WO2005100547A1 - 抗原パルスして得られた樹状細胞 - Google Patents

Abstract

　疾患、主としてＢ型肝炎の予防、治療に有効な樹状細胞を提供する。 　樹状細胞をＨＢｓ抗原でパルスする工程を含む方法によって得られたＨＢｓ抗原提示能を有する樹状細胞は、樹状細胞ワクチンとしてＢ型肝炎の予防、治療に有効である。ＨＢｓ抗原として、ＨＢワクチンに含まれるＨＢｓ抗原を用いることができる。樹状細胞をワクチンでパルスする工程を含む方法によって得られたワクチンパルス樹状細胞は、樹状細胞ワクチンとして、患者だけでなく健常者にも用いることができる。パルスに用いるワクチンとしては、様々な種類のワクチンを用いることができる。

Description

明 細 書

抗原パルスして得られた樹状細胞

技術分野

[0001] 本発明は、疾患の予防、又は、治療に用いることができる榭状細胞に関する。

背景技術

[0002] (榭状細胞ワクチン療法とその問題点）

癌治療等の分野にぉ 、て、榭状細胞ワクチン療法が注目されて 、る。

[0003] 榭状細胞は、生体内で最も強い抗原提示能を有する抗原提示細胞 (antigen pre senting cell: APC)であり、取り込んだ抗原ェピトープを T細胞に提示することによ つて Τ細胞を活性ィ匕し、免疫応答を高めることができる。

[0004] 榭状細胞ワクチン療法は、この榭状細胞を、癌細胞力 抽出した物質、又は、癌特 異的抗原を用いて、生体外でパルスし抗原提示能を亢進させて、榭状細胞ワクチン として生体内に戻す治療法である。

[0005] 癌細胞力 抽出した物質は、一般に、多種類の物質の混合物である。従って、癌細 胞力 抽出した物質を用いてパルスした榭状細胞ワクチンは、細胞抽出物質中の多 種類の癌抗原によって榭状細胞がパルスされたと考えられるため、癌に対する強力 な免疫反応が誘導されると予想される。しかし、このように多種類の物質の混合物に よってノルスした場合は、榭状細胞が提示する抗原を特定することができない。従つ て、癌患者に対する治療ワクチンとして使用することは許されるが、健常者に対する 疾患の予防ワクチンとして使用することは許されない。

[0006] また、癌特異的抗原を用いてパルスした榭状細胞ワクチンにお 、ては、榭状細胞 が提示する抗原を特定することができるが、現在同定されている癌特異的抗原の数 自体がまだ多くな 、と 、う問題点がある。

[0007] 榭状細胞に抗原を提示させる別の態様として、例えば、抗原に由来するペプチドを コードする遺伝子を榭状細胞に導入し、発現させる方法が知られている。しかし、この ようにして調整した榭状細胞ワクチンが、特定の抗原に対して強力な免疫応答を引き 起こすことが可能であったとしても、現段階では、遺伝子操作を用いた榭状細胞を、 疾患の予防等のために健常者に投与することは許されて 、な 、。

[0008] (肝炎について）

肝炎とは、肝臓に起こる炎症であり、主にウィルス、アルコール、薬物が原因となって 引き起こされる。最も多い肝炎は肝炎ウィルスが原因のものであり、今日まで、 7種類 の肝炎ウィルスが見つかつている。また、日本のウィルス性肝炎においては、 B型、 C 型がそのほとんどを占める。

[0009] 肝炎は、急性肝炎と慢性肝炎に大別でき、慢性肝炎とは、肝炎が 6ヶ月以上続くも のを言う。 A型肝炎は、経口感染し、急性肝炎で留まり慢性化はしない。一方、 B型、 C型肝炎は、血液を介して感染し、母子間の垂直感染、家族や異性間の水平感染が ある。また、 B型、 C型肝炎は、急性肝炎力も慢性肝炎に進行するケースが多ぐ慢性 化すると、肝硬変や肝臓癌等の重い肝臓疾病への移行率が極めて高いと言われて いる。

[0010] (B型肝炎について）

B型肝炎の患者は全世界的に分布しており、世界に 3億 5千万人の B型肝炎ウィルス 感染者がいると言われている。特に、中国における感染者は 1億 2千万人と推定され 極めて多ぐ東南アジア全体で、全世界の感染者数の 70%以上を占めるとされる。ま た、世界で毎年約 100万人力 この疾患が原因で死亡していることが報告されている 。 日本においては、 100万人以上の B型肝炎ウィルス感染者がいると推定され、その 10%程度が慢性肝炎患者であると推定される。

[0011] (B型肝炎の治療法とその問題点）

B型肝炎には特効的な治療薬はない。従って、治療は、ウィルスの数を減らしてその 活動を抑えることが目的となる。代表的な治療法として、インターフェロン療法とラミブ ジン療法が知られている。

[0012] インターフェロン療法は、今から 20年ほど前に始められた B型肝炎の最初の治療法 で、インターフェロンが免疫系の働きを助けてウィルスの増殖を抑える役割を果たす。 インターフェロン療法は、ウィルス数が少ないほど効果が期待できるため、一般的に、 ウィルス数力 ¾型肝炎の 1000分の 1である C型肝炎の治療に優れた効果を発揮する 一方、 B型肝炎の治療には、約 20%の患者にしか効果を望めない。また、肝硬変に 移行すると、よりインターフェロンが効きに《なる。さらに、治療に用いられるインター フエロンは、開発し製品とするまでに大きなコストがかかり、 1クールの治療で患者に 2 00— 300万円の大きな経済的負担をもたらす等の問題点も多！、。

[0013] ラミブジンは、本来、エイズの治療薬として開発された薬剤であるが、 B型肝炎の治 療にも有効であることが知られている。ラミブジンは、ウィルス DN Aの合成を直接抑え る働きがあり、 B型肝炎の急速な悪ィ匕ゃ劇症化を食い止める効果がある。ラミブジン は、インターフェロンが効果を示さな力つた B型肝炎患者にも効果を示すことが報告さ れているが、ウィルスが増殖状態にない時には効果が示されない。さらに、長期投与 によってラミブジン耐性ウィルスが現れる等の問題点がある。

[0014] また、これらの B型肝炎治療法は、効果の評価方法がそれぞれ異なって!/、るため、 一律に効果を比較することができない。また、これらの治療法を用いても、 B型肝炎ゥ ィルスを体内力 完全になくすことは不可能であると考えられる。従って、前述のよう な B型肝炎患者の増加を防ぐためには、 B型肝炎を予防することが重要であると考え られる。

[0015] (B型肝炎の予防法とその問題点）

B型肝炎の予防の観点からは、一般に、 HBワクチンが有効である。

[0016] B型慢性肝炎を予防するためには、健常人であっても、体内に抗 HBs抗体を持ち、 維持することが重要である。今日の HBワクチンは、 B型肝炎ウィルスの表面抗原であ る HBs抗原に基づいて作られている。通常、この HBワクチンを 3回接種することによ り、 HBワクチンの効くヒトには、体内に抗 HBs抗体ができる。抗体ができたヒトは、そ の後 B型肝炎に感染することがないが、数年後に抗体値が低下した場合でも、一度 抗 HBs抗体が体内にできていれば感染を免れる可能性があると考えられる。また、 追加接種をすることによって、抗体値を再び高めることもできる。

[0017] し力し、 HBワクチンにも、いくつかの問題点が存在する。

[0018] まず、健常者のうちの約 10%は HBワクチンが非奏功（non— responder)であり、 H Bワクチンを投与しても抗 HBs抗体を産生することができな 、。医療従事者にぉ 、て も HBワクチン non— responderは少なくなく、 日本には数十万人いると考えられる。

[0019] また、免疫能の低下を伴う疾患に力かって 、る人、例えば、 HIV患者、肝疾患患者 、透析患者においても、 HBワクチンが十分に効果を発揮できない。肥満者や喫煙者 にも免疫能の低下がみられる力 これらの人々も HBワクチンに対する反応性が低い

[0020] さらに、肝移植対象者等の免疫抑制剤投与中の人にも、 HBワクチンが効力ないた め、患者は抗 HBs抗体を産生することができない。しかし、 B型肝炎関連肝移植にお いては、抗 HBs抗体値を維持することが治療成績に大きな影響を及ぼすため、肝移 植後、患者は繰り返し抗 HBsヒト免疫グロブリンを投与することが必要となる。投与は 2週間に 1回の頻度で必要であり、このことは年間 250万円という大きな経済的負担 をもたらす。これからは、特に患者の多い東南アジアを中心に、 B型肝炎関連肝移植 が激増すると考えられるため、この経済的な問題の解決が世界的に必要とされている 発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0021] 本発明は、疾患の予防、又は、治療に有効な榭状細胞を提供することを目的とし、 特に、 B型肝炎の予防、又は、治療に好適に利用できる榭状細胞を提供することを目 的とする。

課題を解決するための手段

[0022] 1、 HBs抗原提示能を有する榭状細胞

本発明は、榭状細胞を HBs抗原でパルスする工程を含む方法によって得られた、 HBs抗原提示能を有する榭状細胞である。

[0023] 本発明によって得られた HBs抗原提示能を有する榭状細胞は、 HBs抗原ェピトー プを T細胞に提示することによって T細胞を活性ィ匕し、 HBs抗原に対する免疫応答を 高めることができる。従って、本発明によれば、 B型肝炎の予防、又は、治療に有効な 、 HBs抗原提示能を有する榭状細胞を提供することができる。

[0024] 本発明にお 、て、前記方法はさらに、血液力 前記榭状細胞を得る工程を含むこと ができる。これによれば、血液由来の榭状細胞から、本発明に係る HBs抗原提示能 を有する榭状細胞を提供することが可能である。また、血液を用いれば、従来公知の 方法等を用いて、比較的簡便な操作によって榭状細胞を得ることが可能である。 [0025] 本発明において、前記方法はさらに、生物から前記血液を採取する工程を含むこと ができる。

[0026] 本発明において、前記生物は、ヒトとすることができる。これによれば、ヒト由来の榭 状細胞を得ることができるため、本発明による HBs抗原提示能を有する榭状細胞を、 ヒトに投与することが可能である。従って、本発明によって、ヒトの B型肝炎の予防、又 は、治療に有効な、 HBs抗原提示能を有する榭状細胞を提供することができる。

[0027] 本発明にお!/、て、前記 HBs抗原は、 HBワクチンに含まれる HBs抗原であることが できる。例えばヒトの場合、 HBワクチンとして実際に販売されるものは、健常者を含む ヒトに安全性、有効性が認められ、認可を受けたものである。従って、本発明によれ ば、例えばヒトに安全かつ有効に用いることができる、 HBs抗原提示能を有する榭状 細胞を提供することができる。また、 HBワクチンは健常者に対して使用できるもので あることから、本発明に係る HBs抗原提示能を有する榭状細胞は、 B型肝炎患者等 に対する B型肝炎の治療目的のみならず、健常者に対しても、 B型肝炎の予防目的 で使用することができる。なお、ヒトに限らず他の生物についても、その生物に安全か つ有効な HBワクチンを用いてパルスした榭状細胞を用いることによって、その生物 の B型肝炎を予防、又は、治療することができる。

[0028] 2、 HBs抗原提示能を有する榭状細胞の製造方法

本発明は、榭状細胞を HBs抗原でパルスする工程を含む、 HBs抗原提示能を有 する榭状細胞の製造方法である。これによれば、 B型肝炎の予防、又は、治療に有 効な、 HBs抗原提示能を有する榭状細胞を得ることができる。

[0029] 本発明に係る HBs抗原提示能を有する榭状細胞の製造方法はさらに、血液から前 記榭状細胞を得る工程を含むことができる。これによれば、血液由来の榭状細胞から 、本発明に係る HBs抗原提示能を有する榭状細胞を得ることが可能である。また、血 液を用いれば、従来公知の方法等を用いて、比較的簡便な操作によって榭状細胞 を得ることが可能である。

[0030] 本発明に係る HBs抗原提示能を有する榭状細胞の製造方法はさらに、生物から前 記血液を採取する工程を含むことができる。

[0031] 本発明において、前記生物は、ヒトとすることができる。これによれば、ヒトの B型肝 炎の予防、又は、治療に有効な、 HBs抗原提示能を有する榭状細胞を得ることが可 能である。

[0032] 本発明にお!/、て、前記 HBs抗原は、 HBワクチンに含まれる HBs抗原であることが できる。これによれば、生物、例えば健常者を含むヒトに、安全かつ有効に用いること ができる、 B型肝炎の予防、又は、治療に有効な、 HBs抗原提示能を有する榭状細 胞を提供することができる。

[0033] 3、 HBs抗原提示能を有する榭状細胞を含む組成物

本発明は、本発明に係る HBs抗原提示能を有する榭状細胞を含む組成物である。 これによれば、本発明に係る HBs抗原提示能を有する榭状細胞を、例えば、他の物 質と混合した状態、他の物質に懸濁した状態、他の物質と組み合わせた状態等で使 用することができる。具体的には、本発明に係る HBs抗原提示能を有する榭状細胞 を、例えば、 PBS、生理食塩水、 RPMI 1640培地等に懸濁した態様や、本発明に 係る HBs抗原提示能を有する榭状細胞に、例えば、 TNF— a；、 IL 12、 HBワクチン 、 GM— CSF、 OK432、その他免疫賦活剤等を添加した態様で用いることができる。 従って、本発明によれば、本発明に係る HBs抗原提示能を有する榭状細胞を、使用 目的に適した態様で、又は、本発明に係る HBs抗原提示能を有する榭状細胞の効 果を高める態様で使用することが可能になる。

[0034] 本発明に係る組成物は、さらに HBワクチン添加物を含むことができる。

[0035] 本発明において、前記組成物は、実験試薬、又は、実験キットとすることができる。

これによれば、本発明に係る HBs抗原提示能を有する榭状細胞を、研究、例えば免 疫研究に適した態様で用いることができる。

[0036] 本発明にお 、て、前記組成物は、医薬組成物とすることができる。これによれば、 本発明に係る HBs抗原提示能を有する榭状細胞を、医療、例えば、 B型肝炎の予防 、又は、治療に適した態様で用いることができる。

[0037] 本発明にお 、て、前記組成物は、免疫応答活性ィ匕製剤であることができる。これに よれば、本発明に係る HBs抗原提示能を有する榭状細胞を、 HBs抗原に対する免 疫応答を活性ィ匕するのに適した投与剤形で用いることができる。

[0038] 本発明にお 、て、前記組成物は、細胞ワクチンであることができる。これによれば、 本発明に係る HBs抗原提示能を有する榭状細胞を、生体内に直接投与することが 可能になり、 HBs抗原に対する免疫応答を活性ィ匕することができる。

[0039] 本発明にお 、て、前記細胞ワクチンは、 B型肝炎の予防、又は、治療ワクチンであ ることができる。これによれば、前記細胞ワクチンに含まれる本発明に係る HBs抗原 提示能を有する榭状細胞が、生体内で HBs抗原に対する免疫応答を活性化するこ とによって、 B型肝炎を予防、又は、治療することが可能になる。

[0040] 4、 HBs抗原提示能を有する榭状細胞を用いた、 B型肝炎の予防、又は、治療方 法

本発明は、本発明に係る HBs抗原提示能を有する榭状細胞を用いた、 B型肝炎の 予防、又は、治療方法である。これによれば、本発明に係る HBs抗原提示能を有す る榭状細胞が、 HBs抗原に対する免疫応答を活性化することによって、 B型肝炎を 予防、又は、治療することができる。例えばヒトの場合、これまでの HBワクチンが非奏 功であった健常者、又は、免疫能の低下を伴う疾患に力かっている人、免疫抑制剤 投与中の人等、これまでの HBワクチンが効果を発揮できなかった人が、本発明に係 る B型肝炎の予防、又は、治療方法によって、抗 HBs抗体を産生することができ、 B 型肝炎を予防、又は、治療することが可能になる。

[0041] 本発明において、本発明に係る HBs抗原提示能を有する榭状細胞を、生物に投 与する工程を含むことができる。これによれば、本発明に係る HBs抗原提示能を有 する榭状細胞が、生体内で、 HBs抗原に対する免疫応答を活性化することによって 、 B型肝炎を予防、又は、治療することができる。また、本発明に係る B型肝炎の予防 、又は、治療方法は、 HBワクチンを直接生体内に投与するこれまでの B型肝炎の予 防、又は、治療方法と比較して、高い効果を発揮することが可能である。

[0042] 本発明において、前記生物は、ヒトであることができる。これによれば、ヒトの B型肝 炎を予防、又は、治療することが可能である。

[0043] 5、ワクチンパルス榭状細胞

本発明は、榭状細胞をワクチンでパルスする工程を含む方法によって得られた、ヮ クチンパルス榭状細胞である。

[0044] 本発明にお 、て、「ワクチンパルス榭状細胞」とは、ワクチンでパルスする工程を含 む方法によって得られた、抗原提示能を有する榭状細胞のことを言う。

[0045] 本発明によって得られたワクチンパルス榭状細胞は、ワクチンに含まれる抗原ェピト ープを T細胞に提示することによって T細胞を活性化し、前記抗原に対する免疫応 答を高めることができる。従って、本発明によれば、疾患の予防、又は、治療に有効 な、ワクチンパルス榭状細胞を提供することができる。

[0046] また、例えばヒトの場合、ワクチンとして実際に販売されるものは、ヒトに安全性、有 効性が認められ、認可を受けたものである。従って、本発明によれば、例えばヒトに安 全かつ有効に用いることができる、ワクチンパルス榭状細胞を提供することができる。 なお、ヒトに限らず他の生物についても、その生物に安全かつ有効なワクチンを用い てノルスしたワクチンノ ルス榭状細胞を用いることによって、その生物の疾患を予防 、又は、治療することができる。

[0047] 本発明にお 、て、前記方法はさらに、血液力 前記榭状細胞を得る工程を含むこと ができる。これによれば、血液由来の榭状細胞から、本発明に係るワクチンパルス榭 状細胞を提供することが可能である。また、血液を用いれば、従来公知の方法等を 用いて、比較的簡便な操作によって榭状細胞を得ることが可能である。

[0048] 本発明において、前記方法はさらに、生物から前記血液を採取する工程を含むこと ができる。

[0049] 本発明において、前記生物は、ヒトとすることができる。これによれば、ヒト由来の榭 状細胞を得ることができるため、本発明によるワクチンパルス榭状細胞を、ヒトに投与 することが可能である。従って、本発明によって、ヒト疾患の予防、又は、治療に有効 な、ワクチンパルス榭状細胞を提供することができる。

[0050] 本発明にお 、て、前記ワクチンは、疾患の予防、又は、治療ワクチンであることがで きる。これによれば、これらのワクチンに含まれている、前記疾患に関わる抗原を提示 するワクチンパルス榭状細胞を提供することができる。従って、前記疾患を予防、又 は、 '治療することができる。

[0051] 本発明にお 、て、前記ワクチンは肝炎ワクチンであることができる。肝炎ワクチンとし ては、例えば、 A型肝炎ワクチン、 B型肝炎ワクチン等が知られている。例えばヒトの 場合、肝炎ワクチンとして実際に販売されるものは、健常者を含むヒトに安全性、有効 性が認められ、認可を受けたものである。従って、本発明によれば、例えばヒトに安全 かつ有効に用いることができる、肝炎ウィルス抗原提示能を有する肝炎ワクチンパル ス榭状細胞を提供することができる。また、肝炎ワクチンは健常者に対して使用できる ものであること力ゝら、本発明に係る肝炎ワクチンパルス榭状細胞は、例えば、肝炎患 者等に対する肝炎の治療目的のみならず、健常者に対しても、肝炎の予防目的で使 用することができる。なお、ヒトに限らず他の生物についても、その生物に安全かつ有 効な肝炎ワクチンを用いてパルスした榭状細胞を用いることによって、その生物の肝 炎を予防、又は、治療することができる。

[0052] 本発明にお 、て、前記肝炎ワクチンは、好ましくは HBs抗原を含む HBワクチンで あることができる。これによれば、生物、例えば健常者を含むヒトに、安全かつ有効に 用いることができる、 B型肝炎の予防、又は、治療に有効な、 HBs抗原提示能を有す るワクチンパルス榭状細胞を提供することができる。

[0053] 6、ワクチンパルス榭状細胞の製造方法

本発明は、榭状細胞をワクチンでパルスする工程を含む、ワクチンノルス榭状細胞 の製造方法である。これによれば、疾患の予防、又は、治療に有効な、ワクチンパル ス榭状細胞を得ることができる。

[0054] 本発明に係るワクチンパルス榭状細胞の製造方法はさらに、血液から前記榭状細 胞を得る工程を含むことができる。これによれば、血液由来の榭状細胞から、本発明 に係るワクチンパルス榭状細胞を得ることが可能である。また、血液を用いれば、従 来公知の方法等を用いて、比較的簡便な操作によって榭状細胞を得ることが可能で ある。

[0055] 本発明に係るワクチンパルス榭状細胞の製造方法はさらに、生物から前記血液を 採取する工程を含むことができる。

[0056] 本発明において、前記生物は、ヒトとすることができる。これによれば、ヒト疾患の予 防、又は、治療に有効な、ワクチンパルス榭状細胞を得ることが可能である。

[0057] 本発明にお 、て、前記ワクチンは、疾患の予防、又は、治療ワクチンであることがで きる。これによれば、前記疾患の予防、又は、治療に有効な、ワクチンパルス榭状細 胞を提供することができる。 [0058] 本発明にお 、て、前記ワクチンは肝炎ワクチンであることができる。これによれば、 生物、例えば健常者を含むヒトに、安全かつ有効に用いることができる、肝炎の予防 、又は、治療に有効な、肝炎ウィルス抗原提示能を有する肝炎ワクチンパルス榭状細 胞を提供することができる。

[0059] 本発明にお 、て、前記肝炎ワクチンは、好ましくは HBs抗原を含む HBワクチンで あることができる。これによれば、生物、例えば健常者を含むヒトに、安全かつ有効に 用いることができる、 B型肝炎の予防、又は、治療に有効な、 HBs抗原提示能を有す るワクチンパルス榭状細胞を提供することができる。

[0060] 7、ワクチンパルス榭状細胞を含む組成物

本発明は、本発明に係るワクチンパルス榭状細胞を含む組成物である。これによれ ば、本発明に係るワクチンパルス榭状細胞を、例えば、他の物質と混合した状態、他 の物質に懸濁した状態、他の物質と組み合わせた状態等で使用することができる。 具体的には、本発明に係る HBs抗原提示能を有する榭状細胞を、例えば、 PBS、生 理食塩水、 RPMI 1640培地等に懸濁した態様や、本発明に係る HBs抗原提示能 を有する榭状細胞に、例えば、 TNF— a；、 IL 12、 HBワクチン、 GM— CSF、 OK43 2、その他免疫賦活剤等を添加した態様で用いることができる。従って、本発明によ れば、本発明に係るワクチンパルス榭状細胞を、使用目的に適した態様で、又は、本 発明に係るワクチンパルス榭状細胞の効果を高める態様で使用することが可能にな る。

[0061] 本発明に係る組成物は、さらにワクチン添加物を含むことができる。

[0062] 本発明にお ヽて、前記組成物は、実験試薬、又は、実験キットとすることができる。

これによれば、本発明に係るワクチンパルス榭状細胞を、研究、例えば免疫研究に 適した態様で用いることができる。

[0063] 本発明にお 、て、前記組成物は、医薬組成物とすることができる。これによれば、 本発明に係るワクチンパルス榭状細胞を、医療、例えば、疾患の予防、又は、治療に 適した態様で用いることができる。

[0064] 本発明にお 、て、前記組成物は、免疫応答活性ィ匕製剤であることができる。これに よれば、本発明に係るワクチンパルス榭状細胞を、ワクチンに含まれていた抗原に対 する免疫応答を活性ィ匕するのに適した投与剤形で用いることができる。

[0065] 本発明にお 、て、前記組成物は、細胞ワクチンであることができる。これによれば、 本発明に係るワクチンパルス榭状細胞を、生体内に直接投与することが可能になり、 ワクチンに含まれていた抗原に対する免疫応答を活性ィ匕することができる。

[0066] 本発明にお 、て、前記細胞ワクチンは、疾患の予防、又は、治療ワクチンであること ができる。これによれば、前記細胞ワクチンに含まれる本発明に係るワクチンパルス 榭状細胞が、生体内で、ワクチンに含まれていた抗原に対する免疫応答を活性化す ることによって、前記疾患を予防、又は、治療することが可能になる。

[0067] 8、ワクチンパルス榭状細胞を用いた、疾患の予防、又は、治療方法

本発明は、本発明に係るワクチンパルス榭状細胞を用いた、疾患の予防、又は、治 療方法である。これによれば、本発明に係るワクチンノ ルス榭状細胞力 ワクチンに 含まれていた抗原に対する免疫応答を活性ィ匕することによって、前記疾患を予防、 又は、治療することができる。例えばヒトの場合、前記疾患を予防、又は、治療するた めにこれまで用いられてきたワクチンが非奏功であった健常者、又は、免疫能の低下 を伴う疾患にかかっている人、免疫抑制剤投与中の人等、ワクチンが十分な効果を 発揮できな力つた人が、本発明に係る疾患の予防、又は、治療方法によって、抗体を 産生することができるようになり、前記疾患を予防、又は、治療することが可能になる。

[0068] 本発明にお 、て、本発明に係るワクチンパルス榭状細胞を、生物に投与する工程 を含むことができる。これによれば、本発明に係るワクチンパルス榭状細胞力 生体 内で、ワクチンに含まれていた抗原に対する免疫応答を活性ィ匕することによって、前 記疾患を予防、又は、治療することができる。また、本発明に係る疾患の予防、又は、 治療方法は、ワクチンを直接生体内に投与することによるこれまでの疾患の予防、又 は、治療方法と比較して、高い効果を発揮することが可能である。

[0069] 本発明において、前記生物は、ヒトであることができる。これによれば、ヒトの疾患を 予防、又は、治療することが可能である。

図面の簡単な説明

[0070] [図 1]HBワクチンパルス榭状細胞投与前の抗 HBs抗体値を示す。

[図 2]HBワクチンパルスによる、榭状細胞の HLA— DR及び CD86の変化を示す図 である。

[図 3]HBワクチンパルスによる、榭状細胞の T細胞幼若ィ匕補助能の変化を示す図で ある。

[図 4]HBsメモリー Τ細胞を用いた、 HBワクチンパルス榭状細胞が HBsメモリー T細 胞の増殖能に及ぼす効果を示す図である。

[図 5]HBsメモリー T細胞を用いた、 HBワクチンパルス榭状細胞が抗 HBs抗体産生 能に及ぼす効果を示す図である。

[図 6]血液生化学的検査による、 HBワクチンパルス榭状細胞の安全性テストの検査 項目を示す。

[図 7]ALT検査の結果を示すグラフである。

[図 8]CRP検査の結果を示すグラフである。

[図 9]PT検査の結果を示すグラフである。

[図 10]Creatinine検査の結果を示すグラフである。

[図 11]血清生化学的検査を用いた自己免疫反応に関する安全性テストの結果を示 す。

[図 12]HBワクチンパルス榭状細胞投与による、抗 HBs抗体値の変化を示すグラフで ある。

[図 13]HBワクチンパルス榭状細胞投与による、抗 HBs抗体値の変化を示す。

[図 14]HBワクチンパルス榭状細胞投与による、 HBワクチン non— responderの抗 H

Bs抗体値の推移を示すグラフである。

発明を実施するための最良の形態

[0071] 以下、本発明の最良の実施の形態を説明する。本発明は、以下の実施形態に限 定されず、本発明の要旨を超えない範囲で種々の変更が可能である。

[0072] 1、 HBs抗原提示能を有する榭状細胞

本実施の形態に係る HBs抗原提示能を有する榭状細胞は、榭状細胞を HBs抗原 でノルスする工程を含む方法によって得られる。本実施の形態に係る HBs抗原提示 能を有する榭状細胞によれば、 B型肝炎の予防、又は、治療に有効な、 HBs抗原提 示能を有する榭状細胞を提供することができる。 [0073] 本実施の形態にぉ 、て、「榭状細胞を抗原でパルスする」とは、榭状細胞を、抗原 を取り込んで前記榭状細胞内で分解し、前記分解した抗原をペプチドとして提示しう る状態にすることを言う。

[0074] 本実施の形態にぉ ヽて、榭状細胞を抗原でパルスする具体的な方法としては、例 えば、適切なサイト力イン等の存在下に、抗原と榭状細胞とを共存させて培養する方 法が挙げられる。

[0075] 榭状細胞を得る方法は、最終的に、抗原を取り込みこの抗原を提示しうる榭状細胞 が得られれば特に限定されず、種々の手法を用いることができる。

[0076] 例えば、血液力 榭状細胞を得ることができる。具体的には、例えば、当業者に公 知の方法を利用して、榭状細胞の前駆細胞を含む血液から榭状細胞を分化誘導す る方法、又は、血液力 榭状細胞を直接分離する方法を用いることができる。より具 体的には、例えば、骨髄細胞、臍帯血又は末梢血の CD34陽性前駆細胞から主に GM - CSFと TNF - αを用いて誘導する方法、臍帯血単核球又は末梢血単核球か ら主に GM— CSFと IL 4を用いて誘導する方法、末梢血単核球から主に GM— CSF と IFN— αを用いて誘導する方法、末梢血単核球より直接分離する方法等によって、 榭状細胞を得ることができる。

[0077] また、これらの榭状細胞を得る方法は、必要に応じてさらに、生物から血液を採取 する工程を含むこともできる。前記生物は、 Β型肝炎に感染する可能性の有無によつ て特に限定されるものではないが、例えば、 Β型肝炎に感染しうる生物であることがで きる。前記 Β型肝炎に感染しうる生物には、 Β型肝炎に自然に感染しうる生物や、 Β型 肝炎を人工的に感染させることができる生物を含むことができる。具体的には、前記 Β型肝炎に自然に感染しうる生物としては、例えば、ヒト、チンパンジー等の霊長類や 、ウッドチャック、ペキンダック等のァヒル等、前記 Β型肝炎を人工的に感染させること ができる生物としては、例えば、リス、ラット、カモ、ガチョウ、サギ、ツル、マウス等を挙 げることができる。特に、 Β型肝炎による死亡者が世界で増加している点からも、本発 明を、前記生物がヒトである場合に使用できる効果は大きい。

[0078] また、血液を利用せずに榭状細胞を得る方法としては、例えば、 ES細胞を分化誘 導して榭状細胞を得る方法があげられる。具体的には、例えば、胚盤胞の内部に存 在する内部細胞塊力 樹立された ES細胞を、適切なフィーダ一細胞やサイト力インと ともに培養することによって、榭状細胞に分ィ匕誘導することができる。

[0079] 本実施の形態にぉ 、て、榭状細胞を培養する培地につ!、ては、榭状細胞の前駆 細胞から榭状細胞への分化誘導、榭状細胞の生存、抗原による榭状細胞のパルス 等を阻害しない限り特に限定されないが、例えば、 RPMI 1640培地等を用いること ができる。また、好ましくは RPMI 1640培地である。

[0080] 本実施の形態において、榭状細胞の誘導には、サイト力インを使用することができ る。榭状細胞の誘導に用いるサイト力インとしては、榭状細胞への分化誘導、榭状細 胞の生存、抗原による榭状細胞のパルス等を阻害しない限り特に限定されないが、 例えば、 GM—CSF、 TNF— α、 IL 4、 IFN— α等を用いることができる。

[0081] 本実施の形態において、 HBs抗原の態様は、最終的に、榭状細胞によって提示さ れることが可能ならば特に限定されず、完全なタンパク質の抗原でも、ペプチド抗原 でもよい。

[0082] また、本実施の形態に係る HBs抗原は、例えば、様々な物質や液体と組み合わせ た態様で用いることができる。具体的には、例えば、 HBs抗原をリボソーム等のリン脂 質二重膜を用いて榭状細胞内に導入することや、 HBs抗原を緩衝液、例えば PBS や、培地、例えば RPMI 1640培地に懸濁して榭状細胞に導入することができる。

[0083] また、 HBs抗原の添カ卩時期は、結果として、 HBs抗原が榭状細胞によって提示され ることが可能ならば特に限定されず、例えば、榭状細胞を分化誘導した後に添加す ることができる。また、分ィ匕誘導時に HBs抗原を添加して、一緒に培養することもでき る。また、 HBs抗原のノ ルス時間も、結果として、 HBs抗原が榭状細胞によって提示 されることが可能ならば特に限定されず、例えば、 8時間から 24時間とすることができ る。

[0084] また、 HBs抗原は、 HBワクチンに含まれる HBs抗原であることができる。

[0085] ワクチンには、例えば、生ワクチン、不活ィ匕ワクチン、トキソイド等、 、くつかの種類 が存在する。生ワクチンは、例えば、病原性を弱めたウィルスや細菌を生きたまま接 種するワクチンを言う。不活ィ匕ワクチンは、例えば、ウィルスの粒子や細菌の菌体等を 精製し、加熱やホルマリン等の薬剤を用いて処理して、病原性を消失又は無毒化し て作られるワクチンを言う。トキソイドは、例えば、菌の毒素のみを取り出して精製し、 ホルマリンを加えて免疫原性を失わせずに無毒化したものを言う。

[0086] 本実施の形態における HBワクチンは、 HBs抗原が含まれていればその種類が限 定されるものではないが、現在日本において、ヒトに使用が許可され販売されている HBワクチンは、不活ィ匕ワクチンに分類される。本実施の形態において、不活化ワク チンである HBワクチンを用いる場合は、例えば、組換え沈降 B型肝炎ワクチンや、沈 降 B型肝炎ワクチンを用いることができる。

[0087] 組換え沈降 B型肝炎ワクチンとしては、例えば、 B型肝炎ウィルス DNAの HBs抗原 に相当する部分を、酵母菌や動物細胞等の DNAに挿入し発現させることで、ヮクチ ンの有効成分である HBs抗原を作り、免疫増進剤のアルミニウムゲルを加えて調整 したワクチンを用いることができる。動物細胞として、例えば、 CHO細胞を用いて調 整したワクチンを用いることができる。

[0088] 沈降 B型肝炎ワクチンとしては、例えば、動物細胞等により生産された HBs抗原を 精製した後、アルミニウムゲルをカ卩えて調整したワクチンを用いることができる。動物 細胞として、例えば、 huGK— 14細胞を用いて調整したワクチンを用いることができる

[0089] 2、 HBs抗原提示能を有する榭状細胞の製造方法

本実施の形態に係る HBs抗原提示能を有する榭状細胞の製造方法は、榭状細胞 を HBs抗原でパルスする工程を含む。これによれば、 B型肝炎の予防、又は、治療に 有効な、 HBs抗原提示能を有する榭状細胞を得ることができる。

[0090] 前記製造方法はさらに、血液力 前記榭状細胞を得る工程を含むことができる。こ れによれば、血液由来の榭状細胞から、本発明に係る HBs抗原提示能を有する榭 状細胞を得ることが可能である。また、血液を用いれば、従来公知の方法等を用いて 、比較的簡便な操作によって榭状細胞を得ることが可能である。

[0091] また、前記製造方法はさらに、生物から前記血液を採取する工程を含むことができ る。

[0092] 前記生物は、ヒトとすることができる。これによれば、ヒトの B型肝炎の予防、又は、治 療に有効な、 HBs抗原提示能を有する榭状細胞を得ることが可能である。 [0093] また、前記 HBs抗原は、 HBワクチンに含まれる HBs抗原であることができる。これ によれば、生物、例えば健常者を含むヒトに、安全かつ有効に用いることができる、 B 型肝炎の予防、又は、治療に有効な、 HBs抗原提示能を有する榭状細胞を提供す ることがでさる。

[0094] 3、 HBs抗原提示能を有する榭状細胞を含む組成物

本実施の形態に係る組成物は、本実施の形態に係る HBs抗原提示能を有する榭 状細胞を含むことができる。

[0095] また、本実施の形態に係る組成物はさらに、 HBワクチン添加物を含むことができる

[0096] 本実施の形態において、「本実施の形態に係る組成物はさらに、 HBワクチン添カロ 物を含む」とは、 HBワクチン添加物力 本実施の形態に係る組成物全体中のどこか に含まれている状態を言うとする。すなわち、 HBワクチン添加物が含まれる場所は、 本実施の形態に係る組成物中の榭状細胞の外、中、細胞膜上等どこでもよぐ特に 限定されない。本実施の形態に係る組成物がワクチン添加物を含むことにより、 HBs 抗原として、 HBワクチンに含まれる HBs抗原を用いて本実施の形態に係る HBs抗 原提示能を有する榭状細胞を得たことが、判定可能となる。

[0097] HBワクチン添加物としては、例えば、保存剤、抗生物質、安定剤、防腐剤、免疫増 進薬、緩衝剤、等張化剤等を挙げることができる。具体例としては、チメロサール、硫 酸アルミニウムカリウム、水酸化ナトリウム、塩ィ匕アルミニウム、酢酸、酢酸ナトリウム、 塩ィ匕ナトリウム等を挙げることができる。なお、 HBワクチン添加物はこれらに限定され ない。

[0098] HBワクチン添加物の検出方法としては、例えば、公知の分析方法を用いることが できる。具体的には、例えば、各種クロマトグラフを用いた分離分析、定量分析や、赤 外線分光分析、核磁気共鳴分析、質量分析、元素分析などによる構造分析等を挙 げることができる。

[0099] 本実施の形態に係る組成物は、実験試薬、又は、実験キットであることができる。こ れによって、本実施の形態に係る HBs抗原提示能を有する榭状細胞を、様々な研究 に適した態様で用いることができる。用いうる研究分野としては、例えば、免疫応答、 免疫寛容、サイト力イン産生に関するシグナル伝達メカニズムについての研究や、榭 状細胞を用いた免疫療法についての研究が挙げられる。また、例えば、 B型肝炎の 予防、又は、治療に関わる研究、例えば、遺伝子、 RNA、ペプチド、タンパク質、化 合物、医薬、サイト力イン等のスクリーニング等の目的にも用いることができる。

[0100] また、本実施の形態に係る組成物は、医薬組成物であることができる。本実施の形 態に係る医薬組成物は、例えば、生体内に直接投与する態様や、生体外で他の物 質や細胞と混合する態様で用いることができる。

[0101] また、本実施の形態に係る組成物は、免疫応答活性ィ匕製剤であることができる。本 実施の形態に係る免疫応答活性ィ匕製剤は、例えば、生体内に直接投与する態様や 、生体外で他の物質や細胞と混合する態様で用いることができる。

[0102] 本実施の形態に係る組成物を生体外で用いる態様としては、例えば、本実施の形 態に係る免疫応答活性化製剤と T細胞を混合して、 HBs抗原ェピトープを T細胞に 提示することによって T細胞を活性化する使用方法が挙げられる。また、この T細胞 は生体内に投与して用いることが可能である。

[0103] また、本実施の形態に係る組成物を生体内に直接投与する態様としては、例えば、 細胞ワクチンとしての注射や点滴が挙げられる。細胞ワクチンとしては、好ましくは、 B 型肝炎の予防、又は、治療ワクチンである。また、本実施の形態に係る組成物を生体 内に直接投与する場所としては、例えば、静脈内投与、動脈内投与、胸腔内投与、 腹腔内投与、皮下投与、筋肉中投与、組織内 (例えば肝臓内)投与、リンパ節投与 等が挙げられる。投与の簡潔さの点から、皮下注射が好ましい。

[0104] 4、 HBs抗原提示能を有する榭状細胞を用いた、 B型肝炎の予防、又は、治療 本実施の形態に係る HBs抗原提示能を有する榭状細胞は、例えば、 B型肝炎の予 防、又は、治療に用いることができる。

[0105] HBs抗原提示能を有する榭状細胞を用いた B型肝炎の予防、又は、治療は、例え ば、従来の B型肝炎の予防、又は、治療方法と組み合わせて用いることができる。

[0106] また、本実施の形態に係る HBs抗原提示能を有する榭状細胞を用いた B型肝炎の 予防、又は、治療は、 HBs抗原提示能を有する榭状細胞を、生物に投与する工程を 含むことができる。前記生物としては、例えば、前述のような B型肝炎に感染しうる生 物を挙げることができる。また、拒絶反応を抑えることができれば、榭状細胞が由来と する生物と、投与対象となる生物が、同種生物でも異種生物でもよい。同種生物の場 合においては、本実施の形態に係る榭状細胞を、取り出した自己の体内に投与する ことも、組織適合性抗原が投与可能な程度に一致している非自己の体内に投与する ことも可能である。

[0107] 例えば、前記生物は、ヒトであることができる。この場合、 HLAの型が可能な限り一 致していることが望ましい。従って、榭状細胞の由来は、好ましくは、血縁にあたる提 供者に由来する榭状細胞である。自家細胞を用いれば HLAの型の適合性を考慮す る必要がないため、より好ましくは、投与対象の本人に由来する榭状細胞である。

[0108] 本実施の形態に係る HBs抗原提示能を有する榭状細胞は、前述のように、生体内 に直接投与する態様で用いることや、生体外で T細胞と混合して T細胞を活性化し、 この T細胞は生体内に投与する態様で用いることが可能である。しかし、 T細胞はェ フエクタ一細胞であるため、一度機能を果たすと短時間で死に、消失してしまう。従つ て、 B形肝炎を予防、治療するためには、 T細胞を高頻度で繰り返し投与する必要が ある。それに対し、榭状細胞は、ナイーブ T細胞や HBsメモリー T細胞、 B細胞にも作 用し、繰り返し刺激を与えるため、長時間でかつ強力な効果をもたらす。以上のこと から、本実施の形態に係る HBs抗原提示能を有する榭状細胞を、生体内に直接投 与する態様で用いる方がより好まし 、と考えられる。

[0109] 5、本実施の形態に係る HBs抗原提示能を有する榭状細胞の使用例及びその効 果

以下に、本実施の形態に係る HBs抗原提示能を有する榭状細胞の使用例及びそ の効果について示す。本使用例では、本実施の形態に係る HBs抗原提示能を有す る榭状細胞を、ヒトに投与する工程を含むことができる。本使用例は、 B型肝炎の予 防、又は、治療に適用することができる。なお、本使用例は、以下の場合に限定され ず、本使用例に係る榭状細胞の使用態様は、本発明の要旨を超えない範囲で種々 の変更が可能である。

[0110] 5— 1、 B型肝炎の予防への適用

健常者のうちの約 10%は、 HBワクチンに対して非奏功である人（non— responder )であり、 HBワクチンを投与しても抗 HBs抗体を産生することができないことが知られ ている。 B型肝炎は血液を介して感染するため、医療従事者等は、特に抗 HBs抗体 の必要性が高いと考えられるが、これらの人々においても HBワクチン non— respond erが少なくない。

[0111] そこで、これらの HBワクチン non— responderに、本実施の形態に係る HBs抗原提 示能を有する榭状細胞を投与することによって、これらの人々が抗 HBs抗体を産生 することが可能になる。 B型肝炎の感染を予防するには、抗 HBs抗体値を少なくとも 1 OmIUZmlに維持することが必要であると言われている。後述の実験例 11の結果に よれば、本実施の形態に係る HBs抗原提示能を有する榭状細胞を 1回投与したこと によって、 HBワクチン non— responderの抗 HBs抗体値が平均 30mIUZmlまで上 昇し、 lOmlUZml以上の値をおよそ 3— 6ヶ月間維持できることがわかった。従って 、本実施の形態に係る HBs抗原提示能を有する榭状細胞によって、現在の HBワク チン non— responderが抗 HBs抗体を産生できるようになり、 B型肝炎に感染するの を予防することができる。

[0112] また、現在、 B型肝炎の予防に用いられている HBワクチンは、一定期間ごとに通常 3回の接種を行う必要がある。後述の実験例 11の結果によれば、本実施の形態に係 る HBs抗原提示能を有する榭状細胞を 1回投与することによって、 HBワクチン non— responderのみならず、 HBワクチンが奏功する健常者（responder)の抗 HBs抗体 値も高めることが可能であることがわ力 た。従って、本実施の形態に係る HBs抗原 提示能を有する榭状細胞は、 HBワクチン non— responderのみならず、 HBワクチン responderに対しても、新たな B型肝炎の予防手段として用いることができ、接種回 数と経済的負担を減らすことができる可能性がある。

[0113] また、 HIV患者、肝疾患患者、透析患者、肥満者、喫煙者等の免疫能が低下して いる人にも、従来の HBワクチンが十分に効果を発揮できないことが知られている。こ のような人々も、本実施の形態に係る HBs抗原提示能を有する榭状細胞を用いるこ とによって、抗 HBs抗体を産生することが可能になると考えられる。

[0114] 5— 2、 B型肝炎の治療への適用

B型肝炎の治療には、これまで主に抗ウィルス剤が用いられてきた。しかし、抗ウイ ルス剤を長期間投与することにより、抗ウィルス剤が効力ゝない変異ウィルスが高頻度 で出現することが知られている。その結果、 B型肝炎ウィルス量が再上昇し、肝炎の 憎悪をまねく危険性があった。

[0115] そこで、本実施の形態に係る HBs抗原提示能を有する榭状細胞を用いれば、この ような変異ウィルスの出現頻度を下げることができると予想され、これは B型肝炎治療 にお 、て大きな利点であると考えられる。

[0116] また、肝移植対象者等の免疫抑制剤投与中の人も、免疫抑制状態であるために通 常の HBワクチンが効かず、抗 HBs抗体を産生できない。しかし、 B型肝炎関連肝移 植にぉ ヽては、抗 HBs抗体値を維持することが治療成績に大きな好影響を及ぼすこ とが知られているため、患者は移植後、抗 HBsヒト免疫グロブリンを 2週間に 1回の頻 度で投与することが必要である。このことは患者に、年間約 250万円の負担をもたら しており、この経済的問題の解決が世界的に必要とされている。

[0117] そこで、本実施の形態に係る HBs抗原提示能を有する榭状細胞を患者に投与する ことにより、患者は、抗 HBs抗体を産生できるようになると考えられる。さらに、後述の 実験例 11の結果より、本実施の形態に係る HBs抗原提示能を有する榭状細胞を、 例えば 3— 6ヶ月に 1回の頻度で投与することで、 lOmlUZml以上の抗 HBs抗体値 を維持できると予想される。このことから、本実施の形態に係る HBs抗原提示能を有 する榭状細胞を用いれば、抗 HBsヒト免疫グロブリンを用いるよりも投与頻度を大幅 に減らすことが可能であり、その結果、患者の経済的負担を大幅に軽減できると考え られる。

[0118] また、従来力 存在する HBワクチンは、 B型肝炎の予防ワクチンであり、 B型肝炎 の治療ワクチンは、あくまでも試験的にしか使用されていな力つた。

[0119] それに対して、前述のように、本実施の形態に従って HBワクチンを用いて製造した HBs抗原提示能を有する榭状細胞は、従来から存在する HBワクチンを、 B型肝炎の 予防のみならず、治療にも用いることを可能にした。このことは、現在実際に使用され ており、安全性、有効性が認められている HBワクチンの使用用途を広げるものであり 、さらに、従来力 存在する HBワクチンの効果を高める新たな使用態様を見出したも のと言える。 [0120] 以上から、本実施の形態に係る HBs抗原提示能を有する榭状細胞には、広い使用 用途と大きな利点が認められる。

[0121] 6、ワクチンパルス榭状細胞

本実施の形態に係るワクチンパルス榭状細胞は、榭状細胞をワクチンでパルスする 工程を含む方法によって得られる。これによれば、疾患の予防、又は、治療に有効な 、ワクチンノ ルス榭状細胞を提供することができる。

[0122] 前記方法はさらに、血液力も榭状細胞を得る工程を含むことができる。

[0123] また、前記方法はさらに、生物から前記血液を採取する工程を含むことができる。

前記生物は、ヒトとすることができる。

[0124] また、ワクチンの添加時期は、結果として、ワクチンに含まれる抗原が榭状細胞によ つて提示されることが可能ならば特に限定されず、例えば、榭状細胞を分化誘導した 後に添加することができる。また、分ィ匕誘導時にワクチンを添加して、一緒に培養す ることもできる。また、ワクチンによるパルス時間も、結果として、ワクチンに含まれる抗 原が榭状細胞によって提示されることが可能ならば特に限定されず、例えば、 8時間 力も 24時間とすることができる。

[0125] ワクチンとしては、結果として、前記ワクチンに含まれる抗原が榭状細胞によって提 示されることが可能であれば特に限定されず、例えば、生ワクチン、不活ィ匕ワクチン、 トキソイド、抗毒素等を用いることができる。また、ワクチンの形態も、結果として、前記 ワクチンに含まれる抗原が榭状細胞によって提示されることが可能であれば特に限 定されず、例えば、液状ワクチン、沈降型ワクチン、凍結乾燥ワクチン等を用いること ができる。

[0126] 本実施の形態に用いうるワクチンの例として、百日せきワクチン、ジフテリアトキソィ ド、破傷風トキソイド、ポリオワクチン、麻疹ワクチン、風疹ワクチン、 日本脳炎ワクチン 、インフルエンザワクチン、 BCGワクチン等の結核ワクチン、おたふくかぜワクチン、 水痘ワクチン、 A型肝炎ワクチン、 B型肝炎ワクチン、肺炎球菌ワクチン、黄熱ヮクチ ン、狂犬病ワクチン、コレラワクチン、ワイル病秋やみ混合ワクチン、はぶ抗毒素、ま むし抗毒素、ペストワクチン、 MMRワクチン、月昜チフスワクチン、インフノレェンザ b菌 結合型ワクチン、髄膜炎菌ワクチン、赤痢ワクチン、マラリアワクチン等が挙げられる。 なお、本実施の形態に用いうるワクチンは、ここに例示したものに限定されない。

[0127] 前記ワクチンは、疾患の予防、又は、治療ワクチンであることができる。例えば、前 記ワクチンは、肝炎ワクチンであることができる。前記肝炎ワクチンは、例えば、 HBs 抗原を含む HBワクチンであることができる。

[0128] 7、ワクチンパルス榭状細胞の製造方法

本実施の形態に係るワクチンパルス榭状細胞の製造方法は、榭状細胞をワクチン でノルスする工程を含む。これによれば、疾患の予防、又は、治療に有効な、ヮクチ ンノ ルス榭状細胞を得ることができる。

[0129] 前記製造方法はさらに、血液力 前記榭状細胞を得る工程を含むことができる。こ れによれば、血液由来の榭状細胞から、本発明に係るワクチンパルス榭状細胞を得 ることが可能である。また、血液を用いれば、従来公知の方法等を用いて、比較的簡 便な操作によって榭状細胞を得ることが可能である。

[0130] また、前記製造方法はさらに、生物から前記血液を採取する工程を含むことができ る。

[0131] 前記生物は、ヒトとすることができる。これによれば、ヒト疾患の予防、又は、治療に 有効な、ワクチンパルス榭状細胞を得ることが可能である。

[0132] また、前記ワクチンは、疾患の予防、又は、治療ワクチンであることができる。これに よれば、前記疾患の予防、又は、治療に有効な、ワクチンパルス榭状細胞を提供す ることがでさる。

[0133] 前記ワクチンは、肝炎ワクチンであることができる。これによれば、生物、例えば健常 者を含むヒトに、安全かつ有効に用いることができる、肝炎の予防、又は、治療に有 効な、肝炎ウィルス抗原提示能を有する肝炎ワクチンパルス榭状細胞を提供すること ができる。

[0134] 前記肝炎ワクチンは、例えば、 HBs抗原を含む HBワクチンであることができる。こ れによれば、生物、例えば健常者を含むヒトに、安全かつ有効に用いることができる、 B型肝炎の予防、又は、治療に有効な、 HBs抗原提示能を有する肝炎ワクチンパル ス榭状細胞を提供することができる。

[0135] 8、ワクチンパルス榭状細胞を含む組成物 本実施の形態に係る組成物は、本実施の形態に係るワクチンパルス榭状細胞を含 むことができる。

[0136] また、本実施の形態に係る組成物はさらに、ワクチン添加物を含むことができる。

[0137] 本実施の形態において、「本実施の形態に係る組成物はさらに、ワクチン添加物を 含む」とは、ワクチン添加物力 本実施の形態に係る組成物全体中のどこかに含まれ ている状態を言うとする。すなわち、ワクチン添加物が含まれる場所は、本実施の形 態に係る組成物中の榭状細胞の外、中、細胞膜上等どこでもよぐ特に限定されない 。本実施の形態に係る組成物がワクチン添加物を含むことにより、抗原として、ヮクチ ンに含まれる抗原を用いて、本実施の形態に係るワクチンパルス榭状細胞を得たこと 力 判定可能となる。

[0138] ワクチン添加物としては、例えば、保存剤、抗生物質、安定剤、防腐剤、免疫増進 薬、緩衝剤、等張化剤、着色剤等を挙げることができる。具体例としては、保存剤とし てチメロサール、ホルマリン等、抗生物質としてエリスロマイシン、ラタトビオン酸エリス ロマイシン、硫酸カナマイシン等、及び、他の添加物が挙げられる。他の添加物とし ては、例えば、精製白糖、 L グルタミン酸ナトリウム、ゼラチン、乳糖、グルタミン酸力 リウム、 D ソルビトール、ヒト血清アルブミン、ポリソルベート 80、グリシン、ブドウ糖、 水酸化ナトリウム、硫酸アルミニウムカリウム、塩ィ匕アルミニウム、酢酸、酢酸ナトリウム 、塩ィ匕ナトリウム、塩ィ匕カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素ナトリウム、塩化ナト リウム、フエノールレッド、 L一塩酸アルギニン、リン酸ニナトリウム、リン酸一カリウム、 L アルギニン酸、塩酸リジン等を挙げることができる。これらの他の添加物は、安定剤 、防腐剤、免疫増進薬、緩衝剤、等張化剤、着色剤として添加されることができる。な お、ワクチン添加物はこれらに限定されない。

[0139] 本実施の形態に係る組成物は、実験試薬、又は、実験キットであることができる。こ れによって、本実施の形態に係るワクチンパルス榭状細胞を、様々な研究に適した 態様で用いることができる。用いうる研究分野としては、例えば、その疾患に関するシ グナル伝達メカニズムにつ 、ての研究や、榭状細胞を用いた免疫療法にっ 、ての研 究が挙げられる。また、例えば、その疾患の予防、又は、治療に関わる研究、例えば 、遺伝子、 RNA、ペプチド、タンパク質、化合物、医薬、サイト力イン等のスクリーニン グ等の目的にも用いることができる。

[0140] また、本実施の形態に係る組成物は、医薬組成物であることができる。本実施の形 態に係る医薬組成物は、例えば、生体内に直接投与する態様や、生体外で他の物 質や細胞と混合する態様で用いることができる。

[0141] また、本実施の形態に係る組成物は、免疫応答活性ィ匕製剤であることができる。本 実施の形態に係る免疫応答活性ィ匕製剤は、例えば、生体内に直接投与する態様や 、生体外で他の物質や細胞と混合する態様で用いることができる。

[0142] 本実施の形態に係る組成物を生体外で用いる態様としては、例えば、本実施の形 態に係る免疫応答活性化製剤と T細胞を混合して、ワクチンに含まれて ヽた抗原ェ ピトープを T細胞に提示することによって T細胞を活性化する使用方法が挙げられる 。また、この T細胞は生体内に投与して用いることが可能である。

[0143] また、本実施の形態に係る組成物を生体内に直接投与する態様としては、例えば、 細胞ワクチンとしての注射や点滴が挙げられる。細胞ワクチンとしては、好ましくは、 疾患の予防、又は、治療ワクチンである。また、本実施の形態に係る組成物を生体内 に直接投与する場所としては、例えば、静脈内投与、動脈内投与、胸腔内投与、腹 腔内投与、皮下投与、筋肉中投与、組織内 (例えば肝臓等)投与、リンパ節投与等が 挙げられる。投与の簡潔さの点から、皮下注射が好ましい。

[0144] 9、ワクチンパルス榭状細胞を用いた、疾患の予防、又は、治療

本実施の形態に係るワクチンパルス榭状細胞は、疾患の予防、又は、治療に用い ることがでさる。

[0145] 本実施の形態に係るワクチンパルス榭状細胞は、例えば、従来のその疾患の予防 、又は、治療方法と組み合わせて用いることができる。

[0146] また、本実施の形態に係る疾患の予防、又は、治療は、ワクチンパルス榭状細胞を 、生物に投与する工程を含むことができる。前記生物としては、例えば、前記疾患に 感染しうる生物を挙げることができる。また、拒絶反応を抑えることができれば、榭状 細胞が由来とする生物と、投与対象となる生物が、同種生物でも異種生物でもよい。 同種生物の場合においては、本実施の形態に係る榭状細胞を、取り出した自己の体 内に投与することも、組織適合性抗原が投与可能な程度に一致している非自己の体 内に投与することも可能である。

[0147] 例えば、前記生物は、ヒトであることができる。この場合、 HLAの型が可能な限り一 致していることが望ましい。従って、榭状細胞の由来は、好ましくは、血縁にあたる提 供者に由来する榭状細胞である。自家細胞を用いれば HLAの型の適合性を考慮す る必要がないため、より好ましくは、投与対象の本人に由来する榭状細胞である。

[0148] 本実施の形態に係るワクチンパルス榭状細胞は、前述のように、生体内に直接投 与する態様で用いることや、生体外で T細胞と混合して T細胞を活性ィ匕し、この T細 胞を生体内に投与する態様で用いることが可能である。しかし、 T細胞はエフェクター 細胞であるため、一度機能を果たすと短時間で死に、消失してしまう。従って、疾患 を予防、治療するためには、 T細胞を高頻度で繰り返し投与する必要がある。それに 対し、榭状細胞は、ナイーブ T細胞やメモリー T細胞、 B細胞にも作用し、繰り返し刺 激を与えるため、長時間でかつ強力な効果をもたらす。以上のことから、本実施の形 態に係るワクチンパルス榭状細胞を、生体内に直接投与する態様で用いる方がより 好ましいと考えられる。

[0149] 10、本実施の形態に係るワクチンパルス榭状細胞の使用例及びその効果

以下に、本実施の形態に係るワクチンノ ルス榭状細胞の使用例及びその効果を示 す。本使用例では、本実施の形態に係るワクチンパルス榭状細胞を、ヒトに投与する 工程を含むことができる。本使用例は、疾患の予防、又は、治療に適用することがで きる。なお、本使用例は、以下の場合に限定されず、本使用例に係る榭状細胞の使 用態様は、本発明の要旨を超えない範囲で種々の変更が可能である。

[0150] これまで、癌治療等で行われてきた榭状細胞ワクチン療法にお!ヽては、榭状細胞 を、癌細胞力も抽出した物質を用いてパルスしている。背景技術の項で前述したよう に、細胞力も抽出した物質は、一般に、多種類の物質の混合物である。従って、細胞 抽出物質を用 、てパルスした榭状細胞は、細胞抽出物質中の多種類の抗原によつ てノルスされたと考えられる。そのように処理した榭状細胞は、特定できない抗原や、 疾患に関連のな!ヽ抗原を提示して!/ヽる榭状細胞を含む、抗原提示能を有する多種 類の榭状細胞の集団であると考えられる。このようにして作製された榭状細胞ワクチ ンは、癌治療等の分野において、すでに疾患に力かった患者の治療に使用すること は許されている力 健常者に投与することは許されない。従って、疾患の予防のため に、健常者に対する榭状細胞ワクチンとして用いることは不可能である。

[0151] これに対して、本実施の形態におけるワクチンパルス榭状細胞は、ワクチンを用い て榭状細胞をパルスすることによって作製することができる。ワクチンとして実際に販 売されるものは、健常者を含むヒトに安全性、有効性が認められ、認可を受けたもの である。従って、本実施の形態による、ワクチンでパルスした榭状細胞は、疾患の治 療のための榭状細胞ワクチンとして、患者に使用できるだけでなぐ疾患の予防のた めの榭状細胞ワクチンとして、健常者にも使用することができる。

[0152] また、例えば結核について、 日本では戦後順調に患者数が減少してきたものの、 1 980年頃より減少率が鈍化し、 1997年から 3年連続で患者数が増加した。また、結 核の治療には、抗結核剤の長期投与が不可欠だが、それによつて薬剤耐性菌が生 じる可能性が非常に高ぐそれを防ぐために 2種類以上の多剤併用が鉄則であった。

[0153] そこで、本実施の形態に係るワクチンパルス榭状細胞を、結核の治療に用いること ができる。ここで本実施の形態に係るワクチンパルス榭状細胞として、 BCGワクチン 等の結核ワクチンでパルスする工程を含む方法によって得られたワクチンノ ルス榭 状細胞を用いることができる。これによれば、前述のような薬剤耐性菌の出現頻度を 下げることができると予想され、これは結核の治療において大きな利点であると考えら れる。また、他の疾患についても、治療にワクチンパルス榭状細胞を用いることによつ て同様の効果が期待できる可能性があり、その疾患の治療に大きな利点となることが 予想される。

[0154] また、榭状細胞に抗原提示させる別の手法として、抗原をコードする遺伝子を、ブラ スミドベクター等に組み込んでトランスフエクシヨンすることによって、又は、ウィルスべ クタ一等に組み込んで感染させることによって、榭状細胞内で目的抗原を発現させる 方法が知られている。しかし今日では、このように遺伝子操作を施した榭状細胞を、 疾患に力かった患者の治療に使用することが許される場合はあっても、健常者に対 する疾患の予防のために用いることは許されて ヽな 、。

[0155] これに対して、本実施の形態におけるワクチンパルス榭状細胞は、前述のように、 患者に対する疾患の治療ワクチンとして使用できるだけでなぐ健常者に対する疾患 の予防ワクチンとして使用が可能である。

[0156] また、ワクチンが有効でない患者の原因の一つに、榭状細胞の機能低下が考えら れる。すなわち、これまでのような生体へのワクチンの投与のみでは、十分に榭状細 胞の活性ィ匕ができな!/、状態が考えられる。

[0157] そこで、本実施の形態に係るワクチンパルス榭状細胞を、例えば、生体内に直接投 与する態様や、生体外で T細胞と混合して T細胞を活性化しこの T細胞を生体内に 投与する態様で用いることによって、これまでワクチンが効かず抗体を産生できなか つた健常者に対しても、 目的抗原に対する抗体を産生させることが可能となる。

[0158] 以上から、本実施の形態に係るワクチンパルス榭状細胞には、広い使用用途と大き な利点が認められる。また、本実施の形態に係るワクチンパルス榭状細胞を用いた疾 患の予防、又は、治療は、従来の榭状細胞ワクチン療法とは全く区別されると考えら れる。

[0159] なお、この発明を実施するための最良の形態の項において、 6、一 10、における、 パルスの定義、パルスの具体的な方法、榭状細胞を得る方法、榭状細胞培養のため の培地やサイト力イン、ワクチン添加物の検出方法等は、特に記載しない限り、同項 の 1、一 5、に記したものと同様の解釈、方法、物質を用いることができるものとする。 実施例 1

[0160] 以下、本発明を実験例に基づき具体的に説明するが、本発明は本実施例に限定さ れるものではない。

[0161] (実験例 1) 榭状細胞の調製

(1)へパリン (ノボ ·へパリン注 1000：アベンテイス社製)で内腔をぬらした注射器 ( テルモシリンジ SS—50ESZ :テルモ社製）を用いて、被験者（すでに HBワクチンの 投与を繰り返し受けた経験がある健常人ボランティア 5人を対象とした。 ) 1人あたり 40 一 60mlの採血を行った。得られた血液と、血液と同量の phosphate— buffered sali ne (PBS)を、専用クリーンベンチ内で十分に混合した。次に、 Ficoll— Conray液 (比 重 1. 077)を用いた比重遠心法により、単核細胞を分離した。遠心は、室温、 1800r pm— 3000rpmで 30分間行 、、遠心後の中間層を単核細胞として取り出した。

[0162] (2)同時に、以下の手順に従って、それぞれの被験者から自己血清を得た。まず、 へパリンを使用して ヽな 、別の注射器 (テノレモシリンジ SS— 10ESZ：テルモネ土製） を用いて、被験者 1人あたり約 10mlの採血を行った。次に、得られた血液を滅菌済 みバキュティナ採血管（ベタトン'ディッキンソン社製）を用いて 3000rpmで遠心し、 血清を分離した。

[0163] (3) (1)で得られた単核細胞に PBSをカ卩え、十分に混合した。次に、このサンプル を 4°C、 1800rpm— 2700rpmで 10分間遠心し、（1)と同様の手順で、単核細胞を 再度回収した。この操作を最低 2回繰り返すことによって、単核細胞を十分に洗浄し た。

[0164] (4) (3)によって得られた単核細胞をカウントし、 2 X 10⁶— 2 X 10⁷/mlの細胞密度 で、 35mm dishに 2mlずつ加えた。培地は、（2)で得られた被験者それぞれの自 己血清を 1一 5%の濃度でカ卩えた RPMI 1640培地 (二プロ社製)を用いた。培養は 、専用培養室にて、 37°C、 5%CO濃度、 75%の airの条件で行った。

2

[0165] (5) (4)の単核細胞を 90分間培養後、以下の手順に従って、付着細胞を分離した 。まず、 dishを培養室から取り出し、クリーンベンチ内で 5分間静置した。その後、 dis hを斜めに傾け、培養液を付着細胞全体にゆっくりとかけて洗浄を行い、リンパ球を 取り除いた。

[0166] (6) (5)で得られた付着細胞（単球）を、 1枚の dishにっき、 GM-CSF (ぺプロテツ ク EC社製）を 800UZml、 IL 4 (ぺプロテック EC社製）を 500UZml、自己血清を 1 一 5%加えた RPMI 1640培地 2mlで 4日間培養した。

[0167] (7)培養 4日目に、培養上清の lmlを捨て、新たに（6)に記載した組成の培地を 1 mlカロえ、さらに 4日間培養した。

[0168] (8)培養 8日目に、 dish力も榭状細胞を回収し、榭状細胞数を測定した。

[0169] (実験例 2) HBワクチンによる榭状細胞のパルス

(1)実験例 1で得られた榭状細胞を 2つに分けた。一方の榭状細胞に、 HBワクチン (r HBワクチン「ミツビシ」：三菱ゥエルファーマ社製)を最終濃度 2. 5— 5 μ gZmlに なるように添加して 8— 24時間培養し、 HBs抗原でパルスした榭状細胞を作製した。 (以下、この細胞を「HBワクチンパルス榭状細胞」と記す。）培養は、専用培養室にて 、 37°C、 5%CO濃度、 75%の airの条件で行った。もう一方の榭状細胞は、 HBワク チンを添加せず、ネガティブコントロールとして培養した。

[0170] (2)培養後、 dishから HBワクチンパルス榭状細胞を回収した。回収した細胞と、 P BSを混合して、 4°C、 1500rpmで 5分間遠心後、上清を捨てた。この操作を 5回繰り 返すことによって、榭状細胞を十分に洗浄した。得られた榭状細胞を、 PBS500 1 に加えた。また、ネガティブコントロールの榭状細胞についても同様の操作を行った。

[0171] (実験例 3) HBワクチンパルス榭状細胞の投与

(1) HBワクチンパルス榭状細胞投与前の抗 HBs抗体を測定した。まず、被験者（ すでに HBワクチンの投与を繰り返し受けた経験がある健常人ボランティア） 5人から 採血を行い、実験例 1 (2)と同様の方法を用いて、それぞれの被験者力 血清を得 た。その血清を用いて、 CLIA法によって抗 HBs抗体値を測定した。結果を図 1に示 す。図 1に示すように、被験者 5人のうち、 2人が抗 HBs抗体を産生することができ (抗 HBs抗体陽性， responder)、 3人が抗 HBs抗体を産生できない（抗 HBs抗体陰性， non— responderこと力 Sわ力つた。

[0172] (2)被験者への HBワクチンパルス榭状細胞の投与を行った。まず、実験例 2で得 られた HBワクチンパルス榭状細胞 500 μ 1力ら 50 μ 1を用いて、それぞれの被験者に 各自の榭状細胞に対するブリックテストを行った。その結果、すべての被験者におい てブリックテストが陰性であった。次に、それぞれの被験者に、各自の ΗΒワクチンパ ルス榭状細胞を 450 1皮下投与した。なお、実験例 1から実験例 3に示した ΗΒワク チンパルス榭状細胞の作製、投与の過程において、作業者は滅菌ガウン、滅菌マス ク、滅菌キャップを着用して作業し、操作は可能な限りクリーンベンチ内で行った。使 用試薬は、滅菌済みの試薬を購入して使用し (PBS :インビトロジェン社製、 RPMI 1640 : -プロ社製、等)、使用に際して、肉眼及び顕微鏡で、試薬に混濁がないこと を確認した。また、培養上清中のエンドトキシン測定等を実施することによって、培養 過程での微生物による汚染がな 、ことを確認した。

[0173] (実験例 4) ΗΒワクチンパルス榭状細胞の表面抗原解析

フローサイトメトリーを用いて、細胞表面抗原の解析を行った。

[0174] (1)実験例 2で得られた、 ΗΒワクチンパルス榭状細胞、及び、ノ レスして 、な ヽ榭 状細胞を、 5°C、 1500rpmで 5分間遠心して回収した。回収した細胞を FCM PBS (pH 7. 22 :ギブコネ土製）で洗浄し、再び 5°C、 1500rpmで 5分間遠心して回収した

[0175] (2) (1)で得られたそれぞれの榭状細胞を 4本のスピッツ管に分け、（a) FITC標識 マウス IgG (Cat. No. 349041 :ベタトン'ディッキンソン社製）を 10 /z l、（b) PE標識 マウス IgG (Cat. No. 349043 :ベタトン'ディッキンソン社製）を 2 1、（c) FITC標識 マウス抗ヒト HLA— DRモノクローナル抗体（PM—32414X:ベタトン'ディッキンソン 社製）を 10 1、（d) PE標識抗ヒト CD86 (B70ZB7— 2) (Mat. No. 555658 :ファ 一ミンジヱン社製)を 10 1添加したサンプルを作製した。これらを氷中に 30分間置き 、 lysing solution (ベタトン'ディッキンソン社製）を 2mlカ卩えて混合し、 5°C、 2000r pmで 5分間遠心した。

[0176] (3)回収した榭状細胞を、 FCM PBS (pH 7. 22)を用いて十分に洗浄を繰り返 した後、 FACScalibur (ベタトン'ディッキンソン社製）を用いて、表面抗原の解析を 行った。

[0177] (4)解析の結果を図 2に示す。図 2の横軸は解析した表面抗原、縦軸は表面抗原 の相対濃度を示す。この結果より、 HBワクチンパルス榭状細胞は、パルスしていない 榭状細胞と比較して、 HLA— DRの発現が 1. 2倍、 CD86の発現が 1. 6倍に上昇し ていることがわ力つた。これらの結果から、 HBワクチンパルス榭状細胞が成熟してい ることがわかった。

[0178] (実験例 5) HBワクチンパルス榭状細胞の機能解析 1

(1)ワクチンを打たない他人の末梢血から、実験例 1 (1)と同様にして単核細胞を 採取した。

[0179] (2) autoMACS (Miltenyi Biotec社製）、 Pan T cell isolation kit (Milten yi Biotec社製)を用いて、単核細胞から T細胞を単離する操作を行った。まず、 1 X 10⁷あたりの単核細胞に MACS— Bufferを加えて 80 μ 1とし、さらに 20 μ 1のハプテン 標識抗体カクテル（CD1 lbゝ CD16、 CD19、 CD36、 CD56)を加えて、 6— 12。Cに て 10分間混和した。次に、 MACS— Bufferをカ卩えて洗浄し、上清を除く操作を 2回 行った。続いて、 1 X 10⁷あたりの単核細胞に MACS— Bufferをカ卩えて 80 μ 1とし、さ らに 20 μ 1の MACS抗ハプテン抗体標識マイクロビーズをカ卩えて、 6— 12°Cにて 15 分間混和した。次に、 MACS— Bufferを加えて洗浄し、上清を除いた。続いて、 I X 10⁷あたりの単核細胞に MACS— Bufferを 500 μ 1加え、 autoMACSの Depleteプ ログラムにてデブリーシヨンを行 、、 T細胞を採取した。

[0180] (3) (a)パルスして ヽな 、榭状細胞 1 X 10⁴細胞、（b) HBワクチンパルス榭状細胞 1

X 10⁴細胞に、（2)で得られた T細胞をそれぞれ 2 X 10⁵細胞カ卩えて、 108時間培養 した。培地は、 10%の FCS (フィルトロン社製）をカ卩えた RPMI 1640培地を使用し た。

[0181] (4)それぞれに³ Hで標識したサイミジンを添加してさらに 12時間培養した後、 dish 力 細胞を回収した。

[0182] (5) γ線カウンター（LS6500 :ベックマン社製）を用いて、取り込み能の評価を行つ た結果を図 3に示す。図 3の縦軸はサイミジンの取り込み能を示し、横軸は左から（3) に示した (a)、（b)の場合を示す。この結果から、 HLAの一致していない T細胞に対 して、 HBワクチンパルス榭状細胞は、パルスしていない榭状細胞と比較して、 T細胞 の幼若化補助能が 1. 5— 2倍に亢進していることがわ力つた。

[0183] (実験例 6) HBワクチンパルス榭状細胞の機能解析 2

(1)被験者 (すでに HBワクチンの投与を繰り返し受けた経験がある健常人ボランテ ィァで、かつ、 HBワクチン responder)から 1人あたり 60mlの採血を行い、実験例 1 ( 1)、実験例 5 (2)の方法を用いて、 T細胞を採取した。（以下、この T細胞を「HBsメモ リー T細胞」と記す。）

(2)同じ被験者から、実験例 1の方法を用いて榭状細胞を採取し、二つに分けた。 一方の榭状細胞は、実験例 2の方法を用いて、 HBワクチンパルス榭状細胞とし、もう 一方の榭状細胞は、 HBワクチンでパルスせずネガティブコントロールとした。

[0184] (3) (a) HBsメモリー T細胞 1 X 10⁵細胞と HBワクチン 10 μ g、（b) HBsメモリー T細 胞 1 X 10⁵細胞とパルスしていない榭状細胞 1 X 10⁴細胞、（c) HBsメモリー Τ細胞 1 X 10⁵細胞と HBワクチンパルス榭状細胞 1 X 10⁴細胞を、それぞれ混合培養した。

[0185] (4) 7日後、測定の 12時間前に³ Hで標識したサイミジンを投与し、実験例 5 (5)と同 様に γ線カウンターを用いてサイミジン取り込み能を測定した。

[0186] (5)結果を図 4示す。図 4の縦軸は相対的 cpm比を表し、横軸に左から、 (3)に記し た (a)、（b)、（c)の場合を示す。この結果から、（b)のパルスしていない榭状細胞と混 合培養した場合と比較して、（c)の HBワクチンノ ルス榭状細胞と混合培養した cpm 力 7倍となり、 HBsメモリー T細胞が増殖していた。

[0187] (実験例 7) HBワクチンパルス榭状細胞の機能解析 3

(1)被験者 (すでに HBワクチンの投与を繰り返し受けた経験がある健常人ボランテ ィァで、かつ、 HBワクチン responder)から 1人あたり 60mlの採血を行い、実験例 1 ( 1)の方法を用いて単核細胞を採取した。

[0188] (2)単核細胞 6 X 10⁷細胞を、（a)何も混合せず、 (b) HBワクチン 10 μ g、 (c)パル スして 、な 、榭状細胞 1 X 10⁵細胞、（d) HBワクチンパルス榭状細胞 1 X 10⁵細胞と、 それぞれ混合培養した。培養条件は、実験例 1 (4)と同様の条件で行った。

[0189] (3) 5日後、培養上清を回収し、 CLIA法によって抗 HBs抗体値を測定した。

[0190] (4)結果を図 5に示す。図 5の縦軸は抗 HBs抗体値を示し、横軸に左から、 (2)に 記した（a)、（b)、（c)、（d)の場合を示す。この結果から、 HBワクチンやパルスしてい ない榭状細胞を混合した場合は、抗 HBs抗体を産生させることができな力 たが、 H Bワクチンパルス榭状細胞を混合した場合は、抗 HBs抗体を 15— 56mIUZml産生 させることができることがわかった。

[0191] (実験例 8) HBワクチンパルス榭状細胞投与に伴う過敏性反応テスト (0— 24時間 )

(1)実験例 3にて、 HBワクチンパルス榭状細胞をそれぞれの被験者に皮下投与し た後、 0— 24時間において、ワクチン投与に伴う炎症等の過敏性反応の有無を確認 した。

[0192] (2)その結果、 HBワクチンパルス榭状細胞を投与した被験者 5人全例にぉ 、て、 発熱、発赤、ショック等の急性期過敏性反応は見られな力つた。従って、 HBワクチン パルス榭状細胞は安全であることが確認された。

[0193] (実験例 9) 血液生化学的検査による安全性テスト（0、 1、 3、 14日目）

(1)実験例 3にて被験者に投与した HBワクチンパルス榭状細胞の安全性をさらに 確認するために、それぞれの被験者に対し、 CBC、肝機能、腎機能等についての 5 0項目以上の検査を行った。代表的な検査項目を図 6に示す。 [0194] (2) ALT, CRP、 PT、 Creatinine検査の結果を図 7— 10に示す。それぞれの図 の横軸は投与からの日数を示し、縦軸は検査項目とその値を表す。これらの結果より 、 HBワクチンパルス榭状細胞を投与した被験者 5人全例において、血液生化学的 検査で異常は見られな力つた。従って、 HBワクチンパルス榭状細胞は安全であるこ とがわかった。

[0195] (実験例 10) 血清生化学的検査を用いた自己免疫反応に関する安全性テスト (0 、 14曰目）

(1)実験例 3にて被験者に投与した HBワクチンパルス榭状細胞による自己免疫反 応の有無を検討するために、 IgG量、 IgM量の測定や、サイロイドテスト、マイクロゾ ームテスト、抗核抗体などの自己抗体検査を行った。

[0196] (2)結果を図 11に示す。これらの結果より、 HBワクチンパルス榭状細胞は、 HBヮ クチンパルス榭状細胞を投与した被験者 5人全例で、自己免疫反応は見られなかつ た。従って、 HBワクチンパルス榭状細胞は安全であることがわ力つた。

[0197] (実験例 11) in vivoにおける、 HBワクチンパルス榭状細胞の抗 HBs抗体誘導 能の評価 (0日目、 2、 3、 4、 12週間目）

(1)実験例 3にて HBワクチンパルス榭状細胞の投与を受けた被験者それぞれから

、実験例 1 (2)の方法を用いて血清を採取し、 CLIA法によって抗 HBs抗体値を測定 した。

[0198] (2)結果を図 12、 13、 14に示す。図 12、 14の横軸は投与からの週を示し、縦軸は 抗 HBs抗体値を示す。また、図 13は、図 12のグラフの値を数値ィ匕したものである。 図 14は、 HBワクチン non— responderである被験者の、抗 HBs抗体値の推移を示 すグラフである。図 12、 13の結果より、 1回の HBワクチンノルス榭状細胞投与によつ て、 HBワクチン non— responderであった被験者 3人について 2人力 抗 HBs抗体を 産生できるようになったことがわかった。また、 HBワクチン responderである被験者 2 人についても、抗 HBs抗体値が上昇した。これらの被験者 4例は、抗 HBs抗体値が 1 OmIUZml以上であることから、 1回の HBワクチンパルス榭状細胞投与によって、 B 型肝炎予防、又は、治療に十分な量の抗体を産生できていると考えられる。また、図 14の結果より、この HBワクチン responderであった被験者力 lOmlUZml以上の 抗 HBs抗体値を少なくとも 3ヶ月間は維持できることがわ力つた。

Claims

請求の範囲

[I] 榭状細胞を HBs抗原でパルスする工程を含む方法によって得られた、 HBs抗原提 示能を有する榭状細胞。

[2] 前記方法はさらに、血液力 前記榭状細胞を得る工程を含む、請求項 1に記載の

HBs抗原提示能を有する榭状細胞。

[3] 前記方法はさらに、生物から前記血液を採取する工程を含む、請求項 2に記載の

HBs抗原提示能を有する榭状細胞。

[4] 前記生物は、ヒトである、請求項 3に記載の HBs抗原提示能を有する榭状細胞。

[5] 前記 HBs抗原は、 HBワクチンに含まれる HBs抗原である、請求項 1に記載の HBs 抗原提示能を有する榭状細胞。

[6] 榭状細胞を HBs抗原でパルスする工程を含む、 HBs抗原提示能を有する榭状細 胞の製造方法。

[7] さらに血液カゝら前記榭状細胞を得る工程を含む、請求項 6に記載の HBs抗原提示 能を有する榭状細胞の製造方法。

[8] さらに生物カゝら前記血液を採取する工程を含む、請求項 7に記載の HBs抗原提示 能を有する榭状細胞の製造方法。

[9] 前記生物は、ヒトである、請求項 8に記載の HBs抗原提示能を有する榭状細胞の 製造方法。

[10] 前記 HBs抗原は、 HBワクチンに含まれる HBs抗原である、請求項 6に記載の HBs 抗原提示能を有する榭状細胞の製造方法。

[I I] 請求項 1に記載の、 HBs抗原提示能を有する榭状細胞を含む組成物。

[12] さらに HBワクチン添加物が含まれる、請求項 11に記載の組成物。

[13] 前記組成物は、実験試薬、又は、実験キットである、請求項 11に記載の組成物。

[14] 前記組成物は、医薬組成物である、請求項 11に記載の組成物。

[15] 前記組成物は、免疫応答活性化製剤である、請求項 11に記載の組成物。

[16] 前記組成物は、細胞ワクチンである、請求項 11に記載の組成物。

[17] 前記細胞ワクチンは、 B型肝炎の予防、又は、治療ワクチンである、請求項 16に記 載の組成物。

[18] 請求項 1に記載の、 HBs抗原提示能を有する榭状細胞を用いた、 B型肝炎の予防 、又は、治療方法。

[19] 請求項 1に記載の、 HBs抗原提示能を有する榭状細胞を、生物に投与する工程を 含む、 B型肝炎の予防、又は、治療方法。

[20] 前記生物は、ヒトである、請求項 19に記載の B型肝炎の予防、又は、治療方法。

[21] 榭状細胞をワクチンでパルスする工程を含む方法によって得られた、ワクチンパル ス榭状細胞。

[22] 前記方法はさらに、血液から前記榭状細胞を得る工程を含む、請求項 21に記載の ワクチンパルス榭状細胞。

[23] 前記方法はさらに、生物から前記血液を採取する工程を含む、請求項 22に記載の ワクチンパルス榭状細胞。

[24] 前記生物は、ヒトである、請求項 23に記載のワクチンパルス榭状細胞。

[25] 前記ワクチンは、疾患の予防、又は、治療ワクチンである、請求項 21に記載のワク チンパルス榭状細胞。

[26] 前記ワクチンは、肝炎ワクチンである、請求項 21に記載のワクチンパルス榭状細胞

[27] 前記肝炎ワクチンは、 HBs抗原を含む HBワクチンである、請求項 26に記載のワク チンパルス榭状細胞。

[28] 榭状細胞をワクチンでパルスする工程を含む、ワクチンパルス榭状細胞の製造方 法。

[29] さらに血液力 前記榭状細胞を得る工程を含む、請求項 28に記載のワクチンパル ス榭状細胞の製造方法。

[30] さらに生物力 前記血液を採取する工程を含む、請求項 29に記載のワクチンパル ス榭状細胞の製造方法。

[31] 前記生物は、ヒトである、請求項 30に記載のワクチンパルス榭状細胞の製造方法。

[32] 前記ワクチンは、疾患の予防、又は、治療ワクチンである、請求項 28に記載のワク チンパルス榭状細胞の製造方法。

[33] 前記ワクチンは、肝炎ワクチンである、請求項 28に記載のワクチンパルス榭状細胞 の製造方法。

[34] 前記肝炎ワクチンは、 HBs抗原を含む HBワクチンである、請求項 33に記載のワク チンパルス榭状細胞の製造方法。

[35] 請求項 21に記載の、ワクチンパルス榭状細胞を含む組成物。

[36] さらにワクチン添加物が含まれる、請求項 35に記載の組成物。

[37] 前記組成物は、実験試薬、又は、実験キットである、請求項 35に記載の組成物。

[38] 前記組成物は、医薬組成物である、請求項 35に記載の組成物。

[39] 前記組成物は、免疫応答活性化製剤である、請求項 35に記載の組成物。

[40] 前記組成物は、細胞ワクチンである、請求項 35に記載の組成物。

[41] 前記細胞ワクチンは、疾患の予防、又は、治療ワクチンである、請求項 40に記載の 組成物。

[42] 請求項 21に記載の、ワクチンパルス榭状細胞を用いた、疾患の予防、又は、治療 方法。

[43] 請求項 21に記載の、ワクチンパルス榭状細胞を、生物に投与する工程を含む、疾 患の予防、又は、治療方法。

[44] 前記生物は、ヒトである、請求項 43に記載の疾患の予防、又は、治療方法。