EA009325B1 - Противоопухолевая вакцина, способ получения противоопухолевой вакцины и способ проведения противоопухолевой иммунотерапии - Google Patents
Противоопухолевая вакцина, способ получения противоопухолевой вакцины и способ проведения противоопухолевой иммунотерапии Download PDFInfo
- Publication number
- EA009325B1 EA009325B1 EA200700598A EA200700598A EA009325B1 EA 009325 B1 EA009325 B1 EA 009325B1 EA 200700598 A EA200700598 A EA 200700598A EA 200700598 A EA200700598 A EA 200700598A EA 009325 B1 EA009325 B1 EA 009325B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- tumor
- antigens
- cells
- antitumor
- protease
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 82
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 79
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 title claims abstract description 38
- 238000011398 antitumor immunotherapy Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 156
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 156
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 156
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 96
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims abstract description 76
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 68
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 44
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims abstract description 33
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims abstract description 33
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims abstract description 27
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims abstract description 27
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 claims abstract description 26
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims abstract 10
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 33
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 26
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 25
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 claims description 11
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 claims description 11
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 11
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 5
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 4
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 claims description 4
- 150000002402 hexoses Chemical class 0.000 claims description 3
- DUKURNFHYQXCJG-UHFFFAOYSA-N Lewis A pentasaccharide Natural products OC1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)C(NC(C)=O)C(OC2C(C(OC3C(OC(O)C(O)C3O)CO)OC(CO)C2O)O)OC1CO DUKURNFHYQXCJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 claims description 2
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 claims description 2
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 abstract description 14
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 11
- 230000005975 antitumor immune response Effects 0.000 abstract description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 abstract description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 2
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 abstract 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 23
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 18
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 17
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 16
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 14
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 13
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 10
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 9
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 8
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 6
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 6
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 102220240796 rs553605556 Human genes 0.000 description 6
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 6
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 5
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000005809 anti-tumor immunity Effects 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 4
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 3
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- WXTMDXOMEHJXQO-UHFFFAOYSA-N 2,5-dihydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(O)=CC=C1O WXTMDXOMEHJXQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710117545 C protein Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N Silane Chemical compound [SiH4] BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 229940037642 autologous vaccine Drugs 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000003628 erosive effect Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 102220120573 rs368277209 Human genes 0.000 description 2
- 229910000077 silane Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MMKZAICYSVWBPW-UHFFFAOYSA-N 2-[[2-(difluoromethoxy)phenyl]methylamino]-1-[3-(trifluoromethyl)phenyl]ethanol Chemical compound C=1C=CC(C(F)(F)F)=CC=1C(O)CNCC1=CC=CC=C1OC(F)F MMKZAICYSVWBPW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102000016289 Cell Adhesion Molecules Human genes 0.000 description 1
- 108010067225 Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000000853 LDL receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001831 LDL receptors Proteins 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 101100460719 Mus musculus Noto gene Proteins 0.000 description 1
- SUHOOTKUPISOBE-UHFFFAOYSA-N O-phosphoethanolamine Chemical compound NCCOP(O)(O)=O SUHOOTKUPISOBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000015634 Rectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N Thyrolar Chemical compound IC1=CC(C[C@H](N)C(O)=O)=CC(I)=C1OC1=CC=C(O)C(I)=C1 AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 101100187345 Xenopus laevis noto gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000005085 air analysis Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000006023 anti-tumor response Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 239000012560 cell impurity Substances 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 229940117229 cialis Drugs 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N dodecahydrosqualene Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 229960001438 immunostimulant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003022 immunostimulating agent Substances 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 230000005865 ionizing radiation Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 208000025113 myeloid leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- HTPGOQRGCUSPGR-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid silane Chemical compound [SiH4].OP(O)(O)=O HTPGOQRGCUSPGR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004910 pleural fluid Anatomy 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 208000013718 rectal benign neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 description 1
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- WOXKDUGGOYFFRN-IIBYNOLFSA-N tadalafil Chemical compound C1=C2OCOC2=CC([C@@H]2C3=C(C4=CC=CC=C4N3)C[C@H]3N2C(=O)CN(C3=O)C)=C1 WOXKDUGGOYFFRN-IIBYNOLFSA-N 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 229940035722 triiodothyronine Drugs 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 230000005924 vaccine-induced immune response Effects 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000007762 w/o emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к медицинским технологиям, а именно к иммунотерапии онкологических больных. Противоопухолевая вакцина на основе поверхностных опухолевых антигенов содержит смесь поверхностных опухолевых антигенов. Способ получения противоопухолевой вакцины включает культивирование опухолевых клеток с выделением поверхностных опухолевых антигенов. Предварительно отмытую от ростовой среды первичную культуру живых опухолевых клеток подвергают витальному для клеток воздействию протеазы, отбирают высвободившиеся поверхностные опухолевые антигены. Обработку первичной культуры живых опухолевых клеток протеазой повторяют с интервалами, необходимыми для восстановления клетками поверхностных опухолевых антигенов. Аккумулируют поверхностные опухолевые антигены до достижения их дозы, необходимой для вакцинации, контролируют состав полученных поверхностных опухолевых антигенов. В качестве протеазы может быть использован трипсин. Способ проведения противоопухолевой иммунотерапии включает в себя введение в организм пациента противоопухолевой вакцины. Технический результат, достигаемый при использовании патентуемой группы изобретений, заключается в повышении эффективности лечения онкологических заболеваний за счет усиления противоопухолевого иммунного ответа.
Description
Группа изобретений относится к медицинским технологиям, а именно иммунотерапии онкологических больных, и может быть использована в медицине для терапии онкологических заболеваний и профилактики их рецидивов.
Ограниченные возможности лечения опухолевых заболеваний методами хирургии, химиотерапии и лучевой терапии делают актуальным поиск новых способов лечения онкологических больных. В частности, перспективным считается развитие методов иммунотерапии, принцип действия которой основывается на усилении противоопухолевой защиты, заложенной в иммунитете человека.
Одним из эффективных способов иммунотерапии считается вакцинация, эффективность которой зависит от силы иммунного ответа, вызванного опухолевыми антигенами, либо входящими в состав вакцины, либо требующихся на различных стадиях их производства (например, вакцины на основе антиидиотипических антител, дендритных клеток и т.д.). Таким образом, получение опухолевых антигенов является необходимым условием создания противоопухолевых вакцин.
Известны различные способы получения противоопухолевой вакцины.
Некоторые вакцины изготавливают на основе отдельных антигенов опухолевой клетки (далее ОК) пептидов, белков теплового шока, полисахаридов и других веществ. В частности, известен способ получения пептидных опухолевых антигенов путем их синтеза. Так, вакцина, состоящая из синтезированного пептида длиною в 9 аминокислот показала хорошие результаты при клинических испытаниях на пациентах с миелоидной лейкемией (^1Шатк В. Нагпекктд (Нс 1ттипе 8ук1ет: ТНе Рюшке аиб Ро(сп11а1 оГ Сапсег Уассшек, Оисо1од., 2005, ν. 50, № 4). Другие пептиды показали неоднозначные результаты. К примеру, пептид из белка др100 показавший хорошие предварительные результаты, не смог вызвать достаточного иммунного ответа, чтобы противостоять развитию опухоли у пациентов (Уи Ζ., ВекбГо Ν.Ρ., Сапсег Уассшек: Ргодгекк Рсуса1к Νονν Сотр1ехй1ек. 1. С1ш. [пускТ, 2002, ν. 110, 289-294).
Известен способ использования в качестве антигенов, вызывающих иммунный ответ, углеводных антигенов опухоли. Однако эффективность подобных антигенов была показана только при одиночных опухолевых клетках и ранних метастазах (Ггапсо А. СТЬ-Вакеб сапсег Ргсуспиус/ТНегарсиис Уассшек Гог Сагстотак: Во1е оГ Титоиг-Аккос1а(еб СагЬоНубга1с ΑΛ^^κ, 8сапб. 1. 1ттипо1., 2005, ν. 61, 391-397).
Следует отметить, что вакцины, основанные на определенных антигенах, имеют существенный недостаток. Помимо того что ОК характеризуются множественностью своих антигенов, повышенная их мутационность и постоянно действующий в организме механизм отбора клеток приводят к появлению новых и изменению уже существующих антигенов ОК. Таким образом, очевидно преимущество использования аутовакцин (вакцин на основе ОК самого пациента), которые содержат весь спектр антигенов, против которых вызывается иммунный ответ, в том числе индивидуальные и стадиоспецифические антигены, отличающие развитие опухолевого процесса у конкретного больного.
Известен способ получения антигенов опухоли на основе экзосом. Экзосомы - это нанометровые мембранные везикулы, секретируемые многими типами клеток, в том числе опухолевыми клетками (см., например, \Уо1Гсгк 1. е( а1. Тшпог-бепуеб ехокотек аге а коигсе оГ кНагеб (итог гещсбоп аШфепк Гог СТЬ сгокк-рптшд. N1. Меб., 2001, ν. 7, 297-303), Т- и В-лимфоцитами (В 1утрНосу(ек кесге(е аи(^дсир^еκеиί^ид ν^κ1^. I. Ехр. Меб., 1996, ν. 183, 1161-1172) и дендритными клетками (УЦуодс1 Ь. е( а1. Егабкабоп оГ ек(аЬ11кйеб типпе (итогк икшд а поуе1 сс11-Ггсс уассше: бспбпбс сс11-бсг|усб ехокотек. №(иге Меб., 1998, ν. 4, 594-600).
Недостатком указанного способа является невысокий уровень обогащения экзосом поверхностными белками, являющимися потенциальными антигенами для иммунотерапии. Известно, что экзосомы содержат в основном цитозольные белки и белки эндосомальных компартаментов (см., например, статью Ехокотек: сотрокйюп, Ьюдепекк апб Гиисί^ои, Рсу1счк (тшим^^, 2002, ν. 2, 569-579). Вторым известным недостатком способа является продолжительное время накопления экзосом, что требует нахождения ОК в ростовой среде и ведет к необходимости очищать полученные антигены от компонентов ростовой среды.
Известен способ получения противоопухолевой вакцины, который основан на введении в организм вместо антигенов опухоли кодирующей их ДНК. Антигенпредставляющие клетки поглощают ДНК, продуцируют опухолевый антиген и затем представляют его на клеточной поверхности в комплексе с главным комплексом гистосовместимости, уже способным активировать цитотоксические Т-лимфоциты. Так, хорошие результаты были получены на моделях животных, используя вакцины, основанные на вирусных векторах (см. более подробно, например, Уи Ζ., ВекЕГо КР. Сапсег Уассшек: Ргодгекк Веνеа1κ Νονν Сотр1ехй1ек. I. С1т. (пускС 2002, ν. 110, 289-294).
Недостатком указанного способа является вызываемая реакция иммунной системы на сами вирусные векторы, что приводит к отсутствию явно положительных результатов противоопухолевой вакцинации на людях.
Известен способ получения противоопухолевой вакцины, который предполагает использование в качестве антигенов целых опухолевых клеток, как от самого пациента (аутовакцины), так и от других пациентов (алловакцины). Клетки предварительно инактивируют ионизирующим излучением. Преимуществом данных вакцин является отсутствие необходимости идентификации и выделения конкретных антигенов. Так, клетки, смешанные с БСЖ в качестве адъюванта, были использованы против колорек
- 1 009325 тального рака, меланомы и карциномы почки (см. Агт§1гопд А.С., Еа!оп Ό., Ететд ЕС. Се11и1аг 1ттипоШегару Гог Сапсег, Би1. Мей. 1., 2001, ν. 3323, 1289-1293).
Недостатками указанного способа являются необходимость инактивации опухолевых клеток и плохая пригодность антигенов, расположенных на поверхности целых опухолевых клеток, для фагоцитирования и процессинга антигенпредставляющими клетками.
Из патента США υδ 6039941 (МПК С12Ы 15/09, А61К 31/00, опубл. 21.03.2000) известен способ получения противоопухолевой вакцины из ОК с повышенной иммуногенностью, полученной путем введения генно-инженерным способом генов, кодирующих поверхностные белки с иммуностимулирующей активностью.
Недостатками указанного способа являются, во-первых, необходимость инактивации опухолевых клеток, во-вторых, антигены на поверхности опухолевых клеток плохо пригодны для фагоцитирования и процессинга антигенпредставляющими клетками.
Из международной заявки УО 02053176 (МПК А61К 39/00; С12Ы 5/06; А61К 39/00; С12Ы 5/06 опубл. 11.07.2002) известен способ получения противоопухолевой вакцины на основе лизатов культивированных ОК. Преимуществом этих вакцин является то, что они не требуют инактивации облучением, а дезагрегированные антигены клеток более пригодны, нежели интактные ОК, для фагоцитирования и процессинга антигенпредставляющими клетками, что может приводить к более выраженному иммунному ответу.
Недостатком указанного способа является то, что основную массу лизата ОК составляют внутриклеточные белки, и вызываемый на них иммунный ответ не обладает противоопухолевой активностью, так как внутриклеточные белки опухолевых клеток недоступны для иммунной системы.
Наиболее близким аналогом заявленного способа является способ получения противоопухолевой вакцины, раскрытый в патенте США υδ 5993829 (МПК А61Р 35/00, С07К 14/47, опубл. 30.11.1999). Аналогичные способы, включающие культивирование опухолевых клеток с выделением их поверхностных антигенов, также описаны в патентах υδ 6338853 (МПК А61Р 35/00, С07К 14/47, опубл. 15.01.2002), υδ 5030621 (опубл. 09.07.1991), ϋδ 5635188 (опубл. 03.06.1997).
Известный способ предусматривает культивирование опухолевых клеток в бессывороточной ростовой среде и выделение из ростовой среды клеточных поверхностных антигенов, которые опухолевые клетки теряют в процессе своего культивирования. После очистки собранные антигены используют в качестве антигенов противоопухолевой вакцины. Преимуществом подобных вакцин является высокое содержание опухолевых антигенов с поверхности клеток, которые являются доступными (не спрятаны внутри клетки) для действия иммунной системы. Недостатками известного способа являются низкая продуктивность получения антигенов ввиду спонтанной, без каких либо воздействий, потери их культивируемыми ОК;
получение материала с низким содержанием целевого продукта (антигенов) и большим количеством примесей, вследствие того, что процесс накопления антигенов предусматривает многочасовую инкубацию ОК в ростовой среде (например, инкубация в течение 3 ч в среде КРМ1-1640 описана в патенте υδ 6338853), что подразумевает попадание антигенов в ростовую среду, содержащую более 40 компонентов (аминокислоты, соли, буфер, витамины, глюкоза и т.д.), а также продукты метаболизма и другие вещества, выделяемые ОК в процессе культивирования;
анализ состава получаемой смеси антигенов требует предварительной очистки препарата от компонентов ростовой среды и продуктов жизнедеятельности клеток;
получение необходимой для вакцинации дозы антигенов подразумевает размножение ОК продолжительным культивированием, что ведет к искажению состава получаемой антигенной смеси и снижению эффективности вакцинации;
достаточное для вакцинации количество антигенов по известному способу может быть получено только в процессе культивирования опухолевых клеток, т.е. получение антигенов из изолированных (без культивирования) клеток по данному способу невозможно;
высокая стоимость вакцины, которая определяется длительностью культивирования ОК и наличием стадии очистки поверхностных опухолевых антигенов.
Известны также различные противоопухолевые вакцины на основе смеси отдельных антигенов, антигенов и различных иммуностимулирующих веществ.
Из международной заявки УО 2004012685 (МПК А61К 39/00, опубл. 12.02.2004) известна противоопухолевая вакцина на основе поверхностных опухолевых антигенов теряемых клеткой в процессе культивирования. Изготовление известной вакцины подразумевает возможность ускорения процесса выделения клетками антигенов в ростовую среду различными воздействиями, что может несколько повысить эффективность создания вакцины. Однако данной вакцине также присущи недостатки вакцин, получаемые при культивировании ОК в бессывороточной ростовой среде.
Наиболее близким аналогом заявленной противоопухолевой вакцины является вакцина на основе поверхностных опухолевых антигенов, раскрытая в патенте США υδ 5993829 (МПК А61Р 35/00, С07К 14/47, опубл. 30.11.1999). Аналогичные вакцины также описаны в патентах υδ 6338853 (МПК А61Р 35/00, С07К 14/47, опубл. 15.01.2002), υδ 5030621 (опубл. 09.07.1991), υδ 5635188 (опубл. 3.06.1997).
- 2 009325
Основным недостатком известной вакцины является ее высокая стоимость, которая определяется длительностью культивирования ОК и наличием стадии очистки антигенов, как уже было указано выше.
Известны также различные способы проведения противоопухолевой иммунотерапии.
Известны способы проведения противоопухолевой иммунотерапии моновалентными вакцинами, включающие введение в организм определенных опухолевых антигенов. К ним, например, относятся вакцины на основе синтетических пептидов, белков теплового шока, полисахаридов и других веществ. Указанные способы раскрыты, в частности, в патентах АО 2005083074 (МПК А61К 31/7088; А61Р 35/00; С07К 7/06, опубл. 09.09.2005) и КИ 2271831 (А61К 39/385; А61К 39/39; А61К 51/00, опубл. 20.03.2006).
Недостатком указанных способов иммунотерапии является слабая специфичность получаемого противоопухолевого иммунитета ввиду того, что определенные антигены не являются специфичными для опухоли конкретного больного, так как были выявлены статистически в опухолях определенного вида.
Известен способ проведения противоопухолевой терапии, включающий введение в организм целых инактивированных опухолевых клеток, а также целых опухолевых клеток с повышенной иммуногенностью (см., например, патент И8 6039941, МПК Ο12Ν 15/09, А61К 31/00, опубл. 21.03.2000).
Недостатком указанного способа иммунотерапии является слабая специфичность получаемого противоопухолевого иммунного ответа ввиду того, что антигены на поверхности целых опухолевых клеток мало пригодны для фагоцитирования и последующего процессинга антигенпредставляющими клетками. Также данный способ подразумевает размножение клеток ίη νίίτο для достижения необходимой для вакцинации дозы антигена, что ведет к изменению антигенного состава опухолевых клеток и снижению эффективности иммунотерапии.
Из международной заявки АО 02053176 (МПК А61К 39/00; Ο2Ν 5/06; А61К 39/00; Ο2Ν 5/06, опубл. 11.07.2002) известен способ проведения противоопухолевой иммунотерапии, включающий введение в организм клеточных лизатов опухолевых клеток.
Недостатком указанного способа вакцинации является слабая специфичность получаемого противоопухолевого иммунитета. В данном случае вакцина помимо поверхностных антигенов опухоли, отвечающих за специфичность иммунного ответа, содержит внутриклеточные белки, составляющие основную часть лизата. Таким образом, происходит иммунизация к массе балластных белков и размывание опухолеспецифичности иммунного ответа. Также данный способ подразумевает размножение клеток ίη νίίτο для достижения необходимой для вакцинации дозы антигена, что ведет к изменению антигенного состава опухолевых клеток и, как следствие, снижению эффективности иммунотерапии.
Известны способы на основе комбинации отдельных опухолевых антигенов, а также антигенов и различного рода иммуностимуляторов.
Наиболее близким аналогом заявленного способа проведения противоопухолевой иммунотерапии является способ, раскрытый в патенте США И8 5993829 (МПК А61Р 35/00, С07К 14/47, опубл. 30.11.1999). Аналогичные способы также описаны в патентах И8 6338853 (МПК А61Р 35/00, С07К 14/47, опубл. 15.01.2002), И8 5030621 (опубл. 09.07.1991), И8 5635188 (опубл. 03.06.1997), АО 2004012685 (МПК А61К 39/00, опубл. 12.02.2004). Способ включает введение в организм пациента вакцины, полученной из смеси антигенов, представляющих собой фрагменты поверхностных белков опухолевых клеток спонтанно потерянных клеткой в процессе культивирования в бессывороточной ростовой среде.
К недостатком известного способа можно отнести слабую специфичность получаемого противоопухолевого иммунитета. Данный способ подразумевает использование продолжительно культивируемых ОК, что приводит к изменению их антигенного состава и снижению эффективности вакцины. Второй недостаток - это относительно высокая стоимость способа, определяемая временем культивирования клеток и необходимостью очистки получаемых антигенов от компонентов ростовой среды.
Технический результат, достигаемый при использовании патентуемой группы изобретений, заключается в повышении эффективности лечения онкологических заболеваний за счет усиления противоопухолевого иммунного ответа.
Данный технический результат обеспечивается при использовании противоопухолевой вакцины на основе поверхностных опухолевых антигенов. Согласно настоящему изобретению вакцина содержит смесь поверхностных опухолевых антигенов, представляющих собой аккумулированные пептиды из поверхностных белков живых опухолевых клеток, полученных периодическим и витальным для клеток воздействием протеазы на первичную культуру живых опухолевых клеток.
В предпочтительном варианте реализации изобретения противоопухолевая вакцина может быть получена при воздействии трипсина, выбранного в качестве протеазы.
Указанный технический результат достигается также при реализации способа получения противоопухолевой вакцины, включающего культивирование опухолевых клеток с выделением поверхностных опухолевых антигенов. Согласно настоящему изобретению предварительно отмытую от ростовой среды первичную культуру живых опухолевых клеток подвергают витальному для клеток воздействию протеазы, отбирают высвободившиеся поверхностные опухолевые антигены, при этом обработку первичной культуры живых опухолевых клеток протеазой повторяют с интервалами, необходимыми для восстановления клетками поверхностных опухолевых антигенов, аккумулируют поверхностные опухолевые анти
- 3 009325 гены до достижения их дозы, необходимой для вакцинации, контролируют состав полученных поверхностных опухолевых антигенов.
В предпочтительном варианте реализации изобретения в качестве протеазы используют трипсин.
Указанный технический результат достигается также при реализации способа проведения противоопухолевой иммунотерапии, включающего введение в организм пациента вакцины, полученной из смеси поверхностных опухолевых антигенов, представляющих собой пептиды, полученные из поверхностных белков опухолевых клеток. Согласно настоящему изобретению используют смесь поверхностных опухолевых антигенов, представляющих собой аккумулированные пептиды из поверхностных белков живых опухолевых клеток, полученных периодическим и витальным для клеток воздействием протеазы на первичную культуру живых опухолевых клеток.
В предпочтительном варианте реализации способа в качестве протеазы используют трипсин.
Для получения более специфичного иммунного ответа используют поверхностные опухолевые антигены опухолевых клеток самого пациента.
В других вариантах реализации изобретения используют поверхностные опухолевые антигены опухолевых клеток другого пациента.
В предпочтительном варианте реализации способа в составе противоопухолевой вакцины используют адъюванты.
Далее группа изобретений поясняется конкретными примерами реализации и прилагаемыми фигурами, на которых изображено следующее.
На фиг. 1 - схема осуществления способа получения противоопухолевой вакцины.
На фиг. 2 - масс-спектр поверхностных антигенов, полученных согласно второму варианту реализации изобретения с первичной культуры опухолевых клеток (А); масс-спектр поверхностных антигенов полученных с той же культуры клеток после полной репарации поверхностных антигенов и повторной их обработки протеазой (Б); масс-спектр поверхностных антигенов, полученных с той же культуры клеток после частичной репарации поверхностных антигенов после предшествующей обработки их протеазой (В).
На фиг. 3 - масс-спектры фрагментации поверхностных антигенов, полученных согласно данному изобретению.
На фиг. 3 А, 3Б - спектры СШ фрагментации углеводной части антигенов.
На фиг. 3В, 3Г - спектры СШ фрагментации пептидной последовательности антигенов с определением Ь/у ионов.
На фиг. 4 - кривая выживаемости мышей с привитой опухолью Н22 и вакцинированных пептидной смесью.
На фиг. 1 приведена общая схема способа получения противоопухолевой вакцины.
Ниже представлен первый пример реализации способа получения противоопухолевой вакцины против привитой мышам гепатомы человека Н22. Для получения вакцины используется та же культура клеток Н22.
1. Ростовую среду удаляют из флакона с культурой клеток Н22 и трижды промывают монослой клеток стерильным физиологическим раствором, используя объем, равный половине ростовой среды. Промывку осуществляют не менее 3 раз до удаления остатков ростовой среды.
Следующим и ключевым этапом является обработка витальной для клеток концентрацией протеазы, в качестве которой выбирают трипсин (активность ~3000 ед./мг).
2. Добавляют к монослою клеток 0,0001% раствор трипсина, используя 1 мл раствора на 25 см2 поверхности культурального флакона.
3. Инкубируют флакон при 37°С. Между 5 и 7 мин инкубации отбирают из флакона раствор трипсина, содержащий отщепленные от клеток поверхностные антигены.
4. К клеткам добавляют свежеприготовленную ростовую среду, содержащую сыворотку (обычно 10%), и продолжают их культивирование.
5. Для наработки массы антигенов с интервалом в сутки повторяют пп.2-4.
6. Для оценки пригодности нарабатываемых антигенов проводят их масс-спектрометрический анализ.
7. Наработанные антигены используют для создания вакцины.
Масс-спектрометрический анализ проводят следующим образом. 140 мкл раствора антигенов смешивают со 140 мкл этанола, 720 мкл бутанола и добавляют 15 мкл сефарозы СБ4В. Инкубируют при медленном перемешивании 45 мин. После инкубации сефарозу дважды промывают раствором с тем же содержанием спирта и бутанола и инкубируют 30 мин в 50% растворе этанола. Раствор этанола отбирают от сефарозы и высушивают на роторном испарителе. Полученный осадок растворяют в 10 мкл воды и анализируют времяпролетной (ΜΑΒΌΙ-ΤΘΡ) масс-спектрометрией. 2 мкл анализируемого раствора смешивают на масс-спектрометрической мишени в соотношении 1:1 с насыщенным раствором 2,5-дигидроксибензойной кислоты, содержащей 50% ацетонитрила и 0,5% трифторуксусной кислоты. Полученные на мишени капли проб высушивают на воздухе и проводят масс-спектрометрический анализ в диапазоне масс пептидов от 600 до 4000 Да.
- 4 009325
Известно, что большинство опухолевых антигенов, представляющих интерес для получения вакцины, находятся на поверхности опухолевых клеток (см., например, обзор АпШишог уассшайоп: хсИеге \тс 51апб. Нста1о1ощса. 2000, ν. 85, 1172-1206). Обработка первичной культуры клеток витальным воздействием трипсина приводит к отщеплению фрагментов белков с поверхности клеток (см. ЬокЬоу Р.О., АгсЬакос А.С Рго1еотк Гоо(рг1п11пд: а тебюб Гог се11х ргоГШпд Ьу бйес1 та88-8рес1готе1гу, тезисы НИРО 511' Аппиа1 \Уог1б Сопдгехх, 2006, аЬйтас! №1201). Таким образом, согласно данному изобретению действие трипсина, как и других протеаз, приводит к высвобождению в раствор фрагментов поверхностных белков опухоли. Высвободившиеся под воздействием трипсина поверхностные опухолевые антигены (фрагменты поверхностных белков), к которым в основном и относятся пригодные для противоопухолевой иммунотерапии антигены, используют для вакцинации онкологических больных.
Следует отметить, что забор раствора трипсина, содержащего отщепленные от клеток пептиды, желательно осуществлять до момента открепления клеток от дна культурального флакона, что позволит предотвратить попадание клеток в пробу и избежать дополнительной стадии очистки пробы.
Условия обработки протеазой клеток определяют экспериментально для каждого типа опухолевых клеток и активности используемой протеазы и могут существенно варьировать от 0,0001 до 0,05% для концентрации протеазы и от 30 с до 10 мин для времени обработки клеток. В случае использования трипсина с другой активностью концентрацию его меняют прямо пропорционально увеличению или уменьшению активности.
Клетки при обработке витальными концентрациями протеазы не погибают, что дает возможность повторять процесс обработки первичной культуры клеток трипсином. Для получения необходимой для вакцинации дозы поверхностных опухолевых антигенов процесс обработки первичной культуры живых опухолевых клеток трипсином повторяют многократно с интервалами до суток. При этом в интервалах между воздействием трипсином клетки инкубируют согласно протоколу культивирования данных клеток (т.е. при 37°С в СО2-инкубаторе, в ростовой среде с сывороткой и необходимыми добавками).
Аккумулированные поверхностные опухолевые антигены обрабатывают в соответствии с технологией получения конкретной вакцины, а именно их могут очищать, концентрировать, анализировать на предмет состава, а также модифицировать или смешивать с адъювантами для увеличения иммуногенно сти.
В других вариантах реализации изобретения процесс обработки клеток протеазой может быть сопряжен с процессом пассирования клеток.
Раствор трипсина можно готовить как на стерильном физиологическом растворе, так и на любом подходящем для этого солевом растворе.
Вместо трипсина могут быть использованы другие протеазы, например химотрипсин и т. д.
В случае использования суспензии опухолевых клеток необходимо перед забором антигенов клетки осадить на дно, например центрифугированием, или использовать любой другой подходящий способ.
Указанный анализ состава антигенов, полученных согласно первому варианту реализации изобретения, проводят по протоколу масс-спектрометрии гликозилированных пептидов (М. Тарп е! а1. ИгГГегепба1 апа1у515 оГ хйе-хресйгс Дусапх оп р1ахта апб се11и1аг ДЬгопесбпх: аррйсабоп оГ а ЬубгорЫЬс аГГшйу теНоб Гог д1усорерббе еппс1ипеп1. С1усоЫо1о§у, 2005, ν. 15, 1332-1340). Это объясняется, с одной стороны, тем, что внеклеточные фрагменты белков, как правило, гликозилированы, с другой стороны, именно гликозилированные пептиды являются наиболее иммуногенными и представляют интерес в качестве антигенов вакцины (см., например, Ргапсо А. СТЪ-Вахеб сапсег Р^еνепΐ^νе/ТЬе^ареиΐ^с Уасстех Гог Сагапотах: Во1е о£ Титоиг-Аххос1а1еб СатЬоЬубга1е Апбдепх. §сапб. 1. 1ттипо1., 2005, ν. 61, 391-397).
Обессоливание и концентрирование гликозилированных пептидов для масс-спектрометрического анализа можно осуществлять любым подходящим для этого способом, в частности жидкостной хроматографией (ВЭЖХ).
В других вариантах реализации опухолевые клетки могут быть получены из биологических жидкостей, таких как кровь, моча, ликвор, лимфа, асцитная и плевральная жидкости.
Патентуемый способ получения противоопухолевой вакцины может применяться к любым типам культур опухолевых клеток, в частности прикрепленным, суспензионным, культивированным в матриксе и на подложках, ко всем вариантам совместного культивирования (сокультивирования) клеток, органотипным культурам и клеточным агрегатам (гранулы, сфероиды), а также к свежевыделенным опухолевым клеткам и фрагментам опухолевой ткани.
Далее изобретение поясняется вторым примером противоопухолевой вакцины и способа ее получения с использованием прикрепленной первичной культуры опухолевых клеток рака толстого кишечника человека.
1. Фрагмент ткани опухоли толстого кишечника, полученный в результате хирургического удаления опухоли, переносят в стерильную пробирку со средой КРМ1 1640, содержащую антибиотики, и транспортируют в лабораторию.
2. Переносят ткань опухоли в стерильных условиях в чашку Петри и механически удаляют участки некроза, сгустки крови, а также остатки жировой и соединительной ткани.
3. Осторожно ножницами размельчают ткань опухоли на маленькие фрагменты.
- 5 009325
4. Диссоциируют фрагменты опухолевой ткани до мелких клеточных агрегатов энергичным пипетированием в 10 мл фосфатного буфера силана.
5. Дают оставшимся крупным фрагментам ткани осесть на дно пробирки.
6. Осторожно забирают пипеткой клеточные агрегаты, оставшиеся плавать в растворе, и переносят в новую пробирку.
7. Центрифугируют пробирку при 400 д в течение 5 мин и удаляют супернатант. Осадок, содержащий клеточные агрегаты, ресуспендируют в ростовой среде ΚΡΜΙ 1640 со следующими добавками: 20 мкг/мл инсулина, 10 мкг/мл трансферина, 50 нМ гидрокортизона, 1 нг/мл эпидермального ростового фактора, 10 мкМ этаноламина, 10 мкМ фосфоэтаноламина, 100 пМ трийодтиронина, 2 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, 2 мМ глютамина и 0,5 мМ пирувата натрия, 5% фетальной бычьей сыворотки и затем переносят в 25 см флакон для дальнейшего культивирования клеток.
8. Культивируют при 37°С и 5% СО2.
9. Для изоляции опухолевых клеток от стромальных клеток культуральный флакон несколько секунд прижимают к вибрационной мешалке. Опухолевые клетки ввиду плохих адгезивных способностей открепляются и переходят в ростовую среду.
10. Забирают пипеткой среду, содержащую плавающие в ней опухолевые клетки, и переносят в новый культуральный флакон для дальнейшего культивирования при 37°С и 5% СО2.
11. При достижении опухолевыми клетками 80% конфлюентности удаляют из флакона ростовую среду и трижды промывают клетки 0,9% раствором хлорида натрия или фосфатным буфером силана, используя объем, равный не менее половины объема заливаемой в культуральный флакон ростовой среды. В результате промывки с клеток должны быть удалены следы сыворотки, содержащейся в ростовой среде.
12. Добавляют к клеткам 0,0001% раствор трипсина (активность ~3000 ед./мг), используя 1 мл раствора на 25 см2 поверхности культурального флакона.
13. Инкубируют флакон при 37°С. Между 5 и 7 мин инкубации отбирают из флакона раствор, содержащий отщепленные от клеток поверхностные антигены. Опухолевые клетки в момент отбора раствора должны быть прикреплены ко дну культурального флакона. Если под воздействием трипсина часть клеток открепилась и стала свободно плавать, то раствор применяют при 400 д в течение 5 мин и используют супернатант, свободный от примеси клеток.
14. Для инактивации остатков трипсина в культуральном флаконе необходимо добавить во флакон свежеприготовленную культуральную среду, содержащую фетальную бычью сыворотку и продолжить культивирование клеток при 37°С и 5% СО2.
15. Раствор, полученный в п.13, концентрируют на вакуумном концентраторе при 45°С. Предварительно раствор можно обессолить любым подходящим для этого способом, например обратно-фазовой хроматографией, гель-фильтрацией и т. д. Для удаления остатков трипсина также можно раствор предварительно отфильтровать через фильтр, пропускающий пептиды массой менее 4 кДа.
16. Пп.11-15 повторяют с интервалом в одни сутки для наработки необходимого для вакцинации количества антигенов. Пригодность нарабатываемых антигенов для вакцинации оценивают массспектрометрически.
Количество обработок клеток протеазой и длительность интервалов между ними контролируют анализом состава получаемой антигенной смеси. Если антигенный состав начинает меняться, и увеличение времени между обработкой клеток протеазой не позволяет получить изначальный, соответствующей свежевыделенным опухолевым клеткам, антигенный состав, то клетки считают непригодными для получения вакцины.
Контроль состава получаемой антигенной смеси осуществляют масс-спектрометрически, как описано выше для первого примера реализации способа.
Для выделения клеток из опухолевой ткани используют любой пригодный для этого способ. В случае использования протеазы для диссоциации ткани опухоли, с целью высвобождения опухолевых клеток, необходимо проводить масс-спектрометрический анализ поверхностных антигенов не раньше чем через сутки после инициации первичной опухолевой культуры.
Поверхностные опухолевые антигены, получаемые согласно данному изобретению, должны быть специфичны для опухоли донора клеток. Однако культивирование клеток существенно искажает фенотип первичной культуры по причине невозможности искусственного воссоздания ίη νίίτο условий, при которых росли опухолевые клетки в организме донора. Таким образом, состав получаемых антигенов подлежит обязательному контролю. Ниже представлен пример оценки качества антигенов, получаемых согласно второму варианту реализации изобретения.
Согласно полученным данным при повторном (контрольном) масс-спектрометрическом анализе антигенной смеси воспроизводится не менее 95 мас.% гликозилированных пептидов, что можно считать критерием идентичности двух сравниваемых антигенных смесей. Предлагается оценивать пригодность антигенов, нарабатываемых для вакцинации согласно данному изобретению по наличию не менее 90 мас.% гликозилированных пептидов общих со свежевыделенными опухолевыми клетками.
- 6 009325
Из имеющихся экспериментальных данных известно, что культивирование клеток опухоли прямой кишки позволяет получать пригодные для вакцинации антигены только при использовании 1-го, изредка 2-го пассажа клеток, при условии проведения пассирования через 3-4 дня. При этом не исключается, что добавление в ростовую среду тех или иных ингредиентов, сохраняющих фенотип клеток, может увеличить количество пассажей, пригодных для получения антигенов вакцины.
В случае, если не удалось выделить из ткани опухоли достаточного количества клеток, необходимо их размножить культивированием до нужного количества, при этом обязательным является контроль изменчивости поверхностных антигенов в процессе культивирования клеток. Контроль антигенного состава в процессе культивирования проводят согласно данному изобретению, но без наработки их количества. Например, обработка витальными концентрациями трипсина и масс-спектрометрический анализ проводятся 1-2 раза в неделю в процессе культивирования клеток.
Идентичность антигенов опухоли и антигенов вакцины обеспечивает специфичность вызываемого вакциной иммунного ответа против опухоли. Сравнение масс-спектров антигенов исходной опухоли и нарабатываемых согласно данному изобретению антигенов позволяет контролировать подобную идентичность. На фиг. 2А представлен масс-спектр поверхностных антигенов исходной опухолевой культуры. На фиг. 2Б представлен масс-спектр пригодных для вакцинации и полученных согласно данному изобретению антигенов (спектры на фиг. 2 А и 2Б идентичны). На фиг. 2В представлен масс-спектр антигенов, также полученных согласно данному изобретению, но не пригодных для вакцинации (спектры фиг. 2А и 2В существенно отличаются). Стрелками указаны массы, соответствующие исчезнувшим (на фиг. 2Б) и вновь появившимся (на фиг. 2В) антигенам. Таким образом, контролируя состав пептидов, можно нарабатывать необходимое для вакцинации количество антигенов, вызывающих специфичный иммунный противоопухолевый ответ.
Для подтверждения (не требуется для реализации изобретения) происхождения антигенов из поверхностных белков опухолевых клеток были получены спектры их фрагментации, примеры которых представлены на фиг. 3.
Для этого пробы, полученные в процессе инкубации клеток с трипсином, обессоливали, применяя наконечники для автоматических пипеток с обращенной фазой ΖΐρΤΐρ018 (МИНроге Согр., США), в соответствии с протоколом производителя, и наносили на масс-спектрометрическую мишень с матрицей, как описано выше. Масс-спектры снимали в режиме фрагментации ионов. Идентификация белков осуществляли поисковой системой Мазсо! (Ма1г1х8с1епсе, США) по таксону Ното §ар1епее базы белковых последовательностей ХСВ1 (США) с использованием масс Ь и у ионов (§едиепсе-1ад метод) и/или установленным аминокислотным последовательностям (бе поуо метод).
На фиг. ЗА и 3Б показаны примеры развалов углеводных частей гликозилированных пептидов с массами 1640 и 1480 Да с отщеплением фрагментов 162, 203, 291 Да, что соответствует гексозам (манноза, глюкоза или галактоза), ацетилглюкозамину и сиаловой кислоте соответственно. Фрагментация аминокислотной последовательности пептидов позволила по массам фрагментов идентифицировать в антигенной смеси пептиды из вариабельного и константного доменов тяжелой цепи иммуноглобулина (которые имеют большинство СО антигенов, комплексы гистосовместимости, Τ-клеточный рецептор и молекулы адгезии клеток), рецептора липопротеидов низкой плотности, рецептора интерлейкина 1К-2, С-протеинсвязанного рецептора, главного комплекса гистосовместимости I и II. На фиг. ЗВ представлен пример фрагментов развала с указанием Ь-у ионов для двухзарядного пептида массой 857,4 Да с установленной аминокислотной последовательностью, соответствующей фрагменту С-протеинсвязанного рецептора
Не Суз Суз А1а Сус Суз Ьеи Суз Аг§ Азп Азп Суз Суз Уа1 РЬе Аг§
10 15
На фиг. ЗГ представлен другой пример фрагментов развала однозарядного пептида массой 573,3 Да с указанием Ь-у ионов и с установленной аминокислотной последовательностью, соответствующей фрагменту главного комплекса гистосовместимости типа II:
А1а Уа1 Ьие Азп Аг§
5
Таким образом, получаемые согласно изобретению антигены характеризуется тем, что:
1) состоят из водорастворимых, преимущественно гликозилированных, протеолитических (последовательность которых оканчивается на лизин или аргинин, в случае использования трипсина в качестве протеазы) пептидов массой от 1,2 до 4 кДа,
2) происходят из единого источника - экстрацеллюлярных (внеклеточных) фрагментов белков внешней плазматической мембраны опухолевых клеток,
3) получаются путем воздействия на клетки протеазой в витальной для них концентрации.
Практическое применение смеси опухолевых антигенов, получаемой согласно данному изобретению, обусловлено идентичностью аминокислотных последовательностей и модификаций (гликозилиро
- 7 009325 вания) входящих в смесь пептидов с фрагментами белков, представленных на поверхности опухолевых клеток. Известно, что возникновение опухолевого заболевания является следствием неспособности иммунной системы уничтожать образующиеся в организме опухолевые клетки. Накопленные и очищенные антигены, смешанные с усиливающим иммунный ответ адъювантом, вводят в организм человека или животного. В результате клеточного и гуморального иммунного ответа организма на уничтожение введенных пептидов перекрестно уничтожаются имеющиеся и/или вновь возникающие в организме опухолевые клетки, что и определяет лечебный и профилактический эффект противоопухолевой вакцинации. Для получения полноценного иммунного ответа применяют повторные инъекции антигенов.
Для подтверждения противоопухолевой активности вакцины, полученной согласно данному изобретению, был поставлен модельный эксперимент на подопытных мышах, 20 самцах породы ВЛЬВ/с примерно одного возраста и веса (10 животных в экспериментальной и 10 в контрольной группах).
Опухолевые антигены были получены способом согласно первому варианту реализации изобретения с культуры опухолевых клеток гепатомы Н22. Полученные антигены были обессолены гельфильрацией на сефадексе 0-10 и сконцентрированы на вакуумном концентраторе 8реебУас.
Инъекцию антигенов в количестве 150 мкг вводили подкожно, предварительно смешав в соотношении 1:1 (об./об.) с полным адъювантом Фрейнда. Повторные иммунизации проводили в течение 3 недель (по одной инъекции в неделю) с применением неполного адъюванта Фрейнда. Животным контрольной группы вводили в эквивалентном объеме и по той же схеме, как и в экспериментальной группе, смешанный с физиологическим раствором адъювант Фрейда. После четвертой иммунизации мышам была привита опухоль подкожным введением 1 млн опухолевых клеток гепатомы Н22. В течение трех месяцев отслеживали выживаемость животных в экспериментальной и контрольной группах. Полученная кривая выживаемости (см. фиг. 4) подтвердила наличие противоопухолевой активности антигенов, полученных согласно данному изобретению.
Следует отметить, что результаты модельного эксперимента не ограничивают успешное применение изобретения животными, ввиду идентичности механизма противоопухолевого иммунитета у животных и человека. Способ введения антигена и его доза в пересчете на 1 кг веса сохраняют силу в случае иммунотерапии опухоли у человека, однако схема лечения может быть индивидуальна для каждого больного ввиду тяжести протекания заболевания, стадии опухолевого заболевания, изменчивости опухолевых клеток, способности организма к выраженному иммунному ответу на введенный антиген и т.д.
Ниже приведен пример противоопухолевой вакцины и способа проведения противоопухолевой иммунотерапии на основе поверхностных опухолевых антигенов, изготовленной согласно второму варианту реализации изобретения, для проведения противоопухолевой иммунотерапии человека.
Вакцина состоит из 1 мг смеси опухолевых антигенов, полученных согласно второму варианту реализации изобретения, растворенных в 0,5 мл фосфатного буфера силана, смешанных с 1 мл адъюванта Монтанид Ι8Λ-51 (адъювант фирмы 8уп1ех на основе водно-маслянной эмульсии, содержащий сквален, Плюнорик Ь121, Твин 80).
Вакцину по одной дозе вводят пациенту подкожно в течение трех недель еженедельно и пяти месяцев ежемесячно.
Эффективность вакцинации оценивается по возникшей напряженности иммунитета в отношении вводимых опухолевых антигенов. На 2-3-й день после инъекции оценивают реакцию гиперчиствительности к введенным антигенам по размеру покраснения, возникшего в месте их введения. При этом за базовое значение берется размер покраснения после первой инъекции. Очевидное усиление реакции гиперчувствительности при повторных вакцинациях укажет на возникший противоопухолевый иммунный ответ.
В других вариантах реализации способа проведения противоопухолевой иммунотерапии возможно внутривенное или внутримышечное введение вакцины, а также введение вакцины без адъювантов.
Получение иммунного ответа при использовании заявленного изобретения обеспечивается за счет использования смеси опухолевых антигенов. Множественность пептидов, присутствующих в вакцине, обеспечивает возможность получения иммунного ответа ко всем клеткам, которые имеют на поверхности белки с теми же аминокислотными последовательностями.
Таким образом, настоящее изобретение позволяет многократно увеличить эффективность противоопухолевой иммунотерапии по сравнению с известными способами, в которых применяются моновалентные вакцины.
При использовании настоящей группы изобретений обеспечивается возможность проведения противоопухолевой иммунотерапии с использованием вакцины, обогащенной специфичными для опухоли антигенами, являющимися поверхностными антигенами опухолевых клеток.
Данная возможность создается за счет обработки опухолевых клеток протеазой в витальной для клеток концентрации. Использование витальных концентраций протеазы позволяет отделять только поверхностные антигены опухолевых клеток и избегать гибели клеток, влекущей за собой разрушение их плазматических мембран, что ведет к попаданию в вакцину содержимого цитоплазмы, в частности не представляющих интереса для вакцинации массы внутриклеточных белков. Данный факт приводит к снижению доли специфичных для опухоли антигенов в известных вакцинах, размыванию иммунного
- 8 009325 ответа и, как следствие, к снижению его специфичности в отношении именно опухолевых антигенов.
Таким образом, использование вакцины, обогащенной опухолевыми антигенами, изготовленной согласно настоящему изобретению, позволяет повысить эффективность противоопухолевой иммунотерапии.
Кроме того, повышение эффективности иммунотерапии достигается за счет использования антигенов, полученных аккумулированием с первичной культуры опухолевых клеток. Такой способ изготовления противоопухолевой вакцины позволяет получить при каждом воздействии протеазы антигены практически неизменного состава и накапливать с использованием первичной культуры клеток необходимое для вакцинации количество опухолевых антигенов. Включение в состав вакцины только специфичных для данной опухоли антигенов обеспечивается за счет возможности контроля состава полученных антигенов.
При этом исключается вероятность попадания в состав вакцины антигенов, не являющихся специфичными для данной опухоли. Такие антигены могут присутствовать в составе известных вакцин, изготовленных с использованием размноженных клеток, поскольку известно, что первичные культуры клеток при размножении ίη νίίτο меняют свой антигенный состав. Поэтому состав антигенов, отобранных от размноженных клеток, может быть отличен от состава смеси антигенов, полученных с изолированных (не культивированных) опухолевых клеток.
Вакцины, изготовленные согласно настоящему изобретению, могут представлять собой аутовакцины (полученные на основе опухолевых клеток самого пациента) или алловакцины (на основе опухолевых клеток другого пациента).
Иммунотерапия, проведенная согласно настоящему изобретению, эффективна в обоих случаях ввиду наличия на поверхностях опухолевых клеток различных пациентов пептидов, имеющих одинаковые последовательности аминокислот.
Вместе с тем при использовании аутовакцин, полученных согласно настоящему изобретению, эффект более выражен, поскольку в этом случае вакцина содержит индивидуальные и стадиоспецифические антигены, отличающие развитие опухолевого процесса у конкретного больного.
Таким образом, изобретение позволяет получать опухолевые антигены на основе поверхностных клеточных антигенов и осуществлять на их основе иммунотерапию онкологических заболеваний, а именно вакцинацию.
Claims (9)
1. Противоопухолевая вакцина на основе поверхностных опухолевых антигенов, отличающаяся тем, что содержит смесь поверхностных опухолевых антигенов, представляющих собой аккумулированные пептиды из поверхностных белков живых опухолевых клеток, полученных периодическим и витальным для клеток воздействием протеазы на первичную культуру живых опухолевых клеток.
2. Противоопухолевая вакцина по п.1, отличающаяся тем, что получена при воздействии трипсина, выбранного в качестве протеазы.
3. Способ получения противоопухолевой вакцины, включающий культивирование опухолевых клеток с выделением поверхностных опухолевых антигенов, отличающийся тем, что предварительно отмытую от ростовой среды первичную культуру живых опухолевых клеток подвергают витальному для клеток воздействию протеазы, отбирают высвободившиеся поверхностные опухолевые антигены, при этом обработку первичной культуры живых опухолевых клеток протеазой повторяют с интервалами, необходимыми для восстановления клетками поверхностных опухолевых антигенов, аккумулируют поверхностные опухолевые антигены до достижения их дозы, необходимой для вакцинации, контролируют состав полученных поверхностных опухолевых антигенов.
4. Способ по п.3, отличающийся тем, что в качестве протеазы используют трипсин.
5. Способ проведения противоопухолевой иммунотерапии, включающий введение в организм пациента вакцины, полученной из смеси поверхностных опухолевых антигенов, представляющих собой пептиды, полученные из поверхностных белков опухолевых клеток, отличающийся тем, что используют смесь поверхностных опухолевых антигенов, представляющих собой аккумулированные пептиды из поверхностных белков живых опухолевых клеток, полученных периодическим и витальным для клеток воздействием протеазы на первичную культуру живых опухолевых клеток.
6. Способ по п.5, отличающийся тем, что в качестве протеазы используют трипсин.
7. Способ по п.5, отличающийся тем, что используют поверхностные опухолевые антигены опухолевых клеток самого пациента.
8. Способ по п.5, отличающийся тем, что используют поверхностные опухолевые антигены опухолевых клеток другого пациента.
9. Способ по п.5, отличающийся тем, что в составе противоопухолевой вакцины используют адъюванты.
- 9 009325
Фиг. 1
Фиг. 2
0.0 интенс.
0.8
0.6
0.4
0.2 хЮ4
1.0
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EA200700598A EA009325B1 (ru) | 2007-03-07 | 2007-03-07 | Противоопухолевая вакцина, способ получения противоопухолевой вакцины и способ проведения противоопухолевой иммунотерапии |
| PCT/RU2007/000572 WO2008108679A1 (fr) | 2007-03-07 | 2007-10-16 | Vaccin antitumoral, procédé de fabrication de vaccin antitumoral et procédé de mise en oeuvre d'une immunothérapie antitumorale |
| CN2007800520447A CN101636174B (zh) | 2007-03-07 | 2007-10-16 | 抗肿瘤疫苗制备方法 |
| KR1020097018706A KR20090127132A (ko) | 2007-03-07 | 2007-10-16 | 항 종양 백신의 제조방법 |
| EP07852028A EP2116254A4 (en) | 2007-03-07 | 2007-10-16 | TUMORVAKZINE, METHOD FOR THE PRODUCTION OF A TUMORVAKZINE AND METHOD FOR CARRYING OUT ANTITUMORAL IMMUNOTHERAPY |
| JP2009552621A JP5172864B2 (ja) | 2007-03-07 | 2007-10-16 | 抗腫瘍ワクチン、抗腫瘍ワクチンの調製方法及び抗腫瘍免疫療法の実行方法 |
| US12/545,560 US20110027322A1 (en) | 2007-03-07 | 2009-08-21 | Tumor vaccine, a method for producing a tumor vaccine and a method for carrying out antitumor immunotherapy |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EA200700598A EA009325B1 (ru) | 2007-03-07 | 2007-03-07 | Противоопухолевая вакцина, способ получения противоопухолевой вакцины и способ проведения противоопухолевой иммунотерапии |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA200700598A1 EA200700598A1 (ru) | 2007-12-28 |
| EA009325B1 true EA009325B1 (ru) | 2007-12-28 |
Family
ID=39738469
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA200700598A EA009325B1 (ru) | 2007-03-07 | 2007-03-07 | Противоопухолевая вакцина, способ получения противоопухолевой вакцины и способ проведения противоопухолевой иммунотерапии |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20110027322A1 (ru) |
| EP (1) | EP2116254A4 (ru) |
| JP (1) | JP5172864B2 (ru) |
| KR (1) | KR20090127132A (ru) |
| CN (1) | CN101636174B (ru) |
| EA (1) | EA009325B1 (ru) |
| WO (1) | WO2008108679A1 (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010024719A1 (ru) * | 2008-08-26 | 2010-03-04 | Lokhov Petr Genrievich | Способ получения противоопухолевой вакцины |
| RU2475865C2 (ru) * | 2010-05-04 | 2013-02-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Ростовский научно-исследовательский онкологический институт" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ФГБУ "РНИОИ" Минздравсоцразвития России) | Способ лечения злокачественных новообразований в эксперименте |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EA200700940A1 (ru) * | 2007-04-27 | 2007-12-28 | Петр Генриевич ЛОХОВ | Способ получения противоопухолевой вакцины на основе поверхностных антигенов эндотелиальных клеток |
| EP2198879A1 (en) | 2008-12-11 | 2010-06-23 | Institut Curie | CD74 modulator agent for regulating dendritic cell migration and device for studying the motility capacity of a cell |
| CN110898215A (zh) * | 2019-12-06 | 2020-03-24 | 郑州大学 | 一种基于细胞微囊泡的抗肿瘤疫苗的制备方法及其应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5030621A (en) * | 1987-04-23 | 1991-07-09 | Bystryn Jean Claude | Shed melanoma antigen compositions |
| US6033674A (en) * | 1995-12-28 | 2000-03-07 | Johns Hopkins University School Of Medicine | Method of treating cancer with a tumor cell line having modified cytokine expression |
| US6861234B1 (en) * | 2000-04-28 | 2005-03-01 | Mannkind Corporation | Method of epitope discovery |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6338853B1 (en) * | 1987-04-23 | 2002-01-15 | Jean-Claude Bystryn | Anti-cancer vaccine |
| US5993829A (en) * | 1987-04-23 | 1999-11-30 | Bystryn; Jean-Claude | Anti-cancer vaccine |
| DE4431401A1 (de) | 1994-08-24 | 1996-02-29 | Max Delbrueck Centrum | Lebendvakzine gegen Tumorerkrankungen |
| RU2192884C2 (ru) * | 2000-11-09 | 2002-11-20 | Государственное учреждение Научно-исследовательский институт клинической иммунологии СО РАМН | Вакцина для стимуляции противоопухолевого иммунитета |
| IL140796A0 (en) | 2001-01-08 | 2002-02-10 | Hadasit Med Res Service | An autologous anti-cancer vaccine |
| US7041302B2 (en) * | 2001-01-09 | 2006-05-09 | Biother Corporation | Therapeutic modulation of the tumor inflammatory response |
| US20040022813A1 (en) * | 2002-08-05 | 2004-02-05 | Jean-Claude Bystryn | Shed antigen vaccine with dendritic cells adjuvant |
| WO2005120558A2 (en) * | 2004-05-25 | 2005-12-22 | University Of Connecticut Health Center | Methods for making compositions comprising heat shock proteins or alpha-2-macroglobulin for the treatment of cancer and infectious disease |
| EA200700940A1 (ru) * | 2007-04-27 | 2007-12-28 | Петр Генриевич ЛОХОВ | Способ получения противоопухолевой вакцины на основе поверхностных антигенов эндотелиальных клеток |
-
2007
- 2007-03-07 EA EA200700598A patent/EA009325B1/ru active IP Right Revival
- 2007-10-16 WO PCT/RU2007/000572 patent/WO2008108679A1/ru active Application Filing
- 2007-10-16 JP JP2009552621A patent/JP5172864B2/ja active Active
- 2007-10-16 EP EP07852028A patent/EP2116254A4/en not_active Withdrawn
- 2007-10-16 KR KR1020097018706A patent/KR20090127132A/ko not_active Application Discontinuation
- 2007-10-16 CN CN2007800520447A patent/CN101636174B/zh active Active
-
2009
- 2009-08-21 US US12/545,560 patent/US20110027322A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5030621A (en) * | 1987-04-23 | 1991-07-09 | Bystryn Jean Claude | Shed melanoma antigen compositions |
| US6033674A (en) * | 1995-12-28 | 2000-03-07 | Johns Hopkins University School Of Medicine | Method of treating cancer with a tumor cell line having modified cytokine expression |
| US6861234B1 (en) * | 2000-04-28 | 2005-03-01 | Mannkind Corporation | Method of epitope discovery |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010024719A1 (ru) * | 2008-08-26 | 2010-03-04 | Lokhov Petr Genrievich | Способ получения противоопухолевой вакцины |
| RU2475865C2 (ru) * | 2010-05-04 | 2013-02-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Ростовский научно-исследовательский онкологический институт" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ФГБУ "РНИОИ" Минздравсоцразвития России) | Способ лечения злокачественных новообразований в эксперименте |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EA200700598A1 (ru) | 2007-12-28 |
| CN101636174A (zh) | 2010-01-27 |
| US20110027322A1 (en) | 2011-02-03 |
| KR20090127132A (ko) | 2009-12-09 |
| EP2116254A4 (en) | 2010-04-14 |
| CN101636174B (zh) | 2012-11-14 |
| EP2116254A1 (en) | 2009-11-11 |
| JP2010530843A (ja) | 2010-09-16 |
| JP5172864B2 (ja) | 2013-03-27 |
| WO2008108679A1 (fr) | 2008-09-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Banchereau et al. | Immunobiology of dendritic cells | |
| CN101861167B (zh) | 包含装载有抗原和自然杀伤t细胞配体的单核细胞或未成熟骨髓细胞(imc)的疫苗 | |
| TW592708B (en) | Vesicles, preparation process and use thereof | |
| Lappin et al. | Analysis of mouse dendritic cell migration in vivo upon subcutaneous and intravenous injection | |
| Bhardwaj | Processing and presentation of antigens by dendritic cells: implications for vaccines | |
| RU2575978C2 (ru) | Система и способ получения и хранения активированных зрелых дендритных клеток | |
| US20020155108A1 (en) | Method for ex vivo loading of antigen presenting cells with antigen, and a vaccine comprising the loaded cells | |
| JP5709264B2 (ja) | ワクチン組成物および方法 | |
| US20020187131A1 (en) | Enhanced antigen delivery and modulation of the immune response therefrom | |
| AU2008303453B2 (en) | An ex vivo, fast and efficient process to obtain activated antigen-presenting cells that are useful for therapies against cancer and immune system-related diseases | |
| EA009325B1 (ru) | Противоопухолевая вакцина, способ получения противоопухолевой вакцины и способ проведения противоопухолевой иммунотерапии | |
| CN105007930B (zh) | 用于治疗疾病的同种异体自噬体富集组合物 | |
| US20170072034A1 (en) | Therapeutic cancer vaccine targeted to haah (aspartyl-[asparaginyl]-beta-hydroxylase) | |
| Wang et al. | Potent activation of antigen-specific T cells by antigen-loaded nanospheres | |
| EP2112160B1 (en) | Immunotherapeutic formulations to generate autoantibodies capable to avoid the binding of interleukin-2 to its receptor. Their use in the treatment of cancer | |
| US6838086B1 (en) | Composition comprising low molecular weight hyaluronic acid fragments | |
| US20210324023A1 (en) | Modulating immune responses | |
| WO2008133546A1 (fr) | Procédé de fabrication d'un vaccin antitumoral sur la base d'antigènes de surface de cellules endothéliales | |
| Jang et al. | Induction of cytotoxic T lymphocyte responses by cholera toxin-treated bone marrow-derived dendritic cells | |
| WO2004096244A1 (en) | Method of preparing tumor vaccine for the inducement of anti-tumor activity and a pharmaceutical composition containing the same | |
| RU2755638C2 (ru) | Способ повышения противоопухолевой резистентности, антиоксидантного и иммуностимулирующего воздействия на организм | |
| CN115246870A (zh) | 活化的树突细胞及其在治疗癌症中的应用 | |
| CN113521273A (zh) | 一种使用含有CpG寡聚脱氧核苷酸的复合佐剂的新冠COVID-19灭活疫苗 | |
| WO2005100547A1 (ja) | 抗原パルスして得られた樹状細胞 | |
| EA011421B1 (ru) | Способ получения противоопухолевой вакцины |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): RU |
|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AZ BY KG |
|
| NF4A | Restoration of lapsed right to a eurasian patent |
Designated state(s): RU |
|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): RU |
|
| NF4A | Restoration of lapsed right to a eurasian patent |
Designated state(s): RU |
|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): RU |
|
| NF4A | Restoration of lapsed right to a eurasian patent |
Designated state(s): RU |
|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): RU |
|
| NF4A | Restoration of lapsed right to a eurasian patent |
Designated state(s): RU |
|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): RU |
|
| NF4A | Restoration of lapsed right to a eurasian patent |
Designated state(s): RU |
|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): RU |
|
| NF4A | Restoration of lapsed right to a eurasian patent |
Designated state(s): RU |