WO2024085085A1

WO2024085085A1 - Ｎｋｔ細胞を刺激する樹状細胞からなる樹状細胞製剤の製造方法

Info

Publication number: WO2024085085A1
Application number: PCT/JP2023/037210
Authority: WO
Inventors: 勇介鳥飼; 繁加賀田; 愉希石原; 保之石井; りさ野澤
Original assignee: Ｄｃ－Ｂｉｏｔｅｃｈ株式会社
Priority date: 2022-10-17
Filing date: 2023-10-13
Publication date: 2024-04-25

Abstract

【課題】受益者から採取（成分採血された単球又は単球を含む末梢血）された単球から、従来よりも早く効を奏すＮＫＴ細胞を刺激する樹状細胞製剤の製造方法の提供。【解決手段】前記採取された単球を液体培地を用いた培養容器に入れ、静置して前記単球のうちの一部の細胞を容器の内面に接着させる接着工程と、培養容器の内面に接着した細胞以外の単球を含む非接着細胞を除去する非接着細胞除去工程と、前記培養容器に所定の因子を入れて前記培養容器内面に接着した単球を未成熟樹状細胞に分化させる分化工程と、前記未成熟樹状細胞が非接着状態で存在する培養容器にα－ガラクトシルセラミドをパルスするパルス工程と、未成熟樹状細胞から、ＮＫＴ細胞を刺激する樹状細胞であるＮＫＴ刺激樹状細胞を誘導するＮＫＴ刺激樹状細胞誘導工程とを含み、採血した受益者自身の体内へ戻入させる樹状細胞製剤の製造方法。

Description

ＮＫＴ細胞を刺激する樹状細胞からなる樹状細胞製剤の製造方法

　本願発明は、がん治療、がん予防、健常者の免疫力向上のいずれか一以上に用いる、より副作用の少ないＮＫＴ細胞（「Ｔ」は、Ｔｈｙｍｕｓ、即ち胸腺を意味する。）を刺激する樹状細胞からなる樹状細胞製剤の製造方法であって、特に受益者自身から採取した細胞を元とする樹状細胞製剤の製造方法、並びにその製造方法に係る樹状細胞製剤を加えた血液に関する。

　近年、ＮＫＴ細胞を標的とした、がん免疫療法または健常者の免疫力向上法が開発されている。この療法はがん細胞などそのものを標的とせずに、免疫系の司令塔であるＮＫＴ細胞を活性化する。活性化されたＮＫＴ細胞のアジュバント作用（一部の免疫系細胞を活性化することに起因して他の免疫系細胞の活性化を促し、総合的に免疫系を活性化する作用）によって、強い抗腫瘍効果が現れる。さらに特異的な抗原を標的とするような制限を受けないことにより新たな変異がん細胞にも、がん以外の病原菌やウイルスや寄生虫などに対しても効果が期待できる。

　特許文献１では、単核球を第１の培養容器に入れ、静置して前記単核球のうちの一部の細胞を容器の底面に定着させ、容器の底面に接着した細胞以外の非接着細胞を回収し保存する。残った底面に付着した細胞のうち単球に対し所定の処理を行い未成熟樹状細胞に分化させ、さらに所定の処理を行って成熟させる。その後、成熟樹状細胞に対してα-Galactosylceramide（以下、α―ガラクトシルセラミド）を加え、成熟した樹状細胞から、ＮＫＴ細胞を刺激する樹状細胞を誘導し、保存しておいた非接着細胞と共に第２の培養容器に入れて培養し前記非接着細胞の一部からＮＫＴ細胞を誘導する方法が記載されている。

特許第６８５４２９０号

　特許文献１には、ＮＫＴ細胞が活性化すると大量のＩＦＮ－γ（インターフェロンガンマ）を産生することと、抗原提示細胞（樹状細胞）表面のＣＤ－１ｄ分子が提示された場合、ＮＫＴ細胞表面のＴ細胞受容体を介して活性化シグナルが伝達され、ＮＫＴ細胞が活性化すると知られていると、記載されている。

　特許文献１に開示されているＮＫＴ細胞を刺激する樹状細胞とＮＫＴ細胞を含む細胞組成物については、ＮＫＴ細胞の割合が示されているが、がん細胞に対する多様な効果を生じさせるＩＦＮ－γの産生量に関しては開示されていないので、その効果が明確とは言えない。また、ＮＫＴ細胞を刺激するための誘導を樹状細胞が成熟化してから行うとしている。しかしながら誘導を行うタイミングと、成熟化したタイミングとの時間的な関係性に関して検討した記載が無い。

　このような課題を解決するために、本願発明者が研究開発を進めるなかで、特許文献１の方法よりもより多くの量のＩＦＮ―γを産生し、ＩＦＮ－γの産生がより早く始まる本願発明製剤を見出した。本願発明は、ＮＫＴ細胞を刺激するための誘導を樹状細胞に対して行うタイミングを検討した結果、先行技術（特許文献１）よりもＮＫＴ細胞が産生するＩＦＮ－γの量を多くできる。産生されたＩＦＮ－γは、人体内の自然免疫系、獲得免疫系双方の経路を刺激し活性化するために、大量に産生されたIＦＮ－γの刺激受けた両経路からのより大きな効果を、がん治療などにおいて期待することができ、より高い治療効果を期待することができるＮＫＴ細胞を刺激する樹状細胞からなる樹状細胞製剤の製造方法を提供するものである。

　最初に課題を解決するための手段を要約すると、樹状細胞に対するリガンドのパルスタイミングは、樹状細胞が未成熟である段階で行うことが効果をより大きくする。また、未成熟樹状細胞に対してリガンドをパルスするタイミングは未成熟段階であればいつでも良い、というものでなく、未成熟段階でも所定のタイミングでパルスすることによって大きな効果を得ることが出来る。以下に具体的に解決手段を記載する。

　以上のような樹状細胞製剤に関する課題を解決するために、本願では第一の発明として、
　がん治療、がん予防、免疫力向上のいずれか一以上を目的としたナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞を刺激する樹状細胞からなる樹状細胞製剤の製造方法であって、
（１）受益者から採取（成分採血又は採血された単球又は単球を含む末梢血）された単球を液体培地を用いた培養容器に入れ、静置して前記単球のうちの一部の細胞を容器の内面に接着させる接着工程と、
（２）培養容器の内面に接着した細胞以外の単球を含む非接着細胞を除去する非接着細胞除去工程と、
（３）前記培養容器に所定の因子を入れて、前記培養容器内面に接着した単球を未成熟樹状細胞に分化させる分化工程と、
（４）前記未成熟樹状細胞が非接着状態で存在する培養容器にα-ガラクトシルセラミドをパルスするパルス工程と、
（５）未成熟樹状細胞から、ＮＫＴ細胞を刺激する樹状細胞であるＮＫＴ刺激樹状細胞を誘導するＮＫＴ刺激樹状細胞誘導工程と、
を含むことを特徴とする、前記単球を採取した受益者の体内に戻入するＮＫＴ細胞を刺激する樹状細胞製剤の製造方法を提供する。

　さらに第二の発明として、第一の発明を基礎として、第一の発明の（４）のパルス工程は、（３）の分化工程にて所定の因子を加えた日を０日として、３日乃至は４日目に行う樹状細胞製剤の製造方法を提供する。

　さらに第三の発明として、第一の発明を基礎として、第一の発明の（４）のパルス工程は、（３）の分化工程にて所定の因子を加えてから６０時間後乃至は１０８時間後に行う樹状細胞製剤の製造方法を提供する。

　さらに第四の発明として、第一の発明を基礎として、（４）のパルス工程は、（１）の接着工程にて受益者から採取された単球を培養容器に入れた日を０日として、４日目乃至は５日目までに行う請求項１に記載の樹状細胞製剤の製造方法を提供する。

　さらに第五の発明として、第一の発明を基礎として、（４）のパルス工程は、（１）の接着工程にて受益者から採取された単球を培養容器に入れてから８４時間後乃至は１３２時間後までに行う、樹状細胞製剤の製造方法を提供する。

　さらに第六の発明として、第一の発明を基礎として、（４）のパルス工程は、（２）の非接着細胞除去工程にて培養容器の内面に接着した細胞以外の単球を含む非接着細胞を除去した日を０日として、４日目乃至は５日目に行う、樹状細胞製剤の製造方法を提供する。

　さらに第七の発明として、第一の発明を基礎として、（４）のパルス工程は、（２）の非接着細胞除去工程にて培養容器の内面に接着した細胞以外の単球を含む非接着細胞を除去してから８４時間後から１３２時間後までに行う、樹状細胞製剤の製造方法を提供する。

　さらに第八の発明として、第一の発明から第七の発明のいずれか一を基礎として、（４）のパルス工程においてパルスするα―ガラクトシルセラミドの濃度は３００～１０００ｎｇ／ｍＬである樹状細胞製剤の製造方法を提供する。

　さらに第九の発明として、第一の発明から第七の発明のいずれか一に記載の製造方法にて製造された樹状細胞製剤を加えた受益者の血液を提供する。

　さらに第十の発明として、第八の発明の記載の製造方法にて製造された樹状細胞製剤を加えた受益者の血液を提供する。

　本願発明の、単球を採取した受益者の体内に戻入する、ＮＫＴ細胞を刺激する樹状細胞製剤の製造方法によれば、先行技術（特許文献１）よりもＮＫＴ細胞が産生するＩＦＮ－γの量を多くできる。産生されたＩＦＮ－γは、人体内の自然免疫系、獲得免疫系双方の経路を刺激し活性化するために、大量に産生されたIＦＮ－γの刺激を受けた両経路からのより大きな効果を、がん治療などにおいて期待することができ、より高い治療効果を期待することができるＮＫＴ細胞を刺激する樹状細胞からなる樹状細胞製剤の製造方法を提供するものである。

実施形態２の樹状細胞製剤製造時のα―ガラクトシルセラミドのパルスタイミングと共培養後のＮＫＴ細胞数比率との関係を示すグラフ実施形態２の樹状細胞製剤製造時のα―ガラクトシルセラミドのパルスタイミングと、各条件での共培養後のＮＫＴ細胞数最大比率との関係を示すグラフ１（分化用所定因子添加日を０日とした場合）実施形態２の樹状細胞製剤製造時のα―ガラクトシルセラミドのパルスタイミングと、各条件での共培養後のＮＫＴ細胞数最大比率との関係を示すグラフ２（培養開始した時を起点とした場合）実施形態３の樹状細胞製剤製造時のα―ガラクトシルセラミドのパルスタイミングと共培養後のＮＫＴ細胞数比率との関係を示すグラフ実施形態３の樹状細胞製剤製造時のα―ガラクトシルセラミドのパルスタイミングと、各条件での共培養後のＮＫＴ細胞数最大比率との関係を示すグラフ１（分化用所定因子添加日を０日とした場合）実施形態３の樹状細胞製剤製造時のα―ガラクトシルセラミドのパルスタイミングと、各条件での共培養後のＮＫＴ細胞数最大比率との関係を示すグラフ２（培養開始した時を起点とした場合）実施形態４の樹状細胞製剤製造時にパルスするα―ガラクトシルセラミドの濃度と共培養後のＩＦＮ－γ産生量との関係を示すグラフ本願発明の樹状細胞製剤を人体に使用した場合のＮＫ細胞活性値とＩＦＮ－γ産生量先行技術（特許文献１）と本願発明での発明の効果（共培養後のＩＦＮ－γ産生量）の比較図

　先ず、本願発明の実施形態の説明に先立ち、体の免疫に関して説明する。
　以下本明細書中では、本願発明の製剤のがん細胞に対する効果を例として説明するが他の病原体などに対しても同様の効果を得ることができる。免疫は、もともと生物が持っている自然免疫と、あとから獲得する獲得免疫に分けられる。

　自然免疫は、生まれつき人間の体に備わっている免疫で、細菌やウイルスなどの異物を食べて除去する食細胞を中心に構成されている。食細胞は分子や構造を認識する受容体を持っており、異物の処理・排除を行うタイプと、細胞間で信号の伝達を行う役割を担うものとに大別される。自然免疫細胞としては、好酸球、好中球、好塩基球、マクロファージ、樹状細胞、ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞が該当する。

　一方で、獲得免疫は、体内の病原体を記憶し、再度遭遇した時に、効果的に排除できるようになる免疫である。自然免疫に比べると応答時間がかかるが、さまざまな病原体に反応する多様性を持っている。獲得免疫細胞としては、Ｂ細胞とＴ細胞があり、Ｔ細胞はさらにヘルパーＴ細胞、キラーＴ細胞、制御性Ｔ細胞がある。Ｂ細胞は状態に応じて、形質細胞、メモリーＢ細胞に変化する。

　さらに、自然免疫と獲得免疫の両方を賦活するＮＫＴ細胞もある。
前述の免疫細胞の中で、本樹状細胞製剤が直接的に作用する細胞としては、ＮＫＴ細胞であるが、ＮＫＴ細胞の活性化によって産生されるＩＦＮ－γのアジュバント作用より、併せて、ＮＫ細胞、樹状細胞、Ｔ細胞（ヘルパーＴ細胞、キラーＴ細胞）、Ｂ細胞、なども活性化される。

　以降、本樹状細胞製剤の製造方法で生成される樹状細胞製剤の作用に関わる免疫細胞と免疫機能に係る物質について簡単に説明する。

＜免疫細胞と免疫機能に係る物質の用語の説明＞
＜用語説明：抗原＞
　体に入ってきた異物で、獲得免疫細胞が攻撃対象として認識するための目印になるものである。がん抗原の場合は、正常な細胞には存在しないタンパク質の構造を目印に免疫細胞が攻撃対象として認識する。

＜用語説明：抗体＞
　免疫グロブリンと呼ばれるたんぱく質の総称で、がん抗体はがん細胞のがん抗原と結合し、以下３つの作用でがん細胞を攻撃する。
　中和作用：がん細胞の増殖を妨げる作用
　ＡＤＣＣ活性：キラーＴ細胞やＮＫ細胞の目印となりがんの攻撃を補助する作用
　ＣＤＣ活性：がん細胞のがん抗原と結合した抗体に補体（体内で合成され血清中に存在するタンパク質の一種で、感染防御など免疫反応に関与する物質であり、Ｃ１からＣ９までの９種ある）が結合して、連鎖的にＣ１からＣ９の補体を活性化し、がん細胞の細胞膜に穴をあけて傷害、死滅させる作用

＜用語説明：サイトカイン＞
　免疫細胞から分泌されるタンパク質であり、細胞間の作用に関与する生理活性物質の総称である。対象となる細胞にシグナルを伝達し、細胞の活性化、細胞の増殖、分化、細胞死、機能発現など様々な細胞応答を引き起こす。インターロイキンやインターフェロンや腫瘍壊死因子などはサイトカインの一種である。

＜用語説明：サイトカイン：インターロイキン＞
　サイトカインの一種であるインターロイキンは、現在では３０種類以上が確認されている。特に、体内の異物と戦う白血球の一種であるリンパ球や、マクロファージや好中球などの貪食細胞から多く分泌される。インターロイキンはインターロイキン－２のような数字名称で呼ばれている（以下、インターロイキンをＩＬと略記する。例：インターロイキン－４はＩＬ－４）。例えば、インターロイキンについていくつか産生元と作用について以下記載する。

＜用語説明：サイトカイン：インターロイキン：ＩＬ－４＞
　ＩＬ－４はＴｈ２サイトカインの一つであり、活性化２型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２細胞）やＮＫＴ細胞などから産生される。抗原提示細胞の増殖や分化を促進する。Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、単球などに影響を及ぼす。ナイーブＴ細胞はＩＬ－４やＩＬ－１３などのサイトカインの刺激を受けてＴｈ２細胞へ分化する。ＩＬ－４が活性化Ｂ細胞に作用すると、産生される免疫グロブリン（抗体）がＩｇＭからＩｇＥおよびＩｇＧ１へと変わるクラススイッチが起こる。このように液性免疫系に係る。
　ＮＫＴ細胞は、抗原提示細胞（樹状細胞）が提示するα-ガラクトシルセラミドを認識すると活性化され、ＩＬ－４とIＦＮ－γを産生する。

＜用語説明：サイトカイン：インターロイキン：ＩＬ－１２＞
　ＩＬ－１２は、食細胞（動物体内で組織間を遊送し食作用を有する細胞性免疫を担う細胞：マクロファージや単球、好中球など）や樹状細胞によって産生される。ＮＫ細胞刺激因子であり、ＩＦＮ－γとともにナイーブＴ細胞へ働きかけヘルパーＴ細胞の１種であるＴｈ１細胞へ分化させる。Ｔｈ１細胞はＩＦＮ－γなどのＴｈ１サイトカインを産生しマクロファージやキラーＴ細胞などを活性化する細胞性免疫に関与する。
　α-ガラクトシルセラミドは、樹状細胞（抗原提示細胞）にＩＬ－１２を産生させる。抗原提示細胞から産生されたＩＬ－１２は、ＮＫＴ細胞に作用しＩＦＮ-γを産生させたり、ＮＫＴ細胞表面のＦａｓリガンドを介して、Ｆａｓ抗原（Ｆａｓ受容体）を発現している標的細胞に対し細胞障害活性を示させたりする。

＜用語説明：サイトカイン：インターフェロン＞
　サイトカインの一種であるインターフェロンは、がん細胞やウイルスに感染した細胞などを攻撃するＮＫ細胞や、マクロファージを活性化させ、ウイルスや腫瘍細胞の増殖を抑制する働きや、がん細胞の貪食を促す作用（アジュバント作用）がある。抗ウイルス薬や抗がん剤としても国の承認を受けており、多発性骨髄腫、脳腫瘍、腎がんの治療に使用されている。

＜用語説明：サイトカイン：インターフェロン：ＩＦＮ－γ＞
　ＩＦＮ-γは自然免疫系と獲得免疫系に重要なサイトカインである。IＦＮ－γは自然免疫応答の一部として主にＮＫ細胞とＮＫＴ細胞によって産生され、抗原特異的免疫の誘導後はＴｈ１細胞、キラーＴ細胞、マクロファージなどによって産生される。大量に侵入してきた非自己抗原のプロセシングを加速させ、細胞性免疫反応を亢進させる。マクロファージの重要な活性化因子であり、刺激して細菌を貪食殺菌させる。ＮＫ細胞活性を促進し、またナイーブＴ細胞をＴｈ１細胞へ分化させる。

＜用語説明：サイトカイン：腫瘍壊死因子＞
　腫瘍壊死因子（ＴｕｍｏｒＮｅｃｒｏｓｉｓＦａｃｔｏｒ, ＴＮＦ）は、リンパ球などの細胞から分泌される、腫瘍細胞を壊死させる物質である。ほとんどの悪性細胞に作用するほか，免疫作用を促進する。狭義にはＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β（リンホトキシン（ＬＴ）－α）およびＬＴ－βの３種類である。

＜用語説明：サイトカイン：腫瘍壊死因子：ＴＮＦ－α＞
　ＴＮＦ－αは主にマクロファージにより産生されており、固形がんに対して出血性の壊死を生じさせるサイトカインとして発見された。一般には腫瘍壊死因子といえばＴＮＦ－αを指すことが多い。細胞接着分子の発現やアポトーシスの誘導に関与する。アポトーシスとは、管理・調節された細胞の自殺すなわちプログラムされた細胞死のことを意味する。

＜用語説明：ＮＫ細胞＞
　ＮＫ細胞は、異常な細胞をキャッチする様々な受容体を持っており、ウイルスに感染した細胞やがん細胞など、通常の人体を構成する細胞とは異なる細胞を発見する（人体を構成する細胞を記憶している。）と、それを異常と認識し異常な細胞を傷害する作用を持つ。

＜用語説明：樹状細胞＞
　抗原提示細胞である。異物（病原菌やウイルスに感染した細胞やがん細胞など）取り込み（貪食）によってその異物特有の抗原提示能力を獲得、又は、マクロファージ等から抗原を提示されることでその抗原提示能力を獲得する。そして、その抗原をＴ細胞に提示し攻撃対象として認知させる役割を持っている。樹状細胞は、ウイルスやがん細胞を食する貪食作用を有し、これによって抗原を獲得し、他の免疫細胞に抗原を提示する能力を得る。初期の樹状細胞（未成熟樹状細胞）は抗原を取り込む能力（貪食作用）を持つがナイーブＴ細胞を活性化できない（抗原提示能力がないといえる）。成熟した成熟樹状細胞は、成熟化によってＴ細胞を活性化する抗原提示能力を獲得するが抗原を取り込む能力（貪食）を失っている。

＜用語説明：ヘルパーＴ細胞＞
　樹状細胞などから抗原を提示されることで攻撃対象として認識し、キラーＴ細胞に攻撃を指示する。また、サイトカインを生成してＢ細胞を活性化する。さらに、Ｂ細胞から抗原を提示されることでその抗原が危険な異物のものであるか判断し、その結果をＢ細胞に伝達する。さらに、抗体産生を補助したりする働きがある。

＜用語説明：キラーＴ細胞＞
　キラーＴ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子（ＭＨＣクラスＩ分子は、主にプロテアソーム（タンパク質分解酵素複合体）による細胞質タンパク質の分解によって生じたペプチドを結合する（人間である自分自身を示す目印として）。その後、ＭＨＣＩペプチド複合体は小胞体膜を経て細胞膜の外側へ挿入される。エピトープとなるペプチドはＭＨＣＩペプチド分子の細胞外部分に結合している。このようにしてＭＨＣＩペプチド分子は細胞内のタンパク質をキラーＴ細胞へ提示する。しかし、ＭＨＣＩペプチド分子が外来タンパク質から形成されたペプチドを提示することもあり、この過程は交差提示として知られている。）によって提示された抗原を認識し、自己・非自己を認識し、非自己である細胞を傷害する。ちなみに自己・非自己の認識能力は胸腺における能力教育（負の選択）によって与えられ、ＭＨＣＩペプチド分子によってその能力が使われる。このように獲得免疫であるＴ細胞の応答は、ＭＨＣ分子による抗原ペプチドの抗原提示から始まる。
　ヘルパーＴ細胞の指示で、キラーＴ細胞はウイルスに感染した細胞やがん細胞など、生体にとって、危険または不要な細胞を殺傷し除去する。

＜用語説明：Ｂ細胞＞
　ヘルパーＴ細胞が産生するサイトカインにより刺激され、抗体を生成する。抗原が排除されてもメモリーＢ細胞となって抗原を記憶し、次の侵入に備える役割がある。

＜用語説明：ＮＫＴ細胞＞
　Ｔ細胞と、ＮＫ細胞の両方の特徴を併せ持つ細胞である。活性化されると、サイトカイン（ＩＦＮ－γ）を産生し、免疫賦活・抑制療法の反応を誘導する働きもある。また最も本件発明の製剤によって期待される効果は、アジュバント作用であり、体内の各種の免疫細胞を活性化するとともに、ここが重要な点であるが、増殖させる作用がある。

＜ＮＫＴ細胞を刺激する樹状細胞製剤の作用＞
　本製剤によってＮＫＴ細胞が活性化されることによって期待される主な効果は、樹状細胞の成熟促進作用、アジュバンド作用（各種免疫細胞の活性化、増殖）、がん細胞のアポトーシス誘導作用、血管新生阻害作用等の、非特異的免疫と特異的免疫の双方の作用がある。アポトーシスとは、管理・調節された細胞の自殺すなわちプログラムされた細胞死のことを意味する。

　以上述べたように、自然免疫系を活性化する、ＮＫＴ細胞刺激樹状細胞製剤を使用することで、体内のさまざまな免疫機能を活性化しがん細胞を攻撃することができる。

　以下に、詳細に実施形態を説明するが、製造方法の途中で使用する物質に関しては、全実施形態において共通である。製造元等は初出時のみ記載する。

＜実施形態１：概要＞主に請求項１
　受益者から採取（成分採血又は採血された単球、又は単球を含む末梢血）された単球から、ＮＫＴ細胞を刺激する樹状細胞と変化せしめ、樹状細胞製剤とする製造方法である。

　以下、本明細書中では、「受益者」とは、がん治療、がん予防、免疫力向上のいずれか一以上を目的とした樹状細胞製剤の投与による効果の益を得ることを望む者であり、前記製剤の原料となる自身の単球を提供する者をいう。

＜実施形態１：製造方法＞
　まず、本願発明のＮＫＴ細胞刺激樹状細胞製剤製造方法の概要について説明する。次に本製剤の作用について、以下説明する。

＜実施形態１：（１）接着工程：単球の準備＞
　受益者から採取（成分採血又は採血された単球、又は単球を含む末梢血）された単球を準備する。「準備」とは受益者から採取（成分採血又は採血された単球、又は単球を含む末梢血）された単球を製造現場へ搬入することであり、採血自体は含まない。この接着工程で、後で使用する培養容器や液体培地を製造現場へ搬入し使用できるように整えることも準備に含めてもよい。なお本明細書では特記しない限り、「培養容器」とは、内部に液体培地などの培地を収容している培養用の容器をいう。

　「成分採血」とは、血液を体外に取り出して、専用の機器で血液中から目的の血液成分・因子を分離して再度体内に戻すものである。本願発明では、血液成分として単球を含む末梢血単核球を分離して約１００ｃｃの血液成分を採取する。前記単球を含む末梢血単核球の分離後の血液成分には目的とした前記血液成分以外にも、血漿や血小板が含まれている。成分採血は、血液が凝固しないように単球を含む末梢血単核球分離前に血液中に抗凝固剤を混ぜその後その抗凝固剤が体内に戻されたり、単球を含む末梢血単核球分離のための成分採血に長時間かかったりと、体への負担が大きい。

　なお、成分採血での採取ではなく、末梢血で採血１００～４００ｍＬを行ってもよい。単球を含む割合は成分採血の方が多いが、抗凝固剤を使用せず短時間で採血できるため、末梢血での採血でもよい。

＜実施形態１：（１）接着工程：静置＞
　次に採取した単球を含む末梢血単核球から、Ficoll（登録商標）を用いた比重遠心法にて単核球を採取する。（Ficoll（登録商標）はFicoll-Paque（登録商標）の一部であり、血液をその成分(赤血球、白血球など)に分離するために使用される。）採取した単核球を、液体培地を入れた培養容器に入れる。受益者から採取した単核球は採取から７２時間以内をめどに培地（液体培地が好ましい）が入った培養容器へ入れることが望ましい。単球を含む単核球を、培地を入れた培養容器（液体培地が好ましい）へ入れた時点を培養開始時点とする。以下本願明細書では特記しない場合には、「単球を培養容器へ入れた」といった表記の場合には培地（液体培地が好ましい）の入った培養容器へ入れたことを意味する。滅菌された３７℃恒温環境下で３０分ほど静置しインキュベートする。静置以降の工程は特に記さない限り滅菌された３７℃恒温環境下で行う。静置時間は３０分より長くてもよい、３０分より短いと十分な数の単球が容器内面に接着しきれないため、少なくとも３０分程度は静置することが好ましい。

　本願明細書において、培養容器内面に「接着」するとは、故意に細胞を培養容器内面に接するように押し付けたり、何らかの物質を接着剤のような役割のために用いて細胞を容易には培養容器内面から離れられないように貼り付けたりすることを意味しない。「接着」は重力以外の外部からの力を加えなくとも細胞が内面に接した後に、そのまま内面に接したままの状態を維持することを指す。

＜実施形態１：（２）非接着細胞除去工程：非接着細胞の除去＞
　前記静置後（例：３０分静置）に、培養容器内面に接着せずに液体培地中に浮遊する単球を含む非接着細胞を除去する（別の容器に移す）。容器の内壁面に接着した細胞（単球分画）が液体培地が入った培養容器内に残る。

　取り除いた単球を含む非接着細胞は、別途培養しておくか、または凍結保存しておくことが好ましい。取り除いた非接着細胞（ＮＫＴ細胞を含む）は、製造した製剤と共培養することで、製剤の効能検証に用いることができる。非接着細胞を取り除いた後で、容器の内壁面に接着した細胞（単球分画）を剥離して液体培地中に浮遊させる剥離工程を設けてもよい。前記静置では単球が主に容器内面に接着するため、剥離後は主に単球が液体培地中を浮遊する。

＜実施形態１：（３）分化工程：単球から未成熟樹状細胞への分化＞
　非接着細胞を取り除いた上記液体培地が入った培養容器へ、単球を未成熟樹状細胞へ分化させるための所定の因子として、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ－ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　ｃｏｌｏｎｙ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ；以下、ＧＭ－ＣＳＦ）５０ｎｇ／ｍＬ（３０ｎｇ／ｍＬから７０ｎｇ／ｍＬ程度がよい。これより少ないと刺激が弱すぎて分化が遅くなり、これより多くても分化速度は頭打ちとなってしまいコスト的に不合理）と、インターロイキン４（以下、ＩＬ－４）５０ｎｇ／ｍＬ（３０ｎｇ／ｍＬから７０ｎｇ／ｍＬ程度がよい。これより少ないと刺激が弱すぎて分化が遅くなり、これより多くても分化速度は頭打ちとなってしまいコスト的に不合理）を添加する。添加後、培養を継続する。ＧＭ－ＣＳＦとＩＬ－４を添加し単球を刺激したことによって、培養中の単球が未成熟樹状細胞へと分化する。なお、分化の刺激に用いる物質は、上記のＧＭ－ＣＳＦとＩＬ－４が好ましいが限定されない。刺激物質を添加したことにより、培養容器内は未分化の単球や成熟樹状細胞よりも未成熟樹状細胞が非常に多く存在（優位に存在）する状態となる。分化した未成熟樹状細胞は、培養容器内の細胞の過半数を占め、好ましくは８０％以上を占め、より好ましくは９０％以上を占める。

＜実施形態１：（４）パルス工程：α―ガラクトシルセラミドのパルス＞
　前記のように未成熟樹状細胞が過半数存在する培養容器中の液体培地へ、α―ガラクトシルセラミドをパルスする。α-ガラクトシルセラミドは、協和キリン株式会社の型名ＫＲＮ７０００を使用した。α-ガラクトシルセラミドをパルスされたことにより、未成熟樹状細胞は、成熟後にＮＫＴ細胞を刺激しうる未成熟樹状細胞となる。α-ガラクトシルセラミドはＮＫＴ細胞を活性化させるために必要な糖脂質抗原である。本願発明の特徴は、このα-ガラクトシルセラミドを未成熟樹状細胞に直接的に付与する点である。一般的には成熟樹状細胞が各種異物の貪食によってα-ガラクトシルセラミドの抗原提示能力を得るのであるが、本願発明では未成熟段階で樹状細胞へα-ガラクトシルセラミドを付与（パルス）することで成熟後の樹状細胞に抗原提示能力を与える点に特徴がある。本願発明者らは、先行技術である特許文献１には成熟樹状細胞にα-ガラクトシルセラミドをパルスすることで抗原提示能力を付与するとの記載があるが、本願発明によれば、少なくとも未成熟樹状細胞にパルスした方が、ＮＫＴ細胞へ抗原提示し活性化する効果が高いことを確認している。

＜実施形態１：（５）ＮＫＴ刺激樹状細胞誘導工程：樹状細胞の成熟化＞
　前記のようにα―ガラクトシルセラミドをパルス後に、ＧＭ－ＣＳＦ（５ｎｇ／ｍＬ：３ｎｇ／ｍＬから７ｎｇ／ｍＬ程度がよい。これより少ないと刺激が弱すぎて成熟化が遅くなり、これより多くても成熟速度は頭打ちとなってしまいコスト的に不合理）とＩＬ－４（５ｎｇ／ｍＬ：３ｎｇ／ｍＬから７ｎｇ／ｍＬ程度がよい。これより少ないと刺激が弱すぎて成熟化が遅くなり、これより多くても成熟速度は頭打ちとなってしまいコスト的に不合理）とＯＫ－４３２（１０ｎｇ／ｍＬ：７ｎｇ／ｍＬから１３ｎｇ／ｍＬ程度がよい。これより少ないと刺激が弱すぎて成熟化が遅くなり、これより多くても成熟速度は頭打ちとなってしまいコスト的に不合理）とＰＧＥ２（５０ｎｇ/ｍＬ：３０ｎｇ／ｍＬから７０ｎｇ／ｍＬ程度がよい。これより少ないと刺激が弱すぎて成熟化が遅くなり、これより多くても成熟速度は頭打ちとなってしまいコスト的に不合理）とを前記培養容器中の液体培地へ添加する。これら４種を添加するのは、培養開始から６日目が良い。添加された前記成分からの刺激を受けて、未成熟樹状細胞は成熟化し成熟樹状細胞となる。なお、ＯＫ－４３２は中外製薬株式会社製造の商品名ピシバニールであり、ＰＧＥ２はプロスタグランジンＥ２（英: Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ　Ｅ２，以下ＰＧＥ２）である。なお、成熟化の刺激に用いる物質は、上記のＧＭ－ＣＳＦとＩＬ－４とＯＫ－４３２とＰＧＥ２が好ましいが限定されない。

＜実施形態１：（５）ＮＫＴ刺激樹状細胞誘導工程：最終検査＞
　成熟樹状細胞としたあと、人に注射投与しても安全か否かを確認するための無菌試験、エンドトキシン試験、マイコプラズマ否定試験を行う。さらに、表面マーカー測定を実施し、樹状細胞の品質評価を行う。これらの品質確認検査は、他項目の検査を適宜追加実施してもよい。また、受益者への投与をすぐに行わなかったり、何度かに分けて投与する計画であったりする場合など、必要に応じて製造した樹状細胞を回収し凍結保存液を用いて０．５×１０^７個以上／ｍｌ／バイアル（全血を原料とする場合は０．５×１０^６個以上／ｍｌ／バイアル）となるよう調製し、液体窒素下で凍結保存する。バイアルとは注射剤を入れる容器の1つであり、日本薬局方では密封容器に分類される。所望の効果を得るためには前記の濃度以上とすることが好ましい。ここまでが本願発明のＮＫＴ細胞を刺激する樹状細胞製剤の製造方法である。

＜実施形態１：ＮＫＴ細胞を刺激する樹状細胞製剤の効果＞
　本願発明のＮＫＴ細胞を刺激する樹状細胞製剤を採血した受益者へ使用した場合、受益者体内では、本願発明製剤がＶα２４－ＮＫＴ細胞を刺激し活性化させサイトカインの１種であるＩＦＮ－γを産生させることによって、アジュバンド作用が生じる。ＮＫ細胞は強くそのアジュバンド作用を受けて活性化し、細胞障害性応答によりがん細胞、または正常細胞以外の細胞を攻撃する。活性化ＮＫＴ細胞が体内の未成熟樹状細胞の成熟化を促すことにより獲得免疫系も活性化させる。自然免疫系および獲得免疫系の両方を活性化することによって、がんの治療のみならず、がんの予防、健常者の免疫力向上による疾病罹患の予防などにも効果がある。

　次に本願発明のＮＫＴ細胞を刺激する樹状細胞製剤を、前記製剤を製造するために単球を採取した受益者の体内に戻入した場合の効果を説明する。

＜実施形態１：本製剤の作用：体内への戻入　静脈内点滴＞
　未熟樹状細胞時にα―ガラクトシルセラミドをバルスされた後に成熟化した樹状細胞を含む本製剤が受益者体内に、静脈内点滴などの方法により戻入される。

＜実施形態１：本製剤の作用：Ｖα２４－ＮＫＴ細胞の活性化＞
　体内の血管を通り、本願発明製剤の樹状細胞は、取り込んだ糖脂質抗原であるα‐ガラクトシルセラミドをＣＤ１ｄというリガンドに結合し、体内のＶα２４―ＮＫＴ細胞へ提示する。体内のＶα２４―ＮＫＴ細胞は、受容体にα－ガラクトシルセラミドが結合し（抗原提示を受けて）活性化する。

＜実施形態１：本製剤の作用：活性化ＮＫＴ細胞：ＴＮＦ－α産生、血管新生阻害＞
　活性化したＶα２４－ＮＫＴ細胞はＴＮＦ－α（ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ－α：腫瘍壊死因子のひとつ）を産生し、未熟樹状細胞（未熟ＤＣ）を刺激する。同時にＴＮＦ－αにより、がん細胞に対し血管新生阻害を働きかける。

＜実施形態１：本製剤の作用：樹状細胞の成熟化と、獲得免疫系の活性化＞
　がん細胞又は死亡したがん細胞が放出したがん抗原であるネオアンチゲンを未成熟樹状細胞が貪食する。または活性化Ｖα２４－ＮＫＴ細胞からのＴＮＦ－αにて刺激された未成熟樹状細胞がネオアンチゲンを貪食する。ネオアンチゲンを貪食した樹状細胞はＴＮＦ－αの刺激の効果もあって成熟化する。成熟化した樹状細胞から刺激としてキラーＴ細胞とヘルパーＴ細胞が抗原提示を受ける。抗原提示を受けたヘルパーＴ細胞はＢ細胞をサイトカインで刺激する。刺激を受けたＢ細胞はがん細胞特異抗体を産生して放出する。

＜実施形態１：本製剤の作用：アポトーシス、細胞傷害活性＞
　活性化Ｖα２４－ＮＫＴ細胞が産生したＩＦＮ－γにより刺激を受けたＮＫ細胞は活性化する。そして活性化ＮＫ細胞、活性化Ｖα２４－ＮＫＴ細胞は、受益者自身の細胞ではないがん細胞（または病原体）に対して殺傷（細胞傷害性活性）したり、アポトーシスを促進させたりする攻撃を行う（自然免疫系）。一方前記Ｂ細胞から放出された抗体はがん細胞に結合する。キラーＴ細胞は、抗体が結合したがん細胞（病原体でもよい）の細胞膜に穴をあけてがん細胞を壊死（細胞障害性活性）させたり、ＴＮＦ－β（腫瘍壊死因子、サイトカインの1種）などの物質を産生しアポトーシスを促進させたりする攻撃を行う（獲得免疫系）。活性化ＮＫ細胞、活性化Ｖα２４－ＮＫＴ細胞からの攻撃（自然免疫系）は、本製剤静脈内点滴後１～２日で起きるが、キラーＴ細胞からの攻撃（獲得免疫系）は樹状細胞からの抗原提示後となるため、７～１４日後くらいと時間を要する。

　がん細胞への攻撃を行ったキラーＴ細胞や、ヘルパーＴ細胞は長期間生存することはできないが、前記Ｔ細胞の一部は、リンパ節などで記憶キラーＴ細胞や記憶ヘルパーＴ細胞として存在する（記憶を持つＴ細胞の複製と交換が行われ維持されると考えられている）。一旦がん細胞が消失した後であっても、再度同じ抗原を示すがん細胞が再発生した場合には、前記の記憶ヘルパーＴ細胞が前回の記憶を持つためにすぐに免疫細胞へ攻撃の指示を出し、キラーＴ細胞も迅速に反応できる。Ｔ細胞以外に、抗体を放出したＢ細胞も同様に記憶Ｂ細胞として存在し、再発時には速やかに抗体を放出することができる。

＜効果＞
　ＮＫＴ細胞を刺激する樹状細胞を製造することにより、受益者体内に戻した際には、自然免疫系の経路からＮＫ細胞を活性化させ、樹状細胞を刺激することにより間接的にヘルパーＴ細胞、キラーＴ細胞、Ｂ細胞を活性化することが期待できる。特異的ながんのみへの対応ではなく全体的な免疫力を向上させるために、がん発症により弱った受益者ががん以外の疾病へ罹患することを予防し、罹患しても軽く済んだり回復が早く済んだりすることも期待できる。がん治療以外にも、免疫力向上によるがん予防や、他の疾病予防に有効である。さらに本樹状細胞製剤は、受益者自身の細胞を基に培養した製剤であり、受益者専用であるため、拒絶反応はなく非常に安全性の高い製剤である。

＜実施形態２：概要＞主に請求項２
　本実施形態２では、実施形態１の樹状細胞製剤の製造方法を基礎として、（４）パルス工程は、（３）の分化工程にて所定の因子加えた日を０日として、３日乃至は４日目に行う。

＜実施形態２：（４）パルス工程：α―ガラクトシルセラミドのパルス＞
　実施形態１でのα―ガラクトシルセラミドのパルスタイミングよりも本実施形態２では早く、分化工程で所定の因子としてＧＭ－ＣＳＦとＩＬ－４を添加した日を０日とした時の３日目又は４日目のいずれかに、未成熟樹状細胞が優勢な培養容器中の液体培地へα―ガラクトシルセラミドをパルスする。α―ガラクトシルセラミドは、実施形態１と同様に協和キリン株式会社の型名ＫＲＮ７０００を使用した。

＜実施形態２：（４）パルス工程：最適なパルスタイミング＞
　本願発明の製造方法により製造した樹状細胞製剤は、Ｖα２４－ＮＫＴ細胞を刺激して活性化することで、ＩＦＮ－γなどのサイトカインを産生させ、免疫系の様々な担い手を活性化することを期待される。製剤の効能の判断として、本願発明の製剤に対し製造方法の（２）非接着細胞除去工程にて除去し、別途培養保存しておいた非接着細胞（リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞）など）を製剤完成後に加えて共培養を行い、リンパ球総数に対するＩＦＮ－γを産生するＮＫＴ細胞数の比率を調査する。パルスタイミングと、前記共培養後のＮＫＴ細胞数比率の関係を調査し、最適なパルスタイミングを求める。前記のパルスタイミングはそのようにして決定した。なお、非接着細胞を利用するのは、受益者に身体的負荷をかけないためであってそれ以外の意図はない。従って新たに受益者から末梢血を採血して、採血した末梢血に対して本願発明の製造方法によって製造された樹状細胞製剤を加えて同じ様に効果の比較確認を行ってもよい。また、共培養を行ってＮＫＴ細胞の全リンパ球に対して占める割合の増加具合の違いを観察したが、この観察から判明したことは、本願発明の樹状細胞製剤によってＮＫＴ細胞の増殖率（自己分裂増殖と考えられる）が左右されるということである。従って、本願請求項１に記載の（５）のステップは、単に請求項上「ＮＫＴ刺激樹状細胞誘導工程」とのみ記載しているが、別言すれば、「ＮＫＴ増殖刺激樹状細胞誘導工程」とも言えるものである。

　本実施形態では、単球から未成熟樹状細胞へ分化させるために所定の因子（例：ＧＭ－ＣＳＦとＩＬ－４）を添加した日を０日として、以下日単位で時間表記している。製剤完成後に製剤の効果確認のため、非接着細胞を加え共培養をおこなった。最適なパルスタイミング検証のため、採血した単球を三分割し、α―ガラクトシルセラミドのパルスタイミングが異なる樹状細胞製剤のサンプルを３つ準備した。それぞれ所定の因子添加後２日目（４８時間後）にα―ガラクトシルセラミド（濃度１００ｎｇ／ｍＬ）をパルスしたもの（条件１）、４日目（９６時間後）にパルスしたもの（条件２）、５日目（１２０時間後）にパルスしたもの（条件３）を作成した。

　本製剤の効果確認のため、単球を未成熟樹状細胞に導くための所定の因子添加日を０日とした６日目に非接着細胞を加え共培養を開始する。共培養開始日（共培養開始から０日）当日、共培養開始日から７日目、共培養開始日から１４日目の３回、リンパ球数に対するＮＫＴ細胞数比率を調査した。

　図１は上記のα―ガラクトシルセラミドのパルスタイミング条件（条件１～３）と、ＩＦＮ－γを産生するＮＫＴ細胞（非接着細胞に含まれていたもの）が共培養後のそれぞれのタイミングにおける全リンパ球数に対する比率の調査結果を示した図である。これはフローサイトメーターを利用して調査した結果である。３条件とも、共培養開始後７日目に、リンパ球数に対するＮＫＴ細胞数の比率が最大となった。また３条件中では単球から未成熟樹状細胞へ分化させるために所定の因子を添加した日を０日とした４日目にパルスした場合に、共培養後のＮＫＴ細胞数比率（％）が最大となった。最大となった共培養後７日目のＮＫＴ細胞数比率（％）と、所定の因子添加日を０日としたパルスタイミング（日）との関係を図２ａの散布図に示す。図２ａには二次式で近似した場合の近似曲線を前後にも補外して記載している。この近似曲線の決定係数は１であり、十分に参考となると考えられる。曲線のピークはパルスタイミング３日目と４日目の間にある（近似式から算出すると３．７日）。好ましい範囲はピーク値の－１０％までとなる、おおよそ２．５日目から５日目である。樹状細胞の寿命は数日から１週間程度であるため、あまり本製造方法での製造（単球採血から又は、単球を未成熟樹状細胞に分化させるための所定因子添加から成熟樹状細胞に成熟させるまで、即ち成熟樹状細胞に誘導するための：ＧＭ－ＣＳＦとＩＬ－４とＯＫ－４３２とＰＧＥ２：を添加するまでの期間、（なお、この後完全に成熟するまでの時間長は１０時間から２０時間程度であるのでその時間長分の工程を含めてもよい。）の工程を言う。本実験ではα―ガラクトシルセラミドのパルスタイミングは条件１から条件３で異なるが、ＧＭ－ＣＳＦとＩＬ－４とＯＫ－４３２とＰＧＥ２を添加するタイミングは一斉同時である）に長期間要すると製剤としての使用できる期間が短くなる。そのため培養開始から１週間以内に製剤を完成させることも考慮すると、より好ましくはピーク値の－５％までとなる範囲でもある３日目から４．５日目の間であり、３日目か４日目にパルスするのがよい。最も好ましいのは４日目にパルスを行うことである。

　α―ガラクトシルセラミドを成熟前の樹状細胞にパルスする場合、単球から未成熟樹状細胞への分化の為に所定の因子（例：ＧＭ－ＣＳＦとＩＬ－４）を添加した後、４日目または３日目のいずれかにパルスすることにより、製造された製剤は受益者体内で効果を最大に発揮できる。

＜実施形態３：概要＞主に請求項３
　本実施形態３では、実施形態１の樹状細胞製剤の製造方法を基礎として、（４）パルス工程は、（３）の分化工程にて所定の因子を加えてから６０時間後から１０８時間後までに行う。

＜実施形態３：（４）パルス工程：α―ガラクトシルセラミドのパルス＞
　実施形態１でのα―ガラクトシルセラミドのパルスタイミングよりも本実施形態３では早く、分化工程で所定の因子としてＧＭ－ＣＳＦとＩＬ－４添加した時点から６０時間後から１０８時間後までに、α―ガラクトシルセラミドをパルスする。α-ガラクトシルセラミドは、実施形態１と同様に協和キリン株式会社の型名ＫＲＮ７０００を使用した。

＜実施形態３：（４）パルス工程：最適なパルスタイミング＞
　本願発明の製造方法により製造した樹状細胞製剤は、Vα２４-ＮＫＴ細胞を刺激して活性化することで、ＩＦＮ－γなどのサイトカインを産生させ、免疫系の様々な担い手を活性化することを期待される。製剤の効能の判断として、本願発明の製剤に対し製造方法の（２）非接着細胞除去工程にて除去した非接着細胞（リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）など）を製剤完成後に加えて共培養を行い、ＩＦＮ－γを産生するＮＫＴ細胞数の比率を調査する。パルスタイミングと、前記共培養後のＮＫＴ細胞数比率の関係を調査し、最適なパルスタイミングを前記実施形態２と同様に求める。前記のパルスタイミングはそのようにして決定した。なお、非接着細胞を利用するのは、受益者に身体的負荷をかけないためであってそれ以外の意図はない。従って新たに受益者から末梢血を採血して、採血した末梢血に対して本願発明の製造方法によって製造された樹状細胞製剤を加えて同じ様に効果の比較確認を行ってもよい。また、共培養を行ってＮＫＴ細胞の全リンパ球に対して占める割合の増加具合の違いを観察したが、この観察から判明したことは、本願発明の樹状細胞製剤によってＮＫＴ細胞の増殖率（自己分裂増殖と考えられる）が左右されるということである。従って、本願請求項１に記載の（５）のステップは、単に請求項上「ＮＫＴ刺激樹状細胞誘導工程」とのみ記載しているが、別言すれば、「ＮＫＴ増殖刺激樹状細胞誘導工程」とも言えるものである。

　本実施形態では、単球から未成熟樹状細胞へ分化させるために所定の因子（例：ＧＭ－ＣＳＦとＩＬ－４）を添加した時を０時間として、以下時間単位で時間表記している。製剤完成後に、製剤の効果確認のため、非接着細胞を加え共培養を行った。最適なパルスタイミング検証のため、実施形態１の製造方法に基づいた製造方法を用いて、採血した単球を三分割しα―ガラクトシルセラミドのパルスタイミングのみが異なる樹状細胞製剤のサンプルを３種類準備した。それぞれ所定の因子添加後４８時間後（２日目）にα―ガラクトシルセラミド（濃度１００ｎｇ／ｍＬ）をパルスしたもの（条件１）、９６時間後（４日目）にパルスしたもの（条件２）、１２０時間後（５日目）にパルスしたもの（条件３）を作成した。

　本製剤の効果確認のため、単球を未成熟樹状細胞に導くための所定の因子添加から１４４時間後（６日目）に非接着細胞を加え共培養を開始した。共培養開始日（共培養開始から０日）当日、共培養開始から７日目、共培養開始から１４日目の３回、リンパ球数に対するＮＫＴ細胞数比率を調査した。

　図１は上記のα―ガラクトシルセラミドのパルスタイミング条件（条件１～３）と、ＩＦＮ－γを産生するＮＫＴ細胞（非接着細胞に含まれていたもの）が共培養後のそれぞれのタイミングにおける全リンパ球数に対する比率の調査結果を示した図である。これはフローサイトメーターを利用して調査した結果である。３条件とも、共培養開始後７日目に、リンパ球数に対するＮＫＴ細胞数の比率が最大となった。また３条件中では単球から未成熟樹状細胞へ分化させるために所定の因子添加から９６時間後（４日目）にパルスした場合にＮＫＴ細胞数比率（％）が最大となった。最大となった共培養後７日目のＮＫＴ細胞数比率（％）と、パルスタイミングとの関係を図２ｂの散布図に示す。図２ｂには二次式で近似した場合の近似曲線を前後にも補外して記載している。この近似曲線の決定係数は１であり、十分に参考となると考えられる。曲線のピークはパルスタイミング７０時間後と９６時間後の間にある（近似式から計算すると９０ｈ）。

　好ましい範囲はピーク値の－１０％までとなる、おおよそ６０時間後から１１８時間後までである。樹状細胞の寿命は数日から１週間（１６８ｈまで）程度であるため、あまり本製造方法での製造（単球採血から又は、単球を未成熟樹状細胞に分化させるための所定因子添加から成熟樹状細胞に成熟させるまで、即ち成熟樹状細胞に誘導するための：ＧＭ－ＣＳＦとＩＬ－４とＯＫ－４３２とＰＧＥ２：を添加するまでの期間、（なお、この後完全に成熟するまでの時間長は１０時間から２０時間程度であるのでその時間長分の工程を含めてもよい。）の工程を言う。本実験ではα―ガラクトシルセラミドのパルスタイミングは条件１から条件３で異なるが、ＧＭ－ＣＳＦとＩＬ－４とＯＫ－４３２とＰＧＥ２を添加するタイミングは一斉同時である）に長期間かかると製剤としての使用期間が短くなる。そのため培養開始から１週間以内に製剤を完成させることも考慮すると、６０時間後から１０８時間後までにパルスすることが好ましい。より好ましくはピーク値の－５％となる範囲である７０時間後から１０８時間後までにパルスすることである。

　α―ガラクトシルセラミドを成熟前の樹状細胞にパルスする場合、単球から未成熟樹状細胞への分化の為に所定の因子（例：ＧＭ－ＣＳＦとＩＬ－４）を添加した後、６０時間後から１０８時間後までにパルスすることにより、製造された製剤は受益者体内で効果を最大に発揮できる。

＜実施形態４：概要＞主に請求項４
　本実施形態４では、実施形態１の樹状細胞製剤の製造方法を基礎として、（４）パルス工程は、（１）の接着工程にて受益者から採取された単球を培養容器に入れた日を０日として、４日目乃至は５日目までに行う。

＜実施形態４：（４）パルス工程：α―ガラクトシルセラミドのパルス＞
　実施形態１でのα―ガラクトシルセラミドのパルスタイミングよりも本実施形態４では早く、受益者から採取された単球を培養容器に入れた日を０日として、４日目乃至は５日目までに、α―ガラクトシルセラミドをパルスする。α-ガラクトシルセラミドは、実施形態１同様に協和キリン株式会社の型名ＫＲＮ７０００を使用した。

＜実施形態４：（４）パルス工程：最適なパルスタイミング＞
　本願発明の製造方法により製造した樹状細胞製剤は、Vα２４－ＮＫＴ細胞を刺激して活性化し、ＩＦＮ－γを産生し、免疫系の様々な担い手を活性化することを期待される。製剤の効能の判断として、本願発明の製剤に対し製造方法の（２）非接着細胞除去工程にて除去した非接着細胞（リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）など）を製剤完成後に加えて共培養を行い、ＩＦＮ－γを産生するＮＫＴ細胞数の比率を調査する。パルスタイミングと、前記共培養後のＮＫＴ細胞数比率の関係を調査し、最適なパルスタイミングを求める。前記のパルスタイミングはそのようにして決定した。なお、非接着細胞を利用するのは、受益者に身体的負荷をかけないためであってそれ以外の意図はない。従って新たに受益者から末梢血を採血して、採血した末梢血に対して本願発明の製造方法によって製造された樹状細胞製剤を加えて同じ様に効果の比較確認を行ってもよい。また、共培養を行ってＮＫＴ細胞の全リンパ球に対して占める割合の増加具合の違いを観察したが、この観察から判明したことは、本願発明の樹状細胞製剤によってＮＫＴ細胞の増殖率（自己分裂増殖と考えられる）が左右されるということである。従って、本願請求項１に記載の（５）のステップは、単に請求項上「ＮＫＴ刺激樹状細胞誘導工程」とのみ記載しているが、別言すれば、「ＮＫＴ増殖刺激樹状細胞誘導工程」とも言えるものである。

　本実施形態では、受益者から採取された単球を培養容器に入れ培養開始した時を起点として、以下日単位で時間表記している。製剤完成後、製剤の効果確認のため、非接着細胞を加え共培養を行った。最適なパルスタイミング検証のため、実施形態１の製造方法に基づいた製造方法を用いて、採血した単球を三分割しα―ガラクトシルセラミドのパルスタイミングのみが異なる樹状細胞製剤のサンプルを３種類準備した。それぞれ受益者から採取された単球を培養容器に入れたときから３日後（７２時間後）にα―ガラクトシルセラミド（濃度１００ｎｇ／ｍＬ）をパルスしたもの（条件１）、５日後（１２０時間後）にパルスしたもの（条件２）、６日後（１４４時間後）にパルスしたもの（条件３）を作成した。なおこの実験では、受益者から採取された単球を培養容器に入れた２４時間後に単球を未成熟樹状細胞へと分化させるための所定の因子としてＧＭ－ＣＳＦとＩＬ－４を添加した。

　本製剤の効果確認のため、受益者から採取された単球を培養容器に入れた日を０日として、７日目に非接着細胞を加え共培養を開始する。共培養開始日（共培養開始から０日）、共培養開始から７日目、共培養開始から１４日目の３回、リンパ球数に対するＮＫＴ細胞数比率を調査した。

　図３は上記のα―ガラクトシルセラミドのパルスタイミング条件（条件１～３）と、ＩＦＮ－γを産生するＮＫＴ細胞（非接着細胞に含まれていたもの）が共培養後のそれぞれのタイミングにおける全リンパ球数に対する比率の調査結果を示した図である。これはフローサイトメーターを利用して調査した結果である。３条件とも、共培養開始後７日目に、リンパ球数に対するＮＫＴ細胞数の比率が最大となった。また３条件中では培養開始後５日目にパルスした場合にＮＫＴ細胞数比率（％）が最大となった。最大となった共培養後７日目のＮＫＴ細胞数比率（％）と、パルスタイミングとの関係を図４ａの散布図に示す。図４ａには二次式で近似した場合の近似曲線を前後にも補外して記載している。この近似曲線の決定係数は１であり、十分に参考となると考えられる。曲線のピークは培養開始を０日として、４日目と５日目の間にある（近似式から計算すると４．７日）。好ましい範囲はピーク値の－１０％までとなる、おおよそ３．５日目から６日目である。樹状細胞の寿命は数日から１週間程度であるため、あまり本製造方法での製造（単球採血から又は、単球を未成熟樹状細胞に分化させるための所定因子添加から成熟樹状細胞に成熟させるまで、即ち成熟樹状細胞に誘導するための：ＧＭ－ＣＳＦとＩＬ－４とＯＫ－４３２とＰＧＥ２：を添加するまでの期間、（なお、この後完全に成熟するまでの時間長は１０時間から２０時間程度であるのでその時間長分の工程を含めてもよい。）の工程を言う。本実験ではα―ガラクトシルセラミドのパルスタイミングは条件１から条件３で異なるが、ＧＭ－ＣＳＦとＩＬ－４とＯＫ－４３２とＰＧＥ２を添加するタイミングは一斉同時である）に長期間かかると製剤としての使用期間が短くなる。そのため培養開始から１週間以内に製剤を完成させることも考慮すると、好ましくはピークの－５％となる範囲でもある３．９日目から５．５日目の間である。最も好ましいのは５日目にパルスを行うことである。

　α―ガラクトシルセラミドを成熟前の樹状細胞にパルスする場合、受益者から採取された単球を培養容器に入れた日を０日として、４日目または５日目にパルスすることにより、製造された製剤は受益者体内で効果を最大に発揮できる。

＜実施形態５：概要＞主に請求項５
　本実施形態５では、実施形態１の樹状細胞製剤の製造方法を基礎として、（４）パルス工程は、（１）の接着工程にて受益者から採取された単核球を培養容器に入れてから８４時間後乃至は１３２時間後に行う。

＜実施形態５：（４）パルス工程：α―ガラクトシルセラミドのパルス＞
　実施形態１でのα―ガラクトシルセラミドのパルスタイミングよりも本実施形態５では早く、受益者から採取された単球を培養容器に入れた時から８４時間後乃至は１３２時間後の間に、α―ガラクトシルセラミドをパルスする。α-ガラクトシルセラミドは、実施形態１同様に協和キリン株式会社の型名ＫＲＮ７０００を使用した。

＜実施形態５：（４）パルス工程：最適なパルスタイミング＞
　本願発明の製造方法により製造した樹状細胞製剤は、Ｖα２４－ＮＫＴ細胞を刺激して活性化し、ＩＦＮ－γを産生し、免疫系の様々な担い手を活性化することを期待される。製剤の効能の判断として、本願発明の製剤に対し製造方法の（２）非接着細胞除去工程にて除去した非接着細胞（リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）など）を製剤完成後に加えて共培養を行い、ＩＦＮ－γを産生するＮＫＴ細胞数の比率を調査する。前記実施形態４と同様にパルスタイミングと、前記共培養後のＮＫＴ細胞数比率の関係を調査し、最適なパルスタイミングを求める。前記のパルスタイミングはそのようにして決定した。なお、非接着細胞を利用するのは、受益者に身体的負荷をかけないためであってそれ以外の意図はない。従って新たに受益者から末梢血を採血して、採血した末梢血に対して本願発明の製造方法によって製造された樹状細胞製剤を加えて同じ様に効果の比較確認を行ってもよい。また、共培養を行ってＮＫＴ細胞の全リンパ球に対して占める割合の増加具合の違いを観察したが、この観察から判明したことは、本願発明の樹状細胞製剤によってＮＫＴ細胞の増殖率（自己分裂増殖と考えられる）が左右されるということである。従って、本願請求項１に記載の（５）のステップは、単に請求項上「ＮＫＴ刺激樹状細胞誘導工程」とのみ記載しているが、別言すれば、「ＮＫＴ増殖刺激樹状細胞誘導工程」とも言えるものである。

　本実施形態では、受益者から採取された単球を培養容器に入れ培養開始した時を起点として、以下時間で時間表記している。製剤完成後、製剤の効果確認のため非接着細胞を加え共培養を行った。最適なパルスタイミングを検証するため、実施形態１の製造方法に基づいた製造方法を用いて、採血した単球を三分割しα―ガラクトシルセラミドのパルスタイミングのみが異なる樹状細胞製剤のサンプルを３種類準備した。それぞれ受益者から採取された単球を培養容器に入れたとき（培養開始）から７２時間後（３日後）にα―ガラクトシルセラミド（濃度１００ｎｇ／ｍＬ）をパルスしたもの（条件１）、１２０時間後（５日後）にパルスしたもの（条件２）、１４４時間後（６日後）にパルスしたもの（条件３）を作成する。なおこの実験では、受益者から採取された単球を培養容器に入れた２４時間後に単球を未成熟樹状細胞へと分化させるための所定の因子としてＧＭ－ＣＳＦとＩＬ－４を添加した。

　本製剤の効果確認のため、受益者から採取された単核球を培養容器に入れた時から１６８時間後に非接着細胞を加え共培養を開始する。共培養開始日（共培養開始から０日）、共培養開始から７日目、共培養開始から１４日目の３回、リンパ球数に対するＮＫＴ細胞数比率を調査した。

　図３は上記のα―ガラクトシルセラミドのパルスタイミング条件（条件１～３）と、ＩＦＮ－γを産生するＮＫＴ細胞（非接着細胞に含まれていたもの）が共培養後の夫々のタイミングにおける全リンパ球数に対する比率の調査結果を示した図である。これはフローサイトメーターを利用して調査した結果である。３条件とも、共培養開始後７日目に、リンパ球数に対するＮＫＴ細胞数の比率が最大となった。また３条件中ではこれはフローサイトメーターを利用して調査した結果である。培養開始後５日目にパルスした場合に、共培養開始後７日目のＮＫＴ細胞数比率（％）が最大となった。最大となった共培養後７日目のＮＫＴ細胞数比率（％）と、パルスタイミングとの関係を図４ｂの散布図に示す。図４ｂには二次式で近似した場合の近似曲線を前後にも補外し記載している。この近似曲線の決定係数は１であり、十分に参考となると考えられる。曲線のピークは９６時間後（培養開始を０日とした４日目）と１２０時間後（培養開始を０日とした５日目）の間（約１１４時間後）にある。好ましい範囲はピーク値の－１０％までとなる、おおよそ８４時間後から１４３時間後である。樹状細胞の寿命は数日から１週間（１６８時間）程度であるため、あまり本製造方法での製造（単球採血から又は、単球を未成熟樹状細胞に分化させるための所定因子添加から成熟樹状細胞に成熟させるまで、即ち成熟樹状細胞に誘導するための：ＧＭ－ＣＳＦとＩＬ－４とＯＫ－４３２とＰＧＥ２：を添加するまでの期間、（なお、この後完全に成熟するまでの時間長は１０時間から２０時間程度であるのでその時間長分の工程を含めてもよい。）の工程を言う。本実験ではα―ガラクトシルセラミドのパルスタイミングは条件１から条件３で異なるが、ＧＭ－ＣＳＦとＩＬ－４とＯＫ－４３２とＰＧＥ２を添加するタイミングは一斉同時である）に長期間かかると製剤としての使用期間が短くなる。そのため培養開始から１週間以内に製剤を完成させるために、８４時間後から１３２時間後までにパルスすることが好ましい。より好ましくはピークの－５％となる範囲でもある９４時間後から１３２時間後までにパルスを行うことである。

　α―ガラクトシルセラミドを成熟前の樹状細胞にパルスする場合、受益者から採取された単球を培養容器に入れてから８４時間後から１３２時間後までにパルスすることにより、製造された製剤は受益者体内で効果を最大に発揮できる。

＜実施形態６：概要＞主に請求項６
　本実施形態６では、実施形態１の樹状細胞製剤の製造方法を基礎として、（４）パルス工程は、（２）の非接着細胞除去工程にて培養容器の内面に接着した細胞以外の単球を含む非接着細胞を除去した日を０日として、４日目乃至は５日目に行う。

＜実施形態６：（４）パルス工程：α―ガラクトシルセラミドのパルス＞
　実施形態１でのα―ガラクトシルセラミドのパルスタイミングよりも本実施形態６では早く、（２）の非接着細胞除去工程にて培養容器の内面に接着した細胞以外の単球を含む非接着細胞を除去した日を０日として、４日目乃至は５日目までに、α―ガラクトシルセラミドをパルスする。α-ガラクトシルセラミドは、実施形態１同様に協和キリン株式会社の型名ＫＲＮ７０００を使用した。

＜実施形態６：（４）パルス工程：最適なパルスタイミング＞
　本願発明の製造方法により製造した樹状細胞製剤は、Vα２４－ＮＫＴ細胞を刺激して活性化し、ＩＦＮ－γを産生し、免疫系の様々な担い手を活性化することを期待される。製剤の効能の判断として、本願発明の製剤に対し製造方法の（２）非接着細胞除去工程にて除去した非接着細胞（リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）など）を製剤完成後に加えて共培養を行い、ＩＦＮ－γを産生するＮＫＴ細胞数の比率を調査する。パルスタイミングと、前記共培養後のＮＫＴ細胞数比率の関係を調査し、最適なパルスタイミングを求める。前記のパルスタイミングはそのようにして決定した。なお、非接着細胞を利用するのは、受益者に身体的負荷をかけないためであってそれ以外の意図はない。従って新たに受益者から末梢血を採血して、採血した末梢血に対して本願発明の製造方法によって製造された樹状細胞製剤を加えて同じ様に効果の比較確認を行ってもよい。また、共培養を行ってＮＫＴ細胞の全リンパ球に対して占める割合の増加具合の違いを観察したが、この観察から判明したことは、本願発明の樹状細胞製剤によってＮＫＴ細胞の増殖率（自己分裂増殖と考えられる）が左右されるということである。従って、本願請求項１に記載の（５）のステップは、単に請求項上「ＮＫＴ刺激樹状細胞誘導工程」とのみ記載しているが、別言すれば、「ＮＫＴ増殖刺激樹状細胞誘導工程」とも言えるものである。

　本実施形態では、（２）の非接着細胞除去工程にて培養容器の内面に接着した細胞以外の単球を含む非接着細胞を除去した時を起点として、以下日単位で時間表記している。製剤完成後、製剤の効果確認のため、非接着細胞を加え共培養を行った。最適なパルスタイミング検証のため、実施形態１の製造方法に基づいた製造方法を用いて、採血した単球を三分割しα―ガラクトシルセラミドのパルスタイミングのみが異なる樹状細胞製剤のサンプルを３種類準備した。それぞれ（２）の非接着細胞除去工程にて培養容器の内面に接着した細胞以外の単球を含む非接着細胞を除去した時から３日後（７２時間後）にα―ガラクトシルセラミド（濃度１００ｎｇ／ｍＬ）をパルスしたもの（条件１）、５日後（１２０時間後）にパルスしたもの（条件２）、６日後（１４４時間後）にパルスしたもの（条件３）を作成した。なおこの実験では、（２）の非接着細胞除去工程にて培養容器の内面に接着した細胞以外の単球を含む非接着細胞を除去した２４時間後に単球を未成熟樹状細胞へと分化させるための所定の因子としてＧＭ－ＣＳＦとＩＬ－４を添加した。

　本製剤の効果確認のため、（２）の非接着細胞除去工程にて培養容器の内面に接着した細胞以外の単球を含む非接着細胞を除去した日を０日として、７日目に非接着細胞を加え共培養を開始する。共培養開始日（共培養開始から０日）、共培養開始から７日目、共培養開始から１４日目の３回、リンパ球数に対するＮＫＴ細胞数比率を調査した。

　図３は上記のα―ガラクトシルセラミドのパルスタイミング条件（条件１～３）と、ＩＦＮ－γを産生するＮＫＴ細胞（非接着細胞に含まれていたもの）が共培養後のそれぞれのタイミングにおける全リンパ球数に対する比率の調査結果を示した図である。図３右横の条件の「培養開始してから」を、「（２）の非接着細胞除去工程にて培養容器の内面に接着した細胞以外の単球を含む非接着細胞を除去してから」に読み替える。図３はフローサイトメーターを利用して調査した結果である。３条件とも、共培養開始後７日目に、リンパ球数に対するＮＫＴ細胞数の比率が最大となった。また３条件中では非接着細胞除去後５日目にパルスした場合にＮＫＴ細胞数比率（％）が最大となった。最大となった共培養後７日目のＮＫＴ細胞数比率（％）と、パルスタイミングとの関係を図４ａの散布図に示す。図４ａには二次式で近似した場合の近似曲線を前後にも補外して記載している。この近似曲線の決定係数は１であり、十分に参考となると考えられる。曲線のピークは非接着細胞を除去した日を０日として、４日目と５日目の間にある（近似式から計算すると４．７日）。好ましい範囲はピーク値の－１０％までとなる、おおよそ３．５日目から６日目である。樹状細胞の寿命は数日から１週間程度であるため、あまり本製造方法での製造（単球採血から又は、単球を未成熟樹状細胞に分化させるための所定因子添加から成熟樹状細胞に成熟させるまで、即ち成熟樹状細胞に誘導するための：ＧＭ－ＣＳＦとＩＬ－４とＯＫ－４３２とＰＧＥ２：を添加するまでの期間、（なお、この後完全に成熟するまでの時間長は１０時間から２０時間程度であるのでその時間長分の工程を含めてもよい。）の工程を言う。本実験ではα―ガラクトシルセラミドのパルスタイミングは条件１から条件３で異なるが、ＧＭ－ＣＳＦとＩＬ－４とＯＫ－４３２とＰＧＥ２を添加するタイミングは一斉同時である）に長期間かかると製剤としての使用期間が短くなる。そのため非接着細胞除去から１週間以内に製剤を完成させることも考慮すると、好ましくはピークの－５％となる範囲でもある３．９日目から５．５日目の間である。最も好ましいのは５日目にパルスを行うことである。

　α―ガラクトシルセラミドを成熟前の樹状細胞にパルスする場合、（２）の非接着細胞除去工程にて培養容器の内面に接着した細胞以外の単球を含む非接着細胞を除去した日として、４日目または５日目にパルスすることにより、製造された製剤は受益者体内で効果を最大に発揮できる。

＜実施形態７：概要＞主に請求項７
　本実施形態７では、実施形態１の樹状細胞製剤の製造方法を基礎として、（４）パルス工程は、（２）の非接着細胞除去工程にて培養容器の内面に接着した細胞以外の単球を含む非接着細胞を除去してから８４時間後から１３２時間後までに行う。

＜実施形態７：（４）パルス工程：α―ガラクトシルセラミドのパルス＞
　実施形態１でのα―ガラクトシルセラミドのパルスタイミングよりも本実施形態７では早く、（２）の非接着細胞除去工程にて培養容器の内面に接着した細胞以外の単球を含む非接着細胞を除去してから８４時間後から１３２時間後までの間に、α―ガラクトシルセラミドをパルスする。α-ガラクトシルセラミドは、実施形態１同様に協和キリン株式会社の型名ＫＲＮ７０００を使用した。

＜実施形態７：（４）パルス工程：最適なパルスタイミング＞
　本願発明の製造方法により製造した樹状細胞製剤は、Ｖα２４－ＮＫＴ細胞を刺激して活性化し、ＩＦＮ－γを産生し、免疫系の様々な担い手を活性化することを期待される。製剤の効能の判断として、本願発明の製剤に対し製造方法の（２）非接着細胞除去工程にて除去した非接着細胞（リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）など）を製剤完成後に加えて共培養を行い、ＩＦＮ－γを産生するＮＫＴ細胞数の比率を調査する。前記実施形態６と同様にパルスタイミングと、前記共培養後のＮＫＴ細胞数比率の関係を調査し、最適なパルスタイミングを求める。前記のパルスタイミングはそのようにして決定した。なお、非接着細胞を利用するのは、受益者に身体的負荷をかけないためであってそれ以外の意図はない。従って新たに受益者から末梢血を採血して、採血した末梢血に対して本願発明の製造方法によって製造された樹状細胞製剤を加えて同じ様に効果の比較確認を行ってもよい。また、共培養を行ってＮＫＴ細胞の全リンパ球に対して占める割合の増加具合の違いを観察したが、この観察から判明したことは、本願発明の樹状細胞製剤によってＮＫＴ細胞の増殖率（自己分裂増殖と考えられる）が左右されるということである。従って、本願請求項１に記載の（５）のステップは、単に請求項上「ＮＫＴ刺激樹状細胞誘導工程」とのみ記載しているが、別言すれば、「ＮＫＴ増殖刺激樹状細胞誘導工程」とも言えるものである。

　本実施形態では、（２）の非接着細胞除去工程にて培養容器の内面に接着した細胞以外の単球を含む非接着細胞を除去した時を起点として、以下時間で時間表記している。製剤完成後、製剤の効果確認のため非接着細胞を加え共培養を行った。最適なパルスタイミングを検証するため、実施形態１の製造方法に基づいた製造方法を用いて、採血した単球を三分割しα―ガラクトシルセラミドのパルスタイミングのみが異なる樹状細胞製剤のサンプルを３種類準備した。それぞれ非接着細胞を除去した時から７２時間後（３日後）にα―ガラクトシルセラミド（濃度１００ｎｇ／ｍＬ）をパルスしたもの（条件１）、１２０時間後（５日後）にパルスしたもの（条件２）、１４４時間後（６日後）にパルスしたもの（条件３）を作成する。なおこの実験では、非接着細胞を除去した２４時間後に単球を未成熟樹状細胞へと分化させるための所定の因子としてＧＭ－ＣＳＦとＩＬ－４を添加した。

　本製剤の効果確認のため、非接着細胞を除去した時から１６８時間後に非接着細胞を加え共培養を開始する。共培養開始日（共培養開始から０日）、共培養開始から７日目、共培養開始から１４日目の３回、リンパ球数に対するＮＫＴ細胞数比率を調査した。

　図３は上記のα―ガラクトシルセラミドのパルスタイミング条件（条件１～３）と、ＩＦＮ－γを産生するＮＫＴ細胞（非接着細胞に含まれていたもの）が共培養後の夫々のタイミングにおける全リンパ球数に対する比率の調査結果を示した図である。図３右横の条件の「培養開始してから」を、「（２）の非接着細胞除去工程にて培養容器の内面に接着した細胞以外の単球を含む非接着細胞を除去してから」に読み替える。図３はフローサイトメーターを利用して調査した結果である。３条件とも、共培養開始後７日目に、リンパ球数に対するＮＫＴ細胞数の比率が最大となった。また３条件中ではこれはフローサイトメーターを利用して調査した結果である。非接着細胞除去後５日目にパルスした場合に、共培養開始後７日目のＮＫＴ細胞数比率（％）が最大となった。最大となった共培養後７日目のＮＫＴ細胞数比率（％）と、パルスタイミングとの関係を図４ｂの散布図に示す。図４ｂには二次式で近似した場合の近似曲線を前後にも補外し記載している。この近似曲線の決定係数は１であり、十分に参考となると考えられる。曲線のピークは９６時間後（非接着細胞除去した日を０日とした４日目）と１２０時間後（非接着細胞除去した日を０日とした５日目）の間（約１１４時間後）にある。好ましい範囲はピーク値の－１０％までとなる、おおよそ８４時間後から１４３時間後である。樹状細胞の寿命は数日から１週間（１６８時間）程度であるため、あまり本製造方法での製造（単球採血から又は、単球を未成熟樹状細胞に分化させるための所定因子添加から成熟樹状細胞に成熟させるまで、即ち成熟樹状細胞に誘導するための：ＧＭ－ＣＳＦとＩＬ－４とＯＫ－４３２とＰＧＥ２：を添加するまでの期間、（なお、この後完全に成熟するまでの時間長は１０時間から２０時間程度であるのでその時間長分の工程を含めてもよい。）の工程を言う。本実験ではα―ガラクトシルセラミドのパルスタイミングは条件１から条件３で異なるが、ＧＭ－ＣＳＦとＩＬ－４とＯＫ－４３２とＰＧＥ２を添加するタイミングは一斉同時である）に長期間かかると製剤としての使用期間が短くなる。そのため培養開始から１週間以内に製剤を完成させるために、８４時間後から１３２時間後までにパルスすることが好ましい。より好ましくはピークの－５％となる範囲でもある９４時間後から１３２時間後までにパルスを行うことである。

　α―ガラクトシルセラミドを成熟前の樹状細胞にパルスする場合、非接着細胞を除去してから８４時間後から１３２時間後までにパルスすることにより、製造された製剤は受益者体内で効果を最大に発揮できる。

＜実施形態８：概要＞主に請求項８
　未成熟樹状細胞へ、Ｖα２４－ＮＫＴ細胞を刺激する樹状細胞であるＮＫＴ刺激樹状細胞を誘導するためにパルスする、α―ガラクトシルセラミドの濃度を３００ｎｇ／ｍＬ～１０００ｎｇ／ｍＬとする。以下本実施形態では、受益者から採取された単球を培養容器に入れた日を０日としてα―ガラクトシルセラミドのパルスタイミングを記載する。本実施形態ではα―ガラクトシルセラミドのパルスタイミングは実施形態５を元に培養開始から１２０時間後とする。なおパルスタイミングは培養開始から８４時間後～１３２時間後の間でもよいし、実施形態４で説明したように単核球を培養容器に入れて培養開始した日を０日として４日後ないしは５日後にパルスしてもよい。または実施形態２、３で説明したように分化工程において所定の因子を添加した日を０日として３日乃至は４日目にパルスするか、所定の因子を加えてから６０時間後乃至は１０８時間後までにパルスしてもよい。または前記実施形態６、７のように、非接着細胞を培養容器から除去した日を０日として４日目乃至は５日目にパルスするか、非接着細胞を除去してから８４時間後から１３２時間後の間にパルスしてもよい。

＜実施形態８：（４）パルス工程：最適なパルス量＞
　本実施形態８では、前記実施形態５の製造方法に準じて製造するが、実施形態５との相違は、パルスするα―ガラクトシルセラミドの濃度を３００ｎｇ／ｍＬ～１０００ｎｇ／ｍＬとする点である。本実施形態８では、受益者から採取された単球を培養容器に入れたタイミングである培養開始から１２０時間後にα―ガラクトシルセラミドをパルスした。

　本願発明の製造方法により製造した樹状細胞製剤は、Ｖα２４－ＮＫＴ細胞を刺激して活性化させてＩＦＮ－γを産生することにより、免疫系の様々な担い手を活性化することを期待される。製剤の効能の判断として、本願発明の製剤に対し製造方法の（２）非接着細胞除去工程にて除去し、別途培養保存しておいた非接着細胞（リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞）など）を製剤完成後に加えて共培養を行い、パルスするα―ガラクトシルセラミドの濃度と、共培養後に培養された非接着細胞中のＮＫＴ細胞からＩＦＮ－γが産生された量（濃度）の関係を調査し、効果として確認する。前記のパルス量の範囲はそのようにして決定したものである。

　本実施形態では、受益者から採取された単球を培養容器に入れ培養開始した時を起点として、以下時間単位で時間表記している。製剤完成後、製剤の効果確認のため、非接着細胞を加え共培養を行った。最適なパルス濃度を検証するため、採血した単球を４分割し、α―ガラクトシルセラミドのパルスタイミングが異なる樹状細胞製剤のサンプルを４つ準備した。受益者から採取された単球を培養容器に入れ培養開始したときから１２０時間後に、それぞれ、条件１：濃度０ｎｇ／ｍＬ、条件２：１００ｎｇ／ｍＬ、条件３：３００ｎｇ／ｍＬ、条件４：１０００ｎｇ／ｍＬのα―ガラクトシルセラミドをパルスした。
　本製剤の効果確認（ＩＦＮ－γ産生濃度評価）のため、培養開始した時から１６８時間後に、非接着細胞を加え共培養を開始した。共培養開始した日を０日とした０日目（共培養開始した日）当日、２日目、４日目、７日目、１４日目にそれぞれの条件の試料に対しＩＦＮ－γ産生量を調査した。

　ＩＦＮ-γの測定にはＥＬＩＳＡ法により、ＢＩＯＬＥＧＥＮＤ社のＥＬＩＳＡ　ＭＡＸ　Ｄｅｌｕｘｅ　Ｓｅｔ　Ｈｕｍａｎ　ＩＦＮ－γを使用して行った。

　図５は、受益者から採取された単球を培養容器に入れ培養開始したときから１２０時間後にパルスしたα―ガラクトシルセラミドの濃度と、非接着細胞と共培養開始してから０（当日）、２、４、７、１４日目時点でのＩＦＮ－γの濃度を測定した結果の関係を示す図である。横軸が共培養した日数、縦軸がＩＦＮ－γ濃度（ｐｇ／ｍＬ）である。前記のように条件１～４ではパルスしたα―ガラクトシルセラミドの濃度を０～１０００ｎｇ／ｍＬで４段階に振って実験した。図５に示すように、条件１（０ｎｇ／ｍＬ）と条件２（１００ｎｇ／ｍＬ）では共培養開始から７日目にＩＦＮ－γの産生濃度のピークがある。条件３（３００ｎｇ／ｍＬ）と条件４（１０００ｎｇ／ｍＬ）は４日目に産生濃度のピークがありピーク値は条件２（１００ｎｇ／ｍＬ）と同等である。条件３（３００ｎｇ／ｍＬ）と条件４（１０００ｎｇ／ｍＬ）は、先行技術（特許文献１、以下同じ）で開示された実施形態１の濃度条件（１００ｎｇ／ｍＬ）と同じパルス濃度での産生濃度のピークが３日早まる結果となり、早く効を奏することが分かった。このようにパルスするα―ガラクトシルセラミドの濃度は３００ｎｇ／ｍＬ未満ではIＦＮ－γの産生ピークが遅くなり、１０００ｎｇ／ｍＬを超える濃度をパルスしても１０００ｎｇ／ｍＬと結果は同様であってα―ガラクトシルセラミドが無駄となる。そのため最適なα―ガラクトシルセラミドの濃度は３００ｎｇ／ｍＬ以上、１０００ｎｇ／ｍＬ以下であることが分かった。
　また、後記する先行技術（特許文献１）との比較実験において、同濃度のα―ガラクトシルセラミドをパルスした場合、成熟樹状細胞に対してパルスする先行技術（特許文献１）に対し、未成熟樹状細胞に対してパルスする本願発明のほうが約４倍のIＦＮ-γ産生濃度を得ることができた。先行技術よりも多くのＩＦＮ－γを作り出すことができ、免疫系をより活性化してより大きな抗がん作用を奏することが期待できる。

　本実施形態により、本製造方法の製剤は受益者体内において、ＩＦＮ－γの産生ピークを他条件と同等のピーク値のまま、早めることができ、より早く抗がん作用を奏することが期待できる。また先行技術よりも高いＩＦＮ－γ産生濃度が得られ、より大きな抗がん作用を奏することも期待できる。

＜実施形態９：概要＞主に請求項９、１０
　実施形態１から実施形態８で示した製造方法によって製造される樹状細胞製剤のいずれか一を加えた受益者の血液である。

　前記実施形態１において説明したように、受益者の血液に対して本製剤を加えると、ＮＫＴ細胞を刺激して自然免疫系を活性化（免疫力向上）することに続いて、獲得免疫系をも刺激して活性化させる効果がある。受益者の血液に対して免疫力向上の効果がある。

　受益者の血液を体外へ取り出し、本製剤を加えて加工してもよい。加工した血液（本製剤も含む）を受益者に戻入することで、受益者の免疫力向上が期待できる。または本製剤を受益者体内へ戻入させ、体内の血液に加えて免疫力向上を図ってもよい。なお、受益者の血液に、受益者に輸血可能な血液を加えたものである受益者の準血液によって上記受益者の血液を置き換えてもよい。

＜人体への適用結果＞
　本願発明の実施形態４の条件（採血日に培養開始し非接着細胞を除去し、培養開始後２４時間後にＧＭ－ＣＳＦとＩＬ－４添加し、同５日目にα―ガラクトシルセラミドを３００ｎg／ｍＬパルス）で製造した樹状細胞製剤を、受益者２名へ投与した。本願発明の樹状細胞製剤が体内でどのように効を奏すかは上述している。ＮＫＴ細胞を活性化させＩＦＮ－γの産生を通じて他の様々な免疫をつかさどる細胞を活性化する。特にＮＫ細胞へは大きく影響を及ぼすため、効果投与後のＮＫ活性値とＩＦＮ－γ量を調べた。その結果を図６に示す。２名の受益者へ投与し一人は皮下注射（表上段）、もう一人は点滴にて投与（表下段）した結果である。ＮＫ活性値はＮＫ細胞が活性化したこと
を示す数値である。ＮＫ活性は投与後３日目以降増加し７日目もまだ投与前よりも高い数値である。ＩＦＮ－γの計測下限は０．１であり、通常は０．１以下である。ＩＦＮ－γの計測結果は初日（０日）０．１となっているが、投与後２日目にピークとなり、両人とも大きく数字が増えている。本樹状細胞製剤が目的としたＮＫＴ細胞を活性化しＩＦＮ－γの産生量を早く増やし、ＮＫ細胞をも活性化させるということを達成したことを示す。

＜先行技術との比較：概要＞
　先行技術では、明細書中ではＩＦＮ－γの産生量（産生濃度）について記載されていない。そのため本願発明の発明者が、先行技術である特許文献１に記載の細胞組成物（本願の樹状細胞製剤に相当）の製造方法に倣って細胞組成物を試作し、ＮＫＴ細胞を含む非接着細胞と共培養後のＩＦＮ－γ生成濃度を比較する実験を行った。

＜先行技術との比較：比較例作成＞
　先行技術の再現のため成分採血した単核球を、培養容器の液体培地内に２時間正置し、非接着細胞（リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞）など）を分離し、凍結保存した。この正置し接着細胞の培養を開始した日を０日とする。翌日（１日目）、接着細胞の培養液にＧＭ―ＣＳＦとＩＬ－４を添加し、未成熟樹状細胞へ分化させた。５日目に、未成熟樹状細胞へＧＭ―ＣＳＦとＩＬ－４とＰＧＥ－２とＯＫ－４３２とを添加し、未成熟樹状細胞を成熟化させた。翌６日目に、成熟樹状細胞へα―ガラクトシルセラミド（濃度３００ｎｇ／ｍＬ）をパルスした。

＜先行技術との比較：比較例の効果確認方法＞
　７日目に前記成熟樹状細胞と初日に回収した非接着細胞との共培養を開始した。共培養を開始した日（０日）、共培養開始した日を０日とした時の２、４、７、１４日に非接着細胞中のＮＫＴ細胞が産生したＩＦＮ－γ産生濃度（ｐｇ／ｍＬ）を測定した。

＜先行技術との比較：比較例と本願実施形態との効果比較＞
　上記のように比較例として先行技術に倣って試作した（特許文献１記載の製造方法に準拠、ただしパルスしたα―ガラクトシルセラミドは濃度３００ｎｇ／ｍＬ）樹状細胞と非接着細胞との共培養後のＩＦＮ－γ産生濃度と、本願実施形態８の条件３（パルスしたα―ガラクトシルセラミドは濃度３００ｎｇ／ｍＬ）で製造した樹状細胞製剤と非接着細胞との共培養後のＩＦＮ－γ産生濃度と、を比較した。なお、比較例と本願実施形態８の条件３で製造した製剤の効果確認のためには、有意な差が生じない範囲に細胞数差を抑えた同一受益者由来の樹状細胞とＮＫＴ細胞を含む非接着性細胞を使用した。

＜先行技術との比較：比較例と本願実施形態との効果比較：ＩＦＮ－γ産生濃度＞
　図７にＩＦＮ－γ産生濃度比較結果を示す。横軸に共培養開始後の経過日数０日（開始初日）、２日、４日、７日、１４日を示し、縦軸はＩＦＮ－γの産生濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示す。比較例（先行技術）と本願実施形態８の条件３共に、４日目にＩＦＮ－γ産生濃度が大きくなる。先行技術では４日目より７日目の方が、若干産生濃度が大きい。本願実施形態８の条件３は、先行技術の約４倍大きいＩＦＮ－γ産生濃度を示す結果となった。

＜先行技術との比較：比較例と本願実施形態との効果比較：ＩＦＮ－γ産生ピーク＞
　先行技術である特許文献１で最も好ましいα―ガラクトシルセラミド濃度範囲は８０から１２０ｎｇ／ｍＬと記載されており、特許文献１の実施形態１では１００ｎｇ／ｍＬで実験されている。特許文献１では、ＩＦＮ－γの産生については効果検証されていない。本願発明者の実験中で特許文献１の実施形態１と同様のα―ガラクトシルセラミド濃度（１００ｎｇ／ｍＬ）をパルスする本願実施形態８の条件２では、ＩＦＮ－γの産生ピークは共培養後７日目である。したがって特許文献１には記載ないものの、本願発明者はα―ガラクトシルセラミドのパルスタイミングだけではなくパルス濃度を最適化することにより、先行技術よりも早く効を奏することができる範囲を絞り込むことができることを見出した。

＜先行技術との比較：本願発明の優れた効果＞
　比較例（先行技術）と比べ、本願発明では未成熟樹状細胞へα―ガラクトシルセラミドをパルスすること、パルスするタイミングとその濃度を最適化することにより、早くＩＦＮ－γを産生させることができる範囲を絞り込み、ＩＦＮ―γの産生濃度を著しく向上することができた。

＜アメリカ出願用の治療方法を記載した請求項案＞：（仮）
　本願発明の製造方法で製造したＮＫＴ細胞を刺激する樹状細胞製剤を用いた、がん治療、がん予防、免疫力向上のいずれか一以上を希望する受益者に対する治療法については以下のように記載できる。
　によって製造された製剤による治療方法であって、
（１）受益者から成分採血又は採血によって単球又は単球を含む末梢血を採取する採取ステップと、
（２）採取した単球を液体培地を用いた培養容器に入れ、静置して前記単球のうちの一部の細胞を容器の内面に接着させる接着ステップと、
（３）培養容器の内面に接着した細胞以外の単球を含む非接着細胞を除去する非接着細胞除去ステップと、
（４）前記培養容器に所定の因子を入れて、前記培養容器内面に接着した単球を未成熟樹状細胞に分化させる分化ステップと、
（５）前記未成熟樹状細胞が非接着状態で存在する培養容器にα-ガラクトシルセラミドをパルスするパルスステップと、
（６）未成熟樹状細胞から、ＮＫＴ細胞を刺激する樹状細胞であるＮＫＴ刺激樹状細胞を誘導するＮＫＴ刺激樹状細胞誘導ステップと、
を含むことを特徴とする製造方法によって、がん治療、がん予防、免疫力向上のいずれか一以上を目的としたナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞を刺激する樹状細胞からなる樹状細胞製剤を製造し
（７）前記樹状細胞製剤を、前記単球を採取した受益者の体内に戻入する戻入ステップと、
を有するナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞を刺激する樹状細胞からなる樹状細胞製剤を用いた治療方法。

（仮）
＜前記請求項案の限定条件案＞（仮）
　前記治療方法については、次のいずれか一以上の限定条件を付けることができる。
（ａ）パルスステップにおいて、α-ガラクトシルセラミドをパルスするのは、接着ステップにて液体培地を用いた培養容器へ単球を入れたときから８４時間から１３２時間後（単球を入れた時を０日として４日後ないしは５日後）である治療方法。
（ｂ）パルスステップにおいて、パルスするα-ガラクトシルセラミドの濃度は３００～１０００ｎｇ／ｍＬである治療方法。
（ｃ）戻入ステップにおいて、前記製剤を受益者の体内へ戻入させるのは、接着ステップにて液体培地を用いた培養容器へ単球を入れたときから１５６時間後以降（単球を入れた時を０日として７日後以降）
である治療方法。

＜別実施形態：カクテル製剤＞
　別実施形態のカクテル製剤を受益者の体内に戻入した際の作用を以下説明する。この説明の例では受益者は体内にがん細胞を有している。この別実施形態では、本願発明の製剤とは別に、採取した単球を分割して培養容器に入れ、本願発明で未成熟樹状細胞へリガンドとしてパルスしたα―ガラクトシルセラミドの代わりにＷＴ１ペプチドをリガンドした製剤を並行して別容器で作製し、本願発明の製剤と同時に受益者の体内に存在するように構成する。

　α―ガラクトシルセラミドをリガンドとして使用した製剤は受益者の自然免疫系を活性化し免疫力向上をはかり、間接的に獲得免疫系をも活性化する。様々ながんに存在しているＷＴ１ペプチドをリガンドとして使用した製剤の場合は、がん細胞を対象とした獲得免疫系を直接活性化する。

＜カクテル製剤の作用＞
　本別実施形態は、本願発明の製造方法によって製造した製剤と、類似の製造方法であって未成熟樹状細胞にパルスする薬品をα―ガラクトシルセラミドではなくＷＴ－１ペプチドをパルスした製剤の２種類の製剤を利用する。非特異的免疫療法（製剤（リガンド：α―ガラクトシルセラミド））に関してはすでに説明済みのため、異なる部分である獲得免疫系を直接の目標としたＷＴ１ペプチドをリガンドした製剤の作用を主に以下説明する。受益者体内の、がん細胞は周囲に、免疫機能からのバリアを形成している（免疫抑制作用のため）。

　＜α－ガラクトシルセラミドがパルスされた製剤の作用：ＮＫＴ細胞の活性化作用＞
α－ガラクトシルセラミドがパルスされた製剤は、ＮＫＴ細胞を活性化する。活性化ＮＫＴ細胞は、免疫機能に対して様々な作用をする。

＜活性化ＮＫＴ細胞の作用：アジュバント作用＞
　活性化したＮＫＴ細胞が、サイトカイン（ＩＦＮ－γ）を産生することで、ＮＫ細胞、マクロファージ、キラーＴ細胞を活性化し、がんへの攻撃力を高める。また、さまざまな免疫細胞を活性化する。キラーＴ細胞やヘルパーＴ細胞は、特異的免疫活性であるＷＴ１ペプチドをリガンドとして樹状細胞にパルスすることに起因して活性化されるものであり、この活性化したＮＫ細胞や、活性化したＢ細胞が、非特異的免疫活性の経路による好影響を同時に受けることによって、単純な足し算以上の相乗効果が得られる。この点が本別実施形態の特徴の一つである。

＜活性化ＮＫＴ細胞の作用：がん細胞に対するアポトーシス誘導作用＞
　活性化したＮＫＴ細胞が、セリンプロテアーゼの一種を産生しがん細胞のＤＮＡを分解することで、がん細胞のアポトーシスを引き起こす。

　＜活性化したマクロファージの作用：マクロファージによるがん細胞貪食作用＞
　活性化したマクロファージは、がん細胞やがん死細胞を貪食する。

　＜増殖・活性化マクロファージによる作用：マクロファージによる抗原提示作用＞
　活性化ＮＫＴ細胞は、マクロファージを増殖・活性化させる。増殖・活性化したマクロファージは、貪食作用によって取り込んだがん細胞を断片化して細胞表面に表出する。つまり、がん細胞の抗原を提示する抗原提示作用を奏する。マクロファージはこの抗原をヘルパーＴ細胞へ提示する。

　＜樹状細胞のがん抗原提示作用：樹状細胞によるがん抗原提示作用＞
　未成熟樹状細胞はがん抗原を取り込んで成熟し成熟樹状細胞へと分化し、ヘルパーＴ細胞、およびキラーＴ細胞に対してがん抗原を提示する。本作用は、通常体内で起こりえる抗がん作用であるが、活性化ＮＫＴ細胞の作用により、通常以上に抗がん効果が得られる。このがん抗原は、患者自身のがん細胞を樹状細胞とマクロファージが貪食して提示された抗原なので、人工抗原をリガンドとして使用した製剤よりも高い効果が期待できる。本作用も、本願発明のカクテル製剤が相乗効果を奏する要因の一つである。

　＜ＷＴ１ペプチドがパルスされた製剤の作用：がん抗原提示作用＞
　ＷＴ１ペプチドがパルスされた製剤は、ヘルパーＴ細胞、およびキラーＴ細胞に対して、がんの抗原であるＷＴ１ペプチドを提示し、活性化する。これによりキラーＴ細胞は、がん細胞を攻撃対象として認識し、ヘルパーＴ細胞は、キラーＴ細胞を活性化し、さらにサイトカインを産生することで後述するようにＮＫ細胞を活性化するとともに、Ｂ細胞が抗体を産生するのを促進する。

　＜活性化したヘルパーＴ細胞の作用：がん細胞攻撃指示＞
　活性化したヘルパーＴ細胞はサイトカイン（ＩＮＦ－γ）を産生して、そのサイトカイン中に含まれる情報に基づいてがん細胞に対する攻撃をキラーＴ細胞に対して指示する。また、サイトカインの効果によりＮＫ細胞、Ｂ細胞やマクロファージが活性化することでがんへの攻撃作用が高まる。

　＜活性化したヘルパーＴ細胞の作用：がん抗原（例えばＷＴ１）に対する抗体産生指示＞
　活性化したヘルパーＴ細胞は、サイトカインを産生し、そのサイトカインに含まれる情報に基づいてＢ細胞に対して、がん抗原（例えばＷＴ１）に対する抗体を産生するよう指示する。

　＜活性化したキラーＴ細胞の作用：キラーＴ細胞によるがん細胞攻撃作用＞
　がん細胞を直接攻撃する主戦力となる作用で、活性化したキラーＴ細胞は、がん細胞に発現したＷＴ１を認識して結合し、細胞膜に穴をあけてがん細胞を壊死させる。さらに、ＴＮＦ－β（腫瘍壊死因子、サイトカインの1種）などの物質を産生し、がん細胞のアポトーシスを誘導する。このように、キラーＴ細胞のがん細胞への直接攻撃は、がん細胞を外側と内側の両面から攻撃する強力な抗がん作用である。

　＜活性化したキラーＴ細胞の作用：新生血管破壊作用＞
　がん細胞により新生された血管は、ＷＴ１遺伝子が発現しており、がん抗原（ＷＴ１）を提示されたキラーＴ細胞は、がん細胞だけでなく、新生血管にも攻撃を行う。これにより、新生血管は破壊され、がん細胞への栄養の供給が低下し、がん細胞の増殖を抑える。本作用も、本別実施形態のカクテル製剤が相乗効果を奏する要因の一つである。

　＜活性化したＮＫ細胞の作用：ＮＫ細胞によるがん細胞攻撃作用＞
　活性化ＮＫＴ細胞が産生するＩＦＮ－γに加え、ヘルパーＴ細胞が産生するＩＦＮ－γも加わって刺激され活性化したＮＫ細胞は、がん細胞に対して細胞傷害性応答を示し、がん細胞を攻撃する。

　＜活性化したＢ細胞の作用：がん抗体産生＞
　活性化したＢ細胞は、がん抗原（例えばＷＴ１）に対する抗体を産生し、がん細胞を攻撃する。この抗体は、がん細胞と結合することでがん細胞の増殖を抑えたり、他の免疫細胞（例えばＮＫ細胞やキラーＴ細胞）に対する目印になったりして攻撃を促進する作用などがある。

　以上のように、α―ガラクトシルセラミドをリガンドとした製剤と、ＷＴ１ペプチドをリガンドとした製剤を受益者の体内で同時に存在するように戻入させることにより、本願発明の製剤（α―ガラクトシルセラミドをリガンドとした製剤）のみを使用するよりも早くがん細胞を対象とした獲得免疫系を活性化さすることができ、自然免疫系と獲得免疫系双方を直接活性化することにより単純な足し算ではない相乗的な効果を得ることができる。そのためがん治療を目的とする場合には、本製剤単独よりも効果が早く、より大きな効果を得ることが期待できる。

＜効果＞
　本願発明の、単球を採取した受益者の体内に戻入する、ＮＫＴ細胞を刺激する樹状細胞製剤の製造方法によれば、先行技術（特許文献１）に対し、ＮＫＴ細胞を刺激してＩＦＮ－γをより多く産生させることができる条件を見出したことと、ＩＦＮ－γをより早く産生させるα―ガラクトシルセラミド濃度範囲を絞り込めたことによって、がん治療などにおいて自然免疫系、獲得免疫系双方の経路からの効果を一層期待することができ、より高い治療効果が期待されうる樹状細胞製剤を生成できるという優れた効果を奏し得る。さらに、前記樹状細胞製剤は健常者にとっても免疫力向上の効果を奏しうる。また受益者自身の単球から製造することにより、拒絶反応の心配のない安全な製剤を得ることができる。

Claims

　がん治療、がん予防、免疫力向上のいずれか一以上を目的としたナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞を刺激する樹状細胞からなる樹状細胞製剤の製造方法であって、
　（１）受益者から採取（成分採血又は採血された単球、又は単球を含む末梢血）された単球を液体培地を用いた培養容器に入れ、静置して前記単球のうちの一部の細胞を容器の内面に接着させる接着工程と、
　（２）培養容器の内面に接着した細胞以外の単球を含む非接着細胞を除去する非接着細胞除去工程と、
　（３）前記培養容器に所定の因子を入れて、前記培養容器内面に接着した単球を未成熟樹状細胞に分化させる分化工程と、
　（４）前記未成熟樹状細胞が優位に存在する培養容器にα-ガラクトシルセラミドをパルスするパルス工程と、
　（５）未成熟樹状細胞から、ＮＫＴ細胞を刺激する樹状細胞であるＮＫＴ刺激樹状細胞を誘導するＮＫＴ刺激樹状細胞誘導工程と、
を含むことを特徴とする、前記単球を採取した受益者の体内に戻入しＮＫＴ細胞を刺激するためのＮＫＴ細胞刺激樹状細胞製剤の製造方法。
　（４）のパルス工程は、（３）の分化工程にて所定の因子を加えた日を０日として、３日乃至は４日目に行う請求項１に記載の樹状細胞製剤の製造方法。
　（４）のパルス工程は、（３）の分化工程にて所定の因子を加えてから６０時間後から１０８時間後までに行う請求項１に記載の樹状細胞製剤の製造方法。
　（４）のパルス工程は、（１）の接着工程にて受益者から採取された単球を培養容器に入れた日を０日として、４日目乃至は５日目に行う請求項１に記載の樹状細胞製剤の製造方法。
　（４）のパルス工程は、（１）の接着工程にて受益者から採取された単球を培養容器に入れてから８４時間後から１３２時間後までに行う請求項１に記載の樹状細胞製剤の製造方法。
　（４）のパルス工程は、（２）の非接着細胞除去工程にて培養容器の内面に接着した細胞以外の単球を含む非接着細胞を除去した日を０日として、４日目乃至は５日目に行う請求項１に記載の樹状細胞製剤の製造方法。
　（４）のパルス工程は、（２）の非接着細胞除去工程にて培養容器の内面に接着した細胞以外の単球を含む非接着細胞を除去してから８４時間後から１３２時間後までに行う請求項１に記載の樹状細胞製剤の製造方法。
　（４）のパルス工程においてパルスするα―ガラクトシルセラミドの濃度は３００～１０００ｎｇ／ｍＬである請求項１から請求項７のいずれか一に記載の樹状細胞製剤の製造方法。
　請求項１から請求項７のいずれか一に記載の製造方法にて製造された樹状細胞製剤を加えた受益者の血液。
　請求項８に記載の製造方法にて製造された樹状細胞製剤を加えた受益者の血液。