JP2006514024A - Ｎｋ細胞の増殖に対する効果を有する医薬組成物及びそれを使用する方法 - Google Patents

Abstract

本発明はＮＫ細胞の増殖に対する効果を有する医薬組成物、ＮＫ細胞の増殖を特異的に刺激するための方法及び例えば黒色腫、肝癌又は肺腺癌の抗腫瘍予防、抗腫瘍寛解及び抗腫瘍治療用並びに抗微生物予防、抗微生物寛解及び抗微生物治療用の薬物の製造におけるその使用に関する。

Description

本発明は、ＮＫ細胞の増殖に対する効果を有する医薬組成物、ＮＫ細胞の増殖を特異的に刺激するための方法及び例えば、黒色腫、肝癌、又は肺腺腫の抗腫瘍予防、抗腫瘍寛解及び抗腫瘍治療用並びに抗微生物予防、抗微生物寛解及び抗微生物治療用の薬物の製造における該医薬組成物の使用に関する。

ＮＫ細胞の細胞傷害性の機構のいくつかは前々から知られている。ＮＫ細胞はＣＤ１６分子を発現し、このＣＤ１６分子はＩｇＧ分子のＦｃ部分に対するアフイニティーの低い受容体である。かくして、ＮＫ細胞は、標的細胞上の構造を特異的に認識する抗体のＦｃ部分の認識により抗体で被覆された標的を認識しそして殺す。

ＮＫ細胞はいわゆるキラー抑制受容体（Ｋｉｌｌｅｒ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）（ＫＩＲ）も発現し、このキラー抑制受容体はＭＨＣクラスＩ分子を特異的に認識しそしてＮＫ細胞における細胞溶解経路の活性化を抑制する。かくしてＭＨＣクラスＩポジティブ標的はＮＫ細胞溶解から或るレベルまで保護される。

それにもかかわらず、ＭＨＣクラスＩポジティブ標的を発現しないいくらかの標的は、ＮＫ細胞により殺されない。これは、ＣＤ１６分子又はＫＩＲ分子とは別の活性な機構がＮＫ細胞を活性化することができることを示唆した。

いくつかのＮＫ特異的受容体はＮＫ細胞の活性化における重要な役割を果たすことが確かめられた。

かくして、ＮＫｐ４６は、自然の細胞傷害性をトリガーすることに関与する活性な受容体として開示された。更に最近では、ＮＫ細胞媒介による標的細胞の認識及び死滅に関与する他のトリガー受容体もまた開示された。かくして、Ｍｏｒｅｔｔａ等はＳＤＳ ＰＡＧＥに基づく約３０ｋＤの受容体を開示しており、これはＮＫｐ３０と命名された（ＵＳ ｐａｔｅｎｔ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｓ．ｎ．０９／４４０５１４の分割ＵＳ ｐａｔｅｎｔ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｓ．ｎ．１０／０３６４４４）。

これらの受容体に特異的な抗体は、それらのＦｃ部分によりＦｃ受容体ポジティブ細胞に被覆されるとき、リディレクテッドキリングアッセイ（ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ ｋｉｌｌｉｎｇ ａｓｓａｙｓ）として知られた試験におけるＮＫ細胞認識及び細胞傷害性をトリガーする。

ＮＫｐ４６又はＮＫｐ３０に対して特異的なＦａｂ’２又はＩｇＭは感受性細胞に対するＮＫ細胞の殺能力（ｋｉｌｌｉｎｇ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ）の大部分を阻止するので、多数のＮＫ感受性標的はこれらの受容体の１つを介して死滅することが証明された。これは、これらの受容体の分子構造はまだ開示されていないけれども、ＮＫｐ４６及び／又はＮＫｐ３０に対する特異的リガンドが感受性細胞上に存在することを示唆する。

ＮＫｐ３０及びＮＫｐ４６と会合した形質導入エレメントはＦＣｅＲＩｇ及びゼータホモ二量体である。

ＮＫｐ３０及びＮＫｐ４６を認識する抗体は、ＮＫ細胞によるリンホカインの産生を誘発することができ及び／又はリディレクテッドキリングアッセイにおけるＮＫ細胞の細胞障害性を誘発することができることは以前に証明された。

本発明者は、抗ＮＣＲ（ＮＫ細胞受容体）抗体は、サイトカインと共に使用されるとき、新鮮なヒトＰＢＭＣからのＮＫ細胞の特異的増殖を誘発することができることをここに証明する。興味深いことに、ＣＤ１６は同じ形質導入エレメント（ゼータホモ二量体及びＦｃｅＲＩガンマ）を共有するけれども、可溶性抗ＣＤ１６抗体の添加はＮＫ細胞集団のいかなる特異的増加も支援しなかった。

更に、ＮＫｐ３０及びＮＫｐ４６はＮＫ細胞に厳密に制限されるので、この証明は特異的ＮＫ細胞増殖プロトコールの基礎を与える。

かくして、本発明の目的は、特に、ＮＫ細胞増殖に対する刺激効果を有する医薬組成物を提供することである。本発明の他の目的は、このような医薬組成物を使用することによりＮＫ細胞の増殖を特異的に刺激するための方法を提供することである。

本発明は、例えば、黒色腫、肝癌、又は肺腺腫の予防、寛解及び治療用並びに抗微生物予防、抗微生物寛解及び抗微生物治療用の薬物の製造におけるこのような医薬組成物の使用にも関する。

本発明の医薬組成物は、有効量の、抗ＮＣＲ抗体、例えば、抗ＮＫｐ３０抗体もしくは抗ＮＫｐ４６抗体もしくはその両方を含む群から選ばれる少なくとも１種の抗体又はその免疫反応性断片並びにインターロイキン、例えば、ＩＬ２、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ２１又はその組み合わせを含む群から選ばれるサイトカインを、薬学的に許容されうる担体と共に含み、該抗体及びサイトカインは対象に対して一緒に又は別々に投与される。特定の態様では、サイトカインはＩＬ２、ＩＬ１５又はその両方である。該医薬組成物は該サイトカインをコードする発現ベクターを含むことができる。該ベクターはウイルスベクター及びプラスミドベクターであることができる。あるいは、該サイトカインを投与する代わりに、該サイトカインのｉｎ ｖｉｖｏ産生を誘発させることができる。

好ましい態様では、抗ＮＫｐ３０抗体及び／又は抗ＮＫｐ４６抗体をＩＬ２と混合して使用する。

該組成物において、抗ＮＫｐ３０抗体は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又はその免疫原性断片及び配列番号５よりなる群から選ばれるポリペプチドに特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合性断片である。

配列番号１はＮＫ細胞及び特に成熟ＮＫ細胞により選択的に発現されるヒトＮＫｐ３０ １９０ａａポリペプチド（ＳＤＳ−ＰＡＧＥに基づいて約３０ｋＤ）に関し；配列番号２はヒトＮＫｐ３０受容体の細胞外領域に関し；配列番号３はヒトＮＫｐ３０受容体の膜貫通領域に関し；配列番号４はヒトＮＫｐ３０受容体の細胞質尾部（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｔａｉｌ）に関し；配列番号５は配列番号１から誘導された１５ａａ免疫原性ペプチドに関する。

該組成物において、「抗ＮＫｐ４６抗体」はＮＫｐ４６に対するそれぞれ単離された抗体を指す。

好ましい抗体は、配列番号１を有するポリペプチドに特異的に結合する。

該組成物の抗ＮＫｐ３０抗体及び／又は抗ＮＫｐ４６抗体は、有利には、モノクローナル抗体、アフイニティー抗体、キメラ化抗体又はヒト化抗体であり、そして、更に好ましくは、ヒト化マウスモノクローナル抗体であるか又はヒト起源の抗体である。

更に特に好ましい抗ＮＫｐ３０モノクローナル抗体はハイブリドーマ株Ｉ−２５７６により産生される。

免疫反応性抗体断片を含む医薬組成物において、該断片は本質的にＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ断片及びＣＤＲグラフトヒト化抗体断片（ＣＤＲ ｇｒａｆｔｅｄ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）である。

本発明のヒト化抗体は、特に、本発明に従う医薬組成物をヒトに投与することを意図する場合には、所望に応じてヒトから誘導することができることに当業者は留意するであろう。「抗体免疫反応性断片」とは、本明細書では注目すべきことに抗原結合部位を含むいかなる抗体断片も意味する。かくして、このような断片は、タンパク質分解酵素、例えば、ペプシン又はパパインによる上記抗体の酵素消化により得られるＦ（ａｂ’）_２断片及び当業者により知られているとおりヒンジ領域に位置したメルカプト基の還元によりそれから誘導されたＦａｂ断片を含む。免疫反応性断片は、その配列が関心のある抗体のＣＤＲ領域を含む組換え単一鎖又は二量体ポリペプチド（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｏｒ ｄｉｍｅｒｉｃ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ）も含むことができる。単離されたＣＤＲ領域自体も単離された免疫反応性断片の定義の範囲内に包含される。

前記医薬組成物は、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内又は皮下注射、鼻腔内経路及び外科経路（ｃｈｉｒｕｒｇｉｃａｌ ｒｏｕｔｅ）を含む種々の経路により投与することができる。所望の投与経路に依存して、製剤形態（ｇａｌｅｎｉｃ ｆｏｒｍｓ）は、例えば、錠剤、粉末剤、ペースト剤、パッチ剤（ｐａｔｃｈｅｓ）、顆粒剤、微小顆粒剤（ｍｉｃｒｏｇｒａｎｕｌｅｓ）、ナノ粒子剤（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、コロイド溶液剤、水性溶液剤、注射溶液剤、噴霧剤及びリポソーム剤である。ガレヌス剤形は遅延放出形態及び／又は制御された放出形態に相当することもできる。

本発明の医薬組成物に含まれる「薬学的に許容されうる賦形剤」とは、本明細書では、その溶解性及び／又は化学的性質及び／又は製剤特性（ｇａｌｅｎｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）が所望の投与経路及び患っている（ａｉｌｅｄ）効率レベルに適合している賦形剤を意味する。このような賦形剤は食塩水溶液又はデキストロース溶液を含むことができる。本発明に従う医薬組成物は、いかなる適当な緩衝剤及び／又は安定化化合物も更に含むことができる。

一般的に言えば、本発明の医薬組成物はＮＫ細胞により制御され易い病理に有用である。多数のがん、即ち、黒色腫、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、肝癌、肺腺癌、神経芽細胞腫等が、ＮＫ細胞溶解に感受性であることが示された。ウイルス感染細胞、例えば、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＨＩＶ、ＨＣＶ等もＮＫ細胞溶解に感受性である。

本発明の医薬組成物は、例えば、黒色腫、肝癌又は肺腺癌の抗腫瘍予防、抗腫瘍寛解、抗腫瘍治療のため及び抗微生物予防、抗微生物寛解及び抗微生物治療のために特に有用である。

投与量は処置されるべき患者の状態に依存して選ばれる。

本発明の医薬組成物が毎日の皮下注射用に使用される場合には、有効用量は、典型的には、抗ＮＣＲ抗体が１ng〜１００mg／kg（体重）の範囲内にありそして典型的にはサイトカインが百万単位／平方メートル／日より低い範囲内にある。実際に、ＮＫ細胞の特異的増殖を達成するのにこのような本発明のｉｎ ｖｉｖｏ医薬組成物において使用されるべき抗ＮＣＲ抗体の量は、使用される特定の抗体（アフイニティー抗体、キメラ化抗体又はヒト化抗体）に依存することは注目すべきである。抗体は、好ましくは、ＮＫ細胞の枯渇又は毒性を誘発することなく、刺激のための有効な濃度を得るように使用されるべきである。

有利には、前記インターロイキンは、ＩＬ２でありそして百万単位／m^２より少ない一日量で５〜１０日間皮下注射される。

本発明は、ＮＫ細胞を有効量の上記した医薬組成物と接触させることを含むＮＫ細胞の増殖を刺激するための方法にも関する。

有利には、本発明の方法は、抗ＮＣＲ抗体、例えば、抗ＮＫｐ３０抗体もしくは抗ＮＫｐ４６抗体もしくはその両方を含む群から選ばれる有効量の少なくとも１種の抗体又はその免疫反応性断片の１回以上の注射、及びインターロイキン、例えば、ＩＬ２（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＮＪ，ＲＤＩ−２０２）、ＩＬ１２（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＮＪ，ＤＩ−２１２）、ＩＬ１５（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＮＪ，ＲＤＩ−２１５）、ＩＬ２１（Ａｓａｎｏ ｅｔ ａｌ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２００２；５２８：７０−６）又はそれらの組み合わせを含む群から選ばれるサイトカインの反復注射を５〜１０日間行い、該サイトカインを抗体の最初の注射と同じ日に最初に注射することを含む。好ましくは、サイトカインは、ＩＬ２、ＩＬ１５又はその両方である。

上記方法は、好ましくは、皮下経路によりサイトカインを１日に１回又は２回注射することを含む。

本発明は、例えば、黒色腫、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、肝癌、肺腺癌、神経芽細胞腫の抗腫瘍予防、抗腫瘍寛解及び抗腫瘍治療用並びに微生物予防、微生物寛解及び微生物治療用の薬物の製造における上記医薬組成物の使用にも関する。

本発明のこれら及び他の特徴及び利点は、下記の実施例から更に明らかになるであろう。これらの実施例は、説明の目的でのみ与えられており、本発明の範囲を決して制限することを意図するものではない。当業者により意図される替わりの態様は本発明により包含される。

１．材料及び方法
材料
．血液：
−最初の実験のために、末梢血（５〜１０×７ml ＥＤＴＡチューブ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ＃３６７６５５）を健康なボランチアから採集し（Ｌａｂ．Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｅ，Ｌａ Ｃｏｎｃｅｐｔｉｏｎ）そして２時間以内に処理した。
−更なる実験のために、末梢血サンプルをＥｔａｂｌｉｓｓｍｅｎｔ Ｆｒａｃａｉｓ ｄｕ Ｓａｎｇ（ＥＦＳ）により提供され、そして２４時間以内に処理した（４５０ml±１０％の血液を採集するための凝固防止剤ＣＰＤ６３mlを含有するバッグに血液を採集する；Ｂａｘｔｅｒ＃Ｒ８４４３）。

．ＰＢＭＣ及び初代細胞培養
−５０mlのポリプロピレン円錐形チューブ（Ｆａｌｃｏｎ，＃３５２０７０）
−９６ウエルプレート、Ｕ字形（Ｆａｌｃｏｎ，＃３５７５２５）
−ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃３１８７００７４）
−ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１０２７０−１０６，Ｌｏｔ＃４０Ａ０２８５Ｋ）熱で不活性化された
−ペニシリン−ストレプトマイシン（５０００ｕ／ml，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１５０７００７１）
−ピルビン酸ナトリウム（１００mM，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１１３６００８８）
−Ｌ−グルタミン２００mM（１００Ｘ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃２５０３０１２３）
−Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（登録商標）ＰＬＵＳ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，＃１７−１４４０−０３）
−Ｔｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ０．４％（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１５２５００６１）
−Ｄ−ＰＢＳ（１Ｘ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１４１９０１６９
−血球計算盤（Ｎｅｕｂａｕｅｒ）
−ヒト組換えＩＬ−１５（２５μg，Ｒ＆Ｄ，＃２１９−ＩＬ−０２５）。ＰＢＳ／ＢＳＡ０．１％中のＩＬ−１５のストック溶液（１０μg／ml）を調製し、部分標本化し（ａｌｉｑｕｏｔｅｄ）そして−２０℃で貯蔵した。
−ヒト組換えＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ，１８×１０^６ＩＵ，バッチＡ１９９６０６／２，Ｃｈｉｒｏｎ）。ＰＢＳ／ＢＳＡ０．２％中のＩＬ−２のストック溶液（２×１０^６及び２×１０^５u／ml）を調製し、部分標本化しそして−２０℃で貯蔵した。
−モノクローナル抗体：
−３Ｇ８（抗ＣＤ１６）、５mg／ml、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ
−Ｎ９０１（抗ＣＤ５６）、５mg／ml、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ
−Ｂａｂ２８１（抗ＮＫｐ４６）、２．８mg／ml（マウス腹水からのタンパク質ＡＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）上で精製されたｍＡｂ）
−ＡＺ２０（抗ＮＫｐ３０）、１mg／ml及び１．２mg／ml（マウス腹水からのタンパク質ＡＳｅｐｈａｒｏｓｅ上で精製されたｍＡｂ）。

細胞分裂分析（ＣＦＳＥ標識化）
５−（及び６）−カルボキシテトラメチルローダミン、スクシンイミジルエステル（５（６）−ＴＡＭＲＡ、ＳＥ）混合異性体（ＣＦＳＥ、２５mg；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ、Ｃ−１１５７）
−ＤＭＳＯｈｙｂｒｉ−Ｍａｘ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ＃Ｄ２６５０）
−ＤＭＳＯ中のＣＦＳＥ（１０mM）のストック溶液を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓにより与えられた技術データシートに記載のとおりにして、調製し、部分標本化しそして−２０℃で貯蔵した。

．染色
−９６ウエルプレート、Ｕ字形（Ｇｒｅｉｎｅｒ＃６５０１８０）
−１．２mlマイクロタイターチューブ（ＱＳＰ、＃８４５−Ｆ）
−５mlチューブ（１２×７５ＰＲＯ、ＣＭＬ、＃ＴＨ５−１２ＰＲＯ）
−染色緩衝液：ＰＢＳ／０．２％ＢＳＡ／０．０２％アジ化ナトリウム（Ｄ−ＰＢＳ（１０Ｘ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃１４２０００８３；ウシアルブミン（Ａｌｂｕｍｉｎ Ｂｏｖｉｎ），画分Ｖ（ＦｒａｃｔｉｏｎＶ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃；アジ化ナトリウム、Ｐｒｏｌａｂｏ＃２７９６７．１５０）
−マウス血清ＮＭＲＩ（Ｊａｎｖｉｅｒ）
−この研究で使用された商業的に入手可能なＡｂ（表１）

．フローサイトメトリー
サンプルをＸＬ／ＭＣＬサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）に流した。ＥＸＰＯ（登録商標）３２ｖ１．２ソフトウエア（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）により取り込み（ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ）及び分析を行った。
方法：
．ＰＢＭＣの調製
血液サンプルをＲＰＭＩで容積／容積希釈しそして古典的フィコール法を使用して処理した。
ＰＢＭＣを５０mlの円錐形チューブに集め、ＲＰＭＩ、２％ＦＣＳで４回洗浄し、トリパンブルーで計数した。細胞を、細胞培養の開始のために完全培地（ＲＰＭＩ１６４０、ＦＣＳ１０％、ＰＳ（５０u／ml）、Ｇｌｕ ２mM、Ｎａ．Ｐｙｒ１mM）中に２＊1０ＥＥ６細胞／mlで再懸濁させ又はフローサイトメトリー実験のために染色緩衝液（ＰＢＳ、０．２％ＢＳＡ、０．０２％アジ化ナトリウム）中に１０ＥＥ７細胞／mlで再懸濁させた。

ＣＦＳＥ標識化：
−ＰＢＭＣ（１０^７細胞／ml）をＣＦＳＥ（５〜１０μM）を含有するＲＰＭＩ／ＦＣＳ２％中で３７℃（水浴）で１０〜２５分間インキュベーションした。
−細胞を大容量の冷（４℃）ＲＰＭＩ／ＦＣＳ２％で３回（１０分、１２００ＲＰＭ）洗浄した。
−ＰＢＭＣを完全培地中に再懸濁させ（２×１０^６細胞／ml）そして細胞培養の準備を整えた。

その後の技術の各々について、本発明者は下記の工程を推奨する。
．初代細胞培養
０日目
−ＰＢＭＣ（２×１０^６個／ml）を完全培地（ＲＰＭＩ１６４０、ＦＣＳ１０％、ＰＳ（５０u／ml）、Ｇｌｕ２mM、Ｎａ．Ｐｙｒ．１mM）中に再懸濁させる。
−完全培地を使用して２Ｘインターロイキンストック（ＩＬ−２、ＩＬ−１５及びＩＬ−２＋ＩＬ−１５）を調製する。
−実験に依存して、ＩＬ−２を５０又は４００u／ml最終で使用した。ＩＬ−１５を常に１０ng／ml最終で使用した。
−完全培地を使用して４Ｘ抗体ストックを調製する。
−培養をセットアップする：５０μl ４ＸｍＡｂ＋１００μl ２Ｘインターロイキン＋５０μl ＰＢＭＣ（１０^５個細胞／ウエル）
−完全培地により２００μlとなるように満たす。
３日目：
−培地を変える：１００μlを除去しそして１Ｘインターロイキンを含有する完全培地１００μlを加える。
６日目：
培地を変える：１００μlを除去しそして５０u／mlＩＬ−２（±ＩＬ−１５ １０ng／ml）又は４００u／mlＩＬ−２（±ＩＬ−１５ １０ng／ml）を含有する完全培地１００μlを加える。
９日目：
−細胞を１／２に分けそして培地を加える（６日目）
１３、１６及び２０日目：
細胞増殖に依存して６日目又は９日目と同じ

．染色
この研究で使用された容積、希釈率及びＡｂ濃度を表１に示す。
−培養したＰＢＭＣの染色のために、１ポイントの染色のために１又は２ウエルを使用することができる。コントロールサンプルをインターロイキンで刺激された細胞で調製した。
−％ＮＫ細胞（ＣＤ５６^＋ＣＤ３⁻細胞）を０日目、６日目、１３日目、１６日目及び２０日目に検査しそしてある実験については３日目、９日目及び３５日目に検査した。
−表１に列挙された抗体による０日目及び１７日目における（ある実験について）ＮＫ細胞及びＴリンパ腫コンパートメントの特徴付け

ｍＡｂを分注しそして染色緩衝液により容積を５０μlに調節する。
細胞懸濁液５０μlを加える。
氷上で３０分インキュベーションする。
染色緩衝液で２回洗浄する。
細胞を染色緩衝液１５０μl中に再懸濁させそして染色緩衝液１５０μlを入れたＲＴ１５チューブに移す。
フローサイトメーターでの獲得まで冷凍して保つ。

．サイトメトリー
獲得
−「セットアップモード」においてアイソタイプコントロール混合物を流しそしてセットアップする：ＦＳＣ、ＳＳＣ、閾値、ＦＬ１、ＦＬ２、ＦＬ３及びＦＬ４パラメーター。
．そのＦＳＣ及びＳＳＣ特徴（ＦＳＣ、線状、ゲイン：２、ボルト：４００及びＳＳＣ、線状、ゲイン：２０、ボルト：４００；閾値：ＦＳＣ、１５０）により同定されたリンパ腫に分析を集中させ；これらのパラメーターのボルトはこの研究の各実験間で僅かに異なっていてもよい（培養された細胞のＦＳＣ及びＳＳＣは通常単離されたばかりの細胞のこれらより高い）。
．リンパ腫ゲート＝Ｌｙを描き（ｄｒａｗ）（Ｌｙにおいて少なくとも１００００のイベントを取り込むが、すべてのイベントが集められる）。
−実験で使用した各蛍光プローブのためのボルトをセットアップし（ほぼ、ＦＬ１＝８００；ＦＬ２＝８００；ＦＬ３＝９５０及びＦＬ4＝１０００）；それらは各実験の間で僅かに異なっていてもよい。
−単一の染色サンプル（実験で使用したｍＡｂ又は抗ＣＤ８）を使用してコンペンセーションをセットアップする：
．最初に、ＦＬ１−ｍＡｂサンプルを流し、そして最初のディケード（ＦＬ２ヒストグラム及びＦＬ１／ＦＬ２ドットプロットにおいて＜０．５％）にＦＬ１ネガティブ細胞及びＦＬ１ポジティブ細胞及びすべてのＦＬ２ネガティブ細胞について同じＦＬ２−ＭＦＩを有するようにＦＬ２−ＦＬ１（＝１５〜２０）をセットアップし、次いで丁度ＦＬ２−ＦＬ１で述べたとおりＦＬ３−ＦＬ１及びＦＬ４−ＦＬ１をセットアップする。値を書き込みそしてコンペンセーションをクリアーする。
−各蛍光プローブについてこの工程を繰り返す。
−すべての値をコンペンセーションマトリックスにコピーする。
−アイソタイプコントロールサンプルを取り込み、次いで実験のために調製したすべてのサンプルを取り込む（「９６ウエルテーブル」上の取り込まれたサンプルに相当するｌｍｄ数を書き込む）。
−各サンプル（ｌｍｄ）を記録し、次いで呼び出されたホルダーに移す：年、月、日（例えば、２００２０１２６）。このホルダーはＨＣ／ＰＡホルダー内に位置している。
−ＣＦＳＥサンプルの取り込み
．ＦＬ１コンペンセーションはＣＦＳＥ標識された細胞のみを使用してなされなければならない。
．最初に、アイソタイプコントロールサンプルを使用してＦＬ１、ＦＬ２．．．のためのボルトをセットアップし、次いでＣＦＳＥサンプルを流す。標識化は、すべての細胞がＣＦＳＥについてポジティブいであり、染色が均一でありそしてピークチャンネル（ｐｉｃ ｃｈａｎｎｅｌ）がＦＬ１ヒストグラムの最後のディケードの中央に位置している（ＦＬ１ボルト低下させることなく）とき良好である。
．すべてのコンペンセーションをセットアップする（それらは通常ＦＬ１−ｍＡＢ染色細胞で得られるコンペンセーションよりも高い）。

分析
−そのＦＳＣ及びＳＳＣ特徴（ドットプロットＦＳＣ／ＳＳＣ）により同定されたリンパ腫に分析を集中した。リンパ腫ゲート（Ｌｙ）を描く。
四分区間領域（ｑｕａｄｒａｎｔ ｒｅｇｉｏｎｓ）（ドットプロットについて）及びマーカー領域（ヒストグラムについて）を、アイソタイプコントロールサンプルを使用してセットした（すべての蛍光について：％ＦＬＸ^＋細胞＜０．５％）。
−Ｔ細胞又はＮＫ細胞コンパートメントの分析：
Ｔ細胞＝ＣＤ３^＋リンパ腫は、Ｌｙでゲーティングされた抗ＣＤ３染色ヒストグラムのポジティブ細胞として定義された。
ＮＫ細胞＝ＣＤ３⁻ＣＤ５６^＋リンパ腫は、ＣＤ３／ＣＤ５６ドットプロットにおけるＣＤ３⁻ＣＤ５６^＋ゲート（四分区間の上左部）に相当する。
ＣＦＳＥ染色、ＣＤ２５発現（％）、ＮＫＲ発現（％）及びＣＤ５６密度（ＭＦＩ）を分析した。
−細胞計数及び冷凍
いくつかの培養物を細胞数及び細胞生存率（トリパンブルー排除）について検査し、次いで実験の終わりに冷凍した（２０日又は３５日）。

２、５及び６欄については供与者の注釈を参照されたい。

実施例１抗ＮＣＲ抗体＋ＩＬ２はＮＫ細胞の特異的細胞増殖を促進することができる
−抗ＮＣＲ抗体及びＩＬ２による刺激後のＮＫ細胞の相対的増幅
１人の供与者からのＰＢＭＣを単離しそしてＩＬ２とＣＤ１６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６又はＣＤ５６ｍＡｂｓとの組み合わせに対するそれらのｉｎ ｖｉｔｒｏ応答について試験した。細胞を、飽和量の抗体の存在下に、材料及び方法において説明した如くして処理した。

細胞をフローサイトメトリーにより監視しそしてＣＤ５６＋／ＣＤ３−（ＮＫ細胞）の相対的百分率を決定した。
結果を図１に示す。

この供与者では、抗ＮＣＲ抗体の存在下に１０日目に培養物中のＮＫ細胞の増加（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）があったが、これに対して、ＣＤ１６又はＣＤ５６はＩＬ２単独に比べて有意な増加を誘発しなかった。

この増加が供与者に関連しているかいないかを評価するために、ＰＢＭＣを４人の健康なボランチアから単離しそしてＩＬ２＋ＮＣＲに対するモノクローナル抗体の組み合わせに対するそれらのｉｎ ｖｉｔｒｏ応答について試験した。

細胞を材料及び方法に記載の如くして処理し、そして抗体なしで、又は、飽和量（１０μg／ml）の抗ＮＫｐ３０モノクローナル抗体、抗ＮＫｐ４６モノクローナル抗体、抗ＮＫｐ３０及びＮＫｐ４６のモノクローナル抗体の組み合わせ、抗ＣＤ５６モノクローナル抗体の存在下に置いた。細胞をフローサイトメトリーにより監視しそしてＣＤ５６＋／ＣＤ３−（ＮＫ細胞）の相対的百分率を決定した。

結果を図２に示す。

試験した４人の健康な供与者については、ＮＫ細胞の選択的増加があった。増加は抗ＮＫｐ３０が使用されるとき、ＮＫｐ４６に比較して僅かにより良好である。２つの抗体の組み合わせが最善の増加を与える。

これらの２つの研究の結論は、低用量のＩＬ２（５０単位／ml）と抗ＮＣＲ抗体の組み合わせがＮＫ細胞の選択的増加を誘発するということである。

この増殖がＮＫ細胞の有効な増殖によるか又は培養物中に存在する他の細胞の選択的死滅によるかどうかを評価するために、ＰＢＭＣをＣＦＳＥで染色し、次いで培養の開始時に洗浄して過剰の染料を取り除いた（材料及び方法参照）。ＣＦＳＥは細胞に共有結合する安定な蛍光標識である。細胞が分裂すると、最初の染料含有率の約半分が２つの娘細胞に存在する。細胞が再び分裂すると、最初の染料含有率の１／４が４つの娘細胞に存在する等。標識された細胞を培養しそして上記の如き抗ＮＣＲ抗体及びＩＬ２により刺激した。細胞の染料含有率をフローサイトメトリーにより監視した。

１人の代表的供与者で得られた結果を図３に示す。

ＮＫｐ３０又はＮＫｐ４６＋ＩＬ２共処理は、休止細胞（分裂しない）と同等な蛍光強度を持ったままである細胞の数により示されるＩＬ２単独又はＩＬ２＋関係のないｍＡｂ（ＣＤ５６）よりも良好なＮＫ細胞の増殖を誘発する：それぞれＩＬ２及びＩＬ２＋ＣＤ５６について５０％及び４０％、並びにそれぞれＮＫｐ３０＋ＩＬ２及びＮＫｐ４６＋ＩＬ２について５％及び１１％。

ＮＫｐ３０で最善の増殖が得られ、その場合に６日目の培養物中の細胞の８０％より多くが５回より多くの分裂を受けた。

結論すると、抗ＮＣＲ（ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６又は両方）＋ＩＬ２共処理は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＰＢＭＣからのＮＫ細胞の選択的増殖を誘発する。

実施例２．抗ＮＣＲ＋ＩＬ１５もＮＫ細胞の特異的増殖を誘発する
抗体による刺激の後、細胞の増殖を持続させるのにサイトカインの存在が極めて重要である。ＩＬ１５も１人の供与者に関して細胞の増殖を持続させることができるかどうかを試験するための実験を行った。

細胞をＮＫｐ３０で刺激しそしてＩＬ２、ＩＬ１５又は両方の存在下に培養した。

結果を図４に示す。

この供与者に関しては、ＩＬ１５はＮＫ細胞の増殖を持続させることができた。
我々は、ＩＬ２及びＩＬ１５の組み合わせもＮＫ細胞の増殖を持続させることを確かめた。他の供与者に関する他の実験では、ＩＬ２及びＩＬ１５の組み合わせは2つのサイトカイン単独よりも僅かに良好でありうることが観察された。

実施例３．増殖の誘発のための抗ＮＣＲ抗体の滴定曲線
増殖を得るのに必要な抗体の量を評価するために、抗ＮＫｐ３０抗体を使用して３人の独立した供与者に関して滴定曲線を確立した。結果を図５に示す。この実験は、抗体の効果が約１μg／mlで高原効果により飽和可能であることを示す。最大効果の５０％を得るための用量はこの実験では０．１μg／mlより少ない。

曲線の特徴は使用した特定の抗体及び特にそのアフイニティーに依存することができることに留意されるべきである。ヒト化抗ＮＣＲ抗体の使用も種々の滴定曲線を表示することができる。

実施例４．抗ＮＣＲ抗体＋ＩＬ２ｉｎ ｖｉｖｏの使用の条件
抗ＮＣＲ抗体（１種又は複数種）を最初にｉｎ ｖｉｔｒｏで試験し、次いで適切な動物モデルにおいて試験した。

抗ＮＣＲ＋ＩＬ２はｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＤ２５を誘発し（図６）、かくして大部分のＮＫ細胞においてＩＬ２に対する高いアフイニティーの受容体を誘発することに留意されるべきである。ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、低用量、例えば５０単位／mlはＮＫ細胞の増殖を持続させるのに十分である。かくして、低用量ＩＬ２（典型的には、毎日の皮下注射で百万単位／平方メートル／日より低い）は増殖を持続させるのに十分であることを予測することができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、ＣＤ２５は９〜１０日後ダウンレギュレーションされ、その結果低用量ＩＬ２処理の長さは１０日までであることが予想される。

１人の健康な供与者からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、１０又は３０μg／mlで、指示された抗体（ＡＺ２０＝抗ＮＫｐ３０、Ｂａｂ２８１＝抗ＮＫｐ４６）と共に、６日目までは５０単位／ml ＩＬ２の存在下にそして６〜１０日目では５０単位／ml（黒色バー）又は４００単位／ml（緑色バー）の存在下に培養した。ＮＫ細胞の％は１０日目にフローサイトメトリーにより決定した。 開始時に１０μg／mlの指示された抗体及び培養の間に５０単位／ml ＩＬ２を使用する、４人の健康な供与者からの全未分別ＰＢＭＣからのＮＫの相対的倍比増加（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｆｏｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ）（０日目における％ＮＫ細胞で割った指示された日における％ＮＫ細胞）。相対的倍比増加の平均＋／−標準偏差を表す。 ＮＫ細胞のカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）標識化（ＦＬ１、対数スケール、Ｘ軸）（指示された処理による培養の６日後のＣＤ５６＋／ＣＤ３−細胞に対してゲートをかけた） ＩＬ−２又はＩＬ−１５と組み合わせたＡＺ２０はＮＫ細胞増殖を誘発する。単離されたばかりのＰＢＭＣをインターロイキンの種々の条件下に（０〜６日目は、濃度は下の濃度であり；６〜１３日はインターロイキンの濃度は上の濃度である）そして抗ＣＤ５６ｍＡｂ（Ｎ９０１、ＩｇＧ１、１０μg／ml）又は抗ＮＫｐ３０ｍＡｂ（ＡＺ２０、ＩｇＧ１、１０μg／ml）を使用して培養した。１３日目に細胞を集めそしてＣＤ５６^＋ＣＤ３⁻リンパ腫として定義されたＮＫ細胞の％についてフローサイトメトリーにより分析した。 ３人の供与者（Ａ、Ｂ、Ｃ）から単離されたばかりのＰＢＭＣを、ＩＬ−２（０〜６日目は５０u／ml及び６日目からは４００u／ml）及びＩＬ−１５（１０ng／ml）を含有するＲＰＭＩ１６４０ １０％ＦＣＳ中の指示された量のＡＺ２０と共に培養した。１３日目に細胞を集め、生存率及び計数をトリパンブルーにより評価しそして％ＣＤ５６^＋ＣＤ⁻リンパ腫をフローサイトメトリーにより評価した。 指示された刺激（ＩＬ２（５０U／ml）、ｍＡｂｓ１０μg／mlによる２人の健康な供与者（材料及び方法参照）のＰＢＭＣの刺激の６日後に得られたＮＫ細胞のＣＤ２５誘発。

Claims (15)

1. 有効量の、抗ＮＣＲ抗体、例えば、抗ＮＫｐ３０抗体もしくは抗ＮＫｐ４６抗体もしくはその両方を含む群から選ばれる少なくとも１種の抗体又はその免疫反応性断片、及びインターロイキン、例えば、ＩＬ２、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ２１又はその組み合わせを含む群から選ばれるサイトカインを、薬学的に許容されうる担体と共に含み、該抗体及びサイトカインは対象に対して一緒に投与されるか又は別々に投与される、ＮＫ細胞の増殖に対する刺激効果を有する医薬組成物。
2. 該抗ＮＫｐ３０抗体及び／又は抗ＮＫｐ４６抗体をＩＬ２と混合して使用する、請求項１に記載の医薬組成物。
3. 該抗ＮＫｐ３０抗体が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又はその免疫原性断片及び配列番号５よりなる群から選ばれるポリペプチドに特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合性断片である、請求項１に記載の医薬組成物。
4. 該抗体が配列番号１を有するポリペプチドに特異的に結合する、請求項３に記載の医薬組成物。
5. 該抗ＮＫｐ３０抗体及び／又は抗ＮＫｐ４６抗体が、モノクローナル抗体、アフイニティー抗体、キメラ化抗体又はヒト化抗体であり、そして、更に好ましくは、ヒト化マウスモノクローナル抗体であるか又はヒト起源のものである、請求項１に記載の医薬組成物。
6. 該抗ＮＫｐ３０モノクローナル抗体がハイブリドーマ株Ｉ−２５７６により産生される、請求項５に記載の医薬組成物。
7. 実質的にＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ断片及びＣＤＲグラフトされたヒト化モノクローナル抗体である抗体断片を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
8. 皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内又は皮下注射、鼻腔内経路及び外科経路を含む種々の経路により投与される、請求項１に記載の医薬組成物。
9. 錠剤、粉末剤、ペースト剤、パッチ剤、顆粒剤、微小顆粒剤、ナノ粒子剤、コロイド溶液剤、水性溶液剤、注射可能溶液剤、噴霧剤及びリポソーム剤の形態下にある、請求項１に記載の医薬組成物。
10. 例えば、黒色腫、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、肝癌、肺腺癌、神経芽細胞腫の予防、寛解、治療のため並びに抗微生物予防、抗微生物寛解及び抗微生物治療のための、毎日の皮下注射用に使用されるとき、１ng〜１００mg／kg（体重）の抗体及び百万単位／平方メートル／日より少ないサイトカインを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
11. ＮＫ細胞を有効量の請求項１に記載の医薬組成物と接触させることを含む、ＮＫ細胞の増殖を刺激するための方法。
12. 有効量の、抗ＮＣＲ抗体、例えば、抗ＮＫｐ３０抗体もしくは抗ＮＫｐ４６抗体もしくはその両方を含む群から選ばれる少なくとも１種の抗体又はその免疫反応性断片の１回以上の注射、及びインターロイキン、例えば、ＩＬ２、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ２１又はそれらの組み合わせを含む群から選ばれるサイトカインの反復注射を５〜１０日間行い、該サイトカインを抗体の最初の注射と同じ日に最初に注射することを含む、請求項１１に記載の方法。
13. 皮下経路によりサイトカインを１日に１回又は２回注射することを含む、請求項１２に記載の方法。
14. 該インターロイキンがＩＬ２でありそして該インターロイキンを百万単位／m^２より低い一日量で５〜１０日間皮下注射する、請求項１１に記載の方法。
15. 例えば、黒色腫、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、肝癌、肺腺癌、神経芽細胞腫の予防、寛解及び治療用並びに抗微生物防止、抗微生物寛解及び抗微生物治療用の薬物の製造における請求項１に記載の医薬組成物の使用。

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