溶胞产物制备抗肿瘤疫苗的方法。这些疫苗的优势在于，不需经电离辐射灭活，以及不同于完整的肿瘤细胞，裂解的的细胞抗原更适合吞噬作用和抗原呈递细胞的作用，由此产生更明显的免疫反应。
这种方法的缺点是肿瘤细胞溶胞产物的主要部分是细胞内蛋白，并且由这种蛋白引起的免疫应答没有抗肿瘤的活性，因为肿瘤细胞的细胞内蛋白很难进入免疫体系。
最接近本专利的是美国专利5993829(分类号A61P 35/00，C07K 14/47，公开于1999年11月30日)中描述的制备抗肿瘤疫苗的方法。美国专利US6338853(分类号A61P 35/00，C07K 14/47，公开于2002年1月15日)，美国专利5030621(公开于1991年7月9日)以及美国专利US 5635188(公开与1997年6月3日)中也描述了类似的方法，包括肿瘤细胞培养以及其表面抗原的分离。
另一种公知方法是预先在无血清生长培养基中培养肿瘤细胞，并从生长培养基中分离表面细胞抗原，在此培养程中肿瘤细胞消失。经纯化收集抗原可用作抗肿瘤疫苗的抗原。这种疫苗的优势在于，细胞表面肿瘤抗原含量高，这种肿瘤抗原(并非隐藏在细胞内)容易被免疫系统作用。这种方法的缺点是：
-由于不受外部影响、自发地反应、以及缺少培养肿瘤细胞的抗原，因而抗原产量低；
-所得物质中目的产物(抗原)含量低，且杂质多。这是由于抗原收集之前，肿瘤细胞要在生长培养基中孵育若干小时(如美国专利6338853所述，在1640培养基中培养三个小时)，这意味着要在含有40多种物质(氨基酸、盐、缓冲剂、维生素、葡萄糖等)的生长培养基中收集抗原，同时培养基中还含有代谢产物以及在培养进程中由肿瘤细胞分泌的其他物质；
-要分析抗原混合物的成分，必须事先纯化从生长培养基和细胞代谢产物中得到的产物。
-要分离得到足以满足疫苗接种所需剂量的抗原，必须延长肿瘤细胞培养时间以使其增殖，这会导致抗原混合物组成发生改变并使疫苗功效降低；
-根据该方法，要得到疫苗接种所需的抗原数量，必须通过肿瘤细胞培养，也就是说，利用该方法不可能从离体(无培养)细胞中提取抗原；
-鉴于肿瘤细胞的长时间培养和表面肿瘤抗原必须经过纯化，上述疫苗价格昂贵。
必须强调，肿瘤细胞在无血清培养基中会自然地释放，在膜结构囊泡(如外核体)上的抗原使得基于外核体(见前)制备抗原的方法成为本发明所述抗原制备方法的类似方式。众所周知，除了特定的表面抗原外，外核体还具有高含量的与疫苗接种无关的抗原，特别是胞内蛋白(如Mears R.et al.，“Proteomic analysis of melanoma-derived exosomes by two-dimensionalpolyacrylamide gel electrophoresis and mass spectrometry”，Proteomics，2004，v.4，4019-4031；Hegmans J.P.et al.，“Proteomic analysis of exosomessecreted by human mesothelioma cells”，American Journal of Pathology，2004，v.164，1807-1815；Thery C.et al.，“Exosomes：composition，biogenesisand function”，Nature Reviews Immunology，2002，v.2，569-579)。根据上述方法，也需要在使用前纯化除去外核体的脂质。
该方法的另一缺陷在于将抗原从潜在的有害蛋白污染物，如致热源、毒素和蛋白感染毒素中纯化是困难的。这是因为被肿瘤细胞自动消耗的抗原形成一种蛋白混合物，这会自然地阻止从混合物中去除任何无用的蛋白污染物。
发明内容
本发明所达到的技术效果为由于强化了抗肿瘤免疫应答而提高了肿瘤疾病的治疗效果。
前述技术效果，可通过本发明所提供的制备抗肿瘤疫苗的方法而实现，所述制备方法包括培养肿瘤细胞和分离表面肿瘤抗原。根据本发明，将预先从生长培养基上洗脱的活的肿瘤细胞进行培养，用蛋白酶对肿瘤细胞进行不使细胞死亡的处理，收集释放的表面肿瘤抗原。接着，经过一段时间，用蛋白酶对培养的活的肿瘤细胞进行重复处理，该段时间的间隔足以使得表面肿瘤抗原的活性被细胞恢复。积聚(富集，收集；accumulate)表面肿瘤抗原直至达到满足疫苗接种的剂量，控制得到的表面肿瘤抗原的组分。
根据本发明的实施例，所述蛋白酶为胰蛋白酶。
根据本发明的另一实施例，所用肿瘤细胞为原代培养的肿瘤细胞。
为了获得更强的特异性免疫应答，所述表面肿瘤抗原可以为患者自身的表面肿瘤抗原。
根据本发明的另一实施方式，所述表面肿瘤抗原可以为其他患者的表面肿瘤抗原。
根据本发明的一种实施方式，可以加入佐剂作为疫苗组成之一。
附图说明
以下通过具体实施方式和附图来进一步说明本发明。
图1为实现本发明制备抗肿瘤疫苗的大体工艺总流程图；
图2A为根据本发明第二个实施方式，从原代培养肿瘤细胞得到的表面抗原的质谱图；
图2B为源自同样的培养细胞，在表面抗原完全修复和经过蛋白酶重复处理后，得到的表面抗原的质谱图；
图2C为源自同样的培养细胞，在经过蛋白酶处理、部分修复后，所得到的表面抗原的质谱图；
图3为根据本发明所述方法获得的表面抗原片段质谱图；
图3A，图3B为抗原的碳水化合物中的CID片段图谱；
图3C，图3D为具有b/y离子的抗原肽段序列的CID片段图谱；
图4为接种肽混合物后的H22肿瘤细胞荷瘤小鼠的生命曲线图。
具体实施方式
实施例一是利用人肝癌细胞H22的荷瘤小鼠制备抗肿瘤疫苗的方法。利用了培养的H22细胞来制备疫苗。
1.将生长培养基从培养有H22细胞的细胞瓶中移出，用不少于生长培养基一半体积的无菌生理溶液冲洗单层细胞。冲洗至少三次，以彻底清除培养基中的杂质。
接下来至关重要的一步，是用蛋白酶对细胞进行不使细胞死亡的处理，一般使用胰蛋白酶(酶活力～3000U/mg)。
2.将0.0001％的胰蛋白酶溶液加入到单层细胞中，每25cm2的细胞瓶面积加入1ml溶液。
3.细胞瓶在37℃环境下进行孵育，在孵育到第5至第7分钟之间时，收集含有从细胞表面裂解出的抗原的胰蛋白酶溶液。
4.将新制备的含有血清(通常含10％)的生长培养基加入到细胞中，继续培养。
5.为了得到所需数量的抗原，隔24小时重复步骤2-4。
6.采用质谱分析以评估抗原的有效性。
7.将积聚的抗原用于制备疫苗。
质谱分析的操作步骤如下。140ul的抗原溶液与140ul的乙醇和720ul的丁醇混合，再加入15ul的CL4B琼脂糖凝胶。混合物孵育45分钟并缓慢搅拌。孵育后，用相同的乙醇-丁醇溶液冲洗琼脂糖凝胶2遍，并在50％乙醇溶液中孵育30分钟。收集乙醇溶液并在旋转蒸发装置(rotor-evaporating device)中晾干。所得到的干燥物质复溶于10ul水中，并采用MALDI-TOF质谱仪分析。将待分析的2ul溶液，以1∶1的比例同含有50％的乙腈和0.5％的三氟乙酸的2，5-二羟基苯甲酸的饱和溶液混合，至于质谱仪靶上。在样品板上制备好的样品液滴在空气中干燥，多肽的质谱分析在质量范围600-4000道尔顿(Da)进行。
已知大多数的肿瘤抗原都位于细胞表面，这些抗原在疫苗开发上有一定益处(如综述Bocchia M.et al.，″Antitumor vaccination：where we stand″，Hematologica，2000，v.85，1172-1206)。用胰蛋白酶对原代培养的细胞进行不使细胞死亡的处理，会导致蛋白片段从细胞表面裂解(见Lokhov P.G.，Archakov A.I.，“Proteomic footprinting：a method for cells profiling by directmass spectrometry”，HUPO theses，5-th Annual World Congress，2006，abstract No 1201)。因此，根据本发明，胰蛋白酶以及其他蛋白酶的作用会使肿瘤表面蛋白片段释放到溶液中。在胰蛋白酶作用下释放的表面肿瘤抗原(表面蛋白片段)主要为可用于免疫治疗的抗原，可用于肿瘤患者的免疫接种。
有必要指出，应在细胞脱离细胞瓶壁之前收集含有细胞上分离出的肽类的胰蛋白酶溶液，这样会避免细胞转移到样品中，不必进行额外的纯化步骤。
实验上根据每种肿瘤细胞以及所用蛋白酶的活性程度而确定用蛋白酶处理细胞的条件，这些条件可以极不相同，蛋白酶浓度可以从0.0001％到0.05％，处理时间可以从30秒到10分钟。使用不同活性的胰蛋白酶时，其浓度可以适当调整以提高或者降低酶活性。
细胞经过蛋白酶进行不使细胞死亡的处理后不会死亡，由此可以用胰蛋白酶重复处理原代培养的细胞。为了使得表面肿瘤抗原的剂量足以达到用接种疫苗的要求，可以用胰蛋白酶对所培养的活性细胞进行多次重复处理，两次处理之间应至少间隔24小时。用胰蛋白酶处理细胞的间隔期间，细胞孵育的实验方案要根据特定的细胞来确定(即培养于37℃的CO2培养箱中，生长培养基中含有血清和必须的添加物)。
积聚的表面肿瘤抗原按照特定疫苗的制备技术处理，即，这些抗原可以经纯化、浓缩、组成分析，也可进行修饰或与佐剂混合以增强免疫原性。
在本发明的其他实施方式中，蛋白酶的处理可与细胞传代培养相结合。
胰蛋白酶溶液由无菌生理溶液或任何合适的盐溶液配制。
除了胰蛋白酶，也可采用其他蛋白酶，例如胰凝乳蛋白酶(chemotrypsin)等。
根据本发明的一个实施例，当使用细胞悬液的时候，需在积聚抗原以前，使用离心或其他合适的方法收集细胞。
本发明实施例一中所述的抗原组成分析，采用分析糖基化的肽类的质谱仪器来进行(M.Tajiri et al.，″Differential analysis of site-specific glycanson plasma and cellular fibronectins：application of a hydrophilic affinitymethod for glycopeptide enrichment″，Glycobiology，2005，v.15，1332-1340)。部分原因是由于蛋白片段通常会糖基化，另一部分原因是糖基化肽类的免疫原性最强，为疫苗抗原的有益部分(如Franco A.，″CTL-Based cancerPreventive/Therapeutic Vaccines for Carcinomas：Role of Tumour-AssociatedCarbohydrate Antigens″，Scand.J.Immunol.，2005，v.61，391-397)。
糖基化抗原的脱盐和浓缩可通过任何适当的方式进行，特别是高效液相色谱法(HPLC)。
在其他实施方式中，肿瘤细胞可从生物源液体中分离，如血液、尿液、体液(liquor)、淋巴液、腹水以及胸膜液。
抗肿瘤疫苗的制备方法适用于各种类型的细胞培养，包括贴壁培养、悬浮培养、与母体组织或其他培养基培养、各种形式的细胞共培养、器官培养以及细胞集合体(颗粒、球体)，也同样包括新分离的肿瘤细胞和肿瘤组织片段。
进一步的，实施例二描述了本发明采用人结肠癌细胞贴壁原代培养，制备而成的抗肿瘤疫苗和疫苗的制备方法。
1.通过肿瘤切除手术取得的结肠肿瘤组织片段，移入含RPMI1640培养基和抗生素的无菌管中，送入实验室。
2.在无菌条件下将肿瘤组织转移至有盖培养皿中，去除坏死的部分、血块、残留的脂肪以及结缔组织。
3.将组织小心地用剪刀剪成小片。
4.用10ml的甲硅烷磷酸盐缓冲液(PBS)悬浮组织碎片，强力吹打，使肿瘤组织碎片解离成细胞团块。
5.静置使剩余较大的组织碎片沉到试管底部。
6.用吸管小心收集悬浮于液体中的细胞团块，并转移到一个新的试管中。
7.试管以400g的重力加速度离心5分钟，丢弃上清。将含有细胞团块的沉淀重新悬浮于RPMI 1640培养基中。该培养基内含有胰岛素(20μg/ml)，转铁蛋白(10μg/ml)，皮质醇(50nM)，表皮生长因子(1ng/ml)，乙醇胺(10μM)，磷酸乙醇胺(10μM)，三碘甲腺原氨酸(triiodthyronine)(100pM)，牛血清蛋白(2mg/ml)，谷氨酰胺(2mM)，丙酮酸钠(sodium piruvate)(0.5mM)，胎牛血清(5％)。然后转移至25cm2的细胞瓶中进行细胞培养。
8.在37℃和5％CO2的条件下进行细胞培养。
9.为了从基质细胞中分离肿瘤细胞，将细胞瓶紧压在震动搅拌器上数秒钟。由于肿瘤细胞附着力较弱，因而分离并进入生长培养基中。
10.用吸管收集含有漂浮细胞的培养基，然后将其转移到一个新的细胞瓶中，在37℃和5％CO2条件下进行培养。
11.肿瘤细胞长到80％融合时，从细胞瓶中移除生长培养基，用0.9％的NaCl或甲硅烷磷酸盐缓冲液冲洗细胞三次，所用冲洗溶液的体积不少于生长培养基体积的一半。冲洗后生长培养基中的血清应除去。
12.将0.0001％的胰蛋白酶溶液(酶活性～3000U/mg)加入到细胞中，加入量为每25cm2细胞瓶的面积1ml溶液。
13.37℃孵育细胞瓶。在孵育到第5至第7分钟时，收集含有从细胞上裂解的表面抗原的溶液。收集的过程中，肿瘤细胞仍紧贴细胞瓶壁。如果一部分细胞由于胰蛋白酶的作用脱离了细胞瓶壁而漂浮于液体中，需对溶液以400g的重力加速度离心5分钟，取无细胞的上清备用。
14、为灭活培养细胞瓶中剩余的胰蛋白酶，应加入新制备的含有胎牛血清的生长培养基，并继续在37℃以及5％CO2的条件下孵育细胞。
15、由步骤13获得的溶液在真空浓缩器中，于45℃条件下进行浓缩。浓缩前应用适当方法对溶液脱盐，如反相色谱法、凝胶过滤法等。为了除去剩余的胰蛋白酶，应预先用可滤过分子量低于4kDa肽段的过滤器对溶液进行过滤。
16、经过24小时，重复步骤11-15步骤，以使抗原达到所需的量。这些抗原对疫苗接种的有效性通过质谱仪来评定。
用蛋白酶处理细胞的次数以及数次处理间隔时间的长短，是通过分析所积聚的抗原混合物的组成来决定的。如果抗原组成开始改变，数次用蛋白酶处理细胞之间的间隔增长，不能得到由新分离出的肿瘤细胞得到的最初的抗原组成，那么这些细胞便不能用于疫苗制备。
所积聚到抗原混合物的组成，是通过质谱测定来控制的，正如本发明实施例一种所描述的。
任何合适的方法都可用于从肿瘤组织中分离细胞。用蛋白酶分离肿瘤组织，意在分离肿瘤细胞，进行表面结构的质谱分析时，必须在肿瘤细胞原代培养24小时之后进行。
根据本发明得到的表面肿瘤抗原对肿瘤细胞供体有特异性。但是细胞培养明显改变了原代培养的表型，这是因为人工重建与肿瘤细胞在供体内的生长环境体相类似的体外培养条件造成的。所以积聚的抗原需要进行严格控制。下面进一步说明根据本发明实施例二进行抗原质量鉴定的方法。
根据在对抗原混合物重复进行质谱分析后得到的数据，不少于95％质量比的糖基化肽类得到复制，可以作为两个待比较的抗原组合物的标准品。如果积聚的用于疫苗接种的抗原，其比例不少于一般新分离的肿瘤细胞中糖基化肽类质量的90％，则认为此抗原是可以用于治疗的。
从实验数据中可得知，直肠肿瘤细胞只有使用第一和第二代传代细胞在培养3-4天的情况下，才可用于制备适合免疫接种的抗原。不能否认，在生长培养基中加入一些成分，可以保持细胞表型，增加细胞传代次数，利于疫苗抗原的积聚。
当不能从肿瘤组织中制备得到足够数量的细胞时，则必须对细胞进行培养以增殖，直至达到所需数量，同时必须在细胞培养期间控制表面抗原的变异。根据本发明，在培养过程中控制抗原组成，不需另外的细胞增殖。例如，细胞培养期间，每周一次或两次、用不会使细胞致死的蛋白酶进行处理，以及进行质谱分析。
肿瘤和疫苗抗原的鉴定，保证了由疫苗诱导的抗肿瘤免疫反应的特异性。对比原肿瘤抗原和根据本发明所提供的抗原之间的质谱，可以进行鉴定。图2A所示为原肿瘤细胞表面抗原的质谱图。图2B所示为利用本发明所提供的方法制备的适用于疫苗接种的抗原质谱图(图2A和图2B的质谱具相似性)。图2C所示也是根据本发明所得到的不适用于疫苗接种的抗原的质谱图(图2A和图2C所示明显不同)。箭头指向的面积分别对应消失的抗原(图2B)和新出现的抗原(图2C)。因此，通过控制肽类的组成，可以积聚到疫苗接种所需足够数量的抗原，从而诱导特异性抗肿瘤免疫反应。
为了确定来自肿瘤细胞表面蛋白的抗原的真正起源(虽然这对发明的实现是非必要的)，给出了抗原片段的质谱图，如图3所示的图例。
为此，在加入胰蛋白酶孵育细胞的过程获得的样品，先用自动吸管的头取反相ZipTipC18(Millipore Corp.，USA)，按照说明书的方法进行脱盐。按照前述方法将其置于质谱仪的样品板上。质谱是通过离子片段的状态进行记录的。蛋白的鉴定是通过搜索系统Mascot(MatrixScience，USA)进行，该系统建立于蛋白质序列数据库NCBI(USA)的人类分类单元，使用离子质谱‘b’和‘y’(序列标记法)和/或使用已确立的氨基酸序列。(新生法de novo method)
图3A和图3B显示了分离的质量在1640-1480Da之间的糖基化肽类的碳水化合物部分，裂解片段分子量为162Da、203Da和291Da，这分别与己糖(甘露糖，葡萄糖或者半乳糖)、乙酰葡萄糖胺和唾液酸相对应。利用肽类片段，可以确定其氨基酸序列，并可利用其免疫球蛋白重链(含大部分CD抗原，组织相容性复合体，T-细胞受体和细胞粘附分子)上的可变区和恒定区、低密度脂蛋白受体、白细胞介素IR-2受体、G蛋白偶联受体来确定抗原混合物中的肽类。图3C所示为一个分离片段，其中利用b-y离子指示出分子量为857.4Da的双电荷肽类，确定的氨基酸序列与G蛋白结合受体的片段相对应：
Ile Cys Cys Ala Cys Cys Leu Cys Arg Asn Asn Cys Cys Val Phe Arg
1 5 10 15
图3D所示为另一个分离片段，由b-y离子示出具有分子量为573.3Da的单电荷肽类，确定的氨基酸序列与主要组织相容性复合体I相对应：
Ala Val Leu Asn Arg
1 5
因此，根据本发明获得的抗原的特征如下：
1)它们是有水溶性物质组成，主要为糖基化的肝水解蛋白(当用胰蛋白酶作为蛋白酶时，它们的序列通常以赖氨酸或精氨酸结尾)，其分子量为1.2-4kDa，
2)它们来源相同——都是肿瘤细胞质膜外蛋白的胞外片段，
3)它们都是通过用蛋白酶对活的细胞进行不使细胞死亡的处理而得到的。
根据本发明得到的肿瘤抗原混合物，其实际应用是由确定的氨基酸序列与细胞表面呈现的与蛋白片段混合存在的修饰的(糖基化)肽类来决定。众所周知，肿瘤疾病的发生，是免疫系统无法破坏机体中形成的肿瘤细胞的结果。经过积聚纯化的抗原，与能增强免疫反应的佐剂相混合，然后注入人体或动物体内。由于生物体细胞和体液免疫反应的存在，在机体消灭注射入体内的肽类的同时，体内已有的或新出现的肿瘤细胞也会被破坏，从而决定了抗肿瘤疫苗接种的治疗和预防效果。为了发挥免疫反应的最大作用，可重复注射抗原。
为了确定根据本发明所得抗肿瘤疫苗的活性，用20只年龄和体重相同的BALB/c系雄性小鼠做模型试验(10只作为对照，10只作为实验组)。
根据实施例一得到的肿瘤抗原，来自于培养的肝癌细胞H22。将收集的抗原采用葡聚糖凝胶G-10进行凝胶过滤脱盐，然后并用真空浓缩器SpeedVac进行浓缩。
先将抗原与完全弗氏佐剂以1∶1(体积比)的比例混合，然后取150ug进行皮下注射。使用不完全弗氏佐剂在三周内进行反复免疫(每周注射一次)。对照组动物同时注射混有生理溶液的弗氏完全佐剂。在第四次免疫接种后，用皮下注射的方法将1百万个肝细胞瘤H22接种到小鼠体内。记录三个月内对照组和实验组动物的存活率。绘制存活曲线(图4)确定根据本发明所得抗原的抗肿瘤活性。
需要注意的是，该动物实验的结果并不能认为本发明仅能在动物中成功应用，因为动物和人的抗肿瘤免疫的机制是一样的。抗原的使用方法和其在每公斤体重的使用剂量，保证了其在人类免疫疗法中的作用，但是针对每一个病人，其治疗方案可以根据病情的严重性、疾病所处的阶段、肿瘤细胞的突变性、机体针对抗原而产生显著性免疫应答的能力等，进行个体化定制。
进一步地，以下提供抗肿瘤疫苗和及其抗肿瘤疗法，该肿瘤疫苗是基于表面肿瘤抗原，根据本发明实施例二而制备，用于进行人的抗肿瘤治疗。
疫苗包含1mg肿瘤抗原混合物，该抗原是根据本发明实施例二制备的，溶于0.5ml的甲硅烷磷酸盐缓冲溶液中，并与1ml的佐剂山小星蒜碱(Montanide)ISA-51(Syntex厂利用含有角鲨烯、Plunoric L121、吐温-80的油水乳剂制备而成的佐剂)混合。
给患者皮下注射一个剂量的疫苗，每周一次，持续三周以及每月一次，持续五个月。
用注射肿瘤抗原的免疫强度来评估疫苗的效果。在注射后2-3，注射抗原引起的过敏性反应通过注射局部红斑的尺寸来衡量。以首次注射后出现的红斑尺寸作为基数。重复疫苗接种引起明显的过敏反应，表示免疫反应的发生。
根据本发明的其他实施方式，进行抗肿瘤免疫疗法也可采用静脉或肌肉注射疫苗，也可注射不含佐剂的疫苗。
由于肿瘤抗原混合物的使用，通过本发明所提供方法可确保免疫反应的发生。疫苗中存在的许多抗原，保证能对每一个细胞产生免疫反应，这些细胞自身没有具有相同氨基酸序列的表面蛋白。
因此，本发明与现有的使用单价疫苗的方法相比，其抗肿瘤免疫疗法的效果增强很多倍。
本发明提供的由肿瘤细胞表面抗原组成的富含肿瘤特异性抗原的疫苗，其应用为抗肿瘤免疫疗法的实施提供了可能。
产生这种疗效，主要是由于在用蛋白酶对肿瘤细胞进行不使细胞死亡的处理。用蛋白酶进行不使细胞死亡的处理，仅能使肿瘤细胞的表面抗原分离，而不会使细胞死亡。而细胞死亡会伴随着细胞膜的损坏，从而使得疫苗中出现细胞质内容物，特别出现大量的非疫苗成分的胞内蛋白。这会降低已有疫苗中肿瘤特异性抗原部分含量减少，使得免疫反应不完全针对肿瘤，从而降低免疫应答的特异性，即肿瘤抗原的特异性。
因此，使用根据本发明制备的富含肿瘤抗原的疫苗，可提高抗肿瘤免疫疗法的效果。
此外，免疫疗法的效果提高，是因为使用了积聚自培养的原代肿瘤细胞的抗原。这种制备抗肿瘤疫苗的方法，其积聚抗原的步骤可以在每次蛋白酶处理之后，这样每次积聚的抗原组成实际上是一样的，如此增加了用于疫苗接种的从原代细胞培养中获得的疫苗的数量。使用仅对特定肿瘤具有抗原特异性的疫苗是安全的，因为积聚抗原的组分是可控的。
本发明不会导致疫苗中出现对特定肿瘤具有非特异性的抗原。这种非特异性抗原可能出现在现有的用增殖细胞制备的疫苗中，这是因为体外繁殖过程中的原代培养改变了其抗原组成。因此，从增殖细胞中收集得到的抗原混合物，其组成与通过分离(而非培养)的肿瘤细胞而得到的抗原的组成明显不同。
根据本发明制备的疫苗，可以是自体疫苗(从患者自身细胞获得)或者异体疫苗(从其他患者细胞获得)。
在两种情况下，本发明所提供的免疫疗法都是有效的，因为不同患者的肿瘤细胞，其表面的肽类具有相同的氨基酸序列。
此外，根据本发明制备的自体疫苗更有效，因为这时疫苗含有特定病人在肿瘤发展过程中所个别拥有的、符合特定疾病阶段的抗原特性。
本发明的工业应用为，基于细胞表面抗原制备肿瘤抗原并以此治疗肿瘤疾病，主要利用疫苗接种的方法。
Claims (6)
1.一种抗肿瘤疫苗的制备方法，包括培养肿瘤细胞和分离表面肿瘤抗原，其特征在于：
将预先从生长培养基上洗脱的肿瘤细胞进行培养，用胰蛋白酶对肿瘤细胞进行不使细胞死亡的处理；
收集释放的表面肿瘤抗原；
经过一段时间后，重复肿瘤细胞培养，所述时间的间隔足以使得表面抗原被所述肿瘤细胞恢复；
积聚表面肿瘤抗原直至达到满足疫苗接种的剂量；
控制积聚的表面肿瘤抗原的组分。
2.如权利要求1所述的制备方法，其中至少使用了一种蛋白酶。
3.如权利要求1所述的制备方法，其中所述肿瘤细胞为自体肿瘤细胞。
4.如权利要求1所述的制备方法，其中所述肿瘤细胞为同种异体肿瘤细胞。
5.如权利要求1所述的制备方法，其中所述肿瘤细胞为自体肿瘤细胞和同种异体肿瘤细胞的组合。
6.如权利要求1所述的制备方法，其中所述肿瘤细胞为新分离的肿瘤细胞。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EA200700598A EA200700598A1 (ru) | 2007-03-07 | 2007-03-07 | Противоопухолевая вакцина, способ получения противоопухолевой вакцины и способ проведения противоопухолевой иммунотерапии |
| EA200700598 | 2007-03-07 | ||
| PCT/RU2007/000572 WO2008108679A1 (fr) | 2007-03-07 | 2007-10-16 | Vaccin antitumoral, procédé de fabrication de vaccin antitumoral et procédé de mise en oeuvre d'une immunothérapie antitumorale |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101636174A CN101636174A (zh) | 2010-01-27 |
| CN101636174B true CN101636174B (zh) | 2012-11-14 |
Family
ID=39738469
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2007800520447A Active CN101636174B (zh) | 2007-03-07 | 2007-10-16 | 抗肿瘤疫苗制备方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20110027322A1 (zh) |
| EP (1) | EP2116254A4 (zh) |
| JP (1) | JP5172864B2 (zh) |
| KR (1) | KR20090127132A (zh) |
| CN (1) | CN101636174B (zh) |
| EA (1) | EA200700598A1 (zh) |
| WO (1) | WO2008108679A1 (zh) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EA009327B1 (ru) * | 2007-04-27 | 2007-12-28 | Петр Генриевич ЛОХОВ | Способ получения противоопухолевой вакцины на основе поверхностных антигенов эндотелиальных клеток |
| EA011421B1 (ru) * | 2008-08-26 | 2009-02-27 | Петр Генриевич ЛОХОВ | Способ получения противоопухолевой вакцины |
| EP2198879A1 (en) | 2008-12-11 | 2010-06-23 | Institut Curie | CD74 modulator agent for regulating dendritic cell migration and device for studying the motility capacity of a cell |
| RU2475865C2 (ru) * | 2010-05-04 | 2013-02-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Ростовский научно-исследовательский онкологический институт" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ФГБУ "РНИОИ" Минздравсоцразвития России) | Способ лечения злокачественных новообразований в эксперименте |
| CN110898215A (zh) * | 2019-12-06 | 2020-03-24 | 郑州大学 | 一种基于细胞微囊泡的抗肿瘤疫苗的制备方法及其应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005120558A2 (en) * | 2004-05-25 | 2005-12-22 | University Of Connecticut Health Center | Methods for making compositions comprising heat shock proteins or alpha-2-macroglobulin for the treatment of cancer and infectious disease |
| EP2140873A1 (en) * | 2007-04-27 | 2010-01-06 | Petr Genrievich Lokhov | Method for producing an antitumoral vaccine based on surface endothelial cell antigens |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5993829A (en) | 1987-04-23 | 1999-11-30 | Bystryn; Jean-Claude | Anti-cancer vaccine |
| US5030621A (en) * | 1987-04-23 | 1991-07-09 | Bystryn Jean Claude | Shed melanoma antigen compositions |
| US6338853B1 (en) * | 1987-04-23 | 2002-01-15 | Jean-Claude Bystryn | Anti-cancer vaccine |
| DE4431401A1 (de) | 1994-08-24 | 1996-02-29 | Max Delbrueck Centrum | Lebendvakzine gegen Tumorerkrankungen |
| US6033674A (en) * | 1995-12-28 | 2000-03-07 | Johns Hopkins University School Of Medicine | Method of treating cancer with a tumor cell line having modified cytokine expression |
| US6861234B1 (en) * | 2000-04-28 | 2005-03-01 | Mannkind Corporation | Method of epitope discovery |
| RU2192884C2 (ru) * | 2000-11-09 | 2002-11-20 | Государственное учреждение Научно-исследовательский институт клинической иммунологии СО РАМН | Вакцина для стимуляции противоопухолевого иммунитета |
| IL140796A0 (en) | 2001-01-08 | 2002-02-10 | Hadasit Med Res Service | An autologous anti-cancer vaccine |
| US7041302B2 (en) * | 2001-01-09 | 2006-05-09 | Biother Corporation | Therapeutic modulation of the tumor inflammatory response |
| US20040022813A1 (en) * | 2002-08-05 | 2004-02-05 | Jean-Claude Bystryn | Shed antigen vaccine with dendritic cells adjuvant |
-
2007
- 2007-03-07 EA EA200700598A patent/EA200700598A1/ru active IP Right Revival
- 2007-10-16 WO PCT/RU2007/000572 patent/WO2008108679A1/ru active Application Filing
- 2007-10-16 KR KR1020097018706A patent/KR20090127132A/ko not_active Application Discontinuation
- 2007-10-16 CN CN2007800520447A patent/CN101636174B/zh active Active
- 2007-10-16 EP EP07852028A patent/EP2116254A4/en not_active Withdrawn
- 2007-10-16 JP JP2009552621A patent/JP5172864B2/ja active Active
-
2009
- 2009-08-21 US US12/545,560 patent/US20110027322A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005120558A2 (en) * | 2004-05-25 | 2005-12-22 | University Of Connecticut Health Center | Methods for making compositions comprising heat shock proteins or alpha-2-macroglobulin for the treatment of cancer and infectious disease |
| EP2140873A1 (en) * | 2007-04-27 | 2010-01-06 | Petr Genrievich Lokhov | Method for producing an antitumoral vaccine based on surface endothelial cell antigens |
Non-Patent Citations (7)
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EA009325B1 (ru) | 2007-12-28 |
| US20110027322A1 (en) | 2011-02-03 |
| KR20090127132A (ko) | 2009-12-09 |
| EA200700598A1 (ru) | 2007-12-28 |
| JP2010530843A (ja) | 2010-09-16 |
| WO2008108679A1 (fr) | 2008-09-12 |
| EP2116254A1 (en) | 2009-11-11 |
| EP2116254A4 (en) | 2010-04-14 |
| JP5172864B2 (ja) | 2013-03-27 |
| CN101636174A (zh) | 2010-01-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH11505512A (ja) | マクロファージを調製する方法、ならびにそのためのキットおよび組成物 | |
| Liu et al. | Synthetic MUC1 breast cancer vaccine containing a Toll‑like receptor 7 agonist exerts antitumor effects | |
| CN101636174B (zh) | 抗肿瘤疫苗制备方法 | |
| US20230145817A1 (en) | Neoepitope vaccine and immune stimulant combinations and methods | |
| US20240131152A1 (en) | Nano-particles that contain synthetic variants of gm3 ganglioside as adjuvants in vaccines | |
| JP2019537562A (ja) | 免疫原性アルギナーゼペプチド | |
| EP3642331B1 (en) | T-cell expansion method and uses | |
| CN112516297A (zh) | 一种基于鱼精蛋白为载体的抗原和佐剂共传递纳米疫苗的制备方法及其应用 | |
| CN104136040B (zh) | 自体癌细胞疫苗 | |
| US20080166369A1 (en) | Cancer Vaccine Preparation | |
| CN115785206B (zh) | 肺癌特异性分子靶标07及其用途 | |
| CN115785203B (zh) | 肺癌特异性分子靶标10及其用途 | |
| CN115785204B (zh) | 肺癌特异性分子靶标08及其用途 | |
| CN115785208B (zh) | 肺癌特异性分子靶标01及其用途 | |
| CN112402596B (zh) | 多肽组合物及疫苗 | |
| CN111518216B (zh) | 多肽、含有多肽的组合物及其在肿瘤免疫中的应用 | |
| CN115785207A (zh) | 肺癌特异性分子靶标02及其用途 | |
| CN115785211A (zh) | 肺癌特异性分子靶标04及其用途 | |
| CN115785209A (zh) | 肺癌特异性分子靶标06及其用途 | |
| CN115785205A (zh) | 肺癌特异性分子靶标09及其用途 | |
| JP2023532320A (ja) | 免疫療法 | |
| CN116920082A (zh) | 基于酵母细胞外壳的新抗原肿瘤治疗性疫苗 | |
| CN115785210A (zh) | 肺癌特异性分子靶标05及其用途 | |
| CN115785212A (zh) | 肺癌特异性分子靶标03及其用途 | |
| Novikova et al. | Synthesis of a conjugate of 3´-sialyllactoside with recombinant flagellin as a carrier protein and assessment of its immunological activity in comparison with that of a similar hemocyanin-based conjugate |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |