KR101963920B1 - Nk 세포의 증폭 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 채취된 혈구 세포로부터 시험관 내에서 NK 세포를 증폭시켜, 세포 요법의 최적 개수의 NK 세포를 제조하는 기술을 개발한다. 또한, 본 발명은 NK 세포의 증폭 방법을 제공한다. 본 발명의 NK 세포의 증폭 방법은, NK 세포를 포함하는 세포 집단을 제조하는 스텝과, 상기 NK 세포를 포함하는 세포 집단으로부터 T 세포를 제거하는 스텝과, 상기 T 세포가 제거된 나머지 세포를 2500IU/mL 내지 2813IU/mL의 IL-2를 포함하는 배지에서 배양하는 스텝을 포함한다. 본 발명의 NK 세포의 증폭 방법은, 상기 NK 세포를 포함하는 세포 집단으로부터 조혈 전구 세포를 제거하는 스텝을 포함하는 경우가 있다. 본 발명은, 본 발명의 NK 세포의 증폭 방법에 의해 제조되는 NK 세포를 포함하는 세포 요법을 위한 의약품 조성물을 제공한다. 본 발명의 세포 요법을 위한 의약품 조성물은, 감염증 및/또는 암을 치료하기 위해 사용되는 경우가 있다.
Description
본 발명은, 높은 세포 상해 활성을 갖는 자연 살해 세포(NK 세포)를 높은 순도 및 높은 증폭 배율로 증폭하는 방법과, 상기 방법에 의해 얻어지는 NK 세포를 포함하는 의약품 조성물에 관한 것이다.
NK 세포는, MHC 클래스 I 분자를 발현하는 정상 세포는 공격하지 않고, MHC 클래스 I 분자의 발현이 저하 및 결손된 세포를 주로 공격한다. 따라서 암 및 감염증의 세포 요법에 동종 NK 세포를 사용하면, GVH(Graft-versus-host; 이식 편대 숙주)병의 부작용을 회피할 수 있다는 이점이 있다. 실제로 Miller 외(비특허문헌 1) 및 Rubnitz 외(비특허문헌 2)의 보고에 따르면, 암 환자를 수용자로 하고, 그의 근연(近緣)인 정상인 공여자의 신선한 말초혈 단핵구로부터 NK 세포를 농축한 후 이식했을 때, 이식된 NK 세포는 수용자에 부작용을 일으키지 않고, 일시적으로 생착하여, 세포 상해 활성을 유지하였다. 그러나, NK 세포의 이식 요법의 유효성을 나타내는 임상치료의 효력의 보고는 아직 없다. 그 이유 중 하나는, 공여자로부터 림프구 성분 채집(apheresis)에 의해 회수할 수 있는 세포수에 한도가 있기 때문에, 암 세포 및 병원체 감염 세포와 같은 표적 세포를 사멸시키는데 충분한 수의 NK 세포를 표적 세포가 사멸될 때까지의 기간에 수용자 체내에 체류시킬 수 없기 때문이다.
정상 성인의 말초혈의 1회의 성분 채집으로부터는 약 1×1010개의 단핵구를 회수할 수 있으며, 말초혈 단핵구 중의 NK 세포의 구성 비율을 약 7％로 하면 7×108개의 NK 세포가 얻어진다(비특허문헌 3). 한편, NK 세포의 이식에는 1×105개/kg 내지 2×107개/kg(비특허문헌 1)이나, 5×105개/kg 내지 8.1×107개/kg(비특허문헌 2)의 오더의 NK 세포가 사용된다. 환자의 체중을 60kg으로 하면, 6×106개 내지 4.8×109개의 NK 세포가 필요로 된다. 이것은, 정상 성인의 말초혈의 1회의 성분 채집으로부터 얻어지는 NK 세포의 0.0086배 내지 6.86배에 상당한다. 그러나, 예를 들면 비특허문헌 2에 따르면, NK 세포의 생착 기간은 투여된 NK 세포의 수와는 상관이 보이지 않고, 2일 내지 189일이며, 중앙값은 10일에 지나지 않았다. 따라서, 암 세포 및 병원체 감염 세포와 같은 표적 세포를 사멸시키는데 충분한 수의 NK 세포를 표적 세포가 사멸될 때까지의 기간에 수용자 체내에 체류시키기 위해서는, NK 세포의 이식이 빈번히 반복될 필요가 있고, 이것은 환자에게 큰 부담이 된다.
따라서, 공여자로부터 얻은 NK 세포를 일단 시험관 내에서 배양 증폭하여, 표적 세포를 사멸시키는데 충분한 NK 세포를 얻는 기술의 개발이 진행되고 있다. Terunuma, H. 외(특허문헌 1)는, 인간 CD3에 대한 아고니스트 항체인 OKT3과, IL-2와, 항CD16 항체의 존재하에 정상인의 말초혈 단핵구를 13일간 배양하여, NK 세포를 순도 81.2％, 130배로 증폭하였다. 또한, K562 세포에 대한 상기 NK 세포의 세포 상해 활성(E:T=3:1)은 66％였다. Tanaka, J. 외(특허문헌 2)는, IL-2, IL-15, 항CD3 항체, 5％의 인간 AB형 혈청, 타크로리무스 및 달테파린이 첨가된 배지를 사용하는 방법에 의해 정상인의 말초혈 단핵구 세포를 21일간 배양하여, NK 세포를 순도 73.4％, 6268배로 증폭하였다. 또한, K562 세포에 대한 상기 NK 세포의 세포 상해 활성(E:T=1:1)은 약 55％였다. Carlens, S. 외(비특허문헌 4)는, 인간 CD3에 대한 아고니스트 항체인 OKT3과, IL-2의 존재하에 정상인의 말초혈 단핵구를 21일간 배양하여, NK 세포를 순도 55％, 193배로 증폭하였다고 보고하였다. 또한, K562 세포에 대한 상기 NK 세포의 세포 상해 활성(E:T=1:1)은 45％였다. Alici, E. 외(비특허문헌 5)는, 마찬가지의 조건으로 미엘로마 환자의 말초혈 단핵구를 20일간 배양하여, NK 세포를 순도 65％, 1625배로 증폭하였다고 보고하였다. 또한, K562 세포에 대한 상기 NK 세포의 세포 상해 활성(E:T=1:1)은 약 10％였다. Fujisaki, H. 외(비특허문헌 6)는, NK 세포를 활성화하는 인자를 발현하도록 유전적으로 개변된 백혈병 세포를 피더 세포(feeder cell)로서 사용하는 배양 조건으로 정상인의 말초혈 단핵구를 21일간 배양하여, NK 세포를 순도 96.8％, 277배로 증폭하였다고 보고하였다. 또한, K562 세포에 대한 상기 NK 세포의 세포 상해 활성(E:T=1:1)의 최대값은 약 90％였다.
Terunuma, H. 외(특허문헌 1), Tanaka, J. 외(특허문헌 2), Carlens, S. 외(비특허문헌 4) 및 Alici, E. 외(비특허문헌 5)의 방법으로 증폭된 NK 세포의 세포 상해 활성(E:T=1:1)은, 각각 66％, 약 55％, 45％ 및 약 10％였다. 따라서, 종래기술에서는 NK 세포의 세포 상해 활성이 낮기 때문에, 치료 효과가 낮고, NK 세포의 투여수가 증대되기 때문에 바람직하지 않다. Fujisaki, H. 외(비특허문헌 6)의 방법에서는, 증폭된 NK 세포의 세포 상해 활성은 약 90％(최대값)였다. 그러나, 유전적으로 개변된 종양 세포가 피더 세포로서 사용되기 때문에, 상기 세포가 최종 산물에 혼입된다는 리스크가 있어 바람직하지 않다.
Miller, J.S. 외, Blood, 105:3051(2005)
Rubnitz, J.E. 외, J.Clin.Oncol., 28:955(2010)
Cho, D. 및 Campana, D., Korean J.Lab.Med., 29:89(2009)
Carlens, S. 외, Hum.Immunol., 62:1092(2001)
Alici, E. 외, Blood, 111:3155(2008)
Fujisaki, H. 외, Cancer Res., 69:4010(2009)
따라서, 피더 세포를 사용하지 않고, 제대혈로부터도, 말초혈로부터도 높은 세포 상해 활성을 갖는 NK 세포를 고순도로 증폭할 수 있는 기술을 개발할 필요가 있다.
본 발명은 NK 세포의 증폭 방법을 제공한다. 본 발명의 NK 세포의 증폭 방법은, NK 세포를 포함하는 세포 집단을 제조하는 스텝과, 상기 NK 세포를 포함하는 세포 집단으로부터 T 세포를 제거하는 스텝과, 상기 T 세포가 제거된 나머지 세포를 2500IU/mL 내지 2813IU/mL의 IL-2를 포함하는 배지에서 배양하는 스텝을 포함한다.
본 발명의 NK 세포의 증폭 방법에 있어서, 상기 NK 세포를 포함하는 세포 집단으로부터 상기 T 세포를 제거하는 스텝은, CD3 양성 세포를 제거하는 스텝에 의해 달성되는 경우가 있다.
본 발명의 NK 세포의 증폭 방법은, 상기 NK 세포를 포함하는 세포 집단으로부터 조혈 전구 세포를 제거하는 스텝을 포함하는 경우가 있다.
본 발명의 NK 세포의 증폭 방법에 있어서, 상기 NK 세포를 포함하는 세포 집단으로부터 상기 조혈 전구 세포를 제거하는 스텝은, CD34 양성 세포를 제거하는 스텝에 의해 달성되는 경우가 있다.
본 발명의 NK 세포의 증폭 방법에 있어서, 상기 배지는 자가 혈청, AB형 혈청 및/또는 혈청 알부민을 포함하는 경우가 있다.
본 발명의 NK 세포의 증폭 방법에 있어서, 상기 NK 세포를 포함하는 세포 집단을 제조하는 스텝은, 피험자로부터 채취된 혈구 세포로부터 단핵구를 분리하는 스텝에 의해 달성되는 경우가 있다.
본 발명의 NK 세포의 증폭 방법에 있어서, 상기 혈구 세포는 말초혈, 제대혈, 골수 및/또는 림프절로부터 채취되는 경우가 있다.
본 발명의 NK 세포의 증폭 방법에 있어서, 상기 혈구 세포는 말초혈로부터 성분 채집법에 의해 채취되는 경우가 있다.
본 발명의 NK 세포의 증폭 방법에 있어서, 상기 NK 세포를 포함하는 세포 집단은, 배성 줄기 세포, 성체 줄기 세포 및 인공 다능성 줄기(iPS) 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 줄기 세포 유래의 조혈 줄기 세포와, 제대혈 유래의 조혈 줄기 세포와, 말초혈 유래의 조혈 줄기 세포와, 골수혈 유래의 조혈 줄기 세포와, 제대혈 단핵구와, 말초혈 단핵구로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종류의 세포로 제조되는 경우가 있다. 상기 NK 세포를 포함하는 세포 집단의 공여자는, 수용자인 환자 자신이나, 상기 환자의 근연자나, 환자와는 혈연 관계가 없는 자에서 유래하는 경우가 있다. 상기 NK 세포는, 수용자의 주요 조직 적합성 항원(MHC)과, 킬러 면역글로불린 유사 수용체(Killer Immunoglobulin-like Receptor: KIR)가 불일치하는 공여자에서 유래하는 경우가 있다.
본 발명은, 본 발명의 증폭 방법에 의해 제조되는 NK 세포를 포함하는 세포 요법을 위한 의약품 조성물을 제공한다. 본 발명의 의약품 조성물은, 증폭된 NK 세포 이외에 NK 세포 전구체, T 세포, NKT 세포, 조혈 전구 세포 등을 포함하는 경우가 있다.
본 발명의 의약품 조성물은, 감염증 및/또는 암을 치료하기 위해 사용되는 경우가 있다.
본 발명의 의약품 조성물은, 본 발명의 증폭 방법에 의해 제조되는 NK 세포와 상이한 HLA 유전자형을 갖는 환자에 투여되는 경우가 있다.
본 발명은, 상기 NK 세포를 포함하는 세포 집단을 제조하는 스텝과, 상기 NK 세포를 포함하는 세포 집단으로부터 T 세포를 제거하는 스텝과, 상기 T 세포가 제거된 나머지 세포를 2500IU/mL 내지 2813IU/mL의 IL-2를 포함하는 배지에서 배양하는 스텝과, 상기 나머지 세포로부터 증폭된 NK 세포를 환자에 이식하는 스텝을 포함하는 세포 요법을 제공한다. 상기 세포 요법은, 상기 NK 세포를 포함하는 세포 집단으로부터 조혈 전구 세포를 제거하는 스텝을 포함하는 경우가 있다. 상기 NK 세포를 환자에 이식하는 스텝에 있어서, 증폭된 NK 세포는, NK 세포 전구체, T 세포, NKT 세포, 조혈 전구 세포 등과 함께 이식되는 경우가 있다. 본 발명의 세포 요법은, 감염증 및/또는 암을 치료 및/또는 예방하기 위해 사용되는 경우가 있다. 본 발명의 세포 요법은, 본 발명의 증폭 방법에 의해 제조되는 NK 세포와 상이한 HLA 유전자형을 갖는 환자에 이식하는 스텝을 포함하는 경우가 있다. 본 발명의 세포 요법에 있어서, 상기 NK 세포를 환자에 이식하는 스텝은, 본 발명의 의약품 조성물을 환자에 투여하는 스텝에 의해 달성되는 경우가 있다.
본 발명의 세포 요법에 있어서, 상기 NK 세포를 포함하는 세포 집단은, 배성 줄기 세포, 성체 줄기 세포 및 인공 다능성 줄기(iPS) 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 줄기 세포 유래의 조혈 줄기 세포와, 제대혈 유래의 조혈 줄기 세포와, 말초혈 유래의 조혈 줄기 세포와, 골수혈 유래의 조혈 줄기 세포와, 제대혈 단핵구와, 말초혈 단핵구로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종류의 세포로 제조되는 경우가 있다. 상기 NK 세포를 포함하는 세포 집단의 공여자는, 수용자인 환자 자신이나, 상기 환자의 근연자나, 환자와는 혈연 관계가 없는 자에서 유래하는 경우가 있다. 상기 NK 세포는, 수용자의 주요 조직 적합성 항원(MHC)과, 킬러 면역글로불린 유사 수용체(Killer Immunoglobulin-like Receptor: KIR)가 불일치하는 공여자에서 유래하는 경우가 있다.
본 명세서에 있어서 「NK 세포」란 CD3 음성 CD56 양성의 단핵구를 말하고, 특히 MHC 클래스 I 분자의 발현이 적거나, 상기 발현이 소실되어 있는 세포에 대한세포 상해 활성을 갖는다.
본 발명의 증폭 방법에 있어서, 상기 NK 세포를 포함하는 세포 집단은 당업자에게 알려진 다양한 순서를 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 제대혈 및 말초혈과 같은 혈액으로부터 단핵구를 회수할 때에는 비중 원심법을 사용할 수 있다. 또한, NK 세포는 면역 자기 비즈를 사용하여 채취할 수 있다. 또한, 상기 NK 세포는, 세포 표면 마커에 대한 특이적 항체로 면역 형광 염색을 행하고, FACS(Fluorescence activated cell sorter; 형광 활성화 세포 분류기) 또는 플로우 사이토미터를 사용하여 단리ㆍ동정할 수 있다. 또한, 상기 NK 세포는, 인비트로젠(Invitrogen)사로부터 판매되는 다이날(Dynal)사 제조 다이나비즈(Dynabeads)(상표)나, 밀테니 바이오텍사의 클리니맥스(CliniMACS)(상표)를 포함하지만 이들로 한정되지 않는 면역 자기 비즈를 사용하여, 세포 표면 항원 CD3 및/또는 CD34를 발현하는 세포를 분리 제거하여 제조되어도 상관없다. 또한, T 세포 및/또는 조혈 전구 세포에 대한 특이적 결합 파트너를 이용하여, T 세포 및/또는 조혈 전구 세포를 선택적으로 상해 또는 사멸시키는 경우가 있다. 또한, 상기 T 세포를 상기 단핵구로부터 제거하는 스텝은, 다른 세포 타입, 예를 들면 조혈 전구 세포, B 세포 및/또는 NKT 세포를 T 세포와 함께 제거하는 스텝이어도 상관없다. 조혈 전구 세포를 상기 단핵구로부터 제거하는 스텝은 다른 세포 타입, 예를 들면 T 세포, B 세포 및/또는 NKT 세포를 조혈 전구 세포와 함께 제거하는 스텝이어도 상관없다.
본 발명의 증폭 방법에 있어서, 제대혈 및 말초혈로부터 분리된 단핵구는 동결 보존되고, 환자로의 이식 시기에 따라 해동되어, NK 세포의 증폭에 사용되는 경우가 있다. 또는, 상기 단핵구는 본 발명의 NK 세포의 증폭 방법에 의해 증폭되는 도중이나, 증폭이 끝난 후에 동결되고, 환자로의 이식 시기에 따라 해동되어, 환자로의 이식에 사용되는 경우가 있다. 혈구 세포의 동결 및 해동은 당업자에게 주지된 어떠한 방법을 사용하여도 상관없다. 상기 세포의 동결에는, 어느 하나의 시판된 세포 동결 보존액이 사용되는 경우가 있다.
본 발명의 세포 요법에 있어서 살아 있는 NK 세포를 현탁하기 위한 용액은, 예를 들면 생리 식염수, 인산 완충 생리 식염수(PBS), 배지, 혈청 등이 일반적이다. 상기 용액은, 의약품 및 의약 부외품으로서 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 경우가 있다. 본 발명의 NK 세포 요법은, NK 세포에 감수성을 갖는 다양한 질환의 치료 및/또는 예방에 적용할 수 있다. 상기 질환은, 예를 들면 구강암, 담낭암, 담관암, 폐암, 간암, 대장암, 신장암, 방광암, 백혈병이나, 바이러스, 세균 등에 의한 감염증을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 본 발명의 세포 요법은 단독이나, 또는 외과 요법, 화학 요법, 방사선 요법 등과 조합하여 실시되는 경우가 있다. 본 발명의 세포 요법에서 NK 세포는, 예를 들면 정맥, 동맥, 피하, 복강 내 등으로의 투여에 의해 이식되는 경우가 있다.
본 발명의 NK 세포를 제조하기 위한 세포 배양용 배지는, KBM501 배지(코진 바이오 가부시끼가이샤), CellGro SCGM 배지(셀제닉스, 이와이 가가꾸 야꾸힌 가부시끼가이샤), X-VIVO15 배지(론자, 타카라 바이오 가부시끼가이샤), IMDM, MEM, DMEM, RPMI-1640 등을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다.
상기 배지에는, 인터류킨-2(IL-2)가 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 농도로 첨가되는 경우가 있다. 상기 IL-2의 농도는, 2500IU/mL 내지 2813IU/mL인 경우가 있다. 상기 IL-2는 인간의 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하고, 안전상 재조합 DNA 기술로 생산되는 것이 바람직하다.
본 명세서에서 IL-2의 농도는, 일본 국내 표준 단위(JRU) 및 국제 단위(IU)로 나타나는 경우가 있다. 1IU가 약 0.622JRU이기 때문에, 1750JRU/mL는 약 2813IU/mL이다.
상기 배지에는 피험자의 자가 혈청, 바이오휘터커(BioWhittaker)사, 그 이외로부터 입수 가능한 인간 AB형 혈청이나, 니혼 세키주지사로부터 입수 가능한 헌혈 인간 혈청 알부민이 첨가되는 경우가 있다. 상기 자가 혈청 및 상기 인간 AB형 혈청은 1 내지 10％의 농도로 첨가되는 것이 바람직하고, 상기 헌혈 인간 혈청 알부민은 1 내지 10％의 농도로 첨가되는 것이 바람직하다. 상기 피험자는, 정상인과, 상기 질환에 이환된 환자의 경우가 있다.
상기 배지에는, NK 세포의 증폭 효과를 손상시키지 않는 것을 조건으로서, 적절한 단백질, 사이토카인, 항체, 화합물 그 이외의 성분이 포함되는 경우가 있다. 상기 사이토카인은, 인터류킨-3(IL-3), 인터류킨-7(IL-7), 인터류킨-12(IL-12), 인터류킨-15(IL-15), 인터류킨-21(IL-21), 줄기 세포 인자(SCF), 및/또는 FMS형 티로신 키나아제 3 리간드(Flt3L)인 경우가 있다. 상기 IL-3, IL-7, IL-12, IL-15, IL-21, SCF 및 Flt3L은 인간의 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하고, 안전상 재조합 DNA 기술로 생산되는 것이 바람직하다. 상기 배지의 교환은 원하는 NK 세포의 세포수가 얻어지는 것을 조건으로서, 배양 개시 후 언제 행해져도 상관없지만 3 내지 5일 마다가 바람직하다.
본 발명의 증폭 방법에 있어서, 배양 용기는 상업적으로 입수 가능한 디시, 플라스크, 플레이트, 멀티 웰 플레이트를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 배양 조건은, NK 세포의 증폭 효과를 손상시키지 않는 것을 조건으로서 특별히 한정되지 않지만, 37℃, 5％ CO2 및 포화 수증기 분위기하의 배양 조건이 일반적이다. 본 발명의 목적은 NK 세포를 대량으로 제조하는 것이기 때문에, 상기 배지에서 배양하는 기간이 길수록 보다 많은 NK 세포가 얻어져 유리하다. 배양 기간은, NK 세포를 원하는 세포수까지 증폭하는 것을 조건으로서, 특별히 한정되지 않는다.
본 발명의 증폭 방법에서 상기 NK 세포를 포함하는 세포 집단은, NK 세포 이외에 NK 세포 전구체, T 세포, NKT 세포, 조혈 전구 세포 등을 포함하는 경우가 있다. 원하는 NK 세포가 증폭 후, 예를 들면 비중 원심법, 면역 자기 비즈, FACS, 플로우ㆍ사이토메트리 등을 사용하여 선택되는 경우가 있다. 예를 들면, 상기 NK 세포는 항CD3 항체, 항CD16 항체, 항CD34 항체, 항CD56 항체, 항CD69 항체, 항CD94 항체, 항CD107a 항체, 항KIR3DL1 항체, 항KIR3DL2 항체, 항KIR2DL3 항체, 항KIR2DL1 항체, 항KIR2DS1 항체, 항KIR2DL5 항체, 항NKp46 항체, 항NKp30 항체, 항NKG2D 항체 등을 사용하여, 상기 세포 집단으로부터 선택적으로 분리되는 경우가 있다. 상기 항체는, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 등인 경우가 있다. NK 세포의 선택은, T 세포, NKT 세포, 조혈 전구 세포 그 이외의 세포를 선택적으로 제거하여 행해지는 경우가 있다.
본 발명의 방법 및 의약품 조성물의 제조는, 의약품 및 의약 부외품의 제조 관리 및 품질 관리 규칙에 적합한 조건(good manufacturing practice, GMP)으로 실시되는 것이 바람직하다.
증폭된 NK 세포의 세포 상해 활성은, 당업자에게 주지된 방법에 의해 평가할 수 있다. 상기 세포 상해 활성은, 상기 NK 세포(이펙터 세포)와, 방사성 물질, 형광 색소 등으로 표식한 표적 세포를 인큐베이션한 후, 방사선량 또는 형광 강도를 측정함으로써 정량하는 것이 일반적이다. 상기 표적 세포는 K562 세포, 급성 골수성 백혈병 세포, 만성 골수성 백혈병 세포인 경우가 있지만, 이들로 한정되지 않는다. 증폭된 NK 세포의 성질은, RT-PCR법, 고상 잡종 형성법, ELISA법, 웨스턴 블롯법, 면역 침강법, 면역 비탁법, FACS, 플로우ㆍ사이토메트리법 등을 사용하여 조사되는 경우가 있다.
본 발명에 있어서, 제대혈 및 말초혈의 전혈의 채취와, 자가 혈청의 제조와, 상기 전혈로부터의 단핵구의 제조와, 상기 단핵구의 배양 전후의 세포수의 측정과,배양 전후의 상기 단핵구 중의 NK 세포, T 세포, 조혈 전구 세포 그 이외의 세포 타입의 구성 비율의 측정과, NK 세포의 증폭 배율의 산출과, 측정 오차나 유의성에 관한 통계 해석은, 당업자에게 주지된 어떠한 방법을 사용하여 실시되어도 상관없다.
본 명세서에 있어서 언급되는 모든 문헌은 그 전체가 인용에 의해 본 명세서에 도입된다.
[도 1a] CD3 양성 세포의 제거 전에 CD3 및 CD56에 대한 항체로 2중 염색하여 플로우ㆍ사이토메트리법으로 측정한 결과도.
[도 1b] CD3 양성 세포의 제거 후에 CD3 및 CD56에 대한 항체로 2중 염색하여 플로우ㆍ사이토메트리법으로 측정한 결과도.
[도 2a] 정상인 5명의 말초혈 중의 단핵구로부터 분리된 CD3 음성 세포의 세포수 각각의 증식 곡선.
[도 2b] 정상인 5명의 말초혈 중의 단핵구로부터 분리된 CD3 음성 세포의 세포수의 평균 증식 곡선.
[도 3a] 정상인 5명의 말초혈 중의 단핵구로부터 분리된 CD3 음성 세포의 증폭 배율 각각의 증식 곡선.
[도 3b] 정상인 5명의 말초혈 중의 단핵구로부터 분리된 CD3 음성 세포의 증폭 배율의 평균 증식 곡선.
[도 4a] 정상인 5명의 말초혈 중의 단핵구로부터 분리된 NK 세포(CD3 음성/CD56 양성)의 증폭 배율 각각의 증식 곡선.
[도 4b] 정상인 5명의 말초혈 중의 단핵구로부터 분리된 NK 세포(CD3 음성/CD56 양성)의 증폭 배율의 평균 증식 곡선.
[도 5a] 정상인 5명으로부터 분리된 NK 세포(CD3 음성/CD56 양성)의 배양 세포 전체에 대한 구성 비율의 경시적인 변화를 플로우ㆍ사이토메트리법으로 측정한 결과도.
[도 5b] 정상인 5명으로부터 분리된 NK 세포(CD3 음성/CD56 양성)의 배양 세포 전체에 대한 구성 비율의 경시적인 변화를 플로우ㆍ사이토메트리법으로 측정하고, 평균화한 결과도.
[도 6a] 진행암(구강암, 담낭암 및 담관암)의 환자 3명으로부터 분리된 NK 세포(CD3 음성/CD56 양성)의 배양 세포 전체에 대한 구성 비율의 경시적인 변화를 플로우ㆍ사이토메트리법으로 측정한 결과도.
[도 6b] 진행암(구강암, 담낭암 및 담관암)의 환자 3명으로부터 분리된 NK 세포(CD3 음성/CD56 양성)의 증폭 배율의 평균 증식 곡선.
[도 7] CD69의 플로우ㆍ사이토메트리 해석 결과를 비교한 그래프.
[도 8] CD69의 플로우ㆍ사이토메트리 해석 결과를 비교한 평균 형광 강도(MFI)의 측정값의 그래프.
[도 9] CD16의 플로우ㆍ사이토메트리 해석 결과를 비교한 그래프.
[도 10] CD16의 플로우ㆍ사이토메트리 해석 결과를 비교한 평균 형광 강도(MFI)의 측정값의 그래프.
[도 11] 다양한 세포 표면 마커의 플로우ㆍ사이토메트리 해석 결과를 비교한 그래프.
[도 12] KBM 배지와, CellGro 배지에서 배양된 NK 세포의 증폭 배율의 증식 곡선.
[도 13] 본 발명의 방법으로 증폭된 말초혈 유래 NK 세포의 K562에 대한 세포 상해 활성을 조사한 실험 결과를 나타내는 그래프.
[도 14] 정상인으로부터 분리된 CD107a 양성 세포의 배양 세포 전체에 대한 구성 비율의 경시적인 변화를 플로우ㆍ사이토메트리법으로 측정한 결과도.
[도 15] CD3 양성 세포의 1회 제거 및 2회 제거 후의 NK 세포(CD3 음성/CD56 양성)의 배양 세포 전체에 대한 구성 비율을 나타내는 막대 그래프.
[도 16a] 증폭 전의 CD3 음성 세포와, CD3 및 CD34 음성 세포에 있어서의 CD34 양성 세포의 구성 비율을 나타내는 막대 그래프.
[도 16b] 증폭 전의 CD3 음성 세포와, CD3 및 CD34 음성 세포에 있어서의 CD3 양성 세포의 구성 비율을 나타내는 막대 그래프.
[도 17] 증폭 후의 CD3 음성 세포와, CD3 및 CD34 음성 세포에 있어서의 NK 세포(CD3 음성/CD56 양성)의 배양 세포 전체에 대한 구성 비율을 나타내는 막대 그래프.
[도 1b] CD3 양성 세포의 제거 후에 CD3 및 CD56에 대한 항체로 2중 염색하여 플로우ㆍ사이토메트리법으로 측정한 결과도.
[도 2a] 정상인 5명의 말초혈 중의 단핵구로부터 분리된 CD3 음성 세포의 세포수 각각의 증식 곡선.
[도 2b] 정상인 5명의 말초혈 중의 단핵구로부터 분리된 CD3 음성 세포의 세포수의 평균 증식 곡선.
[도 3a] 정상인 5명의 말초혈 중의 단핵구로부터 분리된 CD3 음성 세포의 증폭 배율 각각의 증식 곡선.
[도 3b] 정상인 5명의 말초혈 중의 단핵구로부터 분리된 CD3 음성 세포의 증폭 배율의 평균 증식 곡선.
[도 4a] 정상인 5명의 말초혈 중의 단핵구로부터 분리된 NK 세포(CD3 음성/CD56 양성)의 증폭 배율 각각의 증식 곡선.
[도 4b] 정상인 5명의 말초혈 중의 단핵구로부터 분리된 NK 세포(CD3 음성/CD56 양성)의 증폭 배율의 평균 증식 곡선.
[도 5a] 정상인 5명으로부터 분리된 NK 세포(CD3 음성/CD56 양성)의 배양 세포 전체에 대한 구성 비율의 경시적인 변화를 플로우ㆍ사이토메트리법으로 측정한 결과도.
[도 5b] 정상인 5명으로부터 분리된 NK 세포(CD3 음성/CD56 양성)의 배양 세포 전체에 대한 구성 비율의 경시적인 변화를 플로우ㆍ사이토메트리법으로 측정하고, 평균화한 결과도.
[도 6a] 진행암(구강암, 담낭암 및 담관암)의 환자 3명으로부터 분리된 NK 세포(CD3 음성/CD56 양성)의 배양 세포 전체에 대한 구성 비율의 경시적인 변화를 플로우ㆍ사이토메트리법으로 측정한 결과도.
[도 6b] 진행암(구강암, 담낭암 및 담관암)의 환자 3명으로부터 분리된 NK 세포(CD3 음성/CD56 양성)의 증폭 배율의 평균 증식 곡선.
[도 7] CD69의 플로우ㆍ사이토메트리 해석 결과를 비교한 그래프.
[도 8] CD69의 플로우ㆍ사이토메트리 해석 결과를 비교한 평균 형광 강도(MFI)의 측정값의 그래프.
[도 9] CD16의 플로우ㆍ사이토메트리 해석 결과를 비교한 그래프.
[도 10] CD16의 플로우ㆍ사이토메트리 해석 결과를 비교한 평균 형광 강도(MFI)의 측정값의 그래프.
[도 11] 다양한 세포 표면 마커의 플로우ㆍ사이토메트리 해석 결과를 비교한 그래프.
[도 12] KBM 배지와, CellGro 배지에서 배양된 NK 세포의 증폭 배율의 증식 곡선.
[도 13] 본 발명의 방법으로 증폭된 말초혈 유래 NK 세포의 K562에 대한 세포 상해 활성을 조사한 실험 결과를 나타내는 그래프.
[도 14] 정상인으로부터 분리된 CD107a 양성 세포의 배양 세포 전체에 대한 구성 비율의 경시적인 변화를 플로우ㆍ사이토메트리법으로 측정한 결과도.
[도 15] CD3 양성 세포의 1회 제거 및 2회 제거 후의 NK 세포(CD3 음성/CD56 양성)의 배양 세포 전체에 대한 구성 비율을 나타내는 막대 그래프.
[도 16a] 증폭 전의 CD3 음성 세포와, CD3 및 CD34 음성 세포에 있어서의 CD34 양성 세포의 구성 비율을 나타내는 막대 그래프.
[도 16b] 증폭 전의 CD3 음성 세포와, CD3 및 CD34 음성 세포에 있어서의 CD3 양성 세포의 구성 비율을 나타내는 막대 그래프.
[도 17] 증폭 후의 CD3 음성 세포와, CD3 및 CD34 음성 세포에 있어서의 NK 세포(CD3 음성/CD56 양성)의 배양 세포 전체에 대한 구성 비율을 나타내는 막대 그래프.
이하에 설명하는 본 발명의 실시예는 예시만을 목적으로 하며, 본 발명의 기술적 범위를 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 기술적 범위는 특허 청구 범위의 기재에 의해서만 한정된다. 본 발명의 취지를 일탈하지 않는 것을 조건으로서, 본 발명의 변경, 예를 들면 본 발명의 구성 요건의 추가, 삭제 및 치환을 행할 수 있다.
실시예 1
NK 세포의 증폭(1)
1. 재료 및 방법
(1) 말초혈로부터의 채혈
말초혈이 정상인과 진행암(구강암, 담낭암 및 담관암)의 환자로부터 채취되었다. 본 실험은, 규슈 대학 의계 지구 부국 임상 연구 윤리 심사 위원회의 승인(승인 번호 22-176, 승인일: 2011년 3월 31일)을 얻어 실시되었다. 서면에 의한 동의가 상기 정상인 및 상기 환자로부터 얻어지고 있다. 채혈, 동결 보존 및 해동은 당업자에게 주지된 방법으로 행해졌다.
(2) 말초혈로부터의 단핵구의 분리
얻어진 혈액은 상온으로 유지된 희석액(1mM EDTA 및 2％ 소 태자 혈청이 첨가된 PBS)으로 2배 희석되고, 각 원심관에 희석혈 20 내지 35mL가 10 내지 15mL의 Ficoll Paque(비중 1.077)에 중층되었다. 원심은 500×g, 실온에서 20분간 행해지며, 브레이크를 걸지 않고 정지되었다. 원심 상청(혈장 부분)은 수 mL를 남기고 제거되어, 중간층이 회수되었다. 원심관 1 내지 2개로부터 회수된 상기 중간층이 1개의 새로운 원심관에 모아져, 상기 희석액에 의해 부피가 50mL로 조정되었다. 2회째의 원심은 500×g, 실온, 5분간 또는 15분간의 조건으로 행해졌다. 상청은 제거되고, 펠릿이 상기 희석액 30mL에 현탁되었다. 3회째의 원심은, 280×g, 실온 10분간의 조건으로 행해졌다. 상청은 제거되고, 펠릿은 세포 농도가 1×107개/mL가 되도록 2mM EDTA와 0.1％ BSA가 첨가된 PBS에 현탁되었다(이하, 「단핵구 현탁액」이라 함).
(3) CD3 양성 세포의 제거
항CD3 항체가 고정화된 자기 비즈(다이나비즈 CD3)는, 0.1％ BSA가 첨가된 PBS로 1회 세정된 후, 상기 단핵구 현탁액에 세포 107개당 50μL가 첨가되었다. 상기 비즈를 포함하는 단핵구 현탁액은, 4℃에서 30분간 로테이터로 교반되었다. 그 후, 상기 자기 비즈는 자석에 의해 상기 현탁액으로부터 분리되어, CD3을 세포 표면에 발현하는 세포(CD3 양성 세포)가 제거되었다.
(4) CD3 양성 세포가 제거된 세포 집단의 배양
상기 현탁액 중의 나머지 세포(이하, 「CD3 음성 세포」라 함) 는, 5％ 자가 혈청이 첨가된 세포 배양용 배지(KBM501, 16025015, 코진 바이오 가부시끼가이샤; 1750JRU/mL의 IL-2 함유)(이하, 「KBM 배지」라 함)에서 5×105개/mL가 되도록 희석되어, 6웰의 배양 플레이트(140675, nunc, 서모 피셔 사이언티픽 가부시끼가이샤)에 파종되었다. 세포 배양은, 37℃, 5％ CO2 및 포화 수증기 분위기하에 21일간 행해졌다. 배지 교환이 배양 5일째, 9일째, 13일째 및 17일째에 행해졌다. 상기 세포는, 피더 세포 없이 배양되었다.
(5) 세포수 및 세포 표면 마커의 해석
상기 말초혈 단핵구의 세포수는, 배양 개시시부터 21일째까지의 사이에 혈구 계산판을 사용하여 생세포수를 계측함으로써 결정되었다. 상기 세포의 세포 표면 마커는, 항CD3 항체(317308, 바이오레전드 재팬(BioLegend Japan) 가부시끼가이샤), 항CD16 항체(556618, BD Pharmingen, 일본 벡톤 디킨슨 가부시끼가이샤), 항CD56 항체(304607, 318321, 바이오레전드 재팬 가부시끼가이샤), 항CD69 항체(310905, 바이오레전드 재팬 가부시끼가이샤), 항KIR3DL1/KIR3DL2 항체(130-095-205, 밀테니 바이오텍 가부시끼가이샤), 항KIR2DL3 항체(FAB2014P, R&D 시스템즈사, 코스모ㆍ바이오 가부시끼가이샤), 항KIR2DL1/KIR2DS1 항체(339505, 바이오레전드 재팬 가부시끼가이샤), 항KIR2DL5 항체(341303, 바이오레전드 재팬 가부시끼가이샤), 항NKp46 항체(331907, 바이오레전드 재팬 가부시끼가이샤), 항NKp30 항체(325207, 바이오레전드 재팬 가부시끼가이샤) 및 항NKG2D 항체(320805, 바이오레전드 재팬 가부시끼가이샤)를 사용하여 플로우ㆍ사이토메트리법으로 해석되었다.
2. 결과
(1) 정상인의 NK 세포의 증폭
도 1a는, CD3 양성 세포의 제거 전에 CD3 및 CD56에 대한 항체로 2중 염색하고, 플로우ㆍ사이토메트리법으로 측정한 실험 결과이다. 도 1b는, CD3 양성 세포의 제거 후에 CD3 및 CD56에 대한 항체로 2중 염색하여 플로우ㆍ사이토메트리법으로 측정한 실험 결과이다. 「CD3 양성 세포의 구성 비율」에서는, 플로우ㆍ사이토메트리법에 의해 계측된 각 실험군의 전체 배양 세포 중의 CD3 양성 세포의 비율이 백분율로 표시된다. CD3 양성 세포의 구성 비율(％)은, CD3 양성 세포의 제거 전에는 69.37％이며, CD3 양성 세포의 제거 후에는 0.68％였다. 이들 결과로부터 명백해진 바와 같이, CD3 양성 세포는 단핵구 현탁액으로부터 현저하게 제거되었다.
도 2a는, 정상인 5명의 말초혈 중의 단핵구로부터 분리된 CD3 음성 세포의 세포수 각각의 증식 곡선이다. 도 2b는, 정상인 5명의 말초혈 중의 단핵구로부터 분리된 CD3 음성 세포의 세포수의 평균 증식 곡선이다. 5명의 정상인으로부터 채취된 말초혈 1mL당의 CD3 음성 세포의 세포수가 배양 개시시, 5일간 배양 후, 9일간 배양 후, 13일간 배양 후, 17일간 배양 후 및 21일간 배양 후에 측정되었다. 각 실험 조건의 표준 편차는, 동일 조건으로 5회 반복한 실험 결과의 측정값으로부터 산출되었다. CD3 음성 세포는, 배양 개시시부터 21일째 후까지 계속 증가하였다. 증가 속도가 13일째까지는 계속 상승하고, 13일째 후에는 저하되었다. CD3 음성 세포는, 배양 개시시의 약 5×105개로부터 21일간 배양 후의 약 700×105개로 증가하였다.
도 3a는, 정상인 5명의 말초혈 중의 단핵구로부터 분리된 CD3 음성 세포의 증폭 배율 각각의 증식 곡선이다. 도 3b는, 정상인 5명의 말초혈 중의 단핵구로부터 분리된 CD3 음성 세포의 증폭 배율의 평균 증식 곡선이다. 상기 증폭 배율은, 5일간 배양 후, 9일간 배양 후, 13일간 배양 후, 17일간 배양 후 및 21일간 배양 후의 CD3 음성 세포의 세포수를 배양 개시시의 CD3 음성 세포의 세포수로 나눈 몫으로서 산출되었다. 각 실험 조건의 표준 편차는, 동일 조건으로 5회 반복한 실험 결과의 측정값으로부터 산출되었다. CD3 음성 세포의 증폭 배율은, 배양 개시시부터 21일째까지 계속 증대되었다. 상기 증폭 배율은 13일째까지는 현저하게 계속 증대되고, 21일간 배양 후에는 약 150배로 증대되었다.
도 4a는, 정상인 5명의 말초혈 중의 단핵구로부터 분리된 NK 세포(CD3 음성/CD56 양성)의 증폭 배율 각각의 증식 곡선이다. 도 4b는, 정상인 5명의 말초혈 중의 단핵구로부터 분리된 NK 세포(CD3 음성/CD56 양성)의 증폭 배율의 평균 증식 곡선이다. 도 4a 및 도 4b에서는, CD3 음성 세포가 CD3 및 CD56에 대한 항체로 2중 염색되어 플로우ㆍ사이토메트리법으로 해석되었다. 상기 증폭 배율은, 7일간 배양 후, 14일간 배양 후 및 21일간 배양 후의 NK 세포의 세포수를 배양 개시시의 NK 세포의 세포수로 나눈 몫으로서 산출되었다. 각 실험 조건의 표준 편차는, 동일 조건으로 5회 반복한 실험 결과의 측정값으로부터 산출되었다. NK 세포의 증폭 배율은, 배양 개시시부터 21일째까지 계속 증대되었다. 상기 증폭 배율은 14일째까지는 현저하게 계속 증대되고, 21일간 배양 후에는 약 400배로 증대되었다.
도 5a는, 정상인 5명으로부터 분리된 NK 세포(CD3 음성/CD56 양성)의 배양 세포 전체에 대한 구성 비율의 경시적인 변화를 플로우ㆍ사이토메트리법으로 측정한 실험 결과이다. 도 5b는, 정상인 5명으로부터 분리된 NK 세포(CD3 음성/CD56 양성)의 배양 세포 전체에 대한 구성 비율의 평균값의 경시적인 변화를 플로우ㆍ사이토메트리법으로 측정하고, 평균화한 실험 결과이다. 도 5a 및 도 5b에서는, CD3 음성 세포가 CD3 및 CD56에 대한 항체로 2중 염색되어 플로우ㆍ사이토메트리법으로 해석되었다. 「NK 세포의 구성 비율」에서는, 플로우ㆍ사이토메트리법에 의해 계측된 각 실험군의 전체 배양 세포 중의 NK 세포의 비율이 백분율로 표시된다. 그래프의 종축은 배양 세포 전체에 대한 NK 세포(CD3 음성/CD56 양성)의 구성 비율(％)이고, 횡축은 배양 일수이다. 각 실험 조건의 표준 편차는, 동일 조건으로 5회 반복한 실험 결과의 측정값으로부터 산출되었다. NK 세포의 구성 비율은, 배양 개시시부터 21일째까지 계속 증대되었다. 상기 NK 세포의 구성 비율은 14일째까지는 현저하게 계속 증대되고, 14일간 배양 후에는 약 90％로 증대되었다. 본 발명은, NK 세포를 선택적이면서도 경시적으로 증폭하는 것이 나타났다.
(2) 환자의 NK 세포의 증폭
도 6a는, 진행암(구강암, 담낭암 및 담관암)의 환자 3명으로부터 분리된 NK 세포(CD3 음성/CD56 양성)의 배양 세포 전체에 대한 구성 비율의 경시적인 변화를 플로우ㆍ사이토메트리법으로 측정한 실험 결과이다. 도 6b는, 진행암(구강암, 담낭암 및 담관암)의 환자 3명으로부터 분리된 NK 세포(CD3 음성/CD56 양성)의 증폭 배율의 평균 증식 곡선이다. 「NK 세포의 구성 비율」에서는, 플로우ㆍ사이토메트리법에 의해 계측된 각 실험군의 전체 배양 세포 중의 NK 세포의 비율이 백분율로 표시된다. 도 6a의 그래프에서는, 종축은 배양 세포 전체에 대한 NK 세포(CD3 음성/CD56 양성)의 구성 비율(％)이고, 횡축은 배양 일수이다. 「NK 세포의 증폭 배율」에서는, 증폭 후의 NK 세포의 세포수를 증폭 전에 말초혈 단핵구 중에 존재하는 NK 세포의 세포수로 나눈 결과가 표시된다. 도 6b의 그래프에서는, 종축은 NK 세포의 증폭 배율이고, 횡축은 배양 일수이다. 각 실험 조건의 표준 편차는, 동일 조건으로 3회 반복한 실험 결과의 측정값으로부터 산출되었다. 도 6a에 도시한 바와 같이, NK 세포의 구성 비율은 배양 개시시부터 14일째까지 현저하게 계속 증대되고, 14일간 배양 후에는 약 85％로 증대되었다. 또한, 도 6b에 도시한 바와 같이, NK 세포의 증폭 배율은 배양 개시시부터 14일째까지 현저하게 계속 증대되고, 14일간 배양 후에는 약 140배로 증대되었다. 21일간 배양 후에는 CD3 양성 세포가 증식되었기 때문에, NK 세포의 구성 비율이 저하되었다. 그러나, 상기 CD3 양성 세포의 증식은 NK 세포의 증폭에는 거의 영향을 미치지 않았다. 이상의 결과로부터, 진행암(구강암, 담낭암 및 담관암)의 환자로부터 분리된 NK 세포는, 경시적으로 증폭되는 것이 나타났다. 또한, 본 발명은, 암, 감염증 등에 이환된 환자로부터 분리된 NK 세포를 경시적으로 증폭할 수 있는 것이 시사되었다.
(3) NK 세포의 분화 마커의 발현
도 7, 9 및 11에 각 세포 표면 마커의 플로우ㆍ사이토메트리 해석 결과를 비교한 그래프를 나타낸다. 또한, 도 8 및 10에 CD69 및 CD16의 플로우ㆍ사이토메트리 해석 결과를 비교한 평균 형광 강도(MFI)의 측정값의 그래프를 나타낸다. 각 실험 조건의 표준 편차는, 동일 조건으로 3회 반복한 실험 결과의 측정값으로부터 산출되었다. 도 7 내지 11로부터 명백해진 바와 같이, 본 발명의 방법으로 증폭된 세포는, 증폭 전의 세포와 비교하여 CD69, KIR2DL3, KIR2DL1/KIR2DS1, KIR2DL5, NKp30 및 NKG2D를 강하게 발현하고 있었다. 특히, 상기 증폭된 세포에서는, CD69의 발현은 약 100％였다. 이들 도면으로부터 명백해진 바와 같이, 본 발명의 방법으로 제조된 세포는, NK 세포로서의 분화 마커를 발현하는 것이 나타났다. 또한, 상기 NK 세포는, 높은 세포 상해 활성을 구비하고 있는 것이 시사되었다.
본 실시예의 실험 결과로부터 CD3 양성 세포, 즉 T 세포를 제거한 후 상기 KBM 배지에서 배양함으로써, 거의 NK 세포만을 선택적이면서도 효율적으로 증폭할 수 있는 것이 나타났다. 대량의 NK 세포가 정상인 뿐만 아니라, 암, 감염증 등에 이환된 환자로부터 제조할 수 있는 것이 시사되었다. 또한, 본 발명의 방법은, 말초혈 유래의 NK 세포 뿐만 아니라 다른 조직ㆍ기관 유래의 세포, 특히 제대혈 유래의 NK 세포를 현저하게 증폭할 수 있는 것이 시사되었다.
실시예 2
NK 세포의 증폭 (2)
1. 재료 및 방법
NK 세포는 실시예 1에서 설명된 방법에 따라 정상인으로부터 제조되었다. 2500IU/mL의 IL-2(AF-200-02-2, 페프로텍(PeproTech), 도요 보세끼 가부시끼가이샤)와, 5％ 자가 혈청을 첨가한 CellGro SCGM(2001, 셀제닉스, 이와이 가가꾸 야꾸힌 가부시끼가이샤)(이하, 「CellGro 배지」라 함)이 세포 배양용 배지로서 제조되었다. 상기 NK 세포는, 실시예 1에서 설명된 방법에 따라 상기 KBM 배지 및 상기 CellGro 배지에서 증폭되었다.
2. 결과
도 12는, KBM 배지와, CellGro 배지에서 배양된 NK 세포의 증폭 배율의 증식 곡선이다. 상기 증폭 배율은, 7일간 배양 후, 14일간 배양 후 및 21일간 배양 후의 NK 세포의 세포수를 배양 개시시의 NK 세포의 세포수로 나눈 몫으로서 산출되었다. 각 실험 조건의 표준 편차는, 동일 조건으로 2회 반복한 실험 결과의 측정값으로부터 산출되었다. NK 세포의 증폭 배율은, KBM 배지 및 CellGro 배지에서 배양 개시시부터 21일째까지 계속 증대되었다. 21일간 배양 후, 상기 증폭 배율은 KBM 배지에서는 약 670배이며, CellGro 배지에서는 약 140배였다.
본 실시예의 실험 결과로부터, NK 세포는 상기 KBM 배지와, 상기 CellGro 배지에서 충분히 증폭되는 것이 나타났다. 따라서, NK 세포는, 세포 배양용 배지의 타입에 관계없이, 2500IU/mL 내지 2813IU/mL의 IL-2를 포함하는 배지에서 증폭할 수 있는 것이 시사되었다.
실시예 3
증폭된 NK 세포의 세포 상해 활성
1. 재료 및 방법
(1) 세포 상해 활성의 정량
NK 세포가 실시예 1에서 설명된 방법에 따라 제조되어, 이펙터 세포로서 사용되었다. K562 세포(만성 골수성 백혈병 세포)가 당업자에게 주지된 방법으로 제조되어, 표적 세포로서 사용되었다. 증폭된 NK 세포와, 증폭되어 있지 않은 NK 세포(이하, 「비증폭 NK 세포」라 함)와의 세포 상해 활성이 당업자에게 주지된 방법으로 정량되었다. 간결하게는, 상기 표적 세포는 3-3'-디옥타데실옥사카르보시아닌(D4292, 시그마 알드리치 재팬 가부시끼가이샤)(최종 농도: 0.01mM)을 첨가한 RPMI-1640 배지에서 10분간 배양함으로써 표식되었다. 상기 표적 세포는 표식 후, PBS(-) 및 무혈청 IMDM 배지를 사용하여 3회 세정되었다. 상기 이펙터 세포와 상기 표적 세포는, 둥근 바닥의 96웰의 배양 플레이트에 파종되어, 무혈청 IMDM 배지에서 2시간 공배양되었다. 이펙터 세포와 표적 세포의 비(E:T비)는, 3:1, 2:1, 1:1, 1:5 및 1:10으로 제조되었다. 세포 상해 활성(％)은, 항MHC 클래스 I 항체 (311409, 바이오레전드 재팬 가부시끼가이샤) 및 7-아미노-악티노마이신 D(A9400, 시그마 알드리치 재팬 가부시끼가이샤)를 사용하여 플로우ㆍ사이토메트리법에 의해 정량되었다.
(2) NK 세포의 분화 마커의 발현
NK 세포는, 실시예 1에서 설명된 방법에 따라 증폭되었다. 배양 개시시, 3일간 배양 후, 7일간 배양 후, 14일간 배양 후 및 21일간 배양 후에 상기 NK 세포와 상기 K562 세포는 2:1의 E:T비로 2시간 공배양되었다. 그 후, 상기 NK 세포에 있어서의 CD107a 양성 세포의 구성 비율이 항CD107a 항체(328606, 바이오레전드 재팬 가부시끼가이샤)을 사용하여 플로우ㆍ사이토메트리법으로 해석되었다.
2. 결과
(1) 세포 상해 활성의 정량
도 13은, 본 발명의 방법으로 증폭된 말초혈 유래 NK 세포의 K562에 대한 세포 상해 활성을 조사한 실험 결과를 나타내는 그래프이다. 종축은 세포 상해 활성(단위:％)이다. 백색 막대는 비증폭 NK 세포의 세포 상해 활성을 나타내고, 흑색 막대는 증폭된 NK 세포의 세포 상해 활성을 나타낸다. 횡축은, 증폭된 NK 세포 또는 비증폭 NK 세포와 K562 세포의 E:T비이다. E:T비가 3:1일 때, 상기 세포 상해 활성은 비증폭 NK 세포에서는 약 30％이고, 증폭된 NK 세포에서는 약 110％였다. E:T비가 2:1일 때, 상기 세포 상해 활성은 비증폭 NK 세포에서는 약 20％이고, 증폭된 NK 세포에서는 약 107％였다. E:T비가 1:1일 때, 상기 세포 상해 활성은 비증폭 NK 세포에서는 약 10％이고, 증폭된 NK 세포에서는 약 100％였다. E:T비가 1:5 및 1:10일 때, 증폭된 NK 세포의 상기 세포 상해 활성은 각각 약 25％ 및 약 15％였다.
(2) NK 세포의 분화 마커의 발현
도 14는, 정상인으로부터 분리된 CD107a 양성 세포의 배양 세포 전체에 대한 구성 비율의 경시적인 변화를 플로우ㆍ사이토메트리법으로 측정한 실험 결과이다. 각 실험 조건의 표준 편차는, 동일 조건으로 5회 반복한 실험 결과의 측정값으로부터 산출되었다. 「CD107a 양성 세포의 구성 비율」에서는, 플로우ㆍ사이토메트리법에 의해 계측된 각 실험군의 전체 배양 세포 중의 CD107a 양성 세포의 비율이 백분율로 표시된다. 도 14의 그래프에서는, 종축은 배양 세포 전체에 대한 CD107a 양성 세포의 구성 비율(％)이고, 횡축은 배양 일수이다. CD107a 양성 세포의 구성 비율은 배양 개시시부터 3일째까지 약 35％까지 증대되고, 상기 구성 비율은 21일째에도 유지되었다.
본 실시예의 실험 결과로부터, 본 발명에 의해 증폭된 NK 세포는 높은 세포 상해 활성을 갖고 있는 것이 나타났다. 따라서, 본 발명은, 피더 세포, 외래 분자를 트랙스펙션한 NK 세포 등을 사용하지 않고, 세포 상해 활성이 높은 NK 세포를 선택적이면서도 효율적으로 증폭할 수 있는 것이 나타났다. 또한, NK 세포가 말초혈 유래의 세포 뿐만 아니라, 다른 조직ㆍ기관 유래의 세포, 특히 제대혈 유래의 세포로부터 증폭되었을 때에도 세포 상해 활성이 높은 것이 시사되었다.
실시예 4
NK 세포의 증폭 (3)(CD3 양성 세포의 반복 제거)
실시예 1 내지 3의 실험 후, NK 세포의 증폭 실험을 거듭하는 가운데 CD3 양성 세포가 비선택적으로 증대되고, CD3 양성 세포의 배양 세포 전체에 대한 구성 비율이 본 실시예의 결과와 같이 30％를 초과하는 경우가 있다는 지견이 얻어졌다. 이 CD3 양성 세포의 비선택적인 증대의 빈도는, 진행암의 환자로부터 성분 채집법으로 채취된 말초혈 단핵구 세포를 이용하여 NK 세포를 증폭한 실험 중 약 30％였다(데이터는 나타나지 않음). 따라서, NK 세포를 선택적으로 증폭하기 위해, CD3 양성 세포를 제거하는 스텝을 반복하는 것을 시도할 수 있었다.
1. 재료 및 방법
실시예 1에서 설명된 방법에 따라 NK 세포는 증폭되고, 세포수 및 세포 표면 마커가 해석되었다. 단핵구 현탁액은 진행암(구강암, 담낭암 및 담관암)의 환자로부터 제조되었다. CD3 양성 세포의 제거가 1회 또는 2회 실시되었다. CD3 음성 세포는 상기 KBM 배지에서 14일간 배양되었다.
2. 결과
도 15는, CD3 양성 세포의 1회 제거 및 2회 제거 후의 NK 세포(CD3 음성/CD56 양성)의 배양 세포 전체에 대한 구성 비율을 나타내는 막대 그래프이다. 각 실험 조건의 오차 막대는 동일 조건으로 3회 반복한 실험 결과의 측정값의 표준 오차를 나타낸다. NK 세포, CD3 양성 세포 및 다른 세포의 구성 비율에서는, 플로우ㆍ사이토메트리법에 의해 계측된 각 실험군의 전체 배양 세포 중의 NK 세포, CD3 양성 세포 및 다른 세포의 비율 각각이 백분율로 표시된다. 그래프의 종축은 배양 세포 전체에 대한 NK 세포, CD3 양성 세포 및 다른 세포의 구성 비율(％)이고, 횡축은 CD3 양성 세포의 제거 횟수이다. NK 세포의 배양 세포 전체에 대한 구성 비율(％)은 CD3 양성 세포의 1회 제거에서는 약 50％이고, CD3 양성 세포의 2회 제거에서는 약 65％였다.
본 실시예의 실험 결과로부터, CD3 양성 세포의 반복 제거는 CD3 양성 세포의 배양 세포 전체에 대한 구성 비율을 저하시키고, NK 세포의 배양 세포 전체에 대한 구성 비율을 증대시킬 수 있는 것이 나타났다. 그러나, 상기 CD3 양성 세포의 반복 제거는 NK 세포를 선택적으로 증폭하는데 충분하다고 할 수 없다. 따라서, 상기 CD3 양성 세포의 반복 제거 이외의 다른 처리를 병용하는 것이 시도되었다.
실시예 5
NK 세포의 증폭 (4)(CD3 양성 세포 및 CD34 양성 세포의 제거)
1. 재료 및 방법
실시예 1에서 설명된 방법에 따라 NK 세포는 증폭되고, 세포수 및 세포 표면 마커가 해석되었다. 단핵구 현탁액은 진행암(구강암, 담낭암 및 담관암)의 환자로부터 제조되었다. CD3 양성 세포의 제거 후, 조혈 전구 세포가 제거되었다. 상기 조혈 전구 세포의 제거는, CD34를 세포 표면에 발현하는 세포(CD34 양성 세포)를 비오틴화 항CD34 항체(343523, 바이오레전드 재팬 가부시끼가이샤)와, 자기 비즈(다이나비즈 비오틴 바인더(Dynabeads biotin binder), 110-47, 라이프 테크놀로지스 재팬 가부시끼가이샤)를 사용하여 행해졌다. 간결하게는, 상기 CD34 양성 세포와, 상기 비오틴화 항CD34 항체가 반응되었다. 그 후, 원심 분리가 행해지고, 상청이 제거되어, 상기 항체가 결합된 세포의 현탁액이 제조되었다. 상기 자기 비즈는 0.1％ BSA가 첨가된 PBS로 1회 세정 후, 세포 107개당 50μL가 상기 현탁액에 첨가되었다. 상기 자기 비즈를 포함하는 현탁액은, 4℃에서 30분간 로테이터로 교반되었다. 상기 자기 비즈는 자석에 의해 상기 현탁액으로부터 분리되어, CD34 양성 세포가 제거되었다. 상기 현탁액 중의 나머지 세포(이하, 「CD3 및 CD34 음성 세포」라 함)는 상기 KBM 배지에서 14일간 배양되었다. 플로우ㆍ사이토메트리법에서의 계측에서는, 항CD34 항체(343505, 바이오레전드 재팬 가부시끼가이샤)가 추가적으로 사용되었다.
2. 결과
도 16a는, 증폭 전의 CD3 음성 세포와, CD3 및 CD34 음성 세포에 있어서의 CD34 양성 세포의 구성 비율을 나타내는 막대 그래프이다. 도 16b는, 증폭 전의 CD3 음성 세포와, CD3 및 CD34 음성 세포에 있어서의 CD3 양성 세포의 구성 비율을 나타내는 막대 그래프이다. 각 실험 조건의 오차 막대는 동일 조건으로 3회 반복한 실험 결과의 측정값의 표준 오차를 나타낸다. CD34 양성 세포 및 CD3 양성 세포의 구성 비율에서는, 플로우ㆍ사이토메트리법에 의해 계측된 각 실험군의 전체 세포 중의 CD34 양성 세포 및 CD3 양성 세포의 비율이 백분율로 표시된다. 그래프의 종축은 세포 전체에 대한 증폭 전의 CD34 양성 세포 및 CD3 양성 세포의 구성 비율(％)이다. 그래프의 횡축은, 증폭용의 각 실험군의 세포 타입을 나타낸다. 증폭 전의 CD34 양성 세포의 구성 비율(％)은 CD3 음성 세포에서는 약 0.15％이고, CD3 및 CD34 음성 세포에서는 약 0.02％였다. 증폭 전의 CD3 양성 세포의 구성 비율(％)은 CD3 음성 세포에서는 약 0.15％이고, CD3 및 CD34 음성 세포에서는 약 0.25％였다.
도 17은, 증폭 후의 CD3 음성 세포와, CD3 및 CD34 음성 세포에 있어서의 NK 세포(CD3 음성/CD56 양성)의 배양 세포 전체에 대한 구성 비율을 나타내는 막대 그래프이다. 각 실험 조건의 오차 막대는 동일 조건으로 3회 반복한 실험 결과의 측정값의 표준 오차를 나타낸다. NK 세포, CD3 양성 세포 및 다른 세포의 구성 비율에서는, 플로우ㆍ사이토메트리법에 의해 계측된 각 실험군의 전체 배양 세포 중의 NK 세포, CD3 양성 세포 및 다른 세포의 비율 각각이 백분율로 표시된다. 그래프의 종축은 배양 세포 전체에 대한 NK 세포, CD3 양성 세포 및 다른 세포의 구성 비율(％)이다. 그래프의 횡축은, 증폭에 사용한 각 실험군의 세포 타입을 나타낸다. 증폭 후의 NK 세포의 배양 세포 전체에 대한 구성 비율(％)은 CD3 음성 세포에서는 약 60％이고, CD3 및 CD34 음성 세포에서는 약 90％였다.
본 실시예의 실험 결과로부터, NK 세포(CD3 음성/CD56 양성)의 배양 세포 전체에 대한 구성 비율은, CD3 양성 세포 및 CD34 양성 세포를 제거함으로써 현저하게 증대되는 것이 나타났다. 또한, NK 세포가 성분 채집법으로 채취된 말초혈 단핵구 세포를 이용하여 증폭될 때에도, NK 세포는 CD3 양성 세포 및 CD34 양성 세포를 제거함으로써 고순도로 증폭할 수 있는 것이 나타났다.
결론
이상의 실험 결과로부터 명백해진 바와 같이 말초혈 유래의 단핵구로부터 CD3 양성 세포(T 세포)를 제거함으로써, NK 세포를 대량으로 제조할 수 있었다. 또한, 본 발명의 방법으로 증폭된 세포는, 본 실시예의 실험 결과에서 밝혀진 바와 같이 매우 높은 세포 상해 활성을 가졌다. 또한, 말초혈 유래의 단핵구로부터 CD3 양성 세포(T 세포) 및 CD34 양성 세포(조혈 전구 세포)를 제거함으로써 NK 세포를 고순도로 제조할 수 있었다.
현재 보고되어 있는 NK 세포의 증폭 방법에서는, NK 세포의 세포 상해 활성이 낮다는 것이 알려져 있다. 예를 들면, Terunuma, H. 외의 NK 세포의 증폭 성적은, 정상인의 말초혈 유래의 NK 세포에 대하여 순도 81.2％, 증폭 배율 130배, 세포 상해 활성 66％(E:T=3:1)였다(특허문헌 1). Tanaka, J. 외의 NK 세포의 증폭 성적은, 정상인의 말초혈 단핵구 세포에 대하여 순도 73.4％, 증폭 배율 6268배, 세포 상해 활성 약 55％(E:T=1:1)였다(특허문헌 2). Carlens, S. 외의 NK 세포의 증폭 성적은, 미엘로마 환자의 말초혈 유래의 NK 세포에 대하여 순도 55％, 증폭 배율 193배, 세포 상해 활성 45％(E:T=1:1)였다(비특허문헌 4). Alici, E. 외의 NK 세포의 증폭 성적은, 미엘로마 환자의 말초혈 유래의 NK 세포에 대하여 순도 65％, 증폭 배율 1625배, 세포 상해 활성 약 10％(E:T=1:1)였다(비특허문헌 5). Fujisaki, H. 외의 NK 세포의 증폭 성적은, 정상인의 말초혈 유래의 NK 세포에 대하여 유전적으로 개변된 종양 세포가 피더 세포로서 사용될 때 순도 96.8％, 증폭 배율 277배, 세포 상해 활성의 최대값 약 90％(E:T=1:1)였다(비특허문헌 6). 이에 비해, 본 발명의 NK 세포의 증폭 성적은 정상인의 말초혈 유래의 NK 세포에 대하여 순도 약 90％, 증폭 배율 400배, 세포 상해 활성 약 100％(E:T=1:1)였다. 종래 기술에서는, K562 세포에 대한 NK 세포의 세포 상해 활성은, 유전적으로 개변된 종양 세포가 피더 세포로서 사용될 때 최대값으로 약 90％(E:T=1:1)였으며, 피더 세포를 사용하지 않을 때 66％(E:T=3:1)였다. 그러나, 본 발명의 NK 세포는 피더 세포 없이 증폭되고, K562 세포에 대한 세포 상해 활성이 거의 100％(E:T=1:1)였다. 따라서, 본 발명은 NK 세포의 세포 상해 활성이 높고, 피더 세포가 최종 산물에 혼입된다는 리스크가 없기 때문에, 종래 기술과 비교하여 현저하게 우수하다. 따라서, 본 발명은 높은 세포 상해 활성을 갖는 NK 세포를 채취된 혈구 세포로부터 고순도로 대량으로 제조하는데 유용하다.
Claims (11)
- NK 세포를 포함하는 세포 집단을 제조하는 스텝과,
상기 NK 세포를 포함하는 세포 집단으로부터 T 세포를 제거하는 스텝과,
상기 T 세포가 제거된 나머지 세포를, 2500IU/mL 내지 2813IU/mL의 IL-2만을 사이토카인으로서 포함하는 배지에서 피더 세포(feeder cell)를 사용하지 않고 배양하는 스텝을 포함하고,
상기 제조하는 스텝과 상기 배양하는 스텝 사이에,
상기 NK 세포를 포함하는 세포 집단으로부터 조혈 전구 세포를 제거하는 스텝을 포함하며,
상기 NK 세포를 포함하는 세포 집단으로부터 상기 조혈 전구 세포를 제거하는 스텝은, CD34 양성 세포를 제거하는 스텝에 의해 달성되는
것을 특징으로 하는 NK 세포의 증폭 방법. - 제1항에 있어서, 상기 NK 세포를 포함하는 세포 집단으로부터 상기 T 세포를 제거하는 스텝은, CD3 양성 세포를 제거하는 스텝에 의해 달성되는 것을 특징으로 하는 NK 세포의 증폭 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 배지는 자가 혈청, AB형 혈청 및/또는 혈청 알부민을 포함하는 것을 특징으로 하는 NK 세포의 증폭 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 NK 세포를 포함하는 세포 집단을 제조하는 스텝은, 피험자로부터 채취된 혈구 세포로부터 단핵구를 분리하는 스텝에 의해 달성되는 것을 특징으로 하는 NK 세포의 증폭 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 혈구 세포는 말초혈, 제대혈, 골수 및/또는 림프절로부터 채취되는 것을 특징으로 하는 NK 세포의 증폭 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 혈구 세포는 말초혈로부터 성분 채집(apheresis)법에 의해 채취되는 것을 특징으로 하는 NK 세포의 증폭 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 NK 세포를 포함하는 세포 집단은, 배성 줄기 세포, 성체 줄기 세포 및 인공 다능성 줄기(iPS) 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 줄기 세포 유래의 조혈 줄기 세포와, 제대혈 유래의 조혈 줄기 세포와, 말초혈 유래의 조혈 줄기 세포와, 골수혈 유래의 조혈 줄기 세포와, 제대혈 단핵구와, 말초혈 단핵구로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종류의 세포로 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 기재된 증폭 방법에 의해 NK 세포를 제조하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 감염증 및/또는 암을 치료하기 위해 사용되는 의약품 조성물의 제조 방법.
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