WO2018043660A1 - ナチュラルキラーｔ（ｎｋｔ）細胞を刺激する樹状細胞の製造方法、およびｎｋｔ細胞を刺激する樹状細胞とｎｋｔ細胞とを含む細胞組成物の製造方法 - Google Patents

ナチュラルキラーｔ（ｎｋｔ）細胞を刺激する樹状細胞の製造方法、およびｎｋｔ細胞を刺激する樹状細胞とｎｋｔ細胞とを含む細胞組成物の製造方法 Download PDF

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活夫 野口
敏雅 只木
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株式会社理研免疫再生医学
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    • C12N2506/115—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from blood or immune system cells from monocytes, from macrophages

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing dendritic cells that stimulate NKT cells, and a method for producing a cell composition containing dendritic cells that stimulate NKT cells and NKT cells.
  • immunotherapy in which the patient's own immune cells are taken out and activated and then returned to the patient has attracted attention as a cancer treatment method.
  • the cause of cancer may be a decrease in the number of immune cells in the body or a decrease in immune cell activity.
  • cancer cells are attacked by increasing the number of immune cells to overcome this.
  • peripheral blood mononuclear cells are pulsed with ⁇ -galactosylceramide, and NKT cells contained in the mononuclear cells are activated or proliferated and administered to the patient to treat cancer.
  • a method is known, and clinical research is being promoted focusing on lung cancer (see Non-Patent Document 1, for example).
  • NKT cell refers to a subgroup having characteristics of both T cells and natural killer cells (NK cells) among T cells. NKT cells are present in only about 0.1% of T cells in peripheral blood. When NKT cells are activated, NKT cells are characterized by producing large amounts of IFN- ⁇ , IL-4, and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF).
  • NK cells natural killer cells
  • ⁇ -galactosylceramide ( ⁇ -GalCer) is presented by CD-1d molecules on the surface of antigen-presenting cells (dendritic cells)
  • ⁇ -GalCer antigen-presenting cells
  • an activation signal is transmitted via the T cell receptor V ⁇ 24V ⁇ 11 on the surface of NKT cells, It is known that NKT cells are activated.
  • an object of the present invention is to provide an economical method for producing dendritic cells that stimulate NKT cells.
  • One embodiment of the present invention is a method for producing dendritic cells that stimulate NKT cells.
  • the manufacturing method is Placing the mononuclear cells in a culture vessel and allowing them to stand to fix some of the cells in the mononuclear cells to the bottom of the vessel; Removing floating cells other than the cells fixed on the bottom surface of the culture vessel; A step of differentiating monocytes out of cells fixed on the bottom surface by putting a predetermined factor in the culture vessel into immature dendritic cells; Maturating the immature dendritic cells by putting a predetermined factor in the culture vessel; Introducing ⁇ -galactosylceramide into the culture vessel and inducing dendritic cells that stimulate NKT cells from mature dendritic cells; It is characterized by including.
  • NKT by fixing the monocytes of the mononuclear cells on the bottom surface of the culture vessel and differentiating them into dendritic cells, NKT can be efficiently produced with a small amount of medium in a relatively short period of time. Stimulating dendritic cells can be obtained. Therefore, the production method of the present embodiment can prepare dendritic cells that stimulate NKT more accurately and economically than the method for obtaining dendritic cells that stimulate NKT described in Non-Patent Document 1, for example. .
  • Another embodiment of the present invention is a method for producing a cell composition comprising dendritic cells that stimulate NKT cells and NKT cells.
  • the manufacturing method is Placing the mononuclear cells in a first culture vessel and allowing them to stand to fix some of the cells of the mononuclear cells to the bottom of the vessel; Collecting and storing floating cells other than the cells settled on the bottom of the container; Differentiating monocytes out of cells fixed on the bottom surface by putting a predetermined factor in the first culture vessel into immature dendritic cells; Putting the predetermined factor in the first culture vessel to mature the immature dendritic cells; Introducing ⁇ -galactosylceramide into the first culture vessel to induce dendritic cells that stimulate NKT cells from mature dendritic cells; Placing the dendritic cells for stimulating the NKT cells and the stored floating cells in a second culture vessel, culturing, and inducing the NKT cells from a part of the floating cells; It is characterized by
  • floating cells that have not settled on the bottom surface of the culture vessel are collected, and mixed with dendritic cells that stimulate NKT cells and cultured in a later step.
  • NKT cells can be induced from a part of the floating cells, and a dendritic cell that stimulates NKT cells and a cell composition containing NKT cells can be obtained.
  • the method for producing a dendritic cell for stimulating NKT cells of the above embodiment may further include a step of cryopreserving the obtained dendritic cells for stimulating NKT cells.
  • the manufacturing method of the cell composition of the said embodiment may further include the process of cryopreserving the obtained cell composition.
  • dendritic cells that stimulate NKT cells can be provided with high accuracy and economically in a relatively short period of time.
  • Example 1 In the culture experiment of Example 1, it is a figure which shows the result of having analyzed the NKT cell with the flow cytometer on Day0, Day7, and Day14. In the culture experiment of Example 1, it is a figure which shows the result of having analyzed the NKT cell with the flow cytometer on Day0, Day7, and Day14. In the culture experiment of Example 1, it is a figure which shows the result of having analyzed the NKT cell with the flow cytometer on Day0, Day7, and Day14. 2 is a graph showing the total cell number and viable cell rate in the experimental group of Example 1.
  • FIG. FIG. 3 is a diagram showing the differentiation rate of dendritic cells in the experimental group of Example 1.
  • Example 2 it is a figure which shows the result of having analyzed the cell surface CD14, CD83, CD86 with the flow cytometer on Day0, before strawberry freezing, and after freezing and thawing.
  • FIGS. 10 (A) to 10 (C) are diagrams showing the results of analyzing NKT cells using a flow cytometer on Day 0, Day 2 and Day 6 in the culture experiment of Example 3.
  • FIG. FIG. 11 (A) to FIG. 11 (C) are diagrams showing the results of analyzing NKT cells with a flow cytometer on Day 0, Day 2 and Day 6 in the culture experiment of Example 3.
  • 12 (A) to 12 (C) are diagrams showing the results of analyzing NKT cells with a flow cytometer on Day 0, Day 2 and Day 6 in the culture experiment of Example 3.
  • FIG. 13 (B) are diagrams showing the results of analyzing dendritic cells with a flow cytometer on Day 0 and Day 6 in the culture experiment of Example 3.
  • 14 (A) and 14 (B) are diagrams showing the results of analyzing dendritic cells with a flow cytometer on Day 0 and Day 6 in the culture experiment of Example 3.
  • FIG. 15 (A) and 15 (B) are diagrams showing the results of analyzing dendritic cells with a flow cytometer on Day 0 and Day 6 in the culture experiment of Example 3.
  • mononuclear cells are placed in a culture vessel and allowed to stand to allow some cells of the mononuclear cells to settle on the bottom of the vessel.
  • the cells settled on the bottom of the container contain a lot of monocytes.
  • the monocytes can be efficiently differentiated into dendritic cells, and finally dendritic cells that stimulate NKT cells can be efficiently obtained in a relatively short period of time. it can.
  • the amount of medium to be used can be reduced, and dendritic cells that stimulate NKT cells can be produced at a lower cost.
  • mononuclear cell means a cell population containing lymphocytes and monocytes.
  • Mononuclear cells can be obtained from blood such as peripheral blood, bone marrow, and umbilical cord blood by known methods such as centrifugation and flow cytometry. Mononuclear cells can also be collected directly from humans by apheresis. It is preferable to obtain mononuclear cells by apheresis because the process can be simplified and the influence on the subject is small by returning blood components other than mononuclear cells.
  • Culture medium is added to the culture container.
  • a known medium suitable for culturing mononuclear cells can be used.
  • a basic medium used for culturing animal cells eg CELL GRO GMP Serum-free Dendritic Cell Medium (Cell Genix, # 20801-0500) etc.
  • serum, growth factors, cytokines, serum substitutes, vitamins, buffers eg CELL GRO GMP Serum-free Dendritic Cell Medium (Cell Genix, # 20801-0500) etc.
  • serum eg CELL GRO GMP Serum-free Dendritic Cell Medium (Cell Genix, # 20801-0500) etc.
  • serum eg. CELL GRO GMP Serum-free Dendritic Cell Medium (Cell Genix, # 20801-0500) etc.
  • serum eg., serum, growth factors, cytokines, serum substitutes, vitamins, buffers
  • a medium obtained by appropriately adding additives such as chemicals and inorganic salts can be used.
  • the culture vessel is not particularly limited as long as it is a vessel generally used for animal cell culture and has a bottom surface for fixing cells.
  • Examples of culture vessels include, but are not limited to, commercially available plates (AGC technoglass, # 3810-006), dishes (CRNING, CellBIND Surface 100mm, # 3296), flasks (Sumitomo Bakelite, # MS-21050), etc. Can be mentioned.
  • the time for allowing the culture vessel containing the mononuclear cells to stand and fixing a part of the mononuclear cells to the bottom of the vessel is not particularly limited, but may be, for example, 1 to 12 hours, preferably 2 hours.
  • the temperature and atmosphere at the time of standing may be the conditions used for the culture of mononuclear cells, and the conditions can be set using an incubator or the like normally used for the culture.
  • the temperature may be about 35-38 ° C., preferably 37 ° C.
  • the CO 2 concentration may be about 1-10%, preferably about 5%.
  • the removal of floating cells that have not settled on the bottom surface of the container can be performed by a usual method.
  • floating cells can be removed by aspiration.
  • the removed suspended cells may be discarded or stored. That is, in another embodiment of the present invention, floating cells that have not settled on the bottom surface of the container may be collected and stored.
  • the collected floating cells can be suspended in a cryopreservation solution suitable for cell cryopreservation, placed in a cryopreservation container, and then cryopreserved at ⁇ 80 ° C.
  • a cell cryopreservation solution is CP-1 (Kyokuto Pharmaceutical Co., Ltd., Sakai # 324042-3).
  • a medium and a predetermined factor are put in a culture vessel in which cells are fixed on the bottom surface, and monocytes among the cells fixed on the bottom surface are differentiated into immature dendritic cells.
  • the medium described above can be used.
  • the predetermined factor for differentiating monocytes into immature dendritic cells include IL-4 and GM-CSF, and it is preferable to use both in combination.
  • IL-4 the concentration range is preferably 100 to 1,000 ng / mL, more preferably 200 to 800 ng / mL, and even more preferably 400 to 600 ng / mL.
  • GM-CSF the concentration range is preferably 100 to 1,000 ng / mL, more preferably 200 to 800 ng / mL, and even more preferably 400 to 600 ng / mL.
  • the culture for differentiation can use the same conditions as the culture conditions described above, and can be appropriately changed by those skilled in the art.
  • the culture time may be a time sufficient for differentiating monocytes into immature dendritic cells, and can be appropriately set by those skilled in the art.
  • the culture time is 4 to 6 days, preferably 5 days.
  • a predetermined factor is placed in the culture vessel to mature the immature dendritic cells.
  • the predetermined factor include IL-4, GM-CSF, tumor cell necrosis factor ⁇ (TNF ⁇ ), and prostaglandin 2 (PGE 2 ). It is preferable to combine these factors.
  • the concentration range is preferably 100 to 1,000 ng / mL, more preferably 200 to 800 ng / mL, and even more preferably 400 to 600 ng / mL.
  • the concentration range is preferably 100 to 1,000 ng / mL, more preferably 200 to 800 ng / mL, and even more preferably 400 to 600 ng / mL.
  • the concentration range is preferably 1.0 to 100 ng / mL, more preferably 5.0 to 20 ng / mL, and even more preferably 8 to 12 ng / mL.
  • the concentration range is preferably 100 to 10,000 ng / mL, more preferably 500 to 5,000 ng / mL, and even more preferably 800 to 1,200 ng / mL.
  • the culture conditions for maturation can be the same as the culture conditions described above, and can be appropriately changed by those skilled in the art.
  • the culture time may be a time sufficient for the immature dendritic cells to mature, and can be appropriately set by those skilled in the art.
  • the culture time is 1 to 3 days, preferably 2 days.
  • ⁇ -galactosylceramide ( ⁇ GalCer) is put into a culture vessel to induce dendritic cells that stimulate NKT cells from mature dendritic cells.
  • dendritic cells that stimulate NKT cells refer to dendritic cells that induce activation and proliferation of NKT cells.
  • ⁇ -GalCer is presented by the CD-1d molecule, and the NKT cell is activated when the NKT cell recognizes this ⁇ -GalCer.
  • the range of ⁇ GalCer concentration in this step is preferably 10 to 1,000 ng / mL, more preferably 20 to 800 ng / mL, and even more preferably 80 to 120 ng / mL.
  • the culture conditions for obtaining dendritic cells that stimulate NKT cells can be the same as the culture conditions described above, and can be appropriately changed by those skilled in the art.
  • the culture time may be a time sufficient for the mature dendritic cells to be dendritic cells that stimulate NKT cells, and can be appropriately set by those skilled in the art.
  • the culture time is 0.25 to 2 days, preferably 1 day.
  • the dendritic cells and the floating cells And NKT cells can be induced from a part of the floating cells.
  • the floating cells when the collected floating cells are cryopreserved, the floating cells can be thawed at 37 ° C. and mixed with the dendritic cells.
  • a part of floating cells is differentiated into NKT cells and activated by dendritic cells that stimulate NKT cells.
  • a cell composition containing dendritic cells that stimulate NKT cells and NKT cells can be obtained.
  • the “cell composition” means a composition containing cells and also containing components other than cells such as a medium and a preservation solution.
  • the production method of the above-described embodiment can further include a step of cryopreserving the obtained dendritic cells that stimulate NKT cells or a cell composition containing the dendritic cells and NKT cells. Even if the dendritic cell or the cell composition is cryopreserved, the cell viability and the expression of the differentiation marker are not decreased, and the function of the cell is not lost. Since cryopreservation is possible in this way, dendritic cells that stimulate NKT cells, and cell compositions that contain NKT cells and NKT cells can be stably provided.
  • the cryopreservation of cells can be performed by cell cryopreservation methods well known to those skilled in the art. For example, the cells can be suspended by suspending them in a known preservation solution suitable for freezing the cells, and the suspension is frozen, for example, with liquid nitrogen and stored at, for example, ⁇ 80 ° C. or lower.
  • the dendritic cells that stimulate NKT cells obtained by the production method of the above-described embodiment, and the cell composition containing the dendritic cells and NKT cells have an immunostimulatory effect and an anticancer effect.
  • a cell preparation for use in infectious disease treatment or cancer immunotherapy can be produced.
  • the present inventors use a blood sample (ID: NKT001-009) of a healthy person to produce dendritic cells that stimulate NKT cells as described below and a cell composition containing the dendritic cells and NKT cells. Carried out.
  • Example 1 On the first day (Day 0), cell components were first separated by apheresis. The cell components were layered on LeucoSep by 30 mL each and centrifuged (3000 rpm, 20 min, r / t, Accel: 1, Decel: 1). Then, collect the mononuclear cell layer in a 50 mL centrifuge tube, add an equal amount of physiological saline to suspend it, and perform centrifugation (1500 rpm, 5 min, r / t, Accel: 3, Decel: 2). It was. 30 mL of AIM-V was added and suspended, and cell aggregates were removed using a cell strainer, and the number of cells was counted.
  • Mononuclear cells 2 ⁇ 10 7 cells were sampled (for Day 0) for flow cytometer measurement.
  • Six 225 cm 2 suspension culture flasks containing 30 mL of AIM-V were seeded and left in an incubator (37 ° C., 5% CO 2) for 2 hours to recover non-adherent cells.
  • the collected non-adherent cells are centrifuged (1500 rpm, 5 min, r / t, Accel: 3, Decel: 3), suspended by adding AIM-V to 2 ⁇ 10 8 cells / mL, and 11.8
  • An equal amount of CP-1 containing human serum albumin was added, placed in a flow bag (NIPRO), and stored at -80 ° C.
  • AlyS505N-0 (NIPRO, # 1020P10) was used.
  • IL-4 was added to AIM-V in the flask so that 500 U / mL, GM-CSF was 500 U / mL, TNF ⁇ was 10 ng / mL, and PGE 2 was 1 ⁇ g / mL. It was left to stand in an incubator (37 ° C., 5% CO 2 ) for 1 day.
  • ⁇ -GalCer was added to AIM-V in the flask so that the concentration was 100 ng / mL, and the mixture was further allowed to stand in an incubator (37 ° C., 5% CO 2 ) for 1 day.
  • non-adherent cells stored on Day 0 were thawed at 37 ° C, centrifuged (1500 rpm, 5 min, r / t, Accel: 3, Decel: 2), and 30 mL of AlyS505N-0 (IL2 100U / mL) was added and suspended.
  • Each cell group is seeded in a bag (2L of medium volume) that connects two 1L bags of AlyS505N-0 (containing IL-2 100U / mL) with a connecting tube (2L of medium), and in an incubator (37 ° C, 5% CO 2 ). Left for 1 day.
  • 1 mL was sampled from the seeded bag for ELISA measurement and centrifuged (1500 rpm, 5 min, r / t, Accel: 3, Decel: 3).
  • the cell concentration and the viable cell ratio of the cells cultured in the 2L bag were measured.
  • numerator was measured with the flow cytometer using a part of cell cultured with the 2L bag.
  • NKT cells are confirmed with TCR ⁇ V ⁇ 24-FITC or TCR V ⁇ 24-PerCP / Cy5.5, TCR V ⁇ 11-PE, 3-CD3-PE / Cy7, CD56-APC or CD56-APC / Cy7.
  • CD14-PE, CD83-PE, CD80-PEor CD86-PE were used.
  • the remaining cells in the 2L bag were further cultured for 1-2 weeks.
  • flow cytometer analysis was performed.
  • FIG. 1 to FIG. 3 show the results of similar tests using cells obtained from three healthy individuals (ID: NKT004, NKT005, NKT006).
  • Va24 and Vb11 in the figure are two types of subunits of the T cell receptor (TCR), which is a molecule essential for antigen recognition, and are also subunits of TCR that recognize aGalCer.
  • TCR T cell receptor
  • FIG. 4 shows the cell viability in these experimental groups.
  • FIG. 5 shows the total number of dendritic cells after culture in these experimental groups, the viable cell rate, and the differentiation rate into dendritic cells (DC).
  • monocytes are isolated from the mononuclear cells by fixing them on the bottom of the flask and differentiated into dendritic cells. Proliferation of NKT cells (up to about 30 times) was confirmed. A tendency for the NKT cell rate to decrease after 2 weeks was also confirmed. During this culture period, there was no change in the total number of cells, and the viable cell rate did not decrease (FIG. 4).
  • Example 2 On the first day (Day 0), cell components were first separated by apheresis. This cell component was layered on LeucoSep in an amount of 30 mL and centrifuged (3000 rpm, 20 min, r / t, Accel: 1, Decel: 1), and the mononuclear cell layer was collected in a 50 mL centrifuge tube. Add and suspend an equal volume of physiological saline, centrifuge (1500 rpm, 5 min, r / t, Accel: 3, Decel: 2), add 30 mL of AIM-V to suspend, and use a cell strainer. Cell clumps were removed.
  • the number of cells was counted, and 2 ⁇ 10 7 cells of mononuclear cells were sampled for measurement of a flow cytometer (for Day 0). These cells were measured for CD14, CD83, and CD86 with a flow cytometer.
  • Six 225 cm 2 suspension culture flasks containing 30 mL of AIM-V were inoculated and allowed to stand in an incubator (37 ° C., 5% CO 2 ) for 2 hours. After that, discard non-adherent cells, add 30 mL of AIM-V to the adherent cells in the flask, and add IL-4 to 500 U / mL and GM-CSF to 500 U / mL to AIM-V in the flask. The mixture was allowed to stand for 5 days in an incubator (37 ° C., 5% CO 2 ).
  • IL-4 On day 5 of culture start, add IL-4 to AIM-V in the flask at 500 U / mL, GM-CSF at 500 U / mL, TNF- ⁇ at 10 ng / mL, and PGE 2 at 1 ⁇ g / mL. And left in an incubator (37 ° C., 5% CO 2 ) for 1 day.
  • ⁇ -GalCer was added to AIM-V in the flask so that the concentration was 100 ng / mL, and the mixture was allowed to stand in an incubator (37 ° C., 5% CO 2 ) for 1 day.
  • CD14, CD83, CD86 on the cell surface were measured with a flow cytometer. Then, centrifuge (1500 rpm, 5 min, r / t, Accel: 3, Decel: ⁇ 2) and suspend the collected cells in 6 mL of cryopreservation solution (10% DMSO, auto 90% autoserum). 1 mL was dispensed and each vial was stored at ⁇ 80 ° C. After thawing, CD14, CD83, and CD86 on the cell surface were measured with a flow cytometer.
  • FIGS. 6 to 8 show the flow sites of cells of three healthy individuals (ID: NKT007, NKT008, NKT009) on day 0, before freezing (after differentiation induction), and after freezing and thawing, on the cell surface CD14, CD83, and CD86.
  • ID: NKT007, NKT008, NKT009 The results of analysis with a meter are shown.
  • FIG. 9 shows the total cell count and viable cell ratio before freezing and after thawing washing in the experimental group corresponding to FIGS.
  • FIG. 9 shows the total cell count and viable cell ratio before freezing and after thawing washing in the experimental group corresponding to FIGS.
  • FIG. 9 shows the total cell count and viable cell ratio before freezing and after thawing washing in the experimental group corresponding to FIGS.
  • FIG. 9 shows the total cell count and viable cell ratio before freezing and after thawing washing in the experimental group corresponding to FIGS.
  • FIG. 9 shows the total cell count and viable cell ratio before freezing and after thawing washing in the experimental group
  • AlyS505N-0 containing IL-2 100 U / mL
  • the cell aggregate was removed using a cell strainer, and the number of cells was counted.
  • Mononuclear cells 2 ⁇ 10 7 cells were sampled (for Day 0) for flow cytometer measurement.
  • Four 225 cm 2 suspension culture flasks were seeded at 6 ⁇ 10 7 cells / 60 mL, and the reagents were added to the four flasks as follows.
  • Flask 1 None Flask 2: 800 U / mL GM-CSF Flask 3: 100 ng / mL ⁇ -GalCer Flask 4: 800U / mL GM-CSF + 100ng / mL ⁇ -GalCer These flasks were left in an incubator (37 ° C, 5% CO 2 ), and the remaining cells were AlyS505N-0 (IL-2 100 U / mL, GM-CSF 800 U / mL, ⁇ -GalCer 100 ng / (1 mL) A 1 L bag was seeded in a bag (2 L of medium) connected by two connecting tubes. The sowed bag was allowed to stand for 6 days in an incubator (37 ° C., 5% CO 2 ). The cell surface molecules of the above-mentioned flow cytometer measurement cells were measured in the same manner as in Example 1.
  • NKT cells were analyzed on Day 0, Day 2 and Day 6, and dendritic cells were analyzed on Day 0 and Day 6 with a flow cytometer. Culturing was performed under the conditions in which no cytokine was added, only GM-CSF, only ⁇ -GalCer, and GM-CSF and ⁇ -GalCer were added.
  • 10 (A) to FIG. 10 (C), FIG. 11 (A) to (C), and FIG. 12 (A) to (C) are respectively for three healthy subjects (ID: NKT001, NKT002, NKT003). The results of analyzing NKT cells with a flow cytometer on Day 0, Day 2 and Day 6 are shown. 13 (A) and 13 (B), FIG. 14 (A) and FIG.
  • FIG. 14 (B), FIG. 15 (A) and FIG. 15 (B) show three healthy subjects (ID: NKT001, NKT002, NKT003) shows the results of analyzing dendritic cells with a flow cytometer on Day 0 and Day 6.
  • FIG. 16 shows the cell viability in these experimental groups.
  • FIG. 10 (C), FIG. 11 (C), and FIG. 12 (C) proliferation of NKT cells could not be confirmed in one week of culture. During this culture period, there was no change in the total number of cells, and the viable cell rate did not decrease (FIG. 16).
  • FIG. 13B, FIG. 14B, and FIG. 15B although monocytes tend to differentiate into dendritic cells in each experimental group, clear results were obtained. I could't.
  • the methods of Examples 1 and 2 can efficiently obtain dendritic cells that stimulate NKT cells in a short period of about 1 week, and can proliferate NKT cells, as compared with the method of Comparative Example.
  • it is liquid culture
  • the present invention is useful for producing dendritic cells that stimulate NKT cells and cell compositions containing the dendritic cells and NKT cells, for example, used in cancer immunotherapy. According to this production method, a highly efficient, stable and economical method for producing the dendritic cell and the cell composition can be provided, which is industrially useful.

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Abstract

NKT細胞を刺激する樹状細胞の製造方法は、単核球を培養容器に入れ、静置して単核球のうちの一部の細胞を容器の底面に定着させる工程と、培養容器の底面に定着した細胞以外の浮遊細胞を除去する工程と、前記培養容器に所定の因子を入れて前記底面に定着した細胞のうちの単球を未成熟樹状細胞に分化させる工程と、前記培養容器にα-ガラクトシルセラミドを入れて、成熟した樹状細胞から、NKT細胞を刺激する樹状細胞を誘導する工程と、を含む。

Description

ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞を刺激する樹状細胞の製造方法、およびＮＫＴ細胞を刺激する樹状細胞とＮＫＴ細胞とを含む細胞組成物の製造方法
　本発明は、NKT細胞を刺激する樹状細胞の製造方法、およびNKT細胞を刺激する樹状細胞とNKT細胞とを含む細胞組成物の製造方法に関する。
　近年、がんに対する治療方法として、手術、化学療法や放射線治療のほかに、患者自身の免疫細胞を取り出して、賦活化させてその後に患者に戻すといった免疫療法が注目されている。がんが発症する原因として体内の免疫細胞数の減少や免疫細胞活性が低下していることがある。免疫療法では、これを克服するために免疫細胞の数などを増やして、がん細胞を攻撃する。
　がん免疫療法の一例として、末梢血単核球をα－ガラクトシルセラミドでパルスし、その単核球に含まれているNKT細胞を活性化または増殖させて患者に投与する、がんを治療する方法が知られており、肺がんを中心に臨床研究が進められている（例えば非特許文献１参照）。
　NKT細胞とは、T細胞の中でも、T細胞とナチュラルキラー細胞（NK細胞）の両方の特徴を持つ亜群を指す。NKT細胞は末梢血中のT細胞のわずか0.1%程度しか存在していない。NKT細胞が活性化すると、NKT細胞は多量のIFN-γ、IL-4、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)を大量に産生する特徴がある。
　抗原提示細胞（樹状細胞）表面のCD-1d分子によってα－ガラクトシルセラミド(α-GalCer)が提示された場合、NKT細胞表面のT細胞受容体Vα24Vβ11を介して、活性化シグナルが伝達され、NKT細胞が活性化することが知られている。
Shinichiro Motohashi, Kaoru Nagato, Naoki Kunii, Heizaburo Yamamoto, Kazuki Yamasaki, Kohsuke Okita, Hideki Hanaoka, Naomi Shimizu,Makoto Suzuki, Ichiro Yoshino, Masaru Taniguchi,Takehiko Fujisawa,and Toshinori Nakayama，A Phase I-II Study of α -Galactosylceramide-Pulsed IL-2/GM-CSF-Cultured Peripheral Blood Mononuclear Cells in Patients with Advanced and Recurrent Non-Small Cell Lung Cancer1. The Journal of Immunolog 182:2492-2501(2009)
　これまでに、NKT細胞を刺激する樹状細胞を効率良く、経済的に製造する方法は知られていなかった。
　そこで、本発明は、NKT細胞を刺激する樹状細胞の経済的な製造方法を提供することを課題とする。
　本発明のある実施形態は、NKT細胞を刺激する樹状細胞の製造方法である。当該製造方法は、
　単核球を培養容器に入れ、静置して単核球のうちの一部の細胞を容器の底面に定着させる工程と、
　前記培養容器の底面に定着した細胞以外の浮遊細胞を除去する工程と、
　前記培養容器に所定の因子を入れて前記底面に定着した細胞のうちの単球を未成熟樹状細胞に分化させる工程と、
　前記培養容器に所定の因子を入れて前記未成熟樹状細胞を成熟させる工程と、
　前記培養容器にα-ガラクトシルセラミドを入れて、成熟した樹状細胞から、NKT細胞を刺激する樹状細胞を誘導する工程と、
を含むことを特徴とする。本実施形態によれば、単核球のうちの単球を培養容器の底面に定着させ、樹状細胞への分化を行うことによって、比較的短期間で、少ない培地量で、効率よくNKTを刺激する樹状細胞を得ることができる。したがって、本実施形態の製造方法は、例えば非特許文献１に記載のNKTを刺激する樹状細胞を得る方法よりも、精度高くかつ経済的にNKTを刺激する樹状細胞を調製することができる。
　本発明の別の実施形態は、NKT細胞を刺激する樹状細胞とNKT細胞とを含む細胞組成物の製造方法である。当該製造方法は、
　単核球を第１の培養容器に入れ、静置して前記単核球のうちの一部の細胞を容器の底面に定着させる工程と、
　容器の底面に定着した細胞以外の浮遊細胞を回収し保存する工程と、
　前記第１の培養容器に所定の因子を入れて前記底面に定着した細胞のうちの単球を未成熟樹状細胞に分化させる工程と、
　前記第１の培養容器に所定の因子を入れて前記未成熟樹状細胞を成熟させる工程と、
　前記第１の培養容器にα-ガラクトシルセラミドを入れて、成熟した樹状細胞から、NKT細胞を刺激する樹状細胞を誘導する工程と、
　前記NKT細胞を刺激する樹状細胞と保存しておいた浮遊細胞を第２の培養容器に入れ、培養して、前記浮遊細胞の一部からNKT細胞を誘導する工程と、
を含むことを特徴とする。本実施形態では、培養容器の底面に定着しなかった浮遊細胞を回収し、後の工程で、NKT細胞を刺激する樹状細胞と混合し、培養する。これによって、該浮遊細胞の一部からNKT細胞を誘導することができ、NKT細胞を刺激する樹状細胞と、NKT細胞とを含む細胞組成物を得ることができる。
　上記実施形態のNKT細胞を刺激する樹状細胞の製造方法は、得られたNKT細胞を刺激する樹状細胞を凍結保存する工程をさらに含んでもよい。また、上記実施形態の細胞組成物の製造方法は、得られた細胞組成物を凍結保存する工程をさらに含んでもよい。
　本発明によると、NKT細胞を刺激する樹状細胞を比較的短期間で、精度高く且つ経済的に提供できる。
実施例１の培養実験において、Day0, Day7, Day14にNKT細胞をフローサイトメーターで解析した結果を示す図である。 実施例１の培養実験において、Day0, Day7, Day14にNKT細胞をフローサイトメーターで解析した結果を示す図である。 実施例１の培養実験において、Day0, Day7, Day14にNKT細胞をフローサイトメーターで解析した結果を示す図である。 実施例１の実験群における総細胞数及び生細胞率を示す図である。 実施例１の実験群における樹状細胞の分化率を示す図である。 実施例２の培養実験において、Day0, 凍結前、及び凍結融解後に細胞表面のCD14,CD83,CD86をフローサイトメーターで解析した結果を示す図である。 実施例２の培養実験において、Day0, 凍結前、及び凍結融解後に細胞表面のCD14,CD83,CD86をフローサイトメーターで解析した結果を示す図である。 実施例２の培養実験において、Day0, 凍結前、及び凍結融解後に細胞表面のCD14,CD83,CD86をフローサイトメーターで解析した結果を示す図である。 実施例２の実験群における凍結前及び解凍洗浄後の総細胞数及び生細胞率を示す図である。 図１０（Ａ）～図１０（Ｃ）は、実施例３の培養実験において、Day0, Day2, Day6にNKT細胞をフローサイトメーターで解析した結果を示す図である。 図１１（Ａ）～図１１（Ｃ）は、実施例３の培養実験において、Day0, Day2, Day6にNKT細胞をフローサイトメーターで解析した結果を示す図である。 図１２（Ａ）～図１２（Ｃ）は、実施例３の培養実験において、Day0, Day2, Day6にNKT細胞をフローサイトメーターで解析した結果を示す図である。 図１３（Ａ）および図１３（Ｂ）は、実施例３の培養実験において、Day0, Day6に樹状細胞をフローサイトメーターで解析した結果を示す図である。 図１４（Ａ）および図１４（Ｂ）は、実施例３の培養実験において、Day0, Day6に樹状細胞をフローサイトメーターで解析した結果を示す図である。 図１５（Ａ）および図１５（Ｂ）は、実施例３の培養実験において、Day0, Day6に樹状細胞をフローサイトメーターで解析した結果を示す図である。 実施例３の実験群における総細胞数及び生細胞率を示す図である。
　以下に、本発明の実施形態を説明する。実施形態は、先行技術文献や従来公知の技術を援用して適宜設計変更可能である。
　本発明の製造方法の実施形態では、まず、単核球を培養容器に入れ、静置して単核球の一部の細胞を容器底面に定着させる。ここで、容器の底面に定着した細胞には単球が多く含まれている。このように単球を分離することで、該単球を樹状細胞へ効率よく分化させることができ、最終的にはNKT細胞を刺激する樹状細胞を比較的短期間で効率よく得ることができる。また、本実施形態では、このように単球を分離することから、使用する培地量を少なくすることができ、より低いコストでNKT細胞を刺激する樹状細胞を製造できる。
　本明細書において、「単核球」とは、リンパ球及び単球を含む細胞集団を意味する。単核球は、末梢血、骨髄、臍帯血等の血液から、遠心分離、フローサイトメトリー等の公知の方法によって得ることができる。また、単核球は、アフェレーシスによってヒトから直接採取することができる。工程を簡略化でき、単核球以外の血液成分を戻すことにより被験者への影響が少ないことから、アフェレーシスによる単核球の入手が好ましい。
　培養容器には培地が添加される。培地は、単核球の培養に適している公知の培地を使用することができる。例えば、動物細胞の培養に用いられる基本培地（例えば、CELL GRO GMP Serum-free Dendritic Cell Medium (Cell Genix, #20801-0500)等）に、血清、増殖因子、サイトカイン、血清代替品、ビタミン、緩衝剤、無機塩類等の添加剤を適宜添加して得られた培地が使用できる。培地の具体例としては、ALyS505N-0（NIPRO, #1020P10）、AIM-V@Medium CTS（ThermoFisher, #0870112-DK）等が挙げられるが、これらに限定されない。
　培養容器としては、動物細胞の培養に一般的に用いられる容器であって、細胞を定着させるための底面を有する容器であれば、特に限定されない。培養容器の例としては、特に限定されないが、市販のプレート（AGCテクノグラス、#3810-006）、ディッシュ（CRNING、CellBIND Surface 100mm、#3296）、フラスコ（住友ベークライト、#MS-21050）等が挙げられる。
　単核球を入れた培養容器を静置し、単核球の一部を容器底面に定着させる時間は、特に限定されないが、例えば、1～12時間、好ましくは2時間であってもよい。静置させる際の温度、雰囲気は、単核球の培養に用いられる条件でよく、培養に通常用いられるインキュベーター等を用いて、条件を設定することができる。例えば、温度は約35～38℃、好ましくは37℃であってもよく、ＣＯ２濃度は約1～10％、好ましくは約5％であってもよい。
　容器底面に定着しなかった浮遊細胞の除去は、通常の方法で行うことができる。例えば吸引によって、浮遊細胞を除去することができる。除去した浮遊細胞は廃棄するか、または保存してもよい。すなわち、本発明の他の実施形態では、容器底面に定着しなかった浮遊細胞を回収し、保存してもよい。例えば、回収した浮遊細胞は、細胞の凍結保存に適した凍結保存液中に懸濁し、凍結保存用の容器に入れた後、－80℃で凍結保存することができる。細胞の凍結保存液の例としては、CP-1（極東製薬、 #324042-3）等が挙げられる。
　次に、細胞が底面に定着した培養容器に培地と所定の因子を入れて、底面に定着した細胞のうちの単球を未成熟樹状細胞に分化させる。培地は上記で説明したものを使用することができる。単球を未成熟樹状細胞へ分化させるための所定の因子としては、ＩＬ－４、ＧＭ－ＣＳＦが挙げられ、両者を組み合わせて使用するのが好ましい。ＩＬ－４を使用する場合、その濃度の範囲は、好ましくは100～1,000 ng/mL、より好ましくは200～800ｎｇ／ｍＬ、さらにより好ましくは400～600 ng/mLである。ＧＭ－ＣＳＦを使用する場合、その濃度の範囲は、好ましくは100～1,000 ng/mL、より好ましくは200～800 ng/mL、さらにより好ましくは400～600 ng/mLである。
　分化のための培養は、上述した培養条件と同じ条件を使用することができ、当業者であれば適宜変更できる。また、培養時間は、単球を未成熟樹状細胞へ分化させるのに十分な時間であればよく、当業者であれば適宜設定できる。例えば、培養時間は、4～6日間、好ましくは5日間である。
　続いて、培養容器に所定の因子を入れて、未成熟樹状細胞を成熟させる。ここでの所定の因子としては、ＩＬ－４、ＧＭ－ＣＳＦ、腫瘍細胞壊死因子α（ＴＮＦα）、プロスタグランジン２（ＰＧＥ２）が挙げられる。これらの因子を組み合わせるのが好ましい。ＩＬ－４を使用する場合、その濃度の範囲は、好ましくは100～1,000 ng/mL、より好ましくは200～800 ng/mL、さらにより好ましくは400～600 ng/mLである。ＧＭ－ＣＳＦを使用する場合、その濃度の範囲は、好ましくは100～1,000 ng/mL、より好ましくは200～800 ng/mL、さらにより好ましくは400～600 ng/mLである。ＴＮＦ－αを使用する場合、その濃度の範囲は、好ましくは1.0～100 ng/mL、より好ましくは5.0～20 ng/mL、さらにより好ましくは8～12 ng/mLである。ＰＧＥ２を使用する場合、その濃度の範囲は、好ましくは100～10,000 ng/mL、より好ましくは500～5,000 ng/mL、さらにより好ましくは800～1,200 ng/mLである。
　成熟のための培養条件は、上述した培養条件と同じ条件を使用することができ、また、当業者であれば適宜変更できる。培養時間は、未成熟樹状細胞が成熟するのに十分な時間であればよく、当業者であれば適宜設定できる。例えば、培養時間は、１～３日間、好ましくは２日間である。
　次に、培養容器にα-ガラクトシルセラミド（αGalCer）を入れて、成熟した樹状細胞から、NKT細胞を刺激する樹状細胞を誘導する。ここで、「NKT細胞を刺激する樹状細胞」とは、NKT細胞の活性化および増殖を誘導する樹状細胞を指す。該樹状細胞の表面では、CD-1d分子によってα-GalCerが提示されており、NKT細胞がこのα-GalCerを認識することによって、NKT細胞が活性化される。
　本工程におけるαGalCerの濃度の範囲は、好ましくは10～1,000 ng/mL、より好ましくは20～800 ng/mL、さらにより好ましくは80～120 ng/mLである。
　本工程において、NKT細胞を刺激する樹状細胞を得るための培養条件は、上述した培養条件と同じ条件を使用することができ、また、当業者であれば適宜変更できる。培養時間は、成熟した樹状細胞を、NKT細胞を刺激する樹状細胞とするのに十分な時間であればよく、当業者であれば適宜設定できる。例えば、培養時間は、0.25～2日間、好ましくは1日間である。
　他の実施形態では、底面に定着しなかった浮遊細胞を回収し、保存していた場合、上記のようにしてNKT細胞を刺激する樹状細胞を得た後、該樹状細胞と該浮遊細胞とを別の培養容器に入れ培養して、該浮遊細胞の一部からNKT細胞を誘導することができる。ここで、回収した浮遊細胞を凍結保存していた場合、該浮遊細胞を例えば37℃で融解して、該樹状細胞と混合することができる。本実施形態では、NKT細胞を刺激する樹状細胞によって、浮遊細胞の一部がNKT細胞へ分化し、活性化される。それによって、本実施形態では、NKT細胞を刺激する樹状細胞とNKT細胞とを含む細胞組成物を得ることができる。ここで、本明細書において、「細胞組成物」とは、細胞を含む組成物であって、培地、保存液等の細胞以外の成分も含む組成物を意味する。
　上述した実施形態の製造方法は、得られたNKT細胞を刺激する樹状細胞、または該樹状細胞とNKT細胞とを含む細胞組成物を凍結保存する工程をさらに含むことができる。該樹状細胞または該細胞組成物を凍結保存しても、細胞の生存率と分化マーカーの発現が低下せず、細胞の機能が失われない。このように凍結保存が可能であることから、NKT細胞を刺激する樹状細胞、およびNKT細胞を刺激する細胞とNKT細胞とを含む細胞組成物を安定して提供できる。細胞の凍結保存は、当業者に周知の細胞の凍結保存方法で行うことができる。例えば、細胞を、細胞の凍結に適した公知の保存液に懸濁し、懸濁液を例えば液体窒素で凍結し、例えば－80℃以下で保存することによって行うことができる。
　上述した実施形態の製造方法によって得られたNKT細胞を刺激する樹状細胞、および該樹状細胞とNKT細胞とを含む細胞組成物は、免疫賦活化作用や抗がん作用を有する。該樹状細胞または該細胞組成物を医薬として許容される担体と混合することによって、感染症治療またはがん免疫療法に使用する細胞製剤を製造することができる。
　以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されるものではない。
　本発明者らは、健常者の血液サンプル（ID:NKT001～009）を用いて、下記の通りNKT細胞を刺激する樹状細胞、および該樹状細胞とNKT細胞とを含む細胞組成物の製造を実施した。
（材料）
　以下の実験で使用した材料は下記の通りである。
・α-GalCer：大阪合成有機化学研究所（大阪合成）　Lot No. N-32-A（GMPグレード品）
・GM-CSF：Miltenyi Biotec, #170-076-136
・IL-4：Miltenyi Biotec, #170-076-135
・IL-2：NIPRO, #87890
・Prostaglandin E-2：SIGMA, #P6532-1MG
・TNF-alpha：Miltenyi Biotec, #170-076-103
・培地：ALyS505N-0　（NIPRO, #1020P10）
　　　　AIM-V@Medium CTS　（ThermoFisher, #0870112-DK）
・抗体：
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control (FC) Catalog # 400114 BioLegend
PE Mouse IgG2a, κ Isotype Control (FC) Catalog # 400214 BioLegend
PE/Cy7 Mouse IgG1, κ Isotype Control (FC) Catalog # 400126 BioLegend
APC/Cy7 Mouse IgG1, κ Isotype Control (FC) Catalog # 400128 BioLegend
Anti-TCR Vα24-FITC Catalog # IM1589 BECKMAN COULTER
Anti-TCR Vβ11-PE Catalog # IM2290 BECKMAN COULTER
PE/Cy7 anti-human CD3 Catalog # 300420 BioLegend
APC/Cy7 anti-human CD56 (NCAM) Catalog # 318332 BioLegend
（実施例１）
　初日（Day 0）に、まずアフェレーシスにより細胞成分を分離した。その細胞成分をLeucoSepに30ｍLずつ重層させ、遠心分離（3000 rpm, 20min, r/t, Accel: 1, Decel: 1）を行った。その後に、50ｍL遠沈管に単核球層を回収して、等量の生理食塩水を加えて懸濁し、遠心分離（1500 rpm, 5min, r/t, Accel: 3, Decel: 2）を行った。AIM-Vを30ｍL加えて懸濁し、セルストレーナーを使い、細胞凝集塊を除去して、細胞数を計測した。単核球2×107cellsをフローサイトメーター測定用にサンプリング（Day 0用）した。AIM-Vを30mL入れた225cm2浮遊培養用フラスコ6個に播種し、インキュベーター（37oC、5%CO2）内で2時間静置し、非接着細胞を回収した。回収した非接着細胞を遠心分離（1500 rpm, 5min, r/t, Accel: 3, Decel: 3）し、2×108cells/mLになるようにAIM-Vを加えて懸濁して、11.8%ヒト血清アルブミン含有CP-1を等量添加し、フローバッグ（NIPRO）に入れて-80℃に保存した。培地は、ALyS505N-0（NIPRO, #1020P10）を使用した。
　他方で、フラスコ内の接着細胞にAIM-Vを30mL添加し、フラスコ内のAIM-VにIL-4が500U/mL、GM-CSFが500U/mLになるように添加し、インキュベーター（37oC、5%CO2）内で5日間静置した。
　培養開始から５日目で、フラスコ内のAIM-VにIL-4が500U/mL、GM-CSFが500U/mL、TNFαが10ng/mL、PGE2が1μg/mLになるように添加し、インキュベーター（37oC、5%CO2）内で1日間静置した。培養開始から６日目で、フラスコ内のAIM-Vにα-GalCerが100ng/mLになるように添加し、さらにインキュベーター（37oC、5%CO2）内で1日間静置した。
　培養開始から７日目で、各フラスコから浮遊細胞を回収し、遠心分離（1500 rpm, 5min, r/t, Accel: 3, Decel: 3）して、30mLの生理食塩水を加えて懸濁した。さらに、遠心分離（1500 rpm, 5min, r/t, Accel: 3, Decel: 2）を行い、30mLのAlyS505N-0(IL-2 100U/mL含有)を加えて懸濁した。ここで、Day 0で保存した非接着細胞を37oCで融解し、遠心分離（1500 rpm, 5min, r/t, Accel: 3, Decel: 2）を行い、30mLのAlyS505N-0(IL2 100U/mL含有)を加えて懸濁した。それぞれの細胞群は、AlyS505N-0(IL-2 100U/mL含有)1Lバッグを連結管で2つ繋いだバッグ（培地量2L）で播種し、インキュベーター（37oC、5%CO2）内で1日間静置した。播種したバッグからELISA測定用に1ｍLをサンプリングし、遠心分離（1500 rpm, 5min, r/t, Accel: 3, Decel: 3）した。ここで、2Lバッグで培養した細胞の細胞濃度と生細胞率を計測した。また、2Lバッグで培養した細胞の一部を用いてフローサイトメーターで細胞表面分子を測定した。
　NKT細胞の確認は、TCR Vα24-FITC or TCR Vα24-PerCP/Cy5.5, TCR Vβ11-PE, CD3-PE/Cy7, CD56-APC or CD56-APC/Cy7で行い、樹状細胞の確認は、CD14-PE, CD83-PE, CD80-PE or CD86-PEで行った。2Lバッグの残りの細胞はさらに1～2週間培養を継続した。継続培養した細胞中のNKT細胞を確認するため、フローサイトメーター解析を行った。
　フローサイトメーターによる解析結果は、図１～図３に示す。図１～図３は、３人の健常者（ID：NKT004、NKT005、NKT006）から得られた細胞を用いて同様の試験を行った結果を示す。図中のVa24とVb11は、抗原認識に必須な分子であるT細胞受容体（TCR）の2種類のサブユニットであり、aGalCerを認識するTCRのサブユニットでもある。これらのサブユニットに夫々特異的に結合する蛍光抗体を検査対象の細胞群と混合した後、フローサイトメーターで解析すると、Va24を認識する抗体が付着した細胞が横軸方向にシフトして、Vb11を認識する抗体が付着した細胞が縦軸方向にシフトして、蛍光強度が強く検出される。これらの抗体の両方が結合した細胞があれば、グラフの中央の四角の中にドットして現れる。このドット一つ一つがNKT細胞を示す。記載されている数値（%）は、1解析に使用した全細胞中に占めるNKT細胞の割合である。すべての実験において、培養開始から１週間でNKT細胞の割合が最大となった。図４は、これらの実験群における細胞の生存率を示す。図５は、これらの実験群における培養後の樹状細胞の総細胞数、生細胞率、樹状細胞（DC）への分化率を示すものである。
　図１～図３、図５から明らかなように、単核球のうち単球をフラスコ底面に定着させることによって単球を分離し、樹状細胞に分化させることで、培養１週間後に明らかなNKT細胞の増殖（最大で30倍程度）が確認された。２週間後ではNKT細胞率が低下する傾向も確認された。この培養期間では、総細胞数に変化はなく、生細胞率が低下することはなかった（図４）。
（実施例２）
　初日（Day 0）に、まずアフェレーシスにより細胞成分を分離した。この細胞成分をLeucoSepに30ｍLずつ重層し、遠心分離（3000 rpm, 20min, r/t, Accel: 1, Decel: 1）を行い、50ｍL遠沈管に単核球層を回収した。等量の生理食塩水を加えて懸濁し、遠心分離（1500 rpm, 5min, r/t, Accel: 3, Decel: 2）した後に、AIM-Vを30ｍL加えて懸濁し、セルストレーナーを使い、細胞凝集塊を除去した。ここで、細胞数を計測し、単核球2×107cellsをフローサイトメーター測定用にサンプリング（Day 0用）した。これらの細胞をCD14, CD83, CD86をフローサイトメーターで測定した。AIM-Vを30mL入れた225cm2浮遊培養用フラスコ6個に播種し、インキュベーター（37oC、5%CO2）内で2時間静置した。その後、非接着細胞を廃棄し、フラスコ内の接着細胞にAIM-Vを30mL添加し、フラスコ内のAIM-VにIL-4が500U/mL、GM-CSFが500U/mLになるように添加して、インキュベーター（37oC、5%CO2）内で5日間静置した。
　培養開始５日目に、フラスコ内のAIM-VにIL-4が500U/mL、GM-CSFが500U/mL、TNF-αが10ng/mL、PGE2が1μg/mLになるように添加して、インキュベーター（37oC、5%CO2）内で1日間静置した。培養開始６日目には、フラスコ内のAIM-Vにα-GalCerが100ng/mLになるように添加して、インキュベーター（37oC、5%CO2）内で1日間静置した。
　培養開始７日目に、各フラスコから浮遊細胞を回収して、遠心分離（1500 rpm, 5min, r/t, Accel: 3, Decel: 3）を行い、30mLの生理食塩水を加えて懸濁して、遠心分離（1500 rpm, 5min, r/t, Accel: 3, Decel: 2）した。沈殿の細胞に30mLの生理食塩水を加えて懸濁して、遠心分離（1500 rpm, 5min, r/t, Accel: 3, Decel: 2）して、再度、30mLの生理食塩水を加えて懸濁する同じ操作をさらに２回繰り返した。得られた細胞の懸濁液の一部をサンプリングして細胞濃度と生細胞率を計測した。また、細胞表面のCD14, CD83, CD86をフローサイトメーターで測定した。その後、遠心分離（1500 rpm, 5min, r/t, Accel: 3, Decel: 2）をして、回収した細胞を6mLの凍結保存液（10%DMSO, 90%autoserum）で懸濁し、バイアルに1mLずつ分注し、各バイアルをマイナス80℃で保存した。解凍後に細胞表面のCD14,CD83,CD86をフローサイトメーターで測定した。
　図６～図８は、３人の健常者（ID：NKT007、NKT008、NKT009）の細胞について、Day0, 凍結前（分化誘導後）、及び凍結融解後に細胞表面のCD14,CD83,CD86をフローサイトメーターで解析した結果を示す。図９は、図６～図８に対応する実験群における凍結前及び解凍洗浄後の総細胞数と生細胞率を示す。各サンプルにおいて、分化誘導した細胞の凍結前後で表面マーカーに差異はなく、CD14の消失とCD83、CD86の増強が確認された（図６～８）。また、各サンプルにおいて、凍結前後で生細胞率に変化はなかった（図９）。
（比較例）
　非特許文献１に記載の方法を参考に、３人の健常者（ID：NKT001、NKT002、NKT003）より採取した単核球を用いて、以下の実験を行った。初日（Day 0）に、まずアフェレーシスにより細胞成分を分離した。その細胞成分をLeucoSepに30ｍLずつ重層させ、遠心分離（3000 rpm, 20min, r/t, Accel: 1, Decel: 1）を行った。その後に、50ｍL遠沈管に単核球層を回収して、等量の生理食塩水を加えて懸濁し、遠心分離（1500 rpm, 5min, r/t, Accel: 3, Decel: 2）を行った。上清除去後、AlyS505N-0 (IL-2 100U/mL含有)を30ｍL加えて懸濁し、セルストレーナーを使い、細胞凝集塊を除去して、細胞数を計測した。単核球2×107 cellsをフローサイトメーター測定用にサンプリング（Day 0用）した。225cm2浮遊培養用フラスコ4個に各6×107cells/ 60mLになるように播種し、4個のフラスコに以下のように試薬を添加した。
フラスコ1：なし
フラスコ2：800U/mL GM-CSF
フラスコ3：100ng/mL α-GalCer
フラスコ4：800U/mL GM-CSF + 100ng/mL α-GalCer
これらのフラスコは、インキュベーター（37oC、5%CO2）内で静置し、残りの細胞は、AlyS505N-0 (IL-2 100U/mL, GM-CSF 800U/mL, α-GalCer 100ng/mL含有)1Lバッグを連結管で2つ繋いだバッグ（培地量2L）に播種した。播種したバッグは、インキュベーター（37oC、5%CO2）内で6日間静置した。上述したフローサイトメーター測定用細胞の細胞表面分子を実施例１と同様に測定した。
　培養開始２日目（Day 2）に、各フラスコから培養液20ｍLを回収し、細胞濃度と生細胞率を計測した。その後、培養液を遠心分離（1500 rpm, 5min, r/t, Accel: 3, Decel: 3）し、さらに1mLサンプリングし、遠心分離（1500 rpm, 5min, r/t, Accel: 3, Decel: 3）した。遠心分離後の細胞は、フローサイトメーターで細胞表面分子を測定した。
　培養開始６日目（Day 6）に、各フラスコから20ｍLを回収し、細胞濃度と生細胞率を計測した。その後、培養液を遠心分離（1500 rpm, 5min, r/t, Accel: 3, Decel: 3）し、さらに1ｍLをサンプリングし、遠心分離（1500 rpm, 5min, r/t, Accel: 3, Decel: 3）した。遠心分離後の細胞は、フローサイトメーターで細胞表面分子を測定した。
　Day0, Day2, Day6にNKT細胞を、Day0, Day6に樹状細胞をフローサイトメーターで解析した。培養はサイトカイン未添加、GM-CSFのみ、α-GalCerのみ、GM-CSFとα-GalCerを添加する条件で行った。図１０（Ａ）～図１０（Ｃ）、図１１（Ａ）～（Ｃ）、図１２（Ａ）～（Ｃ）は、それぞれ３人の健常者（ID：NKT001、NKT002、NKT003）について、Day0, Day2, Day6にNKT細胞をフローサイトメーターで解析した結果を示す。図１３（Ａ）及び図１３（Ｂ）、図１４（Ａ）及び図１４（Ｂ）、図１５（Ａ）及び図１５（Ｂ）は、それぞれ３人の健常者（ID：NKT001、NKT002、NKT003）について、Day0, Day6に樹状細胞をフローサイトメーターで解析した結果を示す。図１６は、これらの実験群における細胞の生存率を示す。図１０（Ｃ）、図１１（Ｃ）、図１２（Ｃ）に示すように、培養１週間ではNKT細胞の増殖が確認できなかった。この培養期間では総細胞数に変化はなく、生細胞率が低下することはなかった（図１６）。また、図１３（Ｂ）、図１４（Ｂ）、図１５（Ｂ）に示すように、各実験群において単球が樹状細胞に分化している傾向が認められるものの、明確な結果は得られなかった。
　以上より、実施例１、２の方法は、比較例の方法と比べて、約１週間という短期間で効率良くNKT細胞を刺激する樹状細胞が得られ、NKT細胞を増殖できることが分かる。また、比較例の方法では、細胞培養バッグでの液体培養であり、実施例１、２の方法よりも、使用する培地量が多い。すなわち、実施例１、２の方法は、比較例の方法よりも使用する培地量が少ない（約１０分の１）ため、経済的である。
　本発明によると、例えばがん免疫療法に用いる、NKT細胞を刺激する樹状細胞、および該樹状細胞とNKT細胞とを含む細胞組成物の製造に有用である。本製造方法によれば、高効率で、安定的且つ経済的な該樹状細胞および該細胞組成物の製造方法が提供でき、産業上有用である。

Claims (4)

  1. 　ナチュラルキラーT（NKT）細胞を刺激する樹状細胞の製造方法であって、
    　単核球を培養容器に入れ、静置して前記単核球のうちの一部の細胞を容器の底面に定着させる工程と、
    　前記培養容器の底面に定着した細胞以外の浮遊細胞を除去する工程と、
    　前記培養容器に所定の因子を入れて前記底面に定着した細胞のうちの単球を未成熟樹状細胞に分化させる工程と、
    　前記培養容器に所定の因子を入れて前記未成熟樹状細胞を成熟させる工程と、
    　前記培養容器にα-ガラクトシルセラミドを入れて、成熟した樹状細胞から、NKT細胞を刺激する樹状細胞を誘導する工程と、
    を含むことを特徴とする、NKT細胞を刺激する樹状細胞の製造方法。
  2. 　得られたNKT細胞を刺激する樹状細胞を凍結保存する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のNKT細胞を刺激する樹状細胞の製造方法。
  3. 　NKT細胞を刺激する樹状細胞とNKT細胞とを含む細胞組成物の製造方法であって、
    　単核球を第１の培養容器に入れ、静置して前記単核球のうちの一部の細胞を容器の底面に定着させる工程と、
    　容器の底面に定着した細胞以外の浮遊細胞を回収し保存する工程と、
    　前記第１の培養容器に所定の因子を入れて前記底面に定着した細胞のうちの単球を未成熟樹状細胞に分化させる工程と、
    　前記第１の培養容器に所定の因子を入れて前記未成熟樹状細胞を成熟させる工程と、
    　前記第１の培養容器にα-ガラクトシルセラミドを入れて、成熟した樹状細胞から、NKT細胞を刺激する樹状細胞を誘導する工程と、
    　前記NKT細胞を刺激する樹状細胞と保存しておいた浮遊細胞を第２の培養容器に入れ、培養して、前記浮遊細胞の一部からNKT細胞を誘導する工程と、
    を含むことを特徴とする、NKT細胞を刺激する樹状細胞とNKT細胞とを含む細胞組成物の製造方法。
  4. 　得られたNKTを刺激する細胞とNKT細胞とを含む細胞組成物を凍結保存する工程をさらに含むことを特徴とする請求項３に記載の細胞組成物の製造方法。
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